厚生省新薬開発研究事業

微生物の二次代謝産物に由来する

難病治療薬（E−64）の開発研究

昭和55年度研究報告書
班 長 今堀和友

昭和56年3月

ま

え

が

き

難病治療薬E−64の研究を開始して以来2年が経ったことになる。第2年度においては初年度の研究の線に沿って，これをさらに発展させることに努力したのであるが，さらに次のような新しい
試みをも加えた。
まず第一は班員の増強である。すなわち，市原明，石浦章一，官武正，寺尾寿夫の4氏を正式班員に加えたが，市原，石浦両氏は細胞内プロテアーゼに対するE−64の効果の判定の幅を拡げるた
め，官武氏は細胞膜に対するE−64の効果を調べるため，それぞれ参加して頂いた。他方，筋ジス
モデル動物として，チキンが妥当か否かについての疑問が生じてきたので，ヒトの生筋をヌードマウスに移植し，これについてのE−64の効果を判定してもらうため，寺尾氏に参加して頂いた。
第二の点は，E−64関連化合物中より今年度からはE−64−Cに的をしぼり，その大量生産の方法を確立することにより，試料供給を保証した。またE−64−Cの連続投与を行ったチキンにつき，生理学，病理学，薬理学，生化学の各方面からその効果を綜合的に判定するとともに，E−64−Cの毒性に関しても徹底的に研究した。
昨年より引きつづき行われた研究については，本年度は大きな進展をみせたものが多く，その中には単に開発研究に止まらず，純学術的な立場からいっても世界の第一線級の成果が得られたものも多く含まれる。その点学術論文集としても充分価値あるものと信じている。
本研究は筋ジストロフィー治療薬の開発という視点から出発し進みつつあるが，その成果の中には筋ジストロフィー症の研究者の参考となるものも含まれているであろう。他方，他の疾患中にも中性のチオールプロテアーゼが関与すると考えられるようになりつつあるものが増加しつつある
今日，本成果はそれら疾患の研究に関係されていな方々のお役にも立つのではないかと考えている。
最後に，本研究遂行に絶大な努力を払われ かつ多忙中本報告書の執筆に労を惜しまれなかった班員の方々，本研究推進につき，すべての面で援助して頂いた厚生省薬務局の方々，さらに本報告書の出版をはじめ，班の運営につき事務のすべてを担当された大正製薬開発部の方々に深謝するも
のである。
今

掘

和

友

目

次

まえがき
Ⅰ

製

造

方

法

1. E‑64‑c の製造

沢田 二郎

9

2. DL‑トランス‑エポキシコハク酸の光学分割法

沢田

二郎

11

3. E‑64‑c 標識体の製造

沢田

二郎

15

4. E‑64‑c の物理化学的性質及び製剤化の検討

沢田

二郎

21

ならびにE‑64‑c投与による阻害について

勝沼

信彦

37

6.カルシウムプロテアーゼに対するE‑64の効果

今堀

和友

43

7．カルシウムプロテアーゼと燐脂質

西塚

泰美

49

市原

明

55

宮武

正

61

杉田

秀夫

67

石浦

章一

71

Ⅱ 標的酵素に対する効果
5.ジストロフィーチキン骨格筋カテプシンB, H及びDの動態

8．プロテアーゼ阻害物質によるべブスタチン非感受性へモグロ

ビン水解酵素の誘導
9.筋ジストロフィーチキンの筋ガングリオシドに及ぼすE‑64の効果について（続報）Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす効果
10.ニューロフイラメント変性に対するE‑64‑cの効果

11. E‑64‑cの骨格筋内分布とin vivoにおけるプロテアーゼ阻

害作用についての検討12. カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究

石浦

章一

75

13. 培養筋細胞に対するE‑64の作用

小沢鍈二郎

85

江橋

節郎

89

寺尾

寿夫

93

16. E‑64‑c の急性及び亜急性毒性に関する研究

大関

正弘

99

17. E‑64‑c の抗原性に関する研究

大関 正弘 111

18. E‑64‑c の感覚器に及ぼす影響

大関 正弘 115

19. E‑64‑cの薬効に関する研究(1)

大関 正弘 123

〜筋管細胞のタンパク分解速度に及ぼすE‑64‑c の影響〜
14. N‑[N‑ (L‑trans‑3‑Carboxyoxirane‑2‑carbonyl) L‑leucyl]‑3‑methyl‑butylamine (E‑64‑c)の筋蛋白質代謝に及ぼす影響
15. ヌードマウスへの異種移植筋の再生に対するE‑64の効果

Ⅳ 全身的影響に関する研究〜筋ジストロフィーチキンに対する薬効試験〜

20. E‑64‑c の薬効に関する研究(2)大関 正弘 131

〜Serotonin myopathyに対するE‑64‑c の効果〜

21. E‑64‑c の一般薬理作用

福原 武彦 141

〜特に呼吸・循環機能及び中枢神経に及ぼす影響〜

22. 取り込まれたE‑64の細胞内分布と運命について勝沼

23. E‑64‑c の生体内動態に関する研究

大関 正弘 163

24. E‑64‑c の薬物代謝酵素活性への影響

北川 晴雄 179

信彦

159

Ⅰ製 造 方 法

1．E−64−Cの製造沢田 二郎

2．DL−トランスーエポキシコハク酸の光学分割法

沢田 二郎

3．E−64−C標識体の製造
4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討…………………沢田

二郎

沢田 二郎

1．E−64−Cの製造

沢

田

二

郎＊

研究協力者 花 田 和 紀＊

玉

井

正

小

目

熊

清

晴＊

安

達

孝＊

司＊

方

的

法

E−61−C，N−〔N−（L−3−tranS−Carboxyoxira−E−6トC合成法に関しては既に昭和54年度報

ne−2−Carbonyl）−L−leucyl〕−3−methyl−butyl−amine，は合成的に得られたE−64類縁体の一

告書5）中に詳細に報告した。ここではこの方法に準拠し，その製造規模をスケールアップするつであり，筋肉のCa＋＋−aCtivated neutral

ことに重点をおいた。尚，出発原料として用い

PrOteaSe（CANP）1）及びラット肝カテプシソ

たL及びD−トランスエポキシコハク酸モノエB2）及びL等のチオールプロテアーゼに対し，
E−64とほぼ同等の阻害活性を有することが既

チルエステルはそれぞれ立体選択的にD及びL一酒石酸より合成した6）。

に明らかにされている。又，大関ら3），4）は毒性，

結或いは生体内動態に関する比較から，E−64−C
が天然E−64に十分比肩しうることを報告している。

果

最終的に2．7kgのE−64−Cを得，本研究事業班員並びに研究協力者に提供した。又，E−64−C

本研究の目的は筋ジストロフィー症に対するは3種の光学異性体を右するが，これらをE−

E−64−Cの医薬品としての開発を最終目標とし

64−Cと比較する目的で合成した。その物理化て，その研究に携わる「E−64研究班員」への学的性質を表1にまとめて示す。又，本年度中サンプルの供給，並びに工場生産に必要な製造に得られたE−64−C及び関連物質の総計を表2にまとめた。

法の検討に関するものである。

表1寧−64−C とその光学異性体の物性
Con負guration mp

ES

Leu

〔α〕D
（OC）

（C＝1，EtOH）

Elemental analysis Calcd．for CISH26N205
C

8
8

3
7

8

1
0
8 00

＊大正製薬株式会社総合研究所

98

ES，Lrans・epOXySuCCinylresidue；Leu，leucine residue

8−39．00（280C）

8

157−1583
4−88．00（290C）

D

8

83−85

3
2

D

＋86．70（270C）

L

8

D

＋45．50（200C）

82−84

8．91

2
4

L

157−160

D

N

1
5

L

L

H
8．34
8

57．31

Ⅰ製 造 方 法
表2 昭和55年度に製造したE−64−C
及びその標識体の総量
E−64−C
L−L

2740g

L−D

0．9g

D−L

1．85g

D−p

0．5g

〔HC〕E−64−C

11．6mCi〔2H〕E−64−C

2．9g

考

察

E−64−Cの合成法に関しては昨年度既に報告した。この方法により，更に，スケールアップの可否を検討したが製造工程上，余り大きな問
題はなく大量製造も可能である。しかしながら，主原料である L−トランスエポキシコハク

酸製造上，非天然型，D一酒石酸から5行程を経て合成するという，行程上の問題と，原料であるD一酒石酸が高価でかつ，安定した入手が10困難であるという大きな課題が残されている。
この問題に関しては安価なフマール酸から得られるDL体を分割する方法（昨年度一部報告）
によりほぼ解決の見通しがついた。これについては別項で報告する。
参考文献
1）今掘和友：私信．
2）S．Hashida，T．Towatari，E・Kominami，N・
Katumuma：Inhibitionby E−64derivatives ofratliver cathepsin BandcathepsinLinvELroand fn vivo，J．Biochem．，88，1805，1980．

3）大関正弘：E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究，昭和54年度研究報告書p．25，
1980．

4）大関正弘：E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究，昭和54年度研究報告書，p・145，1980・
5）沢田二郎：E−64及びその類縁体の製造法に関する研究，昭和54年度研究報告書，p．9，1980．

2．DL−トランスーエポキシコハク酸の光学分割法に関する研究

沢
研究協力者

目

花

田

和

田

紀＊

玉

二

郎＊

井

正

晴＊

小

熊

方

的

清

司＊

法

現在，E−64及びその類縁体を筋ジストロフ

L−Phe−NH2は既報の方法2）で合成した。

ィー治療薬として開発することを目指し研究が進められている。これらの化合物は筋ジストロ

DAA は市販品（東京化成工業製）をW．J．
Gottsteinの方法3）で精製して用いた。DL−t−

フィー症発症の一つの要因であると推定されてESはG．B．Payneの方法4）に従ってフマーいるCa＋＋−aCtivatedneutralprotease（CA

ル酸より合成した。L−t−ESの上記アミンとのNP）を強く阻害する。更に，今掘l）は活性基でジアステレオアイソマ一塩形成による分割に際あるトランスーエポキシコハク酸（以下トES

してのスケールアップに必要な諸条件を検討した。

と略）部分が（2S，3S）配位を有するL体の方がD体よりも，極めて高い活性を示すことを報告している。従って，E−64及びその額縁体をヒト筋ジストロフィー症治療薬として開発していく上で，工業的規模で実用可能なt−ES製造法を確立することが極めて重要である。我々は既に報告2）した様にD−酒石酸より立体選択
的にL−t−ESを合成する方法を確立したが，この方法はD−酒石酸が高価であり，しかも，安定に確保することが困難であるという難点がある。我々は既に昨年度，フマール酸から安価に製造出来るラセミ体t−ESの分割法として種々のアミンを検討して，教程の有望な分割剤を発見した2）。本年度はこれらの中で最も実用性の高いと考えられるL一フェニルアラニソアミ

ド（以下L−Phe−NH2と略）及びデヒドロア
ビェチルアミン（以下DAAと略）についてその実用化に足るスケールアップ法を詳細に検討した。
＊大正製薬株式会社総合研究所

結果

前年度得られた分割剤の中で最も良い成績を示したLPhe−NH2について10倍にスケールアップして塩形成の諸条件を検討した。表1に示す様に溶媒中の含水量を少なくすると塩の収率は多少上昇するが，その旋光度から，逆に純度が低下することが判った。蓑2に示す様に塩形
成時の濃度は大きな影響を与えず，又，DL−t一
表1

L−フェニルアラニソアミドによるDL−ト
ラソスエポキシコハク酸の分割
一塩形成用溶媒の検討一

溶媒量：30ml
DL−tTES：30mmoI
L−Phe−NH2：30mmol
SoIvent Yield（％）〔α〕if（C＝1，MeOH）

95％MeOH

49．1＋58．20

98％

〝

77．7

＋13．00

100％

〟

66．7

＋7．90

11

Ⅰ製 造 方 法
表2

表3

L−フェニルアラニソアミドによるDL一ト

レフェニルアラニソアミドによるDL−ト

ラソスエポキシコハク酸の分割

ラソスエポキシコハク酸の分割−DL−トラソスエポキシコハク酸濃度の影−DLトラソスエポキソコハク酸とL−フェ

響一

ニルアラニソ比の塩形成率に及はす影響一

溶媒：95％MeOH

溶媒：95％MeOH30ml

DL−t−ES：30mmoI

DL−t−ES：30mmol

L−Phe−NH2：30mmol

L認諾冨2／Yield（％）〔a］g（C＝0・9MeOH）
V。1慧言e誌1）Yield（％）la］g（C＝0・9・MeOH）

5
4

7

7
4

5

5
3

1

2
2

9
4

4
2

1

7
2

8

0
3

6
4

6
3

表4

＋62．90＋58．20

1．0
1．1
1．2

49．1
36．3
64．6

＋58．20＋59．40＋7．90＋57．10＋58．30＋61．80L−フェニルアラニソアミドによるDL−トラソスエポキシコハク酸の分割−スケールアップー

A．Preparation of salt

DL−ES（g）

L−Phe−NH2（g）SoIvent
Yield（g）

0．396
27．7

0．492
34．4

〝

95％MeOH O．372（84％）
26．1（84％）〔α〕D＋64．60＋61．30

B．Separation

Salt（g）

MethodYield（g）

0．354
26．0

Ⅰ）owex50column O．128（81．1％）
soIvent extraction
8・34（72．5％）

ESと分割剤の比は麦3に示す様に小スケールの場合と同様に1：1（モル比）が良かった。
この様に検討した範囲では，塩形成は既報の条
件，即ち，95％メタノールにDL−t−ES及びL−Phe−NH2を共に1mmol／mlの濃度で溶解し，結晶を析出させる条件が最も良い成績を示した。しかし，前年度の結果と比べると収率がかなり低かったが，この原因はDL−t，ESの純度にあることが判った。後述する様に95％以上の患屯度の原料を用いれば，大スケールでも収率は80％を越えた。
この塩からL−t−ESを分離するために，従来イオン交換闘旨を用いて釆たが，これは大量処理には不適である。そこで，溶媒抽出法につ12〔α〕D Overallyield＋109．80＋115．40

68・0％
61・0％

いて検討したところ，硫酸々性水溶液より酢酸
ェチルで効率よく抽出分離しうることがわかった。収率はイオン交換樹脂法より若干落ちるが，得られたしトESの純度は更に上昇した。
同条件下で約70倍のスケールで行った分割結果を表4にまとめて示す。
次いで，LPhe−NH2よりもはるかに安価に入手出来る

DAAについて同様にスケールア

ップ条件を塩形成の際の溶媒として種々の含水
量のエタノール及びアセトンについて検討した。麦5に見られる様にエタノールの場合収率は高いが純度は低い。これを再結晶しても純度は上昇するが，収率は大幅に低下するので，アセトンを溶媒として用いる方がはるかに優れて2．DL−トランスーエポキシコハク酸の光学分割法に関する研究
表5

デヒドpアビェチルアミンによるDLトラソスエポキシコハク酸の分割
一塩作成用溶媒の検討−
DL−トES：30mmoI DAA：30mmol

SoIvent Volume（ml）〟

04

95％acetone
85％

〟

5
1

〟

0
3

90％

表6

b〕iF（C＝1，MeOH）

108．6

0
1

95％

Yield（％）
01

100％ethano1

98．4＋25．60＋22．4078．1＋45．5065．5＋53．4062．0＋52．70デヒドロアビェチルアミンによるDL−トランスエポキシコハク酸の分割−DL−トランスエポキシコハク酸濃度の影響一
溶媒：90％アセトソ
DL−t−ES：10mmoI DAA：10mmol
Yield（％）

5
1

1
7

2

0
2

6
6

4

0
3

8
6

4

7
6

8

5
3

SoIventvolume（ml）

表7b〕iI（C＝1，MeOH）＋48．10＋51．50＋50．70＋51．80デヒドロアビェチルアミンによるDLトランスエポキシコハク酸の分割−DLトラソスエポキシコハク酸デヒドpアビェチルアミソ比の塩形成率に及ぼす効果一
溶媒：90％ア七トソ

DL−t−ES：10mmol

DAA／DL−t−ES Yield（％）
0

1

67．2

＋52．6084．0＋49．2099．4
121．7＋48．00＋42．20168．1＋34．30

2

1
1

4

1

6

2

0

表8

〔α〕iI（C＝1，MeOH）

DL−トラソスーエポキシコハク酸のデヒドロアビェチルアミンによる大量分割

A．Preparation of salt
DL−ES（g）

DAA SoIvent
Yield（g）

0・661
36・6

100

〔α〕D

1．427
EtOH O．56（31．1％）
90％acetone
86（83．8％）＋50．80＋52．60

B．Separation

Salt（g）

MethodYield（g）〔α〕D Overallyield

0・549
Dowex50column O．081（84．1％） ＋115．90
86・O soIventextraction lO．7（66．1％）＋115．7O

26．2％
55．4％

13

Ⅰ製 造 方 法いる。次に，DLt−ESに対する溶媒量を検討したが大きな差異は認められなかった（麦6）。
一方，DLt−ESと分割剤の比率は表7に示す
様に分割効率に影響が認められ，収率及び純度を考慮して1‥1．2〜1．4が良いと思われる0塩からL−t−ESの分離は前述のL−Phe−NH2

ることが可能であろう。しかしながら，実用面
から見ると後者は極めて安価に入手出来る点，より有用である。しかも，用いた分割剤は溶媒抽出により約70〜80％が回収可能であるので大規模になる程，コストダウンができるという利点がある。

の場合と同様に溶媒抽出により，アルカリ性水

参考文献

溶液よりク。ロホルムでDAAを抽出して除いた後，水屑を酸性にして酢酸エチルでLt−ES

1）今掘和友：私信．

を抽出することが出来た。

2）沢田二郎：レトランスエポキシコハク酸製造法
に関する研究，昭和54年度研究報告書，p・15，

これらの結果をもとに既報のスケールの約55倍の規模にスケールアップしたところ，表8に示した様に通算収率が約2倍という好結果が得
られた。

1980．

3）W．J．Gottstein，L．C・Cheney：Dehydroabie−
thylamine．A new resoIving agent，J・Org・
Chem．，30，2027，1965．

4）G．B．Payne，P．H．Wiliams：Reactionofhy−

考察

L−Phe−NH2，DAAで分割する方法共に今後，更に工場スケールにまでスケールアップす14

droperoxide

Ⅳ．Sodium tungstate catalyzed

epoxidation ofα，β−unSaturatedacid，J・Org・
Cbemリ24，54，1959．

3．E−64−C標識体の製造

沢田

研究協力者 花 田 和 紀＊

玉

小

目

熊

清

二

郎＊

井

正

晴＊

安

達

孝＊

司＊

的

1．〔lJC〕E−64−Cの製造法
1）f一野山0Ⅹyearbonyl−レ〔HC〕leueime monohyd・

昭和54年度における本事業の成果として合成
E−64−Cが天然E−64に十分代替し得るという結果を得，既に〔3H〕−ラベル体を用い大関によ

L−〔U−14C〕Leucine（1．31g，30mCi）及びtriethylamine（1．52g）の水溶液（60ml）にりその生体内動態について報告されている1）。

t−butyl−S−4，6−dimethylpyrimidine−2−ylthi−

本研究の目的は E−64−C の Ca＋＋−aCtivatedOCarbonate（4．4g）の dioxane溶液を水冷
授拝下滴下した後，2時間室温で撹拝した。一neutralproteaseあるいはCathepsin等に対する阻害機構の解明，及び代謝，生体内分布等，〔3H〕−ラベル体による研究をふまえ，更にHC
標識化合物により，より詳細に検討するためその試料として，〔HC〕E−64−C を製造，提供することにある。あわせて，将来人にも適用が可
能な〔2H〕−ラベル体を製造し，その応用性を動物レベルで検討する目的で活性基であるェポキ
シコハク酸部分に〔2H〕を導入した〔2H〕E−
64−Cを製造することにある。
方法〔HC〕E−64−C は L−〔U一日C〕Leucine を原料として既報のE−64−C合成法2）に準じて，図1に示す様なルートで合成した。又，〔2H〕E−
64−C は図2に示す様に〔2，3−2H〕Fumaric
acidを出発原料とし，K．Hanada等の方法3）に準じてDL−tranS−ethylhydrogenepoxysu・CCinateを得，それを原料としてE−64−C合成法に準じて合成した。各反応を以下に述べる。

＊大正製薬株式会社総合研究所

夜放置後，水（50ml）を加え，ethylacetate（50mlx2）で抽出した。水屑を塩酸々性にしてethylacetate（50mlx3）で抽出し，その有機層を5％塩酸水及び飽和食塩水で順次洗浄し，無水硫酸マグネシウム上で乾燥後，濃縮乾固した。得られた残汝をェクノールー水より結晶化し，そのまま次の反応に供した。
2）f−Butoxyearbonyl−L−〔Hql印亡ylisoamylamine．

上記 t−butoxycarbonyl−L−〔HC〕1eucine
monohydrate，1−hydroxybenztriazol（1．62g），N−methylmorforine（1．21g）及びisoa・mylamine（1．044g）のtetrahydrofurane溶液（2．5ml）に氷冷掟押下，1−ethyL3−（3−dimethylaminopropyl）carbodiimidellydr−

OChloride（2．3g）を徐々に加え，氷冷下1時間，更に室温で2時間掟拝した後，一夜放置した。溶媒を留去後，残睦を水（50ml）に溶解
し，ethylacetate（50mlx3）で抽出した。有機層を合わせ，5％塩酸水，飽和重曹水及び飽
和食塩水で順次洗浄し，乾燥後濃縮乾固し，2．31gの目的物を得た。（収率：1），2）を通算して77％）
15

Ⅰ製 造 方 法
3）L〔HC〕LeWylisoamylamime．
t−Butoxycarbonyl−L−〔lLC〕leucylisoamyl−

amine（2．31g）をギ酸（2．5ml）に溶解し，一夜放置後ギ酸を減圧下留去した。残誼に水を加え，NaOH溶液でアルカリ性にした後，etby−
lacetate（50mlx3）で抽出した。右横層を合わせ，飽和食塩水で洗浄し，乾燥後濃縮乾固し，1．36gの目的物を得た。（収率：88．3％）
4）N−〔Ⅳ−（L−3−frα那一Ethoxyearbonyloxirane−2−

Carbonyl）−レ〔1−C〕lencyl〕isoamylamine・
L−〔1＋C〕Leucylisoamylamine（1．36g），L−g）の30％過酸化水素水（12ml）溶液を加え，NaOH溶液（1．72g，5ml）でpH4．2に調整しながら，650Cで2時間紀拝した。残余NaOH
溶液を加え，更に850Cで1時間置拝した後，BaC12・2H20（42g）の水路液（100ml）を加え2時間室温に放置した。生じた沈殿を炉取し，アセトンで洗浄後，乾燥した。得られた粉末を，H2SO4（8．4g）を含むethylether（100ml）に懸濁し，3時間教拝抽出した0 残堕より再抽出したethylether溶液を合わせ，濃縮
乾回して目的物6．75gを得た。（収率：60．1

ethylhydrogenepoxysuccinate（1．28g），1−％）hydroxybenztriazol（1・08g）及びN−methy−lmorforine（0．81g）を tetrahydrofurane（75ml）に溶解し，氷冷撹拝下，1−ethy1−3−

2）DL−〔2ⅠⅠ〕一打仰8−Diethylepoxysuccimate・（3−dimethylaminopropyl）carbodiimidehy−

drochloride（1．48g）を徐々に加え，室温で4時間摂拝した。溶媒を留去し，残達に水（60ml）を加えた後，ethylacetate（50mlx3）で抽出した。有揆層を合わせ，5％塩酸水，飽和
重曹水及び飽和食塩水で洗浄し，乾燥後濃縮乾固した。残法を ethylether−n−hexane より結晶化し，1．67gの目的物を得た。（収率：71．7％）
5）Ⅳ−〔N−（L−3−frα几8−Carboxyoxirane−2−Cart）On・yl）−L−〔HC〕lelleyl〕isoamylamine（〔HC〕E−64−C）

N−〔N−（L−3−tranS−Ethoxycarbonyloxira−ne−2−Carbonyl）−L−〔llC〕leucylisoamylami−ne（1．67g）のethanol溶液（10ml）にeth−anol一水温液（4：1，2．5ml）にNaOH（2．9g）を溶解して氷冷授拝下滴下した後，室温で4時間紀拝した。10％塩酸水（50ml）を加えて酸性にした後，ethylacetate（70mlx3）で抽出した。有揆層を合わせ，飽和食塩水で洗浄し，

DL−〔2H〕−tranS−Epoxysuccinicacid（6・75g）及び，f−tOluensulfonicacid（0・4e6g）を
ethanol（300ml）に溶解し，6時間煮沸還流した。溶媒を留去後，残蔭をbenzene（300ml）に溶解し，飽和重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄し，乾燥後，溶媒を留去した。得られた油状物を減圧分留して目的物6．93gを得た。（収率：73．5％）3）DI．一〔ZE〕−frαn＄−EtIlyl hydrogen epoxy8uCC−
inate．

DL−〔2H〕−tranS−Diethylepoxysuccinate（6．83g）のethanol溶液（13ml）に氷冷紀拝下，KOH（2．24g）のethanol溶液（20ml）を摘下し，水冷下2時間，更に室温で1時間舵拝した。Ethylether（26ml）を加え，生じた沈殿を炉取した。この沈殿の水溶液（15ml）
を塩酸々性にした後，ethylacetate（20mlx3）で抽出した。有機層を合わせ，飽和食塩水で洗浄し，次いで乾燥後濃縮乾固し目的物5．05gを得た。（収率：70％）
4）Ⅳ−〔N−（DL−〔2H〕−3−frd乃8−El血0ⅩyCarbomyloxi−

rame−2−Carbonyl）−Lleucyl〕isoamylamime．
I）L−〔2H〕−tranS−Ethylhydrogenepoxysu−

乾燥後濃縮した。Ethylacetate−pet−ether より結晶化し，1．223gの目的物を得た。（収率：80．5％）

ccinate（5．05g），L−teucylisoamylamine（6．6

2．Dlr〔2H〕−E−64−Cの製造法

methylmorforine（3．33g）のtetrahydrof−

1）DL−〔2H〕−frα那−epOXySllCCimie acid．

urane溶液（250ml）に氷冷授拝下，1−ethy1g），1−hydroxybenztriazol（4．46g）及びN−〔2，3−2H〕Fumaricacid（10g）及びNaOH−3−（dimethylaminopropyl）carbodiimideh−（5．16g）の水懸濁液に∴Na2WO4・2H20（2．82

ydrochloride（6．32g）を徐々に加え氷冷下2163．E−64−C標識体の製造時間好拝後，一夜50Cに放置した。溶媒を留去後，残法に水（100ml）を加え，ethylacetate（100mlx2）で抽出した。右横層を合わせ，5％塩酸水，飽和重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄し，乾燥後濃縮乾回した。残淀をシリカゲル

N−〔N−DL−〔2H〕−3−tranS−Ethoxycarbony−loxirane−2−Carbonyl）−L−leucyl〕isoamyla−mine（4．65g）の ethanol溶液（26ml）にNaOH（0．72g）の80％含水 ethanol溶液を氷冷授押下滴下した後，更に室温で3時間接拝した。反応液に5％塩酸水（50ml）を加えて酸性にした後，ethylacetate（70mlx3）で抽出した。右横層を合わせ，飽和食塩水で洗浄し，次いで乾燥後濃縮乾固し目的物2．89gを得た。（収率：69％）

カラムクロマトグラフィー（cIlloroform）で精製して目的物4．65gを得た。（収率43％）
5）Ⅳ−〔Ⅳ−（DL−〔2Ⅱ〕−3−frα那−CaTboxyoxirame−2−
eaTbonyl）−LleⅦCyl〕isoamylamine（〔2ⅠⅠ〕E−
64−e）

ES

〔U−14C〕−Leu Isoamylamine YieJd（％）

B oc

OH

OH

H

B oc

77．0

H

88．3
71．7
80．5

0verall：38．9
Tota111．16mCi（S．A．2．87mCi／m mol）
図1〔HC〕E−64−Cの製造行程

図2〔HC〕E−64−Cのラジオクロマトグラム

17

Ⅰ製 造 方 法

Yield（％）

。。＿慧C＝Cく冨￣060．1／C0−OH

H−Leu−isoamylamine

oc／
Cく
＝
〝C＼2H

OEt
OH

73．5
87．5

H

43．0
69．0

Overa11：11．5
図3 DL−〔2H〕E−64−Cの製造行程

結果DL−〔2H〕E−64−Cを得た0
考〔14C〕E−64−Cは図1に示した様にL−〔UT14C〕
Leucineより5段階の反応を経て得られた。
第1段階の Boc化反応の際，原料のし〔U−14C〕bucineが稀薄水溶液であるため反応が十分進行しないことが予備実験でわかった0
又，水溶液を濃縮すると分解の恐れがあるので反応条件を検討し，Boc化試薬を倍量用いることにより問題を解決することが出来，全行程の通算収率で最終的に11．6mCiの目的物（比活察E−64−Cの酵素阻害活性基はレトランスーエ
ポキシコハク酸部分にある。従って，生体内動態，特に標的組織への分布を調べるには・この活性基の代謝を追跡することが極めて大切である。しかしながら，現段階ではしトランスーエ
ポキシコハク酸部分を〔14C〕で標識することは合成上極めて困難である0
大関らは〔3H〕E−64−Cを皮下投与し，放射性2．87mCi／mmol）を得ることが出来たO最終産物は，図2に示した以外の展開溶媒でも活性の大部分は未変化体E−64−Cであることを

TLCのラジオクロマトグラムで単一ピークを示し，放射化学的に純粋であることが確認出来標識したE−64−Cもその用途により十分利用しうると期待される。又，得られた標晶は極めてた。同時に，種々の発色剤で定性的に調べた純度が高く，十分に実験に供しうることがわかが，不純物は検出されず，極めて高純度であることが認められた。

った。

報告している。この事実より，ロイシン部分にしかし，経口投与の場合，トランスーエポキ〔2H〕E−64−Cの製造ルートは図3にまとめ

シコハク酸とロイシンの間の結合が一部切断さた。この方法ではフマール酸からDLトランれるという結果が得られているので，代謝産物

スエポキシコハク酸が得られるため，最終産物を詳細に検討する際，トランスーエポキシコハ

はエポキシコハク酸部分がD及びL体のジアス
テレオアイソマーの混合物である。DLトラン

ク酸部分に〔2H〕標識された化合物は有用な武器となりうると考えられる。又，本品は上述のスーエポキシコハク酸のエステル化の際，従来は触媒として硫酸を用いていたが，かトルエン

