2023年⽇化協LRI研究報告会（ウェブ開催）
2023年8⽉25⽇

⽇化協LRI第11期課題研究
反復投与毒性の評価のための統計学的・数理科学的アプローチによる客観的なリードアクロス⼿法の開発
代表研究者︓吉成浩⼀（静岡県⽴⼤学薬学部）
分担研究者︓⽵下潤⼀（産総研安全科学研究部⾨）︓鈴⽊知道（東京理科⼤学理⼯学部）
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研究背景
n 化学物質の安全性は主に動物実験結果を基に評価されているが、世界的に動物実験代替法の開発が強く求められている。
n EUにおける、動物実験が⾏われた化粧品完成品、原料及び配合原料の販売禁⽌（2013年）、⽶国環境保護庁による哺乳類を⽤いた試験の要求停⽌並びに研究費補助の30%削減（2025年まで）並びに全廃（2035年まで）の発表など、その流れは加速している。
n しかし、全⾝毒性の評価に重要な反復投与毒性に関しては、その毒性の多様さ、複雑さなどの理由から動物実験代替法の開発は全く進んでいない。
n AI/機械学習への期待は⼤きいが、毒性関連の学習⽤データは少なく、予測根拠情報が得られない、などの問題がある。
n このような状況において、複雑な毒性の評価に、グルーピングアプローチ（カテゴリーアプローチ）とリードアクロスが有⽤かつ現実的な⼿段と考えられている。
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グルーピングアプローチとリードアクロス• 化学構造や⽣物学的特徴が類似した化学物質群をグルーピングし、そのグルーピングに基づき毒性評価を⾏う。
• 被験物質（未評価）と同じグループに属する物質の毒性試験結果から、被験物質の毒性を類推（リードアクロス）する。
既存の⼿法における問題点• 類似性は⼈が判断→主観的で、再現性に問題あり• 類似性判断に実験データも利⽤されつつある→どのような実験データを⽤いるべ
きか不明瞭• 被験物質がいずれのグループにも当てはまらない可能性

シリコ
非シリコ︖
メンソールカテゴリー

同じ︖
異なる︖
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体系的・客観的なリードアクロス⼿法開発の課題
リードアクロス⼿法の概略
被験物質（ターゲット）

既存の毒性試験結果

類似物質の選択（ステップ１）
類似物質

（ソース）

被験物質の毒性評価（ステップ２）

課題
ステップ１• どんな指標で類似性を判断︖• 化学構造のみ︖
⽣物学的情報が必要︖
機序の情報は必要︖• どの程度までが似てる物質︖• いくつの類似物質が必要︖
ステップ２• 判断基準は︖• 毒性の有無︓多数決︖１つでもあれば有害︖• LOAEL/NOAELの評価︖

n 客観的なリードアクロスの実施には、検討すべき項⽬が多い。4

本研究の⽬的・概要
HESS等のラット反復投与毒性試験データベースを参照データセットとして、被験物質の化学構造情報やインビトロ試
験結果に基づいて参照データセットから類似（ソース）物質を同定し、それらから被験物質の反復投与毒性を予測するための、客観的なリードアクロス⼿法の開発を⽬指す。
本発表では、肝と⾎液の８つのエンドポイントを対象として、化学構造情報とインビトロ試験情報で順次類似性を評価する「２段階リードアクロス」⼿法開発のこれまでの成果の⼀部を紹介する。

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研究⽅法概略
Original dataset

Test dataset
32 substancesNH2······#1

326 substancesfrom HESSOH

Step 1:
Chemicalsimilarity

#2

#3

#32

Step 2: Biological similarity

Reference dataset
294 substances

Step 1

Step 2
1st sourcesubstances

Final sourcesubstances

RAx

データセット• HESSから326物質（主に化審法基本点検物質）を選択：Original dataset• １割（32物質）を被験物質としてランダムに選択： Test dataset• 残りを類似物質（ソース物質）検索対象データセットに設定： Reference dataset
類似物質選択とリードアクロス• 分⼦記述⼦を利⽤して化学構造が類似する17物質を選択：1st source subst.
• 17物質のうち、インビトロ試験結果が⼀致する物質を選択：Final source subst.
• Final source substancesを⽤いて、各エンドポイントのリードアクロスを実施• 全被験物質について同様の操作を⾏い、予測精度を評価

