厚生省新薬開発研究事業
微生物の二次代謝産物に由来する

難病治療薬（E−64）の開発研究

昭和59年度研究報告書
班 長 今堀和友

昭和60年3月

ま

え

が

さ

厚生省新薬開発研究事業，微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究が発足してから早6年が経過し，本年度はその最後の年にあたる。振り返ってみると，長くて短い6年ではあったが，班員の皆様の多大な御協力により着実な歩みを成し遂げてこられたことを喜びとも誇りともするところである。昭和54年度の報告書の序文を見るとそこには次の様にしるされている。「本研究班の目的は実用に適する治療薬の開発である。それ故にこそ，私は軽々しく臨床への試用をさけ，まず基礎的データを蓄積することが大切だと考え大別して3つの方向から研究を進めることを考えた。」この3つの方向とは，（1）実用に適するE−64類縁体の開発，（2）類縁体の加〃言わによるスクリーニン
グ，（3）か川ね0における種々の効果の判定，である。
この基本方針はこの6年を通じて確実に守られてきたと言えるであろうし，またそれは正しいことであったと思う。事実臨床研究を実施したのは最後の二年間だけであったのである。しかし，この慎重な基礎研究により臨床研究に使用する薬剤の種類，形態，投与量等に関し，信頼できるデータが得られたのみではなく，毒性などに関しても十分なチェッ
クがなされたので，我々は自信を以て臨床研究に踏み出すことができたのであった。
この様な経過は，他の薬剤開発には滅多に見られないものであるかもしれないが，新薬開発の方向としては，最も正しいものであり，ひとっのcasehistoryと成ると自負しているものでもある。これが可能になったのも一つに班員の皆様の御協力のお陰であることはいうまでもないが，他方，大正製薬の異例なはどのご理解によっているのである。一見いかにものんびりした様に見えるこの開発経過は会掛ととってはどんなに歯梓く，じれったく思われたことと察せられるが一度として口を差しはさむことがなかったのは敬服に値することである。
ここに本研究報告書の最終号をお届けすることになったが，内容を御覧頂ければすぐ分かるように，研究は決して終わってはいないのである。せっかくここまできた研究をここで終わらせるのはいかにも残念であり，今後とも何かの形で是非続けたいと考えている。
皆様の暖かい御援助を切にお願いする次第である。
最後にこの6年間，研究の推進に御助力を賜った厚生省薬務局の方々，御多忙中にも係わらず報告書の執筆に協力された班員の諸氏，さらに本研究班の事務を引き受けてくださ
った上 報告書の上梓にまで御努力を惜しまれなかった大正製薬の皆様に心からなる感謝を捧げるものである。
t

班長 今 堀 和 友

目

次

まえがさ

Ⅰ E‑64類縁体の開発

1. ESTの製剤化研究

沢田

二郎

9

2. エポキシコハク酸1,4‑14C標識体を用いたESTの生体内動態(2)大関 正弘 11

3. ESTの生殖に及ぼす影響

大関 正弘 17

4. ESTのin vitro染色体異常試験

大関

正弘

33

福原

武彦

37

5. ESTの一般薬理作用─筋ジストロフィーハムスターの心電図に及ぼす影響を中心として─Ⅱ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究6. カルシウム依存性中性プロテアーゼ(CANP)の構造と活性発現機構7．カルシウムプロテアーゼの活性発現機構

今堀 和友 51
鈴木

紘一

57

西塚

泰美

63

野々村禎昭

67

小沢鍈二郎

71

市原

75

8．レセプター機構におけるカルシウムプロテアーゼの問題点について

9. E‑64‑c の筋蛋白質分解への効果
─平滑筋S1の精製への利用─

10. ESTの培養筋細胞への取り込みの測定についての試み

11．肝細胞の培養維持に関係した膜結合型
トリプシン様エンドプロテアーゼ

明12. 培養マクロファージにおけるE‑64誘導体の取り込みに関する研究

勝沼 信彦 81

Ⅲ 個体レベルにおける研究13. 筋ジストロフィーハムスター(UM‑X7.1)の骨格筋に対する
ESTでの治療効果─1H‑NMRによる観察(第2報)

宮武

正

89

寺尾

寿夫

95

14．筋ジストロフィー動物の尿中アミノ酸排泄に及ぼす

ESTの効果15. ハムスター筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究
─心筋の中性Ca2+プロテアーゼ(CANP)とその内在性

柴田 宣彦 101

阻害因子の検討ならびにESTによる治療実験─
16. 筋ジストロフィーハムスター(UM‑X7.1)における大関 正弘 109

ESTの薬効17. ラット,マウス,ハムスターにおけるESTの薬物代謝酵素系

北川 晴雄 113

およびグルタチオン関連酵素系に及ぼす影響
18. 筋ジストロフィーマウス(C57BL/10‑mdx)における生化学的検討大関 正弘 11919. 実験的クロロキンミオパチーにおけるESTの効果

杉田 秀夫 123

20．体外受精法による筋ジストロフィーマウス
野村 達次 129

(C57BL/6‑dy/dy)の作出
Ⅳ

臨

床

試

験

21. EST第2相臨床試験─中間報告─
今堀 和友，杉田 秀夫，宮武正，石原 傳幸 133

22. EST服用中のDuchenne型筋ジストロフィー症患児におけるnatural killerおよびantibody dependent cell
mediated cytotoxicity活性の変動について

宮武

正 149

I E−64類縁体の開発

1．ESTの製剤化研究二郎

2．エポキシコハク酸1，4−14C標識体を用いたESTの生体内動態（2）・・………・大関 正弘

3．ESTの生殖に及ぼす影響

大関 正弘

4．ESTのinvitro染色体異常試験

大関 正弘

5．ESTの一般薬理作用−筋ジストロフィーハムスターの心電図に及ぼす影響を中心として

福原 武彦

1．ESTの製剤化研究
▲▼

汀P

▲▼

三親夫
◆

省継唯

団

一

●

扇田中

●

小吉田

●

夫美義

哲正一

本田

小 山 郁 夫＊

・月

小 沢 康 雄■

二

普■

岬板書

研究協力者 村 山田沢

栗 山 恵美子＊緒

言

ESTの製剤化は従来硬カプセル剤で検討を進めて釆たが，これに加え投与量の調節，小児への適用，他剤との配合を考慮し，顆粒剤についても検討を行った。
これら製剤の暫定的な規格および試験方法を設定し，苛酷条件下における経時変化試験を実施し安定性を予測した。
また，カプセル剤と顆粒剤の生物学的同等性を溶出試験およびイヌ，バイオイクイバレント試験（以下BE試験と略）により評価した。
測定項目および試験方法
第十改正日本薬局方（以下日局と略）の通則
および一般試験法に記載されている項目については日局に準拠した。
1．規格および試験方法
前報（昭和58年度研究報告書，2．EST原体の規格および試験方法の設定）を参考に設定した。
2．安定性試験各製剤を市販予定の形態で包装し，室内，恒温恒湿槽，蛍光槽または太陽照射下のいずれかで一定期間保存した後，各項目の測定を行った（表1，2）。
3．溶出試験
日局溶出試験第2法（パドル法）に準拠し，試験液には日局崩壊試験法等1液（pHl．2），酢
酸緩衝液（pH4．0）および精製水を各々900ml（370±0．5℃）使用した。パドル回転数は100rpmとした。製剤は1回に1カプセルまたは顆
拉0．5gを用い，各々3回の測定を実施した。
4．イヌBE試験
クロスオーバー法に基づき雌性ピーグル犬6
頭を2群に分け前期投与後休薬期間を1週間とし後期投与を行った（表3）。
投与18時間前から絶食させ，カプセル剤および顆粒剤を各々体重Ikg当たりEST量として2mg相当量を経口投与した。投与後15分，30分，1時間，2時間，3時間，5時間および7時間に採血し血祭中のE−64−Cの濃度を測定した。
結果

1．EST製剤の規格および試験方法
カプセル剤および顆粒剤の暫定的な規格および試験方法を表4に示す。
2．EST製剤の安定性
カプセル剤，顆粒剤とも，いずれの苛酷条件下においても何ら変化は認められなかった。
3．hp紀ro同等性試験
EST25mg含有カプセル，50mg含有カプセ
ルおよび10％含有頬粒の3製剤とも3種の試
験液で良好な溶出性を示し，そのパターンも類似していた。従って，3製剤はれ血わ溶出試
験において同等であると判断した。

● 大正製薬株式会社総合研究所
9I E−64類縁体の開発

表1 カプセル剤の安定性試験（包装；PTPおよび缶）（3年＋α）

（2年）

6

ケ
ケ
ケ

3

月月月月

3

ケ

月

ケ

500

1

・加温加湿 400 75％RH
・光照射
蛍光燈（1，000ルクス）
太陽光（3）試験項目
・外観
・崩壊試験
・定量値
高速液体クロマトグラフ法
・不純物
高速液体クロマトグラフ法（分解物）または薄層クロマトグラフ法

6（1）長期保存試験
・A法
室温
・B法
250 75％RH（2）苛酷試験
・加温
400

500

動物：ピーグル犬 1群3頭
（実験前日より18時間絶食）
投与量：2mg／kg
クロスオーバー法＊試験計画

個体 N o．

前期

後期

1
2
3

対照製剤

被験 製剤

（カプセ ル剤）

（捉拉剤）

被験製剤

対照 製剤

（
輯拉剤）

（カプセル剤）

蓑4 カプセル剤および粗拉剤の規格および試験方法（暫定案）（3年＋α）

（2年）
6ケ月
3ケ月

・光照射

蛍光燈（1，000ルクス）
3ケ月
太陽光
1ケ月
（3）加速試験（原体およびカプセル剤と相対比較）
・400 75％RH
6ケ月（4）試験項目
・外観
・酎填試験
・定量値
高速液体クロマトグラフ法
・不純物
高速液体クロマトグラフ法（分解物）または薄層クロマトグラフ法

4．i几びわ0同等性試験
分散分析の結果，各測定時間におけるE−64−C
濃度，投与後7時間までの血祭中濃皮下面積（AUC。〜，h．），最高血祭中濃度（Cmax）および最高血祭中濃度への到達時間（Tmax）のいずれにおいてもカプセル剤と頼粒剤の間に5％の有10

カプセル剤および輯拉剤の生物学的同等性（イヌBE試験）45
6

表2 顆拉剤の安定性試験（包装；缶）（1）長期保存試験
・A法
室温
・B法
250 75％RH（2）苛酷試験
・加温
400

表3

性状
外観（カプセル内容物、色、におい、昧）確認試験（1）エステルの確認（2）アミノ酸の確認（3）高速液体クロマトグラフ法によるピー
クの相対保持時間
重量偏差試験（カプセル剤のみ）
拉度試験
（甑拉剤のみ）崩壊試験
定量値

日局第1液（pHl．2）
高速液体クロマトグラフ法

意水準において差は認められなかった。以上の結果から，両製剤はイヌを用いたf乃〃gUOBE試験において同等であると判断した。
結語

1．カプセル剤および顆粒剤について暫定的な規格および試験方法を定め，苛酷条件下における径時変化試験において安定性を確認した。
2．カプセル剤および顆粒剤の生物学的同等性を玩ぬ加溶出試験およびイヌを用いたわ7転用BE試験により評価し，同等であることを確認した。

2．エポキシコハク酸1，4−14C標識体を用いたESTの生体内動態（2）
■

弘

計一千

患

部川

長谷

■

〔ェポキシコハク酸1，4714C〕EST（以下14C−
EST）は，〔1，4−14C〕フマル酸より合硬した。比
放射能は54．61pCi／mg，放射化学的純度は98％であった。
実験動物は，当社で繁殖した8遇令のUM−
Ⅹ7．1系筋ジストロフィー雄性ハムスターおよび正常雄性ハムスターを使用した。、また一部の実験には，8週令の雄性ゴールデンハムスター（金丸動物より購入）を使用した。
標識化合物は5％アラビアゴムに懸濁し，特記する場合を除いて50mg／kgの用量で経口●

実験材料および方法●＊

昨年度著者l）はi ESTの活性基と推定される
エポキシコハク酸部分を標識した〔ェポキシコ
ハク酸1．4Jjc〕ESTを用いて，ラットにおける単回投与後の体内動態をロイシン標識体の場
合と比較検討した。その結果，ロイシン標識体に比較して速やかに体内から消失したことから，ロイシン標識体にみられた残留性は大部分ロイシンに由来したものであることを明らかにした。
今回，さらに薬効との関連および体内動態の種差を明らかにするため，正常および病態ハム
スターにおける体内動態について検討したので
報告する。

郎行男

喜正俊

野井訪

河新諏

■

研究目的

■ 大正製薬株式会社総合研究所

正

関

実子和
＊

大

清文

島崎田

福篠森

研究協力者

投与した。
薬物投与後の試料の採取，全身オートラジオ
グラフィーおよび放射能の測定は前報1）と同様に実施した。なお，心筋および骨格筋のミクロ
オートラジオグラフィーは，Stumpfら2）のthaw−mOunt法を一部改良した手法により行った。
結果および考察UM−Ⅹ7．1系筋ジストロフィーハムスター
および正常ハムスターにIJc−EST50mg／kg経口投与後の放射能の排泄を比較した結果，両者間に有意な差はなく，主に尿中へ約60％排泄され，糞中への排泄は少なかった（約30％）。呼気中への排泄はごくわずかであった。一方，ゴールデンハムスターに14crEST5mg／kg経口
投与後の胆汁中への放射能の排泄は，24時間までに約13％であった。これらの結果はラットの場合1）と明らかに異なり，ハムスターの場合は胆汁を介しての糞中への排泄は少なく，主に尿中へ排泄されるものと考えられる。呼気中への放射能の排泄はラットの場合と同様に認められたことから，ハムスク◆￣一においてもESTの
一部はC02にまで代謝されるものと思われる。
正常ハムスターにおける14C−ESTの体内分
布は，全身オートラジオグラムおよび組織内濃度の測定結果から，投与後30分で腎に最も高濃度分布し，次いで肝に比較的高い放射能が認められ，心筋，骨格筋を含む他の組織では血中レベル以下の濃度を示した。投与後24時間で11

I E−64類縁体の開発︵む∽OP︸0婆言去り空電でPヱ巴U絨凹
1

図1

2

3

4

5

（days）

ハムスターにIJc−EST50mg／kgを経口投与後の放射能の尿糞呼気中排泄率
各点は正常ハムスターはN＝3，筋ジストロフィーハムスターはN＝4の平均値を示す。

︵む∽OPで訳︶と⁝＞叫︺U苫叫P巴Pヱ巴豆占
1

図2

2◆

3

4

6

24

（hr）

ハムスターに14C−EST5mg／kgを経口投与後の放射能の胆汁中排泄率
各点はN＝4の平均値±S．E．を示す。

は，全身オートラジオグラム上では腸内に高い放射活性が認められたはかは，腎皮質および肝にのみ微弱な放射活性が残存した。
筋ジストロフィーノ？ムスターの場合においても正常ハムスターと同様な分布パターンを示
し，大きな差は認められなかった。
ラットの場合と比較すると，ラットでは投与初期において肝に最も高く，次いで腎の順であり，分布パターンにも種差が認められた。これ
らの結果は，ESTの毒性試験3）に認められた肝125

毒性の種差の一因と考えられる。
ESTの標的組織である筋肉への分布は，他の臓器に比べて低濃度であったが，組織レベル
での分布状態を検討することは，薬理効果との関連で重要であると思われる。そこで，14C−
EST経口投与後30分の正常および筋ジストロ
フィーハムスターの心筋，骨格筋（前脛骨筋）のミクロオートラジオグラムを作成し，光学朗
微鏡レベルでの放射能の分布を検討した。

2．エポキシコハク酸1，4J4C標識体を用いたESTの生体内動態（2）

30min

24hr

Liver Intestine
図3

正常ハムスターに14C−EST50mg／kgを経口投与後の全身オートラジオグラム
Brain

Lung

KidneyMuscle30min

Heart Liver stomach

Kidney24hr

Liver Intestine
図4筋ジストロフィーハムスターに14C−EST50mg／kgを経口投与後の全身オートラジオグラム

13

I E−64類縁体の開発

l∈hOで．bむuq
Blood Plasma Heart Lung Brain Spleen Pancreas Adrenal Muscle
図5

正常ハムスターおよび筋ジストロフィpハムスターに14C−EST50mg／kgを経口投与後30分の放射能の組織中分布
正常ハムスターはN＝4〜5．筋ジストロフィーハムスターはN＝6〜7の平均値±S且を示す。

前頸骨筋

心筋

図6

14

×200

前額骨筋

×400

正常ハムスターに14C−EST50mg／kgを経口

心筋

図7

×200

×400

筋ジストロフィーハムスターに14crEST50

投与後30分における前頚骨筋および心筋のミmg／kgを経口投与後30分における前頚骨筋おクロオートラジオグラム（H．E．染色）

よび心筋のミクロオートラジオグラム（H．E．
染色）

2．エポキシコハク酸1，4−14C標識体を用いたESTの生体内動態（2）常ハムスターにおけるESTの生体内動態について検討し，薬理効果を示唆する結果が得ら
れ，また，ラットに比較して体内動態に差異のあることを認めた。現在ESTの体内動態の種差について，イヌ，ウサギを用いて実施中であるが，ラットにおける肝毒性の発現機序についても代謝の面から検討する予定である。
結
オペック線維（膿染部）

×200

論

〔ェポキシコハク酸1，4−14C〕ESTを用いてハムスターにおける体内動態について検討した。

1．経口投与後の尿糞および呼気中排泄は，筋ジストロフィーハムスターおよび正常ハムス

ターに大きな差はなく，主に尿中へ排泄された。
2．胆汁中への排泄は，24時間までに約13％と少なかった。
3．組織分布においては，腎に高濃度分布し次いで肝に比較的高く，他の組織は血中レベル以下であった。また，筋ジストロフィーハム
オペック親権（浪染部）

図8

×400

筋ジストロフィーハムスターに14C−EST50

mg／kgを経口投与後30分における前頚骨筋
オペック線椎のミクロオートラジオグラム（Gomoritrichrome変法）

その結果，筋ジストロフィーハムスターでは，正常ハムスターと同様に明らかに心筋および骨格筋線維細胞上に放射活性が認められた。
一方，Gomoritrichrome変法による染色で濃染され，壊死に陥いる前段階の筋線経といわれているOpeque線椎においても黒化銀粒子が認められ，病変線経に明らかに放射能の分布が観察された。なお，壊死線維および筋線維細胞
間には放射能の分布はほとんど認められなかった。これらの結果は，ESTの薬理効果を裏づける興味ある知見と考えられる。
今回，筋ジストロフィーハムスターおよび正スターおよび正常ハムスター間に大きな差は認められなかった。
4．ミクロオートラジオグラフィーの結果から，ESTは正常ハムスターと同様に筋ジストロフィーハムスターの筋線維細胞内に移行することが明らかとなった。
文献1）大関正弘：エポキシコハク酸1，4−1−C標識体を用いたESTのラットにおける生体内動態，厚生省
新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来
する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度
研究報告書，75−84．1984．
2）水平敏知編：オートラジオグラフィー肉眼から電顕まで，医歯薬出版，233，1979．
3）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−54，1983．

15

3．ESTの生殖に及ぼす影響

野

評好

英貞

田根

内中

計千

伸

屯山沢

研究協力者

Ⅰ．器官形成期投与試験
目的

ESTを妊娠ウサギの胚・器官形成期に経口投与し，母獣ならびに胎仔に及ぼす影響を検討
する。
方

法

1．使用動物および飼育条件
動物は6ヶ月令（末経産雌）のニュージーラ
ンドホワイト種ウサギ（新日本動物）を購入し，1週間の予備飼育により順調な体重増加を示したものを用いた。
飼育は金網製のケージに入れ，空調動物舎
で，固型飼料（オリエンタル酵母社製RC−4）と殺菌水を自由に摂取させる方法で行った。
交配は，外陰部検査により，発情徴候のみられた雌と雄を同居させ（8：30〜10：30AM），2回以上交尾の確認された雌を選び，その日を妊娠0日と定め用いた。妊娠動物は1群13〜17匹に分け，試験に供した。
2．投与量および投与方法
投与量決定のため，予試験として本試験と同様の条件により，妊娠ウサギにESTの0（対照），500，1，000および2，000mg／kg／日を13日間経口投与した。その結果，500および1，000
mg／kg投与量において各1例の流産母獣，● 大正製薬抹式会社総合研究所

2，000mg／kg投与量において4／5例の死亡
母獣．また，500mg／kg投与量以上において死胚胎仔数の増加が認められた。以上より，本試
験における最大投与量を500mg／kg／日に選び，以下100および20mg／kg／日に設定した。
ESTは5％アラビアゴム溶液に懸濁して，体重1kg当り10mlの割合でゴム製カテーテルを用い経口投与した。なお，5％アラビアゴム
溶液をESTと同様に投与した群を設け，対照群とした。
3．投与期間
妊娠6日から18日までの13日間，連日投与した。
4．検査項目および検査方法
一般症状は毎日観察し，体重は投与期間中は毎日，その他は週1〜2回，摂餌量は過1〜2回測定した。妊娠28日目に空気栓塞法により屠殺し，胸，腹部内臓器の肉眼的観察を行った
後，着床数，死胚胎仔数および生存胎仔数を調べた。死胚胎仔はその形状により，吸収，初期，
中期および後期に分頬した1）。生存胎仔は性別判定，外表観察および体重測定後，胸・腹部内臓器を肉眼的に観察し，さらにその胸部臓器はプアン液に固定した。内臓検査後，70％エチル
アルコールで固定し，Dawson2）の方法に準じてアリザリンレッドS染色による骨格標本を作製した。プアン固定臓器は西村ら3）の方法に従い，異常の有無を調べた。骨格標本は実体顕17I E−64類縁体の開発

Foodconsumption

三二

0

3

67

Administration一一一一一十l

9

1113

15

17

19

23

28
（Days）

図1妊娠中の摂餌塁および体重変動

微鏡下に全骨格系の異常，変異ならびに化骨進
行度について観察した。
5．統計処理実験結果については，平均値の差はt−検定，率の差は∬2−検定を用い，いずれも危険率1％および5％で統計学的有意性を検討した。

群と変わらなかったが，500mg／kg群の死胚
胎仔数に有意な増加，生存胎仔数に有意な減少
ならびに生存胎仔体重に有意な低下が認められた。

1．母獣に及ぼす影響
体重変動および摂餌量を図1に示した。
いずれの投与群においても流産例はみられず，一般症状，体重，摂餌量にも影響は認められなかった。また，妊娠末期に開腹し，肉眼的に詰臓器を観察したが，異常は認められなかった。
2．胎仔に及ぼす影響

生存胎仔の外表観察では，500mg／kg群に口蓋裂が1例認められたが，内臓観察からは1
例の異常仔も認められなかった。
胎仔の骨格異常および変異の検査所見を表2−1に，化骨状態の検査所見を表2−2に示した。異常骨としては，各群に胸骨核癒合が4〜5例観察されたが，対照群と比べて有意なものではなかった。変異骨としては，頸・腰肋骨，
胸骨核分離および不相称，副胸骨核が観察され，このうち腰肋骨についてのみ，100および500mg／kg群に有意な増加が認められた。
化骨状態については，100mg／kg群に後肢妊娠28日目における子宮内および胎仔の観察所見を表1に示した。
各投与群とも着床数および生存仔性比は対照

左基節骨，500mg／kg群に前肢第1中手骨ならびに左右基節骨の有意な化骨遅延が認められる程度であった。

結18

果3．ESTの生殖に及ぼす影響

蓑1子宮内および胎仔所見Groups（mg／kg）

Contro1

20

100

500

No．ofdams（Fo）

13

17

14

15

No．ofimplants

118

158

114

121

9．3±1．6（17）8．1±1．7（14）8．1±1．4（15）2〈2〉32●書く9〉Implantsperlitter

9．1±2．1（13）No．Ofresorbedanddead
fetuses

Total

4〈3〉

7〈7〉

（％）l）

（3．4）

（4．4）

（1．8）

（26．4■りResorption

0く0〉

3く3〉

2〈2〉

19■■〈6り

Earlydeath

1〈1〉

1〈1〉

0く0〉

3

Middledeath

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0

く0〉

Latedeath

3〈2〉

3〈3〉

0〈0〉

10

〈6〉

〈3〉

No．Oflive fetuses

114

151

Fetusesperlitter

8．8 ±2．3（13）8．9 ±1．5（17）Sexratio

0．90

1．01

0，90

0．98

Male／Female

54／60

76／75

53／59

44／45

Bodyweight（g）
Male

112
8．0

±1．6（14）89
5．9±2．8（15）

31．81±4．84（54）30．60±4．58（76）31．08±6．43（53）29．88±4．92（44）Female32．17±4．73（60）31．83±4．93（75）30．37±6．26（59）30．04±3．53●●（45）Male＋Female

32．00±4．76（114）31．21±4．78（151）30．70±6．32（112）29．96±4．25．■（89）External anomalies

Total
（％）
Visceralanomalies
Total
（％）

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

1＃〈1〉

（0．0）

（0．0）

（0．0）

（1．1）

0〈0〉

0く0〉

0く0〉

0く0〉

（0．0）

（0．0）

（0．0）

（0．0）

Mean±S．D．（）：No．ofanimals〈〉：No．ofdamsinvoIvedwithcase＃：Cleftpalatel）：No．ofresorbedanddeadfetuses／No．ofimplants■：p＜0．05●■：p＜0．01

考察

いずれの投与群においても母獣の一般症状に異常はみられず，体重ならびに摂餌量にも影響は認められなかった。また，妊娠末期の子宮内観察では，いずれの投与群も着床数，生存仔性比は対照群と変わらなかったが，500mg／kg
群に死胚胎仔数の増加，生存胎仔数の減少ならびに生存胎仔体重の減少が認められた。死胚胎
仔数の増加については，予試験の500mg／kg
以土の投与量においても認められており，ESTの500mg／kg投与量は，妊娠ウサギにおける胚・胎仔の生存に影響を与える投与量であると推測された。
生存胎仔の視察において，500mg／kg群に
1例の口蓋裂が観察された。この異常仔はしばしば自然発生するものであるが4），胎仔致死量で出現しているところから，ESTの大量投与との関連が推測された。
胎仔の骨格検査からは，異常骨として各群に胸骨核癒合が4〜5例観察され，さらに変異骨として，100および500mg／kg群に腰肋骨の増加がみられた。この腰肋骨の増加について
は，ラットでは催奇形成の指標になるといわれているが5），遺伝的に不均一なウサギにおいてはしばしば高頻度にみられる変異であり，
19

I E−64類縁体の開発
蓑2−1胎仔の骨格検査所見一異常および変異−Groups（mg／kg）

Contro1

20100No．ofdams（Fo）

13

17

14

No．offetusesexamined（Fl）

114

151

112

Abnormalities
﹀
0
﹀
0
﹀
0
﹀
0
﹀
3
﹀
0
﹀
0
﹀
0
﹀
0
﹀
0

0

く

0

く

0

く

0

く

0

く

4

く

0

﹀
3

4

く

︶
5
・
4
︵

︵

﹀
︑1．
6
・
3

4

︵

︶
4
・
4
︵

﹀
5
︶
3
・
3

5

く

﹀
4

0

く

く

0

0

く

く

0

0

く

く

0

く

﹀
0

く

く

0

0

く

﹀
0

﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
0 0 4 0 0 0 0 0

4

く

﹀
0

0

く

﹀
0

0

く

﹀
0

0

く

5

く

﹀
﹀
﹀
0 0 1

﹀
0

0

﹀
0

0

く

﹀
0

く

﹀
5

0

﹀
0

0

く

﹀
0

0

く

く

﹀
0

0

﹀
0

0

く

﹀
0

0

く

く

﹀
0

5

く

0

く

0

く

0

く

﹀
1

0

﹀
0

0

く

（％）1）

く

﹀
0

0

く

Others
Total

﹀
0

0

Knobofribs

くAbsenceofribs﹀
0

5

Wavedribs

く0Fusion ofribs

く0Fusion ofsternebrae

く0Fusion ofvertebralarches
Deformityofvertebralarches

く0Deformityofvertebralcenters

くFusion ofvertebralcenters

Variations
﹀
0
﹀
0
﹀
0
﹀
0
﹀
0

0

く

0

く

0

﹀
0

く

く

0

﹀
0

0

く

﹀
0

0

0

﹀
0

く

0

く

﹀
0

く

く0〉

0

く

﹀
0

く

﹀
0

0

0

﹀
0

く

﹀
0

0

﹀
0

0

く

0

﹀
0

く

く

Bifurcation ofcervicalvertebralarches

0

﹀
0

0

0

SplitofcerviCalvertebralarches

く

﹀
0

く

0

Bifurcation ofvertebralcenters

0

﹀
0

く

0

Splitofvertebralcenters

く

﹀
0

く

〈0〉

0

く

0

Bilobed vertebralcenters

Splitoflumbarvertebralarches

0

〈0〉

0

〈0〉

Extralumbarvertebrae

0

く0〉

0

〈0〉

0

く0〉

0

〈0〉

Rudimentarylumbarvertebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

Splitofsternebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

Asymmetryofsternebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

く0〉

3

〈2〉

Accessorysternebrae

0

〈0〉

0

く0〉

0

く0〉

2

〈2〉

Dislocated sternebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

Cervical ribs

3

〈3〉

1〈1〉

4

く3〉

6

〈5〉

Lumbar ribs
Shorteningofribs
OthersTotal（％）2）

41〈10〉

61〈13〉

60◆〈13〉〈0〉
1〈1〉63…〈13〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

44

〈12〉

62

（38．6）〈14〉（41．1）

63轟く13〉（56．3）

68■書く14〉（77．3）く 〉：No．ofdamsinvoIvedwithcasel）Totalfetuseswithabnormalities／No．offetusesobserved2）Totalfetuseswithvariations／No．offetusesobserved■：p＜0．05●■：p＜0．01

PalmerJ）はニュージーランドホワイト種で25〜75％の出現を，また，本試験と同一Breederのものを用いた阿久津ら6）は65．2％の出現を報告しており，さらに当研BackgroundDataにおいても66．3％である。したがって，本試験に20みられた腰肋骨の増加はEST投与のみに起因したものとは考え難い。化骨状態については，500mg／kg群に胎仔体重の低下と関連した化骨遅延がみられ，高用量におけるESTの胎仔発育に対する影響が認められた。

3．ESTの生始に及ぼす影響
表2−2 胎仔の骨格検査所見一化骨状態一Groups（mg／kg）

20

No．ofdams（Fo）

13

17

100
14

No．offetusesexamined（Fl）

114

151

112

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

5
1

Contro1

88

SkullSupraoccipitalbone
Cervicothoracic vertebrae
lst cervicalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

2ndcervicalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

3rd cervicalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

4th cervicalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

87く15〉

5th cervicalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

6th cervicalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

7th cerviCalcenter

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

lst sternebra

114〈13〉

151〈17〉

111〈14〉

88く15〉

2nd sternebra

112く13〉

149〈17〉

108〈14〉

83〈15〉

3rd sternebra

114く13〉

151〈17〉

112〈14〉

88く15〉

4th sternebra

113〈13〉

151〈17〉

110く14〉

88く15〉

5th sternebra

78〈13〉

95〈17〉

73く14〉

60〈13〉

6th sternebra

104く13〉

126〈17〉

97〈14〉

79〈14〉

lst metacarpus（rigth）

103〈13〉

128〈17〉

91〈14〉

67■〈14〉

1st metacarpus（left）

103〈13〉

126〈17〉

92く14〉

67■く14〉

2ndmetacarpus（right）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

2ndmetacarpus（left）

114〈13〉

151く17〉

112〈14〉

88〈15〉

3rd metacarpus（right）

114〈13〉

151く17〉

112〈14〉

88〈15〉

3rd metacarpus（left）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

4th metacarpus（right）

114〈13〉

151〈17〉

112く14〉

88〈15〉

4th metacarpus（left）

114〈13〉

151〈17〉

112く14〉

88〈15〉

5th metacarpus（right）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

5th metacarpus（left）

114く13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

Sternebrae

Forelimb

No．ofproximalphalanges（right）5．0±0．0（114）5．0±0．1（151）5．0±0．2（112）4．9±0．4■■（88）No．ofproximalphalanges（1eft）

5．0±0．0（114）5．0±0．1（151）5．0±0．2（112）4．9±0．4■■（88）Hindlimb

2ndmetatarsus（right）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

2ndmetatarsus（1eft）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

3rdmetatarsus（right）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

3rdmetatarsus（left）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

4thmetatarsus（right）

1￣14〈Ⅰ3〉

151〈17〉

112〈14〉

88〈15〉

4thmetatarsus（left）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88く15〉

5thmetatarsus（right）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

88く15〉

5thmetatarsus（left）

114〈13〉

151〈17〉

112〈14〉

No．ofproximalphalanges（right）
No．ofproximalphalanges（left）
No．ofcaudalvertebrae

4．0±0．0（114）

88〈15〉
4．0±0．0（88）4．0±0．0（114）4．0±0．0（151）3．9±0．6●（112）

4．0±0．0（88）16．1±0．7（114）16．1±0．7（151）16．2±0．8（112）16．3±0．9（88）Mean±S．D．（）：No．offetusesobserved●：p＜0．05

4．0±0．0（151）3．9±0．6（112）〈〉：No．ofdamsinvoIvedwithcase■■：p＜0．0121I E−64類縁体の開発

以上のごとく，ESTは100mg／kg以上の投与量において胎仔の発育に影響するものと考え
られた。
結

論

ニュージーランドホワイト種ウサギの胚・器

500mg／kg／日を経口投与した。
ESTは，いずれの投与量でも母獣の一般症
状，体重および摂餌量に影響を与えないが，500mg／kg投与量では胎仔の生存ならびに体
重，また，100mg／kg以上で胎仔の骨発育に影響を与える。

官形成期にESTの0（対照），20，100および

Ⅱ．周産期および授乳期投与試験
3．投与期間目

的ESTを妊娠ラットの周産期および授乳期に経口投与し，母獣ならびにその産仔に及ぼす影響について検討する。
方法

1．使用動物および飼育条件
動物は，Wistar系ラット雌14過令，雄15週
令（静動協）を用いた。飼育は，木屑敷プラス
チックケージに動物を入れ，温度23±2℃，
湿度30〜70％の空調動物室で固型飼料（オリエンタル酵母杜：MF）および殺菌水を自由に摂取させる方法で行った。
妊娠動物を得るために，雌雄を2：1の割合
で昼夜同居させ，翌朝，膣内に精子の認められた雌を選び，その日を妊娠0日と定め用いた。
妊娠動物は，1群22〜24匹（予試験8匹）に分け試験に供した。
2．投与量および投与方法
予試験の結果，ESTは500mg／kg投与量
で，母獣・産仔の体重増加ならびに産仔の生存率（42．9％）に影響を示したが，250mg／kg以下の投与量では，産仔の出生直後の体重を一時的に低下させる程度であった。これより，本試験における最大投与量は320mg／kg／日が妥当と考え，以下80および20mg／kg／日に設定した。
ESTは，5％アラビアゴム懸濁液とし，体重100g当りlmlの割合で1日1回，胃ゾンデを用い強制経口投与した。なお，5％アラビア
ゴム液投与群を設け対照群とした。

