厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究荒木班

平成4年度研究報告書

平成5年3月（1993年）

研究報告書の作成にあたって
平成4年度は，本研究鑑の発足以来第3年日に当り，班としては最終年度となる．

本研究班の第3年目の班会議は，平成4年12月4日拗〜5日出の2日間，東京全共連ビルで行われた．56題の発表があり，その内訳は，筋ジストロフィー37題，ミトコンドリア
脳筋症16題，その他3題であり，研究内容は極めてすぐれたものが多く，出席者に多大の知的興奮と満足を与えたようである。

筋ジストロフィーでは，ジストロフィンテストによる病型診断から遺伝子診断へと発展がみられ，患者診断のみならず出生前診断あるいはキャリアの診断が可能となってきたことは注目すべき進歩であった。これは，サザンブロッテイング解析やmultiple PCR解析
が技術的に可能となったことによるものである．ついでジストロフィン関連蛋白，ジスト
ロフィングリコプロテインの局在とその生理的役割の考察が進み，治療面では，タントロ
レンナトリウムの影響，正常myoblastの移植と注射の効果が検討された．
ミトコンドリア脳筋症では，KSS，MERRF，MELASの三大臨床病型がプロトタイプとして示され，臨床病型に対する遺伝型は一部の症例を除き明らかにされた．しかしその後の研究により臨床病型は予想以上に多彩であり，当初の単一のプロトタイプに単一のミトコンドリア遺伝子異常が必ずしも対応しないことがわかり，臨床症状の多様性と遺伝子上の他の塩基置換や核遺伝子の関与が考えられるようになった．さらにミトコンドリア遺伝子異常に加齢の関与も示されるようになった．ミトコンドリア脳筋症には今後解決すべき問題点が極めて多いことが示されたが，これは，かえって将来の研究テーマとしてチャ
レンジに値する興味あるものといえよう．

本研究班の重要な目標の1つは治療法の開発であった．筋ジストロフィーもミトコンド
リア脳筋症にも残念ながら現在有効な治療法がない．しかし現在，ジストロフィン欠失動

物に正常のmyoblastを移植したり，組み換えジストロフィンDNAを直接筋肉内に注射し，ジストロフィンを発現させる実験が行われている．遺伝子治療は，国際的立場でみるとすでに欧米ではスタートしており，わが国の研究もこれに遅れることなく前進してほしいと思う．

3年間という研究期間は短いが，初年度にあげた研究戦略に向かって研究を進め，約42名の研究班月による研究成果は国際的にも高く評価される内容のものであった．本研究班の班長を担当させていただいたことは身に余る光栄であり，また喜びでもある．班眉各位の努力に心から感謝を申し上げたい．

おわりに本研究班に対し，終始懇切な御指導を賜った国立精神・神経センター総長大熊輝雄先生，神経研究所長杉田秀夫先生，名誉総長里吉栄二郎先生，厚生省保健医療局長谷修一氏，審議官小林秀資氏，政策医療課長西本至氏，岡崎国立共同研究機構生理学研究所
長江橋節郎先生をはじめ多くの関係の方々に深甚の謝意を表したい．さらに日本筋ジスト
ロフィー協会理事長河端静子氏の御支援に感謝する．

筋ジストロフィーに対する治療法は，近い将来開発されることを期待すると共に，班月各位の研究に対するますますの御精進を祈念したい．

平成5年2月く姓長〉荒 木 淑 郎

目次

平成4年度総括研究報告7

平成4年度総合班会議研究報告抄録

15

分担研究報告23

Ⅰ．臨床・病理31

Ⅱ．ミオトニアほか

73

Ⅲ．ジストロフィン・遺伝子

105

Ⅳ．mdxマウスほか

177

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症

201

アンケート調査

267

3年間の研究班の研究に対する感想と今後の期待について

平成4年度研究班名簿285

平成 4 年度

総括研究報告総括研究報告
主任研究者 荒 木 淑 郎

Ⅰ．3年間の研究班の研究目標とその成果
研究目標
本研究班は，杉田班（昭和59年〜平成元年に及ぶ筋ジストロフィー及び関連疾患の病態とその成因に関する研究）の後をうけて，平成2年4月新しく分担
研究者を再編成して発足したもので研究目標を筋ジストロフィーおよび関連疾患（とくにミトコンドリア脳筋症）の成因の解明と治療法の開発とした．
班の構成は初年度は班長のほか，班月38名，顧問3名の計42名，2年度は，41名，3年度は42名である．
研究戦略は1）筋ジストロフィーでは，（1）各病型におけるジストロフィンテ
ストの検討，（2）ジストロフィンの臓器分布と骨格筋細胞膜における局在，（3）ジストロフィン関連蛋白の検討，（4）mdxマウスを用いた病態の解明，（5）筋ジスト
ロフィーの治療法の開発とし，2）ミトコンドリア脳筋症では分子遺伝学的解
析とその治療に重点をおいた．さらに，3）その他の関連疾患の研究は，各班月の独自の研究とした．
研究成果
1）筋ジストロフィー（1）ジストロフィンテストの応用
ジストロフィンの免疫組織化学イムノブロットテストには，特異抗体が必要である．ジストロフィン分子上の異なるドメインを認識する複数の抗体を用いて，生検筋を検索するが，具体的には，モノクローナル抗体2−5E2，3−
4E5，4−4C5の3着を用いれば，ほぼ目的を達する．Kunkelらの30Kと60Kは有用であるが，ポリクローナル抗体のため結合組織のバックグランドが高く出るという欠点がある．臨床診断において特筆すべきことはDMDとBMDの鑑別，DMDとFuknyama型筋ジストロフィーの鑑別，DMDといわゆる肢帯型筋ジストロフィー（一般にジストロフィンは正常）の鑑別が可能とな−9−

ったことである．また，DMD保因者のうち，臨床症状を呈する者は，モザイクパターンが出現するので，肢帯型との鑑別が可能となったこと，またいわゆる肢帯型筋ジストロフィーと臨床診断されている弧発例の中には，本研究班の検討によると，男性の31％にBMDが，女性の12％にDMD保因者が含まれていたことがわかり，適切な遺伝相談の資料としてジストロフィンテストが不可欠であることが示された．
（2）ジストロフィンのと卜臓器分布と超微形態
抗ジストロフィン抗体を用いた，WeSternblottingtechniquc（wb）および免疫染色による検索の結果，DMDでは，いずれの抗体を用いてもwb上全臓器でジストロフィンの発現はみられなかった．とくにDMD患者の脳でジストロ
フィンは欠如しており，DMD患者の知能障害に脳型ジストロフィンの異常が関与する可能性が示された．BMDではwbにて低分子化が示された．またジス
トロフィンの骨格筋細胞膜における局在と超微形態についての観察がなされた．
（3）ジストロフィン関連蛋白（DRP）の検討
ジストロフィンが筋形質膜に存在する糖蛋白と結合して何らかの機能を有することが示唆されており，DMDとBMDの患者生検筋およびmdxマウスの筋について免疫組織学的検討がなされDMDではジストロフィンと共にDRPが著減していることが明らかにされた．
（4）mdxマウスにおける筋病態の研究
mdxマウスでは，ジストロフィン欠損のため複数のionchannelに異常が生じており，細胞内環境の維持には余分のエネルギー消費が必要であると推測された．このhomeostasisは種々の要因により破綻され，細胞壊死が発生するものと考えられる．また運動負荷が誘因となる可能性も指摘された．ジストロフ
ィン欠損と筋変性・壊死の関係については，まだ充分解明されるまでには至っていない．ほかに，筋細胞成長促進因子の研究も進展した．
（5）筋ジストロフィーの治療法の開発
筋ジストロブィーの病因としてDMDではジストロフィンの欠損が明らかにされたが，まだ病因論的役割は不明である．しかし筋破壊の共通の機構として，
カルシウムの細胞体内への異常な流入が示唆されている．細胞体内のカルシウ
ム濃度の異常な上昇は，永続的な筋収縮をひきおこすものと推測されている．
ダントロレンナトリウムは筋形質膜を安定化する作用をもつ抗痙縮薬で，DMD−10−やその動物モデルのmdxマウスで血清CKを有意にさげる作用があることが報告されている．本剤にはステロイドのような長期連用時の重篤な副作用は知られていない．筋ジストロフィー5例についての検討の結果，肢帯型2例において進行が投与後援徐になった例があり，今後検討が進められる予定である．
mdxマウスでの投与実験では，投与群と非投与群との間に血清CK値と筋の組織変化において差はみられず，またmdxマウス筋小胞体からのカルシウムの漏出克進もおこらなかったとの報告がある．つぎに正常myoblastをmdxマウスに注射し，ジストロフィン陽性線経の数を指標にジストロフィー筋の正常比が検討されたが，ジストロフィン陽性線経の出現率は，1回注射群で2．0％，3回注射群で2．9％となり若干の増加が認められた．

2）ミトコンドリア脳筋症
骨格筋内にミトコンドリア（mt）の異常形態を示し，筋生検にてragged−
red fiber（崩壊赤色線維）を認め，骨格筋の障害を呈する疾患を狭義のmtミオパテーと言うが，広義のmt脳筋症は，骨格筋の症状だけでなく脳や心臓など多数の症状を伴うものをいう．mt脳筋症としては，慢性進行性外眼筋麻痺（CPED），Kearns−Sayre症候群（KSS），MERRF（myoclonus epilepsy
associated raggedTred fibers）やMELAS（mitochondrial myopathy，enCe−
phalopathy，lacticacidosisandstrokelikeepisodes）が代表的疾患である．
MERRFやMELASにおいては，以前からmtDNAの異常が示唆されていたが，本研究班の班眉によって，MERRFではtRNALys（8344）の発見，ついでMELASではtRNALeu（3243）の発見があいついでなされ，これらの変異が，患者群においてのみ特異であることより病因であることが示唆された．これらの成果は，国際的に高く評価されている．
mt脳筋症患者で検出されるmtDNAの変異は，主として点変異と欠失であるが，その後ヒトmtDNAの解析が進み，多くの塩基置換が見出され，またいずれも大小の欠失をもっており，点変異と欠矢の複合が疾患病因と考えられている．さらに毒物，薬物といった外部要因，加齢ないし遺伝といった内部要因
による点変異の蓄積によってmtエネルギー生産系の障害がおこり，活性酵素の産生を促し，変異した遺伝子の総量が一定の開催をこえると機能の障害がおこると推測されている．
−11−

本研究班では，さらにmt脳筋症におけるmtDNA異常と臨床症状の多様性との関連の検討，および病理と生化学の検討がなされ，臨床的にも基礎的にも大きな前進が見られた．
関連疾患として筋phosphofructokinase欠損症のnewvariant，高齢で発症したmultipleacyl−CoAdehydrogenase欠損症，Pearsonmarrowpancreas症候群（Pearson症候群）などの興味ある症例の報告があった．
ⅠⅠ．当該研究における未解決の問題点とその解決の見通し
1．ジストロフィーではジストロフイγ遺伝子異常と表現型（欠損部位と臨床との対比），骨格筋細胞膜におけるジストロフィンとジストロフィン関連蛋白およびジストロフィン結合蛋白の局在と機能，ジストロフィンテストの応用と限界（どの抗体を用いれば充分か），ジストロフィーにおける細胞外マトリックスの変化，筋細胞の変性と壊死機構は今後も検討を要する．治療へのアプローチ
としては，ダントロレンの内服や，immobilizationの影響，ミオブラスト注射の効果など始まったばかりである．以上のごとく未解決な問題が多く，基礎と臨床の協力による解明の必要がある．
2．ミトコンドリア脳筋症ではmtDNA変異と臨床像との対比，筋酵素の遺伝
子発現と転写への調節，変異のheterogeneityの同定などに関する基本的な研究が必要である．さらにmtDNAと加齢との関係，あるいは外因子による影響についても検討の必要がある．治療法は，理論的立場を明確にしたアプローチが重要である．

ⅠⅠⅠ．今後該当分野の進め方についての意見
本研究班は，3年間，dystrophinopathyとmt myopathyの研究に専念し，分子遺伝子学的研究レベルでは国際的レベルに達する程の成果がえられた（表）．ジストロフィン抗体の応用は次第に普及し，遺伝子診断や遺伝相談の面でも臨床の場において大きく貢献していると思われる．今後はDMD／BMDを中心に，ジストロフィン，ジストロフィン関連蛋白，ジストロフィン結合蛋白の研究と共に，DMD／BMD以外の筋ジストロフィーの分子遺伝学の研究の推進が重要であると思われる．
また治療の開発面においては，遺伝子治療がすでに諸外国ではスタートして−12−

おり，正常ミオブラストの注射と移植を始める前段階としてのdeliverysystemの開発（例えばウイルスの利用）に向かう必要があると考える．
mtmoypathyではmtDNAdeletion，mtDNAのpointmutations，mtDNA
depletion，mtDNAduplicationと臨床との対比を，基確と臨床の両面から忍耐強く検討を進めてゆくべきではないかと考える．

ⅠⅤ．当該分野に対する国外の研究状況の概要
筋ジストロフィーおよびミトコンドリア脳筋症の研究については海外とりわけ米国，欧州から多くの論文が発表され，著しい発展がみられる．とくに分子遺伝学的研究においては，わが国の水準は高く，欧米のそれに劣るものではない．しかし諸外国の研究層と比較すると研究者数，研究資金，研究協力体制においてわが国のそれは，米国と比べて弱体なところがあると思われる．常に大局をみながら重要課題を決め，協力体制でのぞむ必要があろう．

Ⅴ．その他の希望事項
本研究班は，長年わが国の筋ジストロフィーの成因と臨床に関する研究班として注目をあつめ，常に国際的視野に立つ活動を続けてきた．本班の研究使命が今後も維持され，さらに発展することを強く希望する．
表 筋ジストロフィーおよび関連疾患の成因と治療法開発
に関する研究（筋ジス第2軌 荒木班）
3ヶ年の業績サマリー
1）筋ジストロフィー
1：ジストロフィンテストによる病型診断（可能）2：ジストロフィンの局在と超微形態の検討（進展）3：ジストロフィン糖蛋白と関連蛋白の検討（進展）
4：mdxマウスにおける筋障害機構の解明（進展）5：治療法の開発（正常myoblast注射，タントロレンナトリウムの投与）（進展）
2）ミトコンドリア脳筋症
1：MERRFにおけるmtDNAの点変異（tRNALys8344の発見）
2：MELASにおけるmtDNAの点変異（tRNALeu3243の発見）
3：拡張型心筋症でmtDNAの点変異（tRNA‖e4269の発見）
4：mtDNA異常と臨床症状の多様性との関連の検討（進展）−13−平成4年度厚生省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー」総合班会議

筋ジストロフィー及び問連疾患の成因と治療法開発
に関する研究研究報告抄録ジストロフィン遺伝子異常と表現型

由起子
恵 理

武

田

伸

一

塚

中 村 浩一郎
古 城
徹

川
織

文子之

一

俊洋智

喜

原口茂

澤賀

荒林平古

畑

律 子
後 藤 加奈子ほか（国立精神・神経センター神経研究所）
遺伝学での表現型（Phenotype）とは，ある遺伝子の支配によって発現された形質の型（つまりobservedresultoftheinteractionofthegenotypewithenvironmentalfactors）を指しており，遺伝子型（genotype）に対置した用語である．これをmusicalanalogy

で例えると，genOtype

は全ての情報 を書き込まれた楽譜であり，phenotypeは演奏された結果のサウンドといえる．サウンドは指揮者，奏者，ホールその他のさまざまな環境因子の影響を強く受けている．
ジストロフィンの欠陥によって生ずる臨床像の多様性（clinicalheterogeneity）には，DMDとBMDの差異，高CK血症と筋痙攣を見るⅩ−linked myalgia家系，大腿四頭筋ミオバナーと
BMD，一方のみが臨床症状を呈した一卵性双生児のDMD保因者姉妹，全く同じ遺伝子異常を認めながら臨床経過が異なるBMDの兄弟例等々がよく知られている．しかしながら，このような臨床的観察の背後にあろう分子病理学的機序については，なお未解決の部分が多い．
事を整理する上で我々は，Clinical heterogeneityを取り敢えず（1）genotypeのheterogeneity（different mutationsLthat cause a similar phenotype）と，（2）phenotypeのheterogeneity（differentclinicalcoursesdespiteanidenticalmutationとに分けて考えてみることも必要であろう．前者はさらに①allelicheterogeneity（mutationsatthesamelocus；DMD／BMD，MyD，
FSHD等）と，②locusheterogeneity（mutationsatdifferentloci；DMD−Ⅹp21／SCARD−13q，
DMD／LGD／other myopathies等）に分かれよう．
さて，筋ジス荒木班でもジストロフィン及びその遺伝子異常と臨床に関する多数の報告がなされて来た．ここにその一部を挙げてみることにする．
・筋ジストロフィーを合併したダウン症候群（高木）・ OutlierM筋ジストロフィーの1剖検例（田過）・悪性高熱を呈したBecker型筋ジストロフィー症例（水澤）・運動時筋痛，高CK血症を呈したジストロフィン異常症（後藤ほか）
・拡張型心筋症を主症状とするBecker型筋ジストロフィーの遺伝子解析（庄司）・ジストロフィン分子におけるN末端ドメインの臨床的意義（荒畑）・ジストロフィンのヒト臓器分布（内野）・ジストロフィンの脳型及び筋型プロモーターの検討（斎藤）・筋ジストロフィー家系の遺伝子診断と保因者診断（斎藤ほか）
・臍帯及び筋病理標本によるジストロフィンの遺伝子診断（荒畑）・BMDにおけるジストロフィンの動態（堀ほか）
・女性孤先例のミオバナーにおけるジストロフィン異常症（荒畑）−17−

・ジストロフィンテストによる肢帯型筋ジストロフィーの再検討（荒畑）・先天性筋緊張性ジストロフィーにおけるジストロフィンの発現遅延（清水）
・福山型先天性筋ジストロフィーにおけるジストロフィン局在様式の異常（荒畑）・F−F法，D−E法による骨格筋細胞掟の観察，BMDの検討（若山，小林）・ジストロフィン関連タンパク（DRP）の発現量と臨床的重症度（佐橋，納ほか）
・DRPとジストロフィン結合糖タンパクの機能的関連について（清水）
・筋ジストロフィーにおける骨格筋細胞外マトリックス ラミニン の変化（荒畑）今回は，これらの研究の中からいくつかを例に取り上げて，ジストロフィン遺伝子異常と表現型について論じてみたい．今後の研究の一つの方向は，これら膨大なデータについて，個々の患者・家族のgenotyperphenotypecorrelationを具体的に掘り下げて行くことにあろう．筋ジストロフィ
ーのphenotypeの修飾に，多数の環境因子が関与していることは，それだけ治療法の手掛かりも多く存在し得るとも解釈できるので，この方面のさらなる研究成果が期待される．

厚生省「精神・神経疾患研究委託費」，筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班），平成2年度研究報告書
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」，筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班），平成3年度研究報告書
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」，筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班），平成4年度抄録集−18−

ミトコンドリアDNA異常と臨床像
佐 藤
猛（国立精神・神経センター国府台病院）
ミトコンドリアDNA（mtDNA）の研究の進歩によりmtDNAの変異に基づいた新しいミトコン
ドリア（Mit）ミオバナーの分類が確立されつつあり，対応する臨床像の多様性の示されている．
mtDNAの異常は①mtDNAの欠失／重複，②mtDNAの変異（点変異，埠一塩基欠出／重複）である．本研究虹の多くの班月によって次々と新しい知見が兄いだされているが，その概要を報告する．
1．mtDNAの欠失（多重）（1）進行性外眼筋麻痺症候群（PEO）：Kearns−Sayre症候群（KSS），KSS不全型，眼筋ミオバナ
ー，（2）家族性PEO，（3）Peason症候群，（4）運動後発作性ミオグロビン尿症などにおいて2−8kb
にわたる大欠夫が認められている．欠失端の塩基配列の解析から繰り返し配列を示すものは捌こ過ぎないことも明らかにされている．さらに加齢による欠失mtDNAの増加の機序についても研究されている．
2．mtDNAの変異（1）MELAS．後藤，宝来，小澤，太田班員によりtRNALeu（UUR）をコードする塩基番号3243のAからGへの変換が報告され，ついで第3271，あるいは3250に変換を示す症例も兄いだされている．臨
床像も多くの非典型例が示されている．さらにangipathyの指摘（埜中班月）の意義も大きい．
（2）MERRF．宮武班員によりtRNALysの第8344のAからGへの変換が報告された．RRF（−）の症例，PEOを伴った症例なども兄いだされている．
（3）拡張型心筋症でtRNAHeの第4269変換が岡田班眉により兄いだされている．
（4）Leber病ではND4をコードする領域の第11778のGからAへの変換が兄いだされ，さらにNDlの領域が問題になっている．

−19−

泊鯨へのアプローチ
高

木

昭

夫

（虎の門病院神経内科）
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の治療へのアプローチは以下のように分類される．1）病態に基づく経験的ないし緩和的治療，2）病因に対する治療．前者としては例えば，glucocorticoid
やdantrolenesodiumによる治験が現在進行している．2）としては，正常筋芽細胞（mpc）移植が試みられている．欠損しているdystrophinの補充あるいは正常遺伝子の直接的導入も検討されている．

荒木班では，この3年間に14の治療に関連した研究報告がなされた．ここではその一部を紹介したい．
A）dantrolene sodiumほか
木村・柁らは肢帯型やFSH型筋ジス症例に25〜50mg／dayの薬剤を授与して，血清CK値，日常動作などを分析した．これら指標に好影響のみられる症例もある事実から，現在多施設での治験が進行している．mdxマウスを使用した実験的治療が行われた．20mg／kg／dayの腹腔内投与による血清CK値や筋組織像の変化を観察した．米国の報告と異なり，いずれの指標にも有意の変化を認めなかった．栗原らはmdxマウスの膜電位や電気的ミオトニアに対して，dantroleneの効果を検討した．これらの指標は影響を受けなかった．一方，meXiletineやbestatinは両指標を改善させた．
phenytoinは電気的ミオトニアにのみ有効であった．別の報告では，phenytoinは病理学的所見を改善した．
B）筋芽細胞（muscZe precursorceH，mPC）移植
近年mdxマウスへの正常遺伝子導入のための一方法として，正常な培養筋芽細胞の移植実験が行われている．問題点の一つは移植効率，すなわちdystrophin陽性線経の出現頻度が低い事であった．寺尾らはこの要因として，a）拒絶反応，b）mpcの注入量，C）mpcの融合能や分裂能などを検討した．まずcyclosporinAの併用では著明な効果を得なかった．移植前にホストマウスの全身照射（450rads）を行うと，陽性率は0．6から2．2％に増加した．しかしまだ不十分と考えられた．
ヌード化したmdxマウスに移植を行うと，陽性率は平均6．0％（2．4〜9．7）まで増加した．このよ
うに拒絶反応は重要な因子であることが判明した．高木らは培養筋芽細胞とmincedmuscletissueの各々の移植を行い比較した．
minced tissueの方がdystrophin陽性牢が高く，移植細胞のviabilityが関係すると推定した．
C）ミトコンドリア脳筋症
田代らは嫌気性問値（anaerobic threshold，AT）の概念を筋疾患の治療に応用した．ATは漸増
的運動負荷に際して，血中乳酸濃度の上昇が生ずる直前の運動量あるいは酸素摂取量と定義される．
ATの増加は有気的代謝による運動能力の向上を示している．ミトコンドリアミオバナー症例で，−20−

CoQlO投与8〜12週後にATの増加がみられた．
多発筋炎では，AT以下の運動を継続する訓練が治療上有効であった．
太田らはヒト培養細胞（EB8）にmtDNAを導入する方法を開発した．本症の遺伝子治療への可能性を示した．

−21−

分

担

研

究

報

目

次

Ⅰ．臨床・病理
1）筋ジストロフィーを合併したダウン症候群

33

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

2）筋ジストロフィー症及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究
東京都立神経病院

田

邊

36

等

3）悪性高熱を呈したBecker型筋ジストロフィー症例42

筑波大学臨床医学系神経内科 水 澤 英 洋4) FSH類似症候を呈する家族性アミロイドーシス

46

帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫

5）遠位型ミオバチーの免疫組織化学的研究

50

国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信 義

6) 封入体筋炎の位置づけ(DMRVとの比較を中心として)53

国立精神・神経センター神経研究所 村 上 信 行7）筋エコー法における前腕中央走査の有用性
信州大学医学部第三内科

58

庄

司

進

一

8) 最近見出された筋phosphofructokinase欠損症new variant (PFK noto)

の病態

61

大手前病院（国家公務員等共済組合連合会）

垂

井

清一郎

9）筋疾患の治療効果

64

北海道大学医学部神経内科

田

代

邦

雄

10) 人骨格筋細胞におけるmyoglobin mRNAの局在─電気的研究

徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

68

臣

Ⅱ．ミオト二アほか

11）電気的ミオトニー発生条件の数理的解析
東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸

257512) Myotonic Dystrophyにおける糖鎖構造の特徴

80

名古屋大学医学部神経内科 杉 村 公 也

13) 父親由来のCTG repeat異常を認めたcongenital myotonic dystrophy
の一家系

84

鹿児島大学第三内科 納

光 弘14）筋緊張性ジストロフィー症における遺伝子不安定領域の変化と臨床症状の関連について88

新潟大学脳研究所神経内科

田

中

恵

子

15）筋細胞死と自食作用および再生

92

順天堂大学医学部第一生化学

木

南

英

紀

16）筋再生と塩基性線維芽細胞成長因子 ─第3報─
九州大学医学部脳研神経内科

後

96

藤

幾

生

17) 筋細胞の分化･成長に対するEGF並びにCGRPの促進作用
徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

99

臣

Ⅲ. ジストロフィン･遺伝子18) ジストロフィン関連蛋白の免疫組織化学とacetylcholinesterase

活性像による筋組織の検討

107

東京都立神経病院

田邊等19）生検筋におけるジストロフィン関連蛋白の免疫組織化学的検討
愛知医科大学第四内科 佐 橋

111功20) 筋ジストロフィーにおけるジストロフィン関連蛋白(DRP)の免疫組織化学的研究

116

鹿児島大学医学部第三内科

納

光

弘

21) Dystrophin‑related protein (DRP)とdystrophin‑associatedproteins (DAPs)の結合について

119

帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫

22) 急速凍結deep etching法によるジストロフィンと他の細胞骨格蛋白（アクチン，スペクトリンなど）との相互関係の検討

122

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義23）マウス正常骨格筋細胞膜ジストロフィン分子の形態計測とアクチン, α‑アクチニンとの関係
昭和大学藤が丘病院神経内科

26

126

若

山

吉

弘

24) Becker筋ジストロフィー症筋細胞膜のFreeze‑Fracture法

による研究

131

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

25）ヒト中枢神経系における局在と特性並びにBecker型筋ジストロフィー
135の発現様式について
国立療養所再春荘病院神経内科

内

野

誠

26) Becker型筋ジストロフィーにおける異常ジストロフィンの二次元電気泳動による解研

141(財)東京都神経科学総合研究所分子研究系神経生化学

堀眞一郎

27）筋ジストロフィー赤血球膜ジストロフィンファミリーの検索およびPCR法によるジストロフィン遺伝子欠失診断
宮崎医科大学衛生化学

147

濱

田

稔

28）筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの脳型及び筋型

プロモーターの検討

153

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

29) Southern blott法, nested PCR法, Pulse Field Gel
Electrophoreisis (PFGE)法により保因者診断を行った
Duchenne型筋ジストロフィー家系

157

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

30）拡張型心筋症を呈するベッカー型筋ジストロフィーの遺伝子解析
信州大学医学部第三内科

庄

司

進

162

一

31）長期室温保存された臍帯及び筋病理標本によるジストロフィンの
遺伝子診断

166

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一
16932）ミオバチー女性例に見るジストロフィン異常の出現頻度
国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

17233）筋ジストロフィーにおける細胞外マトリックスの変化
国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

Ⅳ. mdxマウスほか
34) mdx骨格筋の電気刺激時に於ける細胞内Ca2+濃度及びその膜電位
国立精神・神経センター神経研究所

27

吉

田

瑞

子

179

35) 単一チャネル電流記録法によるmdxマウスの細胞内カルシウム流入機構の研究
金沢大学医学部神経内科

高

守

正

治

36) ダントロレンNaを用いたmdxマウスの治療的研究
東邦大学医学部第四内科

栗

181

184

原

照

幸

37) mdxマウスにおけるダントロレンナトリウムのCK値

および運動能力におよぼす影響

188

京都大学医学部神経内科

梶

龍

兒

38) mdxマウスへの正常筋移植

192

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

39) ジストロフィー筋への正常myoblastの注射に関する研究─mdx/nude host へのmyoblast transfer

東京大学医学部神経内科

196

寺

尾

寿

夫

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症40）蛋自賛のミトコンドリア移行とその異常：サイトゾル因子の役割
熊本大学医学部分子遺伝学教室

森

正

203

敬

41）新しい病因によるミトコンドリア病─ピルビン酸脱水素酵素蛋白のミトコンドリア内移行障害─

207

徳島大学医学部小児科

黒

田

泰

弘

42）4世代にわたる慢性進行性外眼筋麻痺
愛知医科大学第四内科

212

佐

橋

功

43) 外眼筋麻痺を伴ったMERRFの2家系

216

国立精神・神経センター国府台病院 佐 藤猛44)高齢発症のmultiple acyl CoA deficiency
九州大学医学部脳研神経内科

219

後

藤

幾

生

西

澤

正

豊

45）ミトコンドリアDNA多重欠失例の解析
自治医科大学神経内科

22246）拡張型心筋症を呈したミトコンドリア脳筋症の一例
大阪大学医学部附属病院小児科

岡

226

田

伸太郎

47) Pearson症候群におけるミトコンドリア異常の生化学的･分子生物学的解析
230
名古屋大学医学部第二生化学

28

小

澤

高

將

48) MELASにおける変異ミトコンドリアDNAの検討

234

三井大牟田病院神経総合医療センター 荒 木 淑 郎49) MELAS患者脳における変異ミトコンドリアDNA量の分析
筑波大学臨床医学系神経内科

水

澤

英

237

洋

50) ミトコンドリア脳筋症MELASの変異ミトコンドリアDNAの変動
自治医科大学第一生化学

太

田

成

241

男

51)ミトコンドリアDNA3243点変異による症状の多様性

244

国立精神・神経センター神経研究所 後 藤 雄 一52）多数の老人斑を伴うミトコンドリア脳筋症剖検脳の解所247

大手前病院（国家公務員等共済組合連合会）垂 井 清一郎

53) ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリアtRNA遺伝子の変異
国立遺伝学研究所 宝 来251聰54）ミトコンドリア異常症の病熊解析

255

自治医科大学小児科 桃 井 真里子

55) ミトコンドリアDNAの導入法の開発
自治医科大学第一生化学

258

太

田

成

男

56）ミトコンドリア異常症の臨床型の広がり（2症例の呈示）
帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫

29

262

Ⅰ．臨床・病理

1）筋ジストロフィーを合併したダウン症候群
高 木 昭 夫＊

研究協力者

坂 井 克 之＊ 松 村 多 可＊小進＊ 斎 藤 深美子＊＊

島

は じめに

皮，扁平鼻背，放線などダウン症候群特有の外表ダウン症候群は頻度の高い常染色体異常症候群

奇形を認めるものの一般内科的に異常なし．IQ
23（m中一Binet式知能検査）と4歳相当の知能であった．下腿に仮性肥大が認められ，四肢近位筋に3−4￣レベルの筋力低下がある．さらにである．筋緊張低下が生下時，幼少時に認められるが，明らかな筋病変の報告はまれである．今回，我々はBecker型筋ジストロフィー（BMD）を合併したダウン症候群を経験した．BMDは最近分
子生物学的手法により診断可能となり，その臨床的表現型は従来考えられていたより多様である．
その頻度も従来の報告より多いと推定される．しかしダウン症候群にBMDを合併したとする報告はない．精神発達遅滞児においては筋疾患が見逃されている可能性がありここに報告する．
症例

症例：22歳，男性
主訴：筋力低下，歩行障害
家族歴：母親が37歳時の第2子，血族結婚なく，家系内に明らかな神経筋疾患なし．ただし母親の血清CK228と軽度上昇していた．
現病歴：処女歩行は2歳半．5歳までには精神運動遅滞はあるものの日常生活上は階段昇降も含め問題なし．12歳になって階段を昇るのが困雉となり，15歳では座位からの立ち上がりが困難，歩行障害も出現し徐々に進行．22歳時，筋疾患を疑われ精査目的で入院となった．
入院時現症：身長143cm，体重62kgと著しい肥満がみられる．短頭，扁平顔，日艮裂斜上，内眼角費＊虎の門病院神経内科＊＊東京医科歯科大学難治疾患研究所

Gowers，徽候陽性，Waddlinggaitであった．
検査所見：血液生化学所見ではCK545（正常：〜150），ミオグロビン327（正常：〜60）と上昇
し，さらに総コレステロール369と高月旨血症がみられた．甲状腺機能，副腎皮質機能を含め内分泌機能に異常なし．心電図上VlでhighR，V5，6でdeep Q，flat TまたCRBBBがみられ，左主後側壁の障害を示唆する所見であった．また201Tl
心筋シンチでも同部に取り込みの欠損がみられた．
心エコーでは心奇形を認めなかった．針筋電図では運動単位数は保たれるものの早期動員傾向を示
し，低振幅短持続活動電位主体で一部に高振幅多相性電位が混入した．筋CTでは大殿，中殿筋は著しい低吸収域であり，大腿では大腿直筋，縫工筋，薄筋は比較的保たれるものの，その他は低吸収であった．下腿ではヒラメ筋は中等度の障害だが前脛骨筋および排腹筋は比較的保たれていた．
上腕二頭筋生検所見：HE染色では筋根絶の大小
不同，円形化および問質の著しい脂肪浸潤を認める．またphagocytosisを伴った壊死再生線経があり，一部にnuclearclumpsを認めた．NADH−TR
染色では筋内線維構築の乱れがみられ，一部に濃縮した萎縮線経を認める．ATPase染色ではtypel優位であった．グリコーゲン，脂質の蓄積，rag一
ged−red fiberはみられなかった．またN末端

−33−

図1

AICによる免疫組織染色
筋線経の筋膜同国が全同性に染まっているものの，染色性の低下した部分が散ft三
する
図3

図2

multiplex PCR
P：本症例 C：コントロール
exon44，48は保たれているもののexon
45，47がみられない．すなわちexon45−
47の欠夫である．

4−4C5による免疫組織染色
図1と同様の所見である．

（aa215L264）を認識するAICによるジストロフ
ィン染色ではすべての筋線経の筋膜周囲が全同性に染まった（図1）．さらにC末端（aa3495−3544）を認識する4−4C5によるジストロフィン染色でもすべての筋線経が全周性に陽性であった（図2）．
これらジストロフィン染色では染色性の弱い部分が散在しているのが目につくものの，コントロールとの差ははっきりしなかった．
PCR解析：BeggsおよびChamberlainらの方法
により末梢血白血球のDNAに対してmultiplex
PCRを行ったところ，ジストロフィン遺伝子のexon45および47の欠損を認めた．exo1144，48は保染色体分析：高精度R分染法による染色体分析では47XY（21トリソミー）であり転座は認められなかった．また他の染色体に明らかな欠夫を認めない（図4）．

たれており，eXOn45から47の欠失と考えられた
（図3）．
−34−

考
察
ダウン症候群に筋疾患が合併した例1卜3）を表に示す．筋緊張性ジストロフィーを合併した症例の報告が2例あるが1）2），いずれも偶然の合併と考えられている．Mielkeの症例は，女性であるが16歳より近位筋優位の筋力低下が進行し23歳の時点でてすりによる階段昇降となっており，筋生検で筋線経の大小不同，円形化，phagocytosisを伴った填
死線経がみられ，筋ジストロフィーとの記載はな
いものの本例ときわめて類似した所見であった．
この例は肢帯型筋ジストロフィーを合併した可能性があるが，決定的ではない．
一般にダウン症候群では筋緊張低下が幼少時にみられ，これが運動発達の遅延の原因とされているものの学童期には消失する．
本例は典型的なダウン症候群であり，12歳時より進行性の近位筋優位の筋力低下がみられ，臨床的にBMD，もしくは肢帯型の筋ジストロフィーに合致した．免疫染色では対照正常例と比較し明
らかなジストロフィン異常は指摘できなかったも

おいては，運動能力の発達の遅れがあるのが通常であり筋症状は見逃されている可能性が高く，今後の症例の蓄積が必要である．
また従来より指摘されているように免疫組織学的なジストロフィン診断には限界があり，ジスト
ロフィンのwesternblotやPCRでの診断が，特にBMDに際して必須であると考えられた．
まとめ

12歳より進行性の筋力低下を示したダウン症候群の22歳男子を塁示した．筋組織は筋ジストロフ
ィーの形態変化を示した．免疫染色ではジストロ
フィンの明らかな異常は指摘しえなかったが，
multiplex PCR法によりジストロフィン遺伝子
exon45〜47の欠矢が証明された．本症例はダウン症候群にBMDが合併したものであり，初の報告である．
謝辞：本報告においてmultiplex PCRを施行していただいた国立精神・神経センター神経研究所のの，multiplexPCR法によりジストロフィン遺伝子のexon45−47に欠損が認められBMDと診断された．ダウン症候群とBMDの合併の報告は

荒畑喜一先生に深謝いたします．

今までない．偶然の合併と考えるとダウン症は出生率1：10004），BMDはDuchenne型筋ジストロ
フィー（DMD）の1／10で出生男児の1：30，000で1）Bird TD：Myotonic dystrophy associatedあるため1：30，000，000という非常にまれな合併となる．BMD，DMDは母親の高齢出産に伴うこ2）AraJR，Tamparillas M，et al：Coincidenceとが多いとする報告はない．本例の母親はCK高値であり保因者である可能性があり，ジストロフ
ィン遺伝子のnewmutationである可能性が低い．
従って本例は偶然BMD保因者が高齢出産となったためダウン症候群となったと考えられる．ただしダウン症候群をはじめとする精神発達遅滞児にdrome（Trisomy21）．J NeuroI Neurosurg

文

献withDown、ssyndrome（Trisomy21）．Neuro1−
gy31：440−442，1981．

Of

myotonic

dystorophy

and

Down

s

syn−

Psychiatry50：110−111，1987．
3）Mielke U and Schimrigk K：Progressive
myopathyintrisomy21．Neuropediatrics19：
132−134，1988．

4）Kuroki Y，Yamamoto Y，et al：Down
SyndromeandmaterialageinJapan，1953−

表 ダウン症候群に合併した筋疾患の報告
B ird n

（1 98 1 ）m yo to n ic d y stro p h y

A ra Z〉（1 98 7 ）m y oto n ic d y stro d ly

M ie lk e 3）（198 8 ）pro g re ssiv e m yo p a th y1973．ClinGenet12：43−46，1977，−35−2）筋ジストロフィー症及び問連疾患の成因と治療法開発に問する研究田研究協力者

水 野 美 彦＊＊ 宮 嶋 智 子＊＊ 栗 原 栄 二＊＊
玉 川 公 子＊＊ 小 宮 和 彦＊＊ 小 田 雅 也＊＊＊

は じめにDMDとBMDの中間の症状を示す症例の存在は古くから認識されていたが，Brookel）らはこの様な症例に対しoutlierという呼称を提唱した．近年のジストロフィン（Dy）研究の発展と相挨って， Outlier におけるDyの分析報告も散見されるようになったが，臨床症状とDyの関連については未だ充分には解明されていない．今回，
我々はoutlier

等＊

追と考えられる1剖検例を経験

し，剖検筋での解析を行なったので報告する．
症

例

死亡時32歳の男子．家族歴，既往歴に特記すべきことなし．妊娠・分娩に異骨なし．初期の運動
発達は頸定3カ月，支座6カ月と正常であったが，這い這いは旨く出来なかった．つかまり立ち，伝い歩き1歳，独歩1歳4カ月と遅れた．歩行開始
後も歩き方が重い感じで，Waddlingであった．高い処から飛び降りるとすぐ尻もちをついた．ジャンプは右足では不可．左では10〜20回位可．走る
ことは遅いが可能であった．よく転び，起立時は膝に手をついた．2歳頃より排腹筋の仮性肥大が出現した．7歳10カ月筋生検にてDMDの診断を受けた．その後．8歳時階段はつかまって昇降可であったが，8歳半で自転車をこげなくなり，9
歳半起立困難となった．11歳で階段昇降不能とな＊東京都立神経病院♯■東京都立神経病院神経小児科＊＊■東京都立神経病院病理り．11歳半歩行不能となった．12歳頃は補装具歩行可であったが，余り歩きたがらなかった．23歳
頃よりいざり這いが困難となった．28歳頃より殆ど嘉たきりとなったが，座椅子では支座可能であった．32歳，経口摂取が減少し、脱水となって当科に入院した．
入院時現症
身長155cm，体重25kg，知能正常．全身の著明な筋萎縮．筋力低下（0−1），腱反射消失，関節拘縮あり．但し，脊椎側雪は殆ど認められなかった．
検査所見
Hb13．3 RBC468万 Ht38．6 WBC13800＿Plt20．7万 TP5．6 Alb3．1 Na122 K4．8
C180 Ca8．O Pl．2 BUN13．3 Creatinine0．3
CreatinO．9 GOT15 GPT13 LDH454 CK43
TC82 TG65 Glu154 UAO．5 CRP8．3
CTR48．7％
ECG：低電位，ST−T：低下，Q：正常
入院後経過
入院時胸部ⅩPにて肺炎，胸水貯留あり．翌日
午後，急にhypovolemicch，OCkとなり，気管内挿管施行，心不全もありジギ使用．その後胸水が徐々に増加したので，胸腔ドレーン挿入，黄色透明な胸水が毎日100−150ml排出された．また，胃腸管出血も合併し血圧が徐々に低下，輸血，昇圧剤使用したが無尿となり，利尿剤にも反応なく，入院後3週間削こ永眠された．

−36−

剖検所見
1．一般病理所見
風船状心房室拡張．心筋層非薄化．心外膜下に帯状，巣状の心筋変性（図1A）．散在性器質化肺炎，肺うっ血．胃底部出血性靡欄．偽膜性腸炎．
副腎，脾，腎のうっ血．脂肪肝．
2．脳病理所見
脳重1276g．大脳皮質表層の横走線経の増加．中脳黒質parsreticulataのSpheroid，lipofuscin含
有ニューロンの増加．
筋組織像
大腿四頭筋，上腕二頭筋，肋間筋は殆ど荒廃して結合織化していた．母指球筋．外眼筋は中等度に変性しており，腹直筋は比較的保たれていた（図2）．心筋にも限局性の変性像が見られた（図1

ジストロフィン（Dy）免疫組織化学
母指球筋，外眼筋，腹直筋，心筋についてABC
法にて施行した．腹直筋では免疫蛍光法でも染色した．各筋ともfaintandfazyな染色形態を示した（図3）．ABC法では極く僅かの線経の一部に陽性所見が見られたが，蛍光法の方が感度が良かった．尚，大脳皮質ではDy陽性細胞は認められなかった．
Western blotting
図4に示す様にWestern blottingによるDyの検出は出来ず，これはDy量が少ないことによる検出限界と考えられた．
DNA分析
筋組織よりのPCR法によるDy遺伝子解析では，Exon45，46の欠矢が認められた（図5）．

B）．横隔膜にも強い変性が認められた．
考察

臨床的にDMDとBMDの中間の症状を示す症例については古くから認識されていたが，その病因論的意義づけについては，不明であった．1983
年Brookeら1）は，この様な中間型に対し Out−lier なる呼び方を提唱した．彼等はその診断基準として，①8歳で介助なしで階段を昇れる，あるいは（診11歳を過ぎて介助にて昇れる，とした．更に同じグループのMedori2）らは1989年この基準を厳密にし，階段の数を4段とし，11歳以上では4段を12秒以内で昇る，とした．一方，Baumbachら3）は1980年 Outlier の診断基準に関して次の様に述べている．即ち，1歳から7歳の間に診断され，15歳までに車椅子となり，20代半ばまで生存するものをDMDとし，一万，7歳以降に診断され，15歳を過ぎて車椅子となり，生命維持装置の補助なしに20代後半乃至30代まで生存するものをBMDとし，この中間に属するものを Outlierと定義した．然しながら，この基準はDMDと
図1

A 心筋の横断面Septum筋外瞑下に変性が見られる（Arrowhead）．B 心筋の組織像局所的な変性像が見られる（＊）HElOOX．

BMDの年齢境界が連続しており，中間が存在し得ず矛盾している．ところでDMDの多くが遅く
とも11歳までには車椅子になっていることは多くの者の認めるところであり，11歳より15歳の間で車椅子となった者を Outlier と考えるのが妥当と思われ右．本例は11歳半で歩行不能となってお−37−

図2 骨格筋組織像．A 大腿四頭筋Gomoritrichrome変法150×．B 上腕二頭鼠Gomoritrickrome変法150×．C 肋間筋HElOOx．D 母指球筋HElOOX．
E 外眼筋HElOOX．F 腹直筋HElOOX．
り，また，生命維持装置の補助なしに32歳まで生存したこと，更に最後まで脊椎側雪が認められなかったことなど，DMDとしては明らかに良性で，一方，BMDとしても明らかに悪性であり，従って■ Outlier と考えざるを得ない症例と考えた．本例の場合，最後は心不全を合併したが，呼吸障害を合併しなかったのは，本例が良性であったことの他に，脊椎側雪を合併しなかったことも関係していると思われ DMDの看護における脊椎側考の予防の重要性が再確認された．
本例では筋組織の破壊の程度が四肢筋，肋間筋
で殆ど荒廃していたのに比べ，母指球筋，外眼筋，腹直筋で比較的軽度であったことが印象的である．
DMDでは小筋の変性が軽いことはこれまでにも指摘されていたことではあるが，その機序については未だ解明されていない．母指球筋，外眼筋は

−38−

図4

図3 A 腹直筋のジストロフィン免疫蛍光染
色Faint and fazyな染色が認められる
200×．B 心筋のABC法によるジス
トロフィン免疫組織染色150X．

Western blotting Dystrophinのbandは認められない．

DMDにおける筋変性を軽減させる要因となる可中筋でありこの点は当てはまるが，腹直筋は小さな筋肉とも言えない．一万，肋間筋はどちらかといえば小筋であるが，変性は極めて強い．我々は能性が示唆された．
Outlier におけるDy遺伝子欠損に関する報告は未だ少ない．Malhotraら7）はExon3，3−7，5−7の欠失例を報告している．Medoriらは性を抑制することを述べてきた・1−5）6㌧ この点を考HindIII fragment2−6，2−8の欠失例，更に，
Baumbachらは同じく HindIII fragment3−7，

え合わせてみると興味深いことが推察される．即9−17の欠失例を報告しているが，Exon number

ち，母指球筋や外眼筋は運動鼠も小さく筋線経にとしては分析されていない．また，Hoffmanら8）加わるtensionも小さいため変性が軽度であり，は7例中Dyの分子量サイズが正常な者が5例，異常な者が2例と報告しているが，やはりExon

これまでの本会議でMDXを用い，不動化が筋変

一九 肋間筋は呼吸のため常に動いており，小筋といえどoverworkによる変性が生じると考えらとしては分析していない．本例はExon45，46が欠れる．同じ呼吸運動に関係しながら腹直筋に変性失しておりin−frame deletionと考えられた．

が軽度であったのは，筋肉が比較的大きい割に呼WesternblottingではDy量が少ないため検出さ吸に際して補助的な役割しかなく，負荷が相対的れなかったが，このことは本例が Outlierl としに小さいことが考えられる．横隔膜の変性が強い
ことはこれが呼吸連動に際し最も活躍する筋肉でては限りなくDMDに近い臨床像を示したこととあることからうなずける．四肢筋に最も変性が強andfazyというBMDpatternを示しており，結いことは説明を要しないであろう．従って，我々局，本例は基本的にはBMDであるがDy量が少ないため重症となり Outlierとしての臨床像をが主張してきたように不要な運動を避けることが関係があると思われた．Dy免疫染色形態はfaint−39−

3．Westernblottingではジストロフィンは検出されず，量的に少ないことによるものと考えられた．
4．ジストロフィン免疫染色の結果はBMD型を示しており，本例は基本的にはBMDであるが，ジストロフィン量が少ないため重症化し，
lier

Out−

となったと考えられた．

5．母指球筋，外眼筋，腹直筋などは変性が軽く，筋への運動負荷が変性を助長していることが示唆
された．
文

献

1）BrookeMH，FenichelGM，GriggsRC，etal：
ClinicalinvestigationinDuchennedystrophy，2．Determination

of

the

power

ofthera−peutic trials based on the natural history．

Muscle Nerve

6：91−103，1983．

2）Medori R，Brooke MH，and Waterson RH：
Genetic abnormalities，inDunchenne andBecker dystrophies，Clinical correlations．
Neurology39：461−465，1989．
3）BaumbachLL，ChamberlainJS，WardPA，etal：Molecular and clinical correlations ofdeletionsleading to Duchenne and Becker
muscular dystrophies．Neurology39：465−
474，1989．

4）EEl過 等，永野美彦：「Immobilization」によるmdxマウス筋変性への影響−Localtetanus
法による検討−． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の
図5

PCR法によるdystrophin DNAの分析
Exon45（A），46（B）の欠夫が認められる．

病態とその病因に関する研究 （杉田三旺）平成元
年度研究報告書，1990，pp151−155．
5）田過 等，水野美彦：「Immobilization」によ示したものと思われ， Outlier の成因を考える上るmdxマウス筋変性への影響一第2報−． 厚で参考となる症例と考えられた．

生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ
フィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関す

結論

1．32歳で死亡した

Outlier

る研究 （荒木班）平成2年度研究報告書，の1剖検例を報告した．

1991，pp191−196．

6）田遠 等，水野美彦：「運動負荷」による成熟

2．ジストロフィンの解析ではExon45，46の欠夫

mdxマウス筋変性への影響． 厚生省「精神・神によるinrframe deletionであることが判明した．

経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連−40−

疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木8）HoffmanEP，FischbeckKH，BrownRH，et班）平成3年度研究報告書，1992，pplO1−

al：Characterizationofdystrophininmuscle

105．

−biopsy specimens from patients with Du−7）Malhotra SB，Hart KA，Klamut HJ，et al：
Frame−Shift deletionsin patientschenne，sorBecker

The New EnglJ Med

with

1988．

Duchenne and Becker muscular dystrophy．
Science242：755−759，1988．

−41−

s

musculardystrophy．

318：1363−1868，3）感性高熱を呈したBecker型筋ジストロフィー症例
水 澤 英 洋＊

＊

山蕗

外後

＊

＊

＊

肘ヤ

利昭

昌 弘＊＊
加奈子＊＊＊＊

＊

＊

＊

＊

は じめに
悪性高熱には特発性のもの以外にDuchenne型
筋ジストロフィー（以下，DMDと略），Central
COre病などの筋疾患などを有する症候性のものがある1）．DMDが悪性高熱を併発する要因として
筋形質膜の異常や筋小胞体の機能異常が指摘されているが，実際に悪性高熱を呈した症例での検索は少なく，十分とはいえない．一方，Becker型筋
ジストロフィー（以下，BMDと略）も悪性高熱を合併する疾患の一つとしてあげられているが，これまで文献的に報告された例は極めて少な．い2）．
今回，我々は全身麻酔後に悪性高熱と心不全にて発症し，ジストロフィン染色や遺伝子解析にて診断したBMDの1例を経験した．本例は，BMDでもDMDと同様の悪性高熱を併発し得ることを示すとともにジストロフィン遺伝子解析，カフェイン拘縮試験，Ca誘発性Ca遊駈（CICR）などの検索を施行した貴重な一例と考え報告する．
症

澤木

吉高

＊

夫郎一

教靖喜

越下畑

大杉荒

研究協力者

例

はなかった．1991年4月，学校検診で心電図異常を指摘されたが放置していた．1992年8月15日，
近医にて虫垂摘除術のため塩化スキサトメニウム，
イソフルレン，ラボナール，笑気，酸素を用いて全身麻酔を施行された．麻酔時，下顎の硬直のため挿菅困難となり，酸素マスクで管理し，手術は終了した．しかし，術直後38．7℃の発熱に気づかれ，うっ血性心不全，ポートワイン状尿を呈し，
高CK血症，高K血症，アシドーシス〔血清CKlO7，000IU／l（正常値0〜190），K6．3mEq／dl，
血液ガスpH7．14〕より悪性高熱と診断された．翌日には解熟し，翌々日には心不全は改善したが，8月19日原因精査のため当院に転院した．
入院時現症：心，肺，脈拍など一般身体所見に異常なし．神経学的には両上下版近位筋にごく軽度の筋力低下（MMT5￣），肪腹筋の肥大，深部反射の全般性の低下（アキレス反射は正常）を認めた．
入院時検査所見：CK50，500IU／1，ミオグロビン
1，090ng／ml，アルドラーゼ80．8IU／1と筋原性酸素の著明な上昇を認めた．心電図にて陰性T（V1症 例：17歳，男性．
主 訴：全身麻酔後の高熱．
既往歴：特記すべきことなし．
家族歴：兄（19歳）が下肢の筋萎縮・筋力低下を有し，後にBMDと診断した（後述）．
現病歴：生来健康で，運動発達や筋骨格系に異常73），ST低下（V5，6），QT延長を呈し，心エコー
では左室の拡張，左室壁の運動低下を認めた．筋電図にて四肢筋にびまん性に筋原性変化がみられ，筋MRIでは縫工筋，薄筋の変性像および膝腹筋の肥大を認めた．
大腿四頭筋筋生検：筋線経の著明な大小不同を認＊筑波大学臨床医学系神経内科■■筑波大学臨床医学系循環器内科＊＊＊虎の門病院神経内科＊＊■＝ト国立精神・神経センター神経研究所

め，萎縮線経，piknotic nuclear clumpsおよび肥大線経が多数存在し，中心核やfiber splittingを呈していた（図1）．
−42−

症例の兄（19歳，男性）：これまで全身麻酔は施行されておらず，悪性高熱の既往はない．幼児期より転倒しやすく，運動は苦手で，走るのが遅かっ
た．18歳より階段昇降がつらくなり，両側大腿部の萎縮に気づいた．神経学的には，下肢近位筋に
軽度の筋力低下（MMT4＋），大腿部の筋萎縮，排腹筋の仮性肥大，深部反射の低下（アキレス反
射は正常）を呈した．血清CK値は4，128IU／1と上昇し，筋電図，筋生検にて筋原性変化を認めた．

ジストロフィン遺伝子解析：白血球よりDNAを分離し，Chamberlain，Beggsらにより調整された
multiplexプライマーを用いたmultiplexPCR解析を施行した．
カフェイン拘縮試験・CICR：生検筋よりスキンド
ファイバー法を用いて施行した．
結果

ジストロフィン免疫組織化学染色：症例および兄ではコントロールに比べ，筋形質陵が淡く不均一

方法

ジストロフィン免疫組織化学染色：生検筋凍結切な染色性を示した（図2）．
ジストロフィン遺伝子解析：症例ではジストロフ

片より抗ジストロフィン抗体（4−4C5）を用いてィン遺伝子のexon3−4の欠失を認めた（図3）．

ABC法にて免疫染色を行った．

カフェイン拘縮試験：症例では閥濃度および50％
活性化濃度ともにtypel筋線経にて低値を示し，
カフェイン拘綿の克進を認めた．また，兄では
typel筋線維3本中1本にて克進を示した．Type2筋線経に関しては症例および兄ともにカフェイン
に対し，正常ないし反応性の低下を示した（表1）．
CICR：症例では正常群と同様の所見を呈し，
CICRの克進はみとめられなかった（表2）．
考察
本症例では，全身麻酔時に悪性高熱，うっ血性図1症例の大腿四頭筋筋生検像
筋線経は著明な大小不同を呈し，萎縮線経，
piknotic nuclear clumpsおよび肥大線経が多数存在し中心核やfiber splittingを呈する．

心不全を呈し，ジストロフィンの免疫組織化学にて染色性の低下およびジストロフィン遺伝子の欠夫を認めたBMD症例である．これまでBMD症
例に悪性高熱を呈した報告は文献的にはほとんど

症例（左）

対照（右）

図2

ジストロフィン染色症例（左）は対照（右）に比し，筋形質膜が全般性に淡くかつ不均一な染色性を呈する．
−43−

Chamberlain

なく，わずかにHeiman−Pattersonらの報告してs

Pr柚睡rSいる下顎硬直と筋融解を呈した1例のみである2）．
この例ではハロセンーカフェイン殉縮試験を施行しており正常所見を示していた．
一万，DMDは悪性高熱をおこしやすい筋疾患の一つであり，高体温はみられるが40℃以上の高体温となることは少ないこと，不整脈，心不全，
心停止など重篤な心症状がほとんどの例で認められること，血液ガスpH低値，血清K高値が多数例みられることなどが特徴とされている3）．本症例ではこれらの臨床的特徴を有しており，BMDでもDMDと同様の悪性高熱を起こすことを示唆している．
DMDが悪性高熱をおこすメカニズムは未だ不図3Multiplex PCR法による症例のジストロフ
ィン遺伝子解析Exon3−4の欠尖を認める．

明であるが，ジストロフィンの欠損という筋形質膜の異常に加え，スキンドファイバー法を用いた
筋小胞体機能の検討がされている．高木ら4）はカ
フェイン拘縮試験ではDMD7例中5例で克進し，

表1

カフェイン拘縮試験

CICRでは4例すべてが正常であったとしており，

fjber type（H）

親濃度 （
鵬）

対 照 群

type l （28）

6．
3 ± 1．6

7．
7 ±2 ．
5

type 2 （26）

9．
8 ±2 ．
4

11 ．
7 ±2 ．
4

type l （7）

4．
8 ± 3．4▼

5．
9 ±2 ．
9t ype 2 （2）

7．
5 ， 川 ．0

7．
5 ， 1 1．
3症

例症 例 の兄Heiman−Pattersonら5）はハロセンーカフェイン

50 ％ 活 性 化 濃 度 （mH ）c a s et ype l （3）

5 ．7 ．5 ．7 ．
5

7．
0 ，6 ．
0 ，7．4t yp e 2 （3）

12 ．
5 ，20 ．20

11 ．3 ，33 ． 18．7

拘縮試験にて5例中2例で冗進がみられたと報告している．また，実際に悪性高熱ないし横紋筋融解を呈したDMD症例にて検討している報告もあり6）8），カフェイン拘縮試験では2例中2例で克進，ハロセン拘縮試験も2例中1例で克進を示している．以上のDMDにおけるスキンドファイバー法の結果と比較して，本症例の所見は特に矛盾したものでなく，BMDでもDMDと同様に筋小胞体の薬物に対する異常反応を有するものと考えられる．しかし，CICRは正常を示したことから特発性の悪性高熱とは異なった発症メカニズムが働いている可能性が高い．

事P＝0．05

表2 CICR（筋小暇体からのCa2T放出速度／nlin）
本 症例

症例 数 （N）

C I C R 元進C

I C R 非 冗進

1 1

7 2

5

4 4

1 9 4

Ca free0 ．
0 8 8 ± 0 ．0 4 3

0 ，1 0 7 ± 0 ．0 3 00．
0 90± 0 ．
05 0

P C a 6 ．5

0．
0 7 9 ± 0 ．0 2 6

0 ．1 6 0 ± 0 ．0 8 4

0．
0 63 ± 0 ．
03 2

P C a 6 ．00．
1 1 3 ±0 ．0 4 5

0 ．7 0 2 ± 0 ．4 9 3

0 ．1 3 7 ± 0 ．
87 7

P C a 5 ．50．
8 6 3 ± 0 ．6 8 4

2 ．7 5 0 ± 1 ．5 1

0 ．6 1 9 ± 0 ．
39 2

P C a 5 ．0

4．
7 2 8 ±2 ．
169

7 ．17 0 ± 3 ．3 4

2 ．3 9 0 ± 1 ．
59

標本 数 （∩）

悪性高熱の遺伝子は第19染色体長腕（19q13．1）にあり，ryanOdinereceptor遺伝子との関連が示
唆されているが9㌧DMD症例におけるジストロフ
ィン遺伝子の欠尖と悪性高熱との関連については明らかではない．本症例のジストロフィン遺伝子の欠夫はexon3−4であり，DMDやBMDにおい（広島大学麻酔科向田圭子先生のご好意による）て高頻度でみられる欠失部位にあたり10），本症例がBMDとして特異的な欠矢を有しているわけではなかった．

−44−

BMDは，本例のように潜在性の筋疾患として存在することが少なくない．全身麻酔の際には，血清CK値や心電図などの異常所見を見逃すこと

progressivemusculardystrophy・BrJAnaes−
th57：1113−1118，1985．

4）高木昭夫，小島 進ほか：悪性高熱およびDu−

なく，潜在する筋疾患を正しく診断し，悪性高熱の併発に注意を払う必要がある．

chenne型筋ジストロフィーにおけるカフェイン拘縮克進の機序と診断的意義．臨床神経29：301−305，1989．

ま

と

め

5）Heiman−PattersonTD，Rosenberg H，etal：

全身麻酔により悪性高熱，心不全を呈し，抗ジHalothan−Caffeine contracture testingin

ストロフィン染色にて染色性の低下とジストロフ

neuromuscular disease．Muscle Nervell：

ィン遺伝子解析にてexon3〜4の欠矢を認めた
BMDの1例を報告した．カフェイン拘縮試験で6）Millar ED，Sanders DB，et al：Anesthesia−

はtypel筋線経の克進を認めたが，CICRは正常

induced rhabdomyolysisin a patient withであった．BMDにおける悪性高熱は，DMDのそ

Duchenne，s muscular dystrophy．Anesth−

れと同様の特徴を有しており，発症機序の一つとesiology48：146−148，1978．

453−457，1988．

して筋形質膜のジストロフィンの異常に加え，カ7）OkaS，IgarashiY，etal：Malignanthyperth−

フェイン拘縮冗進から筋小胞体の機能異常が存在

ermia andDuchennemusculardystrophy：aするものと考えられる．

CaSerepOrt．CanAnaesthSocJ29：627L629，
1982．

謝辞：CICRの検索をしていただいた広島大学麻

8）BrownellAKW：Malignanthyperthermiain

酔科向田圭子先生に深謝する．

Duchenne muscular dystrophy．Anesth−
esiology58：180−182，1983．

文献9）MacLennan DH，Duff C，et al：RyanOdine

1）Brownell AKW：Malignant hyperthermia；

receptorgeneis a candidate for predisposi−

Relationshipto otherdisease．BrJAnaesth

tion to malignant hyperthermia．Nature

60：303−308，1988．

343：559−561，1990．

2）Heiman−Patterson TD，Natter HM，et al：10）Multicenter study group：Diagnosis of

MalignanthyperthermiasusceptibilityinX−

Duchenne and Beckermusculardystrophies

linked muscle dystrophies．Pediatr Neuro1

by polymerase chainreaction．JAMA267：

2：356−368，1986．

2609−2615，1992．

3）Smith CL and Bush GH：Anesthesia and−45−4）FSH類似症候を呈する家族性アミロイドーシス
清 水 輝 夫＊

研究協力者

砂 田 芳

秀＊＊

太

男＊＊＊ 萬 年

田

成

は じめに
顔面，眉甲，上腕部に筋萎縮を呈する，いわゆ
るFSH症候群には，近年その遺伝子座位が第4染色体長腕にmappingされたFSH dystrophy
をはじめ，神経原性のFSHやミトコンドリア異常を伴うものなど，heterogenousな疾患が含まれている．また，臨床症状の点でも不全型や軽症例が多いことが知られている．我々は中年以降緩徐に進行する顔面筋のWeaknessを主徴とする家族症例を経験した．当初は非定型的なFSH症例かと考えられたが，その後の検索により家族性アミロイドーシスⅠⅤ型（FAPIV型）であることが明らかとなった．この疾患は常染色体優性遺伝形式をとり，臨床的には脳神経障害と角膜格子状変性と呼ばれる特異な角膜病変を特徴とするが1），病期によってはFSH症候群との鑑別を要すると思われるので報告する．
症

例

発端者は64歳の男性で，50歳頃から額にシワが寄らなくなるとともに，口唇の動きが鈍くなり，60歳を過ぎると発語や岨嶋に支障をきたすようになった．患者は長野県北部の出身で，3世代42人の家系中14名に同様の症状があり（図1）．常染色体優性遺伝形式をとっている．患者は顔面筋のweaknessのために額のシワ寄せや口笛を吹くこ＊帝京大学医学部神経内科＊＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊＊自治医科大学生化学＊＊＊＊三井記念病院

金

澤

一

郎＊＊
徹＊＊＊＊

とができない．また，顔面皮膚の弛緩のため，眼瞼下垂様に見える．四肢筋には，明らかな筋力低下を認めず，肩甲帯にも著明な筋萎縮はみられな
かった．ATRの消失，四肢遠位部での振動覚の低下がみられたが，起立性低血圧・直腸膀胱障害・性機能障害・発汗の異常などの自律神経障害は認めなかった．
電気生理学的検査：針筋電図検査では，口輪筋でfibrillationpotential，unit数の減少，持続の長い
高振幅・多相性電位がみられた．四肢筋では，高振幅・多相性の傾向はあるものの，unit数はよく保たれていた．顔面神経直接刺激およびBlinkreflexによる顔面神経の伝導検査で，いずれも右側での伝導遅延を認めた．
筋生検所見：三角筋の筋生検では，筋線推構築の異常や細胞浸潤はないが，コンゴ赤染色した切辺を偏光下で観察すると，筋内血管周囲にアミロイド沈着がみつかった．
皮膚生検所見：小丘疹化を伴った色素沈着部位での皮膚生検を行ったところ，エッタリン汗腺や皮脂腺の周囲にアミロイドの沈着がみられた．電顕では約10nm径のamyloid fibrilの集族像を認めた．
眼科検査：角膜全面に微細な線状あるいは点状の混濁がdiffuseにみられ，紐隙顕微鏡で観察すると角膜実質の格子状変性すなわち，COrneallat−
tice dystrophyの存在が確認された．
以上，特異な臨床症状と遺伝形式よりFAPIV型と診断した．発端者を含めた7名の発症者の臨床所見を表に示す．40歳頃より顔面神経障害で発

−46−

2−
′
′
■

物
1

8 基
′
地 拙 920 21 2号
地 塊 20

也

3

2

5

等
地 7 皿 1拙 2 1地

山 帖

6

7

基

図1FAPIV型本邦第一家系（S家系）の家系図，発症者は黒く塗りつぶし，死亡者は／印を付けてある．矢印は発端者を示す．
表1 発症者7名の臨床所見のまとめ
patiQnt

＝エー1

＝エー2
F

80
＋

ここ−7

工ト8

＝エ＝−10＝＝エー12

H

H

F

F

78

66

64

52

47

＋

＋

＋

十

十

＝＝ト9
F

十

F

十

Sk土n（：ban90

十

＋

＋

＋
●
＋

＋ 一 十

＋ ＋− ■■■

一十 ＋ ＋−＋ ＋ ＋

ェX，X
Xエ＝

十

＋ ＋ ＋ ＋

＋ ＋ ＋ ＋

cranial nQrVO
involvomQnt
V
V＝＝

十

ATR

Ab5ent Ab3ent Ab5ent Ab5ent lJormal Nofmal I10rnal

38m30ry
inpairmOnt
toucb，pain
vibration

十
＋

＋
＋

p05ition＋＋★C工．D；

eOrnOal lattice dyStrOpby症し，進行するにつれ，舌下神経，舌因・迷走神経の順に侵され，ATRの消失や四肢遠位部での感覚障害など四肢の末梢神経も侵されていた．角膜病変は全例に存在し，比較的早期に出現する症候と思われるが，視力障害などの自覚障害を欠き，肉眼で捉えることもできない．自律神経障害は認めなかった．
本症アミロイドの免疫組織化学的検討
近年フィンランドのグループによりFAPIV
型で沈着するアミロイドタンパクが単離精製され，これがアクチン結合タンパクの一つであるゲルゾリンに由来することが報告された．アミロイドタ
ンパクは53ないし71アミノ酸残基のゲルゾリン断片からなり2），この断片はゲルゾリンの187番アミノ酸のアスパラギン酸からアスパラギンへの変異を含んでいることが明らかになった3）4）．また，フィンランド人の発症者ではこのアミノ酸変異に対応した一塩基置換，すなわちcodon187の第一塩基がグアニンからアデニンへ置換されていることが確かめられた5）6）（図2）．
そこで，抗ゲルゾリンmonoclonal抗体（Sigma社）を用いて生検皮膚の脱パラ標本を免疫組織化
学的に検討してみると，健常対照者の皮膚では免疫反応はみられないが（図3a），患者皮膚では皮脂腺や汗腺周囲のアミロイド沈着部位に免疫反応がみられ，このアミロイドがゲルゾリンに由来することが示唆された（図3b）．

−47−

Gly Asp Cys

PlasmageIsolincDNA

GGC◎AC TGC
GGC⑥ACTGC
I

Asn
I

173187††

Plasmagelsolin

芳志豆磁釣針攣

amy10idprOtein
inFAPtypeLV

図2

FAPIV型におけるゲルゾリン遺伝子異常，異型ゲルゾリン，アミロイドタンパクの関取

図3 生検皮膚組織の抗ゲルゾリン抗体による免疫組織化学（ABC法，×86）．a：対照皮膚組織．
b：FAPIV型を発端者．矢印は免疫反応陽性物質を示す。

本症におけるゲルゾリン遺伝子解析
本家系におけるゲルゾリン遺伝子異常を検討するため，フィンランド人患者で同定された遺伝子
変異部位を含んだDNA断片をPCRで増幅し，directsequenceを行った．健常対照者では，ゲルゾリン遺伝子のCOdon187の第一塩基（654番塩基）はグラニンだが，発症者ではグアニンとアデ
ニンの両方のシグナルが検出され，フィンランド

人患者と同じ変異をもつheterozygoteであることが示唆された．次に，この変異をより簡便に検出するため，PCR産物の制限酵素解析を行った．
この変異はDNAの制限パターンに変化をもたらさないので，変異部位に人工的にMunI制限部位を導入するようなミスマッチプライマーを用いた．
654番塩基がアデニンの場合に限りMunIsiteを持った116bpのPCR産物が増幅され，MunIで−48−

候群とは明らかに異なるが，病初期においてはfacial weaknessが唯一の症状となることがあり，また常染色体優性遺伝という点からもFSHの不全型あるいは軽症例と診断されてしまうことが考
bp
−1033

えられる．その場合，臨床的には角膜格子状変性の有無をcheckすることが，重要な鑑別点になる−■ ＄58と思われる．また，制限酵素解析による遺伝子診断も簡便で有用である．
文

116bp■ト90bp■−

献1）Meretoja J：Familial systemic par−amyloidosis withlattice dystrophy of the

図4

COrnea，prOgreSSivecranialneuropathy，Skin

ミスマッチプライマーを用いたPCR産物の制限解析によるFAPIV型の遺伝子診断．C：健常対照者，M：DNA分子量マーカー．発症者は酵素消化された90bpのバンドを持つが，家系内非発症者および健常対照者では116bpのバンドしか検出されない．

Changes and variousinternal symptoms．A
previouslyunrecognizedheritablesyndrome．

Ann Clin Resl：314，1969．
2）Maury CPJ：Gelsolin−related amyloidosis．
Identification of the amyloid proteinin
Finnishhereditaryamyloidosisasafragment

消化すると26bpがcutされて90bpの断片ができる．このような方法で本家系の制限解析を行った
結果，発症者7名全例で116bpのDNA断片の他に90bpの断片が検出され，G→Aの変異についてheterozygoteであることが確認された．一方，
非発症者および健常対照者ではPCR産物のMun
Iによる消化はみられなかった（図4）．従って，フィンランド家系と同様に本家系においてもゲル
ゾリン遺伝子のG→A変異とFAPIV型の発症が完全に連鎖しており，この変異がFAPIV型のOf variant gelsolin．J ClinInvest87：1195，
1991．

3）Maury CPJ：Isolation and characterization
Of cardiac amyloidin fami1ial amyloid
polyneuropathytypeIV（Finnish）．Relation
Of the amyloid protein to variant gelsolin．

Biochem Biophys ActalO69：84，1990．
4）GhisoJ，Haltia M，et al：Gelsolin variant（Asn−187）in familialamyloidosis，Finnish
type．BiochemJ272：827，1990．
5）MauryCPJ，KereJ，etal：Finnishhereditary

原因であることが示唆された．

amyloidosisiscausedbyasinglenucleotide
Substitutioninthegelsolingene．FEBSLett

おわ り に本邦ではFAPIV型は我々の報告した1家系
しかみつかっていないが，まだ多くの症例が潜在している可能性が考えられる．進行例では下位脳神経障害や感覚障害を呈し，その病像はFSH症−49−

276こ75，1990．

6）LevyE，HaltiaM，etal：Mutationingelsolin
geneinFinnishherediatryamyloidosis．JExp

Med172：1865，1990．

5）遠位型ミオパテーの免疫組織化学的研究
福 原 信 義＊

研究協力者

中 島

孝＊ 巻 淵 隆 夫＊＊

は じめ にRimmedvacuole（RV）は，RV型遠位型ミオ
バナーの成因と密接な関係を有すると思われるが，その詳細な役割については未だ明らかではない．
また，封入体筋炎とはその臨床所見，筋生検像も酷似しており，両者の関係についてもはっきりしない点が少なくない．最近，封入体筋炎でCongo−
red染色によりRVにアミロイドが陽性である1）amyloid proteinの免疫化学染色は，その染色性を増強するため一次抗血清を反応させる前に99％
formic acidで3分間処理する必要がある．しかしformic acidで処理したi束結切片はばらばらに剥がれてしまい，観察には耐えず，ホルマリン固定パラフィン包埋切片で染色，観察を行なった．
結果

ことが報告された．我々は，RV型遠位型ミオバナ

RV型遠位型ミオバナーでは程度の違いはあるーにおいてP−amyloidproteinとそれに密接な関係を有すると思われるubiquitin，heat shock

ものの，β−amyloidprotein，ubiquitin，HSP70

protein（HSP）の態度を免疫組織学的に検討したので報告する．

傾向が見られた．小径線経の方が反応しやすく（図方法
RV型遠位型ミオバナーの生検筋12例の凍結切

粒状に染め出されるものとがあったが，特に筋膜または72の，いずれの抗体に対しても類似の染色1，3），その反応の仕方には筋線維全体が滴漫性に淡染，あるいは波染するものと，筋線維内に顆

片またはホルマリン固定パラフィン包埋切片について，ABC法により免疫組織学的にβ−amyloid

下の筋形質に多く見られた．β−amyloid protein
はvacuoleの周辺部では染まることがあり，特にubiquitinはvacuole内に封入体のように染色さ

protein，ubiquitin，HSP70または72などを染色した．比較材料としては，アルツハイマー病，ダウン症候群，ジョセ7病，多発性筋炎，先天性筋ジれた（図2）．HSP70（図4）はHSP72より反応

ストロフィー，神経原性筋萎縮などの生検筋または剖検筋を用いた．使用した抗体は，β−amyloid

動終板が多数観察されたが，ubiquitinがその部位で特に強く染め出された（図5）．比較材料として

proteinについてはBoehriger Mannnheim Bio−

用いたアルツハイマー病，ジョセフ病ではβ一chemicaとDAKOより発売されているものを，

amyloid protein，ubiquitinが筋形質がび漫性に

ubiquitinについてはChemiconとDAKOより

淡染する線経が多数みられた．多発性筋炎でそれ発売されているものを，HSP70についてはSigma

らより強く染る線経が多かった．

が強かったが，VaCuOle内でも染色されるものがあった．また，RV型遠位型ミオバナーの1例で運Immuno Chemicals，HSP72についてはAmer−考

shamより発売されているものを用いた．β−＊国立療養所犀潟病院神経内科＊＊国立療養所犀潟病院神経病理察

β−amyloidprotein，ubiquitinの染色に我々が用いた抗体は，アルツハイマー病の脳で老人斑，−50−

図1遠位型ミオバナー，β−amyloid protein染
色，筋形質がび浬性に淡く反応しているほか，頼粒状に強く反応しているところがある （×235）．

図2

遠位型ミオバナー，β−amyloid protein染色，Vacuole周囲で，特に強く願粒状に（矢印）反応している（×235）．

図3 遠位型ミオパテ一，ubiquitin染色，小径線経の反応の方が強い（×235），

図4

遠位型ミオバナー，HSP70染色，小径線経の反応の方が強い（×120）．

神経原線維変化を見つけるために普通に用いられ

しアミロイドの沈着を強めると報告されている．

ている抗体である．β−amyloid proteinは老人斑

封入体筋炎でみられるRVでは，Mendellら1）に一致して染め出されるが，神経原線維変化の部がβ−amyloid proteinを，Askanasら2）がβ一分では染らない．一万，ubiquitinは神経原線維変

amyloid proteinとubiquitinを免疫組織化学的化のところで染るが，老人斑は染め出さない．アに証明している．また，Askanasら3）は眼筋咽頭筋

ルツハイマー病での研究では，β−amyloidprotein

ジストロフィーでみられるRVでubiquitinがみはCongo red染色で染る老人斑の8nm径のアられることを報告している．それらの報告でのβ−ミロイド線推のみならず，Congored染色で染らamyloid proteinとubiquitinの筋線推内の存在
様式はいずれも類似しており，今回我々のRV型

