技術紹介

一般財団法人雑賀技術研究所

LC-MS/MS による食物アレルゲン検査方法
─標準物質「食物由来アレルゲン抽出物 TM」のご紹介─

稲 垣

江 梨，冨 上香 澄，山 下賀容子

1 は じ め にMS/MS の質量分析部に悪影響を及ぼす恐れがある．食

食物を摂取等した際，食物に含まれる原因物質（アレて，適した標準物質が見当たらないことが課題であっルゲン：主としてタンパク質）を異物として認識し，自物アレルゲン検査に LC-MS/MS 法を適用するにあたった．

分の身体を防御するために過敏な反応を起こすことがあ

そこで，雑賀技術研究所では「総タンパク質を含有しる．これを食物アレルギーという．アレルギー患者の健ながら質量分析計で使用可能な標準物質」を開発し，製康危害防止の観点から，食品表示法により，食物アレル品化した．本稿では，標準物質の特長及びこの標準物質

ゲンを含む食品にはアレルゲンを含む旨の表示が定めらを用いた食物アレルゲン検査方法について紹介する．

れている．食物アレルギーを発症する食品のうち，症例が多いものや重篤なものについては「特定原材料」とさ2 標準物質「食物由来アレルゲン抽出物TM」れ，アレルギー表示が義務付けられている．また，一定分析条件の検討や食品への添加試験を経て，総タンパの頻度で健康被害がみられたものについては「特定原材

ク質の定量検査を実施できるようにするには，特定のタ料に準ずるもの」とされ，アレルギー表示が推奨されてンパク質ではなく総タンパク質を含み，LC-MS/MS でいる．

使用可能な標準物質が必要である．これを可能にするた

食物アレルゲン検査方法は，消費者庁通知法（以下通め，標準物質を開発するにあたり，標準粉末から相間移知法という）1）により定量検査法として ELISA 法が，定2）を用いてタンパク質抽出するアプロー
動溶解剤（PTS）性検査法として PCR 法やウエスタンブロット法が指定されている．これらの検査方法は，アレルゲンごとにそチを検討した．その詳細を解説する．
図 1 に標準物質の調製方法を示す．材料となる標準れぞれ個別に検査を行う必要がある．例えば，ELISA粉末は，通知法別添 3 標準品規格を参考に調製した．

法による検査においては，卵であれば卵用の ELISA

例えば卵の場合 , 白色レグホン種の卵殻を外して均一にを実施する．また，検査の妨害物質を含む食品や偽陽性タンパク質抽出には，PTS を用いた．PTS はタンパを示す食品は，正しい結果を得られない場合がある．

ク質可溶化能に優れており，疎水性の高いタンパク質でキット，小麦であれば小麦用の ELISA キットにて検査

ホモジナイズ後 , 凍結乾燥し，乾燥物を微粉砕した．

そこで近年，選択性が高く，複数アレルゲンを検査であっても親水性タンパク質と同等に抽出できる．また，きる LC-MS/MS を用いた手法が注目されている．雑賀PTS は界面活性剤であるが，酸性条件下で有機溶媒を技術研究所は，長年，LC-MS/MS 等を用い残留農薬検用いた液々分配により除去できるために，LC-MS/MS査サービスに携わり，食の安全に貢献してきた．現在の質量分析部に悪影響を与えない．

は，残留農薬で培った技術を活かし，LC-MS/MS を用

弊所では，上記のように調製した標準物質を既に「食いた食物アレルゲン検査方法（以下「LC-MS/MS 法」

物由来アレルゲン抽出物TM」として販売しており，そのという）の開発に取り組んでいる．定量検査には標準物質が必要であり，一般に市販されている標準物質は，カゼインやアルブミン等の特定のタンパク質のみが含有されている．一方，通知法別添「アレルギーを含む食品に関する表示」には，「標準タンパク質は特定のタンパク質や抗原性を持つタンパク質ではなく，なるべくすべてのタンパク質を含んでいることが望ましい」と記載されている．また，通知法に記載されている ELISA 法用の標準物質では，界面活性剤が含有されているため，LCぶんせき 2023 11

