厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究

杉田班

平成元年度研究報告書

平成2年3月（1990年）

研究報告書の作成にあたって
厚生省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究」班が昭和59年に結成され，その研究活動が開始されてから本年（平成元年）は2期日の最後の年にあたり，今年をもって本研究班は終止符を打つ事になります．その間不肖，私が班長として研究班のお世話をしてまいりワーク
ショップ，或いは班会議におきましてその成果がまとめられて参りました．本年度も研究報告書を完成し得ました事は，顧問の先生方，班員ならびに共同研究者各位の絶大な努力に負うものであり深い敬意を表したいと思います．
本年度本報告書に集録された成果はいずれも国際的に水準の高いものであり，過去3年間の成果のつみ重ねにより筋ジストロフィー症及び関連疾患としてのミトコ
ンドリア脳筋症の分子生物学的研究は目ざましく進歩し，病態に関する幾つかの核心に迫る問題点が明らかにされつつあります．
本年度も「一日も早い」治療法の開発を待ちわびながら幾多の息児の尊い生命が失われた事に対し深い哀悼の意を表しますと共に本研究班が組織の上では終了致しますが今後の班長の皆様の断えざる研究に大いに期待したいと思います．
本研究班を活動の場として多くの若い研究者が本疾患研究にその情熱と意欲をかきたてて参りました事はまことに喜ばしい事であり，来年度も引続いて新しい班組織が実現される様に努力し，また関係各位の御援助を切に願うものであります．
本研究の推進に賜った厚生省，国立精神・神経センター，並びに日本筋ジストロ
フィー協会の深い御重力，御支援と御理解に深く感謝致します．

平成2年3月く班長〉杉 田 秀 夫

目次

平成元年度総括研究報告

7

分担研究報告

13

Ⅰ．臨 床

21

Ⅱ．生 化 学53

Ⅲ．遺 伝 子77

Ⅸ．ジストロフィン

101

Ⅴ．mdxマウス

125

Ⅵ．培養・再生161

Ⅶ．ミトコンドリア（1）183

Ⅷ．ミトコンドリア（2）223

Ⅸ．ミトコンドリア（3）251

平成元年度研究班名簿279

平成元年度

総括研

究報告

総括研究報告
班長

杉

田

秀

夫

〔はじめに〕
本研究班は進行性筋ジストロフィー及び関連疾患として，特にミトコンドリア脳筋症の病態及び病因の解明と治療法の開発を目標とし，内外の分子生物学の進歩に伴い3年間の間に幾つかの飛躍的な成果をあげる事が出来た．本年が研究斑の最後の年でもあり過去3年間の研究成果を総括し，今後研究を進めて行く上で重要な意義を持つと考えられる2，3のトピックスについて述べる．

〔Ⅰ．3年間の研究班の研究目標と成果〕
A．進行性筋ジストロフイ⊥
1）デュシャンヌ型（DMD）
DMD，BMDの病因が分子レベルで解明された．即ちDMD遺伝子cDNAのN末端付近の一部から予測されるペプチドに対するポリタロナール抗体は，骨格筋，心筋の表面膜のみを認識する事がわかり，DMD遺伝子産物，ジストロフィンは筋表面膜
又はそれと密接に関連している物質である事が明らかになった．またこの抗体は
DMDの骨格筋，心筋表面膜とは全く反応しない事からDMDは骨格筋表面膜におけるジストロフィンの欠損する疾患である事が確認された．
この発見は従来から提唱されて来たDMDの病因に関する 膜異常説を分子レベルで実証した事になり，DMDの病因の解明にむけて 逆遺伝学 がもたらした成果は高く評価されよう．
またDMD患者に認められる心筋障害は心筋におけるジストロフィン欠損がその原因と考えられ，心筋障害は二次現象ではないと想定される．
2）DMD保因者
従来DMD保因者の発見には血清CK活性が用いられ，約70％の症例で異常高値が認められている．血清CK値が上昇し，軽度の筋力低下が認められるmanifested
carTierではジストロフィンの免疫染色では陽性，陰性，部分染色の3種，即ちモザイク状を呈LLyon仮説が分子レベルでも証明された．筋細胞はジンキチウムを構成するので大部分の筋繊維は 部分染色 が期待されたが10％以下と少なく，陽性，−9−

又は陰性繊維が大部分であった．また陰性繊維が多くなるに従って臨床症状が強く発現する傾向があり，今後保因者発見の一法となろう．
遺伝子による保因者検出法はDMDcDNAプローブを用いDMDの約60％について欠矢が認められている．
3）ベッカー型（BMD）
BMDはDMDとallelicな疾患であると考えられるが検索したBMD仝例でジス
トロフィンは骨格筋表面膜上に弱くかつ部分的（patchy）に発現された．
これらの症例についてジストロフィン分子量，含量を比較検討した．分子量は大部分の症例で正常の400kDより小さい．
Immunoblotによって得られたジストロフィン量は正常の5−60％と幅広く，分子量との間に一定の傾向はなく，免疫染色のデータとも一致しなかった．
菌床症状と関連があるのはジストロフィンの分子量ではなく含量であり，正常の20％以上存在する症例は進行が遅く臨床経過は良好であり，10％以下の症例では進行が速い事が明らかになり，ジストロフィン含量の測定は予後判定に重要な意義を有する事がわかった．
4）その他の神経・筋疾患
DMD，BMD以外の遺伝子性，後天性神経・筋疾患は全て正常筋と全く同じような
ジストロフィンの発現が認められた．唯一の例外は福山型先天性筋ジストロフィーと臨床的に診断された症例の中にまれではあるがジストロフィンが全く発現していない例のある事が兄いだされ，今後検討を要すると思われる．
5）ジストロフィンの臨床応用
ジストロフィン抗体による免疫染色は臨床的に①DMDとBMD，②DMDと肢帯型筋ジストロフィー，③DMDと福山型先天性筋ジストロフィー，④DMD女性保因者と女性肢帯型の鑑別等に有効であり，今後進行性筋ジストロフィーの鑑別診断上
血清CKと共に重要な検査法となろう．またBMDの場合ジストロフィン含量の測定は予後判定上有益である．
B．ミトコンドリア脳筋症
ミトコンドリア（mt）脳筋症は臨床症状の多様性を特徴としているが，本研究班の本邦における症例の分析ではその過半数は進行性外眼筋麻痔（CPEO）を含む
KearnS−Sayre症候群（KSS）であり，ついでMELAS，MERRFの順となっている．ミトコンドリア内の蛋白合成は核DNAとmtDNAの両者に影響される複雑性−10−から，その病因や病態の遺伝子レベルでの解明は容易ではない．
当研究班月によりmtの全ゲノムをカバーする28種類の遺伝子プローブが確立され，KSS症候群の約60％でmtDNAの部分欠夫を示す事が明らかになった．またCPEOの母娘例で共通部分を含む欠失例が報告された．
KSS症候群についての詳細な遺伝子解析の結果，此等の症例の中には全く同じ配列（directrepeat）間に起こった複製上の誤り（slippedmisparing）によるもの，
相同性は高いがdirectrepeatが認められない症例，或は一種類の欠失ではなく，多種類の欠失，即ち多重欠夫の症例も報告された．
MELASに関してはミトコンドリアの明らかな欠夫は報告されておらず，クローン化した筋細胞について分子遺伝学的検索が続けられ，複合体ⅠⅤ欠損筋細胞でサブユニット6のmRNAが明らかに減少しており核DNAの異常が予測された．
当研究班の福原班眉によって初めて記載された福原病，MERRFは遺伝形式からはmtDNAの異常が強く示唆されるが，まだ明らかなmtDNAの異常は発見されていない．ミトコンドリアの遺伝子の異常が病因として推定されていたLeber病については白人症例について点突然変異が報告されたが，本症例についても白人同様塩基番号11，778の位置がGからAへの置換が認められ，この為にNADH dyhydr0−
genaseのサブユニット4の340番のArgがHisに置換している事が明らかになり，
人種を越えた塩基変異が本症の病因と断定し得ると考えられる．
〔ⅠⅠ．未解決の問題点〕
A．進行性筋ジストロフィー
1）ジストロフィン欠損と筋壊死
DNDにおけるジストロフィン欠損がどのような機序で進行性の筋壊死，筋萎縮をもたらすかは完全には解明されていない．BMDはDMDと異なり，不完全ではあるがジストロフィンが発現する事がわかり，この事がDMDより予後が良好である事をある程度説明できると思われる．しかし免疫組織化学で認められるいわゆる pat−Chy な染色の機序はなお不明であり，今後の課題である．
更に同じジストロフィンが欠損していてもmdxマウスでは筋力低下は進行しない．両者の臨床経過の著しい差異がいかなる理由によるかを明らかにする事はDMD
治療法開発の重要な鍵になろう．
2）治療法開発へのアプローチ−11−

DMDにおけるジストロフィン欠損は遺伝子異常（60％は遺伝子部分欠失）による事が明らかになり，従って当面根本治療は望めない．
現在2つの対症療法が考慮されている．
①正常筋芽細胞注入法
正常筋芽細胞を患者筋肉に注入する事によりジストロフィンを発現させる事を目的としているが，注入細胞の数，注入時期，拒絶反応など解決すべき問題点が多い．
②蛋白分解酵素阻害剤
現在厚生省薬務局新薬開発班で二重盲検法で検討中である．
3）その他の筋ジストロフィー
ジストロフィン抗体の免疫染色，immunoblot法を用い従来臨床的に診断された
筋萎縮性，特に肢帯型筋ジストロフィーを再検討する必要があろう．
DMD，BMD以外の進行性筋ジストロフィー，例えば肢体型および福山型先天性筋
ジストロフィー，顔面・肩肝・上腕型に関してはその原因は依然として不明であり連鎖解析も進んでいない．DMDとのアナロジーを考えるならばジストロフィン以外の蛋白欠損による筋表面膜異常が考えられるが，推定の域を脱していない．
B．ミトコンドリア脳筋症
1）ミトコンドリア脳筋症の臨床症状は複雑且つ多様であり，その理由として①
異常発現臓器の多様性，②酵素活性の時間的変動が挙げられる．この2つの嘩徴が合理的に説明できれば病態解明は大きく前進するであろう．
2）ミトコンドリアDNか核ADNAかCPEOを含むKSS症候群では高頻度にmtDNA異常が認められ且つ正常のmtDNAと決矢を持つ異常mDNAが混在（heteroplasmy）しているが，MERRF，
MELASの臨床的特徴を合わせ持った症例で小さい欠矢が兄いだされ，そしてその異常mtDNAは単独で存在していた（homoplasmy）．また，MELASでは複合体1のサブユニットに異常があるとの報告がある．一方MERRFに関しては遺伝子レベルの研究は全く進んでおらず，今後に残された課題である．
3）治療に関して
当研究班月の研究によりCoenzymeQlO（CoQ）の大量療法がKSS症候群に対し臨床症状，検査所見の改善効果を持つことが明らかになった．最近KSS症候群以外のミトコンドリア脳筋症に対しても有効であるという報告もあり，今後の検討が必要であろう．
−12−

担

研

究

分

報

告

目

次

Ⅰ．臨床
1）Emery‑Dreifuss型筋ジストロフィにおける脊髄前根の変化について−他の神経筋疾患との対比から−

23

東京都立神経病院

田邊等2）常染色体劣性遠位型筋ジストロフィーの骨格筋CT像
東邦大学医学部第四内科

栗

原

28

照

幸

3）筋緊張性ジストロフィーにおける筋萎縮分布−CTによる検討−東京医科歯科大学医学部神経内科

33

塚

越

廣

4）神経筋疾患におけるUltrasound Imaging−実画像のデジタル処理−
北海道大学医学部神経内科

40

田

代

邦

雄

5）Lysosomal glycogen storage disease without acid maltase deficiency

3症例の組織化学的，生化学的検討
鹿児島大学医学部第三内科

46

納

光

弘

Ⅱ．生化学

6）絶食−再摂食時に於ける骨格筋速筋と遅筋のエネルギー代謝
信州大学医学部第三内科

庄

司

進

一

山

田

和

廣

7）ラット骨格筋収縮の燐NMR

55

59

大分医科大学生理学教室

8）ヒト正常および筋ジストロフィー骨格筋におけるCa依存性
プロテアーゼおよびそのインヒビターの局在および動態について
熊本大学医学部第一内科

荒

木

淑

郎

9）ラット培養筋細胞におけるリソソームの動態
順天堂大学医学部生化学第一講座

67

木

南

英

紀

10）筋ホスホフルクトキナーゼ欠損症における酵素異常について
大阪大学医学部第二内科神経内科

15

62

垂

井

清一郎

73

Ⅲ．遺伝子11）CANP遺伝子の発現調節と機能

79

東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部

鈴

木

紘

一

12）Kennedy‑Alter‑Sungの症候群の遺伝子解析

金沢大学医学部神経内科

85

高

守

正

治

13）ジストロフィンおよびアセチルコリン受容体mRNA発現に対するカルシトニン遺伝子関連ペプチドの修飾に関する研究
金沢大学医学部神経内科

高

守

正

88

治

14）女性筋ジストロフィー患者に関する細胞遺伝学的並びに分子遺伝学的検索
東京医科歯科大学難治疾患研究所遺伝疾患部門 斎 藤 深美子

9115）進行性筋ジストロフィー非定型例の遺伝子欠失部位の解析

96

東京都臨床医学総合研究所臨床遺伝学

鈴

木

義

之

Ⅳ．ジストロフィン

16）Duchenne型筋ジストロフィーの異常遺伝子産物（ジストロフィン）の二次元電気泳動での検出
103(財)東京都神経科学総合研究所神経生化学

堀眞一郎17）悪性肢帯型筋ジストロフィー症の骨格筋におけるジストロフィンの証明

107

徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

臣

18）Dystrophin：Becker型筋ジストロフィーにおけるdystrophinの分子異常並びにヒト臓器におけるdystrophinの局在について
熊本大学医学部第一内科

荒

木

淑

郎

19）ベッカー型筋ジストロフィーの筋病理−ジストロフィン・テストで確定診断された20例の検討−
国立精神・神経センター神経研究所

杉

田

秀

16

杉

田

秀

116

夫

20）ジストロフィン分子におけるC末端ドメインの臨床的意義
国立精神・神経センター神経研究所

112

121

夫

Ⅴ．mdxマウス

21）mdxおよびcontrolマウスの液体ヘリウム急速凍結骨格筋のfreeze fracture，deep etching，rotary shadow replica法による細胞膜裏打ち構造の研究

127

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

22）mdxおよびcontrolマウスの生後早期における骨格筋細胞膜内
orthogonal array密度について132

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

23）mdxマウス下肢骨格筋のSR‑T membrane systemおよびdipeptides
136

聖マリアンナ医科大学第二生理学教室

吉

岡

利

忠

24）mdxマウスの筋小胞体機能（続報）
虎の門病院神経内科

141

高

木

昭

夫

吉

田

瑞

子

照

幸

25）mdxマウス骨格筋内のCaイオン濃度
国立精神・神経センター神経研究所

14526）mdxマウスの膜電位低下とミオトニー，及びその治療
東邦大学医学部第四内科

栗

原

147

27）「Immobilization」によるmdxマウス筋変性への影響−Local tetanus法による検討−
東京都立神経病院

151

田

邊

等

28）mdxマウスの筋再生能（2）マーカイン局注後の筋再生に及ぼす除神経の影響
鳥取大学医学部神経病理

中

156

村

晴

臣

Ⅵ．培養・再生29）ヒト培養筋細胞の発達に対する筋収縮活動の影響
東京医科歯科大学医学部神経内科

塚

163

越

廣

30）カルシトニン遺伝子関連ペプチドによる筋芽細胞の分化誘導
徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

31）損傷筋組織におけるトランスフェリンについて
東北大学医学部神経内科

172

高

瀬

貞

夫

32）ジストロフィー筋への正常マイオブラストの注射に関する研究
帝京大学医学部第一内科
17

168

臣

寺

尾

寿

夫

177

Ⅶ．ミトコンドリア（1）33）ヒトミトコンドリアDNA・Dループ領域の塩基配列の解析
国立遺伝学研究所

宝 来

185

聰

34）シトクロム酸化酵素小サブユニット遺伝子のクローニングとその発現様式
順天堂大学医学部脳神経内科

190

水

野

美

邦

35）MELASクローン化筋細胞の分子遺伝学的検索
自治医科大学小児科

194

桃 井 真里子

36）Leber病家系におけるミトコンドリア遺伝子解析
新潟大学脳研究所神経内科

宮

198

武

正

37）慢性進行性外眼筋麻痺におけるミトコンドリアDNA多重欠失のPCR法による分析
名古屋大学医学部神経内科

杉

村

公

202

也

38）ミトコンドリアミオパチーのミトコンドリアDNAの解析−Kearns‑Sayre‑Shy症候群の一例について−
九州大学医学部脳研神経内科 後

207

藤

幾

生

39）ミトコンドリア遺伝子病とミトコンドリアDNA変異のタイプ
名古屋大学医学部第二生化学

小

澤

高

40）Kearns−Sayre症候群における異常ミトコンドリアDNAの解析
大阪大学医学部第二内科神経内科

垂

井

212

將
218

清一郎

Ⅷ．ミトコンドリア（2）41）MERRFの臨床知見補遺

225

国立療養所犀潟病院神経内科

福

原

信

義

42）ミトコンドリアミオパチーの31P MR spectroscopyによる検討
北海道大学医学部神経内科

田

代

邦

雄

孝

彦

234

43）Complex Ⅰ欠損症によるLeigh脳症と思われる2例
国立療養所字多野病院臨床研究部神経内科

斉

田

229

44）高カルシウム血症とミオトニア様の手拳開排困難をきたした
238

mitochondrial neuromyopathyの1例
東北大学医学部神経内科

18

高

瀬

貞

夫

45）ミトコンドリア脳筋症における下垂体機能異常
筑波大学臨床医学系神経内科

金

243

澤

一

郎

46）チトクロームc酸化酵素部分欠損−筋線維ときほぐし標本による検討−

国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部

247

埜

中

征

哉

Ⅸ．ミトコンドリア（3）47）家族性ミトコンドリア・ミオパチーにおけるミトコンドリアDNAの解析：non‑D loop領域の多重欠失について

筑波大学臨床医学系神経内科

253

金

澤

一

郎

48）ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリアDNAの欠失
順天堂大学医学部脳神経内科 佐 藤猛49）多重欠失を伴いミトコンドリアDNAの減少のみられた
優性遺伝の疑われるミトコンドリアミオパチーの一例
順天堂大学医学部脳神経内科

水

野

263

美

邦

50）慢性外眼筋麻痺症候群におけるミトコンドリアDNA異常と臨床像・筋病理所見との対応
国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部

埜

中

259

征

267

哉

51）Kearns‑Shy症候群におけるdeleted mtDNAの組織分布とRNA転写について271

東京大学医学部神経内科

19

清

水

輝

夫

Ⅰ．臨

床

1）Emery−Dreifuss型筋ジストロフィーにおける脊髄前根の変化について−他の神経筋疾患との対比から−
田

研究協力者

目

遽

等＊

宮 本 和 人＊＊ 磯崎 英 治＊＊ 林

高 元 喜代美＊＊ 神

田

的

隆＊＊＊

については，有髄線維直径に対する髄鞘の内径のEmery−Dreifuss型筋ジストロフィー（ED）の筋病理像の解釈や，筋電図所見の解釈において従来から筋原性と神経原性変化の種々の程度の混在が指摘されている1）．剖検例での報告でも脊髄前角及び前根に異常がなかったとする原らの報告2）と，前角に異常が見られたとする工藤らの報告3）があり，一定の見解が得られていない．本症が骨格筋自体に変性が起きる疾患であることは間違いがないと思われるが，その並存する神経原性変化の責任病巣を同定するため，脊髄前根の形態学的変化及び定量的計測を実施した．急性脳血管障害（CVD）を対照群とし，四肢の脱力と筋萎縮が軽い
筋萎縮性側索硬化症（ALS）も比較検討した．
対象および方法
EDl例（高元らにより報告4）：筋電図上も神経原性変化と筋原性変化の混在が確認されている），
CVD2例，ALS2例，の合計5例の剖検時採取した第7頸髄前根（C7），第2胸随前根（Th2），第3腰髄前根（L3），膵腹神経，大腿四頭筋を主な検索対象とした．
方法：通常の病理組織学的検索に加えて，脊髄前根及び末梢神経を2．5％グルタール固定後，エポンプロック作成，0．5JJ切片をトルイジンブルーで染色し，デジタイザーとパーソナルコンピュータ
ーで短径を計測しヒストグラムを作成した．一部＊東京都立神経病院＊＊東京都立神経病院神経内科＊＊＊東京都立神経病院検査料病理理 之＊＊比すなわちG−ratioを計測した．更に各前根横断
面総endoneurialareaの面積を計測した．筋組織については凍結切片で通常の組織化学的検索を行
った．
結

果

まず，ED例の筋病理所見で，支配神経として
C7成分が関与している上腕三頭筋について述べ
ると，H−E染色で正常大線経と萎縮線経よりなる
中等度の大小不同を認める．萎縮線経は小角化線
経の散在と小数のPNCが認められる．問質に軽度の脂肪浸潤と線推化を認め，また小数の再生線
経と横断面円形化を呈する線椎も認められる．ただし，明瞭を壊死線推，炎症細胞浸潤は認めない．
ATPase活性像にて小規模なfiber type group−
ingが認められる（図1a，l b）．支配神経として
L3成分が関与する大腿直筋では，筋線推直径に
軽度の大小不同を認め，その内訳は小群集萎縮と小角化線経の散在と思われる．また，問質に軽度ないし中等度の線維化と脂肪浸潤を認め，非萎縮線経で横断面円形化が認められ，病理組織学的にも神経原性変化と筋原性変化の混在が示唆される（図l c，1d）．短月井骨筋では，問質の脂肪浸潤や線維化は殆ど認められず，小角化線経の散在及び一部群集が認められ，更に明らかなfiber typegroupingが認められる．この筋では筋原性変化の所見に乏しく，神経原性変化が中心と考えられる（図1e，l f）．栂指球筋では大小不同が認められるが，萎縮線経も直径30JJまでで高度の萎縮線維−23−

はなく，小角化線経も認められず，多くの線経は g，l h）．傍脊柱筋を凸側と凹側で採取し観察した
横断面円形化を呈している．又，ATPase活性像 が両方とも変化がきわめて強く，殆ど月旨肪組織とでは，typelatrophyが明瞭に認められる（図1 線雄性結合織により置換されている．以上，観察−24−

した範囲では筋組織の変化は傍脊柱筋に最も強く，
大腿直筋・上腕三頭筋・上腕二頭筋で中等度であり，把持球筋・短排骨筋等の遠位筋では比較的軽度であった．なお，変化の内容を質的に見ると，傍脊柱筋では変化高度のため判定不能，上腕三頭筋・上腕二頭筋・大腿直筋では神経凰性変化と筋原性変化の混在，遠位筋では短勝骨筋と拇指球筋で異なり，短排骨筋は殆ど神経凰性変化，拇指球筋はいわゆる筋原性変化で横断面円形化とtypel
atrophyが中心で従来Emery−Dreifuss症に典型的と言われた5）所見を呈していた．
C7前根で，myelinovoidやmyelinの極度に罪薄化した線経も見あたらない（図2a）．有髄神経密度は5214／mm2で対照例と差はないが，ヒスト

G−ratioの正常値は0．6±0．1とされ，対照群ではほぼその範囲に納まるが，Emery−Dreifuss例
でG−ratioが正常範囲より高い，すなわち髄鞘の罪薄化した線経と逆にG−ratioの低いすなわち
axPnalatrophyを示す線経が幾分増加している．
ALS例ではこれらの異常線経の出現頻度が更に高い傾向にあった（図3）．
また，本症例の脊髄前角の観察では，一般病理
形態異常は指摘できなかったただし，mOr−phometric studyは今後の課題である．
考察

グラムでは9J から12／Jの大径有髄線経が減少
し，4ないし7JJの中径の線経が相対的に増加して，正常例の様な二峰性分布パターンは消失し，EmeryTDreifussの剖検例で骨格筋の病理組織像は，①変化が高度で筋組織全体が脂肪織と結合織に置換され，筋原性変化なのか神経原性変化なのか不明な筋，②神経原性変化の強い筋，③筋原性変化の強い筋，④神経原性変化と筋原性変化が6J 付近にピークを有する一峰性パターンとなり，明らかに対照症例とは異なる（図2b）．Th2
前根では，交感神経節前線椎が出るため，小径線
経が非常に多い．この部位の大径有髄線経は肋間筋や傍脊柱筋を支配すると考えられる．この分節ほぼ同等に認められる筋組織があったが，検索した範囲で正常像を呈したものはなかった．
前根の病理形態的観察では，明らかな脱髄像や再生像は見られないが，ヒストグラムでは大径有髄の相対的減少＿と中径線経の増加を認める．原ら

でも，meylinovoidやclusterは認められないが，9JJ以上の大径線経が観察されない（図2C）．ヒ
ストグラムでも大径線経が相対的に減少しているの報告で脊鹿前根は正常だと結論付けているが，傾向が示唆された（図2d）．L3前根のヒストグラ
ムでは対照例のパターンに近く，C7前根やTh2前根に比して変化が軽度であると思われた く図2e，f）．

参考のため球麻痺症状が強く四肢の筋萎縮は比較的軽度であったALS例のC7前根を観察すると，明らかに有髄神経密度が低下し，大径有髄神経が殆ど消失し，残存する神経もmyelinの非薄化した線椎や逆に線維直径に比してaxonの直径の少ないaxonal atrophyを呈する線経が多い。
ただし，明らかなclusterやmyelinovoidと思われる異常は観察した範囲では少なかった（図2g）．ヒストグラムでも，有髄神経密度の軽度の減少と大径有髄神経の減少と中径線椎の増加が認められ正常の二峰性分布は消失し，5JJ付近を頂点とする一峰性分布を呈した（図2h）．

わ〔ストグラムをみると筆者等のヒストグラム
同様∴対照と比べて大径わざ−クか2〃程度左方偏位を示しており，その結論には若干の疑問が残る．脊髄前角の病理形態的観察では明らかな異常は認めない．四肢の筋萎縮が軽度のALSの観察で，やはり大径有髄神経の相対的減少が認められ，Emery−Dreifuss例の前根q）障害棒式に似ていると思えた．G−ratioの測定からもaxonalatrophyと髄鞘の罪薄化の両要素が認められ，ALS例の前根の観察結果と一致する．これらの÷とから，
Emery−Dreifussでの前根大径線稚め減少の原因
として，前角障害によるdyingback的prdcessを想定した．
一部のDuchenne型筋ジストロフイや筋緊張性
筋ジストロフイの報告では，脊髄前角細胞の数的減少や大きさの減少が指摘され6）・7），その神経の標的臓器がなくなったための一種のdisuseatrophyによるものと論じられているが，Emery−Dreifuss−25−

MYEuNATED NERVE F旧ER DJAMETERIN MICRON

図2
−26−

C肌TROL C7

結6・MT10

Gl・0

○

ロ ロ
ロ8 ロ
ここ …＝＝二幸

0．0

Emery−Dreifussの1例で，筋電図的，筋病理組
織学的に神経原性変化と筋原性変化の混在を認め

ロ
牽享た．その例において，脊髄前根で大径有髄線経の軽度の減少を確認した．

ロ

0．6

ロ

0．●

G −0 ．6 7 土0 ．1 0

文

0．2

0

論

4

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献

1）RowlandLP，FetelMetal：Emery−Dreifuss

1皇

16

Dl川ml

pm

musculardystrophy．AnnNeuro15：1117117，
1979．

nbロ

muscular dystrophy−An autpsy case．J

〇

〇
〇

品が一㌔

8
〇

2）Hara H，Nagara H etal：Emery−Dreifuss
NeuroI Sci79：23−31，1987．
3）工藤秀明，谷野定之他：Emery−Dreifuss型筋萎縮症（性染色体劣性遺伝，心筋症を伴う肩甲下腿型筋萎縮症）における脊髄病変．脳と発達14：363−369，1982．

4）Takamoto K，Hirose K et al：A genetic

lardystrophywithhumeropelvicdistribution，

ロ
○
口匂ロ

−

earlyjointcontructure，andparmanentatrial

paralysis．ArchNeuro141：1292−1293，1984．

田

ロ

4
0

ロ ︻HU

㍍㌔亀雫︒

VariationofEmery−Dreifussdisedse．Muscu−

205）HopkinLC，JacksonセA et al：Emery−
Dreifuss humeroperoneal

G霊0．62土0．16

muscular dystro−

phy：An X−1inked myopathy with unusual
COntraCtureS and bradycardia．Ann Neurol

図3

lO：230−237，1981．し6）TomlinsoLnBE，WaltonJNetal：Spinalcord
例では筋電図的にも明瞭な神経原性変化の要素を捉えていることから，本質的に神経原性変化と筋原性変化の共存であると考えられた．

limbmotorneuronesinmusculaidystrophy．
J

Neurol￣Sci22：305」327，1974．

7）WaltonJN，IrvingDeta巨Spinal

cordlimb

motor neuronsin distrophia myotonica．J
NeuroI Sci34：199−211，1977．−−27−2）常染色体劣性遠位型筋ジストロフィーの骨格筋CT像
栗▼ 原 照 幸＊
研究協力者

吉 村 牧 子＊ 根 本
高 宮 活 之＊ 木 下

真

博＊
男＊

常染色体性劣性遠位型筋ジストロフィー（三好）は若年成人に発症し，下肢筋を主に障害する遠位型ミオバナーでその筋障害様式は下腿屈筋群が障
害されやすいという特徴があり1），これは病初期より臨床症状や骨格筋CTで下腿屈筋群のden−Sityの低下として認められている．
今回我々は，生検筋標本でraggedredfiber様所見やtypelpredominanceを認めミトコンドリ
アミオパテーも疑われたが，臨床像および骨格筋
CTにて診断しえた症例を経験したので，同胞の検索も含め報告する．

図1 家系図症例
症例1：29歳，男性，教師
主訴：歩行障害
既往歴：特になし

神経学的には高次機能，脳神経系，知覚系に異家族歴：父方曽祖父と母方祖母が兄妹という血族結婚で，同胞3人のうち長姉も発症し，双胎の次姉にも高CK血症を認める（図1）．
現病歴：出生，運動発達歴は正常であった．18
歳頃に運動後，つま先立ちができないことに気づく．近医整形外科を受診するも原因不明だった．
徐々に進行し歩行時に下肢に力が入りにくく，走るのが遅くなり，26〜27歳頃よりしゃがみ立ちにも不自由を感じるようになってきた．経過中，上肢の脱力は自覚していない．29歳時，精査目的にて当科入院となった．
入院時現症：身長171．5cm，体重64kg，一般内
科学的には異常を認めない．
＊東邦大学医学部第四内科

Pedigroe

常なく，深部腱反射正常，小脳症状も認められなかった．運動系では，筋力検査で排腹筋4／5，大腿屈筋群4／5，大腿四頭筋4＋／5，腸腰筋4＋／5と軽度の低下を認める以外正常，Gowers，sign（＋），かかと立ちはできるがつま先立ちはできなかった．
また下腿屈側優位に筋萎縮が下肢遠位部に認められた（図2）．
入院時検査所見：末梢血，尿，便異常なし．血液
生化学では，TP6．1g／dl，albumin3．4g／dl，GOT
51U，GPT63U，LDH352U，BUN13mg／dl，creatininO．7mg／dl，UA8．7mg／dl，T−Chol122
mg／dl，FBS85mg／dl，血清CKは3110Uと高度上昇（MM76％，MB6％，Alb0％，BB1％，
Bandl17％），血清myoglobin500ng／dl以上，al−dolase55．6U／Lと上昇，安静時血清pyruvateは
1．11mg／dlと正常上限，lactateは11．9mg／dlと正常であった．CRP（−），抗核抗体（−），75g−28−

図2 症例1の下肢像（前・後）大腿下1／3から排腹筋に著しい筋萎縮を認める．

OGTT正常パターン，前腕阻血下運動負荷試験，
エルゴメーター運動負荷試験では，lactate，
pyruvateは正常反応を示した．胸部レ線，心電図
異常なし．針筋電図では大腿屈筋群，下腿伸，屈かった．またcytochromeCoxidase（CCO）染色でも酵素欠損を示唆する所見はなかった．PAS染
色では陽性物質は認められず，電顕でもglycogenの蓄積はなかった．ATPase染色では約66％に筋，傍脊柱筋にshort duration，low voltageの筋原性変化を認め，一部fibrillationの混入を認めた．神経伝導速度は正常だった．

typelpredominanceを認めたが，他の神経原性変化は認められなかった．
骨格筋CT像：頸部，上腕の筋群は異常なく，

筋病理所見：左大腿四頭筋より施行．H−E染色
では筋線維大小不同，中心核の増加に加え，Opa・

paraspinal muscleには外側にごく軽度の低吸収域を認めた．腎筋は異常ない．大腿では大脇屈筋群に低吸収域，萎縮を認める他，大腿四頭筋にも軽度の変化を認め，縫工筋，薄筋はやや肥大傾向

quefiberも散見された．壊死線経，再生線経も散在していたが，VaCuOlationは認められなかった．
NADH染色で内部構築の乱れはない．Gomori−
Trichrome染色ではragged red fiber様所見が1％以下に認められたが，電顕ではミトコンドリ
アの集積をみたがクリステ等の微細構造に異常なを認めた．下腿では排腹筋，ヒラメ筋に著しい低吸収域を認めたが伸筋群はよく保たれていた．その変化は特にヒラメ筋で顕著であった（図3）．

一29−

化学では，TP7．5g／dl，albumin4．2g／dl，GOT34
U，GPT51U，LDH556U，BUN13mg／dl，T・Cho1
164mg／dl，BS99mg／dl，血清CKは1961Uと上昇（MM99％，MB1％，Alb0％，BB O％），血清
myoglobin1450ng／ml，aldolase39．6U／mlと上昇していた．
骨格筋CT像：Paraspinal muscleの最外側の腰肋筋に明らかな低吸収域，萎縮が認められ腎筋

図3群にも小低吸収域が散在していた．大腿では大腿四頭筋の変化が目立ち，屈筋群に比し低吸収域，萎縮が強かった．下腿では肪腹筋，ヒラメ筋に著しい低吸収域，萎縮を認めるが伸筋群はよく保た

症例1の骨格筋CT像
A：L3レベル
B：大腿最大径のレベル
C：下腿最大径のレベルれていて，右下腿の肪骨筋に軽度の変化を見るのみであった．症例1と同様ヒラメ筋の変化の方が膵腹筋より顕著であった（図5）．

症例2：35歳，女性，主婦
主訴．：階段昇降困雉
既往歴：特になし

考案

家族歴：症例1の姉
現病歴：18歳頃運動後につま先立ちができないのに気づいた．最初は1週間位で再びつま先立ちが可能となったが，徐々に症状が持続するようになる．その後お尻をつき出して歩くようになり，
29歳頃より走ることができなくなった．時々膝関

症例1，2ともに18歳頃につま先立ちができな
いことで発症し，脱力は徐々に腰帯筋まで進行してきた．遠位型筋萎縮にしては高度の血清CK値上昇を認めた．家族歴は常染色体劣性遺伝形式をとっている．症例1で施行した筋生検で，筋線維大小不同，中心核の増加，壊死及び再生線経の散節がカタンと力がぬけることがあった．32歳頃より階段昇降に不自由を感じるようになり，特に降りる時にかかとから先に足をつくようになってき在といったdystrophic changeの他にragged
redfiber様の所見を認めたことより，mitochon−

た．しゃがみ立ちも不便となったが，両上肢は日常生活で不自由はない．
初診時現症：体格中等度，一般内科学的には異常はない．
神経学的には高次機能，脳神経系異常なく，深部腱反射正常，知覚障害はない．小脳症状も認められなかった．運動系では，筋力検査で俳腹筋
4／5，大腿四頭筋4／5，腸腰筋3／5と低下していた．
それに加え，頸部屈筋4／5，三角筋4／5，握力（右）14．5kg，（左）10．5kgと上肢，頸部筋群も軽度低下していた．Gowers，sign（＋），かかと立ちはでき
るがつま先立ちはできなかった．また，大腿遠位部から下腿特に排腹筋に明らかな筋萎縮を認めた（図4）．
検査所見：末梢血，尿検では異常ない．血液生drialmyopathyも考慮されたが，1％以下であり電顕でも明らかなミトコンドリアの異常は検出されず，CCO染色でも酵素欠損を示唆する所見はな
かった．またglycogendebrancherenzymeの欠損でも成人型でdistal優位のmyopathyをきたす2）が，PAS，電顕にてもglycogenの蓄積はな
く，阻血下負荷試験の結果からも否定的であった．
常染色体劣性遠位型ジストロフィーの骨格筋CT像は，①下腿屈筋群が高度に侵され，伸筋群が保たれる．②大腿では屈筋，内転筋群とともに大腿四頭筋も障害されやすい．③縫工筋，蒋筋，長内転筋，大腿二頭筋，半膜様筋，大腿屈筋の＿∵部分が肥大し，こ高吸収城となる，①paraspinal
muscleでは進行例で外側から内側へ侵される，⑤腎では小腎筋に限局性の低吸収域を初期より認める，といった特徴が示されており3），今回の2例も−30−

図4 症例2の下肢像（前・後）大腿下1／3から肝腹筋に著しい筋萎縮を認める．

ほぼそれに見合った所見であり，以上より症例1，
2を常染色体劣性遠位型筋ジストロフィーと診断した．特に症例1，2ともに排腹筋の変化よりもヒラメ筋の変化の方が著明であったことが注目された．また，症例1では筋生検でtypel
predominanceを約66％に認めており，主にtypelfiberより成るヒラメ筋の変化が著しかったCT

図5

症例2の骨格筋CT像
A：Llレベル
B：恥骨結合上のレベル
C：大腿最大径のレベル
D：下腿最大径のレベル

所見との関連に興味がもたれた．従来の報告例では剖検例も含めいずれも進行例での検索が多く，ごく初期には排腹筋よりヒラメ筋の障害の方が先行する可能性がある．実際に症例1では徒手筋力テストでは大腿，下腿屈筋群の筋力は4／5〜4＋／5と比較的保たれているにもかかわらず，つま先立
ちやしゃがみ立ちができなかった．このようなと−31−

ころにヒラメ筋の筋力低下が反映されていると考⑥CTが筋萎縮の分布を示し診断上有用である．

えられる．

⑤筋生検でmyopathyはあるがrimmed

ところで，本疾患のしゃがみ立ちについて福田

VaCuOleがなく，glycogenの蓄積がないこと．

らは他の筋ジストロフィーとは異なり，足首を支え手を膝につかずに前へ体重をかけて立ち上がる

文

献ことに注目している4）．っまり本疾患では腰帯筋

1）MiyoshiKetal：Autosomalrecessivedistalの筋力は割合保たれているにもかかわらず下腿屈muscular dystrophy as a new type of

筋群，特にヒラメ筋の脱力と萎縮が初期よりみらprogressive muscular dystrophy．Seventeen

れるためCaSeSineightfamiliesincludinganautopsied

Gowerssign

も他のmyopathyと異なっていると考えられる．このような筋萎縮の分
布が骨格筋CTによって明らかにされ，診断上も有用であった．

CaSe．BrainlO9：31，1986．

2）納光弘ら：Debrancher deficiency

myopathy−inclusion body myositisあるいはrimmedvacuoleを伴ったdistalmyopathyとまとめの関連． 筋ジストロフィー症の発症機序に関す

1）常染色体劣性遠位型筋ジストロフィー症（三好）の一家系2症例を報告した．
2）本疾患の診断には次の5項目が大切である．
①18歳位から下腿屈筋群の脱力より始まってつ
ま先立ちができないという病歴を有すること．
②常染色体劣性の遺伝歴．
③CKがdistalmyopathyであるのに高値を示
す．

−32−

る臨床的研究 （三好珪），昭和57年度研究報告
書，1983，p255．
3）水沢英洋ら：常染色体劣性遠位型筋ジストロフ
ィーにおける骨格筋障害様式：臨床的ならびにCTによる検討．臨床神経27：177，1987．
4）福田恵一ら：三好型末梢型筋ジストロフィーにみられた特徴的なしゃがみ立ち．神経内科24：201，1986．

3）筋緊張性ジストロフィーにおける筋萎縮分布−CTによる検討−塚越庚＊

研究協力者 小田嶋 奈 津＊＊ 松 永 高 志＊＊ 古 川 哲 雄＊

は じ め に

筋緊張性ジストロフィー（以下MDと略す）におけるCT上の全身の筋萎縮分布については，
Bulckeら1）が12症例で計20スキャンを検討したのみである．また先天性筋緊張性ジストロフィー（以下CMDと略す）の筋CT所見の報告は未だな
い．CMDを含めMDの全身の筋萎縮分布について検討したので報告する．
対象および方法
対象はMD8例（32〜56歳，男性3例，女性5例）と生下時からの精神発達遅滞を主訴に受診し，ミオトニア現象を認め，母親をMDと診断した（1例は既に死亡しており，診察できなかった）
CMD3例（18〜31歳，男性2例，女性1例）の計11例である．
方法はGE社製CT9800を用い，G）下顎中央部，②第4，5頸椎間の椎間板，③気管分岐部下縁，④第3腰椎の椎体中央，（9恥骨結合上線より2〜3cm上方，⑥大腿中央部および⑦下腿の最大径部の7レベルで横断撮影した．撮影条件は120
kVp，140mA，スライス幅10mm，スキャン時間3秒に設定した．
下肢運動機能障害の軽い順にStagel（支え無しに階段昇降可能），Stage2（階段昇降に手すりを要す），Stage3（椅子から立ち上がりが支えな
しに可能），Stage4（椅子からの立ち上がりに支えを要し，独立歩行可能），Stage5（支え立ちは可能だが，歩行不能）に分類した．またCT上の＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊埼玉県障害者リハビリテーションセンター内科

各筋を図1の様に分類し，筋萎縮の強さを3段階に分け比較した．
また1例では33歳と38歳時の下月支CTを比較した．
結果

筋萎縮の画像上の変化は，（D筋内部への低吸収
城の浸潤と②筋面積の縮小である．これに対し筋肥大は，（∋筋面積の増大と②高吸収域で示された．
下肢機能障害の順に筋萎縮分布を図2と図3に示した．MD，CMDとも筋萎縮分布に明らかな違いを認めなかったため，両者を一緒に検討した．このうち症例1，2，9，10の4例は異常を自覚していなかった．
下顎部では噴筋と内側異突筋の筋断面積の縮小を，下肢筋萎縮を認めない例（症例9）も含め全例に認めた．
頸部では胸鎖乳突筋の著明な萎縮を仝例で認めた．脊柱直立筋および板状筋と横突辣筋の萎縮を
10／11例で認め，程度は直立筋の方が強い萎縮を示した（図4）．後頸筋のうち僧帽筋と肩甲挙筋は障
害を受けにくく，他の頸筋が萎縮した例では眉甲挙筋の肥大傾向を示した（図4）．最終的には頸筋
全体が脂肪に置き換えられた（図4）．
肩甲部では筋萎縮を傍脊柱筋10／11例で認め，さらに大胸筋6／11例，肩甲骨周囲筋である放下筋と肩甲下筋4／11例に認めた（図4）．
腰腹部では下肢筋萎縮をみないCMDの1例（症例9）で腹筋および傍脊柱筋の肥大を認めたが，残りの全例では腹筋と傍脊柱筋の萎縮を認めた．腹筋の中では特に腹直筋の萎縮が強く，4例
で脂肪に置き換わっていた．腸腰筋のみは障害を−33−

受けず，傍脊柱筋が高度に萎縮した2例では肥大傾向を示した（図4）．
傍脊柱筋萎縮程度のレベルによる違いは，頸部の方が強いもの，腰部の方が強いもの，レベルによる差が明らかでないものと種々あり，障害の受け方は一定しなかった（図4）．
腎部では大腎筋が障害を受けがたく最後まで残る傾向があり，萎縮を小腎筋7／11例，中腎筋5／11
例，大腎筋4／11例で認めた．
大腿筋萎縮は大腿四頭筋，特に大腿広筋の萎縮（6／11例）（内側から外側へ）から始まり，次いで大腿内転筋2／11例，半腱様筋2／11例，羊膜様筋
1／11例，縫工筋2／11例，薄筋2／11例の萎縮をみた．一方肥大を大腿直筋3／11例，内転筋2／11例，
二頭筋1／11例，半腱様筋1／11例，縫工筋1／11
例，蒋筋1／11例で認め，これらの筋肥大を認めた
図1

筋CTの模式図下顎部：1．M．masseter2．M．pterigoideus
medialis頸部：3．M． sternOCleidomas−
toideus4．M．levator scapulae5．M．trap−
ezius6．M．erectorsplnae7．M．splenius，M．
transversospinalis屑甲部：8．M．pectoralis
major9．M．bicepsbrachiilO．M．deltoideus
ll．M．triceps brachii12．M．infraspinatus
13．M．subscapularis14．M．erector spinae，
M．serratus superior．M．rhomboideus腹部：15．M．rectus abdominalis16．M．tran−
SVerSuS abdominalis，M．obliquusinternus
abdominis，M．obliquusexternusabdominis
17．M．iliopsoas18．M．quadratuslumborum
19．Mm．dorsi proprii腎部：20．M．gluteus
maximus 21．M．gluteus mininus 22．M．
gluteusmedius大腿：23．M．rectusfemoris
24．M．vastuslateralis25．M．vastusmedialis
26．M．vastusintermedius27．M．adductor
longus 28．M．adductor magnus 29．M．
SartOrius30．M．gracilis31．M．bicepsfemor−
is 32．M．semitendinosus 33．M．semimem−
branosus下腿：34．M．tibialis anterior
35．M．extensor digitorumlongus，M．
extensor hallucislongus36．M．peroneus
37．M．tibialis posterior38．M．soleus39．M．
gastrocnemius，Caputlaterale40．M．gas−
trocnemius，Caput mediale

−34−

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藍 3蟹 3篭
議彗＿誓3。
璧l盟：miIdatrophy．2国：rnoderateatrophy．3P：severeatrophy・H：hypertrophy
図2 筋緊張性ジストロフィーの筋CT所見−35−

1EZa：mjJdatrophy，2国：moderateatrophy，3r：severeatrophy，H：hypert，。Phy
図3

先天性筋緊張性ジストロフィーの筋CT所見のは，他の大腿筋萎縮が進行した3例であった．
下腿筋萎縮は俳腹筋内側頭（10／11例）から始ま幹の筋萎縮の程度と下肢筋萎縮とは必ずしも並行しなかった．

り，ヒラメ筋8／11例，膵腹筋外側頭7／11例，前脛骨筋4／11例，長指伸筋と長母指伸筋5／11例，
膵骨筋3／11例，後脛骨筋1／11例の萎縮を認めた．
特に後2着は障害を受けにくく，膵骨筋3／11例と後脛骨筋4／11例で肥大を認めた．この筋肥大の混在は大腿同様他の下腿筋萎縮が強いにもかかわらず独歩可能な例で認められ，筋萎縮の軽い例や，歩行不能例では認められなかった．

経過を追跡しえた症例7の33歳時（stage2）と35歳時（stage4）の比較では，下腿では後肪骨筋のみを残し，大腿では大腿直筋，二頭筋，半腱様筋，縫工筋および薄筋を残し筋萎縮が進行した．
残された筋の大部分は肥大傾向を示した（図5）．

大腿と下腿の比較では，下腿のみに病変が限局しているものは4例あり，下肢筋萎縮は遠位筋優位を示した．
以上の変化は左右ほぼ対称的であった．また下肢障害度で分類したstageの進行とともに，CT上の下肢筋萎縮も強くなっていた．頸苦βおよび躯

臨床症状の進行とともに，筋CT．も明らかな変化
を認めた．
考

察

MDのCT上の筋萎縮分布について，Bulcke
ら1）は胸鎖乳突筋，傍脊柱筋，腹筋，下肢遠位筋優位の萎縮を特徴として挙げた．これらの特徴は本研究でも同様に早期から認められた．本研究ではさらに多くのスキャンを検討した結果，彼らの所

−36−

症例2

症例7

症例8

頸部

国図四日
図4

症例2，7，8の頸部，肩甲部，腹部CT
頸部：症例2では肩甲挙筋（1）と僧帽筋（2）のみを残し，ほかの頸部は脂肪に置き換わり，症例8に比較して肩甲挙筋は肥大している．症例7では肩甲挙筋（1）の痕跡を認めるのみで他は全て脂肪に置き換わっている．症例8の後頸筋は直立筋（3）が脂肪に置き換わっている．肩甲部：症例2では傍脊柱筋（4）と左大胸筋（5）が脂肪に置き換わり，症例7では傍脊柱筋の痕跡を認めるのみで，残りの肩甲骨周囲筋は脂肪に置き換わっている．症例8では，左大胸筋の高度萎縮と傍脊柱筋に軽度
低吸収域の混在を認める．腹部：症例2は腹直筋（6）と傍脊柱筋（7），症例7では腹直筋，症例8では傍脊柱筋が脂肪に置き換わり，症例2と8の腸腰筋（8）は症例7に比較して肥大している．

「一・ェ忘
図5

症例7の下肢CT
33歳時大腿では内側広筋（1）と内転筋（2）に低吸収域の浸潤を認め，大腿直筋（3）のみは高吸収域となり，面積も増大し肥大している．下腿では後脛骨筋（4）のみを残し，前面の筋は中等度萎縮し，後面の筋は高度萎縮し，右に強い．38歳時には大腿では大腿直筋（3），二頭筋（5），半腱横筋（6），薄筋（7），縫工筋（8）のみを残し，下腿では後脛骨筋（4）のみを残し，他はほとんど脂肪に置き換わっている．これらの残った筋の大部分は33歳時に比較して形が丸くなり，むしろ面積も増大し肥大して
いる．
−37−

見に加えて新しい幾つかの知見を得ることができた．
従来MDの嘆筋萎縮についてCT上の検討はないが，本研究では下肢筋萎縮以前から両側唆筋
と内側異突筋の萎縮を認め，胸鎖乳突筋萎縮に加えて本疾患で早期に出現する重要な所見と考えられた．
MDの下肢筋萎縮は遠位筋優位であり，本研究で認めたCT上の筋萎縮あるいは肥大の分布は従来の報告1ト7）とほぼ同様であった．
一方，Bulckeら1）はMDの臨床的特徴として，
肩甲帯筋と腎筋は障害を受けにくいと報告したが，CTでは検討していない．本研究で腎筋，特に大腎筋は障害を受けにくいことを確認したが，肩甲帯筋と大胸筋は比較的早期から脂肪に置き換わっている例があった．また腹直筋の早期からの高度萎
縮もMDに特異的な所見と考えられた．
脊椎レベルによる傍脊柱筋の障害程度について
は，Bulckeら1）は，胸腰部に始まり，次第に頸部へ上行するとし，鷺崎ら8）は頸部優位の例も報告した．本研究でも両者があり，一定しないことを確認した．
MDの筋肥大は，腹筋と腰部傍脊柱筋1），また一部下肢筋1）・6）で報告されている．本研究では大腿と下腿での筋肥大の混在は，周囲の筋萎縮が進行した例でしかも歩行可能な例で認められ，萎縮の軽い例や歩行不能例ではみられなかったこと，また筋萎縮の進行の過程で認められたことから，代償性肥大と考えられた．一方，MDでは肩甲挙筋1）・7）・8）や腸腰筋1），5）は障害を受けにくいと記載されているが，本研究でも同様で，むしろ肥大傾向を示した．この両筋の肥大傾向は他の筋疾患では報告されておらず，今後注目していく必要があると考えられた．一方，両側の胸鎖乳突筋と嘆筋の萎縮のみを示したCMDの1例で認められた腹筋と傍脊柱筋の肥大は，他の躯幹筋萎縮をみないことから代償性肥大では考えにくい．Bulckeら1）もれた．
また，本研究で認めたMDおよびCMDの筋萎
縮分布および強さの障害パターンには個体差があり，下肢筋萎縮と頸部，躯幹の筋萎縮とは必ずしも並行しなかった．
一方，CMDとMDは臨床症状あるいは経過の上で一部違いが報告されているが，本研究ではCT上の筋萎縮分布に明らかな違いを見出せなかった．また自覚症状の無い4例でも筋萎縮を確認
でき，CTは筋萎縮の有無を調べるのに有用な方法であった．
まとめ1）CTは自覚症状のないMDあるいはCMDの筋萎縮を調べるのに有用であった．
2）胸鎖乳突筋の著明な萎縮に加えて，嘆筋および内側巽突筋の萎縮も早期に出現した．
3）下肢筋萎縮と頸部，躯幹の筋萎縮とは必ずしも並行しなかった．
文献1）BulckeJAL and Baert AL：Clinical andradiologiCal

aspects of myopathies．CT

SCanningEMGradioscopes．Springer−Verlag，Berlin，1982．
2）Rickards，D，IsherwoodI et al：Computed
tomographyin Dystrophia Myotonica．
Neuroradiology24：27，1982．
3）Serratrice G，Salamon G et al：Resultats
SCannerXmuSCularedans145casdemaladies
neuro・muSCularies．RevNeurol141：404，1985．
4）CaloM，CrisiGetal：CTandthediagnosis
Of myopathies．Preliminary findingsin42
CaSeS．Neuroradiology28：53，1986．
5）大石晴二郎，武内透ほか：筋緊張性ジストロフ
ィー症における骨格筋CT所見の検討．第27回
日本神経学会総会（プログラム／抄録集）．熊本，

早期のMDの1例で腹筋と傍脊柱筋の肥大を，また高橋ら10）は先天性筋緊張症の1例でも両筋の6）高橋良輔，今井輝国ほか：筋緊張性ジストロフ

肥大を報告した．これら腹部周囲筋の肥大は筋緊張を有する疾患特有の所見である可能性が考えら

7）川瀬 譲，自見隆弘ほか：筋緊張性ジストロフ−38−

1986，p224．

ィーの下肢骨格筋CT．CT研究10：73，1988．

イー症の骨格筋CTとADL．第26回日本リハビ

9）TermoteJ・L，Beart A et al：Computed

リテーション医学会総会（プログラム／抄録

toIDOgraphy of the normal pathologic

集）．仙台，1989，p209．
8）鷲崎一成，小島進ほか：筋緊張性ジストロフィ

muscular system．Radiology137：439，1980．

ー症の傍脊柱筋CT所見．第30回日本神経学会

10）高橋良輔，大竹敏之ほか：先天性筋緊張性にみられた筋肥大のCT所見．神経内科29：442，

総会（プログラム／抄録集）．水戸，1989，

1988．

p120．

−39−

4）神経筋疾患におけるUltrasoundImaging−実画像のデジタル処理−
田 代 邦 雄＊
研究協力者

松

浦

亨＊

佐

森 若 文 雄＊ 島
目的（A）超音波画像を安価かつ大量に記録でき，画像処理の元データとして使用に耐えうるデータストレージャーの検討．
（B）組織像をマトリックス展開しその組織固
有音響インピーダンスの分布から実験的に求められた超音波信号ヒストグラムによる神経筋疾患の分経が臨床超音波画像においても有効であるかい
なかの検討．
（C）超音波画像診断を客観化するためのパラメーター抽出の試み．
（A）データストレージャーの検討
方法

超音波診断装置本体は横河RT3600，プローブは5MHz））ニア型をもちいた．初期設定はgain
lOdB，dynamicrange60dB，focus20mm，TGC
fullと一定にした．アナログ方式では，健常者の右側大腿四頭筋をフリーズした画像のNTSC信号を取り出しスチルビデオプレーヤー，VHSビデ
オプレーヤー，S−VHSビデオプレーヤーの各記＊北海道大学医学部神速内科＊＊国立療養所札幌南病院神経内科

松

治＊

功 二＊＊

録媒体に収録した．デジタル方式では超音波診断装置からのNTSC信号を8bit A−Dコンバータ
ーによりデジタル変換し512×512×8bitのフレ

前回，神経筋疾患組織標本の国有音響インピー
ダンス分布をマトリックス変換しシミュレートした画像が臨床超音波画像の形態的特徴をよく反映し，特殊フィルター処理を行うことによって疾患特異性をより強調できる可能性のあることを報告した1）．今回は画像診断の客観化を行うために以下について検討を加えた．

藤ームメモリー上に収録した（図1）．
これらの画像を再生し，アナログ方式の場合はさらに512×512×8bitのデジタル変換を行ってフレームメモリー上にロードし，再現された超音波画像上のグレースケールの濃度断面を得，その直線性を検討することで再現性の評価を行った．
結果
再生されたグレースケール輝度信号の直線性を示す模式図をしめす（図2）．縦軸はグレースケー
ルの輝度，横軸はA・D変換後のチャンネル数である．デジタル方式で記録された場合は再生時の信号の歪みはない．アナログ方式ではS・VHS方式
が三者中最も良好な再現性をしめした．以下
VHS方式，スチルビデオの順に高輝度帯域の再現性が低下し，とくに後者では256階調のうち，低輝度側の1／4程度でしか直線性を得られなかった．
以上述べたように信号の再現性自体はデジタルストレージャーが優れていた．しかし1画面あたりに要する費用は圧倒的に高く，われわれが設定している条件下での実際の超音波画像信号の最高輝度を示す骨の反射でもグレースケール上は最低輝度側から75％程度にしかならないことを考慮す
ると，S−VHS方式のアナログストレージャーであっても充分利用可能と考えられる結果であった．

（B）超音波信号ヒストグラムによる神経筋疾患
の分離
−40−

T G C O F F
G ai n l O d B
かR

60d B

↓

↓

↓

）．S．日日

↓

≡
≡
雄 藩 ≡
癒≡
薄≡
…
≡
豪…
溝 川
5 ▼1 2
↓

Ⅹ
↓

5 1 2
↓

1

8

1 −R 8 ）b i t s

↓
≡
‡
■
■
‡
≡
1 絹 …
1 ≡
…
≡
三
言
；

≡
黒輿卓 宣言
■
∴
釣 台■
■
套‖
5 1 2寺 i￣6■猷狛抗日鳥再図1画像収録および処理装置のシステム図

ー41−

peakを形成し，正常捌実に由来すると考えられる
64channel未満までの裾野を伴った．多発性筋炎

信号強度ではpeakは50−60channelにシフトし，K−Wお
よびLGD群においては100channel前後にmain
peak，50channel付近にSubpeakを形成した．
ALSではpeakは100channel付近に認められた．
今回，上記の各疾患と同様な条件での検討ができなかったドウシェンヌ型筋ジストロフィーでは，
デジタル記録された画像をもちいてヒストグラム処理を行ったがその如akはさらに高輝度帯域にシフトし，生検組織をもちいたシミュレーションの結果と同様に疾患群の分艶が可能であった．
（C）パラメーター抽出の試み
方法（B）で設定した関心領域内を図4にしめす5種類の3×3 matrixデジタルフィルタをもちいてフレームメモリー上で走査して境界強調画像を得
0／064

るとともに，関心領域内の輝度信号ヒストグラム
を求めた．

128

図2 再生されたグレースケール輝度信号の直線性．
縦軸はグレースケールの輝度，横軸はA−D
変換後のチャンネル数．デジタル方式では再生時の信号の歪みはない．アナログ方式ではS−VHS，VHS，スチルビデオの順に高輝度帯域の再現性が低下した．
方法（A）の結果からS−VHSビデオテープを記録媒体とし，超音波診断装置の初期設定も（A）に準じた．健常者および各疾患患者の右側大腿四頭筋・
近位1／3部水平断像を同一画面に収録し，再生
NTSC信号を8bit A−Dコンバーターを介して512×512×8bitフレームメモリー上に展開し，

結果
各疾患の実画像はデジタルフィルタリング処理を行うことで形態的には特徴が強調された．とくに神経原性変化を呈する場合はそのlaminarstructureが顕著となった．スペpスの関係で，処理画像の例として健常者（図5A）およびKtW症例（図5B）を示す．
一方，境界強調処理後の関心領域内輝度信号ヒ
ストグラムはRoberts，filterでミオパテーの要素を持つ疾患群のpeakが低輝度側にシフトし強調された程度であった（図3）．
結論
疾患の診断を客観化するために画像処理を試み再現された大腿直筋・中間広筋に関心領域を設定して検索の対象部位とし，関心領域内の輝度信号
ヒストグラムを算出し，各疾患別に検討した．
結る場合，原画像をいかに忠実に記録・再生できるかが重要であるとともにその経済性も無視できな

果

関心領域内の輝度信号ヒストグラムを図3の最左列に示す．上段の健常者では正常な筋組織を示

すO channel（もっとも輝度信号の低い帯域）に

い．実際に利用するシステムは解析に必要な信号帯域の再現性がよく保たれかつできるだけ安価であることが望まれる．デジタルストレージャーは長所として画像の再現性に優れているが膨大な情−42−

図3 関心領域内の輝度信号ヒストグラムとデジタル処理後のヒストグラム．処理前，健常者では正常な筋組織を示すOchannelにpeakを形成した．多発性筋炎では50〜60，K−WおよびLGD群では100前後にmainpeak，50channel付近にSubpeakを形成した．ALSではpeakは100channel付近に認められた（最左列）．処理後はRoberts，filterでミオバナーの要素を持つ疾患群のpeak
が低輝度側にシフトし強調された程度であった．

報量（一画面512×512×8bitx3として786，432
kbyte）をもち画像蓄積のための費用があまりにも大きい．一方，アナログストレージャーの特徴
は逆で，蓄積すべき情報量が少なく，記録機器も安価であるが画像の再現性はデジタル画像に比し明らかに劣っている．デジタル方式の画像収錦がより安価に実現できるようになればもちろんそれにこしたことはないが，今回の検討で得られたよ
うに，少なくても現段階ではS−VHS方式のアナログ画像収録でも筋エコー画像の画像処理には充分利用可能であり，再生時の信号の7ラツキはフレームメモリー上で加算平均処理を行うことで無視できた．

実画像の超音波信号をヒストグラム処理すると健常者ではほとんどのピクセルが信号強度0に集積する．この現象はシミュレーションの場合にも認められたもので，正常筋組織内の固有音響イン
ピーダンスの分布がほとんど均一に近いことを示している．もちろん最初に画像を収録するにあた
り超音波診断装置のgainをやや高めに設定すれ
ば画像全体の輝度信号も上昇するわけであるから，
正常筋組織の輝度信号のpeakはやや右方に移動
し，その結果fiber type groupingによる音響イ
ンピーダンスの空間的分散の低下現象とも分艶可能となる可能性がある．ミオパテ一群では中輝度帯域にpeakを形成したが輝度ヒストグラムのみ−43−

ではその細分は不可能であった．神経原性疾患でRob er t s

dxは結合組織の増生に伴い残存する筋組織との間に発生する高輝度の信号が増加しpeakを形成する
ことが確認された．もっとも，病初期では正常筋組織が多く残存するため無信号帯域にもpeak形成が生じた．結合組織と脂肪変性の混在するドウ
P r ewl t t

シェンヌ型筋ジストロフィーではさらに輝度信号のpeakは右方移動した．これらの結果はシミュ
レーションの示した結果と同様であり，神経筋疾患の組織診断に超音波画像が充分利用できることを示している．

ラプラシアン（全方向エッジの強調）Sobel

ただ，信号強度ヒストグラムは信号分布の空間的特徴をすべて排除してしまうため，診断の客観化のためには今後さらに形態的な特徴量抽出を併用する必要がある．

図4

5種類の3×3matrixデジタルフィルタ．
それぞれ，境界強調を行うために使用した（dx，dy双方で微分フィルターとする）．

文

献1）田代邦雄，松浦亨，佐藤松治，森若文雄，島功
二：神経筋疾患におけるUltrasoundimaging

図5（A）健常者，（B）K−W症例の実画像（左上段）とデジタルフィルタリング処理画像．フィルタリングを行うことで形態的には特徴が強調された．
−44−

一画像シミュレーションとフィルター最適化−する研究 （杉田班）昭和63年度研究報告書，

厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト

1989，pp30−36．

ロフィー症及び関連疾患の病態とその原因に関−45−5）Lysosomalglycogenstorage disease
witIlOut aCid maltase deficiency

3症例の組織化学的，生化学的検討
納
研究協力者

臼

杵

扶佐子＊

加

光

弘＊

塩

信

行＊

中

原

啓

一＊

樋 口 逸 郎＊ 中 川 正 法＊＊ 矢 田 俊 彦＊＊＊は じ め に

Glycogenosomeを呈する疾患はacid maltase
deficiency（AMD）が代表的なもので，その他稀にdebrancher deficiencyで認めることもある．
最近我々は，aCidmaltase活性，debrancher活性が正常で，生検筋にて多数のglycogenosomeを認めた3症例を経験した．これらは，1981年にDanonら1）が報告したlysosomalglycogenstor−
agediseasewithoutacidmaltasedeficiencyに一致すると思われる．本疾患の病因は未だ不明である．生検筋，fibroblastについて組織化学的，生
化学的にAMDとの相違を検討し，興味ある知見

歳時，筋力低下，知能低下精査のため入院となった．
現症：身長175cm，体重59kg．不整脈（−）．心拡大を認め，胸骨左縁にⅠⅠ度の収縮期雑音を聴取した．肝腫大（−）．神経学的には，WAISにて

IQ60以下と知能低下を認めた．網膜色素変性（＋）．近位筋優位の軽度の四肢筋力低下と筋萎縮を認めた．感覚系，深部腱反射は正常であった．
検査所見：CK値は890IU／1で，MMtype優位の上昇を認めた．安静時の血中乳酸，ピルビン酸は正常．前院阻血運動負荷試験での乳酸，ピルビ
ン酸，アンモニア，尿酸の反応は正常であった．

を得たので報告する．
症

方法
3症例及び成人型AMD（32歳，女性）の生検筋

例

3症例はcasel：21歳，CaSe2：23歳，CaSe3：
8歳で，いずれも男性である．case1，3は孤発例，CaSe2は家系内発症を認める．caselを呈示する．
症例：21歳，男性
病歴：家族歴には特記すべきことない．幼小児期の発達は正常であったが，11歳時，特殊学級にの凍結切片にてルーチンの組織化学及びレクチン
組織化学の検索を行った．使用したレクチンは，ConA，WGA，MPA，SBA，PNA，HPA，
DBA，LFA，UEA−Ⅰの9種類である．ConAはビ
オナン化ConAを用いhorseradish peroxidase（HRP）標識ストレプトアピジンで間接法を実施
し，その他のレクチンはHRP標識の直接法を使編入，短距離走も遅くなった．中学時代にしばしば心惇克進を経験．16歳時，胸写にて心拡大を指用した．また，エボン包埋した生検筋及び培養fi−

摘され，某医科大学に入院．肥大型心筋症の診断をうけた．17歳時には労作時呼吸困難を自覚．20

鉄検索を行った．

＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊国立療養所沖縄病院神経内科＊＊＊鹿児島大学医学部第一生理

neutralα−glucosidase活性（pH6・5）は4MUG基

broblastにて，PAS−Toluidine Blue染色及び電Acidα−glucosidase活性（pH4・0）は4MUG基
質，天然基質（maltose，glycogen）にて測定し，質にて測定した．Debrancher活性は，14C−−46−

trinの分解の2つの方法で測定した．また，培養

Ionomycinによる細胞内Ca2＋濃度の上昇を測定することにより調べた．細胞内Ca2＋濃度は，カバ

fibroblastを用い，他の））ソゾーム酵素活性（α−ーグラスに培養したfibroblastにfura−2／AMI

galactosidase，α−mannOSidase，α−fucosidase，

JLMを370C，30分loading後，単一fibroblastを顕

β一galactosidase，βLglucuronidase，N−aCetyl−

微鏡下に選び，Ionomycinを滴下させ，二波長

P−hexosaminidase）を測定した．Glycogen合成（340，380nm）励起による螢光顕微測光法にて測定は，14C一glucoseを培養fibroblastにとりこませ，
経時的にglycogenへのとりこみを口紙・エタノ

した．外液Ca2＋濃度は2mMCaC12とし，Ion0−

glucoseのglycogenへのとりこみ及びlimitdex−ール沈澱法にてみた．DEAE−Cellulose column

mycinは細胞内Ca2＋濃度が最大となる濃度を用いた．

Chromatographyは，fibroblast extractを結

DEAE−Celluloseにapply，素通り除去後，OrO．5

果

M NaClgradientにて各isoenzymeを溶出させた．また，fibroblastextractよりConA−Sephar−

病理組織学的検索：
凍結筋切片のHE染色では，筋線経の大小不OSeにて糖タンパクを析出させた後，SDS−PAGE，Western blottingを行い，ポリクローン抗acid

同，空胞形成を認め，VaCuOlarmyopathyの所見であった．Acidphosphatase染色では一部空砲にて活性元進を認めたが，成人型AMDに比しそのα一glucosidase抗体にてacidα−glucosidaseのprocessingをみた．
Ionomycinの膜感受性は，fibroblastを用いて変化は軽度であった．エボン包理によるPAS−
Toluidine Blue染色では，空胞内にPAS陽性物

図1case2の生検筋の電顕像（×17，500）多数のglycogenosomeとそれをとり囲む膜構造を認める．
−47−

図2 生検筋のレクチン組織化学（×50）
A．PNAレクチン染色
B．UEA−Ⅰレクチン染色
1：case1，2：case2，3：case3−48−

表l Binding characteristicsinlectinhistochemical analyses
1ectin【residues recognizedI casel case

case

3

AMD

＋

十

＋

十

︼

＋

十

＋

十

＋

十

＋

十

十

◆

＋

＋

十

十

十

十 一

＋

十

＋

十

■

（αGalNAcI

十
十
十 十

DBA

＋
＋

（βGalI（qGalNAcI＋＋
十（￠GalNAc．βGalNAc．qGalI

pNA
HPA

十

十
十

SBA

＋

十
＋

ConA
（qMan．qGIcI
WGA（βGIcNAc．qNeuIMPA（QGalt寸Ac．oGalI

− ＋ 一

＋

十

十

十

＋

十

＋

十

十

十

十
＋
十 十
十

membrane（CM），VaCuOlar

＋

十

◆

LFA
（dNeuI
UEA−工（qFucI＋＋＋：Cytoplasmic

2

membrane（VM）and

VaCuOlar contents（VC7vere positive．
＋＋：V的 ＆ VC； ◆：VM； −：ne9ative

表2

Biochemicalanalysis ofbiopsied skeletalmuscle and fibroblasts
normal1

2

3

A．skeletal muscle
8−91ucosidase acヒivity
4MUG−degrading2
11．3
pfI 4．O
9．3
pfI 6．5
maltose−hydrolytic3
pfI 4．0
108．7

15．6

21．6

13．9

±

10．6

13．3

lO．4

土1．3（5）

86．1

145．8

95．8

±

36．5（5I

8．5±

2．3（4I

Debrancher activitylh
incorporation of C−glucoseinto glycogen
6．2
11．2
10．8
glucoseliberation fromlimit dextrin S
10．7

m．e．

n．e．

3．3（6I

10．4

B．fibroblast
q−91ucosldase

佃UG−de9radin96
pH 4．0
pfI 6．5

107．7
104．O

104．0
108．6

83．3
114．9

maltose−hydrolytlc7
pH 4．0
7．9

12．1

11．1

115．6
99．3

±19．2（7）±23．2（7）7．58（3I

91yco9en−degradln98
pIl4．0

193．8

269．1

305．8

201．9

±

29．9（4I−−■−■−■■一■−・■・−−−−−−−−・−−一一−■−−−−・−−−−−−−一一一一■−−■−−一■■−−一■−−−−−■■■−−・−●−−■−−−−■−−■■●●●−−−■

lI Values are means±SD．wlth the numbers of samplesinparentheses・

2I nmol附／mln／9Wet vt．

3I nm0l of maltose hydr01yzed／min／9We亡・W亡．
4I nmo191ucoselncorporatlon／mln／9Wet Vt．
5）nmol91ucose／mln／9■Vet