如く，DL混合物であり，収率も若干低いが，別項に報告した様にDLトランスーエポキシコ

スルホン酸を用いることにより，硫酸触媒法のハク酸の光学分割も可能であるので，今後，目平均収率より約10％高い収率でジェスチルを得

的に応じ光学的に純粋な〔2H〕E−64−Cの製造ることが出来た。以上の方法により2・9gのも可能である。

18

3．E−64−C標識体の製造る研究，同上p．9．
3）l（．Hanada，M．Tamai，S．Morimoto，T，
1）大関正弘：E−64及びその類縁体の生体内動態にAdachi，S．Ohmura，S．Sawada，Ⅰ．Tanaka：
関する研究，昭和54年度研究報告書p・145，1979・
Inhibitoryactivityof E−64derivativesonpa−
2）沢田二郎：E−64及びその類縁体の製造法に閑す
pain，Agric．Biol．Chem．，42，537，1978．

参考文献

19

4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討

沢
研究協力者

和志武
小

目

沢

田

三

徳＊

林

康

雄＊

小

的

E−64−Cはヒト進行性筋ジストロフィー症に対する薬効が期待され，その治療薬として適用するために多角的検討がなされてきており，標的酵素であるCa＋＋−aCtivated neutral prot−ease及びカテプシソB，L等に対する阻害活性を看することが既に確認されている1）・2）。
一方，E−64−Cをモデル疾患動物において評価する場合，投与条件が血中濃度に影響し，さらには作用部位である筋肉細胞内の濃度にも影響することが考えられる。
本研究の目的は，最も有効な投与ルート，剤形などを決めるにあたって必要な基本的データ
であるE−64−Cの物理化学的性質及び生体に授与した場合の薬動力学的パラメーターを明らかにし，次にこれらに基づき基礎的な製剤化の検討をすること′にある。

1．物理化学的性質
方法

木実験に用いた試料は当研究所において合成されたもので，構造式，化学名，分子式，分子量及び元素分析値を表1に示す。
また，日本薬局方通則及び一般試験法により測定した性状，融点，重金属，ヒ素，塩化物，
乾燥減量及び強熱残分の結果は表2のとおりで＊大正製薬株式会社総合研究所

二

山

郎＊
英

文＊

玉

城

正

夫＊

郁

夫＊

中

池

郁

子＊

あった。
（1）各種溶媒に対する溶解性
各種溶媒に対する溶解性を日本薬局方通則に従って試験した。
但）解離定数（pIb）
解離定数を滴定法3）により求めた。本品157
mgをとり，新たに煮沸し冷却した蒸留水47．5mlを加えて溶かす。この液を窒素気流中で撹拝しながら 0・lN水酸化ナトリウム液（f＝0．943）で滴定した。
（3）旗光度
本品0．1gを精密に量り，測定溶媒を加えて溶かし正確に10mlとする。この液につき，層長100mmの測定管を用いて日本薬局方一般試験法の旋光度測定法により測定し，比旋光度（〔α〕訂）を求めた。
（4）分配係数
本品の200〝g／mlの酢酸エチル溶液を調製する。この液20mlずつを正確にとり，それぞれにpHlの0・2M塩化カリウム一塩酸緩衝液及びpH2．5，4．5，7．0，9．0のBritton−
Robinson緩衝液各20mlを加え，370で1時間振返する。遠心分離した後，水屑及び有機層中のE−64−Cの濃度を液体クロマトグラフ法4）
により定量し，分配係数を求めた。
（5）吸湿性
本品約0．5gをガラス容器にとり，1050で2時間乾燥した後，相対湿度54％（臭化カリウム
飽和溶液），75％（塩化ナトリウム飽和溶液）
及び82％（塩化カリウム飽和溶液）のデシケー
21

Ⅰ製 造 方 法
表l E−64−Cの構造

Structural formula

H。。敦≡ONH￡還H2CHく諾

Chemical name

N一〔N−（L−3−tranS−Carboxyoxirane−2−Carbonyl）一LTleucyl〕−3−methyl一

Molecular formula

ClSH26N205

Molecular weight314．38butylamine（E−64−C）

C，57．31H，8．34N，8．91

Found C，57．35

H，8．51

N，8．89Anal．

Elementary analysIS

表2 品質試験
Impllrities

Determination method Result

Whitecrystalsorcrystalline

Description

powder with odourless anda slightly bitter taste
Melting point

J，P．9First method

156．00

HeaYy metals

J．P．9Second method＜10ppmArsenic

J．P．9Third method＜2ppm

Chloride

J．P．9

Loss on drying

J．P．9（1g，1050，2br）Residue onignition

J．P．9＜0．036％
0．32％
0．03％

クー中に入れ，400の恒温室に7日間放置し，重量増加率（％）を化学はかりを用いて測定した。

（9）Ⅹ綾回折
本品をめのう乳鉢で粉砕した後，ホルダーに
つめ，Ⅹ線発生管球対陰極は鋼（ニッケルフィ（6）赤外吸収スペクトルルター），ゴニオメータ走査速度は毎分lO（2の本品3mgに臭化カリウム0．5gを加え，乳の条件で測定した。

鉢で粉砕混合したものにつき，日本薬局一般試（10）定量法（満定法）

験法の赤外吸収スペクトル測定法の臭化カリウ

本品を乾放し，その約0．5gを精密に量り，ム錠剤法により測定した。

中和エタノール20mlを加えて溶かし，更に（7）核磁気共鳴スペクトル

水30mlを加えた後，0．1N水酸化ナトリウ

本品0．04gに重アセトン0．4mlを加えてム液（f＝1．083）で摘定した（指示薬：プロム

溶かした液につき，内部基準として添加したテクレゾールグリン試液4滴）。ただし，滴定の終点は液の黄色が青色に変わるときとする。

トラメチルシランのシグナルをOppmとし，60MHzの共鳴周波数で水素核について0〜12
ppmの範囲を掃引した。
（8）勲分析
本品約0．01gをとり，α一アルミナを対照とし，室温から3500まで100／分で昇温させ，示
差走査熱分析（DSC）及び熱重量分析（TG）を行った。

0．1N水酸化ナトリウム液1ml＝31．438mg C15H26N205（11）水溶液中での安定性
各種pH．（3〜10）のBritton−Robinson緩衝液を用い，本品の濃度20J唱／mlの溶液を調製する。この液をガラスアンプルに充てんし，650保存における残存率の経時的変化を液体ク
ロマトグラフ法4）により測定した。また，同様

22

4．E−64一〇の物理化学的性質及び製剤化の検討
表3 各種溶媒に対する溶解性S。lvents SolubilitySoIvent（ml）／Solute（1g）DescriptiveterminJ・P・9

MetbanoI

0．9

Very solubleI）ehdrated ethanoI

1．4

Freely soluble

4．3

Freely soluble

AcetoneDioxane25

SolubleEthyl acetate
Dichloromethane

44

Sparingly soluble

150

Slightly soluble

Water

250

Sligbtly soluble

Etber

850

Sligbtly soluble

n−Hexane

Practicallyinsoluble＞10，000

表4 解離定数（250）0・lNNaOHadded（ml）

pH log等吉宗
9
3

2

0
4

2

7
3

2

−0．15

7
3

2

−0．23

9
3

2

−0．31

9
3

2

−0．55

7
3

2

−0．42

8
3

2

3

−0．70

9
3

3

4

5

2

2

0
0
2
9
3
7 8 9 0 3

2

2

0
6

2

2

0

2
5

3

5

2

3

0

6
4

2

5

2

2

0

9
3

1

5

2
3

1

0

4

0

5

2

0

0．00
−0．06

−0．94

Mean〔pXa〕2．38にしてpH7．4の1／15Mリン酸塩緩衝液中における安定性を650，800及び1000保存について検討し，温度依存性を調べた。

表5 各種溶媒中における比旋光度（〔α〕諾）SoIvents

etbanol＋44．50＋44．40＋44．30

各測定結果を表3〜9及び図1〜6に示す。
各種溶媒に対する溶解性はメタノールに極めて溶けやすく，無水エタノール又はアセトンに溶

Mean＋44．40Dehydrated

結果及び考察〔α〕i：（C＝1・0）＋10．lO
Dioxane＋9．80＋10．00＋10．00

けやすく，ジオキサンにやや溶けやすく，n−ヘ
表6 分配係数（370）

キサンにほとんど溶けなかった（表3）。pKa
は2．38であり，エポキシ基の電子吸引性により

0

9

0

4

7

0

7

3

5

■

0

＜ ＜

0

5 1 1
1 0 0

1

4

．

5

4

4

2

も右旋性を示し，比旋光度はそれぞれ＋44．40
及び＋10．00であった（表5）。酢酸エチルー

0

ノール及びジオキサンのいずれの溶媒において

1

強い酸性を示した（表4）。旋光度は無水エタ

Ethylacetate／Water＊

水系における分配係数は通常の一塩基酸と同様にpHが高くなるにつれて減少した（表6）。

＊Britton−Robinson buffer

23

Ⅰ

製

造

方

法

表8 定 量 値

表7 吸湿性（400，7日間）
Relative

Assay Results（％）

9
9

5

9
9

6

9
9

7

9
9

6

0

0

9
9

0

0

4

0

0

9
9

0

0

6

0

0

4

No・慧慧iて芸）mOisture Mean（％）

99humidity（％）

00

表9 水溶液中での安定性（650）Residualcontent（％）
0

4

H
p

O

3

H
p

TimeinDays

pH5．O pl16．O pH7．O pH8．O pH9．O pHlO．0
100．0

100．0

100．0

100．0

100．0

100．0

94．6

97．0

98．0

95．0

94．5

89．4

77．8

78．9

78．9

77．5

76．0

67．7

62．6

61．8

61．3

59．5

54．5

46．2

47．1

47．3

48．2

42．5

39．1

27．6

吸湿性は全く認められなかった（表7）。赤外基のαメチソ基プロトンに，∂7．60及び∂7．74

吸収スペクトルの主な吸収帯はそれぞれ3250
cm▼1はN−H伸縮振動，2950cm．1はC−Hの2Hに相当するシグナルは2つのNHプロ

伸縮振動，1720cm￣1ほカルポキシルC＝0伸ナルはカルポキシル基のプロトンにそれぞれ帰縮振動，1680cm￣1及び1620cm￣1はアミド属することができた（図2）。熱分析は1530に

C＝0伸縮振動，1570cm￣1はN−H変角振融解による鋭い吸熱ピークを示し，1900付近に動，890cm￣1はエポキシ環の逆対称環伸縮振動の吸収に矛盾なく帰属することができた（図

熱分解による発熱ピークと急激な重量の減少をトンに，∂10．13のlHに相当する幅広いシグ示した（図3）。Ⅹ線回折は結晶性を示した（図1）。核磁気共鳴スペクトルの∂0．83及び∂4）。定量法は0．1N水酸化ナトリウム液を用0．92の12Hに相当するシグナルはロイシル基

い，プロムクレゾールグリンを指示薬とする中及び3−メチルプチルアミンのメチル基プロト

和滴定法について検討したところ，良好な結果

ンに，∂1．29〜1．67の6Hに相当する多重線
はロイシル基のメチレン基及びメチン基プロトを得た（表8）。水溶液中での安定性については，
残存率の経時的変化（表9）からE−64−Cの分

ン並びに3−メチルプチルアミンの2位メチレ

解は一次反応式に従うことがわかった。分解反ン基及びメチン基プロトンに，∂3．21の2Hに応速度定数kを求め，PHとlogkの関係を示相当する四重線（J＝7Hz）は3−メチルプチル

した（図5）。この結果，分解反応速度定数のアミンの1位メチレン基プロトンに，∂3．54及

対数はpH3〜10の範囲で大きな変化を示さな

び∂3．65の2Hに相当する2つの二重線（J＝かった。また，pH7．4におけるアレニウスプ

2Hz）はエポキシ環のプロトンに，∂4．49のロット（図6）より得られた直線の傾きから活1Hに相当する四重線（J＝7Hz）はロイシル

性化エネルギーEaは23．2kcal／moleであ24

4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討
ABSORBANCE
N
く⊃

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寸

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く工〉
く＞

の

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く＞

J

くつ

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N

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2

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完

ノ ヨ

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ー■

ミ⊥hYK望変成感蔵竹 N姦

寸

4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討
1900

1530

図3 熱 分 析り，250保存における分解反応速度定数及び903）製剤化の検討に用いた処方％残存期間はそれぞれ1．68×10￣1（day￣1），627

水溶液，水性懸濁液，油性懸濁液及びェマル（day）と予測された。この結果より，水溶液の製剤化には若干の安定化が必要である。

度はいずれの基剤も10％とした。水溶性基剤と2．製剤化検討
方法（1）使用動物
ウサギは日本白色在来雄性体重約3kgを，犬はピーグル犬雄性体重約10kgを用いた。
（2）投与法ウサギの静江は耳静脈より，犬は前腕静脈よりそれぞれ投与した。経口投与と直腸投与は24時間絶食後，試験に供した。筋注は大腿四頭筋
肉へ，また皮下注は背部皮下にそれぞれ投与した。
（3）投与製剤の調製
1）静注パラメーターの算出に用いた処方
2％重曹水溶液にE−64−Cを5，20，50mg／mlの濃度に溶解した。
2）投与ルートの検討に用いた処方
E−64−Cに水酸化ナトリウム水溶液を適量用いて溶解（Na sol．）し，これに注射用蒸留水を加えて10％溶液を調製した。

ジョンの各基剤について調製し，E−64−Cの濃しては投与ルートの検討に用いた処方（NaSOl．）を基本処方とし，これに∴ポリビニルピp
リドンを10％配合した処方（PVP sol．），ニッ
コールBC−15TXを5％配合した処方（BC−15TX），更に，ニッコールMYS−25とリノール酸をそれぞれ5％配合した処方（MYS−25，
Oil）の3処方を調製した。エマルジョン剤としては基本処方にコーン油を84％とニッコール
S0−15を配合した油中水型の処方（W／Oemul．）を調製した。水性懸濁剤としては1％のCMC水溶液にE−64−Cを10％懸濁した処
方（CMCsusp．）を，また，油性懸濁剤としてはコーン油にE−64−Cを10％懸濁した処方（Oilsusp．）をそれぞれ調製した。
4）採血法
ウサギは耳静脈より，犬は前腕静脈より，いずれもヘパリン処理注射筒にて採血した。
5）定量法
血中のE−64−Cの定量は沢田4）らの液体クロマトグラフ法で実施した。供試動物の血渠0．5
mlに5％リン酸溶液0．5mlを加えた後，分光分析用酢酸エチル7mlを加えてよく振り混ぜ，
27

Ⅰ製 造 方 法

28

≡

宗

⊂＞
⊂＞
I．−1

くつ
Cb OO

冨

2

⊂＞

く⊃
【、

吉

⊂＞
くJ⊃

宗

くつ
uつ

等

くつ

宍

⊂⊃
■寸

完

くつ
M N

くつ
▼■■｛

3．0

⊂〉

4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討−1」0−−−−−0−−−−−−0−−−−0−−−−や−一・・・一・・・く＞一・・・・一・〇．一一一

圭一2
J
b凸

j−3
−4

3

4

5

6

8

7

9

10

pH
図5

pHプロファイル（650）︵Tをp︶メぎJ
2．7

2．8

2．9

3．0

与×103
図6

アレニウスプロット（pH7．4）

3分間遠心分離（3000r．p．m．）する。この酢
酸エチル層5mlを分取し，減圧下に濃縮す
る0残留物を溶離液0．5mlに溶かし，この液を液体クロマトグラフの試料とする。E−64−Cの標準溶液とのピーク比から血菜中濃度を算出した。
結果及び考察一般に製剤化にあたっては主薬の物理化学
的，生物薬剤学的な性質を明らかにし，生体に適用されたときの条件を配慮して，投与ルー

ト，剤形を決定する。E−64−Cの生体内挙動については既に大関5）らによる報告がある。これによるとE−64−Cは経口投与では血中，尿中ともにほとんどが代謝物として存在しているのに対し，皮下注及び筋注では未変化体として存在
し，静江した場合には血中からの消失は速やかであることが明らかとなっている。我々はこれらの事実をもとにE−64−Cの製剤化について基礎的検討を加えた。
（1）E−64−Cの静注パラメーター
種々のルートから投与されたE−64−Cはまず29

Ⅰ製 造 方 法︵昌Sdld l∈＼営︶ PL芸丁山lTime（hr）
図7 静江後の血中濃度（2〜3例平均）表102−コソバートメソトモデルから求めた静注パラメーター
犬（2〜3例平均）30

4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討︵言Sdtd−E＼翌︶
0

PL岩丁山

1

2

3

4

5

6

Time（hr）

図8 投与ルートと血中濃度（投与量；50mg／kg ウサギ，2例平均）循環系に移行し，次に作用部位に到達する。し

ついて検討する目的で犬にE−64−Cを20mg／

たがって投与ルートや剤形の検討にあたっては循環系への移行量と速度が重要な指標となる。

kg授与し，ウサギと同様に静注パラメーターを算出した。その結果，プラズマ総クリアラン

静脈内投与は薬物が100％瞬間に循環系に移行

ス（Cl）はウサギのはば半分であり，半減期する投与ルートであり，これから得られたパラ（Tちらβ）はウサギよりもやや長く，犬の方がメーターは他の投与ルートや剤形の検討におい血中からの消失がやや遅いことを認めた。

て基準となる。図7はウサギと犬について種々但）投与ルートの検討の濃度でE−64−Cの2％重曹水溶液を静江した

ウサギにE−64−Cを体重1kg当たり50mg

ときの血中濃度のパターンをみたものである。
表10にこの結果を2−コンパートメントモデルをの割合で水溶液として，種々のルートで投与したときの血中濃度パターンを図8に示す。その用いて解析して得たパラメーターを示す。デー

結果，経口投与の場合，血中にE−64−Cは検出

タ解析は最小二乗法のプログラム（NONLIN）
を用いた0 ウサギについてみれば血中濃度と血されなかった。そこで100mg／kgに増量して検討を加えたが，やはり検出されなかった。次中濃度曲線下面積（AUC）はほぼ段与量に比に種差の影響をみるために犬を選び100mg／

例し，生物学的半減期（T扱β）は投与量を5mg／kgから50mg／kgと変えてもほぼ20分とkgの投与量で経口投与を試みた。その結果，一定値を示した。これらのことからこの投与範囲において，E−64−Cは線形性を有しているこらの吸収は悪いものと考えられる。一方直腸投とが示唆され，今回得た静注パラメーターは投やはり血中にE−64−Cは検出されず，消化管か与の場合，E−64−Cは血中に出現したが，AUC

与ルートと剤形の検討を行う際の基準となりえは3．57J唱・ml￣1・hrであり，吸収量の指標である静往時のAUCの約6％にすぎなかった。

ることが明らかとなった。次に動物問の種差に皮下投与の場合は血中への移行は速やかであり
31

Ⅰ製 造 方 法C〇Na sol．

S．C．

＝

CMC susp．S．C．

△

A Oil susp．i．m・

0
4
0
3

︵昌Sdtd lE＼翌︶ U⊥∽丁凹

＝

▲＝−−▲

CMC susp．i．m．

◇一・一◇

PVP sol．

S．C．

◆一一→ W／O emul．i．m．

ヽ−、ヽ、、−＼、＼、一、㌧＼、Time（hr）
図9 注射剤の血中濃度（投与量；50mg／kgウサギ，2例平均）︵岩Sdtd tu＼翌︶ 0−芯−凹2Time（hr）
図10 直腸投与後の血中濃度に対する添加剤の影響（投与量；50mg／kgウサギ，2例平均）32

4．E−64−Cの物理化学的性質及び製剤化の検討

30分以内に最高血中濃度を示した。AUCは静往時の約80％の値を示し，皮下投与の場合，吸収率が良いことが明らかとなった。
招）製剤化検討
投与ルートの検討の結果，経口投与では血中にE−64−Cを認めなかったが，直腸投与の場
合，少量ではあるが検出した。また皮下投与の場合，吸収効率は良いが，血中からの消失が速いことが明らかとなった。そこでまず注射剤の血中濃度を持続化させるために種々の処方を調製し，ウサギを用いて検討した。その結果を図9に示す。基本処方（Na sol．）にPVPを10％加えた処方（PVPsol．）を皮下投与した場
合，基本処方とほぼ同等のAUCを示し，かつ血中濃度パターンは持続化型となった。コーン油を用いた池中水型のエマルジョン性注射剤（W／Oemul・）を筋肉内投与した場合，最高血中濃度は基本処方の約半分となりかつ6時間における濃度は基本処方が痕跡であるのに対し3・0／唱／mlの比較的高い値を示した。一方CMCを用いた水性懸濁液（CMCsusp．）を皮下投与及び筋肉内投与した場合には初期に著しい吸収抑制を認めたが持続化は認められなかった○ また，コーン油を用いた油性懸濁剤（OilSuSp・）を筋肉内投与した場合，同様に持続化を認めなかった0次に直腸投与での吸収効率の増大を計るために添加剤の配合による処方検討を実施した。その結果，図10に示すようにエーテル系活性剤を配合した処方（BC−15TX）及びェステル系活性剤とリノール酸を配合した処方（MYS−250il）の場合には著しい吸収の増加が認められ，両処方のAUCは静往時のAUCとほぼ同等となり，添加剤の選択により直腸投与の可能性が示唆された。

結論

E−64−Cの物理化学的性質及び薬動力学的パ
ラメーターを明らかにし，基礎的な製剤化の検討を行った。
E−64−Cは光学的に活性（右旋性）な強い酸性物質（pXa2．38）であった。
静江後の半減期はウサギで約21分，犬では約29分であった。静注の場合の血中濃度曲線下面
積（AUC）を100とすると，皮下注，直腸投
与，経口投与の場合のAUCはそれぞれ81．9，
5．5，0であり，投与ルートにより bioavaila−
bilityに差が認められた0
皮下投与の場合，E−64−Cは血中か■らの消失は速やかであった。ある種の高分子（PVP）の添加及び油中水型のエマルジョンで血中濃度の持続化が認められた。また，添加剤の選択により直腸投与の可能性が示唆された0
参考文献
1）今堀和友：第2回E−64開発研究班会議．
2）Hashida．S．，Towatari，T・，Kominami，E・
Eatunuma，N．：InhibitionsbyE−64derivativesof ratliver cathepsin B and cathepsinLin
vitro andin vivo，J．Biochem．，88，1805〜1811，1980．

3）松浦貞郎：イオン定数，p・16〜36，1963・
4）沢田二郎：E−64及びその類縁体の生物薬剤学的研究，微生物の二次代謝産物に由来する難治療薬（E−64）の開発研究，昭和54年度研究報告喜，p−
159〜166．

5）大関正弘：E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究，微生物の二次代謝産物に由来する箆
治療薬（E−64）の開発研究，昭和54年度研究報告
雷．p．145〜154．

33

Ⅰ 標的酵素に対する効果

5．ジストロフィーチキン骨格筋カテプシソB，H及びDの動態ならびにE−64−C投与による阻害について

勝沼 信彦

6．カルシウムプロテアーゼに対するE−64の効果

今堀 和友

7．カルシウムプロテアーゼと燐脂質

西塚 春美

8．プロテアーゼ阻害物質によるべブスタチソ非感受性
ヘモグロビン水解酵素の誘導

市原

明

官武

正

9．筋ジストロフィーチキンの筋ガングリオシドに及ぼすE−64の効果について（続報）

5．ジストロフィーチキン骨格筋カテブシンB，H及びDの動態ならびにE−64−C投与による阻害について

勝
研究協力者

野

沼

田

信

彦＊

隆＊

磯

材

はじめに
筋ジストロフィーチキン（Line413）の萎縮

貝

和

秀＊

料

前記の処理をしたチキンの浅胸筋をとりだ
し，−200Cにて凍結保存した。

筋中でカテプシソ群の酵素活性が上昇している

1．カテプシソB・Hの測定ことに関しては，古くから各種の報告がある1）。
リソゾームのカテプシソ群は，最近では酸性域

凍結筋を4倍量のPBS pH7．2とともに，で蛋白分解活性を発揮するカルポキシルプロテ

ポリトロンを用いて，5倍ホモジネートを作製し遠心上清を75％アセトンで沈澱させ，アセト

アーゼ（カテプシソD）及び弱酸性から中性域で活性をもつチオールプロテアーゼ（カテプシ5mMβ−メルカプトエタノール，2mMEDTA

ソB2）3），カテプシソH4），カテプシソLS）6））にで懸濁したものを測定試料とした。カーテプシソ

大別される。最近まで比等カテプシソ群の正確Bの基質にはBANAを用い，Barrettらの方法8）で活性を測定した。

な分別定量は確立していなかった。今回，我々ンを除いた後に20mM酢酸緩衝液pH5．5，

は此等カテプシソ群が正常チキンと筋ジスチキ
ンでどのような差異があるかを分別定量をおこ

2．カテプシソDの測定なった。またこのチオールプロテアーゼ群に対液p鱒3．8で一晩透析し，酸変性ヘモグロビ
ンを用い9），ペブスタチソで阻害される活性をし，invitroで強い阻害作用を有するE−64−C7）をin vivoで80日間連日投与したチキン胸筋
中のカテプシソB・H・Dの活性を測定し，E−64−Cのin vivoにおける作用を報告する。
実験材料及び方法

上記のアセトン沈澱試料を20mM酢酸緩衝

カテプシソDの活性とした。
結果

カテプシソB活性は，正常チキンに比して筋
ジスチキンでは，明らかに全活性，比活性とも

投与方法に高く，更にE−64−C投与量に応じて全活性，Line413のチキンは，辟化後10日より，300

比活性ともに減少しており，150mg／kg体重，300mg／kg体重投与の両群ともほぼLine412

mg／kg体重，150mg／kg体重，生食，の3群に分けE−64−Cを1日2回皮下に80日間投与した。Line412のチキンも同様に生食を投与した。

チキンと同程度のカテプシソB活性を示している。（図Ia），また同様にカテプシソH活性は，正常チキンに比して，筋ジスチキンでは，明ら
かに全活性，比活性ともに高く，E−64−C投与
量に応じて全活性，比活性ともに減少してい＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門

る。（図Ib），図Ia，Ibを比較してみるとin37

Ⅰ 標的酵素に対する効果㍉■﹁

図1E−64−C投与量とカテプシソの活性300︵D■︶︵ujOJd寧E＼⊃6．0︻上倉＞叫も噂︒叫−篭ds

150

T・−01

︵○●︶︵ヱ冨nEで⊃TOtJ主人⁝一Uく
0controI

E−64−C Dose（mg／kg B．WJday）
a Changein activity of cathepsin Bin chicken breat muscle

300

controIb Change of cathepsin H activity
38

O

150

︵□ ■︶︵u⁝む一〇Ldぎー＼戸岳‡盲壱：蓬邑sl0

E−64rc Dose（mg／kg B．W．／day）

5．ジストロフィーチキソ骨格筋カテプシソB，H及びDの動態ならびにE−64−C投与による阻害について

5︵□■︶︵u芯lOJd

1

鱒E＼nTO︻Jhl叫＞叫もd︵○●︶︵むtUのnEでつTOtヱ音＞ U可

O≡Uas

0

150

300

controI

ET64−C Dose（mg／kg B．W．／day）
C Change of cathepsin D activity

表1E−64−C投与によるカテプシソ群及びCANP活性とフリップテストの結果

Cathepsin B activity Cathepsin H activity Cathepsin D activity
U／gmuscleU／mgprotein U／gmuscleU／mgprotein U／gmuscleU／mgprotein
Ⅹ10−1

Ⅹ10−5

Ⅹ10−1

Ⅹ10−5

Line413
SalineM（n＝12）2．2±0．36 0．69士0．13 4．9±0．871．58土0．311．56±0．42 0．050±0．015
F（n＝10）2．1±0．22

0．63土0．114．9土0．791．48土0．371．17士0．39

0．035士0．012

E−64−C treated

150mg／kgB．W．
300mg／kgB．W．

M（n＝11）1．2土0．14 0．41土0．06 3．0士0．511．01±0．171．35土0．33 0．045±0．01
F（n＝10）1．3土0．28 0．39土0．09 4．0土0．791．20土0．241．35士0．18 0．041±0．05
M（n＝11）0．9土0．15 0．30±0．04 2．8土0．87 0．92士0．28 0．98土0．29 0．033士0．011
F（n＝10）1．4±0．30 0．48土0．10 2．6土0．54 0．87士0．181．35±0．24 0．045土0．01

Line412
SalineM（n＝4）1．2±0．13■ 0．27土0．04 3．6±0．76 0．84±0．210．48土0．19 0．011土0．004
F（n＝7）1．34土0．22 0．31±0．05 3．4±0．64 0．78土0．15 0．40士0．23 0．009土0．006

Activity of cathepsin B was expressed asFLmOlp−nitroaniline produced／min．
Activity of cathepsin H was expressed as FLmOlβ−naPhthylamide produced／min．
Activity of cathepsin D was expressed aspmolamino acids released／hr．

39† 標的酵素に対する効果b

Body weigbt

Content of CANP Flip test
Sample protein activity

Line

g

mg／g muscle

Cpm

10days80days

M（n＝12）l，794±212

31．5土1．8

6，686士1，864

2．3−−◆0．4

F（n＝10）1，312土104

33．4±3．4

4，743土757

4．4→1．4

M（n＝11）

1，935土223

29．6土1．7

5，222±2，199

2．6一一一→0

F（n＝10）1，289土61

33．0土1．6

4．1→1．7

1，880土163
1，333±14829．8±2．2

3，451±959
5，389±1，684

30．1士2．2

3，751士852

1．8一→0．8

413

Saline150mg／kgBW．
300mg／kgB．W．

M（n＝11）F（n＝10）Line

2．5−−→0412

M（n＝4）

SalineF（n＝7）

2，098土230
1，547±10442．8土1．9

4，167土2，7805−−→543．6±2．1

2，593±1，172￣5−→5

CANP：Calcium activated neutralprotease

Vitro と同様にE−64−Cに対してカテプシソB

この原因としては，CANP活性があまり減の方がin vivoでもより強い感受性を有する

少していないこと，カテプシソDが高値であると思われる。図Icには，カテプシソD活性のこと等が考えられるが，カテプシソDの著明な変動を示した。筋ジスチキンは正常チキンに比上昇は問題であり，ペブスタチンとの伴用による効果を見る必要があるものと考える。

して，著明なカテプシソD活性の冗進がみられ，
E−64−C投与群と生食投与群の間に有意な活性の変化は見られず，カテプシソDには全く影響を与えていないことが明らかとなった。またロ
イべプチソ投与時に見られるカテプシソD様プ
ロテアーゼ活性の上昇はみられなかった。表1にカテプシソ群活性変化と体重並びに，筋蛋白
含量，CANP活性，フリップテストの結果をまとめた。（CANP活性，フリップテスト，体重は本実験に使用したチキンのもので，大正製