図1標準物質の調製

501

はじめに，フードプロセッサー等で食品を粉砕し，2で紹介した標準物質を添加する．食品抽出時に加えて前処理すると，標準添加法による定量や添加回収率の算出ができる．
次に，標準物質の調製で用いた PTS により，タンパク質の抽出を行う．PTS は，食品から食物アレルゲンタンパク質を効率よく抽出できる．（抽出試薬について製品化を検討中である）．
その次に，タンパク質を消化する．還元，アルキル

図 2 標準物質
製品名：食物由来アレルゲン抽出物TM
関東化学株式会社にて販売

化，酵素消化によってペプチドまで切断する（図 4）．
アレルゲンタンパク質は高分子のために，このままでは分析が難しいが，ペプチドに断片化されると逆相 LC カ

品目は，小麦，そば，卵，落花生，乳，甲殻類（以上，ラムで保持され分析できる．

特定原材料）及び大豆（特定原材料に準ずるもの）とその後，PTS をトリフルオロ酢酸（TFA）により酸なっている（図 2）．くるみ（令和 5 年 3 月 9 日特定原性にして脂溶化し，酢酸エチル中に分離させて除去す

材料に準ずるものから特定原材料へ移行）については現る．高濃度の PTS をそのまま質量分析部に導入すると在開発を進めている．それぞれアレルゲン 1 品目ずつを含んでいるが，複数含有する混合標準物質や，大豆以外の特定原材料に準ずるもの，マイナーアレルゲン等へ測定に悪影響を及ぼす恐れがあるため，この工程で除去する．
最後に，固相カラムを用いた精製を実施する．加工食
きょうざつ品を対象にする場合，クロマトグラム上に夾雑物ピークの応用も考えている．

3 食物アレルゲン検査方法（LC-MS/MS 法）が出現し，質量分析部でのイオン化阻害等のマトリックス効果が引き起こされる．そこで，固相カラムを用いた

3･1 前処理について精製を実施すると，夾雑物を除去し質量分析部における食品試料はそのままの状態で測定できないために，粉マトリックス効果を軽減できる．固相カラムには様々な砕や抽出，酵素消化，精製等の前処理を行う．雑賀技術

種類があるが，イオン交換カラムや無極性相互作用を利研究所における分析フローシートについて紹介する（図用したカラム等を推奨する．
以上が前処理の工程であり，その後 LC-MS/MS で測3）．

定を行う．開発した方法は，学校法人慶応義塾の特許第4831708 号，「タンパク質試料の調製方法」を食物アレルゲン検査に応用した．

3･2 機器分析について
機器分析は，アレルゲンタンパク質のペプチド断片を逆相クロマトグラフィーで分離し，LC-MS/MS にて測定する．機器分析条件の構築について紹介する．
ま ず， ア レ ル ゲ ン タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 配 列 を
National Center for Biotechnology Information（NCBI）等のデータベースから入手する．次に，その配列を基にSkyline ソ フ ト ウ ェ ア（ ワ シ ン ト ン 大 学 MacCoss Lab）
を用いて，ペプチド断片を予測する．測定する質量数（イオン）を選択して，電圧等の質量分析条件を作製す
図 3 食物アレルゲン検査方法のフローシート

図4502

る．このとき，ペプチドが他の生物と一致しないようタンパク質の消化
ぶんせき 2023 11

データベースで検索し，偽陽性が引き起こされないよういる．小麦アレルゲンは大麦に反応性があるために，大に特異性の高いものを選択する．

麦を使用した製品は偽陽性を示す可能性がある．図 6

このように，アレルゲンタンパク質のアミノ酸配列がは，LC-MS/MS 法における大麦入り包装米飯についてデータベースに記載されていれば，これを元に質量分析のクロマトグラムの一例である．左側は小麦と大麦の両条件を設定できる．新たなアレルゲン品目について検討方を検出するイオンを，右側は小麦のみを検出するイオを開始する際は，ELISA キットが販売されていない品ンを設定した．試料において，小麦及び大麦検出用イオ目であっても，質量分析条件の構築が可能である．