Wt．

6I

nmoI

MU／hr／m9prOtein．

7I nm010f maltose hydrolyzed／mln／m9prOteln．
8I nmol glucose／hr／mg protein．
n．e．；nOt eXamined．

−49−

索の結果を表2に示す．Acidα−glucosidase活性は，4MUG，maltose，glycogen基質とも正常あるいは上昇していた．Neutralα−glucosidase活性は正常で，debrancher活性も14C−glucoseのglycogenへのとりこみ，limitdextrinの分解のいずれの方法でも正常であった．培養fibroblastにおける他のリソゾーム酵素活性は，調べた限りにおいては正常から正常の2，3倍の上昇を認めた．培養fibroblastを用いたDEAE−Cellulose column
Chromatographyのα−glucosidaseisoenzymeの溶出patternは正常であり，aCid a−gluco・
Sidaseは0．14M NaClにて高いpeakとして洛出され，neutralα−glucosidaseは0．28M NaClにてpeakとして溶出された．Fibroblastにおけるlll H
Case AMD

acidα−glucosidaseのprocessingの検索では，正Normal常と同じく110K，70Kのバンドを認め，prOCeSS−

図3Ionomycinによるfibroblastの細胞内Ca2＋濃度の上昇

ingは正常でmatureなacidα−glucosidaseは生質の蓄積を認めた．電顕的には，小さいgly−cogenosomeを多数認め，これらをとり囲む膜構造を認めた（図1）．この所見は，3症例に共通の
特徴的な所見であった．
レクチン組織化学による検索では，β−galac・おいては本疾患とAMD，COntrOl間で差を認めなかった．

toseを認識するPNAレクチン染色において，3
症例ではいずれもvacuoleの内容物及び膜が陽性に染色されたが，AMDでは全くnegativeであった（図2A）．また，fucoseを認識するUEA−I
レクチン染色では，3症例ではvacuoleの陽性所見に加え，plasma membraneの染色を認めた．

成されていると思われた．14C一glucoseのglycogenへのとりこみは，測定した16時間までに

lonomycinの膜感受性：
Ionomycinによる細胞内Ca2＋濃度の上昇は，AMD，nOrmalのfibroblastに比較し，3症例では有意に低下を認めた（図3）．
考察

1981年，Danonら1）は筋力低下，肥大型心筋症，知能低下の臨床的特徴を有し，筋病理ではglycogenosomeを認めるが，aCidmaltase欠損を一方，AMDでは全くnegativeであった（図2
B）．レクチン染色のまとめを表1に示す．PNA，
UEA−I染色以外に，α−mannOSe，α−glucoseを認識するConA，N−aCetylgalactosaminを認識す
るHPA，DBA染色にて，AMDでは認められな認めない2症例を報告，その後，83年2），86年3），87年4）に同様の報告がなされた．今回の3症例も，臨床像，筋病理，生化学所見はこれらの症例に一いvacuoleの陽性所見を3症例において認めた．
一方，WGA，MPA，SBA，LFA染色では，AMD，3症軋ともにvacuoleは陽性に染色され・た．

じまっており，AMDにおけるlate−OnSettypeに対応するが，late−OnSet typeのAMDは
myopathyが主体であり中枢神経症状，心症状がみられないのに対し，本疾患では心筋障害がめだ
ち，これに加え中枢神経障害，軽度の筋力低下を認め，臨床的にもAMDと差を認めた．

生化学的検索：生検筋及び培養fibroblastにおける酵素学的検致し，これらは一つのClinicalentityをなすものと思われる．Onsetは，若いものでは2歳半からは−50−

今回の検索では，凍結筋切片におけるレクチン

今後筋疾患の病態解明にも有用な手段となりうる

組織化学にて，本症ではvacuoleの膜及びplas−mamembraneにAMDでは認められない異常な染色性を認めた．この染色性はAMD以外のと思われる．

VaCuOleをつく るmyopathy即ちrimmed
vacuoleを伴う distalmyopathy及びhypothy−
roidmyopathyでの検索でも認められず，本疾患に特異的なものと思われる．また，細胞内Ca2＋濃度測定にてしらべたIonomycinの膜感受性は，本症のfibroblastにおいてAMD，nOrmalに比し有意に低値が認められた．以上より，本症における膜糖鎖，膜構成の異常が示唆されたが，その原因

1）Danon MJ，Oh SJ，DiMauro S etal：

Lysosomalglycogen storage disease

with

文

献

normalacidmaltase．Neurology31三51，1981．

2）RiggsJE，Schochet SS，Gutmann L et al：
Lysosomalglycogenstoragediseasewithoutacid maltasedeficiency．Neurology33：873，
1983．

3）Byme E，Dennett X，Crotty B et al：に関しては，ER，Golgiにおける糖付加の異常，あるいはcore蛋白の異常など，さらに検討が必要である．リソゾーム膜の成分，その機能と糖鎖の関係については未だ不明な部分が多く，今回示さDominantlyinherited cardioskeletal

れた膜構成の異常がglycogenosomeの形成といかに結びつくかはなお今後の課題と思われる．今4）Hart ZH，Servidei S，Peterson PL et al：

回，レクチン染色が病態解明に有用であったが，筋肉におけるレクチン染色の報告はまだ数少なく

autophagic vacuolar myopathy．Neurology

myopathy withlysosomal glycogen storageand normal acid maltaselevels．BrainlO9：523，1986．

−51−

Cardiomyopathy，mental retardation，and

37：1065，1987．

ⅠⅠ．生

化

学

6）絶食一再摂食時に於ける骨格筋速筋と道筋のエネルギー代謝

研究協力者

庄

司

進

朴

木

活

人＊

吉

田

邦

広＊

足

立

憲

昭＊

柳

沢

信

夫＊

絶食時に骨格筋のエネルギー代謝，特に摂食時に主要なエネルギー源であるグルコースの取り込

一＊

non・COllagen protein（NCP）を測定した．有意差の検定はStudent，s t testを用いた．

みがどの様に調節されるかについては，ヒトの骨結格筋で減少1），ラットの遅筋で減少2）と変化なかっ

体重の変化（図1）
絶食により，体重は減少し，24時間後には有意た3）との報告がある．絶食一再摂食時に於ける骨格筋のエネルギー代謝の調節を検索するため，エ
ネルギー産生系の共通の基質であるグルコースの細胞内へのアップテイク（GU）を測定した．このステップは細胞内の糖質代謝の最も重要な律速段階の一つである．骨格筋の中でも速筋と遅筋の代謝調節に差異が認められた．
方

果になり，平均で57gから72時間後で43gに減少した．再摂食により体重は増加に転じ72時間後で前借に，120時間後では前借より有意に高値に達し
た．
EDLとSOLの湿重量の変化（図2）
絶食により，筋の湿重量は減少し，24時間後に法

Wistar・メス・ラットの60g前後を用い，72時間の絶食（飲水は自由）後再摂食を開始した，各24時間毎のラットの体重を測定し，Cervical dis−
loc云tionでSaCrificeし，eXtenSOr digitorum

l⊥卜

′

0

longusmuscle（EDL）とsoleusmuscle（SOL）
をin vivoでStretChした状態で両側腱を脳外科

b

血管手術用クリップで国定した後に腱で切断し取

＼︑

−

∧U

り出し，Krebs−Henseleit bicarbonate buffer⊃（pH7．4）に95％02−5％C02を通気しながら，370Cでincubateする．このbufferは5mM
sodiumpyruVate，3H・3−0−methylglucose（1・O
jLCi／ml），50mM

glucoseと14C−SuCrOSe（1mM，0．2FECi／ml）を含む．30分のincubation後筋を洗浄，腱を切除，湿重量を測定，Soluene350
で消化，酢酸で中和，ScintisoIEX−H（Wako）
を加え，radioactivityを測定した．一部の筋で

0

1

2

3

1

2

3

4

5

yS

Fastin9

図1

Refeedin9

平均±標準偏差
N＝3−45匹′★ p＜0．05 vs 前値＊信州大学医学部第三内科−55−

SkeletalIluscle Weight

Glucose Uptake per Huscle Weiqht

一息首ざ■掌か■ヨ鼠一望ヱ0∈ユ

0

1

2

3

Fasting

図2

1

2

3

4

5

Refeedin9

N＝4−12筋
黒三角 EDL
自三角 SOL
他は図1脚注と同じ

Fa＄tin9

図3は両筋ともその減少は有意になった．減少率は72
時間までは次第に減少した．再摂食開始24時間でRefeeding

N＝4−10筋
他は図1，2の脚注と同じ

GILJCOSe Uptake per Muscle NCP

は減少が続いていたが，48時間では増加に転じた．

筋当りのNCPは，湿重量の変化と同様な変化を示したが，程度は湿重量より大きかった．即ち前借に対しEDLは−53％，SOLは−37％の減少
が再摂食24時間後にみられた．前値への回復は両筋とも144時間後であった．
EDLのGU変化（図3．4）
筋当りにすると，絶食・再摂食により有意な変化を見なかった．湿重量当りにすると絶食により0値に回復したのに対し，EDLでは144時間後であった．両筋の湿重量差が出てくるのは再摂食96時
間後であった．
EDLとSOLのNCP変化

0dUZ p L呈 S三〇∈ユ

SOLではEDLより変化が少なく平均で21．4mg
から14・7mg（−31％），EDLでは平均で28．8mg
から15．2mg（−47％）であった．従って，両筋の湿重量葦は48時間後には有意差無くなった．再摂食により湿重量はSOLで再摂食120時間後に前

0

1

2

Fastl叩3

1

2

3

Refeedlnq

図4 図3の脚注と同じ
24時間より有意な増加を示し，再摂食によりさらに一段と有意な増加を示し，絶食前の値に復するのは再摂食120時間後であった．NCP当りにしても，湿重量当りと同様な変化を示した．
SOLのGU変化（図3，4）−56−

筋当りにすると，絶食により有意に低下し再摂食120時間で回復していなかった．湿重量当りにす
ると，絶食による増加の変化はEDLに比べ小さ
く遅く，再摂食により一段と増加することは見られず，絶食前借への回復は速かった．NCP当りにしても，湿重量当りと同様であった．
EDLとSOLのGUの差両筋のGUの有意差は湿重量当りでもNCP当で血液中で低下してくるグルコースを取り込む能率を上げエネルギー源の確保を計っているのに対し，遅筋では主要なエネルギー源をグルコースから脂質へ変換している4）ためGUに軽度の増加しか見られないにかかわらず萎縮が軽度であると考えられる．
再摂食時に速筋ではGUが一段と高値にリセットされたことは，絶食による蛋白減少の強い速りでも，再摂食24時間後から消失し，72時間後に再び出現した．

筋での回復にグルコースの利用率を高度に高める

考案
絶食時の体重減少の主要な原因が骨格筋の特に借への回復は変化が大きかった速筋が遅筋より遅速筋の重量減少にあることは，絶食時の骨格筋重量の体重比が速筋では減少し（0．51％→0．43％；），遅筋ではやや増加している（0．38％→0．40％）ことから言える．この骨格筋の重量減少は筋蛋白の減少が主たる原因である．筋蛋白の減少は筋重量の減少率以上で，絶食時の筋は湿重量当り前値より低いNCP濃度を示した．これは水分量が相対は筋のエネルギー代謝が正常化し，蛋白代謝が正的に増加しているためと考えられる．従って，絶食時の体重減少の主たる原因は骨格筋特に速筋の筋蛋白の減少による．これはこの蛋白をエネルギ
ー源として全身で利用しているためと考えられる．
その他に脂肪組織なども当然利用されているが，2．骨格筋の萎縮の主要な原因は筋蛋白の減少で絶対量としては骨格筋が最大の臓器と言える．ここで骨格筋の中で，速筋の蛋白を優先して利用し，遅筋の蛋白の利用は少ない．これは，常に働く姿
勢保持に関与する遅筋の機能を出来るだけ温存しようとする調節の様である．筋の蛋白の減少は再摂食によってもすぐには増加に転じず，体重の回

4．再摂食で，速筋ではグルコース取り込み速度という調節があると考えられる．
骨格筋の重量，NCP量，GUの再摂食による前復より遅れ再摂食24時間後には絶食72時間後より低値を示した．このことは外からのエネルギー源の補給によって代謝の変化が起こるが，骨格筋の蛋白の分解増加が合成より少なくなるのに24時間以上かかることを示している．
GUは，筋全体としては，遅筋で低下と速筋で不かった．いずれも体重の回復より遅かった．これ
常化し，萎縮が回復するのは絶食による変化が大きかった分だけ他の瓶器より遅いと考えられる．
結論

1．72時間の絶食で，Wistarラットの体重の減少の主要な原因は骨格筋特に速筋の萎縮である．
ある．これは速筋で遅筋より強い．
3．絶食により湿重量当りと蛋白当りの骨格筋のグルコース取り込み速度は増加する．これは速筋で強く早い．
が一段と高いレベルにリセットされる．
5．再摂食による，骨格筋の重量，蛋白量，グル
コース取り込み速度の前値への回復は体重の回復より遅れる．変化の少ない遅筋では速筋より比較的速い．筋の重量と蛋白量は再摂食24時間
後に絶食72時間後より低下を示した．
文

献1）OwenOEandReichardGA：Humanforearm
metabolismduringprogressivestarvation．J
ClinInvest50：1536−1545，1971．

変であった．これは従来の報告のラットの道筋で低下2）に一致する．筋の湿重量当りとNCP当り

2）Issad T，Penicaud L，Ferrg P，KandeJ，でのGUでは，速筋で増加が強く遅筋では軽度の増加であったという結果は，強い萎縮の来る速筋

On tissue glucose utilizationin conscious−57−

BaudonM−AandGirardJ：Effectsoffasting
restingrats．Majorglucose・Sparlngeffectin

working muscles．BiochemJ246：241−244，
1987．

4）Rennie MJ and HolloszyJO：Inhibition of
glucose uptake and glycogenolysis by

3）前川聡：絶食状態における骨格筋のインスリンavailability of oleateinwel1−0Xygenated

作用に関する研究（Ⅰ）−インスリン受容体及びperfusedskeletalmuscle．BiochemJ168：161

糖取り込みへの影響一・糖尿病28：571−577，−170，1977．

1985．

ー58−

7）ラット骨格筋収縮の燐N叩R山 田 和 廣＊
研究協力者

武 居 光 雄＊ S．K．Phillips＊

は じ め にNMR信号を加算することによってNMR測定

筋収縮のエネルギー変換過程において，収縮中のエネルギー遊離に対応する筋の化学的変化はク
レアチン燐酸の分解だけであるとする単純化は実のS／N比を向上させた．NMR測定の時間分解能は4ないし16Sであった．また1回の実験に要す

際は成り立たない．このことは，とくに両棲類であるカエルの筋について詳しく調べられてきた．
その一つの例として，両棲類の筋では，収縮によるエネルギー産生（初期熟産生＋仕事）には細胞内カルシウム結合タンパクであるパルバルブミン
へのCa結合反応熱が加わっていると考えられている．一方，ラットのヒラメ筋にはパルバルブミ
ンが含まれていないことが知られており，両棲類の筋とは異なっている．このように両棲類との違いを意識して晴乳類の筋を対象とする研究が最近ようやく行われるようになった．
本研究の目的は，ラットのヒラメ筋を対象として燐NMRを用いて収縮による化学的変化とその回復の時間経過を知ることであった．
方法
ラットヒラメ筋を摘出し，足関節が完全に屈曲した位置における筋の長さを標準として200Cで測定を行った．ラットは4〜8週齢のものを選んだ．燐NMR測定は我々の研究室で両棲類の筋を対象とした研究に用いた方法に準じた1）．即ち8対のヒラメ筋を径20mmのNMR用ガラスチューブ内に保持し，濯流及び刺激を行った．筋重量は合計約1gであった．
筋の刺激は6Sおよび9S持続する30Hzのテ
タヌス刺激により行った．刺激は7及び10分の間
隔で48ないし64回繰り返し，各々の収縮について＊大分医科大学生理学教室

る時間は7ないし12時間であった．
結果
足関節屈曲位における筋のサルコメア長は平均3．3JJmであり，このときテタヌス刺激による張力発生は，単位断面積当りに換算すると，平均1
Nmg￣1（乾燥筋重量）であった．また，200Cにおいて7−12時間における48〜64回の繰り返し収縮による張力低下は16％以内であった（図1）．
図2に燐NMRスペクトルの例を示す．6秒及び9秒間持続するテタヌス刺激による収縮によって，クレアチン燐酸（PCr）の濃度減少及び無機燐
酸（Pi）の濃度増大が観測された．ATPP）変化は認められなかった．これらの変化は収縮後，指数的に回復した．6秒及び9秒間の収縮において，回復の時定数はともに50秒であった．この回復の時定数は，40Cにおけるカエルの筋での回復の時
定数（40分）と比べると非常に小さい1）．9秒間持続する強縮刺激によるPCr及びPiの変化とその回復の時間経過を図3に示す．尚，このような収縮／回復の繰り返しの定常状態における刺激直前のPCr濃度は，11．1JLmOlg￣1（9秒テタヌス，静止筋では12．7），Pi濃度は4．2JLmOlg￣1（9秒テタヌス，静止筋では2．8）細胞内pHは7・16（9秒テ
タヌス，静止筋では7．19）であった．このことは先に述べた張力の結果とともに，このような状態の収縮が生理的なものであり，anOXic coreの生じていないことを示している．
細胞内pH（図4）についてはこのような短い収縮によってアルカリ化が生じ，PCrおよびPiと−59−

㌻ごOEヱ仁﹃召口占d﹃AY打呼mq刈rM†m O97三0仇l凧g打yMrl

0

Fαてモ由dne wlthh16％

1∝1

200

3∞

4∝〉

500

Tinで（S）

図1 ラットのヒラメ筋（8対）のテタヌス刺激（30Hz，9秒間）による等尺性張力発生．最初と48回目の収縮を重ねて示している．下方の矩形波はNMR信号測定のゲートを示す．

10

5

0

−5

−10

−15

図3

ラットのヒラメ筋の収縮（9秒間のテタヌス刺激）による無機燐酸（Pi）およびクレアチン
燐酸（PCr）の変化とその回復の時間経過（mean±SEM，n＝6）．

−20

ChemicQLShlft（p．p．れ）

ー90

0

100

2∝）

300

400

500

Time（S）

図2 ラットのヒラメ筋（8対）の静止時における燐
NMRスペクトル（1024回の測定を加算した）．Pi，無機燐酸；PCr，クレアチン燐酸；
α，β，γ，それぞれのATPのα一，β−，γ一位
燐酸．

図4

同様に指数的に回復する（時定数50秒）．また図4

ネコのヒラメ筋などの比較的大きな筋を対象とする方法が行われている3）．本研究では横断面積の小さい筋を選び，多数の筋を用いてNMR測定におけるS／N比の向上をはかった．この方法の利点の一つは，NMR測定と平行して熟産生の測定の9秒テタヌスでの結果が示すように一度酸性化の方向へのオーバーシュートを示す．
このような収縮によるアルカリ化は，カエルの筋でも測定されており，クレアチン燐酸の分解によってよく説明することができる2）．

ラットのヒラメ筋の収縮（9秒間のテタヌス刺激）による，細胞内pHの変化とその回復の時間経過（mean±SEM，n＝6）．

によるエネルギー論的研究が行える点にある．
このようにして，長時間にわたり筋内部においまとめと考察哺乳類骨格筋を対象として，摘出濯流標本について，・燐NMRを用いて燐化合物の収縮による変化とその収縮後の回復の時間経過を知ることが可能であった．

て低酸素状態の生じない，生理的状態での定常的収縮を生じさせることができた．APCr及び△Piの回復の時間経過は回復熟産生の時間経過とよく一致し回復熟産生は酸化的燐酸化によるPCr回復の過程に由来することが確かめられた．

一方では，血管を確保して濯流することにより，
−60−

文

献

concentration during and after muscle

1）Kawano Y，Tanokura M and Yamada K：

constractionasstudiedbytimer9SOIved31fL

Phosphorus nuclear magnetic resonance

NMR．Alkalinizationby contraction．FEBS

studies on the effect ofduration ofcontrac−

Lett171：1657168，1984．
3）MayerRA，BrownTRandKushmerickMJ：

tioninbull・frogskeletalmuscles．J Physiol（London）407：243−261，1988．

PhosphoruS nuClear magTletic resonance of2）Tanokura M and Yamada K：Changesin
intracellular pH andinorganic phosphateー61−

fast−andslow−tWitchmuscle．AmJ Physio1
248：C279−287，1985．

8）ヒト正常および筋ジストロフィー骨格筋におけるCa依存性プロテアーゼおよびそのインヒビターの局在および動態について
荒 木 淑 郎＊
研究協力者

熊

本

俊

秀＊

D．E．Goll＊＊

LZ．Stern＊Hとした．

我々は，昨年の本会議で筋ジストロフィー（以下，筋ジス）の筋崩壊に関与が深いとされるCa依
存性protease，Calpainおよびそのinhibitorであ摘出筋はアルコール脱水後，LR−Whiteresinに包埋した．超薄切片作成後，一次抗体にmono＿

るcalpastatinについて正常ラット骨格筋における細胞内分布と絶食および脱神経筋における動態を検討し，本酵素は筋線維内にびまん性に存在するものの，基本的にはZ−diskを中心に筋原線維上に存在し，脱神経および絶食筋で有意に増加する

Clonalの抗80K−DaのFEM及びmM calpain抗ことを報告した1）．今回はヒト生検筋を用い，筋ジスを含む各神経筋疾患について同様の検討を行なったので報告する．

で30分間反応させた．対照にはpre−immun0−体またはmonospecificなpolyclonalの抗Calpain及びcalpastatin抗体，さらに二次抗体に15または40nmのCOlloidalgold標識goat anti−
rabbitまたはmouseIgGを用い，それぞれ3rC
Serumを用いた．

定量的検討では，各標本について30，000倍の分
割電顕写真を40枚作成し，画像解析装置を用いて方法

筋原線経の各fraction，筋鞘膜，ミトコンドリア，

検索に用いた症例は表1のごとく，Duchenne型筋ジス（以下，DMD）3例，筋緊張性ジストロ
フィー3例，多発性筋炎6例，ALSを含む神経原性筋萎縮症7例の計19例で，患者年齢は4歳から72歳に及び，いずれも大腿四頭筋または上腕二頭筋より通常の方法で生検を行い，検索に供した．
また，神経症状のない整形外科的疾患患者5例（13〜58歳）から手術中に筋肉を一部採取し，対照

endomysiumのextracellular spaceにおける
COlloida1−gOldの単位面積当たりの密度を算定した．
結果

正常ヒト骨格筋では，Calpainおよびcalpa−
Statinはラット骨格筋と同様に殆ど筋原線推上にび慢性に見られた．筋原線維間内にも僅かに見られたが，特に筋小胞体・T管膜上に集族する傾向は見られなかった．JLM・CalpainおよびmM−

表l Patients
Duchennemusculardystrophy
Myotonicdystrophy
Polymyositis
Neurogenic muscularatrophy
CoritrolCalpainは，共に筋原線維上にびまん性にみられ，3例（4，5，9歳）
3例（20，49，54歳）
6例（35−70歳）
7例（36−72歳）
5例（13−58歳）

Z−diskにより多い傾向を示した．また，筋鞘膜にもJLM−CalpainおよびmM−Calpainは認められた．
表2にヒト正常骨格筋における筋原線経のZ−disk，Ⅰ一band，A−band及び筋鞘膜におけるTotal

Calpainおよびcalpastatin結合のCOlloidal−gOld＊熊本大学医学部第一内科＊＊Arizona大学筋肉生物学教室＊＊＊Ahzona大学内科神経筋部門の分布密度を示した．これらの抗体は何れもpre−immunoserumに比し，有意に多数のCOlloidal＿
goldを認め，ヒト骨格筋にも反応することが示さ−62−

れた．定量的にはcolloida1−gOldの総平均密度で見るかぎりcalpainおよびcalpastatinの各々
69．4％，68．4％がZ−bandを含むI−bandに存在
し，特にZ−diskに各々44．1％，38．9％と多くみられた．なかでも〟MがmMに比し，より多く筋原
線維上，特にZ・diskに分布した．しかし，統計学的にはpolyclonal calpainのみがⅠ一bandおよび
A−bandに比LZ・diskで有意差を認めた他には，

ミトコンドリアでもpre−immunoserumに比し，COlloidal・gOldは有意にみられ，僅かながらCalpainおよびCalpastatinが存在したが，ライソゾーム膜および内には殆ど認められなかった（表3）．一方，endomysiumのextracellular
SpaCeSではbackgroundとの間に有意差は認められなかった．しかし，筋肉内血管内皮細胞，CO1−
1agen fiberに両酵素がしばしば認められた．

Calpastatin，JLM−およびmM−Calpainでは有意差

表4は各神経筋疾患における生検筋の筋線推上を認めなかった．一方，筋鞘膜にもcalpainsおよにおけるcalpainおよびCalpastatin結合のびCalpastatinは共に存在し，JLM及びmM−

COlloida1−gOldの密度を算定した・ものであるが，calpainは各々の3．6％，8．5％にみられ，mM−
calpainがより多く存在する傾向を認めた．

DMDではcalpain結合colloida1−gOldは1．175±
0．11／〝m2と対照に比し，有意に増加し，なかでも表2

The density ofcolloidalgold particles combined withcalpain or calpastatininthe
myofibrilsandsafcolemma ofnormalhuman muscleS

S他山

Pol㌍lo血

PoIydond5

T血t

一J

お 出

0

−J

0

−

0

3

封朋二心 肌00000＋−＋■ 十一十▲051刀川〟血0J j j J
38 2︐刀 3

0

忍ぶ劇1朋

0

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0000＋−＋−十一十■Ⅰ．bandA・band

％or

No．恒㌔

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＿＿＿＿Tob

劇劇二部∬

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＋
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亜

％or N0．／岬1

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10∬
0−
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0＋●十一
＋
胡瓜37劇
000爪V

Com匹dm印t N0．／血1§：Fl印r噂1代m払nS±5．m＋；ぬ⊂桓0皿d印mb叩pOlydomlandbody間rt〇・の±〇・111br乙曲粗0瓜士0・021brI・bmも0・旧士0．051brんbanもmdO．01±0．M
com吋〃山王br姐rt01mm＆；he吋0皿d印ubonm。ndoml8ndb。dymObrZ心粗0・01±0朋brI・血も〇・003士0・旧brんb弧もmdO⊂0血叫メhr
5ar亡OlEmInL★：Sl騨皿mndyd皿mlかom仏ecombh也eんba皿dmdトb皿d噌On58tPく0．01．AuCOⅦ皿bdim鷺tdalPく0．01h）nh鴎汀0皿d

表3

Thedensity ofcolloidalgoldparticlescombinedwithcalpainorcalpastatininthe
mitochondria

andendomysiumofnormalhumanAnlkalpain An也dpaSb血

S加d血
Compa血ent

skeletalmuscle§

A血毎M瓜1p血A皿d・mMdlp血

岬0．／血う岬0．んm2）0ヱ3士0．20★

053士0．45★

PolydonalS Polydona15（No．／〃mう血t∝血on血ia l．労＋0．日★
endomyslum O．01士0．03

脚〇・／J皿う
0．3，＋0．14★
0．糾＋0．03

0．02＋0．02

0・町＋0ヱ0§ ；Figu帽8remeanS士S・E−＋；ぬck訂Oundcounb間代0・0COun叫」m2hrandd匹InIan餌alp85b血Ian小HMdpd皿md

慧諾監霊芯慧霊慧慧芸霊霊悪霊rdd畔地mdO●0★

；SlgniGmnuy心血ntかonbad訂Ou山⊂皿nbatP＜0・01・
−63−

表4

Thedensitiesofcolloidalgoldparticlesinthemusclefiber ofbiopsiedhumanmuscles
thathadbeentreatedwithpolyclonalantibodies tothecalpainsortocalpastatin orWith monoclonal antibodies specific for mM−Calpain♯
And・Cdpain

And・C叫p

認諾謡

血血

等慧㌢

And And

鮎。血

一認諾

芯慧㌢

Conh010．875＋0．099

0．糾何十0．M

0ユ64士0．M Oユ㍑＋0．051

DudlennemuSC山arl．175士0，110●

1．020士OJ4

0ユ24＋0．05

0．409士0．079●

伽加pby
Myo10nicd鰐はOpby O．乃7士0．u
PolymyoSi鮎

0．卯6士0．107

Nenr喝印血mu5mlar l．u9士0．11ユ●
且はOpby0．810士0．伽b
0．m士0．Ml
1．001士0．日

0．176士0．078

0ユ83士Q．050

0204士0．058

0．2位士0．041

0m2●

0351士0．脚＃；Figur田町モm払皿5pln50rmbuSSb皿山m柑Orme鮎m8nbma血0皿側5epamkmicm卵pb5br組曲

prlmalTmdbo叫＋；馳適評0皿dcou皿b：0．0亜±0．02，cou皿吋u皿lbrmddp血址dd騨血血；0．001士0．00lC0皿励hlhmnd〃MandmMdpd皿5．
●・；Pく0．05，：Pく0．01

JLM−Calpainは平均密度では増加を示したが，統計学的に有意差はなく，mM−Calpainのみが有意の増加を示した．また，ALSを含む神経原性筋萎縮症筋では，mM−CalpainのみならずJLM−Calpainも有意に増加した．しかし，Calpastatinは何れの疾患でも対照に比してcolloida1−gOldの平均密度は増加したが，統計学的に有意の増加を認めなかった．また，緊張性ジストロフィーや多発性筋炎
ではcalpainsおよびCalpastatinの増加は共にみられなかった．
図1は4歳のDMDの生検筋であるが，形態的に筋原線経が比較的保たれている筋線経では，上段に示すようにCalpainはその量の増加を認めるが，細胞内分布においては対照筋と何ら変わることなく，筋原線維上にびまん性に認められた．一方，同一筋でも下段に示すように変性が進み，筋原線経の崩壊の著しい筋線経では，むしろ
calpainの数は減少し，所々矢印に示すように
patchyに集族するところもあるが，概して
colloida1−gOldは疎らに散見された．
また，同じDMD筋におけるmM−Calpainの分
布でも，先に示したpolyclonalcalpainと同様に，形態的に筋原線経の変化の軽微な筋線経では，びまん性にmM−Calpainの増加が見られ，筋原線経の変性の著しい筋線経では，やはり減少がみられた．
図2は36歳のALSの生検筋だが，神経原性筋
萎縮症の筋でも上段に示すように，Calpainは対照，DMDと同様に筋原線維上にびまん性に見られた．しかし，筋の変性が進行し，筋原線経の崩壊が著しい筋線練では寧ろ減少する傾向を認めた．
また，mM−Calpainの局在では，やはり同様に変性・崩壊の著しい筋原線経でcolloidal goldは減少した．
考察
これまでヒト生検筋を含め九と も扇形levelでのcalpainおよびCalpastatinの局在と動態に関する検討はないが，前回の濯流固定ラット骨格筋での定量的検討では，Calpainは筋原線維上にびまん性に存在し，細胞内を流動一し易いものの，統計
的にはcalpainsおよびcalpastatinはZ−diskを含むⅠ−bandに多く，また，筋鞘膜にも比較的認められた1）・2）．そしてcalpainのうち筋原線維上には−64−

図1DMD（4歳）患者骨格筋の免疫電顕写真．
形態的に変化の軽微な筋線経ではcalpainsは増加し，筋原線維上にびまん性にみられるが（上段），筋原線経の変性・崩壊が著しいとこ
ろでは，むしろ減少する（下段）．しばしば集族もみられる（←）．Bar＝1FLm

図2 ALS（36歳）患者骨格筋の免疫電顕写真．
神経原性筋萎縮筋でも同様に筋原線経の変性崩壊が著明な筋線経でCalpainsは減少する．

〃Mが，筋鞘膜にmMがより多く存在する傾向を認めたl）．しかし，今回のヒト正常骨格筋での検討

い制限がある，あるいは半定量である，など多々Bar＝1JLm

ではcolloida1−gOldの総平均密度で同様の傾向を認めるものの，濯流国定ラット骨格筋と異なり統問題はあるが，我々は今回colloida1−gOld標識免疫電顕法を用いて検討せ行った．その結果，定量
的にはDMDおよび神経原性筋萎縮症でCalpain

計学的には，必ずしも有意の結果が得られなかった．■これは摘出骨格筋に生検操作による侵襲が加わったためと思われ，それだけに本酵素が細胞内で種々のストレスにより流動し易いことが示唆された．
現時点で本酵素の微量測定がほぼ不可能に近いは有意に増加し，特に前者ではmM−Calpainが，後者ではJLM−およびmM−Calpainが増加して認められた．そして，これら疾患における局在は形態的に変化の軽微な筋線経では対照と同様に筋原

ことから神経筋疾患生検筋におけるcalpainおよびCalpastatinについて十分に検討した報告はな
い．現時点では，天然型のCalpainと活性型のそれを区別出来ないとか，検索し得る筋線推数に著し

Calpainは減少する傾向を認めた．
以上より，筋ジストロフィー筋，脱神経筋の筋
原線経の比較的早期の変性・崩壊に本酵素が何らかの関与をしている可能性が示唆された．本

線維上にびまん性にみられるが，筋の変性が進行し，筋原線経の崩壊の著しいところでは，むしろ−65−proteaseの発見以来，折からの筋ジスにおける筋形質膜の欠損の事実と合致して，本酵素がその発症機序の本質を演じていることが強調され，
CANP説（Ca2十一dependent neutral protease；calpainと同義語）なるものまで出たが，このproteaseは脱神経筋や絶食筋でも有意に増加
し1ト41必ずしも筋ジス筋にSpeCificなものではな
いど思われる．これまでの研究の多くは，本酵素の微量測定が不可能なことから玩J東和での検討に終始しているが，筋ジスにおける本酵素の意義を明らかにするためには，生検筋を含む〝 びわ0
1evelのdataの集積が必須である．しかし，その本

ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）昭和63年度研究報告
書，1989，pp62−67．
2）T．Kumamoto，KleeseWC，CongJYandGoll
DE：LocalizationinelectronmicrographsoftheCa2＋・dependent

proteinases

and

thier

inhibitornormal，Starved，anddenervatedrat
skeletalmuscle．JCellBiol（Suppl）105：27a，
1987．

3）Go11DE，KleeseWC，KumamotoT，CongJ
andSzpacenkoA：Inserchoftheregulation
and

質的な役割の解明には，まず，本酵素の微量測定法並びに天然型と活性型のCalpainの分別法の開発が望まれる．

functionoftheproteinases（Calpain）．

Ca2＋一dependent

IntracellularPro−

teolysis；meChanismsandregulation（edby

Katunuma N and Kominami E），Japan
ScientificSocietiesPress，Tokyo，1989，pp82

文

献

−91．

1）荒木淑郎，熊本俊秀，GollDEandSternLZ：
ラット骨格筋におけるCa依存性プロテアーゼ

4）EIceJS，Hasspieler R and Boegman RJ：

およびそのインヒビターの局在および動態について． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋

skeletal muscle measured by animmuno−

Ca2＋−aCtivatedproteasein

denervatedassay．Exp Neuro181：320−329，1983，

−66−

rat

9）ラット培養筋細胞におけるリソソームの動態
木 南 英 紀＊研究協力者 武 野．大 策＊ 須 藤 典 子＊ 内 山 安 男＊＊

は じ め にDuchenne型筋ジストロフィー症で欠損しているジストロフィンの性質が次第に明らかになりつつあるが，筋細胞膜の異常にはじまり，最終的に筋崩壊・壊死に至るプロセス・機構はまだ全く分

各種酵素活性を測定した．β−グロタロニダーゼ活性はGlaserらの方法3），ベルオキシターゼ活性はIshikawaらの方法4）によった．電子顕微鏡及び免疫電顕の手法はUchiyamaらの方法5）に従って行った．

かっていない．我々は筋蛋白質の終末的な分解には浸潤マクロファージのリソソームプロテアーゼ群が関与すること1），およびそれ以前に筋細胞内の自己貪食−リソソーム系が活性化されていることを報告してきた2）．筋細胞におけるリソソームの動態や自己会食の誘起の機序に関する研究はほ
とんどない．本年度は培養筋細胞を用いた生化学
的及び形態学的なリソソームの動態の解析結果を
報告する．
材料と方法
本研究にはラット由来の筋芽細胞（国立精神・神経センター神経研究所小沢鋲二郎先生より供与）をもちいた．筋芽細胞（L8E63）をはじめ100
mm径のシャーレに1．5×106／dishの細胞を播種し，これを10％の牛胎児血清と3％馬血清を含む
DME液で増殖させ，COnfluentに達した後，4％
馬血清を含むDME液に換え分化誘導させた．異物会食をみるため，西洋ワサビベルオキシダーゼ（3mg／ml）を細胞外に添加し，1時間あるいは15時間（筋芽細胞の場合には8時間）加温の後，それぞれの細胞よりリソソーム分画を得，パコール
密度勾配遠心によって分析した．全ての実験で28％パコールを用い，28，000回転（日立RP−40ローター），40分間遠心し，底から0．6mlずつ分画し，＊順天堂大学医学部生化学第一講座＊＊筑波大学医学専門群

結果
1．筋芽細胞及び筋管細胞におけるリソソームの密度の差
ラット筋芽細胞（図1−a）はconfluentに達す
ると6日日ごろより筋管細胞を形成し始め10−12
日目には殆どは筋管細胞にまで分化する（図1−b）．この12日目の筋管細胞と筋芽細胞より粗リソ
ソーム分画を調製し，パコール密度勾配遠心によってリソソーム密度の差を調べた結果が図2に示されている．リソソームマーカーとしてβ−グルタ
ロニダーゼ活性を測定した．他のβ−へキソサミダーゼなどのマーカーでも同様の結果を得ている．
筋芽細胞ではリソソームは軽い密度分画にほとんどが回収されるのに対し，筋管細胞では管底近くの重い密度の分画に約30％がシフトしていることがわかる．リソソーム密度が重い原因としては，
1）過剰な摂食・会食，2）消化されない物質のエ
ンドサイトーシス，3）リソソーム内分解の障害，
4）分解物のリソソーム外放出の障害などが考えられる．この場合1）の可能性が最も高いと考えられる．
2．過剰な異物会食に基づくリソソーム密度の変化
筋細胞が外から加えた西洋ワサビベルオキンダーゼ（HRP）を取り込み（異物貪食作用），リソソームへ運搬することは証明されている6）．しかし，HRPのリソソームへの蓄積によってリソソーム−67−

図1培養2日目の筋芽細胞（a）と15H目の筋管細胞（b）×400の密度が大きく変化する程度の会食能かどうかの検討はなされていない．培養腹腔マクロファージ
では培養液に加えたHRPのリソソームへの蓄積に比例してリソソーム密度が大きく増加することを我々は兄いだしている．これはマクロファージの強い貪食作用によって，リソソームの分解能を上回るHRPがリソソーム内に蓄積することによることを他の実験結果からも実証している．そこ
で，同様に大量のHRP（3mg／ml）を1％の馬血清を含む筋管細胞に加えた解析結果が図3−aに示されている．HRP添加後1時間では細胞内に入ったHRPは軽い密度分画にほとんどが回収さ
5FractbnNo

図2

10

5

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筋芽細胞（a）及び筋管細胞（b）から調整したリソソーム分画のパコール密度勾配
遠心におけるマーカー酵素の分布

れ おそらくエンドソームに局在すると考えられ
る．15時間後では細胞内HRP量は20倍に達し，25％が重いリソソーム分画に認められる．それにともないリソソームの密度もわずかではあるが重い
分画へのシフトが認められる．同様の実験を筋芽細胞でも行った（図3−b）．筋芽細胞では血清濃度
−68−

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10

5

FractionNo

FractionNo

10

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10
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図3 筋管細胞（a）及び筋芽細胞（b）における西洋ワサビベルオキシターゼ（HRP）の異物貪
食によるリソソーム密度の変化．対照（M），HRP負荷（ト●）を下げることが出来ないので，血清濃度は変えず，
HRPを負荷した．細胞内に取り込まれたHRPの移行は筋管細胞と同様の動態を示し，8時間ではHRPのリソソームへの蓄積につれわずかにリソ
ソームの密度が増大した．今度は，HRPを負荷せず，自己貪食を抑制する条件下（血清濃度を10％とする，図4参照）でリソソーム内蛋白分解を阻害した場合，リソソーム密度がどう変化するかを調べた．筋芽細胞及び筋管細胞にE−64−dを20〝g／ml添加し，16時間後に細胞からリソソーム分画を調製し，パコール密度勾配遠心で解析した．筋芽細胞，筋管細胞ともE−64−dの添加によりリソソームマーカーの30〜40％が重い方へシフトしており，取り込まれた血清蛋白のリソソーム内の分解阻害の結果，リソソーム密度が増大したと考えられる．即ち上記の結果は筋芽細胞，筋管細胞いず
れも異物食食作用を有し，HRPあるいは血清蛋

白を取り込み，一部はリソソームへ運搬しているが，リソソーム内蛋白分解を阻害しない限り，リ
ソソーム内に多量に蓄積するほどの会食能はない
ことを示唆している．
3．筋管細胞における自己会食に伴うリソソーム
密度の変化
種々の血清濃度に変えた筋管細胞にE−64−d（20〟g／ml）を加え，培養し16時間後に細胞を集めた．
粗リソソーム分画をパコール密度勾配遠心で分析した結果が図4に示されている．無血清培地で培養した細胞では重いリソソーム分画即ちオートリ
ソソームに自己貪食のマーカーであるLDHの蓄積がE−64−dの添加により認められるが，血清濃度が上がるにつれ，自己会食が著明に抑制されていることが分かる．一方リソソーム密度は無血清状態の方が血清存在下よりやや高い（E−64−d無添加群の比較）．これは16時間における自己会食能の

−69−

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図4 筋管細胞における自己会食によるリソソーム密度の変化■】

方が異物会食能を上回っていることを示唆しているのだろう．そのことはE−64−dの添加によるリソソームマーカーの重い分画へのシフトが，無血体を用いた免疫電顕的検査でカテプシンLの局在

清状態の方がやや多いことでも裏付けられる．10％血清で維持した細胞では異物貪食された蛋白質の蓄積によるリソソーム密度の増大であり，0％れる．筋管細胞ではミオシンを多量に含むが，昨血清で培養された細胞におけるリソソーム密度の増加は自己会食された蛋白質の蓄積による．
4．L8細胞の形態学的特徴
筋芽緋包から筋管細胞に分化するとカテプシン
B活性は3〜4倍増加する．カテプシンBの局在明した．抗ミオシン抗体を免疫電顕的観察でもそを免疫細胞学的にみると，筋芽細胞では核周囲に限局しているが，分化すると細胞全体に分布する
ようになる．筋管細胞を無血清培地に移し，
E−64−d添加後16時間目の細胞の電顕像を図5−a，bに示す．細胞全体に多数の食胞を認め，種々の内容物が認められる．これらは筋細胞における自己会食胞の形成を意味している．カテプシンL抗を示す金コロイド粒子を含むリソソーム（図5−
C，矢印）が会食胞と融合しているところがみら
年度無血清培養下では自己貪食胞にミオシンが取り込まれていることをウエスタンプロット法で証の金コロイド粒子を貪食胞の中に兄いだすことが出来る．また，時には会食胞の中にミオシンの重合したような像あるいは切断された一部が兄いだ
された．
考

察

リソソームの密度が不均一であることは肝を中心とした多くの研究があり，おそらくリソソーム
内の消化状態を反映すると考えられている．培養
細胞系でのリソソーム密度の変化が生理的機能にともなったものであるかを追求した報告はなく，−70−最近我々は血清の存在がこれに大きく関与することをマクロファージの培養細胞系で明らかにしてく増加したのではないかと推定している．勿論リ
ソソーム酵素の生合成が分化のプロセスで活性化いる．筋芽細胞から筋管細胞へ分化するにつれ，
リソソームのカテプシン群を含む酵素活性が増え3〜5倍に達することを昨年度報告したが，リソソームの密度もこれと平行して増加している．今回の結果はおそらく細胞内に取り込まれた蛋白されることも十分考えられ，おそらく両者とも関与している可能性が高い．筋芽細胞では核周囲だけにみられたカテプシンBが筋管細胞では細胞全（血清蛋白）がリソソームに次第に蓄積していきリ
ソソームの退縞が遅くなり，細胞内のリソソームの数おそらく容積も増え，リソソーム酵素が著し体に広く分布するという形態学的観察，筋管細胞では非常に多くの貪食胞が見られるという電顕的観察も上述の推論を支持しているように思われる．
筋の分化におけるリソソームの動態は玩∴正犯でも調べる必要があろう．

−71−

HRPを筋細胞に負荷したとき，リソソーム密2）Kominami E，Ii K and Katunuma N：

度が重い方へ著しく移行するという現象はみられ

Activation oftheintramyofibralautophagiQなかった（図3）．ニワトリ筋管細胞はHRPを細lysosomal systemin muscular dystrophy．

胞内に取り込み分解し，一部はユタソサイトージ

AmerJ Patho1127：21−26，1987．

スするという6）．本実験ではHRPのユタソサイト

3）GlaserJH and Sly WS：β−Glucuronidase

ージスは確認していないが，過剰のHRPを加え

deficiency mucopoly・SaCCharidosis．Methodsており，つねに細胞内に取り込まれている状態で

forenzymaticdiagnosis．JLabClinMed82：

あり，休みなくリソソームへも運ばれていると考969一づ77，1973．

えられる．筋細胞においてリソソーム密度の変化

4）Ⅰshikawa E，Imagawa M，Hashida S，が小さいことはHRPの細胞内取り込み能，リソ

Yositake S，Hamaguchi Y and Ueno T：

ソームの数，エンドソームーリソソーム融合能なEnzyme−labelling of antibodies and their

どがマクロファージよりずっと低いことに由来す

fragments for enzymeimmunoassay andるのであろう．

immunohistochemical staining．JImmuno−

何らかの細胞障害（例えば筋ジストロフィー症

assay

4：209−327，1983．

など）があると異常産物の処理のため自己会食が誘起され，それが筋線経の崩壊へと導くと考えら

5）Uchiyama Y，Watanabe M，Watanabe T，れるが，障害時にL8筋細胞のリソソーム系がどの

E：Variationsinimmunocytochemicallocal・

ような動態を示すか興味ある問題である．

ization of cathepsin B

IshiiY，MatsubaH，WaguriSandKominami

and thyroxinein

follicular cells ofthe rat thyroidgland and文

献plasma TSH，COnCentrations over24hours．

1）KominamiE，Bando T，liK，HizawaKand

Cell Tissue Res256：355r360，1989．

Katunuma N：Increasesincathepsin B and

6）JaneczkoRA，CarriereRMandEtingerJD：

Landthiolproteinaseinhibitorinmuscleof
dystrophic hamsters．Theirlocalizationin

Endocytosis，prOteOlysisand exocytosis of

invading phagocytes．J Biochem96：1841−
1848，1984．

BioI Chem260：7051−7058，1985．

−72−

exogenousproteinsby culturedmyotubes．J10）筋ホスホフルクトキナーゼ欠損症における酵素・遺伝子異常について
垂 井 清一郎＊・＊＊
研究協力者

中

島

弘＊

河

野

典

夫＊

山

崎

堀

田

紀久子＊

川

知

雅

典＊

大

野

知

行＊
昭＊

は じ め にHMTFhmA千丁訂†！？F彗丁！TT千丁千丁．酬

筋ホスホフルクトキナーゼ（PFK）欠損症（グ））コーゲン病ⅥI型）は，米国MDA（Muscular
DystrophyAssociation）の検索対象としても注目されている常染色体性劣性遺伝の代謝性筋疾患である．分担研究者らが1965年にその第一家系を報告し，同時に欠損酵素を同定して以来1），現在までに世界で約30症例を数える2）．本症の病態分析のうち，赤血球解糖代謝の変動3），筋原性高尿酸血症4）などについてはこれまで報告してきた．現在
私共は，本症の病因を遺伝子レベルで解明したい

LHMl）2El．8

ー1

0

1

2

3

（kb）

（E：EcoRkはHnd晒RPs鴫S：S凱13AtT：Tも可）

図1

正常筋PFKのCDNAクローンと考えている．そこで本研究では，まず正常ヒト
筋PFKの一次構造をcDNAクローニングから決定し，ついで同遺伝子構造を遺伝子クローニン

dideoxy法により仝塩基配列を決定した5）．
②正常ヒト筋PFKゲノムのクローニング

グによって分析した．さらに，筋PFK欠損症患者の変異酵素の構造とその原因となる遺伝子異常を解析した．

り提供された日本人ゲノミックライブラリー

JCRB（日本がん研究振興財団遺伝子バンク）よ（EcoRl部分消化）をヒト筋PFKのCDNAをプローブとしてスクリーニングし，約20kbのインサートを有するクローンを単離した．次に同クロー

方

法

ンの5

①正常ヒト筋PFKcDNAのクローニング

端をプローブとして別のライブラリー（Sau3AI部分消化）からオーバーラップを有する

ヒト筋mRNAより岡山・バーグ法によりインサート長約17kbのクローンを単推した．制限

CDNAライブラリーを作成した．家兎筋PFKの酵素地図作製，塩基配列決定からヒト筋PFK遺部分cDNA（Putney博士より提供さる）を用いて伝子の全構造を解析した．

ヒト筋PFKクローンpHMPl．10を得た．このクローンは5 末端（蛋白N末端）側を含まなかった③筋PFK欠損症患者の分析ため，AgtlOを用いてプライマー・エクステンショ

1gtlOによりcDNAライブラリーを作製した．正ンライブラリーを作成し，1HMPE4．1，人HMP

常cDNAをプローブとして患者筋PFKの完全

2E1．8をクローニングした（図1）．これらは長を含む複数のCDNAをクローニングし（図2），
全塩基配列を決定した．また患者遺伝子について＊大阪大学医学部第二内科＊＊大阪大学医学部神経内科

欠損症患者筋生検標本よりmRNAを抽出し，は，Taqポリメラーゼを用いた遺伝子増幅（PCR）
法により分析した．
−73−

GT，3，端はすべてAGであり，高等動物ゲノム
ヽ

に特有のGT−AGルールにコンセンサスな配列をヽ有していた．
患者cDNAの塩基配列を分析したところ，開始
コドン（ATG）のA（アデニン）を1としたとき，第516番にTからCへの単塩基置換が存在したが，これはThr（スレオニン）のコドンを変えないSilentな置換であった．さらに下流には75塩
基対すなわち25アミノ酸残基に相当するin−frameの欠夫を有した．この欠失部位を含む遺伝
図2

筋PFK欠損症患者の筋PFKcDNAクローン

子領域をPCR法によって増幅し分析したところ，患者遺伝子上にmRNAの欠失部位に相当するユ結

キソン下流のイントロン5，のスプライスサイト

果

正常ヒト筋cDNAの塩基配列から，そのmRNAの構造が明らかとなった．ヒト筋PFKのにpointmutation（GからT）が存在することが明らかとなった．

mRNAは，5，非翻訳領域，開始コドン（ATG）

考以下2337塩基対，779アミノ酸残基の翻訳領域，停案

止コドン（TAA）以下ポリA付加シグナル

ヒトPFKには少なくとも筋型，肝型および血（AATAAA）を含む399塩基対の3 非翻訳領域とポリA鎖からなっていた．またこのmRNAによ

小板型の三種のアイソザイムが存在するが2），血ってコードされる酵素タンパクの分子量は85，050

造についての知見は得られていない．骨格筋では，

ダルトンと算定された．家兎筋PFKでは，遺伝子筋型アイソザイムが，ホモ・テトラマーとして機翻訳領域の配列が報告されているが6），ヒトと比能するが，心筋，平滑筋など他の筋組織で筋型ア

較すると，翻訳領域内のホモロジーは塩基レベル

イソザイムが発現しているか否か，あるいは筋型で89％，アミノ酸レベルで96％であった5）．

以外のどのアイソザイムが発現しているかといっ

小板型についてはいまだその一次構造や遺伝子構

次に，筋PFK遺伝子の構造を解析した．本遺伝

た組織特異性は，Northern分析によって現在解析中である．

子のユキソン構造は，家兎のもの6）と非常によく類似しており（図3），イントロンの長さに相違を

筋PFK欠損症であるグリコーゲン病ⅥⅠ型は，認めたものの，ユキソン数，ユキソン長は完全に筋運動時の疹痛，運動持続能力の低下，溶血およ

一致していた．各イントロンの5び高尿酸血症を主微とし，代謝性筋疾患としては，

端はすべて

嶋的p

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±

N●hlI

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図3

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22

仁一hdlI

封叫叫叫lT芦1●■丁

チエ浩寸志

登竜節詰

家兎筋PFK遺伝子の構造
文献6）より改変．ローマ数字はユキソン番号を，アラビア数字は各ユキソン内のアミノ酸残基
数を示す．
−74−

酵素異常の明らかとなっている疾患単位の一つとして重要視される．本症における高尿酸血症の程度は筋グリコーゲン病の中でも特に顕著で，筋原性高尿酸血症の概念を提唱する契機となった所見でもある4）．筋グリコーゲン病としては比較的多く報告されているグリコーゲン病Ⅴ型では，複数の患者筋のホスホリラーゼmRNAの分析が行われている7）．これによると，V型ではmRNAの完全欠損から量的な変化にわたる様々な欠損状態，
すなわち遺伝的多様性の存在が示唆されているが，

文

献1）TaruiS，OkunoG，IkuraY，TanakaT，Suda
M and Nishikawa M：Phosphofructokinase
deficiencyinskeletalmuscle．Anewtypeof
glycogenosisBBRC19：517−523，1965．
2）Rowiand LP，DiMauro S and Layzer RB：
Phosphofructokinase

deficiency

Basic and Clinical

Myology：（ed by Engel AG＆Banker BQ），1986，pp1603−1617．
3）ShimizuT，Kono N，Kiyokawa H，Yamada

酵素および遺伝子レベルでの変異部位が同定されるまでにはいたっていない．Ⅵ1型では今回の分析

Y，HaraN，MineoI，KawachiM，Nakajimaが最初であるが，患者に認められた25アミノ酸残基の欠夫は，酵素の一次構造上C末端側2分の1に位置し，アロステリック部位の一つ，ADP／

glycolysis andits marked

H，Wang YL and Tarui S：Erythrocyte
alteration by

muscularexercisein typeⅥⅠglycogenosis．

Blood71：1130−1134，1988．

AMP活性化部位の活性中心の一つのArg（アルギニン）の欠夫を伴う．また同時に，2本のαへリックスと1本のβシート構造をも欠失することから酵素全体の立体構造に大きな変化をもたらし，活性の完全な欠損にいたると考えられる．
cDNA上の欠失部位に相当する患者遺伝子領域4）MineoI，Kono N，Hara N，Shimizu T，を現在クローニング中であるが，Taqポリメラー
ゼを用いた遺伝子増幅（PCR）法の結果からは，

5）NakajimaH，NoguchiT，YamasakiT，Kono

患者遺伝子上のPOint mutationによりRNAス
プライシングの異常から75塩基の欠矢をきたしたことが示唆された．複数例のⅥⅠ型患者において筋PFKのmRNA欠損ないし量的，質的な変化が認められるか否か，また遺伝子上のいかなる変異をともなっているかを今後検討して行く必要がある．

muscle phosphofructokinase cDNA．FEBS

YamadaY，KawachiM，KiyokawaH，Wang
YL and TaruiS：Myogenic hyperuricemia．
A common pathophysiologiC feature ofglycogenosis typesIII，Ⅴ，andⅦ．N EnglJ
Med317：75−80，1987．

N，TanakaTandTaruiS：CloningofhumanLett223：113−116，1987．
6）LeeCP，KaoMC，FrenchBA，PutneySDand
ChangSH：Therabbitmusclephosphofructo−
kinase gene．Implications for protein struc−ture，function，andtissuespecificity．JBC262：
4195−4199，1987．

総括7）GautronS，DeagelenD，MennecierF，Dubocq

本研究の結果，D，Kahn A and DreyfusJC：Molecular1．ヒト筋PFKの一次構造をcDNAクローニン
グから決定し，家兎筋酵素との構造比較を行った5）．
2．ヒト筋PFK遺伝子をクローニングし，その全構造を解析した8）・9）．

mechanisms of McArdle，s disease（muscle

3．筋PFK欠損症患者の変異酵素の構造を分子
生物学的手法を用いて分析し，さらにその遺伝子異常部位を同定するに至った10）．

glycogen phosphorylase deficiency）．RNA
and DNA analysis．JCI79：275−281，1987．
8）YamasakiT，Nakajima H，Kono N，Hotta
K，Yamada K，Kuwajima M，Noguchi T，Tanaka T and Tarui S：Humanmuscle
phosphofructokinase gene−StruCture andtwo promoter system，Submitted．
9）Nakajima H，Yamasaki T，Noguchi T，−75−

Tanaka T，Kono N and TaruiS：Evidence

K，Kawachi M，Kuwajima M，Noguchi T，for alternative RNA splicing and possible

Tanaka T and Tarui S：Genetic defectin

alternative promotersin the human muSCle

muscle phosphofructokinase gene due to aphosphofructokinase

pointmutationatthe5

gene

at

the5

untrans・

lated region．BBRC166：637−641，1990．

−76−

splicesite，inpress．

ⅠⅠⅠ．遺 伝子11）CANP遺伝子の発現調節と機能
鈴

研究協力者

木

大 野 茂 男＊紘榎
反秋 田 朗 子＊

森 康 文＊ 川 崎 博 史＊町 洋 之＊ 羽 田 軒子事の生理機能との関係を考察した8）．

は じ め にカルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）
は筋タンパク質の崩壊の引金を引くプロテアーゼとして研究され，CANPやカテプシンB，L，Hなどのシステインプロテアーゼに有効な阻害剤としてE64が開発された．その後，筋ジストロフィー症の原因遺伝子としてジストロフィンが同定され1），ジストロフィンは主に筋肉細胞の細胞膜部位に存在することが示された2）・3）．筋ジストロフィー症，特にDuchenne型（DMD）ではジストロフ
ィンの発現が全く見られないことから2）・3），CANPと筋ジストロフィー症における筋萎縮の関係は次のように考えられている4）．すなわち，DMDではジス．トロフィンの欠損により筋細胞膜の透過性が変化し，細胞外のカルシウムイオンが細胞内に進入し，CANPが自己消化によって不活性型から活性型に変化し，筋タンパク質の分解がおこる．
ジストロフィンの同定と相前後してCANPの活性化機構に関する研究が大きく進展した5）「7）．
その結果，これまで活性型と考えられていた
CANPは実は不活性型のプロ酵素で，大サブユニ
ットのN末端のプロペプチドドメインが切りとられて活性型に変る．この活性化はカルシウムとリン脂質の存在下で自己触媒的におこるが，細胞膜のない玩1戒ねでは活性化するのにmM程度の高いカルシウムの存在が必要である．こうして
CANPが玩1戒ねで何故非生理的に高いカルシ
ウム濃度を必要とするのかが判明し，CANPに関する矛盾点が解決できた．
ここではCANPの生理機能を考えるため，改めてCANP遺伝子の発現機構を検討し，CANP＊東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部門

一＊

材料と実験
ヒトmCANP大サブユニットcDNAの最もN末端側のApaI断片（0．35kb）をプローブとし，
ヒトの染色体DNAライブラリーをスクリーニン
グLCANPの5′上流域のDNA断片をえた．
CANPの上流域の機能を解析するため，CAT遺伝子とSV40のプロモーター／ェンハンサーを含む発現ベクターに種々のCANPのDNA断片を挿入し，CAT活性の変化を観察した．その他の実験方法は文献8に記したものを用いた．
結果と討論
1．mCANP大サブユニットの5′上流域の構造
mCANP大サブユニットのr5′上流域の構造を図1に示した．この領域にE享明確なTATAやCAAT配列はなく∴GC含量が高かった．また，複数個の転写開始卓が見出された．これらはハウ
スキーピング遺伝子に一般的に見られる特徴で，
CANPの発現が普遍的であるごとを考え合せると，CANPもハウスキーピング遺伝子の一つと考えられる．
2．5′上流部の機能の解析
CANP遺伝子の発現を制御する部位を同定するため，CAT発現ベクターの上流にCANPの5′
上流域の種々の断片を組込み，CAT活性の発現を調べた．図2に示すようにCANPの5′上流域の一2．5k一一20bの部分をCAT遺伝子の上流に挿入したプラスミド（p−2．5k／一20CAT）は低レ
ベルのCAT活性しか発現しなかった．すなわ
ち，−2．5k一一20bの部分は弱いプロモーター活性しか示さなかった．次に，上記の断片を5′側ー79−

CGGCCTCCCAAAGTGTTGGGATTACAGGTGTGAACTACCGCACCCAGCCTTATTGGCCA＿700

AATCTGACACCCTATCTATAATCAATAACAGCTGAGCAGTAGTAAmCAGCATTATGCA
ATAGCTCGGTGCTTAGAGTCCCTGTTCTGCCTGTGACTGGTGTGCCACCATTGGGGCCGT−600
CATTTAGCGTCTCCGAGGCTCAGTTTTCTCATCTGTAAA4TGGGGACAATATCAGCGCCT−500
TCTTCAGAGTCGCTGGGAGGATTAAATGAGATGATGTATGCAGAGCCGTTAAGACGATGT

TTGGCACAAAGTTCAGGGCAGCTGGTTTAGTTTCCTCGACTTCACTACCTGACCCTCTGC−400
TAACTCCCCGGGTGTTTTCCGGACGGCCACAACTATCCTAGCCTTCTTCCCTATGGGCTGCAAAGGTGGCCTCGGGTTCCGGTGGGAGCCCCAACTCTGGACCGCGATTCGCGAGCCTCC

ccGGCGCCGGaCCGTGCATCとcGGGAGCTGiccGCAGATfGCAGCACCGGtCCGTGTCGC
negativeelement＿2ら0−PrOmOter
GGCGTTCCCGGCGCTCGGCAGGCCGAGATGGCTGGTCCCGGGCCGGGAGCCCAGCAGGCC

占GGAGCGGCTaAGGCCACACとccGCBGGGCとGGGtr：GC；；dc

SpI

CCGGTG

AP−1（TRE）▼▼▼▼ ▼ ．
▼100
CGCAGCGGCGGCGCCCGCAGTGGCCGCAGCAGGCCGCCGGGCCCTGGCCGCGCCCCAGCC−1GAGCGCAGCGCGGAGTCGCCCCGACCTTTCTCTGCGCAGTACGGCCGCCGGGACCGCAGC

ATGGCGGGCATCGCGGCCAAGCTGGCGAAGGACCGGGAGGCGGCCGAGGGGCTGGGCTCCCACGAGAGGGCCATCAAGTACCTCAACCAGGACTACGAGGCGCTGCGGAACGAGTGCCTC

HisGluArgAlaI leLysTYrLeuAsnGlnASPTYrGluAlaLeuArgAsnGluCYSI」eu
GAGGCCGGGACGCTCTTCCAGGACCCGTCCTTCCCGGCCATCCCCTCGGCCCTGGGCTTC
GluAlaGlyThrLeuPheGlnAspproSerpheProAlaI leProSerAlaLeuGlyPhe

AAGGAGTTGGGGCCCTACTCCGGCAAAACCCGGGGCATCGAGTGGAAGCGCCCCAC
IleGluTr
LysGlu工一euGlyproTyrSerGlyLySThrAr

79
GGAAGCGCGCGGCAGGACGCGGGCAGGGCGGAGAGCCGGGCAGGGCGGGGTGCAGGCCGG
300
ccCGCGCGCGCTGGGGGGGGGCACCGGGTGCTGCAGTGGGGAAGCCGAAGCAGGCCAGATCTGGACACTCGGCGC

図1mCANP大サブユニット遺伝子の5′上流域の構造ー80−

卜N4＋N3＋N2＋Nl」−P2−トpl」
−2．5k

：Jf

−690

−160

；〟

−260

−202

−160

−130

−80

−20

月汀G

：J
mCANP80K

p−2．5k′−2肥汀

p−260′−2仙汀
P−202′一犯汀
P160／一mP−202′棚汀P・202′−130CJ汀
■
0
0

1

ご；；Uq↑VU〇三l巾一〇∝1●l●●●●
一2．5k

−690

−460

−260

−202

−160

−130

−80

Pos旧On OI5■or3■End

図2

mCANP大サブユニット遺伝子の5′上流域の機能解析から3′側に向けて順次削除していったところ

各々独立に作用しうる．この負の作用は配列の方（pT460／−20CAT，p−260／−20CAT，p−202／−20CAT），CAT活性は次第に上昇し，一2．5k
一一202bを除去したものははじめの活性の約13倍に上昇した．従って，−2．5k一一202の領域は
CANPの発現を負に調節する部位である．さらに向には関係なく，CANPのプロモーターの発現を抑制するだけでなく，CANP以外の外来遺伝子のプロモーターにも全く同じ効果を示した．一方
CANP遺伝子の発現を正に調節する領域（−202〜−80）は典型的なTATAボックス等は含まないがプロモーター領域と考えられる．この領域はPlとP2の2つに分けることができる．

5′側を一160まで除去するとCAT活性の著しい低下がみられた．一万3′側から同様な削除実験を行うと，−80〜−20の領域はCAT活性に影響ないが，−130〜−80領域の除去はCAT活性の著しい低下をきたした．さらに詳細な解析を行った結果をもとにCANPの5′上流域の機能の模式を示したのが図3である．CANPの5′上流域の−2．5k一一202の負の発現調節領域は少なくともNl〜N4の4つの部分に分けることができ，

P2（−202−−130）は単独では完全なプロモータ
ーとはなりえないが，TATAボックスを含むイン
ターフェロンのプロモーター等には配列方向には無関係に作用する．すなわち，P2はプロモーターの上流因子といえる．一方Pl（−130〜−80）も単
独では完全なプロモーター活性を持たないが，インターフェロン遺伝子のTATAボックスを含む−81−

Negative ElementP
te r
・rO m O−

− Exonl
■
「
，
。
b

mT h
l

ー2．5kb

−690

−460

−200

−260

−130

−80

＿二三杢N3 垂≒ NI P2コロー一十」
◇

◆

◆

◆

AP−1▲●spl

Trans−ActZng Factor

図3

Trans−Actj喝Factor

mCANP大サブユニット5′上流域の構造模式図

領域の作用をはたすことができる．P2はプロモー

胞質の因子，すなわちトランスの因子が関与する

ターの下流因子に相当すると考えられる．
3．CANPの発現に関与する細胞質因子
CANP遺伝子の発現は正および負のシスの調か否かを検討した．図4に示すようにCANPのプロモーター領域に相当する−202−−20をCAT遺伝子の上流につないだプラスミド（pT−2）とその中のP2（−202−−130）に相当す

節因子によって制御されるが，この発現調節に細−2．5kb
1

−690
；；l

N印

VOE■omonト

−460

ー260

2

5

−130

−80

−20
宣．■

∬G
」一一＿

5

i

4
3
2

ゝ一三一〇く●＞；jO⊂−b
O．

書芸Uく〇三jO亡

くJl

ト→Prom。t。r

−202

1

5

10
P2′pT−2

15

10Hl′pT−1

R虚boIC岬はαtO向tPl脚は

図4

15

pT−1

pT−2

（叩はα′testpl柑nid＝17）mCANP大サブユニット遺伝子の発現に関与する▲細胞質因子の同定−82−

る領域を含むプラスミド（pC−5）を同時にHeLa細胞にトランスフェクトし，pT−2に対しpC−
5（P2）を次第に増したときのCAT活性の変化を調べた．図4左下のグラフのようにP2の発現量を増すとCAT活性の減少が見られた．P2と摸するDNA断片Nlを発現してもCAT活性には影響がなかった．次にNl部分を含むCATプラスミド（pT−1）とNl部分のプラスミド（pC−4）を使って同様な実験を行った（図4中下グラフ）．Nlの発現量が増すとCAT活性は上昇した．Nl以外の断片であるN2，N3，N4もNlと全く同じ効果を示したが，P2は効果がなかった．
以上の結果は次のように解釈できる．CANP遺伝子中にある正（P2）および負（Nl）のシス因子の作用には細胞内に存在するトランスの因子が必須である．P2やNlを同じ細胞で発現させると，
P2やNlと結合して作用を発現する因子が，余分に発現したP2やNl断片に結合して不足する．そTPA処理で活性化されるが，TPA処理でCANP
遺伝子の転写が促進され，CANPの量が増大す
る．増大したCANPはPKCを切断LTPA処理による情報伝達は終了する．このようにCANPの生理機能の1つは情報伝達とのかかわりで，
PKCのダウレギュレーションにおいて重要な機能をはたすと思われる．
ヒトCANPの小サブユニット遺伝子の詳細な機能解析は終っていないが，その5′上流域のヌクレオチド配列は大サブユニットと非常によく似ていて，AP−1，SPl結合部位も存在する．また〃CANP大サブユニットの構造もよく似ている．
おそらくJL，mCANPの大サブユニットと小サブユニットの遺伝子発現の制御機構は基本的には同じと予想される．これら3種のCANP遺伝子は各々別個の染色体上に存在するが，発現調節機構
が良く似ていることによってサブユニットの量比等の制御が同調して行なわれていると考えられる．

のためにCATの発現プラスミド中にP2やNlが作用しなくなると考えられる．P2が作用しなくな
ればプロモーター活性の低下，すなわちCAT活

文1）KoenigM，MonacoAPetal：Thecomplete性の低下となり，Nlの場合には負の制御が作用しなくなるので，CAT活性は上昇する．細胞内に存在するこのトランス因子，おそらくタンパク質性の転写調節因子，の結合は部位特異的なので，他の領域のDNAを発現させても効果はない．しかし，N1−4は同じ効果を示したので，この負の調節領域に働くトランス因子は同一または酷似したものと考えられる．
4．CANP遺伝子の発現調節と機能
上述のごとくmCANPの大サブユニットの遺伝子は正（Pl，P2）および負（N1−4）のシス調
節因子と，これに作用するトランスの因子によって複雑に制御されている．CANP遺伝子の配列（図1）中には転写因子の結合部位としてAP−1，
SPlの存在が目立つ．予備的な知見によれば，
mCANP大サブユニットの転写はTPAによって促進する．すなわち，AP−1結合部位が機能していると考えられる．CANPは前述のようにプロテインキナーゼC（PKC）と非常によく似た条件で

献SequenCe Of dystrophin products，a rOd−
Shaped cytoskeletal protein．Ce1153：219，
1988．

2）ArahataK，IshiuraSetal：lmmunostaining
Of skeletal and cardiac muscle surface

membranewith antibody against Duchenne
musculardystrophypeptide．Nature333：861，
1988．

3）Bonilla，E，Samitt CE et al：Duchenne
muscular dystrophy：deficiency of dystro−
phineatthemusclecellsurface．Cel154：447，
1988．

