厚生

省

新薬開発研究費

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

江

橋

班

平成元年度研究報告書

平成2年3月

研究報告書の作成にあたって
本年度は新薬開発研究の主旨に沿って，本研究班の眼目であったベスタナン及びESTの臨床における薬効判定の二重盲検試験に入った．その成果が待たれるところである．
この研究を通して明らかになったことは，筋ジストロフィーの自然経過について
治療薬検定の指針となるような的確な資料が不十分であったことである．これはどうやら世界的な傾向であって，業績主義の欧米では，この点で我が国よりも杜撰であることは想像に難くない．意外なところに研究のアキレス腱があったわけである．
筋ジストロフィー治療の現実性が乏しかった時代には，薬効判定の立場からの厳密な臨床観察及びテストとその統計学的取り扱いに其の意欲がわかなかったとしても止むを得ないことであった．
この度，本研究班眉の涙ぐましいまでの努力により，幾多のテストを並行させながら，多数の症例の数年にわたる経過が集計されたことは，今後の本症研究者に大きな福音となることは疑いない．
今回の報告に見られた，適切，簡潔なテストと統計的処理は，現代的な臨床試験の一つのモデルを確立したものであって，世界に誇るに足るものと考えられる．
この外にも診断法について，数多くの有意義な知見がもたらされたのも，本年度の特徴であり，その多くが我が国独自の開発である．臨床研究というものが本当の意味で我が国に根を下して来たということであろう．

平成2年3月
主任研究者

江

橋

節

郎

目

次

Ⅰ 分担研究報告
1) CANP遺伝子のクローニングに関する研究

3

─CANPインヒビターの構造と機能─
東京都臨床医学総合研究所

鈴木

紘一

石田

重樹

川崎

博史

西道

隆臣

青山学院大学理工学部 伊藤

尚

林

昌美

榎森

康文

2）細胞内CANPの活性化とその阻害

7

東京都老人総合研究所

川島誠一

3) CANP阻害剤の合成

11

東京理科大学理学部 向山 光昭 植木 正彬
大正製薬株式会社総合研究所 大関 正弘 花田 和紀 玉井 正晴
横尾 千尋 閏名 見事 村田 充男
宮下さつき

4）プロリン含有ペプチド分解酵素とその阻害物質
16
微生物化学研究所 青柳 高明 和田 孝雄 小川 慶治
小島 蕗子 永井真知子 原田 滋子
5) MEL細胞の機能とプロリルエンドぺプチダーゼ

21

国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫 塚原 俊文 石浦 章一

6) E‑64‑CおよびESTの薬物動態24─蛍光HPLCによるマウス血清および筋肉中濃度の測定─
九州大学薬学部 大倉 洋甫 巣

文峰 甲斐 雅亮

7) CANP阻害剤の一般薬理学的研究

30

─表面筋電図中の呼吸運動関連成分の定量化に基づく筋機能評価法に関する基礎的研究─
東京慈恵会医科大学第二薬理学教室 福原 武彦 加藤 總夫 木村 直史
高野

一夫

塚元

葉子

8）骨粗鬆現象におけるCathepsin Bの関与とE‑64誘導体の効果

37

徳島大学酵素科学研究センター

勝沼

信彦

二川

健

唐渡

孝枝

大正製薬総合研究所

花田

和紀

樋口

昭平

村田

光男

千葉大学理学部生物学科 丸山 工作 大日方 昂 小島崇9）哺乳類C‑タンパク質のアイソフォーム特異的モノクローン抗体の作成およびそれを用いた筋病変に伴うC‑タンパク質アイソフォーム変換の解析ⅰ4110) jimpyマウス脳ミエリン局在のCa依在性プロテアーゼ活性の変動
和歌山県立医科大学第二生理学教室 辻繁勝

4611）mdxマウスに対するbestatinの効果

49

東邦大学医学部大橋病院第四内科 木下 眞男 岸
雅彦 栗原 照幸
根本 博之 日高 隆信

12)ベスタチン投与mdxマウスにおける骨格筋組織所見
国立療養所宇多野病院 西谷53

祐 板垣 泰子 斎田 恭子

13) DMD骨格筋CTの経時的変化の検討

57

東京大学医学部脳研病理 中野 今治
国立療養所下志津病院 清水潤 松村喜一郎

東京大学医学部脳研神経内科 川井充 国本 雅也

14) Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進行過程

61

─CTによる経時的評価─
国立療養所東埼玉病院内科 石原 傳幸 青柳 昭雄 儀武 三郎
国立療養所東埼玉病院リハビリテーション科 里宇 明元 原行弘 江端 広樹
近藤 国嗣

15）筋ジストロフィー症の血清LAPについて

65

国立療養所兵庫中央病院 高橋 桂一
国立療養所兵庫中央病院研究検査科 益田 喜信 森鼻 文明 小林 浩子
岡

昭夫

梅枝

孝之

16）ヒト血清中の自己免疫筋抗原(SE‑antigen)の測定

68

国立精神・神経センター武蔵病院 春原 経彦
国立精神・神経センター神経研究所 古川 昭栄 里吉栄二郎
7117）骨格筋ミオシン軽鎖測定のためのラジオイムノアッセイ法のキット化の試み
東京大学医学部第三内科 矢崎 義雄 永井 良三 加藤 祐之

国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫

18）当院においてEST服用を開始した一症例の経過74

─正常児との比較フォローを中心に─
国立療養所西別府病院 三吉野産治 山田みどり 江田伊勢松
19）EST投与Duchenne型筋ジストロフィー症患者の臨床経過:77

─6年目の報告─新潟大学脳研究所神経内科 宮武

正 桑原 武夫 湯浅 龍彦

国立療養所新潟病院 山崎 元義 近藤 隆春

20) Duchenne型筋ジストロフィー症に対するベスタチン長期投与の握力に対する影響
国立療養所箱根病院 村上 慶郎 岡崎
隆 林
梁
正淵

ⅱ

81

英人

21) Duchenne型筋ジストロフィー症幼児例における運動機能─ベスタチン二重盲検例を中心に─
東京女子医科大学小児科

84

福山

幸夫

大沢真木子

斎藤加代子

平沢

恭子

炭田

池中

新井

ゆみ

22) Duchenne型筋ジストロフィーに対するベスタチンの効果に関する研究
─年少児及び年長児に対する二重盲検試験の比較─
東邦大学医学部大橋病院第四内科

沢子

晴美

87

木下 眞男

国立精神・神経センター神経研究所 里吉栄二郎
国立療養所箱根病院 村上 慶郎
国立療養所西別府病院 三吉野産治
東京女子医科大学小児科 福山 幸夫
国立療養所字多野病院 西谷裕

国立療養所兵庫中央病院 高橋 桂一

Ⅱ 低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班分担研究者一覧

ⅲ

93

分担研究報告CANP遺伝子のクローニングに問する研究−CANPインヒビターの構造と機能−
鈴

研究協力者

木

紘

一＊

石 田 重 樹＊榎 森 康 文■西 道 隆 臣事伊 藤

川 崎 博 史＊

尚…

ラット染色体DNAライブラリーを入EM−

は じ め にカルシウム依存性中性プロテアーゼ

BL3をベクターに用いて構築し，上述したラッ（CANP）の内有性インヒビター（CANPイントCANPインヒビターのCDNAをプローブ

ヒビター）はCANPに特異的なタンパク性イに用いてスクリーニングしてラットCANPイ

ンヒビターである．昨年までに，ウサギCANP

ンヒビターの遺伝子クローンを得た．数百塩基

インヒビターに関し，CDNAのローニング及び対に細分したcDNA断片をプローブとして得

その発現実験を行って，CANP阻害活性領域及られた遺伝子クローンのサザンハイプリグイゼ

び阻害機構を検討した1−2）．その結果，CANPイーション分析を行って，各クローンに含まれる

ンヒビターは分子内に3−4回の繰り返し構造

cDNA領域を決定した後，ユキソンを含むを持ち，その中央に存在するTIPPXYR配列周DNA断片をプラスミドベクターを用いたショ辺が基質と競合的にCANP分子と相互作用し，ットガン法によって得た．続いてその塩基配列

その活性を阻害することが明らかになった3，4）．

の解析からラットCANPインヒビターの遺伝

本年度は，ラットを材料に用いて，CDNA及び子構造を決定した．

遺伝子DNAの単経と構造解析を行い，さらに
詳細なCANPインヒビターの構造・活性相関結果および考察等を明らかにした．

1）ラットCANPインヒビターの構造
ラットCANPインヒビターの全アミノ酸配実験材料及び方法

列をcDNAの塩基配列から明らかにした．その既に報告したウサギCANPインヒビターの結果，ラットCANPインヒビターは，603アミ

cDNAを用いて，1が10ベクターに組み込んだノ酸残基からなり，ウサギCANPインヒビタ

ラット肝cDNAライブラリーをスクリーニンーと同様に分子内に約140残基からなる繰り返

グしてラットCANPインヒビターのCDNA

しを4回含んでいた．ラット・ウサギ間の相同クローンを単離した．得られたクローンの性（図1）は，全体にわたって存在していたが，cDNA挿入断片をプラスミドベクターにサブアミノ酸の一致は64％で，これは標的プロテア

クローンし，ジデオキシ法によってその塩基配ーゼ（CANP）の哺乳動物間の相同性（約95％）

列を解析し，その配列からラットCANPインより低かった．しかも，N末端領域に2ヶ所，ヒビターの全アミノ酸配列を決定した．

第2と第3の繰り返し単位間に1ヶ所の計3ヶ
所に数十アミノ酸残基の欠夫が見られ，種間の＊東京都臨床医学総合研究所＊＊青山学院大学理工学部

相違が大きなタンパタ質であることがわかった・
しかし，反応部位であるTIPPXYR周辺の配ー3−般臓器型と，赤血球型と呼ばれる一般臓器型の列（図1のAl〜AⅣ）及びその両側のα−へリックス領域（αN−Ⅰ〜ⅠⅤ及びαC−Ⅰ〜ⅠⅤ）は相

N末端領域を欠き，阻害単位を3回含む分子量同性は高く，基本構造は互いによく類似しておの小さい型の2種が存在するが，この生理的意

り，これらの相同性の高い領域がCANPイン

味や生成機構は不明である．また，CANPイン

ヒビターの機能に重要であることが確認された．

ヒビターの発現量は臓器によって異なっている

このように，CANPインヒビターは動物種問のが，その遺伝子発現の制御機構に関する知見は差は全体では大きいものの，反応部位周辺の配全くない．これらの問題の解決や種々の疾病の列はよく似ており，昨年報告した合成ペプチド

病態と関係しているCANP活性の人為的制御

CANPインヒビター，及び，それに官能基を付等を行う上で，CANPインヒビターの遺伝子に加した誘導体は種を超えて有効に作用すると考関する情報は必須である．これを目的としてラえられた．現在，ここで得られた反応部位周辺

ットCANPインヒビター遺伝子の単艶と構造のアミノ酸配列も考慮して，さらにCANPに解析を行った．
cDNAを70ローブに用いて単離した6個の特異的でより強い阻害剤の合成と活性の検討を

遺伝子クローンは図2および図3に示したよう進めている．
2）CANPインヒビター遺伝子の単位と構にそれぞれcDNAの数百塩基対に相当する領造解析域を含んでいることが明らかになった．各クロ

CANPインヒビターには阻害単位を4個含ーンの挿入断片の長さ（10数kbp）とcDNAとみ，肝臓，心臓などの多くの臓器に分布する一の対応を考えると，CANPインヒビター遺伝子

1
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5。。筆彗

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600

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…

図1

700

ラット及びウサギCANPインヒビターのアミノ酸配列の比較
同じ残基は星印を2着の配列の問に示した．−は欠夫を示す．A−Ⅰ〜ⅠⅤは反応部位の中心にあるTIPPXYR配列を，aN−I〜IV及びαCTI〜IVはその両側に存在するα−へリックス領域を示している．

−4−

の段階で得られた知見は以下のようにまとめる

5一

ことができた．
（》CANPインヒビター遺伝子は少なくとも5万塩基対の範囲に及び，全体で20個以上のユキソンから構成されている．

mS8H A
E
F
G
B
C
D
l
Kbp
RGDl 2 0 ∩．
d ＋ ＋＋ ± − ∩
l
．
d ∩
▼
d
む人
⊂
0 入
RGD5 14 ∩
．
d
n．
d ・
Ht ＋ − ー6−く人ト−
RG D6 20 − − − − − 1十
1
＋
Z
⊂
】
．
d
RGD7 20 十．
d − − ∩
．
d ∩
十 ＋ ∩
0 人
1
∈
．
d n．
d
RGDB 18 十十 寸
十 n．
d − − ∩0 入
1＝U
d − n．
d ± ヰRGt）
11 18 n．
什 士 −U 入

②4個の繰り返し（阻害）単位はそれぞれ4個のユキソンからなり，エキソンーイントロン

接合部位は単位問で相同な位置に存在する．したがって，4回の繰り返しは遺伝子重複によっ∩．d：nOtdeterm竜nedて生じたと考えられる．
図2

得られた6個の遺伝子クローン（ヨラットCANPインヒビターに存在する3（1RGDl，5，6，7，8，11）とそ

カ所の欠失領域（図1）は，いずれもエキソンー

れにハイプリタイズするcDNAの領域，
上半分にプローブに用いたcDNA断片

イントロン接合部位に存在した（図4）．このこの領域を示し，下半分にサザンハイプリとから，ウサギには存在する3カ所の領域をコ

グイゼーションの結果を示す．＋〜十H−

ードするユキソンがラットでは用いられなくなは強度を示す．

ったため欠矢が生じた可能性が強く示唆された．
④赤血球型CANPインヒビターのN末端の3残基前にエキソンーイントロン接合部位が存

CDNA在した．このことは，この上流のイントロン中

人RGD1

H聖上十，

人RGD5

人RGD8
人RGDll在する可能性を示唆している．

く−…−ト

人RGD6
人RGD7

に赤血球特異的な転写を行うプロモーターが存

0．1Kとp

現在，残された遺伝子構造の解明とCANP

一一一一一〉

甘一一，

インヒビターの転写制御領域の構造と機能の解糾…〉析を行っている．また，われわれが発見した骨図3

遺伝子クローンとcDNAとの対応
横矢印（←…→）は図2の結果から予想される各クローンが含むcDNAの領域を表わす．その中で実線部分は塩基配列の解析から確認された部分を示し，破線部分は未だ塩基配列の解析が済んでいな
い部分を示す．下向矢印は塩基配列の解析から明らかになったユキソンーイント
ロン接合部位を示す．

格筋に特異的かつ多量に発現しているnCANPのタンパク質レベルでの同定を行い，骨格筋における機能の解析を続けている5・6）．

1 ▼

Z】

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（1▲）

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川

FE83三一GP三三65三一一一一一一一一一一一一一一一一一一一・一一…一一一一一日一一一一一一一TmDAf5人Ⅰに∑5V▲tl）▲7巳mqEGmSTmS以；㍍ZEGWEXT▲∫RS乙m▲nT訂ETpqmAGG王5Y▲
11ヽ

…

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＝

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は少なくとも5万塩基対の大きさを持ち，おそらく多くのユキソンに分割して存在すると考えられた．
次に，各クローンに含まれるユキソンを同定するため，CDNAとハイプリグイズするサブク
ローンの塩基配列の解析を行った．現在までに約半分の遺伝子構造が明らかになっており，こ−5−

図4

ラットCANPインヒビターに存在する3カ所の大きな欠失領域（一一一）とユ
キソンーイントロン接合部位（下向矢
印）．

文

献

pp．345−352．

1）Enori，Y．，Kawasaki，H．，Imajoh，S．， 4）Suzuki，K．andOhno，S．：CellStructure

Minami，Y．and Suzuki，K．：J．Biol．
Chem．，263：2364−23701988．

and Function，15：1−61990．
5）Sorimachi，H．，Imajoh−Ohmi，S．，Emori，

2）Kawasaki，H．，Emori，Y．，Imajoh−Ohmi，Y．，Kawasaki，H．，Ohno，S．，Minami，Y．

S．，Minami，Y．and Suzuki，K．：J．

andSuzuki，K．：J．Biol．Chem．，264：20106

Biochem．，106，274−2811989．

−201111989．

3）Emori，Y．，Kawasaki，H．，Imajoh，S．，

6）Sorimachi，H．，0lmi，S．，Emori，YIshida，S．，Minami，Y．and Suzuki，K．：

Kawasaki，H．，Saido，C．T．，Ohno，SIntraCellularProteinCatabolism，（edby，Katunuma，N．and Kominami，E．），
Japan Sci．Soc．Press，Tokyo，1989，−6−

Minami，Y．andSuzuki，K．：Biol．Chem．
Hoppe−Syler，1990，in press．

細胞内CANPの活性化とその阻害
川

島

研究協力者

誠

林

一＊

昌 美＊

を上昇させた．CANPの活性化は，自己消化には じ め にカルシウム依存性中性プロテアーゼ

伴う大サブユニットの分子量変化（79k一→77k（CANP）は筋ジストロフィーにおける筋タン→76k）を指標とし，大サブユニットに特異的

パク質の異常分解をもたらす元凶のひとつとさなモノクロナル抗体（1A8A2）を用いたウエス

れ，その阻害剤の開発が本研究班の目的である．

タンプロット法により検出した．赤血球の形態

CANPは大小二つのサブユニットから成り，通変化は，反応終了後グルタルアルデヒドで固定

常は不活性な前駆体として存在する．試験管内し，ノマルスキー顕微境で観察した．

での実験から，CANPはカルシウムイオンの存

結在下で自己消化を起こし活性化されることが分果かった．さらに，細胞膜タンパク質などのウサギ赤血球をA23187あるいはCa2十単独でCANPの基質が存在するとCANPの活性化は処理後，仝血球分画のCANPをウエスタンプ

促進され，要求するカルシウムイオン濃度も低ロット法により検出したところ，いずれの場合下する．また，細胞内にはCANPを特異的に阻もCANPに変化はなかった（図1）．しかし，害する内在性阻害物質も共存し，CANPの活性

両者が共存すると赤血球内CANPは自己消化調節に関与している．このように，単純な試験（活性化）を起こす．その変化は，試験管内で管内の系でもCANPの活性調節は複雑であり，の反応と同様に，中間体である77kを経て活性

ましてや基質・内在性インヒビターあるいは未型の76kへ至るものであった．従って，細胞外知の制御物質が存在し，それぞれの局在性も不Ca2＋が流入し細胞内Ca2＋が上昇すると，細胞明である細胞内でCANP活性が同様な機構で

内CANPが試験管内と同様の様式で活性化す調節されている証拠はない．そこで，最も単純ることが判る．活性化は細胞外Ca2＋濃度に依なであり，一種類のCANP（pCANP）

存的で（図2），6〟Mと非常に低い濃度でも自のみを含む赤血球を用い，細胞内CANPの活

己消化が認められる．一方，A23187が存在しな性化機構を明らかにすると共に，それに伴うタ

いと400〝Mの外液Ca2十でも活性化は起こら

細胞

ンパク質の分解と赤血球の形態変化を検討した．
さらに，試験管内でCANPを阻害する種々の合成阻害剤の細胞レベルでの効果を測定した．

A23187

20llM

Ca2＋

400pM

一

十

一

十

一一＋

十

実験方法
ウサギ末梢血より赤血球を単祉し，カルシウ
ムイオンおよびカルシウムイオノフォア（A23．87）により細胞内カルシウムイオン濃度
図1＊東京都老人総合研究所−7−

ウサギ赤血球内CANPの自己消化A23187卜）WhokG感A23187（＋）Å2318706．2525100400

06．25251004001」M

十

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＿＿1＿．＿F一三課
、76K

図4
図2

CANPの自己消化における細胞膜の影
響（Ca2十依存性）

ウサギ赤血球内CANPの自己消化におよぼす細胞外Ca2＋濃度の影響
卵Sd
30
A23187
C且つ●

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A23187
血生◆

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独108edh旭鳩−

さ7．4K一房．2K−

42．7久一乙血100鵬b血れ■図5m8m鵬no

説諭準率飽姿堪湖鏑

Ca2＋流入により起こる赤血球細胞質および膜タンパク質の分解

tJxl08￠○鵬／血図3化の場であることを示した．

赤血球内CANPの自己消化と細胞膜への結合（時間経過）

細胞内でのCANP活性化に伴い分解されるタンパク質を明らかにするため，図3の実験でない．

細胞質分画と膜分画に存在するタンパク質のパ次に，活性化の過程を細胞質分画と膜分画とターンを比較した（図5）．細胞質分画では変化に分けて解析した（図3）．経時変化をみると，が認められなかったが，膜分画ではスペクトリ

細胞質分画での変化は細胞全体の変化とほぼ同ンの下に新しいバンドが出現し，バンド3，4．1

じであった．これは，CANP全体の98％以上がは時間と共に減少する．

細胞質分画に回収されるからである．膜分画に

以上のように，細胞レベルでCANPの活性回収されるCANPはCa2十の流入に伴って増化を検出する系が確立できたので，本研究の目

加し，主として活性型として結合している．こ的であるCANP阻害剤の細胞レベルでの有効のことから，試験管内実験で証明されたように性について検討した（図6）．その結果，ロイペ

細胞内でも細胞膜が活性化の場である可能性がプチンおよびE−64dは細胞内CANPに対し示唆された．これを明確にするために，溶血さてほとんど効果がなかった．辻仲らの開発した

せた赤血球全体とそれから膜分画を除いた細胞

カルペプチンはある程度の阻害を示したが，最質分画について自己消化のCa2＋依存性を調べも効果の高かったのは我々の開発したCbz−

た（図4）．膜分画を含む溶血物全体での活性化

Leu−Leu−Leu−alで，10JLMでCANPの活性化を抑えた．また，CANPの活性化に伴い生じの方が低濃度のCa2＋で起こり，細胞膜が活性ー8−

る膜タンパク質分解物の生成もこの阻害剤によ
丸23鳩7

す

C童Zく

す

う一

始ゆ鱒細

如し細

孔上し戒

だ欄4d

り減少した．一万，本研究≡姓で最近開発された▼．サ■−・一一−

エポキシ誘導体（003，008，018，023，040）は−■■■●■■

いずれも阻害活性が弱かった（図7）．これらの
祁弼＿

磁碗

エポキシ誘導体は細胞膜を含む試験管内実験で

磯はCANPを阻害する（図8）ので，細胞掟透過性の低さが細胞レベルでの効果を減じているの
1Dl0010｛屯図6

11【1100

0、11IQ1010018001■一赤血球内CANPの自己消化におよぼす
CANP阻害剤の効果（1）であろう．
従来から赤血球の形態変化におけるCa2＋の関与が報告されている．本研究でも，A23187とCa2＋の存在下で赤血球は本来の円板型から有刺型を経て球状型へと変化した（図9）．この変化は細胞内CANPを阻害する10／JM濃度のCbz−Leu−Leu−LeuLalで抑えられる．従って，
Ca2＋による赤血球の形態変化は，細胞内で活性

C■暮◆

十

一

十

化されたCANPによりある種の細胞膜タンパ
図7

赤血球内CANPの自己消化におよはす
CANP阻害剤の効果（2）ク質が切断されて起こることが実証された．
考察

プロテアーゼ阻害剤は，プロテアーゼの生理的機能を探る基礎的研究およびプロテアーゼに基ずく疾患治療の臨床的研究のいずれの面から
C■2■

−

図8

も必要とされる有力な武器である．細胞内プロ◆膜存在下での試験管内CANP自己消化におよぼすCANP阻害剤の効果

テアーゼを標的とする場合，プロテアーゼに対する特異性に加え，標的プロテアーゼに到達するための細胞透過性が要求される．CANPについても，ロイペプテンやE64−Cは試験管内での阻害活性は高いものの細胞レ，ベルでの有効性は疑問視され，それぞれカルペプチンおよびE64−dが開発された．しかし，いずれの場合も細胞内CANPに対する効果を測定する方法に欠けていた．本研究では，CANPが活性化に伴い自己消化することを指標として，細胞内を反応の場とする系を検討することを試みた．
プロテアーゼ阻害剤が細胞に入る過程として，
単に物理的に細胞膜を通過する場合とエンドサ

Å23柑7
可
bI
￠）

図9

二

C㌔◆む迅
十

二

ナ

Ca2十による赤血球の形態変化とCANP
阻害剤の効果イトシスにより生理的に取り込まれる場合とがある．後者の場合，標的プロテアーゼは主として））ソゾーム系のプロテアTゼとなる．CANP
は非リソゾーム系のプロテアーゼであるから，ー9−前者の過程が重要である．この過程を吟味する化のいずれをも阻害した．このことは，後二者上で，リソゾームに欠ける赤血球は適切な系でがCANPにより引き起こされる結果であるこあり，膜透過性に関して明確な答えが期待できとを示すと同時に，本阻害剤が優れた膜透過性

る．

を有することを明らかにした．この阻害剤の疎上述の実験結果から，赤血球の細胞内CANP

水性は極めて高く，細胞膜との親和性が強いとはカルシウムイオノフォア／Ca2＋により活性化思われる．そのため，本阻害剤は細胞膜を透過されることが明らかになった．この際，膜タンしても細胞質内に遊駈することは難しく，細胞パク質が分解され赤血球の形態が変化する．次膜のすぐ内側に留まり機能している可能性が強に種々のCANP阻害剤を検討した結果，我々

い．幸いCANPは活性化の際に細胞膜を場との開発したCbz−Leu−LeuTLeu−alがこれらするので，本阻害剤は特異的かつ効率的に

CANPの活性化・膜タンパク質の分解・形態変

CANPの活性化を阻害できるのであろう．

−10−

CANP阻害剤の合成
向 山 光 昭＊

＊

tT

男

＊

＊

充

晴

正

＊

田

＊

井

＊

享

村

♯

玉

紀

見

＊

和

＊

名

＊

＊

田

尋

き
つ
さ

田

彬

千

下

花

正

尾

＊

木

値 横 言

研究協力者

大 関 正 弘＊＊Aゆg曙fJ毎sp．F−1656の代謝産物として単維は じ め に

我々は，カルシウム依存性中性プロテアーゼ

同定された，新規なシステインプロテアーゼ阻（CANP）に対する特異的阻害剤の創製を目的害剤である．図2に示すように，β−ヒドロキンに研究を行なっている．本年度は，大きく分け脂肪酸を有するトリペプチド誘導体であり，そて，次の2種類の化合物について研究を進めた．

の酵素阻害スペクトラムの特徴としては，表1（1）エポキシコハク酸誘導体に示すように，システインプロテアーゼのみを

本研究班の鈴木班月らは，内在性CANPイ

阻害すること，更にパパインやカテプシンBにンヒビターにおいてCANPを阻害するのに必対するよりも，CANPに対して阻害活性が強い

要な部位は，4つのドメインに共通して兄いだ

ことがあげられる．

されるTIPPXYRというアミノ酸配列を含む，
図1に示した部位であると推定している1）．

a

b

l

我々は昨年度までに，このTIPPXYR配列を

c

d

e

lll

l

DoTnainI…・L GKR EVTI P PKYR E L L・・・・

基に，阻害活性基としてエポキシコハク酸を導DoTnainⅡ…・C G E D D E TV P A E YR L K P・・‥

DoTqainIIE…・L G E K E E TI P P D YRL E E・‥・

入した化合物を約50種合成し評価してきた．そDoThainⅣ

・・‥L GE RDDTI P P E YRH L L・・・・の結果，E−64Cよりも約9倍強いCANP阻害

図1

活性を有する化合物CA−050を兄いだした．

内在性CANPインヒビター活性中心付
近の一次構造とエポキシコハク酸の導入

本年度は，昨年度までの研究を更に発展させ，

位置（a〜e）

新たに図1に示した位置へエポキシコハク酸を

H
H

N

−一し
H

C

−

図2

た．

（レGln） （レLuecinal）
C（レAsn）性の向上を目的として周辺化合物の合成を行っ

FD−056の構造（2）新規システインプロテアーゼ阻害剤FD−
表l FD−056の酵素阻害スペクトラム

056誘導体FD−056は，大正製薬総合研究所において，京E n Z y m e〟 C A N P

都市上京区で採取した土壌より得られた，

P lp a ln
C i th ep 8 1m 8

＊東京理科大学理学部＊■大正製薬株式会社総合研究所

−11−

H

H

C

∵∴C

H

H

O
C

−

H

2

C

H

2

H
N

O

C
H

O

H
N

C

H

1

C

H

H
N

2
H

・

O

C − CIC − C

H

▲

H

C

H

C

050について，昨年度得られた知見を基に，特異

N
O

O

H

また強力なCANP阻害活性を有するCA−

C−C −C

導入した誘導体を合成した．

I C Sl （〃 M ）
2
3 3
7 ．3

E n z y m el C も■ （〟 M ）T r y pS ln＞ 5 0 0C b rt o tr yp s ill＞ 8 0

El a St i ＄e＞ 5 0 0
＞ 5 0 0C i th ep s ln L

＞ 1 ．0 0 0

C i tb e ps iれ D

C a tb ep 8 1m 甘

＞ 1 ．0 0 0

P e p写im

1 8 0

C o ll a ge n a SO

＞ 5 0 0

しかしながらFD−056は，水や有機溶媒に対

表3 本年度合成したFD−056誘導体

してきわめて溶解性が悪く，CANP阻害剤として開発するためには，CANPに対する阻害活性及び特異性の増強とともに，溶解性の改善が必要と考えられる．
そこでこれらの問題点を解決すべく，本年度より新たにFD−056誘導体の合成研究を開始し

S t r u c t u r e

A P −0 1 7

A c −A ■s p （O B z l ）−G l u （O B Z l ）−L e u −H

A P −0 2 3
A P −0 2 4
A P −0 2 5

B o c −A s p （O B z l ）−G l u （O B z l ト L e u −H
Z −A s p （O B z l 卜 G l u （O B z l 卜 L e u −H
B o c −A s p （O M e ト G l u （O B z l ト L e u −H

A P −0 2 6
A P −0 2 7
A P −0 2 8

A
B o
A
A

c −A
c −A
c −A
c −A

s p （O＄ p （Os p （Os p （OM e トGB zlト GB zl卜 GM e ）−Gllllu （O B z l ）−Lu （O M e ）−Lu （O M e ト L
u （O M e ）
−L

