日化協LRI研究報告会
2020年8月21日（金）

慢性ヒ素中毒の発症機構と生体応答に関する研究

徳島文理大学薬学部
角 大悟

本日の内容1. 世界におけるヒ素汚染
2. ヒ素化合物の蓄積に関する検討
2‐1: 亜ヒ酸の入り口の同定
2‐2 :転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減
3. ヒ素化合物の解毒・代謝酵素に関する検討
3‐1 :ヒ素メチル基転移酵素（AS3MT） mRNAのスプライシング
3‐2: 過酸化水素によるAS3MT mRNAのスプライシング誘発世界におけるヒ素汚染

WHO暫定ガイドライン：10 g/L
慢性ヒ素中毒：肝、皮膚、肺、腎臓および膀胱における癌、循環器疾患、血管内皮障害等WHO資料（arsenic map）

烏脚病 = 重度の慢性ヒ素中毒症状

1920年代ごろから、台湾の南西海岸で、深さ100－280メートルの井戸水を飲んでいた住民の間に、末梢血管の障害によって四肢に壊疽が生じ、指の先から黒くなっていく 「烏脚病」が多発。

世界におけるヒ素汚染
Soil and Sediments5 mg/kg (1-40 mg/kg)
鉱山, 製錬工場の廃棄物（5-3000 mg/kg）

Air

ヒ素を高濃度含有した石炭を使用する火力発電所
砒鉄鉱石から製錬> 1000 ng/m3

郊外：
0.02-4 ng/m3
都市部： 3-200 ng/m3

火山活動

As4S4

As2S3FeAsS
Earth crust井戸水のヒ素汚染
Water (Deep well water)

As

As4S4

As

As2S3AsFeAsS
Earth crust環境中に存在するヒ素化合物の化学形態

本日の内容1. 世界におけるヒ素汚染
2. ヒ素化合物の蓄積に関する検討
2‐1: 亜ヒ酸の入り口の同定
2‐2 :転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減
3. ヒ素化合物の解毒・代謝酵素に関する検討
3‐1 :ヒ素メチル基転移酵素（AS3MT） mRNAのスプライシング
3‐2: 過酸化水素によるAS3MT mRNAのスプライシング誘発

ヒ素化合物の蓄積に関する検討
脂溶性の薬毒物ほど細胞内に入りやすいのに、水溶性の高い亜ヒ酸はどうして、健康に影響を与えるのか？

脳皮膚食道

腎臓

サルに亜ヒ酸を投与
OHHO

As

OH

口腔肝臓
Vahter M et al. (1982) Arch. Toxicol.

ヒ素化合物の蓄積に関する検討•

アクアポリンは、Peter Agre（2003年、ノーベル化学賞）らによって同定された水チャネル•

ホ乳類においてAQPには13種の分子種が報告されている•

AQPのなかでもグリセロールのような小分子を通過させる分子種をアクアグリセロポリンと称し、AQP3, 7, 9, 10がこれに属する•酵母を用いた系でFps1p（AQPのホモログ）が亜ヒ酸の取り込みに関与していることが報告された
細胞
As(III)

AQP

As(III)

ヒ素蓄積

細胞毒性

亜ヒ酸の入り口の同定
24 h

A48 h

LacZ AQP9 LacZ AQP9

AQP910LacZ
AQP98642001234Time (min)

5D60

LacZ
AQP9504030201000123 4 5Time (h)6Cell viability (% of control)

CArsenic (ng/well)[14C]Glycerol uptake(pmol/well)B

LacZ
AQP910080
**

60

**

40200050100
As(III) (µM)**p < 0.01 vs. control

Shinkai Y, Sumi D et al. (2009) Toxicol. Appl. Pharmacol.

亜ヒ酸の入り口の同定

WB: AQP9B
120200siCont. siAQP91805’-NT8060**

4020Arsenic (ng/well)32(kDa)

AQP9/5’-NT (% of control)

1003634CsiCont.

siAQP9160**

140
120100**80
6040200Time (h)120siCont.

100

siAQP9**80
60402000siCont. siAQP9Cell viability (% of control)A

612As(III)–+**p < 0.01 vs. control

Shinkai Y, Sumi D et al. (2009) Toxicol. Appl. Pharmacol.

