厚生

省

新薬開発研究費

微生物の二次代謝産物に由来する
難病治療薬（ロイぺプチン）の開発研究1
梅沢班

昭和55年度研究報告書

昭和56年3月

研究報告書の作成にあたって「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の研究」が昭和54年度に厚生省薬務局より新薬開発研究としてとりあげられ，私が班長として本研究班が発足し第2年度を迎えた．
第2年度は初年度に引き続き，ロイペプチソの基礎研究を行うため新たに生化学者の参加を求め，また臨床研究を始めるため国立武蔵療養所神経センター長の里青菜二郎博士の世話で臨床研究者を班員として迎え，本研究班の充実を図った．かくして，本邦斯界の優れた研究者により本班が編成され，私は班長としての任務を全うすることができたと思う．
本年度はロイペプチソの生化学的，薬理学的，生理学的，病理学的研究および前臨床試験ならびに薬効評価の基準を決める研究など，広範囲の研究が施行された．一方，ロ
イペプチソは筋ジストロフィーマウスに投与することにより，顕著な症状回復効果のあることが兄いだされた．また，細胞膜表面に存在することを明らかにしたアミノペプチ
ダーゼBの阻害物質として微生物培養液中から発見され，免疫増強物質として開発中の
べスタチソが筋ジストロフィーマウスに対し，顕著な症状回復効果を有することが発見された．
本研究班の目的は筋ジストロフィー症の治療薬の開発を行うことであるが，班員の努力により著しい成果をあげることができた．また，これらの結果は筋ジストロフィー症の原田，経過の解明にも役立つと思われる．本研究を重要課題としてとりあげられた厚生省薬務局ならびに班員各位に感謝する次第である．
昭和56年3月
班

−

1

−

長

梅

沢

浜

夫

目

次

ⅰ

梅

研究報告の作成にあたって

沢

浜

夫

総括研究報告微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）
の開発研究

3

梅

沢

浜

夫

分担研究報告17

ロイペプチンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究村地孝

高速液体クロマトグラフィーによるロイペプチンおよび25

関連物質の微量螢光定量法
大

倉

洋

甫

33

ロイペプチンの細胞レベルでの研究
岩

崎

祐

三

ロイペプチンの薬理学的研究

41

大

塚

正

徳

脱髄病変に及ぼすロイペプチンの影響

49

米

ⅲ

沢

猛

筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素の活性変動に対するロイべプチンおよびべスタチン投与の影響

55

松

下

宏

ラット実験的筋萎縮に対するロイペプチンの影響

63

高

木

昭

夫

ロイペプチンの筋崩壊阻止作用に関する組織学的研究

67

埜

中

征

哉

筋ジストロフィー症鶏の生産・供給

75

野

村

達

次

Duchenne Muscular Dystrophy患児へのロイペプチン

1回投与とその成績について

77

三吉野産治
ロイペプチンの種々筋萎縮性疾患に対する経口投与の効果─Ⅰ．100mg1回投与について─

81

村

上

慶

郎

ロイペプチン投与の影響─ヒトおよび実験的筋再生に対する検討─

85

木

下

真

男

ロイペプチンの難病治療薬としての開発研究

93

田

中

亘

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）研究班
分担研究者一覧

137

ⅳ

総

括

研

究

報

告

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究

主任研究者

梅

沢

浜

夫

昭和54年度に新薬開発研究の一課題として，産物である．本年度の研究で，べスタチンが筋ジ筋ジストロフィー症の治療研究に蛋白分解酵素阻

ストロフィーマウスに著効を示すことが発見され害物質であるロイペプチンがとり上げられ，このた．かくして，ロイペプチンとともにべスタチン

新薬開発研究班が結成された・の臨床研究が行われることになった．現在，日本初年度においては，ロイペプチンの臨床研究に国内はもとより，米国などの諸外国でロイペプチ

対する基礎研究として，薬理学的研究，生理学的ンおよびべスタチンについて活発な研究が行われ研究，病理学的研究，毒性試験ならびに筋ジストている．各分担研究者により行われた研究は次のロフィーマウスおよび筋ジストロフィー鶏に対す通りである．
1）村地孝（京都大学医学部）：−ロイペプチン

る作用，また効果判定のための基礎研究を行った・のプロテアーゼ阻害作用に関する研究

筋ジストロフィー症の治療薬開発を推進する本研究班は55年度においては，前年度の研究課題

2）大倉洋甫（九州大学薬学部）：一高速液体クを継続して研究するとともに，新たに2名の生化

ロマトグラフィーによるロイペプチンおよび関連学者および3名の臨床研究者の参加を求め，本班

物質の教皇蛍光岳量法3）岩崎祐三（国立武蔵療養所神経センター）：のより充実を図った．本年度はロイペプチンの生−ロイべプチンの細胞レベルでの研究

化学的研究，薬理学的研究，生理学的研究，病理4）大塚正徳（東京医科歯科大学）：−ロイべプ

学的研究，前臨床試験，モデル動物に対する効果

チンの薬理学的研究

な どを調べるとともに，臨床研究を対象とした薬5）米沢 猛（京都府立医科大学）：−脱髄病変効評価の基準を検討した．一方，筋ジストロフィに及ぼすロイペプチンの影響

ーマウスの発症直後（2遇齢）からロイべプチンを投与することにより顕著な症状回復効果のある

6）松下 宏（和歌山県立医科大学）：一筋ジス

ご、とが確認された．また，筋ジストロフィーマウ

トロフィーマーウスにみられる種々な酵素の活性変スおよびニワトリの筋肉内のアミノペプ享ダーゼ

動に対するロイべプチンおよびべスタチン投与の活性が正常群に比べ，異常に上昇していることが影響明らかになったので，べスタチンの筋ジストロフ7）高木昭夫（国立武蔵療養所神経センター）：ィーマウスに対する効果が検討された・べスタチ−ラット実験的筋萎縮に対するロイペプチンの影

ンほ細胞表面に存在するアミノペプチダーゼ活性響 ■を阻害するとともに細胞表面に結合する・−この結8）埜中征哉（国立武蔵療養所神経センター）：果に基づき，免疫増強剤として開発中の放線菌生−ロイペプチンの筋崩壊阻止作用に関する組織学

−

3

−

的研究

存在する・カルパインⅠは40／川Ca2十で50％

9）野村達次（実験動物中央研究所）：一筋ジスの活性化を起すが，カルパインⅡの完全活性化にトロフィー症鶏の生産，供給は3〜5mMのCa2十を必要とする．カルパスタチ

10）三吉野産治（国立療養所西別府病院）：−ンに対してほ，カルパインⅡのほうがカルパイン

Duchenne Muscular Dystrophy患児へのロイペ

Ⅰより高い感受性を示すが，阻害様式そのものにプチン1回投与とその成績については差異がない．

11）村上慶郎（国立療養所箱根病院）：−ロイ

ロイペプチンけ肝臓カルパインⅠおよびⅡをほペプチンの種々筋萎縮性疾患に対する経口投与のとんど同程度に阻害する．その阻害度はアンチパ

効果

インのそれより強く，また，カルパインⅠおよび

12）木下真男（東邦大学医学部）：−ロイペプ

Ⅱはペブスタチンまたはエラスタチナールの阻害

チン投与の影響−ヒトおよび実験的筋再生に対すを受けない．これらの様相は，骨格筋CANPにる検討

ついて知られている阻害剤のスペクトルとほとん13）田中 亘（日本化薬株式会社）：−ロイペ

ど差がなく，CANPがカルパイン群の1つの酵

プチンの難病治療薬としての開発研究素であるとみなして差支えないことを示している．

次に上記各班員の研究成果について要約する．
2・高速液体クロマトグラフィーによるロイベ

1・ロイぺプチンのプロテアーゼ阻書作用に関

プチンおよび関連物質の微量螢光定量法する研究

大倉班員はロイペプチンの筋ジストロフィー症

村地班員は，Ca2＋依存性中性プロテアーゼ

に対する薬効を判定する目的でロイペプチンおよ（CANP）を含むより広い類縁酵素群に対するロ

びその関連物質の高感度定量法の開発研究を行っイべプチンの阻害作用を研究する目的で，まずこた．大倉班員らが開発したベンゾインによるグアの類縁酵素群をカルパイン（calpain，カルシウム

ニジン煩の螢光反応を適用し，ロイペプチン酸のcalとチオールプロテアーゼの語尾−ainの造（LeupCOOH）およびロイシルアルギニン（Leu−語）と命名し，その骨格筋以外の臓器における分Arg）の蛍光誘導体を作成し，これを高速液体ク布を研究した．

ロマトグラフィー（HPLC）により分離する方法

ラット肝臓および脳のカルパインは，これに対である．ロイペプチンはそのままでは反応しにくする内因性の特異インヒビター蛋白質と共存していので，あらかじめ還元してロイペプチノール

いることが明らかにされた．このインヒビターは（LeupOH）にしている．

カルパインと同様に広い分布を示し，カルパスタ

測定法は，試料100FLlに1．5mg／mlNaBH

チン（calpastatin）と命名された．カルパインと50〆を加え室温で5分間放置後，1．5M HC150

カルパスタチンほ，pH7．5におけるDEAE一セ〆を添加し，さらに10分間放置することによりルロース・クロマトグラフィーまたはゲル濾過に過剰のNaBH4を分解する．4mMベンゾイン

よって分別採取されることが知られた．

（メチルセロソルプ中）100′坊0．1Mβ−メルカプ

カルパスタチンは28〜30万ダルトンの分子サ

トエタノール，0・2MNa2SO。100〆1．5MKOH

イズで，きわめて耐熱性の蛋白質である．カルパ

200〆を加え1000Cで90秒間加熱後，水冷下でインの阻害はCa2十を奪取するために引き起され

0・5Mトリス緩衝液（pH9．2），1．25M HC1200

るものではない．

〆を加え，その100〆をHPLCに流す．カラム

ラット肝臓には少なくとも2種のカルパインがJ−

はLichrosorbRP−18（0．4×15cmi．d），溶離は
4−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究

メタノール，0．5Mトリス緩衝液（pH9．0）およおよび27週日の浅胸筋と外転筋についてみび1％テトラー乃−プチルアンモニウム塩の混液た場合，ロイペプチン投与鶏と非投与鶏の筋（7：1：2），検出器は日立賛光モニター（フィル

細胞膜の構造は識別しがたく，両者とも正常タ一式）を用いた．

対照鶏の筋細胞膜構造とは著しく異なることを知った．

結果は，ロイペプチン，Leup COOHおよび
Leu−Argのベンゾイン蛍光体を9分以内に分2）正常マウスの成育に対するロイペプチソ連

離・検出することができた．これらの化合物の検

続投与の影響を知る目的で，ICR系マウスの出限界はHPLC注入量100′上Jでは，それぞれ新生児同胞を2群に分け，一方に生後10日

150，100および150pmolであった．つぎに，ヒ目よりロイぺプチン1mg／体重10gを腹腔

ト血祭（血清）中のロイべプチン塀の定量法を検内に連続投与．最長15週間の観察を行った・

討した．血祭中100pmol／ml（50ng／ml）以上のロ

投与開始後5週目からロイべプチン投与群にイペプチンおよびLeupCOOHを再現性よく測

体重増加の程度が対照群より大となる傾向が定しえた．さらに血柴中に妨害物質として存在すみられたが，投与7遇および15週のマウスる大量のアルギニンおよびペプチド煩を除去するについて行った脳，肺，心臓，肝，脾臓，腎ため，酢酸エチルでロイべプチンの蛍光体を抽出

臓，胸腺，大動脈，副腎についての光学顕徴した．血祭中10pmol／mJのロイべプチンを測定

鏡的検索では異常を認めなかった．現在，電することが可能になった．本法は，ヒト血液中に子顕微鏡による検索をすすめている・

微量に存在するロイべプチンを定量することが可能であり，さらに動物体内におけるロイペプチン

4．ロイベプチンの薬理学的研究の動態ならびにその代謝産物の検索に適用できる・

大塚班員はロイペプチンのジストロフィー鶏の筋収縮に及ぼす影響ならびにラットの筋線維およ3．ロイぺプチンの細胞レベルでの研究

びモルモット神経細胞膜に対する効果などについ岩崎班員はジストロフィー鶏の筋細胞膜に対すて検討した．
1）ジストロフィー鶏における研究：ロイペプ

るロイべプチンの影響ならびに正常マウスの成育

チンがジストロフィー鶏の筋収縮力を増強すに及ぼす影響を検討した．
1）・凍結割断法を用いてジストロフィー鶏の筋

るかどうかを検討するために，以下の実験を

細胞膜の異常を CaVeOlae の密度の変化を指行った．体重約2kgのジストロフィー鶏標として定量的にとらえる方法を開発，この（line413）をエーテル麻酔下に大脳を除去し方法を用いて，ロイペプチン投与が筋細胞膜た後，背位に固定し，長横側手根伸筋および構築に及ぼす影響を定量的にとらえることを

これを支配する神経を露出した．刺激として試みた．まず聯化直後では，ジストロフィー

ほ鶏の筋細胞膜の構造が対照正常鶏のそれと異激（100Hz，100発），C）支配神経の単一刺ならないこと，つまりジストロフィー鶏にお激，d）神経の連続刺激（100Hz，100発）

ける筋細胞膜の異常は醇化後2〜5週の間にの4種を用い，これによって生ずる長横側手発現することを明らかにし，ついでジストロ

板伸筋の収縮をトランスデューサーを介してフィー鶏にロイペプチン50mg／体重1kg

ペンレコーダー上に記録した．上記4種類のを腹腔内に連続授与した場合と非投与ジスト

刺激に対する収縮が約1時間にわたって安定

ロフィー鶏の比較夢行った結果，醇化後13に記録されることを確かめた後，ロイべプチ−−5−a）筋の単一直接刺激，b）筋の連続刺ン（2mg／kg）を腹艦内に投与した．筋あるている．培養5日後よりロイペプチンを投与

いは神経の単一または連続刺激によって生ずした場合，中毒性変化はかなり軽減される．

る単収縮および強縮はロイペプチン注射後

髄鞘形成完了後にロイペプチンを投与した場

1．5時間にわたってまったく変化しないか，

合，50／Jg／mJでは中毒性変化はみられない・

あるいは軽度の減少を示した．以上の結果か

2）髄鞘形成の完成した培養を50〜100J堰／mJ

ら，ロイペプチンはジストロフィー鶏の筋収で1週間処置したのち，EAE家兎血清，多縮を急性実験の範囲では増強しないものと推

発性硬化症患者の増悪期血清を10〜50％の定されているが，慢性的に投与した場合の効濃度で培養液に混じて培養に投与し，脱硫の果については今後さらに検討する必要がある．

出現，そのパターン等を検討したが，対照の2）筋線維および神経細胞の細胞膜に対する効無処置の培養と同様の変化であった．これは

果：ロイペプチンが細胞膜の透過性に影響を抗体による脱髄に対してロイべプチンは影響与えるかどうかを，a）ラットの長址伸筋おを与えていないことを示すものと思われる．

よびヒラメ筋，b）モルモットの交感神経節

感作リンパ球による脱髄に際してのロイペプ細胞，およびC）ラット脊髄の運動ニューロ

チンがどのような修飾を生ずるかを検討する

ンについて，細胞内電極法を用いて検討した．

必要がある．

ロイペプチン5×10￣5〜10￣4g／mJは筋線維

および神経細胞の静止電位，活動電位には影

6．筋ジストロフィーマウスにみられる種々な響を与えなかったが，節前線維刺激によって酵素の活性変動に対するロイぺプチンおよ

交感神経節細胞から記録される興奮性シナプ

びベスタチン投与の影響

ス後電位を抑制した．▲−

松下班員は，筋ジストロフィーマウスにおいて症状進行に伴って認められる血清中，骨格筋およ5．脱髄病変に及ぼすロイ乍プチンの影響

び腎臓中の種々の酵素活性に対するロイペプチン

米沢班員は脱髄疾患の特徴的病変である脱髄病およびベスタチン投与の影響ならびに筋ジストロ

変の誘起に関与するプロテアーゼに対するロイべ

フィーマウスの発症直後からべスタチンを連続投

プチンの効果を検討した．

与したときの症状回復について検討した・

脱髄病変は賦活化された食細胞による髄鞘の破筋ジストロフィーマウスにおいて，症状進行に壊であるが，これには食細胞から放出されるプロ

伴って認められる血清中，骨格筋中および腎臓中

テテーゼの活性によるとされ，プロテアーゼ阻止のクレアチンキナーゼ（CPK），ピルビン酸キナー剤による脱髄病変の抑制が示唆されている．

ゼ（PK），GOT，GPT，Ca依存性中性プロテア￣したがって，まず，ロイペプ≠ンが小脳培養にーゼ（CANP），γ一グルタミルトランスペプチダ

及ぼす中毒性変化，ことに駐輪形成に及ぼす影響ーゼ（γ−GTP）およびロイシン・アミノペプチダ

を検討し，ついで，ロイペプチン処理を行った小ーゼ（LAP）の活性変動に対するロイペプチンお脳培養に脱髄疾患血清を授与して脱髄像の修飾をよびベスタチン投与の＿影響ならびに発症直後の2検討した．

遇齢からべスタチンを連続投与し声筋ジストロフ

二1）型のごとく，マウス新生仔小脳を培養し，ィーマウスの症状回復について歩討を行？ち・培養2日後よりロイペプチンを投与した場合，

1）2カ月齢のC57BL／6J−dy系疾病マウス

一・10′唱／mJ以上の濃度で髄鞘形成の抑制がみ

およびその同腹正常マウスについて上記酵素

られ，オリゴデンtドログリアの変性が目立っの活性を測定した結果，一筋ジストロフィーマ

−

6￣

−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究

ウス血清中ではCANP，γ−GTP，LAPを除筋萎縮モデルとして足関節固定による不動性筋

く各酵素の活性が著しく上昇し，一方，骨格萎縮，および座骨神経切断による脱神経性筋萎縮

筋中ではCPK，PKが著しく活性低下し，を作製した．手術直後より前者に対してはロイべ

CANP，γ−GTP，LAPが活性上昇している

プチン40mg／kgを背部皮下に投与した（12回，ことが認められた．

4週間）．後者にはロイペプチン 8mg／kg，ペブ

2）2〜8週齢の筋ジストロフィーマウスにロ

スタチン4〜8mg／kgおよびdimethylsulfoxide

イペプチンまたはべスタチソを0．2mgずつ（5％）を下腿前面に筋注した（10回，2週間）・

1日2回連続投与，2カ月齢および3カ月齢

ラット体重，筋湿重量，筋蛋白量や筋組織像など

で酵素活性を測定した．また同濃度のロイべの項目を検討した．

プチンおよびべスタチンを1／2量ずつ6遇齢1）不動性筋萎縮：表示したように，筋湿重量の疾病マウスに投与し，4週間後に酵素活性と筋蛋白の減少はロイペプチンにより阻止されなかった．

の測定を行った結果，両インヒビターともに血清中の各酵素活性を低下させ，筋中のi）ヒラメ筋湿重量（萎縮側／健側，％）
ロイべプチソ投与
54土6％（ル＝5）

CANPおよびγ−GTP活性を低下させ，非投与
50土2％（乃＝5）ii）ヒラメ筋蛋白量（mg／wetg）
萎縮側健側CPK，PK，GPT活性を上昇させる効果をもつことが認められた．また，筋中のLAP
活性はロイべプチンで増加し，べスタチンで減少することがわかった・一般にベスタチ

ロイべプチソ130土18（5）141土19（5）非投与

126土9（5）159土20（5）iii）ヒラメ筋non−COllagen protein（mg／wetg）
萎縮側
健側
ロイべプチソ72土13（5）139土21（5）ンの効果の方がロイべプチンより大きく，かつ早期に投与を開始したほど効果が著しい傾

非投与

向が認められた．また両者併用の加重効果は

72土23（5）112土8（5）わずかであるが認められた．筋のミトコンド

2）脱神経筋萎縮に対するロイべプチン，ペブ

リア中の酵素活性は両インヒビターでともにスタチンの筋肉内注射：薬剤投与群の前脛骨GOT，GPTが増加し，γ−GTPが減少する傾筋や長祉伸筋には著明な細胞浸潤，浮踵と壊向がみられ，腎中のγ−GTPは増加していた・

死を認めた．ヒラメ筋には軽度の浮腫を認め

3）べスタチン長期投与群では2カ月齢で約半た．溶剤のみの投与では細胞浸潤を認めた・

数に著しい体重増加，筋力の回復および症状

薬剤の滅菌，脱神経筋viabilityなどを再考の消失が認められた．残りの半数にも一旦症する必要があると思われる．
8．ロイぺプチンの筋崩壊阻止作用に関する組状の回復がみられたが，2カ月齢を過ぎると織学的研究

体重が減少し，症状の進行が元に戻ってくる

埜中班員は，ロイペプチンの筋崩壊過程に及ぼことが認められた．

す影響を筋ジストロフィー鶏を用いた玩ひね0において，またCa2十イオノフォア（A23187）に7．ラット実験的筋萎婁副こ対するロイぺプチン

ょるf仁山わ・0における効果を検討した．

の影響
高木班員は，部分的に筋ジストロフィーにおけ

1）筋ジストロフィー鶏による実験：筋ジスト

る蛋白減少と頸似の機序と思われる実験的筋萎縮

ロフィー鶏（1ine413）雄21羽を3群（無治：をラットに作製し，ロイべプチンの効果を検討し

療6羽，ロイべプチン50mg／kg／日9羽，10た．

mg／kg／日6羽に分けた・ロイべプチンほ腹−

7−

艦内連日投与で，4カ月間経過をみた．体重12羽を，それぞれ生産用コロニーとして維持し種増加は3群で差はなく，全身への影響はなか

卵の生産を実施している．本年度は約2，000個のった・フリップテストではいずれの群も醇化

種卵を生産した．前年度に比較し種卵の生産数が後10遇でほは不能となり，3群間に差は認低下したが，この要因は生産コロニーの更新につめなかった．最も侵される浅胸筋に HE，

いて全羽数を一度に行わず，一部の種鶏について

NADH，APS，AchE，酸フォスファターゼ，のみ行ったため，老齢鶏が残存していたことによ

OilredO染色を行い，酵素活性の差，壊死線るものであった。今後は，定期的にコロニーの更維数，筋線維径を測定した．効果判定に重要新を実施する予定である．

な指標である壊死線維数は100mm2

当り無NH−412，413 系を長期間飼育した結果判明し治療群で43．24，10mg／kg群47．65，50mg／

たことを以下に略記する．

kg群46．40本で壊死過程の阻止はみられず，

1）NH−412系の雄の射精能力は，若い雄ではロイペプチンの腹腔内投与は前回の皮下投与

NH−413系の雄と同様に良好であるが，加齢と同じく筋ジストロフィー鶏に何らの効果もに伴い筋ジストロフィー鶏の NH−413 系に示さなかった．

比較して著しく低下する．

2）Ca2＋（イオノフォア（A23187）による実験：

2）痛風の発症個体はNH−412系の雄に多発ラットヒラメ筋，長祉伸筋をA23187で処理する．また雌では休産中に発症するものがほして実験的ミオパチーを作り，試験管内でのとんどで，産卵中に発症するものはないよう

ロイペプチンの効果をみた．

である．ひとたび痛風を発症した個体は，射ロイペプチンはCPKの遊離は抑えないが

精能力，産卵能力ともに著しく低下し，回復

蛋白質の遊離はヒラメ筋で9．8％，長祉伸筋するものはみられない．

で17．2％抑えた．外液に遊離するα一アクチ3）雌の産卵能力は，NH−412，413 両系とも

ニン量はロイペプチンによって減少することに産卵開始から1年を経過すると急数に低下がSDS電気泳動により明らかとなった．電する．

顕的にもロイペプチン加処理筋ではZ線が比以上の結果から，今後は生産コロニーの定期的較的よく保たれる傾向にあった．このこと更新を予定し，種卵の生産・供給の増加を図る．

はCaイオンによって活性化されるプロテアーゼの活性をロイべプチンが抑制し，Z線か

10・Duchennemuscular dystroplly息児へのら始まる筋崩壊をある程度阻止していること

ロイぺプチン1回投与とその成績についてを表わしている．

三吉野班員は臨床研究の第一歩として Duch・enne muscular dystrophy（DMD）患児に対する

9．筋ジストロフィー症鶏の生産・供給

ロイペプチン1回投与による血中濃度測定，およ

野村班員は筋ジストロフィー症治療薬開発研究

び投与前後における臨床検査上の諸因子の変動な班の班員に筋ジストロフィー鶏の卯を供給する目

らびに副作用などについて検討した．

的で，種卵の生産を検討した．

1）対象および方法：DMD患児7名と原因不前年度に引き続き，財団法人日本生物科学研究

明のミオパチ一息児1名の計8名について，

所（日生研）に委託し，筋ジストロフィー鶏

ロイペプチンを，Augsbergerの式に従って

NH−413系の雄5，雌10，計15羽，およびその投与量を算定し，空腹時1回経口投与を行い，対照として正常鶏NH−412系の雄5，雌7，計投与前，投与後30分，60分，240分の4回

・−

8

−

徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究にわたり採血を行い，血中濃度の測定，CPK，

柴ロイペプチンについてユ三投与30分，1時

血中ミオグロビンの変動，投与前後24時間

間，3時間後に行った．
詣検査は，赤血球数，白血球数，血色素量，目の一般検血，出血凝固時間，プロトロンビ
ン時間の検査のほか，副作用として自覚症，

ヘマトクリット，プロトロビン時間，総蛋白

発疹の有無，消化器症状等，また脈拍，体温，

量，GOT，GPT，LDH，アルカリホスファ血圧等についてチェックした．

ターゼ，γ一GTP，BUN，CPK，コレステロー

2）結果および考案：血中濃度がCPKについ

ル尿蛋白，尿糖，尿ウロビリノーゲン，尿赤ては，この報告までに結果がでていない．一血球，尿白血球，上皮について測定した．

般検血にてほ，赤血球数，白血球数は変化な

筋力はmanualmuscle testingによった．自かったが，血小板の減少がみられた．また出他覚的副作用についても検討した．

血凝固時間の延長がみられた．しかしこれら

2）成績および考案：一般血液検査に異常なく，は1カ月後のものであり有意とは断定Lがた

プロトロンビン時間も著明な変化はみられな

い．プロトロンビン時間は正常であった．血かった．血清総蛋白も正常範囲内にあり，肝中ミオグロビンは減少傾向がみられた．その機能検査では，GOT，GPT，LDH，アルカ他全身状態にはとくに変化を認めず，重篤なリホスファターゼなどに異常を認めず，尿素

副作用はみられなかった．まだデータが充分

窒素，コレステロールも正常範囲内であった．

にそろっておらず，また今回の検査1回のみ

γ−GTPは正常範囲内で多少の変動がみられであり，血中ミオグロビンの変化などもう一た．CPK

度再投与してみて同じような動きをするか今

chenne dystrophyおよびscapulo peroneal

後検討してみたい．

atrophyの各1例に減少を示しており，pOly一はlimb一girdle dystrophy，Du−

myositisの1例では逆にやや増加を示していた．

11． ロイベプチンの種々筋萎縮性疾患に対する

これらの結果は症例が少なく，24時間と経口投与の効果一第1報100mg1回投与についていう短時間のため，にわかに結論づけること

村上班員は臨床研究の第一歩として，種々の筋は困難である．筋力テストでは特別な変化は萎縮性疾患にロイペプチンを1回投与して，血祭

みられなかった．検尿については著変は認め中のロイペプチンの濃度を測定するとともに，種られず，また，認むべき副作用は現れなかっ種の臨床検査を投与前後に測定し，かつ副作用のた．血柴ロイペプチンについては，目下検討

有無を検討した．

中である．

1）対象および方法：対象はLimb−girdle dy−

12．ロイベプチン投与の影響−ヒトおよび実験

strophy，Duchenne dystrophy，myOtOnic

的筋再生に対する検討

dystrophy，pOlymiositis，おのおの1例ずつ
scapulo−perOnealtype muscular atrophyお木下班員は臨床研究の第一歩として，健康対照

よびCharcot−Marie−Tooth病のおのおの1

老ならびに進行性筋ジストロフィー症患者にロイ例で計7例である．年齢は15〜56歳までで，ペプチンを投与したときの影響を調べ，またラッ

男性5例，女性2例である．ロイペプチンは

トにおける筋線維再生に対するロイペプチンの効100mgの1回経口投与法で投与前および24

果を検討した．
1）健常対照者に対する影響：healthyvolun−

時間後に種々の臨床検査を行った．また，血ー9−teer5例に。イペプチン100mgを早朝空腹

酸ロイべプチンを得た．

時に1回投与し，その後の変化を観察した．

2）吸収，排泄，分布および代謝：ロイペプチ

体温，脈拍，血圧，臨床所見，肝機能，腎機

ンとトリプシンとの間の強固（私＝8．2×

能，血液学的検査，血清諸酵素などにつき投

106M−1）で選択的（代謝物と考えられるロイ

与24時間後までに何ら認むべき異常は出現

ペプチン酸，ア七チルロイシンなどとの交叉しなかった．

反応性は＜0．05％）な可逆結合を利用した

2）肢帯型筋ジストロフィー症に対する影響：

COmpetitive binding radioassayを開発し，肢帯型筋ジストロフィー症1例に1回50mg

筋ジストロフィーマウスの経口，皮下投与，を連日1週間投与し，1）と同じ観察を行っ腹腔内投与における15分〜8時間の血中濃たが，同様に明らかな変化はなかった．この度推移と，筋ジストロフィー鶏の経口，皮下間筋萎縮，脱力にも変化はなく，血清CPK

投与，腹腔内投与，筋肉内投与における 30の異常値の改善もなかった．

分〜6時間の血中濃度推移を追跡した．

3）実験的筋再生に対する影響：ラット後肢三また，同法を用いて，ロイペプチンの健康

頭筋に按概的損傷を加え，その後の筋線維再志願者についての第1相試験（木下班員）に生にロイペプチンがどのような影響を有する

おける血中濃度推移の追跡を分担した．結果

かを検討した．対照動物では受傷後2週間でを次表に示すが，経口投与後の動態の目安でほぼ再生が完了するのに対し，投与群には2あるACU（area under the curve）（ng・hr／

週間後筋線維直径の大小不同が目立ち，一部mJ）を投与量（mg／kg）で除した量は健康志に小円形細胞の浸潤がみられた．これらの変顕著で化は10mg／kg／日群よりも 50mg／kg／日群にで0．143hr，筋ジストロフィー鶏で著しかった．しかし再生が完了してから本剤hrであり，比較的良い一致を示した．

0．0885hr，筋ジストロフィーマウス
0．0267の投与を開始した群では明らかな差異はなか

本研究の標的器官である筋肉内のロイペプった．このことから考えて，本剤は筋線経のチン濃度を測ることは血中濃度を測ることよ

損傷から修復の機転において何らかの作用をりも重要であるが，COmpetitive bindingra−

有すると判断したが，その機序については再dioassayより高感度の測定を要する．その目

生実験を反復して検討する必要があると判断的のためにradioimmunoassy法をロイペプ

した．

チンの2種の誘導体をハブテンとして開発した．2種のハブテンに対応する抗血清はとも13．ロイベプチンの難病治療薬としてのにロイペプチンよりもロイペプチノールに対開発研究して，より強い親和性を示し，ハブテンAで田中班員はロイペプチンの難病治療薬としての

1．21×108M￣1，ハブテンBで1．03×108hI￣1

開発研究の基礎研究を行うとともに，各班員にロであった．ハブテンAに対応する抗血清Aを

イペプチンを提供することを目的とし，ロイペプ

用いてradioimmunoassayにより正常およびチンの1）原末試製，2）吸収，排泄，分布および筋ジストロフィーのマウスにロイペプチンを代謝，3）製剤研究，4）一般薬理作用，5）毒性試

皮下投与したときの筋肉，血柴，肝，肝ライ験などを検討した1以下に要約を示す．

ソゾーム中の濃度推移を表示する．

1）原末試製：2m3発酵タンク2基分を1ロットとし，3ロット試製して，3．18kgの硫−10−

筋肉内濃度は血柴内濃度より低いが，より持続的である．

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究
Bioavaiability ofleupeptinin mouse and chicken

Maximum conc．
Route

of

Dose

tl′2

AUC

Animal ad㌫蒜；；ion （蒜蒔） 蒜箔 （pg・hr／ml） 誌‡諾笛；
p．0．

33

1√6

5．C．

30

0．3（α）

i．p．

30

4．3（0．26）

1．6（0．5）

16・8（1・00）

14．7（0．25）

10．9（0．65）

12．8（0．5）

2．6（β）
0．2（α）03

1．7（β）
1．2

p．0．
0
1

S．C．

0
1

Chickeni．p．

0．8

0．23（2．0）

2．0

6．7（1．00）

3．13（0．5）0．2（α）

3．4（0．51）

2．44（0．5）

1．4（0．21）

1．05（0．5）

2．3（β）
i．m．

10

0．7

Serum concentrations ofleupeptin after oraladministration of single dose（100mg）
infive volunteers

Leupeptin（ng／ml）

Body
VolunteeT Age weight（kg）￣AU■C［0〜4tlr］（ng・hr／ml）

8

12

＊・

．

8

4

3 5︑2 ＊． ＊． 0 1
0・5・9・D D 6・8・＊

2 2 1 m m1

2

D 7・2・D 8・8・2・m 3 2 m 1 1 1

5

4
2

8
3

23．116．7

＊

56．7

＊
●

42．2

48．1

8
4

2

52．5

8
3

4

E一ズJ
S

66

7
3

9

81．5

4
2

3

58．3

61．0

5

一

N．D．＊

59

3

4
6

7

D

54

3

61．0

6
2

56．0

5
4

5

2
8

4

C

1

B

60

41

3
4

40．4

8 5．0 2 0 3 2

63．7

112

2
3

7

4

A
＊
＊＊

66

0．2510．5

（hr）

N；D．＊

128．1

16．5

204．2

N．D．＊

133．5

N．D．＊

127．7

N．D．＊

133．4

9．3

145．4

4．0

33．0

N．D．＝1ess than15ng／ml（minimaldetectable concentration）．
not measured because of hemolysis．

筋ジストロフィー鶏の14C一ロイペプチン

前述した筋肉内濃度の持続性と総合して，ロによるラジオオートグラフィーを行った．最イペプチンの筋肉への親和性が結論される・

高血中に近い時点（腹腔内投与，皮下投与で3）製剤研究：原末の光安定性は実用上の問題

は30分，経口では2時間）と腹腔内投与でとならない．鶏用飼料に用いる10％含量のは6時間を採ったが，いずれにおいても筋肉

安定な果粒を試製した．

での放射能は弱かった．

経口または舌下投与用果粒剤，直腸坐剤，同じ鶏から採取した標本についてのエタノール除蛋白上清をロイペプチンとみなしての軟膏，汎用粉剤のそれぞれ安定なものを得て，予備試験的にイヌに投与した1濃度推移を下表に示す．筋肉内濃度は0．57

血簗中濃度のACUでは，静江≪経口，舌〜0．68′唱／gであり，血祭内濃度より低いが，下，直腸≫経皮の順の生物学的利用率であっ

持続的である．

たが，標的器官である筋肉内濃度の多時点測筋ジストロフィーマウスの全身凍結切片を
14C一ロイペプチン水溶液に浸漬し水洗乾燥定技術を開発した後，一正式に投与経路の選択
資料を採る．

した後ラジオオートグラムをとると，脳，筋

4）一般薬理作用：ガラミン不動化ネコの脳波

肉，腸管，軟骨に最も高濃度に吸着していた．

に対して，ロイペプチン10mg／kg／分で10

一一11・一

NlI

（A）

NH−C
CHSCHa CH3Cfr3
＼

／

＼

CH

CH2

／

l

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

・1／2H2SO4
NlT2

CH3CO−NHCHCO−NHCIiCO−NHCHCH＝N〜OCII2COOH

NH
（B）

NH−C

CII3CH3＼／CH

CH3CH3

CH2

＼

l

／

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

・1／2H2SO

NH2CH3CO−NHCHCO−NHCHCO−NHCHCII20CO（CH2）3COOH
StruCureS Of haptens for radioimmunoassay ofleupeptin
Tissue concentrations ofleupeptinin mice after subcut年中甲pS administration ofleupeptin（30mg／kg）

Concentration ofleupeptin（pg／g or ml）
MuscleMusculardystrophy

Normal￣

LiverPlasmaLiYerlysosome

0．5

2．0

6．0

0．5

2．0

6．0

0．5

2．0

6．0

0．5

2．0

6．0（hr）

6．52

1．97

0．42

38．32

3．42

0．23

11．97

7．78

5．37

3．18

2．66

0．51

3．15 2．35 0．52 16．391．93 0．23

26．018．45 2．07

8．67 3．43 2．23

分間の静注は作用を示さなかった．心電図にkg（以上雄3，雌4），20mg／kg，対照（以対してほ波型に変化はきたさなかったがRR，

上雄2，雌4）で11〜15カ月齢のピーグル

QT，PR間隔の延長すなわち心拍数低下が認犬を用いて検討した．なお，雄 200mg／kg，められた．血圧に対してほ著明な低下作用を100mg／kg，雌200mg／kg，100mg／kg，20

示し，それは3mg／kg／分でも認められた．

mg／kg，対照の各群から1頭ずつを投与終了
後35 日間休薬させた．

ウレタン麻酔ネコ脊髄反射電位に対して，100mg／kg以上の群で用量依存的な頻度で10mg／kg の静注は作用を示さなかった．
無麻酔イヌの血圧および心拍数に対して，出現した全身の脱力，限瞼下垂，瞳孔散大，100mg／kgの経口投与は経度の低下および減体表部の発赤・浮腫および重症例で出現した

少作用を示した．

呼吸抑制（300mg／kg群はすべて毎回呼吸抑以上の結果から静江の最大無作用量は，脳制を起し5，7日目の投与後に死亡した．）お波および心電図により判断すると10mg／kg

よびその後の反応が1〜1．5時間で回復する以上である．また，経口最大無作用量はイヌことから，ロイペプチンは自律神経系およびの血圧に対して 50〜100mg／kg と結論でき

呼吸中枢に対する一過性の薬理作用を有してる．第1報で述べたように，ロイペプチンにいると思われる．

よる降圧あるいは徐脈はその節遮断作用に基づくものと思われる．

血液学的には血液凝固およびプロトロンビ
ン時間の軽度の延長傾向が認められた．

5）毒性試験

病理組織検査では肝細胞の軽度の水腫様膨5−1）イヌ経口投与における亜急性毒性（35化と肝細胞内の好酸性歓細顆粒出現とを認め日）：300mg／kg（雌2），200mg／kg，100mg／

たが，血液生化学検査で認められたALP，−12−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究
Leupeptinlevelsin chick muscles
Leupeptin（pg／g muscle）
Route and doseof administration

Plasma 吉蒜al 禁霊1Time（hr）

Sup

ppt

54 2 723 0 1
01 1 1

7−4 4− 3
56 6 600 0 0

5 3
4 0
0 1

Ppt

20
21
01

p・0．（10mg／kg）

Sup

78 71 656 6 600 0 081 7− 428 4 202 0 1

8 5
1 5
2 0

S．C．（10mg／kg）

ppt

84
35
10

50 5 006 0 2i．p．（10mg／kg）

Sup

Pharmacokinetic parameters obtained for severalroutes ofleupeptin
administratedin dogs

ad霊霊霊on（品）鹿 gd（諸mg）竺慧諾C●
0
1

Per ca0
1Intra−VenOuS

0
1

Sublingual

01Intra−reCtal

0

1・38

0．53

2．76（18．7）

1・29

0．64

3．09（20．2）

0．82（2．0）

1・40

0．55

3．96（25．9）

1．18（0．5）

0．56（3．6）

0．03（8．0）

1

Per cutaneous㍑描：相識15・31（100・0） 21・05（0・2）1．15（0．5）

gd：排泄速度定数．
GPT，GOTの上昇を説明するに足るもので化管障害は個体差が大きく，生存例ではまっはなかった・腎の近位尿細管上皮細胞内に微たく異常所見のない例が多かった．

細な硝子滴を認めたが，血液生化学検査およ血液学的検査においては 200mg／kg 以上

び尿検査では腎障害を示す所見はなかった．

群で貧血傾向がみられ，100mg／kg以上群でイヌの急性毒性で骨髄の造血機能減退を示

白血球の増加傾向がみられたが，対応する骨唆する所見があったが，本試験では血液学的髄および脾臓の組織学的所見には著変はみらにも組織学的にも対応する所見を認めなかった．

れなかった．本懐向は消化管障害に由来する

最大無作用量は 20mg／kg と推定された．

ものと推察した．血液学的には変化を認めなかった．

5−2）ラット経口投与における慢性毒性（6カ血液生化学的には雌雄で総蛋白，アルブミ

月）：5遇齢のSprague Dawley系雌雄ラッン値の用量依存的な減少が認められ，雄ではトで400，200，100および50mg／kgの連日

50mg／kgからLDH，GPT，GOTの上昇と投与を行った．なお，1群24匹とし半数は雌では200mg／kgから逆にGPT，GOTの1カ月間回復試験を行った．

低下傾向がみられた．

200mg／kg以上の群で用量依存的に出現し病理組織学的検査では肝細胞の腫大と好塩た死亡例は，亜急性毒性試験におけると同様

基性顆粒の減少がみられ とくに雌で肝細胞にいずれも胃粘膜のビランおよび空・回腸管

内の硝子滴の沈着，肝細胞の壊死および肝重壁の潰瘍，穿孔，癒着を示し，腹水を伴う腹量の増加がみられた．腎重量の増加，近位尿膜炎を皇し，ロイペプチンの胃腸管に対する細管上皮細胞内に硝子滴を認めたが，血液生直接の局所作用を推察させた．なお，この消化学検査および尿検査では腎障害を示す所見−13−