B o
B o
B o
B o

c −A
c −A
c −A
c −A

S p （Os p （Os J）（Os p （OB zl卜 GB z l ）−G
B z l ）−G
B z l ）−G

l
l
l
l

u （O
u （O
u （O
u （O

A
A
A
A
A

た．
方

Co t p o u m d ．ポ0

法

（1）合成
本年度合成した化合物を表2と3に示した．

P
P
P
P
P

・0
−
−0
−0
−0
−0

2
4
4
4
4

9
1
2
3
4

e
e
e
e

u −H
u −H
u −H
u −H

B zlト l l
B zlト V 8
B zl）
−P h
B zl）
−M e

e −H
1 −H
e −H
t −H

A P −0 4 5
A P − 0 4 6
A P − 0 4 7

B o c −A s p （O B z l ）−G l u （O B z l ）−A 1 8 −H
B o c −A s p （O B z l ト G l u （O B z l ト P r o −H
J3 ° C −A s p （O B Z l ）−G l u （O B z l ）−G l y −H

A P − 0 4 8
A P − 0 4 9

B o c −A s p （O B z l ト G l u （O B z l ）−β A l a −H
B o c −A s p （O B z l ト G l u （O B zl）−A l b −H
Aib：−ⅣEC（CE3）2CO−

合成はすべて液相法を用い，エポキシコハク酸
誘導体については，昨年度と同様の方法により合成した．
FD−056誘導体については，α一アミノアルデ
ヒドに対応するα−アミノアルコール誘導体を原料として，トリペプチド誘導体を合成後，Boc−Asp（OBzl）−Glu（OBzl）−Leu−JI

ジメチルスルフォキシド（DMSO）と三酸化イ
オウピリジンコンプレックス（Py−SO3）を用いて酸化し，アルデヒド体とした．図3に代表的a）

4N ECl−Dioxane

b）

Et3Ⅳ

C）

DMSO，Py−SO3．Et3N

図3

な例としてAP−023の合成法を示した．

AP−023の合成法（2）CANP阻害活性の測定
pCANP（豚赤血球由来，200u／mg／ml，半井

ユベーションした後，50JLlのCANP溶液

化学）またはmCANP（豚腎臓由来，200u／mg／（JLCANP：20u／ml，mCANP：40u／ml）を加

ml，半井化学）を用い，次のように測定した．

え，300Cで20分反応させた．10％トリタロロ酢

下記の反応溶液を，400Cで5分間プレインキ

酸500JJlを加えて反応を止め，60分放置後遠心

表2 本年度合成したエポキシコハク酸誘導体
C o l pO Un d．Ⅳ0

C A
C A
C A
C A
C A
C A
C A
C A

− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0

6
7
8
8
9
9
9
9

9
9
4
5
1
2
3
4

C
C
C
C
C
C
C
C
C

− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0
− 0

5
5
5
8
8
8
8
9
9

5
6
7
3
7
8
9
0
5

A
A
A
A
A
A
A
A
A

S
（新 規 誘 導 体 ）H O −t E S −T
H O − t E S −G
H O −t E S −L
H 0 −t E S −L
H O −t E S −T
H O −t E S −A
H O −t E S −L
H C l ・H −L e
（C A
H O
H O
H O
H O
H O
H
H
H
H

O
O
O
O

t r

y r −Al u −Ve u −Ge u −Gy T ，Ar g −Gy 8 −Au −G lu ctr g （Na 1 −Ol y −Ol y −LT g （Nl u 一Vr g −Gy −N Hu reO 2 ）−l A AO
卜 N H B z
O 2ト O B ヱ 1
A A）−N H B Z l

−t
−t
−t
−t

ト N H
lI 8 zII B zH B z−tES−：㍊

S −T
S −T
S −T
S −T

y
y
y
y

r −L y s （Zr 一〇 r n −N
r −L y ＄−N
r −G l n −N

反応溶液
1．2％Casein

O 2 ト It i s −O H
HHy 5 −O H
O 2 ）−G l u −V aa 1 −O H
I u −V a 1 −O H
N H − t E S −O E

− 0 5 0 周 辺化 合物 ）−t E S −T y r −A r g （N−t E S −T y r −A f g （N−t E S −P h e −A r g （N−t E S −T y r −A r g −I
−t E S −T y r −O r n （ZEEEE

し，上清のA28。を測定した．

8
l
l
l

l

lOOJLllOOmM Sodiumglycerophosphate−HCl
1 −O（pH7．5）H

200〟150mM CaC1250JL1250mM2−Mercaptoethano1

20JLl

Inl1ibitor（inlO％DMSO）

50JLl

t

（3）パパイン及びカテプシンB阻害活性の測定

z l−lA…HCEZC鮎Cu（仙パパイン（24u／mg，Sigma社）及びカテプシ
ンB（牛牌由来，25u／mg，Sigma社）を用い，次のように測定した．

−OC O H

下記の反応溶液を，40°Cで5分間プレインキ−12−ユベーションした後，基質溶液（Z−PheTArg−

害活性を示さずCANP特異性の認められた

MCA，200／ M）25FLlを加え，400Cで10分反応させた．10mM E−64C（in O．1M Acetate

CA−092である．

Buffer pH6．8）lmlを加えて反応を止め，励ジンを介してペプチドC端へ導入した，新しい起波長380nm，測定波長440nmで螢光を測定

試みの化合物であるが，CANPに対しては無効

した．

であった．

なおCA−094は，エポキシコハク酸をヒドラ

反応溶液

次に表5には，CA−050の周辺化合物につい0．4M Na，K−Phosphate Buffer

250JLlてまとめた．

（Containing4mM EDTA，昨年度報告したように，CA−050のペプチド

10mM2−Mercapto Ethanol）

部分C端は，CANPに対する阻害活性を強める（pH6．8：Papain，pH6．0：Cathepsin B）

上で極めて重要である．すなわち，CA−009，

Inhibitor（inlO％DMSO）

100JLI

007，008とCA−050を比較してわかるように，

H20

175JJlペプチドC端の置換基の違いにより，CANPに

O．1％Brij−35（半井化学）

425〟l

対する阻害活性は大きく異なり，ベンジルエス

Enzyme25JLl

テル体のCA−050において，これまで最強のCANP阻害活性が認められた．しかしながら，（Papain400nM，Cathepsin−B200nM）

CA−050はカテプシンBやパパインも強く阻害

結果及び考察し，特異性は認められなかった．

（1）エポキシコハク酸誘導体

本年度はまず，CA−050のテロシンが持つフ

表4に，新たな位置へエポキシコハク酸を導ェノール性水酸基の影響を確認するため，テロ入した化合物について，CANP，パパイン，カシン部分をフェニルアラニンに変換したCA−

テプシンBに対する阻害活性を50％阻害濃度057を合成してみた．その結果CA−057においで示し，その導入位置によりa〜eに分けてまては，パパインやカテプシンBに対する阻害活

とめた．

性にあまり変化が無いのに対して，CANPに対これらの中で，CANPに対して阻害活性を示する阻害活性のみが低下した．したがって，テした化合物は，エポキシコハク酸をa，bまたロシンのフェノール性水酸基はCANPに対すはeの位置へ導入したCA−084，085，092，069

る阻害活性を強める効果があることが明かとなの4種であり，CA−069のCANP阻害活性は比った．

較的強いものであった．しかしながら，最も注次にCA−050のベンジルエステルを，ベンジ目すべき化合物は，CANP阻害活性はやや弱い

ルアミド及びイソアミルアミドに変換した化合

ものの，パパインやカテプシンBに対しては阻物CATO56，055，及びCA−055のアルギニン側

表4 エポキシコハク酸誘導体の酵素阻害活性（1）Co n p o u n d Ⅳ0 ．

ab

S t r u ct u r eI C S l （n M ）C A N PP a p a in

2 5．0 0 0

1 才1

C a t b e p s in B

9．5 0 0

1 01

970

1 ．0 0 0

C A − 0 8 4

H O −tE S −L e u −G l y−O E

C A − 0 8 5

甘0 −tE S −L e ーG l y −L y ＄−0

C A − 0 9 4

EC l・
8 −L e u G l y −N m 柑−t S −O E t〉1 0 0 ．0 0 0

2 6 ．3 0 0〉1 0 0 ．0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0

1 7 ．8 0 0〉1 0 0 ．0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0
1 7 ．20 0

C A − 0 9 3

E O −tl：
S −L y −A r g −G l u −† 1−0 Ⅰ
ⅠC

C A − 0 9 2

0 −t E S −A r ーG l u −V a 1−0d

C A − 0 7 9

0 −t E S −G

一Y a 1 −0 且

〉1 0 0 ．0 0 0

1 3 ．5 0 0

C A − 0 6 9

0 −t E S −T y r −A r g （Ⅳ0 2 ト 1 i s−O H

1 4 ．2 0 0

57

2 ．0 0 0

C A − 0 9 1

0 −t E S −T J r −A r g 川 0 2 ト G l u−V a 卜 O E〉1 0 0 ．0 0 0

9 6 ．0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0

3 ．0 0 0

13

40

e

E − 6 4 C

−13−

表5 エポキシコハク酸誘導体の酵素阻害活性（2）C o m po un d Ⅳ0 ．

S t r u c t u r e

C A −0 0 9
C A −0 0 7
C A −0 0 8
C A −0 5 0
C A −0 5 7
C A −0 5 6
C A −0 5 5
C A − 0 8 3
C A − 0 8 7
C A − 0 8 8

E O −tE S−Ty r −A r g （NO 2）−O に‡0 −tE S−Ty r −A r g （Ⅳ0 2ト O M e
EO −tE S−Ty r −A r g （Ⅳ0 2）−O E t
HO −tE S−Ty r −A r g （Ⅳ0 2）−O B z ltIO −tE S−Ph e −A r g （Ⅳ0 2 ）−O B z l
H O −tE S−Ty r −A r g 川0 2ト N E Bz l
EO −tE S−Ty r −A r g （NO 2 ）−lA A

C A − 0 8 9
C A − 0 9 0
C A − 0 9 5

mO −tE S−Ty r−A r g−lA A
EO −tE S−Ty r−O r n （Z ）一M Bz l
EO −tE S−Ty r−L y s （Z ）−NH Bz l
EO −tE S−Ty r−O r n−Ⅳ】B z l
EO −tE S−Ty r−L y s−N ：B z l
10 −tE S−Ty r−G ln−N llB z l
E −6 4 CI C 閃 くn M ）Pa pa inC a th ep s in B

C A N P
4 4 ，0 0 0
5 ，0 0 0
3 ．0 0 0430
1 ，3 0 0
359
460
290
10 1
13 1
562
58 5
1 ．0 5 0
3 ．0 0 0

60 0
41
24
52
60
15
23
21
17
20
68
39
4 88
13

9．00 0
70 0
50 0
4 30
2 98
3 59
3 70
2 30
2 20
1 86
1 60
1 48
5 46
40

鎖ニトロ基を除去したCA−083を合成した．こ029）を合成し，その酵素阻害活性を検討した．

れらの化合物はいずれも，CA−050と同等またその結果，表6に示すように，これらの化合はそれ以上の強いCANP阻害活性を示したが，物はいずれも強い酵素阻害活性を有することが同時にパパインやカテプシンBに対しても強いわかった．また，アセテル基部分をペプチド合阻害活性を示しており，特異性は改善されなか成で通常用いる保護基であるBoc基やZ基にった．

変換した化合物（AP−023，024，025，027）に更にアルニギン部分を，他の塩基性アミノ酸であるオルニテンやリジンに変換したのがCA

おいても，その酵素阻害活性に大きな変化はな
かった．

−087〜090であり，グルタミンに変換したのがなおこれらの化合物の中には，CANPに対し

CA−095である．これらの中には，CA−050などて特異性を示すものは兄いだされなかったが，よりも更に強力なCANP阻害活性を示す化合

いずれの化合物も，E−64CやFD−056と同等も物CA−087やCA−088が兄いだされたが，特異

しくはそれ以上の強いCANP阻害活性を示し，性は認められなかった．またCA−095は，CA−

なかでもAP−027と028は，先に示したエポキ

089のオルニテン側鎖アミノ基部分がアミドにシコハク酸誘導体CA−050，055，056，083など

変化したものであるが，CANPに対する阻害活と同様極めて強いCANP阻害活性を有してい性の低下よりも，パパインに対する阻害活性のた．
このように，FD−056のアスパラギン及びグ低下の方が相対的に大きく，今後のドラッグデ
ザインの参考になると思われる．

ルタミン部分を，それぞれアスパラギン酸及び（2）FD−056誘導体

一般にアスパラギンやグルタミンを含むペプ

表6 FD−056誘導体の酵素阻害活性（1）チドは溶解性が悪いことが知られている．また

R−Asp（R2）−Glu（R3）−Leu−H

FD−056の場合，その構造にみられる長鎖の脂肪酸も，難溶性の一因と考えられる．
そこで本年度はまず，この脂肪酸部分を最もI C b l （n M ）C o tp o um d

0．

R l

R 之

R I

A

P − 0 2

7

80C

0批 1

0】e

1 30

13 0

1日

A

P − 0 28le

0 8z l

Olle

1 50

lT

2 80

1 7

Ae

0 8z l

0ⅠIz l

1 ．0 00

57‖

A ∴P − 0

C A NP

P ap l In

Ca t he p sl n 8

A ∴P − 0 2

9

▲e

O lle

0■￠

1 ．6 30lH】＝

A ∴P − 0 2

5

Boe

O lle

0Ⅰ‡
zl

1 ．7 8071ll

グルタミンの側鎖アミド部分をエステルに変換

A

P − 0 2

6

lC

O lte

0tlz l2 ．1 00

15

19

A

P − 0 24Z

0 8z l0B z l

1 ．4 00

I2 0

9 00

して，それぞれアスパラギン酸及びグルタミン

A ∴P − 0 2380e

0 8z l

別事zl

単純なアセテル基とし，かつアスパラギン及び酸の誘導体とした化合物（AP−017，026，028，−14−

3 ．8 00

10 Q

5 00

F D − 0 5 6

2 ．0 00

3 3．00 0

7．3 80E − 6 4

3 ．0 00

13

10C

グルタミン酸に変えても，CANPに対して強い

おいては，パパイン，カテプシンBに対する阻阻害活性を示すことがわかったため，次にロイ

害活性が大幅に低下したのに対して，CANPにンナール部分の変換を検討した．

対する阻害活性はあまり低下せず，CANP特異表7に示すように，AP−023のロイシナール

性が認められた．

部分を，10種のアミノ酸由来アルデヒドに変換

今後，ペプチドN端，側鎖部分などの修飾にした化合物を合成し，酵素阻害活性を検討した．

より，更にCANPに対する阻害活性及び特異その結果，プロリナール，βアラニナール，ザ

性の増強を目指していく予定である．

ルコシナールに変換したAP−046，048，053で結は，CANP阻害活性が失われたが，他の化合物

語はすべてCANP阻害活性を示し，メテオナー

本年度我々は，内在性CANPインヒビター

ル誘導体AP−044，アラニナール誘導体AP−045の活性中心近傍のアミノ酸配列を応用したエポなどが強い活性を示した．

キシコハク酸誘導体，及び新規システインプロ

特異性の面から考察すると，AP−044，045はテアーゼ阻害剤FD−056の誘導体について研究

他の化合物と比べ，相対的にパパインに対する阻害活性は弱いが，カテプシンBに対しては他を行い，表8、に示すようにCANPに対して特異性を有する化合物CA−092及びAP−049を兄の化合物と同様強い阻害活性を有している．

いだした．しかしながら，これらの化合物のしかしながら注目すべきことに，AP−045のCANP阻害活性，特異性に関してはまだ十分とアラニナールのα炭素にメチル基を導入し，アはいえないため，今後更に検討を続ける予定で

ミノイソプチルアルデヒド体としたAP−049にある．

表7 FD−056誘導体の酵素阻害活性（2）Boc−Asp（OBzl）−Glu（OBzl）TX−H
C … pO u n d

N0 ．

A

P

− 0

4 4

M

e

A

P

− 0

4 5

A

P

− 0 4

A

P

A

P

A
A

表8

CANPに対して特異的阻害活性を有する化合物

I C S ● （¶ M ）X
CP

P ap a t n

C a th e p s i n B

t

8 00

1． 32 0

289

Å 1

8

1 ．5 00

1．2 5 0

276

2

V

a

l

2 ．9 00

30 0

lgO

C A − 0 9

2

− 0

2 3

L

e

u

3 ．8 00

50 0

500

A

9

− 0

4 3

P

h

e

4 ．7 00

62 0

360

P

− 0

4 7

G

l

y

6 ．5 00

31 2

942

P

− 0 4

1

I l

e

6 ．6 00

H

O

380

A

P

− 0 4

9

A

l

b

7 ．8 00

3 8．0 0 0

3 1 ．0 0 0

A

P

− 0 4

6

P

r

o

＞ 10 0 ．0 00

6 8． 90 0

1 7 ．6 0 0

A

P

− 0 4

8

＞ 10 0 ．0 00

5 5． 28 0

1 1 ．8 0 0

A

P

− 0

5 3

＞ 10 0 ．0 00

7 7．0 0 0

1 5 ．4 0 0

F

D − 0

5

2 ．8 00

3 3，0 0 0

7 ．3 0 8

E − 6 4C

3 ．0 00

1340

β Å 1 8
S
6

8

r

A N

I
C o t PO u n d

†0 ．

S

t

C A N

P − 0 4

C 5● （ n M ）r UH C t ll r 亡

0∝ −l s p （O B z l ト G I u （0 8 z l ト い い 1

文P

P l p ▲i 几

C l lIl印 書t n

1 T ．1 0 0〉1 0 0 ．8 0 tI

〉 10 8 ．0 0 0

T ．引用】8 ，0 0 t〉

】 1 ．0 0 0

献1）Kawasaki，H．，Emori，Y．，Imajoh−Ohmi，S．，Minami，Y．and Suzuki，K．：J．
Biochem．106，274−281，1989．

ー15−

B

プロリン含有ペプチド分解酵素とその阻害物質
青
研究協力者

柳

高 明＊

和 田 孝 雄＊小永 井 真知子＊

原 田 滋 子＊筋ジスマウス前肢筋および後肢筋の各種酵素

川

慶

治＊

小

島

路

子＊

示す．

活性を経時的に調べ，ユタトエンザイムである

Glu・NA，L−glutamicacidβ−naphthylamide

アミノペプチダーゼが有意に増加することを認hydrochloride；Arg・NA，L−arginineβ−na−

めた1ト3）．また，患者血清中のアミノペ70チター

phthylamide hydrochloride；Pro・NA，L−

ゼとエンドプロテアーゼが病状の進行に異なる

prolineβ−naphthylamidehydrochloride；Gly

役割を果たしていることを報告した4）．さらに，

LArg・NA，glycyl−L−arginine

筋ジスの発症ならびに進展の機序にプロリン含

ylamide；Lys−Ala・NA，LlysyトL−alanineP

有ペプチド分解酵素（PPDE）が密接に関与して−naphthylamide；Arg−Arg・NA，L−arginyトいることを示唆した5）．

L−arginineβTnaphthylamide；Gly−Pro・NA，

今回は新しい視点からPPDEに属する酵素

βTnaphth−glycyl−L−prOlineβ−naphthylamide；Z−Arg−の動態を筋ジスマウスで調べ，他疾患モデル動

Arg・NA，N−CbzTL−arginylTL−arginine

物と比較した．さらに，PPDEの作用機序を明maphthylamide；Z−Gly−Pro・NA，N−Cbz−

かにすることを目的とし，Dipeptidylpeptidase

glycyl−L−prOlineβTnaphthylamide；Boc−Val

II（DAP−ⅠⅠ）阻害物質の探索研究を行なった．

−Leu−Lys・MCA，t−butyloxycarbonyトL−Valyla）プロIJン含有ペプチド分解酵素（PPDE）の動態−L，1eucy卜L−lysine

実験動物

Phenylalanyl−L−arginine

β一4−methy1−77COumar−ylamide；Pro−Phe−Arg・MCA，L−prOlyl−L−
4−methylL7T筋ジスマウス（C57BL／6−dy／dy）および対照

COumarylamide；Boc−Gln−Ala−Arg・MCA，t

マウス（C57BL／6−＋／dy）は実験動物中央研究−butyloxycarbonyl−L−glutaminyl−L−alanyト所より購入した．実験動物は生後1週から11週

L−arginine4−methy1−7−COumarylamide；Suc

まで，各週ごとに一匹宛屠殺したのち，直ちに−Leu−Leu一Val−Tyr・MCA，SuCCinyl−L−leucyl

前肢筋，後肢筋，心，牌，肝，腎を摘出し，−700C−L−leucyl−L−ValyトL−tyrOSine 4−methy1−7−で保存した．臓器は10倍量のphosphate buf−

COumarylamide；Suc−Ala−Pro−Ala・MCA，feredsaline（PBS）の中で，組織ホモジナイザ

SuCCinyl−L−alanyl−L−prOlyl−L−alanineー（Ultraturrax）を用いて1分間ホモジナイズ

methy1−7−COumarylamide；Boc−Val−ProL

した．酵素活性の測定には，組織ホモジュネー

Arg・MCA，卜butyloxycarbonyトL−ValyトL−

トの3，000Ⅹg，20分間の遠心上清を用いた．

prolyl−L−arglnlne

基質ylamide．

酵素活性測定用の基質ならびに略語は下記に

4−4−methy1−7−COumar−

緩衝液
酵素活性測定用の緩循液は0．02M PBS★微生物化学研究所（pH7．2）を用いた．ただし，prOlylendope−−16−

ptidaseの測定には0．2M Tris−HCl buffer

す酵素がなく，第2主成分に対してはエラスタ（pH7．8）を用いた．

ーゼが0．69，第3主成分に対してはPro一IPが酵素活性の測定0．72の相関を示すにとどまっている．

ホモジネートの遠心上清画分は，それぞれの

図1に，第1主成分の因子得点を週齢に関連

基質溶液および緩衝液を含む反応試験管に分注づけてプロットした図を示す．対照マウスの曲

し，370Cで1時間の反応を行なった．Post−Pro線は前肢，後肢とも良く似た経過をとり，平行−Enzについては，前述の緩衝液を用いて測定しして双曲線状に低下する．一方，筋ジスマウス

た．すべての酵素活性の測定には3本の試験管では前肢，後肢とも第2週で1度上昇したのち，を用い，その平均値を記載した．各酵素活性の次第に低下する．ただし，この時，前肢，後肢測定法および基質は表1に示す．

間に解離が起こり前肢で遷延するのが認められ

蛋白の測定

た．

標準蛋白としてウシ血清アルブミンを用い，

図2は第2主成分の因子得点をプロットした

Lowry法8）で測定した．

ものである．第1主成分におけるような前肢，統計

後肢問の解放は見られなかった．図3は第3主多変量解析の一手法である主成分分析法19）

成分についてのプロットであるが，全体的にあを用いて解析した．

まり特徴的な動きが見られなかった．
筋蛋白の崩壊阻止にセリンおよびシステイ

結果および考察ン・プロテアーゼ阻害物質が有効であるという

PPDEに属する酵素の動態を調べることを目的とし，対照および筋ジスマウスの前肢，後多くの報告があるが，PPDEに属する酵素の阻
害物質も筋崩壊阻止に関与することが考えられ肢における各酵素活性を検討し，主成分分析をる．次項でPPDEに属するDipeptidyl pe−

行なった．表2に示すように，第1主成分に高ptidaseII阻害物質の探索研究について述べる．

い相関（0．8−0．9）を有する酵素はPPDEおよびセリン・プロテアーゼに属する酵素である．

b）Dipeptidyl peptidaseII阻害物質Diocta・
tins AとBの探索研究

第2および第3主成分については高い相関を示プロ］）ン含有ペプチド分解酵素（PPDE）に属

表1List of the proteases measured and their substrates
EnzymeAbbreviation

Substrate

Lys−A−a・NA

DipeptidyIarTIinopeptidase Hl（EC3．4・lZI．4）

DAP1日

Ar9−ArgtNA

DipeptidyIaninopeptidaselV（EC3．4．1LI．5】

DAP−lV

GlrPro・NA

Cathepsin B（EC3．LI．22．1）

Cathepsin B

Z−Arg−Arg・NA

ProIYlendopeptidase（EC3．4．21．26）

Post−Pro−EnZ

Z−Cly−Pro●NA

Plasmin（EC3．4．21．7）

PhsminBocTVal−Leu−Lys−MCA

Tissue k；州ikrein（EC3．叫．21．35）

KalHkrein

Pro−Phe−Arg・MCA

Trypsin（EC3．甘．21．q）

Trypsin

Boc−Gln−Ala−Arg・MCA

Chymotrypsin tEC3．叫．21．りChy−try

Suc−Leu−Leu−VaトTyr・MCA

Leukocyteelastase【EC3．句．21．37）

Elastase

SuC−Al8−Pro−AIa・MCA

α−Thrombirl（EC3．4．21．5）

ThrombhBoc−VaトPro−Arg・MCA

3
q
5
6
7

−17−

2

Z：CarbobenzoxY，Boc：tTbutyloxycarbonyT，Suc：SuCCinyl

6

Cly−Arg・NA

DAP一日

1

DAPJ

DipeptidyIaminopeptidaSell【EC3．叫．川．2】

8

Dipeptidylaminopeptidasel（EC3・q・14．1）

9

Arg・NA
Pro・NA8

Pr0−1P

7

Prolineiminopeptidase（EC3．叫．17．5）

6

Clu・NA

AP−B

1

AP−A

Arginine aminopeptidase（EC3．叫．11．6）

assaY methodlAspartateaminopeptidase（EC3．q；11．7）

Referencefor

表2

Principalcomponents and theirする酵素に対する阻害物質としては，既に下記

relation to enzymesin muscleの阻害物質を報告した．即ち，Pr0−IP（proline

P訂

En叩e P缶

En叩e
AP−B（dipeptidylpeptidaseIV）に対するDiprotins

0Pr0−1P

PlaSmin O▲

EIastase O

O．86

7

0，89

Thrombin0

DAP一日

iminopeptidase）に対するProbestin，DAP−ⅠⅤ

ChY−trYO．83

ChY−try

PPCE

0．82

Pr0−1P

Plasmin〇・7【l TrYp引n

DAP−1

0t70

Kallikrein

−

0．83

PPCE

0

0

Cathep扇n B

−0

0

DAP1

7 一
〇 リ
︷ 0
l
t 一
つ 一 一 7 −1

DAP−1日

0．83

0

．糾

DAP−lV6t 一

Tryp引n0

AP−A O

0

ElaStaSe

DAP−lV−0

TrYPSjn0

Thrombin〇0−0に対するPoststatin，Collagenaseに対するSteffimycins Dなどである20）．

本報告はDAP−II阻害物質としてStre−

8
一 l

■

AP一人

8

Cathepsin B O

AとB，Post−Pro−EnZ（prolylendopeptidase）

1
一 b

ptomyces sp．SA−2581培養炉液から新規阻害物質DioctatinsAとBを見出したので，その単uぎOd∈OU■乳首∪てd−02OUS

，
；
4

了 ＼

：㌫ 器

′ン ぺ

…＼

ヾ

離，精製，阻害活性などについて述べる21）・22）

ヲ；
乙；．
慧 黒 岩 昔Dioctatinの単離，精製′ 一・一・、
亡＿ ＿ ＿、 ＼・へ−・へラット脾臓より精製したDAP−ⅠⅠ23）を用い，．＿＿＿

Lys−Ala・NAおよびPhe−Pro・NAを基質とし
○
：

、
→、・．

3■
5 ，

2

3

4

＼ ＼ − − 一／ − − ＼＼、て阻害活性を測定した．Streptomyces sp．SA、一一一−2581培養炉液より，YMC−GEL−ODS，シリカ

5

Contr0日brelirnb】

6

8

9

10

日
Age（weeks）

一一一・一DystrophY tforeIi汀1bI

一一一一一一一Contr01thindlimbI

図1

一一一一＿＿＿−＿−＿ l、7

Dioctatins AとBを単敗，精製した．

−−一一DyslrOPhy（hindlimb）

Time course of prlnClpalcomponentsI

一Ug已EU︼且一21Ldh028S

／
∠

ム

へ ／一
′一
／ ￣
、
、
、一
ノ ‥

Dioctatins AとBの構造
図4の精製法により得たDioctatins AとBの構造は下図のように決定した．即ち，

′
、ヽ
／一つ
し こ こ
−．
−ノ

へ
／ 、
＼
、−、ノ

ゲルなどのカラムクロマトグラフィーにより

こぺ

二

ノ一
・
一
・
、 ．
．
、
、
一
一
￣
￣
￣ 、−
￣
￣
■
￣
▼
ゝ

SP．SA−2581
270C．7days
Cult

／
／
／

E】
astase（
r三
0．
69）
託∋
ご
；だ 盈

emtrate HHilers．lC5029〃l／mり

MyCelia

YMC GELODS（60A．60／200meSh】

卜・utedwith30…3⊂N

1

2

3

1

− ⊂0ntr01的reHmb1
＿−＿＿

5

6

7

8

9

SHicagelcolumn

10 11
Aqe（weeks】

eluted withCHCb−MeOH−ACOH（100：10：1andlOO：30三日−−−−− Dystrophy tbrelimbl

Controllhindtimb】

一一一一DyslroPhY（hindlimbl

ndl

図2

Time course of principalcomponentII「

Com

PreC岬itated†rom aCidic MeOH sohtion
by neutraliヱation

Djoclalin B（colorlesspowder）
18・1mg′lC500・8り」g仙1≡︼ugOdEOU一己︼リリーLd︼○、

DioctatinA fCOlorless powder）
20・2mg．lC500・19JJg／ml

Pro一作 （r＝0．
7封．A P−B lr＝0・56）

ヽ

図41solationandpurificationofdioctatins
A and B

′ ヽ
′ ヽ
／雪

、
一一一・
・
日
．
、

′′
、、 ＿
／／ 一 一 一 一も＼ 、 、．
／
ヘ
一
l一 ノ

毒虫

＿、
＼＼二

一一一一一・、ノやDioctatins A and B

rBUS

Age（weeks）
ControHforelimb】−−−−

一一一●￣￣ControHhindHrnb）−−−−

Dy〜trOPhy（bretil¶b】

払子 私

書：3

日2N−CH−CH・CO・NH・CH−CH2・CO・NH−C・COOH

Dystrophy thindlirnb】

A：R＝CH3′B：R＝H

図3

Time course of principalcomponentsI11−18−

Dioctatin AはN−〔N−（3−amin0−2−meth−との関連性を究明し，難病解決の緒口としたい．

yloctanoyl）73−aminooctanoyl〕−2−aminobut−
文

2−enOicacid，またDioctatinBはN−〔N−（3−aminooctanoyl）−3−aminooctanoyl〕−27

献1）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F・，Nagai，aminobut−2−enOic acidである．