22

妊娠17日目から分娩後21日目までの約28
日間連続投与した。
4．検査項目および検査方法（1）母獣（Fo）
症状は毎日観察し，体重は投与期間中は毎日，その他は週1〜2回，摂餌量は週1〜2回測定した。各群の動物は22〜24匹に分け，全例自然分娩させ，妊娠日数（精子確認日から分娩日までの日数）および出産率（生仔出産雌数／妊娠雌数×100）を算出した。分娩後は哺育状態を観察し，哺育終了後は分娩後22日目に全例屠殺剖検した。
剖検時には肉眼的観察ならびに主要臓器（心臓，肺，肝臓，腎臓，脾臓，副腎および胸腺）の重量測定および子宮内の着床痕数を調べた。
着床痕数は出生仔数と比較し，出生率（出生仔数／着床痕数×100）を算出した。
（2）産仔（Fl）
出産直後に産仔数，生死，性別判定および外表異常の有無を調べ，4日令時に1母獣当り8匹に調整した。生後の一般状態ならびに外表分化状態（耳介開展日，毛生日，歯芽所出日，眼瞼閲裂日，精巣下降日および膣開口日）は毎日観察した。体重は，生後0，4，7，14および22日目に生存全仔について，22日日以後は1
週毎に生殖能検査に供した産仔についてのみ測定した。また，生存率は，生後4日目（生後4日の生仔数／出産生仔数×100）および生後22
日日（生後22日の生仔数／生後4日の調整直後の生仔数×100）にそれぞれ算出した。
生後22日目には，行動・感覚機能および情3．ESTの生殖に及ぼす影響

二

0

6
二

10

15

17

Administration

19012345678

21

1012

1416

18

20

22

Daysafterdelivery

Daysofgestation

図2 母獣（Fo）の体重変動

（g）
50

40

30

20

10

Administration
0

15

18

21

・←Daysofgestation・■

2

7

二＝

Daysafterdelivery

1422

図3 母獣（Fo）の摂餌塁

動性・学習能検査ならびに生殖能検査に供した産仔を除き屠殺し，臓器の肉眼的観察および軟Ⅹ線撮影（ソフテックス：CMB−2型）による骨格検査を行った。剖検仔のうち，1母獣当り雌雄各1〜2匹については主要臓器（心臓，肺，

肝臓，腎臓，脾臓，胸腺および精巣）の重量を測定した。4週令時にはFoxT），Irwin8）および
Altman9）の方法に準じ，正向，耳介，音，角膜，
光および痛覚反射ならびに平衡感覚を，また5
週令時には傾斜板装置（シナノ製作所：SN−23

I E−64類縁体の開発
蓑3 母獣（F。）および産仔（Fl）所見
Groups（mg／kg）

No．of dams（Fo）
Gestationalperiod（day）
No．ofimplantation traces
Implantation traces perlitter

Contro1

20

22

80

22

22．0±0．2（22）22．1±0．4（22）

204

22

8．6±2．8（22）2422．1±0．4（22）22．1±0．3（24）

181

190

9．3±2．6（22）

320

211

8．2±2．7（22）8．8±2．8（24）Delivery rate（％）1）

100
22／22

100
22／22

100
22／22

100
24／24

No．of newborns

198

179

173

196

Newborns perlitter

9．0±2．5（22）8．1±2．8（22）7．9±2．5（22）8．2±2．5（24）N0．0flive newborns

198

178

173

193

Live newborns perlitter

9．0±2．5（22）8．1±2．7（22）7．9±2．5（22）8．0±2．5（24）Birth rate（％P）
Sex ratio
Male／Female
No．of stillborn

97．1
198／20493．7
178／190

1．22

1．05

109／8991／87

64／10992／101

0

1

0

3

0〈0〉

0く0〉

0〈0〉

0〈0〉

99．5

94．4
168／178100
173／17398．0
145／14898．0
149／152

95．6

91．5暮

173／1810．59■◆

193／211
0．91

No．of newborns withexternal anomalies
Survival rate（％）
At day4

At day22

197／198100
162／162

Mean±S．D．（）：No．of animals observed〈〉：No．of damsinvoIved with casel）：No．of animals delivered withlive newborns／No．of pregnant animals
2）：No．oflive newborns／No．ofimplantation traces
暮：p＜0．05…：p＜0．01463型）を用いて筋力を調べた。さらに，7週
令時にはSchapirolO）の方法に準じて水迷路装置（Waterfi11edmultipleT一maZe；室町機械
製，WM−01型，水深20cm，水温23−25℃）を用い遊泳による運動協調性ならびに学習能検
査11）を，また，8週令時には，Passive avoid−ance response（PAR，自社製装置）による自発
運動量，情動性ならびに学習能検査を行った12）。
10過令時には，1母獣当り雌雄各1匹について生殖能検査を行った。検査は兄妹交配を避け最長3週間の交配を行い，その間，膣内の精子確認により交尾成立数，交尾率（交尾動物数／同
居動物数×100）および交尾成立までの日数を調べた。交尾成立した雌のうち約半数を交尾成
立後20日目に開腹し，子宮内状態，黄体数，着床数，受胎率（妊娠動物数／交尾動物数×100），
生存胎仔（F2）数および胎仔の状態1）を調べた。
24

残りの雌は自然分娩させ，分娩および哺育状態，産仔（F2）数および産仔の一般状態について観察した後，分娩後21日目に屠殺し，臓器の肉眼的観察ならびに着床痕数を調べた。
5．統計処理実験結果については，平均値の差は卜検定，率の差は∬2−検定を用い，いずれも危険率1％および5％で統計学的有意性を検討した。
結

果

1．母獣（Fo）に及ぼす影響（1）一般症状
いずれの投与群においても毒性症状はみられず，死亡例も認められなかった。
（2）体重および摂餌量
妊娠中および分娩後の体重変動，摂餌量を図2，3に示した。体重では，320mg／kg群にお3．ESTの生殖に及ぼす影響

0

4

7

14

0

22

4

7

14

22

Daysafterbirth

図4−1産仔（Fl）の体重変動（離乳前）

28

35

42

49

56

28

35

42

49

56

Daysafterbirth

図4−2 産仔（Fl）の体重変動（離乳後）25I E−64好i縁体の閲発
表4 産仔（F．）の骨格検査所見Groups（mg／kg）

Contro1

20
0
2
1
6

1
7

8
6

6
7

No．ofexaminedoffspring（F．）

0
2

1
2

1
2

No．ofdams（F。）
Abnormalities

0
0
0
0

0

﹀
0
く

0

0

﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
0 0 0 0 0 0
く く ︿ く く く﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀0 0 0 0 0 0 0 0
く く く く く く く く・く く

0

﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
0 0 0 0 0 0
く
く
く
く
く
︿

﹀
0
く

0

0

﹀
0
く

﹀
0
く

0

0

﹀
0
く

﹀
0
く

0

0

〈0〉

Others0

く0〉Extrathoracic vertebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

く0〉

Extralumbarvertebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

Rudimentarylumbarvertebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

Cervicalribs

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

Lumbarribs

0

〈0〉

0

く0〉

0

〈0〉

0

く0〉

Shorteningofribs

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

く0〉

Accessorysternebrae

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

Others

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

0

Abnormalhindlimb00Abnormalforelimb

Sternum

0

l

Ribs

﹀ ﹀
l
0
く く
■岬

Caudal vertebrae

﹀
0
く

O

﹀ ﹀
0 O
︿ く

0

Sacralvertebrae

0

﹀
0
く

0

Lumbarvertebrae

﹀
0
く

﹀
0
く

0

Thoracicvertebrae

0

﹀
0
く

0

Skull

0

0

0

0

0

0

﹀
0
く

﹀
0

0

0

0

0

0

﹀
0

0

Variations

No．ofcaudalvertebrae

26．5±1．5（76）26．4±1．6（68）Mean±S．D．（）：No．ofobservedanimals〈

26．4±1．4（71）26．5±1．4（61）〉：No．ofdamsinvoIvedwithcase＃：Deformedsternebrae（ⅠⅤ，Ⅴ）

表5 産仔（Fl）の外表分化状態
Groups（mg／kg）

Contro1

20

80

320

No．ofdams（Fo）

22

22

22

Detachmentofears（％）

99．0

97．6

98．8

94．1暮

195／197

165／・169

171／173

143／152

96．3

95．9

96．7

92．6

156／162

142／148

147／152

126／136

Day

4

Appearanceofhair（％）
Day lO
Eruptionofteeth（％）
Day12
0peningofeyelids（％）
Day18
Descentoftestis（％）
Day

28

0peningofvagina（％）
Day

38

Mean±S．D．

：p＜0．05

97．5

92．6

94．0

83．8■■

158／162

137／148140／149

114／136

98．8

97．3

100．0

100．0

160／162

142／146

149／149

135／135

83．7

81．6

72．2

86．5

36／43

31／38

26／36

32／37

95．3

92．3

97．6

81．1

41／43

36／39

41／42

30／37

：p＜0．01

No．ofoffspringdeveloped／No．ofoffspringobserved

26

24

3．ESTの生殖に及ぼす影響
表6 産仔（Fl）の行動・感覚機能検査成績
Groups（mg／kg）

Contro1

20

80

320

Male
No．ofoffspringexamined（Fl）

21

19

15

18

Rightingrenex
Pinna renex

21

19

15

18

21

19

15

18

Tone renex

21

19

15

18

Cornealrenex

21

19

15

18

Lightrenex

21

19

15

18

Pain reRex

21

19

15

18

Equilibriumresponse

21

19

15

18

Musculartone（deg．）

38．7±3．6（21）37．7±3．7（19）37．5±2．6（15）37．7±3．3（18）Motorc0−0rdination

19

14

18

Spontaneousactivity

19

15

18

FemaleNo．ofoffspringexamined（Fl）

21

20

21

18

Rightingrenex

21

20

21

18

Pinna renex

21

20

21

18

Tonerenex

21

20

21

18

Cornealrenex

21

20

21

18

Lightrenex

21

20

21

18

Pain reflex

21

20

21

18

Equilibriumresponse

21

20

21

18

Musculartone（deg．）

36．6±3．2（21）Motorc0−0rdination

21

20

21

18

Spontaneousactivity

21

20

21

18

37．5±4．1（20）36．1±1．9（21）36．2±4．4（18）Mean±S．D．（）：No．ofoffspringobserved

いて投与開始後4日目より増加抑制の傾向がみられ，分娩後2日目には有意な抑制が認められた。摂餌量では，体重と同様，320mg／kg群において妊娠18，21日日ならびに分娩後2，14および22日目に有意な減少が認められた。
（3）分娩および哺育所見
母獣の分娩後の状況について表3の一部に示した。いずれの投与群の母獣も分娩時に異常を示さず，妊娠日数および出産率も対照群とほぼ同程度の値であったが，産仔の生存数からみた哺育状況では320mg／kg群に哺育低下が示された。
（4）剖検所見
分娩後22日日剖検では，肉眼的な異常は観察されなかったが，臓器重量において，320mg／kg群の脾臓の絶対重量，心臓の相対重量，腎臓の相対ならびに絶対重量に有意な増加が認められた。
2．産仔（Fl）に及ぼす影響（1）出生後状況
産仔の出生後の状況を表3の一部に示した。
いずれの投与群の産仔にも外表異常は観察されず，出生仔数も変わらなかったが，80mg／kg
群に雄性数の減少を示す性比，320mg／kg群に出生率ならびに4日目における生存率の低下が認められた。
（2）一般症状
いずれの投与群においても一般症状に異常は観察されなかった。
（3）体重
産仔の体重変動を図4−1，4−2に示した。
20mg／kg群の雄の生後4，7，14および22日
目，80mg／kg群の雌雄の4および7日目にいずれも有意な増加がみられたが，320mg／kg
27

I E−64類縁体の開発
表7 産仔（Fl）の水迷路学習検査成績
Groups（mg／kg）

Contro1

20

80

320

Male

S−n
dr
d
123

Straightway
Time

S−n
dr
d仙tht
ht
ht
ht
hS
−n
dr
dt
h仙tht
ht
ht
h
123456789123456789

em
e
aZ
iT
m
T

30．5±19．5（16）9．4± 6．8（16）6．9± 7．5（16）41．0±33．6（15）25．5±21．8（14）20．4±17．0（15）7．6± 3．6（15）9．8± 8．0（14）8．9±10．5（15）6，3±4．6（15）5．9± 2．5（14）4．6±1．0（15）112．2±72．1（16）56．9±72．2（16）34．1±25．0（16）23．3±11．8（16）16．1±4．7（16）11．9±1．8（16）15．8±5．3（16）17．1±4．8（16）13．4±5．9（16）14．1±11．3（16）7．3±12．3（16）3．4± 2．4（16）90．7±59．0（15）66．6±39．7■（14）87．9±55．8（15）60．8±60．5（15）40．8±19．0（14）30．2±10．8（15）29．0±24．1（15）31．3±25．6（14）22．6± 8．1（15）20．2±10．7（15）22．5±17．0（14）19．0± 7．1（15）17．8±11．9（15） 16．0± 7．2（14）13．9± 3．7（15）11．9±3．2（15） 13．5±4．8（14）11．6± 2．6（15）15．1± 5．8（15）25．7±38．9（14）14．1±4．9（15）14．5± 4．8（15） 16．2±15．7（14）14．2± 5．9（15）13．8±4．1（15） 12．2±4．9（14）12．0± 4．0（15）8．4± 3．6（15）8．4± 5．0（14）10．5± 3，9（15）7．1±5．8（15）3．1± 2．3（15）6．4±3．1（14）4．1± 3．9（14）3．8± 2．7（15）2．3± 2．1（15）2．2± 2．9（15）3．3± 4．3（14）1．8±1．6（14）2．5± 2．0（15）0．8±1．1（15）1．4±1．7（14）0．6± 0．9（15）0．1± 0．5（15）0．8±1．1（15）1．8±3．8（14）0．5±1．0（15）0．6±1．0（15）0．8± 2．2（14）0．3± 0．9（15）0．7±1．0（15）0．5± 0．9（14）0．5±1．2（15）2．8± 2．2（16）1．1±1．3（16）0．5± 0．8（16）0．6±1．0（16）0．5± 0．8（16）0．4± 0．8（16）3．8±1．7（15）Female
Time

S
−n
dr
d
123

Straightway

46．6±27．2（16）

S−n
dr
dt
h仙仙仙仙仙S −ndrd仙th仙th仙th
123456789123456789

maT

誓
1
m

T

27．0±21．0■（15）35．4±15．3（16）30．0±22．5（14）6．9± 3．2（16） 11．9±11．2（15）9．3± 9．6（16）7．6± 4．2（14）5．4±1．5（16）6．9± 6．2（15）4．6±1．2（16）5．6±3．5（14）78．6±60．4（16）54．9±22．3（15）73．9±41．4（16）64．8±32．2（14）55．2±40．6（16）42．9±41．9（15）36．4±21．9（16）35．4±20．3（14）32．5±24．9（16）35．8±50．9（16）33．6±33．7（15）20．4± 8．1（15）31．6±39．6（16）20．4± 7．6（14）20．6±14．2（16） 18．6± 6．8（15）16．8± 7．9（16） 15．6± 5．3（15）20．2±23．1（16） 14．8± 5．8（15）16，1±8．3（16） 14．1±4．1（14）15．5± 5．6（16） 19．3±22．9（14）17．8±8．3（16）21．6±21．3（15）21．9±16．7（16） 14．0±4．9（14）15．2± 7．9（16） 15．3± 7．9（15）12．8± 4．3（16） 11．7± 3．7（14）10．4± 6，2（16）7．7± 3．7（15）11．3± 5．7（16）8．6±3．3（14）9．1± 8．2（16）6．7± 6．8（15）6．5± 5．3（16）6．4± 5．2（14）4．6± 5．4（16）5．5± 6．4（15）4．9±7．5（16）3．6±2．8（14）5．8±8．7（16）2．5±1．6（15）3．6±2．5（16）5．1±6．0（14）3．5± 4．5（16）2．3± 2．3（15）2．8±2．7（16）2．8±3．0（14）1．9± 2．1（16）2．1± 4．4（16）1．6±1．5（15）0．7±1．2（15）1．9± 2．0（16）0．9±1．2（14）1．1±1．5（16）2．3± 6．3（14）1．0±1．3（16）0．7±1．1（16）1．9± 2．9（15）0．9±1．8（15）Mean±S．D．（）：No．ofoffspringobserved Time：SeCOnd28

22，5±8．7（16）28．9±29．4（14）19．1± 9．2（16） 19．2±11．3（14）1．4± 2．4（16）0．6±1．0（14）0．8±1．2（16）0．9±1．4（14）■：p＜0．05

3．ESTの生殖に及ぼす影響
蓑8 産仔（Fl）のPAR学習・情動性検杢成績Groups（mg／kg）

Contro1

20

80

320

Male
Exploration
Gatein2．9± 0．9（16）3．3±1．3（15）3．1±0．9（14）3．2±0．9（14）Latency（sec．）

59．0±36．0（16）45．7±30．3（15）42．3±28．2（14）44．7±18．3（14）Staytime（SeC．）

22．2±21．9（16）22．2±13．9（15）31．3±36．1（14）28．5±18．9（14）Ambulation

29．9±7．2（16）25．0±10．4（15）29．8±11．2（14）26．4±10．2（14）Rearing5．6± 3．4（16）6．3±3．1（15）7．1±3．8（14）6．3±3．4（14）Grooming

1．3± 0．7（16）1．3±1．4（15）0．9±0．9（14）0．8±0．9（14）Defecation

0．3±0．7（16）0．2±0．6（15）0．1±0．4（14）0．1±0．4（14）Urination

0．6±1．0（16）0．7±1．4（15）0．8±1．3（14）0．9±1．3（14）Acquisition
Gatein0．0± 0．0（16）0．0± 0．0（15）0．1±0．3（14）0．0±0．0（14）Latency（SeC．）

180．0±0．0（16）180．0± 0．0（15）175．4±17．1（14）180．0±0．0（14）Staytime（SeC．）
Ambulation

0．0±0．0（16）0．0± 0．0（15）0．4±1．3（14）0．0±0．0（14）13．7±11．6（16）12．7±10．6（15）11．6±8．0（14）11．1±10．7（14）Rearing3．5± 3．5（16）2．8± 2．2（15）2．9±2．9（14）2．0±3．0（14）Groomlng

0．9±1．3（16）0．9±1．4（15）1．1±1．2（14）0．6±1．2（14）Defecation

1．1±1．4（16）2．1±1．4（15）1．7±2．1（14）1．1±1．6（14）Urination

0．9±1．2（16）1．2±1．6（15）1．4±1．6（14）1．1±1．6（14）FemaleExploration
Gatein3．2±1．6（17）3．4±1．0（15）3．6±1．2（16）3．5±0．9（14）36．5±13．0（17）35．8±11．0（15）41．2±22．7（16）43．5±22．7（14）Staytime（SeC．）

19．8±19．2（17）23．6±33．2（15）14．4±6．1（16）21．9±12．2（14）Ambulation

36．8± 9．4（17）35．7±11．7（15）36．7±9．1（16）32．3±7．2（14）Rearing7．2±3．2（17）6．7± 2．8（15）7．4±3．6（16）7．4±3．8（14）Grooming

1．4±1．5（17）0．6±1．4（15）0．6±0．7（16）0．9±1．4（14）Defecation

0．0±0．0（17）0．0±0．0（15）0．0±0．0（16）0．0± 0．0（14）Urination

0．0±0．0（17）0．0±0．0（15）0．1±0．3（16）0．0±0．0（14）Latency（SeC．）

Acquisition
GateinLatency（SeC．）

0．0±0．0（17）0．0± 0．0（15）0．0±0．0（16）0．1±0．4（14）180．0±0．0（17）180．0± 0．0（15）180．0±0．0（16）172．1±20．3（14）Staytime（SeC．）

0．0± 0．0（17）0．0± 0．0（15）0．0±0．0（16）2．1±6．4（14）Ambulation

18．2±12．9（17）13．1± 8．6（15）18．2±13．6（16）21．6±13．2（14）Rearing3．9±4．0（17）2．3± 2．2（15）3．0±3．5（16）4．1±3．8（14）Grooming

1．1±1．2（17）1．2±1．1（15）2．1±1．2●（16）1．2±1．1（14）Defecation

0．3±1．0（17）0．3±0．8（15）0．3±0．6（16）0．6±1．3（14）Urination

0．1± 0．2（17）0．1± 0．3（15）0．3±0．6（16）0．4±0．7（14）Mean±S．D．（）：No．ofoffspringobserved

群では，雌雄とも出生時より生後8週令時まで継続した増加抑制が認められた。
（4）剖検所見
生後22日日剖検では，肉眼的な異常は観察されなかったが，臓器重量において20mg／kg●：p＜0．05

群の雌の肺（絶対重量），320mg／kg群の雌の肺（相対重畳）にそれぞれ増加が認められた。
（5）骨格検査
離乳時の骨格検査結果を表4に示した。異常骨として，対照群に胸骨の形成不全が1例観察
29

I E−64校緑体の開発
蓑9 産仔（Fl）の生殖能検査成績
Groups（mg／kg）

contro1

20

80

19

No．ofdams（Fo）

21

19

1 1
2 2

No．ofoffspring（Fl）mated
Male

320

Female74

8 3 33．ハ1−7days

9

13

14

6

8−14days

3

1

1

0

Over15days

4

1

0

154
1

5 2 2 0 ． 〃199Copulating
ト7days8−14days

1

2

0．〃
90

Over15days
Copulativerate（％）1）
Impregnating

80．0
16／20

Pregnancyrate（％）2）
Durationofmating（day）

0
82．4
14／17

84．2
16／19

42．9
6／14

9．0±7．0（22）6．3±6．7（19）6．6±6．8（21）11．0±8．3（19）Mean±S．D．（）：No．ofpairsobservedl）：No．ofanimalscopulated／No．ofanimalsmated2）：No．ofanimalspregnated／No．ofanimalscopulated

されたが，投与群には1例の異常も観察されなかった。
（6）外表分化
外表分化の観察結果を表5に示した。320
mg／kg群において，耳介開展日および歯芽前
出日の遅延が認められたが，他の投与群では対照群と変わらなかった。

（7）行動・感覚機能検査
行動・感覚機能検査の結果を表6に示した。
いずれの投与群においても，行動・感覚機能に関する異常は認められなかった。
（8）学習能および情動性検査
水迷路装置およびPAR装置による学習検査
ならびに情動性検査の結果を表7，8に示した。水迷路学習検査では，直線トレーニングの1回目において，20mg／kg群の雌に，またその後の学習1回目において80mg／kg群の雄にそれぞれ所要時間の短縮がみられた以外はいずれの投与群もほぼ対照群と同様な所要時間およびェラー数を示し，迷路学習にも異常は認められなかった。PAR装置のフィールド内でみら30れた自由探索行動，脱糞および排尿数などの情動性はいずれの投与群も対照群と変わらず（学習前），暗箱入室後の電撃刺激に対するフィー
ルド内の反応も（学習後）80m女／kg群の雌に身づくろい回数が増加した程度であった。また，学習後はいずれの投与群もフィールド内では潜時が延長し，暗箱への入室回数，滞在時間も減少し，対照群と同様な学習効果が認められた。
（9）生殖能検査
産仔（Fl）の生殖能検査における交配成績を
表9，妊娠20日目の子宮内状態および胎仔（F2）所見を表10に示した。いずれの投与群も交配後の成績は対照群と変わらなかったが，320mg／kg群に交尾率および受胎率の低下傾向が示された。妊娠末期の子宮内状態および胎仔（F2）の所見では，20mg／kg群に黄体数の減
少および胎仔体重の増加がみられた以外著変は認められなかった。Flを分娩させたところ，いずれの投与群にも哺育異常はみられず，F2の発育も順調であった。なお，表には示さなかった

3．ESTの生殖に及ぼす影響
蓑10 胎仔（F2）所見Groups（mg／kg）

Contro1

20

80

320
2

No．ofdams（Fo）

8

9No．ofoffspringpregnanted（Fl）

8

9

2

No．ofcorporalutea

93

102

23

Corporaluteaperlitter ll．6±1．5（8）No．ofimplants

9．6±2．1■（7）11．3±1．1（9）11．5±0．7（2）

67

52

79

15

Implantsperlitter

8．4±1．8（8）7．4±3．6（7）8．8±2，5（9）7．5±2．1（2）Implantrate（％）1）

72．0
67／93

77．6
52／67

77．5
79／102

65．2
15／23

1〈1〉

0〈0〉

No．ofresoebedand deadfetuses0〈0〉Late death

0〈0〉No．oflivefetuses

67

Fetusesperlitter0

Middledeath

0

0〈0〉

1

Earlydeath

0

0〈0〉

﹀
﹀
﹀
﹀
﹀
1 日 1 ＝ ‖ 5 1

0〈0〉Resorption

1

Total

8．4±1．8（8）7．3±3．5（7）Sex ratio

1．03

1．83

Male／Female

34／33

1〈1〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

78

15

8．7±2．6（9）7．5±2．1（2）

0．90

1．50

37／41

9／6

33／18

Bodyweight（g）
Male

3．28±0．18（34）3．38±0．24■（33）3．27±0．19（37）3．19±0．25（9）Female2．99±0．29（33）3．18±0．22■（18）3．05±0．22（41）3．12±0．13（6）Male＋Female

3．14±0．28（67）3．31±0．25＊■（51）3．15±0．23（78）3．16±0．21（15）Externalanomalies
Total

0〈0〉

Mean±S．D．■：p＜0．05

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

＊■：p＜0．01（）：No．ofanimalsobserved〈〉：No．ofdamsinvoIvedwithcasel）：No．ofimplants／No．ofcorporalutea

が，交尾不成立動物を非投与動物と交配させた
ところ，対照群と同程度の交尾・受胎を示した。
考察ESTのラットにおける周産期および授乳期投与試験を行った。
母獣（Fo）はESTの320mg／kg投与によって若干の体重増加抑制，摂餌量の減少ならびに腎重量増加を示し，この用量による毒性発現が認められた。ここでみられた腎重量は相対・絶
対重量共増加したもので，亜急性13）ならびに慢ノ性毒性試験14）の結果と一致し，ラットにおけるESTの大量長期投与に共通した影響と考えられた。しかし，いずれの投与群の母獣も分娩状態は正常で，出産仔数もほとんど変わらず分娩時の影響は認められなかった。なお，出生率において，320mg／kg投与でやや低下がみられたが，この低下は実際観察された死産仔数に加え胎生期死亡したものが存在していたことにより，着床痕数を増加させたためと推測された。
産仔（F．）の観察からは，いずれの投与群にも外表異常例はみられなかったが，320mg／kg
投与において，出生後4日目までの生存率に低下が認められた。さらに，この320mg／kg投
与では，産仔の体重増加が抑制され，一部の外表分化にも発育遅延がみられ，明らかに産仔への影響量と考えられた。離乳後の臓器重量，骨31

I E−64頬緑体の開発

格検査，各種行動・感覚機能検査，情動性および学習能の諸検査からは，投与に起因したと思われる異常は認められなかった。また，生殖能検査からは320mg／kg投与で交尾および受胎率に低下傾向が示されたが，これは，受胎動物の子宮内検査，分娩後の哺育能検査ならびに非投与動物との再交配の結果より，生殖能検査時までの生後発育遅延に起因したものと推測された。
結論

andBiology，27，45r60，1972．

5）安田峯生，前田広由：催奇形成試験での指標としての腰肋骨の意義，Cong．Anom．，13，25−29，1973．
6）阿久津貞夫，相沢 篤，松川明彦：Clebopride
Malateの生殖に及ぼす影響に関する研究 ウサギ
における器官形成期投与実験，基礎と臨床，16，5681−5685，1982．

7）Fox，W．M．：ReRex−OntOgenyandbehavioral
development of the mouse，Anim，Behav．，13，234−241，1965．

8）Irwin，S．：Animaland clinicalpharmacolog−
icaltechniquesindrugevaluation，edited by
Nodine，J．H．and Siegler，P．E．，36，1964，Year

Wistar系ラットの周産期および授乳期にESTを経口投与した。その結果，ESTは320
mg／kg投与量で母獣に軽度な毒性を示し，その産仔の生存率，体重増加ならびに外表分化な
どの生後発育に影響を与えた。また、本試験における無影響量は80mg／kg投与であると推測
された。
文

蘭

1）山田 隆，西山 勤，笹島道忠，中根貞雄：0Ⅹ−
aprozinの生殖試験−ラットにおける妊娠前及び
妊娠初期投与試験−，医薬品研究，15，207−224，
1984．

2）Dawson，A．B．：Anoteonthestainingoftheskeletonofclearedspecimenswithalizarinred
S，StainTechnology，1，123−124，1926．
3）西村耕一：マウスおよびラット胎仔の胸部内臓奇形観察のための顕微解剖法，Cong．Anom．，14，
23−40，1974．
4）Palmer，A．K．：Sporadic malformationsin
laboratoryanimaland theirinfluenceondrug
testing，Advancesin Experimental Medicine

32

bookmedicalpublishers．
9）Altman，J．and Sudarshan，K．：Postnatal
development oflocomotionin thelaboratory
rat，Anim，Behav．，23，896−920，1975．
10）Schapiro，S．，Salas，M．and Vukovich，K．：
Hormonaleffectsonontogenyofswimmingab−
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11）Biel，W．C∴Early age differencesin maze
performancein thealbinorat，J．Gen．Psycho1．，
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12）山田 隆，内田英男，市川明美：生殖試験における次世代動物の学習障害検索について，実験動物，
32，107−113，1983．

13）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−54，1983．
14）大関正弘：ESTの慢性毒性に関する研究，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年
度研究報告書，19−39，1984．

4．ESTのinvitro染色体異常試験

大 関 正 弘＊
研究協力者 鈴 木員

洋＊ 安 井的ESTをCHL細胞株に与えて染色体異常誘発の有無を検討する。
方

法

1．検体
ESTは直接法による測定においてはetha−
nolに，また代謝活性化法（以下，代謝法と称す）による測定においてはdimethylsulfoxide（DMSO）に溶解した。
陽性対照薬としては直接法では5−円uOrO−
uracil（5−FU）を，また代謝法ではdimethylL
nitrosamine（DMN）を用いた。
2．細胞株
Chinese hamsterの肺繊維芽細胞由来の株化細胞であるCHL細胞を用いた。
3．細胞増殖抑制試験（予試験）
本試験におけるESTの最大用量を決定するために，以下の50％細胞増殖抑制試験を行った。

CHLの凍結保存細胞を融解し，これを仔牛
血清10％を含むEagleの最小必須培養液（minimumessentialmedium，MEM）を注いだ
底面積25cm2の培養フラスコに移し，炭酸ガ
ス恒温器中で培養した（CO25％，37℃）。細胞がフラスコ底の全面に拡がったところで0．25％のtrypsin溶液を用いて細胞を剥離し，遠沈し■ 大正製薬株式会社総合研究所

一事 中 根 貞 雄■

た後，新しい培養液で細胞を懸濁して6×103
cells／mlとし，この各2mlを10枚の3cm径のシャーレに分注した。CO2恒温器中で3日間培養の後，ethanolに溶解したESTを各シャーレに添加した。濃度は1mg／ml（最終濃度）を最高に，以下公比2で稀釈して全8濃度段階とした。他に溶媒対照（1％ethanol）ならびに無処理対照（血清を含むMEM培地のみ）をそれぞれ用意した。
2日間培養の後、細胞層を10％フォルマリ
ン液で固定し，0．1％crystalviolet液で染色した。染色されたシャーレの光透過度を単層培養
細胞密度計（モノセレーク，オリンパス光学工
業製）を用いて計測し，作図によりESTによる細胞増殖の50％抑制濃度を算出した。この濃度（0．2mg／ml）を本試験における検体の最大用量とした。
4．本試験（1）直接法4×103cells／mlのMEM細胞懸濁培地を調製し，その各5mlを6cm径のシャーレ12枚に分注し培養した。培養3日目に培養上活を捨て，新たにEST（ethanolに溶解）を0．05，0．1
および0．2mg／mlの割合で与えた含血清
MEM培地各5mlをシャーレに加えた。他に無処理（培地のみ），溶媒処理（1％ethanol）および陽性対照（5−FU，0．00625mg／ml）の各2
シャーレを用意した。これら12枚のシャーレを培養し，24時間および48時間後，下記の操作でそれぞれ染色体標本を作製した。
33

I E−64類縁体の開発

培養終了の2時間前に各シャーレに5恥1（201Lg／ml）のCoIcemidを加えた。培養終了後，シ
ャーレに0．2％trypsin液2mlを加えて細胞を剥離し，内容物を遠沈管に移して遠沈した（1，000rpm，5分間）。上清を捨て，残垣に0．075MKCl水溶液3mlを加えて37℃で13分間静置した。これに冷即した固定液（メタノール：酢酸＝3：1）を加えて全量を約5mlとした。再び1，000rpmで5分間遠沈し，上活を捨てて新しい固定液を加えた。以下，室温放置10分間，遠沈・上活彙捨および固定液添加の操作を3回反復した。最後に細胞の沈蔭に少量の固定液を加えて適度な濃度の細胞浮遊液（約0．5ml）とし，その2，3滴を顕微鏡用スラ
イドグラスに滴下した。一夜自然風乾した後，
pH6．8のS6rensen緩衝液で稀釈した1．5％のGiemsa液で15分間染色して染色体標本を完成した。
（2）代謝法6×103cells／mlのMEM細胞懸濁培地を調製し，その各5mlを6cm径のシャーレ12枚に分注し培養した。培養3日目に培養上清を捨て，新たにEST（DMSOに溶解）を0．05，0．1
および0．2mg／mlの割合で与えた仔牛血清含
有MEM培地2．5mlを各2枚のシャーレに注いだ。同時に無処理対照（培地のみ），溶媒対照（0．5％DMSO）および陽性対照（DMNlmg／

20mM N−2−hydroxyethylpiperazine−
N′一2−ethanesulfonicacid（HEPES），

pH7．2：2容40mM nicotinamide adenine dinucleo−
tidephosphate（NADP＋）：1容50mM glucose−6−phosphate（GT6−P）：

1容
50mMMgC12：1容330mMKCl：1容2次蒸溜水：1容5．観察
1処理当り100個の染色体中期分裂像を検鏡観察した。染色体の構造的異常についてはギャップ（gap），切断（break），交換（exchange），環形成（ring），断片（fragment）およびその他（Others）に分類した。また，染色体数の異常については倍数性異常（polyploidy）にのみ着目
した1）。
6．評価法
観察結果について対照群（特に溶媒対照）と検体処理群を比較検討した。CHL細胞の場合，染色体に何らかの構造的異常を有する細胞の出現頻度は無処理あるいは溶媒対照においては3％を越えないとされ，以下の評価基準が行わ
陰性

疑陽性

±
︶

＋
︵
■

︶

卜

廿 ≠
︵
︵
■

︶

﹁

50．0〜100％︵

20．0〜49．9％■

0 〜 4．9％

5．0〜 9．9％
10．0〜19．9％︶

れている1）。
︵

34

phenobarbitalおよび5，6−benzoflavone
で酵素誘導；オリエンタル酵母工業㈱，lot181311）：3容

性性性
陽陽陽

ml）のシャーレ各2枚を用意した。引き続きそれらのシャーレの各1枚にはS9mix O．5ml
を，また他の各1枚にはMEM培地0．5mlを加え，それぞれ代謝活性化処理測定（＋S9）用，
同非処理測定（−S9）用とした。
これら12枚のシャーレを37℃で6時間培養した後，培養液を捨て，さらにHanksの平衡
塩類溶液を用いてシャーレ内部を十分洗い，検体（−S9測定），あるいは検体ならびにS9mix（＋S9測定）を除去した。次いでpenicillin
lOOunits／mlおよびstreptomycinlOqFLg／ml
を含むMEM液各5mlをシャーレに注ぎ，さらに18時間培養を継続した。
以下，直接法と同一の操作で染色体のスライド標本を作製した。

なお，S9mixの組成は次の通りである。
S9（ラット肝磨砕物の9，000G遠沈上活，また，倍数性異常細胞についてはその出現頬度が10％以上の場合，陽性とされる2）。
結果および考察
結果を表1および2に示す。染色体の構造的異常出現率は，ギャップを含む場合（TAG）と含まない場合（TA）の両方で表示したが，以下