はなかった．膵重量は用量依存的に増加し，トロンポプラステン時間（APTT）・全血凝

腺房細胞の踵大と分泌顆粒の増加がみられた・

固時間（WBCF）の延長が著明であったが，無作用量は50mg／kg以下と推定された・

一過性であった．

5−3）イヌ静脈内投与における急性毒性：10〜5−4）イヌ静脈内投与における亜急性毒性（35

12カ齢の雌雄ピーグル犬を用い，141，100，日）：雌雄ピーグル犬を用いて，20，8，3・2

71および 50mg／kg に相当する量のロイペmg／kgで行った．

プチンを1頭当り10mgの投与容量となるよ20mg／kg群では投薬1〜3日間，投与後う生理食塩水に溶かし滅菌し，25m〝分の注直ちに自発運動の低下とともに筋の脱力を起入速度で投与した．

し，涜涙，耳介発赤，結膜充血がみられたが投与後14日間観察したが，死亡は10分

20分後には回復した．8mg／kg群でもさら以内．に生じLD50値は100と141mg／kgの間にあった．死田は呼吸障害により，経口に軽度の症状がみられた．

投与の場合に比し呼吸抑制は急激に起るが持試験に軽度の延長がみられた．

血液学的試験では20mg／kg群で血液凝固

続は短かかった．毒性標的臓器である骨髄，

組織学的には20mg／kg群の腎の近位尿細腎，肝の障害は軽く，消化管には障害は認め

管上皮細胞内に硝子滴がみられ，一部の例でられなかった．

は肺胞上皮の腫大と空砲化がみられた．最大

血液学的には血小板数の減少，活性化部分■一14−

無作用量は3．2mg／kgと推定された・

分

担

研

究

報

告

ロイベブテンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

村

地

孝＊

研 究 日 的研 究 方 法

ニワトリ骨格筋のCa2＋依存性中性プロテアー
ゼ（mNP）がロイペプチンによって強く阻害さ主としてWistar

系ラット（体重120〜180g）を用いた．臓器のカルパインおよびカルパスタチ

れることはよく知られている．われわれは，ラッン活性の測定にあたっては，臓器の血液含量を最ト肝臓，脳，腎臓，脾臓，赤血球，胸腺などに広少にするよう濯流，洗浄につとめた．これは，血く分布する同種のプロテアーゼが，そのCa2＋要液（赤血球）中にカルパインおよびカルパスタチ

求性およびSH還元剤要求性において，CANP

ンが存在するので，それらの混入を極力さけなけと著しく煩似していることを知り，これらに対すればならないからである．摘出した臓器または組る放線菌由来の一群のプロテアーゼ阻害剤の効果

織は，冷所で4倍量のつぎの組成の液でホモジを検討したところ，とくにロイペプチンによってナイズし，その105，000g遠心上清を酵素（およ強い阻害を受けることを兄いだした．

びインヒビター）液とした．用いた緩衝液は，20

そこで，骨格筋のCANPに関する進んだ知見

mMトリス塩酸（pH7．5），0．25M庶糖，lmMと平行して，上記の全身組織細胞に広く分布してEGTA，5mM2−メルカプトエタノールを含む液

いるCa2＋依存性チオールプロテアーゼ（以下カである．

ルパインCalpainと総称する）につき（その精製プロテアーゼ活性は，50mMトリス塩酸緩衝液と性質の研究を系統的に展開することとした・とを用いたカゼイン加水分解により定量した．通常，

くに，肝臓および脳について，カルパインを特異pH7．5，300Cで30分間温置によるトリタロル

的に阻害する細胞内インヒビター蛋白質の存在を

酢酸可溶性ペプチド等の増量をFolin−Lowry法発見したので，これをカルパスタチン（calpasta−

により，750mm の吸光度増加として計測した．

tin）と名づけ，その精製と性質についても研究をのちに述べるように，カルパインには，Ⅰ型と行うこととした．

Ⅱ型の2種があるので，Ⅰ型の定量には0．1mM

これらの研究を通じて，ロイべプチンのプロテ

CaC12を，Il型の定量には5mMCaC12を活性化

アーゼ阻害作用の一般的分子機構を解明するとと剤として加えた．いずれの場合も5mML−システ

もに，その生理的病態的意義を明らかにすること

インを共存させた．プロテアーゼの1単位は750

が本研究の目的である．

nmの吸光度1．0の増加を30分間で与えるべき酵素量と定義した．
プロテアーゼインヒビターの作用をみるために＊京都大学医学部附属病院検査部

は，インヒビターをあらかじめプロテアーゼと−17−

pH7．5，300Cで10分間接触させたのちに，反応対する阻害作用をもった分画の有無を検討したと混液のカゼイン加水分解活性を測定し，活性の低ころ，図1に示すとおり，0．1MNaCl溶出画分に下度を計測する方法を用いた・1単位のカルパイ

強い阻害活性のあることが知られた．このようにンを失活させるインヒビター活性を1単位とした．

して，肝臓可溶性画分から∴オルパインとカルパ
スタチンが分別されたのである．

研

究

結

果

カルパスタチンは見かけの分子サイズが巨大

1）内因性インヒビター，カルパスタチンの存在（おそらく 200，000以上）であることが知られた
ので，分子量約90，000のカルパインとはゲル濾

ラット肝臓ホモジネートの105，000g遠心上清過法によって，もっと簡単に分別されうるであろそのものにつきカルパイン活性を測定したところ，

うことが期待された．その期待通りの実験結果のCa2＋およびシステインの十分量を添加してもま得られたことが図2に示してある．図の上段はラったく活性を検出することができなかった・とこット肝臓の，下段はラット脳の実験結果である．

ろが，この上活を

いずれの実験においても，セファデックスG−200

pH7．5でDEAETセルロース・カラムクロマトグラフィーに供したところ，

ゲル濾過の各画分に，あらかじめ一定量の部分精

図1に示すように，カルパイン活性が0・25hl製カルパインを加えておき，混液のカゼイン加水

NaCl溶出画分に明瞭に出現した・そこでこの活分解活性をみたもので，あらかじめ加えたカルパ

性画分を集め，透析処理ののち，この酵素活性にイン活性による基準値を超えて高いプロテアーゼ︵uu冨N︶8ujJOS宅 AT−

図1ResolutionofcalpainandcalpastatinuponI）EAETCellulosechromatography at pH7．5．
The soluble fraction from200g（wet weight）of ratliver was applied to a DEAE−
Cellulosecolumn（5×20cm）whichhadbeenequilibratedwith20mhlTris−HClbuffer，
pH7．5，COntaininglmM

EGTA

and5m〉Ⅰ2−merCaPtOethanol．Theadsorbedproteins

were eluted by stepwise gradient of NaCl，aSindicated by arrowsin the

魚gure．

A O．5−mlaliquot of each fraction was assayed for the proteolytic（●）orinhibitory（◎）activity，aS describedin the text・、＿＿Tわ959＿＿▼fTa9ti？竺軍

pooled for further purification．．
−18−

that争rf Shaded＿Yere

ロイべプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究が混在するプロテアーゼからさらに分離される．
03A

ここに溶出されるプロテアーゼは，そのCa2＋要
求濃度が著しく低く，先にDEAE−セルロース・

02

クロマトグラフィー（図1）で0．25MNaCl溶出︵︒巴﹃ヱ音曇りく

●

IN H

0

︵EuOのN︶BEd七︒S毒

N Z

l

l

l

o

B

画分として得られたカル′くインとは異なった酵素である．この点はのちに詳述する．
図3のようにして部分精製されたカルパスタチ
ンの性質を表1にかかげる．表1で明らかなように，この内因性インヒビターは，本質的には蛋白質で，おそらくは会合体であるであろうが，その

−

0

EN Z

0

ままでは28〜30万ダルトンという巨大分子である．しかもきわめて耐熱・耐酸性である点がそのIN H特徴といえよう．
0
20

l
40

l
60

l
80

・・3）2種類のカルパインの存在

100

前節で述べたように，Ca2十 感受性に関して著
しい差のある2種のカルパインの存在することが
一図2

Resolutionofcalpain and calpastatin by gel
filtration through Sephadex G−200．The五一

gureisacombin祖reproductionof the datap。blishedf。，rathver（A）and rat brain（B）extracts． The concentrated soluble
fraction of theliver（3g protein）of brain（257mg protein）was￣fractionated on a

3×100cm column at pH7．5，in the presence of
EGTA and2−merCaptOethanol（5mM eaeh）．

Proteolytic activity of each fraction wasdetermined with afiⅩed amount of calpain

知られたので，肝臓から得られた2種につき，そのCa2＋依存性およびカルパスタチンによる阻害の様相を比較した．実験結果の一部を図4に示す・
DEAE一セルロース・クロマトグラフィーの溶出
位置順に，0．1M NaClでカルパスタチンとともに溶出される酵素をカルパインⅠ（型）と呼び，￣
0．25M NaClで溶出される酵素をカルパインⅡlI，Of respective originsI previously added
to each assay tube． Positive and negative
deviations from the baseline activityindi−（型）と呼ぶこととした・図4から明らかなよう

cate elution of calpain（ENZ）andcalpastatin

Ca2十を必要とするにすぎないのに対して，カル（INH），reSpeCtively．

に，カルパインⅠは50％の活性化に40／JMのパインⅡは400／川Ca2＋でも，まだごくわずかの活性が示されたならば，それはカルパインの溶出を意味し，逆に基準値を下廻る結果が出れば，それはカルパスタチンの溶出を意味するものと解釈した．図2のように，肝臓でも脳でも，カルパイン（ENZ）とカルパスタチン（INH）の両田子が，EGTA含有（したがってCa2＋非存在下）の緩衝活性化を得るだけで，完全活性化には3〜5mM
Ca2＋を必要とするのである．Ⅰ型とⅡ型とでは，
カルパスタチン感受性にも原著な差があり，その他，熱安定性，自己融解性，トリプシン感受性などにも相当の差異のあるもようで，これらの点は
目下なお実験中である．
しかしながら，Ⅰ型・Ⅱ型ともに，Ca2十による液中でゲル濾過分別されたのである・
2）カルパスタチンの性質
図1の0．1M NaCl溶出画分を集めてこれをウ活性化機構そのものにはあまり大きな差異がない

ルトロゲルAcA34のカラムにかけ，pH7．5で性プロフィルをみると，100％活性化に必要な．溶出を行うと，図3に示すようにカルパスタチン

Ca2＋

ようで，たとえば，図5に示す

−19−

Ca2＋

濃度依存

濃度には大差があるが，途中の経過には大5︵︻∈＼S一言コ︶音三富H ∈罵言U l一l

0︵︻E＼S︼ココ︶音︐叩一呂u竜虎已万︶ 911

Fraction mmber（3．5ml／tube）

図3

SeparationofcalpastatinandcalpainIby chromatography on
UltrogelAcA34atpII7・5・Thefraction that was eluted at
O・lHNaClfromtheDEAE−Cellulos＝COlumn（Fig．1）wasfracti・

Onatedona3×95cmgelcolumn・Aliquots（0・2mLor20pl）
Ofeachfractionwereassayedforthe proteolytic（●）0，i。hi＿

bitory（○）activity，reSPeCtively．

表l Properties ofcalpastatin
Elution position
Calpastatin

EfEect of treatment

Molecularfrom DEAE−
Cellulose

WeightTreatment

Condition

Inhibitory
POtenCy
remalnlng（％）

Ratliver

pH8．0＊

M・HatanakaI T・Murakaml，

280，000

100℃，20min lOO

Trichloroacetic
acid

l0％，丘nal lOO

Acetone75％，丘nal lOO

Trypsin（1／100）

370C，40min

NucleasePl（1／1．6）

370C，40min

PhospholipaseA2
and C

370C，2hr

Heating

100℃，20min lOO001

0・125MNaCl，

300，000

Heating001Humanerythrocytes＊

0・11INaCl，pH
7．5

280，000〜
300，000

0

Rat brain

0・lM NaCl，pH
7・5

Trypsin（1／100）

370C，40min O

Heating

lOOOC，15min lOO

Trypsin（1／100）

370C，15min O

and T・MLLraChi， unpublished data．

差がない・さらに，図5でみるとおり，両酵素と高くしても回復することはない・換言すると，酵も・そのカルパスタチンによる阻害様式が同じで

素カルパインはその活性発現に絶対的にCa2十をある・すなわち，カルパスタチンによる阻害度は必要としているが，カルパスタチンはその必要な共存するCa2＋濃度によって影響を受けない．一Ca2十を奪取（sequester）するために阻害を及ぼ旦起った部分阻害はたとえ溶液中にCa2＋濃度をしているものではないということである．そして，−20−

ロイべプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

図4

Differencein sensitivitytoCa2＋（A）and to calpastatin（B）between
calpainIandcalpainII・Samplesusedwere：partiallypurinedcalpain
I（0，2mgprotein／ml），CalpainII（●，0・5mgprotein／ml），and cal・
pastatin（2mgprotein／ml）from ratliver・

0

0．2

0．6

1．O

Ca2十（mM）

図5InhibitionofcalpainI（A）andcalpainII（B）fromratliverasafunc・ti。n。fCa2・concentrationin the medium．Amounts（pt）of ratlivercalpastatin（2mgprotein／mt）addedpertubeareshowninthefigure・Each tube contained calpainI（400／g prOtein）or calpainII（25pg

protein）．

この事情は，Ca2＋要求性の著しく異なるⅠ型に

図には示していないが，キモスタチンはアンチパ

もⅡ型にも等しく当てはまることを図5は明示しインより少し弱い程度の阻害を与える・図6はⅠているのである．

型とⅡ型の間に，阻害剤間の差，また阻害機構の

4）カルパインⅠおよびⅠⅠに対するロイベプ

差のないことを意味しているものと解釈されよう・
Ⅰ型とⅡ型とではCa2＋要求性に著差があるのでチンの阻書作用
図6に，ラット肝臓から部分精製したカルパイあるから，これらとロイべプチン分子との相互作

ンⅠおよびⅡに対するロイペプチン等の阻害作用用に関して，Ca2十がどのような役割を果していの実験結果をかかげる．ここには示していないが，るのかほ今後の研究課題である．

カルパインはペブスタチンまたはエラスタチナー
ルによってまったく阻害作用を受けない．アンチ
パインはロイべプチンよりは弱いが阻害を及ぼす．
−21−

考

察

われわれは骨格筋のCANPをも含めて，もうAntipain

50︵㌔︶ぎ苫q∈己言ミリく

図6

EffectofvariousinhibitorsonratlivercalpainI（○）andcalpainII（●）．

少し広くカルシウムプロテアーゼを把えるという集掛こつとめている．また，この内因性インヒビ

立場からカルパインというグループ総称名を提唱

ターとロイべプチンのような外来性インヒビター

したのであるが，国際生化学連合酵素命名委員会との阻害機構の異同を詳細に研究することは，後ではこの提唱の趣旨を採択し，近く改訂される同者の治療薬としての開発にも重要な指針を与える

委員会報告にはカルパインなる常用名がこれら一ことになるであろう．そして，その目的のために群の酵素名として記載されるはずである．したがは，カルパインⅠ，Ⅱ，カルパスタチンのいずれって，CANPはカルパイン群の1種で，とくに骨もが精製される必要があり，われわれはその意味

格筋に分布する類の酵素であるということになる．

でなお基礎的な精製実験をも重ねてゆく計画である．

CANPのCa2＋要求性を既報により検討すると，これは明らかにカルパインⅡ型に属している．一方，心筋については，すでにⅡ型のほかにⅠ型の総括

カルパインの存在が報ぜられており，果して骨格

Ca2＋依存性中性プロテアーゼ（CANP）を含む筋のカルパイン（CANP）がIl型のみなのか，そより広い類縁酵素群に対するロイペプチンの阻害

れともⅠ型も存在するのか，存在するとすれば，作用を研究する目的で，まずこの類縁酵素群の骨

そのようにCa2十の低い濃度で活性化されうるプ

格筋以外の臓器における分布を研究し，カルパイ

ロテアーゼの生理的病態的意義は何かというきわ

ンとカルパスタチンという対をなしてプロテアー

めて興味深い研究課題が提起されたことになるの

ゼとその内因性インヒビターが共存することを明らかにした．

である．
カルパスタチンの発見と，その広い分布およびカルパインについては，Ca2＋要求性の著しくその特徴ある分子としての性質は，このものの生異なるⅠ型酵素とⅡ型酵素の少なくとも2種類の化学的・生理学的研究がこの領域の全体の研究のあることを明らかにし，それぞれのCa2＋による

うえで，きわめて重要な意味をもつであろうとの活性化様式およびカルパスタチンならびにロイペ示唆を与えている・われわれは日下，動物各臓

プチンによる阻害様式の異同について研究した．

器・組織・細胞におけるカルパインⅠおよびⅡ，

カルパスタチンについては，その分子サイズ，

ならびに，カルパスタチンの定量的分布データの耐熱性などの基本的特性を明らかにした．各種臓−22−

ロイべプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究
kami，T．，Hatanaka，M・，andInamoto，T・In−

器におけるこれら諸因子の分布に関する定量的知

tracellularCa2十一DependentProtease

見や，その生理的病態的意義の解明は今後の研究

andItsInhibitor，in Frontiersin Protein Chemistryにまたなければならない．

（T．−Y．Liu，G．Mamiya and K・T・Yasunobu，eds．），EIsevier／North−Holland，New York（1980），pp．343−357．

文献1）Nishiura，Ⅰ．，Tanaka，K・，Yamato，S・，and

6）田中一仁，西浦 巌，大和 進，村他 者，田北雅夫．ラット脳及び肝臓中のCa2十依存性中性プロテアーゼとそのインヒビター・生化学，

Murachi，T．The Occurrence ofanInhibitorofCa2十一Dependent

NeutralProteasein

Rat

Liver．J．Biochem．，84，1657−1659（1978）・
2）Nishiura，Ⅰ．，Tanaka，K・，andMurachi，T・A

50，804（1978）．

7）田中一仁，稲本 俊，村上俊男，村地 孝・Ca2十依存性プロテアーゼの高分子インヒビター：その臓器分布と阻害作用．生化学，51，805

High Molecular WeightInhibitor of Ca2＋−

Dependent Neutral Proteasein Rat Brain・
且ゆgrわれJα，35，1006−1007（1979）・
3）Murachi，T．，Suzuki，Y・，Nishiura，Ⅰ・，Yamato，

S．，Tanaka，K．，andInagaki，S．IntracellularProteasesand Endogenous・Inhibitors，Abstr・，
ACS／CSJ Chemical Congress，April1979，
Honolulu，Hawaii，p．BIOL−6．
4）Murachi，T・，Tanaka，K・，Murakami，T・，andHatanaka，M．Distribution and Properties of（1979）．

8）畑中道代，村上俊男，村地孝．赤血球細胞質に共存するCa2＋依存性中性プロテアーゼとその高分子インヒビター．生化学，51，586（1979）・
9）稲本 皮，田中一仁，笠倉新平，村地 孝・正常および腫瘍リンパ球のカルパインとカルパスタ
チソ．生化学，52，589（1980）・
10）畑中道代，村上俊男，田中一仁，村地孝・カゼ
イソセファロースゲルを用いるCa2＋依存性チ
オールプロテアーゼ（calpain）の精製．生化学，

a ca2＋−Dependent Neutral ProteaseInhibitor

inVariousTissues，Abstr．．XIthInternational
Congress of Biochemistry，July1979．To−
ronto，p．231．

52，613（1980）．

11）田中一仁，播岡徳也，村地孝．ラット肝臓カル
パインおよびカルパスタチソの成長に伴う変動とカルパインの多形性．生化学，52，614（1980）・

5）Murachi，T．，Nishiura，Ⅰ・，Tanaka，KりMura−−23−

高速液体クロマトグラフィーによるロイペプテン

および関連物質の微量螢光定量法

大 倉 洋 甫＊
研究協力者

は

じ

め

甲斐雅亮＊・三浦哲朗＊b）β−メルカプトエタノール（0・1M）一亜硫酸に当分担研究者らが開発したベンゾイン蛍光反応

ナトリウム（0．2M）溶液：β−メルカプトエタノは卜4），グアニジノ基を有する化合物を特異的にール0．78gおよび亜硫酸ナトリウム2・52gを水

ベンゾイン螢光体に誘導しうる．本研究では，こに溶かし全量100mgに調製．40C暗所保存すればBenzoin

Fluorophoreの反応を利用し，ロイペプチンの筋ジストロフィ

少なくとも1週間使用可能．
C）塩酸（1．15M）−トリス緩衝液（0．5M，pHー症に対する薬効を判定する1つの手段として，
ロイペプチンおよびその関連物質の高感度な定量9．2）の混液：トリスーヒドロキシメチルーアミノ法の開発を行った．

メタン12．11gを水80mgに溶かし，濃塩酸でこの方法は，あらかじめペンゾインによって蛍pH9．2に調整後，水で全量100mgに調製（1・O

光標識したロイべプチン（Leup），ロイペプチノM）．このトリス緩衝液と 2．3M塩酸の等容混液ール（LeupOH），ロイペプチン酸（LeupC0−を使用．室温に放置したとき，少なくとも1カ月

OH）およびロイシルアルギニン（Leu−Arg）を，使用可能．

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって，d）1％テトラー乃−プチルアンモニウムヒドロ

迅速に分離し，かつ鋭敏に賛光検出するものであ

キシド溶液（pH9．0）：市販の10％テトラー乃−プ

る．

チルアンモニウムヒドロキシド10mgに水70mg

を加え，4M塩酸でpH9．0に調整後，水で全量実験

方100mgに調製．

法1）試薬溶液の調製

2）基準操作a）ベンゾインーメチルセロソルブ溶液（4a）血渠（血清）の前処理：血菓（血清）200mM）：ペンゾイン

85mgをメチルセロソルプに

FLlに，水あるいは標準液（LeupおよびLeup

溶かし全量100mgに調製．40C，暗所保存すればCOOH）100〆および3M過塩素酸100〆を加少なくとも1カ月間使用可能．

え，撹拝後3，000rpmlO分間遠心する・上澄液＊九州大学薬学部薬品分析化学教室

200〆に，2M炭酸カリウム100〆を氷水中で加−25−

え，析出する遇塩素酸カリウムを除去した溶液を試料とする．

た・図1に示すように，Leupを直接ベンゾインb）蛍光ラベル化反応：試料溶液あるいは標のクロマトグラム（図1B）には，それに基づく蛍光ラベル化反応によって処理した場合，HPLC

準液（Leup，LeupCOOH，LeupOH，Leu−Arg，

蛍光ピークは，ほとんど観察されないが，それをArgなど）100FLlに1．5mg／ml水素化ホウ素ナ

あらかじめ水素化ホウ素ナトリウムによって還元

トリウム50〆を加え，室温で5分間放置後，1．5

した場合には，Leupから生じたLeupOHの蛍

M塩酸50〆を添加し10分間放置する．4mM

光ピークが保持時間8・2分に現れる（図1A）．

ベンゾイン（メチルセロソルプ中）100〆，β−メ
ルカプトエタノール（0．1M）一亜硫酸ナトリウム（0・2M）混液100〆1・5M水酸化カリウム200〆
を加え，100〇Cで90秒間加熱後，氷水中で1．OM」、｝＿八一＿＿＿

トリス緩衝液（pH9．2）と2．3M塩酸の等容混液

0

4

8

12

（min）

0

4

8

12

（nlii】）

200〆を加え，その100′JJをHPLCに付す．
C）・HPLC：カラムは，メルク社のLiChro−
SOrb RP−18（粒径5FEm，カラム長さ0．4×15cmi・d．）を使用．溶離液には，メタノール，0．5Mト

図l Chromatograms of the benzoinderivatives。fLeup（HPLC−injection amount，125pmol）
treated（A）and untreated（B）withNaBH．．

リス緩衝液（pH9．0）および1％テトラ一刀−プチルアンモニウムヒドロキシド（pH9．0）をそれぞれ，70，10および20％（Ⅴ／v）含む混液を常法により脱気して使用．ポンプは，日立635A型を用い，流速0・8m〃minに設定．検出器は，螢光励起
側にEX360および発光側にEM440のカットフ
ィルターを装備した日立液クロ用蛍光モニターを使用．

したがって，Leupを定量するために，Leupの還元体である

LeupOHの蛍光ラベル化体をHPLCによって分離・検出する方法を検討した．
・1）HPIJCによる分離条件
Leup，LeupCOOH，Leu−ArgおよびArgの標準液（各10nmol／mJ）を基準操作（bとC）に従って処理したときに得られるクロマトグラムを図2に示す・4種の化合物から得られる蛍光ラベ
ル化体は，9分以内に，それぞれ単一のピークと結果および考察

して分離溶出される．

当分担研究者らが開発したグアニジノ化合物の使用したHPLCのカラムは，シリカゲル担体

ベンゾインによる蛍光ラベル化反応は4），グアニにオクタデシルシランを化学修飾した固定相を有ジノ化合物（アルギニン，メチルグアニジンなするLiChrosorb RP−18を充填したものである．

ど）をβ−メルカプトエタノールおよび亜硫酸ナ

この充填剤は，逆相分配型であるので，移動相のトリウム共存下，強アルカリ性で加熱する方法でメタノール濃度が高くなると各蛍光ラベル化体は，ある・本研究において，まずこの反応が，Leup

早く溶出し，かつ鋭い蛍光ピークを与える（図3）．

および関連物質の蛍光ラベル化反応として適用で本法では，移動相のメタノール濃度を70％とした．

きるか否かを調べた．
．その結果，Leup をベンゾインにより蛍光ラベ

グアニジノ化合物のベンゾインの蛍光ラベル化

ル化体に導くためには，水素化ホウ素ナトリウム体は，弱アルカリ性領域（pH8．5〜10．5）でもっによって，そのC末端−CHOを−CH20Hにしたとも強い螢光を発することがわかっている2−4）．

もの，すなわちLeupOHに転換す◆る必要があっ

そこで，移動相に加えたトリス緩衝液のpHによ−・26−

・高速液体クロマトグラフィーによるロイべプチソおよび関連物質の微量蛍光定量法

る影響を調べた．図4に示すように，緩衝液のpHが7．5〜9．0において，検討した化合物の分離状態は良好であるが，LeupおよびLeupC0−
OHの蛍光ピークはアルカリ性側において高くなる．したがって，本法では，pH9．0の0．5Mト
リス緩衝液を使用した．このとき，pH9．0のト
リス緩衝液の濃度変化（0．1〜1．OM）によって，各蛍光ピークの分離状態ならびにそれらのピークの高さには著こしい変化はみられなかった・なお，
pH9．0より高いpHの緩衝液を用いた場合，カ
ラム充填剤の劣化が著しく， 長時間それを￣使用す
占一言−Hるには不都合であった．

（min）

図2

テトラー乃−プチルアンモニウムヒ▲ド￣ロキシドほ，ゾChromatogram of the benzoin derivatives・Of
leupeptin−relating

Arg，LeurArgおよびLeupCOOH

compounds．1，＿Arg；2，

Leu−Arg；3，Leup COOH；4，Ledp OH fromの分離をよくするために加えたものである．図5−に示すよう

Leup．
■1

75

0

70

0

0

65

0

︵︒⁝∈︶書コuO uむl遥・

0

主君千号芸

60

60

80

65

図3

70

75

80

Methanol（％）

htethanol（％）

Effect ofmethanoIconcentrationin the mobile phase on peak height：一（A）and retention time（B）．1，Leup COOII；2．Leu−Arg；3，Leup
OH from Leup；4，Arg．

一名叫jづ式
7．0

7．5

8．0

8．5

9．O

pH

7．0

7．5

8．0

8．5

9．O

pli

図4EffectofpHofthemobilephase．onpeakqei申t（A）andreten．
tiontiIもe（B）．1，Ledp COOII；2，Leu−Arg；3，LeupOH from

Leup；4，Arg．
−

27っこ

＿ぴじ

2

20

0

0．5

・1．0

1．5

︵u盲︶賀川︼UO叫luヱ還︼鳥叫むエ駕 式

1一一一一−■一一一一一一疇一一一一一■

2．0

Tetra−lZ−butyJammoniumhydroxide（％）
図5

EfEcetoftetra−n−butylammoniumhyd，。Ⅹid。C。nCe。traii。ninth。

mobilephase onpeakheight（A）andretentiontime（B）．
・：1rLeup COOH；2，，Leu−Argに，0・5および1・0％のそれを加えたとき；∴検討

3，LeupOHfrom Leup；4，Arg．

ル化条件についてHPLCによって検討した．

した化合物の分離は良好で，かつそれらの蛍光ピ

図6は，基準操作に準じた条件において，蛍光∵クの高さにも著しい変化はみられないミ 本法

ラベル化の反応時間とその温度の影響を検討した

では，pH9に調整した1％のテトラ一刀−プチル

ものである・反応温度が高いほど，．各化合物のラ

アンモニウムヒドロキシド溶液を移動相に20％ベル化が迅速になることがわかる．図7は，ラベ（Ⅴ／v）加えることにした．

ル化に必要な水酸化カリウム濃度の影響について，

2）螢光ラベル化反応

1000Cにおける反応時間とともに調べたものであ

上述したように，Leupは直接ベンゾインと蛍る・この図から，1．5M水酸化カリウムを用いた

光反応しないため，水素化ホウ素ナトリウムによとき，1〜2分間の反応時間で，各化合物のラベってLeupOHに導いている．しかし，使用した

ル化体の蛍光ピークは最大値を示すことがわかる．

過剰のその還元剤によって，ベンゾインの蛍光ラ

これらの結果より，Leupおよびその関連物質のベル化反応は著しく妨害されることが認められた．

ラベル化反応には，1．5Mの水酸化カリウムを用

この妨害は，ラベル化反応前にその溶液を塩酸酸

い，1000Cで90秒間加熱する条件を設定した．

性にすれば，解消できることがわかった（その還一方，Leupやその関連物質が，ラベル化反応

元剤は分解し，還元力を失う）．

に必要な強アルカリ性溶液中で不安定であること

1・0〜10mg／mJのその還元剤を用いたとき，い1が認められた．図8に示すように，加熱反応前にずれもLeupを室温にて，3分以上放置すること

その反応液を室温（20cc）で放置したとき，各化によって，約90％のLeupOHを形成すること合物から得られる蛍光ラベル化体の生成は，放置が可能であった．また，その還元剤を塩酸酸性で時間とともに減少している（10分間で10〜20％

分解するには，塩酸を加えたのち室温にて5分間減少）・このとき，氷水中（00C）で放置した場合，以上放置する必要があった．以上の検討から，

LeupおよびLeupOHの分解を阻止できるが，Leupの還元反応として，試料に1．5mg／mlの水LeupCOOHやLeu−Argでは，わずかに分解し素化ホウ素ナトリウムを加えたのち，室温にて5ている．したがって，各化合物を再現性よくラベ

分間放置後，1．5M塩酸を加え10分間放置する

ル化体に導くには，水酸化カリウム溶液を加えた操作法を設定した．

のち，直ちに加熱するのが望ましい．また，加熱

つぎに，その還元剤を加える系において，Leup，

後ラベル化反応液をpH9〜9．5の弱アルカリ性

I・euPOH，LeupCOOHおよびLeurArgの標準に導けば，生じた蛍光ラベル化体は安定で，少な液（各lnmol／mりを用いて，それらの蛍光ラ云

くとも室温に60分間放置しても得られる蛍光ピ−28−高速液体クロマトグラフィーによるロイペプチソおよび関連物質の微量蛍光定量法

王官千号芸︼竜芯 雫むd

60℃
80℃
00℃
0

1．5

5

10

0

1．5

Tjme（mh）

5

10

Time（min）

一毒ヱ駕よ

0

炉
靂

0

一遍蓬一gd1．5

510Time（min）

図6

Time（mime）

Effect of reaction time and temperature onpeak height．

一名Hj焉むら0 1．5

5Time（min）

1．5

5

10

Time（min）

Time（min）

図7

0

10

0

一名芯エゴ富山

5叫︵82655
H O．LO．L2．

0

1．5

86255

戸▲転

︵

︸竜芯 メ3dKOH

叫Leup−OH

E仔ect of potassium hydroxide coneentration and reaction time on peak height．

ークは一定の高さを示した．このとき，ラベル化

図9は，LeupおよびLeupCOOHを添加した反応液を弱アルカリ性に導かず，HPLCに付した

ヒト血渠ならびに無添加のその血梁を，基準操作場合は，ラベル化体が強アルカリ性で不安定であに従って処理したときに得られるHPLCのクロ

るため，得られる螢光ピークは一定の高さを与えマトグラムを示したものである．保持時間4〜8

ず，かつカラムが著しく劣化する結果を得た．

分にかけてきわめて大きな蛍光ピークが現れてい3）ヒト血境（血清）中のLeupおよび関連物

る．これは，その試薬ブランクに基づく蛍光ピー
ク（検出感度を上げた場合に観察される）と血祭

質の定量
ヒト血液中には，グアニジノ基を有する種々のに存在する大量のアルギニンおよび除蛋白されな、化合物が存在しているので，これらの化合物が，かった低分子の蛋白質やペプチド類に由来する蛍

Leup 塀の定量を妨害するか否かを調べる必要が

光ピークであると考えられる．この結果，この大ある．

きい蛍光ピークのために， 血安中のLeu−Argは：
−29−

0
4

0
3

0
3

0
1

0
2

︸もーヱメ冨d

0
2

一遍ヱ駕よ

0
1

0

10

20

30

Time（min）
0

0

0

0

0

一名hjJ宕d0

言草ヱメ冨山102030Time（min）

図鱒

Effect of standing time at room temperature and OCC on peakheight afterthe addition ofpotassium hydroxide．

およびLeupCOOHの蛍光ピークは，いずれも，その添加量に比例したピークの高さを示し，原点を通る直線を示した（図10b）．また，血柴の代りに水を用いて，同様に処理した場合に得られる検量線（図10a）から，これらの化合物の回収率
は，検討した添加量において，Leupでは 86％，
LeupCOOHでは87％であった．
一方，他の除蛋白剤にトリタロル酢酸を用いた
とき，血費に添加したLeupおよびLeupCOOH（各500pmol／0．5mg血祭）の回収率は，それぞれ58％および88％であった．Leupの回収率が過塩素酸の場合よりも低い結果を得た．この場合，
0

4

8

712

（min）

Eg9

0

4

8

（min）

12

0

4

8

12

（min）

Chromatogram ofLeupandLeupCOOHadded
to human plasma，Leup andLeupCOOH（400pmol each）Were added t0200FLl of plasma
respectively，and subjected to the NaBH4
reduction prior to the reactionwithbenzoin．

トリクPル酢酸は，ベンゾインのラベル化反応を妨害するために3），あらかじめェーテルでトリタ
ロル酢酸を試料から除去しなければならず，操作のうえでも過塩素酸除蛋白法より，やや煩雑であった．

A：Plasma＋Leup and LeupCOOfL B：pla・
Sma．C：reagent blank．

また，アミコン社製の限外濾過膜CF−25（分画分子量25，000）を用いて，血柴を水で2倍希釈し測定できないが，LeupおよびLeupCOOHを測て濾過した場合，LeupおよびLeupCOOH（各定することは可能である．

500pmol／0．5mg血簗）の回収率は，それぞれ￣10

つぎに，基準操作に従ってヒト血祭に添加した
Leup

およびLeupCOOH％および 35％であーり，同じく■血祭を塩酸酸性の検量線とその添加（最終濃度0．1M）で2倍希釈して濾過した場合；

回収率を調べた（図10）．血柴に添加したLeup

LeupおよびLeupCOOHのそれは，それぞれ67−30−高速液体クロ∵マトグラフィ一によるロイペプチソおよび閑適物質の微量蛍光定量法
Leup−COOH

30

Leup

30

0．5

0．5

1．0

0

237．5

239．25475

478．5（ng／mlplasma）（ng／mlpIasma）

図10

1．0

（nmol／mlplasma）（nmol／mlplasma）

Calibration curvesfor LeupandLeupCOOHinaqueous
solution（a）andin plasma（b）．

％および32％であった．いずれも，CF−25の限されており，Leupの蛍光ピークも約3倍ほど高外濾過膜では良好な回収率を与えない結果を得た．

く検出されている．この方法では，LeupCOOH

したがって，本法では，ヒト血祭中のLeup類

およびLeurArgの蛍光体は抽出されにくいため測定できないが，Leup に対してほ，10pmol／mlを測定する場合は過塩素酸除蛋白法を採用した・
図10の血柴に添加した検量線から，刃Ⅳ＝2におけるLeupおよびLeupCOOHの検出限界を
血祭中の濃度で表わすと，それぞれ30pmol／mJ（15ng／ml）および18pmol／ml（10ng／ml）であった．本法は，せわめて高感度にこれらの物質を測定することが可能である・しかし，ヒトの血祭中には大量のArgが存在するので，その大きな螢
光ピークのテーリング部分がLeupおよびLeup
COOHの蛍光ピークの位置に重なるために，血集中100pmol／ml（50ng／ml）以下のそれらの濃度を有意に測定することは困難であった・
そこで，血簗由来の大量アルギニンからの蛍光

0ピークを除くために，ベンゾインの螢光ラベル化
反応液から選択的にLeupの螢光体を抽出する方

4

8

12

（min）

0

4

8

12

（min）

図1l Chromatogram of ethylacetateextractfrom法を検討した．

the benzoin reaction mixture of Leup and

図11は，血柴に添加したLeupおよびLeup
COOHの試料を基準操作に従って処理し，そのLeupCOOH added to human plasma．Leup
and LeupCOOH（400pmoleach）Were added
t0200pl of plasma respectively，and ex−
tracted withlml of ethyl acetate afterthe

ラベル化反応液に酢酸エチル（1・0mg）を加え，

且uorescent reaction．The extract（800pE）

蛍光ラベル化体を抽出したその有機層から得られるクロマトグラムを示したものである・これから，
図9にみられた大きな蛍光ピークはほとんど除去−31−

was concentrated to dryness，and the resi−
due was dissoIvedin

200FLt Of O．01H

β→mercaptoethanol． A：plasma＋Leup and
LeupTCOOH．B：reagent blank．

（5mg／mg）の血奨中の濃度を測定することが可能

今後，このHPLC による定量法を応用して，である．この場合，試薬ブランクからのピークが，Leupを投与した動物の各組織内のLeuplおよびLeupの保持時間の位置に検出されるため，現在その代謝物の分析法を検討する予定である．

この試薬ブランクに由来するピークの原因ならびにそれを除去する方法を検討中である．

文

本研究において，プレカラム螢光誘導体化法によるHPLCにより，Leupおよびその関連物質を分離・測定することが可能となった．また，本法に簡便な溶媒抽出操作を前処理に併用すれば，Leupを投与した患者血簗（血清）中の数量のLeupをモニターできることも示唆された．

−32−

献

1）Ohkura，Y．and Kai，M．Anal．Chim．Acia，
106，89（1979）．

2）大倉洋甫，甲斐雅売．臨床化学，9，244（1980）．
3）Kai，M．，Yamaguchi，M．，and Ohkura，Y．
A抑扉．Cゐi桝．Acね，120，411（1980）．
4）Kai，M．，Miura，T．，Kohashi，K．，and Ohkura，
Y．Chem．Pharm．Bull．，in press（1981）．

ロイペブテンの細胞レベルでの研究

岩 崎 祐 三＊1．鶏骨格筋細胞膜の構築とロイぺプチン
凍結割断法は生体膜の微細構造の変化を定量的にとらえる手段としてすぐれた方法である．そこ

トロン画像解析装置を用いて・各試料に？いて筋細胞膜面積約300m／ 2を実測し，その平均をとった．

で，ジストロフィー症において筋線経の変性と密1）加齢に伴うcaveolaeの密度の変化

接な関係があるといわれている，筋細胞膜構築の一 加齢に伴う筋細胞膜構築の変化を知る目的で，変化を凍結割断法を用いて観察した．

階化後3時間以内，醇化後2，5，13，27週目のニワ

検索の対象は1）New Hampshire種由来のジトリについて検索を行った．凍結割断に用いた筋

ストロフィー鶏（413株），2）醇化後10 日日よの一部について，筋線経の直径を計測した結果をり 50mg／kgのロイペプチンを遇6日，腹腔内にまとめたものが表1である．加齢とともに筋線経連続投与を受けたジストロフィー鶏，3）対照とて同じく

NewHampshire種由来の正常鶏（412の直径が増加しているが，浅胸筋の変化が，下肢筋の変化に比べて著しい・対照鶏とジストロフィ株）である．検索の対象とした筋は，浅胸筋と下ー鶏を比較すると，13週齢，27適齢で，ジスト

肢外転筋で，ネンプタール麻酔下に，これらの筋

ロフィー鶏の筋線経の平均直径が対照筋に比べ大から筋膜直下の部分を切り出し，2．5％グルターとなるとともに，直径のばらつきも大きくなって

ルアルデヒドで固定した．次いでその一部をオスミウム酸で固定したのち，エポキシ樹脂に包埋，光学顕微鏡と透過電子原敬鏡による観察を行った．
凍結割断は，グルタールアルデヒドで固定した筋
組織の細片を3〜20時間，25％グリセリン溶液で処理したのち，銅製試料台にのせ，液体窒素で冷却したフレオン12中で急速凍結，エイコー社