文献1）Iodice，A．AリChin，Ⅰ．，Perker，S．and wein−
StOCk，Ⅰ．M．：Cathepsins A，B，C，D andautolysis duringdevelopmentofbreast muscle
Of normal and dystrophic chicken，Arch．
Biocbem．Biopbys．，152，166−174，1972．
2）Barrett，A．J．：HumancathepsinBl．Purifica−tion and some properties of the enzyne．
Biochem．J．，131，809−822，1973．

薬研究所で測定されたデータである。）カテプシ
ソ群の著明な変化に比し，CANP活性は，E−3）Towatari，T．andKatunuma，N．：Crystalliza−

64−C投与群で阻害されるが，正常チキンのレベルには達していない。また，体重，筋蛋白含

B from ratliverlysosomes，Biochim．Biophys．

tion and amino acid composition ofcathepsin
Res・Commun．，83，513−520，．1978．

量，フリップテストは，正常チキンに比して筋

4）Singh，H．and Kalnitsky．G．：Separation ofa new a−N−benzoylarginineサnaphthylamide

ジスチキンは著しく低く，E−64−C投与群でもhydrolase from cathepsin B．，J．Biol．Ciem．，

改善は見られなかった。

253，4319−4326，1978．

5）Towatari，T．，Tanaka，K．，Yoshikawa，D．

考

察

E−64−C投与でカテプシソB，カテプシソHは有意に阻害されているが，筋ジストロフィー症の症状改善にはあまり効果はなかった。
40

and Katunuma，N．：PurifiCationandproperties
Of anewcathepsinfromratliver，J．Biochem．，
84，659−671，1978．

6）Kirschke，H・，Langner，J．，Wiederanders．B．，
Ansorge，S・and Bohley，P．：Cathepsin L A

5．ジストロフィーチキソ骨格筋カテプシソB，H及びDの動感ならびにE−64−C投与による阻害について
new proteinase from rat−liverlysosomes，Eur．
J．BiocIlemり74，293−301，1977．

7）Hashida，S．，Towatari，T．，Kominami，E．

8）Barrett，A．J．：A new assay for cathepsin
Bland other thioI proteases，Anal．Biochem．，
47，280−293，1972．

andKatunuma，N・：Inhibitionsby E−64deri・9）Matsuda，K．and Misaka，E．：Studies on

Vatives ofratlivercathepsinBandcathepsin
Lin vitro andinvivo，J，Biochem．，88，1805−

Cathepsins of ratliverlysosomesl．Puri丘ca・1811，1980．

649，1974．

tionand multiple forms，J．Biochem．，76，639−

41

6．カルシウムプロテアーゼに対するE−64の効果

今
共同研究者

鈴

木

久保田

高

掘
紘

和

友＊

一＊

辻

俊一郎＊

木

橋

村

崇

−＊

吉

雄＊

愛＊

との関係も不明であった。われわれは最近m−

はじめに

CANPからFL，CANPへの変換が自己消化に筋ジストロフィーは筋タンパク質の分解によって生じる筋の退化がその主たる原因として考えられている。筋細胞中にあって，タンパク質

よって起ることを明らかにしたので，ここに報告する。
材料及び方法の分解を司るプロテアーゼとしては一つにはカ
テプシソ塀が考えられ，これについては勝沼班

CANPとしてはトリの胸筋から石浦の方法l）

員のグループによる報告がある0今一つとしにより調製したものを用いた。カゼイン一七7て，われわれはカルシウムで活性化される中性

ァロース4Bは，ファルマシア製の活性化しプロテアーゼ（CANP）に着目し，従来CANP

たセファロース4Bにカゼインを常法に従っを精製するとともに，その性質を明らかにしてて結合させることによって得られた0きた。特にCANPがいわゆるチオールプロテ
アーゼに属するものであることから，これが結

果・カゼイン一七ファロース4Bカラム（1×6E−64で強く阻害されることを発見したのであったト3）。

cm）をバッファーA（20mMトリス，10mM

しかしながら，CANPが細胞内で作用することについては一つ難点がある。それは本酵素

CaC12を加えたもので平衡化し，これに精製しの活性発現には1mM〜数mMというCa2十2−メルカプトエタノール，pH7．5）に10mM

たCANP（0．5mg／0．5ml）を加える。まずイオンを必要とするからであり，これは筋細胞

10mM CaC12

中のCa2＋イオン濃度（数〝M）をはるかに超た後，10mMEDTAを含む／：ッファーAでえた異常な濃度であるからである。

CANPを溶出した。

一方，犬の心筋からは40J MのCa2＋イオン濃度のKdをもつCANPの存在が報告さを40／上Mにもつ〃−CANPであった0

れているが4），同様な酵素（これを〃−CANPという）の骨格筋での存在は確めておらず，まを含むバッファーAでよく洗っ得られたCANPは図1に示すように，Ka
図にはm−CANPのCa2＋依存性をも同時にたこれと，mM程度のCa2＋イオンを必要と示してあるが，両者のCa2＋感受性の差異はき
わめて明らかであろう。ついで他の2価イオンする従来のCANP（これをm−CANPという）の影響をもしらべた。図2にはSr2十に対する感受性，図3にはBa2十に対する感受性を示し＊東京大学医学部第二生化学教室＊＊東京都老人総合研究所てある。いづれの場合にも．，〝−CANPはm−CANPに比し，はるかに低濃度の2価金属イ
43

Ⅱ 標的酵素に対する効果

表1Effects of several metalions on

係につき研究した。カゼインカラムから溶出さ

chicken

れるのが，〝−CANPであるということには，

CANP．

Kd

（mM）

少くとも二通りの説明が可能である。その1つ

metalions m−CANP FL−CANP
Ca2＋

0．15

は，粗CANP抽出液中にはm−CANPとP−

0．05

Sr2十

4．0

0．5

CANPの両方が存在しており，EDTAで前者

Ba2＋

11．5

1．8

のみが溶出され，後者はカラム中に吸着されたままでいるという考え方である。第二には，粗CANP抽出液中にはm−CANPのみが存在しオンで活性化されることが明らかである。

ていたのであるが，カゼインカラム中に存在すその他の金属イオンの影響をまとめて示したのが表1である。
つぎにm−CANPとるCa2＋（10mM）の影響で自己消化を起こし，〃−CANPに変化したという考え方である。

FL−CANPとの相互関

1

3C。nCentration（mM Ca2＋）

図1m−CANPとFL−CANPとのカルシウム感受性●′′￣￣￣

L
−￣￣

凸
i

0
0

●

0
●

●

／ヽ
／
／
／F ，
−C

A N P

m −C A N P

■
I
l
J
l
lJ
l
I
l
l
l
l
l
l
l

0

九一三一岩∴享モモ占

′

5

10
Concentrationlmll

図2
44

15
Sr＝◆I

m−CANPとFL−CANPとのストロンチウム感受性

6．カルシウムプロテアーゼに対するE−64の効果

Re︼atiくe aCtiまty

図3

m−CANPとFL−CANPとのバリウム感受性

㈲
1
0
0

5

10

15

20

Incubation time（min）

図4

m−CANPの自己消化に伴なうカルシウム感受性の変化
10mM CaC12存在下00Cでm−CANPの自己消化を行なわせ，横軸に示した各時間で試料の一定量をとり出し，5mM，150／jM，75J上MのCa2＋存在下で活性を測定した。

0

台叫＞コUdだコd︻む已h一三︺Uくじ誓Uas
0

8．0

9．O
pH′

図5 m−CANPとFL−CANPとの活性のpH依存性45

Ⅰ標的酵素に対する効果

％10
5
喜竃㌢蓋
20

30
〟l（E−64）

図6

m−CANPとFL−CANPとのE−64による阻害以下の実験は後者の考え方が正しいことを示している。まず第一に，m−CANPとP−CANPとをSDS電気泳動で共泳動させると，後者は前者よりわずかに早く移動し，マーカーよりそ〝−CANP活性は急に上昇し・3分で最大値を示した。この時点で自己消化をとめ，それをSDS電気泳動にかけると，80Kのバソドはすでに消失し，76Kのバンドになっていた。す間においてとり出し，それぞれ5mM，150〃M，

なわち〃一CANP活性の出現は自己消化によるものであることが明らかになったのである0自己消化の時間を長くすると，〃一CANPの活性も次掛こ減少するが，それに伴ってSDS電気泳動でも76Kのバンドが減少し，56Kおよびそれ以下の分子量のバンドが増加してゆく0
これは自己消化がさらに進むと，CANPが失活することに対応している0次に得られた〃−CANPにつき，その性質を
m−CANP のものと比較した。図5にはm−．

75JjMのCa2＋存在下で活性測定を行っている。図1から明らかな様に，5mM Ca2十では〃一CANP活性のpH依存性を示してあるが・両者は全く一致している0さらに図6にはm一，m，〃両CANPとも100パーセント活性であ〝−CANPに対するE−64の阻害効果を示してあるが，これについても両者には差異が全くなかった。
なお本研究と平行して，ウサギ骨格筋のCANPについても同様な研究を行った。ウサ
ギの場合m−CANPの2価金属に対する感受の分子量は76，000と求められる。一万m−CANPの分子量は80，000であるから，自己消化により
分子量4，000のペプチドがm−CANPから遊離したものが〃−CANPとすると考えやすい0
そこで，m−CANPを10mMCa2＋ 存在下
00Cで自己消化を行わせてみた。00Cにしたのは常温では自己消化速度が早すぎるため，限定加水分解物をとらえにくいからである0結果は図4に示してある。図では自己消化物を各時るが，150FLMCa2＋ではm−CANPの活性はなく，〃−CANPは85パーセントの活性を示し，
75JJM Ca2＋では65パーセントの活性を示す。
すなわち 5mM Ca2＋ 存在下では，m，〝 両
CANPの活性の和を測定しているのに対し，150JJM，75JjMでは〝−CANPの活性のみを測定している。

性はトリのものよりさらに悪く，Ca三十は5〜

図から明らかな様に，自己消化が進むと共にい。これに対し，ウサギの〃−CANPはトリの46

10mMを要し，Ba2＋では全く活性化されな6．カルシウムプロテアーゼに対するE−64の効果〃−CANPとほぼ同様の金属感受性を示すようれるCANPを犬の心筋より得ている。われわになるo m−CANPよりFL−CANPへの変換

れのFL−CANPとMellgrenのCANP

も，カゼインカラム処理，自己消化の両方で可較してみると，分子量に多少のちがいがある他
は，性質がきわめてよく類似している。すなわ

能であること，変換に伴い80Kの成分が76Kに変わることなど，すべてにおいてトリのものと一致している。

と比ち酵素がすこぶる不安定であることや，DEAE
セルロースカラムからの溶出位置（本報には示

考察

従来CANPについての報告は多くあるが，していないが，FL−CANPはm−CANPより低イオン強度で溶出される）などがよく一致して

Mellgren．）のものを除けばいづれも活性に数いる0また西塚ら5）も昨年度の本班研究報告会
で，低Ca2十イオン濃度で活性化されるCANP

ミリモルのCa2十を必要とする点で，その生理学的意義が疑われていた。本研究によって明らの存在を発表しているが，これについてはわれ
われの〃−CANPとその性質が全くといってかにされた，自己消化によりm−CANPが〝−よいほど一致している。したがって，これら

CANPに変換するという事実はすこぶる重要な意味をもつであろう。例えば，細胞内の1分

CANPはいづれもm−CANPの自己消化に由子のm−CANPがp−CANPに変換されると，これが他の m−CANP を生理的条件下においても〃一CANPに変換し，これらがさらにm−
CANPを限定分解するという，いわゆるカス
ケード反応が進行するであろう。これが無制御に進行するなら筋ジストロフィーの様な病状を起こすことは当然である。
一方今回の結果はm−CANPからFL−CANPへの変換についても示按する所がある。もしもm−CANP単独について自己消化を行わせるな
ら，図4からも明らかなように，00Cにおいて来するものと考えられるのである。一方村地ら6）も肝臓より低Ca2＋イオン濃度で活性化されるCANPを得ているが，安定性の点において〃−CANPと異っており，これが全く別物なのか，臓器のちがいによるものなのかは今後検討を要する問題である。
今回のわれわれの研究により，〃−CANPを得る方法も確立したわけであるから，今後はその革質特異性等を研究することにより，〝一
CANPの生理学的役割はさらに明らかになるものと思われる。

すら限定分解の段階で止めることは困難であ文る。ましてや常温では瞬時に失活してしまうであろう。それに反し，カゼインカラム中で自己消化を行なわせると，限定分解の所で止ってしまいそれ以上の自己消化が起らないことは重要である。すなわち基質が存在する条件下では
m−CANPからFL−CANPへの変換が正しく行
なわれることを示している。筋細胞中の様に，
CANPに対する基質が大量に存在する場にあっては，CANPの変換がうまく行なわれるであろうことは充分に予想されるのである。
現在まで報告されたCANPに関する論文中
MellgrenのみがFLM程度のCa2＋で活性化さ

献

1）Ishiura，S．，Murofushi．M．，Suzuki，K．and
Imahori，K．：J．Biocbem．，84，225，1978．
2）Suzuki，K．，Ishiura．S．，Tsuji，S．，Katamoto，
T・，Sugita，H．，andImahori，K．：FEBS Letter，
104，355，1979．
3）Ishiura，S．，Sugita，H．，Nonaka，Ⅰ．and

Imahori，K．：J．Biochem．，87，343，1980．
4）Mellgren，R．L．：FEBS Letter，109，129，1980．
5）西塚春美ら：微生物の二次代謝産物に由来する
難病治療薬（E−64）の開発研究昭和54年度研究報
告書，p．117−130．
6）村地孝ら：論文投稿中，生化学52巻，第8号
p．813，1980．

47

7．カルシウムプロテアーゼと燐脂質

塚

春

本渕橋

十

明光郎

＊

美

西

＊

雄馨美
＊
＊

義

もっとも重要な課題の一つである。ことに細胞意

用や識別琉序の解明は今日の医学生物学にとり＊神経やホルモンの働らき等，細胞間の相互作

川山井

＊

はじめに

梶西高

＊

岸田高

研究協力者

度のカルシウムにより活性化されるプロテアー
ゼが分布しており，かつこのプロテアーゼは形
質膜に結合している蛋白質燐酸化酵素を選択的に限定分解している可能性が強く示唆された。

表面における刺激や変化がサイトスケルトン系

すなわち，この種のプロテアーゼは当初Mellgr−
enが心筋に見出したものと同種の酵素と予想を介して細胞の形態，機能を調節する機序は，されるが，上述のイノシトール燐脂質の加水分

昨今飛躍的な研究の対象となっている。私共は数年来，こうした受容識別唐序に焦点をあてて解にひきつづいて，情報伝達系の活性化の第2段
機序をなすものと推定される。したがってこの

酵素化学的解析を加えてきたが，最近になり生

プロテアーゼ系には燐脂質が関与するため，E−体の情報伝達系に関与すると予想される新しい型の蛋白質燐酸化酵素系を見出したト3）。こ64をはじめ各種の阻害剤が奏効しにくい理由がの酵素は第1図のように従来明らかにされていについてのその後の知見を簡単にのべ，プロテるCyClicAMPを介する情報伝達系に対応する可能性が高く，形質膜に与えられたシグナル

簡単のためこの種の蛋白質燐酸化酵素はC−

Kinase，CyClic AMP

A−

によりイノシトール燐脂質（PI）が選択的に加水分解され，ここに生成する微量のジグリセリ

あ￣りうると思われる。以下ではこの情報伝達系
アーゼと燐脂質の関係の概要を報告する。なおの関与する酵素はKinase としたい。

ド（DG）がその活動の引き金をひいている。

材料及び検索方法

この過程は可逆的でありカルシウムが必要であるが，この種の蛋白質燐酸化酵素の活性化には

本解析では主としてラット脳より調整した

これ以外にカルシウムプロテアーゼによる限定

C−Kinase，シナプス膜，プロテアーゼを使用

分解の方式が関与している可能性がある4）。そし，その他必要に応じて各種の臓器を用いた。

こで本年度の研究では生体の機能調節に関与す

各種の中性脂質，燐脂質等はすでに記載した方

るこの蛋白質燐酸化酵素の活性化反応を指標と法に従っているが5〜9），E−64は大正製薬よりして，カルシウムプロテアーゼの解析とその役
割の解明を試みた。

寄贈をうけた。その他の試薬品は市販のものをその結果，生体の多くの組織にはこれまであカルシウムプロテアーゼの活性測定は一部カ

きらかにされていたプロテアーゼとは別に低濃ゼインの加水分解反応を定量したが，特に記載用いている。

しない限り，C−Kinaseの限定分解による活性＊神戸大学医学部第二生化学教室

化反応すなわち出現した蛋白質燐酸化酵素の活49

Ⅰ標的酵素に対する効果

Signal a

Bioregulation
ヽ＼

Receptorα）

Phospholipase C

Signalβ

Phosphorylation＆
Bioregulation

Receptor

図12種の受容伝達機構（1）MonodirectionalControI System
GZJgc加わmf乃e依JgJc．
CyClic AMP

A−Kinase

＝＝＝＝二
、

、

＿

Acg秒JcJわJf〃β，GZJgc／わJα研わ2g rJ gJc．

Diglyceride

C−Kinasc′一′、一一一（2）Bidirectional ControI System

CyClic AMP

Diglyceride竺苧
C−Kinasc

一一一・■■、−、

図2 受容伝達枚格と生体機能の調節

性をHlヒストンを基質として測定した0したがってこの活性測定はきわめて選択的であり，回転に関する先人達の莫大な検索から，この程

比較的粗抽出液においても可能と考えられる0調節系に関与すると想像される。例えば，アセ
チルコリン，カテコラミン（α作用）の他，喧

結果の伝達系はいわゆる excitatory process の々のペプチドホルモンその他の生理活性物質の過去における多数の解析結果からC−Kinase

作用の発現に何らかの役割を果していると期待されるl〜4）。A−KinaseはCyClic AMPの作を介する情報伝達系は生体にきわめて広く分用点としてこれも重要であるが，両者は通常多布しており10），かつイノシトール燐脂質の代謝

くの組織，細胞では併存しているように見え（1）C−Kinase系とA−Eimase系の関連

50

7．カルシウムプロテアーゼと燐脂質

二・−三〇二七U︒二号J︒l言三三彗﹁Uここ⁝Jこ﹂ここ

小坂，脳，血管，心臓等の数多くの組織がこれに該当している。この両系がどのような生理作用を示すかはそれぞれの組織にセットされているそれぞれの系の作用点，すなわちA−Kinase，
C−kinaseの基質蛋白質がその鍵を握っているように見える1・9）。今回，これらの基質特異性については本報告書では省略するが，この両系
はたがいに無関係ではなく C−Kinase系に対してCyClicAMP系が抑制的に作用しており，その作用点は上述のジグリセリド生成迄の段階の可能性が高い。第3図はそのような実験の1例を示したものである。この実験は典型的な例
としてトロこ／ビンによる血小板の活性化反応に対するプロスタグランジンElすなわちCyClic
AMP系の抑制作用の機序の解明のための吟味であるが，プロスタグランジンElの存在量に比例してCyClic AMPは増量するが，これと図3 PGElによる血小板活性化の阻害作用は逆にトロンビンによるジグリセリドの生成，およびC−Kinaseによって触媒される40K蛋

る。しかしその生理作用には組織によって著しい多様性があり，例えば第2図に示したように，両系は全く独立して存在してるが，その作用は概して同一の場合（肝臓，脂肪細胞，甲状腺等），また異っている場合がありうる。しかし多くの場合には両系はたがいに相反する生理活性物質の情報伝達に関与していて，例えは血白質の選択的な燐酸化反応は共に平行して抑制されることを示した。この抑制現象はCyClic
AMP自身の共存によっても観察されている。
したがって第2図に示したようにトロンビン→DG→C−Kinase系の情報伝達系のDGの生成の段階でCyClic AMPが抑制をかけていることを示唆している。

Catalytic region

M em branebound C −kinase

R eleased
Catalytic fragm ent−C a2十
一prOteaSe

78％

22 ％

＋C a2＋−prOteaSe

13％

87％

図4

膜結合性C−Kinaseのプロテアーゼによる活性化51

Ⅰ 標的酵素に対する効果

Ca2＋−Protease＊C−kinase＊＊（units／mg protein）︵？OH×EdU︶音ミリく冨冨︺OJd

Skeletal muscle

4，510

80

Heart muscle

980

110

Brain

840

3，270

Kidned390

280

Adipocytes

30

170

Lung

30

360

Liver

20

180

＊One unit：One ng CaSein digested per min＊＊One unit：One PmOI Pi transferredinto

histone per min

図6 組織分布0．5以上の実験例に認めるようにC−Kinase系
2

3

4

図5

Phospholipidによるはアセチルコリンやカテコラミソ（α作用）等を含めたTimein Minutes
Ca−Proteaseの活性化

excitatory membranes

への刺激に際して認められるイノシトール燐脂質の加水分
解と共役しているきわめて重要な情報受容伝達
校溝をなすものと推定され，CyClicAMP系は
上述の撥序を介して抑制的に作用してゆく可能性が作業仮説として成立しうると考えている。
（2）カルシウムプロテアーゼとの関連

ヽ︵訳︶倉人相一Uくど雲l遥

詳細な実験的根拠は省略したが上述の意義が）＼、、、、

Activation of

推定されるC−Kinaseはその活性化の第2段の横棒としてカルシウムプロテアーゼが関与す、、●る可能性を論議したい。C−Kinaseは推定分子量が約77，000であり形質膜に可逆的に結合しう

Jnembrane−boundC−kinaseるhydrophobicな部分が存在するが，第4回のように限定分解をうけて活性中心を有する
フラグメソトが切断され，活性を発揮する可能20性がある。この種のプロテアーゼはカルシウム

Activation ofを必須不可欠として要求しており，その濃度はpurified soluble
C−kinase

0．5
E−64（mg／ml）

図7 E−64の阻害効果

10−5M程度で充分に活性を発揮しうる点で従1．0

来多くの研究者がその対象としていたプロテアーゼとは異っている。またこの種のプロテアー
ゼは形質膜に結合して活性を発揮していると推定されるC−Kinaseを目がけて作用してゆくものと思われ，第5図に示すようにC，Kinaseの限定分解による不可逆的活性化には形質膜の存在が要求される。これまでの種々の解析の結52

7．カルシウムプロテアーゼと隣脂質

果，この形質膜，特に燐脂質はカルシウムプロ
テアーゼに作用して活性化しているのではな
く，基質側のC−Kinaseに作用し限定分解をうける状態をつくり出しているように見える。
したがってカゼインのような基質を用いれば燐脂質の要求性は認められない。この事はプロテアーゼのような蛋白一蛋自問の相互関係を必要とする反応系には細胞内の局在を含めたtopo一graphicalな概念を導入する必要性を強く示変していると考えられよう。

れない課題があるように思われてならない。膜に結合したC−Kinaseの活性化を完全にブロックする抑制剤を手に入れた時，CXinaseの意義と共にカルシウムプロテアーゼ，細胞内限定分解の生理学的な解釈の一端をときほぐす緒が得られるのではないかと期待している。我田
引水の点も多々あるが，御批判と御教示が頂ければ幸甚である。

心筋に見出した第2のプロチアーゼそれ自身で昭和55年度の報告を終えるに当り，本研究に多大の御支援と御助言を賜った今堀和友教授，
ならびに大正製薬株式会社の各位，原生省新薬開発研究助成に対して深い感謝の意を捧げたあると推測されるが，第6図のように全身の組い。

この種のプロテアーゼは先年Mellgrenが織に広く分布していて，この事は今堀和友教
授，村地孝教授らも観察されている。
（3）E−64による抑制作用

文

献1）Nishizuka，Y・：Threemultifunctionalprotein

さて問題のプロテアーゼ抑制剤の作用であるが，膜と結合していない不活性型のC−Kinaseを基質とする従来のカルシウムプロテアーゼのkinase systemsin transmembrane control，
Mol・Biol・Biochem・Biophys・，32，113，1980．
2）Takai，Y・，Kishimoto，A・，Kawahara，Y．，
Minakuchi，R・・Sano，K・，Kikkawa，U・，Mori，

反応は精製した実験系では強力な抑制作用を示
すことは多くの研究者の報告されている通りで

T・，Yu，B・，Kaibuchi，K・＆あるが，上述の生体膜に結合している

as signalling for transmembrane control ofC−

Kinaseの限定分解反応に対しては第7図に例を示すようにほとんどその抑制効果を示さない。このことが何に基因するかは現在さらに解Nishizuka，Y．：

Calcium and phosphatidylinositol turnoverPrOteinphosphorylation，Adv．CyclicNucleotide
Res・，Raven Press，1n preSS．
3）Nishizukn，Y．＆Takai，Y．：Calcium andphospholipid turnoverin a new receptor析中であるが，この完全な理解はC−Kinase，形

function for protein phosphorylation，Cold

質膜，特に燐脂質，ジグリセリド，カルシウム，
プロテアーゼ蛋白質という複数個の反応の場のSpring Harbor Conf・CellProlif・，8，in press．
4）Takai，Y・，Kishimoto，jL＆Nishizuka，Y．：

解析をはなれてはあり得ないきわめて複雑な問題を提起しているように思われてならない。

membranesignallingforproteinphosphoryla−

考察

昨年度につづいて本年度の解析においてもカ
ルシウムプロテアーゼの有する生理的意義，およびそれに対するE−64の効果についてはその核心に迫ることには成功したとは云い難い。しかし，上述のようにC−Kinaseを中心とするCalcium and phospholipid turnover as trans−tion，Calcium and Cell Function，Academic
Press．2，in press．
5）Kishimoto，A・，Takai，Y・，Mori，T．，Kikkawa，
U．＆

Nishizuka，Y．：Activation of calcium

andphospholipid−dependent protein kinaseby
diacylglycerol，its possible relation to phos・
phatidylinositolturnover，J・Biol．Chem．，255，
2273，1980．
6）Mori，TりTakai，Y・，Minakuchi，R．，Yu，B．

細胞の情報伝達系，応答系を指標とした解析か＆Nisllizuka，Y．：Inhibitory action of chlor−

ら，細胞内プロテアーゼのもつ意義の解析の焦点と問題があきらかになってきたように思われpromazine，dibucaine，andotherphospholipidr

る。そこには脂質と蛋白質との間の分子識別の問題や，形質膜を含む局在の問題をさけては通interacting drugsoncalcium−aCtivated，phos−
pholipid−dependent protein kinase，J．Biol．
Chem．，255，8378，1980．

7）Kawabara，Y・，Takai，Y・，Minakuchi，R．，
53

Ⅰ 標的酵素に対する効果
Sano，K．＆

Nishizuka，Y．：PossibleinvoIve−9）Iwasa，Y．，Takai，Y．，Ⅹikkawa，U．＆Nishi−

mentofCa2＋−aCtivated，phospholipid−dependentzuka，Y．：Phosphorylation of calf thymus Hl

PrOteinkinaseinplateletactivation．J．Biochem．，

histone by calcium−aCtivated，phospholipid−

88，913，1980．

dependent protein kinase，Biochem．Biophys・

8）Kawahara，Y．，Takai，Y．，Minakuchi，R．，
Sano，K．＆ Nishizuka．Y．：Phospholipid

Res．Commun．，96，180，1980．
10）Minakuchi，R．，Takai，Y．，Yu，B．＆

Nishi・

turnover as a possible transmembrane slgnal

Zuka．Y．：Widespread occurrence of calcium−for protein phosphorylation during humanactivated，

platelet activation by thrombin，Biochem．

kinasein mammalian tissues，J．Biochem．，89，

Biophys．Res．ComInun．，97，309，1980．

1651，1981．

54

phospholipid−dependent protine

8．プロテアーゼ阻害物質によるぺブスタチン
非感受性ヘモグロビン水解酵素の誘導

研究協力者

田

市

原

中

啓

はじめに
近年，細胞内プロテアーゼの生理的意義はその阻害剤の存在と共に特に注目されているが，その詳細な機構については不明な点が多い。他
方，ライソゾームは種々の氷解酵素を含む細胞内小器管であり，プロテアーゼについても最近，新しい分塀が確立しつつある。
我々は成熟ラット肝初代培養細胞の蛋白質代
謝回掛こ対するライソゾームの役割について，
微生物が産生するプロテアーゼ阻害剤を用い検討していたとき，或る種のプロテアーゼ阻害剤
によって新しいヘモグロビン（Hb）水解活性が強く誘導されてくることを兄い出した0そこでこのプロテアーゼの性質について現在までに得られた結果を報告すると共に同様な誘導現象
をin vivoラットでも認めたので，それらの結果についても合わせて報告する0
実験方法

明＊
二＊

生

垣

荷

彦＊

測定し，α−N−ペソゾイルーDL−アルギニソーβ−
ナフチルアミド（BANA）及びロイシンーβ−ナフチルアミド（LeuNA）水解活性はBarrett3）の方法で測定した。
細胞分画法
肝臓の分画はRagabら4）の方法に準じて行
った。
結

果

In YitroにおけるHb水解酵素の誘導
我々は成熟ラット初代培養肝細胞にロイべプ
チソを処理すると，Hb氷解活性が著明に上昇してくることを兄い出し5），また，この誘導がロイべプチソと同様，アンチパインやキモスタ
チソによっても観察されるが，E−64やエラス
タチナールでは認められないこともすでに報告した6）。ロイペプチソは，酸性ホスファクー
ゼ，チトクローム酸化酵素及びNADPH−チト
クローム還元酵素などの活性には全く影響せず，特異的にHb一水解活性を上昇させるが，肝細胞の分離と初代培養