本日の内容1. 世界におけるヒ素汚染
2. ヒ素化合物の蓄積に関する検討
2‐1: 亜ヒ酸の入り口の同定
2‐2 :転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減
3. ヒ素化合物の解毒・代謝酵素に関する検討
3‐1 :ヒ素メチル基転移酵素（AS3MT） mRNAのスプライシング
3‐2: 過酸化水素によるAS3MT mRNAのスプライシング誘発

無機ヒ素化合物の代謝様式OHOAsOHOH

PNP

As

HOOH

GS

OH

As

SG

As(SG)3As(III)

As(V)

SG

GSH

AS3MT
CH3CH3O

As

OH

GSTO
HOOH

MMA(V)As

CH3GSHOHGS

MMA(III)AsSG

MMA(SG)2

AS3MT
CH3O

As
OH

CH3CH3DMA(V)

GSTO
HO

As

CH3GSH
CH3DMA(III)GS

As

CH3DMA(SG)Kumagai Y and Sumi D (2007) Annu Rev. Pharm. Toxicol.

転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減

‐GCS

As(III)AQP9

As(III)

GSH

As(SG)3AS3MT

MMA(SG)2

MRP1,2AS3MT

DMA(SG)
intra‐cellularextra‐cellular転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減

‐GCS

As(III)

AQP9As(III)GSH

As(SG)3AS3MT

転写因子
Nrf2

MMA(SG)2

MRP1,2AS3MTDMA(SG)
intra‐cellular
extra‐cellular転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減

スルフォラファン（ブロッコリースプラウト）

Shinkai Y, Sumi D et al. (2006) FEBS letters.

本日の内容1. 世界におけるヒ素汚染
2. ヒ素化合物の蓄積に関する検討
2‐1: 亜ヒ酸の入り口の同定
2‐2 :転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減
3. ヒ素化合物の解毒・代謝酵素に関する検討
3‐1 :ヒ素メチル基転移酵素（AS3MT） mRNAのスプライシング
3‐2: 過酸化水素によるAS3MT mRNAのスプライシング誘発

無機ヒ素化合物の代謝様式
OH
O

As

OH

OH

PNP

As

HOOH

GS

OH

As

SG

As(SG)3As(III)

As(V)

SG

GSH

AS3MT
CH3CH3O

As

OH

GSTOHOOH

MMA(V)As

CH3GSHOHGS

MMA(III)AsSG

MMA(SG)2

AS3MT
CH3O

As
OH

CH3
CH3DMA(V)

GSTO
HOAs

CH3GSH
CH3DMA(III)GS

As

CH3DMA(SG)Kumagai Y and Sumi D (2007) Annu Rev. Pharm. Toxicol.

rs3740400

rs3740393

rs7085104

1

3

rs number
rs7085104

intronic or exonic
intronic

rs3740400

intronic

rs12767543

intronic

rs3740393

rs3740390

rs11191439

rs11191453

rs10748835

rs1046778

intronic

intronic

rs10748835

rs3740390

rs12767543

2

rs11191439(Met287Thr)4567

rs11191453

8 910

intronic

intronic

11

Exon

Study area
San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)

AssociationReferences%iAs! , %MMA! , %DMA" Engstrom et al. (2011)

San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)%iAs! , %MMA! , %DMA"
Engstrom et al. (2011)
As3MT expression

Matlab (Bangladesh)%MMA!

Engstrom et al. (2011)

Yaqui Valley of Sonora (Mexico)

DMA(V)/MMA(V)"

Meza et al. (2005)

Yaqui Valley of Sonora (Mexico)

DMA(V)/MMA(V)"

Meza et al. (2005)

San Antonio de los Cobres (Argentine)%MMA! , %DMA"

Schlawicke Engstrom et al. (2007)

Hoa Hau, Liem Thuan in Ha Nam Province (Vietnam)

DMA/MMA !

Agusa et al. (2009)

San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)%iAs! , %MMA! , %DMA" Engstrom et al. (2011)

Matlab (Bangladesh)%iAs! , %DMA"

Engstrom et al. (2011)

San Antonio de los Cobres (Argentine)%MMA! , %DMA"

Schlawicke Engstrom et al. (2007)

San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)%iAs! , %MMA! , %DMA" Engstrom et al. (2011)

Matlab (Bangladesh)%iAs! , %DMA"

Engstrom et al. (2011)

Central Europe (Hungary, Romania, and Slovakia (ASHRAM study))%MMA", %DMA!