きている・表2ほ，これらの筋の筋細胞膜の凍結
割断面について，10／fm2当りのCaVeOlaさの数を算出したものである・CaVeOlaeの密度は，対照鶏についてみると，加齢とともに高くなっているが，密度の上昇度は筋緑経の直径の増大の程度と必ずしも平行しない・醇化直後では，浅胸筋の線維径は下肢筋のそれの約1／4であるが，単位面積当り

製凍結割断装置を用いて試料台温度 −1100C，試のCaVeOlaeの密度は両者とも100〜110である．

料宝真空度1．5×10￣7Torrで行った．白金カー

また成鶏については，線維径の大小にかかわらずボンのレプリカはブリーチで処理，次いで蒸留水

200〜250の間で一定の値を示すようである．対で洗い，300mesh鋼製グリッドにのせ，H−600

照鶏とジストロラィー鶏を比較すると，醇化時に型電子顕散鏡を用い倍率4，000〜6，000で写真投は両者の間に有意の差を認めないが，5週齢以後，影を行った．筋細胞膜の CaVeOlae の密度はコン

ジえトロフィー鶏の値が対照鶏のそれに比べ，常＊国立武蔵療養所神経センターに高値を示している・ここで注目すべきは，組織−33ニー

表l Alteration of musclefiber diameters as a function ofaging
day O

2weeks

5weeks13weeks

27weeks

Super丘Cial pectoralis muscle
ControI．2．7土0．2 10．2土0．7

26．8土1．3

40．5土 9．5

43．5土13．5

Dystrophic

2．4土0．2

8．8土0．5

31．3土1．9

55．0土19．0

58．5土20．5

ControI

8．3土0．2

11．3土0．4

26．6土1．5

72．5土16．0

Dystrophic

7．1土0．4

11．1土0．6

30．8土2．2

83．0±29．0

Lateral adductor muscle

表2 Density of caveolae
day O

2weeks

5weeks13weeks

27weeks

ControI

108．6土3．6128．1土14．8

140．1土4．0

229，5土8．0

202．9土4．6

Dystrophic

111．5土5．3199．7土17．3

241．5土5．2

371．3土1．7

240．3土8．8

ControI

106．4土1．4140．0土9．2

139．7土8．0

240．1土6．5

Dystrophic

105．3土2．9131．1土 9．3 261．8土11．7

307．3土28．6

Super丘Cial pectoralis muscle

Lateral adductor muscle

mean土S．E．，PerlOpm2．

学的にみて筋の変性が明確でない5週齢のジスト

九，これは図 3 に示すジストロフィー鶏の Ca・

ロフィー鶏においても，すでにその筋細胞膜には

veolaeの不規則な排列とは，明確に区別しうる．

変化がみられること，つぎに．ジストロフィー成

つまりジストロフィー鶏の骨格筋膜の特徴として，

鶏では筋の変性が起きに、くいといわれている外転CaVeOlaeの密度上昇とともにその排列の不規則筋においても，筋変性が顕著な浅胸筋と同様な性をあげることができるように思う．

CaVeOlaeの密度の上昇がみられることである．つ3）ジストロフィー鶏骨格筋膜に対するロイぺ
プチンの影響まりジストロフィー鶏の筋細胞且莫の変化は，浅胸筋と外転筋との対比において明らかなごとく，筋以上の観察から，CaVeOlaeを指標としてみた場

細胞胞体の変性の有無にかかわらず起きていると合，醇化時には，ジストロフィー鶏の骨格筋細胞思われる．しかし，筋線経の変性が最も強かった膜は対照鶏のそれと識別しがたく，上述したジス

1写適齢のジストロフィー鶏の浅胸筋で筋細胞膜・トロフィー鶏骨格筋細胞膜に特徴的な所見は，加？変化も最も顕著であったのは，鱒細胞膜の構築

齢に伴い発現することが明らかになった．そこでが筋細胞胞体の変化による修飾をも受けているこ

このようなジストロフィー鶏に特有な変化が，ロとを示しているものと思われる．

イべプチンの連続投与によりどのように影響され

2）・CaYeO1年eの分布嘩式についてるかをみたのがこの実験である．ロイペプチンは

図1は醇化革後の鱒照鶏の浅胸筋の凍結割断像

醇化後10日目から50mg／kgを腹腔内に連続投である・ここにみられるごとく− 醇化直後には与した．症候学的にはロイペプチン投与群と非投CaVeOlaeは不規則に排列し亘野化直後の対照鶏と与群の間に差を認めなかった．￣組織学的にも図4？ストPフィー鶏に共通した所見であり，この時にみられるごとく，ロイペプチシ投与群と非投与

卿こは両者を識別することは不可能である・とこ

群の間にその変性像に質的な違いを兄いだすことろが2週齢以後の対照鶏では，骨格筋膜の Ca・ができなかった．つまり，筋細胞内の空砲形成，

VeOlaeの排列に図2 に示すごとき規則性がみら

壊死線経の出現，脂肪組織の増加￣などが両者に共−34−

ロイペプチソの細胞レベルでの研究

図1醇化直後の正常対照鶏の浅胸筋の凍結割断像・正常筋においても貯化時のCaVeOlaeの排列はジストロフィー鶏同様不規則である．×10，000・−35−

Egl2 5週齢の正常対照鶏浅胸筋の凍結割断像正常筋細胞膜にみられるCaVeOlae排列の規則性を示す．×25，000．

−26−

ロイペプチソの細胞レベルでの研究

図3

5適齢のジストロフィー鶏浅胸筋の凍結割断像．caveolaeの排列に正常にみられた規則性が失われ，その密度も正常筋より高くなっている．×30，000・

一丁37一丁図4

27適齢鶏の浅胸筋の組織嵐上よりDy（ジストロフィー鶏），Leu（ロイべプチン投与ジスト

ロフィー鶏），C（正常対照鶏）を示す．筋線経の大小不同，脂肪組織の介在の程度など，DyとLeuの間に違いがみられない．ェボン包埋，トルイジンブルー染色．

図5 27週齢鶏の浅胸筋の凍結割断像．DyとLeuは識別しがたいが，両者と対照鶏（C）とは明らかに異なる．
れるCaVeOlae排列の規則性が失われている．ま

通した所見としてみられた．また筋線経の直径分

た・CaVeOlaeの密度についても，13適齢鶏の浅布についても図6に示すごとく，両者の間に明確

胸筋では229・5±8．0／〝m2（対照正常鶏），371．3

な差を兄いだしえなかった・図5は27遇齢の対±1・7（非投与鶏），328・0±6．9（投与鶏）と排列

照鶏，ロイペプチン投与鶏，非投与鶏の浅胸筋のの不規則性に加え，単位面積当りの CaVeOlae の

凍結割断像であるが，ロイペプチン投与の有無に数が増加していることが明らかである．27適齢かかわらずジストロフィー鶉の凍結割断面は対照

鶏についても，浅胸筋では202．9±4．6（対照正常

鶏のそれと明らかに異なっており，対照鶏にみら鶏），240・3±8・8（非投与鶏），283．5±26．7（投与ー38−ロイペプチソの細胞レベルでの研究鶏）であり，外転筋では240．1±6．5（対照正常131Veeksold，SuperficialpectoralismuscIe鶏），307．0±28．6（非投与爵），311・9±15・2（投371．3±1．7（55．0±19．0）

Dy与鶏）で，対照正常鶏とジストロフィー鶏の間の差は明白であるが，投与鶏と非投与鶏との間の差．．三三．油量三三呈三三呈●一一一▼一疇一一一三三ヨ三三竺宣三！三六岩内ヨミR美宗罵RR

Dy＋Leup

は個体差による違いの範囲を出ていないものと思われる．図6は，凍結割断に用いた組織の筋線椎328．0±6．9（65．0±20．0）てまとめたもので，ジストロフィー鶏では筋線経

●

●

−

−

■

−

●

●

■

三

三

一−

−

●−

王

●A

t〜

●●●︻

●●●●▼

−

ヱ

●一

⁝●︻

一

●

●

■

●

●

●●︷

●l●⁝一

の直径の分布と caveolaeの密度を各筋群につい＿＿〜■●一一一一一三＝≡ヨ＝虻は持HHHH引射裾引腋毛ERRRの直径のばらつきが対照鶏にくらべ大きいこと，

05
＼●
−−
8
．
ほが
95
．●
24
0
2

Contrr）1

caveolaeの密度は筋線経の直径に必ずしも比例
実験条件下では，醇化後におけるジストロフィー

〇

〇

一

−

●

○

●

●

■

■

●

●

●

●

一

●

−

●

●

●一巾

●一●︻

一●●●▼

⁝●●ス

●l

●⁝︻

●●●●▼

●

●

●

一

■王●●⁝●■

していないことを示している．以上，今回行った
鶏の筋膜に特徴的な筋細胞膜の変化をロイペプチ

27weeksold，SuperEicialpectoralismtiSCle
Dy

ン投与により阻止できなかった・●●

2．マウスの成育に対するロイぺプチン

○

■

●

一

●

■

●

●

●一

●■

●−

■

−

●一

●︻

エ

ー〜

一

l〜

h
d

●

●

●

一

I損

240．3±8．8（58．5±20．5）●−●・■■●■一一一■三＝ヨヨ三雲王らモミ舞罵nR蔦n縄k貞黙寓言

Dy＋Leup

連続投与の影響
生体内では種々なプロティナーゼとそれぞれの283．5±26．7（46．0±23．5）

プロティナーゼに対するインヒビターがバランス．．三三iヱま圭ままヱ三三．．．まま．三．ま．……．．

を保って共存しているといわれている・体外から一一■■■一・日■一一●一三＝ヨヨ三雲ゴミミミ買岩穴司真に絶RたRR

連続的に特定のプロティナーゼに対するインヒビ．．．．●．：．●：．．●．．．．■

Contro1−＿三三ターをもちこんだ場合，このバランスにどのよう

202．9±4．6（43．5±13．5）

三な影響があるのかはよく解明されていないようで

！！
三最

三

三三．＿‥＿．＿●＿……＿…

ある．そこで個体が成熟していない授乳期からロ
イペプチンを連続的に投与，それが個体および各27weeksold，lateraladductormuscle

謂震錯

臓器の成育にどのような影響を及ぼすかをみようとしたのが今回の実験である．実験にはlitter

−

●

三

〇

〇

●

三

一

三

暮〜

●t

●一

th

員

■

●

−

fA

●一

●■

ミ

■

●

ミ

●︻

●

●

●

●●︳︷

∬

Dy

sizeが大きく飼育が容易なICR系のマウスを用＿＿【嶋●一一■■−ヨココ竺三ヨミニミミn扁RR蔦R式に穴馬罵．●．⁝．●；．．●．．．．●．⁝■

いた．1回投与量は1mg／体重10g（100mg／体

Dy十Leup 謂震鍔重kg）で，Stracherがジストロフィーマウスの治療に用いた薬効量の10倍以上である・ロイペ−…ヱましま三三．五三日三日．．王．．＿三．‥．．一プチンは1回投与量が0．1〜0．3mgになるように

一一一【一一一一一一三三ヨヨ三ヨ三三！三馬岩Rn罵n式R荒れ罵

Control■．●．．．．●：．J：⁝●．．．．〇

滅菌蒸留水に溶かし，1週6日腹腔内に生後10謂崇：昌）

日目より最長15週間連続投与した・生後10日．．＿．．三．三三五三．主ま三三主よ三一・…−・。…。。

日に同胞を2群に分け，一方にロイペプチン，他

図6 凍結割断法により検索した筋の直径分布のヒス
トグラム，筋細胞10〟m2当りのCaVeOlaeの数を示す．（）内にそれぞれの筋線経の直径とS・E．を示した．

方は対照群として生食の注射を行った・環境条件を一定にするため，雌雄を分けたのちも，ロイペ
プチン群と対照群を1つのケージに入れた・実験−39−

ほ対照群4，ロイペプチン群5匹で始めたが，7定である．表3はこの2つの実験群における各臓

過日にロイペプチン投与中のものが1匹死亡，15

器重量をまとめたものである．7週目の群で対照週目の実験終了時には各群とも4匹ずつ生存して群とロイペプチン投与群の間に差があるようにみいた．図7に体重の推移を示す．成熟期に入った

えるが，この実験群では両者の間に体重の差が大第6週目ごろよりロイペプチン投与群の体重が対きく，比体重臓器重量をみると両者の間に差がな

照群のそれより大きい傾向がみられた．同様なロかった．以上，大量のロイペプチンを授乳期からイペプチン投与群における体重増加の傾向は他のマウスに連続投与を行ったが，体の発育はロイべ

実験群（表3，grOup2）においてもみられた．7

プチン投与群の方がよい傾向がみられ，また各臓

週および15週間ロイペプチンを投与した群の脳，器の組織学的検索の結果でも異常がみられなかっ心臓，大動脈，肺，胸腺，肝，脾，腎臓，副腎にた．

ついて凍結切片のアミロイド染色，エポキシ樹脂
包埋切片についてトルイジンブルー染色を行い組

ま

と

め

織学的検索を行ったが，現在のところロイべプチ

1）ジストロフィー鶏の筋細胞膜では，醇化後ン投与群と対照群の間の明白な違いは兄いだされ

2〜5週目から，対照鶏のそれに比べ顕著なca−ていない．さらに電子厩敏鏡による検索を行う予

veolaeの単位面積当りの数の増加と，その排列の乱れがみられることを凍結割断法により明らかにしたうえで，このような醇化後に生ずるジストロの効果を調べた．醇化後10日目より50mg／体重
1kgを6日／週腹艦内に連続投与したジストロ0︵鴎︶︺名川む声音〇日0

フィー鶏筋細胞膜に対するロイペプチン連続投与

フィー鶏の浅胸筋と後肢外転筋について，同週齢のジストロフィー鶏および対照鶏と比較した結00果，ロイペプチン投与ジストロフィー鶏の筋細胞
12

3

4

5

6

7

8

膜の構築と非投与ジストロフィー鶏のそれとは識9101112131415（Weeks）

別できないが，対照鶏のそれとは明確に異なるこ

図7 ロイペプチソ投与および非投与ICRマウスの体重の推移．各群4〜5匹の平均と最大最小値を示
す．実線は投与群，点線は非投与群．

とを知った．
2）ICR系マウスについて，生後10日日より15週間，ロイペプチン1

表3Groupl（15weeks）

Group2（7weeks）

ControI Leupeptin ControI Leupeptinmg／体重10g（100mg／kg）を旗艦内に連続投与を行いマウスの成育に対

B．W．

32．3 土2．90＊

36．4 土2．4

17．7 土2．3

27．1土1．1

Liver

2．26土0．30

2．41土0．05

1．72土0．26

1．90土0．26

するロイペプチンの影響

Spleen O．15土0．00

0．16土0．01

0．09土0．03

0．16土0．02

をみた・ロイべプチン投

Kidney O．27土0．02

0．35土0．02

0．14土0．02

0．23土0．02

Lung O．47土0．02

0．45土0．04

0．35土0．03

0．44土0．04

Heart O．18土0．01

0．22土0．02

0．12土0．01

0．17土0．00

大きい傾向がみられたが，Thymus O．04土0．01

0．04土0．00

0．05土0．00

0．06土0．01

各臓器の組織学的検索のBrain O．58土0．00

0．56土0．01

0．48土0，01

0．55土0．01

結果では異常を認めなか

n＝4，

＊

wet weight（g）土S．E．

−40−

与群の体重増加の程度がった．

ロイペプテンの薬理学的研究

大 塚 正 徳＊研究協力者

宮田雄平＊・小西史朗＊・柳沢光彦＊

角尾彰倍＊・鈴江俊彦＊・吉岡耕一＊・赤木宏行＊

一 昨年度に引き続き，ロイペプチンの薬理作用をり去り自発呼吸状態で実験を行った．ニワトリを検討したが，今年度はとくに，背位に固定し，巽の腹側皮膚を切開して長横側手

1） ロイペプチンがジストロフィー鶏の筋収縮

根伸筋（ECRL）を露出させた．ECRL筋の末梢側の掟を切断し，トランスジューサーに接続し，力を，急性実験の範囲で変化させるかどうか，
2）ロイペプチンが筋または神経細胞膜の電気等尺性収縮をベンレコーダー上に記録した．安定した収縮を長時間にわたって記録するために模骨的性質に対して影響をもつか，
3） ロイペプチンおよび関連するプロテアーゼを木製固定台にクギで固定した．神経刺激により抑制物質がニューロンに対するペプチドの作用に発生する収縮を調べるために，ECRL支配神経を影響するか，

上腕部で切断しその末梢端を刺激電極を介して持の三点について検討を加えた．第一点については，

続100〝SeC，10Vの矩形波で20秒に1回刺激しロイペプチンの筋収縮力に対する効果は慢性投与た．一方，直接刺激による筋収縮は，持続2msec，の効果が最も重要であることはいうまでもないが，100Vの矩形波でECRLを直接刺激することにその予備実験として急性投与の効果をみる必要がより発生させた．また，強直収縮に対する影響をあると考えた．第二点は，ジストロフィー症にお調べるために適時，直接および間接頻回刺激（100

いて筋線経からある種の酵素が漏出することが知Hz，持続1秒）を行った．以上の実験は神経およられていることから，細胞膜透過性の関与の可能

び筋の乾燥を防ぐため，パラフィンプール中で行性が考えられ，したがって細胞膜の電気的性質にった．

対するロイペプチンの効果を検討する必要がある結と考えた．とくに昨年度，ロイペプチンがアセチ

表1に示すようにジストロフィー鶏ECRL筋

ルコリン（ACh）受容体を抑制することを兄いだの収縮力は正常鶏に比べて約半分に減弱していた．

したのでこの点をさらに詳しく研究した．

果

ロイペプチン（2mg／kg）を腹腔内に投与すると，間接刺激による単収縮力は一過性に低下した

1．ジストロフィー鶏の筋収縮力に対すが，その後2時間にわたって，直接，間接刺激にる作用

ょる単収縮および強絹に有意な変動はみられなか・実験方法った．単収縮力と強縮力の比にも変化は認められェーテル麻酔下にジストロフィー鶏（Line413

なかった（図1）．

体重約2kg）の大脳を除去し，エーテル麻酔をと＊東京医科歯科大学医学部薬理学教室

ロイペプチンの適用13時間後に同様の測定を行ったところ，直接刺激による収縮は変化がみら−41−表1正常およびジストロフィー鶏ECRL筋の収縮の
性質

単収縮力

2．筋膜の電気的性質およびアセチルコ

強縮力

リン感受性に対するロイぺプチンの

納強縮力欝比（kg／cm2）

．

00
土

一

生後約1カ月のラットヒラメ筋あるいは長址伸筋を摘出し，f乃pffroでKrebs液を潅流して実験．

6を行った．ヒラメ筋を用いた実験では，まず記録

6

6

実験方法

訂01

わ

作用

7

ジストロフィー

．

8

1．63
土0．140．

80．44
土0．051

00
土

乃

正

3．14
土0．253

3807

常

1．14
土0．183用と通電用の2本の微小電極を同一の筋線経に刺入し，矩形波電流により発生する電気緊張性電位を記録した．さらに直流電流により膜電位をuO芯uヱ U︼て声↑−100mVに1分間保持したのち，脱分枝性の矩形波電流によって活動電位を発生させた．
H、一一一一一一一一一一、−−−◆一一一一一一一一一一一一…−叫一一一ト一一†

つぎにラットの坐骨神経を切断後5日日に長址伸筋を摘出した．AChを電気泳動的に適用して得られるACh電位の大きさから，ACh感受性を
mV／nCの単位で求めた．すべての測定は近位の

10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

脛と終板とのほは中間の位置で行った．ロイペプ

Time（min）

図1ジストロフィー鶏の筋収縮力に対するロイペプ
チソの効果．●直接刺激；○間接刺数に対する収縮．強桁には100Hz1秒の連続刺激を用いた．TIy／7tJは単収縮と強縞の張力比．矢印の時点でロイペプチソを投与した．間接刺激による単収縮は5分ごとの値を，その他は適時測定した値をプロットした．詳細は本文参照．

チンの作用は適用30分後から調べた．

れなかったが，間接刺激による単収縮および強精膜の入力抵抗（Rin），長さ定数（j）および時定数

力の低下がみられた．これは神経切断によるシナ（7）を求め，つぎに換算により筋線経の単位長

プス変性の影響と考えられる．

さ当りの膜抵抗（rm），長軸方向の内部抵抗（rl）

結果

ロイペプチン10￣4g／mJ適用により電気緊張性電位および活動電位の波形に変化はみられなかった（図2）．またsquare pulseanalysisにより，E−64Cの作用についても同様に検討を行ったおよび膜容量（cm）を求めた．正常Krebs液中が，投与前後で収縮力の有意な変動は認められなとロイペプチン存在下とで，上記の6個のいずれかった．

の値についても有意の差は認められなかった．活考

動電位の最大上昇速度（MRR）および最大下降

察

ロイペプチンの投与による単収縮力の一過性の速度（MRF）についてもロイペプチンによる∴有意な変化はみられなかった（表2）．

低下は投与のさいのartefactと考えられる．
以上の結果から，ロイペプチンはジストロフィ

一方，除神経後5日目の長址伸筋のACh感受ー鶏の筋収縮を急性実験の範囲では増強しないも性は，正常Krebs液中で214mV／nC（中央値，のと推定されるが，慢性的に投与した場合の効果

乃＝10）であるのに対して，ロイペプチン10￣5g／mgについては今後さらに検討する必要がある．

存在下では100mV／nC（乃＝10）となり，ロイべ

プチンにより抑制された．さらに10￣4g／mJにすると7mV／nC（乃＝10）となり，対照の数十分の−42−ロイベプチソの薬理学的研究
2

LeupeptirL

A

）

〕

′

）

」器
4msee

l

．二二＝二二＝二三＿二ヽ−、

図2 ラットヒラメ筋から細胞内記録した電気緊張性電位（A）および活動電位（B）に対するロイべプチシの効果；・Aの上側は流した電流，下側は電位の記録・B．の上側は電位，下側はその微分波形の記乱1：ロイペプチソを加える前・2：10￣4g／mJ
適用中．3：洗った後．それぞれ別の細胞からの記録二表2 筋膜の電気的定数および興奮性に対するロイべプチソの効果
ControI

Leupeptin（10￣4g／ml）（mean土S．D．）
Rin（MQ）

0．86土0．19（乃＝5）（rnean土S・D・）
0．74

土0．12（乃＝5）

A

（mm）

0．85 土0．13

0．88 土0．07

丁（msec）

4．0 土0．6

4．4

rm（MQcm）

0．14 土0．03（乃＝5）0．13

土0．01（乃＝5）rl（MO／cm）

21

20

土5

cm

（pF／cm）

0．030土0．005

0．034土0．006

MRR（Ⅴ／sec）

348

土21

365

土59（乃＝10）

MRF（Ⅴ／sec）

96

土9

107

土26

土6

（乃＝10）

土0．6

2

Leupeptin

へ、㌦．rh■｛叫」誤20msec〔＼」；設lOOmsec」監
40msec

図3 除神経後5日日の長址伸筋から記録したACh電位に対するロイべプチソの効果．
各記録の下側のトレースは流した電流，上側は細胞内電位を示す．1：ロイべプチ
シ適用前．2：10￣4g／mJ適用中．・3：薬物除去後の記録例．
一に抑制された．正常Krebs液にもどして30分

考後にはACh感受性は124mV／nC（n＝9）に回復

ロイペプチン適用により静止膜の電気的特性おした（図3，図4）．

察

一

よび活動電位に変化は認められなかった．一方，・＝−43−

●て，今回のACh電位は同じ濃度で10％以下に●ヽ抑制された．したがって終板部ACh受容体と，●●●

ロイべプチンの抑制作用に違いのあることが示唆

︳■

●

される．

●●

●●

︵Uu＼Au︶ゎ二三芯u冨エリく

除神経後に出現する終校外ACh受容体に対する

3・交感神経節に対する効果
交感神経節における節後ニューロンの電気的性
質およびコリン作動性伝達に対するロイペプチンの効果を検討した．
実験方法
10￣5

雄モルモットから摘出した下腸間膜動脈神経節

10，4Leupeptin（g／ml）

を濯流梧内に固定し，Tyrode液で潅流した．神図4 ACh感受性に対するロイペプチソの効果．図3と同じ標本．各点は個々の筋線経で測定した
ACh感受性を示す．

経節細胞に敵中電極を刺入して細胞内記録を行った・腰内臓神経の刺激によってコリン作動性

除神経後に出現するACh感受性をロイペプチン

epspを，また細胞内通電によって節後ニューロは用量依存的に抑制した．前回，ロイペプチンはンに活動電位を発生させた．ロイペプチンは

神経筋接合部でクラーレ様作用を示すことを報告

Tyrode液に溶かし濯流を切り換えることによりした・その実験においてはロイべプチン10￣4g／

液槽内に適用した．

mJで終板電位が約80％に抑制を受けたのに対し
2

Leupeptin

A＿予、

．＿JJ

一、

−＿＿、．．＿−．〕〔＼」lmV
lOmsec

』

20mV

」霊

4msec

図5 ロイべプチソ（5×10￣5g／mりのコリ、ン作動性epsp，活動電位および後過分極に対する効果・神経節細昭から傲小電極により細胞内記録を行った．A：腰内臓神経を1Hzで刺激して発生したepspをシグナ
ルアベレージャーで16回加算平均した記録．B：上は活動電位二 下は細胞蜘こ通電した電流量を示す・C：上は通電した電流量・下は鱒二電位で活動電位に続く後退分極を示す．1：対照．2：ロイペプチソ
5×10「三g／mJ存在下．3：ロイペプチソ除去後．
▼！−44

1

ロイべプチソの薬理学的研究
結存在下にepspのfailureの数は変化せず対照とほ果

図5に示すように，脱分極性電流の通電によっぼ同じであった．epspの大きさの分布がPoissonて生じた節後ニューロンの活動電位，およびそれ分布に従うと仮定して分布の分散係数から推定をに続く後過分極の大きさと形は，ロイべプチン

行うと，ロイペプチンによって平均量子数（これ（5×10−5g／mJ）によって影響を受けなかった．一はロイペプチンの神経終末に対する効果を反映す

方，腰内臓神経刺激によって節後ニューロンに発る）は変化せず，単位epspの大きさ（これは多生するコリン作動性epspの大きさはロイペプチ

くの場合シナプス後肢のACh感受性を表わしてン（5×10￣5g／mg）によって対照の 29％ に減少いる）のみが対照の50％以下に減少することがした．epspの大きさはロイペプチンを除いたあ示された（図6B）．

とほぼもとの大きさに回復した（図5A）．

考察

さらにロイペプチンのepspに対する抑制効果

これらの結果は，ロイべプチンがニューロンのの作用点を調べるため，ロイペプチンの適用前後

電気的性質を変化させずに，コリン作動性epsp

で，epSpの大きさの分布をquantalanalysisによを抑制することを示している．さらにこのepspって検討した（図6）．ロイペプチン5×10￣5g／mJ抑制効果は，神経終末からのACh放出の抑制にAlよるものではなく，節後ニューロンのACh受容
91
1
9
1
．6
20
二二
〃U

I

Control体あるいはイオン透過機構（イオノフォア）にロI
0

イペプチンが作用し，ニューロンのAChに対す

丁4

■一

訪

王

∴﹁

■︼

t

T

■llュ
■▲

tt
■▲

‡
0

▲
llll▲
tl▲
■l▲
■l一lll▲T2
t一一l一︳▲
一lllllll上
llt▲
tl且
lll▲
︳一一lltt■lllt
llll一l▲一▲t ■ ■ T l■llll一l■▲ll1︳l●︳︳1︳▲■■一tTる反応性を低下させることによると結論される．

4．ロイベプチンの中枢ニューロンに対

n
⁚tl

p
e
p
U
e

L

Ⅳ＝0．281

調べるために，ラット運動ニューロンに対する作用を細胞内記録により検討した．

■ll−

．
．

tl¶︳■■一l●l■一．

tl一■■Il▲

i
﹂

■ T l
■llltl■ll−．

11111111暮一ll一王︳■lllllt一l■■l一．

．

■I−−−■−I−−−−−−−−−1

ロイペプチンの中枢ニューロンに対する作用を

AJ＝2．104
tl一lllt一︳︳■l1
tllllllltlllt

8▼● − ◆ − ◆ r ◆ − ◆ − 1 ㌢ † ∩∽uO叫︼dEUS一〇−〇．ON−−・−・寸‡−

する作用

実験方法

●■
lIt1−−−丁一一一一一一一一一丁一一一一一一一一一▼一一一

2

3

4mV

生後3〜4日齢のWistar系ラットの脊髄を摘出し，標本槽中に固定し270Cに保温した人工脳

こ
こ

56
1−2
05
2仇

〃Ⅳ

y
r
e
V
O
C
e

R

脊髄液で濯流した．細胞内記掛こは4M酢酸カ
リウムをつめた抵抗30〜60Mflのガラス微小電0極を用い，細胞の入力抵抗の測定は bridge cir−cuitにより記録電極から一定の強さのパルス電
0■一一一一一一一一†一一一4

図6流を通電して行った．シナプス後電位およびニュmV

ロイペプチソ適用前および後のepspの大きさのヒストグラム．ヒストグラムの縦軸は頻度を，
横軸はepspの大きさ（mV）を示す．A：対照．
B：ロイべプチソ5×10￣5g／mJ存在下．C：ロ
イべプチソ除去後．▼印は単位epspの大きさ．
MおよびUはそれぞれepspの大きさの分布の分散係数より求めた平均量子数および単位epspの大きさを示す．

ーロンの入力抵抗の変化の時間経過はトランジェ
ントメモリーを用いてペンレコーダー上に記録した．薬物は人工脳脊髄液に溶解し濯流により適用
した．

−45−

結

果

ロイペプチン10￣4g／mJを，1〜2分間適用すると，多くの場合運動ニューロンの静止膜電位のられる．

ごくわずかな脱分極（2〜3mV）が観察された．
このとき，前根の逆向性刺激によって生ずる運動

5．幼若ラット摘出脊髄におけるSubstaneeP

ニューロンの活動電位の大きさはほとんど変化せの効果に対するロイベプチンの影響ず（図7A），入力抵抗にも顕著な変化は認められ

ロイペプチンのプロテアーゼ抑制作用から考えなかった（図7B，C）．図8は後根の電気刺激にて，運動ニューロンに対するペプチドの作用がロよって運動ニューロンに生ずる興奮性シナプス後イべプチンによって増強されることが考えられる．

電位に対するロイペプチンの影響をみたものであ

この実験ではペプチドとしてSubstance Pを選る．ロイペプチン10￣4g／mJはシナプス電位の自び，それによって起る運動ニューロンの脱分極に然のバラツキにくらべて有意な変化を引き起さな対してロイぺプチンが影響するかどうかを検討しかった．ロイペプチンは，運動ニューロンの静止た．また他のプロテアーゼ抑制物質であるアマス

電位をわずかに脱分極するが．活動電位，入力抵

タチン，べスタチンの作用も併せて検討した．

抗および知覚神経との間のシナプスにおける興奮実験方法性シナプス後電位にはほとんど影響しないと考え

実験には新生ラット遊離脊髄を用いた．生後

A

3

l

＿ル＿ト＿八jmv

7万岩石

図7 運動ニューロ∵／の活動電位，入力抵抗に対するロイペプチソの影
響．・ガラス緻小電位を用いて，運動ニューロンの活動電位（A），
および入力抵抗（B，C）を細胞内記録した．1：ロイべプチソ
101g／mJの適用乱 2：適用中．3：薬物除去後の記録．B，Cでは0．4nA約50msecの矩形波過分極性電流を7秒ごとに通電して親胞の入力抵抗を測定した．Bの上は電流，下は膜電位を示す．Cの下線を付した場所でロイべプチン10￣4g／mJ（LP）およびグリシン1．5×10−4g／ml（Gly）を適用した．C：トランジェ
ソトメモリーを用いた記録で，下向きの線の長さがパルス通電による膜電位電化の大きさを意味する．B：Cの1，2，3で示した時点で得られた記録．
−46−

ロイべプチソの薬理学的研究

二＼、＿．」＿．■二

図8 運動ニューロ∵／のシナプス電位に対するロイべプチソの影響・後板を電気刺激（1／6Hz）し，運動ニューロンから興奮性シナプス後電位を記録しながら，ロ
イペプチソ10−4g／m巨をBの下線で示した期間適用した・Aの1：適用前・2：ロイべプチソ適用中．3：は薬物除去後の記録であり，Bの図中に1，2，3
で示した場所で得られたものである．B：トランジェソトメモリーを用いた記録であり，上向きの緑の高さが興懲性シナプス後電位の大きさを示している・

1〜2日のラット脊髄をエーテル麻酔下で摘出し，コーダー上に記録した（図9）．

正中線に沿って半裁した後，0．2mgの液槽中に固結果定した．濯流液（270C）としてほCaを0・1mM

図9に示すように標本をCa O・1mM，Mg2に下げ，Mgを2mMに高めた人工脳脊髄液またmMの人工脳脊髄液で濯流しながらSubstancePはtetrodotoxin（TTX）を加えた人工脳脊髄液を3×10￣7Mを3sec適用すると前祝から運動ニュ

用い，シナプス伝達を抑制した条件下で実験を行

ーロンの脱分極が記録された（図9）．脱分極はアった．濯流速度は5m〃minで行った．ロイペプ

マスタチン（200／川）によって軽度に増大し，アチン，アマスタチソおよびべスタチン等の薬物はマスタチンを除去すると再び小さくなった．図10

それぞれ濯流液に溶かして適用した・SubstanceはSubstance Pによる脱分極の大きさをプロッ

Pは8分ごとに3秒間濯流系に注入することによトしたもので，アマスタチン，ロイペプチン，ベり適用した．substanceP適用による運動ニュー

スタチン各200fLMの適用によってSubstanceP

ロンの脱分極は前根から吸引電極を介してペンレに対する反応は軽度に，かつ可逆的に増大していSP

Amastatin200FLM

図9 幼君ラット脊髄運動ニューロンのSubstanceP（SP）による脱分極に対するア
マスタチソの効果，SP3×10￣Tllを8分間隔で3秒間液槽内に適用し，運動ニューロンの脱分極をL4前板から細胞外記録した．下線の時点でアマスタ
チソを加えた．CaO．1m）I，Mg2m11を含む人工脳脊髄液中での実験・−47−

しないという事実とも符合するものである．

ロイべプチン

5︵AE︶亡〇二月Lqてd占総括2mg／kgをジストロフィー鶏の腹艦内に授与した場合，急性実験の範囲でみる限り，筋収縮力の増強はみられなかった．しかし慢
30

60

90

性投与の効果，あるいはもっと大量にロイペプチ

Time（min）

図10 幼君ラット摘出脊髄の前択（L4）からの細胞外記録．substance Pによる運動ニューロンの脱分極を8分間隔で記録し，アマスタチソ，ロイ
ペプチソ，べスタチソの影響を調べた．実験はCaO・1m叫 Mg2mlIを含む人工脳脊髄液中で行い，Substance P3×10￣㌦【を3秒間濯流槽
内に適用した．

ンを投与した場合に収縮力がどうなるかについては今後さらに検討が必要である．
筋細胞膜，神経細胞膜の膜抵抗，活動電位など
電気的特性に対してロイペプチン 5×10￣5〜10−4
g／mJはほとんど影響をもたなかった．したがってロイペプチンほ細胞膜のイオン透過性には著しる．しかし，おそらくペプチダーゼ抑制物質の影

い作用はないものと思われる．

響と思われるが，SubstancePの反応は徐々に小ロイペプチンの抗ACh作用は交感神経節，あさくなった．一方，TTX（4×10￣8g／mJ）存在下

るいは除神経筋では著しいもので，実験薬理学的でもsubstance Pに対する反応は同じようにアに興味深い所見である．とくに作用が可逆的であ

マスタチン，ロイペプチン，ベスタチンにより増芦こと，神経終末側にはまったく作用せず，純粋強された．

にシナプス後膜側にだけ作用すること】除神経後考察に筋線維上に出現するACh受容体に顕著な抑制

シナプス伝達が遮断された条件下でみられる作用を示すことなどは今後の研究によってはロイ

Substance Pの運動ニューロン脱分極作用は直接ペプチンが薬理学的toolとして役立ちうる可能

作用に基づくものと考えられる．ロイべプチン，性を示している．しかし昨年度に報告したように

アマスタチン，べスタチンによりSubstancePにロイペプチンをsystemiCに投与した場合，血圧よる脱分極が増大したことは，ニューロンの周囲下降作用もなくまた筋弛緩作用も弱いので，上記にsubstance Pの抗ACh作用はロイべプチンの使用上それほどを分解するプロテアーゼが存在しているためと考えられる．しかし増大の程度は問題となるものではないものと推定される．
ロイペプチン，ベスタチン，アマスタチンがむしろ軽度であって，これらの物質に与って抑制されるプロテアーゼがsubstance Pの生理作用

Substance Pのニューロン脱分極作用を増強した（おそらく神経伝達物質としての機能）を終結さことは，組織中のプロテアーゼの存在から考えてせるために役立っているとは考えにくい．この結当然期待される作用である．しかしこの作用は比論は昨年報告したロイペプチンが脊髄反射に影響

較的軽度のものであった．

−48−

脱髄病変に及ぼすロイペプチンの影響

米

沢

猛＊

脱髄疾患の特徴的病変である脱髄病変は，賦活のであり，したがって小脳培養とくに髄鞘に対す化された食細胞による髄鞘貪食がその本質的な変るロイペプチンの影響を明らかにする必要がある．

化である．実験的には，髄鞘抗原（とくにB．P．）

したがって第1の実験として小脳の培養にさいし，によって生ずる実験的アレルギー性脳脊髄炎

種々の濃度（0．1〜100′唱／mO のロイペプチンを（EAE）での脱髄は遅延型アレルギーによる変化

添加して由緒形成への影響およ￣び培養細胞に与えとされ，感作リンパ球ことにTリンパ球により統る病変を検討した．後述するごとく10／唱／mJ以

括化された食細胞による髄鞘の貪食が中心となる．

上の濃度でロイペプチンほ髄鞘形成を抑制し，幼また一方脱髄抗体による脱髄現象はi〃〃わro の君細胞に非特異的中毒性変化を生ずる．したがっ神経組織においてのみみられるものであるが，髄てロイペプチンを培養後5日日より授与し髄鞘形

鞘のセレプロサイドやサル7ァタイドなどのハブ成への影響を調べた．

テン抗原に対応する抗体である．髄鞘に対しこのこれに用いた培養は新生仔マウス小脳から矢状抗体はオブソニン効果をもたらす．すなわちこの

面で10〜12個の切片を作製し，コラジェンを塗抗体にて処理されることにより髄鞘は食細胞の侵布したカバーグラス上に植え付け，Maximow二嚢を受けるわけである．

重カバーグラス法にて培養した．培養法は，

このように抗体にせよ，感作リンパ球にせよ，

Gey塩類溶液9

脱髄はともに食細胞による貪食現象の冗進というEagle MEM

9形をとる．このように貪食にさいし，食細胞での

ウマ血清

9

プロテアーゼ活性の上昇が指摘されている．した50％鶏胚抽出液，・9がって脱髄現象の抑制にはこの酵素の抑制という10％ブドウ糖ことが有効であろうとの考えがなされてきている．

2の組成である．

われわれはこのようなプロテアーゼ阻止剤，ロイ第2の実験として，20日間培養して髄鞘形成

ペプチンの脱髄疾患への抑制作用の検討を試み，の完成した小脳培養に，ロイペプチンを50〜100

以下のごとき実験を行った．

〝g／mJの濃度で添加した培養液を1週間投与し，その後，EAE家兎血清およびヒトの多発性硬化

実

験

方

法

症患者血清を10〜50％の割で培養液に加えて上

本研究は小脳の培養組織に実験的に生ぜしめた述のロイべプチン処置培養および未処置培養に投脱髄病変に対するロイべプチンの影響を調べるも与した．以後3日間にわたり髄鞘変性の有無，そ＊京都府立医科大学病理学教室のパターン等につき検討した．これらの培養組織−49−

の観察は主として光顕による無固定材料について中毒作用が著しい．その所見により幼君細胞に対行った．

するロイべプチンの非特異的な中毒性病変が示唆されや、したがプて培養5日後よりロイペプチン■

・1

実 験」結 果

÷ ・■ 若投与行へ 翰形成率を求めると表2のごと

1）髄請形成に及ぼすロイベプテンの影響

くなり，髄鞘形成の抑制はやや弱められ，また中培養2日後よりロイペプチンを授与した場合，毒性変化も軽度となる．

培養13，16，20日後に髄鞘形成率（髄鞘形成を

2）脱髄病変に及ぼすロイぺプチンの影響きたした培養数／全培養数）を求めると表1のご

髄鞘形成後の培養にロイペプチンを投与すると，とくになる．すなわち，5，10，100〝g／mJあ濃度

10〜50J唱／mJ濃度ではとくに中毒性変化は認めで髄鞘形成の抑制がみられる．そのロイペプチンられない・100／唱／mJ濃度では軽度ではあるが食による病変として培養中の種々の細胞に変性像が細胞に対し中毒性変化を生ずる．しかし神経組織みられる．とくにオリゴデンドログリアに対するそのものに対してはほとんど変化はみられず，神表l Myellnating rate
DIV

