厚生省精神・神経疾患研究委託費

筋ジストロフィーの発症に問する
細胞生物学的基礎研究
小沢班

平成3年度研究報告書

平成4年3月

班

長

総

括

班長

小

沢

瑛二郎

我々の班の最終的な目的は，筋ジストロフィーの成因を明らかれ，それに対する治療を求めることである0しかし当面の目的は班の名称のように筋ジストロフィーの発症の基礎的な研究を地道に行ってゆくことである0成因を明らかにするには筋が如何にして筋としての性質を獲得し，それを維持しているかということを明らかにすることと・Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の時に欠失するジストロフィンについて理解を深めることを二つの研究を柱とする。
1．ジストロフィン

現在基礎研究班として最も重要なことは・ジストロフィンが何をしているかを明らかにすることである0それによってジストロフィンの欠矢の筋細胞の機能への影響を考えることが可能になり，それによる治療薬の開発に希望をつなぐことになるからである。
本班ではジストロフィンタンパク質の精製とその性質の研究に取り組んでおり，既に精製に成功
しその内部構造の研究や，超微構造の研究を行いまたそれに結合しているタンパク質の問題に取り組んでいる0そしてそこには大きな発展があった0しかし一斉ではまだ精製に問題を残しており，
この問題を解決すべく努力中である。精製したジストロフィン・タンパク質やその結合糖タンパク質を研究することによって・ジストロフィン・システムの作用を探ることが可能となるであろう。
ジストロフィンは細胞膜に存在しており膜細胞骨格であると考えられているが，その存在様式についてはまだ多くの問題がある0これについての研究にも大きな進展があった。存在様式を明らかにすることによって機能を明らかにするためには・他の細胞骨格との比較や膜タンパク質との比較が重要であり，その面からの研究も進んでいる。
2．筋細胞の形成
筋肉の形成を行う遺伝子群myoDlやmyogeninなどが知られている0この遺伝子群が病状の形
成にどのようにか、わっているかはまだ知られていない○しかし，myODlタンパク質がジストロ
フィンの発現にか、わっていることが強く示唆されている。
本姓の研究は特にジストロフィンの研究において・今年度は大きく進展し，多くの注目すべき研究が行われた。これらのいくつかは世界中のジストロフィン研究者が引用すべく記録に残るものとなると考えられる。
一方において国外の研究もすみやかに進んでおり・用いられる雑誌も多岐に渡るので班員には何等かの形で整理された多くの情報の供給が必要である。

ⅰ
目

次

班長総括

小

Ⅰ

沢

鍈二郎

ジストロフィン

1．ジストロフィンの分子形態

3

丸

山

工

作

2．デタージェント非存在下におけるブタ骨格筋ジストロフィンの抽出とその不均一性
桑

山

8

秀

人

3．ラットジストロフィンの精製と性質

15

勝

沼

信

彦

4．ジストロフィン分子上の糖タンパク複合体結合部位について

21

小 沢 鍈二郎
5．ジストロフィンは骨格筋T管（直下）に存在する

28

山

下

茂

6．筋形質膜裏打ち構造およびジストロフィン局在に関する超微
形態学的研究
石

川

32

春

律

7．ジストロフィン又はジストロフィン様蛋白質を広く動物界に
検索する
小

浜

38

一

弘

Ⅱ 細胞膜タンパク質と細胞骨格

8．細胞膜関連構造に局在するα−アクチニンのクローニング

45

眞

崎

知

生

ⅱ

9．骨格筋細胞の発達・萎縮とアクチン細胞骨格調節因子コフィ
リンの量的変動

49

大日方

昂

10．MAP 2c cDNAの強制導入と標識チュブリンの微量注入による微小管の動態と解析
広

川

56

信

隆
63

11．筋巨大蛋白質の発生とその局在
小宮山 政 敏68

12．AMPA型グルタミン酸受容体チャンネルのCa2透過調節機構
三

Ⅲ

品

昌

美

Caとタンパク分解

13．骨格筋小胞体Ca2＋放出チャンネルのカルパインによる分解
と機能変化
飯

野

77

正

光

83

14．カルシウム依存性プロテアーゼの活性化機構
鈴 木 紘 一88

15．ライソゾーム系による筋の崩壊
熊

本

俊

秀

Ⅳ 発生と遺伝子発現

16．ニワトリ胚筋細胞のレチノイン酸への応答性

99

桃

井

隆

17．ビタミンCのもつ筋細胞分化促進作用

104

松

田

良

一

18．癌抑制遺伝子産物RBとcdc2による骨格筋細胞分化と脱分
化の調節
遠

藤

112

剛

ⅲ
19．筋細胞分化制御因子の機能の解析

120

鍋

Ⅴ

発

生

工

島

陽

一

学

20．トランスジェニックマウスを用いたジストロフィン遺伝子発現の調節の試みとマウスジストロフィン様cDNAの構造解析

127

木

村

穣

21．mdxマウス由来胚幹細胞株の樹立及びその利用

134

花

岡

和

則

Ⅰ

ジストロフィン

1．ジストロフィンの分子形態
2．デクージェント非存在下におけるブタ骨格筋
ジストロフィンの抽出とその不均一性
3．ラットジストロフィンの精製と性質

15

4．ジストロフィン分子上の糖タンパク複合体結合部位について

21

5・ジストロフィンは骨格筋で管（直下）に存在する

28

6．筋形質膜裏打ち構造およびジストロフィン局在に関する
超微形態学的研究

32

7・ジストロフィン又はジストロフィン様蛋白質を広く動物界に検索する38

1

ジストロフィンの分子形態

丸 山 工 作＊
研究協力者

要

約

佐

藤

治＊

われわれは，本研究において，鉄亜鈴構造が混ジストロフィンは，Ⅹ染色体上のデュシャンヌ

在物ではないことをゲル炉過法によって示し，頻・筋ジストロフィー遺伝子の産物で，分子量約度の少ないのは界面活性剤の使用による崩壊のた

427，000の巨大なタンパク質である1）。ジストロフ

めではないかとの可能性を示唆する結果を得た。

ィンは筋細胞膜の裏打ち構造を形づくっているものと考えられており，これがないと細胞膜の機能材料と方法が維持できず，筋ジストロフィー症が発症するとウサギ骨格筋から筋原線経を調製し，混在する

みなされている2）。
ジストロフィンの分子構造については，アミノ酸配列から，αアクチニンドメインにスペクトリ

膜成分を出発物とした。筋原線経は，50mMKCl，
1mMNaHCO3，5mMEGTA溶液で5回洗った。
約400gの筋肉を用いた。

ン様シャフトがつづき，独自のC端部分があって筋原線経からミオシンを抽出するため，ハッセ

約150nmのロッド状分子と推定されている1）。現

ルバッハ・シュナイダー溶液（0．6MKCl，0．1M

在までに，ロータリー・シャドウ法によりジスト

KPO4，pH6．5，10mMピロリン酸ナトリウム，

ロフィンの分子形態について，2つの異なった報1mMMgCl2）で5回（1時間）抽出した。10倍量告がだされている。第1は，フランスのugerらの溶液を用いた。

によるもので，長さ約175nmのフレキシブルロ

残透を肉の2．5倍量の溶液（1％NonidetP−40，

ッドという主張である3）。それに対して，われわ

10mMKPO4・pH7・0，0・1MNaCl，1mMMg

れは，長さ約120nmの鉄亜鈴モデルを提唱して

C12，1mMEGTA，0．05mMDFP）で1時間抽いる4）。ジストロフィンを最初に単離したCampb−
ellは，しろgerモデルを改変して2本のジストロ

出し，8，500g15分遠心して膜成分を可溶化した（図1）。

フィン分子がらせんを巻いて，糖タンパク質を介ポリエチレングリコール（6，000）を4％になる

して細胞膜に結合しているモデルを提唱している2）。

よう上清に加え，ジストロフィンなどを沈殿させわれわれのモデルは，赤血球膜の裏打ち構造を形成するスペクトリンの形状に似ており生理的にた。12，000g10分の遠心で集めた。
沈殿を0．3MNaCl，0．1MKPO4，pH7．0，0．

みて十分ありうるものである。しかし，難点は，1％TritonX−100，0．01mMDFP液に溶解し，この鉄亜鈴構造の頻度がごくわずかしかないとい同液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム

う事実である。だから，何かの混在物ではないか（3．3×13cm）にかけ，0．3MKPO4，pH7．0を含むとの指摘ももっともである。

溶液で溶出した（図1のHy−ap）。高分子量成分としてリアノジン・レセプターが多量に含まれている＊千葉大学・理学部・生物学科

が，そのすぐ下にジストロフィンが認められる。

4

この画分を0．15MNaCl，10mMKPO4，pH7．5，

セプターは除かれ，ジストロフィンが主成分とな

0．1％TritonX−100，0．05％NaN3，0．01mMDFPっている。イムノブロットにより，N端部分のジに対して透析してからWGA−アガロースカラム

ストロフィン抗体（AIC）とC端部分の抗体（4（0．9×20cm）5）2本にかけた。吸着した糖タンパク−4C5）といずれも反応した（図1）。

質は0．3MN一アセチルーD−グルコサミンを含む

電子顕微鏡による分子形態の観察には，雲母坂

溶液で溶出した（図1のWGA）。ジストロフィン

上に試料（50％グリセリン，0．1MNaCl，10mMが多くなっていることがわかる。

Tris−HCl，pH7．5）をスプレーによって分散させ，さらにDE52カラムにかけてジストロフィンをプラチナとカーボンを7．50の角度で蒸着した（J

純化した（1．5×4cm）。0．1MNaCl，10mMK

FD−9000蒸着装置）。JEMlOOS電子顕微鏡下

PO4，PH7．5，0．1％TritonX−100，0．01mMDで観察した。

FP液で吸着させ，0．2MNaClを含む溶液で溶出した。図1のDE52のように，リアノジン・レ

Skeletal muscle

図1．ジストロフィンの精製

5

結

高分子量画分（a）の電子顕微鏡像は，まさに鉄亜果

図1のDE52溶出液約20mlをアミコン社のCentriprep30で，1，500gの遠心によって約40

鈴が主であった。中にはフレキシブルロッドもあったが，70％は鉄亜鈴であった。

倍に濃縮し，Asahipak GS−710のカラムにかけ（a）には，さまざまな鉄亜鈴構造がみられた。そた。溶液は0．3MNaCl，20mMTris−HCl，pH

れらを分頬してみると，図4のようになる。まず

7．5，0．5％CHAPS，10／上g／mlロイペプチン，0．

長さ108mm，幅2nmはどの両端に球をつけた鉄05mMDFPである。Tosoh HPLC，0．5mlんIin

亜鈴がみられる（a）。球直径は，約13nmである。

でゲル炉過した。

われわれは，これをジストロフィンのモノマーと

図2にみられるように，ボイド・ポリュウムに仮定した。このモノマーが2本少しずれて結合しつづいて溶出する高分子童画分（a）を濃縮してSDS

たダイマーがbである。長さ130nm，幅3nmで電気泳動にかけると，ジストロフィンが主成分である。さらに，このダイマーが側面結合したテト

あるが，さらに高分子量のいくつかのバンドが認

ラマー（C）が典型的な鉄亜鈴である。長さは130mmめられた。それらの少くとも3本は抗ジストロフとダイマーと変らないが幅は5mmと太くなって

ィン抗体と反応したのでジストロフィンのオリゴいる。このテトラマーがいくつもつらなって複雑

マーとみなされる。メイン・ピーク（b）は，ジストな構造がつくられる（d）。
テトラマーの鉄亜鈴は，1％TritonX−100抽出液

ロフィンが主成分であった。
メインピーク（b）のローターリー・シャドウ像（図ではほとんど見られないこと，0．2％CHAPS抽出3）は，フレキシブルロッドと球状物のからまりあ

液ではジストロフィンの抽出は少ないが鉄亜鈴がったものである。これらの像は，DE52標品にみかなり存在することから，界面活性剤処理によっられるのと同じである。

てこわれるのではないかと考えられる。図3（b）にDE52eluate
壬doncentration
CenIrip柑P30（Amicon）

ぬr；1tXhm
図3．ゲル炉過したジストロフィンの電子顕微鏡像
図3の（a）と（b）画分

h ∴ − ノ ．
︳

Bar＝100nm

図4．ジストロフィン分子の形態（a）モノマー（b）ダイマー（C）テトラマー（鉄亜鈴）（d）テトラマーの会合体

7

みられるフレキシブルロッドと球形物は，崩壊しダイマ一にモノマーの方向性の違いがあるのか，

たテトラマーが分散したようにみえる。大きな球

テトラマーではどうなっているのかは興味ある問

形物はロッドのかたまりのようである。モノマー

題である。C端とN端に特異的なモノクローン抗の大きさをもったロッドも存在するが，球は一端体があるので，パラレルかアンチパラレルか明らにしかついてないものが多い。

かにしたいところである。現在，まだ実験に成功していない。

論議

われわれのジストロフィン鉄亜鈴モデルは，ゲル炉過法によりポピュレーションの多いサンプルを得たこと，その主成分がジストロフィンである文

献1）Koenig，M．，Monaco，A．P．and
Kunkel，L．M．（1988）Cell，53，219−228．

ことからより確かになってきたといえよう。そし2）Ervasti，J．M．and Campbell，K．Rて，界面活性剤によって崩壊しやすいと考えれば（1991）Cell，66，1121−1131．

その頻度の少ないことが説明できよう。界面活性3）Pons，R，Augier，N．，Heilig，R．，

剤を用いないでジストロフィンを可溶化できれば，

IJbger，J．，Mornet，D．and Lもger，J，J．

その分子形態が保存されていると期待でき，この（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87，

方面からの追究が望まれる。

7851−7855．

ugerら3）の長さ175mmのフレキシブルロッド

4）Murayama，TリSato，0．，Kimura，S．，

は，ウサギ骨格筋では確認されていない。彼らはShimizu，T．，Sawada，nand Maruyama，

ニワトリ筋胃から得ているので直接比較できない

K．（1990）Proc．Jpn．Acad．66B，（ニワトリ筋胃からは，ウサギ骨格筋の方法でジス

96−99．

トロフィンを精製できない）。
ジストロフィン分子のN端側とC端側の構造が異なり，分子に方向性が存在する1）。したがって，

5）Campbell，K．P．and Kal11，S．D．（1989）
Naturq338，259−262．

2デタージェント非存在下におけるブタ骨格筋
ジストロフィンの抽出とその不均一性

桑 山 秀 人＊研究協力者 杉 浦 全 代＊＊ 杉 田 秀 夫＊＊＊江 橋 節 郎＊＊

要

約

ムとして組織内に存在している可能性が高い。

デクージェントを使わない条件での調製を試みた。豚ひき肉を，ウェー′ヾ一・エドサル液（10倍緒言容量，ATP存在下）で2度抽出した。残瘡を冷水

Hoffmanら1）Koenigら1）・2）によりヒトDuch−

で良く洗浄して，沈殿をpH8．6（室温）に合わせ，enne型筋ジストロフィー（DMD）において特異的

ジストロフィンを37℃で1時間抽出した。懸濁液に欠損している遺伝子が同定され，その遺伝子上のイオン強度がlmM以下であれば昨年度報告しにコードされている蛋白質はジストロフィンと命たTritonX−100による可溶化と同程度に抽出で名された。DMDでは，患者の筋細胞膜3￣6）にジきた。

ストロフィンが存在しないため，膜の機能に何ら

ジストロフィンの不均一性については，ヒト・かの重大な欠陥があって筋萎縮が起こると予想さジストロフィンの一部分，アミノ酸一次配列440

れている7）。現時点では，ジストロフィンは細胞−489（N端側領域）または配列3495−6544（C端膜を単純に安定化しているだけなのか，さらにそ側領域），に相当する合成ペプチドを抗原にして作れ以外に特殊な役割を担っているのかについて，成したウサギ抗血清との反応を指標にして調べた。

何らかの方法により探り当てることが緊急課題の

ブタ骨格筋の粗ジストロフィン分画をSodium

一つになった。この問題を研究するためにはもとdodecyl sulfate（SDS）存在下の調製用ポリアクの機能を保ったジストロフィンを調製することがリルアミドゲル電気泳動（PAGE）にかけて，免疫重要である。最近，Loveら8）により常染色体にお抗体と特異的に反応する成分として分子量400k

けるジストロフィン類似の遺伝子が発見され，さDaの2種の蛋白質を得た。

らにKhuranaら9）によりジストロフィンと同じ分N端側領域の抗血清は豚より単離した両成分に子量の関連蛋白成分（DRP）が筋抽出試料中に兄対して同じ程度に反応するのに対して，C端側領いだされた。このような状況から，組織より抽出

域の抗血清は400kDa成分と特異的な反応を示し，されたジストロフィン試料の不均一性を明かにす

380kDaとは弱く反応した。mdxからの抽出物にることも必要になってきた。

は弱いながら400kDa成分が認められたが，380kDa成分は染まらなかった。
380kDaは400kDa成分とともにアイソフォー＊帯広畜産大学教養課程化学研究室＊＊岡崎国立共同研究機構＊＊＊国立精神神経センター・神経研究所

ここではデタージェント非存在下でのジストロ
フィンの抽出について述べ，以前，我々が豚骨格筋ジストロフィンとして報告した分子量のわずかに異なる二成分に関する新たな知見を報告する。

9

材料 と 方法したジストロフィン類似遺伝子の一部分は我々が粗ジストロフィンの調製は特に記述しない限り

もちいている抗体A2の抗原である合成ペプチド

操作はすべて4℃でおこなわれ，遠心分離は10，（配列3495−3544）と重複する。昨年度の報告で000Ⅹgで10分間行った。また以下で用いる溶液

豚ジストロフィン試料についてこの配列部分のシには1．4mM2−merCaptOethanol，0．5mg／l

ーケンスを探索すると，ヒト・ジストロフィン配

leupeptin，0・1mM phenylmethylsulfonyl
fluorideおよび0．7mMbenzamidin−HClを加え列の3490−3499，3504−3508，3519−3525およた。ブタ骨格筋は屠殺後，直ちに実験室に輸送し，られ，抗原となったヒト配列3495−3544のうち

氷冷して挽き肉を作り，0．5kgずつに分け−8027残基がブタ・ジストロフィンで同定された。こ℃に保存したものを必要に応じて解凍して使用しのブタ・シーケンスはLoveら8）の報告した常染色た。

体由来の遺伝子情報とは部分的にしか合致しなかび3535−3544と完全に一致するシーケンスが得

挽き肉（500g）に10容量のウェーバー・エドサった。従って，我々がここで用いる抗体反応はD

ル液（0．6MNaCl，5mMNa2CO3，20mMNa

RPではなくジストロフィンを識別していると考え

CO3，1mMATP−Na2，0．1mMEGTA）を加る。

え，ヒスコトロンホモジナイザーを用いて破砕した（pH7．4）。2時間撹拝後，遠心して沈壇を集め結果と考察た。沈恋に10容量のウェーバー・エドサル液を加ジストロフィンは膜の裏うち構造に深く関与しえ撹拝・遠心を繰り返した（pH7．5）。得られた筋ていることが示唆されている。細胞膜骨格におけ

残蔭に10容量の水を加えて均一にしたのち，遠心る関連蛋白質との相互作用の研究や，ジストロフ

して沈恋を集めた。この操作を上宿の電気伝導度

ィン分子の形態を研究するのに適した試料が必要が30／上mho以下になるまで合計4回繰り返した。

である。ウサギ骨格筋ジストロフィンについては，

筋残瘡（約500ml）を2容量の水に懸濁LNaOH

穏和なデタージェントであるジギトニン11￣12）やをもちいて室温でpH8．6に合わせ，ジストロフィ

TritonX−10013￣14）などの存在下で抽出・精製がンを37℃で1時間抽出した（最終pH〜8．4）。HC

可能となっている。これらの試料から何らかの方lをもちいてpH7．6にしたのち，氷冷し，遠心上法でデタージェントを除けば良いのであるが，一宿を粗抽出液とした（pH〜8．3）。

度加えたデタージェントはジストロフィンの性質

SDS存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動を損なわずに除去することは困難である。我々は（SDS−PAGE）による分析・調製は昨年度の報告

デクージェントを使わない調製法を再検討した。

で述べた方法に従っだ0）。

勝沼15）あるいは石浦ら16）が指摘しているように，

タンパク質およびペプチド断片とジストロフィ

TritonX−100存在下においても，高イオン強度でン抗血清の反応性はSDS−PAGE後のゲルをニト

はジストロフィンは抽出されなかった（表Ⅰ）。抽

ロセルロース膜を用いるイムノブロット法で分析

出において重要な条件は低イオン強度と弱アルカした。2種の異なるウサギ抗ジストロフィン血清

リ性（約pH8．5）である。Tritonを加えるとジスト

AlまたはA2は，ヒト・ジストロフィン配列440

ロフィンは抽出されやすくなるが，その理由は細−489（N端側領域）または3495−3544（C端側領胞膜が溶解するためではなく，細胞膜骨格におけ域）の合成ペプチド断片をもちいて作成された。

る関連蛋白質との疎水性相互作用を弱めるためと

我々はジストロフィンを抗体反応で同定してい思われる。温度は抽出性を変えるような大きな効

るが，A2抗体は豚DRPとジストロフィンを区別

果は無いが，得られる試料の純度は37℃のほうしているかどうかは問題となる。、Loveら8）の発表が良かった。抽出に関して，ジストロフィンはス

10

表Ⅰ

イオン強度
爪】

ブタ骨格筋ジストロフィンの抽出

Triton濃度 抽出pH● 温度 抽出時間
％

℃

hour

1．5

8．8

4

2

1．5

8．5

4

1

1

8．2

4

2

0

7．9

4

2

0

7．5

4

1

0

8．7

4

1

0

8．7

37

1

0

8．4

37

2

抽出＝

＊：遠心上清の抽出液（4℃）のpE値‡キ ジストロフィン抽出の相対的程度を＋で示した。

ペクトリンやα−アクチニンと類似点が多く，機と溶けた。精製法は確立していないが，骨格筋ジ

能面での頬似性が予想される。

ストロフィンをデクージェントおよび変性剤なし

抽出試料中のジストロフィンは50，000回転でで筋組織から抽出できることは確認された。

2時間の超遠心により沈殿した。また抽出物をゲ

図2は試料の蛋白染色およびイムノプロットのルろ過（トヨパールHW75）とすると，ジストロフ

結果を示す。C端側領域に対する血清（A2）は400

ィン溶出のみかけの分子量は約1，000万を示した

kDa成分と特異的な反応を示し，380kDaとは弱（図1）。ジストロフィンは，自身あるいは混在すく反応した。一一万，N端側領域に対する血清（A2）る蛋白質と会合していると思われる。豚筋肉よりは両成分に対して同じ程度に反応し，さらに360得られた粗ジストロフィン分画の一部分はWGA

kDaおよび205kDa成分とも反応した。この結果

カラムに結合したが，選択的濃縮には成功しなか

は以前の報告に一致している10）。4℃で一晩放置った。抽出液に0．3MNaClを加えてDMS0分画を行うと20−45％にジストロフィンは濃縮さした豚肉から調製したジストロフイγ試料でも図2と同様の結果が得られたので，Al抗体と反応れた17）。DMSO濃縮物は短時間に低イオン強度

する分子量400kDa以下の成分のすべてを調製中・弱アルカリ性の水溶液で希釈すると溶けたが，の分解産物とは考えにくい。

一晩以上放置すると，凝集して不溶化した。この

A2抗体が蛋白量の多い400kDa成分と蛋白量

凝集物はpH9．5でも溶けないが6M尿素を加えるの少ない380kDa成分に，同程度に反応するとい

11

∴＼㌧

ノP

．

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︑∧−−′

■ ﹂ ⁚ √ ノ F

ト ・ ＝ 二

ノr一

ロ．

■﹂＝﹁−

q 〜 1 1 ︑ とてこ

1ンニーこく小二巾：ぺ小二ペン＞0く−＞＝Hン＝．L

20

40

TubeNo・（15・8ml）
図1・ブタ骨格筋抽出物のトヨパールHW75カラム（￠6cmx40cm，0．15
M NaCl，20mMHEPES，0．1mMEGTA，pH7．5）によるゲルろ過。分画30のSDS−PAGE（4％）の矢印は400kDaおよび380k
Daのジストロフィンを示す。

A

B
12

3

4

5

1

2

C
3

4

5

12

3

図2・SDS−PAGE（5％）後のイムノブロットによるブタジストロフィン同定。
A・抗体Al（N端側）によるイムノブロット染色。B．抗体A2（C端側）によるイムノブロット染色。C．金コロイドによる蛋白染色。短い矢印で示す分子量マーカー（kDa）は上から200，116，9．7および6．6を示す。長い矢印の分子量（kDa）は上から400，380，360，205を示す。
1；分子量マーカー，2；抽出軌 3；DMSO濃縮物，4；6M尿素による可溶化物，5；陰イオンカラムの素通り分画。

4

5

12

A
12 3

4

専一r

B
5
2 3

4

ニ￣■コ＝

c
51 1 2

3

ニー

一一

i

・●純

4

5

二

帯畿
、、一

、二■■！

図3．SDSLPAGE（4％）後のイムノブロットによるマウスジストロフィン。

A．抗体Al（N端側）による染色。B．抗体A2（C端側）による染色。
C．アミドブラックによる蛋白染色。短い矢印で示す分子量マーカーは200kDaのミオシン重鎖。1；分子量マーカー，2；ブタ抽出物，3；
マウスBALB九 4；マウスC57BL／10ScSn，5；マウスC57BL／
10ScSn−mdX BrCN。

う結果について，我々は豚骨格筋400kDa成分に豚の400kDa成分と380kDa成分の相違点を調は少なくとも2種のジストロフィンが存在し，そべた。図4はSDSゲルから抽出精製した両成分にれら400kDa成分のうち，一方はA2と反応する

キモトリプシンを加え酵素加水分解し，生成したが，他方はA2と反応しないと解釈している。

分解産物をSDS−PAGEで分析した結果である。

380kDa成分は豚筋組織に始めから存在すると考

分解ペプチドの金コロイド染色は明らかに異なる

えたいが，あるいはA2と反応する400kDaの分パターンを示したが，抗体染色では380kDa成分解物である可能性もある。Al抗体の400kDaにの分解ペプチドにおいてC末端側抗体と反応する

対する強い反応性は，400kDa成分の蛋白量が分解物のうち57kDa成分が特に弱い点を除くと，380kDa成分よりも量的に多く存在するためと解全体に類似の結果を得た。380kDaは400kDa成釈できる。

分とともにアイソフォームとして組織内に存在しマウス試料におけるAlおよびA2抗体に対すている可能性が高い。

る反応性を調べた。A2抗体は豚380kDaとほと
んど反応しないのに対し，正常マウスの380kDaとはAl抗体と同様に反応した（図3B）。一方

文

献1）Hoffman，E．P．，Knudson，C．M．，

mdxではAlは反応せずA2が400kDaのみと反Campbell，K．R，and Kunkel，L・M・応した。これはmdxからの抽出物に対するジスト（1987）Nature

ロフィン抗体の反応に関する田中ら18）の報告と一330，754r7572）Koenig，M．，Monaco，A．P・，and致した。図3の結果を簡単に説明することはでき

Kunkel，L．M．（1988）Cel153，219−

ないが，400kDaと380kDaにはいくつかのアイ

228

ソフォームが存在することを示唆している。

3）Sugita，H．，Arahata，K．，Ishiguro，T・，

13

3

A
2
1

︑射

︵

5 6 9 4 ＜V 4 D
4 3 2 2 2 1 k

一寸玉m﹂．︒：二∴巨卜1

図4．SDSrPAGE（12％）による400kDa成分と380kDa成分との比較。
SDSゲルから抽出精製した5J唱／50／Hのジストロフィンに0．5相のキモトリプシンを加え，30℃で30分の加水分解し，生成した分解産物
をSDS−PAGE（12％gel）で分析した。異なる部分を矢印で示した。
A．抗体A2（C端側）によるイムノプロット染色。B．金コロイドによるペプチド断片の染色。1；380kDa，2；400kDa，3；分子量マーカー。右側の数字はマーカー分子量を示す。

Suhara，Y．，Tsukahara，T．，Ishiura，S．，

M．，and Ozawa，E．（1988）Proc．Japan

Eguchi，C．，Nonaka，I．，and Ozawa，E．

Acad．64B，205−208（1988）Proc．Japan Acad．64B，

7）Hoffman，E．P．and Kunkel，L，M．
（1989）Neuron

37−394）Zubrzyeka−Gaarn，E．E．，Bulman，D．

2，1019−10298）Love，D．R．，Hill，D．F．，Dickson，R．，

E．，Karpati，G．，Burghes，A．H．M．，

Spurr，N．K．，Byth，B．C．，Marsden，Befall，B．，Klamut，H．J．，Talbot，J．，

R

Hodges，R．S．，Ray，P．N．，and Worton，and Davies，K．E．（1989）Nature339，

R．G．（1988）Nature

55−58

333，466−469

F

Walsh，F．S．，Edwards，Y．H．，

5）Arahata，K．，Ishiura，S．，Ishiguro，T．，

9）Khurana，T．S．，Hoffman，E．P．，andTsukahara，T．，Suhara，Y，Eguchi，C．，

Kunkel，L．M．（1990）J．Biol．Chem．

Ishihara，T．，Nonaka，I．，and Ozawa，

265，16717−16720

E．，and Sugita，H．（1988）Nature 333，
861−8636）Shimizu，T．，Matsumura，K．，
Hashimoto，K．，Mannen，T．，Ishiguro，T．，Eguchi，C．，Nonaka，I．，Yoshida，

10）Kuwayama，H．，Sugiura，M．，Sugita，H．，and Ebashi，S，（1990）Pro．Japan
Acad．66B，145−150
11）Campbell，K．P．and Kahl，S．D．
（1989）Nature

338，259−262

1412）Yoshida，M．and Ozawa，E．（1990）
J．Biochem．108，748−752
13）Salviati，G．，Betto，R．，Ceoldo，S．，
Biasia，E．，Bonilla，E．，Miranda，A．F・，
and Dimauro，S．（1989）Biochem．J．
258，837−841

14）Murayama，T．，Sato，0．，Kimura，S・，

15）勝沼信彦（1991）小沢班平成2年度研究報告書3−716）石浦章一，荒畑喜一，塚原俊文，杉田秀夫（1989）生化学 61，1371−137517）Ebashi，S．and Koga，R．（1988）Proc．
Japan Acad．64B，323−32618）Tanaka，H．，Shimizu，T．，and Ozawa，Shimizu，T．，Sawada，H．，andE．（1989）Proc．Japan Acad．65B，

Maruyama，K．（1989）Pro・Japan238−241

Acad．65B，207−210

153

ラットジストロフィンの精製と性質

勝 沼 信 彦＊研究協力者 松 田 佳 子＊＊ 辻明 彦＊＊

本研究の目的とその意義

DMDのモデル実験動物であるMdxマウスは，DMDの遺伝子産物であるジストロフィンはジストロフィンは完全に欠損しているものの，そKunikelらにより，リバースゼネティクスの方法の臨床像は，ヒトDMDとは明らかに異なり軽症で，そのアミノ酸配列が推定されている1）。タンである。このように欠損しても動物問でそのフェパク質としてのジストロフィンの研究は合成ペプ

ノタイプが異なる場合，ウサギのみでなく他の動チド抗体を用いて行なわれ，ジストロフィンは筋物のジストロフィンの研究を行い，相互に比較す

細胞膜の内側に局在し，裏打ち構造として機能しることが必要となる。

ていると予想されている2）。ジストロフィンの精製は，その含量が高いウサギ骨格筋を材料として，方法と結果

Cawbellら3），丸山ら4㌦小沢ら5）により行なわれ，① ジストロフィンに対する抗体の作製と，ジス

界面活性剤で可溶化されたジストロフィンは，小トロフィンの免疫学的検出法

麦胚芽レクチン（WGA）に結合する糖タンパク質

ジストロフィンのcDNAから予想されるアミノをはじめとする複数のタンパク質と複合体を作っ酸配列460−485に相当する合成ペプチドを作製ていることが報告されている。Cawbellらは，ジし，ヘモシアニンと縮合後ウサギに免疫した，得ストロフィン欠損により，ジストロフィン結合タられた抗血清は，合成ペプチドーセファロースカ

