文部省
科学研究費補助金総合研究A（課題番号 00537030）

新たに発見された二つの神経・筋異常マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価（代表者 江崎 孝三郎）

昭和55〜57年度

研究成果報告書（財）実験動物中央研究所
昭 和 58 年 3 月

報告書作成にあたって
最近、ヒトの疾患のモデルとなる動物の開発が重要視されるようになるとともに・いくつかの研究班が組織され、積極的にモデル動物を開発する努力がなされています〇十万、ヒト疾患について
は医学分野の研究者によって、モデルとなる可能性をもつ異常動物についての研究は実験動物学、
獣医学分野の研究者によって別個に行われることも多く、両者の連携は必ずしも緊密であるとはい
ぇないのが現状であります。しかし、動物に発見された異常形質がヒトの疾患のモデルとなり得るか否かの評価のためには、異常発現要因の解析、ヒト疾患との類似点と相違点の検討、動物の遺伝・的改良などが医学、実験動物学分野の研究者の強力な連携のもとになされねばならないと考えられます。
このような観点から、本研究班は、新たに発見された二種の異常動物について、実験動物学、基礎医学、臨床医学の各分野の研究者がそれぞれの専門分野で解析するとともに、モデル動物としての総合的な評価をおこなうために組織されたものであります0
各班員の多大な努力のおかげで、初期の目標以上の成果をあげることができたものと感じております。昭和55年度からの3年間の研究期間を終了するに当り、得られた成果をまとめてこゝに刊行することに致しました0この報告書が神経・筋疾患分野での研究者に少しでもお役に立てば幸に存じます。
本研究班は「応終了致しますが、こゝで紹介した異常動物にはまだ解明しなければならない点も多々残されています0班員の諸先生方はさらに研究を続けられる予定になっていますが・今後は班員以外の先生方にも動物をお渡しできるよう努力する所存であります0こゝで報告します二種の異常動物に興味をお持ちになった方は御申し出いたゞきたいと存じます0
おわりに当り、終始御協力いたゞいた班員各位、ならびに公開合同班会議の際にご援助いただい
た「医学組合研究の推進に関する研究」班代表者森亘教授、和歌山医科大学松下宏教授に深く感謝いたします。

昭和58年3月

代表者

江

崎

孝三郎

目

次

課題番号

1

研究課題

1

研究組織

1

研究経費

1

研究発表

2

A．学会誌等2

B．口答発表

2

C．出版物

3

研究成果

Ⅰ．遺伝性前・外側下腿筋群萎縮（pma）マウスの成因の解析と疾患モデ
5ルとしての評価

1．pmaマウスの発見の経過と遺伝分析ならびに解剖所見

72．pmaマウスの解剖・組織学的検索

133．pmaマウスの病因に関する病理組織学的研究

29

4．pmaマウスの病因に関する発生学的検索

41

5．pmaマウスの生化学的解析

45

Ⅱ．乳時期に運動失調を起して死亡する（mdy）マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価

53

1．mdyマウスの発見の経過と遺伝様式の分析

55

2．mdyマウスの組織化学的解析

59

3．mdyマウスの神経病理学的研究

75

4．mdyマウスの電気生理学的解析

85

5．mdyマウスの生化学的解析

89

文部省科学研究費補助金（総合研究A）研究成果報告書
課題番号：00537030
研究課題：新たに発見された二つの神経・筋異常マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価

研究組織：・研究代表者：江

崎

孝三郎

（実中研）

研究分担者：有嶋

和（麻布大・農）

江

崎

孝三郎

（実中研）

石

原

侍

幸

北

浦

小

浜

宮

55

年度

55−57

〝

（東埼玉病院）

5〟孝（金沢大・教養）

57

〝

一

弘

（東京大・医）

55−56

〝

田

堆

平

（東医歯大・医）

55−57

〟

中

村

昌

弘

（大阪大・医）

55−57

〟

埜

中

征

哉

（神経セソクー）

57

〝

小

川

恵

弘

（都神経研）

55−57

〟

遠

山

正

弥

（大阪大・医）

55−5

7

〟

上

山

義

人

（東海大・医）55−57〝

研究協力者：早川純一郎（金沢大・医）今西美知子（都神経研）

春美（都神経研）

岡

義

多

田

愛

子

（神経セソクー）

豊

福

照

子

（神経セソクー）

吉

村

幸

夫

（実中研）

研究経費：昭和55年度

3，000千円

昭和56年度

3，000千円

昭和57年度

3，000千円

計

9，000千円−1−

7

研究発表：
A．学会誌等
1．中村昌弘、林宏、倉田陽一、小野啓郎、遠山正弥、塩坂貞雄、江崎孝三郎、安田幸雄：運動ニューロン疾患モデル（遺伝性前・外側下腿筋群萎縮マウス）の神経解剖学的検討。中部整災誌、23：305，1980・
2．中村昌弘、林宏、倉田腸一、小野啓郎、遠山正弥、塩坂貞雄、江崎孝三郎、安田幸雄：運動ニューロン疾患モデル（遺伝性前・外側下腿筋群萎縮マウス）の神経解剖学的検討−ヘテロ
マウスについて−中部整災誌、23：1363，1980．
3．江崎孝三郎、安田幸雄、中村昌弘、林宏、小野啓郎：遺伝性前・外側下腿筋群萎縮マウス、
実験動物、30：151，1981．
4．中村昌弘、林宏、倉田陽一、大川敦子、小野啓郎、遠山正弥、塩坂貞雄、江崎孝三郎、、安田幸雄：運動ニューPソ疾患モデル−遺伝性歩容異常マウスの神経解剖学的研究−神経研究の進歩、25：229，1981・
5．宮田雄平：運動ニューロンの発生と分化．神経研究の進歩．26：495，1982．
6．MiYata，Y．：A new mutant mouse with motor neurone disease．
Develop．Bi01．（inpress）

B．口答発表
1．江崎孝三郎：新たに発見された二種類の神経筋異常マウスの現在までの知見（文部省総合研
究（A）神経筋異常マウス研究史報告）．公開シンポジウム話題の自然発症ヒト疾患モデル動物、1981年2月、大阪．
2．江崎孝三郎、吉村幸夫、小川恵弘、宮田雄平：新たに発見された遺伝性・神経原性筋異常マ
ウス．第16回日本実験動物学会、1981年、東京．
3．北浦

孝：Deveiopmentai properties of muscular proteinsin

the normal and diseased mouse．体力科学30；375（1981）
4．江崎孝三郎：「新たに発見された二つの神経・筋異常マウスの成田の解析と疾患モデルとしての評価」班報告．公開合同班研究発表会、疾患モデル動物の開発と利用．1982年11月、
大阪．
5．中村昌弘：前外側下腿筋群萎縮マウスの成田の解析と疾患モデルとしての評価、その1．公開合同班研究発表会、疾患モデル動物の開発と利用、1982年11月、大阪．
6．埜中征哉：前外側下腿筋群萎縮マウスの成因の解析と 疾患モデルとしての評価、その2．公開合同斑研究発表会、疾患モデル動物の開発と利用、1982年11月、大阪二7．小川意弘：乳仔期に発生する神経節異常マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価、その1・公開合同班研究発表会、疾患モデル動物の開発と利用、1982年11月、大阪．

ー2−−

8．宮田雄平：乳仔期に発生する神経筋異常マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価、その2．公開合同研究班研究発表会、疾患モデル動物の開発と利用、1982年11月、大阪・

C．出版物
1．中村昌弘、小野啓郎：自然発症内反足症（CFlマウス）・疾患モデルハソドブック帆2、
pp．221−228，医歯薬出版、東京、（1982）・
2．江崎孝三郎、中村昌弘、遠山正弥：遺伝性前・外側下腿筋群萎縮マウスの疾患モデルとしての検計 自然発症疾患モデル動物の開発と利用．pp・230−240，清至書院、東京、（1982）．

−3−

Ⅰ．遺伝性前・外側下腿筋群萎縮（pmα）マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価

卜1・Pmαマウス発見の経過と遺伝分析ならびに解剖所見
江

崎

孝三郎＊

はじめに
マウスの遺伝性筋異常としては、dystrophyamuscularis（遺伝子記号dyおよびdy2J，muSCu−】ar dysgenesis（7ndg），myOdystrophy（myd），muSCule deficient（ndf）およびmotor end−
plate disease（Tned）などが報告されている。
筆者らは、CF♯1マウスを近親交配している過程で、筋疾患に起因すると推定される歩様異常を・示す個体を発見し、この異常形質を保存するとともに、遺伝様式の分析と解剖学的検索をおこなったので報告する。

Ⅰ．異常動物の発見までの経過
異常の発見された動物の起源は、実験動物中央研究所が1967年にCarworthInc．U．S．A．より導入し、クローズドコロニーで維持していたCF♯1マウスである。翌68年から、卵白アルブミ
ン投与によるアナフイラキシーに対する高・低感受性の系統の育成が、江崎によって開始された。
1976年に、協同研究者の安田が、高感受性系統（CAS）の兄妹交配21代の一腹の産仔（雌4頭、雄2頭）のうち、雌2頭に歩行異常のみられることを発見した。これらの雌2頭を同腹の正常雄と交配したところ、1組の交配から出生した雄2頭、雄3頭のうち、雌、雄各1頭が雌親と同様の異常を示した（図1）。そこで以後は、同腹の異常雌と正常雄の交配、または正常雌と異常雄の交配によってこの異常形質を保存し
ている〇

．9日ヲ

なお、後述の遺伝様式の分析によって、この異常を支配する

○
l

F21

0

×

□

l

．l．

□

○×□

主遺伝子は常染色体上の劣性遺伝子であると推定されたので、

∴

O X

○×□
■

F22

●

□

●×□

mlar atrophy，遺伝子記号を

F23□t O e x□

t

O

○

tl

Ox□
lll

F240 〇 〇・● □ □ ■ 1

○

■．Ⅰ

〇×口
I

この主遺伝子をperonealmus一

口

□

l

○
l

○

□
■

一

ロ
l

□・
l

ロ

四九αと命名した。

異常ライン（pmα）

Ⅱ．異常マウスの外見的症状
異常マウス（以後pmαマウス）

正常ライン（CAS）○：正常雌 ［コ：正常雄●：異常雌 『：異常雄の外見的症状をみると、出生時には後肢は両側ともに棒状で、

図1．異常を発現するラインと正常ラインの系統図＊（財）実験動物中央研究所−7−

内側に回転し、いわゆる内反尖足を星している。成長に伴い、足関節の背面への自動的屈折と足指の伸展が困難になり、後肢をひきずるように下垂足歩行を行う（図2）。しかし、関節の拘縮は認められない。加齢に伴い、症状は次第に悪化するが、顕著ではない。また、症状の発現には多少の個体差が認められる。

図2・前・外側下腿筋群萎縮（叩α）マウス異常（pm￠）マウスの成長は、同腹の正常（ヘテロ）マウスと比較してやや遅く、低体重である。
繁殖は雌、雄ともに可能であるが、雄の生殖能力は比較的早期（4〜6月齢）に低下する傾向がみられる0これは、加齢に伴う症状の悪化によって、交尾行動が困難になるためと推測された。

Ⅲ．遺伝的支配の分析
A．同系内での交配実験
異常雌、雄の交配からは、異常マウスのみが得られた。また、前述の系統維持のための交配、すなわち、同腹の異常マウスと正常マウスの交配からは、異常と正常がほぼ1：1の割合で出現した（蓑1）。
B．近縁の系統との交配実験

表1・異常（pmα）系内での交配実験成績

異常マウスをそれと同「血縁の正常マウス
仔
交配 の 種類

の

正 常

表

現

型

の系統（CAS，図1参照）と交配し、F．，F2，

異 常Flと正常系統のマウスとのもどし交配およ合計
異 常 ×異 常異 常 ×正常 ＊

雌

雄

雌

雄

0

0

36

40

76

33

40

37

30

140

びFlと異常マウスとの交配における異常マ
ウスの発現を観察した。
表2に示すごとく、Fl世代およびF．と正常マウスのもどし交配においては、正常マウ・同腹の異常マウスと正常マウス

スのみが得られた。F2世代においては、135
頭中28頭に異常が発現した。また、Flと異−8−

常マウスのもどし交配で得られた仔において

表2・異常（pmα）マウスと正常（CAS）＊
マウスの交配実験成績

は、66頭中32頭に異常が出現した。
これらの異常マウス出現頻度は、この異常が常染色体上の1個の劣性遺伝子に支配されていると仮定したときの理論的分離化、すな

スのもどし交配においては1：1とよく一致

Fl X 正常Fl X n

10
55

13
52

0
16

0
12

9
1

2
1

していたC

Fl X 異常

6
6

0

5
3
1

0

3
2

11

5
2

14

0
2

異常×正常

5
1

わち、Rにおいては3：1、Flと異常マウ＊CAS：pmαと同一起源の正常系（図1参照）

C．他の系統との交配実験

異常マウスとC3H／Heマウスとの交配を行い、Fl，F2，FlとC3H／Heとのもどし交配および、Flと異常マウスとのもどし交配における異常マウスの発現を観察した。

表3．異常（pmα）マウスと正常（C311／He）
マウスの交配実験成績

表3に示すごとく、R世代およびFlとC3H／Heとのもどし交配においては、
異常マウスは発現しなかった。抗世代においては、440頭中42頭にBと異常マウスとのもどし交配で得られた仔にお異常×正常■

27

43

Fl X

正常

19

31

Fl X F1

206

FlX異常

60

0

いては、197頭中61頭に異常が発現し

6

70

0

0

50

た。しかし、異常マウスの発現頻度は、

19213

29

440H

この異常が1個の劣性遺伝子によって支3130197…

配されていると仮定したときの理論的発

76■C3H／Heマウス

現頻度より低かった。また、異常個体に

榊pく0・01，理論比との有意差

おいても、異常の程度が極めて軽症のもの、片側性のものなど、表現度に種々のバラツキがみられた。
以上の交配実験から、この異常は、常染色体上の1個の遺伝子によって強く支配されているが、その表現皮は他の遺伝子、すなわち遺伝的背景によって影響されるものと考えられる。

Ⅳ．解剖学的所見
A．骨格系の変化
内臓を除去して剥皮した後、95界エタノールで固定した体謳を29らKOHで透明化し、骨格をアリザリンレッドSで染色した後、風乾して骨格標本を作製し、観察した。
外見的所見と同様に、後肢以外には骨格異常を認めることはできなかった0．Pm通マウその後肢のうち、下腿骨の長さおよび足の長軸の長さは、前肢に比べて相対的に短く、脛骨および俳骨の発達が正常より悪かった。また、Pmαマウスの脛骨と排骨の間隙は、正常マウスに比べて著明に狭い。
さらに、距骨の排骨関節面の角度に異常がみられた。すなわち、正常マウスの距骨・俳骨関節面は−9−

中線に対しほぼ直角であるのに対し、卿α
マウスでは約60度の角度となり（図3）、
址面が内反していた。さらに、一部の個体
では足根骨の癒合がみられた。
しかし、これらの骨格系の異常はいずれも1次的なものではなく、後述の前外側下腿筋群の萎縮による2次的な変化であると考えられた。

B．骨格筋の変化
図3．距骨関節面の角度の異常
左：異常マウス、右：正常マウス

皮膚および皮下組織を除き、全身の骨格筋を露出して解剖学的に観察した。離乳後成熟に至るまでのいずれの動物においても、脛骨の前・外側に位置する筋群に著明な萎縮がみられ、腱成分のみがはっきりと観察された。
HE染色によって観察すると、叩αマウスにおいては、前・外側下腿筋群、すなわち前脛骨筋、．
長母址伸筋、長址伸筋および排骨筋群に著明な萎縮および脂肪変性などの異常がみられた。異常筋においては、脂肪変性に陥り、筋線経が全くみられない部位、large group atrophyを起こし、正常な筋線経がほとんどみられない部位、筋線経は認められるが、著しい大小不同と円形化を示す部位などがみられた。