4）塚原俊文，杉田秀夫：筋ジストロフィーの新展開，実験医学6：1097，1988．
5）Suzuki K：Calcium activated neutral
protease：domain structure and activity
regulation．TrendsBiochemSci12：103，1987．
6）SuzukiK，lmajohSetal：CalciumaCtivated

細胞質から細胞膜に移行し活性化される．PKCは−83−

neutralproteaseanditsendogenousinhibitor．
FEBS Lett220：231，1987．

7）SuzukiK，Imajoh S et al：Regulation ofreiterated negative enhancer−1ike elements

activity of calcium activated neutral

regulatetranscriptionofhumangenefor・the

protease．Adv Enzyme Regu127：153，1988．

largesubunitofcalcium・dependentprotease．

8）Hata A

and Ohno S et al：Tandemly−84−

J BioIChem264：6404，1989．

12）Kennedy−Alter−Sung症候群の遺伝子解析
高 守 正 治＊研究協力者

松

横 地 英 博＊は じ め に

球脊髄性筋萎縮症Kennedy−Alter−Sung症候群（以下KASと略する）は伴性劣性遺伝型式をもつ
遺伝性運動ニューロン疾患で1），同疾患の遺伝子を明らかにすることは，運動ニューロン疾患の病
因解明の糸口として重要な意味をもつと思われる．
FischbeckらはⅩq21．31に位置するプローブ
DXYSlとKAS遺伝子の間に有意の連鎖を認め，
KAS遺伝子がⅩ染色体長腕近位部にあると推定
した2）．我々は昨年度の本姓会議でDXYSlによる遺伝的多型が本邦でも認められることを報告した．今回はDXYSlによるKAS家系の検索の結果，および平行して行っているPulsed field gelelectrophoresis（以下PFGEと略する）による巨大DNAレベルでの解析結果を報告する．
対象および方法
KAS6家系より検体を得た．
方法1．末梢血白血球から単牡したDNAを制限
酵素TaqIにて切断，アガロースゲル電気泳動により分離した．ナイロン膜にサザントランスファ
ー後，AmericanType Culture Collectionを通じDr．Pageより供与されたDXYSlを32Pでラベルしたものとハイプリグイズさせ，バンドをオ

原

四

郎＊

島

孝

仁＊

．結
果
KAS6家系の解析結果を図1に示す．DXYSl
はⅩ染色体において11．8kbと10．6kbの多型を示し，11．8kbのバンドのみられた個体をA，10．6kbのバンドのみられた個体をBで示す．左肩に矢印のついた個体で検体が得られたが，6家系中3家系で母親がすでに死亡しており検体が得られなかった．
PFGEではDXYSlは正常男性，正常女性ともに約150kbのバンドを認め，女性のバンドは男性のバンドの倍程度の漉きを示していた（図2）．これに加えて男性では約250kbのバンドを認めた．
同様にKAS患者のSfiIdigestをI）XYSlとハイ
プリグイズさせた結果が図3である．KAS1，
2，3は互いに別の家系に属する患者で，COntl，
2，3は正常男性である．KAS2，3は正常男性と同じ約150kbのバンドを示したが，KASlは約170kbのやや大きいバンドを示した．この他の2名のKAS患者では正常男性と同じ大きさのバンドを認めた．
正常個体のSfiIdigestとDXYSl近傍のプロー
ブDXSl（Xq11−13），DXS178（Xq21．2−22）をートラジオグラフィーにより検出した．
方法2．PFGEは，Van Ommenらの方法3）に従い，末梢血白血球を低融点アガロースに包埋し除蛋白後，制限酵素SfiIにて切断した．泳動はパルスタイム50秒，約20時間展開し，約600kb以下のDNA断片を分離した．DNAのサイズマーカーとしてラムダDNAのCOnCatemerとSacchar0−18

4▼品▼品6−品O。b蜘t。C8両r Al1．8kb
l patlont
810．6kb

mycescerevisiaeの染色体を用心た．
図1＊金沢大学医学部神経内科
ー85−

KAS6家系の分析結果

F

F

M

M

図2

正常男性と女性のPFGE分析結果

lS＜∠

1．1uOU

M
∽
−く
二と

M
■J

⊂
○
くJ

二∵：十九三千′ス

図3

KAS患者3名と正常男性3名のPFGE分析結果−86−−250kb−150kbハイプリグイズさせた結果，DXSlは約80kbのバ
ンド，DXS178は約100kbのバンドを検出した．
考zyme（ⅩhoI，SalI，MluI等）を使ってPFGEによるⅩ染色体長既近位部の解析を進めたい．

察

結Pageら4）の報告同様，DXYSlは，TaqIdigest
でX染色体において11．8kbと10．6kb，Y染色体において14．6kbのバンドを検出した．この疾患の場合，連鎖について情報が得られるのは母親が2重ヘテロ按合体の場合であるが，図1で第1家系と第4家系がこれに相当し，いずれにおいても組
み換えが生じていない可能性が強い．今後，家系を増やしKAS遺伝子とDXYSlとの間のlod

語

KAS6家系のうち，2家系においてKAS遺伝子座とDXYSlの連鎖が認められた．PFGEによる分析ではDXYSlはⅩ染色体由来の約150kbのSfiI断片を検出した．KAS6例中5例で同じ大きさのバンドを認めたが，1例で約170kbのやや大きなバンドを認めた．

SCOreを求めたい．同時にDXYSl近傍の他の70
ローブを用い，より強く連鎖するプローブをみつけ出す必要があると考えられる．
PFGEを用いることにより，DXYSlはSfiI

文献1）Kennedy WR，Alter M and SungJH：
Progressive proximal spinal and bulbar
muscularatrophyoflateonsetAsex，1inked
recessivetrait．Neurology（Minneap）18：671

digestで男女共通に約150kbのバンドを認めることから，このバンドはⅩ染色体由来と考えられる．
これに加えて男性で認められた約250kbのバンド

2）FischbeckKH，IonaescuV，RitterAWetal：はY染色体由来と推定したが，Ⅹ染色体のpartial

muscularatrophy．Neurology36：1595−1598，

digestionである可能性もある．互いに別の家系に属するKAS患者6例中，5例で正常男性と同じ
約150kbのバンドを認めたが，1例では約170kbとやや大きいバンドを認めた．これはRFLPである可能性の他，疾患自体による遺伝子の変異である可能性も考えられる．しかしFischbeckらの報
告では2）KAS遺伝子とDXYSlは組み換え価
e＝0．04において最大のlodscore3．53を示してお−680，1968．

LocalizationofthegeneforX・1inkedspinal
1986．

3）Van OmmenJTB and VerkerkJMH：
RestrictionanalysisofchromosomalDNAinasizerangeuptotwomillionbasepairsby
pulsed field gradient electrophoresis．
Human

approach

Genetic，IRL

Disease，apraCtical

presse，1986，ppl13−133．

4）Page D，DeMartinvi11e B，BarkerDetal：

り，まだかなり距敵があると推定される．また
PFGEの分解能として数10kbの不正確さが出る

Single−COpySequenCehybridizes・tOpOlymor−という報告もあり5），この点も除外する必要がある．

Ychromosomes．ProcNatAcadSciUSA79：

正常個体ではSfiI digestでDXSlは約80kb，DXS178は約100kbのバンドをそれぞれ検出した．
いずれもDXYSlによって検出されるバンドと大5）Van Ommen GTB，VerkerkJMH，Hofker

きさが異なっており，未だこれらのプローブ間の距艶は不明である．今後，DXYSl近傍の種々のプ
ローブを用い，またSfiI以外のrare cutting en−

geneonthehumanX−Chromosome．Cel147：−87−

phic andhomologouslocionhumanX and5352−5356，1982．

MH et al：A physicalmap of4millionbp
around the Duchenne muscular dystrophy499−504，1986．

13）ジストロフィンおよびアセチルコリン受容体
mRNA

発現に対するカルシトニン遺伝子関連ペプチドの修飾に関する研究
高 守 正 治＊研究協力者

吉 川 弘 明＊ 安 川 善 博＊

骨格筋における支配神経の役割は，単に興奮の添加した．8時間培養後，Guanidinium／Cesium

伝達にとどまらず，筋の栄養因子の供給という意
味でも重要である．筋の神経性栄養因子としてアセチルコリン（ACh）が重要視されてきたが，近年神経終末部にはAChとともにカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）が存在することが知ら

Chloride法によりtotal RNAを抽出しサンプルれるようになり1），その神経性栄養因子としての役割が注目されるようになった．CGRPは37個のアミノ酸よりなるペプチドで，カルシトニン遺伝
子上にコードされており，mRNAのスプライシ
ングの過程で臓器特異的にカルシトニンとRNA国定にはUV照射を行なった．プローブに

CGRPという異なったmRNAが発現することが知られている2）．我々はこれまでに，筋膜にはCGRP特異的結合部位が存在し，それがG蛋白質にカップリングしていること，さらにセカンドメ
ッセンジャーとしてcAMPを介してAChR誘導
増加や筋単収縮張力増強をもたらすことを示してを使用した．この部位はスペクトリン様3重ら旋きた3）．これはCGRPが神経性栄養因子として働くことを示すものと思われる．今回は骨格筋構成蛋白であるAChRおよびジストロフィンの発現に神経性栄養因子であるCGRPが影響を及ぼすか否かについて調べた．

とした．このサンプルを使いホルムアルデヒド法
によるノーザン7●ロットハイプリグイゼーション，
スロットドットハイプリグイゼーションを行なった．フィルターはナイロンフィルターを使用し，はβTaCtin，AChRα−Subunit，ジストロフィンの
cDNAを用いた．ジストロフィンのプローブはKunkel博士の了承を得てAmerican Type Cul−
ture Collectionより入手したcDNAの4−5aと8構造の一部に相当する（図1）．cDNAはRandom
Primer DNAラベリング法により32Pラベルした．ハイプリグイズ後洗浄したフィルターをフイ
ルムに露光し，デンシトメーターでフイルム上の特異的バンドの濃度を定量した．結果はβ一aCtin
をinternalcontrolとしてAChRα一SubunitとジストロフィンmRNAの変化を調べた．
結果

β−aCtinとAChRα−Subunitを70ローブとして使ったノーザンプロットハイプリグイゼーション

材料および方法

では各々に特異的な一本のバンドが検出できた

ウイスター系ラット胎児の下肢筋をトリプシン
処理し初代培養細胞を作成した．Dulbecco改変（図2）．β−aCtinmRNAをinternalcontrolとしてAChR

α−Subunit mRNAの変化を調べるとEagle培地に10％FBS，1％ペニシリンーストレ
プトマイシン液を加え5日間培養したあと，ディッシュを2群に分け，一方には10￣7MのCGRPを

CGRP添加群は対照に比べ，約1．7倍に増加して＊金沢大学医学部神経内科

ったスロットドットハイプリグイゼーションの結いることがわかった．スロットドットハイプリグ
イゼーションの結果も同様であった．
ジストロフィンのCDNA475aを70ロープに使−88−

束は，CGRP添加群と対照群の間には差がなかった（図3）．cDNA8をプローブに使った場合も同様であった．
考られるようになったが4），その機能はまだわかっていない．一方，AChRは筋細胞の機能をつかさどる膜蛋白であり脱神経などの条件によって発現量や分布が大きく変わることが知られている．骨格筋の支配神経は，筋の性質や機能を調節するこ察

ジストロフィンは細胞骨格蛋白のひとつと考え−89−とが知られているが，それはAChRのように特定の蛋白合成促進もしくは抑制によるものと考えられる．CGRPは骨格筋の神経性栄養因子として，
AChR mRNAの増加をもたらし，結果として筋膜上のAChR数を増加させる．一方，ジストロフィンは少なくとも10￣7MのCGRP添加後8時間で，CDMD4−5a，8を用いて検索するかぎりmRNAの発現に影響を受けなかった．しかし，ジストロフ
ィンが筋の構成蛋白のひとつとして神経因子の修飾を受ける可能性は否定しきれず，今後さらに別の条件，因子について検討する必要がある．

文

献1）Takami K，Kawai Y et al：Effect ofCalcitoningeneLrelated peptide on contrac−
tionofstriatedmuscleinthemouse．Neurosci
Lett60：227L230，1985．
2）AmaraSG，JonasVetal：AlternativeRNA
processlng

inCalcitonin gene expression

generates mRNAs encoding different
polypeptideproducts．Nature298：240−244，
1982．

3）Takamori M and Yoshikawa H：Effect of

謝辞 本研究で使用したβ−aCtinとAChR α−
Subunitのプローブは大阪大学医学部第二内科，
上野聡先生からいただきました．また本研究の一Calcitoningene−related peptide on skeletal

部は金沢大学がん研究所分子生物部飯田慈子先生，亀山恩典教授にご指導いただきました．謝意を表します．

4）Hoffman EP and Kunkel LM：Dystrophin−90−

muscleviaspecificbindingsiteandGprotein．
J NeuroI Sci90：99−109，1989．
AbnormalitiesinDuchenne／Becker Muscu−
1ar Dystrophy．Neuron2：1019−1029，1989．

14．）女性筋ジストロフィー患者に問する
細胞遺伝学的並びに分子遺伝学的検索
斎 藤 深美子＊

研究協力者

外 村

晶＊

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）は伴性身性の遺伝疾患で，新生男児3，500人に1人の割合で発生する．この症例の3分の1は新生突然変異と考えられ，ヒトの遺伝子突然変異牢としては非常に高い値を示している．近年の研究の進展によ

たん自質はジストロフィンと命名された分子量427KDのポリペプチドである．このジストロフィンの遺伝子のCDNAを用いて男子DMDの細胞を検索したところ，その50−70％に遺伝子欠夫が発見されたため2ト4），男児患者でのDMD発症機
構にDNA欠夫が大きな意義を持つことが明らかになった5）．
一方，男児DMDに対して稀に女性も発症するが，一般的に臨床症状は軽く，その発症機構については（1）ホモ接合体の発症6），（2）ターナー症候群
での発症（45，Ⅹおよびそのモザイク）7），（3）へテロ接合体（保因者）の発症8）および（4）Ⅹ染色体を含む転座保有者での発症9），10）が考えられており，染色体の数的異常あるいは構造的異常と深い関わり
あいのあることが推測された．この点を考慮し，我々は数年来，女性患者に関して細胞遺伝学的な検索を行ない，同時にそのリンパ球由来のリンパ＊東京医科歯科大学難治疾患研究所遺伝疾患部門＊＊東京医科歯科大学難治疾患研究所ウイルス／免疫疾患部門

本

輿太郎＊＊

芽球細胞株を作成してきた．今回J．ま，女性患者での細胞遺伝学的解析結果をまとめて提示し，またその中の家系内発症例（ヘテロ撲合体の発症例と思われる）について分子遺伝学的検索を行なったので，その結果もあわせて報告する．

り，DMDの遺伝子座はXp21．1〜21．3上に存在し，遺伝子の全長は2，300kbの巨大なもので1），Ⅹ
染色体の約1％を占める大きさであることが明らかとなってきた．DMD遺伝子の突然変異率の高さもこの遺伝子の巨大さに起因していると考えられる．また，遺伝子本体のCDNAは75個以上のエクソンからなる14kbにわたるもので，産生される

山

対象
女性筋ジストロフィー患者
1．孤発例（特に10歳以前の若年発症例）
2．家系内発症例（男児DMDのいる家系の中での保因者と思われる者（母，娘等）の発症例で，発症年齢は問わない。）
方1．細胞遺伝学的検索

法

対象者からヘパリン採血した末梢血に
RPMI1640を加え，PHAを添加後48時間から72時間培養する．その後細胞を回収して，0．075MのKClで低張処理する．通常どおりに細胞をカルノア固定した後，染色体標本を作製する．分析は，通常のギムザ染色，G分染法，高精度分染法，およびⅩ染色体の不活性化パターンを調べる目的でR分染法をおこなった．
2 分子遺伝学的検索
1）cDNAプローブ
DMDのCDNAは，American Type Culture
Collection（ATCC）より入手したもので14kbのCDNAは図1に示すように，6種類の断片としてプラスミドに挿入されている．
2）genomic DNAのisolation
家系内発症例の女性患者（5名），未発症の保因者（2名）および同一家系内の男児DMD（3名）

−91−

5

山」ん▲1言込とJ

8

7

8

9

10

11

12

13

14

トTL±▲一一・▲TJ＿し∵・t・ワtしこ二・lH▲」J・−▲一1・・Hl一‥J

CDNA

S一
3

く掌も
く一一一 ．＞
1−2a9−14

ぐ−5b−7−−−−う
＜

一一＞

4−5a

のリンパ芽球細胞株を用いてgenomic DNAを抽出し，HindIIIで切断した．
3）Southern hybridization

O．6−0．8％agarose gelで電気泳動後，South−
ern blot法により，各genomic DNA断片を
NylonmembranefilterへtranSferした．cDNA
はプラスミドより切り出して精製し，マルチプラ
イムDNAうべリングシステムを用いてPで標識した後hybridizationを行なった．
結果

得られた検体は全部で26例で，（1）孤発例および（2）家系内発症例に分けてまとめた（表1および
表2）．
（1）孤発例（表1）：15名
細胞遺伝学的検索を行なった年齢は2歳から3歳まで様々ではあるが，ほとんどの例で発症年齢が低く，特に2〜3歳のものが多い．既に歩行不能の患者については，カッコ内にその時期を示した．また精神発達遅延（MR）を示すものも約50％存在した．患者15名の中4名にⅩ染色体を含む転座染色体が発見され，皆共通にⅩp21で切断が生じていた．これらの例でのⅩ染色体不活性化パタ

1．細胞遺伝学的検索

表l Femalepatientswithmusculardystrophy（Ⅰ）sporadiccases■●−−−−−−−−−●■■●−−−−■■−−●−■−t−−−−−−−■■−−■−−−−−−■■−−−■−■−−−−−−−−■■■■−■−−−−−−■一一■●−−−−一一−■■■−−−

patient 芸≡；m？t 記…e；t 霊三三n，MR E慧…：et （Xninact）−−−−1−−●■−−●−−●−−−■−−−−一一−−−−−−−■−−−−−−−−−−−−−−−■■−−−−−−■−−−−■−−−−一一−−−−■■■−−−

1−MaSu lly

2−3y

4−工t工t19y

5−YoMo24y6−ReSa21yllm

46．X．t（X；5）（100％）ー（11y）

46．XX

一

46′XX

一（14y）＋

46．X．t（X；15）（96．4も）

＋

46．XX

＋

46．XX

一

−（9y）
12−13y
2−3y
V

3

＋

46′Ⅹ′t（X；19）

十

（−）

46．XX

＋

卜）

46．XX

＋

46′XX

J

5m
つ

ll−HaSh9y

34m

39ylOm

−

6m

Ⅴ一

6

15−KiKa5m

714−An工S lly

7m

0

13y

3

13−KuSh31yy

一12−Ki工S

−（8y）

V

2yllm

y

10−NaHo

46．X．t（X；3）（94・5号）

＋

y

︻

7m

＋

十

3

2

5y

V

︼

3y

4ylm

9−NaFu一（12y）
3

2

m

′ b

8−EiSo934ym

7−ShSh

Ⅴ 一

2

16y

V 一

3−Te工n

＋
2

7

14y

m

2−KiSa

＋

46′XX

＋

46．XX

4y

＋

45．X／46．XX／47．XXX

30y＋

46．XX／47．XXX−−−−−−−−■−−−−−−−−■■−−−−●■●■■−■■■−−■−−−■・．−−−−−−■■−−−−−■■一一■−−−−−−−−−−■■−−■−−■−−■−−■−●■●−■■■−−

−92−

表2

Femalepatientsandcarrierswithmusculardystrophy（ⅠⅠ）familialcases−−−−−■■■●l■■一■■−−−−−−■■■■−−−−−●■一−■一一一−−■一−−−−−−−一一−−−■−−−−−−■−−●■一一●−−−−−−●■−−−一一−−−■−−

Patient …≡；mヲt 記…。…t S：i三三ng MR ≡慧…：et・−●−●−−−■■■一一■−●−−−−−−−−一一■■−−−−−●●一一一一■■一−−−一一−■−−●−−■■■−■−−−●一−■■■−●−−−t■■−■l■一一●■■−■■−−−■一−

1−YoYa

22ylm

5−6y

＋46．XX＋

45．X／46，XX（LCL．F）
45．X／46．XX／47．XXX

4
y

6
y
y

m
5

2

ー（7−8y）＋

46．XX−（10y）

＋

46，XX

y

0
1

y

4
3

●

y
6
3

2
5

0
1

y

00

y

＋

46．XX

十

46．XX

十

46．XX

＋

46．XX

十

45，Ⅹ／46，XX／47，XXX

十45．X／46．XX
45．X／46．XX／47．XXX（F）

10−Hi工S

35y

2m

＋

46，XX

11−MaHo

40y

2m

＋

46．XX

C1−SaSa

34y

3m

46′XX

C2−FuNa

63y

6m

46′XX

y

9−HiOn

5

つ J

y

つ J

n O

8−MoYa

y

l

l

KaIく0

m

つん

7−He王くOm

5

6−RyYoy75−AsTsmm
70U4−でoYa40ym
3

3−HaSh

l
yyyyy
6
03
94
1
3

2−HoHiーンを調べると，正常なXが，ほぼ100％不活性化
していた．これら転座染色体に対し，2名にⅩ染
色体の異数性を示す細胞が観察された．
（2）家系内発症例（表2）；11名

る8つのバンドが欠失しており，一番5′側の3．2kbのバンドのみ存在していた．次のCDNA断片
2b−3に対する結果では，上記の男児は5′側の5つのバンドが欠失していた．また，その母親の発発症年齢は−2〜52歳と非常に幅が広いことが特徴である．また，臨床症状の軽度な人が多い．11症者（F2）でも同様に，CDNA断片1−2aから2b−3に対する13ケのバンドが欠失していた．一方，CDNA断片8については，C2−Sの男児BMDに
10．Okbのバンドの欠夫が見られ，この欠矢は母親由来であることが分かった．

名中4名にXの異数性を示す細胞が観察された．
2．分子遺伝学的検索
女性の家系内発症例，保因者および各家系内のDMD男児のリンパ芽球細胞を用いて欠矢の有無について検索した．図2にcDNA断片ト2aに対する分析の結果を示す．各レーンの番号のうち，Fl〜Fllは女性患者，Cl，C2は未発症の保因者，Mは母親，そしてSは息子のDMDあるいはBMD患者を示している．正常の場合，HindIIIによる切断で，このCDNAに対し10．5，8．5，8．0，7．5，
4・6，4・2，3．25，3．2，3．1kbの9つのバンドを示した．F2−SのDMD男児は，このCDNAに対す

考察

細胞遺伝学的検索の結果，孤発例および家系内発症例の合計26例において，（1）ホモ接合体の発症あるいは（2）ターナー症候群での発症は検出できなかったが，（3）の保因者の発症例と思われるケー
スでⅩ染色体のモザイクが計6例（23％）に観察された．また，（4）のXを含む転座例は，4例（15％）発見された．このことから，臨床的には全く−93−

ターナー症候群の症状を示さない女性の軽度の発症者の中には，体細胞分裂における染色体不分離により生じたXのモザイクを有する者がかなり存在する可能性が示唆される．この点に関しては，
細胞遺伝学的検索の有用性が強調されよう11）．
一方，分子遺伝学的検索により，家系内発症例
女性患者5名中1名にcDNAの5′側の断片ト2aから2b−3にわたる欠夫が検出され，また，未発症の保因者にCDNA8に対する10．Okbのバンドが欠失していた．この欠失は，それぞれ息子の患者に伝わり，前者はDMD，後者はBMDの症状を呈している．ちなみにBMDではこの10．Okbのバンドが高率に欠失しているため，その意義についてはさらに検索を必要とする．

今後，転座あるいは正常核型を有する孤発例について，同様の検索を行なうと共に，転座例についてはさらに，Ⅹの不活性化との関連性を持たせた検索を進める予定である．
謝辞：最後に，検体を提供して下さった次の先生
方およびそのスタッフの方々に，深く感謝の意を表します．
国立療養所東埼玉病院内科
東京医科歯科大学神経内科
国立療養所下志津病院神経内科
昭和大学藤が丘病院神経内科
福岡大学医学部小児科
愛知医科大学内科−94−

石原博幸先生
塚越 康先生
中野今治先生
若山吉弘先生
満留昭久先生
佐橋 功先生

信州大学医学部内科
国立精神・神経センター

武田伸一先生
杉田秀夫先生locus．Genomics2：90，1988．

6） Danieli GA，Mostacciuolo ML，Bonfante A
andAngeliniC：Duchennemusculardystro・文

献

phy．Apopulationstudy．HumGenet35：225，

1）MandelJL：Thegeneanditsproduct．Nature

1977．

339：584，1989．

7）Bortolini ER，da Silva DM，Chequer RS，

2）Koenig M，Hoffman EP，Bertelson CJ，

Vianna−MorganteAMandZatsM：Duchen・Monaco AP，Feener C and Kunkel LM：

nemusculardystrophyinagirlwitha45，Ⅹ／

CompletecloningoftheDuchennemuscular

46，XX／47，XXⅩchromosome constitution．

dystrophy（DMD）cDNA and preliminary

AmJ Med Genet25：239，1986．

genomiC organization of the DMD genein

8）Sugita H and Tyler FM：Pathogenesis ofnormalandaffectedindividuals．Ce1150：509，

muscular dystrophy．Trans Ass Am Physi−

1987．

Cians76：231，1963．

3）Den DunnenJT，Bakker E，Klein Breteler

9）Saito F，Tonomura A，Kimura S，MisugiN

EG，PearsonPLandvanOmmenGJB：Direct

andSugitaH：Highresolutionbandingstudy

detectionofmorethan50％oftheDuchenneof an X／4translocationin a female withmuscular dystrophy mutations by field

Duchenne muscular dystrophy．Hum Genet

inversion gels Nature329：640，1987．

71：370，1985．

4）WapenaarMC，KievitsT，HartKA，AbbsS，

10）富 英明，埜中征哉，杉田秀夫，里青首二郎，

BlomdenLAJ，DenDunnenJT，Grootscholten

斎藤深美子：Ⅹ染色体一骨染色体間の相互転座

PM，Bakker E，Verellen−Dumoulinを認めた進行性筋ジストロフィーの女児例．臨Ch，

床神経26：965，1986．

BobrowM，VanOmmenGJBandPearsonPL：
AdeletionhotspotintheDuchennemuscular11）Sano M，Saito F，Yamamoto K，Tonomura

dystrophy gene．Genomics2：90，1988．

A and Tsukagoshi H：Duchenne muscular5）MonacoAP，BertelsonCJ，Liechti−GallatiS，

dystrophyin a female with45，Ⅹ／46，ⅩX

Moser H and Kunkel LM：An explanation

Chromosome constitution．JpnJ HumGenetfor the phenotypic difference between

32：257，1987．

patientsbearingpartialdeletionsoftheDMD−95−15）進行性筋ジストロフィー非定型例の遺伝子欠失部位の解析
鈴 木 義 之＊
研究協力者

新

本

美智枝＊

大

は じ め に

島

幸

弘＊

桜

庭

均＊

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）及びジストロフィンCDNAはAmerican Type
Culture Collection（ATCC）より入手した．こBecker型筋ジストロフィー（BMD）の遺伝子座のCDNAを各種制限酵素で切断しアガロースゲ

はKoenigらにより解明され，その病因となる蛋
白ジストロフィンの約14kbにわたるcDNAの全

Cher＆Schuell．NA45）を用いて回収した．

構造も決定されている1）・2）．我々はDMD及び

2）DNAの抽出

BMDの遺伝子診断を，この遺伝子座内もしくはその近傍に座位を有する11種の多型プローブを用患者および正常人コントロールのEpstein−Barrウィルス（EBV）により株化したリンパ球よい，RFLPs（Restriction fragmentlength

り，プロテアーゼK処理，フェノール抽出，リボ

polymorphisms）による連鎖解析により行ってきた3）・4）．またジストロフィンCDNAをプローブとヌクレアーゼA処理でDNAを抽出した．

ル電気泳動後，各DNA断片をDEAE膜（Schlei−3）サザンプロット

して用い，DMD，BMD患者における欠夫につい抽出したDNAを各種制限酵素で切断し，0．7％て検討し，様々な欠矢を見出し報告した5）．またアガロースゲル電気泳動後，DNAをニトロセル

我々がこれまでに診断した患者家系の中に，DMD

ロース膜に転写した．

遺伝子座の外にある多型プローブ754に対し欠矢4）ハイブリッド形成を示す非定型的筋ジストロフィー患者を見出し，
この患者の欠失範囲について検討してきた5）．

ニッタトランスレーション，マルチプライム標識システムもしくは5′末端標識により，プロー

今回我々はこの患者の欠失部位の末端を明らか

ブDNAを32P標識した．このプローブを用いハにする目的で，ジストロフィンCDNAの5′末端

イプリグイゼーション後，一80℃でオートラジオ

側からいくつかのエクソンに対応するようにグラフィーを行った．

cDNAを切り出し，これらをプローブとして用い

5）ゲノムDNAのクローン化

サザンプロット分析を行った．またエクソン3にATCCよりヒトⅩ染色体ライブラリーを入手

相当する合成オリゴヌクレオチドをプローブとしした．エクソン3に相当するオリゴヌクレオチドて，ヒトⅩ染色体ライブラリーよりエクソン3を含むゲノムDNA断片をクローン化し，これを用（331−360nt）をDNA合成装置（AppliedBiosys−
tems381A）にて合成し，これをプローブとして，

いてエクソン3近傍についてこの患者の欠矢の末

ヒトⅩ染色体ライブラリーよりエクソン3を含む

端の有無について検討した．

DNA断片をクローン化した．

対象および方法
1）cDNAプローブ

結果1）ジストロフィンCDNAの各エクソンに対す
るサザンプロット分析＊東京都臨床医学総合研究所臨床遺伝学

ジストロフィンCDNAより主にエクソン1を−96−

含む断片（1−248nt XmnI断片）を切り出しプ

新たに2．7kbのバンドが検出されたが，患者におローブとして用い，患者及び正常人コントロール

いては両バンドは検出されなかった．またエクソのサザンプロット分析を行った（図1）．正常人コン1，2，3を含むcDNA断片に対するサザンプ

ントロール（レーン1−4）では，EcoRIによる切断で6．5kbのバンドが，またHindIIIによる切ロット分析の結果では，正常人コントロールは先の6．5kb，2．7kbのバンドに加え，新たに4．8kbの断で3．Okbのバンドが検出された．しかし患者（レバンドが検出された．しかし患者においては4．8ーン5）においては，これらのバンドは検出されなかった．

kbのバンドのみが検出された．
同様な結果がHindIIIによる切断においても得

図2にエクソン1，2を含むcDNA断片（29−られた．正常人コントロールではエクソン1，2

268ntDdeI断片），及びエクソン1，2，3を含に対し3．Okbのバンドが検出された．またエクソ

むcDNA断片（1−407nt BamHI断片）をプロ

ン1，2，3をプローブとした場合，3．Okbのバンーブとした場合のサザンプロット分析の結果を示ドに加えて4．8kbのバンドが検出された．しかしす．ェクソン1，2を含むcDNA断片に対し，正患者においては3．Okbのバンドは検出されず，4．8

常人コントロールでは先の6．5kbのバンドに加え，kbのバンドのみが認められた（図は省略）．
1

2

3

4

5

Hind‖

SCale（kb）
0

0．2

0．4

0．6

0．8

図1ジストロフィンCDNA断片（エクソン1）をプローブとしたサザンプロット分析−97−

とSphI切断部位の間に位置していることが確認された．
これらのクローンのBamHI断片をプローブとして，患者及び正常人コントロールのサザンプ
ロット分析を行った．その結果を図4に示す．Sph
Iによる切断で4．Okb，HindIIIによる切断で4．8
kb，SphI，HindIIIの両酵素での切断で1・5kb，3・2
kbのバンドが検出され，正常人コントロールと患者の間に差は認められなかった．
考察

ジストロフィンCDNAの各エクソンに対応する
図2

断片をプローブとして用いたサザンプロット分析

ジストロフィンCDNA断片（ェクソン1，
2及びエクソン1，2，3）をプローブとしたサザンプロット分析の結果より，この患者においてはエクソン1を含
むEcoRI断片（6．5kb）及びエクソン2を含む
EcoRI断片（3．Okb）が欠失していた．しかしエ2）ゲノムDNAのクローン化とこれを用いたサ

クソン3を含むEcoRI断片（4．8kb）は検出さザンプロット分析
ジストロフィンCDNAエクソン3に相当する

れ，その大きさも正常人コントロールと差は認められなかった．このことより，この患者の欠失の合成オリゴヌクレオチドを用い，ATCCより入手

一方の末端はエクソン2と3の間にあると推定さしたヒトⅩ染色体ライブラリーよりエクソン3を含むDNA断片をクローン化した．3種の異なっれる．同様の結果は，HindIII断片に対するサザン
プロット分析の結果からも得られた．そこで我々たクローンが得られた．これらのクローンははこの患者の欠夫の末端を含むDNA断片を得る

15−20kbのヒトⅩ染色体ゲノムDNAをインサために，患者DNAを数種の制限酵素で切断し，エートとして含んでいる．これらのクローンのサザクソン3を含むCDNA断片に対しサザンプロット

ンプロット分析の結果，合成オリゴヌクレオチド分析を行ったが，今までのところ欠夫の末端を含（ェクソン3）に対しいずれのクローンも，EcoR

む異常なバンドは検出されていない．

IまたはHindIIIによる切断で4．8kbのバンドをそこでさらに広範囲にエクソン3近傍を調べる

示した（図は省略）．
次にこれらのクローンの制限酵素地図を作成しために，ヒトⅩ染色体ライブラリーよりエクソン
3を含むゲノムDNA断片をクローン化した．得らた．結果を図3に示す．各種制限酵素で切断後のれたクローンは先のサザンプロット分析の結果か

サザンプロット分析の結果，エクソン3はPstI

ら予想されたように，エクソン3を含む4．8kbのEcoRI及びHindIII断片を含んでいた．このクロE￠ORL

日印nd‖＿＿．SphlSaclーンのBamHI断片をプローブとしてサザンプ

EcoRl Bam川

ロット分析を行った結果，患者及び正常人コント
ロールにおいて，これらのクローンの制限酵素地

genom始DNA
■一

一

exon3

＿1

0

1

図から予想されたようなバンドが検出され，両者
2

3

4

5

SCalelKb）に差は認められなかった．以上の結果より，この患者のエクソン3より5′側約5kbは正常であり，欠夫の末端はさらにそれより上流にあると推定さ

図3

エクソン3近傍の制限酵素地図

れた．
ー98−

図4

ゲノムDNA断片をプローブとしたサザンプロット分析

近年Zubrzycka−Gaarnらにより，ジストロ

間で欠夫の生じる確率は他のイントロンと比べてフィンCDNAの5′側2kbのエクソンのゲノム高いと考えられる．

DNA上での分布が報告された（図5）．これによる

近年Nudelらによりジストロフィンは脳においとエクソン2と3の間は比較的離れており，このても発現しており，その転写産物はalternative

2I0

1

1

2

：I

霊

4

I

5・6

7

01

11

llll

101112131415

11lI

ll

Patient
図5 ゲノムDNA上での各ユキソンの分布と患者の欠失部位（文献6，7を改変）
−99−

590

＿1500

splicingにより第1エクソンが筋肉のそれと異なっていることが報告された8）．またFeenerらによ4）Shimmoto M，TsujiA，YangR−C，Nomura

り，ジストロフィンは組織により数種のアイソ

and recombinationsin the genelocus of X
−linked muscular dystrophies．J Metab Dis

Y，SegawaMandSuzukiY：DNA deletions

フォームが存在する可能性も示唆されている9）．
患者の臨床像と欠矢の範囲の関連を考える上で，

ll：324−328，1988．

上記のジストロフィンの多様性は重要であると考

5）鈴木義之，新本美智杖，楊 構成，大島章弘，えられる．また，それぞれのアイソフォームにそ桜庭 均： 厚生省「精神・神経疾患研究委託

れぞれ異なった調節部位が関与している可能性も費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とある．この患者のジストロフィン遺伝子座の5′

その病因に関する研究 （杉田姓）昭和63年度研究報告書，1988，pp209−222．

上流部分の欠失部位を調べることは重要であろうと考えられる．今後パルスフィールドゲル電気泳

6）Zubrzycka−GaanEE，BulmanDE，KarpatiG，動，ジーンウォーキングにより，この患者の欠夫

BurghesAHM，BellfallB，KlamutHJ，Talbotの末端を明らかにし，臨床像との関連について検J，HodgesRS，RayPNandWortonRG：The

討していく予定である．

Duchenne muscular dystrophy gene productislocalizedinSarcolemmaofhumanskeletal

文

献muscle．Nature333：466−469，1988．

1）KoenigM，HoffmanEP，MonacoAP，Feener7）MalhotraSB，HartKA，KlamutHJ，Thomas

Cand KunkelLM：Completecloningofthe

NST，BodrugSE，BurghesAHM，BobroyM，duchenne muscular dystrophy（DMD）

Harper PS，Thompson MW，Ray PN andcDNA and preliminary genomic organiza−

Worton RG：Frame−Shift deletions intion of the DMD genein normal andpatientswithDuchenneandBeckermuscularaffectedindividuals．Ce1150：509−517，1987．

dystrophy．Science242：755−759，1988．

2）KoenigM，MonacoAPandKunkelLM：The

8）NudelU，ZukD，EinatP，ZeelonE，LevyZ，complete sequence ofdystrophinpredicts a

NeumanS andYaffeD：Duchennemuscularrod−Shaped

cytoskeletal

dystrophy gene productis notidenticalin

protein・Cel153＝

muscle andbrain．Nature337：76−78，1989．

219−288，1988．

3）Shimmoto M，Tsuji A and Suzuki Y：9）Feener CA，Koenig M and Kunkel LM：

Restriction fragmentlength polymorphisms

Alternative splicing of human dystrophinon the short arm of X chromosome among

mRNA generatesisoforms at the carboxy

theJapanease population．JpnJ Humanterminus．Nature338：509−511，1989．

Genet33：333−338，1988．

−100−

ⅠV．ジストロフィン

16）Duchenne型筋ジストロフィーの異常遺伝子産物（ジストロフィン）の二次元電気泳動での検出
堀

＊

＊

＊

＊

＊

＊

γ∵

民和

＊

林本

＊

＊

＊

平宮

＊

＊

天晴

輝幹

＊

水 田

清吉＊

＊

子子等

弘幸

浦谷達

杉大田

研究協力者

眞一郎＊

＊

＊

＊

＊

は じ め にDuchenne型筋ジストロフィーにおける欠損遺伝子が単維され，それにコードされている蛋白質（ジストロフィン）が推定された1）．更に，欠損遺伝子の核酸配列からジストロフィンのアミノ酸配列を推定し，ペプチドを部分的に化学合成した後，
このペプチドに対する抗体を使って，ジストロフィンの局在が組織化学的に明らかになってきた2）．
しかし，この蛋白質の化学的性質，生理的役割は推測の域を出ていない．よって，ジストロフィンの検出単髄はこの疾患の診断・病因解明における今日的課題である．ここでは，ジストロフィン蛋
白を二次元電気泳動によって単艶検出することに成功したので報告する3）．

抗体を使用した．
筋蛋白の可溶化と抽出：摘出した筋組織を筋湿重量の20倍（ml／gm）の8M塩酸グアニジンー0．1M
Tris−HCl，pH7．5−10％β−メルカプトエタノール
ー2％NP40−10mMpyrophosphate混液（塩酸グ
アニジン混液）にガラスホモゲナイザーで懸濁した後，5M尿素−l Mチオ尿素−0．167％β−メル
カプトエタノール混液（尿素混液）に対して一晩透析した．透析した筋組織の懸濁液を遠心し，その上清を可溶化された蛋白質標品とした．
二次元電気泳動：平林の開発した二次元電気泳動
法5）により，抽出した蛋白質を分捜した．分維された蛋白質は銀染色あるいはWestern blotting後ジストロフィンに対するモノクローン抗体で検出した後，観察した．

実験方法
結筋肉：120日齢筋ジストロフィーマウス（C57BL／
10ScSn−MDX，MDX−マウス）及び正常対照マウス（C57BL／10ScSn）の長指伸筋，ヒラメ筋，心筋，ウサギの背筋，4ヵ月齢ラットの長指伸筋，76歳女性パーキンソン病患者の前脛骨筋の生検筋，35歳男性肢帯型筋ジストロフィー患者の大腿四頭筋の生検筋について検索した．
杭ジストロフィン・モノクローン抗体：ジストロフィンのN末より215番から264番のペ70チドを抗原として，清水ら4）により作られたモノクローン＊㈲東京都神経科学総合研究所神経生化学＊＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊＊筑波大学生物科学系＊＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊＊＊東京都立神経病院

果Duchenne型筋ジストロフィーと類似の遺伝子異常をもつとされているMDX−マウスの長指伸筋の筋蛋白質を二次元電気泳勤し，銀染色によって観察したところ，大部分の蛋白質はMDX一マウス，正常対照マウス共に認められたが，中性領域
で，ミオシン重鎖よりもややアルカリより（pI5．5）で分子量350KDと推定される蛋白質（MD350／
5．5−prOtein）は，MDX−マウスでは欠損していた6）．なお，この領域は，電気泳動による分経に際して，筋組織に多量に含まれるミオシン蛋白により，影響を受け易い．そこで，ミオシン蛋白が低
イオン濃度で沈澱することを利用して，筋組織を塩酸グアニジン混液で処理し，筋蛋白質を可溶化

−103−

図1

二次元電気泳動によるマウス筋におけるジストロフィンの検出
A；長持伸筋，B：ヒラメ筋，C；心筋．1；正常対照マウス（C57BL／10ScSn）筋の蛋白質
スポットを銀染色したもの．2；正常対照マウス筋の蛋白質スポットを抗ジストロフィン・
モノクローン抗体でimmunoblottしたもの．3；筋ジストロフィーマウス（C57BL／10ScSn−MDX）筋の蛋白質スポットを銀染色したもの．4；筋ジストロフィーマウス筋の蛋白質ス
ポットを抗ジストロフィン・モノクローン抗体でimmunoblottしたもの．MHC；ミオシン
重鎖．矢印はMD350／5．5−prOteinを示す．

−104−

した後，0．15MKCl溶液に対して透析した．ミオンに対するモノクローン抗体に特異的に反応する

シン蛋白の大部分は沈澱分画に回収されたが，正ことから，この蛋白質はジストロフィンであると結論した．

常対照マウスで認められたMD350／5．5−prOtein
は上清分画に回収された．さらに，筋蛋白質全体

Feenerら（1989）7）はジストロフィンのmRNAの分布を観察するためには，二次元目のSDS−の解析からジストロフィン分子の多様性，殊にC

PAGEにおけるアクリルアミドの濃度勾配を5末部分の変化を推測しているが，MD350／5．5−％−12％にする必要があるが，問題の部分を拡大

proteinは，マウスの長指伸筋，ヒラメ筋及び心筋して観察するため，二次元目のSDS−PAGEに際において同様に認めることができたことは筋の種してアクリルアミドの濃度を4％に均一にして泳類による蛋白質の差は無いか，有ってもその差は動してみたところ，正常対照マウスでは存在する

小さいと思われる．また，この蛋白質はラット，

MD350／5．5−prOteinがMDX−マウスでは消失しウサギ，さらには人においてもマウスと同じ分子ていることが，より明瞭に確認された（図1Al

量及び等電点に認めることができたこ ジストロ及び3）．そこで，ジストロフィンに対するモノク

フィンの二次元電気泳動による結果からはジスト

ローン抗体に対してこの蛋白質が特異的に反応すロフィンの種差および筋組織による差は小さいのるか否かをWestern blottingにより観察したとではないかと推測される．

ころ，MD350／5．5−prOteinはこの抗体に特異的にジストロフィン蛋白質の二次元電気泳動上での反応した（図1A2及び4）．MDX−マウスにおけ検出の成功は，ジストロフィン蛋白質の単艶精製る筋ジストロフィーの発症は長指伸筋のみならずが可能であることを示しており，ジストロフィン

ヒラメ筋あるいは心筋においても認められることの蛋白化学的研究の新たな展開を期待できる．まが知られている．これらの筋組織についても同様

た，各種筋疾患の病態の変化あるいは鑑別診断にに検索してみた．長指伸筋と同様に，ヒラメ筋おジストロフィンの含量および性状が問題になってよび心筋においても，正常対照マウスではいるが，この分野への応用も可能である．

MD350／5．5−prOteinは認められるが，MDX−マウスでは欠損した（図1Bl及び3，Cl及びま3）．また，この蛋白質はジストロフィンに対するとめ

マウス，ラット，ウサギおよび人の筋組織中のモノクローン抗体に対して特異的に反応した（図ジストロフィン蛋白質を二次元電気泳動により単1B2及び4，C2及び4）．またウサギ，ラット

級検出することが出来た．この方法でみるかぎり，
ジストロフィン蛋白質の種差，および筋組織の問及びパーキンソン病あるいは肢帯型筋ジストロ
フィーの患者の筋組織においても，ギストロフィンに対するモノクローン抗体に特異的に反応するの差は小さいと推測された．

MD350／5．5−prOteinが検出された（図2）．ジスト

検出できたことはジストロフィンの蛋白化学的研

ロフィンは0．6M KCl溶液では可溶化出来なかっ

究およびジストロフィンによる各種筋疾患の病態

たが，塩酸グアニジン混液で組織を処理した後にの解析あるいは鑑別診断に新たな展開を可能にす
る．

は，0．15M KCl溶液に溶解できた．
考

ジストロフィン蛋白質を二次元電気泳動で単離

文

察

献

正常対照マウスには認めることができるが，

1）Hoffman et al：Dystrophin．The protein

MDXLマウスでは欠損しているMD350／5．5−

productoftheDuchennemuscularlocus．Ce11
51：919，1987．

proteinはジストロフィンのアミノ酸配列から推定される分子量（420KD）及び蛋白質の等電点

2）杉田秀夫ほか：Duchenne型筋ジストロフィ（〜5．56）に近似していた．さらに，ジストロフイーの欠損蛋白質一免疫組織化学的検討一

−105−

厚生

図2

二次元電気泳動によるラット，ウサギ及び人の筋におけるジストロフィンの検出
A；Wistarラットの長指伸筋，B：ウサギの背筋，C；パーキンソン病患者の前脛骨筋，D
肢帯型筋ジストロフィー患者の大腿四頭筋．1；筋蛋白質スポットを銀染色したもの．2
筋蛋白質スポットを抗ジストロフィン・モノクローン抗体でimmunoblottしたもの．MHC
ミオシン重鎖．矢印はMD350／5．5−prOteinを示す．

省「神経疾患委託費」筋ジストロフィー及び関proteins with agarose gels

連疾患の病態とその病因に関する研究

dimension．AnalBiocheml17：443，1981．

（杉田姓）昭和63年度研究報告書，1989，p239．

inthe first

6）堀眞一郎ほか：筋ジストロフィーマウス
（MDX）筋の高分子領域での欠損蛋白質につい

3）HoriSetal：Detectionofdystrophinontwo−
dimensional gel electrophoresis．Biochemて． 厚生省「神経疾患委託費」筋ジストロフィ

Biophys Res Comm161：726，1989．

ー及び関連疾患の病態とその病因に関する研4）Shimizu T et al：A monoclonal antibody

究 （杉田姓）昭和63年度研究報告書，1989，

against a synthetic polypeptide fragment ofdystrophin（aminoacidsequencefrom215to

p239．

7）Feener CA et al：Alternative splicing of
humandystrophinmRNAgeneratesisoforms264）．ProcJapan Acad64：205，1988．
5）Hirabayashi T：Twordimensional gel
electrophoresis of chicken skeletal muscle−106−

at the carboxy terminus．Nature338：509，
1989．

17）悪性肢帯型筋ジストロフィー症の骨格筋におけるジストロフィンの証明
川 井 尚 臣＊研究協力者

玉 木 康 民＊ 増
佐 野 雄 二＊ 乾田健二郎＊ 須 原 芳 宏＊
俊 夫＊＊ 米 田 賢 治＊＊■は じ め に

我々の教室では，臨床症状や臨床経過はDu−
Chenne型と似ているが，常染色体劣性の遺伝型を示す筋ジストロフィー症を，一つの独立した遺伝・臨床型の悪性肢帯型malignantlimb−girdle
typeとして分類してきた．本病型はDuchenne型とは遺伝型が異なっており，その骨格筋細胞にはジストロフィンが存在すると推定される．本研究では，悪性肢帯型の生検骨格筋中のジストロフィンを免疫組織学的に検索した成績を述べる．
対象と方法
対象：対象症例は，当科で過去に悪性肢帯型と診断された3症例（図1）で，うち2例（症例1，
症例2）は現在も経過を観察中の症例であり，残りの1例（症例3）は十数年前に経験した症例である．これらの症例の生検骨格筋についてジスト
ロフィンを検索した．
方法：上記3症例の生検骨格筋の凍結切片或いはホルマリン固定の組織切片をへマトキシリン・エオシン（H・E）染色し，ジストロフィー性変化を確認した後，その標本の連続切片についてジス
トロフィンの免疫組織化学的染色（ABC法）を行った．ジストロフィンに対する抗体はDr．Hoff−manから供与を受けたものであり，1，000倍に稀釈して用いた．
また，症例1については，ジストロフィン遺伝
子の6種類のprobe（ATCCより入手）を用い＊徳島大学医学部第一内科＊＊国立療養所徳島病院神経内科＊＊＊国立療養所徳島病院内科

25′21：○

（川の

ll

′ 9
くTlT）

症例3

図1悪性肢帯型の3症例と家系図．数字は過去の検索時の年齢を示した．（）内は血清CK活性値．正常値は25U／以下．
て，白血球より抽出したDNAをHindIIIにて分解LSouthernblot解析を行った．
以下，検索症例の要約を示した．
症例1図2a：30歳男性．単発例であるが，両親は近親婚である．頸定1歳7カ月，処女歩行
は2歳6ヵ月と遅れていた．その頃から登琴性起立がみられた．15歳までは，手摺を持って階段の昇降が可能であった．その後症状は進行し，現在，起立は不能である．筋萎縮は全身にみられるが頸部，躯幹，四肢近位部に強い．厚生省研究班の下肢機能障害度は7度である．血清CK活性値は現在は正常値に近いが，20歳時には604単位（正常25

ー107−

図2

a：症例1

b：症例2

単位以下）と高値を示した．母の血清CK値は正常である．
症例2 図2b：33歳，男性，単発例である．
両親の近親婚はない．処女歩行1歳3カ月，3歳時に走るのが遅く，転びやすかった．14歳で歩行不能になった．現在は殆ど寝たきりである．筋萎縮は全身にみられるが，特に頸部，躯幹，腰帯，
四肢近位に強い．下肢機能障害度は7度，血清CK
活性値は現在は正常値に近いが，23歳時は146単位であった．母の血清CK活性値は正常である．
症例3 図2C：9歳女性，両親は近親婚で，単発例である．処女歩行は1歳6ヵ月と遅れ，転倒しやすかった．3歳時ふくらはぎが太いのに気づいた．6歳時に登撃性起立が出現，9歳初めより坐位からの起立が不能になった．末梢血リンパ球の染色体検査では正常核型を示した．筋萎縮は上腿，腎部に中等度に認められ，上腕，肩甲部にも軽度にみられる．血清CK活性値は777単位と上昇，母のCK値は正常である．
下肢機能障害度の経過：図3に3症例の下月支機

C：症例3

能障害度の経過を示した．12−13歳頃まではDu−
chenne型の経過と極めて類似している．その後はDuchenne型に比べ少し緩やかである．
成績

1．筋病理組織像：（生検筋組織のH・E染色）
症例1の検索組織は30歳時の左外側広筋，症例2のものは33歳時の左外側広筋であり，それらの凍結組織標本を観察した．症例3については9歳時の左大腿筋の生検筋のホルマリン固定標本を観察した．いずれの症例の組織標本でも筋細胞の大小不同と壊死，問質の増殖，並びにopaque細胞などがみられ，特殊な構造物や蓄積は認めなかった．
すなわち，ジストロフィー性の変化がみられた（図4a，図5a，図6a）．
2．骨格筋中ジストロフィンの免疫組織化学
症例1，症例2について検索したのは凍結組織標本であるが，症例3はホルマリン固定標本である．症例1，症例2では筋細胞の表面膜に一致して全周性に明確に褐色の染色がみられ，その部位

−108−

2
3
4
−b

SqE 二〇き○ ○倉−33等−00085

0

5

15

20

25

30

A90tYr＄）

図3 3症例の下肢機能障害度の経過（実線）対照としてDuchenne型のものも示した（点線）．
L−■mLG（male），●−．→mLG（female），ロー一一ロDMD（male）．

図4 垂例1．外側広筋．a：生検骨格筋組織像

図5 症例2．外側広筋．a：生検骨格筋組織像（H・E染色），b二ジストロフィンのABC（H・E染色），b：ジストロフィンのABC
染色．×160

染色．×310−109−好ら1），2）により提唱され，確立された筋ジストロ
フィー症の一遺伝・臨床型であるが，臨床症状がDuchenne型と類似していることもあり，個々の症例の診断に当ってはDuchenne型との鑑別が容易でないことがある．また，男性病者の場合は一部のBecker型や肢帯型とも鑑別を要することもあるなど，遺伝・臨床的事項により診断する場合は問題がないわけではない．
最近，Kunkelらのグループ3），4）の研究によりDuchenne型ではジストロフィン遺伝子が欠損していることが明らかにされ，また，その遺伝子産物のジストロフィンが筋細胞の表面膜部分に存在することが明らかにされた5）．そして，免疫組織化
学的に本蛋白質を染色するとDuchenne型ではまったく染色されないが，その女性保因者ではモザ
イク状に，またBecker型ではpatchyに染色されるなど，それぞれの疾患や病態により染色性に特徴のあることが報告されている6）．従って筋組織中のジストロフィンの染色は特に臨床症状や経過図6 症例3．大背筋，a：生検骨格筋組織像

がお互いに似ている筋ジストロフィー症の診断確（H・E染色），b：ジストロフィンのABC
染色．×310

定には不可欠と考えられる．
本研究において，3症例の骨格筋組織が筋ジス
トロフィー性の変化を示し，ジストロフィンが細にジストロフィンの存在が確認された（図4b，胞の大小にかかわらず明確に横断面で全周性に染

図5b，図6b）．そして，ジストロフィンの染色
性は筋細胞の大小，内部の変化などに殆ど関係な色されたとの成績が得られた．このことは，これらの症例が鑑別を要するDuchenne型やBecker

くどの細胞でも明確に認められた．症例3でも同型とはジストロフィンの遺伝子に関しては明らか様の染色性がみられたが，ホルマリン固定のために異なるものであることを示唆する成績であり，か非特異的反応と思われる染色性が細胞内部にも悪性肢帯型の存在がジストロフィンの面からも確認められた．

かめられたことになる．

3．ジストロフィン遺伝子の検索

悪性肢帯型は，勿論，三好ら1）12）によって多数の症例1についてのみ検索を行った．ジストロフ

家系例によって遺伝・臨床的に確立されたものでィン遺伝子を全てカバーするprobe7種類を用あるが，本論文の3症例個々については，臨床症いて検討したが，どのprobeでも対照（正常人）と全く同じパターンが得られた．すなわち，少な状，血清CK活性値，筋組織像だけでは悪性肢帯

くとも本研究で用いたHindIIIで切断したジスト

索により前述の病型（疾患）とは鑑別でき，診断

ロフィン遺伝子のDNA断片には異常が見られなかった．

が確定された．このように，単発例の個々の症例

考型とは決定し難い．しかし，ジストロフィンの検の診断確定にも筋細胞中のジストロフィンの検索は特に重要であり，従来，単発例でDuchenne型，Becker型，あるいは女性のDuchenne型病者な察

悪性肢帯型の筋ジストロフィー症は当教室の三どとされていた症例の中からも今後ジストロフイ−110−ン検索の普及によって，本病型が発見されるものと思われる．

26：496，1970．

3）Koenig M，Hoffman EP etal：Complete

DNAの分析については，1例のみ行い正常パ

ClonlngOftheDuchennemusculardystrophy

ターンが得られたが，他の例についてもひき続き（DMD）cDNA and preliminary genomiC

検討したい．また，これら症例の ジストロフィン

OrganizationoftheDMDgeneinnormalandのWestern blottingは現在検討中である．

affectedindividuals．Ce1150：509，1987．
4）HoffmanEP，Brown RHJr．et al：Dystro・

おわ り にphin．The proteinproduct of the Duchenne

筋ジストロフィー症悪性肢帯型の骨格筋細胞のmusculardystrophylocus．Cel151：919，1987．

表面膜部分に一致して，仝周性に明確にジストロ5）Sugita H，Arahata K et？l：Negative

フィンを証明し，本病型の存在を改めてジストロ

immunostaning of Duchenne muscular

フィンの面からも確認した．

dystrophy（DMD）and mdx muscle surface
membrane with antibody against synthetic

文

献peptide fragment predicted from DMD

1）三好和夫，多田義明ほか：進行性筋ジストロフ

CDNA．ProcJapan Acad64：37，1988．

ィー症の悪性肢帯型malignantlimb，girdle6）Arahata K，Hoffman EP et al：Dystrophin

type．この型の存在と本症分類上における意義．

diagnosis：Comparison of abnormalities by

厚生省進行性筋ジストロフィー症研究班業績集

immunofluorescence and immunoblot（ⅠⅠ），1974，p39．

analyses．ProcNatlAcadSciUSA86：7154，

2）多田義明：進行性筋ジストロフィー症の悪性肢1989．

帯型malignantlimb−girdle type．四国医誌−111−18）Dystrophin：Becker型筋ジストロフィーにおけるdystrophinの分子異常並びにヒト臓器におけるdystrophinの局在について
荒 木 淑 郎＊

研究協力者

内 野

誠＊＊ 三 池 輝 久＊＊＊は じ め に

homogenize後，遠沈して得られた上活の蛋白濃

Becker型筋ジストロフィー（BMD）において度を測定して10mg／mlとなるように調整し，4は分子量427kdの正常のdystrophin（ d ）とは質的に異なる d が産生されており1），遺伝子レベ〜12％gradient polyacrylamide gelの各レーン

ルの説明としてはDNAのreadingframeが残存
し，eXOnの欠失程度に応じて，短縮した蛋白質が産生されているとする説（いわゆるframe shift仮説）2）が最も注目されている．今回我々はBMD行った．electroblottingはHoffmanらの方法ににおける d の分子異常について検討するため，
western blotによる d の分析を行ない，また併せて d のヒト臓器内分布を明らかにすることを試みたので，その結果について報告する．

二種類の抗原に対する抗体）を一次抗体に用い，対象並びに方法

抗体に用いて，ABC法による染色及びへマトキシ

対象はBMD6例（13〜41歳），Duchenne型筋
ジストロフィー（DMD）6例（2〜12歳），正常対照8例（10〜74歳）で，その生検筋を用いて抗d 抗体によるwesternblot並びに免疫組織化学
染色による検索を行った．またヒト各臓器内のに100JJgの蛋白を添加してSDSゲル電気泳動を従って−20℃の冷凍室内で100V，0．36Aで約3時間の通電を行った．ImmunostainingはHoffman
より供与された羊抗 d 抗体（30kd及び60kdのbiotinylatedrabbit antisheepIgGを二次抗体としてAvidinBiotinperoxidasecomplex（ABC）

法にて行った．免疫組織化学染色は1恥の凍結切片を作成し，アセトン固定後，抗 d 抗体を一次リンによる後染色を行って鏡検に供した．
結果Westernblotによる検索で，正常対照の骨格筋
では分子量427kdの位置に一致して，明瞭な dd の分布について検討するため，筋緊張性ジス
トロフィー（54歳女性）及びDMD（26歳男性）の剖検臓器（骨格筋，心筋，大脳，小脳，胃，肺，
肝臓，腎臓，膀胱など）について同様の検索を行った．Western blotによる d の検索は生検あbandの発現がみられた．DMDでは6例全例でるいは剖検組織の一部を秤量後，10倍量のSDS
液（2％SDS，5％βrmercaptoethanol，4mM
EDTA，0．1mM PMSF，40mM tris，0．24Mられた（図1）．DMD及びBMDにおける

glycine，40％glycerine，pH8．5）を加えて

dbandは欠如していた．BMDではDMDと同様に d bandが発現しない例（1例），正常の427kdより低分子化したdを有する例（2例），並びに正常分子量で含量が減少した例（3例）がみ
dの欠如ないし減少が添加した蛋白量の違いによるものではないことを証明するため，同一のサンプルをアミド70ラック染色（蛋白染色）して，myOSin
heavychain（MHC），α一aCtinin，aCtinなどの各＊熊本大学医学部第一内科＊＊国立療養所再春荘病院神経内科＊＊＊熊本大学医学部発達小児科

筋構造蛋白を発色させると，MHCに比較して，明らかに d の含量が減少しているのが確認された
−112−

1

−、「−し．l、Jl一一し：三一、訃．）卜T「−．［ミ ．− 、∴、

2

3

4

5

6

7

8

Co帝0妻musdesusin9anti−dystrophinan沈氾顛1Orlgln

2

3

4

5

6

7

8

→

dYStrOPhln一・

c

図2
C

図1

DMDBMDI

C

BMD〜

C

BMD3

C

Duchenne型（DMD），Becker型（BMD
l，2，3）および正常対照（C）の骨格筋のWeStern blotting．正常対照においては明瞭なdystrophinbandの発現をみるが，DMDでは欠如している．BMDでは欠如する例（BMDl），低分子化したdystrophinも有する例（BMD2），正常分子量で含量の減少する例（BMD3）がみられる．

DMDBMD‡C

BMD三

C

8MDき

C

抗dystrophin抗体でimmunostainingを行った後に蛋白染色（アミド7ラック染色）
したもの（図1と同一サン70ル）．MHC：
myosin heavy chain．α−Act：α一aCtinin，

BMDにおいてはMHCに比較して明らかにdystrophinの含量が減少している．

lmmuno b10t analY引SOf＼・ar10uS tlSSueSPeClm即S Of
MYOtOm■C

1

2

c

c

dvstrOPhY

3

4

5

6

M

Br

Br

SI

7

8

9

ST

H

用

11

（図2）．
免疫組織化学染色では正常対照は筋線経の表面膜に一致して全周性に均等な uの局在が認められ，DMDでは仝例欠如していた．BMDでは全体に染色性が悪く，また線絶間で抗体の沈着に濃淡がみられ，部分的消失（いわゆるpatchystain）
がみられた．
次にpreliminary studyであるが，筋緊張性ジストロフィー（死後5時間）並びにDMD（死後1時間）の剖検臓器を用いて，前述したwesternblot
及び免疫組織化学染色による検索を行った．筋緊張性ジストロフィーにおいては死後5時間経過した組織でもwestern blotで骨格筋と心筋に明瞭な

dbandの発現がみられた（図3）．ただ大脳，胃，膀胱など骨格筋，心筋以外の臓器組織で
は明らかな

d

bandの発現はみられなかった．
−113

M

H

〔

図3 筋緊張性ジストロフィー（54歳，剖検例）の各組織のwestern blotting．C：正常対
照の骨格筋．M：筋緊張性ジストロフィーの骨格筋．Br：大脳，St：胃，H：心筋．

DMDでは死後1時間と早い時期に採取された剖
検臓器であったが，骨格筋，心筋を含め，全臓器で d bandの発現はみられなかった（図4）．免疫組織化学染色では筋緊張性ジストロフィーの骨格筋や心筋の筋表面膜に局在が認められ，WeSt−
ernblot所見と一致する所見が得られた．大脳皮質では神経細胞の胞体が正常羊血清を用いた
negative controlと比較すると軽度褐色に染まる傾向がみられたが，骨格筋や心筋のように明瞭ではなく，胃・膀胱などでも同様に明らかな局在は確認できなかった．DMDでは骨格筋，心筋を含め，検索した全臓器で dた．

の局在は認めなかっ考察

DMD及びBMDは同じくⅩ染色体短腕の．

d遺伝子の欠陥に基づく疾患であるが，臨床像に大きな差がみられ，遺伝子レベル・蛋白質レベルでの違いについて種々検討されている弘4）．欠失する
exonの大きさや部位にはあまり関連がみられな
いところから，DNAのreadingframeのShiftの有無により，DMDとBMDの違いが生じるとす

るKunkelらのいわゆるframe shift仮説が現在最も有力視されており，BMDの90％はこの仮説で説明可能といわれている．しかしこれに対する反論もあり，Malhotraら5）はBMD，DMD及び中間型29例の遺伝子解析の結果，BMDの6例仝例，
中間型の10例中8例，1番目のexonを欠失している 2例を除く11例のDMD仝例においてframe shiftを伴う欠夫がおこっていることを明らかにしている．すなわちframe shift仮説に従わないBMDも少なからず存在する可能性があるが，今回の我々の検索でもBMDには異常分子量の d を有する症例の他に，正常分子量で含量が減少した例がみられ，前者についてはframeshift仮説で説明が可能であるが，後者についてはframe shift仮説では説明は困難と思われた．
Hoffman自身も同様のBMD例の存在を明らかにしている6）が，今後正常分子量で量が減少する
場合の遺伝子レベルの機序について， d の生理的役割と同様に多面的検討が必要と思われた．
一方ヒト剖検例では大脳・胃・膀胱などに dの発現を確認できなかったが，マウスでは確認できるので，今後新鮮な検体を用いて再検が必要と考えられた．

tmlmnOb如8円輌SisOfvarぬust軌eSPeCimensofDMD
1

2

3

4

5

6

7

8

9

ま

10

1）BMDにおける dとめの分子異常並びに d の

ヒト臓器内分布を明らかにするため，WeStern
blot及び免疫組織化学染色による検索を行った．
2）BMDにおいては427kdより低分子化したdを有する例， d を欠如する例及び正常分子量で d が著減する例がみられた．一方筋緊張性ジストロフィーの剖検例において骨格筋及び心筋においては筋表面膜に d の局在がみられたが，その他の臓器では dは確認できなかった．
3）Frame shift仮説だけでは説明困難なBMDが少なからず存在する可能性があり， d の産生
c

図4

c

M

M

Br

Br

BI

H

H

C

DMD剖検例（26歳）の各組織のwestern
blotting．C：正常対照の骨格筋，M：DMDの骨格筋，Br：大脳，Bl：勝胱，H：
心筋．

機構について多面的検討が必要である．また dのヒト臓器内分布についても再検が必要である．
文献1）Hoffman EP，Fischbeck KH，Brown RH，−114−

JohnsonM，MedoriR，LoikeJD，HarrisJB，26：189−194，1989．

Waterston R，Brooke M，Specht L，Kupsky

4）Hoffman EP and Kunkel LM：Dystrophin

W，ChamberlainJ，CaskeyCT，ShapiroFand

abnormalitiesin Duchenne／Becker muscu−

KunkelLM：Characterizationofdystrophin

1ardystrophy．Neuron 2：1019−1029，1989．

inmuscle−biopsy specimens from patients

5）MalhotraSB，HartKA，KlamutHJ，Thomas

With

DuchennesorBeckers

NST，BodrugSE，BurghesAHM，BobrowM，musculardystrophy．N EnglJ Med318：1363−1368，
1988．

2）MonacoAP，BertelsonCJ，Liechti−Ga11atiS，

Harperps，Thompson MW，Ray PN and
Worton RG：Frame−Shift deletions inpatientswithDuchenneandBeckermuscular

Moser H and Kunkel LM：An explanation

dystrophy．Science242：755−759，1988．

for the phenotypic differences between

6）HoffmanEP，KunkelLM，AngeliniC，Clarke

patientsbearingpartialdeletionsoftheDMD

A，Johnson M and HarrisJB：Improved

locus．GenomiC占2：90−95，1988．

diagnosis of Becker musculardystrophy by3）GutmannDH andFischbeckKH：MolecularbiologyofDuchenneandBeckerdystrophin
1017，1989．

smuscular

dystrophy：Clinicalapplications．AnnNeurol−115−

testing．Neurology

39：1011−19）ベッカー型筋ジストロフィーの筋病理−ジストロフィン・テストで確定診断された20例の検討−杉 田 秀 夫＊
研究協力者

階
荒

堂

三砂子＊

有

川

恵

理＊

喜

埜

中

征

哉＊

畑

一＊

Kunkel，Hoffmanらによるジストロフィンの発見1）以後，鑑別困難な臨床像を呈する症例にお表
patient

いてもデュシャンヌ型，ベッカー型（以下BMD）

age

at

faznilybiop8y hiStOry
2
3
4

4

6

5

7

6

8

の再検討を試みた．

3

確定されたBMD患者20例につき一般筋病理所見

2た．我々は今回ジストロフィン・テストで診断の

1及び肢帯型筋ジストロフィーの診断が可能となっ

600
＋

2

3349
9999
3044

3

ND

＋

3699

5

7
2

1
6

748

＋

4367

8
2

1

一

788
4420

7

十
＋

十

7
2

1

＋

十

4

＋

M⁚M

3
2

1

M

1
3

1
8

M

2
3

1

2
3

2
0

＋

1373

日比

1790

9

方

8004

＋

7
1

1

筋原性変化に加え神経原性変化が混入していた．

3103

◆

4
1

1

549−18，365U／1と全例で上昇，筋電図では2例で＋M um M N N M

1あった．明らかな家族歴は12例に認め，CPKは

549
4150

3
1

1

Clinicalcaseで，10と13，18と20は各々兄弟例で

3200

M p M
n

0

検時，全例自力歩行可能であった．症例2はpre−

np
M

18365

2
1

1

検討した．表に対象患者の臨床像を示す．筋生

＋

2
1

9

BMD20例（2〜32歳）の生検筋（上腕二頭筋）を

EMG

11200
3372

0
1

8

象

1979年〜1989年に当センターで検索された

CPK●

（U／1）

8

7

対

Clinicalfeaturesof BMDpatients法●

ジストロフィン・テストは免疫組織化学法2）及normal＜110U／1．np：notparticular，

M：myOgenic．N：neurogenic．

びウエスタンプロット法3）を行った．ウエスタン
プロット法では分子量400kd，蛋白量100％を正常
結果及び考案

値とした．
一般組織化学染色は，H＆E，mOdifiedGomori−

抗ジストロフィン抗体による免疫組織化学染色

trichrome，NADHrTR，ATPase，NSE，aCidでは正常筋では筋表面膜の全周にジストロフィン

phosphatase，alkaline phosphataseについて主が認められるが4），BMDでは全例筋表面膜のジスに検討した．

トロフィンの免疫染色は淡く，いわゆるpatchystaining像4），5） を示した．
ウエスタンプロット法によるジストロフィンの＊国立精神・神経センター神経研究所

分析結果では，仝例で分子量異常と蛋白量減少を−116−

ロット法から仝例BMDと確認された．
一般組織化学染色では従来の報告と同様に，筋線経の大小不同，中心核増加，壊死再生，Splitting，反応性の細胞浸潤，問質結合織の増生，内部構築の乱れ等の筋原性変化に加え，小角化線

く，著明な大小不同，中心核増加やsplittingが認められた（b）．NADH−TR像では，若年群の筋線維
内部構築が保たれている（C）ことに比べ，年長例ではmotheaten fiberやwhorled fiberなど筋線維