ンパク質の細胞内動態も変化することを見出してラムにて精製した。ジストロフィンの検出は次のいる。然し，ウサギには良い筋ジストロフィーモ様に行った。SI）S−PAGE（4−15％グラジェント

デル実験動物はない。良いモデル実験動物のあるゲル）後，ゲル中のタンパク質をニトロセルロース

ものにつきジストロフィンの研究をする必要があ

フィルターに転写（100mA，15時間，メタノール

る。その上，ジストロフィンはウサギ・ブタ・マ

抜きの転写液使用）し，3％BSAでブロッキング

ウスでかなり異なるものと思われ，ヒトの場合も（30分間），一次抗体（10〟g／ml）15時間，二次

かなり異なることが考えられる。また，ジストロ抗体（アルカリフオスファターゼコンジュゲート，フィンの存否と筋萎縮の関係にも′ヾライティーが3，000倍希釈），5時間反応後，発色させた。

存在するもののようである。以上の理由から，我㊤

界面活性剤可溶化ジストロフィンのポリエチ々は，ラット骨格筋を材料として用い，ラットジ

レングリコール分画

ストロフィンの性質を調べ，ウサギジストロフィ

ハッセルバッハーシュナイダー溶液で遠心洗浄ンとかなり基本的な性質が異なることを見出した。

を行ったラット骨格筋ミクロゾーム画分より，1％トライトンⅩ−100，20mMピロリン酸，0．5M＊徳島大学・酵素科学研究センター＊＊徳島大学・工学部・生物工学科

塩化ナトリウム含量50mMトリス塩酸緩衝液pH
8・5にて，ジストロフィンを可溶化後，105000×g

16

PEGFRACTIONJn−ION

OFRATEmTROPHIN

PEG2−4％ppt−dyS廿OPhin

1，SVerStaining2Iimmunostainhg
匿日．PEG FRACTIONATION OF RAT DYSTROPHIN
1．silver staining

2．immunostaining

1時間遠心した。得られた上宿にポリエチレング

すように，いずれの界面活性剤を用いてもラット

リコール6000を順次加え，遠心後各沈殿に含まジストロフィンは可溶化されず，ポリエチレングれるジストロフィンの検出を行った。図1に示す

リコール6000で不可逆的に沈殿すると考えられ，

ように，トライトンで可溶化されたラットジスト

可逆的に沈殿するウサギジストロフィンとは異なロフィンは，ポリエチレングリコール2−4％のっていた。

沈殿に濃縮された。次に，ポリエチレングリコー③

小麦胚芽レクチン（WGA）アガロースカラム

ル2−4％の沈殿を，トライトンⅩ−100，CHA

に対する親和性PS，ジキトニンを含む各50mMトリス塩酸バッ

ウサギジストロフィンは，WGAに親和性を持

ファーpH7．5，0．5M塩化ナトリウム溶液にて，つ糖タンパク質と複合体を作っているために，界それぞれ抽出し，105000×g，1時間遠心後，上面活性剤で可溶化後，WGA−ゲルマフィニティ

溝，沈殿小のジストロフィン量を調べた。図2に示クロマトグラフィーにて，ジストロフィンの極め

17

IrreversibJe precipitation

OfratdystrophinwithPEG
12

3

4

56

ST

dystrophin−−200kDa

116kDa80kDa

Tribnextra￠t＄叩川，PPt（2）CHAPSextract sup（3）ppt（4）Digitoninextract SuP（5）ppt（6）図2．1rreversible precipitation ofrat dystrophin with PEG
Trionextract sup（1），ppt（2）CHAPS extract sup（3）ppt（4）Digitonin extract sup（5）ppt（6）て有効な精製濃縮が可能である。ラットジストロ

結合しなかった。動物の種が異なると，糖タンパ

フィンも，WGAゲルカラムによる精製が可能か

ク質の糖鎖構造が変化することも考えられるので，どうか調べた。ウサギ，ラットジストロフィンも，

WGA以外のレクチンカラム（ConA，RcA，UEA，

WGAqゲルカラム（Vactor社製）にかけ，洗浄後，DBAカラム……）で同様の実験を行ったが，ラッ0．5M N−アセチルグリコサミンにてゲルに結合

トジストロフィンは，いずれのレクチンカラムにしたものを溶出した。図3に示すように，ウサギも親和性を示さず，素通り画分に存在した。以上

ジストロフィンは，WGAゲルに結合し，N−アの結果から，ラットジストロフィンは，ウサギジ

セチルグルコサミンにて特異的に溶出された。一ストロフィンと異なり，糖タンパク質との複合体

方ラットジストロフィンは，全んどWGA−ゲルにとして可溶化はしていないようである。

18

WGA−agarOSeaffinitychromatography
rabbitdys廿OPhin

dys廿OPhinmtdyS廿OPhin

dyS廿OP仙Pa88廿vough

eluatewithNAGA

図3．WGA−agarOSe affinity chromatography④

ヨウ化カリウムによるラットジストロフィン

緩衝液pH7・5で抽出し，105000×g，一時間遠の可溶化

心し，上宿中の可溶化されたジストロフィンの含界面活性剤で可溶化されたラットジストロフィ量を調べた。コントロールとして，ハッセルバッ

ンは，WGA一アフィニティークロマトグラフィ

ハーシュナイダー（HS）溶液にて抽出したものをーができないため，未変性の状態で精製するのは用いた。図4に示すように，ラットジストロフィ

非常に困難であると考えられた。そのため，界面ンは，0・2Mヨウ化カリウムでも可溶化された，活性剤を用いない可溶化方法について検討したとそれで0．2Mまたは0．6Mヨウ化カリウムで抽出

ころ，比較的低濃度のヨウ化カリウムにてラットされたラットジストロフィンを透析によりヨウ化

ジストロフィンが可溶化されることを見出した。

カリウムを除去し，レクチンカラム，DEAE−セラット骨格筋ミクロゾーム画分を，0．2Mから3ルロース，ハイドロキシアパタイトカラムにかけ，

Mまでのヨウ化カリウム含有25mMトリス塩酸

その溶出位置を調べた。表1は，各種クロマトグ

19Solubi］izationofratdystrophin

byKltreatment

ST123
ニ二二二ニ

45

6789

ーー

一dySbOPhin

200kDa−1，2；0．2MKl，3，4；0．6MKt5，6；1MKL
7，8；3MKも9，HS

図4．Solubilization of rat dystrophin by KI treatment
l，2；0．2MKI．3，4；0．6MKI，5，6；1MKI，7，8；3MKI，9，HS

蓑1．Comparison between Rat and Rabbit Dystrophin

TritonX−100

K■¶itonX−100

WGA−agarOSe u血OUnd unbomd
ConA−Sepharoso unbound u血oundbound

DEAE−CeMose O．15−0．2MNaC1
bound
Hydroxyapatite o．2MPO．

bound

bound

0．15−0・2MNaCI O．15−0．2MNaCI
bound
0．3MPO・PEGfTaCtionatjonirreversib−eprecipitadon ND

bound
O．3M

PO▲

4％
rovor＄iblep柁eipitatjon

20

ラフィーにおける挙動を，トライトン可溶化ラッ

大切なものと考えられるジストロフィンが動物のトジストロフィン，ヨウ化カリウムで可溶化したラ

種を問わず相同性が高いタンパクであることを考ットジストロフィン，トライトン可溶化ウサギジスト

えると生理機能を発現するための膜上での存在様

ロフィンで比較したものである。ヨウ化カリウム

式も動物の種を問わず類似性は高いと考えられるで可溶化したラットジストロフィンも，トライト

べきである。ジストロフィンの膜上での存在様式

ン可溶化ジストロフィンと同様，WGA，ConAカを明らかにすることは，その生理機能の解明，ジラムに親和性を示さなかった。しかし，DEAE−

ストロフィン欠損と筋肉リソゾームカテプシン群

セルロース，ノヽイドロキシアパタイトカラムでのの増加による筋タンパク崩壊元進との関係の解明

挙動は，トライトン及びヨウ化カリウム可溶化ラ

にとって最も重要である。今後ラットジストロフ

ットジストロフィン，トライトン可溶化ウサギジ

ィンの膜上の存在様式，ヨウ化カリウムにて可溶

ストロフィンの3者に全んど差は見られなかった。

化 精製したラットジストロフィンの諸性質について明らかにしていきたい。

考案

ラットジストロフィンとウサギジストロフィン

文

献の一番の性質の違いは，WGA，ConAカラムに対1）Koening，M．，Monaco，A．P．and

する親和性である。その原因としてはラットジス

Kunkel，L．M．Cell，53，219−228

トロフィンは，糖タンパク質と複合体を作ってい（1988）

ない，または，複合休として存在しているとして

2）Arahata，K．，Ishiura，S．，Ishiguro，Tl，も，可溶化の過程で糖タンパク質が解離する，糖Tsukahara，T．，Suhara，Y．，EgtlChi，C，，タンパク質の糖鎖構造が全く異なっている等が考Ishihara，T．，Nonaka，T．，Ozawa，E．

えられる。ラット，ウサギジストロフィンともに，and Sugita，H．Nature，333，861−863

骨格筋の免疫組織染色では，細胞膜に局在してい1（1988）ることが判明しているが，両ジストロフィンの界

3）Cambell，K．P．and Kahl，S．D．

面活性剤による可溶化条件は異なっている。ウサ

Natllre，338，259−262（1989）

ギジストロフィンは，中性で容易に可溶化される

4）Murayama，T．，Sato，D．，Kimura，S．，のに対し，ラットジストロフィンは，低濃度のピ

Shimizu，T．，Sawada，H．，and

ロリン酸が共存し，弱アルカリ性であることが界

Maruyama，K．Proc．Jpn．Acad，668

面活性剤による可溶化のために必要である。これ（1990）

らを考えると，ラットとウサギのジストロフィン

5）Yoshida，M．and Ozawa，E．J．

の膜上での存在様式が同じであるとは考えられな

Biochem，108，748−752（1990）い。しかも，此の差異の意義は生理機能上非常に

21

4

ジストロフィン分子上の糖タンパク複合体結合部位について

研究協力者

鈴

小 沢

鋲二郎

木

厚

吉

田

幹

晴

これまで多くの免疫組織化学的研究により，ジDAPCを精製することが可能である。さらに現在，ストロフィンが骨格筋や心筋の膜の細胞質側に局

このDAPCをアルカリ処理することによってジス在していることが明かとされてきだ）・2）。一次構

トロフィンも単離できるように．なった。複合体造の解析に基づいた分子構造予測3）とあわせて，中の糖タンパク質は膜タンパク質であると考えら

この観察結果から，ジストロフィンはアクチンとれるので，筋肉においてもジストロフィンはこれ結合しながら筋細胞膜裏打ち骨格を構成している

らの糖タンパク質を介して形質膜に結合していると考えられるようになってきた。しかし，生化学と推測し得る。このジストロフィンに結合するタ的な研究の遅れから，まだジストロフィンの膜直ンパク質群の一つ一つの構造と機能を明かとし，

下における存在状態，分子構築を具体的に実証す

またDAPCの分子構築を調べることが，ジストロ

るには至っていない。実際，ジストロフィンのア

フィンの機能研究の次の生化学的課題である。

クチン結合に関しても直接的にはまだ確認されていないのが実状である。

今回我々は，ジストロフィンと糖タンパク質複合体との結合部位＝ジストロフィンの膜タンパク質

近年，筋肉膜の界面活性剤可溶性画分において結合部位を明かとすることができたので報告する。

ジストロフィンがいくつかのタンパク質とともに

これは，ジストロフィン分子の高次構造をカルパ

大きな複合体を形成していることが示された4）・5）・6）。

インによる限定分解を用いて研究する中で遅良く

昨年，当研究室の吉田らはこの複合体に含まれる発見しえたものである。これまでジストロフィン

6種のジストロフィン結合タンパク質をSDSゲルの膜結合部位は，一次構造の解析から，他のタン上で同定し，分子量の大きいものから順にAO（94

パク質（ジストロフィン関連タンパク質を除いて）kD），Al（62kD），A2（52kD），A3（43kD），A4との相同性のないそのC末端ドメインにあると予（36kD）そしてA5（24kD）と名づけt5）。また．

測されていた3）。結論から先に述べるならば，我Campbellらはこの他に，単クローン抗体を用い々の結果はこの予測を裏切るものであり，ジストて，CBB染色では同定しにくい分子量156kDの陪ロフィンがむしろその手前に存在するシステイン

タンパク質を発見した6）。これらのジストロフィン結頻出ドメインを中心とした領域を膜タンパク質に合タンパク質のいくつか（A2，A3b及び156kDプロ結合させていることが示された。これまでの臨床テイン）は小麦胚芽レクチン（WGA）結合性の糖タ的研究7）から，ジストロフィンの機能にとってこ

ンパク質であり，これらの糖タンパク質を介するのシステイン頻出ドメイン周辺領域の重要性がす

ジストロフィンー結合タンパク質複合体（DAPC）

でに指摘されてきている。今回の我々の結果は，のWGAアフイニティーカラムへの結合を利用してこの事実を分子レベルで合理的に説明するものであった。

＊国立精神神経センター・神経研究所・機能研究部

22

材料

と方法

せ，それを抗原としてウサギを免疫した。できた＜DAPCの精製＞：ジストロフィンー結合タンパ

抗血清はBSA−Sepharoseカラムに通し，抗BSA

ク質複合体（DAPC）は既に吉田らの報告してい抗体を血清中から除去した。

る方法に基づいてウサギ骨格筋から精製した5）。
但し，本研究ではジチオスレイトール（DTT）を

結果

と考察

筋肉の膜画分調製時に2mM，以後のカラムクロ

ジストロフィンー結合タンヾク質複合体（DAPC）

マトグラフィーにおいては0．5mMとなるようにをカルパインによって準定常状態にまで分解する添加した。

と，図1alane1，2に示すような結果を得る。ジ

＜カルパインによるDAPCの消化，および消化物

ストロフィンはカルパイン消化に対して非常に感のWGAによる分離＞：カノレヾインはシグマ杜から受性が高く，速やかに145kD，117kD，100kD，購入した。消化反応はDAPC／カノレヾイン＝100：

54kD，44kD及び33kDなどの断片に分解する。

1という重量比で25℃30分間おこなった。使用し一方，結合タンパク質は，AO及びA3aを除いて，た緩衝液は以下の通りである。（20mMHEPES，

そのほとんどがカルパイン消化に対して抵抗性を270mM NaCl，2mMCaCl2，0．5mMDTT，示しているようにみえた。実際，DAPCの示す消0・1％digitonin，PH7．5）。反応は5mM EGTA

化パターンは精製したジストロフィンの消化パタの添加によって停止させた。その後溶液を，レクーンとほとんど変わらず，結合タンパク質の存在

チン結合用緩衝液（20mM HEPES，0．5M

による主要な新しいバンドがあまり見られないこ

NaCl，3mM MgCl2，2mM EGTA，0．5mMとが指摘されている（吉田ら未発表データ）。少な

IJrT，10pg／mlleupeptin，PH7．5）によって平

くとも，結合タンパク質に含まれる糖タンパク質衡化したWGA−Sepharoseカラムに通し，消化のカルパイン消化抵抗性は，ビオチン化WGAを用物をWGA吸着画分と非吸着画分とに分離した。

いた染色によって確認された：DAPC中の糖

その際，WGA吸着画分の溶出はN−アセチルーD−

タンパク質，A2，A3b及び156kDプロテイン

グルコサミン（NAG）を含む緩衝液（20mMの分子量はカルパイン処理によってほとんど

HEPES，0．3MNAG，0．5mM DTT，0．1％

変化せず，またWGA結合能を完全に維持しdigitonin，10JLg／mlleupeptin，pH7．5）を用いていた（図1b）。従って，もしカルパイン処理がておこなった。

ジストロフィンと糖タンパク質との結合を損なっ＜抗ジストロフィン抗体＞：抗体POOa，PO4d，ていないならば，消化物をWGAアフィニティー

P23a及びP34Cに関してはすでに報告している。

カラムに通した場合，糖タンパク質との結合部位

それぞれヒトジストロフィンのアミノ酸配列1卜をその内部に有するジストロフィン断片のみが60，440−489，2360−2409および3495−3544を

WGAに吸着すると考えられる。実際，図1a認識するポリクローナル抗体である。Dy4／6D3

lane3，4に示すように，ジストロフィン断片のはNichoIson博士の好意によって入手した単クロ

うち145kD断片の一部（145b）及び100kD断片ーン抗体であり，ヒトジストロフィンの1180−

がWGAに対する結合性を維持しており，これら

1388番のアミノ酸配列を抗原としたものである。

の断片に糖タンパク質結合部位が存在すると考え今回作製した二つのポリクローナル抗体P30b及られた（図2）（またこの実験において，結合タンびP3lbは常法に従い以下のように作製した：そパク質のうちAlのみが，あまり分解を受けていれぞれ，ヒトジストロフィンの3085−3097及びないにもかかわらず他のものと異なる挙動を示し，3186−3200番のアミノ酸配列に対応する合成ポ

WGAに吸着できなくなることも示された。従っリペブタイドを牛血清アルブミン（BSA）に結合さて，Alのジストロフィン結合部位は他の結合夕

23

譲

さぎ

dystrophin ￣I欝ト『−−−■■1■−145kD
ト

AO

錨i鯵
−1−

−

−

義i宗．絨

領賢

椒

藤

A3芭⊂〒

A4

■

■

Al⊂溺鹸
A2

156−kD− ｛●＿− 一■−117kD
一■・・100kD

一■−54kD
一■−44kD

A2

−

A3b一

⊂＝
卜

■−
一

●
一

■

楓′穣職
棚

漣W〈

一■−33kD

A5・−

1

2

3

4

1

2

図1ジストロフィンー結合タンパク質複合体のカルパイン消化パターン，および消化物のWGAアフイニティーカラムによる分離。aはクーマジーブル
ー染色，bほどオチン化WGAをもちいたブロッティング染色。

図2 図1の結果の模式図○

3

24

ぎおお薄青一gggggggg gg
200

−

116

−

66

−

志気

42

＿

30

＿

￣←￣145kD
一■ト117kD一■￣100kD￣←54kD一←44kD￣←33kD

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

POOa PO4d Dy P23a P34C
図3

WGA吸着，および非吸着画分の各種抗ジストロフィン抗体を用いたイム
ノブロット。各抗体のエピトープの位置は，図5を参照のこと。

ンバク質の結合部位とは異なる可能性がある）。

結合しない117kD断片も認識した。すでにこの膜タンパク質結合部位をジストロフィン分子上で同117kD断片のN末端は145bのN末端と同一で，定するため，ジストロフィン分子のさまざまな部

ヒトジストロフィンの1993番からのアミノ酸配分を認識する5種類の抗体を用いてWGA吸着画列に相同であることが吉円らによって示されてい分，非吸着画分のイムノブロットをおこなった（図る（吉田未発表データ）。従って以上の結果から，

3）。これから，上記の145bはP23aで認識され，ジストロフィンの膜タンパク質結合部位は，145b

100kD断片はどの抗体とも強い反応性を示さなと117kD断片の非重複部位に存在する事が示唆いことが明かとなった。また，ジストロフィン分

され，分子￣星Itのおおまかな見積から，それはジス

11のC末端にエピトープをもつP34Cは145b

及トロフィンのシステイン頻出ドメイン周辺に位置

び1日nkDのどちらの断片にも反応しなかった。こすることが予想された。次に私たちは，この領域

れから，膜タンパク質結合部位が，予想されているのアミノ酸配列を認識する2種のポリクローナル（㌧吊喘ドメインより内部に存在することが示唆さ

抗体P30b及びP31bを新たに作製し，それらをれろ‖

用いてイミノブロットをおこない，この予想を確

さらに興味深いことに，P23aほWGA

に

25

さま
′

′

200−

116￣

増静

欄臓

蠣l■

蠍

一一145kD

一一100kD

66 −42・−＿−＿38kD

一一35kD

30

−

1

2

3

P30b
図4

4

5

6

P31b

新たに作製した抗ジストロフィン抗体，P30b及びP31bを用いたイムノ
ブロット。

認した（図4）。すなわち，これらの抗体は117kD

結合性の最小の断片と考えられるが，P30bのこを含むWGA非結合性の断片は全く認識せず，一の断片への反応性はP3lbよりもかなり弱かった。

方WGAに結合した145b及び100kD断片を共に従って，35kD断片のN末端はP30bのエピトー認識した。さらにこれらの抗体は，これまでに同プ周辺にあることが予想される。

定されていなかったWGA結合性の2つの小さな以上の結果を総合すると，ジストロフィンの膜

ジストロフィン断片，38kD及び35kD断片を新タンパク質結合部位は，P30bのエピトープ周辺

たに認識した。これらは，145kD断片と117kD

からC末端側へ35kDの範囲，すなわちアミノ酸

断片の非重複部分に対応すると考えられる。特に番号では約3090−3400の領域に限定し得ること

35kD断片はカノレヾイン消化によって生成するWGAが明かとなった（図5）。この領域は，ジストロフ

26

0

1000

POOa PO4d Dy4J6D3
t t

2000

3800

■

3685

P23a P30b，P31b P34cl I⊥dァ∫如♪上山

117kD

35・3gkD

図5 ジストロフィンの各プラグメントの位置，および膜タンパク質への結合に必須な部分の同定。
ヰ央のジストロフィン分子模式図内部には，一次構造から予測されている四つのドメイン構造13）がわかるように示してある。：N末端ドメイン（白色部），スペクトリン様の棒状ドメイン（斜線部），システイン頻出ドメイン（黒色部），C末端ドメイン（点描部）。濃い斜線の部分は，Koenigらがプ
ロテアーゼの消化を受け易い部分として予測した仇ヒンジ 領域12）を示している。WGA結合性のジストロフィン断片は影付きのバーで，非結合性断片は白色バーで表している。矢印で示した領域は，ジストロフィン分子上で最もその一次構造が保存されている領域である。C末側のギザギザの実
線は，可変的スプライシングが主要に起こる位置を示す。

イン分子上のシステイン頻出ドメイン，及びC末

各組織特有の機能を果たせるようにしているのか

端ドメインの頭の部分を主としてカバーしており，もしれない。もちろん我々の今回の実験は，ジス

ヒトジストロフィンのアミノ酸配列の中で最もトロフィンのC末端と膜タンパク質複合体との相（＞99％）保存されている部分3123−34188）に驚互作用を完全に排除するものではない。

くほどよく一致していた。近年，筋肉膜上に存在

Koenigらほ，DMD／BMD患者の症状とそのジすることが観察されてきている9）ジストロフィン

ストロフィン遺伝子における欠損の位置との相関

関連タンパク質（DRP）のC末端も，この領域のの解析をおこない，ジストロフィン分子上のどの

3187−3400番のアミノ酸配列と高い相同性を示部分がその生理的機能にとって重要かを明かとすす10）。従って今回の結果は，DRPもまたジストる研究をおこなった7）。その結果，すでにこれま

ロフィンと同様な膜タンパク質複合体を利用してで，重度な筋ジストロフィーの症状を示すに至る

膜にアンカーリングしている可能性をうかがわせ

ジストロフィン分子上の欠損は，我々が膜タンパる。また，ジストロフィンは組織によって異なる

ク質結合部位であると同定したシステイン頻出ド

可変的スプライシングを受けて発現していること

メインおよびC末端ドメインの頭の部分に集中しが指摘されている1日が，その主要なスプライシンていることが指摘されている。従って，我々の今

グ部位はアミノ酸残基でいえば約3408前後に存回の結果は，ジストロフィンと膜タンパク質との在している0従って，それ以降のジストロフィン

相互作用がジストロフィンの機能発現にとって決のC末端は膜結合を中心的に担っているのではな

定的に重要であることを示唆している。

く，むしろその結合を修飾し，ジストロフィンが

27

文

献

1）Arahata，K．etal．Nature333，861−
863（1988）．

2）Watkins，S．C．，Hoffman，E．P．，Slayter，
H．S．＆Kunkel，L．M．肋ture333，863−
866（1988）．
3）Koenig，M．，Monaco，A．P．＆Kunkel，
LM．Cg／753，219−228（1988）．
4）Campbell，K．P．＆Kahl，S．D．肋ture338，259−262（1989）．

5）Yoshida，M．＆Ozawa，E．LBiochem．
108，748−752（1990）．

6）Ervasti，J．M．et al．肋ture345，315−
319（1991）．

7）Koenig，M．et al．Am．J肋桝．Gg〃gf．
45，498−506（1989）．
8）Lemaire，C．，Heilig，R＿＆Mandel．J．L．
且ルナβ0ノ二

7，4157−4162（1988）．

9）Tanaka，H・，Ishiguro，T．，Eguchi，C．，
Saito・K・＆OzawaJE．msiochemisi77
96，1−5（1991）．

10）Love，D．R．et al．Ndture339，55−58（1989）．

11）Feener，C．A．，Koenig，M．＆Kunkel．
L．M．肋J〝rg338，509−511（1989）．
12）Koenig，M．＆Kunkel，L．M．J，Biol．
（乃gm．265，4560−4566（1990）．

28

5ジストロフィンは骨格筋で管（直下）に存在する

山 下
研究協力者

鳥 居

茂＊

俊＊＊ 佐々木 博 之＊＊＊野々村 禎 昭＊

Kunkelらによって蛋白質ジストロフィンが筋を作製した。スキムミルク，血清アルブミンでブジストロフィー病因遺伝子産物ということが明ら

ロック後，同液に溶かしたフォーク抗体で37℃でかにされてから，骨格筋でのその局在，機能につ3時間反応させ，良く洗浄してから，ABC液又はいて多くの研究がなされている。局在については

HRP標識2次抗体又はFITC標識2次抗体で同上細胞膜（下）の存在について杉田ら1）が示して以

ブロッキング液中に37℃1時間以上反応させ，良来，筋腱接合部，神経筋接合部に濃厚に存在する

く洗ってからHRP，ABCでは強力染色法を行いという結果の他はみるべきものがない。

検鏡，FITCはDABC0−50％グリセロール処理

細胞膜の陥凹であるT管膜でのジストロフィン

後蛍光田微鏡下で観察した。

の局在については，その存在がそもそもトライア

電顕標本は同上HRPでの普通染色を確認（後述ッドからとられた2）という歴史的背景から，先ずするT管との反応）してから，スライドグラス上

この附近に存在すると考えられたにも拘らず，最でオスミュウム後固定，脱水，エポキシ樹脂に包近，Kunkelらはむしろ否定的な結果を示してい

埋，細切した後軽くウラン染色した。

る3）。
我々はジストロフィン配列の最C端25残基アミ結

果ノ酸を合成し，システエインを加えこれら8個をFITC染色は全ての標本で細胞膜が染っていた。

リジンでつないだフォーク型抗原から特異性が高時に縦方向に垂直に周期的に蛍光が認められるこく，抗体価の高いポリクローナル抗体を得たことともあったが明らかではなかった。この頃迄，一を昨年報告した。この抗体を用いて，種々の方法

次抗体反応は室温2〜3時間又は低温室オーバナを馬区使して，T管膜附近に本当にジストロフィン

イトを行ってきたが37℃3時間反応を行うことにが存在しないのかを明らかにすることにした。

よって，この周期は認め易くなった。さらに油浸で1，000倍で観察するとフォーカスを変えると周方

法期が明らかな面があることに気付いた。普通400

ラットを1％パラフォルムアルデヒド潜流又は倍程度では表面膜しか染っていないのに油浸で明別出後30分程固定（リン酸バッハー下），高張庶糖

らかにフォーカスの差によって周期が認められるで24時間以上置換後，凍結し，主として縦断切片

ことがわかった。第1図にそのような例を示すが，aで表面膜のみが染っていたものがフォーカスを＊東大医薬理変えると，C，d，eの上部の細胞では明らかに＊＊東大医整形

周期がみえてくる。この時下部の細胞では膜が周＊＊＊慈恵医大医化研期に一致してドット状に染っている。この周期間隔は標本をどの様な長さで固定するかで異ってい

29

豪∴二子
図1油浸顕微鏡高倍率でフォーカスを変化させた際のジストロフィン抗体
反応位置の変化
ラット凍結切片（骨格筋縦断像）の抗体反応をF汀C−標識二次抗体でaからr迄フォーカスを変えた像変化を写した。a；2つの細胞膜が染っている。b；2つの細胞で縦断面に垂直に周期がみえてくる。下の細胞では周期に対応してドット状に染まる。Cとd；上の細胞の周軋下の細胞のドットはさらに明らかとなっていく。eとf；下の細胞は視野から消え，上の細胞は全休が光って（周期は一部残して）いる。恐らく膜表面にフォーカスがあっていると思われる。

るが，あまり解像出来ない為，こまかい議論は出来なかった。

なかった。
免疫電顕法には色々な方法があるが，我々は光そこでABC染色を行い，強力に染色してみた顕との対応も出来，もとの像がはっきりとらえらところ第2図aに示す様なきれいな周期を得るこれる「方法」に書いたpost−embedding法をとっとが出来た。この時の濃い帯の巾は約1．2〜1．5／上m

た。但し像の維持をよくする為，比較的状態の良薄い帯の巾は1．3〜1．6／∠m，連続で同時につくっい（この様な時，ABC染色は弱）が染色は特に強た標本位相差像から筋原線維周期3．0／上mなので，くはないが周期構造をもっているものについて標

この染色はA一Ⅰ接合部に一致し，T管暇の存在する本作製を行った。第3図に示すようにT管と筋小場所と一致している。これ迄は骨格筋であったが，胞体の僅かな間隙にHRP染色が認められた（矢尻若しT管槙で反応がおきているとすれば心筋ではZ

頑で示す）。この例は一般ウラン後染色が強すぎ帯に相当する処にあり，一般に心筋は短縮状態で固た為，対比的にうまくは示せなかったが，広範囲定されるが第2図では，位相差で2．2／∠mの筋原緑にわたって，この限られた領域が染っていた。

園周期をもっていたが，同様に2．2／上mで等間隔でABC染色反応を示していた。これらの染色は強考察力に行っているので，コントロールをみてみたが，

これ迄，ジストロフィン抗体でT管附近を染めb，dに示すようにこの様な特異的周期はみられることが出来なかったのは，3図でみられるよう

30

図2

骨格筋，心筋でのジストロフィン抗体反応のABC法での表示
a，b；ラット骨格筋，C，d；ラット心室筋。a，Cはジストロフ
ィン抗体反応標本。b，dは2次抗休のみの発色のコントロール。aではA−Ⅰ接合部を，CではZ帯部に相当する場所を染めている。

図3 第2図の様な処理を行った後の電顕標本（ラット骨格筋）
ABC染色はa，b（低倍率）共で管と筋小胞体間の間隙（リアノジン
受容体のフットのある処）を選択的に染めている（矢尻頑で示す）。フットと区別出来ない場所もある（2重矢尻頭）。

31に，非常に僅かな範囲領域でしか反応しないので，あったらその量は極端に少いことになるが，T管光顕レベルで可視化することは最初から困難であ膜にあれば，或る程度の量は存在することになる。

った。この為には37℃で反応させることが必要で

骨格筋は心筋の約2倍量（A−Ⅰ接合部はZ帯にあり，しかも1図でみるように油浸にして1，000

対して2倍）あることになるし，トリアッド分画倍という高倍率でフォーカスを変えながら観察すにはかなり存在することになる。これらを含めてる必要があった。この結果からT管（下）にジス