この活性増加はシクロへキシミドの同時添加で成熟ネズミ肝実質細胞はコラゲナーゼ漂流法

完全に抑制されるので，蛋白質合成を介した酵によって分離し，血清及びホルモンを含むウィ

素誘導と考えられる。またこの誘導現象はマウリアムスE培地に分散後，炭酸ガス培養器内でスL細胞，樹立肝株細胞では認められなかった0

通常の静匿単層培養で維持した1）。

更に，糖蛋白質の糖鎖合成を選択的に阻害する
Tunicamycin7）がこの酵素誘導を完全に抑制

酵素活性の測定
酵素標品は凍結融解後の細胞上清画分を用したので，誘導されたHb水解酵素は糖蛋白

い，Hb水解活性はAnson2）の方法によって質と推定された。
さて，このHb水解酵素の性質について，＊徳島大学医学部附属酵素研究施設酵素病理部門

細胞の粗抽出画分を用い以下検討した。至適55

Ⅰ 標的酵素に対する効果︵∑︶uOコ巴盲むU亡OU IUdN−−−−

1020Fraction number3040

図1ラット肝細胞のチオール・プロテアーゼと誘導されたHb一水解酵素のCellulosePhosphateChroma−
tographyによる分析
初代培養2日後の肝細胞にロイべプチソを終濃度50JJg／mlで約30時間処理し，ハンクス液で洗浄後，細胞を集めた。凍結融解によって細胞から抽出した酵素を予めpepstatin・SepharoseaRinitychomatographyを通してCathepsin Dを分離し，その非吸着分画を濃縮後平衡化緩衝液で透析し試料ほ品とした。
カラム：1×7cm，平衡化緩衝液：1mM EDTAを含む50mM酢酸ナトリウム（pH5．0），溶出：NaCl
濃度を0から0．8Mに増大させる直線濃度勾配法，流速：20ml／時間，各画分の液量：5．3m1，−：A280
mm，・・・・・・：電気伝導度から計算した NaCl 濃度 −△−BANA水解活性，−［コー：Leu NA水解活性，一〇一：べブスタチソ非感受性Hb水解活性（5JJg／mlのべブスタチソ存在下で対照群は5mM2−MSH及び5mM EDTAを含むpH5，。イペプチソ処置群ではpH4の最大活性を示すPH筑域で測定）
上図：未処理の対照肝細胞，下図：ロイぺプチソ処理肝細胞，H．B．Lの記号は各々，カテプシソH，B及びLの溶出位匠を示している。

56

8・プロテアーゼ阻害物によるべブスタチソ非感受性へモクpピソ水解酵素の誘導︵u叫言Jdぎ＼uj・与等﹀音トニ冨U壱鼠S
50

Protein（％of Total）
図2InVivo肝臓におけるHb水解酵素の誘導とその細胞内分布
体重200gラットの腹腔内にロイべプチソを1回5mg・12時間おきに4日間注射し，最後に投与後，絶食にして12時間後に殺し実験に使用した。細胞分画は通常の遠心分画法によって行い，lightmitochond，ial
fractionをlysos〇malfractionとした。N＆D：核及び組織破片画分，M：ミトコンドリア画分，：ライ
ソゾーム画分・P：ミクロゾーム画分，S：上溝画分，名画分は凍結融解して酵素を抽出後，活性を測定したoHb水解活性はべブスタチソの有無で測定し，図の斜線部分はべブスタチソ非感受性Hb水解活性を，白抜き部分はべブスタチソ感受性Hb水解活性即ちカテプシソD活性を示している。
57

Ⅱ 標的酵素に対する効果

pHは3〜5の酸性領域にあり，pH安定性もるので，カテプシソBによる水解と思われる。

酸性領域で最も安定であるが，中性及び弱アル尚カテプシソHにはHb氷解活性はほとんど

カリ性領域でも可成り安定である。これらの性認められなかった。さて主なHb水解活性は

質は酸性領域に至適pHを有し，Hbをよく水解するライソゾームカテプシソDと頸似して0．55M NaClで溶出されるが，この酵素は酸いるが，本酵素がカテプシソDのようなカルポ
キシループロテアーゼに特異的な阻害剤である

性pHで陽イオン交換体と強く結合すること
やBANA及びLeuNAなど合成基質に全くペブスタテンで全く抑制されないことからカテ作用しないことから，カテプシソLと推定した。そこでロイペプチンで処理した場合をみる

プシソDとは異なった酵素と思われた。従ってと（下図），まずBANA−水解活性の分布に著

本酵素はべブスタチソ一七ファローズに吸着しないので，この77ィニティクロ∵マトグラフィ

るしい変化が見られる。BANA水解活性はロ一によってカテプシソDと分離した。またこの性が抑制されているが，この場合，カテプシソ

酵素はPMSF，DFPなどセリン残基修飾剤で抑制されず，IAA．TLCK，PCMPなどSH一在していることは興味深い現象である。次に，基修飾剤で阻害されることから，所謂，チオー
ルプロテアーゼに属する酵素と思われる。更に誘導されたペブスタチン非感受性Hb水解酵素のパターンをみてみると，一つは0．3MNaCl

教生物産生の酵素阻害物質8）の影響を調べる

で溶出され，これは明らかにカテプシソB．L．Hと，ロイペプチン，アンチパイン，キモスタテとは異っている。そして他に0．4Mから0．55

ンなど本酵素の誘導物質により強い阻害を受けると共にE−64によっても阻害されるが，エラ

M NaClの広領域にわたって溶出される活性

イぺプチソ処置で対照の約30％位までその活Hがほとんど消失し，カテプシソBは可成り存が認められるが，この酵素とカテプシソとの異スタチナールでは阻害されなかった。他方，本同については尚不明であり，現在，両酵素の精酵素の分子量をセファデックスG−75のゲルク
ロマトグラフィーで求めると，BANA一水解活製を進めている。更に等電点分画法によってこ性とほぼ同位置に溶出され，分子量は約29，000

5．6にあるが，その前後に不均一などークが認と推定された。これらの結果は，本酵素がカテプシソB．H．Lなどの細胞内チオール・プロ

められ，この結果は図1で示したイオン交換ク

テアーゼ9）と煩似しているので，これらとの異致した。また本酵素標品をコンカナバリンA一同を検討する為に，セルロース・ホスフェイの酵素の等電点を調べると，主な活性はpI＝ロマトグラフィーに見られる不均一性とよく一

ト・クロマトグラフィーによる分析を行った。

クロマトグラフィーにかけると吸着画分に加え，非吸着画分にも相当量の活性が回収され

図1はその結果を示したものであるが，上図はた。各分画の酵素は再クロマトグラフィー後に対照，下図はロイペプチソを処理したものであ同一分画に回収されるので，糖鎖構造にも可成る。まず上図のBANA一水解活性のパターンは
二つのピークを示し，0．1M NaClで溶出すりの不均一性が予想されたが，このことと表面る大きい方は同時にLeu NA水解活性をも有しているが0．2M NaClで溶出する小さい方
はLeu NAには全く作用しなかった。即ち前荷電の不均一性との関連性については現在検討中である。
In viYOにおけるHb水解酵素の誘導
初代培養肝細胞で観察したロイべプチンによ者はエンド＆ユタソ・べプチダーゼ活性を持つことからカテプシソHであり，後者はカテプシ

る Hb一水解酵素の誘導はロイペプチンをラッソBと結論できる。次にペブスタチン非感受性でも同様に観察された。ラット100g体重当り

Hb水解活性の溶出パターンを見てみると，こ2．5mg量のロイペプチンを12目刺岩1おきに連続の活性も大小二つに分布しているが，前者の小さいピークはカテプシソBの位置に一致してい投与すると，4日後には肝臓のペブスタチン非58＝旗睦内に直接注射することによってinvivo

感受性Hb水解活性は対照の約10〜20倍上昇

8．プロテアーゼ阻害物によるペブスタチソ非感受性へモクpピソ水解酵素の誘導

するが，ペブスタチソ感受性Hb水解活性即とやその至適pHが酸性領域であることなどか

ちカテプシソD活性はほとんど変動しない。そこでこの誘導現象について臓器応答性を調べてらも支持されると考えている。
考

みると，種々の臓器で誘導されたが，特に肝臓の察

他腎臓で著るしい誘導効果が認められた。対照
動物の各臓器におけるHb水解活性は腎臓でプロテアーゼ阻害剤によるこのHb−水解酵素の誘導撥作については現在全く不明である。

最も高く，次いで肝，脾，肺，脳，心臓などで即ちこの誘導現象が誘導物質の構造類似性に高いが，筋肉の活性は極めて弱い。同様な傾向

依存したものか，若しくはプロテアーゼ阻害の特異性によるものかもよく解っていない。例えはBANA一水解活性においても認められ，これはライソゾーム含量が臓器によって異なっていは，前者の場合なら，誘導物質が allosteric

ることを示唆している。そしてほとんどの臓器

activatorか或いはStabilizerとして作用すのHb一水解活性はべブスタチソで阻害される
カテプシソDによるものであるが，腎臓は例外ることなどが考えられ，また後者の場合には，チオール・プロテアーゼの強い阻害剤である E−

的にペブスタチソ非感受性Hb水解活性が高64に誘導能力がないことから，セリン・プロテ

く，その活性はカテプシソD活性よりも寧ろ高アーゼを阻害することによってこの誘導が発現する可能性が考えられる。しかしながら何れに値を示し，大変興味深い。
次に，この誘導酵素の肝臓における細胞内分布を調べた結果を図2に示した。下図は対照
動物の場合であり，大部分のHb一水解活性はしてもこの誘導機構については誘導酵素の細胞内局在性，誘導物質の膜透過機構とその作用部

ペブスタチン感受性及び非感受性の両者ともラ位及び誘導酵素の酵素学的性質などを詳しく解明しない限り決定的な結論は得られない。他方

イソゾームを含む軽いミトコンドリア分画に回この誘導されるHb一水解酵素は細胞内で最も収され，典型的な細胞分画パターンを示している。しかしながら，ロイペプチンを処置した

強いプロテアーゼ活性を有するライソゾーム・
カテプシソDの数倍の活性を示すことから，何

ラット肝臓のHb水解活性はライソゾーム分らかの生理的意味があると思われるが，この酵画より寧ろ，核・ミトコンドリア及び上清分国

素が本来細胞内に存在するものか人工的な産物にその主な活性が認められ，極めて不均一な分であるのか，この点も重要な問題であるので現在検討中である。

布を示した（上図）。そしてこの場合，Hb氷
解活性はそのほとんどがペブスタチソによって阻害されない誘導酵素であるが，ペブスタチソ
によって阻害されるカテプシソD活性も同様不一均一に分布する。またライソゾーム内に存在す
るBANA一水解活性や酸性ホスファクーゼ活性も，Hb水解活性と同様に不均一な分布を示した。この事は，ロイぺプチソ処理によって，ライソゾームが重い分画に移動する為，核及びミトコンドリア画分にその酵素活性が回収されることと同時にロイペプチソがライソゾーム足英を不安定化する為，ライソゾーム酵素の上活分画への漏出が起こっていることを示唆している。
従ってこの誘導されるHb一水解酵素も本来ライソゾームに局在していた可能性が考えられるが，この可能性はこの酵素が糖蛋白質であるこ

文献1）田中啓二，市原明：蛋白質・核酸・酸素，23，
1259，19782）Anson，M．L．：J．Gen．Physiol，22，79，1938．
3）Barret，A．L．：Anal．Biochem．，47，280，1972．
4）Ragab，HりBeck，C・，Dillard，C，＆Tappel

A・L・：Biochim．Biophys．Acta．，184，101，1967．
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Biochem・Biophys．Res．Commun．91，102，1979．
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7）高月 昭，田村学造：生化学51，969，1979．
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1977．

9）Kirschke．H．，Langner，J．，Wieders，B．，
Ansorge，S．，Botlley，P．＆Broghammer，U．：
Acta，Biol，Med，Gem．，35，285，1976．
59

9．筋ジストロフィーチキンの筋ガングリオシドに及ぼすE−64の効果について（続報）

官
研究協力者

渥

美

暫

武

至＊

正＊メ＊
有

は じめに

賀

敏

夫＊＊

中

村

京

子＊＊

但）糖組成の分析法
単離精製したガングリオシドの糖組成は，比著者らは，筋ジストロフィー症における膜異色法及びガスクロマトグラフィーを用い測定し常の研究の一環として，筋ジストロフィーチキ

た。へキソースはanthrone硫酸法4），へキソ

ンを用いて主要な筋ガングリオシドを比較検討

サミソはした結果，このガングリオシドの組成に異常を認め，1）更に，E−64投与群では，構造が不明の

Svennerholmら6）の方法を用いた。各中性糖

Ⅹgangliosideが減少するという結果を待，前回の報告書で報告した2）。今回は，構造の不明

カラムを用いるガスクロマトグラフィーで定量なガングリオシドの構造を明らかにするとともに，個々のガングリオシドが筋ジスチキンでどのように変化するかを検討してみた。
方法（1）チキン筋ガングリオシドの構造決定
鶏前胸筋30kgよりクロロホルムーメタノー

ル（1：2及び1：1，容比）で総脂質を抽出

Gattら5）の方法で，シァル酸ははSweeleyら7）の方法で3％SE−30ガラスした。シァル酸の種類はYuら8）の方法で決定した。
（凱 完全メチル化法によるシァル酸結合状態の決定
ガングリオシドの完全メチル化は，Ando
ら9）の方法を用いた。完全メチル化ガングリオ
シドは，メタノリーシス後，ガスクロマトグラ
フィー及びガスクロマトグラフ質量分析計を用いて結合状態を決定した。

し，ついでアセトン分画によりアセトン不溶分極）シアリダーゼによるガングリオシドの水解画を得，更にFoIchの分配法を行ない，粗ガ

ガングリオシドはClostridiumperfringens

ングリオシドを得た。ついでMomoiら3）の方

neuraminidaseで370C，18時間処理し分解産法でDEAE Sephadex column chromat0−

物を薄層クロマトグラフィーにより同定した。

graphyを行ない，4分画mono一，di−，tri一結果及びpolysialogangliosideを得た。各分画は，Andoらの方法に従い，Iatrobeads column

チキン胸筋より5個のガングリオシド（A，B，Chromatography及び薄層クロマトグラフィ

C，D，及びE）を単離精製した。そのガングリーを用いて，各ガングリオシドを単離精製した。

オシドの薄層クロマトグラムは，第1図の如くである。AとBはそれぞれ，GM3

と

GD3の

標準物質と同一のRfを示した。他の3つのガ＊自治医科大学神経内科＊＊東京都臨床医学総合研究所

ングリオシドは特有な移動を示し，既知のガングリオシドのRfとは一致しなかった。A，B
61

Ⅰ標的酵素に対する効果

【Bl

【A］
逓汐

藤

瀞

相違凝

＿

！

嘉

一■
＝≡

1

一

嘉

ニ

■■

厳

−

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事

禁

藤

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2

3

A

B

C

D

E

1

2

3

A

B

C

D

E

l：ヒト脳ガングリオシド，2：GMa及びGDaガングリオシド，3：チキン筋の総ガング
リオシド，A−E：単離精製したチキソ筋ガングリオシド
図1単離精製したチキン筋ガソグリオシドの薄層クロマトグラフィー

用C上・●…‖；㍉日日4t肋ヱ1鳥C12川20
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〔

L

bJ

l

L

BG：ヒト脳ガングリオシド，RG：ヒト赤血球膜ガソグリオシド
C：Control．D：Dystrophy．
図262

筋ガングリオシドの薄層クロマトグラフィーi

9・筋ジストロフィーチキンの筋ガソクリオシドに及ぼすE−64の効果について（続報）
表1筋のガングリオシド組成＊FLg NANA／g protein

及びCガングリオシドの糖組成は，グルコース（GIc），ガラクトース（Gal）及び

N−アセ

決定できなかった。
次に，ジストロフィーチキン筋ガングリオシ

チルノイラミン酸（NANA）であり，その比ドを対照チキソと比較検討した。その薄層クロGIc：Gal：NANAはAでは1：1：1，Bでマトグラフィーの結果を図2に示した。先に分は1：1：2，Cでは1：1：3であった。Dガ

離した5個のガングリオシドの他，更に2個のングリオシドは更に∴N−アセチルグルコサミソ

ガングリオシドFとGが検出された。Fは，ヒ（GIcNA）を含み，その比は，GIc：Gal：GIc

ト赤血球の主要ガソグリオシドであるSialyl−

NA‥NANA＝1：3：2：1であった。次に，完全メチル化ガングリオシドをメタノリーシス

Paraglobosideと同一Rfを有し，Gは，新しいガングリオシドで，その構造は調べていな

後，ガスクロマトグラフィーを行なったとこ

いが，最近

ろ，Aより1つのピーク（peakI）が，B及びGal−GalNA−Gal−Gal−GIc−Cer

CからはPeakIの他もう1つのピーク（peak

オシドと薄層上同様な移動度を示すことから，

H）が認められた。Bでは，peakIとⅠⅠの比

これと同一なガングリオシドと考えられる。

が1：1であり，Cでそれが1：2であった。
このピークを質量分析計で調べた結果，peakI

次に，これらのガングリオシドの薄層クロマ
トプレートを二波長クロマトスキャンナーを用は，1，2，4，7，8，9−0−methyl−N−aCetylneura−

いてスキャンして定量した。更に，筋ジスチキン

minicacid，peakIIは1，2，4，7，9−0−methy1−8−

E−64−C150mg／kg，E−64−C300mg／kg

OTMS−NTaCetylneuraminicacidであった。
ガングリオシドA，B及びCはClostridium

群及び経口投与群について検討した。その結

perfringens neuraminidase

筋では，G以外の全てのガングリオシドの増加で水解した結果，全てlactosylceramideとなった。
以上の結果より，ガングリオシドA，B及びChienlO）らが報告したNANA−
なるガングリ治療

果は表1の如くである。ジストロフィーチキン
を認めた。特にDガングリオシドの増加が顕著であった。

Cの構造は，A：NANA−Gal−GIc−Cer（GM，），

E−64−C治療による影響は，総ガングリオシ

G：NANA（2→8）NANA−Gal−GIc−Cer

ド含量については，ジストロフィー群と差を認（GD3），C：NANA（2→8）NANA（2→8）

めなかった。各ガングリオシド分画では，Gガ

NANA−Gal−GIc−Cer（GT3）であることが明ングリオシドを除くいずれのガングリオシド

らかとなったo Dの糖間の結合は微量なため，も，対照に比しジストロフィー群と同程度の増63

1 標的酵素に対する効果

加を認め，そのうち，Dガングリオシドの平均
値はジストロフィー群で9．3土3．5J唱（NANA／
gprotein）に対し，E−64−C−150投与群で6．8

文1）Miyatake，T献Atsumi，T．，Ariga，T・and±2．2，E−64−C−300投与群では6．6±2．2，P．0．

Nakamura，K：Gangliosidesin dystrophic

群では4．0と減少を示した。

Chicken muscle．in Sympc＞Sium on Muscular
Dystrophy．in press．

フィーチキン筋で増加していることを認め，

2）宮武 正，渥美哲至，有賀敏夫，他：筋ジストロ
フィー症における筋膜脂質に関する研究−筋ジストロフィーチキソの筋ガソグリオシドに及ぼすE−64の効果について，今掘班，昭和54年度報告書．

又，これがE−64投与により有意に低下することを報告した。チキン筋ガングリオシドには他

3）Momoi，T．，Ando．S．and Nagai．Y・：High考察

我々は，チキン筋ガングリオシドがジストロの臓器には認められない特異な構造を有するものが存在するため，その抽出と分画法にあたって，多大な困難が存在する。前回の報告では構造の未知であったⅩガングリオシドの構造を検討したところ，この分画には5個のガングリオ
シドが含まれていることがわかり，そのうち3つについては構造が明らかになった。即ち，C
ガングリオシドは今回我々によりGT3であることが判明した。Fは，Sialylparagloboside
であり，又，Dは，糖組成及びTLC上のRf倍
より

Chien

ら10）により報告されたNANA（2→3）Gal（1→4）GIcNA（1→3）Gal（1→4）

GIcNA（1→3）Gal（1→4）GIc−Cer

なるガ

pp．99−102．

resolutionpreparativecolumnchromatographic
systemforgangliosidesusingDEAE−Sephadex
and anew porous silica，Iatrobeads，Biochim
Biophys・Acta，441，488−497，1976・
4）Scott，T．A．，Jr．andMelvin．E．H・：Determina−tion of dextran with anthrone，Anal．Chem．，
25，1656−1661，1953．
5）Gatt，S．and

Berman，E．R・‥A

rapid

pr0−

ccdure for the detemination of aminosugars

on amicroscale，Anal．Biochem．，15，167−171，
1966．

6）Svennerho1m，L．：Quantitative estimationof sialic acids．ⅠI A colorimetric resorcinol−hydrochloric acid method，Biochim Biophys・Acta，24，604−611，1957．
7）Sweeley．C．C．，Bentley．R．，Makita，M・and

ングリオシドと考えられる。

WellsW．W．：GasrLiquid Chromatography of

ジストロフィー筋では，このDガングリオシ
ドの増加が特に認められた。これらのガングリ

Trimethylsilyl Derivatives of Sugars and

オシドの増加は，ジストロフィー筋において，これらのガングリオシドを含む膜の増加，又は，これらのガングリオシドの合成克進又は分解の低下が考えられる。
次に，E−64−C治療による効果についてであるが，先に示したように，未処理のジストロフィーチキン筋と，統計学的有意差は認められなかった。ただ，そのうち，Dガングリオシドの平均値は，E−64−C−150投与群，E−64−C−300

RelatedSubstances，J．Am．Chem．Socリ85，

2497−2507，1963．

8）Yu，R．K．and Ledeen，R・W・：Gas−1iquid
chromatographic assay oflipidLbound sialic
acids：meaSurement Of gangliosidesin brainof severalspecies，J．Lipid Res．，11，506−516，
1970．
9）Ando，SりKon，K・，Nagai，Y・andMurata，T・：

Chemicalionization and electron impact
mass spectra of oligosaccharides derived
from sphingolipids，J．Biochem・（Tokyo），82，
1623−1631，1977．

投与群，及びP．0．群で減少を示した。このD

10）Chien，J．L．and Hogan，E・L・：Characteriza−

ガングリオシドは，ジストロフィー筋で正常のtion of two gangliosides of the paragloboside

8．5倍と最も顕著な増加があり，今後，この変化の原因を追求するとともに，E−64による影響を例数を増して検討したい。

series fromchicken skeletal muscle，Biochim．

64

B三ophyE・Acta，620，454−461，1980・

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす効果

10．ニューロフィラメント変性に対するE−64−Cの効果杉田 秀夫

11．E−64−Cの骨格筋内分布とInvivoにおけるプロテアーゼ阻害作用について
石浦章一

12．カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究

石浦章一

13．培養筋細胞に対するE−64の作用

小沢疾二郎〜筋管細胞のタンパク分解速度に及ぼすE−64−Cの影響〜
14．N一〔N−（L−tranS−3−Carboxyoxirane−2−Carbonyl）−L−leucyl〕−3−metyl−

butylamine（E−64−C）の筋蛋白質代謝に及ぼす影響

江橋 節郎

15．ヌードマウスへの異種移植筋の再生に対するE−64の効果………………………寺尾寿夫

10．ニューロフィラメント変性に対するE−64−Cの効果

杉 田 秀 夫＊，＊＊
共同研究者

鎌

＿倉

恵

子＊

井

原

康

夫＊

石

浦

章

一＊＊

研究目的

がわかった5）・7）。InvivoでのWaller変性で，生化学的にもNFtripletが変化することがわ● ラットなど，哺乳類の末稽神経軸索蛋白成分

かった6）。以上から，SchlaepferはCa依存

として，neurOfilament（NF），microtubles

性で且つPCMB，TLCK，TPCK等で阻害さ等がいわれているが，これら蛋白質のSDSれる性質を持った，特に∴NFに親和性のある

polyacrylamidegelelectrophoresis上での同定についても近年，研究が進められている。

proteaseの存在を推測している7）。

Microtubulesのtubulinについては早くよ

plasmaに於てそのNFである分子量20万のり研究が進んでいたが1），NFについても，
1975年のHoffman，Lasekら2）のSlowaxonal

蛋白にCaに依存して作用し，PCBM，TLCK，

flowcomponentの研究以来議論され，最近，Squid axoplasmaでも森，黒川により3），分子量各々20万，16万，6．8
万のtripletproteinであることが確立された。

TLCK，TPCKで阻害される酵素の存在が推測されている9）。

一方，invertebrateでは，myXicolaaxo−

leupeptin で阻害される酵素の存在が8），又NFである分子量16万の蛋白にCaに依存して作用し，PCMB，

Schlaepferらの1971年以来の研究により，

我々はラット坐骨神経切片を用い，in vitro

invitro＿での末梢神経切片incubation実験でのincubation実験で，NFに対するCaイから，Calcium（Ca）に依存して病理形態学的オンの影響，及びそれに対する E−64−ClO）・11）にmicrotubules，NFの、disruptionがおこの効果をSDSpolyacrylamideslabgelelec−

り，これがinvivoでのWaller変性の際のtrophoresisを用いて検索した。

変化に似ていることがわかった1）・7）。又，この材料及び方法変化が，Caを含まない溶液中ではおこらず，
PCMBで前処置することによって阻害される

1）150〜200g

ことがわかっ串4）。生化学的にも，同様の実験＊ 東京大学医学部脳研神経内科

坐骨神経を取り出し，板及び末梢端は除いて，6mm の Segment に切る。これを次の各溶
液内でincubate した。基本溶液（以下Basic
medium．B．M．と略す）は Tris−HCl（5mM，pH7．4），NaCl（130mM），KCl（4mM），
Penicilline G（1000u／ml），glucose（1g／1）である。溶液Aは B．M．＋5mM EGTA の＊＊国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部

Cafree溶液，溶液BはB．M．＋5mM又はで，SDSpolyacrylamidegel上で，先に述べたNFtripletがCaに依存して消失し，この変化がCaを含まない溶液中ではおこらす，
PCMB，TLCK，TPCK等で阻害されることのオスのWistar

ラットより

67

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果

10mMCaC12，溶液Cは溶液別こ0．015mg／ml

Oreを150〃g／mlを用いた実験では4〜24時
間，30〜350Cでincubate L，経時的にとり中で行なった。
2）ラット又はウサギ脊髄，及び坐骨神経より
NFをSchlapfer12），森13）らの方法の変法で精製した。材料を低張液車で静置してNFを抽出し，0．1M NaClで安定化させ，最後に
1Msucroseを用いてpelletとして回収し，これを1）の実験の対照として用いた。ウサギ脊髄より精製したNFにウサギ骨格筋より抽出したCa−aCtivated neutral protease（以下出し，300FLlの2％SDS，0．08M Tris−HCl

CANPと略す）5FEg，又は20FLgを0．1Mダ〜2mg／mlの種々の濃度のE−64−Cを加えた。
すべての溶液はpH7．4に調製し，Caイオンの組織内浸透をよくするため，1％TritonX−
100，又は150FLg／mlのionophore（A23187）を用いた。溶液内のSegmentは1％Triton
X−100を用いた実験では1〜7時間，ionopI1−（pH6・8），10％vol／volのglycerol，5mM
2−merCaptOethanol中で homogenize L，
5分間加温した。各サンプル10〜20〃gをLaemmli31）の方法に従い，7．5％SDSpolya−
Crylamideslab gel electrophoresisにかけた。GelはCoomassieBrilliantBlueR−250

胃＼、轡、＼磯 莞警警

糟﹂．d一−粕

寧■

中でも同様に作用させた。各サンプル5膵を
7．5％ SDS polyacrylamide slab gel elec−
trophoresisにかけ，硝酸銀による染色を行な

匝−仙−tonX−100を用いた10mMCaC12を含む溶液

た。一方，上記溶液中にE−64−Cを加えた溶液

照︑．

で染色した。E−64−Cの添加実験は，1％Tri−

リセロリソ酸ナトリウムーHCl，5mM CaC12，

25mM2−merCaptOethanol中で300Cで作用させ，0〜60分の間経時的にとり出し，SDS，Trisを含む溶液中に溶解し，5分間加温し襲単組・空碧空碧

郎鱒軒

＼

ヽ▲

欄

・一・一十

二才 間

2

3

野

1

4

．樋

盛

5

6

7

8

9

10

図11％TritonX−100を用いた実験の7．5％SDSpolyacrylamideslabgelelectroresis．1，2，
3はCafree，5mMEGTA溶液中でincubationした結果で左より右へ2，4，6時間である。
5，6，7は10mMCa溶液中でincubationした結果で左より右へ2，4，6時間である。
8，9，10は10mMCa＋1mg／mlE−64−C溶液中でincubation した結果で左より右へ2，
4，6時間である。
4はラットSpinalcordより精製したneuro負lamentである。
矢印は上から下へ20万，16万，6．8万M．W．の蛋白を示す。
68

10．ニューロフィラメント変性に対するE−64−Cの効果った。

2）ウサギ脊髄より精製したに∴NF triplet
結PrOteinにCANPを直接作用させると10分ご

果ろより消失し，この変化はE−64−Cで完全に抑1）Caを含む溶液B中では，1％Triton X−
100を用いた場合，10mM Caでは1時間で，5mMCaでは2時間で，NF proteinの選択的消失がみられた。これに対し，Cafree溶液
A中，及びE−64−C を添加した溶液C中では制された（図2）。
考案

以上より，invitroにおいてNFtripletがCaイオンに依存して消失し，その変化がE−

7時間までの観察では，NF tripletに変化はみられなかった（図1）。又E−64−Cの濃度を変えて実験したところ，最低30／jg／mlでNF
tripletの変化に対する阻害がみられたが，その効果は1mg／ml，0．5mg／mlなどよりは弱く，15／Jg／mlでは阻害はみられなかった。
次にionopboreを用いた実験でもCaを含む溶液B中では，NFtripletの選択的消失がみられたが，TritonX−100の場合より時間がか
かり，10mM CaC12溶液内で6時間incuba−tionした頃から消失が現われはじめた。Ca
free溶液，E−64−Cを添加した場合には最高64−Cにより阻害されることがわかった。Caイ

24時間までincubation したが，NF triplet
PrOteinに変化はみられなかった。

ジストロフィー症で，CANPがCaにより活性されZ−bandに選択的に作用するように，

オン濃度は10mMでは，5mMより速く NF
tripletを消失させた。このことから，末梢神経に，Caイオンに依存性があり，thiolpro−
teaseinhibitorであるE−64−Cで阻害される性質を持った酵素が存在し，ⅣFに作用することが推測される。この酵素の性質は筋肉等でみつかっているCANPに非常によく似ている。
事実，NFがCANPの基質となり，その変化がE−64−Cで阻害されることが2）の実験より証明された。
この酵素は，筋疾患であるDucbenne型筋

七■﹂一⁚−
1
図2

2

3

4

5

6

ウサギSpinalcordより精製したneuro丘lamentにウサギ骨格筋より精製したCANPを作用させた結果。
1，2，3はneurc＞filamentO・5rngにCANP20iLgを作用させた結果で左より右へ0，20，
60分である。
4，5，6は上記条件に10′唱E−64→Cを作用させた結果で左より右へ，0，犯60分である。
矢印は上より下へ20万，16万，6．8万のtriplet proteinを示す。
69

Ⅲ 組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果

末梢神経の病的状態，つまり Waller変性等
で，Caイオンが末梢神経のaxon内に流入する事により活性化され，NFに選択的に作用すると考えられる。
なお我々は，invivoにおいても，ラット坐骨神経をエーテル麻酔下に切断し皮膚を縫合してWaller変性をおこさせ，経時的に断端より末梢で末梢神経をとり出し，homogenize
後，SDSpolyacrylamide gelelectrophore−
sisにかけることにより NFの変化を調べた。
手術2日後よりNFtripletの選択的消失がみられた。しかし，E−64−Cをinvivoに注入した結果は，皮下注，腹艦内注等の投与方法を用い，E−64−Cの濃度も種々変え（10mg／kg〜
50mg／kg），且つE−64−Cの溶媒も生食，20％
DMSO，01ive oilなどを変えて試みたが，NF変性の阻害はみられなかった。
結論