D．末梢神経の変化
解剖学的に坐骨神経の走行をみると、総排骨神経に異常がみられた。外見的に極めて軽症のマウ
スでは、総排骨神経が細くなっているのが認められ、重症のものではそれが欠損していた。脛骨神経および排腹神経の走行には異常はみられなかったが、正常マウスのそれらと比較してやや太くなっているのが認められた（図4）。

Ⅴ．考察

解剖学的検索によって、この異常は総排骨神経の退縮または欠損による前外側下腿筋群の萎縮によることが示唆されたことから、この異常はヒトのCharcot−Marie Tooth型筋萎縮症あるいは
WerdnigqHoffmam病のモデル動物となる可能性が考えられる。
十方、前外側下腿筋は萎縮しているけれども明らかに存在していること、脂肪変性をまぬがれた筋においては神経・筋終板が認められる点からみると、総俳骨神経が発生の過程で退綿を起した可能性、あるいはこの筋群の一部が総俳骨神経以外の神経、例えば脛骨神経の分岐などによって代行的に支配されている可能性などが考えられる。これらの点に関してはさらに詳細な検索をす′る必要
がある。

ー10−

図4．坐骨神経の走行。異常マウスには総排骨神経がみられない。
（左：異常マウス、右：正常マウス）
次に、遺伝的支配を分析するための交配実験をおこなったところ、同系内の交配および近縁の系
統との交配では、この異常が常染色体上の1個の劣性遺伝子によって支配されていると推定された。
しかし、血縁のない系統との交配では、発現した異常の程度に重症、軽症、片側性、両側性など種々のバラツキがみられ、異常個体の発現頻度は理論的な分離比より低かった。これらの点から、この異常は常染色体上の1個の劣性遺伝子によって強く支配されているけれども、その表現度は他の遺申子、すなわち遺伝的背景に影響されるものと考えられる。この主遺伝子をperonealmuscularatrophy、遺伝子記号をpmαと命名する。
なお、この遺伝子の表現度が遺伝的背景によって影響されることは、この異常をヒト疾患のモデ
ルとして利用するときに、種々の程度の症状を示す動物を作出できる可能性をもつものと考えられ
る。

要

約

CF♯1マウスを近親交配している過程で発見された歩様異常マウスを、解剖・組織学的に検索したところ、総俳骨神経は退縮または欠損し、前・外側下腿筋群は萎縮していることが明らかにな

ー11−

った。
また、交配実験によって遺伝的支配を分析したところ、この異常は常染色体上の1個の劣性遺伝子によって強く支配されているけれども、その表現度は遺伝的背景によって影響されるものと推定された。この主遺伝子をperonealmuscular atrophy、遺伝子記号をp7naと命名する0文

献1）Duchen，L．W．（1970）．J．Neurol．Neurosurg．Psychia亡．33，
238−250．
2）Gluecksohn−Waelsch，S．（1963）．science142，1269−1276．

3）Lane，P．W．，T．C．Beamer and D．D∴町ers（1976）．J．Hered．
67，135−138．

4）Meier，H．andJ．L．Southard（1970）．Life Sci．9（partⅡ），137−144．
5）Michelson，A．M．，E．S．Russell and P．J．Harman（1955）．
Proc．Na亡．Acad．Sci．41，1079−1083．

6）womack，J．，A．MacPick and H．Meier（1977）．Mouse NewsLe亡ter，56，40．

−12−

Ⅰ−2・Pmα＿マウスの解剖・組織学的検索
中

村

昌

弘＊

遠

山

正

弥＊＊

はじめに
江崎、安田により開発された常染色体劣性遺伝形式を有するpmαマウスは、ヒト内反足と似た足変形を示し、両後肢をひきずるようにして足外側縁ないし足背部で荷重して歩く（図1）。当初、

図1．pmαマウス…内反足変形を呈する（×0．7）
我々はこのpmαマウスがヒト先天性内反足のモデル動物になるのではないかと考えて、以下に述べる種々の検索を加えた。

Ⅰ．基礎的検索A．外観的特徴
押αマウスは、前述のごとく常染色体劣性遺伝形式を有するために、1）pmαマウス、2）症状の発現しないヘテロマウス（外観上および椴能上正常マウスと全く同じマウス）、3）本症に関与する異常遺伝子を全くもたない正常マウスの三種類のマウスをかけ合わせ方を工夫すれば同腹で同時に得ることができる。
この卿αマウスは、同腹のヘテロマウスや正常マウスと比較して成長が遅く、体が小さい。両後肢の異常については既に述べたが、その異常は膝より末梢においてであり、膝関節や股関節の形態異常や動きの異常は認めなかった。

＊大阪大学医学部整形外科
榊大阪大学医学部高次神経研ー13−

B．骨格の異常
アリザリン赤で染色した骨相標本を作製して、同じ週齢の正常マウスと比較した。
外観上の変化と同様に骨格も全体にpmαマウスの方が少し小さいこと以外に特別の変形や奇形を認めない。内反足ということで、足収骨の形状や配列を入念に検索したがヒト先天性内反足にみられる距骨の形態異常や距骨・踵骨・舟状骨の配列異常はなかった。
ただし正常マウスと比べて脛骨、排骨および足の長軸の長さが短かく、かつ楔状骨癒合症の合併
頻度が高い。

C．骨格筋の異常
後肢骨格筋の変化に主眼を置いて検索したところ、肉眼で前および外側下腿筋群に著明な萎縮を見た（図2、A：正常マウス、B：pmαマウス…前、および外側下腿筋群は正常マウスと異なり萎縮している）。
マウス下腿筋群は表1に示すように主として、①前下腿筋群、④後下腿筋群（浅層）、④後下腿筋群（深層）、④外側下腿筋群、の四つの筋群に分けられる。
表1．マウス下腿筋の筋肉およびその支配神経

MUSCLES OF THE LEG

工．Anterior Crural Musclesl）H．Tibialis anterior

deep peroneai nerve2）M・Extensor digitorumlongus

deep peroneal verve

3）H．Extensor hallucislongus

deep peroneal nerve

工工・Posterior Crural Muscles：Superficial

1）H．Gastrocnemius

tibial nerve

2）H．S01eus

tibial nerve

3）的．Plantaris

tibial nerve

工工工・Posterior Crural huscles：Deepl）H．Popliteus

tibial nerve

2）机・Flexor hallucislongus

tibial nerve

3）H・Flexor digitorumlongus

tibial nerve4）M・Tibialis posterior

tibial nerve

工V．Lateral Crural Musclesl）机・Peroneuslongus

SuPerficial peroneal nerve2）朗．Peroneus brevis

Superficial peroneal nerve3）M・Peroneus digiti quarti

deep peroneal nerve4）M・Peroneus digiti quinti

deep peroneal nerve−14−∴∴−∴■、∴∵

し∴日、Lj■、．−．、＿：■＿

図2．a：正常マウス、b：pTTLaマウス・・・・・・anter0−1ateral cruralmusclesが正常マウスと異なり萎縮に陥っている。
前下腿筋群には、前脛骨筋、長址伸筋、長母址伸筋の三筋があり、外側下腿筋群は、長排骨筋、
短俳骨筋、第四址俳骨筋、第五址俳骨筋の四筋から成る3と−15−

後肢骨格筋の変化を詳細に検討するために正常マウスおよびp7∽マウスの後肢をホルマリン固定
後脱灰して連続横断切片を作製した。P循妃マウスでは、図2bの肉眼所見と同様に横断切片でも前および外側下腿筋群が高度の萎縮に陥っている。
殊に、深排骨神経により運動支配を受けていると考えられている前脛骨筋、長母址伸筋、長址伸筋、第四址排骨筋、第五址排骨筋は著明な筋萎縮のために個々の筋肉を同定できない。そして、その多くは脂肪組織に置換されている。残存筋線経の多くはその直径が極めて細くいわゆるsmallround fiberとなり、小さいものでは直径約3FEmと正常の1／4−レう0の小径化を示しlarge
group atrophyの像を皇する。浅排骨神経に支配されると考えられている長・短俳骨筋では一部
筋線経の小径化を観察した。特に長俳骨筋では小径化した筋線経がやや多数みられるが、全体として筋組織はよく温存されている（図3：マウス下腿横断面。黒枠は前および外側下腿筋群を示す。
a＝正常マウス、b：pmαマウス…前および外側下腿筋群は高度の萎縮に陥っている0特に深排骨神経により支配されている筋群は、高度の変性を示す。）。

ab

図3．マウス下腿横断面。黒枠は前および外側下腿筋群を示す。a：正常マウス、
b：pmαマウス・目前および外側下腿筋群は高度の萎縮に陥っている。とくに深誹骨神経により支配されている筋群は、高度の変性を示す。

D．末梢神経の異常
解剖学的に坐骨神経の走行をみると、萎縮した前および外側下腿筋群の支配神経である総排骨神経が肉眼的に認められない。脛骨神経と俳腹神経の走行異常はないが、特に排腹神経は正常マウスと比べて太い（図4、正常マウスおよびp7皿マウスの坐骨神経の横断面、a：骨盤内での坐骨神経、−16−

b：大転子部での坐骨神経、e‥大腿末梢部）
a
SCIATIC NERVE AT IH［

SCIATIC NERVE掴THEPELVLS

し「VF10lこGREATER TROCHANrE11
4トFE∴T EU

けl〔＝rllAl M1Nr∧ND COPJMON PER（）NEAI NERV〔八1日咤l〕lSI∧L END OF†HF TlHGH
TF「l（：OVMON PFRDNEAL NERVF

図4．正常マウスおよびp，naマウス（AFFECTED）の坐骨神経、a：骨盤内の坐骨神経
b：大転子部での坐骨神経・・・p7naマウスのsuralnerveの方が太いo c：大腿末梢部での脛骨神経などを示す。
E．脊髄の異常
頚椎から仙椎まで椎弓切除を行い、後板が脊掛こ入いる部位を指標にして各髄節を同定し、髄節毎に連続切片を作製した。
HE染色およびKliiver−Barrera染色により光顕的に観察した0変性所見や炎症性変化は全くみられない。しかし、腰髄、仙能では脊髄前角の大型細胞が正常マウスに比べ減少傾向を示していた。

以上の基礎的な検索によって、このク服マウスは生下時よりすでに内反足変形を示すものの足板骨ことに距骨や踵骨に形状の異常や配列異常がなく脊髄前角細胞の減少および総排骨神経の欠損にょりその支配筋である前および外側下腿筋群が著明な萎縮、変性を示し、そのために生じた麻痺性
内反足であることが判明した0
しかし前および外側下腿筋群の運動支配神経である総俳骨神経が欠損しているにもかかわらず一部の筋肉がなぜほぼ正常の筋組織を維持しているのかとの疑問が生じてくる0
かつて総排骨神経が存在して、何らかの原因で総排骨神経のみが変性、消失してしまったものか・ぁるいは総排骨神経が発生、分化の過程の異常のために形成されなかったのか、またその発生・分化の異常として神経自体に原因があるのかそれともtargetorganである前および外側下腿筋群に原田があるのか、もっと単純に考えて、長および短排骨筋は排骨神経以外の神経支配を受けているのかなどが推測される。
そこどpmαマウスと同じCF♯1の正常マウスとヘテロマウスを用いて、これにpmマウスを加えた3グループに分けて以下の検索をおこなった0ー17−1）組織学的、組織化学的染色‥・各マウスの前および外側下腿筋群の筋組織の比較検討。
2）コリンエステラーゼ（ChE）染色…同下腿筋群における神経筋終板の検索と比較。
3）鍍銀法（鈴木法）…同下腿筋群における末梢神経の検索と比較検討。
4）HRP（horseradish peroxidase）法…同下腿筋群を支配する体性運動性神経の脊髄における起始核の比較検討。

Ⅱ．組織学的、組織化学的染色による筋の検索
正常マウスとヘテロマウスは、10適齢、体重30gの雄を、またpmαマウスは、14週齢、体重31gの雄を用いて、それぞれの前および外側下腿筋群をとり出し、10〟の厚さの新鮮凍結切片を作製して、HE染色およびNADHq tetrazolium reductase染色を行った。
正常マウスとヘテロマウスを比較すると、両者ともに病的所見はみられないが（図5a、5b）正常マウスでは、NADH濃染線経が58．3浄占め、ヘテロマウスでは69．895であった。筋線経の直径は正常マウスが濃染線経、薄染線維ともに50〟をピークとする分布を示すのに対し、ヘテ
ロマウスでは両線維ともにその直径が35〟をピークとする分布であった。（図6、前および外側下腿筋群のNADH−TR染色、a：正常マウス、b：ヘテロマウス）（図7）

図5・a：正常マウス（×150）、b：ヘテロマウス（×150）、C：pmαマウス…白く抜けているところは脂肪変性の部位で、写真の上半分は1arge group atrophy を示している。
筋線経の温存されているところもあるが（写真の下半分）その直径に大小不同があり、正常マウスと比べ小径化を示す。

ー18−

図6．

前および外側下腿筋群のNADH−TR染色左：正常マウス（×100）‥・濃染線維および薄染線経がモザ
イクパターンを示す。右：ヘテロマウス・‥正常マウスとほぼ同様のパターン。

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S仁山空L LO比u山王⊃N

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0

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50
60
DIAMETER（〃）

図7．マウス前および外側下腿筋群のNADH−TR染色による筋
線経の直径のヒストグラム。
a：正常マウス・‥濃染線経、 b：ヘテロマウス…両線経と薄染線維ともに50〟を
もに35〟をピークとす
ピークとする分布を示す。
る分布を示す。

−19−

70

80

90

いっぽう、叩￠マウスの前および外側下腿筋群は著しい大小不同を示しながらも筋線経が温存されている部位もあれば、1arge group atrophyに陥り正常の筋線経がほとんど見られない部位や、脂肪変性に陥り筋線経が全くみられない部位もあり（図5e）、明らかな神経原性筋萎縮の像を呈
している。

肌

コリンエステラーゼ（ChE）染色による神経筋終板の検索皿と同様のマウスで、それぞれの前および外側下腿筋群を取り出し、10〟の厚さの新鮮凍結切片を作製した。Gerebutzoff法にのっとt）ChE染色を施行したところ正常マウス、ヘテロマウスの前および外側下腿筋群には、多数のChE染色陽性を示す神経筋終板が認められた（図8、a：正常マウス、b＝ヘテロマウス、C：pmαマウス）。

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図8．前および外側下腿筋群における神経筋終板。（ChE染色）
a：正常マウス（×250）、b＝ヘテロマウス（×250）、

C＝pmaマウス（×250）

またp7naマウスでも、large group atrophyや脂肪変性を免れた筋線経には少数ながらもChE
染色陽性を示す神経筋終板が認められ（図7e）、それぞれの神経筋終板の間に反応の強さや光学顕微鏡レベルでの著しい形態上の差は見られなかった。

Ⅳ．鍍銀法（鈴木法）による末梢神経の検索
pmαマウスでは、総排骨神経が肉眼的には認められないにもかかわらずChE染色陽性の神経筋
終板が観察されたことより、なんらかのかたちで押αマウスの前および外側下腿筋群に末梢神経が入ってきていると考えられた。そこで萎縮下腿筋群の鍍銀法（鈴木法）を行なったところ、残存筋
机織に末梢神経が認められ（図9e）、正常マウスやヘテロマウスのそれらと比較して光学顕微鏡