量的な問題，生化学的分画を骨格筋，心筋でやり，

トロフィンが存在することは明らかになったが特その量を比較検討することなどをやっていきたい。

に心筋と骨格筋では反応様式が異っているという

又，トリアッド分画で直接ジストロフィンの存在

ことは我々の結果が正しいことを示している。見を証明することも検討していきたい。

えないからといって存在しないと結論することは危険である。我々は逆に認められたから存在するという立場であるので優位であったと言えるだろう0又，その存在は非常に微妙なものであって，これ迄認められなかったのも当然かもしれない。
おかげで我々は抗原抗体反応を強く表示する方法を確立することが出来た。
一方，若しジストロフィンが細胞表面膜のみで文

献1）Arahata，K．etal．，（1988）Nature333，8612）Hoffman，E．P．etal．，（1987）Nature
330，754

3）Bayers，T．J．etal．，（1991）J．CellBiol
l15，41132

6

筋形質膜裏打ち構造およびジストロフィン局
在に関する超微形態学的研究
律 田 田

野

春増嶋

尾

■ ■ ■ ■ ′

巻

石昇男

藤

道

研究協力者

俊

和

村

上

修

古

村

徹
南

夫

アブ・サレムはじめに討した。とくに，共焦点レーザー顕微鏡を応用す

筋ジストロフィー症の筋線経に欠損する蛋白質

ることによって，ジストロフィン免疫染色性が筋としてジストロフィンが同定されて以来，この蛋

形質膜に沿って一様な分布ではなく，不連続で，白質の化学的性質，細胞内局在，分子形態などのしばしば内部の筋原線経の槙紋と関係した格子模研究が急速に進んでいる。この蛋白質は正常筋線様の分布を示すことを明らかにした。また，筋腱経の形質膜に局在することが示され，おそらくは連結部において，筋線維端に極めて強い免疫染色

形質膜を裏打ちしていると考えられている1・2）。

性が認められた。この部位では，形質膜のほとん

しかしながら，この蛋白質がどのような高次構造

どは典型的な裏打ち構造を有しており，この免疫を作り，膜とどのように連結しているかは推論の染色性と裏打ちは場所的によく重なる。

域を出ていない。

筋形質膜と裏打ち構造ないしジストロフィンと最近になって，ジストロフィンに特異的に結合の関係を超微形態学的に分析するためには，よりする糖蛋白質の存在が明らかにされ，ジストロフ

単純化した系についても調べる必要がある。われィンはそれらと複合休をなして筋形質膜に固定さわれは今回，筋形質膜標本を調製し，これについれていると考えられている3）。この糖蛋白質はて，各種電子顕微鏡法を応用して分析したので報WGA結合性を有し，一部が細胞外に突出してい告する。

るという4）。しかし，このジストロフィンー糖蛋

白質複合体の分子形態，局在，および膜との相互関係はいまだ明らかにされていない。

材 料 と方法
本研究に用いた筋形質膜標品はOhlendieckらのわれわれは，これまで，各種電子顕微鏡技法を方法6）によって調製した。成熟家兎から背筋を切駆使し，ジストロフィンの分子形態および局在をり出し，緩衝液中でホモジェナイズし，遠心し，明らかにすることを目的に研究を進めている。昨その上清を再び超遠心した。その結果得られる上

年度は，モルモットの正常骨格筋について，抗ジ宿を軽ミクロゾームとした。この軽ミクロゾーム

ストロフィン抗体を用いた蛍光抗体法によって，をさらに0．6MKClで処理し，超遠心することをジストロフィンの分布様式を調べ，電子顕微鏡に繰り返した。その沈瘡を次に庶糖密度勾配で超遠ょって調べられた裏打ちの分布5）との相関を検心し，0．303M／0．878M庶糖界面の膜分画を粗
筋形質膜分画として，主な分析試料とした試料の＊群馬大学医学部

一部として，この粗模分画からWGA凝集法によ33ってさらに鈍化したものも用いた。
以上の各段階の膜標品から，ネガティブ染色法，あり，ほとんどがアクチンフィラメントであった。

（2）粗筋形質膜

超薄切片法，シャドウイング・レプリカ法により次の段階として，庶糖密度勾配超遠心で得られ試料を作製し，電子顕微鏡にて観察した。超薄切た膜標品はすべて膜のみからなり，線維構造は全片試料には，タンニン酸を含むアルデヒド固定液

く兄いだされなかった。まず，ネガティブ染色でを用いた。抗ジストロフィン抗体にはモノクロー

調べると，瞭成分は円形，楕円形，管状，不定型

ナル抗体4−4C5（IgG）腹水（富士レビオ㈱およびなど形態的に多様で，大きさも様々であった（図

味の素㈱提供）を用いた7）。

1）。リボゾームが付着する小胞は認められなかった。これらの膜の中で，比較的大型で本定形の小結果（1）軽ミクロゾーム胞をなすものはしばしば中に膜構造を容れ，また微細な線維構造が小胞内面に付着するのが観察さこの標品をネガティブ染色で観察したところ，れた。このような形態は超薄切片の観察において膜成分に加え，多量の線維構造の混在が認められ明瞭に認められた（図2）。大型，不定形の小胞はた。線維構造は主としてアクチンおよびミオシン

膜が比較的厚く，3層構造が明瞭で，内部には微フィラメントからなっていた。膜はすべて小胞状

細線維構造の裏打ちや膜の封入が認められた。さを呈し，形態的には多様であった。次に，軽ミク

らに，膜表面に粒状の突出が多数観察された。わ

ロゾームを0．6M KCl処理を施した膜標品では，

れわれは，これらの特徴を持つ小胞を筋形質膜由

線維構造はわずかで，散在性に認められるのみで来とみなすことにした。これらの特徴に基ずくと，

図1粗筋形質膜標品のネガティブ染色像。
大型不定形の小胞（矢印）が散在性に見出される。内部に膜や線維構造を容れており，筋形質膜由来と考えられる。

34

図2 粗筋形質膜標品の超薄切片像。
表面平滑な球形や管状の小胞に混じって，大型不定形の，線維構造などを内容物にした筋形質膜小胞（矢印）が多数認められる。

粗筋形質膜標品の全小胞の兢〜坑が形質膜と概算（図4b）。

される。実際，コロイド金標識のWGA（麦胚芽膜から突出する粒子像はシャドウイング・レプ凝集素）を反応させたのち，ネガティブ染色してリカ法による電子顕微鏡観察からさらに明瞭に観観察すると，これらの特徴を持った小胞のみが金察された（図5）。多くの膜は外表面が比較的平滑標識を示した。

であるのに対し，一部の膜に多くの粒子が集団を超薄切片を強拡大で観察すると，いくつかの興なして分布するが認められた。粒子像は大型・不味ある所見が得られた。まず，形質膜と見なされ定形の膜に多く，ネガティブ染色および超薄切片

る小胞には，膜を裏打ちするように微細な線維構の観察とよく一致する。このように，粒状突出と造が網目をつくっていて，膜と密接に連結してい内部の線維性裏打ちとが局在的によく一致するこるように見えた（図3）。裏打ちする線維構造の主とは興味深い。

体はアクチンフィラメントより小さく，また，線（3）免疫電顕観察

維構造は膜に沿って一様に分布することはほとん

粗筋形質膜標品にはかなりのジストロフィンのどなく，不連続な分布様式を示した。興味深いこ

濃縮が電気泳動的に認められる。したがって，筋とに，裏打ちのある膜領域では，膜から外へ突出

形質膜と見なせる小胞にはジストロフィンが含まする粒子像が常に認められた（図4a，6a）。このれているはずであり，ジストロフィンはおそらく突出は長さがほぼ一定していて，膜面から約12−

裏打ちする微細線維網形成に関与すると考えられ15nmであった。この突出は膜が斜めに切れた領る。そこで，この膜標品を支持膜を張ったグリッ

域では平面的に分布した粒子像として観察できたドに載せ，免疫電子顕微鏡的に反応させた。抗体

35

図3 筋形質膜
筋形質膜（SL）は概して大型不定形の小胞をなし，しばしば内部に膜を容れ，線維構造の裏打ち（矢印）や外表面に突出する粒状構造が特徴的である。大矢印は膜が切線方向に切れた部位を示す。

図4 筋形質膜
a．横切りされた筋形質膜（SL）の直下に線維構造の裏打ち（矢印）が形成されており，その部位に一致して外表面に粒状構造（矢じり）が認められる。
b．膜が切線方向に切れた部位では，膜表面に粒状構造（矢じり）の平面的分布が観察される。

図5 粗筋形質膜標品のレプリカ像
平滑な表面の小胞に混じって，表面に多数の粒状構造を有する大型不定形の小胞（矢印）が認められる。

図6 筋形質膜a・筋形質膜（SL）の超薄切片像。膜直下の緑維性裏打ち（矢印）と外表面の粒状構造（矢じり）との関係に注目されたい。
b・抗体染色した筋形質膜（SL）のネガティブ染色像。0．1％トリトン前処
理後，間接法にて抗ジストロフィン抗体染色を施してある。標識金粒子（矢じり）は膿直トーの線維構造上に見出される。

37にはモノクローナル4−4C5を用い，二次抗休に一部である可能性が高い。結合蛋白質の一つは大はコロイド金を標識したものを用いた。無処理のきな分子で，細胞外に大きく突出しているらしい8）。

膜では全く金染色は見られなかったが，0．1％ト

今後，結合蛋白質に対する抗体を用いて，今回可リトンⅩ−100処理後では，小胞内の線維構造が選視化された粒状構造とジストロフィンとの関連を択的に染色された（図6b）。さらに，1％トリト

調べていきたい。

ンで前処理すると，膜はかなり破壊，抽出され，内部の繰維構造が分散傾向を示したが，小胞に関係した繰維構造には染色が認められた。このこと
は，膜を裏打ちする線維網がジストロフィンを含有することを示したことになる。
現在，さらに純化した筋形質膜標品についても同様の分析を進めている。

文1）Watkins SC，Hoffman EP et al（1988）
Nature333：863−866

2）Arahata K，Ishiura，S et al（1988）
Nature333：861−863
3）CampbellKP＆Kahl SD（1989）
Nature考献察

本研究では，単離した筋形質膜の超微構造を各種電子顕微鏡法を用い，分析した。粗形質膜分画の中で，膜を裏打ちする微細頼経網の存在は特徴的で，この線維網がジストロフィンを含むことを

338：259−262

4）ErvastiJM，Ohlendieck，K，Kahl SD，
Gaver MG，＆Campbell KP（1990）
Nature345：315−319

5）Ishikawa H（1988）Arch．Histol．Cytol．
51：127−145

免疫竃顕的に示すことができた。このような線維

6）Ohlendieck K，ErvastJM，SnookJB，＆

綱がどのような蛋白質構成を有するか，また，筋Campbell KP（1991）J．Cell Biol．112：

細胞におけるどのような構造に相当するかほさら

135−148に検索が必要である。さらに興味深いことは，こ7）Hagiwara Y，Yoshida M，NonakaIの線維網の局在に一致して，膜上で外へ突出する

and Ozawa E（1989）Protoplasma

大型の粒状構造が見出されたことである。この粒

151：11−18子が膜内蛋白質と関連の深いことは疑いなく，最近明らかにされたジストロフィン結合糖蛋白質の

8）ErvastiJM＆Campbell KP（1991）
Cel166：1121−1131

38

7

ジストロフィン又はジストロフィン様蛋白質を広く動物界に検索する

小

研究協力者

は

じ

め

林

浜

一

千

尋＊

に

近年になり，ジストロフィンに的し，筋細胞の

弘＊

石

川

良

樹＊

体窒素に移し，液体窒素中に冷却したステンレス製のミルで機械的に破壊した。約0．3gの材料を膜蛋白質としての役割について興味ある知見が得10％SDS，235mMTriS−HCI（pH6．7）3．35mM

られつつある。たとえば，アセチルコリン受容休

EDTA，10％2−メルカプトエタノール及びプロとジストロフィンの局在が類似しているという報ムフェノールブルーより構成されるSDSサンプ

告（1）もそのうちのひとつであろう。この研究

ルバッファー0．6ml中にすばやく移した。バッフ

はジストロフィンがアセチルコリン受容体の密度

ァー中の材料はさらにポッター型テフロンホモジの高いシビレエイの電気器管には異常なほど多重ェナイザーでさらにhomogenizeしたのち，沸騰に存在するという研究を生んだ（2−4）。魚類でした湯に3分間つけた。室温に一夜間放置し，こあるにもかかわらずヒトのジストロフィンと同様のホモジェネートを14，000×gで10分間の遠心な性質があった。ここに改めて，どの様な動物ににかけた。遠心後の上宿を試料として下記のウエ

ジストロフィン又はその類似物質が存在するかとスタンプロットに用いた。

いう問題が生じるようになった。

ウエスタンプロッ・ト：調製した試料はSDS存

本研究では図1に示される系統樹に従って，代在下の5％ポリアクリルアミド・スラブを用いた表的な動物種につきそれらの筋組織にジストロフ

電気泳動にかけ（SDS−PAGEと略す），ただちにィンが存在するかどうかとウエスタンプロット法

PVDF−membrane（ミリポア社）に転写した。

により検討したのでここに報告する。

これはセミドライ転写装置（ニッポンエイド一社）
を用い，0．175M Tris−0．9Mグリシン及び20

実

験

方

法

％のメタノールを含む転写バッファー中，20Vの材料：ニッポンゴカイの休壁筋，イシダタミガ

電圧を約1時間にわたり水冷下でかけて行なった。

イの足筋，ベンケイガこの鉄部筋，ナマコの体壁

一次抗体は国立精神神経センターよりいただい

縦走筋，マアジの肯筋，アフリカツメガエルの足た抗ジストロフィン抗休：P34を用いたく5）。2筋，キンセンガメの足筋，mdx及びコントロール

次抗体はビオチン化した抗ラビットIgG抗体を用

マウスの足鼠 ニワトリ（白色レグホン）の胸筋。

いた。発色反応はベクター社のVectastainABC

試料調製：名大臨海試験場に於て新鮮な材料をキットを用いて行なった。

ドライアイスーエタノール中で急速に凍結し，ド電気泳動・転写は必ずダブルで行い，片方は上ライアイス存在下で群大に運搬した。ただちに液記の抗体染色 他方はアミドブラックの蛋白染色を行なった。電気泳動にかける試料の量はこの蛋＊群馬大学医学部薬理学教室

白染色中のアクチンの量が各々の試料でほぼ同じ

39

図1．用いた動物がどの程度の進化したものかを知る目的で柔軟樹に於てマークを入れた。矢印1はナマコ；矢印2はマウス，ニワトリ，カメ，カエル及びアジ；
矢印3はゴカイ；矢印4はカニ；矢印5はカイが担当する。それぞれの動物の
学名は実験方法の材料に示した。

40

のみならず，その存在の証明ができなかった動物になるように調節した。
本法によるジストロフィン検出はいくつかの研（アジ，ゴカイ，カィ，カニ及びナマコ）の試料に究室で行なわれているもので特に新しいものではも明瞭に存在した。特に後者の試料の結果に関しないが，我々の研究室でも正常に作動しているかての解釈には今後検討が必要である。

どうかにつき，mdxマウスとコントロールマウス

考より得られた試料をウエスタンプロットすること

察により検討を加えた。図には示さないが確かに後本実験ではマウスのジストロフィンと同様のも者では440kDaにP34抗体と反応するバンドがのがニワトリ，カメ及びカエルの骨格筋組織に存みられたものの，前者には全く検出されなかった。

在することが証明された。マウスのジストロフィンを含め，SDS−PAGEの移動差に差異があるか

実

験

結

果

どうかにつき今後検討の余地を残している。

図2は各種脊椎動物より得られた試料を同一の魚類として，アジより試料を得たが図2に示す

PVDF membraneに転写したのち抗ジストロフ

ようにジストロフィン又はジストロフィン様蛋白

ィン抗体と反応させたものである。ニワトリとカ質は検出されなかった。同じ魚類でエイの電気器

メの試料中にマウスのジストロフィンと同一の移管にはそれが存在する（2−4）。エイの骨格筋に動度を示すバンドが染色された。カエルでは反応存在するかどうかという問題もあるが，P34抗休か弱いながら同様のバンドがみとめられたものの，

でみるかぎりでは魚類がジストロフィン又はジス

アジでは全く検出されなかった。

トロフィン様蛋白質の存在するかどうかの境界と図3は脊椎動物以外のものについて検討を加えなるであろう。

たものである。図2と同様にマウスをpositive

魚類以下の（図1参照）動物よりの試料についcontrolとして同一のウエスタンプロット上でのては，P34抗体でみるかぎりはジストロフィン及抗体との反応性をしらべた。ゴカイ，カィ，カニびジストロフィン様蛋白質はなさそうである。し及びナマコすべてにおいて，マウスのジストロフ

かし前述のように低分子側にいくつかの抗体と反ィンと同一の移動度を示すバンドは検出されなか応するバンドがあった。試料調製には蛋白質分解った。

を防ぐよう最大の努力を払ったものの，ジストロ

以上より，マウス，ニワトリ，カメ及びカエル

フィン及びジストロフィン様蛋白質がすべて分解の骨格筋に於てはジストロフィン又はジストロフ

して低分子側に移行したという可能性が理論的に

ィン様蛋白質が存在すると結論できた。アジ，ゴは考えられる。しかし，この可能性は少ないと考カイ，カィ，カニ及びナマコの筋組織に於てはジ

えられ，今後ジストロフィン及びジストロフィン

ストロフィンが存在するというデーターは得られ様蛋白質が存在しないということを明確にする必なかったものの，ただちに存在しないと結論でき要があると考えている。このためには1）膜分画なく，今後，検討の必要が生じている。

を得て，これにつき検討を加えること，及び2）

図には示さないが，シオシン重鎖又はそれより

ジストロフィンの他の部位と反応する種々のジス

も分子量の小さい側に，抗ジストロフィン抗体とトロフィン抗体を用いて検討することが必要であ反応するバンドがいくつかみられた。これらはジろう。

ストロフィンの分解産物ないしはジストロフィン

用いたP34抗体はジストロフィンのN末端近くとエピトープを共有する蛋白質である。これらのを認識するものであるが（5），この部位の異常がバンドはジストロフィンの存在が証明される動物

ジストロフィー発症と関係が深いと考えられてい（マウス，ニワトリ，カメ及びカエル）よりの試料る。この考えに立てば魚数は問題点を残すが，

41

・・、・l．・∵

一一myOSlnheaYyChain

図2．各種脊椎動物の骨格筋よりのSDS抽出試料をウエスタンプロット分析をしたもの。用いた抗体はP34抗体でジストロフィンのN末近くを認識するものである。
FISH（マアジ肯筋を用いた）には抗体と反応するバンドがpositive ControlのMOUSE（mdxマウスに対するコントロールマウス足筋を用いた）に担当する部位（矢印でdystrophinと示す）認められなかった。

図3．下等動物の筋組織よりのSDS抽出試料をウエスタンプロット分析したもの。
positive ControlのMOUSEに担当する部位（矢印でdystrophinと示す）に抗体で染色されるバンドが認められなかった。

42

魚類より下等な動物の筋組織にはヒトのジストロ

Murname，A．A‥Douville，Kりフィー症と類似した病気は存在しないであろうと

Froehner，S．C．（1991）Localizationof

予想される。

dystrophin relative to acetylcholine

andreceptor domainsin electric tissue and文

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Torpedo marmorata electrocyte：evidence

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N．R．，Kramarcy，N．R．，Gao，K．−Ⅹ・，

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5．Hagiwara，Y・，Yoshida，M・and Ozawa・E．（1989）Protoplasma151：11−18・

43

Ⅱ

細胞膜タンパク質と細胞骨格

8・細胞膜関連構造に局在するα−アクチニンのクローニング

45

9・骨格筋細胞の発達・萎縮とアクチン細胞骨格調節因子

10・MAP

コフイリンの量的変動

492c cDN皐の強制導入と標識チュプリンの微量注入による微小管の動態と解析

56

11・筋巨大蛋白質の発生とその局在

63

12・AMPA型グルタミン酸受容体チャンネルのCa2透過調節機構

68

45

8

細胞膜関連構造に局在するα−アクチニンのクローニング眞 崎 知 生＊
研究協力者 今 村 道 博＊＊ 桜 井

は

じ

め

に

武＊＊ 小 川 昌 克＊＊において細胞形質膜関連構造に局在するという結

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症患者に果を得た。このことは，115k蛋白質の一次構造

特異的に欠損している遺伝子産物（ジストロフィと，ジストロフィンやスペクトリンの構造を比較

ン）は正常人では骨格筋細胞の形質膜直下に局在することによって分子構造と機能の関連についてしていることが示されている。このジストロフィ

新たな情報が得られることを示していると言える。

ンのアミノ端領域の一次構造はα−アクチニンおよび

そこで我々は，まず，この新しいα−アクチニン

β一スペクトリンのアミノ端領域の一次構造と高い類分子種の一次構造を明らかにする目的でcDNAク

似性を有しており，また，α一アクチニン分子の構造解

ローニングを行なった。

析により，この領域はアクチン結合構造を含むことが明らかに＿されているためジストロフィンがアクチン

材料と方法

系細胞骨格を含む隈の裏打ち構造の構築に深く関与

CDNAライブラリーの作製：Li−Urea法で成していることが示唆されている。細胞内における蛋鶏肺より調製したRNAをオリゴdTカラムにかけ

白質の局在はその蛋白分子の機能を解析する上でmRNAを得，CDNAを合成した。このcDNAを重要な情報を提供するが，ジストロフィンとスペ

JgtlOおよび栂tllにノ1ッケージングし，ベク

クトリンの両者が細胞膜直下に局在しうるというターの異なる2種類のcDNAライブラリーを作製

事実は，この2種類の蛋白間の相同性が高い一次した。

構造領域がそれらの局在に関与し，類似した機能

115k蛋白質cDNAのスクリーニング：115k

を担っているということを暗示している。ただし蛋白質cDNAのスクリーニングは2種類のプロー

α−アクチニンについて考えてみるとα−アクチニン

ブを用いて行なった。一つは我々がすでに報告しは骨格筋筋節のZ一題や，平滑筋細胞の濃密或ているニワトリの緑維芽細胞型α−アクチニン分子

また非筋細胞のストレスファイバ空や接着斑とい

種のcDNAを用いてIgtlOより，もう一つは

うような，主に細胞膜領域を除くアクチン線経の115k蛋白質に特異的な抗血清（ウサギ血清）によ

統合郡にその局在が認められ，ジストロフィンやりスgtllのライブラリーより行なった。

スペクトリンの局在とは全く区別される。近年，
我々は全く新しいタイプのα−アクチニン（115k

CDNAの核酸配列の決定，またノーザンプロッ
ト解析は文献8に準じた。

蛋白質）を発見し，この分子が未熟な骨格筋細胞結果 と 考察＊京都大学医学部第一薬理＊＊筑波大学基礎医学系

我々の兄い出した新しいαノアクチニン分子種（115k蛋白質）はニワトリの肺より精製すること

46に成功している。精製115k蛋白質を尿素存在下

うち2つは我々がすでに発表している線維芽細胞で変性させた後，リシルエンドペプチターゼを作型かアクチニン（プローブとして用いたもの）と用させて得た2つの消化断片のアミノ酸配列を調完全に一致していた（図1，A）。また，残りのべたところ，その断片のうち一つは，すでに発表

4つのクローンはBaronらがニワトリ線維芽細胞されているニワトリの線維芽細胞型α一アクチニンのcDNAライブラリーよりクローニングしたα−の配列と完全に一致していた。またもう一つの断ァクチニジと一致していたが（図1，B，C），そ片から得た配列はこれまでに発表されているどののうちの2つのクローンは線維芽細胞型α−アクチ

α−アクチニンともことなるものであったが，線維ニンcDNA（Fal）の3′側EcoRlフラグメント

芽細胞型αノアクチニンの配列との相同性は83％と（約1kbp）を用いたサザンプロットにおいて反応高いものであった。そこで我々は115k蛋白質の性が異なることが示され，これらは3′端の核酸配

cDNAをスクリーニングするにあたって，プロー

列に違いがあることが示唆された。これらの結果

ブに線維芽細胞型a−アクチニンのcDNAと115k

は3種類の異なるα−アクチニンクローンが得られ蛋白質に特異的に反応する抗体を用いた。

たことを示していたが同時に，115k蛋白質をコ

線推芽細胞型α−アクチニンeDNAによるスクリードするcDNAではないことを示していた。

ーニング：ニワトリ線維芽細胞型α−アクチニンの115k特異抗体によるスクリーニング：115k蛋

cDNA（Fafゝの5・側Ec。Rlフラグメント（約2白質に特異的な抗体を用いスgtllライブラリーかkbp）をプローブとして用い（図1，A参照）

ら90万クローンを検索したところ，最終的に6つ

栂tlOライブラリーより90万のクローンをスクのcDNAクローンを得た。これらの制限酵素マップ

リーニングした。最終的に得た陽性クローンよりは全て一致していたが，上記の線維芽細胞型かア

6つのクローンの制限酵素マップを作製すると同クチニンのマップとは異なったものであった（図1，

時に一部の核酸配列を決定し声ところ，これらのD）。このクローンをサブクローニングした後，5A丘喝Pent

3

H

B

P

P

H

B

P

P

H

H

B

p

P

H

H

血卯entr

E

5−

H

B

P

H

P

P

P

ト−lkb・・・一一一」

図1．α−アクチニンeDNAクローンの制限酵素地図
図中のH，B，P，Eはそれぞれ肌〝CⅡ，朗椚HI，PdⅠ，乱川RIを示している。
クローンBとCは3．端のnon−COding領域の構造が異なる○一部の核酸配列を決定し，アミノ酸配列を推定し異的に発現しているという蛋白レベルでの解析結たところ，115k蛋白質に特異的な配列が兄いだ

寮生非常によく一致していた。

された。このことは，このクローンが115k蛋白α−アクチ二ン分子種と115k蛋白質との類似性：

質をコードしていることを示していた。

現在までに，上記の115k蛍I

115k蛋白質mRNAの発現：骨格筋組織におけるの核酸配列を決定している。この配列から予測され115k蛋白質mRNAの発現を115k蛋白質cDNA

る蛋白質の一次構造をこれまでに報11iされているα一の3

旧cDNAの約8割

側BamHlフラグメント（図1，Dを参照）をアクチニン分子種と比較したところ，表1に示したプローブにしてノーザンプロット法により解析しように繰維芽細胞型のα一アクチニン分子種（Fα−

た（図2）。肺組織においては約4kbのところに強An）とは84％，骨格筋型分子種（Pα−An）とは76いバンドが認められ，115k蛋白質mRNAの発現％の類似性が認められた。このことは115k蛋白質が認められた。また，成鶏胸筋ではこのmRNAが進化的には骨格筋型分子種より線維芽細胞型にの発現はほとんど認められなかったが，13日胚のより近いことを示していたが，骨格筋型と線維芽細

胸筋には115k蛋白質mRNAの発現が認められた。

胞型の類似性が81％であることを考えると，115k

この結果は115k蛋白質が未熟な骨格筋細胞で特蛋白質は線維芽細胞型分子種とも進化的には距

一一28S

一一18S

図2・骨格筋組紛こおける115k蛋白質mRNAの発現48

表1．ニワトリ胚115k蛋白質と骨格筋型および線推芽細胞型かアクチニンとの類似性
P．
血 n

F．
αA n

115 K

75．
7

83．
9

F・
αA n

80．
5

離があることを示唆していた。

Fogarty，K．E．，J．CelLBiol．96783−795

現在，115k蛋白質の特異的な局在と分子構造の関連を解析する目的で115k蛋白質の全一次構造の決定を行なっている。

（1983）

7）Lazarides，E．，J．CellBioL，68202−219（1976）

8）Arimura，C．，Suzuki，T．，Yanagisawa，M．，
参

考

文

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49

9

骨格筋細胞の発達・萎縮とアクチン細胞
骨格調節因子コフイリンの量的変動
＊
＊
＊

祐一

成賢

＊
＊

＊
＊

野

南草

＊
＊

子郎
■

陽 正

とき，あるいは神経支配に異常が生じて活動出来■ ■ ■ 一 ′骨格筋は筋ジストロフィー症のように病変した

昂＝

＊

に

品斧

方＊

め

二二︑

じ

洋利

は

部 岡

阿 長

研究協力者

であるが，そのことを理解していく上でアクチン
細胞骨格の制御因子の研究は重要な一面と考えられる。

ない場合などに顕著に萎縮していく。また，伸長，張力発揮，収縮頻度などが筋の発達要因としては

材料

と方法

たらくことが知られている。このような場合に，筋細胞の培養：マウス骨格筋C2細胞の培養は筋組織内の筋芽細胞の増殖とえ死のバランスの変DMEM培地に10％ウシ胎児血清（FCS）を加えて化や蛋白質合成の量的な変化か起こることが考え増殖させたのち，5％馬血清を含む分化培地で維られるが，さらに収縮装置を構成する蛋白質の質持した。心筋細胞は8日目ニワトリ胚尤、筋から解的な変化（アイソフォーム変換）が起こることが離，グルタミンを含まないMEM培地に5％FCS

既に指摘されている。さらに筋萎縮過程で筋原繊を加えて培養した。

維が減少することから蛋白質の集合度にも変化が電気泳動とイムノプロット：筋組織からSDS溶液起こることが考えられる。最近の本研究者らの研（4％SDS−4％メルカプトエタノールを含む）で究で，発生途上の幼若な筋細胞には性質の異なる抽出した蛋白質をSDS−アクリルアミドゲル電気

数種のアクチン調節蛋白質が存在し，アクチンの泳動（13．5％ゲルを使用）で展開し，それをニト

フィラメントへの集合の制御やダイナミックなア

ロセルロース膜に転写，抗体を用いて蛋白質のバ

クチンの再配置に深く関わることが示され藍こ

ンドを検出した。正常筋と萎縮筋を比較する場合，

れらアクチン集合制御蛋白質は，筋萎縮過程でのサンプル内の筋湿重量が同一となるよう配慮した。

筋原繊維のアクチン細胞骨格の崩壊，再編成にも二次抗体としてHRP標識一抗マウスIgG抗体を関わっている可能性が考えられる。そこで，筋萎

用い，ジアミノベンチジン（DAB）を基質として検縮の顕著な除神経筋とジストロフィー筋をとりあ出し藍げ筋萎縮時のアクチン制御因子（特にコフイリン）

抗休：抗コフイリン抗体（モノクローン抗体，M−の変動と細胞内での作用を検討した。本研究の最23〜，抗ミオシンアルカリ軽鎖抗体（EL−4軋抗

終目標は，ジストロフィンをもつ正常筋細胞と，ADF抗体（ポリクロナル）は既に作成，特異性を

これを欠くジストロフィー筋細胞の間で収縮構造確認したものを用いた。

の安定性にどのように差があるかを解明すること

ノーサーンプロット：筋から抽出した全RNAの一定量をとり，既にクローニングしたコフイリン＊千葉大学理学部生物学科

CDNAをプローブとして行った。

50

cDNAトランスフェクション：1．1kbのコフイリ

ばALD筋）に顕著に存在，それに比して速筋（胸ンcDNAをベクター（pcDL−SRa296）に組み込筋）での存在量は少ない。ALD筋の長軸方向のみリン酸カルシウム法によりマウスC2筋細胞に薄い切片を作成し，免疫組織化学的にコフイリン