M．andUmezawa，H．：J．Clin．Invest．，67：

Dioctatins AとBの阻害活性

51−59，1981．

各種のアミノペプチターゼおよびジペプチジ2）Aoyagi，T．，Tobe，H．，Kojima，F・，

ルペプチダーゼに対するDioctatins AとBの

Hamada，M．，Takeuchi，T．and Umez−

阻害活性はDAP−ⅠⅠのみに強い阻害を示した

awa，H．：J．Antibiot．，31：636−638，1978．

（表3）．Dioctatins AとBのDAP−IIに対す

3）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Suda，H．，

る阻害形式は括抗阻害，Ki値はDioctatinAがHamada，M．and Takeuchi，T．：J．

2．0×10，7M，DioctatinBが1．3×10￣6MであAntibiot．，29：97−99，1976．
4）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，った．
Dioctatins AとBを含むPPDE阻害物質のM．，Miyoshino，S．and Umezawa，H．：

筋ジスマウスに対する効果は目下検討中である．

Clin．Chim．Acta．，129：165−173，1983．
5）厚生省新薬開発研究（江橋珪）：低分子酵素

まと阻害物質による難病治療薬の開発研究，昭め筋ジスマウスの前肢筋および後肢筋中のプロ

和63年度研究報告書，1989，p．p．3−7．

テアーゼ活性の動態を経時的に追究した．各種

6）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，のプロテアーゼ活性は対照に比べ有意に増加す

M．，Okubo，M．，Masaki，Y．and Umez−

る．主成分分析による解析では，PPDEおよび

awa，H．：J．Appl．Biochem．，7：273−281，

セリン・プロテアーゼに属する酵素が第1主成

1985．

分に高い相関を示した．筋崩壊に関与すること

7）McDonald，J．K．and Schwabe，C．：Inが考えられるDAP一ⅠⅠに対する阻害物質を探索

proteinasesin mammalian cells and

しDioctatinsAとBを見出し，その構造を決定

tissues（ed．by Barrett，A．J．）EIsevier／した．これらのプロテアーゼ阻害物質と筋崩壊

North−Holland Biomedical Press，Am−

表31nhibitoryactivityofdioctatinsAand

Sterdam，1977，p．p．314−322．

8）McDonald，J．K．，Leibach，F．H．，Crin−

B againstvariouspeptidasesdeland，R．E．andEllis，S．：J．Biol．Chem．，に50（閏／mn

243，4143−4150，1968．

Dioctatin A Dioctatin B
DAP一日

DAP−I

＞100
＞
＞

0
0

＞

＞

0
0

0
0

−31，1986．
11）Barrett，A．J．and Kirschke，H．：Ⅰn

＞

＞

＞100

＞

＞

0
0

fMet−APawa，H．：Biotech．Appl．Biochem．，8：23

0
0

0
0

Leu−AP

M．，Osanai，M．，Imahori，K．andUmez−

＞

＞

AP−M

10）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，

0
0

0
0

AP−B

242：4623−4630，1967．

0
0

＞

0
0

AP−A

9）Ellis，S．andNuenke，J．M．：J．Biol．Chem．，

0．89

0
0

＞

DAP−lV＞100
0
0

DAP1110．19＞100

methodsinenzymology（ed．byLorand，L．）Academicpress，NewYork，1981．p．p．

AP＝aminopeptidase；fMet：formylJrlethiDnine，

535−561．

DAP；dipeptidylpeptidase−19−12）Kato，H．，Adachi，N．，Ohno，Y．，Iwanaga，18）Lowry，0．H．，Rosebrough，N．J．，Farr，S．，Takada，K．and Sakakibara，S．：J．

A．L and Randall，R．J．：J．Biol．Chem．，

Biochem．，88：183−190，1980．

193：265−275，1951．

13）Nagase，H．andBarrett，A．：Biochem．J．，

19）Kendall，M．：In multivariate analysis，Charles Griffin and Co．，London，1975，

193：187−192，1981．

14）Kawabata，S．，Miura，T．，Morita，T

p．p．13−29．

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80，p．p．341−361．

−20−

MEL細胞の機能とプロリルエンドぺプチダーゼ
杉 田 秀 夫＊
研究協力者

塚 原 俊 文＊石 浦 章 一＊は じ め にリティックプロティナーゼ活性の他，種々の分細胞内タンパク質量は生合成と分解によって解活性を検討した．プロリルエンドペプチダー

バランスを保たれ，それぞれ特有の半減期を持

ゼ活性はSuc−GPLGP−MCAを基質として，2っている．このバランスは，細胞の状態や環境−メルカ70トエタノール存在下，pH7．0で測定によって変化することが知られており，特に筋した．

ジストロフィー等の進行性の筋萎縮を伴う疾患

細胞の熱処理は，FCSを含まない培地に懸濁においてはタンパク分解の異常が病態と深く関した細胞を450Cでインキュベートした．そのわっている．このようなタンパク分解系の異常

後，氷冷したPBSを加えて直ちに遠心するこが生理機能の喪失や疾患といかなる関連性があとによって細胞を集めた．

るのかは十分に明らかにされていない．そこでこれを明らかにする研究の一環として特異的な結果および考察

タンパク分解が昂進して細胞のタンパク質の量

MEL細胞をDMSOの存在あるいは非存在が大きく変化すると考えられる細胞の分化をモ

下で6日間培養後，細胞内プロテアーゼ活性をデルとしてタンパク分解経路がどの様に変化す測定した．細胞はDMSOの添加によって赤芽るのかを，分化誘導が容易なMEL細胞を利用

球様に分化し，ヘモグロビンを合成するようにして調べた．さらに，より病的な状態の1例となるが，表1に示したようにDMSO存在下でして細胞に熱処理やストレスを負荷し，同様な変化が引き起こされるか否かを検討した．

表l Changes ofprotease activities during
MEL cell differentiation

実験方法
MEL細胞は10％FCSを含むRPMI1640
培地で培養した．細胞分化の誘導は，4×104

Substrate pH

Actlvlty
Cont DMSO
n mole／mjn／mg

8−EKK−MCA

7．5

O．026

0．029

Cell／mlに調製した細胞を1．5％DMSO存在

8−VPR−MCA

7．5

0．649

0．469＊

下で6日間培養することによって行った．培養

8−VLK−MCA

7．5

0．206

0．240

後，遠心によって細胞を集め，PBSによって48−FSR−MCA

7．5

0．585

0．507

回洗浄した後，細胞を超音波によって破壊し，遠心上清を用いてプロテアーゼ活性を測定した．
プロテアーゼ活性はMCA基質の分解を指標として測定し，カテプシンB＆L，マルチキャタ

PFR−MCA

7．5

0．833

0．696＊＊S−APA−MCA

7．5

0．254

0．126＊

R−MCA

7．5

4．76

5．35

5．5

0．285

0．305

Z＿FR＿MCAS￣昔昔㌦．。。．一。8 。．269＊＊
いATP） 9．0 1．069＊国立精神・神経センター神経研究所＊pく0．01，＊＊pく0．05

ー21−

1．687

培養した細胞では非存在下で培養した細胞に比表3

べてSuc−APA−MCA分解活性が有意に減少しResidual activity of prolyl endope−
ptidasein heat−treated MEL cellsていた．この活性減少は細胞の分化に伴う現象

Temp・（OC）
Intact質を調べた．この酵素は分子量約7万でSuc−

IntactIntact

100

10

96．1

20

96．7

30

80．9

0
1

5

Intact01

5
4

Sonlcated

プトエタノールに依存的であったが，E−64によ

0

クー
2
4
4
4

IntactGPLGP−MCAを最もよく水解した．2−メルカ

Tine Activity（％）−
2
4であると考えられたので，MEL細胞からSuc−
APA−MCAを分解する酵素を精製してその性っては阻害されなかった．これらの性質より，
本酵素はプロリルエンドペ70チターゼと推定さ
表4れた．

EffectsofvariousreagentsontherTnal
inactivation of PEPase

次に，種々の70ロテアーゼ阻害剤が細胞内でRea9ent Con（：．

プロリルエンドペプチダーゼを阻害するか否かを調べるため，培地中に阻害剤を加えて培養し40

Aetlnomyeln D

35

25♪9ル1

一

None

▲

MO

3

⊥

′

⊥

b

O．1血比

⊥

O．l mH

EO−ES−Tエー0拭e2

EtO−ES−TR（NO2）OBヱ

一⊥2が示されたのでその効果も調べた．

J

m4CI

たBz−ES−PP−OBzが本酵素を阻害する可能性■

l t

50♪9′ml
l mH

ESl●

■

測定した．特に，昨年の研究で細胞毒性を示し

2

ヱⅩp．2

43

Cyclobex山mide O．5m且つた後に細胞を洗浄し，破砕後，細胞内の活性を

Re81dual Actlvlty

Exp．l pone

しかし，表2に示したように細胞内に取り込
まれて十分な効果を発揮する阻害剤はなかった．

れずこれらの合成は失活に必要でないと考えら

一方，細胞を熟処理してプロリルエンドペプ

れた．またプロテアーゼ阻害剤等の添加によっチダーゼ活性が減少するか否かを調べた．細胞ても失活が抑えられないことからリソソーム等

を420Cで処理しても活性は変化しなかったが，で分解されて活性を失っているのでもないと推450Cで処理すると急速な失活がみられた．しか定された．また熱処理によって細胞内インヒビ

し，超音波破壊した細胞では450C処理でも活性

ターが活性化する可能性も考えられたが，熟処低下はみられなかった（表3）．

理した細胞内にはインヒビター活性は認められライゼートでは活性の減少がみられないことなかった．

から，熱処理による失活が細胞機能と関わって熟以外のストレスを細胞に負荷したところ細いると考えられたのでどの様な機能が活性調節

胞内の酸化型グルタチオン濃度を上昇させるメに必要かを調べた．表4に明らかな様にこの失ナジオンの添加によってプロリルエンドペプチ

活はタンパク質や核酸の合成の阻害剤に影響さ

ダーゼ活性が減少した（表5）．そこで細胞ライゼートに酸化型グルタチオンを加えプロリルエ

表2 EffectsofinhibitorsonPEPaseactiv．

ンドペプチダーゼが失活するか否かを確かめた．

ity
工nhibitor conc．

Aく：tlvity（亀）None
Z−Thlopro−
thiazolidine

表5

Effects of stresses on proteinase
activities

100

Reagents

0．1mH

pApMSF O．1mM
Bz−ES−Pp−OBz O．1mH

72．2

69．7
83．0

Conc．

None
EtOI王

6

H202

1m班

出enadione−22−

PEPase

lOO
号

501朗

CathB＆L

lOO
68
87
21

HCP

lOO
87

117

39

96

101

68

結

表6InactivationofPEPasebytheadditionof GSSGConc．（mM）

論

MEL細胞の分化やストレスの負荷に伴ってプロリルエンドペプチダーゼ活性が特異的に減Activity32

内酸化型グルタチオン濃度の上昇が関与してい

3

5

8

0

06

⊥

少した．ストレス負荷による活性減少には細胞ることが示唆された．

q
ノ

つー

文

献

1）Tsukahara，T．，Ishiura，S．and Sugita，

表6に示したように450Cでインキュベートし

H．：Cell StruSt．Funct．，14：940，1989．

たライゼートでは酸化型グルタチオンの濃度に2）Tsukahara，T．，Ishiura，S．，Kominami，E．

依存して活性の減少がみられた．しかし370CでandSugita，H．：Exp．CellRes．，inpress・は酸化型グルタチオンを加えても活性は減少し3）Prett，G．，Hough，R．andRechsteiner，M．：

なかった．この実験結果は細胞内においてはプ

J．Biol．Chem．，264，12525−12532，1989．

ロリルエンドペプチダーゼが熱処理やメナジオ

4）Tsukahara，T．，Ishiura，S．and Sugita，

ン添加によって生じた酸化型グルタチオンによって活性を調節されている可能性を示唆した．

−23−

H．：Submitted．

E−64−CおよびESTの薬物動態
一蛍光HPLCによるマウス血清および筋肉中濃度の測定一
大 倉 洋 甫＊
研究協力者

巣

文 峰＊

甲 斐 雅 亮■は じ めにわれわれは，高選択的かつ高感度な蛍光誘導

盲目2

愕rnMJrUrUrU／CH5

体化試薬を利用した蛍光検出・高速液体クロマ

H、＿ ノCONH−CH−CON
C−C

トグラフィー（HPLC）を手段として，血液なら

ハ0／▼＼H

H桑00C

C 2CH2CH宣

びに筋肉中に分布しているロイペプチン1），ベ
フェニシノール5）・6），アンチパイン7），ホルフェニ

一ヽ′
H

C

昨年度は，ペ70チド様化合物であるE−64−C︐ヽ′nH。。ンC議0を開発し，それらの生体内動態を検討してきた．

‖

C

＝HH

C
2

H
N
O

シン8）などの実用的かつ簡便な薬物モニター法

／げへ
ヽ
C
2

︐︶
︐ ⊃日∩
‖∩
‖ ∩ ︵L正し

スタテン2）・3），p一ヒドロキシベスタテン3）・4），ホルE−6上トCおよびESTの蛍光ラベル化剤として，当分担O研究者らが既に開発した3−プロモメチルー6，7

二二二三三−ジメトキシー1−メチルー2（1Hトキノキサリノ

CH2−8「BトDMEOン（Br−DMEQ）を用い9），10），E−64−Cのカルポキ血清および筋肉中のE−64−CおよびESTの薬水溶液に懸濁したESTあるいはE−64−Cを50

物モニター法を開発した．さらに，E−64−Cまたmg／kgの投与量で経口投与した．投与後，水だはESTを経口投与したマウス体内（血清およけを与え，各時間ごとにマウスを頸動脈切断にび筋肉）の経時的濃度変化を調べた．

より殺し，直ちに血清および僧帽筋を採取した．
得られた血清および筋肉を−800Cの冷凍庫に

実験方法

保有した．

（1）経口投与：近交系のC57BLマウス（雄性，5週齢，約18g体重）に5％アラビアゴム（2）E−64−Cの定量：血清10J 1にH20（検量線
作成時，E−64−Cの標準水溶液）10J 1およびアセトン200〝1を加え，除蛋白する．筋肉試料の場■九州大学薬学部

合は，筋肉20mgにH20（検量線作成時，E−64
−24−

︐ヽ一

2

ラベル化法を蛍光検出HPLCに応用し，マウス

日nC

図1Fluorescence derivatization of EST
and E−64−Cwith Br−DMEQ

︐ヽノ

Fluorophore1）．

本年度は，このBr−DMEQ試薬を用いる蛍光

hH日

C

日H⁚

C
2

C
2
日
rL
H
HH
0
C

︵

HHH
■
ぺ
HN
CW
H O
′

7日2Cく：：；

O

により蛍光ラベル化する方法を確立した（図h︑／COってESTをE−64−Cへ導き，続けてBr−DMEQ

り∴︒T叫

‖∩‖H‖

また，ESTのラベル化には，酵素加水分解によ︒．悶

シル基を蛍光ラベルする反応条件を設定した．

−Cの標準水溶液）50〃1を加え，ホモジナイズす合，E−64−Cの添加回収率を調べた（図2）．そのる．これにアセトン200〟1を加え，除蛋白す

結果，アセトン200JJl以上を使用したときに良る．両試料とも，それぞれ1000gで，5分間遠

好な回収率（80％）が得られた．

心後，各上清20JJlを遮光バイヤルに移す．バイ

アセトンをラベル化反応液中0−60％（Ⅴ／v）

ヤルに，100mMKHC03のDMF−H20（4：1，の範囲で変化させたとき，E−64−Cの蛍光体の生V／V）溶液10JLlおよび4mM Br−DMEQの成量を調べた．図3に示すように，反応液中のDMF溶液70〃1を加え，1000C20分間加熱す

アセトン濃度が20％以上になると，蛍光生成物

る．その50／ 1をHPLCに注入する．
（3）ESTの定量：血清10J′＝こH20（検量線作成時，ESTの標準水溶液）10〝1および300
units（10mg）／mlcarboxylesteraseの0・1M（24±50C）で30分間放置する．筋肉試料の場合
は，筋肉20mgにH20（検量線作成時，ESTの；︶ hHU＞00月

リン酸塩緩衝液（pH8．0）2JJlを加え，室温標準水溶液）50JJlを加え，ホモジナイズする．
ホモジネートに300units（10mg）／mlcarboxyl
0

100

200

300

400

esteraseの0．1Mリン酸塩緩衝液（pH8．0）5〟1を加え，室温（24±50C）で30分間放置す

図2

Effectoftheamountofacetoneinthe
deproteinizationontherecoveryofEる．酵素反応後，両反応液にアセトン200／Jlを−64−C

加え，1000gで5分間それぞれ遠心したのち，

AlO−JLlprotionoflOnmol／mlE−64

各上清20ノバをE−64−Cの定量法と同様に蛍光−CWaSaddedtolOJLlofserumandthe

誘導体化反応に用い，HPLCによって蛍光ラベ

mixture was deproteinized with

ル化体を分離検出する．ESTの定量値はE−64−

acetoneatvariousamountsandtreat・

Cの定量値を差し引くことによって求める．

ed asintherecommendedprocedure．
⊥0（4）HPLC条件：カラムはTSKgel ODST120
T（150×4mm，i．d．；粒径，5JLm）を使用し溶出したのち，直ちにCH。CN−H20（19：1，■息恵三ぶり小山

速0．8ml／minで送液した．E−64−Cの蛍光体がⅤ／v）の溶艶液を同じ流速で流し，カラムを洗浄︵JづヨゝF巴一Jqヨ﹀

た．CH。CN−H20（2：3，Ⅴ／v）の溶離液を流した．蛍光検出は，励起波長380mmおよび発光
波長460nmで行なった．

0

結果および考察

図3

10

20

30

40

50

60

Effectoftheconcentrationofacetone
inthereactionmixtureonthederivat・（1）試料の前処理および誘導体化反応
E−64−Cの蛍光誘導体化反応は有機溶媒中でization of E−64−C

A20−PlportionoflOnmol／miE−64

進行するので，生体試料の除蛋白剤としてアセ，CWaStreatedasintherecommended

トンを用いた．コントロールマウスの血清10〟1

procedureforthederivatizationintheにE−64−C標準液（100nmol／ml）10JLlを添加

presence of acetoneinthe reaction

し，50−400JJlのアセトンにより除蛋白した場−25−

mixture．

のピークはほぼ直線的に低くなり，アセトンによって誘導体化反応が阻害されることが分かっ■五首芸∵馬g

蛋白した上清）を減じることは，生体試料中の微量E−64−Cの測定が困難になるので，定量操作には上清20〟1をラベル化反応に用いた．
また，Br−DMEQ試薬によるラベル化反応は︵小河︻ヨhhdh■7月山王た．しかし，反応に用いる試料量（アセトン除

KHC03の存在下で進行する．KHC03のDMF−H20（4：1，Ⅴ／v）溶液（濃度，0−200mM）
0を使用して，蛍光誘導化反応に及ぼす影響を調

2

4

6

8

10

Br−DHEO（mM）

べた（図4）．KHCO3濃度が100mM以上のとき蛍光ピークは最大となった．しかし，150mM

図5以上のKHCO3溶液を室温で長時間放置する

Effect of the concentration of BrTDMEQ onthederivatizationofET64−と，KHC03の結晶が生じるため，100mMの溶液を用いた．

AlO−JLlportionoflOnmol／miE−64
LC WaS added to serumandtreated as

生体試料中のE−64−Cを誘導体化する場合にintherecommendedprocedurewithBr−DMEQ at various concentrations．

必要なBr−DMEQ濃度を検討した（図5）．4
mM以上のBr−DMEQであるときに最大の反応収率が得られた．しかし，高濃度の試薬（6び370Cでは，少なくとも1時間反応しても最大mM以上）を用いると，試薬由来の蛍光ピークの蛍光ピークは得られなかった．一万，1000Cでのテーリング部分がE−64−Cの蛍光ピークの検は，10−25分間で最大の蛍光ピークが得られた出を妨害したので，4mM Br−DMEQを使用した．

件を選択した．

生体試料を用いたとき，蛍光誘導化反応は標（図6）．したがって，1000C，20分間の反応条（2）E−64−CおよびESTの定量

準試料の場合よりやや遅く進行した．600Cおよ

図7は，E−64−Cをマウスに経口投与し，投与■負号ヱ二竃だ

50

100

150

；T弓hHdhヱqH巾︶

一息やぷ∴扁麗；T已ヨhhdh︺可月︼ヱ
0

10

200

図4

20

30

40

50

Tl皿e rmln）

ⅩHCO3（mM）

Effect oftheconcentrationofKHCO3

図6

Effect ofreaction time and tempera−

0n the derivatization of E−64−C

ture on the derivatization of E−64，C

AlO−JLlportionoflOnmol／mlE−64−C WaS added to serumandtreated as

AlO−JLlportionoflOnmol／mlE−64−CWaSaddedtoserumandtreated as

inthe recommended procedure withinthe recommended procedure at37，

KHCO3at Various concentrations．

60andlOO．C forvariOus periods．
−26−

60

hO一〇〇■中凸

苫白鼠∞Oh hO一U月中凸○叫COduのH

0

10

20

：10

40

50

D lO

Tlme fmln）

図7

20

30

40

50

で1m0lmln）

Chromatograms of E−64−C

図8

in（A）

Chromatograms of E−64−C Obtained

serumand（B）muscleat4hafteroral

withhydrolysisofESTin（A）serum

administration of E−64−C tO a mOuSeand（B）muscle at（Do紀：50mg／kg）．

administration of EST to a mouse4

h after oral

（Dose：50mg／kg）．

Peaks：1＝E−64LC，Others＝reagent

blanksand endogenous substancesin

Peaks：1＝E−64，C，Others＝reagent

Serum and music．ConcentrationsofEblanks and endogenous substancesin−64−C：（A）8．40nmol／mlinserum，（B）

serumandmuscle．ConcentrationsofE

3．88nmol／ginmuscle．

−64−C and EST：（A）137nmoIE−64−C
and15nmoIEST／mlinserum；（B）23
nmoIE−64−C andlO nmoIEST／gin

後4時間における血清および筋肉試料から得らmuscle．

れたクロマトグラムである．また，ESTを同様にマウスに投与し，同じく投与後4時間に採取線を示した．検量線の相関係数（r）はそれぞれした血清および筋肉中のESTを酵素反応によ0．999および0．997であった．また，S／N＝3にってE−64−Cに変換したときに得られるクロマ

おける検出限界はほぼE−64−Cの場合と同様でトグラムを図8に示す．E−64−Cの蛍光ピークは

血清中では500pmol／ml，筋肉中では300

保持時間20分に溶出し，試薬ブランクおよび生

pmol／gであった．また，同じ試料を6回繰り返

体由来の妨害ピークと良好に分放された．

して測定して得られた相対標準偏差は5

マウス血清および筋肉に添加したE−64−Cのnmol／ml血清の場合は5．2％で，1．5nmol／g

検量線は少なくともそれぞれ0．5〃mOl／mlお筋肉の場合は6．1％であった．

よび0．8JJmOl／gの添加量まで原点を通る直線（3）E−64−CおよびESTの体内動態
E−64−Cを投与したマウスの血清および筋肉を示した．検量線の相関係数（r）はそれぞれ0．999および0．998であった．また，S／N＝3に中E−64−Cの経時的濃度変化を調べた（図9おける検出限界は血清中では500pmol／ml，筋A）．E−64−Cの濃度は血清および筋肉中とも投肉中では320pmol／gであり，HPLCの注入量

与後1時間で最大値に達し，その後徐々に減少で表わすと，約0．6pmolに相当する．また，同した．血清および筋肉における濃度曲線のE−64

じ試料を6回繰り返して測定して得られた相対−Cの消失半減期はそれぞれ約8．7および約5．2

標準偏差は5nmol／ml血清の場合は4．7％で，時間であった．なお，E−64−Cを授与したとき，1．5nmol／g筋肉の場合は5．5％であった．

血清および筋肉中におけるESTの生成は認め

一方，マウス血清および筋肉に添加したESTの検量線は少なくともそれぞれ0．7／JmOl／ml
および1．OJJmOl／gの添加量まで原点を通る直られなかった．
ESTを投与した場合の血清および筋肉中ESTの経時的濃度変化を調べた結果を図9B

ー27−

（B）ESで（A）E−64−C adminlstratlon

ト∽山⁚hd▼ nTふふ−H︵b hO HE＼TO∈王
0

2

4

6

8

0

2

Time（h）

図9

administration

4

6

8

でime（h）

Concentrations of EL64−C and ESTinserum and muscle of mice（n＝3）after oral
administrations of（A）EL64−C and（B）EST（Dose；50mg／kgeach）．
CurveS：S，EL64−Cinserum；M，E−64−Cinmuscle；S，ESTinserum；M，ESTinmuscle．

に示す．ESTの消失半減期は血清中では約4．0

内において，その薬物活性代謝物としてのE−64

時間で，筋肉中では約5．3時間であった．EST−Cが高濃度に血清および筋肉中に分布し得るを投与したマウスの血清および筋肉中ではE−ことを化学的に明らかにした．

64−Cもその代謝物として検出された．その濃度は投与後6時間まで徐々に増大した．また，血文

献

清では約0．8時間以後，筋肉では約1．5時間以

1）Kai，M．，Miura，T．，Ishida，J．andOhkura，

後において，代謝物E−64−Cの濃度はESTの濃Y．：J．Chromatogr．，345，259−265，1985．

度を上回り，それぞれ投与後4時間および6時

2）Ishida，J．，Yamaguchi，M．，Kai，M．and

間で最大値を示した．特に，6時間後採取した

Ohkura，Y．：J．Chromatogr．，305，381−

血清中のET64−C浪度は，等量のE−64−Cを投与

389，1984．

したマウスの6時間後の血清中のE−64−C浪度3）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：の14倍も高い値を示した．これらの結果は，

Ⅹenobio．Metabol．Dispos．，1，397−403，

EST投与の方が，E−64−C投与より，より高い薬

1986．

物活性が得られ易いことを示唆した．

4）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：J．
Chromatogr．，344，267−274，1985．

おわ り に5）Tamura，M．，Kai，M．and Ohkura，Y．：

Br−DMEQ試薬を用いた蛍光HPLCは，E−

Jap．J．Clin．Chemリ13，1957201，1984．

64−CおよびESTを経口投与したマウスの血清

6）Kai，M．，Tamura，K．，Ohno，M．and

および筋肉中の徽量E−64−Cの薬物モニターを

Ohkura，Y．：Biomed．Chromatogr．，1，143可能にした．また，酵素による加水分解法によ−146，1986．

って生体試料中のESTも同じ蛍光HPLCに

7）甲斐雅亮，坂本靖浩，三浦哲朗，大倉洋甫：

よって高感度に定量できた．

分析化学，35，329−331，1986．

開発した方法により，ET64−CあるいはEST

8）Chao，W．−F，Kai，M．andOhkura，Y．：J．

投与マウスの血清および筋肉中の両薬物濃度を測定した結果，ESTを投与したとき，マウス体

Chromatogr．，430，361−367，1988．
9）Yamaguchi，M．，Hara，S．，Matsunaga，R．，−28−

Nakamura，M．and Ohkura，Y．：Anal．

Nakamura，M．and Ohkura，Y．：J．

Sci．，1，295−296，1985．

Chromatogr．，346，227−236，1985．

10）Yamaguchi，M．，Hara，S．，Matsunaga，R．，−29−

CANP阻害剤の一般薬理学的研究
一表面筋電図中の呼吸運動問連成分の定量化に基づく筋機能評価法に問する基礎的研究−
福 原 武 彦＊研究協力者

加 藤 絶 夫＊

木 村 直 史＊

高 野 一 夫＊塚 元 葉 子＊ヒト筋ジストロフィー症の治療薬の開発を推

しくは横隔膜の筋電図から，これに相当する成分を検出した報告もある2）8）12）13）

進するうえで，生理学ならびに病態生理学的基昨年度，我々は，ヒトの呼吸筋表面筋電図を盤に立った薬効の定量的評価法が確立される必

非侵襲的に導出し，そこに含まれる高頻度同期

要があることはいうまでもない．その評価法に波相当成分を周波数分析の手法を用いて同定す

おいて用いられる手旨標が可及的に非侵襲的な計ることによって，呼吸調節系，運動神経機能，

測手法によって測定することができ，しかも，神経筋伝達，および呼吸筋収縮機能との関連の

実際の臨床症例に対しても適用可能であり，さもとに，これらの機能的な異常を定量的に評価

らに治療薬の薬効のみならず病態，およびそのし得る可能性につき検討した8）．今年度我々は，進行もしくは改善の程度の評価方法としても応諸種の中枢性運動性命令に対する呼吸筋群の電用され得ることが確認されるならば，その評価

気的応答性を定量的に評価する方法の確立を目

法の有用性は，極めて高いものとなるものと考標として，健常人から導出された呼吸筋群の表えられる．

面筋電図のパワースペクトル解析と複数の導出

目

的

一方，麻酔下，人工換気下に導出された高等部位間のコヒーレンス解析1）を組合せることに哺乳動物の呼吸筋ならびに呼吸補助筋群を支配

よって，筋集合活動電位中に発現する呼吸運動

する遠心性神経の吸息性活動電位が，60−130

関連成分とそれ以外の分別を試み，あわせてそHzの成分，すなわち「高頻度同期波」成分をその臨床的検査ならびに診断への応用可能性を検の主成分として多く含んでいることが知られて討した．この評価法が，一つの臨床検査法としおり4）・5）・9）・10），これは，脳幹に存在する呼吸中枢て確立されれば，筋ジストロフィー，重症筋無内の神経回路において共通に形成され，呼吸運力症あるいは筋萎縮性側索硬化症などの運動単動に関連した骨格筋群を支配する神経内の運動位の障害をきたす疾患の病態ならびにその治療

神経細胞の同期的発火を引き起こし，効率的な薬の薬効の機能的かつ非侵聾的な評価法として呼吸運動の中枢性制御に関与する成分である可応用し得る可能性が期待される．

能性が示されている9）．また，この高頻度同期波が神経筋伝達を介して呼吸筋の筋電図中にも発実験方法現する事実は，ウサギ，ネコ，イヌにおいても呼吸器ならびに心疾患の既往歴のない健常男

確認されており4卜7），さらに，健常人の肋間筋も子7名（22〜35歳）を被験者とした．座位において，以下の7部位より，約2cmの間隔で装着＊東京慈恵会医科大学第二薬理学教室

した直径約8mmの銀塩化銀皿電極により表−30−

面筋電図を双極性に導出した（時定数0．03

連続記録とともにデータレコーダ（TEAC，ⅩR秒）：左顎二腹筋前腹上（図1左上の模式図の−510）に収録し，実験終了後，筋電図中に混入（∋），横隔膜胸骨部近傍上の刺状突起両側（同②，③），第7，第8肋間前腋寓線上の左右肋間する心電図成分をR一波同期FFT法により除部（同①，（9），および左右第2，第3肋間鎖骨
中線内側（同⑥，（D）．筋電図の導出下，被験者

