バイオリサーチセンター株式会社

組織透明化サンプル用の 3D 高速分子ラベリング技術
西1尾将

人

は じ め に今日に至るまで組織観察の手法は，顕微鏡性能の向上や，トランスジェニックのように遺伝子操作を用い特定の部位に蛍光タンパク質（ GFP, RFP など）を導入する技術によって飛躍的に発展し，日増しに鮮明な組織内部のイメージを正確に捉えることが可能になっている。
特に 2 光子や多光子顕微鏡の登場は，今まで捉えることができなかった深部のイメージを局所的に映し出すツールとして汎用されている。しかし，従来の組織観察
では，組織全体を立体的・多角的に捉えることが難しい。
2 光子や多光子顕微鏡といえども組織の深さ 1 mm 程度しか光が届かないことから，これまでの組織観察では組織を薄くスライスし，各スライスの顕微鏡画像を重ね合わせて 1 枚の立体的な画像を取得するのが一般的である。そのため，断片的な画像をパズルのように張り合わせることから血管，神経のつなぎ目を正確に捉えることが困難であった。その点において，組織全体を透明化する技術は，組織観察の常識を超える発明であった。理化学研究所のグループが樹立した Sca/e1)やウイーン大学が発明した 3DISCO2)，は世の中に組織透明化技術を知らしめるきっかけとなった。マウス全脳の組織を特定の試薬に浸け込むことで丸ごと透明化し，組織全体の蛍光イメージングを成功させた事例（図 1）は神経科学分野に鮮烈な印象を与えた。
組織透明化により，2 光子顕微鏡の光がマウス全脳表

図1

ａ と透明化サンプルのイメージング
マウス透明化全脳 ｂ
画像 層から 5 mm の深部まで届くようになった。さらに，巨ａ CLARITY 法によって透明化処理したマウス全脳。
大分子の抗体を用いる免疫染色（組織 3D イメージング）

ｂ パルブアルブミンに YFP タグしたマウス透明化脳半
球のライトシート顕微鏡画像。の技術が飛躍する第一歩として， 2019 年マサチュー
セッツ工科大学のグループは eFLASH5)と呼ばれる新規高速免疫染色技術を提案した。本稿ではこの eFLASH体分子が組織の深部までアクセスすることが困難である法と，この技術を搭載する LifeCanvas Technologies 社ためである。また，スライス切片でなければ顕微鏡の光の高速免疫染色システム SmartLabel について紹介する。

が細部まで届かないという問題があった。透明化手法の2

従来の組織免疫染色樹立により，2 光子顕微鏡を用いて，あらかじめGCaMP6 を発現させたマウスの透明化全脳の表層から 5摘出した組織を免疫染色する場合，パラホルムアルデ

mm 以上の神経細胞の可視化を行なえるにようになっヒド（PFA）等で固定し，その組織を数 10 nm オーダー

た3)。この報告例は，トランスジェニック技術と組織透に薄くスライスすることが一般的である。この理由は抗明化技術を融合すれば，組織のスライス切片を作成する

168

ぶんせき  

ことなく全組織での 3D イメージングが可能であること

免疫染色の早さと均一性を克服するものと期待される。

を示している。組織透明化手法は，組織と浸潤させる溶

この方法は組織に対して電気泳動を印加し，その推進力液の屈折率を同程度にすることによって，視覚的に組織を利用して抗体を組織内部へ強制的に移動させることがを透明に見せている。そのため，この溶液の浸潤性が組できる。電気泳動を行うことによって，従来の浸透法で織を透明にするために重要であると考えられている。こは長期間必要であった染色時間がおよそ 24 時間に短縮の浸潤性に大きく寄与しているのが，組織透明化工程のされた（図 2)5)8)。この電気泳動を用いて組織の深部へ一つである組織の脱脂であり，東京大学のグループが開抗体分子を効率的にアクセスするためにはドデシル硫酸発した CUBIC3)やスタンフォード大学の Kwanfun らがナトリウム（SDS）のようなイオン性界面活性剤の存在樹立した CLARITY4)が存在する。有機溶剤や界面活性が不可欠である。しかし， SDS 分子は，抗原抗体反応剤を用いることで組織の細胞膜や脂肪組織を穏やかに除を阻害する効果があることが一般的に知られているた去することができる。この脱脂の効果は組織の免疫染色め，通常の SDS PAGE ように SDS 分子を移動媒体と効率にも影響を与えるものと推察できる。免疫染色で一して利用することが難しい。上記の理由から，般的に用いられる IgG 抗体は分子量 150 万ほどの巨大eFLASH 法では陰イオン性界面活性剤であるデオキシ分子である。通常の組織では細胞膜を持つため，抗体はコール酸ナトリウム（ NaDC ）を採用している。 NaDC細胞内部へアクセスすることができない。しかし，透明は pH 依存的に抗体との親和性が変化する性質を有して化組織であれば抗体が組織深部へアクセスすることが容易である。そのため抗体染色を行い，透明化組織を観察する事例が近年報告されている6)7)。一方，透明化した全組織に対する抗体染色には二つの課題が示唆されている。一つは染色に必要な時間である。細胞膜を取り除いた組織といえどもマウスの全脳サイズで抗体が組織深部へ浸透する時間はおよそ 2 週間から 1 か月程度必要である。もう一方は，組織表層と深部における抗体濃度の不均一性である。深部の抗体量が極端に少なく，表層の抗体量が多く存在することになり，バックグラウンド蛍光を生みだすことが懸念されている。このような課題を一度に解決できる方法として提案されたのが 2019 年にYun ら が 報 告 し た 電 気 泳 動 を 用 い て 抗 体 染 色 を 行 う
eFLASH 法5)である。