4．ESTのinvitro染色体異常試験
表l ChromosomeaberrationtestofESTwithCHLcellline；Directmethod
Dose No．of Polyploid Structuralaberrations3Idetected

mg／ml 霊言霊Se S浩te。
24hr

48hr

0

1

1

2

0

0

一 一 一 ±

0

1

0

0

0

0

≠

9

9

0

5

9

0

36

3

0

0

6

0

0

5

0

0

3

0

0

0

1

0

1

0

0

0

1

0

2
4

1

7

2

6

9

0

2

0

0

0

0

0

3

0

0

0

1
3

0

0

6

0

1

9

0

1

0

4

0

0

0

3

14

0

0

0

0

0

3010

0

0

0

0

3

7

1

3

1

1

0

1

0

0
0

0

3

0
0

0．1
0．2

0
0

0．05

0
0

soIvl1

0
0

nOne

24hr

48hr G B E R F O TAG TA G B E R F O TAG TA

5−FU2）

0．00625

100

1

1

29

19

92

96

38

0

9

8

81

66

≠

1）Ethano12）5−Fluorouraci13）G：gap B：break E：exchange R：ring F：fragment O：others（pulverization，COmplexexchange，etC．）
TAG：Totalaberrantcellsinc】udingthegap．

蓑2

TA：Totalaberrantcellsexcludingthegap．

ChromosomeaberrationtestofESTwithCHLcellline；Metabolizingmethod

Dose No．of Polyploid StruCturalaberrations31detected

mg′ml

禁霊…■

誌温e。

Judge−
ment＋S9assay

一
一
一
一
±

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

TA

1

0

TAG
2

0

0

0

0

0

O

0

0

F

0

0

R
0

0

0

E
0

0

0

0

75

0

1

3624

1

0

1

4

1

5

3

1

B

0

9

0

3

G

0

1

0

TA

2

0

0

TAG
0

0

0

O
4

0

0

0

0

0

0

F
0

0

0

4

6

2

3

R
0

0

4

0

E

0

2

0

B

0

2

1

2

1

1

0

1

0

1

0

100

G

4

0

0

0
0

0．2

0
0

0．1

0
0

0．05

0
0

solvい

0
0

nOne

＋S9

0

−S9

−S9assay

DMN21

1

0

210

0

0

3

836

80

77

≠

1）Dimethylsulfoxide2）Dimethylnitrosamine3）G：gap B：break E：exchange R：ring F：fragment O：others（pulverization，COmplexexchange，etC．）
TAG：TotalaberrantceHsincludingthegap． TA：Totalaberrantcellsexc】udingthegap．

の考察はTAG表示に基づいて行った。ここにみるように直接法（表1）の24時間培養において，ESTの0．2mg／ml処理では染色体に構造異常のある細胞の出現率が42％（陽性，≠）に及んだ。0．1mg／mlおよび0．05mg／ml処理ではそれぞれ6％（±）および2％（−）であり1
用量相関性が認められた。また，48時間培養においても0．2mg／ml処理では9％（±）の構造異常率を示した。48時間処理での構造的異常の出現率の低下は，24時間の培養時点で染色体異常を起こした細胞が分裂できずにその後死滅したために48時間時点における異常出現率が低下した可能性が考えられる3）。これに対し，陽性対照としての5−FU O．00625mg／mlでは直接法の24，48時間培養でそれぞれ29％（≠），

81％（叶）の構造異常細胞がみられた。この数
値は石館らの報告1）（24時間値25％，48時間値86％）と較べて妥当なものである。
一方，代謝活性化法（表2）の場合，対照法
としての−S9測定においてはESTの0．2mg／
ml処理で9％（±）の構造異常が出現したが，ラット肝ミクロゾームの酵素系を添加する十S
9測定においては異常の出現はなかった（0％）。これに対し，活性化処理で染色体異常が誘発されることが知られているDMNlmg／
mlでは＋S9測定で80％（≠）の細胞に何らかの構造異常がみられた。この数値も文献1）上妥
当なものである（＋S9測定値73％，−S9測定
値3％）。
なお，染色体の倍数性異常に関しては陰性と35

l E−64類縁体の開発判定された。
ESTの変異原性についてはこの他に細菌復帰突然変異試験（Amesテスト）4），マウス骨髄細胞小核試験5）およびマウス骨髄細胞染色体異常試験6）をいずれも当研究所にて実施している。
既に報じたごとく，結果は全て陰性であった。
要

約

Chinese hamsterの肺繊維芽細胞株（CHL）
を用いてESTの染色体異常誘発性を検討した
結果，下記の成績を得た。
（1）直接法24時間測定の場合，ESTのCHL細胞に対する50％増殖抑制濃度である0．2mg／ml処理で染色体中期分裂像の42％に何らかの構造異常がみられた。また，0．1mg／mlおよび0．05mg／mlの処理ではそれぞれ6％およ
び2％の異常率であった。
（2）代謝活性化法の場合，対照としての非活性化測定においてはESTの0．2mg／ml処理で9％の中期分裂像に構造異常がみられたが，ラット肝ホモジネイト上活とその補酵素系（S9mix）を加える活性化処理測定においては異常像は全く認められなかった。
（3）直接法，代謝活性化法を通じてEST処理群に染色体に対する倍数性異常の誘発は認められなかった。

36（4）陽性対照薬として用いた5−FUならびにDMNによる異常誘発率は文献と対比して妥
当なものであった。
文献1）石館拡監修：染色体異常試験データ渠，リアライ
ズ杜，1983．
2）石館 払，吉川邦衛胤 祖父尼俊雄：食品添加物の変異頂性試験成績一昭和54年度厚生省試験研究門による第1次スクリーニングデータ（第1回），変異原とi…j性，12，82−90，1980．
3）石館 基：培養細胞を川いる染色体異常の検出法，組織培養，5，115−122，1979．
4）大関正弘，安井 一，後藤宏三，中根貞雄：E−64−dの変異原性試験（Amestest），厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に山来する難病治療薬（E−64）の閲発研究」昭和57年度研究報告書，
65−67，1983．

5）大関正弘，鈴木 汀，酒井 茂，安井 一，中根
貞雄：E−64−dの小核試験．厚生省新薬開発研究事
業「微生物の二次代謝産物に山来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究軸告書，69−
70，1983．

6）大関正弘，安井 一，酒井 茂，鈴木 洋，中根貞雄：ESTのマウス骨髄細胞染色体異常試験，厚生省新薬聞発研究新薬「微生物の二次代謝物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年
度研究報告吉，59−61．1984．

5．ESTの一般薬理作用
一筋ジストロフィーハムスターの心電図に及ぼす影響を中心として−

福 原 武 彦■目的E−64およびその類縁体の進行性筋ジストロ
フィー症に対する治療薬としての有効性評価に関する開発研究の一環として，58年度までにE−64（DL体，L体），E−64−CおよびEST（Er64−d）の呼吸，循環機能および中枢神経系の活動に及ぼす影響ならびにE−64rcおよびESTの諸種摘出臓器標本に及ぼす影響について薬理学的研究を行なってきた3〜7・12〜14）。
本年度は，筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）8）およびゴールデンハムスターの心電図に及ぼすESTの影響について検喜寸し要である。本年度の研究では，UM−Ⅹ7．1系統の筋ジストロフィーハムスターの心電図上の変化について定員的な解析を行ない，非侵襲的かつ機能的な方法である心電図解析法のEST薬
効評価法としての有用性について検討した。心電図の定量的解析法にはデータ解析用com−
puterを用いてR−R間隔の変動係数および心電図の平均加算を演算した。心電図R−R間隔の変動係数は最近，臨床において自律神経系の機能検査法の一つとして広く用いられているがml），心筋に障害が生じた場合にも変化をきたし得るので自律神経機能および心筋機能の総合的指標とした。

た。さらに前年度に引き続きESTの諸種摘出臓器標本に及ぼす影響に関する検索に加えてゴールデンハムスターの胃底部および食道下部標本に対する作用を検討した。
ヒト筋ジストロフィー症において心筋変性に伴って起こると考えられる多様な心電図上の変化が認められることが知られている鼠18）。一方，
その疾患モデル動物の一型と考えられる筋ジス
トロフィーハムスターの病態に関する多数の形
態学的および生化学的研究が報告されているが・乙816），心電図について検討した報告は少な
い1・17）。ヒト筋ジストロフィー症に対する治療薬の有効性評価に関する研究推進の基礎として，疾患モデル動物においてヒトに応用可能な可及的非侵聾的な薬効評価方法を確立することが必◆ 東京慈恵会医科大学第2薬理学教室

Ⅰ．ESTの描出臓器標本に及ぼす影響
実験方法
本年度はゴールデンハムスターの胃底部および食道下部標本について検討した。
ゴールデンハムスター（雄性，体重120〜140g）を用い，断頭，放血後に胃底部および食道下部標本を抽出した。各摘出臓器標本を95％
酸素，5％炭酸ガスの混合ガスで飽和した
37℃のKrebs−Ringerbicarbonate液を満たしたマグヌス装置（マグヌス管内容積57ml）に懸垂した。張力トランスデューサー（Forcetransducer，type45196A，日本電気三栄）を用いて各標本の自発収縮および薬物または電気刺激により誘発される収縮に対するESTの影響を検討した。EST3mgを無水エタノール1m1
37

I E−64類縁休の開発

J■ 蔦5。Lmg
図1ハムスター胃底部標本の自発収縮ならびにAChによる収縮に及ぼすESTの影響
A：EST3×10▲6g／ml，B：EST3×10▼5g／ml．C：0・1％エタノール，D：1・0％ェタノ
ールの適用による影響。E：AChlO￣6g／ml，F：EST

3×10，5g／ml前処置後のAChlO￣6g／ml．G：1．0％エタノール前処置後のAChlO￣6g／mlによる収縮。A−Dの●はESTあるいはエタノールの適用時点を，E−Gの●はAChの適用時点を示す。区l右下部の横線は時標30secを，縦線は較正500mgを示す。

イ／′「。五mg
1min

図2

ハムスター食道下部標本の自発収縮ならびにAChによる収縮に及ぼすESTの影響
A：EST3×10−6g／ml，B：EST3×10￣5g／ml，C：0．1％エタノール，D：1．0％
エタノールの適用による影響。E：AChlO￣6g／ml，F：EST3×10−5g／ml前処置後のAChl0−6g／ml，G：1．0％エタノール前処置後のAChlO．6g／mlによる収縮。A−Dの●はESTあるいはエタノールの適用時点を，E−Gの●はAChの適用時点を示す。図右下部の横線は時標lminを．縦線は較正◆100mgを示す。

に溶解し，濃度3×10L3g／mlの薬液を調製した。これをさらに蒸留水で10倍に希釈し，濃度
3×10￣4g／mlの液を得た。両溶液の適用液量を0．57mlとして実験を行なった。したがってマ
グヌス管（内容積57ml）内最終濃度はそれぞれ3×10−5g／mlまたは3×10￣6g／mlであっ38

た。対照としてEST溶液の調製に用いた用量と同量のエタノール溶液（マグヌス管内最終濃皮0．1％および1．0％）を適用し，その影響を検討した。

5．ESTの一般薬理作用●

図330sec−1．0g

ハムスター食道下部標本の電気刺激により引き起こした収縮に及ぼすESTの影響
刺激電圧17V，刺激持続100msec，刺激頻度0．2Hzの矩形波により電場刺激を行ない，収縮を引き起こした。A：EST3×10L6g／ml，B：EST3×10r5g／ml，C：0．1％エタ
ノール．D：1．0％ェタノールの適用による影響。A，Bの●はESTの適用時点を，C，Dの●はエタノールの適用時点を示す。図の右下部の横線は時標30secを，右端の縦線
は校正1．0gを示す。

蓑1胃底部および食道下部摘出臓器標本に及ぼすESTの影響
EST
N

controIA

EthanoI
B

C

D

EffectofACh（10▲6g／ml）

controlafter

EST（B）

after

ethanol（D）

mean±SD mean±SD mean±SD mean±SD mean±SD mean±SD
Fundusventriculi

7

100％

0

−1．5±2．0

0．1±0．40100％39．9±10．859．4±28．3

5−6 100％ −4．1±4．9 −5．0±9．9 −4．1±7．4 −5．1±9．8 100％ 73．8±23，5 96．8±22．7
Esophagus

●4

100％

99．8±7．2 55，1±8．3 95．8±3．9 52．8±6．1

A：EST3×10￣6g／ml．B：EST3×10−5g／ml，C：0．1％エタノール．D：1．0％エタノール適用例。N：例数。
mean±S・D・：平均値±標準偏差。＊電場刺激により引き起こした収縮。

結

果

1．ESTのハムスター摘出胃底部標本に及ぼす影響
EST3×10▲6g／mlおよび3×10L5g／mlによって胃底部の自発収縮に顕著な変化は認められなかった（図1A，B）。AChlO．6g／mlにより引き起こした胃底部の収縮はEST 3×10￣5g／mlにより抑制されたが，対照のエタノールによっても同程度抑制された（図1E，F，G）。
2．ESTのハムスター描出食道下部標本に及ぼす影響かった（図2A，B）。AChlOr6g／mlにより引き起こした食道下郡の収縮はEST 3×10￣6g／ml
により変化せず，EST3×10￣5g／mlにより抑制されたが，対照のエタノールによっても同程度抑制された（図2E，F，G）。EST3×10￣5g／
mlと対照の1．0％エタノールの抑制効果の間には有意の差が認められなかった（表1）。食道下部の電気刺激により引き起こした収縮はEST3×10．6g／mlにより変化せず，EST3×10￣5g／mlにより対照のエタノール適用時と同程度抑制された（図3，表1）。

食道下部の自発収縮は3×10￣6g／mlおよび
3×10￣5g／mlの濃度のESTによって変化しな
39

I E−64類縁体の開発

両≠≠心1100msec

図4ゴールデンハムスターおよびUM−Ⅹ7．1の心電図
心電図第ⅠⅠ誘導。較正電位：100FN。時標：100msec。A：ゴールデンハムスター（17週令）の心電図。B：UM−Ⅹ7．1（18週令）の心電図。いずれもEST非投与例。

3Mmsec

図5

40

UM−Ⅹ7．1の心電図R波の間隔ヒストグラム
心電図第II誘導。Computerを用いて500柏について清算した結果。縦軸：R−R間隔数，
横軸：R−R間隔（msec）。破線はEST投与前（9−10週令）のR−R間隔の平均値を示す。
A：対照群（EST非投与群）。B：EST投与群。BのI：EST投与前，BのⅠⅠ：EST
投与後4週。BのⅢⅠ：EST投与後8週。

5．ESTの一般薬理作用

0

2

4

6

8

（weekS）

0

2

4

6

8

（weeks）

図6

ハムスターの心電図R−R間隔およびR−R間隔の変動係数に及ぼすESTの影響
丸印：UM−Ⅹ7．1，三角印：ゴールデンハムスター，白抜き：対照群（EST非投与群），
黒塗り：EST投与群。平均値±標準誤差。A：ハムスターの心電図R−R間隔に及ぼす
ESTの影響。縦軸：心電図（第ⅠⅠ誘導）R−R間隔（msec），横軸：EST投与後の退散（weeks）。B：ハムスターの心電図R−R間隔の変動係数に及ぼすESTの影響。縦軸：
心電図R−R間隔の変動係数（％）。変動係数：500柏のR−R間隔の標準偏差×100／平
均値（％）。横軸：EST投与後の週数（weeks）。

Ⅲ．筋ジストロフィーハムスターの心電図に及
ぼす影響

実験方法
9週令の雌雄のゴールデンハムスター14匹
および，10週令のUM−Ⅹ7．1系の雌雄の筋ジストロフィーハムスター11匹を用い，それぞれを2群に分け，片方を対照群とし，もう一方をEST投与群とした。ESTを粉末飼料（日本
クレア株式会社，CE−2）に0．375％の比率に混合し（EST300mg／kg／day相当），給餌した。
対照群には飼料のみを与えた。9〜10週令で投与を開始，17〜18週令まで8週間継続投与した。2週間毎にハムスターをベントパルビタール（50mg／kg，i．p．）により麻酔した後，心電図を標準肢誘導，第Ⅰおよび第Ⅱ誘導（図4）によって導出し，呼吸運動曲線と共にペンレコーダにより記録すると同時に磁気テープに収録
した。実験終了後，磁気テープを再生し，デー
タ解析用コンピューター（日本電気三栄，シグ41

I E−64類縁体の開発

0

2

6

8

（woeks）

0

2

4

6

8
（weok＄）

図7

ハムスターの呼吸周期および体重に及ぼすESTの影響
丸印：UM−Ⅹ7・1，三角印：ゴールデンハムスター，白抜き：対照群（EST非投与群），
黒塗り：EST投与群。平均値±標準誤差。A：ハムスターの呼吸周期に及ぼすESTの影響。縦軸：呼吸周期（msec）。横軸：EST投与後の週数（weeks）。B：ハムスターの体重に及ぼすESTの影響。縦軸：体重（g）。横軸：EST投与後の週数（weeks）。

ナルプロセッサ7TO8および7T17）を用いて心電図のR−R間隔とその変動係数（500区間のR−R間隔の標準偏差×100／平均値）および呼吸周期を算出した。また心電図波形の変化（特にPQ間隔，QRS間隔，ST間隔およびSTレ
ベルの変化）を定量的に検討するために心電図の平均加算（100回加算）を行なった。心電図
STレベルの変化はQを基準としてSまでの電位差函（SがQよりも低い場合を負符号とした），QからST部分のピークまでの電位差百〒および両者の和（∈汚＋Q〒）をそれぞれQおよ
びR問の電位差頭の絶対値で除した値，すな
わち∈汚／Q面，百〒／Q百および（∈汚十∈汗）／醇を42

百分率で表示した（図11）。
結果

1．心電図のR−R間隔とその変動係数に及ぼすESTの影響

EST投与前，UM−Ⅹ7．1のR−R間隔はゴー
ルデンハムスターのそれに比べ有意に（p＜0．05）延長していた（図6A）。R−R間隔は過令，体重増加につれて延長したが，それとともにUM−X7．1とゴールデンハムスターのR−R
間隔の差は認められなくなった（図6A，図7
B）。EST投与前，UM−Ⅹ7．1のRTR間隔の変動係数はゴールデンハムスターのそれに比べ小1mmsec

図8 ハムスターの心電図の平均加算波形
Computerによって演算した心電図（第ⅠⅠ誘導）の平均加算波形（100回平均加算）。
A：ゴールデンハムスターの心電図の平均加算波形。B：UM一Ⅹ7．1の心電図の平均加算
波形。Ⅰ：EST投与前（9−10週令），ⅠⅠ：EST非投与例（17−18週令），rll：EST投与後8週（17−18遇令）。UM−X7．1，EST非投与例（17−18週令）の平均加算心電図ではST部分の上昇が顕著である。時標：100msec。

さい値を示した（図6B）。ESTを投与した群のUM−Ⅹ7．1では，R−R間隔の変動係数は週令を経るにしたがって増大し，投与開始から8週間
後，ゴールデンハムスターのR−R間隔の変動
係数と同程度となり，EST投与前に比べて有意に大きくなった（図6B，図7B）。一方，ESTを投与していないUM−Ⅹ7．1（対照群）では，8週間後もR−R間隔の変動係数の値は小さいままであり，有意な変化は認められなかった（図6B）。ゴールデンハムスターのR−R間隔の変動係数にはEST投与群および対照群ともに
週令および体重増加に伴う著明な変化は認められなかった（図6B，図7B）。
2．筋ジストロフィーハムスターの呼吸周期および休重
UM一Ⅹ7．1の呼吸周期はゴールデンハムスタ
ーのそれに比べ有意に（p＜0．05）延長していた（図7A）。呼吸周期は週令，体重増加につれて延長したが，8週間経過後もUM−Ⅹ7．1の呼吸周期はゴールデンハムスターの呼吸周期より長いままであった（図7）。10週令のUM−Ⅹ7．1（77〜98g）はEST投与直前において既に9週
令のゴールデンハムスター（123〜140g）に比べ軽量であった（図7B）。体重は各群共，EST
投与後8週間にわたり増加し続け，EST投与
群と対照群の間に有意の差は認められなかった（図7B）。
3．ESTのハムスターの心電図波形に及ぼす影響
第Ⅱ誘導の心電図の平均加算波形上 2または3峰性のQRSの出現頻度はUM−Ⅹ7．1（11例中4例）がゴールデンハムスター（13例中0例）より有意に大であった（図9）。PQ廟隔およびQRS間隔についてはゴールデンハムスタ
ーおよびUM−Ⅹ7．1問，EST投与群および対照群間で有意差は認められなかった（図10）。
しかしながら，UM−Ⅹ7．1の心電図のST部分
はゴールデンハムスターに比べ有意に短縮していた（図10）。EST投与群および対照群（EST
非投与群）の間でST部分の時間間隔に有意な差は認められなおった。QおよびR問の電位差43I E−64類縁休の開発

図9

UM−X7．1の心電図のQRS波の異常
Computerを用いて得られた心電図（第11誘導）の平均加算図（100回平均加算）。時標：50mseco UM−Ⅹ7・1ではゴールデンハムスターに比べ，2峰性または3峰性のQRS（QRSの多純化）の出現額度が有意に大であった。UM−X7．1（10−11週令）：36．4−
45．5％（11例中4−5例）。ゴールデンハムスター（9−10週令）：0−7．7％（13例中0−1例）。

を基準としてST部分の上昇率を計量的に評価したところ，UM一Ⅹ7．1のST部分はゴールデンハムスターのそれよりも有意に上昇していた（図11）。EST投与開始から4週後〜8週後の期間において，ESTを投与したUM−X7．1のST上昇率は対照群（EST非投与群）に比べ統計学的に有意ではないが小さくなる傾向が認められた。ゴールデンハムスターではEST投与
開始から8週後，STが有意に低下した。
考察

Ⅰ．ESTの矯出臓器標本に及ぼす影響
今回，検討した濃度（EST3×10L6g／mlおよび3×10￣5g／ml）では，胃底部および食道下部
標本にESTの作用によると考えられる変化は認められなかった。EST3×10．5g／mlによって引き起こされたAChlO．6g／mlによる胃底部ならびに食道下部の収縮の抑制および食道下部の電気刺激によるESTの溶媒として用いたエタノールの作用と考えられる。
Ⅲ．筋ジストロフィーハムスターの心電図に及ぼす
影響

EST投与前，UM−X7．1のR−R間隔の変動
係数はゴールデンハムスターのそれに比べ小さ
44

い値を示していた。この結果は最近BIO14．6
系統のジストロフィーハムスターと正常ハムス

ター（BIO FIB）のR−R間隔の変動係数を算出
し，比較した結果と一致している15）。ESTを投与した群のUM−Ⅹ7．1では，R−R間隔の変動
係数は次第に増大し，8週間後，EST投与前に比べて有意に大きくなったが，ESTを投与していないUM−Ⅹ7．1（対照群）では，8週間後もR−R間隔の変動係数の値は小さいままであった。この結果はESTがUM−Ⅹ7．1のR−R
間隔の変動係数値を改善する作用を有することを示唆する。通常，呼吸周期は週令，体重増加
につれて延長する（図7）が，UM−Ⅹ7．1の体重がEST投与直前において既にゴールデンハ
ムスターに比べ軽量であったにもかかわらず，
UM−Ⅹ7．1の呼吸周期がゴールデンハムスターのそれに比べ延長していた事実（図7）は，呼吸筋の変性以外にUM−Ⅹ7．1とゴールデンハ
ムスターの麻酔薬に対する感受性の差，肝代謝
酵素活性の差に起因する可能性が考えられる。
その他に呼吸筋変性とこれに伴う固有受容器の障害が関与している可能性も考えられる。したがって，UM−Ⅹ7．1の呼吸筋の自発性筋電図についても今後，検討する必要があると思われ

5．ESTの一般薬理作用

PQintervaI

図10

QRSinterval

STinterval

ハムスターの心電図のPQおよびQRS間隔に及ぼすESTの影響
白色柱：対照群（EST非投与群），灰色柱：EST投与後8週。G．H．：ゴールデンハム
スター。平均値±標準偏差。N：例数。

0
0

R

P

qR
1
∃。虹

0 も

Lead llトS hO UO 叩＞望む一uUULむd

／

S

l

QS／
qR
N＝5

N＝7

6．日．

］

N＝S

uM−X7．1

P＜〇・05

QT ／
qR
N＝S

N＝S

N＝7

（
す亘・節 目 訴

N＝S

N三5

G．H．

UM−×7．1

pく0・05

p＜0・Ol］］N＝S N＝7

N＝S N＝S

G．H．

UM−X7．1

1t

P＜0．01

図11ハムスターの心電図のSTレベルに及ぼすESTの影響
白色柱：対照群（EST非投与群），灰色柱：EST投与後8週。G．H．：ゴールデンハム
スター。平均値±標準偏差。N：例数。QRの電位差を基準としてSTの上昇率を計量的に評価した。
45

I E−64規縁体の開発

る。Lossnitzerらは33〜40過令のBIO8262
系統のハムスターの心電図のPQ間隔および
QRS間隔が対照の正常ハムスターのそれに比べて有意に延長していることを報告している17）。今回検討した17週令のUM一Ⅹ7．1のPQ間隔およびQRS間隔とゴールデンハムスターのそれとの間に有意の差が認められなかった（図10）が，この差は週令数の差が一因と考えられる。UM−Ⅹ7．1群において2峰性のQRS波など心室内伝導障害の存在を示す所見の出現頻度がゴールデンハムスターに比べ高いので，さらに観察を続けることにより，UM−Ⅹ7．1の心電図においてもPQおよびQRS間隔の延長が認められる可能性がある。UM一Ⅹ7．1とゴール
デンハムスターの心電図の平均加算波形を比較すると，UM−Ⅹ7．1ではST部分の有意な短縮（図10）と顕著な上昇（図11）をきたしていることが判明した。この心電図上の変化は傷害心筋細胞および問質液中における局所性のカルシ
ウムおよびカリウムなどの電解質の変化に起因する可能性もあろう。EST投与後のUMTX7．
1でR−R間隔の変動係数が有意に大きくなり，
また統計学的に有意ではないがSTの上昇が抑制される傾向が認められたことはヒトおよびモデル動物におけるESTの薬効評価の一方法として心電図の定量的解析法が有用となる可能性を示唆している。このためには今後さらに長期間にわたりESTの効果について検討する必要があると考えられる。
要

約

1．今回，検討した濃度では，胃底部および食道下部標本にESTの作用によると考えられ
る変化は認められなかった。
2．UM−Ⅹ7．1と正常のゴールデンハムスタ
ーの心電図所見を比較すると，UM−Ⅹ7．1では心電図R−R間隔の変動係数および平均加算した心電図波形，特にQRS波形およびST部分に変化をきたしていることが判明した。
3．EST投与群でR−R間隔の変動係数が大きくなり，統計学的に有意ではないがSTの上昇が抑制される傾向が認められたことはEST
46の薬効評価においても心電図所見が有用である・可能性を示唆する。
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5．ESTの一般薬理作用

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12）木口百合子，後藤和利，高野一夫，西川嘉伸，八反丸善文，宮川政昭，亀井淳三，福原武彦：微生物
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47

Ⅱ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究

6．カルシウム依存性lt］性プロテアーゼ（CANP）の構造と活性発現機構
今堀 和友

7．カルシウムプロテアーゼの活性発現機構

鈴木 紘一

8．レセプター機構におけるカルシウムプロテアーゼの問題点について

西塚 泰美
9．E−64−Cの筋蛋白質分解への効果−平滑筋S．の精製への利用−
野々村禎昭
10．ESTの培養筋細胞への取り込みの測定についての試み
小沢鋲二郎

11．肝細胞の培養維持に関係した膜結合型トリプシン様
エンドプロテアーゼ

市原

明12．培養マクロファージにおけるE−64誘導体の取り込みに関する研究

勝沼 信彦

6．カルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）の構造と活性発現機構

今 堀 和 友＊研究協力者 川 島 誠 一＊ 猪 股 光 司＊ 中 村林

愛＊昌 美＊ 笠 井 陽 子★

はじめに
筋ジストロフィーや心筋梗塞における筋肉壊
死は最終的には筋細胞内プロテアーゼによる筋
原繊維の崩壊によるものと思られる。その元凶と目される細胞内プロテアーゼにカルシウム依
存性中性プロテアーゼ（CANP）がある。実際こって，これらのCANPは，細胞内での存在部位
や果たしている機能も異なる可能性が強くなった。本年度は筋原繊維タンパク質などに対する
両CANPの作用およびCANPインヒビターの性質について検討した。
結果

れらの筋疾患において，CANPを活性化するカ

1．天然基質に対するCANPの作用

ルシウムイオン濃度の上昇やCANP総活性のCANPの内在性基質と考えられる骨格筋筋
原繊維タンパク質，赤血球膜タンパク質および細胞骨格タンパク質であるビメンチンに対し
P−CANPおよびm−CANPを作用させ，分解される成分，分解速度，分解産物を調べた。筋原
繊維ではミオシンおよびアクチンが（図1），赤
血球膜ではスペクトリンおよびバンド3が分解を受けた。いずれの場合も切断速度は〟−CANPの方がm−CANPより高い。ビメンチンはこれ
らのタンパク質よりさらに速やかに分解され，
CANPの良い基質であることが判明した。生じる分解産物は両CANPで異なり，基質特異性の差が認められた。
2．CANPの自己消化
CANPによる基質の分解に際し，常に
CANP自身の自己消化が起こっていた（図2）。
特にIL−｛ANPの場合，80Kサブユニットは79
Kから77Kを経て76Kへと限定的に自己消化を受ける。76Kへ変換してもさらに基質の分解は進み，この分子種にプロテアーゼ活性が存在することを示唆している。m−CANPの場合はこのような限定的自己消化は起こらず，80Kサ増大が観察されている。また，筋タンパク質の分解パターンもCANPによるものと類似している。しかし，CANPにはカルシウム感受性の異なる 2種類のCANP b−｛ANPとm−
CANP）が存在し，一方ではCANPを特異的に阻害する内在性インヒビターも共存する。したがって，CANPの活性は少なくともカルシウム
イオンと内在性インヒビターにより二重の制御を受ける複雑なものであり，CANPの作用を明らかにするためには先ず各CANPの活性調節機構を解明する必要がある。そこで，ウサギ骨格筋よりFL−CANP，m一一CANPおよび内在性イ
ンヒビターを均一にまで精製し，CANPがどのようにしてカルシウムイオンで活性化され，どのようにして内在性インヒビターで阻害される
かを分子レベルで検討している。昨年度は〃一
CANPとm−CANPの酵素学的性質とタンパ
ク化学的性質を明らかにし，両CANPは質的に異なる酵素であるとの結論に達した。したが■ 東京都老人総合研究所

51□

酵素・細胞・組織レベルにおける研究
FL−CANP mTCANP（Ca：250／∠M）
ト′1▼，

tCa：2．5mM）

−

′′

萄牒炉頑

Myosin− ｛l■l申、「− ■l
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ReaGtionTime（min）
図1iL−CANPおよびm−CANPによるウサギ骨格筋筋原繊維タンパク質の分解

92．5K

m−CANP（Ca：250／tM）（Ca：2．5mM）

79K

一一
−

66．2K

〝￣CANP

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45K

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0．51

ReaGtionTime（min）
図2

52

ビメンチンの分解に伴うCANPの自己消化2510153060

6．カルシウム依榊／HJlr／lIプロテアーゼ（CANP）の構造と活性発現機構

Substrateけ）（Ca‥250州，4ユC）Substratoト）

92．5K−
■■■

−

■■

一

66．2K−
45K−

明輪ih．

31K−

21．5K−

00・512510153060

00．512510153060

ReaCtionTime（min）
図3〟−CANPのrI己消化における基質の影響

プニットの消失と共にプロテアーゼ活性は減少

CANPが不活性であることの実証は難しく，する。いずれのCANPの場合も30Kサブユニ

CANPの阻害剤であるE−64，ロイペプチン，

ットは反応の初期段階で速やかに分解される。
FL−CANPにおける限定的自己消化が単にタン

モノヨード酢酸などはいずれも自己消化反応とパク質加水分解に伴う副次的なものか，あるい

基質の分解反応とを同時に阻害した。
3．内在性CANPインヒビターの精製とその性質

はFL−CANPの活性化に必要な意味ある過程か

CANPインヒビターは種々の動物組織につを検討した。FL−CANPを優れた基質であるビメ

いて報告があるが，その性質，特に分子量に関

ンチンの存在下および非存在下で自己消化させしては多くの矛盾がある。その原因としてインると，76Kへの変換速度はいずれの場合も同じ

ヒビターの調製方法が考えられる。そこでウサであった（図3）。このことは，自己消化は

ギ骨格筋より種々の方法でインヒビターを部分

CANP分子内で起こる反応であり，CANPが精製し，その分子量を測定した。粗抽出液を

基質を分解する反応とは別個の過程であることを示唆する。一万，76Kがさらに分解される過DE−52，フェルセファロースなどのカラムクロ

マトグラフィーで部分精製した標品をゲルろ過

程は基質により阻害され，基質の分解と同じ機で分別すると低分子量の主成分と高分子領域へ

構によるものと思われる。自己消化により調製至る広汎な分子量を有する成分とから成っていした76K分子を含む〟−CANP（76Kp−CANP）
は元のP−CANP（79Kp−CANP）とはぼ同程度た。一方，インヒビターの特性を利用して粗抽出液を酸処理・熱処理して得た標品は高分子量のプロテアーゼ活性を有し，そのカルシウム感の主成分と低分子量の微量成分を含んでいた。

受性は高まっていた（図4）。以上の結果より，これらの高分子インヒビターと低分子インヒビ

天然の79K FL−CANPは不活性型であり分子内

ターは再クロマトグラフィーでもその溶出位置での限定的自己消化により76Kp−CANPに変は変らず，単なる解離・会合により生ずるもの

換されて初めてプロテアーゼ活性を発現するとではない。さらに，SDS存在下でゲル電気泳動

いう活性化モデルを提出した。しかし，79K〟−

を行うと，低分子型標品では分子量2〜3万に，53Ⅲ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究（■‥加l嶋fe〉
92．5K■

100

66．2K−︵訳︶きち逼り＜○＞；q●○∝45K−￣膏嘗蚕澄＿

31K−
耳

や敷

1胃

減師

象

21．5K−

80

60

40

0

0

100

010
0

2

200
ConCentrationofCa（〟M）

5102040

Roa￠tionTime（min）

図4

自己消化した〝−CANPの活性

94K
43K
67K BPB

図5

30K

20K
67K

94K

43K
30K

20K BPB
14K

精製CANPインヒビターのSDSLポリアクリルアミド電気泳動図と阻害活性の同定

高分子型標品では分子量10万の分画にそれぞ

プロテアーゼに対しては全く阻害効果を示さ

れ阻害活性があった。したがって，両インヒビず，阻害作用はCANPに特異的であった。サブ

ターはサブユニットの分子量も異なっている。

ユニット当り高分子型で5分子，低分子型で1各インヒビター標品の精製をさらに進めると最分子のウサギm−CANPを完全阻害する。

終的に得られたもののサブユニットは，低分子型で2．4万と2．6万，高分子型で11万のものであり，それぞれに阻害活性の存在が確認された（図5）。ゲルろ過による分子量測定から両イン
ヒビターともサブユニット2個から成るダイマ
ーと決定された。これらのインヒビターは他の
54

考

察

CANPの細胞内での機能に関しては末だ推
測の域をでていないが，可溶性タンパク質より
構造タンパク質をよく切断すると報告されている。本研究でも筋原繊維や膜タンパク質成分の6．カルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）の構造と活性発現機構

分解が確認されたが，その速度は高いとは言い難い。一方，細胞骨格タンパク質ビメンチンは速やかな切断を受け，CANPは細胞内で細胞骨格の代謝を介して細胞機能調節に係わっている可能性を示唆する。また，FL−CANPとm−CANPの基質切断部位に差が認められ，単に活性化に要するカルシウムイオン濃度が異なるだ
けではなく，細胞内で果たしている機能も異な性の変化はニワトリ