通，および非共通の周波数成分を定量的に同定に以下の9項目の負荷を実行させた（各30秒〜1分）：1）安静呼吸，2）下顎の開閉を伴う

ル密度関数，2）すべての筋電図間の組み合わせ

強制呼吸，3）パルサルバ・テスト，4）連続に直交パワースペクトル密度関数）を骨法に基的な唾液の嘆下，5）舌突出，6）吸息位での息こらえ，7）呼息位での息こらえ，8）深呼づいて0−200Hzの帯域につき推定清算した1）．

吸，および9）ビニール・バッグ法による再呼吸．

相関を各周波数ごとに0から1の間の数値で示

上記の筋電図の記録を呼気中炭酸ガス濃度のさらに，10−200Hzの帯域全体における2筋

EupneaForcedbreathing

去した上で13），これらの筋電図中に含まれる共する目的で，1）各筋電図の自己パワースペクトの相互パワースペクトル密度関数（同相ならび

また，異なる部位から導出された2筋電図間のすコヒーレンス（関連度関数）を推定した．

ValsalYa．S

叫刷〟困休止Eupnea Breath hold■ng（りnaneUVer

SwalEow■ng

TongueprotruslOn

木霊圭㌻キルサ

Breath holding（E）

Deep breath油g Rebreathi叩

5：一山守山＝一日HHHHu HH⊥⊥リセ山一ミート山一㌣1−ト∴托し1−1−1山1−111l
6＝日日：日日∴＝三日日日三日三日日日日日日日日日日日≡H EH

一三一HHHH上目

5S

図1，図2 1〜7，健常人から導出された筋電図記録．それぞれ左上の導出部位①〜⑦の筋電図記録．FECO2，・呼気炭酸ガス濃度（校正は0−5％）．校正は200／ Ⅴ（1−7）．時標は5S．記録277中のスパイク様電位はECGの混入．
−31−

電図間の相関の程度の指標として， ■coherent

期性成分の存在を示唆するピークは検出し得なindex（付記参照） を定義し，その安静呼吸下かったので，以下の解析においては，これらのの値に対する対数変化率と，同帯域における筋スペクトルが大きく変化を示し，かつヒトなら

電図振幅の二乗平均値の対数変化率を2次元平びに動物における高頻度周期波の発現周波数帯面上にプロットし，これを一一power versus

域2）・4）t弘9）・10）を含む10−200 Hzの帯域全体の変

COherentindex plot（P−C plot） とした（付化を評価することとした．
そこで，これらが安静呼吸下に導出された筋

記参照）．

電図に対する変化を定量的に検討する目的で，

実験成績

各負荷下の筋電図に対し， P−Cplot

を試みた

導出部位の表面筋電図の振幅は，それぞれの負図のパワー値，すなわちその振幅の二乗平均値

荷により大きく変化したが，その程度は導出部の対安静呼吸変化率を示し，縦軸は，10−200Hz

位によって様々であった（図1および2）．そのの帯域におけるcoherentindexすなわち，共通

周波数分析を行なったところ，それぞれの筋電の周波数成分の含有率の村安静呼吸変化率を示

図の自己パワースペクトル密度関数，および異すものである．ここではそれぞれの対数としてなる導出部位間のコヒーレンスにはさまざまなプロットさせているため，安静呼吸時の座標点

定性的ならびに定量的変化が見出された（図3は原点上にのることになる．例えば，ある負荷

および4：ただし以下には，最も特徴的かつ興によって座標点が第Ⅰ象限に移動した場合，そ味深い変化を示した左顎二腹筋前腹上および左れは，2筋電図問の相関の程度が高まった上で

右第2，第3肋間鎖骨中線内側の組み合わせのそれぞれの活動量が増大したことを意味し，逆解析結果の一部のみを図示した）．本解析の結に，座標点が第ⅠⅤ象限に移動した場合，それは，果，これらのスペクトルには，定常性の高い周それぞれの活動量が増大したものの，2筋電図

e
W
O
P
O
t
‖︸
a

Forced brモalhing

ValsaIvals maneUVer

C

Eupnea転﹈巨（図5および6）．このプロットの横軸は，筋電A山口淫彗

呼吸性あるいは非呼吸性の負荷によって，各COherence
A−C

G，I

癌二
二∴、

Sw8日0、Y佃g

巨∃菌

T（】ngUe PrOtrUSion

0

図3

200

HZ M．H．：2つu

左顎二腹筋前腹上および左第2．第3肋間鎖骨中線内側から導出された表面筋電図の自己パワースペクトルならびに両者間のコヒーレンス・スペクトル．横軸はいずれも周波数（0−200Hz）．自己パワースペクトル密度関数の縦軸，相対パワー密度の平方値（Ⅴ／Hz）；コヒーレンス・スペクトルの縦軸，コヒーレンス（0−1）．A，B，C．A−Cな
らびにB−Cは，右下の模式図における導出部位およびその組み合わせを表わす．
−32−

CRE﹈⁝

e
W
O
P
O
t
‖−
a

■

Eupnea﹂Breath holdlng（り﹂Breath holdlng（E〉﹂

Deep breathlng

COhe「ence

宿二
・二

﹂

Rebreat柚咽﹂図4

左右第2，第3肋間鎖骨中線内側から導出された表面筋電図の自己パワースペクトルならびに両者間のコヒーレンス・スペクトル解析．詳細は図3および4に準ずる．

POWER vs．COHERENTINDEX PLOT

C B
−
c

A

C

Euprlea

8rea【h holdlng‖

Forced breathing

8「eath holdlng tE）

R由reathing

C

8
c

E岬nea

Oeep breathlng−

商S、Va110Wl咽TorlgUe pr0trusl0∩

い三7；22−35y；叫

十∴㍉

A
−
C

POWER vs．COHERENTlNDEX PLOT−

c菌
hl7；22−35y；叫

図5，図6 左顎二腹筋前腹上および左右第2，第3肋間鎖骨中線内側から導出された表面筋
電図のスペクトル解析結果のfLC plot．A，B，C，A−CならびにB−Cは，右下の模式図における導出部位およびその組み合わせを表わす．一つの黒丸は一人の被験者の解析結果を示す．縦軌横軸ともに，1目盛が10dB．P−Cplotの詳
細については本文参照．

間の相関の程度は低くなったことを意味する．

る運動神経によって支配される筋群の筋電図間

この ■P−Cplot を行なった結果，1）解析のの解析結果は，同じ負荷下においても全く異な対象とする導出部位の組み合わせによって，なる特徴的な変化を示した（図7の左右）．こと

らびに，2）負荷の種類によって，その座標点に，連続的な唾液の囁下（図7の⑥）や舌突出

は，さまざまな位置に移動することが確認され（図7⑤）といった非呼吸性の負荷，あるいは，た（図7）．特に，脊髄上の異なる髄節，あるい

強制呼吸（図7②）ならびに呼息位における息は，脳幹と脊髄のように，離れた部位に起始す

こらえ（図7⑦）といった呼吸性の負荷におい−33−算出したが，疾患群と健常群の間に有意な差は

POWER vs．COHERENTlNDEX PLOT

認められなかったことを報告している．

①：Eupr杷a②こForced breathlng③：Va】salva■s maneuver
＠：SvはIlowing⑤：Tongue pro ruslOn⑥：8reath hoId■ng‖⑦：Breath hoIdIng（E）⑧：Deep breath川9⑳：Rebreathlng

これらの研究では，表面筋電図のパワースペ
クトル解析によってその周波数成分に及ぼす筋変性の影響を定量化することが試みられている−
10

0 C ld ）l

C l咽 ④②が，一般に表面筋電図の周波数成分は，中枢神

⑦
⑤ ⑧10
t中
1

野

p

P ld B】

▼
l0

0

鱒

1

経系からの運動性命令が，神経筋接合部におけ③
井 珊

る伝達ならびに筋活動電位の発生過程を通じて

⑨

⑥
⑥鞄

⑨

③

変調され，さらにそれが，筋線維群の電気緊張

②
．
10

⑤④

電位性の相互干渉や時間的かつ空間的な加算を
tl叩小

図7

○††■ub岬Ct∝

22−3S Y：Hl

受けた上で集合電位として発現するものと見倣される11）．したがって，これらの研究において用左顎二腹筋前腹上および左右第2，第3
肋間鎖骨中線内側から導出された表面筋
電図のスペクトル解析結果のP−C plot．
A，B，C，A−CならびにB−Cは，右下の模式図における導出部位およびその組
み合わせを表わす．（彰一⑨は安静呼吸時
および＼各種の負荷施行時の結果を仝解析
例（n＝7）について平均した値を表わ
す．縦軸，横軸ともに，1目盛が10dB．
P−C plotの詳細については本文参照．

いられたパワースペクトル解析のみによっては，
筋電図の周波数成分の変化が，中枢神経系からの運動性命令の変化によるのか，神経筋伝達機構，筋活動電位発生機構ならびに筋収縮機構な
どを●ふくむ筋活動の変化によるのかを弁別することは不可能である．
一万，本研究において認められたように，電気緊張電位性の干渉の影響を無視し得る程度まで隔れた部位から導出した複数の筋電図間に共て異なる導出部位間の組み合わせによる P−C

通の互いに同期した周波数成分が検出された場

plot 上の座標点の位置の差は顕著であった（図5，6および7）．

合，その同期性は，中枢神経内の神経連絡に由来するものと見倣し得る．
また，呼吸中枢が血中酸素および炭酸ガス濃考度を適正に維持するための反射性応答能を保持

察

現在までに，骨格筋の表面筋電図のパワース

しているならば，安静呼吸時に呼吸中枢から呼ペクトル解析に基づいて，筋ジストロフィー症

吸筋・呼吸補助筋群へと伝えられる運動性の出における筋収縮機能の変化を解析する試みが行

力は，一般的な随意運動性の出力に比し，定常

なわれている．永田11）は上腕二頭筋の表面筋電性と安定性ならびに再現性に富んだものである

図を記録し最大随意筋収縮ならびに正弦波追従と考えられ得る．

補償トラッキング動作下のパワースペクトル密本研究では，各筋電図間に共通な周波数成分

度関数を推定し，疾患群の補償トラッキング動の含有率をcoherentindexとして定量化し，そ作下の平均パワー周波数が，健常群のそれよりの変化を，それぞれの筋電図のパワースペクトも有意に低い事実を示している．また，安武14）

ル密度の変化とともに，安静呼吸下との比較のは筋ジストロフィー症の患者において第6−第もとに定量化することを試みた．その結果，様々

8肋間において横隔膜の双極表面筋電図を導出

な呼吸性もしくは非呼吸性の負荷に対する，パ

し，そのパワースペクトル解析の結果から，呼ワー値とcoherentindexの変化態度が，導出し吸筋の疲労を鋭敏に検出し得る指標と考えられた部位の組合せによって極めて多様，かつそれているHighfrequency／Lowfrequency比3）をぞれに特徴的であることを確認し得た．しかも，−34−

負荷によっては，異なる個体においてもその

但し，TP五：OOp（f）df

P−Cplot上の変化が，定常的に再現性をもって発現する事実も見出された．従って，筋電図を（TP，：負荷下，TP：安静呼吸下の値）
縦軸C［dB］：

導出している部位の近傍において，筋線経の萎
縮や，神経筋接合部の機能的障害などの病態生

20・log諾

理学的な変化が生じた場合，この，COherent（C，：負荷下，C：安静呼吸下の値）

indexとパワー値の対安静呼吸変化率にも大き文な変化が認められるものと推察される．例えば，
coherentindexの低下をともなわないパワー

献1）Bendat，J．S．andPiersol，A．G．：

Random値の低下は，それが，中枢由来の運動性出力のData：AnalysisandMeasurementProce−

減少ではなく，筋変性に由来した変化である可dures

能性を示すと考えられる．従って，次の研究課

1971．

，JohnWileyandSons，NewYork，

2）BruCe，E．N．andAckerson，LM．：High−

題は，本研究において得られた成果をふまえ，適正かつ最適な測定条件，筋電図の導出方法などを初めとした標準的な計測ならびに解析方法

frequency oscillationsin human
electromyograms during voluntary

および測定結果の解釈（臨床的所見との対応をCOntraCtions，J．Neurophysiolリ56，542−

含む）につき十分な知見を積み重ねることであ553，1986．

る．このような検討の結果に基づき確立される

3）Cohen，C．A．，Zagaelbaum，G．，Gross，D．

解析法は，筋ジストロフィー症における呼吸筋

Roussos，C．H．and Macklem，P．T．：

変性の進行の程度の機能面からの判定およびClinical manifestations of

CANP阻害剤の治療効果に関する非侵襲的なmusclefatigue，Amer．J．Med．，73，308−

定量的評価方法としても有効な臨床的応用が期待される．

inspiratory

316，1982．

4）Dittler，R and Garten，S．：Die zeitliche
Folge der AktionsstrGmeinPhrenicus

付記

und Zwerchfell bei der natiirlichen

1．Coherentlndex（CxY）の推定

Innervation．Z．Bio1．，133，420−450，1912．

5）Gasser，H．S．and Newcomer，H．S．：
CxY

J：001PxY（f）Fdf

PhysiologiCal action currentsin theL700px（f）df・／：00pY（f）df

phrenic nerve．An application of the△thermionic vacuum tube to nerve

Px，：X，Yの相互パワースペクトル密度関数

physiology．Amer．J．Physio1．，57，1−26，

Px，PY：それぞれ，ⅩおよびYの自己パワース

1921．

ペクトル密度関数

6）福原武彦：CANP阻害剤の一般薬理学的研究−スペクトル解析を用いた筋電図および神経活動の定量的評価法−，厚生省新薬

2．Power versus Coherentlndex Prot

開発研究費「低分子酵素阻害物質による雉

（P−C ptot）

病治療薬の開発研究」江橋班昭和61年度研

20・log驚＋20・log驚究報告書，1987．
7）福原武彦：CANP阻害剤の一般薬理学的研究一筋電図および神経活動中の呼吸運動−35−

関連成分の定量的評価法に関する基礎的研

ムを発現する遠心性神経活動における高頻究−，厚生省新薬開発研究費「低分子酵素

度同期波の局在とその機能的意義．自律神阻害物質による難病治療薬の開発研究」江

経，25，503−510，1988．

橋班昭和62年度研究報告書，1988．

11）永田屁：筋と筋力の科学一筋収縮のスペク

8）福原武彦：CANP阻害剤の一般薬理学的トル解析，不味堂出版，1984，pp．204−213．

研究一神経活動および筋電図の周波数分析12）Sapuntsov，L．E．：Correlationanalysisofに基づく呼吸筋機能評価法に関する基礎的electricalactivity ofhumanmuscles of

研究−，厚生省新薬開発研究費「低分子酵respiration．Bull．Exp．Biol．Med．，71，604

素阻害物質による難病治療薬の開発研究」−606，1971．

江橋班昭和63年度研究報告書，1989．

13）Schweitzer，T．W．，Fitzgerald，J．W．，

9）Kato，F．，Kimura，N．，Takano，K．and

Bowden，J．A．and Lynne−Davies，P．：

Hukuhara，T．，Jr．：Quantitativespectral

Spectralanalysis ofhumaninspiratorY

analysisofhighfrequencyosci11ationsin

diaphragmatic electromyograms，J．

efferentnerveaCtivitieswithrespiratory

Appl．Physio1．，46，152−165，1979．

rhythm，In：

their

Respiratory

Neuromotor

Control

Musclesand，eds，G．C．

14）安武敏明：横隔膜筋電図の周波数分析，厚生省神経疾患研究委託費「筋ジストロフィ

Sieck，S．C．GandeviaandW．E．Cameron．

ー症の疫学，病態および治療開発に関する

AlanR．Liss，NewYork，1987，pp．263−

研究」昭和62年度報告書，1987，pp．228−

267．

232．

10）加藤縛夫，木村直史，福原武彦：呼吸リズ−36−

骨組髭現象におけるCathepsinBの関与とE−64誘導体の効果．勝 沼 信 彦＊
研究協力者

二 川
樋

口

健■
昭

唐 渡 孝 枝事

平‥

村

田

光

花 田 和 紀＊＊男H

研究の日的・意義

実験方法と結果

脱灰（Ca）現象に起因する骨粗鞍症は多い．

（1）無Ca食餌による実験的骨租怒症のCathe・

これは高齢化社会を迎えて普遍的な病態として

PSin群の動態

特に重要であることは言うまでもない．その上無Ca食で飼育したラットを4過と6週に殺に悪性腫瘍によるMalignant hyper calcemia

し，大腿骨を取り，液体窒素共存下に磨砕し，や妊娠時・閉経後の骨粗軽症も長く解決すべき

バッファーで抽出する．血清Caは軽度低下を対照疾患として問題にされてきた．最近はビタ

示すが，一定以上の低下はおこらない．骨からミンD3とPTHの研究が急速に進展して，骨の脱Caにより補給されるためで，大腿骨重量形成不全に対する対策は大きな進歩をみせた．

は図1のごとく低下する．磨枠に対しても物理

しかし，脱灰（Ca）の作用因子と機構に関する的に著明に脆くなっている．CathepsinH活性

分子レベルでの研究はなかった．Caを支持する

をR−MCA，Cathepsin B＋L活性をZ−F−R−

マトリックス蛋白の分解に関与している酵素にMCAで，CathepsinBはZ−R−RTMCAで測定関しても，主にコラゲナーゼのみが注目されてした．Hにはまったく両群に差はない．Bは著

おり一部エラスターゼも取扱われていた．我々

明に上昇しており，B＋L活性には軽度の上昇

は，各種の高カルシウム血症動物の血中Ca濃があるが，これはBの上昇による値である．夫々

度をE−64誘導体が著明に低下させることから，の抗体で測定すると明らかに無Ca食群で骨マトリックス蛋白の分解にCathepsin群がCathepsinBの量のみが増加しており，LとH

関与していることを予想した．一般にマクロフの量は全く変化していない．従来から一番着目ァージやクッパー細胞等の網内系食細胞にはされてきたコラゲナーゼ（typeIV）は図2のご

CathepsinBが圧倒的に多く，且つ容易に誘導的増加も起すことを明らかにしてきた．従って

とく無Ca食による脱灰には関与していないことが明らかとなった．

OsteoclastのCathepsin群がこれに関与して（2）E−64投与による骨Cathepsin群の抑制いることは最も考え易い．実際に骨脱灰におけ同様に無Ca食で6週間後にE−64を腹腔注るOsteoclastのCathepsin群の役割を明らか

射して6時間後に大腿骨のCathepsin群を測にし，その特異的阻害剤E−64誘導体および定したのが図2である．普通食群，無Ca食群を

Cystatin群の効果を明らかにすることを目的問わず，腹腔注射されたE−64は骨のカテプシとしている．

ン群を非常によく阻害することがわかる．これまでの集積された実験により，腹腔注射された
E−64aは6時間後にはほとんど無い．またE−＊徳島大学酵素科学研究センター＊＊大正製薬総合研究所

64aによる阻害はBとLに比べてHに対して感度が悪いので，細胞内に取込まれたE−64の−37−

La〉 骨重量と酵素活性（b）抗体によるCathepsinBのタンパク呈測定

図1無Ca食ラット，大腿骨の1ysosome酵素の変動

lCa．deRcienCy

図2

7weeks】（E−611a after Lp．6hrJ

Movements oflysosomalcystein proteinasesin femur with osteopolosis

濃度ではHは阻害されていない．一般にはg乃ある．しかし，この実験では，B，L，Hとも

uiuoでリソゾーム内にある場合，BとLは完全に阻害されているところから，大部分がOsteo一阻害されてもHは全く阻害されないのが普通でClastから分泌されたものであろうと推定され−38−

MechanismofBoneResorptionbyOsteoclast

る．図3のごとくウエスタンプロットの結果は，カテプシン群は活性型（成熟型）として分泌さPrecursor Ce‖

れて骨のマトリックス蛋白骨格を分解して脱灰・、ご￣をおこすのであると推定できる．図4にその模式図が示してある（マクロファージでは大部分lがプロ型で分泌される）．

DeferenciationandFusion（EGF．TGF，PGE，PTH，Ds）〔互支う

OsteocIast

Activation（PTH．DJ）．′Pro．Ca．B←Mature Ca，B
＼Initial pr（通uctOsteopalosis Control

図3

Western bloting of Cathepsin Bin
femur extracts

図4

表lInhibition specificieies of EL64derivertivesfor Cathepsin B，L and H（No．1）（ID50nM）
B

L

H

CANP

B：

L：

H

N

0

0
3

3

0

6
1

0
− さ

N

9

N

山 ・
■ さ

0

2
几 7

N

1．9叫0．000

500．000

1

35．000320−000

500．000

1：10．000：100．000

3．000：qO．000

1．800．000

1．000．000

200．000

1：30．000：20，000

B specific0

138．000

−

2

q6

0

O
q
山 ・

3
▲ 7 ︻
3

0

ヒ
N

■ U

0

N

7
■ ︶

0

u3．000

1，帥0

255

1沌：

1

1

2：

叫．8

250，000

330

65；

1

2

2q0−000

2．000

70

Evenly effeCtive

3

C

1．600

0．087

30：

20．00050．0001；1m．000

8

0
0

1

N

9
l
u ．
1
1

l

N

M

100
110

1，200，000
1−280．000

40．00010：

1：10．000

1叫．00010：

110．000

0

2

8
1

N

400′000

16

1100−000

5．000

10：

3．000

10：

んさ．ザ呼亡1：20．000

0

N

18

9

1

30．000

7
0
7
▲ U

︻ 8

5

（3）Ca欠乏食ラットでのE−64による血中Caの高Ca血症がE−64で低下させうるとのデー

濃度の低下

タもある．

食物からCaの供給がない動物においてはE（4）Cathepsin B特異的E−64誘導体の開発−64aの投与により6時間をピークにした著明

E−64とカテプシンの−SHとの結合部であな血中Ca濃度の低下がおこる．骨からの脱灰るエポキシコハク酸のカルポキンル基に各種のによる血中への供給が阻止されるためと考える

トリペプチドを結合したものを合成したところ，ことができる．またMaligTlanthypercalcemia

表1におけるNo．16，No．30，No．42の阻害は完−39−

表2Inhibition specificities of EL64derivertives for Cathepsin B，L and H（No．2）
llD50nM）
Calhepsin

B

Cathepsin

L

Cathepsin

E−611C

6．8

t3．q】

No．28

110

日60）

No．30

11．9【3）N0．6Z

30

150．000

1，250．000

No．65

18

150．000

900．000

No．71

2．080

1‡0．000＞1．000．000

No．7q

q．5

200．000

400．000

0．5（0．1）
335（810】41．000（35．000）

500

H
日6射り

3．800（6250】
叫30．000【320．000）

全にB特異的であった．特にNo．30はBに対すにした誘導体のうち水解されない，しかもBへる感度が良く，E−64Cと同じレベルであるのでの特異性の強いNo．74をトノブとするNo．62，

使用し易いはずである．E−64CはBとLと同時

No．65等の合成に成功している．これらB特異阻害に使用できるが，この場合Hに対する感度的阻害剤は上記骨粗軽症の治療剤として期待ではかなり悪い．しかしこのシリーズはエステル

きる．更に，各種Cystatin群のこの目的に対す誘導体であり，乃びわクでは水解して特異的を失る治療薬としての開発にも可能性がある（表2）．

う．この欠点をカバーすべくNo．30の構造を基−40−

哺乳類C−タンパク質のアイソフォーム特異的モノクローン抗体の作成およびそれを用いた筋病変に伴うC−タンパク質アイソフォーム
変換の解析
丸 山 工 作＊

研究協力者

日 ＊
エロ

大日方

小

島

月ま ＊
フJく

C一タンパク質は鶏骨格筋の発達過程や萎縮

バク質の粗画分を得，これをマウスに免疫して過程で著しい変化を示すことが特異的なモノク

モノクローン抗体を作成，抗遅筋C−タンパク質

ローン抗体を使用して明らかにされている1）・2）．

抗体RX−75をクローニングした．確立した他

特に鶏筋ジストロフィー症では，速筋である胸のモノクローン抗体，速筋／心筋C−タンパク質筋の中に遅筋型のC一タンパク質アイソフォーに対するもの（FC−18）（前年度報告）とミオシ

ムが出現する3）．最近二次元電気泳動法によるC

ンH一鎖に対するもの（MF−20）7）も用いた．

−タンパク質の詳細な解析が可能とされ4），ジス

2．その他の方法
等電点電気泳動は平林の方法8）に従い，支持トロフィー筋ではある種の遅筋型アイソフォー体にはアガロースを用い，pH領域の異なる酸ムが特徴的に現われることが解明された5）．
鶏でみる限りC−タンパク質は筋の病変過程

性，中性，塩基性の3層のゲルを重ねて行った．

を探る良い指標と思われる．哺乳類の筋ジスト

この方法がC−タンパク質の解析に有効である

ロフィー症でもC−タンパク質の変化は顕著にことは既に報告した5）．その後，二次元目の電気起こるであろうか．もしそうであれば，哺乳頬

泳動はSDS−7％アクリルアミドゲル上に展開

筋ジストロフィー症もC−タンパク質を一つのし，CBB染色するか，ニトロセルロース膜に転指標として解析していけることになる．このこ

写後，抗体を反応させてタンパク質のスポットとを明らかにするために，私達は有用なモノクを同定した．SDS−PAGEはLaemmli9）に従い，

ローン抗体を作成すること，C−タンパタ質の変イムノブロット法はTowbinら10）の方法に従化をとらえるための二次元電気泳動システムのって行った．電気泳動用試料のほとんどは，新確立を進めてきた．本年度，哺乳類遅筋C−タン

鮮な筋を8MグアニジンHCl抽出したもの

パク質に対する特異抗体の作成に成功した．そを，5M尿素一lMチオ尿素液に透析して作成しして，筋ジストロフィー症マウスをモデルとして用いた．精製遅筋C−タンパク質は酪農学園大て哺乳類筋ジストロフィー症におけるC−タン

学山本克博博士よりご供与いただいた．

パク質の変化を検討した．
結果（1）哺乳類の遅筋C−タンパク質特異的モノク

実験の方法

ローン抗体RX−75の作成

1．抗体の作成
ウサギのヒラメ筋よりOffer6）の方法に従い

遅筋C−タンパク質を免疫原として得られた

DEAE−Sephadexカラムクロマト法でC−タン

モノクローン抗体の一つRX−75はイムノプロ
ット法において，精製したウサギヒラメ筋（遅＊千葉大学理学部生物学科筋）C−タンパク質に反応し（図1a），ヒラメ筋−41−

とC上またこの抗体はウサギのヒラメ筋（遅筋）

a

b

c

d

筋原線経のM線付近を除くA帯の中央部を染めた（図2aとb）．この部位にC−タンパク質が存在することが既によく知られている．しかし，心筋と速筋の筋原線経を染めることはなかった（図2Cとd）これらのことから考えて，この抗体は遅筋C−タンパク質に特異的と言える．一方，ラット，マウスよりSDS一処理により抽出したタンパク質をイムノブロット法により検定し鴫たところ，遅筋，速筋，心筋いずれの場合にもこの抗体は反応性を示さなかった．しかし，螢
光抗体法で調べるとラット，マウスの遅筋由来の筋原線経のC−タンパク質の局存部位を選択的に染めた（データ省略）．従って，ラット，マウスの遅筋C−タンパク質とも交差反応できる
ものの，変性したこれらタンパク質との反応性は低下するものと考えられる．
（2）哺乳類C−タンパク質の二次元電気泳動パターン
ウサギの遅筋，速筋，心筋からの抽出タンパ
ク質を二次元電気泳動ゲルに展開，RX−75とFC−18，MF−20との反応性を根拠にウサギの遅筋型（sc），速筋型（fc），心筋型（cc）C−タン
パク質アイソフォームの電気泳動ゲル上でのス
ポットを確定した．図3−a，Cに3種の筋タンパ
図1

ク質の混合物に上記の3抗体を反応させ同定さ哺乳類遅筋C−タンパク質を認識するモ
ノクローン抗体RX−75の特異性
ウサギのヒラメ筋（遅筋）から精製した
C−タンパク質（a），心筋（b），大腿直筋（速筋）（C），ヒラメ筋（d）の仝タンパク質抽出液をSDS−PAGE（7％ゲル）に展開し，イムノブロット法により抗体（RX−75）の反応性を調べた．アミドブラック
染色による電気泳動パターン（左）と抗体処理の結果を示す．

の仝タンパク質抽出物に対してもC−タンパク質と同じ分子量（約14万）に相当する単一のバ
ンドにのみ反応することがわかった（図1d）．
しかし，ウサギの心筋や速筋（大腿直筋）の仝タンパク質抽出物には反応しなかった（図1b
−42−

図2

RX−75とウサギのヒラメ筋（a，b）と大腿直筋（C，d）の筋原線経との反応
RX−75処理後，FITC一抗マウスIgG処理による間接螢光抗体法で調べた．位相差像（左）と螢光像（右）を示す．

Q

図3

ウサギ（左）とマウス（右）のC−タンパ
ク質の二次元電気泳動パターン
ウサギの心臥長持伸筋（速筋），ヒラメ筋の抽出タンパク質の混合物を二次元に展開し，CBBによる染色（a）またはRXJ
75，FC−18（抗心筋／速筋C一タンパク質抗体■）とMF−20（抗ミオシンH一鎖抗体）の3重処理（C）により，心筋（cc），速筋（fc），遅筋（sc）C一タンパク質およびミオシンH−鎖（矢尻）を同定した．マウスのヒラメ筋（b），および心筋，長指伸筋，ヒラメ筋の抽出タンパク質の混合物内のC−タンパク質のスポットをウサギとの比較により推定した．

れたC−タンパク質アイソフォームとミオシン
H−鎖の位置関係を示す．マウスの場合，RX−75が反応しなかったので遅筋C−タンパク質スポットを免疫学的に同定できなかったが，電気泳
図4 マウスの大腿直筋の成長に伴うC−タン
パク質アイソフォームの変化
a．生後3E】齢：b．生後7日齢：
C．生後30日齢．略号は図3に同じ．

動パターンをウサギの場合と比較することにより，SCのスポットを推定した．fcとccはFC−18の結合によって同定された．マウスの3種のC−
タンパク質アイソフォームの位置関係は図3dのようになる．

により調べた（図4）．生後3日齢では速筋型C（3）筋発達とC−タンパク質アイソフォームの−タンパク質はわずかに見られる程度で，主とし変化て遅筋型C−タンパク質が存在していた（図4