ラット坐骨神経切片のin，Vitro でのin−
Cubationの実験を行ない，SDS polyacryla−
midegelelectrophoresis法で調べた。Caイ
オンに依存して，NF tripletprotein（20万，
16万，6．8万M．W．）が消失し，この変化はE−64−Cを加えた溶液中及びCafree溶液中ではおこらなかった。この結果は末棉神経内に，Caイオンに依存して活性化され，E−64−Cで阻害される性質を持つ酵素が存在することを推測させ，この酵素はCANPに極めてよく似た性質を持つと思われる。

and their generality among mammalian neu・rons，J．Cell Bio1．，66，351，1975．
3）Mori，H．and Xurokawa，M．：Morpbologicaland biochemical characterizationofneurofi1a−
mentsisolatedfrom the rat peripheral nerve，Biomed．Res．，1，24，1980．

4）Schlaepfer，W．and Hasler，M．B・：Charac−terizationofthecalcium−induceddisruptionof
neurofilamentsin rat peripheralnerve，Brain
Resリ168，299，1979．

5）Schlaepfer，W．W．and Micko，S・：Calcium・
dependent alterations of neuro丘lament pro・
teins of rat peripheralnerve，J．Neurcchem・，
211，1979．

6）Schlaepfer，W．W．and Micko，S．：Chemicaland structural changes of neuro丘lamentsin
transected rat sciatic nerve，J．Cell Bio1．，78，
369，1978．

7）Schlaepfer，W．W．：Nature of mammalian
neurofilaments and their breakdown by cal−Cium．In Progressin Neuropathology，Vol．4（ed．Zimmerman，H．M．）Raven Press，New
York，pp．101−123，1979．
8）Pant，H．C．and Gainer．H．：Properties of a
Calcium−aCtivated proteasein squid axoplasm
Whichselectivelydegradesneuro丘lament pro−teins，J．Neuroboi1．，11，1，1980．
9）Gilbert，P．S．and Newby，B．J．：Neuro丘la−ment disgulSe，destruction and discipline，
Nature256，586，1975．
10）Hanada，K．，Tamai，M・，Yamagishi，M．etal．：Isolation and characterization of E−64，
a new thioI proteaseinhibitor，Agric．Biol．
Chemり42，523，1978．
11）Hanada，KリTamai，M．．Ohmura，S．etal．：

Stucture and synthesis of E−64，a neW thiol

文●献proteaseinhibitor．AgriC．Biol．Chem．，42，529，
1978．

1）Weisenberg，R．C．，Borisy，G．G．and Taylor，
E．W．：The coIchicinebinding proteino：mam−malian・brain anditsrelationtomicrotubules，Biochemistry，7：4466，1968．
2）Hoffman，P．N．and Lasek，R．J．：The slow
COmpOnent Of axonal transport．Identification
Of major struCtural polypeptides of the axon

7012）Schlaepfer，W．W．：Studies on theisolation
aIid

substructureofmammalianneurofi1a＿

ments，J．UltrastruCt．，61，149，1977．
13）Laemmli，U．K．：Cleavage of structuralproteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4，Nature，227．680，1970．

11．E−64−Cの骨格内分布とin vivoにおけるプロテアーゼ阻害作用についての検討

究協力者

花

田

和

石

浦

章

一＊

紀＊＊

玉

井

正

はじめに

晴＊＊

相

木

敬

子＊＊

含む20mMトリスーマレート緩衝液，pH6．8を用いてホモジナイズし，1，000r．p．m．5分

E−64並びにその塀縁体のチオールプロテアの遠心で筋フィラメント分画（MF）を得た。沈ーゼ阻害活性については種々の報告がある1），2）。

殿（MF）をもう一度同緩衝液で洗いこの上清と中でも動物細胞のチオールプロテアーゼでは前に得た1，000r．p．m．の上溝を混ぜて19，000

Ca．依存性プロテアーゼ3）・4），カテプシソB，
L5）・6）及びH7）を強力に阻害すると言われていr．p．m．1時間遠心しミトコンドリア，ライソ

る0 しかしながらin vivoでの阻害様式については異論のあるところであり，E−64投与によって細胞内プロテアーゼ活性が減少するのはゾーム分画（ML）を得た。この上清と再び洗濯した上清とを混ぜて上清画分（PS）とした。
ライソゾームのマーカー酵素である酸性マル
ターゼは村上らの方法9）で測定した。
Caイオノフォアを用いたα−アクチニン遊離

血清中に含まれるE−64が酵素調整の段階で混入したものではないか，とも考えられている。

の実験は石浦の方法10）によった。なお外液の我々はinvivoに投与したE−64−Cが骨格筋

α−アクチニソ量はCBB染色したポリアクリルのいかなる画分に存在するか，また生筋の中にアミドゲルを600nmでトレースし定量した。

存在するE−64−Cが実際にタンパク分解阻害活性を持つのかどうかを調べる目的で，ラットにE−64−CをS．C．投与し，骨格筋内の分布とinvivoでのインヒビターの作用を我々が開発したZ一線崩壊阻止活性8）で観察した。
材

料

ウィスク一系ラット（200g）を使用した。
〔3H〕E−64−Cは365FLCi／mgのものを用いた。
方法

結果及び考察
表1は2匹のラットを用いて行った〔3H〕−
E−64−Cの3時間後の骨格筋内分布である。3Hは大部分が上清画分に回収されることが明らかになり肝臓で報告されているようなライソゾー
ムへの濃縮5）・6）はこの時点では起こっていなかった。表1より上清画分の比活性はMF，及びML分画よりも数段高く，ほとんどの〔3H〕
E−64−Cが細胞内小器官に結合したり，とり込

ラットにE−64−Cを10mg／kg皮下投与し，まれているのではなく，可溶性画分に存在するといえる。

3時間後，及び24時間後放血し，後肢筋約2g

そこで，ライソゾームへの濃縮は骨格筋ではを採取した。骨格筋は約10倍量の50mMKClを

時間がかかる可能性を考え，E−64−C投与24時＊ 国立武蔵療養所神経セソクー疾病研究第1部＊＊大正製薬株式会社総合研究所

間後の3Hの分布を同様の方法で測定した。その結果が表2である。表2では何らかの理由によ71

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果
表1
Fraction

Total R．A．

Protein

S．A．

Exp．1（1．884g）
WH113．8mgMF

71．6

42，380

592

ML

1．93

3，420

1，770

PS

19．2

83，3684，353

Exp．2（1．915g）
WH

143．2

233，700

MF

71．7

47，522

ML

2．65

4，799

PS

29．1

137，689

184，680dpm

l，623

10mg／kg，Subctaneouslyinject・，after3h・

表2
Fraction Protein Total R．A．
mg

S．A．

dpm

Acid Maltase

dpm／mg

Uuits

U／mg

Exp．1（2．055g）
WH

127．4

602，360

4，832

MF

64．4

138，380

2，147

4，788

74．3

ML

1．69

2，820

1，669

1，097

649

PS

44．5

378，378

8，505

2，390

53．7

Exp．2（1．892g）
WH

133．6

528，990

3，959

MF

62．3

140，560

2，256

4，008

64．3

ML

1．82

3，250

1，783

1，149

630

308，705

8，094

2，732

71．6

PS

38．1

10mg／kg，Subctaneouslyinject・，after24h・

り総放射活性が3時間のグループよりも異常に多く見られた。この理由は不明である0しかしながら表1と同様にライソゾーム分画への特異いと考えられた。
次に，これらより生体内のE−64−Cの濃度を算出すると，可溶性画分では（表2，Exp．1

的な濃縮はこの時点でも見られず，やはりほとんどが上溝画分に来ることが判明した。分画操参照）約23FLg／g wet weight 存在すること作がうまくいったことは表2の酸性マルターゼの比活性が他の分画の10倍近い事実を見ても明分に存在するCa依存性プロテアーゼ（10／増／
g wetweight）を阻害するのに十分な量であらかである。以上の事実により，生体に投与されたE−64−Cは確かに骨格筋中にはいり，しかる○そこで，in vivoにE−64−Cを投与し，筋肉内濃度が最高になった時点で骨格筋をとり出もその可溶性画分に比較的多く存在することがし，外からCaを筋細胞内に入れてプロテアー

明らかになった。またこの時点では血液中の3Hはほとんど無視出来，しかも骨格筋中の3Hゼを活性化させ，その特異的Z一線消去作用を定量すれば，実際E−64−CがinvivoでプロはそのほとんどがE−64−Cの形で存在すること

テアーゼを抑えるか否かが判定できるわけである。Z線の消失は外液に流出したα一アクチニが明らかになり，分解産物を見ているのではな
72になるが，理論的にはこれで生体内の可溶性画

11．E−64−Cの骨格筋内分布とin vivoにおけるプロテアーゼ阻害作用についての検討
表3
MuscleAdditionsProtein

α一aCtinin

arbitrary U
Soleus
5

1

EGTA

9

Ca

6

5

6

5

Ca（E64C）
Ca（E64C）
9 乱 26公

EGTA
Ca
Ca（E64C）
Ca（E64C）
25mg／kg，Subctaneouslyinject．
after30min．

1

2

3

4

5

6

7

▼■′￣1

¶

8

山人■和

←α−アクチニソ（上のバンド）

叫ト ニー

二二㌧

瀾
一m，

■t†

二三二

嶋鮭

㈱

幣
図1

外液に溶出したタンパク質のSDS（13％）ゲル電気泳動図。1−4はE−64−C（25mg／kg）投与群。5−8はその対照（非投与群）。1，2，5，6がEDL，3，4，7，8がS〇leus。反応液には1mM CaC12を添加し，A23187（25FLg／ml）シクロへキシイミド（0．5mM）中で370C，
511イソキュベート後の上清をとったもの。ただし，5と7にはlmM CaC12の代りに0．1
mM EGTAを加えてある。
73

Ⅲ．組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果

ンの量を測定することで定量化が可能である。

文

図1はインキュベーション5時間後の外液のSDSゲル電気泳動図である。赤筋である
Soleusでも白筋であるEDLでもCaがa−アクチニンの遊離を促進することは明らかであ献1）Hanada，K．．Tamai，M．，Morimoto，S．，Adachi，T．，Ohmura．S．，Sawada，J．and Tanaka．Ⅰ．：
Ⅰnhibitory activity of E−64

derivatives on

papain，Agr．Biol．Chem．，42，537，1978．

る（図1のNo．5−8），そこでinvivoでE−

2）Hanada，K．，Tamai．M．，Morimoto，S．，Adachi，

64−Cを投与したラット骨格筋ではどうなるか

T．，Oguma，K．．Ohmura，S．and Ohzeki，M．：A

を見ると（図1のNo．174），SoleusでもEDL

Specincthiol proteaseinhibitor，E−64

でもCaによるα−アクチニソの遊離を抑えな

derivatives，Peptide Chemistry，31，1979．

いことがわかる。これを定量化したのが表3である。Soleus筋ではある程度α一アクチニンの遊離が抑えられているかのような印象を受ける

andits3）Sugita，H．，Ishiura，S．，Suzuki，K．and
Imahori，K・：Inhibitionsofepoxidederivatives
On Chickencalcium−aCtivatedneutralproteaseinvitroandinvivo，J．Biochem．，87，339．1980．

が，EDLでは全く抑えていない。この実験では使用したE−64−Cの量も多く，しか．も注射後

4）Sugita，H．，Ishiura，S．，Suzuki，K．and

30分と，生体内分布が最大の点を選んだにもかtease anditsinhibitors．In vitro effect on

かわらずin vivoでのプロテアーゼ阻害に対しては否定的な答が出たが，理由はいくつか考

Imahori，K．：Calcium activated neutral pro−infact myo丘bril，Muscle and Nerve，3，335，
1980．

5）Hashida，S．，Towatari，T．∴Kominami，E．and

えられる。第1は，Z線消失，α−アクチニソ

Katunuma，N．：Inhibitionsby E−64derivatives

遊離に関与するのはチオール以外のプロテアー

Of ratliver cathepsin B and Cathepsin Lin

ゼである，という考え方であるがこれはinVitroandinvivo，J．Biochem．，88，1805．1980．

VivoにおけるE−64−Cの阻害実験によって否

6）Barrett，A．J．：Human cathepsins B and H．

定された。第2は精製したプロテアーゼに対す
る E−64−Cの効果と，invivoにおける効果と

expressionofcathepsinsindystrophic muscle，は違う，という可能性で，粗抽出液などではE−64はプロテアーゼを抑倒しにくい11）という説もあり詳細に調べる必要がある。
本研究において，E−64−Cは骨格筋内細胞質
可溶画分に存在することが明らかになり，ライ
ソゾーム酵素を阻害しにくい状況にあることが判明した。しかしながら，可溶性画分に存在す
るZ線遊離酵素（Ca依存性プロテアーゼ煩）を完壁に抑制することは出来ず，この点について問題があると思われる。

747）Eatunuma．N．and Noda，T．：Pathogenic

Proc．Symp．Mus．Dys．，pp．42，1980．
8）Ishiura，S．こndSugita，H．：Calcium−aCtivatedneutral protease．Its rolein muscle cell

degradation，Proc．Sym．Mus．Dys．，Pp．47，
1980．

9）村上博彦，高木昭夫，埜中征故，石浦章一，杉田秀夫，水谷誠：日本ウズラに発見された梼原病
Ⅱ型，神経内科，13，326，1980．
10）石浦章一，埜中征故，杉田秀夫：本報告書
11）西塚春美，その他：カルシウムプロテアーゼと蛋白質リン酸化反応による生理絞能の調節に関する研究，E−64班会議昭和54年度報告書，pp．117．

12．カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究

石 浦 章 一＊・
研究協力声 埜 中 征 哉＊ 杉 田 秀 夫＊＊

表l

はじめに
骨格筋を構成するタンパク質の代謝は，肝臓のタンパク質などに比して遅く，また数多くの因子によって調節されている。非常に精密な過程を経て合成されるタンパク質の調節機構については詳細な検討がなされているが，分解過程

Muscle

組織中のCPK量
Wet Weight CPK act．
（g）

（U／g）

Soleus o．106±0．004

611士52

EDL o．124土0．002

1789士68

n＝8．mean士S．E．M．

についてはその調節機構の存在すら示唆されて解酵素と考えられるに至った。第1の特性は二いない状態である。その困難さはある特定の生

価陽イオン，特にカルシウムによって活性化さ体内プロテアーゼが非常に広い特異性を持ち，れることで，生体内プロテアーゼの中ではこのどのプロテアーゼがどのタンパク質を分解してように特異的なCOfactorを持つものは珍し

いるかを厳密に推定することが出来ないことに起因する。その点骨格筋は，限られた数のタンい。第2は活性発現に必要な残基はSH基であり，SH試薬による活性化や阻害剤との反応性

パク質によって構成されしかも量が多いというより典型的なチオールプロテアーゼであるこ

実験上の長所を持つ故，この種の実験には比較と。第3は，非常に奇妙な基質特異性を持ち至的多く用いられてきた。分解系を調節する因子

適pHのある中性付近でも人工基質はほとん

としてほ，ホルモン，アミノ酸などの報告があど水解せず，また可溶性酵素も分解しないこるが，最近筋ジストロフィー症の病態とも閑適と。そして第4は，それぞれの臓器に特異的なして，カルシウムが分解系に作用しているのでインヒビターを持っており通常の状態では作用はないかと広く考えられている。その最たるものが，カルシウム依存性プロテアーゼの発見でかしながら現在までのところ骨格筋以外では酵ある。

素は精製されておらず全く同一群の酵素である

しないと考えられること，などである1）・2）。し動物の各臓器に，カルシウムに依存した新しのか，また非常に類似した酵素（例えばカテプ

いプロテアーゼが存在するとの報告は1970年代の初め頃から2，3あったが，ここ数年の問には1980年Mellgrenによって発見された低カル

シソBとL）が存在するのかの確証はない。

ばすべての臓器の可溶性画分に活性が回収されシウム依存性プロテアーゼ3）もその本体は不明

ることが判明し，そのubiquitousな存在様式である。我々は1978年，ニワトリ骨格よりカルと特異な作用から全く新しい一群のタンパク分

シウム依存性プロテアーゼ（Calcium・Activa・＊ 国立武蔵療養所神経セソクー疾病研究第1部＊＊東京大学医学脳研神経内科

tedNeutralProtease：CANP）を精製し，それが特異的に筋構成タンパク質を分解するこ75

Ⅲ 組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果とを発表した。また酵素の大部分は可溶性画分

mMのシクロへキシイミドを添加した。370Cに存在するものの，その一部は骨格筋Z線に局でインキュべ−ト後，上清に遊証したタンパク

在し4），筋のdisassemblyに関与するらしいとの結論を得た。

質はLowry法で定量し，その種類はSDS電

しかし，これらの事実から得られた筋崩壊の気泳動法にて検索した。外液に遊託したCPK

スキームはすべて推測であり実際に生体内にお（クレアチンキナーゼ）量は，Boehringer社のキットで測定した。

いてCANPがZ線に作用し，筋線経の崩壊に

骨格筋内のCANP活性測定法は既報の通り関与しているのかどうかさえ明らかではなかった。本研究はこの点を明確にするため，とり出であるが，特に硫安50％の沈殿にて測定した。
また精製

CANP

と精製カテプシソB（徳島

した正常な骨格筋に外からカルシウムを導入し大学医学部，野田隆先生の御厚意による）のタ

そこで観察される変化がタンパク分解作用の結ンパク分解活性は，サクシニルカゼイYを基質

果であるのか否かを検討したものである。また同時にライソゾーム酵素である種々のカテプシとして，pH7．5（0．1Mダリセロリソ酸ナト

ソの筋タンノミク質崩壊に対する作用についても考察する。
方リウム）とpH5．5（0．1M酢酸）で行った。
結果（1）A23187の生体膜に対する影響

法

イオノフォアとは，生体膜に作用してイオンカルシウムイオノフォアA23187（図1）は，透過能を高める働きのある抗生物質である。

Calbiochem社から購入しDMSOに溶解してA23187は図1に見られるように分子末端にカ使用した。E−64−Cは大正製薬より寄贈を受けルポキシル基を持つため，カルポキシルイオ

た。
まず，Wistar系ラット（250g）から赤筋でのイオン選択性を持つ物質であり，これら陽イノフォアに分類され，Mn＞Ca＞Mg＞Sr＞Br

Extensordig−

オンとH十との問で電気的に中性な交換反応を

itorumlongus（EDL）筋を旺と共にとり出行うとされている。しかし，A23187を骨格筋あるSoleus筋と自筋である

し，Kameyamaらの方法5）に準じてKrebs−に作用させると種々の変化が起こることから，

Ringer溶液中でインキュべ，トした。この年

単にイオン交換のみならず，生体膜への直接的令のラットではSoleus約70％がslowtype
で残り30％が fast type となっているが，

toxicity が想定されたので，この点について

EDLではほぼ100％がfast typeに分化していると考えられる6）。通常のインキュベーショ
ン混液には，タンパク合成を抑えるため0・5
A23187

実験を開始した。膜の破損は骨格筋からのCP
Kの漏出を指標とした。これは，Duchenne型筋ジストロフィー症における血清CPXの特異的上昇と形質膜の破損の関係に対応するものと考えることができるからである。
図2AはA23187の反応混液中の濃度と，1時間後に反応混液に流出したCPK量との関係をプロットしたものである。明らかに，
A23187の濃度とCPKの流出には比例関係があることがわかる。また，EDLとSoleusの違いは2つの可能性が考えられる。1つは，EDLの膜の方がSoleusよりも弱くイオノフ

ォアによって破壊され易い，という可能性，もう1つはこの差は単にEDL
図176

イオノフォアA23187の構造とSoleus中のCPKの量を反映しているにすぎず膜は同様に

12．カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究

3∈＼n︶トトlA−↑Uく鍼dU︵tE＼⊃︶と三一U再出dU

0

1

2

3

4

5

INCUBATION TIME（h）
0

5

12．5
A23187（〃g／ml）

B

図3 カルシウムによるCPKの遊離反応泥液（4ml）にはA23187（25J唱／ml），シクロ
へキシイミド（0．5mM）を添加。○＋Ca（lmM），●＋EGTA（0．1mm）。実線はEDL，破線はSoleus・な分子量の大きなタンパク質よりも，もっと小さなペプチド顆の流出の方が大多数を占めてい二E＼苦︶．U亡OU u叫ヱOhd

ることが想像された。
以上の実験により，A23187単独でも生体膜に影響を与え，CPKのようなタンパク分子を外液に放出することが可能な程度の変化を膜に及ぼしていることが判明した。
（2）カルシウムによる骨格筋の崩壊
次にカルシウムによるCPKの遊離を見ると
0

図2

12．5

図3に見られるごとく，ほとんど影響を与えな
いことがわかる。このようにカルシウムイオソ

A23187（〃g／ml）

は単独では正常な骨格筋からのCPX遊離を促

A23187の生体膜に対する影響進させることはなく，A23187ほどは生体膜に5反応溶液（4ml）にはA23187（任意），シクロへ
キシイミド（0・5mM）EGTA（0・lmM）を含む。
イソキュべ−ショソは370C，lIl。

悪影響を及ぼさない。しかしながら，この時，明らかに外液に流出するタンパク質の総量が増破壊されているという可能性である。これを明加すること（表2参照）が判明した。この差は流出するタンパク質の相違に起因するのではな

らかにするため組織中のCPK量を検討し表1

く，主としてカルシウムによってタンパク質のに示した。明らかにEDLの方が約3倍多く
CPKを含むことがわかり，これは図2Aのデ分解が促進され，その結果としてのアミノ酸遊ータと対応していることから後者の可能性を示唆している。これに反して溶出総タンパク量は態的にはZ線の消失が見られるが，その他の構
造，例えば，A，Ⅰ帯やM線の異常は認められ離の上昇を反映しているものと考えられる。形

Lowry法で測定する限り大差はなかった（図なかった（図4）。図5は，インキュべ−ト後2B）。このことから，この時点でCPKのようの骨格筋より α一アクチニンを抽出し，その量77

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果

図478

インキュベート後のEDLの電顕像
A：EGTA，B：＋Ca

12．カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究

1
1

0
1

9

●

8

し

●二 ●
十轟 三．
■●望︼ 十

●●

7

■

0−0

■

十ヨ一一・

−■宗瞥 −

J

6

5

4

3

2

1＿J

12

∴こ

こ●

ゝ・
■

●

■

義二■f
【DL SOL
図5

骨格筋低イオン抽出物のSDSゲル電気泳動図（14％）

No・5−8が抽出したα−アクチニソ分画。＋，−はインキュベーション時のカルシウムの有無。
No・6でα一アクチニソの減少がN0．5に比べて明白である。

表2 種々の因子によるタソバク質の遊離に対する影響Muscle Additions

Protein release

そこで問題は，このカルシウムによるZ線の消失は既知のCANPの活性化によって直接的に起こるのか，またはカルシウムが細胞内器官を破壊しそこから新たなプロテアーゼが放出さ（％of wet wt．）

れた結果であるのか，更にこれは単なる細胞内
EGTA l．34±0．23
Soleus Ca（n＝6）

3．29±0．10（n＝3）

Ca，E−64−C l．84±0．27（n＝3）

EGTA l．28士0．27
EDL Ca（n＝6）

2．66土0．10
Ca，E−64−C

2．17±0．32の環境の変化（ATP量，酸化還元電位の変化
イオン組成など）によるものなのかが問題になる。まず，第1，第2の可能性，つまりタンパ（n＝3）

ク分解作用を介するかどうかについて検討を加（n＝3）

えた。その結果，インキュベーション混液にチ（37OC，5h）mean土S．E∴M．

オールプロテアーゼインヒビターを加えた時にのみZ線遊離阻害が見られた。効果があったのを比較したものである。カルシウム処理筋（特にEDL筋）において96，000ダルトンのα一アクチニンの減少が見られる。このα−アクチニンの減少は図4で見られたZ線の消失に対応する。以上の事実より，Z線の特異的消失は
A23187の作用によるのではなく，カルシウムが骨格筋細胞内に流入することによって引き起こされると結論づけることができる。しかもこはE−64−C，ロイべプチンであった。表2では，まず外液に流出するタ∵／ノミク量がE−64−Cによってある程度抑えられていることがわかる。そこでどのタンパク質の遊離がE−64−Cによって抑制されるかを見たのが図6である。E−64−Cを添加した方はSoleusでもEDLでも96，000
ダルトン（α一アクチニソ）のみが外液流出を妨げられていることがわかる。形態的には図7にのカルシウムの作用はZ線に非常に特異的であ示すようにE−64−C処理筋（図7B）の方は比り，このZ線消失は細胞内にカルシウムが流入

較的筋線経が一様なのに比して，カルシウム処したことを表す良い指標の1つになると考えら

理筋（図7A）では筋線経の過収縮による分断，れる。

並びにフラグメソHと（図中央上部）が見られ
79

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果Eる。以上の事実を総合すると，カルシウムによSるZ線の消失は確かにチオールプロテアーゼを介するものであり，E−64−Cはカルシウムによる骨格筋のフラグメソト化を強く抑制することが明らかである。

雷雷 雷雲．

AiLiiっ＿一．；＿諺

TM−串■巨・・小一
d−→一

品

甥■電l

t■−

等学

■■■■

次に，E−64−C処理筋と未処理筋中のCANP

芸蔓

▼▼℡

活性を測定した（表3）。SoleuS，EDL共に
E−64−C処理でCANPの活性が大幅に低下し

モ1彗

二二＿．

ているのがわかる。

−・＜凧オ

「

■−

最後に，カテプシソがライソゾームより可溶
性分画に遊離LZ線を消失させる可能性もある−ー■■■ど∵虜恩領温【図6

ため，我々が発見したもう1つのZ線遊離酵素であるカテプシソBとCANP との作用を比較」＄

外液に流出したタンパク質のSDS電
気泳動図

左の2つはE（EDL），S（Soleus）の筋線経を分子量マーカとしたもの。右4つが遊離したタンパク質o E−64−C添加により96Ⅹ（α−アクチニソ）の遊離が抑制されているのがわかる。

した。図8はE−64−Cと両プロテアーゼとの相互作用を示したものである。この結果よりカテ
プシソBの方が10倍はどE−64−Cに対する感受性が高いので，カテプシソBが細胞可溶画分に遊離してくるならばE−64−Cによって十分に阻害される状況にあるといえる。
考表3

E−64−C処理による筋CANP活性の変化
CANP Activity

Muscle ConditionSU／gwetwt．％Act．
SoleusEDL

none（n＝10）

4．67±0．33

100E−64−C（n＝5）

1．59士0．3134

none（n＝10）

2．22±0．15

100

E一朗−C（n＝5）

1．68±0．67

76

mean ± S．E∴M．

表4

本研究により，カルシウムの骨格筋崩壊に及ぼす作用は主としてタンパク分解作用を促進させてZ線を消失させることであることが明らかになった。しかしながらこのZ線に対する作用は，直接CANPを活性化させることなのであるか，または間接的な細胞内小器官の破壊による生体内ATP濃度や酸化還元状態の変化によってCANP以外のチオールプロテアーゼが活性化されたための結果であるのかは依然として

Duchenne塑筋ジストロフィー症における筋崩壊過程とCa†イオノフォアによる崩壊との比較 −CANPかカテプシソか−Muscledeg・inDMD
In cytosol

Ionophore

CANP

Cathepsins

CytOSOl

CytOSOllysosome

thiol．

thiol．

thiol．

pH7．4

neutralneutralacidicCa−pOSitive丘bers

Ca−SenS．

Ca−SenS．

Ca−insens．

Z−lineloss

Z−lineloss

Z−lineloss

Z−lineloss（B）

M−lineintact

M−lineintact

M−lineintact

M−lineloss（B）

A，Ⅰ−bandintact

A，Ⅰ−bandintact

A，Ⅰ・bandintact A−bandloose（B）はカテプシソBの作用。
80

察

12．カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究

図7

ェボンに国定した切片をトルイジンプール染色したもの

A：＋Ca
不明である。蓑4にCANPとカテプシンの作用の比較と，イオノフォアによる筋崩壊のパタ

B：＋Ca，E−64−C
Z線の特異的消失の機構についてはよくわかっていない。しかしながらCANPの筋構造ターンをまとめた。同時にDMDにおける筋崩

ンパク質への作用7）（蓑5）を見ると，ある程壊の特徴も記したこヵルシウムイオノフォアに度の推測が可能である。CANPはα一アクチニ

よるZ線の消失はこの裏にて比較する限りカンとZ−タンパク質というZ線の骨格を形作る

テプシンB，H，LよりもCANPによるもの

タンパク質はほとんど分解せず，フィラミン，と考えられる。しかし，カテプシソが筋崩壊に全デスミソ，Eu−アクチニンなどのZ線を構成す

く関与しないというのではなく，あくまでもZるマイナータンパク質をよく分解することか緑の消失という筋崩壊の第1段階ではCANP

ら，これらのタンパク質がCANPによって限の関与が示唆される，ということである。

定分解されてα−アクチこンが遊離し，筋原線
81

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果

表5

H鎖200，000

L鎖1

25，0002

18，0003

16，000アクチン

局在
A A A A I I I I I M A Z Z Z

ミオシン

分子量

42，000トロポミオシンα34，000

トロポニソ

T

40，000Ⅰ

20，000C

17，000M−タソバク質

165，000

C−タンパク質

135，000

α−アクチニソ

96，0007ィラミソ

250，000

Eu−アクチニソ

42，000デスミソ

55，000Z−タンパク質

54，000コネクチソ
バンド3600，000

チューブリソ

52，000

カルモデュリン

18，000著者

低分子量（7〜18万）に限定分解 Sugita（1980）
Isbiura（1980）
一部23，000に限定分解
分解せず
Dayton（1975）
分解せず
Dayton（1975）
Dayton（1975）
分解せず
Islliura（1979）
18，500と16，000に分割
14，000と低分子量に分解
Ishiura（1979）
低分子量に分解
Islliura（1979）
Isbiura（1979）
分解せず
Isbiura（1980）
分解せず
Dayton（1975）
低分子量に分解
Ishiura（1978）
一部78，000に分解
240，000と9，500に限定分解
Davis（1978）
Kuroda（1981）
低分子量に分解
Isbiura（1980）
低分子量に分解
Islliura（1980）
分解せず
Maruyama（1981）
分解される
Maruyama（1981）
分解される
低分子量に分解
Isbiura（1978）
分解せず
IsIliura（1979）