Lindberg et al. (2007)

Chuquicamata (Chile)%MMA"

Hernandez et al. (2008a, 2008b)

MMA/As"Agusa et al. (2009)

Torreon, Coahuila (Mexico)

DNA damage "Sampayo-Reyes et al. (2010)

Matlab (Bangladesh)%iAs! , %DMA"

Engstrom et al. (2011)

Yaqui Valley of Sonora (Mexico)

DMA(V)/MMA(V)"As(III)/MMA(V)"

Meza et al. (2005)

Hoa Hau, Liem Thuan in Ha Nam Province (Vietnam)

DMA/MMA!

Agusa et al. (2009)

San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)%iAs! , %MMA! , %DMA" Engstrom et al. (2011)

exonic (Met287Thr) Hoa Hau, Liem Thuan in Ha Nam Province (Vietnam)

intronic

rs1046778

Matlab (Bangladesh)%iAs! , %DMA"

Engstrom et al. (2011)

San Antonio de los Cobres (Argentine)%MMA! , %DMA"

Schlawicke Engstrom et al. (2007)

San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)%iAs! , %MMA! , %DMA" Engstrom et al. (2011)

Matlab (Bangladesh)%MMA!

San Antonio de los Cobres, Tolar Grande, Olacapato, Salar de Pocitos (Argentine)%iAs! , %MMA! , %DMA"
Engstrom et al. (2011)
As3MT expression

Engstrom et al. (2011)

Matlab (Bangladesh)%MMA!

Engstrom et al. (2011)

Sumi D and Himeno S (2012) Biol. Pharm. Bull.

AS3MTの選択的スプライシングの検出
mRNAMW

RT-PCR

1,353 bp
1,078 bp872 bp603 bp

1 2 3

4 5 6 7 8 9 10 11 12pSC-B

AS3MT

pSC-B
Sumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun

mRNAスプライシングとは？

12 34 5678 91011DNA
転写（DNAの塩基配列情報を読み取り、相補的なRNAを合成する）

pre‐RNA

スプライシング（必要なエキソンのみを集約する）

mature‐RNAAS3MTの選択的スプライシングの解析
Human AS3MT genome DNA
12 34 5678 9105’

113’

開始コドン

splicing

WT 3 4,5

終止コドン

mature mRNA

41.7 kDa

WT
3Exon 3 deletion

2.65 kDa

4,5Exon 4 and 5 deletion

31.1 kDa

Sumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun

AS3MT活性測定方法
AS3MT (WT or 4,5)30 G

SAM（メチル基供与体）

1 M

GSH（還元）7 M

As (III)

10 M

4,5WTWT4,5

H2O2 10 L
37C 6 hr
95C 5 min

37C 1 hr
95C 5 min

HPLC-ICP-MS

カラム： CAPCELL PAC C18 MGII (2.0 mmid×150 mm)
ライン： PEEKチューブ1/16インチ×0.13 mm
移動相： 5 mMテトラブチルアンモニウムヒドロキシド
3 mMマロン酸
4％メタノール
流速： 200 L/min
測定時間： 13 min (ICP-MS: 10 min)
オーブン温度： 37C
オートサンプラー： 4C
注入量： 5 L

WB

CBBSumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun

HPLC‐ICP‐MSによるヒ素化合物の形態分析DMA(V)As(III)MMA(V)

40000

As(V)

CPS

30000
20000
10000
00200400

Time (s)600スプライスフォームはAS3MT活性が欠損している

CPS

MMA(V) As(V)MMA(V) As(V)MMA(V) As(V)

25000

25000

25000

20000

20000

20000

15000

15000

15000

10000

10000

10000

5000

5000

5000

0000200

400 600

0200400 600

0200400 600

Time (s)Time (s)Time (s)タンパク質なし

WT

4,5Sumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun

スプライスフォームはAS3MT活性が欠損している

CMV

AS3MT（WI or Δ4,5）

DMA(V) As(V)

遺伝子導入

亜ヒ酸添加

HPLC-ICP-MS

CPS

pcDNA

DMA(V) As(V)DMA(V) As(V)

1500150015001000100010005005005000000200400Time (s)pcDNA6000200400Time (s)600WT/pcDNA0200400Time (s)600

