腸内細菌叢の改善を目指した大豆たん白質摂取の時間栄養学的研究
佐々木 裕之＊早稲田大学大学院先進理工学研究科
薬理学研究

The Timing Eﬀects of Soy Protein Isolate Intake on Mice Gut Microbiota
Hiroyuki SASAKI＊
School of advanced science and engineering, Waseda University, Tokyo 162-8480

ABSTRACTSoy protein isolate intake is known to cause changes in gut microbiota. Although
there are some reports about the effect of soy protein isolate intake on gut
microbiota, the eﬀective timing of intake has not been investigated. In this study,
we examined the eﬀect of soy protein isolate intake timing on gut microbiota. Mice
were fed twice a day, in the morning and evening. The mice were divided into
three groups: 1. Mice that were fed only casein protein; 2. Mice that were fed soy
protein isolate in the morning; and 3. Mice that were fed soy protein isolate in theevening. Mice were housed under each experimental condition for two weeks, andthen sacriﬁced at three points, i.e., before morning feeding, four hours after morning
feeding, and four hours after evening feeding). We measured cecal pH, and collected
cecal contents and feces. Short-chain fatty acids (SCFA) were measured by gas
chromatography from cecal contents, and 16S rRNA was extracted from feces andfor analyzing microbiota composition using a next-generation sequencer. Cecal pH
was lower and SCFA was higher in the morning soy protein isolate intake groupthan that in the evening intake group. In addition, microbiota composition wassigniﬁcantly changed in the morning soy protein isolate intake group than in theevening intake group. Therefore, soy protein isolate intake in the morning may
have relatively stronger effects on the microbiota than that in the evening. Soy
Protein Research, Japan 23, 192-198, 2020.
Key words : microbiota, chrono-nutrients, feeding timing, circadian＊〒162-8480

192

東京都新宿区若松町2-2
大豆たん白質研究

Vol. 23（2020）哺乳類の腸内には約40兆個の細菌が生息しており，この集団を腸内細菌叢と呼ぶ．腸内細菌叢は消化・方法

吸収，代謝，免疫などの宿主の生理機能に影響を及ぼすことが報告されている1）．そして，腸内細菌叢

使用動物の変化が代謝疾患や炎症性大腸炎疾患など種々の疾

動物実験は早稲田大学動物実験審査委員会の許可を患を引き起こす要因となり得る．例えば，肥満患者得た上で行った（許可番号2018‐A030）．本研究では，の腸内細菌叢にはFirmicutes という細菌群が増加し，東京実験動物株式会社より購入した9週齢のICR雄マ

Bacteroidetes という細菌群が減少する．そしてこの腸ウスを使用した．マウスは22±2℃，湿度60±5%，明内細菌叢を無菌マウスに移植すると，通常食を摂食し暗12時間ごとの環境で個別に飼育した．明期開始時刻ているにもかかわらず，脂肪量の増加が確認された．

をZeitgeber time 0（ZT0），暗期開始時刻をZT12とつまり，腸内細菌叢が原因となり肥満を誘発したこと定義した．

が明らかとなった2）．このように宿主の生理機能は腸内細菌叢の影響を強く受けている．

本研究では，高脂肪食中のたん白質がカゼインたん白質である餌（カゼイン餌）と大豆たん白質である餌

この腸内細菌叢と宿主の生理機能の関係性は，腸内（大豆餌）を用意した．各餌の組成をTable 1に示す．

細菌叢が産生する短鎖脂肪酸（SCFA）によって宿主なお，たん白質量は粗たん白質量が等しくなるようにの生理機能が調整されている3）．SCFAには酢酸・酪酸・調整した．また，食物繊維はセルロースのみで，水溶プロピオン酸が含まれているが，腸内細菌叢が難消化性食物繊維を含んでいないため，腸内細菌叢が悪化す性の食品成分を発酵・分解することでSCFAが産生さる．

れる4）．さらにSCFAはそれ自身が弱酸性であるため，SCFAの増加は腸管のpHを低下させて，有害菌の増殖を抑える3）．
腸内細菌叢の構成は年齢，食事，運動など様々な要因によって変化するが，食事が腸内細菌叢に及ぼす影響については数多く報告されている．多くのたん白質は分解後に小腸で吸収されるが，一部のたん白質は小腸で分解されず，大腸にまで届き，腸内細菌叢の構成に影響する5）．大豆たん白質にはこのような性質を持
つたん白質を多く含み，大豆たん白質の摂取が腸内細菌叢の多様性を高め，SCFAの産生を促すことが知られている6）．
多くの生物は体内時計を有しており，睡眠・覚醒，摂食行動，代謝機能などの生理機能は日内変動を示すことが知られている7）．この体内時計は脂質代謝や糖代謝に関わる酵素の発現も制御している7）．そのため，Table 1. Nutrition components (g) in each diet (100 g)
Casein protein
Soy protein isolate
L-cysteine
β-corn starch
α-corn starch
SucroseSoybean oil
Lard
Cellulose
Mineral mixture
Vitamin mixture
Choline bitartrate
Total