13

16

20

Leupeptin
O（COntrOl）

76．5＊

93．0

98．2

（64．4〜83．9）（84．2〜96．5）（92．2〜99．4）

78．6

93．1

（62．2〜88．5）（80．6〜97．2）

8．1＊＊

78．6

90．0

96．7

（62．2〜88．5）（76．9〜95．4）（85．6〜98．8）

0．5

48．2

58．1

64．5

（33．2〜63．9）（43．1〜72．2）（49．4〜75．2）

1．0

0

5．0
（0
ノ

10

100
（90．5〜100）〜11．2）

16．7

29．2（7．9〜32．3）（19．8〜47．1）

〜8．7）

（0

〜8．7）

（0

〜8．7）

（0

〜8．7）

0

．100

6．3

0

0

（0

（2．6〜17．9）
0

0

（0

〜8．7）

Leupeptin was applied from2DIV，＊＊＊Myelinatingrチteinpercent・ノ〃g／mJ．

l

・表2
DIV

Myelinatingrate
13

16

20

Leupeptln
O（COntrOl）

83．9＊

ト

（70．0〜91．5）

6．3

10＊＊
1

−

．▲（2．5〜17．9）

21．9

53．3
（37．5〜68．2）

ニ

（0

〜8．7）

（0

〜8．7）

（0

〜8．7）

（5．6〜28．2）

0

0・

50

（0

〜8．7）

（0

〜8．7）

0
▼

12．5

0

＿

（0・〜．8．7）＿（86．0〜98．9）（12．6〜36．3）

0
20＿

96．8

・96．8

（86．0、98．9）

0
（0

〜8．7）

（0

〜8．7）

0

0

100

Leupeptin was applied from5 DIV，
しヽ
■＊

＊＊

Myelinating

rateinpercent．

〟g／mJ．

−50−

脱髄病変に及ぼすロイペプチソの影響

図2（下）図1と同一視野，EAE血清20％投与後別時間所見・髄掛肖矢はロイ
ペプテンで処理されていない培養での睨髄と強度やパターンの上で異なる
ところはない．

−

51−

経細胞，グリア細胞，髄鞘にも変化がない．

guanidobenzoate（NPGB）で抑制される．既述のこのようにロイベプチンで処理された培養にごとく脱髄病変が食細胞による変化であるならば，

EAE家兎の抗血清を投与した場合，20〜50％の

またこれが中性蛋白酵素の放出に帰因するもので濃度では無処置の培養に与えた場合と同様に投与

あれは，食細胞の賦活化や中性蛋白酵素の抑制剤

後6時間ごろより髄鞘の腫脹，断裂等が始まり，の使用により脱髄病変の阻止が可能であろうとい12時間後には髄鞘の連続性は失われる．24時間

うのがプロテアーゼ阻止剤使用の主要な考え方である．

後には残存する髄輪はほとんどみられない．すな
わちロイペプチン前処置により脱硫病変出現を修飾せしめることはできなかった．このことは
EAE血清の濃度を変えても同様である．

〝〝ひナ0の神経組織は脱髄病変の時間経過の観察を含め，脱髄パターンの研究などに最も適している・しかしわ＝扉われの組織は種々の環境変化に一方MS患者血清についてみると，一般に患きわめて敏感に反応する．したがってロイペプチ

者血清の脱髄能はEAE抗血清に比し必ずしも強ンによる脱髄病変の修飾を検討するには，ロイペ

いものではないが，この実験に使用した症例に関プチンそのものによる小脳培養の変化を調べる必

して50％の濃度で作用させたが24時間後に約要がある・髄鞘形成への影響を検討した結果，前半数の髄鞘の破壊がみられた．ロイべプチン前処

述のごとく培養初期からロイペプチンを授与した

置により脱髄所見に認むべき違いはみられなかった．
このように 乃γわro の神経組織で抗体による場合の中毒性変化はかなり高度であるが，髄鞘形
成後にはその影響は50／瑠／mJの濃度でも軽度で，この濃度が一応の標準投与濃度とみなしうる．

脱髄病変に対し，ロイペプチンの影響を積極的に証明する所見は得られなかった．

f乃∽われの神経組織に抗血清を投与して生ずる脱髄病変は，いわゆる脱硫抗体によって生ずるものであるが，髄鞘のガラクト七レプロサイドない考案

しサルファタイドをハブテン抗原とするものであ

脱髄病巣の周囲でプロテアーゼ活性の上昇する

る・この抗体は補体依存性のものであり，食細胞

ことは，二，三の研究者により報告され，これがによる髄鞘貪食を主徴とする脱髄ではあるが，抗髄鞘破壊の原因であろうという考えが一部の神経体により髄鞘がopsonizationを受け，食細胞に化学者によって報告されてきた．そしてこのことよる貪食を可能ならしめるものである．その点でから実験動物での脱髄疾患の発症にさいし，プロ

食細胞そのものが斌活化されているものではない．

テアーゼの阻止剤を投与することにより発症を防したがってこの抗血清によって食細胞が髄鞘破壊ぎうる可能性が指摘された．このことは直ちに一を行うのは蛋白分解酵素の活性が上昇しているか部の研究者によって試みられているがまだ充分納否か明らかではない・そしてこの種の脱髄が生体得しうる結果は出ていない．

内で生じているかも明らかではない．

この脱髄とプロテアーゼとの関係に関する研究

これに対しざ乃〃ん0およびわ日直か0で共通してでは，髄鞘のB・P・は既活化された食細胞が遊離認められている脱硫現象は，感作されたTリンパする少なくとも2種類の蛋白融解酵素により分解

球によって駅活化した食細胞が髄鞘の層状構造のされる・その1つはプラスミノーケ∵／非依存性の間に侵入し，その層状構造を離間し，一方では胞活性を有L EDTAにて抑制される．他の1つは状の融解をきたす変化である・したがって同じ食プラスミノーゲン依存性の活性を有している．

細胞による貪食ないし髄鞘破壊とはいえ，抗体にこの物質は蛋白酵素の働きを有し，nitrophenyl−

よる場合と感作リンパ球による場合とでは食細胞−52−

脱髄病変に及ぼすロイベプチソの影響の態度には異なったものがあることは考えられる．

現，そのパターン等を検討した．いずれの場合もこのような点から抗体ないし抗血清を用いて検抗血清による脱髄には対照の無処置の場合との間索のほか，EAE感作リンパ球および多発性硬化に違いは兄いだせなかった．

症の末梢リンパ球など遅発性過敏症に関連する細胞による検索が望まれる．

文

献1）Cammer，W．，Bloom，B．R．，Norton，W．T・，and稔

Gordon，S．Degradation of basic proteinin
myelin by neutral proteases secreted by

括脱髄病変に及ぼすロイペプチンの影響を調べる

stimulated macrophages．Proc．NatL．Acad．
gci．ひ．5．，75，1554−1558（1978）2）Smith，M．E．Proteinaseinhibitors and theため，マウス小脳の培養組織を用いてロイペプチ
ンの髄鞘形成への影響を検討した．培養初期より

suppressionof

EAE．ZnThe

Suppressionof

授与した場合10／唱／mJ以上の濃度で髄鞘形成のExperimentalAllergicEncephalomyelitis and抑制および中毒性変化がみられた・ロイペプチン

M．L．Cuzner，pp．211−226，Academic Press，Multiple

Sclerosis，ed．A．N．Davison

and

New York（1979）．

投与開始を遅らせることにより，その抑制や中毒性変化は軽減する．そして髄鞘完成後は50〝g／3）Yonezawa，T．，Bornstein，M．B．，andPeterson，
E．R．Organotypic cultures of nerve tissue

mJの濃度でも髄鞘をはじめとして中毒性変化は

asamodelsystemforneurotoxicitylnVeStlga−tion

みられない．

andscreening．Zn

ClinicalNeurotoxicology，

anded，P．S．Spencer

and H．ILSchaumburg，pp．788−802，Williams＆Wilkins，New York（1980）．
4）米沢 猛．脱髄疾患と脱髄機構（宿題報告）．日
柄会誌，67，31−55（1978）・

髄鞘完成後の培養を50〜100′唱／mJで1週間処理し，その後EAE家兎血清およびMS患者血清を10〜50％の種々の濃度で投与して脱髄像の出−Experimental

53−

筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素の活性変動に対するロイペプチンおよびべスタテン投与の影響

松

研

究

目

下

宏＊

研究協力者 辻繁勝＊

材料 と 方法的

われわれは昨年来すでに発症している筋ジスト

C57BL／6J−dy系マウスの疾病個体および同腹ロフィー症マウスを実験モデルとして使用し，プ正常個体を使用した．1カ月齢未満の個体は当教

ロテアーゼ・インヒビターを投与したときの症状

室で繁殖したもの，1カ月齢以上のマウスは実験進行に与える影響について，主として酵素活性変動物中央研究所より購入したものをそれぞれ使用

動の面から解析を行っている．昨年度は，ロイペした．無処置のマウスでの酵素活性測定には8〜

プチンを1．25mgずつ隔日に投与した場合に疾10週齢の疾病個体および同腹正常個体各10頭が病の進行に強い相関をもついくつかの指標酵素の用いられた．プロテアーゼ・インヒビター投与実

活性が，血清中で低下し骨格筋中で上昇するとい験には疾病マウス各20頭を一実験区とし，10頭う症状改善を示唆する変化が認められることを報ずつを1ケージに入れ，それぞれ投与群と対照群

告した1）．しかしこの場合，同時に，長期間の投（食塩水投与）とした・

与では著しい体重減少を招き，むしろ有害な影響

ロイペプチンおよびべスタチンは0．9％NaCl

があることも認められた．そこで本年度は引き続

溶液にそれぞれ1mg／mJ濃度に溶解して使用しきロイペプチンおよびべスタチンを発病初期の筋た．投与量は0．2mgずつ1日2回背部の皮下にジストロフィーマウスに，より低濃度で連日投与注射した．併用の場合はロイペプチン液およびべした場合，疾病の進行と強い相関を示すいくつか

スタチン液を1：1に混合したもの，また対照群の酵素の活性変化にどのような影響を与えるか，には0．9％NaCl液をそれぞれ0．2mgずつ同様

また臨床症状に回復が認められるか，などについに注射した．

て検討を行った．指標酵素として測定された酵素

2〜8週齢の各実験区マウスに連日注射を行い，はリソゾーム酵素のCa2＋依存性中性プロテアー

2カ月齢，2．5カ月齢および3カ月齢で酵素活性

ゼ（CANP），膜局在酵素である γ−グルタミルト

測定のため断頭採血した．血液は30分間室温静ランスペプチダーゼ（γ一GTP）および，ロイ シ

置後2，000rpm，10分間測定し，分離した血清をン・アミノべプチダーゼ（LAP），細胞質酵素で酵素原品として使用した．後肢の骨格筋および腎あるクレアチンホスフォキナーゼ（CPK），GOT，は断頭後速やかに10倍容の0．32M庶糖液に入れ，GPT，ピルビン酸キナーゼ（PK）の計7酵素で，テフロンホモジェナイザーでホモジェナイズし，

いずれも血清中あるいは骨格筋で特異的な活性変通常のSchneider法に従って可溶性分画とミトコ

動を示す酵素として知られている・

ンドリア分画に分離し，それぞれ標晶として使用
した．ミトコンドリア分画はさらに低張液処理を＊ 和歌山県立医科大学第二生理学教室−

55−

行った後酵素標品として使用した．

る・いずれの酵素も疾病マウスの方が正常対照マ

酵素活性の測定はまずCANPはDaytonらのウスより高い活性を示しているが，とくにPKお方法2）に準じて行い，CPK は Okinaka らの方

よびCPK活性が著しく上昇していることが注目

法3），GOT および GPT は Reitman−Frankel

される・骨格筋中の各酵素の活性値を示したもの

法封，γ−GTPはOrlowski法5），LAPはTuppy

が表2であるが，CANP，GOT，γ−GTPなどの法6），PKはTanakaらの方法7号こそれぞれ準じて活性値が疾病マウスで著しく上昇していることが行った．酵素標品中の蛋白含量はLowry法によ認められた・またCPKおよびPK活性は疾病マって測定した．

ウスにおいて血清中の場合とは逆に正常対照マウスよりも著しく活性低下していることがみられる．
結果

γ−GTP活性は疾病マウスで正常の10倍以上の1）疾病による酵素活性変動

活性値を示しているのが注目される．

表1ほ無処置のC57BL／6J−dy系マウスにつ以上の結果から用いられた酵素が筋ジストロフ

いて血清中の遊出酵素の活性値を示したものであィー症発症に伴っていずれも特異的な活性変化を

表1Activities of various enzymesin sera from normal anddystrophic mice

Enzymes Dystrophic Normal D／NxlOO

CPK

7．41土1．69

5．18土0．79

143．1＊＊

GOT

44．11土2．67

36．57土3．03

120．6＊

GPT

27．04土1．33

22．88土2．28

118．2＊

LAP

2．97土0．62

2．85土0．31

104．2＊＊＊

PK

254．7 土21．8

Units：CPK（mg

50．3

土6．3

506．4＊

Pi／mlserum／30minxlO￣3）；GOT，GPT（plIOXaloacetate orpyruvate／mE serum）；LAP（unit／ml
SerumXlO￣2）；PK（FLmOINAD／mlserum／minxl0−2）．

Allmice usedin the experiment werein8〜10Weeksofage・＊♪＜0．001，＊＊♪＜0．01，＊＊＊N．S．

表2

Activitiesofvariousenzymesinmusclesfromnormalanddyst，。PhicmicJ

Enzymes Localization Dystrophic Normal I）／NxlOO

CANP CytosoI

128．4

土23．9

CPK CytosoI

0．26土0．21

GOT CytosoI

39．4土6．8

Mitochondria
GPT CytosoI
Mitochondria
γ一GTP Mitochondria

35．6土3．9
土1．9

21．5

土3．4

5・58土1・18

土16．2

7．6＊
134．9＊＊

土13．2

74．3＊＊

14．2土2．3
32．8

109．9＊＊＊

土9．5

65．5＊＊

0・44土0・32

1，268．2＊

0．87土0．19

99．3土13．6

178．8＊

29．2土3．7
47．9

15．6

LAP Cytosol l．02土0．10
PK Cytoso1

71．8

3．44土0．34

117．2＊＊＊

152．4土22．3

65．2＊

Units：CANP（40・D・（280n町）／mgprotein／20hr）；CPK（mgPi／mgprotein／
30min）；GOT＆GPT（云MbxaloacetateorpyruVate／mgprotein）；γ−GTP（unit／
mgproteinxlO￣8）；LAP￣（unit／mgproteinxlO．2）；PK（FLmOl／mgprotein／minx

lO「2）・
Allmice usedin the experiment werein8〜10weeksJ）fage．
＊♪＜0．

001，＊＊♪＜0．01，＊＊＊N．S．

−56−

筋ジストロフィーマウスにみられる種々の酵素の活性変動に対するロイペプチソおよびべスタチソ投与の影響示していることが確められたので，つぎにプロテしているのが認められる．また4週間投与群では7−ゼ・インヒビターを投与した場合の疾病転紆■∴CpKが対努の5倍以上に；またLAPが1．6倍する効果についてこれらの酵素の活性変動を指標にそれぞれ活性上昇しているほか，CANP

およとして検討した．

びGOTを除いて全酵素に活性上昇傾向が認めら

2）ロイベプチン投与の酵素活性に対する影響れる．CANP活性の減少は投与期が長いほど率が

表3はロイペプチン投与群での血清遊出酵素

悪くなる傾向を示しているが，べスタテンとの併の活性変動を対照群での活性値との百分率で示し用投与では，CANP

たものである．2カ月齢で測定したマウスのうち間投与よりも大きくなっており，全般的に併用投1週間投与群ではLAPを除いた各酵素がわずか与のが効果が大きくなる傾向が認められる．骨格ながら減少傾向を示しているが，2週間投与群に筋ミトコンドリア分画中の酵素活性に対しては短なるとすべての酵素に活性低下が認められる．と期間の投与ではロイペプチンの効果はあまりみら

くにPK活性が著しく低下していることが注目れず，4週間投与ではじめてγ−GTP活性の著しされる．3カ月齢で測定した群でもPK活性の大い低下，GOT，GPT

幅な低下がみられるが，べスタチンとの併用投与（表5）．また腎中のγ一GTP活性はロイペプチン

では，全酵素に活性低下が認められ，ロイペプチ

投与によって増加の傾向が示された．

活性の減少程度が単独4週の活性上昇が認められたン単独投与よりもやや効果的と思える傾向を示し

3）ぺスタチン投与の酵素活性に対する影響ている．一方骨格筋中の可溶性分画中での活性変つぎにべスタチン投与の実験結果であるが，表化は表4のごとく1週間投与ではやくもCANP

6ほ血清遊出酵素での効果を示したものである．

が約1／4に活性低下し，PKが1．3倍に活性上昇

1週間投与ですでにLAPを除く全酵素に減少傾

表3

Effect ofleupeptin administration on serum enZyme aCtivities
in dystrophic mice

2monthAge

Period lweek

2．5month

2weeks

4weeks（＋best．）

3

month

4weeks

4
2

2

一

4

5
9

0

3
9

4

3
7

9

95．1

8

9

6

7

7
9

1

7

7

9

4

一

5

＊
5

7

9

100．0

9

4

5

1
1

3

4

102．1

8

1

0

9

0

3

100．0

8

4

68．2

＊Leupeptin／salinexlOO．

表4

Effect ofleupeptin administration on muscle enzyme activities
in dystrophic mice

2monthAge

Period lweek
CANP

2．5month

2weeks26．7＊

4weeks（＋best．）

43．4

CPK lOl．8
GOT lO4．0
GPT

96，4

3month4weeks

36．9

70．6

102．6

524．6

107．7

117．2

81．0

112．6

107．9

116．1

LAP−

101．9

104．9

PK

131．2

108．4

＊Leupeptin／salind￣×100．

■−57−

161．5

118．7

￣

157．9

112．7

表5

E仔ect ofleupeptin administration on mitochc．ndrial enzyme
activitiesin dystrophic mice
2

Age

month

Period lweek

2．5

2weeks

m〇nth

3

month

4weeks（＋best．）

4weeksMuscle
GOT

93．5＊

100．8

91．6

124，6

GPT

91．4

95．7

92．7

116．3

γ−GTP

48．4

93．7

35．7

17．5

122．5

107．3

116．1

149．5

Kidneyγ−GTP＊Leupcptin／salinexlOO．

表6

Effect of bestatin administrationonserumenzymeactivities
in dystrophic miee

2monthAge
Periodl week

weeks

4

weeks

6

weeks

month

4

weeks

5

9
9

5

4
8

3

9
8

1

2
4
4
7︐ 9 9

8

5

9
5

3

7
4

4

9
8

9

6
7

1

1
5

4

5
9

7

4

9
9

0
8

6

3

9

8

2
6
0
6
1

1
2

7

2
9

■ 9 5 ・ 9 8 ・ 9 3 ・ 8 3 ・

＊
7

4
9

9

6
6

K T T PP O P A K
C G G IL P

＊Bestatin／salinexlOO．

2

3

向がみられ，とくにCPKおよびPKの活性が大

全般的にはむしろ上昇の傾向を示しているものと幅に低下をみせている．全般的に投与期間が長い考えられる．同様にミトコンドリア分画局在のほど，効果が大きい傾向が認められるが，これは酵素についても，表8

換言すれば，投与開始時期が早いほど効果的であGPTに対して活性上昇，γ−GTPに対して活性低ることを意味し，たとえば2カ月齢で測定した4下の効果が投与期間が長いほど顕著に認められた．

週間投与群と3カ月齢で測定した4週間投与群で腎臓中のγ−GTP活性についてもロイペプチン同は，べスタチンの投与期間は同じであるが投与開様やや増加の傾向が認められた．

のごとく

GOT

および

始時期が2カ月齢の方が1カ月早いことになり，

4）ベスタテン投与による症状回復効果

両群の活性変化を比較すると，いずれの酵素でも以上の結果から，これらプロテアーゼ・インヒ

2カ月齢の方がより効果的に活性低下傾向が現れビター，とくにベスタチンを至適投与量で発症直ていることがわかる．したがって，べスタチンの後の早い時期から連続授与すれば，血清中および効果は投与開始の時期が早いほど大きいものと考

骨格筋中での指標酵素活性に対する回復効果が認えられる．

められること，したがって間接的に症状改善の憤

表7はべスタチン投与による骨格筋可溶性分向があることが明らかになったので，つぎに実際画中の酵素活性の変化を示したものであるが，の臨床症状について回復効果の有無を検討した．

CANPおよびLAP活性は低下し，CPKおよび

表9は2週齢からべスタチン投与を開始した筋PK活性が増加する傾向が投与期間が長くなるほ

ジストロフィーマウスと無処置の同齢筋ジストロ

ど顕著に認められる．またGOTおよびGPT活

フィーマウスの1カ月齢および2カ月齢時の体重性は6週間投与でやや低下の傾向をみせているが，変化を示したものであるが，1カ月齢ですでに投−58−

筋ジストロフィーマウスにみられる種々の酵素の活性変動に対するロイべプチソおよびべスタチソ投与の影響
表7

Effect ofbestatinadministrationonmuscleenzyrneactivities
in dystrophicmice
2monthAge
Periodl week2

CANP lO7．7＊

weeks

4

3month
weeks

6

weeks

4

weeks

35．5

16．6

76．8

156．3

213．8

374．6

113．7

109．2

90．0

109．5

115．4

104．6

86．7

164．3

78．5

80．4

74．4

139．4

122．0

161．6

77．4

CPK

168．3

GOT

132．1

GPT

110．7

LAP

124．4

111．0

PK

120．2

136．8

＊Bestatin／salinexlOO．

表8

Effect of bestatin administration on mitochondrial enzyme
activitiesin dystrophic mice

2monthAge
Periodl week

2

weeks

4

weeks

6

weeks

3

month

4

weeks

MuscleGOT

107．0＊

112．5

116．1

124．4

116．3

GPT

105．6

111．7

114．9

126．2

114．8

γ−GTP

149．6

59．9

37．8

48．9

37．4

112．3

97．3

127．9

138．3

Kidneyγ−GTP

93．1＊Bestatin／SalinexlOO．

表9

Comparison ofbody weight of bestatin treated dystrophic micewith that ofuntreated miceSex Treatment l month

Male

FemaleUntreated

2month

8．5土1．4 ［6．5〜10．0］（10）10．0土1．9 ［6．5〜13．5］（14）Treated ll．5土2．7 ［7．0〜16．0］（20）＊＊

16．5土4．3 ［11．5〜訂．5］（22）＊9．8土1．6 ［7．0〜11．5］（12）14．1土1．5 ［12．5〜16．0］（8）＊13．1土0．9 ［11．5〜14．5］（10）＊19．4土3．8 ［15．5〜訂．5］（12）＊6．8土1．0 ［6．0〜8．0］（10）10．9土0．8 ［10．0〜12．0］（11）Untreated

Treated ll．0土2．3 ［9．0〜18．0］（14）＊13．5土2．5 ［8．5〜20．5］（16）＊＊

9．7土0．6［9．0〜10．5］（8）＊12．8土2．6［11．0〜18．0］（6）＊11．5土1．6 ［8．5〜12．5］（10）16．3土2．5 ［13．5〜20．5］（6）＊＊Brackets show the range of each data．
Parentheses show the numbers of mice used．
Unit：g body weight．

＊♪＜0．001，＊＊♪＜0．01．

与群では雌雄ともに有意な体重増加が認められる．

トロフィーマウスと比較した結果，表9のごとく

この変化は肉眼的にも歴然と認められるが，同時1カ月齢では雄が，2カ月齢では雄がそれぞれ両に体重増加とともにほとんど筋ジストロフィーマ

群で統計的に有意な体重増加が認められ，また1

ウス特有の症状を消失し正常マウスに近い成長をカ月齢の雄，2カ月齢の雌では回復効果の著しい示すマウス群と，症状の改善および体重の増加は群のみで有意の増加が認められた．そこで体重増ある程度みられるが劇的な変化とはいえないマウ加の著しい群について体重増加のみでなく筋力の￣ス群とに二分されていることがわかった．それぞ回復が実際に起っているのか否かを知るために運れの群についての平均体重変化を無処置の筋ジス

動強制負荷テストを行った．600Cのホットプレ−59−

が確められた・すなわち，CANP，γ一GTPおよび
LAPはいずれも疾病マウス骨格筋で活性上昇し，逆にPK，CPKは骨格筋中で活性低下し血清中で著しく活性上昇していることが認められた．
GOT，GPT両酵素は骨格筋中および血清中でと︵u叫∈︶UEコ営萱○ l三〇↑もに活性上昇が認められた．
疾病マウスにロイペプチンまたはべスタチンを連続投与すると，骨格筋中のmNPおよびγ一GTPがいずれも著しく活性低下を示すことが明らかになったが，これは両インヒビターがともに直接これら酵素の活性阻害作用をもっていることを示している．またLAP活性はべスタチン投与でのみ活性低下が認められ，ロイペプチン投与ではむしろ活性増加の傾向がみられたのはロイペプ
チンのLAP酵素に対する阻害作用はあまり強く
1

2

3

4

5

6

7

Time（mjn）

中のγ−GTP活性が両インヒビター投与でともに

図l Test of holding ability on bestatin treatedand non−treated dystrophic mice．N，nOrmal
mice；Bl＿5，treated

4y

ないことを示唆しているものと考えられる．腎臓

mice；Cl＿S，nOn−

treated功／mice．

上昇傾向を示したのは，恐らく直接酵素に対する阻害効果よりも症状全体の改善によって腎臓におけるアミノ酸再吸収践能の回復がより強く現れた−ト上にマウスを置き，円筒状でフタのある金網結果と考えられる．

をその上にかぶせておくと，マウスは足の裏が熱PKおよびCPK活性は両インヒビターの投与いので金網によじ登る．この状態を7分間継続しでともに血清中で著しく低下し，骨格筋中で上昇てホットプレートから足を離し，金網にすがり付を示したが，これは昨年度の結果1）とよく一致す

いていた時間の総和を示したものが図1である．

る．GOT，GPT活性についても，程度は少ない

正常マウスは100％が一度金網に登ると実験時間がPK，CPKとほは頬似の変化を示し，ベスタチ

中は下に落ちることがなかったのに対して，無処ンの方がやや効果が大きかった．これらの結果か

置の筋ジストロフィーマウスは2／3以上の時間ホ

ら，昨年度の報告で示されたマウスの筋ジストロ

ットプレート上に落ちていることがわかる．さらフィー症に対するロイペプチンの作用には直接酵

にべスタチン投与マウスでは明らかに無処置疾病

素活性を阻害する効果とともに膜横能を回復させ

マウスよりも金網よじ登り時間が長く，正常に近る間接効果があるという仮説が確認されると同時い筋力の回復があることが明らかに認められる．

に，ベスタチンにも同様な作用があり，むしろ効果が大きいことを示唆している．さらにこのべス

考

タチンの作用が投与開始の時期が早いほど，かつ察

今回指標として用いられた7酵素は，いずれも投与期間が長いほど大きな効果を示すことから，

マウス筋ジストロフィー症において，症状の進行

逆にいえは，筋ジストロフィーマウスでは一般的に伴って特異的な活性変化を示すことが知られてな膜撥能の低下が発症以前からすでに存在し，こいる酵素であるが，今回の実験結果によってそれの変化が症状の進行に重要な役割を果しているこ−60−

筋ジストロフィーマウスにみられる種々の酵素の活性変動に対するロイベプチソおよびべスタチソ投与の影響と，したがってできるだけ早期にこの変化を抑えてやれば筋ジストロフィー症の症状進行がくい止められる可能性があることを示しているものと思に見られる種々の酵素活性変数に対するロイべ
プチン投与の影響．第15回日本実験動物学会講演要旨集，p．75（1980）．
2）Dayton，W．R．，Reville，W．J．，Goll．D．E・，andStromer，M．H．A Ca＋＋−aCtivated protease

われる．

possiblyinvoIvedin myo丘brillar protein
turnover．Partial characterization of the

総puri丘ed enzyme．Biochemistry，15，2159−

括

2167（1976）．

1）筋ジストロフィー症マウスにロイペプチン
またはべスタチンを連続投与することによってい
くつかの酵素の血清中への遊出を減少させ，骨格筋中の活性を増加させることが認められたが，そ3）Okinaka，S．，Sugita，H．，Momoi，lL，Toyokura，Y．，Watanabe，T．，Ebashi，F．，and Ebashi，S．
Cystein−Stimulated serum creatinkinasein
health and disease．J．Lab．Clin．Mbd．，64，
299−305（1964）．
4）Reitman，S，and Frankel，S．A colorimetricの効果はべスタチンの方が大きく，また投与期間

method for the determinationofserumgluta−

が長いはど著しい傾向が認められた．

mic oxaloacetic and glutamic pyruVic trans−aminase．Am．J．Clin．hthol．，28，56（1957）．

2）筋ジストロフィー症マウス骨格筋で認められるCANP，γ−GTPおよびLAPの活性増加は
ロイべプチンまたはべスタチン投与によって著しく抑制された．

′．βfoJ．C九g桝．，240，338−347（1965）．
6）Tappy，H．，Wiesbauer，U．，Wintersberger，E．
Amino3）発症初期からべスタチンを長期授与することによって著しい症状回復，体重増加などの効果

acid一♪一nitroanilideasasubstrateforamino peptidases and other proteolytic en・zymes．ガ可か5りJgr Z．P如∫OJ．C九g桝．，329，
278−288（1962）．

7）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F・，and Mori−が認められた．

mura，H．Crystallization， Characterizationand metabolic regulation of two types of

文1）辻5）Orlowski，M．and Meister，A．Isolation ofγ−
glutamyltranspeptidase from hog kidney．

繁防，松下

pyruvate kinasesisolated from rat tissues．

献′．βわC九g〝L，62，71−91（1967）．

宏．筋ジストロフィーマウス

−61−

ラット実験的筋萎縮に対するロイペプチンの影響

高 木 昭 夫＊
研究協力者

埜中征哉＊・水沢英洋＊・助川単行＊安部和子＊・小川敬子＊

実験的筋萎縮に対するロイペプチンなどの投与

量はビューレット法で測定した．

non collagenの効果を観察した．使用した筋萎縮モデルでは著

proteinは，筋ホモジェネートを0．1N NaOH

明な筋重量の減少があり，筋蛋白の分解が活発に中でインキュべ−トし，その上活分画を得た．さ

進行しているものと推定される．筋蛋白減少の撥

らに5％TCAにて沈澱を得て，その蛋白を定量序は詳細には理解されていない．しかし部分的にした．

は筋ジストロフィーにおける蛋白減少と同一の撥
序に従うものと仮定している．

結果

1）不動化による鹿用性筋萎縮
方法a）体重：ロイべプチン投与群では，体重は2種の筋萎縮モデルを作製した．第1は不動化432±11g（mean±S．E．M．，n＝5）から377±16による廃用性萎縮（disuse atrophy byimmo−g（乃＝5）へと若干の減少を塁した・非投与群のbilization）である．ラットの一側足関節をキルシ

体重は324±4g（乃＝5）から406±13g（乃＝5）ュナー鋼線を使用して伸展位で固定した1）．固定へと増加を塁した・

後よりロイペプチン40mg／kgを背部に皮下注射b）ヒラメ筋湿重量（表1）：ロイペプチン投した．注射は遇3回，4週間継続した．廃用側お与群において廃用側は健側の54±6％に減少し

よび陸側よりヒラメ筋（SOL）を採取して各種のた．非投与群においては50±2％に減少した・両分析を行った．第2は一側坐骨神経切断後の筋萎者間に有意差は認められなかった・形態学的には

縮を対象とした．この場合は，ロイペプチン 8

廃用例で一様に筋直径の減少が認められる・筋線

mg／kg，ペブスタチン 4mg／kg，5％ dimethyl経の変性や壊死は観察されない・筋ファイバータ

sulfoxide（DMSO）を生理食塩水とともに下腿前イプに関しては，タイプ1線経が減少し，タイプ面に筋注した2）．対照群には5％DMSOを生理

2線経が増加する傾向があった・

食塩水とともに筋注した・これを以下溶剤群と称C）ヒラメ筋の蛋白量（表2，3）：湿重量当りする．注射は遇5回，2週間継続した・健側およの蛋白量はロイペプチン投与の有無にかかわらず，i

び脱神経側より，前脛骨筋，長址伸筋（EDL）お廃用側と健側では同一である・湿重量は廃用側でよびヒラメ筋を採取して検討した．検討した項目は半減しているため，ヒラメ筋全体としては約半は，ラット体重，筋湿重量と筋蛋白量である．一量の蛋白を喪失したことになる・この蛋白の喪失

部の資料では筋の形態学的検討を行った．蛋白はロイべプチンにより影響を受けなかった・単位＊国立武蔵療養所神経センター第一部

湿重量当りのnon−ccllagen proteinは廃用筋で−63−

表1廃用性萎縮筋の重量に対するロイべプチソの影響（萎縮側／健側，％）投与群

54．2土5．6＊％（乃＝5）

非投与群

50．5土1．5 （乃＝5）

小化は進行していた．溶剤群の長址伸筋とヒラメ筋のいずれにおいても，軽度の細胞浸潤が観察された．壊死や浮腫は認められない（図1）．

＊ Mean土S．E．M．両者間に有意差なし．
なお，健側のヒラメ筋湿重量は，投与群では，
仇19g（平均），非投与群では0．16g（平均）であった．

C）筋湿重量（表4）：薬剤投与の脱神経長址
伸筋は健側の177％に増加した．薬剤投与の脱神経ヒラメ筋は健側の96％ とほは不変であった．
溶剤群の脱神経長址伸筋は健側の 62％，脱神経
ヒラメ筋は50％に減少した．薬剤投与により筋表2 ヒラメ筋の蛋白量に対するロイベプチソの影
響（mg prot／wet g）

重量の減少は阻止されたかの印象を与える．しか廃用側

健

し後述の蛋白量や組織学的検討ではそうではない

130土18126土9141土19159土20投与群（5）
非投与群（5）側ことがわかる．
d）前脛骨筋の蛋白量（表4，表5）：薬剤群

廃用側対健側，投与群対比投与群のいずれの間にも有意差はない．
表3ヒラメ筋のnon−COllagen proteinに対するロ
イべプテンの影響（mg prot／wet g）

廃用側健

表4 筋湿重量に対するロイべプチソとべブスタチ
ソの筋内投与の効果（脱神経側／偉側，％）EDL

側

投与群（5）

72土13

139土21＊非投与群（5）72土23

112土8＊キ薬剤群（5） 177土33％
溶剤群（5）
62土4＊ 廃用側では健側より減少した（♪＝0・03）・＊＊ 廃用側対健側には有意差なし．
軽度減少した．この減少に対してもロイペプチン

SOL

96土14％
50土1

EDL：長址伸筋，SOL：ヒラメ筋．EDLの薬剤群対溶剤群は♪＝0．01，SOLの薬剤群対溶剤群は♪＝0．02．
溶剤群のEDL対SOLはP＝0．02．なおEDL健側の重量は，0．12g（平均，溶剤群），0．15g（平均，薬剤群）である．SOL健側の重量は0．12g（平培，
溶剤群），0．15g（平均，薬剤群）であった．

は影響を与えなかった．
表52）神経切断後の筋萎拍

前脛骨筋の蛋白量に対するロイペプチソとべ
ブスタチンの効果（mg prot／wet g）

a） ラット体重：薬剤投与群および溶剤投与

脱神経側群のいずれにおいても，実験の前後を通じて，ラ

健 側

薬剤群（4） 110土6 178土3
溶剤群（4） 152土10 184土7

ット体重の変動はみられなかった．
b）形態学的観察：薬剤投与群では注射部位に出血や筋膜の肥厚混濁が観察された．前脛骨筋，
長址伸筋とヒラメ筋を採取した．薬剤投与群ではいずれの筋も浮腫状で，筋肉の鮮紅色は失われていた．凍結切片の組織学的検討を行った．薬剤群
では筋線維間隙は拡大し，浮腫の存在を推定させ薬剤群の脱神経側対健側は♪＝0．001．溶剤群の脱神経側対健側は♪≒0．05．脱神経側に関して，薬剤群対溶剤群は♪＝0．03．
表6 前歴骨筋のnon−COllagen proteinに対するロイベプチソとべブスタチソの効果（mgprot／wet g）

た．問質には単核球や多形核細胞の浸潤が認めら

脱神経側れた．注射部位に近接する長祉伸筋の変化は強く，薬剤群（4） 124土5
溶剤群（4） 147土15

筋細胞の染色性は低下し，筋核は消失し，壊死線経と推定された．薬剤群のヒラメ筋でも浮腫は著明であった．壊死線経はないが，筋線維直径の細
−64−

健

側

202土12
205土13

薬剤群の脱神経側対健側は♪＝0．001．溶剤群の脱神経側対健側は♪＝0・03．脱神経側に関して薬剤群対溶剤群は有意差なし．

ラット実験的筋萎縮に対するロイぺプチソの影響

T、、−′ ヽい

‥ナ二

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ヽ

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サJ

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ヽ＿＿．＿−−■

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リ誓ト音 貿■⊥−JJ》二￣＿＿＿■二打ヽi▼

図1長址伸筋（a，b，C）とヒラメ筋（d，e，f）の顕微鏡写真（HE染色，140倍），a，d：無処置の健側，b，e：溶剤注射の脱神経側，C，f：薬剤注射の脱神経臥 脱神経後には筋直径の減少と筋核の増加と肥大化がある．溶剤注射では軽度の問質の反応がみられる．薬剤注射では浮腫と細胞浸潤が認められる．注射部位に近いEDLの反応が高度であった．

において健側の178mg／wetgから，脱神経側で考は110mg／wetgに減少した．溶剤群においては

1）実験的筋萎縮

健側188mg／wetg，脱神経側152mg／wetgであ2種の筋萎縮モデル，ななあち不動化による廃った．non−CO11agen proteinは脱神経により健側用性萎縮と神経切断後の筋萎縮を作製した．これの72％に減少した．薬剤投与はこの減少を阻止

らのモデルでは術後2週ないし4遇後には，筋湿することはなかった．

重量は半減する．筋蛋白の定量結果から推定して，

察

この間に多量の蛋白の崩壊が進行することは確実である．廃用性萎縮の場合には，単位湿重量当り−65−

の蛋白量は不変であるが，nOn−COllagen protein

経筋は循環障害をきたしやすくヂ惑染に対する抵は減少する．脱神経筋では蛋白量とnon−COllagen

抗性も低下するといわれている．

protein の両者とも減少した．これらのモデルに

薬剤群の脱神経側長址伸筋の重量は健側のもの

おける筋蛋白喪失の桟序に関する情報はほとんより増加していた．脱神経側ヒラメ筋の重量は対どない．また筋ジストロフィーのさいの蛋白分解

照側とほは同一であった．しかし薬剤により筋萎の枚序との異同に関しても知られていない．しか縮が阻止されたためとは考えられなかった．形態

しそれぞれの場合の蛋白分解のトリガーは何であ

学的には筋直径の減少が認められ，一部に壊死がれ，最終的には蛋白分解酵素の関与するものであ存在する．組織の浮腫が著明である．あるいは単ることは容易に推定される．したがって蛋白分解

位湿重量の蛋白含量が著減しているなどの事実が酵素の阻害剤を生体に投与したときに，筋萎縮のあるからである．

発現がいかなる影響を受けるかを検討するのが本研究の目的である．

筋肉内投与の実験には，薬剤の滅菌や動物組織の抵抗性を再検討する必要があろう．しかしヒト

2）不動化による廃用性萎縮に投与する場合を想定するとき，薬剤を筋肉内へ

ロイペプチン投与群ではラット体重の減少が認

反復注射する方式は現実的ではないであろう．もめられた．しかし今回は対照としての非投与群のし将来この種の薬剤が治療として適用されること実験を同一時期，同一サイズのラットを使用してになれば，有効な別の投与法を検討する必要があ

施行していない．したがってロイペプチンの体重る．

に対する影響の判定は保留した．ロイペプチンの皮下投与によって廃用性萎縮の発現が影響を受け

結論

なからたことは明らかである．ラットにロイべプ

ラットに実験的筋萎縮を作製し，ロイべプチン

チンを皮下注射したさいの薬剤の体内分布に関すの効果を検討した．一側足関節不動化による廃用

るデータはまだないようである．マウスの場合に性萎縮に対してロイペプチン（40mg／kg）を背部は皮下注射により血中濃度の上昇は充分に認めらに皮下注射した．ロイペプチンは筋萎縮の発現にれる．ただ骨格筋内で薬剤が有効濃度に到達しう

影響を及ぼすことはなかった．

るかどうかが問題となろう．したがって薬剤を筋肉に直接投与する方式を検討する必要があった2）．
3）脱神経による筋萎縮

坐骨神経切断後の筋萎縮に対して，ロイペプチ
ン，ペブスタチンおよびジメチルスルフォキサイ

ドの筋注の効果を観察した．しかし薬剤注射群にDMSOを萎縮は著明な筋炎が併発したため，その効果の半睡は筋に直接注射した．ペブスタチンは難溶性であるできなかった．ロイペプチンなどの投与法に関しため，懸濁液を筋注することになった．薬剤は懸ても若干の考察を行った．

ロイペプチン，ペブスタテンと濁液であるためミリポアフィルターを通す滅菌処理は行わなかった．薬剤群では注射部に浮腫や著明な細胞浸潤が発生した．一部には筋壊死が観察された．注射部より離れたヒラメ筋にも浮腫が発生していた．溶剤のみの投与群では，軽度の細胞浸潤が観察された．健側への薬剤の筋注は今回は行われなかった．したがって著明な組織反応は脱神経筋のためか否かほ不明である．一般には脱神
−66−

文

献

1）助川卓行，米本恭三，高木昭夫，重中征哉．実験
的廃用性萎縮筋の病態生理（抄録）．臨床神経学，
20，1099（1980）．
2）Stracher，AりMcGowan，E．B．，Hedrych，A．，and

