令和２年８月２５日

ウイルスの不活化に最適なＬＥＤ光の決定– A 型インフルエンザウイルスの不活化に最適な紫外線を決定する
新たな指標「RAE」を開発–
徳島大学大学院医歯薬学研究部・予防環境栄養学分野の高橋章教授、馬渡一諭講師、児島瑞基大学院生ら７人と同大学院社会産業理工学研究部の榎本崇宏講師ら３人、京都府立医科大学感染病態学教室、日本フネン株式会
社の共同研究グループは、A 型インフルエンザウイルスの不活化に最適な紫外線を決定する新たな指標「RAE」を開発しました。３種類の紫外線発光ダイオード（UV-LED）を組み合わせることで「RAE」の高い光源の作成に成功し、季節性及び鳥インフルエンザウイルスに対して高い不活化効果を実証することできました。この成果は７月８日に学術雑誌 Microorganismsにオンライン掲載されました。また、本技術を特許出願いたしました。

【研究グループ】
徳島大学 大学院医歯薬学研究部 予防環境栄養学分野
高橋章教授、馬渡一諭講師、上番増喬特任助教、下畑隆明助教、
児島瑞基大学院生、野中理沙大学院生、Thi Kim Ngan Bui 大学院生
徳島大学 大学院社会産業理工学研究部
榎本崇宏准教授、芥川正武講師
木内陽介顧問（現・徳島大学名誉教授、研究支援・産官学連携センター客員教授）
日本フネン株式会社 研究開発部
和田敬宏、岡本雅之、伊藤浩、東條健治
京都府立医科大学 感染病態学教室
中屋隆明教授、大道寺智講師【特許の出願状況】「ウイルスの紫外線殺菌装置及び紫外線殺菌方法（特願 2020-094721）」
国立大学法人徳島大学、日本フネン株式会社【学術誌への掲載状況】『Irradiation by a Combination of Different Peak-Wavelength Ultraviolet-LightEmitting Diodes Enhances the Inactivation of Influenza A Viruses』
Mizuki Kojima, Kazuaki Mawatari, Takahiro Emoto, Risa Nishisaka-Nonaka, Thi Kim
Ngan Bui, Takaaki Shimohata, Takashi Uebanso, Masatake Akutagawa, Yohsuke
Kinouchi, Takahiro Wada, Masayuki Okamoto, Hiroshi Ito, Kenji Tojo, Tomo Daidoji,Takaaki Nakaya, Akira Takahashi
Microorganisms 第 8 巻 第 8 号 E1014 ページ（2020 年 8 月発行）
https://doi.org/10.3390/microorganisms8071014

【本研究の背景】
新型コロナウイルスによる感染症（COVID-19）が蔓延し大きな社会問題となっています。コロナウイルスと同様に、インフルエンザウイルスも過去 10 年〜40 年の周期でパンデミック（世界的流行）を発生しており、人類にとって脅威となっている病原ウイルスの 1 つです。インフルエンザウイルスはエンベロープタイプの一本鎖 RNA ウイルスで、コロナウイルスと似通った構造を有しています（図１）。
A 型インフルエンザウイルスは多くの亜型が存在し、ヒト以外の哺乳類や鳥類を宿主とする人獣共通感染症のウイルスで、鳥インフルエンザが発生した場合、ヒトだけでなく、養鶏産業に大きな被害をもたらします。ウイルス遺伝子の突然変異を高い確率で起こしやすい性質があり、宿主間での感染か繰り返されれば、やがてヒトに適応した新型インフルエンザになる可能性があります。当研究グルー
プは、紫外線発光ダイオード（UV-LED）による病原性微生物への殺菌・不活化効
果と機構を解明する研究を続けており、2018 年には UV-LED の照射が A 型インフル エ ン ザ ウ イ ル ス の 不 活 化 に 有 効 で あ る こ と を 報 告 し ま し た （ Journal of
Photochemistry & Photobiology, B: Biology 第 189 巻 193-200 ページ）
。近年では様々なピーク波長の UV-LED が開発されていますが、どのピーク波長の UV-LED が病原ウイルスの不活化に最も効果的か明らかにされていませんでした。また、紫外線殺菌灯として広く利用されている低圧水銀ランプ（UV ランプ）と病原ウイルスへの不活化効果を比較した報告は多くはありませんでした。そこで、本研究ではピーク波長の異なる 7 タイプの UV-LED と UV ランプを一定の照度・照射時間に合わせて A 型インフルエンザウイルスの溶液に照射し、不活化効果を比較しました。また、得られた結果をもとに、病原性ウイルスの不活化に最適な LED 光の波長の決定する新たな指標を開発することを目的としました。