筋病変時のC−タンパク質の変化を理解するa）．7日齢では速筋型が明瞭に検出されるよう基礎として，正常マウスの筋発達過程でC−タンになり，遅筋型アイソフォームとの共有が認め

パク質アイソフォームがどう変化するかを大腿られた（図4b）．その後成長につれ遅筋型C一タ直筋（ほぼ速筋）を材料に，二次元電気泳動法

ンパク質は消失していき，14日齢には痕跡程度−43−にまで減少し，30日齢には完全に消失した（図4C）．一方，その間，速筋型C−タンパク質には増加が見られた．生後30日齢では速筋型と思われる2つのスポットがあり，そのうち，塩基性側のスポットが量的に多く出現しており，その後両スポットの割合は変化するようにみえる．
▲

このように，晴乳類の速筋発生過程においてC−

l

タンパク質のアイソフォームは，遅筋型から速筋型へ移行することが明らかになった．
（4）筋ジストロフィー症dyマウスにおけるC−タンパク質アイソフォームの変化
マウス筋ジストロフィー症モデルの一つdy
マウスでは十分に発症している生後3カ月齢になると，速筋に遅筋C−タンパク質（sc）が出現するのが見られた．大腿直筋と長持伸筋（EDL）の場合を図5に示す．正常大腿直筋では，速筋
CLタンパク質（fc）のみでSCはほとんどみられない（図5a）のに対しdyではscが明瞭に検出された（図5b）．EDL筋の場合，正常筋でもscを含む個5C）がdyマウスではscの量が増し，fcよりもむしろ主成分となる（図5d）．遅図5筋であるヒラメ筋でも筋の萎縮は見られたが，
C−タンパク質の泳動パターンにはほとんど変化は見られなかった．即ち，正常，dyマウスともscが検出されるのみであった（図5e，f）．
考正常（a，C，e）およびdyマウス（b，d，f）の速筋および遅筋におけるC−タンパク質の比較
筋の全抽出タンパク質の二次元電気泳動
パターンを示す．aとb，大腿直筋：Cとd，EDL筋：eとf，ヒラメ筋．略号
は図3に同じ．

察

前年度と本年度の研究で，哺乳類（特にウサヒトの筋組織凍結切片とも反応するので，免疫ギ）のC−タンパク質アイソフォームを識別する

組織化学的研究にも適用できる．ただしマウス

モノクローン抗体が用意された．これにより，の場合は，二次抗体の問題から直接螢光抗体法

筋タンパク質の二次元電気泳動マップの上でCがなされるべきであろう．モノクローンである−タンパク質アイソフォームの位置が決定され，故，抗体を多量に得ることは容易であり問題は筋の発達や病変時のC−タンパク質の変化を探ない．ヒト場合，予備的な検定では，RX−75とっていく基盤ができた．最近の二次元電気泳動

FC−18のC−タンパク質アイソフォームへの特法によるニワトリC−タンパク質の研究結果に異的結合が鮮明ではなく，もう少し検討するこ

よれば，筋の発達，病変時にC−タンパク質は複雑に，しかし顕著に変化することがわかったのとが求められている．

で，晴乳類についても，今後更に詳細な電気泳と筋病変に伴うC−タンパク質の変化の内容は，動法による解析がなされるべきと思われる．

ニワトリでみられた傾向によく似ている．即ち，これらの抗体は筋のウサギ，ラット，マウス，

本研究で明らかになった哺乳類の筋成長過程

幼若期の速筋における遅筋型C−タンパク質の−44−

−378，1989．

発現であり，筋変性の著しいdyマウスの速筋における遅筋C−タンパク質の出現である．しか5）Kojima，T．，Sano，K．，Hirabayashi，T．

し，遅筋でのC−タンパク質の変化は見られなかand Obinata，T．：J．Biochem．，107：470−った．このことは，ニワトリの発生過程で遅筋

475，1990．

ではC−タンパク質の変化しない1），ヒト筋ジス6）Starr，R．and Offer，G．：Methods
Enzymo1．，85：130−138．

トロフィー症での変化は速筋で主に現れるとい

7）Bader，D．，Masaki，T．andFisclman，D．

うなど以前の報告11）に一致する．

A．：J．CellBio1．，95：763−770，1982．

文1）Obinata，Tリ

献8）Hirabayashi，T．：Anal．Biochem．，117：443−451，1981．

Reinach，F．C．，Bader，D．，

Masaki，T．，Kitani，S．and Fischman，D．

9）Laemmli，U．：Nature，227：680−685，

A．：Dev．Bio1．，101：1167124，1984．

1970．

2）Obinata，T．：Zool．Sci．，2：833−847，1986．

10）Towin，H．，Stahlin，T．and Gordon，J．：

3）Obinata，T．andShinbo，K．：Muscleand

Proc・Natl・Acad・Sci・U・S・・76‥4350−

Nerve，10：351−358，1987．

4354，1979．

4）Takan0−Ohmuro，H．，Goldfine，S．M．，

11）Webster，C．，Silberstein，L．，Hays，A．P．＆Kojima，T．，Obinata，T．，and Fischman，
D．A．：J．MuscleRes．CellMoti1．，10：369−45−Blau，H．M．：Cell，52，503−513，1988．

jimpyマウス脳ミエリン局在のCa依存性プロテアーゼ活性の変動

繁 勝＊

辻

Jimpyマウスは中枢神経系の成熟オリゴデ

分艶にはNortonらの方法を用いた．CANPイ

ンドログリア細胞の数が極端に少く，その結果

ンヒビターの除去にはDEAEセルローズによミエリン膜形成不全を発症し，頻発する強直性

る方法を行なった．即ち，ミエリン膜標品の3

痙攣発作のため1ヶ月齢迄に死亡するが，そのmlとDEAEセルローズ（ワットマンDE52）液発現症状の類似性からヒトのPelizaeus Merz＿

を3：7の割合で混合し，4℃で30分間撹拝しbacher病のモデル動物として知られている1）．

た後，セルロース粒子を遠心分散し，これを緩病因に関してはⅩ一染色体上のProteolipid

箇液A（トリスーHCl（pH7．4）：25mM，protein（PLP）遺伝子のエクソンの1つに異常が有ることが認められているが2），発症期にミEDTA：2mM，EGTA：10mM，β−メルカプ
トエタノール：50mM，ベンザミジンーHCl：5

クログリア或いはマクロファージの数が著しくmM）に100mMのNaClを加えた液10mlで増加していることも報告されている3）．発症に2回洗源する．更に，セルロース粒子を緩衝液

至る迄の過程に就いては未解明である．一方，

Aに250mMのNaClを加えた液5mlで3回ミエリン膜構成蛋白の分解に関しては種々の膜洗搬する．この250mMNaCl洗源液を合せた

内在性プロテアーゼが関与していることがヒもの（15ml）をインヒビター除去mMCANP酵ト4）或いはラット5），ウシ6）などの中枢神経系を素標品とした．

用いた研究によって報告されている．そこで，
我々はjimpyマウスの脳中で，ミエリン形成期

結に起こると考えられる種々のプロテアーゼ活性

果

まず脳ホモジネート中のプロテアーゼ活性をの変動を調べ，ミエリン形成不全発症における調べる為に種々のプロテアーゼに対応するpe−

プロテアーゼの関与に就いて検討を行なった．

ptidyl−MCA基質を用いてpH7．4での活性を測定した．その結果，キモトリプシン用基質の材料と方法

Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCAと，ト［）プシン

実験に使用した動物は当教室で維持している用基質のBoc−Phe−Ser−Arg−MCAに対する水B6CBA／J−jp系マウスの2−3週齢の発病個解活性がjimpyマウス脳において高い値を示

体（jp／Y）及び正常対照個体（＋／Y）である．

すことが判った（表1）．更に，マウス脳中にはプロテアーゼ活性の測定には種々のpeptidyl−
MCA合成基質を用い，25℃，30分間，インキ
ユベートし，反応終了後進放したAMCを励起

表l Protease activitiesin brain ofjimpy
mOuSe
controI

J／C
9

2

0 ノ
3

′

2

8

q
8

5

2

8
8

つ J

3

′ 埠

q ノ

5

5
0

8

8

7

0 ノ

ノ

−46−

8

1

1

2

2

Unit；n mOles AhC／30min／mg protein︵U 1 1 0 0 0

2

8

3

Boc−Val−Pro−Arg−HCA＊和歌山県立医科大学第二生理学教室′ q 一 −

Z−Phe−Arg−MCA

J q

Suc−Ala−Pro−Ala−MCA′ 0

Boc−Phe−Ser−Arg一KCA

0 1 1 0 1 1

M庶糖液による分画法を用い，又ミエリン膜の

Jimpy

7

行った．脳ホモジネートの分画には通常の0．32

Z−Arg−Arg−MCA
Suc−Leu−teu−Val−Tyr−HCA

0 1 0 0 2 1

波長380mm，蛍光波長460nmで蛍光測定してSubs亡rate水解活性は至通ることが認められた（表4）．又，添加するCa十十pH城が酸性（pH6．5）のものとアルカリ性の濃度は0．5mMの時，最も有効であることが（pH8．6）のものの2ヶが存在し，粗ミトコン

判った．そこでCa＋＋存在下で賦活されるプロ

ドリア分画をDigitonin処理することによってテアーゼ活性について，種々のプロテアーゼイ

現われる酸性プロテアーゼ活性がjimpyに於

ンヒビターによる阻害実験を行い，その性質をて対照の約2倍程高くなっていることが判った

調べてみた．結果は表5の如くEDTA，E−64，（表2）．一方，Suc−Leu−Leu−ValTTyr−MCA

Leupeptin，Antipainなどによって強く活性阻を基質とする中性（pH7．4）プロテアーゼ活性害を受けることが判り，この活性はキモトリプ

も，粗ミトコンドリア分画中ではjimpyマウス

シン様中性プロテアーゼで，CANPに極めて類脳の方が対照マウス脳よりも有意に高い値を示

似した性質を有することが推定された．

Boc−Phe−Ser−ArgrMCAした（表3）．然し，細胞質分画中の活性には差

次に，この活性がはたしてCANP酵素に依異は認められなかった．この基質はCa＋十一依存

るものか否かを知る為に，脳ミエリン分画から性中性プロテアーゼ（CANP）によっても水解

予め，CANPインヒビターを除去したものを標されること，ヒト，ラットなどでミエリン膜中品として，CANP特異的な基質として合成されにCANP活性が存在し，ミエリン構成蛋白のたSuc−Leu−Tyr−MCA7）と，キモトリプシン用

tum OVerに重要な役割を果たしていることな

基質で，CANPによっても水解されることが認どが知られていることから，この粗ミトコンド

められているSuc−Leu−Leu−Val−TyrTMCA

リア分画中の中性プロテアーゼ活性がミエリンの2つの基質に対する水解活性を比較する実験

分画中に存在し，Ca＋＋に対して感受性か否かをを行なった．活性は0．5mMのCa＋＋存在下で検討する実験を行なった．その結果，マウス脳のミエリン分画中にはCa＋＋一非依存性の活性と表4Ca＋＋−aCtivatedand−independentneu−
tral protease activities

共に反応液中にCa＋＋を添加することによって

inmyelinCon［roI

J／C

fraction fron jimpy brain

上昇する活性が存在し，しかもjimpyマウス脳Jimpyにおいて対照と比較して有意に活性上昇していca◆十一added O．396土0．076（5ぎ0．118士0．026（5）3．36

ca◆◆−f，ee O．521土0．162（5亨★0，190±0．046（5）2．74

表2 Boc−PheLSer−Arg−MCA hydrolyzing

Unit：n mOles AMC／101nin／mg protein
Substrate：Suc−I．eu−Leu−VaトTyr−MCA

activitiesinmitochondrialandcytosol
fraction ofjimpy brain
Fraction
Hi亡OChondrial

Jimpy

ControI

11．2

表5

J／C

5．97

1．88

3．09

0．95

Effectofproteaseinhibitors on Ca＋＋−aCtivatedneutralproteaseactivityin（p‡16．5）

myelin fraction ofmousebrain
2．94

CytOSOl（pl王8．6）

工nhibitor Concentra亡ion

′b

3

′ q

′ 0

−q
8
0

8

q ノ

0
0

0ノ

2

qノ

0

﹁／

2

2

2
7

q ノ
5

0

′ 0

〇一ノー

′ b

0 ノ

0

7

2

0
0

PhoSpt10ramidon
Bestatin

J／C

0

Leupeptin
Antipain
Chymosta亡1nElastatinal

0

Con亡rOI

Pepstatin A

0

brain

0

drial and cytosol fraction of jimpy

Jimpy

1

E−64

yzing activities（pH7．4）in mitochon・

FraCtlOn

1

Suc−Leu−Leu−VaトTyr−MCA hydrol・

冨iTlhibition
3

DFP
P比SF
EDTA
PCMB

0

表3

一

★：Digi亡Onin treated

慧慧荒川ルルルルル

Unit：n nOles AKC

6

Hit。。も。ndria1

9．52土0．35（さきCytOS010．57土0．12（5）Substrate：Suc−Leu−Leu−VaトTyrTMCA

5．87土0．54（5）1．62

0．69士0．26（5）Enzyne source was prelnCuba亡ed with0．83

one of tbeinhibitors at250c for30

Unit：n nOleS AHCParentheSiS Shov numbers of mi亡e USedt：甘く0．01

min，and the residual ac亡ivity vas
de ermined．

−47−

の値からEGTA添加によってCa＋＋−freeの特異的基質であるSuc−Leu−Tyr−MCAを水解状態で測定したCa−非依存性の中性プロテアーすること，E−64，ロイペプテン，などのプロテ

ゼ活性を差引いたイ直をmMCANP活性としてアーゼ阻害物質によってほぼ完全な活性阻害を表示した．結果は表6の如く，jimpyマウス並び受けることなどの事実から，mCANPである可に対照マウス共にSuc−Leu−Tyr−MCAに対す能性が強く示唆された．

る水解活性の方がSucTLeuTLeu−Val−Tyr−

今回の結果から，発病したjimpyマウス（2MCAに対する値よりも数倍高く，又，jimpyと−3週齢）脳中のミエリン膜画分でこの酵素活

対照との活性差も，前者では5倍近い値を示し性が著しく上昇していることが明らかになったていた．以上の結果からこのCa一依存性のキモが，この事はこの時期のjimpyマウス脳中ではト））プシン様プロテアーゼ活性はmMCANP

オリゴデンドログリア細胞形質膜中で主要構成

酵素による活性であることが強く示唆され，又，蛋白の或るものの分解が冗進している状態が存

jimpyマウスに於ては，発病期に脳中のミエリ

在することを示唆しており，未成熟段階でのオン膜分画におけるこの酵素活性が著しく増加しりゴデンドログリア細胞の破壊，或いは成熟ミていることが判明した．

エリン膜形成の抑制という現象を引き起こす原因の一つになっている可能性が考えられる．

考察

中枢神経系のミエリン膜分画中にCANP活文性が存在し，ミエリン膜構成蛋白のPLP，MBP

献1）FarkasLBargeton et al：Acta．Neur−などのturn overに重要な役割をはたしている

Opathol．（Berl．），21：272，1972．

ことはヒト，ラット，或いはウシなどに於て報2）Ikenaka，K．etal：J．Mol．Bio1．，199：587，

告されている．又，ヒトの脱髄疾患などでは，

1988．

疾病に伴ってこの酵素活性に異常が認められる

3）Imamoto，K．：Arch．Histol．Jap．，48（4）：ことが知られている8）．我々はマウスの中枢神

411，1985．

経系のミエリン膜画分中で同様な酵素活性が存

4）Sato，S．andMiyatake，T．：Biomed．Res．

在することを認めた．この酵素活性はCANP

3：461，1982．

5）Banik，N．L．et al：J．Neurochem．，
表645（2）：581，1985．

Ca＋＋一aCtivatedneutralproteaseactiv−

ities（pH7．4）in myelinfraction of

6）Chakrabarti，A．K．et al：Neurochem．

jimpybrainafterremovalofinl1ibitor

Res．，14（3）：259，1989．
．7）Sasaki，T．etal：J．Biol．Chem．，259（20）：Substrate

Jimpy

Con亡roI

J／CA

5．01士2．43（8）★1．02土0．34（6）4．9B

1．33土0．66（5）★

2．5

0．53土0．33（5）12489，1984．

8）Hogan，E．L and Banik，N．L．：In
Handbook of Neurochemistry ed by A．

Substrate：A，Suc−Leu−Tyr一KCA
B，Suc−Leu−Leu−Val−Tyr一hCA

Unit‥ノ川日劇C／30min／mgproteiヮ
Paren亡hesis shov numbers of mlCe uSed．
貴：Pく0．01

Lajtha，PlenumPress，N．Y．，1985，Vol．10，
p．p．285−337．

ー48−

mdxマウスに対するbestatinの効果
木 下 眞 男＊
研究協力着

岸

雅 彦＊

栗 原 照 幸＊根 本 博 之＊日 高 隆 信＊我々は前回，mdxマウスの筋細胞膜の電気生成の内，NaClの代わりに59．6mMの理学的異常に対するbestatinの作用を検討し，Na2SO4，KClの代わりに5mMのKH2PO．をbestatinにはmdxマウスに対する筋細胞膜安用いて作成した低Cl溶液5）・6）に標本を浸し，定化作用があることを指摘した1）．そして，bes−

myotoniaのモデルの一つとした．又，通常のtatinの効果は数十分程度の短時間でその効果

Tyrode溶液にCI channel blockerであるを発揮することから，bestatinは筋細胞膜に直anthraceneT97Carboxylic acid（A−9−C）を1接作用しているものと考えられる．又，近年

Ⅹ10￣4Mの濃度で加える事によりmyotonia

mdxマウスではDuchenne型筋ジストロフィ

モデルを作成した7）・8）．以上の2つのmyotoniaー症と同様にdystrophinの欠損があることがのモデルに対して，bestatinを40mg／Lの濃度報告されている2）．しかし，mdxマウスので作用させ，electricalmyotoniaの頻度，RMP

dystrophin欠損は，我々が電気生理学的に認めにどのような変化を来すかを観察した．

ることのできる筋細胞膜異常3）・4）とどのように約4週齢のmdxマウスの横隔膜標本を作成

関連しているのかは明かではなく，bestatinがし，Tyrode溶液中のbestatinの濃度を20mg／

筋細胞膜にどのように作用するかも明かではな

L，40mg／Lとした場合のelectricalmyotoniaの頻度とRMPの変化を検討した．RMPの検今回，我々はbestatinの効果がmdxマウス

討は前回同様，同一検体から50−100本のRMPに限られたものなのか，非特異的なものかを知を測定し，ヒストグラムを用いて検討した．

る目的で，他のmyotoniaのモデルに対するBestatinの濃度変化に対しては，同実験を数回

bestatinの効果を検討した．又，bestatinの効果

試行して集計したものを用いた．Bestatinの効が発現する濃度を調べる目的で，種々の濃度で果はWilcoxoム検定を用いて検討した．

bestatinをmdxマウスに作用させてその効果結を検討したので報告する．

果

Rat及びBlOマウスにbestatinを作用させ

方ても，RMPのヒストグラムには変化を来さな法

まず，C57BL／10Sc（BlO）マウス及びWistar

かった．又，electricalmyotoniaはbestatinを系ラットを用いて横隔膜標本を作成し，40mg／

作用させる前後において，ほとんど出現しなか

Lのbestatinを作用させ，投与前後で静止膜電った（図1，2）．BlOマウスの横隔膜標本を低位（RMP）を計測した．

Cl溶液に浸すと，RMPは著明に低下し，65−70

次に，BlOマウスを用いて，2種類の％の線経でelectrical myotoniaが出現するよ

myotoniaのモデル作成した．Tyrode溶液の姐うになる．このモデルにbestatinを作用させても，electricalmyotoniaの頻度を減少させるこ＊東邦大学医学部大橋病院第四内科とはない（図3）．BlOマウスにA−9−Cを作用−49−

RMPsof rat hemidiaphragrn before and afteradding Bestatin（40mg′／し）to the muscle chamber．
No

No▼

aRe1885btln

beore BQSblh

80

即nne8n剛MP・N＝18D・

mein RMp LN＝18日・一81∈三358

一郎8−353・S【ゝSD mV

60

68

叩

48

2【】

nnv

一雄 ㍊臥
20

40

5D

68

70

即

98

18ロ

4□

58

闘

70

88

RMPトmv）

図1

9【110O

RMPトmVj

正常Ratにbestatinを作用させてiJ，
RMPには変化を来さない．

RMPSOfa57−day−Old810mousebetoreandafter
addingBesta仙（40相rL）tolhemusckChamber・Noatter8eSbthmean R〟P rNFlOかm℡an MP（N＝1001−872工305／SD lnV−871±390lSOl mV＿＿＿∴＿＿
4ロ

50

印

7

m

肌 用D
RMPトMVJ

明

弘

6【】10

即

ヨD

柑O

RMPトmvl

図3
図2 BlOマウスにbestatinを作用させても，RMPには変化を来さない．

億Cl溶液により誘発されたBlOマウスのelectricalmyotonia．bestatinにより抑制されない．

させると，やはりほとんど全ての線経で使用前微小電極を刺入した筋線雄の44％に見electricalmyotoniaが出現するようになる．しられたものが，bestatin使用後は25％に減少し

かし，ガラス管微小電極が細胞内に入った時にた．Bestatin40mg／Lの濃度ではRMPのヒスは著明なelectrical myotoniaが出現して脱分

トグラム上，RMPの低い線経が減少し，RMP

極するため，安定したRMPの測定は困難であの正常な線経が増加する傾向を認めた．これはった．このようなモデルにbestatinを作用させWilcoxon検定においても0．5％の危険率で有ても，やはり全ての線椎で微小電極刺入時に意であった．そして，electricalmyotoniaの頻

electricalmyotoniaが出現し，（図4）bestatin

度は20mg／Lの時と同じく26％に減少したによりその頻度が減少する傾向は認められなか（図5）．Bestatinは20mg／Lの濃度でmdxった．

マウスのelectrical myotoniaを抑制するが，

Bestatinを20mg／Lの濃度でmdxマウスに作用させた場合，RMPのヒストグラム上にmdxマウスの低下したRMPの改善は40mg／
Lの濃度に達しないと認められなかった．

は変化は見られず，Wilcoxon検定においても有意差は認められなかった．しかし，mdxマウスに見られるelectrical

myotoniaはbestatin
−50−

考

察

Bestatinは正常な筋細胞膜には電気生理学

48

50

60

70

80

9D lOO
RMP

N0．

トmVl

mdx．Bestatin（40Tng L）

80
mean RMP／N＝371

60−76．1二123

TS．D．mV pく0005

bL汀St freq．26㌔

48
加

ロ

40

図5

50

60

70

80

90
HD
RMPトmVI

Mdxマウスにbestatinを20mg／L，40
mg／Lの濃度で作用させたときのRMPのヒストグラム．20mg／Lの濃度ではelectrical myotoniaの頻度は減少する
が，有意なRMPの改善は認められない．

図4 1×10J4M／Lのanthracene−9−Carbox−
ylic acid（A−9rC）により誘発された
BlOマウスのelectricalmyotonia．Bes−
tatinにより抑制されない．

40mg／Lの濃度ではelectrical
myotoniaの頻度は低下し，RMPも有意に改善する．

的には影響を及ぼさないし，低Cl溶液の為に低下したRMPを改善することはなかった．そし巣はなくmdxマウスのelectricalmyotoniaはてmdxマウスのRMP低下に対してbestatin

bestatinによって抑制されることを考え合わせが効果を発揮するのは20mg／Lでは不十分でるとmdxマウスのelectrical myotoniaはCI

40mg／Lの濃度からであった．低ClとA−9−C

conductanceの低下以外の機序で起こっているによって誘発されるelectrical myotoniaは可能性を示唆する．Mdxマウスの低下した

bestatinでは抑制されないという結果を得た．

RMPを改善する機序については今後の検討がmdxマウスのelectricalmyotoniaに対する阻必要である．

止作用はRMPがまだ改善する作用を及ぼさな

Mdxマウスの筋線経を電気生理学的に検討

い20mg／Lの濃度から出現する事が今回の実

すると，RMPの正常な筋線経と低い筋線経が験で明らかになった．低Cl溶液による混在し，又，electricalmyotoniaも全ての筋線

electrical myotoniaやA−9−CによってCI

経で見られる訳ではない．Mdxマウスでは，全channelをblockすることによって生じるての筋線経でdystrophinが欠損している事か

electrical myotoniaに対してはbestatinの効ら，これらの電気生理学的異常を来すのは−51−dystrophin欠損とそれ以外のfactorも関与し

省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストていることを示唆する．そして，微小電極が挿ロフィー症及び関連疾患の病態とその病因

入できる筋線経はある程度の大きさのある筋線に関する研究（杉田班）．昭和62年度研究

椎で，壊死に陥った小さい線維ではなく筋細胞報告書，1988，pp227−231．

壊死に至る途中の過程にある筋線経をここでは

4）岸 雅彦，栗原照専ら：Mdxマウスにみら計測記録していると考えられる．従ってbes−

れるミオトニーの筋細胞内記録とCa桔抗tatinは，mdxマウスの筋細胞が壊死に陥る以剤のミオトニーに対する効果．臨床神経，前の過程にもその効果を発揮するものと思われ

29：563−567，1989．

る．

5）Iyer，Ⅴ．，Ranish，N．A．，etal：TheeffectOf denervation on subsequentin vitro

文

献induction of myotonia．Neurology，27：

1）木下眞男，岸雅彦ら：ベスタテンの筋細胞669−671，1977．

膜安定化作用に関する実験的研究．厚生省

6）塩屋敬一，田中政幸，栗原照幸ら：筋細胞「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質に

外Na，K，Cl濃度とミオトニーの発生機序よる難病治療薬の開発研究（江橋班）昭和に関する研究．臨床神経，26：856−862，

63年度研究報告書，1989，pp19−21．

1986．

2）Arahata，K．Ishiura，S．，Ishiguro，T，．et

7）Bryant，S．H．，Morales−Aguilera，A．etal：

al：Immunostaining of skeletal and

Chloride conductancein normal andCardiac muscle surface membrane withmyotonicmusclefibersandtheactionof

antibody against Duchenne muscularmonocarboxylic aromatic acids．J．

dystrophypeptide．Nature，333：861−863，

Physio1．，219：367−383，1971．

1988．

3）栗原照幸，内田東彦ら：mdxマウスに見られるmyotonicburstの筋細胞内記録．厚生−52−8）栗原照幸：ミオトニーの発生機序に関する
電気生理学的研究．臨床神経，18：332−
338，1978．

ベスタテン投与mdxマウスにおける骨格筋組織所見
西

谷

裕＊

研究協力者 板 垣 泰 子＊

斎 田 恭 子＊Mdxマウスは，Ducenne型筋ジストロフィも存在した．しかしその殆どの部位において細ー症（DMD）と同じ膜蛋白であるdystrophinの胞反応が盛んであり，会食細胞に加えて恐らく欠損を有し，DMDのモデル動物として注目さ多くの筋芽細胞が存在するものと思われた．まれている1）2）．今回我々はmdxマウスにべスタ

た多くのmyotubeが認められ，中心に核を有しナンを投与し，筋組織学的にその影響につき検た再生線経も存在し，活発な再生現象が認めら討したので報告する．

れた．
ベスタテン投与を行ったmdxマウスでは，

対象と方法

これに比し同様に群をなした壊死線経の存在が対象として3週齢と7週齢のmdxマウス各認められたが，細胞反応に乏しく大部分では4匹を使用した（表1）．いずれも生後2週目より腹腔内へベスタナンを1日0．4mg連日投与

myoblastやmyotubeの存在を認めることが出来なかった．壊死線維以外の部位では筋線経はした．したがって3週齢のmdxマウスでは7中心核を有するものはなく，また変性所見も乏日間，7週齢のmdxマウスでは35日間の投与

しく大小不同も著明でなかった（図1）．
7週齢のマウスでは，やはり填死線雄の集団を行った．コントロールとしては同年齢の無投が存在し，中には筋束全体に及ぶような部分も与のmdxマウスを使用した．
エーテル麻酔下に両側上腕三頭筋を採取し，あったが，再生所見も活発に認められた．筋線

凍結切片にてHE染色，Gomori−trichrome染経は大小不同が著明で線維径が100耳mに近い色，NADH染色，ATP染色を行い壊死，再生

肥大線経も多く存在した．数多くの中心核を持の検討および線推径の比較検討を行った．

った線経が認められ，以前変性し崩壊した部分
は結合級や脂肪織の増殖を伴う事なく形態上は結

ほぼ完全に修復されている様に思われた．

果

3過齢の無投与のmdxマウスでは，部分的ベスタテン投与マウスでも，これらの所見はに群をなして壊死線経の集団が認められた．填

無投与のマウスに比較して特に異なる所見はな

死線経の集団は10数個から100個近くのものかった（図2）．
図3では，中心核を有する線維数の全体の筋

表l Materials and methods
lge

3−

lo

Bestatin

Ad■inistratioll

4

2工g／day for

4

（−）

4

2●g／day ror

7

dayS

lD【HOけSE
7V

3

卜）

35

days

線経に占める比率を示した．これは再生の指標であると同時に，壊死を起こした線維数をも表していると考えられている3）．ベスタナン投与
マウスでは3週では7．4％，無投与マウスでは34．6％と明かにベスタテン投与マウスで低値であった．7週齢では中心核を有する線経の割＊国立療養所宇多野病院

合はベスタテン投与マウスが75％，無投与マウ
−53−

図1

A）3過齢コントロールmdxマウス

図1B）3週齢ベスタテン投与mdxマウス

図2A）7週齢コントロールmdxマウス

図2B）7週齢ベスタテン投与mdxマウス−54−齢，7週齢ともに最大径，最小径ではベスタテ
ン投与マウスと無投与マウスで大差ないが，平均径はベスタテンを投与したもので低値であった．また標準偏差値を平均値で割り1000を掛けたvariabilitycoefficientは，筋線経の大小不同を示す指標としてよく使われているが250以下が正常とされてる4）．投与マウス，無投与マウス
1，5W

3W SW

7＼V

5M

ともいずれも250より大きかった．ベスタテン

12M

投与マウスでは，コントロールマウスと比較し
図3

Frequency of fibers withinternal
nuclei（Tricepsbrachii）て3週齢で低く7週齢で高値であった．初期における筋崩壊の遅延とその後に引き続く再生現象の遅れを示しているのではないかと思われた．

スが65％と，ベスタテン投与マウスでやや高め
であった．

考

察

筋線維径のヒストグラムの比較では，ベスタ

1986年辻，松下らはdy／dyマウスにベスタテ

テン投与マウスでは，3週齢，7週齢とも無投ンを投与し，臨床症状の改善，血清酵素値の正与のマウスに比べて小径化傾向が認められた常化と同時に，組織学的に筋線経の変性，壊死，（図4）．