帯A

1，000，000

分解様式

帯帯帯帯帯帯帯帯帯線帯線線線線線Ⅰ線

筋タンパク質種々の筋構成タソバク質に対するCANPの効果（ニワトリ骨格筋）

可能性があるものとして，今後の研究の進展が期待される8）。
倉上一Ud g⁝︸dt︒∝

参考文献
1）Ishiura，S．，Murofushi，H．．Suzuki，K．and
Imahori，K．：Studies of a calcium−aCtivatednelltralproteasefromchickenskeletalmuscle，
Ⅰ．J．Biocbemり84，225，1978．

2）Ishiura，S．，Sugita，H．，Su2；uki，E．andIma−
hori，K．：Studiesofacalcium−aCtivatedneutral
9

8

7

6

5

4

3

protease from chicken skeletalmllSCle，II・J・

p〔E−64−C〕

図8 E−64−Cによるプロテアーゼ阻害。
横軸は反応混液中のE−64−Cの濃度。縦軸はサク
シニルカゼイン水解活性。反応は300C，30分。
○カテプシソB，●CANP。両酵素とも単一標晶である。
経のフラグメソト化が誘発されると考えられる。
本研究によって，Z線の遊離がE−64−Cに

Biocbenm．，86，579，1979．
3）Mellgren，R．L．：Canine cardiac calcium−
dependent proteases，FEBS Lett・，109，129，
1980．

4）Ishiura，S．，Sugita，H．，NonakaI・andImahori，
E．：Calcium−aCtivated neutral protease．1tS
localizationinthemyo丘bri1，eSpeCially at the
Z−band，J．Biochem．，87，343，1980・
5）Kameyama，T．andEtlinger，J・D・：Calcium−
dependent regulation of protein synthesis

よって抑制されることは，DMDにおける筋のand degradationin muscle，Nature，279，344，

異常な崩壊をE−64−Cがinvivoにて抑える

1979．

82

12．カルシウムによる骨格筋の崩壊に関する研究
6）Ishiura，S．，Nonaka，ⅠりSugita，H．andMika・

gradative rolein muscle cells，Proc．Int．

Wa，T．：Effectof the denervation of neonatal

Cengr．Mus．Dys．Univ．Tokyo Press，1981，

rat sciatic nerve on the differentiation of
myosininasinglemusclefiber，Exp．Neuro1．，
1981，in press．
7）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．and Sugita，H．：

CalciumTaCtivated neutral protease．Its de・in press．
8）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．and Sugita，H．：
Suppression of calcium−induced removal of
Z・linebya thiol−PrOteaSeinhibitorE−64−C，J．
Biocbem．，90，283，1981．

83

13．培養筋細胞に対するE−64の作用〜筋管細胞のタンパク分解速度に及ぼすE−64−Cの影響〜

小 沢 鉄二郎＊
研究協力者 伊 井 一 夫＊ 木 村 一 郎＊
萩

原

康

研究日的
筋ジストロフィ症では，タンパク代謝回転速

子＊

長谷川

孝

幸＊

とともに，CO2インキュベーター（4％COゎ

36・50C）中で培養した。約90時間後，筋管細胞が一面に形成され，しかもあまり密にはなって度の冗進が一般的に見られる。筋ジストロフィ

いないころ，繊維芽細胞を除くために30／Jlの症の動物からの培養筋細胞で同じようなタンパ

100FLg／ml

ク代謝回転速度の克進があるかどうか，また培q）を加えてさらに培養を続けた。Ara−Cを加養筋細胞でのタンパク代謝回転が体内でのタソえて30時間後に20JJl（lJ応i）のし〔U−14C〕

バク代謝回転をどこまで忠実に反映しているか

tyrosine（Amersham，50FLCi／mi

議論の余地のあるところであるが，培養筋細胞
は薬物がタンノミク代謝回転に及ぼす影響をみる
系としてはすぐれていると思われる。
E−64−Cはタンパク分解酵素阻害剤として開発された薬物であり，体内でもタンノミク分解を抑えることにより，筋ジストロフィ症の治療に役立つ可能性があるかもしれない。この可能性を検討する一助として，E−64−Cの培養筋細胞の全タンパク分解速度に及ぼす影響を調べた。
材料及び方法
実験系をできるだけ単純化するために，繊維芽細胞や筋原細胞の混入の少ない筋管細胞を次のようにして得て，用いた。
ウズラ10日胚の胸筋からKonigsbergl）の方法で，筋原細胞（secondary culture）を得，
コラーゲン処理した径60mmのFalconbishに，1．6×101の細胞をまき，EagleのMimi−
mum EssentialMedium（MEM）80％，馬
血清15％，ニワトリ胚抽出物5％の混合液3ml＊国立武蔵療養所神経セソタ一機能研究部のCytOSine arabinoside（AraT

2％ェク

ノール水溶液；比活性509mCi／mmole）を加えて培養を続けてタンパクを標識した。Tyro−
Sineは筋肉では合成も分解もされないし，細胞内プールと外液との間で速く平衡化されると報告されている2）のでこのアミノ酸を選んだ。
lJC−tyrOSineを加えてから24時間後に培養液をのぞき，Ara−C処理によって死に至った単核細胞とタンパクにとりこまれなかったHC−
tyrosine をのぞくために，5mlの1mMtyrosine を含んだMEMで三回洗い，3mlのMEM85％と馬血清15％の混合液を加えて培養を続けた。培養液を変えて2時間後，さまざまな濃度のE−64−C（0−1．53mg／ml）を含む
1mMNaHCO3−0・9％NaCl水溶液を50〃1加えてさらに22時間または48時間培養後，培養液を除き，5mlのSaline Gで二度洗い，1mlの2％SDS水溶液を加えて筋管細胞を集め−800Cで保存した。
タンパク分解の結果，培養液中に遊離してくる放射能は，培養液0．6mlに60％過塩素酸を
60′ 1加え00Cで1時間以上放置し，遠心で沈殿をのぞき，その上清0．3mlに10mlの85

Ⅲ 組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果

ノニオンカクテル（Nonion：Toluene系Cock−tail＝3：ア）を加えて放射能を液体シンチレー
ションカウンターで測定したムタンパクに残存している放射能は，筋管細胞の2％SDS溶解物0．1mlに1mlの10％
TCAを加えて，00Cで30分以上放置し，沈殿をニトロセルロースフィルター（0．45／J）に集

め，5％TCAで洗って遊離の放射能を除いた
のち，フィルターを10mlのノニオンカクテ
ルに溶かして放射能を液体シンチレーションカ
ウンターで測定した。計数効率は約80％であり，バックグラウンドとして5％TCAで洗った負lterをノニオンカクテルに溶かしたものの計数を用いた。
DNA定量は，筋管細胞の2％SDS溶解物
0．6mlに−200Cに冷やしたェクノールを2倍容加え，−200Cで一晩置き，沈殿を遠心で集め，沈殿に2mlのエタノールを加えて600C
で20分間加温したのち遠心し，沈殿をもう一度
2mlのエタノールで室温で洗って乾燥させた
のち，Hinegardnerの方法3）に従って行なった。標準としては仔牛胸腺DNA（Sigma）を
用いた。
結

果

表1掬は，llCtyrosineを洗いきり，新し表1 ウズラ戯管細胞の蛋白分解に及ぼすE−64−Cの影響（E−64−CIJ唱／ml，1日間インキュ
ベーション）

伍）培養液中のPCA可溶性計数（Cpm／皿）
Mean

2hr lO，005土
24br

＋E
−E

SD

474

n

（2）

43，550土1，050 （3）t＝2．81
45，490士 570 （3）（p＜0・05）

03）細胞総蛋白中の残留計数（Cpm／FLgDNA）

Mean（％）

SD n

2hr lO，967（100）±41（2）
24hr

86

＋E 8，218（74・9）士61（3）t＝4．40−E 7，999（72．9）±60（3）（p＜0・02）

い培養液に変えてから，2時間後と24時間後の培養液中の酸可溶性の放射能（タンパク分解によって生じたtyrosineによると考えられる）を示す。2時間後にすでに存在するPCA−
SOlubleな放射能は主に速い代謝回転のタンパ
クの分解によると考えられる。筋タンパクは遅い代謝回転をもつと考えられる4）ので，我々は遅い代謝回転のタンパク分解に対するE−64−Cの効果を主にみるために，洗ったのち2時間後に培養皿をE−64−C（1／増／ml）を入れたものとそのかわりに溶媒のみを加えた対照群に分け，さらに22時間培養を続けたのち，培養液中のPCA−SOlubleな放射能と細胞のタンパクに残存している放射能とを測定した。後者の場
合は，培養皿ごとの筋管細胞の量の違いを補正するためにDNA量を測定してFLg DNAあたりの放射能を計算し，表にあらわしている。
表1伍）からE−64−CがPCA−SOlubleな放射能の増加を若干抑えていること，また脚から細胞のタンパク中の放射能の減少を抑えていることがわかる。E−64−Cを加えたものと加えなかったものとの差のt値は，それぞれ2．81，4．40でそれは有意であった（それぞれP＜0．05，P＜
0．02）。（功から全細胞タンパクの平均の半減期を求めると，＋E−64−Cでは52．8時間，対照では48時間で，lJ唱／mlのE−64−Cの存在下で約10％半減期がのびると計算された。しかし，これらの差は大変小さくてこれらの差が有意にでたのは，この実験では標準誤差が小さかった
ことによっており，この実験だけから結論をいうのは早計であると考え，さらに同様な実験を繰り返した。
表2は，いろいろな濃度のE−64−Cを加えて，48時間培養後の筋管細胞のタンパクに残っている放射能を測定した二つの実験の実測値（〃g DNAあたりのCpmに換算している）
をすべて示している。培養時間を長くしたのは半減期に近い時間のほうが薬効による差がはっ
きりすると考えたからである。実験Ⅰで，E−64−Cを入れる前（培養液を変えて2時間後）のタンパクに残っていた放射能は15，384土339（Cpmper FLgOfDNA，n＝4）であり，その13．培養筋細胞に対するE−64の作用
表2 ウズラ筋管細胞の蛋白分解に及ぼすE−64−Cの影響（2日間イソキュべ−ショソ）Conc・OfE−64C（〃g／ml）
ExperimentI

ExperimentII

Mean of allvalues
SD

0

0．2

1

5

25

9，575

8，975

9，348

9，562

9，811

9，581

9，156

9，392

9，600

9，069

8，545

8，917

8，828

9，684

8，528

9，547

9，386

9，411

8，123

9，314

9，132

8，943

9，568

8，943

8，948

9，904

8，883

9，278

9，049

8，903

8，788

9，033

9，539

9，059

9，290

9，176

9，480

±172

士381

士330

土器1

8，906
士549

0
0
0
0
1

9
8

くN0−0翌J鼠udU

E−64−C（FLgper ml）
図1 ウズラ筋管細胞の蛋白分解に及ぼすE−64−Cの影響

48時間後にはタンパクに残っている放射能は
その60％まで減っている。E−64−Cの濃度をあげたもののほうが，高い放射能を示すという傾向が実験ⅠでもⅠでも見られるが，各E−64−C
実験ごとに統計処理したものでは，どのE−64−
C濃度でも対照と比べて有意な差は認められなかった。実験Ⅰ，Ⅰの値を比べると，各E−64−

C濃度における実験値の平均，また全実験値の分散に有意な差がないので，実験Ⅰ，Ⅰの値を総合して，一元配置分散分析を行なった。Fcal＝2．39で，有意水準F品（0．05）＝2．71には達しなかった。
さらに，表2の値をE−64−Cの濃度を対数目盛にとり，プロットしたのが図1である。E−
87

Ⅲ 組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果

64−C濃度が0．2−25／唱／mlの間でタンパク中合，シャーレによって30％近くもDNA量がに残存した放射能（CpmperFLgI）NA，y）を，異なることがあった。このシャーレ毎の筋管細log〔E−64−C〕に対して一次対応させうると考えて，回帰直線式と相関係数を求めると，y＝胞の量の違いはDNA定量による補正をしない
場合，大きな実験誤差となり，タンパク分解速9197＋16210g〔E−64−C〕，r＝0．383という値が求まるが，有意水準0．05における相関係数（自度の小さな抑制は有意なものとしては観察できなくなる。実際タンパクに残存する放射能を

由度24）の値0．388には達しなかった。

DNAあたりに標準化することによりSDは平均値の6％以下に抑えることができ，比較的小考察及び結論さい変化も有意な差として認めることができる

これまでに得られた実験結果からは，E−64−
Cがウズラの筋管細胞のタンノミク分解を抑制すはずである。しかし例数を比較的多くとった表
2の結果では，有意な差を認め得なかった。しると断定することはできない。どの実験でもたがって，E−64−Cによって培養筋管細胞のタ

E−64−C を加えたもののほうが，タンパクに残ンパク分解が抑制されるかどうかをはっきりさ存する放射能が高いことが観察された。しかせるた鋸こは，さらに誤差の少ない実験系をくし，そのタンパク分解抑制の度合は，25′唱／む必要があるとともに，E−64−Cが培養筋管細mlの濃度でも，タンパクに残存する放射能で胞のタンパク分解酵素を阻害しているかどう

みて対照の約7％にすぎず対照のタンパク分解

か，またどのようなタンパクの分解を抑制するの半減期を約10％のはすにすぎないため，誤差かという疑問に答える必要があると思われる。

がきわめて小さい実験をするか，実験例数を多文

くするかしなければ有意な差は認められない。
培養筋管細胞では，自発的収縮がおこり，細胞がはがれやすくなる。このはがれを少なくするために，コラーゲン処理したシャーレを用い，

献1）Konigsberg，Ⅰ．R．：Skeletal myoblastsin

Culture，〃gf加由i乃

居れり肌0わgク，Vol．LVIII，

511−527，1979．
2）Fulks，R．MりLi，J．B．and

細胞がOvergrowthにならないよ

Goldberg，A．L．：

うな条件

Effects ofinsulin，glucose andaminoacidson（うえつけた細胞数，Ara Cを加える時期を

protein turnoverin rat diaphragm，J．Biol．

加減）を選んだ。それでもある程度の筋管細胞のはがれは避けられず，そのはがれもどのシャ

3）Hinegardner，R．H．：Animproved nuoromet−ーレでも同じ程度におこると仮定することはできなかった。それゆえ，何らかの標準化がCbem．，250，290−298，1975．
ricassayforI）NA，Anal．Biochem．，39，197−201，
1971．

4）Millward，D．J．：Protein degradationin

必要であり，DNA量を基準にした。それはmuscleandliver，inComprehensive Biochemi・核は筋管細胞に分布しており，筋管細胞がはがStry Vol．19B partl Protein metabolism（ed．

れるならばその量に応じた核数が失なわれ，
DNA量はそれに応じて減ずると考えたからで

Florkin，M．）EIsevier Scienti丘c Publishingある。実際，多くのシャーレを用いた実験の場

88

Co．Amsterdam．pp．153−232，1980．

14．N−〔N−（L−tranS−3−Carboxirane−2−Carbonyl）−L−
1eucyl〕−3−methyl−butylamine（E−64−C）の筋蛋
白質代謝に及ぼす影響

江
研究協力者

小

浜

一

橋

弘＊

白

節

郎＊

尾

智

明＊

三

谷

昌

平＊

研究目的
低濃度（10￣5〜10￣6g／ml）の蛋白質分解酵素
阻害剤E−64−Cを生筋に細胞膜を介して投与した野合の効果を，蛋白質代謝回転を指標に検討した。
実験結果と考察
1）E−54−Cの筋細胞へのとりこみ
成熟雄ラットのひらめ筋を碇をつけたまま両足より遊離した。一方を12．6J疋i／mlの3H−
E−64−C（3・4×10￣5g／ml），他方を12．6J疋i／mlの3H一イヌリンを含むリンゲル液中にて95％酸素−5％炭酸ガスを通気しながら380Cで2時間振とうし，筋重量当りにとりこまれるア
イソトープ量を比較した（図1）。ひらめ筋に取り込まれるE−64−Cの放射能はイヌリンの5〜10倍になり，筋湿重量当り2．3′喀／gのE−
64−Cが取り込まれる計算になった。
2）総蛋白質分解速度に及ほす影響
両足より遊離したひらめ筋の一方は，0．5mMシクロへキシミドを含むリンゲル液（KRC）中に，他方は，5×10￣6g／mlのE−64−C及び0．5mMシクロへキシミドを含むリンゲル液（KREC）中に，95％酸素−5％炭酸ガスを通気しながら380Cで振とう保温した（2時間）0リンゲル液中にもれ出るチロシソ量は筋＊東京大学医学部薬理学教室

XlO CPM／mg
図1生筋に対するE64Cの結合
成熟雄ラットの両足のひらめ筋を腱をつけたままで取り出し，重量を測定した。片方は12・6J Ci／ml
のきHイヌリソを含むリソゲル液中に，他方は12・6〃Ci／mlの3HE−64−C（3．4×10￣5g／ml）を含むリ
ンゲル液中に95％酸素一5％炭酸ガスを通気しながら380Cで2時間振とうした。筋を0．2NNaOHを含
む0．3M KCl中にて破壊しその放射能を測定した。
SoIvent Spaceは1−C−イヌリンを用いて測定した。グラフはSoIventSpace中の3H放射能をさし引いた筋全体の総放射能を示す。
総蛋白質分解速度をあらわす1）。
なお，デークーの再現性の問題については表1を参照されたい。
E−64−C

存在下（Tyr EC）では196．2土

74・8nmoles／mg湿重量（m土S・D・n＝13），
そしてE−64−C非存在下（Tyr C）では235．8±91．5n moles／mg湿重量（m土SD，n＝13）のチロシソが遊離された（表2）。遊離されたチロシソ量は有意（P＜0．05）に低下し，E−
64−Cは筋蛋白質総分解を抑制すると結論される。なお，E−64−Cの効果は5×10．8g／mlと89

Ⅲ 組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果

表1遊離されたチPシソ量の再現性の検討
Right Left
1

3
1
1

1

0
6
1

1

1
6
1

1

00 溢 61 67

701（nmoITyr／mg wet weight）
図1の説明に示される様に両足のひらめ筋を別々のフラスコ中にて0．5mMシクロへキシミドを含む
リンゲル液中で振とうした。Exp・1と2は別々の日におこなった実験で，RとLはそれぞれ1個体のラットの右及び左のひらめ筋よりのデーター（n mol／
mg湿変量）を示す。
同一実験内ではRとLの値がよく一致することに注意されたい。
表2

表2よりTyrCが250以上のものをぬき出し（4例），対応するTyrECの値と共に平均したもので，
CとEはそれぞれ前者と後者に対応する。CとEの間には高度（P＜0．005）の有意差があった。棒は遊離されたチロシソ総量（nmol／mg湿変量），線は標準偏差を示す。

チPシソ遊離により測定した筋蛋白
質総量の分解速度に及ぼすE−64−C（5×10￣6g／ml）の影響。

No．of Experiment TyrC Tyr EC
1

252

103

2

388

292

3

195

199

4

203

180

5

188

184

6

447

362

7

230

214

8

221

246

9

283

117

10

209

228

11

168

166

12

112

103

13

170

156

235．8
土
91．5

196．2
：土
74．8

mean

表はすべての実験デークーを集計したもので，筋単位重量（mg）当り蛋白合成阻害剤を含むリンゲル
液中（KRC）に放出されたチロシソの総量（nmoles）を示す。右表中TyrC及びTyr ECは，それぞれ
E−64−Cを含まないもの及びそれを5×10￣ g／ml含
むKRC中に放出されたチロシソ量を示す。たて列の数は実験回数を示す。対応するTyrCとTyrECの差はF検定上5％水準で有意な薬効が認められた。

0
図3

100

200

300

nmol／mg

イオノフォアA23187の存在下におけるE−64−Cの作用

10￣一g／mlのA23187非存在下（E，C）及び存在
下（IE，IC）のシクロへキシミドを含むリンゲル液（KRC）へのチロシソ遊離総量を棒にて示す。線は標準偏差を示す。E及びIEは5×1076gmlのE−64−C
存在下のKRCを用い，C及びICはE−64−C非存在下のKRCを用いたことを意味する。4例においてEとCの問には有意義は認められなかったが，IEとICの問には5％水準で有意差が認められた。
他は表2の説明に同じ。
量以上の実験例をぬき出すと（図2），それは，別2．5土90．8（m土SD，n＝4）であった。対応

いう低濃度においても認められた。
表2より，TyrCが250n moles／mg湿重90

するTyrEは218．5土128．6（m±SI），n＝4）となり，蛋白質分解はE−64−Cによりコントロ14．E−64−Cの筋蛋白質代謝に及ぼす影響

ールの63．8％にまで抑制された。E−64−Cの蛋
白質分解抑制はTyrCの値の高い実験例において著明と考えられる。
図3はイオノフォアA23187存在下と非存在下の間でE−64−Cの効果を比較したものである。イオノフォア非存在下では全体のチロシソ遊離量が少なく（TyrC＝175．5土30．2，Tyr
EC＝172．8土29．2，2例共にm土SD n＝4）
有意なE−64−Cの効果がみられなかった。イオノフォア存在下では，Tyr C＝275．8土77．2（m＝SD，n＝4）及び，TyrEC＝242．3土74．0（m＝4）となった。E−64−Cの有無にかかわらずチロシン遊離量が多くなった。これは，亀山とEtlingerの結果（2）を確認するものである。
次に，イオノフォア存在下では，チロシソ遊離

0

図4

らのデークーは，イオノフォアにより筋細胞のり直接Caイオン濃度を変化させE−64−Cの効果を検討した（蓑3）。KRC及びKREC（いずれも2．5mMCaイオンを含む）においてはE−
64−Cはチロシソ遊離を抑制するが，KRC及びKRECのCaイオンを1mM GEDTAにおきかえた場合E−64−Cは無効であった。この事
実は，イオノフォア存在下のE−64−Cの効果と共にE−64−Cの効果がCaイオンを介している
表3 サポニン処理筋に対するCaイオンのE−64−Cの作用に及ぼす影響。
Tyr

C

Tyr

EC

Ca

431

348

G

229

224

Ca：ひらめ筋を10−5g／mlのサポニンを含むKRC
又はKREC中にて振とうした時に遊離されるチロ
シソ総量を示す。
G：ひらめ筋を10●5g／mlのサポニンを含みCaイオンの代りにlmM GEDTAを加えたKRC又はKREC中にて振とうした時に遊離されるチロシソ総量を示す。
他は表2の説明に同じ。

10

構造蛋白質の分解速度に及ぼすE−64−C（1×10￣Og／ml）の影響。

蛋白質分解速度が促進され，図2に示された場

次にサポニンを用い筋に穴をあけることによ

8x10㌔pm／diSh

量が有意に（P＜0．05）に低下していた。これ

合と同様に，E−64−Cの効果が発現され易くなったと考えられる。

4

組織培養された筋構造蛋白質に3Hロイシンをパルスした。チェース時に1×10￣6g／mlのE−64−Cの不存在下（C）と存在下（E）の2群に分けた。棒は行ったすべての実験デークーを示し，構造蛋白質全体中に残存する放射能を示す。線は標準偏差を示す。
くり返しのある2元配置でかつデータ一に欠損のある要因分析をブロック，デザイソを用いて行なった6）。計算されたF値（Fcal）は，8．65で，F検定
上1％水準で有意な薬効が認められた。かっこ内の数字は例数を示す。
ことを強く示唆する。Caイオン濃度依在性について詳細に検討することが今後に残されている。
3）筋構造蛋白に及ほす影響
ニワトリ胚胸筋より筋芽細胞を遊離し，同一細胞数を数多くの培養皿に播種した3）。培養皿
上筋細胞を十分に培養させたのち（約3日後），
3Hラベルのロイシンを筋細胞にとり込ませた。
培養皿を二群に等分し，一方は，アイソトープを含まない培養液にて，他方はアイソトープを含まないE−64−Cを5×10￣6g／ml含む培養液
にて，さらに2日間培養を継続した。培養皿ごとに筋細胞を収穫LlmMジイソプロビール
・フルオロフォスフェイト（DFP）を含む0．1

MKCl中にて細胞を破壊した。10，000×glO
91

Ⅲ 組織及び細胞中のタソバク代謝に及ぼす結果

ジーブリリアント・ブルー（CBB）にて染色した。ミオシンH鎖（分子量230，000ダルトン）のバンドをカミソリで切り出した。蛋白質量は蛋白質に結合しているCBBをピリジンで抽出したのち比色により6）。そして放射能はポリア
クリルアミド・ゲルを過酸化水素水にて溶解し

10

20

8pocitic Activity

図5 ミオシンH鎖の分解速度に及ぼすE−64−〇（5×10￣6g／ml）の影響
図4の説明通りに3Hロイシソでパルス●チエー
スされた培養筋細胞より，アクチン及びミオシンH鎖を遊離した。これら蛋白質に残存する比放射能（任意単位）を棒にて示す。線は標準偏差を示すo E：E−
64−C存在，C：E−64−C非存在下，EとCの間には有意差が認められた（p＜0・05）0

たのち，液体シンチレーション・カウンターにより測定した。
図5に示される様に，ミオシンH鎖の比放射能は，培養液にE−64−C（5×10▲6g／me）が存在すると26．5土2．9（任意単位の比放射能，m
土SD，n＝6）で，E−64−Cが存在しないと22・0
土2．6（m土SD，n＝6）で，前者は後者より有意（P＜0．05）に高かった。
蛋白質分解酵素によるミオシンの筋細胞内での分解が抑制されていると考えられるが，今後例数を重ねて結諭したい。

分間の遠心をすると，筋構造性蛋白質は沈殿す

結語る。沈殿を0．2NNaOHに溶解し，液体シンチレーション・カウンターにより放射能を測定

E−64−Cは低濃度で生筋に直接作用させてそした。蛋白質の放射能総量の多いことは，それの蛋白質分解を抑制した。蛋白質分解の促進しだけ筋細胞内で構造蛋白質の分解が抑制されてている筋においてこの抑制は著明であった。こいることを示す。

の過程にCaイオンの関与がある事を示唆する

図4に示されるごとく，構造蛋白質には，
E−64−C（1×10−6g／ml）存在下では非存在下よ

事実も明らかとなった。
文

りも有意（P＜0．01）に多くの放射能が保持された。即ち，E−64−Cは構造蛋白質の分解を抑制すると結論される。
4）ミオシンH鎖の分解速度に及ほす影響
3）に示したプログラムで培養された筋細胞を

献

1）Fulks，R．M．，Li．J・Bリand

GJldberg，A・L・：

J．Biol．Cbemリ250，292，1975・

2）Kameyama，T・andEtlinger，J・D・：Nature，
279，344，1979．

収穫する際，培養皿ごとに個別に収穫するので

3）Kohama，K．andOzawa．E・：DeVelop・，Grow−th，and Differ．，19，139，1977．

はなく，E−64−Cを含むものと含まないものと

4）Ⅹohama，K．and Holtzer，H・：J・Biochem・に大別して筋細胞をプールした。2）の0・1M
KCl沈殿に筋重量の5倍のlmM DFPを含
むグバ・ストラウプ液を加えてアクトミオシンを抽出した。粗製アクトミオシンはグバ・スト
ラウプ液の9倍の冷水を加えることによって沈殿させた4）。沈殿蛋白質をSDS存在下のポリ
アクリルアミド・ゲル中に電気泳動し5），クマ

92

1981．

5）Laemmli，U．K・：Nature，227，630，1970・
6）Fenner，C．，Traut・R・R．Manson，D・F・．andWikman−cc．ffelt，J．：Anal．Biochem．，63．595，
1975．

7）佐久間昭：薬効評価一計画と分析−Ⅰ，東京大学出版，1977．

15．ヌードマウスへの異種移植筋の再生に対するE−64の効果

寺

尾

寿

夫＊

研究協力者 大 沢 仲 昭＊＊

目的tensionをかけて固定移植した。
このようにEDLのhomotransplantation

筋ジストロフィー症をはじめ，多くの筋疾患をしたマウスには毎日5mgのE−64を腹腔の原因の解明やこれらの筋肉の再生能力の研究内に注射し，種々の時間後（主として2週後）には，組織培養法が主に用いられている。しかに，ネソブタール麻酔下にSaCrifice L，EDL

し，これには種々の制約があるため，いまっはを取り出し，その外観の観察，重量の測定を行

invivoの培養である筋の移植実験の価値が見なった，その後これを凍結し，クリオスタット

直されている。しかるに，異種動物間の移植でで8βの切片を作り，これを組織学的，組織化は拒絶反応が働くため，長時間の観察には，やはり困難を伴う。

学的に検討した。なおコントロールとしては，

そのため，われわれは数年来，胸腺を欠く細64の代りに生理食塩水を毎日0．1ml腹隆に注射したマウスを用いた。

胞免疫不全動物であるヌードマウスを用いて移植実験を行なってきた。

同様にhomotransplantationを行ない，E−結果

この報告はヌードマウス内におけるジストロ
フィー筋の再生を観察し，これを促進する物

EDLを移植した場合には，2〜3日で横紋質，とくにE−64の効果を研究するため行なっは消失し，一様な染色性を示す変性をきたす。

ているものの第一報である。

次いで筋の周辺から血管が入り込み，またmy−方法Oblast，fibroblast，maCrOphageなどより成る細胞浸潤が起り，また5〜7日位でbasop−

今回行なった筋移植法はマウスのExtensor

hilicな胞体を有し，核が鎖状に並ぶmyotube

digitorumlongus（EDL）のhomotransplan−が形成され始める。この場合移植した筋肉片のtationである。

中央部では変性に陥った古い筋肉が残存してい動物はddyマウスの生後6週の雄を使用した。

るのがみられる。2週を経ると殆ど新しい再生
筋線経より成る筋肉が形成されるようになる。

移植法はddyマウスをネンブタール麻酔下に一側のEDLを除去し，その後に，他のマウ

3週以後では明瞭な横紋の形成が見られる。

スの同側EDLを摘出したものを，両端に軽い

場合に？き比較してみよう。
1）外観＊ 帝京大学医学部第一内科＊＊東京大学医学部第三内科

次にE−64を注射した場合と注射しなかった

E−64を毎日注射したマウスの再生筋はコントロールに比し，形，大きさにとくにきわだっ93

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果

E

64icONで．
写真1
マウスの移植に用いたものと反対側のEDLを取り出して，その重量を比較したものが第1図である。

5咄瑚韓堤蛤＼咄州堰朝粧

マウスの数は充分でないが，コントロールより重いものが見られた。さらに例数を増して検討中である。
3）組織学的及び組織化学的所見
H−E等による通常の組織学的所見はE一朗を注射したもの（写真2）とコントロール（写真3）との間に著明な差はみられなかった。ただE−64注射例では血管増生がやや多かったが，これが赤い色の原因とは考えられない。筋筋再生に対するE64の効果（ddyマウスEDLのhomotransplantation2遇後）を折紙でよくblot L血液を除いても着色は不変であったからである。