ー20−

レベルで著明な差は見られなかった（図9a、9b）。

■1．■

図9．前および外側下腿筋群の鍍銀法（鈴木法）
a：正常マウス（×250）、b：ヘテロマウス（×250）、C＝pmマウス（×250）。

矢印が神経を示す。萎縮下腿筋群で筋線経の温存されているところに末梢神経が観察された。

V．HRP法による脊髄起始核の検索
以上のことからpmαマウスの萎縮に陥った前および外側下腿筋群は総誹骨神経以外の運動神経支配を受けていることが強く示唆されたので、正常マウス、ヘテロマウス、p仇αマウスそれぞれ7−
10適齢、体重20−30gの雌雄を用いて、各グループ4匹ずつにHRP法を施行した。
すなわち、それらマウスの右側前および外側下腿筋群にHRPを体重1gあたり0．1喝の割合で注入し、24時間後にグルタ∴−ル・ホルモール混液で確流固定する。ただちに頚椎から仙椎まで椎弓切除、硬膜切開を行ない、同液中に4℃にて6−24時間後固定する。ついで頸髄から仙鈍まで
各絃節ごとに、後根が脊誌を出る高さで同定し切離する。
これら各髄節を309も蕉糖を含む緩衝液中に6−12時間浸潰後、35／上の連続切片を作製しtetramethylbenzidine（TMB）反応5）を行なう0
各髄節ごとにHRPにより標識される細胞の分布、数、形状、大きさなどを観察した。
1）正常マウスでは、第8胸髄から第5腰髄までのHRP注入側と同側（右側）の多数の前角細胞が標識された（図108）。
髄節内分布をみると、胸臆および第1膜髄では、その前角細胞はdorsomedial nuclei（DM）とventr。m。dialn。Clei（VM）より構成されており≡）ゆDMでは同側の第8胸髄から第1腰範まで標識され、その標識細胞数は第11胸虹をピークとする分布を示した。TMでは、同側の第10
胸能から第1腰虹にかけて標識され、その数は第12，13胸髄をピークとする分布を示し、それら標識細胞はすべて中型、紡錘形細胞であった（第1腰髄の前角細胞は、胸髄と同じ細胞群により

−21−

1も

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図10．右後肢の前および外側下腿筋群のHRP法により標識された青竜前角細胞の分布。
a：正常マウス…第8胸故から第5腰証までの広い範囲にわたって同側の前角に多数の標識細胞が観察された。胸誌レベルで、反対側の前角にも少数ながらHRP標識細胞が見られた。b：ヘテロマウス…正常マウスのものと比べて、同側の前角における標識細胞数はやや少ないが、それらの分布はほぼ同じである。いっぽう、反対側の前角細胞は正常マウスにおけるよりも多数標識された。C：pmマウス‥・第11胸鎚から第4贋造
までの同側の前角細胞が標識された。反対側の前角細胞は、全く標識されなかった。
DL，dorsolateral nucleus；DM，dorsomedial nucleus；VL，VentrOlateral
nucleus；VM，VentrOmedial nucleus；LS，lumbosacral nucleus

構成されているので第1腰誌の観察結果は胸鉱の項に含めた（図11a））。
腰誌では、その前角細胞群は主としてventrolateralnuclei（VL），dorsolateral nuclei（I）L）および1。mb。SaCralnucl。i（LS）より構成されてお。2ミ 標識細胞の舐節内分布をみると、DLは同側の第2腰鎚から第4腰誌まで分布し、第3腰酷で極めて多数標識された。
VLは、同側の第2−5腰証において標識され、その数は第4腰証をピークとする分布を示した（図11a）。
LSは、同側の第2、3腹鼓で標識された。これら腰誠における標識細胞はすべて大型の多極細胞であった（図12b）。
また正常マウスの4例中1例に第9、第10胸紛こおいてHRP注入側と反対側（左側）のDMの若干の細胞にも標識細胞が観察された（図128）（表2a）。
2）へテロマウスでは、同側の前角における標識細胞の分布は正常マウスとほぼ同じであったが、標識細胞数は正常マウスに比べやや少なかった（図10b）。
証節内分布をみると、正常マウスに比べ胸酷におけるDM、膜誠におけるVLでの標識細胞数は

−22−

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図12．a：胸能におけるHRP標識

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細胞。反対側のDMも標識さL lれている。小型の紡錘形細胞

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である。

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b：腰能の同側のVLおよび

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図11．前および外側下腿筋群のHRP法により標識された同側の前角細胞の分節内分
布とその数（棒グラフの数値は、同側の前角における標識細胞数の平均値を示す）。
a：正常マウス…胸髄と腰髄にそれぞれピークをもつ二蜂性分布を示す。b：ヘテロマウス…正常マウスと比べて、胸髄のDMと腰髄のVLでの標識細胞数が少ない。e：p7協マウス…胸髄における標識細胞数が著しく減少している。
DL，dorsolateral nucleus；DM，dor−somedial nucleus；VL，VentrOlat，eral
nucleus；VM，VentrOmedial nucleus．

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DLが標識されている。大型の多極細胞である。

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表2．HRP法による脊舐前角での標識細胞数のまとめ。数値は各caseごとの各舐節での標識細胞数であり、（）内の数値は反対側の前角における標識細胞数を示す。
a：正常マウス…caSe4で反対側の前角細胞も少数ながら標識されている。b：ヘテロマウ
ス＝‥㌧naSe1，3，4で反対側の前角細胞も標識されている。e：pmαマウス‥・反対側の前角細胞は全く標識されない。

減少しているものの、第4、第5腰砿DLにおける標識細胞数は正常マウスにおけるそれより多数であった（図11b）。
さらに、ヘテロマウスでは高頻度に（4例中3例）反対側の前角細胞にも多数の標識細胞が観察された（表2b）。
3）pmαマウスでは、同側の第11−13胸誌と第2−4腰掛こおいて標識されたがその標識細胞数は正常マウスやヘテロマウスに比べ著しく少なかった（図10e）。とくに胸誌における標識
細胞数が著しく減少しており、胸髄で全く標識されないものも見られる（表2e）。
紘節内分布をみると、胸鎚レベルのDM、VMと腰舐レベルのVLでの標識細胞数が著しく減少
している反面、DLでの標識細胞数は正常マウスやヘテロマウスでのそれらよりも多数であった（図10C）。
反対側の前角細胞は、全く標識されなかった（表2e）。

Ⅵ．考察

従来、変性実験などにより、マウス前および外側下腿筋群は第4−6腹鼓の前角細胞より運動支ー24−

配を受けていると考えられていた3としかしながら最近開発された逆行瞳軸索輸送を利用したHRP遠）亀用いて再検討を加えたところ、従来考えられていたよりも幅広い範囲の脊弘前角より運動支配を受けていることが明らかとなった。
すなわち、これらの筋群は同側の第8胸証から第5腰鉦までの広い範囲の前角細胞より神経支配を受けており、さらに胸髄における反対側のごく少数の前角細胞からも神経線経を受けており、両側性支配のあることが判明した。
上述した正常マウスにおける標識前角細胞の分布と比べてみると、ヘテロマウスでは、胸詭レベ
ルのDMにおける標識細胞数の減少が目立ち、四股マウスでは、胸槌のVM、DMにおける標識細胞数が、ともに著明に減少していることが判明した。
またヘテロマウスでは、主として胸能で反対側の前角細胞にも、かなり多数の標識細胞が観察されたが即はマウスでは反対側の前角細胞は全く標識されなかった。
以上の事実から、このpmαマウスの病因のひとつとして胸髄レベルにおける支配ニューロン′の減少によることが推測される。
今まで述べたpmマウスの所見をまとめると、（1）HRP標識細胞数はとくに下位胸舐レベルで著明に減少している。
（2）総排骨神経が肉限的に認められない。
（3）俳腹神経は、正常マウスのそれよりも太い。
（4）前および外側下腿筋群のほとんどは神経原性萎縮を示し、脂肪組織におきかわっているところもみられるつく5）前および外側下腿筋群のうち萎縮や脂肪変性を免れた筋組織には、神経筋終板および末梢神経が存在する。
故に、このpmマウスは脊駐前角細胞より末梢の下位運動ニューロンの異常により発症した麻痺性内反足マウスである。
なおへテロマウスで、胸鈷レベルで反対側の前角細胞にもかなり多数の標識細胞が観察されたという事実のもつ意味を説明するのは困難ではあるが、ひとつには同側の前角細胞の揆能異常を反対側で代償しているとも考えられるが証拠はない。

Ⅶ．モデルとしての有用性
pmマウスは、前述のごとく整形外科領域で関心の高い先天性内反足の疾患モデルでなく、むしろ、（1）青砥前角細胞の減少と総誹骨神経の欠損、すなわち下位運動ニューロンの異常が主である。
（2）支配筋（前および外側下腿筋群）に神経原性萎縮がみられる。
（3）常染色体劣性退転を示す。
（1）｝3）の特徴は青砥性進行性筋萎縮症（SPMA）、神経性進行性筋萎縮症（Charcot−Marie−
Tooth病）などの主として下位運動ニューロンに異常をきたす疾患モデルになると考えられる。し

−25−

かし、
（1）生下時よりすでに発症していて、症状の進行が明らかでない。
（2）末梢神経、筋肉の病理学的変化にも明らかな進行はみられない。
（3）脊髄に萎縮や変性や脱証所見を認めず、また再生を示唆する所見もない。
これらのことは、進行性の変性疾患を考える上で矛盾する点であるが、pmαマウスにおいては、胎生初期に変性が進行してしまったとも考えられる。
また整形外科領域で難病のひとつとされる多発性関節拘縮症の病理所見として、（1）脊詭前角細胞の減少がみられるが、変性や脱紘あるいは炎症所見はない。
（2）羅患部の骨格筋に神経原性萎縮をみることがある。
以上の所見が本症のヒト胎児の剖検にて報告されている。
pmαマウスでは両足関節以外の関節に拘縮や変形など認められず、臨床症状は異なるが病理変化
はヒト多発性関節拘縮症に類似している点もあるので、この疾患との関連性も検討する必要があろ
フ0

Ⅶ．関連する他のモデル動物
マウスでは、1959年Robins7）が発表した先天性内反足モデルマウスがある。このマウスは同腹の正常マウスより体が小さく、下腿筋は萎縮していて個々の筋肉を分離することが困難であり、骨格異常として足根骨の癒合がみられたと報告している。また常染色体劣性遺伝を示すなどpmαマウスと類似した点が多いが、詳細な研究はなされていないようである。
遺伝性の神経筋疾患を持つ突然変異マウスは現在まで100種以上あるとされている。その中には日本で発見されたrolling mouse Nagoyaのような運動失調を特徴とするものやfalterのように麻痺が進行して死亡するものもある。しかし、pm協マウスのように生下時よりすでに発症していて、麻痔は後肢に限られ、症状の進行がほとんどみられないマウスは前述のRobinsのマウス以外には文献的に見当らない。
マウス以外では1968年Nixon6）がみつけた後肢のみに進行性麻痺をきたすSyrianハムスターが有名である。Pmaマウスと異なる点としては、（1）sex−linked mutationで雌に発症しない。（2）麻痺は生後6−10カ月頃より出現して進行する。（3）麻痺は痙性である。（4府故に変性所見がある。
類似点としては、（1）麻痔は後肢のみに限局される。（2府誌前角細胞の減少を認める。などがあげィヌでは1979年山内ピ）が発表した神経性筋萎縮症モデルや、1979年C。rkl）がH。redita，yCanine spinalmuscular atrophyとして発表したものなどがある。これらはいずれも生後4−5カ月頃より発症し、麻痺は進行性で全身に拡がることなど即氾マウスとは異なる。
このp7naマウスは多発性関節拘縮症やCharcot−Marie−Tooth病など、下位運動ニューロンおよび骨格筋の異常をきたす疾患を研究する上で、また脊舐、末梢神経、骨格筋の分化、発育を研究する上で貴重なモデルと考えている。

ー26−

文

献

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ー27−

I−3．pmαマウスの病因に関する病理組織学的研究埜 中 征 故事研究協力者 豊福照子，多田愛子
総誹骨神経支配下の前・外側下腿筋群の選択的萎縮を認める遺伝性マウスが江崎らにより見出さ
れ、pe，。nealm。SC。1a，at，。bhy（p，n。）マウスと命名されたま）これらのマウスでは、後肢の内反足が生下時よりみられるが、症状は非進行性であることより、総誹骨神経支配下の筋の形成不全が推定されてきた。事実これらの動物では総俳骨神経の欠如が認められている。中村ら2）は詳細な病理学的検索を行い、総俳骨神経の欠如は青島前角細胞の異常に起因するのではないかと推論し、このマウスはヒト先天性多発性関節拘縮症のモデル動物となりうるだろうとした。
我々は今回即妃マウスの骨格筋を再度組織化学的に検索し、また青島前板の有鉱神経のヒストグ
ラムを作成し、即埠マウスの病因につき検討したので報告する。

対 象・方 法対象としたのは生後2−3月のpmαマウスと同系（CF＃1）正常マウスである。
骨格筋の検索は萎縮の著明な前脛骨筋、長指伸筋、それと外見的には正常なヒラメ筋、排腹筋である。正常マウスからも同じ筋をとり出した。筋は横断面が得られるように液体窒素で冷却したイ
ソベンタンで凍結し、組織化学染色用に10JLの連続切片を作成した。切片にhernatoxylineandeosin（HE）、mOdified Gomori trichrcme，NADH−TR，ATPase（routine，pH4．5，4．3）、aCetylch。lin。Ste，aSe（AchE）、酸フオス77クーゼ染色を行った3）またグルクー
ル固定後の筋束にもAebE染色をし、運動終板の存在を確めた。
萎縮した前脛骨筋の一部は電子顕徴鏡検索用にカコジル酸ナトリウム緩衝グルタールアルデヒド固定を行った。固定後同緩衝液で洗源、OsO．液にて後固定、アルコール脱水、エポキシ樹脂に包埋した。
脊誌前根、末梢神経検索のためにはマウスを全身麻酔下に開胸し、左心室よりグルタールアルデ
ヒド液を注入、擢流国定した。固定後背誌をとり出し、第3、第4腰誌前根、坐骨神経をOs04で後固定し、エポキシ樹脂に包埋した。1J 厚切片にトルイジンブルー染色を行い、最終倍率×1．000の写真を作成、横断面での有鎚神経総数、神経線維径を測定した。

結果（1）萎縮筋の組織学的、組織化学的所見
萎縮筋（前脛骨筋、長持伸筋）は大半のpmαマウスで正常のHo以下と細く線維化のため白く弾力性に乏しかった。横断面でみると筋線維径が10／ 以下のものが大半で結合織に埋もれたように
事国立武蔵療養所神経センターー29−

存在した（図1）。また脂肪織も増加していた。細い筋線経はしばしば胞体の中心に大型で円形の

図1・ク服マウスの前脛骨筋。筋線経は細く結合織に埋没したようにみえる。核は大きく円形で、胞体の中心に位置する線維（矢印）が多い。脂肪組織（f）も増加して
いるo HE，×800．

核をもっていた。このように強く侵された筋では連続切片でみてもAehEの活性はなく運動終板の存在は確認されなかった。そこで前脛骨筋全体をグルタール固定L
AehEの活性をしらべたが、Pmα
マウスでは全く活性がみられなかった（図2）。
萎縮筋が比較的よく保たれた筋では筋線経は太く、その数も多かった。しかしこのような比較的軽症例は極めてまれであった。軽症
例ではAehEの活性がわずかにみられたが（図3）、正常に比べるとはるかに活性は低く、その範囲も狭かった。またNADH−TR染図2・即旭マウスの萎縮筋（A）には対照筋（B）にみられるようなAchE活性（矢頭印）の部がみられない。長指伸筋、グルタールアルデヒド液固定、AehE染色、
×100．