ないいわゆるdiffuse

pre−amyloid

plaqueでも染る．ubiquitinは神経細胞内の神経原線推塊を形成する15−21nm径のtubulo−filamentsのとこ

遠位型ミオパテーでの所見とも極めて類似していろで反応し，また，細胞外ではアミロイドに結合発現してくる蛋白質であるが，β−amyloidprotein

る．HSP4）は熟ショックなどのストレスで大量に−51−

4）RVをもたない疾患でも，アルツハイマー病，
ジョセフ病などいろいろな疾患の筋肉でも筋形質がび浬性に淡染する線椎が多数見られるものがあ
った．
文

献

1）MendellJR，SahenkZ，GalesTandPaulL：
Amyloidfilamentsininclusionbodymyositis．

Novelfindingsprovideinsightintonatureof
filaments．Arch Neuro148：1229−1234，
1991．

図5 遠位型ミオバナー，ubiquitin染色，運動終板（矢印）で特に強く反応している（×230上2）Askanas V，Engel WK and Alvarez RB：
Light and electron microscopiclocalization
Ofβ−amyloid proteinin muscle biopsies ofとubiquitinもRVに特異的な所見ではなく，色々な疾患の筋肉に出現してくることが判った．

patientswithinclusion−bodymyositis．AmerJ Patho1141：31−36，1992．

しかし，RVを特徴とする筋疾患では特に強く出

3）Askanas V，Serdaroglu P，Engel WK and

現して来て，その局在もRVと密接な位置関係にAIvarezRB：lmmunolocalizationofubiquitin

あるものもあった．

inmusclebiopsleSOfpatientswithinclusion

ubiquitinは，正常筋でも運動終板で特に強く染

bodymyositisandoculopharyngealmuscularる5）ことが報告されていたが，今l百】の観察でもそ

dystrophy．NeurosciLet130：73−76，1991．

のことが確認された．
ま4）Serdaroglu P，Askanas V and EngelWK：
Immunocytochemicallocalization of ubi−とめ

quitin at human neuromuscularJunCtions．

遠位型ミオバナーの生検筋でβ−amyloid
protein，ubiquitin，HSP70，HSP72を免疫組織化
学的に検討した．それらの反応は，
1）RVを有する筋疾患で特に強く出現する．
2）筋線維全体が禰漫性に淡染あるいは浪染しているものがあり，特に小径線経の方が反応しやす
かった．
3）筋線維内に顆粒状に染るものがあり，特に筋膜下に多くみられたが，RVの周辺部，VaCuOle内にもみられた．

−52−

Neuropath Appl Neurobiol18：232−236，
1992．

5）清水輝夫，川合 充，山崎峰雄，蓑田清次：
Rimmedvacuolemyopathyにおける熟ショッ
クたんばくhsp72の局在． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成3年度研究報告書，1992，pp51−
54．

6）封入体筋炎の位置づけ（DMRVとの比較を中心として）後 藤 雄 一＊
研究協力者

村 上 信 行＊・＝竹 光 正 和＊
里 吉 営二郎＊＊ 埜 中 征 哉＊・＊＊

は じめに

方

Rimmed vacuole（以下RVと略す）は眼咽頭型筋ジストロフィー，緩徐進行型筋ジストロフィーなどの様々な疾患に認められ，疾患特異性はないとされている．一方，封入体筋炎（以下IBMと略す），distalmyopathy with rimmed vacuole
formation（以下DMRVと略す）はRVを病理学的に特徴とする．柑Mは欧米では比較的多く認められるのに対して，日本ではごく希な疾患とされている．近年，IBMとして家族性を示すものや炎症細胞浸潤のないものなどが報告されており，
DMRVとの異同が問題にされるようになった．
我々はRVの疾患別頻度を検討し，IBMを同定法

Congo red染色はMendellらの方法に準じた．
Ubiquitin免疫染色には，Chemicon社のマウスモ
ノクローナル抗ubiquitin抗体を用い，間接法にて染色した．β一amyloid protein免疫染色には，
精製抗アミロイド・コンポーネント（affi28）とベーリンガ一社の抗ベータ・アミロイド・アルツ
ハイマー・ポリクローナル抗体を用い，標識アピジン法にて染色した．
結果

3403例中87例，2．5％に1切片に3個以上のRVが認められた．RV陽性例の疾患別頻度を表1にし得ると報告されたCongored染色，ubiquitinおよびβramyloidprotein免疫染色を行い，IBMとDMRVを比較検討したので報告する．

示した．頻度は低いものの様々な疾患にRVは認められた．また，IBM，DMRV以外にも限咽頭遠位型筋ジストロフィー，Marinesco−Sj6gren症候群，糖原病2型に高頻度にRVが認められた．

対象
対象は国立精神・神経センター神経研究所に
1978年から1992年9月までに寄せられた3403例の生検筋を用いた．RVはGomoritrichrome変法

RV陽性55例中Congored染色にて陽性，疑陽性，陰性所見を認めたものは，それぞれ18例（32．7％），5例（9．1％），32例（58．2％）であった（図1，表2）．種々の疾患に陽性所見は認められ，RV
のみならずspheroid bodyやcytoplasmic bodyの周囲の細胞質に陽性所見が認められた．

染色にて観察し，1切片に3個以上RVが認められるものをRV陽性例とした．なお，ミトコンド
リア脳筋症は除外した．RV・陽性55例について
Congo red染色，抗ubiquitinおよびβ−amyloid
protein抗体を用いた免疫組織染色を行った．

＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部＊＊国立精神・神経センター武蔵病院

Ubiquitin免疫染色では，陽性，疑陽性，陰性それぞれ28例（51．0％），9例（16．3％），18例（32．7％）であった（図2，表2）．また，β−amyloid
protein免疫染色ではそれぞれ35例（63．6％），14
例（25．5％），6例（10．9％）であった（図3，表2）．両免疫染色ともにRVやspheroidbodyなどを有する変性線経に陽性反応が認められた．以上

ー53−

表1 各神経筋疾患におけるRVの出現頻度
Dlagnoses

Number of Number
patlents examlned

工BM

of blopsles
havlng RV Percentage

5

5

100㌔

52

3

5．8も

Polymyosltls

75

1

1．3亀

DMRV

18

18

100㌔

Oculopharyngo−
dlstal MD

4

4

100亀

quadrlceps MP

2

2

100％

Marlnesco−
SJ6gren synd．

11

9

81．8㌔

DMD

286

2

0．7電

BMD

77

3

3．9％

LG

82

6

7．3亀

MtD

51

芦

5．9電

7

4

57．1㌔

10

6

60．0％

4

2

50．0％

183

2

1．1㌔

2536

12

0．5㌔

Dermato一

myosltls

Glycogenoses
2a2b
Rlgld splne
Synd．
Neuropathles
Others
Tota1

3403

87

2．6％

RV：rlmmed vacuoles，エBM：lncluslon body znyosltls

DMRV：dlstal myopathy wlth rlmed vacuole formatlon
MD：ZnuSCular dystrophy．MP：myOPathy，DMD：Duchenne type muscular
dystrophy，BMT）：Becker type muscular dystrophy，
LG：11md−glrdle type muscular dystrophy．MtD：Myotonlc dystrophy

3染色ともに陽性率は異なったが，特に疾患特異性を示すものではなかった．
考察
RVはH＆E染色で青く，Gomoritrichrome変法染色で赤く染まる顆粒により縁どられた細胞質
内空胞である．また，RVはacidphosphatase染
色やnonspecific esterase染色で高活性を示す．

現在，変性した細胞内蛋白を分解する自己会食能が異常に活性化されたためにRVは形成されると考えられている．RVは種々の疾患に認められ，疾患特異性のないものとされている．一方，IBM，DMRVではRVは筋病理学的特徴の一つに挙げられている．我々の行ったRVの疾患別の出現頻度を検討した結果，頻度は低いが様々な疾患にRVは認められ，RVそれ自身は疾患特異性

−54−

表2

Congored染色，ubiquitinおよびβramyloidprotein免疫染色
NuJnberDlagnoSeSl）lopsles

st81ned

of

・

Congo

＋／一

4

エBM
Dermato一

red

一

2

2

Ublq111tln

・

0

0

0

十／一

Beta−amy101d

一

十

＋／一

一

2

4

0

0

4

0

0

2

0

0

2

0

1

1

myosltls
Polymyosltls
DMRV

1

0

0

1

0

0

1

0

1

0

13

7

2

4

11

2

0

9

3

1

1

1

0

1

1

Oeulopharyngo−
dlstal MD

2

0

1

1

0

Quadrlceps MP

2

1

0

1

1

0

1

0

2

0

Marlneseo−

7

0

1

6

1

2

4

3

3

1

3

2

0

1

1

1

1

2

1

0

SJ6gren synd．
BMD
LG

5

2

0

3

5

0

0

4

1

0

MtD

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

Glycogenoses
28

2

0

0

2

0

0

2

2

0

0

3

2

1

0

2b
Paget◆sdlseaseNeuropathles

l

l

l

O

O

O

O

0

0

3

0

0

0

0

1

0

0

l

1

0

0

1

0

0

Others

8

1

0

7

0

3

5

6

1

1

Tota1

55

18

5

32

35

14

6

＋：pOSltlve

図1

3

1

28

9

18

＋／−：equlvocal−；negatlve

図2 33歳 男性 糖原病2b型
Ubiquitin陽性（矢印）と陰性反応（矢頭）を示すRVを認める．
A：Gomori trichrome変法染色
B：Ubiquitin免疫染色 ×400

51歳 男性IBM
RVに一致する部位にCongored陽性反応（矢印）を認め，炎症細胞浸潤（星印）を認める．
A：Gomori trichrome変法染色
B：Congo red染色 ×180−55−

種々の疾患などにも同様のinclusionが認められる．すなわち筋病理学的にIBMとDMRVは細胞浸潤を除いては非常に類似したものであるからである．
1991年，MendllらはIBMのRVを有する筋線経にConogred染色陽性物質が認められIBMに特異的に認められるものであると報告した1）．また，Askanasらは1991年にIBMのRVを有する
筋線経に抗ubiquitin抗体を用いた免疫染色陽性物質が認められ，またこれが免疫電顕にて15−20
JLmのfilamentousinclusionに一致することを
図3

33歳

男性

報告した2）．さらに1992年にβ−amyloid protein
抗体を用いた免疫染色により同様に陽性物質がIBMに特徴的に認められ，これがより細い
filamentousinclusionに一致することを報告し
た3）．

DMRV

RVに一致した部位にβTamyloid pro−tein陽性反応を認める．
A：H＆E染色B：β＋amyloidprotein免疫染色 ×400

Congored染色陽性物質は，種々の筋神経疾患を示すものではなかった．一方，IBM，DMRV，
眼咽頭遠位型筋ジストロフィー，Marinesco−Sj8−gren症候群などのRVの頻度の高い疾患においては，これらの疾患の筋萎縮を説明し得る程の変性機転がRV以外に認められないことから，これらの疾患においてはRVはなんらかの病因的意義を有するものと考えられた．
当研究所における炎症性筋疾患中のIBMの頻度は，143例中5例（3．5％）と欧米での報告に見られる25％に比較して極めて少ないものであった．
この頻度差の原因として人種の違い，環境の違いなどの様々なものが考えられるが，一つには診断基準の違いによるものが考えられる．これは，近年IBMに家族性を示すものや炎症細胞浸潤を認めないものが報告されるように欧米ではIBMの診断基準が拡大解釈されることがある．これに対して，日本においてはDMRVが比較的多くみられるため家族性を示すものや炎症細胞浸潤のないものをIBMと診断されることはない．
このように近年，IBMとDMRVの異同が問われるようになってきた．これは，IBMに特異的であるとされていた電顕にて観察される直径15−20
jLmのfilamentousinclusionがDMRVを含むに認められ，頻度は低いが，RVの他にcytoplasT
mic bodyやspheroid bodyを有する変性線経に認められた．
Ubiquitinは細胞内蛋白の一つであり，選択的蛋白分解の際に変性蛋白に結合する．これにより変性蛋白は，prOteaSOmeCOmplex内で細かく切断される．Ubiquitin免疫染色の結果，ubiquitinは
RVを有する変性線椎のほかにcytoplasmic
bodyやspheroid bodyを有する変性線経に認められ，様々な疾患に認められた．
また，β−amyloid proteinは，膜糖蛋白である
アミロイド前駆体蛋白が異常な蛋白分解されることにより生じると考えられている．P−amyloid
protein免疫染色の結果，β−amyloidproteinは二染色同様にRVやspheroidbodyを有する変性線経に認められ，種々の疾患に認められた．
以上のように3染色ともに頻度は異なるが，様々な疾患に認められ，特に疾患特異性を有する
ものではなく，RVを有するような変性線経に非特異的に認められるものであった．Askanasらの報告と併せて考えるとIBMに認められるような
filamentousinclusionがDMRVなどを含む種々の疾患に認められるという報告に合致するものと考えられた．

−56−

IBMとDMRVは臨床的に類似する点がある
が，遺伝形式，発症年齢，羅患筋等において異なっており，異なった疾患概念と考えられる．一方，筋病理学的には炎症細胞浸潤を除き非常に似かよった病理像を呈し，IBMを同定し得るとされたこ
れら三染色法を用いても鑑別することはできなかった．これらのことからIBMとDMRVを鑑別す
る際は，筋病理学的には炎症細胞浸潤が重要であり，これと臨床経過および臨床症状などを総合的に判断し，診断する必要があると考えられた．

文献1）MendellJR，Sahenk Z，et al：Amyloid
filamentsininclusion body myositis．Arch
Neuro148：1229，1991．
2）Askanas V，Serdarouglu P，et al：Im−
munolocalization of ubiquitinin muscle
biopsleS Of patients withinclusion body
myositis and oculopharyngeal muscular

dystrophy．NeurosciLett130：73，1991．

3）Askanas V，Engel WK，et al：Light andelectronmicroscopiclocalization ofβ−amyloidproteininmusclebiopsiesofpatients
withinclusion−body myositis．AmJ Pathol
141：31，1992．

−57−

7）筋エコー法における前腕中央部走査の有用性
庄 司 進 一＊
研究協力者

朴

木

清

人＊

吉

田

邦

広＊

は じめ に
Heckmattら1）および田代ら2）の神経筋疾患の診断に筋超音波（筋エコー）診断法が有用との報告があり，我々は1984年頃より今まで約700例の神経筋疾患患者を対象に大腿部のみから撮像部位を増やし，三角筋部，上腕中央部屈側，第三腰椎傍脊柱筋部，大脇中央部前後面，下腿最大径部前後面の7ヵ所で筋エコー像を撮像してきた．最近さらに前腕中央部屈側での撮像を加えた．この前腕中央部屈側での特徴的所見と，その有用性について報告する．
対象および方法
対象は13例，神経原性は5例で，その内訳は筋萎縮性側索硬化症（以下ALS）3例，SPMAl
例，神経原性屑甲下腿型萎縮症1例，筋原性は8

柳

表

澤

対

信

夫＊

象

疾患名

人数

神経原性
筋萎縮性側索硬化症（ALS）
脊髄性筋萎縮症（SPHA）
神経原性肩甲下腿型筋萎縮症
筋原性
顔面肩甲上腕型筋シーストロフト（FSH）
筋緊張性シーかロフィー（HHD）
多発性筋炎（PH）
その他のミオパチー

例で，その内訳は顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ
ー1例，筋緊張性ジストロフィー（以下MMD）
2例，多発性筋炎2例，その他のミオパテー3例
である（表）．超音波断層装置は日立EUB−415を用い，すべての条件を一定にして撮像した．また，
図1に正常対照の前腕中央部屈側横断の筋エコー像を示した．
結果

図2−1は，56歳男性ALS患者の上腕および前腕中央部属側の横断像で，深手旨屈筋で中等度の筋
肉内エコーの増加を認める．
図2−2は，50歳男性SPMA患者の同部位の筋＊信州大学医学部第三内科

図1

1
2

Flexor carpi radialis
Palmarislongus

3 Flexor digitorumSuperficialis
4 Flexor pollicislongus
5 Flexor digitorum profundus
6 Median nerve

2−1US ofMid−biceps＆MidTforearmin ALS（56M）
2−2

US of Mid−biceps＆Mid−forearmin SPMA（50M）

2−3

US ofMid−biceps＆Mid−forearmin Scapuloperonealatrophy（58M）

2r4

US of Mid−biceps＆MidLforearmin FSM（gM）

2L5

US ofMid−biceps＆hJIid−forearmin Polymyositis（46F）

2−6

US ofMid−biceps＆Mid−forearmin MMD（32F）

2−7

US of Mid−biceps＆Mid−forearmin MMD（27M）278

US ofMid−biceps＆Mid−forearmin Hoffmann−59一

s syndrome（26F）

エコー像で，やはり深指屈筋での軽度の筋肉内エコーの増加を認める．

考察

以上の結果より，神経原性筋萎縮症では一般に

図2−3は，58歳男性神経原性肩甲下腿型筋萎縮症の同部位の筋エコー像で，上腕二頭筋の萎縮と筋肉内エコーの増加，前腕で深指屈筋での筋肉内エコーの増加を認める．

上肢遠位筋が障害され易いが，特に深指屈筋が障

神経原性筋萎縮症では5例中4例で深指屈筋で筋肉内エコーの増加を認めたが，増加のない1例
は全被検筋で異常を認めなかったALS例であった．

MMDで，臨床的にMMDは上肢遠位筋が早期か

図2−4は，9歳男性顔面肩甲上腕型筋ジストロ
フィー患者の上腕および前腕中央部屈側の横断像
で，明らかな筋肉内エコーの増加は認めない．
図2−5は，46歳男性多発性筋炎患者の同部位の筋エコー像で，上腕二頭筋で筋肉内エコーの増加を認めるが，深指屈筋では明らかな変化を認めな害され易いことが示唆される．筋原性疾患では，一般に近位筋が障害され易いため深指屈筋の障害されている例は少ない．障害がめだった症例はら障害されるが），探指屈筋が早期から障害されることが示唆される．従って，この筋は上肢における近位筋と遠位筋の障害を比較する際，上肢遠位筋の障害の指標となる．
結論

筋エコー法の前腕中央部屈側走査で検査できる
深指屈筋は，上肢遠位筋の障害の指標となり，神経原性筋萎縮症や筋緊張性ジストロフィー症では早期より障害される．

図2−6は，32歳女性筋緊張性ジストロフィー患
者の同部位の筋エコー像で，深指屈筋での著しい
筋肉内エコーの増加を認める．
図2−7は，27歳男性筋緊張性ジストロフィー患
者の同部位の筋エコー像で，8カ所走査における全被検筋の中で深指屈のみで筋肉内エコーの増加を認める．
図2−8は，26歳女性Hoffmann症候群の同部位の筋エコー像で，全被検筋で筋肉内エコーの増加を認める．
筋原性では8例中3例で深指屈筋で筋肉内エコーの増加を認めたが，3例中2例はMMDで，同筋の著しい筋肉内エコーの増加を認め，その1例のMMDは，深指屈筋のみで筋肉内エコーの増加を認めた．第3例日は，全披検筋で筋肉内エコーの増加を認めたHoffmann症候群であった．

−60−

文

献

1）HeckmattJZ，Leeman S，etal：Ultrasoundimaglnginthe diagnosisofmuscledisease．
J PediarlOl：656，1982．

2）田代邦雄，松浦享ほか：神経筋疾患における
ultrasoundimaging一一1：T所見および筋生検
所見との関連について． 厚生省「神経筋疾患研究委託費」筋ジストロフィーの臨床，病態と成因に関する研究 （杉田班）昭和59年度報告書，
1985，pp90−95．

3）Harper PS：Myotonic Dystrophy．（2nd ed）
Saunders，London Philadelphia Toronto
Sydney Tokyo，1989，p4．

8）最近見出された筋phosphofructokinase欠損症
new variant（PFK Noto）の病態
垂 井 清一郎＊
研究協力者

中

川

智

左＊

西

川

嘉

郎＊

中

島

弘＊＊

嶺 尾 郁 夫＊＊ 河 野 典 夫＊＊

筋肉の解糖系における最も主要な律速酵素はphosphofructokinase（PFK；EC2，7，1，11）
であり，Monodモデルが最初に通用された代表的アロステリック酵素の1つである．私共は1965年，大阪府下和泉市の住民において筋PFK欠損症を見出し報告した1）が，その後本症はグリコーゲン
病ⅥⅠ型として記載されている．1990年に至り，最初の家系の変異を同定したが，それは筋PFK遺伝子のイントロン15の5 端のドナー部位におけるGrTの単塩基置換であり，その結果，イント
ロン15のスプライス部の破癌によって，上流のエキソン15内のドナー部位類似の配列（GTを含む
モチーフ：cryptic splice site）が認識され異常なスプライシングが生じた結果，mRNA上で75
塩基の欠矢を招いていることが明らかになった2）（PFKIzumi）．この変異は，ないしJapanesemutation

Japaneseclassicformとも称せられているが，最近私共は，大手前病院の入院患者中に，病態も遺伝子変異も異なる筋PFK欠損症を見出した．本症例はミオバナーの症状が必ずしも前景に出ておらず，しかも筋PFK活性が正常対照の1／100（standardassay）に低下している興味ある症例であり，筋PFK欠損症の臨床診断法をめぐる考察とともに，本症例を報告する．

＊大手前病院（国家公務員等共済組合連合会）■＊大阪大学医学部第二内科症例

症例：K．S．22歳，男性．
主訴：心裔部痛．
病歴：8年前より心南部痛ないし胃潰瘍をくり返していたが，1991年10月の健康診断においても胃潰瘍を指摘され，しばらく抗潰瘍剤の投与を受けていた．11月末から再び心裔部痛が出現し，12月4日精査加療のため入院．
黄痘（溶血性）と検査所見（高CK血症と高尿酸血症）に注目した主治医が訊き出すまで，筋肉の症状を特に深刻に自覚したわけではない．しかし，小学生時代短距艶競争ではいつも最下位だっ
た．球技はむしろ得意で，中学・高校時代はテニス部に所属した．普段はバス通学だったが，過に1−2度，約4kmの山道を自転車で通学した．ジョギング，水泳（平泳ぎ）は皆と同様にできた．
登山などの激しい運動の際，時々悪心，嘔吐を訴えた記憶がある（これは筋PFK欠損症において屡々認められる症状である）．運動時に筋肉痛や筋肉のこわばりもなく，SeCOndwind現象を経験したことはない．なお1988年6月に1回と，1991年4月にも再び，右足関節に痛風発作があった．
家族歴：両親は従兄妹結婚．兄弟は兄が1人で，兄も十二指腸潰瘍の既往がある．特に筋症状は訴えていない．

現症：身長180cm，体重65kg，球結膜軽度黄染，貧血（−），筋肉の発育正常，萎縮（−），仮性肥大（−），腱反射正常，病的反射（−），握力：右43kg，左40kg．
−61−

本症例の病歴を一読して代謝性筋疾患を頭に浮かべることは必ずしも容易でないと思われるが，若干のルーチン検査データから筋PFK欠損症を鑑別診断の姐上にのぼせた．その理由は従来からの症例分析によって，筋PFK欠損症には共通した重要な特徴の存在することを確認していたから
である3）4）．最も重要な診断のポイントは3点であり，これは本疾患の正しい診断へ到達する3つの門にもたとえられる（図：本症に比較するとMcArdle病の診断に通じる門の数は1．5といってもよいであろう）．一般的にいえば，第1はやはり解糖障害に基づく代謝性ミオバナーの存在であり，運動（通常は半阻血下運動負荷）に伴う血中ピルビン酸，乳酸の上昇は抑えられていて，逆に筋運動とともに血中アンモニアは著明に増加し，次第にCKも増加する．第2は，赤血球中でヘモグロ
ビンと酸素との親和性を調節する重要な代謝物，
2，3−bisphosphogly cerate（2，3BPG）の顕
著な減少を伴う溶血冗進であり，赤血球のlife
Spanは通常半減する．間接ビリルビンは屡々上昇＿＿＿顎選一＿−＿（a）筋PFK欠損症

し，網赤血球の増加，骨髄の赤芽球系の増生，血中ハブトグロビンの減少は必発であるが，溶血性黄症はあっても溶血性貧血に至ることはない．何
故なら，かつて私共5）が示したように，ヒト赤血球
PFKは筋型PFKと肝型PFKのハイブリッド酵素であり，筋型PFKが欠損しても肝型PFKによる活性は残存するからである．通常網赤血球の増加を招く状態では赤血球2，3BPGは上昇する
し，溶血冗進を招く酵素異常として頻度の高いピ
ルビン酸キナーゼ欠損症でもやはり2，3BPGは上昇する．したがって2，3BPGの低下を招く
溶血冗進像は診断上の意義が高い．第3の診断上のポイントは筋原性高尿酸血症であり，筋運動に伴ってイノシン，ヒポキサンチンが著明に血中に増し，やや遅れて尿酸が上昇する6）7）．従ってこの
高尿酸血症は日常生活における運動量に依存し，目差変動が目立つ．筋庶性高尿酸血症は，筋肉のエネルギー代謝が障害される如何なる種類の代謝性ミオバナーにおいても認めうるが，筋PFK欠損症ではその発現の程度が著しい．その理由は，
筋PFK欠損症では単にグリコーゲンの利用が障害されるのに止まらず，例えばMcArdle病などと異なり，流血のグルコースの利用も障害されるからである．
さて，今回の症例では，半阻血下運動負荷における乳酸の上昇は，完全には欠如せず，正常範囲の下限程度であったが，運動に伴って血中アン吏
ニ7，続いてCK，尿酸の著しい増加を招いた．また2，3BPGの減少を伴う溶血冗進像も定型的であった（表）．そこで筋生検を施行したが，すでに述べたごとく，フルクトースー6−リン酸を充分

／／＼

＝供ゝ

量添加するstandard assayでは，PFK活性が正常対照の1／100であり，筋PFK欠損症の診断が確定した．

MetabolicMyopathy（b）Mc Ardle病
図

筋PFK欠損症の診断にいたる3つの入口（a）

Mc Ardle病のそれ（b）との対比

なお，本症例で消化性潰瘍が頻発した理由は明らかでないが，潰瘍の誘因とみなされている活性酸素の生成がふんだんに流血中に存在するキサン
ナン酸化酵素基質によって促進された可能性がある．少なくともアロブリノール投与後，潰瘍は発生していない．
本症例の精細な遺伝子分析は現在進行中である
ー62−

表

筋PFK欠損症のnew variant（PFK Noto）の臨床データ
PFKIzumi PFKx PFK Noto

正常対照No・l No・2

No・l NO・1

筋肉
グリコーゲン（mg／gmuscle）
PFK活性

t．川

．38

t．0

t．56

0．01

−

0．02

2．57

0．Ot

O．0Ⅰ

赤血球寿命（T…）
ほ
4

00

4

2．2

3

2

托 0．2・こ1．0 1． 0
間は 0．2〜0．6
0．6

13

9

14

5．2

5

血清ビリルビン（mg／dJ）

25・−30l．5−2．06

網赤血球（％）

5・0

2・6■■＝■＝●一一●●●●●●●●●●●●‥‥●●●●●‥一一●−■一一一一■●一一一…■一一一一一一●■−……‥−■●■一一■●一一●一一●■＝■・■−日日●■●一一一一●■■血清尿蚊（mg／dJ）

3．0〜7．8（男）7．l〜川．4−

6・4〜23・8

2．5〜6．8（女）が，少なくともイントロン15のスプライス部に破錠はなく，PFKIzumiとは全く別種のVariantであることは明らかとなっており，これを患者の出身地（石川県能登半島）からPFKNotoと呼称することが内定している（ちなみに最初のPFK
Izumiの家系は大阪府和泉市の出身である）．
なお，Standardassayにおける筋PFK活性が正常対照の1／100であるに拘らず，半阻血下前腕
運動負荷において一定度の乳酸上昇を認め，それに対応して日常生活における筋運動の能力に必ずしも顕著な低下が示されない理由も，変異PFKのキネティックスの変化のあり方（例えば生理的な低濃度のフルクトースー6−リン濃度下におけるATP阻害度の軽減）に基づく可能性が高いが，これについても遺伝子変異との対応において分析を進めている．

文

献1）TaruiS，OkunoG，IkuraY，TanakaT，Suda
MandNishikawaM：BiochemBiophysRes
Commun19：517q523，1965．
2）Nakajima H，Kono N，YamasakiT，Hotta
K，Kawachi M，Kuwajima M，Noguchi T，Tanaka T and TaruiS：J BioIChem265：
9392−9395，1990．

3）垂井清一郎：Molecular Medicinel：104−
129，1993．

4）垂井清一郎：日内会誌76：1347−1365，1987．
5）TaruiS，KonoN，NasuTandNishikawaM：
Biochem Biophys ResCommun34：77−83，
1969．

6）MineoI，Kono N，Shimizu T，Hara N，Yamada Y，Nonaka K and TaruiS：J Clin
Invest76：556−560，1985．

7）MineoI，Kono N，Hara N，Shimizu T，YamhdaY，KawachiM，KiyokawaH，Wang
YLandTaruiS：N EnglJ Med317：75−
80，1987．

−63−

9）筋疾患の治療効果
田 代 邦 雄＊研究協力者

伊 藤 和 則＊ 牧 野
森 若 文 雄＊ 島

は じめに

表1

運動強度を徐々に増加していくような運動（漸増負荷運動）で運動強度が低いときは，有気的（有酸素的）ェネルギーの供給機構が働く．しかし運動強度が高くなるとその需要量に対して有気的代謝によるエネルギー量だけでは不十分となるので解糖系も参加してくる。そのため，筋細胞中に乳

功

均＊＊
二書目

ミトコンドリア ミオバナー4症例のまとめ：46〜65歳の男性2例，女性2例，罷病期間は11年から21年，仝例血中ビルビン酸が高値を示していた．症例1，2，
4でcytochrome c oxidaseの低下が見
られた．
症 例 1

症 例 2

症 例 3

症 例 4

46 歳

52 歳

56 歳

65 歳

13 年

11 年

11 年

21 年

1 2 ．2

1 0 ．3

1 0 ．61 6 ．3

酸

0 ．7

0 ．8

1 ．2 7

1 ．3 4C R

3 4 4 ．5

2 5 0 ．2

3 5 2 ．2

3 6 8 ．2

S u c c i Jl a t e C y t C R

2 7 0 ．8

2 5 8 ．8

2 4 4 ．2

2 2 3 ．0

対象は慢性進行性外眼筋麻痺を伴うミトコンド
リア ミオバナー（CPEO）4症例，筋緊張性ジス
トロフィー4症例，多発性筋炎2症例である．
CPEOは男性2例，女性2例であり，年齢46歳

C y t

9 3 ．21 2 2 ．3

1 4 5 ．2

1 3 0 ．2

方法

〜65歳，罷病期間11年〜21年である（表1）．4例
すべて血中ピルビン酸の上昇がみられ，CytO−
Chrome c oxidaseの低下が3例に見られた．また遺伝学的検索で多重欠夫が認められた．筋緊張性ジストロフィーはすべて男性で，22歳〜52歳，
CK値は53−461IU／Lであった（表2）．多発性筋炎は62歳，38歳の女性で罷病期間は12年，5か月であり，ともにステロイド治療を継続していた．

1．CPEO4例にCoQlO150mg／dayを経口投与
し，4週，8週，12週後のATを測定した．その酸が貯蓄される．運動強度の増加に伴い解糖系代謝が関与してくる時点を推定するには運動中の血中乳酸濃度が増加しはじめる時点から求められる．
この時点をWassermanらはAnaerobic Thresh−old（AT）と名付けた．このATを指標として薬剤効果，運動療法の有効性を検討した．
対

象

年

齢

擢

病

期

乳
ビ

間

鞍
ル

ビ

N ID Ecy t

Cン

O ェi d a s e

後90mg／dayの継続投与をした後（8か月），1か
月のplacebo投与後のATの測定を行い，AT，心拍数，負荷量の時間的経過を検討した．
2．筋緊張性ジストロフィーのATを測定し，その運動能力を検討した．
3．多発性筋炎にステロイド療法を施行し，運動療法の有効性と運動量の指標を検討した．

＊北海道大学医学部神経内科■＊美唄労災病院リハビリテーション科■＊＊国立療養所札幌南病院神経内科
−64−

表2

家

族

症例 1

症例 2

症例 3

症例 4

−

−

＋

＋

歴

年

齢

24 歳

22 ・
歳

52 歳

49 歳

性

別

♂

♂

♂

♂

体

重

37 kg

58 kg

47 短

52 k g

154

53

46 1

10 ，6

3 ，5

7 ，7

C K

この間，ステロイド10mgを連日投与した．運動療法前のATは14．40mg／kg／min，6か月後のATも同様に15．04mg／kg／minと有意な上昇はなく，CK値も一定で運動療法が比較的有効と思われた．
症例2は発症から5か月と比較的亜急性期の時期であり，CKが200IU／1程度まで低下し，運動療法を開始した．開始前のATは16．0と低値であり，筋緊張性ジストロフィー4症例のまとめ：22−52歳の全例男性であり．CK値が53−46IU／1であり，筋力低下はほぼ同等と考えられた．

（I C ／ 1 ）H G P く右 ， 左 k g ）8 ，7結
1．ミトコンドリア

運動療法開始後2か月で22．0mg／kg／minと年齢を比較しても充分なところまで改善した．また心拍数の低下，最大運動量が71ワットとまだまだ持久力の低下は認められるものの着実に改善が見られた（表4）．

AT

果

（血A州
25

ミオパテー4例について

ー症例l

症例2，症例3，症例4のCoQ1090mg投与
後，1か月のplacebo投与した場合，ATはそれぞれ21．0から20．22mg／kg／min，18．3から17．2mg／
kg／min，24．8から23．40ml／kg／minと低下傾向にあるが有意な差はなかった．また心拍数に関しても同様有意な変化は見られなかった．負荷量も症

20

▼症例2
＿圧す13

15

＿症例4

10

5

0

投与前

症例1，2はATを越える運動が可能であったが症例3，4はATまで到達ができなかった．症
例1，3はそれぞれATが15．2，14．5mg／kg／minと年齢を考慮に入れても相当低下が著しかった．
また心拍数の増加，不整脈の出現があり，ATに到達してからmax（最大運動量）までの時間の短縮と運動量の低下が見られた．
症例3，4は共に39ワットまでの運動量が最大であり，心電図でも不整脈の出現があり，ATまで
は運動ができなかった（表3）．
3．多発性筋炎2例について
症例1は50ワットを指標として運動を継続した．
−65−

8遇

12遇

9

Tl名付■y pll⊂亡b（CoQl015h拘）例4を除いて変化は認められなかった．症例4の負荷量がCoQl。中止後も増大した．CoQl。150mg
投与では4例すべてATの上昇が見られ，CoQl。
30mg投与と比較して有意に改善がみられ，臨床症状でも持久力，易疲労感の自覚的症状が改善された（図）．
2．筋緊張性ジストロフィー4例について4遇

C oq 10YOy W

90m 〟▲yph Ctb

H R

Lo■d

YOユ
／
W

H R

Lo■d

症例 1

19 ．
35

12 8

70

症例 2

2 1．
0

13 0

62

20．
22

13 0

61

症例 3

1g：
3

12 0

朗

17 ．
2

11 8

63

24 ．
3

124

75

23 ．
40

13 0

89

（
汀肋 かnhか血Y一止）（lTln ■巾血

仙

▼止I

症例 4

図 上段がミトコンドリア ミオバナー4症例のCoQ．。150mg投与から90mg，placebo
までの時間的推移とATの変化を表した．
CoQl。150mg投与後8，12週で有意にATの上昇が見られた．90mg投与にてもATの有意な下降は見られず，1か月のplacebo投与でも多少下降ぎみではあるが，有意差はなかった．
下段はCoQ．。90mg投与とplacebo投与
時のATと心拍数（HR），負荷量（load）を示した．症例1以外ですべて有意な差がみられなかった．

表3

筋緊張性ジストロフィーのAT測定とmax（最大運動立）を示した．症例1，
2はATまで運動が可能であったが，15．2，14．5mg／kg／minと低値を示した．

表4

撼A X

VO2／
I

IⅡ LOAD

VO2州

Ⅰ
旺 LOAD

症例 1

15．
2

115

35

24．
0

135

63

症例2

14．
5

137

65

20．
5

157

92

症例3

17．
5

145

39

症例 4

12．
0

130

39

多発性筋炎の運動前後のATを示した．
症例1は14．40，15．04mg／kg／minとATは低いが，運動機能は維持され，また症
例2は亜急性期ではあったが，運動療法
前後で有意な上昇が見られた．
運動療法前
AT

症例 1 （
62歳 ）

Ⅲi

l月AD

14．40

運動療法中
AT

Ⅲi

］
u AD

133

71

15．04

（
ステロ
イFlOn g）
症例 2

（
38歳 ）

16．0

141

41

22．0

（
ステロ
イド
15ng）

考
察
ATとはどのような指標であろうかとの疑問があり，現在でもいろいろ賛否両論が存在しているが，トレーニングで向上し，加齢，疾患で低下するという意味では幾多の体力的指標と同等である．
しかしATはまだ体力指標としても検証途上であるといえる．現在確立された指標としてはVO2
maxが一般的であるが，徐々にVT（換気城値）
LT（乳酸城値），OBLA（onsetofbloodlactate
accumulation）等の指標も使用されてきている．
WassermanらがVO2maxよりもかなり低い強度ですでに乳酸が出現することを示した上でこのような（最大ではなく）中くらいの強度において，
なんらかの体力的指標が存在することを示唆した．
しかし，それが無酸素性代謝の結果としての血中乳酸は血液でも緩衝作用の結果として二酸化炭素に置き換えられること，およびその二酸化炭素の排出のために同時に肺胞換気が促進されるを示し
た1）2）．確かにそのような中くらいの運動強度の指標には魅力があった．概念の定義づけの段階で数多くの反論が出現した3）．
AT関連指標として前述したLT，VTが出現
し，それぞれ追う指標であることが認識されてきた．混乱はあるもののそれぞれの指標を適材適所で使用することが今後必要となるであろう．とくに換気の非直線的変化点として判定される換気城
値がわれわれの領域でATと考えられ，運動耐用能の1つの指標として利用されることが考えられる．これは無酸素の城値ではなく，そのような換気の変化を起こす生体内の生理学的変化の中に種々の疾患を分類したり，リハビリテーションの効果を判定したりする上での重要な鍵が含まれていると思われる．
今回われわれはミトコンドリア ミオバナーの症例に対して運動負荷を行い，その運動能力と薬剤の効果についての検討を行い，ATの指標が妥当性を有しているかをも検討した．CoQl。の投与量にATが相関を有し，臨床症状との有意な相関が見られた．酸素摂取量の増加と心拍数の減少は明らかに運動能力の改善を意味し，また1か月の休薬では少なくともAT，心拍数，負荷量に変化な
く，CoQ．。の効果を完全に消失するには少なくとも1か月以上は必要であることが今回の実験で明らかになった．またCoQl。150mgと90mgとの間に臨床症状を含めた差はほとんどないことも失証された．
また筋緊張性ジストロフィーでは心臓の障害を含めた筋肉病変が主体であるが，今回ATを測定した4例では曜病期間と運動療法に起因すると思われる相違が見られた．22歳，24歳と若年層ではなんとかATが測定可能であったが，49歳，52歳
ではATまでの運動ができなかった．また前者2例はともに現在もリハビリテーションを継続しており，また後者2例は日常生活のみで取り立てて運動は行っていなかった．4例すべて心拍数120／−66−

min以上で不整脈の出現がみられた．このことか
ら筋緊張性ジストロフィーの運動訓練はAT以
下特に30−40ワットと低い運動を行うことで心臓に過度の負担をかけずに運動機能を維持すること

AT測定を行った．2例はATまで到達したが，2
例は運動継続が不能であった．測定可能の2例はともにATが低値を示し，ATからpeakまでの時間の短縮がみられた．

が可能であることが考えられた．
多発性筋炎における運動療法はどの程度の負荷量を指標として実施すべきか問題であるが，ATを基準として運動量を決め，それ以下の運動量を継続することで機能維持は可能であることが考えられる．運動機能の向上を目的とするためには前3．多発性筋炎にステロイド治療を行い，ATを測定し，理学療法を継続した．1例はATの変化はみられなかったが，運動機能の維持には有効であった．1例はATの上昇，心拍数の減少，負荷量の増大が認められた．

回本班研究で報告したようにAT以上の運動とくに150％〜200％以上の運動が必要となり，これ

文献1）Wasserman K，VanKessel AL and Burton

らの患者には到底無理であり，また疲労の蓄積により，症状の憎悪が充分考えられる4）．AT以下の運動を持続的に行い運動能力を維持することが症
例1では認められ，症例2は亜急性期でもあり，AT以下の運動でも，AT，心拍数の増大が見られ

GG：Ⅰnteractionofphysiologicalmechanisms

duringexercise．J ApplPhysio122：71−85，
1967．

2）Wasserman K，Whipp BJ，KoyalSN，etal：
Anaerobic threshold and respiratory gas

た．

exchangeduringexercise．JApplPhysio135：
236−243，1973‥

結語3）山本義春，宮下充正：これまでのATとこれか

1．ミトコンドリア ミオパテ一にCoQl。を投与

らのAT．体育の科学39，1989，pp348−363．

し，AT，心拍数（HR），負荷量（load）を測定した．CoQl。150mgと90mg投与におけるAT，HRの有意な差は見られなかった．また1か月のplacebo投与ではAT，HR，loadの低下は見られなかった．
2．筋緊張性ジストロフィーに運動負荷を加えて

4）伊藤和則，田代邦雄，森若文雄ほか：筋疾患の−67−

治療効果について． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法の開発に関する研究 （荒木班）平成3年度研究報告書，1992，pp59−61．

10）人骨格筋細胞におけるmyoglobin mRNAの局在−電顕的研究川 井 尚 臣＊研究協力者

三ツ井 貴 夫＊ 赤斎 藤 美 穂＊ 増

池 雅 史＊
田 健二郎＊

横

井

健

治＊

は じめに

ものを用いた．陰性対照はプラスミドDNA

ミオグロビン（Mb）は筋細胞中で酸素の運弧貯蔵を行っており，酸素を必要とする筋のミトコ
ンドリアにとってきわめて重要な蛋白質である．
本蛋白質は筋の障害時にしばしば血中や尿中に増加する．骨格筋疾患の場合これは骨格筋に由来す（pBR322）をビオナン化したものを用いた．
Ⅰn situ hybridizationは下記の2種類の方法で行った．すなわち，1）Pre−embedding法：骨格筋を0．5％グルタールアルデヒド加4％パラホル

るものであり，従って骨格筋ではMbを喪失していることになる．Mbの喪失は筋細胞の障害をさらに増強すると考えられ，筋にはそれを補充する必要が生じる．我々は，in situ hybridization法
を用いて骨格筋細胞におけるMbのmRNA（MbmRNA）の局在を調べ，筋細胞内におけるMbの生合成がどのように行われているかを検討してきた．前年度は光顕的に検討した成績を報告
した1）が，本年度はその研究を発展させ，電顕的に筋細胞の微細構造とMbmRNAの存在部位との関係を検討し，筋細胞内におけるMbの生成部位を同定した．
対象と方法
対象は人正常骨格筋（44歳，男性，腸腰筋）とDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）筋（11歳，男性，大腿四頭筋）である．Insituhybridiza−tionに用いるMbのプローブは赤星博士2）より供与を受けたブタMbのCDNAをPstlで処理して得られた2つの断片365bpと209bpのうち小分子の後者を用いた．プローブはビオナンで標識した＊徳島大学医学部第一内科

ムアルデヒドで固定した後に6〝m凍結切片を作成し，in situ hybridizationを行い，つぎにヤ
ギ抗ビオテン抗体，ついで金（5nm）標識ウサギ抗ヤギIgG抗体を反応させ，エポキシ樹脂で包埋し，その後超薄切片を作成する方法と，2）Post−embedding法：骨格筋を上記と同様に固定し，LR White Resinで包埋した後60nmの超薄切片を作成し，in situ hybridizationを行い，その後
ヤギ抗ビオナン抗体，金（10nm）標識ウサギ抗ヤ
ギIgG抗体と反応させる方法である．電顕観察は
JEOL社JEMT1200EXIIを用いて行った．この方法ではMbmRNAの存在部位に金粒子が直径5nmおよび10nmの円形の陰影として認められる．
結果

正常人骨格筋：Pre，embedding法では金粒子
陰影は主として筋原線絶間に認められた（図1）．
本方法では筋原線維問に少数の金粒子が観察されたが，筋原線維上には殆ど認められなかった．
Post−embeddingでは金粒子は筋原線維上，筋原
線維間，筋柴などに認められた．金粒子陰影は単独（1個）あるいは複数個がclusterを形成して存在しており，筋原線経では主としてA帯に認めら−68−図1正常人骨格筋におけるMbmRNAのin situ hybridization．金粒子像は筋原線維間に認められる（pre−embedding法）左上の口内は拡大図．

れ，Ⅰ帯にも少数存在していた（図2a）．その他
筋原線維間や筋核近傍の筋葦にも比較的多くの金粒子が認められた（図2b）．陰性対照では金粒子はほとんど認められなかった．金粒子は単独（1個）に存在するものが74％，2−4個がclusterを形成するものが22％，4個以上が集まりclusterを形成するものが4％あり，単独のものが最も多かった（図3）．筋細胞内の部位別に分布を調べると，筋原線経のA帯に分布するものが最も多く39％，ついで筋核近傍の筋菜が28％，筋原線維間のものは21％であった（図4）．
DMD筋：Pre−embedding法で検討した成績を示す（図5）．金粒子は筋原線維間に認められた．
考察
正常人骨格筋，ならびに一部のDMD筋におけるMbmRNAのin situ hybridizationの成績を報告した．直径約5nmおよび10nmの金粒子はMbmRNAの存在を示すと考えられ，MbmRNA

は筋放線経のA帯と筋核近傍の筋葦に比較的多く存在し，筋原線絶間にも分布していることが見出された．そして，筋細胞ではリポソームがA
帯，筋原線推間3）および，筋核近辺の筋葦に多いことを考慮すると，筋細胞内のMb生成は主としてこれらの部位で行われていると考えられる．Mb
は骨格筋でⅠ帯に限局して分布しているので4），本
蛋白質は前述のMbmRNAの多い部位で生成されたのちⅠ帯へ移動し，Mbを保持する何らかの機構によってその部位に限局して存在するものと考えられる．MbmRNAが筋核に近い筋梁に多く認められたのは，この部位でMbが生成されていることに加えて，筋核で合成されたMbmRNAが筋細胞内の転写部位へ運搬されていることも反映していると思われる．
筋蛋白のmRNAの局在については，文献的に
myosin heavy chainの成績が報告されている．
大部分は筋原線推間に存在しており5）MbmRNA
が筋原線経のA帯や筋核近傍の筋楽に多量存在するのとはかなり異なっている．

−69−

図2

a．正常人骨格筋におけるMb mRNAのinsituhybridization．金粒子（矢印）は単独のものと複数のdusterをなしているものが認められる（post−embedding法）．
b．正常人骨格筋におけるMb mRNAのinsituhybridization．筋核近傍の筋菜に多数の金粒子（矢印）が認められる．
N：筋核（posトembedding法）．

−70¶

騒郵︻＼盛二〇日Iの■一〇

ご七二千の︶ 鎗壷二／小義嘲︵qE札的︶︵NEミS︶

1

2〜4

5以上
CluふtOr当たりの金粒子致A帯

図4対照（pBR322）

鎗軽−＼戯L

47視野

l帯

筋原線維同

核近傍

ミトコンドリア

Mb mRNAシグナルの筋線維内の分布．
金粒子はA帯に分布するものが最も多く（39％），他に筋核近傍の細胞質（28％）
や筋原線維間にも多い（21％）．

01
のつ一〇

図3

2〜4

5以上
CIu＄tくけ当たりの金艶子数一定の視野中のMb mRNAシグナル．
単独（1個）の金粒子が最も多く（74％）
観察される．下段は陰性対照．

図5

DMD筋のMb mRNAのin situ hybridization．金粒子が筋原線維間に認められる（矢印）（pre−embedding法）．
−71一DMD筋についてはまだ十分な成績が得られて顕的研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

いないが，著者らは，さきにNorthen blot法でMbmRNAがDMD筋で多いことを報告し6），ま筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法

たinsituhydridization法でも光顕的には本症の非萎縮筋は正常筋に比べむしろ増加しているとの成績を得ている1）．電顕的な検討によりDMD筋
におけるMbの生成状態を知ることができれば開発に関する研究 （荒木班）平成3年度研究報
告書，p139，1992．
2）AkaboshiE：Cloningandsequenceanalysis
OfporcinemyoglobincDNA．Gene40：137，
1985．

本症の筋障害と好気的代謝障害との関係の究明に役立つと思われる．

3）Horne Z and HeskethJ：Immunological

今後，本法を用いて筋ジストロフィー筋，ミトコンドリアミオパテ一筋などにおけるMbの生成について検討し，これらの疾患の病態解明，ひいては治療法の開発に役立てたい．

muscle．Evidence for myofibrillar associa・

localization of ribosomesin striated rat

tion and ontologicalchangesin the subsar−
COlemmal；myOfibrillar distribution．Bio−
ChemJ268：231，1990．
4）Kawai H，Nishino H，Nishida Y，et al：

まとLocalizationlofmyoglobininhumanmuscle

め筋細胞内のMbのmRNAの存在部位をinsitu
hybrization法を用いて電顕的に検討し，
MbmRNAは筋細胞内で主としてA帯，筋庶線維間，筋核近傍の筋柴などに存在することを明らかにした．この成績はMbが筋細胞内のこれらの部位で生成されていることを示唆する．

Cellsbyimmunoelectronmicroscopy．Muscle
NervelO：144，1987．
5）Wenderoth MRand Eisenberg BR：Ultras・
tructuraldistributionofmyosinheavychain
mRNAincardiac tissure：Acomparisonof
frozen and LR White embedment．J Histo−
Chem Cytochem39：1025，1991．

文献6）鳴尾隆子，川井尚臣ほか：神経・筋疾患の骨格筋におけるミオグロビンおよび生合成．四国医1）川井尚臣，三ツ井貴夫，鳩尾隆子ほか：人骨格
筋細胞におけるmyoglobinmRNAの局在一電誌 47：109，1991．

−72−

ⅠⅠ．ミオトニアほか

11）電気的ミオトニー発生条件の数理的解析
栗 原 照 幸＊
研究協力者

寺 田 和 子H 吉 沢 修 治書目西 村 千 秋＊＊岸雅 彦＊ 木 下 真 男＊

は じめに容量に関するパラメータを正常値から変化させ，

ミオトニーの発生機序については，筋細胞膜のClコングクタンスが低下する場合，fastNacur−
rentがenhanceされる場合及びその両方が重なって起きる場合など，種々の異なる機序が存在す
る．膜の電気活動に関する数理モデルにおいて電周期発火や連続発火の発生の有無・定常電位値等を，数倍計算と力学系の理論により調べた．数値
積分にはRunge，Kutta法を用いた．

気的ミオトニーが起きる条件の一部を昨年報告したl）が，本年は発生条件を網羅的に明らかにすることを目的とした．イオンチャネルの異常は一つとは限らず，複数のチャネルの異常が組合さって起こっていることもあるので，この点に特に注意した．これによって，どのような組合せの膜異常がミオトニーを起こし得るか予言することができ

1．電位波形例

るので，一つのチャネルにこだわらない考え方を発展させることができ，その上で，実験への応用の道が開かれると考えられる．
方

法

1．モデル
解析の対象としたモデルは，哺乳動物の筋に関するHodgkinTHuxley方程式（以下HH式とする）でSpaCeClampを仮定した，表1の常微分方程式である．生理定数（パラメータ）の正常値としては，文献2ト4）に基づいて定めた温度22℃の値を用いた．

2．解析方法モデル方程式において，各イオンチャネルや膜＊東邦大学医学部第四内科＊＊東邦大学医学部医学情報学＊■■東京大学工学部機械情報工学

結果

図1に，モデルで数値計算を行った場合の電位波形例（左），文献5）にある実験的に得られた波形（右）を示した．数倍計算の際のパラメータ値は，
図の左上がgl＝0．310，∇石＝−59，左下がgl＝0．323，∇石＝−59，他は全て正常値であり，これはいずれもリークコングクタンスgl（Clコングク
タンスが大部分を占める）が低下しかつ，Na活性化因子の電位依存性を定めるパラメータ∇諒が過分極方向に変位した状態，即ち，fast Na cur−rentが増大した状態である．左上は，反復発火の後，静止膜電位（RMP）−81mVより脱分極側の745mV附近の定常電位に収束していく例であり，左下は，周期発火を続ける例である．この実験データは，ラット横隔膜筋にClチャネルブロッカー
であるアントラセンー9−カルポン酸を投与した場合である．数理モデルと実験の波形はよく類似している．
2．Clコンダクタンスのみ低下した場合
HH式では，gl（CIconductanceが主成分）の正常値0．4に対し，0．084以下で周期発火が生じる（図2）．その電位レベル・周期・発火の生じ易さ
等の性質は，両生類の筋の場合6）7）と同様であった．これらの性質は，生理実験で知られている性

−75−

表1

筋細胞膜の電気活動に関する哺乳動物骨格筋のパラメータを用いた数理モデル
Hodgkin−Huxleyequations（mammaIianmuscle）：SPaCeCIamp

叫dlこ16品m3h（V−VNa）・或n4（V−VK）・gJ（V−Vl日／CM
dm′dt＝αmM・（1−mトβmM・mdh匂t＝αhM・（1−h）−PhM・hdn匂t＝αnM・（1−nトβnM・n
α爪ⅣtVm）
αmM tβmM＝βmexpHV−Vm）／18）

1・eXPト（V−Vm）／6．81
αh【Ⅵ＝αheXPf−（∨−Vhい4．71

βhM F

1十eXPt−Ⅳ−Vh）／7．6）

αn（V・Vn）
αnMi

βnM⊆βnexpHV−Vn）／40）

1・eXPt−Ⅳ・Vn）／刀

normalconstants（22℃）
gNa；50・Ommho／cm2；言＝0・08

VNa岩50mV

βm＝0・8gK＝22mmho／cm2

VK＝・70rnVms−l qn＝0．0088ms−1

ms−1て扁＝・55βn＝0・037ms・lmV Vn＝−40αh＝0・006ms−1

cM＝1・9mV
yF／cm2

gJ：0・4 mmho／cm2 7T：1・3
Vl＝・81mV

Vh；・41

質と定性的によく対応していた．
定常電位としては，glが正常値では，膜の通常の静止状態に対応する電位−81mVのみがあるが，gl＝0．14以下では，脱分極側に別の安定な定常電位が現れる．ただし数値計算では，この電位に収束する波形は通常の電流・電圧刺激では現れない．
（図に示した不安定な定常電位は，実際には観測されることのない状態である．）
3．Clコンダクタンスの低下と共にfast Nacur・rentをenhanceした場合
図3に，glとⅥ首位の組合せに対する周期発火の状態の生じる範囲と安定定常状態の個数を示した．（図2は，図3の∇孟＝−55（正常値）の直線状での解の電位を示したものである．）図3で，正常値（gl＝0．4，∇苗＝−55mV）を含む，Hopf分
岐を示す直線より右側の領域では，膜の静止状態に対応する定常状態が唯一の安定状態であり，1回の刺激に対して1回だけの正常な活動電位が生じる．図の三角形の領域内では，図1下のような周期発火が生じる．この領域の左縁の外側近傍（でかつ直線より左側）のパラメータ値では，図1上のような反復発火が生じる．
図3より，Nacurrentがenhanceされる（∇石が上昇（脱分極）する）と，周期発火が生じ始めるglの間借が上昇する．すなわち，反復発火が生じ易くなることが読み取れる．
4．電気的ミオトニーの発生条件
他のパラメータについても同様に，周期発火が生じ始めるglの閥値を指標として，反復発火を起こす（または起こり易くする）変化の方向を調べた結果を表2にまとめた．表2で2重かっこのものは，影響がごく小さい．
これらの条件は組合せにより，図3のような形
で加算的に働き，単独では反復発火を起こさない−76−

Ⅰ40nA

120mv
ト

一一」

l00m‡

experiment

Simulation

図1 電位波形例

3

2

0

1

0

−80

0

−100

0

−60

4

−40

0

＞−20

5

tN∈0︑0盲∈＝むOU召⊃PU8萱0亘■○

20
＞
∈

0

40

ー60

図2 gl（Clを主とするリークコングクタン
ス）に対する周期発火の最大・最小電位と定常電位値

−58

−56

−54

・52

−50

中高（PaTameterOnSOdiumact王vation日mV）

図3

ような異常も条件が重なると反復発火を起こす可能性がある．
また，これらの条件と逆の方向にパラメータを

gl（Clを主とするリークコングクタンス）とVm（Na活性化因子mの電位依存性に関するパラメータ）の値の組合せに対して周期発火の生じる範囲と安定定常状態の個数変化させることにより反復発火を止めることができる．
考する波形は得られなかったが，図3から読み取れ
るように，編￣がわずかに過分極方向に変わるとこのような波形が現れるので，パラメータの誤差

察

1．数理モデル上の反復発火発生条件について、数理モデルでは，Clコングクタンスの低下のみを考慮すると，実際の筋では，反復発火が起こり得ると考えられる．

では，図1（1）のような脱分極した電位に収束

Fast Nacurrentの増大は，今回の解析では単−77−

表2 Hodgkin−Huxley方程式において反復発火を生じる（生じ易くする）
パラメータの変化

Clconductanceの低下
Na透過性の増大

g／減少

活性化因子mの電位依存性の過分極方向への変化（不活性化因子hの電位依存性の脱分極方向への変化（最大conductanceの増大（（平衡電位の低下【脱分極方向への変化】

叫。上昇等
打低下等）

（平衡電位の低下％低下）（（電位依存性の脱分極方向への変化（（膜容量の増大

拓上昇等））
好上昇））
∽低下）
仇増大））

独では周期発火を起こさなかったが，Clの場合と線経に静止膜電位の低下（脱分極）が報告されて同様に，パラメータの誤差を考慮すると現実の筋

いる．

元増大）
‰低下））

K

（（最大conductanceの増大（RMP【リーク平衡電位】の低下

では起こし得ると考えられる．

その他の膜特性については，myOtOnia con−

HH式では，単独でミオトニーを発生させる膜

genitaで，静止状態でのKコングクタンスの上昇

異常は，Clコングクタンスの低下とfastNacur−

がClの低下に合わせて起こっていることが報告

rentの増大の2つだけと考えられる．これは，以されている．それ以外の疾患では複数のチャンネ

下に述べるように，従来ミオトニーで主に観察さ

ルの姐合さった異常があるという報告はない．

れている膜異常である．

今回報告した数理モデル上での発生条件は，従2．生理的に知られている条件との対応

来あまり検討されていない膜特性もミオトニーの以下の点で，数理モデル上の発生条件は，従来知られているミオトニーの発生条件（詳しくは文発生に関与している可能性を数理モデル上網羅的に示している．

献1）表2）を含んでいる．
1）Clコングクタンスの低下が関与しているミオトニーは，ヒトのmyotoniacongenita（Thom−
Sen型），及び動物では先天性のヤギのmyotonia
がある．
2）fast Na currentの異常が関与しているミオ
トニーとしては，myOtOnic dystrophy，para−
myotonia等の報告がある．また，ミオトニーの治
療薬の多くはNaチャネルを抑制する働きをもつものである．
3）recessivegeneralizedmyotoniaについては，
Naの異常とClの低下の両方があることが報告されている．

結語

筋細胞膜の電気活動に関するモデルである
Hodgkin−Huxleyにおいて，反復発火を生じる条
件を網羅的に明らかにした．これらの条件（膜特性の変化の方向）は，現在までにミオトニーの原因と考えられている変化の方向とその組合せを含んでいる．さらに，他の（組合せ）の可敵性を示している．これにより，HH式が成立する範囲ではどのような組合せの膜異常がミオトニーを引き起こし得るかを予想できるので，原因解明のための実験や，治療薬開発への助けになると考えられ
る．

4）mdx mouseでは，横隔膜標本では一部の筋
−78−

文

献

4）Duval A and Leoty C：Ionic currentsin

1）栗原照幸，岸 雅彦，寺田和子，西村千秋，吉mammalian fast skeletal muscle．J Physio1

沢修治，根本 博，日高隆信，木下真男：mdx
マウスの電気的病態と薬物治艶，筋活動電位の5）Furman RE and Barchi RL：The patho・分析，及びミオトニーの数理的解析． 厚生省「精physiology of myotonia produced by ar0−

神・神経疾患研究委託珊」筋ジストロフィー及maticcarboxylicacids．AnnNeuro14：357−

び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究

365，1978．

（荒木址）平成3年度研究報告書，1992，pplO6−

278：403−423，1978．

6）Terada K，Yoshizawa S and Nishimura C：
Periodic firingln muSClemembrane atlow

110．

chloride conductance．TransIEICE E74−5：

2）PapponePA：Voltage−Clampexperimentsin
normal and denervated mammalian skeletal

999−1002，1991．

musclefibres．J Physio1280：377−410，1980．

7）Terada K，Yoshizawa S and Nishimura C：3）Adrian RH and Marshall MW：Sodium

Periodic solutionsin the Hodgkin−Huxley

CurrentSinmammalianmucleJ．Physio1268：

equationsformuscle．TransIEICEE75−A：

223−250，1977．

928−930，1992．

−79−12）Myotonic Dystrophyにおける糖鎖構造の特徴
杉 村 公 也＊
研究協力者

伊 藤
高 橋

塵

太＊

筋緊張性ジストロフィー（以下MyD）は，第19番染色体の上に原因遺伝子を持つ常染色体優性の疾患で，近年protein kinase familyとそのあとに続くtriplet codonの繰り返しが原因遺伝子であることが判明した1）．この疾患では筋肉の萎縮やミオトニアなどの全身の骨格筋障害に加え，知能低下，不整脈，白内障，耐糖能障害，不妊傾向
等の多彩な症候を示し，早期老化をきたす疾患の1つとして考えられている．
昨年度，我々はMyD患者血清IgGにおいて
galactose残基を持たない糖鎖の増加と，galac−
tose残基を1個持つ2種類の糖鎖の比率の変化があることを報告した2）．今年度我々は，MyDに見られる血清IgGの糖鎖の変化が，慢性炎症性疾患（以下CID）において報告されている3）IgGの糖鎖の変化の特徴と質的に異なるのか否かを検討する目的で，MyDとCID患者群よりそれぞれIgGを精製し，その糖鎖構造を比較した．
対

本

田

仁＊

昭＊ 高 橋 面豊 子＊＊

象

方

法

血清1−2mlを40％硫酸ammoniumにて塩析し，陰イオン交換chromatography，affinity
Chromatographyを用いてIgGを精製した．精製
度はSDS−PAGEを用いて確認した．
精製したIgGは，蛋白分解酵素にてglycope−ptideの状態にし，glycoamidase Aを用いて
01igosaccharideを遊馳した後に，2−aminopyri−
dylationにて遊艶した糖鎖の非還元末端を蛍光ラベルし，2次元map法を用いてその構造を検討した．統計学的処理はMann−Whitney検定を用
いた．
結

果

シァル酸のついた糖鎖を分析すると，健常人の血清より精製したIgGに比べ，MyD患者においては，18例中11例で血清IgGはシァル酸含量の低下を認めた．しかしMyD例でも正常な含量を示すものもあり，統計学的に健常者との間に有意差は認めなかった．

検討した患者群は，MyD群は18例，CID群は9例であり，CIDの内訳は多発性筋炎7例，SLEl
例，結節性多発動脈炎1例であった．CID群に関

中性糖糖鎖は，既報の如く4！HPLC上でODS−
COlumnでbutanolでのgradientにより，大別す
ると4群に分かれた．そのおのおのが異なった種

しては，未治療時にpolyclonalにIgGの増加を認める例が多いために，治療前及び治療後の少なく
とも2点において検討した．対照として健常成人12例を検討した．

類の2本鎖であり，第1群はfucoseを持たない＊名古屋大学医学部神経内科＊＊中萱中央研究所糖鎖研究部門

群，第2群はfucoseを持つ群，第3群はbisecting
GIcNAcを持つもの，第4群はfucoseとbisect−ing GIcNAcを持つ群で，いずれも左よりgalac・
toseを持たないもの，1個のgalactoseをman・
nose a1−6の枝に持つもの，1個のgalactoseを
mannoseα1−3の枝に持つもの，2個のgalactose−80−

／八で五山室芋蔓⁝八日目巨富星丁箸⁝︵HHq

墓︵？−且王︵？；古くZO一旦Tleq〆Ut．喜︒1⁝／雷芋蔓きき︒く弓−草書YNU亘Tl富︑○∞○￠︵u篭︶○∈lトUO；コ︻u・︺霊︺望七u竃遥JUS撰；岳きSuO毒U80毛だ晋20卜占Up遥召？uEコtB・S凸Oudu︒StS意u再UJdH〇三岩畳コSpUdp曇U召d聖賢U叫 OS選言dU苫鼠茎でuO篭眉p︒詔p召gU烏合p眉雲qOSuOで巴︸薫hjUUdSO選〇・StO壱Bpu再白書ローU薫きS葛篭d苫∈︒−−篭−
けさOt0号dhOS蔓占UUdSO選OhOS聖竜馬宅名Ou⁝∈意p苫d−OS遥lO邑UJdH−︒U︒S︒−邑§U t区

董蔓茎魚沼‖㌍／雷エ﹂

蔓l蔓喜八損得昌︒ノ芸︶L

蔓−蔓主調摘弼巨富星章⁝︵HHH
／ざ且L

qコOJ伊

−81−

星妻⁝燕律弼⁝E qコOJ址

蔓書芸︵HHHH㌍／亨呈

蔓喜呈指摘目星章⁝︵＝日日日吉U
星・−亨蔓喜八⁚日日蔓的

星−蔓妄帯描弼㍊
星妻⁝指摘消毒⁝＝享⁝人昌∵⁚∵⁚⁚二∴ V−dnOJu董芋蔓ききへ︷門∬抱く喜／八でlきき等く毒ul d⊃OLu

旬SUalUla〇ua〇SaJOnlda＾！letatl

を持つものに分かれた．第3群のfucoseを持たず，bisectingGIcNAcを持つ群はごく小さな割合
であった．

Fの占める割合，％）＋（01igosaccharideGの占める割合，％）＋2Ⅹ（01igosaccharideHの占める割合，％）

健常人より精製したIgGがdigalactosyloligo−
SaCCharideが主であるのに対し，CIDではgalac−
toseを持たない糖鎖が主であり，digalactosyl
Oligosaccharideは著減していた．しかし，2種類のmonogalactosyl oligosaccharideの割合（01i−
gosaccharideFperoligosaccharideG，以下F／Gratio）は，正常対照が2．27±0．55であるのに対し，CIDで2．20±0．41と変化が認められなかっこの計算式によれば，CIDで1128±231％・mg／
dl，正常対照群が1083±159％・mg／dlと両者間にた．一方MyDにおいては，CIDと同様にaga−
lactosyl oligosaccharideの増加が認められるのみならずF／Gratioも1．36±0．32（p＜0．001）と変化が認められた（図1，2）．
さらに， 単位血清当たりのIgGに含まれる
galactose含量 を算出するために，次の計算式を用いた．

有意な差を認めないのに対し，MyDにおいては前2群に対し593±159％・mg／dlと有意な低下を示した（p＜0．001）．またCIDを治療前，治療後で比較した場合，一分子あたりのgalactose含量は，治療後で明らかに増加するが，IgG−galactose
indexにおいては両群で有意差を認めなかった
（図3）．
結

論

1．MyD患者血清より精製したIgGの糖鎖構造はgalactoseを持たない糖鎖の増加が特徴的であった．

（血清IgG濃度，mg／dl）x（（01igosaccharide

■

●l●l●

T・十l

●●

●●

●●●●●●■■■

l

0
0
0
1

T・十l

●●

T士

0
0
5
1

●

■︳●

丁士

■●●

●

T・士

ヽ

丁−丁⊥
︳■ヽ●一■■■

l●ヽ

●●0；q∝U正ControIs ClD MyD
図3Comparison of the t
Index

IgG−Galactose

amongthecontroIs，inpatients

WithCIDandinthosewithMyD．The
一

ControI CJD MyD

IgG一galactoseindex

wascalculated

fromtheformula：（serumIgGconcen−
tration，mg／dl）×（2×（relativelevelof

図2Comparisonoftheamountofoligosac−
Charide FtothatofoligosaccharideG（F／Gratio）incontroIs，patientswith
CIDandwithMyD．TheF／Gratioin
MyDwasslgnificantlylowerthanthat
in CID and controIs（p＜0．001）．Bar
shows mean±SD．

OligosaccharideHratio，％）＋（relative
level of oligosaccharide F and of
Oligosaccharide G，％）），The
galactoseindex

in

MyD

was

一一IgG一slgnifi−

Cantlylower than thatinCID andin
COntrOIs（p＜0．001）．Barshowsmean±
SD．
−82−

2．CID患者血清より精製したIgGの糖鎖構造は
従来の報告通りにgalactoseを持たない糖鎖の増加を認めたがこの現象は血清IgG濃度が高い患者群に，より著明に現われる傾向があった．

MyDにおける病態としての¶粟の異常を解明するためには，我々の結果と合わせ，細胞膜におけるN−linked oligosaccharideの検討が必要と考えられる．

3．単位血清中のIgGに存在するgalactose量はCIDと健常人とで差を認めなかった．一方，MyD

文献1）BrookJD，McCurrach ME，Harley HG，は，他2群に比して明らかな減少が認められた．

BucklerAJ，ChurchD，AburataniH，Hunter4．galactoseを1個持つ2種類の糖鎖の比（F／Gratio）はMyDと他2群との間に有意な差を認めた．
5．以上の検討結果よりMyDにおけるIgGの糖鎖の変化はCIDとは異なった機序によることがK，Stanton VP，ThirionJP，Hudson T：
Molecular basis of myotonic dystrophy；
expansionofatrinucleotide（CTG）repeatat
the3

推定された．

endofatranscriptencodingaprotein

kinase family member．Ce11199268：799−
808，1992．

考2）ItoK，TakahashiN，HirayamaM，HondaH，

察

MyDの遺伝子が近年相次いで報告され1），prO−
tein kinase familyとその後に続くCTG repeat
がその本態であると判明したが1），今まで指摘されてきた 膜の異常 と結びつくdataはその後報TaknhashiA：Abnormalitiesofoligosacchar−

告されていない．一方，今回我々が明らかにした

3）Tomana M，Schrohenloher RE，Koopman

MyDにおけるIgGにおけるβ1，4，galactosyla−
tionの異常は，MyDにおいてアスパラギンに結合する糖蛋白質糖鎖（N−linkedoligosaccharide）
合成系の異常が存在することを強く示唆するのみ

WJ，Alarcon GS and Paul WA：Abnormal

ならず， 膜の異常 と言われてきた病態の一部に糖鎖合成系の異常が関与している可能性をも示唆するものである．その意味では，1983年にStibler4）TakahashiN，IshiiI，Ishihara H，MoriM，らがMyDの赤血球膜を単糖分析し，6％のシァ
ル酸含量の有意な低下とgalactose含量の低下傾向を報告している5）のは注目に値する．赤血球においてはN−linked oligosaccharideそのものが数％しか存在しないが，彼らのdataは赤血球表面に存在する複合糖鎖であるN−linked oligosac−
charide，0−1inkedoligosaccharide，glycolipidsをまとめて加水分解し，有意差がでなかったもの

Oligosaccharides of human normal andidemoietiesofIgGinpatientswithmyotonic
dystrophy．J Clin Biochem Nutri1993，in
preSS．

glycosylation of serumIgG from patients
withchronicinflammatorydiseases．Arthritis
Rheum31：333−338，1988．

Tejima S，Jefferis R，Endo SandArata Y：
ComparativestruCturalstudyoftheN−linked

pathologicalimmunoglobulin G．BiochemiS−
try26：1137−44，1987．

5）StiblerHandSydowO：Thesialicacidandのgalactose含量に関し低下傾向を示した．今後，−83−

galactose concentrationsin erythrocyte

membranesinpatientswithmyotonicdystro−
Phy，1imb−girdle and facioscapulohumeral
dystrophy．J NeuroISci58：389−399，1983．

13）父親由来のCTG repeat異常を認めたcongenital
myotonic dystrophyの一家系

納
■

肘軒

逸

口数
佐

樋伊

リザ

博尚

1992年初頭に，Brookl），Fu2），Mahadevanらの遺伝子DM−1が特定され，その中にCTGrepeatの延長による不安定領域が含まれることが明らかとなった．さらに，このtriplet repeatの延長がMyDyにおけるanticipation3）を説明し得ることも明らかとなってきた．一方，COngenitalMyDy
は，母親由来であるといわれており3），われわれが行なった鹿児島，沖縄地区における疫学調査でも，
COngenital MyDyの母親はすべてMyDyであった．今回，われわれは祖父，父親に不安定領域の異常を認めたcongenitalMYDYと考えられる家系を経験したので報告する．

術をうける．4歳までオムツを使用し，8歳頃よ
りつかまり歩行開始．現在，短下肢装具，杖を使用して歩行可能である．
現症：身長118cm，体重17kg，高度の知能障害，
顔面筋麻痺，構語障害，高口蓋，筋萎縮・筋力低下，内反尖足，反張膝を認める．Grip myotonia
はなく，perCuSSion myotoniaをわずかに示す．
症例2：15歳 女性，症例1の姉．
主訴：指先に力が入らない，
現病歴：生下時体重3500g，floppyinfant，走頸3．5
カ月，歩行開始11．5ヵ月．幼稚園の頃より，よく口が開いているのに母親が気づいていた．小学校
では歩行は特に遅く，鉄棒にもぶら下がれなかった．10歳頃より缶ジュースの栓を開けられないことを自覚し，13歳時に筋力低下を主訴に当科紹介
受診．

象

症例1：10歳 女性
主訴：顔面筋を含む全身性筋力低下・萎縮，精神発育遅延．
現病歴：生下時体重3200g，母親に羊水過多あり．
floppyinfant，哺乳する力が弱く生下時より内反足を認めた．定頸1歳，1歳時に国療南九州病院，
鹿大第三内科を受診し，COngenital myopathy，
精神発達遅延，Moebius症候群と診断される．同時期に内反尖足に対して，両側のアキレス腱延長＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊鹿児島大学医学部且艮科
＊＊＊大阪大学医学部老年病医学

口

＊

的

3グループにより，Myotonicdystrophy（MyDy）

対

田

山谷

針針肘

正由暫

川西木

目

中上三

研究協力者

現症：身長146cm，体重38kg，IQ＝55，顔面筋力低下，軽度の喋下障害，びまん性の筋力低下，筋萎縮を認める．動揺性歩行，階段昇降不能．Grip
myotonia，perCuSSion myotoniaを認める．
症例3：42歳 男性，症例1，2の父親．
主訴：手先に力が入りにくい．
現病歴：小学校の頃はかけっこは早い方であった．
高校時代はラグビー，大学時代はボクシングをしていた．39歳頃より，手先に力が入りにくくなり，
最近下肢の筋力低下を自覚している．41歳時より耳嶋があり，軽度の両側神経性難聴を指摘されて
いる．

−84−

筋生検所見：症例1，2，3にて上院二頭筋より筋生検を施行した．HE染色は，症例1，2では中心核などの増加はなく，症例3でもわずかに中心核の増加を示すのみであった．ATPase染色では，3例ともにTypelfiberatrophyを認めた．
症例1から4の臨床症状および検査所見のまとめを表1に示す．

図l Predigree ofa congenitalmyotonic dystro・
phy family HA

表l Clinical andlaboratory findingsin DM
familyyusclo▼ealme＄＄
HusCle atrOpby
yyotonla
Serut Cl（Fく40．Mく55）
VyotonIc dlscbarge
Eeart COndtlCtion bloek

Frontil YentrlCular

＋

＋

−

primerlO2，primerlOlとprimerlO2）1）を用いてCTGrepeatの長さについて検討した．PCRの反応条件は，Daviesらの方法に従った4）．Controlとして，CTG repeatを5回含むcDNAを用いた．
結

N E 柁

Inerea＄ed centril mt】elel＋＋

lobモatTOpbr dllatittOn

Typelllber atrophyてdigestion後，0．8％アガロースゲルにて電気泳動を行い，Southern blotting後，Digoxigeninlabeled cDNA25（1．4kb BamHI fragment，
provided by Dr．K．Johnson）とハイプリタイゼ
イション後，Chemiluminescent detectionを行
い，Ⅹ線フイルムへ感光した．また，CTGrepeat
領域をはさむ2組のプライマー（primer96と祀

Bralm CT＋ ＋ 十 日 ＋ 一

yental retardation

l川
M
lq−55

州
毎 一 日 ∬ 一 一 一 一 山 一 ■Eeiかt（ct）
leigbt（lg）

15y／F
it blrtb⁝閃686〇一＋＋＋7〜＋一聞

lg00I onset㌦t
il
rIH⁝＋＋±51陀一〇一hUlq一

Age／＄eID〃−J不安定領域のDNA分析
以上の4例および祖母，母親の白血球よりDNAを抽出し，不安定領域の検討を行なった．抽出したDNAは，制限酵素BamHIまたはSacIに現症：知能正常．Hatchetface，遠位部優位の筋
力低下・筋萎縮，Grip myotonia，perCuSSion
myotonia陽性．
症例4：69歳 男性，症例3の父親．
現病歴：自覚的には，異常はないが，検診にて糖尿病を指摘されたことがある．53歳時に胆石摘出術をうけ，67歳時に白内障を指摘されている．筋力低下はなく，針筋電図でもmyotonicdischargeは認められなかった．
以上4症例の家系図を図1に示す．