図1

組織化学的にはMyosinATPaseやDPNH

た変化はみられなかったが，移植後1〜2遇の染色では，E−64投与群は活性が強い印象を受けた。

ものはコントロールに比し赤い色を帯びているものが多かった。（写真1ではやや黒味を帯びてみえる。）

2）重量
再生筋の重量と，飼育保存してあるdonor
94

考

案

以上の如く種々の移植筋の再生に対するE−
64の効果を検討中であるが，この場合次の点を注意する必要がある。

15．ヌードマウスへの異種移植筋の再生に対するE−64の効果

写真2

95

Ⅲ 組織及び細胞中のタンパク代謝に及ぼす結果

まず第1に，移植された筋の再生においては筋線維そのものの再生と共に，これを支える血管と神経線経の再生も重要な要素であることである。生体内に移植された筋線経の再生は，invivoと異なりこれら全体の総和として起るのである。第2には当然のことながら，出来上った筋線経は性状がE−64注射で如何なる影響を受けるかという点である。しかし第3の問題として，再生筋はその形態学的特徴や再生量と共に，成熟した筋線経になるまでの時間的要素も考慮されなければならない。すなわち，E−64が筋線経の再生の速度に影響を与えないかという点である。そして最後の重要な問題として，
正常筋のみでなくジストロフィー筋などの病的な筋肉の再生に与える効果がある。

96

これらの各点につき，今後検討を進める予定
である。
文

献

1）Zalewski，A．A．：Survival，reinnervation andhistochemiCal maturation of skeletal muscle
xenograftin the nude mouse，Exp・Neurol・，
58，261，1978．
2）Wakaya，Y．，Schotland，D・L and Bonilla，E．：Transplantationofhumanskeletalmuscle
tonudemice，aSeguentialmorphologicstudy，
Neurology，30，740，1980・
3）Hironaka，T・andMiyata，Y・：Transplanta−tion of skeletal musclein normal and dys・

trophicmice，Exp・Neurol・147・1I1975・

ⅠⅤ 全身的影響に関する研究

16．E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究

大関 正弘

17．E−64−Cの抗原性に関する研究

大関 正弘

18．E−64−Cの感覚器に及ぼす影響

大関 正弘

19．E−64−Cの薬効に関する研究（1）大関 正弘〜筋ジストロフィーチキソに対する薬効試験〜

20．E−64−Cの薬効に関する研究（2）大関 正弘〜Serotonin myopathyに対するE−64−Cの効果〜

21．E−64−Cの一般薬理作用

福原 武彦〜特に呼吸・循環捺能及び中枢神経系に及ぼす影響〜

22．取り込まれたE−64の細胞内分布と運命について

勝沼 信彦

23．E−64−Cの生体内動態に関する研究

大関 正弘

24．E−64−Cの薬物代謝酵素活性への影響

北川 晴雄

16．E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究
＊

弘

＊

男章子

保

＊
＊

裕

＊

本西松

＊

樟河岩

＊

雄明子

貞正恭

＊
＊

E−64−Cの安全性研究の一環として，マウス

法

動物は4週令のdd系雌雄マウス（静動協：
体重20g前後）及び6週令のWistar系雌雄ラット（静動協：体重200g前後）をそれぞれ
7日間の予備飼育の後，実験に使用した。被験薬物のE−64−Cは重曹水で中和溶解後，生理的食塩水液に混和し，一投与段階あて10匹の動物に各々静脈内，皮下，腹腔内及び経口投与した。
投与後7日間，各動物の一般症状を観察するとともに生死を確認し，死亡例については発見後すみやかに剖検を行った。また生存例については7日目に全例の剖検を行った。
LD50値はLitchfield−Wilcoxon 法により
算出した。
結

板村

＊

的

及びラットに静脈内，皮下，腹腔内及び経口投与し，その急性毒性を検討する。
方

中木岸

＊

古

忠義男合

1．急性毒性
目

正

関

大

道蔭幸早

戸

島山沢上

笹瀬鬼尾

研究協力者

果

i）一般症状マウスでは腹腔内投与において投与直後に一過性の興奮，また数分後から自発運動の抑制がみられた他に著変は認められなかった。死亡は

これら症状変化の著しい例にみられ その発生は投与2〜4時間から出現し，大部分が48時間以内に死亡した。また，他の投与経路では特に症状変化は観察されなかった。ラットでは静脈内投与の数例に血尿，皮下投与例に投与皮膚面の痴皮，潰瘍及び肉芽形成，腹腔内投与例に自発運動の抑制，呼吸数の減少，血涙，下痢などがみられ，また死亡例は大部分が投与1時間後から48時間以内に観察された。経口投与では症状変化は認められなかった。
ii）剖 検死亡はマウス及びラットとも腹腔内投与例にのみ認められ，これら死亡例の剖検では消化管粘膜の軽度な充血以外に著変はみられなかった。またラットの生存例では腹腔内投与例に腹水増加，肝腫大及び腹腔内諾臓器の相互癒着などが観察された。一方，他の経路での投与例及びマウスでは特記すべき変化が認められなかった。
iii）LD50値
LD50億を一括して表1に示す。
静脈内，皮下及び経口投与ではマウス，ラッ
トとも検液調整及び投与容量から考えられた最大可能量を投与しても死亡は認められなかった。腹腔内投与ではマウス及びラットとも2，100〜2，500mg／kgのLD50値を示し，マウスとラットあるいは雌雄の間に差はみられなかった。

＊大正製薬株式会社総合研究所
99

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表1E−64−Cのマウス及びラットにおける急性毒性

2．亜急性毒性
Ⅰ

ラット

日

的

E−64−Cの安全性研究の一環として，ラットに1カ月間経口及び皮下投与し，その亜急性毒性を検討する。
方考

察

E−64−Cはマウス及びラットにおいて静脈内，皮下及び経口投与では投与可能最大量においても死亡例がなく，また腹腔内投与では死亡例が出現するものの2，000mg／kgを越える高い
LD50倍を示し，その急性毒性は弱いものと推察される。しかし，皮下投与時の投与部位における炎症性の変化あるいは腹腔内投与時の腹膜炎様の変化は被験薬が何等かの刺激性を有することを示唆するものと考えられ，その刺激がE−64−Cの物性によるものかいなかについては不明であるが，大量投与あるいは連続投与時にこれらの変化の増強あるいはこれらの変化に基づく二次的な毒性発現の誘発が推測される。さらに製剤学的な検討が必要と考えられる。
結論

E−64−Cをマウス及びラットに静脈内，皮下，
腹腔内及び経口投与し，その急性毒性を検討し法（1）動物：6週令のWistar系雄ラット（静動協：体重160〜190g）を1週間の予備飼育後，1群10匹あて群別して実験に使用した。動物は温度23土20，湿度55土5％のバリヤーシステムの動物室で飼育し，飼料（オリェソタル酵母社
製MF）と水は自由に摂取させた。
（2）投与量及び投与方法：E−64−Cは重曹水に中和溶解後，生理的食塩水に混和し，経口投与の投与量は1，000及び2，000mg／kg，投与容量は20％（W／v）検液を体重100gあたり各々0．5ml及び1mlとし，また皮下投与の投与量は125，250及び500mg／kg，投与容量は6．3％，12．5％及び25％（W／v）検波を体重100g
あたり各々0．2mlとして1日1回1カ月間，経口及び背部皮下に投与した。対照群には生理的食塩水をそれぞれ同様に授与した。
（3）検査項目
1）一般症状：毎日一般症状の観察及び体重測定を行うとともに1週間に2度摂食量及び摂水量の測定を行った。

激を誘発するが，LD58値はいずれの投与経路

2）血液学的検査：1カ月間の投与終了後，
ェーテル軽麻酔下に限寓静脈叢より採取した新鮮血を用い，赤血球数，白血球数，血小板数においても1，000mg／kg以上の値を示し，種（Toa Microcell Counter），ヘモグロビン量差及び性差は認められなかった。

（Cyanmethemoglobin

た。その結果，E−64−Cのマウス及びラットへの大量投与は投与部の皮膚，腹腔内に局所的刺法），ヘマトクリット

値（毛細管遠心分離法）を測定した。
3）血液生化学的検査：投与終了後，エーテ
ル軽麻酔下に外腸骨動脈より採取した新鮮血を遠心分離して得た血清についてオートアナライ
ザー（日立分析装置712型）により血糖量（グルコースオキシダーゼ法），総蛋白量（Biuret10016．E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究

■一一

壱二3
ニ㌻憂＝

0
0

︵ヱ︼与芯三台0日：P．∩，
0−−−一一〇：e

10ControI
E−64−ClOOOm（1／kqe：2000mg／kq

一一一：S．C．

ControI〇一一・・〇・

L−64−C125mg／k9●一一一●：

250mg／kg

汁一一六・500mg／kg

20

30（Days）

図1E−6トこのラットへの1カ月連続投与における体重変動法），アルブミン量（BCG法），尿素窒素量（ウ
レアーゼインドフェノール法），クレアチニソ
量（Jaだe変法），総ビリルビン量（アルカリア
ゾビリルビン法），総コレステロール及び中性

脂肪量（酵素法），GOT，GPT活性（UV法），
ALP活性（Kind−King 変法），LDH 活性（UV法），CPK活性（01iver変法），無機リン量（FiskeLSubbarow変法）を測定し，さらにNa，K量（炎光法一島津原子吸光AA−650）についても測定した。
4）尿検査：投与終了時の強制排泄尿について
蛋白，糖，pH，ケトン体，潜血（ラブスティックス一日本エームス社）の半定量的検査を行った。
5）病理学的検査：投与終了後，外表及び眼の異常の有無を観察し，エーテル軽麻酔下に放血致死させ，開胸腹して内部諸臓器を詳細に観察し解剖した。摘出した脳，心，肺，肝，腎，脾，腸間膜リンパ節，胸腺，下垂体，甲状腺，副腎，精巣及び精巣上体については各々湿重量を測定した。これら諸臓器に加え胃，十二指腸，骨格筋（大腿部）及び背部皮膚についてはLillieの10％中性緩衝ホルマリン液で固定後，常法のごとくパラフィン切片を作製LH．E．染色，また必要に応じて腎のPAS，Massonのtrichrome及びWeigertの線維素染色を施して病理組織学的検索を行った。
結果

投与期間中，両投与経路のいずれの被験物質投与群にも死亡例は観察されなかったが，皮下投与群に急性毒性試験時と同様な投与部皮膚面の痴皮，潰瘍及び肉芽形成などの刺激性病変が用量依存性にみられた。
体重変動を図1に示す。
経口投与では1，000mg／kg以上，皮下投与では250mg／kg以上の群に有意な体重増加抑制がみられ，経口投与においてより著明であった。また体重変化を示した各々の投与群では摂食量の減少憤向もみられた。
血液学的検査結果を表2に示す。
皮下投与の500mg／kg群に白血球数の増加のはか，貧血を示唆する赤血球数，ヘモグロビ
ン量及びヘマトクリット値の減少がみられた。
一方，経口投与では各群とも著変は認められな
かった。
101

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表2 E−64−Cのラットへの1カ月連続投与における血液学的検査所見

RBC＝Red Blood Cell，WBC＝White Blood Cell，Hb＝Hemoglobin，Ht＝Hematocrit．
Pla．＝Platelet＊P＜0．05＊＊P＜0．01

表3 E−64−Cのラットへの1カ月連続投与における血液生化学的検査所見
P．0．（mg／kg）

Testitems

Controll
Glucose

mg／dl

1000

1

S．C．（mg／kg）
2000

Control1

125

1

250

1

500

181土17174土26153土27152土15147±11145±13

6．1士0．2

6．1土0．2

5．6土0．1

5．6±0．2

5．2士0．2

5．1士0．2

1．0土0．04 1．1±0．1

1．0±0．1

0．9土0．04

三諾：慧tein ；荒は；≡3：； 3．3土0．1 3．3土0．1 2．8土0．1 2．9土0．1 2．6±0．1 2．5士0．1
1．1±0．03 1．1士0．04 1．2士0．1

A／G
Creatinine
Total bilirubin
Total cholesteroI
Triglyceride
GOT

ALP

24．1：±1．6 21．9±1．2 24．1±2．2 22．7±2．1 21．8土2．4 21．0土2．0 20．8土1．6

0．6士0．05 0．6±0．1 0．5土0．04 0．5土0．1 0．5土0．04 0．5士0．04
0．2土0．03 0．1±0．03 0．1：土0．03 0．1±0．01 0．1土0．02 0．1±0．02 0．1±0．02
66土5
76土7＊＊
82土5＊＊
63±4
64土6
72±7＊＊
85土6＊＊
0．6土0．1

67土17＊＊

110土27

117士3698士19149土26＊＊

198士81＊＊114土84137＝ヒ39300士196＊ 308土108＊＊31土9

53±16＊＊

72±37＊＊

48土44

57土20

129土106＊ 142土51＊＊

52土5

48±5

51±7

38土3

39士5

33土4

30士4＊＊

811土98858土155478土125407±94631±237486±160269±375 1209土172＊ 907土575

834土350943±323656士1677．9±1．1

9．3土0．5

7．9二と0．8

7．9土1．0

8．7士0．8

8．8士0．7

142士2
5．0土0．5

143士2

142±2

142±3

146±1＊＊

139＝亡3144士2

5．4土0．3

5．7土0．2

5．0士0．3

4．8士0．2

4．7±0．1

4．7士0．2

757土81CPX

955土297IP一

117士14＊＊96±18

一204土41

一

LDH

Ⅹ

GPT

醐 酬 離 別 慧 器 用 川 柳 嘲 嘲

BUN

6．9＝ヒ1．1

Na
Iく＊P＜0．05＊＊P＜0．01

血液生化学的検査結果を表3に示す。
経口投与では1，000mg／kg以上，皮下投与では250mg／kg以上の群にそれぞれ共通して血清脂質成分及びトランスアミナーゼの変動がみられた。
尿検査ではいずれの投与群においても変化は認められなかった。
主な剖検所見は経口及び皮下投与群にみられた腎の軽度腫脹及び槌色と皮下投与群の投与部
痴皮及び潰瘍形成等であった。摘出各臓器の相10267±17＊＊

対重量を表4に示す。
絶対重量及び相対重量の両重量において経口投与では1，000mg／kg以上の群に肝の増加及び腸間膜リンパ節の減少，さらに2，000mg／kg
群に副腎の増加と胸腺の減少が認められた。皮下投与では125mg／kg 以上の群に肝，250mg／kg 以上の群に脾，500mg／kg群に副腎の重量増加がみられ，また500mg／kg群に腸間膜リン㌧べ節の重量減少が認められた。その他
絶対重量または相対重量のみに変化のみられる

16．E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究
蓑4 E−64−Cのラットへの1カ月連続投与における臓器重量P．0．（mg／kg）

S．C．（mg／kg）

OrgansControl l

1000

Brain mg％

0．62土0．02

Heart mg％

271：土12272士12Lungs Ing％

346士14

Liver g％1

2000

Controll

125

1

250

1

500

0．60土0．03

0．61士0．02

0．62±0．02 0．67士0．04＊＊

278：土17272土8271士17279±12272士12355士16359土16335±21

327士18343士35358±33

3．68土0．11

3．69士0．16

3．74土0．19

3．86±0．13

3．94：±0．29 4．09±0．18＊＊ 4．63±0．27＊＊

Kidneys g％

0．63±0．02

0．73士0．02＊＊ 0．80土0．02＊＊

Spleen mg％

201二と13

M．Lymphnodesmg％
Thymusmg％

0．65±0．03＊！0．69土0．04＊＊

210土9

0．65土0．02 0．69土0．02＊＊ 0．77土0．04＊＊ 0．86士0．03＊＊

210±14

224土22225土7243±17＊271±11＊＊42土6＊＊

48土5

50士34

49土8

40土8＊

55土7

42土8＊＊

127：土9123土14

109士14＊＊137土12

128：土12128土15125士15Hypophysismg％

2．6±0．2

2．8±0．2

2．7士0．3

2．6土0．3

2．5±0．2

2．8士0．3

2．7土0．2

Tyroideamg％
Adrenals

5．4土1．3

5．5土0．8＊＊

5．5：±1．0

5．3土1．2

5．5土0．7

6．3土1．0＊

5．4土0．8

12±1

14±1

15士1＊＊

13土2

13土1

14土2

15±1＊＊

mg％
Testis g％

1．03土0．04

1．10土0．05 1．16±0．06＊＊ 0．98土0．04 1．02±0．02＊＊ 1．04土0．02＊＊ 1．09士0．04＊＊

Epididymis

256土19276±14＊mg％＊P＜0．05

286士23＊＊

241土15256土14＊260土13＊＊264±14＊＊

榊P＜0．01

臓器が種々みられた。
臓器ごとの病理組織学的検査所見を以下に示す。
肝では対照群にごく小城の壊死巣，塀洞内における貪食細胞の集族及び肝細胞の胞体内エオ
ジン好性滴状物の沈着等がいずれも軽度に観察された。被験物質投与群では経口及び皮下各群にこれら変化の増強のはか，肝細胞の大小不甲，肝細胞核の膨化，分裂及び多核化等が用量依存性に認められた。経口投与の1，000mg／kg
群の変化は皮下投与の250mg／kg群，経口投与の2，000mg／kg群は皮下投与の500mg／kg
群のそれとほは同程度の強さを示した（写真1〜2）。

腎では対照群に皮質外帯の一部の尿細管上皮に軽度な硝子滴沈着が認められ，この硝子滴沈
着は被験物質投与の各群で増強し皮質外帯のほとんどと皮質内帯の一部の尿細管上皮に分布して観察された。このような腎における組織変化
は経口及び皮下投与とも用量依存性にみられ，両投与経路の変化の強さは肝における変化と同様に経口投与の1，000mg／kg，2，000mg／kg
群は皮下投与のそれぞれ250，500mg／kg群とほぼ同程度であった（写真3）。
腸間膜リン㌧ペ節ではリソパ炉胞の萎縮が経口投与の 2，000mg／kg 群及び皮下投与の500
mg／kg群，胸腺では実質萎縮，副腎では皮質束状層細胞の踵大が経口投与の2，00Omg／kg
群にそれぞれ軽度にしかも一部の例に観察された。
背部皮膚では皮下投与において対照群に投与
部真皮の軽度な細胞浸潤がみられたが，被険物質群ではさらに125mg／kg以上の群に表皮剥
脱及び錯角化が用量反応性に増強して観察され，高用量群では潰瘍性変化も散見された（写真4）。
その他観察した脳，心，肺，脾，下垂体，甲状腺，精巣及び精巣上体ではいずれの投与群にも著変は認められなかった。

103

Ⅳ 全身的影響に関する研究

T
い1

a

b

圭言草−；

．●

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一．ヽ午．t

てこ●・〇・8、−㍗∵ 予、㍉亮一、＿、．．くせ・、．￠
一心．

堅番

●

■

▼

ヾ■

i∴㌔■■、．、㍉一一．
Vや（

吾二十二・一1℃㌔．ぎ

1碧議● ●■ ■て雪・† 轟言王二．令、ふ・J・●鵠草木∴ 々。

弓l●．：十∴一十や

写真1：肝（E−64−C500mg／kg 皮下投与，
ラッり
肝細胞核の分裂増加及び多核化 ×250H．E．

．苓号捏立

ヽ一

一曹■▲一＿

・JLナ＿

亀

写真2：肝（E−64−C500mg／kg皮下投与，ラット）

肝細胞の小壊死巣 ×怒O H．E．

い●ヽ﹁∵∵∵∴㌻

■
●

′
− 古

ーこ＿＿

▲−▲i∴．■i￣1J

写真3 腎（E−64−C500mg／kg 皮下投与．
ラッり
尿細管上皮の硝子滴沈着 ×おO Masson s
tricbromelO4

写真4：皮膚（E−64−C500mg／kg皮下投与，ラット）

潰瘍形成 ×100 H．E．

16．E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究考察

今回実施した1カ月間の連投試験では既報1）の2週間の皮下投与の結果に比べて，E−64−Cの影響が強く認められた。しかしながら，質的な相違はあまり認められないことから，これらの現象は投与量の増加及び投与期間の延長によるものと考えられる。投与経路による影響の程
度は投与量の違いを考慮すると，皮下投与においてより強く認められたが，これは吸収，排泄等，E−64−Cの生体内動態の違いと併せて，投与部位への刺激的な影響等，その二次的な要因にもよると考えられる。
それぞれの投与経路における肝の変化は組織学的に肝細胞核の変化と壊死像に代表され，また腎の変化は変性に属する病変と分類される。
変性，壊死等は物質代謝障害によって生ずる退行性変化であって，これらの病変がさらに進行
すると，生命の危険にさえ達するものであるが，少なくとも今回の結果では致死例は認められず，重篤な病的変化には至っていないと推察
された。
結

論

E−64−C をラットに1カ月間，経口投与で1，000，2，000mg／kg，皮下投与で125，250，
500mg／kg処置し，その亜急性毒性を検討した結果，経口投与では1，000mg／kg以上，皮下投与では250mg／kg以上に肝，腎を主体とした中等度の影響がみられた。投与経路の違い
による毒性の比較では経口投与よりも皮下投与の方がより強い影響が認められた。
ⅠⅠ筋ジストロフィーチキン
目

的安全性研究の一環として筋ジストロフィーチ
キンを用いたE−64−C の薬効試験に併せて毒性的影響を検討する。
方法ーチキン（line413）を1群10〜12羽あて群別し，実験に用いた。その他，対照として同日令の正常チキン（line412）の雄5羽，雌6羽を使用した。動物は1カ月間，370の育雛器内，それ以降は温度23土20，湿度55土5％の動物室で自動水洗ケージ内に1ケージ1羽ずつ収容して飼育し，飼料（日清製粉社製）と水は自由に摂取させた。
（2）投与量及び投与方法：E−64−Cは重曹水に中和混和後，生理的食塩水に混和し，7．5及
び15．0％（W／v）液に調整した。投与量は150及び300mg／kgとし，体重100gあたり0．2mlの液量を1日2回（AM9：00及びPM4：00）に等分して80日間，腹側部皮下に投与した。対照群には生理的食塩水を同様に授与した。なお，正常チキンは無処置とした。
（3）検査項目：投与期間中は毎日一般症状を観察し，10日に1回体重測定を行った。投与終了時には断頭により採取した血液を遠心分離して得た血清について，オートアナライザー（日立自動分析装置712型）により血糖量（グルコースオキシダーゼ法），総蛋白量（Biuret法），
アルブミン量（BCG法），尿素窒素量（ウレアーゼインドフェノール法），クレアチニン量（Jaだe変法），総ビリルビン量（アルカリアゾ
ビリルビン法），TTT（肝捺能研究班規準操作変法），総コレステロール及び中性脂肪量（酵素法），GOT，GPT活性（UV法），ALP活性（Kind−King変法），無機リン量（Fiske−
Subbarow法），リン脂質，尿酸量（酵素法），
Ca量（OCPC法）を測定し，さらに Na，K量（炎光法），Cl量（電気滴定法）も測定した。採血後には剖検して内部諸臓器を観察後，
心 肺，肝，腎，脾，副腎，精巣，卵巣を摘出し重量を測定した。これらの諸臓器はLillieの10％中性緩衝ホルマリンに固定後，常法の如くパラフィン切片によるH．E．染色，また必要に応じて腎のMassonのtrichrome及びWeigertのfibrinoid染色標本を作製して病理組織学的検査を行った。

（1）動物：膵化10日令の雌雄筋ジストロフィ105

Ⅳ 全身的影響に関する研究

耳
0
0

主意云古屋

0

10

20

30

40

50

60

70

80

ddyS

図2 E−64−Cの筋ジストロフィーチキンへの80日間連続投与における体重変動
表5 E−64−Cの堆筋ジストロフィーチキンへの80日間連続投与における血液生化学的検査所見
Dystrophyline413
NorInalline

Testitems

E−64−C（mg／kg）
Control
150g

TTT
TotalcholesteroI
Triglyceride
GOT
GPT
ALP
IP
Phospbolipid
Uric acid
Na
K
Ca
Cl

106

＊＊P＜0．01

離別雲脚柳川ⅢM酬醐酬嘲瑚醐瑚

Total bilirubinl

BUN
Creatinine＊P＜0．05g

A／G

lAlbuminlgm

Total protein

仲川川畑

Glucose

1

412

300

240土10235土20242土12278±213．5±0．2
1．3土0．1

3．2土0．2＊＊

3．0±0．3＊＊

3．6土0．5

1．3土0．1

1．3土0．1

1．3土0．1

0．6土0．1

0．7土0．1＊＊

0．7土0．1＊＊

0．6土0．2

2．3土0．2

2．7±0．3＊＊

2．6土0．2＊＊

2．8土0．5

0．3土0．02

0．3土0．01

0．3土0．02

0．3±0．04

0．10士0．01

0．12土0．01＊＊

0．13土0．02＊＊

0．14土0．02

0．1土0

0．1土0

0．1土0．05

0．1土0104±19105士14104土17

113土8

43±7

45土9

51±8＊

44土13

985±4031032±203822土126

149土18

5土1

6±2

5：土1

5土4

43土10

39土11

42土9

37土23

5．5土0．5

5．7±0．8

4．6土0．8＊＊

5．7土0．6

193士36204±35

224土52

208土2014．9±2．9

13．3土2．9

12．5土3．6

14．1士2．8

149土5

149土6

156土5＊＊

158土5

5．8土0．5

5．8士0．5

6．5±1．3

10．4土0．5

6．0土0．9
10．8土0．7

10．6：±1．2

10．9±1．2

121士3

120±5

119士5

116土3

16．E−64−での急性及び亜急性毒性に関する研究
表6 E−64−Cの雌筋ジストロフィーチキソへの80日間連続投与における血液生化学的検査所見

d
／
g
m

Glucose

d d
／
／
g
g

Total protein
AlbuIninCreatinine
Total bilirubin
TTT
Total cholesteroI
Triglyceride
GOT
GPT酬醐酬川柳柳川mM醐mg

A／G
BUN

250±15250土14247土10271土26

3．3土0．2

3．0±0．3＊

3．1土0．2＊

3．3土0．3

1．4±0．05

1．3士0．1＊

1．4士0．1

1．5土0．1

0．7土0．04

0．8±0．04＊

0．8土0．05＊

0．8土0．04

3．1土0．2

3．4土0．5

3．2土0．3

3．5土0．2

0．3±0．03

0．3±0．02

0．3土0．02

0．3士0．04

0．16±0．01

0．18±0．02＊

0．18土0．01＊＊

0．19土0．02

0．1±0．04

0．1土0

0．1土0

0．3土0．2

100土10

92土12

98土9

113：土1863±18

46土11＊

53士13

90±33

660±164586土114760士236

163士15

6士1

6士2

6士2

40土6

41士7

45士13

62士14

IP

5．1±0．5

5．2士0．6

4．9土0．5

6．2土0．8

200土12197±29197士18236土42

12．2土2．2

10．9土2．5

12．1士1．4

13．3土4．7

151土6

151土3

155士4

155土4

5．8土0．5

6．1土0．6

6．4士0．7＊

6．5±0．5

11．4土0．8

10．0±1．5＊

10．3士1．2＊

10．7士1．1

117土6

117±7

113士7

113土2

〝l醐嘲珊瑚嘲

7土2

ALP

Phospholipid
Uric acid
Na
K
Ca
Cl
＊P＜0．05＊＊P＜0．01

結果

投与期間中，いずれの投与群においても死亡例はみられなかった。症状変化では対照群の雄1例に貯化40日頃から歩行異常，起立不能が認められたが，E−64−C投与群では異常例がみられなかった。またマウスやラットのような投与
部皮膚の病変はまったく観察されなかった。体重変動を図2に示す。
正常チキンと筋ジストロフィーチキン及び雌雄の間には差が認められるものの，筋ジストロ
フィーチキンでの対照群と E−64−C 投与群との間には差はみられなかった。
血液生化学的検査結果を蓑5，6に示す。
E−64−C投与群において雌雄共通した変動として，総蛋白量の減少，A／G比の上昇，総ビリルビン量の増加が認められた。その他一部の検査項目に雌雄問に共通性のない変動がみられた。
剖検所見では起立不能を呈した対照群の雄において腎の黄白色調の隆起状大豆大結節がみられ，また薬物投与の如何に拘らず，各群の数例に比較的小さな精巣が散見された。摘出各臓器の相対重量を表7に示す。
150mg／kg以上の投与群に精巣重量の減少がみられたが，その他の臓器には著変が認められなかった。
病理組織学的所見では腎において尿細管上皮の硝子滴沈着が雌雄とも150mg／kg以上の投与群に観察された（写真5）。この硝子滴は屈折性を有し，エオジン及び Masson の tri−
Chrome染色で赤染，Weigert の線維素染色
で濃青紫色の染色態度を示した。その他の所見として，正常チキンの肝細胞の月旨肪化，対照群
107

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表7 E−64−Cの筋ジストロフィーチキソへの80日間連続投与における臓器重量＊P＜0．05＊＊P＜0．01の雄1例の腎炎及び尿管炎，薬物投与の有無に拘らず，肺胞内石灰様物質の沈着とその貪食反応，精巣の精細管萎縮，精細胞の巨大細胞様SynCytialmassの形成及び問質炎等が観察さ
れた。
考

察

E−64−C投与による影響として，血清値の変動と腎の組織変化があげられる。組織所見における腎の変化は尿細管上皮の硝子滴沈着で，これは先のラット亜急性毒性試験で観察されたも

写真5 腎（E−64−C 300mg／kg皮下投与，
雄の筋ジストロフィーチキン）
尿細管上皮の硝子滴沈着
tricbrome

108

×250

Masson，Sのと同質の変化で，物質代謝障害に基づく退行性変性を示すものである。血清蛋白量の変動も著変を示すものではないが，この腎病変に関連しているのかも知れない。なお，精巣の重量変化は組織的に対照群より増強された変化が得られなかったことから判断して，偶発的な変化と考えられる。

16．E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究

結論

筋ジストロフィーチキンにE−64−C150及び300mg／kgを80日間連続皮下投与し，その毒性を検討した結果，150mg／kgから一部の血清分析値にわずかな変動と組織学的に腎の尿細管上皮変性が観察されたが，その他，特に毒性的徴侯は認められなかった。

文献1）大関正弘：E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究，厚生省新薬開発研究事業，「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和54年度研究報告書，pp．25−
36

109

17．E−64−Cの抗原性に関する研究

大 関 正 弘＊
研究協力者 小 友国府田進＊ 中 池 司 郎＊
寿

子＊

森

千鶴子＊

10mg／kg背部皮下投与した。感作後経目的に採血し，得られた血清について，Hartley系
雌性モルモットを用いた受身皮膚アナフィラキ
シー（PCA）1）により，E−64−Cに対する抗体価を測定した。惹起抗原としては，E−64−Cと研究日的E−64−Cの安全性検討の一環として，ウサギ
及びモルモットに対する抗原性を検討する。
材料及び実験方法