−30−

¶ト

宣∴ごむ諷

図3．比較的よく保たれた筋をもつpmαマウス（A）ではAehE活性をわずかに認める（円内）が、対照（B）のAehE活性部（矢印）に比べるとはるかに活性は低い。
長指伸筋、AehE，×400．

図4．比較的萎縮の軽いp諏αマウス（A）でも対照（B）のように酸化酵素反応で分別できるような筋線維タイプの分化はなく、→様に高い活性を示している。長
持伸筋、NAI）H−TR染色、×400．

−31−

色でみると重症例と同じく筋線経は一様に高活性を示し、正常のような高活性と低活性の筋がモザイクをなして存在する像は得られなかった（図4）。すなわち筋線維タイプの明らかな分別がみられなかった。また細胞内の網目様構造（intermyOfibrillar netwotk）も整然とせず不規則であり、
筋原線経の配列異常が推定された。Centralcoreはみられなかった。
細い10／∠径以下の筋線経はATPase染色のアルカリ、酸性前処置いずれにも濃染しいわゆるタイプ2Cの反応を示した（図5）。やゝ大径の筋線経が時に混在したが、それはしばしば分化した
タイプ2Aの反応を示していた。

A・−
図5・Pnaマウス萎縮筋はアルカリ前処理のroutine ATPase（A）でも、酸性側（pH43）
処理（B）でも濃染するいわゆるタイプ2C反応を示す。前脛骨筋、×400．
叩αマウスのヒラメ筋、俳腹筋には著明な変化は見出せなかったが、一匹のみ排腹筋に神経原性変化（軽いfiber type grouping）を認めた。

（2）電子顕微鏡所見
筋線経は細かったがほとんど全てに筋原線経の形成をみた（図6）。筋核は大きく、しばしば明瞭な核小体を認めた0筋内にはまれに有魂神経を教本みるのみであり、神経筋接合部の存在は確められなかった。筋衛星細胞の増加はみられなかった。
筋原線経の形成はあっても筋原線経が極めて少くミトコンドリアが集塊した線維（図7）、Sar−
eomereが十分に形成されず帯構造が全くみられない線維（図8）が多く混在した。ネマリン小体は存在しなかった。

ー32−

図6．pmαマウス萎縮筋の電子顕微鏡像。筋線維径は小さく胎児期の筋（筋管細胞）に似るが筋衛星細胞の増加はない。前脛骨筋。

図7．叩αマウスの萎縮筋では写真下にみられるように帯構造がかなり形成されたものもあるが、上部の筋のように筋原線経があまり存在しないきわめて未熟な感じ甲する線経が多数混在する。前脛骨筋。

ー33−

図8・筋原性はかなり存在しても帯構造の形成がきわめて悪い線経も多く存在する。
pmαマウス前脛骨筋。

（3）末梢神経所見
マウスの脊髄根はその高さ（第3〜第5膜砿）を決定し、坐骨神経は本幹の最近位部を選んだ。
しかし個体差、採取の位置などによりその値の偏差が大きく数量的な検討を加えるには尚検体数が必要であると考え、この報告からは除外した。
pmαマウスには著明な左右差の存在するのがまれにいる。今回、左後肢は全く正常、右後肢は典型的pmαマウスという例をpmα×C3H／鮎の子孫より得ることができた0このマウスの左前脛骨筋・長指伸筋などは組織学的に全く正常であったが、右後肢では総俳骨神経は肉眼的には確認しえず・その支配下の筋は押αマウスにみられるのと共通の所見を示した（図9）。このような例では個体差を考慮する必要はないし、また固定などの条件による差も考慮にいれる必要はなく、左と右の神経を数量的に比較するのみで明瞭な解答が得られる利点がある0そこで一検体ではあったが、有能神経数を数えその直径を計測し、左右で比較した。
第3、第4腰証前根、坐骨神経での計測値は表1に示した0蓑でみられるように有髄神経の総数、
平均直径・偏差値には左右比較し有意の差はなかった0組織学的にみても、左右ともに神経線経の脱落・変性像はみられなかった（図10）0また正常マウスの脊髄前板と比較してもその形態に差はなかった。
有故神経線維径のヒストグラムを作成し、線維径の分布をみたが、第3腰肱、第4膜髄（図11）、
坐骨神経（図12）、いずれでも左と右を比較して有意な差は認められなかった。また脊髄横断面ー34−で左右とも前角細胞の脱落、変性の所見は得られなかった。

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一

図9．同一個体で左後肢は正常、右後肢は内反足を示したマウスの前脛骨筋。
左（L）と右（R）で筋線維径が著しく異ることがわかる。HE，×800．
表1．左右差のあるpmαマウスの脊髄前根、坐骨神経内の有能神経線維総数と直径
部

位

第

3

膿 髄

第

4 腰

総

左

（健 常 側 ）

数

直

径

（〟）

総

右

（躍 患 側 ）

数

直

径

（
〟）

7 4 2

5．
9 6 ± 2．
5 8

6 9 2

5．
5 8 ± 2．
5 4

髄

8 3 5

5．
4 7 ± 2．
2 6

8 6 3

5．1 6 ± 2 ．
1 8

坐 骨 神 経

4，
0 5 7

4．
3 0 ± 2．
2 4

4．
2 7 6

3．
0 3 ± 3．
3 1

図10．1図9と同一マウスの第4腰髄前根。健常在左（L）と萎縮側の右（R）を比較しその間に何らかの形態学的差を認めない。有髄神経の数、径、密度とも等しい。エボン包埋切片、トルイジンブルー染色、×600．
−35一

2

4

6

81012ド

2

4

681012ト

図11・左右差のあるp7妃マウスの第4腰龍前板有舐
神経線維径ヒストグラム。

Total：4057

2

4

6

Total：4279

81012ll

2

4

681012ll

図12・左右差のある押αマウス坐骨神経有誌神経線
維ヒストグラム。

考察

pmαマウスでは・総俳骨神経の先天性欠如が最も大きな形態学的変化としてみられることは江崎らll中村ら2）によりすでに確認されている。総排骨神経によって支配される筋（前脛骨筋、長指伸筋、長母指伸筋、長排骨筋、短排骨筋、第4および第5指俳骨筋）は細く、ほとんど索状に近い。
個々の筋の同定は可能で少くとも前脛骨筋、長指伸筋は個々にとり出すことができるので、これらの筋は無形成ではなく低形成であることがわかる。
これらの筋を組織学的に検索すると、筋線経は細く、核は大型で胸体の中心部に位置し、胎生期の筋、すなわち筋管細胞に酷似する。組織化学的にも未分化なタイプ2C反応を示した。

ー36−

ヒトを含め多くの晴乳煩で胎生早期の筋は組織化学的に赤筋（タイプ1）、自筋（タイプ2）の分別がない。ヒトでは生下時にはゞ筋線維タイプは分化した形をとっているが、ラットではまだ未分化である告5）皿Pas。染色でみるとこの未分化な線経はアルカリ前処理、酸性前処理何れでも活性を失わない（分化したタイプ1線経はアルカリ前処理で活性を失い、タイプ2線経はpH4．6で活性を失うタイプ2A線経とそれ以下のpHで活性を失うタイプ2B線経が存在する）06）このようなタイプ1と2線経の分別のない未分化な線経はタイプ2C線経と呼ばれている。ラットでは生後急速にこのタイプ2C線経から分化したタイプ1、2A、28線経に分化するがさ）生下時に坐骨神経を切除すると筋線経は小径のまゝ残りモ8）また対照に比べ長くタイプ2C反応を持続し7）なか
なか分化した形とならない。すなわち筋線経がタイプ2C線経からタイプ1、2A、2B線経へと分化するには神経の支配が必要であることを意味している㌣9）叩マウスの萎縮筋がタイプ2C反応を示したことは、これらの筋が神経の支配をうけていないことを裏づけている。萎縮筋にAehE活性が見出されなかったこと、電子顕微鏡的にも有髄神経がほとんどなく、運動終板が確認されなかったことは、肉眼的に総排骨神経が欠如していたことと考えあわせて、この筋萎縮は神経支配の欠如に由来すると結論できる。まれに萎縮筋内に正常にやゝ近い筋線経が存在し、タイプ2C線経
でなく分化した形をとるものがあったことは、総俳骨神経の完全欠如例ばかりでなく部分欠如例のあることを示している。
筋が分化する以前に脱神経をうけたため、筋線経の多くが小径で未分化な状態で持続する疾患に
we，dnig−H。ffmam病がある三）p，naマウスの萎縮筋はAchEの活性はないがWerdnig−H。ffmann病では存在するので、後者の筋は一度神経支配をうけその後脱神経をうけたと考えられる。そのよ
うな多少の相違点はあっても、PTnaマウスの萎縮筋はⅥ屯rdnig−Hoffmann 病罷恩筋の病態を知る上に重要な情報を与えてくれるものと思われる。
総排骨神経の欠如を説明するものとして①脊駐前角細胞の異常（無一低形成）、（参総誹骨神経へと分岐する部での異常、④一度できた総俳骨神経が変性脱落、の3つの可能性が考えられる。もし
青島前角細胞の異常であり、総俳骨神経を支配すべき神経細胞が欠如しているとするならば腰誌下部の前板有舐神経線経が減少しているはずである。例えばⅥ穐rdnig−Hoffmann病や、筋萎縮陸側索硬化症では前角神経細胞の減少と平行して前根有誌神経線椎の変性脱落がみられ、その数の著明な減少がある㌘）pmマウスでは第3、第4腰誌で前棍内有琉神経を検索したが、数、直径に何ら変化なく、また変性所見もみられなかった。さらにそれ以下の坐骨神経本幹でも有舐神経に何の変化もみられなかった。この事実は少くともpmαマウスは脊組前角細胞の異常による疾患でないことを示している0
また坐骨神経のどの郡にも有島神経がよく保たれていたことは④の総排骨神経の退行性変化の可能性も否定できる。もし（参であるとするならば、坐骨神経に何らかの逆行性病変が存在するはずだか
らである。
以上の結果から叩αマウスは総排骨神経へと分岐するはずの神経束が分岐せず、他の神経束と迷走している可能性が強くなった。他の神経へというと誹腹神経が最も可能性が高い。pmαマウスで−37−

はこの俳腹神経が異常に太いことが指摘されていることはその可能性をさらに強くするが、総排骨神経となるべき神経束が俳腹神経と共に走行しているとしても、どこに終っているかは不明である。
さらに、何故総俳骨神経が分岐しなかったのか、それは筋自体に責任があるのか、あるいは神経系に責任があるのか今後解明すべき大きな問題である。
何れにしてもこのpmαマウスは発育期における神経と筋の相互作用を知る上に、また神経と筋線
経の発育分化の関係を知る上にも重要72：モデル動物であることは疑いがない。またWerdnig−Hoff−mam病や先天性多発関節拘縮症の病因、病態を知る上にも極めて有用なモデル動物と考えられる。

ま

と

め

pmαマウスでは総俳骨神経支配下の筋は索状に細く、筋線経は未分化で胎生早期の筋の組織学的、組織化学的特徴をもっていた。筋内に有塩神経がきわめてまれにしかみられなかったこと、筋線経にAchE活性がなかったことより、これらの萎縮筋は神経支配をうけなかった結果発育、分化しなかったと考えられた。筋萎縮の著明なて川はマウスでも下部腰縫前校内、坐骨神経内の有砿神経総数、直径とも対照に比べ差がなく、病理学的変化がみられなかった。このことはpm灯マウスでは脊砧前
角細胞、前板、総排骨神経分岐郡より中枢側には異常なく、分岐部以下の異常であると推定された。
総俳骨神経がなぜ分岐しなかったのか、分岐すべき総排骨神経はどこイこ終っているのか、今後解決すべき大きな課題である。

文献1）江崎孝三郎，安田幸雄，中村昌弘，林宏，小野啓郎：遺伝陸前・外側下腿筋群萎縮マウス，
実験動物，30：151−155，1981．
2）中村昌弘，林宏，倉田陽一，大川敦子，小野啓郎，遠山正弥，塩坂貞夫，江崎孝三郎，安田幸
雄：運動ニューロ【：／疾患モデル−遺伝性歩容異常マウスの神経解剖学的研究−．神経進
歩，25：229−239，1981．
3）Dubowi亡Z，Ⅴ．＆Brooke，M．H．：Muscle Biopsy．A Modern Approach．

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4）岡田理美，埜中征読，石浦章一，杉田秀夫：ラット筋線経の発育・分化に関する組践化学的研究．神経内科，15：363−370，1981．
5）Brooke，M．H．，Williamson，E．＆Kaiser，K．K．：The behavior

Of four fiber typesin developing and reinnervated叩SCle．
Arch．Neuro1．，25：．360−366，1971．
6）Brooke，M．H．＆Kaiser，K．K．：Muscle fibre types：How manyand dla亡kind？Arch．Neuro1．，23：369−379，1970．

ー38−7）埜中征裁，Chou，S．M：Wbrdnig−Hoffmann病羅息筋の組織化学的検討一実験動物との対比を中心として−．臨床神経，18：491−498，1978．
8）Engel，W．K．＆Karpa亡i，G．：tmpaired skeletal rnuscle ma亡ura．
tion following rleOnatal neurec亡Omy・I）ev・Biol・）17：713−723）
1968．
9）工shiura，S・，Nonaka，工・，Sugi亡a，H・＆Mikawaク

T・：Effect of

denervation of neonatal rat sciatic nerve on the differentia−
tion

of

myosininasinglemusclefiber・Exp・Neurol・タ

73：487−495，1981．
10）Chou｝S・M・＆Nonaka，工・‥Werdnig−Hoffmann disease：Proposalof a pathogene亡ic mechanism．Acta Neuropathol・（Berl・），41：
45−54，1978．

−39−

卜4．pmαマウスの病因に関する発生学的検索
＊

弘弥郎

＊
＊
＊
＊

＊

三

昌正孝

村山崎

中遠江

はじめに
pm皿マウスの後肢の異常は出生時にすでに発症している。このマウスの異常発症時期を知ること
は本症の病因の解明にとって重要なことであると考えられる。本研究ではpmマウスの発生の各時．期の組織学的検索をおこない、正常マウスと比較した。

材料と方法
posterior footplateが分化してくる胎生12日（Stage20）および四肢が急速な発達を遂げる胎生13日（Stage21）を主眼において、胎生10日（Stage16）から胎生16日（Stage24）のpmαマウスおよび正常マウスの胎仔の後肢の肉眼的および光顕的観察を行い、骨格筋や末梢神経の発生、分化について比較検討した。

結果

胎生10日（Stage16）ではp7naマウス、正常マウスともに体長3−4mで、hindlimb budがやっと現われたところである。
後肢と呼ぶべきものもなく肉眼的観察で両者に差はない。
胎生11日（Stage18）では両マウスともに体長約5−6mとなるがやはりhindlimb budの段階にあり、後肢と呼ぶべきものはない。
胎生12日（Stage20）
p7naマウスの胎仔は体長約8mで足（posterior footplate）が下腿より分化してくる時期にあたる0正常マウスの胎仔も体長約8mmで、やはりposterior footplateが下腿より分化しており、ともに外観上の差異はない。（図1．胎生12日の胎仔、a：pmαマウス、b：正常マウス）
後肢の連続横断切片（約4／りを作製し、HEおよびボディアン染色を施行した。
光頭にて観察したところ、骨格筋の分化は見られず、総排骨神経はじめ脛骨神経、俳腹神経などの末梢神経を同定することができない（図2．胎生12日胎仔の下腿横断面。HE染色。a：pmα
マウス、b：正常マウス）。