ンでは検出され，小麦検出用イオンでは不検出であっ

設定した質量分析条件を用いて，食品で検査を実施すた．したがって，試料からは小麦は不検出であり，大麦る前に，標準物質のみをペプチド断片化して測定する．

のみ検出であると判別できた．このように，よく似たタ

ここで，使用する装置に合った最適電圧を定め，保持時ンパク質であっても，特異性の高いイオンを設定する

間，ピーク形状や感度を確認し，分析条件を構築する．と，分析対象のアレルゲンを区別して検出できる．以上

最終的には，実際に食品で検査した結果を考慮し，夾雑のように，LC-MS/MS 法は，複数イオンの設定により物の影響が少ない最適なイオンを定量イオンに選択す選択性が高くなり，ELISA 法では偽陽性を示す可能性る．食品によって最適なイオンが異なる場合があるた
め，測定時は複数イオンの設定を推奨する．

3･3 検査方法の特長
LC-MS/MS 法の特長は，複数のアレルゲンを一斉に検査でき，選択性が高いことである．実際の検査結果を用いて紹介する．
かまぼこ

図 5 は，LC-MS/MS 法における蒲鉾の検査例である．
各アレルゲンにおいて，標準物質の添加ピークが確認できる．また，この蒲鉾は原材料に卵を含んでおり，原材料表示の記載通り，卵アレルゲンのみ検出されている．
LC-MS/MS 法では，ELISA 法のように対象とするアレルゲンを限定せずに，図に示すような複数アレルゲンを一斉に検査できる．
ELISA 法では偽陽性を示す食品が存在し，その情報はキットメーカーによる反応性データ3）4）に記載されて

図5
ぶんせき 2023 11

図6

大麦入り包装米飯試料の小麦アレルゲンクロマトグラムの一例

蒲鉾（原材料表示に卵の記載あり）試料のクロマトグラムの一例

503

のある食品でも判別できると考えられる．

たした．通知法では，試料がアレルゲンタンパク質を10 μg/g 以上含むと微量を超える混入があると判断され3･4 加工食品での検査例るために，この数値がアレルギー表示の目安となる．

LC-MS/MS 法が多様な加工食品に適用できるか，4以上の結果から，LC-MS/MS 法が多様な加工食品に種類の試料を用いて精度等を評価した結果を紹介する．
試料には，海藻入り煎餅，鶏レバー入りベビーフー
表1ド，レトルトパウチ食品（ミートソース）及び大麦入り
試料名包装米飯（3･3 図 6 における同一試料））を用いた．これ ら を 試 料 に 選 択 し た 理 由 に つ い て， 表 1 に 示 す．

海藻入り

ELISA 法で測定が難しい場合がある試料を選択した．

煎餅

分析者 1 名が 1 日 5 併行の試験を行い，併行精度，真度，検量線の相関係数，定量下限について評価した．
結果について，表 2 に示す．併行精度（RSD）は 11 ％以内，真度は 93～110 ％，検量線の相関係数（r）は0.983 以上となり，良好な結果となった．定量下限について，5 μg/g 以下となり，通知法の表示基準レベルを満表2

鶏レバー入りベビーフード試料の選択理由
海藻に含まれる粘性成分が，ELISA キットの抗体と吸着する場合があるため
鶏 レ バ ー を 含 み，ELISA 法 に お い て「乳・落花生」に偽陽性を示す可能性があるため3）4）