33･ 1

電気泳動技術を応用する新規免疫染色方法

図2

浸透法と電気泳動の染色効率の比較

eFLASH

免疫染 色は ，核染 色試薬 である Syto16 （ 488 nm ）とeFLASH 法の原理

Histon 3 タン パク質 を抗 原と する anti H3 標識 抗体ａ浸（ 594 nm ）を用いて 24 時間染色工程を実施した。
ｂ 電気泳動法。
透法 eFLASH 法は，全組織に対する免疫染色において，

図3

eFLASH 法の抗体染色の原理5)
陰イオン性界面活性剤である NaDC の pH 依存的な抗体との親和性変化を利用することによって，組織全体に抗体分子を拡散させる。pH の制御は反応液に含まれる d Sorbitol の電気分解によるギ酸の生成によって行われる。※Kwanfhun らの 2019 年の論文の図を引用しました。

ぶんせき  169いる（図 3 ）。高 pH 下では抗体と強くミセルを形成すジングの品質性を向上させる役割を担う。 SmartLabelるのに対して，中性 pH 下ではその親和性が大きく低下の構造は，灌流チャンバーと灌流溶液を入れるポート，する。この性質を利用するために eFLASH 法におけるまた内部には冷却ファンが搭載されている。灌流チャン反応溶液には， NaDC のほかに糖の一種である d Sor-バーには左右に電極が配置されており，その中央部分にbitol が含まれている。 d Sorbitol は電気泳動中に電気組織を保持するためのサンプルカップを置くことができかん分解を起こし，ギ酸に変化する。これにより溶液の pHる。このサンプルカップは半透膜で区切られており，半を意図的に下げることが可能になる。そのため，この電透膜で区切られた内部にサンプルと抗体，反応溶液を入気泳動中の溶液の pH 変化を利用することによって，電れることになる。半透膜で区切ることによって，電気泳気泳動初期では抗体が組織中の抗原とは反応せず抗体が動による抗体分子の移動が半透膜内に限られる。抗体の組織全体に拡散される。電気泳動終期では，組織全体に均一性を確保するためにサンプルカップの底面にはス拡散された抗体が抗原と反応するようになる。つまり，ターラーバーが置かれている。灌流チャンバーにはマグ

全組織の高速かつ均一性の高い免疫染色が実現できる。

ネティックスターラーが内蔵しているため，抗体反応溶実際， eFLASH 法を利用することによって均一性の高液を常時撹拌することができる。また，灌流チャンバー

い免疫染色結果が得られている5)。次の章では，この全にはサンプルカップを回転する機構も備えており，電気組織に対して有効な新規免疫染色方法を活用したシステ泳動の電子線が組織に部分的に暴露されることを防ぐ。

ムの紹介をする。

すなわちサンプルが回転することで染色のムラを抑えるかくはんことが可能になる。電気泳動に伴う強力な発熱もピエゾ
3･2

高速免疫染色システム SmartLabel について

LifeCanvas Technologies 社 の SmartLabel 高 速 免 疫

素子の冷却ファンを利用することで安定した温度制御が実現している。

染色システム（図 4 ）は， Kwanfhun らが 2019 年に発表した eFLASH 法に基づき開発された。LifeCanvas 社

3･3は組織透明化に必要な工程を網羅できるように製品を取り揃えている。その中でも SmartLabel は， 3D イメー

SmartLabel によって染色した透明化組織の観察
このような eFLASH 技術に基づく SmartLabel シス
テムによって，標識抗体やタンパク質，核染色分子と