・大阪大学医学部整形外科
・・大阪大学医学部高次神経研
・・＊実験動物中央研究所ー41−

胎生13日（Stage21）
両マウスともに体長約10汀m
で、前肢後肢ともにその長さを増している。外観上両者間に著明な差はない。（図3．月姓13
日胎仔、a：pmαマウス、b：
正常マウス）

下腿横断面で、骨格筋が分化の途上にあるがまだ明瞭に個々の筋肉を同定することができな
い。pmαマウスの胎仔では、その前および外側下腿筋群にあた
図1．胎生12日胎仔。a：pmαマウス、b ＝正常マ
ウス…ともに体長約8mmL。外観上後肢などに差を認めない。

る部位の組織学的観察でも特別の異常は認めない。末梢神経では、脛骨神経、俳腹神経は見られるが排骨神経は既にない。他方正常マウスではこれら三つの末梢神経が明確に観察される。
（図4．胎生13日胎仔下腿横断面。a：p肌αマウス…脛骨神
経、俳腹神経は見られるが、誹骨神経は観察できない。b：正常マウス）。
胎生14日（Stage22）では体長約11〜12〝爪で、fooいplateで個々の指が分離してくる0
両マウスとも、下腿横断面で

図2・胎生12日胎仔の下腿横断面。a：p仇αマウス、
b：正常マウス‥・骨格および筋肉の分化はみられない。

の骨格筋および末梢神経の所見
は胎生13日の胎仔と同じである0

胎生16日（Stage24）
体長14〜17rmで正常マウスの16日胎仔と比べpmαマウスでは下腿筋の発育が全体に悪い。
とくにその前および外側下腿筋群に、筋組織が見られるもののそのmuscle volumeに比べ著明に減少している。

−42−は正常マウス

図3．胎生13日胎仔。a：叩αマウス、b：正常マウス‥・
体長約10mmで四肢に著しい発育を見る。両者を比べて、外観上後肢に差異を認めない。

図4．胎生13日胎仔の下腿横断面。
a：pmαマウス、b：正常マウスoT，脛骨。F，俳骨。tn，脛骨神経。Sn，排腹神経。
pn，排骨神経。pmαマウスでは、既に排骨神経が見
られない。
考

察

叩妃マウスは胎生初期の後肢が分化してくるStage21（胎生13日）で既に排骨神経の分化が見られない。この時期に骨格筋は正常マウスと比べ大きな差は認めない0以上より、まず神経側に第一の病因があり、骨格筋の変化は二次的なものと推測される0−43−

卜5．pmαマウスの生化学的解析
北

浦

小

浜

孝＊
一

弘‥

はじめに
ヒトの疾患モデル動物としては、筋ジストロフィーマウスや自然発症高血圧ラットをはじめ数多
くのものが知られている。我々は最近新しく発見された歩行異常を呈するpmαマウズ）の成因と疾患モデルとしての評価を行うために、筋肉および血清の生化学的解析を行ったので報告する0
筋肉に関しては、2種煩（速筋型と遅筋型）の収縮特性が古くから知られており、それは筋肉を構成する筋蛋白の種煩に依存して決定されると考えられている0中でも収縮蛋白と呼ばれるものの1つであるミオシンは最も重要なものと考えられ、速筋型ミオシンと遅筋型ミオシンの存在量が筋肉の収縮特性を決めると考えられている。また、この他にも制御蛋白と呼ばれるものとして、■トロ
ポミオシン、トロポニソなどが知られており、これらも収縮特性と何らかの関係があると考えられている。従って、本研究ではこれら諸蛋白の筋肉内における質量的変化および差を正常なものと比較することによって検討した。
筋肉はまた収縮のためのエネルギー代謝を必要としており、そのシステムの違いにより有酸素的
代謝型と無酸素的代謝型にも分類できる。疾患のある細胞では代謝異常の発生が考えられるところから、この点についても収縮特性と同様に検討を行った。
また、器管の異常は多くの場合血液成分の変化として反映され、疾患の程度や臓器特性が明らかになる場合がある。従って、血液特に血清成分の検討も試みた。

方法と材料
江崎らの報告にもあるように、pmαマウスは前・外側下腿筋群に異常を皇するところから、我々は、下腿筋群の筋蛋白の分布パターンを第づこ調べた。マウスはベントパルビタール・ソーダを腹腔内投与（40呼物）し、深麻酔後、頚動脈からの放血により処置した0放血した血液の一部は血清成分の分析に用いられた。マウスは、pmαマウス及び正常な同腹のマウスが対照（Control）として用いられた。また、正常なものは、特に発育の基礎資料として、発育段階の異なるものが余分に調べられた。
下腿筋群は、最も異常の大きいと思われる前脛骨筋（Tibialisanterior muscle）と外見上も組織学上も異常の認められない足底筋（Plantaris muscle）とヒラメ筋（Soleus muscle）が調べられた。各々の筋を、ガラスホモジナイザーにより試料調製液（A）−（9・5M Urea、2界
NonidateP−40、5界

2−MercaptDethan01、1・69らAmpholine（pH5−7）、0・49らAm由Oline・金沢大学教養部…東京大学医学部ー45−

（pH3・5−10））とともに均一化した後、等電点電気泳動（IEF）とSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を組み合わせた二次元電気泳動法により分画を行った。二次元
電気泳動法は基本的には0′Farrell（1975）の方法2）に従った。分画された筋蛋白はCoomassie
brilliant blue法により染色を行った。また、遅筋の代表として知られるヒラメ筋はマウスの場
合、遅筋型綻経と速筋型線維及び中間型線経の存在が認められており 、発育に伴って、それらの量的関係が変化することが考えられている。発育状態を検索するために、単一筋線維（Single mus−cle fiber）についても、上記とほぼ類似の方法により調べた。染色は、蛋白量が微量なため、oakleyら（1980）による銀染色法3）に従って行った0筋蛋白の同定は、既知の蛋白を抽出・精製した後 eo一migrationを行って同定した。
筋肉はまた、代謝特性を知るために、別の試料溶液（B）−（0．1M KCl，5mM MgCl2，1mM
EDTA，50mM Tris−HCl buffer，PH7tO）において均一化を行い、600×g

にて10分間遠心をした後上宿を乳酸脱水素酵素（LDH）の7イソザイム分析にかけた。LDHは筋肉型（M−type）と心臓型（H−type）の二種のアイソザイムがあり、前者は細胞の無酸素的代謝と関係が深く、また後者は有酸素的代謝と関係があると考えられており、それらの細胞内における割合が、その代謝特性を表わすと考えられている。LDHの分画は、DietzとLd）ranOの方法（1967）4）に基本的に従って行った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画されたアイソザイムは、テ
トラゾリウム塩を用いる活性染色法により可視化し、デソシトメーターにより定量した。更に、単一筋線経の特性を知るために、一部の筋の単一筋線経においてもLDHのアイソザイムの検討を行
い、収縮特性と代謝特性の関連性についての検討もあわせて行った。
血清成分の分析は、臓器特性を知るためのスクリーニングとして行い、ヒトの臨床検査においてもよく調べられる、LDH，a−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（d−HBDH）、クレアチンキナーゼ（CPK）、グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ（GOT）およびグルタミン酸ピルビン
酸トランスアミナーゼ（GPT）の活性を酵素法により測定した。

結果

一般的に知られている哺乳類の骨格筋における二次元電気泳動法によるモデルパターンを図−1に示した0通常速筋型（Fast−type）は分子量4万3千以下の酸性の筋蛋白としてアクチン（Actin，A）、a型ト。ポミオシン（a−Tropomyosin，a−TM）、速筋型ト。ポニンC（f−Troponin C，fTN−C）を1種頸づつ、そして3種煩の速筋型ミオシン軽鎖（f−Myosin Light
Chains，fLCl，fLC2，fLC3）を持ち、遅筋型は、アクチン（A）、J9型トロポミオシン（J3−TM）、遅延型トロポニソC（sTN−C）を1種煩づつと、2種煩の遅筋型ミオシン軽鎖（S一恥osin
Light Chains，SLCl，SLC2）を持つと考えられている。両型を混合すると図−1の中央下に示すようになり、各々の異種性を同定することができる。正常（Normal）な群とpmαマウス
群における筋全体の分画バクTソを速筋としての前脛骨筋（Tibialisanterior muscle）は図−
2、足底筋（Plantaris muscle）は図−3、そして遅筋としてのヒラメ筋（Soleus−46−

MODELPATTERNOFADULTSKELTALNUSCLEPROTEMS

BY2−DIMEN引ONAL ELECTROPHORESLS（rEF／SE）S−PAQE）
Sbw

Fast
にF＿

︼○く1−ODdl

OH￣

OH￣

OH￣

■ト一一

旺F＿．．

uOY1−の凸dl▼

図1．2次元電気泳動法による筋蛋白のモデルパターン
musele）は図−4に示した。これらの筋でNormalとpmαを比較すると、異常の最も著明なTibialis anteri。rmuSCl。（図−2）の5週齢において、Normalは図−1に示すようにミ
オシンがほぼ速筋型であるのに対し、P7naではfLClに対するsLClの存在比が大きく、またTN−Cにおいても遅筋型のsTN−Cが存在しており、筋蛋白の分化の遅れまたは異常が示唆されている。驚くべきことに、一見正常に見えるSoleus muscle（図−4）においても同様なことが発見された。遅筋としてのSoleus muscleは発育に伴ないSlow−typeの蛋白成分が増加するのが普通であるのに対し、図−4の5週齢におけるミオシン軽鎖成分がpmαにおいてはNormalよりFast−tyPeのものが多量に存在しており、またTN−Cにおいてもp7naでFast−tyPeが多く存在し′・分化が遅れていることを示していた。しかし、Plantaris muscleではそのような差は見られなかった。これらは障害のある部分はもちろん、正常に見える筋、特に遅筋のSoleus rnuscleでも蛋
白質の遺伝子発現が異常になっていることを示すものである。Soleusmuscleの単一筋線経で調べた場合には、図−5に示すような2種類の存在が認められただけで、Nomalもpmαも細胞は正常であることが確認され、図−4の示す結果はこれら2種頬の存在量の違いによるものと考えられた。このような分化の遅延はpmαの正常な筋では少くとも2ケ月齢までで、以後はNomalと同じような分化が認められた。しかし、異常のあるTibialis anterior muscleでは一定した変化が認められなかった。
次に、代謝特性を示すLDHのアイソザイムパターンを示す（図−6）。ここでは、長指伸筋（Extensor digitorumlongus muscle）、Tibialis anteriormuscle，Soleusmuscle・心筋（Cardiac muscle）と血清における結果を示した。図−6から明らかなように、萎縮の著しいEDL，TIBの活性が顕著に低くなっている。これらの結果を表−1にまとめた0表−

ー47−

WHOLE MUSCLE PROTEINS PATTERN OF
TIBIALIS ANTER10R MUSCLES FROM NORMAL＆PMA MICENORMALほF・一一」ト

十

PMA
十

一−tEF

一

3−Wk−OIdi

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5−Wk−Old

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、，√C

化。。ノ

…￣）i這3

図2・ 前脛骨筋の筋蛋白の分布パターン
WHOLE MUSCLE PROTEINS PATTERN OF
SOLEUS MUSCLES FROM NORMAL a PMA MICE

uOt1−の凸由−▲▼餌￠く鼠−轡eW−ュ▼3−Wk−Old

●しろll

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5−Wk−OkIぺトTu
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図3．

●

霊
■lGl
、エ蒜謡等

晶守攣∵
札ぷ鴇

足底筋の筋蛋白の分布パターン

WHOLE MUSCLE PROTEJNS PATT∈RN OF
PLANTARIS MUSCLES FROM NORMAL＆PMA MICENORMAL
蛇F一一一

二

￣亡▲

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リ○く血−め凸の・I▲▼

3−Wk−Old

一■LGl

5−Wk−Old●一■hGl

￣ヽh62

1餌さ

図4．

ヒラメ筋の筋蛋白の分布パターンー48−＿

望讐芸−空茶1ユー■・＿PMA

β一tYP8Sing一〇Fibor Of80L

久一tYpOS栂loFib8rOt＄OL
OH

＿＿＿■

OH

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l
uOくdIの凸の1−▼聖誓言Iの白のL

H

一一一lEFr二g謂■LCl一●「「芸●L61＿−●一l■Ot暮し￠ト＿′嶋劇●LC2−●′

轟細図5．ヒラメ筋の単一筋細胞の典型的遅筋型線維（左）と中間型線維（右）の筋蛋白の分布パターン
表1．LDHのアイソザイムの割合
LD H

LDH
NORMAL
1

2

3

4

5

＆
8

7

tyP eく≠）H−ty PO （
％）M −

PMA
8

9

E DL

10

（
N）

20．
3

70 ．
7

（
P）

16 ．
3

83 ．
7

（
N）

13．
6

80．
4

（
P）

15 ．
2

84 ．
8

8 0 日 誓；

42．
0
3 1．
8

58 ．
0
08．
1

c A可

53 ．
1

40．
0

53．
0

40．
4

丁旧

図6．

lS O Z Y M E

LDHのアイソザイムパターン

ご；（N）：NORMAL，（P）：PMA
lではp7naにおいて、EDLとSOLの代謝がM−typeが増加しているところから無酸素的代謝の増進が認められた。特に遅筋と言われるSOLの無酸素的代謝の増大は、先の筋蛋白の分化の遅延化と十致する傾向を示している。単一筋線経で調べたところSOLでは先の筋蛋白による分類とほぼ一致するLDnのアイソザイム分布が存在することが示された（図−7）0典型的な遅筋型線
稚くTypical slow fiber）で45−55％M−tyPeの分布があるのに対し・中間型線維（Inter−mediate fiber）はそれが60−70％であった。先の表−1の結果と合わせて考えると、中間型線経の増大即ち分化の遅れがp乃妃において生じていることを示すものである0
最後に血清の諸酵素の活性についての結果を表−2にまとめた0ここでは、Normalとpmαの間にいずれの酵素においても著名な差がみられなかった。これは、pmαの萎縮筋の変化が完全に生じた後で、すでに細胞の変性が完了したために血清中に異常の出現がみられなかった可能性があ
る0

ー49−

図7．ヒラメ筋の単一筋細胞のLDHアイソザイムと筋蛋白の分布パターン

表2．

血清中の酵素活性ENZYMEACTTVITY OFSERUM（Unit／T）

C O N TR O L
S EX

含A G E（
W K）

PM A
含
20±
7（
6）

考 察
以上pmαマウスの生化学的解析の結果、このマウスは収縮特性、代謝特性のいずれの面からみても、筋細胞分化の遅れが示唆された。

B．
W ．（
g）

20±
4（
5）
27．
4士
3．
0（
5）

25．
2±
1．
6（
6） ない筋においても確認された。神

LD H

126土
33（
4）

112土
34（
4）

∝−H B D H

14．
8士
5．
5（
3）

15．
2土
7．
7（
4） 筋における分化の遅れは、筋原性

C PK
G PT

146士
50（
4）

141±
34（
5）
5．
6士
2．
8（
2）

G O T

1．
8土
0．
6（
2）

それはまた、外見上異常のみられ

経支配上、関係のないと思われるの因子による可能性がうかがわれるが、歩行異常による移動能の低下による発育への影響の可能性も

0．
6土
0．
3（
3）
1．
0土
0．
8（
2） 残されている。
文士S．
D．
（
No．
of sam pJes）
−50−

文

献

1）Esaki，K．，Yasuda，Y．，Nakamura，M．，Hayashi，H．，l＆Ono，K．
A new mutantin the mouse：Peroneal muscular atrophy．Exp．
Anim．30；151−155（1981）
2）0−Farrell，P．H．
Highresolution

tw〇一dimensional

electrophoresisofpro亡eins・

J・．Biol．Chem．250；4007−4021（1975）．
3）Oakley，B．R．，Kirsch，D．R．，＆Morris，N．R．
A simplified ultrasensitive silver stain for de亡ecting
proteinsin polyacrylamide gels・Anal・Biochem・105｝361−363（1980）．
4ンI）ietz，A．A．，＆Lubran0，T：