350

300
0

集萎縮はなく，fiber type groupingも軽度であった．
注目すべき点は，これらの筋病理所見に筋生検時の年齢によって一定の傾向が見られたことである．図2は左に15歳以下の若年群，右に16歳以上の年長群における特徴的な筋病理像を示した．若年例では活発な壊死・再生像がしばしば群をなしてみられ（a），反応性炎症像を伴う事が多いのに比し，16歳以降の年長例では壊死・再生線経は少な

400

5

10

15

20
AGE

25

30（yrs）

乏

私fiber type grouping，pyknotic nuclear
Clumpsといった神経原性変化の混在が見られた．
BMDにおける神経原性変化については従来より強調されてきた6）が，今回の検討では明らかな群

A≡OUN↓0¶DYS↓ROP㈲10︒5︒

N≡dO∝トSと□﹂0トエロ一山き∝く﹂⊃U﹈﹂〇三同時にあるいはいずれかを認めた（図1）．
以上のように免疫組織化学法及びウエスタンプ●molecularweightofdyStrOPhin（N＝400kd）
O amountofdystrophin＊ brothers（N＝100％）

図l Westernblot analysis of the BMD patients

認め，年長例ではtype2C線経は減少し大小不同が著明であった（図4）．
一方，免疫組織化学法でのジストロフィンの染
色性には年齢による差異は認められず，いずれも抗ジストロフィン抗体による染色性は弱く，同様のpatchy staining像を呈していた．
次に，発症年齢の著しく異なる兄弟症例を検討した．

から6−7年の経過であったが，H＆E，mGt像では壊死・再生が若年者ほど活発で，NADH−TR像
では年長例ほど内部構築異常が目立っていた．ヒ

兄：症例20（32歳）は幼少年期発症・緩徐進行性で10歳より養護学校で過ごした．現症では，近位筋優位に中等度の筋萎縮を認め，Gowers，sign陽性，Waddling gaitあり．筋電図上，筋原性変化（＋）．CPKl，373IU／1．
弟：症例18（31歳）は25歳で初めて症状を自覚．
現症では下肢近位に認めるのみ．筋電図上，筋原性変化（＋）．CPK4，420IU／1．
発症年齢・羅病期間・進行の度合が著しく異なるにも係わらず，筋病理像では若干程度の差はあるもののどちらも年長者BMDの特徴を有していた．ジストロフィン・テストでは，兄弟ともに免疫染色でpatchy stainingを呈し380kdの分子量異常を伴っていた．兄弟で臨床経過がかなり異なる理由は不明であるが，兄・弟ともにジストロフ
ィン蛋白量が20％以上で綬徐進行例と考えられストグラムでは若年例で多数のtype2C線経をた3）．

内部構築異常が目立った（d）．ATPase染色では，若年群にはpreclinicalcaseでも既に著明なtype2C線維増加を認める（e）一方，年長群ではtype2C
線経は減少し散在性にみられる程度（f）であった．
図3にBMD患者を15歳以下の若年群及び16歳以上の年長群にわけて，筋病理所見の出現頻度をそれぞれ棒グラフで示した．
次に，以上のような筋病理像の年齢による差異と，BMDの発症年齢・羅病期間・進行の度合との関係を調べた．
まず，発症から筋生検までの期間が同様で年齢の異なる3例を検討した．症例5（7歳），13（17歳），17（28歳）はいずれも筋力低下に気づかれて

−117−

図2

Morphological changesby age
a：Patient5（7y．0．），H＆E
b：Patient14（23y．0．），H＆E
C：Patient7（8y．0．），NADH−TR
d：Patient20（32y．0．），NADH−TR
e：Patient2（3y．0．），ATPasepH4．2
f：Patient16（27y．0．），ATPase pH4．2
Bar＝100JJ−118−

PERCENTAGE OF PATIENTSCHANGElNF［BERSIZE

O

SmallanguIated耶bers
Selectivefiberatrophy
typel

房友渕

type2Alype2Bbレ〟ノ〟．．Ju．．F．〟．′．皿⊥二▲こ」寧

ltibertypegroupingtibertypepredominance¶bertypede¶ciency（28）NUCLElinternalnuclej
PyknoticnuclearcIumps

字瑠…荒犯12調
仙ノノノ」．′′ノ〟ノ′．．′〝．〟云竺転

DEGENERATION＆REGENERAT10N

neCr0引S
Pha90CytOSis
SPlittir唱

二二二二二〟γ．竺≠basoph獅Cfibers
increasedIype2C¶bers
CELLULARRESPONSE
n州ammatorY
Hbrosis−

ARCHJTECTURALCHANGE
targetOは†bersmoth−eaten¶bers」

CCODEFICIENTFIBERS

吻

J−young（≦15y．0．）

図3≡一一一一両一声■

圧詔辺Old（＞15yJl）

Histological featuresinBMDとめ

1．ジストロフィン・テストで確定診断されたベ（％）

CHANGEJNDISTRIBUT10N
9rOUPatrOPhy

ま

100

房男
F

hypertrophic¶bers

50

ッカー型筋ジストロフィー症20例（2−32歳）の筋病理（上腕二頭筋）を再検討した．従来の報告と同様に，筋原性変化を主に認め，一部神経原性変化の混在を認めた．
2．筋病理所見は筋生検時の年齢によって一定の傾向を認めた．
3．15歳以下では活発な壊死・再生像が中心であった．
4．16歳以降では内部構築の乱れ・Splitting・中心核増加などの慢性変化が主であった．
5．年齢に伴う筋病理像の変化は，今回検索した限りでは臨床像（発症年齢・罷病期間・進行の度合）やジストロフィンの免疫染色性・分子量・
蛋白量とは無関係であった．
謝辞：ジストロフィン・テスト（ウエスタンプロ
ット法）はHarvard Medical School，theDevision of GeneticsのHoffman，Kunkel両先生にご協力いただきましたことを深謝します．

Frequenciesofabnormalfindingsin20
patients aresummarizedonbargraph．

0

′l

5
0

叫S∝山空正Buu声ZuU∝ud

100

150

小叫
図4

Changeindistributionbyage
Histogramsof500fibersareshown・3・differentaged−patientshadnearlythesame
Sufferingperiodsof6−7years．
−119−

文

4）ArahataK，IshiuraS，IshiguroT，Tsukahara

献1）Hoffman EP，Brown RH，Kunkel LM：

T，SuharaY，EguchiC，IshiharaT，Nonaka

Dystrophin：The protein product of the

I，Ozawa E，Sugita H：ImmunOStaining of

Duchenne muscular dystrophylocus．Cel1

skeletal and cardiac muscle surface mem−

51：919−928，1987．

brane with antibody against Duchenne
muscular dystrophy peptide．Nature333：2）SugitaH，ArahataK，IshiguroT，SuharaY，

861−863，1988．

Tsukahara T，Ishiura S，EguchiC，Nonaka
I，Ozawa E：Negativeimmunostaining of5）ArahataK，HoffmanEP，KunkelLM，Ishiura

Duchenne muscular dystrophy（DMD）and

S，Tsukahara T，Ishihara T，Sunohara N，

mdx muscle surface membrane

NonakaI，Ozawa Eand Sugita H：Dystro−withphin diagnosis：COmparison of dystrophin
antibody

againstsynthetic

peptidefrag一abnormalities byimmunofluorescent andmentpredictedfromDMDcDNA・ProcJpn
Acad64（SeriesB）：37−39，1988．

immunoblot analysis．Proc Natl Acad Sci

3）HoffmanEP，KunkelLM，AngeliniC，Clarke
A，Johnson M，HarrisJB：Improved
diagnosisofBeckermusculardystrophyby
dystrophin testing・Neurology（USA）・＼86：7154−7158・1989・

6）Bradley・．．WG，JonesMZ，MussiniJM，Fawcett
PRW：Becker−type muSCular dystrophy．
Muscle Nervel：111−132，1978．

39：1011−1017，1989．

−120−20）ジストロフィン分子におけるC末端ドメインの臨床的意義
杉 田 秀 夫＊
研究協力者

荒

畑

有
目

川

喜
恵

一＊

石

浦

章

一＊

塚

原

俊

文＊

理＊

階

堂

三砂子＊

埜

中

征

哉＊

的

スに免疫して型どおり調製された．ジストロフィ

我々はこれまでデュシャンヌ型筋ジストロフィー（DMD）で，特異的に欠損しているタンパク質

ンの局在は蛍光抗体間接法にて，また分子量とタ
ンパク量は隣接の凍結切片を用いたウエスタンプ−ジストロフィンーの骨格筋における発現様式をロット法にて測定した．なお蛍光の定量化も試み明らかにし，その臨床診断的意義を検討してきた．

た．

特に免疫組織化学的に見てDMDとBMD（ベッカー型筋ジストロフィー）とが異なる事を初めて

結果

兄いだし報告した1ト5）．そもそもBMDは1955年

ウエスタンプロット法と免疫組織化学法の両者

Beckerにより記載された筋ジストロフィーで，臨床的に良性DMDとも言われているとおり発症の結果から，DMDではジストロフィンの完全欠損が，ONDでは正常の発現が確認された．しかし

年齢はDMDよりやや遅く，臨床経過・予後ともBMDではジストロフィン分子量の変化（減少17，に軽症であるが，今日ではその分子遺伝学的背景

増加3例），タンパク量の減少（5−60％）およびが解明されつつある．すなわちBMDとDMDと免疫染色の異常（全体的な淡染性と部分的欠損）は同じジストロフィン遺伝子のヘテロな欠陥によが認められた（表，図）．またMPM200microscopeる疾患（al1elic disease）である事が判明していphotometry systemによる筋形質膜の蛍光強度
はDMD：1．0±1．4，BMD：27．4±12．2，OND：る．
今回我々は，Kunkelらの提唱するDMDと102．9±7．7であった．

BMDの差異に関するジストロフ十ンのreading
frame仮説の妥当性について検討した．これをタ考察および結論

ンパク質レベルから明らかにする目的で，ジスト

DMDで欠損している筋細胞膜関連タンパク質

ロフィンのC末端ドメインに特異的なモノクロー

であるジストロフィンは4つのドメインから構成

ナル抗体を用いその発現様式を検討したので報告されN末端から順に，アクチン結合ドメイン，スする．

表Immunocytochemicalanalysisofthedystrophin
対象と方法

Crterminuswithamonoclonalantibody

対象はDMD18，BMD20，その他の各種神経筋疾患（OND）32の計70例である．抗ジストロフィ

Clinical N0．0f Dystro kDadiag・ンC末端ドメイン・モノクローナル抗体はペプチ
ドⅠⅤ（ヒトC末端アミノ酸番号3495−3544）をマウ

CaaSeS

DMD
BMD

phin

18
20

（17）

OND

−121−

32

％
n＝100

absentnormallmmuno−stainingOabnormal（3）＊国立精神・神経センター神経研究所

n＝400

4C5

＋
＜400

5−60

＞40010−30
400

100（faint＆patchy）＋＋（normal）

図

抗ジストロフィンC末端モノクローナル抗体，4C5，による骨格筋の螢光染色およびこれと対応したH＆E染色．DMD（a，b），BMD（C，d），正常筋（e，f）を示す．ジストロフィンC末端の免疫反応はBMDと正常筋では存在するが，DMD筋では欠損している．（×340）

ペクトリン類似の3重螺旋構造を24回繰り返す中れないという事実や，ヒトとニワトリの間で95％

間ドメイン，EFハンド構造をもつ高システインのホモロジーを認めることから，ジストロフィン

ドメイン，およびC末端ドメインの順に並んでいの生理機能発現にとって重要な役割を担っているる．このうちC末端については，他のいかなる既ドメインである可能性が示唆されてきた．また知タンパク質ともアミノ酸配列に相同性が認めら

Campbellらは（1989）ジストロフィンの部分精製−122え僅かの欠失であるとしてもジストロフィンの欠に成功し，ジストロフィンがC末端で筋細胞膜を構成する糖タンパク質と結び付いていることを示

損を来してしまうし（C末端は欠損；DMDの場した．さらにFeenerらは（1989）C末端のスプラ合），他方reading frameがシフトせずに残ってイシングの差によって多くの臓器特異的アイソ

いれば，誓え大きなinternaldeletionが存在してフォームが作られていることを発見している．ついてもジストロフィンは（不完全ながらも）発現まり少なくとも骨格筋では3種の，脳ではそれとする（C末端は存在；BMDの場合）と考えられは異なる3種の，平滑筋ではもっと短い2種のジる．

ストロフィンが作られていることが判明した．従文

献って，Campbellらの言うようにC末端が膜タン
パク質との結合部位であるならば，臓器によって

1）SugitaH，ArahataK，IshiguroT，SuharaY，それぞれ異なるジストロフィン結合タンパク質がTsukahara T，Ishiura S，EguchiC，Nonaka

存在している可能性がある．そして最近，英国のIandOzawaE：Negativeimmunostainingof

Love，Daviesら（1989）によってヒト第6染色体

Ducherme muscular dystrophy（DMD）and

上にジストロフィンのC末端と73％ものホモロジ

mdx mouse muscle surface membraneLwith

ーのある塩基配列が兄いだされ，しかもこのantibody againstsyntheticpeptidefragment

CDNA・B3をプローブとしてとり台児骨格筋培養
細胞のmRNAを検索したところ，ジストロフィ
ンmRNA（14kb）とは異なる13kbのmRNAがpredicted from DMD cDNA．ProcJapan

2）ArahataK，IshiuraS，IshiguroT，Tsukahara

検出されたことで新たな問題提起がなされている．

T，SuharaY，EguchiC，IshiharaT，Nonaka

Acad64：210−212，1988．

今回我々はDMD／BMDを含む70例の各種神経I，Ozawa E and Sugita H：Immunostaining

筋疾患について，ジストロフィンのC末端ドメイ

Of skeletal and cardiac muscle surface

ンの発現様式を検討したわけであるが，これらのmembranewithantibody against Duchenne

結果から，BMDとONDにおいてはジストロフィ

muscular dystrophy peptide．Nature466−169，1988，

ンのC末端ドメインが保たれているが，DMDで333：

は欠損していることが判明した．これはジストロ3）Arahata K，Ishihara T，Kamakura K，

フィン・タンパクの安定化または生垣機能の発現

TsukaharaT，IshiuraS，BabaC，MatsumOtO

にとって，そのC末端部分を含む構造が必須であT，NonakaIandSugita H：Mosaicexpres−ることを示唆しているものと考えられ，極めて重sionofdystrophininSymptOmaticcarriersof

要である．また，同時に，PCR法とサザンプロッ

Duchermesmusculardystrophy．N

EnglJ

Med320：138−142，1989．

ト法によるDMD遺伝子の欠失解析に基づいて
Kunkelらによって提唱されてきたジストロフィ

4）Arahata K，Ishiura S，Tsukal1ara T andンのreadingframe仮説がタンパク質レベルから

Sugita H：Dystrophin digest．Nature337：
606，1989．

具体的に基づけられたと言える．
なおこの仮説は，タンパク質レベルで見た

5）ArahataK，HoflmanEP，KunkelLM，Ishiura

DMD（ジストロフィンは欠損）とBMD（ジストS，Tsukahara T，Ishihara T，Sunohara N，ロフィンは分子量に異常があっても存在）の差異

NonakaI，Ozawa E and Sugita H：Dystro−が遺伝子レベルでは具体的にどうなっているのか

phin diagnosis：COmparison of dystrophinという疑問に対する最も有力な考え方である．仮abnormalities byimmunonuorescent andにジストロフィンのreadingframeがシフトして

immunOblot analysis．Proc Natl Acad Sci

しまえばstopcodonが働いてしまうなどして，讐（USA）86：7154−7158，1989．

−123−Ⅴ．mdxマウス

21）mdxおよびcontrolマウスの液体ヘリウム急速凍結
骨格筋のfreezefracture，deepetching，rOtary
SIladowreplica法による細胞膜裏打ち構造の研究
若

研究協力者
緒

山

吉 弘＊

渋

谷 誠 二＊

言せ，家兎抗羊2次血清の1000倍希釈液を4℃にてHeuserにより開発された急速凍結，deepetch・
ing，rOtaryShadow法によるreplica膜の観察は細胞の3次元的観察に適しており，membraneover night反応後ABC法にて試料を作製，無染
色で電顕にて観察した．

CytOSkeletalinteractionやcytoskeletal ele−mentsの微細構造の詳細を研究するのに極めてDeep etching replica法では7匹の成熟mdx
マウスと6匹の成熟mdxコントロールマウスの長址伸筋（EDL筋）を用いた．方法は有用である．特に細胞膜と細胞膜関連細胞骨格と

1）mdxマウスとコントロ◆−ルマウスのEDL筋を採取する．

の相互関係を究明するにはきわめて有力な手段となりうると考えられる．近年Duchenne筋ジスト
ロフィー症（DMD）の遺伝子産物である分子量427
kDaの蛋白質dystrophiんは正常骨格筋細胞膜の細胞質側に存在することが明らかにされつつあり，
DMDではdystrophinが筋細胞膜に欠如している．我々は同じくdystrophinが欠損していると報告されているmdxマウスとdystrophinが存在す
るmdxコントロールマウスを用い，免疫透過電
顕的ならびにdeep etching replica法によるre−plica膜の電顕的観察にてdystrophinの超微形態と存在様式を研究するため本研究をおこなった．
材料と方法
免疫透過電顕的観察には6匹の成熟mdxマウスと6匹の成熟mdxコントロールマウスの大腿四頭筋を4％パラフォルムアルデヒド液で1時間
固定後，クリオスタットで細切し，7．5％蕉糖入り
0．1Mリン酸バッファーで4回洗浄後over night2）急速試料凍結装置Eiko RF−23型に液体窒素と液体ヘリウムを入れ−269℃まで冷えた純銅
blockに採取した筋の小片を庄着し急速凍結する．

3）上記標本をEiko FD−5A凍結割断装置に移し−110−−120℃で凍結面の表層を割断する．
4）割断後試料台の温度を−90℃まで上昇し真空度1−2×10￣7Torrで約30分間deep etching
をおこなう．
5）deepetchihg後試料台に装着した標本の温度を−160℃前後まで冷やす．
6）その後電子銃に装着した白金を膜庄計でその厚さを監視しながら，また試料台を回転しながら蒸着し，次に同じく電子銃に装着したカーボンを試料の上の白金膜に回転蒸着してreplica
膜を作製する．
7）次に試料のついたreplica膜を凍結割断装置
から取り出し，塩素系漂白剤で筋肉だけを消化で更に洗浄後正常家兎血清で非特異的反応をブロックした．次にKunkel博士より供与された60
kDaジストロフィン抗体を4℃で72時間反応さ＊昭和大学藤が丘病院神経内科

しreplica膜を得る．
8）replica膜を蒸留水で3分ずつ3回洗浄する．
9）replica膜を鋼メッシュにすくい取る．
10）得られたreplica膜を乾燥後，電顕にて観察し，写真を撮影する．

−127−

なお，Heuserらはcytoskeletal elementの写
真は白黒反転して論文に発表している．こうする

面には粒子の存在は少なく，筋細胞の脂質2重層とcytoskeletal elementが黒のback groundから浮き出したように白く観察され，より良く見え在していた．またグルタールアルデヒド固定標本と異なり，なまの急速凍結標本では筋細胞膜のPるので多くの発表でこの方法が採用されている．

面に粒子がE面より多いという傾向は見られなか

しかしreplica膜の電顕写真はもともとcontrast

った．

の内面はP面，E面とも膜内粒子が著しく多く存が強く，そのうえこのように白黒反転させるため

さてmdxマウスとmdxコントロールマウス

何度も写真を焼き直すと更にcontrastが増加す

EDL筋の筋細胞膜直下の細胞質側には形態の異るため，本論文では電顕ネガをそのまま印画紙になる細月包骨格成分が網状構造をなし（図4），とくに筋細胞膜E面の観察できる視野では捌包膜直下の細胞骨格成分が，筋細胞膜の其の内表面に付着している像がみられた（図4）．

焼き付け，CytOSkeletal elementsは白のback
訂Oundに黒い構造物として観察されるようにし
た．
結

果

考

免疫透過電顕的には抗ジストロフィン抗体はmdxコントロールマウスの筋細胞膜に一致して見られ（図1A），更に高倍率で観察すると筋細胞
膜直下で筋細胞膜に摸して図1Bの矢印のように強い免疫反応が見られた．一方，筋細胞の内部を観察すると図1Cの矢印のようにSR−T結合が3相構造を形成しているが，この部を含め筋細胞の横管（t−tubule）は抗ジストロフィン抗体では染色されなかった．他方mdxマウスの筋細胞膜は図1D，Eに見られるようにmdxコントロール
マウスで見られるような筋細胞膜直下の強い抗ジストロフィン抗体反応が欠如していた．尚非免疫羊血清を用いた対照標本ではmdxコントロール
マウスには抗ジストロフィン抗体反応は見られなかった．
次に液体ヘリウムによる急速凍結標本のdeep
etching replica膜の電顕的観察では筋細胞への割断面の入り方に関し2種類が見られた．すなわ

ちcollagen，laminin，heparan sulfate proteo−
glycanなどの基底膜物質を通り筋細胞の真の外表面，筋細胞膜P面，ここから筋形質に入り筋細胞膜直下から筋細胞の内部が観察できる面（図2
A，B）ともう1つは筋細胞の内部から筋細胞膜の其の内表面，ここから筋細胞膜の脂質2重層へ割断面が入り筋細胞膜E面そして基底膜層から細胞外腔が観察できる面（図3）である．このようにして観察できる筋細胞膜は真の外表面と其の内表

察

筋細胞膜裏打ち構造にはspectrin1），fodrin2），
ankyrinl）などがあるとされていたが，最近DMD
gene productであるdystrophinも筋細胞膜裏打
ち構造として存在する￣と考えられている．細胞骨格成分は従来の透過電顕的手法ではその超微形態の詳細を研究することは困難であり，本研究では個々の細胞骨格成分を1個1個詳細に観察するためにdeepetching，rOtarySpadowreplica法を用いた．分駈精製したspectrinのrotary shadow
replica法による検討では，その太さは約2−3m，長さが約100mmであるとされている3）．また
actin filamentは約5nm間隔の周期をもつ
Subunit structureが長く縦に並び縞紋様の構造を呈している4）．この様に細胞骨格同定の手がかりは多少あるものの，SpeCtrinなどはdimerや
tetramerなどを形成している可能性もあり事情は複雑である．dystrophinに関してはその分子量などからコンピューター解析により，長さ約150nmと想定され，その大部分は25個のtriple
helical segmentをもつ梓状構造からなっていると考えられている5）．
本研究ではmdxマウスおよびmdxコントロールマウスEDL筋細胞膜裏打ち構造は共に網状構造を呈し，その一部が筋細胞膜の其の内表面に付着していた．その細胞骨格の形態の詳細は現在
定量的に検討中であり，更に抗ジストロフィン抗体で標識し，その標識標本の本法による検討も加−128−

幻 ′ へ ⁚

A
騰

㌦ 二

㍉

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■
．
■

一

㌧
B

努 ■ ■ ′ ／ ′ へ ′ ⁚ ′ り ′ 〝 ′ カ ′ ㌣ ＝ 粥 や ⁚ ・ ㍉ 1 γ ． ′ γ シ
／ ′

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′ 三 ・ 〟 ′ ノ ン 笥 ■ ′ ′

1 ′ 〜

′

／ ′ ′
心

C

′ ． 心 ︑ ／ ′ ′ ／ ′ ′ l

図1A，B，C；mdxコントロールマウスEDL筋の抗ジストロフィン抗体による免疫染色像
Aでは免疫反応は筋細胞の表面に一致して見られる．BはAの高倍像で，免疫反応は矢印のように筋細胞膜直下に見られる．Cでは免疫反応は筋細胞膜の表面に見られるが，矢印のようにSR−T junctionを含めた横管系には見られない．
（A：×5300，B：×42300，C：×21100）

D，E；mdxマウスEDL筋の抗ジストロフィン抗体による免疫染色像で，EはDの高倍像．
筋細胞表面には免疫反応が見られない．（D：×5300，E二42300）

−129−

図2

mdxコントロールマウスEDL筋のdeep

replica膜の電顕像

従来の透過電顕像よりfilamentは格段にはっきりと観察出来る．Pは細胞膜P面でBはAの矢印の部分の拡大像．個々の細胞膜裏打ち構造がはっきりと観察出来る．（A：×18700，
B：×149300）

Eは筋細胞膜E面．矢尻の線より下に筋細胞膜の真内表面が見られ，ここへ細胞質側から多くの細胞骨格成分が付着している．（×149300）

−130−

図4

mdxマウスEDL筋の細胞膜裏打ち構造
画面上方には網状構造をした細胞隈裏打ち構造の細胞骨格成分がみられ，その一部が筋細胞
膜の真内表面に付着している．（×149300）

patients．AmJPathol132：410−416，1988・

え，個々の筋細胞膜裏打ち細胞骨格の同定を進め

3）ShottonDM，BurkeBEetal：Themolecularていきたい．

struCture Of human erythrocyte spectrin．

文

献Biophysical and electron microscoplC Stu−

dies．J MoIBiol131：303−329，1979・

1）Branton D，Cohen CM et al：Interaction ofcytoskeletal proteins on the human eryth，

4）HeuserJE，Kirschner：Filamentorganization
revealedinplatinumreplicasoffreeze−driedrocyte membrane．Cel124：24−32，1981．
2）Miranda AF，Bonilla Eet al：Immunocyto−

cytoskeletons．JCellBio186：212−234，1980・

chemiCal study of dystrophinin muscle

5）KoenigM，MonacoAPetal：Thecomplete

cultures from patients with Duchenne

sequenceofdystrophinpredictsarod−Shaped

muscular dystrophyand unaffected control

cytoskeletalprotein・Cel153：219−228・1988・−131−22）mdxおよびcontrolマウスの生後早期における骨格筋細胞膜内orthogonalarray密度について
若 山 吉 弘＊
研究協力者

渋

谷

誠

二＊

Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）と欠損遺伝子部位がほぼ同様で，その遺伝子産物であ

電顕にて観察し，撮影された筋捌包膜写真中のOA密度を算出するため，最終倍率が16万倍の写るdystrophinも欠如するmdxマウスの筋細胞膜

真を各々のマウス1匹につき，最低10本の筋線維（5P面および5E面）について，mdx群とcon＿trol群それぞれ60枚ずつ，各stageごと計120枚（3stagesで合計360枚）をcodeL，すべて混ぜ合わせ，mdx群かcontrol群か不明の状態で，1微細構造異常については昨年度報告したり．そのなかで我々はDMDおよびmdxマウスにみられる膜内粒子異常の内，特にorthogonal array（OA）の減少が最も顕著であることを兄いだし，
dystrophinとの関係に注目した．
今年度は，昨年度が成熟mdxマウスを用いた

本の筋線経の1．5−1．85JJm2の面積をもつ領域内のに対し，より早期の生後間もないearly stage
でのmdxおよびcontrolマウスの骨格筋細胞膜でのOAの数を算出し，この後，これらはdecoding
L，各々の時期におけるmdx群とcontrol群で統計学的に検討した．

標本を，Freeze−Fracture法により作製し，膜内粒子，特にOA密度についてさらに検討をおこなった．

結果
光顕的に生後3日および7日のmdxマウスで方法

生後3日，7日および14日の雄mdx（C57BL／
10ScSn−mdx）ならびにそのCOntrOl（C57BL／lt）
ScSn）マウスを各々6匹ずつ使用し，その両側前腰骨筋（TA筋）を摘出し，右側TA筋はイソペン
タンおよび液体窒素下で凍結固定後，光顕組織標本を作製した．左側TA筋は十分に露出し，下腿骨につけたまま，直ちに2．5％グルタールアルデヒ▼
ドリン酸緩衝液の中で2時間固定し，実体顕微鏡下でTA筋の筋膜を注意深く取り除いた後，約1×2mmの小さなブロックに切り，10％〜30％グ））セリン溶液に浸致し，Freeze−Fracture（F−F）碍により，筋細胞膜電顕標本を作製した．F−F、法による標本割断には，Eiko FDIIA（−120℃，
2・5−4×10丁7Torrの条件下）を用いた．
＊昭和大学藤が丘病院神経内科

は壊死線経の存在は明らかでなく，COntrOlマウスと比較しても外観上大きな違いはみられなかった．一方，生後14日のmdxマウスでは，その一部
で壊死線経の集塊が散見された．
各stage別のF−F法によるTA筋筋細胞膜標
本における1ルm2あたりのOA密度は（表），生後3日，7日，14日の順に，mdx群では，そのMedian値およびMidrange値（25％〜75％）（括弧内）が，0．54（0−1．62），4．37（2．24−9．40），
4．31（0．54−7．54）であり，一方，同様に，COntrOl群においては，0．54（0−2．69），8．08（3．87−16．33），
11．85（5．39〜16．65）であった．生後3E】mdx群
ならびにcontrol群では，すでに，少数ながら，両群ともにOAの発現を認めているが，統計坤こは両群で有意差はみられなかった（p＞0．1by Wil−
COXOn rank−Sum teSt）．しかしながら，生後7日になると，COntrOl群のOAの数は著明に増加し，かつmdx群も増加を認めたものの，その密度

−132−

表

DensityoforthogonalarraysandtheirpitsperJLm2intibialisanteriormuscleplasma
membranes of．mdx and controlmice at different early stages・
Pvalueswere calculatedbyWilcoxonrank一畠umtest．

Age
3

Mediandays

Midrange（25％MDXControl

7

days MDX

−

75％）

O．54

0

−

1．62

O．54

0

−

2．69

4．37

2．24

−

9．40

8．08

3．89

−

16．33

4．31

0．54

−

7．54

l1．85

5．39

−

16．65

pく0．01

Contr01

14

daYS MDX

pく0．一01

Controlは明らかにCOntrOl群に比べて少なく，統計的にはなかった．しかしながら，これらのOA密度はも有意に少なかった（p＜0．01）．さらに生後14日
においては，COntrOl群のOA密度は生後7日以ヒトpreclinicalおよびsymptomatic DMDと比較した場合には，earlystagemdxマウスではか上に増加し，一方，mdxマウスではその密度が横這いか，やや減少傾向にあり，やはり統計的にもなり多くのOAが発現しているといえた．

COntrOl群より有意に減少していた（p＜0．01）（図A−D）．

が，正常マウスやヒトでは成長過程にある若いマ

OAの機能については現在ほとんど不明である
ウスやヒトの方が多いことを，我々はF−F法を用いた研究にて発見している5）．このことは，OAが考骨格筋の活発な機能と強い関係をもち，逆にOA

察

Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）およびmdxマウスの筋細胞膜微細構造異常の内，直径約60−70ÅのSubunitから成り＿結晶様構造を示の少ないことが骨格筋機能を減じることに結びつすorthogonal array（OA）の減少が，最も顕著であることはすでに報告している2）．一方，pre−Clinical DMDのOA密度に関しては若山ら3）がが多く認められ，このことがmdxマウスがDMD

SymptOmaticDMDと同様に，その著明な減少を報告しているが，mdxマウス生後早期におけるOA密度については未検討のままであった．本研
究の結果，臨床的，光顕組織学的に，また電顕的にも異常がみられない4）生後7日のearly stage
mdxマウスにおいて，すでにOA密度の統計的に有意な・減少を認めたが，より早期の生後3日のmdxマウスでは，COntrOlマウスと比べて有意差

くかもしれない．mdxマウスでは，今までの報告を含め，すべてのStageでヒトDMDよりもOA
より機能障害が軽いことと関係しているかもしれない．
また本研究の結果から，mdxマウスでは生後極めて早期には同時期のCOntrOlマウスと同等に，すでにその骨格筋細胞膜内にOAが発現しているが，生後3日から7日の短期間の内にOAはある程度まで増加するが，その数に関しては成熟が停止してしまうといえた．その原因がdystrophinであるとするならば，OAの発生成熟には，その極めて早期の過程でdystrophinと何らかの繋がり

−133−

図

Highmagnification electronmicrographs of freeze−fracture preparationsillustrating
OrthogonalarraydensityofprotoplasmiC（P）faceintibialisanterior（TA）muscleplasma
membrane Ofcontroland mdxmice atdifferentearlystages．
Fig・A；COntrOlmouseat3daysafterbirth，Fig・B；mdxmouseat3daysafterbirth，Fig，C；COntrOlmouse at7daysafterbirth，Fig・D；mdxmouseat7daysafterbirth．
・Decreaseddensityoforthogonalarrays（arrows）isapparentinmdxmembraneat7days
after birth．
C＝Caveolae．×80，000を必要とする可能性が推測されるが，OA減少は
ヒトDMDやmdxマウスの他に，顔面肩甲肢帯型筋ジストロフィー症6）や福山型筋ジストロフィー症7）でも認められ，OAの減少はdystrophin以外の要因も考慮すべきであろう．

結①幼弱mdxマウスではより多くのOAが発現していた．
②mdxマウスがDMDより機能障害が軽い点に関して，mdxマウスではそのCOntrOlマウスよ今後さらに，OA発生成熟過程におけるdystro−
phin関与の有無，神経支配あ影響，neurOmuS−
CularjunctionやmyotendinousjunCtionにおけるOAの存在様式と密度，OA以外の膜内粒子のearlystagemdxマウスにおける変化などをF−F法を用いて検討する必要がある．

語りは有意にOAが減少しているものの，DMD
より，すべてのStageで，mdxマウスの方がOA密度が多いことと関係している可能性も考えられた．
③臨床的，光顕組織学的にほとんど異常．を認めないmdxマウス生後1週の時期で，すでに，OA密度の統計的に有意な減少がみられたことは，−134−

筋ジス症状発現機序に関して，dystrophin欠如の他に，OAの発生成熟過程の異常の関与も示唆された．

Tokyo Press，Tokyo，1982，p355．

4） Cullen MJ，Jaros E：Ultrastructure of theskeletalmuscleintheXchromosome−1inked
dystrophic（mdx）mouse；COmpariSon with

文

献

Duchennemusculardystrophy．Acta Neuro−1）若山舌弘，渋谷誠二：mdxマウス長址伸筋細胞

pathol（Berl）77：69，1988．

膜のFreezeTFracture法による微細構造の経5）Wakayama Y，Jimi T et al：Dystrophin

時的変化について． 厚生省精神・神経疾患研究

immunOStaining and freeze−fracture studies

委託費筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態

of muscle of patientsとその病因に関する研究（杉田班）昭和63年度

amyotrophiclateralsclerosis andDuchenne

研究報告書 ，1989，p231．

muscular dystrophy．J NeuroI Sci91：191，

2）Shibuya S and Wakayama Y：Freeze−fracture studies of myofiber plasma mem・with early stage

1989．

6）Schotland DL，Bonilla E et al：Freeze−

X chromosome−1inked muscular

fracturestudiesofmuscleplasmamembrane

dystrophy（mdx）mice．Acta Neuropathol

inhumanmusculardystrophy．ActaNeuro・

brane

in

pathol（Berl）54：77，1981．

（Berl）76：179，1988．

3）Wakayama Y，Bonilla E et al：Freeze−7）Wakayama Y，Kumagai T et al：Freeze−fracture study ofhuman dystrophic muscle

fracturestudiesofmuscleplasmamembranewith special emphasis on Duchenne andin Fukuyama−type COngenital muscularpreclinical

Duchenne

dystrophy．Neurology（Cleveland）35：1587，

dystrophy（edbyEbashiS）University

dystrophy．

Muscular

1985．

of

−135−

23）mdxマウス下肢骨格筋のSR−Tmembrane
SyStemおよびdipeptides含有量
土

研究協力者
緒

同 利 息＊

田 中 みどり＊山

言

4℃で2．5％グルタールアルデヒド0．1Mリン酸

下

勝

正＊

山

田

幸

宏＊

筋ジストロフィー症モデル動物であるmdxマ
ウス骨格筋細胞の形質中やミトコンドリアに結合しているカルシウムイオン濃度は上昇してお緩徳液で前固定し，2％オスミウム酸で後固定，その後脱水，包埋，薄切した．電子顕微鏡像は直接倍率20，000倍で三連構造（triads）を中心に撮影

り6）・11），カルシウム依存性蛋白分解酵素の賦活化が議論されている9）・10）．記録された張力をみると，生後数日のひらめ筋（SOL）および長址伸筋（EDL）では，その収縮曲線はClose3）の報告と同様であり，たとえmdxマウスの骨格筋であってし，3・3倍のプ））ントを得，feetあるいはjun−
Ctionalgapの幅は0．1mm精度のルーペを用い測
定した4）．この場合，feet構造が明瞭なものをランダムに抽出して行った．
Dipeptidesの分析には除蛋白されたSOLおよ

も加齢によってそれぞれの特徴を示すようになった11）．すなわち張力発揮は対照群と比較してなんら有意的な差は認められなかったが，微細構造学的知見を踏まえた前報では11），三通構造（triads）に含まれる筋小胞体（SR）および横行小菅系（TびEDLを逆相分配型高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて行い，hypersi10DS系カラムからan−Serineおよびcarnosineを分析した．
細胞内小器官に結合するカルシウムイオン検出−tubule）の間瞭に存在するjunctionalgap幅の拡大を認めた．最近，数多く報告されている
ryanodine receptor（calciumTaCtivated−Cal−
Ciumreleasechannel）あるいはdihydropyridine−bindingproteinについてjunctionalgap帽との関係をさらに検討するために（∋三達構造の微細構
造の詳細，（診膜系におけるユタオリン抗体から直接的カルシウムイオンの検出の試み，③筋収縮エ
ネルギー産生に緩衝作用を持つdipeptides含有
量，について研究した．

の目的で，その発光蛋白であるaequorinを数本の筋線経に注入し，凍結，薄切後，ウサギで得られたanti−aequOrinと反応させDAB（diamino−
benzidine）による反応粒子を電子顕微鏡学的に観察した．
結果
図1および2には生後4日目および2週齢におけるmdxマウスとその対照マウスのSOLおよびEDLの三連構造の電子顕微鏡写真が示されている．一般的にSOLではEDLに比較して細胞内実験方法
当研究室で繁殖し，飼育している筋ジストロフ
ィー症モデル動物であるmdxマウスとその対照

膜系の発達が悪く，対照群（AおよびC）のjun・Ctionalgap中のfeet構造（bridgestructure）は
SOLで完成されていないことが多い．mdx群（BおよびD）では細胞内膜系に未発達な構造が時々マウスのひらめ筋（SOL）および長址伸筋（EDL）
を用いた．生後4日および2週齢の片側摘出筋を観察され，その特徴として筋原線経の走行とpar−allelに位置する三連構造を認める．2週齢の＊聖マリアンナ医科大学第二生理学教室

mdx群（D）では，junctionalgap帽に拡大が認められている．測定された結果から（表1），mdx−136−

図1 ひらめ筋の三連構造
A：生後4H目の対照筋，B：生後4日日のmdxマウス筋，C：2週齢の対照筋，D：2週
齢のmdxマウス筋

図2 長址伸筋の三連構造
A：生後4日目の対照筋，B：生後4日日のmdxマウス筋，C：2週齢の対照筋，D：2週
齢のmdxマウス筋
群で20nmでありおおよそ対照群と比較して4symbol）においてcarnosineの低濃度が分析さnm増加しており，有意差（p＜0．01）が認められ

れ，anSerine／carnosineratioは上昇する傾向にた．
図3はEDLのanserineおよびCarnOSineの加あった．図には示されていないがSOLの場合も同様であり，いわゆる筋肉の炎症あるいは加齢に齢による影響をみたものであるがmdx群（closed

付随したその上昇が，生後5−7週齢のmdx群

−137−

EDL

Car．0
Ans．ム

るように，mdxマウス骨格筋線経のjunctional●

gapの帽の拡大からT−tubuleに局在するという▲

最近，Dulhunty4）が報告しているように，T−tubule中に認められ，negative chargeを有する

0 0′AA▲▲

聖SS≡買切＼︼︒2ユryanodine receptor2）・8）あるいはfeet構造5）にある種の構造変化が生じていることが疑われる．

○

構造，すなわちglycocalyxは，junctionalgapを介して直接SRの終槽に到達し，そこに集積して
10

20

30

40
Weeks

図3

長址伸筋のanserineおよびcarnosineレ
ベルの加齢による変動
Car．：CarnOSine，Ans：anSerine，○△：対照筋，●▲：mdxマウス筋．

いるカルシウム結合蛋白であるcalsequestrinに影響を与えているという．もしそのような系があれば，筋鞘からの信号は直接，SRからのカルシウ
ムイオン放出をコントロールすることになる．
Junctionalgap幅の拡大が，興奮収縮連関にどの程度の影響を与えているか不明であるが，mdxマ
ウスの筋形質中やミトコンドリア中のカルシウムで認められた．

イオンの上昇6）・9）・10）から考えると，カルシウムイ

Ant卜aequorinのDAB反応粒子は主にSRおよびTrtubuleの膜系に局在しており（図4），ミオンの遊維機構調節になんらかの影響を与えても不思議はない．すなわち幅の拡大自体がSR膜かトコンドリア内には発見されなかった．粒子は筋らのカルシウムイオンのpassiveなリークに関与

小胞体膜の終槽に特徴的であり，一部筋原線維上して，筋細胞内カルシウムイオンの上昇を引き起のM線や太・細フィラメントの重なり合う部位にこしているかも知れない．さらにmdxマウス骨もその局在が認められた．

格筋細胞のdystrophinの欠落は，現在のところ筋
鞘の微細構造変化として捉えられていないが，も考察しあるとすれば筋鞘と連続している横行小菅系とmdx骨格筋の収縮曲線は速筋でも緩筋タイプを示すと報告されているが，我々の用いた週齢の筋肉においては前回11〉同様に収縮時間や張力に変化は認められなかった．SOLおよびEDL仝筋の中に壊死線経が少なく，再生筋線経の占める比結合には疑問が残る．この写真からDAB反応粒率が高いことによるものであろう．表に示され子は扶上に認められ，フリーなカルシウムイオン

図4の関係は興味深い問題である．静止状態において筋線維内に庄注入されたaequorinはカルシウム
イオンと結合し，DABの反応粒子として検出されたと考えられるが（図4），SR中のイオンとのAnti−aequOrin処理筋の免疫電子顕微鏡写真
Z：Z帝，M：M線，Sr：筋小胞体，mt：ミトコンドリア
−138−

表

横行小菅系が構成するjunctionalgapに，前報と対照マウスおよびmdxマウス下肢骨格筋細胞のjunctionalgap帽
TheuidthofthejunctiDnal

gapin

the

triadS

同様に拡大が認められた．このことからカルシウ
ム遊艶機構が考察された．筋収縮エネルギー産生

C［r鵬X andc。ntで山muse skeletalmuscle（mean土5．0りm）
lrdx

を緩衝しているとされるdipeptidesの含有量はcontrol

mdx骨格筋で，特にCarnOSineが低下していたこ
4−dayl昭USe

2−Ueek mouse

15 士 2．9

15 土 2．1

（121）

（162）

20土

4．3

（154）

ReSUltsuere

obtainedontheとから，anSerineとのratioは上昇し，嫌気的解糖作用によって筋収縮エネルギーの供給が考えられ

16 土 2．8

た．

（173）

three−foldphoto一文

graph of electron−micrographuith direct
magnification of2口，000叫

献1）Avena RM and Bowen WJ：Effects ofは試料作成過程においてほとんど消失してしまったと考えられる．筋原線経に残る反応粒子はその一部としてみることができるであろう．今後収縮中の条件を得て検討してみたい．

carnosine and anserine onmuscle adenosine
triphosphatases．J BioI Chem244：1600−
1604，1969．
2）Block BA，Imagawa T，Campbell KP and

Dipeptidesは筋組織に多量に含まれ，筋収縮エネルギー供給において大きな緩衝作用を持つといFranzini−Armstrong C：Structuralevidence

われる．Myoglobin濃度が低く，ATPエネルギー
産生を嫌気的代謝に俵存している自筋においては，高い濃度のanserineを含み，CarnOSineとともにミオシンATPaseを活性化する1）・12）．加齢においてあるいは筋肉の炎症においてanserine／car−nosineratioが上昇することが知られており7），5〜7週齢のmdxマウスのEDLにおいても上昇

components of transverse tubule／Sarcoplas・が認められた（図3）．骨格筋へのトレーニング，
特に持久性運動を与えた場合，このratioは下降し，筋組織における好気的代謝由来のエネルギー
獲得の性質が生じ，加齢に抵抗していることが報告されている（未発表データ）．このことから考えるとmdxマウス骨格筋では，若年齢においてす

fordirectinteractionbetweenthemolecular

micreticulumjunctioninskeletalmuscle．J
Cell BiollO7：2587−2600，1988．
3）CloseRI：Dynamicpropertiesofmammalianskeletalmuscles．PhysioIRev52：129−197，
1972．

4）Dulhunty AF：Feet，bridges，and pillarsin
triad junctions of mammalian skeletal
muscle．Their possible relationship to cal・cium bufferin terminal cisternae and T−
tubulesandtoexcitationTCOntraCtioncoupl−

ing．J Membrane BiollO9：73−83，1989・
5）Franzini−ArmstrongC：Membranoussystem

でに加齢状態にあるdipeptidesの性格を示していることになり，筋収縮エネルギー産生には好気的より嫌気的解糖によるpathwayが主となっていることが考えられた．週齢の若いmdxマウスに持久的運動を負荷したときのdipeptidesの動きについては興味深い問題であり，今後の課題である．

inmuscleFunction

fibers．Inof

MuscleThe（ed

StruCture

by

Boume

and

GH）

Academic Press，New York，London，1973，
Vol．II2nd edn，pp531−619．
6）GlesbyMJ，EduardoRosenmannBSc，Nylen
EandWrogemannK：SerumCK，Calcium，magnesium，andoxidativephosphorylationin
mdx mouse muscular dystrophy．Muscle

結語
mdxマウスのSOLおよびEDLの筋線経にお7）Parkhouse WS，McKenzie DC，Hochachkd

いて，その細胞内小器官の一部である筋小胞体とPW and OvalleWK：Bufferingcapacity of−139−、Nervell：852−856、1988．

deproteinizedhumanvastuslateralismuscle．

10）Turner PR，Westwood T，Regen CM andSteinhardt RA：Increased proteindegrada−

J Appl Physio158：14−17，1985．
8）SmithJS，Imagawa T，MaJ，Fill M，tion results from elevated free calucium

Campbell KP and Coronado R：Purified

levels foundin muscle from mdx mice．
Nature335：735−738，1988．

ryanodine recepter from rabbit skeletal
muscleis the calcium release channel of
SarCOPlasmic

reticulum．JGen11）吉岡利息，田中みどり，竹倉宏明：ジストロフィー筋の細胞内膜系と収縮． 厚生省「精神・神経

Physio192二疾患研究委託費」筋ジストロフィー症および関

1−26，1988．

連疾患の病態とその病因に関する研究（杉田址）

9）SozaM，KarpatiG，CarpenterSandPrescott
S：Calcium−induced damage of skeletal

昭和63年度研究報告書11989，pp254−257．

musclefibersismarkedlyreducedbycalcium12）YunJandParkerCJ：Theeffectofcarnosine

Channelblockers．Acta Neuropathol（Berl）

On myOfibrillar ATPase activity．Biochim

71：70−75，1986．

Biophys ActallO：212−214，1965．

−140−24）mdxマウスの筋小胞体機能（続報）
高

研究協力者

木

小 島
紫

進＊

芝

良

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）患者が全身麻酔に際して，しばしば悪性高熱に類似する
全身反応を呈することが知られている1）．この現象はDMD骨格筋においてなんらかのカルシウム
イオン（Ca）調節異常の存在を示唆している．ヒトやブタの典型的悪性高熱では筋小胞体（SR）のCa誘発性Ca遊離の冗進が指摘された2）．我々は昨年にひきつづき，DMDのモデルとしてmdxマウスを使用して，SRのCa遊離につき分析を行った．昨年度は生後8−20週のマウスに於て，Caf−feine拘縞の冗進とCa漏出の増加を報告した．本
年は3−4週齢の筋壊死のさかんな時期の動物を使用して，SRにおけるCa遊艶を分析した．
方昭 夫＊・＊＊井田雅

昌＊＊ 荒 木祥＊
誠＊＊

（0．3mg）をincubate後，洗濯した．筋切片をソルエンにて溶解後放射能を測定した．
結果1）Caffeine拘縮（図2，表1）
0．1mM EGTAを含む弛緩溶液中で1〜5mM Caffeineによる拘縞の大きさを比較した．
mdxでより大きな拘絹を観察した．統計的には2mM Caffeineによる拘縞にのみ有意差を認めた（p＝0．05）．50％活性化に要するCaffeine濃度は
mdx2．3mM，BlO3．3mMであり，mdxで有意に低下していた（p＝0．01）．

法G】曽10￣▼H

3〜4週齢のmdxマウス（mdx，C57BL／10

2

6−2

6−81

6−0．1

カJu Cd亡nE

6−2

mln

ScSn−mdx）および対照（BlO，C57BL／10SnSc）の前脛骨筋を使用した．Caffeine拘絹の分析はス
キンドファイバー法によった1）．スキンドファイ

Cq2

バーはWoodらの化学的スキンドファイバーを3日〇一▼M
min

6−2
X

G−2

6−0，16−8130mM Cdltlnt

6−2

min

使用した3）．SRよりのCa漏出は図1の模式図に従って分析した．即ち，SRに一定条件下でCa
Gl

二hl0−9M

6−2

6−0．16−0．130■¶M

CαHtn■

G−2を摂取させた後，2mMEGTAを含む弛緩溶液（G−2）に一定時間接触させた．その後SRあ残存
するCa量をCaffeine拘縞の大きさ（収縮曲線の図1積分値）から推定した．1分間にSR中のCaが全て漏出した場合の速度を1min▲1とした．
Ryanodine受容体の定量には筋凍結切片を使用した．H3−ryanOdineを含む溶液（20mMTris−
HCl，0・1MKCl，4mMATP，0．025mMCaC12，
pH7．0）中で，スライドガラスに付着した筋切片
葦虎の門病院神経内科＊＊沖中記念成人病研究所−141−

スキンドファイバー法によるSRよりのCa漏
出実験の模式図（中段）SRにCa溶液中で2分間，Ca摂取させた後，2mM EGTAを含む溶液（G−2）にⅩ
分間接触させる．0．1mM EGTAを含む溶液
中（G−0．1）でCaffeine拘絹を発生させ（B），
その大きさを測定する．
（上ヰ段）G−2，Ⅹ分の操作をはぶいた対照実験である．このCaffeine拘縮AとA の平均とBの大きさを比較して，Ⅹ分間に漏出したCa量を推定した．

Contrqctur●

1・0

2・0

3・0

ん0

2

5．0 mM
CoHeine

図2 Caffeine拘縞の洩度・反応関係
縦軸：Caffeine拘露の大きさ
横軸：Caffeine濃度●mdx，○対照（BlO），平均値±S．D．を図
示した．

図3

表l Caffeine拘縞の50％活性化に要する
Caffeine濃度（平均値±S．D．）

表2

■dx

2．3

±

0．7

中M（n＝12）

3．3

±

0．9

■【（n＝11）m川1

きい（p＝0．05）

1．

SRよりのCa漏出速度に対するprocaine
およびMgの影響（平均値±S．D．）
810

rate（■in￣1）

EGTA

O．15

土

15■M procaine O．14

・Adxと810の間には有意差有6筋小胞体（SR）よりのCa漏出
縦軸：SR中に残存するCa量
横軸：G−2溶液との接触時間2分間でのCa漏出はmdxでBlOより大

2■M

810

4

り（p＝0．01）◆

2）SRよりのCa碍出（図3，表2）2mM EGTAを含む溶液中でのCa漏出の時

8．

6■M Mg O．17

いた（p＝0．05）．Ca漏出に対する5mMprocaine
あるいは6mMmagnesiumion（Mg）の影響を調べた（表2）．mdxおよびBlOのいずれにおいて

Ryanodine結合はmdxおよびBlOともに，80−
100mMで飽和され，結合定数もほぼ同一であった．筋切片による測定のため正確ではないが，最

EGTA

土

0．07（5）（n．S．）

O．32

±

0．10（4）◆5tM procaine O．29◆

61M Mg O．29

●■dxと

土

土

0．11（4）（n．S．〉

0．09（4）（n．S．）

810の比較では有意差有り（p＝0．01）

大結合量はほぼlnmole／wetgramであった．

もprocaineやMgはCa漏出速度に影響を与えなかった．
3）Ryanodine受容体の測定（図4）0．06（5）く∩．S．）

MDX

2IIM

間経過を検討した．筋線維間でのばらつきが大き
いが，mdxではCa漏出量がより大きな傾向を認めた．2分間のCa漏出はmdxで有意に増加して0．05（5〉

土考察

昨年度は8−20週齢のマウスを使用して実験を行った．この過齢となると，mdx骨格筋はほぼ再生筋線経より成るといわれる．そのため結果の解釈に問題を残した．本年は筋細胞壊死が頻発して−142−

関連を更に追求する必要があろう．
今回は2mM EGTAを含む溶液中でのCa漏3▲仇常に作動するCa pumpにより再摂取される．遁
匪Ca濃度上昇をきたすことはないと推定される．
ただCa漏出増加があればCa pumpは常時作動
し，ATP消費は増加し，筋障害の原因となりうるであろう．またSR近傍でCa濃度が多少なりとも上昇するならば，Caffeineあるいはhalothane
といった薬剤の効果は増強する可能性がある．すなわちCaffeine拘縮冗進はCa漏出増加によって招来されうるであろう．
Ca漏出増加はmdx遺伝子異常の一次的発現2O．

︵眉一∽＼苫∈d︶PuコOq2苛○亡叉∝

出を比較した．Ca−Chelator，すなわちEGTAを0とした溶液中でのこの種の分析は技循的に困難であろう．したがって生体内の条件下でCa漏出の証明は困難である．Ca漏出が生じていても，正

0．1

0

20

40

60

80

100

〔3H〕Ryanodine（nM）

図4 筋凍結切片によるH3−ryanOdine結合
MDXとBlOではともに，80〜100mMで飽和され，両者間に差をみとめない．
いる3−4週齢のものを使用した．その結果前年同様にCaffeine拘縞の克進およびSRからのCa
漏出増加をmdxで確認した．またmdxでは筋線
維間でデータの変動が大きいのが注目された．
SR膜を通してのCa移動に関しては，i）Ca
pump，ii）Ca release channel，iii）Caleakage
Channelなどの機構が想定されている．Ca誘発性
Ca遊離（CICR）はCa release channelを介するものといわれる4）．CICRの機序はCaffeineにより促進され，prOCaineやMgにより抑制される
事実がある．今回とりあげたCa漏出はprocaine
やMgにより影響されなかった．それ故，CICRとは独立した現象であろう．mdxにおけるCICRはCaffeine拘縮以外に，より直接的に今後評価する必要がある．またCICRに関連してryanodine受容体に関する予備実験を開始し，その一部を記載した．
mdxで観察したCa漏出冗進の機序や意義については現時点で不明の事が多い．Ca漏出は
CICRと独立のCharmelによると仮定しているが，その分子レベルの証拠は皆無である．CICRとのとは考えにくい．mdxにおいても筋線維間の変動が大きい．3週齢より4週齢でより著明との印象をうけている（data未発表）．このように筋変性にともなう2次的現象である／可能性は大である．Ca
漏出増加の機序の追求は臨床的意義があるものと考えている．
まとめ

3〜4週齢のmdxマウスの筋小胞体機能を分析した．8−20週齢のマウスで観察されたのと同様に，Caffeine拘縮冗進を確認した．筋小胞体からのCa漏出が増加しており，これがCaffeine拘縮冗進の一因と推定した．Ca漏出はprocaineやMgイオンの影響を受けず，おそらくCa誘発性
Ca遊離の機序とは別のものと推定した．
文献1）高木昭夫，小島進，荒木誠：悪性高熱およびDuchenne型筋ジストロフィーにおけるカフェ

イン拘縮冗進の機序と診断的意義．臨床神経29：301−305，1989．

2）Ohta T，Endo M，Nakano T et al：Ca−

ー143−

induced Ca releasein malignant hyperther−mia−SuSCeptible pig skeletal muscle．AmJ
Physiol256（Cell Physio125）：C3587367，

1989．

3）WoodDS，ZollmanJPetal：Humanskeletal

al：Primary structure and expression from
COmplementary DNA of skeletal muscle

muscle：Propertiesofthechemicallyskinned

ryanodine receptor．Nature

fiber．Science187：1075，1975．

1989．

4）TakeshimaH，NishimuraS，MatsumotoTet−144−

339：439−445，25）mdxマウス骨格筋内のCaイオン濃度
吉 田 瑞 子＊研究協力者

柴昨年に引続き筋ジストロフィー症モデルマウス，
mdxの静止状態における骨格筋細胞内Caイオン濃度を検索した．
試料および方法
3週齢と16週齢のmdxとその対照マウスBlOの雄を各々10匹ずつ検索した．骨格筋は長指伸筋を筋束で使用した．腱から腱まで採取した筋束は，緩衝液中で長指伸筋以外のものをできる限り除去した．
緩衝液はHank，S−HEPES（137mMNaCl，5．36
mM KCl，1．27mMCaC12，4．17mM NaHCO3，
0．44mM KH2PO4，0．168mM．Na2HPO4・12
H20，0．81mM MgSO4・7H20，5．55mM
glucose，10mM HEPES）を用いた．
細胞内Caイオン濃度の検出は，蛍光プローブ
fura−2を用い，画像解析法で行った．furar2の筋細胞内負荷は，膜透過性のfura−2−AM（10FEM）とその膜透過性を高めるpluronic F−
127（0．08％）を緩衝液に加えて，超音波で1分間分散し，その中に筋束を入れ，微量の02：CO2＝
95：5を吹込みながら10℃で1時間半浮置した．
その筋束を25℃の緩衝液で洗搬後セルにセットした．セルは昨年使用したものと同じであるが，筋束の国定は，腱をアロンアルファーで培養用カバーグラスに直接接着した．この筋束を倒立型蛍光崎

浩＊

筋細胞は自己発光があるが，細胞の重なりが少ないところは自己発光強度が小さいので，その部位の細胞を1肢につき20本以上検索した．fura−2を負荷した筋細胞が，機能を維持していることを
5mMカフェイン処理で調べ，また蛍光がCaイ
オンと結合したfura−2であることを1FEMイオノマイシンで確認した．
細胞内のCaイオン濃度は，ビデオに記録した蛍光像を画像解析装置で処理し，蛍光強度比（Ⅰ340／Ⅰ360）を求め検量線より細胞内Caイオン濃度を算出した∴検量線はCa緩衝液にfura−2とタンパク質を加えて作成した．Ca緩衝液はHarafuji−Ogawal）に則ったHoriuchi2）の方法を模倣した．溶液は25℃でpH7．00，I＝0．20の条件で10mM EGTA，4．3mM ATP，5．OmM MgC12に，作成するCa
イオン濃度に必要なCaC12量と−それに対応したKCl量を加えて調製した．このCa緩循液に40jLM
fura−2とγ一グロブリン（シグマG5009）を50mg／mlおよび100mg／mlを加えて検量線用標準溶液とした．この標準溶液を筋細胞とほぼ同じ太さのガラス毛細管に封じ，25℃の水中に入れ，蛍光顕
微鏡下で筋細胞と同じように340nm・と360nmの蛍光像より蛍光強度比を求めて検量線を作成した．

た．

結果と考察
最近fura−2を初めとする蛍光プローブは，タンパク質と結合する3）ので，蛍光70ローブと塩溶
液のみのCa緩衝液で作成した検量線は，細胞内のCaイオン濃度を正しく反映していないと云われ始めた．そこで筋細胞内に近づけた溶液で検量線を得るため，Ca緩衝液に50mg／mlと100mg／＊国立精神・神経センター神経研究所

mlの割合でγ−グロブリンを加えて作成した．その検量線を図に示す．γ−グロブリンが増加する

顕微鏡下に設置し，緩衝液を濯流した．
画像処理を行うために，筋細胞をキセノン光源
からの340nmと360nmの2波長で励起し，それぞれの蛍光像を超高感度カメラで撮り，モニターテ
レビジョンで観察しながらビデオテープに記録し

ー145−

2l
O
・・

mg−γ一globulin／mlでは35nM〜80nMとなり，100mgTγ−globulin／mlでは50nM〜130nMとなった．細胞内のCaイオン濃度が130nMというの51・は，わずかに高いが，これ等のCaイオン濃度は，現在まで予測されている細胞内Caイオン濃度に0︵∈EO￠の＼∈UO寸望0焉﹂倉suり︼亡■いて差異は認められなかった．この蛍光強度比を
検量線を用いてCaイオン濃度に換算すると，50一致する．これ等の結果より，mdxの静止状態における長指伸筋内Caイオン濃度は正常値である
ことを結論する．
8

7

6

5

ま

PCa

と

め

3週齢と16週齢のmdxとBlOマウスの静止状態における骨格筋（長指伸筋）内のCaイオン濃度

区lは，いずれの場合も最大130nM以下で，正常値をと，Caイオン濃度が高い領域で蛍光強度比が小さくなった．しかし低濃度領域では大きな差はなかった．実際，筋細胞内でfura−2が作用しているタ
ンパク質量が不明なので，この2種類の検量線を用いた．
fura−2を負荷した筋細胞に，5mMカフェインを作用すると筋細胞は収縮運動をし，筋細月包の機能を維持していることを示した．，また1JJMのイオノマイシンを作用させると，340nmによる蛍光強度が大きく増加した．これは細胞外から細胞内にCaイオンが流入して，fura−2と結合したことを示した．すなわちfura−2−AMが細胞外から細胞内に透過して，細胞内でfura−2に分解してCaイオンと結合していることを示した．
3週齢と16週齢のmdxとBlOマウス雄の各々10匹の長指伸筋の蛍光強度比は，いずれの場合も0．65−0．80であった．mdxとBlO間，週齢間にお示した．mdxと対照のBlO間に差異は認められな
かった．
文

献

1）HarafujiH and Ogawa Y：Re−eXamination
Oftheapparentbindingconstantofethylene
glycol bis（β−aminoethyl ether）−N，N，N，N′−

tetraacetic acidwithcalciumaroundneutral
pH．J Biochem87：1305，1980．
2）Horiuchi K：Some properties of theCOntraCtile system and salcoplasmic
reticulum

Of skinned slow fibres from

XenOpuS muSCle．J Physio1373：1，1986．
3）Konishi M et al：Myoplasmic binding of−146−

fura−2investigated by steady−State fluores−
cence and absorbance measurements．Bio・
phys54：1089，1989．

26）mdxマウスの膜電位低下とミオトニー，
及びその治療栗 原 照 幸＊

研究協力着

岸
根

雅 彦＊ 日 高 隆 信＊
本博＊

は じ め にMdxマウスは，Ⅹ−linkedrecessiveの遺伝形式を持つ筋ジストロフィー症のモデル動物で，近年，荒畑らによ りmdxマウスの筋細胞膜ではdystrophinがDuchenne型筋ジストロフィーと同様に欠損していることが兄いだされた．この事より，mdxマウスの筋細胞膜異常を調べる事は，Duchemme型筋ジストロフィーの発症のメカニズ
ムを知る上でも重要な事と思われる．
我々は，今までmdxマウスの筋細胞膜を電気生理学的に検討して，筋細胞内記録により静止険
電位（RMP）の低下やelectricalmyotoniaなどの電気生理学的異常が見られる事を報告してきた．
今回はmdxマウスの筋細胞膜の電気生理学的異常をさらに詳しく調べた．この異常を改善する薬剤として，前回Ca桔抗剤の作用を検討した．今回
は，プロテアーゼ阻害作用を持つ事からI）uchen・
ne型筋ジストロフィー症への効果が期待されているbestatinについて検討を加えたので報告する．
方法

生後4日から218日までの年齢の異なるmdx
マウス14匹と，4匹のC57BL／10Scマウスの横隔膜標本を作成し，95％02と5％C02の混合ガスで酸素化したTyrode溶液に浸しながら3M KCl
を満たしたガラス管微小電極を用いて筋細胞内記録を行なった．RMPの測定を30−100本の筋線経に対して施行し，ヒストグラムを作成した．又，＊東邦大学医学部第四内科

木

下

眞

男＊

electrical myotoniaの出現の有無も記録し，
burstの頻度やburstとRMP低下との関連についても検討した．
Mdxマウスの横隔膜標本に神経筋伝達阻害剤のd−tubocurarineを作用させ，electrical
myotoniaが細胞膜の異常により生じている事を確認した．又，CI channel blockerであるanth・
racene−9−Carboxylic acidを作用させ，
electricalmyotoniaの変化を観察した．
Bestatinの効果を見る為に，4週齢のmdxマウスを使用し，bestatinをTyrode溶液1000mlに対し40mg加えて，30分後に筋細胞内記録を行ない，Ca桔抗剤と比較しながら筋細胞への作用を検
討した．
′結
果
MdxマウスのRMP平均値はコントロールのBlOマウスに比べて低い．しかし，ヒストグラムを作成すると，−75mV付近を境としてそれよりRMPの高い筋線経と低い筋線経があり，2相性のパターンを示していることがわかる．BlOマウスの場合は，ほとんどが−75mV以上の筋線椎で，単相性のパターンである（図1）．したがって，
mdxマウスではRMPの正常な筋線経とRMPの低い筋線経が混在するため，平均としてのRMPが低く なると考えられる．Electrical
myotoniaの頻度も計測し，筋線経のRMPが−77mV以下である事とmyotoniaが生じる事との間でズ2検定を施行したが，各日齢のmdxマ
ウスでは，この2つの事象の間には有意な関係は見られなかった．しかし，すべてのmdx マウス−147−

Restingmembrane potentials（RMPs）

mdx mouse（ALL）

No．
200

15D

lOO

50

0

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95100

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95100

RMP（−mV）

RMP（−mV）
l No．ofmyotonicfibers
at varjous RMPJevels．

■No．oImyotonic fibers
at varjous RMPlevels，

図1ヒストグラムによるmdxマウスとコントロールマウスのRMPの比較．検索した全ての年齢のマウスを総計している．mdxマウスではRMPが正常な線経と−75mV以下の筋線経がそれぞれグループを形成し，2相性のパターンをとっている．

のRMPを総計すると，electrical myotoniaは下した．Ca指抗剤では前回の報告のとおりで，RMPの低い線経で出現しやすい傾向が見られた．．
年齢の変化で，ヒストグラムのパターンや，

electricalmyotoniaは減少するが，RMPには変化をきたさない．

electrical myotoniaの頻度に変化が来ないかど
うかも検討したが，はっきりとした傾向は認めら考れなかった（図2）．

察

Mdxマウスは，Ducherme型筋ジストロフィー

Mdxマウスの横隔膜標本にd−tubocurarine症と同様に，その細胞膜のdystrophinが欠損して（dTc）を用いて神経筋接合部をブロックしても，いる事が発見され，Duchenne型筋ジストロフィ

electricalmyotoniaは出現し，これはelectricalー症の病因解明のモデル動物として重要なものとmyotoniaが末梢神経ではなく，筋細胞膜の異常に由来している事を意味している（図3）．又考えられている．しかし，人間のDuchenne型筋ジ

anthracene−9−Carboxylicacidを用いてClチャが活発であることなどから臨床像や経過に大きなンネルをブロックすると，正常筋に用いたのと同違いがあり，それが単に種の違いによるものなの様にほぼすべての線経でburstが認められた（図か，筋再生が活発で筋力低下が軽いためだけなの

4）．これは，mdxマウスで従来見られたものよか，臨床症状の発症にdystrophin以外のfactorが関与しているかどうかは不明である．

りも，持続の長いものであった．
Mdx■マウスにbestatinを用いて同様の検討をストロフィー症とmdxマウスには，後者で再生

今回の我々の研究では，dystrophinが全ての筋行った．Bestatinの投与により，mdxマウスの筋線経で欠損しているにもかかわらず，電気生理学

線経のうちRMPの低い線雄群の減少でRMPが的には正常な筋線経と異常な筋線経の混在が見ら改善し（図5），electrical myotoniaの頻度も低れた．この事から，我々が電気生理学的に兄いだ−148−

mdx mouse

Histogram ofrestingmembranepotentiafs

d−tubocurarine

ユ0−6g／m蔓

mdx（4daysold）
meanRMP（N＝34）：−66．5±10．2（S．D．）mV

二＿＿一一一￣二
RMP（−mV）」

mdx（39daysold）

1紬V

O，1＄eC

図3
mean RMP（N＝100）：
一69．5±13．9（S．D．）mv

Mdxマウスにd−tubocurarineを用いて神経筋接合部をブロックしてもelectricalmyotonia
は消失しない．

mdx mouse404550 55 60 65 7075釦85 90 95100
RMP（一mV）

arlthracerほ−9−CarboxyHe aく：id（lxl0−4M／し）mdx（71daysold）
40

meanRMP（N＝100）：

30

ご0

10

0

二÷

−76．6±8．8（S．D．）mv

RMP（−mV）

図2

年齢の異なるmdxマウスのRMPのヒス
トグラム．年齢によるヒストグラムのパターンの変化はない．

す事の出来る膜異常は，dystrophin欠損を直接反映しているものでは無いと思われる．このようにすべての筋線経が一様にではなく部分的に現れてくる生理学的異常は，形態学的に正常筋線経の中に壊死線経の群集がみられる事と似た現象と思われる．しかし，微小電極が入って計測出来た筋線

0．1sec経は，ある程度の直径のある線経で，すでに壊死に陥ったものではなく，壊死に陥る前の段階における筋細胞膜の機能障害を示しているものと考えられる．したがって今回見られた生理学的異常はdystrophin欠損に伴う膜異常が筋線維壊死を引き起こすまでの過程を反映するものと思われる．
しかし，全ての線経でdystrophinが欠損している
−149−

図4

Mdxマウスにanthracene−9−Carboxylic
acidを用いてClチャンネルをブロックす
ると，正常筋に用いたのと同様に，ほぼす
べての筋線経でburstが認められた．

RMP s o f a

dTcによってブロックされないので，末梢神経で4−We e k−01d mdx mo u s e

before and after addlng beStatln
to the ゎuscle chamber．

はなくて筋細胞膜の異常によって起こっているもNo．

mean MINtl15日

mean RhPINIlOOI1

45のと考えられる．そして，mtO

after

45

−78．1土8．40（S．D．ImV

マウスのようにmyotoniaの症状として立ち直り反射が遅い事も−82．9土7．81tS．D．ImV

mdxマウスではなく，又，普通の針電極で筋細胞3015」血−5 皿
38

50

闘

70

88

90180

RMP（一mV）

50

60

70

80

90

外記録を行った時でもmyotonic burstは起こらない．筋細胞内に電極を入れた時にはじめてelectrical myotoniaとしてburstが記録出来る．

100

RMP（一mV）

図5 Mdxマウスにbestatinを用いると，筋線経のうち，RMPの低い筋線維群のRMPが改善した．

これはmdxマウスでは，myOtOniaの程度としては軽く，イオンチャンネルの異常を薬物によって増強して始めてmyotonic burstが長時間起こる
ようになるものと思われる．しかし，mdxマウスにみられるelectricalmyotoniaが，膜のどのようなチャンネルの障害によって生じているのかは，
現時点では明らかではない．薬剤の作用機序を含のに全ての線経が一様には壊死に陥らないというめて，さらに検討が必要と考えられる．