CANPやウサギmTると考えられる。したがって，筋ジストロフィーで起こる筋タンパク質の分解を詳細に検討すれば，CANPによるものか否かはもちろん，どのCANPによるものかをも決定できよう。
〝1ニANPはカルシウムイオンの存在下で限定的自己消化を起こし，活性発現に要するカル
シウムイオン濃度が低下する。このことは，〟−
CANPのプロテアーゼ活性発現に必要なカル
シウムイオン濃度は実は自己消化一活性化に必ていた分子量の差異に関しては本研究で解決し要な濃度であり，活性化されたFL−CANPは低濃度のカルシウムイオン存在下で基質を切断することを意味する。このようなカルシウム感受

アミノ∴酸組成がほぼ一致していることもこの考CANPでも観察されるが，後者では8万サブユ
ニットの分子量変化は認められない。ニワトリ
CANPは従来m」：ANPに属すると考えられていたが，自己消化を起こしカルシウム感受性が上昇するという面ではむしろp−CANPと似ている。
CANPインヒビターについて従来報告された。すなわち，完全な形のインヒビターは分子塁11万のサブユニット2個から成り，複数の反応部位を有するポリインヒビターである。低分子型インヒビターはそれぞれの反応部位が調製過程において混在するプロテアーゼにより切り出された活性断片と考えられ，その最小単位
は分子量約2．5万のサブユニットから成る。高
分子型および低分子型インヒビターの比活性やえを支持している。

55

7．カルシウムプロテアーゼの活性発現機構

鈴

木

紘

一■

研究協力者 大 野 茂

男＊ 榎 森 康 文事

今忍■ 川 崎 博 史＊

城

は じめに
筋ジストロフィー症に関係すると思われるカ
ルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）の
cDNAおよび退伝子の構造を解析し，その結果から，CANPの構造と活性発現機構を明らかにすることを目標に研究を行った。
昨年度の研究でニワトリmCANPのcDNAの概略構造が明らかになったので，本年度はさらにこれを進めニワトリCANP cDNAの全塩
基配列を決定した。
結果と考察
1．ニワトリmCANPの構造る。
成熟CANPの構造をDayhoffのデータバン
クを使って，構造既知のタンパク質と比較した。その結果CANPは図2に示すように4個のドメインから構成され，第Ⅲ，第Ⅳドメイン
はチオールプロテアーゼおよびカルモデュリンにそれぞれ似ていることが明らかになった。第Ⅲドメイン（ア■ミノ酸残基No．81−330）はパ
パイン，カテプシンBなどのチオールプロテアーゼとよく似た構造を持っていた。CANPの活性中心はCys−108であることがカルポキシメ
チル化したCANPのアミノ酸配列を分析して明らかにされている3）。このCys−108のまわりのアミノ酸配列は他のチオールプロテアーゼのニワトリ骨格筋より抽出したmRNAをもと

活性中心のCysのまわりのアミノ酸配列4）と酷に作製したcDNAバンク1）から，合成ヌクレオ
チドプローブを用いて約2kbの長さを持っ似していた（図3）。この活性中心のCysはパパインやカテプシンBなどのチオールプロテ

DNA断片を2本単離した。この2種のDNAアーゼではN末端から25〜30残基の所にあ断片の構造からニワトリCANP cDNAの全塩る。CANPにおいてはNo．81からはじまる配基配列を決定した2）。CANPのcDNAは長さ約列がこれに相当し，活性中心Cys−108はこの

3．5kbで，mRNAの直接翻訳産物は705個の仮想のN末端から29残基はなれ，カテプシン

アミノ酸残基からなることがわかった（図1）。

Bの場合と全く同じ位置である。また，チオー

一方，成熟CANPは704個のアミノ酸からな

ルプロテアーゼではCysの他にHisも活性中るので，直接翻訳産物が成熟CANPに変わる
プロセシングにおいて，N末端のMet−1がと心を構成している5）。図3に示すようにCANPのHis−265のまわりのアミノ酸配列は，他のれ，Met−2が成熟CANPのN末端になる。しチオールプロテアーゼの活性中心Hisのまわかし，この新しいN末端は検出できないので，りのアミノ酸配列とよく似ていた。したがっおそらくアセチル基でふさがれていると思われて，His−265はCANPの活性中心と考えられ＊東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部

る。
CANP

のC知端を含む第Ⅳドメイン（No．
57

Ⅱ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究

18
20
30
48
50
占8
MMPFGGIAAR LQRDRLRAEG tJGEHNNAUKY LNQDYEALKQ ECIESGTLFR DPQFPAGPTA
78
80
98
100
118
120
LGFKELGPYS SKTRGUEHJ（R PSELUDDPQFIUGGATRTDI CQGALGDCHL LAAIGSLTLN
138
148
158
1占8
170
180
EELLHRUUPH GQSFGIEDYAGIFHFQIHQFG EWJDtJVVDDL LPTKDGELLF UHSAECTEFH
l98
200
2．18
228
230
248
SALLEKAYAK LNGCYESLSG GSTTEGFEDF TGGUAEMYDL KRAPRNMGHIIRKALERGSL
258
・2占0
278
288
290
388
LGCStDITSA FDMEAUTFKK LVKGHAYSUT AFKDUNYRGQ QEQLIRIRNP HGQUEHTGAIAJ

318

328

330

340

358

3朗

SDGSSEHDNI DPSDREELQL KMEDGEFHMS FRDFMREFSR LEICNLTPDA LTKDELSRHH

378

388

390

…

ノ

…

428

TGNFEGTHRR GSTAGGCRNN PATFHINPQF KIKLLEEDDD PGDDEVACSF LUALMQKHRR

438

440

450

RERRVGGDMH

TIGF一UYEUP

EEAQGSQNVH

4朗
LIくKDFFLRNQ

470

480

SRARSETFINLREVSNQIRL

490
588
510
528
538
540
PPGEYIUVPS TFEPHKEADFILRUFTEKQS DTAELDEEIS ADLADEEEIT EDDIEDGFKN
SS8
5占8
578
580
59O d的MFQQLAGEDM EISUFELKTI LNRUIARHKD LKTDGFSLDS CRNMUNLMDK DGSARLGLVE
d18

占28

FQZLHNKIRSHLTIFRQYDL

占30
DIくSGTMSSYE

占48

d50

占朗

MRMALESAGFKLNNKLHQUU

VARYADAETG

占78▲
占88
898
788
UDFDNFUCCLIJKLETMFRFF HSMDRDGTGT AUMNLAEHLL LTMCG

718

図1ニワトリmCANPのアミノ酸配列

OriginalTranslationProduct（CANPPrecurSOr）
81

t

331

1

号

二

ゝ 一
夕 弘

−＝
一

⊃一
・

ふ ・
ふ ． 二．

561

l
ll

705

巨lV∃
Cafciumbinding protein

thiotprotease（calmoduHn）

27K

図2

27K
CANPのドメイン構造

17K

7．カルシウムプロテアーゼの活性発現機構

81

CANP

−ARG

Asp−PRO

PHE一一LE−V札−㊤ GLY−ALA一丁HRCATHEPSIN B LEU

ALA−ARG−GLN−TRP−SER−AsN−CYSCATHEPS川II TYR

TRP−ARG−LYS一

一LYS

ILE

TRP−ARG図−LYS

AcT川日日N LEU

TRP−AR6−SER−

PAPAINAsN−VAL−VAL−
GLY−ALAVAL一

GLY−ALA VAL−VAL−
17

1

93

CAHP

Asp CYS−TRP

CATHEPS川B

GLN−GLY

SER

C∧THEPS川日

GLN−GLY−ALASER CYS−TRP

PAPAINGLN−GLYSER CYS−TRP

AcI川tD川

GLN−GLY GLU−CYSGLY CYS−TRP

CYS一TRP

29

TYR−SER匝10匹かHE−LYS−Asp 匝IAsH軍司ARG

CANP
CATHEPS川

B

CATHEPS川H

AR6−ILEPAPAIN㊥vAL−ILE−

ALT川IDINCANP〔ATHEPS川B−PR0−TYR−TRP−LEU

CATHEPS川H

一TYR−TRP−ILE

PAPA川−GLY−TYR一ⅠLE−LEU

AcT ID川 曾GLY−GLY＠−Asp−TYR−TRP一一LE
図3

CANPの活性中心Cys−108，His−265のまわりのアミノ酸配列の比較

561−705）は，カルモデュリンなどのカルシウ

由でカルモデュリン様タンパク質と結論でき，

ム結合タンパク質と非常に類似性が高く，カル

CANPは分子中にカルモデュリンを共有結合

モデュリン様のカルシウム結合タンパク質と考で組込んだ酵素といえよう（図4）。

えられる6）。カルモデュリン様と考えられる理

第Ⅰと第Ⅲドメインの機能はまだ明らかでな

由は，①第Ⅳドメインは145残基からなりカル
モデュリンと同じ長さであること，②代表的な

いが，CANPは4つのドメインからなり，第IIカルシウム結合構造であるEFハンド構造とよ

ドメインはプロテアーゼ活性の発現に，第Ⅳドメインはプロテアーゼ活性を制御し，カルシウ

く似たアミノ酸配列であること，（卦アミノ酸配列から推定した2次構造が，へリックスールー

ム感受性を発現する部位である。
2．CANP遺伝子の構造

プーへリックス構造を持ち，EFハンド構造と同

CANPは分子進化の点から考えると，4個のじであること，④カルモデュリンと同じく，このEFハンド構造が4個連続して存在するこ

異なった遺伝子，少なくとも，チオールプロテ
アーゼとカルモデュリンの遺伝子が融合してでと，などである。第Ⅳドメインはこのような理きたものと考えられる2）。これをさらに明らか59

Ⅱ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究

∽−

150

CANP

Calrl血ulin571589

了19

6糾−

6糾

7：：土

他ovine）

trol！OninC（rabbit muSCIe）

rnyo＄infightchain（cah研C）

myoSinlightehain（regulatory）

Pan／albumin▲−l00PS血tl∫e
振噂等 kllXOrbta

図4

CANPの第IVドメインの構造
誤．〇 −

器＝蓼

寸．寸 − 禿I l − ■ ●HindHI

唱．￠ −

CN−

BamHI
HindⅡⅠ／BaTnHI

寸．の 一

Pstl
BamHI／EcoRI

EcoRIノHindIn

陶芸糎抽
l

l

−−

図5

60

CANPのmRNAと染色体DNAのプロッティングによる分析

7．カルシウムプロテアーゼの活性発現機構にするためにCANP遺伝子の構造を解析した。
ニワトリCANP遺伝子は約10kbの長さで，21個のエキソンからできていた。イントロンとエキソンの接合部が必ずドメインの境界部にあcDNAとハイプリグイズするCANP遺伝子はユニークであると結論できる。
4．CANPの構造と活性制御
CANPは共有結合で結ばれたカルモデュリ

り，CANPのドメイン構造と遺伝子構造はよくンを含むといえるが，このような例ははじめて対応していた。

である。カルモデュリンは普通遊離状態で存在され，活性中心Cys−108を含む相同な領域がし，Ca−カルモデュリン複合体となってはじめて標的酵素と結合し，その活性を制御する。こイントロンで分断されるだけでなく，もう1つ

れに比べると，CANPは分子中に制御タンパクの活性中心His−265との間には3個のイントロンが見出された。したがって，ドメインⅡの質を含むのでカルモデュリンが遊離状態にある
ときより，厳密な活性のコントロールが可能で部分は機能単位とェキソンとは必ずしも対応していなかった。チオールプロテアーゼで遺伝子ある。この事実はCANPが細胞内プロテアー

構造がはっきりしている例がないので，この現せると極めて合理的である。

象がCANPに特有かどうか不明である。
ドメインⅣの4個のEFハンド構造は，各々ニワトリのmCANPをmMCa2十の存在下で自己消化させるとカルシウム感受性が増大し，1個のエキソンでコードされていた。カルモデ〝MCa2＋の下で活性を持っようになる。この際ュリンのようなカルシウム結合タンパク質は，のCANPの構造変化を調べ，．N末端から16個1個の始原カルシウム結合配列が2回の遺伝子のペプチドが遊離することを見出した。N末端

重複をへて生じたものと考えられているが，ドから短いペプチドが遊離するだけでCa2＋感受

メインⅣの遺伝子構造はこの説とよく合致して性が変わることは極めて面白い現象で，この事いる。

実と今まで酵素化学的にえられている事実のとドメインⅢは7個の土キソンによってコード

CANPのドメイン構造は遺伝子構造を解析

ゼで常に基質と接する状態にあることを考え合を結びつける研究を進めている。

した結果からも支持され，分子進化や酵素活性

文の制御を考える上で極めて興味ある現象である。
3．CANPのmRNAの分布と遺伝子
CANPのCDNAをプローブに使い，種々の臓器に含まれるCANPmRNAをノーザンプロ
ット法で分析した。図5に示すように調べたす
べてのニワトリ臓器で約3．5kbのCANPのmRNAが検出された。また，ドットプロット法
によってニワトリ臓器抽出液中のmRNAの量を測定したところ，肺の含量が最も高く，次いで心臓や肺臓で，筋肉や砂嚢のCANP mRNAの含量は低かった。

献1）鈴木紘一：カルシウムプロテアーゼの機能発現機構，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度研究報告書，91，1984．
2）Ohno，S．，Emori，Y．，Imajoh，S．．Kawasaki，H．，
Kisaragi，M．and Suzuki．K．：Nature，312，566，
1984．
3）Suzuki，K．，Hayashi．H．．Hayashi，T．andIwai，
K．：FEBSLett．，152，67，1983．
4）Takio，K．，Towatari，T．．Katunuma．N．，Teller，
D．C．andTitani，K．：Proc．Natl．Acad．Sci．USA，80，3666，1983．
5）Neurath．H．：Science，224，350，1984．

一方，ニワトリ染色体DNAを種々の制限酵6）Tufty，R．H．and Kretsinger，R．H．：Science．

素で切断し，サザン分析を行ったところ，いずれの場合も図5に示すように1本のバンドが検7）Suzuki，K．andIshiura，S．：J．Biochem．，93，

出された。以上の結果，我々がえたCANPの187，167．1975．
1463，1983．

61

8．レセプター機構におけるカルシウム
プロテアーゼの問題点について

財町

宜秀

山村

● 神戸大学医学部第二生化学教室●

proteinkinaseCの2つであ．って，いずれも特有の機序で活性化されるが，他方CANPによっても活性化をうけることがこれまでの解析で明らかになっている4）。そこでこの現象の生理的意義を明らかにするべく，種々の解析を実施■

ッヂ大学から提出されたため，この機構の重要性が一層増加した3）。その概略を図1に示しているが，このシグナルの伝達機構の中で最も重要な律速段階の酵素はphospholipase Cと

労竹野

また過去一ヶ年の問，この受容体機構において，イノシトール3燐酸（IP。）がカルシウムの初期動員に働いているとの知見が英国ケンプリ

泰 明之

私共は過去六ヶ年，本研究班に所属する機会にめぐまれ，筋ジストロフィーの病態解析の一つの試みとして，形質膜の受容体機構におけるカルシウムプロテアーゼ（CANP）の関与に焦点をあてて来た。殊に形質膜のイノシトール燐
脂質の代謝回転に共役する外界シグナルの受容伝達機構は，最近各領域で注目を集めており，
神経末端からのアセチルコリンやカテコラミンの放出，これを受けて応答する種々の細胞における反応機構は，本研究班の当初，我々による
proteinkinaseCの解明を契機として急速に進められており，筋組織では紅彩筋，心筋，平滑筋等におけるその役割が具体的な解析の対象とされている1・2）。

宏

はじめに

塚

西 本西

岸中

研究協力者

した。
材料および方法
protein kinaseC，phospholipaseC，CANP
はいずれもラット大脳，肝等より調整した。
種々の細胞応答については血小板，白血球，リンパ球，平滑筋等の実験系を用いたが，これらは主として既報の方法卜鋸に従っている。
結果と考察
1．レセプター機構とphospholipaseC
図1に示す受容体機構では外界シグナルによるイノシトール燐脂質2燐酸（PIP2）のphosp−
holipaseCによる加水分解が初期過程において鍵となっているが，この機構は現在不明である。GTPの関与が示唆されているが，動物組織のphospholipase Cの研究はなお充分でない。
すでに本酵素がCANP等のプロテアーゼによって活性化されていることが報告されているが4・7），今回，大脳，肝等の組織に少なくとも2種の酵素が存在し，それぞれmM Ca2＋および〝MCa2＋で活性を表わすことが明らかとなった。これはmCANP，FLCANPと類似する現象
であるが，実際に生体内条件においてCANP
がphospholipaseCの活性調節に直接関与しているとの証拠は得られなかった。
2．proteinkinaseCの活性化とCANP
当初に報告したごとく，prOteinkinaseCは
通常はイノシトール燐脂質，殊にPIP2の分解により生成するジアシルグリセロール（DG）に63

Ⅱ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究
SignalCa2＋protease

CellularResponses

図1

レセプター機構

より活性化されるが，CANPによっても活性化される。J上CANPはDGによって既に活性を顕わしているproteinkinase Cに好んで作用するので4），CANPは図1の受容体機構の活性化に働いているとの説がその後，Tapley andMurryによっそ提出された9）。そこで，我々は積極的にこの現象の生理的意義を明らかにする
べく，各種の細胞種をそれぞれに対応する生理活性物質によって刺激し，その直後にprotein
kinase CのCANPによる加水分解フラグメン
ト（活性型）を探索したが，すべて結果は陰性であり，prOteinkinase Cの活性化にCANPが直接関与しているとの証拠は得られなかった。
3．CANPの活性化因子
そこで観点を変えて，CANPの活性化因子の存在と，その外界シグナルによるCANP活性化への関与を想定し，種々の解析を行った。その結果，CANPの活性化因子として分子量約15000の蛋白質がシナプゾーム膜，血小板膜等の不溶性分画に存在していることが明らかとなった。この活性化因子を単離して吟味した結果，mCANP，FLCANP両者をともに約7〜10倍活性化する能力を示すが，Ca2＋に対する感受性は変化させず，また外界シグナルに際してこ
64の因子が働いてい右との根拠は得られていな
い。これまでに報告されたeANPの可溶性活性化因子10）とは異なったものであるが，いずれもその役割は不明である。
4．CANPは，DownRegulatiomに関与するか
図1に示す外界情報の伝達系は今日筋収縮を含めて多くの細胞応答についてその是非が解析されている。これまでの多数にのぼる解折からはこの機構が強く支持されており，分泌，収縮等の細胞応答のみでなく，増殖因子による細胞応答等にも論議が拡大されている。また，ホルボールエステルの作用点がprotein kinase C
であることもほぼ認められているといえよう。
この機構の活性化はイノシトール燐脂質の代謝回転と共役しており，上述のDGとIP3が2次伝達物質として働いているト3）。これまで我々を含めた多くの解析によって，CANPがphos−
pholipase C4・11），prOtein kinase C4・7）をともに活性化することが示され，この受容体機構へのプロテアーゼの関与が積極的に解析された。〔かしその結果は細胞内における受容機構活性化への関与を証明することは出来なかった。むしろ，CANPは受容体機構の活性化ではなく，
downregulationを考えさせる結果が多い。
例えば，細胞を増殖因子やホルポールエステ

8．レセプター機構におけるカルシウムプロテアーゼの問題点についてルで刺激すると，その受容体であるprotein
kinaseCの活性化が直ちに認められるが，酵素の絶対量は極めて急速に消失し，いわゆるdown regulationとして認められる。また実際にprotein kinaseCのCANPによって生成するフラグメントは急速にさらに分解されて消失することが試験管内の解析から示唆される。
外界シグナルに対する受容体機構のdown
regulationが何を意味するのか，現在ほとんど不明であるが，CANPの生理的役割の一つにdown regulationがあるか否かは今後も引き続いて吟味してよい課題と考えられる。
文

献1）Nishizuka．Y．：Nature，308，693，1984．
2）Nishizuka，Y．：Science，225，1365，1984．
3）Berridge，MJ．andIrvine，R．F．：Nature，312，
315，1984．

4）西塚泰芙：カルシウムプロテアーゼと細胞情報の受容伝達，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度研究報告書，95，1984．
5）Kikkawa，U．，Minakuchi．R．．Takai，Y．and
Nishizuka．Y．：Methodsenzymo1．，99，288，1983．
6）Kajikawa．N．，Kishimoto，A．，Shiota，M．and
Nishizuka，Y．：Methods enzymo1．，102，279，
1983．

7）Kishimoto，A．．Kajikawa，N．，Shiota，M．and
Nishizuka，Y．：J．Biol．Chem．，258．1156，1983．
8）Kikkawa，U．，Takai，Y．，Tanaka，Y．，Miyake，R．
and Nishizuka．Y∴J．Biol．Chem．，258，11442，
1983．

9）Tapley，P．M．and Murray，A．W．：Biochem．
Biophys．Res．Commun．，118，835，1984．
10）DeMartino，G．N．andBlumenthal，D．K．：Bio−Chemistry．21，4291，1982．
11）Hirasawa，K．，Irvine．R．F．andDawson，R．M．
C．：Biochem．J．，206，675，1982．

65

9．E−64−Cの筋蛋白質分解への効果
一平滑筋Slの精製への利用−

野々村 禎 昭＊
研究協力者 山 下茂＊ 松 井 幸 子■ 江 橋 節 郎＊＊

は じめに
分担者は昨年度は班長の特別依頼研究に従事したので，本年度は本来の発生分化過程でのE−64−Cの効果について研究する予定であった。
しかし本年がこのプロジェクトの最終年度に当
たり，まとまった研究になった方が良いとの考
えから，計画の最終項であった筋蛋白質研究で実際的にE−64−Cが効果を挙げる例にとり組むことにした。
ミオシンの酵素分解によって頭部の単頭のアクチン結合部とATPアーゼを残したSl分画が実験に使われる。骨格筋ではミオシンをキモ
トリプシン処理することで阻止薬としてDFPを用いて良好なSlが得られている。しかし平滑筋ミオシンではキモトリプシンは頭部近くを切ってしまいSlが得られないことが岡本によって確かめられている1）。一方かつてBailinとBarany2）はパパインを用いて平滑筋からSlを得，後にMarstonとTayler3）もこの方法でSlを得ているが，粗雑な実験に終わっている。
パパインでSlを得る方法では阻止剤として
モノヨード酢酸の多量が用いられてきた4）。前述の平滑筋のSlの仕事2−3）でもこの方法がとられている。
E−64−Cは本研究班の報告をみてもパパインに対しては良い阻止剤なので，これを用いて平滑筋からSlを得てその性質を確かめることをこころみた。
材料と方法
平滑筋ミオシンは鶏砂嚢から江橋の方法5）を多少変えて6）調製した。アクチンは同様に鶏砂
嚢から江橋の方法刀で調製した。ATPアーゼはYoungburg，Youngburg法8）を多少かえて9）行
った。SDS−PAGEはLaemmliの方法10）に従い
ミニスラブで行った。
結果と考察
ミオシン5〜10mg／mlを，100〜150mM
KCl，2mMEDTA，lQFLMβ−メルカプトエタノール，10mMリン酸バッファー（pH7．4），パパ
イン20〜3伽g／mlで25℃10分処理し，直ちにE−64−C5〜25J上Mまたはモノヨード酢酸（以下MIIと略）lmM〜0．2mMになるように加え，SDS処理10）して1部は100℃3分煮沸，他はそのままにしてSDS−PAGEにかけた。パ
パイン濃度が低いとミオシンheavychainが残り，20Kのp−1ightchainも残った。パパイ
ン濃度をあげるとheavy chainは消え，同時にp−lightchainも消失した。この時残っているのは110−130K，95K，70K，25Kのバンドと17Kの1ight chainであった。これらは煮沸
SDS−PAGEの結果であって，そのままかけた方のE−64−C処理の方は煮沸の方と同じパ■ターンを示したが，MIIはlmMでも70K以上の東京大学医学部第一薬理学教室

バンドは分解して60K以下に多数のバンドが●■ 岡崎国立共同研究機構生理学研究所

現われていた。MIIの濃度を下げると40K以■67

Ⅲ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究

図1Papain（P）分解した平滑筋ミオシンに対するE−64−C（E）とモノヨード酢酸（M）の効果（15％SDS−PAGE）
右半分は試料を煮渾してからSDS−PAGEにかけ（boil）左半分はそのままかけた（n．b．）。
左端は分子量マーカー；n．b．でM−1mM．0．5mM加えても分解が生じている。E−25LLM
は分解を防いでいる。
DE52
柑mMKCl
128−

75

158K◆
95 ◆■

69●−

r r

27−薮J

綱鯵

図2

ヽ■

Slの精製をDE52カラムで行った結果のSDS−PAGE
lOmMKCl−トリス（pH7．4）から4＝00mMKCl．トリスで勾配をかけて流出した。125mM
KCトトリス迄にSlの95K．17Kと恐らく二・ソクの入った69K，27Kが120−150Kのロッドから分離している。

下のバンドだけになっていた。SDS下でもパパイン活性は残り，あるいはむしろ切れ易くなっており，丁度CleavlandのSDS下ペブタイド
マップ法11）を行ったと同じであろう。いずれにしても調製時にはパパインは暫くは残存するの68

でMIIは阻止剤としては不充分なことがわかるLE−64−Cは効果的なことがわかる（図1）。
Slの精製は同上処理液を冷却水で2〜3倍に稀釈，時にMgC12を5〜10mM加えて遠心，
上宿をDEAEL52カラムにかけた。KClは50

9．E−64−Cの筋蛋白質分解への効果

表12q上MのE−64−Cの存在はほとんど阻害がなかった（表1）。

EffectofE−64−C＆MIAAon
glZZardmyosinATPase（Pi〃mOles／mg．min）

5mM EDTA（0．5MKCl）

0．305＋2′爪tE−64−C O．290＋10正ME−641：
5mMCaC12（0．5MKCl）

パパインーE−64−Cをもちいることによって平滑筋のSlが容易に得られた。平滑筋生化学
にとって有用な方法となることが期待され
る12）。

0．278
0．107，

0．120＋2〃ME−64−C

0．105，

0．110＋10正ME−64−C

0．110，

0．118＋0．2mM MIAA

0．114，

0．125＋0．5mMUⅥIAA

0．101，

0．115

mMとして50mMから400mM KCllOmM

文献1）Okamoto，Y．etal．：J．Biochem．，88，361，1980．
2）Bailin，G．andBarany，M．：Biochim．Biophys．
Acta．，236，292，1971．
3）Marston，S．B．andTaylor，E．W．：J．Mol．Bio1．，
139，573，1980．

4）Lowey，S．etal．：J．M．B．，42，1，1969．

リン酸バッファーで勾配をかけて流出した。75〜120mMKClのところに95K，70K，25K，175）Ebashi，S．：J．Biochem．，79，229，1976．

Kバンドは一緒に来て，110−130Kバンドと分

96，575，1984．
7）Ebashi，S．：J．Biochem．，97，693，1985．

離出来た。この110−130KはRodであることが確かめられ，95K，17KがSl，70K，25Kは6）Nakamura，S．andNonomura，Y．：J．Biochem．，

8）Youngburg，G．E．and Youngburg，M．Ⅴ．：J．
Lab．Clin．Med．，16，158，1930．

nickが入りSDS−PAGE時に95Kが分解した

9）Nonomura，Y．andMatsui．K．inpreparation．

ものと考えられる（図2）。

10）Laemmli，U．K．：Nature，227，680，1970．

このSlは高いK−EDTA−，Ca−ATPアーゼ活性を示し，Mg−ATPアーゼをアクチン存在によって活性化することがわかった。K−
EDTA−ATPアーゼ，Ca−ATP7−ゼに対し11）Cleaveland，D．W．et al．：J．Biol．Chem．，252．
1102，1977．

12）Nonomura．Y．，Yamashita，S．andMatsui，K．in
preparation．

69

10．ESTの培養筋細胞への取り込みの測定についての試み小 沢 瑛二郎暮研究協力者 北 村 忠 久H 萩 原 康 子■

ESTは，体内へ吸収されるときに脱エステル化されてE−64−Cとなって，標的細胞に入り，入ったE−64−Cは細胞質内のCANPおよびリソゾーム内のカテプシンと結合することによって作用を示すという作業仮説のもとに研究が行われている。
我々は，この作業仮説の検討をするために以下の実験を行った。マウス由来の骨格筋株細胞
G8細胞が融合して筋管細胞が形成されたのを確認した後，14CラベルESTを培養液に入れて作用させた。作用時間は，24−50時間であった。ESTは10％血清中では6時間で99％がE−64−Cに変化する（大正製薬データ）ので10％
馬血清，10％牛胎児血清を含む培養液中での作用はラベルしたE−64−Cの効果をみたことになると思われる。石浦班員の報告によれば，E−64−Cのとり込みは，イヌリンとの対比でみる限り24時間ではぼプラトーに達する1）ので，ここに示したのは十分な時間をかけたものと考えることができよう。
Ⅰ．オートラジオグラフィー
1．培養条件および電顕用処理法の検討
電顕に適した固定，包理法を検討する￣目的で11日目ニワトリ胚胸筋のprimary cultureに
培養3日目よりE−64−C3（加g／mlを24時間作
用させ，2．4％glutaraldehyde＋2％paraform
aldehyde（0．1M cacodylate buffer）で固定

し，rinse，脱水後エボン包哩とした。この材料からウルトラミクロトーム（ライへルト社製，

UM−4）で表面に平行に1〃切片および超薄切
片を切り出し，それぞれ光顕および竃顕観察に供した。
結果：この方法で良好な竃顕像が得られた。筋細胞内には筋原線経がよく発達しており，Z帯，M帯は明瞭に認められた。Lysosomal
structureも観察されたが数は少なく，小さなものが多かった。以上の結果，満足できる電顕像が得られたので以下同じ方法で実験を進めた。
2．マウス筋細胞のcel11ine G8 についての検討
マウス筋細胞株 G8 を7日間培養し，上記のように固定・包埋して電朝で観察した。
所見：一般に細胞の胞体は大きく，多数の
polysome，ミトコンドリアの集団が見られる。
細胞周辺にはrumeがよく発達しており，ここでは顆粒状の基質と多数のpolysomeを観察する。筋原線経はdiffuseまたは境界の不明瞭な束を成しており，Z帯と思われるdenseな部分が散在している。M帯は認識できず，ニワト
リ胸筋に較べてarrangementが悪い（図1）。
LysosomalstruCtureは少なく，小数のpri−marylysosomeと思われる構造（図1矢印）を見るのみである。また，筋原線経が乏しく，
polysomeに満ちている幼若な細胞も認められた。

■ 国立武蔵療養所神経センター機能研究部＝ 京都府立医科大学第二病理71

ⅠⅠ酵素・細胞・組織レベルにおける研究

図1mousemusclecelllineHG8一 増産7日目
myofibrilは不規則な束を作り，不整形のZ

図21dcAESTによる光朗オートラジオグラフィー

帯が散在している。少数のPrimarylysosomeは印）を見るユ ーは1〃mを示す（以下の図でも同じ）二．

24時間作用させた。銀粒子は主として細胞質上に認められるが特定の場所に集中している

培養7日目のG8に14cTEST30噌／miを傾向はない。14Cの長い飛程を示す銀粒子のトラックが観察される。

濃靂牽叢警，莞
勲靂ナ慧＼■適し態；■l l＿

巨1▼」妙．，，′

曾二・．・；・∴．欄静一

図314CLESTによる竃顕オートラジオグラフィー
14C−ESTの作用条件は図2と同じ。
現像さiLた鋭粒＋かmitochondria7）問のCytOplasmicmatrix上に認められる。
3．マウス筋細胞cellline G8に対するESTの影

図414C−ESTによる竃顕オートラジオグラフィー
14C−ESTの作用条件は図2と同じ。
細抱質内には多様な内容物を持つIysosomal
StruCtureが認められるが．鋭粒子はこの部
分には見られない。
むautophagosomeないしはそれに由来する
residualbodyであろうと推定される。

培養7日目よりESTを30JJgおよび60〃g／ml加え24時間作用させた。竃顕所見はいずれ

4．オートラジオグラフィーの濃度でも同様であった。いずれの材料でも不FLgないし60pg／miを7日間培養した

規則な形をしたdense bodyがpolysomeや24時間作用させ，充分に洗ったのちェボンに包mitochondriaの間に介在して認められた（図4，5，6）。内容は小器官を思わせるvesic−

埋した。この材料から1〟および超薄切片を作り，それぞれ光顕および電顕オートラジオグラ

14CでラベルしたEST（54．61pCi／mg）を30G8にularなもの，顆粒状のもの，均一なものなど

フィーに供した。光顕オートラジオグラフィー

様々であった。これらはIysosomalstruCtureにはコダックNTB−2乳剤を2倍に希釈してコと思われるが，その内容から様々の小器官を含ートし，30日間の露出後，FDlllで17℃，472

10．ESTの増兵筋細胞への取り込みの測定についての試み

−

F∴雫鳶壱
ぶ・− ■∴メ才・J■■−．、一・

■・・・＿

」〈
烏こ渠」h
図5トlc−ESTによる電頸オートラジオグラフィー‖C−ESTの作用条件は図2と同じ二myofibril の束．lysosomal structure．
mitochondria

外集情像などが観察されるか

鋭粒子はこれらを逝け
上に認められる

30

60にbubble法でうすくコートした2）。40日間の
DW

く一）

30

60

K
94．．＿＿．

67−

攣

48−．

30−
20

銀粒子の大部分がmyofibrilの上に観察される。

cytoplasmie matrix＄DSト）

図61dc−ESTによる竃艶オートラジオグラフィー
14C−ESTの作用条件は図2と同じ。

−曹丁亡ゴ

＿＿＿

淋
14．4■．．＿＿

図7Ⅰ4C−ESTによるSDS−PAGEオートラジオ
グラフィー（−）はllc−ESTむ培養液に加えないCOntrOlで，細胞を集め破壊Lt：後でIJc−EST5fLg／miを加えincubateした＝30はllc−EST30fLgml
を、60は60〟g mlを24時間培養液中で作間させた後に細胞を集めた二 左3レーンは細胞を1㌔SDSで破壊Lたもので．右3レーンは蒸留水中超音波で破壊したもの：．培鼠 作用条
件：i竃質図と同じ＝ PAGE：12．50b．露出時
間：3tH］：

分間現像した2）。竃頸オートラジオグラフィーにはサクラNR−H2乳剤を使い，脱ゼラチンをしたのち，カーボン蒸着を施したグリッドの上露出後FDlllで18℃3分間現像し，定着・水洗ののち，ウラン・鉛二重染色をし電顕（HITACHI，H−12型）で観察した。
光顕所見：銀粒子は細胞の上およびそのすぐ近傍に見られ，バックグランドはほとんどない。
14Cの長い飛程に対応した銀粒子のトラックが観察された（図2）。以上の所見からldc−ESTは
確かに ■G8 細胞に取込まれていると思われた。詳しく見ると銀粒子は主として細胞質の上に分布しているが，特定の場所に集中している像はなかった。また，トルイジンブルー染色を施したエボンlFL切片ではlysosomaldense
bodyの集結が容易に観察できるが，このような部位に銀粒子が集っている像も認めなかった。14C．ESTの濃度（3Qpg／mlと6QFLg／ml）による差はほとんど無かった。
竃顕所見（図3−6）：現像された銀粒子は折れ曲がった特有の形をしており容易に認識することができる。電圧巨オートラジオグラフィーにおいても銀粒子が細胞の一定部位に集中して観察されることはなかった。14Cは飛程が長く，乳剤中でも1軸に及ぶと考えられている。しかし，
私達の方法で乳剤をコートした場合，銀粒子は標本の上を高々一層に覆っているにすぎない。
したがって標本に含まれる線源から出た放射線はそのごく近くを覆っている銀粒子を感光した
のち，その外方に放散してゆくと考えられ，実73