結合織の増殖等の筋ジス特有の所見の改善を認

表2において筋線維径の分析を示した．3週

めている5）．今回の我々の試みでは，大勢におい
rlDX mousc（7Wecks）

MDX mouse（、3weeks）

10

20

30

40

50

70

60

10

20

30

40

50

図4
表2 Analysis of fiber diameters（Triceps
brachii）
川ALTSIS or HBER Dl川ETERS【Triceps BraChii）
翫H．
（〃t）

60

Fiber Dはmeter付m）

Fiber Diameter（LJm）

慮in．
鵬an S．D．
（〝■） （〃t）

Ⅴarilbility
Coefricient門1川18い）別は】＝−）

46．7

9．8

24．0

6．6

275

44．5

9．5

28．2

7．5

338

7Y！日日【B（◆）

95．3

13．5

41．4

12．8

309

削D．8卜）

98．0

13．6

46．5

12．9

278

−55−

70

80

90

て組織上の筋ジスの変化に改善を認めることは

mutantmdx：inheritedmyopathyinthe

できなかった．Dy／dyマウスではマクロファー

mouse．Brain，110：269，1987．

やTリンパ球等の細胞性免疫の異常が同時に存3）Karpati，G．，Carpenter，S．andPrescott，

在することがしられており，これらへのベスタ

S．：Small−Caliberskeletalmuscle fibers

テンの影響も無視できないのではないかと思わ

do not suffer necrosisin mdx mouse

れた．しかしmdxマウスにおける3週齢でのdystrophy．MuscleNerve，11：795，1988．

中心核線経の出現率の低さと平均径の小径化は，

4）Coulton，G．R．，Morgan，J．E．，Patridge，

初期の筋崩壊を遅延させている可能性を示唆し

T．A．et al：The mdx mouse skeletalていると考られた．

muscle myopathy：I．a histroglCal，morphometric

文

献

and

biochemicalinvesti一

gation．Neuropathol．Appl．Neurobio1．，

1）Tanabe，Y．，Esaki，K．andNomura，T．：

14：53，1988．

Skeletal muscle pathologyin x5）Tsuji，S．andMatsushita，H．：Successful

Chromosoe−1inked muscular dystrohy

treatmentofmurinemusculardystrophy（mdx）mouse．Acta．Neuropathol．

With the proteaseinhibitor Bestatin．J．

（Berl．），69：91，1986．

Neurol．Sci．，72：183，1986．

2）Torres，LF．B．and Duchen，L．W．：The−56−

DMD骨格筋CTの経時的変化の検討
中 野 今 治＊
研究協力者

清

水

川

井

潤＊＊

松

村

喜一郎…

充＊＊＊ 田 本 雅 也＊＊＊

表1は じ め に症例のCT所見追跡年数

DMDの骨格筋CT像の病勢に伴う変化につCT画像を用い，間接的に推定されてきた．今回

2 年間
3 年間
4 年間
5 年間
6 年間
7 年間

2
5
4
8
11
3

平 均

4．9年間

我々は，同一症例の経過を年余にわたり追跡し，
DMD骨格筋CT所見の経時的変化を検討した．
対

症例数

追跡年数

いては，これまで主に臨床ステージ別患者群の象

1983年より1989年までの7年間に，最低2年以上臨床経過を追跡し，この間2回以上筋CTを行なったDMD33例を対象とした．症例は3歳−28歳までで，年齢別の例数は図1に示すとおりである．表1に症例のCT所見の追跡

表2年数を示す．表2に同一症例で撮ったCTの回
数を示す．

表1

対象：デュシャンヌ型筋ジストロフィー33例

同一症例で撮ったCTの回数症 例数

C T の回数

症例 数

2 回
3 回
4 回
5 回

12
9
8
4

平 均

3．1回

方

法

CTはTCT604Toshibaを用い，WLO，
図1

対象：デュシャンヌ型筋ジストロフィー

33例

WW300の条件で，肉眼的障害の程度を表3に示すように，画像上の筋の脂肪化の割合に注目
し，5段階に分類した．この障害度分類に基ず＊東京大学医学部脳研病理＊＊国立療養所下志津病院＊＊＊東京大学医学部脳研神経内科

き，全身の23筋について評価した．
又，23筋の障害進行度を比較し，進行度の異
−57−

表3

CT画像上の筋の肉眼的障害度分類

障害度
障害度

Ⅰ
1

に図3に示した．縦軸は筋障害度数の平均を示
し，横軸は筋障害度の重い順になるように筋肉正常

軽度虫食い状に低吸収域（筋相当部の5〜10％以下）が認められるもの

をならべている．障害進行度の異なる代表筋として，大腎筋，大腿四頭筋，薄筋，頸部板状筋

障害度 u

中等度低吸収域（筋相当郡の10〜知％）が認められるものの4筋を選び，検討することにした．

障害度 Ⅳ

高度低吸収域（筋相当部の50％以上）が認められるもの

時的変化を示す．縦軸に筋障害度を取り，横軸障害度

完全に脂肪化したもの

V

図4に代表筋4筋の各症例ごとの筋障害の経に年齢を取り，個人の経過を直線で結んだ．図上，太線は12歳以上まで歩行可能であった比較的機能のよいDMD例を示す．

なる代表筋として，大腎筋，大腿四頭筋．薄筋，大腎筋の筋障害の進行は，5歳の時点ではす

頸部板状筋を選び，これらの筋の進行度の単純

でに障害度ⅠⅠ度又はⅡⅠ度に達しており，急速に和をCT総和値とした．CT総和値の経時的変進行し11歳頃には障害度Ⅴ度に達している．大化を追うと同時に，上田の機能障害度との対応

腿四頭筋は，5歳の時点では障害度Ⅰ度又はⅠⅠもおこなった．

度であI），やはり急速に進行し11歳頃には障害度Ⅳ度又はⅤ度に達し，その後緩徐進行となる．
結

果

薄筋は，障害の開始は前2筋と比べるとやや遅

今回の検討に用いた症例のうち，1症例の骨格筋CTの経時的変化を図2に示す．
DMDの筋障害の進行には筋によⅠ）差異が存在することが知られている．そこで，代表とな

く8歳以降であり，進行スピードも遅く，やはり11歳に障害度HI度又はⅠⅤ度に達し緩徐進行となる．頸部板状筋においては，さらに障害の開始及び進行が遅くなる．

る筋を選び，各症例ごとにDMDの骨格筋CT

このように，いずれの筋も年齢の進行と共にの経時的変化を検討するため，まず全身23筋の筋障害も進行している．しかし，筋によりその障害の進行パターンを比較した．今回の症例を用い，各筋について年齢ごとの筋障害度数の平障害進行の時期，障害のスピードに差異が存在する．

均値を求め，全身の筋障害度が比較できるよう

次に個々の筋における個人の経時的変化に注

図2 代表症例の筋障害の経時的変化

が交叉せず，帽を保ちつつ進行していく傾向がある．このことにより，筋障害は個人差に相当する数年の幅を持ちながら固有の進行パターンに沿い進行していることがわかる．又，図上機能の比較的よいDMD例が全体の中で遅い方にシフトし，しかも障害度が進行するほど，そのずれが目立っている．機能のよい例の方が，画像上も遅く進行することを示すものと考えられる．
大∴大■羊繹大大】■ll と ■半蠣＝l 陣 8仁多 やnl 積nH髭 ヨ
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書へb E
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甘
薯
外轟8
内
稚

次にDMDの画像上の進行度を代表する値としてのCT総和値の経時的変化を図5に示す．

図3 全身23筋の筋障害度の比較

図よりわかるように，CT総和値は3−9歳の間から増加しはじめ，年齢の進行とともに増加している．そして，各CT総和値に達する年齢には，個人により数年の差がある．やはり，太線で示す機能のよい例の方が遅い方にシフトし，

5

川

は

20

万

CT総和値の増加の開始が遅れ，増加のスピー

二カ暮●

ドも遅いことがわかる．

大腿四頭筋

図6にCT総和値と上田の機能障害度との対応を示す．図よりわかるように，機能障害度の一、二∵＿進行にともない，CT総和値は増加している．
又，機能障害度がⅤ度以上の末期に近い例では，

図4 代表筋4筋の筋障害の経時的変化

機能障害度上変化なくても，CT総和値では増加を示す例が少なからずあることがわかる．

目する．いずれの筋においても，筋障害は5歳
考から10歳の間に急速に進行するが，11歳頃か

察らは，数年間同じ障害度にとどまり，その後徐々DMDのCT画像上の筋障害について，川井に進行する傾向を有す．このように経過が急速

ら1）は，臨床ステージごとの患者群の検討より，進行期と緩徐進行期にわけられる傾向は，代表

DMDの個々の筋はそれぞれ固有の障害進行を筋以外の他の筋においても，緩徐進行となる障
害度は筋により異なるが11歳頃を境として存在した．歩行不能となる年齢が，ちょうどこの

5
6
CT

7

総和櫨8

時期であり，筋障害の進行と臨床像との対応を

9
10
11
12

考える上で興味深い．

日
14
15

以上のように，各筋の障害経過は，それぞれ

16
17
11

固有の進行パターンを取る．

1I
20
21

一方，図からわかるように，各筋障害度に達

22
2二1
24

する年齢及び次の筋障害度に移る年齢には数年

25

12

二】4

5

6

7

8

9IOll121】川1516171819

202122〜】21乃2627282，刃】1の個人差が存在する．又，2段階以上の筋障害の進行を追跡できた症例では，経過を結んだ線
−59−

図5

CT総和値の年齢に伴う変化

のことは，CT総和値がDMDの進行を示すよ

機能11
障害度

り細かい指標となりうることを示唆する．一方，（上田）11
11

CT総和値の進行の時期，および速度には個人V差に相当する帽があり，個人のCT総和値はこⅣのパターンに沿って進行している．従って，個Ⅲ

人の経過中の一枚の筋CT画像を用い，DMD

皿

全体の中で，画像上の進行度の位置づけができ，

1

将来の進行度についてもある程度予測が立てら
5

6

7

8

9101112り141516171819202122232425

れると考えられる．さらに，CT総和値と各種臨

CT総和値

床機能との対応をつけることにより，DMDの図6 CT総和値と機能障害度との対応

進行を客観的に評価する指標として筋CTを用たどることを明らかにし，それに基づいて筋障いれると考えられる．

害進行のパターン分類をおこなっている．今回
我々は，同一症例を用い，個々の筋の経時的変化を実際に追うことで，DMD各筋の固有の障

ま

と

め

1．DMDの骨格筋CT像を肉眼的に評価し経時的に追跡した．

害進行パターンを明らかにした．
CT画像上の筋障害度の評価のしかたとして

2．筋障害の進行は，個人差に相当する幅を持は，筋CT値2），筋CT−index3），筋％断面積4），

ちつつ各筋固有のパターンに沿い進行した．

などを用いた報告がある．筋CT値を障害の指3．CT画像上の筋障害度を示す代表値として，標として用いる場合，特に末期の障害の強い筋

CT総和値を提唱した．

や，痩せの強い例の筋では，筋の輪郭を明瞭に

4．CT総和値は個人差に相当する数年の幅を保ちつつ，年齢に伴い増加した．

同定できなかったI），筋膜や血管のCT値に影響され，正確な値が得られにくい場合がある．
また，筋断面積を用いる筋CT−indexは，さら文

献に個人差の要素がはいってくる．今回我々が用1）川井充，国本雅也ら：Duchenne型筋ジス

いた筋CT像の肉眼的評価法は，筋CT値に比トロフィー症の骨格筋CT所見とこれにもべれば，栄養状態に影響されにくく，末期の像とづく病期分類．臨床神経，25：578，

でも適用しやすい．そして，筋内の筋線経と脂1985．

肪化の割合に注目すれば，比較的たやすい．実

2）立野勝彦，西村敦ら：進行性筋ジストロフ

際の臨床の場で，CT画像上筋障害度を評価す

ィー症の下肢筋群のCTパターンについて．

るのに，有用な方法と考えられた．

総合リハ，10：525，1982．

今回，本評価法を用いて，DMDの各筋の固有

3）堀川博誠，小長谷川正明ら：Duchenne型の障害進行パターンを明らかにした．さらに，

筋ジストロフィー下肢筋CT像の定量的解

これらのパターンに基づき，DMDの画像上の析．臨床神経，25：1277，1985．

進行度を代表する値として，CT総和値を提唱

4）石原博幸，里芋明元ら：CTスキャンによし，この値の経時的変化を迫った．CT総和値

る筋障害の定量的評価法．第2報Duchen−

は，機能障害度が年齢にともない段階的に変化

ne型筋ジストロフィー症における下腿筋

していくのに対し，年齢とともに比較的なめらの障害の進展過程．筋ジストロフィー症のかに増加した．又，機能障害度上では進行がな

疫学，病態および治療開発に関する研究．

くても，CT総和値では増加を示す例も多く，こ昭和62年度研究報告書，1988，p．114．

−60−

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進行過程−CTによる経時的評価一
石 原 博 幸■
研究協力者

里 芋 明 元＊＊ 原行 弘＊＊

江 端 広 樹＊＊近 藤 国 嗣＝ 青 柳 昭 雄＊

儀 式 三 郎＊は じ め にり障害が認められた．これに対し，腹筋群，縫我々は，これまでCTによる筋障害の定量的

工筋，薄筋，後脛骨筋は比較的末期まで残存す評価法の検討を行い，性，年齢別の正常値を報るという結果を得た．昨年度までの研究は多数

告するとともに疾患例の評価に応用してき例を対象とした横断的研究であったが，今年度

た1）・2）．筋障害を評価するための指標としては，はEST治験例10例を対象に，筋障害の進行過従来のCT値と断面積に加えて，残存する筋の程の1年間の縦断的追跡を行ったので，ADL，

割合と月旨肪置換の程度を評価するために考案し筋力の推移と合わせて報告する．

た筋および脂肪の％断面積という指標を用いた．
この定量的評価法を用いて，昨年度の本会議な対象および方法

どで，71例のDMD例を対象に下肢筋の筋障害

対象は，EST治験施行中のDMDlO例で，年の進行過程を分析した結果を報告した（表齢は6歳から10歳，Swinyardstageは，初回

1）1）・2）．障害が初期から認められる筋は，骨盤

評価時がstageII 7例，III 3例，一年後の評

帯・体幹では，大腎筋，中腎筋，大腿筋膜張筋，価時はⅠⅠ6例，ⅠⅠI l例，ⅠV l例，V 2例

大腿では，大腿二頭筋，内転筋群，大腿四頭筋，であった．1年間のStageの変化は，不変が6例

下腿では排骨筋，勝腹筋であり，腸腰筋，腰方（ⅠⅠ→ⅠⅠ，6例），一段階増悪が2例（ⅠⅠ→ⅠⅠⅠ，形筋，傍脊柱筋，半腱様筋，半膜様筋は中期よⅠⅠⅠ→ⅠⅤ，各1例），二段階増悪が2例（ⅠⅠⅠ→Ⅴ，
2例）であった．

表1

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症
における筋障害の進行過程−CTによる評価のまとめ方法は10例の下肢筋のCT像を初回と1年後の2回評価し，さらにESTプロトコールで用いられているADLスコア（9項目，38点満

期

中

期

晩

期

筋 群

初

骨盤帯
体 幹

大骨筋
中骨筋
大腿筋腰張筋

腹腔茄
腰方形筋
傍脊柱茄

腰直筋
腹斜茄

大 腿

大腿二頭茄
内転筋群
大腿四頭筋

半腱種苗
半膜様筋

縫工筋
薄 二
筋

下 腿

餅骨茄
餅腹筋

前歴骨茄
ヒラメ茄

後腰骨茄

点）および徒手筋力テストによる筋力の評価との関連を検討した．CTスキャナーは日立
CTW−500を用い，撮影条件はスライス幅5mm，スキャン時間6秒，Ⅹ線120KVp，200mAとした．また，CT値の安定性を確認するための較正を定期的に行った．スライス部位は大腿中央部および下腿最大径部とし，大腿と下腿各筋のCT値の平均，断面積および％断面積を求め＊国立療養所東埼玉病院内科＊＊国立療養所東埼玉病院リハビリテーション科

た．％断面積は，CT値が30から120の筋の部
分と−60から−200の脂肪の部分各々についてー61−求め，残存する筋の割合と脂肪置換の程度を評

後の評価を表す．内転筋群，大腿二頭筋，大腿価した．

四頭筋，排骨筋，排腹筋は初回評価の時点から

図1に実際の方法を示す．まず，トラックボ

CT値が低く，1年後の評価でもさらに低下を認ールで目的とする筋を囲うことにより，CT値

めた．各筋とも1年後の評価ではCT値の低下の平均と断面積が表示される．次に1eveldetec−を認めたが，その程度は後脛骨筋，ヒラメ筋，tionを用いて，30から120の正常の筋CT値を

縫工筋，薄筋では少なかった．図2b，2Cには有する部分の割合を求める．この例では排骨筋

各筋の筋の％断面積と脂肪の％断面積の変化をの筋の％断面積は2．7％と表示されている．さ示すが，内転筋群，大腿二頭筋，排骨筋，排腹らに右に示すように，−60から一200の脂肪の筋において，筋線維部分の減少と脂肪置換が早CT値を有する部分の割合を求める．本例ではく進む傾向が認められた．

脂肪の％断面積は74．8％と表示されている．以

実例として，初回評価時stage Ⅲ，1年後上の操作を下肢の各筋において行い，各筋のCT値，断面積，筋および脂肪の％断面積を求めStageIVの症例の排腹筋とヒラメ筋のCT所見の変化を示す（図3）．排腹筋は筋の％断面積がた．

25．9％から12．0％に低下しているのに対し，ヒラメ筋は63．9％から61．4％とほとんど変化
結がなく，1年間の両筋の筋障害の進行程度には

果

1．下肢筋のCT値，筋および脂肪の％断面積の変化：図2aに大腿，下腿各筋のCT値の10例差が見られた．

の平均を示す．実線は初回評価時，破線は1年の大腿全体のCT値，筋の％断面積，脂肪の％【二J j￣1￣F．ご丁・・、−LilJ：：Ⅳ￣1・．ド・■

2．症例毎のCT所見の推移：図4に各症例毎■・「、：十一￣．・．￣仁∴．l、．一

国l CTスキャンによる定量的評価法（本文参照）

図2 下腿，大腿各筋のCT値（HU），筋の％断面積（％），脂肪の％断面積（％）の一
年間の推移

図3 一症例における俳腹筋とヒラメ筋の％断面積の一年間の変化（本文参照）−62−

¶tIモLATl仰紺，闇CF mぶCLE
CF Tト日射㈹ADL双：腫
【
⊃

【】

【】

【
コ

a

【コ

図4 10症例の大腿全体のCT値（HU），筋の％断面積（％），脂肪の％断面積（％）の一年間の変化（本文参照）

ロ

：
㊥

1

5 8

mα＝M＿成しE（THIQl）
ロ〇・lTl王（r∝■9：】こ托：川l闇

0竃書く王（r mα＝岨1【川11W【TH相川−

図5

R＝臥74（Pく臥【5）図6

大腿全体の筋の％断面積とADLスコア
との関係

図7

大腿H頸筋の筋力（a）と筋の％断面積（b）の一年間の推移●・−∴ADLスコアの推移とCT所見の推移との関係：a．ADLスコア，b．大腿全体の筋の％断面積（％）

断面積の変化を示す．症例B，C，Dにおいては1年間の変化が大きいのに対し，症例A，Ⅰ

4．筋力の推移とCT所見の推移との関係：図では変化が少なかった．症例F，Jは初回評価

7aは徒手筋力テストで評価した大腿四頭筋筋の時点からCT値と筋の％断面積の低下および力の変化を，図7bは大腿四頭筋の筋の％断面

脂肪の％断面積の増加の程度が他の症例に比べ積の変化を示す．両者のレーダーチャートの形て大きかった．

はある程度対応した変化を示したが，症例E，

3．CT所見の推移とADLスコアの推移との関Fのように，CT値の変化はほとんどないにも係：図5aにADLスコアの変化を，図5bに大かかわらず，筋力の低下は著しい症例も見られ

腿の筋の％断面積の変化を示す．全体の傾向とた．

しては，筋の％断面積が大きいほどADLスコ

図8には大腿四頭筋の正常の筋CT値を有す

アも高い傾向が認められた．しかし，症例Fのる部分の断面積の絶対値と徒手筋力テストとのように筋の％断面積が低いにもかかわらず，関係を示す．両者には有意な相関が認められ，

ADLスコアは高いという例外も見られた．まSpearmanの順位相関係数は0．78であった．

た，症例B，Cのように，筋の％断面積の低下が大きい症例ほどADLスコアの低下も大きい

考察傾向が認められた．さらに，CT所見とADLス

今回我々はCTスキャンを用いて，DMDlO

コアとの関係を検討したところ（図6），両者に

例の下肢筋の筋障害の進行過程を1年間経時的は有意な正の相関が認められた（Spearmanのに観察した．その結果，筋障害の進行過程に関

順位相関係数＝0．74，P＜0．05）．

して，前回71例を対象に横断的研究を行った時−63−

筋力に関しては，徒手筋力テスト自体が定性的

Tト亡托しATtα日夏¶8訓CSA CF恨LE
朴のM¶OF q月脈Im
4
3

8
6

な評価法を検討し，CTの諸指標との対比を行

4

3

【】
2
3

っていく必要がある．

3
0︶

3

筋障害のCTによる定量的評価は疾患の自然

6
d﹁

ロ

2

口

2

M∵n T OF QU RDR・1︵LEAPSな評価法であり，今後より定量的，かつ実用的−

8

経過の把握，薬物や訓練の効果判定などのひと

【】

⊂l
1由

20

つの補助手段として有用と考えられる．今後，

識へ

く11．080）

CF祇6S−SECTl湘L艦A OF rLJSCLE（mlゼ）□ R三日．7台（m可TN）

さらに長期間の追跡を行っていきたい．

図8 大腿四頭筋の筋力と筋の断面積との関係

結語

1．CTスキャンを用いて，DMDlO例の下肢筋とほほ同様の結果を得た．すなわち，大腿ではの筋障害の進行過程を経時的に観察し，筋力，

大腿二頭筋，内転筋群，大腿四頭筋は早期よりADLの推移との対比を行った．

障害され，かつ，障害の進行も早いのに対し，2．筋障害の進行過程は，前回の横断的研究と内側ハムストリングスの障害は比較的緩徐に進ほぼ同様の結果であり，障害は大腿では，大腿み，縫工筋，薄筋は障害の進行が極めて緩徐で二頭筋，内転筋群，大腿四頭筋→半腱様筋，半あった．下腿では，肪骨筋，月井腹筋の障害が早

膜様筋→縫工筋，薄筋の順に，下腿では，膀骨く，前脛骨筋，ヒラメ筋がこれに続き，後脛骨筋，月井腹筋→前脛骨筋，ヒラメ筋→後脛骨筋の筋は障害の進行が遅かった．このように筋によ順に進行する傾向が認められた．

って障害の進行速度に差が見られる原因は不明

3．症例の中で，障害の進行が早い例と遅い例

だが，ひとつの可能性としては，筋の使用頻度が認められた．

の違いが考えられる．すなわち，動作中に多く

4．ADLおよび筋力の推移とCT所見との間に使用される筋ほど，OVerWOrkによる障害が起はある程度の相関が認められた．

こり易く，そのために障害の進行が早いという可能性である3）．この点に関しては，今後，動作文

献

中の筋の使用動態の分析を含めて，さらに検討

1）里芋明元：Duchenne型進行性筋ジストロを加える必要がある．いずれにしても，筋障害フィー症（DMD）における筋障害の進行過の進行過程に関して，今回の縦断的研究で前回

程−CTスキャンによる定量的評価−．リの横断的研究と同様の結果が得られたことは，

ハ医学，26：159−171，1989．

意義あるものと考えられ，今後さらに長期間の追跡を行っていく予定である．

2）石原博幸，里芋明元ら：Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進

今回の対象例10例においては，筋障害の進行

行過程一CTスキャンによる定量的評価一が早い群と比較的遅い群の2群がみられたが，厚生省低分子酵素阻害物質による難病治療

その理由については，対象例がEST治験例で薬の開発研究，昭和63年度研究報告書，あることもあり，自然経過なのか，薬物の影響

1989，p．p．67−71．

なのか判断ができず，今後の検討課題である．

3）Benett，R．I．and Knowlton，G．C．：Over・

ADLおよび筋力の推移とCT所見の推移とWOrk weaknessin partially denervatedの間にはある程度の相関が認められたが，このSkeletalmuscle．Clin．Orthop．，12：22−29，

ことは我々のCTによる定量的評価法の妥当性

1958．

を示しているものと考えられる．ただし，特に−64−

筋ジストロフィー症の血清LAPについて

研究協力者

益

田

岡

目

書

高

橋

桂

一＊

信＊＊

森

鼻

文

朗＊＊

小

林

浩

子＊＊

昭 夫＊＊ 梅 枝 孝 之＊＊

た．同年齢の正常対照と比較する必要があるが的

これまでに我々はDuchenne型筋ジストロフ

今回は出来なかった．平均値で比較するとィー症（DMD）にベスタテンを投与すると2時

DMDではやや高値である．DMD25症例につ間後に血清leucine aminopeptidase活性

いて検討した．年齢と障害度は相関係数r＝（LAP）が有意に低下し，placeboでは低下せず，測定法の検討の結果から，この現象が生体0．94（p＜0．01）で，また障害度とlog CK値
はr＝−0．93（p＜0．01）の有意な相関がみら内で起こっていることを報告した1）・2）．

れたが，障害度とLAP，年齢とLAP，LAPと今回は他の筋疾患でのLAPの値の検討と，

CK，LAPとLDH，LAPとγ−GTP（以下DMDにおけるLAPがどの様な因子と開通しGTP）の間には有意な相関はみられなかった．

ているかを検討したので報告する．またベスタ

図1に障害度とLAPの関係，図2にLAPとテン長期投与の例として，当院で行った二重盲

log CKの関係を示す．

検が解任されたので，LAPの変動を検討した結2）筋緊張性ジストロフィー症（MyD）の血果も報告する．
▲義▲tt▲1■■▲

Y

方

法

種々の筋疾患患者の血清LAPをL一口イン

J
＿

150

−

l＝5

一

ルーP−ニトロアニリドを基質としたオートアナ￣一一一一−−●り

亡1一事■▼■暮暮暮tt

◆l＿07

X

￣￣：−

■一一一一一

￣

図1

果

◆

㌢一一一一−−−÷−」￣￣−

一一一￣

10

結

事

Y＝1二！コ．b7b

一

100

イ

ヽ1．0〔OI

ライザー法で測定した．DMD患者および入院中の患者では早朝安静空腹時に採血した．

¶

LAP

175

2〇

二；0

■0

50

も0

70

eO X

デュシャンヌ型筋ジストロフィー症における障害度と血清LAPの開通

1）DMD25例（厚生省研究班8段階分類で
障害度1：5名，4：2名，5：3名，6：7
名，7：4名，8：4名）のLAPは138．2±▲1▲▲▲▲雷1■暮Y log日ソ対日

れ1

事
Y＝

亨

t

，

ビ

ン

▼1▲霊暮霊1霊■5．78141−5＿08597F−03

y＿tヽ1．OE−11■○

20．7（平均±SD）Goldbarg Rutenburg Unitであった．当院での成人の正常値は125±25で3SDを上限にとると200以上が異常高値になる．DMDで200を越えたものは1名もなかっ110

図2＊国立療養所兵庫中央病院＊＊国立療養所兵庫中央病院研究検査料

120

130

140

1ち0

169

170

デュシャンヌ型筋ジストロフィー症における血清LAPとlog CKの関連−65−

活LAPは170．0±24．8（n＝10）で，年齢と相Ef柏〇t O†BestaHnon LfpinD」C鴨「㈹dゝ6trOPhy担いents

関傾向を示したが有意ではなかった．CKは年齢と逆相関の傾向を示すが，LAPとCKはむし
ろ正相関の傾向を示した（図3）．またLAPは
GTPおよびLDHと正相関を示し，後者はr＝0．74（p＜0．05）で有意であった（図4）．
3）肢帯型筋ジストロフィー症（LG）のLAP
は164．1±35．7（n＝7）でDMDより危険率5図5％で有意に高かった．LGのLAPは年齢，CK，LDH，GTPと有意の相関を示さなかった．
4）これら3種の疾患42名を合わせて検討
すると年齢とLAPはr＝0．49（p＜0．01）で正ベスタナン150mg分3食後および偽薬
内服の血清LAPにおよばす影響．開錠
結果：No20およびNo53がベスタテ
ン，No19，No21，No96が偽薬．

相関し，LAPとlog CKはr＝−0．40（p＜No20が真薬で，No96は偽薬であった．投与後0．01）の逆相関を示した．LAPとLDH，LAP

4週でのLAPの低下が意味を有すると思われとGTPは有意の相関がなかった．

た．

5）ベスタナンの長期投与例として二重盲検でのLAPの変動を昨年度報告した（図5）2）．図

考察および結論

中点線で結んだNo19とNo21はLAPの低山本らはDMDで血清LAPの有意な上昇を下がないと判断したが，これらは閑鍵の結果偽報告し，各症例の経時的測定で障害度5−6で最薬と一致した．No53とNo96は低下し，No20も高くなることを報告している3）．但し障害度7は判定不能としたが，開鍵の結果No53との症例は1例のみで障害度8の症例は含まれていない．我々の症例には障害度5以上の症例が18例含まれているが障害度との相関は得られなかった．また各障害度でのLAPの平均値の間に有意差はなかった．また山本らは血清CKとLAPの有意の相関を認めないことを報告しているが，我々の結果も同様であった．MyDではLAPの平均値はDMDより高いが，体重や