レトルトパウチ食品 加工度が高く，野菜・豚肉・スパイス等様々なマトリックスを多く含むため（ミートソース）
大麦入り
包装米飯

大麦を含み，ELISA 法において「小麦」に偽陽性を示す可能性があるため3）4）

加工食品における試験結果

アレルゲン

併行精度※1（RSD%）

海藻入り

小麦煎餅

卵
乳
落花生

試料

試料の選択理由

真度※1（%）

相関係数※2（r）

定量下限※3（μg/g）

8

97

0.990

1

6103

0.983

1

7

99

0.987

1

3

104

0.987

0.5

そば

3

110

0.983

1

甲殻類

699

0.983

1

大豆

6

101

0.985

0.5

鶏レバー入り

小麦

2

100

0.996

1

ベビーフード

卵

3

93

0.997

1

乳

4

96

0.997

1

落花生

10

103

0.997

1

そば

3

97

0.997

1

甲殻類

3

101

0.998

1

大豆

6

101

0.993

1

レトルトパウチ食品

小麦

3

105

0.988

5

（ミートソース）

卵

7

99

0.995

0.5

乳

2

102

0.996

0.5

落花生

7

105

0.996

0.5

そば

3

102

0.994

0.5

甲殻類

4

100

0.996

1

大豆

6

100

0.994

1

大麦入り

小麦

31060.997

1包装米飯

卵

41100.992

5

乳41070.997

1

落花生

111030.992

1

そば71100.993

1

甲殻類31060.997

1

大豆11060.996

1

加工食品に標準物質を添加（ n ＝ 5 ）．※ 1：10 µg/g の結果；※ 2：0.5，1，5，10，20 µg/g の結果；※ 3：目標値（併行精度 20 ％ 以下，真度 70 % 以上 120 ％以下）を満たす 0.5，1，5，10，20 µg/g の最小濃度．

504

ぶんせき 2023 11適用でき，食物アレルゲン検査方法として活用できると示唆された．

4 ま と め3） 日本ハム株式会社中央研究所：“FASTKIT エライザ Ver.
Ⅲシリーズ，食品反応性データ（2018 年 8 月改訂）”，〈https://www.rdc.nipponham.co.jp/fastkit/fastkit_elisa3.html〉，（accessed 2023. 8. 7）.
4） 株式会社森永生科学研究所：“モリナガ FASPEK エライザ
Ⅱ，食品反応性データ”，〈https://miobs.com/product/tokutei/faspek2/reactive.html〉，（accessed 2023. 8. 7）.

我々は，LC-MS/MS 法で用いる標準物質「食物由来アレルゲン抽出物TM」を製品化した．本稿では，この標準物質の特長及びこの標準物質を用いた食物アレルゲン●

検査方法を紹介した．今後は，この検査方法の実用化に向けて，研究機関や食品会社等の検査現場への導入をす●

稲垣 江梨（Eri Inagaki）
一般財団法人雑賀技術研究所研究開発室．
（〒640─8341 和 歌 山 市 黒 田 二 丁 目 1 番

すめていきたいと考えている．一部の加工食品メーカー

20 号 ）．《 現 在 の 研 究 テ ー マ 》GC/MS，では，将来的に自社製品の品質管理に取り入れることをLC/MS を用いた食品分析．

目標に LC-MS/MS 法について取り組みを始めている．

E-mail : inagaki@saika.or.jp

通知法において採用されている方法ではないものの，品質管理で有効に活用できると期待される．また，LCMS/MS を食物アレルゲン検査にも利用することで，装置の活用の幅が広がると考える．
今後，LC-MS/MS 法に興味を持つ会社が増え検査方法が普及し，食の安心安全につながっていくことを望ん

冨上 香澄（Kasumi Tokami）
一般財団法人雑賀技術研究所研究開発室．
（〒640─8341 和 歌 山 市 黒 田 二 丁 目 1 番20 号 ）．《 現 在 の 研 究 テ ー マ 》GC/MS，LC/MS を用いた食品分析．
E-mail : tokami@saika.or.jp

でいる．雑賀技術研究所は，検査方法の開発をはじめとする様々な活動を通じ，社会に貢献していく所存である．

山下 賀容子（Kayoko Yamashita）
一般財団法人雑賀技術研究所研究開発室．
（〒640─8341 和 歌 山 市 黒 田 二 丁 目 1 番

文献1） 消費者庁：平成 27 年消費者庁次長通知消食表第 139 号，“食品表示基準について（別添）アレルゲンを含む食品に関する表示”（2015）.
2） T. Masuda, M. Tomita, Y. Ishihama : J. Proteome Res., 7, 731（2008）.

20 号 ）．《 現 在 の 研 究 テ ー マ 》GC/MS，LC/MS を用いた食品分析．

E-mail : k.yamashita@saika.or.jp

会社ホームページ URL：

https://www.saika.or.jp/allergen/index.html

関連製品ページ URL：

https://www.kanto.co.jp/dcms_media/other/REA-18.pdf

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