事は，dystrophin欠損という事以外にも他のfac−
torが関与している可能性がある．

文

献

Myotoniaを呈する動物としては，先天的にヤ1）Holliday TA，Van MeterJR et al：

ギにみられるmyotoniaが有名であり，myOtOnia

Electromyographyofchickenswithinl1eritedの研究に用いられてきた．1965年にジストロフィ

musculardystrophy．AmJ Physio1209：871

ーチキンにmyotoniaが認められる事が報告された．これはdTcにより消失しないので膜異常に伴うものと考えられている1）．1973年には，やはり筋
ジストロフィー症のモデル動物であるdy／dy マ
ウスにmyotoniaが認められる事が報告されたが2），dy／dy マウスでは同時に神経筋接合部や末−876，1965．

2）GilbertJJ，Steinberg MC and Banker BQ：
Ultrastructuralalterationsofthemotorend・
platein myotonic dystrophy of the mouse（dy2J／dy27）．JNeuropathoExpNeuro13：345−364，1973．

梢神経の障害も伴っており，dTcでmyotoniaが3）EbersteinA，GoodgoldJ and Pachter BR：

消失することからmyotoniaのモデルとしては不Effect of curare on electromyographic and

適切と考えられている3）．しかし，dy／dy マウス
で脱神経によるものとは考えられない膜異常（Clコングクタンスの低下）を指摘する報告もある4）．

COntraCtileresponsesinthemyotonicmouse．
Exp Neuro149：612−616，1975．
4）FarnbachGC，BrownMJandBarchiRL：A

1978年にmtoマウスが発見され5），小動物の中で

maturational defectは最もmyotoniaのモデルとして適した動物と考

propertiesofdystrophicmousemuscle．Exp

えられている．mtoマウスのmyotoniaはdTcにより消失する事はなく，末梢神経障害も指摘されていないので，本当のmyotoniaと考えられている．
Mdxマウスに見られたelectricalmyotoniaは

−150−

in

passive membrane

Neuro162：539−554，1978．
5）HellerAH，EicherEMetal：Myotonia，aneWinherited「musclediseaseinmice．J Neurosci
2：924−933，1982．

27）「Immobilization」によるmdxマウス筋変性への影響−Localtetanus法による検討−
田

等＊

遽

研究協力着

水

野 美 彦＊＊
結目的mdxマウス及びドゥシャンヌ型筋ジストロフィ

果

1週後（図1），2週後個2）の各1例の不動ー（DMD）では筋膜におけるジストロフィン（Dy）
欠損が報告されているが，Dy欠損と筋変性との因果関係については未だ解明されていない．昭和60年度の本姓会議において中村ら1）は生後3週のmdxマウスの坐骨神経を切断し，排腹筋を経時的側，対照側の組織所見を示す．各例共程度の差はあれ，不動側において中心核線維・変性線経の出現が少なくなっている．特にSOLにおいてこのに組織学的に検討し，筋線経の変性が抑制されることを報告した．彼等はmdxマウスにおける筋変性には神経支配が存在し，かつ筋の自発的収縮が必要であると結論している．我々は神経切断の効果としての筋のimmobilization（不動化）に注
目し，脱神経を伴わない状況下での不動化による筋変性への影響を検討した．

処置群（p＜0．01）及び対照側（p＜0・05）と比較して有意に変性が抑制された．一万，2週目でも無処置群と不動側の間（p＜0．01），及び対照側と不動側の間（p＜0．05）で有意差を持って不動側で変性が抑制された．対照側では無処置群より変性度が強い傾向があり，特に1週目でこの傾向が大であった．不動側でも中心核線経は徐々に成長し対象・方法ており，不動化により再生は抑制されなかった．
EDLにおいては1週目，2週目とも有意な変性の生後3週のmdxマウス12匹を用い，その内8匹にtetanus toxinを従来の方法に従って右月井腹

傾向が著明である．表1に各筋の変性度の比率を示したが，1週目ではSOLにおいて不動側は無抑制は認められなかった．
表1中心核線維・変性線経の比率

筋に1回筋注した．4匹は無処置とした．Local
tetanus出現後1，2週後にtetanus群各4匹，及び無処置群各2匹を殺し，両側ヒラメ筋（SOL）
及び長址伸筋（EDL）を採取した．各筋について
横断面標本で中心核線維及び変性線経の合計数を計測し，全線維数に対する比率を求めた．又全標
本について中心核線維・変性線経を除く線経の平均直径を求め，無処置群，処置群の不動側，対照側の間で比較した．

日種較

S O L （劣）E m （ガ）

7

Ux
Cx
Tx

32 ．
6 ± 2 ．0 手
58 ．
5 ±2 0 ．3 ‡9．
3 ± 4 ．926 ．
9 ± 6 ．4
13 ．
9 ± 2 ．2
12 ．
8 ± 3 ．4

Ux
Cx
Tx

5 7 ．6 ± 10 ．4 ‡

14

26 ．
9 ±0 ．
741 ．
9 ±5 ．
2
2 9 ．7 ±4 ．
7

6 1 ．6 ± 5 ．8 手
2 8 ．8 ± 2 ．1

Ux：無処置群
Cx：処置群対照臥 Tx：処置群Tetanus聞＊東京都立神経病院＊＊東京都立神経病院神経小児掛

手pく0．01，‡pく0．05（Txに対して）ー151−

図11週目の処置群
A二Tetanus側SOL，B：対照側SOL，C：Tetanus側EDL，D：対照側EDL．HEx90−152−

図2 2週目の処置群
A：Tetanus側SOL，B：対照側SOL，C：Tetanus側EDL，D：対照側EDL，HEx90
−153−

E

E：Tetanus側SOL，F：対顔側EDL．ATPasepH4．6．×90
表2 平均直径
日

7

14

種穀

S OL （〝 ）E D L （〝）Ux

22 ．
0 ± 2 ．0
2 4 ．1 ± 2 ．9
25 ．
5 ± 3 ．2

20 ．0 ± 0 ．5

28 ．
7 ± 1 ．0
25 ．
4 ± 2 ．3
25 ．
0 ± 3 ．1

3 0 ．7 ± 0 ．2
2 3 ．9 ± 1 ．2
26 ．1 ± 1 ．4

Cx
T又
Ux
Cx

考
察
Tetanus toxinの1回筋注によって得られる
localtetanusでは，SOLは短縮位で，EDLは伸展位で保持される．これまでの成熟ラットでの実験ではこの状態は約4週間持続したが2），生後3週のmdxマウスでは1週間，長くても2週間しか持続しなかった．この差が何によるの別ま今後検討する予定である．

19 ．8 ± 2 ．1
21 ．8 ± 1 ．2

Ux：無処置群
Cx：処置群対腰側、Tx：処置群Tetanus棚Karpatiら3）はdystrophy hamsterに脱神経を施し，筋変性の抑制を報告している．その中で変性の抑制の機序については不明であるとしながらも，最も可能性のある説明として脱神経により筋の成熟が抑えられたことを挙げている．

一方，平均直径の比較では表2に示すように無処置群ではSOL，EDL共増加を示した．また処置群のEDLも若干の増加を示したが，・SOLでは不動側，対照側とも2過までの間では殆ど変化が認められず，両者の間でも殆ど差は認められなかった．

Karpatiらの実験区dystrophyhamsterにおけるものであったが，中村らは既に述べたように
mdxマウスにおいて脱神経を施行し，やはり筋変性の抑制を見ている．そして筋変性には通常の筋活動が必要であると述べている．脱神経の影響がどのように筋変性の抑制に関係しているかは複雑

Tx

−154−

な問題を含んでいるわけで，脱神経を伴わない
local tetanusにおける実験はその点で有意義と思われる．
今回の実験で分かったことは（1）mdxマウスの筋変性は筋の短縮位における持続的不動化によって有意に抑制されること，（2）伸展位における持続的不動化では有意な変性の抑制は見られないこと，（3）筋変性の抑制と筋線経の直径との間には相関はないこと，そして（4）処置群の対照側では無処置群に比べてむしろ変性が強い傾向にあったこと，などである．同じように不動状態にありながら短縮
位のSOLで変性の抑制がみられ，伸展位のEDL
で抑制が充分見られなかったことは，伸展刺激が変性の誘引と何か関連があることを示唆している．
即ちジストロフィンは筋膜の内側に存在していることが示唆されているわけであるが，短縮位で固定される場合は膜の構成物は緊密な状態になり，伸展位では逆に疎になることが予想される．膜の構成物が疎になれば膜の透過性が冗進し細胞外カルシウムが流入し，変性を引き起こす機序が考えられる．一方，SOLにおいて処置群の対照側が無処置群と比較して変性が強い傾向が見られたが，これは処置群ではtetanus側が歩行に際して使用できなくなるので，対照側に負荷がかかり変性が強くなったことが考えられる．従って筋活動そのものが変性を促しており，運動が激しいほど変性も強くなることが考えられた．
Karpatiらは筋の成熟の停止，言い替えれば筋線経の直径が増加しないことが変性の抑制と関係があることを示唆しているが，今回の実験に於て変性が抑制されたSOLにおいても筋線経の平均直径は対照側，無処置群と比べて変わりなく，1
週目ではむしろ若干増加している．従って筋線経の直径が増えないことは単に不動化に伴う廃用性萎縮の結果に過ぎないと考えられ，筋の成熟度と変性との間には関係は無いと思われた．
結語

生後3週のmdxマウスにlocaltetanusを適用
し，1，2週後に持続的短縮位にあるヒラメ筋において筋変性の有意な抑制を見た．持続的伸展位にある長址伸筋においては抑制は軽度で有意ではなかった．mdxマウスにおける筋変性は筋活動によって促進される可能性が示唆された．今回の実験は例数も期間も少ないので今後それらを増やして検討してゆく予定である．
文献1）中村晴臣，高田邦安，加藤信介，本田誠四郎：
mdxマウス骨格筋に対する神経切断の影響．
厚生省「神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症の臨床，病態と成因に関する研究 （杉田班）
昭和60年度班会議報告書，1986，pp39−43．
2）水野美彦，ChouSM，田連 等：Localtetanus
による実験的ミオパチ一に関する研究． 厚生省「神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症の臨
床，病態と成因に関する研究 （杉田］旺）昭和60
年度姓会議報告書，1986，pp57−62．
3）Karpati G，Carpenter S and Prescott S：
Prevention of skeletal muscle fiber necrosis−155−

inhamsterdystrophy．MuscleNerve5：369−
372，1982．

28）mdxマウスの筋再生能（2）マーカイン局注後の筋再生に及ぼす除神経の影響
中 村 晴 臣＊
研究協力者

高

田

邦

は じ め にmdxマウス（mdx）はDuchenne型筋ジストロ
フィー（DMD）同様，伴性劣性遺伝に基づく筋ジストロフィー症モデル動物であり，DMDと同じ
くdystrophinの欠損が示されて以来，積極的に検索されている．しかし，mdxでは筋線推再生が活発で臨床症状を殆ど示さず寿命もほぼ正常で，筋萎縮が進行し死に至るDMDと大きく相違している．mdxで筋の再生が活発な理由はまだ明らかでない．我々が従来行った実験により，mdxでは進行性筋萎縮をきたすdyマウスと異なり末梢神経に明らかな形態学的異常を認めないこと1），若い
mdxの坐骨神経を切断すると下腿筋は成長を止め同時に壊死がほぼ完全に阻止され，やがて神経再支配を受けると再び壊死・変性を示すこと2），更に局所麻酔剤マーカイン（塩酸ブビバカイン：
BPVC）で惹起した筋壊死とその後の筋線経の再生能について，mdxと対照動物との間に再生能自体の有意な差はないこと3）が明らかになった．
BPVCは血管や末梢神経に殆ど影響せず選択的に筋線推壊死をきたすところから，上記の実験は神経支配の保たれた状態の筋再生能を観察している．我々はmdxにおける正常な神経支配が進行性の筋線維壊死や筋萎縮を防ぐ要因である可能性を考え，本年はBPVC局注による筋壌死後の再生に神経支配の有無がいかなる影響を及ぼすかを検討した．
方法
実験には昨年同様生後35〜45週のmdxマウス＊鳥取大学医学部神経病理

安＊

高

瀬

靖＊

および同時期の対照マウスを用いた．この時期のmdxは，一度壊死に陥った後の再生筋が大部分を占めるので筋線経の性状が比較的均一であり，また若い動物に比べ，ヒラメ筋が太く薬液の漏出が少なく比較的一定の結果が得られやすい．ネンブ
タールで全身麻酔した後下腿の皮膚を切開し，両側ヒラメ筋を露出し，直視下に0．5％BPVCO．1
mlを注射し，十分筋が膨張するのを確認して，皮膚を縫合した．さらに左側については大腿後面皮膚を切開し，坐骨神経を約10mmにわたって切除した．注射後3日，7日，10日，14日後に屠殺し，
左右ヒラメ筋を採取後，カコジル酸緩衝液加2．5％
グルタール溶液で固定し，型のごとくエポキシ樹
脂包埋し，1〟切片・超薄切片をそれぞれ光顕・電顕で観察した．また，mdx・対照とも同量生食
水をヒラメ筋に注射し，同様に標本を作成したものを生食水注射の対照とした．動物数は各時点でmdx・対照各々3匹である．
結果

BPVC注射3日後にはmdx・対照とも筋線維
壊死と活発な筋貪食像，多数の活性化された筋衛星細胞が認められた（図1）．問質に多数の単球・マクロファージさらに線推芽細胞の浸潤を伴い，左ヒラメ筋ではさらに神経線経の変性像を伴っていたが，壊死，衛星細胞の量に，除神経の有無による差は認められなかった．7日後ではmdx・対照あるいは神経切除側・非切除側のいずれも，
myotubeおよび中心核をもつ多数の再生筋線経が形成され，なお一部には筋会食像も残存していた．また，この時点では4者のいずれも問質の細胞浸潤，膠原線経の増加が比較的目立った．再生−156−

経の直径を計測した結果を図4に示した．
考察
BPVCは血管や末梢神経に殆ど影響せずほぼ選択的な筋線維壊死をきたす．昨年度我々はmdx
および対照動物のヒラメ筋にBPVCを注射して筋壊死を惹起し，その後の筋再生について検討し

図1

mdxと対照との問で有意の差がないことを示し
た3）．
一方，神経支配が筋線経の発達に不可欠なことは言うまでもなく，以前の我々の除神経の実験でも，坐骨神経の切断直後から下腿筋（膵腹筋）はNADH−TRによるタイ70分化が失われ，非切断

BPVC注射3日後，mdx除神経側
筋線維壊死と活発な筋会食像，多数の活性化された筋衛星細胞を見る．エボン1／Jm−
トルイジン青．×248

側で認める急速な筋線経の直径増大も見られな
い2）．また，同時に除神経による筋の脱分化はmdxの筋変性に対し抑制的に作用し，筋線維壊死が抑制されることが示されたが，除神経が筋再生に関してどのような影響をあたえるかは従来余り検討されていない．
今回の実験の結果，筋の壊死変性と初期における筋衛星細胞の活性化に対して支配神経の有無は

図2 10日後，mdx除神経側問質に多数の線維芽細胞があり，膠原線経が増生．×4，340
筋線椎の直径分布はmdx・対照のいずれも除神経の有無による顕著な差はなかった．10日後には対
照動物の非神経切断側で問質の組織反応がわずかだったのに比べ，同じ動物の除神経側では問質の細胞浸潤や線維症が目立ち，mdxでは両側とも問質線維症が目立った（図2）．再生筋線経の直径分
布はmdx・対照とも除神経の有無でその平均値に大きな差はなく，mdxでやや直径のバラツキが大きかった．14日目ではmdx・対照の両者の除神経側で再生筋線経の直径の有意な減少が認められ，
とくにmdxでやや細かった（図3）．また，問質線維症は14日日ではmdx・とくにその除神経側ではかなり残存していたが，対照動物では7−10日と比べかなり減少傾向にあった．4着の再生筋線

殆ど影響がなく，mdx・対照ともmyotube，中心核線椎の形成にまで至った．直径増大も注射10，日目まで，非切断側とほぼ変わりないが，14日目では非切断側と比べ萎縮が明らかとなった．また，
この直径増減はmdx・対照がほぼ同様に推移していた．以上から，mdxにおいても筋の再生過程で神経支配の有無は直接影響しないが，引続く筋線
経の成熟に神経支配が必須であると思われた．また，同様の結果が対照動物でもあてはまるものと考えられる．
次に，BPVC注射後の筋再生過程では，当初mdx・対照動物とも除神経側で10日まで問質線維症が残存するが，14日目ではmdxでのみ線維症が明らかだった．
従来，mdxマウスでは筋再生が活発に行われ，DMDと違って問質線維症が殆ど起こらないとさ
れ4），さらに線推症が起こらないことが筋線維再生の盛んな所以との見解もある．しかし最近週齢の進むとともにmdxにおける筋の膠原線経の増加傾向は著しく，52週のmdxでは対照に比較し

−157−

図3

14日後，a：mdx除神経側，b：同非切断側，C：対照除神経側，d：同非切断側．
除神経側で再生筋線経の直径の減少．問質線維症はmdxで残存，対照では減少．
エボン1Jfm−トルイジン青．×150

2−3倍以上に増加しているとの報告がある5）．
我々の実験動物もかなりの老齢であり，元来の線維症に加えて，BPVCによる壊死で問質の組織反応が一時的に活発化したのかも知れない．除神経

m ⊂
0 A N
●

20

▲T

側で線維症がより明らかに見えるのは，単に筋線
経の直径増加の停止による見掛けだけの可能性も否定できないが，あるいは筋線経の直径増加の停止のため，mdxに特有の膠原線椎の過剰な反応がおこるという可能性も残り，今後検討が必要と思
われる．

駐車空
7

10

14d S

図4 各群再生筋線経の平均直径の推移

m＝mdx：C＝対照；N＝神経非切断側；T＝除神経側．Sは生食水注射の対凰

結語
マーカイン局注後の筋再生に対する支配神経の除去の影響を検討した．mdx・対照とも再生筋の−158−和60年度研究報告書，1986，pp39−43．

形成に至る10日後までは，有意の影響を与えなかった．また，14日後では除神経の影響による筋線

3）中村晴臣，高田邦安：mdxマウスの筋再生能マ

維萎縮が明らかとなった．問質線維症はmdxとーカイン局注による筋壊死と再生 厚生省「精くにその除神経側でより明らかであり，mdxの問神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症

質線維症は再生筋線雄の発育程度に影響される可及び関連疾患の病態とその病因に関する研究（杉田班）昭和63年度研究報告書，1989，pp223−

能性が示唆された．

226．

文

献

4）CullenMJandJarosE：Ultrastructureofthe

1）中村晴臣，田中順一，高田邦安：mdxマウスの坐骨神経所見 厚生省「神経疾患研究委託費」

skeletalmuscleintheXchromosome−1inked

筋ジストロフィーの臨嵐 病態と成因に関する

Duchenne musculardystrophy．Acta Neuro・研究 （杉田班）昭和59年度研究報告書，1985，

pathol（Berl）77：69−81，1988．

pp39−41．

dystrophic（mdx）mouse．comparisonwith5）Marsha11PA，WilliamsPEandGoldspinkG：2）中村晴臣，高田邦安，加藤信介，本田誠四郎：
mdxマウス骨格筋に対する神経切断の影響 厚

Accumulationofcollagenandalteredfiber−

生省「神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー

geneexpressioninthemdxdystrophicmouse・の臨床，病態と成因に関する研究 （杉田班）昭Muscle Nerve12：528−537，1989．

typeratiosasindicatorsofabnormalmuscle−159−

ⅤⅠ．培養・再生29）ヒト培養筋細胞の発達に対する筋収縮活動の影響

研究協力者

松

本

塚

越

春

秋＊

康＊

Ⅴ．Askanas＊＊

W．K．Engel＊＊

筋収縮活動は，筋細胞の発達に重要な役割を果たしていると考えられているが，ヒトの筋細胞の切片上にて，単位長さ当たりの核の数を算出した（／mm）．3）末梢核，中心核の割合：培養皿に対発達に及ぼす影響については未だ明らかではない．
また，筋疾患の病因，病態を理解する上で，筋収縮活動が筋細胞の発達に及ぼす影響を検討する事は重要と考えられる．そこで，我々は，ヒト培養

して垂直な面で切断して，3〝mの横断切片を作成し，メチレンブルー，アズールⅠⅠ染色施行後，末梢核，中心核の割合を算出した（％）．また，同筋細胞の発達に対する筋収縮活動の影響につき，形態学的に検討したので報告する．

じ切片上にて，筋線経の最大径，貴小径を算出した（〃m）．
結材料及び方法
4例の内因性筋疾患を有しないと考えられるヒトの生検筋より，既に報告した方法により，筋単独培養を行ない，それに，後根神経節をつけた13
日日妊娠ラット脊髄片を併置培養した1）．併置培
養後，平均10日前後で筋細胞は自発収縮を始める
が，その最初の収縮が見られた時点で，tetrO−
dotoxin（TTX）2／ Mを投与し，収縮活動を4週間ブロックした（実験A）．更に，4週間自発収縮させた後に，TTXを授与し，筋収縮活動を4週間ブロックした（実験B）．実験A，Bに於いて，上記の期間終了後，培養細胞は，通常のグルター
ルアルデヒド，オスミウムの二重固定後，電顕用に包埋した．包埋後，観察したい領域を，光学顕微鏡下にて選択し，直径3mm前後のドリルにて打ち抜き，ブロックに再包埋し，3JJm切片及び超薄切片を作成した．3JJm切片を作成後，実験A，Bに於いて，以下のparameterにつき；光学
顕微鏡下にて，定量した．1）横紋形成した筋細胞の割合：培養皿に対して平行な面で切断して，3J〃n切片を作成し，メチレンブルー∴アズール
ⅠⅠ染色施行後，横紋形成した筋細胞の割合を算出
した（％）．2）単位長さ当たりの核の数：上記の＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊USC NeLKOmuSCufar Center

果

実験A：筋単独培養では，eXplant後1週間で，遁走した筋芽細胞が融合し始め，筋管細胞を形成するが，脊髄片併置培養後，平均10日前後で，筋管細胞は自発収縮を始める．この時点では，すべての筋管細胞に於いて，横紋形成は認められなかった．自発収縮後，数日で，一部の筋管細胞に，横紋形成が認められ，その数は徐々に増加し，4週間後には，多数の横紋形成した筋管細胞が認められた（図1a）．また，多数の集合した筋線経が，eXplantした脊髄片の周辺に認められた．一方，TTXを投与した筋細胞では，自発収縮は完全にブロックされ，横紋形成した筋細胞は，ほとん
ど認められなかった（図1b）．また，多数の筋線経が集合する傾向も認められなかった．3JJm切片上での定量の結果は，表に示してある通りであるが，まとめると，4週間自発収縮させた筋細胞では（4WCM），4週間自発収縮をブロックした筋細胞（4WPM）に比し，横紋形成した筋細胞の割合は有意に増加し（p＜0．001），単位長さ当たりの核の数は，有意に減少し（p＜0．001），末梢核の割合は有意に増加していた．また，筋線経の最大径，最小径共，4WCMで，有意に減少していた（p＜0．001）．
実験B：4WCMでは，上記の結果の様に，ほぼ半数の筋細胞に横紋形成が認められるが，TTX−163−

図1 a 4週間自発収縮させた筋細胞の位相差顕微鏡写真：ほとんどすべての筋細胞に横紋形成が認められる．（×400）b4週間自発収縮をブロックした筋細胞の位相差顕微鏡写真：横紋形成は認められない．（×400）C4週間自発収縮させた筋細胞の3耳m切片：多数の横紋形成を認める．（×625）d4週間自発収縮をブロックした筋細胞の3耳m切片：横紋形成は認められず，多数の中心核を認める．（×625）を投与後，自発収縮は速やかに停止し，数日後には，一部の筋細胞で，横紋が消失し始め，1−2
週間後には，位相差顕微鏡下では，ほとんどの筋細胞にて，横紋は消失した．3JJm切片上での定量の結果では，表に示されているように，8週間自発収縮させた筋細胞（8WCM）では，4週間
自発収縮後，TTXを投与して4週間自発収縮をブロックした筋細胞に比し，横紋形成した筋細胞の割合は，有意に増加し（p＜0．001），単位長さ当たりの核の数は，有意に減少し（p＜0．001），末梢核の割合は，有意に増加していた（p＜0．001）．また，筋線経の最大径，最小径共，8WCMでは，有意に減少していた（p＜0．001）．これらの結果
は，筋収縮活動をブロックする事によって，一旦，形成された横紋が消失し，末梢に局在していた核が，再び，中心に遊走する事を示している．

ー164−

表
ヱⅩp E R エX E y でA L
Co n tr a e t ln 9

e R O 3 5 −6 でR ＝Å℡ ＝O y

MA

1 9 ．5（キ）±

E R O TL E y GT E

5 ．4

y ロC 工．
E ェ p E R○●0 0 1 ）3 ．3

（n ＝ 6 ）8 ＝ 6 2 ▲I

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m
n n

くp
く
く8 苫刈

4 ．8

土

4 9 ．3±tp
く 0 ●0 0 1
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9 1

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m

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5 2 ．0

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4 ．6

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く
（n ＝6 ）

D E 8 ェG y B
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0 ．3

5

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7

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0 ．2

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1 ．4（n ＝6 1

ヨ＝1 3 0 ）

土

n 好

1 ．4

（n ＝3 ）

き＝2 1 4 ）（pく
3 ●8 土 0 ．4
（n ＝6 ）
匝 此 柑 ＝1 3 2 ）0 ●0 0 1 ）1 5 ．6 土 1 ．3
t n ＝6 1（班 r a 三1 2 6 ）（p く
1 4 ●2 土 5 ●2
（五三3 ）（n X y き＝3 4 2 ）〇・〇叫 ）
8 3 ．3 ± 1 ●2
（n ＝3 〉（n 好 き＝2 0 2 ）e I−
E ＝ （篭）p o rl pb o rl 1

I）工M

1 ．7

n 貯

（n X F き＝ 3 0 6 ）

アェB E R（n ∬tp
く 0 ●0 0 1
tn ＝ 6 ）
1 8

0 ．6

±

E エアヱR ＝光三y T 1 も
e o n t r lC t ln 9（n X F B ＝ 4 2 1 ）（h X f S ＝ 1 3 7 ）ェn t e r n a 1
L O C A T ＝O y

D E 8 ェG H A
p l r l l y 電O dtp
く ○ ●0 0 1（p
く 0 ●ロ0 1 ）5 0 ．7 土 5 ．8
tn ＝ 3 ）8
3 土 1 ．4
（n ＝3 〉 5 ￣
5 ．8 ± 5 ．2
（n ＝3 ）
1 6 ●7 土 1 ●2
（ ＝＝3 1（n 貯 き＝ 3 0 6 ）（h K F 8 ＝2 1 4 〉
t n X r S ＝3 1 2 〉
ln 貯 5 ＝2 0 2 ）8 m 11 1 03 ttp
く 0 ●0 0 1 〉
6 ．0 ± 0 ．0 9
（n ＝3 〉
0 ．2 ± 0 ．2 2
t n ＝3 ）（血肝 3 ＝3
I
t n 好 き＝2 1 9 I

L a r9 0 5t

8 ．0

tp
く 0 ．0 0 1 ）5 ．8 土 0 ．1 3
（n ＝3 ）
7 ．2 土 0 ．1 9
（n ＝3 ）（n 貯 8 ＝2 3 3 ）n X f S ＝2 0 0 ）（u n ）（p

く 0 ．0 0 1 ）くn ＝ 3 1
1 3 ．6t n X 7 8 ＝3 6 6 〉

tnⅣ

CロLTURED EVXAy XロSCI−E pェBヱR87±

0 ．1 2m＝土

0 ．5 6（n ＝ 3 ）き三2 1 日HロX￡ER OF CpL℡ロRヱ8

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三

tp
く 0 ．0 0 1
8 ．0 ± 0 ．2 2
（n ＝3 ）
11（n X f S ≡2 3 3 ）m氾ER OF Xロ8CLE r王もER8

4

土

n 貯

0 ．4 0（n ＝3 〉

さ＝2 0 0 1

COロN℡ED

EXpER＝XEyTAL DESェGy1−5Y的151nnorYatOd mS．￠Ontr01−COntrlCtln9
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EXpER＝光三Ⅳ℡AI．DtほェGH3−

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Ye0kS and pafalyzod byで℡Ⅹfor tbo加Ⅹt4Y0013・

透過型電子顕微鏡による検討：4WCMでは，
myofibrilの形成が良好で，Z帯，A帯，Ⅰ帯，M帯の区別が明瞭に認められた（図2a）．横断切片
では，多数の末梢核が認められ，個々の筋線維内には，myOfibrilが，denseに詰まっている像が観1）横紋形成が良好である．2）核は，末梢に局在している．3）単位長さ当たりの核の数が少ない．4）筋線椎の直径が小さい．5）より多く■の筋線経が集合する傾向を持つ．
横紋形成に関しては，動物γ（ラット，鶏，蛙）察された（図2C）．一万，4WPMでは，myOfibrilの形成は，不良で，Z帯，A帯，Ⅰ帯，M帯の区別は，不明瞭であり，一部の筋細胞では，Z帯は完全に消失しており（図2b），また，一部では，変形したZ肴が認められ，いわゆるdensebodyの形
成が認められた．横断切片では，多数の中心核をの培養筋細胞を用いた検討でも、，種族により程度の差はあるが，横紋形成は，筋収縮活動に支配されている事が報告されている2），錮）．ヒトの筋細胞でも，これらの動物の筋細胞とほぼ同様の結果が得られたが，ヒトの場合は，他の種族（ラット，蛙）と比べて，筋収縮活動に支配されている度合

認め，個々の筋線経は，大小不同があり，筋線維内には，myOfibrilは，ほとんど認められなかった（図2d）．

が強いと思われる．また，鶏培養筋細胞の生化学的検討で，筋収縮活動により，myOSinの合成が促進され，筋収縮活動をブロックする事により，

考察
今回の我々の検討から，ヒトの筋細胞に於いて

myofibrillar proteinの変性が促進される事が報告されている5）．我々の検討でも，PMでは，myOfi−
brilの形成が不良である事から，ヒトの筋細胞には，横紋形成及び末梢核の発達は，筋収縮活動によって支配されている事が明らかになった．
我々の検討から，自発収縮させた筋細胞では（CM），収縮活動をブロックした筋細胞に比し（PM），次の様な特徴を持つ事が明らかとなった．

於いても，myOSinを含めたmyofibrillarproteinの合成は，筋収縮活動に支配されていると考えられる．
実験Bに於いて，筋収縮活動をブロックする事
により，一旦，形成された横紋が消失し，末梢に−165−

図2 通過型電子顕微鏡写真
a 4週間自発収縮させた筋細胞の縦断切片：Myofibri1の形成が良好である．（×3600）
b 4週間自発収縮をブロックした筋細胞の縦断切片：Myofibrilの形成が不良である．
（×3600）C4週間自発収縮させた筋細胞の横断切片：多数の末梢核を認める．（×3200）
d 4週間自発収縮をブロックした筋細胞の横断切片：多数の中心核を認める．（×3200）

局在した核が再び中心に遁走する事から，横紋及び末梢核の発達のみならず，維持にも筋収縮活動が必要であると考えられる．
従来，￣末梢核の発達に対する筋収縮活動の影響につき，二検討を加えた報告はない．今回の我々の検討で，末梢核の発達及び維持は，筋収縮活動に支配されている事が明らかとなった．一般に，動物の骨格筋では，desminを含めた中間大フィラメ
ントが，末梢核の支持組織としての役割を果たしていると考えられている6）．最近，マウスの培養筋細胞の検討で，TTXを投与した筋細胞では，des・min中間大フィラメントの分布，配列に乱れを生じる事が報告されており7），これらの事実は，ヒトの筋細胞に於いても，筋収縮活動をブロックする事により，desminを含めた細胞骨格蛋白の分布，配列に乱れを生じ，核が中心に局在する可能性が考えられる．一般に，筋疾患では，中心核が増えるが，これらの事実は，筋疾患の病態を考える上で，興味ある事実と思われる．
一般に，筋細胞の発達に於いて，primary
myotubesから分かれてsecondary myotubesが形成されていくと考えられており，このSeCOn−−166−

1983．

darymyotubesへの分化は，nerveLITluSClecontact

及び筋収縮活動により支配されセいると報告され4）KoenigJ，Oren M and Melone MAB：ている9）．我々の検討では，CMでは，PMに比Establislment ofneuromuscularcontdctsin

し，より多くの筋線経が集合する傾向がある事，

Cultures of rat embryonic cells：Effect of

単位長さ当たりの核の数が少ない事，及び筋線経

tetrodotoxinonmaturationofmusclefibersの直径が小さい事などが認められたが，これらのand formation and maintenance of acetyl−

事実は，筋線維数の増加を反映していると考えら

Cholinesteraseれる事から，ヒトの筋細胞に於いても，primary

Clusters．Dev Neurosci5：314−325，1982．

myotubesからsecondary myotubesへの分化，発達が，筋収縮活動により支配されている可能性

5）BandmanEandCemyLC：Myosintransition

が，考えられる．この点に関しては，今後，更にtheexpressionofneonatalmyosin．JCellBiol

詳■しく検討していく必要があると思われる．

lOl：45a

今後は，筋細胞の発達に対する筋収縮活動の影

and acetylcholine receptor

incellculture：muSCleactivityisrequiredfor6）TokuyasuKT，DuttonAH and Sin女er SJ：

響に関して，分子レベルでの機序を解明していく

Immunoelectron microscopic studies of必要があると思われる．

desminlocalization andintermediate fila．
ment organizationin Chicken skeletal

文

献muscle．J CellBio196：1727−1735，1983．

1）Kobayashi T，Askanas V and EngelWK：7）TassinAM，PaulinDandRiegerF：Unusual

Humanmuscleculturedinmonolayerandco−

Organizationofdesminintermddiate

fila＿

Cultured with fetalrat spinalcord：lmpor−mentsin muscular dysgenesis．and TTX−

tance of dorsalroot ganglia for achieving

treated

SuCCeSSfulinnervation．J Neurosci7：3131−

1988．

3141，1987．

myotubes．Dev

Bio1129：一37−47，8）DuxsonMJ，RossJJandHarrisAJ：Transfer2）AndersonMJandCohenMW：Nerveinduced

Of differentiated synaptic terminals fromand spontaneous redistribution of acetyl−

prlmary myOtubes to new−formed muscle

Cholinereceptorsonculturedmusclecells．J

Cells during embryonic developmentin the

Physiol（London）268：757−773，1977．

rat．NeurosciLett711：147−152，・1986．

3）Churuk HM and Holland PC：Effect of9）HarrisAJ：Transfer ofsyrtapticterminals

tetrodotoxin relaxation of cultured skeletalfrom primary to secondary myotubes．

muscle on the sarcoplasmic−reticulum Ca−

Muscle＆Nerve（Suppl）9：∴44f1986．

transportATPase．ExpCellRes144：143−157，−167−30）カルシトニン遺伝子問連ペプチドによる筋芽細胞の分化誘導
川 井 尚 臣事
研究協力者

佐

藤

幸

一＊

鳴

尾

隆

子＊

有

井

敬

治＊

瀬

部

俊

彦＊

斎

藤

史

郎＊

山

口

久

雄＊＊

は じ め にDNA当たりの値（mUCK／JLgDNA，ngMb／

我々は培養筋細胞を用いて筋細胞の成長，分化，および蛋白合成の促進因子について研究を行なっており，昨年度の本研究班会議ではCaイオノフ
ォア・（A23187）が筋細胞の分化を促進させることを報告したli．しかし，A23187は生理的物質でないので，本年度は人体において中枢神経や末梢神経

JLgDNA）を示した．対照としてはCGRP非添加
培養液により培養した細胞を用い，同様の検索を行なった．

に広く存在し，運動神経末端部ではアセチルコリン（Ach）と共に，Achによる筋収縮作用を増強す
るなど，筋細胞に対する作用が注目されているカ
ルシトニン遺伝子関連ペプチド（calcitoningene−related peptide：CGRP）2）について，筋細胞の分化に及ぼす作用を検討した．
対象と方法
培養細胞にラット筋芽細胞（L6）を用いた．培
養液は2％馬血清と6〟g／ml▼のインスリンを含むI）ulbeccos modified Eagle

S（DME）液を用いた．Zこれに最終濃度が1nM，10nM，100nMになるよう．・にCGRPを添加した3種類の培養液を作製し，細胞培養を行なった．すなわち，それぞれの培養液を入れた直径60mmのシャーレに
1×105個／dishの筋芽細胞を播種し，10日間培養した．この間2日毎に新しい培養液に交換し，培
養6日目，8日目，10日目に細胞の形態変化を観察すると共に細胞を採取し，DNA量3），クレアチ
ンキナーゼ（CK）活性値，ミオグロビン（Mb）
量を測定した．なお，CK活性値，Mb量としては＊徳島木学医学部第一内科＊＊徳島大学医学部第一生理成績

CGRP非添加培養系を用いた対照実験では，筋芽細胞は培養6日日頃より筋管細胞を形成し始め，10日削二は殆どの細胞が筋管細胞に分化し，これに伴いDNA当たりのCK活性値，Mb量は急速に増加した．CGRP添加培養系では，筋細胞は形
態的には対照群との問には明らかな違いは見られなかったが（図1），CGRPの濃度が1nM，10nM
群ではDNA当たりのMb量はいずれの培養日数でも対照群に比べ，濃度依存的に増加した．特にCGRPlOnM群の培養10E］昌では対照の3．4倍に増加した．しかし，CGRPの多い100nM群では，
どの培養日数でもCGRPlnMあるいは10nM群に比べてMb量の増加は少なかった（図2）．一方，CK活性値はCGRPのどの濃度の群，あるいはどの培養日数においても対照群との間に差は見られなかった（図3）．
考察

我々は筋芽細胞の培養系を用いて，細胞の形態的な分化や節固有蛋白の増加を指標として筋細胞の分化促進物質の発見に努めると共に，それらの物質の分化促進作用の機構について検討を加えてきた．本研究では，同じ培養系を用いてCGRPの筋細胞分化促進作用について検討し，このペプチドが，分化促進作用を有することを示唆する成績ー168−

図1A：CGRP非添加培養液中の培養10日目の筋細胞．×530
B二CGRP濃度が10nMの培養液中の培養10日目の筋細胞．×530を得た．CGRPは11番染色体の短腕のカルシトニ
ンと同じ遺伝子上にコードされ，組織特異的なス
プライシングを受けて生成される37個のアミノ酸よりなるペプチドである．神経系では脳内の各部
位，脊髄後角および運動神経に存在することが知られているが，鶏の培養骨格筋細胞ではアセチル
コリンレセプターの合成促進作用4）があるなど，筋に対する作用も注目されている．本研究では，
CGRPは10nMの濃度までは濃度依存的に細胞内Mb量を増加させ，100nMではこの増加がやや減少するとの成績を示した．Mb量が筋細胞内に増加することを筋細胞の分化の一つの指標とすると，
CGRPは筋細胞の分化促進作用を有すると考えられる．この作用機序としては，CGRPには細胞内カルシウム濃度を増加させる作用があるとされているので，まず細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こし，これによって筋細胞の分化を促進する
可能性が考えられる．カルシウムイオノフォアが同様に筋細胞内のMb合成を促進したことも，この考えを支持する成績である．しかし，CGRPには細胞中のCyClic−AMPを増加させてadenylate
cyclase活性を上昇させたり5），運動神経では，終末部でAchと共存し，Achの筋収縮作用を増強す
る作用6）など種々あり，筋細胞の分化促進はカルシウム以外の因子による可能性も残されている．
本研究ではCGRPは筋細胞内のMb量の増加を促進したが，筋細胞の形態にはCGRP非添加の対照筋細胞との間に明らかな違いは認められなかった．しかし，細胞形態の変化の有無についてはさらに詳細に検討する必要がある．一方，CK活性
値はCGRP非添加の対照群とCGRP添加群との間に明らかな差は認められなかったが，これはCGRPがMbの生合成のみを特異的に促進する特性を持つためか，またはCKが筋細胞の分化に際LMbより遅れて出現するためかも知れない．
以上の成績からCGRPは筋芽細胞に対して分化促進作用を示し，特に生化学的分化作用を有するものと考えられる．このことは，CGRPが生理−169−

mUCK／pgDNA
80

COntrOt⊂＝＝コ

CGRP lnH r∴∵・∵1
JJ lOnH E＝＝≡ヨ60〃 100nH 圏

40
20

一■捧戯帝
6日

0

培
図2

養

日

数

筋細胞内Mb量に対するCGRP添加の影響（平均値n＝3）

ngMb／〟gDNA

8 日

6 日

培

図3

養

日

数

筋細胞内CK活性値に対するCGRP添加の影響（平均値文

的に人体に存在する物質であることより筋細胞の分化や蛋白合成に神経終末部の神経ペプチドが関n＝2）
献与していることを示唆し，筋の蛋白合成制御機構

1）川井尚臣，佐藤幸一ほか：培養筋芽細胞の増殖，分化とリソゾーム酵素並びにミトコンドリア酵の解明や筋萎縮の治療法の開発に重要な知見と思素． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジ

われる．

ストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究M（杉田班）昭和63年度研究報告

おわ り に書，1989，p73．

CGRPは筋細胞の分化過程でMb合成促進作用を示すが，このことは筋細胞の蛋白合成や分化の制御に神経終末部のペプチドが関与していることを示唆し，興味深い知見である．
−170−2）AmaraSG，JonasVetal：AlternativeRNA
processlngin calcitonin

gene expression

generates mRNAs encoding different poly・
peptide products．Nature298：240，1982・

3）Erwin BG，Stoscheck CM et al：A rapid

culturesofchickembryomyotubes．Neurosci
Lett71：59，1986．

fluorometric method for the estimation of

DNAin culture cells．Anal BiochemllO：5）橋本和哉：運動神経終末で，Achと共有する遺伝子関連ペプチドの作用について．阪大医誌

291，1981．
4）Fontaine B，Klarsteld A et al：Calcitonin
generrelated peptide，a peptide presentinSpinal cord motoneurons，inCreases the40二293，1988．

6）遠山正弥：神経ペプチドの生理的意義をめぐって共有rCGRPを中心として．自律神経 23：
197，1986．

numberofacetylcholinereceptorsinprimary−171−31）損傷筋組織におけるトランス7ェリンについて
高

瀬

研究協力者

貞 夫＊

小 林 和 夫＊（2）筋損傷ラットにおける各種臓器抽出液の作は じ め に

我々は筋損傷時の筋芽細胞を増殖させる因子（MPF：分子量96kの蛋白質）の存在について報告してきた1）．しかし筋芽細胞を増殖させる既知の物質の中で，トランスフェリン（Tf）は分子量が80kで，熟に不安定でありMPFと類似していた．Tfは球形の糖蛋白質で，同じ大きさのNドメ
インとCドメインからなり，1分子に2個のFe3十を結合する鉄の供与体としての機能を持つが，近年鉄の供与と関係しない細胞増殖因子としての可能性も指摘されている2），3）．Tfは多くの培養細胞の成長に必須のものであり，種々の培養細胞の増殖を促進することが明らかにされてきた4）．特にニワトリの筋芽細胞の増殖促進因子として良く知られている5）．しかし筋損傷時の筋再生にTfが関製

ラット前脛骨筋に約5mmの切断損傷を5〜6回加えた後，12時間後に損傷筋及び種々の臓
器（筋，肝，腎，心，脳，血染，血球，肺）を採取し，PBSを加え25％抽出液を63年度本姓会議報告と同様の方法で作製した6）．対照として非損傷筋ラット（皮膚だけ切開し筋を損傷しないもの）の各種臓器を用いた．
（3）臓器抽出i夜による筋芽細胞増殖の測定
ラット筋芽細胞L6を15mm径シャーレに5−7×104個培養した．培養液は63年度本姓会議に報告したと同様の方法で行なった6）．24時間後臓器抽出液（3％）を含む培養液と取り替え3日間わっているかについては不明である．そこで我々はラットの損傷筋においてTfは増殖促進因子として作用しているか，又Tfは筋芽細胞の増殖の引金になりうるかについての検索を行なった．

培養した．トリプシンにて細胞浮遊液を作製し，血球計算盤にて細胞数を算出した．各値は3検体の平均をもって表わした．
（4）臓器抽出液中のTfの測定
損傷筋ラットにおける各種臓器抽出液のTf量

材料・方法（1）損傷筋組織における杭Tf抗体による組織学的検索をロケット免疫電気泳動法にて測定した．トリス
緩衝液（pH8．6，〟＝0．025）による1％アガロー
スにウサギで免疫した抗ラットTf抗体を添加（0．7％）してアガロースゲルを作製した．ゲルのウイスター系雄ラット250gの前脛骨筋に，液体窒素で冷却した7gの鉄棒（径7mm）を15秒間押し当てて凍結損傷を作製した．経時的に損傷筋を採取し（3，15分，1，2，3，6，12時間，
1，2，3，5，7，10日後），採取筋の凍結標本にHE染色，methylgreenpyronine染色及び抗ラット抗体による免疫染色（ABC染色）を行ない光顕的に観察した．

試料穴に7ノJlの抽出液及び既知濃度のTfを入れ100V，150分間泳動した．ゲル乾燥後Coomassie
Blueで染色し，泳動距敵を測定することによりTfの量を算定した（図1）．
（5）抗Tf抗体を加えた損傷筋抽出液による筋芽細胞増殖の測定
ラット前脛骨筋に切断損傷を加え，12時間後の損傷筋抽出液を作製した．培養筋芽細胞L6の培養液に抽出液（2．45％），及び種々の濃度の抗ラッ＊東北大学医学部神経内科

トTf抗体（0，5，12．5，25／Jl／ml）を加え培養した．3日後トリプシン処理による細胞浮遊液よ−172−

図1 ロケット免疫電気泳動法によるTfの測走り筋芽細胞数（cells xlO4／dish）を算出した．
（6）Tf添加による培養筋芽細胞増殖の測定
ラット筋芽細胞L6の培養液中に，種々の濃度（0，6．25，12．5，25，50，100JLg／ml）のFe飽和
ラットTfを加えて培養した．3日後にトリプシン処理後，培養細胞数を算出した．
結果（1）損傷筋組織におけるTfの局在
凍結損傷筋における筋再生は，損傷12時間後に損傷部と非損傷部の境界域に筋芽細胞が出現して始まり，損傷3〜4日で最も増加する．Tfは損傷
6時間後よりやはり境界域に出現し，主に壊死線
経の胞体内にみられ，問質にも認められる（図2）．12時間後にてTfは貴大となり，その後減少

⁝

毒■L一

什

8■一i一−■l零已−I電lE▲した（図3）．損傷5日巨＝こmyotubeが形成されるがTfはmyotube内にみられず，おもに問質に軽度みられた．
（2）筋損傷ラットにおける各種臓器抽出享夜の筋芽細胞増殖性とTfの相関性（図4）

図2 凍結損傷筋（損傷12時間後）におけるTfの分布（酵素抗体法）
A：損傷部（Ⅰ）と非損傷部（N）の境界
域に帯状のTfを認める（×16），B：境界
域ではTfは主に填死線維内に認められるが問質にも分布する（×50）

Tf量は血環にて最も高く（3．95±0．63mg／ml），脳では最も低かった（0・10±0・軍2）．筋では非損傷筋より損傷筋に高かった（P＜0．05）．筋芽
細胞増殖性については，損傷筋に最・も強く（30．83±0．62cellsXlO4／dish），脳でも高値であった（24．25±3．54）．血葦ではTf値が高いにもかかわらず筋芽細胞増殖性は12．26±0．75にとどまり，Tfと筋芽細胞の増殖性に必ずしも相関性はみられなかった．
−173−

1

2

3

4

5

8

7

8

叫
愴l●■代■叫l∫Y

図3

損傷筋組織におけるTf及び筋芽細胞増殖の経時的変化02
0■1−

言．OlX︶ S■凸︑S一一︼U人 U

2

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S●凸︑▼一〇l HSJ一uU

0

10

20

30
ml〔l／mt

TR▲札SFERIllN∧HT180DY

図5

抗Tf抗体を加えた損傷筋抽出液のTf及び筋芽細胞増芦直性

50

S●凸︑寸一〇l X S一﹂︼U

0

20

−10

60

80

100

120

mic．g／mI

muSCIeljve「kidney hea「L b「ain plaSma blood tUng

図4 筋損傷ラットにおける各種臓器抽出液の筋芽細胞増殖性とTf

図6 Tf添加による培養筋芽細胞の増殖（3）抗Tf抗体を加えた損傷筋抽出液の筋芽細胞増殖性
抗Tf抗体の添加量に比例して，培養中のTfの量が減少した．筋芽細胞の増殖も抗Tf抗体の添加量に比例して抑制された（図5）．
（4）Tf添加による培養筋芽細胞の増殖
培養液に種々の濃度のTfを添加しても筋芽細胞の増殖に有意の変化を認めなかった（図6）．
考遅れて損傷3日後に最大となり，損傷部と非損傷部の境界域より再生が始まることがわかった8）．
今回損傷筋組織のTfの分布を免疫組織学的に検索した結果，Tfの出現は損傷12時間後に最大となり，その時間経過はMPFの経過とほぼ一致してみられた．又Tfの出現部位は筋再生の場である
境界域の壊死線維内及び問質に認められた．これ
らの事よりTfは早期の筋再生過程に関連した物
質であることが示唆された．
抗Tf抗体を加えた損傷筋抽出液による筋芽細察

筋損傷後の再生過程における我々のこれまでの研究では，損傷筋組織には筋芽細胞増殖因子（MPF）が存在し，MPFは損傷12時間後にピークを持って出現する7）．筋芽細胞の増殖はそれより胞増殖を検討した場合でも，抗Tf抗体により筋芽細胞の増殖が抑制され，Tfは筋芽細胞の増殖に関連した因子であることがわかった．
しかし筋損傷ラットの各種臓器抽出液の筋芽細−174−

胞増殖性とTf量を検討した場合では，両者に明らかな相関はみられなかった．特にTf量は血菜
が損傷筋より約2倍も多かったが，筋芽細月包増殖
性はむしろ損傷筋抽出液がより高かった．つまり損傷筋抽出液による筋芽細胞増殖作用は，Tfのみによるとすると矛盾する結果であった．
又Tfの添加による培養筋芽細胞増殖性を検討した場合，Tfの添加のみでは筋芽細胞の増殖はみられなかった．Bischoffも種々の哺乳動物（ラット，ウシ，ヒト）の鉄飽和Tfを培養液に加え，ラット筋衛星細胞の活性について検討したが，いずれのTfにても活性化させることはできなかったと報告している9）．以上の結果をまとめるとTfは認めた．2）損傷筋抽出液の培養筋芽細胞増殖性は，抗Tf抗体の添加により抑制された．3）損傷筋ラットの各種臓器抽出液のTf量と筋芽細胞増殖性の関連性はみられない．4）Tf添加のみでは
培養筋芽細胞の増殖はみられない．
以上より，Tfは筋損傷後の初期再生過程に関連した因子であるが，Tfだけではラット筋芽細胞増殖の引金にはならないことがわかった．従って
MPFはTfに類似するがTfとは異なる物質と考えられた．
文献1）小林和夫，高瀬貞夫ほか：実験的再生筋における筋芽細胞増殖因子の研究．臨床神経 27：

筋損傷後の再生過程の一因子と考えられるが，Tf
だけでは筋芽細胞増殖の引金にはならないと考えられた．

1602，1987．

2）Goubin G，Goldman DS et al：Molecular

ではTfに類似していて筋芽細胞を増殖に導く物質はどのようなものであろうか．このことにつClonlng andnucleotidesequence of a trans−

いて最近興味ある二つの報告がある．Brownらは
ヒト黒色塵に特異的に存在する膜抗原蛋白P97を発見した．P97は分子量は97Kで鉄を結合する性

ChickenB−CelllymphomaDNA．Nature302：

formlng gene detected by transfection of

114−119，1983．
3）TormeyDC，Imurie RCetal：Identification

質をもち，TfのN末端とホモロジーがあり，P97
に対する抗体はTfと交叉反応することが確かめられた10）．又GoubinらはニワトリのB cell

Of transferrin as alymphocyte growth

lymphomaのDNAをNIH3h3マウス細胞にト4）BameS D and Sato G：Serum−free cell

ランス7ェクトした後，癌遺伝子ChBlym−1を検出した．そのChBlym−1の塩基配列より予想される蛋白質はTfのNドメイン，CドメインのCulture：aunifyingapproach．Cel122：649−

promoterinhuman serum．Expel Cell Res
74：163−169，1972．

655，1980．

5）IiI，KimuraIetal：AMyotrophicprotein

N末端側によく類似していることを報告した2）．
これらのTf類似の蛋白は，腫瘍細胞の膜蛋白や癌遺伝子蛋白であり細胞の増殖因子である可能性を示唆している．又細胞膜のTf受容体は成長

fromchickembryoextract：Itspurification，identity to transferrin，andindispensability
foravianmyogenesis．DevBio194：366−377，
1982．

の盛んな細胞や，癌細胞に高密度で存在し，細胞増殖の表面マーカーとも言われている．分子生物
学のめざましい進展とともに今後もおそらく増殖

6）高瀬貞夫，小林和夫：脱神経による筋芽細胞増と関連したTf類似の蛋白がさらに明らかにされるであろうし，MPFもこれらに属するグループの増殖因子なのかも知れない．

態とその病因に関する研究 （杉田班）昭和63年

殖因子への影響， 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病度研究報告書，1989，p95．
7）高瀬貞夫，小林和夫ほか：実験的再生筋における筋芽細胞増殖促進因子について， 厚生省「神まと経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症の臨床，

め1）筋損傷早期より損傷筋組織にTfの増加を−175−

病態と成因に関する研究 （杉田姓）昭和60年度

研究報告書，1986，p151．

crushedadultmuscle．DevBioll15：140−147，

8）高瀬貞夫，小林和夫ほか：凍結損傷による筋病

1986．

変の組織学的研究， 厚生省「精神・神経疾患研

10）Brown PJ，Hewick RM et al：Human究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患のmelanoma−aSSOCiatedantigenp97isstructu・

病態とその病因に関する研究 （杉田珪）昭和62

rallyandfunctionallyrelatedtotransferrin・

年度研究報告書，1988，p279．

Nature296：171−173，1982．

9）Bischoff R：A satellite cellmitogen fromー176−32）ジストロフィー筋への正常マイオブラストの注射に問する研究
寺 尾 寿 夫＊
＊

子生

恭良

■

＊

十

下里

岡五

■

一＊＊＊

は じ め に

貴近，Lawl），Partridge2），Karpati3）らは，正常のmyoblastをジストロフィー動物の筋に注射することにより，ジストロフィー筋の性質を正常化することを試みている．
われわれも正常のmyoblastのジストロフィー
筋への注射を行って，その変化につき研究しているが，本報告は現在までの結果をまとめたもので
ある．
方

＊

喜

■

畑

司治

永 井 由紀子＊荒洋哲

高 津 成 美＊

藤中

加弘

研究協力者

法

1）myoblastの採取および培養正常のmyoblastはC57BL／10ScSn（以下B−10と略す）の生後1−4日目の幼君マウスの下肢筋を取り出し，血管，神経，筋膜，腱などを取りて行い，1本のEDLにつき，注射する細胞数は
3×106前後とした．
なお注射は桂皮的に行う他，皮膚を切開し，直接筋を見ながら注射し，注射後皮膚を縫合する方法もとった．
3）組織学的・電気生理学的研究
注射後，種々の時間後取り出し，組織学的に検討し，また抗ジストロフィン抗体を用いて免疫組
織化学的に観察した．
なお，myOblast注射後2か月のEDLにつき電気生理学的に収縮特性の変化を調べたが，この際には刺激はin vivoで行い，tWitch tensionの測
定には0・2m secのSupramaXimal square puls
を，またtetanictensionには100Hz，31回の刺激を使用して測定した．

除いた後にtrypsin処理し，炉過後collagencoat−
ingdishに移し，培養を行って得たものである．
なお使用したmediumはDulbecco，s modified

4）CyclosporinAの投与
一部のマウスには拒絶反応を抑制するため，
CyClosporinA（CyA）を使用して実験を行った．

Eaglemedium（66％）にmedium199（23％）とFBS（10％）を加えたものである．

この場合にはCy Aをmdxマウスの体重1kg当り50mgの割合にオリーブ油を溶かして，30日間培養の終ったprecursor cellはtrypsinを用いて再び集め，遠心後適量のmediumを加えて5×連続経口投与した．Myoblastの注射は経口投与開始の翌日行い，Cy Aの経口投与終了後2週〜1か月後に，SaCrificeして検討した．

107／mlになるようにし，筋に注射した．
2）注射法

Hostは生後2か月のmdxマウスでターゲッ
トとした筋は主として長指伸筋（EDL），一部は大腿四頭筋を用いた．注射は筋の数か所に分割し結果
図1は正常myoblast注射後2か月のmdxのEDLに見られた再生部位のH−E染色を示してい＊帝京大学医学部第一内科＊＊帝京大学医学部薬理＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所

る．中心核を有するmdxの筋線経に囲まれて，やや細い再生筋線椎がみられる．これらの再生筋は注射による機械的損傷後活性化されたmdx由来−177−

図1正常myoblast注射後2か月のmdxのEDL（H−E染色）のmyoblastや，注射されたB−10のmyoblastから形成されたものと思われる．

思われる細胞浸潤がみられる．図5はその1例を示している．但し，このような組織像はmedium

このような再生筋線経を抗ジストロフィン抗体

のみ注射したEDLまたは単に生食のみを注射しを用いてimmunostainingを行ったのか図2であた場合にも見られることがあり，真の拒絶反応とる．一部に抗ジストロフィン抗体で染色される線の鑑別はH−E染色のみでは必ずしも容易ではな経がみられる．これらのジストロフィン陽性の筋線維群は注射時の筋損傷後の再生時に，B−10の

上述の如く，B−10のmyoblast注射後のジスト

myoblastがとり込まれ，mOSaic線経を形成した

ロフィン陽性の線経は数本の線推群としてしか現か，またはB−10のmyoblast同志から生ずる

れないが，その理由としては，1）注射された

myotube由来の筋線経のいずれかであると考えられる．

PreCurSOr Cellは僅かしか移動しないこと，2）

図3も同様なジストロフィー陽性の線維群を示にとどまらず，流出してしまうものが多いこと，すが，よく見ると筋線維膜は一様に染色されず，

Karpati3）らが指摘しているように，注射時筋肉中
3）拒絶反応が起こることなどが考えられる．

膜の一部のみが染色されたり，全周が染色されてそこでわれわれは拒絶反応を抑制するため，も著しく不均一だったりする線経があるのがわか

CyClosporinAを使用して実験を行った．CyAのる．

投与法は方法の項で述べた通りであるが，Cy A

図4は縦切りの陽性線経を示すが，ジストロフ

使用下に正常myoblastの注射を行ったmdxのィンは非常に長い範囲に亘って証明される．

EDLの抗ジストロフィン抗体による染色でも，ジKarpati3）によると，陽性線椎の部分は90〜800jLmに達するというが，われわれの所見もこれと一致

ストロフィン陽性の線推数が増加したという所見は得られなかった．

していた．

一方，拒絶反応とみられる細胞浸潤について

なおmyoblast注射後には，一部に拒絶反応と

Cy A投与群と非投与群を比較すると，投与群で

−178−

図2

正常myoblast注射後2か月のmdxのEDLの抗ジストロフィン抗体による
immunostaining

図3

正常myoblast注射後2か月のmdxのEDLの抗ジストロフィン抗体による
immunostainmg

−1791

図4

正常myoblast注射後2か月のmdxのEDLの抗ジストロフィン抗体による
immunostaining（縦切り）

図5

正常myoblast注射後2か月のmdxのEDLにみられた細胞浸潤一180−

減少がみられたが，Cy A投与例でも細胞浸潤はのhostのSatellitecellとfuseしてmosaicfiber

10匹中3匹にみられた．そのためCyAの投与量，が形成され，ジストロフィーの発現が抑制される

投与期間などにつき検討中である．

場合である．第2は正常のdonorのmyoblast同
志がfu畠eして正常の筋管捌包が作られ，これから生ずる正常の筋線経が作られることである．
事実彼はmdxのSOleusに正常のmyoblastを注射し，6か月後に筋の重量が増加し，tetanic
tensionも増すことを示している1）．しかしわれわ
れの注射後2か月日のEDLの結果はtwitchおよびtetanic tensionともに増加がみられなかっ

次にわれわれは，正常myoblastを注射した
mdxのEDLの収縮力に変化がみられるか否かについて電気生理学的な測定を行った．10匹のmdxの一側のEDLに正常のmyoblastを2〜3×106
注射し，他側のEDLには同量のmediumを注射して，2か月後に収縮特性を比較した．これらのmdxには全例CyAを50mg／kg，30日間経口授与した．
その結果myoblast注射EDLの単位断面積当りのtwitch tensionは46．5±10．0（対照55．9±
21．7），同じくtetanictensionは92．5±29．4（対照114．7±61．7）で，対照との間に有意な差はみられなかった．
なお，これについてはmyoblast注射後の経過を追って検討中である．
考た．これが実験に使用した筋の差によるのか，注
射後の時間の差によるのか，他の原因によるのかは明らかでない．
Karpatiら3）によれば，ヒトのmyoblastを
Lmdxのquadricepsに1b6程度注射した場合，ジス
トロフィン陽性の線椎は全体の4−7％しかみられないという．したがってこれを増すためにはさらに多くのmyoblastを注射する技術的な問題の解決が必要である．

案

正常myoblastのジストロフィー筋への注射は
Lawら1）により始められ，その後Partridge2），
Karpati3）らにより研究されている．元来ヒトの骨格筋はHLAのClassl抗原を欠き4），動物の骨格筋もH2抗原を持たないことが知られている5）ので，移植後の拒絶反応は弱いと考えられるが，myoblast注射に際しては拒絶反応が起こってくることは確かなようである．そのためPartridge
らはmdxマウスをヌード化したdouble mutantのマウスをhostとして用い，Karpatiらはヒトのmyoblastをクローン化して注射している．またLawらもC57BL／6Jのimmunocompatibleな
hostとdonorを使用したり，Cy Aを用いたり6）している．
われわれはcyclosporinAを使用したが，拒絶結語1）B−10マウスの下肢筋のmyoblastを培養し，これを生後2か月日のmdxマウスのEDL等に
3×106個注射した．
2）注射後2か月日に筋を取り出して観察すると注射部位に再生筋線経が多数みられ，これを抗ジストロフィン抗体を用いて免疫組織化学的に染色するとジストロフィン陽性線経の数本の束が出現していた．
3）myoblast注射後の筋肉中の拒絶反応を抑制するため，hostにCyAを50mg／kg，30日間に亘り毎日経口投与したが，細胞浸潤を完全に抑制することはできなかった．またジストロフィン陽性の線椎の増加もみられなかった．

反応の抑制や収縮力の改善には不充分であり，なお検討が必要と思われる．

4）mdxのEDLに正常myoblastを注射し，2か月日に電気生理学的に調べた．しかし，対照のEDLに比し，単位断面積当りのtwitch tension，Lawら1）によれば，ジストロフィー筋に正常

tetanictension，COntraCtiontime，half−relaxa−

myoblastを注射した場合，再生筋の出現が筋力のtiontimeは有意の変化がみられなかった．

回復に役立ったのは2つの場合が考えられる．第1は正常のdonorのmyoblastがジストロフィー
−181−

文

RoseML：IncreasedexpressionofHLAABC

献1）Law PK，Goodwin TG and Wang MG：

classlantigensbymusclefibersinDuchenne

Normalmyoblastinjectionsprovidegenetic

muscular dystrophy，inflammatory myo−treatmentformurinedystrophy．Muscleand

pathy，and other neuromuscular disorders・LanCetl：361−363，1985．

Nervell：525−533，1988．
2）Partridge TA，MorganJE，Coulton GR，

5）PonderBAJ，Wilkinson MM，Wood M and

HoffmanEPandKunkelLM：Conversionof

WestwoodJH：Immunohistochemical dem−

mdxmyofibersfromdystrophin−negativeto

onstration of H2antigensin mouse tissue−pOSitivebyinjectionofnormalmyoblasts・

sections．J Histochem Cytochem31：911−

Nature，337：176，179，1989．

919，1983．

3）KarpatiG，PouliotY，Zubrzycka，GaarnEet

6）Law PK，Goodwin TG，and

Li

H−J：

Histoincompatible myoblastin5ection

al：Dystrophinisexpressedinmdxskeletal
muscle fibers after nやrmal myoblastim・

improves muscle structure and function ofplantation．AmJPath135：27，32，1989・

dystrophicmice．TransplantProc20：1114￣

1119，1988．

4）Appleyard ST，DunnMJ，Dubowitz V and−182−

ⅤⅠⅠ．ミトコンドリア（1）33）ヒトミトコンドリアDNA・Dループ

領域の塩基配列の解析
宝

研究協力者

来

早 坂 謙

聴＊

二＊

村

山

久美子＊

制限酵素切断型多型による分析で，ヒト
mtDNAは，顕著な人種特異性を示す事が知られている．我々は，95人のヒトの胎盤から得た対象および方法
mtDNAは，3大人種よりなる95人の胎盤から得た．内訳は制限酵素による解析で異なったタイ

mtDNAのnon−COding領域の塩基配列を決定した．これらの配列は，Dループ領域を形成しているほとんどの領域を含む少なくとも482塩基対でプを示す61人の日本人，日本人以外のモンゴロイ
ド10人（朝鮮人3人，中国人4人，インドネシア人，フィリピン人，パプアニューギニア人各1人），コーカソイド17人，異なる7つの地域出身のアフリカ人7人である．胎盤よりmtDNAを分牡ある．既に決定されている6個体の配列と合わせた比較分析の結果，数多くの塩基置換・挿入・欠矢という注目すべき特徴が観察された．配列間の塩基置換数の平均値は1．45％と算出され，この値はmtDNAのゲノム全体を対象とした制限酵素

精製し，KpnI，SacIの2重消化を行い，nOn−
COding領域（Dルーフ0），約500塩基対を，pBlue−
SCriptにクローニングし，タイデオキン法によっによる解析から得られた値よりも3−4倍高い．
さらに，高頻度に変化しやすい部位も同定された．
この14塩基対の部分では，17種類の異なる配列が同定された．また，塩基置換の97％以上がトランジッション型によるものであった．また，塩基置
換・挿入・欠夫の部位の分布には偏りが観察されて塩基配列を決定した2）．KpnIサイトは，nOn−
COding領域では，1あるいは2サイトをもつ個体がありKpnIおよびSacI消化により得た563塩基対あるいは482塩基対の断片の配列を決定した．

た．系統解析では，コーカソイド間，モンゴロイ
ド問での相違よりも，ネグロイド間での相違の方が大きいことが明らかになった．事実，ネグロイ
ドの一部は系統樹においては最初に分岐している．
系統樹による解析できわだった知見は，モンゴロ
イドが異なった2つのグループに分けられること

結果
すでにこの領域の配列が決定されている6個体の配列を含めて計101個体の配列を比較したとこである．モンゴロイドの一部の分岐は，ネグロイ
ドの一部の最初の分岐に続いて起こっている．残りのモンゴロイドはその後コーカソイドと共に分岐している．このことは，制限酵素による解析か
ら日本人のなかには2つの異なったグループが存在することを示した我々の以前の研究を確証するものであった1）．
＊国立遺伝学研究所

ろ，563塩基のうち113の部位で多型性を示した（図1）．この図では，Anderson．らにより、報告されたnoncoding領域のL鎖の塩基配列を示してある3）．KpnIサイト1とSacIサイトは，すべての個体でみられたが，KpnIサイト2は多型性を示した．そのため，各個体において563塩基対ある
いは482塩基対のクローニングと配列決定を行い，100個体の配列についてAndersonによる配列と比較した．図1では，少なくとも一個体で観察された塩基置換・挿入・欠矢をAndersonらの配列の下に示してある．合計113サイトで，変異．が観察され 4つのサイトでは2種類の異なる塩基置換かー185−Kpn1−1

GmCCACCC AAGTAmAC TCACCCATCA ACAACCGCTA TmCGT ACATrACTGC
I
bp16048

C

CCC

Kpm1−2CAGCCACCAT GAJuATTGTA CGGTACCATA AATACTrGAC CACCTGTAGT ACATAん1AAC
T
A
A
T
C
C
A
T
T
G
GGG
T

ccAATCCACA
TCT

TCAAAA一一…CCCC
T

CTCCCCATGC−一ccCCTTTT

I

AC

G

TTACAAGCAA
Tr

A

C

GTACAGCAAT
GAT

I

C

CAACCCTCAA
T

CmC

G

G

CTATCACACA TCAACTGCAA CTCCAAAGCC A−CCCCTCACC CACrAGGATA CCAACAAACCGCAGT GTC C G G A C TT CT T G A T G G TTA

TACCCACCCT TAACAGTACA TAGTACATAA AGCCAmAC CGTACATAGC ACATTACAGT
TT GmC C CC G C TAT CC T G TCCAAATCCCTr CTCGTCCCCA TGGATGACCC CCCTCAGATA GGGGTCCCTT GACCACCATC
T
TC
TAC
C
A
T
G

CTCCGTGAAA TCAATATCCC GCACAAGAGT GCTACTCTCC TCGCTCCGGG CCCATAACACCTCGTTGGGGGTAG CTん1AGTGAA CrGTATCCGA CATCTGGTrC CTACTrCAGG GTCATAAAGCAGCCrAAATAGCC CACACGTrCC CmAJuTAA GACATCACGA TGGATCACAG GTCTATCACC
G

A

SaeI
CTATTAACCA CTCACGGGAG CTC
†

bp

36

図1Nucleotide sequences ofthe major noncodingregiOnThesequencereportedbyAndersonetal（1981）isshownintheupperlineswiththebase numbers．Mutations observed atleastin oneindividualare shownin thelower
lines．−，sstandfordeletions／insertionsandlettersrepresentbasesubstitutions．Cloning
sites（SacI and KpnILl or Kpnト2）are alsoindicated by bold faceletters．A
hypervariable domainisboxed・観察されたこ また，塩基置換はこの領域の配列の3′側よりも5′側に，より高頻度に観察された．これ
ら多型部位のうち，塩基置換によるものが106部位であった．また一塩基の欠失・挿入の起きている部位が7カ所で観察された．観察された配列変異
をパターンの違いに従って分類したものを表1に示した．∴全てのデータからの分類では，トランジッション型による変異の方がトランスヴァージョン型によるものよりも圧倒的に顕著であった．すなわち97％はトランジッション型であり，トラン
スヴァージョン型はわずかミ％であった・さらに，
どリミジン塩基間（T−C間）でのトランジッショ

ンはプリン塩基間（A−G間）より高頻度に起こっていた．各サイトにおける塩基置換数を数えたところ，なおトランスヴァージョンより10倍多くト
ランジッションが観察された．本研究では，すでに報告されているmtDNAのnoncoding領域でのいくつかの配列の特徴を確認すると共に4）・5），2
箇所で塩基Aの欠夫を，5箇所で塩基Cの挿入を観察した．これらの挿入・欠矢は，AあるいはCが連続的に繰り返されている特殊な領域で見つかっている．また，多型部位の分布を調べたところ，
non−COding領城中においてもかなりの偏りが観察された（図2）．ヒストグラムは連続する20塩基−186−