4,5/pcDNASumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun

ヒトAS3MTのアミノ酸配列

MAALRDAEIQKDVQTYYGQVLKRSADLQTNGCVTTARPVPKHIREALQNVHEEVALRYYGCGLVIPEHLENCWILDLGSGSGRDCYVLSQLVGEKGHVTGIDMTKGQVEVAEKYLDYHMEKYGFQA
SNVTFIHGYIEKLGEAGIKNESHDIVVSNCVINLVPDKQQVL
QEAYRVLKHGGELYFSDVYTSLELPEEIRTHKVLWGECLGGALYWKELAVLAQKIGFCPPRLVTANLITIQNKELERVIGDCRFVSATFRLFKHSKTGPTKRCQVIYNGGITGHEKELMFDANFTFKEGEIVEVDEETAAILKNSRFAQDFLIRPIGEKLPTSGGCSALELKDIITDPFKLAEESDSMKSRCVPDAAGGCCGTKKSCSumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun

ヒトA3MTのアミノ酸配列
SAMとの結合

MAALRDAEIQKDVQTYYGQVLKRSADLQTNGCVTTARPVPKHIREALQNVHEEVALRYYGCGLVIPEHLENCWILDLGSGSGRDCYVLSQLVGEKGHVTGIDMTKGQVEVAEKYLDYHMEKYGFQASNVTFIHGYIEKLGEAGIKNESHDIVVSNCVINLVPDKQQVLQEAYRVLKHGGELYFSDVYTSLELPEEIRTHKVLWGECLGGA
LYWKELAVLAQKIGFCPPRLVTANLITIQNKELERVIGDCRFVSATFRLFKHSKTGPTKRCQVIYNGGITGHEKELMFDANFTF
KEGEIVEVDEETAAILKNSRFAQDFLIRPIGEKLPTSGGCSALELKDIITDPFKLAEESDSMKSRCVPDAAGGCCGTKKSC

活性中心
酵素の安定性Sumi D, Fukushima K et al. (2011) Biochem. Biophys. Res. Commun本日の内容1. 世界におけるヒ素汚染
2. ヒ素化合物の蓄積に関する検討
2‐1: 亜ヒ酸の入り口の同定
2‐2 :転写因子Nrf2活性化による亜ヒ酸毒性の軽減
3. ヒ素化合物の解毒・代謝酵素に関する検討
3‐1 :ヒ素メチル基転移酵素（AS3MT） mRNAのスプライシング
3‐2: 過酸化水素によるAS3MT mRNAのスプライシング誘発

過酸化水素曝露による新規AS3MT mRNAの選択的スプライシング

1 2345 6 7 8900.25

0.52.010 11

HepG2細胞血清freeH2O2添加

H2O2 (mM)
WT
3AS3MT6 hr
RNA回収
RT-PCR

1.0240 bp

β-actin

Sumi D et al. (2016) Biochem. Biophys. Res. Commun

過酸化水素曝露による新規AS3MT mRNAの選択的スプライシングDNA転写
immaturemRNA

1 2 345678エキソン イントロン

91011

選択的スプライシング

1 2 10 11
Δ3-9 AS3MT
Sumi D et al. (2016) Biochem. Biophys. Res. Commun

過酸化水素曝露による新規AS3MT mRNAの選択的スプライシング

イントロンエキソンESE
両端のスプライシング促進

AS3MTmRNA

ESE : Exonic splicing enhancer

SRSF5SRSF5SRSF5SRSF5SC35SF2/ASF

SRSF9ETR3

HiTra2αETR3

HiTra2β1ETR323910Sumi D et al. (2016) Biochem. Biophys. Res. Commun

過酸化水素曝露による新規AS3MT mRNAの選択的スプライシング

H2O2添加培地交換( 血清free )核内タンパク質抽出24 hr培養

HepG2細胞Western blot

1.5～6 hr

1.5 hr013 hr2016 hr2012 H2O2 (mM)

SRSF4
SRSF6SRSF5Lamin B
Sumi D et al. (2016) Biochem. Biophys. Res. Commun

SRSF5 siRNA導入HaCaT細胞における亜ヒ酸感受性の変化

SRSF5Cont. No.1 No.2SRSF5GAPDHcontrol siRNA

120

Cell viability(% of control)

siRNA140
SRSF5 siRNA（No.1)

100
SRSF5 siRNA (No.2)

80604020

SRSF5siRNAAS3MTmRNA00.1

Cont. No.1 No.2

WT31

10As(III) (M)

1001000

SRSF5 siRNA導入HaCaT細胞の亜ヒ酸感受性の上昇に関与する因子

Control siRNA

48 hr
SRSF5 siRNA (No.1)