図１. A 型インフルエンザウイルスと新型コロナウイルスの特徴（アメリカ微生物学会の情報を一部改変）

【結果の概要】
ピーク波長（カタログ値）がそれぞれ 365nm、310nm、300nm、290nm、280nm、270nm、及び 260nm の UV-LED（すべて日亜化学工業製）を使用して低圧水銀ランプ（UV ランプ）との比較を行いました。本研究では、哺乳類と鳥類への感染抑制効果を評価するために、イヌ腎尿細管上皮由来細胞（MDCK 細胞）と発育鶏卵の2 種類の感染宿主を用いて紫外線照射による不活化効果を評価しました。すべての光源を同じ放射照度（2.4mW/cm2）となるように調整し、ウイルス溶液に 2 秒間照射を行いました。照射後のウイルス溶液を MDCK 細胞と発育鶏卵に感染し、ウイルス力価（感染力価）を評価しました。すると、260 nm UV-LED による照射が最も不活化効果が高く、UV ランプよりも有意に高くなりました（図２）。次に、定量的 RT-qPCR 法で UV-LED または UV ランプ照射によるウイルス RNA の傷害性を評価しました。すると、感染力価の結果と同様に 260 nm UV-LED による照射が最も傷害度が高く、UV ランプよりも有意に高くなりました（図３左）。また、UVLED や UV ランプ照射によるウイルス力価の低下（不活化効果）はウイルス RNAの傷害性と高い相関性を示しました（図３右）。そこで、紫外線光源の発光スペク
トルとウイルス RNA の吸収スペクトルと相関性を示した係数「RAE」を考案しました（図４上）。これまで用いた紫外線光源の「RAE」とその不活化効果には高い相関性があることが示されました。そこで、より高い「RAE」の紫外線光源を作成するために、3 種類の UV-LED を組みあせた Hybrid 型 UV-LED を作成しました（図４下）。同じ放射照度（2.4mW/cm2）で 2 秒間照射した場合、Hybrid 型 UV-LED は最も高い不活化効果を示しました（図５）。Hybrid 型 UV-LED の照射による高い不活化効果は、H1N1 亜型だけではなく、鳥インフルエンザウイルス（H6N2 亜型）にもみとめられました（図５）。UV-LED などの紫外線光源の「RAE」を高くする、つまり、光源の発光スペクトルをウイルス RNA の吸収スペクトルに近づけることにより、紫外線照射によるウイルス不活化効果を高めることができる可能性が考えられました。

図２. 本研究で用いた紫外線発光ダイオード（UV-LED）
本研究で用いた UV-LED（日亜化学工業製）と低圧水銀ランプ（UV ランプ）の波長スペクトル。すべて放射照度が 2.4 mW/cm2 に調整して照射を行った。UV-LEDもナローバンドであるが、 UV ランプの方が短い波長で波長帯も小さいことがわかる。

図３. UV-LED 及び UV ランプ照射による A 型インフルエンザウイルス（H1N1 亜型）
不活化効果の比較
ウイルス溶液に UV-LED または低圧水銀ランプ（UV ランプ）を 2.4mW/cm2 で2 秒間照射後、MDCK 細胞または発育鶏卵に感染させ、ウイルス力価を測定した。
ウイルス力価はフォーカス形成単位 FFU/mL（感染宿主：MDCK 細胞）と 50 %鶏卵感染価 EID50/mL（感染宿主：発育鶏卵）で評価を行った。260 nm UV-LED による照射が最も不活化効果が高く、UV ランプよりも有意に高かった。下図は未照射及び 260 nm UV-LED 照射のウイルス溶液を感染させた MDCK 細胞の顕微鏡像で、ウイルス感染細胞を可視化した（免疫細胞染色による蛍光標識）。

図４. UV-LED 及び UV ランプ照射による A 型インフルエンザウイルス（H1N1 亜型）の RNA 傷害度の評価とウイルス不活化効果との相関図
定量的 RT-qPCR 法で UV-LED または UV ランプ照射によるウイルス RNA の傷害性を評価した。260 nm UV-LED による照射が最も傷害度が高く、UV ランプよりも有意に高かった（左図）。UV-LED や UV ランプ照射によるウイルス力価の低下（不活化効果）はウイルス RNA の傷害性と高い相関性を示した（右図）。