ⅠⅠ酵素・細胞・組織レベルにおける研究

3
6

CytOPlasmicmatriXandpolysome

3

Others（Golgiなど）

4lysosomalstructures

4
1

myofibril

6
1

mitochondria％ ％ ％ ％ ％際には個々の銀粒子の位置は線源に比較的近いものと推定される。そこで細胞質上に見られる銀粒子がどのような割合で小器官上に観察されるかを3伽／ml，24時間作用させた群について算出してみた。その結果はであった。
アイソトープの飛程の問題，写真上で各小器官の占める割合の算定など修正する要因は残されているものの，この結果は（1）lJc−EST が
CytOplasmic matrix（＋polysomes）の中に含まれている可能性が高いこと，および（2）1ysos−
Omalstructureとはあまり関係がないことを示唆していると思われる。
Ⅱ．一次元電気泳動像
上に述べたように細胞内にESTが入る場畠にどのような分子量のものに附着するかを調べた。
コントロールとして，細胞を蒸留水や1％SDSで集めて破壊した後，ESTを結合させたものを調べた。蒸留水で集めたものでは，分子量の高いところから低いところまで多数の線が74

現われ，多くの分子種についていることが分った。一方SDS液で集めたものでは分子量32K程度の緑がわずかに認められた。
ESTを作用させた細胞を同様に集めたとこ
ろ，両者とも32K，24K程度のものと，SDS液では30K，蒸留水では28K位のものとが現われた。80Kの線は得られなかった。
考案

以上の結果は，ESTは細胞中に入り，高分子に結合するが，リソゾームには集まらないことを示している。また細胞内のオルガネラに結合していないものも，CANPの80Kサブユニッ
トに結合しているという証拠は得られなかった。電気泳動で得られた32Kはあるいはカテ
プシンの一種であるかもしれないが，積極的にそれを認めることにはならなかった。

参考文献
1）石浦章一，山下 瓦小浜一弘，杉田秀夫，江橋節郎：培養筋細胞の蛋白代謝に及ぼすE−64−Cの影響，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」，
昭和56年度研究報告書，91−95，1982．
2）藤田哲也，北村忠久：オートラジオグラフィー，
新組織化学，朝倉書店，′Nl挿口朗他線 60−102，1975．

11．肝細胞の培養維持に関係した膜結合型
トリプシン様エンドプロテアーゼ

市 原

明＊

研究協力者 田 中 啓 二＊

1．初代培養肝細胞の生存促進因子としてのトリプシン・インヒビター
初代培養肝細胞は種々の分化型肝機能を有し，また色々なホルモンによく応答し，さらに，EGFなどの増殖因子に依存して分裂・増殖する1）。肝細胞のホルモン作用や再生機構の研究には無血清培養が必須な条件であるが，初代培養肝細胞の場合には，血清無添加では約1日し（A）か細胞は維持できず，このことは，血清中に肝実質細胞の生存を促進する物質が存在することを示唆している2）。この物質の同定中に，ウシ下垂体の粗抽出分画に血清と同程度の強い肝細胞の生存促進活性があることを兄い出し2），その因子を単離精製したところ，意外にもそれがウ
シ膵臓トリプシンインヒビター（BPTI）である
ことが，種々の生化学的検討から明らかになった3）。図1にBPTIの初代培養肝細胞の生存に

くB）

（C）

図1初代培養肝細胞の生存に対する血清とウシ膵臓トリプシン阻害剤の効果
肝実質細胞をコラゲナーゼ渾流法で分推し，0．1〃Mインスリンと1〃Mデキサメサゾンを含むウィリアムズE培地で3日間培養後，位相差顕微鏡で撮影（×300）。
㈱対軌（B）ウシ血清（5％）添加，（C）ウシ膵臓トリプシン阻害剤（0・12〟g／ml）添批＊ 徳島大学医学部附属酵素研究施設酵素病理部門
75

Ⅲ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究

表1初代培養肝細胞の生存促進活性と肝臓形質膜結合型プロテアーゼ
に対する種々のプロテアーゼ阻害剤の影響
膜結合型70ロテアーゼの活性H

初代培養肝細胞の生存促進活性■
添加物質

5
8

仙

8
2
8
2
3
8
9
9 1
0
0
0

0
0
1

5
6
9

0
0

0
5
1

280

0
5

AntithrombinⅠⅠⅠ

6

179

9
2

3．9

Cl−Ⅰnl1ibitor

0
5

2060

α2rPlasmininhibitor

0
5

2000

α2−Macroglobulin

56

αrAntitrypsin

0
5
8 7

80

0

10

EST

0
5

50

Elastatinal

0
5

Pepstatin

0
5

50

阻害率
（％）

0
5

40

Chymostatin

7
7

Leupeptin

0

40

0

40

LimabeanTI

4
6
9
2 1 7

EggwhiteTI

濃度
g
〃
0
5

0．12／g／m1
40

65

SoybeanTI

（％）
0
0
1

BPTI

濃度

TLCK

l

TPCK

l

NLethylmaleimidelO−phenanthroline

l

0

lO

5
9

0．1mM

PMSF

8
9

DFP

00
3
0

TI；trypSininhibitor●培養3日後における残余蛋白質を測定し，5％血清の値を100％として表示．
培養条件は図1参照。
2FLgの精製酵素を用い，通常はBz−Arg−pNAを基質として使用したが，α2−Macroglobulinの効果を調べる場合にのみ3H−methyl−カゼインを基質とした。

対する効果を示した。そこで，種々のプロテア
ように，トリプシン様酵素の阻害剤に特異的に促進活性を有するBPTIを中心にその作用を検討してみると，この阻害剤は細胞内の蛋白質分
解速度には全く影響しないこと，さらに，α2−プ

生存促進活性が認められ 中でもα1−アンチト

ラスミン・インヒビターをセファロース4Bにリプシン，α2−プラスミンインヒビターなど血結合させ，細胞内に取り込まれないようにした
場合でも，同様な生理活性を有することから，
これらは肝細胞の表面膜に直接作用している可能性が示唆された4）。

ーゼ阻害剤の影響を調べてみると，表1に示す

清中のプロテアーゼ阻害剤にも有効な作用が認められたことから，血清の肝細胞生存効果はプ
ロテアーゼ阻害剤の働きによることが判明した。
このように，トリプシン・インヒビターが細胞の生存促進といったような強い生物学的作用を示すことは，その作用機序の解明と共に非常に興味深い現象である。そこで，最も強い生存76

2．肝細胞膜に結合したトリプシン楼エン
ドプロテアーゼの発見と分離・精製およびその性質
トリプシン・インヒビターが肝細胞の表面膜

11．肝細胞の培養維持に関係した膜結合型トリプシン様エンドプロテアーゼ

1

2

3

4

5

表2 肝細胞膜結合型プロテアーゼの基質特異性濃度
活性（mM）（nmoles／h）

2

0

4

0

1

0

0

1

6

0

1

9

0

1

3

1

0

5

1

0

6

1

0

6
4

1

0

8

1

0

8

1

0

6
7
1

0

7
2
4

1

DAVal・Leu・Arg−pNA
Bz−Phe・Val・Arg−pNA
D−Val・Leu・Lys−pNA
BzLArgApNA
Bz−Arg−OEt
Bz−Arg−βNA
CBZ−Ala・（Arg）2−4MeO一βNA

Arg−βNA

ハーコールの密度勾配遠心法で分離した肝楓の形質摸
（1（〕0〟g）を37qC，pH7．4で保i比後，5倍量のアセトン
で蛋白質を沈澱させ、SDSLPAGEで分析。1；未消化の形質胤2；2．5時間保軋3；5．t州寺間保温 4；ロイペ
プチン（50fJg／ml）存在下で5時1甜菜乱 5；キモスタ
テン（50〟g／ml）存丞三下で5時馴染温。なお，3で見られるような自己消化のIil棉りはDFP およびウシ膵臓ト
リプシン阻害剤の共存下でも観察された。

0

図2 ネズミ肝臓形質膜動′1質の自己消化とプロテアーゼ阻害剤の影響

1

Leu−βNA

0

■』−

0

−

0

」■i．■−

1■■■

0

SuccinylL（Ala）3−pNA0Glutaryl−（Ala）2・Phe−4MeO−βNA0

Bz−Tyr−OEt

0

Bz−Tyr−pNA

精製酵素（2噌）を使用して活性を測定。
pNA；p−nitroanilide，β−NA；β−naphthylamide，
OEt；ethylester，4−Meo−βNA；4−methoxyA伊naphthylamide．

に吸着する糖蛋白質であり，（3）阻害剤の特異性は表1に示したように，BPTIをはじめとする種々のトリプシン阻害剤の他，DFPやPMSFによって強く阻害された。（4）基質特異性は種々のトリプシン様酵素の合成基質の他，カゼインや変性アルブミンを限定分解した上で細胞の生存促進という生物活性を示すことが，キモトリプシン，エラスターゼ，アミノペ

は，当然，細胞膜にはそれら阻害剤の特異性に

プチダーゼ等の合成基質には全く作用しなかっ対応したプロテアーゼが存在することを示唆した（衰2）。（5）また本酵素の至適pHは7．0前ている。そこで肝臓からその形質膜をPercoll

後にあった。

の密度勾配遠心法で精製し，種々の基質を作用以上の結果は，本酵素が，トリプシン様のセさせて，存在するプロテアーゼの種類を検索す

リン性・中性エンドペプチダーゼであることをると，中性領域では，Val・Leu・Arg−pNAや示唆している。さらに本酵素は疎水性が強く，

Val・Leu・Lys−pNAなどのトリプシン様酵素

精製酵素でもその可溶化には界面活性剤の存在の合成基質に親和性の強いプロテアーゼ活性が検出された。しかし，キモトリプシンおよびェが不可欠であり，また，4℃，あるいは凍結条
件下で，数ヶ月間は失活しない安定なプロテア

ラスターゼ活性は認められなかった。そこでこーゼであった。以上の性質は，本酵素が現在まのトリプシン様酵素を細胞膜から種々の非イオでに細胞内に知られているいずれのトリプシン

ン性界面活性剤を用いて抽出後，BPTIをリガ

様プロテアーゼとも，またいずれの膜結合型プンドとしたアフィニティー・クロマトグラフィ

ロテアーゼとも，明らかに相違していることをーで単一に精製した5）。その精製標品を用いて種々の酵素学的性質を検討すると，（1）本酵素のゲルろ過法によって求めた見掛けの分子量は示しており，このことは，本酵素が新しい細胞
膜結合型のプロテアーゼであることを示唆している。

約12万，（2）コンカナバリンA−セファロース77

Ⅱ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究蓑3 種々の組紅の形質膜に結合したトリプシン様酵素の活性分布
DegradingActivity
PlasmaMembranes

Bz−Arg−pNA

D一Val・Leu・LysLpNA（nmoles／h） （％）

9
0

0

4
2

2

2

1．01

8

6

0．66
5．85

3

0

0．92

0

3．06

0

9

0

0

1
0

MorrisHepatoma（7794A）

0MorrisHepatoma（7316A）

1

0

8．34

3

3
1

36．7

0
1
5
0 1 2
1
1

2
0
0
3
1

0

33．0

3

0
0
1

1

1
2

RatBrain（myelin）
EhrlichAsitesTumorCells

2

RatErythrocyte（ghost）
RatBrain（cerebrisymaptOSOmal）

4

RatKidney（renalbasobateral）

1

Mouse Liver

4

Rat Liver（nmoles／h） （％）

3．26

パーコール密度匂配遠心法で精製した細胞膜標品（100瑠）を用い酵素活性を測定。

3．細胞膜結合型トリブターゼの生物学的機能に関する考察
著者らが，肝細胞膜より兄い出した新しいトリプシン様酵素（トリブターゼ）の阻害剤に対する特異性は表1に示したように肝実質細胞の無血活初代培養下におけるプロテアーゼ阻害剤の生存促進効果に極めてよく相関しているので，この酵素の機能発現は何らかの機構で肝細胞の生存と密接に関係していると予想される。
そこで，このプロテアーゼの機能を解明する目
的で，精製した形質膜の自己消化のプロセスを解析すると，図2に示すように，形質膜の構成
蛋白質のほとんどは37℃において長時間，イ
ンキュベーションしても，その前後において有意な変化が認められないが，分子量200K，60
K，52Kの三種類の成分は自己消化を受け時間経過に依存して消失した。これらの膜蛋白質の分解は，ロイペプチンなどのトリプシン様酵素の阻害剤でほぼ完全に抑制され その特異性
は，表1に示した精製酵素の性質と一致するので，この自己消化に関与する内在性プロテアー
ゼは著者らの兄い出したトリブターゼと同定された。以上の結果は，これら膜蛋白質のいずれかが，恐らく肝胞膜の生存に必須な役割を担っていて，それが無血清初代培養下ではその内在性プロテアーゼによって分解されるために細胞の生存を不可能ならしめるが，血清，あるいは
78

BPTI等を培地に添加してこのプロテアーゼ活性を阻害した場合には肝細胞は長時間維持し得ることを示唆している。
しかしながら，このような血清の肝細胞に対する防御機構が生体内でも起こっているか否かは不明であり，これはむしろ，肝実質細胞の初代培養下における特殊現象であって，この内在性プロテアーゼは本来，別な生理機能を有していると考える方が妥当かも知れない。
そこで，この膜結合型トリブクーゼの機能を推定するためにその分布を検討した（表3）。
種々の臓器から，その形質膜を分離・精製
し，本酵素に親和性の高い基質を用いてその分解活性を測定すると，ラットおよびマウスの肝細胞膜には同程度の活性が認められたが，腎臓膜に部分的な活性が観察された以外では，脳や赤血球膜にはほとんどその活性が検出されなかった。また興味深いことには，種々の肝癌細胞膜においてもその活性に見るべきものがなく，これらの知見は，本酵素が，肝臓の分化機能に関係している可能性を強く示唆している。この酵素の細胞内の機能については，膜蛋白質の代謝回転，細胞内外のマトリックス蛋白質の消化，分泌蛋白質の限定分解における修飾，エン
ドサイトーシスにおける関与など種々の可能性が考えられるが，その本態は不明である。現在，
この酵素のモノクローナル抗体の作製等を試みており，今後，この新しい膜結合型トリブクー

11．肝細胞の培養維持に関係した膜結合型トリプシン様エンドプロテアーゼ

ゼの構造とその活性発現の機序および生物学的機能について検討してゆきたいと考えている。

Biochem．．92，1985−1994．1982．
3）Asami，0．，Nakamura，T．，Mura，T．andIchih−ara，A．：J．Biochem．，95，299−309，1984．

文

献1）Ichihara．A．，Nakamura，T．and Tanaka，K．：
Mol．Cell．Biochem．．43，145−160，1982．
2）Horiuti，Y．．Nakamura，T．andIchihara，A．：J．

4）Nakamura，T．，Asami，0．，Tanaka．K．andIch−ihara，A．：Exp．CellRes．155，81−91，1984．
5）Tanaka，K．．Nakamura．T．andIchihara，A．
（SubmittedforPublication）

79

12．培養マクロファージにおけるE−64誘導体の取り込みに関する研究

勝 沼 信 彦＊研究協力者 木 南 英 紀＊ 塚 原 俊 文＊は じめに
EST（E−64，d）は強力なチオールプロテアー
ゼインヒビターであり，EST投与の標的酵素の一つはリソゾームのチオール性カテプシン群である。最近我々は筋ジストロフィーハムスタ
ーを用いた実験で，ジストロフィー筋でみられる著明なカテプシンB＆L活性の上昇は，外より筋細胞内に浸潤してきたマクロファージに由来することを免疫組織学的手法で明らかにした1）。したがって，ESTのマクロファージへの取り込みと，それに続くリソゾームのカテプシン活性の抑制を調べることはESTの薬効を知るための重要な基礎的データを与えると思われる。今回はラットの腹腔マクロファージを培養系に移し，E−64−CおよびESTの細胞内への取り込みを対比しながら検討した。
材料と方法
生理食塩水に溶解させた6％のカゼイネイ
ト15mlを腹腔内注射し4日後に腹腔洗浄でマ
クロファージを集めた。径60mmのファルコ

ンシャーレを用い10％子牛血清を含むRPMI
1640培地で培養した。シャーレ1枚当りの細胞数は3〜4×106とした。2時間後に吸着しない細胞を除き，さらに同じ培地で一夜培養
後，E−64誘導体の取り込み実験では無血清のRPMI培地に換え，各種E−64誘導体を加え，それらの効果をみた。細胞内タンパク分解に対するE−64誘導体の効果をみる時には，一晩の培養による細胞のspreadingの完了後，10％
子牛血清を含む無ロイシンMEM培地に0．5PCiの〔UJ4C〕−ロイシン／dishを加えたものに
換えタンパクをラベルした。24時間後，細胞をPBSで2回洗浄後，血清および10mMのロイシンを含むMEM培地に換えchaseを行った。
インヒビターはchaseの期間に加え，効果を判定した。すべての実験は3回の培養実験の平均である。Chaseの後，培地および細胞に100mMロイシンを含む10％TCAを加え，上活はそのまま放射活性を測定し，沈澱は10mMのロイシンを含む5％TCAで2回洗浄後，NCSに溶解し，放射活性を測定した。内在性タンパ
ク分解はTCA可溶性画分の放射活性（培地＋細胞）
全放射活性（TCA可溶性画分＋細胞のTCA沈澱画分の放射活性）×100で表現した。カテプシンB＆L活性はZ−Phe−Arg−MCAを基質として測定した2）。
結果

1．E−64誘導体のマクロファージカテプシンB＆L
活性に及ぼす影響
マクロファージがシャーレにspreadした後無血活培地に換え，各種プロテアーゼインヒビ
ターを加え2時間培養した。細胞をharvest
L，トリトンⅩ−100の抽出液の遠心上宿を用■ 徳島大学医学部附属酵素研究施設酵素化学部門

いてカテプシンB＆L活性を測定した結果が81

Ⅲ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究

表1に示されている。E−64（L），E−64−a，E−64，

表1

各種プロテアーゼインヒビターのマクロファージ・カテプシンB＆L活性に及ぼす影響

Cいずれも50〟g／mlでほぼ同じ阻害がみられ

〃g／ml

％

None

100

DMSO（1％，Ⅴ／v）

98．1

Antipaln

05Leupeptln
E−64（L）

0
5

E−64−a0502E−64−C●04
2E−64−C，0．2FLg／mlのESTは約2時間ではぼ
完全にプロテアーゼ活性を阻害している。つまり，E−64−CとESTでは無血清培地中でその効
果に約100倍の差がみられる。しかし，ESTは脂溶性であり，細胞膜に吸若しやすいことは容易に想像される。そこで培養外液にESTを加え，2分後に細胞をharvestL，4回PBSで洗浄後，カテプシン活性を測定し，吸着の程度を調べた。2分という時間は細胞膜に吸着ないしは一部はエンドサイトースされていてもリ
ソゾームまでは達していないと思われる時間でInhibit。rS Concentrations慧霊冒1

0
5

た。ロイペプチン，アンチパインのマクロファ
ージのカブテシン活性の阻害が弱いことはその後数回の実験でも確かめている。注目すべきは
ESTが非常に微量でカテプシン活性の阻害がみられることである。より詳しく調べるため，
外液のE−64−CとESTの濃度をいろいろ変え，
培養2時間後の細胞のカテプシン活性が図1に示されている。E−64−Cのカテプシン活性の阻害の1／2濃度は101Lg／ml，ESTの場合は約0．2FLg／mlであった。E−64−CおよびESTともにtime−dependentなカテプシン活性の阻害がみられるが，図2に示すごとく，2恥g／mlの

EST■

79．0
86．3
12．8
11．4
20．5
12．4
3．0

24時間の培養による細胞の定着後，無血清培
地に置代え．各種インヒビターを加え2時間培養した。細胞を剥推し，抽出液遠心上清のカテプシン活性を測定した。
■終濃度1％のDMSOを含む。
2．ESTのタンパク質分解の抑制
次にマクロファージの内在性タンパク質の分解に及ぼすESTの効果を検討した。リソゾー
ムの細胞内タンパク質分解への関与の程度は細胞外環境によって著しく影響される。本実験では10％の血清存在下で，24時間14C一ロイシンでラベルしており，半減期の長いタンパク質の分解を細胞がひどいタンパク異化状態にはなく．

ある。予想通り，ESTは2分間の細胞との接触

むしろ同化状態に近い状態でみていると考えらで活性を阻害しているのに対し，E−64−Cはれる。図4はタンパク分解のキネテックスを示

100〟g／mlでも全く阻害は認められない（図3）。すなわち，今まで測定してきたESTのカ性は細胞内のものと培地のものの合計である

テプシンの阻害は少し過剰に見積られているこが，細胞内のTCA可溶性放射活性はどの時点とになる。ESTが細胞内に，しかも実際にリソでも低値で一定であった。したがってTCA可ゾームへ取り込まれているかは今回の実験では溶性の分解産物は培地に蓄積され続けていたことになる。今回の実験では24時間でのタンパ

わからない。ロイシン骨格を標識したESTのしている。この表現ではTCA可溶性の放射活

時間のオーダーでゆっくりしたものであるこ

ク分解の程度は約41％であった。しかし，これは実験によって時に大きく変化することがあと，およびESTの取り込みは温度に感受性がる。図5はESTの細胞内タンパク分解の抑制あり，カテプシン活性の阻害を指標に調べるとを示している。その阻害は濃度依存的であり，37℃に比べ20℃の培養では著しくESTの取り込みが減少する。このことはESTの細胞内10FLg／mlのESTで28．7％の阻害が認められた。ESTの濃度を増やすとまだ徐々に阻害はへの取り込みはpermeationというよりもpin−大きくなる。同時に行ったE−64−ClOQpg／ml

ocytoticなものであることを示唆している。勿論直接的な証明はない。

を外液に加えた実験では24．8％の阻害がみら

細胞内への取り込みは数分のオーダーではなく

82

れ，2q〝g／mlでは阻害効果は極めて弱い。すな12．培養マクロファージにおけるE−64誘導体の取り込みに関する研究

0

20

40

60

80

100

0．2

1
EST（FLg／ml）

E・64・C（〃g／ml）

図1

0．5

マクロファージカテプシンB＆L活性のE−64−CおよびESTによる阻害
24時間の培養による細胞の走着後，無血清培地に置代え，図に示す濃度の E−64誘導体を外液に加え2時間培養した。細胞を剥離し，抽出液遠心上清のカテプシンB＆L
活性を測定した。

5

EST（FLg／ml）
0．5

1

50

Time（h）

E−64−C（FLg／ml）

図2

E−64−CおよびESTによるマクロファージ
カテプシンB＆L活性の阻害の時間経過
実験方法は図1と同じであり，無血清培地に置換後．E−64−C（20FLg／ml）あるいはEST（0．2〃g／ml）を加え，0．5，1および2時間後に細胞を剥離し，カテプシン活性を測定した。

図3

2分間E−64誘導休とのインキュベーションによるマクロファージカテプシン活性の変化
無血清培地に置換後，指示されている濃度のE−64−C（●）あるいはEST（○）と2分間接触させる。直ちにPBSで4【司細胞を洗浄した
後，細胞を剥離し，カテプシン活性を測定した。
83

Ⅲ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究︵㌔︶と用言Ug⁝P巴ヱqコl︒SqU↑
4

8

12

16

20

24

Time（h）

図4

マクロファージにおける細胞内タンパク質分解のキネテックス
TCA可溶性分解産物の蓄積の時間経過を示している。結果は3枚の培菱の平均値±標準偏差で示されている。

︵訳︶仁︒三qコul
5

EST（FLg／ml）

図5

ESTによるマクロファージ内のタンパク質分解の阻害
あらかじめ標識された細胞のタンパク質が指示された濃度のESTの存在下で24時間に分解される量を測定した。阻害はEST非存在下で観察される分解の％で表現さ
れている。

84

12．培養マクロファージにおけるE−64誘導体の取り込みに関する研究

0．1

0．2
EST（FLg／ml）

5

E・64・C（〃g／ml）

図6

血清を含む培地におけるE−64誘導体のマクロファージカテプシンB＆L活性の阻害
図5と同じ実験条件であり，10％の子牛血清を含む培地に指示されている濃度のE−64−C（○）あるいはEST（●）を加え．24時間培養した。細胞を剥離し，カテプ
シン活性を測定した。

わち，タンパク質のターンオーバーに及ぼす影響ではESTはE−64−Cの10倍あるいはそれ以上の効果をもつと思われる。無血活培地でのカ
テプシンの阻害をみた場合ESTはE−64−Cの100倍の作用があったので，血清存在下ではどうかを調べたのが図6である。実験条件は図5と同じである。血清存在下ではE−64誘導体の細胞内のカテプシン阻害効果は著しく低下しており，しかもESTとE−64−Cの効果の差はおよそ20倍であった。
考察と考えられた。ESTはE−64−Cよりも試験管内でのカテプシンの阻害活性はずっと弱いので，ESTは細胞内に取り込まれてE−64−Cに変換されていると想定される。細胞内に取り込まれたEST（実際にはE−64−Cになっている）がリ
ソゾームへ入るかどうかはアイソトープを用いた実験の結果を得たねばならない。また，どの程度遊離の状態で細胞質にあるかどうかを知ることも取り込みの機構を考える上で重要である。〔3H〕−E−64（DL）を動物に投与した実験で，我々は極めて迅速に血中→細胞質→リソゾ
ームへと放射活性が推移していくことを肝臓で

ESTはE−64，Cのエステル体で細胞内への取り込み，特に腸管での吸収を良くするために観察した3）。リソゾームではタンパク結合分画開発されたものである。しかし，実際にESTとE−64−Cが細胞内への取り込みにどの程度差があるのかデータがなかったので今回の実験を行った。2つの指標，すなわち細胞内カテプシ
ンB＆L活性の阻害および細胞内タンパク分解の抑制で調べた限り，ESTはE−64−Cの10〜20倍マクロファージには取り込まれやすい

その大部分は分子量30，000前後のカテプシンに結合していることを明らかにしている。マクに放射活性が入ること，さらにその後の検討でロファージの場合も同様であるかどうかの憶測はできない。ESTのマクロファージタンパク質の代謝回転への効果とカテプシン活性の阻害に必要な濃度に大きな差がみられるのは細胞内に取り込まれたESTの大部分がリソゾーム中85

Ⅲ 酵素・細胞・組織レベルにおける研究にないことによるのかも知れない。リソゾーム

通って初めてE−64−Cに変換するものが薬剤と分画中のカテプシン活性を測定すれば，このギ
ャップは近づくことも考えられる。ESTのカ

回の結果は示唆している。

テプシン活性の阻害が血清存在下と非存在下で著しい差がみられる。これには2つの可能性が考えられる。1つはESTが血清に吸着すること，もう1つはESTが血清のエステラーゼによって速やかにE−64−Cに変換されるという可能性である。ジストロフィー症の羅患筋に効率よくE−64誘導休を取り込ませるためには，腸管を通ってもなおエステル体であり，筋細胞を86してはより優れたE−64誘導体であることを今

文献1）Kominami，E．，Bando，Y．，Ii，K．，Hizawa，K．，
andKatunuma，N．：J．Biochemり96，184ト1848，
1984．

2）Barrett，A．J．，and Kirschke，H．：Methods
Enzymol．80，535−561．1981．
3）Hashida，S．，Kominami，E．andKatunuma．N．：
J．Biochem．91，1373−1380，1982．

Ⅲ 個体レベルにおける研究

13．筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）の骨格筋に対する
ESTでの治療効果−lH−NMRによる観察（第2報）・…………………‥宮武riE

14．筋ジストロフィー動物の尿中アミノ酸排泄に及ぼすESTの効果

寺尾 寿夫
15．ハムスター筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究
一一一一心筋の中性Ca2＋プロテアーゼ（CANP）とその内在性阻害因子の検討ならびにESTによる治療実験−…………………柴田宣彦

16．筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）におけるESTの薬効大関 正弘
17．ラット，マウス，ハムスターにおけるESTの薬物代謝酵素系およびグルタチオン関連酵素系に及ぼす影響

北川 晴雄

18．筋ジストロフィーマウス（C57BL／10Tmdx）における生化学的検討………大関
19．実験的クロロキンミオパチ一におけるESTの効果

正弘

杉田 秀夫

20．体外受精法による筋ジストロフィーマウス（C57BL／6−dy／dy）の作出・・…・野村 達次

13．筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）の骨格筋に対するESTでの治療効果−lHTNMRによる観察（第2報）
宮 武

正■

研究協力者 桑 原 武 夫■ 湯 浅 龍 彦＊

は じめに
核磁気共鳴（NMR）法では従来の組織生化学的手法と異なり，非侵襲的に目的臓器の組織固有の機能および生化学的特性を知ることが可能である。このことにより，同一個体に生じた生
化学的変化を経時的に観察することが出来るよ
うになった。
我々はこの方法を用い，ESTの筋ジストロ
フィー症（DMP）骨格筋に及ぼす効果の観察を
DMPハムスター（UM−Ⅹ7．1）を用いて行ってきた。
著者らは昨年度DMPハムスターでのESTの4週間投与の効果を報告した1）が，当時観察期間が短期間でもあり，EST投与・非投与両群間に統計的に有意の差を認めなかった（図る。すなわち，生後5ないし6週齢（コントロール：n＝9，DMP己EST：n＝5，DMP言EST：n＝5），11ないし12週齢（コントロール：n＝7，

DMP己EST：n＝10，DMP言EST：n＝10），24
週齢（コントロール：n＝11，DMPeEST：n＝7，DMP言EST：n＝9）であり，DMP群ではさらに31週齢（eEST：n＝9，言EST：n＝10），コントロール群では40週齢（n＝5）であった。
装置は前回と同様89mmの口径を持っsur−
face coil方式のNMR spectrometer（磁場強度6．4Tesla）で，Surfacecoilはハムスターの下腿屈側に接触させた。
Proton T1時間の測定はsaturation recov−
ery法を用い，Tauを0．3，0．5，0．7，1．0，1．3，
1．7，2．1，2．9，4．1，10．1秒と変化させて10個のfreeinductiondecay（FID）を得，各々の水
ProtonのFIDのpeakintensityの減衰曲線

1）。

今回は例数を追加し，さらに期間を延長してより非線型最少二乗法により計算を行い緩和時間を求めた。

観察を行った。
対象と方法

結

果

対象はDMPハムスター（UM−Ⅹ7．1）と正Microcapillaryに封入したTetramethylsi−

常コントロールハムスターであり，DMPハムス

1an（TMS）からsurfacecoilまでの距離を1mmと3mmとに変化させ設定した筋肉モデ

ターは，さらに生後4週齢よりEST O．0375％を基本飼料に混入投与した群と，ESTを混入しない飼料を投与した群に分けた。観察個体数
は経過観察中の死亡例を随時補完したため各測定時毎に変動があるが以下に示すごとくであル（図2）で測定したFIDを図3−a，bに示す。距離1mmではTMSのFIDは減衰の途中で逆転し（図3−a），一方距離3mmでは減衰が認められなかった。
DMPとコントロールのlH−NMR spectrum■ 新潟大学脳研究所神経内科

両者間に顕著な相違を認めなかった（図4）。
89

Ⅲ

個体レベルにおける研究

NO TREATMENT EST TREATED
N＝9（0．0375％p．0．）
N＝8

7・8

12・13

7−812・13weeks
afterbirth
4・5

9・10weeksof treatment

図1ChangesofprotonTltimefromhind・legmuscleofESTadministrated（left）and
non−administrated（right）dystrophichamster．Those from7WeeksTOldTnOrmal
COntrOlareshownin between．

二〇U qUdtnS

図2 Tetramethylsilan（TMS）isenclosedina
Small caliber tube and wrapped withmuscle．DistancebetweenthesurfacecoilandTMSisadjustedtol mmand3mm．

90

EST投与経過のProtonTl時間の推移を図5に示す。DMPはEST投与（opencircle），非投与（closedcircle）双方とも5過齢から10過齢にかけて緩和時間が延長する傾向が認められ，その後両者とも短縮してきた。
他方，コントロール群（closedsquare）では加齢により延長せずむしろ短縮してくることが認められた。
DMP群ではコントロール群に比し5遇齢以降でprotonTl時間が延長することが認められた（p＜0．01）。
DMP群中EST投与群では15過齢まで非投13．筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7．1）の骨格筋に対するESTでの治療効果lH−NMRによる観察（第2報）

10

5

0

−5

10

5

0

−5

（b）

（a）

図31H−NMRspectraobtainedbychangingtaufromO．ltolO．lsecond・Distance
betweenthesurfacecoilandTMSislmmin（a）and3mmin（b）．

5

0

−5

（a）

5

0

−5

（b）

図41H−NMRspectraobtainedfromahind−1egofanormal（a）anddystrophic（b）
hamstermuscleobtainedat269．70MHzusingsurfacecoil．

与群とに差は認められないが，これ以降はEST投与群では非投与群に比し短縮傾向が認められた（p＜0．05）。
考案

Surface coilを用いてのin vivo NMR spe−
ctroscopyの欠点としてNMRsignalを得る部
位の同定の困難さがとりあげられるが2），図3−

aで認められるFIDの逆点はTMSがsurface
coilに近すぎるためか，パルス巾が広すぎるため認められる現象であり，図3−bで減衰が認められない点はパルス巾が狭すぎるためか，またコイルからの距離が遠すぎるために起こる現象であると説明されている3）。本実験ではパルス巾を2〃SeC と固定しているためコイルから
l〜3mmの隠 すなわちGastrocunemius91

Ⅲ 個体レベルにおける研究

00
5．0麗＼qE叫二トu︒盲hd

0
0
0
1

＊：p＜0．05＊＊：p＜0．01

5

図5

10

15

25

30

35

40weeks

Chronologicalchangesofproton−Tltimeinthehamstermuscles．

muscleの緩和時間の測定が行われていると考えられる。
本報告で検討の指標としているProtonTl時
間は組織中の自由水の多寡のみならず，細胞成分のCOnformationalchangeに大きく影響を受けるとされており4），異常組織では組織内外の浸出液，浮腫の他細胞の変性等があり，そのため緩和時間の変化が認められるとされている。また，正常の骨格筋の成熟に伴い緩和時間
がexponentialに短縮してくることも知られている5・6）。
本報告ではDMP筋のProtonTl時間が5週
齢以降では全て正常コントロールに比較して延長しており，11ないし12週齢までは延長する
傾向が，そしてその後に短縮してくる傾向を認めた。これはDMPハムスターの骨格筋組織で埜中ら7）が述べているごとく，2〜4週齢以降
より壊死・再生が活発に行われているという事
実と開通している可能性が考えられた。また，
Proton Tl時間で見る限りDMP筋もある時期までは正常に発育していると言い得，その後のProton Tl時間がコントロールより延長することの意味付けとしては，本実験では脂肪のピー
クと水のピークとは別々に緩和時間を計算しているため，単に脂肪浸潤によるものでなく筋線
92

20

経の変性や再生筋線経の増加あるいはそれらの総体を考慮に入れる必要があると思われる。
EST投与群でのProtonTl時間は投与群と非投与群は15週齢までは同様の変化を認める
が15過齢以降はEST投与群ではProtonTl
時間が短縮し，正常コントロール群のProton
Tl時間の値に近づくがこれはProtonTl時間の推移から見ると正常コントロールの経過に近づいたと言い得る。この事実はESTがDMP
骨格筋の自然経過に何らかの影響を及ぼしていると言い得ると思われる。
しかしながら，骨格筋の変性・再生そして成熟の総体がProtonTl時間として描出されているということを考えると，ESTが最終的にef−
fectiveであると言い得るか否かは寿命の延長等を含めた総合的判断が必要と思われる。
文献1）桑原武夫．湯浅龍彦，宮武 正：筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7．1）の骨格筋に対するESTでの治塘
効果，厚生省新薬開発事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58
年度研究報告書，145−148，1983．
2）湯浅龍彦，吉武 正，桑原武夫，梅田稚宏，江口
恵二：31P核磁気共鳴法による生きたラットの脳における高エネルギーリン酸化合物（ATP，クレア13．筋ジスハムスター（UM−X7．1）の骨格筋に対するESTでの治療効果IH−NMRによる観察（第2報）