10 M As(III)曝露
3 hr
RNA回収

SRSF5 siRNA (No.2)

次世代シークエンサーでRNA量の解析

SRSF5 siRNA No.1とNo.2で共通して減少しているmRNA群を抽出

SRSF5 siRNA導入HaCaT細胞の亜ヒ酸感受性の上昇に関与する因子

Relative value (vs. control siRNA)

6Cont. siRNACont. siRNA - As(III)SRSF5 siRNA - As(III)543210

SRSF5

ABCC3IFI6

IFI27

OTUD6B

As(III)によりmRNA量が変化なし

XAF1

CBS

FOXA1

CHAC1

As(III)によりmRNA量が上昇

NRP2SUOXHIVEP3As(III)により SRSF5の効果がmRNA量が減少見られない

候補遺伝子のsiRNA導入HaCaT細胞の亜ヒ酸感受性の変化

mRNA levels(vs. control siRNA)

IFI6

IFI27

XAF1CBS

FOXA1

1.2
1

1: Cont. siRNA
2: Target siRNA

0.8
0.6
0.4
0.2
01212

121212Cell viability (% of control)

140120Cont. siRNAIFI6 siRNA100

IFI27 siRNAXAF180CBS siRNA
FOXA160402000.1110As(III) (M)

1001000ヒ素化合物の毒性研究から見える展望• 亜ヒ酸の入り口としてAQP9を同定した。
• 転写因子Nrf2の活性化により亜ヒ酸毒性が軽減した。
→ 慢性ヒ素中毒患者に対するNrf2活性化剤を使用した解毒効果• AS3MT mRNAのスプライシング異常を検出した。
• 亜ヒ酸の毒性に関わる因子としてFOXA1を同定した。
→ 慢性ヒ素中毒患者におけるAS3MT mRNAのスプライシングはどうなっているか？
→ 慢性ヒ素中毒による中毒症状とFOXA1との関連性

医薬品としてのヒ素化合物

As2O3

急性前骨髄球性白血病（APL）【正常な好中球への分化・成熟】

幹細胞

骨髄芽球

前骨髄球

骨髄球

後骨髄球

【急性前骨髄性白血病における分化・成熟の障害】

ATRA投与により、骨髄球以降への分化・成熟の再開

ATRA投与亜ヒ酸投与

亜ヒ酸との共存により、ATRAによる骨髄球への分化再開が、促進されるか？

亜ヒ酸はATRAによるHL‐60細胞の分化を増強させる

0M1

10e0

10e1
10e2
10e3
Yellow Fluorescence (YEL-HLog)

10e4

Plot3: Gated by : Gate 18048 h70***72 h
***
**

**60

DMSO (0.1%)
ATRA (0.1 M)

50
40
3020
100

Forward Scatter (FSC-HLin)
2500
5000
7500

10000

ATRA(0.1 M)% of events in Upper-Right

Plot3: Gated by : Gate 1

Forward Scatter (FSC-HLin)
2500
5000
7500

10000

DMSO(0.1%)

00.25

0.5

As(III) ( M)

00.25

0.5

As(III) ( M)**p < 0.01***p <0.0010M1

10e0

10e1
10e2
10e3
Yellow Fluorescence (YEL-HLog)

10e4

計測した10,000細胞のうち,青枠に入った細胞数の割合を定量
Sumi D, Suzukawa K et al. (2016) Life Sci.

ATRAはAQP9 mRNAの発現を亢進させる

12Relative mRNA value

10**Cont.
ATRA 0.1 M
ATRA 1.0 M

HL-60細胞（分化前）
ATRA
添加

8**

6

AQP9 ↑

42As(III)

N. D.

0
AQP3

AQP7

AQP9N. D. = not detected**p < 0.01

分化増強

As(III)謝辞••

徳島文理大学薬学部 姫野誠一郎教授、スタッフの皆様、学部生
筑波大学大学院人間総合科学研究科 熊谷嘉人教授、大学院生

御清聴、ありがとうございました。

アジア地域におけるヒ素汚染【中国】内モンゴル自治区

【中国】
シンチャン
ウイグル自治区

【中国】
山西省

【インド】
西ベンガル州【バングラディッシュ】【タイ】
ロンピブン村3,000,000【日本】
土呂久・松尾【台湾】
嘉義、台南県47,000,000

【中国】
貴州省
【フィリピン】
ミンダナオ島