Shafiq，S．A．In vivo effect of proteaseinhi−
bitorsin denervation atrophy．且申．Neurol．，
66，611−618（1979）．

ロイペプチンの筋崩壊阻止作用に関する組織学的研究埜 中 征 哉＊
研究協力者

石浦章一＊・高木昭夫＊

進行性筋ジストロフィーの骨格筋の主な病理学

週1回の体重測定とフリップテストを行い，全的変化は，筋線椎の変性・壊死である・なぜ筋線

身状態を観察した．フリップテストは羽を広げす

経が壊死に陥り，その数を減ずるか原因は不明で

ばやく仰臥位とし，10秒間以内に立ち直りがである．原因は不明であるが，筋が崩壊するとき何きたものに20点を与え，つぎに15秒間安静にらかの蛋白分解酵素が関与する可能性が示唆されし，再び10秒間のテストを試みた．このようにていて，その蛋白分解酵素の活性阻害剤であるロ

して連続5回テストを行い，可能回数×20をフ

イペプチンが筋崩壊を阻止するのではないかといリップテストの得点とした．この得点の各群でのう期待がもたれている．そこでわれわれは崩ジス

平均値を経時的に算出しグラフにした・

トロフィー鶏（筋ジスチキンと略す）を用いての

醇化後4カ月目に全例より静脈麻酔下に浅胸筋

実験と，Ca2＋イオノフォア（A23187）を用いて（右鎖骨下，胸骨近端で外表筋膜直下）の一部をの実験を行い，ロイペプチンの筋崩壊阻止に関すとり出し，筋組織標本を作成した．筋組織は液体る効果をみた．

窒素で冷却したイソペンタン内で凍結，10／J切片を作成し，hematoxylinandeosin（HE），mOdifi−

対象と方法

ed Gomoritrichrome，menadione−linkedα−gly−1）筋ジストロフィー鶏に対するロイベプチンの効果

cerophosphatedehydrogenase（MAG），NADH−
TR，aCid phosphatase，PAS，OilredO，aCetyl−

対象としたのは筋ジスチキン（line413）とその正常対照（line412）である・筋ジスチキンは雌雄

cholinesterase，nOnSpeCi丘cesterase，phosphory・

lase，Ca染色（GBHA）を行った・

でその症状の程度が異なるので今回は雄鶏43羽

筋線維径の比較のため，筋ジスチキンの無処置を選んだ．正常対照は2群に分け，1群6羽は無群より6羽，10mg／kg投与群より6羽，50mg／

処置，他群10羽には醇化後10日日よりロイペkg投与群より7羽を選びHE染色標本の最終倍

プチン50mg／kgを週6回腹腔内投与した・ロイ

率250倍の写真を作成した・さらに各個体よりペプチンは滅菌蒸留水にて溶解し，投与量が0・2300本の筋線経の直径を計測し，各群での平均を〜0．5mgとなるようにした．筋ジスチキンは3群出し，筋線維径の分布を比較検討した・に分け，第1群12羽は無処置，第2群6羽にロ貪食細胞をもつ壊死線経は酸ホスファターゼ染

イペプチン10mg／kg，第3群9羽にはロイペプ

色で明瞭に染出されるので，本染色陽性の線経を

チン50mg／kgをやはり週6回腹腔内投与した・

各標本より数え，100mm2当りの本数に換算し，＊ 国立武蔵療養所神経センター

各群での比較検討を行った・
ー67−2）カルシウムイオノフォア（A23187）によ表l Body weight at4months after hatching（male chicken）

る実験的ミオパチ一に対するロイぺプチン

Ⅳの効果
A23187はCaイオンを細胞内にとり入れる

ControIs（transport）作用を有する抗生物質である．ヒト
筋ジストロフィーでは後述するように，筋細胞の膜の欠損部より

Caイオンが細胞内に流入し，Ca

Mean土S．D．（g）

Untreated

6

2，653土241

Treated（50mg／kg／day）

10

2，785土206（ms．）

122，379土249

Dystrophics
Untreated

イオンによって活性化される蛋白分解酵素の活性

Treated（10mg／kg／day）

9 2，416土166（n．S．）（50mg／kg／day）

6 2，416土202（n．S．）

化が起り，構造蛋白の崩壊をきたすと考えられている．A23187により試験管内に生じた筋線経の崩壊はヒト筋ジストロフィーの病理像に似ていて，
Z線から始まる筋の崩壊像が得られる．
成熟ラットから自筋である長址伸筋（EDL）と赤筋であるヒラメ筋をとり出し，Ca2十 を除いた

Krebs−Ringer−bicarbonate液にA23187を0．25FLgを加えたもの，A23187にCa2＋1mMを加えたもの，A23187にCa2＋1mhlとロイペプチ
ン100／唱／mJを加えたものの3液で37cc5時間
インキュべ−トし，外液に溶出する α−アクチニン，CPKと筋由来の蛋白質の遊離をみた．以上

3液中でインキュべ−トした後の筋はカコジレー
ト酸ナトリウム緩衝2．5％グルタルアルデヒド

液にて2時間固定，さらに1％Os04で2時間後固定し，アルコール脱水後エポキシ樹脂に包埋し電子顕微鏡的検索に供した．

図1筋ジスチキン無処置群，ロイペプチン10mg／
kg／日投与群，50mg／kg／日投与群におけるフリップテストの経時的変化．●10mg；△untreatd；
050mg．

めにロイペプチンの投与の有無にかかわらずかな
りのばらつきがあるが，醇化後1カ月ごろより次第に不能となり始めた．16週目には全例不能となった．ロイぺプチンを投与したための効果はまったく認められなかった．
C）組織学的，組織化学的検討：HE染色で結

果

みると正常対照群ではロイペプチン投与群，非投1）筋ジストロフィー采引こ対するロイぺプテンの効果

与群問に何ら差はなかった．筋ジスチキンでも，筋線経の大小不同，脂肪織の増加，結合織の増加，

a）体重の変化（表1）：対照（line412）と筋などの変化は10mg／kg，50mg／kg，無投与の3ジスチキン（1ine413）では前者の方がやや重か群間に差は認められなかった．組織化学的にもった．体重の増加は各群で差はなく，ロイペプチ

NADH−TR，PAS，OilredO，エステラーゼ染色

ンの投与量と関係はなく，ロイべプチンによる全で各群間に差はなかった．

身への影響はみられなかった．注射による局所的d）筋線維径による検討（表2）：醇化後4カ

な皮下出血がときにみられる以外，諸臓器には肉月時の各個体より 300本の筋線経を無差別に抽眼的に何ら異常なかった．

出し，その直径を測り平均値をみたのが表2であb）フリップテスト（図1）：フリップテスト

る・筋ジストロフィーでは筋線経の大小不同があによる立ち直り試験では個体間に差が著しく，たるため偏差値は大きい．ロイペプチンを使用した−68−

ロイペプチソの筋崩壊阻止作用に関する組織学的研究
表2

Fiber diameter of dystrophic PS muscles at4months
gズ

0γ0

N Meandiameter（P）土S．D．
Untreated dystrophics

60．16土29．47

6＊

Treated dystrophics
Leupeptin（10mg／kg／day）（50mg／kg／day）

6＊

58．56土29・48（n・S・）

7＊

56．59土30．13（n．S・）＊300muscle負bers measuredin each chicken．

表3Incidence of necroticfibers with phagocytosisin PS muscles
Total

N necr。tic
fibers…J聖L2、N。／100mm2
area（mm2）664

Leupeptin（10mg／kg／day）

6

70

146．9

47．65（n．S．）（50mg／kg／day）

7

69

148．5

46．40（n．S．）

Untreated dystrophics

148．2

43．24

Treated dystrophics

を

忘憂等㌫㌍
葺控二婆

をへ

言責主宣竃
〉

2 密壷磯藍垂れ澄盛…
図2

Ca2十を含まないKrebs−Ringer−bicarbonate掛こA23187のみ加え3−7
OC 5時間インキュべ−トしたラ ット長址伸筋．筋の構造はよく保たれている．

群でもその平均値，偏差値とも無治療群と比較し治療群，治療群とも差は認めなかった．

意の差はなく，ロイペプチンによる節線経の変性

e）壊死線維数による効果判定（表3）：筋ジ40本強であり，統計的に有壊死の抑制効果はみられなかった．
2）A23187による実験的ミオパチ一に対するストロフィーにおいて蛋白分解酵素が筋崩壊に何

ロイぺプテンの効果

らかの役割を果すとし，さらにロイペプチンがそラット自筋のの活性を抑えるとするならば壊死線経の数は理論

EDL，赤筋のヒラメ筋いずれの的に減少してよいはずである，そこで壊死線経の筋もA23187のみの液では5時間インキュベー

数を酸ホス7ァターゼ染色の標本より算出したのトした後も電顛的にもmyo丘brilはよく保たれてが表3である．100mm2当りの壊死線経の数は未

いてZ線は健在であった（図2）このとき細胞の−69−

基底膜はよく保たれているのに形質膜はその連続もZ線はよく保たれている傾向にあった．しかし性が失われ断裂していた．A23187とともにカル

完全にZ線の消失が防がれているわけでなく図5

シウム1mMを加えるとZ線は消化され消失し，のように一部Z帯の断裂をみるところもあった．

サルコメアの断裂がみられた（図3）．このときM

電子廟教鏡による検索はあくまでも局所的なもの

帯，ミオフィラメントはよく保たれていてZ帯のをみており，ロイペプチンがどれほど筋の崩壊を

選択的消失が示された．A23187，Ca2十とともに阻止しているか定量的にみることはできない．

ロイペプチン100JJg／mJを加えるとヒラメ筋（図表4ほインキュべ−トしたときのmedium中4），EDL（図5）とも形質膜が欠損している部でに遊離した蛋白とCPKの量をロイべプチンの有㌘讐㌢琴戦野肇藁琵

○帯G

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異議三一 芋㌦十七． 妻夢苛ヌ
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3＿ ＿一、ヒゞ；つ湖i「二二二＞二，㌧⊥」と∴と

図3∵：1汀か■Ⅵ一

i
．
墨
・
︑
√

図2と同じ溶液にCa2＋1mふI加えるとZ線の選択的消失，サルコメアの断裂がみられる．

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図4

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A23187，Ca2＋lmht液にさらにロイペプチン100／Jg／mJを加えると形質膜が消失しているところ（天頭印）でもZ接はよく保たれている．ヒラ
メ筋．
−70−

ロイペプチソの筋崩壊阻止作用に関する組織学的研究

図5 ロイペプチソはZ線の崩壊の完全な阻止とまではいかず，場所によっては天頚印のようにZ韓が断裂しているところもある．長杜仲賃軌
表4

Effects ofleupeptin ofprotein andCPKreleaseinthe
presenceofCa2÷and

A23187

Muscle Additions（％￡r慧wt．）（票も

7

4
4

7

％

4
4

4

27 −17．2％

％

1
1

2

2

Leupeptin

0
＋

5

2

4
7

None

6

1
1

1

74 −9．8％

Leupeptln
EDL

2
一

l

3
9

Soleus None

After5hr，at37OC．
無により比較検討したものである．これからはロ〃加実験と，A23187を使用しての吉光γか0実

イペプチンほヒラメ筋からの蛋白の遊離を9．8％，

験を行った．玩乃通用実験では前回の皮下注のとEDLで17．2％

き1】と同じく，今回の腹腔内投与でも何らの効果とかなり抑えていることが明らかとなった．筋肉黎酵素のCPKはロイペプテン

も兄いだせなかった．その原因としてつぎのことの有無にかかわらずほぼ同じ量漏出しているのでが挙げられる．

ロイペプチンほ筋蛋白の崩壊をかなり抑えている

まず第1に考えられるのはロイペプチンを皮下と思われた．インキュベートしたmediumをや腹腔内などに投与しても，筋ジスチキンの骨格

SDS gel電気泳動でみたのが図6である・Z帯に筋線稚内へ到達しないのではないかということで存在するα−7クチニンの漏出はEDLでかなりある．50mg／kg／日のような大量投与でも何らの抑えられており，またヒラメ筋でも抑えられてい効果のみならず副作用もないということは筋へのることが明らかであった．

到達が十分でないという可能性を大いに残している．この可能性を肯定するのは筋肉内に直接注射

考してその効果をみる以外はない．筋内に直接注入

察

ロイペプチンが筋ジストロフィーの病変をどしてよい効果をみたという Stracher ら2）の結果

こまで抑えるか，筋ジスチキンを使用してのざ乃を重視し，われわれも現在筋内投与による効果を

−71−

S計三二

⊥﹁二；

4■﹁11

3㌧ニ

2ニニー一

二二二轡

＝

∴

鳥類という大きな種的差も考えると，筋ジスチキンはヒト筋ジストロフィーのモデル動物としてまだ多くの問題が残されている．
第3にはロイペプチンがCANPなどプロテアーゼの活性を確実に抑制したとしても，果してこれらの酵素が筋の崩壊にどれだけ関与しているか∴ということである．これらの酵素がヒトでも筋ジスチキンでも筋の崩壊に大した役割を果していな
いとするなら，すなわち別の横序で筋の崩壊がくるとするなら，CANPなどの活性を抑制したところで病理上も臨床上も何ら改善をみないのは当
図6 長址伸筋（1，2），ヒラメ筋（3，4）をA23187とCa2十でインキュべ−トしたとき（1，3）とそれにロイペプチソを加えたとき（2，4）のin−
Cubation mediumのSDSgel電気泳動臥 α−アクチニソ（矢印）以外の構造蛋白には各筋で差がないのに，αrアクチニソのみ筋からmediumへの遊離がロイペプチンで抑えられていることがわかる・長牡伸筋（E），ヒラメ筋（S）の電気泳動を比較のため示している．
検討中である．

然である・CANI千が筋ジストロフィーの筋の崩壊に大きく関与している可能性はあっても決定的事実はない．
筋ジスチキンに問題はあっても，ヒトに近いよいモデル動物がないので筋ジスチキンを使用したが，今回もあまりよい結果は得られなかった．そこでわれわれはわ＝最わ加の実験を行い，ロイペプチ
ンがどれだけ筋の崩壊を阻止するか確めた．Ca2＋

第2に考えられるのは，筋ジスチキンでは病理

イオノフォア（A23187）は抗生物質でCa2十を細像がヒトと大きく異なり，病因的に同一とみなし胞内にとり入れる（tranport）働きを有するといてよいかどうかということである．ヒトでは筋形

われる・Ca2＋とA23187の入った液で筋をイン質膜の欠損があり，そこからCa2＋の細胞内へのキュべ−トするとZ線が消失するのはCa2十が大流入が起り，高濃度のCa2＋下でカルシウム依

量に細胞内に入り

CANPを活性化させるためで

在性蛋白分解酵素，たとえばCalciumactivated

あろう・わZか加ではCa2十が細胞内に入ると過収

neutralprotease（CANP）のような酵素が活性化縮をきたし（opaque丘ber），それからZ線の消失

されをみるが，わ川ffroでは筋線経は収縮はしている

Z線より始まる筋構造蛋白の崩壊をみるというのが近年最も広く信じられている仮説である．

がわZひね昭のときほど強くない．

事実ヒト筋ジストロフィーでは組織化学的にCa2＋

しかしA23187とCa2十でインキュベートしたが大量に細胞内に存在することが確められている．

あとの筋の病理像は，ヒト筋ジストロフィーのそ

しかし筋ジスチキンではCa2十染色陽性線経はほれときわめてよく似ていることは事実である．ことんどなく，また形質険の欠損も兄いだされていの実験過程でロイペプチンをmediumの中に加ない3）・筋ジスチキンでは多数の空胞を細胞内にえると筋の崩壊はある程度抑えられることがわかみるのがヒトと違う特徴で，形質膜の欠損より，った・完全にまで抑制しないのはロイペプチンのこの空砲が筋の変性に何らかの意味をもつと考え濃度など種々の要因があり，今後逐次解決せねばられている・筋の変性にCANPのような蛋白分ならないだろう．

解酵素が何らかの働きをしている可能性はあって

A23187を使用しての実験からいえることは，もそれを裏づける有力な根拠はない．晴乳動物と少なくとも筋の崩壊にはCANPが何らかの関与−72−

ロイべプチソの筋崩壊阻止作用に関する組織学的研究をしているであろうということであり，ロイべプ
チンがその活性をある程度抑えうるということである．今後，A23187でf乃む滋，0中にミオパチーの状態を作り，ロイペプチンの作用をみる予定でソの作用，−臨床的，病理学的検討−．微生
物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究，昭和54年度報告書，pp・55−59（1980）．
2）Stracher，S．，McGowan，E．B．，andSha丘q，S・A・
Muscular dystrophy；inhibition of degenera・
tioninvivowithproteaseinhibitors．Science，ある．

200，50−51（1978）．

文献1）埜中征故，高木昭夫，石浦章一，村上博彦，杉田秀夫．筋ジストロフィー鶏に対するロイべプチ−73−3）埜中征鼓，春原経彦，杉田秀夫，石浦章一．筋ジストロフィー鶏骨格筋の組織学的，組織化学的研
究．神経内科，11，259−269（1979）．

筋ジストロフィー症鶏の生産・供給

野 村 達 次＊研究協力者

梅沢英彦＊＊・斎藤宗雄＊

前年度に引き続き，財団法人日本生物科学研究

結果判明したことを以下に述べる．

所（日生研）に委託し，筋ジストロフィー症鶏1）NH−412系の雄の射精能力は，若い雄ではNH−413系の雄5，雌10計15羽，およびそのNH−413系の雄と同様に良好であるが，加齢に伴対照として正常鶏NH−412系の雄5，雌7計12い筋ジストロフィー症鶏の NH−413系に比較し羽を，それぞれ生産用コロニーとして維持し種卵て著しく低下する．
2）痛風の発症個体はの生産を実施している．本年度は約2，000個の種

NH−412系の雄に多発卯を生産した．前年度に比較し種卵の生産数が低する．また，雌では休産中に発症するものがほと下したが，この要因は生産コロニーの更新についんどで，産卵中に発症するものはないようであて全羽数を一度に行わず，一部の種鶏についてのる．ひとたび痛風を発症した個体は，射精能力，み行ったため，老齢鶏が残存していたことによる産卵能力ともに著しく低下し，回復するものはみものであった．今後は，定期的に一部分ずつの鶏られない．

を更新し，1年間ごとにすべてのコロニーを更新

3）雌の産卵能力は，NH−412，NH−413両系する方法を行う予定である．このため，現在は種ともに産卵開始から1年を経過すると急激に低下

卯の生産数が低下しているが，次年度から順次増する．
以上の結果から，今後は生産コロニーの定期的加するものと予想される．
NH−412およびNH−413＊（財）実験動物中央研究所＊＊（財）日本生物科学研究所

系を長期間飼育した更新を予定し，種卵の生産・供給の増加を図る計
画である．

−75−

DuchenneMuscularDystrophy息児へのロイペプチン

1回投与とその成績について

三吉野産治＊
研究協力者名中村宏志＊・三池輝久＊・小堀良治ヰ

今回われわれは，小児Duchennemuscular

数およびその分塀，出血凝固時間，プロトロンビ

dystrophy（DMD）におけるロイペプチン1回投ン時間についてチェックした．その他臨床的観察

与時のロイペプチン血中濃度の推移およびそのととして，皮膚症状，消化器症状，精神神経症など

きのCPK，血中ミオグロビン，出血凝固時間，プの一般状態と，体温，脈拍，血圧のチェックを行

ロトロンビン時間，一般検血ならびに全身状態のった．

臨床的観察を行ったので報告する．ただし，ロイ
ペプチン血中濃度，CPKについては，この報告結果および考案

時までにデータが揃っておらず割愛する．

表2にロイペプチン投与前および投与1日後の一般検血，出血凝固時間，プロトロンビン時間の日的および方法

結果を示す．ロイペプチンの出血凝固系への影響

目的は，ロイペプチン1回投与時における血は，血液凝固第9因子を抑制するとされており，

中濃度の時間的推移，およびその副作用等をチェ

内因系凝固時間をチェックすべきであったが，今ックすることにした．

回は外因性凝固時間のプロトロンビン時間しか検方法は，表1に示すように4〜6歳までの歩行査しなかった．

可能なDMD

児7人と最下段に示す診断がまだ一般検血にてほ，赤血球数，白血球数には変化をついていないミオパチーの息児を対象として選ん認めず白血球分類にてもとくに異常を認めなかっだ．ロイペプチンの投与量は，大人1回100mg

た．血小板数に関しては1例を除いて減少していの投与を規準にして，患児の体重に相当する年齢ない．この結果を有意なものとしてよいかどうかを，1970年厚生省調査乳幼児身体発育値より求は，検査が1日後に行われたものであり，断定はめ，Augsbergerの式〔小児薬用量＝成人量×（4できない．出血時間，凝固時間では幾分延長傾向

×年齢＋20）／100〕より薬用量を計算し授与した．

がみられる．しかし，この検査の時点では投与後投与時間は午前中の空腹時に行い，昼食の摂取は24時間を経過し，ロイペプチン血中濃度は低下

許可し，また運動制限もとくに行わなかった．

していると考えられ，ロイペプチンの影響による

ロイペプチン血中濃度の推移をみるために，投とは考え難く，他の要因によるものと考えられる．L

与前，投与後30，60，240分の採血を行い，同時

プロトロンビン時間については，8例ともに延に血中ミオグロビン，CPK の推移をみた．また

長傾向はみられず正常範囲にあった．動物実験で投与前，投与後1日目における赤血球数，白血球は，プロトロンビン時間の延長もみられるとされ＊国立療養所西別府病院

るが，今回の投与量ではまず影響はみられないと
−77−

チ

ロン

3 6 4 44430243 2 4 4 公

2
1

Y・N・ 6男 14 慧霊怒。athy

3
5
7
．
4
4
．
1
8
1
1
0

DMD
DMD
I）MD
DMD
DMD
DMD
DMD

0
2

728
600
1，093
655
646
638
645

断

5
1

6 男
5 男
6 男
4 男
4 男
4 男
6 男

診

重か

CPK

可可可可可可可珂

T．Ⅰ．
K．Y．
Y．T．
M．A．
M．T．
T．S．
M．0．

（歳）・性別体拉

年 齢′ごま＿慧ロl−

行
歩

症 例

象

憲

表1対

表2 ロイべプチソ投与前，後における検血，出血凝固系の変化

RBC（万）

蒜トロンビン

6

0
3
7
0 0
3 3
8
5

8

0
3

4

0
3

0 0
3 3
5
4

6

0
1

5

一
4

8

8

0
3
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0
1
1 1

7

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3

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5

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1
1
2
1
1
1

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3
2

8

1
1

7

1

7

l
1

0
3
5

3
1

9

l
1

5

1

5

8

後
l
1

4

4
1

8
1

2

2

9

1

4

1

0

1
0
0
1 1 1

5

5
1

7
1

7

0
1

7

3

2

1
1

8
1

9
1

8

2

0
3
5

3

3

3

9

7

8
1

0
3

5

2

8

2

5

2

3

9
4

9

8

0
2

4
2

6

9

5

一

6
4

前

8

4

3

4
4

一

後
9

1
2

5
2

3
1

6

5

7

0
3
7

4

5

6

1

1
4

9
4

8

1
3

9

9

5

5

5

6

3
1

7

7
4

0
4

後
0
3

0
1

0
1

8

7
4

3

4

4

9
4

7
4

1

Y．N．

6

9

8
4

5

8

7
4

8
4

6

M．A．

前

4
4

T．S．
M．T．

後

凝固時間

7

M．0．

前

前

9
4

T．Ⅰ．

後

出血時間

前

5

K．Y．

血小板（万）

後

0
5

Y．T．

WBC（千）

前思われる．
（ng／ml）

図1は，ロイペプチン投与後における血中ミオ
グロビンの経時的変化をみたものである．CPKは，検体の都合上末測定である．8例のうち4例にミオグロビンの減少傾向がみられる．CPKに関しては，ロイペプチンにより減少がみられるという報告もあるが，ミオグロビンについてはまだ報告がないようであり，今回の結果が有意なものであるか，血中ミオグロビンに影響を与える種々の要因を考慮する必要があり，今後の検討を要する．
これまでに述べた表2，図1に関しては，最初の1回投与の結果であり，このデータだけからではロイペプチンの筋肉に及ぼす影響，および血液3060240（min）

凝固系に対する影響についてはあくまでも参考に

図1ロイべプチソ投与後の血中ミオグロビンの変化

しかならない．

のはか，発疹などの皮膚症状，下痢，嘔吐などの

表3は，ロイペプチン投与後における全身状態

消化器症状，精神神経症状などにほ異常を認めなの変化を体温，脈拍，血圧についてみたものであかった．肝機能については，今回はチェックしてるが，とくに大きい変化は認めなかった．またそ

いない．

−78−

Duchenne Muscular Dystrophy患児へのロイべプチソ1回投与とその成績について
表3 体温，脈拍，血圧の変化
体

温
（OC）

与薬前 240分後

血圧（mmHg）

与薬前 240分後

与薬前 90分後

6
9

6
9

6

2

0
9

4
1
1

3

6

8

3

6
3

6

2

6
9

6

3

0

3

6
3

4
8

K．Y．

6
3

Y．T．

脈
拍
（／min）

2
0
1

7

3

0

一

6
9

3

1
6

6
3

2

8
2
4
1
0
1
1
1
1

8

6

6
3

3

4

2

6
3

3

2
6

3

9
5

Y．N．

2

M．A．

6
3

M．T．

2

T．S．

6
3

M．0．

6
4
9
1
2
1
0
1
1
0
1
1 1
1
1

T．Ⅰ．

90／60

124／44

116／60114／56

104／40100／60（−）

102／70（−）

102／68

（−）

90／62

（−）

104／55

108／74

102／50（−）測定せず．
以上，今回われわれが行ったロイペプチン1回

れば各時間おきについて検討していきたいが，種投与におけるいくつかの結果について報告した．

種の問題があり，少なくとも投与前と血中濃度ピ

しかし，ロイペプチンの血中濃度およびCPKのーク時における時点で検査を施行したい．また同

値がまだわかっておらず，血中濃度の関係と各デ時に内因系凝固時間を示すAPTT

ータについて検討することができないのほ残念でと考えている．そのほか肝機能，筋肉内酵素のいある．とくに血中ミオグロビン値とCPKに対す

くつかについても検討していかねばならないと思るロイペプチンの関連性については，今回の投与

うが，まだ幼児であり，患児に与える苦痛また採においてわれわれが一番注目していた点であるが，血量などを考えると不可能ではないかと思える．

も検査したい

次回横会があればこの結果について報告したい．

今後，ロイペプチンのみでなく，Phase3 まで

また，出血凝固時間，プロトロンビン時間，およ

いっているべスタチンについてもできれば検討しび一般検血については1日後の時点でみているたていきたいと考えている．

め，ロイペプチン血中濃度との相関についてはっ

以上，まだ充分な検査結果がそろっていないが，きりしたことがいえない．次回もう一度ロイべプ

今回行ったロイペプチン1回投与における臨床的

チン1回投与を行う計画であり，そのときはでき観察について報告した．

−79−

ロイペプチンの種々筋萎縮性疾患に対する経口投与の効果−Ⅰ．100mg1回投与について−村 上 慶 郎＊研究協力者 岡 崎 隆＊・林 英人＊

蛋白分解酵素阻害物質としてのロイペプチンは，尿糖，尿ウロビリノーゲン，尿赤血球，尿白血球，

進行性筋ジストロフィー症のモデル動物に対して上皮について測定した．筋力はの効果が認められている．

testingによった．自他覚的副作用についても検今回われわれは，臨床実験の第一歩として，種manual muscle

討した．

種の筋萎縮性疾患にロイペプチンを1回授与して，血祭中のロイペプチンの濃度を測定すると同時に，成績および考案

種々の臨床検査を投与前および後に測定し，かつ成賃は表1のごとくで，一般血液検査に異常な副作用の有無を検討した．

く，プロトロンビン時間も著明な変化はみられなかった．血清総蛋白も正常範囲内にあり，肝機能対象および方法

検査では，GOT，GPT，LDH，7ルカリホスフ

対照はIimb−girdle dystrophy，Duchenneァターゼなどに異常を認めず，尿素窒素，コレス

dystrophy，myOtOnic dystrophy，pOlymiositis，

テロールも正常範囲内であった．γ−GTP は正常

おのおの1例ずつ SCapulo−perOneal type mu−

範囲内で多少の変動がみられた．CPKはlimb−

SCular atrophyおよびCharcot−Marie−Tooth病

girdle dystrophy，duchenne dystrophyおよびのおのおの1例で計7例である．年齢は15歳か

scapulo peronealatrophyの各1例に減少を示し

ら56歳までで，男性5例，女性2例である．

ており，POlymyositisの1例では道にやや増加を

ロイペプチンほ100mgの1回経口投与法で投示していた．

与前および24時間後に種々の臨床検査を行った．

これらの結果は，症例が少なく，24時間というまた，血祭ロイペプチンについては投与30分，

短時間のため，にわかに結論づけることは困難で

1時間，3時間後に行った．

ある．筋力テストでは特別な変化はみられなかっ詔検査は，赤血球数，白血球数，血色素量，ヘた．

マトクリット，プロトロンビン時間，総蛋白量，検尿については著変は認められず，また，認む

GOT，GPT，LDH，アルカリホスフォターゼ，べき副作用は現れなかった．

γ−GTP，BUN，CPK，コレステロール，尿蛋白，＊国立療養所箱根病院

血簗ロイペプチンについては，目下検討中であ
る．

−81−

表l Effects of oraladministration ofleupeptin
M．N．

Age（years）

38

Disease23

通ale・Limb−girdle
dystrophy
A

Scapulo−perOneal Charcot−Marie−
muscular atrophy Tooth
B
492

517

6，400

4，600

Hb（mg／dり

12．8

14．7

14．6

15．8

Ht（％）

39

43

43

47

PTT（101）

13

18

14

16

20

Total protein（g／dL）

7．0

6．9

7．2

7．0

6．9

GOT（IU）

16．0IU l9．0

21．0

20．0

23．0

GPT（IU）

14．0

16．0

20．0

19．0

20．0

LDH（IU）

260

260

280

280

300

2乙0

84

35

77

Total cholesteroI

175

170

265

260

160

︶
一
︵
︶
一
︵
︶
土
︵

2
〜
l

︶
2
︶
一
〜
一
︵
l
︵

0

22．0

145

0
7

15．0

350U

︶
一
︵

4
1

15．0

CPK（U）

︶
土
︵

15．0

BUN（mg／dり

︶
一
︵

20

︶
一
︵

8．0

16

2

6．5

28

2
〜
l

6．5

15．0

︶
︶
︶
一 一 土
︵
︵
︵

6．0

7．0

2
2
︶
〜
〜 一
l
l
︵

6．0

γ−GTP（mU）

︶
︶
︶
一 一 土
︵
︵
︵

Al−P（K−AU）

4

6，600

B

488

4

5，400

A

5

453×104

Male

21001
76
14
77訝冴20825

B

T．Ⅰ．

56

Male

Sex

RBC（×104）
WBC

K．E．

5
6
1

Urination

︶
︶
2
︶
土
一
〜
一
︵
︵
l
︵

︶
一
︵
︶
一
︵

B：before；A：after

︶
一
︵

︶
一
︵

WBC
Cast

︶
〜 一
l
︵

︶
一
︵

RBC

〜
l

2

︶
土
︵

Urobilinogen

︶
一
︵

Sugar

︶
一
︵

Proteinpィペプテンの種々筋萎縮性疾患に対する経口投与の効果
inpatientwithvariousneur0−muSCulardisorders

T．T．

T．W．

T・G・

J・W・

49

44

15

FemaleFemaleMale

Male

Polymyositis

Limb−girdle

Myotonic dystrophy

Duchenne dystrophy

48

B

A

B

A

dystrophy

A

A

B

370

376

335

342

368

376

417

422

4，000

4，200

4，200

4，800

4，800

4，600

4，400

4，600

9．7
30

8．5

9．7
30

28

8．5

10．7

11．0

11．8

28

32

33

37

11．5
36

15

15

15

15

14

14

20

14

6．6

6．5

6．4

6．5

6．2

6．4

6．8

6．6

48．0

52．0

26．0

23．0

32．0

33．0

19．0

19．0

28．0

27．0

10．0

12．0

41．0

44．0

300

360

360

340
4．0

340

300
4．0

4．5

17．0
360

16．0
340

4．0

6．0

6．0

9．0

8．0

30

45

37

16

15

15

15

15

20

20

12

12

42

215

161

190

150

160
︶
一
︵
︶
︶
︶
3
︶
一 土 一 〜
＋
︵
︵
︵
2
︵

土
︵

︶

一
︵
一
︵

︶

〜
l

2

一
︵

︶

2
〜
l

︶

︶
一
︵

一
︵

︶
土
︵

︶

︶
一
︵
︶
一
︵

︶
一
︵

︶
︶
一
一
︵
︵

︶
＋
︵

︶
一
︵

l

2

︵

＋

︶

l

2

〜

︶
土
︵

︵

︶

︶
一
︵

l

︵

︶

︶
一
︵

︵

︶

︶
︶
土 一 〜
︵
︵

170

︶
︶
一 一
︵
︵

230

︵

24

215
︶

24

215

土一土

161

230

︶
＋
︵

126

42

︶
︶
︶
︶
3
一 一 土 一 〜
︵
︵
︵
︵
2

25

14

︶
︶
︶
︶
3
︶
一 一 土 一 〜
＋
︵
︵
︵
︵
2
︵

16

35

ロイペプチン投与の影響−ヒトおよび実験的筋再生に対する検討

木 下 英 男＊
研究協力者

川崎研一＊・山田信興＊

蛋白分解酵素阻害物質であるロイペプチンと進表1主な検査項目

行性筋ジストロフィー症との関連が注目されるよ一般血液検査：赤血球数，Ht，Hb，網赤血球数，
血小板数，白血球数，白血球像
血液凝固検査：プロトロンビン時間，部分トロ∵／
ボプラスチソ時間
血液生化学検査：酵素系：GOT，GPT，ALP，LDH，CPK
脂 質：総コレステロール，中性脂肪
蛋白質：総蛋白，アルブミン，グロブリン

うになってから，現在までに実験動物筋ジストロ
フィー症に対する効果が検討されてきている・
今回，われわれは健康人に対するロイペプチン投与による影響を検討したのち，進行性筋ジスト
ロフィー症患者への投与を試みた．つぎに，進行性筋ジストロフィー症の病態生理のうえでは筋線

電解質：Na，K，Cl，Ca，P
その他：BUN，クレアチニソ，尿酸，TTT
その他：尿検査，心電図，胸部Ⅹ線像

経の再生がきわめて重要な役割を果している・そこで筋線維再生に対して，ロイべプチンがどのような影響を及ぼすかを明らかにする目的で動物実結験を行った．

healthyvolunteer5人の体温，脈拍，血圧に関果する経時的変化において，投与前と有意な変化は
1．健康人に対するロイぺプチン投与のみられなかった（図1，2，3）．また，上腕二頭筋

影響について筋力および握力についても投与前に比べて増強す

方

法

年齢

39〜58歳（平均45．4歳）のhealthy

volunteer

る傾向はなかった（図4，5）．投与後12時間，5人に対して，ロイペプチン100mg

24時間目の採血結果でも，何ら副作用はみられなかった．

を早朝空腹時に1回投与後，生体への影響をみる
目的で，15分，30分，1時間，2時間，4時間，

2．進行性筋ジストロフィー症患者に対8時間，12時間，24時間後に，血圧，脈拍，体するロイベプチンの影響

温，上腕二頭筋筋九 握力を測定．投与後8時間，

方

24時間目に採血し，一般血液検査，プロトロンビ

患者は31歳の男性（図6）．処女歩行の遅延，

ン時間，部分トロンポプラスチン時間，肝機能検

小児期近位筋力低下および筋萎縮を認め，昭和査，腎横能検査，電解質，CPK，心電図等を施行

55年4月当科に入院．精査の結果，肢帯型ジスト

した（表1）．

ロフィー症と診断された．この患者に対して，ロ法

イペプチン100mgを1週間連日投与を行い，投＊東邦大学第四内科

与前および投与終了後に採血し，筋力テストおよ
−85−

B nr
B lhr

4

8

12

2

4

6

12

24

12

24

24

7
3
6
3

︵P︶憲±

5
3

図1体温の変化（健常人5例）．B：投与前，1〜
24hr：投与後時間以下同じ．

9
8
7︵人ミ三二≡≦

6

叶十叶−牛315min301hr2

4

8

ユ2

24

48

図4 上腕二頭筋筋力の変化．
8

15min301br

24

図2 脈拍の変化．

815min301hr

2

4

812

24

図5 握力の変化．

0201︵葺Eg︶出召

0
0
0
9

4

8

12

24

00
80
70

︵加工E∈︶ご一雲90

図3 血圧の変化．上：収縮期圧，下：拡張期圧．

図6
−86−

肢帯聖ジストロフィー症．

8

ロイべプチソ投与の影響
表2

肢帯塑ジストロフィー患者のロイペプチソ投与前と投与後の検査成績

苓Ⅰ可 ur yBefore After

一一一一一一一一一一一一

G ro u p l＿… ＿＿＿＿＿… ＿＿＿G r o up 2

一一一一一一一一… 一一一

G r ou p 3

一一一一… 一一一一一一

G r ou p 4＿＿＿＿＿… ＿＿●＿＿G ro u p 5）く一

Pectoralis maJ

5

一

5

一

2
l
十
4

′V
I njur y4

IliopsoasX令I nju ry

十

一 〇
2
l
l

6
l

Lt（kg）X勺 。i。r y一

5一

Rt（kg）

一

5

5

Grip strength一

Wrist nex．

5

Wrist ext．

一

5

Triceps brachii

一

5

Biceps brachii

I niur y一

55

Muscle strength

4
4

4
4

一

Quadriceps

一
5
一
5

Gowers sign

5

一 ＋
5
︵

Gastrocnemius

5

Tibialis ant．

5

Hamstrings

十 一 一 一 一 ＋

十Adductors of thigh

3

2

1

0

1

2weeks

Leupeptin
図7

実験方法．一一一10mg／kg，‥−50mg／kg・︵Blood chemistry test

その後，無菌的に下肢三頭筋を露出し，Kocher

CPK（IU）

833

759

GOT（IU）

23

21

甜子で40〜50回挫減を加えて，手術別を閉鎖し

GPT（IU）

15

20

た．その後，連日ロイペプチンを腹腔内へ注射し，LDH（IU）

445

349

WBC

4，000

筋線経の再生への影響を経時的に観察した・

4，100

動物は，筋肉挫滅後24時間，3日，7日，14

RBC（10，000）

467

349

Hb（g）

15．2

14．8

日，28日放置した計5群に分け（図7），各群に

Ht（％）

45．2

44．2

pィペプチンを10mg／kg／day，50mg／kg／day投S−Ca（mg／dJ）

11．0

7．9

TP（g／dJ）

7．0

6．5

与し，投与後1週間および2週目に筋肉を生検し，Gomori−Trichrome変法，PAS，NADH，Phos−phorylase，myOSinATP染色を行い，筋線維径変

び一般血液生化学的検査を施行した．
結化，筋線維構造の変化，タイプ別分布状態につい

果

投与前に比べて，投与後，臨床的に筋力の改善はみられなかった．一般血液生化学検査では，投て，その期間に相当する挫減コントロールラットと比較した．

与後，血清CPK，LDHで若干の変化がみられた

結果が有意ではなかった（表2）．ロイペプチン投与終a）体重の変化

了後，4週間経過した現在もとくに症状の改善も各群の筋肉挫滅ラットにロイペプチンを投与し，その後2週間体重の変化を観察した・その結果，なく，副作用も認められていない・

各群とも，対照，10mg／kg／day投与，50mg／kg／
day投与，3者の間で有意な差はみられなかった

3．ラットにおける筋技維再生に対する（図8）．

ロイぺプチンの影響
方b）筋線維構造の変化法

体重200g前後のウィスター系，雄成熟ラット

対照群の筋線維構造の変化は，筋肉挫滅後24を使用．ラットはネンブタールで腹腔内麻酔をし，時間で丘broblast類似の細胞が全受傷部を占め・−87−9）・また，この時期には，タイプの別がほぼ明瞭Fこなった．
ロイペプチン投与による節線維構造への変化を観察した・筋肉挫滅後1日，3日，7日放置した群におけるラットにロイペプチン連日2週間腹腔内注射した後の組織像は，各群とも共通して，同剤10mg／kg／day投与では，大小不同は目立たないが，対照群に比べて小径化傾向を示した（図10）．
012

図8

3

4

5

6

7

8

91011121314（day）

ロイペプチン投与による体重の変化．−対照，一一一10mg／kg，一一一50mg／kg．

同剤50mg／kg／day投与では，10mg／kg／day投与に比べて大小不同が著しく，全体に小円形細胞浸潤がみられた・10mg／kg／day投与と同様に対照

3日後には，大部分后broblast類似の細胞であっ群に比べて小径化傾向を示した（図11）．筋肉挫たが（70〜90％），筋原線経を有Lmyoblastと呼減後，14日および28日放置したラットでは，対びうるものが少数認められ，細胞の中にはかなりの長さを有し複数の胞状の核が中央に並び，周囲照10mg／kg／day投与，50mg／kg／day投与の3着の間に有意な差はみられなかった．ロイペプチンに筋原線経を有するmyotube期の筋線椎も観察