Casein diet
22.86
−
0.18
13.71
15.5
10.0
4.0
24.0
5.0
3.5
1.0
0.25
100.0

Soy diet
−
23.78
0.18
12.79
15.5
10.0
4.0
24.0
5.0
3.5
1.0
0.25
100.0

Tamura K & Sasaki H et al . Nutrients（2019）より一部改変

食事の時刻や摂食タイミングによって，その食品成分の影響が変化する可能性が考えられる．また，日内変実験スケジュール

動は腸内細菌叢の構成や機能にも存在していることが本研究では腸内細菌叢の改善効果を検証するため，知られている8）．以上を踏まえると同じ食品成分でも，実験開始前に1週間カゼイン餌を自由摂食させ腸内細朝食摂取と夕食摂取では腸内細菌叢に与える影響が異菌 叢 を 悪 化 さ せ た． マ ウ ス に1日2回，ZT12とZT20なる可能性が考えられる．そこで，本研究では，大豆に1.8 gの餌を与えた．なお，活動期である暗期のうたん白質をいつ摂取することで腸内細菌叢をより改善

ち，前半のZT12の餌を朝食，後半のZT20の餌を夕食させることができるのかを検証した．と定義し，摂食可能時間を4時間と設定した．実験群
は，朝食と夕食ともにカゼイン餌を摂取するカゼイン群，朝食に大豆餌・夕食にカゼイン餌を摂取する朝大豆群，朝食にカゼイン餌・夕食に大豆餌を摂取する夕大豆群を用意した．各条件下で2週間飼育した．その後，大豆たん白質研究

Vol. 23（2020）193

ABreakfast

ZTCasein

12BDinner

162004

Cecal pH
7.5
7.4
7.3

M-Soy=0.053

7.2
##

##

##

##

7E-Soy%%%

7.1
6.9
6.8
: Sampling: High Fat Diet (Casein) 1.8 g

6.7: High Fat Diet (Soy protein) 1.8 g[μmol/mg cecal weight]

Acetic acid
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0ZT12

ZT20

ZT4

AVE

E

ZT4

AVE

Propionic acid
0.035
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0ZT12

ZT20

ZT4

AVE

F
Lactic acid
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0

[μmol/mg cecal weight][μmol/mg cecal weight]

ZT20

D

[μmol/mg cecal weight]

C

ZT12%%%

ZT12

G=0.085

ZT20%

ZT4

AVE

Butyric acid
0.035
0.030.025
0.020.015
0.010.005
0=0.071

%
##

#

##

ZT12

ZT20

ZT4

AVE

Simpson index
1=0.075

0.9=0.090: Casein: Morning Soy: Evening Soy

0.80.7

ZT12

ZT20

ZT4

AVE

Tamura K & Sasaki H et al . Nutrients（2019）より一部改変

Fig. 1. The eﬀect of soy protein isolate intake timing on cecal pH, SCFA levels and microbiota diversity. (A)Experimental schedule. The white and black bars indicate environmental 12 h light and dark conditions.
The blue cylinder indicates the feeding timing of 1.8 g of High Fat Diet with casein. The orange cylinder
indicates the feeding timing of 1.8 g of High Fat Diet with soy protein isolate. The red triangles indicate
the sampling time. (B-F) Cecal pH and Short-chain fatty acid levels (ZT12, ZT20, ZT4 and an averageof three points) of mice that were kept in each feeding condition for two weeks. (B: cecal pH, C: acetic
acid, D: propionic acid, E: lactic acid, F: butyric acid). (G) Alpha-diversity about Simpson index. All data
represented as mean ±SEM (n=5). ## p <0.01, # p <0.05, evaluated using one-way ANOVA with Tukey
post-hoc test. %% p <0.01, % p <0.05, evaluated using Kruskal-Wallis test with Dunn post-hoc test.