1：25

150
LAP

図3

Y

臓器の大きさを考慮する必要がある．MyDで筋緊張性ジストロフィー症における血清
LAPとCKとの関連

はLAPはLDHと有意の相関を示し，DMDとは相違した．このことはMyDにおけるLDHの由来や臓器よりの酵素遊雛の機構の相違があ

LDH＿【Y1．0E◆11

り，MyDの多系統疾患の一つの表現かも知れ75⊥

ない．LGはMyDより平均年齢は若く，いずれも介助起立ないし歩行の可能な症例でLAPも一・・

DMDより高値を示したが，同様に筋肉量や臓■・器重量の差を考慮すべきであろう．LGでは−

125

MyDにみられたLAPとLDHの相関は観察

150
」 ■P

図4

筋緊張性ジストロフィー症における血清
LAPとLDHの相関されなかった．すべての症例をあわせてLAPを検討すると，年齢と有意の正相関があり，CK−66−

とは逆相関する．このことから我々の血清LAP

薬の開発研究（江橋班），昭和62年度研究の測定では筋由来のLAPをどの程度測定して報告書，1988，pp83−85．

いるかが問題になる．

2）高橋桂一，梅枝孝之ら：ベスタナンの血清

ベスタナンの内服で短期，長期ともに血清

LAPに及ぼす影響．厚生省新薬開発研究

LAPの低下が観察されたが，DMDの臨床的な費・低分子酵素阻害物質による難病治療薬

改善あるいはメリットをもたらすかどうかはこの開発研究班（江橋珪），昭和63年度研究

こでは結論できなかった．

報告書，1989，pp93−95．
3）山本真理，佐藤 猛，杉田秀夫：Duchenne

文型筋ジストロフィー患者血清のAminope・献1）高橋桂一，西尾芙久：Duchenne型筋ジス

ptidase活性一骨格筋に由来する酵素の同トロフィー症の血清酵素におよぼすべスタ

定および活性について−，臨床神経学，28：

テン（NK421）の効果．厚生省新薬開発研735−741，1988．

究費・低分子酵素阻害物質による難病治療−67−

ヒト血清中の自己免疫筋抗原（SE−antigen）の測定
春 原 経 彦■研究協力者

古 川 昭 栄＊＊ 里 書 栄二郎＝

重症筋無力症や多発性筋炎の約半数の患者血中に，骨格筋から生理食塩水で抽出される物質

抗体価はすでに報告した方法にしたがった1）・2）．
SE−antigen測定系の確立に対する抗体が存在する1）．以後この抗原物質

一般的に感度，定量性，信頼性の高いサンドをsaline extract（SE）−antigenとよぶ．我々

イッチエンザイムイムノアッセイ（EIA）法を採はこれまでにSE−antigenに対するモノクロー

用した．SE−antigen分子上の認識エピトープをナル抗体を作製し，これを用いて以下に示すよ

異にする2種のモノクローナル抗体1E7，7

うなSE−antigenのいくつかの分子特性，組織D9を用いた．まず一方の抗体を100／Jg／mlの内分布を明らかにしてきた．1）SETantigenは濃度になるように0．1M Tris−HCl buffer，

骨格筋，心筋に分布し胸腺にも微量存在する．

pH7．6（THbuffer）で希釈したものを50JLlず2）分子量は210kda．，3）培養下では融合しつ96穴ポリスチレンプレートに添加し90分間た多核筋管細胞が合成し，分裂中の細胞には存回相化した．0．5％スキムミルクを含むTH

在しない，4）細胞外に分泌される，5）筋組

bufferで30分間ブロッキングし，プレートを級の細胞外マトリックスと横紋構造に相関する

洗浄後，1％BSAを含むTH bufferに溶解し構造に存在する．

た測定サンプル50JJlを室温で3時間反応させ以上の知見からSE−antigenは血中にも存在た．次にビオテン化したもう一方の抗体を4℃することが予想される．そこでSE−antigenので15時間反応させ，ストレプトアピジン標識し生理的機能を明らかにすること，自己免疫筋疾

たβ−D−ガラクトシダーゼを反応させた．プレ患との関連を調べる目的でヒト血清中のSE−ートに結合した酵素活性を4−メチルウンベリ

antigenの定量系を確立した．

フェリルβ一D−ガラクトンドを基質として測定した．SE−antigenはいまだ完全に精製されてい方法ないため，ヒト骨格筋のPBS抽出物をセ77

血清サンプルロース6Bにてゲルろ過し，SE−antigen活性の正常人血清48例，重症筋無力症（MG）患者
82例，多発性筋炎17例の血清を1％ウシ血清

最も高い分子量100kda．以上の画分を濃縮したものを常に標準品として用いた．

アルブミン（BSA）を含むTHbuffer（組成は結果と考察下記）にて10倍に希釈し，EIAに供与した．
抗アセチルコリン受容体抗体価，抗SE−antigen
抗体価の測定SE−antigen定量システムの確立

抗アセチルコリン受容体抗体価，抗SE−antigen

結果，7D9抗体をプレートに固相化しビオナン

2種のモノクローナル抗体の組合せを試した
化した1E7抗体を用いたEIAシステムだけ＊国立精神・神経センター武蔵病院＊＊国立精神・神経センター神経研究所

がSE−antigenの測定が可能であった．標準試料0．01−100〟g／mlの範囲で用量依存的な検−68−

⁝⁚宣言主宰：量曲線が得られた（図1）．
正常人，PM，MGの血清中のSE−antigenレベルを図2にしめす．標準試料換算で検出限界まで広範囲にわたって分布していた．性差およ

ことがわかる．

1

ム

血清中のSE−antigenレベルと抗SE−antigen
抗体価および抗アセチルコリン受容体抗体価と5の相関性の検討？ エ ・ ・ − ・常人を問わずほとんどのヒト血清中に存在する∈︑誉ユ竺乱雲？山の果からSE−antigenは自己免疫筋疾患患者，正5び3群間の有意差は兄いだせなかった．この結

● ●

0
1

以下のものから50JJg／mlの高濃度を示すもの⁝⁚を7−静f

ヒト血清中のSE−antigenレベル

MG患者血清について縦軸にSE−antigenレ
ベルを，横軸に抗SE−antigen抗体価をプロッ●

トし，両者の相関性を調べたのが図3Aである．
両者にはまったく相関性が認められなかった

N

PM

MG

図2 正常人，多発性筋炎，重症筋無力症患者
血清中のSE−antigenレベル
N：正常人，PM：多発性筋炎，MG：重
症筋無力症

0
0

いて縦軸にSETantigenレベルを，横軸に抗アセチルコリン受容体抗体価をプロットし，両者

0
500⊂むUd血︼0⊃t﹂−Ol言su〇一三（R2＝0．001）．同様にMG患者血清80例につの相関性を調べたのが図3Bである．抗SE−antigen抗体価と同様に両者にはまったく相関性が認められなかった（R2＝0．014）．
血清中のSE−antigenレベルの加齢にともなう変化
SE−antigenの血中レベルは筋疾患患者，正常人共に存在濃度範囲がきわめて広く，疾患に対
0．01

0．1

1

10

100

ConcentrationofSE−antigenFraction（FL度／rTlI）

図1

ヒトSE−antigenの標準検量曲線
ヒト骨格筋のPBS抽出物をゲル濾過し活性のある溶出画分を濃縮して標準試料とした．
横軸はそのタンパク質濃度，縦軸はβ−D−ガラクトシターゼ活性の蛍光強度を示す．

する特異性も兄いだせないため年齢との相関を検討した．20−50歳の正常人血清中のSE−
antigenレベルを年齢に対してプロットしたのが図4Aである．ほぼ32歳をピークとする山なりの分布を示し，SE−antigenの血中レベルは青
年期後半に最も高く以後徐々に減少すると推定された．MG患者群での年齢対比では（図48）
この傾向はあまり顕著でなく，20−30歳の年齢
ー69−

A∈専占空○晋︻？山の．・：●・・●．；f・、・●￣￣￣￣￣−iTiTてJここ：i■l：・づ・−1．．・●．
●
■l l
●

●

0．01

●

●

0．05

●

●

●

0．1

0．5

AntLSEantiMkS（absorban￠Oat500nm）

B∈︑鴫︑ユ209−亡？uS●●●●●●

●●

●●●●●

●

●

．∴・」∴て・∴∴‥−
●

●●■
● ● ●

●

■l ●●●●
●

●

●
●●

●●

●●

●

1

10

100

Anh紙用antibodIeS（plIⅦl／鵬）

図3

血清中のSE−antigenレベルと抗SE−
antigen抗体価および抗アセテルコt）ン
受容体抗体価との相関性の検討
縦軸は血清中のSE−antigenレベルを，
横軸は抗SE−antigen抗体価（A），抗ア
セチルコリン受容体抗体価（B）を示す．

層に高値の，50歳以上の年齢層に低値を示すものが多い傾向を認めた．
0．1

まとめと結論

0

20

40

60

80

Age

ラットの組織内分布を調べた以前の結果から
SE−antigenは骨格筋と心筋にのみ局在していることが明らかになっている．今回の検討により，SE−antigenが正常人を含めたほとんどのヒト血中に兄いだされること，その血中レベルは

図4 正常人と重症筋無力症患者における血清
SELantigenレベルと年齢との関係
縦軸は正常人（A）と重症筋無力症患者（B）血清中のSE−antigenレベルを，横軸は年齢をしめす．0：女，●：男．

年齢依存性であること，などからなんらかの筋肉機能と相関していることが示唆された．

Immunol．Methods，94，161，1986．
文

献2）Furukawa，SリAkazawa，S．，Furukawa，

1）Akazawa，S．，Furukawa，S．，Kamo，I．，
Satoyoshi，E．and Hayashi，K．：J．

−70−

SリKamo，I．，Satoyoshi，E．andHayashi，

K．：J．Neuroimmuno1．，6，397，1984．

骨格筋ミオシン軽鎖測定のためのラジオ
イムノアッセイ法のキット化の試み
矢 崎 義 雄＊研究協力者

永 井 良 三＊ 加 藤 祐 之＊ 杉 田 秀 夫…

Ⅰ 骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰの部分ペプチドの収縮の景小単位である筋原線経を構成している収縮蛋白のミオシンの，小さなサブユニット

作製

である軽鎖は，一筋細胞の障害時に筋原線経からわれわれは，ヒト胎児心筋のmRNAから作容易に解離し，また小分子であることから速や製したcDNAライブラリーから，心房筋およびかに細胞外に逸脱し血中に出現する．したがっ心室筋ミオシンの軽鎖Ⅰ（アルカリ軽鎖）の遺て，血中のミオシン軽鎖を検出してその濃度を伝子をクローニングして，その塩基配列からア測定できれば，筋原線経の崩壊の進展状況を知

ミノ酸配列を決定した．図1に示すように，心ることが可能となる．従来の指標であるCPK室筋タイプミオシン軽鎖Ⅰは，心房筋タイプとやLDHなどの筋蛋白酵素は，可溶性蛋白であ

アミノ酸レベルでその相同性は約71％であっるために，細胞障害時に細胞膜透過性克進によた．骨格筋ミオシンで自筋タイプの軽鎖Ⅰとのり迅速に逸脱してしまい，細胞構築崩壊をその相同性は約62％認められた．このようなアミノ

血中濃度は必ずしも反映するものではない．し酸配列から，われわれは心筋ミオシン軽鎖Ⅰとたがって，血中ミオシン軽鎖値の測定は，筋障

比較的相同性の少ない骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰの害の定量的な診断と薬物療法などによる治療効

部分配列（＃4EEKIDLSAI，＃5TGDSKIILS−

果の評価に，臨床的にきわめて有用な指標になQV）を基に2位頬の合成ペプチドを作製した．

るものと考えられる．
われわれはすでに，骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰに

ⅠⅠ部分ペプチドに対する抗体の作製

対するラジオイムノアッセイ系を開発し，筋ジ2種類の合成ペプチドをウシ血清アルブミン

ストロフィー症で血中軽鎖値が著しく高値とな

蛋白と結合させ，完全フロイントアジュバントることを示した．しかし本法では，標準蛋白とHllman ALCl（汁）Human VLCl（MI

してヒトの骨格筋ミオシン軽鎖が必要であり，

Humarl LClf（1）Chicken LCl⊂（Hl

また抗体血清にも量的制限があって，広く一般

Human ALCI

臨床に用いられるに至っていない．そこで今回Human VLCIHuIman LCl f
Chick亡h LClC

われわれは，骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰのアミノ酸

Hlllnan ALCl
Hllman YLCI
Hu廿はn LClf
Chicken LCle

配列より部分ペプチドを生合成し，これを抗原

HⅦman ALCI
Humall YLCI
Hlllban LClf
Chlcktn LClCにしてラジオイムノアッセイ系の確立を試みた．

YEDFVEGL豆YFDl（EGNGTYMGAELRHYLA

HlIman ALCI
Human VLCI
Hllnan LCll
Chlcken LClC

＊東京大学医学部第三内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

EDANGCINYEAFYrHl

図1骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰのアミノ酸配列と，抗原として用いた部分ペプチド＃4と＃5の構造を示す．
−71−

と混合した後，ウサギに250JJgずつ2週間おき

図表で明らかなように＃4では血清の数十万に3回皮内注を行い免疫した．5週目に血清を倍，そして＃5では数万倍稀釈より有意の発色が採取してその抗体価をELISA法にて測定した．

認められた．そしてEC5。は＃4で数万倍，＃5で

図2，3に示すELISA法は以下のように行は数千倍稀釈と，きわめて結合親和性の高い抗った．まず96穴型ウェルの固相にPBS緩衝液

血清が得られていることが明らかとなった．まに溶解したヒト骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰの部分ペた実線に示したように，それぞれの合成ペプチ

プチド，＃4と＃5のそれぞれを固定した．次にドが10〟g／ml存在することにより反応系に抑血清を図に示すような稀釈倍率で加え，さらに制がかかることから，特異性にもこの合成ペプビオナンで標識したヤギの抗ウサギIgG抗体

チドに対する抗血清はすぐれていることが示さを添加して40C24時間インキュべ−トした．それた．

の後洗液をくり返し行い，さらにアビデンで標識したベルオキダーゼ酵素を加えた．発色色素ⅠIl 骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰの測定としてOPDを加え，最終的にはその発色の吸次に，このような合成ペプチドに対する抗血光度を分光光度計にて測定した．したがって，

清により，実際の骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰ蛋白が

その吸光度が抗体の力価に相当する．

測定可能であるか，同様にELISA法により検討した．
まずウェルにヒト骨格筋より稀釈法によって

9m

SMLP13−4＃4Rabbitm■・・・・・・・・・・・・t

抽出純化したミオシン軽鎖Ⅰを吸着させ，そこ・、 ・◆．

8に段階的に稀釈した抗血清を反応させた．コン

m
・叫

．

●

吼

仙45n＝Hm

一
∧ ∪

●●・・、

トロールとして，前回確立したラジオイムノア

■・・・t

6
∩ 肌

、 、・、

＼

．

︻ ■
− m

ッセイに用いた抗血清を同様に稀釈して加えた．

4
m
3
n −

図4に示すように，ラジオイムノアッセイに用■いた，骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰ蛋白に対する抗体・・・・・・・、 ・・− ●

2
1

280

1800

5080

25仙8

125800625000引250M

0D仙tionでは，数千倍稀釈から有意の反応を呈して，吸光度が上昇したが，合成ペプチドに対する抗血OLC（十川JJg／mn ●LC（−）

図2 骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰの部分ペ70チド＃
4に対する抗血清の稀釈曲線

清では，＃4に対するものも，＃5に対するもの

SMLKll
m
■ 肌
吼
4

n︻
m
▲仏

Hm

l

●
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、 ・・
．

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5

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6

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仙15▲‖

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ヽ ・・
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SMLP23＃5Rabbjt
9

ヽ・、h

12500

3
■
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・、 ・
−

．．

62500

3は500

15625的

Se川mdilutjon

2
叫 ■
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・・●

小 ・・・
・・
・・・■
■■

OI4

1
2 d o

t o 叫

5 0

0

2 5 0

0

1 2 弧

0

6 2 弧

0

●，5

△C刷れ1

3 1 2 5 M

DHu血n

図4

OIC（十川I19／爪l） ●LCト）

ペ70チド＃4および＃5に対する抗血清の
骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰとの反応曲線
コントロールは前回報告したラジオイム

図3 骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰの部分ペプチド＃5に対する抗血清の稀釈曲線

ノアッセイ用の抗血清の反応を示す．
−72−

にも百倍稀釈まで検討したが，有意の反応は認かったために，その正確な定量には2千倍稀釈

められなかった．

が限度であり，したがって測定可能な検体数は

これは合成ペプチドに対しては，親和性も特異性も高い抗血清が得られたが，これらの抗血限られてしまい，広く多施設で使用出来るキッ
ト化はほとんど不可能である．

清は残念ながら，骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰ蛋白に

そこで今回われわれは，骨格筋ミオシン軽鎖は反応せず，合成ペプチドの認識される抗原提Ⅰのアミノ酸配列から合成ペプチドを作製して，示部分が蛋白分子構造の内部に埋没してしまっ

これを抗原に抗血清が得られれば，十分な抗原て結合出来ない可能性が考えられた．

量ばかりでなく標準蛋白としても量的制限がな
くなり，日常臨床で使用できるキット化が可能

考である．このようなアプローチから，骨格筋ミ按

われわれは心筋ミオシン軽鎖Ⅰに対するモノ

オシン軽鎖Ⅰのアミノ酸配列から，9個と12個

クローナル抗体を用いたイムノラジオメトリッ

からなる合成ペプチドを作製して抗血清を作り，

ク法あるいはELISA法による測定キットを開ELISA法を行った．しかし合成ペプチドに対し発し，急性心筋梗塞を中心とした心筋障害の感ては，感度も特異的にもすぐれた抗血清が，ウ度と特異性にすぐれた診断薬として広く日常臨

サギを免疫することにより得られたが，実際の床においても使用されるようになった．一方，

軽鎖蛋白分子では，その認識する抗原決定基が骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰに対するラジオイムノア
ッセイの開発も試み，筋ジストロフィー症患者

分子構造の内部に埋没されてしまい，反応が得での骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰ血中値の著しい上昇

来れば次回はN末端に近いアミノ酸配列からを示し，昨年本研究会において発表した．しか構造を選択して合成ペプチドを作製し，再度測し，その抗血清の抗体価が，抗原として十分な

定系のキット化を試みたいと思う．

られず測定系の確立にまでは至らなかった．出量のヒト骨格筋ミオシン軽鎖Ⅰ蛋白が得られな−73−

当院においてEST服用を開始した−症例の経過
一正常児との比較フォローを中心に一三吉野 産 治＊研究協力者 山 田 みどり■ 江 田 伊勢松＊

は じめに

遠城寺法にてDQ＝59と，知能低下がみられた．

我々は，当院で初めてEST（ロキシスタナン）

初診時検査所見（表）：血液生化学検査で，を使用する症例をフォローするために，EST調GOT354単位，GDT643単位，LDH3826単

査票の項目の中から，運動機能に関係するとこ

位，CK12890単位，アルドラーゼ113シグマ単ろを取りあげ，正常コントロール群と比較検討位と上昇しており，尿中クレアチニンの減少，した．

尿中クレアチンの増加がみられた．胸部レント
ゲン，心電図では，特に異常は認めなかった．
症

下肢の骨格筋CTで，大腱中央部において，半例

症例：5歳，男子
主訴：肝機能異常

膜様筋部のlowdensityを認めた．

妊娠・分娩歴：異常なし

比較検討

既応歴：クループ．気管支喘息

EST調査票の中から以下の8項目について，

家族歴：家系内に同様の疾患なし．但し，母のCK値825単位（正常0−25単位）と高値であった．

正常コントロール群と比較し，ESTの効果判定の有効性について検討した．
①右手握力，②左手握九③仰臥位からの立ち

現病歴：頚走3ヶ月，坐位の時期は不明であ上打り時間，④仰臥位からの起き上がり時間，るが，1歳までは特に異常に気づかれなかった．
昭和61年にクループのため，唐津赤十字病院に（訓春子からの立ち上がり時間，⑥階段4段昇り

入院し，その時，肝機能異常を指摘された．その後，乳児肝炎としてフォローされた．昭和63

正常コントロール群は，3歳9か月から6歳3

時間，⑦10m走行時間，⑧3m這行時間．

年12月，CKの高値に気づかれた．翌，平成元
年1月に，九州大学小児科で筋生検を受け，
Duchenne型筋ジストロフィー症と診断された．
同年10月，ESTによる加療を希望して当院を受診した．

表 初診時検査所見
ヘモグラム

血液生化

IBC454メl叶／−■I T一一r0

Ht

汎5：

GOT

鵬C7000／■■I LM（St6‡Seg49‡ly37‡

理学的所見：身長96．9cm（−2SD），体重
15．0kg（−1SD）で，肪腹筋の肥大とGowers，
徽候が見られた．
神経学的所見：深部腱反射は消失しており，＊国立療養所西別府病院

6．2g／dl

山b＝g／dl

Hb12・5g／dl T−Bi10．2毎／dl llp ll．9【AU肋1王Eo T：）−lt 27．1XlOり■■ユ
枚屋

異常なし

354川／l GPT

3826川／1
T−Cbol141■／dl TG87■g／dl引用／dl Cr8．35■‡／dl

Ha

12．11

139■Eq／11

Cl lO81Eq／l CA

尿中クレアチニン

屯下

I

4，7■

尿中クレアチン上昇

Ct12890川CbeSt

トI INL

ECG

佃L

骨格芯CT

半農珪石のLov denslty−74−

843IU／1

γ−GT日】U／l

4．01EVI

8．8叩／dl／dl ICm l．6IU／l▲ld l13．0シカU

か月（平均5歳0か月）の神経・筋疾患のない

4．15秒，コントロール群は2．92秒〜3．57秒と差10名で，男子7名，女子3名である．

がみられた．
⑦3m這行時間；息児は5．53秒〜5．32秒，

結コントロール群は2．70秒〜4．53秒とやや差が果①右手握力：患児は平均3．2kg〜3．5kg．コ

みられた．

ントロール群は平均4．6kg〜10．8kgとやや差がみられた．
②左手握力：患児は平均3．0kg〜3．6kg，コントロール群は平均4．3kg〜11．2kgで，差はみられなかった．
（∋仰臥位からの立ち上がり時間（図1）：息児は3．92秒〜5．54秒，コントロール群は1．20秒〜1．98秒と明らかな差かみられた．
⑥仰臥位からの起き上がり時間（図2）：息児は2．60秒〜2．08秒，コントロール群では0．51
秒〜1．44秒とやや差がみられた．
⑤椅子からの立ち上がり時間：息児は0．7秒〜0．6秒，コントロール群は0．20秒〜0．50秒と差を認めなかった．

3

4⑥10m走行時間（図3）；息児は5．57秒〜

5

6

年

脆

7

く才＿〉

図2 仰臥位からの起き上がり（無補助）⁝＼・・・lllL． ′ − ′ ／ 上

00

0
0

0

0

0

−1

5

6

4

5

0

3

3

0

6

7

図1仰臥位からの立ち上がり

図310m走行 歩行時間（無補助）
ー75−

7

考

ESTの効果判定に最も有効であるのは仰臥位

按

我々の症例は1例で，EST服用を開始したばからの立ち上がり時間であろうと思われた．

かりである．今回は，本症例をフォローしていくなかで，ESTの有効性をよりよく反映するもまのを正常児10名と比較して検討した．

とめ

1．当院でEST（ロキシスタテン）を初めて正常値という点からみると，3−6歳という年齢の運動機能の発達は，個人差が激しいと考え使用した5歳，Duchenne型筋ジストロフィー症の臨床経過を報告した．

られる．更に，この年齢では，息児は息児なり

2．息児に対するESTの効果をより明らかの発達を確得し続けているなど，効果判定に雉にするために，3−6歳の正常児10名の握力，仰しい点がある．

臥位からの立ち上がり，及び起き上がり，椅子

そのためには，よりバラツキの少ない項目が，又，患児とコントロール群との差が明らかな項からの立ち上がり，階段4段昇り，10m走行，3m這行の時間を比較検討した．
3．本児1名ではあるが，正常児と比較して，目が，効果判定に有効と思われる．
今回の結果では，バラツキが少ない項目は仰以上の項目の中では，仰臥位からの立ち上がり

臥位からの立ち上がり時間，仰臥位からの起き時間が，ESTの効果判定に有効であると思われ上がり時間，10m走行時間であった．なかでた．

も，息児とコントロール群に明らかな差がみら

4．今後，息児の経時的データと，機会があれたのは，仰臥位からの立ち上がり時間であっれば，更に症例数を増やし，ESTの臨床的効果

た．

を判定していきたい．

以上より，本症例をフォローしていくうえで，−76−

EST投与Duchenne型筋ジストロフィー症患者の臨床経過：−6年日の報告−
宮

武

正＊

研究協力者 山 崎 元 義＊＊ 近 藤 隆 春＊＊
桑 原 武 夫＊ 湯 浅 龍 彦＊

は じ め にく，を各項目4点満点計32点を100％として計

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症（以算した．下肢筋力は，以下の6筋，すなわち，

下DMD）に対して，E−64（以下EST）投与に

腸腰筋，大殿筋，Hamstrings，大腿四頭筋，前よる臨床治験が開始されて，約6年が経過した．

脛骨筋，膵腹筋，をDaniels法で13段階に細分

日常生活動作能力（以下ADL）で検討すると化し，筋力に0〜10点の評価で60点を100％とEST投与群では，非投与群に比して，より高値して，その経年変化を検討した．ROMは各関節をとる傾向にあった1）．本年は昨年に引き続きの拘縮度をBrookeらの方法で算出し，％で示EST投与DMD児のADLを，非投与児の下肢した．

筋力（MMT），関節可動域（ROM），ADLの面から比較検討したので報告する．そしてEST投与DMD児の現況についても報告する．

結果

下肢ADLスコアーは経年的に低下しているが，急速に低下している群と比較的保たれる群対象がみられた（図1）．筋力も同時に加齢と共に低国立療養所新潟病院入院中のDMD男児で入下するが，かなりのVariationがみられた（図院時歩行可能であった22例である．入院時平均2）．歩行不能時の平均は46．5±6．2％であった．

年齢は9．6歳±1．6歳で，平均歩行不能年齢は

ROMは加齢と共に制限が高度となった（図11．5歳±1．9歳であった．入院時のStageはI

3）．歩行不能時の3関節のROMをみると（図2名，ⅠⅠ16名，ⅠⅠIl名，ⅠV3名である．EST投

4）股関節の屈曲拘縞が強く，これが歩行不能の与群は昨年と同様EST投与時歩行可能であっ一因と思われた．DMD児が歩行不能になる原た7例である．

因として，絶対的な筋力低下だけでなく，拘縞が原因となる症例も認められた．このことは法

下肢のADLスコア一，下肢の筋力下肢のROMで検討した．下肢のADLスコアー8項目
すなわち（∋立っている，②椅子にすわる，（訓寿子から立ちあがる，①しゃがむ，（9床から立ち
あがる，⑥階段を昇る，（∋階段をおりる，⑧歩＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立療養所新潟病院㌘㌫Ⅷ細Ⅶ川棚川棚甜一
8切明1〇＼﹂︶﹂凸く

方

朗

5

図1

10

A旺

15

28

下肢ADLの経年変化

缶（γ0）

の歩行速度を検討したところ，3例において若干の改善をみたことを報告2）した．今回はその3例の下肢ADLスコアについて現在までの経過につき検討した（図5）．その結果症例1は筋力が十分保たれており良好な下肢機能を維持していたが，12歳時に拘綿のため急速に歩行不能
開

5

18

15

28

25

となった．症例2もかなり長期まで筋力が維持（yo〉されていたが，拘縞の進行と共に歩行不能とな

図2 下肢筋力の推移

った．症例3はEST服用時は非投与群と同程︼害UりU等−9年⊆巳岩垂道三

讐品 川別 間 駆 聞 川棚 詔⁝18度であったが，徐々に良好な経過をとり，いわゆるstageIV期が長く続いたが，下肢機能の低下は非投与群と同様な経過をとった．
国立療養所新潟病院において24例のOpen
Studyが行われてきた3）が，投与開始時のStageに比して仝例進行しており，現在の歩行可能児はいない（表1）．stageV］Hの2例は呼吸不全に

祝

5

柑

図3

瓜【15

28

て体外式人工呼吸器を使用している．投与開始路（yo）

時2例に軽度の嘔気，嘔吐を認めたが消化剤の下月支関節ROM併用で改善している．rGTPの軽度上昇を3例

山岩OS山喜ト0芸卜看U

闘現98 80 78 田 切 48 38 甜 18に認めたがその後正常範囲におちついている．
．
蹟 】
9 B
○

組
7 8

○
A
ご

6 8
5 8

迂

■
b −
○
＿
▲
・、、こ
、・
＿■
ヽせ：車 こ

座

√

㌧

＼

38

＼
ゝ

29
＿
＿．
−．
．．
＿ ＿．
H
1 8

＼
一
・㌧ ．．
▲
、 ヽ ：
一 一

色

3，由6

6，舶

8＿齢

11．00

13．88

16．【】旧年蘇Hip Knee

図5【〕nkle（joint）

48．2±13夏

13．2土4．3；

23．6±9．1Ⅹ（−35．60）（−17．8つく13．1つ−・EST（＋）付J O G8581

A c8502

X08503

下肢ADLの経年変化

表l EST投与群（24例）

歩行不能時の下肢3関節のROM

e

ta

S

図4

一

4 日

−EST（−）l訂J

8＋ヽ

開始時（昭和59年） 現在（平成2年）

I
7
0
1
8
7

H

0

m＝m
▼

−78−

l

能であり投与1年後でも歩行可能であった5例

0る傾向がみられたこと，EST投与開始時歩行可V討し，非投与群に比して5例で機能が維持されn能であった7例につき下肢ADLスコアーを検Hない重要な点である．昨年EST投与時歩行可H

EST投与群においても検討されなければなら

8nU

検血，血液生化学上も著変なく安全性が認めら

8
Q9
口 U
8 7

れている．なお，投与時で死亡した例はいない．

68

1例，上腸間膜動脈症候群で投与を中止してい

5
﹁
3

一 u

2

8

一
l

n M I

察

︻ u

一

考

8n U

る．
進行性の疾患であるDMDに対してEST投

5．tZ8

8．1鷺】

与を行い約6年が経過した．全例でStageは進

1臥86

13．閃

15．88

18．88

21．関

白（吏（リ．0）・・・・一・・m（−）

行しているが，副作用の発現はみられていない．
歩行可能の早期よりEST投与を受けた群に下肢機能が長く維持される傾向があり，臨床的にも有用と思われた．
歩行不能となってからの薬物評価が困難であ

1
首
の
坐
り

ることから，より多数例での検討が必要である4）・5）・6）・7）．そのため平成1年よりstageI〜ⅠII

2
保 坐
つ 些
姿
勢

でかつ6−10歳の患者に限定し，より簡便で合理的な基準に基づいた二重盲検試験が開始され

3
報

た．DMDのnaturalcourseの多様性をふまえ，≡

一一EST（A〉

図6

体幹ADLの経年変化

表2

体幹ADL項目（6項目）

4 点
3 −

普 通 に出 来 る
凛 ばい で頭 を もた げ うる が仰 け で はも た げ られ な い

2 〃
1 ′

遭【
れ ヽで も更頁をも たげ ら れ ない
皇 位で は 首 がす わ って い るが 少 しで も 傾 け る と頭 が匂 わ る

0 一首 坐 り不 能

4 点
3 ・

バ ラ ンス が くず れ ても 立 ち なお る （4 0●以上 飼 幹 を傾 け て も）多 少の バ ラ ン スは とれ る （10 ●− 35 飼 幹 を傾 け て も）2