投与後，1週間の組織像では，対照，10mg／kg／

された・7日目には，完成した節線経の中にmyo−tube期の筋線経が多数混在するようになる．14

day投与，50mg／kg／day投与の3着において有意な差はみられなかった．

日目には，全視野でほぼ正常の構造を有する筋線

C）筋線維径の変化経が多数を占め，全体に肥大傾向であった（図ロイペプチン2週間投与後の筋線維径を測定し

図9 筋挫滅後2週間経過した筋肉の組織像（対照群）（Gomori−Trichrome変法 ×100）．
−88−

ロイペプチソ投与の影響

図10

筋挫滅1日後にロイペプチン10mg／kg／day投与し，2週間経過した筋肉の組織像（Gomori−
Trichr・Ome変法 ×100）．

図11筋挫滅1日後にロイべプチソ50mg／kg／dayを授与したもの．
−89−

た．筋挫滅後1日，3日の群では，対照群は，ロ
イペプチン投与群に比べて直径が80．3±4．6，
82．4±3．5／Jm（タ＜0．05）と著しく大きかった．
これほどではないが，同様の傾向が挫滅後7日，14 日の群でもみられた．投与量の差による影響を検討したところ，筋挫滅後1日の群では，50
mg／kg／day投与で直径が 52．5±12．4FLm，10
mg／kg／day投与で直径が 58．0±4．2fLm（P＜0．05）と10mg／kg／day投与に比べて50mg／kg／
day投与では小径化傾向を示した．同様の傾向は
図13

挫滅後3日，7日，28日の群において＼みられた（図12）．一対照，10mg／kg，50mg／kgの各群の筋線
維直径の比較．−対照，一一一10mg／
kg，一一一一50mg／kg．

つぎに各群のラットにロイべプチンを2週間投与したさいの筋線維径の分布状態を検討した．

筋挫滅後7日開始の群では，対照において90〃m以上の大径線経が含まれる以外，対照とロイ

筋挫滅後1日開始の群においては，対照は，ロ
イペプチン投与に比べて，全体に右方移動を示し，
80／Jm以上の大径線経が50％以上を占めていた．
投与量の差による影響は，50mg／kg／day投与でペプチン投与の間に変化はみられなかった．投与
量による差では，50mg／kg／day投与では10〜30
FLmの筋線経が10mg／kg／day投与に比べて多く含まれていた．

10mg／kg／day投与に比べてやや左方移動を示し，
20／Jm以下の小径線経も含まれていた（図13）．

筋挫滅後14日の群では，対照が投与群に比べてやや右方移動を示した．また50mg／kg／day投筋挫滅後3日開始の群では，挫滅1日のラット

与で80JJm以上の大径線経が含まれていた．

と同様に，対照ではロイペプチン投与群に比べて，右方移動を示し，50mg／kg／day投与では，10mg／kg／day投与に比べて 40FLm以下の筋線経が筋挫滅後28日の群では，対照，10mg／kg／day
投与，50mg／kg／day投与，3者の間において有意な差は認められなかった．

かなり多く含まれていた．

4．考案および結語
今回，われわれは，ロイペプチン投与後の健康人に対する影響を検討した後，肢帯型ジストロフ
ィー症に対する同剤の効果をみた．
健康人に対するロイペプチン100mg1回投与
では，生体には何ら影響を及ぼさなかった．その後，肢帯型ジストロフィー症へ同剤100mg連日
1週間投与したが，臨床的に筋力等の改善がみられなかった．また検査上も有意な変化はみられな
かった．今回の投与量では，何ら影響がみられな
Groupl Group2 Group3
Group4GrotJp5（4weeks）（2weeks）（7days）（3days）（ldays）

図12 各群の筋線維径の平均（♪＜0．05）．■対照，⊂］10mg／kg，国50mg／kg．

かった，今後，投与量の増加ないし投与期間を延長して，経過観察の必要があるように思われる．
ラット下肢三頭筋に枚枕的挫減を加え，その後−90−

ロイベプチソ投与の影響の再生過程を，対照，10mg／kg／day投与，50かではないが，大量群の方がより変化が顕著であmg／kg／dayの3者に分け，経時的に比較検討したった点からみて，薬剤の影響が何らかの役割を果が，基本的には各群間に著しい差異はなく，ほぼしていることは疑いのないことと思われる．薬剤

同じ過程を示したが，対照においては，挫滅2週が再生の完成を阻害する傾向を有するのか，ある

間後には大部分の動物では再生が完了しているの

いは感染の可能性を増大するのか，これらの点はに対して，ロイペプチン投与群，とくに大量投与

今後の検討をまつ必要があるが，再生が完了したでは，同じ期間後になお筋線経の大小不同が著し

筋線経には何らの影響がない点から考えて，損傷

く，一部に小円形細胞の浸潤もみられた．しかし，を修復する過程で本剤が何らかの働きを有するもすでに再生が完了した群では投与によって明らかのと考えられる．この点が筋ジストロフィー症のな差異は生じなかった．投与群で小径線経が存在

治療上どのような意義を有するのか，今後慎重なしたり，大小不同が著しかったりした原田は明ら検討が必要であろう．

ー91−ロイペプチンの難病治療薬としての開発研究

田

中

亘＊

Ⅰ．原 末 試 薬
研究協力者 山崎忠雄＊ 野崎光生＊ 飯島富士男＊ 高木健吉＊ 冨田勝久＊ 櫻井韓勝＊

Ⅰ．吸収，排泄，分布および代謝
1．ロイべプチソの数量定量法
研究協力者

山下孝和＊

水口

茂＊

高山秀樹＊

才野智之＊

石橋正冗＊

宮崎

浩＊

2．ロイペプチソのマウス，ニワトリおよびヒトにおける血中濃度
研究協力者

山下孝和＊

水口

茂＊

高山秀樹＊

石橋正冗＊

宮崎

浩＊

3・筋ジストロフィー病態動物における［HC］ロイべプチソの全身オートラジオグラフィー（2）研究協力者 水口 茂＊ 山下孝和＊ 高山秀樹＊ 石橋正フ［＊ 宮崎 浩＊
4・筋ジストロフィー病態動物におけるロイペプチンの筋肉内濃度
研究協力老

山下幸和＊

水口

茂＊

高山秀樹＊

石橋正フ［＊

宮崎浩＊

Ⅲ．製 剤 研 究研究協力者 寺田 降＊ 中田 実＊ 二宮 宏＊ 伊藤忠雄＊ 島津忠寿＊ 吉田功一＊
山下辛和＊ 高山秀樹＊ 石橋正冗＊ 宮崎 浩＊ 橋本一也＊ 山下 巧＊
高橋克俊＊
Ⅳ．

ロイペプチソの一般薬理作用（第2報）
研究協力者 古田康彦＊ 石川道雄＊ 伊藤真治＊ 高平 孝＊ 菅原 稔＊ 宮崎 浩＊

Ⅴ．毒 性 試 験
1．ロイペプチソのイヌ静脈投与における急性毒性
研究協力者 伊藤公一＊2，入江幸夫＊2，酒井勇治＊2，坪崎正寿＊2，松田 明＊2
木葉徳安＊2
2．ロイベプチソのイヌ経口投与における亜急性毒性
試験責任老 橋本虎六＊3（林 裕造）＊8
担 当 者 大滝恒夫＊8，今井 清＊3，安藤光男＊3，山口一書＊8，橋本恵子＊8
植木真知子＊さ，閑 剛辛＊8，吉田菊子＊3，稲田浩子＊‡，米屋浩子＊3
山 口 肇＊8
3．ロイベプチソのラット経口投与における慢性毒性試験責任者 橋本虎六＊＄＊ 日本化薬（株）医薬事業部薬品開発研究所＊2 日本化薬（株）医薬事業部安全性研究所＊‡食品薬品安全センター秦野研究所
ー93−

担 当 者 大滝恒夫＊8，洋口順二＊さ，池田 久＊3，山口一書＊8，今井 清刈
橋本恵子刈，関 剛幸＊8，米屋浩子＊8，畔上二郎＊き，松井英一＊8
青田菊子＊8，稲田浩子＊8
4．ロイペプチソのイヌ静脈内投与による亜急性毒性試験責任者 橋本虎六＊3
担 当 者 大滝恒夫＊＊，今井 清＊3，松井英一＊3，安藤光男＊さ，溝口順二＊3
橋本恵子＊3，閑 剛幸＊3，青田菊子＊3，稲田浩子＊丑，山口 肇＊き−94−ロイペプチンの難病治療薬としての開発研究に通じLeupを吸着させ，4倍容の水で洗浄した．つぎにpH2の7％アセトン水840gで溶出

Ⅰ．原 末 試 験し，Leup画分420gを得た．
培

ついでこの溶出液を減圧下で84gに濃縮した

養

gfrゆfo〝ひre∫rO∫g〟∫のスラント培養菌体をグリ後，69gの活性炭カラムに再度通じLeupを吸セリンと可溶性右横天然窒素源を含む培地に接種着させた．水洗後，70％アセトン水670gで溶出し，270C，24時間振迄培養したものを200g容発し，減圧下アセトンを留去したのち，pH4に調酵タンクに120gの同様の培地を仕込んだものに整し，28gのダイヤイオンHP40に吸着させた．

接種し，270C，18時間通気控拝培養して前培養と同容量の水で洗浄後，pH2の50％アセトン水する．これを2m3容発酵タンクに1．2maのグリ84gで溶出LLeup画分33gを得た．これをダウ

セリン，無機塩とアミノ酸混合物から成る培地をエックスWGRでpH5．2に調整した後，減圧濃仕込んだもの2基に接種し，270C，33時間通気撹縮を行い，濃縮液4gを得た．これを凍結乾放し，拝したものを1ロットとした・

Leup硫酸塩1．06kg力価を得た．培養濾液から得られた培養物は2・4m3（培養力価1・15mgの収率は38．5％であった．
同様の操作を3ロット行い，総量3．18kg力価

力価／mJ）で，総力価は2．76kg力価であった・
培養物から濾過により菌体を除き，2・04m8の濾を得た．

液（総力価2．34kg力価）を得た・

Ⅰ．吸収，排泄，分布および代謝
精製

1．ロイぺプチンの微量定量法

濾液2．04m8をpH6に調整し，117gのダイ
ヤイオンHP40に吸着させ，水洗後50％メタノール硫酸水370gにて溶出，ロイペプチン（Le−筋ジストロフィー症の治療薬としての開発にあup）画分1801を得た．ついでこのLeup画分

たって，ロイペプチン（Leup）の生体液，臓器組のメタノールを40ccで減圧下に留去し，水溶液

織中の濃度を正確に測定することは，pharmaco−

35gを得た．これを5N硫酸でpH2に調整し，

kineticsおよびpharmacodynamics

一夜放置後，析出した不純物を濾過により除去しめに必須である．［14C］Leup を用いた動物実験1）

た．

では，血簗中の放射能の多くは短時間で血簗蛋白

濾液40gを105gの活性炭（精製白鷺）カラム
−95

の検討のた

にとり込まれた代謝物であり，Leup の量は微量−であった．Leup の薬効と血柴中濃度の関係を明り合成した．入LAc−L−LeuとL−Leuは日本理化

らかにするためには，生体中に存在する数量の学薬品（東京），ウシ膵臓トリプシンとL−Leu−L−

Leupを高感度で，しかも特異性の高い定量法を

Leuはシグマ社（米国）よりそれぞれ購入した．

開発するのが必須である．

［3，4，5−3H（N）］LeuはNewEnglandNuclear

グラフィーーマススペクトロメト（米国）より購入した．［3H］−Leup（473．5mCi／

リー（GC−MS）は生体中の薬物あるいは生体成mmol）はL一［3，4，5−3H（N）］Leuより才野ら7）の分の数量定量2）には優れた手法として利用されて方法により合成した・得られた［さH］−Leup はいるが，Leupの分子内にはグアニド，アミドおNaBH4を用いて還元したのち，放射能検出器

よびアルデヒド基のような極性基を看するため，（Berthold HPLCRadioactivityMonitorLB503

熱安定性に優れ，かつ揮発性に富んだ誘導体にす型）付HPLC（島津HPLC LC−2型）を用いてることは困難で，GC−MSによる分析は不可能で

放射化学的純度を測定した結果，95％以上であ

あった．

った．

ガスクロマトLeupの蛋白分解酵素の阻害作用は，トリプシb）Leup標準液および［3H］−Leup溶液i）Leupン，プラスミン，パパインのようなセリンまたは

標準液：50mM CaC12および100

チオールプロテアーゼの活性中心と選択的結合に

mM NaClを含む10mM・トリスー塩酸緩衝液（ト

基づいている8）ことに着目し，Leup とトリプシ

リスー塩酸緩衝液）100FEl中にLeup6〜800ngをンの可逆結合を利用した−含有する．

competitive bindingr？dioassayによるLeupの肇異性の高い傲量定量法を確立した．

ii）［aH］−Leup溶液：トリスー塩酸緩衝液
100FLl中に［3H］TLeup23nCiを含有する．

一方，immunoassayは繁雑な分離操作をするこ

C）標準曲線となく数量の薬物4）および生体内成分5）を定量す

Leup標準液100FLl，［3H］一Leup溶液100FLlおることが可能である．そこで，特異性の高い抗体

よび正常イヌ血清を370Cで5分間プレインキュ

産生を意図したハブテンおよびハブテンーウシ血べ−トしたのち，ウシ膵臓トリプシン5／唱／0．001

清アルブミン（BSA）結合体を合成し，得られたN塩酸50〆を加え，混合後370Cで2時間イン

ハブテンーBSA結合体を家兎に投与して得られた

キュべ−トした．反応液に冷エタノール 3．0mg

抗血清の特異性について検討した．

を加え，3，000rpmlO分間遠心分離し，トリプシンと結合したLeupと遊離型Leupの分離を行っ

A．ロイベプテンのトリプシン阻書作用を利た．沈澱物を蒸留水に溶解し，液体シンチレーシ

用したCOmpetitive bindimgradioas・ョンカウンター（Aloka LSC−753 塾）でその放Sayの開発射能を測定した．

1）実験方法Leup添加量をX軸，添加

Leup

量による

a）実験村料［3H］−Leupとトリプシンとの結合阻害率をy軸Leupにとり，標準曲線を作成した．

は本報告書Ⅰの発酵により得られたものをそのまま使用した．ロイペプチン酸（Leupd）Leupの定量

COOH）は近藤ら6）の方法により合成した．Ⅳ−ア

試料200FLl，［3H］−Leup溶液100FLlおよびト

セチルーL−ロイシルーL−ロイシン（Mc−L−Leu−

リスー塩酸緩衝液100〆を370Cで5分間プレイ

L−Leu）は，レロイシルーL−ロイシン（L−Leu−L−

ンキュべ−トし，以下Cの標準曲線作成法に従っLeu）のアセチルイミダゾールのア七チル化によて操作し，標準曲線より定量した．

−96−

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究

2）実験結果および考察
各種プロテアーゼに対するLeupの阻害活性8）は，カテプシンBが最大で，つぎにトリプシン＞
パパインであったが，容易に入手できるプロテアーゼとしてトリプシンを選択した．
遊離型およびトリプシン結合Leupを分離する
ためには，種々の方法が考えられるが，操作が簡便でかつ大量の試料を迅速に処理できることから
冷エタノール沈澱法を使用した．
Leupとウシ膵臓トリプシンの結合定数を図1

図2 Calibration curve ofleupeptin．

に示す Scatchard plot より求めたとき，8．2×に関係なくほぼ一定の回収率が得られた．

106M￣1であった．

常法9）に従って，Leupの最小検出感度をBlank

図2は，Leup定量のための標準曲線を示す．

値とその標準偏差から計算すると 3ngであった．

図から明らかなように，6〜800ng の範囲で良好

Leup

な直線性を示した．

の代謝物と考えられる

Leup COOH，

Ac−L−Leu−L−Leu，L−Leu−L−Leu，Ac−L−Leu お

血渠1mlに50，100，150，200ngのLeup

よびL−Leuの交叉反応性を表2に示した．5種を添加し，本法により分析したときの回収率を表のLeup推定代謝物は，いずれも0．05％以下の1に示す．本法は，50〜200ng／mJの範囲で濃度

交叉反応性を示したにすぎなかった．したがって，本法は，生体液中のLeupの定量においてきわめて特異性の高い有用な方法であることが明らかとなった．

B．Radioimmunoassayによるロイ
ぺプテンの微量定量法の開発
1）実験方法a）試50

薬Leupは発酵法により得られた品質のものをそ月（pmoI／hbe）

図l Scatchardplot ofleupeptin fortrypsin．

のまま利用した．LeupCOOH6）およびジヒドロ

表l Recovery ofleupeptin sulfate added to dog plasma

Added Found Recovery（％）
Sample（ng／mlplasma）（ng／mt plasma）

Mean土S・D・
2
5

3
5

4
5

7
4

0
5
0
5

1
5

6
4

6
5

5
4

0
0
1

4
9

3
0
1

2
1
1

8
9
5
9

6
5
1

7
3
1
0
5
1

6
0
1

5
8
5
5
3
0
1 1 2

100土6．3
99土5．5

5
0
2
4
9
1

2
0
2

1
8
0
5
1
2
1
2
2

6
9

3
0
2

5
9
1

9
4
1
4
5
1

2
9

0
0
0
0
2
2

0
5
1
0
5
1

0
0
1

1 2 3．4 5 6 7 8

97

101土8．1

104土4．8

N−C−CIC

表2 Cross reactivity ofleupeptin andits related（A）

COmpOunds to the present competitive bind−NH

H−Cク・1／2H2SO一
H
H

l

（％）

CH2

l

l

−

CH2

2

CH

CH

Cross reactivity

Compound−

甲シCH3 C甲／CH3

H
N

H

ing assaylCH，CO−NHCHCO−NHCHCO−NHCHCH＝N〜OCH2COOH

Leupeptin（Leup）

100

Leupeptinic acid（Leup COOH）
Ac−L−Leu−L−Leu＜0．05

C等㌔Hやノ
CH
l

l

CH2

CH2

t

l

2

＜0．05

−

＜0．05

L−Leu

−

Ac−レLeu

NH−Cク・1／2H2SO4日‖＝H＝H

＜0．05

H
N

（B）

＜0．05

L−Leu−L−Leul

CH3CO−NHCHCO−NHCHCO−NHCHCH20CO（CH2）3COOH

ロイペプチン（Leup CH20H）6）はLeupを酸化あ

図3

Structures of haptens forradioimmunoassay

るいは還元することにより調製した．またAc−レ

Ofleupeptin．

Leu−L−LeuはL−Leu−L−Leuを7−七チルイミダゾて合成した．また，ハブテンーBSA結合体を図4

ールでア七チル化して調製した．

に示す経路で合成した・すなわち，LeupCH20H

473．5mCi／mmol）は（100mg）を無水ピリジン2mgに溶解し，無水グ［3H］−Leuを用いて才野ら7）によって合成された

ルタル酸50mg（2当量）を加えて室温で24時ものを使用した．［3H］−LeupCH20Hは［3H］−

間放射した．ピリジン留去後，残漆を水［3H］−Leup（比放射能5mJにLeupを水素化ホウ素ナトリウム（NaBH．）で還溶解し，Amberlite XADTIIカラム（10×2cm

元して調製した．［3H］−Leu（比放射能110Ci／m−i．d．）に通導し吸着させた．水150mgでカラムをmol）はNew England Nuclear社より，NNL

洗浄したのち，メタノール100mgで溶出し，溶ジサクシミジル・カーポネート（DSC）はケミサ

出液を濃縮乾固して目的とするハブテン，すな

イェンス社より，BSA（フラクションⅤ）はシグ

わち，ジヒドロロイペプチンーへミグルタレート

マ社（米国）より，またcomplete Freunds

adju−（LeupCH20H−HG）（4）90mg を得た（収率り購入した．Amberlite

72．5％）．ここで得られたハブテン（4）とⅣ，入L

XAD一ⅠⅠおよびXAD−ⅠⅤほ，Rohm＆Hass社

ジメチルホルムアミド中，DSCにより活性エス（米国）より購入したものをAxelsonとSj5valllO）

テル体（5）としたのち，5を0．05Mリン酸緩衝の方法に従って洗浄した後に使用した．

液（pH7．3）中BSAとvantはヤトロン（株）よb）ハブテンならびにハブテンーBSA

4〇Cで24時間反応させた．反応液を4ccの蒸留水に対し一夜透析したの結合体

ち，■凍結乾燥してハブテンBSA結合体B（6）を

の合成

得た．

本実験に用いた2種のハブテンの構造を図3

ハブテンAおよびBの比放射能はいずれも

に示した．

0．40J

ハブテンーBSA結合体Aは前年度報告11号こ従っ
Ac−L−Leu−L−Leu−L−Arg・CH20H（Dihydroleupeptin）

Glutaric anhydride

PyridheG／mmolであり，ここで得られたハブテン

Ac−L−Leu−L−LeuTL−Arg・CH20CO（CH2）3COOH（4）凡〃−disuccimidyI
carbonate

BSA［Ac−L−Leu−L−Leu−L−Arg・CH20CO（CH2）3CONH］nTBSA←盲訂テrAc−L−Leu−L−LeuTL−Arg・CH20CO（CH2）3COO
（6）

（5）

図4 Synthesis ofhapten andha如n−BSAconjugate forradioimmunoassay・ofleupeptin．
−98−ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究

BSA結合体AおよびBの比放射能は14・92およ

溶解してassayに供した・

び13．23〃Ci／mmolであっち・この結果から

プ

BSAlmolにハブテンAは37mol，ハブテンBはの 0．05Mトリスー塩酸緩衝液（pH7・6）を加え

33mol結合していることが判明した・てホモジナイズした．得られたホモジェネートl迫）筋

肉：筋肉0・5〜1gを採取し・5倍容

mJに30倍容のエタノールを加えて除蛋白したC）抗血清の調製
在来種白色家兎（雌，体重2・5〜3kg）1羽当りハブテンーBSA結合体2・0mgを0・5mlの滅のち，以下血柴の場合と同様に処理した・
2）実験結果および考察

菌生理食塩水に溶解し，等量のCOmpleteFre−a）抗血清の特異性

unds・adjuvantを加えてエマルジョン化したも′、プテンーBSA結合体Aに対する抗血清［A］のを1回の免疫量とし，1カ月ごとに背部皮下の力価は，免疫開始後7カ月で検量線作成可能な（8〜10カ所）に投与を繰り返し，最終免疫後10までに上昇し，このときの最終希釈率は1，000倍

日目に採血を行った・常法により血清を分離してであった．抗血清［A］の特異性については・こ

抗血清を得た・の希釈率で検討した・
抗血清について，［3H］−Leupを標識体に用い・

d）Assay法
標準品，3H一標識体および抗血清は0・05Mリ

LeupCH20Hおよび代謝物の1つであるLeup−

ン酸緩衝液（pH7・3）（0・1％NaN3・0・1％ゼラ

COOHに対する交叉反応性を検討した結果を表チンおよび0．9％NaClを含む）で希釈した・

3および図5に示した．図5から明らかなように・

LeupCH20H（0〜50ng）の緩衝溶液（0・3ml）

抗血清［A］はLeupCOOHに対してLeupとに，［3H］−LeupCH20H（calO，000dpm・0・1

同等の反応性を示すことが判明した・さらに・mg）および希釈抗血清（0・1mg）を加えよく撹拝

LeupCH20Hに対してほ，Leupより1・7倍の高したのち，4ccで18時間インキュべ−トした・い反応性を示した・
これらの結果より，Leupの定量に際してはそ

結合型および遊離型Leupの分鰍はSchiller
ら12）の方法に準じて，ポリエチレングリコ￣ルの測定形をLeupCH20Hとした方が約1・7倍検（平均分子量6，000）を用いて行った・

出感度を上げることができた・
そこでつぎに，［3H］−LeupCH20Hを用いてradi。aCtivityはAtomlight⑧一シソチレ，タ（New England Nuclear社製）4mlを加えてLeupCH20HとLeupCOOHに対する抗血清

LSC−753型液体シンチレーションカウンタ￣（Aloka社製）で測定した・
e）試料調製法i）血液：血祭1mgをとり，30倍容のエ

タノールを加え除蛋白し，3，000rpmで10分間遠心分離した・上清を濃縮乾固したのち残漆を水2mlに懸濁し，NBH4水溶液（20mg／ml）1mlを加え室温で1時間放置した・希塩酸で過剰の試
薬を分解後，Amberlite XAD−IV カラムー（5×1．5。mi．d．）に通導し，吸着させた・水30mgで洗浄したのちメタノール60mgで溶出した・メタ
ノールを留去して得られる残漆をリン酸緩衝液に−99−（ng／tube）

図5

Cross−reaCtionofantiserum［A］
byuseof［3H］Leupeptin

表3 Percent cross−reaCtion of anti−leupeptin antiserum withleupeptin andits related compounds

Cross−reaCtion
antiserum

CompoundA＊

Leupeptin（Leup）

10こ）

Dihydroleupeptin（LeupCH20H）

175．6

Leupeptinic acid（LeupCOOH）

75．0

A＊

100

B＊

100

23．0

0．25

Ac−L−Leu−L−Leu＜0．0002＜0．0002

Ac−L−Leu＜0．0002＜0．0002

L−Leu−レLeu
L−Leu＜0．0002＜0．0002＜0．0002＜0．0002一一￣−￣￣￣￣￣￣￣一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一Tracer

3HTLeup＊A：LeupCH＝N

3n−LeupCH20H

B：LeupCH20CO（CH2）3CONH−

OCH2CONH−BSA，

BSA［A］の反応性について調べた結果を表3および
図6に示した．このとき，LeupCOOHは23％の交叉反応性を示し，［3H］−Leupを用いたときにおけるLeupCOOHのLeupCH20Hに対する交叉反応性を約半分に減らすことができた．しかしながら，その特異性は定量に利用するには充分なものではなかった．
図7

また，抗血清［A］はAc−L−Leu−L−Leuを含む4種の化合物に対しては，ほとんど交叉反応を示
さないことが判明した．

Cross−reaCtion ofantiserum［B］
by use of［aH］dihydroleupeptin．

に対してきわめて特異的に反応し，LeupCOOHとの交叉反応性は，わずか0．25％であった．上

一方，ハブテンーBSA結合体Bに対する抗血清［B］の力価は免疫開始後3カ月で検量線作成可能
なまでに上昇した・このときの最終希釈率は4，000倍であった・抗血清［B］の各化合物に対する交叉反応性を表3および図7に示す．図7から記のLeupCOOH以外の4種の化合物についてもほとんど交叉反応性は認められなかった．
このような抗血清の著しい特異性の差は，ハブテンの化学構造の敏妙な差によるものと推測され興味深い．

も明らかなように，抗血清［B］はLeupCH20H

以上の結果をまとめると，生体液中のLeupの数量定量を行うためには，Leupをその還元成績体であるLeupCH20Hとし，抗血清［B］でas−Sayすることにより，きわめて化合物特異性が高
く Leupを測定することが可能となった．
b）抗血清の結合定数（足．）
抗血清［B］のLeupCH20Hに対する親和性を，
Scatchardplot法13）により検討した．図8からも

0・5

1

2

5

10

20

50（ng／tube）

図6

Cross−reaCtionofantiserum［A］
byuse oflaH］dihydroleupeptin．

明らかなようにScatchardplotは直線性を示し，その勾配からgaは1・03×108M￣1であった．抗血清［A］についても同様にぶ．を求めたところ，−100−ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究

簡便なことから生体試料中のLeupの特異的な徴量定量に有力な方法であることが判明した．
以上の結果，ハブテンBより調製した抗血清［B］は LeupCH20H にきわめて特異性が高く，
Leup の生体内代謝物との交叉反応性もほとんどないことを認めた．現在，この抗血清［B］を用いてのradioimrnunoassayの開発を検討中である．

0

5

10

2． ロイベプチンのマウス，ニワトリお

15

β（nM）
図8

よびヒトにおける血中濃度

Scatchard plot for anti，leupeptin antiserum［B］．

臨床における薬物の治療効果は，投与量よりも1．21×108ht￣1であった．これらの値はウシ膵臓

血中濃度によく相関することが知られている．

トリプシンを用いた本報告の COmpetitive bind−

Leup を筋ジストロフィー症の治療薬として開発

ing radioassayのK＆（8．2×106M．1）に比較してするにあたり，適切な治療体系を確立するために親和力の大きいことが判明した．

はPharmacokineticsの解明が必須であり，bio・C）検量線および検出感度

Tavailabilityの良い投与方法の選択が重要である．

実験方法d）のassay法に準じて最終希釈率

pharmacokinetics の研究において，われわれ

1，000倍の抗血清［B］を用いて作成した検量線

は化合物特異性，感度の面でも優れた competi−を図9に示す．検量線は0．6〜50ng／tubeの範tive binding radioassayを用いて腹腔内，皮下の定量

および経口投与時のマウス血中濃度ならびに旗艦が可能となった．また，本法における検出限界は内，筋肉内，皮下および経口投与時におけるニワ

0．5ng／tube と推測される．

トリ血中濃度を測定し，薬動力学的パラメータを囲で良好な直線性を示し，LeupCH20H

radioimmunoassay法は前述したウシ膵臓ト

求めた．さらに本法を経口投与におけるヒト血中リプシンとの可逆的結合を用いた competitive

濃度測定にも応用することができたので，この結binding radioassay法に比較して，より高感度で果についても併せて報告する．

Leppを定量できることが明らかとなり，操作もA．マウスおよびニワトリにおける血中濃度1）実験方法a）マウス
筋ジストロフィーと同系のC57BL／dy雄性マ
ウス（体重20〜30g，6週齢）に30mg／kgの割
合で経口，皮下および旗艦内投与した．投与後0．25，0．5，1，2，4および8時間（腹艦内投与については0．5，1，2，4，6時間）にエーテル麻酔下，頸動脈より採血した．血液をヘパリン10〜100（ng）20単位と静かに混和したのち3，000rpmで10
図9 Calibration curve ofleupeptinol．

分間遠心分離して血祭を得，分析用試料とした・−101−b）ニワトリ神経センター・埜中征哉博士（班員）よりいた
だいた成鶏（ニューハンプシャー種，line412，体︵︻∈＼琶︶亡〇二三一uguOU言のヱd

重2．8〜3．5kg）に，Leupを10mg／kgの割合で皮下，腹艦内および筋肉内に投与した．なお，経口投与では30mg／kgの割合で投与した．投与後
0．5，1，2，4，6時間に静脈より血液1mgを経時的に採血した．血液をヘパリン10〜20単位と静かに混和したのち3，000rpmで10分間遠心分離
して血祭を得，分析用試料とした．
C）血紫中ロイペプチンの定量

0．511．52

本研究報告書「ロイペプチンの微量定量法（1）ロイペプチンのトリプシン阻害作用を利用した
COmPetitivebindingradioassay」により測定した．

4

6

8

Timeafterinjection（hr）

図1l Plasma concentration ofleupeptinaftersub・
CutaneOuS administration ofleupeptin（30mg／kg）inmice．

2）実験結果および考察
a）マウスの血中濃度︵︻∈＼宣︶uO 芸u3uOU空ヒS芸l

経口投与における血中濃度曲線を図10に示す．二投与後0．5時間で血中濃度は最大（1．6／唱／mん乃＝3）に達したのち，1．6時間の半減期をもって減少した．図11および図12に，皮下および腹艦内投与における血中濃度曲線をそれぞれ示す．
皮下投与では，投与後0．25時間で最高血中濃度（14．7／堵／mん 〃＝3）を示し，ついで急速に減少していった．このときのLeupの血中からの消失パ
ターンは二相性を示し，各相における半減期はα

0．5

1

1．5

2

4

6

Time afterinjection（hr）

相で0．3時間，β相で2．6時間であった．
図12

Plasma concentration ofleupeptin afterin−
tra−peritoneal administration ofleupeptin（30mg／kg）in mice．

一方，旗艦内投与では，投与後0．5時間でその血中濃度は最大（12．8′g／mち 乃＝3）に達し，以後皮下投与の場合と同様に急速に減少していった．
腹腔内投与におけるLeupの血中からの消失パタ〃＝3 −ンも二相性を示し，それぞれの半減期はα相で0．2時間，β相で1．7時間であった．
各投与経路における血中濃度下面積（AUC）をTime alter adminiStration（hr）

図10

比較するとき，皮下≧腹腔内＞経口投与の順であPlasma concentration ofleupeptin afteroral
administration ofleupeptin（30mg／kg）inmice．

った．また，皮下投与におけるAUCを1としたときの経口および腹腔内投与のAUCの柏対比は−102−

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究
表4

Bioavai1ability ofleupeptinin mouse andchicken
Maximum conc．

Route

of

Dose

．

′し、

AUC

Animal ad芸㌫芸rZ；ion（還琵g）tl′2（hr）（p蒜㌫l） 雲g；訂欝；Mouse p．0．

30
S．C．

1．6

4・3（0・26）30

0．3（α）

1．6（0．5）

16．8（1．00）

14．7（0．25）

10・9（0・65）

12．8（0．5）

2．6（β）i．p．

300．2（α）

1．7（β）
Chicken p．0．

30
S．C．

0・8

0．23（2．0）

2．0

6．7（1．00）

3．13（0．5）0．2（α）

3．4（0・51）

2．44（0．5）

1．4（0．21）

1．05（0．5）

1．2

10

i．p．

10

2．3（β）
i．m．

10

0．7

筋肉内投与の場合も，Leup の血中からの消失

それぞれ0．26および0．65であった（表4）・

は速やかで，このときの半減期は0．7時間であっも）ニワトリの血中濃度
皮下投与における血中濃度曲線を図13に示す・
投与後0．5時間で血中濃度は最大（3・13／噌／mム 乃＝3）に達し，その後ゆるやかに減少した・
そのときの半減期は2時間であった．
図14および図15に腹艦内および筋肉内投与における血中濃度曲線を示す．いずれの場合も0．5時間に最高血中濃度を示し，それぞれ 2．44
〝g／mJおよび1・05′唱／mJであった・
旗艦内投与におけるLeupの消失パターンは二0．5

1

相性を示し，各相の半減期はα相で0．2時間，β相で2．3時間であり，マウスの腹腔内投与の場合

24TimeafterinieCtion（hr）

図14に得られたパターンによく一致していた・

Plasmaconcentration ofleupeptinafterin−
tra−peritoneal administration ofleupeptin（10mg／kg）in chickens・︵tE＼苫︶亡︒ 巴一u吉︒︒︒d∈SjL
0．5

1

2

4

0．5

Time afterinjection（hr）

図13

1

2

4

Timeafterinjection（hr）

Plasmaconcentrationofleupeptinaftersub−

図15 Plasmaconcentration ofleupeptin afterin−

Cutaneous administration ofleupeptin（10tra−muSCular

mg／kg）in chickens．

（10mg／kg）in chickens・−103−

administration ofleupeptin

成績のすべて正常範囲内にあるものから選択した．
︵tE＼琶︶uO 巴言古uOU昌Sqtd

被験者には本試験の目的，方法および安全性等について十分説明し，試験参加についての同意書を得たのち，試験を実施した．被験者は試験日の前日入院した．
b）投与薬剤
Leupをマンニトールにより20倍散としたものを投与した．
0．5

1

2

4

6

C）薬剤の投与と試験採取

Timeafteradministration（hr）
図16

東邦大学医学部木下真男教授（班員）および慶Plasma concentrationofleupePtinafteroral
administration ofleupeptin（30mg／kg）in

応大学医学部加藤隆一教授の監督下，被験者5名

Chickens．

（体重54〜66kg，年齢39〜57歳）は試験当日の朝食を抜き，上記薬剤の2g（LeuplOOmg相当

た．
経口投与における血中濃度曲線を図16に示す．

量）を水100mgとともに服用し，月艮用後0．25，

経口投与では，その投与量が30mg／kgにもかか

0・5，1，2，4，8および12時間の各時点で採血

わらず，血中濃度は投与後2時間でわずか0．23

した・血液は1時間室温に放置し，常法に従って

FLg／mlにとどまった．経口投与におけるLeupの血清を分離し凍結保存した．また，採血は，病院血中からの消失も比較的速やかで，その半減期は内の一般病室にて行った・昼食および夕食は院内食を摂取した．

1．2時間であった．

2）実験結果および考察

表4にニワトリ（成鶏）におけるLeupの各投
与経路におけるbioavailabilityを示した．各投与

経口投与の各時間における血中濃度測定値およ

経路におけるAUCを比較するとき，皮下＞腹腔

び血中濃度曲線を表5と図17に示す．Leupの＞筋肉≫経口投与の順に小さくなり，皮下投与に血中濃度が最大に達するまでの時間については，

おけるAUCが最も大きく優れたbioavailability
であることが判明した．
皮下投与におけるAUCを1としたときの腹腔与方法と投与量が異なるためAUCを比較することはできなかった．

B． ヒトにおける血中濃度︵∈己pS−∈＼賢︶uコd邑npJ

内および筋肉内投与AUCの相対比はそれぞれ
0．51および0．21であった．経口投与は，他の投1）実験方法a）被験者
0

被験者は，日本化薬（株）の男子社員から募集し

2

4

8

12

Timeafteradministration（hr）

た・東邦大学医学部付属大橋病院で内科的診察，血液検査，血液生化学的検査，尿検査およびその1

図17

他の検査（胸部Ⅹ線，心電図）を施し，これらの−104−

Serum concentration ofleupeptin afteroral
administrationofleupeptin（100mg／man）in
five volunteers．

ロイべプチソの難病治療燕としての開発研究
表5

Serum COneentrations ofleupeptin after oraladministration of single dose（500mg）
in

負ve volunteers

Leupeptin（ng／rnl）

Body

AUC［0〜4hr］（ng・hr／mりVolunteer Age weightNot measured because of hemolysis．

12（hr）＊．5＊．＊＊．30
D6・DDD9・4・
軋1mNN

6
6

N．D．＝less than15ng／mL（minimaldetectable concentration）・

8

352＊．＊．01
0・5・9・DD6・8・221m軋1

9
5

2
4

4

＊．50＊．664
D7・2・D8・8・2・
凡32m111

4
5

9
3

D
S

2

3＊
3．
55＊24
．
3
52
63
73
88
4
4

0
6

7
5

D

1

328264
8別
43
824

6
6

1
4

C

0．5

4035277
06
15
88
14
25
61
6
4

7
4

B
E一ズ

A
＊
＊＊

0．25

70＊．0511
3・6・Dl・2・8・3・
65m6542（kg）

個体差が認められたが，5名の平均値をとると，投与後0．5時間で最大値56．7ng／mJを示したの

実

験

方

法

ち，4時間まで2．1時間の半減期をもって減少し，

1）実験動物および投与方法

12時間後には検出限界（15ng／mJ）以下となった．

国立武蔵療養所神経センター埜中征哉博士（班各ボランティアにつき0〜4時間の血中濃度測員）よりいただいた筋ジストロフィー雛鶏（ニュ

定値に基づいたAUCを計算した結果を表5の最ーハンプシャー種，line413，体重351〜524g，

後のカラムに示した．ボランティアBにおいてき

6週齢，雌）に［14C］−Leup（比放射能10FLCi／mg）

わめて高い値を示した以外に，他の4名においてを10mg／kgの割合で腹腔内，皮下，および経口はほとんど等しい値を示した．この結果，絶対吸投与を行った．

収量にほとんど差のないことが示唆された．

2）全身オートラジオグラフィー
腹腔内投与においてほ投与後0．5および6時間

3．筋ジストロフィー病態動物における後に，皮下および経口投与においては投与後それ［14C］ロイぺプテンの全身オートラ

ぞれ0．5および2．0時間後にエーテル麻酔したジオグラフィー（2）のち，ドライアイスーヘキサンで凍結死させ，常法14）に従ってオートラジオグラムを作成した．
3）筋肉内濃度の測定

ロイペプチン（Leup）の作用模作として考えられるプロテアーゼ阻害作用から［14C］−Leupを筋

オートラジオグラム作成時の凍結ブロックより

ジストロフィー鶏に投与したときの筋肉内オート

浅胸筋および大腿筋をとり出しホモジナイズした．

ラジオグラムは興味深い問題である．しかしながそのホモジネートをェタノールで除蛋白して上清ら，Leupはきわめて代謝されやすく，オートラと沈澱の放射能を測定した．

ジオグラム上の窯化はLeupの濃度を反映していない．そこで筋ジストロフィー鶏に，腹腔，皮下，実験結果および考察

経口投与後のオートラジオグラムを作成すると同腹腔内投与後0．5時間の全身オートラジオグラ

時に，同一個体を用いて筋肉内濃度を測定し，投ムを図18に示す．投与部位である腹腔内の黒化

与方法の比較検討を行った．

を除くと，腸内容物，肝，胃内容物に強い黒化がみられ，次いで黒化は腎，腸と続くが標的組織である筋肉にはほとんどみられなかった．また投与−105−

図18 Whole−body autoradiograms showing thedistribution ofradioactivity afterintra−peritoneal
administration of［1．C］leupeptinofchickwith musculardystrophyinadoseoflOmg／kg．
−106−

ロイぺプチソの難病治療薬としての開発研究

図19

Whole−body autoradiograms showing the

distribution of radioactlVlty after subcutaneousadministration of［14C］1eupcptin of chickwith mllSCular dystrophyin a dose oflOmg／kg．

後6時間においても腹腔内には依然強い異化が残自質をも含めて観察していることになる．そこで，っており，他組織においてほ胃内容物＞肝，食道，

蛋白質にとり込まれた［14C十Leu の影響を除く

羽軸限＞腎，腺胃の順に，ついで骨髄＞心臓血，ため，オートラジオグラム作成時の凍結ブロック

肺，脊髄＞小脳となり，筋肉にも弱いながら黒化

より筋肉をとり出してホモジナイズした．そのホが認められた．

モジネートにエタノールを加え，除蛋白して蛋白

図19に皮下投与後0．5時間のオートラジオグ

質にとり込まれた［14C］−Leu に由来する放射活ラムを示す．かなりの放射能が皮下に存在しその性と，上清の放射能を測定してLeupに換算した窯化は強い．肝，胃，腸内容物の黒化が最も強く，のが表6である．腹腔内投与後0．5および6時間