導入，3〜5日培養した。コフイリンの発現は蛍の局在を調べたところ，筋原繊維のⅠ一帯部位に光抗体法で確認した。

存在することが認められた。成熟骨格筋でも一定

免疫細胞化学：細胞を4％パラフォルムアルデヒの役割を演じていることがうかがえる。

ドで15分間さらに100％アセトンで5分間固定し骨格筋を除神経すると，顕著な筋萎縮が起こる

た後，MAB−22を用いた間接蛍光抗休法でコフことが知られるが，その際コフイリンの発現が艶ィリンを検出，さらにローダミン標識ファロイジ

著に高まることが明らかになった。図1に示すよ

ン染色してアクチンの局在を観察した。

うに，生後すぐのヒヨコ胸筋を除神経し，その後の成長過程で筋を採取し，SDS溶液により抽出さ

結果

れる蛋白質をSDS−PAGEに展開，抗コフイリン

1）除神経骨格筋におけるアクチン調節タンパク

抗体（MAB−22）を用いてイムノブロット法で解質コフイリンの発現上昇析した。除神経されない対照筋では成長につれコ

正常な発生・成長過程で骨格筋細胞に存在する

フイリンの量が減少するのに対して，除神経筋でコフイリンの量は徐々に減少するものの，成熟筋はコフイリンの量がふ化直後のレベルに保たれるにも明瞭に存在が認められた。ニワトリの親骨格

か，むしろ増加の傾向が見られた。このことは筋筋についてみると，コフイリンは遅筋繊維（例え

凍結切片を間接蛍光抗体法で調べた場合にも観察

CONT
kn

ld

DN

20dlnl 20d瑠m

anti−COf川ntMAB−22）
図1．ニワトリ骨格筋（胸筋）のふ化後の成長に伴うコフィリンの量的変化と除神経の影響
ふ化1日日に胸筋の一方を除神経し，無処理（CONT）および除神経（DN）筋をふ化後1日（1d），20日（20d），1ケ月（1m）に採取，筋抽出物中に存在す
るコフイリンをSDS−PAGE と組み合わせたイムノブロット法により検出した。上段にSDS−PAGEのパターン，下段に抗コフイリン抗体によるイムノブ
ロットを示す。

51

された。

を示す。生化学的な解析によりこのように量的に成熟したニワトリ胸筋を除神経した場合にも，増加したコフイリンは細胞内の可溶性画分に存在，

1〜2ケ月後にはコフイリンの量的な上昇が明瞭

繊維構造に結合していないことが示された。

に認められた。コフイリンの発現変化を知るため

2）筋ジストロフィー症（dy）マウスでのコフイに，除神経2ケ月目の筋および対照筋RNAを抽リンの発現上昇

出し，ニワトリ胚よりクローニングされたコフイ

筋萎縮の鋸井なもう一つのケースとして，dyマ

リンcDNAをプローブとして，ノーザーンプロッ

ウスの筋を解析した。SDS溶液による筋抽出液を，ト法で調べた。図2−Aに示すように，対照筋にSDS．PAGEと組み合わせたイムノブロット法

比して除神経筋で著しいコフイリンmRNAの増加（MAB−22を使用）で調べた。同一湿重量の筋組が認められた。従って，除神経筋ではコフィリン

織を比較するようにサンプルを諷製した。ニワト

遺伝子発現が転写レベルで高められていることがリの場合と同様にマウスでも，正常筋では速筋

明らかである。コフイリンの量的な増加は蛋白質（大腿直筋，前頚骨筋など）よりも遅筋（ヒラメ筋）

レベルでも確認された。図2−Bに正常および除により多くのコフイリンが検出された。筋萎縮の神経筋からの蛋白質抽出液をMAB−22を用いて著しい2ケ月齢のdyマウスの大腿直筋と前頚骨筋行ったイムノブロットにより解析した結果を示す。

では正常筋に比して，明らかに多量のコフィリン

除神経筋内の細胞にはぼ一様にコフィリンの増加が検出された（図3）。このとき正常には速筋としが免疫組織化学法により観察された。このことはての特性を示すこれらの筋に遅筋型ミオシン軽鎖

コフイリンの発現上昇が再生途上の幼若細胞のみの出現も見られた。萎縮過程での筋繊維の性質のでなく，既存の筋繊維において起こっていること

変化あるいは幼若な筋細胞の出現を示唆している。

C

DN

C

DN

CBB MAB−22

図2．親ニワトリ胸筋を除神経したときのコフィリンの発現変化
コフイリンcDNAをプローブとしたノーザーンプロット（左半分）とMAB−22によるイムノブロット（右半分）の結果を示す。ノーザーンプロットの左図は用いたRNAの電気泳動パターン。28S，18SのrRNAのバンドが見られる。
イムノブロットの左図は蛋白質電気泳動のCBB染色パターン。いずれの場合もDNは除神経，Cは対鞘臥＊はコフイリンのバンドを示す。

52

一方，発生初期の幼若筋で存在が知られるアクチ

3）培養筋細胞内のアクチン細胞骨格へのコフィ

ンの脱重合因子（ADF）はこのジストロフィー（dy）

リンの作用

筋では殆ど検出されなかった0従って，dy筋での細胞内でコフイリンの発現量が高まったとき，

コフィリンの増加は筋再生に伴う幼若筋細胞の出

筋細胞内のアクチンフィラメントにどのような影現だけで説明できず，萎縮途中の筋で発現が高ま響をもたらすかを探るために，細胞内のコフイリ

りアクチン細胞骨格の変動に関与していることがンの存在量を人為的に高める試みを行なった。

推測される。

まず，培養筋細胞の細胞膜やジギトニンで壊し

I

2

3

図3・筋ジストロフィー症（dy）マウス骨格筋におけるコフィリンの発現変化
2・5ケ月齢の正常（N）およびdyマウス（dy）のヒラメ筋（1），大腿直筋（2）前頚骨筋（3），心筋（4）のSDS溶液による抽出蛋白質をSI）S−PAGEに展開（上段）し，抗ミオシンアルカリ軽鎖抗体（a），抗コフイリン抗体（b），抗ADF抗体を用いてイムノブロットを行った。Lsl：遅筋（心筋）ミオシン軽鈷；LH，Lr3：速筋ミオシン軽鎖；CF：コフイリン

53

た後，コフィリンを外部から細胞内に浸透させてADFなどのアクチンへの作用がミオシンやトロポ

その効果をみた。この場合，多量のコフイリンをミオシンの存在で妨げられることが知られている必要とするのでクロpン化されたコフイリンcDNAことに一致する。′il・格筋培養細胞を用いた場合にをpETベクターに組み込み大腸菌で発現させたもも同様の結果を得た。しかし，同条件で筋原繊維のを，カラムクロマトグラフィーにより精製してを構成していないアクチンフィラメント（ストレ用いた。このようにして得たコフイリンは試験管

スファイバー）はコフイリンによって崩壊するの内でアクチンに対して十分活性があることを確認が観察された（図4−d，e）。

してある。図4−a，bに心筋細胞をモデルとし次にコフイリンcDNAのトランスフェクション

て行った結果を示す。高い濃度（2．5mg／hl）のによりマウスC2筋細胞内のコフイリンの発現量

コフイリンを細胞内に入れても筋原繊維アクチンを高めた。コフイリンが高発現されていることがはあまり壊れないようにみえる。コフイリンや免疫細胞化学的に確認された細胞は，形態的には

図4．細胞内のアクチン細胞骨格に対するコフィリンの作用
40′fMジギトニンで処理した心筋細胞と繊維芽細胞を，コフイリン（2・5m針山）を含む（a，b，d）または含まない（C，e）生理的塩溶液で1時間処理した後，ファロイジン（a，C，d，e）あるいは抗コフイリン抗体（MAB−22）で染色した。a，b，Cの挿入図は拡大図。

やや偏平化接触阻害されない傾向にあり，ほとなど特徴的な性質が知られるが，萎縮過程でのアんど筋管細胞を形成しなかった。ストレスファイ

クチンフィラメント系の変化に関わるものとしてバー状のアクチンフィラメントはかなり残存した。

興味深い。ジキトニン処理細胞へのコフィリンのこのような細胞をジメチルスルフォキシド（DMSO）

導入実験から筋原繊維アクチンはコフィリンに抵処理すると核内あるいは細胞質内に顕著なアクチ抗性があるが，ストレスファイバー様のアクチン

ン●コフイリンロッドを形成した。

フィラメントはコフィリンの影響を強く受けることがわかった。生きた筋細胞内にcDNAトランス

考察

フェクションによりコフィリンの発現を高めた場

本研究結果より，ジストロフィー筋や除神経筋

合には，ストレスファイバーが存在し続けたことのように萎縮が進行している筋ではアクチン集合から，細胞内でのコフイリンのアクチンへの作用

制御因子の一つコフィリンの発現が顕著に高まるは単純ではないことを示している。イノシトール

ことが明らかになった。しかし，幼君骨格筋ではリン脂質（PIBなど）によるコフィリンの機能のたらく他のアクチン制御因子ADF，やプロフィリ抑制なども関わることが指摘されている。実際にンの萎縮筋での発現上昇はみられなかった。コフ

筋萎縮過程でのアクチンフィラメントの脱集合やイリンはG−アクチン，F−アクチンいずれにも再編成にコフィリンがどのように関わっているか

結合，pH依存的にアクチンの集合制御，DMSO

についてはさらに研究を進める必要がある。

などによるストレスを受けた細胞内での核内移行

図5・CDNAトランスフェクション法によるコフィリンの高発現と筋細胞の形態変化
コフイリンを一時的に高発現しているC2筋細胞の抗コフイリン抗体（上段左，下段）およびローダミン標識ファロイジン（上段右）による染色像

55

文

献

and Takan0−Ohmuro，H．（1990）In1）Obinata T．（1985）ZooI Sci，2：833r847．

Developmental Cardiology・mOrphogenesis2）Obinata，T．and Abe，H．（1991）Inand function（Clark，E．B．and Takao，A．

Frontiersin Muscle Research（Ozawa，E．，
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mistry29，7414−7419．

56

10

MAP2c cDNAの強制導入と標識チュプリンの微量注入による微小管の動態の解析

廣 川 信 隆＊
研究協力者 岡 部 繁 男＊
梅 山 剛 成＊

要

旨

神経細胞はその分化の過程で神経突起内に平行に配列する特徴的な微小管構造を形成するが，選から組み込み安定化することは神経細胞に特徴的であり，MAP2Cの幼弱期神経細胞における重要な役割を示唆すると考えられた。

択的安定化等の微小管dynamicsの変化がこの過程に関与すると考えられる。

マウスMAP2c cDNAのクローニング

今回，幼弱期神経細胞に多く発現される微小管

高分子量MAP2AとMAP2Cはsinglegeneよ関連蛋白2C（MAP2C）の形態形成，微小管dy−

りのalternativesplicingmechanismに由来する

namicsに与える影響について検討した。

と報告されている。

467アミノ酸よりなるmouseMAP2Cの全長

そこで生後0日令のマウスcDNAライブラリー

を含むcDNAをクローニングし，MAP2Cの発現をMAP2Aの部分シークエンスでスクリーニングが細胞骨格構造に与える影響を調べるため線維芽することにより1687basepair（b．p．）よりなる細胞（COS cells）にtransfectionした。tranSfec−

CDNAクローンを単離した（図1，A）。1401

tionされた細胞では間期の微小管構造が変化し，b．p．の完全なopenreadingframeを含み，467

微小管束を形成した。同時にビメンチン線経の再アミノ酸をコードした。既に報告されているMA

構築が見られ微小管束に平行に存在するビメンテ

P2Aのアミノ末端（1−151）とカルポキシル末端

ン線維束が形成された。一方アクチン線経の構造（1513−1828）が保存されており中間部分の1361は変化しなかった。

アミノ酸残基を欠いていた（図1，B）。Splicing

微小管束の形成過程を解析するためMAP2c部位のアミノ末端側は酸性アミノ酸残基が豊富でcDNAを強制導入したCOS細胞にビオチン標識チA−Kinaseへの結合部位を含む。又，カルポキシ

ュプリン分子をmicroinjectionした。外来性チュ

ル末端側は塩基性アミノ酸残基が豊富で微小管へ

プリン分子は既存の微小管束の遠位端より組み込の結合部位とされる18アミノ酸残基よりなる3回

まれ境界明瞭なsegmentsを形成した。

の繰り返し配列と，そのアミノ末端側のプロリン

さらにcaged−fluorescein標識チュプリン分子を残基の豊富な部分（16％）を含む。

microinjectionL，微小管束をphotoactivation
することにより，微小管束内の微小管のturn−OVerが非常に抑制されていることを示した。
微小管束を形成しチュプリン分子をその遠位端形質導入による微小管束の形成
MAP2Cの発現により細胞内の微小管構造の変化をcDNAを強制発現ベクター（pβactCAT9のCATgeneと置換）に組み込み（pβact2C），＊東京大学医学部第一解剖

線維芽細胞（COS cells）にリン酸カルシウム法を

57

用いてtrangientにtransfectionすることにより検太い微小管束が形成され細胞辺縁にのびだすのが討した。

観察された（図3，B）。これらの微小管束の多TranSfectionされた細胞のcrudesupernatant

くはMTOCを起始としない。又，細胞質の微小管

proteinsの抗MAP2抗体によるWestern blot−

束に取り込まれない線維状の微小管は著しく減少

tingによりコントロールの細胞には存在しない70した。抗MAP2抗体像はMAP2Cの局在がこのKdのバンドが染色され報告されているMAP2C

微小管束に一致することを示した。

のSOS−PAGE上の分子量と一致した（図2）。

微小管安定化剤のタクソールによりCOS細胞をTransfectionされた細胞を48hr後0．2％Triton

処理（5／lM，24hr）すると微小管束を形成す

X−100で膜を可溶化した後固定し，抗チュプリン，ることは（図3，D）MAP2Cが微小管の重合を

抗MAP2抗体で二重染色した。

促進し安定化することが微小管束の形成に関与す

COS細胞の問期の微小管は微小管形成中心（Mることを示唆する。

TOC）より放射状にひろがる微純な構造を形成す

しかしタクソールにより安定化された細胞内のるが（図3，A），tranSfectionされた細胞では微小管束はMAP2Cをtransfectionされた細胞にA▼215
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図1

MAP2A

1川O
●川

MAP2C

A：マウスMAP2Cの核酸及びアミノ酸配列box部分は3回の繰り返し配列，縦線はスプライシング部位を示す
B：MAP2AとMAP2Cの一次構造の比較

58

SDS・裡GE

8LOT

壬￣￣￣ 一一

喜室墓

室窒

図2

MAP2c cDNAをtranstectionしたCOS細胞のSDS−PAGE及びWestern−blotting．
抗MAP2抗体で染色される70kdのband（矢印）を示す。

図3

A：COS細胞の抗チュプリン抗体染色像。
B，C：MAP2c cDNAをtranstectionしたCOS細胞。抗チュプ
リン（B），抗MAP2（C）抗体による二重染色像。
D：タクソール処理したCOS細胞の抗チュプリン抗体染色像。

uられるように密に束状化することは稀で，又細抗チュプリン抗体とファロイジンによる二重染

胞質内の線維状の微小管がほとんど完全に消失す

色像よりアクチン線経の走行に対する影響は見らることはなかった。従って微小管束形成にMAPれず，微小管束の形成された細胞にアクチン線経2Cは安定化以外に何らかの積極的な作用を有すのストレスファイバーが観察された（図4，C，D）。

ると考えられた。即ちMAP2C分子相互，又は他の蛋白を介在するcross【linkの存在，あるいはチェプリン分子の酸性カルポキシル末端とMAP2C

微小管束への外来性チュプリン分子の組み込み
部位の塩基性微小管結合部位との相互作用による静電外来性チュプリン分子の微小77束への組み込み

気的中和による効果等の可能性が考えられるがさ部位を調べるためpβact2Cと膜抗偵cDNAをC。

らに詳細な検討を要する。

LtranSfectionL，48hr後抗膜蛋白抗体で染色されMAP2Cをtransfectionした細胞を固定後，抗チュプリン，抗ビメンチン抗体で二重染色するこる細胞にビオテン標識チュプリンをmicroinjection
した。

とにより，ビメンテン線経の再構築が起こり微小5分，15分及び2時間後，膜を可溶化した後抗管束と平行に存在するビメンチン線維束が形成さ

チュプリン，抗ビオチン抗体で二重染色した。

れることを示した（図4，A，B）。神経突起内で5分後固定した細胞では，抗ビオチン抗体像よMAP2が微小管とニューロフィラメントを架橋りビオチンチュプリンは主に既存の微小管の遠位することを考えると興味深い。

端に組み込まれた（図5，A，B，矢印）。一方近図4

MAP2c cDNAをtranstectionしたCOS細胞。
A，B：抗チュプリン（A），抗ビメンチン（B）抗体による二重染色像。
C，D：抗チュプリン抗体（C），ファロイジン（D）による二重染色像。

図5

MAP2Cと膜抗原cDNAをco−tranSteCtionした細胞にビオチン標
識チュプリンをmicroinjectionした後，5分（A，B），15分（C，D），
および2時間で固定。
抗チュプリン（A，C，E）及び抗ビオチン（B，D．F）抗体による二重染色像。
矢印は微小管束の遠位端からの外来性チュプリンの組み込みを示す。

位側の染色は弱い。この結果はチュプリン分子の即ちdynamicinstabilityが抑制されていることを組み込みに対するavailableな末端が主に遠位端に示唆Lin vitroにおける報告と一致する。

存在することを示している。微小管は主にそのプ

2時間後，抗チュプリン，抗ビオテン抗体像はラス端で伸長するので，微小管束内の微小管は軸一致した（図5，E，F）。以下のphotoLaCtiva−

索内微小管と同様にプラス端が主に細胞辺縁側にtion法を用いた実験により，微小管束内の微小管存在する可能性が考えられた。しかし微小管のマのturn−0Verは非常に抑制されており，2時間でイナス端もinvitroでは遅いながら伸長を示すの全体がturn−OVerされることは考えられない。又でより正確な微小管の極性の決定が必要と考えら

蛍光顕微鏡で微小管束内の個々の微小管を観察すれた。

ることはできない。従って染色像の一致は微小管

又，細胞質内にビオチンチュプリンによるselト

束へのビオチンチュプリンの広範な組み込みの進

nucleationと考えられる多数の微小管が観察され行たが，MAP2Cの発現により微小管重合に対するわしていると考えられた。

あるいは微小管束の一部分のturnhOVerを表

Criticalconcentrationが細胞内で低下し，相対的にチュプリン分子が枯渇していることを反映していると考えられた。

微小管束内の微小管のturn−0Verpβact2Cと膜抗原cDNAをco−tranSfection

15分後固定した細胞では，5分後固定した細胞L，48hr後，抗膜抗原抗体により染色される細胞と同様ビオテンチュプリンは境界明瞭なsegmentsにcaged−fluorescein標識チュプリンをmicroAとして微小管束の遠位端より組み込まれた（図5，
C，D，矢印）。

injectionした。ラベルを微小管束に組み込ませる

境界明瞭なsegmentsの形成は，微小管束内の個々の微小管が近位側の境界を越えて短縮しないことを示しており，確率的な微小管の伸長と短縮，

図6

ため2hrインキュベートした後，スリット状の365nmのmicrobeamを0．25〜0．5sec微小管束に照射Lbar状の蛍光を励起した。Photoactiva−
tionされた部位の遊離チュプリン分子は数秒で拡

コントロール（A），及びMAP2C，膜抗原cDNAをtranstecti。nされた細胞（B）をphotoactivationする直前（pre）及びactivati。n後の蛍光の時間経過（分）。

62

散するため蛍光の消退は微小管のturn−OVerを

チュプリン分子を交換することができず，turn−示している。

0Verの抑制が起きる可能性が考えられた。

transfectionされていないCOS細胞では蛍光は神経特異的なMAPsを多く発現しているPC12

速やかに消退し20分後蛍光はほとんど見られず活細胞あるいは後根神経節細胞では微小管のturn−

発なturn−OVerを示した（図6，A）。

0Verが低下しており，ヌPC12細胞では微小管のMAP2Cを発現している細胞ではphoto−aCti−

遠位端より遊離チュプリン分子を組み込むことがvation後90分経過しても蛍光の消退はほとんど見報告されており，今回MAP2Cを発現することにられず非常にturn−OVerは抑制されていた（図6，より形成された微小管束のダイナミックスはこれB）。photoactivationの直後鮮明であった蛍光のに頬似すると考えられた。

barの境界は次第にノコギリの歯状に変化したが，その全体の位置は基本的には不変であった。
この結果とピオチンチュプリンのmicroinjection

従って幼弱な神経突起を伸長している神経細胞においてMAP2Cは微小管のturn−OVerを抑制し微小管束を形成し，新たに組み込んだチュプリンによる結果を併せると，微小管束内の微小管は分子を安定化することにより形態形成，機能に重dynamicinstabilityの抑制のため短縮，脱垂合し要な役割を果たしていることが示唆された。

63

11筋巨大蛋白質の発生とその局在
小宮山 政 敏＊
研究協力者

は

じ

め

丸

山

工

に

作＊＊

嶋

田

裕＊

供による）である。

本研究は，筋特有の構造形成に対する筋巨大蛋

抗体を提供して下さったCornell大学D．A．

白質の役割を解明することを目的とし，本年はコ

Fischman教授（MF20），ならびに国立精神神経

ネクチン（分子量約3000kD），ネプリン（分子量センター小沢瑛二郎部長（PO4d）に感謝します。

500kD〜800kD）およびジストロフィン（分子量427kD）の発生と微細構造レベルでの局在について追求した結果を報告する。

結果

と考察

1．コネクチンの発生
コネクチンの発生過程について培養心筋細胞を

材料

と方法

用いて蛍光抗体法で調べたところ，アクチンおよ

コネクテンとネプリンの発生については，ニワ

びα−アクチニンを含むトZ−Ⅰ様構造がまず形成

トリ胚の心筋および胸筋の1次培養細胞を用いて，され，後にコネクチンおよびミオシンがこれと関各種の抗休とローダミン標識ファロイジン（M。−

係をもつようになることが観察された（図1）。コ

lecular Probes，OR）のいろいろな組み合せによ

ネクチンは初めミオシンと一致した斑状に現れ，る二重染を行い，蛍光顕微鏡で観察した。また免Aバンドの出現と同時に周期的な配列（ダブレッ疫竃顕法は，金コロイド標識抗体を用いて包埋前ト）をもつようになった（図lc，d）。このように，染色により行った。用いた抗体はポリクローナル

コネクチンの発生はミオシンの発生と密接にかか

抗コネクチン1），抗ネプリン2㌦ およびモノクロ

わり合っていることが予想された7・8）。

ーナル抗コネクチン（4C931，SM14）），抗ミオシ

コネクチンとミオシンおよびα−アクチニンとン（MF20）5），抗a−アクチニン（BioMakor，の関係を，二重染色による免疫電顕法で調べたとRehovot）である。

ころ，大きなポリゾームが抗コネクチンおよび抗ジストロフィンの局在については，成熟雌ラッミオシンによって同時に標識されるのが観察され

トの［足の］長指伸筋（EDL）およびニワトリ胚心た（図2a；矢尻）。これは蛍光抗体法でみられた筋の培養細胞を用い，凍結超薄切片による免疫電斑状の構造7・8）に相当すると思われた。しかし，顕法および免疫染色後の急速凍結ディープエッチ

これらのポリゾームはα−アクチニン抗体では標レプリカ法により，微細構造レベルで検索した。

識されなかった。このように，コネクチンとミオ用いた抗ジストロフィン抗休はPO4d6）と4−4C5シンは合成されるとすぐに関係をもつようになる（富士レビオ株式会社および味の素株式会社の提と考えられた。
横紋をもたないⅠ−Z−Ⅰの部分をみると，コネク＊千葉大学医学部解剖学第1講座＊＊千葉大学理学部生物学科

チンの標識はミオシンフィラメントのあるところに限られていた（図2b；矢尻）。dense bodyの周64

図1培養1日（a，b）および2日（C，d）の心筋細胞。抗コネクチン（a，C）およびα−アクチニン（b），または抗ミオシン（d）の二重染色。スケール＝10／上mo

辺にはα一アクチニン抗体による標識がみられた

プリンとα一アクチニンに周期性が現れ，ネプリ

ので（図2b；矢印），卜Z−Ⅰへの抗体の浸透性にンのバンドはシングレットとしてZ線と同じ位置は問題がないと思われた。したがって，横紋をもにみられた（図4a，b）。培養4日目には，アクチ

たないトZlにおいても，コネクテンはα−アクンの周期性が現れた。この段階ではネプリンのバ

チニンよりもミオシンと密接に関係していると考

ンドは未だシングレットであったが，培養6日目

えられた。

にはダブレットとなり，親の筋におけるものと同以上から，コネクチンほ発生の初期よりミオシ様の像を呈するようになった（図4C，d）。

ンと密接に関係し，先に形成されたⅠ−Z−Ⅰにミオ

以上のことから，筋蛋白質の集積の順序として

シンと同時に組み込まれると考えられ，その時には，まずアクチンとα−アクチニンを含む線維状

コネクチンフィラメントはミオシンフィラメント

のⅠ−Z−Ⅰが形成され，次にネプリンがこれに組みをZ線に結び付けるように働くものと思われた。

込まれ，最後にコネクチンとミオシンが組み込ま

2．ネプリンの発生れると考えられた。周期性については，先ずZ線

ネプリンの発生は骨格筋細胞で追求した。培養とネプリンのシングレットが現れ，やや遅れてコ

1〜2日の筋芽細胞や若い筋管では，ファロイジ

ネクテンとミオシンのバンドが出現し，その後アンとα−アクチニンが陽性であってもネプリンはクチンの縞が明瞭になり，最後にネプリンバンド

陰性の線維（図3a，b；黒矢），またネプリンが陽がダプレットになることが明らかになった。この性であってもミオシンとコネクテンは陰性というように，ネプリンの発生は他の蛋白質に比べて遅線維（図3C，d；自失）がみられた。また，ネプ

いので，ネプリンは筋フィラメントの正しい配列

リンの蛍光はα一一アクチニンの斑と同じ位置にみの形成には直接に関係しないことが考えられた。

られた（図3a，b；矢尻）。培養3日になると，ネ

65

図2

培養1日（a）および3日（b）の心筋細胞0抗コネクチン（5nmgold）（a，b）および抗ミオシン（10nmgold）（a），または抗a一アクチニン（10nmgold）（b）の二重染色。スケール＝0．2／hn。

翠雷■こ㌘曙誓言ニ二 二￣雷、．票「！−ミ海：禁二・．至、．．滑二誓竺竺竺慧

虚二二去塾−∴一一
車∴主筆二男芸二、．こき諜表芸子宝
図3

培養2日の骨格筋細胞。抗ネプリン（a，C）と抗α−アクチニン（b），または抗ミオシン（d）との二重染色。スケール＝10〟m。

66

3．ジストロフィンの局在

et al（1989）J．〟α∫CJg βg∫．CgJ 加わわ．

ジストロフィンの局在は2つの電頚的手法により観察した。

10：350−359．

3）Matsuno A，Takan0−Ohmuro H，Itoh

ラットのEDLを凍結超薄切片法にて観察すると，ジストロフィン抗体による標識は主として細胞膜の付近にみられた（図5；矢尻）。また同筋のクリY，et al（1989）乃∫∫〟g Cg／721：495−
505．

4）Itoh Y，Suzuki T，Kimura S，et al

オスタット切片にジストロフィン抗体染色を施し（1988）J．βgoc加刑．（To烏プ0）104：504−

た後，凍結ディープエッチレプリカ法を用いると，

508．

ジストロフィンの標識はおもに細胞膜内面にみら

5）Masaki T，Bader DM，Reinach FC，et

れた（図6；矢尻）。さらにニワトリ胚心筋の培養

al（1982）In Muscle Development：細胞をフィジカルラブチャー法9）によって内部をMolecular and Cellular Control（Pearson

露出し，ジストロフィン抗体で標識して凍結ディ

ML＆Epstein HF eds．），Cold Spring

ープエッチし，レプリカを作製すると，嘆性小器

Harbor Laboratory，pp．405−417．

官や細胞膜に標識がみられた（図7；矢尻）。
今後これらについてさらに追求し，ジストロフ

6）Yoshida M＆Ozawa E（1990）′βgOCゐgm．108：748−752．

ィンの立体的な局在様式や細胞骨格との関連，発7）嶋田 裕，小宮山政敏，豊田直二，丸山工作生に伴う局在の変化，筋収縮による極性の変化な（1990）厚生省神経疾患研究委託費野々村班

どについて明らかにしたい。

平成元年度報告書．59−64．
8）Komiyama M，Maruyama K，＆

文

献1）Maruyama K，Sawada H，Kimura S，et al（1984）J CgJ βわ／．99：1391−

Shimada Y（1990）J MuscleRes．Cell〃0わ．11：419▼428．

9）Isobe Y＆Shimada Y（1986）Cell
Tわ∫αg 斤β∫．244：47−56．

1397．

2）Maruyama K，Matsuno A，Higuchi H，∵∵＼葦華群画∴∴∴…亮恵㌫
二千十二二∴三＿・二∴十十∵㍉∴ ‥′′■ ∴￣＿．F．．．∴

哀二三聖二
図4

培養3日（a，b）および6日（C，d）の骨格筋細胞。抗ネプリン（a，C）と抗αrアクチニン（b），または抗コネクチン（SMl）（d）との二重染色。スケール＝10FLmo

67

図5

ラットのEDLの凍結超薄切片免疫電顕像。抗ジストロフィン（PO4d）染色（5nm gold）。スケール＝0．5／fm。

図6

ラットEDLのクリオスタット切片の凍結ディープエッチレプリカ像。抗ジスト
ロフィン（4−4C5）染色（10nm gold）。スケール＝0．2／∠m。

図7

培養心筋細胞のフィジカルラブチャー凍結ディープエッチレプリカ像。抗ジスト
ロフィン（4−4C5）染色（10nm gold）。スケpル＝0・2／上mo

68

12

AMPA型グルタミン酸受容体チャンネルのCa2＋透過調節機構

品 昌 美＊はじ

めに

相同性は約40％である。

グルタミン酸受容体チャンネルは高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質受容基 本 構 造体であり，シナプスでの神経情報伝達に中心的役

一次構造の親水性／疎水性右解析することによ割を担っているとともに，記憶と学習の基礎となって，グルタミン酸受容体チャンネルのサブユニ

るシナプス可塑性の発現および脳虚血やてんかんットはアミノ末端にシグナルペプチドと推定され重積状態などの病態で発生する神経細胞壊死などる疎水性配列を，またカルポキシル末端側に4箇に深く関わっていることが示唆されている。薬理

所の疎水性領域（Ml−M4）を有していること

学的および生理学的研究からグルタミン酸受容体が兄い出される（図1）。したがって，グルタミ

チャンネルに多様性のあることが指摘され，少なン酸受容体チャンネルはアミノ末端側が外側すな

くともNMDA型，AMPA（古くはキスカル酸）型，

わちシナプス間隙に位置し，カルポキシル末端側

カイニン酸型に分類して考えるのが一般的であっの4箇所の疎水性領域で膜を貫通しているものとた。AMPA型受容休はNa＋，K＋を透過し，通常の考えられる。M2領域の近傍には負に荷電したア

興奮性シナプス伝達を担っているのに対し，NM

ミノ酸残基が存在しており，アセチルコリン受容

DA型受容体はCa2＋に対して高い透過性を有し，体のチャンネル部位とよく対応している。したがシナプス可塑性や種々の病態時における神経細胞って，グルタミン酸受容体チャンネルは基本構造

死に関与していると考えられている。

においてニコチン性アセチルコリン受容体，GA
BAA受容体，グリシン受容体などの神経伝達物質

分子的多様性サブユニットcDNAの単離と構造決定によって依存性イオンチャンネルと類似していることが明らかとなった。

グルタミン酸受容体チャンネノレには従来想定されしかし，一一次構造そのものについては有意な相ていた以上に多くの分子種が存在することが明ら

同性は兄い出されず，またグルタミン酸受容体はかになってきた。これらのサブユニットは一次構

他の神経伝達物質依存性イオンチャンネルに比し造の類似性からいくつかのサブファミリー（α，約二倍の大きさを有している。その違いは大部分

β，れ民 亡，ぐ）に分頬することができる。同一サ

アミノ末端側すなわち膜の外側のシナプス間隙にブファミリーに属するサブユニット（例えばα1，位置すると想定している部分にある。Ml領域のα2など）はお互いに約70％のアミノ酸配列の相