Separation and quantitation oflactate dehydrogenaseisozymeS
by desk electrophoresis．Amal．Biochem・20；246−257（1967）・
5）北 浦

孝

Developmental properties of TnuSCular proteinsin the normalLand diseased mouse．体力科学

30；375（1981）．

−51−

Ⅱ．乳時期に運動失調を起して死亡する（m句）マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価

皿−1．

mdyマウスの発見の経過と遺伝様式の分析
江 崎 孝三郎＊
研究協力者 吉 村 幸 夫＊

筆者らは、ICRマウスを近親交配している過程で、神経・筋疾患に起因すると考えられる運動失調を示す個体を発見した。この異常形質を保存するとともに、遺伝様式の分析をおこなったのでその成績を報告する。

Ⅰ．異常動物発見までの経過
1976年に日本クレ7（株）より入手した、nOninbredのJcl：ICRマウスを起源とした近交系を育成する目的で兄妹交配をおこなっていたところ、第6代の雌・雄1組の交配より出生した初産仔3匹のうち2匹に、後肢をひきずるように行動する異常が生後17日に発見された。この異常仔は2匹とも離乳前に死亡した。そこで同じ雌・蛙の交配を続け2産次以降の仔を観察したところ、各産次で初産の仔にみられたと同様の異常を発現するものがみられた。しかし、異常を発現した仔はいずれも離乳前に死亡するため、これらの動物を繁殖に使用することはできなかった。従って、この形質の保存のためには後述の後代検定を用いた系統維持をおこなう必要があった。

Ⅱ．異常マウスの外見的症状
出生時には外見的な異常は認められず、同腹の正常仔と区別することはできない。生後10−12
日頃になると、異常仔は後肢が麻痺したようになり、後肢をひきずるように前肢のみではふく前進する。症状は次第に進行し、後肢は反転したようになり、時には体を回転することもみられる。生後15−16日頃より衰弱がはげしくなり、呼吸困難の様相もみられ、通常は生後20日以前に死亡する。生後10−12日の症状発現開始の時期に同腹の正常仔を淘汰して、母親に異常仔のみを哺育させると、22−23日齢まで生残することもある。

Ⅲ．遺伝様式の分析
A．同系内における交配実験
異状を発現した個体は離乳前に死亡するため交配実験に使用することはできなかった。そこで、異常個体が出現した腹の正常雌・雄を組にして交配実験をおこなった。得られた成績を表1に示した。16組の交配をおこなったところ、8組の交配からは異常仔は出現しなかったけれども、残りの8組の交配では異常仔が出現し、総産仔敦121匹中正常仔が91匹、異常仔が30匹であった。
この異常が常染色体上の1個の劣性遺伝子に支配されていると仮定した場合、交配の全組合せの■ 財）実験動物中央研究所阜

ー55−

うち異常仔の出現する組の割合の理論

表1異常（mdy）系内での交配実験成績
交 配 の 組 数

1 6

仔

の

正

常

表

現

型

異

常

値は4／9、そこでの正常仔と異常仔計の比の理論値は3：1となる。上記の

8

1 0 0

0

1 0 0

8

9 1

3 0

1 2 1

7 ．1

9 1

3 0

1 2 1

交配実験の成績はこれらの理論値とよく一致していた。

＊1e x p ．＊2

B．血縁関係のある正常ラインとの交配実験＊1：異常マウスと同腹の、正常雌・雄を交配＊2：理論的期待値

異常仔を出藍させたこと．のある雄（Carrier）をICRの正常ラインの雌と交配した時のFlおよびF2の成績を表2に示した。Fl
においては得られた41匹（雌14匹、雄27匹）のすべてが正常であった。次に、Flどうしの交配を14組おこなったところ、10組の交配においては異常仔の出現はみられなかったけれども、残りの4組の交配では異常仔の出現がみられ、総産仔数80匹中、正常仔が58匹、異常仔が22匹であった。これらの成績は前項と同様にこの異常が常染色体上の1個の劣性遺伝子に支配されていると仮定したときの理論値と良く一致している。
蓑2

mdy保困マウスと正常ICRマウスとの交配実験成績
仔

交 配 の 組 合 せ

保 因 マ ウス × I C R
F l X

の

正

表

常

現
異

型
計

常

雌

雄

雌

雄

1 4

2 7

0

0

4 1

9 4

1 0 4

0
− 0

0

1 9 8

2 9
、

2 9
＿＿ノ
5 8

9
1 ．
3
、−、′一ノ
2 2・

8 0

Fl
1 0

1 4

4
e x p ・＝

3．
5

6 0

2 0

8￣
0

＊1：理論的期待値

C．血縁関係のない正常ライン（C57BL／6）との交配実験
異常仔を出産させたことのある雄（Carrier）をC57BL／6と交配し、そこで得られた成癖を表3に示した。凡においては得られた12匹のすべてが正常であった。次に、Flどうしの交配を6組おこなったところ、5組からは異常仔は出現しなかったけれども、1組の交配から生れた88匹中22匹に異常仔が出現した。

−56

−

表3

m中保田マウスとC57BL／6マウスとの交配実験成績
仔

交 配 の 組 合 せ

保 困マ ウス ×C 5 7 B L ／ 6
F l

X

正

表

常

現
異

型
計

常

雌

雄

雌

雄

6

6

0

0

1 2

3 4

4 1

0

0

7 5

3 7
｝

2 8

8 8

6 5

1 1
1 2
、
一一｝一
一
一ノ
2 3

6 6

2 2

8 8

F5 l

1

e x p ・＊1の1．
5

＊1：理論的期待値

以上3種の交配実験によって、この異常は常染色体上の1個の劣性遺伝子に支配されているものと結論できる。この遺伝子をmotorneuron disease−Yoshimura、遺伝子記号を7ndy
称する。

ー57

−

と仮

皿−2．mdyマウスの組織化学的解析
石 原 博 幸＊
今臥実験動物中央研究所で新しく発見されたmutant，7ndyマウスを検討する揆会に恵まれたomdyマウスは生後10日日頃より歩容異常を発症し・四肢の筋力低下が急速に進行し生後20日
日頃に死亡するという極めて急速な経過をたどる0遺伝的には常染色体劣性遺伝形式をとることが既に解明されている。生後間もなく発症し、急速な経過をとるなどヒトにみられるWerdnig−
Hoffmann病のモデルになりうるかという可能性も考えられた0
末だ、mdyマウスの筋肉についての組織化学的検討はされていないことから・筆者はこのマウスの下肢筋を中心に組織化学的検討を行ない、さらに神経筋接合部についても検索を行ない若干の知見を得たので報告する。

対象および方法：
対象はm中マウス25匹（雄14匹、雌11匹）・生後12−17日・対照として生後12−21
日のマ■ゥス（主にTndyマウスのlitterjnate）26匹（雄14匹・雌12匹）である0
ェーテルにて麻酔後、前脛骨筋、ヒラメ筋、大腿四頭筋などを採取した。筋肉はトラガカソトゴ
ムによりコルク片に垂直に接着、液体窒素で冷却したイソペソタン中で急速に凍結固定し・￣70℃の冷凍庫に保存した。
−25℃のクリオスタットで厚さ10〟†竹の連続切片を作成した。
ヒラメ筋、前脛骨筋：H＆E染色、PAS染色、Gomoriのトリクローム変法・Oilred O染

色：ATPase染色（routine，．PH4・6，pH4・2）・NADH−TR染色・menadione￣linked
a−glycerophosphate dehydrogenase染色、nOnSpeCific esterase染色・aCetyト
cholinesterase染色、aCidおよびalkaline phosphatase染色、phosphorylase染色を施行したJ）
大腿四頭筋：PestronkとDrachmanにより1978年に報告された・神経末端と神経終板を同時に染色する方浸鉛神経筋接合部を観察した。クリオスタットで厚さ50βの切片を・クリオス
タット中で冷却したスライドガラスに付着させた後、原法に従って染色した0
生後14日目の2例（雄と雌）を、29らグルタールアルデヒドで濯流固定し・背髄・前臥未檎
神経を採取した。標本は29もグルタールア′げヒドで2時間固定・固定後29もオスミウム酸にて後固定（2時間）、アルコールにて脱水後、エポソ包埋し・thick sectionを作成・トルイジン
ブルーにて染色、光学顕微鏡で観察した。

■ 国立療養所東埼玉病院

−59

−

結 果：
生後14日目のm再マウスを潅流固定し第3腰髄前角、前祝および坐骨神経を光学顕微鏡で観察したが、背髄前角神経細胞、前棍神経および坐骨神経の軸索および髄鞘には明らかな異常は認めなかった。
mdyマウス19匹（雄12匹、雌7匹）、対照マウス12匹（雄7匹、雌5匹）について前脛骨筋（自筋）、ヒラメ筋（赤筋）を採取し組織化学的に検討を行なった。
mdyマウスでは、筋線維直径の大小不同は軽度に認めるものの筋線経の壊死、変性、再生はみられなかった。また小径線経や群集萎縮、標的線経も見られず、円型細胞浸潤や脂肪、グリコーゲンの貯留も認めなかった。トリクローム変法ではネマリン小体はなく、セントラルコアを思わせる所
見もNADH−TR

染色には認めなかった。ATP ase染色でもⅠとⅡ型線経への分化は明らかであり、本mutantが単純な末梢神経障害やヒトの筋ジストロフィーおよび先天性ミオパチーのような筋厚性疾患とは異なる所見を示していることが明らかとなった。
図1には生後12日目の対照マウスとmdyマウスのH＆E染色の結果を示す。上段の前脛骨筋では筋直径が殆んど両者間に差がないが、下段のヒラメ筋では対照で筋直径が大であることがわかる。
図2には生後14日目の対照マウスとmdyマウスのH＆E染色結果を示す。前脛骨筋では12日目の図1と同様に筋線維直径がmdッマウスでやや小さい傾向はあるものの両者の差はほとんどないが、ヒラメ筋ではmdyマウスで明らかに小であった。
生後178日となると、（図3）前脛骨筋でも筋線経の直径は対照マウスの1／2程度となりヒラメ筋では約1／3程度となっている。以上からmdタマウスでは対児マウスに比べ、筋線維直径が、発症後進行性に小さくなることが判明したが、この原因として筋萎縮が起こるのか、筋の尭育障害
で両群の差が出現するのかの2つの可能性が考えられた。
図4には生後12日目の対照マウスとTndyマウスのATP ase染色（pH4．2）の染色結果を示す。図でわかる通り、typelと2への分化には異常がないと思われ、両タイプ共にmdyマウスで直径が小であることが（特にヒラメ筋）観察された。
図5には生後17日目の対照マウスと7ndyマウスのATP ase染色（pH4．6）の結果を示す。

77Ldyマウスでは対照マウスに比べ、typel、type2型線維共に直径が小さくなっていることが明らかである。
図6には生後12日目と17日目の対照マウスとmdyマウスの前脛骨筋でのATP ase

染色結果を示す。対照マウスでは5日間の間に筋線維直径は大となり、mdタマウスでは筋直径が殆んど変化しないところから、茄萎縮が進行すると考えるより成長（発育）の障害が存在する可能性が高い。
図7には図6と同様にヒラメ筋でのATP ase染色の結果を示す。
以上のように筋原性異常、通常の末梢神経障害を示す異常は筋病理所見上全く見られず、筋の発達障害の存在が裁く示唆された。次に、神経筋接合部の形態について検討した。Pestronk＆Drachmanの方法によれば神経末端と運動終板が同時に染色される。
図8は生後17日目のmdyマウス（雄）での染色結果を示す。この染色七は療板を支配する神経−60−

図1生後12日目、発症まもなくの耽dyマウスの下髄筋のH＆E染色を示す。
1：対照マウスの前脛骨筋
3：対照マウスのヒラメ筋
2：mdyマウスの前脛骨廟
4：mdyマウスのヒラメ筋

ー61−

図2

生後148日、H＆E染色

×85

1：対照マウスの前脛骨筋

3：対照マウスのヒラメ筋

2：彿dyマウスの前脛骨筋

4：mdyマウスのヒラメ廟

−62

−

図3

生後17日目の所見

H＆E染色

1：対照マウスの前脛骨筋

3：対照マウスのヒラメ筋

2：鵜dyマウスの前脛骨筋

4：mdyマウスのヒラメ筋

−63

−

図4

生後12日目の所見、ATP ase染色（pH4．2）

×85

1：対照マウスの前脛骨筋

3：対席マウスのヒラメ筋

2：耽dyマウスのヒラメ筋

4：帯dyマウスのヒラメ廟

ー64

−

図5

生後17El目の所見、ATP ase染色（pH4．6）

×85

1：対照マウスの前脛骨筋

3：対照マウスのヒラメ痴

2：彿巾マウスの前脛骨筋

4：mdyマウスのヒラメ筋

−65

−

図6

生後12日日と生後17日目の比較、前脛骨筋、ATP ase染色、×85
1：対照マウスの前脛骨筋

3：対腰マウスの前脛骨筋

生後17日

2：mdyマウスの前脛骨筋 生後12日
4：彷dッマウスの前脛骨筋
上段はPH4．2、下段はpH4．6のATP ase染色

生後12日

生後17日

−66

−

図7

生後12日目と生後17日目の比較、ヒラメ筋、ATP ase染色、×85

1：対照マウスのヒラメ筋、生後12日

3：対席マウスのヒラメ筋、生後17日

2：取dyマウスのヒラメ虜、生後12日

4：mdyマウスのヒラメ筋、生後17日

上段はpH4．2、下段はpH4．6のATP ase染色

−67

−

図8

生後17日目の彿dyマウス大腿四頭筋の染色の結果、×170、矢印は運動終板を示すが、図9の対照マウスに比べ神経末端の分岐が多く複雑な形態を持っている。（Pestronk＆Drachman法）

図9 図8と同じ方法による染色。対照マウスでは神経末端の分岐数が少なく比較的単純な形態である。×340。

−68−

末端の分岐の数（terminalbranchpoints）と運動終板の長さ（endplatelength）が定量的に計測可能となる。図の矢印が終板の部分であり、複雑な形態をとっていることが明らかである0
図9には対照マウス生後17日目の終板の形態を示す0比較的濃く染色されている部分が運動終板であり、神経末端分岐数は比較的少なく形態は図9のmdyマウスに比し単純なことが観察された0
運動終板の長さについては、対照15ケ、mdy17ケの終板で比較したが、前者で51士17〟・後者が54士10〟と有意差をみなかった0しかし分岐数については表1のような結果を得た0雌
マウスのみで比較したものである。生後17日目のmdyマウスの神経末端分岐数は明らかに増加しており、立体的にこれを図示すると図10のようになる0
表1

7花dyマウスおよび対照マウスの神経終板の分岐数の比較

TERMI帆＿Ⅰ沢村tH POII打S
FGモ

C洲TR乱

MDYKLBE

8．5

2．5

さらに詳細に観察するとm中マウスでは図11の矢印のように一つの運動終板に複数の神経末端が入り込んでいる（polyneuronalinnervation）ことが多く、分岐数の増加はこれに起因することが考えられた。このpOlyneuronalinnervation
す。TndyマウスではpOlyneuronalinnervationを示す運動終板の割合を検討し表2に示を持つ運動終板の割合が明白に高く・立体ヒ