ついで腎が強い．羽軸根，骨髄，腺胃と異化は続くの値を比較すると，投与後の時間経過の長いほど，が筋肉に対する黒化はきわめて弱いものであった．

沈澱中の放射能（すなわち14C蛋白質）が多く観

経口投与後2時間のオートラジオグラムを図察された．筋肉内のLeup量が薬効に関与するこ

20に示す．黒化は胃内容物および腸内容物に最とを考えると，少なくとも上清中の放射能を比較も強く食道＞羽軸限＞肝＞腺胃＞腎＞骨髄＞牌，すべきものと判断した．ところで各投与経路にお肺と続き，筋肉にも弱いながら黒化が認められた．

ける最高血中濃度を示した時点での筋肉を採取し，ところで昨年度の報告日で述べたように［14C］−

非蛋自画分の放射活性を比較すると，浅胸筋，大Leupは速やかに代謝されて［14C］−Leuから

腿筋ともに1g当り0．57〜0．68J唱の値を示し，［14C］蛋白質あるいは［14C］−C02になる．したがほとんどLeupの量に差がないといえる．腹腔内って［14C］−Leupの全身オートラジオグラムは蛋投与における血中濃度は筋肉内濃度とは対照的に

−107−

図29

Whole−bodyautoradiogramsshowing thedistribution￣ofradioactivityafteroraladministra＿tionof［14C］leupeptintochickwithmusculardystrophyinadoseoflOmg／kg．
−108−

ロイぺプチソの難病治療薬としての開発研究
表6

Leupeptinlevelsin chick muscles
Leupeptin（FEg／g muscle）

Route and dose ofadministration

Time（hr）

Plasma
Sup

Sup

pPt

Sup

ppt

20
21
01

74
56
00

54
23
01

7 6
6 6
0 0

5 3
4 0
0 1

4
6
0

2 7
0 1
1 1

3
6
0

78
56
00

81 7 428 4 202 0 184 8 535 1 5
10 2 0S．C．（10mg／kg）

50 5 006 0 2i．p．（10mg／kg）

ppt

Femoral Super丘cialbiceps pectoralisp．0．（10mg／kg）

減少した．筋肉内濃度は血中濃度に比べて持続性ーおよび同齢の正常マウスを使用した．
云）神経センター（埜中博士）において10，の傾向を示した．
以上述べてきたように，腹腔，皮下および経口（10mg／kg）投与の最高血中濃度における筋肉50mg／kg腹腔内4カ月連続投与した筋ジストロ
フィー成鶏（line413）を使用した・
2）試料の調製

内濃度はほは等しく，筋肉1g当り約0・7／gのLeupが検出された．このLeup量が筋肉内プロ
テアーゼ活性を抑制するかは今後の検討を待たねa）マウ子における筋肉内Leup濃度は3に準じて行った．

ばならない．

b）Leupを腹腔内達続投与した筋ジストロ
フィー鶏各1羽に10，50mg／kgを最終投与した．
投与後0．5，2，6時間後に局所麻酔剤塩酸プロカ

4．筋ジストロフィー病態動物におけるロイぺプチンの筋肉内濃度

イン筋注下，経時的に筋肉1gおよび血液を採取した．血液はアングロットを1滴添加し，3，000

筋ジストロフィーマウスおよび筋ジストロフィ

rpmlO分間遠心分離し，血鷺を得た・

鶏においてほ，蛋白分解酵素であるlysosomal

3）筋ジストロフィー鶏の筋肉および血薮中濃度の測定

protease15）あるいは Calcium activated neutral

筋肉および血液は1−B）に準じて，抗血清Aを

protease161活性の著しい克進が認められており，
筋肉内組織におけるLeup濃度が薬効に大きく影用いてradioimmunoassayにより測定した．

響するはずである．そこで，筋肉および血渠中の

4）回

収

率

Leup濃度の関係および筋肉組織内のプロテアー

正常成鶏（line412），筋ジストロフィー成鶏

ゼ活性とLeup濃度の関係を明らかにするため，（1ine413）および同雛鶏（1ine413）の浅胸筋1

筋肉内のLeupを測定した．

gをそれぞれ20％ホモジェネートとした．このホモジェネート

実 験 方 法＿

0．2mgにイヌ血祭0．1mち［3H］一Leup17．5，35，70，140ngを添加し，370C

1）実験材料

2時間インキュべ−トした．インキュベーションa）標識化合物

終了後，7mgのエタノールで除蛋白し，遊離およ［14C］−Leup（16．48mCi／mmol）および［3H］−

び結合型Leupを分離し，￣沈澱および上清中の放Leup（473．5mCi／mmol）は才野ら17）により合成

射能を測定した．

されたものを使用した．

5）全身吸着オートラジオグラフィ￣−川筋ジズトロフィー々ウスわ全身凍結切片をテーb）実験動物i）C57BL／6J−dy

7遇齢の筋ジストロフィ

プの着いたまま0．1FLCi／0．003mg／ml水溶液中で−−109−

50Cで10分間インキュベーションした．切片は，とを考え合せると，結合型Leupは多くとも数％

冷蒸留水で3回水洗し，ドライアイス表面で凍結，の量であった．したがって，EtOH上清中の乾燥した．以後は3に準じてオートラジオグラム

Leupの定量は，筋肉内Leupの量を反映していを作成した．

ることが明らかとなった．
2）マウスにおける［14C］Leupの筋肉内濃度
マウスに［14C］Leupを皮下投与したときの後実験結果および考察
1）回

収

率

肢筋肉，血祭，肝lysosome中の放射能をLeup

筋肉内に存在するLeupは筋肉内のプロテアー

換算した値を表8に示す．投与後30分では，筋ゼと enzyme−inhibitor（E・Ⅰ）complexを形成しジストロフィーマウスが正常マウスに比較して高てプロテアーゼ活性を抑制することが期待される．

い筋肉内濃度を示した．一方，筋ジストロフィー

したがって，筋肉内Leupはプロテアーゼと結合および正常マウスにおいて，筋肉中Leupの減衰

して存在しB／F分離のエタノール除蛋白では，は血祭中よりも遅い傾向を示した（図21）．肝沈敦中にLeupが移行する可能性があった．筋肉

lysosome中Leup

内のLeupの測定法は，1の方法によれば遊離型の方が正常よりも遅い傾向を示した．

の減衰は，筋ジストロフィー

のみしか測定できない．そこで，筋ジストロフィ

3）腹腔内達統投与における筋肉内濃度

ー成鶏，筋ジストロフィー雛鶏，正常成鶏の浅胸神経センターで4カ月間腹腔内達続投与した筋筋の20％ホモジネートからエタノール除蛋白にジストロフィー鶏に10，50mg／kg腹艦内投与しよる［3H］−Leupの上清中への回収率を表7に示たときの筋肉濃度を図22に示す．10mg／kgでは，

した・ほとんどのLeupはエタノール上溝中に存

投与後2時間で筋肉1g当り

在し，沈澱中のLeupは非特異的な吸着を含むこが検出された．この数値は，3で述べた一回腹腔

表70．66FLgのRecovery of［3H］leupeptinin supernatant and precipitate
Obtained by deproteinization witll ethanol

嘲dde㈲

Leda

Recovery（％）

plasma器諾ith慧霊 還監h
8

3
9

0

7

3
9

5

6

7

7

2
9

0

0
0

8

6

Ppt

3

6

7

Sup
2
9

6

8

6

2

2
9

2

4

7︐

1
9

3

1

4

7

3
9

8

3

3
9

7

2
9

8

ppt

一

3

7

2
9

7

2

Sup
2

3

3

7
9

3

PPt

3
9

2
9

3

6
9

9

6

3

6
9

7

7

0

Sup

4

3

5

ppt

6
9

5

1

7

Sup

5

7

6

7

0

1

一

4

表8 Tissue concentrations ofleupeptinin mice after subcutaneous administration ofleupeptin（30mg／kg）

Concentration ofleupeptin（FLg／g or ml）

Muscle Plasma
0．5

Muscdlardystrophy

NormalLiver Liverlysosome

2．0

6．0

0．5

2．0

6．0

0．5

6．521．97

0．42

38．32

3．42

0．2311．97

2．0
7．78

6．0

5．37

0．5

2．0

6．0（hr）

3．18

2．66

0．51

3．15 2．35 0．5216．39 1．93 0．23 26．01 8．45 2．07 8．67 3．43 2．23
−110−

Leup

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究

内投与後の筋肉内濃度とほぼ一致しており，連続投与による蓄積性は血液，筋肉において認められ︵uJO−E＼琶︶u ︻gnj

ないことを示唆している．
以上の筋ジストロフィーマウスおよび同鶏の筋

肉内濃度の実験結果は，実験例が少なく統計処理ができないので，さらに今後の検討を得たねばな
らない．また，今回の筋肉内濃度はラジオアイソ
トープ法あるいはradioimmunoassayにより定量した．1の定量法で述べたように，今回の定量法は024

代謝物をも含めて測定しているので，CrOSS−reaC−

6

Timeafter admirlistration（hr）

tivity のない新たに調製した抗血清を用いて筋肉

図2l Plasma and muscle concentrations ofleu−

内濃度の測定を検討する予定である．

peptln after subcutaneous administration of4）［14C］Leupの全身吸着オートラジオグラ

leupeptin（30mg／kg）in normal and mus−フィー

Cular dystrophy mice．

Leup と筋肉組織との親和性を，図23 に示すように吸着オートグラフィ一により検討した．

Leupは脳，筋肉，腸管および軟骨に最も高濃度︵uLヱE＼加ミ︶u苫鼠コOJに吸着し，ついで心臓＞脾臓＞腎臓＞肝蟻の順に吸着した．肺，褐色脂肪にも弱い吸着が認められた．標的組織である筋肉に高濃度に吸着したこと
は，昨年度の本報告の全身オートラジオグラムとは対照的できわめて興味深い．この結合がプロテ
アーゼーLeupのいわゆるE・I complexであるのかどうかを今後明らかにしたい．飯も血相の吸着
0

2

4

6

Timeafteradminjstration（hr）

オートラジオグラムにおいてLeupの筋肉組織へ

図22 Plasma and muscle concentration ofleupep−の吸着性の強さほ，f乃ひね0 での親和性を示唆し

tin after repeatedintra−peritoneal admini−
Stration ofleupeptlnin musculardystrophy
Chickens，ている・しかしながら，筋肉内Leupの量はかな
り低い値を示した．Leup の筋肉組織への親和性

図23 Autoradiogram showing the distr・ibution of radioactivity afterincuba−tion of［14C］1eupeptin with mouse whole−body section．
−111−

に加えて筋肉組織への移行の問題が今後の大きな

1）飼料の調製法

課題であろう．

乳糖，およびPVP（ポリビニルピロリドン）

を賦形剤として，Leupを10W／W％含有する16Ⅲ． 製 剤 研 究〜24meshの粒度の顆粒を常法により調製し，つぎにTC−5（ヒドロキシプロピルメチルセルロー

ス）を用いてコーチングし，飼料添加用顆粒とし

1．硫酸ロイベプテンの安定性に関するた．さらに，通常使用するニワトリ用飼料に本顆研究粒を混合し，Leup2W／W％含有飼料を調製した．

A．原未の安定性

2）飼料中ロイぺプチンの安定性

昭和54年度研究に引き続き，硫酸ロイペプチ
ン（Leup）原末の光に対する安定性を試験した．

1）で調製した飼料添加用顆粒，およびこれを含有した飼料をおのおのビニール袋に入れ，室温，結果を表9に示す．白色透明瓶に密栓して入れ，白色蛍光燈1，000ルクス下30日，および自然直

非加湿および250C，75％RH（相対湿度）加湿の条件下に保存した．

射光下60日間保存後観察をしたが，含量の低下

結果を表10に示す．室温，非加湿3カ月では，は認めなかった．また，着色，固結等の変化も認

約3％程度の含量低下を認めたものの外観変化

められなかった．

なく，ほぼ安定であった．250C75％RH加湿3カ
月では，含量低下は顕著であり，加湿に対して不安定なことが判明した．含量低下の50％からB．ニワトリ用飼料の調製
Leup の筋ジストロフィー鶏投与実験に用いる

80％がラセミ化によるものであった．
本研究で調製した飼料添加用顆粒および本品を飼料についての検討を行った．

表9 The effect oflighton the stability ofleupeptin
Content ofleupeptin（％to theinitial）

Appearance

レform D−form

Initial lOO．0

0．0

White powder

壬も慧霊云t3号i謡；105・5

0．0Sunlight：60days

O．O White powder

99．6

White powder

表10 The stability ofleupeptinin the feed for chicken
Preserved

Initial Roonも慧荒言ture
L−form D−form App．
Leupeptin granule lO0．0
Feed for chicken（COntaining the lOO．0
Leup granule）

0．0

0．0

White
gran・

White
gran・

25OC75％RH3months

L−form D−form App．
97．2

96．8

App．，appearanCe．
−112−

1．7

1．6

White

L−form I）−form App，
68．7

24．6

White

gran・

gran・

White

White

gran・

70．8

14．1

gran・

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究配合したニワトリ用飼料は，吸湿を避けるために

2）各製剤サンプルの調製とその安定性

ビニール袋に入れて，さらに缶等の容器に入れ，表12に，各投与ルート製剤の処方，および常気密に保存しつつ使用することが必要である．

法により調製した，各製剤サンプルの室温および25cc1カ月保存後の含量の残存率の測定結果を示した．その結果，いずれの製剤サンプルにおい

2．硫酸ロイぺプチン製剤の研究ても，含量は低下せず，外観も変化せず安定であった．

Bioavailabilityが良く，局所刺激性をはじめとする副作用が少なく，また投与しやすい剤型およ3）考察

び投与ルートを明らかにする目的で，今回はその表12に示したように，各製剤における Leup
は安定であることがわかったので，これらを基礎的実験を行った．

bioavailabilityの検討用試料として用いることにこのため，まず，投与ルートの選定に供しうる各製剤サンプルを試製し，それらの安定性についした．ただし，静注投与は別に生理食塩水溶液て検討した．さらに，試製した製剤を用いて投与（昭和54年度研究報告書，p．85参照，25cc1日

ルートのスクリーニングを行うべくピーグル犬に保存後の残存率は約98％である）を本実験では投与し，bioavai1abilityを検討した．

用時調製して用いた．
B．硫酸ロイぺプチンの各種投与経路

A．製剤の試製とその安定性
1）予におけるbioavailabilityの検討

試㌧験

経口，舌下投与製剤用斌形剤として，乳糖，

Leupの投与ルートを選定する目的で2−A

D−マンニトール，PVP（ポリビニルビロリドン）で作成した各種製剤を用い，イ封こおける血中濃およびHPC−L（ヒドロキシプロピルセルロース）

度測定によるbioavailabilityの比較実験を行った．iを選び，Leup との配合安定性を調べた．結果を表11に示す．この結果，経口，舌下投与製剤用

1）実験方法

既形剤として，基剤としてほ D−マンニトール，a）試

結合剤としてはPVPが適当であることがわかっ

表11に示した各製剤を用いた．静脈内投与は料

Leupを用時生理食塩水に溶解し（20mg／ml）ミた．

表11The effects ofexcipients andbindersonthestability ofleupeptin
Binders

Excipients

InitialL−formp−formAppearanCe

Preserved
for6months
at room
temperature

L−formD−formAppearance

Preserved
for15days
at65．20C

L−formD−form＊＊＊Appearance

Lactose D−Mannitol

PVP＊

HPC−L＊＊

100．0
0．0

100．0
0．0

100．0
0．O

100．0
0．O

White WhiteWhite White

powderpowderpowder powder

94．4
0．0

100．4
0．0

93．5
1．7

36．2
34．7

White WhiteWhite White

powderpowder powder

powder

53．0
38．6

50．1
23．7

40．3
46．2

15．1
6．4

White WhiteWhite White

powderPOWderpowderLuviskoIK30，pOlyvlnylpyrrolidon．
HPC−L，hydroxypropylcellulose．
−113−

powder表12 Stability of various formula ofleupeptin

Content ofleupeptin（％toinitial）
Preserved at Preserved
room temp．（1hl）
at25OC（1M）

Appearance

LTform D−form L−form D−form082
18

Leupeptln
D−MannitoI

Granule＊

White
104．2

98．6

granule

98．3

115．7

Supp9Sitor・y

100．4

ointment

PVP−K30＊＊

White

Suppository Leupeptln l

斑岩2…21199
5

Ointment

Leupeptin
5
D−Mannito195

Powder

＊

White

5
9

Leupeptln
Plastibase
50W＊＊＊＊

101．5

100．3

White
powderGranule，Oraland sublingaldosage form・＊＊

PVP−K30，LuviskoIK−30（polyvinylpyrrolidon）．

＊＊＊

WitepsoIH−15，Dynamit NobelChemicals Co．

＊＊＊＊

Plastibase50W，Squibb Co．

リボアフィルター（GSタイプ，0．22′

2）実験結果m）濾過を各投与経路における血中濃度パターンを図行った．
経口投与および舌下投与は顆粒剤をおのおの
20mg／ml，100mg／mlの濃度に蒸留水に用時溶解

24〜28に示した．排泄速度定数（足。），半減期（fl／2），AUCを表13に示した．

して用いた．

静脈内投与では血中濃度は二相性を示し，投与b）投与方法および血中濃度の測定

後10分で21．05／g／mJの血集中濃度を示した．

雄性ピーグル犬（体重10〜13kg，成犬）4頭

α相（distributionphase）のKdは2．67（ll／2＝
0・25hr）でβ相（eliminationphase）のKdはを用い，クロスオーバー法により行った．
Leupの投与量は10mg／kgとした・各投与方

0・52（fl／2＝1．37hr）であり，両相の変換点は30

法と採血時間はつぎのようにした．
i）静脈内投与：前肢静脈より投与し10，20，誼）経口投与：強制投与し，0．5，1，2，4，8，
24時間後に採血した．
揖）舌下投与：強制投与し，0．5，1，2，4，8，
24時間後に採血した．
Ⅳ）経皮投与：腹部15cmx15cm
10cmxlOcm

を脱毛し︵雲ESd−d−∈＼琶︶Uミ邑nqJ

30分，1，2，4，8，24時間後に採血した．

に軟膏を塗布し表面をサランにより覆い，0．5，1，2，4，8，24時間後に採血した．
Ⅴ）直腸投与：0．5，1，2，4，8，24時間後にTimeafteradministration（hr）

採血した．
Leupの血中濃度測定は，ⅠⅠ−1−A competitive

国24 Plasma concentration ofleupeptin afterin−binding radioassayに準じて行った．

tra−VenOuSinjectionofleupeptin（10mg／kg）
in dogs．

−114−

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究︵昌Sヱd一E＼琶︶u宣鼠n︒J︵言Sdldl∈＼琶︶u宣邑nj

図25

図26 Plasma concentrationofleupeptinaftersub−

administration ofleupeptin（10mg／kg）in

lingualadministration ofleupeptin（10mg／

dogs．

kg）in dogs．

Plasmaconcentration ofleupeptinafterper一
cutaneous administration ofleupeptin（10Plasma concentration ofleupeptin afterin−︵言SdtdtE＼琶︶亡亘鼠ココ

Plasmaconcentration ofleupeptinafteroral

Timearteradminstration（hr）

図27

図28

tra−reCtal administration ofleupeptin（10mg／kg）in dogs．

rng／kg）in dogs・

表13

Pharmacokineticparametersobtained forseveralroutes ofleupeptin
administratedin dogs

Route ofadministration

Dose

tl／2

（蒜昌）

崩

Zr

gd

AUC

（〟g叫mりMaximum conc．

雲お等冒

0
1

冒溜妄言】岩：…≡〔封15・31（100・0） 21・05（0・2）Intra−VenOuS
0
1

Per os0

Sublingual

1

Intra−reCtal

0 0
1 1

Percutaneous

1．38

0．53

2．76（18．7）

1．15（0．5）

1．29

0．64

3．09（20．2）

0．82（2．0）

1．40

0．55

3．96（25．9）

1．18（0．5）

0．56（3．6）

0．03（8．0）

ー115−

分から1時間の間であった．
経口および直腸投与後の最高血祭中濃度はそれ実験方法ならびに結果

ぞれ1．15／唱／mJ（30分），0．55（1．40hr）で，両1）ロイベプチンのネコ脳波，心電図および血投与後の血中濃度曲線はきわめて類似した．また圧に対する作用

半減期は静注β相の半減期とほぼ同じ値を示した．

脳波および心電図に対する最大無作用量を検討

舌下投与においてほ投与後2．Ohrで0．82／瑠／するため，ガラミン不動化ネコにLeupを静脈内

mJの最高血集中濃度を示し，方。0．64，り21．29

持続注入した．皮質脳波および深部脳波誘導法はhrであった．このときの最高血中濃度時間には第1報とまったく同様に行った．心電図は第Ⅰ誘個体差が認められた．

導にて記録した．大腿動脈圧を同時に記録した．

経皮投与においてほ，投与直後から24時間まLeupl，3および10mg／kg／minで10分間ので，検出限界付近の血梁中濃度を示すにとどまっ

持続注入中あるいは注入後における脳波は，投与

た・なおNDは検出限界の1／2を使用した．

前に比較して著明な変化が認められなかった．心各投与経路における静脈内AUCに対する面積

電図に関しては，10mg／kg／minで注入開始約3

比は18・7％，舌下投与20．2％，直腸投与25．9％

分後より，RR，QT，およびPR間隔が明白に延および経皮投与3．6％であった．

長したが，その他の変化はほとんど認められなか直腸投与群中に投与後約3時間から24時間にった．一方，血圧は用量に依存して下降し，10かけ血便が観察され，全頭の宿便中に潜血反応がmg／kg／min，10分間の注入では著明な下降を示し認められた．局所毒性を観察した結果，大腸部にた．心電図および血圧の変化は注入中止後約60

限局性の急性ulcerおよび粘膜上皮変性が肉眼的，分で回復した．3例のうちの代表的な1例を図

組織病理学的に認められた．

29に示す．

3）考察

2）ネコ脊髄反射電位に対する作用

Leupの各投与ルートによるAUCは，静脈投ウレタン（1．2〜1．5g／kg）腹腔内投与で麻酔し与≫直腸投与＞舌下投与≧経口投与≫経皮投与のたネコ（2〜3．5kg）を用いた．坐骨神経を電気刺順であった．AUCのデータに基づいて投与経路

激装置（日本光電，MSE−3）で刺激（条件：0．2を選定するならは，上記の直腸，舌下，経口投与

Hz，0・05msec，SuPramaXimal）したときに生じとなるが，Leup の直腸投与は局所毒性が明らか

る反射電位を同側のL7の前根より導出した．反であり，採用すべきでないと考えられる．この結射電位は，オシロスコープ（日本光電，VC−7）で果，経口投与および舌下投与がLeupの投与方法として最適であろうと判断された．

観察し，加算装置（三栄測器，7S O6）で，10

また，標的器官である筋肉内濃度で選択すべきであるとするならば，その測定法を確立してさらに投与経路と製剤を選択する必要がある．

回加算したのち，Ⅹ一Y レコーダー（日本光電，
WX−4401）上に記録した．脊髄弓切除した脊髄は背部の皮質でパラフィンプールをつくり，一定の温度に保った．プール温度およびネコの体温はそれぞれ36〜370Cおよび37〜38〇Cに保った．

Ⅳ・

ロイペプチソの一般薬理作用

Leup3および10mg／kgの静江により脊髄反（第2報）

射電位はほとんど変化しなかった．2＿例のうち1例を図30に示す．同時に記録した大腿動脈圧は

第1報17号こ続いてロイペプチン（Leup）の一般
薬理作用をさらに検討し，以下の結果を得た．

15〜40mmHg低下したが，2〜14分後に回復し
た．

−116−

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究
CONT

CONT

FC√…
PCJWや仰山叶〜仙小舟小叫…叫

仙叫刷叫小爪ん〜、一心．

OC・ノ．、・人■■−〜−，1−ヘル｛岬一一小ヽ一一ヽノヽ

ゾー佃…ヽルル．小一
碑仙叫両軸項瑚軌叫

HIPP−小畑世叫坤両州咄佃
30mg／kg．i．≠

100mg化g．i．V．

￣Jノヽ■・′一一▲仙

勅棚減叫佃冊吋刷小mmト垣

30mgJkg．Lv．

扁cl001JV

100mg化9．Lv．

J

CONT

H t Hl Hi H H
日日・【品山鳥晶山鳥品龍山晶30mgJkg．i．V．

l日日十日上目卜上目日日＝日日
山高山肌山肌揖品揖品

一一日日日日日日日l巨日日」」Hl日日日日
減最高品晶混歳品晶混品
100mg／kg．LV．
！盲iii

−

■

！■l

−

i

．晶山山肌鳥山山人山人五山鳥人鳥山ン

・1筑

lseC
図29

Effect ofleupeptinonEEG（upper），bloodpressure（middle），andECG（lower）in a gallamineTimmobilized cat．FC，frontal cortex；PC，parietalcortex；OC，OCCipitalcortex；HIPP，hippocampus；AMG，amyg−

3）無麻酔イヌの血圧および心拍数に対する作 および心拍数低下を起した（図31）・
用

結論ならびに考察

第1報17）で同様の実験を行い，Leup50mg／kg
経口投与では血圧および心拍数はまったく影響を

1）ガラミン不動化ネコの脳波に対して，ロイ

受けないことを報告した．今回はさらに用量を増

ペプチン1，3および10mg／kg／minで10分間の加して検討した．実験方法は第1報とまったく同

注入は，ほとんど作用を示さなかった・心電図に様に行った．

関しては，その波型は上記注入量により影響を受

LeuplOOmg／kgの経口投与は軽度の血圧低下

けなかったが，RR，QT，およびPR間隔の延長−117−Before以上の結果から，静脈内投与による最大無作用

此」

量は，脳波および心電図により判断すると，10
mg／kg以上と結論できる．
また，経口投与による最大無作用量は，イヌの血圧に対して50mg／kgから100mg／kgの間とLeupeptinlO mg／kg，i．V．

結論できる・第1報17）ですでに述べたように，
5min

Leupによる降圧あるいは徐脈はその節遮断作用に基づくものと思われる．

」、′

ラット摘出脊髄に対してLeupが作用しないことはすでに大塚ら18）により報告されている．今回のネコ f乃∫fJ〟標本を用いてLeupを静脈内投

十皿二

10min

与した実験の結果は彼らの結果とよく一致した．

Ⅴ．毒 性 試 験
30min

図30

＿∴」

1．ロイベプテンのイヌ静脈内投与における急性毒性

Effect ofleupeptin on spinal reflexin the

Leup のマウスおよびラットにおける急性毒性

urethane anesthetized cat．

0

体重8．6〜11．0kg）を用い，静脈内投与による急たイヌ経口投与における急性毒性も筆者ら20）は報

トト

︶
−

︵u叫∈＼一q︶﹂ ■ ト ■ ト ト0
0 0︵uHEE︶
dn

告したが，今回，雌雄ピーグル犬（10〜12カ月齢，は，すでに田中ら19）によって報告されており，ま性毒性を検討した．
0

30

60

120

180

投与量は，141，100，71および50mg／kg（50Time（min）

図31Etfect ofleupeptin（100mg／kg）p．0．0n
bloodpressure

and

heart

rateinacon＿

SCious dog．

mg／kgから始め，公比J官でup and down

方式で設定）で，各投与群に雌雄計3頭以上〔Dog No．1，2，3（以上雄），4，5，6（以上雌）〕すなわち心拍数低下が10mg／kg／minの注入によを用い（ただし，50mg／kgは雄1頚），各投与量り認められた・血圧に対してはLeupは低下作用に相当するLeupを投与直前に，イヌ1頭当りを示し，10mg／kg／minの注入ではその作用は著10mgの投与容量になるように滅菌した生理食塩明であった．

液に溶解して，給餌前（AM8：30〜9：30）に，原

2）ウレタン麻酔ネコ脊髄反射電位に対しては
Leup3および10mg／kg静注は作用を示さなか則として約5m〃minの注入速度で静脈内投与し，14 日間観察した．

った．

1）一般症状・■3）無麻酔イヌの血圧および心拍数に対して，投与半ばからすでに全身脱力と同時に呼吸抑制

LeuplOOmg／kgの経口投与は軽度の低下および〔腹式で弱く不規則，間軟性で呼吸数の減少と，減少作用を示した．

ときに深呼吸がみられ 高用量投与群では一過性−118−

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究

2）血液検査慧 割 だ l投与斬欄潤 】∩ 5 ln n
l0
l
l
1
ンニ●
2
3
ウ1●
14 1 45／●
6／●
il
100 【2
13

71

1
2
3
4

20
l

m
l

投与終了子
麦
40
50
l
l

6n
l

78
l

投与前，投与3，7，14日後に前肢槙側皮静脈

80分
lから採血し，また死亡例については参考のため死l

亡直後の心臓採血を行い検査した．最高用量141l

mg／kg投与群の検査成績を死亡例，生存例別に分類し，表15（1）（2）に示した・さらに，参考の

／ノ／／●
t

ため低用量71mg／kg投与群（雄3頭）を用いて，

l

一部の血液凝固系検査について投与後の経時的推lll移を測定し，表16に示した．血液学的には，死l50 妻1 l亡例に共通して白血球数の減少，リンパ球比の増l加，血小板数の減少，活性化部分トロンポプラス
図32 ロイペプチソイヌ急性毒性（i．V．）における急性（呼吸抑制）の推移（投与終了後の症状発現持続時間）．医死亡，□生存，＊死亡時点．

長が著明に認められた．また表17にみられるよ表14 ロイペプチソのイヌ急性毒性（i・Ⅴ・）うに，生存例（死亡のみられない低用量71mg／kg投与群）においても投与直後から血小板数の投与量 死亡率（死亡動物数／実験動物数）
雄

1
4
1

3
3
3
1
． ／
／
／
／
2
1
0
0

0
0
1

（mg／kg）

チン時間（APTT），全血凝固時間（WBCT）の延減少およびAPTTの延長が一過性で著明に認め雌られ，死亡，生存例を問わずLeup投与直後の末

2／3

梢血は，一過性に内因系の凝固因子に対し強い阻

1
7

0／l

LDo

害作用を受けていることが認められた・一方，血05

液生化学的には，死亡例に共通してGOT，GPT，の呼吸困難から呼吸停止がみられたので，その時点で投与を中途停止し，呼吸の回復を待って徐々に投与した。したがって投与所用時間が延長した（図32）〕に続いて，口腔粘膜の蒼白，瞳孔散大，
限瞼下垂，限瞼反射の鈍化などがみられ，投与終了後は横臥の状態のまま呼吸抑制が継続し，次第にチアノーゼ症状が進行し，呼吸困難をきたし，ついには呼吸は停止して投与10分以内に死亡す

CPK値の軽度の上昇およびUA値の著明な上昇が認められ，また，GLU，LDH値にも軽度の上昇がみられる例があった．生存例ではGPT，LDH
値の上昇が残存性所見として投与3または7日後の検査で認められたが，観察期間終了時には回復した．死亡，生存例を問わず一過性で軽度な肝障害が推察され，また死亡例でUA値の上昇にみられる急性の代謝異常が認められた・
3）尿る例が100mg／kg以上投与群にみられ，最高用量141mg／kg投与群では雌雄ともに2／3例が死亡した（表14）．生存例では，呼吸抑制は経時的検

査投与前，投与3，7，14日後に15時間尿（PM5：00〜AM8：00）を採取し検査した．

に徐々に回復し，それに伴ってチアノーゼ症状も

表15，16に示したように，死亡例，生存例とも回復を示し，また心拍も正常となり，投与13〜に著変は認められなかった．なお，尿沈漆にも異74分後にはすべての症状は回復した（図32）・症

常はみられなかった・

状回復後はほとんどの例に食欲がみられ，投与24）病理学的検査日目以降も食欲旺盛で一般症状にはとくに異常は

動物は，死亡または観察期間（14日間）終了時

みられず，また体重は観察期間中ほぼ横ばいで正屠殺後，直ちに剖検し，主要の臓器について病理常な推移を示した（表15（2））．

組織学的検索を行った．肉眼所見では，死亡例に−119−Dose（mg／kg）

表15（1）ロイペプチソのイヌ急性毒性（i．V．）における血液検査値および尿検査（死亡犬）

Dog number

1

115

117
5．5

4．9

5．3

1．5

6

3
5

9

9

●

3

．

4

6

3

．

9

8

1

●

0

3

8

．

1

0

4

．

0

0 9 ．
4 5 3

6

8

3

8

輌1
6．
5一一一一一土
0740556土一一一一土
0綿425．土一一一一土
06
1

A，投与前に採血；B，死亡直後に心臓採血（投与終了後10分以内に死亡）．
＊15時間尿（PM5：00〜AM8：00）．
＊＊剖険時膀胱貯留尿．

．

土

2

．

0

．

9

土

9

0

3

2

．

3

土

8

3

8

0

土

9

3

6

4

土

5

1

9

4

土

6

＋

3

4

3

Occult blood

5．5

8 4 3 7 4
6 5 5 ． ．5

1

4

Bilirubin

6

土972186004534
1415157・0・1O
2l
．・
1．
35011

1

●

︐

50

1．080

■

◆

3

3

＊＊

1．060

9

︐

●

60

1．090

3
3

5

5

m m m

＊＊

1．060

0

1

3 9 7 3 0 3
1 2 4 6 ． ．5

d d＜Urinary value＞

ず
1150せ16038592010
還

112

5．2

6 1 6 33 3 ．．3
3

5

1 0
．．5
3

2

0．71

8

75．6

7
．

6

●

115

5．4

8
4
●

2
7
●

4
6
3

41．2

5

69

2

●

20．4

109

5

5

3
8

3．06

3

0 1 5 39 7 ．．0

4

●

2

5．78

4

謡乳叫叫酬

−120−

5

9

11．0

10．7

2
4

144

7 6 1 ． ．6

96

117
一 ′ ■

166
l ▲ ■

107

2

1

5 1
2

18．0

1

13．3

1

1
2

0．02

1

111

0．14
●

160

0．13
0

150

17

6

36．4
46．6

0
0 8
8 9
．
0 6
5 1

3．9

2

26．1
30．0

4

152
4．4

5

51．3
65．5

3 0 1
．2
4 1 5

144

3．8

6

5．4

7
6

7
4
1

143

4．9

1

4．7

8
4
7

ず

4．6

8
2

1．7

5．8

9
1

135

d

0．97
1．06

g g
m m

Ketones6

土Urobirinogen

147

4．0

．叫嘲嘲嘲瑚嘲認勒坤酬酬

Glucose6

土pHProtein

1．2

5．5

80
52
㍍8
n・
1 54
2W
2l
・
O 4 0 6︒
67
2︒ 7 ︒
4116

Eo

147

ず
6 6 5 172
5．
．
8211350せ2203166102
50．1
1 4 1 5
6票川⁚蒜

Ba

0．84

6●
0・
22
12
3・
7●
〃0
23
06
72
43060
4
7
21
75
12
31
5
1
■

Seg
Ly
Mo

2．0

ず
11
0．
．
5161
03
せ5
1 1 0 3720
50 1 1
6芸還

Sta

1．070

S．G．

638
8M
13
5
7
・
1
2
9
5
・
針 1 4 ︒ 17
61
4︒
27 ︒
411

0

WBC

kg lO．2

B・W．

％
Ht

55

mJ＊

Volume

98
5．
．
614
71
5
0 せ 1 8 00
36 8 0 0 2 065116品Hb g／dt
Reticulo． ‰PL xlO3
APTT sec
WBCT

×％％％％％％％

Others

63
︒3
5
14
・
1・
︒ 14
1W
88
35
・︒ 56
52
3︒ 7 ︒
4117＜Hematology＞
RBC xlO4

1．3

A

B
B

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究
表15（2）ロイペプチソのイヌ急性毒性（i．Y．）における血液検査値および尿挨査（生存犬）
Dose（mg／kg）
Dog number

Days after treatment

5．4

1．4

1．4

1．5

5．5

6．2

6．5

37．2

27．8

5一
0．42129．
6㌢89079137010
6
7
11
7211
5
1

117

5．1

Others

0
0

．

0

1
1

1．2

3
6

4

7

2
8

0

113．2

4

232．5

．

．

34．0

3

8

4．7

24．9

2

2

5．8

0
0
9

2

0

．

9

0

1
1

4
3
8
1

●

3

1

．

3

5

0

5

0

6

3

■

0．47

3

．

0

139．1

0．55

■

︐

4

3

6

57．2

3

8

2

4

4

●

30．7

5

6

9

3

．

359

33．2

9

3．32

76

4

3．54

5

7

2

5．39

■

7

2

111

5．80

9

1

2

0

●

120

0

．

9

108

●

2

1．05

103

0

0

10．9

0．74

0

．

2

11．5

7

0

1

0．04

1

8

4

173

0．07

．

●

1

206

2

1．6

1

6

5．1

5

●

112

5．3

．

2

117

5

4．2

4

7

1

150

4．4

5

．

1

145

1

4

7

．

3

0．58

1

52．4

0．45

5

81．2

64

l

．6

︑

26．5

●

27．0

1

．3

0

77

1

3．52

242

■

3．40

47

0

34

1

5．49

2

5．14

3

14

5

115

2

108

4

92

1

94

5

98

1

0．87

4

CPK
UA

13．1

3

IAP

9．3
0．59

1

LDH

0．03

9

ALB

0．04

0

TP

15

8

CHO

144

．

GLU

230．9

207

1

CRN

758．7

3

BIL
BUN

．6

38

●

GPT
ALP

︐

GOT

l dU QU 5 1 1 1 2 4 4 7 3 6．4
0 1 1 ．5 ．1．．1 6 7 ．
3 2
0 1 0
5 3
2 5

Mg
IP

4

Ca

1

／
／
／d

CI

憲嘲瑚嘲筑榊坤醐酬酬醐酬抑盟刷刷吋

K

207262543151725444271
L4
〇1
●5
l1
︐5
︐3
︐2
1
00
5■
39
10
00
・1
13
36
0■
・■
14
1・・180・
5
32
60

e
h
C

＜Blood
Na

4U
5■
．2
22
9．
㌢260612
95050
日
■2
■2
7
91
62
1
1
4
1

118

5．2

4

113

0

4．1

6

145

4．1

︻3

143

3．7

1α

141

4 1

Eo

9 5 6 6 1 9 〃 7 1 4
3 ． ．1 8 ．0 4
6 2
7 9 6
1 1 3 1

Ba

3︶
0．
9．
r2
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44り803史J4070
﹁
7
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3．0953
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62
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3321
4
1

Seg

○︼

Sta

0

×％％％％％％％

WBC9●
5 7 9 6 34
一α 1
8 0 6 9723 0 1 0
7
5
91
3211
3
1

％

Hb g／dJ
Reticulo． ‰PL xlO3−APTT sec
WBCT

6t
0．
6 1 3 120伊．1
405
14
14040
8
5
01
3221
4
1

Ht

63
〇．
一
4 1 3 244訂．0 5 0 67
92
20 2 0593221
311＜Hematology＞
RBC xlOI

●

土

5

土

一

土

6

7

土

6．5

0

土

1

6
＋

150
1．045

2 ．
0 6

6
＋

370
1．015

5
2

6

＋

100
00
6
55
・
土

l

6

pH
Protein

0

40
1．080

0

20
1．060

1

60
1．080

508

mJ＊

S．G．

0

＜Uuinary value＞
Volume土

GlucoseKetones
Bilirubin
Occult blood
Urobirinogen

B．W．

kg

9．4

9．5

10・1

9・6

＊15時間尿（PM5：00〜AM8：00）

−121−

土

9・4

土

9・3

土

土

9・4

9・4

表16 ロイペプチソのイヌ静脈内投与後における血液凝固系検査値の推移

検査項目

投与量

晶

投与前

1時間

2時間

3時間

5時間

132

152

0
5
1
＞
0
5
1
＞

3

図34 肝臓・100mg／kg投与群No・1イヌ（死亡）．血液のうっ浦に伴う類洞の拡張・肝細胞の萎縮がみられ，さらに胞体内には中空胞が認められる（HE染色
−122−

−

＝1
5
・
1
4
・
1
5
・

3
3
1

2

＝
7
7
・
3
4
・
4
8
・

8
8
1

1

≒王で轍こぶ
図33 肝臓・71mg／kg投与群No．1イヌ（生存）著変なし（HE染色 ×75）．

＝警一

37

≡琵喜衝漉

×75）．

6時間

6
1
1

3

＊＊症状回復時．

30分＊＊
一918一505
01＞
1＞71mg／kg

5〜7分＊
201310一一一

APTT（SeC）

2

71mg／kg

92
96
9．
6
5
11
71
11
11
1
1
2

1

PL（×108／mma）

投与終了後経過時間

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究

図35 腎臓．50mg／kg投与群No．1イヌ（生存）．近位尿細管上皮胞体内にPAS陽性顆粒が認められる（PAS染色 ×150）．

図36 腎臓．141mg／kg投与群No．1イヌ （死亡）．近位尿細管上皮胞体内にPAS陽性顆粒が認められる（PAS染色 X150）．
共通して肝臓，腎臓および脾臓のうっ血が強度にれなかった（図33，34）．腎臓では，死亡例，生みられ，腸管全域の充うっ血も認められたが，生存例ともに皮質近位曲尿細管上皮胸体内に糖県顆