アミノ末端側にはニワトリやカエルのカイニン酸

同性を有しているが，異なるサブファミリー間の結合蛋白や大腸菌のグルタミン結合蛋白と相同性を有する部位が兄い出され，グルタミン酸などの＊新潟大学脳研究所

アゴニストの結合部位を形成していると推定され

69

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マトト

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三崎

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70

る。細胞質側に位置すると想定されるM3とM4と組み合わせて発現させた場合に観察される電流との間の領域には，Ca2しカルモデュリン依存性プ

応答は，カイニン酸に対して最も大きくグルタミ

ロテインキナーゼⅡおよびプロテインキナーゼCン酸やキスカル酸に対しては小さい。しかしながによってリン酸化され得る部位が兄い出される。

ら，濃度一応答曲線から，親和性はキスカル酸に

長期増強の誘導と維持に蛋白質リン酸化酵素が関

対して最も高く次いでグルタミン酸である。カイ

与していることが示唆されており，本受容体がリニン酸に対する親和性は最も低い（図2）。した

ン酸化による調節を受けている可能性がある。

がって，αサブファミリーはAMPA型受容体のサ
ブユニットであると考えられる。

機能的性質

β2サブユニットも単独で機能的グルタミン酸

クローン化したサブユニットcDNAよりinvitro

受容体を形成し，グルタミン酸，カイニン酸，キでmRNAを合成し，アフリカツメガエル卵母細胞

スカル酸に応答を示した。γ2サブユニット単独で翻訳させることによりグルタミン酸受容体を発では応答が認められないが，β2サブユニットと現させ，その機能を解析した。α1（GluRl）サブ組み合わせて発現させると電流応答が数倍増加しユニットは単独で機能的グルタミン酸依存性イオた。これらの受容休はカイニン酸に高い親和性をンチャンネルを形成する。α1サブユニットより成示したことから，β2サブユニットとγ2サブユ

る受容体はグルタミン酸のみならずキスカル酸に

ニットはカイニン酸型受容体を構成していると考もカイニン酸にも応答を示した。α2（GluR2）

えられる。

サブユニット単独ではカイニン酸に微弱な応答を

α1サブユニット単独の濃度一応答曲線とα2示すのみであったが，α1サブユニットと組み合わサブユニットと組み合わせて発現させた場合の曲せて発現させるとα1単独の場合より大きな電流応線にはHill係数に大きな違いが見られる。Q，1サ答が観察された。

ブユニットより成る受容体の種々のアゴニストに

α1サブユニットを単独あるいはα2サブユニット

対するHill係数はほぼ1に近いのに対して二つの0
8

Q u is q u a la te
A M PA

6

G Iu ta m a te

4

むSuOds聖一望○膏声正▲■K a in a te

2

■

10●8

10−7

10−6

10−5

10−4

Agonistconcentration（M）
図2

7ゴニストに対するα1／α2グルタミン酸受容体チャンネルの濃度一
応答曲線。

10−3

71

サブユニットを組み合わせた場合の係数は1．5−酸受容休チャンネルはCa2＋透過性を有し，その電2．4である。この結果は，α1とα2との間に正の流応答と膜電位との関係には強い整流作用が認め

協同性があることを明確に示している。複数のグられる。ところが，α1サブユニットとα2サブルタミン酸受容体を組み合わせて発現させると電ユニットとの組み合わせによって形成される受容流応答の大きさが増すことも考え合わせると，グ体チャンネルはCa2＋に対してほとんど透過性を示

ルタミン酸受容休チャンネルは他の神経伝達物質さず，その電流応答と膜電位との関係はほぼ直線

依存性イオンチャンネルと同様，複数の異なるサ的であった（図3）。α1／α2受容体の性質は実

ブユニットより構成されているものと思われる。

際に神経細胞に兄い出されるAMPA型受容体の性質によく合致している。したがって，α2サブユニ

Ca2＋透過性決定部位

ットはAMPA型受容体のチャンネルの性質を決定

α1サブユニットにより形成されるグルタミン

する上で非常に重要であることが明らかとなった。

α1
NomalRinger

Ca2＋TRinger

Na＋／K十一freeRinger−

叫一一／ノ｛一一一一、−■▲一一＿￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣￣

￣￣∵＼

α1／α2
NomalRinger

図3

α1グルタミン酸受容体チャンネルおよびα1／α2グルタミン酸受容体チャンネルのカルシウムイオン透過性。

72

さらにグルタミン酸受容体サブユニットの一次構

Sakmann（1991）．Ringsofanionicamino

造を比較すると，α2サブユニットのM2領域にacids as structural determinants ofion selecti−

は他のサブユニットと異なり正電荷を有するアルVityin theacetylcholine receptorchannel．Proc．

ギニンが存在することを兄い出した。このアミノ

R．Soc．Lond．B244，69−79．

酸残基をグルタミンに置換したα2サブユニット

K．Imoto，T．Konno，J．Nakai，F．Wang，M．

で構成される受容体はCa2十に高い透過性を示した

MishinaandS．Numa（1991）．Aringofun−（図4）。したがって，このアルギニン残基がA

Chargedpolaraminoacidsasacomponentof

MPA型グルタミン酸受容休チャンネルのCa2＋透過

Channelconstrictionin the nicotinicacetylch0−性および膜電位依存性を決定していることが明ら

1ine receptor．FEBSLett．289，193−200．

かとなった。

M．Mishina，K．Sakimura，H．Mori，E．Kushiya，
M．Harabayashi，S．Uchino andK．Nagahari

文

献（1991）．A singleaminoacid residue deter−

K・Sakimura，H．Bujo，E．Kushiya，K．Araki，M．

minestheCa2＋permeabilityofAMPA−Select−Yamazaki，M．Yamazaki，H．Meguro，A．War揖hi−

iveglutamatereceptor channels．Biochem．

na，S．Numa，and M．Mishina（1990）．Functional

Biophys．Res．Commun．180，813−821．
M．Mishina，K．Sakimura，E．Kushiya，K．Araki，

expressionfrom clonedcDNAsofglutamate
receptorspeciesresponsivetokainateandquis−

M．Yamazaki，M．Yarrnzaki，and H．Meguro

qualate．FEBS Lett．272，73−8O．

（1991）．Structureandfunctionofacetylch0−

T・Konno，C・Busch，E．VonKitzing，K．Imoto，

1ineandglutamatereceptors，inttNeurotrans一

F．Wang，J．Nakai，M．Mishina，S．Numa，andB．

mitterregulationofGenetranscription

α1／α2

α1／α2−R586Q

αLK445E／α2

αトK445E／α2−R586Q

N＝N＿∴一一二一一一一・・．．＿

〔

I
Na

I

，Ca2

Rectifying
図4

Na十，対十Linear▼
Na＋，Ca2十Rectifying

α2サブユニットのM2領域の正電荷を有するアルギニン残基をグルタミンに置換したα2サブユニットで構成される受容体チャンネルのカ
ルシウムイオン透過性。

Fidia

73

ResearchFoundationSymposium7，133−142．
S．Kawamoto，H．Onishi，S．Hattori，Y．Miyagl，

M．Mishina，K．Sakimura，H．Mori，K．Araki，
E．Kushiya，M．Yamazaki，M．Yamazaki，H．

Y．Amaya，M．Mishina and K．Okuda（1991）．

Meguroand T．Morita．Structureandfuction

Functional expression of the alsubunit of

Ofthe AMPA−Selectiveglutamatereceptor

the ANPA−Selectiveglutamate receptor

channel．ProceedingsofthelstBiennial

channel，uSlnga BaculoviruS SyStem．Biochem．

International Conference on Amino Acid

Biophys．Res．Commun．181，756−763．

Research．，in press．

75

Ⅲ

Caとタンパク分解

13．骨格筋小胞体Ca2＋放出チャンネルのカルパインによる分解と機能変化77

14．カルシウム依存性プロテアーゼの活性化機構

83

15．ライソゾーム系による筋の崩壊

88

77

13

骨格筋小胞体Ca2＋放出チャンネルのカルパインによる分解と機能変化

飯 野 正 光＊研究協力者 大 室 弘 美＊ 川 名 陽 子＊

ま

と

め

骨格筋小胞休は細胞内Ca2＋濃度の制御に最も重筋小胞体のCa2＋放出チャンネルはカルパイン処

要な働きをしており，Ca2十を取り込むCaMg−

理によって，NH2末端側から分子量約14万の部分

ATPaseとCa2＋放出チャンネルを備えている。こで分解されて，分子量約43万のCOOH末端側のフのうちCa2＋放出チャンネルはライアノジン受容体とラグメントに分解された。このような分解によっして単離精製され一次構造も明らかにされている（2とても，CICR機構のCa2＋依存性，アデニンヌクレ

またこれはCa2＋によるCa2＋放出（CICR）機構としオチドによる促進効果等は維持されたが，最大Ca2＋て機能すると共に，生理的な興奮収縮連関の際の放出速度が約2倍に増大した。この結果より，Ca2＋

Ca2＋放出を起こすチャンネルであると考えられて放出チャンネル分子内の機能局在が明らかになっいる（3，4三ところで，筋小胞体の蛋白のうちCa2＋

た。このようなカルパインによるCa2＋放出チャン

放出チャンネルが特異的にカルパインによって分ネルの分解は，筋ジストロフィーにおけるCa2＋

解され，チャンネル活性が増大すると報告されて動態異常に対して増悪効果を現わす可能性が考えいる（5）。このことは，結果として細胞内Ca2＋濃度られる。

増加に傾き，カルパインの活性化をさらに促進すると予想され，筋ジストロフィーの病態を考える

緒言

上で非常に重要であると考えられる。そこで本研

筋ジストロフィーの骨格筋細胞では細胞内Ca2＋

究では，スキンドファイバーを用い生理的な構造

代謝異常が存在し，このため筋崩壊が引き起こさを保ったままの筋小胞体でも，カルパインにようれるとする説が提唱されており，この機構に関与てCa2＋放出チャンネルが分解されるかどうか，まする酵素として，Ca2＋依存性の蛋白分解酵素であた分解されるなら機能にどのような変化が生じる

るカルパインが候補に上げられている。カルパイ

かについて解析した。

ンは骨格筋細胞内に存在し，燐脂質が存在すると〃M程度のCa2＋によって活性化されることが示さ

方法

れている（1）。従って，筋ジストロフィーにおけるC。ヲ・

スキンドファイバー ウサギ腸腰筋から幅約10

代謝異常で細胞内Ca2＋濃度が上昇した場合，カル

mm長さ約50mmの筋束を切り出し，短縮するのパインが作用して筋蛋白質の分解を引き起こし，を防ぎながら弛緩液に移した。これから幅約2m

筋崩壊につながることが考えられるが，詳細につmの細い筋束を取り出し，50〟g／hlのサポニン

いては明らかでない。

を含む弛緩液中で処理してスキンドファイバーとした。

＊東京大学医学部薬理学第2講座

カルパイン処理 サポニン処理した筋束をさら78に細く分離して，2本の筋線経からなる長さ2シダーゼ標識二次抗体を用いて検出した。

mmの線維束を取り出し，ステンレス線に両端をCa2＋放出機構の解析 カルパイン処理後あるい絹糸で縛って固定した。これを一旦（Ca2＋ATP）

は未処理の標本をステンレス線に結び付けたまま除去液（10mM EGTA，100mM KMs，20mM

内径400／1mのガラスキュベットに挿入固定した。

PIPES，pH7．0）に移し標本内のATPを洗い去

これをポンプにつないで溶液交換が行えるようにった。その後100iLg／mlのm−カJLdヾインGigma）

した。キュベットは落射蛍光顕微鏡のステージ上を含む高Ca2十液（2mMCa，100mMKMs，20mMに固定し，345mmと365nmの紫外光で交互に励

PIPES，pH7．0）に移して，撹拝しながら酵素処理を行った。この後（Ca2＋ATP）除去液に戻してカ起し，蛍光強度を光電子倍増管で測定しCa2＋濃度

ルパインを洗い去った後，筋小胞体機能の測定を実験のプロトコールを図1に模式的に示す。

行った。

1）Ca2＋取り込み。カルパイン処理後は収縮制御を測定しだ6）。

これと平行して5本から10本の筋緑経を含む長蛋白系が分解されて，MgATP中で不可逆的収縮

さ約20mmの筋束を5本用意し，全く同様の酵素が起きるので，ATP非存在下にCICRチャンネル処理を行った後，後述するゲル電気泳動解析を行を介して受動的なCa2＋を取り込みを行った。このった。予備実験の結果，カノレヾインを30分以上処理ためCa2＋濃度を1mMに上げ，CICR機構を活性化

するとはっきりした分解が起こることが分かったするためAMPを10mM加えた溶液中に1分おいた。

ので，以後の実験では室温で60分以上の処理条件

この後AMPとCa2＋を除去（ウオッシュ）した。

を用いた。

2）テスト処理。CICR機構を活性化するため10ゲル電気泳動及びイムノブロット スキンドフ

mMEGTAで緩衝したCa2＋溶液を一定時間処理し，

ァイバーから2％CHAPS溶液中でCICRチャンネ

その後ただちにCICR機構を停止させるため，10m

ル（ライアノジン受容体）を抽出し，2−15％のMMgZ十と10mMプロカインを含む液でCa2＋を洗アクリルアミドグラディエントゲルを用いたSDS

い去った。

電気泳動（Laemmli）を行った。泳動終了後，常3）アッセィ。EGTA濃度を下げ，40FLMのfura法に従ってゲル上の蛋白質をニトロセルロース膜−2を含む液に移してから50mMカフェインを投与に転写し，CICRチャンネルのCOOH末端に対するして筋小胞体内のCa2十を完全に放出させ，その時抗体と反応させた。抗原抗体反応産物はベルオキのCa2＋放出量をfura−2の蛍光強度変化として測定した。
テスト処理の時間とともに筋小胞体に残存してアッセイ時に測定されるCa2＋量が減少し，その時受動的Ca2◆
取り込み

間経過は単一指数関数で近似できるので，Ca2＋放出速度は指数関数の速度定数を用いて表した。

ウオッシュ

結

果

図2にカルパイン処理によって分解された骨格テスト

筋スキンドファイバーのイムノブロットの結果を
アッセイ

≒ニ

示す。見かけの分子量約45万のバンドがカルパイン処理後に約35万に分解されている。用いた抗体
はCOOH末端を認識するものであることから，こ

図1

CICR機構解析法の模式図の結果はカルパイン処理によってNH2末端から見79

図2 カルパイン処理によるライアノジン受容休分解産物のイムノブロット法による解析0両端のレーンは対照のライアノジン受容体（Rya．R．）
で，真ん中の2つのレーンはカルパイン処理をそれぞれ60分あるいは90分行った分解産物。

︵u盲＼︶∝0︼0−○○lq∝
6．5

6．0

5．5

PCa
図3

カルパイン処理前後のCICR速度。Mg2＋およびアデニンヌクレオチ
ド非存在化。

80

かけの分子量にして約10万の部分が切断されたことを示す。また分解産物の移動皮はジストロフィ

考察イムノブロットの結果から，ライアノジン受容体はカルパイン処理によりジストロフィンと同様

ンとほとんど同じであった。
酵素処理時間を60分以上に延長したり，酵素濃な分子量のCOOH末端を含むペプチドに分解され度を3倍にしたり，処理温度を370Cにするなどのることが明らかになった。CDNAクローニングか方法を用いてもこれより小さいフラグメントに分ら示された分子量はライアノジン受容体57万（2），ジ

解することができなかった。

ストロフィン43万（7）であるので，分子量にして約

カルパイン未処理及び処理後のスキンドファイ

14万のペプチドがNH2末端から切り落とされたこ

バーを用いてCICR速度を測定した結果を図3に示とになる。この切断部分よりNH2末端側をN−フした。低Ca2＋濃度ではCICR速度は著明な影響をラグメント，COOH末端側をC−フラグメントと受けていない。しかしpCa5．5では，Ca2＋放出速呼ぶことにする（図5）。
このような切断が起こっても，CICR機構のCa2＋度が2倍近く増加している。
このようなCICR機構の促進作用はアデニンヌク

感受性は失われなかったが，最大Ca2＋放出速度がレオチドで見られるものと全く同じである。そこ

約2倍に元進した。これはアデニンヌクレオチド

で，アデニンヌクレオチド存在下のCICR機構がカに見られるCICR促進効果と非常に良く似ている。

ルパイン処理によってどのような影響を受けるか

しかし，カルパイン処理後もAMPPCPの促進効果を調べた。図4に示すように，ATPアナログのが見られたので，アデニンヌクレオチド結合部位

AMPPCP存在下でも，低Ca2＋（pCa6）でのCICR

がN−フラグメントに存在するとは考えにくい。

にはカルパイン処理は影響を与えず，pCa5．5の

このような結果から，C−フラグメントにCa2＋
チャンネル，Ca2＋結合部位及びアデニンヌクレオ

CICR速度を約2倍程増大させた。

チド結合部位が存在すると考えられる。これに対して，N−フラグメントはCa2＋チャンネルのCa2＋︵u一∈︑︶∝0︻0102の∝PCa6．0

図4

PCa5．5カルパイン処理前後のCICR速度。1．5mMMg2＋，2mM
AMPPCP存在下。

81

lll

l

N−フラグメント
直列抵抗

N−フラグメント

lV

vl′I

アミノ酸散

チャン坤噌lC−フラグメント
Caチャンネル
Ca感受性
ATP感受性

C・フラグメント◎

図5 上：ライアノジン受容体とカルパインによる分解産物を示す模式図。
下：Ca2＋放出チャンネルの機能を示す等価回路oca2＋放出を電流で表すと・C−フラグメントはCa2＋およびアデニンヌクレオチド依存性の可変抵抗で・N−フラグメントはそれに対する直列抵抗と見なすことができる。

透過性を抑制するように作用すると考えられる。

し，構造をもった状態では，これ以上に分解され等価回路で示すと図5の様になる。

ない可能性もある。

ブタの悪性高熱症では，CICR機構がちょうどカ

このようにCa2＋放出チャンネルは収縮系の制御

ルパイン処理によるものと同様に促進しており（8），蛋白などに比べて，カルパインによる分解にはか615番目のアミノ酸であるアレルギニンがシステ

なり耐性のある蛋白であるようである。しかし，インに変異していることがその原因であると考えカルパインが活性化を受けるのは膜燐脂質が存在られている（9）0この変異部位がN−フラグメントする細胞膜直下であり，まさにCICRチャンネルがの中央部にあることは興味深い。

存在する部位なので，酵素による分解を受けない

Jonesらのグループは，分離筋小胞体標本をカとは断定できない。もし筋ジストロフィーの病態

ルパイン処理して，我々が得たと同様の見かけのでCa2＋放出チャンネルがカルパインによる切断を

分子量35万のペプチドを得ている（5）。但しそれが受けると，Ca2十放出が起こりやすくなり，さらにNH2末端側か，COOH末端側かは明らかにされてカルパインの活性が高まって自己崩壊機序が進展いなかったが，我々の研究によってCOOH末端側することが予想される。

であることが明らかになった。Jonesらはさらに酵
素処理を進めるとライアノジン受容体はもっと小文

献さなペプチドにまで分解されると報告している（5）。

1）鈴木紘一 厚生省神経疾患研究依託費（小沢

しかし我々の今回の実験では，酵素処理を強くし班）平成2年度研究報告書 pp．83−88．

てもこれ以上のフラグメントに分解することがで

2）Takeshima，H．etal．（1989）Nature339，

きなかった。さらに条件を工夫して，もっと小さなC−フラグメントにできるならどのような機能変化が起こるかも興味のあるところである。ただ439−445．

3）Endo・M・（1985）curr・TqZ，．MembT：Transp．
25，181−230．

824）Ebashi，S．（1991）Ann．Rev．Physiol．53，
1−16．

5）Rardon，D．P．etal．（1990）Circ．Res・67，
84−96．

6）Iino，M．（1989）J Gg仇P如∫わJ．94，363−383．

7）Koenig．M．etal・（1988）Cell53・219−228・8）Ohta，T．etal．（1989）A〝‡・／・P如如J・
256，C358−−℃367．
9）Fujii，J．etal．（1991）Science253・448￣

451．

83

14 カルシウム依存性プロテアーゼの活性化機構

鈴 木 紘 一＊・＊＊＊

研究協力者 西 道 隆 臣＊ 川 崎 博 之＊ 長 尾 俊 介＊
鈴 木 英 紀＊＊ 田 上 憲次郎＊＊

は

じ

め

に

カルシウム依存性プロテアーゼ（カルパイン）
は，カルシウムの存在下で基質を切断するので活ルパインが基質を切断するのに必要なカルシウム
濃度は〟M程度であることが示された4）。
カルパインが自己消化に要するカルシウム濃度性のある酵素と考えていた。その後，基質を切るはリン脂質の存在で著しく低下する。本年度は，ときに必要なカルシウム濃度が生体内のカルシウ

このリン脂質によるカルパインの活性化への効果

ムよりずっと高い原因を追求した結果，これまでが，生体内でも実際に見られるのか否かを検討した。

活性を持つと考えていたカルパインは，実は，活性のない酵素前駆体で，この前駆体がカルシウム

実験材料および方法の存在下に自己触媒的に活性型に変化し，活性型

カルパインはウサギ筋肉から単離した〃−およびが基質を切断することが判明した。昨年度，いくm一カルパインを使用した。カルシウム濃度はE

つかの実験事実をもとにカルパインの活性化モデ

GTA緩衝液を使って調節した。フォドリンはウシルを提唱した1￣3㌧

腎臓から既法の方法で抽出精製し，これを抗原に

カルパインは不活性な酵素前駆体として細胞質してウサギで特異抗体を作成した。

に存在する。細胞が種々の刺激を受けて細胞質のカルシウム濃度が上昇すると，カルパインはカル
シウムを結合して生体膜に移行する。生体膜上で結果と討論
1．前駆体および活性型に特異的な抗体

リン脂質とカルシウムの存在下にカルパインの活

ヒトの〃−カノレヾインは自己消化の際に図1に示性化がおこり，活性型のカルパインが生体膜またす構造変化がおこる。すなわち，カルパイン大サはその近傍にある基質タンパク質を切断する。カ

ブユニットのN末端から26個のアミノ酸がとれ，ルパインの自己消化による活性化は生体膜上，す27番目のアミノ酸が活性型カルパインのN末端になわちリン脂質が存在すると生理的カルシウム濃なる。前駆体型および活性型に特異的な抗体を調度でおこるが，生体膜がないとmMに近いカルシ製するため，それぞれ恥1〜20およびNn27〜31番

ウム濃度が必要になる。これまでinvitroで測定に相当するペプチドを合成し，これを抗原としてしたカルパインのカルシウム感受性は，この自己用いた。ポリクローナル抗体ではあるが，各々特消化に必要なカルシウム濃度に相当し，活性型カ

異的な抗体がえられた。
2．血小板の刺激に伴うカルパインの活性化5）
血小板には〃−カノレヾインだけが含まれる。上記＊東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部＊＊同循環器病研究部

1でえられた前等区体および活性型〃−カノレヾインに＊＊＊現東京大学応用微生物研究所

対する特異抗体を使って，血小板を刺激したとき

84におこるカルパインの活性化を調べた。図2に示体型しか存在しない0この前駆体型は刺激後1分したのは血小板をカルシウムイオノフォアtで刺以内に完全に消失する。一方活性化型は刺激前の激したときの結果である○図2右側に示すように，

血小板には全く存在しないが，刺激後1分で最大血小板にカルシウムイオノフォアーを作用させる

量に達し，その後急速に減少して10分後には消失と数分のうちに血小板の凝集が観察される。左側する。血小板では刺激に伴なってすべてのカルパは前駆体型と活性型カルパインに対する抗体を用イン前駆体が急速に活性化され，活性型のカルパ

いたウエスタンプロットである。刺激前には前駆

インは不安定でごく短時間のうちに分解される。

Pro−Calpaln
120

H2N−SEE￣￣

25

ノ一一QR−LGLGー

巨 叫即，。．弓pro￠alpainantibody

autolysis；，l

H2N−LGRHEノ

ActiYe−Calpaina￠tive￠alpainantibody

図日 カルパイン前駆体が活性型になるときの大サブユニットの構造変化と抗体を作るために使用した抗原部位。

抗前駆体抗体○1■2

抗活性化型抗体5−0−1t2−51

76Kうー

図2 ヒト血小板の凝集（右側）とその際のカルパイン大サブユニットの変化（左側）。

85

刺激に伴って活性化されるカルパイン前駆体の量インの活性化を阻害するはずである。この考えにや，活性化に要する時間などは細胞や刺激の種類

もとずき，カルパインのプロテアーゼ活性に対すによってさまざまであった。しかし，いずれの場

るネオマイシンの効果をまず調べた。カルパイン

合にも活性型カノレヾインは不安定で急速に消失した。

のフォドリン分解を10▼6Mカルシウムの存在下で活性型カルパインは前馬区体型カルパインからin検討した。ネオマイシン（100〃M）はフォドリン

vitroでは容易に作ることができる。しかし，この加水分解に対し何らかの影響も与えなかった。

れまで生物材料から活性型カルパインが単離され一方，カルパインがフォドリンを加水分解する反たことはないので，活性型カルパインが本当に細応はPIP2を加えると用量依存的に著しく加速され胞内でもできるのかについて若干の疑問があった。

る。この系にネオマイシンを加えると，PIP2に依今回の血小板や他の剖養細胞を使って行った実験

存した加水分解の促進だけが阻止される。すなわ

で，活性型カルパインが刺激に伴って細胞内で実ち，ネオマイシンは予想通りにPIP2と相互作用し，際に生成することが明らかになった。また，これPIP2がカノレヾインを活性化するのを阻害することまで活性型カルパインが生物材料から単離できなが判明した（図3）。

かった主な理由は，活性型カルパインが不安定で次に，リンパ球系のMolt4細胞をカルシウムイあるためと予想された。

オノフォアで刺激したときにおこる内在性のフォ

3．カルパインの活性化と基質の分解に対するネドリン様タンパク質の加水分解に対するネオマイ

オマイシンの効果

シンの効果を調べた（図4）。細胞にカルシウム

ネオマイシンはStreptomyces fradiaeが生産す

イオノフォアを添加すると，フォドリン（230K）

る抗菌性物質で，イノシトールリン脂質と相互作用が分解し，150Kの断片が生じる。これにネオマをし，ホスホリパーゼCの活性を阻害することにイシンを添加すると，フォドリンの分解が阻害さ起因すると考えられている。カルパインの活性化れる。また，カルパインの活性を阻害する膜通過にイノシトールリン脂質（PIP2，PIP，PIなど）が性の低分子阻害剤E64dを添加してもフォドリン

重要な役割をはたすなら，ネオマイシンはカルパの加水分解は阻害される。図4中のフォドリンの図3

カルパインによるフォドリンの加水分解に対するネオマイシンの効果

86

図4

Molt4細胞をカルシウムイオノフォアで刺激した際におこるフォド
リンの加水分解に及ぼすネオマイシンとE64dの効果

蓑 フォドリンの加水分解に対するネオマイシンとE64dの効果。図4の結果を定量したもの。
P roteo 〜由 （（％ ）ln h ib iもo n（％ ）n O Tte00▲2 3 18 7 （2 LIM ）

23 ．
7

0

＋ n e o m y o ln
（5 m M ）7．
369＋ E64d（0．
5m M ）

5．
6

76（150K）／（23αく＋15｝く）87

バンドをトレースして定量し，その結果をまとめる。

たのが表1である。カルシウムイオノフォアを加今後は，細胞がいかなる刺激をうけたときに，えると，内在性のフォドリンの分解がおきる。上カルパインがどの生休膜でどの位活性化されるか

述のように，この系にネオマイシンまたはE64dを明らかにし，カルパインの生理機能を明らかにを加えると，フォドリンの分解のほとんど（70〜したい。また，カルパインの活性化モデルは〃一80％）が阻害される。フォドリンの分解がE64d

カルパインの活性化を説明するのには好都合であで阻害されることは，フォドリンの分解の大部分

るが，m−カルパインの活性化はこのモデルでははカルパインによるものであり，ネオマイシンが十分説明できない。m−カルパインの活性化に必分解を阻止したことは，この際に働くカルパイン

要なカルシウム濃度は確かにPIP2の存在下で低下の活性化が主にPIP2などのイノシトールリン脂質

するが，生理的なカルシウム濃度に比べるとまだを通した経路でおこることを示す。また，ウエス

かなり高い。m−カルパインの場合にはそのカル

タンプロットにより活性型カルパインの量を定量

シウム感受性を高める何らかの機構が必要である。

すると，用いたMolt4細胞では1mMネオマイシ

幾つかの研究室から報告があるカルパインの活性ンでカルパインの活性化がほとんど完全に止って化タンパク質がこの機構と関係している可能性がいた。

あり，その他の活性化因子の関与も考えられる。

以上の結果から，カルパインの活性化の大半は，これらの点については引続き検討を加えている。

PIP2などのイノシトールリン脂質を介す系によることが明らかになった。イノシトールリン脂質は各種の生体膜に含まれ，生体膜に含まれる濃度のイノシトールリン脂質でカルパインは十分活性化

文献1）Suzuki，K．＆Ohno，S．：CellStructureand
Function，15：1−6（1990）される。従って，カルパインは細胞膜をはじめと

2）鈴木紘一：AnnualReview細胞生物学1991

する種々の生体膜上でイノシトールリン脂質とカ（矢原一郎，御子柴克彦，月田胤一郎編），

ルシウムの存在下で活性化されるものと予想され

中学医学礼 pp．294−306（1991）．

る。事実，血小板の活性に伴うカルパインの挙動

3）鈴木紘一：細胞工学，10：878〜885（1991）．

を免疫電顕で追跡すると，前駆体型のカルパイン

4）Saido，T．C．，Mizuno，K．＆Suzuki，K．：Bi0−は細胞質に存在するが，活性型カルパインは生体

med．Biochim．Acta，50：4−6（1991）．

膜上に存在することが明らかになった。これは前

5）西道隆臣，鈴木紘一：血小板活性化の生化学

駆体型カルパインがカルシウムを結合すると生体（日高弘義，山崎博男，大熊稔，青木延雄，

膜に移行し，生体膜上でリン脂質の存在下に活性蔵本淳編），金芳堂，pp．135−154（1991）．

化されるとした我々の活性化モデルとよく−致す

88

15

ライソゾーム系による筋の崩壊

熊 本 俊 秀＊研究協力者 上 山 秀 嗣＊ 渡 辺要

約進＊ 荒 木 淑 郎＊

従来より，筋ジスの筋線稚内のCa濃度が高いこと

筋原線維構成蛋白がautophagyを介したライソより，Ca依存性プロテアーゼ（calpain）が本症のゾーム系によって分解されるか，若しされるなら筋変性に重要な役割を演じていることが推測され如何なる機序で分解されるかを明らかにするため，ている1）0 しかし，我々のimmuno一gOldを用い脱神経処理したラットにchloroquine（CQ）を授たcalpainの免疫竃朗の検討では，本プロテアー

与した骨格筋を実験モデルとして検討した。脱神

ゼは変性の初期に増加するが，筋崩壊の進行と共経することにより，単独にCQのみを投与した筋にに減少し2），かつ脱神経筋などの他の病的筋でも比較し，筋原線経の崩壊と共に，autOPhagic