チンリン酸）の測定−ハロセン麻酔と低酸素状態の影響−，脳神経，35（11），1089−1095，1983．
3）梅田雅弘，江口恵二，小川秀次郎，湯浅龍彦，桑原武夫：部分測定のためのコイル形状とその特性の研究，第22回NMR討論会，259−261，1983．
4）Hazlewood，C．F．，Chang．D．C．，NichoIs．B．L．
and Woessner，D．E．：Nuclear magnetic reson−
ancetransverserelaxationtimesofwaterprotons

1974．

5）湯浅龍彦，桑原武夫，宮武 正：核磁気共鳴法による骨格筋の発達に関する研究，NMR医学，2（1），49−54，1982．

6）桑原武夫，湯浅龍彦，宮武 正：核磁気共唱法による筋ジストロフィー症の研究「筋ジストロフィー症の発生械序に関する臨床的研究」三好軌昭和
57年度研究報告書，214−217，1983．

in skeletal muscle，Biophys．J．，14，583，606，93

14．筋ジストロフィー動物の尿中アミノ酸排泄に及ぼすESTの効果

寺 尾 寿 夫＊
研究協力者 高 津 成 美事 平 口 峰 子＊目動物および方法

的

骨格筋が崩壊や再生をする場合，筋肉内の遊離アミノ酸プールに大きな変化が起こり，これが尿中に排泄されるアミノ酸に反映される。筋mdxマウスは月令3ヶ月の雄性マウスを使用し，コントロールは雄のC57BL／6Jを用いの崩壊の指標となるアミノ酸としてもっとも重た。餌はマウス用飼料と水を自由に与えた。採尿は採尿用特殊ケージを用いて，少なくとも2要なものは3−methylhistidine（以下3−MH）

度，24時間尿を蓄尿した。ESTは同じ飼料にでありト3），またある程度これを示するものに0．375％含むものを食べさせた。

taurineがある。これらは大部分が筋肉に含まれているということのほかに，とくに3−MH

3ヶ月のゴールデン人ムスターを用い，これには骨格筋中のactinと白筋のheavy chain中

毎日体重1kg当り25mgのクロロキン（20mgのmyosinのヒスチジン残基がメチル化される／ml生食に溶かしたもの）を腹腔内に注射しことによって作られ，再利用されたり代謝された。この場合の採尿は注射開始後，1，3，5週にたりすることなく，そのまま尿中に排泄されることが知られているからである。

行なった。

クロロキンミオパチーの研究には，生後2〜

筋肉中遊離アミノ酸はmdxマウスまたはゴールデンハムスターをsacrifice後，Quad−

我々は一昨年，筋ジストロフィーハムスターであるBIO14．6の尿中3−MHの排泄がコン

riceps，EDL，Gastrocnemius，Soleusなどを取トロールハムスターBIO FIBの与れより多く，り出し，直ちに0．4M過塩素酸を加えてhom0−

前者では筋の崩壊が進んでいることを示した。

genizeL，その上活につき，アミノ酸自動分析

またESTの投与により3−MHの排泄が有意に機を用いて測定した。

減少し筋の変性崩壊が阻止されることを報告しだ）。今回の研究の目的の第1は，近年ジストロ

尿中遊誰アミノ酸も尿を除蛋白後，同様に測定した。また尿中のクレアチニンについては，

フィーマウスとして注目されているmdxマウ

ヤトロンのキットを用いて測定を行なった。

スについて，これと同じ現琴があるか否かを調べることである。第2は，実験的ミオパチーとして知られるクロロキンミオパチ一につき，筋の変化とESTの効果を尿中3−MHなどを指標として研究することである。

結果

Ⅰ．mdxマウス
1．mdxマウスの尿中遊離アミノ酸
図1は尿中に排泄される遊離アミノ酸をmdxマウスとコントロールマウスにつき比較● 帝京大学第一内科

したものである。これにみる様に，3−MHや95

Ⅲ 個体レベルにおける研究

Ou某lq巴uu一モ∽a−○∈亀

図1Urinaryfreeaminoacidlevelsofdystrophicmouse（mdx）

dystrophicrnouse（mdx）

＊

図2

96

TheeffectofESTonurinaryfreeaminoacidlevels

P＜0．025

14．筋ジストロフィー動物の尿中アミノ酸排泄に及ぼすESTの効果＊

図3

P＜0．025＊＊P＜0．05

FreeaminoacidlevelsinQuadricepsofdystrophicmouse（mdx）

taurineのみならず，その他の各遊離アミノ酸

Ⅱ．クロ目口キンミオパチーのクレアチニン当りの排泄量は両者に有意の差がみられなかった。

1．クロ田キンによる尿中遊離アミノ酸排泄の変化

2．mdxマウスの尿中遊離アミノ酸排泄に及ぼす
ESTの影響kg連日腹腔内注射後の尿中遊離アミノ酸の排図2はmdxマウスに0．375％のESTを含む
飼料を2ヶ月間与え，尿中に排泄される遊誰アで比較したものが図4である。注射後第1週では多くのアミノ酸に減少傾向がみられたが，3−ミノ酸を，ESTを与えなかった場合と比較しMHは増加を示していた。第3週では3−MHたものである。EST投与後はlysine，Ornithineの増加が続きさらにtaurineも排泄増加を示し，その他valine，arginineも上昇していた。

の排泄増加と1−methylhistidineの減少がみられたが，3−MH，taurineを含むその他のアミノ酸には変化がみられなかった。
3．mdxマウスの骨格筋中の遊離アミノ酸

ゴールデンハムスターにクロロキン25mg／

泄の変化を，注射前，1週間注射後，3週間注射後

2．クロロキンミオパテー動物の尿中アミノ酸排泄に及ぼすESTの効果
次にESTを含まない通常の餌で飼育しなが図3はQuadriceps中の遊離アミノ酸濃度をらクロロキンを注射したハムスターとESTを

mdxマウスとC57BL／6Jにつき比較したもの

0．375％含む餌を与えながらクロロキンを注射である。mdxマウスではtaurineの有意の増したハムスターにつき，尿中に排泄される遊離加とglycine，alanineの有意の減少がみられアミノ酸を比較した。いずれもクロロキン注射た。この様な変化は，Gastrocnemiusなどの他

期間は3週間である。図5はその結果を示したの骨格筋でもみられた。なおmdxマウスの骨格筋にみられるこれらのアミノ酸の異常は，ジMHが有意に減少し，筋の変性崩壊が阻止されものである。EST投与群ではtaurineと3−ストロフィーハムスターBIO14．6の骨格筋のたことを示している。またthreonine，gluta−

アミノ酸の変化とよく似ていた4）。

mine，β−alanineなども有意に減少するが，これらはゴールデンハムスターにESTのみを投97

Ⅲ 個体レベルにおける研究
hanster（Golden）
Chloroquine25rng／kg／dayi．p，irtjection

0Uで焉巴U u∈＼sO一〇∈ミ

図4

Changesofurinaryfreeaminoacidexcretionafterchloroquineadministration
hamster（Gorden）
Chloroquine25mg／kg／dayi．p．irtjection3weeks

＊

図5

98

P＜0．025＊＊

P＜0．05

TheeffectofchloroquineonurinaryfreeaminoacidexcretionWITHandWITHOUTEST

14．筋ジストロフィー動物の尿中アミノ酸排泄に及ぼすESTの効果

hamster（Gorden）

Chl0rOqUine25mg／kg／dayi．p．呵ection5weeks＊P＜0．025

図6＊＊

P＜0．05

ChangesoffreeaminoacidlevelsinQuadricepsafterchloroquineadministration

与した際にもみられる変化である。

の場合と異なり，mdxマウスの尿中に3−MH．

3．クロロキンによる骨格筋中遊離アミノ酸の変化

taurineなどの排泄増加は認められなかった。

図6はクロロキン投与後5週目のゴールデン

またESTによる3−MHの排泄抑制もみられな

ハムスターのQuadriceps中の遊離アミノ酸をいなど予想に反する結果が得られた。この理由

末処置のハムスターのそれと比較したものであは明らかでないが，mdxマウスでは生後2〜る。クロロキン投与群ではtaurine，glutamic

3週から2ヶ月位の問に筋の崩壊と再生が強く

acid，glutamineの増加とglycineなどの減少起こり，その後はかなり安定した状態になってがみられた。また筋肉中に多く含まれているいるといわれる。我々の使用したmdxマウス

CarnOSineは有意の変化を示さなかった。なおは3ヶ月のもので，既に安定した状態にあるとこれらの変化は他の骨格筋でもみられたが，こ思われ，2ヶ月以前の若いmdxマウスに関する測定が必要と考えられる。

れらの筋のH−E染色標本では変化がみられず，遊離アミノ酸は光顕的に異常のみられない投与
初期から既に変化がみられることが明らかにな
った。
考

案

第2はクロロキンミオパチ一に関する結果についてである。抗マラリア剤が筋の壊死と
massive taurinuriaを起こすことは1962年
Bowdenら5）により報告されているが，最近では，佐野，杉田らにより，これがrimmed

第1に，筋ジストロフィーマウスに関する研VaCuOleを伴うdistalmyopathyと似た筋病

究では，ジストロフィーハムスターBIO14．6

変を示すこと，またこれがESTにより劇的に
99

Ⅲ 個体レベルにおける研究阻止される事が組織学的に示されている。我々の知見は，尿中の3−MHやtaurineを指標とした場合，まだ組織学的に筋病変がとらえられる様になる前に，既に筋の崩壊が始まっており，またこれがESTにより顕著に阻止されることを示している。
結

語

文

献

1）．Ballard，F．J．andTomas，F．M．：3−Methylhis−
tidine asa measure ofskeletalmuscle protein
breakdownin humansubjects，thecaseforits
continueduse．．Clin．Sci．，65，209，1983．
2）Elia，M．，Caster，A．，Bacon，S．，Wimearls，C．G・
andSmith，R．：Clinicalusefulnessofurinary3−
methylhistidineexcretioninindicatingmuscle

1．月令3ヶ月のmdxマウスではコントロー
ルマウスC57BL／6Jに比べて，尿中に3−MHの排泄増加はみられなかった。
2．mdxマウスを0．375％のEST加飼料で飼育しても，尿中遊離アミノ酸の排泄の変化はみられなかった。
3．ゴールデンハムスターにクロロキンを25mg／kg注射すると，初期より3−MH，taurineなどの尿中排泄増加がみられた。
4．これらの排泄増加はEST投与により抑制された。
5．クロロキン注射ハムスターの骨格筋中遊離
アミノ酸も注射開始初期より変化を示した。

100

proteinbreakdown．．Brit．Med．J．，282，351，1981・

3）寺尾寿夫，増野和子，大沢仲昭：筋移植の再生な
らびにアミノ酸代謝に対するE−64の効果，厚生省
新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来
する難病治墳薬（E−64）の開発研究」昭和57年度
研究報告，201，1983．
4）寺尾寿夫，増野和子，大沢仲昭：ジストロフィー
ハムスターと正常ハムスターの筋の交換移植についての研究，厚生省神経疾患研究「筋の発生と分化に関する基礎研究」昭和57年度研究報告，9，
1983．
5）Bowden，D．H．andGoyer，R．A．：Drug−induced
musclenecrosiswithmassivetaurinuria，Arch．
Path．．74，137，1962．

15．ハムスター筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究一心筋の中性Ca2＋プロテアーゼ（CANP）とその内在性阻害因子の検討ならびにESTによる治療実験−
柴 田 宣 彦■研究協力者 和 田目

的

58年度の成績において，Ca2＋依存性プロテアーゼ阻害剤の投与が，筋症ハムスターの生存日数に延命的に働く傾向のあることが知られたので59年度には動物数を増し，延命効果の確認を行うことを目的とした。他方，前年度にひき続き，EST連続投与が子孫にどのような影響を及ぼすかも累代数を重ねて検討することにした。
生化学的には，本症心筋症の進展械序に関し，（1）本症心筋の小胞体はATP−Mg2＋依存性
Ca2＋取込み能が健常心筋のものの約蟻であり，したがって心筋細胞内でのCa2＋の増大が推測される，（2）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図（PAGE）上ミオシン垂鎖（My・H）を主とする構造蛋白の融解がみられ，これが健常心筋からの筋原繊維とCa2＋・プロテアーゼ（CANP）
を5mM CaC12存在下で照置した後のPAGE像と類似する，（3）心筋症心筋では内在性のCANP阻害因子活性が健常心筋のものに比し低い，ことなどを58年度までに報告した。これらの事から，本症心筋症の発症進展に心筋／ト胞体の性状変化のみならず内在性CANP阻害因
子の変化の重要性が示唆されたので，59年度は本因子につき更めて追究した。

■ 大阪府立成人病センター第一内科＝ 大阪府立成人病センター病理

昭＝

実験方法
A．EST投与実験（1）生存日数に与える影響を知る実験
遺伝性特発性に筋症を発生するゴールドハム
スターの同腹仔を二群に分け，一方には，EST
混入固形試料の経口投与を行い，他方には，対照群とし普通の固形試料の投与を行った。ESTの濃度は100mg／kg体重／日で，実験群は40匹，対照群は39匹でスタートした。各群共動物の生存日数より，生存曲線をっくり両群を比較した。
（2）累世代連続投与実験
兄妹交配による妊娠ハムスターを二分し，妊娠10日日頃より一群にはEST混餌食，他群には普通食を与え，世代を重ねても投与群の子孫にはESTを，非投与群の子孫には普通食を，
妊娠時を含めて投与し続けた。投与量は100mg／kg体重／日および30mg／kg休重／日の二方法とした。各世代とも両群の動物は生後約150日で屠殺し，心臓の半分は組織内Caの定量に，残り半分は組織学的検索に供した。
組織学的には，石灰沈着の程度を0，1，2，3度とし，各々に0から3までのスコアを与え，動物数で割った平均値をもって各々の群の石灰沈着度とした。妊娠歴のある雌ハムスターはすべて検索対象から除外した。動物数は，100mg／kg
体重／日144匹，30mg／kg体重／日124匹で対照群120匹であった。

101

Ⅲ 個体レベルにおける研究
heart muscles＋10vol．of

4mM EDTA
2mM DTT
50mM NaC15mM THB（pH7．4）

ste。②ceniif。ge27×1。。×g，。。min．

l
step③ sup．（pH adjust to7．5）

lstep④ dialysis againstl

0．1mM EDTA
2mM DTTlOmM NaC15mM THB（pH7．4）

step⑤ DEAE52SephacelColumn chromatography（gradient，0．1−0．6M NaCl）〔CANP fraction〕〔inhibitor fraction〕

N

⑥

p
e
t
S

J

fraction（25−70％）Jsame as theleft

0．1mM EDTA
2mM DTT
50mM NaC15mM THB（pH7．4）

step⑧ Ultrbgel AcA34gel filtration
step（9l

DEAE52Sephacel Column chromatography（gradient，0．1−0．6M NaCl）
図1CANPおよびCANP阻害因子の抽出

B．心筋CANP阻害因子の検討（1）ハムスター心筋のCANPおよびCANP阻
害因子の抽出（図1）
健常および心筋症ハムスター，それぞれの心臓を80〜100個集め，心室筋のみを材料とし，前者で15g，後者で20gの湿重量で抽出を始め，
図1に従い調製。58年度報告のものと多少異なり，Step⑤DEAE イオン交換クロマトで
NaClO．30〜0．35M分画に阻害因子活性成分，
0．45〜0．50分画にCANP活性成分を分別採取した後，硫安処理（Step⑥），次いでゲルろ過（step（∋）と再度のDEAEイオン交換クロマト
102（step⑧）を行い調製した。こうして，阻害因子の調製過程での脱落を防ぐことを心掛けた。
（2）CANP活性とCANP阻害活性測定
測定方法はいずれも58年度報告に準ずる。
すなわち，CANP活性測定は変性カゼインを基質にCANP含有標品を加え，5mMCaC12添加
で反応を開始，30℃，60分解置後TCAで反応を止め遠心，上宿のOD280nmでの吸光度を測定（図2）。吸光度0．1を以って1単位とした。
阻害因子活性は，図1のstep⑤で得た
CANP活性成分をinhibitorの調製法に準じ図1のごとく精製を進め，SDS−PAGE上分子量

15．ハムスター筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究

2．4％Casein

100FL：2．4％Casein lOOFL
2Jj；β・ME
2／」
50FL：100mM EGTA 50FL

β・ME
lOOmM⊆竺旦1之0．5M THB

200〃：0．5M THB 200〝
くpH7．4〉くpH7．4〉

坐塾…H20H20

皇堕と800／J：

J

800〝

Preincubated30℃

5min．

Sample200fLl

1

30℃

60min．reaction

10％TCAl．Oml（Stop of reaction）
4℃t。min．Stan。ing（♪3，。。。×g5mi。．
ppt．

sup．

†
0．D．280absorbance
図2

150

CANP活性の測定方法

200

250

300

350days

図3 Survivalofexperimentalandcontrolanimals
約13万を主成分とするはぼ単一なバンドをも
つCANPを用い，これにCANP阻害因子標品を加え，変性カゼイン存在下に5mM CaCl2添

加で反応を始め，反応後のCANP活性を前述のごとく測定。CANP阻害因子無添加の値の50％抑制を以って1単位とした。
103

Ⅲ 個体レベルにおける研究〇・・．・．一OcontroI EST（−）

L＞・・・△100mg／kg／day EST（＋）…Å・、
ム・・●・・▼
ゝゝ ■ふ．．．‥．・、
ム

150

200

250

300

350days

図4 Survivalofexperimentalandcontrolanimals（male）

成績

A．EST投与実験（1）生存日数に与える影響を知る実験
EST投与群において対照群よりも長期間生存する傾向がうかがわれた（図3）。現在まだ実験が継続中であるが，この傾向は変らないことが予測される。生存日数を動物の雌雄別に分けてみると，今回の実験では雄の生存日数が対照
雄に比べて著しく延命しており，雌のそれは対104照雌との問に著差がみられなかった（図4，5）。

（2）累世代連続投与実験
今回は58年度成績にひき続き，F4からF6までの成績を検討したが前年度のFl→F3の成績と同じく心組織内石灰量には，100mg／kg体
重／日，30mg／kg体重／日，普通食の三群において認むべき差が存在しなかった（図6）。また，体重増加出産匹数なども三群で差がみられなかった。

15．ハムスター筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究
CaくFLg／gtissue〉⊂コcontroI EST（−）
E∃30mg／kg／day EST（＋）
EZZZl100mg／kg／day EST（＋）
トー→S．E．

l

l

l

l

FI F2

F3

図6

F4

F5

F6

generation

Calciumcontentintheheart

ーChow，30mg／kg／day＆ 100mg／kg／day，Fl→F6−−

B．心筋CANP阻害因子の検討（1）心筋CANP，CANP阻害因子の調製
方法図1でのべたごとく，58年度報告で心筋症ハムスター心筋ではCANP阻害因子の収量が健常ハムスターのものに較べて極度に少なかったので，この点を確かめるのが本年の目的であるため，出発材料を心筋症の場合20g，健常心の場合15gとし，CANP阻害因子とCANPの調製を行った。図7−Aは健常ハムスター心筋のCANP，CANP阻害因子調製step⑤の
DEAEイオン変換クロマト，図7−Bは心筋症
におけるものである。
両者同様の溶出パターンを示すが，低イオン
強度で溶出されるCANP阻害因子分画での活性が心筋症の場合極度に低いことが注目された（図7−B）。今回も58年度報告と同様，CANPには大きな変化を見ないがCANP阻害因子は心筋症で低下が示されたので，前回用いた調製
初期における連続2回のDEAEイオン交換ク
ロマト処理の代りに図1step⑤での活性分画を直ちに硫安処理し，ゲルろ過，再度のイオン交
換クロマトと調製過程を少なくし，各過程でのCANP，CANP阻害因子を検討した。

（2）心筋CANP，CANP阻害因子活性表1は図1−Step⑤，⑧，⑨各過程での心筋症（UM）および健常（HEL）心筋CANPの活性と収量の推移である。Step⑤から⑧で心筋症の場
合約5倍，健常心筋で約6倍比活性が増大し精製度が進んでいるが，Step⑧から⑨では比活性・はかえって減少し，精製度はstep⑧の過程に止まる。ともあれ，このレベルで，心筋症と健常心筋のCANP活性を較べると比活性は両者ほぼ同等で，得られた蛋白量は心筋症の場合20gから7．2mg，健常心の場合15gから3．9mgであった。もし出発心筋量を同一としても心筋症で同等の比活性をもつCANP量が健常のものよりも大であることを示す。
表2は同様の調製過程でのCANP阻害因子の活性推移をみたもので，健常心（HEL）の場
合，Step⑤，⑧，⑨の各過程で比活性は2．8〜
3．2u／mgとはぼ不変で，図1の方法では精製が難しいことが判る。ともあれ，この方法で心筋症（UM）のCANP阻害因子活性をみると，
step⑤で比活性が0．43u／mgと極端に低いことが注目され，58年度報告と同様の成績であった。
105

Ⅲ 個体レベルにおける研究l︵・⁝⁝一叫un︶uO三q⁝Jul旨言AコUddNくU

TI−三一U芸0・ 6

uMむ︸0己︶EuO式．白ロ
50

FractionNo．（6．Oml／Tube）

図7−AIst．DEAE52SephacelColumnchromatographyforisolationofm−CANP
andm−CANP−inhibitorfrommyocardiumofhealthyhamster．

lT・⁝・一叫uコ︶uO芸qコu−呂ことヱ一U帽dNくU

T1−喜一U芸06
・︵IuMヱOJd︶uuOのN．白ロ
50

FractionNo．（6．Oml／Tube）

図7−BIst．DEAE52SephacelColumnchromatographyforisolationofm−CANP
andm−CANP−inhibitorfrommyocardiumofdiseasedhamster．

106

15．ハムスター筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究
表1
U M −C A N P

p r o t ．C o n c ．
（m g ／m l）

v o l．
（m l ）

S p ．a C t ．
（u ／m g ）to ta l p ro t ．
（m g ）

to ta l a c tiv ity（u ）D E A E

2 ．77

8 ．
4

0 ．60

23 ．3

13 ．
98

u ltro g e l

0 ．3 14

2 3 ．
0

3 ．0 9

7 ．2

22 ．
25

D E A E

0 ．32 99 ．1

2 ．3 4

3 ．0

7 ．
0 2

p r o t．C o n c ．
（m g ／m l）

v o l．
（m l ）

S p ．a C t ．
（u ／m g ）to ta l p r o t．
（m g ）

to ta l a c tivi ty（u ）H E L TC A N P
D E A E

1 ．6 2

8 ．5

0 ．54

13 ．7

7 ．4 0u ltr o g e l

0 ．16 22 4 ．0

3 ．14

3 ．9

1 2 ．2 5

D E A E

0 ．2 0 4

8 ．1

2 ．79

1 ．7

4 ．7 4

Note：Oneunitofactivityisdefinedasachangein0．1absorbanceunitat280nm／1hour．

U M −inムib ．

p r o t．C o n c ．
（m g ／m l）

v o l．
（m l）

Sp ．a Ct ．
（u ／m g ）to ta l p r ot ．
（m g）

to ta l a c tiv
i ty
（u ）

0 ．
43

16 ．
9

7．
27

D EA E

2．
11

8．
0

u ltro g e l

0．
211

13．
0

2．
7

D EA E

0．
19 2

1．
2

0．
2

p r o t．C o n c ．
（m g ／m l）

v o l．
（m l）

S p ．a C t ．
（
u ／m g ）to t a l p r o t．
（m g）

H E L Tinh ib ．

to ta
l

a c tiv ity（u）

DE A E

1．
87

7．
6

2．
81

14 ．
2

39．
90

u ltr og e l

0．
107

38 ．
0

3．
18

4．
1

13．
04

D E A E

0．
300

6．
8

3．
20

2．
0

6．
40

Note：Oneunitofinhibitorisdefinedasthatamountofinhibitorwhichwillinl1ibittwo
unitsofcalcium−aCtivatedproteaseby50％underthestandardassay．

つまり，心筋症ハムスターの心筋では，
CANP活性は健常のものと差異をみないが，
CANP阻害因子に変化があり，その活性の極端な低下が認められた。
考察

EST投与実験の場合，生存日数に関しては，
EST投与群において延命効果が存在することが分かった。この成績は前年度の成績をさらに裏付けするものであり，EST投与が筋症ハム
スターの寿命に延命的に作用することはまず間違いのないことと思われる。現在，実験は継続中であるが，実験終了時の成績で統計学的有意差の有無を検討する予定である。
累世代連続投与実験では，F4→F6まで検討したが，前年度のFl→F3の成績同様，各群の間に認むべき差がなく，また一定の傾向もみられな
かった。57年度の成績では，ESTの4週間投
与群が非投与群に比べて心筋組織内の石灰沈着量が低いという成績が得られたが，この理由として，生後2ケ月位までのハムスターは食欲が旺盛であり，摂取量が大であることが考えられる。それに引きかえ長期投与では成長した動物の食餌摂取量は少なくなるため，心筋本来の病
変が薬の効果を上回って進行してしまうものと思われる。一応1日塁100mg／kg体重／日になるよう設定してあるが，生後100日を超えた動物は一般に摂取量が少ない。したがって，投与方法を考慮することにより，例えば成長に応じて濃度を大にすれば血中濃度が大となり，有効107

Ⅲ 個体レベルにおける研究な成績が期待できるかも知れない。一方，各世代とも投与群と非投与群の成績に著差がなかったことは，この薬剤は胎盤を通して胎児に作用する効果はほとんどないことを示しており，同時に毒性もないことを示唆するものと考えられる。
生化学的には，58年度報告にみられたと同様，心筋症では心筋CANP活性には健常心筋のものと差異をみないが，内在性CANP阻害
因子に著明な変化があり，通常の調製方法では調製が難しく，阻害活性の低いことを認めた。
もし，遺伝的に，この阻害因子の生成異常があり，構造や性状が健常心筋のものと異なっていて調製方法の変更により調製可能となる事もあり得るかも知れない。この点は今後の検討にまちたいが，既に緒言でも述べたごとく，本症心筋で小胞体でのCa2＋捕捉能の減弱がみられる
ことや，Ca2＋含量の増大，構造蛋白の崩壊像など，CANPの活性化による構造蛋白の傷害が考えられるところである。そして，ハムスター心筋症の発症は胎生早期のCa2＋桔抗剤ベラパミール投与により抑制されるとの報告からも心筋内のCa2＋濃度の増大と本心筋症の発症と関連する可能性が高い。この観点から，本症心筋で
CANP阻害因子の活性の低いこと（総活性，比活性とも）は本症心筋でのCa2＋の増大とともにCANPの易活性化を推測させる。
今後，熱処理，その他の手段をも併用して，

108

真に本症心筋にCANP阻害因子の低下があるか否かを確める予定である。
ともあれ，CANPが本症心筋症の進展に，そのinhibitorの低下と共に関与しているとすると，SH−プロテアーゼの1つであるCANPは，
SH−プロテアーゼinhibitor EST 投与により阻害され，心筋症の進展に阻害効果をみる事が当然期待される。
EST投与実験でもミニポンプを用いた常時連続投与でその進展抑制効果がみられたこと
は，生化学的知見を支持するものかも知れない。

ともあれ，治療実験での今後の注意点としては，EST投与が，筋症ハムスターの呼吸筋にどのように影響するかを検討することが必要である。ヒトの筋ジストロフィー患者は末期に呼吸不全に陥ることが知られており，私共の筋症ハ
ムスターは，ヒト筋ジストロフィー症の恰好のモデル動物と思われるからである。
結論

1．筋症ハムスターに対するEST投与（固形飼料による経口投与）は生存日数延長効果を来すことを確認した。しかし，累世代連続投与での効果はなく，ESTの胎盤通過能の低いことが推測された。
2．心筋症心筋では内在性CANP阻害因子の調製が難しく，活性の低下が注目された。

16．筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）

におけるESTの薬効

史町

貞俊

苅

村家

大野

■

● 大正製薬抹式会社総合研究所●

1．動物および投与量
当社で繁殖したUM−Ⅹ7．1系ハムスターを
離乳直後の4週令時に，各群33匹になるよう
グループ分けをした。この際，同腹の仔を可能な限り均等に各群へ配分した。薬物はオリエン
タル酵母社製CMF固型飼料にESTを各々0．0375％，0．125％の割合で添加し自由摂取させた。摂餌量から換算して，各個体当りの平均摂取量はそれぞれ約30mg，10Qmg／kg／dayに相当する（以下，30mg群，100mg群と称する）。
2．評価方法
毎朝9〜10時に観察して生死を調べた。生存日数を算出し，スチューデントのT検定法を

■

法

子子紀

方

和聡和

影響を調べる。

■

効果を一昨年より検討して来た。昨年迄に離乳
直後一ケ月間の短期投与試験において，EST
はCPK等の血祭酵素活性の上昇抑制ならびに心筋のカルシウム沈着および壊死変性を遅延せしめる効果があることを報告してきた1）。
上記改善効果が延命効果として反映されるならば，その臨床上の意義は大きい。本年はこの点を検討すべくEST連投による生存期間への本上田●

我々は，チオールプロテアーゼ阻害剤である
ESTの筋ジストロフィーハムスターにおける

弘

松山花

●

的

正

関

晴明雄
■

大

正正貞

井村根

目

玉木中

研究協力者

用いて統計処理した。
3．死亡動物の死因に関する病理学的検査
死亡動物は死亡発見後直ちに剖検し，肉眼的に顕著な変化の認められた心臓，肝臓，肺および呼吸筋の代表として横隔膜を摘出した。これらの臓器はLi11ieの10％緩衝ホルマリンに固定し，常法に従いパラフィン切片による
Hematoxyline・EosinおよびAzan染色標本を作製し光顆下で観察した。
結果および考察筋ジストロフィーハムスターにESTを混合した飼料を離乳直後より死亡するまで自由摂取させた。図1に示す様に，生後120日日頃より死亡が認められ，コントロール群は300日日迄
に全例死亡した。しかし，EST30mg群は33匹
中4匹，100mg群では10匹が300日以上生存していた。
本実験において，コントロール群の雌雄に生存期間の差が認められなかったため，両者を合せて算出した平均値を表1に示した。コントロール群の平均生存期間は214．9日であり，本系統を確立したJasmin等の報告2）している約190日と大きくは異ならなかった占EST投与群

は30mgおよび100mg群共に有意に平均生存期間を延長しており，ESTが全身的症状に何らかの改善作用をおよぼしてその進行を遅らせたものと思われる。また，予備検討の結果では，
EST投与群とコントロール群との問に摂餌量．
の差がほとんどなく，この作用は飼料摂取量の109

Ⅲ 個体レベルにおける研究

図1ESTを混餌授与した筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）の生存期間

蓑1ESTを混餌授与した筋ジストロフィーハ
ムスター（UM−Ⅹ7．1）の平均生存期間
Contro1

214．9±39．2

EST30mg／kg／day

247．8±51．0＊＊

ESTlOOmg／kg／day

256．3±66．6＊＊＊■：p＜0．01

平均日数±S．D．

差による栄養状態への影響の結果でないと考えられる。
死亡動物の形態的な病変内容は，コントロー
ルとEST各濃度投与群の問に明らかな差は認められなかった。死亡した動物にはぼ共通した重篤な所見は，胸水，腹水の貯留，心臓左心系を主体とした房室内，心耳内血栓（図2），高度のうっ血肝（出血併発）および肺胞内心臓病細胞の出現を併う無気性肺などに要約された。すなわち，UM−Ⅹ7．1系ハムスターは特に心筋障
害度の高い系として確立した系であり，本試験において死亡の原因は心臓の器質的病変による心機能障害およびその結果としての循環障害と考えられるが，これらに端を発したうっ血肝や肺機能障害，二次的な心機能低下がこれを増長せしめたと考えられる。
昨年度短期投与試験において，ESTが筋ジ
ストロフィーハムスターの心筋障害に対し改善作用を示したことを報告した。一方，骨格筋に

図2 房室内，心耳内血栓（コントロール，224
日齢，H．E．染色）
110

おいては個体差が非常に大きいため，薬効評価は困難であったが，一部の実験では障害改善傾向も認められていることから，ESTの長期投与において骨格筋細胞に対しても何らかの改善が現れることは十分期待出来る。したがって，本試験におけるESTの延命効果は薬物の長期16．筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）におけるESTの薬効継続投与により，遺伝的に発症する心筋および骨格筋の細胞障害の進行が緩和された結果と推
察される。
結

語

1．EST投与により，筋ジストロフィーハ
ムスターの生存期間を有意に延長した。
2．コントロール群およびEST投与群の死
亡動物の死因は，共に心臓の器質的病変による心機能障害に端を発するものと考えられた。
3．ESTの延命効果は，その筋細胞障害改善作用が全身的症状の進展を遅延させた結果得られたものであろうと考えられた。

参考文献
1）大関正弘：筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度報告書．171−
182，1984．
2）Jasmin，GandEu，H．Y．：Cardiomyopathyof
Hamster

Dystrophy，Annals

New

York

Acad一

cmyofSciences，317，46−58，1979．

111

17．ラット，マウス，ハムスターにおけるESTの薬物代謝
酵素系およびグルタチオン関連酵素系に及ぼす影響

北 川 晴 雄■研究協力者 五十嵐研究員的生体に取り込まれた異物は，主に肝ミクロゾームの薬物代謝酵素系により代謝活性化を受け毒性を発現する例が多く報告されている。さらにこれら活性代謝物の一部はグルタチオン抱合を受け速やかに解毒・排泄されることも多くの例について知られている。したがって，生体にとっては異物として認識される医薬品が，肝臓の薬物代謝酵素あるいはグルタチオン関連酵素系に影響を与えるか否かは，それ自身あるいは薬物併用時の毒性発現に関して重大な意義を有する。一方，肝ミクロゾーム薬物代謝酵素系およびグルタチオン関連酵素系活性には，それぞれ著明な種差がみられることが知られている。
そこで，本分担研究課題として本年度はラット，マウス，ハムスターにおけるESTの肝薬
物代謝酵素系およびグルタチオン関連酵素系に及ぼす影響を検討した。
実験材料および方法
動物はWistar系雄性ラット（8週齢），ddY
系雄性マウス（6週齢）およびGolden系雄性
ハムスター（5週齢）を用い，約1週間予備飼育した後，実験に供した。ESTは5％アラビ
アゴム溶液に用時懸濁し200mg／kgを5日間連続経口投与した。なお，対照群には5％アラ
ビアゴム溶液を5ml／kgの割合で経口投与し隆書 大 森栄■た。最終投与24時間後に，動物は断頭潟血し，可及的速やかに肝臓および腎臓を取り出し，その湿重量を測定した。腎臓の場合は，その重量の4倍容の冷1．15％KClを加えて20％ホモジ
ネートとした。また，肝臓に関しては重量を測
定後1．15％KClにて濯流し，肝重量の4倍苓
（マウスの場合は9倍容）の冷1．15％KClを加えて20％ホモジネート（マウスの場合は10％ホモジネート）にした。この様にして得られた肝および腎ホモジネートの一部はガーゼを通した後，rGTP活性の測定に用いた。さらに，肝ホモジネートの残りは常法に従い超遠心分離によりミクロゾーム（Ms）画分と細胞質（cyto・SOl）画分とに分離した。Ms画分は一定量の冷1．15％KClに懸濁して酵素材料とした。肝および腎ホモジネートのγ−GTP活性はIgarashiらの方法1）により測定した。また，肝Msのアミノ
ピリンN−脱メチル化活性はNash法2）により，アニリン水酸化活性の測定はImaiらの方法3）に準じて行った。さらに，肝Msのカルポキシ
ルエステラーゼ活性は，基質としてp−Nitro・
phenylacetateおよびIsocarboxazideを用い，それぞれKrishの方法4）およびSatoh andMoroiの方法5）により測定した。また，CytOSOl
中のグルタチオンベルオキシダーゼ（GSH−Px）
活性は過酸化水素（H202）を基質としてLaw・
renceandBurkの方法6）に準じて測定した。さらに，グルタチオン S−トランスフェラーゼ活
性は基質として1−クロロー2，4−ジニトロベンゼ■ 千葉大学薬学部薬効安全性学講座薬物学研究室

