向科学技術振興財団

研究助成成果報告書

エマルジョン電気泳動法による脂質異性体の高性能分離法
Development of the separation method for lipid isomers
by capillary electrophoresis with emulsion

助成年度

令和 4 年度研究助成

助成番号MZR2022006

研究期間

2022/04/01～2023/03/31

代表研究者

岡本 行広

(Okamoto Yukihiro)

大阪大学 大学院基礎工学研究科 物質創成専攻 化学工学領域
共同研究者

設けていないキーワード

脂質分子, キャピラリー電気泳動分離, エマルジョン，抽出１．研究の背景と目的

Fig.2 Problems of LC-MS in thelipidomics.には，脂質分子の異性体の優れた分離手法が必須項

Fig .1 Importance of lipidomics research.

目となっている(Fig2)．

細胞や生体内における脂質分子の代謝物の変ところで，キャピラリー電気泳動法は，水溶液化を網羅的に探索し，生命現象を包括的に理解し中の試料に対して短時間で優れた分離分析を可能ようとする研究『リピドミクス』が重要となってとする手法の一つである．その中でも，異性体のいる(Fig1)．現状，リピドミクスでは液体クロマ様な試料に対しても優れた分離性能を示す．キャトグラフィー(LC)の分離後，質量分析(MS)によるピラリー電気泳動で，異性体，特に光学異性体を構造解析という LC-MS 法が使用されている．しか分離する際には固定相を泳動液に添加，もしくはし，LC では，構造が多様な脂質の中でも特に，構充填剤・キャピラリー壁面に固定化して用いる．

造・幾何・光学異性体の分離が困難なケースが多泳動的に添加する手法は簡便であるため，これまい．さらに MS は分子量が同じである異性体の区でにもシクロデキストリンなどの固定相を用いた別が不可能である．つまり，LC-MS 法は，特に異キャピラリー電気泳動分離法が報告されている．

性体のリピドミクス研究において問題を有してしかし，今回の目的分子である脂質分子は難水溶いる．言い換えると，リピドミクスの研究の発展性であるため，水に溶解しているキラルセレクタ

ーを用いることは不可能である．このため，有機度計を用いて評価した．

溶媒もしくは有機溶媒を含む水溶液に溶解可能な固定相を用いる必要がある．そこで，本計画では(2)エマルジョンXを用いた抽出分離

エマルジョンを固定相に用いた電気泳動法を用いエマルジョンXを用いることで，細胞から脂質分て，脂質分子の分離法の開発を目指した(Fig3)．

子の抽出が可能になると考えられる．そこで，疑さらに，一般的に生体試料を扱う場合，夾雑成

似細胞として蛍光色素を含むリポソームを作製し分と目的成分を抽出などの前処理を行った後に，た．DPPCリポソームを凍結融解法により作製し，精密分離そして分析を実施する．このため，前処内水相にカルセイン水溶液を内封した．リポソー

理の効率化(操作時間，回収率/選択率/濃縮率など

ムの溶解は，内水相のカルセインが放出され、コの項目)は重要である．

バルトイオンにより消光されることで確認した．

そこで，本研究期間では，まずは，脂質分子のまた，エマルジョンからの脂質の抽出は二相分離抽出やキャピラリー電気泳動分離を可能とするエを誘起させ，DPPCに対してUV-VISスペクトル解析マルジョンの検討を行うことを目的とした．(以下を行い，抽出能の評価を実施した．の記述では現時点で公表不可の箇所はXという名称を用いている)

最後に，脂質分子のキャピラリー電気泳動分離の可能性を検討した．現段階では，脂質分子を用いた分離を検討する段階には至っておらず，難水溶性物質をモデルとしてキャピラリー電気泳動分離を検+-討した．

３．研究の成果

Fig.3 Schematic illustration of capillaryelectrophoretic separation with emulsion.
Emulsion plays the role of the stationaryphase.
２．研究の内容・方法(1)エマルジョンXの作製およびその評価
組成比を変えて，エマルジョンXを作製した．そ

エマルジョンＸの形成を動的光散乱測定から確認できた(Fig4)．また，塩濃度の増加により粒子径の増大が観測されたため，生体試料の様な高塩濃度の試料の場合は，エマルジョンの粒径の肥大化もしくは二相分離がおこる恐れがあることが予測された．のエマルジョンの粒子径に関して，動的光散乱法を用いて評価した．また，生体試料を想定しているため，水溶液の塩濃度に対する安定性を同じく動的光散乱法による粒子系の変化として評価した．また，エマルジョンの安定性や，抽出分離に影響を及ぼすゼータ電位に関して，ゼータ電位測定装置を用いて評価した．さらに，電気泳動分離において，バルク溶液の電気伝導度も重要な項目となる．このため，バルクの電気伝導度に関しては，電気伝導計を用いて評価した．また，バルク懸濁液の粘度も電気泳動分離に影響を及ぼす因子の一つである．このため，バルク溶液の粘度を粘Fig.4
Size
distributionofdifferent
composition of emulsion X measured byDLS.