増加し得ることがわかり3），筋線経の崩壊には，

vacuoles（AVs）または二次ライソゾームが過剰

もう一つの細胞蛋白代謝を担うライソゾーム系のに形成され，また，CathepsinBなどのライソゾー

関与を明らかにする必要がある。従って，筋の崩

ム・プロテアーゼ活性が元進した。AVs内には，壊課程において筋原線維蛋白がautophagyを介し竃顕的にmembranousstruCture．mitochondria

たライソゾーム系によって分解（崩壊）されるか，

remnants，glycogen顆粒を認めるものの筋原線経

若しされるなら如何なる機序で分解されるかを，の成分はなく，各種筋原線維蛋白の抗体を用いた塾頭空でなくinvivoの系を用いて明らかにする

免疫組織学的検討でもAVs内に陽性反応はみられことを目的として研究を行なった。

なかった。一方，CathepsinB，H，Lは，一次または二次ライソゾーム内に限局するほか，Calpain
と共に，対照筋に比し細胞質にもより活性がみら

材料と方法
エーエル麻酔下で，Wistar系雄ラット12匹の右れた。すなわち筋原線維蛋白は細胞膜，mitochond−

坐骨神経を坐骨結節直下で結紫した。そのうち6

ria．glycogenなどとは異なり，AVsに取り込まれ匹に連日50mgパig／日のchloroquinechloride

ることなく，ライソゾーム外へ逸脱したcathepsin（CQ）溶液を腹腔内注射し，残りの6匹には同量

あるいはcalpainなどのライソゾームまたは非ライの生食水を同様に注射した。結繋後，4，8，16日

ソゾーム・プロテアーゼにより分解される。

目に両群の左右ヒラメ筋を摘出し，一部はアルコール脱水後，型の如く，エボンーアラルダイト樹

は

じ

め

に

筋ジストロフィー（筋ジス）において，ジスト

脂に包埋し，0．2％トルイジンブルー染色横断標本を作成し，観察すると共に，竜顔的観察を行な

ロフィン蛋白が欠損していることが判明したが，った。Densebodiesまたはautophagicvacuoles

しかし，その筋線経の崩壊機序は未だ不明である。

（AVs）を有する筋線経の出現頻度は，上記標本を基に，200個の筋線経を数え，算定した。免疫＊熊本大学医学部第一内科

竃顕用にはLRwhiteレジンに包埋し，pOSt−

89embedding法で，一次抗体にポリクロナールの抗結果α−aCtinin，myOSin，aCtin抗体を，二次抗体に10

形態学的所見：エボンーアラルダイト包埋トル

nm−gOld結合抗ウサギIgG抗体を用い，各々室
温で1時間および30分間反応させた。また，組織

イジンブルー染色横断標本での検討では，CQ投
与のないラットの非神経結条筋（対照筋）では16の一部は，凍結標本を作成後，Gomoriの方法で日目でも，特に形態学的に変化を認めない。対側acidphosphatase（ACPase）染色を行なうと共の神経結条筋（脱神経筋）では，筋緑経は4日目に，一次抗体にポリクローナルの抗calpain，Cathe−

ではぼ正常だが，8，16日目にかけて筋線経の萎psinB，H，Lおよびα−aCtinin，myOSin，aCdn抗縮，横紋の消失，変性がみられた。しかし，対照体を用い免疫組織学的検討を行なった。二次抗体

筋および脱神経筋ともに非CQ投与ラットめ骨格には抗ウサギtIgG抗体を用い，各々室温で2時筋では明らかなdensebodiesあるいはAVsはみら

間および30分間反応させ，免疫染色はABC法を行れなかった。

なった。免疫組織学的検討は，ヒトのrimmed

一方，CQ投与ラットの非神経結崇筋（CQ投与

VaCuOlesを有する遠位型ミオパテー患者の生検筋筋）では，8日目でもその形態に大きな変化を認についても同様の方法で行なった。

めないが，16日目では，筋線稚内にdense bodies

また，各実験筋をポリトロンホモジナイザーであるいはAVsを持つ筋線経がごくわずかながら散

ホモジナイズ後，可溶性分画を調整し，SDS−P

見された。しかし，筋線経の変性，壊死はない。

AGE後，ポリクロナールの抗Calpain抗体を用い，対側のCQ投与ラットの神経結繋筋（CQ投与一

イムノプロットを行なった。

脱神経筋）では，筋の萎縮，構紋の消失，変性，

4816Days図1対照筋，脱神経乳CQ投与筋およびCQ投与一脱神経筋におけるdense bodiesまたはautophagic vacuolesを有する筋緑経の出現頻度

90時に壊死がみられたが，種々の大きさ，形をした

0，16日目では，6．5％±1．5および99．0％±0．9

densebodiesおよびAVsが，CQ投与筋に比し過と，明らかにCQ投与一脱神経筋で著明にAVsの剰に形成し，認められた。また，竜顔ではgly−過剰形成がみられた。

COgenの増加，mitochondriaの変性・崩壊，またまた，CQ投与筋および脱神経筋でみられるAVs

筋原線経の粗しょう化あるいは崩壊がみられた。

の超微形態の比較検討では，前者でみられるAVs

図1に対照筋，脱神経筋，CQ投与筋およびCQ投は殆どdense bodies，membranous stuct，ure，

与一脱神経筋について，エボンーアラルダイト包

mitochondrialremnantsなどのheterogenous

埋トルイジンブルー染色横断標本でこれらdensematerialsより成るが，後者でみられるAVsでは，

bodiesあるいはAVsを有する筋線経の出現頻度を

上記materialsに加え，多数のglycogen顆粒，す示した。非CQ投与ラットでは神経支配および脱なわちglycogenosomeがみられ，これは所謂，ヒ神経筋共に，これら構造物は全く認められなかっトの遠位型ミオパチーや眼・咽頭型筋ジストロフ

た。一方，CQ投与ラット，すなわちCQ投与筋おィーでしばしばみられるrimmed vacuolesに酷似

よびCQ投与一脱神経筋では，4日目では各々0．5

した4・5）（図2a，b）。

％±0および71．7％±4．2，8日目では1．0％±

免疫組織学的検討：16日目におけるCQ投与−

図2

CQ投与r脱神経筋（a）およびCQ投与筋（b）にみられるautophar
gic vacuolesの電顕像。Bar＝1FLm。脱神経処理により空胞内には，多数のglycogen顆粒（glycogenosomes）がみられる。

9ユ

脱神経筋の免疫組織学的検討では，α一aCtinin，

ライソゾーム内に限局するものの，増加している

myosin，aCtinなどの筋原線維蛋白は筋線稚内にことが示された。また，Cathepsin陽性顆粒を有認められるが，AVsあるいは二次ライソゾームとする線経はしばしば，細胞質も濃染した。ラット

思われる空胞内には認められない。免疫竃朗レベのCQ投与一脱神経筋では空胞が小さく，判定しにルでの検討でも同様であった。一方，Cathepsin

くいので，同じAVあるいは二次ライソゾームであB，H，Lは，対照筋では殆ど染色されないが，CQ

ると卜のrimmed vacuolesについても検討した。

投与一脱神経筋では，顆粒状濃染し，AVsや二次ヒトのrimmed vacuolesのうち，空胞内にACP−

図3

ヒトrimmed vacuolesの連続標本。ACPaseおよびCathepsin B
活性のない空胞はAVsであるが，免疫染色で内部に筋原線維蛋白の陽性反応を認めない。

92

aseあるいはCathepsinB活性がみられないのはしばしば，細胞質内も陽性反応を示した（図4）。

AVsであるが，ラット筋のそれと同じように空胞

また，Calpainは対照筋ではややモザイク様に淡内にはα−aCtinin，myOSin，aCtinなどの筋原線

く染色されるが，CQ投与一脱神経筋では，しばし

維蛋白は認められなかった（図3）。また，rimm−

ば強陽性を示す線経が散見され，活性が増加してed vacuolesのうち，二次ライソゾーム内にはいることが示唆された。

CathepsinB，H，L活性が認められた。基本的にこイムノブロット法：Calpainのimmunoblotでれらプロテアーゼはライソゾーム内に限局するが，は，16日目のラットの対照筋では明らかではない

図4

ヒトrimmed vacuolesの連続標本の免疫組織。Cathepsin B，H，Lは空胞内に存在するが（二次ライソゾーム），しばしば細胞質にも陽性反応がみられ，プロテアーゼが逸脱していることが示唆される。

が，脱神経筋，CQ投与筋では薄く，さらにCQ

ことが知られている6）。従って，筋原線稚蛋白が投与一脱神経筋では，より明瞭なcalpainのバンド

autophagyを介したライソゾーム系によって分解がみられた。すなわち，免疫組織の結果と合わせ，（崩壊）されるか否かを明らかにする目的で，CCQ投与一脱神経筋ではcalpainはその活性が増加

Q投与筋をモデルに本実験を行なった。

していることが示された（図5）。

まず，AVsの過剰形成における脱神経の影響を

Cathepsin活性の測定：筋ホモジネートのca−

明らかにするために，−側坐骨神経を結繁し，Cthepsin B，B plus LおよびD活性は，16日目でCQを投与したが，対照筋および脱神経筋では光顕Q投与筋は，対照筋に比し，明らかに活性増加を

上AVsは全くみられず，CQ投与筋では16日でもわ示したが，脱神経筋，CQ投与一脱神経筋はそれ以ずかに認める程度であった。しかし，CQ投与一脱上に高活性を示した。しかし，両脱神経筋の間の神経筋では，早期から過剰のAVsがみられ，16日

酵素活性に有意な差異はなかった（図6）。

目でははば全ての筋線経にみられた。すなわち，CQ投与ラット骨格筋においては脱神経によりAVs

考察が過剰に形成されることが明らかになった。

CQの長期投与により骨格筋の筋線稚内に多数の

また，CQ投与一脱神経筋では，電顕的にもA鴨

rimmed vacuoles類似のAVsを過剰に形成され，に加え，筋原線経の粗しょう化，断列，崩壊がみその筋崩壊にライソゾーム系が深く関与している

られ，一方，生化学的に筋内のCathepsinB，B

図516日目の対照筋，脱神経筋，CQ投与筋およびCQ投与一脱神経筋の可溶性成分のイムノブロット。Calpainは対照筋ではみられないが，CQ投与一脱神経筋では明瞭なbandとして認められ，活性が元進していることが示唆される。

94

U／9．tissue

mlU／g・tissue mlU／g・tissue
60

0．6

50

0．5

40

0．4

30

0．3

20

0．2

10

0．1

0．0

0
CO＋Den．CQ Den．Cont．

CathepsinB

CQ＋Den．CQ Den．Cont．

CathepsinB＆L

CQ＋Den．CO Dcn．ConL

CalhepsinD

図616日目の対照臥脱神経筋，CQ投与筋およびCQ投与一脱神経筋のCathepsin B，B plus LおよびD活性。

plus LおよびD活性の増加がみられた。すなわち

筋原綿維蛋白はAVsに取り込まれることなく，ラ

本病的筋の筋崩壊にライソゾーム系の関与が深く

イソゾーム外へ逸脱したcathepsinなどのライソゾあることが示唆された。CQ投与一脱神経筋にみらーム・プロテアーゼおよびCalpainなどの非ライソれるAVsの電顕的検討では，空胞内には細胞膜由

ゾーム・プロテアーゼにより分解（崩壊）される

来と思われるmembranous structure，mkochon−

可能性が示唆された。

driaremnants，glycoge戚粒が認められるが，筋原線経は明らかに見出せなかった。すなわち筋原Cathepsinの各抗体を分与下さった順天堂大学
医学部生化学木南美紀教授に深謝致します。

線維蛋白がAVs内に存在しない事実を確認すべく，
各種筋原線維蛋白の抗体を用い，空胞内にこれらの成分が存在するか否かを検討したが，α−aCti−

文献1）KarNC，PearsonCM：Acalcium actiⅥated

nin，myOSin，aCtinなどの陽性反応は全く見出せ

PrOteaSein normaland dystrophichuman

なかった。

muscles．Clin Chem Acta

一方，CathepsinB，L，Hは，一次または二次ラ

73：2937297，

1976

イソゾームに限局する他，しばしば筋の細胞質に

2）荒木淑郎，熊本俊秀．GollDE，SternLZ：

も陽性反応がみられた。このことはある種の病的ヒト正常および筋ジストロフィー骨格筋によ状態では，これらプロテアーゼが一次または二次

るCa依存性プロテアーゼおよびそのインヒビ

ライソゾームから細胞質に逸脱する可能性を示唆

ターの局在および動態について．tt厚生省

している。また，細胞質内に存在する非ライソゾ「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフーム・プロテアーゼであるcalpainは正常対照に比ィー症及び関連疾患の病態ちその病因に関す

し，CQ投与一脱神経筋でより強い活性を示した。

る研究以上より，細胞膜，mitochondria．glycogenはAVsに取り込まれ，一次ライソゾームとの癒合→二次ライソゾームのプロセスで分解されるが，（杉田班）平成元年度 研究報告書，

1990，pp62−66．

3）KumamotoT，Kleese WC，CongJ，Goll
DE Pierce PR，AllenRE：Localization of

95

theCEe＋−de−pendentproteinasesand5）FukuharaN，KumamotoT，TsubakiT：

theirinhibitorin normal，fasted，and de−Rirrmedvacuoles・ActaNeurOpathol

nervatedrat skeletal muscle．The Anat0−（Berl）51：229−235，1980

micalReccord232：60−77，1992

6）KumamotoT，ArakiS，WatanabeS，4）KumamotoT，FuknharaN，NagashimaM，

IkebeN，FuknharaN：Experimentalchloro−

KandaT・WakabayashiM：Distalmyo−

qulnemyOPathy：Morphologicalandbio−

Pathy：Histochemicalandultrastructural

Chemicalstudies．Eur Neuro129：202−

Studies．ArchNeuro139：367−371，1982

207，1989

97

Ⅳ 発生と遺伝子発現

16．ニワトリ胚筋細胞のレチノイン吸への応答性

99

17．ビタミンCのもつ筋細胞分化促進作用

104

18．癌抑制遺伝子産物RBとcdc2による骨格筋細胞分化と脱分化の調節112

19．筋細胞分化制御因子の機能の解析

120

99

16

ニワトリ胚筋細胞のレチノイン酸への応答性

桃
研究協力者

井

富 田 幸 子＊ 林隆
謙 介＊＊ 中 村 清 二＊＊＊1．序る。今回，レチノイン酸の筋細胞への生理作用をビタミンAの誘導体であるレチノイン酸は発性調べるひとつの方法として，レチノイン酸に応答

過程での形態形成，とくに肢芽形成，や神経系のするRARβおよびMyoDのmRNAの発現を指形成での生理作用が注目されている（1）。レチノイ

標にニワトリ胚筋細胞分化の各段階におけるレチン酸に結合するタンパクとして，細胞内レチノイ

ノイン酸に対する応答性について検討した。

ン酸結合タンパク（CRABP）と核内レチノイン酸
2．方

レセプター（RAR）の存在があきらかにされてお法り，CRABPにはⅠ，Ⅱのサブタイプが（2，3），

2−1

培養

RARにはα，β，rの三種類のサブタイプが存在

筋芽細胞前駆体はステージ23の肢芽筋細胞予定する（4）。CRABP−Ⅰが神経系に発現するのに対域を機械的に単離した。筋芽細胞は11日胚ニワト

し，CRABP−Ⅱはニワトリ胚の筋，骨に特異的

リ胸筋より常法に従って，分離した。筋芽細胞前に発現し，肢芽形成において部域特異的発現を示

駆体，および筋芽細胞をトランスフェリン，15％

す（1）。ステージ23の肢芽の筋細胞予定域には体節

馬血清を含むMEM培地中にて，レチノイン酸存より移動してきた筋細胞の前駆体が存在するが，在下で培養をおこなった。筋管細胞は筋芽細胞をそれらの細胞は一部CRABP−Ⅱが弱陽性として3日間培養し，融合したものを筋管細胞としてレ存在しているが，筋細胞の分化にともなって，

チノイン酸とともに培養した。

CRABP−Ⅱ強陽性をしめすようになる（1，5，2−26）。⊥方，RARはα，β，γが組織特異的発現

培養細胞よりグアニジンチオシアネート法を用を示すものの，肢芽において部域特異性の発現をいて，RNAを分離し，ホルマリンアガロース電示さず，筋細胞前駆体，骨芽細胞前駆体などで気泳動後，ニトロセルロースフィルターにプロッ

RABαは均一な発現分布を示す（6，7）。骨格トした。プローブとして，ニワトリRARβ，ニワ

筋細胞におけるレチノイン酸の生理作用は現在まトリMyoDのcDNAをマルチプライマーラベルキ

RARPおよびMyoDの検出でのところ知られていないが，このようにレチノ

ットを用いて，32P標識し，RARβ，MyoDのイン酸の情報伝達に関与する結合タンパクや受容mRNAの検出をおこなった。

体の筋細胞における発現は，筋細胞の分化や機能2−3にレチノイン酸が関与していることを示唆していイムノプロット

筋芽細胞，筋管細胞の粗核画分は0，5M
NaClを含む50mM TrispHCl（pH7，4）バッ＊東京女子医大，心血研＊＊神経研究所機能研究部＊＊＊東京大学医学部薬理学教室

ファーにて抽出し，遠心後，上宿のタンパク（100ug）をSDSアクリルアミドゲル（12％）電気泳動に供した。泳動後，ニトロセルロースフィルター

にプロットし，RARαの合成ペプチドに対する特異抗体を用いてイムノブロット法にてRARα蛋白の検出を行った。

3−2

レチノイン酸にたいする応答性

ステージ23の筋細胞予定域から得られた筋芽細胞前駆体はレチノイン酸（1uM）に応答してRAR
J9のmRNAを3時間以内に発現することが判明

3．結
3−1

果

した（図2）。一万，11日胚の胸筋より得られた筋

RARα蛋白の発現

芽細胞はRARβを発現していないが，1nMのレ

筋芽細胞，筋管細胞におけるRARαの発現を
イムノブロットで調べた（図1）。
筋芽細胞でRARα蛋白の発現が観察されたが，培養3日後にはRARα蛋白の発現が減少し，5日後には，RARαの蛋白は観察されなくなった。
￣方，筋細胞特異的蛋白であるミオシンは培養とともに存在量の増加が観察され，筋芽細胞から筋管細胞へと分化していた。

チノイン酸に応答し，RARβを発現し，濃度依存的に増加がみられた0しかし，筋管細胞では，0・1￣1uMのレチノイン酸にたいして微かに反応が検出するだけであった（図3）。
一方，筋細胞特異蛋白の発現に関与するMyoD
遺伝子の発現は，筋芽細胞ですでに発現がみられるが，PPAにより抑制された。

A←Myosin

RAR申す」』−

．恥，叫

2

3

1

2

図1イムノブロットによるRARα蛋白の発現の解析。
A）筋芽細胞，筋管細胞におけるRARα蛋白発現。
1；培養1［］目，2；培養3日目，3；培養5日目
B）Myosin蛋白の発現
1；培養1日目，2；培養3日目

101︒吏て雫漣群釈QくN銘∈Q屯田く銘﹂磯野臣皆寸N
刃潜入†＼車上Q︵ヨコtlヨurO︶些撃誓三党蒜毒蒜返 ■碧雲無感︒蹄梶野献Q取

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ぷ蒜遠心下草崇警こ＼≠上や箪鱒竺些零苛即や準壌糧翠等柵濾古森越︵mZへ11 トK︶坦二二卜‖1ふ闘￡ N︻ ∞ M O102

しかし，lnMのレチノイン酸処理により約2倍にしかし，筋管細胞では，レチノイン酸に対する応増加し，10nMのレチノイン酸で最高値をしめし，答性が消失し，RARβの発現は1uMレチノイン

レチノイン酸無処理の約5倍量のMyoD mRNA酸によっても微かにしか見られなかった。このよが発現していた。しかし，それ以上のレチノイン

うにレチノイン酸は筋細胞分化の初期に応答性を酸の濃度はMyoDの発現を抑制した（図4）。

示すこと，また，生体では，レチノイン酸は数十一数nM存在することから，発生過程において筋4．考察

細胞はレチノイン酸の生理作用の影響下に分化す

培養系では多くの癌細胞がレチノイン酸で分化ることが推測された。一方，筋細胞の分化過程が促進する事が知られているが，正常細胞では，において筋特異的蛋白の発現を調節するMyoD遺表皮細胞，軟骨細胞など分化誘導する細胞の例は伝子の発現はレチノイン酸（1−10nM）により約少ない。われわれは，ニワトリ胚の筋組織にレチ

2−5倍増加した。このことはレチノイン酸がノイン酸にたいする結合蛋白（CRABPⅡ）を兄い

RARaや誘導されたRARPを介して直接あるいだしたことから，筋細胞におけるレチノイン酸のは間接にMyoD等の筋分化に必須な遺伝子の発現

生理作用に注目した。その結果，筋芽細胞，及び調節することにより，筋細胞の分化を調節していその前駆体細胞では，RARαが発現しており，る可能性を示唆している。

レチノイン酸（1nM）に応答して，RARPのまた，イムノブロットでRARα蛋白が筋管細mRNAの発現が促されることが明らかになった。

胞に検出されなくなることが，筋管細胞のレチノ

し−）10

図4

9

8

7

6

−LogM

TPA処理LE筋芽細胞におけるレチノイン酸によるMyoDmRNAの発現誘導。筋芽細胞を様々な濃度（0．1nM−luM）のレチノイン
酸と24時間培養し，MyoDのmRNAの発現を調べた。

103

イン酸にたいする応答性の減少の原因として考え

ノイン酸と生理作用。蛋白質核酸酵素36：

れるが，筋管細胞の核は筋芽細胞の核同様陽性を

2506，1991

しめすことから（未発表），イムノプロットで検出

2）Kitamoto，T．Momoi，T．et al．

されなくなるのは，ミオシンやアクチンなどの筋

The presence ofa novel cellular retinoic

特異的蛋白の大量の発現の結果，RARα蛋白のacidTbinding proteinin the chick

量が相対的に減少したためとも考えられる。むしembryos．Biochem．Biophys．Res．

ろ，CRAPⅡ蛋白が筋管細胞に分化するにつれ増Commun．157，1302，1988．

加してくることが，freeのレチノイン酸がRARa

3）Kitamoto，T．Momoi，M．et al．

との結合することを抑制し，レチノイン酸の応答

Expression of cellular retinoic acidを減少させている可能性も否定できない。

binding proteinⅡ（Chick−CRABPⅡ）in

分化の初期で筋細胞がレチノイン酸に応答することが判明したが，筋細胞分化の決定にレチノイン酸が関与しているか否かはあさらかでない。しthe chick embryo．Biochem．Biophys．
Res．Commun．164：49，19894）Zelent，A．，KruSt，A．，etal．Cloning of

かしながら，未分化精巣腫瘍細胞であるP19EC

murine a and P retinoic acid receptors

細胞はレチノイン酸の濃度依存的（10nM）に骨格

anda novel receptor T．predominantly

筋細胞へと分化することから，レチノイン酸が筋

expressedin skin．Nature339：714，198a

分化の初期の決定機構に関与している可能性も考5）Momoi，T．，Kumagai，H．et al．

えられ，今後中胚葉未分化細胞である10T／2細Retinoic acidreceptorin the chicklimb

胞，ニワトリ胚ステージ21肢芽細胞をもちいて検bubsin the early developmental

索していく予定である。．また，ジストロフィンおStageS．Biochem．Biophys．Res．

よびその関連蛋白など，筋特異的蛋白の発現に関Commun．168：544，1990．

して検討していく必要があるものとおもわれる。

文献1）桃井 隆：発生分化と形態形成におけるレチ6）桃井 隆：厚生省神経委託研究平成3年度報告書（小沢班）7）Tomita，S．Momoi，T et al．（投稿中）

104

17

ビタミンCのもつ筋細胞分化促進作用

松

は

じ

め

田

に

良

一＊

ルベッコ改変イーグルMEM（高グルコース型），

ビタミンCは生体内でコラーゲン合成の際のコ60／上g／mlカナマイシン）に浮遊したBC3Hl細胞

ファクターとしての作用，抗酸化作用，鉄イオンをまき，2日毎に培地交換しながらコンフルエンの吸収，アミノ酸代謝における作用などの機能をトになるまで細胞した。その後，培地を増殖培地

もつり。このビタミンC（アスコルビン酸）の多彩から分化培地（10％馬血清，90％イーグルMEM，

な生理活性は個体の生存に必須であるにもかか

60／上g／mlカナマイシン）に交換して分化培養0日

わらず，その細胞レベルでの作用に関する知見目とした。培地交換は2日毎に行ない，その際，は多くない。そのおもな原因としてアスコルビン

実験群には最終濃度100／上MになるようにAsc2−酸のもつ不安定性が考えられる。即ちアスコルビ

Pを加えた。このAsc2−Pは和光純薬より入手

ン酸は水溶液中では不安定で，とくに37℃の中性

し，分子量を400として100mMになるように溶液中（通常の細胞培養条件）では24時間以内に，PBSに溶解後，ろ過滅菌し分注，凍結保存したもはば完全に酸化分解される。Hataら（1989）は，のを用いた。

このような細胞培養条件下にも分解されず安定な免疫組識学：培養液中に最終濃度10％になるよ

活性持続型ビタミンCとしてアスコルビン酸2−うホルマリン液を加え，室温で3分間固定した。

りん酸（Asc2−P）を報告した2）。この発見によ

洗浄後メタノールにより10分間処理し，10％馬血

りビタミンCの及ぼす培養細胞の増殖や分化に対清を含むPBS（0．1％アジ化ナトリウム含有）を加する影響が容易に検討できるようになった。

え4℃に保存，4日以内に使用した。1次抗体と我々は筋細胞の分化能に欠陥があると考えられしては，抗筋肉型ミオシン重鎖抗体にはMF204），ている（筋芽細胞同志が細胞融合せず，いわゆる抗myogenin抗体としてIF5075），抗マウスコラ

最終分化をおこさない）マウス筋細胞株BC3H13）ーゲンタイプⅠ抗体（バイオデザイン），抗ラミニを用いて，その細胞分化に対するビタミンCの影ン抗体（シグマ）を用いた。抗体の希釈，反応は響について検討した。その結果，Asc 2−Pはそれぞれの指示によった。2次抗体には抗マウス

BC3Hl細胞の筋分化に促進的作用をもつことがIg一テキサスレッド標識抗体又は抗ウサギIg−

わかった。

FITC標識抗体をそれぞれ100倍に10％馬血清を含むPBSにて希釈して用いた。

材 料 と方法

RNAの分離及びノーザンプロット解析：トー細胞培養：BC3Hl細胞株はATCCより分与さタルRNAはRNAzol（シナバイオテックス）を用れたものを用いた。ゲラチンコートしたプラスチ

いて分離した。凡そ15Jjg／レーンの割合でSaitoh

ック培養皿に増殖培地（20％胎児牛血清，80％ダらの報告（1990）6）と同じ条件で泳動後，ノーザ
ンプロット解析を行なった。プローブとしては＊東京大学教養学部生物学教室

MyoDI cDNA（Lassar）7），myOgenin cDNA

105

（OIson）8），L32cDNA（Bowman）9），GAPDHD）中でそれぞれ4口問（A，C）又は8日間（B，cDNA（Dugaiczk）10）を用いた。

D）培養した細胞の抗ミオシン重鎖抗体による免疫蛍光抗体染色パターンを示す。対照群では少数

結 果 と 考察の単核細胞が陽性に染色されるのに対し，実験群

図1にビタミンCをふくまない（A）又は含む分

では多くの細胞，とくに培養日数がふえるにつれて化培地（B）中で10日間培養したBC3Hl細胞の位増加する多核筋管細胞がMF20によって陽性に染

相差顕微鏡像を示す。Aは特記すべき形態変化は色されている。従ってビタミンCはBC3Hl細認められないのに対し，ビタミンCの影響により

胞の筋細胞としての分化を促進する作川があるこ

Bでは多核筋管細胞が出現している。図2にビタとがわかった。これは今まで筋分化能に欠陥があ

ミンCを含まない（A，B）又は含む分化培地（C，ると報告されてきたBC3Hl細胞が自発的に筋分

図1

ビタミンCによるBC3Hl細胞の多核筋管細胞形成。
分化培地中で10日間培養した細胞の位相差顕微鏡像，スケールは200pm。Aは対照，BはビタミンC処理（100FLMAsc2−P）群。矢じり
印は筋菅細胞中の核を示す。

106

化できることを示した例として注目される。ではしている。この結果から次の様なことが明らかでビタミンCにより筋分化が促進されているⅨ二：3Hlある。即ち1）BC3Hl細胞はビタミンC非存在下細胞における筋分化制御遺伝子産物myogeninのでも筋分化制御遺伝子myogeninの発現を行なう。

発現はどうであろうか？抗myoge血l抗体によ2）しかしビタミンC存在下の細胞はさらに多核る染色パターンを図3に示す。シンボルは図2と化を起こすため自己活性化された細胞核はさらに同じである。興味深いことにビタミンC非存在下

多くなりmyogeninの発現率は上昇を続ける。3）に分化した細胞は4日目には多くの細胞がmy0−

多核筋管細胞は分化形質である筋型ミオシン重鎖

geninを発現するものの8日目にはその陽性細胞の発現をさらに活性化する。この様にビタミンC

数が激減するのに対し，ビタミンC存在下に分化により筋芽細喝同志の融合が促進されることがした細胞は4日目，8日目共，多くの細胞が抗myogenin発現率の上昇につながっていると考え

myogenin抗体により染色されている。全細胞核られる。ではMyoDlの発現はビタミンCにより数あたりのmyogenin抗体染色陽性細胞核数，同変化するであろうか。図5AはMyoDlをプロー

じくミオシン重鎖（MHC）抗体染色陽性細胞核数のブとしてビタミンCを含まない分化cDNA培地中

比及び細胞融合指数（Fusionlndex）をグラフに示

で10日間培養したBC3Hl細胞由来のRNA（レー

したのが図4である。各ポイントは100〜300個

ン1），ビタミンCを含む場合（レーン2），陽性対の全細胞核数あたりの陽性細胞核数の百分率を示照として分化48時間目のマウス筋細胞株C2C12由F ￣㌻−＿￣ ￣￣二￣二覇．㍗㍉∵、・・・琶

＿＿・二十ギ＿二
聖賢二・二＿二

「1．丘
J

i

二千頚
図2

ビタミンCによるBC3Hl細胞の筋型ミオシン重鎖発現の活性化。

A，Cは対照。B，DはビタミンC処理群。A，Bは分化培地中で4日間培養。C，Dは同じく8日間培養したものをMF20にて蛍光抗休染色した。スケールは1（氾〟m。

107

図3

ビタミンCによるBC3Hl細胞のmyogenin発現の活性化。
記号は図2と同じ。スケールは100pm。抗myogenin抗体IF507にて蛍光抗体染色した。

乗のRNA（レーン3）に対するノーザンプロットのしたがってビタミンC処理は筋分化制御遺伝子

パターンである。この結果からビタミンCは

myogeninに対して比較的特異的活性化を起こす

MyoDlの転写活性を上昇させないことが明らかと思われる。

である。これに対してmyogenin cDNAをプロー

ではビタミンC（この場合はAsc2LP）は一ブとした場合が図5Bである。このプロットでは

体どのステップで効いているのだろうか？ま内部対照としてリボゾーム蛋白質サブユニットのずコラーゲンの合成分泌過程で必須なプロリ1つであるL32のcDNA及び図5Cではグリセロ