果

SacI digestion，BamHI digestionにて，症例
3，2，1の順に600bp，2．7kb，4kbの延長をしめすバンドがみられ，世代ともに不安定領域の延長が認められた（図2）．
CTGrepeat領域を含むPCRでは，primer96−
primer102を用いた場合，COntrOI DNAの160bpのバンドに対して，祖父（症例4）では200bpと300
bpのバンドがみられ，約50回のCTGrepeatを持つalleleが推定され premutationの状態と考えられた．一方，祖母では200bpと210bp，母親では160bpと220bpの各2本のバンドが認められたのに対して，父親（症例3）では200bp，症例1，2では220bpの各1本のバンドのみが認められた
（図3）．

検査所見
頭部CT所見：症例1で前頭葉の萎縮を，症例2で脳室の軽度拡大を認めた．

−85−

表2

Manifestations ofcongenitalmyotonic
dystrophy％in126￠aSeS CaSel caSe2

＋
＋

6

＋一一

4−

2
2
7
6
︻ ■

＋

＋ ＋ ＋ ＋ ＋一

7

・ 4 −

distreSSⅣeonatal feeding difficulty
Eydralmio8
且eduCed fetal moveInent

4
6

Neonatal reSpiratory

3

Talipe＄96Mental retardatioJI

8

Delayed motor develo叩ent

7

腎eaknesS

Hypotonia

58

Faeial

57．9
25．4
22．2

±
＋
＋

士

Earper PS．197961

不全が認められなかった点以外はcongenital
MyDyの症状と矛盾せず，COngemitalMyDyと診断できると考える．症例2については，earlyon−
図2

Predigree and southern blot analysis of athree一generationof

myotonic

SetのMyDyと考えた．CongenitalMyDyは，一般的にはもっぱら母親由来であることより1），そdystrophyの原因については，体内環境因子やgenomic

family HA

imprinting，またはmtDNAの関与が示唆されている5）．しかし，本家系は，臨床的にも遺伝子レベルの検討でも祖父，父親由来であり，COngenital
MyDyが必ずしも母親由来とは限らないことを示している．このことは，本家系の場合congeni−
tal MyDyの発症が体内環境因子よりも遺伝子異常により強く依存していることを示唆するものではないだろうか．いずれにしても，COngenital
MyDyにおけるCTG repeat延長機序を考える
上で大変興味深い症例と考えられる．今後，祖母，母親を含めた6例のか〟」の塩基配列の検討を行う予定である．

図3

文献1）BrookJD，McCurrachME，etal：Molecular

PCR productsusingprimers96andprimer
lO2which flank CTG repeats
C：CDNA25containing 5 CTG repeatsbasisofmyotonicdystrophy；eXpanSionofa
trinucleotide（CTG）repeatatthe3，endofa
transcriptencodingaproteinkinasefamily
member．Cel168：799−808，1992．

考察2）FuYH，PizzutiA，etal：Anunstabletriplet

症例1，2の臨床症状をcongenitalMyDyの報告例と比較してみると，表2に示すように，症例
1では人工呼吸器を使用するような明らかな呼吸

repeatinagenerelatedtomyotonicmuscular
dystrophy．Science255：1256−1258．1992．
3）HarperPS，HarleyHG，etal：Anticipation−86−

inmyotonicdystrophy；Newlightonanold5）PoultonJ：Congenital myotonic dystrophy

problem．AmJHumGenet51：10−16．1992．

andmtDNA．AmJHumGenet50：651−652，

4）DaviesJ，YamagataH，etal：Comparisonof
the myotonic dystrophy associated CTG

1992．

6）Harper PS：Myotonic dystrophyininfancy

repeatinEuropeanandJapanesepopulations．

andchildhood．ttMyotonicDystrophy

J Med Genet29：766−769．1992．

WBSaundersPhiladelphia．1979，pp170−206．

−87−

edby

14）筋緊張性ジストロフィー症における遺伝子不安定領域の変化と臨床症状の関連について
田 中 恵 子■
研究協力者

江 口
辻

郁
省

代＊ 小野寺次＊ 小野沢は じめに筋緊張性ジストロフィーは常染色体優性遺伝を示し，その頻度は10万人に5．5人といわれている1）．臨床症状は多彩であり，先天性筋緊張性ジス
トロフィーの発症機序やanticipasionのメカニ
ズムは不明だった．しかし最近原因遺伝子がDavid Brookらをはじめとする複数のグループ
により明らかにされた2）3）．
本症の原因遺伝子は19番染色体の長腕13−3領域にあって3 の非翻訳領域にCTGの3塩基の繰り返し構造をもち，このCDNAはcyclic AMP
dependentのprotein kinaseにhomologyが高いと言われている2）4）．正常者ではCTGrepeatが3−36個であるのに対し，患者では50以上から2000個にも及ぶことがある．このexpansionの程度と臨床症状との詳細な対応はまだなされていな
い．我々は本症の臨床症状の多様性の分子メカニ
ズムを明らかにする目的で，本症患者のこの不安
定領域の増加の程度をサザンハイプリグイゼーシ
ョンで確認し，臨床症状との比較検討を行った．
対象と方法
新潟県内の20歳から81歳までの筋緊張性ジスト
ロフィー患者35名で，男性18名，女性17名であり，このなかには3世代を1家系，2世代8家系を含む．発症年齢は0歳から49歳である．

事新潟大学脳研究所神経内科■■国立療養所新潟病院神経内科

理事 小 池直川 近 藤亮子＊
浩＊＊

臨床分類基準は次のように定めた．まず発症年
齢は，筋力低下やミオトニーを自覚した年齢とした．日常生活動作は3段階に分類し，StageIを筋症状なく，早発のCataraCtやhatchet faceのみをきたすもの，StageIIを筋症状は呈するが独歩可能なもの，StageIIIを独歩不能で，つかまり歩行または車椅子を使用するもの，または臥床状態にあるものとした．
知的機能は，3段階に分類した．GradeIを知能低下の認められないもの，GradeIIを日常生活に支障はないが学業成績不振であったもの，
GradeIIIを強い知能低下を呈し，就学不能であったものとした．
遺伝子診断として患者及び正常コントロールの末梢血から，高分子ゲノムDNAを骨法により抽出した．制限酵素EcoRl，BamHl，Pstlで消化した後アガロースゲルに電気泳動しニトロセルロー
ス膜にトランスプロットし，32Pでラベルしたプ
ローブでハイプリグイゼーションを行った．プロ
ーブはマサチューセッツ工科大学のDr．DavidBrookより供与されたpMlOM−6（図2−A）をさらにHincIIで切断して，CTG repeat部分を除いたものを使用した．
結果
1例として父親を第一世代とする1家系を示す（図1）．この家系の2世代目は3人とも患者であり，長男は初発年齢30歳で10数年後には独歩不能となり現在車椅子歩行で療養所に入院中である．

−88−

長女は32歳発症で40歳からつかまり歩行となり，なかった．しかし制限酵素Pstlで消化した場合，次男は35歳発症で現在41歳で歩行障害なくADLは保たれている．長男が最も重症であり，次いで

normal bandのほかに100bpの増大をもつbandの出現があり，臨床症状は極めて軽微であるもの

長女，次男の順であるが，CTGrepeatのexpanp
sionの程度も重症度に応じて増加している．母親は正常と思われたが，父親は30台の頃より白内障があり，趣く軽いhatchedfaceを呈するが，筋症
状は全く認めなかった．この4人のゲノムを
EcoRlで消化し，サザンハイプリグイゼーションの遺伝子変異を有するものと結論した．
筋緊張性ジストロフィー遺伝子のEcoRl．PstlのCut Siteは図2に示したとおりである．患者でを行った．正常対照者ではnormalbandはpoly−morphismを呈し，8．6，または，9．8kbpいずれ
か，あるいは双方のサイズの切断断片が得られた．
臨床症状からはおそらく父親が1世代目と思われたが，EcoRlでは明らかなexpansionは認められ
nonは1
王

PII

P

口Gre匹at−

prObe

ZDyOtOnic dystrophy
P b

mG rep飴t

図1Physical map

はCTG repeatが50個以上に増大するがEcoRl
による消化ではpolymOrphic siteを有するために，正確にexpansionの定量を行うことは難し
い．さらに図2に示したようにEcoRlの消化では断片長が大きくなり，軽度のexpansionの評価は困難である．この点を解消するために，eXpanSionの定量は制限酵素Pstlを用いて，サザンハイプリ
グイゼーションを行った．この場合normalband
は1．1kbpに認められ，abnormalbandはsmearとなって増大する．Bandがsmear状になる理由
はsomatic celllevelでのexpansionの程度が異なることが示唆されるが，我々はこのSmearの広がりの中間値をexansionの増加値として処理した（図2−B）．全35症例でPstl断片の増大は0．1か
ら6．2kbpに及んでいた．以上のデータを用いて解析を行った．

まず発症年齢と，eXpanSionとの関連を検討した．先に述べたようにミオトニーや筋力低下を自覚した年齢を初発年齢と定め，各expansionの程度との関係をみると，両者の間に強い相関はみられなかった．しかし発症が早いものほどrepeat数が増加している傾向があると思われた．つぎに重症度との相関をみるために患者の同一年齢時，即ち40〜45歳でのADLの状況とexpansionの程度を比較した．ADL上StageIは3名，StageIIは19名，StageIIIは5名であった．Expansionの平均値はそれぞれ0．33±0．17，2．58±1．42，4．75±0．93kbpで，これらについてt検定を行った．
この結果StageI，ⅠⅠ間で0．1％以下，StageII，ⅠⅠⅠ間で1％以下の危険率で平均値の有意差をみた（図3）．同一年齢において，四肢筋力からみた重1症度と，eXpanSionの程度とは明らかな関連があると結論した．

ⅢⅢ・

pく0，02‡

pく0．05

GradeI 低下の認められないもの
GradeII 学業成績は劣るが日常生活に支障のないもの
GradeIIl 幼少時i：り強い知能低下あり就学困雉であったもの
図4

知的機能とexpansion

次に知的機能とexpansionとの関係をみた．
GradeIは4名，GradeIIは18名，GradeIIIは5名で，各グループでのexpansionの平均値はそれ
ぞれ，0．98±0．79，2．83±1．32，4．50±1．17kbpであった（図4）．同様にt検定を行い各平均値の差をみると，GradeI，II問では2％，GradeII，
ⅠⅠⅠ問では5％の危険率で有為な差をみた．
さらに我々の症例ではanticipationは全親子間で認められた．発症年齢は母から子へ平均25．8Ⅱ●

pく0．001；

pく0．OI

Ⅲ

StageI 筋症状の認められないもの
StageII 筋症状はあるが独歩可能なもの
StagellI 独歩不能なもの

歳，父から子へ■は28．7歳早くなっており，それに伴って，全親子間でexpansionの増大もみられ，
この平均値は1．28±0．40，2．26±1．11であった（図5）．同一家系内においては発症年齢，重症度において，repeat数の増大と明らかな相関が認められ
た．
考

図3

察

本疾患は，臨床症状が多彩であり，経過も進行

40−45歳でのADLとExpansion−90−

repeatの増大皮と関わっていることが明らかになり，今後このCTGrepeatの増加がmyotoninprotein kinaseのmRNAの翻訳や安定性あるいはmyotoninproteinkinaseの活性などにどの様な影響を与えるかについて検討していく必要があると考えられた．
文

献1）Osame T and Furusho T：Genetic
epidemi010gy of myotonic dystrophyin
Kagoshima andOkinawa districtsinJapan・
ClinNeuro123：1067−71，1983．
2）J David Brook，Mila E McCurrach，etal：
Molecular basis of myotonic dystrophy；
maternal paternal

Expansionofatrinucleotid（CTG）repeatat

図5 parental expansion

the3

end

ofa

transcriptencodingaprotein

kinase family member．Cel168：799−808，性であるため，統計的処理を行なう際には慎重を要する．我々は，発症年齢を筋症状の出現時期として定め，また重症度に関しては同一年齢時の日
常生活動作で比較し，さらに知的能力に関して，
遺伝子不安定領域の増大との比較を行った．この

1992．

3）YH Fu，A Pizzuti and RG Fenwick：An
unstable triplet repeatin a gene related to
myotonicmusculardystrophy．Science255：1256−1258，1992．

結果，日常生活動作に関してはStageI，II間で4）GJunsen，etal：Characterizationofmyotonic

0．1％，II，III問で1％の危険率でrepeat数の増大の平均値に有意の差をみた．また，知的機能に関

dystrophy reglOn perdicts multiple protein

してもGradeI，II間，ⅠⅠ，ⅠII間で各々2％，5％の危険率で有意差をみた．また，anticipationは

l：261−267，1992．

isoform−enCOding mRNAs．Nature Genetics

5）JessicaBuxton，etal：Detectionofanstable

全ての家系で認められ，eXpanSionの増大も次世
代では全例に認められた．今回我々の検索から，四肢筋，中枢神経系においてその重症度はCTG−91−

fragmentofDNAspecifictoindivisualswith
myotonic dystrophy．Nature355：547−548，
1992．

15）筋細胞死と自食作用および再生
木 南 英 妃＊
研究協力者

上 野

隆＊

武 野 大 策＊ 内 山 安 男＊＊

は じめに
本研究姓で筋細胞の変成・壊死に伴う細胞内の自食作用の誘起とリソゾーム内タンパク分解の機構を解析してきた．平成2年にVacuolarmyopa−
thies（rimmedvacuoleを伴うdistalmyopathy，
DMRVと封入体筋炎）においてvacuoleに一致してエビキチンータンパク質複合体がカテプシン
群，リソゾームの股マーカー，LGP−120と共に局
在することを報告した1）．エビキチンは種々の神経変性疾患，たとえばアルツハイマー病の神経原線経や老人斑の構成要素となっている．ユビキチ
ンは筋，神経いずれもリソゾーム起源あるいはリソゾームに関連した部位に局在している．蓄積の場がリソゾームであることを考えると，タンパク分解がうまく進まない理由は，ユビキチン依存性

対象・方法
実験的急性壊死筋作成
8週齢のウイスター系ラットを用いた．ネンブ
タール麻酔下に右後脚を切開し，ヒラメ筋を露出し直視下に0．5％塩酸ブビバカイン200〟1を注入し，皮膚を縫合した．2，5，8日目に屠殺しヒラメ筋を採取した．
組織染色
凍結切片に対しHE染色および免疫染色をおこなった．免疫染色は凍結切片を蛍光抗体法で染色した．一次抗体は77イニティー精製したanti−ratCathepsinB，anti−ratCI−M6PRを5JLg／mlの濃度で，二次抗体はFITCanti−rabbitIgG（カッベル社）をPBSで2000倍希釈したものを用いた．

のタンパク分解系よりもリソゾームの分解系に問題があるように思われる．今回，ブビバカインによる急性筋壊死実験モデルでユビキチン化タンパ
ク質が分解の基質になっているかどうかを調べた．
筋の再生，つまり衛星細胞（筋芽細胞）の増殖には稜々の増殖因子とそのレセプターを介するシ
グナル伝達機構が働いていると考えられる．そこウエスタンプロテイング
10％ゲル（エビキチン）および7％ゲル（CI−M6PR）でSDS−PAGEをおこなった後，ニトロセル
ロース膜に転写し，特異抗体を反応させ，ベルオ
キシターゼ標識二次抗体を用いておこなった．

で，同じくブビバカインによる実験的壊死筋を作成し，筋再生の過程におけるIGF−ⅠⅠのレセプタ

1）カテプシンBの動態
ブビカイン注入2日後には広範に壊死線経が存在し，壊死巣では多数のマクロファージを中心とする貪食細胞が浸潤し，壊死線経を埋めつくしていた．リソゾームのプロテアーゼの一つカテプシーであるCI−M6PR（カナオン依存性マンノース
6リン酸レセプター）の動態を調べた．

＊順天堂大学医学部第一生化学＊＊岩手医科大学第二解剖学

結果

ンBは以前の報告のように，会食細胞の核周囲がつよく点状に染色された（図1B）．注入後8日日
ではかなりの部分はHE染色に好塩基性の胞体をもつ再生細胞に置き変わっていた．ほとんどの−92−

図1実験的壊死筋におけるカテプシンBの免疫蛍光染色（×200）
A：ブビバカイン注入前 B：注入後2日目 C：注入後8日目

筋線経は正常筋と染色性に差がないけれども，一部の筋線維内に，とくに小型の再生細胞と思われる細胞の胞体が点状に染色された（図1C）．
2）ユビキチン化タンパク質の変動
ラットヒラメ筋をポリトロンホモゲナイザーを用いて5倍客のPBSの中でホモゲナイズし，400×gの遠心上清を得た．これを100，000×gで遠心し，その上活を可溶性分画，沈殿を沈殿分画と表示している．タンパク量を合わせ電気泳動にかけた．正常筋の上清分画では50〜30kDa付近に，沈殿分画では80〜40kDaあたりにエビキチン化されたタンパク質をバンドが認められた（図2）．
ブビバカイン注入2日目ではエビキチン化タンパ
ク質は上活，沈殿とも著しく減少し，注入5日になると回復がみられ，8日目にはほとんど正常筋と同じ分布パターンを示した．
3）Cl−M6PRの変動
ブピカイン注入後，CI−M6PR（IGF一ⅠⅠレセプター）の変動をウェスターンプロテイングと免疫組織染色で検討した．図3に示すように注入後2日目に300kDaのCトM6PRのバンドがみられるが，注入前，5および8日目ではこの方法では検出されなかった．免疫組織額的にみると，正常筋では
−93−

図2

実験的壊死筋におけるユビキチンータン
パク質複合体の変動
ブ七ンヾカイン注入後2，5，8日目のヒラメ筋における変化．10％SDS−PAGEによる解析．

CI−M6PRはendomysiumに限局して均一に染色された．ブビバカイン注入後2日目の免疫染色ではendomysiumのみならず，組織間に浸潤した
会食細胞が強く染色された．さらに5日目になると筋線推全体の染色性は低下するが，再生細胞の胞体内の染色性が増加していた（図4）．

考察

今回の結果は急性な筋崩壊では，エビキチン化
タンパク質は他の筋構造タンパク質と同様おそら
く浸潤マクロファージのプロテアーゼによって分解されることを示唆する．すなわち，分解のための基質タンパク質の一つと思われる．我々は平成2年度にDMRV2例と封入体筋炎2例について
RV，日食胞に一致してエビキチンが存在することを示した．Askanasら2）3）は最近封入体筋炎10
例中10例，眼咽頭ミオバナー2例中2例に，VaCu−
01eをもつ筋線経は抗エビキチン抗体で強く染色される封入体をもつことを証明した．彼らはさらに電顕的にも検索を加えており，免疫沈殿物はcytoplasmictublofilaments（CTFs）にのみ局在することを強調している．CTFsのない多発性筋炎，周期性四肢麻痺，脱神経後の筋萎縮などを含む他の疾患18例では抗エビキチン抗体に反応する
封入体，染色像は得られなかったという．CTFs
はエビキチン依存性タンパク分解経路の異常によ

図3

実験的壊死筋におけるCトM6PRの変動
ブビバカイン注入後2，5，8日目のヒラメ筋における変化．7％SDS−PAGEによる解析．

って生じた産物とも考えられるが，ljソゾーム起源であるRV，日食細胞内にユビキチンが検出されることを考えると，リソゾーム機能が不調のため，リソゾーム内にユビキチン化されたタンパク

図4：実験的壊死筋におけるCトM6PRの免疫蛍光染色（×200）
A：ブビバカイン注入前 B：注入後2日目−94−

が蓄積することが考えられる．実際我々4）はラッ
ト肝で，Mayerら5）は線維芽細胞で，E−64処理によってリソゾーム内タンパク分解を抑制すると，多数の日食胞の出現とその中にエビキチン化タン
パクが著しく増えることを証明している．両グループの結果の相違はユビキチン化されたタンパクのリソゾームへの取込が選択的か，非選択的かという点であり，今後の研究の進展が待たれる．い文献1）木南英紀，上野 隆，武野大策ほか：筋細胞死とリソゾームプロテーゼ群． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関．＿
連疾患の成員と治療法開発に関する研究 （荒木姓）平成2年度研究報告書，1991，pp211−
214．

2）AskanasV，SerdarogluP，EngelWK，etal：

ずれにしても，VaCuOlatedmyopathyで日食胞内でのタンパク分解が速やかでないならば，日食胞の退露は遅延し，エビキチン化タンパクが日食胞内に蓄積することになる．勿論，エビキチン依存性のタンパク分解系の異常による場合も否定はでImmunolocalization of ubiquitinin muscle

きず，今後の検証に委ねられる．
筋の崩壊後，mdxマウスでは活性な再生がみられ，そのため致死的な脱力を呈きない．筋再生の過程にタンパク分解や増殖因子がどのように関与しているかを明らかにすることは重要である．再生の盛んなプビバカイン注入後5日日，さらに8日目でもカテプシンBが再生細胞と思われる細胞にみられたことは今後その役割を検証するのに十3）Askanas V，Serdaroglu P and Engel WE：

分値すると思われる．CI−M6PRはリソゾーム酵
素の細胞内輸送に働くばかりでなく，IGF−ⅠⅠのレセプターでもある．肝細胞の再生ではCトM6PRとTGF−βが門脈側から中心静脈側へ平行して増加していき，CI−M6PRはTGF−βの細胞内取込，活性化にも働くことが示唆されている6）．最近

withcysteineproteaseinhibitors．BiochemJ

我々はプロカテプシンLに増殖促進活性があることを兄いだしており，このレセプターとして働く
可能性もある．プビバカイン注入後2日目CI−M6
PRの発現は最大となり，主としてマクロファー
ジに由来することが確認された．再生途上の線経にも染色性がみられ，今後増殖因子IGF一ⅠⅠ，プロカテプシンの動態と同時に調べる必要がある．

−95−

biopsies of patients withinclusion body
myositis and occulopharyngeal muscular

dystrophy．Neuroscience Lett130：73−76，
1991．

Immunohistochemicallocalization of ubi−
quitinininclusion body myositis allowsits
light

microscopic distinction from poly−

miositis．Neurology42：460−461，1992．
4）DohertyFJ，Osborn NV，WassellJA，etal：
Ubiquitin−prOtein conjugates accumulatein
thelysosomalsystem of fibroblasts treated263：47−55，1989．

5）Ueno T and KominamiE：Mechanism andregulation oflysosomal sequestration andproteolysis．BiomedBiochimActa50：3657
371，1991．

6）JirtleRL，BICarrandCDScott：Modulation
ofIGF−II／mannose−6−phosphate receptors
andTGF−β1duringliverregeneration．JBioIChem266：22444−24450，1991．

16）筋再生と塩基性線維芽細胞成長因子一第3報−
後 藤 幾 生＊研究協力者

笹ケ迫 直 一＊ 神 武 直 子＊
山

猛＊

田

は じめに

小

林

卓

郎＊

法にて増幅し定量をおこなった．プライマーはエ

塩基性線維芽細胞成長因子（basicFGF）と筋壊
死・再生の関係について，昨年度は免疫染色を用いた方法で検討・報告したl）．すなわち，正常筋においてはendomysiumに限局して染色されるbasic
FGFか，bupivacaineHClによる実験的壊死・再生筋においては，変性筋の胞体，細胞浸潤の強い壊死巣，初期の再生筋の胞体に染色され，再生がキソン2，3にそれぞれ設計した．プライマーの塩基配列は，SenSe，5−TACCTTGCTATGA AG−GAAGA−3，（塩基番号241−260），antisense，
5，−GTTCGTTTCAGTGCCACATAC−3（塩基番号365−385）である．逆転写はRAV−2 reverse
transcriptaseを用い，RNAに10pmoleのanti−senseプライマーを加え42℃，60分で行った．逆転

進んだ段階では，再びendomysiumに限局して染色されるという経過をたどった．そこで今年度は，実験的壊死・再生筋におけるbasicFGFの遺伝子発現の検討を行ったので報告する．

写後10pmoleのSenSeプライマー，32Pで5，末端対象・方法のCをGに置換させたDNAをKunkel法にて実験的壊死筋作成
8週齢のC57BLマウスを用いた．昨年と同様合成したものを用いた．このCOmpetitive temp−
late2）は同じプライマーで増幅されるが，そのネンブタール麻酔下に右後脚を切開，ヒラメ筋を露出，直視下に0．5％bupivacaineHC1100FElを注入した．6，12，24時間後，および3，5，10日
後にヒラメ筋を採取し直ちに，液体窒素にて凍結・保有した．
RNA抽出
GTC−CsCl法を用いてヒラメ筋よりRNAを抽出した．RNAはアガロース・ゲルにてチェック
し，吸光度計にて濃度を測定した．
定量的PCR

PCR産物は塩基置換のためmRNA由来のもの

basic FGFのmRNAは，得られるRNA量が少ないため，mRNAよりcDNAを作成後，PCR

図2に，正常のヒラメ筋肉由来の0．5JJgのをラベルした0．1pmoleのantisenseプライマーを加え94℃30秒，57℃2分，72℃1分を1サイクルとしてPCRを行った．PCRにおける内部標準として図1のように，basic FGFの塩基番号278＊九州大学医学部脳研神経内科と違いDdeIで消化されない．よって，PCR産物
を酵素処理後，10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い，107bpのmRNA由来のバンドおよび145bpのtemplate由来のバンドそれぞれのradioactivityをイメージアナライザー（フジフイルム）で計測し，mRNA量をtemplateに対する比であらわした．
結果RNA，10amoleのCOmpetitive templateを用いて16から26サイクルまで2サイクル毎にPCR産物を取り出し，mRNAおよびtemplate由来のバ−96−

wt＿CDNA ←聖．TCrTAAGJ旦空叫十Ddel︵○扇J︶ゝlち膏空膏爪丘

箭離Veト−TGTAAG−1
145bp
図1内部標準として用いたcompetitivetem−
plate

Basic FGFの塩基番号278のCをGに置換させたcompetitive templateを示す．このtemplateのPCR産物はDde
Iで消化されないが，mRNA由来の
PCR産物（W卜CDNA）は消化され，
antトsenseプライマーを32Pで標識しておくと．それぞれ107，145bpのバンドとして検出される．

4．0
〃gRNA

図3

RNA量とPCR後のW卜CDNA／tem−
plateのradioactivity ratio
同一の正常筋由来のRNA量をかえ逆転
写後，内部標準として10amoleのcom−
petitive templateを混入した後PCRを行った．0．125−4．OJJgのRNA量の範囲でリニアな関係が得られた．

ンドのそれぞれのradioactivityを計測し各サイ
クルごとにプロットしたものを示す．22サイクル
までは両者ともexponentialに増幅されtem−

plateに対するmRNAのradioactivityの比は一定であった．24サイクル以後では増幅効率は低下
し，radioactivityの比は一定した値が得られなかった．よって22サイクルまではtemplate，mRNA
ともに同じ効率で増幅されると判断された．そこで，以後の実験で余裕をもたせ，18サイクルでPCRを終了し定量実験を行った．
図3に同一のRNAを用い，逆転写時の量を変
18

20

22

24

26

CyCle

図2

mRNAおよびcompetitivetemplate由来のPCR産物の増幅曲線
22サイクルまでは両者ともexponentialに増幅され その曲線は平行関係を保っている．この結果より同じ増幅効率であると判断される．

えてPCRを行った結果を示す．横軸にRNA量，
縦軸にtemplateに対するmRNAのradioactiv−
ityratioをプロットした．リニアな関係が得られ，定量性があると判断された．
図4に，実際に0．5％bupivacationHClを注入して作成実験的壊死筋でのbasic FGFのmRNA
量の測定結果を示す．bupivacaine注入後6，12時間でbasic FGFのmRNA量は約3倍に増加した．以後減少し，24時間後では約1．5倍，3，5，
10日後では正常とほぼ同じレベルとなった．

−97−

0

図4

1

3

Bupivacaineを注入したマウスヒラメ筋のbasic FGF mRNA量の経時的変化

考

文

察

今回のbupivacaineによる実験的壊死筋では，
basic FGF mRNAは変性・壊死の早い時期（注入後6，12時間）に増加している事が示され，この時期に活性化された細胞が産生していることが考えられた．
BasicFGFは筋芽細胞，血管内皮細胞，線維芽細胞，マクロファージなどさまざまな細胞において産生されることが知られている3）．一方，組織学

献1）後藤幾生，笹ケ迫直一，神武直子ほか：筋再生と塩基性線維芽細胞成長因子，り厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィーおよび関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木址）平成3年度研究報告書，1992，
pp151−154．

2）Gilliland G，Perrin S，Blanchard K，et al：
Analysis of cytokine mRNA and DNA：

的にはbupivacaine注入6，12時間後の段階では筋線経が変性・壊死に陥っているが，壊死巣には少数の好中球，単核球が見られるのみで，細胞浸Detection and quantitation by competitive

潤はまだピークではない．また，壊死巣は迅速に
再生筋線経に置換され，結合組織の増生や血管新生は認められない4）．これらのことから考えると，

3）GospodarowiczD：IsolationandCharacteri・

basic FGFはbupivacaine注入直後に活性化された細胞，おそらくは筋衛星細胞において発現が増加している可能性が推測された．

polymerase chain reaction．Proc NatlAcad
Sci USA87：2725−2729，1990．
zationofAcidicandBasicFibroblastGrowth
Factor．MethodsinEnzymo1147：106−119，
1987．

4）Benoit PWand BeltWD：Destructionand
regeneration of skeletalmuscle after treat・ment with alocal anesthtic，bupivacaine（MarcaineR）．J AnatlO7：5477556，1970．

−98−17）筋細胞の分化・成長に対するEGF並びにCGRPの促進作用
川 井 尚 臣＊研究協力者

有 井 敬 治＊ 岡 崎 誠 司＊ 土
西 田 菩 彦＊ 斎 藤 史 郎＊

橋

孝

之＊

は じめに

培養期間中は2日ごとに培養液を交換し10日日

我々は筋ジストロフィーをはじめとする難治性の筋萎縮症の治療法を開発する目的で，筋細胞の分化・成長や再生の促進因子について研究しており，すでに神経因子の一つであるカルシトニン遺伝子関連ペプチド（calcitonin gene−related pe−まで培養を継続した．対照群，各種添加群とも培
養3日目，6日目，8日目，10日目に細胞を採取し，そのDNA量，Mb量およびCK活性値を測定した．
DNA量の測定はErwinら1）の方法に準じて行った．Mbの測定はradioimmunoassay（RIA）2）

ptide：CGRP）が筋細胞の分化・成長促進作用を有することを報告した．本研究では上皮細胞の増殖促進因子である上皮増殖因子（epidermal
growth factor；EGF）の筋細胞に対する分化・成長作用について調べ，併せてCGRPのこの作用に対する影響についても検討した．

で行い，CK活性倍の測定はCPKキット（和光）
を用いて行った．培養細胞当たりのMb量とCK
活性値は，それぞれMb／DNA（ng／FLg），CK／
DNA（mIU／JLg）で表現した．
細胞内Ca2＋濃度の測定は，培養3日臥

6日

対象と方法

日，10日目に培養液をHEPES bufferに置換し，これにFura−2ANを添加し，培養細胞の蛍光強度

本研究にはラット筋芽細胞（L6）を用いた．この細胞を培養皿1個当たり10万個の割合で播種し10日間培養した．培養液には2％馬血清とインスを顕微蛍光分光測光装置を用いて340nmと380nmの波長で測定し，両者の比を求め，その値と校正曲線より細胞内Ca2＋濃度を算出した3）．成績のリン（3JLg／ml）を加えたDMEM液を用い，本培
養液のみで培養したものを対照群とし，培養液にCGRP（10nM）あるいはEGF（1nM）を添加し培養したものを，それぞれCGRP添加群，EGF添加
群とし，またCGRPとEGFの両者を添加したものを両者添加群とした．CGRP及びEGFの添加

統計処理はt検定及びMann−Whitney検定を用いた．

量は，それぞれを培養系に各種の濃度で添加して10日間培養し，培養細胞のDNA当たりのMb量結果1．培養筋芽細胞の形態変化
各培養群とも筋芽細胞（L6）は播種後3日日頃より急速に増加し始め，6日日より融合し筋管細胞に変化し始めた．その後，融合細胞は急速に増を算出し，その値が最も大きくなった培養系の添加量を至通添加量として以後の実験に用いた．

加し，培養8日目には殆どが筋管細胞に分化し（図1），10日日まで培養継続が可能であった．培
養8日日には細胞の短軸長は対照群の10．91±●徳島大学医学部第一内科

0．98JLm（mean±SE）にたいして，CGRP添加群−99−図1 培養筋芽細胞（培養8日目）（a）対照群の筋管細胞（b）CGRP添加群の筋管細胞（C）EGF添加群の筋管細胞（d）両者（CGRP＋EGF）添加群の筋管細胞．
位相差顕微鏡 ×150

群は23．49±1．26×10▲2ng／〟gと3倍に達し，各添加群とも対照群に比べ高い値を示した（p＜0．m）
（図3）．
−100−

T●﹂

添加群が11．81±0．66×10▲2（mean±SE）ng／〟gと対照群の8．11±0．63×10▼2ng／〟gの1．5倍，
CGRP添加群は15．77±1．22×10▼2ng／JLgと対照群の2倍に増加，CGRPおよびEGFの両者添加3−0﹂だgq石の一Xの︸LOエS

8日目にはCGRP添加群と両者添加群は対照群に比べ高い値を示した（p＜0．01）．EGF添加群は対照群と差を認めなかった．培養10日目にはEGF︵∈ユ︶では14．84±1．30JLm，EGF添加群では17．04±
1．51JJm，両者添加群では16．75±1．40JJm，と各添加群とも対照群に比べ大きかった（p＜0．02）（図2）．各添加群間の短軸長には有意差はなかっ
た．
2．培養細胞のMb量の変化
培養細胞の細胞当たりのMb量（Mb／DNA）は
培養6日目には各群の間に有意差はなかったが．

COntrOI CGRP EGF CGRP†EGF

巨三三」
図2 各群の培養8日目における細胞単軸長の比較．各添加群とも対照群より有意に太い．＊：p＜0．01，＊＊：p＜0．02（n＝50）

0
事

l

■

0
0

一1■■■弓一

0

0

5

0
0

日

0

−

5

養

0

1

0

︵mユ＼PN．≡×︶V喜＼q≡︵≡u︶uOこ巴lugu8
十NqU L空コ 00巴∈一

5

8日
培

事
I
■

商
3日

数

培

図3 培養筋細胞内Mb量の経時的変化．
〇一〇 対照群，●−● CGRP（10nM）
添加群，ローロ EGF（1nM）添加群，q−T 両者（CGRP＋EGF）添加群．
Mb／DNAは各群とも経時的に増加し，培養10日日では両者添加群が最大である．

6日
養

日

10日
数

⊂】conTrOl・∈∃CGRP（10nH）．固貯（1n軋■■C肝十EGF
図5：細胞内Caイオン濃度の経時的変化．
各群とも経時的に増加しているが，培養
3日目，10日目で，各添加群とも対照群
より有意に高い値を示した．＊：p＜＊：p＜0．01（n二12）0．01，＊＊：p＜0．05（n＝50）0050︵g＼≡︶≦邑＼岩526．87±1．67IUルgと，やはり高い値を示した（p＜0．01）（図4）．
4．培養細胞内のCa2＋濃度の変化
細胞内Ca2＋濃度は対照群，各添加群共に培養日数とともに増加した．培養3日目には各添加群

5とも対照群に比べ高く（p＜0．01），6日目にはEGF添加群のみ有意に高い値を示した（p＜0．01）．培養10日目には添加群はすべて対照群より高値であった（p＜0．01，p＜0．05）（図5）．

0

6日

8日
培

養

日

数

図4 培養筋芽細胞内CK活性値の経時的変化．
0rO 対照群，●−● CGRP（10nM）
添加群，□L□ EGF（1nM）添加群，
L−4 両者（CGRP＋EG）添加群．CK／
DNAは各群とも経略的に増加を示す．
培養10日目において各添加群が対照群より高い値を示した．＊：p＜0．01，＊＊：

考察筋ジストロフィーをはじめとする筋萎縮症には難治性のものが多く，その治療法は現時点で確立されたものはない．とくに筋ジストロフィーのDuchenne（DMD）型については，近年その原因遺伝子は突きとめられたが，依然として有効な治療

p＜0．05（n＝12）

法がないのが現状である．最近，筋芽細胞の移植，3．培養細胞のCK活性値の変化
培養細胞の細胞当たりのCK活性値（CK／DNA）は各群とも経時的に増加したが，8日目ま
では各群の間に有意差はなかった．しかし，培養
10日目には対照群で18．75±0．80（mean±SE）
IU／pg，CGRP添加培養群で22．95±1．37IU／FLgと対照群に比べ値を示した（p＜0．05）．また，EGF
添加群は26．61±1．58IU／〟g，両者添加群はステロイドホルモン療法，ダントリウムの投与などが試用され，一部治療効果のあるものも報告されているが，まだ実用化されていない．
我々はこれらの方法とは異なり，筋細胞の再生や増殖・成長を促進させ，これを筋萎縮の治療法として確立したいと考えている．具体的には先に述べたごとく筋細胞の形態的変化，筋固有蛋白の増加4），および細胞内Ca2十濃度の変化を指標とし−101−

て筋細胞の分化・成長促進因子の研究を行っている．そして，すでに培養筋芽細胞に対するサイト
カラシンBとカルシウムイオノフォアの分化促進作用の違いを兄いだし，筋細胞あ分化・成長には細胞膜が大きな役割を果たしていることを報告した5）．また，CGRPの筋細胞の分化・成長促進作用を明らかにした．
本研究では，同じく筋芽細胞（L6）の培養系に細胞増殖因子のEGF，神経ペプチドのCGRP，あるいは両者を添加培養し，筋芽細胞の形態的分化・成長に伴う培養細胞中のMb量，CK活性値およびCa2＋濃度を調べ，EGFの筋細胞分化促進作用とCGRPとの相互作用について検討した．
培養細胞の形態的変化については，筋芽細胞の融合時期は各群にて差はなかったが，培養8日目には各跨加群とも筋管細胞の短軸長が対照群に比べ太く，EGFとCGRPは共に筋管細胞の成長に対し促進的に作用していることが示唆された．
培養細胞中のMb量はCGRP添加群と両者添加群では，培養8日目すでに対照群に比べ有意に高いが，EGF添加群では培養10日目に増加した．
また，EGFとCGRPの両者添加群では単独添加群に比べ高値を示した．EGFとCGRPで培養細
胞内Mb量の増加時期を比較すると，後者が早い時期に増加を示した．その増加量は両者の添加群
で各単独添加群の和より大であり，EGFとCGRPのMb増加機序は互いに異なっていることが示唆された．
以上の培養筋細胞中のMb量およびCK活性値増加の成績は，EGFとCGRPが筋細胞のこれ
らの蛋白質の生合成を促進することを示すものであり，言い換えればEGFおよびCGRPは筋細胞の生化学的分化の促進作用を有すると言える．
細胞内Ca2＋迫皮は細胞分化に関係のあることが知られている5）6）．本研究では，Ca2＋濃度は培養初期より全ての添加群で対照群より高い値を示し，その上昇が筋芽細胞の筋管細胞への分化，ならびに生化学的分化の誘導に関与している可能性が考えられる．一万，本研究に用いたEGFやCGRP
は共に細胞内Ca2十を増加させる作用があり，培養筋細胞でもこれらがCa2＋浪度の上昇に作用していることが考えられる．
EGFは腺細胞で産生され，そのレセプターは皮膚，消化器粘膜を中心として全身に認められる7）．
粘膜細胞に対する研究は多い7）が，筋細胞分化や成長に関するものは少ない．
一方，CGRPは運動系および感覚系に広く分布している8）ほか，神経・筋接合部にも存在しており9），筋に作用する神経因子として何らかの重要な役割を果たしていると考えられている．本研究の成績は一般の細胞分裂促進因子のEGFが筋細胞の分化・成長にも促進的に働いていることを示したものである．また，BGFが神経ペプチドであるCGRPの存在下でより強い筋細胞分化・成長促
進作用を示したことは神経系と細胞増殖因子の相互関係を示すもので興味深い．
これらの成績は直ちに筋萎縮の治療に用いることはできないが，人の筋萎縮の病態解明，ならびにその新しい治療法の開発の糸白になることを期待している．
まとめ

筋芽細胞の培養系を用い，BGFとCGRPの筋細胞の分化・成長に対する影響を検討した．その結果，両者ともに筋細胞の分化・成長作用が認められた．またBGFはCGRPの存在下で両者の単独作用の和以上の促進作用を示し，EGFとCGRPの作用機序は互いに異なることが示唆された．
文
献1）Erwin BG，Stoscheck CM，et al：A rapid
fluorometric method for the estimation of

DNAin cultured cells．Anal BiochemllO：
291，1981．

2）MiyoshiK，SaitoS，etal：Radioimmunoassay
for human myoglobin；methods and resultsin patientswith skeletalmuscle ormyocar−
dialdisorders．JLabClinMed92：341，1978．
3）GrynkiewiczG，PoenieM，etal：Anewgener・

−102−

ation

of

Ca2＋indicatorswith

greatlyim・

provedfluorescenceproperties．J BioIChem260：3440，1985．

4）Shainberg A，Yagi1G，et al：Alteration of7）福山隆一，清水信義：増殖因子受容体の組織分
布．蛋白質・核酸・酵素（増刊号）36：994，

enzymaticactivitiesduringmuscledifferenti・
ationin vitro．Dev Bio125：1，1971．

8）RosenfeldMG，MermodJJ，etal：Production5）佐藤幸一，川井尚臣ほか：培養筋細胞の増殖・

of a novel neuropeptide encoded by the

1991．

calcitonin gene

分化に対するCaイオノフォアならびにサイト
カラシンBの影響．臨床神経 31：809，1991．

via tissuespecific RNA

processlng．Nature304：129，1983．

6）Shainberg A，Yagi1G，et al：Control of9）Mora M，Marchi M，et al：Calcitonin

myogenesisinvitrobyCa2＋concentrationin

generelatedpeptideimmunoreactivityatthe

nutritionalmedium．Exp CellRes58：163，

human neuromuscularJunCtion・Brain Res

1969．

492：404，1989．

−103−

ⅠⅠⅠ．ジストロフィン・遺伝子18）ジストロフィン問連蛋白の免疫組織化学とacetylcholinesterase活性像による筋組織の検討
田

研究協力者

宮

本

和

退

人＝

等＊

林

理

磯 崎 英 治＊＊ 堀

は じめ に昨年度の当班会議で，筋組織でacetylcholines−
terase（以下AChE）活性をTago法1）により組織化学的に証明したことを報告し，神経筋接合部（以下NMJ）以外に，筋ジストロフィー症をはじめ壊死再生現象を伴う疾患において再生筋線経に
AChE活性が発現することを報告した2）．また，α−bungarotoxin（以下α一BT）結合試験にてacetylcholine receptor（以下AChR）を組織学的に観察し，再生筋においてもAChRは神経筋接合部に限局していることを報告した．
一方，dystrophin関連蛋白（以下DRP）は，ア
ミノ酸配列がdystrophinのC末端と高い相同性を示す常染色体（6番）でcodeされる筋構成蛋白
でSpeCtrin，α−aCtinin，さらにX染色体でCOdeされるdystrophinとともにspectrin superfami1yに属している．DRPは，通常NMJに存在し，Duchenne型筋ジストロフィー症（以下DMD）な
どで筋細胞膜に活性が現れることが報告された3）4）．

本研究は，筋組織におけるAChE活性およびDRP免疫活性の対比を目的とした．
対象
当院でこの5年以内に経験したDMD5例，
Becker型筋ジストロフィー症（以下BMD）5＊東京都立神経病院＊＊東京都立神経病院神経内科＊＊■（財）東京都神経科学総合研究所神経生化学部門

之＊＊

村

橋

真＊＊

慎一郎＊＝

例，肢帯型筋ジストロフィー症（以下LG）3例，
myotonicdystrophy3イ札顔面肩甲上腕型筋ジス
トロフィー症（以下FSH）2例，など合計40症例の生検骨格筋である．また，正常ラット，MDX
mouse，BlO mouseの筋も一部使用した．
方法
AChE活性は，昨年の報告と同様にKarnovsky−Roots液を100倍に希釈したTago法にて組織化学的に行った．DRPに対する抗体は石浦らにより供与されたpolyclonal抗体を用い，ABC法にて行い，最終的な発色は，両者ともDABニッケル法にて行った．DystrophinはNOVO Castra社のdysl，2，3抗体を用い，SpeCtrinも同社の抗体を用いた．これらの反応はすべて，10ミクロンの
新鮮凍結切片を用いて行った．
結果

まず，正常ラット，MDXmouse，BlOmouse
では，上記の方法にては，骨格筋組織内にDRPの免疫活性を証明することはできなかった．正常ラットでは，SpeCtrinとdys3が陽性に染まった．
Tago法によるAChE活性像は，いずれの実験動物においてもNMJに強く認められたが，ヒトとは異なり正常筋では，NMJ以外には全く活性を認めなかった．MDXmouseでは，筋線維表面に多少活性を認めたが，ヒトDMDと比較すると頻度はかなり少なかった．
神経筋疾患を有きない例では，DRPの免疫活性−107−

の差はあるが，ほとんどの筋線経の表面が陽性に染まった．DMDにおいては，どの症例においても，DRP陽性線経が高頻度に認められ，症例間のばらつきは少なかった．また，DMDで壊死再生現象が著明な部位でも，DRP染色によるNMJの活性はよく保たれていた．TagoによるAChE活性
像では，再生線経の筋細胞膜及び一部の線経では，細胞質に活性が認められた．また，一部の線経には，AChE活性を全く認めないものもあった．やはり，AChE活性像で見たNMJの形態は，よく保たれていた．また，SpeCtrinは，いずれの線経でも陽性であり，欠損を認めなかった．図2で示されるごとく，DMDにおいて，DRP染色とTago法の陽性線経は必ずしも一致しない．Tago法よりDRP陽性の線経の頻度が多少多い．

図1Contro16y（F）

BMD例において，dystrophin活性が弱い線経にDRPが陽性になり，Tago法も陽性で，DRP染
色とTago法の陽性線経が一致した（図3）．BMD
において抗dystrophin抗体dysl dys2dys3間で染色性の差異が認められる例があったが，今回の報告では詳細は割愛した．DRP陽性線椎の出現率は，一般に，DMDより低率であったが，症例間のばらつきが多く，dystrophin陰性線経が太い例
でDRP陽性線経が多い傾向がみられた．
LGやFSHさらにmyotonic dystrophyにおける再生筋線経では，Tago法によるAChE活性像は，DMDやBMDと同様に陽性であった．しかし，DRPは，対象群と同じくNMJのみに陽性で壊死線経や再生線経で活性を認めなかった．

図2

考察及びまとめ
石浦らの抗DRP polyclonal抗体を用いた系では，正常ラット，MDXmouse，BlOmouseの骨DMDは，NMJのみに強く認めたが，問質組織や神経線
維さらに筋細胞隈には認めなかった（図1）DMD症例では，HE染色で，壊死再生現象が著明で大小不同と問質の線維化などDMDの特徴がよく認められた部位で，DRP染色とTago法による−AChE活性像を対比した．DRP染色では，程度

格筋組織でDRPの免疫活性を証明できなかったのは，ヒトとは抗原の特性が違ったためと考えられた．Tago法では，いずれの実験動物のNMJにおいて強いAChE活性を認めたが，NMJ部以外
では，MDXmouseでごく一部の筋線維表面に活性を認めたのみであった．筋組織でのAChE活性の分布は，正常ヒト，または筋ジストロフィー症
ヒト筋と比較してよりNMJに限局する傾向が強

−108−

表 結果

全例のN M J筋 内神経 線維DHDの再 生 線維
D ⅢD の 通 常 線 維
BHDの再 生 線維
BMDの通 常 線維
L．
G ／F SH 再 生 線 維同通 常 線維A C h E

D R P

＋＋
＋
＋＋
＋〜 一

＋＋

＋＋
＋〜 −
十＋

＋〜 −
十〜 二
＋〜 一

＋〜 −

する役目が中心で，dystrophin欠損病態では，細胞膜をも構造的に保護していることが示唆された．
DMDやBMDで壊死再生現象が著明な部位でもNMJがよく保たれており，この部位でDRP活性が高いこととの関連が示唆された．また，NMJが保たれると神経からの有害な刺激ももたらされるが，それを上回る別の有害な因子の存在が示唆され，今後さらに研究が必要であると思われた．
謝辞：抗DRP抗体を供与していただいた東大応
微研 石浦章一博士に深謝いたします．
文献1）Tago H，Kimura H and MaedaT：Detailed
acetylcholinesterasefiberandneuronalstainー
inginratsbrainbyanewandhigh1ysensitive
histochemicalprocedure．J Histochem Cyto・

図3

Chem34：230，1986．

BMD2）田過等，宮本和人ほか：筋疾患の再生筋におけく，細胞膜や細胞質への分布頻度はかなり低く，種による差を示した（表）．
ヒトにおいて再生筋隈表面および細胞質でAChE活性が上昇するのは，神経から放出される

るtrue acetylcholinesterase活性像について−Tago法による検討結果．− 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィーおよび関連疾患の成因とその治療法開発に関する研

acetylcholinの分解を促進して，再生筋を機能的に保護していることが示唆された．MDX mouse究（荒木鑑）平成3年度研究報告象1992，pp39−42．

では，脱神経した筋細胞は，壊死に陥らないとの報告5）があり，神経からの過剰なacetylcholinは，

3）Khurana TS，Watkins SC，et al：Immun0−

幼弱筋にとって有害と考えられた．これはdystro−
phin欠損の有無とは無関係と思われた．
一万，DRPは，神経筋接合部を筋肉側から支持

dystrophinrelatedproteininskeletalmuscle．

−109−

localizationanddevelopmentalexpressionof

Neuromuscular Disordersl：185r194，
1991．

4）TanakaH，ⅠshiguroT，etal：Expressionof5）Karpati，etal：Smallcaliberskeletalmuscle

adystrophin−relatedproteinassociatedwith

fibers do not suffer necrosisin MDX mousethe skeletal muscle cell membrane．Histo・

dystrophy．Muscle＆Nervell：795−803，

Chem96：1−5，1991．

1988．

−110−

19）生検筋におけるジストロフィン関連蛋白の免疫組織化学的検討
佐
研究協力着

衣

斐

橋

達＊

周

荒 畑 喜 一＊＊ 杉

は じめにジストロフィン関連蛋白（DRP）は常染色体6番目に規定されており，ジストロフィン（Dys）とC末端ドメインのアミノ酸配列が約80％の相同性を持つ分子量420万の蛋白である1）．本研究ではDysと相同性のないDRP上のLDPpeptideを抗原としたpolyclonal抗体2）（石浦章一博士より供与）を用い，ジストロフイノバナーを中心とした

功＊
防対象および方法
対象は愛知医科大学第四内科での生検180筋を用いた．ジストロフイノバナーとして，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）4，DMD保因者3，
Becker型筋ジストロフィー（BMD）12，他の疾患筋として多発性筋炎（PM）25，肢帯型進行性筋
ジストロフィー（LG）10，筋緊張性ジストロフィー（MyD）10，進行性外眼筋麻痺4，低K性ミオ
バナー3，筋萎縮性側索硬化症8などである．対照筋としては筋疾患を疑い筋生検を施行し病的病

田

代

伯

為＊

田 秀 夫＊＊のほかに抗β−SpeCtrin（Spec）抗体，抗desmin（Des）抗体，抗vimentin（Vim）抗体（Novocastra社）を用い免疫組織化学染色を行い，一般組織化学
的にはKarnovsky法による Cholinesterase（ChE），nOnSpeCific esterase，NADH−TR，組
織学的にはHE，mOdifiedGomoritrichromeの各染色を行った．
結神経・筋疾患生検筋について免疫組織化学的にDRPの局在を，Dysなどと比較しながら検討し
た．

拡＊

果

1）対照筋
筋細胞膜はDRPの染色性はなかったが，線維により限局的に染色される部位（衛星細胞？）があり、当該部には核が存在した．筋組織内では神経・筋接合部，筋内神経，血管内皮および平滑筋，筋
紡錘の錘内線維および被膜が染色された（図1）．
神経・筋接合部の後シナプス膜はDRP，Dys，
Spec，Desともに濃染した．
一方筋・腱接合部はDys，Specとも終末に浪染したが，DRPではChE活性陽性部に対応し弱く染色されたが非特異染色の可能性も否定できなかった．

理所見を認めなかった生検筋を用いた．
方法は新鮮凍結連続切片にてABC法にて抗DRP抗体，各抗ジストロフィン抗体（Novocastra

2）ジストロフイノバチー
DMDでは，濃淡はあるものの殆どの筋細胞膜
でDRP陽性であった．Dys染色陽性所見を呈す
るいわゆるrevertantsは症例・線維毎にDRP染社Dysl，Dys2，Dys3，富士レビオ社4−4C5），そ

色性は一定しなかった（図2）．

＊愛知医科大学第四内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

DMD保因者ではDys陰性線経はDRP陽性であったが線維により対応しないものもあり，ChE
活性陽性線経とも比較的対応していた．
−111−

、B

章一∧

図1

対照筋でのDRPの局在
DRPは神経・筋接合部（EglA太矢印）筋内神経，（図A二本矢印），筋紡錘睡内線推（図B太矢印）とその後股，血管平滑筋（図B二本矢印），毛細血管内皮細胞（図C細矢印），筋細胞街掴細胞部（図C大矢Err）に局在する．Bars＝50JLm．

B2

三二二
㍉∴

図2

f

習

‥

Dys

▲∴

ジストロフイノバナーでのDRP（1）DMDではDRP陽性線経が多く，Dys陽性線維（黒丸）ではDRPの染色性は一定しなかった（症例Aでは陽性，症例Bでは陰性）．（Al，Bl：DRP染色，A2，B2：Dys2による染色）Bars＝50JLm．

−112−

BMDではDes強陽性，Vim，ChE陽性でDys
染色にて細胞が薄く染色される再生線経にDRPった（図4）．稀ではあるがMyDではringfiber，
LGにて非再生線経に陽性所見を示した症例もあが陽性であり，また一部minor hot spot領域が欠失LDys3抗体の染色性がなかった症例で，再生線維以外の線経でもDRP陽性であった（図3）．
3）他の疾患PM，低K性ミオパテN，LG，MyD，遠位型ミオバナー，球脊髄性筋萎縮症（BSMA）では時にった．筋線経の分化異常とされるmyotubular
myopathyではDRPは陰性であった，
神経原性疾患ではChE活性が陽性の小角化線
経，群集萎縮線経はDRP陰性であった．またtar−

DRP陽性線経が見られ，それらはChE陽性，Dysで弱陽性，Des強陽性，Vim陽性の再生線経であ

図3

get fiberのtarget部はジストロフィンC末端抗体（Dys2，4−4C5）で陽性であったがDRPは陰性であった．

ジストロフイノバナーでのDRP（2）DMD保因者ではDRP陽性線維（Al黒丸）はほとんどがDys陰性線経であったが，必ずしも対応しない線経があった（Al：DRP，A2：Dysl）．
BMDではDRP陽性線維（Bl黒丸）は再生線経でありDys染色では他の線経より薄く染まっていた（Bl：DRP，B2：Dysl）．症例により非再生線経もDRP陽性であった（Cl＝DRP，
C2：Dysl）．Bars＝50FLm．

−113−

図4

その他の疾患でのDRP
DRP陽性線維（矢印）は多発性筋炎（A，PM），低K性ミオバナー（B，Hypo K），肢帯型筋ジストロフィー（C，LG），遠位型ミオバナー（D，DistalM），筋緊張性のジストロフィー（E，MyD），球脊髄性筋萎縮症（F，BSMA）などでおもに再生線に見られた．Bars＝50pm．

考察

DRPは常染色体6q24上にコードされ，Dysと分子量がほぼ同じでありC末端部の80％のアミノ酸配列が相同性を持つ蛋白である1）．既報告では
DRPはマウス胎児，mdxマウス筋細胞膜，DMD
筋細胞膜に局在し，正常筋では神経・筋接合部，
筋内神経・血管に局在が報告されている2桝．
本研究ではほぼ既報告と同様の所見を確認するとともに，筋細胞膜上で一部DRP陽性の部分がみられた．そしてこの部分には核が存在し，後述の再生線維細胞膜にDRPが局在することから衛星細胞の可能性が示唆された．また筋紡錘の錘内

線維細胞膜にも陽性であった．
ジストロ7イノバナーにおいてはDMDで殆どの筋細胞膜にDRPは存在したが，−一部存在する
Dys陽性線推（revertants）ではその染色性は一様ではなかった．またDMD保因者ではDys陰性線
経がDRP陽性の傾向があったが，必ずしも一致
せず切片の連続性に関連した可能性も示唆された．
さてDRPは正常筋では胎生期に陽性であり，筋の分化とともにDRPは陰性化し，Dysが発現してくる．一方DMD筋やDMD保因者のDys陰性筋ではDysが欠如し，またDMDでのrever−tantsおよびBMD筋ではDys蛋白機能が低下し−114−ているためDRPが代償性に筋の発生・分化ある
いは再生過程を終了しても残存している可能性が推察された．
その他の筋疾患ではPM，LG，MyD，低K性ミオバナー，MyD，遠位型ミオバナー，BSMAなどの再生筋線経に陽性であった．再生筋ではVim陽性，Des強陽性になるとされ，連続切片にてDRP
陽性線経とほぼ一致することを確認した．再生筋においてもDRPは筋の発生・分化と同様の態度をとるものと考えた．神経原性疾患では小角化線
経，群集萎縮線経がChE陽性となるがDRPは陰性であり，ヒト成人筋では除神経一神経再支配過

ストロフイノバナーのうちDMDではほとんどの筋細胞膜が濃淡の差はあるが染色性があり，DMD
保因者ではDys陰性線経が陽性，BMDでは再生筋に陽性，一部症例で非再生筋も陽性であった．
その他の筋疾患では多発性筋炎，低K性ミオバナ
ー，LGなどの再生筋に陽性であった．
文

献2）Love DR，Hill DF，et al：An autosomaltranscriptinskeletalmusclewithhomology
to dystrophin．Nature339：55，1989．
2）TakemitsuM，IshiuraS，etal：Dystrophin−

程にはDRPが関与していないと考えられた．

related proteininthe fetal and denervatedSkeletal muscles of normal and mdx mice．

結語
神経・筋疾患生検筋においてジストロフィン

Biochem Biophys Res Comm180：1179，（Dys）関連蛋白（DRP）の局在を免疫組織化学的にDysなどと比較検討した．対照筋では衛星細胞と考えられる一部を除き筋細胞膜にはほとんど局在しなかった．神経・筋接合部は強陽性，血管平滑筋および内皮細胞，筋内神経が染色された．ジ

3）KhuranaTS，HoffmanEP，etal：Identifica−

1991．

−115−

tionofachromosome5−enCOdeddystrophin
Lrelated protein．J BioI Chem265：16717，
1990．

20）筋ジストロフィーにおけるジストロフィン問連蛋白（DRP）の免疫組織化学的研究
納

研究協力者

光 弘＊

樋 口 逸 郎＊ 新 山 尚 仁＊
中 川 正 法＊ 福 永 秀 敏＊＊は じめに
ジストロフィン関連蛋白（DRP）は正常骨格筋においては主として神経筋接合部に局在する蛋白であるl）が，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）及びBecker型筋ジストロフィー（BMD）
においては筋細胞股上の発現が冗進していることが報告されている2）3）．今回我々はDMD及びBMDにおけるジストロフィンとDRPの筋細胞
膜上の発現様式を比較検討し，DRPの発現量とジストロフィン欠損の程度及び臨床的重症度との間に関連があるか否かを検討した．
対象と方法
対象はDMDlO例，BMDlO例及びその他の各柾
神経筋疾患（炎症性筋疾患，代謝性筋疾患，先天性ミオバナー，神経原性筋萎縮他）50例の生検筋である．
方法は生検筋の連続凍結切片に対し，ジストロ1）：25％以下の低下．また，筋細胞膜上のDRPの発現の程度も以下の5段階で評価した．（4）：75％以上の筋線経に出現，（3）：50％〜75％の筋線経に出現，（2）：10％〜50％の筋線経に出現，（1）：10％以下の筋線経に出現，（±）：正常筋と同程度の染色．
ジストロフィン及びDRPの染色性と臨床所見（血清CK値，発症年齢，重症度等）の相関の有無を検討した．
結DMD及びBMD以外の神経筋疾患の生検筋においては筋細胞膜上のDRPの発現はほとんど認められず，正常筋と同程度であった．DMDの骨格筋においては，DRPは大多数の筋線経の細胞膜上に仝周性に発現していた．ジストロフィン残存線
経の一部においてもDRPの発現が認められた．
DMDにおいては症例間の発現量の差は少なかっ

フィンのN末端，rOd中央部及びC末端に対する3種類の抗ジストロフィンモノクローナル抗体

表

BMDにおけるジストロフィン及びDRPの免■疫組織化学的染色と臨床像

症例 年齢／牲 血清CK
ジストロフィン
（正常値）N未 Rod C末

DRP l監床診断

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2

■鹿児島大学医学部第三内科＊■国立療養所南九州病院

ルルルルルルルルルル

1（Novocastra社）と抗DRPポ））クローナル抗体（石浦章一博士より供与）を用いた免疫組織化学的染色をABC法にて施行した．ジストロフィンの染色性の低下は以下の5段階で評価した．（−）：
全欠扱，（一4）：75％以上の低下，（−3）：50％〜75％の低下，（−2）：25％〜50％の低下，（−

果図2

図1症例7のジストロフィン染色（a）とDRP
染色（b）×200
ジストロフィンのC末端は染色性が低下しており，DRPはかなりの筋線経の細胞膜上に全周性の発現がみられる．
た．
BMDの筋細胞膜上におけるDRPの発現は，症症例10のジストロフィン染色（a）とDRP
染色（b）×350
ジストロフィンのC末端はpatchyの染色性を示すが，DRPは神経筋接合部以外の筋細胞膜上にはほとんど認められない．

10においては，神経筋接合部以外の筋細胞膜上にはDRPの発現をほとんど認めなかった（図2）．

例によりかなりの差が認められた．BMDにおけるDRPの発現の程度，ジストロフィンの低下の程度及び血清CK値を表に示す．年齢は筋生検施
行時のものであり，5歳と4歳の症例については
その後それぞれ13歳及び14歳まで経過を観察し臨床診断を下してある．
BMDの筋細胞膜上のDRPの発現様式で最も多く認められたのは再生線経を中心とした一部の

考察
DMDにおける筋細胞膜上のDRPの発現に関しては従来の報告と同様の結果であったが，BMDにおいては，これまでの報告と異なり，症例により差が認められ明らかな再生線維以外の筋線経の筋細胞膜上に強く発現している症例も存在した．

いてはDMDと同程度の強い全同性のDRP発現

BMDにおけるジストロフィン欠損の程度とDRPの発現の程度とは明らかな相関はなかった．
また，全体としてはDRPの発現と発症年齢や臨床経過とも相関は認められなかった．しかし，特が認められた（図1）．一方，それと対照的に症例にDRPの発現が高度であった症例5及び症例7

筋線維のみに認められるパターンであり発現の程度は1〜2の症例が多かった．しかし症例7にお−117−

ではCKの上昇が比較的軽度であり，特に症例7はジストロフィンの欠損がかなり高度であるにもかかわらず，42歳時にも起立，歩行が可能であり比較的良性の経過を示している．
症例10は，ジストロフィンの免疫組織化学では
rodとC末端がBMDの特徴であるpatchyの染色を示しN末端は完全欠損を示し，ブロッテイン
グでもN末端を欠いた分子量340kdの異常ジスト
ロフィンが証明され，DNAのPCRを用いた分析
でもexon3−19の欠矢が証明された症例であるが，臨床的には10歳で歩行不能となり14歳の現在でもDMDの臨床経過と同様の進行を認めている．
本例は完全欠損したジストロフィンのN末端の重要性を示唆する症例として既に報告した4）が，今回の検索でDRPの発現が特に少ないことが明らかとなり，筋細胞膜上のDRPの発現異常が臨床
病型を修飾している可能性がある．本例においては神経筋接合部のDRPは存在しており，DRPが欠損しているのではなく，筋細胞股上のDRP発現機構に何らかの異常があるものと考えられる．
以上のようにBMDにおいては筋細胞膜上のDRP発現は症例により差があり，一部の症例においてはDRPがジストロフィンの代償作用を有している可能性があり，今後より詳細な定量的比較と症例の蓄積が必要である．

ま

と

め

1）DMDにおいては，筋細月包股上のDRP発現は全般的に増加しており各症例間で大差はなかった
が，BMDにおいては症例によりかなりの差がみられた．
2）ジストロフィンのC末端が保たれているにもかかわらず，臨床的にはDMDと区別ができなかった一例においてDRPの発現が特に少なかった．
3）BMDにおいては筋細胞膜上のDRPの発現が著明な症例では，血清CKの上昇が比較的軽度であった．
4）BMDの一部の症例においては，DRPが何らかの代償作用を有する可能性がある．
文

献1）Takemitsu M，Ishiura S，Koga R，et al：
Dystrophin−related proteinin the fetal anddenervated skeletal muscles of normal andmdxmice．Biochem Biophys Res Commun
180：1179−1186，1991．

2）Voit T，Haas K，LegerJO，et al：Ⅹp21
dystrophinand6qdystrophin−relatedprotein．
Comparativeimmunolocalizationusingmul−
tipleantibodies．AmJPathol139：969−976，
1991．

3）Tanaka H，Ishigro T，Eguchi C，et al：
Expression of a dystrophinLrelated protein
associated with the skeletal muscle cell

membrane．Histochemistry96：1−5，1991．
4）HiguchiI，Fukunaga H，Usuki F，et al：
Phenotypic Duchenne muscular dystrophy
withC−terminaldomain．PediatrNeuro18：
310−312，1992．

−118−21）Dystrophin−related protein（DRP）とdystrophin−aSSOCiated proteins（DAPs）の結合について清 水 輝 夫＊
研究協力者

松

村

喜一郎＊・＊＊寺Dystrophin（〜400kDa）は筋細胞膜直下に存在する細胞骨格蛋白で，Duchenne型筋ジストロフ
ィー（DMD）と，その動物モデルのmdxマウス
において欠如している．Dystrophinは筋細胞膜に存在する複数の糖蛋白と複合体を形成している1）3）．Dystrophin−aSSOCiatedproteinS（DAPs）
は156kDa（156DAG），59kDa（59DAP），50KDa（50DAG），43kDa（43DAG），35kDa（35DAG），25kDa（25DAP）の6つのサブユニット

よりなる1）3）．蛋白生化学的，分子生物学的分析より，G）156DAGと43DAGは同一遺伝子にコードされ，pOSt−tranSlational processingによって2つの蛋白になる事，（診156DAGは細胞外基質の主要構成蛋白であるlamininと特異的に結合する

事，③50DAG，43DAG，35DAG，25DAPは，膜蛋白である事，④59DAPは細胞内にある事，が頭らかとなった3）4）．またdystrophinのN末端
domainがF−aCtinと結合する事も示された．以上より，dystrophin complexは筋細胞隈を介して，筋細胞股下細胞骨格（γ−aCtinなど）と細胞外基質をリンクし，筋細胞膜の安定性に重要な役割を果している．
DMDとmdxマウスではdystrophinが欠如するためDAPsのすべてが筋細胞膜で著減してい＊帝京大学医学部神経内科＊＊Howard Hughes Medicalhstitute（HHMl）and

Department of Physi010gy and Biophysics，
University oHowa Co＝ege of Medicine

尾

寿

夫＊

Kevin P．Campbell＊＊る5）6）．その結果筋細胞股下細胞骨格と細胞外基質のリンクが崩壊し，それが筋細胞膜不安定化→筋細胞死をひきおこすと推定される5）6）．一万50DAGの特異的欠損のみでもDMDと表現型の極似した疾患（SCARMD）を生じ得る事は，筋ジストロフ
ィーの発症において，dystrophinよりもむしろ
DAPsの欠落がより重要である事を示唆している7）．すなわち，将来DMDの治療法が有効となるためには，いかにして筋細胞膜のDAPsを回復す
るか，がポイントになる．
DMDにおいてDAPsを回復する方法はいくつか考えられるが，その1つはdystrophinの類似蛋
白を活用できないだろうかというアイデアである．
もしDAPsと結合して複合体を筋細胞膜に形成し得る蛋白があるならば，その発現を人工的に調節する事によりdystrophinの代用にし得るかもしれない．その候補としてdystrophinTrelated
protein（DRPもしくはutrophin）がある．DRP
はヒト第6番染色体，マウス第10番染色体上のDMDL遺伝子によってコードされる〜400kDaの蛋白で，アミノ酸配列はdystrophinのそれと近似している8）9）．さらにdystrophin上のDAPs結合部位の存在するcysteineLrichならびにC末端
domainにおいて特にホモロジーが高い点は注目すべきである8）10）．この点はdystrophin代用蛋白としてのDRPの潜在的有用性を示唆する．
本研究ではDRPとDAPsの結合性を，主にmdxマウスを用いて検証した11）12）−119−1）免疫組織学的にみた所正常マスウではDRP
は神経筋接合部（NMJ）に限局した．DystrophinとDAPsはNMJを含め筋細胞膜全体に分布し討した．
4）免疫染色上 mdxマウスの小骨格筋・心筋では大骨格筋に比し筋細胞膜のDAPsは良く保たた．mdxマウスではdystrophinを欠如した．
DAPsは筋細胞膜において著減していたが，DRPの存在するNMJにおいては良く保たれていた．
DMDでもmdxマウスと同じ所見が得られた．以上のC0−localizationのデータはDRPとDAPs

れ，それに一致してDRPは筋細胞膜全体に極めて高度に発現していた．これはイムノブロット法
でも確認された．
5）抗50DAG抗体は正常マウス心筋よりdystro−

がNMJで結合し複合体を形成している可能性を示唆した．以下生化学的にこれを検証した．
2）正常ならびにmdxマウス骨格筋より膜分画を調節し，digitoninで可溶化後wheatgermagg−
lutinin（WGA）カラム，DEAEカラムにかけ，その溶出液を濃縮後ショ糖密度勾配にかけ分析した．
正常マウスではdystrophin，DRP，DAPsはすべて共沈降した．mdxマウスではDRPとDAPsはオーバーラップして沈降したが，DAPsのかなり

phinを，mdxマウス心筋よりDRPを沈降した．
4），5）は，mdxマウスの小骨格筋・心筋の細胞股において過剰発現したDRP complexがdystrophincomplexの欠損を代償し，その結果これらの筋の障害が大骨格筋よりも軽度である可能性を示唆している．
現在我々はDRP，DRPcomplexの機能を追求
中である．
文
献
1）ErvastiJM，Ohlendieck K，KahlSD，Gaverの分画はDRPと共沈降しなかった．この事は①
DRP（それ自体にはWGArbinding activityなし）はWGA−binding糖蛋白と結合し複合体を作っている．②DRP complexはdystrophin com−

MG and Campbell KP：Nature345：315r
319，1990．

2）ErvastiJM，KahlSDand CampbellKP：J
BioI Chem266：9161−9165，1991．

plexとほぼ同サイズである．③mdxマウスにおいてDRPと共沈降しなかったDAPsは正常なら

3）ErvaStiJMandCampbellKP：Cel166：1121

dystrophinと結合するはずの，解離したDAPsである．④mdxマウスにおいて一部のDAPsは
DRPと結合しているかもしれない，事を示唆した．
3）DRPとDAPsの結合性をより直接に検証するため免疫沈降実験を行った．抗50DAG抗体は
DAPsの他にDPRを沈降した．一方抗DRP抗体−1131，1991．

4）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，LeveilleCJ，Slaughler CA，Sernett SWand
CampbellKP：Nature355：696−702・1992・
5）OhlendieckKandCampbellKP：JCellBiol
l15：1685−1694，1991．

6）OhlendieckK，MatsumuraK，etal：Neurol・は，DRPの他にDAPsの一部を沈降した．以上の結果は正常，mdxマウス両者で共に認められた．
前期1）〜3）のデータを総合し，DRPはdystrophinと同一，もしくは抗原的に類似した糖蛋白と複合体を形成しているとの結論に達した．
さてDMD，mdxマウスにおいては，すべての筋で一様にdystrophinが欠如しているにもかかわらず，筋障害の程度は一様ではない．すなわち外眼筋・固有手筋などの小骨格筋，心筋では大骨格筋より障害の程度がはるかに軽度である．我々はこれらの筋におけるDRP，DAPsの発現状態を検Ogy，ln preSS．

7）Matsumura K，Tome FMS，et al：Nature
359：320−322，1992．

8）Love DR，HillDF，et al：Nature339：55−
58，1989．

9）BuckleVJ，GuenetJL，Simom−ChazottesD，Love DR and Davies KE：Hum Genet85：324−326．1990．

10）SuzukiA，Yoshida M，Yamamoto H，and−120−

Ozawa E：FEBS Lett308：154−160，1992．

11）Ohlendieck K，ErvaStiJM，Matsumura K，

12）Matsumura K，ErvaStiJM，Ohlendieck K，

Leveille CJ，Kahl SD and Campbell KP：

KahlSDandCampbellKP：Nature，inpress．

Neuron7：499−508，1991．

−121−22）急速凍結deep etching法によるジストロフィンと他の細胞骨格蛋白（アクチン，スぺクトリンなど）との相互関係の検討
小 林 高 義＊
研究協力者

松 本 春 秋＊大 野 伸 一＊＊Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の遺伝子産物であるジストロフィン（DP）の筋細胞内の超微構造的局在を明らかにするために，我々はマ
ウス培養筋管細胞を使用して急速凍結−deepetching（QF−DE）法によって3次元的に検討し，DPが細胞膜直下に不規則に配列し，aCtinrlike
filamentsと密接にlinkして存在していることを明らかにしてきたが1），今回はDPと細胞骨格蛋白の1つであるスペクトリン（SP）及びアクチン（AC）との相互関係をみるために同様の方法で培
養筋管細胞による検討を行ったので報告する．
材料及び方法DMDのmodel動物であるmdxマウス及びそのCOntrOlマウスであるscnマウスを使用した．
新生マウス下肢筋より無菌的に筋組織を取り出し，
コラーゲン塗布カバースリップ上にexplant cul−
tureした．培養液はDulbecco smodifiedEagle s
MEM67％，medium199 23％，fetal bovine
Seruml0％の組成のものを使用した．培養は，約1週間行い，充分な筋管細胞が得られた段階で以下の実験に使用した．培養細胞を2％パラホルムア
ルデヒドで5分間国定し，0．5％サポニンで15分間処理した．光顕的免疫染色には，DPは，C末端に＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊山梨医科大学第一解剖■＊＊信州大学医学部第二病理

亀

田

馬、場

典

佳＊

宮

武

正＊

健＊＊＊

対するモノクローナル抗体，SPは抗ヒトあるいはチキンポリクローナル抗体，ACは，FLaCtinを認識するrhodamine−palloidinを使用し，DPとSP，DPとAC，SPとACとの相互関係をみる目的で，FITCとrodamineによる免疫蛍光二重染色を行った．QF−DE用免疫染色には，DPはC末端に対するモノクローナル抗体で30分染色後，peroxidase標識抗マウスIgG抗体で染色した．
SPは，ポリクローナル抗体を用い，2次抗体として，ヤギ抗兎IgGgold（10nm）を用いた．ACをみる目的で，S−1（myosinsubfragmentl）による修飾を行った．免疫染色対照群としてscnマウ
ス由来筋管細胞に正常マウス血清とPBSを一次抗体で染色し，またmdxマウス由来筋管細胞にDP抗体を使用した．電顕レプリカ膜作成のために10％メタノール浸漬後，液体窒素で冷却し，液体窒素中で凍結割断を加えた．Eiko社製FD−3S
装置内（−95℃，2−6×10￣7Torr）で15〜30分
間deep etching後，白金と炭素で回転蒸着した．
型のごとくレプリカ股を作成，日立HS−9，H−700
電顕で観察した．
結果

I．DPとAC，DPとSP及びSPとACの免疫蛍光二重染色による観察（図1）DPとACの2重染色では，筋細胞膜直下にDPが染色される部位に一致して，F−aCtinが強く染

ー122−

図2

Replicaelectronmicrographsforpurer＆rphology（A）and S−l decorated
ultrastructure（B）inscnmyotubesat
about one week of culture．Bar＝0．5〟m．
（A）Lattice−likefilamentousnetworks

図1LightmiCrographsofdoublelabellingfor dystrophin（dy）and F−aCtin（ac）（arrows）areobservedjustunderneath［a］；dystrophinandspectrin（sp）［b］

the plasmalemma．Parallel

and actin and spectrin［C］at about

microrfilamentsandshort−linkingthinfilaments are associated with each

OneWeekofculture．DystrophinandF

Other just under thelattice−likefilamentous networks．

−aCtin are c0−localizedin most areas
Ofimmaturescnmyotubes（arrowsin（B）Inanotherarea，mOStOfthe8〜10a），however dystrophin and spectrin

nm microfilamentsaredecoratedwith［b］or actin and spectrin［C］have
reclprOCal

stainlng

patternS

running

S−ltoidentifyactinfilaments．S：Cellinim一

surface．

mature myotubes（arrows and arrow−heads）．

−123−

ACの染色が逆に低下する傾向を認めた．
ⅠⅠ．QトDE法による観察
超薄切片による免疫電顕的観察では，SPは，
scn，mdx共に細胞膜直下に不連続性に存在すると共に，一部は細胞質内にも存在が確認された．
QトDE法による3次元的超微構造の検討では，
scn，mdx共に，細胞膜直下に格子状のfilamentous networkが局所的に観察され（図2−
A），逆にそのfilamentousnetworkの観察されない部分ではS−1で修飾されるAC filamentsと考えられるfilametsが密に集合している像が観察された（図2−B）．ImmunogoldによるSPの局在の観察では，（図3−A）の如く，filamentous net−
work上にgold particleが認められ，このnet−
workにSPが存在していることが明らかになった．一万，ACが密集して存在している部分（図3
TB）では，gOld particleは認められなかった．
考察