また組成が変化するにつれて電気伝導度の上昇が要する時間は数分であるため，このエマルジョン観測された。この結果より，組成の変化によりw/oは脂質分子の抽出に有用であると期待できる．さからo/wへの変化が観測された(Fig5)．また，各組らに，脂質分子の抽出という観点で，抽出性能を成における粘度を測定した結果，粘度はどの組成評価した結果，濃縮率は100～150倍程度であっでもほぼ一定であることが判明した．以上より，た．この点に関して，今後，組成比や抽出操作のエマルジョンの形成の確認ならびに分離抽出に影最適化を行い，回収率，濃縮率，選択性の向上を響を及ぼすエマルジョンの特性を明らかとした．

目指していきたい．以上より，エマルジョンを

Fig.5 Conductivity measurement
different composition of emulsion Xof

Fig.7 Capillary electrophoretic separation ofmodel compounds with emulsion X.

用いると，細胞から脂質分子の抽出の可能性を示唆する結果を得ることに成功した．
最後にエマルジョンXを用いたキャピラリー電気泳動分離を実施した．難水溶性物質と水溶性色素をモデルとしてキャピラリー電気泳動分離を試みた結果，特定の組成でこの２成分の分離に成功した(Fig7)．キャピラリー電気泳動分離に関しては，未知な点が多いため，分離機構の解明はもちろん，分離性能の向上のため，分離に影響する因子の解明を今後行っていく予定である．

Fig.6 confirmation of liposome collapse
with emulsion X by fluorescencequenching.

４．結び
リピドミクスを指向した脂質分子の抽出およ

続いて，エマルジョンによる抽出・キャピラリ

びキャピラリー電気泳動分離法に関して，エマルー電気泳動分離を試みた．その結果，Fig6に示すジョンを適用した新規手法の開発を目的として様に，リポソームとエマルジョンＸを混合する研究を実施した．その結果，エマルジョン X の作と，リポソームの蛍光の消光を確認した．つまり製に成功するとともに，抽出・キャピラリー電気リポソームが溶解したことが確認された．これに泳動分離へ影響するエマルジョンＸの特性を明らかとした．最後に，エマルジョンＸを用いて，細胞を模倣したリポソームからの脂質分子の抽ニック」，(技術情報協会), in press

3.

岡本 行広, イ ジョンフ, 大城 敬人, ナノポア解出および脂質分子を模擬した分子を用いたキャ

析のための脂質抽出法の開発, 第 83 回分析化

ピラリー電気泳動分離を実施し，抽出に成功する

学討論会(富山), 2023.05

とともに，脂質分子のキャピラリー電気泳動分離の可能性を示唆する結果を得ることに成功した．

4.

Yukihiro Okamoto, Jungu Lee, Takahito Ohshiro,
in preparation.

５．今後の研究方向性・課題

６．その他

この一年間で，エマルジョンXの作製および物性謝辞

測定を行い，物性を明らかとした．そして，抽出

本研究は，向科学技術振興財団の研究助成によりやキャピラリー電気泳動による精密分離への適用実施可能なものでありました．誌上を借りて，御の可能性を示唆する結果を得ることに成功した．

礼を申し上げます．

そこで，今後の研究の方針として，細胞からの脂質分子の抽出の最適化およびキャピラリー電気泳動法を用いた分離性能の評価を行っていく予定である．そして，研究案を策定した段階の目標である，現状のLC-MS法の問題点を改善し，そしてLC―MS法を凌ぐ性能の実現を課題として研究を実施していく予定である．

６．参考文献リピドミクスに関して
1.

有田誠，脂質クオリティ研究の基礎と臨床，医学の歩み，269, 2019

リピドミクス解析に関して2.

中 西 広 樹 ,オ レ オ サ イ エ ン ス ,14巻,321(2014)
キャピラリー電気泳動分離に関して
3.

キャピラリー電気泳動基礎と実際, 本田進／
寺部茂・編，講談社サイエンティフィク ，1995/04/01

7．論文・発表1.

岡本 行広，ヤヌス粒子の熱泳動に対する基材
表面の効果，ぶんせき，2023,5,205

2.

岡本 行広，キャピラリー電気泳動法の測定原理と装置活用のコツ, キャピラリー洗浄での留意点,「キャピラリー電気泳動のデータ解析と分析テク