ン及びリジン水酸化酵素のコファクターとしてアルデヒドりん酸脱水素酵素（GAPDH）のcDNAのビタミンCがこのBC3Hl細胞の筋分化促進にを同時に用いた。RNA

標品は増殖培地中の効いている可能性がまず考えられる。そこでこの

BC3Hl細胞由来のもの（レーン1），ビタミンプロコラーゲンのプロリンの水酸化を阻害する目

Cを含まない分化培地で10日間培養したBC3Hl

的で2つの異なった阻害剤を用いてその影響を調細胞由来のもの（レーン2），ビタミンCを含む

べた01）Cis−OHプロリンによる阻害：あらか

分化培地中で10日間培養したもの由来のRNA（レじめ培地中にCis−OHプロリンを50喝／ml及至ーン3）である。この結果から明らかにビタミン100〃g／ml加えておくとビタミンC存在下にも正C処理によりmyogeninの転写物の増加がみられ常なプロリン水酸化（transの形に水酸基を導入ることがわかった。それに対してL32やGAPDHする）ほおこらずコラーゲンの3垂らせん構造がの転写産物の量はほとんど変化が認められない。

形成されないことが示されている1日。そこでBC3Hl

108

0

2

0

2

0

2

4

6

8

10

4

6

8

10

6

8

10

4

DaysinCuIture
図4

ビタミンC処理をしたBC3Hl細胞の筋型ミオシン重鎖（MHC），
myogeninの発現と融合指数（Fusionlndex）の経日的変化0縦軸は
全細胞核数あたりの陽性細胞核数を示す。十はビタミンC処理群，−は対照群を示す。

109

A

12

3

MyoDl

B

1

2

3

4

myogenin

GAPDH

図5

BC3Hl細胞の発現するMyoDl（A），myOgenin＋L32（B）及びGAPI）H（C）mRNAに対するノーザンプロットによる解析。
説明は本文参照。

110

図6

ビタミンCによるBC3Hl細胞の作る細胞外基質の構築。
A，Bは抗マウスコラーゲンタイプI抗体，C，Dは抗ラミニン抗休による蛍光抗体染色。細胞はA，Bは分化培養2日目，C，Dは8日目のものを示す。A，Cは対照群，B，DはビタミンC処理群を示す。

細胞をAsc2−Pと50pg／ml及至100pg／mlのテネシン，プロテオグリカン等と相互作用しながCis−OHプロリンを含む分化培地で10日間培養をら複雑なマトリクスを構築すると考えられている。

試みた。その結果，ビタミンC存在下に形成されではビタミンC処理によりBC3Hl細胞の作るコ

るはずの多核筋管細胞は出現せずMF20陽性細胞

ラーゲンやラミニンの分子局在はどのように変わもCis−OHプロリンの濃度に依存して減少しているだろうか？コラーゲンタイプⅠとラミニンに対った（データはここでは示さない）。この分化を抑する抗体を用いた免疫蛍光抗体法による染色パタ

制されたBC3Hl細胞由来のRNAに対してのノーンを図6に示す。A，BはコラーゲンタイプⅠ，

ーザンプロットのパターンが図5B，Cのレーン

C，Dはラミニンを示し，A，CはビタミンC非4である。L32とGAPDHは対照と同レベル検出

存在下で培養したもの，B，DはビタミンC

されるのに対し，myOgenin転写産物の崖はほと存在下で培養したものである。Aに示された

んど検出レベル以下である。従ってビタミンC

如くビタミンC非存在下ではプロコラーゲンのもつBC3Hl細胞に対する筋分化促進効果の作の水酸化がおこらず分泌顆粒中にコラーゲン前駆

川点はコラーゲン合成と分泌に密接な関係がある体が蓄積した状態になっているのに対し，ビタミと考えられる。

ンC存在下ではほとんどのコラーゲンタイプⅠがコラーゲンは細胞外基質の主要成分の一つで，正常に修飾をうけ，細胞外にあみ目状構造をつく

他の成分のあるラミニン，ファイブロネクチン，って分布していることがわかる。又，ラミニンは

111

ビタミンC存在下では細胞間にあみ臼状又は細胞文

献

膜あるいは表層上に点状に分布している（D）が，1）稲垣，荒川，香川，池田，吉田，村田，鈴江

ビタミンC非存在下ではラミニンは不定形の分布（1985）ビタミン学Ⅱ（日本ビタミン学会編）

を示している（C）。このことからビタミンCがpp．567−599，東京化学同人

BC3Hlの作る細胞外基質の形成に大きな役割を果していることが証明された。今後はこの細胞外
基質のどの成分が筋芽細胞の融合を促進する効果をもつのかを検討したい。

2）Hata，R．，＆Senoo，H．（1989）′．CeLL
P如∫扉．138，8−163）Taubman，M．B．，Smith，C．W．J．，Izumo，
S．，Grant，J．W．，Endo，T．，Andreadis，A．，＆Nadal−Ginard．B．（1989）′．CeZl筋ジストロフィー症と本研究の関連

βわJ．108，1799−1806

筋ジストロフィー症で欠損している遺伝子産物

4）Bader，D．，Masaki，T．，＆Fischman，D．A．

ジストロフィンは筋細胞の細胞膜直下に存在する（1982）／．CgJ β如．96，763−770

裏打ち蛋白質であることが最近の研究から示され

5）Wright，W．E．，Sassoon，D．A．，＆Lin，ている。又，このジストロフィンはそれと特異的V．K．（1989）CgJ／56，607−617に結合する膜上の糖蛋白質と複合体を作っている

6）Saitoh，0・，OIson，E．N．，＆Periasamy，M．

と考えられている。この糖蛋白質がどのような生（1990）上β如．C加桝．265，19381−

物学的機能を持っているかは未だ不明である。本19384

研究により筋細胞が自前で作るコラーゲンを中心

7）Tapscott，S．J．，Davis，R．L．，Thayer．

とした細胞外基質が筋芽細胞の融合や分化形質のM．J．，Cheng，P．−F．，Weintraub，H．，＆

維持に重要な役割を演じている可能性が示唆されLassar，A．（1989）∫Cわ〝Cg242，405−

た。細胞外基質の何がどのようにしてこのような

411

筋分化の促進に関係しているのかは今のところ不明であるが，細胞外基質はその受容体などの膜上の糖蛋白質を介して細胞自体に大きな影響を及ぼ

8）Edmondson，D．G．，＆01son，E．N．（1989）Gg〃β∫＆8g玖

3，628−6409）Agrawal，M．G．，＆Bowman，LH．

していることから考えて，ジストロフィンに結合（1987）′β如．C舶用．262，4868−4875

する糖蛋白質がこの細胞一細胞外基質問の相互作

10）Dugaiczk，A．，Haron，J．A．，Stone，E．M．，

用に関係している可能性が考えられる。今後はこDennison，0．E．，Rothblum，K．N．，＆の観点から筋分化に影響を及ぼす細胞外基質成分

Schwartx，R．J．（1983）朗oc加刑．22，と筋細胞膜との相互作用について調べていきたい。

1605−1613

11）Saitoh，0．，periasamy，M．，Kan，M．，＆
Matsuda，R．（1992）Exp．Cell Res．199，
in press．

112

18

癌抑制遺伝子産物RBとcdc2による骨格筋
細胞分化と脱分化の調節

遠 藤
研究協力者

要

後

藤

進＊

剛＊

大久保

約

悌＊

岸

本

健

は

じ

め

雄＊＊

に

誘導性プロモーターにつないだSV407αrggr

骨格筋細胞の最終分化には，増殖の不可逆的停をマウス骨格筋細胞株C2にトランスフェクトし止，一群の筋特異的遺伝子の発現，および細胞融て得たC2SVTtsll細胞では，最終分化をした筋

合の3つの現象が不可欠であり，いずれか1つで管細胞に／β叩grを誘導すると，増殖を停止しても欠けると最終分化には至らない。したがって最いた細胞が再び細胞周期にはいり細胞分裂がもた

終分化の機構を解明するには，これらの個々の現らされる。この現象は脱分化とみなすことができ象を誘導する細胞内因子を同定するとともに，そる。この骨格筋細胞の分化にともなう増殖の停止，れらの因子（タンパク質）の発現機構を明らかに

および脱分化による分裂の再開を誘導する機構をする必要がある。この最終分化の機構を解明する

解明するために，癌抑制遺伝子兄βとM期誘導因目的で私たちは，Zn2＋などの重金属により活性化子（MPF）の活性サブユニットcdc2に着目し，されるメタロチオネイン遺伝子プロモーターにつ

それらの発現と活性を調べた。最終分化の過程でないだSV40T抗原遺伝子（温度感受性largeTおは，足βmRNAとタンパク質の量は著しく増加

よび野性型smalltをコードしている）をマウス骨し，逆にcdc2の発現量は減少した。しかし脱分化の過程では，点βの発現量は減少し，一方αわ2格筋細胞株C2にトランスフェアトして形質転換細胞株C2SVTtsll（以下C2SVTと略す）を得ているの発現量はM期付近で増大した。またcdc2の（1）。この未分化の筋芽細胞をZn2＋存在下でlarge

Ser／Thrキナーゼ活性はその発現量と正の相関

Tにとって許容温度の33℃で培養すると，誘導さ関係を示した。これらのことは，分化にともなうれたlargeTにより分化が阻害される。またZn2＋

増殖の停止と脱分化にともなう分裂の再開には，不在下であらかじめ最終分化を起こし形成させたそれぞれRBとcdc2が主要な役割をしているこ筋管細胞を，Zn2十存在下に移しJβrggrを誘導すとを意味している。またlarge Tそのものあるいると，不可逆的に増殖を停止していると考えられはlarge Tによって誘導されるある因子によって，ていた細胞が再び細胞周期にはいり，18時間後にRBとcdc2の発現および活性がそれぞれ負と正にはDNA合成を，34時間後には細胞分裂を行なう

調節されていることを示唆している。

（1，2）。この現象は脱分化とみなすことができる。
癌抑制遺伝子である網膜芽細胞腫遺伝子月βの産物（RB）は，細胞周期のGO／Gl期においては＊千葉大学理学部生物学教室＊＊東京工業大学生命理工学部生休機構学科

脱リン酸化されており，SからM期にかけてはリン酸化されている。また特に脱リン酸化されたRB

113は，癌遺伝子産物のSV401argeTやアデノウイにして検定した。細胞を0．1％TritonX−100を含

ルスEIAなどと複合体を形成しうる。さらに，

む50mM Tris−HCl（pH8．0）で抽出し，この抽脱リン酸化されたRBは，増殖にかかわるいくつ

出物に最終濃度1m9／nlのヒストンHlおよびレーかの遺伝子の転写因子であるE2FやC−Mycとも

32p］ATPを加え，30℃で60分間インキュベート

結合することが示されている。これらのことから，した。ヒストンHlのリン酸化の程度を32pの取脱リン酸化されたRBはE2FやC−Mycと結合すり込みによるオートラジオグラフィーにより調べることにより，それらの転写活性を抑制して，そた。

の結果，増殖を抑制すると考えられる。一方，リン酸化されたRB，あるいはいくつかの癌遺伝子

結果

産物と複合体を形成したRBは，E2FやC−Myc

1．分化の過程における斤βとcdc2の発現と結合することができなくなる。そのために遊離増殖培地（10％ウシ胎児血清を含むDME培地）

したE2FやC−Mycにより増殖にかかわる遺伝子中で培養していたC2SVT筋芽細胞を分化培地の転写が起こり増殖がもたらされると推測されて（5％ウマ血清を含むDME培地）に移すと48時間いるほ）。このようにRBの活性はリン酸化や他のほどで筋管細胞の形成がみられるようになる。96

タンパク質との相互作用で調節されていると考え

時間経過すると，80％以上の細胞が筋管細胞を形られており，その発現量と活性との間には有意な成する。この最終分化の過程で12時間おきに細胞関係が兄いだされていない。

からRNAを調製して，ノーザンブロッティング

MPFはタンパク質Ser／Tbrキナーゼ活性を持によりいくつかの筋特異的遺伝子（ミオシン重鎖，つ活性サブユニットのcdc2と調節サブユニット

α−アクチン，トロポニンT，ミオシン軽鎖2）のcyclinBとからなり，G2からM期にかけて活とRBおよびcdc2のmRNA量を調べた（図1）。

性化される。MPFによってリン酸化される基質

筋特異的遺伝子のmRNAsは増殖している筋芽細として，ラミン，ヒストンHl，MAP2などがあ胞には検出されなかったが，細胞が分化するにつる。これらのリン酸化により，M期の際に起こるれて出現し，量が増していった。RBmRNAは増核膜の崩壊，染色体の凝縮，微小管の再構成がも殖中の筋芽細胞にも少量存在していたが，36時間たらされると考えられている（4，5）。またRI王と後あたりから急激に量が増大した。72時間後に発SV401argeTもin vitroでcdc2によりリン酸

現量はほぼ最大値に達し，それ以降はそのレベル化されることが示されている。

を維持していった（8，9）。一方cdc2mRNAは，￣したがってRBとlargeTおよびcdc2は相互筋芽細胞では多量に存在していたが，分化の過程作用して細胞の増殖を調節しているものと思われでしだいに減少し，84時間後以降はごくわずかしる。この研究ではC2SVT細胞を用いて，その分か検出されなかった。

化にともなう増殖の停止，および脱分化による増次にタンパク質量の変動を，RBに対するモノ殖の再開を誘導する機構を解明するためと，RB

クローナル抗体PMG3−245およびcdc2に特異とcdc2に着目し，それらの発現と活性を調べた。

的なPSTAIRモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡法により調べた。RBは筋芽細胞にはほ

材料

と方法

とんど検出されなかったが，筋管細胞の核には多ノーザンプロッティングは文献（6）に，イムノブ

量に存在していた（図2A−F）（8，9）。Cde2はロッティングと免疫蛍光顕微鏡法は文献（7）に準じ筋芽細胞でも筋管細胞でも細胞全体に分散した状て行なった。

態でみられたが，特に筋芽細胞に多量に存在してcdc2のヒストンHlキナーゼ活性は次のよういた。この分化の過程におけるタンパク質量の減114

少は，イムノブロッティングによっても明らかに減少していった。RB mRNAも同様にしだいに減された（図3A）。

少してゆき，34時間後には筋芽細胞中のレベルに

2．脱分化の過程における斤βとcdc2の発現まで低下した（8）。一方cdc2 mRNAは最終分化

あらかじめ形成させたC2SVT筋管細胞を100をした筋管細胞ではほとんど存在していないが，〟MZn2＋を含む33℃の増殖培地に移すと，メタ

脱分化により細胞がG2からM期にはいる24時間

ロチオネイン遺伝子プロモーターを介してJαrgβ

後以降に著しく増加した。

Tが誘導される。この様子をノーザンブロッティ

脱分化によりM期にはいった筋管細胞では，RBングでみると，2時間後あたりからJαrgg rタンパク質もmRNAと同様にほとんど存在してmRNAが誘導されはじめ，約8時間後にその量いなかった（図2G−Ⅰ）。逆にcdc2は，脱分化には最大に達した。その後しばらく発現量は減少しより増加することが免疫蛍光顕微鏡法で示された。

たが，細胞分裂のみられる34時間後付近では再びまたこの増加は，mRNAの場合と同様に24時間最大値にまで回復した（図4）。この発現と非常に後以降すなわちG2からM期にかけてであること

協調的にcrjun mRNAが誘導されたuO）。筋特異が，イムノブロッティングにより明らかにされた的遺伝子mRNAsはこの脱分化の過程でしだいに（図5A）。

0

12

24

36

48

60

72

84

96

h

−MHC
一■l

β，羊Actinα−Actjn
一丁nT

−MLC2

■■●■｝■¶■●■iRb

図1

C2SVT細胞の最終分化の過程におけるββとαわ2の発現。最終分化の過程で12時間おきに細胞からRNAを調製して，ノーザンブロッテ
イングにかけた。（Aいくつかの筋特異的遺伝子（ミオシン垂鎖，α−アクチン，トロポニンT，ミオシン軽鎖2）mRNAsおよびP−とγてクチンmRNAs．（B）RB mRNA．（C）cdc2mRNA．

115■呂ミ8︻悪−てミートK︒望宝輪蜂Qだ東棟時こ卜﹂樽嘆Uu碑聾Q蛍患脚韓望望思時
鱒PJ爬PE屁︒吏﹂雄藩Pぜ恕蔭来由∴﹂亜叙面目P等N・mUヨd整媒ゝTTlロへ＼中将も存じ田出刃∞∽ZSmH名山呂州33S︷qQ條心裏感品
レ↓鱒ギ軍挙芦当欄︵hIC︶碧患脚騒吏﹂漣彗余波噛■︵HTS璧豊撫蜂や璽軍学警告﹁扁︵TU︶蛍要撃雫雪に㌫召還甘糧﹂二で罫恵存森雪︒宿髄Q嘲緋へシ︑八へ西田小足♂刃∪岩十や蛋刃さ余波喋0盛夏↑ASNU N図116．くN銘RH
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L工心u01S王

00トC ≡凸・T q≡

117

Mt

O

→・GM＋Zn2＋330C

6

1218

24

30

36

42

48h

−Cdc2

＝Histone Hl

雷

1、−

？

¶

32p−HistoneHl

図5

C2SVT細胞の脱分化の過程におけるcdc2タンパク質量の変動およびcdc2のヒストンHlキナーゼ活性。（A）PSTAIR抗体を用いたイムノ
ブロッテイング。（B，C）ヒストンHlキナーゼ活性。SDS−PAGEのCBB染色（B）と32pの取り込みをみたオートラジオグラフィー（C）。

3．分化と脱分化の過程におけるcdc2キナーゼ
活性の変動

考

察

この研究により，骨格筋細胞の最終分化の過程

cdc2のもつSer／Thrキナーゼ活性が分化と脱ではRB mRNAとタンパク質の量が著しく増大

分化の過程でどのように変動するかを，Cdc2のし，逆にcdc2の発現とそのキナーゼ活性は低下

よい基質であるヒストンHlのリン酸化を指標にすることが示された。またSV401argeTによっして調べた。筋芽細胞では非常に高いキナーゼ活てもたらされる脱分化の過程では，斤βの発現量性が認められたが，最終分化の過程でこの活性はは減少し，一方αわ2の発現とそのキナーゼ活性著しく低下した（図3C）。また脱分化の過程では，はG2からM期にかけて増大することが明らかに

G2期に相当する24時間後あたりからこのキナーされた。

ゼ活性が顕著に高まった（図5C）。したがって今までに他の細胞種を用いて調べられている限cdc2の発現量とその産物のキナーゼ活性との間には明瞭な相関関係が認められる。

りでは，RBの増殖抑制活性はリン酸化により調節されており，細胞周期におけるその活性と尺β118の発現量との間には明瞭な関係が兄いだされていcdc2はin viiroでRBをリン酸化することがない。したがって少なくともC2SVT細胞および示されているが，Cdc2が活性化されるのはGZ／

その親株のC2細胞の分化による増殖停止には，M期であるのに対し，細胞内でのRBのリン酸化

リン酸化されていないRBタンパク質が蓄積するはSからG2期にかけて起こる。最近，Cdc2に必要があると考えられる。またSV401argeTは類似した鮎r／ThrキナーゼとしてCDK2が同定

特にリン酸化されていないRBと結合し，その増された。この活性はS期の誘導にかかわっている

殖抑制活性を阻害すると考えられている。したがようである吐乳 したがって玩＝油川のRBのリンって脱分化にともなって細胞周期を回る際は，酸化はcdc2ではなくCDK2によるものかも知れ

RBはリン酸化されている必要はないということない。今後，分化と脱分化の過程におけるCDK2になる。同様の理由から，筋管細胞内でのRB量の発現と活性についても調べる必要がある。αわ2の減少は細胞周期を再開するのに不可欠というわ

やCβ斤2の転写調節機構についてはまだ報告がけではないかもしれない。このRB量の減少はなされていない。C2SVT細胞は細胞分化と脱分

largeTを誘導した結果として起こったわけであ化を増殖という面からみた場合，それを調節してるから，largeT自身，あるいはlargeTによっいる尺βおよびαわ2，Cか斤2の発現機構を研究て誘導されたある遺伝子産物によってββの転写

するうえでも有用である。

が抑制されたか，またはRBmRNAが不安定になった結果ということが考えられる。Jαrggrの発文

献現によって，プロトオンコジーンのC−ノ〟打が誘導

1）Endo，T．＆Nadal−Ginard，B．（1989）された（図4）（10，11）ことは，この考えを支持

CgJはJ即β〃d〟OJgC〟Jαr月山ogッ q／

しているかも知れない。なぜならばcJunは転写

MuscLe DezJe10♪ment（F．Stockdale

因子AP−1としての活性を持ち，いくつかの遺伝

Kedes，eds．）．Alan R．Liss．Inc．，New子の転写活性化または転写の抑制を行なうからで
ある。

＆L．

York，Pp．95−104．

2）遠藤剛（1989）厚生省神経疾患研究委託費

この研究の結果から，骨格筋細胞の最終分化に

tt筋ジストロフィー症の発症に関する遺伝子

ともなう増殖の停止と脱分化にともなう細胞分裂

工学的基礎研究（野々村班） 昭和63年度研究報告書，pp．103−109．

の再開も，増殖中の細胞の細胞周期と同様に，Cdc2のキナーゼ活性の変動によって調節されていることが推測される。増殖中のHeLa細胞の場
合，Cdc2のmRNA量とタンパク質合成量はG2からM期にかけて増加するが，そのタンパク質総3）Weinberg．R．A．（1991）Science254：1138−1146．

4）Moreno，S．＆Nurse，P．（1990）CeZl61：
549−551．

量は細胞周期を通じてほとんど変化しないna。し5）Lewin，B．（1990）CeL161：743−752．

かしC2SVT細胞の最終分化と脱分化の過程では，

6）Endo，T．＆Nadal−Ginard，B．（1987）

Cdc2のmRNA量のみならずタンパク質量も変動

Cg／／49：515−526．

した。これは増殖中の細胞の場合には細胞周期の7）Tokuue，Y．，Goto，S．，lmamura，M．，

各期が短いために，ある程度の長さの寿命を持つ

Obinata，T．，Masaki，T．，＆Endo，T．

と思われるcdc2タンパク質の総量は変動しない（1991）助A CgJJ励∫．197：158−167．

が，最終分化の場合にはcdc2の合成が低下する

8）Endo，T．＆Goto，S．（1992）submitted

GO／Gl期が長いために，そのタンパク質量が減少したものと思われる。

for publication．

9）遠藤剛（1990）厚生省神経疾患研究委託費

119

れ筋ジストロフィー症の発症に関する遺伝子

物学的基礎研究（小沢班） 平成2年度研究報

工学的基礎研究（野々村班） 平成元年度研究告書，pp．94−100．

報告書，pp．30−37．
1012）McGowan，C．H．，Russell，P．，＆Reed，

Endo，T．（1992）submitted for publica−

S．Ⅰ．（1990）〟oJ．Cg打．βわ7．10：3847−

tion．

3851

11）遠藤剛（1991）厚生省神経疾患研究委託費
筋ジストロフィー症の発症に関する細胞生

13）Hunter，T．＆Pines，J．（1991）Cell66：
1071−1074．

120

19 筋細胞分化制御因子の機能の解析

鍋

要

島

旨

陽

一＊

められている。4種の筋分化制御因子は何れも筋分化制御因子群の機能を筋細胞で特異的に発Helix−Loop−Helix構造を分子の中央に持ち，そ現する遺伝子の転写誘導能を指標に検討し，次ののN末端側に塩基性配列を持つDNA結合蛋白で結果を得た。1）骨格筋ミオシン軽鎖遺伝子のエあり，中胚葉多能性細胞を筋芽細胞へと誘導する

ンハンサー領域には5個のEboxが並んでおり，活性を有しているがその機能分担，階層性，因子

MyoD，myOgeninは異なる配列を認識してエン間の相互作用など詳細な機能については不明な点

ハンサーを活性化している。2）プロモーターにも多く残されている。筋分化制御因子はDNAに

はMLCboxとEboxが並んでいるが筋分化制御因

直接結合し，ヒエラルヒーの下位に位置する遺伝

子はMLCboxに直接結合しないがMLCboxを活子の転写を制御することによって様々な現象に関性化して転写を誘導する。Eboxを介しての転写与していると考えられるが，筋収縮蛋白遺伝子が誘導は極めて弱いがEboxがMLCboxと並んでいそのターゲットの一部であることが明かとなり，ることにより，全体の活性が3倍に増大すること

転写誘導機構の解明が進められている。我々は以から，MLCboxとの相互作用による転写の増大に前よりミオシン軽鎖遺伝子群の転写誘導機構を解Eb、0Ⅹが機能している。3）2つの全く性質を異析してきたが，これらの遺伝子群のシスの制御因にする因子であるEboxとMLCboxの活性化に筋子に対して筋分化制御因子群がどの様に作用する

分化制御因子が関与しており，筋特異遺伝子の発かを検討することによって筋分化制御因子群の機

現は筋分化制御因子群によって一元的に制御され能の一端を明かにしたので報告する。

ている可能性が高い。
実
は

じ

め

に

筋細胞は中胚葉多能性細胞より筋芽細胞への決

験

方

法

1）筋分化制御因子を強制的に発現するプラスミ
ド，発現制御機構をテストするプラスミドの構

定，引き続く筋管細胞への分化，筋管細胞におけ築る収縮構造の形成に代表される生化学的分化のプ

ニワトリ骨格筋のcDNAライブラリーよりマウロセスを経て形成される。この過程の制御に最もスのMyoD，myOgeninをプローブとしてクロス

重要な役割を負う因子としてMyoD遺伝子が単離

ハイブリにより，3種の筋分化制遺伝子（CMDl，されて以来，筋細胞分化の分子機構の研究は急速

myogenin，MRF4）をクローン化した。次いで各に発展し，現在では4種のMyoD類似の筋分化制種の細胞で普遍的にかつ強く発現するアクチン遺御遺伝子が分離され，その機能の詳細な解析が進伝子のプロモーターの下流にcDNAを連結し，強制発現プラスミドを構築した。テストプラスミ＊国立精神・神経センター神経研究所 遺伝子工学研
究部

ドは（9骨格筋型ミオシンアルカリ軽鎖LClf遺伝子の5

上流領域3．3kbと大腸菌CAT遺伝子を121

連結したもの，及び㊥5 上流配列より2kb上流に存ドを織維芽細胞に導入し，転写誘導活性を測定し在するエンハンサー配列を除いたもの，㊥エンハンサ

たところ，MyoD，myOgeninは転写を誘導する

ー配列をLClf遺伝子のプロモーター上流に連結しがMRF4は転写を誘導できなかった（図1）。このたもの，④LClf遺伝子のプロモーターを−299まで

活性はエンハンサーを取り除くことによって失わしか持たないものを構築し，エンハンサーにたいするれることから，MyoD，myOgeninがエンハンサ

筋分化制御因子の作用の検討に使用した。第2のーに作用した結果と判断し，次ぎにLClf遺伝子

テストプラスミドは胚型ミオシン軽鎖し23遺伝子のの上流299bpまで含むプロモーターにエンハンサ

プロモーター配列にCAT遺伝子を連結したもの，プーを連結したテストプラスミドに対するMyoD，

ロモーターに存在するMLCbox，Eboxの一方を欠い

myogeninの作用を検討したところ，MyoDは転たもの．両者を欠いたものを構築し，MLCboxに対写を誘導するがmyogeninは転写を誘導できなかする筋分化制御因子の作用の検討に使用した。

った。この結果から，MyoDは上流2kbに存在す

2）転写誘導活性の測定

るエンハンサー配列を活性化し，LClr遺伝子のテストプラスミドと筋分化制御因子強制発現プ転写を誘導するがmyogeninはエンハンサー配列

ラスミドをリン酸カルシウム法で10Tl／2細胞に加えて第2のシス因子を必要としていることがあるいはニワトリ繊維芽細胞に導入し，発現した示唆された。myOgeninに応答するシス因子のCAT活性を測定し，転写誘導活性とした。

検索を行なったところ，MyoDに応答するエンハ
ンサー（ELCIDと名付けた）の3，端側に並んで実 験 結 果存在することが明かとなった（図2）。ELCIDは

1）エンハンサーに対する筋分化制御因子の作用

2個のEboxより構成されているが，myOgenin

MyoD，myOgenin，MRF4発現プラスミドとに応答するエンハンサー領域（ELCIG）にも3個

LClr遺伝子の上流3．3kdをもつテストプラスミのEboxが存在し，結果として5個のEboxが並ん

CMyOgenin

でMRF4

CATACtiYity

2L＿t

SkeletaIMuscleMyosinA】kaliLight
ChahGeneUpstreamR喀血

図1筋分化制御因子による転写誘導122

でおり，MyoD，myOgeninは異なるEboxを認識し子とMLCboxの直接の結合は確認されないことてLClr遺伝子の転写を誘導していると考えられから，筋分化制御因子がMLCboxに結合する転る。図2にその配列を示すがエンハンサーとして

写因子の発現を誘導し，二次的にMLCbox を活

よく解析されているMCK遺伝子のエンハンサー

性化している可能性が高い。

と高い相同性を持つことを併せて図示した。MRF4
もEboxを認識して転写を誘導すると推察される

考がMRF4に応答するシス因子は末だ明かにされ察

エンハンサーに対する作用が3種の筋分化制御ていない。

因子で異なっていることを明かにしたが，特に

2）MLCboxに対する筋分化制御因子の作用

MyoD，myOgeninが認識するEboxが区別され胚型軽鎖し23遺伝子のプロモーターは筋細胞でたことに意義を認めたい。この違いがMyoB

強く遺伝子を発現するが，この領域にはMLCbox

myogenin分子のどのドメインに依存しているかとEboxが並んでおり，その役割を検討した。図を明かにすることが次ぎの課題である。MRF4に3に示すように何れの筋分化制御因子もL23プロ

よる転写誘導は確認されなかったが，MRF4によモーターを活性化する機能を有している。MLCbox

り内在性のLCl／LC3遺伝子の発現は誘導される。

を欠くとたとえEboxがあってもその活性は著し

この結果は本実験で使用した領域にはMRF4に応く減少するがEboxを欠いても十分活性が保持さ答する領域が含まれていない可能性を示唆していれる。さらにMLCboxのコア配列に変異を導入る。筋細胞で発現する遺伝子の発現制御領域にはすると筋分化制御因子に応答する活性を失うことEboxとCArGあるいはMLCboxが存在し．このも明かとなった。なお，Eboxが並んでいると両者が筋分化制御因子の制御下にあり，筋細胞にMLCbox単独に比して約3倍の活性が認められおける特異的発現，筋管細胞への分化に伴う発現る。これは両因子が単独で機能する活性を足した誘導の基本要素となっている。これらのことを図ものよりはるかに高いことから，両因子に結合す4にまとめた。

る蛋白が相互作用し，より機能的に高度な複合体が形成されることを示唆している。筋分化制御因

MouseMCK

5㌧TTAACCCAGACATGTGGCTGCTCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTGAGCCTCAC−3．

ChickELCID5一−AGGAGCTGCAGATGCCAGCAATATCTCACATCCTCAGCTGCTGCTGCTTTCCCTT−3．

ChickELCIG GGGCAAATCCCAGCAAGTGTGAGGCTGGGGGTTCGCTCAAGTGCTTGTGCTCACAGGAAGAGGCTGCTAACAGCACGAGAGGAGCCATCCTGCTGCGGCAGCTGCAGAGC
ACAGGGACACATCTCCACGCTTTGCTCCCAGGGGACAGGCAGGCACAGCCCACACACTCCCAGGGATGTCCTGGACACATCC