ン（CDNB）を用いHabigらの方法7）に従い測定
113

Ⅲ 個体レベルにおける研究
表1

EffectoftreatmentwithESTonbodyweight，1iverweightand
kidneyweightinrats，miceandhamsters．

Bodyweight（g）
ControISpecies

Liverweight（g）

EST

ControI

Kidneyweight（g）

EST

ControI

EST

Rat

206．0±5．1 191．8±4．6

7．5±0．3

1．52±0．04

1．49±0．03

Mouse

31．3±0．530．9±0．5

1．7±0．1

1．9±0．1

0．48±0．02

0．50±0．02

Hamster85．3±4．587．3±3．3

3．5±0．1

3．6±0．3

0．88±0．03

0．87±0．07

8．3±0．4

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
AllanimalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days．

表2

EffectoftreatmentwithESTontheproteinrecoveryof
Wholehomogenatesinrats，miceand hamsters．

Liverhomogenate Kidney homogenate
ControI

ESTSpecies（mgofprotein／gliver）

Rat

156．8±6．8

ControI

EST（mgofprotein／gkidney）

179．6±7．1■

153．0±11．4

162．1±5．4

Mouse

182．0±

6．0

172．3±3．7148．5±

6．8

149．1±3．3

Hamster

149．6±10．0

156．8±4．4123．3±

6．0

123．6±3．3

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
AllanimalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days．
p＜0．05vscontrol．

した。なお，蛋白定量はLowryらの方法8）によ
り行った。
実験結果
1．EST投与による体重，肝重量および蛋白回収率
に対する影響表1に示す様に，EST200mg／kgを5日間連続投与した時の体重および肝重量はラットにおいて対照群と比較して若干減少傾向がみられたが，有意な変動ではなかった。また，腎重量に関しては，いずれの動物種においても有意な変動はみられなかった。
表2には肝臓および腎臓のホモジネートにおける蛋白員の変動を示した。ラットにおいてはg肝臓あたりの蛋白量はEST投与により有意に増加したが，マウスおよびハムスターでは対照群との間に有意差はなかった。また，腎ホモ
ジネートの場合は，いずれの動物種でも有意な
114

変動はみられなかった。
一方，表3から明らかな様にMsの蛋白量はラットにおいて約20％の減少がみられた。しかし，CytOSOlの蛋白量に関してはいずれの動物種においても有意な変動はみられなかった。
2．EST投与による肝Ms薬物代謝酵素活性に対する影響
肝Msにおけるアミノピリンの脱メチル化活性およびアニリンの水酸化活性に及ぼすEST投与の影響を表4に示した。アミノピリンN−
脱メチル化活性に関しては，ラットにおいてEST投与によりmg蛋白およびg肝あたりい
ずれでも約50％の活性減少がみられたのに対し，マウスでは逆に増加する傾向が認められ，ハムスタ」ではほとんど有意な変動はみられなかった。次に，アニリン水酸化活性ではラットとハムスターにおいて約20％程度の活性低下がみられた。

17．ラット，マウス，ハムスターにおけるESTの薬物代謝酵素系およびグルタチオン
関連酵素系に及ぼす影響蓑3

EffectoftreatmentwithESTontherecoveryoftheprotein
inrats，miceandhamsters．
proteinrecovery

Microsomes
ControI

16．12±0．78

Mouse lO．47±0．82
Hamster

ControI（mg庖liver）

Species

Rat

EST

Cytosol（mg／gliver）

13．43±0．38●

9，66±0．69

16．20±0．79

EST70．89±3．20
35．76±1．47

17．08±0．98

73．16±1．0133．24±1．33

71．93±2．05

77．30±2．19

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
AllanimalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days・■p＜0．05vscontrol．

蓑4EffectoftreatmentwithESTontheactivitiesofAminopyrineN−demethylationand
Anilinehydroxylationinlivermicrosomesinrats．miceandhamsters．
AminopymneN−demethylation Anilinehydroxylation

S。e。ies T，eatm。nt （フ禁霊n）（翫禦n）（麗1漂n）（翫禦n）RatControI
EST

Mouse

ControI
EST

Hamster ControI
EST

9．56±0．41

4．99±0．44

79．23±3．79

0．59±0．01

2．75±0．09日

36．88±1．24●＝

0．58±0．03

7．75±0．54●

8．89±0．30

93．31±8．36

1．31±0．03

13．77±1．19

9，95±0．16

99．81±4．75

1．44±0．06

13．80±0．72

8．96±0．46

144．90±8．68

1．05±0．01

17．42±0．51

8．23±0．26

140．45±8．84

0．87±0．06●

14．95±1．38

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
A11animalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days．
p＜0．05，Hp＜0．01，‥■p＜0．00lvscontrol．

表5

EffectoftreatmentwithESTonthehepaticactivitiesofcarboxylesterase
inrats，miceandhamsters．

p−Nitrophenylacetate Isocarboxazide

S。。。i。S Tr。atm。nt （寵1語n）傭悪n）（7：gl票．min）傍悪20min）
Rat Contro1

1．61±0．05

26．10±2．05

61．06±2．26988．62±76．60

EST l．29±0．06暮

17．40±1．12●

44．71±1．88日

583．68±31．41■

2．44±0．14

25．82±3．05

56．33±4．16599．76±77．34．EST

2．19±0．14

22．09±2．73

53．69±3．29526．78±67．92

Hamster Control

12．10±0．60

195．46±11．26

322．06±10．25

5210．20±300．84

EST

12．06±0．27

205．82±12．75

320．92±6．29

5491．85±416．75

Mouse Contro1

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
AllanimalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days．
●p＜0．01，‥p＜0．001vscontrol．

115

Ⅲ 個体レベルにおける研究
表6

EffectoftreatmentwithESTontheactivityofhepatic
cytosolic GlutathioneperOXidasesin rats，mice andhamsters．

Glutathioneperoxidase activity
SpeCies Treatment（U／mg prot．）

Rat

0．110±0．004

7．783±0．482

0．088±0．005日

6．432±0．328●

ControI
EST

Mouse ControI
EST
Hamster ControI
EST（U／gliver）

0．191±0．004

13．636±0．499

0．187±0．006

12．434±0．728

0．173±0．011

12．449±0，915

0．175±0．008

13．505±0．704

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
AllanimalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days．

p＜0．05，‥p＜0・01vscontrol．

一方，肝Msのカルポキシルエステラーゼ活性は表5に示す様に，ラットにおいてのみ著明

考察および結論な活性の低下がみられた。p−Nitrophenylac−

ラット，マウスおよびハムスターの3種の動etateおよびIsocarboxazideいずれの基質を物を用いて，ESTの薬物代謝酵素およびグル
タチオン関連酵素系に及ぼす影響を検討した。

用いた場合でも同様の結果であり，マウス，ハムスターでは有意な変動はみられなかった。
3．EST投与によるグルタチオン関連酵素活性に対する影響表6に示す様に，グルタチオンベルオキシダーゼ活性はラットにおいてEST投与による有薬物代謝酵素およびグルタチオン関連酵素活性には著明な種差がみられた。ラットのアミノピ
リンN−脱メチル化活性およびアニリン水酸化
活性はマウス，ハムスターのそれの約50％であった。同じMs膜結合性酵素であるカルポキ

意な低下がみられたが，マウスおよびハムスタ

シルエステラーゼ活性はハムスターが最も高く

ーではほとんど変動しなかった。また，グルタ

p−Nitrophenylacetateに対する活性ではマウ

チオンS−トランスフェラーゼ活性に対するスの約5倍，ラットの約8倍の活性を示した。

EST投与の影響は表7に示した。マウスおよ

また，Isocarboxazideを基質とした場合のエびハムスターではほとんど有意な活性変動はみ

ステラーゼ活性でもハムスターが最も高かった

られなかったが，ラットでは明らかな活性上昇が，次いでラット，マウスの順であり，p−Nitro−が認められた。さらに，肝および腎γ一GTP活性に対するESTの影響は表8に示した。肝rphenylacetateの場合と異なった。このことはカルポキシルエステラーゼには基質特異性の異GTP活性はEST投与によりラットでは約5倍なるアイソザイムが複数知られていることかの活性増加がみられたのに対し，マウスでは逆ら，各アイソザイムの各動物種間での差異によに約50％の活性阻害がみられた。ハムスター

るものと考えられる。さらに，生体内過酸化物

ではほとんど有意な変動はみられなかった。一の処理において重要な役割を演じているグルタ方，腎γ1；TP活性ではラットにおいて有意な低下がみられたが，マウス，ハムスターではほチオンベルオキシダーゼ活性に関しては，ラッ

とんど変動しなかった。

トはマウス，ハムスターの約50％であった。ア
ミノピリン，アニリンの代謝活性，カルポキシ
ルエステラーゼ活性およびグルタチオンベルオ
キシダーゼ活性には明らかな種差がみられた

116

17．ラット．マウス，ハムスターにおけるESTの薬物代謝酵素系およびグルタチオン
関連酵素系に及ぼす影響
表7

Effectoftreatment withESTontheactivityofhepatic
cytosolic Glutathione S−traIISferasesin rats．mice andhamsters．

GlutathioneS・tranSferaseactivity
Species Treatment

Rat

ControI
EST

Mouse

ControI
EST

Hamster ControI
EST（mU／mgprot．）（U／gliver）

0．40±0．01

28．10±1．24

0．45±0．01●

33．02±1．09■

1．27±0．07

91．54±6．69

1．47±0．07

97．22±3．82

1．26±0．08

91．08±7．46

1．32±0．04

102．28±5．67

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
All animals were treated with EST at a dose of200mg／kg，Orallyfor5days．事p＜0．05vscontrol．

表8

EffectoftreatmentwithESTontheactivitiesofγ−Glutamyltranspeptidaseinhepatic
andrenalhomogenatesinrats，miceandhamsters．
Liverhomogenate Kidneyhomogenate

Species Treatment
Rat（mU／mgprot．）（mU／gliver）
81．11±8．45

3．37±0．10

514．17±40．55

419．81±69．42H

2．87±0．06‥

463．86±20．13

Control O．19±0．02

34．68±3．70

1．30±0．06

191．94±7．78

EST

O．11±0．03●

17．36±4．55●

1．21±0．06

179．91±8．51

Control l．08±0．05

161．78±17．48

1．15±0．03

141．08±7．23

EST153．25±11．95

1．13±0．04

140．13±7．52

Control O．51±0．05
EST

Mouse

Hamster（U／mgprot．）（U／gkidney）

2．34±0．40●

O．98±0．09

Eachvaluerepresentsmean±S．E．obtainedfrom4−5animals．
AllanimalsweretreatedwithESTatadoseof200mg／kg，Orallyfor5days・■p＜0．05，Hp＜0・01vscontrol・が，EST投与による影響はラットにおいてのみ認められ，いずれも顕著な活性低下がみられた。
最近，ラットにおいて高用量のEST連続投与により血中トランスアミナーゼ活性が増加することが報告されている9）ことから，上述の各酵素活性の低下はラット肝の障害を反映したものと考えられる。臨床的に肝胆道系疾患時の有用なマーカー酵素として繁用されているγ−
GTP活性は，EST投与によりラット肝臓においてのみ著明な増加がみられた。このことはEST投与によるラット肝障害を反映したものと示唆され，ラットのみの現象であるか否かは諸酵素活性よりみて今後のさらに詳細な検討が必要である。また，γ−GTP活性に関して最も高い活性を示す腎臓においてはEST投与による活性の上昇はみられず，むしろ減少傾向を示した。したがって，腎臓に対してはさらに詳細な検討を要するが，朗著な影響はないものと推察される。以上のことより，EST投与の影響には著しい種差がみられ，ラットに対して最も大きく，マウスおよびハムスターは比較的抵抗性の高い動物であると考えられる。
文

献1）Igarashi，T．，Satoh，T．．Ueno．K．andKitagawa．
H．：J．Biochem．．93，33，1983．
2）Nash，T．：Biochem．J．，55，416，1953．
117

Ⅲ 個休レベルにおける研究
3）Imai，Y．．Ito，A．and Sato，R．：J．Biochem．，60，
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1966．

5）Sato，T．andMoroi，K．：Bochem．Pharmaco1．，
24，1517，1973．
6）Lawrence．R．A．and Burk，R．F．：Biochem．
Biophys．Res．Commun．，71，952，1976．

1187）Habig，W．H．，Pabst，M．J．andJakoby，W．B．：J．
Biol．Chem．，249，7130，1974．
8）Lowry，0．H．．Rosebrough，N．J．，Farr，A．L．and
Randall，R．L．：J．Biol．Chem．，193，265，1951．

9）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−54，1983．

18．筋ジストロフィーマウス（C57BL／10Tmdx）

における生化学的検討（1群7匹）。正常コントロールとしてはC57
BL／10を静岡実験動物協同組合より4週令の動物を購入して用いた（1群8匹）。
2．血菜中酵素活性測定法
血液を大腿動脈および静脈より採取し，ヘパリンを加えて遠心分離して血欒とし，日立712■ 大正製薬株式会社総合研究所●

C57BL／10−mdxは当社で繁殖し，症状の経時変化の検討には種々の週令の雌雄を用いた

●

1．動物

●

法

文旭雄

方

貞和貞

に，症状の進展状況を知るために種々の週令の動物の血柴中酵素活性および骨格筋中のカテプ
シン活性を測定した。

村極根の動物の生産を目指して繁殖を試みるととも大京中いない。本年は薬効試験を実施するに十分な数■てから日が浅く，その病状等十分明瞭になって■を入手した。しかしながら，本系統が確立され●我々は，ESTの薬効評価を行うため，本動物

子美男であることが期待される。

和直保様式であることから，より人に近いモデル動物●

Duchenne型筋ジストロフィー症と同様の遺伝

弘＊モデル動物はⅩ染色体に異常があり，人の本藤本＊

兄い出した遺伝性の病態モデル動物である。本

正

＊

晴勇明

俊

Ⅹ−リンクト筋ジストロフィーマウス（mdk）
は，G．Bulneldらl）がC57−BL／10マウスから

関松佐樽

大
／正

的

苅

玉潮野

目

井田家

研究協力者

型自動分析装置を用いて測定した。
3．骨格筋中カテプシン活性測定法
後肢骨格筋中カテプシン B＆L活性を沢田らの方法2）に従い測定した。
結果および考察雌雄各5匹を入手し，兄妹交配を4回実施
し，全て順調な妊娠，分娩，哺乳状態であった。
1脂の仔の数が6〜8匹と正常動物と比べて少いが，順調に成長した。Fl動物を兄妹および半兄妹交配法で実施したが，喰殺例があるなど繁殖状態が良好ではなかった。しかし，1産および2産のF．の場合，若干の喰殺例が認められたものの，順調な繁殖状態であった。現在，F2動物について交配を実施している。今後，順調に繁殖出来，薬効試験に供給できると思われる。
筋ジストロフィーマウスmdxは外観上何ら病変は認められない。しかし，組織化学的観察
により，その骨格筋に病変が認められ，血清中のPK活性が著明に上昇していることが知られている1）。4週令から12週令の動物の血奨中酵素活性を測定した結果，PK，CPK，GOT，GPT，およびLDHがコントロール群と比べ有意に上昇していた（図1〜5）。
各酵素活性は，4週令より徐々に上昇し，10
週令時に最高値を示した。10週令時には，コントロール動物と比べ，約5〜100倍程度の異常な高値を示していた。また，比較的低い値を示
す4週令時においてもコントロール群に比べて119

Ⅲ 個体レベルにおける研究

図1

筋ジストロフィーマウスC57BL／10−mdxの

図2

血祭中PK活性の経時変化

筋ジストロフィーマウスC57BL／10−mdxの血資中CPK活性の往時変化

nV
5
0
2
0
9

︵n・uUEJdせこ↑dU

0
6
0
3

4

図3

筋ジストロフィーマウスC57BL／10−mdxの図4

血柴中GOT活性の経時変化

6

8

10．

12
Weeks

筋ジストロフィーマウスC57BL／10−mdxの血祭中GPT活性の経時変化

0O
8︵当ののコでn︶J増qU叫SdqJl噌U

O
6
︵ U
O
4
O
O
O
2

0．00

4

6

8

10

12

Weeks

図5

筋ジストロフィーマウスC57BL／10−mdxの血染中LDH活性の経時変化
120

図6

筋ジストロフィーマウスC57BL／10−mdxの骨格筋中カテプシンB＆L活性の経時変化

18．筋ジストロフィーマウス（C57BL／10−mdx）における生化学的検討

上昇しており，特にPKは50倍の高値を示していたことから，4週令時にはすでに発症していることがわかった。カテプシンB＆L活性は血祭中酵素活性とは逆に4週令時が最も高く，以後低下傾向にあった（図6）。
以上のことから，骨格筋の病変は4週令以前
から激しく進行していることが想像され，ESTの薬効試験においては可能な限り早期より投与する必要があると思われる。

参考文献
1）Bulfield．G．，Siller．W．G．，Wight．P．A．L．and
Moore．K．J．：Proc．Natl．Acad．Sci．USA．，81，
1189−1192，1984．

2）大関正弘：E−64頓縁体のわめ0におけるプロ
テアーゼ阻害，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究」，昭和56年度研究報告書，13−28，1982．

121

19．実験的クロロキンミオパチ一におけるESTの効果杉 田 秀 夫暮研究協力者 佐 野 元 規＊ 藤 田 武 久■ 石 浦 章 一＊

目

的

我々はラットにクロロキンを長期投与することによりrimmed vacuoleを伴うミオパテーが発症することを報告し，クロロキン長期投与により惹起される筋萎縮には筋細胞自体のautolysosomeが関与する可能性を報告した1・2）。autOlysosome内ではリソゾームプロテ
アーゼの活性が元進しており，その中でも特にCathepsin B＆Lの活性の上昇が著明で筋蛋白の分解に重要な役割を果たすものと推論した。
今回我々はチオールプロテアーゼインヒビターであるEST3）を用いてクロロキンミオパチーの発症が抑制されるかどうか検討を加えたので
報告する。
方

法

雄のウィスターラット体重200gを各群30匹ずつ2群に分けた。第1群はクロロキン2リン酸50mg／mlの溶液を50mg／kg／dayの割
合で60日間連日腹腔内に投与し，普通の餌を与えた。第2群はクロロキン50mg／kg／dayと同時に餌に混ぜたEST（1．25％）を60〜90
mg／kg／dayの割合で投与した。
60日後に両群の体重およびひらめ筋の湿重量を測定し，ひらめ筋について組織化学的なら
びに生化学的に比較検討した。
組織学的には右側のひらめ筋を用いて既報の● 国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部

ごとく1）各種組織化学的染色を行った。定量的にはGomoritrichrome染色で両群のひらめ筋のそれぞれの筋線維300本のうち，rimmed
vacuoleの存在する割合を検討し，75％以上の筋線経にrimmed vacuoleが存在する場合を（叶）とし，以下75〜50％に存在する場合を（≠），50〜25％に存在する場合を（＋），25％
以下の場合を（±）と表示した。次にacid
phosphatase染色でphagocytosisをうけているnecroticRberを確認して，その数を全fiber数に対する百分率で表わした。両群の各筋肉の筋線維300本の直径を測定して統計学的に比較検討した。
生化学的には左側のひらめ筋を，湿重量の10倍量の phosphate buffered saline−0．1％
TritonX−100でホモジナイズして，8，000×g，
20分の遠沈後上活について各種のリソゾーム
酵素活性を測定した。リソゾーム酵素活性の測定方法は既報のごとく1）行った。
筋構造蛋白は8，000×g，20分，遠沈後のpelletをphosphate buffered salineで数回洗ってsoluble proteinを完全に除いた後，弱ア
ルカリで可溶性の蛋白をLowry法4）で牛血清
アルブミンをstandardとして定量した。
結果

1．両群の体重増加および筋湿重量
クロロキン腹腔内投与開始2週間後位よりク
ロロキン単独投与群に比較してEST併用投与
群では運動がより活発で体重の増加も良好で元123

Ⅲ 個体レベルにおける研究

表2

表1Bodyweightandwetweightof
SOleus muscle

SOleusmuscle

B ody
W etw eight
N um berW eight ofsoleus
（
g）
（
m g）

G roupChloroquine （50m g：
lkg．
／
day）

Chloroquine （50m g！
kgi；
Pday）＆EST （60L90m g／kg／
day）

7ncidenceofrimmedvacuolesin

Group

十廿

Chloroqulne

13262±34

120十2123315±38144±22●

Mean±S．D．Tpく0．01

4

＋

8

＋

±

Total
number1

0

13

皆無uine o o 716 23＋｛

rimmedvacuolesinmorethan75％of負bers

十十rimmedvacuolesin50−75％of6bers＋

rimmedvacuolesin25−50％offibers±

rimmedvacuolesinlessthan25％of負bers

l事■L＿．

卓二了7￣了、了三了
Jl了一

㌧与

と′越∴●王＿≡tB）

図1 HE染色所見（×470）（A）：chloroquine単独投与群．rimmedvacuole（矢印）がみられる（B）：chloroquine＋EST併用投与群

気がよかった。両群30匹で実験を開始したが最終的にはクロロキン単独投与群で13匹，EST併用投与群で23匹が生存した。EST併用
投与群の中で死亡した7匹にもクロロキンミオ
パチーの発症は見られなかった。
60日後の実験動物の状態は，クロロキン単独
投与群では後肢の麻痺を示し，後肢を引きずるものが多く認められたが，EST併用投与群では後肢を引きずるものは一匹も見られなかった。
60日後の体重およびひらめ筋の湿重量には両群で有意の差が認められた（表1）。
2．組織学的所見
Gomori trichrome染色法を用い，rimmed
VaCuOleを形成している筋線経の割合を4段階124に表示した結果は表2の通りである。EST併用投与群では，筋線経には正常所見を示すもの
が多く．一部の筋線稚内にGomoritrichrome
染色でわずかに赤い顆粒が認められ，aCid
phosphatase染色で軽度の活性の上昇が認められるのみで完全なrimmed vacuoleの形成に至らぬものが多数をしめていた（図1）。
壊死線経の頻度は，クロロキン単独投与群に比較してEST併用投与群で著明な減少が認められた（表3）。
・筋線経の直径を両群で比較したところEST
併用投与群で有意の増加が見られた（表4）。
3．生化学的所見
各種リソゾーム酵素活性を測定したところ，リソゾームチオールプロテアーゼである，

19．実験的クロロキンミオパチ一におけるESTの効果

表3

Incidenceofnecroticfiberswith

表4phagocytosisinsoleusmuscle

Group

Numberof No．of負txtrS IncidenceGroup animals examined％

Fiberdiametersofsoleusmuscle

慧窓Of Me怒S・D・

chloroqulne

13

chloroquine 13 24，866 0．505±0．294 雷恕ulne
contro1
雷呈設uine 23 46，747 0・044±0・005●p＜0・001

Mean±S．D．（％）・p＜0．001

蓑52334．3±5．3

52・7±3・8●552．6±10．6日

日Fqjino，0．（1980）

EffectofESTonlysosomalenzymeactivitiesinexperimental
ChloroqulnemyOpathy

EnzymeaCtivity（mU／mg）
Enzymechloroquine（n＝13）

chloroquine＆EST（n＝23）

control（n＝10）29．5±7．2

Cathepsin B＆LI

230．0±73．3

31．5±10．1‥

Cathepsin BI

231．5±76．6

35．5±6．5日

m．d．

Cathepsin HI

53．2±8．941．8±6．1●

9．69±0，80

CathepsinD2

88．2±19，3

56．1土7．4●24．8±5．3

Acid phosphatase1041±157

869±103◆278±521．68±0．24

0．90±0．13

0．316±0．064

0．466±0．072

0．394±0．056●

0．209±0．056

α＿Galactosidase3

a＿Glucosidase3

lunit＝lmicromole／min

p＜0．01

Hp＜0．001

1：lmicrounit
2：lunit＝theamountOftheenzymeWhichcatalyzedanincreaseofl．Oabsorbanceat280nm

3：arbitraryunit

CathepsinB＆LがEST併用投与群で正常コ
ントロール群と同程度まで抑制されていた。同
じリソゾームチオールプロテアーゼである
CathepsinHはクロロキン単独投与群よりは抑制されていたが正常コントロール群よりは高値を示していた。他のリソゾーム酵素活性はあまり抑制されていなかった（表5）。

蓑6EffectofESTonthestructuralproteins
inexperimentalchloroquinemyopathy

Group n Str完熟慧ein
Chloroqulne

13

10．33士3．05

誤謬uine 23 15・47土3・28●
control l015．45土2．89

Mean±S．D．●p＜0．01

筋構造蛋白はEST併用投与群では，クロロ
キン単独投与群より有意差をもって増加しており正常コントロール群とほとんど差がなかった

（表6）。
考

案

我々は実験的クロロキγミオパチーでは
autophagic vacuole（autophagosomeとautolysosomeの総称）の出現が肝細胞に見られ，そのほとんどがautolysosomeの性質をも
ち蛋白分解に関与する可能性を報告した2）。同じことが筋細胞においても考えられ，aut0−
1ysosomeには，特にCathepsin B＆Lの活性が高く，筋蛋白分解に重要な役割を果たしていることが推定された。
今回我々は，微生物の二次代謝産物由来のエ
ポキシコハク酸の誘導体であるE−64−Cのエチ
ルエステル体であるEST3）を用いて実験的ク
ロロキンミオパチーの発症がほぼ完全に抑制されることを証明した。ESTはチオールプロテ
アーゼの特異的な阻害剤であり，特にcathe−
psin BおよびLに対して阻害作用が強く，Cathepsin Hに対しては比較的阻害作用は弱い5・6）o

ESTによりひらめ筋においてCathepsin B
125

Ⅲ 個体レベルにおける研究＆L活性がほぼ正常レベルまで抑制されて，実験的クロロキンミオパチーの発症が抑えられたLong・
term Admi nistration
OfChloroquine

ことにより，クロロキンミオパチ一においてlnductionofAutolysosomes

は，筋蛋白分解にautolysosomeに存在する
Cathepsin B＆Lが第一次的な役割を果たすもInduction of Lysosom alT hiol
proteases （Cathepsin B＆L）のと考えられる。
従来ESTをdystrophicchicken7），dystroph−ichamster8）に投与したinvivoの実験では，非IncreasedproteolysIS

投与群との問に有意差が認められるものの筋崩MuscleAtrophy

壊を完全に抑制するには至っていない。塩酸プ
ビバカインによる実験的急性筋崩壊においてもESTを加〃れ0で投与した場合，筋蛋白の分解

図2

MechanismofMuscleProtein
Degradationを抑制することはできなかった9）。
実験的クロロキンミオパチーの場合にはESTが有効であったが，その理由としてンミオパチーの場合と同じように筋崩壊に筋細胞自体のリソゾームチオールプロテアーゼが関

distrophyモデル動物および塩酸プビバカイン

与すると想定される。したがってrimmedによる筋崩壊とクロロキンミオパチーとは作用機序が異なることが考えられる。

vacuoleを伴うdistalm≠opathyの臨床例においても実験的クロロキンミオパチーと同様にDistrophy動物およびDuchenne型筋ジス
トロフィー症のモデルとされている塩酸ブビバ

ESTの効果が期待されよう。

カインの場合には筋形質膜の障害により，まず
CANPが活性化され，筋原線経の分節化が起こ
り，主としてマクロファージ由来のカテプシン
群により筋崩壊が完了する10）。一方クロロキン
ミオパチーの場合には筋形質膜には障害はなく
opaquefiberの出現もないことによりCANPが活性化されることなく，筋細胞自体のリソゾーム系に何らかの異常が起こりCathepsin B＆
L活性の高いautolysosomeが出現する。この文献1）佐野元規：実験的クロロキンミオパチーの生化学的研究一第1報，臨床神経，25（5），1985．
2）佐野元規：実験的クロロキンミオパチーの生化学的研究一第2報，臨床神経，投稿中．
3）沢田二郎：E−64−d製造法の検討，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報
告書，15−23，1983．
4）Lowry，0．H．，Rosenbrough，N．J．etal．：Pro−

autolysosomeのCathepsin Bが筋蛋白分解に重要な役割を果たしているものと考えられる。

tein measurementwith the phenol reagent．J．

したがってESTによりautolysosome内のチ

5）Noda，T．，Isogai，K．etal．：Effectsoncathepsin

オールプロテアーゼが抑制されることにより筋崩壊が抑えられたものと推定される（図2）。
最近rimmedvacuoleを伴うdistalmyopa−
thyにおいて筋線維内のvacuoleの周辺がBiol．Chem‥193．265−275，1981．

B，H．and Din pectoral muscle of dystrophic
chickens（Line413）ofin vivo administration
OfE−64−C（N−〔N−（2−3−Transcarboxyoxirane−
2−Carbonyl）−L−Leucyl］−3−Methyl−Buty1−

amine）．J．Biochem．．90，893−896．1981．

Cathepsin B，Cathepsin Hの抗体で陽性に染6）Barrett，A．J．，Kembhavi．A．A．etal．：L−tranS−

色されることが報告され11），また実験的クロロ

Epoxysuccinyl，1eucylamido（4−guanidino）

キンミオパチーの場合にもvacuoleの周辺がCathepsin Bの抗体で陽性に染色されている

butane（E−64）anditsanaloguesasinhibitors
OfcysteineproteinasesincludingcathepsinB，H
and L，Biochem．J．．201，189−198，1982．

（未発表データ）。Rimmed vacuoleを伴う

7）Sugita，H．．Kimura，M．et al．：In vivo

distalmyopathyの場合も，本質的にクロロキ

administration ofa thiolproteaseinhibitor，E−

126

19．実験的クロロキンミオパチ一におけるESTの効果

64rc，tOhereditarydystrophicchicken，Muscle＆Nerve，5．738−744，1982．
8）杉田秀夫，埜中征哉：筋ジストロフィーハムスタ
ーに対するE−64−dの効果．組織学的及び組織化学的研究1）骨格筋の病理（分担），厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報
告書，261−266，1983．
9）石浦章一，佐野元規はか：実験的急性筋崩壊に対するESTの効果，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年研究報告書，127−130，
1984．
10）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．et al．：Two−Step me−

chanismofmyofibrillarproteindegradationin
acute plasmocid−induced musclenecrosis，Bio・Chim．Biophys．Acta．，798，333−342，1984．

11）木南英紀，勝沼信彦ほか：Rimmed vacuoleを伴うdistalmyopathyにおけるカテプシンB及びHの局在，厚生省神経疾患研究委託費「筋ジストロ
フィー症の臨床病態と成因に関する研究」昭和59年度研究報告書，印刷中．

127

20．体外受精法による筋ジストロフィーマウス
（C57BL／6−dy／dy）の作出

野 村 達 次■研究協力者 横 山 峯 介＊ 江 崎 孝三郎■

はじめに筋ジストロフィー症のモデル動物として使用されるC57BL／6rdyマウスは，常染色体劣性
遺伝によりホモ型で発症する。このホモ型の筋ジストロフィーマウスは，生後2〜3週齢で発症しはじめ，性成熟時に達しても自然交尾が不能なためにホモ型個体同士の交配はできず，仔を得ることも不可能である。このため，ホモ型の個体を得るためにはヘテロ型同士の交配によって行われるのが一般的にとられている方法である1）。この場合，ホモ（dy／dy）・ヘテロ（dy／＋）・正常（＋／＋）の遺伝的に異なる3種類の個体が同腹仔として混ざって生まれてくることになるため，症状が発現する以前にホモ型個体を他の個体と判別することは不可能である。
今回我々は，体外受精の技術を応用することにより，胎生期から明確にホモ型と認識できる
筋ジストロフィーマウス（C57BL／6−dy／dy）を作出することを試みた。
材料および方法
体外受精には，当研究所で生産された成熟した筋ジストロフィーマウス（C57BL／6−dy／dy）の雄と雌を用いた。体外受精によって得られた胚を移植するためのレシピェント（倍腹雌）にはJcl：ICRの成熟雌を用いた。
体外受精用の末受精卵は，雌に5IUのPMSG■ 財団法人実験動物中央研究所（Pregnantmareserumgonadotropin）とhCG（human chorionic gonadotropin）を48時間間隔で投与し，排卵を誘起したものを使用した。精子は，雄の精巣上体尾部から採取したものを，体外受精用のTYHメディウム2）に懸濁
し，1〜1．5時間炭酸ガス培養装置内でインキュベートしてから使用した。
体外受精の方法は，豊由ら乙3）の報告しているものに準じて行った。受精後4〜6時間に卵を観察し，第2極体が放出され，雌・雄計2個の前核の形成されているものだけをMWメディウム4）に移し替え，培養を行ってその後の発生を調べた。さらに2細胞期に発生した胚は，あらかじめ精管結染雄との不妊交尾で偽妊娠を誘起しておいたレシピエントの卵管内へ移植して，仔への発生を調べた。
結果および考察
3回にわたって実施したC57BL／6−dy／dy
マウスの体外受精実験の成績を表1に示した。
ホルモン（PMSG−hCG）処理により，約70％の雌で排卵が誘起され，体外受精に供される正常な末受精卵を得ることができた。予想されたことではあるが，高齢（3ヶ月齢以上）で，筋ジストロフィーの症状の進んだ個体は排卵の誘起
されないものが多かった。体外受精により222
個（排卵陽性雌でみると平均6．9個）の受精卵が得られ，その大多数（94％）は培養により形態的に正常な2細胞期胚へと発生した。
つぎに，培養により2細胞期へと発生した胚129

Ⅲ 個体レベルにおける研究
表1C57BL／6−dy／dyマウスにおける体外受精成紙

実験
No．

使用動物数
雄
雌

排 卵 陽 性雌 数（％）

2細胞期へ発生
した卵数（％）

40（4．4）40（100）6

得られた前核期
卵数（平均）

9832（74）

20（2．9）19（95）

162（13．5）150（93）222（6．9）209（94）

表2 C57BL／6−dyマウス体外受精卵の2細胞期胚での卵管内移植成績
卵

精子

移植旺数

dy／dy dy／dy
＋／＋

＋／＋

出生仔数（％） 馳乳仔数（％）

171

59（35）
98

51（52）♀：告48（28）

18：30

44（45）

23：21

を，卵管内へ移植したさいの成績を表2に示しの作出を試みた。その結果，胎生期や新生期かた。C57BL／6−dy／dyの171個の胚を13匹のレシピェントに移植したところ，11匹（85％）

ら，明確にホモ型と認識できる個体を再現性のある値で作出することが可能となった。

で妊娠が成立し，59匹（35％）の仔が得られた。

文

これらのうち48匹（28％）が離乳に至った。また，コントロールとして行った正常マウス（C57BL／6）の成績は，出生仔数・離乳仔数とも17％高い値であった。
マウス卵の体外受精は，これまで卵と精子の相互作用や受精現像の解析等に焦点があてられたものが多く，体外受精卵を仔へと育てるような検討は十分ではなかった。本研究では，仔を得ることを第1目的として実験を進担，再現性のある値で筋ジストロフィーのホモ型個体を作出できるようになった。仔への発生率について
は，いくつかの点で改良を加えることにより上げることも可能と考えられる。
結論

体外受精法により，C57BL／6−dy／dyマウス

130

献1）辻 繁勝：筋ジストロフィーマウス（dy．dy2J），
疾患モデルハンドブック（川俣順一，松下 宏編）．医歯薬出版．419−424．1979．
2）豊田 裕，杭山峯介，星冬四郎：マウス卵子の体外受精に関する研究Ⅰ．精巣上体精子による受精成績，家畜繁殖誌，16，147−151，1971．
3）豊田 裕，横山峯介，星冬四郎：マウス卵子の休外受精に関する研究Ⅲ．精子侵入時期に及ぼす精子体外培養の効果，家畜繁殖誌，16，152−157，
1971．