少 しバ ラン ス を くすす と す ぐに 倒 れ る（10 ●未 満 の傾 きで ）

−

1 −
0 〝

少 し さ さえ れ ば坐 って お れ る
よ り かか ら ね は生 って お れ ない

4 点

字 を使 わず に仰 け にゆ っ く り澤 転べ る

3 〃
2 〝

手 を支 えれ ば仰 け にゆ っ く り謀 転 べ る（一 旦 横 向 きに な って か ら も含 む〉
一 旦 は這 い に なっ てか ら ヰ転 ぶ

位位 −く 1 〟 手 が支 えき れ すに その ま ま くず れ るよ うに寝 転 ぶ、・＿ノ′〉 0 ・・ 介 助 な しに は寝 転 べな い

的確に病態をとらえることが，薬効判定の上でも重要である．その観点から今回歩行不能とな

4
≡
雷
返

る要因を，ADL，筋力，拘縞という面から検討

る

し，歩行不能になる条件としていくつか異なっ5
這た理由が存在することを確認した．今後は，よう

り客観的に評価検討するために，筋肉CT，MRI

6
近
臥坐き
竺 竺吉

を用い，ESTの臨床的有用性と比較検討してゆくことが必要と思われる．

4 点
3 一

ぐる ぐ る廻 れ る
手 と 足 を使 っ て環 返 るか や や日 徹 を感 ず る

2 −時 間 を かけ れ ばや っ と寝 返 りが 出 来 る（15秒 〜3 0秒 ）

l 一
0 一

葉 返 り は出 来 ない が横 向 き にな れ る
機 向 き にも な れな い

4 点

四 つ ん這 い で 速 く這 える

3 一
2 −

幸 をついて 四つ人遭 いで遭む が指先 を外方 ない しは後方 に廻 して徐 々に1 う
床 に肘 をつ け て遭 う （四 つん 這 い をと る の に時 間 を要 し諾 うの も 遅い）

1 −

床 に肘 をつ け て遭 お うと す るが 進 め ない （四つ ん這 い 保 持可 、 蓬 えな い 〉

0 ◆全 く；王えな い

4 点

手 を 使 わず に起 き上 が る

3 〝

手 を使 って起 き上 が ろ

2 −
1 ヶ

まず 腹臥 位 と な り起 き上 が る
まず 腹臥 位 と な り起 き上 が るが 長 時間 を要 す （20秒 − 1 分）

〇一

起 き 上 が り不 能

歩行不能となってからの評価法には困難があるが，私達は下肢ADLと同様に，体幹ADLが有用であることを提案したい．体幹に関連した

文

献ADLとしては以下の6項目（∋首のすわり（診坐1）宮武正ほか：Duchenne型進行性筋ジスト

位姿勢を保つ，③ねころぶ，⑥ねがえる，⑤這

ロフィー症の臨床経過：日常生活活動能力

う，⑥起きあがる，である（表2）．試みに国立（ADL）の経年推移．厚生省新薬開発研究

療養所新潟病院でのEST投与群と非投与群の費・低分子酵素阻害物質による難病治療薬

経年変化をしめす（図6）．下肢ADLと同様のの開発研究班会議（江橋址）昭和61年度研検討を行ったが，下肢と同様，EST投与群でやや高値を維持する傾向にある印象をうけ，今後究報告書，1987，p．p．3−97．
2）宮武正ほか：Duchenne型筋ジストロフィー症の臨床的検討：EST投与群5年目の多数例の検討が望まれる．
DMDにおいては各病態に応じて，その病期経過とEST二重盲検試験の出発．厚生省

毎に種々の観点から，薬剤の有用性を臨床的に新薬開発研究費・低分子酵素阻害物質によ

正しく評価していく事が重要と思われた．

る難病治療薬の開発研究，昭和63年度研究報告書，1989，p．p．85−87．
−79−3）宮武正ほか：EST臨床試験，厚生省新薬開apeutic trials based on the natural

history．M＆N，6：91103，1989．

発研究事業．微生物の二次代謝産物に由来
する難病治療薬（E−64）の研究開発址会議

6）石原博幸ほか：EST臨床試験，厚生省新薬（今堀班），昭和60年度研究報告書，1986，

開発研究事業・微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究姓会

p．p．109−121．

4）Dubowitz et

議，昭和60年度研究報告書，1986，p．

al．：Management ofmus−

Cular dystrophy：pharmacological andphysical aspects．Bul1．，36：139−144，
1980．

123．

7）石原博幸ほか：治療薬の効果判定法における問題点．厚生省新薬開発研究費・低分子5）Brooke M．H．et al．：Clinicalinvestiga−

酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究，

tionin Duchenne mucular dystrophy：2

昭和61年度研究報告書，1987，p．p．99−

Determination of the Power of Ther−

103．

−80−

Duehenne型筋ジストロフィー症に対するベスタテン
長期投与の握力に対する影響
村 上 慶 郎＊

研究協力者

岡 崎

隆＊

林

英

人＊

梁

正

淵＊

は じ め に

そこで，私どもは，本院外来を受診した，未Duchenne型筋ジストロフィーに対する原因

治療のDuchenne型筋ジストロフィー症の平均

療法的な薬物はまだ開発されておらず，今回作

握力を測定した．対照となった患者は，4歳児4られた蛋白質分解酵素阻害剤であるべスタテン

例，13歳，15歳，16歳の患者はいずれも5例，などは，筋ジストロフィー症の進行するのを遅5歳，6歳，7歳，8歳，10歳，11歳，12歳，14らせるのが可能かどうか期待されているもので歳の患者はいずれも6例，9歳の患者が7例，計ある．従来からの研究では，CKなどの血清酵素

74例で全て男性であった．測定した側はいずれの変動も年単位の経過の評価にはあまり通さな

も右側の手であった．

いことが判明している．そこで種々の臨床デー

握力計は竹井機器製のデジタル握力計（30kg

タ，特に運動機能，ADL，CT等による筋の画まで測定可能で100g目盛り）を使用して，3回像診断等をこの目的のために用いることが試み

測定し，その最高値を取った（表1）．
Duchenne型筋ジストロフィー症の握力の平られている．
運動機能の中では，徒手筋力テスト，握力，
立ち上がり時間，10m走行時間等がよく用いら

表1

れている．中でも握力は，筋ジストロフィー症
では，手指の筋力かなり末期まで保たれ，歩行

4歳（4例）
5歳（6例）
6歳（6例）
7歳（6例）
8歳（6例）
9歳（7例）

不能になっても測定が可能なため，広く用いられている．これは，前腕及び手指の総合筋力として，前述の如く，比較的末期まで測定可能であり，且測定手技が簡単であるためである．
そこで，今回は握力がベスタテンの長期投与によって影響されるかどうかを検討した．
Duchenne型筋ジストロフィーの握力の経年的変化とベスタチンの効果
日本人の握力の年齢別の正常児の平均についての報告は見られるが，Duchenne型筋ジスト
ロフィー症の年齢別の平均握力については散見するにすぎない．
＊国立療養所箱根病院

Duchenne型筋ジストロフィー症の握力の変動（右）
2．7±2．14
4．8±1．83
5．8±1．40
6．1±2．02
8．2±3．81
8．5±4．12

10歳（6例）
11歳（6例）
12歳（6例）

8．2±3．81

13歳（5例）
14歳（6例）
15歳（5例）

8．2±4．91

16歳（5例）

6．2±5．01−81−

8．5±4．12
8．1±4．30

7．3±4．80
6．5±4．86

即位！kg

−
一

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−

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事寸■
ll

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3

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￣
￣ 虚 1■1 5【￣ 鑓 明 る

図2

図1ベスタナンの使用と握力（3−4歳より開

始群）①

−

O l■

ベスタナンの使用と握力（3−4歳より開

始群）②

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

−

t ▲ ■■

−
7

−

．3

間

図3

図4 ベスタナンの使用と握力（6歳より開始
群）②

ベスタテンの使用と握力（6歳より開始

群）①

−82−

−

均は11歳台で最高となり，以後減少の傾向にあた症例のその後の経過である．

るが個人差も多く，それより高年齢まで増加す

症例：1歳6ケ月で独り立ちの遅れで本院に紹るものもある．

介された．
家族歴では，母親の2人の弟がDuchenne型

次に，3−4歳からベスタナンの使用を始めたグループと6歳頃からベスタテンの使用を始め

筋ジストロフィー死亡している．歩行不能にはたグループとに分け，5〜7年後に，握力がどの

2人とも5−6歳でなっている．1人は本院で18様に変化したかを検討した．べスタテンは1日歳で死亡している．

量150mgを投与した．

臨床経過は，正常満期産，生下時体重は3−4歳で投与を開始した6症例では，症例1，3000g，1歳7か月で1人立ち可能．

2，5，6が対照の握力の平均値より上回ってい来院時の現症は下肢の近位筋の筋力低下著明

た．また1例（症例5）は8歳までは上回っていで，下肢に仮性肥大が著しい．歩行は数歩可能．

たが，9歳で下回った（図1，2）．

体重12kg，血清CKは10830単位．

次に6歳でベスタテンを使用し始めた6例で1歳8ケ月よりベスタテン投与を開始，1歳9は，1例を除いては，いずれも対照を上回らなか

ケ月頃より歩行が可能になった．しかしよく転った（図3，4）．

んだ．

以上，ベスタテンを5〜7年間使用した場合

その後の経過は表2のごとくで，現在は小学3〜4歳で使用開始したものと6歳で使用を始

校2年に在学中．階段は手摺が必要，とはん性

めたものとの握力の変化は前者の方が後者より起立である．

もベスタテンを使用しない対照に比べて，握力は上回っていた．

母親は弟たちに比べて歩行期間が長いと言っている．

なおベスタテンの使用期間中に特別の副作用は認めなかった．

表2

少べスタナン投与後の運動機能，ADLの変
化（1歳8か月より開始）

括投与前

ベスタテン15mg／日を5〜7年間に渡ってベスタナンmg
立ち」かl欄孔け

Duchenne型筋ジストロフィー症に使用して握た与荊6ケ月雉12ナ月1け月 ■裾1．狛】・郁］：射】（那】 て朋 ：朋l T銅
醐）
り

900

，1

600

3＿6

9叩

300

150

闇

150

湖

潮

150

29

2拓

257

283

324

日1

436

552

2

3

6

55

6

75

握力（古川g％′しテル指数力の変動を検討したが，3−4歳から使用開始し

任委kg

垢

粥

垢

2

24

乃

たグループと6歳から使用を開始したグループ
では3−4歳から開始したグループがベスタテ

おわ り にンを使用しない対照に比して，握力の低下は遅べスタナンの6−7年間の長期投与はDu−れる傾向にあった．

chenne型筋ジストロフィー症に対して効果は
1歳8ケ月からベスタテンを使用開始したDu−見られないようであるが，しかし，私どもの早Chenne型筋ジストロフィー症の7年後の経過期からの使用の結果と1歳8ケ月からの使用のについて例から見るとやや進行を遅らしているようにも

次に1歳8ケ月からベスタテンを使用開始し思われる．従来の動物実験の結果等からしても，て，7か年に渡って使用している1例について生後できるだけ早くベスタテンの使用を開始す

述べる．この症例は1昨年の本研究班で発表しれば多少の効果が見られるかも知れない．

−83−Duchenne型筋ジストロフィー症幼児例における運動機能−べスタテン二重盲検例を中心に一
福 山 幸 夫＊

研究協力者

大 沢 真木子＊

斎

藤 加代子＊

平 沢 恭 子＊炭 田 沢 子■

池

中

新

晴

美＊

井

ゆ

み＊

表1 二重盲検登録症例

近年筋ジストロフィー症の診断年齢が低下し，
乳児期診断例も増加してきた．また幼君例を対症 例象とした新薬の治療も試みられている．一方，薬効判定の基準となる自然歴がなく，薬効評価をどのように行うかが1つの課題になっている．
我々は，過去1年間Duchenne型筋ジストロ
フィー症に対するNK421の第ⅠⅠⅠ相二重盲検試
験に参加し，その例に於ける真薬，偽薬の別が今回明らかになったので，投薬後の両群に於ける運動機能変化につき検討した結果を報告し，

G ol代 r S

過 去 の

歩行 開 始

両 足

柊 7

年 齢

S t a 9e

徴候

使用 桂 浜

年 齢

跳 躍

Sta9e
脱 落

開 始 時

時

B

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4 ：1 1

2 ．Ⅰ − 13＋

無2 ：0 0

0

8

日．0

3 ：06

2 ．Ⅰ − 13＋

右1 ：0 60

2 ．Ⅰ − 14

8

D川

3 ：02

2 ．Ⅰ − 15

無1 ：0 60

2 ．Ⅰ 一 1 5

8

Y ．K

2 ：10

2 ．Ⅰ − 13＋

右1 ：0 3

0

1．ト 1

B

T ．S

2 ：00

3． 皿

＋

無

1 ：0 50

2 ．Ⅱ − 1 3

P

H ．K

6 ：0 1

2 ．Ⅰ − 13−

無1 ：0 40

2 ．Ⅰ − 1 4

P

K ．Y

3 ：0 7

2 ．Ⅱ − 15T

無1 ：0 30

2 ．Ⅰ − 1 3

P

H ．H

3 ：00

2 ，Ⅰ − 1 3−

無1 ：6 3

2C錮

1＿ト 1

P

Y ．S

2 ：09

2 ．Ⅰ − 1 3−

無1 ：1 0

0

2 ．1

P

S ．0

2 ：0 73 ▲Ⅲ

右1 ：0 40

2 ，Ⅰ − 1 5

T

T

−15

さらに過去のNK421服用経験例と非経験例の日常動作所要時間についても報告する．

た．

3．結 果
1）ステージの変化：表1に示すごとく治験終A．二重盲検試験
1．対象：表1に示すごとくNK421使用例

了時のステージは，其薬群で低下1／4例，不変

5例，プラシーボ群5例である．新薬の1例は途1／4例，上昇2／4例，偽薬群で順に2／5例，0／5

中で転院のため脱落した．プラシーボ群に含ま

例，3／5例で，両群間に特に差は認められなかっれている両足跳躍2cm可能な例は抗ジストロ

た．

フィン抗体染色にて生検筋が染色されず，Du−

2）日常動作所要時間

Chenne型であることを確認した．

a．10m走行：図1に投与開始後の基礎値か

2．方法：対象例の日常動作所要時間の測定，らの変動を示した．投与開始後の変動幅は偽薬

動作様式の観察，筋力テストおよび血清GOT，

例は−3秒から＋2秒にと小さいが，真薬例の方GPT，CPK測定などを投薬開始前8週間より4は−10秒から1秒の変動を示していた．図2に週毎に投与後52週まで行った．全体の結果は別

変動の平均±SDを示したが，投与開始後12に報告される予定であるので，ここでは日常動

週，および36週から48週では真薬例の方が偽作所要時間についてのみ述べる．

薬群よりも所要時間がより短縮している．
b．床からの立ち上がり時間

日常動作所要時間は投薬開始以前の値で最も同様に投与開始後の所要時間の変化を図3に短いものを基礎値とし，その値からの変動を見示した．真薬投与例では投与開始後の所要時間＊東京女子医科大学小児科の変動は一定の傾向を示さなかった．平均±SD−84−

・200−
L土．・．上皇．・．＿⊥ユ＿ヱ＿＿ユ」

0

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8

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20

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28

32

36

40

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48

▲・

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」

■｛l

図3 床からの立ち上り所要時間の投与開始後
の変化

52

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図110m走行所要時間の投与開始後の変化（破線はプラシーボ例，実線はベスタナ
ン投与例）

′

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ン
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140；AA；da：rl

図2

図4 床からの立ち上り所要時間の投与開始後の変化（平均±SD）．（実線はベスタテ
ン，破線はプラシーボ）

10m走行所要時間の投与開始後の変化（平均±SDの範囲を示す）．（破線はプ
ラシーボ例，実線はベスタチン投与例）

でみると図4のようになり，投与開始後28週の同不能，6例が可能であった．前者を典型例，後時点で真薬例の所要時間の方が短い傾向を示し者を良性例として扱った．これらの症例を過去たが，他の時点では所要時間はむしろ真薬例ののベスタナン投与歴の有無で分け，測定した10方でより延長する傾向を示していた．

m走行所要時間および床からの立ち上がり時
間を歴年齢半年毎に抽出し平均±標準偏差を計

B．Duchenne型筋ジストロフィー症に於ける算した．

日常動作所要時間

2．結果（表2）

1．対象並びに方法：対象は東京女子医大小

1）10m走行所要時間

児科を1974年以降1989年12月までに受診し，表2に示すごとく，Duchenne型典型例では510m走行時間，床からの立ち上がり時間を測定

歳時に最も短く，これはベスタナン使用例も非したことのある rいわゆるDuchenne型筋ジス

使用例も差がなかった．これに対し良性例ではトロフィー症Jの症例計32例である．これらの7歳時に黄も短い傾向を示した．
また，10m走行が息児なりに明らかに遅くな

例の同動作観察年齢は症例ごとに異るが1歳かり始める年齢は，典型例では7歳，良性例では

ら10歳6カ月に及ぶ．
これらの症例を両足跳躍の可否（高さ5cm

10歳であった．

の箱を飛び越えられるか否か），頸部の前屈筋の2）起立所要時間

筋力が3以上あるか否かで検討すると，26例がDuchenne型典型例では4，5歳時で最も短−85−

表2 年齢別各動作所要時間の平均
た己

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l lOm走行慧新年紅塵轟ヒ■口軍隊「第㍍rr】：；；曇…‡十憲二蔦監仁一
13）川）

L27＝1，70日り

4貞6カ月斥芸等

lII

十十∴．．
i柑心ト．柑鮎い笥±柑ll￣l￣￣1川
2．ユ＿＿UL＿＿＿

く，これはベスタテン使用例も非使用例も差がおける基礎値を求め報告し，最も誘発しやすいなかった．これに対し良性例では6，7歳時に最日常動作は10m走行，起立動作であり同所要も短い傾向を示した．

時間測定が最も有効であろうと報告した．そのまた，床からの立ちあがりが明らかに困難になり始める年齢は，典型例では6歳半−7歳で，結果をふまえて今回は10m走行，起立動作を検討した．

何か物に掴まらなければ立ちあがれなくなるの2重盲検試験の結果では，ベスタナン使用例

が7歳6か月で1例，8歳で1例，8歳6か月でと非使用例で10m走行では前者の方が所要時

5例，9歳で3例，9歳6か月で1例で，それ以間が短縮する傾向にあったが，起立所要時間は降可能な例は1例もない．ベスタテン非使用例

むしろ後者の方が良い傾向を示しベスタテンがの例数が少ないので比較はできないが，使用例，

有効とはいえなかった．起立動作と10m走行

非使用例の間に特に差は認められなかった．

では前者で使用する筋は主に躯幹の筋であり，良性例では8歳頃より立ち上がりが困難にな

後者よりは本症患児にとってより早期に困雉とりはじめるが，10歳過ぎた現在でも可能な例もなる動作である．したがってあまり進行の進んある．

でいない筋に対しては一時的に有効であるとい

3．考 察

うことは否定できない．＿

Duchenne型筋ジストロフィー症は，生下時

過去にベスタナンを服用したことのある例とからすでに発病しているが，その後遅れながら非使用例において，10m走行，床からの立ち上も発達し運動機能を獲得し6歳頃から機能低下

がり時間を見たが特定の傾向は認められなかっが目だってくるといわれてきた．しかしながらた．しかしながら10m走行所要時間と，床から近年，新薬開発が進み，より幼若児において治の立ち上がり所要時間が最も短い年齢は前者が療が行なわれるようになると，それらの症例に5歳，後者が3−4歳と臭っており，今後治療効

おいて薬効を短期間に判定するための詳細な基
礎データーがないことが問題となってきた．

果を見る時には運動の種類と年齢を考慮する必昨年我々は，これら治験で使用される日常動際などに比較データーとして使用することがで作所要時間と動作様式発達パターンの正常児に要がある．今回集積したデーターは今後治療のきると思われる．

−86−Duchenne型筋ジストロフィーに対するべスタテンの効果に関する研究
一年少児及び年長児に対する二重盲検試験の比較一
木 下 真 男＊研究協力者

里 吉 栄二郎＊＊ 村 上 慶 郎＊＊＊
福 山 幸 夫† 西 谷裕††Duchenne型筋ジストロフィーに対するベス

三吉野 産 治＊＊H
高 橋 桂 一†††方法

タテンの効果を研究する動きは，臨床試験とし対象は3歳以下，3〜5歳の二群で，独歩可能ては既に昭和56年1）から行われており，全国規

なDuchenne型筋ジストロフィー診断確定者．

模でのオープン試験を経て，昨年度から二重盲

被検薬はベスタナンドライシロップ1日1回

検試験を行った．参加施設は表1に示す通りで，50mg内服．対照薬はマンニトール，投与期間は

症例は3歳以下，3−5歳の二群に層別し，以下52週間．

の方法で実施した．

効果判定には図1に示すような観察項目を用い，それぞれの項目について経時的変化を調べた．また副作用についても同図左側に示すよう

表1 参加施設な観察を行った．

国立京菜所八雲病院

国立硬養所刀亀山病院

北海道杜全事業協会帯広病院

国立療養所西京良病院

国立肩養所西多賀病院

神戸市立中央市民病院

国立療養所岩木病院

鳥取大学医学部

国立療養所持根病院

国立便箋所原病院

国立精神神技センター

国立栄養所徳島病院

東邦大学医学部大橋病院

高知医科大学

東京郁立神技病院

高知県立子鹿園

東京女子医事斗大学

国立凍寒所西別府病院

時間（図2），GOT（図4），CPK（図5）の変化

国立簾養所鈴鹿病院

福岡大学医学部において実薬群で有意に改善の成績を示した．

浜松医村大学措同市立子供病院

福井医科大学

久留米大学医学部

全体としては表3に示すように若年群の総合改

岡崎市立岡崎病院

熊本大学医学部

善度が，実薬61％，プラセボ44％と芙薬群で名古屋市立東市民病院

大分医科大字より改善を示す例が多かった．しかし推計学的

国立療養所兵庫中央病院

国立療某所沖縄病引亮

国立療養所宇多野病院

成績

対象とした症例は表2に示す通りで，最終的には計101例に対して治験を行った．
図2以下に成績の主なものを示すが，それらのうち，分散分析の結果では若年群の階段昇り（以上31施設）には有意でなかった．
考按

べスタチンの本症に対する効果としては，前＊東邦大学医学部大橋病院＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊国立療養所箱根病院■＊＊＊国立療養所西別府病院†東京女子医科大学小児科††国立療養所宇多野病院†††国立療養所兵庫中央病院

回のオープントライアルでも，5歳未満の息児において階段昇降姿勢，頚筋，股関節筋などの筋力の改善を認め，また20m直進歩行．階段昇降，仰臥位から起坐までの時間などの短縮を認−87−

lt●りl●■＿t■It●−●●l T■ ■tlr■l●′■■f■●ヽ・′■∫▼l■○■｝lエ◆ ●◆■〜，
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図1 経過観察表

表2 対象症例効1割定線外完全除外症例効】HH定■外王由①＋年齢g■① 独歩不能① 早期艶話（》 瓜11不足
完全臓外1由q）1線後、転院等により
兼良廿で

2

4

6

8

10

12

14

図2 若年者群，階段昇り時間・実線（実薬群）の方が点線（プラセポ群）より時間が有意に短縮している．

2

4

6

8

10

12

2

14

4

6

8

10

12

14

図6 同CPK，全体として有意差はないが（一部で有意・），全体として実薬群が低値の傾向にある．

図3 階段降り時間，全体としては有意差はな
いが，芙薬群が短縮傾向にある．

表3 総合改善度

層

別

つt

銅

名

改

善

軽度
改さ

不

変

q t
f 化

悪

化

計

改善 率

よし

（＞軽 改）汁置

Hl −12 1

1円

l 】∩

8 円

l例

○桝

2 3 桝

6 1 ％

††ll

0 桝

1 1 桝

1 2 桝

：∩

○桝

2 5 円

l l ヽ

＝ ・121

l ll■

7 円

1 3 椚

】■

2■

2 6桝

1 1 ヽ

′うり

0 円

1 0 円

1 3 鋼

3 円

ln

ご T ll

】7 ヽ

以下

1 −−

l．S＿

5 轟

2

図4

4

6

8

10

12

l．S．

14

同血清GOT，全体として実薬群の方が低値を示している．

の結果，僅かに幾つかの項目で若年児群で本剤がプラセポに勝る結果を得た．しかし，その効
果は部分的であり，疾患治療薬としての意義を認めてまでには至らないように考えることができる．また副作用については表4に示す通りで，本剤の安全性には全く問題はないと考えられた．

0
4
0
2

ベスタチンについては10年を越す治験活動00が行われてきたが，今回の二重盲検試験を以っ

0
8て一応の終結とすることが妥当と考えるに至っ

0
6

た．
結
2

図5

4

6

8

10

12

14

語

1．3歳未満．3−5歳の二群について，Duchenne型筋ジストロフィーに対するベスタテンの効

同CPK，同様に実薬群が低値を示している．

果を二重盲検法により比較した．
2．若年者群において，階段昇り時間，血清めた2）．このことから本剤が若年息児ほど効果

GOT，CPKの年間推移がベスタチン群の息を示す可能性を考えて，今回は更に若年とし，児で良好な成績が得られた．

3歳未満，4−5歳児に分けて治験を行った．そ3．総合改善度についても，若年者群でベスタ

−89−

った．

表4 副作用症状
薬剤 名

症例 番 号症

状

兎現 率

6．Ducheene型筋ジストロフィーの治療剤とズー一検 定して，本剤が高い有用性を有するという成績
N K 4 2 1

3 3

嘔吐

3 9

嘔 吐 ・軟 便 ・腹 痛

6 4

屯気

6 5

発疹

7 5

屯 吐 ・下 痢 ・発 熱7 8

唱 吐 ・下 痢

1 0 6

プラセ ポ

は得られなかった．

嘔 吐 ・下 痢

7 4

皮膚掻 痺惑

7 6

嘔 吐 ・下 痢 ・発 熱

7 7

下 痢 ・食 欲 不 振

8 4

口 角 炎 ・発 疹

献1）木下真男，川崎研一，山田信行，亀井敢行：

下痢

2 3

文

1 2 ％

筋障害に対するベスタテン・ロイぺプテン

N ． S ．

の影響一実験的及び臨床的研究，厚生省新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来する難病治療剤（ロイペプチン）の開発

9 ％研究，昭和56年度研究報告書，1982，p．p．
77−83．

2）木下真男，豊吉栄二郎，福山幸夫，三吉野
テン群が良好な成績を示したが，推計学的に

産治，村上慶郎：Duchenne型進行性筋ジ有意な差には至らなかった．

ストロフィーに対するベスタテンの効果．

4．本剤が若年者の方に有効である可能性が示

厚生省新薬開発研究費，低分子酵素阻害物
質による雉病治療薬の開発研究，昭和61年

唆された．
5．本剤に起因すると考えられる副作用はなか−90−

度研究報告書，1987，p．p．127−133．

分担研究者一覧

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班・班月名簿
氏

名

所

属

所

在

地

電

話

番

号

岡崎国立共同研究機構
生理学研究所

444 岡崎市明大寺西郷中38

幹事 青柳 高明微生物化学研究所
酵素研究部

141品川区上大崎3−14−23

03−441−4173

幹事 木下 真男

東邦大学医学部大橋病院
第四内科

153 目黒区大橋2−17−6

03−468−1251

幹事 勝沼 信彦

徳島大学酵素科学研究センター 770 徳島市蔵本町3−18−15

珪長 江橋 節郎

0564−53−7345（直）0886−31−3111

内2550

東京慈恵会医科大学
第二薬理学教室

105 港区西新橋3−25−8

運営 杉田 秀夫
幹事

国立精神・神経センター
神経研究所

187 小平市小川東町4−1−1

班月 丸山 工作千葉大学理学部生物学科

260 千葉市弥生町1−33

監事 福原 武彦

03−433−1111

内2255
0423−41−2711

内5101
0472−51−1111

内2622

珪眉 大倉 洋甫

九州大学薬学部
薬品分析化学教主

812 福岡市東区馬出3一ト1

092−641−1151

班眉 辻

和歌山県立医科大学
第二生理学教室

640 和歌山市9番丁90734−31−2151

班長 福山 幸夫

東京女子医科大学
小児科教主

162 新宿区河田町8−103−353−8111

珪眉 三吉野産治

国立療養所西別府病院

874 別府市大字鶴見4548

0977−24−1221

珪眉 村上 慶郎

国立療養所箱根病院

250 小田原市風祭412

0465−22−3196

姓眉 鈴木 紘一東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報研究部

113 文京区本駒込3−18−22

03−823−2101

班眉 川島 誠一

東京都老人総合研究所
生化学部臨床第一研究室

173 板橋区栄町35−2

03−964−1131

班員 向山 光昭

東京理科大学
理学部化学教室

162 新宿区神楽坂1−3

03−260−4271

大正製薬㈱ 総合研究所

330 大宮市吉野町1−403

繁勝

班眉 大関 正弘

内6151
内319

内3068
内268
0486−63−1111

内351

珪月 矢崎 義雄 東京大学医学部第三内科

113 文京区本郷7−3−1

03−815−5411

内8274，8278
班長 宮武

正 新潟大学脳研究所神経内科

951新潟市旭町通一番町757

0252−23−6161

内5180

班月 石原 博幸 国立療養所東埼玉病院
第三内科

349−01蓮田市大字黒浜4147

0487−68−1161

班月 西谷

裕 国立療養所宇多野病院

616 京都市右京区
鳴滝音戸山町8075−461−5121

姓月 高橋

桂一 国立療養所兵庫中央病院

669−13 三田市大原1314

07956−3−2121

址月 中野

今治 東京大学医学部脳研病理

113 文京区本郷7−3−1

03−815−5411

班月 春原

経彦 国立精神・神経センター
武蔵病院放射線診療部

187 小平市小川東町4−ト1

0423−4ト2711

址友 石井

靖男 日本化薬味式会社

102 千代田区富士見町1−11−2

03−237−5154

珪友 岩城

正広 鳥居薬品株式会社

272 市川市南八幡3−14−3

0473−78−4121

顧問 今堀

和友 三菱化成生命科学研究所

194 町田市南大谷110427−26−1211−93−