表l Analysis of nucleotide substitutions，deletions andinsertions

Observed nu皿ber

1ype of mutatlon
Wb01e data Eaeb poSltlon

922

Substltutlon

c

c

T

一●

7
3
ュ

T・一

4
3

A・・●

G

G・一

人

46

Tr8nSltlon
C

→

A

A

5

一一

C

一一

2

で

0
ュ
ヽ
⊥
9

2

●

−

9

C

5

6

一・一

2

3

AA

1

ヽ
7
9

エnsertlonl2⊥

t TranSltlon
DeletloI

l

2

2

C

TransYerSlon

G

▲

G・●

100
6

．C

A・一

10

446

の配列内での変異数の合計を示してある．高頻度に変異が起こっている部分は，tRNA−Pro遺伝子側にみられ，1箇所だけ高い多型性を示す部分が，SacIサイト側にも観察された．この部分は3大人種全てにおいて多型性を示すことより，古い由来の多型によるものと思われる．超可変領域は16178bpから16197bpまでの20塩基の中に存在することが明らかになった．このように変異の分布に顕著な偏りが観察されたことは，Dループ内においても機能上の制約に差異があることを示唆している．超可変領域では，わずか14塩基の領域で，塩基置換・欠失・挿入等で17種類の異なる配列が観察された．すなわち約60％の個体が表2中のNo．1配列であったが，その他の個体ではCストレッチ内の塩基置換，TからCの置換とそれに伴うCストレッチの伸長とAストレッチの減少などの種々の配列が観察された．表2中のJl，J2は，制限酵素による分析での日本人のグループⅠとグ
ループⅠⅠに相当している．特にNo．10からNo．17の配列にみられるAおよびCの塩基数の変異は，mtDNAの複製時の誤りによるものと考えられる．
またこのTからC（bp16189）へのトランジッショ

図2

Distribution of mutations
Thehistogram showsthe totalnumberof base substitutions，deletions andinsertionswithin contiguous non−OVer−

lappingblocksof20iases．Ahypervaria−
bledomainis apparentnearone ofthe
KpnIsiteswithin the D−loop region．K
andSstandforKpnI，andSacIrecogni−
tionsites，reSpeCtively，uSedforcloning．

ンは異なる系統の中で何回か起こっていることが，系統樹による分析により確認された．以上のようにnon−COding領域の多型性はいちじるしく，制限酵素切断型多型分析によるnucleotide diver・
sityの値（0．4％）の約4倍の値（1．5％）を示し，ヒトの集団内変異を同定するのに極めて有効な領域であると考えられた．
101個体の配列間の塩基置換数をもとに，
Unweighted Pair Grouping法（UPG法）6）により系統樹を作成した（図3）．クラスタリングのパターンから，少なくともClからClOまでの10個の

−187−

表2

Mitochondrial DNA sequencesin a
hypervariable domain and observed
numbersinthe three racial groups
ntDm

8eqnenく：eき

M

JI

J2

Tot81

1

3

1

3

■

−

1

AAAA一一一一CTCCCTCCCC

7

AA仏一一一一∝CCmCTC

4．

5

3．

N

5

AAAA一一一一ccCCCTCCCC▲▲AA一一一一ccCCCTCCCT

⊥

1．

2．

C

−

−

1

●

1

1

■

1

■

●

3

■
1

I

■

3

−

−

⊥

−

▲▲A▲一一一一∝mCCCCC■

AAAA一一一一ccCTCTCCCC

6．

■

S．

3
⊥

1

−

2

●

−
ュ

■

−

●

AAAA一一一一TCmCCCCC⊥

AAAA一一一一ccCTGCCCCC

8．

■

T．

5

1
●

●
▲

■
8

9

−
■

−

AAA一cccc∝CCCCCCCC一

AA九九一一ccccCCCCCCCC

12．

1

ll．

●
−

4

−
1

−

ュ
■

2

4

■

−

−
2

⊥

打，C．X．Jl andJ2

1

⊥

■

●

■

AA一一一ccCCCCCCCCCcc

4

●

ュ

■

1

18．．▲▲一一cccc∝CCCCCCCC

17．

6

●

AAA一一一一一ccCCCCCCCC

●

15．

■

AAA一一一ccCCCCCCCCcc■−

AAA一一ccCCCCCCCCCcc

14．

⊥

−

1

13．

⊥

1

●

−

1

▲AAA一一一ccccCCCCCCC

1

−

−

AAA▲一一一一mCCCCCC

■

■

●

g．

lO．

8tand for Nerr01dS，Cauc■￡01dS．808−Jlpane00

1bng0101dき．JaplneSe grOupl且ndJap▲ユeSe tTOup2．re＄peetl▼ely．

10
5
GenetIc dはtance（DxlO3）

クラスターに分類するこ＿とができる．これらのク

図3

A phylogenetic tree showing thelOl

ラスターの中で，C5，C9，′ClOは異なる人種が混

mtDNAlineages from the three racial

じり合っている／しかし，残り7つのクラスター

grOupS

Alllineages are tentatively classified
intotenclustersdesignatedasCltoClO．

は同じ人種か．ら形成されている．ClとC4は黒人
クラスターで，C2，C3，C6，C7，C8はモンゴロイ

・Distdnces（D）are expressed by the
number ofnucleotidesubstitutions／site／

ドにより形成されている．コーカソイドについて

lineage．

は特有なクラスターがないが，C9はおもにコーカソイドより成り立っている．Clに属する黒人は他のクラスターから最初に分岐し，続いて，2つの特徴であることが明らかとなった．人種内およびモンゴロイド集団（C2とC3）が残りの黒人（C4）

人種間の比較分析では，黒人集団の多様性が著しと他のクラス・ターから分岐した．これは，モンゴ

く，モンゴロイドの一部（日本人のグループⅠに

ロイド集団の一部は他のモンゴロイド集団と異な相当）がそれに続き，白人集団と他のモンゴロイ

っキ系統的位置づけになることを示唆している．

ド集団（日本人のグループⅠⅠに相当）内の多様性

この結果は，黒人の一部とモンゴロイドの一部がが低い値を示した．・

残りの個体から最初に分岐したという，我々の制限酵素による解析を確認するものである7ト9）

文献さらに我々が明らかにしてきた日本人が2大ク

1）Horai S and Hayasaka K：Intraspecific

ラスターに分かれることが，・今回の日本人以外のnucleotidesequencedifferencesinthemajor

アジア人の分析によりモンゴロイド集団としてのnoncoding reglOn Of human mitochondrial−188−6）Sokal RR and Sneath PHA：Principles of

DNA・AmJ HumGenet，1990（inpress）．
2）SangerF，NicklenSandCoulsonAR：DNA
SequenClngWithchainLterminatinginhibitors．
Proc Natl Acad Sci USA74：5463−5467，
1977．

numerical taxonomy．W．H．Freeman，San
Francisco，1963．

7）HoraiS and Matsunaga E：Mitochondrial
DNApolymorphisminJapanese．ⅠⅠ．Analysis3）Anderson S，Bankier AT，Barrell BG，De

withrestrictionenzymesoffourorfivebase

BruijnMHL，CoulsonAR DrouinJ，Eperon

pair recognition．Hum Genet72：1057117，

ICEetal：Sequenceandorganizationofthe

1986．

humanmitochondrial genome．Nature290：457−465，1981．

8）Horai S，Gojobori T and Matsunaga E：
Distinct clustering of mitochondrial DNA

4）Aquadro CF and Greenberg BD：Human
mitochondrialDNAvariationandevolution：
analysisofnucleotidesequencesfromseventypes amongJapanese，Caucasians and
Negroes．JpnJ Genet61：271−275，1986．
9）Horai

S，Gojobori

TandMatsunaga

E±

individuals．GeneticslO3：287−312，1983．

Evolutionaryimplications ofmitochondrial5）GreenbergBD，NewboldJEandSuginoA：

DNA polymorphisminhuman populations．

Intraspecificnucleotidesequencevariability

HumanGenetics（edbシVogelF＆Sperling

SurrOunding the origin of replicationinK）Proceedings of thehumanmitochondrialDNA．Gene21：33−49，

Congress，Springer−Verlag，Heidelberg，1987，1983．

pp177−181．

−189−

7thInternational

34）シトクロム酸化酵素小サブユニット遺伝子のクローニングとその発現様式
水 野 美 邦＊

研究協力者

太 田 成

男＊＊ 中 野 康 伸＝

富

薫＊＊ 大 塚 美恵子＊＊＊

永

実験方法

は じ め にミトコンドリア脳筋症において，シトクロム酸化酵素欠損がしばしば見られる1）．シトクロム酸

PCR（poJymerasechainreaction）によるクロー
ニング化酵素の3サブユニットはミトコンドリアにコー発表された塩基配列6）〜8）を基にオリゴヌクレオ

ドされており，残りの10小サブユニットは核
DNAにコードされている2）．また，これらの小サチドを作製し，ヒト繊維芽細胞cDNAライブラリ

ブユニットは，抗体との反応性などが各組織によで増幅した．アガロース電気泳動で対応するバンって異なっており，組織特異的に遺伝子が発現す

ドを切り出し，もう一度PCRにて増幅した．これーをPCRの鋳型として各々のCDNAをPCR9）

ることが想像されている2）．実際，SDSポリアクリ

によって，サブユニット4，6a，8のCDNAをク

ルアミドゲル電気泳動によって，心筋と肝臓で分ローニングした．

子量の異なるサブユニットが検出されている3）．

アイソフォームの遺伝子のクローニングの試み

また，サブユニット6aでは，CDNAのクローニン

直腸癌細胞cDNAライブラリーをPCRクログによって，別の遺伝子にコードされていることーニングしたcDNAをプローブとして，スクリー
ニングした．アイソフォームのCDNAクローニンが明らかとなっている4）．
ミトコンドリア脳筋症においてシトクロム酸化

グのためにハイプリグイズの条件を50℃にした．

酵素の小サブユニットの異常遺伝子の同定の報告

Northern b10tはないが，ミトコンドリア脳筋症患者の中には，
シトクロム酸化酵素の小サブユニットの欠損に起死後1．5時間の剖検組織より，全RNAを抽出，精製した．凍結した組織を液体窒素温度下で乳鉢因する例もあると思われる．とりわけ，ミトコン

で粉末にして，グアニジンチオシアネートに溶解する．ついで，超遠心法によってCsFクッション
を通し精製した．そして骨法によりクローン化されたcDNAをプルーブにして，各組織のmRNAの量をNorthern blotにより，検索した．
PCRによるmRNAの半定量化

ドリア脳筋症の組織特異的発症とシトクロム酸化
酵素小サブユニットの組織特異的発現や組織特異的アイソフォームの存在の関連は注目に値する．
昨年は，サブユニット6CのCDNAクローニン
グについて報告したが5），ひきつづき，小サブユニ
ットcDNAのクローニングをすすめ，各組織に於ける発現量を調′1た．また，塩基配列の決定された遺伝子についての遺伝子診断法についても述べる．
＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊自治医科大学生化学＊＊＊自治医科大学神経内科

全RNAをシトクロム酸化酵素欠損株と正常株から上に述べた方法により分社し，サブユニット
4と6CのCDNAの5′側と3 側の配列のオリゴヌ
クレオチドを作製し，2組のプライマーとRNAO．lpgを混ぜて，PCRL，アガロT−ス電気泳動にて分画した．また，全RNA中のふRNA量を
Northem blotで，定量した．

ー190−

結

く発現しており，8は腎で肝よりも発現しているなど，各々のサブユニ■ット遺伝子によってその相対量は一定ではなかった．心筋と骨格筋の遺伝子発現も各サブユニットによって異なっていた．
微量組織からのmRNAの半定量と遺伝子診断
小サブユニット遺伝子の塩基配列が明らかとな

果

cDNAのクローニング
シトクロム酸化酵素小サブユニット遺伝子のク
ローニングに関する論文は1989年のみで，10を越し，ヒトのCDNAでクローニングされていないのは，サブユニット7bのみとなった10）（表）．しかったので，PCRによる遺伝子の増幅が可能になった．そこで，次に，微量組織におけるmRNAの半定量を試みた．Northem blotによる方法は，組し，アイソフォームの遺伝子のクローニングは，緒についたばかりである．私たちは，今回直腸癌組織から作製したCDNAライブラリーをスクリ

織が0．1JJgほど必要で微量生検組織からmRNAを定量するのは困難である．全RNAO．1〃gをoligo dTをプライマーとして，逆転写酵素でcDNAを作製し，PCRによって増幅した．プライーンし，サブユニット6a，8のCDNAをクローニングして，塩基配列を決定し，Shornらの報告した肝cDNAと比較した7）・8）．結果は，発表された塩基配列と完全に一致した．ハイプリグイズの条件
を弱くし，アイソフォームのCDNAをクローニン
グできることを期待したが，陽性クローンはすべて同一であり，6a，8の新たなアイソフォームのマーは，サブユニット4と6CのCDNAの5′側と3′側配列に相補的な2組のプライマーを作製し，4種のプライマー共存下でPCRにより増幅した．
その後アガロース電気泳動により分画した．サブ
ユニット4と6CのCDNAに対応するバンドが2遺伝子はクローニングできなかった．
シトクロム酸化酵素小サブユニット遺伝子の組織特異的発現
次に剖検組織から抽出したRNAを用いて，各々のサブユニットのmRNAの相対量を比較し本みられ，その比率はNorthernblotの結果と一致した（図2）．したがって，PCR法によってmRNAの相対量は定量化できると結論された．
この方法によって，小サブユニットの欠夫などのた．図1に結果を示す．例えば，6Cは肝細胞でよ
表COX

シトクロム酸化酵素小サブユニット遺伝子のクローニングの現状（Trends Biochem Sci14：
501「503，1989より抜粋）
No．ofsubuni【lVBoYine147

CDNAS

N・Teminalamino tissue seqllenCe
acids

Genes

Hllman

Refs

Chromosomes

80Vine Human Rat＋

HCart AHGS

bovine：2
hllmana，b，C，d15（C（）ズイ） e，14（CO朋PJ）

＋
＋
＋

＋

nOne

−

＋

＋

＋

十
十
●

＋

human：2Jl f，ghuman：6−7
h，i，

＋
＋

human：1−2
human：41＋

ral：＞2＋■

44

Heart ITAKPA
Liver IHSKPP

＋

46

十

VIII

＋

61
56
47

十

Ⅵm
ⅥIc

十−十

73
56

十一十

Ⅵb
ⅥC
ⅥIa

98
84
糾
85

CO朋ズ

Heart SHGSHeart ASGGG
Hear【ASAAKGDH
Liver SSGAHGEE
Hear【ACAEDIHeart STAL
HeaR FEQRVA
LiYer FENKVPHeart SGYS
Heart SmEGPG

一十

Va lO5Vb
VTa

15（CO都A）i，j，k．1，m，
1，m．n
q，p
0，q，r，5，tbovine：＆・9u，Y．W

bovine：ふ」7
hbman：3k，Whumam：1■

11（CO朋）

0，S，X，

iLomax，ピー山．（19糾）クroc．〃α〟Acd．∫cf．【／エ481，6295J299；bZeYiani．どJdJ．（1987）Gピ〝ど55．205−217；CGopoIan，eJd．（1989）∧bcねたAc血Rg∫・17，
1276；dBachman，〝山・（1987）Ggnど55，21㌢229；eLomax．grdJ．G帥e（inpress）；IR血to，どJ止（1988）G〜朋69，245−か6；gDroste，〜Jd・（1989）Ⅳ

cJdc

AcEdsRes・17，4375；hZeYiani．eEaL．（1988）Genピ65：1−11；iFrancke，perS．COtnmum．；jGrossman．Aqua，andLomax，unPublished；kSchon，perS・

COmmum；IScbIeげ，dd．（1988）g〟β0J．7．か閲91；mBeMentandLomax，unpublished；nFabii，Jd．〃UCicAc血血尺J．（1989）17，朗00；
OCapaldi，PCrS・COmmun・；PTaanman，etaE．（1989）NzJCLeEcAcEdsRes．17，1766；qOtsuka，etqL．（1989）NucLeEcAdd；Lb．16．10916；rParimoo，etaL．（1984）
βわd〝軋β〜叩月γ∫・尺だ・Cbmm．118．聞2−900；SSuske．gJ正（1987）血r．J．β加九g仇168，か㌻07；tSuske，机上．（1988）か〃A7．16ゝ171；uSeelan．どJd・（1989）〃 ckJcAcfゐ尺四・17，糾10；YFabr適，α正（1989）〃〟CJd亡Adゐ尺は117，7107；WAqua．gJdJ．〃〟CJgfCAc通尺打．（inpress）；ⅩRimto，ピーgJ．（1989）⊥βお人Cたど爪．264，10595−106∝）．

−191−

今年度は，4を繊維芽細胞（DNAライブラリー）より6a，8のCDNAを直腸癌細胞よりcDNAをNORTHERN BLOTTJNG

クローニングした．アイソフォームのクローニングも試みたが，未だ成功していない．今後は，ア
イソフォームの遺伝子のクローニングが精力的に行われると思われる．
クローニングされたcDNAを用いて，各組織におけるmRNAの相対量をみた．もしも，各サブユ

lV

ニットの遺伝子が一種類であるならどの組織でも相対量は一定であることが期待される．ところが
結果は，各サブユニット遺伝子の発現は組織によってまちまちで，複雑な発現様式を示した．これは，組織特異的に発現するアイソフォームの存在

Vlaを仮定すると説明できる．
つぎにPCRを用いた半定量法を開発した．
CDNAのクローニングによって塩基配列が決定され，PCRが適用できるようになったからであV＝る．2組のプライマーを共存させて，CDNAを増幅させるとその相対量が維持されるので，PCR法
によって相対量を半定量化できることが明らかとなり，PCRによる遺伝子診断に道を開いた．この，増幅されたcDNAの塩基配列を直接決定する
ことも可能である．
文

献1）CapardiRA：Mitochondrialmyopathiesand
respiratory chain proteins．Trends Biochem

図1

Sci13：144−148，1988．

シトクロム酸化酵素小サブユニットのヒト各組織に於ける遺伝子発現．左の数字は，各サ70ユニットに対応する．各々のサブユ
ニットの相対値が組織によって異なり，組織特異的なアイソフォームの存在を仮定すると説明できる．

2）KadenbachBetal：Evolutionofaregulatory
enzyme：Cytochrome−C OXidase（Complex
IV）．

CurrenttopicsinBioenergetics（edby

LeeCP）A云ademicPress，1987，Vol15，pp114−162．

3）Kadenbach B et al：Tissuerspecific genes

遺伝子診断が可能となった．

COdeforpolypeptideVIaofbovineliverandheart cytochrome c oxidase．FEBS Letters

考察

138：236−238，1982．

1989年には，シトクロム酸化酵素核遺伝子のク4）Schlerf A et al：Characterization of two

ローニングについての10を越す論文が発表され，different genes（cDNA）for cytochrome c

関心の高さを物語っている10）．私たちは昨年ヒト

OXidase subunitⅥIa from heartandliver of

サブユニット6Cのクローニングについて報告し，

the rat．EMBOJ7：2387−2391，1988．

−192−

mRNA

図2

PCRによるmRNAの半定量法
左は，Northem blotで，1は，シトクロム酸化酵素正常株，2は欠損株（Shimoizumiet
al：CytOChromecoridase−deficientmyogeniccelllinesinmitochondrialmyopathy，Ann
Neuro125：615，1989）．
右は，2姐のプライマー存在下でのPCR．サイクル数をかえてアガロース電気泳動によって，2つのサブユニット遺伝子を分離した．NorthernblotでもPCRでも，シトクロム酸化
酵素欠損株（2の列）でサブユニットVIcが減少している．

5）Otsuka M etal：Nucleotide sequence ofto chromosomeII andisexpressedinboth

cDNAencodinghumancytochromecoxidase

muscle and nonmuscle tissues．J BioIChem

subunitVIc．NucAcidsRes16：10916，1988．

264：10595−10600，1989．

6）ZevianiM et al：Isolation of cDNA clone

9）Saiki RK et al：Primer directed enzymatic

encodingsubunitIVofhumancytochromec

amplification of DNA with a thermostable

oxidase．Gene55：205−217，1987．

DNA polymerase．Science7）Fabrizi GM et al：Sequence of a cDNA
specifyingsubunitIVaofhumancytochrome

239：487−491，

1988．

10）LomaxMIandGrossmanLI：Tissue−SpeCificc oxidase．Nuc Acids Res17：6409，1989．

genes for respiratory proteins，Trends
Biochem Sci14：501−503，1989．

8）Rizzuto et al：Agenespecifyingsubunit VM
ofhumancytochromecoxidaseislocalized−193−35）MELASクローン化筋細胞の分子遺伝学的検索
桃 井 真里子＊

研究協力者

太 田 成

男＊＊

下

夫＊

泉

秀

は じ め に

富
小

永
林

薫＝
葉

子＊

必要である．

MELAS（mitochondrialencephalomyopathy

本研究では，シトクロム酸化酵素サブユニット

Withlacticacidosis andstroke−likeepisodes）

をコードしているミトコンドリアDNAの塩基配発症の機序を遺伝子レベルで解明するには，酸化リン酸化に関連する酵素活性の失われた細胞株を分駈確立することが必要である．

列を決定することによりその病因を明らかにしよ

私たちは，昨年報告したように，MELAS患者
骨格筋生検試料から，筋芽細胞を分馳し，複製開

し，核DNA遺伝子の発現についても考察した．

始点を欠くSV40ウイルスDNAを導入することによって，形質転換し，培養細胞をクローン化した1）．これらのクローンのなかには，シトクロム酸化酵素活性の欠損した細胞株がみられた2）．同時にシトクロム酸化酵素活性を有する筋芽細胞株も同時に分馳することができた2）．
MELAS筋組織においてシトクロム酸化酵素の活性がモザイク状に欠損していることがしばしばみられ，本症の特徴のひとつで病因をさぐるう
えで重要な視点である．同一の患者の同一組織からシトクロム酸化酵素欠損株と正常株が同時に分うと試みた．さらに，核にコードされる小サブユ
ニットのmRNA量をNorthern blotにより比較

実 験 法
培養細胞
患者骨格筋からの筋芽細胞株の分離および，シトクロム酸化酵素欠損株の分散については昨年報
告した．
ミトコンドリアDNAの塩基配列決定
全DNAを培養細胞から分馳し，BamHIで切断後ショ糖密度勾配超遠心法によって部分精製し，PCR法4）（polymerase chainreaction method）
によってmtDNA断片を増幅した．さらに非対称
PCRS）で一本鎖DNAを増幅し，そのDNA断片

散されたことは，組織化学の結果と一致し，これらの培養細胞系におけるシトクロム酸化酵素欠損の原因の究明はMELASにおける酵素欠損の機構を明らかにすることを意味すると言える．
シトクロム酸化酵素は，核遺伝子とミトコンド

をそのまま塩基配列決定の鋳型として，dideoxy
nucleotide chain termination法によって塩基配リア遺伝子の二重支配を受けている．すなわち，
3サブユニットはミトコンドリアDNAにコード

ニングし，塩基配列を決定した．
mRNAの定量

列を決定した．この方法によっては明瞭な結果が得られなかった領域については，PCRでmtDNA
断片を増幅しM13ファージDNAにサブクロー

され，残りの10サブユニットは，核遺伝子にコー培養細胞をグアニジンチオシアネートで処理し，ドされている3）．そこで，酵素活性の失活は，ミト抽出し，CsCl密度超遠心法によって仝RNAを分コンドリア遺伝子の異常によるものか，核遺伝子艶精製した．Northern blotは骨法に従った．サの異常によるものなのかを決定することが，まずブユニットⅠ，II，IIIのプローブはmtDNAを
PCRで増幅したDNA断片を用いた．サブユニッ＊自治医科大学小児科＊＊自治医科大学生化学

ト4，6a，6C，8のプローブはクローン化された
CDNAを用いた6）−7）．
ー194−

結

mtDNAの塩基配列

果昨年までの結果によりシトクロム酸化酵素欠損

ミトコンドリアの転写に異常がなかったので，
mtDNAに異常があるとすればシトクロム酸化酵

株のmtDNAにはSouthernblotによって検出さ素サブユニットの構造遺伝子に変異があると思われる程度の欠夫は認められていない．したがって，もし，mtDNAに異常があるならば，点変異か短いれた．そこで，シトクロム酸化酵素欠損株のmtDNAのシトクロム酸化酵素サブユニット領域

欠夫である．また，可能性としては，転写の低下の塩基配列を決定し（図2），報告されたヒトも考えられる．そこで，まず，mtDNAにコードさ

mtDNA塩基配列と比較した．その結果，10の塩基れるサブユニットI，II，IIIのmRNA量を置換が認められた（図3）．このうち，6塩基は，Northern blotにより調べた．結果は，図1に示アミノ酸の変換を伴わない変化であり，1塩基は，すようにシトクロム酸化酵素欠損株と正常株ではtRNAの変化であった．残りの3塩基はアミノ酸

量，長さ共に差が認められなかった．

の変化を伴う変化であったので，同じ患者から得ミトコンドリア内の転写

たシトクロム酸化酵素正常株のミトコンドリア
DNAの塩基配列も決定し比較した．この正常株

Nortner11矧OtのmtDNAの塩基配列もシトクロム酸化酵素欠損株のmtDNAのと同一であり，また他の動物種のmtDNAで塩基配列が保有されておらず，これらの変異はシトクロム酸化酵素活性に影響を及ぼさないと結論された（図3）．
核DNAにコードされる小サブユニットの転写
次に核にコードされる小サブユニットのmRNA量をNorthernblot法によって調べた．全RNAを電気泳動後，ナイロン膜に写し取り，クローニングされたcDNAをプローブとして各々のmRNA量を調べた．結果は図4に示すように6Cが減少しており他のサブユニットには，変化がな
かった．
考

察

シトクロム酸化酵素のサブユニットは核遺伝子とmtDNA遺伝子にコードされているので，シト
クロム酸化酵素欠損の原因として，ミトコンドリ
アDNAの異常か核DNAの異常か，あるいは双方かを決定する必要がある．mtDNAの異常か否かを決定するにはmtDNAの塩基配列を決定す
図1

ミトコンドリアDNAにコードされるシトク
ロム酸化酵素サブユニットⅠ，ⅠⅠ，ⅠⅠⅠの転写＋は，シトクロム酸化酵素正常株，−はシト
クロム酸化酵素欠損株．mRNAの長さ，量に＋一間で有意な差が認められない．

ればよい．昨年報告したように，シトクロム酸化
酵素欠損株ではすべてのミトコンドリアのシトク
ロム酸化酵素が欠損していたので，もし，mtDNAに異常があるとすれば，均一であると仮定した．
そこで，mtDNAの塩基配列をPCR直接塩基配列決定法で決めた．結果として，少なくともシト−195−

Sequence Strategy
6（X旧

＝

7（X）0

＝
二
こ

＝

こ

二

＝

＝

こ

こ
＝

こ

＝

二
＝

＝
二
＝

二

＝

二

二
こ

二
こ

＝
こ
二

三

二

二

つ

C

［
C

二

つ

こ
C

ニ
C

［

二
二

〇
二

C

こ

〇
三
⊂

〇
二

二
C

〇
二
C

二

〇
ニ

1（X氾bpDirectsequence・−一一一一一

M13

sequenceo．一・一■

図2 塩基配列決定法
PCR法でDNA断片を増幅し（−），非対称PCR法によって，あるいはM13ファージに組み込んで，一本鎖DNAを作製し，塩基配列決定のための鋳型にした．

クロム酸化酵素のサブユニットをコードする領域て，遺伝子発現が組織特異的に，あるいは細胞特には，ミトコンドリアDNAの異常はみつからな
かった．問題点としては，別の複合体のサブユニ
ットをコードする領域に異常があって，その複合体の分子集合などの異常によって，シトクロム酸

異的に変化するようになった可能性も考えられる．
しかし，同一部から得た細胞がどのように異なって遺伝子発現様式に変化を与えるのかについては化酵素の活性が影響をうけるという新しい考え方の可能性も理論的には否定できない．しかし，現段階では，シトクロム酸化酵素サブユニット領域のミトコンドリアDNAに異常がないことが確定したので，核遺伝子の異常によってシトクロム酸化酵素欠損がひきおこされる可能性が強い．
しかし，もし，核遺伝子の異常とすれば，何故同一患者の同一部から採取した細胞で酵素活性が異なるのかを説明するのは容易ではない．核DNAは免疫系細胞を例外とするとすべての組織
で核DNAは同一であると考えられているので，組織特異的に発現する遺伝子の異常によると考えなければ，説明できない．また，転座などによっ

現在の知識では容易に説明できない．
核遺伝子のサブユニット6C遺伝子の発現が欠損株で有意に減少していたが，これは，シトクロ
ム酸化酵素欠損の原因と考えるよりも酸化リン酸化の異常により二次的に引き起こされたものと考えている．
いずれにしても，現在の知識では説明がつかない現象が見られ，MELASの発症には未知の機構が働いていると考えられる．今後は，ミトコンド
リアDNAの異常によるのか否かを確定するためにミトコンドリアDNAの全塩基配列を決定し，もし，ミトコンドリアDNAに異常が見つからなければ，発現ベクターライブラリーDNAを欠損珠に導入し，酸化リン酸化の回復を指標に核

−196−

CO工

Aウ1Å（6737）
GCC（7028I

CO工工GCGf7600I

CO工工工でGA（9377）
でTA（9540）
CCG（9575）e tュaュa叩enm
HAATLP叫描椚阻芸mHeもaFeId COXト）COX（十）Bovine HouSe Xenopus

工工工

CGA（9559）
Ar9

tRNA−Asp Eek

図3

AAGG℡A一一▼＿＿＿

COXt−I姐GAでA．一▼■▼＿＿

COXl＋）AAGATA

BovineGAGGTAHouse

AAGATA

XenopllSGAGATG

伽Gln相加mpm

でhr
CO

mLel
︒a
GC
Cm
︒地
A

ACAt8860）

肌Ser肥貼Cmpm

ACCl8701）
でhf∝⊥a馳1amm
GAGACp6

躍如亀AlaCnPm

ATPase一一一▼＿＿

一一一一▲一一，【＿一一一一一r

一一一一▲一一1−−

塩基配列の比較
HeLa細胞の塩基と異なる塩基部分のみを記した．COX（−），COX（＋）は，それ
ぞれシトクロム酸化酵素欠損，正常株を示す．

図4

DNAの異常遺伝子の同定を試みようとしている．
文

核DNAにコードされるシトクロム酸化酵
素小サブユニット遺伝子の転写＋，丁は，それぞれ シトクロム酸化酵素正常株，欠損株を示す．ⅠⅤ，ⅤIa，ⅤIc，†lII
は，それぞれ，各サ70ユニットをしめす．
VIcにおいては，有意に欠損殊でmRNA
量が少なかった．

献1）Gluzman Y et al：Origin−defective mutantsof SV40．Cold Spring Harbor Symp Quant

DNA polymerase．Science

Bio144：293−300，1980．

1988．

239：487L491，

2）ShimoizumiH et al：Cytochromec oxidase5）GyllenstenUBandErlichHA：Generationof−deficient myogenic celllinesin mitochon−

Single−Stranded DNA by the polymerase

drial myopathy．Ann Neuro125：615−621，

Chain reaction andits application to direct

1989．

sequencingoftheHLA−DQAlocus．ProcNatl

3）CapardiRA：Mitochondrialmyopathiesand

AcadSciUSA85：7652−7656，1988．
6）Otsuka M et al：Nucleotide sequence of

respiratory chain proteinS．Trends Biochem
Sci13：144−148，1988．

CDNAencodinghumancytochromecoxidase4）Saiki RK et al：Primer−directed enzymatic
amplification of DNA with a thermostable−197−

Subunit VIc．NucIAcidsRes16：10916，1988．
7）manuscriptin preparation

36）Leber病家系におけるミトコンドリア遺伝子解析
宮

正＊
＊

子将

恵高

中澤

田小

＊

＊

＊

＊

＊

事

＊

＊

釆

＊

＊

次聴

省

＊

辻宝

誠樹

春

田部

米阿

研究協力者

武

は じ め にトコンドリア遺伝子を解析し，この塩基変異がLeber病は，思春期から成人期にかけて急性あLeber病に普遍的に存在するものかどうかを検討

るいは亜急性の視力低下で発症する遺伝性の視神経萎縮症である．視神経の病変以外にもWPW症候群などの不整脈や，精神・神経症状を伴うことがある．母系遺伝を呈する家系が存在することや，
骨格筋生検で形態異常を伴うミトコンドリアの増殖が認められることなどから，ミトコンドリアの遺伝子の異常が病因として推察されていた1）．
最近，Wallaceら2）によってLeber病の病因に関連したミトコンドリア遺伝子の変異が初めて報告された．彼らは，北欧および北米の主に白人のLeber病患者家系のミトコンドリア遺伝子を分析し，塩基番号11778の位置にGからAの置換が存在することを兄いだし，この塩基置換がLeber病の病因と関連があることを指摘した．この塩基置換によってミトコンドリア電子伝達系酵素複合体のNADH−dehydrogenase subunit 4の340番目のArgからHisへの置換が生じる．
ミトコンドリア遺伝子は核の遺伝子に比べ十数倍の高い頻度で自然の塩基置換を生じるため，正常でも人種間での多型性を有している．また，Leber病は白人に多く発症することが知られており，彼らの兄いだした塩基置換がLeber病に関連するものなのか，正常でも認められる多型性に過ぎないのかを判断する必要があった．
そこで我々は，彼らの分析した家系とは全く人種的に独立した日本人のLeber病の二家系のミ

した3）．
方

法

塩基番号11778のGからAの置換が制限酵素
5拘NIの認識部位の消失を生じることから，患者および家族の白血球DNAの5粒NIによる
RFLP（restriction fragmentlength polymor−
phism）をクローン化したミトコンドリアDNA
断片をプローブとして用い，サザーン解析を行った．図1は，5拘NIの制限酵素地図である．図の下には，プローブとして用いたクローン化mtDNA断片を示した．正常では，1．1kb，0．92kb，0．68
kb，0．37kbの4つのmtDNA断片がこのプロー
ブとハイプリグイズする．もし，日本人のLeber
病患者においてもWallaceらが白人で兄いだしたのと同一の塩基変異が塩基番号11778に存在す
れば，一箇所の5拘NI認識部位の消失により0．92
kbおよび0．68kbの断片が消失し，新たに1．6kbの断片が現れることが予想される．
mtDNAに欠矢や挿入などの大きな構築異常が無いことを確かめるため，他の制限酵素肋Ⅰ，
月言〃dIII，珍αⅠⅠによって白血球DNAを消化後，サザーン解析を行った．
次に，この5拘NIの認識部位の実際の塩基配列を検討した．まず初めにこの部位をはさむ形で20merの01igonucleotideを合成し，TaqDNA
polymeraseを用い，一定の条件でdenaturing，＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊新潟大学医学部眼科＊＊＊国立遺伝学研究所人類遺伝学＊＊＊＊名古屋大学医学部第二生化学

primerammealing，primerextensionを40回繰り返し，この二つのprimerではさまれた233bpの遺伝子領域をPCR（polymerasechainreaction）4）−198−

11778

△

△

12457

12823

Norm。l H皿：［…2kb：「．三省ドニ7
1．1kb
Leber

；−

川．，

1．6kb O．37kb−†

MltochondrialDNA PrObo

図1制限酵素駒NIのrestriction map

図3

Leber病家系の制限酵素ShNIを用いた
サザーン解析（2）−199−

を用い増幅した．さらに，このDNA断片を

NormalLeber

pUC19plasmidにsubcloningL，Sanger法によって塩基配列を解析した．また，この得られた結果がPCRによるmisreadingあるいはcloning
artifactである可能性を否定するため，PCRによって増幅したDNA断片のdirectseaquencingも同時に行った．
結果と考察
図2は一家系目の制限酵素j拘NIを用いたサザーン解析の結果である．二人の発症者を含む4人で，通常では認められない位置に5拘NI認識部位の消失による1．6kbのDNA断片が認められた．

Normal図4

正常人およびLeber病患者のミトコンドリア
遺伝子の塩基配列Leber病においては塩基番
号11778のGからAへの置換が兄いだされる．

GAA CGC ACT CAC AGT CGC ATC ATA ATC CTC TCT CAA
GZ祝かg gカァ幻85er APgエe祝的tJZeエek geァG‡乃
】

l

11770

11780

1

Leber

1

】

11790
1

GAA CGC ACT CAC AGT CAC ATC ATA ATC CTC TCT CAA
GZ祝Arg

でわ㌘

gi8

5eヂ

gfs上組〟e士∫ヱeエgu SeP G乙れ

340

図5

Leber病患者におけるミトコンドリア遺伝子の塩基変異

ミトコンドリア病の一つである慢性進行性外眼筋

解析結果である．今回分析した日本人のLeber病

麻痺においては，正常のmtDNAと変異を持つの二家系において，塩基番号11778の部位にGか

mtDNAが混在して存在しheteroplasmyをなす

らAの塩基置換が認められた．PCRで増幅したことが知られているが，今回分析したLeber病のDNA断片のdirect sequencingによっても同一の結果が得られた．この塩基置換はWallaceら

家系のmtDNAにおいては，遺伝子のpopulation
は単一で，・変異mtDNAのみで構成されていた．

が，北欧および北米の主に白人の家系において兄

また，この異常は女性を介してのみ三世代にわた

いだしたものと全く同一の塩基置換であり，このって伝えられ，完全な母系遺伝形式をとっていた．

人種を越えた塩基変異がLeber病の病因と断定

この結果はミトコンドリア病が母系遺伝を示すこ

しうると考えられた（図5）．
今後は，他のmtDNAの領域に塩基変異は存在とを遺伝子レベルで証明した例と考えられる．
図3は，二家系目のサザーン解析の結果である．

しないのか，この塩基置換がNADH−COenZyme

この家系においても発症者及びその兄に1．6kbの

Q酸化還元酵素の高次構造・活性にどのように影異常なDNA断片が兄いだされた．

響しているのか，なぜ病変が視神経に限局してい他の制限酵素肋Ⅰ，月わ7dIII，均αⅠⅠによるサザーン解析においては，発症者は正常と全く同るのかなどの問題が検討される必要があると思われる．

一のパターンを示しmtDNAの大きな欠夫や文

rearrangementはないことも確かめられた．
図4はsubclon化したPCR断片の塩基配列の献

1）NikoskeleineneE，HassinenIEetal：Leber

−200−

S

hereditary optic neuropathy，a maternal
di由ase？．Lancetii：1474，1984．

mutationinfamilywith

Leber

s

hereditary

Optic neuropathy．Lanceti：1076，1989．

2）Wallace DC，SinghG et al：Mitochondrial

4）Saiki R and Gelfeld DH：Primer−detected

DNA mutation associated with Leber，senzymic amplification of DNA with ahereditary optic neuropathy．Science242：

thermostableDNApolymeraSe．Science239：

1427，1988．

487，1988．

3）YonedaM，TsujiSetal：MitochondrialDNAー201−37）慢性進行性外眼筋麻痺におけるミトコンドリア
DNA多重欠矢のPCR法による分析
杉 村 公 也＊
＊

行之嗣
■

＊

＊

＊

＊

♯

書

＊

知千雅

■

■

山淵中

村馬田

＊

起 一 子

書浩智

昭＊

桶藤本

金斉山

野橋藤澤

大高佐小

研究協力者

弥＝＊

欽高司＊
将＊＊＊
表l Symptomsandthelaboratoryresults

は じ め にof the patients
Case l（H．K）

2（F．S．）

3（Y・Y）

FamilyhistoⅣ

Hypoacusis＋

り少数のmtDNA欠夫を検出する目的で，
polymerase chain reaction（PCR）法による骨格筋mtDNA欠夫の検索を行なった．

EMG

WNL

WNL

−

＋

＋

＋−

類のmtDNAが存在するheteroplasmy型の変異が，KSSとCPEOのおよそ1／3の症例において，Southern blot法により検出されている2）．しかし，従来のSouthem blot法にて検出される
mtDNA欠失は，欠失mtDNAが仝mtDNAの10％以上存在する場合に限られている2）．我々は，よConsanguinity＋＋

BlepharOptOSis
EOMlhlit
Pig・retinopathy

4012＋十十十●＋＋

F

■

3715

O
3 5

Age，Sex
Onset

M

近年，Kearns−Sayre症候群や慢性進行性外眼筋麻痺におけるミトコンドリアDNA（mtDNA）の欠矢が明らかにされている1）．正常の長さのmtDNAと大きな欠失を伴ったmtDNAの2種

Dys血a

RRF

酸・ビルビン酸も高値を示した．

対象

対象は，慢性進行性外眼筋麻痺の3症例で，30歳・男，37歳・女，40歳・女である（表1）．症例
2，3においては兄弟に難聴を認めた．症例1，
3の両親はいとこ結婚であった．全例に眼瞼下垂・外眼筋麻痺を認めたが，網膜色素変性は認めなかった．症例3では，構音障害を認め，難聴は仝例に認めた．心電図は，仝例正常範囲内であった．症例1，3においては典型的なragged−redfiberを認めなかったが，形態学的にミトコンドリ
アの増加を認め，安静時の血清および髄液の乳＊名古屋大学医学部神経内科＊＊名古屋技済全病院神経内科＊＊＊名古屋大学医学部第二生化学

方法

Total DNAは，10mgの生検骨格筋を
proteinase K／SDS処理後，phenol／chloroform
処理を2回行い，ethanol沈澱により得た．
Southemblot分析は，mtDNAを1ヶ所で切断する制限酵素Pz）uIIを用いて50ngのtotalDNA
を消化し，0．6％agarosegelにて電気泳動を行な
い，membrane filterアルカリ・プロットした後，PCR法にて増幅したD−loop領域のmtDNA断片をプローブとしてhybridizationを行ない，ECL法により検出を行なった．
PCR法は，tOtalDNAlOngをtemplateとして用い，TakaraのGeneAmpkitに従って反応−202−

液を調製した．即ち10mMTris−HClpH8．3，1．5
mM MgC12，200JLM deoxiribonucleoside tri・2

phosphateとした．反応に用いたprimer pairは7種類で，コントロールにおいて異常バンドが検3出されないことが確認されたpairを用いた（表2）．
反応はThermal cyclerのstep cycle pr0−

gramを用い，CyClingparametersは，denaturing
Step94℃×15秒，annealing step45℃×15秒，extensionstep72℃×80秒とし，35サイクルの増幅を行なった．
PCR法により検出された異常バンドがmisan−

図1 Southern blot analysis

nealによるものでないことを確認するために，必要に応じてprimershift法を行った．最初に増幅

次に，この異常バンドがmisannealによるものに用いたprimer pairをそれぞれ約300bpずつずらしてPCR増幅を行ない，そのずれに一致するだ

でないことを確認するためにprimer shift PCR法3）を行なった．図2中央のパネル（L820−

け異常バンドの長さが変化することを確認した．

H1338）に示すように，左のprimerをL790より

結

0・3kb右方のL820に置換し，右のprimerを
H1363より0．3kb左方のH1338に置換LPCR増果Southern blot分析の結果，症例1と3ではコ幅を行なった．すなわち，primer pair L790−

ントロールと同じ16．6kbの正常mtDNAのみがH1363よりprimer間距艶が0．6kb短いprimer
pair L820−H1338を用いて増幅を行なった．その検出されたが，症例2においては，16．6kbの正常バンドに加え，9．5kbの異常バンドを認め，7．1kbのmtDNA欠夫の存在が示された（図1）．

結果，症例1，2，3に0．5kbの異常断片が増幅され，primer pair L790−H1363にて認められた1．1

mtDNAの塩基番号7，900から13，650の5．8kbkbの異常バンドが4．7kbの欠矢をもったの断片を増幅するprimer pair L790−H1363を用いたPCRの結果を図2左のパネルに示す．コン

mtDNAに由来するものであることが確認された．

トロールにおいて認められた5．8kbの正常バンドに加えて，症例1，2，3においては，1．1kbの異primer H1338を固定したままで，左方のprimer
を0．3kb右方のL853に置換してPCRを行なっ

常バンドが認められた．

た結果である．期待された0．2kbのバンドは検出

図2右のパネル（L853−H1338）は，右方のされず，症例1，2，3においてそれぞれ0．9，
表2

Primer pairsused for the PCR

0．3，0．5kbの異常断片が増幅された．この結果，
図2左のパネル（L790−H1363）と中央のパネル

Primerpa汀

FlankingreglOn Distance（L820LH1338）で認められた4．7kbのmtDNA
欠夫の開始点は，primerL820とL853の間，すな

L4−

H580

nt．40−

5820

5，78kb

L434−

H815

nt．4340−8170

3．83kb

L651−Hl136

nt．6510−11380

4．87kb

L790−H1363

nt．7900−13650

5．75kb

まるmtDNA欠夫は，症例ごとに異なっているこ

L820−H1338

nt．8200−13400

5．20kbとが示された．すなわち，症例1，2，3におけL853−H1338

mt．8530−13400

4．87kb

る，それぞれ4．0，4．6，4．4kbの欠夫の存在が示唆

LlO76−H1450

nL10760−14520

3．76kb

された．

わち塩基番号8，201から8，531の間にあることが確認された．さらに，塩基番号8，531より右方から始他の4種類のprimer pairを用いたPCR増幅
−203−

貴書

たき

目玉

ト■ご

重量

】こく

十

i■11、11十∵十

菓毒害：摘：号
州一一一一

一一一」等≒〒
lll二i：くり一・一一→｛−■lll：りi＿l

図2Primer shift PCR methodの結果を含めて表3に示す．塩基番号40から5，820の5．8kbの断片を増幅するprimerpairL4−H580を用いたPCR増幅の結果，症例1と3にそれぞれ1．Okbと2．1kbの異常バンドを認め，それぞれ
4．8kbと3．7kbの欠夫の存在が示唆された．症例
2においては，1．8，1．3，1．Okl）の少なくとも3本の異常バンドを認め，この領域におけるmtDNA

表3

H580
（5．8kb）

fr喝menl＊delenon†の複数の欠失（4．0，4．5，4．8kb）が示された．この領域は，12S rRNAとND2の間を増幅する

L434− H815
（3．8kb）

丘agment
ddelion（DISlanCe）

u−

L651−Hl136

bgmenl（4．9kb）

deletlOn

L790−H1363

hgmenl（5．8kb）

delet10n

L820−H133g fmgment（5．2kb）
deleIion
L853−日1338（4．9kb）

fIagmentdele【ion

L1076−日145（）（3．8kb）

fragmentdelelion

1．8，1．3，1．0
4．0，4．5，4，8
0．4
3．4
d．6
4．3

27
1
・0
3
・
7・
1
30
・
4・
5
4＝
・巳06
・揖M︒
40
・
8・
︒
3・

−204−

PnmerPa】r000
Hl鍔103・
6
4柏・㍑

するbrimer pair L434−H815を用いたPCR増幅1の結果，症例1，2，3において，それぞれ0．7，
0．4，0．7kbの異常バンドを認め，それぞれ3．1，
3．4i3．1kbの欠夫が示唆された．このprimerpair
により増幅される領域には，ND2とCOlの間にあるL鎖複製開始点が含まれており，このL鎖複製

the PCR

．
8O
．
L︒8
40
・
7・
1
30
・
4・
5
4＝
・4
7・
一㍍一9
〇︒
4
・柏
・㍑

primer pairであり，この領域のmtDNA欠夫は，我々が調べた限りでは，1例が報告されているのみである1）．
塩基番号4，340から8，170の3．8kbの断片を増幅

Muscle mtDNA deletions detected by

Under）inedareidentlfiedbylheprlmerShiftPCRmethod・Sizesoftheabnormalfragmentsandthecalculateddelet10nSareeXPreSSedlnkb・＊SizeoftheabnorTna］fragmentsamplifiedbythePCR・†SiZeOfthemtDNAdeleLlOnSCalculatedbysublraCtlngthesizeoftheabnomal
fねgmentsfromthepnmerdislanCe・

開始点を含む欠夫が存在する可能性があり興味深たことから，misannealの可能性は低いと考えら

い．

れた．

次に，塩基番号6，510から11，380の4．9kbの断片今回用いた7種類のprimer pairでは，異常バを増幅するprimer pair■L651−H1136を用いた

ンドが仝症例に検出され，mtDNA多重欠矢が存

PCR増幅の結果，症例1，2，3において，それ在するこ，とが示唆された．L790−H1338とLlO76−

ぞれ0．4，0．6，0．4kbの異常バンドが増幅され，

H1450のprimer pairによるPCR増幅で認めら

4．5，4．3，4．5kbのmtDNA欠矢が示された．これたように3症例に共通の欠矢が存在し，の領域は，Southern blot法で確認された単一欠
矢の好発部位である．

mtDNA欠夫には好発部位が存在することが示された．今回の症例については検索を行なっていな

さらに，塩基番号10，760から14，520の3．8kbのいが，正常に存在する数bpのdirectly repeated

断片を増幅するprimerpairLlO76−H1450を用い

SequenCeにおけるrecombination類似の機構がたPCR増幅の結果，3．8kbの正常バンドに加え，

mtDNA欠夫の発生機序として提唱されており5），

3症例に共通の0．8kbの異常バンドを認めた．こ今回の症例においても同様の機序がmtDNA欠

れらは，3．Okbの欠夫の存在を示している．さら夫の発現に関与していると考えられた．症例2でに，症例1，2においては，1．6kbの異常バンドもはSouthernblot法にて7．1kb欠夫を認め，正常認め，2．2kbの欠矢も示された．この領域も前の領

mtDNAと欠失mtDNAの2種類が存在する域と同様にSouthemblot法でのmtDNA単一欠

heteroplasmy型の変異と判断されたが，PCR法

夫の好発部位である．

ではさらに多種類のmtDNA欠夫が検出された．
これは，Southemblot法で検出された7．1kbの欠考

察

夫は，多くのmtDNA欠夫の中の1つのpopula・

PCR法により検出される異常バンドには，3種tionを示しているにすぎないことを示している．

類の可能性がある．すなわち，①mtDNA欠夫に

症例1，3では，従来のSouthem blot法では，由来するもの，②他のSampleのCOntamination

16．6kbの正常バンドのみが認められたが，PCRによるもの4），③primerの一方が期待した

法ではmtDNA多重欠夫が検出された．生検骨格

mtDNAの部位よりも内側にannealするか，あるいは，primerがともに核DNAの不定の部位に筋の量が少量であったため，PCR法で検出される

annealするものの3種類の可能性がある．これらのうち，②のCOntaminationの可能性に関して

量のDNAを用いたSouthern blot分析によって決定することはできなかった．しかし，PCR法のは，症例ごとに異なる異常バンドがprimer pair

みにて検出される少量の欠失mtDNAであってを適当に選択することにより検出されることから，

も，それらの欠失mtDNAが多種存在し，総体とSampleDNA間のCOntaminationは否定される．
さらに，コントロールでは異常バンドが検出されれ，mtDNA多重欠夫が本症の病因であると考えないことから，PCR反応系への他のSampleのCOntaminationも否定される．（卦のmisannealの欠失mtDNAの正常mtDNAに対する比率を，大しで慢性進行性外眼筋麻痺を発症し得ると考えらられた．

可能性に関しては，primerpairs L790−H1338と文

献L820−H1338を用いたprimer shift法により否定

1）HoltIJ，Harding AE and Morgan−Hughesされる．■しかし，他のprimerpairsに関しては，

JA：DeletionsofmusclemitochondrialDNA

primershift法を施行していないため，misanneal

in patients with mitochondrialmyopathies．

か否かの判断は慎重でなくてはならない．しかし，Nature331：717，1989．

今回用いた6種類のprimerpairsでは，いずれも2）Moraes CT，DiMauro S，Zeviani M et al：

コントロールでは，異常バンドが検出されなかっMitochondrialDNAdeletionsinprogressive−205−externalophthalmoplegiaandKearns−Sayre

4）LoYD，MehalWZandFlemingKA：False−

Syndrome．N EnglJ Med320：1293，1989．

positive results and the polymerase chain
reaction．Lancetii：679，1988．

3）SatoW，TanakaM，OhnoK，YamamotoT，Takada G and Ozawa T：Multiple popula−5）Tanaka M，SatoW，Ohno K，YamamotoT

tionsofdeletedmitochondrialDNAdetected

andOzawa T：Directsequencingofdeleted

by a novel gene amplification method．

mitochondrial DNAin myopathic patients．

Biochem Biophys Res Commun162：664，

Biochem Biophys Res Commun164：156，

1989．

1989．

−206−

38）ミトコンドリアミオパテーのミトコンドリア

DNAの解析
−Kearns−Sayre−Shy症候群の一例について
後

研究協力者

目

古

谷

博 和＊，＊＊山 田

小

林

卓

郎＊

榊

猛＊
佳

之＊■

で髄液蛋白の上昇（90mg／dl）が認められた．ま的KearnS−SayreTShy症候群（KSS）を含むミ
トコンドリアミオパテ一においてはこれまでに筋組織にミトコンドリアDNA（mtDNA）の欠夫が高頻度に存在することが報告されている．しかしながらこの欠夫は末梢血には認められず，欠失
mtDNAの存在は組織により異っており，その機序に関しては不明である．
これまでに我々は3例のミトコンドリアミオバ
ナーについてDNA blotting法とpolymerase
chainreaction（PCR）を用いて欠失mtDNAの検出を試みたが，そのうち2例の筋組織mtDNAに欠夫を認めた．今回そのうちのKSSの一例に関して，mtDNAの欠失領域を決定するとともに筋組織以外のmtDNAに関して欠矢の有無を検討したので以下に報告を行う．
対象・方法
症例は36歳の女性．家族歴，既往歴に特記することはない．30歳頃より眼球運動障害で発症，35
歳頃より年数回起こる痙攣発作を主訴としで九大神経内科を受診した．
神経学的所見では限瞼下垂，全方向への外眼筋
麻痺，近位筋優位の軽度の筋力低下と筋萎縮を認めたが胞底に色素沈着はなかった．検査所見では心電図で不完全右脚ブロック，脳波で全般的な徐汲化，MRI−CTでのCOrticalatrophy，髄液検査＊九州大学医学部脳研神経内科＊＊九州大学遺伝情報実験施設

藤 幾 生＊

た，筋電図で軽度のミオバナーの所見，筋生検でraggedTred fiberが認められ，KSSと診断された．なお組織染色でCytOChrome coxidase部分欠損を認めたが電子伝達系酵素はComplexIV（CCO）を含めて正常範囲内であった．
この患者の筋組織，培養線維芽細胞，末梢血中の白血球のmtDNAを抽出してサザンブロッティ
ング，pOlymerase chain reaction（PCR）によりふtDNAの欠矢の有無を調べ，その塩基配列を決定することでその領域を決定した．
結果

1．制限酵素動〝ⅠⅠ，乃JIで処理後，正常人
cytochrome oxidaseI（COI）領域をプローブ
としてsouthemblottingを行ったところ，mtDNA
中一ヶ所しか認識部位の無い制限酵素fb〝ⅠⅠで処理した場合には，筋組織と培養線維芽細胞から抽出したmtDNAにおいて約16．5kbの正常バンドに加えて約14．5kbの短いバンドが認められた．
この二本のバンドの濃度をdensitometerで比較したところ，欠失バンド濃度は筋組織では正常型の90％と約1対1の比で存在したのに対して，線
維芽細胞卒は24％で約4分の1であった．一方，
白血球では全く検出されなかった．
またmtDNA中に二ヶ所認識部位のあるPst
Iで処理した場合にも筋組織と培養線維芽細胞から抽出したmtDNAにおいて約2．Okb短いバンドが出現していた．
2．この結果から患者mtDNA中には欠夫のあ−207−

ることが疑われたので，次にPCR法を用いて欠失部位の同定を行なった．
図1にPCR法で用いた6種類の合成70ライマーの位置を示した．プライマー20と23，22と24を用いた場合には正常コントロールに比べて差は認められなかった．一方，プライマー25と42を用いたPCRでは，筋組織と線維芽細胞では正常（4．55とcytochrome B遺伝子の間の約1．8kbであることが判明した（図3）．
3．さらに欠失型（2．6kb）のバンドをプラスミ
ドpUC18にサブクローニングしてその塩基配列を決定した結果，欠夫はミトコンドリアゲノムの13，644から15，403まで1）の1，758塩基対であり，欠失部分の塩基配列を詳細に検討すると，欠失開始kb）及び欠失型（2．6kb）の二本のバンドが認められているが，末梢血白血球では正常のバンド（4．5kb）しか認められなかった（図2し
次に筋組織に認められた欠失型（約2．6kb）の短いバンドを切り出して制限酵素地図を作成して欠失部位の位置を予想したところ，制限酵素＆O

部分と融合部分の5′末端に3塩基の挿入を挟んで17塩基の相同性のある配列が存在していた．この，結果NADH dehydrogenase subunit5（ND5）RVと5妙Ⅰ部位の間に欠失部分の存在することが判明した．その部分をミトコンドリアゲノム

NADH dehydrogenase subunitに対応させると，NADHdehydrogenasesubunit

遺伝子とcytochromeB（Cyt．B）遺伝子が融合することが判明した．しかし読み枠にずれはなく，接合部分で新たにアルギニン（Arg）が出現L5（ND5）と

cytochrome B（Cyt．B）が融合した遺伝子が形成されると予想された（図4）．

HumanMitochondrjaDNA（16，569bp）
図1PCR法で用いた6種類の合成プライマーの位置を示す．正常mtDNAではプライマーHF20とHF23を用いてPCRを行なった際には3．8kb，HF22とHF24を用いた際には3．9kb，HF25とHF42を用いた際には4．5kbのバンドが出現する．
−208−

組織ではほぼ同量であるのに対して線維芽細胞では約4分の1にしかすぎなかった．近年Nelson
らはKSS症例の中枢神経系での欠失型mtDNAの分布を検討し，筋組織，脊髄，大脳皮質にも正常型，欠失型がほぼ同量存在することを示している4）．本症例で線維芽細胞で欠失型の量が少ない
ことの理由は現時点では不明であるが，異常mtDNAを多く持つ細胞は増殖能が低く，細胞分裂の頻度が多いほど欠失型mtDNAを有する細胞の割合が減少してゆくと考えられる．この場合細胞分裂の頻度の低い中枢神経系などでは欠失型
mtDNAが多く存在し，頻繁に細胞分裂を行って図2いる線維芽細胞などでは正常型のみが生き残ると考えられる．
しかし，末梢血白血球に欠失型mtDNAを認めたとする報告もあることや4），同じく ミトコンド
リアの異常で起こると考えられているLeber病でプライマーHF25とHF42を用いた際のPCRの結果を示す．コントロールの正常人胎盤組織（レーンC）には4．5kbのバンドが認められている．患者筋組織（レーン1），
線維芽細胞（レーン3）では4．5kbの正常バンドに加えて約2．6kbの短いバンドが出現している．筋組織（レーン1）では4．5kbの正常バンドも薄く認められている．白血球（レーン4）には短いバンドは認められなは遺伝子内の一塩基置換が原因と考えられることなどから5），6），ミトコンドリアミオパテ一において
必ずしも疾患の発症機序が同一とは考えられず，
今後は各症例において筋組織だけでなく全身組織での欠失型mtDNAの分布を検討することが必要であると考えられる．

しヽ

結

考

案

論

mtDNAに欠矢の認められたKSSの一例を報

これまでにミトコンドリアミオパテーの告した．

mtDNAの欠失については数多く報告されている

筋組織同様に培養線維芽細胞にも欠夫の認めらが，その中にはD−loop部分から始まる多種類のれたことから，mtDNAの欠夫は全組織に及ぶこ欠失2）や，direct repeat sequenceを境界としてと，その割合は組織によって異なることが予想さ始まるものなどがある3）．本症例ではD−loop以外

れた．

の部分に欠夫が存在しており，また境界部分に相欠矢部はNADH dehydrogenase subunit 5（ND5）遺伝子とcytochrome B（Cyt．B）遺伝
子の間の約1．8kbであり，境界には17塩基の相同性のある配列が認められた．このことから，相同同性のある領域の存在することなどから欠矢の種類は後者に属すると考えられる．
欠失mtDNAの組織による分布の違いはこれまでにも報告されているが，本症例でも筋組織のみならず線維芽細胞にも同様の欠夫が認められて配列がmtDNA欠失02機序に関与していることが予想された．

いる．しかしながら正常型と欠失型との量比は筋ー209−

SubcTonedFragment

図3 ミトコンドリアゲノムに対応させた欠失領域．筋組織に認められた欠失型約2．6kbの短いバ
ンドを切り出して制限酵素地図を作成して欠失部位の位置を予想した．これはNADHdehy−
drogenasesubunit（URF5）（ND5）からcytochromeB（Cyt．B）に及ぶ（約1．8kb）．
1，758・bp deletion

Wild・tVPe SequenCe

13，644J

ND557−TCACCCTAACAGGTCAACCTCGCTTCCCCACCCTTACTAACATTAAC−3T

Cyt・B

5T−CCTCCCATTCCGATAAAATCAq送呈⊆⊆HACCCTTACTA一旦皇CAATC−3．
†
15，403

Deleted mtDNA secruence

5一一

一

ACCCTAACAGGTCAACCTCGCTTCCACCCTTACTACACAATC−3一

SerLeuThrGiyGinPro旦⊆旦PheHisProTyrTyrThrIie−

ND5−−−■−■−−−−−−■■−−−−−

図4

Cyt．B
……■1■■■■■■■■■■■1■■■■■■■■■■●

欠失領域の塩基配列を示す．上段に正常mtDNAの塩基配列，下段に患者mtDNAの欠規部分の配列を示す．相同性のある部分を下線で示した．
−210−

文

献

4）NelsonIet al：Mapping of heteroplasmic
mitochondrial DNA deletions

1）The numberingsystem forbase position ofhuman mitochondrial

KeamS，

Sayresyndrome・NucIAcidsRes17：8117−

genome sequenceis

8124，1989．

employedinGenBankTM DNAdatabase・2）Zeviani M et al：An autosomal dominant

in5）Wallace DC et al：Mitochondrial DNA

disorderwithmultipledeletionsofmitochon−

deletionassociated

with

Leber

s

heveditary

drial DNA starting at the D−loop reg10n．

optic neuropathy，Science242：1427−1430，

Nature339：309−311，1989．

1988．

3）Yuzaki M et al：Multiple deletionsin6）VilkkiJetal：GeneticheterogeneityinLebermitochondrialDNAatdirectrepeatsofnon

hereditary optic neuroretinopathy revealed−D−loop regionsin cases of familialmito−

bymitochondrialDNApolymorphism・AmJ

chondrialmyopathy．Biochem Biophys Res

Hum Genet45：206−211，1989．

Commun164：1352−1357，1989．

−211−39）ミトコンドリア遺伝子病とミトコンドリア

DNA変異のタイプ
小 澤 高 将＊
研究協力者

大
山

野

欽

司＊

田

中

本

智

子＊

山

本＿株

は じ め に

我々は昨年度，ミトコンドリア・サイトバナー
におけるheteroplasmy型のmtDNA欠矢が，本疾患の分子遺伝学的病因であることを報告した1）．
今回我々は，このmtDNA欠尖の発生機序を検討するとともに，PCR法による小さなpopulationの欠失mtDNAの検出を試みた．
PCR plus Sl分析
始めに，mtDNA欠夫の機序を明らかにするためには，欠失部位の塩基配列を決定する必要があ
る．その準備段階として，我々は，欠失部位を正確に決定する方法を考案した2）．PCR法による増幅とSl nuCleaseによる消化を組み合わせた，PCR plus Sl法の原理を図1左に示す．hetero−plasmy型のmtDNA変異を示す組織には，正常の長さのmtDNAと大きな欠夫をもったmtDNAが混在しており，PCR法を用いてそれぞれを特異的に増幅する．正常mtDNAから断片A−Bを増幅し，欠失mtDNAから断片A−Dを増幅する．これらを混合した後，denatureL，これを急冷してheteroduplexを形成させた．これに1本鎖DNAを選択的に消化するSl nuCleaseを作用させることによって，相補となっていない部分を除去した．
SlnuClease消化に対してresistantな断片の大きさを測定することによって，点Aから星印で示した欠夫の開始点までの距敵を正確に求めることができる．また同様に右端の位置を，断片C−Dと断＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊藤田学園保健衛生大学医学部神経内科＊＊＊愛知医科大学第四内科

雅

嗣＊

佐

子＊＊

藤
佐

弥＊

橋

功…

片A−Dの間でheteroduplexを作らせ，求めることができる．
PCRplusSl法を用いた分析例を図1右に示す．
lanelに示すように欠夫の左端を決定するために，
欠失mtDNAから3．1kbの断片を増幅し，正常mtDNAからは1．9kbの断片を増幅した．lane2に示すように，Sl消化後に0．45kbの断片が出現している．同様に，欠夫の右端を，lane3，lane4で示したように決定した．
図2は，PCRplusSl法で決定した欠失領域を，他の方法で決定した結果と比較したものである．
国立遺伝研の宝釆先生より供与して頂いたクローン化したmtDNA断片を用いたSouthernblot法（A）では，プローブに用いた断片の大きさによって欠失領域決定の精度が規定される．Bは，PCR法に用いるprimerをshiftして，欠失mtDNAか
ら断片を増幅できるか否かによって，欠失部位を決定した結果を示している．この方法では増幅のために作成したprimerの間隔によって精度が規定される．これに対し，PCRplusSl法（C）では，SlnuClease消化にresistantな断片の大きさの測定精度を10％と見積ると，50ないし60bpの正確さで欠失部位を決定することができる．この患者では，欠矢が，ATPase subunit6の遺伝子領域に始まり，CytOChrome b遺伝子の領域に終わっていることが明らかになった．
PCR直接塩基配列決定
このように欠矢の部位を正確に決定した上で，PCR法で増幅した断片の塩基配列をdirect se＿quencingにより決定した3）．始めに，1次増幅を行−212−

PCRplLISトnleぬod

円かで31sIZe（㌫拍NA

1

A

B

↓

C

如plげ−。ati。。
8

A、

3

2

4

D

せ
C D
イ13，1
疇疇1．9

く11．7

−11．0
レ頗erodupleスfor帖Onも
A

8

C

D

イ10．55
∧

●

n

∧

●

U

一喝0．45ヰS RUC滝るSeかgesいonD瞥：十∴トや

図1PCR plus S．method
ATPaseB／6

CO3

ND3

ND4L／4
L568
うト

L820
ー＞

L962

L1108

うト

一一＞

＜−

日1136

8005

9020

8201

9621

8650±50

図2

L1451
う・

＜−

＜−

＜一

日13381日479

H1619

1495516048

14810

16209

15660±60

Deleted regiOn ofmtDNA determined by three different methods

primerのうち，primer2の量を，もう一方のdirect sequencingの結果，この患者では，
ATPase6遺伝子とcytochrome b遺伝子の中にprimerlの量の百分の1になるように加えてそれぞれ存在する5′rATCCCCA−3′の7塩基対のasymmetric PCR増幅を行い，Single strand
DNAを得た．これをtemplateとして，primer2

直接繰り返し配列の問で，7，039bpの欠夫が生じを用いて，通常のSangerのdideoxy nucleotide

子は，frameshiftを起こすことなく欠失部位で連

termination法により塩基配列を決定した．

続しており，ATPase subunit6の一部と，CytO一いdouble strand DNAを得た．これに，2つのていた（図3上段）．この患者における両者の遺伝−213¶

〆一一一二ナ†ニー一一1
5−TTTCCCCCTCTATTGATCCCCATCCTCCATATATcc3

F P P L LI PI L H M S HybrLid
F P P L L I P L W A G T ATPase 6
L I L A M I P I L H M S

8601

ATPase1

6gene

Cytochrome d8646
1

5−ATTTCCCCCTCTATTGATCCCCA−CCTCCAAATATCTCATCAACAA3一

5−ccTCATCCTAGCAATAATCCCCATCCTCCATATATCCAAACAACAA3

王，6。。
図3

Cytochrome jigene l，68エ

PCRdirectsequencingofthecrossingoverregionofmtDNA

Chromebsubunitの一部からなるhybridprotein

その遺伝子産物のアミノ酸配列を図4に示す．

が生成される可能性が示された（図3中段）．両遺typelとして示した13塩基対のdirectlyrepeated

伝子を並べてみると，7塩基対の直接繰り返し配列の右側にも，かなり高いhomologyが見られ，この部位でcross overが起きやすくなっている

SequenCeによって起きる欠矢の場合には，2つ遺ことが示された（図3下段）．mtDNA欠失の生成の機構として，mtDNA上の2ヶ所に塩基配列の繰り返しがあり，その間でrecombinationに類似した機構で，CrOSSOVerが生じていると考えられた．欠夫をもったmtDNAには，H鎖複製開始点

後にTAGのStOpCOdonが生じるため，正常よりとL鎖複製開始点が保持されており，自己複製が可能であると考えられた．また，欠失mtDNAは正常mtDNAよりも短いため，欠失mtDNAは複製の過程で正常mtDNAよりも有利となり，次第

proteinが生成されることになる．7塩基対の長にpopulationを増すと考えられた．これに対し，切りとられた配列の方は，複製能を持たず，消滅
LSouthem blotでは検出されなくなると考えられた．
これまで塩基配列が決定できた欠失部位と，欠る．さらに，CCTというわずか3塩基対のdirect−

夫の結果生じるhybridgeneの塩基配列，さらに，伝子の間にframe shiftが生じ，異常に短い遺伝子産物が生じる．この欠夫では，CrOSSOVerの直短いabnormalATPase8subunitが生じることになる．type2として示した7塩基対のdirectly
repeated sequenceによって生じるin framedeletionの場合には，hybridgeneが生じ，hybrid
さの直接繰り返し配列の間で起こった欠矢では，ATPase6subunitとcytochromebsubunitからなる12kDaのhybrid proteinが生じることにな
lyrepeatedsequenceの間で起こった欠夫では，
ATPase6subunitとND5subunitの一部ずつから構成される69kDaのhybrid proteinが生じると考えられる．これらの欠失領域にはtRNA遺伝子が含まれているため，欠失mtDNAが単独で存−214−

Typel deletion：Frameshift→Deleted protein
4，977・bp mtDNA deletion→5−kI）a abnormalATPase8subunit
8，483
Wild−typeSequenCelAⅥ）ase8gene
5l−AACTACCACCTACCTCCCTCACCAAAAGCCCATAAA−31
ND5gene

5㌧CTCTCACTTCAACCTCCCTCACCATTGGCAGCCTAG−31†
13，459DeletedmtDNAsequencehybridgene
5．−AAC TAC CAC CTA CCT CCC TCA CCA TTG GCA GCC TAG−3．
hybridprotein−Asn TYr His Leu Pro Pro Ser Pro Leu Ala Ala stop

Type2deletion：Inframe→Hybrid protein
7，039・bp mtDNA deletion→12・kDa ATPase6＋Cylb hybrid protein
8，624

Wild−tyPeSequenCe↓
ATPase6gene
5T−CCCCCTCTATTGATCCCCACCTCCAAATATCTCAT−3，
Cyochromebgene 5T−ATCCTAGCAATAATCCCCATCCTCCATATACCAAA−31†
15，662
DeletedmtDNAsequencehybridgene
5T−CCC CCT CTA TTG ATC CCC ATC CTC CAT ATA TCC AAA−3−
hybridprotein−Pro Pro Leu Leu Zle ProIle Leu His Met Ser Lys−

3，717・bp mtDNA deletion→69・kDa ATPase6＋ND5hybrid protein
9，192

Wild−typeSequenCe
ATPase6gene
ND5gene15l−CTTCTAGTAAGCCTCTACCTGCACGACAACACATAA−3．
5l−GCCTTAGCATGATTTATCCTACACTCCAACTCATGA−31†
12，908