図５. 紫外線光源の発光スペクトルとウイルス RNA の吸収スペクトルとの相関性を示した係数「RAE」 と Hybrid 型 UV-LED
紫外線光源の発光スペクトルとウイルス RNA の吸収スペクトルと相関性を示した係数「RAE」を考案した（上図）。3 種類の UV-LED を組みあせて、高い「RAE」の紫外線光源 Hybrid 型 UV-LED を作成した（下図）。

図６. Hybrid 型 UV-LED 照射による季節性及び鳥インフルエンザウイルスへの不活化効果
Hybrid 型 UV-LED と 258 nm、260 nm、270 nm UV-LED の照射によるウイルス不活化効果を比較した。ウイルス溶液に同じ放射照度（2.4mW/cm2）で 2 秒間照射した場合、Hybrid 型 UV-LED は最も高い不活化効果を示した。Hybrid 型 UV-LED の照射による高い不活化効果は、H1N1 亜型だけではなく、鳥インフルエンザウイルス（H6N2 亜型）にもみとめられた。

【今後の展望（研究者からのコメント）】
昨今の新型コロナウイルス感染症拡大に伴い、紫外線照射による病原ウイルスの不活化にも関心が集まっています。水銀および水銀を使用した製品の製造と輸出入の規制が進められており、水銀を含まない紫外線光源として LED が注目されています。LED はフィルターを介さずにナローバンドの光を発光可能ですが、市場に出回っている UV-LED のピーク波長は様々です。本研究では日亜化学工業株
式会社よりピーク波長が 10 nm ずつ異なる UV-LED を提供いただき、A 型インフルエンザウイルスへの不活化効果を比較しました。放射照度 2.4 mW/cm2 で 2 秒間の照射という僅かなエネルギーの照射でも、260 nm、270 nm、280 nm UV-LED は不活化効果を示しました。なかでも、260 nm UV-LED は UV ランプよりも有意に高い不活化効果を示しました。
しかし、深紫外線（UVC）LED は発光効率が低いため、さらにウイルス不活化の効率を上げる必要があると考えました。そこで、紫外線光源の発光スペクトルとウイルス RNA の吸収スペクトルと相関性を示した係数「RAE」を考案しました。
「RAE」を高めるために作成した Hybrid 型 UV-LED による照射は、他の UV-LEDに比べて高い不活化効果を得ることができました。
「RAE」は病原ウイルスの不活化を目的とした紫外線光源を新たな指標となると考えています。
私どもの最近の研究より、季節性コロナウイルス HCoV OC43（新型コロナウイ
ルス SARS-CoV-2 と同じベータコロナウイルス属のコロナウイルス）は A 型イン
フルエンザウイルスよりも UV-LED 照射で不活化されやすいことがわかってきました（図７）。今後は、「RAE」が新型コロナウイルスや他の病原ウイルスへ応用可能か検討を行うとともに、本技術の用途拡大を目指していきたいと考えています。

図７.季節性コロナウイルス（HCoV OC43）と A 型インフルエンザウイルス（H1N1亜型）に対する 280nm UV-LED 照射の不活化効果の比較
280nm UV-LED（日亜化学製 NCSU334B）を照射した際の不活化効果を比較した。
季節性コロナウイルス（HCoV OC43）は VeroE6/TMPRSS-2 細胞に感染させて、ウイルス力価 TCID50/mL を測定した。季節性コロナウイルスは A 型インフルエンザウイルスよりも UV-LED 照射で不活化されやすかった。
研究協力者：福田朔・古家光二（徳島大学医学部医科栄養学科４年）【特記事項】
本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金（課題番号 20H01616）及び徳島大学研究クラスター事業「近紫外-深紫外発光ダイオード照射による病原ウイルス不活化の最適化シミュレーション技術の開発と応用」の支援を受けて行いました。

【問い合わせ先】＜徳島大学＞
部局名大学院医歯薬学研究部
予防環境栄養学分野
責任者 高橋 章（タカハシ アキラ）
電話番号 088-633-9598
FAX088-633-7092
ﾒｰﾙｱﾄﾞﾚｽ akiratak@tokushima-u.ac.jp