194

大豆たん白質研究

Vol. 23（2020）

ZT12（食事前），ZT20（朝食摂食開始8時間後），ZT4（夕食摂食開始8時間後）の3ポイントでサンプリングを行結果

い，盲腸内pHの測定，盲腸内容物，糞便の採取を行った（Fig. 1A）．

盲腸内pHは大豆たん白質を朝食に摂取しても，夕食に摂取しても，摂取4時間後の時刻において低下しSCFA測定た．また，1日を通しての影響を検証するために，3ポ

SCFA測定はガスクロマトグラフィー水素炎イオンイントの平均値（AVE）を算出したところ，朝食摂取化検出器（FID）（GC2020；島津製作所）を用いた．0.05

も夕食摂取も盲腸内pHは低下した（Fig. 1B）．SCFA

gの盲腸内容物を0.4 mLのジエチルエーテルと0.2 mL

は，特に乳酸と酪酸において，大豆たん白質を朝食のエタノールを加えSCFAを抽出し，0.05 mLの硫酸に摂取しても，夕食に摂取しても，摂取4時間後の時で酸性化した．その後，室温で30秒間12,000 rpmで遠刻において有意に増加した．しかし，AVEを見ると，心分離し，1μLの有機層をガスクロマトグラフィーに朝食摂取においてのみ有意な増加が確認された（Figs.

注入した．キャリアガスはヘリウムガスを使用し，初1E, F）．以上より，大豆たん白質の摂取は朝食でも夕期温度を80℃，最終温度を200℃とした．

食でも，摂取4時間後にSCFAが増加し，盲腸内pHを低下させるが，朝食に摂取すると，その効果が長く続腸内細菌叢解析くことが確認された．

約0.2 gの糞便サンプルを懸濁し，PCI（Invitrogen）

次に腸内細菌叢の解析を行った．腸内細菌叢の多様980μL，3 mol/L酢酸ナトリウム溶液100μL，イソプ性を示すα多様性（Simpson index）はAVEにおいて，ロパノール900μLを用いてDNA抽出を行った．その朝食の大豆たん白質摂取によって増加する傾向が見ら

後，16S rRNA遺伝子の可変領域の内，V3-V4領域をれた（Fig. 1G）．次に，大豆たん白質摂取から8時間後ターゲットとしたプライマーを使用し，アンプリコにおける腸内細菌叢の構成を解析した．各個体の腸内ンPCRを行った．なおプライマー配列はIlluminaが提細菌叢の構成をプロットで示し，プロット間距離が離供するプロトコルに基づいた．その後，Nextera XTれれば，その個体間の腸内細菌叢の構成は異なっていIndex Kit v2（Illumina）を用いて，デュアルインデッることを示す．プロット間距離を算出したものを統計

クスとイルミナシーケンスアダプターの2種類のタグ量として示し，腸内細菌叢の構成に有意な差があるかを付加した．そして，Miseq reagent kit v3（Illumina）どうかをPERMANOVAで検定を行った．ZT20におを用いてシーケンスを行った．得られたシーケンス

いて，カゼイン群と朝大豆群の腸内細菌叢の構成は有データはQIIME（ver. 1.9.1）というソフトウェアを用意に異なっていた（Fig. 2A）．その一方で，ZT4において解析した．

いて，カゼイン群と夕大豆群の腸内細菌叢の構成に有意な差は見られなかった（Fig. 2B）．また全ポイントの腸内細菌叢の構成を比較すると，カゼイン群と朝大豆群のプロット間距離の方が夕大豆群よりも大きく離れており，朝食の大豆たん白質摂取の方が腸内細菌叢の構成を大きく変えることがわかった（Figs. 2C-E）．
また，具体的にBacteroidetes ，Lactococcus の腸内細菌が変化していることもわかった（Figs. 3A, F）．

大豆たん白質研究

Vol. 23（2020）

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A

ZT20 : Casein vs. M-Soy

B

ZT4 : Casein vs. E-Soy

CaseinMorning Soy
Evening Soy

Statisticvalue-valueStatisticvalue-value

ZT20 : Casein vs. M-Soy 1.886

0.008

ZT4 : Casein vs. E-Soy 1.396

0.071

CD

Casein vs. M-Soy

Casein vs. M-Soy

Statisticvalue-value

2.478

0.002

ECasein vs. E-Soy

Casein vs. E-Soy

Statisticvalue-value1.460

0.048M-Soy vs. E-Soy

M-Soy vs. E-Soy

Statisticvalue-value

0.982

0.485

Tamura K & Sasaki H et al . Nutrients（2019）より一部改変
Fig. 2. The eﬀect of soy protein isolate intake timing on microbiota composition. (A-E) Microbiota composition.
(A: comparison of Casein and Morning Soy at ZT20, B: comparison of Casein and Evening Soy at ZT4,
C: comparison of Casein and Morning Soy at all points, D: comparison of Casein and Evening Soy at all
points, E: comparison of Morning Soy and Evening Soy at all points). The principal coordinate analysis
plots of unweighted UniFrac distance metrics obtained from sequencing the 16S rRNA gene in feces(n=15). The tables in ﬁgure indicate the result using PERMANOVA.