今回の培養マウス筋管細胞を使用した実験では，
DPとSPはreciprocalな分布を示し，またDPとACはcolocalizationする部分が存在したが，SPとACは，光顕的免疫蛍光2重染色でも，QF−DE法による3次元的超微構造レベルでもrecip−
rocalな分布を示した．また，3次元的超微構造レベルでDPはまだ規則的なfilamentous network
図3

Replica electron micrographs furim・を形成していないが，SPは部分的にきれいな格

munogoldlabelling of spectrinin scll

子状のfilamentousnetworkを形成していた．一myotubesataboutoneweekofculture・
Bar二0．5JLm，Immunogold particles

方，生体内では，DPとSPは，光顕レベルの観察

are observed on thelattice−likeではあるが，COlocalizationを示すことが報告さ

filamentouslletWOrks．

れている21．このわZ びわ℃とわ7 乙壷βの異なる所（B）In a different area of the same

見は，SPの機能を考える上で示唆的で，DPある

myotubes，110immunogold particles
are obseved on the 8−10nm mi・いは他の細胞骨格蛋白が筋細胞の形態維持に重要な役割を果たしているとするならば，それらの蛋

crofilamens．S：Cell surface．

白が十分発現していず構造的にも配列が未完成の色される部位を認めた．DPとSPの2重染色による観察では，未熟な筋管細胞の段階では，SPは筋細胞の全体にび慢性に染色される傾向を認め，DPの存在しない部分ではむしろSPが強く染色される部位が散在性に存在した．またSPとACの2重染色では，SPが強く染色される部位ではときに．SP networkが代償的役割を筋細胞の未熟な段階に果たしている可能性が考えられる．
今後更にdystrophinrelated proteinあるいは膜を貫通しているglycoproteinとDPとの関係
更に1aminineなどの細胞外matrixとの関係を
3次元的超徴構造レベルで検討し，これらの蛋白−124−

の相互関係を明らかにし，各々の蛋白の構造と機能を明らかにすると共に，DMD／BMDにおける文

献1）Park−Matsumoto YC，Ohno S，Baba T，

筋細胞膜の崩壊機序を明らかにしていきたい．

Kobayashi T and Tsukagoshi H：Im−
munocytochemiCal study of dystrophinin

結論

Cultured mouse muscle cells by the quick−

DPは筋管細胞膜直下にACと密接に関係して存在しているのに対して，未熟な培養筋管細胞では，SPとACあるいはDPとの密接な相互関係

freezing and deep−etChing method，Histo−
ChemJ24：383−392，

2）Porter GA，Dmytrenko GM，WinkelmanJC

はあきらかではなかった．一方SPは，未熟な筋管細胞の段階でもscn，mdx共に1attice−likefilamentous networksとして細胞膜直下に存在
した．

−125−

andBlochRJ：Dystrophincolocalizeswithβ
一SpeCtrinindistinctsubsarcolemmaldomains

in mammalian skeletal muscle．J Cell Biol
117：997−1005，1992．

23）マウス正常骨格筋細胞膜ジストロフィン分子の形態計測とアクチン，α−アクチニンとの問係
若 山 吉 弘＊

研究協力者

結

泣 谷 誠

二＊

武

篤＊＊ 鬼 木 弘 明＊＊＊田R

従来から我々はmdxコントロールマウスや
mdxマウス骨格筋を用いfreeze−etChing法によるreplica股の電顕的観察にてジストロフィンの超微形態とその存在様式を研究している．本年度
は昨年度に続き抗ジストロフィン抗体標識骨格筋の本法による研究にてジストロフィンの形態計測
及びそのアクチン，α−アクチニンとの関係を検討
した．
材料と方法
mdxコントロールマウスの大腿四頭筋を文献
3の方法や化学固定し凍結，クリオスタットで細切しよく洗浄した後，非特異的反応を除去するた
め5％正常ロバないしヤギ血清を室温にて30分間反応させた．1次抗体としてDrs．Hoffman，Byersより供与された羊抗60kDaジストロフィン抗体又はウサギ抗6−10抗体のそれぞれ1000倍希釈液にて4℃24時間反応させ，0．1Mリン酸バ
ッファー溶液にて4回洗浄した．2次抗体は20倍
希釈10nm金コロイド標識ロバ抗羊抗体（BioCell，UK）又は20倍希釈10nm金コロイド標識ヤ
ギ抗ウサギ抗体（Amersham，UK）を4℃24時間反応させ，よく洗浄した後冷却した2．5％グルター
ルアルデヒドi容液にて4℃30分間固定した．ジス

自

見

隆

弘＊

トロフィンとα−アクチニンとの関係は5％正常
ロバ及びヤギ血清で非特異的反応を除去後，羊抗60kDaジストロフィン抗体とウサギ抗α−アクチニン抗体（Transformation ResInc）をそれぞれ1000倍，20倍希釈し混合し細切筋標本に4℃24
時間反応させた．2次抗体は20倍希釈10nm金コ
ロイド標識ロバ抗羊（BioCell，UK）及び20倍希
釈5nm金コロイド標識ヤギ抗ウサギ抗体（Amersham，UK）を混合し4℃24時間反応させ
上記のように処理した．2次抗体標識標本のうち1部を冷却1％OsO。溶液で1時間固定後エボンに包埋し超薄切片を電顕にて観察した．Freeze−
etching法用には金コロイド標識2次抗体液がグ
リセロールを含むためにこれを除去し，またバッファーの塩類除去のため蒸留水にてよく洗浄した．
急速試料凍結装置Eiko RF23型に液体ヘリウムを入れ−269℃まで冷えた純銅blockに採取した筋の小片を庄着し急速凍結した．その後標本をEiko FD5A凍結割断装置に移し−150〜−
160℃，真空度1−2×10￣7Torrで凍結面の表層を割断し，試料の温度を−90℃まで上昇して約30
分間deep etchingを行った．その後標本の温度を一150〜−160℃前後まで再冷却し，プラチナとカーボンを回転蒸着して15Aのプラチナ膜圧をもつreplica膜を作製した．

＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院臨床病理＊＊＊昭和大学藤が丘病院電顕室
−126−

結

果

考

Freeze−fracture法によりreplica膜を作製し筋細胞膜裏打ち構造を観察するとそれは低倍像では細胞膜に付着した細胞骨格の群集としてみられた．倍率を拡大すると筋細胞膜内表面に付着した梓状の細胞骨格が網状構造のネットワークを形成

察

FreezeLetChing法でみられる膜細胞骨格のnetworkにはジストロフィン，スペクトリン，フォドリン，アンキリンなど種々の膜細胞骨格が含まれている．我々はここ数年来mdxコントロー
ルマウス骨格筋の生の無化学固定標本1）や化学固しているが，規則的な網状構造ではなかった．
次に羊抗60kDaジストロフィン抗体とウサギ
抗6−10ジストロフィン抗体の10nm金粒子標識
2次抗体修飾骨格筋では抗6−10ジストロフィン

定標本の抗ジストロフィン抗体修飾検体2）3）の抗体反応標本の方がsignalが多く見られた．このようにして識別されたジストロフィン分子の形態はおおむね梓状であるが，CurVeしたものCOil状のもの，端がやや拡大したもの，一端から他端へ
直径がやや細くなるものなど細部では多少の形態のVariationがみられた（図1，2，3）．50個のジストロフィン分子で太さ，長さを実測するとそれぞれ6．1±1．5，112．2±16．3であった．レプリカ

能性として筋細胞膜内面に垂直に近い状態で存在

膜のプラチナの厚さは15Aなのでジストロフィンの太さ長さの両側，両端の30Aすなわち3nmのプラチナ膜厚を差し引くとジストロフィン分子の太さは3．1±1．5，長さは108．2±16．3であった．
このジストロフィン分子は筋原線維束最外層の約5nmの周期をもつactinfilamentと考えられる

freeze−etChing法による検討を続けている．10nm
金粒子の付着したジストロフィン分子の多くは筋細胞膜内面にほぼ平行に存在していた．1つの可するジストロフィン分子はfreeze−etChing法の過程でなされる剖断により除去されてしまうことも考えられ，本論文には記述していないが，次の実験4）を行った．すなわちジストロフィンの異なった動物にて免疫されたN端5），C端4）抗体を用い2次抗体として5nm，10nm金コロイド標識2次抗体を用いて2重免疫電顕的研究を行った．そして5nm，10nm金粒子の筋細胞膜からの距離を測定し，5nm，10nm金粒子群の距離のgroupmean±SDを算出した．その結果，この2群間で統計的に有意差がみられなかったこともfreeze−
etching法で観察されたジストロフィン分子が筋細胞膜内面にほぼ平行に存在するという所見を支ものとend−tO−Sideassociation（図4，5）やend−tO−endassociationをするものがみられた．次に持する結果と考えられる．

α−アクチニンの正常骨格筋細胞内での局在は透過電顕的には筋細胞膜内面とZ帯にあったが，予想外の所見として筋細胞内の隣接する筋原線推束間のZ帯付近の筋細胞質にも5nm金粒子が存在しα−アクチニンが局在していることが示されな多少のVariationがあるが，おおむね梓状構造

た（図6）．freeze−etChing法では透過電顕的にα−アクチニン分子が存在した部位に5nm金粒子が存在しα−アクチニン分子の局在が確認されたが，10nm金粒子の付着したジストロフィン分子とα一アクチニン分子との結びつきを示す所見は得られておらず（図7），今後更に検討を進める予定である．

次にジストロフィン分子は結果の項で記した様を呈し，その形態計測ではジストロフィンは長さは約110nm，太さは約3nmであった．これはPons6）らのニワトリ砂のうより分放されたジスト
ロフィン分子の170nmよりはずっと短くSato7）
らのウサギ骨格筋より分推されジストロフィン分
子の長さ約110nmにほぼ一致した．更にジストロ
フィン分子のなかには筋原線維最外層の約5nmの縞紋構造をもつアクチンフィラメントとend−
to−Side，end−tO−endassociationをしているものがみられたが，今後更に種々の抗体を用い，ジス
トロフィン分子の筋細胞膜関連細胞骨格における存在様式を研究してゆきたい．

−127−図1〜2はウサギ抗6−10ジストロフィン抗体，図4，5は羊抗60kDaジストロフィンとそれぞれ10nm金コロイド標識ヤギ抗ウサギおよびロバ抗羊2次抗体修飾mdxコントロールマウス骨格
筋のfreeze−etChing法によるreplica隈の電顕像．図6，7は羊抗60kDaジストロフィン抗体とウサギ抗α−アクチニン抗体反応後それぞれ10nm，5nm金コロイド標識，ロバ抗羊，ヤギ抗ウサギ抗体標識mdxコントロールマウス骨格筋の電顕像．尚，図3は図2のジストロフィン分子群の部分の手書き像．図1の骨格筋細胞陵内表面には比較的多くの10mm金粒子（矢印）により示されるジス
トロフィン分子が存在している（×137，000）．図2は図1のほぼ中央のジストロフィン分子群の高倍像でジストロフィン分子はおおむね梓状であるが，カーブしたもの，コイル状のもの，他端が1端より細くなってゆくもの，端が球状に膨らんでいるもの（矢尻）などかなり形態にVariationが−128−

みられる（×274，000）．このジストロフィン分子の金粒子の位置からジストロフィン分子のN端C端と考えられる部位を図3に示した．図4は大きい矢印で示される10nm金コロイド粒子の付着したジストロフィン分子（小さい矢印）を示し，これが筋原線推束最外層のfilamentと連結している（×137，000）．図5は筋脱線維束最外層のジストロフィン分子と連結しているfilamentの拡大像で小さい矢印で示す約5nmの周期構造がみられる（×274，000）．図6でα一アクチニンは筋細胞膜内側とZ帯及びその付近に存在し（小さい矢印），ジストロフィンは大きい矢印のように筋細胞膜内側に存在した（×68，500）．図7でもα−アクチニン（小さい矢印）はZ帯及び筋細胞膜内面（CS）にジストロフィン（大きい矢印）は筋細胞膜内面に存在した（×137，000）．

−129−

文

献

tructureandmodeofexistenceofdystrophin

1）WakayamaYandShibuyaS：Observations

molecule：Immunoelectron microscopic andOnthemuscleplasma membrane−aSSOCiatedfreeze−etChing studies of muscle plasma

CytOSkeletons ofmdx micebyquick−freeze，membranes of murine skeletal myofibers．

deep−etCh，rOtary−Shadow replica method．

Submitted for publication．

Acta Neuropathol（Berl）80：618−623，1990．

5）Hoffman EP，MorganJE，et al：Somatic2）Wakayama Y and Shibuya S：Antibody−reversion／suppression of mouse mdx

decorated dystrophin molecule of murine

phenotypeinvivo．JNeuroISci99：9−25，

Skeletalmyofiber as seenby freeze−etChing

1990．

electronmiscroscopy．JElectronMicrosc40：

6）PonsF，AugierN，etal：Isolateddystrophin

143−145，1991．

molecules as seen by electron microscopy．

3）Wakayama YandShibuyaS：Gold−labelled

Proc Natl Acad Sci USA87：7851−7855，

dystrophinmoleculeinmuscleplasmalemma

1990．

Of mdx control mice as seen by electron7）SatoO，NonomuraY，etal：Molecularshape

miScrosopy of deep etching replica．Acta

Of dystrophin．J Biocheml12：631−636，

Neuropathol（Berl）82：178−184，1991．

1992．

4）Wakayama Y，Shibuya S，et al：Ultras−−130−24）Becker筋ジストロ7イ」症筋細胞膜のFreeze−Fracture法による研究
＊

弘

吉

山

若

隆信義

兄杉岩

I

自三黒

＊

二也め

＊H

誠拓ゆ

谷林木

追小鈴

研究協力者

弘＊ 鬼 木 弘 明＊＊
子＊＊＊＊長谷川修†之† 熊 谷 俊 幸††

方Dystrophin分子は，筋細胞膜のdystrophin
associatedglycoprotein（DAG）とdystrophin−glycoproteincomplexを形成し，Duchenne筋ジストロフィー症（DMD）では，dystrophinの欠如に伴いこれらのDAGも著明に減少することが報告されている1）．このDAGの減少はFreeze−
Fracture（F，F）法の研究でも，DMDの筋細胞膜
における膜内粒子の減少として従来よりいわれている2）3）．
一方，Becker筋ジストロフィー症（BMD）でもdystrophin分子に異常がみられるが，院内粒子の変化に関してはまだほとんど検討されておらず，
本研究を実施した．
対象

臨床所見，検査所見にてBMDが強く疑われ，
一般筋生検所見，dystrophin染色，一部にはDNA
解析にて診断したBMD生検筋5例（平均23歳）
ならびにCOntrOlとして，整形外科手術時より得，
組織化学的に異常のない正常骨格筋7例（平均26歳）のF−F標本を作製した．

F−F法：対象とした各々の筋標本は，2．5％グルタールアルデヒドリン酸緩衝液の中で2時間固定し，約1×2mmの小さなブロックに切り，10％〜30％グリセリン溶液に浸軟し，Eiko FDIIA（−
120℃，2．5〜4×10￣7Torrの条件下）にて標本を割断し，筋細胞レプリカ膜を作製した．
膜内粒子密度算定：作製したレプリカ膜を電顕にて観察し，筋細胞膜部位を無作為に写真撮影し，最終倍率16万倍で印画紙に焼き付けた．筋細胞膜
電顔写真中の膜内粒子数は，各々の標本につき最低10本の筋線推（5P面および5E面）をBMD
5症例，COntrO117症例について，BMD群50枚，COntrOl群70枚，計120枚の写真をcode L，intramembranous particle（IMP），Orthogonalarray（OA），Orthogonalarraysubunitparticle（OASP）の各々の段内粒子密度をそれぞれsingle
blind法にて算出した．これらはdecodingした
後，BMD群，COntrOl群について，統計的に比較検討した．
結＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院電顕宝＊＊＊横浜赤十字病院小児科＊■＊＊神奈川県五二とも医療センター整形外科†横浜市立大学医学部神経内科††愛知県コロニー中央病院小児神経科

法

果

FqF標本におけるIMPの密度をBMD群とCOntrOl群とで比較すると，OASPの粒子数を含まない場合，含む場合ともにP面において両群間で有意差はなく，BMDにおいてIMP密度は正常であった（表1）．またE面におけるIMP密度も−131−表11MP density per square micronin muscle plasma membrane of normal
COntrOland

P

facea

1800

±

P

284C

Becker

faceb

2009

E

±204C

s

musculardystrophy（BMD）．

face

P

936

1870±284￠

±119e

racea

faceb

1943

E

±332e

face

810±2489C

1818 ± 81

1937 ± 52

1008 ± 81

1790 ± 289 1903 ± 389

538 ±1111

1845

2038

903

±491

755

±164

1461±

1764 ± 481

2135 ± 422

826

±222

2073 ± 388

2487 ± 346

918 ±1122

1882 ± 200

2333

±242

902

±187

1803

1825

687

1984

±314

2546

±193

1042 ± 67

1798

±169

2132 ± 251

757 ± 68

±453

1842±

28日

2161±

80d日払9±±51dMJ1799±

206
417

1605

±
±

206
422

98d■1953±146dM771士

±4344
±1177

71d＝且

a Without orthogonalarray Subunitpart．icles．

E p〉0．1（tvo tailed ttest）

b Vith orthogonalarray subl皿itparticles

M p〉0．1佃o tailedttest）

C HeaLl±standard deYiation for each subject．
d Group mean±st．aJldarderror of themeanin

表2Pに含まれる粒子数の平均を比較すると，COntrOl
群15．43±0．38／jLm2，BMD群13．56±0．58／JLm2とやはりBMD群で有意に減少しており（p＜0rthogonalarray density per square
miCroninmuscleplasmamembraneof
normalcontroland

Beckersmuscular

0．05bytwotailedttest），BMD群ではcontrol
群に比べてsmallsizeのOAよりなっていた（表3および図A−B）．

dystrophy（BMD）．
Hed ian

H idr訂lge（
25X to 75X）

Con Lrol4．
43

2．
65 −10 ．
94

BHtI

2．13

1．
67 − 4．
55

M p〉0．1（two tailedttest）
each group．

考察

本研究の結果から，dystrophin分子の量的・質的異常のみられるBMDにおいても，その筋細胞
膜微細構造の異常が認められることが確認された．

pく0．0llWilcoxon rank sum teSL）

P面と同様にBMDにおいて正常であった（表1）．

1JLm2あたりのOA密度はそのMedian値およびMidrange（25％〜75％）（括弧内）が，COntrOl
群では4．43（2．65〜10．94）であり，BMD群では2．13（1．67〜4．55）と有意に減少していた（p＜0．01byWilcoxonranksumtest）（表2および
図A−B）．
OASPの数，すなわち各々のOAひとつあたり

しかしながら，次の点でdystrophinが完全に欠如するDMDの筋細胞膜微細構造変化と相違がみられた．
DMDでは，IMP密度の減少がP面E面ともに認められ，OA密度もその多くの筋線経でほとん
ど見られない程著減しており，またOAを構成す
る平均OASPも非常に減少しているのに対して2）3）BMDにおけるIMP密度は正常であり，またOA密度や平均OASP数はDMDと同様に減少しているものの，その程度はDMDより軽かった．
臨床的に良性で，予後も良好なBMDにおける筋

−132−

表3

Subunit particle number per one
Orthogonal arrayin muscle plasma
membrane of normal control andBeckers

musculardystrophy（BMD）．

14．84±3．948
13．73 ±2．6215．20 ±3．05
15．29 ±1．94
16．35±2．74
15．82 ± 3．41
16．80 土2．40

11．57±3．188
14．69 ±5．58
12．89 ±2．73
14．04 ±4．08
14．59±2．5215．43±0．38川

13．56±0．58bH

a Hca．n士standard deviation for each subject．．
b Group mean±sLa血arderror or the meanin eachgrO叩．
u pく0．05（Lvo Lalled t LesL）

よび細胞院外基質との機能的つながりに興味がもたれた．今後，膜内粒子の免疫細胞化学的な検討が必要と考えられた．

図A−B Highmagnification electronmiT
crographsoffreeze−fractureprep−
arationsillustrating orthogonalarray densityin muscle plasma

結membranes of P faces of normal
control（A）and

Beckers

muscu−

lardystrophy（B）．Decreasedden−
sities of both orthogonal

論

1．BMD筋細胞膜のIMP密度は正常であり，一方，OA密度はDMDと同様に減少しており，
smallsizeであったが，その程度は軽かった．
2．筋細胞膜微細構造変化，特にOAの減少程度

arrays（arrows）and orthogonal array
subunitparticles are apparentin
Becker，s plasma membrane・C＝Caveolae．Bar＝0．2JLm．×93，300・

細胞膜微細構造変化が，不完全ながらもdystro−phinが保持されていることと関連があるような結果が得られたことは興味深い．
以前我々は，若い正常ヒトおよび正常マウス骨は筋ジストロフィー症の重症度と相関が見られた．
3．今後さらに，通常のトF法により観察される膜内粒子の内，特にどのような粒子がdystrophinと結合する膜内糖蛋白であるか，Fracture−Label法などを用いて検討したい．
文

献

格筋ではOAが非常に多く見られること，さらにmdxマウスにおけるOAの減少程度が，DMDと1）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvaStiJM，et

比較して軽いことをすでに報告し，著しいOAの減少は骨格筋の機能低下を引き起こすことを推測した4）5）．本研究の結果も筋ジストロフィー症の重症度とOAやOASPの減少程度に相関がみられ，

edglycoproteinslinking dystrophin to the2）Schotland DL，Bonilla E，et al：Duchenne

OAとdystrophinを含む細胞膜関連細胞骨格おdystrophy；Alterationin plasma membrane

al：Primarystructureofdystrophin−aSSOCiat−

extracellularmatrix．Nature355：696−702，
1992．

一133−

StruCture．Science196：1005−1007，1977．

amyotrophiclateralsclerosis and Duchenne

3）WakayamaY，OkayasuH，etal：Duchenne

musculardystrophy．J NeuroISci91：191−

dystrophy；reduced density of orthogonal

205，1989．

array subunit particlesin muscle plasma5）Shibuya S and Wakayama Y：Changesin

membrane．Neurology（Cleveland）34：

muscleplasmamembranesinyoungmicewith1313−1317，1984．

Xchromosome−linkedmusculardystrophy；a4）Wakayama Y，JimiT，et al：Dystrophin

freeze−fracture study・NeuropathoI Applimmunostaining and freeze−fracture studies

Of muscles of patientswith early stage−134−

Neurobio117：335−344，1991．

25）Dystrophin：ヒト中枢神経系における局在と特性並びにBecker型筋ジストロフィーの発現様式について
内

研究協力者

寺 本
岩 下

仁

誠＊

野

郎＊ 直 江 弘 昭＊ 三 池 輝 久＊＊
宏＊＊＊安 藤 正 幸＊＊＊＊荒 木 淑 郎†

Dystrophinはreversedgeneticsの手法により発見されたDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）患児で欠除ないし著減する巨大分子蛋白（Mr427kd）である．抗dystrophin抗体を用いた免疫染色ではdystrophinは骨格筋，心筋，平滑筋の表面膜に局在がみられ，最近の5年間に得られた多くの知見からdystrophinは筋の収縮と弛緩の過程で形質膜に弾力を与える膜骨格の重要な構成成分であろうと推定されている．ただその正確な役割は今日なお不明である．最近モデル動物を用いた研究では筋肉組織のみならず，収縮・弛緩たBecker型筋ジストロフィー（BMD）生検筋のdystrophinの発現様式についても同様に検索を加え，PCR分析結果と比較検討した．
対象と方法
対象は神経筋疾患以外で死亡した正常対照剖検
例5例（42〜74歳），筋緊張性ジストロフィー1例（54歳），IQ50以下の知能障害を認めたDMDl例（26歳）で，骨格筋，心筋，肺，胃，腎臓，膀胱，に無関係と考えられる中枢神経でもdystrophinの存在が明らかにされ，これらの組織においては大脳（前頭葉，頭頂葉，後頭葉）・小脳・脊髄の各組織について抗dystrophin抗体（DYS−1，2，
3，60kD，30kD，DMDpeptideIV）を用いた検索を行った．またBMD30例（6−69歳）でCham−dystrophinは収縮・弛緩以外のもっと多様な生理機能に間与している可能性がでてきている．

berlain及びBeggsらの19primerによる多重PCR分析（SRLに依頼）を行い，うち18例では生dystrophinの発見以前よりDMD児では低IQ
ないし精神発達遅滞児の頻度が高いことが知られ検筋のdystrophinテストと比較した．

ていたが，本症の疾患過程に密接に関連した一次的な現象か，運動障害や教育機会の不足などによる二次的影響なのか，意見の一致をみていなかった．今回まだ明らかになっていないヒトの各組織

結果
ヒトCNSにおけるdystrophinの局在と特性に関する部検例での成績（1）Immunoblot所見
正常対照並びに筋緊張性ジストロフィーにおい特に中枢神経系（CNS）におけるdystrophinの局
在並びに特性を明らかにするため，認識部位の異なる6種類の抗dystrophin抗体を用いて，Im−munoblot及び免疫染色による検索を行った．ま＊国立療養所再審荘病院神経内科＊＊熊本大学医学部発達小児科＊‥1l：■国立療養所筑後病院＊＊＊＊熊本大学医学部第一内科†三井大牟田病院神経難病研究センター

IてはDYS−1，DYS−3，60kD，30kD，DMD
peptideIVを使用した場合，骨格筋，心筋では生検筋と同様の明瞭な427kDのdystrophin bandの発現が認められ，胃・膀胱などの平滑筋組織，さらに大脳，小脳などの中枢神経組織でも比較的明瞭なdystrophinbandの発現が認められた．ただ肺や腎臓などは極めて痕跡的で，脊髄では確認困−135−

雉であった（図1a）．詳細に観察すると，骨格筋・心筋ではDYSrl，3，60kD，30kD抗体で427kD

は，DYS−1，3，60kD，30kDでは骨格筋，心筋，平滑筋組織の筋表面膜に抗体の局在がみられの主要なbandの他に400kD付近にもう1本の薄いbandが認められ，doubletとして観察された．
一方平滑筋組織，大脳・小脳では一本のbandで，脳のbandは骨格筋の主要bandと同じ分子量域，逆に平滑筋のbandはわずかに高分子量城のた．一方大脳ではneuron，小脳ではpurkinje細胞の胞体や樹状突起の表面に小斑点状に抗体の局在が認められた．DYS−2ではneuronは陽性に染色されず，血管壁に抗体の局在が認められた．DMD
PeptideIVではgliaや血管壁が陽性に染色された．
DMDにおいてはいずれの抗体を用いても骨格筋，心筋，平滑筋の表面睦，大脳・小脳のneuronには明らかな抗体の局在は認めなかった（図2）．

bandとして観察された．ヒト骨格筋のC末端領域を認識するDYS−2では，骨格筋や心筋のdystrophinは明瞭な一本のbandとして認められ，平滑筋組織でも一本のbandが確認されたが，脳ではdystrophinbandの発現はみられなかった．
DMDにおいてはいずれの抗体を使用しても骨格筋を始め，大脳，胃・勝胱など検索し全組織でdystrophinの発現は認めなかった（図1b）．
（2）免疫染色所見
正常対照及び筋緊張性ジストロフィーにおいて

II BMDにおけるPCR分析及びdystrophin
testとの相関
BMD30例中，欠失（＋）15例，欠失（−）15例であった．欠失（＋）はExonlケの欠失4イ軋
Exon3ケの欠失8例，Exon4ケの欠失3例であった（表）．30例中18例でImmunoblotを実施したが，BMDにおいては（∋分子量の異常を示す例
M凸喜

凸三日

S巨0∪

TI

∈JOu

S∈LOU

C

∈LOu

B□喜

C

3

C凸喜

M凸喜

12

dystrophin−
∩

山
P
0

S
V
d

C E﹂2

立二王王
川
8

2

12

3

4

5

6

7

8

9

（a）Normal control，lanel，Skeletal
muscle；lane2，Cardiac muscle；1ane

4

5

6

7

8

910

（b）Normalcontrol，lanesl，3，5，7，9；
DMD，lanes2，4，6，8，10．Lanesl
and2，Cardiacmuscle（CM）；lanes3
and 4，Cerebralcortex（cc）；1anes5
and6，Cerebellum（CB）；lanes7 and
8，StOmaCh（ST）；1aneS9 andlO．
skeletal muscle（SM）．Blots were
Stainedwithanytidystrophinantibody
DYS−1．

3，ccrebralcortex（frontallobe）；1ane
4，Cerebral cortex（parietallobe）；
1ane5，Cerebellum；lane6，Splnal
COrd；lane7，StOmaCh；1ane8，blad−der；lane9，COntrOlbiopsied skeletal
muscle．Thelocation of dystrophinis
indicated；the doublet appearanceis
typicalofstriatedmuscle（arrows）．

図1Immunoblot analysis ofdystrophininvarioushumantissues．
−136−

表

DescriptionofBMDpatientswhounderwentmultiplex PCRanalysis
and dystrophin testing

Pt

a 9e

clinical（y ） stag el（

detetio n

W estern b lot
X一
日
n ked
lm m U nO ■fam ilY
reduα
dl
eveI
s of
Si
ze of
両t
叩仙 dYStrOPhin（kD）
lt Stain in 9 historv
1什

4 25

PatChy

Y

3

（
−
）
（
・
）
。
9．
E芸
3

1十

390

†
aint

N

14

CK †

（
・
） 誓

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nd：nOt done
※SwinYaTd s class怖cation※※Normal dYStrOPhin rnoIecular mass．427kD＋廿：＜10％Normallevel，Or Undetectable
lt：10−20％normaHevels，＋：20−50％normaHevels
N：nO．Y：YeS−137−

図21mmunohistochemicallocalization of dystrophin．Cryosections（10Flm）of normal
controIskeletalmuscle（a），DMDskeletalmuscle（b），nOrmalcontrolbladder（C），DMD
bladder（d），nOrmal controI cerebral cortex（e），DMD cerebral cortex（f），nOrmal
COntrOIcerebellum（g），andDMD cerebellum（h），labelledwithDYS−2（a，b，C，andd）andDYSLl（e，f，g，andh）．Notetheintensedystrophinimmunoreactivityofthe
Surface membrane of the skeletal and smooth muscles，and the punctateimmunor−
eactivityalOng thecellbodies and dendrites of the cerebralcorticalneurons andthe
CerebellarPurkinjecellsinthenormalcontroIs（arrows）．Ontheotherhand，nOapparent
immunoreactivity was notedin DMD．Bars＝25FLm．

−138−

（10／18），（∋dystrophinを検出困難な例（3／18），③正常対照とdystrophinの移動度に差がみられない例（5／18）がみられた．（卦の場合DMDとの区別が困難であるため，通常のABCkitより3倍以上抗原検出感度の高いeliteABCkit（vecstain社）を用い，発色基質もnaphtholより感皮の高いDABを用いたところ，薄いながらdy bandの発現が認められた．また（卦のBMDに対してはSDS−PAGEの泳動時間を約2倍に延長したところ，
dystrophinの分子量の違いが明瞭となり，全例低分子量であることが明らかとなった．PCR分析結果との関連では欠失（＋）例では欠失するExon数が多いものほどdystrophinの低分子化も明らかであった．一方欠失（−）例では通常の泳動時間ではdystrophinの移動度に正常対照と差がみられない例が多く，SDS−PAGEの泳動時間の大幅な延長により，分子量の違いが始めて明らかになる例が多かった．免疫染色では正常対照の筋表面
膜が均等かつ全周性に染色されるのに対して，
BMD例では18例中16例は筋線維毎に染色性に濃淡があり，また全周性ではなく筋鞘膜がとぎれとぎれに染色されるpatchystainの像を示した．2
例は全周性に染色されたが，faintで，Immunob−
lot上はdystrophinの低分子化を認め，PCR分析
でも欠失（＋）であった．
考察
著者ら1）は1989年に60kD及び30kD抗体を用いて，BlOマウスでは骨格筋のみならず脳にもdystrophinが発現し，免疫染色上neuronの膜が染色され，一方mdxマウスは脳でもdystrophinを欠如することを報告した．同様のモデル動物を用いた脳のImmunoblot所見はHoffmanら2）に
よって既に報告され，対照マウス脳ではdystro−
phinbandが発現するのに対して，mdxマウスではこれを欠くことが明らかにされている．ただ検体入手が困難なこともあって，ヒト健常者やDMDの組織についての成績はこれまで殆んど報告がない．今回健常対照及びDMDの剖検組織について検索したが，Immunoblot上，モテリレ動物で明らかにされている成績と類似の成績が得られ，免疫染色でもdystrophinは健常者のneuronの胞体表面に小斑点状に存在し，知能障害を有する
DMD例ではdystrophinを欠くことが明らかになった．dystrophinのmRNAがヒト骨格筋や心筋のみならず，微量ながら平滑筋や脳組織にも存在することが既に明らかにされていた3）が，今回の成続はこれらの成積に合致する結果と思われる．
DYS−1，3，60kD抗体などでは脳にdystrophinが発現するのに対し，DYSq2（ヒト骨格筋のC末端を認識する）ではdystrophinが発現しなかったのは，dystrophinの4つの領域の中でも，特にC末端領域は骨格筋，平滑筋，脳型と組織によってアミノ酸組成に違いがみられ，DYS−2は骨格筋や平滑筋のdystrophinを認識しても，脳のdys−
trophinは認識していないことによるものと思われる．免疫電顕による検索で，Lidovら4）はdystro−phinが対照マウスneuronのpostsynapticmem−
braneに局在することを報告している．ヒト脳についての免疫電顕所見についての報告はまだ行われていないが，Lidovらと我々の免疫染色パターンの類似性，並びにpreliminary studyであるがラット脳の免疫電顕所見でも同様の成積が得られ，ヒトでもpostsynapticmembraneに存在する可能性が充分考えられる．DMD患者では高率にIQ異常が認められ，その原因については前述したように種々論議されてきたが，本研究を通して，本来neuronに存在すべき脳型dystrophinをDMD
恩児が欠除していることが，IQ異常に結びつくことが示唆される．DMD／BMDの骨格筋で明らかにされたように今後知能障害程度と脳型dystro−
phinの量的・質的異常の関連を更に詳細に検討することが，まだ明らかになっていないdystrophinの生理機能を解明する上でも重要と考えられる．
一方BMDのPCR分析では50％に欠矢を認めたが，Exon3ケ以下の短い欠夫が12／15例と多数を占めた．PCR所見とImmunoblotによるdys−
trophinの分子量との関係ではExonの欠矢が3ケ以上の例では通常のSDS−PAGEでdystro−
phinの分子異常を検出可能な例が多数を占めたが，Exonの欠矢が1ケあるいは欠失（一）例では正常対照とdystrophinの移動度に差が認められ−139−

ない例が多数を占めた．Hoffmanの54例のBMDの分析5）でも，約15％に正常分子量のdystrophinをもった症例が報告されているが，恐らくこれらの症例は欠失距離が短く，通常のSDS−PAGEでは対照との間にdystrophinの移動皮に差がでない症例と思われた．免疫染色では16／18例はいわゆるpatchystain像で，BMDにcompatibleな所見を示したが，2例では全問性に染色され免疫染色所見のみでは誤診する恐れがあり，PCR分析及びImmunoblotを合わせて判断することが重要と思われた．日本のBMD例は欧米に比して，欠失距
艶の短い例の頻度が高い可能性があり，今後更に文献1）UchinoM，ArakiS，etal：MuscleNerve12：
1009−1016，1989．

2）HoffmanEP，HudeckiMS，etal：Niuronl：
411−420，1988．

3）ChellyJ，KaplanJC，etal：Nature333：858−
860，1988．

4）Lidou HGW，Byers TJ，et al：Nature348：725−728，1990．

5）HoffmanEP，KunkelLM，etal：Neurology

多数例での検討が必要と思われる．

−140−

39：1011−1017，1989．

26）Becker型筋ジストロフィーにおける異常ジストロフィンの二次元電気泳動による解析
＊
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谷橋遠

†

大佐田

研究協力者

ジストロフィンは分子量は427kDa，等電点は5．5，長さ125nmの細長い糸状の蛋白質で，骨格筋の表面膜に局在している．N一端にはactinに親和性を持ったペプチドがあり，筋収縮蛋白と結合し，C一端の近くにはcysteineを多く含んだペプ
チドがあり，筋の表面膜の糖蛋白質と結合している．また，中央部は類似したペプチドの繰り返し構造をしており，2ヵ所にプロリンを多く含む部分があり，この部分は屈曲しやすい構造をしている．この屈曲しやすい部位によって，ジストロフ
ィン同士で6角型の網の目構造を構成し，筋の表方法
既に報告した（1）のように，摘出した筋組織を4M塩酸グアニジン含溶液で処理した後，0．15
MKCl溶液に対し透析し，ミオシンの大部分を沈澱として取り除いた．上清を，5M尿素含溶解液に対して透析した後，二次元電気泳動法により分推した．分離した蛋白質は銀染色した後，観察した．また，ジストロフィンはPVDF隈に転写した
後，ジストロフィンに対する単クローン抗体AIC，Dysl，Dys2，Dys3，4C5および5E2を使って，Western Blottingにより検出した．

面膜を裏打ちすると共に，筋の収縮弛緩に応じて，伸び縮みしていると考えられている．さて，この結巨大蛋白質はDuchenne型およびBecker型筋ジ単クローン抗体AICによって認識される
スポット

ストロフィーで顕著な異常を認める．即ち，Du−chenne型筋ジストロフィーではほとんどの例で完全欠損している．Becker型筋ジストロフィー
では，ジストロフィンの分子量が，正常より大きかったり，小さかったりしている．ここでは，Becker型筋ジストロフィー（以下，BMDと略す）のジストロフィンの多様性について，二次元電気泳動法を用いて検討した．

■㈲東京都神経科学総合研究所分子研究系神経生化学＊＊帝京大学医学部神経内科＊＊■愛知医科大学神経内科＊＊■＊国立精神・神経センター神経研究所†東京都立神経病院

果

筋蛋白質を二次元電気泳動で分離し，奴染色（図1A）及び，AIC抗体によるWesternBlotting（図1B）で蛋白質の位置を観察した．図1Cには鋭染色で認められた蛋白質（図1A）の位置を図形化し，WesternBlottingで認められた蛋白質（図1B）の位置を示した．症例1は正常対照として用いた
Parkinson病患者の骨格筋であるが，図1Cに番号1で示した位置に一致してAIC抗体に反応するスポットが，ただ一つ検出された．この位置は分子量約420kDa，等電点約5．5である．症例2は23歳のBMD患者筋で，症例1で観察された正常対照筋と同じ，1の位置に一致するスポットが認められた．この例は，位置は正常であるが，量が著し

−141−

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図1二次元電気泳動で単クローン抗体AICによって検出される蛋白質 （A）銀染色による検出．（B）Westernblottingによる検出 （C）銀染色で観察された蛋白質の位置（黒く塗I）
つぶしたスポットはAIC抗体で検出された位置を示す．番号はBMDにおいてAIC抗体で検出されたスポットの位置を示す）−142−

く減少していた．症例3は32歳のBMD患者筋で，ィンより分子品が大きく酸性よりのもの，4の位

3と5の位置に一致してAIC抗体に反応するス

置は正常ジストロフィンとミオシン重鎖の中間のポットが認められた．3の位置は正常ジストロフ

分子量で，正常ジストロフィンよりもやや酸性よィンよりやや分子量が小さく，ややアルカリより，

りのもの，6と7の位置はC−蛋白質に近い位置

5の位置はミオシン重鎖よりやや分子量が大きく，
正常ジストロフィンよりややアルカリよりのものに分子量のやや大きいものと小さいものであった．

である．症例4は8歳のBMD患者筋で，1，2，
4，6および7の位置にAIC抗体に反応するスポットが認められた．1の位置は正常ジストロフィンと同じ位置のもの，2の位置は正常ジストロフ

例のBMD忍者筋で観察されたスポットの位置に表

これら代表例で示したスポットの位置を基に，23
ついてまとめたのが，表である．23例の内17例において，3および5の位置の2ヵ所に，3例において，1の位置の1ヵ所に，1例において，3のBMD患者の骨格筋において単クローン抗体AICによって検出されるスポットの位置．
番号は図1Cに示したものに相当する．
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−143−

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q u ad rk op s b m o ris

3叩．240M ．
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M ．
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M ．
bico p s b ra ch ii

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M ．
q u ad rb op s b m o ris

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M ．
b k e p s b ra ch ii

に観察された3の位置の分子量および等電点は症例により分子量は330から400kDaの幅で，等電点位置の1ヵ所に，1例において，1，3および5の位置の3ヵ所に，1例において，1，2，4，
6および7の位置の5ヵ所にAIC抗体によってはp15．47から5．51の幅での変動が観察された．
ジストロフィン各部位を認識する単クローン抗体による検索検出されるスポットが観察された．つまり，BMD患者では，単一のスポットとして検出されること5の位置に観察される蛋白質が3の位置に観察される蛋白質の分解産物であるのか否かを調べるため，ジストロフィン蛋白質のN端，C端およびもあるが，2つから5つの組合せとして検出される方が多く，その内，3と5の2ヵ所の組合せが

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綜 譜 、
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＞
二
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∴ 十 買要言空 ‡温
鋸㍑批㍊紺勘 ＝・輿瀞折駅−H

茸

十
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鞘

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Z≡dO∝トSトロ

000N

嘉 誇
十
十 羞
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十
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十

十 ★
十
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十
十

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、
＋
十
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十
聾姥

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．鼓
垂
十
∞

鼓

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十

野

十

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≒

十十

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慰

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…
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禦離 婚 単組世印面酎
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遠洋 義莞適
：
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：
L
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：
1勢卑寓 ○野滝、 璧豊璧澄渡 妄諾 語
錬机
㌢数戒
苺
蹟 華∵
裟芸 濡
努 等鼓、
軒
、
港が
堰瀾 堅嬰せせ ′．
分等
増湧別鉄 桶 、
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が車座計
軍署 鰯
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ノ
黒 慧芸雪空 漂
学学歴血璧 禦 芝喪 か針畝強者○：
1
沈誉￣
hr 据 、
慢
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．
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帝塚 十十
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ノ
小郡矩 史
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翫 翫 ‡十 十十十十十十手如方…
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㌢雄絞 座 頭腐 針秘弾奏威厳）￣淡さ Yn 祝′
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静電 巌茫 ○ノ
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野鼠控隼鹿
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町亘亙牽 、
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智慧遥タ を威せ
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鳩 狩￥
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A

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、
ウ

烹
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鼓

ぎ

如 ＞
、
蒜 ㌫諾 意鳶 萱′
讃W 奉 鮎
野詠嘆
蹄宿廃 宣
字、
餞ノ
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〉癌
妙義廃車 親藩＼
還 違芸
鞘営農唇還 ノ
彗 貞
聖
顔襲撃
鎖些

㍍野苺
詳轟滝

．す脂心拍せGLトトで肇垂足﹂蟹堅．︸﹂婁り壷屋重鎮琴曾∑呈芸蒜．ト脂ふ義甚慧讐摺GNのえご3月哉ふ＝︶寸．Sh凸．MSh凸．Z凹S．U l
く笠褒八1白へ各点﹂荘重．烏ぐ挙り︶︵霊巴 霊山悪u宍痘二ヤヌト卑さて⁚下トロエ付言．す
信心車聾G芸置題に与t賜．鱒悼冬苦US刊軍票Z将士亘りてハ†卜n﹂下笹聖賢92烹−N阿S︐塾箭星川最も多く（75％の頻度）観察された．23例中17例

中央部をそれぞれ特異的に認識する単クローナル

44番目から50番目のExonにかけての欠矢が高頻抗体を用いて，WesternBlottingを行った．図2

度に観察される．正常ジストロフィンよりやや小に示すように，ジストロフィンのN端を認識する

さい分子読330〜400kDaの異常ジストロフィン

AIC，5E2およびDys3のみならず，ジストロの検出はこのホットスポット領域のExonのin−

フィンの中央部のN端よりを認識するDysl，frame−deletionによって，理解できる．一方，同およびC端を認識するDys2および4C5のいずれの抗体によっても，3および5のスポットは一患者で，時に，より低分子の異常ジストロフィンの検出が報告されてきたが，この異常ジストロ

検出された．このことはジストロフィンのC端，フィンに関しては，従来，BMDのホットスポット

N端及び中央部をそれぞれに保持した分子量と領域のExonの近くにコードされているプロリン

等電点の異なる2種の蛋白質が存在することを示を多く含む部分が筋組織中に存在する蛋白分解酵している．3および5の2ヵ所にAIC抗体で検出素によって分解され易く，このため，BMDではホされた他のBMD患者16例についても検索したとットスポットのinframe−deletionによって産生ころ，この症例と同様にいずれの抗体によってもされた異常ジストロフィンが分解されて，ホット

3および5の2ヵ所に検出された．

スポットよりもC端側を欠失した低分子のジス
トロフィン断片が観察されるとする説と，BMD
では何等かの原因でホットスポットの部位で，他の筋ジストロフィーとの比較
BMDの他，Duchenne型筋ジストロフィー5

alternativesplicingが起こり，それよりも下流の例，肢帯型筋ジストロフィー18例，顔面肩甲上腕C端部分が欠失した低分子ジストロフィンとin−型筋ジストロフィー1例，Floppyinfantl例，筋frame−deletionに含まれるExonのみが欠失し

緊張性ジストロフィー3例，福山型筋ジストロフ

たジストロフィンの2種類が観察されるのだとすィー1例，Parkinson病2例について，検索した．

る説が報告されている（2，3，4）．私達の実験

5例のDuchenne型筋ジストロフィーではジスト

結果は230kDa付近のジストロフィンにおいても，

ロフィン抗体に反応するスポットは全く検出されN端のみならず，C端も保持していることを示しなかった．他の症例では，正常ジストロフィンとている．これは従来の仮説では説明できない．

同じ，分子量および等電点の位置に観察され，ここで示したBMD患者筋で見られたようなジスト

BMDでは，Triple helical segmentをコードしている部位でalternative splicingが起こり易く

ロフィンの多型性は観察されなかった．よって，なっていて，いくつかのExonをスキップして読

3と5の2カ所に観察される異常ジストロフィン

まれることがあると仮定するならば，N端とC端の検出はBMDに特異的であると思われる．また，の両方を保持した2種類のジストロフィンが出現

BMDおよびDMDは伴性劣性遺伝をするが，こすることを理解できる．この場合，2種類mRNAの疾患のキャリヤーである母親の筋1例を検索しが出来ていることになる．この存在の有無を証明たところ，正常ジストロフィン以外に，異常ジス

することがこの問題を決着する鍵である．また，

トロフィンが観察された．

この異常ジストロフィンはBecker型筋ジストロ
フィー以外には観察されず，この疾患に特異的で考あったことは，DNAかはRNAへの転写の過程

察

BMDでは，分子量330〜400kDa，等電点
5．47〜5．51と分子量235〜250kDa，等電点に，この疾患に固有の異常が存在する可能性を示唆している．

5．5〜5．53の2種の異常ジストロフィンが高頻度に検出された．従来，ジストロフィン分子に関し

ま

と

め

て，Becker型筋ジストロフィーでは大小の多型

BMD患者の骨格筋のジストロフィンを二次元性が指摘されていた．BMDでは遺伝子解析から，電気泳動法とジストロフィン分子のC端，N端及−145−

び中央部をそれぞれに認識する単クローン抗体を文

献用いたWesternBlotting法を併用し検索した．こ

1）HoriS，etal：Detectionofdystrophinontwo

こで検索したBMD23例中17例において，ジスト−dimensional gel electrophoresis．Biochim

ロフィンのC端およびN端を保持した分子量とBiophys Res Comm161：726−731，1989．

等電点の異なる2種の蛋白質が同時に存在するこ

2）Hoffman EP，et al：Characterization ofとを兄いだした．この異常ジストロフィンの存在

dystrophininmuscle−biopsyspecimensfrom

はBMD以外の筋ジストロフィーでは観察されず，

patientswithDuchenne

この疾患に特異的であった．さらに，従来，BMD

sorBecker，smusCu−

lar dystrophy．New EnglandJ Med318：

で観察される低分子のジストロフィンは高分子ジ

1363−1368，1988．

ストロフィンの蛋白分解酵素による分解産物ある
いはBMDで欠矢の頻発するExon部位より下流

3）Beggs AH，et al：Additional dystrophinを欠くalternative splicingによる産物であるとresultsfromproteolyticcleavageatdeletionの説であったが，ここで兄いだした結果はジスト

junctions．AmJMedGen44：378−381，1992．

ロフィン分子の中央部をコードしているExonの4）Vainzof M，et al：Additional dystrophin

いくつかをスキップするようなalternativesplic−ingがBMDでは高頻度に発現していることを示

fragmentin Becker Muscular Dystrophy

唆する．

DNAdeletion．AmJMedGen44：382−384，

fragmentinBeckerMusculardystrophymay

Patients：Correlation with the pattern of
1992．

ー146−

27）筋ジストロフィー赤血球膜ジストロフィンファミリーの検索およびPCR法によるジストロフィン遺伝子欠失診断
濱

研究協力者

竹

中

均＊

稔＊

田

丸

山

塩 坂 孝 彦＊＊ 仲
井 上 兼次郎＊＊＊

地

は じめに
筋ジストロフィー（筋ジス）の確定診断に用いられる筋生検は患者に苦痛を与え，同意を得ることも困雉である．患者に苦痛を与えることなく本症の診断に用いうる新しい方法の確立が待たれる．
本研究の目的は，血液を試料として確定診断や重症度判定のみでなく保因者の検索にも応用可能な方法を探ることにある．前年度1）に引続き，本症の患者・息児の血液からリンパ球を分艶してその遺伝子の欠失部位を同定した．また，その欠夫が赤
血球タンパク質の組成に影響するか否かを調べるため，赤血球膜ゴーストを調製してその構造タン
パク質の定性的分析を進めた．
筆者の一人（MH）ら2）は，デュシェンヌ型患者の赤血球に低浸透圧処理を加えると，健常者の赤血球と異なってアデニル酸キナーゼおよびヘモグ
ロビンの漏出が著しく加速されることを報告した．
この赤血球膜の脆弱性は，膜の物性の異常のほか
スペクトリンを含む細胞骨格タンパク質の変異に

英

晴＊

佐

田

栄

司＊＊

剛＊＊＊吉 原 明 子＊＊＊存在様式は，骨格筋形質膜におけるジストロフィン（DYS）一糖タンパク質複合体のそれとよく似た構造をとることが予想される．筋細胞における膜の裏打ちタンパク質であり，スペクトリンとの類似性5ト7）からスペクトリンファミリーの一員でもあるDYSの欠損が本症の病因として認定されている事実を考慮すると，赤血球膜の裏打ちタン
パク質であるスぺクトリンの分析，特にDYSと関連した分析は興味深い．
方法

今回の検索の対象は国立療養所宮崎東病院に入院加療中および在宅で療養中の患者・患児で，表1にまとめた構成を示す．その内訳はDuchenne
型およびBecker型（DMD／BMD），20名；Limb−Girdle型（L−G），17名：福山型先天性筋ジス（FCMD），4名；顔面肩甲肢帯型（FSH），2名：
その他の神経筋疾患，8名の合計51名であった．
およそ7mlの血液を同意の上採取して4℃で保質（Band3タンパク質など）や膜表在性タンパク質（アンキリンなど）と結合することが判明している3）4）．これらの赤血球膜の裏打ちタンパク質の有し，採血後3時間以内に赤血球とリンパ球の分離を開始した．
【赤血球とリンパ球の分取〕
EDTA（Na2）加血液3，5mlを3mlのモノポリ分離溶液（Flow Laboratories）に重層し，20℃■宮崎医科大学衛生学＊＊愛媛県立医療技術短期大学＊＊＊国立療養所宮崎東病院

で1，000×g（r8，。）30分遠心した後，同社のプロトコールにしたがって赤血球とリンパ球を分取した．
直ちに赤血球はゴーストの調製に供し，リンパ球起因する可能性が高い．スペクトリンは赤血球膜の細胞質側に存在して，種々の膜内在性タンパク−147−

表l Patients profile

表2 01igonucleotide primer sets used

No．

Sex A9e Dia卯OSIs

A9−01

H lO DMD

87−07

F

38

Ⅰ一G

A9−02

M ll DIID

B1−12

F

37

1∠；

A9−03

H

15

DMD

87−1：I r JI3

A9−04

F

23

DMD

B1−1JI M J柑

A9−06

H

18

DIjD

B7−15

F

51

u；

A9−07

H

12

DMD

B1−17

F

32

1−G

A9−09

H

14

DHD

B1−19

H

43

A9−11

H

17

DHD

B7−20

F

31

A9−13

H ll DMD

B7−21

F

40

LG

A9−14

M

18

DH8

B7−22

F

28

1．G

A9−15

M

18

DM8

B7−25

F lO LG

人9−16

H

21

DMD

B7−10

37

A9−17

日

17

DMD

B7−11

f■

A9−18

M

41

BMD

A9−05

F

2JI DMD

B1−24

H

7

87−27

F

A9−20

M

A9−23

M IJI DMD

M

Ⅰ．G

LG

1．G

FSll

40

rCMD

FCHD

H

FCHD

M

18

DMD

87−28

F

20

DHD

A9−08

H

58

B1−05

H

17

DHD

A9−21

日

57

A9−10

F

▲9−12

I1

A9−1，

H

B7−01

F

B7−02

M

B7−03

F

31

A9・一22

F

LG

B1−06

F

55

LG

B1−08

F

58

LG

B7一〇，

44

LG

B7−23

38

LG

B7−26

58

LG

FCHD
T

B7−04

H qT BIID

FSA

27

A9−24

B7−16

1G

J13

0therS

分静置した．4℃で15，000×g，30分の遠心を，沈澱の色が薄ピンクを呈するまで繰り返し，沈澱は最終的に−80℃で冷凍保有した．

0therS

24

0thers52

0LherSH

8

0亡hefSH

4

0thergF

ン酸緩衝液（4℃）に加えてよく混和し，氷上30

0thers0thers4153524︒41︒179諾6128︒1243369︒2273︑83481861415︒935

Sex Aqe Di的nO515

Pm134681317197
44
39
朋5
40
55
4152

Exon SizooIProducts
No．

約8Jgのタンパク質を含む赤血球膜ゴースト
標品に含まれるポ））ペプチドを，LaemmlilO）の方法に基づいたSDS存在下2時間の6％ポリアク

は一80℃で冷凍保有した．
〔遺伝子欠失部位の同定〕
今年度はChamberlainら8）のプライマーに加えてBeggsら9）のプライマーおよびプロモーター（Pm）塩基の配列に基づいたプライマーも分析に用いた（表2）．粗プライマーをミリジェンDNA
合成装置を用いて合成し，55℃で10時間のNH。処理により脱保護した後精製して用いた．
リンパ球は0．9％NaClで遠心洗浄（2，500×g，
30分，3回）し，プロテアーゼ処理，フェノール／CHC13抽出法による除タンパク質後，フェノール
沈澱法でDNAを回収した．PCR法によるDNA
増幅（アステック社）は，93℃で1分の熟変性，
55℃で1分のアニーリング，70℃で2分の伸長反
応を30サイクル繰り返した．
〔赤血球ゴースト膜タンパク質の分析〕
赤血球画分を集めて0．85％NaClに浮遊させ，20℃で1，000×g（ra，。），30分遠心した．よく浮遊させた沈澱約2mlを35mlの16．6mM（低張）リリルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAGE）で分乾
し，CoomassieBrilliantBlueR−250（CBB）で染色した．SDS−PAGEゲル中のポリペプチドは25mM Tris，192mM Glycine，0．05％SDS，40％methanol中，15mV，90分通電してイモビ
ロンーP（Millipore社）に転写（TEFCO社）した．転写膜上のポリペプチドは金コロイド（Amer−
sham社）で染色して同定した．イムノブロット法
による解析には，膜上のポリペプチドに種々の細胞骨格タンパク質に対する一次抗体を結合させた
後，ABC法（VectastainElite，VectorLabora−
tories）で染色した．一次抗体の抗原は赤血球スペ
クトリン，神経細胞スペクトリン，神経軸索スペクトリン（以上はChemiconInternational，Inc．，
USA），アンキリン（Transformation Research，
Inc．），およびDYSのロッド領域（DYS−1，アミノ酸残基1181−1388），C末端領域（DYS−2，アミノ酸残基3669−3685）およびN末端近傍領域（DYS−3，アミノ酸残基321−494）（以上の抗DYS
抗体はNovocastraLaboratoriesLtd．）である．

−148−

Del帥0nScr88r刷90日〕ysVophlnG即18

M C

1

2

3

4

M C

1

2

3

4

LG

B7−04；4，B7−05．

反応に用いた一次抗体の濃度は特記しない限り各社のrecommendationにしたがった．
結果と考察（1）PCR法によるDNA増幅と欠失部分の検出
今回はChamberlainらに加え，Beggsらのプラ
イマーおよびPm部分に対応するプライマーの3種を用いて，合計17種類のexonについて検索した（表2）．図1には典型的な増幅像を示した．
欠夫の存在は3回以上PCRを繰り返して確認した．特にexon8，19，45，50，51およびPmについては，プライマー3対ずつを用いた増幅処理により欠夫の有無を再確認した．全ての試料について分析した結果を図2に模式的に示した．病型に関わらずPm領域に欠夫はなかった．DMD／
BMDの20例中15例（75％）に部位・長さが一様ではないが欠矢が検出された．欠矢の頻度が高かったのはexon47（10例）であり，eXOn45，47，49のいずれかを欠失しているものは12例に及んだ．L
Gで欠夫が見られた2例は共に男子症例であった．
A9−19はexon45，47が欠失LBMDである可能性を否定できない．他の病型ではDYS遺伝子に欠矢は無かった．
以上の結果から，PCRを用いた診断法はMMFMMMMMMMMMMMMMFMMFMMFMFFFFMFFMFFFFMFFMFMMMFFFFMM

A∵AA

20
30
40
60
7D
9l
1l
3l
4l
5l
6l
71
8
0
31
40
40
50
6
0
2
9
0
11
2
■
1
．
2
2
0
0
．
1
0
1
1
1
■
−1
12
23
27
22
23
14
15
07
29
20
21
02
25
20
01
05
04
2788126893
9 9 9鵬崇捕霊霊霊宝欝87耶霊舶87即87即87即即87訂即即断訂即即舶即即即霊朋即即即87

図1PCRによる増幅像．用いたプライマーを各図の右側に示した．M，サイズ標準（100base
ladder）；C，対照群；1，B7−02；2，B7−03；3，

101
51
2
8
1
2
3
1化
1け
81
11
7
81
4
21
1
82
1
24
7
0川
3
11
1
75
4558叫38
38
5
1
0
1
8
4
3
3
0
7
8
2
4
30
72
47
37
47
86
55
78
35
27
4434124528

No，Sex Age

図2 DYS遺伝子欠失部位．Aは入院加療中の・
Bは在宅加療中の患者・息児を表す．

DMD／BMDの確定診断に有用であると結論できる．また，DNA抽出にはフェノールのみよりもフェノール／CHC13を用いた方が再現性がよいことが判明した．しかし1組のプライマーで増幅されてもmultiplex PCR法では欠矢として観察される症例もあったことから，PCR法による診断には，DNAprobeを用いたSouthernblotに加え，連鎖解析を併用した正確な臨床所見と病理所見が不可欠であろう．
（2）赤血球膿ゴーストのポリペプチド組成とイムノ
ブロッテイング（1）の解析でexonの欠矢を示した代表的なもの
9例と臨床症状はL−Gでありながら欠夫のないもの1例，および病型が不明の1例を対照群と比較した．SDSrPAGEの結果，病型に依存した特異的な変化はみられなかったが，個体間では見かけ上の差異が存在した（図3）．DNAの欠失部位とー149−

バク質の分布についても分析することが重要であAろう．
転写後のイモビロンーP上のポリペプチドの分布にも顕著な差異はみられなかった（図3B）．転写操作には高分子量のポリペプチドが転写される条件を設定したが，金コロイド染色像が示すように分子量240kDaのα−スペクトリンからアクチンと等しい分子量である約43kDaのポリペプチ
ドに至るまでのポリペプチドが存在しており，イ
ムノブロットに適した条件で転写されたと言える．
しかしながら，スペクトリンに関してはαよりもβの転写が優位であった．この事実はイムノブロット像からは必ずしも定量的な議論ができないことを示す．
抗スペクトリン抗体を一次抗体としたイムノブ
ロットの結果を図4に示した．抗赤血球膜スペク
トリン抗体を用いた場合（図4A），抗体濃度を1／2000に希釈しても病型に関わらず多くのバンドが染色された．一方，抗神経細胞・樹状突起スペク
トリン抗体を用いると（図4B），両スペクトリン
ポリペプチド鎖が染色されたがβ−スペクトリン
図3

AはSDS−PAGE後CBBで染色した．BはイモビロンーPに転写後金コロイドで染色した．分子量マーカーを参照して構成ポリペプ
チドの位置を右に示した．

が優位であった．この事実は，抗赤血球スペクト
リンで見られた多くの染色バンドがスペクトリンの分解物に由来する可能性が低いことを示唆する．
他方，抗神経軸索スペクトリンでは染色されなかった．したがって，抗赤血球スペクトリンによるスペクトリンの量に相関がある可能性は低かった．
膜内在性タンパク質であり，アンキリンなどを結合するBand3タンパク質は明瞭な染色像を与えなかった．アクチン・スペクトリンなどと結合複合体を形成する膜表在性タンパク質であるBand
4．2タンパク質に該当する分子量およそ70kDa付
近のポリペプチドについては，A9−06 と A9−19が他の試料と比べて見かけ上低い含量を示した．
これらの個体差は少なくとも年齢には関係はしない．赤血球ゴーストの調製には高い再現性を保証すべく注意を払ったので，個体問にみられたこれらの差異が調製時に発生したとは考え難い．本研
究ではCBBで染色したため，糖タンパク質などが明瞭に現れていない可能性がある．今後定量的に分析することのほか，糖タンパク質やリボタン染色は非特異的な吸着に由来する可能性が高い．
抗アンキリン抗体を一次抗体としたイムノプロッ
ト像でも病型に依存した差異は無かった（図4C）．興味深いことに病型との関連は明確ではなかったものの，抗アンキリン抗体はいくつかの症例についてスペクトリンを染色した．
3種の抗ヒト・ジストロフィンモノクローナル
抗体（DYS−1，DYS−2およびDYS−3）を用いたイムノブロット像を図5に示した．DYS−1を一次抗体としたイムノブロットでは，病型に関わらず数本の染色帯が見られ，アンキリンの高分子
量部分に比較的鮮明な染色帯が検出された．スペ
クトリン領域ではβ−スペクトリンが優位に染色された．これは金コロイド染色が指摘した量的な問題によるのかも知れない．DYS−2を一次抗体

−150−

図4

抗赤血球スぺクトリン（A），抗神経細胞体ス
ペクトリン（B），抗アンキリン（C）抗体を一次抗体としたときのイムノブロット像．金コ
ロイド染色像での位置を参照したポリペプチ
ドの位置を右に示した．

図5

ー151−

抗DYS抗体を一次抗体とした時のイムノブ
ロット像．A，DYS−1；B，DYS−2；C，DYS−3．金コロイド染色像での位置を参照したポリペプチドの位置を右に示した．

とした場合もDYS−1で得られた結果とほぼ同じであったが，低分子領域での染色は軽微であった．
DYS−3を一次抗体としたときには，スペクトリ
ンの染色はきわめて希薄であった．いずれの抗体

巨大分子に対して易漏出性を示す事実に関する分子レベルでの根拠は解明されなかった．しかしながら，DYSとスペクトリンが免疫学的に相同性を示す可能性が示唆されたことから，筋ジスの病因についても病型に依存した差異は顕著ではなかった．これらの結果は，赤血球スペクトリンには
DYSのロッド領域と類似した抗原構造が存在す
るが，N末端近傍は類似性が低いことを示唆している．今回の研究結果は，スペクトリンがDYSと共通の抗原性を持つことを示唆したが，分析手法の解明に，赤血球膜の構造および速度反応論的なアプローチが重要であることを指摘できた．
文1）潰田 稔，塩坂孝彦，竹中 均，丸山英暗，佐田栄司，仲地 剛，井上謙次郎，澄田道博：筋が定性的なものであった．今後の課題として定量的な分析を進めることに加えて，本症におけるスペクトリンやアンキリンの遺伝子の構造やその発現様式を調べ，健常者のそれと対比して解析を進めることが重要であろう．
まと献

ジストロフィー組織ジストロフィンファミリーと生体膜積能． 厚生省「精神・神経疾患研究委
託㌍」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木址）平成3年度
研究報告書，1992，pp90−94．
2）KubySA，HamadaM，NessetCC，TylerFH
and Ziter FA：Biochemistry of Metabolic

め

DMD／BMD，L−G，FCMD，FSHを含む種々の筋疾患患者・息児の血液を試料として，リンパ球からDNAを抽出してDYS遺伝子の欠失部位を同定した．また，同時に調製した赤血球膜ゴー
ストの細胞骨格タンパク質の質的変化について，種々の抗細胞骨格タンパク質抗体を用いたイムノ
プロット分析を加えた．DYS遺伝子の欠夫はL−
G症にも僅かに検出されたがDMD／BMD症に高頻度に見られた．DMD／BMDにおいてDNAの欠矢の部位は一様ではなかったが，頻度として
exon45，47，49の欠矢が高かった．DNA欠失部位
及びその長さと赤血球ゴースト股のスペクトリン
含量の問には密接な関連は兄いだせなかったが，Band4．1タンパク質の含量に差異が見られた．赤
血球の細胞骨格タンパク質であるスペクトリンが筋型DYSのロッド領域およびC末端領域と相同性を有することが定性的に示唆された一方で，今後の問題としてデンシトメトリーを含む定量的解
析の重要性が指摘された．今回の研究結果からは，筋ジス患者の赤血球がアデニル酸キナーゼなどのProcesses（edbyLennonDLF，StratmanFW＆Zahlten RN）EIsevier Biomedical，New
York，1983，pp303−322．
13）LunaEJandHittAL：Science258：955−964，
1992．

4）DaviesKAandLuxSE：TrendsinGenetics
5：222−227，1992．

5）Koenig M，Hoffman EP，Bertleson GJ，MonacoAP，FeenerCCandKunkelLM：Cel1
50：509−517，1987．

6）BryanJandKaneRE：JMoIBiol125：207−
224，1978．

7）LouvardD：Curr．TopicsCellBioll：51−
57，1989．

8）ChamberlainJS，GibbsEJ，NguyenPN and
Caskey CT：Nucleic Acid Res16：11141−
11156，1988．

9）BeggsAH，KoenigM，BoyceFMandKunkel
LM：Human Genet86：45−48，1990．
10）Laemmli UK：Nature227：680−685，1970．

−152−28）筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの
脳型及び筋型プロモーターの検討
斎 藤 加代子＊
研究協力者

佐久間
泉＊ 山 内 あけみ＊ 原 田 隆 代＊
池 谷 紀代子＊ 森 田 玲 子＊ 福 山 幸 夫＊

は じめに
ジストロフィンは骨格筋のみならず，鱒にも発現している．骨格筋は筋型プロモーターにより，む），BMD6例，中間型1例，FCMD14例においてDQまたはIQテストを施行した．これらの患神経細胞は，脳型プロモーターによりコントロー者の遺伝子変異はChamberlainら4），Beggsら5）ルされているl）．Boyce，Kunkelら2）により筋型プロモーターの90kb以上の上流に，脳型プロモータ

叩Or叩ーが位置していることが明らかになった．そして，
01

その臨床的意義について検討がなされつつある．
一方，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）

00の約30％に非進行性知能障害を認める．患者のIQ

09は平均約80であり，初期には言語性IQの低値が目立つことが知られている3）．脳におけるジスト

000

ロフィンや脳型プロモーター領域の異常が，筋ジストロフィー患者の知能障害の病態に何らか関与

07

するのではないかと考えられてきている．

0
6

我々は，DMD，Becker型筋ジストロフィー（BMD），福山型筋ジストロフィー（FCMD）の患

0
5者のDNAを用いて，筋型及び脳型プロモーター△
l【temediatt！

0
4

について調べたので報告する．

0
3

対象と方法

0
2

対象はDMD39例，BMD6例，中間型1例，
FCMD23例，非福山型と考えられたCMDl例である．この1例は臨床的にはCMDと診断していたが，ジストロフィン遺伝子の欠夫を示し，特異な経過のDMDと考えた．これらの症例のうち，DMD23例（先に述べた臨床診断CMDl例を含＊東京女子医科大学小児科
−153−

図1

ジストロフィン遺伝子変異を調べた筋ジ
ストロフィー患者で，知能テストを施行した症例のDQまたはIQの分布．

のmultiplex PCRとcDNAプローブを用いた
Southern blotによって判定した．筋型プロモーを図示すると図1のように，DMDでは平均77，
BMDでは平均94であり，我々の症例では有意差

ター，脳型プロモーター領域の塩基配列の一部をはなかったが，一般にはDMDでは，BMDより有意に低値を示すと言われている．IQ70以下の症例
はDMDでは39例中10例（26％）であったが，BMD
6例共に75以上であった．FCMDに関しては，知能レベルを見ると，平均34であり，仝例70以下でプライマーとして，PCR増幅を行った．
結果

DNAを分析した患者のDQまたはIQの分布

‡1

2

3

図2

図3

4

5

6

7

8

9

柑lト1ほ13141516

DMD患者の筋型，脳型プロモーター領域のPCR増幅．
ェクソン12または51をプロモーターと共に増幅した．

cDNAプローブを用いたSouthernblot法．ェクソン1−7の欠矢を示した．
−154−

あった．

木ビネ一式で98であった．13歳でハム無線免許，
17歳では英検3級，その後，簿記3級を取得して，障害者労働自立センターに勤務し，ワープロの仕事を行っている．21歳におけるIQテストは
WAISLRにて85であり，言語性IQは97，動作性
IQは75であった．

DMD患者の筋型，脳型プロモーターのPCR増幅の結果を図2に示す．ェクソン12またはエクソ
ン51を，プロモーター領域と共に増幅した．1ane
7において筋型，脳型プロモーターとも欠失していた．この症例の臨床像，特に知能面に関して以下に述べる．
症例は21歳．運動機能障害の進展は典型的なCDNAプローブを用いたSouthernblot法では，
図3のように，この症例はエクソン1〜7の欠夫

DMDである．7歳11ヵ月に行ったIQテストは鈴を示した．以上に示すように，本症例は知能障害

51

2

3

4

5

6

7

8

9

柑11121314

a：brain promot即b：muscle promoter
e：exon12

図4

CMD，FCMDにおけるジストロフィン遺伝子の筋型，脳型プロモーター．全例で異常なかった．

8rO〔80I

dYStr坤仙gme
10

20

30

40

50

→■−
A
一一

図5

60

D■D
一一

ht■t血

⊂＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ 8MD

ジストロフィン遺伝子の欠失領域とDQ，IQとの関係．
−155−

文

がないにも拘わらず，エクソン7より上流の脳型
プロモーターを含むジストロフィン遺伝子の5

献1）Feener CA，Koenig M and Kunkel LM：

端の欠失を示していた．また，先天型については，

Alternative splicing of human dystrophin

ジストロフィン遺伝子の筋型，脳型プロモーター

mRNA generatesisoforms at the carboxy

ともに全例で異常はなかった（図4）．

terminus．Nature338：509−511，1989．
2）BoyceFM，BeggsAH，FeenerCandKunkel

考察

LM：Dystrophinistranscribedinbrainfrom

患者のIQ，DQを縦軸にして，ジストロフィン

adistantupstreampromoter．ProcNatlAcad

遺伝子の欠失領域を図示した（図5）．Rapaport

Sci USA88：1276−1280，1991．

ら6）はエクソン52はDMDの知能に関係するので3）Marsh GG and Munsat TL：Evidence forはないかと報告しているが，我々の調査ではエク

earlylmpalrment Of verbalintelligencein

ソン52の欠失例の4例のうち1例はDQ112であDuchenne muscular dystrophy．Arch Disった．症例数が少ないのが，特定のエクソンの欠Child49：118−125，1974．

夫と知能障害との関連は明らかではなかった．本

4）ChamberlainJS，GibbsRA，RanierJE，etal：

症例は知能障害がないにも拘わらず，エクソン7

MultiplexPCRforthediagnosisofDuchenne

より上流の脳型プロモーターを含むジストロフィ

muscular dystrophy．InInnis MA，（ed byン遺伝子の5 端の欠矢を示した．

GelfandDH，SninskyJJ＆WhiteTJ，）PCR

ジストロフィンはニューロンのpost synaptic

ProtocoIs：AGuigetoMethodsandApplica・

membrane上に発現しており，脳におけるジスト

tions，Academic Press，New York，London，

ロフィンの欠損や脳型プロモーターの異常が知能障害と関係しているのではないか推定されている．

1990，pp272−281．

5）Beggs AH，Koenig M，Boyce FM，et al：

しかし，我々は脳型プロモーターの欠失，すなわ

Detection of

ち脳におけるジストロフィンの欠損のみによってdeletionsbypolymerasechainreacton．Hum

DMDの知能障害を説明することは困雉であろうと考えた．Barら7）はジストロフィン遺伝子の398％

of DMD／BMD gene

Genet86：45−48，1990．
6）RapaportD，Passos−BuenoMR，Brandao L，端から転写される6．5kbのmRNAを発見し，さetal：Apparent association ofmentalretar−

らにこれはジストロフィンのC−terminalとシス

dation and specific patterns of deletions

テインリッチドメインのみを含んでいる70．8kD

SCreenedの蛋白をコードしていると述べている．これは，Duchenne muscular dystrophy．AmJ Med

骨格筋には発現が少なく，脳，肝臓，葦丸に多い

Genet39：437−441，1991．

と報告している．DMDの知能障害にはこのようwith probes cf56a and cf23ain

7）BarS，Barnea E，LevyZ，NeumanS，Yaffe

な転写産物の関与の可能性もあるかもしれない．

D and Nudel U：A novel product of the

本症例は，脳におけるジストロフィンと知能障害との関係を明らかにしていくうえで貴重な症例でDuchenne muscular dystrophy gene whichあると考えた．

greatly differs from theknownisoformsin
itsstructureandtissuedistribution．Biochem
J272：557−560，1990．

−156−29）Southern blott法，neSted PCR法，Pulse Field Gel
Electrophoreisis（PFGE）法により保因者診断を行った
Duchenne型筋ジストロフィー家系
斎 藤 加代子＊
研究協力者

山 内 あけみ＊ 原 田
森 田 玲 子＊ 佐久間隆

代＊ 池 谷 紀代子＊
泉＊ 福 山 幸 夫＊

は じめにDuchenne型（DMD）およびBecker型（BMD）
筋ジストロフィーの女性保因者の診断は臨床的に重要な役割を持ち，従来の家系調査，血清CK値の測定に従っていた．近年，Southern blot法やPCRによるDNA分析など種々の分子遺伝学的分析が可能となった．cDNAプローブを用いた
Southern blot法において．遺伝子欠夫を有する家系でjunction fragmentを認めない場合には，gene doseにより保因者診断を行うが，より確実な解答を得る努力が必要である．
我々は，DMDの1家系に関して，家系分析，血清CK値測定と並んで，CDNAプローブを用いた
Southern blot法，1）ンパ球由来RNAのnested
PCR法，pulsefieldgelelectrophoresis（PFGE）
法の3通りの分子遺伝学的保因者診断を行った．
対象
DMDの兄弟発症の家系（図1a）．2人の男児は典型的DMDで，母親および2人の女児は無症

図1DMD家系における家系図CK値South−
ern blot法の結果
a）家系図および血清CK値b）Southern blot法のテンシトメータ
ーによる分析

状である．母親の兄弟にDMD確実例が1人，疑い例が1人いる．
方法

1．家系図を作成し，女性における保因者の可能性を検討した，＊東京女子医科大学病院小児科

高値とした．

2．家族構成員の血清CK値測定．150U／L以上を−157−

3．患者および家族の末梢血リンパ球からDNA

2．本家系の血清CK値は，父親および長女ではを調製，CDNAプロNブを用いてSouthen blot，

正常範囲内，母親および次女では軽度高値，患児

ハイプリグイゼ→ションを行い，デンシトメータ

2人は著明高値を示した（図1a）．

ーによりgene doseを調べた．
4．nestedPCR法りによりmRNAを調べた．患3．Southernblot法のgenedose分析の結果，者および家族のリンパ球より調製したRNAZ）を

2人の患児ではシグナルa，b，d，は欠失しておりexon48−50が欠失領域であることがわかっ

reverse transcriptase（BMR祉）によりcDNA

た．母親，および2人の女児では患者の欠夫に相とし，これをtempelate DNAとして，図2に示当するa，b，d，が1コピー分しかないことかす2組のprimerを用いてPCRを2回行い増幅ら保因者であると考えられる．一方，長女はすべした．このPCR産物を電気泳動した．

てのシグナルが2コピーであり，正常女性パター

5．PFGE法3）を用いて保同者診断を行った．

ンであった（図1b）．

対象家族のリンパ球をアガロースゲルブロック

4．nestedPCR法によるmRNAは，患児2人で中に封入し、SfiI（BMR祉）処理後．CHEF−

はジストロフィン遺伝子に欠夫があるため小さなDFTMIIシステム（BioRad）で20時lH］泳動，South−

サイズ463bpのバンドのみが認められた．母親では，患児2人と同じように異常サイズのバンドのern blot，CDNAプローブ8を川いてハイプリグ
イゼーションを施行した．
結み，次女では463bp，860bp両方のサイズのバンドが検出され，いずれもジストロフィンmRNAに
果異常があると考えられた．長女では正常サイズの1．家系図から，母親は兄弟と息子が患者であるのでdefinitecarrier，2人の女児はその兄弟が患