ストグラムに図示すると図14のようになる。

考 察：
適当な疾患モデル動物を発見することは疾患の病因解明、治療上大きな意味を持つと考えられている。但し、モデル動物である以上、当然ヒトとは病感が異なることは避けられず・疾患モデル動物の研究にはおのずから限界があることは当然と思われる0筆者は今回筋肉の形暦学という立場から、このmutantを検討した。筋自体の変化を示すmutanU部数は少く・dyマウスの・dy2J4）マゥスがよく知られているが発症時期が生後数週とmdyマウスとは異なる経過を示し、急速に死の転ー69一TERMf岨＿BR付にH POINTS

生後用日

MDYマウス
対照マウス

図10

表2

mdyマウスおよび対照マウスの神経終板の分岐数の比較

7ndyマウスおよび対照マウスのpolyneuronalinnervationを持つ神経終板の比率

円1≠正脈仇軋＿ⅠトNE臥胎TI（刑F6E

CCNTRCLMI）YPtXJSSE47．5

帰をとることから・ヒトのWerdnig−Hoffmann病に対応するモデル動物になりうるかと期待された0筋病理の上からはこのWerdnig−Hoffmann病にみられる大群集萎縮が全く認められず、また筋ジストロフィーを思わせる筋原性所見もみられなかった0また、検索例数は少ないが、中枢
神経系や坐骨神経にも著変なく当初は筋力低下の原因が全く（形態学的には）不明であった。そこ
で神経筋接合部を検索してみたところ、結果は分岐数の増加が発見され、その原因としてpoly−
neuronalinnervation

を持つ終板の割合が著増していることが想定されるに至ったわけであ

−70

−

図11

大きな矢印が示す運動終板には、小さな矢印で示すように、2つの神経が入り込み、複雑な形態となっている。このpOlyneuronalinnervation
が彿dyマウスにおける分岐数の増加の原因と考えられる。
（Pestronk＆Drachman染色） ×340

Pα＿仙Ⅰ廿旺Rl爪丁目α剛￣￣MDYマウス

興マウス

図12

7ndyマウスおよび対席マウスのpOlyneuronalinnervationをもつ神経終板の比率−71−

1976年B，OWnらは5）正常ラットのヒラメ筋ではpolyneuronalinnervationを持つ運動終板は生下時100珍であり、生後13〜15日目で50珍、約20日で殆ど0珍になると報告している。この報告と比較しても、TndyマウスではpOlyneuronalinnervationを持つ終板の割合は高率であることは明らかである。今回は単に形態学的に検索したのみであり、電気生理学的アプローチは行なわなかったので、終坂の立体的広がりを隅々まで観察することは不可能であり、polyneuronalinnervationをunderstimateしている可能性は非常に高く、実際にはもっと高い値をとると思われる。
前述のように、出生後polyneuronalinnervationは徐々に減少し、一つの終板は一つの神経により支配されるようになるが、このプロセスの障害の存在がmdyマウスの症状の原因でありう

小川％観察によれば背髄前角細胞の分布異常があると報告されており、宮脇電気生理学的な検索によれば、①Caイオンに対する感受性の異常、②神経伝導速度の異常など、神経原性の異常の存在が示唆され、神経筋接合部異常疾患というよりも、背髄前角細胞の異常が原因となり、何らかのtrOPhic factorの欠如により発症すると考えるのが一番合理的であると考えられる。
mdyマウスと同じような運動異常マウスとしてDuchenらが1967年に報告したmedマウスが知られている曾9）1の遺伝形式、発症時臥症状、死亡時期などmdyマウスと全く同様であり、形態学的には神経筋接合部異常が強度であり、神経筋接合部異常疾患と考えられている。medマウスではterminal sproutingが著明であるが、本mdyマウスでもultraterminal sproutingを示唆する所見が一部には見られている。宮田はmd てⅦま伝導速度がおくれることを報告しているが、medマウスでは正常であるとされ、この点では全く異なり、mdyマウスが独立した、新しいmutant
であることが強く示唆されるが、両者が本当に独立した疾患単位なのかどうかは、もう少し詳細に比較検討が必要ではないだろうか。
さて、ヒトとの関連については、ヒトのWerdnig−Hoffmann病のモデルには、mdyマウスは不適当であると結論せざるを得ないが、神経筋接合部の発達のメカニズム解明については有用な示唆を与えるモデル動物となりうると考えられる。

結 論：
mdyマウスの筋および神経筋接合部を形態学的（組織化学町）、に解析した。
① 筋は進行性に萎縮するというより、発達の遅延、停止が見られるのみで、type1、2への分化もよく、筋原性、神経原性の所見をみない。
②

神経筋接合部ではpolyneuronalinnervationを持つ運動終板の割合が高く、発達の遅延叉は停止の存在が考えられた。
③ 上記の発達障害は、他のアプローチによる結果と合わせると、背髄前角神経細胞の異常に起因すると予想される。

ー72−

④ 神経筋接合部発達のメカニズム解明には有用な動物モデルと考えられる0文献1）Dubowitz

V・＆Br00ke

M・H・‥Muscle

biopsy‥A

modernapproach・Philadelphiat PAT WB Saunders，1973・
2）Pestronk，A・＆Drachman・D・B・：Anew
measurementofsprouting

at

stain

for

quahtitative

neuromuscular］unCtions・Muscle＆Nervel：70−74′1978．
3）Michelson，A・M・，Russell・E・S・＆Harman，P・J・‥Dystrophia

muscularis：A hereditarY Primary myopathyin the house mouse・Proc．Nat．Acad．Sci．，41：1079−1084′1955・

4）Meier，H．＆Southard′J・L・‥MusculardYStrOPhYin

the

mouse

causedbY a11eie at the dy−10CuS・Life Science・9（Part2）：
137−144．1970．
5）Brown′M．C・．JansenlJ・K・S・＆van

Essen・D・：p01yneuronai

innervation of skeletal musclein new−born rats andits
alimination during maturation・rJ・PhYSi01・261：387−422，1976・
6）小川忠弘：「新たに発見された二つの神経・筋異常マウスの成田の解析と疾患モデルとしての評価」研究臥昭和57年度班会議・昭和57年12月29日・大阪・
7）宮田雄平：「新たに発見された二つの神経・筋異常マウスの成因の解析と疾患モデルとしての評価」研究臥昭和57年度班会議・昭和57年12月29日・大阪・
8）Duchen，L．W・，Searle′A・G・＆Strich・S・J・‥An

hereditary

motor end−Piate diseasein the mouse・，J・PhYSioi・，189，
4−6p．1967ご9）Duchen，L・W・：HereditarY mOtOr end−Piate diseasein themouse：light and electron microscopIC Studies・，J・Neur01・
Neurosurg．Psychiat・133：238−250′1970・

10）Duchen，L・W・＆Stefani，E・：EiectrophYSi010gicai studies
of▼neurOmuSCular

disease一一〇f

thetransmissionin

hereditarY．lmotor

end−Platemouse．′J．Physioi・212：535−548，1971・−73−

Ⅱ一3．m句マウスの神経病理学的研究
小

川

恵

弘＊

研究協力者 今西美知宕岡 春美干江崎、吉村らによってICR系マウスに新たに発見されたmdyマウスの臨床所見の発現に神経系がどのように関与しているかを知る目的で中枢神経系、末梢神経系および筋肉について対照群と比較しながら光学顕微鏡や電子顕微鏡などを用いて種々の日令の症例について主に病理形態学的に研究を進めた。また一部の例については形態計測による定量的研究も行った。
方法

Ⅰ．光学顕微鏡的研究：ネムプタール腹腔内投与による麻酔のあと4％パラホルムアルデヒドを左心室より注入し全身を港流周定した。固定後大脳、中脳、橋、延髄、小脳や脊髄を形をくずさな
いように取り出した。摘出後同じ固定液で一晩冷蔵庫内で固定し肉眼観察後パラフィン切片用の切り出し材料とした。大脳は前額断に3等分したものと矢状断に切り出し、小脳は歯状核を含むように前額断と矢状断に切り出した。中脳、橋、延髄は前額断に、脊髄は頸髄・胸髄・腰髄をそれぞれ
一ヶ所前額断に切り出した。末梢神経は頸髄および膿髄の板部、上腕、前腕、大腿、下腿はそれぞれの神経と一部の例では後板神経節を摘出した。筋肉は上腕筋、前腕筋、上腿筋、下腿筋、足筋および肋間筋を材料とした。染色法は神経系についてはルクソール・77−スト・ブルーとへマトキ
シリン・エオシソの重染色、ボディアン鍍銀法を行い、末棉神経についてはマロリー染色も行った。
筋肉はへマトキシリン・エオシソ染色、リン・タングステン酸へマトキシリン染色を行い、一部の例では末湾流凍結切片につきアセチルコリソエステラーゼ反応を行った。

Ⅱ．電子顕微鏡的研究：ネムプタール麻酔後、0・1モルリン酸緩衝液加2％グルタールアルデヒ
ド液にて濯流固定をした。標本摘出部位は光学軒数鏡のための検索部位と同じである。エタノール
脱水後通常の方法でエポキシ樹脂包埋をした。1ミクロン切片作製後トルイジソブルー染色をし光学顕徽掛こよる検索資料とした。その後一部をトリミングし超薄切片を作製し鉛とウランの2重染
色後電子顕微鏡による検索に供した。

Ⅲ．形態形測による定量的研究：Ⅱと同じ方法で固定した動物の第3腰髄前板を取り出し、エタ
ノール脱水・エポキシ樹脂包埋したブロックから1ミクロン切片を作りトルイジソブルー染色をした。光学顕微鏡で全体像写真を作製し面積を測定した。また高倍率写真を全面掛こついてもれなく撮影し、その後2000倍前後に拡大した（症例によって拡大率が違う）。この写真を用いて面積当りの有髄神経線経の数を知り、また各有髄神経線経の外局長を計測し直径に換算した後直径と式敷＊ 東京都神経科学抱合研究所神経病理−75−

の関係を知るためにヒストグラムを作製した。
全研究に使用した動物は次の如くであった。
日令

mdy Contro1

結

果

12日

6

3

13日

0

0

Ⅰ．光学顕微鏡的研究

14日

3

0

1）大脳：クモ膜、血管では全例とも正常対照と

15日

2

2

同様著度は認められなかった。前頭葉、頭頂葉、後

16日

3

3

頭葉、側頭葉とも神経細胞の層構造は各日令の正常

17日

8

4

対照例と差はなく、また各神経細胞の大きさ・細胞

18日

3

3

質の性状・核の状態も正常対照例と差はなからた。

19日

5

2

萎縮・変性・脱落はもとより核と細胞質の比も正常

20日

4

0

対照例に比して特に大きなものもなく発育障害を示

01

唆する所見もみられなかった。大脳白質のルクソー

34例

18例

ル・77−ス ト・ブルーによる染色性は正常対照例

22日とその巾や濃度において差はなく各々の有髄神経線経にも変性などの所見は認められなかった。
2）小脳：分子層、プルキニエ細胞層、顆粒層など小脳皮質は正常対照例とその発育において差はなかった。また、変性、萎縮、脱落等病的な所見も認められなかった。 白質でも発育は良く、神経線経の変性・脱落などの所見もみられなかった。歯状核も良く保たれ特に異常を思わせる所見はなかった。上・中・下小脳脚もそれぞれ特に異常を示唆する所見は認められなかった。
3）中脳：大脳脚、中心灰自質、赤核、黒質などその構成要素には特に異常は認められなかった。
4）■橋：顔面神経核、三叉神経核、青斑核などのすべての核と網様体及び橋核と横行線維及びそれらの問を走る大脳皮質脊髄路にも特に異常な所見はなかった。
5）延髄：同様に異常を思わせる所見はなかった。
6）脊髄：生後12日日では前角細胞は腹外側群、腹内側群、背外側群などほぼ同じ大きさの神経細胞がみられ、全体としてやや小さく背外側群に小数正常対照例と同じくらいの大きさのものを認める。正常対照群では前述3群のうち、背外側辞には大きな良く発達した神経細胞が認められ、腹外側群や腹内側群にも大きな神経細胞が少数認められる。生後15日のmdy例では背外側群と腹外側群にはほぼ同じ大きさの神経細胞が認められるようになり、腹内側群の神経細胞は前2群に比べて小さい。一方、正常対照群では3群の神経細胞がほぼ同じ大きさとなるが腹内側群の神経細胞はやや小さい。生後18日になると、mdy例では腹外側群と背外側群の神経細胞はほぼ同じ大きさとなり腹内側群との差が出てくる。対照群も同様の所見を示す。
これらの発達の進行とは別にmdプ例では、胞体が濃染される小さい神経細胞や核の占める割合の大きな比較的小さ・な神経細胞で凹凸の強い萎縮を思わせる細胞や細長い神経細胞などの所見が時に認められることがある。12日例ではこの変化を思わせるわずかな所見を示す細胞が時に認められー76−る。14日から16日以後になると更に明瞭にこれらの所見を示す細胞が前角神経細胞群の中に時に出現してくる。脊髄の白質や後角における所見は正常対照群との差は認められなかった（図1a、b）。

図1．m勾マウス（生後19日）の頸髄。白質に異常は認められない0
腹外側、背外側に大きい神経細胞がみられる。
−77−7）末梢神経：同日令の正常対照群に比べてmdy群の末梢神経では、ルクソールファーストブル
ー染色標本でみると一般にやや淡く染色される。縦切片標本でしかもシュワン細胞などの核が多く存在するものもある。強拡大にすると髄鞘の薄い線経や細い線経が多く、しかも時に有髄神経線経が髄鞘塊のように虚脱に陥っているものもみられる（図2）。この所見は幼君なものにほど良く認められ、しかも18日例でもみられたが、後者の所見は15日例以後のものに稀に認められるようになった。
8）筋肉：正常対照例では各グループの大きさには特に差を認めない。しかし、12日例では1つのグループの筋線経には大小不同をわずかに認められた。15日例ではほぼこの所見はみられな
くなり筋繰経にほぼ同じ太さとなる。一方、mdy例では所々にグループ全体が小さいものが認めら
れr図3）、幼君例ではこのグループの中の各筋線経にも大小不同がみられたが20日例でもこの所見を示すものがあった。また線経の角が丸かったり、中心核も時に認められた。縦切片では筋線維鞠の核も多くみられた。PTAH染色では横紋は対照例とほぼ同じであったが、マロリー染色で薫染する筋線経では横紋が不明瞭なものもみられた。

Ⅱ．電子顕微鏡的研究：
光学顕微鏡的に異常な所見の認められなかった大脳・小脳・中脳・橋・延髄については1ミクロン切片作製とそれらの光学顕微鏡的検索のみで終った。脊髄、末梢神経及び筋肉の所見につき以下に述べる。脊髄前角細胞内に認められた中空胸は小胞体の拡大したものと判明した。これはゴルジ装置の周辺の小胞と関連するものであって対照群においても同様な所見を認めた。前角神経細胞の核や核