196

大豆たん白質研究

Vol. 23（2020）

Relative abundance

AB

1

0.02

0.8
0.6

0.1

0.01

0.4

000.2%%

ZT12

ZT20

ZT4

AVE

Relative abundance

D
0.25
0.2

ZT20

ZT4

AVE

F

0.003

0.5

0.1

ZT12

#ZT20

ZT4

AVE%
%

0.3

%
%

=0.052
%

0.2

0.001

0.05

#0.4

0.002

0.15

0ZT120.2
0E

0.1
ZT12

ZT20

ZT4

0AVEGRelative abundance

C0.03

0.3

ZT12

ZT20

ZT4

AVE0

ZT12

ZT20

ZT4AVE

H

0.05

0.02

%%

0.04
0.03

: Morning Soy

0.01

0.02

0.005

0.01
0: Casein

0.015

ZT12

ZT20

ZT4

AVE

0: Evening Soy
ZT12

ZT20

ZT4

AVE

Tamura K & Sasaki H et al . Nutrients（2019）より一部改変
Fig. 3. The eﬀect of soy protein isolate intake timing on microbes. (A-C) The relative abundance of microbes at
the Phylum level. (A: Bacteroidetes , B: Proteobacteria , C: Firmicutes ). (D-H) The relative abundance ofmicrobes at the Genus level. (D: Biﬁdobacterium , E: Enterococcus , F: Lactococcus , G: [Ruminococcus] , H:Desulfovibrio ). All data represented as mean ±SEM (n=5). # p <0.05, evaluated using one-way ANOVA
with Tukey post-hoc test. %% p <0.01, % p <0.05, evaluated using Kruskal-Wallis test with Dunn post-hoctest.
での絶食時間は8時間絶食である．ここで絶食時間の考察

長さと腸内細菌叢の関係性について考察する．先行研究より，食物が胃に入り，胃壁が刺激されると中枢本研究の結果をまとめると，大豆たん白質を朝食まを介して蠕動運動が発生する9）．この時，絶食時間がたは夕食に2週間摂取すると，大豆たん白質摂取8時間

長いほどこの反応は大きくなり，蠕動運動が促進され後の時刻で盲腸内pHが低下し，SCFA産生，腸内細菌る9）．さらに，長い絶食（36時間）後の再給餌により叢の多様性が増加した．さらに，大豆たん白質を夕食

乳酸産生菌が増加する10）．一方で，モルヒネ投与によよりも朝食に摂取すると，大きく腸内細菌叢の構成をる蠕動運動抑制で腸内細菌叢の種の豊富さが低下し，変え，SCFA産生を促した．つまり，大豆たん白質は悪玉菌が増加する11）．以上の報告から，長い絶食時間

夕食ではなく朝食に摂取することで，より効果的に腸後の朝食摂取により，蠕動運動が促進されたことが腸内細菌叢を改善する可能性が示唆された．

内細菌叢に良い影響を与え，その時に大豆たん白質を本研究では，朝食摂取と夕食摂取では，朝食摂取の摂取したことで，大豆たん白質が有効に腸内細菌叢に方が腸内細菌叢の構成を大きく変え，腸内細菌叢を改影響し，腸内細菌叢が改善したと考えられる．本研究善した．これは，摂取までの絶食時間の長さが関係しでは検証していないが，我々の以前の報告で，水溶性ていると考えられる．今回の実験条件では，朝食摂取食物繊維を絶食時間が等しい条件で朝食と夕食に摂取するまでの絶食時間は16時間絶食で，夕食摂取するまさせると，朝食摂取と夕食摂取による腸内細菌叢への大豆たん白質研究

Vol. 23（2020）

197

影響に差がなくなることを示している12）．

がって，本実験の結果はヒトでは朝食の大豆たん白質

実際のヒトの生活を考えると，一般的に3回の食事のうち夕食から朝食までの絶食時間が最も長い．した

要摂取が腸内細菌叢の改善に効果的であると期待できる．

約

本研究ではマウスを用いて，朝食と夕食の1日2食の摂取条件下で，いつ大豆たん白質を摂取することで腸内細菌叢を効果的に改善するかを検討した．その結果，朝食に大豆たん白質を摂取したマウスの方が，夕食に摂取したマウスよりも，腸内細菌叢の構成を大きく変え，短鎖脂肪酸の産生量が増加した．つまり，大豆たん白質は朝食に摂取したほうが腸内細菌叢の改善に効果的である可能性が示唆された．この朝食摂取と夕食摂取の影響差は摂取までの絶食時間の長さが関係していると考えられ，今後は絶食時間の長さと腸内細菌叢の関係性を明確にする必要があると考えられる．

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大豆たん白質研究Vol. 23（2020）