860bpのバンドのみが検出された（図2）．

者であるのでpossible carl・ierと考えられる（図るDNA分析を行った．図3のa，b，Cのように

1a）

父親と長女では正常パターンのシグナルが3本認

5．PFGE法を用いて，より高分子レベルにおけめられたが，患児2人では正常サイズのバンドは
46 暮
47 14 8 14 9
l
146 暮
47

；
一
ミ
く
．
；
…・
：
リ

5（
）
t 5 日 52≡
妻吾
妻
1 5 1 1 52

lを認めた．母親と次女では，正常パターンの3本

／
SF
椚

′

認められず，約500KbのFI fragmentよりほぼ
100Kb大きな約600Kbの新たなバンド1本のみ

ノのシグナルと同時に患児らと共通するこの新たなバンドの計4本が認められた．この結果からも，本家系において，母親及び次女は保因者，長女はgenotypeも正常な非保因者であることが示唆された．

pCR
PrOdtlCtS／

考察

本家系において，母親は家系分析から保因者と診断できるが，2人の女児は遺伝子診断によらなければ明確な診断はつけられない．特に長女は血清CK値も正常範囲であった．そこでサザンプロ
ット法による遺伝子解析を行いgenedose分析から母親及び，次女を保因者，長女は非保因者と診断した．本家系のようにサザンプロット法におい図2

本家系のnested PCRによるmRNAの解析てjunction fragmentが検出できない場合，den−158−

能なDNAサイズは20Kb程度までである．1983
年SchwaltzとCantOrら3）によL），アガロースゲ
ル中の高分子DNAに交差する2方向から交互に電圧をかけ，数十キロベースから数十メガベースのDNA断片を解析する電気泳動法，PFGE法が開発された（図4a）．この方法はジストロフィン
遺伝子の解析の極初期から活用され，1986年にはすでにden Dunnenらにより染色体Xp21近辺
4．5Mbに渡るSfiI制限酵素地図が作成され4㌧
ジストロフィン遺伝子の解明に大きく貢献した．
PFGE法の中でも我々の用いたContour
Clamped Homogenous Electric Gel Electro−
phresis（CHEF法）は現在最もよく用いられているタイプで（図4b），これは六角形に配置した電極間に抵抗を入れ，各電極に異なる電圧をかけることにより，均一の電場を形成したものである．
また，電場の交差する角度を1206とし，より広い
DNAサイズ領域で分析できるようにされている．

図3

本家系のPFGE法の結果を，denDunnenらが示した，SfiI制限酵素断片地図と対比させ図5にPFGE法の結果

Sitometerを用いたgene dose分析でシグナルの．

F n●1■■・−抽 月山

濃度により保因者を判定する．しかし，この方法︶
a

じサイズでシグナルが重なってしまう場合，息児の検体が得られない場合など，十分な保因者診断が行えないことがある．従ってmRNAの検索や，PFGEによる高分子DNAの検索が必要となる．
本来ジストロフィン遺伝子は主に骨格筋で発現しているが，リンパ球でも500−1000細胞当り，1
コピーのジストロフィンmRNAが存在し，PCR

PrOVす亡の色巾Ctr首1訂一d

では，DNA断片が小さすぎたり，DNA断片が同

smallor fragmont竃

IargeIra9mentで2回増幅することにより分析可能な材料とな＼︑了・る1）．患児2人では異常サイズのmRNAのみを認めたが，次女では正常サイズと異常サイズのmRNAが1コピーずつ存在することから保因者と診断された．長女は正常サイズのmRNAのみ＋ ＋ ＋ ＋

2コピー存在し非保因者であった．母親は異常サイズのnlRNAのみが再現性を持って認められた．
これは正常サイズのmRNAが微量なため，検出し得なかった可能性があると考えた．

lFLOW

図4

a）PFGE法の原理b）Contourrclamped homogenous
electric field gel electro phoresis

一般的なアガロースゲル電気泳動法では解析可−159−（CHEF）法の原理

何 何珂何円田 ￠DNA probe8

吻

deletion s旺e ot dystrophhl genenormal band siヱe…；］岬Ctedresu・t

干

1m†

L d

だ悪評0−

旦 partialdigeStiveSfiI sitos
量図5

MydigestjveSがI sites

ジストロフィン遺伝子のSfiI制限酵素地図の一部と本症例のPFGE法の結果の解釈示した．正常検体をSfiI処理後，CDNA probe
8でハイプリタイズした結果，a，b，C，の3種類のシグナルを認められた．これに対して，欠矢のある患児においては，欠失によりSfiI切断
点Fが消失しているので新たなバンドa ，b ，Cを予想したが，実際には600Kbのjunction frag−mentシグナル1本しか認めなかった．これは，paritallydigestivesiteであるsiteE，GとHがなんらかの理由で機能せずfullydigestivesiteのDと1のみで切断が行われている可能性を考えた．

文

献1）RolandGRoberts，DavidR Bentley，Teresa
FMBarby，ElizabethMandMartinB：Direct
detectionofdystrophingenerearrangements
byanalysisofDystrophinmRNAinperiph−
eralbloodlymphocytes．Lancet336：1523−
1526，1990．
2）Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi：
Single−StepmethodofRNAisolationbyacid
guanidinium thiocyanate−phenol−Chloroform

extraction．Analytical Biochemistry162：
まとめ

156−169，1987．

DNA兄弟発症例の1家系を保因者診断のため
種々の方法で保因者診断を試みた．

3）SchwartzDCandCantorCR：Separationof①Southernblot法で解析したgenedoseから保因者と考えられていた症例を他の方法でも確認でgradient electrophoresis．Cel137：67−75，

きた．（診nested PCRではRNAレベルの欠矢を確認した．③PFGE法では，新たにjunctionfrag−mentを兄いだすことができた．今後，これらの方法を種々の家系において，より正確かつ詳細な保因者診断を施行するために応用して行けるものと考えた．

4）van Ommen GJB，VerkerkJMH，Hofker

yeastchromosome−SizedDNAsbypulsefield

1984．

MH，et al：Aphysicalmapof4millionbp
around the Duchenne muscular dystrophy
geneonthehumanX−Chromosome．Cel147：499−504，1986．

5）denDunnenJT，GrootscholtenPM，BakerE，−160−

etal：TopographyoftheDuchennemuscular

13duplications．AmJ Human Genet45：

dystrophy（DMD）gene，FIGE and cDNA

835−847，1989．

analysisof194casesrevealsl15deletionsand−161−30）拡張型心筋症を呈するベッカー型筋ジストロフィーの遺伝子解析
庄 司 進 一＊
研究協力者

吉

田

篭

島

邦

広＊

中

村

昭

則＊

充＊

柳

澤

信

夫＊

は じめに
Duchenne／Becker型筋ジスト ロフィー
（DMD／BMD）は，同じDMD遺伝子の異常に基づく疾患であるが，DMDに比べてBMDでは臨
床的なスペクトラムが広いことが知られている．
近年，multiplex polymerase chain reaction（multiplex PCR）法やSouthern blot法を用いたDMD遺伝子の解析が盛んになり1ト4），従来，臨床的に肢帯型筋ジストロフィー，大腿四頭筋ミオ
バナーなどとして経過観察されていた症例が遺伝
子解析の結果，BMDと診断されることが増えてきている5）6）．また遺伝子解析による診断技術の向上によりBMDでは，かつては稀な症候と考えられてきた拡張型心筋症を伴う症例もよく知られるようになり，中には心不全で発症するようなBMD症例も報告されている7）．本研究ではそのような拡張型心筋症を伴うBMD患者に注目してDMD遺伝子の変異と臨床病型との対応を検討した．
対象と方法
対象は互いに血縁関係のないBMD患者4名である（表）．この中で症例1は18歳にてうっ血性心不全のために死亡しているが，生前，はっきりした筋萎縮，筋力低下がなく，骨格筋症状としては運動時の筋痛が見られたのみである．症例2は現＊信州大学医学部第三内科

池

田

修

一♯

在のところ自覚症状はなく，神経学的にも正常であるが，学校検診にて心電図異常を指摘されたことが診断のきっかけになった．なお本例の兄も同様の心電図異常があり，15歳でうっ血性心不全にて死亡している．症例3と4はいずれも近位筋優位の筋力低下があり臨床的にも典型的なBMDと考えられた．
方法は患者末梢血よりゲノムDNAを抽出し，
multiplexPCR法，およびSouthernblot法を用いてDMD遺伝子の変異を検討した．PCR法のprimerはChamberlain2），Beggsら3）の論文に準じて，また一部はDMD遺伝子cDNAの配列8）に基づいて合成した．PCRの条件は桜庭ら4）の方法
に従い，計12個のexon（exonl，2，3，6，
8，13，17，43，47，50，52，60）とmuscle−SpeCificpromoter（Pm）領域をスクリーニングした．
Southern blotはゲノムDNAをHindIIIで消化した後，32PでラベルしたcDNAプローブを用いて施行した．
結果

図1に症例1，2，3のPCRの結果を呈示した．Aに示すごとく症例1と2ではexonlに相当するバンドが増幅されず，症例3ではexon47に相当するバンドが増幅されなかった．また症例1，2においてはmuscle−SpeCific promoter（Pm）とexon2は正常に増幅された（図1B上段）．症
例1と2における欠矢の範囲をさらに検討するた

−162−

表

Clinicalandlabolatorydataof4patients

Patients

2

3

18／H

10／M

25／H

Ageat onset（year）

5

Age at diagnosis（year・）

12

10

16

＋

†

†

Family history
Clinical features

＋
＋
6

8
T
⊥

⊥−

T

UCGg）

ヽ ノ
e
⊥− ⊥−

︶
e

⊥

ECG

＋

D

N

︶
e
＋

Husclebiopsyd）

1

V
6
＋
1
2

congestiveheartfailureb）
serumCKC）

▼1

■

●
⊥ −

muscle weakness

IT

0

−

l

n

l

Ⅹ
e
n

n

YA
e

7

T

⊥T

201TIscintigraphyh）
Gene deletion■⊥Tmuscle cramp

9

＿a）

7▼︶4
W
〃 2 3 4 ■ ● H 〜 49 十 十 十 ＋ O n
3ⅩeAge（year）／Sex

1

4

人 U

8）：thispatientcomplainsofnosubjectivesymptons，b〉：ClassificationonthebasisofNeYYorkHeart
Association．C）：serumCKvaluedividedbynormalupperlimit．d）：dystrophicchange（necroticand
regenerating fibers．phagocytosis．Opaque fibers．variationin fiber size．increasedinter・nal nuclei andhypertrophicfibers）．e）：infarctpatternofposter0−18teralwallofleftventricle．f）：non−SpeCific
Sで−Tchange．g）：dilatedcardioⅢyOPathy（dilationofventricularcavitiesandhypo／8kinesisofventricular
walls）．h）：reducedmyocardialuptake and／orthinnessofleftventric。larwalls．ND：n。td。ne

め開始コドンATGを含む1Raと1Rbの2つ

exon47の単独欠矢と考えられた．

のreverse primersを合成し（図1C），l F
primerとの組合せでPCRを施行した．症例1と2においては1F−1Raでは予想したサイズのバンドは認められなかったが，l F−l Rbでは正常に増幅された（図1B下段）．
以上より症例1と2における欠夫はexonlの考察今回，呈示した症例のうち1と2は臨床的に明らかな筋萎縮，筋力低下がないにもかかわらず，
10歳代で致死的な心不全を呈する点が特徴的であり，BMDの中でもきわめて特異な病型として注後半から始まり，eXOn2には及んでいないことが推測された．PCRの結果をさらに確認するた
め欠失部分に該当するcDNAプローブを用いてSouthern blotを施行した．
図2にはSouthern blotの結果を示す．症例1，2ではexon1，2に相当する3．2kbと3．25kbのバンドが検出されず，代わりに正常では見られな
い約4kbのバンドが見られた．PCRの結果と総合してこのバンドはexonlの一部とexon2を含むjunctional bandであり，その欠夫はintronl内でexon2に最寄りのHindIII siteを巻き込んだ広範囲に及ぶものと推測された．
症例3と4に関してはexon47に相当する10．O
kbのバンドが検出されなかったが，eXOn46，48に相当するバンドは正常に見られたことから目される．この2症例は遺伝子変異に関しても従来，あまり報告のないexonlからintronlにかけての欠夫であり，しかも2例に共通して見られたことはその特異な臨床所見との関連において以下の2つの点で興味深いと考えた．
まず第1にジストロフィンのN端の意義という点である．ジストロフィンのN端付近は構造上，α−アクチニンとの類似性が指摘されており，
アクチン結合ドメインと考えられているが，eXOn
lはこの中に含まれておらず，その意義については不明である．アミノ酸のコード領域に関して見れば，eXOnlのみが特異的に欠失したこの2症例はジストロフィンのN端の意義を推察する上でも貴重な症例と考えられる．
第2にはジストロフィン遺伝子の発現調節とい−163−

図1multiplex PCR法によるDMD遺伝子の解析
A：症例1と2ではexonlの欠失，症
例3ではexon47の欠尖が認められる．

図2

B：症例1と2ではmuscle−SpeCificpromoter（Pm）とexol12は正常に増幅されるが，開始コドンを含む
exonlの後半は欠失している．
レーン番号は表の症例番号と対応する．
レーンC：正常コントロール

C：DMD遺伝子N端のPCR primersの相対的位置と症例1と2で予測される欠失部位を示す．

Southern blot法によるDMD遺伝子の解析
A：症例1と2ではそれぞれexonl，exon2に対応する3．2kbと3．25kbのバンドが認められず，代わりに4kbのバンドが見られる（矢印）．
B：症例3と4ではexon47に対応する
10．Okbのバンドが認められない．
レーン番号は表の症例番号と対応す
る．
M：正常男性コントロール，F：正常女
性コントロール

う点である．creatine kinaseやtroponin Cなど

genomiC organization of the DMD geneinの筋蛋白遺伝子には特徴的に大きなintron lのnormal中に転写調節に関与する因子が存在していることが知られているが9）10），症例1，2における遺伝子

509−517，1987．

and affectedindividuals．Cel150：2）ChamberlainJS，Gibbs RA，RanierJE，解析の結果は骨格筋および心筋でのDMD遺伝子

Nguyen PN and Caskey CT：Deletionの発現に際し，eXOnlからintronlにかけての

SCreenlng OftheDuchennemuscular dystro・部分が重要な役割を担っていることを示唆するも

phylocusviamultiplexDNA amplification．

のである．特にこの部分によるDMD遺伝子の発Nucleic Acids Res16：11141−11156，1988．

現調節が骨格筋と心筋で異なっている可能性があ3）BeggsAH，KoenigM，BoyceFMandKunkel

り，今後，検討していく予定である．

LM：Detectionof98％ofDMD／BMDgene
deletionsbypolymerasechainreaction．Hum

文Genet86：45−48，1990．

献4）SakurabaH，IshiiK，ShimmotoM，Yamada

1）Koenig M，Hoffman EP，Bertelson CJ，Monaco AP．Feener C，and Kunkel LM：

HandSuzukiY：AScreeningfordystrophin

CompletecloningoftheDuchennemusculargene deletionsinJapanese patients

dystrophy（DMD）cDNA and preliminary

Duchenne／Beckermusculardystrophybythe

−164−

with

multiplex polymerase chain reaction．Brain

Thecompletesequenceofdystrophinpredicts

Dev13：339−342，1991．

a rod−Shaped cytoskeletal protein，Cel153：219−228，1988．

5）ArikawaE，HoffmanEP，KaidoM，Nonaka
ofpatientswithdystrophinabnormalitiesin

9）SternbergEA，SpizzG，PerryWM，VizardD，
Weil T and OIson EN：Identification ofalimb−girdlepatientpopulation．Neurology

upstreamandintragenicregulatoryelements

41：1491−1496，1991．

thatconferce11−typeLreStrictedanddifferen・I，SugitaHandArahataK：Thefrequency6）Sunohara N，Arahata K，Hoffman EP，tiation−SpeCific expression on the muscle

YamadaH，NishimiyaJ，ArikawaE，Kaido

Creatinekinasegene．MoICellBio18：2896−

M，NonakaI and Sugita H：Quadriceps

2909，1988．

myopathy；formefruSteOfBeckermuscular10）ParmacekMS，VoraAJ，ShenT，BarrE，

dystrophy．Ann Neuro128：6347639，1990．

Jung F，and LeidenJM：Identificationand7）阪田千種，春原経彦，埜中征哉，荒畑喜一，杉Characterization of a cardiacTSpeCific tran−

田秀夫：心不全症状を初発症状としたBecker

SCriptionalregulatory elementinthe slow／型筋ジストロフィーの一例．臨床神経30：

Cardiac troponinCGene．MoICellBiol12：

210−213，1990．

1967−1976，1992．

8）Koenig M，Monaco AP and Kunkel LM：−165−31）長期室温保存された臍帯及び筋病理標本によるジストロフィンの遺伝子診断

研究協力者

川

口

洋

荒

畑

子＊

後

喜

一＊

藤

加奈子＊

塚

原

俊

文＊

武 田 伸 一＊ 埜 中 征 哉書，＊＊目的phatase，NSE，CCO）を施した凍結切片による筋

デュシャンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィー（DMD／BMD）の保因者診断の際に，発端者からの情報が得られないことがしばしばある．このような場合の保因者診断の手段としてRT−PCR

病理組織標本は，各染色ごとに厚さ1叫mの切片
10枚をプレパラートより剥馳する．これらを1×

法1）あるいは定量的PCR法2）が知られているが，その際にも発端者からの情報が有力な手がかりとなることがある3）．そこで我々は発端者がすでに死亡し遺伝子診断に必要な生検材料や血液等が入手できない場合に，残された臍帯と筋病理組織標本を用いてゲノムDNAの抽出を試み，ジストロ
フィン遺伝子診断の可否について検討した．

フェノール／クロロホルム抽出，クロロホルム抽出

対象および方法
今回我々が対象としたのは，DMD患者の臍帯3例（保存期間：5，6，29年間），正常コントロールの臍帯2例（保存期間：20，62年間）と，DMD／

1）最長62年間室温にて保有された乾燥臍帯よRSB500FElに洛解し，SDS及びプロティナーゼKを添加し，37℃にて反応させ，フェノール抽出，を経てエタノール沈澱させ，ゲノムDNAを抽出する．そしてジストロフィン遺伝子をChamber−lainあるいはBeggsのプライマーを用いたマル
チプレックスPCR法により増幅し，アガロース
ゲル電気泳動にてバンドの有無を確認する．
結BMD患者の筋病理組織標本2例（保存期間：1，
14年間），正常コントロールの筋病理組織標本2例（保存期間：1，4年間）である．さらに入手可能であった症例に関しては，末梢血リンパ球および筋凍結切片のゲノムDNAについて，同一症例の臍帯から抽出したそれと比較検討を行った．
臍帯は，コルク片の上にトラガカントガムで固定し，クリオスタット内で厚さ10JJmの切片を10枚作製する．10通りの染色（H＆E，mGT，NADH，
SDH，PAS，Oil−red O，ATPase，Acid−phos−＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊国立精神・神経センター武蔵病院

果り抽出したゲノムDNAも，新鮮材料より抽出したDNAと同様に，ジストロフィン遺伝子のPCR法による増幅が可能であった．DMD患者群では，ジストロフィン遺伝子の部分欠矢が仝例で検出された．
2）同一患者の臍帯，末梢血リンパ球及び生検
筋より抽出したDNAを用いてジストロフィン遺伝子をPCR法により増幅し，それぞれを対比させると，いずれの抽出法においても同一部位にジストロフィン遺伝子の欠夫が認められ，さらに増幅されるべきエクソンについてはすべてコントロールと同様に増幅されていた（図1）．
3）凍結切片による筋病理組織標本より抽出したゲノムDNAを用いた場合の結果を各染色法ごとにまとめた（図2，表）．NADH，SDH，−166−

表 筋病理組織標本を用いたジストロフィン
遺伝子の増幅と欠夫の発現
D M D ／3 M D

コ ン トロ ール（
D K ．K ． ② T ．S ． ① Y ．Z ． ② H ．T ．
Exon45−47 del．

no de l．

no del．

no de l．

H＆E

ー

−

−

−

mGT

−

−

−

−

NA DH

＋

＋

＋

＋

SDH

＋

N I）

十

＋

PAS

−

N D

−

N D

OR0

−

N D

−

N D

ATPase

＋

N D

＋

N D

Beggs，Pdmers

AcP

＋

N D

＋

N D

図1臍鼠末梓川川ンハ晩及び生検筋より抽出したDNAの対比（PCR）

ⅣSE

ー

N D

−

N D

CCO

−

N D

−

N D

M

1

2

3

ATPase，Acid−phosphatase染色標本からはジス

4

トロフィン遺伝子解析が可能なDNAが得られた．
しかし，へマトキシリンによる核染色を伴う他の組織化学染色標本（H＆E，mGT，PAS，Oil−red
O染色標本）からは遺伝子解析に適当なDNAは得られなかった．なおNSE，CCO染色標本からも遺伝子解析に適当なDNAは得られなかった．
考察以上の結果より，長期間室温にて保存された臍

貰：守一か・

帯および筋病理組織標本の一部を用いることによ

1：HiEり，すでに死l＝したDMD／BMD患者のジストロ

2：皿GT

フィン遺伝子診断が可能であることが示された．

3：ⅣADf1
4：ATPaSe

しかし，筋病理学において最も基本的な染色法であるH＆E染色切片が，PCR法による遺伝子解析に不適当であったことから，その理由を知るため

図2

組織化学染色標本より抽出したDNAの対比（PCR）に次のような実験を行った．通常のPCR反応液
50ノ上目二，組織化学染色で使用するへマトキシリン
1〟1を添加し，ジストロフィン遺伝子の増幅を試みたところ，コントロールに対してへマトキシリ
−167−

結

ン添加サンプルではDNAの増幅が全くみられなかった．従って，へマトキシリンがDNAのPCR
増幅を阻害するひとつの要因となっていることが示唆された．次にへマトキシリンを含む各種組織
化学染色液の，ゲノムDNA自体に及ぼす効果を確認するために，組織化学染色で使用するへマト
キシリン液，エオジン液及びGomori液の原液を直接ゲノムDNAに添加したところ，へマトキシ
リン添加サンプルでは，他の2本のサンプルにはみられない染色の沈澱が形成された．引き続きこれらのサンプルからゲノムDNAを再抽出し，ジストロフィン遺伝子のPCR法による増幅を行った．DNA solutionの1／100量のエオジン液，あるいはGomori液を加えたサンプルでは、ジスト

論1）長期室温にて保有された乾燥臍帯からPCR法によるジストロフィン遺伝子解析が可能なゲノムDNAが得られた．
2）DMD／BMD患者群では同一患者の臍帯，末梢血リンパ球及び筋凍結切片より抽出したゲノム
DNAについて同一部位にジストロフィン遺伝子の部分欠矢を確認した．
3）組織化学染色標本ではNADH，SDH，ATP−aSe，Acid−phosphatase染色標本からPCR法によるジストロフィン遺伝子解析が可能なゲノム
DNAが得られた．
4）へマトキシリンによる核染色を伴う標本はいずれも不適当であった．

ロフィン遺伝子は正常に増幅され、ゲノムDNA文

はエオジン液あるいはGomori液の存在下でもほぼ完全な形で存在することが示された．しかし，

献1）RobertsRG，BarbyTFM，MannersE，DNA solutionの1／100量のへマトキシリン液を

et al：Direct detection of dystrophin gene

添加したサンプルでは，DNAの増幅は全くみら

rearrangements by analysIS Of dystrophin

れず，へマトキシリンがPCR反応を阻害するとmRNAinperipheralbloodlymphocytes．Am
J Hum Genet49：298，1991．

いうよりはゲノムDNAそのものを阻害する可能性が示唆された．一万1／1000量のへマトキシリン

2）AbbsS，BobrowM：Analysisofquantitativeを添加したサンプルではジストロフィン遺伝子はPCR for the diagnosis of deletion and正常に増幅された．以上のことより，少なくともduplicationcarriersinthedystrophingene．J

H＆E染色およびGomoriトリクローム変法では，
カウンターステインとしてのへマトキシリンによ3）荒畑喜一：筋ジストロフィーの遺伝子診断−

Med Genet29：191，1992．

り，その染色切片が遺伝子解析に不適当となっていると考えられた．

Duchenne型筋ジストロフィーと筋緊張性ジス
トロフィーの現況 「630，1992．

−168−

医学のあゆみ162：

32）ミオパテー女性例に見るジストロフィン異常の出現頻度
荒 畑 喜 一＊
研究協力者

埜

中

征

哉＊

E．P．Hoffman＊＊

目的

我々は本研究姓でこれまで，DMD／BMD，
FCMD，LGDにおけるジストロフィンテストの有用性，ジストロフィンN一，C一末端ドメインの臨床的意義，及びジストロフィン関連遺伝子のクローニング等について報告してきた．最近では，適切な遺伝子診断と遺伝相談によってDMD／BMDの家族発症例は減少しているが，約30％にみる孤発例（newmutation）の対策は残されている．New
mutationがあるとは，発端者のDMD患者に遺伝子の変異が存在するが，母親のリンパ球（体細胞）には遺伝子変異が存在しない場合をさす（母親は保因者では無い）．現実的には，DMD孤発例の母親はgermline mosaicismである可能性もあり，これらを完全に予知することは困難である．

古

賀

律

子＊

E．Bonillaほか＊＊＊

織化学，イムノブロット，DNA解析等）を実施した．このうちジストロフィン異常の発見された症例については，検査前の臨床診断，臨床的重症度，
血清CK値等と，ジストロフィンテストの結果について対比検討した．
結果

DMD保因者を示唆する，ジストロフィンのいわゆるモザイクパターン（ジストロフィン陽性と陰性の非壊死筋線経が同時に見られる：図1）は505例中46例（9．1％）に出現した．46例のうち21例（45．6％）は男児DMD患者を家族に持っていたが，残りの25例（54．3％）は全て孤発例であった．
この25例（DMD保因者）が，ミオバナーの存在を疑われて筋生検を受けた女性孤発例全体（210例）

一方，免疫組織化学的にジストロフィンのいわゆるモザイクパターンが検出されれば，ジストロ
フィン異常症（dystrophinopathy）の可能性があり，診断的意味合いは高い．一そこで今年度は，①
女性孤発例のミオバナーに占めるジストロフィン
異常症の出現頻度，（診それらの臨床的特徴を，主に占めた割合は12％を数えた．孤発例ジストロフ
ィン異常症25例の検査前臨床診断は，肢帯型筋ジストロフィー（LGD）が9例（36％）を数え，次いで高CK血症の8例（32％）であった（表）．また，家族として免疫組織化学法により検討し，併せてDNA解析，イムノプロット解析を実施した．

った事から，ジストロフィンテストで予後を推定することは適当でないものと考えられた．しかし，孤発例ではジストロフィン陰性筋線維数が多いほどジストロフィンタンパク量は少なく，血清CK
値は高い傾向を示し，臨床的にも重症度の高くなる傾向を認めたことは興味深い（図2）．なお孤発対象及び方法ミオバナーの存在が疑われ，筋生検を受けた女
性505例について，ジストロフィンテスト（免疫組＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊University of Pittsburgh SchooT of Medicine，U．S．A．

例ではジストロフィン陰性筋線維数，臨床的重症度，血清CK値は必ずしも一定の相関を示さなか

例のうち，Ⅹ；常染色体転座が3例に，染色体カリ
オタイプの異常（47／XXX）が1例に認められた．

■＊＊Corumbia−Presbyterian MedicalCenter．U．S．A．

−169−

衰 ジストロフィン異常の兄いだされた女性孤発例の臨床的検討
榔

1．5〜61歳（15・8±13・0）

斑鳩

1．2〜45歳（10・3±9・9）〃トロフィンテ小首の 腹帯型筋ジストロフィー・‥36％（9ノ25）
脚

高CK血症……………32‡（8／25）
筋ジストロフィー………16％（4／25）
女児DMD（転座）……・8％（2／25）
多発筋炎……………‥

41日／25）

川口フィン帥細緻 2．1〜97．4％（40・7±32・1）
榊折インタンパ憎 く5〜100％（49．2±32・l）
蛸CK個
逼伝子緋掛

1，000〜24，0001U／1（8・620±5・640）
欠失（2）．重複日．転座（3），染色体型異常（1）・noninf。rmative（4）考察

DMDの保因者診断にさいして，RFLPsを利用した連鎖解析での診断の正確さは，flanking（＝遺伝子近傍の）マーカーによるが，flankil唱マーカーに対してinformativeな症例の存在する場合に
図1

っいては，約75％では98％の正確さで保因者診断

ジストロフィンの免疫組織化学（b）と，連続切片のH＆E染色（a）．孤発例女性
ミオバナー患者に兄い出された，ジスト
ロフィン染色の，いわゆるモザイクパターンを示す．（300×）が可能とされている．反面，25％では正確な保因者診断ができない．この中にはflankingマーカ．
どうしの間で組み換え（recombination）を生じているものとか，informativeマーカpがDMD遺

Data

from

part

B¶

伝子の一方の側にしか見つからないものや，正常と異常の（Xの）ハプロタイプが決まらないものなどが含まれている．今回我々は，免疫組織化学法によるジストロフィンテストにより，ミオバナ
08

ー女性例に見るジストロフィン異常の出現頻度を04接見ることができ，またジストロフィンの欠損部

06り，筋形質隈へのジストロフィンの局在様式を直M亡巨∋︻OU

検索し得た．本法は，きわめて鋭敏な検査法であ位を推定することもできるなどの点で優れた検査法といえる．しかし，結果の判定は主観的であり，またDMD保因者のどの程度がモザイクパターンを示すかなお不明である．特にCK値正常の無症

978864595252525144423631302016161612．6．76．Z

候性保因者の場合は検索機会も乏しい．おそらく，
Cdumnl

何ら免疫組織化学染色の異常を示さないDMD保因者も存在するであろうから，実際の女性例ジス

図2

トロフィン異常症はさらに多いものと推察される．

−170−

【ヨ

CdumnZ

ジストロフィン陰性筋線維数（％：columnl）とイムノブロット法によるジストロフィ
ンタンパク量（％，n＝100：column2）の相関．

＊研究協力者 （あいうえお順・敬称略）・施設
石川信義
北見赤十字病院小児科
石原博幸
国立療養所東埼玉病院
鎌倉恵子
防衛医科大学第三内科
菊本 修
木下真男
熊谷公明
作田亮一

広島大神経精神科
東邦大大橋病院第四内科
神奈川リハビリテーション病院小児科
国立精神・神経センター

里青首二郎
杉田秀夫

国立精神・神経センター

春原経彦
埜中征哉
馬場史子
浜田恵亮
平澤恵理

国立精神・神経センター
国立精神・神経センター
国立精神・神経センター
長崎原爆病院小児科
県立宮崎病院小児科
順天堂大脳神経内科

柳川敏彦

和歌山県立医大小児科−171−33）筋ジストロフィーにおける細胞外マトリックスの変化
荒

研究協力者

林
塚

原

畑

由紀子＊ 平俊 文＊ 埜

喜

一＊

澤

恵

理＊

中

征

哉＊

武

田

伸

一＊

E．EngvallH

近年，Campbellらによって，ジストロフィンが基底陵の主成分であるラミニン（A，Bl，B2各

そのC末端側で筋細胞膜の糖タンパク複合体とサブユニット）とⅠⅤ型コラーゲン，及び筋細胞骨結合していること，そしてジストロフィンの欠損

格タンパクであるジストロフィンとスペクトリン

しているDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）

に対する抗体を用いて免疫染色し，その染色パターンを比較検討した（表1）．

では，このジストロフィン関連膜糖タンパク（dystrbphin−aSSOCiated glycoproteins−

DAGs−）も著明に減少していることが報告された．さらにこのDAGsの細胞外サブユニット（156K−DAG）が基底膜の主成分の一つであるラミニンと結合していることも報告されている．
基底股は細胞外マトリックスの特殊なもので，筋形質膜の外側を層状に覆い，筋細胞を保護し，また，筋の再生にも重要な働きをしているものと考えられている．
そこで我々は，筋ジストロフィーにおける細胞
外マトリックスに注目し，ジストロフィンの欠損

加えて，各疾患群よりage一matChedの5症例を選び，IBAS自動解析装置を用いて免疫染色強度を定量的に計測した．方法は，同じ条件で免疫染色した標本からそれぞれ56，006〟m2に相当する部位をランダムに選択し，それを3，264個のピクセ
ルに分割した．バックグラウンドによる誤差をなくすため，平均細胞質濃度を差し引いた後，ピクセル毎の濃度を自動的に測定し，単位面積当りの平均免疫染色強度を計測，さらに測定部位に含まれている筋細胞の膜の全周長を測定し，単位且莫当りの平均免疫染色強度を計算した．

は二次的に細胞外マトリックスの変化を引き起こ

結果
筋形質膜に存在するジストロフィンの免疫反応

すかどうか，また逆に，細胞外マトリックスに一次的な異常が存在するとすれば，それが筋形質股に変化を及ぼすかどうかを検討した．
対象及び方法
対象は臨床的，筋病理学的に診断の確定している64症例．福山型筋ジストロフィー（FCMD）17
例，nOn FCMD13例，DMD16例，疾患対照として，筋ジストロフィー以外の神経筋疾患（OND）
18例の生検筋を用いた．
クリオスタットで6／Jmの連続切片を作成し，＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊LaJoLla Cancer Research Center，CA，USAはDMD筋では認められなかった．FCMDでは対照筋と比較して異常な染色パターンをとる線経が多く認められた．ジストロフィンおよびスペクト
リンに関しては，われわれがこれまでに報告してきたものと同様の結果が得られた（E．Arikawa，etal：J NeuroISci1991）．
ラミニンは対照筋では，筋線維周囲の基底膜に一致してBl及びB2鎖が明瞭に染色された．しかし，A鎖は血管のみを染色し，筋周囲には認められなかった．nonFCMDでも同様の結果が得ら
れた．

−172−

表l Antibodies usedin this study
AntigenLamininA

Antibody Antibody Inmunogendesignation type source
mAb

Human

4ElO，BI MouSe mAb

Hunan

Mouse nAb

HunanRabl）it serum

HllnanRabbit Ser¶Hn

Hunan

llDS，A

LaⅡinin B1

Laninil B2

LfotlSe

2E8

Laninin（EHS tumor）

EHS

CollagenIV

Dystropbin

2−5E2
4−4C5

Mouse mAb
ltouse mAl）

6−10

Rabbit●＄erqn

Hl1品anMollSe mAl）

Spectrizl●●

Synthetic

peptideS

COrreSpOnding

toaIhinoacidS

440−489（2−5E2）and 3495−3544（4−4C5）of htlnan dyStrOphin．
H Provided by Drs．Louis M．Kunkel and TitnothyJ．Byers．

表2

Analyzed withIBAS system

Meanimmunolabellingintensityina retangularregion（56，006um2）
Laninin BI Lamizlin B2

FCMD

20．8＋7．5￣0tber CMD

48．2＋11．8

23．7＋9．9￣

43．3＋10．6●●

0ND

41．7＋13．1

29．8＋12．0

44．2＋10．5

48．0＋9．4￣￣

DHDCollagenIV DyStrOphin

31．6＋7．3

37．3＋6．5

48．5＋4．8

5．0＋2．1

45．4＋15．8

45．9＋6．6

31．0＋5．2

28．4＋4．8

Meanimmunolabellingintensityper unit membrane
Laminin BI Laninin B2

FCMD

21．2＋5．20

0tber CMD

44．1＋17．100

26．4＋9．30

49．7＋8．0

32．4＋6．9

45．1＋15．300

35．7＋14．2

29．9＋12．0

48．8＋15．3

4．0＋1．8

DMD

46．7＋10．0

48．8＋9．6

0ND

35．3＋12．6

31．7＋10．4

Eacb

of

5

age一matCbed

Values are the zzlean

CollagenIV Dystrophin

patientsvas

23．5＋6．1

exanined・＋SD and shov the Significant differcnce byStudent′s t−teSt betveen・and．●（P＜0．005），＃0and

27．1＋5．300（Pく0．025）．

−173−

azld

＃＃（Pく0．01）．

OND

図
−174−

ジストロフィンの欠損しているDMDにおいてもラミニンBlおよびB2鎖は，対照群と同様筋線維周囲に明瞭に染色された．ところが，対照群
では血管のみに認められたA鎖が淡いながらほ
とんどの筋線維周囲にも認められた．
さらにFCMDでは，ラミニンBlは対照群と比較して，その免疫染色強度が著しく減少していた．B2鎖の染色強度も減少していたが，血管は対照群同様に明瞭に染色された．またFCMDでも，A鎖がほとんどの筋線経で検出された．
ⅠⅤ型コラーゲンは対照群では，筋線維及び血管の基底膜に一致して，明瞭に染色されたが，FCMDでは，多くの筋線経で染色パターンに異常が認められた（図）．
これらの変化はIBASによる免疫染色強度の定量的解析においても確認された．すなわち各疾
患群の単位面積当り，及び単位膜当りの平均免疫反応強度を比較すると，FCMDのおけるラミニン
BlおよびB2鎖は他の疾患群と比べ有意に減少していた．しかし，ⅠⅤ型コラーゲンに関しては，IBASでは疾患による有意な差は認められなかった（表2）．

まとめ

1．対照筋では筋線維基底膜に一致してラミニン
Bl，B2鎖の免疫染色を強く認めたが，A鎖は認められなかった．
2．DMDではBl，B2鎖の免疫染色性は対照筋と同様であった．しかし，A鎖の淡い染色がほとんどの筋線経で認められた．
3．FCMDでは，筋線維基底膜のBl，B2鎖の免疫染色強度に著明な減少を認め，染色パターンにも異常が認められた．また，DMD同様A鎖がほとんどの筋線経で認められた．
4．FCMDにおいて，ⅠⅤ型コラーゲンの免疫染色パターンは異常であったが，染色強度の減少は認められなかった．
5．血管の免疫染色性には疾患群による差異を認めなかった．
考察
1．FCMDでは骨格筋線経の基底膜に何らかの異常が存在し，これが形質膜の脆弱性に関与している可能性が示唆された．一方，ジストロフィンの欠損は必ずしも骨格筋線維基底膜の基本構造には異常をきたさないものと考えられた．なお，
FCMDおよびDMD筋におけるA鎖出現の意義は今後の検討が必要であると思われた．

−175−

Ⅳ．mdxマウスほか

34）m血骨格筋の電気刺激時に於ける細胞内Ca2＋濃度
及びその膜電位吉 田 瑞 子＊
研究協力者

松 崎 哲 也＊Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）とそのモデルマウス（mdx）の骨格筋細胞では，膜の内側にあるジストロフィンが欠損しているために，過剰のカルシウムイオンが細胞内に流入し，細胞内カルシウムイオン濃度が高くなっていると考えられた．しかし私達が，静止状態のカルシウムイ
オン濃度を測定したところ，予想外にもmdx筋と対照（BlO）筋で差が無かった1）．脱神経した
mdx骨格筋細胞は壊死しない2）と言う報告もあり，静止状態のmdx骨格筋内のカルシウムイオン濃度が正常であることが裏付けられる．
そこで，私達はZ−lineの乱れを生じたり，カル
シウムイオンの一部が細胞内に結合蓄積するのは3），・筋細胞が興奮した時に，T一管に存在するカ
ルシウムチャンネルからカルシウムイオンが，細胞内に過剰に流入するためと考えた．そこでmdx
骨格筋の電位依存性カルシウムチャンネルを調べたところ，T−管にあるL一型カルシウムチャン
ネルが，対照（BlO）に比べ，約10mV低い電位（−40mV）で活性化されることが分かり，mdx筋ではカルシウムイオンが過剰流入することが明らかになった4）．その結果，細胞内カルシウムイオン
濃度の上昇が予測される．そこで電気刺激時の筋細胞内カルシウムイオン濃度がどの様になるか調
べ，併せて膜電位測定を行った．
方法

カルシウムイオン濃度測定＊国立精神・神経センター神経研究所

3〜4週齢のmdx（8匹）とその対照BlO（9匹）の長指伸筋を腱から腱まで採取し筋束を使用した．
筋細胞内カルシウムイオン濃度の測定は，蛍光プ
ローブfura−2を用い，画像解析法で行った．
Krebs−HEPES溶液に10JLM fura−2−AMと0．08％pluronicF−127を溶解し，その中に筋束を入れ，液面に酸素一炭酸混合ガス（95：5）をそよがせな
がら，10℃で2−2．5時間浮置して，furaL2を筋細胞内に負荷した．その筋束をKrebs−HEPES溶
液のみに入れ，室温で約10分放置後，1叫M
tetrodotoxinを含むKrebs−HEPES溶液を満たしたセルに固定して，顕微鏡下に置き，酸素一炭酸混合ガスを液面にそよがせながら，25℃でカルシウムイオン濃度を測定した．電気刺激は，
Krebs−HEPES溶液を満たしたガラス電極を用いて，強縮刺激（durationl msecの刺激をinter−
va120msecで，350回）を与え，その間の筋細胞
内のカルシウムイオン濃度を測定した．
カルイウムイオン濃度の標準曲線は，80mg／mlのγ一gulobulinと80JLMのfura−2をカルシウム
イオン標準溶液に加え，筋細胞に近い太さのキャ
ピラリーにその溶液を充填し，筋細胞のカルシウ
ムイオン濃度測定条件と同じ条件で測定し，作成
した．
膜電位測定
上記と同様のマウスの長指伸筋を，Krebs−
HEPES（3mMKCl）溶液で満たされているセルに固定し，顕微鏡下に置き，溶液表面に酸素一炭酸ガス（95：5）を吹き，3M−KClガラス電極を用い，25℃で測定した．

−179−

結果と考察匹につき8本以上測定した．その結果，両者間の骨格筋細胞内カルシウムイオン濃度
筋細胞内が破壊されない強度の電気刺激を与え，強縮させたmdx骨格筋細胞内カルシウムイオン
濃度は，対照BlOに比べ低かった．BlOはカルシウ
ムイオン浪度が，500〜1000nM上昇したのに対膜電位には差が無かった．共に−85mV〜−100mVし，mdxのそれは300−500nMであった．この結果は，昨年の電気生理の結果からの予想に反するが，一昨年報告した結果と一致する．一昨年長指伸筋にfura−2を負荷し，強縮電気刺激を与え，収縮時のカルシウムイオン潰皮をポイント測光法で測定した．その結果，刺激時のmdx筋細胞内カル
シウムイオン濃度は，80nM（静止状態）から
300−700nMに上昇したが，BlOのそれに（500−られ，fura−2負荷が静止股電位に影響を与えない

1100nMに上昇）比べ低かった．測定数が少なかったため（mdxの細胞11本と対照BlOの細胞16本を測定した）結論を控えたが，今回の画像解析法の結果と考え合わせ，何故mdxの細胞内カルシウ
ムイオン濃度の上昇が低いのか原因は現在のところ解らない．
私達は細胞内カルシウムイオン潰度を測定する
過程で，電気刺激に依って骨格筋細胞内が破壊さを示し，mdxは−92．5±4．9（SD）mV（n＝44），
BlOは−91．7±4．7（SD）mV（n＝42）だった．この結果は，C．Mathesら5）の結果と一致する．
fura−2が負荷された筋細胞でも，同じ結果が得ことも明らかになった．
まとめ

1）強縞刺激時のmdx細胞内カルシウムイオン
温度は，BlOのそれよりも低かった．
2）連続した電気刺激を筋細胞に与えると，筋細胞内破壊が生じ，筋ジストロフィー症の壊死した筋細胞に似た筋細胞となる．
3）長指伸筋の股電位はmdxとその対照BlO間に差異がなかった．

れ，筋ジストロフィー症の筋細胞顕微鋭写真に見られる破壊された骨格筋細胞像に似た筋細胞が得られた．即ち連続的に強度の高い電気刺激を与えると，筋細胞は収縮して，細胞内カルシウムイオン濃度は，20〟M以上になる．筋原線経には亀裂が入り断裂する．筋原線経は断裂したところから収縮（いわゆる過収縮）を起こし，連続して正常筋
原線経が見られた．細胞内で断裂が起きたとこ
ろには空洞ができた．この筋細胞内破壊は，電極が接触していない細胞でも同じ現象が生じるので，ガラス電極が細胞に接触して，細胞膜に傷が出来，細胞外から細胞内にカルシウムイオンが多量流入したために生じたとは考えられない．電気刺激で細胞内破壊が起きる現象を，詳細に調べてゆけば，mdxの筋細胞破壊の引金を兄いだし，引いてはDMDの筋破壊の引金を兄いだすことが可能であることが示唆された．
膜電位
6匹のmdxと対照BlOの長指伸筋細胞を，1
−180−

文

献

1）吉田瑞子，柴崎浩：mdxマウス骨格筋内のCa
イオン濃度． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田址）平成元年度研究報告書，1990，pp145−146．
2）Karpati G，et al：Small−Caliber skeletal
muscle fibers do not suffer necrosisinmdx
mouse dystrophy．Muscle and Nervell：795−803，1988．

3）DunnJF and Radda GK：Totalion content
of skeletal and cardiac musclein the mdx
mousedystrophy：Ca2＋iselevatedatallages．

J NeuroI ScilO3：226−231，1991．

4）吉田稲子，井上勲，松崎哲也：mdx胎仔骨格
筋の電位依存性カルシウムチャンネルについて．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト
ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木姓）平成3年度研究報告書，
1991，ppll1−113．

5）Mathes CF，et al：Sodium current andmembrane potentialin EDL muscle fibers

fromnormalanddystrophic（mdx）mice．Am
J Physio1261：C718−C725，1991．

35）単一チャンネル電流記録法によるmdxマウスの細胞内カルシウム流入機構の研究
高 守 正 治＊研究協力者

浅 賀 知 也＊ 福 島 功 二＊
太 田 雅 也＊ 古 野 茂 一＊

は じめに

筋細胞増兵

Duchenne型筋dystrophy症では細胞骨格蛋白質であるdystrophinの欠損が指摘されている．しかしdystrophinの生理的役割は現時点では明らかになっていない．Dystrophinが欠損した骨格筋
では細胞内Ca濃度が上昇しているとする報告が多く，dystrophinの欠損は細胞内カルシウムの調節機構に障害を釆たす可能性が示唆される．
Turner等によれば安静時細胞外カルシウム＿膿度を低下させた場合，dystrophicな骨格筋の細胞内カルシウム濃度も正常レベルまで低下する1）．従ってdystrophicな骨格筋細胞では細胞外から細胞内へのカルシウム流入機構に異常を来たしている可能性がある．カルシウム流入に関与するチャンネルには大きく分けて電位依存性のものと電位非依存性のものがあるが本研究では静止膜電位近傍で細胞内カルシウム流入に関与すると思われる
電位非依存calciumleak channelに注目し対照と比較検討した．
方法
細胞培養：実験動物中央研究所から供給された
mdxマウス及び対照としてBlOマウスを飼育し新生仔を実験に用いた．新生仔の後肢より筋組織を摘出LDulbecco smodifiedEaglemedium（以下DMEM）中で細切し0．2％トリプシンを加えてマウスを70％エタノールで消帝
1

両後肢より筋柑紙を取lJ DMEM中で紹断
1

0．2％トリプシン活油を加え37℃．30分間インキュベート
1

1000rpmt5分間遠心分郡緩上沼を除去
1

10％FCS．10％tlOrSe SeTUm加DMEMを加えビペッティング
1

60ml¶桂の皿に40分間プレインキュベートLは紺芽租脂を除去
1

筋芽和泊を集めて35mm径の皿に分注
筋細胞が融合し線描形成を硝三雲緩電気生理学的美順に使用

図1 筋細胞培養法
上清を除去し，10％FCS，10％horse serum加DMEMに細胞成分を浮遊させプレインキュベー
トにより線維芽細胞を除去した．その後コラーゲンを塗布した35mmペトリ皿にまき，4日日以降
筋細胞が融合して筋線経を形成した段階で実験に用いた（図1）．
電気生理学的方法：電気生理学的実験はパッチク
ランプ法を用いて行った．実験に用いる細胞は培養液を使用1−2時間前に実験用細胞外液（inmM）（NaCl138，KC12．7，CAC121．8，MgC12

30分インキュベートした後，1000rpm5分遠心し1．06，glucose5．6，pH7．2）に置換した．パッチ電極は微小電極用ガラス管（Gl．5）を成茂製二段階垂直プラーで引き，先端付近にシルポットを■金沢大学医学部神経内科

塗布して被膜を形成した後，熟研磨を行って作成した．実験には抵抗が5−10Mnの電極を用いた．
−181−

ガラス電極内には96mM BaC12よりなる内液を用（a）いた．単一チャンネル電流記録は日本光電製パッチクランプ用アンプにより行った．測定データは
SONY製のDATに記録し，後に日本光電製解析
ソフトを用いてデータ処理を行った．
結果
1．静止股電位は約−40mVであり，以後の電位表
示は細胞の静止股電位を−40mVと仮定して膜電位を表すこととした．

2．mdxマウス骨格筋細胞および対照としてBlO
マウス骨格筋細胞よりcell−attatChedpatch法により単一チャンネル電流を記録した．mdx及びBlO骨格筋に認められた静止隕電位近傍で自発性に開孔するチャンネルは共に電位非依存性であり，（b）

ピペット内圧を変化させることにより開孔確率は変化しなかった（図2a，b）．
3．mdx骨格筋細胞より記録したチャンネルのコ
ングクタンスは11pS，BlO骨格筋より記録したチ

宣㌣「予J㌧八一・㌢〜㌔JYYm′∵h仙kvで㌔−一ノ宮／一▲・・・∴∴−へ￣．＿、．・・、、・∴￣￣−￣￣、−、￣．．仙￣

ャンネルのコングクタンスは10pSであった．また，反転電位はmdxが45mV，BlOが46mVであり，両チャンネルは同一のものと考えられた（図3）．

一・一∴八㌧、叫−￣

4．チャンネルの開孔確率（mean±SD；n＝20）は膜電位が−60mVの時mdx骨格筋細胞では0．083±0．02であるのに対してBlOでは0．023±」

図2 単一チャンネル電流記録，下向きの電流が内向き電流を表わす．（a）BlO（b）mdx

0．015（P＜0．01），膜電位が−80mVの時mdxでは0．083±0．02，BlOでは0．024±0．015であり（P＜0．01），mdx骨格筋細胞において対照の4〜5倍0の頻度でこのチャンネルは開くものと思われた
（図4）．

0

●
●U

○

●○

●0

■U

2

● mdx
O BlO

○
●U
∩●

︐J

であるmdxマウス骨格筋細胞のカルシウム透過

1−察︵くd uELコU

考

Duchenne型筋ジストロフィー症のモデル動物

4pS

性チャンネル異常についてはこの数年いくつもの報告が成されている．1990年Franco等は鳥の翼の骨格筋を伸展した状態に保つことにより筋ジストロフィー症モデル動物類似の筋組織像が得られることからstretch−SenSitivechannelが筋ジスト
ロフィー症の発症に関与している可能性を指摘し
−182−

ー100

−80

−60

−40

−20

0

日embrane potent181（mV）

図3

電流一電圧曲線

20

8

卯訓
mm︒
血︒
Bl
●0

2

質であるジストロフィンの欠損に伴って生じるチャンネルの機能異常は我々が今回指摘したcal−

6
4

過性チャンネルに及んでおり，これらのチャンネ

2

ルが筋組織の置かれている様々な条件下で個々に1過剰反応し，結果として相加的に細胞内カルシウ
ム濃度上昇を引き起こすものと思われ，Calcium
leak channelもこの一翼を担っているものと考

8
6

えられる．

4

〇一≡q三Ea ；≡ヱU uO吉ciumleak channelも含め幾つものカルシウム透

⊥

2
●

ー80

−75

・70

文
−65

−60

・55

−50

15

membranepotential

献1）P Turner，T Westwood，et al：1ncreased
protein degeneration results from elevated

図4 各段電位における開孔確率

freecalciumlevelsfoundinmusclefrommdx（mean±SD；n＝20in each）

mice．Nature335：735−738．1988．
2）A FrancoJr andJ Lansman：Stretch−

た2）．更にFranco等はmdxマウス骨格筋においSensitivechannelsindevelopingmusclecellsてstretch−inactivatedionchannelの開確率がコ

fromamousecel11ine．J Physio1427：361−

ントロールに比べて有意に高い3）と報告し，筋ジ

380，1990．

ストロフィー症の発症にはこれらmechanosen−

3）AFrancoJrandJ Lansman：Calciumentry

sitive channelが関与している可能性を指摘した．

throughstretch−inactivatedion channelin

また1991年吉田らはmdxマウスでは電位依存性
カルシウムチャンネルも細胞内カルシウム濃度上

mdxmyotubes．Nature344：670−673，1990．

4）吉田瑞子，井上勲，松崎哲也：mdx胎仔骨格筋

昇に関係している可能性を示唆している4）．更にの電位依存性カルシウムチャンネルについて．

本研究では静止膜電位近傍で自発性に開孔する電厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト

位非依存性のチャンネルについてmdxマウス骨

ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関

格筋細胞での開確率がコントロールに比べて高い

する研究 （荒木姓）平成3年度研究報告書，ことを指摘した．このチャンネルはコンコダクタ

1992，ppll1−113．

ンスが10pS，反転電位が45mVであり，Turner等

5）PFong，PTurner，etal：lncreasedactivity

が指摘したcalciumleak channe15）6）と同一のも

of calciumleak channelin myotubes ofのと思われる．Francoらや吉田らが指摘していDuchenne human and mdx mouse orlgln．

るmechanosensitive channelや電位依存性カル

Science250：676−673，1990．

シウムチャンネルとは物理的，電気生理学的に異6）PTurner，PFong，etal：1ncreasedcalcium

なる条件で開口する点に特徴があり，少なくとも

influxindystrophicmuscle．JCellBioll15：

安静時の細胞内カルシウム濃度上昇に寄与してい1701−1712，1992．

る可能性があると思われた．大きな細胞骨格蛋白−183−36）ダントロレンNaを用いたmdxマウスの治焙的研究
栗 原 願 事＊研究協力着

岸雅 彦＊ 大 迫 正 行＊

仁 科 牧 子＊ 木 下 眞 男＊

日的タントロレンNa（DTNa）は筋小胞体からのCa放出を抑制することにより興奮収縮連関を阻止する薬剤であり，臨床的にも筋弛緩薬として用いられたり，悪性症候群の治療にも用いられている．近年，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）
患者にDTNaを用いると，血清CKが低下し，ジストロフィーの進行を抑制するという報告がBertoriniらによりなされた1）．また，DTNaがmdxマウスのCKを下げるという報告もなされている2）．我々はmdxマウスに見られる筋細胞膜の電気生理学的異常に対するDTNaの作用を検討したので報告する．

の影響を検討した．
in vihvstudy：5週齢の無処理のmdxマウスの神経一横隔膜標本を作成し，DTNaを10mg／Lの濃度になるようTyrode溶液に加えて，筋標本を浸し，RMPs及び筋活動電位のパラメーターを測定し，比較検討した．
in uitrostudy：3週齢のmdxマウスに対して，
毎E］10mg／kgのDTNaの腹腔内投与を2週間施
行後，神経丁横隔膜標本を作成し，通常のTyrode
溶液を用い各パラメーターを測定し，比較検討した．又，排腹筋の組織学的検索も合わせて行った．

ーor■aI aCtion potent柑Iand paral噌terS

方法
Mdx mouseの神経一横隔膜標本を作成し，前回までの方法と同様の手技を用いて筋細胞内記録を行い，静止膜電位（RMPs）及びmyotonicburstの有無を各実験で50−100本の筋線経について計測した．また，ガラス管微小電極が筋細胞内に入っている状態で神経刺激を行い，筋細胞内活動電位を記録した．活動電位波形はA／Dコンバータ
ー及びパーソナルコンピュータを用いて，サンプ
リングクロック10KHzにて取り込み，約10本の筋線経のpeak voltage，rising time，half decay
time，Vmaxを測定し（図1），統計学的な検索を行った．以上の検索を下記の方法にてDTNaを作用させた標本に対して行い，DTNaの筋細胞膜へ

2．88（msec／di＞）m〉01t

図1神経一横隔膜標本において神経刺激を行い記錨した正常筋活動電位の波形．これらのパラメーターを測定し，比較検討をおこなった．

＊東邦大学医学部第四内科−184−

mdx control

筋活動電位のrisingtimeはinviuostudyでは0．95±0．12msec，in vit7V Studyでは0．95±0．15msecであった．対照mdxマウスの1．17±0．17msecと比較すると短縮しており，nOn一matChedt

RMP（mean±S．D．）−75．4±7．3mV（n＝100）
bul＄tlreq．：26％−teSt（p＜0．05）でも有意であった．Vmaxはin
扉紺で106．6±33．2V／sec，加 むか0で115．8±∴−＿￣￣￣＿
40

50

印

70

80

9010011O RMP（一mV）

17．3V／secであり，対照mdxマウスの94．8±
30．4V／secと比較して大となる傾向を認めた．
Halfdecaytimeはin vivoで1．16±0．30msec，
in vitYVで0．97±0．19msecで，対照mdxマウスの1．18±0．24msecに比べて短縮する傾向を認めた（表1）．
DTNaの腹腔内投与を施行したmdxマウス，

rTldxin vitro study：dantrolenelOmg／L

RMP（m帽欄∩±S．D．）−72．1±8．6mV（∩＝70）
burSt什eq．：32％＋−￣＿−＿
40

50

60

70

80

90100110及び対照mdxマウスの排腹筋の組織学的検索を施行した．HE染色ではどちらもfocal necrosis
を認め，正常線経に混じり小径の中心核線経が存在した．筋線経の平均直径も20−30JJm前後で，投与群と対照群で変化は認められなかった（図3）．
60Kdの抗ジストロフィン抗体を用いたジストロ

RMP（−mV）

mdxin vivo study：dantrolenelOmg／kgX2Wi．p．
N0．

MP（Mean土S．D．）−70．9±10．OmV（n＝；100）

…二＝
40

図2

50

60

70

80

90100110bu†＄tIreq．：33％

フィン染色でも投与によるジストロフィン発現は認められず，組織学的にもDTNaに伴う改善は認められなかった．

RMP（一mV）

タントロレンNa（DTNa）をinvtvoおよび
乃〆rPで使用した場合の静止段電位のヒス
トグラム．DTNaによるRMPsの改善，ヒストグラムのパターン変化およびelectrical
myotoniaの減少は認められなかった．

結

考察及び結語
タントロレンNaは筋小胞体からのCa放出を抑制することによりE−C couplingを阻止する薬果

DTNa腹腔内投与mdxマウス（in vitro
study）のRMPsは一70．9±10．0（S．D．）mV，対照mdxマウスのRMPsは−75．4±7．3（S．D．）
mvでありRMPsの改善はなく，ヒストグラム上の分布にも改善は認められなかった．またmyotonic burstの頻度もDTNa投与mdxマウスでは33％，対照マウスでは26％であり，ミオト
ニーの制御効果は認められなかった．標本を浸す
Tyrode溶液に直接DTNaを入れた場合（invitYVStudy）でも同様にRMPs，ヒストグラム上の分布，及びmyotonicburstの頻度には変化は認
められなかった（図2）．

剤であり，5−30mg／1では等尺性張力を20〜35％まで低下させる．しかしBertoriniらは，筋力低下を釆たさない程度の用量によりDMDにおける血清CK低下作用，ジストロフィーの筋力低下抑制作用を認めたと報告している1）．そして，DMD及びmdxマウスにおけるDTNaの血清CK低下
作用の機序については明らかではない．DTNaが正常の筋細胞膜には影響を与えない事は良く知られているが，DMDやmdxマウスのような異常な筋細胞膜にどのように働くかは不明である．そこ
で，我々はDTNaの筋細胞膜安定化作用の有無について検討を行った．
mdxマウスの筋細胞膜の電気生理学的異常として，壊死に陥る過程を反映すると思われる
RMPの低い筋線経の存在，及び筋細胞膜の不安−185−

表1筋活動電位波形の各パラメーター．DTNa使用によりrisingtime短縮，Vmax増大などの傾向を認めるが，この事によりburstが起こり易くなることはあっても筋細胞膜は安定しない．
jn vitro study：dantrolenelOng／L

P value （non−contro ldantrolene
（
∩＝12）
（
∩＝14） matched t−
teSt）
RMP
（
mV）80，
7 ±5．
7 79．
7 ±6．
5
0．
707
Vmax
（
〉
／
sec）94．
8 ±30．
4 115．
8±17．
3
0．
044＊
Peak voItage（mV）59．
4 ±12．
4 57．
8 ±8．
4
0．
718
Rising t血
e
（
ms）1．
0．
002＊
17 ±0．
17 0．
95 ±0．
15
0．
024＊
Ha lf−
decay time （ms）1．
18 ±0．
24 0．
97 ±0．
19
in vivo study：dantroLenelOmg／kgi．p．X14days

P value （non−controldantrolene
（
∩＝12）
（
∩＝15） matched t−
teSt）
RMP
（
mV）80．
7 ±5．
7 78．
4 ±6．
7
0．
377
Vmax
（
V／
sec）94．
8 ±30．
4 106．
6±33．
2
0．
365
Peak voItage（mV）59．
4 ±12．
4 59．
5 ±10．
40．
968
Rising til
柁
（
ms）1．
0．
001＊
17 ±0．
17 0．
95 ±0．
12o．
863
Ha lトdecay time （ms）1．
18 ±0，
24 1．
16 ±0．
30 l＊significant（pく0．05）

図3mdxマウスの排腹筋のHE染色標本．A：対照mdxマウス，B：DTNa使用mdxマウス．
DTNa使用による組織学的改善は認められなかった（×200）

−186−

表2

数多くの薬剤が試みられてきており，DTNaもまたDMDの進行を抑制する可能性のある薬剤とし

Bestatin，Mexiletineはmdxマウスの筋細胞膜の電気生理学的異常を改善するが，DTNaにはこのような作用は認められなかった．

B e s ta t ∩M e x i le t n e
D PH
TT X
D a n t r o le n e

低 RMPsの 改 善：burst抑 制 効 果

＋

＋
＋
＋
＋

＋
−
−
−

て諸家の報告があるが，どの程度DMDの予後を改善出来るのかは，まだ十分に検討されてはいな
い．さらにDTNaは元来筋収縮を抑制する薬剤であり，すでに弱っているDMD患者の筋力をさらに低下させる可能性もある．今後の憤重な検討が必要と考えられた．

−

定性を反映すると思われるelectrical myotoniaの出現を我々は報告してきた2）．そして，これらの筋細胞膜異常を改善する薬剤としてbestatin3）や
mexiletine4）があるが，DTNaにはmdxマウスの
筋細胞膜の電気生理学的異常を改善させる作用は認められなかった（表2）．また，DTNaには筋活
動電位におけるrising timeを短縮させる傾向があるが，この事によりmyotonicburstは起こりやすくなっても，筋細胞膜が安定することは考えられない．DTNa使用に伴うこれらのパラメーターの変化に関してはさらに検討してゆく必要はある
が，いずれにせよ，DTNaはmdxマウスの筋細胞
膜の電気生理学的異常を改善する作用は存在しないと思われる．DMDやmdxマウスにおけるCK

文献1）BertoriniTE，PalmieriGMA，etal：Effectof
dantroleneinDuchennemusculardystrophy．
Muscle＆Nerve14：503−507，1991．
2）QuinlanJG，Johnson SR and Samaha FJ：
Dantrolenenormalizesserumcreatinekinase
inmdxmice．Muscle＆Nerve13：268−269，
1990．

3）KishiM，Kurihara T，etal：Thestabilizing
effect ofbestatin on the resting membranepotentials of X−linked muscular dystrophy

mice．JpnJ Psychiatr Neuro144：593−600，
1990．

4）栗原照幸，日高隆信，岸 雅彦，根本 博，木下英男：mdxマウスの電気生理学的及び治療低下作用の機序として，E−Cuncouplingに伴う筋収縮抑制作用が筋崩壊を抑制している可能性が考的研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

えられるが，組織学的検索では筋崩壊の抑制を示
唆する所見は認められなかった．
DMDの進行を抑制する薬剤として，現在まで

法開発に関する研究（荒木班）平成2年度研究ー187−

筋ジストロフィー症及び関連疾患の成因と治療報告書 1991，pp172−176．

37）mdxマウスにおけるダントロレンナトリウムのCK値および運動能力におよぼす影響
梶

研究協力者

龍 見＊

小 島 康 祐＊ 濱 野 利 明＊ 中 村 道 三＊
鴨 田 早 苗＊ 木 村淳＊

筋ジストロフィーにおいては細胞内Caが筋線

筋力への影響を明らかにするため，今回我々は経の壊死に関与していることが推察されている1）．

mdxマウスを用い，タントロレンを投与して，そ

これまで筋肉内へのCa流入を抑制することで効のCK値および運動能力に及ぼす影響を検討した．

果を見た報告が動物実験および臨床での研究でい
くつかなされている．しかしこれまでのところ，

方法

筋ジストロフィーに対する有効な治療法は確立されていない．

投与群に分けた．投与群には，タントロレンナト

タントロレンは骨格筋の興奮一収縮連関に作用

リウム0．3mgを4週間連日腹腔内投与した．タン

4週齢mdxマウスを，タントロレン投与群，非し，筋小胞体からのCa遊離を抑制する薬物としトロレンナトリウムは0．667mg／mLになるようて知られている．近年，タントロレンを筋ジスト蒸留水で洛解し，その0．45mLを投与した．非投与
群には生理食塩水0．45mLを同様に4週間腹腔内投与した．
効果の判定には，体重，運動能力，CK値，および組亀学的検討を用いた．運動能力は回転ケージ

ロフィーの治療に応用した報告が散見される．
mdxマウスはDuchenne型筋ジストロフィーと同様にジストロフィン蛋白を欠き，その病態生理に共通点があると考えられ，モデル動物として注目されている．1990年Quinlanらはmdxマウスにタントロレンを投与して，血清CK値が低下することを報告しているが，筋力についての詳しい検討は行っていない2）．逆に，タントロレンはmdx
マウスのCK値には影響しないという報告もあり3），その効果も確立したものではない．1991年
Bertoriniらはタントロレンを少数例のDuchen−
ne型筋ジストロフィーに投与し，血清CK値の低下を認め，筋力低下をやや改善させたという報告をしている4）．しかし，その作用機序は明らかではに1時間放置し，その回転数で評価した．体重および運動量は投与前と投与後1週間毎に測定した．
投与4週間後，ケタミンで深麻酔下で心臓穿刺により採血を行い，血清CK値を測定した．
実験に使用したマウスは投与群29匹，非投与群28匹で，合計57匹を用いた．投与群にて薬剤投与とは無関係の原因で2匹が死亡したが，この2匹を除き，合計55匹で検討を行った．
結果の検定は，unpairedttestにて行い，p＜0．05を有意とした．

ない．
筋ジストロフィーに対するタントロレンの効果，＊京都大学医学部神経内科

結果1）体重に対する影響（図1）投与前では両群の問に差はなかった．投与後に

−188−

〇
3
2
一5
0
1
5

︵空−色盲声音0田

2

0
0

0

3W

4W

QF800

0 日 ロ 書 8 8

2W

00白

1W

ロdantroleno
田COntrOl
図l Comparison ofbody weight

dantroIeno

図3

900
800

COntrOl

Comparison ofCK

dantrotene

700
600

主
○
∽
U

400

300

4

1u⊃00

u

500

5

亡：
q〉
〉く

3

4W

2

［］dantrot即〇

1

2W

3W

0

四eonlr81
図2

Comparison ofexercise

2．8

3

3．2

3．4

3．6

3．8

4

4．2

4．4

4・6

4・8

4

4．2

4．4

4・6

4・8

10gCK

おいて，タントロレン投与群でやや体重が低下す
る傾向にあったが，有意差を認めなかった．

COntrOl762）運動能力に対する影響（図2）
1時間の回転数は，投与前では，タントロレン
投与群，非投与群に差はなかった．投与1週間後，3週間後では，投与群で運動能力が低下する傾向を示したが，有意差を認めなかった．投与2週間
後では，投与群で500±185（mean±SD），非投与群で640±212（p＜0．02），投与4週間後では，投与群で525±220，非投与群で659±201（p＜0．05）と有意の運動能力の低下を示した．
3）CKに対する影響（図3，4）
図3に示したように，タントロレン投与群では非投与群に比べてCK値はやや低下する傾向を示

5

≡4
＝1
0

03
2

1

0

2．8

3

3．2

3．4

3．6

3．8
10gCK

P＝0．15

図4

Comparison oflog CK

した．平均値はタントロレン投与群では7044± IU／Lであった・CK値は正規分布をしていないた
5916IU／L（mean±SD），非投与群では9408±9478 め，nOnparametrics（Mann−WhitneyU）で検定−189−を行ったが，有意差を認めなかった．（P＝0．38）
正規化のため対数変換を行った．正規分布より大きく外れる値を投与群より1例，非投与群より2例削除し，合計52例で検討を行った．対数倍の平均は，投与群では3．73，非投与群では3．87と投与群で低下する傾向を示したが，有意差は認めなかった．（P＝0．15）（図4）
4）運動能力とCK値の関係（図5）投与4週間後の回転数とCK値の関係を示す．
投与，非投与にかかわらず，運動量とCK値の問には相関関係は認められなかった．
5）病理学的検討
筋線経の組織学的検討を行ったが，タントロレ
ン投与群，非投与群で明らかな組織学的な差を認めなかった．
考察

運動能力について．タントロレン投与により回転ゲージの回転数に低下が見られた．Quinlanらの報告2）では下肢の筋重量を測定し，運動量の判定に用いているが，今回の我々の方法のほうがより直接的に運動量を反映すると考えられる．タン
トロレン投与により運動量が低下することは，本薬剤を臨床応用する場合においては注意を要する点と考えられる．ただし今回用いたタントロレンの量は，体重当たりに換算すると12−20mg／kgと臨床的に用いる量と比べると高用量である．
（Bertorini4）らの報告では6−8mg／kgを投与し
45000

40000

85000

CK値について．Quinlanらの報告2）では，タントロレン投与群で明らかなCK値低下を認めているが，今回の実験条件では，タントロレン投与により，・CK値はやや低下する傾向にあったが，有意差は得られなかった．Quinlanらはタントロレン
を経口で投与しており，投与経路の差による可能性もある．そのため我々もタントロレンの経口投与を行った．今回は示していないが，その結果でも投与群でCK値が軽度低下する傾向はあったが，有意の差はなかった．
投与群では運動量が少ないため，CK値が低下傾向を示したということも考えられるが，投与後の運動量とCK値には相関関係はなく，運動量の差のみではCK値の差は説明できない．
Duchenne型筋ジストロフィーおよびmdxマウスにて欠損しているジストロフィン蛋白は，Caのhomeostasisに関係していることが示唆されている．タントロレンは筋小胞体からのCa遊敵を抑制することが知られており，この作用が，欠損しているジストロフィンの機能を一部代償し，CK値を低下させた可能性が考えられる．
まとめ

mdxマウスにタントロレンナトリウムを4週
間腹腔内投与を行った．タントロレン投与により，CK値はやや低下する傾向を示したが，有意差は認めなかった．タントロレン投与群で運動量の低下を認めた．CK倍と運動量との間には相関関係
はなく，CK値の低下は運動の差によるものではないと考えられた．今後，投与方法，投与量も含めて，さらに検討する必要があると考えられる．

お
20

0︒︒M

︵己⊇︶と0

狐0

ている．）

文

献

15000

1）Turner LFG，Westwood T，Regen CM and1皿Steinl1ardt RA：Increased protein degrada・

5000

tionresultsfromelevatedfreecalciumlevels
foundinmusclefrommdxmice．Nature335：

0

100

200

300

4【り

5∝16（氾700

ExOrCis0−4W（伽）00090010001100

図5735−738，1988．

o danlroleno
eOntrOl

2）QuinlanJG，Johnson SR and Samaja FJ：

Correlation of exercise and CKDantrolenenormalizesserumcreatinekinase

ロ

−190−

inmdxmice．Muscle＆Nerve13：268−269，と治療法開発に関する研究 （荒木妊），平成3

1990．

年度研究報告書，1992，pp119−122．

3）高木昭夫，小島 進，井田 雅，渡部知司，黒4）Bertorini TE，Palmieri GMA，GriffinJ，

岩義之：dantrolene sodiumによるmdxマウ

IgarashiM，HintonAandKarasJG：Effectスの実験的治療． 厚生省「精神・神経疾患研究

OfdantroleneinDuchennemusculardystro−

委託㌍」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因

phy．Muscle＆Nerve14：503−507，1991．

ー191−38）mdxマウスへの正常筋移植
高 木 昭 夫＊
研究協力者

井

田

雅

祥＊

小

は じめに
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の病因
が細胞骨格蛋白ジストロフィンの遺伝的欠損であることが明らかとなった1）．遺伝性疾患の治療には本来異常遺伝子の修正が必要であるが，骨格筋
は単核の筋芽細胞が融合してできる多核細胞であることから，正常筋芽細胞を融合させることによって異常遺伝子を有する筋に正常遺伝子を導入することができる．これに基づいて，DMDに対して骨格筋移植によって治療する試みが行われている．
筆者らは基礎的実験として，DMDのモデル動物
であるmdxマウスに同系統の正常マウス（BlO）の培養筋芽細胞および細切筋片を移植した．1ケ
月後，被移植筋を取り出し，CryOStat法で切り出した切片にヤギのポリクローナル抗体を用いてジストロフィン染色を行い，ジストロフィン陽性筋
線経の出現を確かめることによって移植の効果を検討した．
材料および方法
1）筋芽細胞の培養と移植：寺尾2）らの方法に従って，生後5−7日のBlOマウスの後脚から皮膚・骨・血管を除き筋組織を取り出した．細切したのちトリプシンで筋芽細胞を遊馳し，COllagenL
coateddish（直径90mm）に蒔いた．66％Dulbecco
SModifiedEagleMedium＋22％medium199＋
10％fetalcalfserum＋1％penicillin，Strept0−
mycin，fungizone＋1％insulin（以下，mediumと略）を加え5％CO2下37度でincubationを行■虎の門病院神経内科

島

進＊

渡

辺

知

司＊

い，3日ごとにmediumを交換した．
14日後dishがほぼ培養細胞で被われたところ
で，トリプシン処理を行い細胞を集めた．ミクロ
シリンジフィルターを通して濾過したのち，元のdish1枚あたり5枚のdishに蒔き，Subcultureを行った．
7日後，dishがほぼ培養細胞で被われた時点
で，Subcultureと同様の方法で培養細胞を集め，
medium約1mlに浮遊した．このうち20JLlをとり血球計算板で細胞数を求めたところ約4×106／
mlであった．移植は生後28日目のmdxマウスをネンプタールの腹腔内注射により麻酔し，右前腰骨筋に切開目視下で1匹につき0．5mlを数カ所に分けて筋肉注射した．コントロールとして左前脛骨筋にmediumを注射した．
2）細切筋片の移植：生後5〜7日のBlOマウスの後脚から筋組織を取り出して細切した．生後28日目のmdxマウスをネンブタールの腹腔内注射
により麻酔し，右前腰骨筋に切開目視下で細切筋片を移植した．
3）被移植筋の病理学的検討：筋芽細胞移植群，
細切筋片移植群ともに移植から1カ月後，両側の前脛骨筋を取り出し，CryOStat法で切り出して染色した．染色はHE染色および抗ジストロフィン
抗体〔D−90（Dr．Kunkelより供与されたヤギ血清で作成されたポリクローナル抗体）〕による免疫
組織化学（Biotin−Streptavidin法）を施行した．
結果
図1に細切筋片移植におけるHE染色と連続切片におけるジストロフィン染色を示す．HE染−192−

図1 細切筋片の移植（1）
上がHE染色，下が連続切片におけるジ

図2 細切筋片の移植（2）
上がHE染色，下が連続切片におけるジストロフィン染色．
膜に治ってジストロフィン陽性を示す筋練経が5−6本の集まりを形成している．

ストロフィン染色．
ジストロフィン陽性筋線経の中には，HE染色で融合や中心核の存在を示すものがある．

色では筋線経の円形化，大小不同，申し、核，問質の増加などの筋原性変化が見らゴ した．ジストロフ
ィン染色では数個の筋線椎が全個性に陽性に染色され，ジストロフィンの存在が確かめられた．また，ジストロフィン染色で陽性に染色されている
筋線経の中には，HE染色で融合しているように
みえ，また中心核をもっているものもあった（図2）．HE染色像で対応する筋線経の近くには，細胞浸潤が存在していた．蛍光抗体法によるジスト
ロフィン染色ではさらに8−10個の陽性線経の集団を形成しているのが認められた（図3）．さら断面を示しており走行が一致していた．このこと

図3 細切筋片の移植（3）蛍光抗体法によるジストロフィン染色．

から，陽性線経は移植した筋片そのものではなくサテライト細胞が融合して陽性化した線推である

筋芽細胞を移植したmdxマウス6匹についてに，これらの陽性線経は陰性の筋線経と同様の横と考えた．

ジストロフィン陽性線維数を調べたところ表1，−193−

表1 筋芽細胞の移植の効果

被 移植 m dxとができた．しかし，寺尾らは前者の方法で十数本の陽性線維群を認めており3），今回筋芽細胞の移植の成績が不良であった原因は主に技術的な問題によると考えられる．一方，細切筋片の移植は比較的容易であるにもかかわらず，寺尾らの成績に近い数字が得られており，移植の一手段となりうると考えた．

dYStrO P hin 陽性繰維 数

マ ウ ス

移植 側

1

2 〜3

2

4 〜5

3

1〜 2

4

1（一2

5

2 〜3

6

1〜 2

非移 植側

細切筋片の移植後に出現したジストロフィン陽性筋線経の由来として，移植したBlOマウスの筋片そのものが染まったという見方もできる．しかし，細切筋片は筋線経の方向を無視して移植しており，一方生着した陽性筋線経の走り方は約2mmにわたって連続切片を染色したが陰性のものと同