図5
図4ａ と内部構造 ｂ
SmartLabel システム外観 ａ SmartLabel 本体とタッチパネル制御モジュール。
ｂ

2 ch 灌流チャンバーとリザーバーポート。
170

SmartLabel で染色したマウス透明化脳半球のライトシート顕微鏡画像
ａ 核染色である Syto16 （ 488 nm ）を用いて細胞核を染
ｂ Alexa594 を標識した anti TH（594 nm）を色した。
用いて，Gaba ニューロンを染色した。

ぶんせき  テクノロジーとライトシート顕微鏡の技術が合わさることで全組織のまま空間分解能の高いイメージングデータが得られることが期待される。組織透明化技術は，いまだ発展途上の部分が多い。通常行われるスライス切片での免疫染色とは異なり，透明化組織はその抗原性が異なることが示唆されている。そのため，使用できる抗体のライブラリー作成や組織の新たな固定方法の確立が急務であると考えられる。当社では，これから全組織イメージングの需要が高まっていく中で研究者に提供できるような有用なデータベースを構築していく所存である。
文
図6

献

マウス透明化全脳における c fos タンパク質の染色1) H. Hama, H. Kurokawa, H. Kawano, R. Ando,T. Shimogori,H. Noda, K. Fukami,A. Sakaue Sawano, A. Miyawaki :anti c fos 抗体と Alexa 標識二次抗体（ 594 nm ）を用いて SmartLabel でマウス透明化全脳にタグした。

2) A. Ert äurk, K. Becker, N. Jahrling, CP. Mauch, CD. Hojer,

Nat. Neurosci, 14, 1481 (2011).

JG. Egen, F. Hellal, F. Bradke, M. Sheng, HU. Dodt : Nat.
Protoc, 11, 1983 (2012).

いった様々な分子に適用することができる。 LifeCan-3) K. Tainaka, S. I. Kubota, T. Q. Suyama, E. A. Susaki, D.
Perrin, M. Ukai Tadenuma, H. Ukai, H. R. Ueda : Cell,vas Technologies 社では独自で開発したライトシート

159, 911 (2014).

顕微鏡 SmartSPIM を取り扱っている。ライトシート顕4) K. Chung, J. Wallace, SY. Kim, S. Kalyanasundaram, AS.

微鏡とは，励起光をサンプル面に対してシート状に当Andalman, TJ. Davidson, JJ. Mirzabekov, KA. Zalocusky, J.
Mattis,て，蛍光を取得することができる顕微鏡である。このよAK.

Denisin,S.

Pak,H.

Bernstein,C.

うな顕微鏡を活用することで全組織の 3D イメージング

Ramakrishnan, L. Grosenick, V. Gradinaru, K. Deisseroth :Nature, 497, 332 (2013).のデータ品質を飛躍させることができる。図 5 は，

5) D. H. Yun, Y G. Park, J. H. Cho, L. Kamentsky, NB.

SmartLabel を用いてマウスの透明化脳半球に細胞核をEvans, A. Albanese, K. Xie, J. Swaney, C. H. Sohn, Y. Tian,

染める Syto16 と GABA ニューロンと特異的に結合す

Q. Zhang, G. Drummond, W. Guan, N. DiNapoli, H. Choi,H Y. Jung, L. Ruelas, G. Feng, K. Chung : bioRxiv, (2019).

る anti Tyrosine Hydroxylase ( anti TH ）を利用して得られたイメージングデータである。両方の染色試薬で

6) E. Lee, J. Choi, Y. Jo, J. Y. Kim, Y. J. Jang, H. M. Lee, S. Y.
Kim, H J. Lee, K. Cho, N. Jung, E. M. Hur, S. J. Jeong, C.
Moon, Y. Choe, I. J. Rhyu, H. Kim, W. Sun : Sci Rep, 6,18631 (2015).

表層から深部に至るまで特定の細胞が染まっていることが示されている。また，直前の神経細胞の活動をモニターしているとして，注目を集めている c Fos タンパ7) K. Tainaka, T. C. Murakami, E. A. Susaki, C. Shimizu, R.
Saito, K. Takahashi, A. Hayashi Takagi, H. Sekiya, Y.

ク質の検出のため，マウスの透明化全脳に anti c fosArima, S. Nojima, M. Ikemura, T. Ushiku, Y. Shimizu, M.

抗体を導入した結果を図 6 に示した。このことは，細Murakami, K. F. Tanaka, M. Iino, H. Kasai, T. Sasaoka, K.

胞の成熟期や活動期の初期にしか発現しないようなバイ

Kobayashi, K. Miyazono, E. Morii, T. Isa, M. Fukayama, A.
Kakita, H. R. Ueda : Cell Rep, 24, 2196 (2018).