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研究⽅法概略（２）
エンドポイント（EP）• 28⽇間反復投与毒性試験で認められる代表的所⾒をグループ化• 肝臓６種（細胞死/炎症、肝機能低下、肝機能亢進、胆管障害、肥⼤、脂質代謝異常）、⾎液２種（凝固障害、貧⾎）
化学構造の類似性評価• alvaDesc分⼦記述⼦（2649種）を使⽤• 物質間のユークリッド距離を算出
インビトロ試験による類似性評価• 細胞傷害試験︓CellTiterアッセイ（細胞内ATP含量）、LDH放出試験、細胞内GSHレベル• HepG2細胞を⽤いたハイコンテント解析（核、ミトコンドリア、F-アクチン、中性脂肪蓄積、リン脂質蓄積の37パラメータ）• ラットP450阻害試験（７種）• 閾値を設定して実験値を２値化（陽性/陰性）• 毒性EPとの統計学的関連性を基に試験を選択
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２段階リードアクロスの結果（その１）
1: Cytotox
2: P450
3: HCA

4: Combination A
5: Combination B
6: Ensemble

LV02

BA

LV03

Liver function ↓110.8

Liver function ↑Sensitivity

Specificity

LV04

LV05

Bile duct lesion

Hypertrophy

LV06
Dyslipidemia

BL02

111

0.8

0.8

0.8

0.8

0.8

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

00- 1 2 3 45 60- 1 2 3 45 60- 1 2 3 45 60- 1 2 3 45 61Anemia

0- 1 2 3 45 6- 1 2 3 45 6

n インビトロ試験結果に基づいてソース物質を選択すると、多くのEPで予測精度が向上した。
n 特に、P450試験を利⽤した場合に向上の程度が顕著であった。
n 複数の試験結果を組み合わせた場合に、必ずしも単独利⽤の場合よいもよい精度が得られることはなかった。
8２段階リードアクロスの結果（その２）
1: Cytotox
2: P450
3: HCA

4: Combination A
5: Combination B
6: Ensemble

LV01
1Liver cell death

0.8

BA

Sensitivity

BL01
1

Coagulopathy

0.8

gEP
0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

0

- 1 2 3 4 5 6Specificity

0Cytotox
Para. p-value

P450
HCA
Para.
p-value Para. p-value

LV01 LDH 0.3014 rCYP2B1 0.1397

Mit0.3686

BL01 GSH 0.0206 rCYP3A2 0.0026

TG0.0009- 1 2 3 4 5 6n LV01とBL01では、インビトロ試験結果によるソース物質選択は、予測精度を向上しなかった。試験の種類によってはむしろ低下させた。
n LV01では、いずれの試験カテゴリーにおいてもgEPとの関連性が⾼い試
験がなく、関連性の低い試験を⽤いたことが原因かもしれない。
n BL01では、分⼦記述⼦を⽤いたRAxで既に⾼い予測精度が得られていたために、精度向上が認められなかった可能性がある。

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まとめと今後の計画
n 分⼦記述⼦を利⽤してソース物質を選択した後に、インビトロ試験結果に基づいてソース物質をフィルタリングすることで、多くのEPでリードアクロス精度が向上した。特に、P450試験でその効果が強く認められた。⼀⽅、複数試験の組み合わせの効果は認められなかった。
n 効果が認められた物質、認められなかった物質の特徴把握を含めて、結果の検証を進める。
n 現時点では、試験結果を陽性/陰性の２値に変換して利⽤しているが、複数の試験結果を効果的に利⽤するために、実測値やそれを⽤いた距離に基づく類似性評価を検討する。
n EPによっては今回⽤いた試験結果では統計学的な関連性が認められなかったことから、他の試験データの活⽤も検討する。
n さらに、第⼀段階の化学構造情報を⽤いた類似性評価に関しても、分⼦記述⼦、正規化⼿法、物質間距離、ソース物質数、等の検討を進める。
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