存例ではすべての臓器に著変はみられなかった．

粒の出現がびまん性に軽微ないし軽度に認められ病理組織学的所見では，死亡例に共通して総体的た（図35，36）．骨髄では，生存例（4／9）に骨髄に各臓器とも血液のうっ滑が著明で，とくに肝臓脛内における未熟琴および組織球の増生牢ミ軽微にで循環不全によるうっ血および乏酸素血性甲病変

観察された（国37）が，死亡例では器質的変化埠と考えられる類洞の拡張，肝細胞の萎縮および胞

ほとんど認められなかった（図38）・

き

体内における中空胞の出現がびまん性に軽度に観

5）結論および考察察されたが，生存例では何ら器質的変化は認めら

Leup のイヌ1回静脈内投与における致死量時，Tr123−−丁畏て、、夢

巨肇寸．ぎ竃

図37 骨髄．141mg／kg投与群No．2イヌ（生存）．全般的に卵円形核をもつ幼弱細胞がやや目立って認められる（HE染色 ×150）．

図38 骨髄．141mg／kg投与群No．5 イヌ（死亡）．器質的変化は認められない（HE染色 ×150）．
雌雄とも100mg／kg以上にあり，LD50値は141

現は迅速かつ強度であった反面，症状発現の持続mg／kg と100mg／kgの間にあると推定される。

時間は短く，毒性標的臓器における障害は軽度でまた，その毒性標的臓器は骨髄，腎臓および肝臓

あった・これは薬物の吸収性に伴う生体内での代であるが，それらの障害はきわめて軽度であり，

謝性または滞留性における投与経路の差を反映し直接の急性死因としてほLeupの呼吸中枢などへたものと推察される．また，経口投与において吸の作用と推測される急性の呼吸障害および循環障

収経路としての薬物の直接作用由来が考えられた害が考えられる。

消化管（粘膜）の障害は，静脈内投与においてほ今回のLeupのイヌ静脈内投与における急性毒まったく認められなかった．

性を経口投与の場合20）に比較すると，その毒性発−124−

なお，Leup投与後の末栴血における一過性でロイべプチソの難病治療薬としての開発研究

著明な血小板数の減少は，短時間内（静脈内投与

度に個体差がみられたが用量依存性もみられたの場合投与後せいぜい2時間以内）の現象であり，（100mg／kg投与群；雄3／3に1〜2回／35日間，血小板回転の観点から，Leup の直接作用による200mg／kg投与群；雄2／3だ3回／35日間，雄血小板の破壊によるものとは考えにくく，その機3／4に3〜6回／35日間）．300mg／kg投与群の雌序の解明には血小板機能などの観点からもさらに

2／2ほ投与開始5日目に，3回目の発作後，他の1例は7・日日に5回目の発作後に，呼吸抑制（チ検討する必要がある．
病理組織学的ご指導を賜った食品農医薬品安全性評
価センター，榎本 真先生に深く感謝する．

ェーンストークス呼吸をまじえた呼吸数の減少）が起り，約30分間の昏睡状態ののち呼吸が停止
し，続いて心拍も停止し死亡した（投与約1・5時間後）．その他の投与群では全例全投与期間の投2． ロイベプチンのイヌ経口投与におけ与に耐え，症状発現日においても症状回復後は食る亜急性毒性欲が認められた．体重は投与後1週目までに軽度Leupの35

日間連日経口投与による毒性を雌

雄ピーグル犬（11〜15カ月齢，体重：雄10．2〜
14．2kg，雌9．0〜12．2kg）計28頭を用いて検討の減少が雌雄の100mg／kg以上の投与群の全例にみられ，以後は回復傾向を示したが，一部では投与開始時の体重に回復しない例も認められた・
2）血液検査した．

投与量が 300mg／kg（雌2頭），200mg／kg，投与開始前，投与開始後1，5週目および回復

100mg／kg（以上雄3頭，雌4頭），20mg／kg，対試験では投与中止後5週目に全例前肢正中静脈か照（以上雄2頭，雌4嶺）の各群を設け，1頭当ら採血し，下記の項目について測定した・りの各投与量に相当するLeupをゼラチンカプセa）血液学的検査

ルに充填して（対照群にはゼラチンカプセルのみ

白血球数，赤血球数，ヘモグロビン量，ヘマトを）毎日午前10時に強制経口投与し，約90分

クリット値，MCV，MCH，MCHC，血小板数，後に給餌した．回復試験として雄200mg／kg，

網赤血球数，白血球百分比，赤血球粒度分布，赤100mg／kg，雌200mg／kg，100mg／kg，20mg／kg，

血球抵抗性，血液凝固時間およびプロトロンビン

対照の各群から1頭ずつを投与期間経過後35 日

時間．

間休薬させた．

b）血液生化学的検査・

1）一般症状

総蛋白，アルブミン，A／G比，総コレステロー

雄100mg／kgおよび雌200mg／kg以上の投与

ル，尿素窒素，尿酸，クレアチニン，アルカリホ

群に，投与後30分ごろより呼吸促迫に続いて全スファターゼ，GOT，GPT，LDH，総ビリルビ

身の脱力がみられ，腹臥または横臥状態を呈した．

ン，無頼リン，Ca，Na，K，Cl，クレアチンホス

それに伴って瞳孔散大，限瞼下垂および顔面，耳フォキナーゼ，血清蛋自分画．

介，口唇周囲，腋窟部の発赤と耳介，限瞼周囲の血液学的には，100mg／kg以上の投与群におい著明な浮踵が認められた．重症例では一過性の呼て，血液凝固試験で投与後1週目の検査で軽度の吸困難がみられた．これらの症状は時間（60〜90

血液凝固時間の延長傾向が認められた・またプロ分）の経過とともに回復に向い，投与約1時間半

トロンビン時間でも投与後1，5週目の測定で軽後では起立し歩行可能となった．以上の症状は投度の延長傾向がみられる例があったが，休薬後に与の度ごとにいつも発現するのでなく，また投与は回復した．

回数とも関係なく，発現する頻度および症状の程ー125−

生化学的には，100mg／kg以上の投与群において，投与期間中の検査で，アルカリホスファター

組織学的には，100mg／kg以上の投与群において，

ゼ活性の軽度の上昇およびGPT活性の著明な上肝で肝実質細胞の水踵様膨化と肝細胞内の微細な昇が高頻度に認められ，またGOT活性の著明な

好酸性顆粒が観察されたが，肝細胞の壊死は認め

上昇が認められる例もあったが，休薬後には正常られなかった．なおKup仔er細胞にほへモジデリ

範囲内の値に回復した．

ンの沈着がみられた．また腎で近位尿細管上皮細その他の項目については，いずれも検体投与に胞内に硝子滴が認められた．

起因する変化は認められなかった．
3）尿検回復期間終了時屠殺例においては，投与期間終査了後屠殺例に観察された肝および腎の所見のうち，投与開始前および投与開始後の1週ごとに各群より2頭を選び，24時間の蓄尿を行い，尿量，比肝のKup仔er細胞におけるへモジデリンの沈着
以外の異常所見はまったく認められなかった．

重を測定し，試験紙を用いて蛋白，pH，ブドウ糖，

上述以外のすべての臓器において，検体投与に

ウpビリノーゲン，ビリルビン，潜血を半定量的起因すると考えられる障害を示唆する所見は認めに測定した．

られなかった．また測定したすべての臓器重量に投与期間および回復期問を通してウロビリノー

も著変は認められなかった．

ゲン，ビリルビン，ケトン体の陽性例が散発的に

6）総括および考察認められたが，対照群を含む全投与群にわたってLeupの35

日間連日経口投与によるピーグル

みられた．その他の項目には異常値は認められな犬における毒性試験（投与量は300，200，100おかった．

よび20mg／kg）の結果を要約して表17に示した．

4）眼科的検査100mg／kg以上の投与群において，一般症状とし投与開始前，投与開始後5週目および投与中止て発現した全身の脱力（腹臥あるいは横臥），眼後5週目に，眼底カメラによる眼底検査と検眼鏡

瞼下垂，瞳孔散大，頭部を中心とした体表部位

または細隙燈顕微鏡による角膜，水晶体，虹彩，（耳介，顔面，口唇周囲）の発赤と浮腫および重症結膜の検査を行ったが，いずれも異常は認められ例でみられた呼吸抑制（最高用量300mg／kg投・なかった．

与群の2例はいずれも呼吸抑制に続く呼吸困難か

5）病理学的検査

ら投与開始後5〜7日目に死亡した）などの症状

動物は途中死亡時，最終投与1日後および回復を総合すると，Leupは自律神経系および呼吸中

期間終了時に直ちに剖検し，諸臓器について臓器枢に対する一過性の薬理的作用を有していること

重量の測定および病理組織学的検査を行った．

が推察される．また血液学的所見として血液凝固

途中死亡例においては（300mg／kg投与群のおよびプロトロンビン時間に軽度ながら延長傾向2／2），肉眼所見として胸部および腹部臓器とくにが認められたことは，Leup の強い蛋白分解酵素

肺，肝および腎のうっ血が著明に認められ，組織阻害作用が血液中の酵素活性に影響を与え，血液学的には肝の中心静脈周囲，碑の脾柱周囲，副腎凝固田子に作用していることが推察される．さら皮質，胃粘膜，小腸粘膜，脊髄および脳中央隆起に病理組織検査で観察された肝細胞の軽度の水腫

部に微細な出血巣が散見され，全身性の出血傾向

様膨化，肝細胞内の好酸性微細顆粒の出現にみらが認められた．また，肝細胞内にはエオジンに均れる形態学的変化は，アルカリホスファターゼ，∴

一に染まる小顆粒が多数観察された．

GPT，GOT活性の上昇にみられる血液生化学的投与期間終了後の屠殺例においては，肉眼所見所見を説明しうるだけのものではなく，何らかのとしてすべての臓器に著変は認められなかったが，機序で肝細胞からの細胞内酵素の放出が推察され

二二一126−ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究
表17 試験結果の要約：ピーグル犬におけるロイべプチソの亜急性毒性（5週間経口授与）
観察事項

対

照

20rng／kg lOOmg／kg

使用動物数 雄2，
雄2，
雌3＋（1）＊雌3＋（1）
1．死亡

なし

2．一般症状

なし

3．体重

正常

4．血液学的検査
末梢血球
著変なし
赤血球粒度分布 著変なし
Ⅴ 血液凝固試験
著変なし
プロトロソピソ 著変なし
時間
5．生化学的検査（詰；霊芝 ≡雷GOT活性正常
6．病理組織学的検査
肝細胞の軽度な 変化なし
水腫様の膨化
肝細胞内の好酸 変化なし性顆粒腎接の近位尿細 変化なし
管上皮細胞内硝子滴
全身性の出血憤 変化なし

雄2＋（1），
雌3＋（1）

200mg／kg

300mg／kg

雄2＋（1），
雌3＋（1）

雌2なし

雌2／2例が死亡．
5日目および7日
日．全身の脱力と呼吸困難を示し，投与後約1．5時間後に死亡した．

なし

考雄100mg／kg以上雌200mg／kg以上の投与例に，投与後約30分ごろより全身の脱力がみられ，腹臥または賃臥状態を呈した．それに伴い，限瞼下垂，瞳孔散大および顔面，
耳介，口唇，腋窟部の発赤と耳介，限瞼周囲の著明な浮腫が認められた．
重症例では一過性の呼吸困難がみられた．これらの症状は時間（60〜90分）の経過とともに回復に向い，投与後約1・5
時間後では起立し，歩行も可能となった．
軽度な減少←
1週以後回復顔向←軽度な血液凝固延長傾向がみられた（雄1／3，雌1／4）
軽度の延長（雌←（雄2ノ3，雌
2／4）

1／4）

3／4）

←（雄2／3，雌

雄（3／3），雌（雄（3／3）で上昇（ （4／4）で上昇

雄（1／3）で上昇

雄（1／3）で上昇

雄2／2，雌2／3

雄1／2，雌3／3

雄2／2，雌2／3

雄1／2，雌3／3

休薬後5過では正常値に回復した．

休薬後5週ではこれらの組織学
的変化はみられ
なかった．

雄，雌全例
←

向

7．最大無作用量備

死亡例（雌2／2例）に認められた．

約20mg／
kgと推定＊（）回復例数る一 また腎の近位尿細管上皮の細胞内に緻細硝子 されるが，この点は田中ら19）によって3つの秩序滴が多数認められたがJ＿血液生化学的検査および の考察がなされているが，本試験においてもその尿検査では腎障害を示す所見はみられなかった・ 解明にはさらに検討が必要である・
この硝子滴変化は一般的に蛋白の再吸収像と解釈

なお，ピーグル犬の急性毒性20叱おいて骨髄の−127−

造血能減退を示唆する所見が認められたが，本試ようになり，2〜3週目ごろから腹部の膨満，血験では血液学的にも組織学的にも骨髄の造血機能便および全身の貧血が観察される例があった．こに影響を及ぼしたと判断される所見は認められなかった．

れらの多くは衰弱から死への転帰をたどった．

以上の結果から，Leupの35

日間連日経口投400mg／kg投与群では，投与開始2週目で雄に，4週目で雌に死亡例がみられ，それ以後，死亡例

与によるピーグル犬における毒性試験において，が散発的にあった．投与期間終了時の死亡率は，Leup は閲値を超えると呼吸中枢などに対する一400mg／kg投与群の雄で36％（8／22），雌で40％

過性の死に至らしめる薬理作用を有しているが，（8／20），200mg／kg投与群の雄で13％（2／16），雌

Leupの毒性標的臓器としてほ肝，腎の障害が考で4％（1／24）に達した．

えられるが，その障害程度は軽徴であった．蓄積
性も少なかった．

症状発現には個体差が認められ，対照群と同様にまったく異常を示さない例も多かった．

最大無作用量は，諸検査において異常の認められなかった20mg／kgと推定した．

投与期間中に異常がみられた例は35日間の休薬期間中の回復はみられず，腹部の膨満と血便を示した雌400mg／kg投与群の1例は休業期間中

3・ロイベブテンのラット経口投与におに死亡した（25日日）．

ける悟性毒性また，雄400mg／kg投与群で摂餌量の増加抑制が投与開始後1カ月目までに認められ，のち徐Leup のラット5週間連日経口投与による亜急徐に回復したが，それに呼応して対照群および他性毒性はすでに田中ら19）によって報告されていの投与群に比べて明らかな体重の増加抑制が，投るが，今回，Leup の6カ月間連日経口投与によ

与期間および回復期間を通して認められた．同様

る慢性毒性をSpragueDawley系雌雄ラット（5に雌400mg／kg投与群においても，わずかに体遇齢）を用いて検討した．

重の増加抑制傾向が認められた．

臨床予定使用量（50mg／man）を考慮して，投2）血液学的検査

与量が400mg／kg，200mg／kg，100mg／kg，50

投与開始後6ヵ月目および休薬後1カ月目の屠

mg／kgの各群に対照群を加えた計5群を設け，殺前日に各例について尾静脈より採血し，下記の1匹当りの各投与量に相当するLeupを，ラット

項目について測定した．

の体重100g当り1mgになるように精製水に溶

赤血球数，ヘマトクリット値，ヘモグロビン量，

解し（対照群には精製水のみを），1日1回13時

MCV，MCH，MCHC，白血球数，血小板数，白から14時の間に6カ月間（連日）胃ゾンデを用

血球百分比，血液凝固時間，プロトロンビン時間．

いて強制的に経口授与した．雌雄各実験群には24匹を用い，6カ月間投与時に各群から原則となお，剖検時にとりはずした大腿骨の骨髄塗抹標本による骨髄検査も実施した．

して12匹ずつを選出して屠殺剖検し，残りは1
カ月間休薬して回復試験とした．

投与期間終了時の測定で，赤血球数，ヘモグロ
ビン量およびヘマトクリット値が雌雄の一部の投

1）一般症状与群で生理的正常値範囲内での減少傾向がみられ

いずれの投与群においても投与後の一般状態にた．また，白血球数の増加および白血球百分率には著変は認められなかったが，投与開始1週目ごおけるリンパ球比の減少と好中球比の増加が雄ろから雌雄200mg／kg以上投与群において自発400mg／kg投与群でみられ，その他の投与群で運動の低下，立毛および貧血を示す例がみられるもその傾向は認められた．骨髄像においては，顆

−128−

ロイベプチソの難病治療薬としての開発研究

粒系細胞および赤血球系細胞に著変は認められな

定量的に測定した．
糖，潜血は全投与期間を通して検出されず，まかったが，雌のリンパ球細胞の減少傾向が認めらたその他の項目においても正常域を逸脱する例はれた．
その他の項目においてほ，いずれも検体投与になく，検体投与に起因すると考えられる変化は認められなかった．

起因すると考えられる変化は認められなかった．
また，休薬1カ月後にはいずれの投与群のいずれ

5）眼科学的検査の項目にも異常値はみられなかった．

投与開始後1週間目，6カ月および回復期間終3）血柴生化学的検査

了後に，各群につき2例ずつ眼底カメラによる眼屠殺剖検に先立ってネンプタール麻酔下でヘパ底検査と検眼鏡による角膜，水晶体，虹彩，結膜

リン処理注射筒を用いて下大静脈より採血し，下の検査を行った．さらに，投与期間および回復期記の項目について分析した．

間終了後に各群2例を選び，網膜電位（ERG）の総蛋白，アルブミン，A／G比，総コレステロー検査を行った．

ル，尿素窒素，グルコース，尿酸，クレアチニン，

眼底検査では，投与期間終了後の検査で400

アルカリホスファターゼ，GOT，GPT，LDH，mg／kg投与群の一部の例で，眼底静脈の収縮が総ビリルビン，無機リン，Ca，Na，K，Cl・認められたが，これらの例の一般症状にみられる投与期間終了時の検査で，総蛋白，アルブミン

全身貧血から失血性貧血に起因する変化と推察さ値の低下が雌雄の投与群で用量依存的に低下した・れた．またERG所見としては特記すべき変化は

その他，雄ではほぼ全投与群にわたってA／G比，認められなかった．

LDH，GPT，GOT，IP値の上昇がみられた．と

6）血圧検査りわけLDH，GPT，GOT値の変動が著明であ

投与開始後1週臥1，3および6カ月目に各群ったが，いずれも用量依存性を示さなかった．一より5匹ずつを選び尾静脈血圧を測定したが，雌方，雌ではグルコース，UA，クレアチニン値の雄いずれの投与群においても検体投与に起田する低下とIP値の上昇が認められたが，いずれも用影響は認められなかった．

量依存性がみられなかった．また，GPT値の低こ下

7）病理学的所見

およびGOT値の低下傾向がみられた．

動物は途中死亡時には剖検し，また投与期間お回復期間終了後の検査では，雄投与群でのよび回復期間終了時に血液検査用の採血後，腋窟

LDH，GPT，GOT，IP値の上昇およびクレ7チ

動脈を切断し放血死させて剖検し，諸臓器についニン値の低下と雌投与群でのIP値の上昇が依然て臓器重量の測定および病理組織学航検査を行っとして認められた以外は，はば正常値範囲内に回た．途中死亡例では，小腸（とくに空・回腸）の腸復した．

壁に穿孔がみられ，腸管相互または周囲臓器との以上のように生化学値に種々の変動が観察され癒着を起し，腹水を伴う腹膜炎症状を呈し（死亡たが，それらには用量依存性が顕著でなく，また原田），著明な例では胃以下の腹腔内臓器が分離は雌雄で逆の変化がみられた・不可能な状態にまで癒着が進行しており，癒着の4）尿検

みられない個所の潰瘍部では，肉芽組織が渠膜側査

投与開始後1週目，1，3および6カ月目に各群に突出し大きな肉芽踵を形成している例も認めら

より4匹を選び，24時間尿を採取し，尿量，比重れた．また，ほとんどの例に胃腸の出血（びらを測定し，また試験紙を用いてpH，糖，蛋白，ん）または潰瘍と腸間膜リンパ節の踵大が認めら

潜血 ウロビリノーゲン，ケトン体をそれぞれ半

れた．

−129−

表18
50mg／kg

検査項目

死亡率・
一般症状
座重
血液険査
▲ 血液学的検査

血奨生化学的検査

ラットにおけるロイべプチソの慢性
lOOmg／kg

蛙（0／21），雌（0／24）
なし

雄（0／16），雌（0／19）
なし

正常

正常

雌：RBC ・Ht・Hb（1傾向）

雄：WBC（†憤向）雄：総蛋白（1），A／G比（†），LDH（††）
GPT（††），GOT（††）

雌：A／G比（†傾向）ヽ ＿I

雄：総蛋白（1），A／G比（丁），LDH（††）
GPT（††），GOT（ll），IP（†）
雌：IP（†），グルコース（1），UA（1）クレアチニソ（1）尿検査
眼科学的検査病理学的検査
臓器重量

著変なし
著変なし

若変なし
著変なし

雄：腎（†憤向），膵（††）

雄：腎（†），膵（††）
雌：肝・腎（†），膵（ll）

雌：肝・腎（†），膵（††）
組織学的所見肝小葉中心帯の肝甑胎内に硝子滴の沈着
肝細胞の単細胞壊死または巣 雄（1／13），雌（4／14）
状壊死
Kup仔er細胞の腫大妊（2／9）

腎
近位尿細管上皮細胞内に硝子 雄（13／13），雌（14／14）
滴の沈着膵

雄（9／9），雌（11／11）

雄（5／9），雌β711）

腺房細胞の陸大と分泌顆粒のノ雄（3／13），雌（3／14）‥増加
微小膵管の増生と円形細胞浸 堆（9〜13），雌（2／14）
潤を伴らた■限局性の線維化

雄（2／9）＿！雌（7／ll）

腸二二

望・回腸における潰瘍形成 ．雄（1／13）

十肇度・††著明￣これらの変化の埠かに，・肝，◆腎の担織学的検査

用量依存性を示して，■雌雄の全投薬群に認められ

i；率いて，肝細胞内および近位尿細管上皮細胞内

た・肝では小葉中心帯の肝細胞内の硝子滴の沈着の硝子摘沈着の増加が認められ，．投与期間が進む）と，それに伴う肝細胞の腫大と細胞質の好塩基性につれて著明になこつた．

顆粒の減少が雌雄の 200mg／kg以上投与群に認屠殺剖検例では，投与期間終了時の検査においめられた・さらに，雌雄ともに．Kup鮎r細胞の腫て，腎で近位尿細管上皮細胞内に硝子滴の沈着が大と細胞質の泡沫化が用量依存的に認められた．

ー130−

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究
毒性（6カ月経口投与）試験結果の要約
200mg／kg

400mg／kg

備

考各群24匹使用，途中事故死あり
雄（2／16），雌（1／24）
雄（8／22），雌（8／20）
投与開始1週目ごろから自発運動の低下，立毛，貧血 2〜3週目ごろから腹 症状発現のない例あり（個体差）
部膨満，血便，全身貧血→2〜4週日から死亡発現
雄雌：投与開始1カ月目から増加抑制
正常雄雌：RBC・Ht・Hb（1傾向）
WBC（†煩向）雄：総蛋白（1），アルブミン（1），A／G比（†），LDII（††），GPT（††），
GOT（††），IP（†）
雌：総蛋白（1），アルブミン（1），A／G比（†），GPT（1），GOT（1傾向），
IP（†），グルコース（1），UA（1），クレアチニソ（1）雄雌：RBC・Ht・Hb（1傾向）
雄：WBC（†），リンパ球比（1），好中球比（†）
雄：総蛋白（1），アルブミン（1），GPT（†），GOT（†），IP（†）

生理的正常値範囲内
休業後1カ月では正常

雌：総蛋白（1），アルブミン（1），GPT（1），GOT（1傾向），IP（†），グル

雌：IP（†）

総蛋白，アルブミン（用量依存性）
休業韓1カ月でなお雄：LDH（††）
GPT（†T），GOT（††），IP（†）

コース（1），UA（1），クレアチニ
ソ（1）

著変なし
著変なし

著変なし
署変なし

雌一さ■肝・腎・膵（†），膵（††）

雄：一腎（†），膵（ll）
雌：肝・腎・膵（†），膵（††）

膵（比体重の増加を伴い用量依存性）

雄（3／8），雌（13／14）

雄（7／8），雌（6／6）

休薬後1カ月で消失傾向

雌（1／14）雄（1／8），雌（6／6）

休薬後1カ月で消失

雄（5／8），雌（1／14）

雄（8／8），雌（4／6）

用量依存性

雄（7／8）彗雌酢叩雄（8／8），雌（6／6）

程度に用量依存性
休薬後1カ月で消失傾向

雄（8／8），雌（町14）

雄（8／8），雌（5／6）

雄（8／8），雌（7／14）

雄（4／8），雌（3／6）

雄（1／8），雌（2／14）

雄（2／8），J唯（3／6）

雄：腎（†），膵（††）∴二言二と二三」用量依存性「ふト′
休薬後1カ月で消失

休薬後1カ月で回復傾向

その他雌の400mg／kg投与群で肝細胞の単細胞200mg／kg以上投与群（例外的に雄50mg／kg投壊死ある上峰巣状壊死がみられた・膵で軍事腺房細胞の踵大と分泌顆粒（Zymogen顆粒）の増加，敵与群の1／13．例）に散見され，こ潰瘍底部では筋唇は消失し肉芽組織におきかえられ菓膜側へ突出

中な膵管の増生と円形細胞浸潤を伴った限局性のして肉芽踵を形成する例が多か？た・ ・
以上の臓器所見のほとんどは休薬期間終了時の線維化巣が雌雄の全投薬群に用量依存的に認められた．消化管では空・回腸の潰瘍形成が雌雄の例では消失あるいは回復傾向を示した．

−131−

その他の臓器においてほ対照群と比べて検体投与に起因する変化は認められなかった．

るいは巣状壊死がみられた．さらに，雌で肝重量の増加がみられた・以上の所見から細胞内の硝子臓器重量においてほ，雌雄ともに投与期間終了

滴変化と酵素活性の変化との相関性あるいは所見時の腎および膵の重量増加が全投与群で観察された・とくに膵の重量増加には比体重の増加も伴い，の性差など矛盾点も多いが，検体が肝機能に影響を及ぼしていることは示唆される．

明らかに用量依存性が認められ 休薬1カ月後に腎重量の増加は雌雄にみられ，組織学的検査においてもなお雌の場合増加していた．その他，肝おいて近位尿細管上皮細胞に硝子滴の沈着が観察

および膵の重量増加が投与期間終了時の雌の投与されたが，生化学的検査，尿検査においてほ腎障
害を示唆する所見は得られなかった．

群に認められた以外は，投与および回復期間終了
時とも著変はみられなかった．
8）総括および考察

膵重量の増加は雌雄に用量依存性を示して認められ，また組織学的検査においても用量依存的にLeupの6カ月間連日経口投与によるラット慢性毒性試験（投与量は400，200，100および50

腺房細胞の腫大と分泌顆粒の増加がみられた．こ

mg／kg）の結果を要約して表18に示した．

いて膵の重量および膵の酵素含量が上昇すると報れは，一般に蛋白分解酵素阻害剤の経口投与にお雌雄200mg／kg以上投与群において用量依存告されている21・221ように，強い蛋白分解酵素の阻性を示して発現した死亡例は，田中ら19の報告と同様にいずれも胃粘膜のびらんおよび空・回腸に害作用をもつ本検体の投与によるラットの膵椋能克進を示唆している．

おける管壁の潰瘍および穿孔あるいは腸管周囲臓

田中ら川およびイヌの毒性試験やから，本検体器との癒着がみられ，腹水を伴う典型的な腹膜炎の血液凝固系に対する阻害作用が予想されたが，を呈しており，本検体のラットの胃腸管に対する本試験では血液検査で異常は認められなかった．

直接の局所作用が推察された．なお，この消化管

これは谷本ら細が論じているように，Leup投与に及ぼした障害には個体差が著明にみられ，まっ後血液凝固時間およびプロトロンビン時間の測定

たく異常を示さない例も多かった．

時まで18〜24時間が経過しているので，測定

血液学舵検査において，雌雄の一部の投与群で時の血中濃度が低下しているためと考えられ，

生理的正常値範囲内の貧血傾向（対照群に比して）Leup血液凝固系に対する阻害作用には蓄積性ががみられ また白血球の増加あるいは増加傾向がないことを示唆している．

みられたが，骨髄および脾臓の組織学的検査にお以上の結果から，Leupの6カ月間連日経口投

いても著変はみられず，また白血球の増加憤向は与によるラットの慢性毒性試験において，高用量

消化管障害に由来する腹膜炎による変化と推察さ投与群でみられた死亡原田は，Leupの直接の局

れ，本検体の溶血性および造血系に及ぼす毒性はとくに認められなかった．

所作用由来が考えられる消化管の潰瘍形成（穿血鰹生化学的検査において，雌雄で総蛋白，ア
ルブミン値が軽度ながら用量依存的に減少し，ま続投与により認められた毒性標的臓器は肝，腎，膵であると推察された．

た雄でLDH，GPT，GOT値の著明な上昇と，雌最低用量50mg／kg投与群においても，血液検では逆にGPT，GOT値の低下傾向がみられた．

査，病理学的検査で変化が認められたことから，また，肝の組織学的検査において，雌雄で肝細胞無作用量は50mg／kg以下と推察される．

孔）による腹膜炎（二次的症状）であり，長期連の腫大と好塩基性顆粒の減少，とくに雄より雌で肝細胞内の硝子滴の沈着，肝細胞の単細胞壊死あ−132−

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究

クリット値，MCV，MCH，MCHC，血小板数，
網赤血球数，白血球百分比，赤血球粒度分布，赤4．ロイベプチンのイヌ静脈内投与によ

血球抵抗性，血液凝固時間およびプロトロンビン

る亜急性毒性時間．
b）血液生化学的検査

Leupの35 日間連日静脈内投与による毒性を雌雄ピーブル犬各10頸（13カ月齢，体重雄11・2

総蛋白，アルブミン，A／G比，総コレステロー〜12．8kg，雌9．0〜11．0kg）を用いて検討した・

ル，グルコース，尿素窒素，尿酸，クレアチニン，

予備試験の結果を参考にして，投与量が20・O

アルカリホスファクーゼ，GOT，GPT，LDH，mg／kg，8．0mg／kg（以上雌雄各3頭），3・2mg／

総ビリルビン，無横リン，Ca，Na，K，Cl，CPK，kg，対照（以上雌雄各2頭）の各群を設け，1頭

血清蛋自分画．

当りの各投与量に相当するLeupをイヌの体重

血液学的には，雌8mg／kg投与群の1／3例でkg当り0．5mgになるように生理食塩液に溶解し投与1週目および5週目の検査において，赤血球（対照群には生理食塩液のみを），原則として毎日数の減少，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値の午前10時に右前肢正中静脈に投与し，約1時間低下がいずれも軽度に認められ（貧血傾向），ま後に給餌した・

た生理的範囲内での白血球の減少傾向が雌3・21）一般症状mg／kg投与群の1／2例とともに認められた・そ投与開始後数日間，雌雄20mg／kg投与群（5／6の他，血小板数の減少傾向が雄の 3．2mg／kg投例）および雌8mg／kg投与群（1／3例）に，投与直与群（1／2例），8mg／kgおよび20mg／kg投与群

後．（約1分後）より不穏状態に続いて自発運動の（各1／3例），雌の8mg／kg投与群（1／3例）に，低下が観察され，さらに重篤な場合は後肢の脱力

また生理的範囲内での血液凝固時間の延長傾向

を起し，旗臥または横臥状態に陥り，口腔粘膜に（1週目の測定）が雄20mg／kg投与群（1／3例），

チアノーゼが観察された．これらの例を含めて，雌20mg／kg投与群（2／3例）にそれぞれ認めら雄の8mg／kg以上の投与群，雌の3・2mg／kg以れた．

上の投与群で程度の差はあるが，耳介の発赤，結血液生化学的には，雌雄20mg／kg投与群の各膜の充血，流涙，流産などの症状が観察された・

1／3例，雌8mg／kg投与群の1／3例で，GPT値

これらの症状は全投与期間にわたって頻発したがの上昇が1週目の測定で認められ アルカリホス

一過性のものであり，投与後約40分以内に回復

ファクーゼ，LDH値の上昇も伴う例があった・した．

またCPK値が1週目の測定で雌3・2mg／kg投雌雄の対照群および各投薬群の全動物はいずれ

与群の1／2例で高値を示し，雌の対照群および投も35日間の投薬に耐え，食欲の減退はみられず

与群のほぼ全例に軽度な上昇傾向を示した・以上

体重はほは横ばいで推移し，検体投与による変化のいずれも5週目の測定では正常範囲内の値に回は認められなかった・

復した．その他，コレステロール値が雌8mg／kg

2）血液検査投与群（1／3例）に，またBUN値が雌3・2mg／

投与開始1週間前，投与開始後1，5週目に全kg投与群（2／2例），8mg／kg投与群（1／3例）

例前肢正中静脈より採血し，下記の項目についてに5週目の測定でそれぞれ軽度の上昇を示した・
以上のほかはいずれの検査値においても検体投測定した．

与に起因すると思われる変化は認められなかった・a）血液学的検査
白血球数，赤血球数，ヘモグロビン量，へマト

−133−

3）尿

検

査

に認められた．その他造血組織における所見とし

投与1週間前および投与開始1週毎に全例につて，骨髄の有核細胞とくに顆粒球系細胞の増加がいて24時間の蓄尿を行い，尿量，比重を測定し，雌3．2mg／kg投与群（2／2例）に認められ，その試験紙を用いて蛋白，pH，グルコース，ウロビリ

うち1例には脾に髄外造血巣がみられ，とくに赤ノーゲン，ビリルビン，潜血，ケトン体を半定量

血球系細胞の増加が認められた．

的に測定した．

上述以外の臓器においては，検体投与に起因す

投与期間を通して蛋白質陽性が雄の対照群およると考えられる障害を示唆する所見は認められなび全投薬群に検出されたが，なかでも 20mg／kg

かった．また測定したすべての臓器重量にも著変投与群（2／3例）に4週目の検査で著明な陽性値は認められなかった．

（≠〜帖）が検出された．また蛋白質陽性例のほ6）総括および考察

とんどにビリルビンが検出された．

Leupの35 日連日静脈内投与によるピーグル

その他の項目には著変はみられなかった．

犬における亜急性毒性試験（投与量は 20．0，4）眼科的検査

8．0および3．2mg／kg）の結果を要約して表19

投与前および投与開始後5週日に眼底カメラにに示した．

よる眼底検査と検眼鏡による角膜，水晶体，虹彩，

一般症状として雄の8mg／kg 以上の投与群，結膜の検査を行っ￣たが，いずれも異常は認められ

雌の 3．2mg／kg 以上の投与群で投与直後に観察なかった．

された耳介の発赤，結膜の充血，流挺，さらに5）■病理学的検査

高用量群で発現した自発運動の低下，全身の脱動物は最終投与1日後にネンブタール麻酔下で力（腹臥または横臥状態となる）などの症状は，頸動脈より放血死させ直ちに剖検し／諸臓器につLeup の自律神経系に対する一過性の薬理作用にいて臓器重量の測定および病理組織学的検査を行よるものと推察され，ピーグル犬の急性毒性（経った．なお，骨髄検査として，大腿骨の骨髄組織

口，静脈内投与），亜急性毒性（経口投与）におけの塗抹標本を作製し鋭検した．

る症状と共通するものであったが，投与量が比較

肉眼所見としては，すべての臓器に著変はみら的低用量であったため軽度であった．

れなかったが，組織学的虹は，肝において，肝細血液学的検査で，雌の8mg／kg

および3．2胞の細胞質内におけるはは赤血球大のエオジシ好mg／kg投与群の一部の例で貧血傾向，白血球の性の粗大顆粒の出現，および小葉中心帯の肝細胞減少傾向，骨髄検査での顆粒球系細胞，赤血球系内における政経な硝子滴の出現が雌雄の20mg／細胞の増加，脾での髄外造血巣などが認められた

玩投与群に高頻度に観察された．腎におしこて，が，これらは生体反応としての骨髄における細胞

近位尿細管上皮細胞内における云オジシ好性の敵

成分の変化Iとすぎないもので，検体投与による骨中な硝子滴の出現が，雄では20m占／kg投与群の髄障害を示唆する所見とは考えられず，∴イヌ経口

3／3例；雌では3．2mg／kg投与群以上の、5／8例に投与による亜急性の場合と同様に，骨髄造血能に認められた．

影響を及ぼしたと判断される所見は認められなか）▲

また非特異的な変化として，対照群を含むほぼった．

全例に近位尿細管主部直部の上皮に軽度の空胞変

また20mg／kg投与群の数例に血液凝固時間の性が藷められた．また肺におし√て，肺胞壁の上皮

延長傾向が認められたが，これも同様にLeupの細胞の空胞化を伴った腫大および上皮細胞あ軽度

蛋白分解酵素阻害作用が一過性に血液中の酵素活な脱落が雌雄の20mg／kg投与群に局部的に軽度性に影響を与えたことが推察される．

⊥134−

ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究

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翌週嘉Qn誓lザ点ト′ノ琶警さらに組織学的検査において，肝細胞の細胞質

β如九g肌，86，1403（1979）．
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daIM・，Aoyagi，TりMaeda，K．，Takeuchi，T．，

細硝子滴が雌雄の 8．0mg／kg投与群以上に認めandられた・一方血液生化学的検査において，GPT，

7）才野智之，染野哲也，宮崎 浩．昭和54年度本報告雷，p．80（1980）．
8）青柳高明．蛋白質核酸酵素，お，597（1980）．
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ALP，LDH値の上昇が雌雄の20mg／kg投与群
および雌の 8mg／kg投与群の一部の例の1週目の測定で認められ（5週日の測定では認められなかった），一過性で軽度な肝践能障害が示唆された・また軽度ながら BUN値の上昇が雌の 3．2

126，705（1976）．

11）山下幸札 水口 茂，高山秀樹，石橋正光，宮崎浩・昭和54年度本研究報告書，p．79（1980）．
12）Schiller，H・S．andBrammall，M．A．SEeroids，mg／kgおよび8mg／kg投与群に5週目の測定で認められ一方尿検査で著明な蛋白質が雄2024，665（1974）．

mg／kg投与群で投与が進むにつれて検出され，

13）Scatchard，G．Ann．凡Y．Acad．Sci．，51，660

Leupの腎に対する障害が示唆された．以上の肝，（1949）．

14）進藤英世．オートラジオグラフィー肉眼から電餌まで（水平故知編），医歯薬出版，東京，p．27

腎に関する病理組織学的変化と臨床検査値の変化
は経口投与による亜急性毒性の場合にも認められ，その践序について経口投与実験で考察したが，組織学的所見における硝子滴の由来の解明にはさらに検討が必要である．
以上の結果から，Leupの35 日間連日静脈内投与によるピーグル犬における毒性試験において，Leupの毒性標的臓器としては経口投与の場合と同様に肝，腎が考えられるが，その障害の程度は軽徴であった．
なお，最大無作用量は3．2mg／kg以下と推察される．

UmezawaタII・Chem．Pharm．BuLL．，17，

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−136−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチン）
研究三班分担研究者「覧
．

名

l

所

属

〒14

氏

住

所

東京都品川区上大崎3−14−23

班 長 梅沢 浜夫

傲生物化学研究所

幹 事 岩崎 祐三

国立武蔵療養所神経センター

187

日本化薬株式会社薬品研究所

115

微生物化学研究所

141 東京都品川区上大崎3−14−23

〝

田中

亘

〝

青柳 高明

03（441）4173

東京都小平市小川東町262（10423（41）2711

東京都北区志茂3−31−1203（901）7171

03（441）4173

監 事 米沢猛

京都府立医科大学病理学教室602

京都市上京区河原町通広小路
上ル梶井町465075（251）5320

班 員 村地孝

京都大学医学部臨床検査部

606

京都市左京区聖護院川原町

〝

大倉 洋甫

075（751）3502

九州大学薬学部薬品分析教室

812

福岡市東区馬出3−1−1092（641）1151

〝

大塚 正徳

東京医科歯科大学医学部薬理学教室〝

松下

和歌山県立医科大学第二生理学教室

〝

高木 明夫

国立武蔵療養所神経センター

〝

埜中 征故

国立武蔵療養所神経センター

〝

野村 達次

実験動物中央研究所

〝

三吉野産治

国立療養所西別府病院

〝

村上 慶郎

国立療養所箱根病院

〝

木下 英男

東邦大学医学部附属大橋病院第四内科

宏

橋
江

力員

協班

節郎

113

東京都文京区湯島1−5−45
03（813）6111

640

和歌山市九番丁90734（31）2151

187

東京都小平市小川東町2620
0423（41）2711

187

東京都小平市小川東町2620
0423（41）2711

213

神奈川県川崎市高辞区野川1430
044（755）5441

874

別府市大字鶴見4548
0977（24）1221

250

小田原市風祭412
0465（22）3196

153

東京都目黒区大橋2−17−603（468）1251

東京大学医学部薬理学教室

113

東京都文京区本郷7−3−103（812）2111

〝

里書栄二郎

国立武蔵療養所神経センター

〝

勝沼 信彦

徳島大学医学部酵素研究施設

187

東京都小平市小川東町2620
0423（41）2711

770

徳島市蔵本町3−18−15
0886（31）3111

順不同

−137−

微生物の二次代謝産物に由来する
難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究

非売品

1981年6月 20 日 発行
編

者

製作者

梅

沢

浜

夫

株式会社学会出版センター
新日本印刷