4）Whitten．W．K．：Nutrientrequirementsforthe
Culture of preimplantation embryoin viETV．
Advan．Biosci．．6．，129−139，1971．

Ⅳ

臨

床

試

験

21．EST第2相臨床試験一中間報告−

今堀 和友，杉田＿秀夫，吉武 正，石原 博幸
22．EST服用中のDuchenne型筋ジストロフィー症患児におけるnaturalkillerおよびantibodydependentce11
mediatedcytotoxicity活性の変動について

宮武正21−EST第2相臨床試験
一中間報告−

今 堀 和 友＊1杉 田 秀 夫＊2宮 武

正＊3 石 原 博 幸＊4

研究協力者 桑 原 武 夫＊5 西 澤 正 豊＊5目

的昨年度，成人筋疾患患者（成人Duchenne型患者を含む）および小児期Duchenne型筋ジス
トロフィー患者にESTを1回または1週間連続経口投与し，その際の生体内動態および安全性について検討を行ったl）。
今年度は，本格的な臨床試験へ移行し，原則として独立歩行可能なDuchenne型筋ジスト
ロフィー入院患者に対して，本剤を長期投与し，有効性および安全性の両側面より臨床的有用性について検討した。
試験方法
あらかじめ班内にPhase H小委員会（今堀，江橋，杉田，福原）を設け，試験計画および
CaseReportについて十分な検討を行った。なお，試験に用いたCaseReportを巻末に付した。
1．実施施設
本試験は国立療養所新潟病院および国立療養所東埼玉病院において実施した。
実施に際しては，上記施設の関係者（医師，
看護婦，理学療法士）により，試験計画につき十分に検討を行い，試験の統一を図った。
2．対象●1東京都老人総合研究所◆2 国立武蔵療養所神経センター■3 新潟大学脳研究所神経内科
暮1国立療養所東埼玉病院■5 国立療養所新潟病院

対象患者24例の年齢（7〜14才），Stage（1〜5），体重（17．5〜40．0kg）および投与塁（75〜175mg／日）を表1に示した。
なお，本試験に参加することについて，あらかじめ患者保護者より文書による同意を得た。
3．用法・用量
EST25mgおよび50mg含有カプセルを使用し，早期第2相臨床試験の結果をふまえ，4mg／kg体重を1日1回朝食後30分に投与した。
4．併用薬剤，併用療法
カルシウム桔抗剤は併用しないこととし，それ以外で試験前から授与していた薬剤について
は・原則として用法・用量を変更しなし．、で試験期間中も併用した。
リハビリテーションなどの運動機能訓練は，試験前と同様，試験期間中も実施した。
5．検査項目筋ジストロフィー成因に関する仮説（図1）から考えて，EST投与開始後，最初に現われてくると期待される変化は，本剤がタンパク分解
酵素阻害剤であることより，筋収縮タンパクの分解産物である3−メチルヒスチジン（MH）乙3）の尿中への排泄が減少することである。しかし，筋タンパク量が減少してくる筋ジストロフ
ィー患者では，3−メチルヒスチジンの排泄の絶対量での比較は困難なため，単位筋タンパク
量当りの分解，すなわち筋タンパクの分解率で推移を追究することとし，生体内全筋タンパク量を尿中クレアチニン（CRN）排泄量より概算
した4）。
133

Ⅳ

臨

昧

試

験

蓑1患者の背克て
施

設

症

例

投
年

齢

（
オ）

S ta g e

体

重

（
kg ）

N o．

東

埼

玉

病

院

新

潟

病

院

量
m g／
k g 体 重 ／日

1

11

4

23 ．
0

10 0

4．
3

2

13

4

31 ．
6

1 25

4．
0

3

11

4

28 ．
2

125

4．
4

4

11

4

26 ．
2

10 0

3．
8

5

12

4

26 ．
2

10 0

3．
8

6

7

2

20 ．
0

10 0

5．
0

7

8

2

17 ．
5

75

4．
3

8

10

4

26 ．
2

100

3．
8

9

10

4

25 ．
6

100

3．
9

10

8

2

20 ．
2

75

3．
7

11

9

4

21 ．
2

75

3．
5

12

10

5

28 ．
6

125

4．
4

13

11

5

25 ．
2

100

4．
0

14

7

1

20 ．
2

75

3．
7

15

9

5

2 1．
5

10 0

4．
7

16

12

5

36 ．
0

150

4．
2

17

14

2

36 ．
0

15 0

4．
2

18

9

2

18 二
2

75

4．
1

19

11

2

40 ．
0

17 5

4．
4

20

9

4

19 ．
5

75

3．
8

15 0

4．
0

21

12

2

37 ．
8

22

8

■
1

19 ．
3

75

3．
9

23

9

2

20 ．
1

75

3．
7

24

8

2

2 7．
4

75

2．
7

25 ．
7 ± 1．
3

10 3 ±64．
0 ±0 ．
1

平 均 ±S 且

10 ±0 ．
4

次に臨床効果として期待されることは，機能面に本剤の影響が反映され，ADLテスト，筋力テストのスコアの減少がゆるやかになるかある
いはスコアが上昇することであり，さらに，膜異常により漏出する血清酵素（CK）が，低下することも考えられる。
以上のことをふまえ，以下に示す検査を実施した（表2）。
（9マニュアルテスト

同一患者については，試験期間を通して同一検査者により測定を行った。
筋力テスト，ROM（関節可動域）テスト，機能テスト，ADL（日常生活動作）テストを投与
開始時，投与開始後4，12，24週目に実施し，Stage（機能障害度）を記載した。
②臨床検査
血液一般検査，血清電解質検査，血液生化学134

与m g ／日検査は，投与開始時，投与開始後2，4，12，24週目に実施した。
また前述の筋タンパク分解率を検討する目的
で，24時間蓄尿を行い，尿中3−メチルヒスチ
ジン，クレアチニン，クレアチンを投与開始時，投与開始後4，12，24週目に測定した。その際，苗床開始前3日間および蓄尿期間中は内規を含まない食事とした。
③その他
投与期間中適時一般症状観察，体重測定を行い，また心・肺機能についても投与開始時および投与期間中少なくとも1回は実施した。
結果

現在，24週目まで経過しており，投与を継続中であるが，以下に24週目までの中間成績を報告する。

21．EST第2柏臨床試験一中間報告−

筋収縮タンパク崩壊††
MH／CRNin Urine
．＿」＿

再葺で筋

￣、、

萎縮へノ〉＼／＼ノ†CRNin Urine

ADLテスト，筋力テスト

図1 Duchenne型筋ジストロフィーの成因に関する作業仮説
蓑2

検査項目

マ ニ ュ アル テ ス ト
筋 力 テ スR O M

ト13 種 計 24項 目

テ ス ト

11桂 計 22 項 目

機 能 テ ス
A D L

ト

5 項目

テ ス ト

25項 目

臨床 検 査血 液一般検査

赤 血 球 数， 白 血球 数 ，ヘ モ グロ ビ ン， ヘ マ トク リ ッ ト，
血小 板 数， 白 血球 分 類

血 清 電解 質 検査

N a ，K ，C l． C a，P

血 液 生化 学 検査

C K ， G O T ， G P T ，A L P ， γ−
G T P ．L D H l

IC D H ，

総 ビ リル ビン， B U N ， ク レア チニ ン， 稔 コ レス テ ロー ル，
トリグ リセ ラ イ．
ド， 総 蛋 白尿検査

糖 ， 蛋 白， ウ ロ ビ リノー ケ ン， 沈 法， ク レア チ ニ ン（
C R N ）暮，クレア チ ン●
， 3一メチル ヒス チ ジ ン（M H ）
●

そ

の

他

−一 般 症 状 ． 心 ・
肺 機能 ， 体 重●：集中測定1．筋力テストおよびADLテスト

筋力テストは，288点満点で実施し，投与後24週目までで，スコアの減少が10点未満，10点以上低下した症例は，各々13例（54％），11
例（46％）であった。
ADLテストは，100点満点で行われ，投与後24週目までで，スコアの減少が5点未満の症例は12例（50％），5点以上低下した症例は12例（50％）であった（図2）。
2．尿中3−メチルヒスチジン／クレアチニン値

尿中3−メチルヒスチジン／クレアチニン値の推移を図3に示した。個々の症例で追跡すると，開始時と比較し17例（71％）が12週目で￣減少を示した。この内11例（65％）は24週目
においても開始時と比較して，減少を認めた。
また，12週目で増減を示さなかった4例の内，1例は24週目において減少を認めた（図4）。
全体としてみると，投与開始時は平均0．045であったが，12週目には，平均0．038と有意な減少が認められた（p＜0．01）。24週目では，12週
135

Ⅳ

（点）

臨

床

試

験

（点）

ADLテスト

筋力テスト

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

0

4

12

24（W）

図2

0

4

24（W）

12

ADLテストおよび筋力テストの総点の推移

4

12

24（W）

・：Dystrophicboys，11．3才（n＝20）2）
0：Normalboys，

図33−メチルヒスチジン／クレアチニン値の推移（実測値）

目と比較し4例において上昇を認め，全体としては開始時のレベル（平均0．045）に戻った。なお，参考までに図3中にDuchenne型筋ジスト
ロフィー患者および健康な少年の3−メチルヒ
スチジン／クレアチニン値（文献値2））を併記した。
4週目の3−メチルヒスチジン／クレアチニ

ン値の推移別に，その後の推移を検討した（図5）。開始時と比較して4週目に90％以下に減少した群，90〜110％であった群および110％
以上に増大した群に分けた。90％以下に低下した群については，その後も低値を維持している
136

11．4才（n＝11）2）

が，4週目で減少を示さなかった群は，それ以後投与を継続しても明確な減少は認められなかった。
3．血清中CK活性各々の施設で測定を行ったので，施設別に結果をまとめた（図6）。東埼玉病院においては，
4週目および12週目で有意な減少を認めたが，24週目では逆に上昇する症例が多く，平均値としては開始時のレベルに戻った。一方，新潟病院においては，4週目においてのみ有意な減少を認めたが，12週目，24週目と経過するに従って，徐々に上昇する症例もあった。

21．EST第2相臨床試験一中間報告一

OW

12W

24W

＋（11）
＋（
17 ）

0 （2 ）

（
24 ）

−（4 ）
＋（1 ）
0 （1 ）

0 （4 ）

−（2 ）
−（3 ）

ー（3 ）

図4

＋：投与開始時に比べて減少
0：投与開始時に比べて不変−：投与開始時に比べて増加
日：例数

尿中3−メチルヒスチジン／クレアチニン値成績（％）【4週日／投与開始時≦90％】 （％）［90％＜4週日／投与開始時＜110％】（％）【110％≦4週日／投与開始時】

4

12

24（W）

4

12

24（W）

4

12

24（W）

工：Mean±S．E．

図5 3−メチルヒスチジン／クレアチニン値の推移（平均値）−4週目と投与開始時との比較−
4．安全性
失した。
①一般症状
その他の一般症状には，何ら特記すべき変化
食欲不振，堰気・嘔吐，胃部不快感，JL、嵩部は認められなかった。
痛などの消化器症状が9例（38％）に10日間〜②臨床検査所見
2ヶ月間にわたり発現したが，メトクロプラ
筋ジストロフィー患者では，筋肉由来のミドなどを併用することにより，上記症状は消GOT，GPT，LDHが血清中へ漏出するため異常
137

Ⅳ

臨

東埼玉病院

（mU／mI）

2

4

床

試

験

新潟病F完

（mU／mり

12

2

4

12

24（W）

図6 血清中CK活性の推移
表3
施

IC D H

症

例

N

o ．

（m

U ／mi

． 正 常 域4

臨床検査成績
〜 1 7 ）Y − G T P

（m

U ／m

l， 正 常 域

0 − 6 0 ）

設
名

東

開

始 時

2 W

4

W

1 2 W

2 4 W

開 始 時

1

7 ．0

4 ．3

4 ．6

6 ．1

5 ．0

8

6

2

5 ．5

4 ．4

4 ．1

5 ．6

4 ．9

9

1 0

3

5 ．7

5 ．0

3 ．9

6 ．1

6 ．1

9

2

W

4

W

1 2 ￣
W

24 W

5

8

4

7

10

8

1 1

8 ＿

1 2

1 0

4

8 ．5

7 ．6

7 ．4

7 ．8

1 1 ．5

13

1 6

10

14

1 3

埼

5

6 ．1

4 ．1

5 ．4

5 ．5

5 ．9

10

1 1

8

10

9

玉

6

6 ．3

5 ．2

6 ．3

5 ．5

5 ．9

7

7

7

8

6

7

5 ．2

4 ．6

2 ．6

4 ．8

4 ．8

8

8

7

9

6

8

4 ．6

4 ．3

3 ．7

4 ，4

4 ．5

7

8

6

7

6

5 ．5

5 ．2

4 ．6

6 ．1

4 ．4

8

9

8

10

7

10

6 ．1

4 ．4

5 ．4

5 ．2

5 ．0

8

8

6

8

6

1 1

6 ．7

5 ．2

5 ．9

5 ．5

3 ．7

1写

1 0

7

9

7

1 2

4 ．2

4 ．6

4 ．6

5 ．2

5 ．4

10

1 0

9

10

9

1 3

4 ．8

5 ．0

5 ．2

5 ．4

4 ．6

16

1 1

10

12

10

14

4 ．3

3 ．3

4 ．4

4 ．1 ・

3 ．6

7

9

6

7

6

15

5 ，9

3 ．6

4 ．4

4 ．6

3 ．7

8

9

1 1

10

7

16

6 ．3

3 ．9

4 ．4

5 ．4

4 ．8

1 1

1 3

12

12

12

5 ．9

5 ．1

4 ．6

4 ．8

4 ．1

8

1 1

9

12

12

3 ．9

5 ．5

3 ．7

5 ．7

3 ．6

9

19

12

15

15

19

4 ．8

4 ．1

4 ．1

5 ．0

4 ．7

6

8

12

10

1 1

2 0

5 ．9

5 ．0

3 ．9

6 ．1

4 ．4

2 4

14

1 1

13

9

2 1

4 ．8

3 ．7

3 ．7

5 ．4

4 ．0

15

15

16

16

14

2 2

4 ．2

5 ．2

4 ．6

4 ．3

4 ．6

9

12

1 1

11

10

2 3

3 ．6

4 ．4

4 ．3

4 ．4

4 ．4

4

9

10

8

8

2 4

6 ．3

5 ．2

4 ．5

4 ．8

4 ．3

13

13

11

14

12

病
院

新

9

17
18

潟
病
院

＿

−

に高値を示し，肝機能の指標とはなりえないた
内の変動であった。同様に測定したγ1；TPにめ，本試験においては，肝機能の特異的な指標関しても，本剤によると考えられる変動はな
としてICDHを測定したが，いずれも正常範囲
く，24過までの投与期間中，肝への影響を示唆
138

21．EST第2相臨床試験一中間報告−

する結果は認められなかった（表3）。
また，腎機能の指標であるBUNおよびそのフィー患者の場合，年齢に関係なくほぼ一定である2）。今回測定した尿中3−メチルヒスチジン

他の臨床検査値にも，24遇まで経過した現在，本剤によると考えられる変動は認められなかっ／クレアチニン値は，24週目において12例た。

ストロフィーハムスター（BIO14．6）で確認さ考察

昨年度，早期第2相臨床試験において，筋疾
患患者（筋ジストロフィー患者を含む）における本剤の生体内動態を検討した結果，本質的には健常成人男子と異ならないことが確認され，1週間反復投与時までの安全性についても何ら問題はなかったl）。これを受け，本年度は本格的な治療を目的とした臨床試験へ移行した。
今回．対象とした症例は，Duchenne型筋ジストロフィー患者であるが，限られた期間で評価を行うことを考慮に入れ，症状の進行が比較的速い独立歩行可能な患者のみに限定した。また，環境の違いによるデータのばらつきを極力少なくし，同時に安全性を十分に観察できるよ
うにするために入院患者のみを対象とした。
24週目までの中間成績をまとめた結果，全身機能を最も反映していると考えられるADLテ
ストにおいて，スコアの減少が5点未満にとどまった症例が全体の50％（12／24）であり，筋力テストにおいては，スコアの減少が10点未
満が54％（13／24）であった。ただし，スコアが5点以上または10点以上上昇した症例は認められなかった。これらの推移が自然経過と比較し，緩徐な低下であるかどうかを評価するには，あまりにも自然経過に個人差が大きく，24週間という短期間では評価が困難であるため，さらに長期にわたる経過観察が必要である。なお，ADLテストと筋力テストのスコアは，極めてよい相関を示した（r＝0．90）。
3−メチルヒスチジンは，筋肉の収縮タンパ
クの大部分を占めるアクチン，ミオシンに含まれており，タンパク分解後尿中へ排泄される了ミノ酸であるが，再利用されないことから筋肉の分解を表わす指標となりうると考えられている乙3）。また，筋肉当りの分解率を表わす3−メチ
ルヒスチジン／クレアチニン債は，筋ジストロ（50％）が開始時と比較して減少しており，筋ジれた成績7・8）と同様，本剤の投与により筋タンパ
クの分解をある程度抑制している可能性が示唆された。一方，投与後4週目において減少を示した症例は，その後も低値を維持する傾向があったことから，4週目の変動がその後の推移をある程度予測できるとも考えられた。今回は，投与方法を1種類に固定（4mg／kg体重，1日
1回朝食後服用）して観察を続けたが，今後増量を含め用法・用量の変更をした場合3−メチ
ルヒスチジン／クレアチニン値がどのような変動を示すかなどさらに多方面からの検討が必要と考えられる。
血清中CK活性は，投与後4週目に両施設において減少を認めたが，24週目までには上昇を示す症例が多く認められた。しかし，非常にばらつきが大きいため，明確な傾向を得るに到っていない。
ESTを長期にわたり投与することは初めての経験であったので，安全性については特に慎重な検討を行った。一般症状では，一過性の食欲不振，嘔気・堰吐などが9例（38％）に発現したが，鎮吐剤を併用することにより，症状は消失し，このために投薬を中止した例はなかった。亜急性9）および慢性毒性試験10）においてラットに特異的にGOT，GPT活性の上昇が認められているが，本試験においては，これらの変化は認められず，また肝の特異的な指標ICDH，γ−
GTP活性にも本剤によると考えられる変動がないことから，今回の用法・用量の範囲では肝への影響はないものと判断された。その他の臨
床検査値についても，本剤によると考えられる
異常変動は認められなかった。
しかし，24週間では臨床的有用性の評価を行
うには短期間すぎるため，さらに長期にわたる
継続的な経過観察が必要であろう。

139

Ⅳ

臨

床

試

験

4）Graystonc，J．E．：Creatinineexcrctionduring
まとめ

1．原則として独立歩行可能なDuchenne型筋
ジストロフィー患者24名にEST4mg／kg

体重を1日1回朝食後経口投与した。
2．24週目までの中間成績は，筋力テスト，
ADLテストにおいて各々13例（54％），12例（50％）が10点未満，5点未満の減少にとどまった。尿中3−メチルヒスチジン／クレア
チニン値は，12例（50％）が減少した。
3．安全性については，一過性の消化器症状が9例（38％）に認められた。
文献1）杉田秀夫，宮武 正：ESTの早期第2相臨床試
験，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度研究報告書，217−224，1984．
2）Ballard，F．J．et al∴Increased turnover ofmusclecontractileproteininDuchennemuscuT
lardystrophyasassessedby3−methylhistidine
andcreatinineexcretion．Clin．Sci．，56，347−352，
1979．

3）McKeran，R．0．et al．：3−Methylhistidine
excretion as anindex of myofibrillar protein
catabolismin nuromuscular disease，J．Neurol．
NeurosurgeryPsychiat．，42，536−541，1979．

140

growth，HumanGrowth，Ed．Cheek，D．B．etal．．
Philadelphia．182−197，1968．

5）宮原 正：E−64の第1相臨床試験一第一段階−，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報告書，147−155，1983．
6）宮原 正：ESTの第1相臨床試験一続報−，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度
研究報告書，193−216，1984．
7）寺尾寿夫：移植筋の再生ならびにアミノ酸代謝に対するE−64の効果，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報告書，201−
206，1983．
8）寺尾寿夫：筋ジストロフィーハムスターの移植
筋の再生およびアミノ酸代謝に及ぼすESTの効
果，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度研究報告書，149−154，1984．
9）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−54，1983．
10）大関正弘：ESTの慢性毒性に関する研究，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年
度研究報告書，19−39，1984．

21．EST第2柏臨床試験一中間報告−

EST Case epOrt

141

Ⅳ

Ll．D uchenne 型■

l診 断年 令 l

現症

2 ．和式 ） l

l ．

1．
無 2．
有

仮

大

1．
無 2．
有

つ ま先 立 歩 行

1．
無 2．
有

知

1．
無 2．
有
発症年令 l

性
覚

肥
異
才

常
ヶ月

単位
（

CK （
現 在 までの最高値 ）

生

検

試

2 ．

近 位 筋 脱 力

処女 歩行 1筋

床2．その他 （ヶ月 合 併 症 1 1．無オ

S tag e （1．洋式

臨

1．
未実施

験

7 ・

8 ・

膝 関 節 の 拘 縮
股 関 節 の 拘 縮
足 関 節 の 拘 縮
外眼筋の脱 力または下垂皮疹オ
ヶ射 歩行不 能 l

3 ．

4 ．

1 無
1．
無
1．
無
1．
無
1．
無
オ

2．
有
2．
有
2．
有
2．
有
2．
有
ヶ月

正常妓

検査年 月 日）2．
実施 〔1．
正常

）
）

2 ．有（
5 ・

6 ・
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年

2．
異常 （

）
〕

病
［ ：：
≡実芸濃
筋

電

活動電位I

慧警

馴

月

日

検査年 月 日年

月

日

検査 年 月 日

図
年

月

日

（
1ノト 2．
正常 3．
大）歴

検査年 月 日
心

電

図
年

家

族

142

月

日

21．EST第2相臨床試験一中間報告一〔経過一覧表〕
評 価 日
項

投

（

目

投 与開始時
年
月
日）

第
（ 年

週目
月
日）

（

第
年

週目
月
日）

E S T （m g／日，回数 ）
与
薬

併 用 薬
（m g／日， 回数 ）剤

体

重 （kg ）

S tag e （1 ．洋 式

2 ．和 式 ）A D L T O T A L SC O R E
M M T T O T A L S CO R E

心

肺

活

量 （c G ）

心

胸

比
pH
Pco2
P o2

動
肺

脈
血

機

V IR −
S

心
電

能
図

発現の有無
副
作

種

1．無 2．有1．
無 2 ．有

類

1．

1．

2．

2．

3．

3．

／

用
程

度

1．
軽度 2．中等度 3 ．
高度・1．軽度 ￣
2．中等度 3．高度

143

Ⅳ

臨

床

試

験

〔筋力テスト〕
項

検査 日（月／日） 投 与 開 始 時

第検 査 者 名

（ ／

目

首

屈

曲

伸

展

肩
嬰
烏口

外

肘

屈

転

右
左
右
曲
左

関
右

節

伸

展

屈

曲

左
右
手

左
関
右
節

伸

展
左
右

股

屈

曲

伸

展

左

関
節

右
左
右
屈

膝

曲
左

関
節

伸

展

右
左
背

足

屈

右
左
関
右

節

底

握

144

屈

力
（kg ）

左
右
左

（ ／

）

週目
）

第
（ ／

週目
）

第
（ ／

週日
）

第
（ ／

週目
）

21．EST第2相臨床試験一中間報告−〔ROMテスト〕
I査日（月／日）投与開始時 第 週 目 第 週目 第 週目 第 週目 第 週 目 第 週目（／ ）（ ／ ）（ ／ ）（ ／ ）（ ／ ）（ ／ ） （ ／ ）註 晶 動城）検養老名
肩 外 転（
0〜180）

右肘 伸 展（
0 〜5 ）

右手首 背屈（
0 −70 ）

右股 伸 展（
0 〜15 ）

右

膝 伸 展
（
0）

右

足首 背屈
（
0〜20）

右

Iliotibia l B and
Iliop soas
Q uad riceps
G astrocnem ius
H am strlngS

左
左
左
左
左
左
右
左
右
左
右
左
右
左
右
左

側

攣

無 2．
有
1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．

後

攣

1．
無￣
2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．
無 2．
有 1．

〔機能テスト〕
項

検 査 日（月／ 日） 投与開始時 第 週 目 第 週 目 第 週 目 第 週 目 第 週 目 第 週 目（ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ）目
検査者名

仰臥位からの立ち上がり時間

秒

秒

秒

秒

秒

1 秒

秒

階 段 4 段 昇 り時 間

秒

秒

秒

秒

秒

秒

秒

10 m 走 行 時 間

秒

秒

秒

秒

秒

秒

秒

椅子からの立ち上がり時間

秒

秒

秒

秒

秒

秒

秒

車椅子 で10 m 走行時間

秒

秒

秒

秒

秒

秒

秒

各試験とも、120秒で完了しない場合は「−」を記入
145

Ⅳ

臨

床

試

験

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＼
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＼
＼
＼
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21．EST第2相臨床試験一中間報告−〔臨床検査（Ⅰ）〕項

検 査 日（月 ／日 ） 投与 開 始 前 投 与 開 始

第

（ ／

） （ ／

目 （単 位 ） 正 常 値

） （ ／

週 目 第

週 目 第

） （ ／

週 目 第

） （ ／

週 目 第

） （ ／

週 目

） （ ／

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ト リ グ リセ ラ イ ド
総 蛋 白

化

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IC D H

学

147

）

Ⅳ

臨

床

試

験

〔臨床検査（ⅠⅠ）〕項

目 （単 位 ） 正

検 査 日 （月 ／日 ） 投 与 開 始 前 投 与 開 始 時 第 週 目 第 週 目 第 週 日 第 週 日 第 週 目
常 値（ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ） （ ／ ）ク レア チ ニ ン
ク レア チ ン
3 −M e h is
尿

糖
蛋

白

ウ ロ ビ リノ ー ゲ ン
沈i査〔副作用詳細〕〔発現時期）：月 日（投与 週目）〔程度〕：1．軽度2．中等度3．高度
投与継続
投与中止（月 日）
休薬（／ 〜 ／）
減量（ mg／日一→
mg／日）

薬剤投与（
そ の他（

〔原因〕

1．本剤によるものと考えられる
2．併用薬によるものと考えられる
3．原疾患によるものと考えられる
4．その他（））

〔転帰・経過〕〔発現時期〕： 月 日（投与 週目）〔程度〕：1．軽度2．中等度3．高度
投与継続
投与中止（月 日）
休薬（／ 〜 ／）
減量（ mg／日一→
mg／日）

薬剤投与（
そ の他（

〔転帰・経過〕

148

）
）

〔原因〕

1．本剤によるものと考えられる
2．併用薬によるものと考えられる
3．原疾患によるものと考えられる
4．その他（

22．EST服用中のDuchenne型筋ジストロフィー症患児におけるnaturalkillerおよびantibody dependent cell
mediatedcytotoxicity活性の変動について

西澤 正 豊＝＊

●

粁ど

信直

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谷沢

＊

美夫

はじめに

武宮高

宮

正武

中原

田桑

研究協力者

方

法

E−64と同じチオールプロティーゼインヒビ

対象は，8歳9ヶ月から14歳3ヶ月までの歩行可能な9名の男児で，Er64誘導体（EST）
が75から175mg／日，（4mg／kg／日）投与された。投与前と投与4週後に，NKおよびADCC
活性を測定した。疾患群に対するコントロール
としては，年齢および障害度が一致する9名の男児を選んだ。NKおよびADCC活性の正常値は，22名の健康成人から得た。今回は，薬物負荷による変化を求めることを目的としたため，健康小児を対象とした正常値は求めなかった。

ターであり，CANP活性を抑制するロイペプチ

NKおよびADCC活性の測定は，末梢血単ンは．invitroでヒトnaturalkiller（NK）活性核球をeffectorとし，各々K−562とニワトリを抑制する5）。
ウィルス性上気道炎がJL、肺機能不全の誘発因子

赤血球をtargd細胞とした。4時間培養後に放出される51crを測定し，各々下記の式より求めた。effector：target比は20：1で行った。

となり得るため，ウイルス感染の防御に重要な

experimentalrelease−SPOntaneOuSrelease

働きをするNK細胞が抑制されるとすれば，生maximumrelease−SpOntaneOuSrelease

Duchenne型筋ジストロフィー症の病因として，最近筋の膜異常説が注目されている1）。特に，筋細胞内に存在し，Ca2＋で活性化される
Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）は，筋収縮に関連した蛋白の分解の初期段階に作用すると考えられている乙3）。CANPは，アスペルギル
スから分離されたチオールプロテアーゼインヒ
ビターであるE−64により強力に阻害を受ける
ため2），E−64による筋崩壊の予防が期待されている。

Duchenne型筋ジストロフィー症患児では，命予後にも大きな影響を与える可能性がある。
今回著者らはDuchenne型筋ジストロフィー症患児にE−64誘導体を投与する機会があり，E−64がヒト末梢血NKおよびantibody
dependent cell mediated cytotoxicity（ADCC）活性に，どのような影響を及ぼすかについて検討を行ったので報告する。
■ 新潟大学脳研究所神経内科■■ 国立療養所新潟病院

×100（％）

推計学的処理は，対応のあるt検定により行
った。
結

果

疾患群コントロール9名の患児のNK活性は40．3±19．7％で，健康成人の値（45．6±
20．0％）と差は認められず，EST投与にても有意な変化は示さなかった（投与前31．7±
13．7％，投与後33．0±16．9％）（図1）。
一方，ADC（ゴ活性は有意の差はないものの，
149

Ⅳ

臨

床

試

験

図1EST投与によるnaturalkiller活性の変化。
陰影範囲は，健康成人から得られた値の平均
値±標準偏差を示す。

図2 EST 投与によるantibodydependentcell
mediated cytotoxicity活性の増強。
陰影範囲は，健康成人から得られた値の平均
値±標準偏差を示す。

健康成人の値（59．9±12．5％）に比し，低めの値（44．4±17．2％）を示し，患児群では健康成人では認められない値（40％以下）を示す者も認められた（図2）。EST投与によりADCC活性は，41．2±15．7％から56．9±11．6％へ2．5％の危険率で有意に上昇した（図2）。
免疫グロブリンや補体など他の免疫学的指標については，今回観察しなかった。なお，投与期間中肝機能障害など重篤な副作用は認められなかった。

用に違いが認められたことは，両者の細胞障害機序に違いがあることを示しており興味深い。

考察

E−64は筋内CANPに及ぼす影響の他に，マウスのリンパ球に対しては，Concanavalin A
による幼若化反応を冗進させたり，2次抗体産生能を低下させるなどの作用があり…），ラットのアジュバント関節炎に対しては予防効果があると言われている＄）。
ロイペプチン5）と異なり∴ESTではNK活性が低下せず，逆にマクロファージによると思われるADCC活性が元進した理由は不明である。
しかしNKとADCC活性に対するESTの作
150

免疫担当細胞とセリンプロテアーゼに関する研究は多いが，チオールプロテアーゼについての情報は乏しい。従来のインヒビターに較べて，毒性の低い本剤を用いることで，免疫担当細胞でのチオールプロテアーゼの役割を検討できると思われる。
結語

EST投与により，NK活性は変化しなかったが，ADCC活性の元進が認められた。これは，本剤のDuchenne型筋ジストロフィー症に対する治療上 否定的評価にはならない。
文献1）Rowland，L．P．：BiochemiStry of muscle
membranesin Duchenne musculardystrophy．
MuscleNerve，3，3−20，1980．
2）Sugita，H．，Ishiura，S．，Suzuki，K．andImahori，
K．：Ca−aCtivated neutral protease anditsin−
hibitors：invitro effect onintact myofibrils，MuscleNerve，3，335T339，1980．

22．EST服用中のDuchenne型筋ジストロフィー症患児におけるnaturalkillerおよびantibodydependentcellmediatedcytotoxicity活性の変動について

3）杉田秀夫：進行性筋ジストロフィー症の発生病理の解明と新治療法の開拓，脳と発達，15．100−
1041983．

proteaseinhibitor，On antibody formationin

mice，Biochem．Bipohys．Res．Commun．118，117−123，1984．

4）Toy0−Oka．T．，Shimizu，T．and Masaki，T．：

7）Amamoto，T．，Okazaki．T．．Komurasaki，T．，

Inhibitionofproteolyticactivityofcalciumac−

Hanada，K．andOmura，S：EffectofE−64．thiol

tivated neutralproteasebyleupeptinandanti−

proteaseinhibitor，Onthesecondaryanti−SRBC

pain，Biochem．Biophys．Res．Commun．，82，484−

responsein viETT），Microbiol．Immuno1．，28，85−

491，1978．

97，1984．

5）Goldfarb，R．H．，Timonen，T．andHerberman，

8）Amamoto，T．．Okazaki，T．，Komurasaki，T．，

R．H．：Productionofplasminogenacitivatorby

Oguma，K．，Tamai，M．，Hanada，K．and Omura，human natural killer cells．Large granular

S．：Immunopharmacologic profiles of a thiol

lymphocytes，J．Exp．Med．，159，935L951，1984．

proteaseinhibitor．L−TnlnSrDicyclohexyl epo−6）Amamoto，T．，Okazaki，T．，Komurasaki．T．，

XySuCCinate，Japan．J．Pharmaco1．，34．335−342，

Hanada，K．andOmura，S．：EffectofE−64，athiol

1984．

151

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究班
班 員 および関係者名簿
氏

名

施

設

名

所

在

地

主任研究者
今堀 和友 （班長） 東京都老人総合研究所〒173 板橋区栄町35−2

分担研究者
江橋 節郎

岡崎国立共同研究機構生理学研究所〒444 岡崎市明大寺町字西郷中38

杉田秀夫

国立武蔵療養所
神経センター 疾病研究第一部〒187 小平市小川東町4−1−1

勝沼信彦

徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素化学部門〒770 徳島市蔵本町3−18−15

西塚泰美

神戸大学医学部第二生化学〒650 神戸市中央区楠町7−5−1

福原

武彦 （
幹事） 東京慈恵会医科大学第二薬理学〒105 港区西新橋3−25−8

国立武蔵療養所
神経センター 機能研究部〒187 小平市小川東町4−1−1〒213 川崎市宮前区野川1430

北川

実験動物中央研究所
晴雄（監事） 千葉大学薬学部
薬効 ・安全性学講座薬物学

寺尾寿夫

帝京大学医学部第一内科〒173 板橋区加賀2−11−1市原明

徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素病理部門〒770 徳島市蔵本町3−18−15

宮武正

新潟大学脳研究所 神経内科

〒951 新潟市旭町通一番町757

柴田宣彦

大阪府立成人病センター 第一内科

〒537 大阪市東成区中道1−3−3鈴木紘一

東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報部門〒113 文京区本駒込3−18−
22

野 々村禎昭東京大学医学部第一薬理学〒113 文京区本郷7−3−1

石原博幸

国立療養所東埼玉病院〒349−
0 1 蓮田市大字黒浜4147

大関

正弘 （
幹事） 大正製薬㈱ 総合研究所

小沢鋲 二郎野村

達次〒280 千葉市弥生町1−33〒330 大宮市吉野町ト403

沢田 二郎

大正製薬㈱ 総合研究所〒330 大宮市吉野町1−403

会沢

大正製薬㈱ 開発部

〒171 豊島区高田3−24−1

国立武蔵療養所 神経セ ンター〒187 小平市小川東町4−ト1

微生物化学研究所〒141 品川区上大崎3−14−23

国立武蔵療養所
神経セ ンター 微細構造研究部〒187 小平市小川東町4−ト1

孝雄

班友里吉栄二 郎青柳高明

埜 中 征哉