図2

LCl遺伝子EnhancerのCore配列

123

豊野Qレ﹂刃巾既神慮Q帖由轟嘉と女鹿＝†阿uくトYhEUU

hh

JEUA

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UYhY巨UU ト↑UトトトトUYU

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ポ0月 U．営﹄■■■訂■罰

1

トトトUU↑U↑UU UUUuUUトト≡・邑﹂琵璧岬も夜∪この一︒己︒よ恥題望MNJQ軒国璽岳だ虫塙 の区

UUqUUトUqhU UhUqUペトUト︒⁝法上︒劇HOd⁚H

UuVUUトUuトU uくUuくトUくY↑のM0月 U．営u＋＋∇⁝．■﹁：；一一≡：t一．⁝l⁝．■⁝．一1．

−1

■

ロ

■−●−

ト

■■Vぅち‰

甲
噂
．
咄
∴転

2

■

124

文

献

1）Fujisawa−Sehara A．，Natx，Shima Y．，

3）Uetsuki T．，Fujisawa−Sehara A．，
Nabeshima Y．，and Nabeshima Y．

Komiya T．，UestukiT，and Nabeshima

Regulation of the chicken embryonic

Y．Differential trans−aCtivation of

myosinlight−Chain（L23）gene．Mol．

muscle−SpeCific regulatory elements by

Cell．Biol．（1989）10，2562−2569

chicken MyoD，Myogenin，and MRF4・

4）Shiraknta M．，Nabeshima Y．，Konisi T．，

J．Biol．Chem．in Press
2）Fujisawa−Sehara A．，Nabeshima Y．，

and FujiiTKuriyama Y．Upstream
regulatory reglOn forinducible

Hosoda Y．and Nabeshima Y．Myogenin

expression of the chicken skeletal

contains two domains conserved among

myosin alknlilight−Chaingene．Mol．

myogenic factors．J．Biol．Chem．（1990）

Cell．Biol．（1988）8，2581−2588

265，15219−15227

125

Ⅴ

発

生

工

学

20．トランスジェニックマウスを用いたジストロフィン遺伝子発現の調節の試みとマウスジストロフィン様cDNAの構造解析
21．mdxマウス由来胚幹細胞株の樹立及びその利用

127

134

127

20

トランスジェニックマウスを用いたジストロフ

ィン遺伝子発現の調節の試みとマウスジストロ
フィン様cDNAの構造解析

木

村

穣＊

研究協力者 勝 木 元 也＊，＊＊鍋 島 陽 一＊＊＊梶 原 景 正＊＊＊＊浜 之 上 誠＊＊＊長谷川 孝 徳＊＊ 横 山 峯 介＊＊
竹 光 正 和＊＊＊埜 中 征 哉＊＊＊

は

じ

め

に

CDNAライブラリーより，ジストロフィン様cDNA

我々は導入遺伝子の構造を工夫することによっの単離を試み，昨年度は一つのcDNAクローンをて，遺伝子導入マウス（トランスジェニックマウ

単離することができた。本年度はcDNAクローンス）個体内でジストロフィン遺伝子発現を抑制すの塩基配列の全決定を行ったのでここに報告する。

ることを目的として研究を進めている。近年，デュシェンヌ型（DMD）およびベッカー型（BMD）

材料と方法

筋ジストロフィー症の原因はジストロフィン遺伝

トランスジェニックマウス作成にはC57BL／6子の変異にあることが強く示唆されてきたが，実系統の受精卵を用い，Gordonらの方法によって験動物としてよく用いられるマウスにおいてはわ

DNAを導入している7）。継代にあたっては，通常，ずかに∽血の点突然変異が知られるのみであり，初代マウスの性成熟を待って交配したが，一部はこの遺伝子の機能的な発現の調節機構や発現異常

体外受精も行った。また早期に死亡した雌の初代と発症との関係を個体レベルで検討する系は未だ

マウスについては，卵巣移植によって可能な限り，確立されていないのが現状である。本年度は，昨子孫取得に努めた。

年度作製したトランスジェニックマウスについて，

一部のトランスジェニックマウスについては採その系統化に取り組むと共に一部の解析を行った。

材を行い，導入遺伝子の発現をまずRNAプロッ

また，一一万でジストロフィン遺伝子に類似した

ト解析により検討した。また同時にジストロフィ遺伝子の存在や，筋肉以外の組織におけるジスト

ン抗体を用いた組織化学的解析も行った。

ロフィンの発現が報告されているが1ト6），特に脳におMD911クローンの塩基配列決定にあたっては，けるジストロフィン様タンパク質の発現は，DMD

まずlgtlOにクローン化されたcDNAをBluescript

等で時として観察される精神遅滞との関連を想起

SK（＋）に再クローン化したのち，Exonucl占aseⅢおさせるものであることから，初代神経培養細胞のよびMung BeanNucleaseを用いて数々の欠失変
異体を作成した。これらのクローンを鋳型とし，＊東海大学医学部＊＊（財）実験動物中央研究所＊＊＊国立精神・神経センター＊＊＊＊神奈川歯科大学

Sanger法によりcDNA両鎖の塩基配列を決定し
た。

128

結

リペプチドを筋肉細胞内に発現させ，ジストロフ

果ィンの機能的な発現を阻害しようと言うものであ1．トランスジェニックマウスの系統化
マウス個体内でジストロフィン遺伝子の機能的る（図1）。両遺伝子とも，すでに我々が他のトラ発現を抑制するために，昨年度我々は2つの導入

ンスジェニックマウス作製で有効性を確認した

遺伝子を構築し，トランスジェニックマウスを作

cDNA発現ベクターの骨格を持ち，またジストロ製した。まず第1は，ジストロフィン遺伝子のフィン遺伝子のプロモーターはよく解析されていmRNAに相補的なRNAを産生するアンチセンス

ないことから，筋肉細胞に発現するプロモーター

導入遺伝子を用い，筋肉細胞中でジストロフィン

・エンハンサーとして，マウスミオシン軽鎖遺伝

タンパク質の発現を抑制しようというものであり，子3型のプロモーター（MLC3）およびエンハン

また第2は，ジストロフィンの膜直下での局在とサーを配置している8・9）。

その機能的な発現の相関が強く示唆されることか

昨年度報告したように，MADから3匹，MSD

ら，機能的には欠陥を持ちながら本来の局在場所

から7匹のトランスジェニックマウスが得られたでは，正常なジストロフィンと競合するようなポが，それぞれ一匹ずつ早期に死亡し，またMSD

MAD XL巌も「占繭−」C−
VS−qZ〇u

9一己〇LUMSD
hILC3
ミオシンアルカリ
軽仏遺伝子
プロモーター

mc2−6

mc2D−5A

シグナル

エンハンサー

マウスジストロフィン
CDNA

図1導入遺伝子の構造

A（10●0□矧ロqロロ旧闇ロロ○（100相H副｝ロ△0厄批孔コロロコ

図2 MADⅡ2−4m系統図（00は雌，コロは雄，△Aは早期死亡個体，
×は食殺を示す。（｝BAはへミ型接合体であることを示す。）

qO伯闇旧

129

の別の一匹は生後一日目に卵巣移植を行った。

について観察したが，MSDⅡ1−2mにおいて初代

MADの出生数に対するトランスジュニックマウ

マウスが生後1日目に死亡し，わずかに継代されスの取得率（8．3％）はMSDのそれ（25．0％）に比た一匹の子孫が生後22日目に突然死亡したほかは

べかなり低かった。

正常マウスと全く変らなかった。

今年度は初代マウスのうち，MAD2匹（MAD

現在，導入遺伝子の発現およびジストロフィン

Ⅱ2−4m，MADⅡ2−11m）およびMSD6匹（MSDの発現について，それぞれRNAプロット解析おⅡ1−2m，MSDⅡ1−13p，MSDⅡト14p，MSDⅡ2−

よび免疫組織抗体法について検討しているが，前9，MSDⅡ2−12p，MSDⅡ2−13p）について継代者については5系統6匹中発現を確認されたものを試みた（右肩のm・pはそれぞれ雌，雄をあらわす）。

はなく，また後者についても6系統15匹の検体中継代の結果，図2−図8の系統図に示すような子にジストロフィンの発現が顕著に低下したと思わ孫が得られた。このうちMADⅡ2−11mについてれる検体は兄い出されていない。

は，卵巣移植まで試みたが子孫は得られず，また2．ジストロフィン様mRNAに対するcDNAの

図7に示すMSDⅡ2−12pの場合もトランスジェ

全塩基配列決定ニックマウスの継代は不成功であった。そのはか

このcDNA（MD911）は，胎生17日目のマウスのマウスについてははぼメンデルの法則にしたが脳の初代培養cDNAライブラリー約8Ⅹ104クローった導入遺伝子の伝達を示した。

ンからヒトジストロフィンmRNAの3，末端側初代マウスおよびその子孫について症状の有無（7875−13973）に相当するcDNAをプローブと

［コ

△（｝×

〇〇〇□□

22dD

図3

MSDⅡ1−2m系統図

AA△AO（｝□
図40000（IO厄和訓コ

MSDⅡト13p系統図

130

A（｝○ロ皿iロ○［iロロロ
図500□×000ロロ帽引jMSDⅡ1−14p系統図［］△△△○ロロ正ロロ

OqHiE口丁ロロロ

ロ⊂沌引コロ○（100ロ田口ロ△△△△0咤引コロ
図6

OqHIOqH｝ロロ

MSDⅡ2−9m系統図

、三
〇

〇

○［コ［コロ［コ［コロ［］⊂］〇 〇 〇 〇［コ［コ［コ［コ図7

MSDⅡ2−12p系統図

00□ロロ帖引j□

131

図8

MSDⅡ2−13p系統図

して，スクリーニング，単離されてきたものであ

たMLC3は，心筋では発現しないこと，またマる。MD911の塩基配列の決定は，CDNA部分を

ウスMLCプロモーターにラットのMLCエンハン

Bluescript SK（＋）ベクターに再クローン化した後，サーがうまく作用するかどうかなどの問題点が存欠失クローンを系統的に作成しジデオキシ法によ在する。またMSDから産生されるタンパク質がって行った。単離したcDNAは776bpで，一部に内在性ジストロフィンと競合する保証はない。今連続した欠矢がみられるものの，ヒトジストロフ

後同様の目的でのトランスジェニックマウスの作

ィンcDNA3末端（非コーディング領域）と83％

製においては培養細胞系での発現確認なども必要のホモロジーを示した（図9）。ヒトーマウス間のとなろう。ただMADトランスジェニックマウス

非コーディング領域の相同性としては非常に高いの取得率が低く，継代例は1例であること，あると思われ，また，いくつかのエネルギー的に安定

いはMSDⅡト2mにおける2例の死亡例などはな

なステムアンドループ構造をとり得ることが判明

んらかの導入遺伝子の効果を示すものかも知れなした。

い。
一方，昨年，マウス胎児大脳初代培養細胞

考察

cDNAライブラリーからジストロフィン様mRNA

現在ジストロフィン遺伝子に変異を持つマウスに対するcDNAが単離し，一部の塩基配列を決定

で解析が進んでいるものは点突然変異のmdガのみしていたが，今年度はその全塩基配列を確定するである。ジストロフィン遺伝子の発現はDMD／

ことができた。マウスのジストロフィンmRNA

BMDの発症に深く関わっており，個体レベルでの3 側の塩基配列が明らかにされていないため，

この遺伝子発現を抑制したマウスが作成できれば，これがジストロフィン本来のmRNAに由来する

ジストロフィン遺伝子発現の調節機構のみならず，かどうかは現在のところあさらかでないが，図9

本疾患の発症機構の解明や，治療法の検索に役立に示すようにヒトジストロフィンmRNAに対す

つマウスができるものとして本計画はスタートしるcDNAとの相同性は非常に高く，マウスのジス

た。

トロフィンmRNAの3しかしながら，現在のところ導入遺伝子の発現は確認されず，またジストロフィンの発現低下や側の配列を反映している可能性は十分にある。
今回mRNAの3

非翻訳領域における種間を越症状の出現もほとんど皆無である。MLCl／3共にえた高い相同性が兄い出されたことは興味深い。

骨格筋で発現するものの，今回やむを得ず使用しmRNAの安定性などに関わっている配列なのか

132

TTAACTTCmG

111308111AGTGTAATTAGCTTTTGGAGAGTGGGCTGACATC＾AGTGT＾ATTAGCTTTTGGAGAGTGG
12I CGAGTGGGTTTTGTCCATTATTAATTGT八八TT＾＾CATC八八八CACAGCTTCTCATGCTATT★★ ★
★★ ★★★★★★★
★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★★★★★★★★★★」＝■★★
13141II GTTTTGTCCAでTATTAATAATTAATT−−AATTAACATCAAACACGGCTTCTCATGCTATT
72I TCTACCTCACTTTGGTTTTGGGGTGTTTCTAGT八ATTGTGCACACCT九ATTTC＾CAACTT★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★
★★★★★★★★★★★★★★★ ★ ★★★★★★ ★★★

13199．．TCmCCTCACTTTGGTTTTGGGGTGTTCCTGATAATTGTGCACACCTGAGTTCACAGCTT
1321cACCACTTGTCTGTTGTGTGGACACCAGTTTCC−−一一一一−−−−−一一TTTTTTCATTTATA★★★★★★★★★★★

★★★

★★

★

★★★★★

★★★★★★

★★

★★★

13259．．CACCACTTGTCCATTGCGTTATTTTCTTTTTCCTTTATAATTCTTTCTTTTTCCTTCATA
179I ATTTCCAAAAGAAAACCCAAAGCTCT入AGATAACTATITT−−G八九八TTTGGTTCTGGTCTT★★★★ ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★★★▲★★★★
★★★★★
★
★ ★ ★

133191．ATTTTCAAAAGAAAACCCAAAGCTCTAAGGTAACAAATTACCAAATTACATGAAGATTTG
237，G−CTTTCTCTCTC−TCTCTCTCCTTTATGTGGCACTGGGCATTTTCTTTATCCAAGGATT
★

★★★

★★★

★

★

★

★

★★★★★★★★★★★

★

★★★★

★

★★★★★★★★★

★★★★★★★★★

133791．GTTTTTGTCTTGCATTTTTTTCCTTTATGTGACGCTGGACCTTTTCTTTACCCAAGGATT
295．TGTTTTCACCAAGATTでAAAACAAGGGGTTCCTTT一一一−CCT＾CT八八GTLAGTTT一一−−−−★ ★★
★★
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★★★
★★★★★★★★★★★★★★★
13439tT−TTAAAACTCAGATTTAAAACAAGGGGTTACTTTACATCCTACTAAGAAGTTTAAGTAA

345T−TAAGTTTCATTCTAAAATCCmGGTAGATAGAGTGC一一−−ATAGTTTTGTTTTnnTCTT★★★★★★★★★★★★★★★★★★★

★★★★★

★★★★★★★★★

★★★

★★★★★★★★★★★★★★★

13498TI GTAAGTTTCATTCTAAAATCAGAGGTAAATAGAGTGCATAAATAATTTTGTTTTAATCTT
400■

TTCGTTTTATCTTTTAG−−ATATTAGTTCTGGAGTGAATCTATCAAAATATTTGZmTAnA

オ★

★

★★★

★★★★★★★★

★

★★★★★

★★★★★★★★★★

★★★

★★★

★★★★★★★★★★

★★★

13558t−TTTG−TTTTTCTTTTAGACACATTAGCTCTGGAGTGAGTCTGTCATAATATTTGAACAAA458−

AACTGAGAGCTTTATTGCTG−ATTTT＾＾GCAT∧A−−−−TTTGG＾C＾TC＾TTTC−−−−−AT★★ ★★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★★★★★★★★★★★★
★★★★★★★★★ ★★★★★
− ★

13617．．AATTGAGAGCTTTATTGCTGCATTTTAAGCATAAでTAATTTGGACATTATTTCGTGTTGT

508I GTTCTTTATAACCATCAAGTATTAAAGTGTAnATC＾T＾＾TCAGTGT九八CTG八八GC＾T＾＾T★★★★★★★★★★★★★★ ★ ★★★★★★★★★ ★★★★儀＝■★★★★★★
★★★★★★★★★★★★★★★★
136771−GTTCTTTATAACCACCGAGTATTAAACTGTAAATCATAA−−TGTAACTGAAGCATAAA

568，cATCACATGGCATGTATCATCATTGTCTCCAGGT＾CTGGACTCTTACTTG＾GTATC＾TZn★★★★★★★★★★★★★★★ ★
★★★★★★★ ★ ★★★★★★★★★
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★

13733．cc TCACATGGCATGTTTTGTCATTGTTTTCAGGTACTGAGTTCTTACTTGAGTATCATAA
6281TAGATTGTGTTTTAACACCAACACTGTAACATTTACTAATTATTTTTTTnAACTTCAGTT★★

★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★

★★★★★★★★★★★★★★★■★★★★★★★

13793TT TATATTGTGTTTTAACACCAACACTGTAACATTTACGAATTATTTTTTTAAACTTCAGTT

688■

TTACTGCATTTTCACAACATATC＾GATTTC＾CCnn＾T＾TnTGCCTT＾CT＾TTGmTT八T＾★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★■‖l★★★★★★★

13853T．mCTGCATTTTCACAACATATCAGACTTCACCAAATATATGCCTTACTATTGTATTATA
7481TTACTGCTTTACTGTGTATCTCAAT八八八G
13913

GTACTGCTTTACTGTGTATCTCAATAAAGC＾CGCAGTTATGTT＾C

図9MD911の全塩基配列（ヒトジストロフィンcDNA3
較の結果，一致するカ所を＊でしめす。）

末端配列との比133

も知れない。

5）Feener CA，Koenig M et al．：

また昨年度報告したように，これをプローブとAlternative splicing of human

してRNAプロット解析を行うと，新生マウス脳，

dystrophin mRNA generatesisoforms

心猿・肺共に5kbのmRNAが検出されると共に，

at the carboxy terminus．Nature

脳で特に8kbのmRNAが強く反応する（ジストロ509−511，1989．

フィンmRNAと思われる＿14kbのRNAは心臓・

338，

6）Hoffman EP，Monaco AP et aL：

肺のみに検出される）。Bar等は成体ラット脳にConservation of the Duchenne Muscular

おいて同様なRNA（6．5kb）の存在を認めており10），

Dystrophy Genein Mice and Humans．

もしこれらが同一のジストロフィン遺伝子に由来

Science238，347−350，1987．

するものならば，少なくとも竃歯類の脳において7）GordonJW，Scangos GA et aL：は従来の報告に比べ，はるかに長さの短い異型ジ

Genetic transformation of mouse

ストロフィンmRNAが存在することになり，今

embryos by microinjection of pulified

後DMDにおける精神遅滞との関連を考えていく

DNA．Proc．Natl．Acad．Sci．USA

上で注目すべき事実であると考える。

7380−7384，1980．

77，8）Rosenthal N，KornhauserJM ei aL：
文献1）Hoffman EP，Kunkel LM ei al．：

Myosinlight chain enhancer activatesmuscle−SpeCific，developmentany

Dystrophin Abnormalitiesin Duchenne／

regulated gene expressionin transgenic

Becker Muscular Dystrophy．Neuron2；

mi（黒．Proc．Natl．Acad．Sci．USA

1019−1029，1989．

7780−7784，1989．

2）Love DR，Hill DF et al．：An86，9）Donoghue M，Ernst H et aL：A muscle−

autosomal transcriptin skeletal m11SCle

specific

Withhomology to dystrophin．Nature

end of the myosinlightTChainl／3

339，55−58，1989．

genel∝uS．Genes and Develop．2，

3）Hoffman EP，Ihdecki MS et aL．：
Ce11and Fiber−type Distribution of
Dystrophin．Neuronl，411−420，1988．
4）ChellyJ，KaplanJC ei al．：

enhancerislocated

at

the3

1779−1790，1988．

10）Bar S，Barnea E et aL：A novel
product of the Duchenne muscular
dystrophy gene which greatly differs

Transcriptin of the dystrophin genein

from the knownisoformsinits

human muscle and non−muSCle tissues．

struCtllre and tissue distriblltion．

Nature333，858−860，1988．

Biochem．J．272．557−560，1990．

134

21

mdxマウス由来胚幹細胞株の樹立及びその利用

花 岡 和 則＊

は

じ

め

に

患モデル動物の開発のための基礎的研究の一つと胚幹細胞（ES）株は，発生過程のマウス胚の中してES細胞株を効率的に樹立するための培養条で活発に増殖・分化を行っている全能性未分化幹件について検討を加えてきた。本年度は，ジスト細胞である。ES細胞は，生殖巣の腫瘍である奇ロフィン遺伝子が欠損し筋ジストロフィーのモデ

形歴の未分化幹細胞（胚性癌腫細胞，EC細胞）

ルマウスと考えられているmdxマウス胚に由来すと性質が類似しており，1）培養下で無限増る胚幹細胞の樹立について報告し，その応用につ殖能を有すること，2）正常なマウスの初期胚（胚いて考察する。また，これらの胚幹細胞を用いて盤胞）に注入すると体内のあらゆる細胞（生殖細gene targetingを行うための予備的な研究につい胞を含む）に分化しキメラマウスを形成できるこてもその概略を報告する。

とがこれらの細胞の著しい特徴である。この性質を利用すると，培養下で遺伝子操作を施した胚幹

胚幹細胞の樹立

細胞を用いてキメラマウスを作成し生殖細胞へ分［方法］1）初代培養 マウス胚盤胞期胚（受精化させその子孫を得ることにより胚幹細胞を担体

後3日）を培養条件下（15％FCSを含むDMEM）（vehicle）としたマウス個体の遺伝子操作が可能に移す。胚は通常3−5日目には，培養ディッシとなる（図1）。この手法は，直接マウス受精卵にュ上に発達した卵円筒様構造を形成した。実体勤遺伝子を導入する方法に比べいくつかの利点があ

微鏡下でこれらの胚の胚体外胚妻（原始外胚葉）

る。特に，相同組み換え反応（homologous recomの部分を単離し，トリプシン／EDTA処理によりbination）を利用することにより任意の遺伝子のこれらの細胞塊を軽く解離した後，フィーダー細機能が破壊された幹細胞株を単離することができ胞上に移した。フィーダー細胞としては，マウスるという報告は，この手法（Gene Targ eting）（12−15日胚）由来初代培養繊維芽細胞及びSIMの応用範囲を飛躍的に広げるものであり，広範なマウス由来株細胞であるSTO細胞株にマイトマイ

注目を集めている。

シン処理を施したものを用いた（10上り／ml，3hr）。

胚幹細胞は，奇形脛幹細胞に酷似した細胞であ2）培地

様々な培地を検討した結果，DMEM

るが，腫瘍の過程を経過していないことから初期培地に，メルカプトエタノール（10￣7M），非必

胚細胞により近い性質を保持していることが期待

須アミノ酸（シグマ，200培希釈で使用），アデノ

でき，事実胚操作の担体としては有利な点が多い。

シン，グアノシン，シチジン，ウリジン（各3mM），

反面，胚幹細胞株の樹立は奇形歴より困難であり，チミジン（1mM），LIF（Leukemiainhibi tory

一般的な技術として確立されたものとはいえない

factor，102U／100ml）を加えたものを使用した。

のが現状である。我々は，キメラ法を利用した疾血清は40以上のロットのうち最もES細胞の増殖のよいものを選び使用した（血清濃度，20％）＊国立精神神経センター神経研究所［mdxマウス由来胚幹細胞の樹立］

135

上川，川ぎ
J

遺伝子の導入

L丁Trr．TR」

薬剤による選択∵」」細胞のクローニング↓L」l l解析選別1七．昌江爪此盆

キメラマウス

交配

ご＝ここ（生殖細胞への分化

匡日．胚幹細胞を利用したマウス胚の遺伝子操作

B6C3HFlマウス胚を用いて，胚幹細胞の樹立［mdxマウス由来胚幹細胞の標識化］の条件を検討した。培養下に移された胚細胞は多今回樹立されたmdxマウス由来胚幹細胞は，ジくの場合極めて不安定であり，数週間後には様々

ストロフィンの欠損した発生的多能性未分化幹細な細胞に分化しその増殖性を失った。3（Xカ個以上胞であり，正常なマウス胚に注入するとキメラマの胚を用いて，培地の組成，継代方法，フィーダ

ウスを形成し，ジストロフィン遺伝子の機能や発ー細胞などについて様々な検討を加えた。最初に

現の解析に威力を発揮することが期待される。キマウス胎児の初代培養繊維芽細胞をフィーダー細メラマウスを解析するためには，キメラを構成す胞として用い，細胞の増殖が安定した後にSTO

る二種類の細胞群（mdxマウス由来胚幹細胞及び細胞株をフィーダーとして用いることにより効率

宿主胚細胞）を組織レベルで判別できることが必

的に幹細胞を未分化状態で分離できることを兄い須である。そこで，mdx胚幹細胞に外来遺伝子をだし，3株のES細胞珠を樹立した。この方法に導入し標識化することを試みた。導入遺伝子としより，197個のmdxマウス初期胚から17株の胚幹ては，昨年度の研究で普遍的に発現することが確

細胞株を単離することに成功した（図2）。これら

認されているヒトペプチド進展因子（EFlα）プの細胞株はいずれも体外で長期間安定に維持できロモーターに核移行シグナル及び標識遺伝子としること，培養下で高い分化能を有することが確認て大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ（LacZ）遺伝子をされており，現在生殖細胞への分化能について検連結したプラスミドpEFNLacZを作成した。こ討を急いでいる。

の遺伝子をリン酸カルシウム法によりmdx胚幹細136

図2．mdxマウス由来胚幹細胞株

胞に導入し，核が標識化された細胞株を単離したた。

（図3）。核だけを標識することにより，いくつか［方法］N−myC遺伝子のプロモーターを除き，の組織の細胞質で発現している内在性β−ガラク

さらにそのエクソンの一部をネオマイシン耐性遺トシダーゼとの区別が可能となり，組織レベルで伝子と置き換えた遺伝子断片を作成し（図4），電のmdx細胞の追跡に有効な実験系を構築すること

気窄孔法により胚幹細胞株に導入した。これらのが可能となった。

細胞をネオマイシン存在下で培養することにより，相同組み換えにより宿主染色体上のN−myC遺伝

胚幹細胞を用いたGene targeting技術の確立

子が導入遺伝子と交換した細胞（ネオマイシン耐マウスの細胞に導入された外来遺伝子は，多く性遺伝子を発現する）だけを選択的に単離するこの場合宿主細胞のゲノムの不特定の位置にランダとができる。この方法により65の胚幹細胞株を単ムに組み込まれる。しかし，導入遺伝子と宿主ゲ離した。相同組み換えが生じていることの確認にノムに相同性がある場合，低い確率ではあるが相はサザンハイブリゼーション法を用いた。これら同な遺伝子間で交換反応が生じることが知られての細胞を，マウス胚に注入しキメラマウスを作成いる（相同組み換え，homologous recombination）。

した。誕生したキメラマウスをB6C3HFlマウス

マウス胚幹細胞で相同組み換え反応を利用すること交配した。誕生したマウス（Fl）同士を交配し，とにより，染色体上の特定の迫伝子を選択的に破N−myC遺伝子を欠損した動物個体を作成した。

壊した動物個体を得ることが可能であり，Gene［相同組み換えによりN−myC遺伝子の欠損下マ

targetingと呼ばれている。この手法は，迫伝子

ウス個体の作成］の機能解析や劣性遺伝性疾患のモデル動物の作成

1．ネオマイシン存在下で選択された65の胚幹細に有力な手法として注目されている。我々は，こ胞株のうち約半数の32株のクローンで相同組み換の手法を筋ジストロフィーの解明や筋発生過程のえが生じていることが確認された。

附折に利用するための第一歩として，名古屋大学

2．これらの細胞クローンを用いてキメラマウス

ゲ′レープとの共同研究によりマウスのN一myC通を作成した。誕生したキメラマウスを野生型マウ

信J一・を破雌したマウス個体を作成することを試みス（B6C3HFl）と交配し，3匹のキメラマウス

図3．標識された胚幹細胞株

R8

図4．マウスN−myC遺伝子のGene targetingA）マウスN−myC遺伝子の模式図B）N−myC遺伝子破壊のためのターゲッテイングベクター

において生殖細胞キメラであることが確認された。

スを作成することによりジストロフィン遺伝子のこれらのキメラマウスの子孫（Fl）同士を交配し，機能や発現を今後解析する予定である。また，胚N−myC遺伝子が欠損したマウスを作成した。

幹細胞を用いた実験系のうち最も有力な手法の一

3・この結果からGene targeting技術を確立すつであるGene targeting技術を確立することにることができたと考えられる。

も成功した。現在，この手法を用いて筋形成に関与する遺伝子の機能解析のための共同実験が進行

考察中である。Gene targeting技術は，ヒトの遺伝

本研究により樹立されたmdxマウス由来胚幹細性難治疾患の多くを占める劣性遺伝疾患のモデル

胞株は，ジストロフィン遺伝子を欠損した発生的動物を人為的に作成することが可能な現在唯一の多能性細胞株である。この細胞株の核がLacZ活

実験系と思われる。本年度の研究をもとに，筋ジ性により特異的に染色されるようにデザインされストロフィーのような劣性遺伝性疾患のモデル動た標識遺伝子を導入した細胞株を得た。これらの物作成のための実験系の確立に向けて今後研究を標識化されたmdx胚幹細胞株を用いてキメラマウ

進める予定である。

139

2指−1

筋ジストロフィーの発症に関する細胞生物学的基礎研究
氏

名

所

属

住

所

主任

小沢瑛 二郎国立精神 ・神経センター神経研究所

187

小平市小川東町 4 −1 −10423 （4 6 ）1720

藁葺

真崎

知生

京都大学医学部606

京都市左京区吉田近衛町
075 （75 3 ）439 1

幹事

鍋島

陽一

国立精神 ・神経センター神経研究所

187 小平市小川東町4 −−
1 −1
0423 （4 1）2711

監事

勝沼

信彦

徳島大学酵素科学研究セ ンター

770

分担

飯野

正光

東京大学医学部

113 文京区本郷 7 −3 −1
03 （3812 ）2111

〝

石川

春律

群馬大学医学部

371 前橋市昭和町3 −39 −220272 （31 ）72 21

〝

遠藤

剛

千葉大学理学部

260 千葉市弥生町 1 −33
0472 （5 1 ）1111〝

大 日方 ■昂千葉大学理学部

260

〝

木村

穣

東海大学医学部

2 59 伊勢原市望星台
ー1 1
0463 （93 ）1121

〝

熊本

俊秀

熊本大学医学部

8 60

熊本市本荘 1 」 1 −1
096 （34 4 ）2 111

〝

桑山

秀人

帯広畜産大学080

帯広市稲田町〝小浜一弘

群馬大学医学部370〝

小宮 山政敏千葉大学医学部

280 千葉市亥鼻 1 −8 − 10472 （22 ）7 171

〝

鈴木

紘一

東京都臨床医学総合研究所

113 文京区本駒込3 −18 −22
03 （3823 ）2101

〝

花岡

和則

国立精神 ・神経センター神経研究所

18 7 小平市小川東町 4 −1 − 10423 （4 1）2711

〝

広川

信隆

東京大学医学部

113

〝

松田

良一

東京大学教養学部

153 ￣目黒区駒場 3 −8 −1
03 （3467 ）1171

徳島市蔵本町 3 ￣
0886 （3 1 ）3111

千葉市弥生町 1 −33
0472 （5 1）1111

0 155 （48 ）5111
前橋市昭和町3 −39 −220272 （3 1）7221

文京区本郷 7 −3 − 1
03 （38 12 ）2 111

140

氏￣

名

所

分担

丸山 工作

千葉大学理学部

260

〝

三品

昌美

新潟大学脳研究所

951 新潟市旭町通1−757
025 （223）6161

桃井

隆

国立精神・
神経センター神経研究所

187 小平市小川東町4 −1 −10423 （41）2711〝山下茂

東京大学医学部113

文京区本郷7 −3 −1
03 （3812）2111

顧問

江橋 節郎

岡崎国立共同研究機構長444

岡崎市明大寺町字西郷中
0564 （53）7345

山田 圭津

国立精神・
神経センター神経研究所
・機能研究部

187 小平市小川東町4 −1 −10423 （41）2711

属

住所

千葉市弥生町1−33
0472 （51）1111