0 〜2

じであった．コントロールのmdxマウスにも少数の陽性筋線経が存在するが，8−10本の集まり
は移植によらねば認められないと思われる．このことから，移植筋のサテライト細胞がレシピエン
トの筋細胞に融合してジストロフィンが発現したと考えた．

表2 細切筋片の移植の効果披移植 m d x d YStrO P hin 陽性 線維数
マ ウ ス
移 植側
非移植 側
1
2

2 〜3

3

16

15

HE染色上筋線経の円形化，大小不同，中心核，
問質の増加などの筋原性変化が見られるほか，細胞浸潤が存在しており，ジストロフィン陽性線経の近くにみられることから拒絶反応の発現を考え
た．

0 〜2

2に示すように，多いマウスで4−5本，少ない

今後，拒絶反応の予防をはじめとして生着率を殖やす方法を検討する必要がある．

ものでは1−2本と非移植側と大差がなかった．
結これに対して細切筋片の移植では2匹で15〜16本のジストロフィン陽性筋線経がみられ，筋芽細胞の移植よりも多くの陽性線経を認めることができた．しかし，全体としての筋線維数は2000−2500本であったので陽性化したものは0．6−0．8％に過ぎなかった．
考察

ヤギ血清の抗ジストロフィン（ポリクローナル）
抗体を用いることにより，移植を受けたmdxマウスにジストロフィンの存在する筋線経の集まりを確認することができた．培養筋芽細胞の移植と細切筋片の移植の効果については，後者の方が容易でかつ多くのジストロフィン陽性線経を得るこ語

1．骨格筋移植によるDMDの治療について基礎的実験として，mdxマウスにBlOマウスの培養筋芽細胞の移植および締切筋片の移植を行った．
2．ジストロフィン染色陽性筋線経の生着数は，
培養筋芽細胞の移植ではコントロールと大差がな
かったが，細切筋片の移植では15−16本のジスト
ロフィン陽性線経が確認できた．細切筋片の移植
は筋芽細胞の移植に比して容易でかつ効果もあった．
3．ジストロフィン陽性筋線経はその走行が陰性
線経と同じ方向であり，かつ8−10本の集まりを形成していた．このことはBlOのサテライト細胞
がmdxの筋と融合してジストロフィン陽性線維−194−になったことを示すと考えられる．

CytOSkeletal protein．Cel153：219−228，1988．

4．HE染色では，細胞浸潤などの炎症反応を伴っており，拒絶反応の発現が推定された．
5．今後さらに生義軍を高める方法を検討する必要がある．

2）寺尾寿夫，高津成美ほか：ジストロフィン筋への正常マイオブラストの注射に関する研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ
フィー症及び関連疾患の病態とその成因に関する研究 （杉田班）．平成元年度研究報告書，

謝辞：筋芽細胞の培養についてご教示下さった帝
京大学寺尾寿夫教授，抗ジストロフィン抗体D−90を供与して下さった国立精神・神経センター荒畑

1990，pp177−182．

3）寺尾寿夫，加藤洋司ほか：ジストロフィン筋へ

喜一先生に深謝いたします．

の正常myoblastの注射に関する研究−注射法の検討−． 厚生省「精神・神経疾患研究委
託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と文
献1）KoenigM，MonacoAP，etal：Thecomplete

治療法開発に関する研究 （荒木：旺）平成3年度

SequenCeOfdystrophinpredictsarodshaped−195−

研究報告書，1992，pp123−126．

39）ジストロフィー筋への正常myoblastの注射に関する研究−mdx／nude hostへのmyoblast transfer

寺 尾 寿 夫＊
研究協力者

清

水

輝

夫＊

臼

杵

扶佐子＊

本

書

慶

史＊

園 生 雅 弘＊ 大 井 博 子＊ 藤 田 幸 子＊

近年のジストロフィンの発見はDuchenne型筋
ジストロフィーの治療に期待を持たせる大きな出来事であった．しかし400KDを越える大きさのジ

ロフィン陽性線経の出現率を指標として観察したのでその結果を報告する．

ストロフィン分子の機能を生化学的に補うことは困雉であり，期待されるgenetherapyも多くの壁動物および方法
使用したマウスはC57BL／10−mdx−nu／nuである．このmdxとnudeマウスのdoublemutantはに直面しているのが現状である．その中でmyo−blast transferは正常の遺伝子またはその遺伝子産物を直接筋に送り込むと云う点で，上述の方法の代用法としての期待が持たれている．myoblast
transferが実験的に開始されてから，すでにかな
りの時間が経過したが，動物実験においても必ずPartridge研究室由来のものであり，このマウスは同研究所より国立神経センター（竹光正和先生）と昭和大学藤が丘分院（若山書弘先生）に供されており，われわれはその一部を頂き自繁したものを使用した．使用したマウスは計8匹であり，いしも良好な結果が得られないまま，ヒトでもこれが試みられるようになっている1）2）．
この方法の問題点のひとつはmyoblastを注射した後のhost側の拒絶反応を如何に抑制するかと云う点である．われわれはこれまでmdxマウ

ずれも生後1か月である．正常のmyoblastは既に報告した方法により得たものである．すなわち
幼若のB−10マウスの下肢筋を摘出，結合織，血管などを除いた後trypsin処理し，炉過後co1−

スを対象として，CyClosporinAの投与やhostへのradiationを行ってhost側の拒絶反応を抑制しながら，正常のmyoblastをtransferLその結果を本姓会議で報告してきた3）4）．この際その効果の指標にはジストロフィン陽性線経の出現率を用いたが，その結果は必ずしも高率ではなかった．

mediumを用いて培養を行った．培養終了後

1989年Partridgeら5）はmdxマウスをnude化
したdouble mutantmouseを使用し，myOblast
transfer後の陽性線経の出現率は10−40％と報告している．今回われわれも，このマウスを使用して研究を行い，myOblasttransferの効果をジスト＊帝京大学医学部神経内科

1agencoatingdishに移し，Dulbecco

smodifiedtrypsinを用いて増殖したmuscle precursor cell（mpc）を集め，遠心後5×106個／mlになるように
medisumにsuspendL注射に用いた．目標とした
ジストロフィー筋は長指伸筋（EDL）である．一側のEDLに上記mpcを数か所に分け，1本のEDL当り2．5×105個筋注した．他側にはmedium
のみを同量注射しコントロールとした．
注射は皮膚を切開して直視下に行い，注射後1か月でEDLを取り出し，CrOSS−SeCtionの薄切切片を作り，H−E染色標本の他に，抗ジストロフィン抗体を用いてimmunostainingを行った．蛍光
顕微税下にジストロフィン陽性線経を観察し，こ−196−

れが何％出現するかを計算した．
結果

図1は生後2か月のmdx／nudeマウスのEDLのH−E染色像である．これに見るように大部分の筋線椎は中心核を有しており，壊死と再生が活発に起っていることを示している．しかしこのマ
ウスの運動は一見正常で筋のweaknessは明らかでなかった．
myoblast transferを行う前のmdx／nudeマウスのEDLを抗ジストロフィン抗体で染色するとmdxマウスの場合と同様にほとんど陽性線経は

図2

myoblast transfer後1か月日のmdx／

みられなかった．しかし僅かではあるが，陽性繰

nudeマウスのEDL（抗ジストロ7イン

経が1〜数本の束になって出現することがあり，抗体によるimmunostaining）

Hoffmanら6）の云うrevertantと考えられる．
myoblastを注射した後1か月日のEDLではジストロフィン陽性の線経が所々に数本〜十数本群をなして出現するのが見られる（図2）．時には注射部位にかなりの数の群がみられることがある（図3）．ジストロフィンの蛍光は筋膜の仝同にみられることが多いが，ときにはその一部だけに見られるものもあった．
これらの陽性線経が全線維中にどの位の比率で含まれるかを，いくつかのcross−SeCtion標本につき観察し，陽性線経のパーセントを8匹のmdx／
nudeマウスのEDLにつき示したのか表である．
これに見るように，筋線経によってかなりの変動

図3

myoblasttransferlか月日のEDL（抗ジストロフィン抗体によるimmunos−
taining）があるが，2．4％〜9．7％陽性となり，平均は6．0％
で，コントロールの1，8％に比し有意に増加していた．
考察

今回の結果はこれまでに報告したcyclosporin
A投与やhostのradiationにより免疫抑制を行った時のジストロフィン陽性線経の出現率に比し
図1mdx／nudeマウスのEDL（H−E染色，生高い値を示していた．このことはmyoblasttrans−
ferによるジストロフィン陽性線経の出現率を上後2か月）昇させるためには拒絶反応の抑制が如何に重要で
−197−

表

Dystrophin positive fibersin mdx／nu

より若いmdx／nudeマウスを使用し，より多くの

EDLsl month after myoblast transfer

mpcを注射し観察している所である．

Ho st Num ber o f positivo libers／
T0 1al■
bers

％

No

m yobIaSl transtor

C On tr01

m yoblaSt tranSIel

control

1

50 ／ 612

6 ／ 624

8．
2

1．
0

2
3

27 ／ 666

8 ／ 508

12 ／ 584

15 ／ 621

4．
1
2．
4

1．
6
2．
4

4

45 ／ 579

6 ／ 319

7．
8

1．
9

5

24 ／ 688

15 ／ 672

3．
5

2．
2

6

60 ／ 750

8 ／ 360

8．
0

2．
2

7

24 ／ 528

12 ／ 892

4．
5

1．
3

8

36 ／ 370

12 ／ 612

9．
7

2．
0

AYOrさ
gO

6．
0±2 ．
7
」

，
＜川

ま

と

め

1）生後1か月のmdx／nudeマウス8匹のEDLに正常（BTlO）マウスのmyoblastをtransfer
L，1か月日に取り出し，抗ジストロフィン抗体によるimmunostainingを行ってジストロフィン
陽性線経を観察した．

1．
8土0 ．
5

2）ジストロフィン陽性線経は2．4〜9．7％（平均」6．0％）に出現し，コントロールの1．8％より有意あるかを示しているように思われる．

に増加していた．

上述のようにPartridgeら5）は同じマウスのEDLを使用して研究し，10〜40％の高率に陽性線経の出現を報告している．彼等の成績に比べれば

謝辞：本研究に用いたmdx／nudeマウスは国立
精神・神経センター竹光正和先生および昭和大学

我々のデータは低値にとどまっていた．myoblast
transfer後の陽性線経の出現は，注射された正常のmyoblastが正常のmyotubeを形成し，それら同志が互に癒合してジストロフィン陽性の線経を形成するかまたは注射時の損傷によりhostの筋線経の衛星細胞が活性化され，注射された正常の藤が丘分院の若山吉弘先生がPartridge先生より

myoblast由来のmyotubeとfusionすることによりジストロフィン陽性の線経が形成されることが考えられる．しかし第3の可能性は注射された
myoblastが無傷のジストロフィーの筋細胞膜を通過してジストロフィーのmyoblast由来のmyotubeと癒合し，ジストロフィン陽性線経を作

1）Gussoni E，Pavlath GK，et al：Normal

頂いたものを，両先生の御好意により分けて頂いたものであり，これらの先生方に深甚の謝意を表
します．

参考文献
dystrophin transcriptsdetectedinDuchenne
muscular dystrophy patients after myoblast
transplantation．Nature356：435−438，1992．
2）HuardJ，BouchardJP，et al：Human
myoblasttransplantation，preliminaryresults

ることである．損傷を受けていないmdx／nuの筋細胞のextracellular matrixの厚いmeshwork

Of4cases．Muscle and Nerve15：550−560，

を，注射された正常のmyoblastが通過し得るかどうかは大きな問題であるが，Partridgeらの研究は或程度通過し得る可能性を示しているように思われる．

3）寺尾寿夫：ジストロフィー筋への正常マイオブPartridgeらの報告に比し，今回のわれわれのデータが低値にとどまった理由はいくつか考えられる．第1は彼等の使用したmdx／nudeマウスは班）平成元年度研究報告書，1990，pp177−

生後5〜27日で，われわれの用いた生後1か月日のものより若かったこと，第2は注射したmpcの数がEDL当り5×105−4×106でわれわれの場
合より多かったこと，第3に注射時に筋外への洩れが起ったことなどである．このためわれわれは1992．

ラストの注射に関する研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田182．

4）寺尾寿夫：ジストロフィー筋への正常myob−
lastの注射に関する研究−Ⅹ線照射の効果．

−198−

厚生省「精神・神経疾患研究委託亨モ」筋ジスト
ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木珪）平成2年度研究報告書．
1991，pp200−203．

5）PartridgeTA，MorganJE，etal：Conversion6）Hoffman EP，MorganJE，et al：Somatic

ofmdxmyofibresfromdystrophin−negative reversion／suppression of the mouse mdx
to−pOSitivebyinjectionofnormalmyoblasts・

phenotypeinvivo．J NeuroISci99：9−25，

Nature337：176−179，1989．

1990．

−199−

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症40）蛋白質のミトコンドリア移行とその異常：
サイトゾル因子の役割
正 敏＊

森

研究協力者

村 上

は じめに

薫＊

蛋白質のミトコンドリア移行のシステムを構成すミトコンドリアは細胞のエネルギー産生，アミる因子の異常に分けて考えることが出来る．（丑にノ酸代謝，糖代謝（TCAサイクル），脂肪酸β酸化，尿素合成前半などを担う重要な細胞小器官（オ

ついては症例が報告されはじめているが，（診につルガネラ）の一つである．ミトコンドリアはそれ機構を明らかにすることが重要である．我々は肝自身が複雑な構造を持っており，サイトソルに面臓のミトコンドリアマトリックスに局在する2つしている方から外膜，股間分画，内膜およびマトの尿素サイクル酵素−カルバミルリン酸合成酵素

リックスの4つの区画より成っている．ミトコン

Ⅰ（CPSI）とオルニテントランスカルバミラーゼ

ドリアの大きな特徴の一つは，固有の遺伝子（OTC）−を実験系として蛋白質のミトコンドリ

DNAと蛋白質合成系を持ち，部分的な自律性をア局在化とその異常の研究を進めているl）．

いては先ず蛋白質のミトコンドリア局在化の分子備えていることである．しかしミトコンドリア

我々はまずラットCPSIとOTCのin uitrv合DNAはきわめて小さく，2種のリボソーム成を行い，両酵素が分子量の大きい前駆体の形でRNA，22種のtRNAおよび呼吸鎖に関与する13種のポリペプチドのみがコードされていることが合成されることを明らかにした．引き続いて多くの研究室で種々のミトコンドリア蛋白質について分かっている．最近ミトコンドリアDNAの異常同様の実験が行われ，ミトコンドリア蛋白質の大によるミトコンドリア病（ミトコンドリア脳筋症）

部分が前駆体として合成されることが明らかとなが発見され，その研究が急速に進んでいる．一方，った．さらにミトコンドリア蛋白質の合成部位が外膜，膜間分画，マトリックスに存在する全ての蛋白質および内膜の大部分の蛋白質は核染色体

遊維リ華ソームであること，前駆体がサイトゾルのプールより数分以内にミトコンドリアに移行し，

DNAにコードされており，ミトコンドリア外部

ミトコンドリアに存在するプロセシングプロテア

で合成されたのち，1枚または2枚のミトコンドーゼによって成熟蛋白質に転換されることを明ら

リア膜を通過して内部へ移行し，または膜に組みかにした．

込まれる．すなわち，ミトコンドリアの形成はミさらに玩J粛和で合成した蛋白質前駆体を単馳

トコンドリア遺伝子と核染色体遺伝子の2重支配

ミトコンドリアに取り込ませて成熟酵素に転換すを受けている．したがって核支配ミトコンドリア

る玩㍑融和のトランスポート再構成系を開発し，蛋白質のミトコンドリア移行の障害はミトコンド

このトランスポートとプロセシングの系が①組織

リア病を釆たす．蛋白質のミトコンドリア移行の特異性がなくどのミトコンドリアでも使用出来る，異常は①個々のミトコンドリア蛋白質の異常と②（診種特異性が低く，ラットやマウスのミトコンド
リアが使用出来る，（診複数の前駆体に共通である，

十熊本大学医学部分子遺伝学④トランスポートのステップにエネルギーが必要
−203−

0

であることなどを明らかにした．ついでOTC前に32アミノ酸残基の 延長ペプチド（presequen−
駆体の性状およびミトコンドリアへの移行の仕組

0

腸菌でOTC前駆体の大量発現させ，均一に精製0必要がある．そこで遺伝子工学の手法を用いて大0みを明らかにするためには前駆体を大量調製する

0ce） が付着していることを明らかにした．この前

0︼J邑∈l盲ぢJ￡

駆体cDNAをクローン化し，成熟酵素のN末端すると共に，精製前駆体を用いる玩J融和のトラ
ンスポート系を開発した2）．そして，精製前駆体の0ミトコンドリア移行にサイトゾルに存在するタン

20

40

60

Incubation（min）

パク貿因子が必要であることを発見し，この因子

図1をPBF（presequencebindingfactor）と名付けると共に，それを均一に精製した3）．精製PBFは
精製OTC前駆体のミトコンドリア移行を強く促進した．今回は，PBFが他の前駆体タンパク質のミトコンドリア移行にも関与しているかどうかをわ びgrPで合成したOTC前駆体のミトコンドリア移行に及ぼすPBFの効果．
未処理網状赤血球ライ七一ト，PBF除去
ライ七一トまたはPBF再添加ライ七一トで合成したOTC前島区体の単艶ミトコ
ンドリアへの取り込みを測定した．

調べた．
0
0

れる

0

〝 ひねβでのOTC前駆体の姿を反映していない可能性がある．そこでよりわZ びわβに近いと思わ

0

ドリア移行は精製PBFの添加により強い促進を受ける．しかし，尿素変性した精製OTC前駆体は0︼L已∈−盲BJ￡

方法と結果尿素で変性させた精製OTC前駆体のミトコン

乃〃ブ和で合成したOTC前躯体を用いてPBFの効果を調べた．
0

網状赤血球ライセートのタンパク質合成系で合

20

40

0

Incubation（min）

成したOTC前駆体は単駈ミトコンドリアに効率よく取り込まれた（図1）．しかし網状赤血球ライ

図2 アスパラギン酸アミノトランスフェラー
ゼ前駆体のミトコンドリア移行に及ぼすPBFの効果．

七一トにはPBFが含まれているので，OTC前駆体を結合させたセフアローズで処理することにより，PBFを除去したライセートを調製した．PBF
ンドリアに取り込まれなかった．ところが，精製

PBFの効果を調べた．未処理のライセートで合成したアスパラギン酸アミノトランス7ェラーゼ前

PBFを添加するとOTC前躯体の取り込みはほ

駆体は効率よくぼ完全に回復した．したがって，PBFは変性精製（図2）．ところが，PBF除去ライセートで合成さ除去ライセートで合成したOTC前駆体はミトコ

ミトコンドリアに取り込まrした

OTC前駆体のみならず，invit7V合成OTC前駆れた前駆体のミトコンドリア取り込みは見られず，体のトランスポートをも促進することが明らかと

精製PBFの再添加により取り込みは回復した．

なった．

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ前駆体を用いてもほぼついで，他の前駆体のトランスポートに対する同様の結果が得られた（図3）．したがって，PBF

ー204−

0

■

したがって，タンパク質のミトコンドリア移行に

30

明らかとなった6）．

4

0
3

0

考

察

前駆体タンパク質がミトコンドリア膜を通過し2
一

0

一L邑∈ 亡UUJ￡はPBF依存性経路と非依存性経路があることがlて内部へ移行するためには，ほどけた状態にならなければならない．延長ペプチド部分が成熟タン
パク質部分のfoldingを防ぐ可能性も考えられた
0

20

40

60

が，OTC前駆体の延長ペプチドは成熟酵素部分のfoldingを直接には強く阻害しないことが分っIncubation（min）

た7）．前駆体蛋白質がリポソームで合成されて延図3

リンゴ酸デヒドロケナーゼ前駆体のミトコンドリア移行に及ぼすPBFの効果．

長ペプチド部分がリボソームより出てくるとPBFが結合し，可溶性の複合体を形成して前駆体の凝集を防ぎ，前躯体を膜透過可能な状態に保つ
ドリア表層に存在すると思われる

0
4

ー

几 V
3

PBFレセプタに結合し，延長ペプチド部分が次いでPBFから延長ペプチドに対する別のレセプターに移されOた後，外股と内膜のコンタクトサイトを通ってマ

2
O

一JOdE u8J￡

0
■ ﹂ つ

ものと思われる8）．この複合体は恐らくミトコン

O
1

トリックスに移行すると考えられている．最近ようやくPBFcDNAの単艶に成功したので，これ
0

20

40

を用いて

0

PBFレセプターの検索を行いたい．

これらを基礎として，タンパク質のミトコンドリ

Incubation（min）

ア局在化の障害を解析したい．
図4

3−オクソアシルCoAチオラーゼのミ
トコンドリア移行に及ぼすPBFの効果．

文献1）森正敏，村上 薫：タンパク質のミトコンドリ

は少なくとも一群のタンパク質のミトコンドリア移行に関与していることが明らかになった．

ア移行と異常BlOmedica7：139−143，1992．
2）MurakamiK，AmayaY，TakiguchiM，Ebina

脂肪酸β酸化系酵素の1つである3−オキソア
シルCoAチオラーゼは例外的に延長ペプチドを

Y and Mori M：Reconstitution ofmitochon−

持たず，成熟酵素タンパク質N末端16アミノ酸残transcarbamylase precursor expressed in

基がミトコンドリア移行シグナルとして働く4）5）

凸cherichhl COli．J BioI Chem263：18437−

drialproteintransportwithpurifiedornithine

チオラーゼのミトコンドリア取り込みに対する18442，1988．

PBFの効果を調べた．未処理ライセートで合成し3）MurakamiK and Mori M：Purified prese−

たチオラーゼは効率よく単馳ミトコンドリアに取quence binding factor（PBF）forms an

り込まれた．しかし，他の前駆体の場合と異り，

import−COmpetent COmplex with a purified

PBF除去ライセートで合成したチオラーゼも効

mitochondrialprecursorprotein．EMBOJ9：

率よくミトコンドリアに取り込まれ，PBFを再添

3201−3208，1990．

加してもほとんど効果は見られなかった（図4）．

4）ArakawaH．TakiguchiM，AmayaY，Nagata

ー205−

S，Hayashi H and Mori M：CDNA−derived

mitochondria．JBioIChem267：13119−13122，

amino acid sequence of ratmitochondria13

1992．

−0XOaCyl−CoA thiolasewithno transient7）MurakamiK，Tokunaga F，IwanagaSandpresequence：Structural relationship with

Mori M：Presequence does not prevent

peroxisomalisozyme．EMBOJ6：1361L1366，

foldingofapurifiedmitochondrialprecursor

1987．

protein andisessentialfor association with5）AmayaY，ArakawaH，TakiguchiM，Ebina

areticulocytecytosolicfactor（S）．JBiochem

Y，Yokota S and Mori M：A noncleavable

lO8：207−214，1990．

Slgnalformitochondrialimportof3−OXOaCyl

8）Mori M and Murakami K：Transport of−CoA thiolase．J BioI Chem263：14463−

mitochondrialprecursor proteins；their con・

14470，1988．

formationalcompetence andrelated factors6）MurakamiK，TanaseS，MorinoYandMori（Minireview）．Cell Struct Funct14：643−

M：Presequence binding factor−dependent

647，1989．

andindependentimport of proteinsinto−206−41）新しい病因によるミトコンドリア病−ピルビン酸
脱水酵素蛋白のミトコンドリア内移行障害−
黒 田 泰 弘＊
研究協力者

伊

藤

道

徳■

内

Ⅰ．緒 言
ミトコンドリアは細胞のエネルギー塵生などの重要な機能を担う細胞内小器官の一つである．ミトコンドリアは固有の遺伝子と蛋白合成系をもっており，最近ミトコンドリア病（ミトコンドリア脳筋症）の原因としてミトコンドリア遺伝子の異

藤

悦

雄＊

横

田

一

郎＊

ⅠⅠ．研究対象
校数のミトコンドリア酵素の活性が低下していたが，ミトコンドリア外の酵素活性は正常であっ
た先天性高乳酸血症患者2）から得た培養皮膚線維芽細胞を対象とした．また，高乳酸血症を伴わない患者から得た培養皮膚線維芽細胞を対照とした．

常が兄いだされ，その研究が急速に進んでいる．
しかし，大部分のミトコンドリア酵素蛋白質は核IIL 研究方法

遺伝子を鋳型として細胞質で前駆酵素蛋白質とし

1）Immunoblot分析
培養皮膚線維芽細胞から分推したミトコンドリ
ア粗分画の蛋白質をSDS−PAGEで分離し，牛心て合成され，その後ミトコンドリア内へ移行して成熟酵素蛋白質となる1）．すなわち，ミトコンドリ
ア酵素蛋白質はミトコンドリア遺伝子と核遺伝子の二重支配を受けており，核遺伝子支配のミトコ
ンドリア酵素蛋白質の異常によってもミトコンド
リア病を釆たす．このミトコンドリア酵素蛋白質
異常の原因は1）酵素蛋白質そのものの異常と
2）前駆ミトコンドリア酵素蛋白質のミトコンド
リアへの移行過程の障害とに分けて考えられる．
これまで我々は前者に属するミトコンドリア病の原因の一つであるビルビン酸脱水酵素（PDH）欠損症患者においてPDHのαサブユニット（Elα）遺伝子変異の解析を行ってきた．今回我々は，複数のミトコンドリア酵素の活性低下を認めたことから，ミトコンドリアへの前駆ミトコンドリア
酵素蛋白質の移行過程の障害が推測された高乳酸血症患児2）において，PDH蛋白質のミトコンドリ
アへの移行障害について検討したので報告する．

臓から精製したElαとPDHのβサブユニット（Elβ））に対する抗血清を用いたImmunoblot法
でElα，Elβ蛋白質の量とサイズを検討した．
2）セル・ラベリング分析およびパルス・チェイ
ス分析前駆Elα，前駆Elβ，成熟Elαと成熟Elβ蛋
白質の合成過程を検討するためにHuqらの方法3）にしたがってセル・ラベリング法を行った．
次に，合成された前駆Elβと前駆Elα蛋白質のミトコンドリアへの移行過程を検討するために
パルス・チェイス分析を行った．培養皮膚線維芽細胞を35S，Methionineとジニトロフェノールを含む培養液で培養して35S−Methionineでラベルされた前駆酵素蛋白質を合成させた．次に，ジニ
トロフェノールと35S−Methionineを含まない培
養液で0分から30分間培養してラベルされた前駆
酵素蛋白質をミトコンドリア内へ移行させた後，■徳島大学医学部小児科

抗Elβ抗体または抗Elα抗体と反応させ生成さ−207−

図l Immunoblot分析
lanel；Purified ox PDHC stained with amidoblacklane
lane 3；Controllane 4；Patientlane 5；Control

2；Purified ox PDHC

れた抗原体複合体をSDS−PAGEで分触し前駆酵
素蛋白質と成熟酵素蛋白質とをフルオログラフィ
ーにより可視化した．また前駆酵素蛋白質と成熟
酵素蛋白質量とをテンシトロメトリーにより定量
した．

Ⅳ．結 果
1）Immunoblot分析では図1に示すように患児由来の培養皮膚線維芽細胞ミトコンドリア内のElαおよびElβ量は著明に減少していた．
2）セル・ラベリング分析では患者，対照ともに前駆Elα成熟Elα蛋白質（図2A），前駆Elβ，成熟Elβ蛋白質（図2B）を認め，その合成は障害されていなかった．しかし，ミトコンドリアへの前駆酵素蛋白質の移行を阻害しなかった場合，患者では残存前駆Elβの割合が26％で対照（8％）に比して多く前駆酵素蛋白質が残存していた（図2B，lanel，lane3）．また，前駆Elαの残存量の割合は患児と対照でそれぞれ19％と18％で明らかな差は認めなかった．
次に，前駆Elβ（図3），前駆Elα蛋白質（図4）の移行速度をパルス・チェイス分析で検討した．対照では前駆Elβ蛋白質が50％となったのは
チェイス8．0分後（図3A）であったのに対して患児では20．5分後（図3B）で，患者での前駆Elβ蛋白質のミトコンドリアへの移行速度は対照の39−208−

図2 仏）Elαのセル・ラベリング，（B）Elβのセル・ラベリング前駆ミトコンドリア酵素
蛋白質のミトコンドリアへの移行を阻害するRhodamin 6−Gを含むラベル培養液と含まないラベル培養液を用いてセル・ラベリングを行った．

A）Control
Chase

0

B）Patient

Ⅶ

相

加

￠

卸

与

川

3

4

15

20

30

tm■nl

PElβ・−
Elβ一一

1

図3

2

5

6

Elβのパルス・チェイス分析対照仏）および患者（B）由来の培養皮膚線推芽細胞を用いてパルス・チェイスを行った．
ミトコンドリアへの移行阻害剤であるDNPを含む培養液で1時間のパルスを行った
後，図に示す時間のチェイス後に抗Elβ抗体と反応させた．
前駆および成熟酵素蛋白質量はフルオログラフィー後デンシトロメーターで定量し，それぞれの割合を算出した．前駆Elβ蛋白質量が50％となったチェイス時間（T50）は対照では8．0分，患者では20．5分であった．

％であった．また，50％の前駆Elα蛋白質がミトの原因として前駆Elα，前駆Elβ蛋白質両方のコンドリア内へ移行したのは対照でチェイス7．5

シグナルペブタイドに異常がある可能性も否定で分後（図4A），患児では12．0分後（図4B）であきないが，2つの酵素蛋白質の遺伝子変異が同時り，患児の前駆Elα蛋白質のミトコンドリア内へに起こる可能性は非常に希であることや他のミトの移行速度は対照の62．5％であった．

コンドリア酵素の活性も低下していることから，
前駆酵素蛋白質のミトコンドリアへの移行過程のⅤ．考 察

異常によって前駆Elα，Elβ蛋白質のミトコンド

今回，我々は複数のミトコンドリア酵素の活性低下を認めた患者由来の培養皮膚線維芽細胞におリアへの移行が障害されていると考えられる．前駆酵素蛋白質のミトコンドリアへの移行にはいて前駆ピルビン酸脱水素酵素蛋白質のミトコン

ATPが必要であり、ミトコンドリアでのATP合

ドリア内への移行障害を明らかにした．移行障害

成障害により前駆Elα，Elβ蛋白質の移行障害が

−209−

図4

Elαのパルス・チェイス分析対照仏）および患者（B）由来の培養皮膚線維芽細胞を用いてパルス・チェイスを行った．
ミトコンドリアへの移行阻害剤であるDNPを含む培養液で1時間のパルスを行った
後，図に示す時間のチェイス後に抗Elα抗体と反応させた．
前駆および成熟酵素蛋白質量はフルオログラフィー後デンシトロメーターで定量し，それぞれの割合を算出した．前駆Elα蛋白質量が50％となったチェイス時間（T50）は対照では7．5分，患者では12．5分であった．

起こったとも考えられる．しかし，これまで報告

る．これまでシグナルペブタイドの異常によるされたピルビン酸脱水酵素欠損症などミトコンド

個々のミトコンドリア酵素のミトコンドリア移行

リア酵素欠損症ではATPの合成が障害されてい障害は報告5）されているが，ミトコンドリアへのるにもかかわらず，他のミトコンドリア酵素の活移行過程に関与する因子の障害によるミトコンド性低下は報告されておらず，ATP合成低下が前リア病の報告は見られず，本症例が世界第一例日
である．

駆酵素蛋白質の移行障害の原因とは考えられない．
最近，森らによって前駆酵素蛋白質のミトコンド
リア移行に必要なサイトゾル因子が明らかにされVL 今後の展望と問題点てきている4）．本患者ではこれら前駆ミトコンド

これまでの研究でPDH欠損症の遺伝子レベル

リア酵素蛋白質のミトコンドリア移行に関与するでの異常を検討してPDH欠損症患者においてⅩ

因子の障害によってミトコンドリア機能が低下し，染色体上にあるElα遺伝子変異を同定し，ヘテロ按合体である女児患者では変異遺伝子の発現度が高乳酸血症などの症状をきたしたものと考えられ−210−

組織によって異なっているために酵素活性測定のみでは確実な診断が困難であることを明らかにした6）7）．また，新しいミトコンドリア病の病因として，ミトコンドリア酵素蛋白質のミトコンドリアへの移行過程に関与する因子の異常を世界で初めて兄いだした．しかしながら，ミトコンドリア病の病因を明らかにして確実な診断を行い，さらに治療法を開発して行くためには未だ多くの問題点が残されている．そこで，今後以下に述べるような研究を進めて行くことが必要である．
1）Elα欠損症の遺伝子診断法の開発
Elα遺伝子はⅩ染色体上にありへテロ接合体である女児患者では組織によってⅩ染色体の不活性化の割合が異なっており，酵素活性測定だけでは用いる組織によっては診断が不可能な場合が文

献1）GlickBandSchatzG：lmportofproteinsinto
mitochondoria．Annu RevGenet25：21−44，
1991．

2）KobayashiM，IchikiT，Sugiyama N，etal：
Multiple enzymedefectsinmitochondria ofa casewith congenitallactic acidosis andhyperammonaemia．JInher Metab Dis15：809−811，1992．

3）HuqAHMM，ItoM，NaitoN，etal：Demon−
Stration of an unstable variant of pyruvate
dehydrogenaseprotein（El）inculturedfibrob−lasts from a patientwith congenitallactic
acidemia．Pediatr Res30：11−13，1991．
4）森正敬，村上薫：蛋白質のミトコンドリア移行とその異常：サイトゾル因子の役乱

厚生省ある．したがって女児患者においても確実な診断を行うためにElα欠損症の遺伝子診断法を開発する．

「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー

2）変異遺伝子発現系の開発
遺伝子解析により同定された変異遺伝子から合成される変異Elα蛋白質がPDH複合体酵素機

pp201−204．

及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木址）平成3年度研究報告書，1992，

5）Fenton WA，Hack AM，KrausJP，et al：能に及ぼす影響を検討し，新たな治療法を開発して行くためには，Elα以外の正常なPDH複合体
構成蛋白質遺伝子を持つElα変異遺伝子の発現系を開発することが必要である．この発現系の開発によりElα欠損症患者の遺伝子治療の基礎的

Immunochemical studies of fibroblasts from

検討も可能となる．
3） ミトコンドリア酵素蛋白質の移行障害部位の同定
我々が初めて兄いだした，ミトコンドリア酵素
蛋白質のミトコンドリア内移行障害患者においてその障害部位を分子レベルで解明する．これによってこれまで知られていないミトコンドリア酵素のミトコンドリアへの移行過程が解明されるとと1987．

もに他の疾患の病因解明の糸口となる可敵性がある．

patients

with methymalonyトCoA mutase

apoenzyme deficiency；detection of a muta−

tioninterferingwithmitochondrialimport．
Proc Natl Acad Sci USA84：1421−1424，6）黒田泰弘，伊藤道徳，内藤悦雄ほか：ミトコン
ドリア脳筋症の病因解明−ビルビン酸脱水素酵素複合体異常症における変異遺伝子解析−． 厚
生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ
フィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成2年度研究報告書，
1991，pplO7−111．

7）黒田泰弘，伊藤道徳，内藤悦雄ほか：ミトコン
ドリア脳筋症の病因解明−ビルビン醸脱水素酵
素欠損症女児例における分子遺伝学的病因検

謝辞：最後に貴重な症例を御紹介頂きました名古屋市立大学医学部小児科の小林正妃先生，和田義索一． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋郎教授に深謝致します．

発に関する研究 （荒木班）平成3年度研究報告

ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開書，1992，pp195−200．

−211−42）4世代にわたる慢性進行性外眼筋麻痺

研究協力着

衣

斐

佐

橋

達＊

田

功＊

代

伯

為＊

周

防

拡＊

大 野 欽 司＊＊ 田 中 雅 嗣＊＊ 小 澤 高 格＊＊

は じめに

l

Kearns−Sayre症候群を含む慢性進行性外眼筋
麻痺（CPEO）や他のミトコンドリア病の多くは母系遺伝が示唆され1），また欠失または点変異ミト【ll】

コンドリアDNA（mtDNA）がその病因と深く関連している．
ここに報告するCPEOの一家系は4世代にわたり母系遺伝と女性発症が確認され，かつ多数の同胞数にも拘らずCPEOの発生は低浸透性であった．本家系の臨床特徴とmtDNA異常は示唆に＊愛知医科大学第四内科＊＊名古屋大学医学部第二生化学

●

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l

D O

βpクP

［VI］田 口○ □図 家系図
CPEOの確認例（●印）は写真また記録により確認された例のみを記載した．
●：慢性進行性外眼筋麻輝（CPEO）＼：発端者＊：mtDNA解析におけるtRNATyrのheteroplasmy型の点変異の確認例／：検索例○：○の中の数字は兄妹数を示す．

症例報告（発端者）
患者 K．H．（発端者）38歳，OL，既婚
主訴：限瞼下垂家族歴：母方曽祖母・同祖母の姉（写真にて確認），

1カ月間メルカゾール5mg／日を投与され約1カ月で甲状腺機能は正常化した．しかし以降甲状腺機能はむしろ低下し，極少量のlevothyroxineを⑥【＝】

富み，発端者を中心とした臨床・筋病理学的検討とmtDNA解析結果を報告する．

母が何れも成人期発症のCPEOであった（図）．
先祖の出身地：長野県
既往歴：とくに異常なし，結婚20歳，二子（男，女）は健康．
現病歴：28歳時（1982）に左眼瞼下垂と眼球運動困難に気づく．病状の日内変動なし，複視は軽度．
34歳急性甲状腺炎にて他院初診（1989．3），当時約

l

（診 ●

【l］

投与された．34歳時に当院を紹介受診し，以降4年間にわたり加療中［CoQl。＋idebenone＋levo−
thyroxine投与］であり，症状は極軽度進行性を示す．
現症
一般身体所見：身長160cm，体重43kg（標準体重の−21％）．（生涯最高体重52kg），血圧138／86
mmHg，体温36．3℃，脈拍72／分脈柏66／分；整，
心音清，クモ状指貧血・黄痘・リンパ腺艦大・浮腫なし．肝・牌艦なし．腹部平担，グル昔の克進．

ー212−

271（n；195−400），CK77−464（n；25−195）．

皮下脂肪は貧．二次性徴・月経は正常．
神経所見：意識清明，知能明晰，やや神経質，協調的．脳神経では眼瞼下垂（右く左），中等度の眼

Myosin軽鎖IO（n＜2．57），Myoglobin68（n：18−66），葉酸2．9（n；3．6〜6．5），電解質正常．
抗AChR抗体・抗ミトコンドリア抗体は陰性．サ球運動障害（右＝左）．視力正常．軽度の複視．白内障・網膜変性なし．顔面・頸筋の筋萎縮・筋力低下は前頭筋，眼輪筋・口輪筋・広頸筋・胸鎖乳突筋に中等度に認める．難聴・囁下・構語障害なし．四肢・体幹運動系筋萎縮・筋力低下：上肢帯〜上肢にび慢性．握力右15kg，右12kg．動揺性歩イロイド（×200〜1600），ミクロゾーム抗体（×200）陽性，TSH一受容体抗体陰性．頭CT・脳波
異常なし，Tensilontest陰性．心電図では軽度の心筋障害．筋電図は筋原性，神経伝導速度正常，

waning現象陰性髄液検査は実施しえず．内分泌検査では甲状腺機能としてTSHは時に上昇，
T3・T4倍の軽度低下，TBG正常．耐糖能正常．自転車運動負荷試験での乳酸［（L），mg／dl］，ビルビン酸［（P），mg／dl］およびL／P比の負荷前後値
は夫々（L）；11．1063．2，（P）；0．703．2，L／P：
15．9［つ19．8であり異常値を確認した．筋生検（上行なし，爪先・踵立ち正常．下肢に脱力感がある．
筋トーヌスは全般性に低下．筋緊張反応・不随意運動・運動失調なし．深部反射は低下ないし消失．
病的反射陰性，感覚障害なし．自律神経系では便意頻数があり，これはCoQl。の一日量150mg投与にて著明に改善したが，中止にて再増悪し，本薬剤の有効性が明らかに確認された．
臨床検査
以下の主要臨床検査所見を確認した．

腕二頭筋）では高度のragged−redfibers［RRF］（4．0％）とcytochrome c oxidase活性陰性線推［CCO（−）線推］（10．68％）の増加を認めた．
しかし神経庇性所見を含む他の異常はなかった．
なお連続切片による観察ではRRFはCCO（一）
線経に対応した．電顕的にミトコンドリア内封入体を認めた．ミトコンドリアDNA（mtDNA）解すなわち血沈・尿・便・血算・凝固系に異常なし．
TP7．0，Alb4．5，A／Gl．80，TTT5．2，Bil
O．53，UN6．7，UA3．7，CRNO．59，Al−plO3，
Amy1301，T−Chol178，GOT16，GPT9，LDH

表：CPEO発端者以外の家系内検索例における臨床データ（mtDNAの点変異は発端者と同一のヘテロ型の点変異を示す）

母

所

見

字L
酉変

ピルピソ
西安

血 清
CK 値

年
歯令

臣畠 床

76
†

C P EO （左 ＞右）琶血性心 不 全死
多発脳 梗塞 、高 血圧

未検

未検

1 82

53

糖 尿病 、 難 聴
虚 血性 心 疾 患
高 脂 血 症 ， T 。′

10 ．8
0 ．9 8t負 荷 陽 性 ）5152

高 血圧、 腎炎 、鳴 息
ブドウ 膜 炎 、 高 脂 血 症

1 1．2
0．7 4
（負 荷 陰 性 ）

13 0

13

特 にな し14 ．2

日 ．2 116 1

1負 荷 陰 性 ）118．1

特 にな し

は
ー

…

3 ．3

−213−

l o．7 1

71

荷陰性 I
l
′
）

0 ．3 0 ′
・
ノ

20 ′
）

1 4 ．90 ．9

17 0析：サザン・プロット法では欠矢は証明されなかった．点変異はmtDNAの全周シークエンスにて既報告のCambridgesequence2）と比較し，計19塩
基置換が確認された．すなわちtRNAに2塩基［tRNATyrのheteroplasmy型およびtRNAGly（homoplasmy型］，rRNAに4塩基置換，非翻訳領域に13塩基置換［8：D−loop，4：他の非翻訳領域］の塩基が確認された．なおtRNAGlyの置換は宝来らにより正常多型の可能性が指摘されている変異3）であった．

さて本家系における遺伝形式では低浸透率をとる常染色体優性遺伝も否定できず，事実如様な報
告家系もある5）．しかし病因と強く関連していると考えられるmtDNA上のtRNATyrのhetero−plasmy型変異は母系遺伝を示しており，本遺伝として異母姉妹にその変異やCPEO発症がなかった点が問題となる可能性がある．これに関して
は血液細胞中へのmutant mtDNAのSegrega−tionが当初より陰性であった可能性などを考えたい．
さてCPEOの主要なmtDNA異常としては，近親者の臨床データ
CPEOを呈し亡くなった症例は夫々の顔写真と近親者の事情聴取にて確認した．近親者の検索は発端者の母，異父姉妹2名及び実子2名につき行なった（図，表）．なお発端者の母親は73歳時に鬱血性心不全を発症し1991年12月（76歳）時に心不全・多発性脳梗塞にて死亡したため，その臨床データは前医入院時のものを参照し，またmtDNA解析はその入院中に実施された輸血時のクロスマッチのロ紙よりサンプルを採取し，法医学教主と協力しDNAを採取検索し，また他の症例は末梢血よりmtDNAを抽出し分析した．
以上のうち異父姉の1名が糖尿病と難聴があり何らかのミトコンドリア病との関連が示唆されたが），発端者と同一のtRNATyrのheteroplasmy型変異は母および臨床的に無症状の実子2名に確認された．
考察およびまとめ約半数例がmtDNAの多くはhot spot領域の欠失例であり，また残りの約1／3はmtDNAのtRNALeu（UUR）上の3，243のA→G transition（heteroplasmy）すなわち所詮MELAS変異が存在するという6）．
本家系の点変異は従来報告のないtRNATyrの変異をheteroplasmy型に認めた．これは正常多型の可能性は少なく，さらに検索が必要であろう．
しかし欠失未確認のCPEO例では多彩な核遺伝子の異常に伴う症例が存在する可能性がある一方，
mtDNA上の多種・多彩な点変異またそれらの複数異常，通常のサザン・プロット法にて検出が出来ない程度の欠矢などが種々にcombinationL
CPEO発症する事実が示唆された．
文献1）田中雅嗣，小澤高格：ミトコンド．リアDNAの欠矢と母系遺伝．臨床検査33：211，1989．
2）AndersonS，BankierAT，etal：Sequenceand

本CPEO家系は以下の如くまとめられる．すな
わち①4世代にわたり多数の同胞中で各世代に一名ずつの低頻度かつ女性に母系遺伝をとりCPEOを発症した：（診CPEOの発症は何れも成人期であり，発端者では外眼筋麻痺以外に顔面・上肢近位筋筋力低下，腸管塙動冗進を呈した：③mtDNA解析にて病因との関連性が示唆されるtRNATyrのheteroplasmy型の点変異を認めた：④発端者の異父姉妹には同点変異が陰性であった；⑤CoQl。大量療法が極めて有効であった：などが挙げられる．

Organization of the human mitochondrial
genome．Nature290：457，1981．
3）宝来

聴，近藤るみほか：ミトコンドリア

DNAのtRNA遺伝子上の変異．

厚生省「精神・神経疾患研究委託費」班会議抄録集 （荒木班）平成4年度．演題番号＃53，Dec，1992．
4）VanDenOuwelandJMW，Lemkes HHP，et−214−

al：Mutationin mitochondrial tRNALeu（UUR）
genein alarge pedigree with maternallytransmitted typeII diabetes mellitus anddeafness．Nature Geneticsl：368，1992．

5）ZevianiM，ServideiS，et al：Anautosomal6）SchonE：Moleculargeneticsofpathologicaldominantdisorderwithmultipledeletionsof

mtDNA mutations．in Abstracts ofInterna−

mitochondrial DNA starting at the D−looptional Conference on gene regulation andregion．Nature339：309，1989．

expressioninmitochondrialdisease andtheaglng prOCeSS．Dec．1992．

−215−43）外眼筋麻痺を伴ったMERRFの2家系
佐

研究協力者

平

訳

浩

藤

猛＊

佐々部

富士男＝＊森

子＊＊

松

光

紀＊＊＊

四 家 敏 秀＊＊＊＊今 井 寿 正＊⇒‖−＊

進行性外眼筋麻痺（PEO）を呈するミトコンド
リアミオバナーにはKearns−Sayre症候群（KSS）や眼筋ミオバナーなどがあり，多くの症例
ではミトコンドリアDNA（mtDNA）の大欠矢を示すことが知られている．一方，myOClonusepilep−
sy with ragged−red fibers（MERRF）および
mitochondrial myopathy，enCephalopathy，
lactic acidosis and stroke−like episodes（MELAS）ではそれぞれ異なるmtDNAの
tRNAの点変異が見出されている．外眼筋障害はMELASでは稀に記載されているが，MERRFではほとんど知られていない．外眼筋麻痺と全身ミ
オバナーを主症状としたため，初診時PEOが疑われた．mtDNA検索ではじめてMERRFでみられるtRNAの点変異が確かめられた1例を経験した．
さらに他にも外眼筋障害を伴ったMERRFの1例を経験し，家族のリンパ球mtDNAも含めて
mtDNAの解析を行った．
症例

症例1．58歳，女性．主訴は両下肢の脱力，歩行障害．既往歴・家族歴には特記すべきことはなかった．
現病歴：幼少時の精神・運動発達に異常なし．48
歳頃から両下肢の脱力のために階段の昇降が困難♯国立精神・神経センター国府台病院＊＊東京大学医科学研究所寄生虫学＊＊＊山口大学医学部神経内科＊＊＊＊順天堂大学医学部脳神経内科になってきた．以来徐々に進行し，54歳時に転倒して以来，歩行障害は急速に悪化し，しゃがみ立
ちも困難となったため，1991年5月山口大学病院に入院した．
入院時現症：体格中等度，栄養は普通，知能は総合IQ90．両側限瞼下垂中等度，眼球運動は上下視
方向中等度制限を認めたが，上方視の際限瞼は挙上した．胆振（−），網膜色素変性（−）．両側に感音性難聴，構音・囁下障害なし，四肢近位筋優位に筋力低下，筋トーヌス低下があり，腱反射は全て消失していた．感覚障害（−）．四肢の失調，
開脚歩行を認め，Tandemgait不能，Gowers徽候陽性であった．ミオクローヌスは認められなかった．
検査成績：血清CK283uと軽度上昇，乳酸24．8，
ピルビン酸0．8mg／dl，髄液では乳酸24．2，ピルビン酸1．3mg／dlと乳酸値の上昇を認めた．髄液蛋
白88mg／dlと上昇．MCVは上肢では正常，筋電図
では一部に神経原性変化がみられた．脳波では側頭葉にsharp waveが認められた．頭部CTスキャンでは小脳が軽度萎縮していた．エルゴメータ
ー運動負荷試験では乳酸，ピルビン酸が著明に上昇した．筋生検では多数のragged−redfiber，およびcytochrome c oxidase陰性線経が認められた．筋の電顕では結晶状封入体を含むミトコンド
リアが多数みられた．
本症例は外筋麻輝と小脳症状がみられ，ミオク
ローヌス様の痙攣発作がないことから，KSS不全型と初診時には考えられていた．なお中等度の限瞼下垂は上方視時には正常に近く改善していた．

−216−

COSe2．W f〔Imlly

症例2．44歳，男性．主訴は手指の振戦と構音障
害（言葉が出にくく，ろれつが廻らない）．
既往歴：特記すべきことなし．
家族歴（図3）：姉（ⅠⅠ3）が家族性ミオクローヌ
スてんかんと診断され，37歳で死亡している．82
歳の母（Ⅰ2）も数年前から下肢の不随意運動のため，歩行が困難となっている．

に企図振戦と動作時ミオクローヌスを認めた．感覚障害（−）．
検査成績：血清CK121と軽度上昇，乳酸15．1，ピ

現病歴：17歳頃から話し方が遅いことに気付かれていた．24歳時手指の振戦と上肢のミオクローヌ

ルビン酸1．09mg／dl，髄液では乳酸24，ピルビン酸
1．36mg／dl．筋電図では神経原性変化と筋原性変化とが混在していた．脳波では基礎律動の徐波化傾向がみられた．頭部CTスキャンでは脳幹部の萎縮が認められた．OKNでは垂直，水平方向とも開発不良であった．エルゴメーター運動負荷試験

スが始まった．パルプロ酸Naとタロナゼパムの投与を受けていたが増悪したため，1992年6月順天堂大学病院に入院した．

では乳酸，ピルビン酸の著明な上昇がみられた．
筋生検ではragged−red fiber，CytOChrome coxidase染色陰性線経に加え，SDHに強陽性を示

入院時現症：身長164cm，体重47kgと中等度のやせがみられる．知能は計算力が軽度低下．眼瞼下垂す血管が認められた．
本症例はMERRFと考えられたが，眼球運動障
害が認められる点は特異であり，mtDNAの解析を行った．

（−），眼球運動は上・下視3／5，側方視4／5と制限，
両側軽度感書性難聴．四肢筋の筋力はほぼ正常であるが，筋萎縮が中等度にみられた．筋トーヌスは低下，腱反射はアキレス腱のみ低下．両側上肢−217−

言：芋茎t一一一r匡
ミトコンドリアDNAの解析
患者の生検筋，および家族（図1，2）のリン
パ球からDNAを抽出し，目的とするmtDNAの領域を01igoprimerを用いてPCRにて増幅した．
すなわちmtDNAの欠矢の検出には遺伝子番号5205から14701を含む領域，MELASには第83441），MERRFに対しては第32432）を含む領域を増幅した．MELASについては第8344のA→Gの変換を認識するApaIにて増幅mtDNAを切断した．MERRFについてはmismatchedprimerを用いたPCRを行い，増幅mtDNA3243のA→
Gの変換を認識するNaeIにて切断した．MERRF
については増幅したmtDNAを蛍光プライマー法を用いABIの自動塩基配列解析装置により全塩基配列を決定した．

パ球では母（Ⅰ），3名の兄弟（ⅠⅠ1，2，3）に第3243のA→G変換が認められた．なお父（Il）
では日本人の正常者でも記載されている9塩基対の欠矢が認められている（図4）．
考察・結論
症例1ではKSSの不全型と鑑別が困難なほど
外眼筋麻痺の症状がはっきりとしており，ミオク
ローヌス様の痙攣発作がみとめられず，mtDNA
分析で初めてMERRFと診断することが出来た．
症例2は家族性ミオクローヌスがみられ，
MERRFを疑ったが同様に外眼筋麻痺を伴っていた．MERRFでは外眼筋麻痺の記載がほとんどみられないが今後診断に際して注意が必要と思われる．2症例ともDollseyetestが陰性のことから外眼筋障害は筋阻性の要素が大きいとおもわれ

結果
症例1の骨格筋およびリンパ球ではPEOにて報告されているmtDNAの大欠失，およびMELASで記載されている第8344の変換は認められなかった．しかし，MERRFで報告されている第3243，tRNALysのA→Gの変換が認められ，
仝塩基配列の解析でも確認された．3名の子供のリンパ球でも同様に第3243の変換が検出された．
PCRで増幅したmtDNAの電気泳動でみとめらる．しかし，上方視にて眼喰下垂が改善したこと
は核上性の要素も関与していると考えられる．
文献1）Goto Y，NonakaI and Horai S：A mutation
inthetRNALeu（UUR）geneassociatedwiththe
MELAS subgroup of mitochondrial ence・
phalomyopathies．Nature348：65ト653，1990．
2）Yoneda M，Tanno Y，Horal S，et al：Aれるバンドでは正常と変異mtDNAの割合は，症状のない子供達でも変異mtDNAの比率が男児では多く，2名の女児でも大体1：1であった（図commonmitochondrialDNAmutationinthe

2）．

Int21：789−796，1990．

tRNALysofpatientswithmyoclonusepilepsy
associatedwith raggedTed fibers．Biochem

症例2の生検筋とリンパ球，および家族のリン
218一44）高齢発症のmultipleacylCoAdehydrogenasedeficiency
後 藤 幾 生＊研究協力者

荒 木 栄 一＊ 小 林 卓 郎＊

は じめに
Lipid storage myopathyはカルニテンの欠乏によりおこるが，その二次的原因としていくつかの有機酸代謝障害が明らかにされている．これらはふつう小児期に発症し，重篤な全身症状をおこす．今回われわれは高齢で発症し，multipleacyl
CoA dehydrogenaseの異常が示唆された1ipid
StOrage myOpathyの症例を経験したので報告する．
症例

症例：62歳，男性（NM920072）
主訴：下肢易疲労性
既往歴，生活歴：特記事項なし
家族歴：血族結婚はなく，同様な症状の人はいな
現病歴：1979年（50歳），1987年（57歳）の頃に2，3週間持続する一過性の下肢易疲労感があった．1991年12月頃より歩行時に息がきれ，下肢が疲れやすいのを自覚するようになった．その後症状は次第に進行し50m程度の歩行も困難になった．また1992年3月頃より頚部筋の疲労感も出現した．
入院時現症：一般内科的所見では，漏斗胸以外特に異常はなかった．神経学的には下肢筋肉の軽度萎縮，頚部筋と四肢近位筋の軽度から中等度の筋力低下があった．歩行は数10m程度で下肢の疲労感が出現し，歩行器を必要とした．Gowers徽候は陰性だった．四肢深部反射は低下していた．
■九州大学医学部脳研神経内科

検査成績：血液生化学でGOT125IU／1，LDH1806
IU／1，CK788IU／1と上昇していた．血中のビタミ
ンB2は54．3ng／ml（正常：50−84）カルニナン
は1．62mg／ml（正常：1．22−1．86）であった．甲状腺機能，副腎機能は正常だった．また心電図，
心エコーでは特に異常はなかった．針筋電図では
polyphasic potentialを認めたが，Short dura−tion，lowamplitudepotentialはみられなかった．
神経伝導速度は正常だった．血中の乳酸，ピルビ
ン酸は安静時にはほぼ正常だったが，15分間歩行により著明に上昇した．
筋生検所見：H．E染色で筋線経の軽度の大小不同，筋線維内の小空胞がみられた．ズタン染色では，空胞部に脂肪の蓄積がみられた（図1）．
Gomori trichrome染色では，ragged−red fiberの増加は認められなかった．またcytochrome c
OXidase染色では，活性欠損はなかった．電顕では，脂肪滴による空胞がみられた．ミトコンドリ
アではクリステの減少，dense granuleがあったが，結晶様の封入体は認められなかった．筋肉のカルニナン量は遊離カルニナンが低値で，総力ルニテンに対するアシルカルニナンの割合が増加していた（表）．
尿中有機酸分析：24時間絶食負荷でエチルマロン酸，アジピン酸，ズベリン酸，グルタル酸，2ヒドロキングルタル酸などの上昇がみられた（表）．
治療経過：リボフラビン120mg／dayの経口投与にて，筋肉易疲労感は投与3日日頃より改善し，歩行器を必要としなくなった．その後外来5か月の経過では入院時の諸症状はみられていない．CK
値は投与後より正常化した（図2）．さらに好気的−219−

運動負荷試験では乳酸，ピルビン酸の上昇は軽減した（図3）．また尿中の有機酸分析でも正常化が
みられた．
考

察

尿中で認められた有機酸はミトコンドリア内の直鎖アシルCoA，グルタりルCoAの代謝物であり，これらのdehydrogenaseの活性低下を示唆している（図4）．このことから本症例をmultiple
acylCoAdehydrogenase欠損症と診断した．本
表 検査成績
筋肉カルニチン量
遊離カル二テン
アシルカル二テン

1．09（1．33±0・65）

総力ルニテン

1．68（2．34±1．00）

アシル／総（％）

64．6（44・8±8・4）

尿中有機酸
図1

大腿四頭筋の生検組織
A：H．E染色×50
筋線経の軽度の大小不同，筋線維内の′ト
空胞がみられる．
B：ズダン染色×50
筋線維内の′ト空胞に脂肪の蕾損を認める．

FLmOl／g wetweight

0．59（1・02±0・43）〟g／mgクレアチ二ン

エチルマロン酸

30

（1．6）

アジピン酸

72

（5．6）

ズベリン酸

47

（4・0）

グルタル酸
2＿ヒドロキシプルタル酸

22

（3．2）

23

（2・8）

1992．5月

6月

7月

8月

前憶

−P︑ひ∈ 鮭八．宣︐刃 3（）は正常値

07．5（分）

図3 好気的運動負荷試験
7．5分間歩行による乳酸，ピルビン酸の変動を示す．

図2リボフラビン投与によるCK値の変化−220−

電刊圭達系
図4

アシルCoAからの電子伝達路及び本患者での障害部位

例は発症前に仕事のストレスで生活がやや不規則になった以外に特に問題はなく，もともと潜在的

謝辞：筋肉のカルニナンを測定していただいた名に代謝異常があったものと思われる．軽症で高齢発症のmultipleacylCoAdehydrogenase欠損症の報告は稀であり1ト3），特に本例のような高齢の症例はない．治療としてリボ7ラビン投与の有効性がいくつかの例で報告されているl）2）．リボフラ
ビンは体内でフラビンアデニンジヌクレオチド

していただいた金沢医科大学 久原とみ子先生に（FAD）となるが，これはアシルCoAからの電子伝達に関わる酵素（図4）の補酵素となる．またFADの欠乏は，これらの酵素の不安定化につながることが実験的に示されている4）．本例ではリボ
フラビン投与が非常に有効であったことより，ミトコンドリアでのFADの相対的欠乏が発症のひ
きがねになったものと考えられた．一次的な原因は不明だが，aCylCoAdehydrogenaseに共通の電子受容体であるelectrontransferflavoprotein（ETF）やETF脱水素酵素の異常が考えられる．
今後この点を明らかにするため，実際の酵素活性，
酵素量についての検討が必要と思われる．

古屋市立大学杉山成司先生，尿中有機酸分析を深謝いたします．
文献1）DeVisserM，ScholteHR，etal：Riboflavinr
responsivelipid−StOrage myOpathy andglutaricaciduriatypeIIofearlyadultonset．
Neurology36：3687，1986．
2）TurnbullDM，BarthlettK，etal：Shortchain
acylCoAdehydrogenasedeficiencyassociat−
ed with alipid−StOrage myOpathy and
SeCOndarycarnitinedeficiency．NEnglJMed
311：1232，1984．

3）DiDonato S，Frerman FE，et al：Systemic
Carnitine deficiency due to lack ofelectrontransfer flavoprotein ubiquinone
OXidoreductase．Neurology36：957，1987．
4）Nagao M，Tanaka K：FAD−dependent
regulation oftranscription，tranSlation，pOSt

ま

と

め

−tranSlational processlng，and post−prOCeSS−

multipleacylCoAdehydrogenase欠損症によing stability of variousmitochondrial acyl

る1ipid storage myopathyの症例を報告した．
本例は高齢発症の稀な症例であり，リボフラビン
投与が非常に有効であった．

CoAdehydrogenasesandofelectrontransfer−221−

flavoprotein

and the site of holoenzyme

formation．J BioI Chem25：17925，1992．

45）ミトコンドリアDNA多重欠失例の解析
西 澤 正 豊＊

研究協力者

川 嶋 信

五＊
ロ

＝土二
ロ

田 充 男＊ 太 田 成 男＊＊

進行性外眼筋麻痺と難聴を主徴とするミトコン
ドリア脳筋症の家系例において，ミトコンドリア

方法

発端者の剖検時に全身諸臓器を得て，−70℃にDNA（mtDNA）に多重の欠矢を認めた．この欠
夫の臓器分布を解析し，本家系におけるmtDNA
欠矢の伝搬様式について検討した結果を報告する．

保有した．mtDNAの欠矢の有無はまず，South−
ern解析により検討した．保有臓器から骨法によ症
例
発端者は死亡時47歳の男性で，2歳年下の妹にも同様の症状を認める．父方の祖母と母親とが従姉妹同士という近親婚がある．

転写した．ついで，mtDNAのH鎖2862位から3551

18歳頃から進行性の難聴を呈し，30歳頃，両側の眼瞼下垂と外眼筋不全麻痺が出現した．40歳頃，四肢の筋委縮，筋力低下と性腺萎縮に気付いた．

radiography後，FujiImageAnalyzerを用いて，41歳時，筋生検にてragged−red fiber（RRF）とcytochrome c oxidaseの活性染色で活性陰性線経を認め，ミトコンドリア脳筋症と診断された．

tion（PCR）を用い，約4kilobase（kb）のPCR

囁下障害が進行して，誤喋による無酸素脳症を繰り返し，ターミナルの1年6ヶ月間は人工呼吸器により維持されていた．47歳時，腎不全のため死亡した．
本例の筋組織の組織学的検索においては横隔股に最も高度の変化を認めた．すなわち，筋線経の秒：72℃，3分とし，30サイクルの増幅を行った．

大小不同が著しく，空胞を有する肥大線雑，壊死
線経，多数のRRFが混在していた．頚部の筋組織

DyeDeoxy Terminator kitを用いた．

りtotalDNAを抽出し，これをPvuIIにて切断
後，アガロースゲルに電気泳動し，ナイロン膜にはよく残っており，RRFを散在性に認めた．大腿四頭筋では筋線経の萎縮と脂肪化が高度に認められた．

位に相当するフラグメントをrandom hexamer
法によりラベルしたものをプローブとしてSouthern blot hybridizationを行った．auto−
バンドのderlSitometryを行った．
さらに微量の欠矢はpolymerase chain reac−
産物が生ずるようにプライマーの位置をシフトして検索した．PCRの条件は94℃，30秒：55℃，30
正常のサイズよりも小さいバンドが検出された場
合にはこれをゲルから切り出し，非対称PCR法により一本鎖のDNAを合成し，これを鋳型として直接塩基配列を決定した．塩基配列の決定には
ABI社製の自動シークエンサーとTaq

結果Southern解析では外眼筋を含めて検索したい
ずれの筋組織においても正常よりも小さい，欠夫を有する異常mtDNAを2種類認め，mtDNAがpleioplasmyを示すことを確認した（図1）．欠矢＊自治医科大学神経内科＊＊自治医科大学第一生化学のサイズはそれぞれ約4kbと約8kbに相当した．筋組織以外の諸職者封こおいてはSouthern解
−222−

1

図1Southern解析によるmtDNA欠夫の検索
1：白血球 2：肝 3：大脳 4：心5：腸腰筋 6：横隔膜 7：大胸筋
8：舌 9：胸鎖乳突筋10：外眼筋
11：大腿四頭筋

2

図2

3

1

5

6

7

8

9101112131415

PCR法によるmtDNA欠矢の検索
mtDNAのH13515→H15773の領域をPCRにより増幅し，アガロースゲルに泳動した．
1：骨髄 2：脾 3：肺 4：甲状腺
5：副腎 6二腎 7：肝 8：側頭筋
9：横隔膜10：胸鎖乳突筋11：大胸筋
12：舌13：大脳14：白血球15：心析では欠夫を有するmtDNAは認められなかった．
次に，臨床的，および病理組織学的な筋障害の程度と欠矢を有するmtDNAが存在する割合との相関について検討したところ，表に示すように，
病理学的に最も高度の病変を認めた横隔膜においいた．筋組織ではSouthernで認められた2種類て，欠矢を有するmtDNAを最も多量に認めた．
しかしながら，臨床的には障害が高度であった外眼筋や大腿四頭筋においても，組織学的変化が最も軽度であった胸鎖乳突筋においても欠夫を有す
るmtDNAの割合はいずれも約30％で変わりななサイズの欠夫を有するmtDNAを同定できた．

く，異常mtDNAが存在する割合と筋障害の程度とが明らかに相関するとは結論できなかった．
Southern解析の結果とは異なり，PCR法では筋組織のみならず，全身諸臓器においてさまざまなサイズの欠矢を有するmtDNAを認めた（図2）．欠夫のパターンは臓器組織によって異なって
表の欠夫を有するmtDNAだけではなく，さまざま
欠夫を有するmtDNAをいくつか単離してその欠失周辺部の塩基配列を決定したところ，いず
れも3ないし12塩基からなるdirect repeatが存在していることを確認した（図3）．
最後にこの発端者の父親，母親，妹からも血液の提供を受け，白血球から骨法によりtotalDNAを抽出し，PCRにより欠夫の有無を検索した．その結果，母親，患者，妹には同じパターンの欠夫が認められた．一方，父親の白血球mtDNAにも欠夫が認められたが，そのパターンは他の3名と筋組織に存在する欠夫を有するmtDNAの存在比率

muscles normal mtDNA ntDNA tNith

1

﹁

4

9

′

2

9

2

5

9

一

2

∧

7

l

8

U

一
7

▲

2

7

l
3

0

7

1

9

一

5

6

l

7

eXt raOCUlar

6

5

l

4

7
1

quadricePS femoriskb

6

Ster【OClOidomastoid

8

deletion（‡）

P8CtOralis maJOr
tonguekb mtDNA vJith

deletion（‡）

lliopsoas
diaphragm

4

（鷺）

l

8911

8921

1209l

cTTACCACAAGGC卿m（M7−7−−−−aCaCC【a）TCCCCCATTCTCCT 8930−12082（−3153）
9381

9391

12061

12071

GCGCGATGT適塾垂鱒感（一N−aCaCgagaaa）ACACCCTCATGTTC 9400−12059（−2660）
9561

9571

12981

GAACAGGCATCACCCCGCE鵜（−−−一一−−M−−

9561

9571

Cta）GGCCTCCTCCTAGC

12991

13001

GAACAGGCATCACCCCGq肌（−−M−一一−一一一〜Cta）GCAGCAGCAGGCAA

13511

13521

135日

13641

9579−12990（−3412）

1458l

cAAAGACCACATCATCGAAC（T…一一一一一−−−aaC）AATCAATACTAAAC

13521

AAAGACCACATCATCGAAcc（−

9579−12978（−3400）

14531

13529−14574（−946）

14541−−−−P−−−aaCC）TCCCCCAAAATTCA13530−L4529（−LOOO）

13651

1542l

TCGCTTCCCdACCCTTAcm（−…一一ccaCCCt【aCta）CACAATCAAAGACG13661−15417（−L577）

図3 帖正された欠失周辺部の塩基配列

HSub≡

きよ3S

Hて4360−159

日13515▼15773

は異なるものであった（図4）．
考察
進行性外眼筋麻痺と雉聴を＿−i二徴とする兄妹例においてmtDNAに多重の欠失を認めた．mtDNAの欠夫については1988年に単一の人欠尖を有する
mtDNAと正常mtDNAがheteroplasmyを示す

童

2

j

4

3

21

4

3

21

7∵hHH一・）r，2：ijこミミIent，3：sister，4：室川tll（：r例がはじめて報告され，ついで母親から娘に欠尖が伝わったとする家系例も報告された．その後，

図4

筋組織におけるmtDNAの単一の欠夫はKearns−Sayre症候群や進行性外眼筋麻痺の症例において数多く記載されてきた．一方，常染色体性優性
遺伝形式をとる進行性外眼筋麻痺の家族例の筋組織においてはmtDNAに多重の欠矢が同定された1）．これらの欠夫の多くがmtDNAの反復配列

3

本家系の白血球においてPCRにより認められるmtDNAの欠失

PCRプライマーの位置を換えてみても母親，患者，妹は同一のパターンの欠矢を示し，欠失そのものが伝搬している可能性が考えられる．これに対して父観には欠夫は確かに認められるが，そのの部位で生じていることから，核にコードされ，
mtDNAの複製過程に関与する因子の異常が想定パターンは他の3名とは異なっており，この欠失されてきている．最近では筋組織のみならず，いくつかの組織においてSouthern解析のレベルで多重の欠夫を認めた例も報告されている2）．
本家系の遺伝形式としては常染色体性劣性遺伝と母系遺伝とが考えられる．両親が正常であることから，常染色体性優性遺伝の可能性は低い．本と，この家系では欠夫を生じさせる核性の因子が家系については白血球の検索しかできていないが，は高齢者において出現しやすい欠夫である可能性
常染色体性劣性に伝搬している可能性とが想定される．すなわち，父親の欠夫が他の3名と同じ機序で成立しているのであれば常染色体性劣性遺伝
で，欠夫を生じさせるなんらかの因子について両
親はヘテロ，患者，妹はホモということになる．
一方，父親の欠夫は偶然の合併とすれば母系遺伝

−224−

文

ということになり，欠失そのものが伝搬している

献可能性が考えられる．遺伝形式についての結論は本家系においてmtDNAに欠夫を生じさせる原因が同定されるのを待たねばならない．同時に，高齢者において生じ易い欠夫が存在するのか否かを多数例について検討すること，この家系について上記の4名以外の情報を求めることが重要であ1）Zeviani M，et al：An autosomal dominantる．家系によっては正常者にもmtDNAの欠夫を認める例があり，欠矢の存在が筋症状の発現にどこまで関与しているのか，疑問視する報告もあautosomal dominant disease．AmJ Hum

disorderwithmultipledeletionsofmitochon・
drial DNA starting at the Drloop region・
Nature339：309−311，1989；ZevianiM，etal：
Nucleus−drivenmultiplelargescaledeletions

ofthehumanmitochondrialgenome：Anew
Genet47：904−914，1990．
2）SuomalainenA，etal：Multipledeletionsof

る3）．

mitochondrial DNAin several tissues of a

従来のmtDNA欠矢の報告の多くは筋組織にっいてのみ，Southern解析を行うことによって兄いだされたものである．しかし，本報告ではPCRを用いることにより，Southernでは検出できない

patient withsevereretarded depression and多数の欠矢が多くの組織において兄いだされ得ることを示した．また，本家系では欠夫は検索した
限り，反復配列の部位で生じていたが，その反復の数は従来の報告例よりも少なく，最少では3塩基であった．このような配列はmtDNAゲノム中には極めて多数存在しており，従来欠矢のhotfamilial progressive external ophthalmo・
plegia．JClinInvest90‥61−66，1992・

3）Cormier V，et al：Autosomal dominantdeletions of themitochondrial genomeina
caseofprogressiveencephalomyopathy・Am
J Hum Genet48：643−648，1991・
4）SchonEA，etal：Adirectrepeatisahotspot

spotとして報告されてきた13塩基の反復配列4）で生じるスリップ機構と同じスリップ機序を想定できるのか否か，今後の検討が必要である．

−225−

forlarge−SCaledeletionofhumanmitochon・
drialDNA．Science244：346，349，1989．

46）拡張型心筋症を呈したミトコンドリア脳筋症の一例
岡 田 伸太郎＊
研究協力者

序

福 島 久 雄＊ 乾
塚 本 浩 子＊ 田論

幸 治＊ 柳 原
中 順 子＊ 藤 村

格＊
晴 俊＝

月で死亡した．

ミトコンドリア脳筋症は全身臓器でのミトコン
ドリアの機能異常が原因となる多彩な臨床症状を示す疾患群であり，その代表的疾患である
MELASlト3）やMERRF4）5）などではミトコンドリ

アDNAのtRNA領域の点変異が原因である事が知られている．最近われわれは拡張型心筋症と巣状糸球体硬化症をともない全身臓器にcyto−
Chrome C oxidaseの部分欠損を呈した興味ある
ミトコンドリア脳筋症の1例を経験し，ミトコン
ドリアDNAの塩基配列を決定しミトコンドリア
DNAのtRNAIIeをコードする領域に病因と関係すると思われる1塩基置換が存在することを見出したので報告する6）．
症
例
18歳男子10歳時蛋白尿が出現，腎生検にて巣状糸球体硬化症と診断．13歳時に全身強直間代性痙攣初発．18歳時より易疲労感出現しレ線上で心拡大を認め当科入院．家族歴は特記すべきことなし．低身長（−2．6SD），低体重（−3．2SD）．感音
性難聴と軽度の精神遅滞以外神経学的な異常認め
ず．頭部CTとMRIで軽度の脳萎縮．眼底正常．
SPECTで脳血流量の全般的な低下．軽度の高乳酸血症を認めたため筋生検を施行し，raggedredfiberとcytochrome C oxidaseの部分欠損を認めたためミトコンドリア脳筋症と診断したが種々の治掛こ抵抗する心不全の悪化のため入院後3か＊大阪大学医学部附属病院小児科＊＊大阪大学医学部附属病院神経内科

方法DNAの抽出：ヘパリン採血した全血および生検筋より骨法に従いSDS存在下にプロテナーゼK処理し，フェノール／クロロフォルムで抽出してからエタノール沈殿によりDNAを回収した．
塩基配列の決定：ミト コンドリアDNAのtRNAをコードする領域をPCRで増幅後，1％
アガロース上で電気泳動することにより精製した．
AppliedBiosystems，Japanの自動蛍光シークエ
ンサーとTaqDyeDeoxyCycleTerminatorKit
を用いて塩基配列を直接決定した．
異常ミトコンドリアDNAの検出：この症例に特有なtRNAlle上の1塩基置換はmismatchprimerによるPCRと制限酵素SspIによる消化で検出可能である．PCR産物を制限酵素SspIで消化後アクリルアミドゲル上で電気泳動し，手チジウムブロマイド染色，または銀染色（第一化学）を行なった．この方法では，この1塩基置換が存在すると制限酵素で消化されず184bpのバンドがそのまま残り，正常では153bpと31bpのバンド
が，それぞれ検出される．
剖検施器での異常ミトコンドリアDNAの分
布：一20℃で保有してあった臓器より定法に従ってDNAを抽出後，mismatch primerを用いた
PCRにより増幅した．PCR産物を精製後，その1部をα−32PTdCTP存在下に1サイクルのPCR
反応を行なってラベルした．さらに制限酵素Ssp
Iで消化してからアクリルアミドゲル上で電気泳−226−

Hismatch PCR and SspI Digestionmtl〕NA
3

4116

AAATATGTCT＃

3−

Mutantwild

4299

AAAGA一misJnatCh primer

forWard primer■◆

MUTAN丁目84bp）

l PCR

旧し工）（153bp）

ll SspIによる消化（AATATr）
Mutant184bp

Wild

153bp＋31bp

コントロール全血図2

コントロール全血

消化前ミトコンドリアDNA，tRNA‖e領域に存在する塩基番号4269（A→G）の1塩基置換の検出．mismatch primerによるPCRと制限
酵素SspIによる消化で検出可能であり，変異が存在すると消化されず184bpのバンドがのこる．正常では消化されて153bpと31bpのバンドになる．

コントロール全血

父全血

母全血

全血

骨格筋

心筋

心筋

図1

mismatch primerによるPCRと制限酵素
SspIによる消化左からマーか−，患者心筋の消化前，以下はSspI消化後で患者心筋，骨格筋，全血，母親
全血，父親全血，正常者3名の全血．