DeletedmtDNAsequencehybridgene
hybridprotein

5l−CTT CTA GTA AGC CTC TAC CTA CAC TCC AAC TCA TGA−3T
−Leu

Leu

図4

Val

Ser

Leu

Tyr

Leu

His

Two types ofmtDNAdeletions

−215−

Ser

Asn

Ser

Trp一

在したとすると，そのミトコンドリアは蛋白合成

を0．3kb内側のL能を欠如する．ところが，正常mtDNAと欠失たところ，4．9kbの正常断片に加えて，Aで認められた4本の異常バンドが，それぞれ0．3kb短い断片として増幅された．この結果から，この患者
では欠夫を持ったmtDNAは単一ではなく，多種類の欠失mtDNAが存在し，個々の欠失mtDNA

mtDNAが共存する結果，欠失mtDNAの遺伝情報も発現していると考えられる．つまり，異常な
サブユニットも合成されると予想される．
プレイオプラスミー型mtDNA変異
同様に外眼筋麻痺を呈しながらheteroplasmy型の欠矢が従来のSouthern blot分析で検出されない患者がおり，臨床診断と遺伝子レベルの診断の不一致が見られている．そこで我々は，hetero−plasmy型の変異を示さない患者においては，Southern blot分析の検出限度以下の量の欠失に移動させてPCRを行なっのpopulationは小さいものの，その総体としては，症状を引き起こす閥値に達していると考えられた．このmtDNA多重欠夫をpleiosplasmy型
mtDNA変異と我々は命名した．pleioplasmy型のmtDNA変異は，外眼筋麻痺を主徴とする疾患
以外にも広く存在する可能性があり，各種疾患の病因となっている可能性がある．

mtDNAが存在していると考え，PCR法による欠失mtDNAの検索を行なった4）．primer shift

ま

と

め

PCR法にて，患者の骨格筋mtDNAを増幅した

ヒトにおけるmtDNA変異を，我々は3種類に結果を図5に示す．Aに示すように5．2kb離れた分類した．第1には，Leber氏病におけるhomo−primer対を用いてPCRを行なうと，正常の断片に加えて，コントロール（C）では検出されない，

plasmy型の変異がある．第2には，Kearns−

少なくとも4本の異常バンドが患者（P）におい

marrow／pancreas syndromeにおけるhetero−て検出される．次に，misannealingによる異常バ

plasmy型の変異があり，このtypeのmtDNA欠

ンドを否定するために，Bに示すようにprimerL

夫の発現機序として，今回報告したようにdirect−

Sayre症候群，慢性進行性外眼筋麻痺，Pearson s

■1．0

−0．8
■0．65

−0．45

図5

Multiple populations of deleted mtDNA−216−

1y repeatedsequencesの間に生じるrecombina−

amplification ofdeletedmitochondrialDNA

tionに類似した機構が働いていると考えられた．

from a myopathic patient and analysis of

第3には，Kearns−Sayre症候群や慢性進行性外deleted region with Sl nuClease．Biochim

眼筋麻痺におけるpleioplasmy型の変異がある．
これは，主にPCR法によって検出される変異で3）Tanaka M，SatoW，Ohno K，YamamotoT

ある．我々は，これらのmtDNA変異によって起

andOzawa T：Directsequencing ofdeleted

きる一連の疾患をミトコンドリア遺伝子病と呼ぶ

mitochondrial DNAin myopathic patients．

ことを提唱しており，従来のミトコンドリア・サ

Biochem Biophys Res Commun164：156，

イトパテ一に分類される疾患のみではなく，老化

1989．

Biophys ActalO09：151，1989．

の諸過程や神経および筋の各種変性疾患において4）SatoW，TanakaM，OhnoK，YamamotoT，も広く認められると考え5），さらに検索をすすめ

Takada G and Ozawa T：Multiple popula−tionsofdeletedmitochondrialDNAdetectedている．

by a novel gene amplification method．

文

献Biochem Biophys Res Commun162：664，

1）Ozawa T，Yoneda M，Tanaka M，Ohno K，

1989．

SatoW，SuzukiH，NishikimiM，Yamamoto5）Linnane AW，Marzuki S，Ozawa T and

M，NonakaIandHoraiS：BiochemBiophys

Tanaka M：Mitochondrial DNA mutations

Res Commun154：1240，1988．

as animportant contributor to agelng and2）Tanaka−Yamamoto T，Tanaka M，Ohno K，degenerative diseases．Lanceti：642，1989．

Sato W，Horai S and Ozawa T：Specific−217−40）Kearns−Sayre症候群における異常
ミトコンドリアDNAの解析
垂

清一郎＊

＊
＊

れている4）．我々はKearns−Sayre症候群7例の骨格筋ミトコンドリアDNAをSouthern blot法
によって解析し，1．4kbから5．6kbの欠矢を伴う

リア内膜電子電達系酵素活性は2例がcomplex
I＋lII低下，1例がcomplexI＋III，IVともに低下，他の4例は正常範囲を示した5），6）．
骨格筋ミトコンドリアDNAのSouthern b10t

5例を兄いだした．本研究ではこのDNA欠失機序の解明を目的として，ミトコンドリアDNAの欠失断端周辺の塩基配列を決定した．

解析：生検筋約20mgから抽出7）した全DNAを
BamHI，EcoRI単独消化，BamHI／PstI二

対象と方法

表1KeamS−Sayre症候群症例の臨床的特徴
1＊

2

3

4＊

Age（Yr）／seX

53／M

47／F

20／M

Age of onset

20

15

14

Ophthalmoplegia
RetinaI degeneration

5＊

6＊

＋

＋

＋

7＊

32／M

40／M

23／M

22／M

22

15

10

18

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

44

253

35

＋

＋

＋

＋

＋

＋

HearJngloss＋

Hearl bIock＋

CSF protein（mg／dJ）

51

70

82

58

Ragged−red fibers

＋

＋

＋

十

＋

＋

十

十

Exercise jnducedlactacidemia＊の一つとしてslippedmispairingmodelが提唱さ

Limb muscle weakness＊＊

対象としたKearns−Sayre症候群症例は完全型
1例，心伝導障害を欠く不全型6例で，これら全例において外眼筋麻痺，網膜色素変性，難聴，エルゴメーター運動負荷試験での乳酸，ピルビン酸
異常増加，生検筋のragged−red fibersを認めている（表1）．生検骨格筋の湿重量当りミトコンド

Kearns−Sayre症候群ではミトコンドリア
DNAの部分欠失例1ト3）が存在し，その欠失機序

Case

郎正聴

嘉

＊

川景来

西梅宝

＊

＊

聡之郎

知史

＊

は じ め に

野道藤

＊

上上依

久行俊

文信晴

栽培村

曽高藤

研究協力者

井

＊DeJetions of mitochondTjal DNA＊大阪大学医学部第二内科神経内科＊＊国立辻伝学研究所

−218−

・

重消化後，アガロース電気泳動で展開し，ナイロ
ンメンブレンに転写，ハイプリグイゼーションを行った．プローブはヒト胎盤組織から抽出精製したミトコンドリアDNAを用いた．ミトコンドリ

アDNA欠失部位のより正確な同定には，国立遺伝学研究所宝来聴先生から供与されたミトコンド

症例4，5，7はほぼ同一部位の欠夫を有しているが，ミトコンドリア内膜電子伝達系酵素活性はそれぞれcomplexI低下，IV低下，正常であり，欠失部位と活性低下との関連は見られない．
欠失周辺塩基配列の解析から，症例4は10bp
directrepeat

ACCGCTAACA（9007−9016，

リアDNAクローンをプローブとして用いた．
欠失断端周辺塩基配列解析：Southern blot解

14566−14575）問の5569bp，症例5は5bp direct

析の結果，同定された欠失領域の100−300bp外側に相当するprimer（20−23mer）を合成し，pOly−
merase chain reaction法にて欠失断端周辺を標的として特異的に増幅した．この増幅されたの5555bp，症例7は13bpdirectrepeat

DNA断片を適当な制限酵素で消化後，M13ファージに組み込み，ジデオキンヌクレオチドー酵素法にて塩基配列を決定した．個々の症例における異常ミトコンドリアDNAの塩基配列を正常配列8）と比較し，断端配列の特異性について検討した．

repeatCCCAC

CCTCACCA（8560−8564，14115−14119）間

ACCTC（8470−8482，13447−13459）問の4977bpが欠失していることが明らかとなった．症
例5における5bpdirectrepeat CCCAC は正常
ミトコンドリアDNA中に60カ所存在しているにもかかわらず，その欠夫は他の2例とほぼ同一の部位に生じていた（図2）．症例1ではその欠失断
端にdirect repeatは存在せず3383bp（12497−
15879）の欠夫であった（図3）．この欠失断端周
辺部位の正常ミトコンドリアDNA塩基配列を用いて，欠夫の5′端，3′端の配列を比較すると高い

結果

homologyが認められた（図4）．

Southern blot解析により同定された欠矢の大きさ，部位を図1に示す．欠夫の大きさは，それ
ぞれ症例1は3．5kb，症例4は5．6kb，症例5は5．5kb，症例6は9．2kb，症例7は5．Okbであった．欠失部位はATPase6／8からND5／6にかけての
hot spot と呼ばれている部位に集中している．
OH

考

案

Schonらは，ND5およびATPase8にある13bp
directrepeatでの欠夫を多数例に兄いだし，この事英からミトコンドリアDNA欠失機序として，DNA複製過程でDNAが一本鎖になった時生ずるdirect repeat間での欠失，つまりslippedmispairing 仮説9）を提唱している4）．そして，この13bpdirectrepeat

は

H∝8山

Sd

L−Strand

ACCTCCCTCACCA

こ：；：

5

ACCTCCCTCACCA

日

日

（2）
ACCGCTAACA

田

口

日

（3）

CCCACロ【ⅧⅧDD C＋【川口
（60）

図1

図2

Southem blot法により同定されたミトコ
ンドリアDNA部分欠夫の局在−219−

EE］t］皿川MEElmD

Case5

ミトコンドリアDNA欠失断端に兄いだされたdirect repeatの局在，個数

また，directrepeatが多数かつ広範囲に存在するにもかかわらず欠夫はほぼ同じ領域に集中していることから， hotspot での欠夫がdirectrepeatの存在のみで規定されるものではなく，他の因子が関与している可能性が考えられる．さらに欠失断端にdirect repeatが存在していない1症例を兄いだしたが，この断端周辺部に相当する塩基配列には13bp中11bpのhomologyが認められた．
結語

1．Kearns−Sayre症候群5例で3．5〜9．2kbのミトコンドリアDNA部分欠夫が，いわゆる hot
spot

領域に存在していた．

2．欠失断端に5bp，10bp，13bpdirectrepeatを有する3症例を兄いだした．他の1症例にはdirect repeatは存在しなかった．
文献1）Lestienne P and Ponsot G：Kearns−Sayre
図3

Syndrome with musclemitochondrial DNA

症例1におけるミトコンドリアDNA欠夫
断端のSequenceオートラジオグラフィー
像
ND

deletion．Lancetl：885，1988．
2）Zeviani M，Moraes CT，DiMauro S et al：Deletions of mitochondrial DNAin KeamS−

5

Sayre syndrome．Neurology38：1339−1346，

12496

5LCCCCACAACAATA

5−AACAAAATACTCA

1988．

TCATGTGCCTAGAC−33）Moraes CT，DiMauro S，Zeviani M et al：
ATGGGCCTGTCCTTq3

15580

Mitochondrial DNA deletionin progressive

Cyt b tRNA（Thr）

externalophthalmoplegiaandKearns−Sayre
Syndrome．N EnglJ Med320：1293−1299，

Maximum Homology
CCCCACAACAATATTCA TGTGCCTAGAC＊＊＊＊ ＊＊＊＊ ＊＊＊＊＊ ＊＊＊＊ ＊ ＊AAAACAA AATACTCAAATGGGCCT GTCCTT

図4

1989．

4）Schon EA，Rizzuto R，Moraes CT etal：A
direct repeatis a hot spot forlarge−SCale

症例1の欠失断端周辺塩基配列とhom0−
logy分析

deletion of human mitochondrial DNA．
Science244：346−349，1989．

ミトコンドリアDNA中に二カ所（8470−8482，
13447−13459）存在しており，この領域がspot5）OgasaharaS，NishikawaY，YorifujiSetal：

hot

Treatment of KearnSLSayre syndrome withであるとしている．我々はSchonらと同一

COenZyme Ql。．Neurology36：45r53，1986．

の13bp direct repeatに加え，新た、に5bp，10bp

6）YorifujiS，OgasaharaS，TakahashiMetal：

direct repeat間での欠夫を兄いだし，Slipped

Decreased activitiesin mitochondrialinnermispairing機序によると思われる欠夫が5bpという短い配列間でも生じうることを明らかにした．

membrane electron transport system

inmuscle from patients with Kearns−Sayre
220−

Syndrome．J NeuroI Sci71：65−75，1985．

mitochondrialgenome．Nature290：457−465，7）Davis LG，Dibner MD，BatteyJF：Basic
methodsinmolecularbiology，EIsevier，New
York，1986，pp47−50．

1981．

9）EfstratiadisA，PosakonyJW，ManiatisTet
al：Thestructureandevolutionofthehuman8）AndersonS，BankierAT，BarrellBGetal：
Sequence and organization of the human−221−

βLglobingenfamily．Cel121：653−668，1980．

ⅤⅠⅠⅠ．ミトコンドリア（2）41）MERRFの臨床知見補遺
福 原 信 義＊
研究協力者

米

持

洋

介＊

馬

場

鈴 木 正 博＊＊＊米 田

広

子＊

長

MERRF（ミトコンドリア異常を伴うミオクロ症

ーヌスてんかん）l）が最初に報告されてから約10年がたち，その間に多数の症例が報告され，その疾患としての臨床的，病理学的特徴は明らかになってきたように思われる．
国立療養所犀潟病院において，1988年4月より

症例1 42歳 男性
主訴：歩行障害

1989年10月までの入院患者でミオクローヌスを主訴とする患者13例の疾患別頻度（表1）で最も多いのは遺伝性歯状核赤核被殻ルイ体萎縮症（DRPLA）の5例，ついでMERRFの3例となっており，DRPLAとMERRFの2つが進行性ミ
オクローヌスてんかんの原因として最も多いことが判る．この最近経験したMERRFの3例を今までの経験例2）と比べて，MERRFの鑑別診断上の問題点を述べたい．

表1

ミオクローヌスの原因疾患

国療 犀潟病院入院患者
1988．4〜1989．10

DRPLA
MERR F
中毒（DPH；CBZ）
GM2 ガングリオシドーシス
Lance−Adams症候群
CreutzfeIdt−Jakob病

計＊国立療養所犀潟病院神経内科＊＊新潟県厚生連中央病院＊＊＊長岡赤十字病院＊＊＊＊新潟大学神経内科

5例
3
2
1

1
1

13例

島

勝＊＊

誠＊書目
例

家族歴：類似疾患は見られない
既往歴：生来，知能がやや低かったという．19歳時，胃潰瘍で手術
現病歴：29歳より視力障害があり，眼科医より網膜変性症，白内障と診断され，白内障の手術をうけている．32歳時にミオクローヌスによると思われる脱力発作があり，てんかんの診断を受けている．当時，眼底で視神経萎縮の所見が見られている．34歳頃よりやせが目立ち，次第に歩行が障害されてきた．36歳になると小脳失調が著明となり，
アステレキンスも目立ち，38歳時には某病院に入院しているが，当時全身の激しいミオクローヌス発作が認められている．その後も歩行障害がます
ます強くなるため，42歳時にリハビリのため国療犀潟病院に入院している．
入院時所見：知能低下（長谷川10点），外眼筋は正常，胆振（＋），感音性難聴（＋），構語障害（緩徐言語）．四肢筋は下腿の筋力が低下，筋萎縮はび浸性だが近位筋優位で特に上肢の筋萎縮が著明であった．線維束攣縮（−）．アキレス腱反射消失，
両側バビンスキー，チャドック反射（＋）．表在感覚は正常，深部感覚は下肢で著明低下．足変形はないが，左足は下垂していた．上下肢の小脳失調がはっきりしており，支えなしでは立位を維持できなかった．時々，ミオクローメスによる脱力発
作，動作性，企図性ミオクローヌスがみられた．
神経因性膀胱（膀胱収縮筋括約筋協調不全）（＋）．

検査成績：脳CT：小脳，脳幹部萎縮．脳波：放波，妓徐波が頻発．血液乳酸（表2）：正常．大腿
−225−

表2

（十），握力やや低下，下肢深部反射消失，バビン
スキー，チャドック反射（＋），上下肢，特に下肢の小脳失調が著明で歩行器を必要とする．表在感覚は正常，深部感覚は低下．両上肢，体幹にミオ
クローヌスがあり，転倒しやすい．

血中乳酸・ピルビン酸値
乳

酸

ビルビン酸

症例1安静時 7．9−9．2喝／dl O．62−0．48喝／dl
運動後 14．6
0．73
症例2 安静時 17．6
運動後
55．2

1．16
1．63

症例3 安静時
運動後

1．20
2．02

27．9
60．7

正常（安静時）3．3−14．9

検査所見：脳CT：大脳，特に側頭葉の萎縮，脳幹，小脳の萎縮．脳波：2．5Hzの妹徐波，光刺激で3Hz群発波を誘発．体性感覚誘発電位（図）：0．30−0・94

24．3〟Ⅴの巨大波（＋）．大腿四頭筋生検：ミトコ
ンドリア異常（＋），電子伝達系酵素の分析では異常は認められなかった．
症例3 26歳男性

四頭筋生検：ミトコンドリア異常（＋）．
症例2 67歳女性
主訴：歩行障害
家族歴：兄弟，息子（症例3）に同様疾患
既往歴：小児期より中耳炎で難聴があった．

主訴：歩行障害
既往歴：特に無い
現病歴：6歳ごろより走るのが遅くなる．15歳よりミオクローヌスのため手が不器用になり，階段より転げおちることがあった．17歳時，自転車で

現病歴：57歳頃より難聴が強まり補聴器使用．62
歳時，全身痙撃発作があり，脳波で♂波による群
発波（＋）で抗痙攣剤の服用開始．66歳より歩行が徐々に障害されてきた．67歳時，精査目的で国療犀潟病院に入院．
入院時現症：IQ76，断綴性言語，感音性難聴
SUEEP

48．88mS

588

転倒，意識消失のため長岡赤十字病院受診し，脳波異常にきづかれ，てんかんの診断を受ける．20
歳時，歩行時のふらつきがあり，ミオクローヌス
てんかんの診断を受ける．歩行失調，ミオクロー

TIMES REJECT8
HFF 1845（×−Y PL8TTER）

目玉

川TENSITY
IHTERURL
DURRTIOH

CAL

SEP

88リ
8．255
0．3 mS

2．88．U
4．8れS／dlVPOS．暮l M．R t
コ

図
−226−

ヌスはその後徐々に悪化する．25歳時，新潟大学に入院，筋生検でMERRFの診断．その後も歩行

roidlipofuscinosisについで多い疾患となっている．表3に今回の3症例の臨床症状をまとめ，今までの報告例2）における症状頻度と比較した．症
例2の62歳の発症というのは今までの報告で最高年齢の発症であり，息子（症例3）が6歳で発症しているのと比較すると同一家系内における経過の違いに注目される．

障害が強くなるため26歳時に国療犀潟病院に入院．
入院時現症：IQ72．視神経萎縮（＋），構音障害（＋），四肢はび漫性に筋萎縮，筋力低下があり，上下肢の小脳失調も中等度にあるため，移動には歩行器を必要とする．深部反射消失，バビンスキ
ー，チャドック反射，足クローヌス（＋）．表在感覚は正常，深部感覚は低下．凹足（＋）．上肢にアステレキシスがあるほか，動作性ミオクローヌスのためしばしば転倒した．

症例1で白内障があったが，今までMERRFでの白内障の報告は無い．しかし，20歳台で白内障が生じていることと，Greeneら4），Sengersら5）により白内障を伴うミトコンドリアミオバナーの家系が報告されていることから症例1の白内障もミトコンドリア代謝の異常と何らかの関係を持って検査所見：脳CT：小脳萎縮著明，大脳萎縮は軽度．脳波：多辣徐波，♂波群発（＋）．
考生じてきたものと思われる．症例1では入院当初
300−1，000mlの残尿があったが，ミニプレスにより残尿が軽快している．症例3でも300mlの残尿があったが，今までMERRFで排尿障害の報告はなくこれから注目していかねばならない症状の1つと思われる．

察

表1のように，症例数は少ないが進行性ミオク
ローヌスてんかんの1／3はMERRFであり，
MERRFは今まで考えられていた以上にポピュラーな疾患と思われる．表4にMontrealNeuro・
logicalinstituteにおける進行性てんかんの疾患

体性感覚誘発電位では，症例2でP25，N33の巨大電位がみられた．MERRFにおける巨大SEP

別頻度3）を示したが，そこでもMERRFはce−
表33症例のまとめ

症例 1
42歳男

症例 2
67歳女

症例 3
福 原
26歳男 （1987）

発病年齢 （蔵）

3〜42
︶

2

7

85

︶

％

52．9
42．9

︶
︑

︶

′

︶

︶
︶

︑

︶

︶

1

︶

′

︶

︶

6

︶

︶

9 9 4

ノ

︶

0

︑

︶

09
06

︶

︶

117
261

1

︶

︶

01
08

︶

︶

＋ ＋ 一 十 十 十 一 ＋ 十 十 十 ＋ ＋︶▲ ∧ u く く く く く ′ l く ︵ く く ′ l ′ し く
l
︵

︶

227

︶

7

白内障

6

一 ＋ 一 ＋ 十 十 一 ＋ ＋ ＋ 一 ＋ ＋Q ︵ ︵ ︵ ︵ ︵ く く ︵ ︵ ︵ く く く
l
︵

︶

0

点

く

十十＋＋＋＋一＋＋＋＋＋＋

式I↓↓↓↓−−−IトII↓

長

害行下覚覚失射害ス撃口性

副 ′−︑︵︵︵︵︵︵︵︵︵くく︵反ス

障誤読柑㌔憲

害

詠 ︒射幸

調

深バ排ミ全

語諾矧 削㍑尿管

知視難眼言小筋感

能 低 下
神 経 萎 縮聴振表43）MERRFでも白内障，神経因性勝胱がみられ進行性ミオクローヌスてんかんの原因疾患（MontrealNeurologicalInstitute，1960L
1989，E．Andermann et al，1989）
患者数

る．
4）血中乳酸，ピルビン酸値は必ずしも診断には役立たない．

家族数5）他のミトコンドリア脳筋症との鑑別にはUnverricht−Lundborg病
Lafo「a病

SEPが役立ちうる．
2
1

237133120348234120

Ce「OidIipofuscinosis
幼 児 型
若 年 型
成 人 型
ミトコンドリア脳筋症
腎不全ミオクローヌス症候群
神経軸索ジストロフイ
分類不明
Ramsay Hunt症候群

文1）Fukuhara N，Tokiguchi S，Shirakawa K
et al：Myoclonus epilepsy associated withragged−red fibers（mitochondrial abnor・
malities）．Disease entity or a syndrome？
Light一andA【コelectronmicroscopic

studiesof

twocasesandreviewofliterature．J NeuroI

62

計

献

Sci47：117−133，1980．

は未だ1，2の論文にしかみられないが，電気生

2）福原信義：ミトコンドリア脳筋症，神経進歩

理学的にはMERRFのミオクローヌスも他の進
行性ミオクローヌスてんかんと同様であるという

31：604−616，1987．

3）福原信義：Ramsay Hunt症候群と福原病．神点と，MELASなど他のミトコンドリア脳筋症との鑑別にSEPが役立ちうるという点で重要と思

経進歩34：125−133，1990．
4）Greene HL，Schubert WK and Hung G：

われる．

Chroniclactic acidosisofinfancy．J Pediatr
76：853−860，1970．

結論5）SengersRCA，TerHaarBGA，TrijbelsJMF

1）MERRFは進行性てんかんの原因として本

etal：Congenitalcataractandmitochondrial

邦ではDRPLAと並んで多い疾患である．

myopathy of skeletal and heart muscle

2）MERRFでは60歳以上の高齢発症があり，同associatedwithlacticacidosisafterexercise．

一家系内でも発症年齢が異なることがある．

J Pediatr86：873−880，1975．

−228−42）ミトコンドリアミオパテーの3lp MRspectroscopyによる検討
田 代 邦 雄＊
研究協力者

伊

藤
島

和 則＊ 宝 金 清 博＊＊
功 二日＊森 若 文 雄＊

は じ め にミトコンドリアミオパテ一に対して酵素学的また遺伝子学的アプローチがなされ，その病因が徐々に解明されつつある．九日戒財の状態で筋肉内のエネルギー代謝を測定することはMRI
SpeCtrOSCOpyが出現するまでなかなか容易ではなかったが，最近筋肉内のpH，Pcr／Pi（クレアチ
ニンリン酸／無機リン），ATP等のパラメータにて細胞内のエネルギー代謝が測定可能になり，非侵襲的にまた容易に行えるようになってきた．今回われわれはミトコンドリアミオパテーの症例に対して，CoQ投与前後の筋肉のSpeCtrOSCOpyを施行した．またMELASの2症例に頭蓋内の病変部に対するspectroscopyも経験したので報告する．
方法と症例
A：前回の本会議で報告した家族歴を有する症
例で特に44歳の男性を1年間経過観察した．症状は眼瞼下垂，外眼筋麻痺，胸鎖乳突筋の筋力低下を認めた1）．
上腕二頭筋の筋生検はGomori Trichrome染
色でragged−redfiberが認められ，酵素学的検索
にてCCO（cytochrome c oxidase）の活性低下を認めた．治療としてCoQ60mg／day，イデベノン
90mg／dayを使用した．治療前後の血液中の乳酸，
ピルビン酸の比較では，治療後ピルビン酸が0．4（0．74）と正常値まで改善している．症状では＊北海道大学医学部神経内科＊＊札幌麻生脳神経外科病院＊＊＊国立療養所札幌甫病院

眼除下垂が軽度改善した．しかし外眼筋麻痺に改善は認められなかった．
Siemens社Magnetom（磁場強度1．5Tesla）を用いて5インチのSurfacecoilを被検者の膵腹筋に置き，安静時及び運動負荷前後の筋肉内のエネ
ルギー代謝を経時的に測定した．ATP，Pi，PcrのSpeCtraが分隠され，Pcr／Piを計算し，時間による推移を検討した．
B：MELASと思われる2症例に対して頭蓋内病変部の31P MRspectroscopyを施行した．
症例1：15歳 男性

主訴：口がうまく回らない，うまく歩けない．
経過：昭和63年7月頃に歩行の不安定さ，階段の昇降がつらいことを自覚し，某医を受診し，左後頭葉にCTで異常低吸収域を指摘された．10月
30日全身性痙撃を起こし，以後入退院を繰り返した．平成1年8月上旬，両手の痙攣が出現し，右第3指を中心とした不随意運動が出現するため，
某医より当科に紹介入院となった．
既往歴：特記すべきことなし
家族歴：特記すべきことなし
神経学的陽性所見では軽度意識障害（Ⅰ−3）
があり，脳神経系では右同名半盲，側方注視眼振，
対光反射減弱が改められた．運動機能は右癌性片麻痺，腱反射冗進，また腱反射の左右差があり，知覚機能では右感覚鈍麻が認められ，また四肢失調があった．高次脳機能検査ではGerstmann症
候群と知能検査（WAIS：動作性検査IQ＜60，言語性検査IQ＜60）は高度の知能低下が認められた．
検査所見では乳酸，ビルビン酸以外の血液，生−229−

化学，検尿，内分泌すべて異常なかった．
血液中
乳酸

髄液中

12・8mg／dl（9．0−16．0）56．5mg／dl

ピルビン酸1．40mg／dl（0．36−0．59）2．02mg／dl

で右側頭一後頭葉に異常高信号域が新たに認められ，以前の病巣（左側頭一頭頂一後頭葉）はやや縮小されていた（図1）．
症例2：10歳 男性
主訴：痙撃発作な高信号城と左後頭葉内面にも同様な異常高信号

現症：生来健康で正常な発育を示していたが，昭和63年12月12日，突然ベットから転倒し，口角から泡をだしているところを発見された（失禁もともなっていた）．
既往歴：特記すべきことなし
家族歴：特記すべきことなし域を認めた．また入院後約2か月後に同様な条件

神経学的陽性所見では意識清明であり，脳神経，

ECG，ChestX−P，腹部Ⅹ−Pすべて異常なかった．
MRIのT2weightedimage（TR3000msec，

TE90msec）の画像では左側頭一頭頂葉に広範囲

図1

症例1の入院時（上段）と入院後約2か月後のMRIを示す−230−

運動機能，感覚機能，小脳機能すべて正常であった．

検査所見は血液，生化学，電解質，尿検査に異常を認めず．

乳酸

血液中21．3（9−16）mg／dl

ピルビン酸

2．38（0．36−0．59）mg／dlの治療効果をPcr／Piをパラメータとして使用して検討した．運動負荷前のPcr／Piは治療前後と対照との差は認められなかった．対照では運動負荷前後でもPcr／Piに変化は認められないが，この症例は運動負荷後約2〜3分でPcr／Piが低下
し，その後に前値に回復するために約8分要した（図3）．しかしこの症例に約8か月の治療を施行した後，同様にPcr／Piを運動負荷前後で見ると治療後のPcr／Piの低下は改善し，また前値に回他の検査所見（ECG，ChestX−P，腹部XrP等）
も異常を認めなかった．
上腕二頭筋の筋生検では筋原性の変化が認められるがGomori Trichrome染色でもragged−redfiberは出現しなかった．
酵素学的検索NADH cytochrome c reductase

556．5

Succinate cytochrome c reductase

1339．5

Cytochrome c oxidase

611．1

これらの電子伝達系酵素活性はすべて正常範囲であった．
MRIは（TR3000msec，TE80msec）側頭一後頭葉の境界部に異常高信号域が認められた

復するまでの時間約6分と短縮が認められた．これは症状の改善と同様な相関が見られ，治療効果の判定に3lP MR spectroscopyが非常に有用であると考えられた．
2．症例1の頭蓋内病巣における3lP MR
SpeCtrOSCOpyを示す（図4）．左患側と対称の健側部位をFrogs法にて比較検討した．左側は比較的分離が良好であるが，健側はPcr，Piを含めた分離がやや不良であったが左右のPcr／Pi，pH等に差は認められなかった（図4）．
症例2においてPcr，Piが分離されているが，ATPが分離不良であったが，Pcr／Piは明らかに低下し，pHは6．72と酸性側に偏位した（図5）．

（図2）．
結

果

1．ミトコンドリアミオパテーの症例に対して

図2

考察
ミトコンドリア脳筋症におけるlactic acidosis
は異常ミトコンドリアによるピルビン酸代謝の障症例2のMRIを示す
−231−

r

P

c

r

く1 ，8 3 士

P

c

r

／

P

i

t

l

t

1 ．

2

1

1 ．

6

2

E

0 ．

7

8

1 ．

0

0

E

0 ．

5

9

0 ．

5

1

0 ．

6

3

0 ．

7

8

6 ．

7

8

7 ．

0

6

1 ．0 3 ）／PM（ 1 ．3 0 ± 0 ．5 2 ）

P

c

r

／

P

D

く0 ．5 5 ± 0 ．1 3 ）

P

c

r

／

P

−A

T

P

（1 ．8 8 ± 0 ．8 8 ）PH（7 ．0 4 ± 0 ．0 7 ）

O pre

図3

5

10（min）

ミトコンドリアミオバナーの症例の筋肉内での3lP MR spectroscopyから得られる
Pcr／Piの運動負荷前後での時間的推移を見た害に起因し，この解糖系の促進はADPのリン酸化の程度により，加速される．31PMRspectros−
COpyは特に細胞内のpHの変化を安静，運動負荷後でモニター可能であり，またPcr／Piの低下はミトコンドリアミオバナー以外にもDuchenne型
筋ジストロフィー症，多発性筋炎，その他でも認められるが，これらはすべてミトコンドリアの機能異常（1次性，21欠性）にもとづく疾患で起こることが指摘されている2）・3）．
Pcr／Piは運動負荷による変化を経時的に観察することはミトコンドリアの機能（動態）を反映する指標としてもっとも有効であり，また特異的である．今回治療の指標としてPcr／Piの経時的検討をおこなったが，臨床症状の改善と平行して
Pcr／Pi低下の度合が減少し，前値までの回復時間の短縮を認め，容易にしかも鋭敏に変化が観察可能であった4ト6）．
MELASは多彩な臨床症状を示し，また進行性であり，神経症状の他に心電図上の異常を含めた全身の障害が認められる．今回われわれは2例のMELASを経験し，症例1は症状が常に進行し，それに伴いMRIにて病巣の拡大と古い病巣部の縮小傾向を認め，当初は病巣部の浮腫が出現し，

図4

症例1の頭蓋内病巣部の3lP MR
SpeCtrOSCOpyとそれぞれのパラメータの比を示す

周囲組織への圧迫をも出現した．
症例2は1年間経過観察をおこなっているが，症状の進行，また病巣部の拡大も認められない．
頭蓋内の病変特に脳梗塞，脳腫瘍などの3lP MR
SpeCtrOSCOpyは散見されるが，MELASの病変部に対する検討はわれわれが調べる限りではまだ報告されていない．今回症例1のSpeCtraの分離状態が不良であり，これはテクニック上の問題かと思われた．そのために息側と健側のPcr／Pi等の差が認められなかった．また症例2は病巣側のPcr／Piの低下，pHの酸性側への偏位を認めた．

−232−

15

10

5
図5
結

0

−5

−10

−15

−20

PPM

症例2の頭蓋内病巣部の3lPMRspectroscopyを示す
語

Clinicalbiochemistry．AnnNYAcadSci428：

1．ミトコンドリアミオパテーの症例にCoQを約

318−332，1984．

1年間投与したが，臨床症状の改善と筋肉内

3）Chance B，Clark BJ，Nioka S et al：

での3lP MRspectroscopyのPcr／Pi（運動負荷前後）をCoQ投与前後で比較すると臨床

PhosphoruS nuClear magnetic resonancespectroscopyinvivo．Circulation75（suppl）：

症状と平行してPcr／Piの低下と前借に回復

103−110，1985．

するまでの時間の短縮が認められた．
2．MELASの2症例に頭蓋内病巣部の3lP MR

4）Radda GK and Taylor DJ：Application of

SpeCtrOSCOpyを施行した．症例1は病巣側とpathology．IntRevExpPath012：1−60，1985．

正常側との差は認められなかった．症例2は病5）ArgovZ，BankWJ，MarisJetal：Bioener−

巣側のPcr／Piの低下が認められた．

nuclear magneticresonance spectroscopyln

getic heterogeneity ofhumanmitochondrial
myopathies：phosphoruSmagneticresonance文

献

SpeCtrOSCOpyStudy．Neurology37：257−262，

1）田代邦雄，伊藤和則，斉藤敏之，森若文雄，島功二，菅野富夫：ミトコンドリア電子伝達系の検討（第3報）． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病

1987．

6）Am01d DL，Matthews PM and Radda GK：
Metabolic recovery after excercise and theassessment of mitochondrial function

in

態とその成因に関する研究 （杉田：旺）昭和63年

human skeletal musclein vivo by means

度研究報告書，1988，pp177−181．

Of31P−NMR．Magnetic Resonance Medl：

2）Chance B：Application of

31P−NMR to−233−

307−315，1984．

43）ComplexI欠損症によるLeigh脳症と思われる2例
斎

研究協力者

田

孝

藤 井 達 哉＊＊ 奥彦＊

野 武 彦＊＊ 三 河 春 樹＊＊

は じ め にLeigh脳症は主として乳幼児にみられる変性疾
患で，眼振，低筋緊張，喋下障害，痙性麻痺等，多彩な症状で発症する．その原因として，
pyruvate carboxylasel），pyruVate dehy−
drogenase complex（PDHC）2），CytOChrome c
OXidase3），NADH−CoQ reductase（complexI）4）〜6）等の欠損が報告されているが，それらのう
ちで，PDHCおよびcytochromecoxidase欠損症が最も多くみられる．一方，COmplexI欠損によるLeigh脳症の発症は，我々の知る限り3例の図1症例1左：1歳3ヶ月時のCT．両側被核，中脳に低吸収域を認める．右：4歳9ケ月時のT2強調MRI（TR2500TE80）．
高信号域を両側被核，尾状核頭部に認める．
脳室拡大，皮質萎縮もみられる．

報告しかない．今回我々は，臨床的にLeigh脳症と診断された2例にcomplexI欠損を認めたので報告する．
症例

症例1：4歳女児．家族歴に特記すべきものはな
い．満期安産で出生したが，頸定7ヶ月，つかま
り立ち13ヶ月と，発達遅滞に気づかれていた．1
歳2ヶ月時に，左眼瞼下垂が出現し，その後さらに両側眼瞼下垂と外眼筋麻痺が出現した．その1
ケ月後には喋下障害も現われ，坐位も不能となった．理学所見としては，躯幹の低緊張，両側顔面対麻痺を認めたが，深部腱反射，眼底は正常であった．血中乳酸3．6mmol／1，ピルビン酸56．8〟mOl／1と，乳酸の高値を認め，CTで両側対称性に低吸収域を，被核，尾状核，橋，中脳に認めた（図1）．Leigh脳症の疑いの診断のもと，ビタミ
ンBlの投与を受け，経過観察されていたが，4歳時に，精査入院となった．入院時所見として，外眼筋麻痺，眼振，顔面対麻痺，躯幹低緊張，痙性＊国立療養所宇多野病院臨床研究部神経内科＊＊京都大学医学部小児科

四肢麻痺，アテトーゼを認め，膝蓋腱反射は克進
し，Babinski反射を認めた．髄液中の乳酸，ピルビン酸は，それぞれ4．2mmol／1，18旬mol／1と両者とも上昇していた．心電図，心エコー図は正常，
ABRではⅠ波Ⅴ波頂点間潜時の延長を認めた．
筋電図は低振幅多相波を認めた．T2強調MRIでは，両側対称性に高信号域を，被核，尾状核頭部，
視床，黒質，延髄に認め，また著明な脳室拡大と皮質萎縮を認めた（図1）．
症例2：18ヶ月女児．家族歴に特記すべきものはなく，満期安産で出生．6ヶ月までは正常の発達であったが，その頃より退行が始まり，11ヶ月時には癌性四肢麻痺と囁下困難が出現した．13ヶ月
時の理学所見は著明な躯幹の低緊張，右顔面不全
麻痺，痙性四肢麻痺を認めた．T2強調MRIで，
両側対称性に高信号域を被核，尾状核，視床，黒質，脳梁，前頭側頭葉の自質および小脳自質に認めた（図2）．18ヶ月時のMRIでは，白質の高信
号域は著明に拡大し，前頭葉の大部分と，側葉，−234−

いが，症例1の臨床像およびCT，MRI所見は，Leigh脳症のそれに合致すると考えられる．症例2においては，MRIで自質の広汎な障害を認めた
点で，やや非定型的であったが，培検でLeigh脳症の確定診断を得た症例で，広汎な大脳白質の障害を認めた例の報告もあり，これをもってこの症例をLeigh脳症でないと言うことは出来ない．2
症例ともNADHrcytochrome c reductaseの低下を認めるが，SuCCinate−CytOChrome creductaseは正常であり，COmplexI欠損症と診
図2断された．一方症例1ではPDHCの活性低下も

症例2 左：1歳2ヶ月時のT2強調MRI（TR4000TE80）．両側対称性に高信号域を尾状核頭部，被核，視床，さらに前頭側頭部の大脳自質に認める．右：1歳6ヶ月時のMRI．大脳白質の高信号域の著明な拡大を認める．

あり，この症例において，COmplexIとPDHCのどちらの欠損が主たる原因であるのか，また両者の低下は同時に起きたものなのか，一方の欠損によってひきおこされた2次的現象なのかという点が問題となった．本例では血中，髄液中の乳酸ピ

頭頂，後頭葉の一部にまでおよんでいた（図2）．

ルビン酸比が，それぞれ63．4，22．5と高値を示し，
このことは，電子伝達系の障害がエネルギー代謝

方障害の主たる原因であることを示唆すると考えら

法

筋生検は大腿四頭筋外側広筋に行なった．ミト

れた．ComplexI欠損症では，しばしば2次的なコンドリアの分離はBookelman7）らの方法で行

CytOChrome c oxidaseの低下，あるいはcytoT
chrome b欠損の合併を認めるが，本例のようにない，CytOChrome c oxidase活性はWharton，Tzagoloff8）の方法，NADH−CytOChrome creductase，SuCCinate−CytOChromecreductase活性はSottocasa9）らの方法，PDHC活性は

PDHCの低下を合併する例の報告はなく，その原因について今後の検討が必要と思われた．
Van Ervanら4）〜6）は3例のComplexI欠損症
によるLeigh脳症を報告している．しかし彼らのSchofieldlO）らの方法で測定した．

症例は我々の症例と異なり，その臨床経過は極めてゆっくりとした進行を示し，またCT所見は3結果生検筋の光顕検査では，2症例ともraggedred

例とも異常を認めていない．我々の症例は2例と−fiberは認めなかった．しかし電顕では，症例1でも亜急性の進行を病初期に示し，CT，MRIで基底筋原線維間の空砲と，クリスタの乱れた異常ミト
コンドリアを認め（図3a），症例2では，Cristal

核と脳幹に異常を認めた点，より定型的な例に近membraneの増加した巨大ミトコンド1）アを認がMELASとして発症することが知られている

めた（図3b）．筋ミトコンドリア酵素活性は，症が，Leigh脳症の原因にもなり得ることが示され，

例1，2，ともにNADHLCytOChromecreductase

ミトコンドリア病のheterogenousな側面が，新ためて確認された．

の有意な低下を認め，一方succinate−CytOChrome

いと考えられる．ComplexI欠損症はその殆んど

creductase，CytOChromecoxidaseは正常であっ文

た．症例1はPDHCの活性低下も示した（表）．

献1）Hommes FA，Polman HA and ReerinkJD：
考

察

Leigh

Leigh脳症の確定診断は培検によらぬばならな
ー235¶

s

encephalomyelopathy：Aninborn

errorofgluconeogenesis．ArchDisChild43：

図3

a症例1筋原線推間の空胞とcristaeの乱れた異常ミトコンドリアを認める．×5000
b 症例2 Cristaeの増大した巨大ミトコンドリアを認める．×17，000

−2361

表

Enzyme activitiesinmusclemitochondria

NADH−⊂ytOChrornec龍Succinate−⊂ytOChromec薔

reductase

Patientl
Patient

14
2

Contr01

cytoChromecoxidase＊

reductaSe

pyruvatedehydrogenase＊着COmplex

1456

109

22

80

1024

116＋38146＋551302＋659（56−200）（58−254）（401−2793）

傭nmol／mlm／mg mitoChondrial protein．1着pmol／mln／mg protein．
ControI values are expressed as means土SI）With the rangein parenthesis（N＝9rfor
pyruVate

dehydrogenase

complex，N＝10forothers）．

Wetal：Mitochondrialencephalomyopathy：

423−426，1968．

2）Farmer TW，Veath L，Miller AL et al：associationwith an NADH dehydrogenase

PyruVate decarboxylase deficiencyin adeficiency．Arch Neuro144：775−778，1987．

patient

with subacute necrotizing ence・

7）Bookelman H，TrijbelsJMF，Sengers RCA

phalomyelopathy．Neurology23：429，1973．

andJanssen AJM：Measurement of cyto−3）WillemsJL，MonnensLAH，TrijbelsJMFet

Chromesinhumanskeletalmusclemitochon−sencephalomyelopathyinapatientdria，isolated from fresh and frozen stored

With cytochrome c oxidase deficiencyin

muscle specimens．Biochem Med19：366−

muscle tissue．Pediatrics60：850−857，1977．

373，1978．

al：Leigh4）VanErvanPMM，CabreelsFJM，Ruitenbeek8）WhartonDCandTzagoloffA：Cytochrome

W et al：Subacute necrotizing encephal0−oxidase from beef heart mitochondria．

myelopathy（Leigh

Method Enzym0110：245−250，1967．

syndrome）associatedwithdisturbedoxidationofpyruvate，malate

9）Sottocasa GL，Kuylenstierna B，Emster L

and2−0Ⅹ0glutarateinmuscleandliver．Acta

and Bergstrand A：An electron−tranSpOrt

NeuroI Scand72：36−42，1985．

SyStem aSSOCiatedwith the outermembrane

5）Van Ervan PMM，Ruitenbeek W，Gabreels

Ofliver mitochondria．J Cell Bio132：415−

FJM and Renier WO：Disturbed oxidative
metabolism

in439，1967．

subacute necrotizing ence−10）Schofield PJ，Griffiths LR，Rogers SH andphalomyelopathy（Leigh syndrome）．Neu・

WiseG：Animprovedmethodfortheassay

ropediatrics17：28−32，1986．

Of platelet pyruvate dehydrogenase．Clin

6）VanErvanPMM，GabreelsFJM，Ruitenbeek

Chim ActalO8：210−227，1980．

−237−44）高カルシウム血症とミオトニア様の手拳問排困難をきたしたmitochondrialneuromyopathyの1例
高 瀬 貞 夫＊

研究協力者

望 月
望

るり子＊

月

小

林

和

夫＊

康＊ 宮 林 重 明＊＊

骨格筋の症状を主体とする狭義のmitochon−

甲状腺ホルモンもビタミンBlも正常だった．確

drialmyopathyには，緩徐に進行し，時に症状の欠乏が証明されたmitochondrialmyopathyの1例において，軸索障害による慢性進行性のニュー

定診断のつかないまま，経口ビタミン剤の投与だけで症状は徐々に改善し，8カ月後に退院した．
その後10年は，水道の配管の仕事などが可能であった．
28歳時より転びやすくなり，当科を受診した．

ロバナーと高Ca血症および高K血症を合併し，一時的にミオトニア様の手拳開排困難をきたした

この時はまだ独歩可能だったが，2週間後に咽頭痛と38度台の発熱が出現し四肢の脱力が急速に進症例を経験した．多様な臨床像を呈するmito−

んだため当科に入院した．

Chondrial myopathyのなかでも特異な症例と思

当科入院時現症：身長163cm，体重62kg．肘，膝，踵に痛風結節を触れた．胸部腹部に異常なし．
神経学的には，知能指数の低下（WAISfullLSCale

変動する症例が知られている1）．今回我々は，骨格筋ミトコンドリア内電子伝達系ComplexIII，IVのわれたので報告する．
症例で65点）を認めた．網膜色素変性はなく，外眼筋
麻痺もなかった．顔面と四肢の近位筋の筋力低下

患者：29歳，男性
主訴：四肢脱力
家族歴：父は脳出血で死亡．母が糖尿病性腎不全で人工透析中．
現病歴：生下時体重2480g，処女歩行は1歳頃で，その後明らかな精神運動の発達異常には気づかれていなかった．

が著明で，立位保持もできなかった．
また，握力は測定不能（両側ともO kg）であったが，hand grippingは可能で，その手を開排しようとすると，第3−5指の中手基節関節での伸展が遅れた（図1）．この手拳闘排困菓酎ま反復によ

18歳時，走ると足がつりやすくなり，下肢の腫張感と痔痛を主訴として当院第二内科に入院した．
入院時，両側の膵腹筋の硬結と腫脹，四肢の筋力低下が見られ，軽度の高カルシウム血症，高尿酸って軽快することはなかった．Percussion
myotoniaは見られなかった．四肢の深部腱反射はすべて低下，病的反射は認めず，知覚系・自律神経系の異常はなかった．
検査所見：尿と末梢血に異常なし．血清Na141血症，高脂血症を指摘された．CPKは66IU／Lと正常であった．筋生検で神経原性筋萎縮，神経生検では軸索変性の所見が得られた．特発性副甲状腺機能元進症とBeriberi症候群が疑われたが，副mEq／1，K4．6mEq／1，CllO7mEq／1，Ca11．0mg／
dlと軽度増加，イオン化P4．1mg／dl．Ccr61ml／
minだが，クレアチニン0．8mg／dl，BUN19mg／dl
で，尿中Caも179．3mg／dlと正常範囲内であっ＊東北大学医学部神経内科
＊＊
同
小児科

た．血清総蛋白7．7g／dl，血清アルブミン4．3g／dl，
血液ガスpH7．43，P。290．5mmHg，P。。242．2
mmHg，HCO327．7mEq／1，イオン化Caも2．8mg−238−

れるだけだった（図2）．
排腹神経生検では有髄線経が著明に減少し，
myelin ovoidも散見された．Onion bulb形成も僅かだが認められた（図3）．電顕的にはdener−vatedschwanncellclusterが所々に認められた．
ヒストグラムでみると（図4），前回検査時から有髄線経は大径・小径ともに減少していたが，今回はさらに減少していた．無髄線経は正常範囲内であった．Onionbulb形成に乏しく，myelinovoidもある点から，慢性進行性の再生所見に乏しい軸索変性を中核とする変化と考えられた．
上腕二頭筋の生検では，筋線経の大小不同と中心核の増加，多数のragged−redfiberが認められた（図5A）．Smallanguratedfiberと軽度のtype2

fiber atrophyも認められるが，neurOgenic

Changeの程度は前回ほどではなく，今回はむしろ
myogenic changeが主体となっていた．Cyto−
chrome c oxidase活性染色では75％の筋線経に活性低下が認められた（図5B）．電顕でも，筏状封入体を持つ異常なミトコンドリアの集積が筋築
膜下や筋線維間に認められた（図5C）．

図1 急性期の手拳闘排困難

生検筋ミトコンドリア分画の電子伝達系酵素の活性は，NADH−CytOChrome c reductase68．6％と正常だった．尿酸7．4mg／dlと軽度増加．LDH
611IU／L，CPKlO3IU／L．中性脂肪132mg／dl，総コレステロール185mg／dl．ビタミンB2が50ng／
mlとやや減少していたが，Bl・B6・B12は正常だ
った．甲状腺機能・副甲状腺機能は正常だった．

（ControIs148．2±25．5），Succinate−CytOChromec reductase34．9（ControIs135．0±51．7），Suc−
Cinate dehydrogenase115．9（ControIs116．6±
27．2），CytOChromecoxidase576（ControIs1475±

血中乳酸1．4mg／dl，ピルビン酸25．6mg／dlといずれも上昇しており，エルゴメーターによる15分
15wattの運動負荷でも有意の上昇を見せた．
髄液の細胞数0／3，蛋白46mg／dl，糖59mg／dl．
乳酸は2．0mg／dlと上昇，ピルビン酸も40．0mg／dlと上昇していた．
神経伝導速度は上肢は正常，下肢では膵骨神経のMCVは正常下限（42．2m／sec）だが，排腹神経のSCVは導出されなかった．
手拳開排困難が見られた急性期の筋電図では
neurogenic patternとmyogenic patternが混在していた．典型的なmyotonicdischargeはみられ

図2 筋電図所見

ず，perCuSSionにて軽度の被刺激性克進が認めら
239−

図3 脾腹神経生検像：著明に有髄線経は減少し，ところどころにミエリン球（矢印）を認める．

本症例19

正常コントロール

77年

1

9

8

9

年

2．500

2．000

1．500

1．000

500

0

0

0
0
0
0
h Y
0
0
0

▲ U O

0
0
0
0
■ V

〇 一

0
0

T
0

0
0

5

0
0
0
0

一 t

0
0
0

O ■

0

止

川血

血

∧U

l

0

■■J

● ▲

hU

︳

0

−240−

0

▲ ． 〇

排腹神経ヒストグラム

0
0

図4

図5 筋生検組織像
A（HE染色，×40）；筋線維径の大小不同があり，TG染色でragged−redfiberに相応する
線推（矢印）が多数見られる．
B（CCO染色，×25）：約75％の筋線経にCCO活性の低下を認めた．
C（電顕像，×30，000）；細胞膜下に多数の異常ミトコンドリアを認める・−241−plexIIIとComplexIVが，正常コントロールの50％以下に低下していた．
入院後経過：手拳闘排困難は日内変動を示しな
がらも，入院後1か月で消失した．四肢筋力も徐々SymptOmaticmyotonia3），慢性頸部神経根障害におけるpseudonyotonia4）などがある．本症例では桔抗筋の同時筋電図を行っておらず，末梢神経障
害の再生過程におけるmisconnectionで，手掌の屈筋群と伸筋群が同時に収縮する機序も否定できない．しかし末梢神経の形態学的検索では，むしに改善して4か月後には立位保持が可能となり，7か月後には独歩可能となって退院した．
経過中ビタミンBl・BZ・イデベノン・エビキノンが投与されているが，中止後もなお症状の改善が認められた．Ca値は，入院後4か月間は11．0かろ再生所見に乏しく，しかも症状は一時的であったことから，これも否定的である．経過中変動のあった血清Kと血中Caの高値が筋の興奮性と何らかの関係があった可能性が考えられるため，今後の経過を慎重に追跡したい．

390），ATPase1419（ControIs875±200）〔いず
れも単位はnmol／min／mg〕であった．以上，COm−

ら11．9mg／dlの間にあったが，その後9．9mg／dlに正常化した．K値は4．5から5．9mEq／1の間を変動した．尿酸値は尿酸排泄剤投与にも関わらず，

1）かぜ症状を契機として急激に増悪したmito・

退院時も8．2mg／dlと高いままであった．

Chondrial neuromyopathyの1例を報告した．

ま

と

め

2）生化学的にはcomplexIII，ⅠⅤの部分欠損が認

考

察

められた．

本症例の特徴は，血中Ca，血清K，尿酸の上昇などの生化学的異常と手拳闘排困莫酎こある．
高Ca血症の原因として，内分泌障害，腎障害，
悪性腫瘍を疑い検索したが，これらは否定的であった．イオン化Caが正常であることから，尿酸・乳酸・ピルビン酸などの有機酸と結合したCaが多い「見かけ上の高Ca血症」と考えられる．もしそうであるとすると，他のミトコンドリア脳筋症の症例でも見られてよいはずだが，我々の調べたかぎりでは記載しているものがなく，今後の多数
例での検討が必要と思われた．
本症例の手拳闘排困雉は一見gripmyotoniaの様だったが，perCuSSion myotoniaも筋電図上のmyotonic dischargeも認められず，truemyotoniaとは異なる現象と考えられる．True
myotoniaと鑑別すべき手拳開排困難には，Isaacs
ら2）のミオキミアと発汗克進を伴う症候群，

3）臨床的には，手拳開排困難，高Ca血症，高K血症，高尿酸血症が，急性期に認められたことが特徴であった．
文献1）福原信義：ミトコンドリア・ミオバナー．神経
進歩25：1320，1981．
2）IsaacsH：Continuousmusclefibreactivityin
anIndian male with additional evidence ofterminal motor fibre abnormality．JNNP
30：126，1967．

3）Walton JN and Gardner−Medwin D：
Myotonicdisorders，

muscles，4thed

Disordersofvoluntary．（edbyWaltonJ）Churchill

Livingstone，Edinburgh，1981．p508．
4）里富営二郎，木下嘉男：慢性頸部神経根障害にpolyneuropathyやpolymyositisに稀に伴う−242−

おけるPseudomyotonia現象について，最新医学28：291，1973．

45）ミトコンドリア脳筋症における下垂体機能異常
金 澤 一 郎＊
研究協力者

大

越

敦

は じ め にミトコンドリア脳筋症は，中枢神経系や筋をはじめ多臓器に及ぶ多系統疾患に位置づけられている．従来より，種々のミトコンドリア脳筋症に内分泌異常の合併例が散発性に報告されていたが1）〜5），その機序は十分解明されていなかった．近年，大浜らはmitochondrial myopathy，lactic
acidosis，and stroke−1ike episode（MELAS）およびmyoclonusepilepsywithragged−redfibers（MERRF）の剖検例にて下垂体前葉細胞における

夫＊

石

井

亜紀子＊

脾腹神経生検にて有髄神経線経の脱落を呈し，CTにて大脳，小脳の萎縮を認めた．
〔症例3〕19歳，男性．診断：MELASとMERRFの移行型．10歳頃より発症し，難聴，痴呆，痙攣
発作，ミオクローヌス，小脳失調，右同名半盲を呈した．筋生検ではragged−redfiberを認め，筋のミトコンドリア電子伝達系酵素の生化学分析ではcomplexIが正常下限であった．排腹神経生検
では大径有髄線経の脱落を有し，頭部CT，MRI
にて脳梗塞様病変を認めた．

ミトコンドリアの形態異常を報告した6）ことにより，本症における内分泌異常に関して注目されて内分泌症状と内分泌機能検査

いる．我々は，ミトコンドリア脳筋症3例におけ〔症例1〕内分泌症状：思春期より低身長とるいそうが目立ち，身長146cm，体重29．5kgである．陰毛発達は正常であるが，乳房発達はきわめて不良で，これまで月経の発乗はなく，二次性徴不全を呈した．

る内分泌機能，特に下垂体前葉機能を検討し，3
例全例に視床下部一下垂体系の機能異常を見出したので報告する．
対象

内分泌機能検査：甲状腺機能はT。111ng／dl，〔症例1〕25歳，女性．診断：MELAS．17歳より同名半盲を伴う発作性嘔吐・頭痛を頻回に認め，以後，全身痙撃発作の反復や痴呆や精神症状が出現した．神経学的には，高度の痴呆，視力低下，
求心性視野狭窄，筋萎縮，左半身の感覚障害，失調性言語を呈した．筋生検にてragged−redfiberを認め，筋の生化学分析では，ミトコンドリア電子伝達系酵素complexI〜IVの酵素活性は正常であった．CT，MRIにて，大脳・小脳の萎縮および後頭葉領域に脳梗塞様病変がみられた．
〔症例2〕50歳，女性（Sasakiら2），1983）．診断：
MERRF．発症は42歳で，小脳症状，動作性ミオク
ローヌス，筋萎縮，深部反射克進，病的反射陽性を呈した．筋生検にてragged−red fiberを認め，＊筑波大学臨床医学系神経内科

T45．OJLg／dl，freeT40．7ng／dlと正常であり，副腎機能はcortiso18．OJg／dlと正常であったが，性腺機能はestradiollOpg／dl，prOgeSterOne O．3
mg／dlと低下していた．下垂体前葉機能は，表1に示すようにarginineおよびL−DOPA負荷によるGH分泌は無反応を呈し，grOWthhormonreleas−
ing factor（GRF）負荷試験ではGHの上昇はみられたが，分泌遅延を認めた．したがって，視床下音別生GH分泌低下と判定した．LH−RH負荷試
験ではLH，FSHの分泌遅延，低反応を呈し，視床下部性LH，FSH分泌低下を認めた．ACTH負荷試験では明らかな異常は示さなかった．
〔症例2〕内分泌症状：身長155cm，体重34・5kgと高度のるいそうを呈したが，性腺発達は正常であった．
内分泌機能検査：甲状腺機能はT3101ng／dl，−243−

表1症例1の内分泌機能検査（1）ar亨inine負荷試験（arginineO・5g／kgi・V・）tlme（min）

0

30

60

90

GH（ng／ml） 4．5
3．6
4．0 ．3．8（2）L−DOPA負荷試験（L−DOPA500mg p．0．）
time（min）

GH（ng／ml）

0

4．9

30

3．1

60

90

3．5

120

2．9

5．1

（3）GRF負荷試験（合成hGRFliLgi，V．）
time（min）

GH（ng／ml）

0

3．0

15

30

7．0

6．5

60

14．4

90

120

16．7

8．6

2．LH，FSH：LH−RH負荷試験（LH−RHlOOpgi．V．）
time（min）

0

15

LH（mIU／ml） 19．5
F SH（mIU／ml）14．8

38．1
22．8

30

47．0
21．0

60

40．3
21．4

90

38．4
20．6

120

34．4
21．1

T410．1JLg／dlと正常だが，副腎皮質機能は尿中 mg／dayと低下がみられ，ACTH負荷試験にて遅17−OHCS排泄量1．1mg／day，17−KS排泄量1．5
延反応を認めた．下垂体前葉機能検査では表2の
表2 症例2の内分泌機能検査（1）arFinine負荷試験（arginineO・5g／kgi・V・）tlme（min）

0

30

60

90

120

GH（ng／ml）

1

2

1

2

7

（2）insulin負荷試験（regularinsulin O．075U／kgi．V．）
time（min）

GH（ng／ml）

0

5

30

60

90

120

2

7

6

4

2．LH，F SH：LH−RH負荷試験（LH−RHlOOiLgi．V．）
time（min）・

LH（mIU／ml）
F SH（mIU／ml）

0

15

30

60

90

127
86

205 261
90 105

230
97

68
53

3．TSH，PRL：TRH負荷試験（TRH500FLgi．V．）
time（min）

0

15

T SH（mIU／ml）
6
PRL（mIU／ml） 10

20
69

30

21
59

60

90

19
38

16
18

4．ACTH試験（ACTH−Z O．5mgi．m．for3days）
Basal excretion After（day）
vor vor vor lst
2nd
17−OHCS（mg／dl）1．5

1．5

1トES（mg／dl）

1．11．8

0．8

−244−

2．6

3rd

7．6

7．5

32．3

2．5

3．0

11．7

ように，GHがinsulin，arginine負荷のいずれにも無反応であったが，LH−RH負荷試験による
LH，FSH分泌は正常，TRH負荷試験による
TSH，PRL分泌は正常であった．ACTHは10pgと低下していた．
〔症例3〕内分泌症状：身長170cm，体重51kgで，全身のやせ以外には特記すべきことなし．
内分泌機能検査：甲状腺機能はT3106ng／dl，T47．4JLg／dl，freeT。0．9ng／dl，副腎機能はcorti−
SOl16．5JLg／dl，性腺機能はtestosterone6．1ng／
dlと正常であった．下垂体前葉機能は，表3のようにLH−RH負荷試験にて，LHおよびFSHの分泌遅延・低反応がみられたが，L−DOPAおよびarginine負荷試験によるGH分泌，TRH負荷試
験によるTSH，PRL分泌，およびACTH分泌は正常であった．
考察ミトコンドリア脳筋症3例において内分泌機能を検討し，全例に視床下部一下垂体系の機能異常を認めた．臨床症状と内分泌機能異常との関連をみると，症例1の無月経および二次性徴障害は視床下部性LH，FSHの分泌障害が関与するものと考えられる．また，低身長は視床下部性GHの分
泌障害に加えて視床下部性LH，FSHの分泌障害による二次性徴不全が加わったものと考えられる．．
症例2のるいそうに関しては，筋萎縮およびACTHの分泌障害による副腎皮質機能低下が関与するものと考えられる．しかし，症例2ではGHが低下していたにもかかわらず，身長が正常であるのは，発症年齢が42歳と遅かったことによるものと考えられる．症例3では，明らかな臨床症状がないにもかかわらずLH−RH負荷試験にて視床下部性LH，FSHの分泌障害がみられたことは，ミトコンドリア脳筋症の症例にはこのような潜在性の下垂体機能異常が存在することを示唆するものである．したがって，ミトコンドリア脳筋症には内分泌症状の明らかな症例あるいは潜在性の症例も含めて，視床下部一下垂体系の機能異常がかなりの症例に存在している可能性があるものと推定できる．
これまでミトコンドリア脳筋症に内分泌機能異常を呈した報告は散発性に報告されている．Fitz−
Simonsらは視床下部性不妊症を呈したMERRFの症例を報告している1）．Kuriyamaらは低身長を呈し，GH，LH，FSHの分泌低下を認めたKearnS−
Sayreの症例を報告しており3），我々の症例1に類似している．織茂ら4），Doriguzziら5）も性腺機能異常を呈した症例を報告しているが，下垂体機能には明らかな異常は認めなかった．
一方，大浜らはミトコンドリア脳筋症の剖検例にて下垂体ホルモン分泌細胞内のミトコンドリアの形態異常を報告しており注目されている．しかし，我々の症例1および3では一次性の下垂体異表3 症例3の内分泌機能検査

30

60

90

●

0

V

time（min）︶．L

1．GH：arginine負荷試験（arginine O．5g／kg

120
7
i

︶

V

9

0

15

7
●

●
︶
9

0
3

7
●

2
l

9．3
17

2

TSH（mIU／ml）1．2 14．4 14．5
PRL（mIU／ml）
8
56
30

●

60

0

30

−245−

15

L

0

●

time（min）

V

3．TSH，PRL：TRH負荷試験（TRH500iLg

1

60

37．3
11．8

3

30

LH（mIU／ml） 15．6 35．0 41．7
FSH（mIU／ml） 8．111．0 12．4

9time（min）

0

GH（ng／ml） 3．2
6．4
8．8
4．8 3
2．LH，FSH：LH−RH負荷試験（LH−RHlOO／エg

常というより視床下部性下垂体前葉機能異常と考えるべき症例であり，ミトコンドリア脳筋症の下垂体機能異常に関しては，視床下部性，下垂体性の両者を考慮すべきである．また，本症における視床下部一下垂体系機能異常の発現機序として，（》大浜らが報告している下垂体ホルモン分泌細胞内のミトコンドリアの形態異常によるもの，②ミ
トコンドリア異常による視床下部の向下垂体ホル
モン産生細胞の障害，③視床下部におけるmito−
Chondrialangiopathyによる虚血性変化，などが考えられるが，これらの解明には，症例の蓄積や病理組織学的検索などによる詳細なる検討が必要である．

中征哉先生に深謝いたします．
文

献1）FitzsimonsRB，Clifton−BlighPandWolfen−
denWH：Mitochondrialmyopathyandlactic
acidaemia with myoclonic epilepsy，ataXia
and hypothalamicinfertility：a Variant ofRamsay−Hunt syndrome？．J NeuroINeuro−

Surg Psychiatry44：79−82，1981．
2）Sasaki H，Kuzuhara S，KanazawaI et al：
Myoclonus，Cerebellar disorder，neurOpathy，
mitochondrial myopathy，and ACTH
deficiency．Neurology33：1288−1293，1983．
3）KuriyamaM，SueharaM，MarumeNetal：

まとHighCSF andpyruVateCOntentinKeamS−め

1．ミトコンドリア脳筋症の3症例において内分泌機能検査を施行し，全例に視床下部一下垂体系の機能異常がみられた．
2．視床下部性下垂体前葉機能の障害が低身長や無月経などの臨床症状に関与している可能性を示した．
3．明らかな内分泌症状がない症例でも，下垂体機能試験にて潜在性の機能異常を兄い出した．
4．ミトコンドリア脳筋症における視床下部一下垂体系の機能異常は重要な臨床所見の一つと考えられる．

Sayre syndrome．Neurology

34：253L255，

1984．

4）織茂智之，冷牟田英三，池田正行ほか：Cyto−
chrome c oxidase部分欠損による oculo・Craniosomatic neuromuscular disease withragged−red fibers｛の1家系2症例．臨床神経26：194−201，1986．

5）DoriguzziC，PalmucciL，MonginiT etal：
Endocrine invoIvement in mitochondrial
encephalomyopathywithpartialcytochromeC OXidase deficiency．J NeuroI Neurosurg
Psychiatry52：122−125，1989．

症例1および3の筋ミトコンドリア電子

6）大浜栄作ほか：ミトコンドリア脳筋症の下垂体伝達系酵素の測定を施行していただきました国立
精神・神経センター神経研究所微細構造研究部埜

謝辞

におけるミトコンドリア異常．第30回日本神経ー246−

病理学会総会学術研究会抄録集1989，p232．

46）チトクローム・C酸化酵素部分欠損−筋線維ときほぐし標本による検討−
埜 中 征 哉＊
研究協力者 後 藤 雄 一＊ 長谷川 ひとみ＊ 松 岡 太 郎＊
は じ め にKearns−Sayre症候群（KSS）を含む慢性進行性
外眼筋麻痺症候群（Chronicprogressiveexternal
ophthalmoplegia，CPEO）の組織化学的特徴はragged−redfiber（RRF）の存在と，CytOChrome
COXidase（CCO）の部分欠損である．またmyo−
Clonus epilepsy with ragged−red fibers（MERRF）でも主な組織化学的異常はCCOの部
分欠損である．このCCO部分欠損を形態学的により特徴づけることはミトコンドリア病の病理発生を考える上にきわめて重要である．我々は筋線経のときほぐし法を考案し，CPEO，MERRF生検筋についてそのときほぐし法で1本1本の筋線経についてCCOの欠損の状態を検索し，両者の形
態発生上の違いを見出したので報告する．
対象と方法
対象と したのは，ミト コンドリアDNA（mtDNA）に種々の長さの欠夫をもつCPEO4
例と，mtDNAに欠夫をみないMERRFの2例である．6例とも組織化学的にCCOの部分欠壬員を認めた（図1）．
生検筋の一部の小筋束を2％グルタールアルデ
ヒド（0．05MphosphatebuffersalinePBS緩衝液，pH7．3）で15分固定後，PBSにて洗練し，Seligmanらの方法でCCO染色し，実体顕微鏡下で，PBS液内で筋線経を1本1本ときほぐし
た1），2）．ときほぐし標本にするとCCO（＋）とCCO（−）の部分が節状に分布するのがみられるので，各々の長さを測定し，CCO（−）の節の長さと，＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部

mtDNA欠夫の位置，長さ，量との対比を試みた．
ときほぐした1本1本の筋線経のCCO（−）の部とCCO（＋）と（−）の部の移行部を切りとり，その部をOsO。で後固定し，脱水後エボンに包埋して電子顕微鏡的に検索した．
結1）ときほぐし標本

果

上記6例の生検筋（約1−1．5cm長）からとき
ほぐし線維100本ずつ（計600本）を検索した．
CPEO4例全例でCCO（＋），CCO（−）の節状分布（segmentaldistribution）がみられた3）．CCO（−）の長さは数百ミクロンから4mmまでの長さで，その量，長さは筋線推ごとにより異なっていた（図2）．欠失したmtDNAの量（％），部位とCCO（一）の量（％）を対比したのが表である．症
例1ではCCOのサブユニットであるCOl〜C03をコードする部は含まれていないのに表現型としてはCCOの部分欠損であった．4症例と検討対象例が少ないので結論的なことはいえないが欠失mtDNAの量の多いものはCCO（−）の量が多い傾向にあった（表）．
MERRFの患者では光顕的にはCCO部分欠損であった．ときほぐしではCCO活性の高低は一本の筋線推内で多少みられたが，明らかな節状分布はみられなかった（図3）．すなわち酵素欠損した部分はかなり長い距艶に分布し，CCO（＋）とCCO（−）の部の移行はないか，あっても境界不鮮明であった．
2）電顕所見CPEOの患者のときほぐし標本の電顕ではCCO（＋）と（−）の移行部は電顕的にもかなり明−247−

PTifnt DebtedmtDNA塩Enzyme
No．

Size（kb）

Defect

％

E

0
0
6
0 0
2 4

7
7

3

7
7

2

2
2

1

0
7・

R

0

0

0

肝

9
4

4

0

1
2

（biochemistry）

図1慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO），MERRF患者生検筋内のミトコンドリアDNA異常．生化
学的にはCPEOの症例4の複合体Ⅰ欠損を認めた以外は正常（N）である．

CP【0

0．5くm

図2

表

CPEO生検筋のときほぐし標本（cyto−
chromecoxidase染色）．一本の筋線維内に酵素活性が欠損した部位と，正常活性がある部位（濃染している）が節状に分布し
ている．