オマーカーに対しても SmartLabel システムが有効であ

8) S Y. Kim, J. H. Cho, E. Murray, N. Bakh, H. Choi, K. Ohn,ることを示している。

L. Ruelas, A. Hubbert, M. McCue, S. L. Vassallo, P. J.
Keller, K. Chung : PNAS, 11, E6274.

4お わ り に西尾将人（Masato NISHIO）

高速免疫染色システム SmartLabel は，電気泳動を利用する新規免疫染色方法 eFLASH の原理をベースとしバイオリサーチセンター株式会社（〒1010032 東京都千代田区岩本町 1 7 1 瀬木ビル 2F）。東京薬科大学大学院薬学研究科ている。組織全体に電気泳動を印加することで抗体分子薬学専攻博士後期課程修了。博士（薬学）。

を高速に組織深部内へ送ることができる。また，NaDC≪趣味≫水泳・オープンウォーター。と抗体との親和性を pH 制御することで抗体が組織全体E mail : nishio＠brck.co.jpに均一に分布させることを可能にしている。このようなぶんせき 
 

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+//////////////////////////////////////////////,
2
1 バイオリサーチセンター株式会社企業HP：
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1
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1 http://www.brck.co.jp
2
1
2
1
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1 バイオリサーチセンター株式会社 SmartLabel 製品ページ：
21
https://product.brck.co.jp/index.php/maker/l/lifecanvastechnologies/smartlabel
21-0000000000000000000000000000000000000000000000 .

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２：〔E mail : infopacd.jp〕◯
３ ：〒558 8585 大阪市住吉区杉本 3 3 138 大阪市◯
立大学大学院工学研究科  幸一〔TEL・FAX :0666053080，Email : tsuji＠achem.eng.osaka
cu.ac.jp〕
４ ： 中 村 洋 〔 TEL : 03 3490 3351 ， E mail :◯nakamura＠jsac.or.jp〕
５ ：〒102 8554 東京都千代田区紀尾井町 7 1 上智◯
大学理工学部物質生命理工学科分析化学研究室内〔 TEL ： 03 3238 3370 ， FAX ： 03 3238 3361 ，E mail : ta hayas＠sophia.ac.jp〕
６ ：〒 263 8522 千葉市稲毛区弥生町 1 33 千葉大◯
学共用機器センター 桝 飛雄真〔TEL : 043 290 3810，E mail : masu＠faculty.chiba u.jp〕
７ ：〒560 0043 大阪府豊中市待兼山町 1 1 大阪大◯学大学院理学研究科化学専攻分析化学研究室 塚
原 聡 〔 TEL : 06 6850 5411 ， E mail : sxt ＠chem.sci.osaka u.ac.jp〕
８ ：〒599 8531 大阪府堺市中区学園町 1 1 大阪府◯
立大学大学院工学研究科 久本秀明〔 TEL : 072 254 9285 ， E mail : hisamoto ＠ chem.osakafu u.
ac.jp〕

172

９ ：〒501 1196 岐阜市大学西 1 25 4 岐阜薬科大◯学機能分子学大講座薬品分析化学研究室 江坂幸
宏〔 TEL : 058 230 8100 （内線 3640 ）， E mail :esaka＠gifu pu.ac.jp〕
10 ：〒 780 8520 高知市曙町 2 5 1 高知大学教育◯
研究部総合科学系複合領域科学部門〔 TEL : 088 844 8306，E mail : IC＠jsac.jp〕
11 ：〒 470 0392 豊田市八草町八千草 1247 愛知工◯業大学工学部応用化学科 村上博哉〔TEL : 0565 48 8121，E mail : jafia＠aitech.ac.jp〕
12 ：〒 192 ◯0392 八王子市堀之内 1432 1 東京薬科大学生命科学部 熊田英峰〔 E mail : kumata ＠ ls.
toyaku.ac.jp〕
13 ：〒 120 ◯8551 東京都足立区千住旭町 5 東京電機
大学工学部環境化学科内 保倉明子〔 TEL : 03 5284 5445，E mail : kigen＠jsac.jp〕
14 ：〒 259 1293 平塚市土屋 2946 神奈川大学理学◯部 西本研究室〔 TEL : 0463 59 4111 ， E mail :y24moto＠kanagawa u.ac.jp〕
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16 ：〒 950 2181 新潟市西区五十嵐 2 の町 8050 新◯
潟大学教育研究院自然科学系 梅林泰宏〔 TEL :025 262 6265 ， E mail : yumescc ＠ chem.sc.
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ぶんせき  