勤し，オートラジオグラフィーを行なった．
A

結果と考察

A＝U

G⊆C

本症例はMELAS類似の臨床経過を示してい

A＝U

A＝U Acc甲tOr
Stem

るが，発症の年齢がおそいこと，はっきりとした

AA

TWC100p

U
U

A

A

∪

C

A

CmG
C A

‖

C ‖ G

U

CuG

C

∪

U

C 川 G

G U

UMA

A

A

た点など特異な臨床像を持つミトコンドリア脳筋

A

A
U

臓器にcytochrome c oxidaseの部分欠損を呈し

G型心筋症と巣状糸球体硬化症を伴ったこと，全身

A

G＼蔓≡買
風＝

StrOkelike episodesが認められないこと，拡張

A
G

u＝A

uA

U＝A

症である．病因としてミトコンドリアDNAの異

A＝U

C≡G

常が強く示唆されたため本症例のミトコンドリア

U＝A

A血∝血

DNAの解析を行なった．全ミトコンドリアDNAl㈹pをプローブとしたサザンプロットでは欠矢はなく，MELASとMERRFの原因とされている塩基番号3243，8344のA→Gの点変異も検出されなかっドリアDNAの異常の多くがtRNAをコードす

A

tRNAIleた．ミトコンドリア脳筋症の原因となるミトコン
る領域に存在するため本症例の筋肉中のミトコン

U G
u

図3

ドリアDNAのtRNA領域の塩基配列の解析を行なった．その結果，tRNAlleの領域に塩基番号tRNA‖eの3次構造と点変異の位置矢印でアクセプターステムの根本の互いに水素結合している塩基対に1塩基置換がおこっている事を示す．

4269（A→G）の1塩基置換が存在することが明らかになった．この1塩基置換はmismatchは見出されなかった．

primerによるPCRと制限酵素SspIによる消化で検出可能である（図1）．

この症例では血液と生検筋のミトコンドリア
DNAはほとんどが変異ミトコンドリアDNAで40人の血液または生検筋のミトコンドリア

あったが銀染色では少量の正常ミトコンドリア

DNAをスクリーニングしたが，この1塩基置換

DNAが検出された（ヘテロプラスミー）．また母−227−

程度存在していたが骨格筋，心筋，小脳では異常
ミトコンドリアDNAが優位であった．この結果は必ずしも臨床経過の臓器による重篤度とは関連はしていなかったが，同じ臓器内でも部位により

4）．

今回，我々は拡張性心筋症を伴った特異な臨床
Eh−JJ河凸凹∝UU

E○∝mM∝uU

国JU︼∝トZM＞ トh凹J∝凹＞−J

一 国︑HUSP∑ DTOhJMq

完JUSO∑SgSh01JI

異常ミトコンドリアDNAが比率が大きく異なっている可能性もあり今後検討する必要がある（匡経過をとったミトコンドリア脳筋症のミトコンド））アDNA解析によりtRNAHe領域に病因と関係すると思われる新しい点変異を見出した．今後は，この異常ミトコンドリアDNAの病因との関連を細胞生物学的に解析して行き．たい．

図4

剖検臓器での異常ミトコンドリアDNAの分布．PCR産物に1回，αL32P−dCTPを取り込ませてから制限酵素SspIで消化し電気泳動により分離した．上のバンドは変異ミトコン
ドリアDNA，下のバンドは正常ミトコンド
リアDNAに対応する．

文

献1）GotoY，HoraiSandNonakaI：Amutation
inthetRNALeutUUR）geneassociatedwiththe
MELAS subgroup of

mitochondrial ence−phalomyopathies．Nature348：651−653，1990．
2）InuiK，FukushimaH，TsukamotoH，Taniike
M，Midorikawa M，TanakaJ，NishigakiT

親の血液中のミトコンドリアDNAはほとんどがand Okada S：Mitochondrial ence−

正常型であったが，この症例に特有な異常ミトコ

phalomyopathies withthe mutation of the

ンドリアDNAが少量存在していた（図2）．

mitochondrial tRNALeu（UUR）gene．J Pediatr

本症例では母親由来の異常ミトコンドリア
DNAが増幅されて優位な変異となり，ミトコン

120：62−66，1992．

3）InuiK，TsukamotoH，FukushimaH，Taniike

ドリア脳筋症の発症に至ったと考えられる．

M，TanakaJ，Nishigaki T and Okada S：

この1塩基置換はtRNAlleのアクセプタース

Detection of the A to G（3243〉 mutation of

テムの根本の互いに水素結合している塩基対におmitochondrialDNAinJapanesefamilieswith

こっており，立体構造に大きな影響を与えると考

mitochondrialmyopathies．JInherMetabDis

えられる（図3）．

15：311−314，1992．

またこの領域のホモロジーを検索したが，哺乳4）SchoffnerJM，LottMT，LezzaAMS，etal：

類ではよく保有されていた．

Myoclonus epilepsy and ragged−red fiber

剖検各種臓器での異常ミトコンドリアDNAのdisease（MERRF）is associated

比率を32Pでラベルする事により検討した．PCR

with amitochondrial DNA tRNALys mutation．Cel1

産物に1回のみα一32P−dCTPを取り込ませてか

61：931−937，1990．

ら制限酵素で消化すると変異を持つもの比率をよ

5）Yoneda M，Tanno T，Horai S，Ozawa T，

り正確に定量することができる7）．その結果，異常ミトコンドリアDNAの比率が臓器により大きく

Miyatake T and Tstdi S：A commOn
mitochondrialDNAmutationinthetRNALys

異なっていることが明らかになった．腎臓，肝臓，Ofpatientswithmyoclonusepilepsyassociat−

大脳皮質では正常ミトコンドリアDNAが約50％

edwithraggedrredfibers．BiochemInter21：−228−

Commun186：47−53，1992．

789−796，1990．

6）Taniike M，Fukushima H，YayagiharaI，

7）Tanno T，YonedaM，NonakaI，Tanaka K，TsukamotoH，TanakaJ，FujimuraH，Nagai

Miyatake T and Tsuji S：Quantitation of

T，Sano T，YamaokaK，ⅠnuiKandOkada

mitochondrial DNA carrylng the tRNALys

S：MitochondrialtRNAHe mutationin fatal

mutationin MERRF patients．Biochem

cardiomyopathy．Biochem Biophys Res

Biophys Res Commun179：880r885，1991．

−229−

47）Pearson症候群におけるミトコンドリア異常の生化学的・分子生物学的解析
肘

高

澤

小

＊

肘ヂ
＊

＊

＊

田

義浩

田

＊

＊

＊

和下

＊

＊

＊

酔い

＊
＊

＊

＊

鐘

野西

佐大

＊

伸

嗣正夫

雅

中井倉

田今佐

研究協力者

は じめに

炎に掟思して入院した．汎血球減少，骨髄におけPearson症候群は乳児期早期に始まる大球性のるmyeloblastの増加（12％）とringed sidero
blast（＞15％）が見られ，高乳酸血症（75mg／
dl，正常14・9mg／dl以下）を示した．筋ではrag−
ged−redfibersは見られなかったが，多数のチトクロームCオキシターゼ活性陰性の線経が見られた．意識障害が急速に進行し，2歳時に敗血症で死亡した．
症例2 3カ月 男児．
主訴：貧血．
家族歴：二人兄弟．兄（5歳）と母は健康．
妊娠中の経過：特に異常なし．

鉄芽球性貧血，種々の程度の汎血球減少，骨髄細胞の空砲化とringed sideroblastの出現，膵外分泌機能障害を主症状とする予後不良の稀な疾患である1）．高乳酸血症と代謝性アシドーシスを伴い，肥大型心筋症や腎の尿細管機能障害，肝不全などを合併することもある．本疾患の分子・遺伝子学
基礎を明らかにするために，ミトコンドリア呼吸鎖の酵素サブユニットの欠損ならびにミトコンド
リア遺伝子（mtDNA）の欠失および点変異を解析した2）．

現病歴：在胎37週，2860g，Apgar9にて出生．日
齢0に顔色不良，日齢1に呼吸困難を呈し，貧血症例および方法
症例11歳11カ月 男児．
主訴：貧血．
家族歴：二人兄弟．姉（3歳），両親とも健康．
妊娠中の経過：特に異常なし．
現病歴：在胎39週，3920g，Apgar9にて出生．日
齢4にHblO．6g／dlと貧血傾向を示し，生後1カ
月にはHb5．7g／dlと進行し，白血球減少も伴った．生後8カ月まで同程度の貧血を繰り返し，定期的な輸血を必要とした．1歳11カ月にて急性腸＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊名古屋市立大学医学部小児科＊＊＊香川医科大学小児科＊＊＊＊広島大学医学部小児科（Hb8．2g／dl）と代謝性アシドーシス（pH7．02，
BE−27．4）に気づかれた．月齢16にはいったん軽快
し退院したものの，生後3カ月に再び貧血と代謝性アシドーシスをきたして精査入院となる．息児はその後，再び軽快するも発作的に貧血とアシドーシスを繰り返している．
方法ウエスタンプロット分析：組織から単柾したミト
コンドリアをポリアクリルアミド電気泳動により分離し，ナイロン膜に移した後，ウシのミトコン
ドリアの複合体Ⅰ〜Ⅴに対する抗体を用いてそれぞれのサブユニットを検出した．免疫反応性のサ−230−

ブユニットの量をデンシトメターを用いて定量し，＞ヽ

蓋抽 言羞空室 重量羞

対照と比較によって減少の程度を算出した．
サザンプロット分析：症例1においては，剖検各臓器において5pgのmtDNAを制限酵素PuuII笠；：＝〕：」已⊥出＝とこ』（Takara）および助mHI（Toyobo）にて消化
し，0．8％アガロースゲルを用いて電気泳動により−由mHl−

分馳した後，ナイロン膜に移した．D−loop領域をPCR法で増幅したDNA断片をプローブとして

図2

用い，増感化学発光法により検出した．欠失一戸相川−

症例1の剖検組織における欠失mtDNAのサザンプロット分析

mtDNAと正常mtDNAの比率は感光させたⅩ
線フイルムを用いてデンシトメトリーにより求めた．
遺伝子増幅：5ngの鋳型DNAに50pmolのL
primerおよびH primer，各100FLMのdNTP，
1．25unitsの7bq DNA polymeraseを混合し，Thermal Cyclerを用いて，94℃−15秒，55℃−
15秒，72℃−40秒（30サイクル）でmtDNAを増幅した．
塩基配列の決定：mtDNAの欠夫の境界領域および全領域の塩基配列を自動DNAシークエンサー
を用いて蛍光プライマー法により決定した3）．
結果ウエスタンプロット分析：症例1の剖検組織からミトコンドリアを単離し，電子伝達系の複合体Ⅰ〜Ⅴに対する抗体を用いて，ウエスタン70ロット

C

P

軸t
図1

叫鑑警鰹駆詳−細雨鰹堅零

分析を行った結果，分析した全組織において複合

C

P

C

P

c

P

体Ⅰのサブユニットに最も著しい欠損が示された（図1）．
サザプロット分析：図2に症例1の各組織におけるサザンプロット分析を示す．月α∽HIによる消化では，正常mtDNAに由来する16．6kbの断片に加えて，約5kbの欠夫を有する変異mtDNAに由来する11．6kbの断片が検出され，正常
mtDNAと欠失mtDNAとの混在（heteroplas一my）が示された．欠失mtDNAの割合は組織間で大きく異なることが明らかになった．助腸ⅠⅠ消化では，欠矢のないmtDNAに由来する15．Okbの断片と，欠失mtDNAに由来する10．Okbの断片が見られた．PuuIIにおける10．Okb／15．Okb比は同じ臓器での，励∽HIにおける11．6kb／16．6
kb比に一致していた．勒〟ⅠⅠ消化において通常より1．6kb短い15．Okbの断片が検出された原因は，
通常の月腸ⅠⅠ切断部位（塩基番号2650）から1．6kb離れた塩基番号1005にTからCへの転位が存在し，PuuIIのSite gainが生じたためと判明した．
欠矢の域の解析：欠夫の部位と大きさをprimer
Shift PCR法4）を用いて解析した後，ダイレクト
シークエンス法により欠失周辺の塩基配列を決定した（図3上 症例1の欠夫はATP8遺伝子から
ND5遺伝子にわたる4977塩基対の欠失であり，13

C

P

c

p

C：Cont−d P：Patient

症例1の剖検組織のミトコンドリアにおける複合体Ⅰサブサブユニットのウエス
タンプロット分析

塩基対の順方向繰り返し配列が欠失の境界に存在した．症例2の欠矢はtRNAHts遺伝子からCytb
遺伝子にわたる3151塩基対の欠失であり，順方向
繰り返し配列を伴わなかった．
図4にそれぞれの組織における免疫化学的に検出された複合体Ⅰのサブユニットの量と仝−231−

表 Pearson症候群の患者（Pl，P2）において兄いだされた非同義置換

SequenceofthedeletedmtDNA
Patientl

塩基番号遺伝子ATPas0ND

8…2＼

D010tIon

4977bp

5

13460

13928

5●…CTA CCT CCC TCA C嬰

Patient2

ND5

D010tlon

3151bp12203＼CCGAGAん……CAC GA：袈：5，。▲ニ

症例1および症例2におけるmtDNAの欠失の境界領域の塩基配列

アミノ酸置換変異 ヒト ウシマウス

ラット

G C C Thr Ser Thr Ser IJ8

12338

ND5

T C

・

Thr Met Met

11150

ND4

G A

一

丁hr A】a HO l旭

13708

ND5

G A

−

Thr A】a Leu−

Leu Ser Cys

15714
Cytb C T
4732 ND2A−tRNAHld

図3

塩基置換
標準 PI P2e Met

日8
〟a AJa

他

日e

10609

ND4L T−

G Sor Asn Lou Tyr Tyr
C Thr Met ThT Thr Ser

12406

ND5

・

A

G

lle

Vaf

Phe

Ser

Thr

％60幻4 03020

脊椎動物のミトコンドリアにおいてコドンACA
がinitiatorとして使われている例はなかった．この変異は6例のCPEO患者および40例のコント
ロールでは観察されなかったが，症例1の母親および姉ではホモプラスミーの状態で存在した．
考察
Pearsonは1979年に造血組織と膵臓外分泌機能障害を主症状とする疾患として marrow−pan−creas症候群 を報告した．しかし，その病巣は造血組織や膵外分泌のみならず，心臓，肝臓，腸，
腎尿細管と幅広く，肝不全や敗血症が死因となることが多い．ここに報告した例は膵外分泌機能不全を思わせる所見はなかったが，分析した剖検各臓器に電子伝達系のサブユニット欠損および欠失Musclo Heart LIver Kidney Braln Pancreas

図4

症例1の剖検組織における免疫化学的に検出しうる複合体Ⅰサブユニットの量と全mtDNAに対する正常mtDNAの割
合の比較

mtDNAに対する正常mtDNAの割合を比較した結果を示す．複合体Ⅰサブユニット量の減少は，正常mtDNAの割合の低い腎臓が正常の10％と最も著しく，欠失mtDNAの割合の少ない心臓と

mtDNAが広く分布していた．したがってPear−
son症候群は全身性の疾患として捉えることが必要であろう．
R6tigら5）はPearson症候群の患者の血液細胞においてmtDNAの欠矢を報告した．一方含量が低い傾向が認められた．
症例1および症例2のmtDNAの全塩基配列を決定した．両症例においてtRNA遺伝子に変異は見られなかった．翻訳領域におけるアミノ酸置
換を伴う変異を表に示した．症例1ではND5遺伝

Kearns−Sayre症候群（慢性進行性外眼筋麻痺を含む）の患者の組織においてもmtDNAの欠矢が報告されているが，多くの症例において血液細胞
中ではサザンプロット法では欠失mtDNAを検出することができない．このためKearns−Sayre症候群とPearson症候群の臨床的表現型の相違は欠失mtDNAの組織分布の違いに基づくと考えられてきた．ところが，最近Fisscel−Ghodsian

子領域の塩基番号12338にT→C塩基転位が見られた．この転位によってMetに対するコドン
ATAがThrに対するコドンACAに変化した．

ら6）は貧血のないKearns−Sayre症候群の患者の血液細胞において欠失mtDNAが75％を占めていたと報告し，欠失mtDNAの組織分布のみでは脳ではサブユニット量の減少率もそれぞれ正常の55％，41％と軽かった．このように正常mtDNAの割合が低い組織において複合体Ⅰサブユニットー232−

Pearson症候群とCPEOの臨床症状の相違を説

mitochondrialDNA mutations．ttTechniques

明できないことを示唆した．本研究においてof

mtDNAの欠矢が呼吸鎖酵素サブユニット量の減

staff）．Humana Press．Clifton．（in press）

少に関与していることが示された．各症候群に固Neurobiolgy

（ed

by

Lang−

症候群における表現型の相違に関与している可能性が考えられた．

Watanabe K，Awaya S and Ozawa
Detection of platelet

TYamamoto T，Maehara M，Negro

T

矢と協調的に，Pearson症候群とKearns−Sayre

K

1993．

4）Ota Y，Tanaka M，Sato W，

O
n
h
O

有のmtDNAの点変異が，両症候群に共通する欠Molecular

mitochondrial DNA

deletionsin Kearns−Sayre syndrome．Invest

文

献OphthalmolVis Sci32：2665−2675，1991．

1）PearsonHA，LobelJS，KocoshisSA，Naiman

5）R6tigA，Cormier V，Blanche S，Bonnefont

JL，Windmi11erJ，LammiAT，HoffmanRand

JP，LeDeistF，Romero N，SchmitzJ，Rustin

MarshJC：A new syndrome of refractory

P，FischerA，SaudubrayJMandMunnichA：

sideroblastic anemia with vacuolization ofPearsonmarrowprecursors andexocrine pancreatic

multisystem mitochondrial disorderinsmarrowLpanCreaS

Syndrome；Ainfancy，JClinInvest86：1601−1608，1990．

dysfunction．J Pediatr95：976−984，1979．

2）Sano T，Ban K，Ichki T，Kobayashi M，6）Fisschel−Ghodsian N，Bohlman C，Prezant

TanakaM，OhnoKandOzawaT：Molecular

TR，GrahamJMJr，Cederbaum SD andand genetic analyses of two patients with

EdwardsMJ：Deletioninbloodmitochodrial

PearsonDNAinKearns−Sayresyndrome．PediatrRessmarrow−panCreaS

Syndrome

31：557−560．1992．

Pediatr Res（in press）1993．
3）Tanaka M and Ozawa T：Analysis of−233−48）MELASにおける変異ミトコンドリアDNAの検討
荒 木 淑 郎＊研究協力者

箕 田 修 治＊＊ 徳 永誠＊＊ 熊 本 俊 秀＊＊

安 藤 正 幸＊＊ 埜 中 征 哉＊＊＊作 田 亮 一＊＊＊は じめにprimer pairの一方の5，端を放射性同位元素（RI）

我々はミトコンドリア（mt）脳筋症における筋［γ732P］ATPでラベルしてpolymerase chain

病理学的特徴であるragged−red fibers（RRF）及reaction法にてmtDNA変異部を含む領域のmtDNA断片を増幅した．変異部認識の制限酵素

びcytochrome c oxidase（CCO）活性欠損線経と変異mtDNAとの関係を明らかにし，mt脳筋症の各病型たぉける変異mtDNAの役割を明らか（Cfr13I）で切断し，そのDNA断片のRIの強さで正常と変異mtDNAの割合を検討した．

にすることを目標に研究を進めている1）2）．今回
は，MELASにおける変異mtDNAの役割につい
て検討する

と

と

もに，MELASの点変異

mtDNA，tRNALeu（3243）の変異部がtranscrip−tion terminationとしての機能を低下させるか否かを検討した3）．
方法1）対象と してMELAS患者4例［3例はmtDNAtRNALeu（3243）変異4），1例はtRNALeu（3271）変異5）］，CPEO患者1例（4．9kbのCOm−mondeletionl）を有している），正常対照1例の生検筋を用いた．
2）これら生検筋の連続切片を用いてCCO染色およびSDH染色のhistochemistryを行い，12S
及び16S ribosomal RNA（rRNA）の領域とCCO
subunitIIをカバーする2種類のmtDNA断片をプローブにinsiluhybridization（ISH）を行った．
3）RRFおよびnon−RRFにおける正常と変異
mtDNAの割合を明らかにするために，SDH染色
した3叫mの筋切片から1個の筋線経を採取し，結果1）MELAS患者筋でもCPEO患者筋と同様に，
RRFにおいて全（正常と変異）mtDNAは著明に増加していたが，その多くは変異mtDNA由来であった．また，これらのRRFでは，CPEOと異なりCCO活性が保たれているものが多かった．
2）筋内小動脈においてはSDHにて濃染する血管（SSV：StrOngly SDH−reaCtive bloodvessels6））でmtDNAの著明な増加を認めたが，その多くは変異mtDNA由来であった．
3）変異mtDNAの割合はRRFにおいてnon−
RRFより高値を示した．
4）mtDNAのrRNA領域とCCO subunitII領域のmRNAの割合を上記生検筋のISH法を用いて検討したところ（図1），その比率はtRNALeu（3243）変異を有するMELAS患者とtRNALeu（3271）変異を有するMELAS患者，CPEO患者及び正常対照との間で有意差がなかった（図2）．この結果より，tRNALeu（3243）がtranscriptionter−minationの働きを低下させるという仮説7）は否定的であった3）．

＊三井大牟田病院神経病総合医療センター■＊熊本大学医学部第一内科＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所−234−

図1MELAS（3243変異）患者生検筋連続切片で，rRNA領域とCCOsubunitII領域の2種類のプローブを用いたin situ hybridization（ISH）
a．rRNA領域のプローブを用いたISHでmitochondrial（mt）DNAを検出
b．rRNA領域のプローブを用いたISHでribosomalRNAを検出
C．CCO subunitII領域のプローブを用いたISHでmtDNAを検出
d．CCOsubunitII領域のプローブを用いたISHでmessenger（m）RNAを検出
a−Cの自点とdの黒点は連続切片での同じfiber（RRF）を示している．a，Cより2種類のプ
ローブは同じhybridizationの効率を持つが，b，dよりrRNAはmRNAより多量に存在していることがわかる．このrRNA／mRNA比を他の生検筋と比較した．

考察

MELASにおいて，RRFばかりでなくSSVにの比は小さくなることが予想されるが，その比率はtRNALeu（3243）変異を有するMELAS患者とおいても変異mtDNAの著明な増加がみられた

tRNALeu（3271）変異を有するMELAS患者，

ことは，筋組織内および脳内の小動脈で著明にミ

CPEO患者及び正常対照との間で有意差がなか

トコンドリアが増加しているとするこれまでの知見6）8）9）に変異mtDNAが深く関与しているといった．この結果，tRNALeu（3243）がtranscription
terminationの働きを低下させるという仮説は否うことを示唆したものであり，MELASの特徴で定的であった．これは，MELAStRNALeu（3271）

あるstroke−likeepisodesを考える上で重要な所見と考えられた．

変異がtranscriptionterminationbindingfactor

MELASにおけるtRNALeu（3243）の変異はを用いた報告10），生検筋のISHより得られた報transcriptionterminationbindingfactorの結合

告11），と合致するよのであった．このように，部内にあって，tranSCriptionterminationの働きを低下させるのか病因であるとの仮説が玩‡通用

tRNALeu（3243）の異常はtranscription termina−の系を用いて報告された7）．この仮説が正しいとのbinding siteに含まれないこと5），Cybrid celltionの障害というより，他のメカニズムによる可能性が示唆された．

すれば，rRNAでは終止せず蛋白コード領域へと

今後ともミトコンドリア脳筋症の各病型におけmRNAが伸展することになり，rRNA／mRNA

る変異mtDNAの役割を明らかにしていきたい−235−

くN正∈︑くN∝﹂

inthetRNALeu（t：UR）geneassociatedwiththe
MELAS subgroup of

mitochondrial ence−phalomyopathies．Nature348：651−653，1990．
5）Goto Y，NonakaI and Horai S：A new
mtDNA mutation associated with mitochon−
drial myopathy，enCephalopathy，lactic
acidosis and strokerlike episodes（MELAS）．
Biochim BiophysActalO97：238−240，1991．
6）Hasegawa H，Matsuoka T，Goto Y and
N

］

R

N

］

R

N

］

R

N

R

］

N

NonakaI：Stronglysuccinatedehydrogenase

R］−reaCtive blood vesselsin muscles from

図2

patientswithmitochondrialmyopathy，enCe−

各生検筋におけるrRNA／mRNA比の比較
各生検筋のRRFとnon−RRF10本ずつにおいて，ISHのgrainを数えて
rRNA／mRNA比を求めた．N：non−RRF，R：RRF．1：正常対照，2：
CPEO患者，3−5：tRNALeu（3243）変異を有するMELAS患者3例，6：tRNALeu（3271）変異を有するMELAS
患者．

phalopathy，lactic acidosis and stroke−1ike
episodes．Atln Neuro129：601−605，1991．
7）HessJF，ParisiMA，BennettJLandClayton
DA：ImpalrmentOfmitochondrialtranscrip−
tionterminationbyapointmutationassociat−

ed with the MELAS subgroup ofmitochon−
drialencephalomyopathies．Nafure351：236−239，1991．

と思っている．

8）Ohama E，Ohara S，Tanaka K，et al：
Mitochondrial angiopathyin cerebralblood

文

献vesselsofmitochondrialencephalomyopathy．

1）Mita S，Rizzuto R，Moraes CT，et al：

Acta Neuropatho174：226−233，1987．

Recombinationviaflankingdirectrepeatsis9）Sakuta R and NonakaI：VascularinvoIve・

a major cause oflarge−SCale deletions ofhuman mitochondrial DNA．Nucleic Acids

mentinmitochondrialmyopathy．AnnNeuro1
25：594−601，1989．

10）King MP，Koga Y，Davidson M and Schon

Res18：561−567，1990．

2）Mita S，Schmidt B，Schon EA，et al：

EA：Defectsinmitochondrialproteinsynthe・

mitochondrial

Sis and respiratory chain activity segregate

genomesin cytochrome−C OXidase−deficientwith the tRNALeu（UUR）mutation associatedDetectionofdeletedmusclefibersofapatientwithKearns−Sayre

With

Syndrome．ProcNatlAcadSciUSA86：9509

phalopathy，1actic acidosis，and strokelike

mitochondrial

myopathy，enCq一

episodes．MoI Cell Biol12：480−490，1992．

−9513，1989．

3）Tokunaga M，Mita S，Sakuta R，NonakaI11）Moraes CT，Ricci E，Bonilla E，et al：The

and Araki S：Increased mitochondrialDNA

mitochondrial tRNALeu（UUR）mutation inin blood vessels and raggedTred fibersin

mitochondrial encephalomyopathy，lactic

mitochondrial myopathy，enCephalopathy，

acidosis，andstrokelikeepisodes（MELAS）；

1actic acidosis，and stroke−like episodes

genetic，biochemical，and morphological（MELAS）．Ann Neurol（in press）．

COrrelationsin skeletal muscle．AmJ Hum4）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation−236−

Genet50：934−949，1992．

49）MELAS患者脳における変異ミトコンドリア
DNA量の分析
水 澤 英 洋＊
研究協力者

白

岩

伸

子＊

太

田

成

男＝

は じめに

MELAS症例である．下垂体機能検査にて視床下

MELAS患者では，mtDNAのtRNALeu（UUR）の塩基番号3243におけるAからGへの点変異があり，その塩基置換をもつ変異mtDNAと正常
mtDNAが混在するへテロプラスミーの状態であることが知られている1）2）．

部下垂体性GH，LH，FSHの分泌障害があり，原
発性無月経，低身長との関連が疑われた．死亡時，27歳．患者2は，19歳男性．精神発達遅滞，全身性けいれん等が認められたMELAS症例．対照として24歳から47歳の剖検脳5例および16歳から58歳までの正常骨格筋を用いた．
昨年発表した患者1の全身臓器における正常

昨年，我々は視床下部下垂体系の機能異常を伴うMELAS患者の1剖検例で，大脳，小脳，下垂体，筋，末梢神経，甲状腺，副腎，肝臓，腎臓，
牌臓，胃，小腸，大腸の各組織において，変異
mtDNAと正常mtDNAの比率を測定し，臓器間の分布を調べた．脳下垂体で最も正常mtDNAの比率が低く5％だった．しかし，その他の臓器の中には臨床的には問題がなかったにもかかわらず
変異mtDNAが高い比率で含まれているものが見られた．臨床的な表現型との関連については，
いろいろな考え方があるが，その一つとして，
mtDNAが代償的に増加していてmtDNAの絶対量が異なっているとすれば，変異mtDNAの比率は高くても正常の機能を示す可能性があると思われる．そこで，今回我々は上記剖検脳の各部分，
および筋のmtDNA量を定量し．それを正常コントロールと比較することにより，この問題を検討した．
対

mtDNAの分布は図1のようだったが，この際，総mtDNA塁は定量していなかった．副腎，甲状腺などは，臨床的には機能は正常だったが，正常
mtDNAの比率は大脳皮質と同程度であ？た．
方

料問でのDNA量のばらつきを補正するためにリボゾーマルDNA6）を含むDNA断片をラベルしてハイプリグイズし，リボゾーマルDNAを中心とする核DNAにハイプリグイズする部分を定量し仝DNA量相対値とした．

象

患者1は，昨年度の本姓会議において報告した＊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊自治医科大学生化学法

患者1，対照5例の大脳皮質，大脳白質，大脳基底核，小脳皮質，小脳自質の各組織，および患者1，2と対照5例の筋からプロティナーゼK法によりDNAを抽出し，mtDNAをサザンハイプ
リタイゼイション法にて定量した．プローブには，クローン化したヒトmtDNA断片を用いた．各試

結果

図2はサザンプロットによるmtDNA量の定量である．脳の各部位および筋ともに対照と比較
−237−

0
∩﹀
0
8
0
6

0
4
0
2

︵ボ︶vZロー巾∈LOU−○−u2u00

図1MELAS患者剖検組織内の正常mtDNAの分布
してはっきりと増加しているといえるものは認められない．
図3は核DNAに対する比をとってノーマライズした結果を示す．頭頂葉皮質の梗塞様病変，小く、ざ ㌔きく㌔
二二二＝脳皮質，小脳髄質ではコントロールの平均に対して1．5倍から3倍程度の増加を示してはいるが，そPCCC PPCの他の大脳皮質，前頭葉白質，大脳基底核では増加は見られない．図4は骨格筋で検討した結果だが，患者1の各部位の筋，患者2ともにコントロールに対して明らかな差は認められなかった．
考図2

サザンプロットによるmtDNA量の定量
Frontal：，Temporal：，Parietal：，0ccipital‥

各々前頭葉，側頭葉，頭頂葉，後頭葉皮質，
Frontald．W．：前頭葉深部自質．P：患者1の脳，Pl：患者1の筋，P2：患者2の鼠 C：
コントロール察

最近，CPEO，MELASなどの症例で，筋mtDNA量を主にinsituhybridization法で定量した報告が発表されている3）4）5）．Moraesら5）はMELAS5例，対照3例の検討で，MELAS例中2例しか稔mtDNA量の増加はみられなかったと報告している．その2例の筋では変異mtDNAが95％あるにもかかわらずCCOの欠損した筋線
経が少なかったとしておI），これらの症例では代償機転が働いている可能性があると考察しているが，そのような症例はこのように一部で，大部分の症例では対照と同程度である．その他の報告3）4）
でも総mtDNAの増加が見られるのは一部の症

一238−Temporal＜Z凸U︑VZ凸l∈−01uU−uOOO＞；巾一心∝

PCCCC PCCCC PCCC PPCCC PCCCC PCC PCC PCC PCC PCC PCC

図3

脳の各部位におけるmtDNA量（mtDNA／nuclear DNA比）
P：患者1，C：コントロール

86

例の脳および骨格筋においては，変異mtDNAの増加によって正常mtDNAは著しく減少してお4

り，総mtDNAの増加による代償は起きていないと思われる．またこれは，in siiu hybridization
法による研究とも一致する結果と思われるが，今

20

くN凸U︑くNDl∈−○︼uO−U000上馬−中正が，正常コントロールに較べて有意な増加あるいは低下は認められなかった．従って，検言寸した症

後，さらに症例数を重ねて検討することが必要だと考えられる．

PI PI PI PI PI P2CI C2C3C4C5

簡抑鬱掛物鴫

まとめ

1．MELAS患者剖検脳および骨格筋のmtDNA
図4筋におけるmtDNA量（mtDNA／nuclearDNA比）

量を定量し，正常コントロールと比較した．

Pl：患者1，P2：患者2，C1−4：コントロール
SCM：Sternocleidomastoid muscle

変異mtDNAの増加によって正常mtDNAは著

2．総mtDNA量の増加は見られないことから，
しく減少し，代償機転は起きていないと思われた．

例に限られている．また，筋以外に，脳などでmtDNA量を検討した研究は，まだほとんど報告
されていない．
今回，我々はMELASl例（患者1）の脳の各部位，および骨格筋2例（患者1，患者2）における総mtDNA量をサザンプロットで検討した
−239−

文

献

1）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation
inthetRNALeu（UUR）geneassociatedwiththe
MELAS subgroup of

mitochondrial ence−phalomyopathies．Nature348：651−653，1990・
2）Kobayashi Y，Momoi MY，Tominaga K，

MomoiT，NiheiK，YanagisawaM，Kagawa

associated with mitochondrial DNA

Y and Ohta S：A point mutationin thedelesions．NatureGeneticsl：359−367，1992．

mitochondrialtRNALeu（UUR）genein MELAS

5）MoraesCT，RicciE，BonillaE，DiMauroS，（mitochondrial myopathy，enCephalopathy，

and Schon EA：The mitochondrial

1actic acidosis and stroke−like episodes）．

tRNALeu（UUR）mutationin mitochondrial

Biochem Biophys Res Commun173：816−

encephalomyopathy，lactic acidosis，and

822，1990．

StrOkelike episodes（MELAS）；genetic，

3）Mita S，Schmidt B，Schon EA，DiMauro S，
andBonilla

E：Detectionofbiochemical，andmorphologicalcorrelations

inskeletalmuscle．AmJ HumGenet50：934

deleted−949，1992．

mitochondrial genomesin cytochrome−C
OXidase−deficient muscle fibers of a patient6）Moraes CT，Shanske S，Tritschler HJ，With Kearns−Sayre syndrome．Proc Natl

AprilleJR，AndreettaF，BonillaE，SchonEA，

Acad Sci USA86：9509−9513，1989．

and DiMauro S：mtDNA depletion with

4）MoraesCT，RicciE，PetruzzellaV，Shanske

Variable tissue expression：A novelgenetic

S，DiMauro S，Schon EA，and Bonilla E：abnormalityinmitochondrialdiseases．AmJ

Molecular analysIS Ofthe musclepathology

Hum Genet48：492−501，1991．

−240−50）ミトコンドリア脳筋症MELASの変異ミトコンドリア
DNAの変動太 田 成 男＊研究協力者

小 林 葉 子＊＊ 桃 井 真里子＊＊

は じめに

方

法

ミトコンドリアDNA（mtDNA）の変異によって発症するミトコンドリア脳筋症患者は，なんらかの原因で変異mtDNAが増加して初めて発症

MELAS変異mtDNAの相対量
MELAS変異mtDNAの相対量の測定には，以下の2つの方法を併用した．

するはずである．昨年，本報告書においてCPEO
患者由来の欠失mtDNAは，培養細胞において次第に増加し，見かけ上正常mtDNAを排除することを報告した1）2）．欠失mtDNAは短いために複製速度が迷いという利点が考えられるが，点変異については変異mtDNAの増加を説明することは（》 PCRプライマーの一方の5 側をアイソトー
プラベルし，PCRにて3243近傍のmtDNAを増幅させる．そして，PCR産物を4細Ⅰで切断し，ポリアクリルアミド電気泳動で変異mtDNA断片と正常mtDNA断片を分匪した．そして，そのできない．しかしながら，MELAS患者の家系調査において，MELAS患者の母親と同胞は変異
mtDNAを有しているものも，患者よりも変異
mtDNAが少ない例が大多数であり，それらの例
では補因者である同胞は母親よりも変異mtDNAが増加していた3）．そこで，MELAS3243の変異
mtDNAは何らかの原因で次第に増加していることが推測できる．変異mtDNAの増加の機構を理解することはすなわち発症の機構を解明することであり，また，変異mtDNAの増加をとめたり，減少させることが可能になれば，ミトコンドリア
脳筋症の治療を可能にすることを意味する．そこで，変異mtDNAの増加の分子機構を解明する目的でまず，MELAS患者由来の培養細胞において塩基番号3243のA→Gの変異を持つmtDNAの挙動を調べた．

＊自治医科大学第一生化学＊＊自治医科大学小児科

比率より変異mtDNAの相対量を求めた4）．
② もうひとつの方法は全サザンプロット法によった．培養細胞より，ProteinaseK法で仝DNAを分離し，制限酵素4匝Ⅰで切断した．1％アガロ
ース電気泳動で分画したのち，サザンプロットで切断断片と未切断断片の比率を求めた．ナイロン
膜へのDNAの転写には加圧式プロッターを用いて，定量的に転写した．また，プローブは，3243の上流側と下流側の断片をそれぞれアイソトープ
ラベルし，未切断の断片をまたいでハイプリタイ
ズしないようにした．こうして，定量性を確かにした．
MELAS3243変異をもつ細胞株
一昨年報告したように，MELAS患者の骨核筋由来細胞を複製開始点を欠くSV40−DNAで形質転換し，さらに，細胞をクローン化した5ト7）．このなかで，シトクロム酸化酵素の組織化学的染色で染色されなかった細胞珠を選択した．この細胞珠はグルコースを含まない培養液DM170では生育できず，大部分は2日後に死滅した．さらに，こー241−

の株をクローン化したものを使用した．このクロ

MELAS患者由来細胞はDM170培地ではほとんーン細胞は変異mtDNAを94％，正常mtDNAをどの細胞が生育できず，死滅した．ところが，1カ月すると明らかに増殖する細胞が出現した．その細胞の正常mtDNAは20％に増加していた．この細胞をDM170で培養を続けると変異mtDNAと正常mtDNAの比率は80：20で不変であった．

6％含んでいた．
培養液
グルコースを含む培地としてはHamF12に10％のウシ胎児血清を加えた培地を用いた．グルコースを含まない培地としてはDM170（極東化学）に10％のウシ胎児血清を加えた培地を用いた．この培地はグルコースの代わりにガラクトースとどルビン酸を含む．
結果と考察
細胞には二つのエネルギー産生糸が存在する．
一つは嫌気的な解糖系であり，グルコースを基質として利用する．もうひとつは，好気的な酸化的リン酸化で，ミトコンドリア内でその反応が行われる．そこで，酸化的リン酸化欠損株では解糖系を利用して生育できるが，グルコース不含培養液
ではいづれも利用できず生存できない．前述の

1

2

8

4

5

6

7

＄

9101112

図1にはサザンプロットの結果を，図2には変異
mtDNAの比率の変動をグラフにしたものである．
一方，前述のMELAS患者由来のクローン株（変異mtI）NA：正常mtDNA＝94：6）で
HamF12培養液で培養を続けると変異mtDNAと正常mtDNAの比率は変化しなかった（図1と
図2）．
ところが，DM170で培養し，正常mtDNAが20％の増加した細胞をHamF12で培養すると，図1，2に示すように変異mtDNA次第に増加した．ついには，変異mtDNAが94％のもとの状態にまで回復した．すなわち，変異mtDNAは正常
mtDNAよりも見かけ上の複製速度は速いことが示された．
以上のことより，変異mtDNAと正常mtDNAの比率は以下の条件により決定づけられることが考えられる．

2

3

4

5

CuJturetime（month）

7．HamF12．1m011th

8．H曇mF12∴2川旧nths●−glucose＋PyrUVate咽aIactose

9＿HamF12．31m0111hs

ll．DM170．3mOn【hslO．HdmF12，4monlhs
DM170．5monlhs

図1

O
8

1

6，日8mF12．2weoks

4．DM170．2monlhき5．DH170．3monthS

U

3．DM170．1m011th

mF12．3m（】nlh︵
9︵邑＜Z凸lElU男コEI00葛∝1．抽如げ12

O＋glucoSe

MELAS患者由来変異mtDNA（3243A→G）をもつ細胞のサザンプロット．AapIで切断した後，1％アグロース電気泳動で分画した．
一番上のバンドは正常mtDNA由来であり，下の二本はApaIで切断されたものすなわ
ち，変異mtDNA由来のバンドである．レーンの番号に対応する培養条件は図の下に示す．

図2

−242−

MELAS変異mtDNAの変動．
HamF12とDM170培地に長期的に培養を続け，変異mtDNAの比率の変動を示した．
0…○はHamF12で培養を続けた場合．
●…●はDM170で培養を続けた場合．
●・ ○はDM170で培養した後，HamF12で培養したことを示す．

① ある間借までは，変異mtDNAの方がmtDNA自身の複製としては有利である．

DNA deletionsinto HeLa cellslacking② しかし，ある間借を越えて変異mtDNAが多くなると酸化的リン酸化能が低くなりすぎて，細胞の維持，あるいは増殖ができなくなり，正常
mtDNAをより多く持つ細胞が有利となる．

dysfunction．Proc NatlAcad Sci USA88：

mitochondrialDNA resultsinmitochondrial

10614−10618，1991．
3）KobayashiY，ⅠchihashiK，OhtaS，etal：The

mutant genesin

mitochondrial

myopathy，③ 変異mtDNAと正常mtDNAの比率は両者のバランスによって決定され，変異mtDNAの間

encephalopathy，lactic acidosis and stroke−

借は細胞内外の環境によって決まる．例えば，グルコースを含まない培養液では間借は正常

plified throughgenerations．JInher Metab

mtDNAが20％であるが，グルコースを含む培養
液下では正常mtDNA6％である．
このように変異mtDNAと正常mtDNAの比4）水澤英洋，白岩仲子，太田成男：変異ミトコン
ドリアDNAの分布． 厚生省「精神・神経疾患率は変化しうるものであり，このコントロールを可能にすることによって，治療への道は開けるものと期待される．また，変異mtDNAを減少させる方法として変異mtDNAを多く持つ細胞を選択的に殺すことも一方法であるとも言える．

成因と治療法に関する研究 （荒木址）平成3年

like episode（MELAS）were selectively am・Dis15：803−808，1992．

研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の度報告書，1992，pp255−259．
5）桃井真里子，小林菓子，市橋光ほか： 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー
及び関連疾患の成因と治療法に関する研究 （荒木班）平成2年度報告書，pp261−265，1991．

文献1）太田虎男，林純一，埜中征哉ほか：ミトコンド
リア脳筋症変異mtDNAによるタンパク質合成低下． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

6）KobayashiY，MomoiMY，TominagaK，et

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木珪）平成3年度報告

7）KobayashiY，MomoiMY，TominagaK，et書，pp211−215，1992．

al：A point mutationin themitochondrial
trNA−Leu（UUR）geneinMELAS．Biochem
Biophys Res Commun173：816−822，1990・
al：Respiration−deficientcellsarecausedby
asinglepointmutationinthemitochondrial2）HayashiJ−Ⅰ，Ohta S，Kikuchi A，et al：
IntroductionofdiseaseLrelatedmitochondrial−243−

tRNA，Leu（UUR）genein MELAS．AmJ Hum
Genet49：590−599，1991．

51）ミトコンドリアDNA3243点変異による症状の多様性
後 藤 雄 一＊
研究協力者

作

田

亮

一＊

埜

は じめに

中

征

哉＊

宝

来

聴＊＊

より定量した．

MELAS（mitochondrial myopathy，enCe−
結phalopathy，lactic acidosis and stroke−like

episodes）は脳卒中様症状を特徴とし，小児期に発症するミトコンドリア脳筋症の一つである．
MELASの患者の約80％に，tRNALeu（UUR）の塩基
番号3243にAからGへの点変異を認める1）．
MELASには低身長，難聴，糖尿病，心筋症など
多くの合併症が認められる．MELASの遺伝子診断が進むにつれて明らかな脳卒中発作がなくミオバナー症状もほとんどみられない患者にもMELASの変異である3243変異を認めるものが少なからず存在することがわかってきた．そこで，我々は，このような非典型例が今後MELASに移行するかを予測できれば臨床上有用であると考え，
典型的MELASと非典型例において変異ミトコ
ンドリアDNAの割合や筋病理像，生化学所見などを検討した．
対象・方法
骨格筋に3243変異を有する症例の中でPavla−
kisの提唱したMELASの主症状である脳卒中様症状，乳酸アシドーシスなどをみた典型的な
MELAS30例とその母親3例，脳卒中様症状が全く認められない非典型例6例を対象とした．骨格筋から分推した全DNAを用いてtRNALeu（UUR）
領域をPCR法にて増幅し制限酵素ApaIで消化して3243変異の有無を判定した．変異ミトコン

果

脳卒中様症状のない非典型例の患者は1）進行性ミオクローヌスてんかん，低身長，2）心筋症，糖尿病，難聴，3）痩せ，軽度外眼筋麻棒，4）呼吸障害，筋力低下，5）慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO），6）低身長などの症状を呈していた（表1）．症状の初発年齢は，半数が20歳以降と遅い傾向があった．MELASの母親の年齢は40から50歳で，1人は無症状，あとの2人は易疲労性，難聴，
軽度の筋力低下などを呈していた．
変異mtDNAの割合は，典型的MELASが平均84％，非典型例62％，MELASの母親61％と，非典型例や母親では，典型的MELASに比べて変異mtDNAの割合が少ない傾向があった．ただし，そのばらつきは大きく，非典型例でも80％を越えるものが2例存在した（図1）．
典型的MELASにおいて変異mtDNAの割合
が症状とどのような関係にあるのか知る目的で，脳卒中症状の初発年齢と変異DNAの割合を検討した（図2）．MELASの初発年齢は5から15歳に多く，変異mtDNAも70％以上がほとんどであった．年齢と変異mtDNAとの負の相関は認められなかった．変異mtDNAが70％以下の患者が矢印のように4例認められた．この中の一例にはRRF（ragged−red fiber）を認めなかったが，このようドリアDNAの割合はサザンプロッティング法にな例にも血管の変化であるSSV（strongly SDH・
−reaCtive blood vessels）が認められた．

＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊国立遺伝学研究所

さらに，典型的MELAS，その母親，非典型例の筋病理，生化学所見を検討した（表2）．RRFは−244−

表1 非典型例の主な症状

郷輔一

症状の初発
年齢

1
つ︼

り

つ 一

6ア
20y

つ

3
5

5

わん

4

つ一つJ

9y

′ ○

主な症状
低身長
筋力低下、歩行障害
痩せ、筋力低下、軽度眼瞼下垂慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）
ミオクローヌスてんかん
糖尿病、靂聴、拡張型心筋症
呼吸障害、筋肉痛、筋力低下、高CK血症

0
0

。

。

0
9

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0

10

l

20

30

40

50

age at onset（y）

図2

図1典型的MELAS（MELAS），非典型例（atypical），典型的MELASの母親（mothers）における骨格筋の3243変異の割合．

典型的MELASにおける脳卒中様症状の初発年齢と骨格筋の3243変異の割合との関係．変異mtDNAの割合が70％以下のものが4例認められた（矢印）．

表2 筋病理，生化学所見の比較

RRF SSV I IV I＋ⅠⅤ

典型的MELAS

3着ともほぼ全例に認められた．SSVは，典型例
では93％，しかし非典型例や母親では1／3にSSVをみない例が存在した．生化学的には，典型
例，非典型例とも複合体ⅠとⅠ＋ⅠⅤ欠損が多く，逆に母親では3例とも正常範囲だった．
非典型例の中に，変異mtDNAや筋病理所見が大きく変化した例があった．患者は，表1の症例
3であり，6歳から一過性の筋力低下，歩行障害を呈し筋生検を施行され，20歳に痩せが進行した
ことから2度昌の筋生検が行われた．筋病理では，

皿＝30

29

非典型例
皿＝6

MEu相の母
皿＝3

28

10

3

4

（97）（93）（33）（10）（13）

6

4

2

0

（100）（67）（33）32（1001（67）

0

0

1

（17）

0

3
（50）

3
（1001

（）内は％

7歳時には筋線経の著明な大小不同，RRFは60％と著明に増加し，CCO活性はび漫性に低下していた．ところが，20歳のときは，大小不同は軽くRRF
も7％と1／10に減少し，12％にCCO活性の部分−245−

欠損線経を認めた．SSVは2回ともみられなかった．この患者の筋の3243変異の割合を定量した．
7歳時には78％あった変異mtDNAは20歳時には25％と1／3に減少していた．
考

非典型例が今後脳卒中様症状を呈するか予測す
ることは雉しいが，変異の割合や血管の変化（SSV）などを指標にして憤重なフォローが必要と考えられた．

察

文

典型的MELAS，その母親，非典型例において
筋病理，生化学，変異mtDNAの割合を比較検討した．筋の変異mtDNAの割合は，典型例が平均84％と高い傾向があったが，個々の例をみるとその値のばらつきが大きく70％以下でもMELASがいる一万80％以上でも脳卒中様症状を示さない
非典型例が認められた．このことからMELAS発症を，単に骨格筋の変異mtDNAの割合によってのみ知ることは困難であると考えられた．
非典型例のなかに変異mtDNAやRRFの割合
が10数年の間に著明に減少した患者がみられた．
mtDNAの変動に関しては，加齢による変異
mtDNAの増加2），末梢血単核球における3243変
異の減少の報告3）がある．しかし，本例のようにCCO欠損の良性乳児型4）のように臨床症状，筋病
理像の著明な改善をみた例におけるmtDNAの分析の報告はない．本例の結果から，ミトコンド
リア異常症の症状の多様性は，各臓器における変異mtDNAのある時点の割合だけでなく，経時的に変異mtDNAの量的変化が何らかの要因によって惹起され，その結果，ある特定の臓器に際だって異常が出現する可能性が示唆された．

献1）Goto Y，Horai S，Matsuoka T，et al：
Mitochondrial myopathy，enCephalopathy，
lactic acidosis，and stroke−like episodes（MELAS）；aCOrrelativestudyoftheclinicalfeatures and mitochondrial DNA mutation．
Neurology42：545，1992．
2）HattoriK，Tanaka M，Sugiyama S，et al：Age−dependentincreaseindeletedmitochon−
drial DNA

inthe human heart；pOSSible

COntributory factorpresbycardia．AmHeartJ121：1735，1991．

3）西澤正豊，吉田充男，太田成男ほか：MELASにおける点変異ミトコンドリアDNAの変動．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト
ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木址）平成3年度研究報告書，
1992，p252．

4）DiMauro S，NichoIsonJF，HaysAP，etal：−246−

Benigninfantilemitochondrialmyopathydue
to reversible cytochrome c oxidase defi・

Ciency．Ann Neuro114：226，1983．

52）多数の老人斑を伴うミトコンドリア脳筋症
剖検脳の解析
＊

β
只

清

井

垂

■

＊

堂原

＊

階柳

＊

＊

聡郎

＊

＊

史

三砂子＊＊
武 彦＊＊

＊

＊

＊

MELASは脳卒中様発作を特徴とするミトコ
ンドリア脳筋症であり，ミトコンドリアDNA（mtDNA）上のtRNA遺伝子に特定の点突然変異が兄いだされている1）．主要な中枢神経症状である卒中様発作に加え，精神症状，知能退行などがしばしば観察されるが，脳病理所見には脳血管でのミトコンドリア異常以外の特徴的な病変は少ない2〉3）．本研究では，典型的MELAS症例の母親であり，経過中に分裂病棟精神症状がみられ53歳で死亡した症例の剖検脳において多数の老人斑を兄いだし，その神経病理学的，分子遺伝学的解析
を行った．
対

野藤

上依

＊

＊

久俊治

文晴幸

我村

曽藤乾

研究協力者

泌機能検査結果から汎下垂体機能不全の存在が疑われた．Brain CT，MRIでは異常所見なし．上腕二頭筋生検標本のModifiedGomoritrichrome
染色では明らかなRaggedredfibersは認められず，筋内小血管がSDH染色で濃染するいわゆる
SSVはなかった．本症例と娘2人は生検筋，白血球においてmtDNA上のtRNALeu（UUR〉遺伝子点
突然変異の存在が確認されている4）．また染色体分析結果は46ⅩⅩでありDown症候群は否定された．
剖検所見：脳重量約1000g，全般的な軽度の萎縮
以外には肉眼的所見に異常は認められない．割面
でも梗塞様軟化巣などの粗大病変は見られない．
病理組織所見では大脳皮質および海馬，海馬傍回象

症例：死亡時53歳女性．卒中様発作，けいれん発作の既往なし．家族歴では娘2人のうち妹は卒中様発作，けいれん発作を有する典型的MELAS症
例，姉は精神発達遅延，難聴あり．51歳時より食思不振，無気力状態．53歳時，嘔気，嘔吐，尿閉，
意識障害にて入院．意識障害改善するも分裂病様
精神症状が出現し，約6ケ月後急死した．入院時，血中筋原性酵素高値，低ナトリウム血症が認められた．血中乳酸，ピルビン酸は正常範囲であったが髄液中乳酸，ピルビン酸は高値であった．内分
図1海馬支脚部のBielschowsky染色．多数の老人斑（Primitiveplaques）が認められる．

＊国家公務員等共済組合連合会大手前病院＊＊大阪大学医学部神経内科＊＊＊大阪大学医学部小児科−247−

に多数の老人斑が認められた（図1）．神経原線維
変化はほとんど見られず，神経細胞の脱落も明ら
かではなかった．
新鮮凍結脳組織の一部においてSDH染色，ードするAPP遺伝子エクソン17の塩基配列を決Cytochrome c oxidase（CCO）染色を施したが脈絡叢上皮細胞にSDH強陽性を認めた以外，いわゆるSSVはなく，皮質神経細胞のCCO染色ではfocal deficiencyは認めなかった．

神経病理学的解析：前頭葉皮質の抗β蛋白抗体
免疫染色では老人斑と一致する斑状の免疫染色陽性像が得られた（図2）．多数のDiffuseplaques

方法

神経病理学的解析：抗β蛋白抗体を用いて前頭葉皮質における老人斑の免疫染色を行った．次に，
症例剖検脳各部位での老人斑，神経原線維変化の出現頻度をBielschowsky染色標本で検討した．
老人斑についてはDiffuse plaques，Primitiveplaquesに分けて計測した．
分子遺伝学的解析：剖検時，脳の一部を急速凍結
LDNA分析に供した．すでに乾らによ り

定した．
結

果

およびAmyloid coreと変性Neuriteを有する
plaquesが混在して存在していた．老人斑は大脳皮質の全域に存在したが前頭葉，側頭葉に最も多数認められた．海馬，海馬傍回にも中等度の老人斑が認められたが，線条体，視床，小脳皮質には少なく，Meynert基底核にはほとんど見られなかった．神経原線維変化は海馬に極小数認められた以外は検出されなかった（表1）．

tRNALeu（UUR憶突然変異を有するmtDNAが生検筋で82％，白血球で10％存在することが報告されている4〉ため，ここでは神経組織の各部位（前頭葉皮質，被殻，淡蒼球，後根神経節）における変異mtDNAの比率を検討した．抽出精製した絵DNAを制限酵素ApaIで消化後，Southernblot
解析を行い，変異mtDNAの比率は出現したバンドのradioactivityを測定して算出した．
次に最近AIzheimer型痴呆19例中10例の脳

図2

mtDNAでNADH dehydrogenase subunit2（ND2）のコドン331に点突然変異が検出され，アラニンがセリンあるいはスレオニンに置換され−＋Strlotum︻

Plm洲叩OCamPd
GYrUa

一

0edpitd
HippoCamPua

T引1gles一

Tl川叩旧柑I
Pariot81

Neurofib州arY

一

Frontd＋＋−一＋＋

CoItOX

Primitive＋

るAPP遺伝子の変異はコドン717のバリン，コド
ン713のアラ二ン，コドン693のグルタミン酸の置換をもたらすものである6）．そこでこの領域をコ

Senile Plaques＊D椚us8

十 十＋＋＋
十＋＋＋さらに本症例には多数の抗β蛋白抗体染色
陽性amyloid plaquesが存在することからβamyloid precursor protein（APP）遺伝子の突然変異の有無を検討した．これまで報告されてい表1剖検脳各部位での老人斑，神経原線維変化の出現頻度十十ていたとの報告がなされている5）ため本症例のND2遺伝子の塩基配列を決定し，変異の有無を検討した．AIzheimer型痴呆3例の剖検脳のND2遺伝子についても同様に検索した．

前頭葉皮質の抗β蛋白抗体免疫染色．老人喪Eと一致する斑状の免疫染色陽性像が存在している．

十BasaI NudouS
OI MoYnOrt
ThalもmuS＋

Ct汀bt州ar Cort8X

＋

＊−；0

＋；1−7．

−248−

十＋十；8〜／×200．1Fie−d考

察

MELASに特徴的なmtDNA変異を有する成人MELAS剖検例において大脳皮質に多数の老人斑を兄いだした初めての報告である．これまでのMELAS剖検脳の報告では大脳皮質における梗塞様所見が主要なものとされており，老人斑を伴ったという報告はない．これは本例がこれまで

図3

前頭葉皮質から抽出したmtDNAのApaI消化後Southernblotオートラジ
オグラフィー像

表2

神経組織の各部位における変異mtDNAの比率報告されているMELAS症例の剖検例のうち最も高齢であることによる可能性が考えられる．一般にAIzheimer型痴呆の病理学的特徴として海馬，海馬傍回，側頭頭頂領域に特に多数の老人斑，
神経原線維変化が出現することが知られている．
本症例では老人斑め分布がこれとは異なり，神経Mutated Mitochondriat DNA（％）senH〇円aqUeS

0
8

Globus Pallidus

6
8

PutamOn

9
8

Frontal Cortox

35

Dorsal R00t Gangtion

分子遺伝学的解析：本症例ではtRNALeu（UUR）点突然変異が存在するため，3kbのバンドに加えて
1．2kb，1．8kbの新たなバンドが見られる（図3）．
これらのバンドのradioactivityから算定された前頭葉皮質，被殻，淡蒼球，後根神経節における変異mtDNAの比率は，それぞれ89，86，80，53％であった（表2）．中枢神経系では筋とほぼ同程度の変異mtDNA比率であったが，この中では多数の老人斑が存在していた前頭葉皮質で最も高比率であった．
ND2遺伝子の塩基配列を決定した結果，本症例のコドン331はアラニンであり既知の変異は検出されなかった．同時に検索したAIzheimer型痴
呆3例の剖検脳mtDNAにおいても変異は検出されなかった．
APP遺伝子エクソン17にも塩基置換は検出さ

原線推変化をほとんど伴わないことから現時点ではAIzheimer型痴呆の合併とは考えにくい．また，最も多数の老人斑が出現していた前頭葉大脳皮質ではmtDNAの89％にtRNALeu（UUR）変異が存在しており，AIzheimer型痴呆で報告されているND2遺伝子，APP遺伝子の変異は検出されなかった．神経病理学的，分子遺伝学的分析，染色体分析から現時点ではAIzheimer型痴呆の合併とはいいがたく，Down症候群の合併も否定されたことから，ミトコンドリア遺伝子異常と老人斑生成との関連が示唆された．
謝辞：抗β蛋白抗体を御供与していただきました東京大学応用微生物研究帝石浦章一先生，AIz−heimer型痴呆剖検脳を検索させていただきました大阪大学精神科武田雅俊先生に深謝します．
文献1）GotoV，NonakaIandHoraiS：Amutationin the transfer RNALeu（UUR）gene associatedwith MELAS subgruop of mitochondrial
encephalomyopathies．Nature348二651−653，

1990．

2）Ohama E，Ohara S，Tanaka K，et al：

れず，APP遺伝子には既知の変異は存在していな
かった．

Mitochondrial ang10pathyin cerebralblood
VeSSelsofmitochondrialencephalomyopathy．
ActaNeuropathol（Berl）74：226−233，1987．
3）Goto Y，Horai S，Matsuoka T，et al：−249一Mitochondrial myopathy，enCephalopathy，Detectionofpointmutationsincodon3310f

lactic acidosis，and strokelike episodes

mitochondrialNADHdehydrogenasesubunit（MELAS）．Neurology42：545−550，1992．

2inAIzheimer

4）1nuiK，Fukushima H，Tsukamoto H，et al：
Mitochondrialencephalomyopathieswiththesbrains．BiochemBiophysRes

Commun182：238−246，1992．
6）Kosik

KS：AIzheimersdesease；aCellmutation of the mitochondrial tRNALeu（UUR）

biologicalperspective．Science256：780−783，

gene．J Pediatr120：62−66，1992．

1992．

5）Lin

F，Lin R，Wisniewski HM，et al：ー250−53）ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア
tRNA遺伝子の変異

研究協力者

服

部

優

宝

釆

子＊＊

水

聴＊

野

美

邦＊＊

後

藤

雄

一＊＊＊

作 田 亮 一＊＊＊埜 中 征 哉＊＊＊

は じめに

1

ミトコンドリア脳筋症に関しては，1990年以来，
MELASにおけるtRNALeu（UUR）上の2種類の点突然変異（塩基番号3，243及び3，271），MERRFにおけるtRNALys（塩基番号8，344）の変異が，相次いで我々の研究グループより報告された1ト3）．さらに他のグループから，他のミトコンドリア脳筋症や欠夫のないCPEOにおいてもいくつかのミ

汀

m

Ⅳ

図1

トコンドリアtRNA上の点変異が報告された4）．
しかし，同じ臨床型を呈しながら変異が同定されない症例が存在したり，複数の臨床型に共通の変異が存在するなど，ミトコンドリアDNA変異と表

全tRNA領域の塩基配列を決定する研究を継続してきた．今回，複合体Ⅰ欠損を伴う分類不能なミトコンドリアミオパテー1家系，及び欠夫をもたないCPEO9例においてミト コンドリア
tRNAの全領域を決定し，新たな点変異を検出したので報告する．

事国立遺伝学研究所＊＊順天堂大学医学部脳神経内科＊■＊国立精神・神経センター神経研究所

Mitochondrial tRNA mutations

N ueはOt事
dopos仙）n N 0．

疾患の関連については未だ不明な点が多い．我々はこれらの疾患においてミトコンドリアDNAの対象及び方法分析に用いた複合体Ⅰ欠損の家系を図1に示す．
多くのミトコンドリアミオバナーが中枢神経を含め複数の臓器に異常を認めるのに対し，この家系の患者はミオバナーと複合体Ⅰ欠損のみを里した．

校合体Ⅰ欠損を呈するミトコンドリア脳筋症患者の家系図．
■●＝臨床症状あり ○＝臨床症状なし

G eno a rd l衿SM On

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胴N Am rH p all

1／
9

4／
60

A．
C．
虞em

複合体Ⅰの欠損はいくつかの異なる臨床型を呈することが報告され MELASに特に高率にみられるが，この家系ではMELASの多くに検出される
nt3243の点変異をもたず臨床的分類が困難であった．今回調べ得た家系内7人のうち，2人が筋力低下と易疲労性，3人が易疲労性のみを示したが，残りの2人には筋症状はなかった．さらに発端者には繰り返し起こる突然の呼吸不全がみられた．

−251−

図2 患者および正常人におけるミトコンドリアtRNALeu（UUR）遺伝子近傍の塩基配列．
＊はMELASに主要に兄いだされる変異（nt3，243）を示す．

この家系の発端者を含む3人の生検筋と7人の家発端者の筋DNAを用いて，ミトコンドリア全

MutantWlld−tyP●族の血液よりDNAを抽出し，最も重症であった

包．250

3．250
1

1

…0人CGQQTA…

・・・QACGOQCA・…

…CTQQCCAT…・・・・CTQQCCOT…

tRNA領域の塩基配列を決定した．
CPEOの解析にはすでにサザンプロット法にPCR■nP肘l引州OnWlth■鵬■m●t鵬PrlM●rて欠夫のないことを確認した9例のCPEO［CPEO（−）］の生検筋より得られたDNAを用い，ミトコンドリア全tRNA領域の塩基配列を決

3．248

8．240

1

I

5㌧…CTQQC￠−3■i
与一一…ccQQC6−3一〇〇m○○OqUOnC●
鵬●mat￠hprlMOr（80−m●r）

定した．症例の臨床及び生化学データは，表に示した．CPEOは，約70％の症例にミトコンドリア
DNAの大欠尖が報告されてきたが，欠矢のない●▼・・●OQGCQQT▲＝・・・○○￠GOQ￠▲・・・・・・
060OGGAT…

eeQQC￠OT…
GGqqGGqT●‥

CPEO患者も臨床的には相違がないとされてお

N■
●l劇○
●
●
uOn

り，我々の症例もそうである．
塩基配列の決定は，仝tRNAを含む領域を11対のプライマーをもちいて非対称PCR法にて増幅

匝
・
・
・
QQ￠
￠
・
・
・
￠
CQO

後，サンガ一法にて行なった．
結果及び考察複合体Ⅰ欠損の家系での検討
発端者のミトコンドリアDNAの仝tRNA領域の塩基配列を決定した結果，ミトコンドリア
tRNALeu（UUR）遺伝子の塩基番号nt3，250にTからCへの変異がみられた（図2）．この塩基はtRNA
ー252−

nO●
d
unO ■

図3

‥
‥
‥

l

t一
〇
lrtqm●
nt■

ミスマッチプライマーを用いたPCR法
によるtRNALeu（UL R）上の3，250における変異の検出法．

と表現型およびミトコンドリア転写終結過程との関係に関して，なんらかの示唆を与えているのかも知れない．しかし，3，250変異は今のところ1家系にしかみられないので，真に疾患特異的変異かどうかは今後の検討が必要である．
CPEOでの検討
図4

PCR法によるNaeI消化産物の電気泳動パターン．
上のバンドが元のPCR産物（199bp）
で，下のバンドがNaeI消化断片（177bp）である．B，Mはそれぞれ血液あるいは筋肉より調整したDNAを示す．

解析したCPEO（−）9例のうち6例で，1箇所あるいは2箇所のそれぞれ異なる塩基置換を計6箇所検出した．これらはすべてトランジション型
変異であった［tRNAC）n（塩基番号4，343，TからC），tRNAGln（4，386，TからC），tRNAAla（5，601，のDHUループに位置しており，ヒト，ウシ，ラットではT残基だがマウスでA，トリ，カエルでは
Cと生物進化の過程で，すべての分類群では必ずしも保有されていない箇所であった．しかし，ヒト上科（チンパンジー，ゴリラ，オランウータン）
では完全に保有されていた．さらにこの塩基の変異を簡単に診断できるようミスマッチプライマーを作製し，増幅したPCR産物をNaeIで消化した（図3）．つまり，nt3，250の変異が存在すると177
bpと22bpの2つの断片に切断される．この結果，調べた3人の筋及び7人の血液mtDNAにおいて，この変異はすべてへテロプラスミーで存在していた（図4）．更に正常人50人と他のミトコンド
リアミオバナー58人（MELAS40，MERRF6，
CPEO12）でこの変異の有無を検討したが，1例にも観察されなかった．このことから，3，250変異
がこの家系において疾患と開通している可能性が高いと思われた5）．
この新たな点変異nt3，250は，MELAS患者の80％にみられる点変異nt3，243と同様tRNAl−eu（UUR）

GからA），tRNAArg（10，410，TからC），
tRNALeu（CUN）（12，311，TからC），tRNAThr（15，927，GからA）］．nt4，386の変異が2人の患者に共通していた以外，他の5箇所の変異は1人ずつにしか認められなかった．またこれまでに，
CPEO（−）で既に報告されたtRNA上の変異（nt3，243，10，006，12，246）はいずれも観察されな
かった1）4）．次に検出された6箇所の塩基置換について制限酵素を用いたDNA診断を，60人から90人の正常人で施行した．これらの変異が制限酵素
認識部位とならないときには，ミスマッチプライ
マーを用いて，新たな制限酵素部位を作成した．
その結果，nt12，311の変異を除く5箇所の変異は正常人にも観察され，ホモプラスミーで存在したのでこれらの塩基置換は疾患の発症とは関連しな
い，遺伝的多型であると考えられた（表）．残る
nt12，311の変異のみは90人の正常人に認められず疾患と関連する可能性が残される．しかしCPEOの1例のみにしか検出できなかったので，疾患特異的変異であるかどうかの判断には今後症例の蓄積による検討が必要である．

遺伝子のDHUループに位置する．生物進化の過程で必ずしも保有されていないため，tRNAの構造に直接与える影響は不明だが，この変異はMELASの主要な変異であるnt3，243と同様，転写終結因子の結合ドメインの中にあるためにミトコンドリア転写終結に障害を与えると考えられ
る6）7）．この様にnt3，250変異とnt3，243が結果的に同様の生物学的影響をもつとすると，遺伝子異常

ミトコンドリア異常症における疾患特異的DNA
変異に関する基準
ミトコンドリアDNAには正常人集団に存在する多くの遺伝的多型が知られており，ある塩基置
換が疾患特異的であると推定するには次の様な条件を満たしていることが必要である．すなわち（1）DNA変異は，同一の病型を示す複数の独立な−253−

家系由来の患者に共通に兄いだされ，多数の正常

2）Goto Y，NonakaI and Horai S：A new

対照中に同じ変異が観察されないこと，（2にの変mtDNA mutation associated with mitochon−

異は，生物進化の過程で種の違いをこえて保有さ

drial myopathy，enCephalopathy，lactic

れている塩基部位あるいは重篤なアミノ酸置換をacidosis and stroke−like episodes（MELAS），

引き起こす部位で生じていること，（3）この変異は，Biochimica et Biophysica ActalO97：238−

患者自身を含めて少なくとも数人の家族メンバー

240，1991．

で，ヘテロプラスミーとして存在することなどで

3）Yoneda M，Tanno Y，HoraiS，Ozawa T，ある．今回調べた9例のCPEO（−）においても，

Miyatake T and Tsuji S：A common

ミトコンドリアtRNA上にいくつかの塩基置換

mitochondrial DNA mutationin tRNALys ofが観察されたが，このような条件をすべて満たす

patientwith myoclonus epilepsy associated疾患特異的な点変異は存在しなかった．欠失のな

withragged−redfibers．BiochemInt21：789

いCPEO患者とミトコンドリアDNA異常の関−796，1990．

連を明らかにするには，さらに他のタンパク質を4）LauberL，MarsacC，KadenbachBandSeibel

コードする遺伝子の解析も必要だろう．

P：Mutationin mitochondrialtRNA genes；a frequent cause of neuromuscular disease．

結語

NucI Acids Res19：1393−1397，1991．

ミトコンドリアtRNA上には，予想していたよ5）Goto Y，Tojo M，TohyamaJ，HoraiS andり多くの正常人に存在する遺伝的多型と思われる

NonakaI：A novel point mutationinthe

変異が存在する．よって，これらの点変異が，あmitochondrialtRNALeu（UUR）geneina fami1yる疾患に特異的なものであるか否かの判断は，非Withmitochondrial myopathy．Ann Neuro1

常に困難な場合が多く，特に1家系あるいは1症

31（6）：672−675，1992．

例にしか検出できないような点変異は注意を要す

6）HessJF，ParisiMA，BannettJLandClayton

る．今回我々の検出した点変異も，この点では，DA：Impairmentofmitochondrialtranscrip・疾患との関連が未だ希薄である．さらに最近，すtionterminationbyapointmutationassociat−

でに疾患特異的であろうと報告された点変異が，ed with the MELAS subgroup ofmitochon−

後に正常人でもみられる多型だと訂正される例がdrialencephalomyopathies．Nature351：236

ある．このような誤りを防ぐには，その点変異が−239，1991．

充分な数の正常人に存在しないということを最初

7）Kruse B，Narasimhan N

and Attardi G：に検討しておくことが必要である．また近縁の種

Termination of transcriptionin human

で保有されているかどうかの検討も充分行われる

mitochondria：identificationandpurification

べきであり，我々が継続してきた近縁種でのミト

Of a DNA binding protein factor that

コンドリア塩基配列決定のデータは，この意味で，promotes termination．Cel158：391−397，

究めて重要であると考えられる．

1989．

8）HoraiS，Satta Y，Hayasaka K，Kondo R，

文

献

InoueT，IshidaT，HayashiSandTakahata

1）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation

N：Man

s

placeinhominoidea

revealed

byinthetRNALeu（UUR）geneassociatedwiththe

mitochondrial DNA genealogy．J MoI Evo1

MELAS subgroup of mitochondrial ence−

35：32−43，1992．

phalomyopathies．Nature348：651L653，1990．

−254−54）ミトコンドリア異常症の病態解析
桃 井 真里子＊
研究協力者

伊

東

茂

子＊

松

Pearsonmarrowpancreas症候群（以下Pear−
SOn症候群と略）は，新生児期発症の鉄芽球性貧血，汎血球減少症，肝機能障害，膵外分泌不全，を主とする重症の疾患であり1），高乳酸血症の合併などから，ミトコンドリア機能障害が想定されていたが，1989年に ミト コンドリ アDNA
（mtDNA）に欠夫が報告されて以来，ミトコンド
リア異常症の1病型としてCPEOとの関連が注目される疾患である．

井

美

華＊

小

池

通

夫＊＊

処理後，サザン解析に使用した．ハイプリグイゼ
ーションプローブとしてdAAAGACGTTAGGT−CAAGGTGAG，塩基番号1317〜1339を合成し，5端を［γ32］ATPで標識し，泳動後，Fijix

Bioimaging Analyzer（BAS2000）にて定量した．
欠矢の両端近傍の塩基配列は，PCR増幅フラグ
メントを非対称PCRにて1本鎖DNAフラグメ
ントを増幅し，Fluolescent dye dideoxy nu−
Cleotide terminator法にて塩基配列を決定した．

報告されたmtDNAの欠夫は種々の領域，サイズであり，CPEOで報告されているhotspotを共有する点から，mtDNA欠夫と病型との関連が興味ある点である．また，R6tigらは，9例のPear−

1

2

3

4

SOn症候群のすべてにmtDNAの欠失近傍に
directrepeatsequencesが存在したと報告し，欠失発生の機序をdirect repeat sequencesの塩基配列からhomologousrecombinationなどの機序を推定した2）．本研究ではdirectrepeatsequences
を認めなかった欠夫を有したPearson症候群の1例の遺伝子解析の結果を報告する．

図1

Heteroplasmic deletionsin mt
genomesin theliverand skeletal

muscle．Afterthedigestionofthetotal

方法

新生児期に重症の鉄芽球性貧血，汎血球減少症，肝機能障害，腎尿細管性アシドーシス，高乳酸血症，糖尿病を発症し，生後26か月で代謝性アシドーシスの進行により死亡した男児の凍結剖検組織（−80℃保存）をmtDNA解析に使用した．DNA
はProteinase Kにて処理後分取し，PvuIIにて

DNA sample with PvuII，Samples
Were electrophoresed on a O．8％
agarosegelandhybridizedwiththe32P−labeled probe，andthe bands were
Visualized by autoradiography．The
liver（1anel）andmuscle（lane2）of
thepatientshowedheteroplasmyofthe
mtgenomeswithwildtypegenomesof
16．5kdanddeletedgenomesof9．2kb．
Controlmuscles（lanes3and4）were
homoplasmiC＊自治医科大学小児科＊＊和歌山医科大学小児科

genbmes．

−255−

with

wildtype mt結すように，肝の変異mtDNAは全体の84．5％であり，筋では82．1％であった．欠失部位は，図2に果患者の肝，骨格筋からは，16．4kbの正常mtDNAと，9．2kbの変異mtDNAが検出された．欠失のサイズは7．3kbと考えられた．図1に示示すように，CPEOで報告されているhotspot領域を含み，D−loopを含まない領域であった．塩基配列決定により，欠矢は7374bpであり，図3に示すようにdirectrepeatsequenceはみられなかった．欠失両端よりそれぞれ20bpの範囲ではim−precisedirectrepeatも存在しなかった．欠矢は
塩基番号8582−15957か，8583−15958と考えられた．
考察
Pearson症候群にmtDNAの欠矢が報告されて以来，ミトコンドリア異常症の1病型として，

図2

CPEOとの関連が注目される．新生児期発症，重症の血液学的障害，肝機能障害，膵外分泌不全，を主痘痕としてほとんどは致死的であるこの疾患と，外眼筋麻痺を主症候とし多くは年長時期移行の発症であるCPEOとは，報告されたmtDNAの欠失範囲に関しては全く同様であり，臨床病型の違いの由来は不明である．Pearson症候群において報告されている欠矢とCPEOにおける欠矢

Localizationofthedeletioninthecase
OfPearsonsyndrome．Deletedreg10nis
Shown by an arrow．Abbreviationsin
thefigureare：NDl，ND2，ND3，ND4L，
ND4，ND5，ND6：Subunitsl，2，3，4L，
4，5，60fthe NADH dehydrogenase，
respectively；COI，COII，COIII：
SubunitsI，II，IlI of the cytochromeC OXidase，reSpeCtively；ATPase 6，
ATPase 8：Subunits 6 and 8 0f
ATPase，reSpeCtively；Cytb，CytO・
Chromeb；OH，OL：replicationorigins
Ofheavyandlightstrands，reSpeCtive−

はhotspotを共有し，両者に何らかの差異を認めない3）．CPEOで報告されている欠夫の大きさは1．3kbから8．8kbにわたり，Pearson症候群での大きさは2．7−7．6kbである．我々の症例の欠矢は7．3kbである．報告されている症例と比較しても，欠矢の大きさと臨床症状は関連していない．
McShaneらの報告にみるような新生児期にPearson症候群で発症し，その後，年長時期にKSSを発症した症例の存在は，Pearson症候群とly．Single capitalletters represent
amino acids．

8583

5

TAGGCCTACCCGC

Deletion
GTACTGATCA

7374bp ブ†5958
TCCAAGGACAAAT

」

8582

C

AGAGAAAAAGTCT

3

1

DeLetion

7374

一→ 15957

bp

ATP6

図3

CharacterizationofthenucleotidesequencesattheboundariesofthemtDNAdeletions
in

the

case

of

Pearsonsyndrome．Thesequences

are

of

L−Strand，reading5

common single nucleotide sequence，C，Of either end should be conserved．
−256−

to3

．A

CPEOが強く関連する病型であることを示唆し，その臨床病型の差は，年齢と各組織の変異
mtDNA量が重要な因子であることを示唆していsequencesの存在が関与している可能性も考えら
れる．
文