図3

瞭であった．移行部ではCCO（＋）と（−）のミトコ
ンドリアが共存した部もあったが，多くの場ではDeletedmtDNA（％）vsCCO（一）segment

CCO（＋）と（−）のミトコンドリアは集合し，モザ（length）
No

引王○（kb）

MERRF生検筋のときほぐし標本（cyto−
chromec oxidase染色）．CPEO（図2）と異なり節状欠損の像はみられない．

イクの場は少なかった（図4）．またCCO（−）の部
SIt08

％

仙川bor篇％○lCCOト）％ofCCO【◆）

CPEO
1

2．2

ND4．5

60

100

20．1

79．9

2

7，7

CO1−3，Nt〉4，5

20

100

18．0

84．0

3

7．7

CO1−3．ND4，5

40

100

12．4

87．6

4

4．9

CO3，ND4，5

70

100

、25．4

74．6

羊NumberoH鳩erSeXamn鴨dでは巨大化したミトコンドリアが多数集っていて，
これは光顕的なRRFの部に相当すると考えられた．CCO（−）の節の部では全てのミトコンドリア
はCCO（r）でCCO（＋）とCCO（−）のミトコン
ドリアがモザイクをなすことはなかった．逆にCCO（＋）の節では全てのミトコンドリアはCCO（＋）であった．

¶248−

図4

Cytochrome c oxidase（＋）と（一）節部の移行部の電顕像．一部に酵素活性が正常（矢頭部）と欠損（矢印）ミトコンドリアが共存するが，大部分の所では共存像（細胞内モザイク）はない．ときほぐし標本をcytochrome c oxidase染色し，Epon包埋，超薄切片にウ
ラニール染色のみ行ったもの．

考察
KSSを含むCPEOの患者の50−60％は，mtDNAに欠夫のあることが明らかにされ4），5），本症ではmtDNAの突然変異が病因的に大きな意
味をもつことが示唆されている．mtDNA欠失部
位は患者ごとに異なり，また正常と欠失した
mtDNAが共存し（heteroplasmy），その量比も患者ごとに異なっている5）．そのために欠失した
mtDNAと臨床，病理像との因果関係を求めにく
く，欠失したmtDNAが何を意味するか不明な点が多かった．
我々はCPEOには仝例CCO部分欠損が組織化学的に証明されることより，このCCO部分欠損の量とmtDNA欠失部位と量が何か関係あるのではないかと思い検索を進めてきて，欠失した
mtDNAの量とCCO欠損線維数の間に正の相関を見出した（本珪会議演題50を参照）．症例1では欠矢部にCCOをコードするサブユニットである
COl〜3が含まれず複合体ⅠをコードするND
4，5が含まれていた．この例では複合体Ⅰの欠損は生化学的に証明されず，表現型の異常として
はCCO部分欠損のみで，欠失したmtDNAと表現型の間に因果関係が見出せなかった．このような例の生検筋でも複合体Ⅰ活性を組織化学的に証−249−

明できれば，複合体Ⅰの部分欠損をも証明でき，
CCO部分欠損が2次的現象であることが明らかにされるかもしれない．mtDNAの異常では酵素欠損の部は節状であるため，筋組織をホモジェネ
ートして生化学的に酵素活性を測定したのでは，
なかなかmtDNA異常の意味するものを明らかにすることはできないため，組織化学的なアプローチが重要な意味をもつだろうと考えられるi
CPEOはmtDNAの異常で酵素欠損の部が節状であることは筋の発育分化途上におけるmitoticsegregation

文献1）NonakaI，KogaYetal：Tissuespecificity
incytochromecoxidasedeficientmyopathy．
J NeurblSci92：193，1989．
2）Seligman AM，Karnovsky MJ et al：
Nondropletultrastructuraldemonstrationof
CytOChromeoxidaseactivitywithapolymer−
1Zlng OSmOphylic reagent，diaminobenzidine（DAB）．J Cell Bio138：1，1968．
3）YamamotoMandNonakaI：Skeletalmuscle

で説明がつく．MERRFのpathologyin chronic progressive external

CCO部分欠損が節状でないことは，MERRFでOphthalmoplegia

は核DNAの異常が一義的であるか，もしくは，もしmtDNAの異常があっても，正常と異常のミトコンド））アが共存する（heteroplasmy）可能性は低い．ではなぜCCO（＋）とCCO（，）の線経が共存するかについては，神経支配などの外的因子がActa Neuropathol（Berl）76：558，1988．

影響を与えていると考えられる．代謝性筋疾患（例
えばPompe病）でも筋線経のタイプごとでまた筋束ごとによって侵される程度が異なるから，酵
素活性の発現様式などの選択性は存在すると考えられるからである．

with ragged−red fibers．

4）HoltIJ，Harding AE et al：Deletions ofmusclemitochondrialDNAinpatientswith
mitochondrialmyopathies．Nature331：717，
1988．

5）MoraesCT，DiMauroSetal：Mitochondrial−250−

deletionsinprogressiveexternalophthalmo・
plegia and Kearns−Sayresyndrome．N Engl
J Med320：1293，1989．

ⅠⅩ．ミトコンドリア（3）47）家族性ミトコンドリア・ミオパテ一におけるミトコ

ンドリアDNAの解析：n9m−Dloop領域の多重欠
矢について
金 澤 一 郎＊研究協力者

大 越 敦 夫＊ 柏 崎 通 介＊＊
太 田 成 男＊＊ 香 川 清 雄＝は じ め にミトコンドリア・ミオパテ一，特にKearns−
Sayre症候群や慢性進行性外眼筋麻痺の多数例に筋ミトコンドリアDNA（mtDNA）の部分欠矢が認められている1ト3）．しかし，その多くは孤発例であり，家族歴を有する症例は少なく4）・5），本症の遺伝形式を考察する上で多くの問題点を残している．
最近，常染色体優性遺伝を呈する家系に筋
mtDNAのD−loop領域における多重欠夫を認め，核DNAによるmtDNAの欠夫に対する作用をる6）・7）．両親はいとこ婚で，症例1および2以外の人々は全て臨床的には無症状であった．両症例とも，眼瞼下垂，視力障害，視神経萎縮，ごく軽度の外眼筋麻痺，四肢および体幹の筋萎縮，筋力低下，軽度の知能低下，末梢神経障害を認めた．筋
生検にて多数のragged−red fiberを認め，CytO−
chromecoxidase（CCO）染色ではCCOの部分欠損を呈し，筋の生化学的分析にてミトコンドリ
ア電子伝達系酵素complexIおよびIVの活性の低下を認めた．

示唆する報告があり5），注目されている．また，従来報告された症例の大多数は単一欠夫と考えられていたが，pOlymerase chain reaction（PCR）
法による分析の結果，mtDNAの多重欠失を有する症例が報告された5）．我々はすでに本症の筋
mtDNAに兄弟例においてほぼ同一の部分欠夫を有するミトコンドリア・ミオバナーの家系を報告
した6）17）．今回は，PCR法を用いて筋mtDNA断片を増幅することにより部分欠夫が兄弟でともに同一のパターンをとるnon D−loop領域の多重欠矢であることを証明し，さらに欠矢部の塩基配列を決定したので報告する．
症

方法

材料：mtDNA分析には，症例1，2，対照の計
3例の生検凍結筋を用い，高分子DNAを抽出した．
Southern bIottingによるmtDNA分析：抽出したDNAを制限酵素P〝〝ⅠⅠにより消化後，
southernblottingを施行した．下記に示す01igo−
nucleotideをPCR法にて増幅したmtDNA断片
をhybridization probeとして用いて，random
primerlabeling法で標識した．異常mtDNAの定量的解析はAMBIS radioanalyticimaging
SyStem（AMBIS SystemInc．，San Diego CA，USA）を用いて測定した．

例

症例1（51歳男性），症例2（49歳男性）は，すでに筋mtDNAの部分欠夫の存在することを報告したKearns−Sayre症候群不全型の兄弟例であ0日gonucleotides（図1）：自動DNA合成装置
mode1381A（Applied BiosystemsInc．，CA，
USA）により01igonucleotidesを合成後，PCR法
により増幅してprobeとして用いた．

＊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊自治医科大学第一生化学

Probel（PRl）；dGATATqTCTCCATACC−CATTAC（nucleotide number4，214−4；235）−253−

OH一、、、

ATP（】Se8
図1Restrictionmap ofhumanmitochondrialDNA andlocationsofhybridization probes（PR1−PR4）andoligonucleotidesusedasprimersinpolymeraSeChainreactions（PCR）．
The numbersindicate nucleotide numbers of mtDNA according to（1）．The
hybridizationprobesusedwerefragmentsofmtDNAofresidue4，214to5，791（PRl），
10，122toll，609（PR2），13，473to13，970（PR3）and15，701to16，039（PR4）．ND，CO，
ATPaseandcytbaregenesforsubunitsofNADH−CoQreductase，CytOChromeoxidase，ATPaseandcytochromeb，reSpeCtively；OHandOL，OriginsofreplicationforH−Strand
andL−Strand，reSpeCtively；16Sand12S，geneSfor mitochondrial ribosomalRNA；Sac
I，BamHI，HindIII，PvuII andPstI，reStrictionsitesoftheserestrictionenzymes；
Closed circles on both strands，geneS for mitochondrialtRNAs．

−254−

and

dCGAAGAAGCAGCTTCAAACCTGC（5，791−5，769）

Probe2（PR2）；dTTTTGACTAC−CACAAC−TCAACG（10，122−10，143）anddATTTTAGGTCTGTTTGTCGTAGG

30％のmtDNAにそれぞれ欠夫がみられた．
PCR法を用いたmtDNA分析：それぞれのmtDNA断片（8，986〜14，268）をPCR法にて増幅後，励∽HI，乃fIにて消化し，電気泳動にて分散した結果，図3に示すようにmtDNAの断片

Probe4（PR4）；dCCACTAAGCCAATCAT−

は400bp〜2，000bpに及ぶ多数のbandを検出した．このことはmtDNAの欠夫が多重欠夫であることを意味しており，また症例1，2とも全く同一パターンを呈した．したがって，Southemblot−
ting分析におい．て幅の広いextra bandを認めた
ことは多重欠夫によるためと考えられる．
DNA塩基配列：欠失部位の塩基配列は図4にTTATTGA（15，701−15，724）anddCTTCCCCATGAAAGAACAGAGAA

示すが，少なくとも12個の欠失起始部を認め，その欠夫の大きさは490bpから4，642bpであった．

（16，039−16，017）

それら全ての欠矢部の塩基配列には，4〜12bpに及ぶshort direct repeatを認めた．

（11，609−11，587）

Probe3（PR3）；dATTAGCAGGAATAC−CTTTCCTCA（13，473−13，495）anddCTCGTAAGAAGGCCTAG（13，970−
13，954）

PCR法を用いたmtDNA分析：すでに報告されている本症例の欠失推定部位6）・7）を考慮に入れて，症例および対照の筋mtDNA断片をdATAG−
CCCTGGCCGTACGCCTA（8，986−9，006） とdCGGGAGGATCCTATTGGTGCG（14，268−
14，248）を01igonucleotideprimerとして用いて，PCR法により増幅した（図1のPCR）．増幅したmtDNAを制限酵素励mHIおよびEbtIにより消化後，電気泳動を施行した．
DNA塩基配列：症例1について上記PCR部を増幅したmtDNA断片をsubclone化し，欠失
mtDNAの塩基配列をdideoxy nucleotide法により決定した．
結果Southern b10ttingによるmtDNA分析：全
mtDNAをprobel〜4を用いてSouthemblot−
tingを施行した結果，症例1および2において約
2．5〜6．5kbの欠矢を有する帽の広いextra bandを認めた（図2）．また，これらの欠矢を有する
mtDNAの割合やパターンが各probeにより異なっており，各probeごとに欠夫を有する
mtDNAを定量的に測定した．Probelでは症例
1で62％，症例2で70％，prObe2では症例1で50％，症例2で40％，prObe3では症例1で56％，症
例2で55％，prObe4では症例1で35％，症例2で考察

PCR法を用い，筋mtDNAの多重欠夫を有するミトコンドリア・ミオパテーの兄弟例を報告した．検索した範囲ではその多重欠夫は兄弟例において同一のパターンを呈し，さらに症例1における塩基配列の分析では，nOnD−loop領域に少なくとも12個の欠夫が存在し，その欠矢部には4−12bpに及ぶdirect repeatを認めた．
これまでミトコンドリア・ミオバナーにおける筋mtDNAの部分欠夫は，Holtらの報告1）以来，多くの報告例がある．しかし，その多くは孤発例であることから遺伝形式に関するmtDNAレベ
ルでの解析は十分ではない．これまで，Ozawaらによる母娘に筋mtDNAの部分欠矢を有する母系遺伝を示唆する報告4）やZevianiらの常染色体
優性遺伝例でmtDNAのD−loop領域を起始部とする多重欠矢を認めたとする報告5）などがある．
ここでZevianiらは，mtDNAの複製や転写の制御部位がD−loop領域に集中していることから，
D−loop領域が核とmtDNAの相互作用に重要な役割を有LD−loop領域から始まるmtDNAの欠矢が起こると説明している．しかし，我々の症例は欠失部位がD−loop領域とは明らかに異なる部位に存在し，また兄弟例ともほぼ同一のパターシ−255−

PRI PR2
12 3 12

3

PR3
12 3

PR4
12 3

卓￣苫騙￣千言申
図2

蠣輸→d6．6kbp→←12．5

TotalSouthernblotting．Samplesof5JLgOftotalDNAweredigestedwithPvuIIand
SubjectedtoSouthernblotting．ThehybridizationprobesusedwerePRl，PR2，PR3and
PR40fFigl，Whichareindicatedatthetopofeachpanel．Hybridizationsweredetectedbyautoradiography．Lanesl，2and3，thesamplesfrompatientl，patient2andacontrol，
respectively．

を有する多重欠共を認めた点が特異である．この点に関しては以下のような可能性が考えられる．
1）本家系の遺伝形式を常染色体劣性遺伝と仮定
すると両親の核遺伝子の作用により兄弟のmtDNAの同一部位が変異を起こした可能性，

2．兄弟ともに同一のパターンをとる筋mtDNA2）母親の筋mtDNAに検出できない程度の少量の欠夫が存在するために母系遺伝により兄弟に欠矢が起こった可能性，3）兄弟ともに筋mtDNAに欠夫を起こしやすい部位が存在し，何らかの機序により兄弟の同一の変異が起こった可4．欠矢の発現機序にE右directrepeat部におけるslippedmispairingmodelの関与が推定される．

能性，などが考えられる．
MtDNAの欠夫が起こるメカニズムは未だ十1）HoltIJ，Harding AE and Morgan−Hughes

分に解明されていないが，Schonらは13bpよりな

in patients withmitochondrialmyopathies・るdirectrepeatが大きな欠夫に対するhotspots
であり，directrepeatによるhomologousrecom−
binationが欠矢に関与していると提唱している9）．

Nature331：717−719，1988．

の多重欠夫を認め，欠失部位はD−loopとは明らかに異なっていた．
3．欠矢部の塩基配列には，4−12bpに及ぶ12種類のdirect repeatを認めた．

我々の症例でも4−12bpのdirect repeatを認め，homologous recombinationが欠夫に関与している可能性もあるが，すべての欠矢をhomologous
recombinationで説明するにはdirect repeatが短すぎることから，むしろslipped mispairingmodelによる可能性のほうが強いと考えられる．

文

献

JA：DeletionsofmusclemitochondrialDNA2）Zeviani M，Moraes CT，DiMauro S etal：
Deletions ofmitochondrialDNAin KeamS−
Sayresyndrome．Neurology38：1339−1346，
1988．

3）Moraes CT，、DiMauro S，Zeviani M et al：
MitochondrialDNAdeletionsinprogressive
externalophthalmoplegiaandKearns−Sayre
Syndrome．．N EnglJ Med320：1293L1299，
1989．

∫ま

と

4）Ozawa T，Yoneda M，Tanaka M et al：

め一

1．家族性ミトコンドリア・ミオバナー症例におMatemalinheritance of deleted mitochon・いてPCR法を用いてミトコンド））アDNAの解

drial DNAin a family with mitochondrial

析を行なった．

myopathy．Biochem Biophys Res Commun
−256−

1筆

写叫r

ミ9．3

kbp

．
5●795

3咄24も

馴軌

一一0．92

ゆ0．42

図3

Fragmentsamplifiedbythepolymerasechainreaction．Fragmentsbetweenresidue8，986
and14，268（Fig・1，Center）wereamplifiedfromthetotalDNA（1JJg）fromtwopatients（1anesl and2，patientsl and2，reSpeCtively）and the nomalmuscleDNA（lane3）．
Mrisa standardDNA mixture（1ane4）．Thefragmentswerestainedwithethidium
bromide andvisualized underultravioletlight．Thefragment ofnormalmitochondria
without anydeletion appeared at5kbp（indicatedbyanaTrOW）．Thesamplesfrom
thetwo patientsgaveatleast16differentbandsasindicatedbyarrowheads，andthe
amplification patterns resembled one another．

−257−

9270

13820

9280

CAGGGGCCCTCTCAGCCCTC（ −−−−CagCCCtC）GCTGTCACmCCTAGGACT

9430

14090

9440

9282−13809（」1528）

14100

CACCACCTGTCCAAAAAGGC（ −−−−ccaaaaaqqC）ATAATTAAACmACTTC
13970
13980
9430
9440

944ト14082（−4642）

ACCTGTCCAAAAAGGCCTTC（ paggccttc）TTACGAGCCAAAACCTGCcc
13740
13750
9480
9490

9445−13963（−4519）

TTTTTTTCTTCGCAGGATTT（ 州ttCqCaggattt）CTCATTACTAACAACA
14140
15150
9520
9530

9498−13734（」1237）
9533−14134（−4602）

CACTCCAGCCTAGCCCCTAC（−一ccCtaC）TCCTAATCACATAACCTATTCC

9560

9570

13960

13970

9575−13950ト4377）

ccccGAACAGGCATCA墜墜（一一一一些旦）TATCTAGGCCTTCTTACGAGCCAA
9580
13960
13970
TCACCCCGCTAAATCCCCTA（ 〜aatCCCCta）TCTAGGCCTTCTTACGAGC
14150
14160
9590
9600

9588−13952（−4366）

TCCCCTAGAAGTCCC些嬰（−些姓）TAATCACATAACCTATTCCCCCG

9601−14137（−4537）

9600

14150

14160

AGTCCCACTCCT仙哩（−一些堕）AACCTATTCCCCCGAGCAATCTC

9611−14146（−4536）

lO750
14140
14150
ACATAACCTAAACCTACTCC（−−CCtaCtCC）TAATCACATAACCTATTCcc
14160
14170
10920

10759−14137（−3379）

ATTTAGCTGTTCCCC些（一一一旦旦坦）ATTCCCCCGAGCAATCTCAATTA

10926−14151（−3226）

13750

13760

14260

14270
13762−14251（一190）

図4

Nucleotide sequences ofthe breakpoint regionsinmtDNA from patientl・Twelve
differentdeletionpattemSWere Observedin14Clones・Numbering ofnucleotidesis
accordingtothatofHeLacellmtDNA（1）．Breakpointsareindicatedinparentheses・
Smalllettersindicate nucleotides within deletions．RegiOns of direct repeats areunderlines．

Kanazawa I：A familial mitochondrial

154：1240−1247，1988．

5）ZevianiM，ServideiS，Gellera C et al：An

myopathywithpossiblemultipledeletionsof

autosomaldominant disorder with multiple

mitochondrial DNA．Biomedical Res

deletions of mitochondrialDNA starting at（Tokyo）10：453−457，1989．

339：309−311，8）Mizusawa H，Watanabe M，KanazawaIet6）中西孝雄，大越敦夫，金澤一郎ほか：ミトコン

sociatedwithperipheralneuropathy：partial

ドリア・ミオパテー1家系におけるミトコンド

deficienciesofcomplexI and complexIV．

リアDNAの．解析． 厚生省「精神・神経疾患研

J NeuroISci86：171−184，1988．

the D−loop region．Nature
1989．

al：Familial mitochondrial myopathy as−

究委託費」簸ジストロフィー症及び関連疾患の9）Schon EA，Rizzuto R，Moreas CT et al：A

病態とその病因に関する研究 （杉田址）昭和63

direct repeatis a hot．spot forlarge−SCale

年度研究報告書，1989，pp139−144．

deletion

7）Ohkoshi N，Harihara S，Nakanishi T and

ー258−

of

human

mitochondrial

Science244：346−349，1989．

■DNA．

48）ミ．トコン ドリア昭筋症におけるミトコンドリア
DNAの欠失
佐
研究協力者

平

訳

浩

藤

猛＊

子■

関

田 中 茂 樹＊中は じ め にミトコンドリア（mt．）脳筋症で骨格筋などにおいて，ミトコンドリアの電子伝達系酵素の欠挽，
さらにmtDNAの欠夫が報告されている1），2）．われ
われは種々の疾患の骨格筋のmtDNAの解析を行い，mtDNA欠失例を兄いだし臨床像との対比を行った3）．さらにmtDNAの欠失部位の正確な同定を試みたので報告する．
症例
次の32例の骨格筋を検索した．

村

公

一＊

石

垣

眞

二日

宝

来

泰

別事
聴＊＊＊

歳で死亡した．3歳で難聴，34歳頃から進行性外眼筋麻痺と四肢筋の萎縮が始まっている．妹は44
歳で，15歳から難聴，27歳から下肢筋力低下，34
歳から限険下垂が始まっている．母は健康であるが下肢筋のmtDNAを同様に検索した．
方法

ミトコンドリアの電子伝達系酵素活性：骨格筋からミトコンドリアを抽出し，二波長分光光度計
にて各複合体の活性を測定した．
Southem blotting：mtDNAプローブはヒト
胎盤から精製したtotal mtDNAをPvuIIで慢性進行性外眼筋麻痺症候群（CPEO）
Kearns−Sayre症候群（KSS）不全型4眼筋ミオバナー
7
MELAS
MERRF

11例

4
1

で切断した16種の断片をpUC19ベクターにてサブクローンしたものを用いた．凍結骨格筋から抽他のミトコンドリアミオパテー

5
6

出したDNAを制限分解酵素で切断，電泳後，genescreenplus膜に転写し，ハイプリグイゼー
ションを行った．

急性筋壊死症アルコール中毒1

ゲルマニウム中毒

2
2
l

悪性高熱
不明
CMT
その他

1inearize後，α−32P−dCTPまたはα一32P−dATP
をmultiprimelabeling法で標識したものを用いた．さらにtotal mtDNAを適当な制限分解酵素

さらにpolymerasechainreaction（PCR）法により，欠失DNAの両端をはさむように合成L
たorigoprimerを用いて，mtDNAの一部を
1，000−2，000kb増幅し，適当な制限分解酵素で切41断した後，Southernblothybridizationを施行し，計 32例 欠失部位をより正確に同定した．

なおKSS不全型2例は兄妹例である．兄は47＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊順天堂大学医学部共同病理＊＊＊国立遺伝学研究所

結果と考察
Total mtDNAプローブおよびそのfragment
mtDNAプローブを用いた．
Southernblottingにて8例の患者に3．3−8．1−259−

kbにわたりmtDNAの大きな欠矢を認めた（表1）．

報告と全く同一であった（表2）．さらに横紋筋融Southernblottingにより得られたautoradiogra−
phy上の正常及び異常mtDNAのbandをden−Sitometerにて計測して両者の比率を求めた．異常mtDNAの占める比率は1．0−68．0％と大きな割合を占めていた．8例中3例は外眼筋症状のみを呈しており四肢筋力は全く正常であったが異常
mtDNAの占める比率は30〜68％と大きな割合を解症など他のミオバナーではmtDNAの欠夫は見られなかった．Charcot−Marie−Tooth病では筋生検にてragged−red fiberが認められることがあるがやはり異常は見られなかった．
骨格筋のmt．電子伝達系酵素活性の測定ではmtDNAの欠夫を示した症例はほとんどの例が占めていた．即ち，臨床症状と異常mtDNAの占める比率とは対応していなかった．
MERRFおよびMELASではSouthem blot−

reductaseの低下を示していた（図1）．
PCR法にて欠失mtDNAの両端をはさむ残存tingで検出できるような大きなmtDNAの欠矢は認められなかった．この結果はMoraesら2）の
表l Deletions ofmitochondrialDNAinCPEO
Age Symptoms mA deletlons
Ageqt

Myopqthy

C□Se Sex Onset CNS Gene「QlOculor SIzEb PerCe望t＋＋十十十十十＋＋＋＋＋＋＋■一＋十十＋一■一一

■1．
ノ山
⊂．
ノ1
7︐
⊂へ
Jノ
1l
0l
78
1
∵∴㌦∵−1・∵．
山．山．2⊂Jl﹁つ22127J・U．■ヽノ6700

表2

8．し

7．6

2．勺．勺．q

8．し

7．6

1．0′1．0

5．1

2上し1

CytOChromecoxidase，SuCCinatecytochromec

部を約2，000−3，000kb増幅後，制限分解酵素にて切断してから電気泳動して欠失部をより正確に同定した．欠失領域はCytOChrome c oxidaseのsubunitIII，COmplexIのSubunit4，5に対応する部位が多かった（図2）．この欠失領域はSchon
ら4）の報告した部位と大体一致していた．彼らが示しているように欠矢部の両端の塩基配列の繰り返し構造の存在によりslipped misspairingが生じやすいのかもしれない．塩基配列を正確に同定することによりこの間題をより明確にする予定で

5．0
5．5

65．句

5．2

67．9

5．0

29．8

ある．
KearnsTSayre症候群の兄妹例では8．1kbとMit．DNA deletionsinthree mitochondrialmyopathies
Moraos，1989

Sato，1989

mtDNA
mtDNA
No．
dolouonS No．dolOtions

Groups

1

0

0

4

0

9

0

Oc山ar myopathy

﹇円山

3

0

3
1

KSS

5

同＝山

2

1：CPEO

2：Doflnod mlt．encophaJomyopatMeS
MERRF
MELAS
LOigh

3：Undefinedmit・OnCePha10myOPathfos0

Cong．lacHc aduosis

−260−

3

0

OthO■rS■sec−1．mg−1，m「1

0．1

0．2

0．3

CytochromecoxidasJ
C PEO

（
0．
153±0．
058）…

M ELA S（0．
187±0．
126）

●●

●−●●
●

●

●

●

C ontr01 （0．
272±0．
0087）
l
C PEO

（
158 ．
2 ± 17 ．
9〉

M ELA S（138 ．
7±9 6 ．
2）

C on tro l（
158 ．
7 ±5 8 ．
8）●

ADH eytochrome c
寧

●

●

蒙享

≡
＝
亘ヰ

reductase

≡
三
二
≒
・
：
・
＿
‡
三
＝
一
；
一
■
＝
●

●●

室

●

宝＝∃

Succjnate cytochrome c
C P E OM

（9 3 ．2 ± 4 4 ．2 ）EL A S（2 0 3 ．3 ± 7 4 ．4 ）C o n t ro l

（1 6 3 ．7 ± 7 0 ．7 ）

●

●●

●●

●

：
；
．
≡
‡
こ
二
≡
‡
隷二
●，
三
十三
‥

＝
■
￣
￣
i■
二
・
二
■
＝
■
・
・

l

50

100

＝
幸1￣−
＝
＝

150

200

♯＊nm01／min／m90f mit．protoin
（●

図1

2

4

6

patien亡S Vi亡h m亡DNA deletions）

Mitochondrial enzyme activityin biopsied muscles

8

10

12

14

16

議禰

添

削

6豊

52

1ここ・h一日…し−J：・・−1−11‥ ‥−‥トミ了し−

2
P

ド
≡
憾
：
■
■
■

P
3
P
5
P
6
P
7

二：二二：二二五才：二二二二二＝

8
P

癖二二二二二二二亘五二二二二二二二麺

図2

Localization of mitochondrial DNA
deletions

7．6kbとの全く同一の領域に欠夫を有する2種類の異常mtDNAが1〜2％混在していた（図3）．症状のない母親には大きな欠失はみとめなかった．
しかしながら兄妹共に全く同一部位にmtDNAの欠夫を示していたことは母親から何らかの異常
mtDNAを受け継いでいたことが強く示唆される．
文

献う：5205・r・15号■＝

就 き富農慧珊摘葛那

1）HoltIJ et al：Deletions of mitochondrial
DNAin patients with mitochondrial

図3

myopathies・Nature331‥717，1988・

Amplified products of PCR ofmuscle
mit・DNAfromsiblingsofCPE0−261−2）Moreas CT et al：Mitochondrial DNA
deletionsinprogressiveexternalophthalmo・

andPathology（edbyKimCH＆OzawaT），

Proceedings ofInternationalSymposiumOn

plegiaandKeamS−Sayresyndrome．NEngJ

Bioenergetics，Plenum，New York，1989，in

Med320：1293，1989．

preSS．

3）Sato T etal：Mitochondrial myopathies．

4）SchonEAetal：Adirectrepeatisahotspot

Morphologicalapproachtomolecularabnor−

forlarge−SCaledeletionofhumanmitochon・

malities．

drialDNA．Science244：346，1989．

Molecular

Biology，Biochemistry，−262−

49）多重欠失を伴いミトコンドリアDNAの減少のみら
れた優性遺伝の疑われるミトコンドリアミオパテーの一例
水 野 美 邦書
研究協力者

大 塚 美恵子＊＊

太

田

成

男＊＊＊吉

は じ め に

田充

男＊＊

Pedigree

ミトコンドリア脳筋症患者骨格筋において，しばしばragged−redfiberが認められ，ミトコンド
リアが蓄積すると考えられている1）．これは，エネ
ルギー代謝の異常によって，何らかの機構が働き，ミトコンドリアが増殖すると推定されている．逆に，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の減少によって引き起こされたミトコンドリア脳筋症例の報■●

ニP10bable K88rnS−SaYre SYndrom一≧

ロの：P10Sis

告はない．

図1症例Aの家系図．矢印は症例Aを示す．

Kearns−Sayre症候群（KSS）や進行性外眼筋麻痺progressiveexternalophthalmoplegiaにおいては，mtDNAの欠夫の例が多数報告されている2）・3）．これらの場合，ほとんどは家族歴がなく，孤発例が大部分であり，欠矢部は単一である．最近，常染色体優性遺伝を示す家系で，多重欠考が報告されている4）．
今回，私たちは，常染色体優性遺伝が疑われる家系のKSS不全型患者でmtDNAの著しい減少と多重欠夫が見られたので報告する．

に基づく確定診断ではないが，眼筋下垂を示し，症例Aと同様の兆候を示すことより，図のような常染色体優性遺伝様式を示すと判断した．
症例B：20歳男性，兄弟発症のmitochondrial
encephalomyopathy withlactic acidosis andstroke−like episodes（MELAS）である．
症例C：30歳男性．孤発例のMELASである．
対照：正常対照として，筋疾患のない症例の大腿四頭筋を検索した．

実験方法
症例A：54歳女性．10年来の進行性外眼筋麻痺，Southern b10t

全身筋力低下，難聴，脳波異常及び髄液タンパク質増加がみられた．筋生検ではragged・redfiberが確認され，不全型KSSと診断された．54歳時，呼吸不全にて死亡後，大腿四頭筋を摘除，検索した．
家族歴：症例Aの家族歴を図1に示す．生検試料った．プローブは，ヒトmtDNAをクローニング

仝DNAの精製とSouthern blotは，常法に従した断片あるいは，ヒトmtDNAを部分精製したDNA画分をPCRS）で増幅した断片を用いた．プ
ローブの位置を図2に示した6）．
Western bl0t
Westernblotは生検試料をTCAによりタンパ
ク質分解酵素活性を完全に止め，その後全タンパ＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊自治医科大学神経内科＊＊＊自治医科大学生化学

ク質をSDSに潜解し，SDSポリアクリルアミド
電気泳動にかけた．抗体は，抗酵母ATP合成酵素−263−

抗体を用いてWestern blotによりミトコンドリ
アタンパク質量を比較すると症例AでややATP
L−Strand
H−Strand

合成酵素の減少がみられたものの（図3），mtDNAほどは減少しておらず，ミトコンドリアの数というよりもミトコンドリア内のDNA分子数の減少が推定される．
ミトコンドリアDNAの多重欠失また，症例AのmtDNAのSouthernblotで，
感光時間を長くすると16．6kbpの他に連続的な短いバンドが認められた．この短いバンドが非特異

図2

ミトコンドリアDNAの制限酵素地臥PR1，2，3はそれぞれSouthernblotに使用したプローブを示す．

ベータサブユニット抗体を用いた．
結果ミトコンドリアDNAの減少

3人の患者骨格筋及び正常対照よりDNAを精製し，SouthernblotによりmtDNA量および長さを調べた．これらの試料で16．6キロ塩基対のmtDNAのバンドを認めたが，その強度は異なっていた．すなわち，症例AではmtDNAの強度は対照の15％以下に減少していた．逆にMELAS患者はmtDNAが増加していた．下段パネルはEtBr染色の結果であり，全DNA量はほぼ一定である．また，湿重量あたりの仝DNA量は対照群とほとんど変わらず，症例AのmtDNAの減少は，特異的であると結論された．DNA源が剖検試料でありそのためにmtDNAの減少の可能性もあるが，他の剖検試料ではmtDNAの減少はみられないことから，mtDNAの減少は，症例Aの場合に特異的な現象であると思われる．
また，電子顕微鏡写真によると明らかなミトコ
ンドリアの減少は観察されなかった．そこで，ミトコンドリアタンパク質であるATP合成酵素の
ー264−

図3

ミトコンドリアDNAのSouthernbl。t

A，E，Fは，それぞれ，症例A，B，Cを示す．B，C，Dは，正常対照．
下段は，EtBr染色した全DNA．E，Fのミ
トコンドリアDNAは増加しているが，Aは逆に著しい減少を示した．

的な分解切断に起因しているのではないことを示

欠矢部を同定しており，D−loopから欠夫が始まっすために，様々な制限酵素で切断し，種々の
mtDNAの箇所のプローブでハイプリグイズしたているとしている4）．もしも，患者Aにおいても欠（図4）．もし，精製過程や死後変化などの非特異的分解によるものであれば，どの制限酵素で切断しても短い断片が検出されるはずである．結果は，Sacl断片や，Dral断片には，連続的な短いバンドがほとんど認められず，2つの複製開始点間（図2におけるOHOL間の右半分側）にのみ多重欠夫が存在すると思われた．
また，プローブ3でハイプリグイズした時（図5）も，多重欠夫が認められた．Zevianiらは，常染色体優性遺伝を示す家系患者において，多重欠夫を認め，PCRで増幅後サブクローニングして，

図4

夫がD−loop領域から開始していればプローブ3
でハイプリグイズしたときには，短い断片は検出されないはずである．結果は他のプローブを用いたときと同様短い断片が検出され，本症例の多重欠夫の開始点はD−loop領域に限定されていない．
Zevianiらは，先にも述べたように，PCRで増幅した断片をサブクローニングして，塩基配列を決め，欠失開始点がD−loop領域に限定していると結論しているが，その塩基配列から得られた欠夫の長さとSouthern blotの結果とは一致せず，むしろ，彼らのPCRでは，Drloopから開始する欠矢部のみを増幅させたと考えられる．そこで，わATP合成酵素ベータサブユニット（Flβ）のWesternblot
症例A（P）では正常対照（C）に比べタンパク質の軽度減少がみられる・−265−

さらに，mtDNAの多重欠矢も同時に観察された．
この二つの現象の関連は明らかではなく，今後の課題である．
この症例は常染色体優性遺伝がうたがわれており，核遺伝子の関与が示唆されている．この核遺伝子の実体は明らかにされていないが，核遺伝子とミトコンドリア遺伝子の相互作用を明らかにしていく過程でミトコンドリア脳筋症の本体がより明らかにされていくものと思われる．
文
図5

献1）BrielVetal：Oculoskeletalmyopathywith

ミトコンド））アDNAのSouthernblot

Cは正常人の血球細胞，Pは症例Aの骨格筋を示す．（症例Aの骨格筋ミトコンドリアDNA
は著しく減少していたので仝DNAをあわせるために対照として，血球細胞を用いた）．
PRl，2；3は，それぞれ図2に示したプロー
71こ対応する．症例Aでは，BamHI，PvuII
断片で連続的な短い断片が見られた．一方，Sacl，Dral断片では，短い断片が検出されず，
図2の左側領域には，多重欠損が，存在しない
ことを示す．

abnormalmitochondria．CanJ NeuroI Sci
ll：390−394，1984．

2）HoltIJetal：Deletionofmusclemitoch。nT
drial DNA−in patientswith mitochondrial
myopathies．Nature331：717−719，1988．
3）Morares C T et

al：Mitochondrial DNA

deletionsin progressive external optha1−

moplegiaandKearns−Sayresyndrome．NEng
J Med320：1293−1299，1989．
4）Zeviani M et al：An autosomal dominant

たしたちは，彼らの症例も本症例と同様欠矢部は，disorderwithmultipledeletionsofmitochon−

特定部に極在していないと考えている．

drial DNA starting at the D−loop region．
Nature339：309−311，1989．

考察5）SaikiRKetal：Primerdirectedenzymatic

常染色体優性遺伝が疑われる家系のKSS不全

amplification ofDNA with at thermostable

型症例の骨格筋よりDNAを抽出し，mtDNAを
DNA

Souternblotにより検索した．その結果mtDNAが特異的に減少していることが明らかとなった．

polymerase・Science239＝487−491，

1988．

6）AndersonSetal：Sequenceandorganization

mtDNAの減少によってミトコンドリア脳筋症がOfthehumanmitochondrialgenome．Nature引き起こされた症例はなく，興味深い例である．

290：457−465，1981．

−266−50）慢性外眼筋麻痺症候群におけるミトコンドリア
DNA異常と臨床像・筋病理所見との対応
埜 中 征 哉＊
研究協力者

後 藤 雄 一＊ 宝 来

目
的外眼筋麻痺を伴うミトコンドリアミオパテー（MMP）の症例では，高頻度にmtDNAの大きな

表1

No．0t
Patl●nt

s●X
H／F

MtONA

D●I●tlon

Group A：PEO

は相関がないと述べているが，個々の症例ごとの臨床症状や筋病理所見との関係については言及し

TypIcaIKSS

3

1／2

PEO

27

14／13

Pto，laOnly

3

1／2

3
19
0

Group8：HMPwlthovt PEOorpto雷l書ていない3）．我々は，欠失mtDNAが病態にどのよ
うに関わっているかを知る目的で，一欠夫の有無と臨床症状・酵素活性・筋病理所見との関係を調べた．特に外眼筋麻痺を伴うMMP患者の筋組織に

対象と方法
対象は筋生検にてCCOの部分欠損の像を呈した49例で，内訳は眼瞼下垂か外眼筋麻痺を有する

サザンプロット法によるミトコンドリア
DNA検索の結果
PEO：prOgreSSive extemal ophthalmo−
plegia，KSS：KearnS−Sayre syndrome，
MMP：mitochondrialmyopathy

欠共が認められている1ト3）．欠失mtDNAは，正常の大きさのものと混在しており，その割合は症例ごとで違いがある．Moraesらはすでに，mtDNAの欠夫は慢性外眼筋麻痺症候群（CPEO）の症例にのみ認められ，欠矢の大きさや位置と酵素活性と存在するcytochrome c oxidase（CCO）の部分欠損に注目し，CCO欠損線錘の頻度とmtDNA
欠矢との関係を中心に検討した．

聴＊＊

HERRF

6

2／4

0

0th01＄

6

4／2

0Grol叩C：Non−MMP
MyotonIcd

trOPhyHyp●rCK〇mId

3
l

l／0

1′2

0
0

性を測定した4）．DNAについては，ヒト正常
mtDNAをプローブとしてサザンブロッティング法を行い欠矢の有無を調べた5），6）．正常に対する欠失mtDNAの割合はデンシトメトリー法にて算出した．さらに欠失断端を含む領域をPCR法にて増幅し，HaeIIIとHinfIによる切断パターン

MMPの症例が33例（グループA），眼瞼下垂も外眼筋麻痺もないMMPの症例が12例（グループB），MMP以外の症例（筋緊張性ジストロフィー
3例，高CK血症1例）が4例である（表1）．全から欠失部位を同定した7）．

症例の生検筋について各種の組織化学染色を行い，
特にCCO染色では横断面で500−1000本の筋線経のうち活性のない筋線経の出現頻度を計算した．
また分離ミトコンドリアタンパクの呼吸鎖酵素括痺を有する例（22例，67％）に認められた（表1）．Moraesらの指摘するように，臨床症状として外眼筋麻痺が必発していた3）．頻度は欧米の報
告（40％台）よりやや高めであった3）・8）．外眼筋麻痺以外の症状で，欠夫の有無による差を認めた症状はなかった．
欠矢の部位はH鎖とL鎖の複製点の間の＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部＊＊国立遺伝学研究所

結果
mtDNAの欠夫は全てグループAの外眼筋麻−267−

1・8−8．8kilobaseで，Schonら9）の報告したいわ
ゆるhotspotの例は5例（23％）で，その頻度は欧米より低かった（表2）3〉・8）．欠夫の大きさや位置は，酵素活性との間に明らかな相関は認めなかった（表3）．また同じ大きさ，同じ部位の欠矢をもつ10a〜10eの5例についてみても，欠失
mtDNAの割合と酵素活性との問に相関は認めなかった（表3）．
CCO活性のない線経の頻度は，外眼筋麻痺を有するグループAにおいて，欠夫のある群は，ない群より有意に高かった（表4）．また欠夫のある群は，他のグループと比較しても有意に高かった（表4）．一一万，欠矢のある症例についてみると，CCO
欠損線経の頻度と欠失mtDNAの割合との間に強い正の相関を認めた（図）．
考察

まずはじめに，mtDNA欠夫と臨床症状との関係について考えてみたい．欠夫を認めたCPEO患者の半数以上は眼瞼下垂が初発症状であり，眼瞼
下垂も外眼筋麻痺とともに重要な臨床症状に違いない．しかし，Moraesらがすでに報告しているよ
表2

うに，今回の研究でも，臨床症状として外眼筋麻痺が必発していた3）．このことは，外眼筋麻痺だけが疾患特異的症状なのかどうか，外眼筋麻痺と眼瞼下垂は本質的に違う発症機序で起こっているのかどうかという問題を残すことになる．また，全てのCPEO患者がmtDNAの変異を有するのかどうかということも今後の問題であり，この点は患者mtDNAの全塩基配列を決めることで解決される可能性がある．
一方，生化学的酵素活性とmtDNA欠夫との問には，今回の研究で示されたように，明らかな関係は認めなかった．その理由は三つ程考えられる．
まず第一に，ミトコンドリアの生合成やミトコン
ドリア内代謝がmtDNAと核DNAの両者に支配されていることがあげられる．欠失mtDNAが病気と何らかの関係があると考えられても，核DNAからの影響が強いために表現型としては酵
素欠損にならないことが考えられる．この点の解
明は，核・ミトコンドリア相互関係の生理的作用の基礎的研究の発展を待たねばならない．第二に，核DNAの変異と違って，このmtDNAの変異に正常のDNAが共存していることである．一部のミトコンドリアDNA欠夫の部位
破線内に欠失断端が存在することを示す．番号右の括弧内の数字は症例数を示す．

OH

N0．

Sizo

1（1）

8．8

2（31

7．7

3（1）

7．3

（kb）

4（1）

6．8

5（1）

5．5

6（1）

5．4

7（1）

5．3

8（1）

5．2

9（1）

5．1

10（5）

4．9

11日） 4．2
12（1）

2．8

1．3（1）2・3
14（2）

oH

品■」品目品．昌．盃這息品．品iう

2．215（1）1．8−268−

表3 欠失例22例のまとめ
I，IVandV：COmplexI，ⅠVandV，Cyt‥CytOChrome，n：nOrmal・RRF＝ragged−redfibers

C85●
No・

Rati00l En王ym●Acl州t】●＄

引王○○t
Dtktion
仕b）

〇
4

5
8
0

1
1
4

0

8

6

5

7

一

2

3

l
9
l

2
6
6

0
l
9
l

2

2

7
1

2

1
一

2
1

8

1

mtDNAが機能を失っても残っている正常
mtDNAが表現型としては十分な活性をもっている可能性がある■．変異mtDNAがある一定のレベルを超えて優位になると，急に酵素活性が低下してくるのかもしれない．最後の理由は，現在行っている生化学的酵素活性の測定方法が，ある量の組織全体としてしか測定できないことによると考えられる．すなわち，一部に活性低下の部分があ●p＜0．0100000︵ボ︶巴OqElUOで笥P⊥UOO

0っても，他の正常の部分でマスクされる可能性が高い．このことは，組織化学的な結果と比較しても明らかと思われる．
最後に欠失mtDNAと筋病理所見，特にCCO
欠損線経との関係について述べる．CCO欠損線経が散在する病理所見（CCO部分欠損）は種々の疾患で認められ，ミトコンドリア内外の異常による
CCO機能不全の最終的な表現型と考えられる．今
10

20

30

40

50

60

70

80

90

1○○

DeletedmtDNA（％）

図

一
5

2

Ⅹpく0．05

4

3

5

4

2

2

4

12

Group C：

〇
2

8

4

GlOUPB；

0

2

3

11

0

2

2

22

Wlth01ltd●l●uor1

6

4

1

With d●t●tion3eGroup A：0

4

0

N0．0t Ra990くトl●d CCO−d●IIdont
p州●ntS nb●一書仰¶b●r8（幻

■
1

9

4

0

ccO欠損線経の頻度

9

9

d

表4

1
1

9

4

0

：

6

■

q

4

0

：

・づ

7
1

▼

C

：

：

2

4

q

0

：

：

4
1

5

1

9

：

：

5

b

：

5

−

5

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2

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7

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：

：

3

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ト■■

：

：

7
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5

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：

：

2

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5

5

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3

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4

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7
1

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3

3

I−

一一イ

6〇
▼一
83
04
04
1−
60
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05
48
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58
01
．2
55
85
05
87
47
40
0．
0〇
カ
1
うー

7

7

b
2

：

：

nn■nnnnl−nlnnnnnnnnnnnn

7

7

2

：

ご

CCO D●Iict●nt

珊用いl紬椚㈱nn■nnnnnnnnnnnnnnnnnnn

7

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a
2

T T T T ■

8

8

1

ト．・
：

−4
0∽20
04
30360909070
02
80
03
70
05
50
05
40506050

IV・VVV・V‥・HCyt．認昌‡7．−「
1 2 8 6 3 3 4L4 5 6 8

欠失例20例におけるCCO欠損線経の頻度と欠失mtDNAの割合回の研究では，mtI）NAの欠夫はCCO部分欠損のある症例にのみ認められたこと，また欠失
mtDNAの割合が高いほどCCO欠損線経の数が多いことが示された．このことは，CCO部分欠損
がmtDNAの異常の十分条件とは言えないが，必−269−

要条件である可能性を示している．

Variabilityin the activity of respiratory

ところで欠失mtDNAはCCO欠損部位でどのChainenzymesinmitochondrialmyopathies．

ような役割を担っているのであろうか．今回の研Acta Neuropatho176：135，1988．

究の結果から，CCO欠損部位には他の部位より欠5）Southern EM：Detection of specific

失mtDNAが多く存在することが予想されるが，SequenCeSamOngDNAfragmentsseparated

さらにin situハイプリグイゼーションなどで確by gelelectrophoresis．J MoI Bio198：503，

認する必要がある．また，CCO部分欠損の起こる

1975．

メカニズムを筋発生と関係づけて研究することで，より欠失mtDNAの病態への関わりが明らかに

6）Horai S，Gojobori T and Matsunaga E：
Mitochondrial DNA polymorphismin

されると思われる．

Japanese．I．Analysis with restriction en・
ZymeS Of six base palr reCOgnition．Hum

文献

Genet68：324，1984．

1）HoltIJ，Harding AEand Morgan−Hughes
JA：DeletionsofmusclemitochondrialDNA7）SaikiRK，GelfandDH，StoffelSetal：Primer

in patients with mitochondrialmyopathies．
Nature331：717，1988．

with a themOStable DNA polymerase．

2）ZevianiM，Moraes CT，DiMauro S et al：8）HoltIJ，Harding AE and Morgan−Hughes

Deletions ofmitochondrialDNAinKeamS−

JA：DeletionsofmusclemitochondrialDNA

Sayresyndrome．Neurology38：1339，1988．

inmitochondrialmyopathies．Nucleic Acids

directed enzymatic amplification of DNA

Science239：487，1988．

3）Moraes CT，DiMauro S，Zeviani M etal：

Res17：4465，1989．

MitochondrialDNAdeletionsinprogressive9）Schon EA，Rizzuro R，Moraes CT et al：A

externalophthalmoplegiaandKearns−Sayre

direct repeatis a hot spot forlarge−SCale

Syndrome．N EnglJ Med320：1293，1989．

deletion of human mitochondrial DNA．

4）Koga Y，NonakaI，Sunohara N et al：−270−

Science244：346，1989．

51）Kearns−Shy症候群におけるdeletedmtDNAの組織分布とRNA転写について
清 水 輝 夫＊
研究協力者 中 瀬 浩 史書
ものを用いた．Deletionの認められた症例に関しは じ め にHoltら1）によってlarge−SCale deletionをもつてはEcoRI，XbaI，HindIII，PstIの各制限

ミトコンドリアDNA（mtDNA）がwild type

酵素切断部位の有無をSouthem blottingにて検

mtDNAとともに存在することが証明された．そ

討し，deletion部位をmappingした2）．次に一部のの後の検索によって1arge−SCale deletionはミト症例においてpolymerasechainreaction（PCR）

コンドリア・ミオパテーの多様な臨床病型のうち法を用いてdeletedmtDNAのdeletion部位の塩ではKearns−Shy症候群（KSS）2）及びその不全型

基配列を決定した．Deleted mtDNAの臓器別分であるProgressive external ophthalmoplegia

布をKSS3症例で検討した4）．第1例は骨格筋，（PEO）3）にのみ存在すると考えられている．本症の発症機構を理解する上で以下の点が検討すべき問題として残されている．1）mtDNAのdeletionの発生機転についての考察は不十分である．2）
外眼筋麻痺の合併は必発であり，この臨床病型の均一性が何に起因するのか一つの問題である．この点からdeleted mtDNAの臓器別分布を検索す
ることはきわめて重要と考えられる．3）Deletion
部位と生化学的異常との対応の欠如は本症の発症機序と関連して重要な問題である．以上の諸点を明らかにするために以下の実験を行なった．
方

白血球，血小板，第2例では大脳，肝，骨格筋，第3例では大脳，小脳，骨格筋，心筋，平滑筋，肝臓，腎臓についてDNA抽出し，Southernblot−
tingを行い，nOrmalmtDNAとdeletedmtDNAの相対量比をみた．
DeletionのあるPEO例及びdeletionのない
PEO例について生化学的検索を行なった．Cyto−
Chrome c oxidase（ComplexIV），NADH cyto−
Chrome c reductase（ComplexI＋III），Succin−
ate cytochrome c reductase（ComplexII＋III），
NADH dehydrogenase，Succinate dehy−
drogenase，Citratesynthetaseを測定した．またKSS症例骨格筋及びクローン培養した線維芽細法

129例のミトコンドリア・ミオバナー（KSS，胞5）よりGuanidium／Cesium Chloride法によりPEO，MERRF，MELAS，Benign，infantileform，

RNAを抽出し，NorthernblottingによりRNA

Malignantinfantile

form，Leighs

syndrome

解析を行なった6）．プローブはdeletionにより生

etc．；米国コロンビア大学・国立神経研究所及び東じたfusiongeneのdeletion切断部位の

京大学神経内科症例）の骨格筋DNAを抽出し，PvuIIにて切断後アガロース・ゲル電気泳動を行

m13

い，Southernblottingにて検討した．プローブは
ヒト骨格筋より抽出したmtDNAをPvuIIにて切断後random−primer法によりP32ラベルした

左側

右側

各々のDNA断片をAttadiらの作製した

vecterのinsertよりあるいはPCR法にて増幅されたDNA断片から作製し，random−
primer法によりラベルして用い，fusionRNAの有無を検討した．またKSS症例よりクローン培
養した線維芽細胞のhomoplasmic cloneと＊東京大学医学部脳研神経内科

heteroplasmiccloneを用い，100mMemetine存
−271−

■

■

10

1〜

1▲

川

kb

Typical Probab旭KSS KSS PEO

こ−㍉・‥−‥＿ニー．完・−；三・一．い…一・・三…丁n0．0J騨抽即座
2

1

8

1

0

1

1

0

1

0

0

1

1

0

0
一．．．＿．＿．日月」．一日−‥＿．．．．．．＿‥．‥

0

0

1

1

0

0

二二二二二二二二扁二二二二二二二．杉％％瑚■■∴ ∴6．鼠●∴−∴∵∴ ∴田辺ヨ■■』■100＿…．．．．．．‥6．4‥‥

0

1

0

二二：二：二二二1ユニ∴二二二二

0

1

0

0

0

1

1

0

0

1

0

0

二二：二：：∴：：てこ0：二∵二∴二二二二二∴二：二二二二

0

1

0

0

0

1

1

0

0

4

0

0

1

Tota11015

回l Kearns−Shy症候群におけるmtDNAのdeletion部位
破線部は制限酵素切断部位の有無から判断したdeletionの確実な部分，斜線部はdeletionの可能性のある未確定部分．KSS：Kearns−Shy syndrome，PEO：prOgreSSive external
Ophthalmoplegia．
WIDESPREADTISSUtiDISTRIBtmONOFMrTOCHONDRIALDNA
DELEnONStNKEARNS−SHYSYNDROMt：（PeTCent Of deleted mtDNA population）
PERCENTDELErEDmtDNA

TtSSUE

Skdetdmuscle：

peC血
pSOaS
diapbmgm

図2

60％
58％
55％

Smoo山muscle：

4％

Hean：

39％

Crd〉ellum：

15％

Frotlt且llobe：

44％

Liver：

14％

Ki血ey：

44％

KSS剖検例における各臓器ごとのdeleted mtDNAの割合−272−

CASElCACAAACTACCACCT
T N Y
Ⅱ
L

撃等C甘C空包

ATPase8（8482）CASE2

TTGGCAGCCTAGCATTAGCAGGAATACCT
L

A

A

事

ND5

（13460）7521bpTGCGACTCCTrGACG．．．．………．……ACCTCCTGGCGACC」−一一一一一・一一・一r

cccccATrATTCCTAGAACChGGCGACC
P

P

L

ft

L

E

ぎC字亘評評l

COXⅡ

図3

CAGACAATTATACCCTAGCCAACCCCTTA
I） N Y T L A N P L・・・・・
l（7982）（15504）

CYTb

Kearns−Shy症候群の2症例にみられたdeletion部位のdirect repeat（A）とNorthernblottingによるRNA解析（B，C）
A：症例1は13bpのdirect repeatを示し，

hot spotで生じたselectionである．症例2は8bpのdirect repeatを認めるがframe shiftはない．

在下細胞質での蛋白合成を抑制し，S35Lmeth−ionineを用い，ミトコンドリア合成蛋白のみをラ
ベルし，4MUrea存在下のSDS−PAGEにて検討した．
結

bpのdirectrepeatはmtDNAの複製開始部位を
deletionに含まない条件下においてmtDNAのdirectrepeat中最長のものである．またdeletionを持つ症例の60％近く になんらかのdirect
repeatが存在している．
mtDNAの組織分布についてKSS剖検例を含果

KSS18例中15例，PEO44例中17例にdeletionが認められ，各症例のdeletionの大きさと部位を図1に一覧として示した．H鎖L鎖のmtDNA複製開始部位（OH及びOL）は必ず保存されるが，0。
及びOLの間はほぼ全域にわたりdeletionが存在していた．また仝例に共通してdeletionしている部位はない．このdeletionの部位を見ると29例中11例（38％）の症例はほぼ同一の部位にdeletionがあると考えられる．これらの共通のdeletionを持つ症例について，PCR法を用いてdeletion部
位の塩基配列をみると， hot spot となるdele−tionにおいて13bpのdirectrepeatを認めた．13

む検索を行なったところ，deleted mtDNAは骨格筋ばかりでなく中枢神経系（大脳，小脳），心筋，腎臓，肝臓，消化管平滑筋においても存在し，白血球においても一部の症例で認められた．しかしdeleted mtDNAとnormalmtDNAとの相対量比は組織ごとに異なり，骨格筋に多く，ついで心筋，中枢神経，腎臓に多く，肝臓，平滑筋では乏しかった．
生化学的には，各症例においてdeletionの部位とどの呼吸酵素活性が低下するかには相関関係は認められず，deletionのあるPEO例及びdeletionのないPEO例の対比においてはmtDNAにコー

−273−

開SE！

R．

柳引網膵軋

DELETED

B．

Pt
P

い十日㌧日代＝

6ノ8）8．8

P2

ご

P C

kb¶

B：症例1におけるRNA転写．DeletedmtDNAよりfusion RNA（1．3kb）が合成されていることを示す．C：COntrOl，P：patient．Pl probel，P2：prObe2．

ドされるサブユニットを持つ酵素（すなわちえられる．一方，S35▼methionineの取り込みによComplexI，IIl，IV）はすべて活性の低下する傾るmitochondriaにおける蛋白合成の検討をした向を認めた．そこで，deletedmtDNAのRNA転写を調べると，第1例では1．3kb，第2例では0．8

が，このfusionmRNAに対応した蛋白の存在は証明されなかった．

kbの正常では存在しないバンドを認め，deletion
考によって生じたfusion geneに対応するfusion
mRNAの存在がNorthern blottingにて証明され，deletedmtDNAもRNA転写されていると考察

Directrepeatの存在は半数以上のKSS症例のdeletionの発症機序と−2741

してintramolecular

CRSE

2

凱

B．
こ・：

∴）

fl f†

fl f4

￣r‥■■

、

・

上l

kb（rvlb）−

C：症例2におけるRNA転写．0．8kbのfusionRNAの存在を示す．fl：homoplasmicclone，
f4：heteroplasmic clone．

recombinationが想定される．とくに40％近いものは13bpのdirect repeatをもつ特定部位で生じており

hotspotとなっている．KSSは多くは

SpOradicであるが，mtDNAにdeletionを引き起こす素因が常染色体優性に遺伝する家系が報告されていることからも7），このdeletionは各個体の発生初期あるいは00Cyte内で発生したと考えられる．
外眼筋が必ずおかされるという臨床像の特徴の一つの説明としてthreshold effectによるものがあり，外眼筋は骨格筋・心筋などとともにエネル

ギー消費の高い組織であり，中枢神経系とともに骨格筋・心筋などは酵素活性の低下が表現型としてあらわれやすいと考えられる．しかし，異常mtDNAの組織分布をみることによって別の観点が示された．KSS剖検例では骨格筋についで心筋・腎臓においてではdeleted mtDNAの割合が多いが，中枢神経・肝臓・平滑筋においては量的に少なく，組織ごとにmutant mtDNAとwild
typemtDNAの割合が異なっていた．このようなgenotypeの差は発生途上でmitotic segregationが生じることにより基本的には説明される．ほと¶275−

ある．RNA転写は両鎖ともDループ近傍より開fヰf！

始し，一本の長い前駆RNAが合成され，原則としてtRNAあるいはtRNAの相補部位が切りとら碍■■ ■山れて，H鎖の転写からは14個のtRNAと2個の・一・・・・・一rRNAそして10個mRNAが合成される．そのた

COH1

め，mtDNAのRNA転写がpolycisternicであり−【0†−全体としてまったく転写されていないか，あるいはRNA転写は行なわれているが，deletionによCVT b，HD2っていくつかのtRNAが欠損しているために蛋・・・− MOl
−

CO〉く

一・一

−

白合成がされていないか二つの機序が考えられる．
りCO〉く

RTPq9e

本研究で示したように，deletedmtDNAもRNA

Hl

転写はほぼ正常に行なわれており，emetine存在
6下での蛋白合成実験においてもfusionRNAに対応するbandはSDS−PAGE上にも存在せず，いく種類かのtRNAの欠損により蛋白合成系が障

図4

害されていると考えられる．Mutantとwildtype

KSS症例2におけるミトコンドリア蛋白
合成．Emetine存在下におけるheteroplas−
mic及びhomoplasmic cloneのS35−met＿hi。nineにラベルされた蛋白を示す．
Fusion RNAに対応するbandは存在しなの二種類のmtDNAが同一のミトコンドリア内に存在した場合，両者はco−predominantである
ので，正常なmtDNAによってtRNAが補われて，mutant mtDNAによる酵素欠損が表現型として現われにくいと考えられる．したがって，こんどの例で骨格筋にdeleted mtDNAが多い理由
として生体内で細胞分裂の続いている組織においの事実は同一のmitochondria内では正常のmtDNAからtRNAの補給はほとんどないこと，てはdeleted mtDNAを持つ細胞が選択的に脱落

すなわち多くの場合各mitochondriaはhomoTしていく と考えられる．この考えは正常な
mtDNAとdeleted mtDNAの両者を持つ培養細plasmyであり，mitochondria内でのgenetic

胞と正常mtDNAのみを持つ培養細胞をクロー

complementationは行なわれていないと考える
一つの根拠を示している6）．

ン化したとき，その成長速度は正常なmtDNAの文みを持つ細胞が圧倒的に早く，混合培養したときはほとんど正常なmtDNAを持つ細胞のみが選択されてしまうという培養細胞系の観察によって献

1）HoltFJetal：Deletionofmusclemitochon−
drial DNAin patients withmitochondrial

あることより逆に細胞内のレベルではmtDNA

myopathies．Nature331：717−719，1988．
2）Zeviani M et al：Deletions of mitochondrialの割合が増加するような機序が考えられるとする

DNAinKearns−Sayresyndrome．Neurology

立場もあるが，現在のところまだ実験的裏付けを

38：1339−1346，1988．

支持されている5）．さらにKSSが進行性の疾患で欠いており，臓器分布の問題はさらに検討が必要

3）Moraes CT et al：Mitochondrial DNA
deletionsinprogressiveexternalophthalmo−

である．
一方deletionの部位と生化学的異常との間には対応関係がなく，deletionの部位がいずれにあplegia and Kearns−Shy syndrome．New Eng
J Med320：1293−1299，1989．

ってもmtDNAにコードされたサブユニットを4）SchonEAet al：A direct repeatis a hotspot

持つ電子伝達系酵素活性がすべて低下する傾向に

forlarge−SCaledeletion ofhumanmitochon−−276−

drialDNA．Science244：346−349，1989．

tionofKearnSLSayresyndrome：Implications

5）MoraesCTetal：Heteroplasmyofmitochon・for pathogenesis．submitted．

drialgenomesinclonalculturesfrompatients

7）Zeviani M et al：An Autosomal dominant

withKearns−Sayresyndrome．BiochBiophys

disorderwithmultipledeletionsofmitochon・

Res Com160：765−771，1989．

drial DNA starting at the D−loop reglOn．

6）Nakase Hetal：Transcriptionandtransla・ー277−

Nature339：309−311，1989．

平成元年度研究班名簿

平成元年度 杉田班 名簿
区

分

≡
旺

氏

長

杉

所

名

田

秀

夫

事

荒

木

淑

郎

事

清一郎

大 阪大 学 医 学部 第 二 内科

寺

尾

寿

帝 京 大 学 医学 部 第 一 内科
〒173

佐

〝

藤

猛

J／

木

紘

一

〒 113
吉

武

正

高

〝

木

昭

夫

：
旺

月

栗

原

照

幸

木

南

美

紀

〝

〝

斉

田

孝

彦

JJ

鈴

木

義

之

〝

田

通

等

〝

埜

〝

堀

中

征

哉

〝

水

野

美

邦

〝

桃

井

真里 子

吉

岡

利

息

（
内2221）（
内1562）
助 教 授

03 −8 13 −3111（
内3322）

部長

03−823 −210 1

教

授

025 −223 −616 1

部

長

03 −588− 11 1

教授

03 −468 −1251（内5180）（内 2016）（
内15−4 36）
教

授

部

長

075 −461−5 121

副 所 長

03 −823−2101

院長0423 −23−5111

部

長0423 −4 1−2711

（
内275）

（
内5 103）（
内3201）

小 平 市小 川東 町 4 − 1 − 1

府 中市 武蔵 台 2 − 6（
内5211）
副 参 事
研 究 員
教

−281−

（
内4020）
03 −8 13 −3111

助 教 授

0285−44 −2111（
内3321）

栃木
33
11 県
−河
1 内郡 南 河 内 町 薬 師寺

川崎 市 宮 前 区 菅生 2 −16 − 1

0423−25 −388 1

授

文 京 区本 郷 2 − 1 − 1

聖 マ リア ンナ医 科 大 学 第 二生 理

03 −813 −3 111（
内 35 14）

府 中 市 武蔵 台 2 − 6 − 1

自治 医科 大 学小 児科〒213

03 −964 −1211

文 京 区 本 駒込 3 −18 −22〒329 −04〝

授

京郡 市 右 京 区鳴 滝 音 戸 山

順 天堂 大 学 医 学部 脳 神 経 内科
〒 113

教

（
内5611）

文京 区 本 郷 2 − 1 − 1

東 京都 神 経 科 学総 合 研 究 所 神 経生 化 学〒 183

06 −45 1−0051

目黒 区大 橋 2 −17 − 6

国 立 精 神 ・神 経 セ ンター 神 経 研究 所
〒 18 7真 一郎

授

港 区虎 ノ 門 2 − 2 − 2

東 京 都 立神 経 病 院
〒18 3

教

新 潟市 旭 町 通 1 番 町 757

東 京 都 臨 床 医学 総 合 研究 所 臨 床 遺伝 学
〒113096 −344 −2111（内5416）

国 立療 養 所 宇 多野 病 院 臨床 研 究 部神 経 内科
〒616

授

文 京 区 本駒 込 3 − 18 −22

順 天堂 大 学 医学 部 第一生 化 学 教 室〒1130423 −41−2711

教■

東 邦大 学 医 学部 大 橋 病 院 第 四 内科
〒 153

連 絡 の際 の 電話（
内5 101）

文 京 区 本郷 2 − 1 − 1

虎 の 門病 院 神 経 内科
〒 105

長

板 橋 区 加 賀 2 −11 − 1

新 潟 大学 脳 研神 経 内科
〒951

所

大 阪 市 福 島 区福 島 1 − 1 −50

東 京 都 臨床 医 学総 合研 究 所
遺 伝 情報〝け る地 位

順 天 堂 大学 医学 部 脳 神経 内科
〒113

鈴

所属にお

地

熊本 市 本 庄 1 − 1 − 1

井

夫

名

小平 市 小 川 東 町 4 − 1 − 1

垂

〒553
〝

設

在

熊 本大 学 医 学部 第 一 内科
〒860

幹

施

国 立精 神 ・神経 セ ン ター神 経 研 究 所
〒 187

監

属

所

（
内3448）

教授044−977 −8 111（内3408）

区

分

氏
吉

JJ

所

名
田

瑞

子

若

山

吉

弘

lJ

原

信

義

納

JJ

小

金

沢

鹿 児 島大 学 医学 部 第三 内科

高将

名 古屋 大 学 医 学部 第二生 化 学

郎

川

け

井

尚

臣

け

後

藤

幾

生

り

斉

藤

深美子

〒812

〒113
清

ル

水

輝

夫

ル

進

一

信州 大 学 医 学部 第三 内科

J／

杉

村

公

也

名 古 屋 大 学 医学 部 神 経 内科

高

〃

瀬

貞

夫

高

／
J

守

正

治

田

JI

代

邦

雄

塚

JJ

越

廣

中

J／

村

晴

臣

ル

宝

釆

ル

山

田

問

三

好

和

国 立遺 伝 学 研 究所

腐

大分 医 科 大 学生 理 学

夫

授

052 −741−2 111（
内 2146）（
内 203 1）
助 教 授

助 教 授

0886 −31−3 111

教

授

092 −641− 1151

助

手

03 −813−6 111（
内 3204）（
内 228 1）（
内 6132）師

03 −815−5411

助 教 授

0263 −35−4600

助

052 −741−2 111

講（
内 8763）（
内 532 1）
手（
内 229 7）
助 教 授

−282−

022 −274 − 1111（
内 2323）

教授0762 −62−8 151

教授

0 11 −716− 1161（
内 3950）（
内 602 7）
教授

03 −813−6 111（
内 3380）教授0859 −33− 1111

助

手0559 −75−0 771

教授

0975 −49−44 11（
内 2371）（
内 568）

大
医大
分が
県丘
大分
1郡
−1506
狭 間町

徳 島市 蔵 本 町 3 丁 目

0298 −53−3 192（
直通 ）三 島市 谷 田 111

徳 島大 学 医 学部 第一 内科〒770

教

米 子市 西 町86〒879 −56顧

0992 −64−22 11

文 京 区湯 島 1 − 5 −45

聡

〒411
和

授

札 幌市 北 区 北 14条 西 5 丁 目

鳥取 大 学 脳 研神 経 病理〒683

教

金 沢市 宝 町 13 − 1

東京 医 科 歯 科大 学 医 学部 神 経 内科
〒113

（
内553）

仙 台市 青 葉 区星 陵 町 1 − 1

北海 道 大 学 医学 部 神 経 内科〒060（
内 269）

名 古屋 市 昭 和区 鶴 舞 町65

金沢 大 学 医 学部 神 経 内科〒9200255 −34−3 131

松 本市 旭 3 − 1 − 1

東北 大 学 医 学部 脳 研神 経 内科〒980

長

文 京 区本 郷 7 − 3 − 1

司

〒466

医

文 京 区揚 島 1 − 5 −45

庄

〒390

045 −971− 1151

福 岡市 東 区 馬 出 3 − 1 − 1

東 京大 学 医 学部 脳 研神 経 内科
〒113

授

徳 島市 蔵 本 町 3 丁 目

東 京医 科 歯 科大 学 難 治研 細 胞 遺伝0423 −41−2 711

教

茨 城 県つ くば市 天 王 台 1 − 1 − 1

九州 大 学 医 学部 神 経 内科

連 絡 の際 の 電 話（
内 5143）

名 古屋 市 昭 和 区鶴 舞 町65

徳 島大 学 医 学部 第一 内科〒770

長

鹿 児 島市 宇 宿町 1208− 1

筑 波大 学 臨 床 医学 系 神 経 内科
〒305

室

新 潟−
468
県1中頸 城 郡 大潟 町 犀 潟

弘

一

け る地位

横 浜 市緑 区 藤 が丘 1 −30

光

〒466
付

所属にお

地

国 立療 養 所 犀 潟病 院 神 経 内科

〒890
沢

名

小 平 市小 川 東町 4 − 1 − 1〒949 −31

／
J

設

在

昭 和大 学 藤 が 丘病 院 神 経 内科
〒227

福

施

国 立精 神 ・神 経 セ ン ター神 経 研 究所
〒 187

J／

属

所

（
内 2640）

名 誉 院長0886 −31− 3111

区

分

氏
豊

ル

所

名
倉

康

夫

所

宇尾野

公

義

当

安

部

和

子

設

在

名

所 属 にお地ける地 位
長03− 964 −1131

名誉 院長

0542 −45 −0101

静 岡市 城 東 町24 − 1

沖 中記 念 成 人病 研 究所
〒105

院

連 絡 の 際 の 電話

板 橋 区栄 町 35 − 2

国 立静 岡 病 院
〒420

事 務 担

施

東 京都 老 人 医療 セ ン ター
〒173

ル

属

港 区虎 ノ門 2 − 2 − 2−283−

03−588 −1111（内2168）