図2．mdyマウス（生後19日）の大願神経。髄鞘のうすいものが多くみられる。
−78−

図3．m勿マウス（生後15日）の大腿筋。グループ萎縮がみられる。
膜及び細胞質内のミトコンドリアやニッスル顆粒といわれる粗面小胞体などの細胞小器官や神経細管などには特に異常な所見はみられなかった′（図4）。またシナプスの構造や数も正常対照例と差はなかった。
末梢神経では光学顕微鏡的にみられた虚脱した線維以外、軸索内にミェリン様小体など変性産物を思わせる構造が極稀に認められたがフィラメントの増加などの所見はなく、正常対照例と差はな
かった。またシュワン細胞や周圃問質にも異常な所見は認められなかった。
筋肉では19日例の上腕筋線維鞘細胞の細胞質内に筋原線経の太さぐらいの線維構造物がグルー
プをなして散在する。神経筋接合の神経終末部にはシナプス小胞やミトコンドリアもみられたが、その数は少ないものもあった。またシナプス小胸の膜が不明瞭なものもみられた（図5）。しかしこれらの小器官の明らかに断定しうる変性所見は認められなかった。一方、後シナプスの構造であるsynaptic cleftをみるとsecondary synaptic cleftが筋細胞側に少ない所もあり丸味をおびてていた。細胞質内に100オングストローム前後の線雄性構造物が所々集積してめられた。他の小器管に関しては正常対照例と差はなかった。筋線経では各バンドなどの構造は良く保たれていたが、時に流れているような所見もみられた（図5）。

Ⅲ．形態計測による定量的研究
結果は表1、図6および7に示す如くであった。
生後17、19、20日齢、各1例であるが、発症例の有髄神経線維数の実数は正常対照例に比しー79−

図4．mdyマウス（生後17日）の脊髄前角神経細胞。特に異常な所見はない。

−80−

図5．勒ねマウス（生後19日）の上腕外筋の神経終板。説明は太文参照。

て少なく、（19日例を除いて）しかも単位面積当りの有髄線維数は発症例の方が多く、日令が進むにつれて対照例の値に近くなる。これらのことは組織学的に脊髄前角の神経細胞の脱落だけで説明することはできなく、脱落のみならず発育の不良にもとずくと都合が良さそうである。
中枢神経系での話であるが軸索の太さが0．2〃以上にならないと髄鞘はできてこないという。
ヒストグラムでみると正常対照例では2峯性の分布を示すが、発症例ではそれがはじめは明らかだがだんだん一峯性になっていく傾向にある。しかし細い線経の占める割合が多くなってくる。これは、一つには序々にではあるが発育していると考えるか、ある程度まで発育した線経が萎縮しつつあるためかどちらかであり計測結果だけからでは不明確である。

ー81−

表1．対照マウスとmdyマウスの第3腰髄前板における有髄神経線椎の数

Numborof Number

Animal

r2

0．065
0．047

t
l

0．062

3
1
1

0．056

3

■

0．049

0

7

■

9

■

A

一

15666．6

915486．3689440．12
717247．606lP20匝DY．C

fibor m・f′lp2
3
8

l

C

■

珂珂珂珂珂叫

■

A

■

P19

C

︵

P19

Y Y Y
D
D
D
U員 VI u

︷

P17

Y
D
M

P17

Aroa myelinat8d or

18365．3
6
7

P20匝DY．▲

0．062

712331．7

P：day after birtb

MDY．C：COntrOI
MDY．A：affeeted（bomo叩gOteI

Dl■■●t●r OI

Nt■b●r OI ny●ll■■t●dIHHH

n，●Hl■t●d m●一〇

100

128

80

78

100

128

●
●
■
●
●
●
■
●
■

0080608〇一〇〇一■ − ■ − 一 − − ■

75

●

●

〇 ヱ●︳○○▲t．一−〇一bAiご−

■

○

80

n

●

001−10−2t︸t一▲■▲1■〇五−A
一員

●

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■

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■81▲V■一○■ − ● 一さ▲1▲l■○−︳▲■

ー80506080508080

t 一 ●01t▲〇一〇一t︸●︳・■▲■

0−0060■リ0︻VO︳00−b二Ui00011−ウ？

YDY．▲18tPlTI

2

r
− 0．8
−1．0
−1．5

05080−008060︻V0−0

1DY．C10lp171●

図6．生後17日のマウスの第3腰髄前板における有髄神経線経の太さと数の関係。上段：対照マウス、下段：mdyマウス
ー82−

Dl●血●t●r OI H■−も●T d

；
l

●

b▲YtT

■
一
−
●
●
−

011〇三2；∂■︼一▲

−
−

b二■

●
−
−

biO

い ： b O 丘 0 8 0 8 0 8 0 8 0 8 0● 一 ● 一 ● − − ● 一 −

34一息

●

0

15

80

80

78

76

100

100

118

11

160

日0

178

178

■
●

0605050−080808

011■

0011言上ウニ3811■；D▲！も■0108060−060608

JDY．▲24tP20）

0011エコ二王■ユニ︼11＝6；○AY8

yDY．C 23 け20I−▼●llttt●dIH川一

量

レー806060もObO■rn；00

一∫●日日t●dItb●▼0

一

図7．生後20日のマウスの第3腰髄前板における有髄神経線経の太さと数の関係。上段：対照マウス、下段：mdyマウス

考察

結果の項で述べた如く光学顕微鏡や電子顕微鏡を用いての形態学的検索によりマウスの所見として認められたのは脊髄以下筋肉までである。
脊髄前角の各神経細胞群からの神経線経は一般的にいうと脊髄の髄節が上部ほど頭部の筋へ行き
しかも外側ほど躯幹から遠い所を支配する。その細胞はヒトでは長径】00〝、短径30〜70〟といわれ非常に大きな神経細胞よりなる。前角神経細胞の数は正常対照側に比Lmdy群は少ないということはなかった。しかし前角を構成する各神経細胞群の日令による大きさの変化をみるとmdy群では正常対照群に比して大きさ細胞が遅れて出てくる。しかし注意深く管理をして生後20日まで生存した例でも同日令の対照と同じようにはならなかった。このことはこの群が正常対照群に比し器質的に叫マウスの神経細胞に認められた中空品神経細胞全体が小さく濃く染色されるいわ
ゆるdark cell といわれるものは正常対照例にも時に賑められ、いわゆる固定操作中の人工産物といわれるものに一致する㌔）
末栴神経の光学政教鏡、電子顕微鏡による観察でも検索した範囲では結果の項で述べた如く両者の差はほとんどなかった。しかし、有髄緑経を比較すると細い線経が多かったことと、太い軸索にもかかわらず髄鞘の厚さが対照例ほどではなかったものがみられた。これらのことは形態計測の結果に良く一致した。
Tessa3）がラットの坐骨神経の有髄神経線経を低栄養とコレステロール合成阻害剤投与例で計測した結果は我々の形態計測の結果に一致する所が多く発育不良と早期退縞が混在しているものと予ー83−想される。
筋肉の電顕所見で軸索末端部ではシナプス小胞もミトコンドリアも多く対照例と差が認められなかったが、筋細胞側のpost synaptic cleftの部では膜の肥厚がみられたが凹凸が少なく、即ちsecondarv synaptic cleftの形成が悪かった。これはシナプスの発育を含めた形成の不良ともいぇ羞5）また、筋細胞の核周囲などの細胞質内には100オングスト。−ム前後の線維性構造物が認め6）られたが種々の細胞の変性時にしばしばこのような構造物がみられることがあることと考え合わせると発達の遅延に何らかの原因でこの部に更に障害が現われたと考えられはしないだろうか。

結論

神経筋接合部の発育の遅延と変性にもとすく遺伝的息疾マウスと思われる。

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2）CaTnmermeYer，J．，：Thei鱒pOrtanCe Of avoiding Hdark

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3）Hedley一砕lyte．T．E．，：MYeiination of rat sciatic nerve：
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1975・Butterworths′

London

and

−84

−

Boston・PP424−428．

Ⅱ−4．mdyマウスの電気生理学的解析
宮

田

雄

平

新たに発見された神経・筋異常動物のうち離乳前に死亡するマウス（以下mdyと呼ぶ）の運動系に異常があるか否かを電気生野学的手法により検索した。
7ndyマウスのヒラメ筋あるいは内側俳腹筋をその支配神経と伴に切り出し、invitroで実験を行なった。漂太はKrebs液で濯流した。
濯流液中のCa濃度を下げるあるいはMg濃度を上げることはシナプス伝達を抑制する。図1はそのようなイオンの影響を調べたものであり、正常Krebs液（Ca，2．52mM：Mg，1．25mM）下で神経刺激に応じて発生する筋収縮高を10％に取った。Ca濃度を下げた場合、正常とmdyマウスとの問には差は見られなかった。】Ⅵg濃度を上げてゆくと、正常に比べmdyマウスでの筋収縮はより強く抑えられた。シナプス伝達に及ぼすMgイオンの作用をさらに検討するために、終板部筋線
経にガラス微小電極を刺入し量子的解析を試みた。10mMのMg濃度下において神経刺激に応じて発生する電位はmdyではallornone的であった。つまり、全く終板電位は発生しないか、あるいは発生した終板電位が関値に達し活動電位を生ずるかのいずれかであった。この現象は、Mgイ
オソが神経終末ではなく軸索に直接作用して活動電位の発生を抑えていることを考えさせた。

鹿町鴫

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2

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5
【Mg】

図1．シナプス伝達におよぽすCaおよびMgイオンの影響〇一一・〇：mdyマウス、＝：正常マウス・＊ 東京医科歯科大学医学部

−85

−

10mM

図2は軸索に対する高濃度Mgイオンの影響を示す。坐骨神経を切り出し、一側の断端を刺激し発生する複合活動電位を他端より記録し、正常Krebs液下で発生する電位を100％とした。15mM
Mg適用によりmdy（白丸）神経の活動電位は著るしく減少し、正常液にもどすことにより電位

Ca−free

15mM Mg

TTX
l

t

●●

100

‡∴♂梅鞠謳00

0︹芭亘＜PU⊃Od∈00

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0

60

120

min

図2．軸索に対する高濃度Mgイオンの影響○：mdッマウス、●：正常マウスは回復した。しかし回復はしばしば不完全であった。無Ca液適取によっては電位は変化しなかった。一方、正常マウス（黒丸）の軸索活動電位は高濃度Mgおよび無Ca液適用により影響はなかった。したがって、図1の結果は高濃度Mgがmdyの神経軸索に直接作用し活動電位の発生を抑えているものと解釈される。テトロドトキシン（10￣7秒句のは正常・mdyマウス共に活動電位発生を完全に抑制した（図2右端）。つまり、mdyマウスにおいてもNaイオンによって活動電位が発生していると言える。
Mgイオンにより軸索の活動電位発生が抑制されることから、同じ2価イオンである，Caイオン
によっても活動電位発生が抑制される可能性が考えられる。神経刺激に応じて発生する筋収縮をベンレコーダーに措記し、Caイオンの影響を図3に示す015mMCaによりmdyマウスでの神経刺−86−

激に応じて発生する筋収縮は抑制された（A）。正常神経筋漂A

太にはほとんど高濃度Caの影響は見られなかった（Ba）。
正常標本に15mMMg液を適用した場合の収縮高は滑らかに減少する（Bb）のに対し、1515mM CamM Caによるmdyでの収縮減
少経過は階段状であった（A）。

・B a

このことは、Caイオンが軸索に直接作用し、活動電位発生を抑制していることをさらに強く示唆する。

15mM Ca

これらの結果から、mdyマウ
スの軸索膜はMg、Caイオンにより興奮性が抑制されると結論される。7花dyマウスの血清Ca、Mg濃度は正常マウスと同じであったことから、これら2価イ15mM Mg

オンに対する反応はirrvitroで見られる異常と考えられる。

図3．軸索に対する高濃度Caイオンの影響

mdyマウスは生後10日日頃
A：mdyマウス、B：正常マウス

より次第に動きが鈍くなり、特に下肢の動きは14日以降にはほとんど見られず離乳前に死亡する。しかしながら前述のように
invitroで神経を刺激した場合に筋収縮が発生することはinvivo での行動異常を説明し得ない。
支配神経を前板まで遊離し部位を変えて刺激すると、生後14日日以降には坐骨神経刺激に応じての筋収縮は発生するが前板刺激によって筋収縮はおこらなかった。図4は18日令mdyマウスの例を示す。前板刺激は筋収縮を全くひき起さなかった。模式図に示すようにA、B、Cと刺激部位を末梢側に移動するにつれ筋収縮高は増加した（b、C。各記録の2段目のトレースが筋収縮）。
最小の筋収縮をひき起すに必要な刺激強度も末梢に移動するにつれ減少した（a。3番目のトレースが刺激強度）。これらの結果は、mdyマウスの個体の内で運動ニューロンの軸索が中枢側から末梢側に向って次第に興奮性を失なってゆくことを示唆する。
図4上の模式図に示すように総誹骨神経の断端より活動電位を同時に記録した（各記録の最初のトレース）。A・Bいずれの部位での活動電位はほぼ同じ程度であった。さらに後根を刺激することによっても同程度の電位が記録された。すなわち、この活動電位は知覚神経由来のものであり、

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−

a

￣「

￣′一つ＝こ二二ア ≒．図4．神経線経の各部位を刺激したときの筋の収縮。（表文説明参照）
知覚神経は正常であることが示唆される。このことは二価イオンに対しても煩推されることで、二価イオンの適用により軸索の活動電位は完全には消失しなかった（図2参照）。
以上の結果から、mdyマウスにおいては運動ニューロンの異常があり、かつ枚能の脱落が個体の内で進行していると結論される。このマウスはmotorneuron disease Yoshimura（7ndy）マウスと呼ぶのが適当と思われる。正常のマウスで坐骨神経を切断し、術後経時的に神経の興奮性を調べても二価イオンによる興奮性消失は見られなかったことから、mdyの運動ニューロンの異常は単純な変性ではないと考えられる。

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Ⅱ−5．mdyマウスの生化学的解析
＊

孝弘郎
■
＊

＊

＊

＊
＊

一純

浦浜川

北小．早

研究協力者

最近新しく発見された運動失調マウス（mdy）の成因と疾患モデ′レとしての評価の一環として、筋および血清の生化学的解析をおこなったので報告する。

方法と材料及び結果
mdyマウスは発症後の生存期間が極めて短く、個体の多きさも10才に満たないものが多い0検討した内容及び方法は先述のPmα（Ⅰ−5参照）とほぼ同じである。図1に筋全体としてみた場合の筋蛋白の分布を示した。7孔dy（マウス）では、個体の大きさがⅣ打珊血の2／つ〜1．／つであるにもかかわらず、下肢の筋の分化はほぼ同じように進行しているように思われ、著明な差は見られなかった。図2にLDHのアイザムパターンを示し、表1にその割合をまとめたが、肌花滋とmdyの間にはあまり大きな違いがみられなかった。ヒラメ筋と前脛骨筋においてはmdyで、若干M−typeの増加がうかがわれ、発育の遅れが示唆された。

SくつLEUS MUSCLE

図1．筋蛋白の分布パターン

・金沢大学教養部
・・東京大学医学部
・・・金沢大学医学部

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−

LDH

18 0 Z Y M E

H−tyPO （％ M −tyP e （
≠）
EDL

（
N）

7．
8

02 ．
2

（
M）

9．
9

00．
1

（
N）

0．
6

00．
4

（
M）

4．
9

05．
1

80 L （
N）

2 7．
2

72．
8

（
M ） 23．
4

7 0．
0

T旧

（
N）
C A RD く
M）

45．
2

54 ．
8

48．
3

53．
7

（N）ごNORMAL．（M）：MDY

表1．LDHのアイソザイムの割合

図2．LDHのアイソザイムパターン
C：正常マウス、M：硯dyマウス

考察及び結論以上訊dyにおける生化学的解析の結果、代識特性の面から細胞の分化の遅れが示唆された。しかし、収縮特性と関連のある筋蛋白の上からは、大きな差が対照群との間で認められず、他の臓器に帰国する発育不良の可能性が考えられた。

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