る4）．

献

mtDNAが欠夫を生じる機構に関しては，

1）PearsonHA，LobelJS，KocoshisSA，etal：

R8tigらは検索したすべてのPearson症候群のAnewsyndromeofrefractorysideroblastic

欠失近傍領域にdirectrepeatsequenceが存在しanemiawithvacuolation ofmarrowprecur−

たとし，そのrepeatの塩基配列がcleaving sig−

sers and exocrine pancreatic dysfunction．J

nalの結合部位の配列と近似性を認めることから，

Pediatr95：976−984，1979．

mtDNAのmiscleavage，homologous recom−
binationが欠失生成の機構と考えられると推定

2）Rotig A，Cormier V，Koll F，et al：Site−

した．我々の症例は典型的なPearson症候群であgenomein the Pearson marrow−panCreaSり，欠夫の部位も従来報告のある部位を含むものであったが，directrepeatsequenceは存在せず，
flanking regionのCのみが共通であった．Mita
らは，CPEOの29％に繰り返し配列を認めないが，そのような症例ではsmallinverted repeats
や，imprecise repeatsが検出されると報告したが5），本例では両端20bpの範囲ではそれらも存在しなかった．本例の欠矢の3，端はtRNA−prOline
遺伝子内であり，3，端の4bp上流はtRNA−
threonine遺伝子があり，directrepeatsequencesを有しない欠夫の生成にはtransfer RNA

specific deletions of the mitochondrial

Syndrome．GenomicslO：502−504，1991．
3）Rotig A，Cormier V，Blanche S，et al：
Pearson，s marrow−panCreaS Syndrome．A
multisystem

mitochondrial disorderin

infancy．J ClinInvest86：1601−1608，1990．
4）McShaneMA，HammansSR，SweeneyM，et−257−

al：Pearson syndrome and mitochondrial
encephalomyopathyin a patient with adeletionofmtDNA．AmJNumGenet48：39−42；1991．

55）ミトコンドリアDNAの導入法の開発
太 田 成 男＊
研究協力者

猪

原

直

弘＊

林

純

は じめに

一＊■

方法と原理

正常遺伝子や変異遺伝子の機能を明らかにするには，マウスなどの個体や培養細胞へ目的の遺伝子を導入することが有力な方法である．遺伝子の導入法には多くの方法が開発され，遺伝子の機能が細胞レベル，あるいは個体レベルで研究されてきた．しかし，それは哺乳類細胞では核遺伝子に限られ，ミトコンドリアDNA（mtDNA）を哺乳類細胞に導入する方法は開発されていない．今後のミトコンドリア脳筋症の研究にはmtDNAの導入法の開発が必須であり，mtDNAを自由に導入することにより，以下のことが可能になると期待される．
① 患者のmtDNAに塩基置換が発見されても個人差なのか，あるいは機能低下を引き起こす病
因の変異かは現在は容易に判定できない．変異
mtDNAを導入することによって機能低下を引き起こすか否かを判定できるようになる．
② 配列の異なる複数のmtDNAを導入してそれらの増減などの挙動を知ることが可能になる．
例えば，変異mtDNAの数を増加させる塩基配列を系統的に決定することが可能になる．
③ さらに発展させてモデル動物を作製することが可能になる．
④ 将来的には正常mtDNAを導入することによって，遺伝子治療への道も開ける可能性も対象となりうる．

そこで，ヒトmtDNAを培養細胞に導入する方法の開発を試みた．

（D 細胞の選択
HeLa細胞由来のmtDNAを全く持たない細胞EB8はグルコースを含む培養液でのみ生育す
る1）．それは，グルコースなしでは解糖系でもATPを合成できなくなるからである．そこで，EB
8にmtDNAを導入した時，EB8がグルコースなしの培養液でも生育できるようになれば，酸化的リン酸化能の回復を指標に細胞を選択することができる．図1にその原理を図示した．
（a mtDNAの打ち込み
ミトコンドリアにmtDNAを導入するには細胞質膜，ミトコンドリア外股，内股を通過させる必要がある．そこで，金属粒子にmtDNAを付着させ，Heガスの圧力を利用して金属粒子を打ち込んだ．従来の装置は火薬の爆発によるもので，打ち込むスピードを制御することが困雉であったが，Heガスの圧力を利用するとガス圧を制御することが可能である．
mtDNAは胎盤から精製し，CaCl2とスペルミ
ン存在下で直径1／Jmのタングステン粒子に付着させた．その後，BioRadのParticle Delivery
Systemを用いて，mtDNAを打ち込んだ．
③ 培養液
グルコースを含む培地としてはHamF12にウ
シ胎児血清10％を加えて使用した．グルコースを含まない培地としてはDM170（極東化学）にウシ
胎児血清を加えて使用した．DM170はガラクトー
スとどルビン酸を含む．

■自治医科大学第一生化学＊＊埼玉がんセンター研究所生化学−258−

HeLacelllackingmtDNA工、、了tungustencoatedwithmtDNA
●

●

●

●

＼

謹：
二
．
主
．
淑
錨

く

祀

て∴十、＿「＼図1

mtDNA導入法の原理
mtDNAを付着させた金属粒子をmtDNAを持たない細胞に打ち込む．極一部の粒子だけがミトコンドリア内に入り込み，複製される．酸化リン酸化が回復するとグルコースなしの培地でも生育可能になるが，他の細胞は死滅する．

結果と考察方法にしたがってmtDNAがない細胞EB8にmtDNAを打ち込んだ後，一週間，HamF12培
地で培養した後，DM170で16時間培養し，その後90％DM170，10％HamF12の培養液で培養した．
大部分のEB8は16時間DM170処理しただけで，死滅した．2週間すると明らかに増殖してくる細胞が認められた．図2にDM170，90％培養液で増殖してきた細胞を示す．図3にはmtDNAを打ち込んだHeガスの圧力と増殖してきた細胞の数の関係を示す．このように増殖してきた細胞は明らかにmtDNAを打ち込む条件に依存した．また，
mtDNAを付着させないタングステン粒子を打ち込んだ場合は生育してきた細胞は認められなかっ

−259−

図2

mtDNAを導入したのち，DM170
HamF12＝90：10で生育してきた細胞．

図5

500

1000

1500

2000

PresSure formicroprojectiLe（PSi）
図3

mtDNAを導入したHeガスの圧力とDM170：FamF12＝90：10培地で増殖してきた細胞の割合．特定のスピードで
mtDNAを打ち込んだ時だけ，酸化リン酸化が回復していることがわかる．

mtDNAを導入した細胞のミトコンドリ
ア内タンパク質合成．エメテン存在下でアイソトープラベルメチオニンを取り込ませ，ミトコンドリア画分をSDS−
PAGEでタンパク質を分画した．右図は6M尿素を含むゲル，左は尿素を含まないゲルを用いた．→で示すようにHeLa細胞では尿素を含まないゲルでは複合体Ⅰのサブユニット3の移動度が異なる．
mtDNA導入株ではHeLa細胞のそれと移動度が異なるので，HeLa細胞由来のmtDNAが増加したのではないことが明らかである．HeLaCotはEB8の親株．TransformantはmtDNAを打ち込
んだ細胞．CybridはEB8に細胞質を融合させた細胞．

た．従って，mtDNAを付着させたタングステン粒
子を打ち込むことによって酸化的リン酸化の回復
した細胞が出現した．その割合は，おおよそ10，000
細胞に1細胞の割合であった．

DM170，90％培養液で増殖してきた細胞では明らかにミトコンド1）ア画分にmtDNAが検出されさらに，mtDNAがミトコンドリア内に入り込

コンドリア画分にmtDNAが検出されたが，外来

み，複製していることを確認するために，ミトコ
ンドリアを分画した．ショ糖蜜度勾配遠心によっ

EB8由来のmtDNAではないことを確かめた．

た．
このように，酸化的リン酸化能が回復し，ミトのmtDNAが導入されたことを確認するために，て，ミトコンドリア画分を得て，ドットプロット
にてmtDNAの存在を確認した．図4に示すよう

EB8はHeLa細胞由来でありHeLa細胞のミトにEB8ではmtDNAでハイプリグイズする画

アミノ酸が異なっているためにSDS−PAGEによ

分は認められなかったがmtDNAを打ち込み，って容易に区別できる．HeLa細胞質タンパク質

コンドリアは呼吸鎖複合体Ⅰのサブユニット3の−260−

印のように，HeLa細胞の複合体Ⅰサブユニット
3は，6M尿素を含むSDS−PAGEでは移動度が変わらず，尿素を含まないSDS−PAGEでは明らかに移動度が変化した．しかし，mtDNAを導入した細胞では明らかにHeLa細胞とはその挙動を釦￠叩きe伽〃β秒伽鵬〃f
mtDNADotBlotHybridization

卜 ●●響●●●●●● Trans−。rmant
繍番場議場錮鱒砂確 ・（下）mtDNA・le＄＄EB8

図4

mtDNAを導入した細胞のミトコンドリ
アの分画とmtDNAのドットプロット．
上はmtDNAを導入した細胞のミトコ
ンドリアをスークロース密度勾配遠心分離法で分画し，各分画の一部をアルカリ変性させ，ナイロン膜に結合させ，
mtDNAでハイプリグイズした．下の図はEB8でmtDNAとはハイプリグイ
ズしない．

異にした．したがって，外来のmtDNAが導入されたことを示している．
今後は，大腸菌で増えるプラスミドにmtDNAを組み込み，部位特異的変異を組み入れたDNAを導入し，酸化的リン酸化を低下させる塩基置換を系統的に探索する予定である．
文

献1）HayashiJ−I，Ohta S，Kikuchi A，et al：

合成阻害剤であるエメチン存在下でアイソトープ

Ⅰntroductionofdisease−relatedmitochondrial

ラベルメチオニンを取り込ませ，ミトコンドリア

DNA deletionsinto HeLa cellslacking

分画をSDS−PAGEにてタンパク質を分赦して，

mitochondrialDNAresultsinmitochondrial

mtDNAにコードされるタンパク質の合成を調べ

dysfunCtion．Proc NatlAcad Sci USA88：

た．図5にオートラジオグラムの結果を示す．矢10614−10618，1991．

−261−

56）ミトコンドリア異常症の臨床型の広がり（2症例の呈示）
清 水 輝 夫＊
研究協力者

中 瀬 浩 史＊＊ 武 田 浩 一＊＊＊作 田ミトコンドリア・ミオバナーの臨床病型は

表

KSS，MERRF，MELASの三大病型がプロトタ

学＊＊＊＊3症例ミトコンドリア遺伝子異常の検索のまとめイプとして提示され，この特定された臨症病型にS outhom 3243 3 271 11丁78 8 別4 122 46 12308 8 993
b b 也r喝 A to G T to C G b A A to G C to A A to G T to G

対応する遺伝型（ミトコンドリア遺伝子異常）は一部の症例を除いては明らかになった．しかし一

症例 1
4 1才 女症 例 24 2才 男
症例 3
7 7才 男方同定された各々ミトコンドリア遺伝子変異をそれぞれ一つの遺伝型と考えたとき，それに対応する表現型は予想以上に様々な症状を示し，当初の＋三一i

単一の臨床病型（プロトタイプ）に単一のミトコ
ンドリア遺伝子異常が対応するとする想定は覆さ

ア異常症の臨床病型をもう一度遺伝子異常との関れてきている．このような遺伝型と表現型との関連での再整理が急務となっている．本研究では連は核遺伝子の異常においても問題となる点であ

我々の経験したミトコンドリア異常症の非典型例

るが，この場合には単一遺伝子の変異のありかた

2症例を呈示し，遺伝型と臨床病型との関係を論（欠矢や点突然変異の部位）と表現型との対応をさずるとともに，近年特に問題となっている加齢にぐる試みがなされ，なんらかの対応を得ることによるミトコンドリア遺伝子異常との区別からミト

しばしば成功している．しかしミトコンドリア・

ユンドリア異常症に入れるべきか否かが問題とな

ミオバナーの遺伝型と表現型との関係に関してはる遺伝型は明確ではない高齢者の症例を示す．なお，ミトコンドリアDNAの異常はルーチンで行

ミトコンドリア遺伝子上の同一の変異が異なった表現型と取り得ることが問題である．このことは次の三つのことを問いかけている．第一にはいわっているSouthern blottingによる欠矢の有無及び表に示した7ヶ所の点突然変異の有無を検索しゆるsomatic segregationのみでこの臨床症状のた．

多様性を説明し得るものであるのか，第二にはミ症

トコンドリア遺伝子上の他の塩基置換や核遺伝子のなんらかの異常が症状を修飾している可能性，第三にはいままでのミトコンドリア異常症と考えられていなかった症状を呈する症例がミトコンド
リア異常と関連することが知られ，ミトコンドリ＊帝京大学医学部神経内科＊＊東京大学医学部神経内科＊＊＊東京労災病院神経内科＊＊＊＊日赤医療センター神経内科例

症例1：41歳，女性，無職，短大卒．21歳頃より頭痛が時々あり，31歳頃より便秘傾向あり．38歳
より両側の耳鳴り・難聴を自覚，39歳一過性に尿閑となるが，自然寛解する．41歳，麻痺性イレウ
ス，低緊張性膀胱を主徽とし入院した．入院時所見として低身長（152cm），低体重（34kg），軽度の知能低下（WAIS VIQ60，PIQ62）・盛者性雉
聴を認めるが外眼筋麻痺・眼瞼下垂を欠き網膜色−262−

素変性症も認めなかった．ロ及び舌に不規則な不随意運動があり，四肢近位筋に4−4￣程度の筋力低下を認めるが明らかな筋萎縮はなく腱反射も正
常で病的反射はなく協同運動も正常であった．検査所見では乳酸アシドーシス（安静空腹時血中68．0mg／dl，髄液中58．2mg／dl）・髄液は蛋白・細胞数ともに正常，自律神経機能検査では起立性低血圧は認めないが低緊張性膀胱と発汗試験において右足背部の局所汗腺密度の低下（88／cm2；正常
対称206±40／cm2）を認めた．筋生検上RRFを全体の4．5％に認め，COX陰性線経も散在した．排腹神経生検所見では小径有髄線維減少を主体とした所見が得られた．生検筋のミトコンドリア遺伝
子の解析ではMELAS mutation（Anderson ＃3243のAからGへの変異）を認めた．
症例2：42歳，男性．27歳甲状腺機能低下症により頸部筋群（伸筋＞屈筋）の筋力低下・浮腫・易疲労性を認め治療により症状消失するがCK軽度

図1症例2の骨格筋CT像，傍脊柱筋群の著明な脂肪化を示す．

高値のみ持続した．33歳頃よりおじぎをする時など躯幹を前屈すると再び重力に抗して伸展することが不可能となった．41歳になり左上肢の筋力低下も生じ入院．入院時所見では傍脊柱筋群・上肢帯（左優位）の筋力低下を呈したがrigidspineは

葦こ〇二ヂ
図2

A：症例におけるMELASmutation（tRNA■一eu肌R）［Anderson＃3243のAからGへの変異］）
B：症例2におけるミトコンドリアDNAの欠失−263−

馳撃済濯蕾
図3 3症例の生検筋組織像
A：症例1の上腕二頭変筋生検像，RRFの存在を示す．
B：症例1の神経生検像，小径線維優位の脱落を示す．
C：症例2の三角筋生検像，細胞浸潤と変性した小径化線経を認める．
D：症例3の上腕二頭筋生検像，ring fibersの存在を示す．
E：筋構築の乱れを認める．（NADH染色）
F：COX陰性線経の増加を示す．

−264−

なく，体幹の前屈は可能であったが自力で重力に抗して持ち上げることは不可能であった．心筋障
害（心電図上心室性期外収縮・房主ブロック，心
エコー上心室壁の輝度の上昇）・蛋白尿（2gr／day）・甲状腺機能低下症（T4製剤投与により正常化，抗甲状腺抗体・抗マイクロゾーム抗体陽性）を認めた．骨格筋CTでは上肢帯筋群のほかほぼ全長にわたる傍脊柱筋群の著明な萎縮及び脂肪化が認められた．筋電図は筋原性変化が主体であるが，fibrillation・pOSitive sharp wave・
psudomyotoniaも認め炎症性筋疾患に近い所見であった．筋生検は前医において上腕二頭筋生検が行われているが初期病変として少数のRRFとともにNADH−TRにて濃染する小径化線経を認めたが，一方今回生検した三角筋では，初期病変のうえに筋線経の大小不同・中心核の増加が目立
ち，さらに一部に筋線経の壊死と血管周囲リンパ球浸潤を認める一方，COX陰性線維・RRFも認めた．三角筋のDNAの解析において約2kbの欠夫を伴ったミトコンドリア遺伝子を認めた．
参考症例：77歳男性，深部知覚障害による歩行障
害が数カ月の経過で出現し，精査目的で入院した．
入院時神経所見としては筋萎縮・筋力低下などの骨格筋の症状はなく，上下肢の深部腱反射の消失，
四肢遠位部の表在知覚・振動覚の低下などの軽度の末梢神経障害を示唆する所見が得られた．しか（lgr／day）・軽度の腎性糖尿も存在する．現在までのところミトコンドリアの遺伝子異常は同定されていない．
考察ミトコンドリア異常症は全身臓器に異常を呈し
うるが，消化器症状を前景とするものとしてLauberら1）のいうCIPO（Chronic Intestinal
Pseudoobstruction（withmyopathyandophth−almoplegia）と，Bardosiら2）のいうMNGIE（Myo一，neur0−，gaStrOintestinal

encephalo−

pathy）の二つの病型があるが，一部においては混乱が認められる．CIPOはその極型としては麻痺
性イレウスの病像をとり基本的には自律神経系の異常から生じる便秘傾向が前駆症状となると考えられる．その遺伝型としてはLauberはtRNA
Leu（UAG）［Anderson＃12308のAからGへの変異］・
tRNASer（GCU）［Anderson＃12246のCからAへの
変異］・tRNAGly［Anderson＃10006のAからGへの変異］が同時に認められた症例を報告しているがこの例では外眼筋麻痺を伴っている．本例とはほぼ同様の症例はInuiら3）がいわゆるMELAS
mutationとして知られるtRNALeu（UUR）［Ander−son＃3243のAからGへの変異］の異常を報告しており，本例は臨床的には類似しているが発症機序として自律神経系の異常が示唆された点が重要し主訴である歩行障害はRomberg陽性であり，深部知覚障害によるものと考えられた．検査所見
では頸椎Ⅹ一P・ミエログラフイ一・MRIにおいてC4−5に明らかな頚髄の圧迫所見を認め，C4−Thlにcanalstenosisを認めた．安静により症状の一部軽快をみたことから頸椎病変が深部知覚障害のである．一方BardosiらのいうMNGIEは乳酸ア
シドーンス・吸収障害・外眼筋麻痺・ミオパテ一・血管系の異常を症状とし，その消化器症状の機転としては消化器自体の線維化を主体とするもので発症に相当関与したと考えられたが，末梢神経伝導速度の低下（MCV：23−25m／sec，SCV：33．7
m／sec）を認め，特に運動神経のdiatallatencyの延長（6．25〜7．65msec）が明らかであった．患者の承諾が得られたので筋内神経検索を目的として
一見無症状の上腕二頭筋を生検したところ，多数の大きな欠矢を伴った症例とは異なり，1）外眼筋が侵されず，傍脊柱筋・上肢帯筋群が特異的に侵されるという特異な筋病変の分布をとっている
こと，2）骨格筋組織生検所見において初期像として一部にRRFも混在していたが筋線経の変性のring fibersと共にSDHで濃染するRFFを多数認め，COX陰性線経も20％近くに及んだ．全身的には心電図上不完全房室ブロックと蛋白尿あり，本例とはその機転が異なると考えられる．
第2例は骨格筋病変の分布が従来のmtDNA

像を認め，極めて非典型的であった．
第3例は筋生検上無症状の上腕二頭筋において多数のRRFを認めるが一方さらに多数の筋線経での筋構築の異常やring fibersの存在など加齢

−265−

文

による筋病変と類似する一方このRRFはミトコ

献

ンドリアの集積であり，また加齢による変化は横1）LauberJ，Marsac C，Kadenbach B，et al；

隔膜・下肢筋に多く出現し，一方上肢での頻度はMutationsinmitochondrialtRNAgenes；a

少なくCOX陰性線経の割合も加齢で生じる3−5

frequent cause of neuromuscular diseases．

％を大きく上回る割合で生じている4）．このこと

NucleicAcidResearch19：1393−1397，1991．

から本症例は加齢との関係をさらに検討する必要

2）BardosiA，CreutzfeldtW，DiMauroS，etal：があると考えるが，ミトコンドリア・ミオバナー

Myo−，neur0−，gaStrOintestinal ence−に伴うニューロバナーが生じた可能性を強く示唆

phalopathy（MNGIEsydrome）duetopartial

するものであり，さらに．ミトコンドリアDNAの

deficiencyofcytochromecoxidease；aneW

検索をすすめている．

mitochondrial disorder．Acta Neuropatho（Berl）74：248−258，1987．

まと3）InuiK，Fukushima H，et al：Mitochondrial

めミトコンドリア異常症の臨床型と遺伝型の関係
は非典型例の増加により，一見混沌とした状況にある．しかし，現時点において両者に関係は存在しないとする立場をとらず，一例一例を慎重に臨
床病型と遺伝子異常を検索することによってなんらかの法則性を兄いだす努力がさらに必要であると考える．

encephalomyopathieswith the mutation ofthemitochondrial tRNA（Leu（UUR））gene．J
Pediatr120：60−66，1992．
4）Muller−HockerJ：Cytochrome c oxidase
deficienct fibersin thelimb muscle anddiaphragmofmanWithoutmusculardisease；anage−relatedalteration．J NeuroISci．100；
14−21，1990．

−266−

3年問の研究班の研究に対する感想と今後の期待について
アンケート調査

本研究班は，平成4年12月4−5日班会議を行い，研究成果の発表がなされた．その後，：旺長として研究班月に次の如き依頼文を送った．
「本研究班は，まもなく3年日を終了します．この3年間の感想，今後さらにどのような研究の展開を期待しているかなどについておまとめいただきたく手紙を差し上げました．アンケート結果を今後の参考にしたいと思いますので，なにとぞ御協力賜わります様お願い申し上げます．なお返信の送付期限は，平成5年1月5日，送付先は班長までにお願いします．」
この依頼文に対し，珪月各位から貴重な感想または今後の研究の目標などについて御意見をいた
だくことができた．ここにアンケート調査に御協力いただいた23人の方々に心から感謝申し上げた
い．また御意見は若干編集し，匿名にて掲載したいと思うので，御寛容の程お顔いする次第である．
平成5年2月
班長 荒 木 淑 郎−269−

〔1〕筋ジス荒木班で3年間お世話になり，大変有難うございました．
3年間の感想および今後の研究の展開についてとのことでございますが，何分，若輩の私には全体を見透すことは困難でございますので，簡単な一般論で御容赦頂きたいと存じます．
1．筋ジストロフィー症
1）DMD・BMDでは，ジストロフィン遺伝子の異常が明らかになり，簡便にジストロフィンテスト
ができるようになって以来，診断の確度が著しく向上し，病型の多様性についてもが知られるところとなった．今後，症例の蓄積によりgenotypeとphenotypeの関係につき，より詳しい解析がなされることが期待される．
2）ジストロフィン関連蛋白など筋形質膜構成成分とジストロフィンの相互関係，筋収縮蛋白との相互関係をcellbiology・Cellphysiologyの立場で明らかにすることができれば，ジストロフィン
遺伝子欠夫がもたらす細胞生物学的意義がはっきりすると思われる．
3）キャリア診断の精度をより向上させ，胎児診断も併せて予防医学のシステムを確立する．
4）筋の壊死・再生にかかわる，筋障害に共通のメカニズムを詳細に検討し，治療に役立てる．
2．ミトコンドリア脳筋症
1）ミトコンドリアDNAの解析により，KSS・MELAS・MERRFの診断にかかわる問題は飛躍的に進歩した．しかしながら，症例の蓄積に伴い，新たな遺伝子変異が明らかにされ，単一の変異では本症の発症を説明できにくくなった．今後それぞれの変異の相互関係，遺伝子変異が結果としてもたらす細胞生物学的変化について明らかにしていく必要がある．
2）電子伝達系酵素は，ミトコンドリアDNAおよび核DNA双方の支配をうけており酵素複合体
形成過程で核DNA側に由来する異常の可能性も考えられており，核DNAの異常，ミトコンドリア
膜でのtransportの問題も今後の課題と思われる．
3）各病型で変異ミトコンドリアDNAの存在比と組織障害の程度の関係が議論されているものの，変異DNAが98−99％と圧倒的に多いにもかかわらず，組織変化を生じない例もあり，組織側の条件についても検討されるべきと思われる．
以上，稚拙なまとめで申し訳ございません 今後ともどうぞよろしくお願いもうしあげます．
（K．T．）〔2〕筋ジス班では，いろいろと御尽力いただき，御陰を持ちまして研究活動を継続することが出来ました．まことにありがとうございます．
さて，昨年の暮れ，筋ジス姓の3年間の感想と今後の研究方向について，アンケートしたい由のお手紙を拝受致しました．思案の上，ここでは，私達の研究成果と今後の研究方向を申し述べさせて頂きます．
私達は，遺伝性筋ジストロフィーの遺伝子異常の発現に照準をあて，ジストロフィンの分子量が420kDaであることもあって，蛋白質，殊に，100kDa以上の高分子蛋白質に注目して，蛋白化学的観点から研究してきました．この3年間の研究成果としましては，
1．筋ジストロフィー患者の骨格筋ジストロフィンを二次元電気泳動によって解析することによって，BMDにおける異常ジストロフィンは，Exonのinframe deletionによるものと，ジストロフ
ィン分子の中央部をコードしているExonのいくつかを飛び越すようなalternative splicingによる，さらに低分子のものがあることをあさらかにしました．従来，この低分子異常ジストロフィン
は高分子異常ジストロフィンの分解によって出現すると云われてきましたが，私達の観察結果は，蛋白質の分解ではなく，遺伝子の転写の過程に，この疾患に特有な異常が存在することを示唆して
−270−

います．
また，筋ジス3班の珪眉との共同研究により，CySteine−richdomainのみを欠失しているDMDの症例を見つけました．
2．遺伝性筋ジストロフィーの動物モデルであるMDX一マウスでの実験で，筋原線経を束ねる機能をもっていると考えられているC−蛋白質を特異的に分解する酵素を兄いだしました．現在，この酵素を絶品まで精製することに成功しています．
今後，私達の研究方向としましては，BMDにおける異常ジストロフィンと遺伝子の転写過程の異常をmRNAの段階で解析し，BMDに特異的な転写異常を明らかにしたいと考えています．また，ジストロフィンの異常と病態との関連に迫るため，ジストロフィン蛋白質の高純度精製と結晶化によって，立体構造の解析にも研究領域を広げてみたいとも考えています．
筋ジストロフィーにおける蛋白質の分解機序を明らかにすることは，治療法の開発にもつながる事でもありますので，私達の兄いだしたC−蛋白質分解酵素について，さらに研究を継続したいと考えています．
また，筋蛋白質の高分子領域を二次元電気泳動で解析している過程で，ジストロフィンに似た分子量をもった異種の蛋白質が，DMD，BMD以外の筋ジストロフィーに存在することを兄いだしています．高分子領域での異常蛋白質の出現と筋ジストロフィーとの関連を異常蛋白質マップとして集約できるか否かについて，症例を増やして検討したいと考えています．
今後とも，研究が継続できますように，なにぶんともよろしくご指導ご助力頂けますようお願い申し上げます．
（S．H．）〔3〕平素は何かと御指導頂き大変有難うございます．荒木班3年間の感想や今後の研究の方向性について記させて頂きます．
筋ジス荒木班に加えて頂き，正常骨格筋細胞膜におけるジストロフィンの超微局在や分子の超微形態の観察をさせて頂きましたが，特に超微形態の観察に関しましては試行錯誤の連続でした．幸いにも私は米国ペンシルバニア大のDonald L．Schotland教授のもとで筋ジストロフィー症生検
筋のフリーズフラクチャ一法による研究を行っておりましたので，凍結電顕技法に関しましてはある程度の技術の蓄積はありました．しかし，フリーズエッチング法は方法論的にはフリーズフラク
チャ一法の延長線上にはありますが，細部にわたっては条件設定で試行錯誤の連続で，またその所
見の読み方についても何かと工夫が必要でした．骨格筋細胞の基本構築はフリーズエッチング法ではどのように見えるのか，抗体修飾するとどのように見えるのか，それは水晶の付着とどのように異なるのか，抗体修飾をより明らかに鑑別するにはどうすればよいか，などを実際に実験で得られる結果から種々考えをめぐらし，又，文献と首っ引きで解決し進んで参りました．現在，これらの問題はほぼ解決し方法論的にもほぼ一定の水準に達したのではないかと考えております．そしてや
はり良い抗体を入手することが実験の成否にとって大切であることもわかりました．
現在興味をもっておりますのは，（Ⅰ）ジストロフィンと他の膜細胞骨格との関係，とりわけジスト
ロフィンと結合し筋細胞膜を貫通し細胞外基質と連絡しているdystrophin associated glyco−
protein（dystroglycan）に関する研究や，（Ir）dystrophinrelatedproteinの研究と，OIDジストロフ
ィン遺伝子の移入の問題です．
先ず，（Ⅰ）ジストロフィンと他の膜細胞骨格との関係は現在も進行中ですが，特に最近アミノ酸配列等が明らかになったdystrophinassociatedglycoprotein（Nature355：696−702，1992）の膜内外より適当なアミノ酸配列を選びその部分のペプチドを合成し，家兎免疫抗体を得ていますので，−271−

これを用い次のような実験を計画中です．
1）骨格筋細胞における分布，また筋腿移行部や神経筋接合部での分布の特性について
2）Duchenne，Becker筋ジストロフィー症等の各種生検筋での染色態度の検討
3）従来の免疫電顕での膜を中心、とした局在（筋細胞膜の内側に局在するのか外側に局在するのか）の解明
4）フリーズエッチング法でのジストロフィンとの関係などを研究していく予定です．
また，（II）dystrophin related proteinはDuchenneジストロフィー症やmdxマウス骨格筋に多いとされ，ジストロフィンの欠損を代償している可能性も大きいため，これをフリーズエッチング法で三次元的に分子形態やその分布状態を解明したいと考えております．
更に，川ジストロフィン遺伝子のジストロフィン陰性筋細胞への移入の問題は従来諸家により研究されてきておりますが，筋ジストロフィー症の治療との関係で特に大切ですので，私達もこの研究に加わっていきたいと考えています．近年英国Partridge博士により開発されたmdxヌードマ
ウスを得ておりますので，これを用いジストロフィン遺伝子移入の可能性につき追及していきたいと考えております．
筋ジストロフィー症の研究もジストロフィン遺伝子や蛋白の発見により，1つの山を越えた感がありますが，まだまだ未解決の問題が山積しており，今後も微力ながら少しでも本症の病態や治療法の解明や確立に向け努力する所有でございますので，今後とも何卒どうかよろしく御指導の程お願い致します．
（Y．W．）【4〕この3年間の感想研究班全般に対して：
Duchenne型（DMD）のジストロフィン遺伝子の欠損が発見され，また筋細胞膜部分においてその遺伝子産物のジストロフィン蛋白が同定された直後の3年であったので，本研究班においてもこの方面の研究が多く，そして研究も急速に進展したと思います．また，ミトコンドリア脳筋症についても遺伝子レベルの研究が急速に進展したと思います．ただし治療に関する研究発表（特に筋ジストロフィーに関する）が少なかったように思います．
私達の研究に対して：
1）筋ジストロフィーの病態
私達はmdxマウスを用いて，そのヘテロ接合体（キャリア）の骨格筋細胞では筋核によってジス
トロフィンを産生できる核（＋核）と，できない核（一核）がほぼ1：1の割合で存在することを
免疫組織学的に明らかにしました．また，従来のmdxのヘテロ接合体ではジストロフィンは筋組織の横断面で，ジストロフィンの染色性を有する筋細胞と有しないものがモザイク状に存在するとされておりましたが，そうではなく，それぞれの筋細胞で染色性を若干異にしていることを明らかにしました．その他，mdxマウスの筋DNA合成曲線を調べ，生後6過までは筋細胞の活発な再生があるがその後は少なくなることを示した．
2）筋ジストロフィーの治療
本症の治瞭法り開発を削的として，筋の分化・成長因子についての研究を行い，筋細胞膜が筋の分化・成長に重要な役割を有することや，epidermalgrowthfactor（EGF），Calcitoningenerelated
peptide（CGRP）に筋分化・成長作用があることを発見した．将来，これらを本症の治掠薬として使用できる可能性を示した．
−272−

3）ミトコンドリア脳筋症
本研究班のもつ1つの研究テーマであるミトコンドリア脳筋症については常染色体優性遺伝を示す家系を発見し，そのmtDNAに多重欠夫のあることを見出し，mtDNA異常が核の遺伝子異常により起こる可能性を臨床的に示しました．
また，私達が従来研究を行っているミオグロビンについては，insituhybridiztionによりその遺伝子の筋細胞における発現状態を明らかにした．
以上のごとく，本研究姓においてこの3年間に私達の研究を進展させることができました．
今後の研究の展開について
1．筋ジストロフィーの研究
1）病態① Duchenne型の女性キャリアの骨格筋にはジストロフィン遺伝子に異常がありジストロフィンを産生できない核と異常がなく産生できる核の2種類が混在すると推定される．同キャリアの生検筋についてinsitlEhybridization法により欠矢のあるジストロフィンmRNAと欠夫のない（正常）mRNAの局在を調べ，筋核との位置的な関係を明らかにし，ジストロフィン産生核と非産生核がatrandomに混在しているか否かを検討する．また，同時にジストロフィン蛋白の筋細胞膜上の局在部位と筋核との位置的関係を調べ，DMDの女性キャリアの筋細胞におけるジストロフィン産生の実態を明らかにすると共に，人の筋核においてLyonhypothesiesが実際に作動しているか否かを検討する．
② ジストロフィン関連蛋白（DRP）に対する抗体を用いて筋ジストロフィーの三好型など常染色体劣性遺伝を示す筋ジストロフィーにおける同蛋白質の欠損の有無を検討中である．ひき続きこの研究を進展させる．
2）治療
Duchenne型の治療に関しては最近，筋細胞（筋芽細胞）の移植，副腎皮質ステロイドホルモン剤
あるいはタントリウムの投与などいくつか報告されており，一部有効との成績が得られているが，それぞれ欠点があり，効果もきわめて不充分で，まだ実用段階には至っていない．
我々は，前述のごとく治療法の開発を目的として筋芽細胞の培養系を用いて筋の分化・成長物質の発見に努めており，すでに神経ペプチドのCGRPや細胞分化因子のEGFにその作用のあることを発見した．筋の成長や分化には各種の物質の関与が考えられるので，ひき続き各種の細胞成長因子（IL−6など）やホルモンについて同作用の有無を検討する．また，筋細胞の分化・成長をより正しく把握するため，その指標として従来のミオグロビンやCKに加えてMyoDIやmyogeninなどの遺伝子発現についても検討する．
本研究は筋細胞の成長促進物質による筋萎縮の進展遅延を目的としている．次の段階ではそのいくつかを組み合わせて動物に授与し効果を観察し，将来はこれを人の筋ジストロフィーの治療薬に発展させたい．
2．ミトコンドリア脳筋症の研究
1）ミトコンドリア脳筋症のミトコンドリアDNA（mtDNA）異常
mtDNAに大欠夫のある常染色体優性遺伝のミトコンドリア脳筋症と単発性のものについて筋
mtDNAの解析を行い，それぞれのmtDNA欠矢の本質的な違いを明らかにし，常染色体優生遺伝のミトコンドリア脳筋症を一つの臨床病型として確立する．このため可能であれば，無症状の両親の筋mtDNAの検討も行いたい．常染色体状の遺伝型を示すものは病因が細胞核に存在するので治療法を考える上でも重要である．
−273−

2）ミトコンドリア脳筋症症例の間脳下垂体異常の検討
本症には低身長，糖尿病など内分泌異常を示すものがあり，視床下部一下垂体系の異常が指摘されている．しかし，従来の報告は下垂体の機能も同時にみているので，視床下部自体の機能異常については明らかになっているとは言えない．そこで，我々はいくつかの視床下部刺激物質による負荷テストを行い，GHRH，CRFなど視床下部由来のホルモンを測定し，本症における視床下部下垂体系，とくに視床下部の異常を明らかにしたい．
3）ミオグロビンとミトコンドリアとの関係
ミオグロビンの生理作用の一つはミトコンドリアに酵素を供給することであり，ミトコンドリアとは密接な関係のある蛋白質である．従来は主として正常筋やジストロフィー筋についてミオグロ
ビンならびにそのmRNAの局在や分布を検討してきた．今後はミトコンドリアミオパテ一筋について検討し，ミトコンドリアの機能とミオグロビンの関係を明らかにしたい．
（H．K．）〔5〕 3年間址月にお加えいただきありがとうございました．高いレベルの研究に接することができ，私達自身の研究活動を活性化することができました．
3年間の感想として，病因解明に関する立沢な研究が分子レベル，細胞レベルでなされていますが，最も重要で最も難しい治療法開発に関する研究がもう少し多くてもよいように感じました．
現在，遺伝子治療が注目されていますが，米国ではゴーンェ病，アデノシンデアミナーゼ欠損症の酵素補充療法が開発され，我国にも輸入されています．遺伝子治療に限らず酵素補充療法，薬物療法など新しい治療法の開発はもちろんのこと，過去に試みられたがもう一度見直してみる価値のある治解法などに関する研究が望まれます．
私達は平成4年度にミトコンドリア酵素前駆体のミトコンドリア内への輸送障害によると考えられる高乳酸血症を見出しました．幸運なことに班月の熊本大学森教授がミトコンドリア酵素のミト
コンドリア内輸送機構を分子レベルで研究されておられますので森教授との共同研究で全く新しい病因による高乳酸血症が確認され，原因不明の他の疾患の病因解明の糸口を提供するのではないかと期待しております．
また，私達はミトコンドリア脳筋症を含め高乳酸血症の治療にジタロル酢酸ナトリウム（DCA）
を用いた経験があります．DCA投与により組織のピルビン酸脱水素酵素（PDH）が活性化されて，血中および髄液中の乳酸レベルが低下します．臨床症状の改善もみられました．しかし，動物実験での肝癌発生などの副作用が報告されています．最近，私達は酵素活性および遺伝子レベルの検討で，ピルビン酸脱水素酵素複合体異常によるミトコンドリア病の中には補酵素であるビタミンBlに反応する病型，すなわちビタミンB．による治療が期待できる病型が比較的多いことを見出しました．
しかし，ミトコンドリア痛の症例数は少ないので一施設で上記の様な治療法の有効性を確認することは困難です．そこで，筋ジストロフィーのタントロレンナトリウムの治験のような多施設によるグループ研究が望まれます．
以上，感じたままを遠慮なく書かせていただきました．今後ともよろしくお願いいたします．
（Y．K．）〔6〕この3年間は，DMD，BMDのdystrophinの異常と臨床病型との対応，あるいはdystrophinの構造と機能などに対する研究が進み，再にミトコンドリア脳筋症に関しては，分子生物学的な解明が飛躍的に進んだ3年間と思います．
−274−

個人的には，ジストロフィンの機能を知るために，超微構造的レベルでジストロフィンと細胞内の他の骨格蛋白（アクチン，スペクトリン，デスミンなど），膜を貫通しているdystrophinrelated
glycoproteinとの関係を明らかにし，DMD，BMDにおける異常と筋変性過程の機序を明らかにしていきたいと思いますが，今後の研究の全体の方向としては，遺伝子導入を含めたgenetherapyの方向を模策していくのが一つの大きな課題と思います．
（T．K．）〔7〕この3年間KunkelらのDMD geneLdystrophinにふりまわされすぎたようにおもい・これに直接関係しない研究は発表さえはばかれるような雰囲気は1つのファッションであると確信します．厚生省がなぜあれほどに介入したのか疑問がのこり後味の悪さがのこりました．研究者の自由が失われていると言う点で改善していただきたいところです．同時に神経センターの存在だけがめ
だつのも本来の委託研究の趣旨から逸脱しており残念な点です．私のような者がいうには大変勇気のいることですが，このままでは研究する意欲がそこなわれ将来筋肉研究をやめ他の分野にかわる
人がでるものと思いあえてもうしあげました．私共はMyotonicdystrophyや他のdystrophy，COn−genitalmyopathyも対象として微力を尽くして研究を進めたいと存じます．

（T・S・）〔8〕本研究姓は刷筋ジストロフィーおよび（功その関連疾患（主にミトコンドリア病になっていますが）に関し，本邦における①先駆的な研究成果と②成果の患者への反映を目的としていたことは明らかであります．
先ず過去3年間の私達自身の研究成果に関する成果としては：刷に関しては，DuchenneおよびBecker型筋ジストロフィーの生検筋に関してジストロフィン
およびジストロフィン関連蛋白染色を行い，その染色性を通じこれら両型の筋ジストロフィーの発現に関連した蛋白の特異性および局在性につき詳細に検討した．
（跡こ関しては我々は多くのミトコンドリア病の症例を発掘し研究を成し得た．そしてミトコンド
リア病の原因遺伝子と臨床表象（phenotype）に関する検討を臨床例（家系例）を通じ，とくにmtDNA点変異との関連とそれら症例の治療結果につき検討した．その中で従来の疾患範噂では典型的な肢帯型筋ジストロフィー家系の中にミトコンドリア病が存在する事実を明らかにし，また新
たな点変異を有する慢性進行性外眼筋麻痺の家系例につき報告した．
さて本研究班全体の過去3年間の結果を自分達の研究成果にも照らし合わせてみましても，刷と（団の両研究には相互を完全には理解し合えない夫々の奥深い一面を感じます．
佃では組織学的・遺伝学的データが飛躍的に発展したにもかかわらず，治療的な面の大きな発展にまでは及ばなかった点を率直に認めざるをえない．より疾患に近い本研究班の使命は，研究者の枠を越えた治療に関するジェネラル・デスカッショを初年度に班内でラウウンド・テーブル式に数回にわたりフランクに論じあい，その結果を班長の下で簡潔に統括し，各班月にそれから生じたテーマを割り当て，たとえ結果が同一になったにせよ治療的発展を期待するために必要ではないでしょうか．
一方，現実的に我々の施設では小児筋ジストロフィー症例は比較的少ないものの，多くのBecker
型また依然肢帯型とせざるをえない社会生活を営み，子孫を残した成人筋ジストロフィー症例がおり，Duchenne型の症例とは異なる家庭間題を生じており深刻である．すなわちそれら患者は余りtjを開けられない個人的事情を有している場合が多いからである．今後は筋ジストロフィーの疾患対象をその施設独自の患者屑にあった研究成果の出し方を指導し研究を進めることが必要になろうか
とも思います．
−275−

（B）ミトコンドリア病に関しては，臨床的には各種の疾患でmtDNA異常が明らかにされた点は大きな進歩であった．昨年度の本姓会議直後にハワイで実施されたミトコンドリア病の国際カンファレンスに参加し，本研究に対し既に突き当たっている問題として，単一のmtDNA異常が疾患特異性があるか否か，また遺伝子異常｛蛋白合成障害■疾病発現となっているのか否かなど今後さらに追及すべき点が多く，より基礎的な研究者から治療的な側面などのアドバイスも受けつつ新たな研究段階に踏み込む必要性があろうかと思います．また老化とも関連したミトコンドリア病の裾野の拡がりを考える上で，本研究班が率先して診断センター的な施設を拡充する社会的使命があるかもしりません．
その他，mdxマウスを含むミオバナーの基礎的なデータに関し，例えばmdxマウスにおける結果
は桂を越えたデータが果たしてヒトの疾患に反映されているか否かなどの問題が生じているものと思います．すなわちヒトDMD，BMDがあまりにも多様な臨床的・分子遺伝学的・姐級学的側面を有していることが示されたため，実験動物などの基礎的なデータはさらにミオバナーの多様な一面へ詳細に迫る必要性が生じているものと考えます．
以上，我々としては今後ともに本研究姓を通じ，臨床に基づいた広範なミオバナーの研究が飛躍的に発展することを願っています．
（Ⅰ．S．）〔9〕・ジストロフィンの発見で，先生の研究班に於て各種筋ジストロフィー症を，信頼度の高い方法で診断が出来るようになったことは大変意義深いと思います．またジストロフィンと共に，ジス
トロフィン関連タンパク質，ジストロフィン結合糖タンパク質の発見，局在様式が研究され，成果が出始めて来たことは，筋崩壊の直接原因を見出すために，さらに治療方法を見出すためにも役立
ち，これからの研究を加速すると思います．
今後，今迄の研究を基礎に，筋崩壊の直接原因を見出し，治療に役立つであろう筋崩壊の防止，筋再成の促進，再成筋の維持に係るような研究を重点的に行って行けたら良いと思います．ジスト
ロフィン，ジストロフィン結合糖タンパク質等の機能解明も上記の研究を進めるに当り必要不可欠だと思います．
私は昨年電気刺激で筋細胞内が崩壊する現象を捉みましたので，筋壊死への直接原因を見出せるよう努力しようと思っております．
（M．Y．）〔10〕荒木姓の姓月として3年間研究させていただきありがとうございました．大変お世話になり厚く御礼申し上げます．
その間の研究を通じまして感じたことや将来の見通しなどを簡単に述べてみたいと思います．
小生がやっていたmyoblast transferの実験はもともとは江稽班，杉田班を通して行っていた筋の移植から続いているものであります．
筋ジスの患者さんに対する治療法としては薬物療法はいろいろ試みられていますが，目立って有効なものはなく，また期待のgenetherapyも多くの困難に直面している現状です．筋力の落ちて行
く筋ジスの患者さんの筋力を保ち，体全体の筋とはいかないまでも2−3の筋だけでも救い，ADLの改善に役立てようと思って始めたものです．
現代では腎や心，角膜を始め，多くの臓器の移植が可能になっており，移植に伴う拒絶反応の抑制も目覚ましい進歩をしているので骨格筋でも応用できると考えています．中でもclassIMHC
抗原を欠き，拒絶反応が起こりにくいとされる骨格筋ではこの点に関しては他の臓器より容易とも考えられます．
−276−

荒木班の珪月として行っていたmyoblast transferは杉田秀夫先生等からも示唆をいただき始めようとしていたところ，丁度PeterLaw，Partridge，Karpatiらが始め，発表されたので，早速小生も帝京大学の動物室の培養の研究者らと共同して始めたものです．
この方法は筋移植と異なり，注射でできる利点があり，注目すべき方法だと思います．しかしこの方法では現在までのところジストロフィン陽性線経の出現率が低いのが悩みです．
これは次の4つの大きな原因があると考えます．
1）拒絶反応が十分抑えきれていない．
2）注射したmyoblastが筋細胞膜とその回りの厚いextracellular matrixを通過できない可能性がある．
3）注射するmyoblastの活性，fibroblastとの比率，量や濃度が適切でない．
4）注射法，とくに注射時の漏れなど．
これらを解決し，更に陽性率を上げるにはどうするかがmyoblast transfertherapyが成功するかどうかの大きなポイントだと思います．
これに関してはPartridgeの1989年のNatureの報告で10〜40％の陽性率を得たという文献は勇気を与えてくれます．理想に近い条件ならここまで上げる事ができる事を示しているからですし，
これなら筋収縮力もかなり上昇するはずです．
従って今後は（1）拒絶反応のより有効な抑制法の研究（2）注射されたmyoblastが筋細胞膜を通過しやすくする方法の研究（3）myoblastの培養法（4）myoblastの注射法の研究が必要です．
（1）に関しては他の臓器移植とも関連していますが，急速に進歩している分野でもあり，これらの応用が可能と思います．
（2）については種々の蛋白分解酵素の利用，物理的な方法の検討を行うべきと考えています．
（3）のmyoblastについては培養法の検討とmyoblastのクローニングが必要です．fibroblastもある程度含まれていた方がextracellularmatriXの形成に有利だとの説もあり，至連な比率の決定も必要でしょう．またmyoblastの活性低下の防止やその増強も研究すべきです．
（4）の注射法については注射するmyoblastの量，濃度，注射間隔，hostの年齢等の検討を含め，研究を要します．
これらを行うにはかなりのman powerが必要で，研究協力体勢の確立が必要と思います．
また外国ではすでにヒトで行っていますが，我国ではもっと十分な動物実験を繰り返す必要があり，ヒトへの応用は倫理的な問題もあり慎重にすべきだと考えています．
そして最後に，現在はmyoblast transferばかりが注目されていますが，小生が従来からやっていた筋移植法も同時に検討を要すると思っています．
1本の骨格筋をそのまま移植する方法は顔面神経麻樺や手の筋肉の麻痺，膀胱括約筋，肛門括約筋の麻痺には主に自家移植ではありますが，治療法として既に行われ長い歴史がありますので，筋ジスの治療に応用できないはずはありません．この場合には前にmdxとB，10のEDLの交換移植でご報告申し上げましたが，移植された正常筋からの再生筋は筋ジスのhost中でもほとんど100％
ジストロフィン陽性筋であります．もっとも再生筋の筋線経はoriginalの60％位になってしまいま−277−

すが，機能としてはこれでも十分でしょう．
この場合問題となるのは
1）患者のALDを保つのにどの筋を選ぶか
2）拒絶反応の抑制
3）神経，血管の縫合です．
これには外科，整形外科，リハビリ科の先生方の協力が必要です．そしてこの場合も十分動物実験が必要であり，とくに大型の動物での筋移植実験，神経，血管の吻合の研究を要します．筋移植の研究では従来形態学的な研究が主流でしたが，電気生理学的な研究，とくに芙際どのくらいの筋
力が移植筋から得られるのかを十分調べる必要があります．
この班は「筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究」であり，筋ジスの治療法開発を目標の一つに掲げているので私が関係しているmyoblast transferおよび筋線経についての私見を思いつくまま申し上げました．
機能を次第に失っていく患者さんや母親から，実験台になってもいいと言われるたびに胸が痛みますが，この方面の研究に興味をもつ研究者が1人でも多くなることと，荒木先生および荒木班のさらなるご発展を祈っております．
（H．T．）〔11〕先日の班会議の御運営大変お疲れ様でございました．また班会議終了後のダントロレンの中間報告会議の開催も併せて大変お疲れのことと存じます．
筋ジス荒木班の3年間の感想につきましては，筋ジストロフィー部門，ミトコンドリア脳筋症部
門で飛躍的なというところまではいきませんが，それなりにそこそこの成果はあがってきたように思います．中には班の主題たる 筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発 と直接関係のない演題も少数だされていましたが，1年目，2年目，3年目と回を重ねるにしたがって筋ジス
ならびにミトコンドリア異常症以外の内容はかなり減ってきたように思います．今後はまだ解明されていないdystrophinの生理機能の解明が重要と思いますが，FSH，myOtOnicdystrophy，limb，girdleなどの原因遺伝子の単経，原因蛋白の解明，DMD／BMDでなされてきたような遺伝子解析と病態解明などに関する研究も増えていますので，ミトコンドリア脳筋症も合わせて，研究対象は更に広がっていく可能性が高いように思います．従いまして筋疾患の殆ど全般について幅広く病態を解明していくのか，筋ジス特にDMD／BMDにしぼって成因解明，治療法の開発をめざすのかで，班長の皆様の研究計画も変わってくるように思います．小生としては後者の道の方が真の成果はあがるのではないかと思います．
（M．U．）〔12〕今後の研究展開
i）赤血球股関係：
赤血球股が1eakyとなることはdystrophinの欠夫やtruncatedのものとなることだけが原因でなく，恐らく，glycophorinCの糖鎖の変化も含めて，脂質二重膜の脂質構成の変化も寄与する可能性も大きいので脂質膜の構造変化を脂質や股貫通のタンパク質についても詳細に検証したいと考えています．βTSpeCtrinを含む赤血球膜裏打ちタンパク質の欠損を見出すか，作り出せないものかと考えています．anesthesiainduced rhabdomyolysisのようなものがすぐ出来ると上記の検証のよい展開が期待されてましょう．生体膜のprotectionの手だてが可能になれば骨格筋に応用できるのではないでしょうか．
−278−

ii）ヒト骨格筋，mdxマウス関係：
骨格筋や単離心筋の培養系を確立して，DMD遺伝子発現系の抑制によってdystrophin欠損細胞が作れないかと考えています．これにdystrophingeneの導入を行うなどDMD／BMDの病態細胞を作成し，心筋細胞ですとbeatingなどの機能面のCheckも同時に出来ると思います．dystrophin
欠損のみでは，DMDが再現できないと考えています．
つまり，nOn prOgrammedやprogrammed apoptosisの機序解明の立場からも究明したいものです．
iii）その他
DMD／BMD筋細胞組成の中に正常と異なる構成があるのではないか．frameshiftに留めるfac−
torは何か．glycoproteinとdystrophinの相互作用に介入するfactorは何か，myOSinが胎児型に停滞したままで成人型に転換されて来ないのはどの様な機序によるものか，など調べてみたいと考えます．
故Dr．KubygroupでDMD brainのCKB型に正常と異なるpeptideのmappingに関する報告がありますので，これがmentalretardationとの関係があるか否かもさらに検討したく，元の研究室に残されていた結晶酵素を皆引き取っております．
以上，簡単で，とりとめのない所感でございますが書き述べました．

（M．H．）〔13〕3年間の先生の研究班に加えて頂き，お陰様で私共のミトコンドリア形成の研究を発展させることが出来ましたと共に，珪会議ではよい勉強をさせて頂き，誠に有雉うございました．心より感謝申し上げます．
ミトコンドリア病の研究はミトコンドリア遺伝子病の研究が大変進んでいるのに対して，核支配
ミトコンドリアタンパク質遺伝子側の異常によるミトコンドリア病の研究ははじまったばかりの状態です．従って今後ますます重要になる分野であると考えます．哺乳類の系ではタンパク質のミト
コンドリア局在化に関与する因子がほとんど同定されていませんが，私共は幸いにもその一つの遺伝子を単離することが出来ました．これらの因子の遺伝子が単維されれば，その異常によるミトコ
ンドリア病の研究は急速に進展すると期待されます．事実，ミトコンドリア形成因子の異常を思わせるミトコンドリア病の症例も報告されていますので，私共の単離した遺伝子がお役に立つ可能性があります．
遺伝子治療はミトコンドリア病研究の大きな目的でありますが，ミトコンドリア遺伝子病については治療に向けての基礎研究がスタートしていますが，相当の困難が予想されます．一方，核支配
ミトコンドリアタンパク質遺伝子の異常によるミトコンドリア病は，一旦病因遺伝子が明らかになると，現在急速に進展している遺伝子治療法と同じ原理での治療が可能ですので，直ちに遺伝子治療の基礎研究を開始することが可能です．
この3年間には残念乍ら私共の成果を疾患に結びつけるところまでには至りませんでしたが，今後は私共の成果を病因解析に応用すると共に，遺伝子治療のモデル実験を行いたいと考えております．
なお先生の班には筋ジスとミトコンドリア病が含まれ，共にミオパテーと主とすることで共通性はありますが，両疾患が密接に関係していることもありませんので，2つのグループに分けるのも一つの案かと存じます．
3年間本当に有雉うございました．先生の益々の御活躍を祈りますと共に今後共御指導御力添え下さいますようお願い申し上げます．
（M．M．）−279−

〔14〕筋ジストロフィーの荒木址に所属させていただき，3年間多くのことを学ばせていただき深謝しています．
3年間の感想，今後の研究の展開についての期待についてまとめるようにとのことですので，私の意見を申し上げます．
（D 筋ジストロフィーの治療法の開発が何としても大切であると思います．
プロテアーゼ阻害剤（ロイペプナン，べスタナン，E64など）
副腎皮質ステロイド剤
移植実験
タントロレンNaによる治療の4つが今までなされて釆ましたが，今後更に強力に進める必要があると思います．
（∋ 分子遺伝学
診断的に進歩しましたので，次には治療への応用を考えて行かなければならないと思います．
③ 正確な診断によって，遺伝相談や指導を行うこと．
今思いつくことは以上の3つであります．
（T．K．）〔15〕筋ジス杉田姓より荒木班に変わる際に分子遺伝学を中心に姓が構成されると記憶しており，
当時応募もいたしませんでしたが，2度目より先生の御配慮で班に加えていただき2年間参加させていただきましたことは大変有意義でございました．また，姓の研究内容の1つの柱に「治療法開発に関する研究」があり，私どものグループとしてはこの部分に参加できました．その間，タントリウムの全国治験もスタートし，その中にも加えていただきありがとうございました．
ミトコンドリア脳筋症，ジストロフィンなどの基礎的研究は今後も続いていくと存じますが，私どもの研究の展開としましては，治療法，とくに現在K．Ⅰ．が担当しておりますanaerobicthreshold（AT）を指標とした治療法の評価，開発を続けていくつもりであります．
新しい研究班の目的，班構成がどうなるのか，わかりませんが，筋ジス研究姓の益々の御発展をお祈り致します．
（K．T．）【16〕この3年間で最も気付きました点の一つは，我が国の分子遺伝学的研究レベルの向上ではな
いかと思われます．これはまた遺伝子診断や遺伝相談の面でも臨床の場に大きく貢献していると見うけられます．
今後につきま．しては，やはりDMD／BMDとジストロフィン，ジストロフィン関連タンパク，ジストロフィン結合タンパクの研究とともに，DMD／BMD以外の筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究の推進が大切ではないかと考えております．

（K．A．）〔17〕この3年間はdystrophinmyopathyとMt．myopathyの研究に終始し，しかしそれなりに大変な成果があったと存じます．MELASのDNA変異の同定などはその代表例です．しかし一方
でMt．myopathyではDNA変異とclinical manifestationsの関係が却って雉しい局面になってきたともいえます．
これからは，筋酵素の遺伝子発現，転移の調節やmutationのheterogenetyの同定などbasicな分析につとめるとともに，ジストロフィーを中心としたmyopathyを更に広い視野でとらえ，また治療法にも理論的な方法論的立場を明確にしてかかるべきかと考えます．
きたる国際筋神経学会で，ミトコンドリアの「サテライト」をとの強い要謂のあった件でも，Mt．
−280−

myopathyとglycolytic defectsを対比することによってより分析が深まるのではないかと考え具申しましたところ了承を得て，その方向で考えております．
何でも全体の混沌を率直に見据えながら，今後も進むべきではないか，割り切れる所は割り切り，割り切れない所も切りすてず更に混沌の中へ乗り入れる心構えが必要かと日頃思考しております．
日頃のご懇情に深謝し，先生の一屑のご自愛お祈り申し上げます．

（S．T．）【18〕1）3年間の感想
ちょうど，mOlecularbiologyやmoleculargeneticsの発展とその成果が臨床医学にも反映される時期にあたり，この班がまさに基礎と臨床を統合する形であったことは非常によかったと思います．
私自身も含め，共同研究も随分進んだように感じています．また，このような研究班の班月であったことを大変感謝しております．
2）今後への期待
今後も，是非このような形，すなわち基礎と臨床とが協力・啓発しあえるような研究班が組織されることが重要であると存じます．個人的にも，現在軌道にのり成果がではじめた研究をさらに発展させるべく，このような研究班で活動させていただきたいと念願しております． （A．M．）〔19〕 ミトコンドリア脳筋症の遺伝子レベルでの病態解析 のもと，1年日はミトコンドリア脳筋症はミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常に起因するのでは，との仮設に基づき，小児科領域での疾患であるMELASをとりあげmtDNAの塩基配列決定を行うこと．とし，PCR法を用いて開始した．1例のMELASにおいてAndersonの配列とは異なるいくつかの部位を兄いだしたが病因と結び付ける事が出来なかった．2年目にはtRNA領域に的を絞り塩基配列決定を行い，神経セン
ターの後藤先生の好意によりMELASの3243変異の情報を提供して頂き，我々の症例でも確認できた．また家系で検索すると母親もその変異をもち，卒中様発作はないが，痩せ，筋力低下，痴呆といった症状を呈している事が判明し，この変異が臨床的に多様であることが判明した．3年目は，
MELAS以外でのtRNAの異常の検索を進め，拡張型心筋症を里する例において新しいtRNAlleの点変異を兄いだした．またこの変異が病態とどのようにかかわっているかを検討するため埼玉ガンセンターの林純一先生と共同研究を進めている．
以上3年間を振り返ってみるとKSS，MERRF，MELASにてmtDNAの変異は同定され，また様々な変異が様々なミトコンドリア脳筋症で報告されているが，変異が多型なのか，病態と関連するのか困難なことがある．これを解決する方法として〆細胞を用い解析する事が考えられる．私達は今後，mtDNA異常のモデルマウスを作るため，ES細胞へ変異mtDNAを導入し，臓器への分布と病態との関係を今後行いたいと考えている．
（S．0．，K．Ⅰ．）〔20〕筋ジスおよびミトコンドリア病における遺伝子変異の解明についてはこの3年間で大きな進展が得られた．今後，遺伝型と臨床病型との問の対応をさらに解明していく必要があろう．研究班
月の再構築を行い，重点課題を定める必要があろう．
（T．0．）〔21〕筋ジストロフィーの病因，病態を明らかにすることを目的として，筋ジス荒木班に入れていただき，早いもので既に3年が経ちました．班長の荒木先生，事務局としてお世話をしてください
ました高木先生には本当にありがとうございました．
−281−

日常の診掛こ携わりつつ，疾患の本質は如何なるものであるかという疑問に対する解答を得るた
め，DMDとBMDの遺伝子変異と遺伝子産物ジストロフィンの異常を調べ，臨床との関連を分析して参りました．遺伝子診断と免疫学的検討（蛍光抗体法とイムノブロット法）により，臨床症状が発現する前の段階でのDMDやBMDの確定診断が可能となり，臨床経過，症状，従来の検査では鑑別困雉な疾患を，遺伝子レベル，細胞レベルで異質な状態であるか否か，判定することができる
ようになりました．しかし，筋ジストロフィーの患者さんやそのご両親と話をしていて， 筋ジスト
ロフィーはここまでわかったのになぜ治せないのですか という期待を込めた疑問に，いまだ応えられないこと，そして幼いときから診療をしてきた筋ジストロフィーの子供たちの症状の進展を食い止めることのできないことに，無力感を抱いております．
今後の筋ジストロフィーの研究としては，治療的研究の方向に向かって行かなければならない時期であることを痛感致します．
また，ほかの型の筋ジストロフィー，特に福山型筋ジストロフィーの遺伝子解析は，社会的にも必要性が求められている研究であります．患者の登録患者からのサンプルの登鈍celllineの作成，遺伝子解析など単独の施設で行うより，いくつかの研究室の共同研究ですすめていくことが必要であると考えます．このような目的のもとに，筋ジストロフィー研究班がさらに発展し，日本の医学と医療の進歩に貢献できるように，私どもも微力ながら尽くす所存でございます．（K．S．）〔22〕3年間班月に加えていただきまして誠に有難う存じます．
当初は私の移籍に伴いまして大変ご迷惑をお掛け致しまして申し訳ございませんでした．3年間
ミトコンドリア脳筋症の発症機序の解明を目標と致しまして研究を続けてまいりましたが，甚だ不十分なままでおりますことを大変申し訳なく存じております．
ミトコンドl）ア脳筋症の領域では1年目にミトコンド1）アDNAの点変異がMERRF，MELAS
において発見され，班会議も大変excitingでありました．その後もミトコンドリアDNAの研究は続けられていますが，ミトコンドリアDNAに認められる変異がいかにして多様な臨床症状の発症に結びついて行くのかは依然として解明されておりません DNAレベルの異常を今後は細胞，組織，個体レベルで解析することにより，tRNAであればあるtRNAの異常がいかにして特定の臨床病型の発症に至るのかを明らかにすることが病態の理解と治療法の開発に不可欠と考えております．
このためには貴重な剖検例をより詳細に解析することと並んで，細胞レベル，個体レベルでのモデ
ル系を開発することが重要であると思います．ミトコンドリアへの遺伝子導入の成功はその突破口の一つとなる重要なステップで，今後細胞レベルでの解析にはβ0細胞が応用されることになると予想しております．マウスモデルを探索する努力も必要と思います．
私は筋ジストロフィーの措置痛棟に3年間勤務したことがございますので，個人的には筋ジスの治療に関心をもっております．栃木県には措置病棟がなく，直接患者さんに揺する機会がほとんどありませんので，臨床研究は困難でありますが，遺伝子治療の可能性について今後研究したいと考えまして，若い医局員を国立精神・神経センターに内地留学させております．分子生物学の成果を臨床の現場に還元できるような研究の展開に期待しております．
3年間大変お世話になりまして誠に有雉うございました．厚く御礼申し上げます．（M．N．）〔23〕ここ数年の筋ジストロフィー症および関連疾患研究の進歩は目ざましいものがある．特に本年度の荒木班々会議では筋ジストロフィー症に関して保因者診断を含めた遺伝子レベルでの研究或いはジストロフィン蛋白質と他の細胞内糖蛋白質との関連など極めて高度な研究報告が成され敬月艮
−282−

した．更にミトコンドリア疾患では遺伝子治療に関係した報告まであり今後の研究の在り方，可能性を示唆しているものと思われ大いに学ぶものがあった．
しかし本年度の研究報告を見ても，特にジストロフィン蛋白質の生理機能に関する研究はまだ充分進んでいるとは言い難い印象を受けた．最近では生化学的，分子生物学的或いは形態学的レベルでの解明が充分成された上で生理機能の研究が行われるという一連の流れがあるように思われ；ジストロフィンの研究についても現時点では同様に思われた．現在のジストロフィン蛋白質関連の生理機能研究はジストロフィン蛋白質欠損に伴う細胞障害に絞られていると言っても過言ではなく，本年度の我々の報告も含め幾つかのグループよりジストロフィン蛋白質が欠損する事により細胞内へのカルシウム流入に関係したチャネルに異常を来す可能性が示されている．しかし今までに報告された異常チャネルは多種に及んでおりカルシウム関連チャネルだけに注目してもジストロフィンの細胞生理機能に果たす役割が如何に広範囲に及ぶかが容易に推察される．ただこれらの異常が必
ずしもジストロフィン欠損に伴う一次的な現象ではなく，例えばジストロフィンと関連する糖蛋白質の機能障害による二次的現象を見ている可能性も否定はできない．従って現在見ている生理現象を更に細かく追求するするためにはジストロフィンの生化学的，形態学的研究の進歩が必要である．
一方でジストロフィンは骨格筋だけではなく心筋等他の組織にも発現しており個々の組織に於ける生理機能もまた今後の重要な研究課題である．この意味で興味深いのは本年度珪会議でジストロフ
ィン遺伝子のエクソン1からイントロン1にかけての部分欠掛こより骨格筋障害を伴わない拡張型心筋症を生じた症例報告である．ジストロフィンは極めて大きな骨格蛋白質であり上述したように何らかの単一機能のみを担っているとは考え難い．むしろ上記症例の如く，ジストロフィンのある
一部がある特定の組織に於いて特別な生理的役割を果たしている可能性が推察される．しかしこの様な病態生理を臨床症例の蓄積のみ解明する事はベッカー型筋ジストロフィー症が少ないなど困雉であり，やはりトランスジェニックマウスを用いるなど分子生物学の力を借りる必要があるものと思われる．この様に生理学，特に細胞生理学の進歩には他の研究分野での進歩が常に要求される時代になってきている．
しかし逆に生理学的研究の進歩が要求される場面もある．目頭でも触れたように時代の流れは遺伝子治療へと向かっており，有効な治療法が無い現時点では遺伝子治療の開発は大切である．しかしジストロフィン遺伝子は大き過ぎ，効率的な細胞への組み込みができず大きな壁に突き当たってしまっている．この点でジストロフィン遺伝子上の個々のエクソン，イントロンの各組織に於ける生理機能の解明が遺伝子治療の進歩の助けとなるものと思われる．つまり生理機能の研究だけが取り残されて良い理由はどこにもなく，むしろ生化学的，分子生物学的事実が生体でどの様にアウトプットされているかを確認する手段であり，上述したような様々な興味深い諸問題を解決する手段でもある．現時点で我々のグループはジストロフィン蛋白質の欠損に伴う細胞障害の生理機能の解明及びジストロフィン蛋白質欠損による各種チャネル異常の研究を目的としているが，ジストロフ
ィン遺伝子のどの部分がどの様な生理機能にどの様にして関与しているかに強い関心を抱いている．
その第一歩として最近拡張型心筋症でのジストロフィン遺伝子異常の研究などを含め骨格筋以外の諸臓器に於けるジストロフィン蛋白質欠損の持つ生理学的意味について検討を始めている．班会議の報告を聞いていると個々の研究グループが相当なレベルで研究を行っており庄倒されるばかりであるが，我々のグループもこの数年の内に一つのまとまった結果を出し，何らかの形で筋ジストロ
フィー症の治療に役立てることが夢である．
上記の通り，機能解明の土台の上に立った遺伝子治療が理想的とはいえ，並行して筋細胞への遺伝子導入の技術は確立しておくべきであると考え，−283−

1．Reporter遺伝子の作製（プラスミドがDEAE−dextranを利用したtransfectionによってHela細胞で遺伝子発現できることを確認）
2．九日通用での筋細胞への遺伝子導入のための
1）carrier（vehicle）の選択
2）DNAとcarrierとの結合の方法の開拓などを行っている．本年度の姓会議では未だ公表するに値するデータではないと考えひかえたが，今後もこの方向での作業を積極的に発展させて行く予定である．
（M．T．）−284−平成4年度研究班名簿

平成4年度 荒木班 名簿
区

分

主

氏

任

荒

所

名

木

淑

郎

事

垂

井

清一 郎

事

高

終

名 古屋 大 学 医学 部生 化学

後

藤

幾

生

九州 大 学 医 学部 神経 内 科

佐

藤

猛

寺

尾

寿

夫

け る地 位木昭

夫

虎 の門 病 院 神経 内科

虹

荒

畑

喜

一

国 立精 神 ・神経 セ ン ター 神 経 研 究 所
〒187

〝

内

野

誠

〝

田

成

男

栗

原

照

幸

国 立療 養 所 再秦 荘 病 院神 経 内 科

〝

木

南

英

紀

〝

後

藤

雄

一

〝

斎

藤

加代子

〝

佐

橋

功

清

水

輝

夫

東 京 女 子 医科 大 学 小 児科

〝

田

過

等

〝

西

澤

正

豊

（内2281）
副 院 長0473 −72 −3501

教授

03 −3964 −1211

部長

03 −3588 −1111

部

長0423 −41 −2711（内3000）（内2016）（内5114）
医長

教授

03 −3468 −1251

教授

03 −38 13 −3111（内3324）（内3514）
研 究 員〒 329 −
04

栃師
薬木 寺3311
県 河内 郡−南
1 河 内町−287−

0423 −4 1−2711（内5214）

講師

03 −3353 −8111

助 教 授

056 1−62 −3311（内31230）（内2 176）

助 教 授

03 −3964 −1211

院

0423 −23 −5110（内19 11）
長（内3201）

府 中市 武蔵 台 2 − 6 − 1

自治 医科 大 学 神 経 内科

0285 −44 −2111（内3151）

板 橋 区加 賀 2 −11− 1

東 京 都 立神 経 病 院 神経 内科

096 −242 −1000（内536）

助 教 授

愛作
岩
知雁
県愛
叉21
知 郡 長 久 手町

帝 京 大学 医学 部 神 経 内科

〒 183

（内2031）

新 宿 区河 田町 8 − 1

愛知医手
斗大学 神 経 内科

〒 173

092 −641 −1151

小 平 市 小 川 東町 4 − 1 − 1〒480 −11〝授

文 京 区本 郷 2 − 1 − 1

国立 精 神 ・神 経 セ ン ター 神 経研 究所 ■

〒162

教

目黒 区大 橋 2 −17− 6

順 天 堂 大 学 医学 部 生 化学

〒187052 −741 −2111

栃 師寺3
薬木 県河311
内郡
−南
1 河内町

東邦 大 学 医 学部 第 四内科

〒113

授

熊 本 県菊 池郡 西 合 志 町2659

自治医 科 大 学医 学 部 生化 学

〒153

教

小平 市小 川 来町 4 − 1 − 1〒329−04〝

06 −941 −0484

括 区 虎 ノ門 2 − 2 − 2〒86ト 11太長

板橋 区加 ㌍ 2 −11 − 1

高

〒105

院

市 川 市 国府 台 1 − 7 − 1

運 営 幹 事貝096 −368 −7554

福 岡 市東 区 馬 出 3 − 1 − 1

帝 京大 学 医 学部 神 経 内科
〒173

連 絡 の際 の電 話

名誉 教授

名 古 屋市 昭 和 区偽 舞 町6 5

国 立精 神 ・神経 セ ン ター 国府 台 病 院
〒272

〝

所属にお

地

大 阪 市 中央 区大 手 前 1 − 5 −34

滞

〒8 12
〝

名

熊 本 市長 嶺 町2042 −123

小

〒466
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設

在

国 家公 務 員 等共 済組 合 連合 会 大 手 前病 院
〒540

幹

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熊 本大 学
〒862

監

属

所

助 教 授

0285 −44 −2111（内3522）

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金沢 大 学 医 学部 神 経 内 科

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北 海道 大 学 医学 部 付 属 病 院 神経 内科

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授

06−451 −0051

教授0992−64 −2211（内2330）（内2146）
助 教 授

0886−31 −3111（内3204）

講師075− 751 −3770

教授0886−3 1−3 111

講師

03 −3 813 −6 111（内2320）（
内3385）
助 教 授

講師

052 −74 1−2 111

教

授0762−62 −8 151

教

授

011 −716 − 1161（
内2297）（
内3950）（
内6028）

札 幌 市北 区北 14条西 5 丁 目助

手

025 −223 −6 161

教授0985 −85 −0873

助 教 授

0559 −75 −077 1（
内5 183）〒95 1 新 潟 市旭 町 通 1 番町 757
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宮崎 医科 大 学衛 生 化 学

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国 立 遺伝 学 研 究 所 人類 遺 伝 研 究〒889 −
16

宮城 県宮 崎 郡 清武 町 木 原5200

三 島 市 谷胡 1111

暮庄司進一（平成4年11月30日まで）‥吉田邦広（平成4年12月1日から）−288−

0263−35 −4600（
内532 1）

金 沢 市宝 町 13− 1

新 潟 大 学 医 学部 付 属 病 院 神 経 内科

〒4 11045−971 −1151（内269）

名 古屋 市 昭 和 区鶴 舞 町 65

守

〒060

教

松 本 市旭 3 − 1 − 1

高

〒920

0423−46 −1715（
直通）

文 京 区湯 島 1 − 5 −45

名 古 屋 大 学 医学 部 神 経 内科〒466

長

徳 島市 蔵 本 町 3 −18 −15

信 州 大 学 医 学部 第三 内 科〒390

室

京 郡 市 左 京 区聖 議 院 川 原町 54

東 京 医 科 歯 科大 学 医 学 部神 経 内科
〒113

（内3445）

徳 島市 蔵 本 町 3 −18 −15

徳 島大 学 医 学部 小 児科
〒770

（内4002）0285−44 −2111

鹿 児 島市 宇宿 町 1208 − 1

京 都 大 学 医学 部 神 経 内科

0423 −−25 −3881

助 教 授

大 阪市 福 島 区福 島 1 − 1 −50

徳 島 大 学 医学 部 第一 内科

0255−34 −3131

研 究 員

横 浜 市 緑 区 藤 が丘 1 −30

鹿 児島 大学 医学 部 第 三 内科

〒 770

副 参 事

小 平 市 小 川 東町 4 − 1 − 1

大 阪 大 学 医学 部 ′ト児 科

連 絡 の際 の電 話

（内553）

栃師薬
木 寺33
県 河 11−1
内郡 南 河 内町

昭 和 大 学藤 が丘 病 院 神経 内科

〒 890

副 院 長

新 潟 468犀坑川 −l頚1城 郡 大 潟町

国 立 精 神 ・神 経 セ ンター 神 経 研 究所

〒 553
的

け る地 位自治 医科 大 学 小 児 科

〒 227
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所属にお

地

真里子

〒 18 7〝名腑 東 京都 神 経 科 学 総 合研 究 所 生化 学

〒 329 −
04

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眞一 郎

〒 183
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国 立療 養 所 犀 潟 病 院 神経 内科〒949 −
31

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直通 ）

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内568）

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熊 本 大 学医 学 部 分 子遺 伝 学 教 室

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国立 静 岡病 院

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東 京 都 老 人医 療 セ ン ター

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教

096 −34 4−2 111

授（
内677 1）
名 誉 教授0886 −3 1−3 111

名号
手院 長
■

0542 −4 5−0 101

名誉院長

03 −3964− 113 1

静 岡 市 城 東町 24 − 1

板 橋 区 栄 町35 − 2

枠 中記 念成 人病 研 究所
〒 1050298 −5 3−3224

徳 島 市 歳 本町 3 −18− 15

義

〒 173

助 教 授

熊 本 市 九 品寺 4 −2 4− 1

徳 島 大 学医 学 部〒 420

連絡 の 際 の電 話

つ くば 市 天王 台 1 − 1 − 1

公部

け る地 位

敬

宇尾野

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所属にお

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事 務 担 当 者名

筑 波 大 学臨 床 医 学 系神 経 内 科

〒 770

倉

設

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洋

〒 862
顧

施

英

〒 305
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属

括 区 虎 ノ門 2 − 2 − 2−289−

03 −3588− 1111（
内 2168）