正常ラット血清のincubationmiⅩture（370C，
30分；E−64−C−RTS）を用いた。

1．ウサギによる抗体産生
NZW系雌性ウサギ（2．5〜3．0kg）を用い

2．ウサギ遅延型皮膚反応た。感作抗原としてE−64−Cと正常ウサギ血清1で用いたウサギを使用した。day49に左のincubationmiⅩture（370C，30分）を用い，脇腹を刈毛し，E−64−CのSaline溶液（1mg／

表1のⅠに示すスケジュールで感作した。一次ml），E−64−C−RTS及びRTS各0．1mlずつ

感作では，抗原液と等量のFreund scomplete
adjuvant（Difco）の懸濁液を，E−64−C とし皮内注射した。注射後24及び48時間目に皮膚を観察し，Draize の皮膚一次刺激性試験の判定て0．5及び5mg／kg四肢足掛こ皮下投与した。

基準2）に従いランク付けした。

二次感作では，抗原液をE−64−Cとして1及び

仙dH
a

T▲

表1実験スケジュール
14

21

28

35
1

†

42

49

1

50

51

1

bleedingI
bleeding
prlmary SenSitization

Skin reaction
SeCOndary sensitization

4

8

day o

−

†

†

12−T

ⅠⅠ．Guinea pigs†

SenSitization＊大正製薬株式会社総合研究所
111

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表2

ウサギ抗血清のPCA

3．モルモット全身性7ナフイラキシー
Hartley系雌性モルモットを用い，表1のⅠは産生されていないものと考えられた（表2）。
2．ウサギ遅延型皮膚反応に示すスケジュールで感作した。E−64−C は

表3に結果を示す。コントロール群ではRTS

Salineに溶解後，等量のFCAとの懸濁液と惹起により4例中1例でかすかな紅斑が認めら

し，E−64−C として0．3及び3mg／kgを後肢れた（24時間目のみ）。E−64−C低用量感作群

筋肉内に投与した。最終投与の2週間後に抗原では，24時間目には，いずれの抗原惹起においの静脈内投与による惹起を行なった。すなわちても1〜2例にかすかな紅斑が認められたが，E−64−C−RTSをE−64−Cとして2．5mg／kg投与後，江田3）の方法に従い，アナフィラキシー

48時間目にはRTS惹起のみ1例に認められ症状を観察し，症状の全般的評価（general

いずれの抗原惹起においても1例ずつかすかな

SymPtOmS）として，何らの症状を示さないも紅斑が認められたが，48時間目にはいずれも消のを0，1〜3症状を示すものをⅠ，4〜7症

失していた。

状を示すものをⅡ，8症状以上または死亡した
ものをⅢとした。

た。E−64−C高用量感作群でも，24時間目には各判定時間において，対応する惹起抗原ごとにWilcoxon

結果

s rank sum testにより統計処理を行なったが，コントロール群とE−64−C感作群の間に有意差は認められなかった。

1．ウサギによる抗体産生

3．モルモット全身性アナフイラキシー

PCAの結果，いずれの被検血清を用いても結果を麦4に示す。いずれのモルモットにお色素漏出は認められず，E−64−Cに対する抗体

いてもアナフィラキシーショックの誘発は認め112

17．E−64−Cの抗原性に関する研究
表3 ウサギ遅延型皮膚反応

表4モルモット全身性アナフィラキシー

られず，E−64−Cには全身性アナフィラキシー

FCAとともにウサギに皮下注射して感作し，誘発作用はないものと考えられた。

得られた抗血清についてモルモットPCAを行考察なったが，E−64−Cに対する抗体は認められなかった。また，ウサギ遅延型皮膚反応試験にお一般に新規薬剤の抗原性試験は，薬物をFCA

いては，各群で1〜2例ずつかすかな紅斑が認のような強力なアジュバントとともに免疫した

められたが，惹起抗原としてRTSを用いた場

り，あるいは，薬物を予めf乃〝ifr0で血清な合にも認められたこと，コントロール群でも認められたことより，RTSもしくはE−64−Cのどとincubate L，そのmixtureを免疫した
りして，薬物に特異的な抗体を動物に産生させるか否かで抗原性が判定されている。本試験に一次刺激性による紅斑形成であり，E−64−Cに対する細胞性免疫反応によるものではないと考

おいてほ，E−64−Cを血清とincubate 後，えられた。モルモットにE−64TCを

FCA

と
113

Ⅳ 全身的影響に関する研究

共に4回筋肉内注射し，最終感作後2週間目に反応は認められなかった。従って，E−64−Cは，

E−64−Cを静脈内注射しても，全身性アナフィ
ラキシーショックの誘発は認められなかった。

抗原性物質になる可能性は極めて少ないものと以上の結果より，E−64−Cは，抗原性物質になる可能性は極めて少ないものと考えられた。
結論

E−64−Cの抗原性について，ウサギによる抗体産生，ウサギ遅延型皮膚反応及びモルモット
全身性アナフィラキシーの3試験法により検討したが，E−64−Cに対する液性及び細胞性免疫114

考えられる。
文献1）岡田秀親：モルモットにおけるPCA反応，免疫実験操作法A，626頁，1970．
2）森川藤凰：局所刺激試験法，白須春彦，松岡理編， 新しい毒性試験と安全性の評価 ，ソフトサ
イエンス社，433頁，1975．
3）江田昭英：薬物アレルギー試験，薬効の評価（2），
地人書館，181貢，1973．

18．E−64−Cの感覚器に及ぼす影響

粁
㍗
﹂

＊

朗

島贋

大書

＊

合

1．E−64−Cの網膜機能に対する作用
試験動物として，9遇令のウィスク一系雄性

雄子

法

点古

方

＊

E−64−Cの安全性研究の一環として，E−64−Cの視覚及び聴覚に及ぼす影響を検討する。

弘

的

根辺

申渡

＊

日

正

関

忠志

＊

大

遺訓

島部

笹阿

研究協力者

り閉限させ，電極の乾燥を防ぐため10分毎に生
理食塩水を滴下した。
刺激光は光刺激装置（MSP−2R：日本光電）
によるキセノン光とし，0．3ジュールの強度で左眼より 50cmの場所から照射した。
ERG の増幅と観察はブラウン管オシロスコープ（VC9：日本光電）と前置増幅器（AVB−
2：日本光電）により行い，データ処理装置

ラット（日本動物）体重別0〜300gを使用し，1群6匹とした。
E−64−Cは水に難溶であるため，静脈内投与（ATAC−350：日本光電）及びレコーダー（056

に際し，飽和NaHCO3−生理食塩水にて溶解
後，PH7．4，濃度250mg／mlの水溶液に調製して用いた。
網膜機能の指標として網膜電図（ERG）を用い，蓮井の方法l）（1968）により観察，記録した。すなわち，局所麻酔下（0．1％塩酸リドカ
イン：藤沢）でY字型気管カニューレを挿入したラットに，筋弛緩薬（アメリゾール：吉富）

フォトトランジスター（P−6：日本電気）を使：日立及び B−2：東新電気）により記録した。
また，ERGの頂点潜時測定のため光刺激時は，0．1mgを腹腔内投与し不動化させ，直ちに人工呼吸（110回1分：高橋商店）を施し，ラットを固定した。
閑電極と不閑電極には，生理食塩水を含ませた黒綿で白金を覆った自金一綿電極を使用し，
関電極は左限角膜中央部を少しはずれた場所に，不閑電極は前頭部の皮膚を切除し，露出させた骨膜上にそれぞれ接触させた。なお，右眼は瞬間接着剤（アロンアルファ：東亜合成）によ＊大正製薬株式会社総合研究所

図1ERG要素の模式図
A−a：a波振巾，A−b：b波振巾，
L−a：a渡頂点潜時，Lb：b波］鼠点潜時
115

Ⅳ 全身的影響に関する研究
Light Adapted ERG．十・：￣…∴100m seC

Arrow：Photic StimuLus
ERG：0．3Joute．ERP：40Joute＆
VEP：0．3Joule
Time Constant：2．O sec

図2 ERG，ERP及びVEP各要素の模式図
A：振巾，L：頂点滞時，（e）：明順応，（d）：暗順応，Ⅰ・W・：初期波

用し，ブラウン管オシロスコープの他のチャンネルに記録した。
なお，ラットには試験開始16時間前より暗順応を与え，気管切開その他の操作は暗い赤色光
照明下で行った。ERGの記録は暗順応下で，薬物投与前，投与後2，5，10，15，20，30，
45及び60分に行った。
ERGの各要素の計測は時定数2．Osecの記録より，図1の様式に従って行い，a波とb波の振幅と頂点潜時を求めた。
2．E−64−Cの視党系及び聴器に及ほす影響
試験動物として10週令のACI／N系雄性ラット（星野試験動物）体重180〜220gを使用した。
E−64−Cは前記の方法で溶解し，ラット12匹に500mg／kgを30日間皮下授与し，対照とし
116て同数のラットに生理食塩水0．25ml／100gを皮下投与した。
（1）視覚系に及ぼす影響
投与期間終了後，眼底カメラ（RC−2：コーワ）により眼底を観察し，16時間の暗順応後，（1）ERG，（2）早期受容器電位（ERP）（3）
脳波視覚誘導電位（VEP）を暗順応下及び明順
応下（125ルックス）で以下のように観察記録した。
前述の方法にてERG用電極を装着後，0．3ジュールの刺激光でERG を観察・記録し，40ジュールの刺激光でERPを記録した。

VEP記録には，ラット頭部皮膚と骨膜を切除し，直径1．5mmのネジ電極を十字縫合の
右方3mm，下方6mmと嗅球上の頭蓋骨に埋め込み，刺激光として0．3ジュールのキセノ18．E−64−Cの感覚器に及ぼす影響

mln

mln

O

O

l於m

l
PhoticStimuLus

2

2

5

5

5

10

10

10

15

15

15

20

20

20

30

30

30
45

45

60

60
≡＿＿＿‡二CONTROL

三三三千I
E64C

45
60

500mgルg

幸三ミニ
巨6与ClOOOmg／kg
50msec

図3

mln
OE−64−C500mg／kg及び1000mg／kgを静脈内投与した場合のERG変化

1企m

mIn

2

2

5

5

5

10

10

10

15

15

20

20

30

30

2

45
60

きて十†＿
CONTROLl
PhoticStimuIus

O

45
60

企

15
20

姫

30￣し′′（

45−＼一、−日＿＿＿

60

E・64・C2000mg／kg E64｛2000mg／kg
50msec

図4

E−64−C2000mg／kgを静脈内投与した場合のERG変化
右の例には死亡例における変化を示す
117

Ⅳ 全身的影響に関する研究
AmpLitudeb wavem SeC
90喝∴、△＿△・′A一一、む一・一

80

且廿皿0−−−か一一一一甘一一一一￣匂
000

0

70
く＞一・〇一CONTROL・41ゝ・E−6ケC

60500mg／kg−｛1−｛｝・E−6キClOOO mg／kg
・〇・・〇一・E−64・C2000mg／kg

50・〇・・〇日・0．

30
一一▲−，〜一旬一一一一一

20

a WaVe

10

0

0

10

20

30

45

60
min

0

10

20

30

45

60
min

図5 E−64−C の静脈内投与による ERG 頂点
潜時の変化

図6 E−64−Cの静脈内投与によるERG振巾の変化

ソ光を3秒に1回の頻度で30回ラット左眼に照3．推計学的処理
測定値は平均と標準偏差を求めて，t検定により平均値の有意性を検討した。

射した。VEPの増幅は前置増幅器とブラウン管オシロスコープにより行い，電位はデーター
レコーダー（DFR−3915：ソニー・マグネスケール）を介して，データ処理装置にて加算した。
電気生理学的検査は，最初，暗順応下でERG，
ERP，VEPの順に10分間隔で行った後，明順
応下（125ルックス）で20分間放置し，VEP，ERG，ERPの順に10分間隔で行った。
ERG，ERP及び VEP の計測は図2の様式にて行った。
（2）聴器に及ぼす影響
投与期間終了後，全例の動物について耳介反射を利用した聴力検査を行った。
耳介反射閲値の測定は動物用プライェル・オージオメーター（PA−1：永島医科器械）を用
い，0．5，1，2，4，6，8，10，12，15及び20
kHzの周波数について行った。

118

結

果

1．E−64−Cの網膜機能に対する作用
暗順応ラットに生理食塩水，E−64−C500及び1000mg／kgを静脈内投与した場合のERG変化を図3に示し，E−64−C2000mg／kg を静脈内投与した場合のERG変化を図4に示した。
また，E−64TC投与後のERG各指標の変化を図5及び6に示した。
対照群（生理食塩水投与）及びE−64−C500
mg／kg投与群では，静脈内投与後60分まで顕著な変化は認められなかったが，E−64−ClOOO
及び2000mg／kg投与群では，b波頂点潜時の延長及び振幅の減少が用量相関的に認められた。
なお，E−64−C500mg／kg 以上の投与により心拍数の減少が認められ，2000mg／kg投与

18．E−64−Cの感覚器に及ぼす影響

10

20

30
day

図7 E−64−Cを30日間皮下授与したラットにおける体重変化

群では1例が図4右のようなERG変化を示し，投与後35分に死亡した。
2．E−64−亡の視党系及び聴器に及はす影響
E−64−C500mg／kgを30日間皮下投与した
場合に，運動抑制が認められ，図7に示すように投与後18日目より体重増加の抑制憤向が認められた。さらに，投与後22日には1例の死亡が認められた。
（1）視覚系に及ぼす影響
1）眼底検査投与期間終了時の眼底検査において，何ら異常は認められなかった。
2）視覚機能検査
E−64−C 500mg／kg 投与群におけるERG，ERP及びVEPの測定結果をそれ
ぞれ表1，2及び3に示した。
ERP及びVEP の各要素には E−64−C 投与による変化が認められなかったが，ERGではa波とb波の振幅減少が認められた。しかし，個々のERG記録には頗著な変化は認められなかった。
（2）聴器に及ぼす影響
投与期間終了時に測定した耳介反射閲値の平均値は表4に示すとおりで，E−64−C500mg／kg
投与群では20kHzの刺激音に対して反射閲値の上昇が認められた。
考察

視覚系は視覚受容器及び中枢への伝導路のほか，数多くの付属器を含む感覚系であり，臨床上では多様な検査法により障害の検索がなされている。これら諸検査法のうちERG は網膜の機能をよく反映するとされてお＿り，ERG各波の発生部位についてもほぼ明確にされている2）〜4）。

E−64−Cを静脈内に投与した場合，1000mg／
kg以上でERGb波が顕著に変化し，E−64−Cが双極細胞5）あるいはミュラー細胞6）に何らかの影響を与えることが示唆された。しかし，b波は酸素の影響を受け易く7），E−64−C投与により心拍数の減少が認められたことによりb波の変化はアノキシア等の二次的な影響と考えられ，E−64−Cは網膜神経枚能に直接作用しないものと考えられる。
E−64−C500mg／kgを30日間皮下投与したラットにおいて，ERG波形の変形は認められなかったが，ERGの計測の結果ではa波及びb
波振幅の減少が認められた。
ジアミノジフェニルアルカンの視覚毒性はタン′くク質等のチオール基との反応によるとする
119

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表1E−64−Cを30日間皮下投与したラットにおけるERGの計測結果＊p＜0．05＊＊p＜0．01

Mean±S・D・

表2 E−64−Cを30日間皮下投与したラットにおけるERPの測定結果

Group l N 巨eakLatency（msec）l Amplitude（pV）

Mean土S．D．

表3 E−64−Cを30日間皮下投与したラットにおけるVEPの測定結果

Mean土S．D．

（unit：m SeC）

表4 E−64−Cを30日間皮下投与したラットにおける耳介反射閉値＊p＜0．05120

Mean士S．D． （単位：dB）

18．E−64−Cの感覚器に及ぼす影響報告があり8），E−64−Cはチオールプロテアー
ゼに特異的に作用するとされるものの，他のタンパク質に対しても作用する可能性があることを考慮すると，E−64−C投与によるERGの振幅減少は，E−64−Cの網膜内チオール基に対する作用が反映されたものとも考えられる。
一方，聴覚に関しても，20kHzの音に対する耳介反射閲値の上昇が認められた。この変化
は薬物による聴器障害の初期変化として認めら

早期電位について，日限，72，364−376，1968．
2）Granit，R．：The components of．the retinal
action potential and their relation to thedischargein the opfic nerve，J．physio1．，77，
207〜240，1933．

3）Cone，R．A．：Earlyreceptorpotential；photo
reversal change displacementin rodopsin，
Science，155，1128〜1131，1967．

4）米村大歳，河崎一夫：網膜電図の臨床応用一律
動様小波を中心として。日本医事新報，No．2538，
23−271972．

れるものであるが9），反射閲値の上昇が軽度で5）Brawn，K．T．：The elctroretinogrm：Its

あり，20kHzの音に対してのみ認められたことにより，E−64−Cが聴覚系に影響を及ぼす薬

COmpOnentS and their origins，Vision Res．8，

物とは断定できなかった。
以上のように，E−64−Cは視覚及び聴覚に影6）Tomita，T．Electrophysiological studies of

響を及ぼす可能性が示唆されたが，いずれの変化も軽度であったことから，より長期の連続投与により詳しく検討することが必要と考えられる。

633〜677，1968．

retinalcellfunction，Invest．Ophthalmo1．，15，
171〜187，1976．

7）Brawll，K．T．and Mllrakami，M．：A new
receptor potential of the mokey retina withno detectadllatency，Nature，201，626〜628，
1964．

8）Reading，H．W．：Effect of a retinotoxic

結論

E−64−Cの視覚及び聴覚に及ぼす影響をラットにおいて検討した結果，視覚，聴覚とも軽度の影響が認められた。

phenoxyalkane on the visual cyclein rabbit
retina，Biochem．Pharmacol，19，1303〜1313，
1970．

9）秋吉正豊：抵生物質による聴器障害の病理，動物の内耳の病理組織像を中心に，Medicina，10，
881〜888，1973．

文献1）蓮井勲：シロネヅミの網膜電図，一腰波形及び121

19．E−64−Cの薬効に関する研究（1）〜筋ジストロフィーチキンに対する薬効試験〜
＊

弘

＊

男子暗

＊
＊

井

＊

保恭正

本

＊

樽岸玉

＊

雄男紀

兵事和

＊

板沢田

中鬼花

＊
＊

的

筋ジストロフィーチキン（1ine413）にE−

64−Cを80日間連続皮下投与して，その治療効果を検討する。
方

正

関

忠明子子
＊

大

道正裕敬

島村松木

日

笹木岩栢

研究協力者

法

（1）動物：膵化後10日目の筋ジストロフィー
チキン（1ine41の 雌雄を1群10〜12羽あて
群別し，また対照として同日令の正常チキン（line412）の雄5羽，雌6羽を使用した。
（2）投与量及び投与方法：E−64−Cは重曹水にて中和溶解後，生理的食塩水に混和し7．5及
び15．0％（W／v）液を調整した。投与量は150
及び300mg／kgとし，体重100gあたり0．2mlの液量を1日2回（AM9：00及び PM
4：00）に等分して80日間腹側部皮下に投与した。対照群には生理的食塩水を同様に授与した。なお，正常チキンは無処置とした。
（3）検査項目‥投与期間中は10日間隔に体重，血渠中のPK，CPK及びLDH活性の測定ならびにフリップテストを行った。
フリップテストの判定法は，両羽を広げた状
態で静かに仰臥させ，それからの起立能力とした。評価は，起立したものを1点，10秒経過して起立不能のものを0点とした。この操作を5回くり返して起立回数をもとめた。

80日間の投与終了時に断頭により放血屠殺して浅胸筋を採取し，これらの組織学的，組織化
学的検索ならびに筋中のCa＋＋−aCtivated ne−utralprotease（CANP）活性の測定を行った。浅胸筋の採取部位は，検索部位を統一する
ために鎖骨直下，胸骨近位部の外表膜を含めその直下部を選んだ。
組織学的，組織化学的検索用として採取した筋は液体窒素で冷却したイソペンタンで凍結
し，10FL の連続切片を作成し，H．E．，aCid
phosphatase，aCetylcholinesterase，PAS，
NADH−TR染色を施し，各群での比較検討を行った。筋線維直径はH．E．染色標本から最終倍率250倍の写真を作成し，各々300本の筋線
維径を計測して作成したヒストグラムで比較した。また，壊死線経に対する抑制効果をみるた
めに壊死線経の貪食細胞に陽性反応を示すacid
phosphatase染色標本から100mm2stiickにおける壊死線維数をかぞえて記録した。
筋肉中のCANP活性は杉田等の方法l）に従って，筋ホモジネートより等電点沈澱法で得た画分の活性を測定した。なお，測定感度を上げるために∴N．Jentoftの方法2）に準じて調整した〔HC〕−メチルカゼインを基質として使用した。測定法を図1，基質製造法を図2に示す。
結果

フリップテストの結果を各々の群ごとに起立＊大正製薬株式会社総合研究所

能力の平均値として表1に示す。
123

Ⅳ

全身的影響に関する研究

Reaction mixture（0．2ml）
0．23％［1−C］一methyl・CaSein（0．2pCi／mg）
70mM glycerophosphate buffer，PH7．5
30mM2−merCaptOethano1
20FLlenzyme（preparedbythe methodofIshiuraelal・）
6mM CaC12（presencc and absence）
300C，30min←0．2mloflO％TCA
OOC，20minlCentrifugation3000rpm，10min

ppt．

Sup・
determination of radioactivity（0．1ml）

図1チキソの訪中CANP活性測定法
Reaction mixture（20ml）
300mg Casein（Hammarsten）
20mM［1．C］Formaldehyde（0．5mCi／m mol）

0．1M HEPES buffer，pH7，540mM

NaCNBHさ124brat250C
Dialysis againstlOmM Tris−HCl buffer，pH7．0
1［1．C］一Methyl−CaSein
以0mg；98′

Ci（0．41J

Ci／mg）

図2［HC］−メチルカゼインの製造法

表1E−64−Cを処置した筋ジストロフィーチキンのフリップステストにおける平均起立回数
10

124

1

20

1

30

1

40

1

50

1

60

1

70

19．E−64−Cの薬効に関する研究

7
6

6

5
70t

4

TOtH l＼己

H一∋H

3

20

30

40

50

60

70

80

20

30

days

40

50

60

70

80

days

図3 E−64−C処置による雄筋ジストロフィーチ
キソの血祭中CPK活性

図4 E−64−C処置による雌筋ジストロフィーチ
キソの血菜中CPK活性TOt三吉

70H三吉H
30

40

50

60

70

80

days

図5 E−64−C処置による雄筋ジストロフィーチ
キンの血祭中PX活性

30

40

50

60

70

80

days

図6 E−64−C処置による雌筋ジストロフィーチ
キソの血祭中PX活性125

Ⅳ 全身的影響に関する研究

Ot択一＼ゴH
NI

20

30

40

50

60

70

80

dayS

20

30

40

50

60

70

80

days

図7 E−64−C処置による堆筋ジストロフィーチ
キンの血祭中LDH活性

図8 E−64−C処置による雌筋ジストロフィーチ
キンの血菜中LDH活性

起立能を雌雄間で比較すると，いずれの検査日においても雌の方が高い起立頻度を示した。
対照群とE−64−C治療群との比較ではむしろ後者の方が低頻度の起立能を示し，E−64−Cによる起立改善はうかがわれなかった。
血菜中のCPX，PX，LDH活性の各検査結果を図3〜8に示す。
各活性値とも対照群との間に有意な差は認められなかった。

照群との筋線維径の分布を図9に示す。
筋ジストロフィーチキソは正常チキンに比べ大型線経が多く，小径のものから大径へと幅広い分布を示した。次に筋ジストロフィーチキン
の対照群とE−64−Cの各治療群との筋線維径の分布を図10，11に示す。
E−64−Cの各治療群における筋線経の直径は対照群のそれに比べてむしろ大径化を示し，60〝以上の肥大線経の数は増加し，正常チキンの分布パターンへの改善はみられなかった。
表2に各群の100mm2stdCk における壊死線維数を示す。
対照群に比べ，各治療群ではむしろ壊死線維数の増加傾向がみられ，E−64−Cの壊死線経に対する抑制効果は認められなかった。
さらに，PASや NADH−TR，aCetylchol−inesteraseの各活性も各治療群と対照群とはほぼ同等な反応結果が得られ，両者間に明らかな差は認められなかった。
筋肉中のCANP活性の測定結果を表3に示す。

投与終了時における浅胸筋の組織学的，組織
化学的検索結果では，対照群の筋ジストロフィーチキンの浅胸筋に，肥大線経が多数存在し，
筋線経の大小不同が著明で，強い貪食反応を受ける壊死線経が散在性にみられ，その貪食細胞にacid phosphatase活性が認められた。またPAS，酸化酵素反応（NADH・TR），あるいはacetylcholinesterase等の各染色で，それぞれ活性の高い線経が多くみられ，いずれも筋ジストロフィーチキンに特徴的な変化が確認された。
正常チキン群と筋ジストロフィーチキンの対
126

19．E−64−Cの薬効に関する研究

4

20

40

60

80

100

120

um

Djameter

図9 正常チキソ及び筋ジストロフィーチキン（対照群：雄）浅胸筋の筋線維径ヒストグラム

4

20

40

60

80

100

120

Vm

Diameter

図10 無処置（対照群）及びE−64−C150mg／kg処置した筋ジストロフィーチキソ（堆）浅胸筋の筋線維径ヒストグラム

127

Ⅳ 全身的影響に関する研究

4

20

40

60

80

100

120

um

図11無処置（対照群）及びE−64−C300mg／kg処置した筋ジストロフィーチキソ（雄）浅胸筋の筋線維径ヒストグラム

表2 E−64−Cを処置した筋ジストロフィーチキソ（堆）浅胸筋の壊死線維数−perlOOmm一一

Mean土S．D．

表3

128

E−64−C処置による筋ジストロフィーチキン浅胸筋中のCANP活性19．E−64−Cの薬効に関する研究
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ジストロフィーチキン）

一
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一・・人⁚

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活性はE−64−C投与により低下する懐向がみられたが，上記各所見との相関は認められなか∴誉∴∴仁才h．一転・十紅
写真1浅胸筋（正常チキン）×100H，E．
写真2 浅胸筋（対照群筋ジストロフィーチキン）
節線経の大小不同及び貧食反応を伴う壊死線維 ×100H．E．
対照群の筋ジストロフィーチキンでは正常チキンの約1．6〜1．8倍のCANP活性値の上昇が認められた。またこれらの値は雌雄の間でかなりの差があり，雄の方が約1．5倍の高い値を示
して発症度と一致した傾向がみられた。
E−64−Cの投与によりCANP活性は低下す
る懐向がみられ，明瞭な用量依存性は認められないものの，雄の150mg／kg群では有意な低下がみられた。
考

写真3 浅胸筋（E−64−C300mg／kg治療群，筋写真2より筋線経の大径化を示すが，その他は同様所見 ×100H．E．

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●．．1●嘉㌢、ヽ−察筋ジストロフィーチキンにE−64−Cを150及び300mg／kg80日間皮下投与して，その治療効果を検討した結果，フリップテスト及び羅患浅胸筋の組織学的，組織化学的検索において，校能的及び形態的変化の改善を示唆する所見は得られなかった。一方，筋肉中のCANPった。本報で用いたCANP活性の測定法は筋肉中の全活性（不活性型も含めて）を測定する方法であり，生体内で実際に作動している
CANP活性を観察するという意味では問題の残る方法である。今後，さらにすぐれた測定法の開発が必要であろう。
今回の投与量は，われわれが先に行った40，
100mg／kg投与によるパイロット試験の成績において毒性的所見がほとんど得られなかった
こと，また鶏における血中濃度がラットに比べてかなり低いことから設定したものである。しかし，今回の場合，この高投与量ではすでに物
質代謝障害が誘発され，その他にも何等かの非特異的な影響のあったことが推察され，効果判定としてほ他の要因がかかわり過ぎており，またこれらの要田が効果発現の妨害になったことも考えられ，古雅びわγクにおける種々の効力結果を考慮に入れると，より低用量の方が結果的には適していたように思われる。一方，最近，筋ジストロフィーチキンは病態モデル動物としての適性に若干の問題点も指摘されており，今後 より多様な病態モデル動物での検討が必要と思われる。

129

Ⅳ 全身的影響に関する研究

効の評価についても検討の余地があると思われ

結

論

る。

筋ジストロフィーチキンにE−64−Cを80日

文献間投与して按能及び組織形態面から治療効果を検討した結果，筋肉中のCANP活性の低下傾向がみられたが，その他のいずれの所見においても改善効果は得られなかった。今後，筋ジス

1）杉田秀夫，石浦章一：各種神経肪疾患のCANP
活性，厚生省筋ジス（三好班），昭和54年度報告象
2）N．Jentoft and D・G・Dearborn：Labelingof proteins by reductive methylation using

トロフィーチキンを用いてE−64−Cの薬効評価

sodiumcyanoborohydride，J・Biol・Chem・，254，を行う場合，E−64−Cの適用量の検討がさらに4359−4365，1979．

必要であろう。他の病態モデル動物における薬130

20．E−64−Cの薬効に関する研究（2）〜Serotoninmyopathyに対するE−64−Cの効果〜

大
研究協力者

相

目

原

弘

関

和＊

的

Serotoninmyopathyは薬物により発症するmyopathyとして1971年MENDELLら1）により報告されて以来，DUCHENNE型ジス
トロフィー症との比較に関する多くの報告が提出されている2）3）。我々は，昨年 Serotoninmyopatbyにおける行動，筋肉重量，血中Creatinephosphokinase（CPK）活性，光頭像等についてその特徴を明らかにした4）。今回はさらに種々の血中酵素活性，電頗像及び血中ア
ミノ酸濃度について検討を加え，Serotoninmyopathyの特徴を明らかにしたうえで，

E−64−Cの効果を検討した。
方

法

正
土

弘＊
田

武

司＊

倉

地

道

雄＊

1−，2−及び3−CyCleのラットより，Seroto−nin投与の1，2，4及び8時間後にbeparini−
Zed syringe で心臓から採血し，3，000rpm
20分間遠沈し，血菜を調製した後，その酵素（Creatine phospl10kinase；CPX，Lactate
dehydrogenase；LDH 及び PyruVatekinase；PK）活性及び各種のアミノ酸含量を測定した。なお，CPK及び PK はそれ
ぞれRosalki法5）及びBoyer法6）を用い，
LDHおよび各種アミノ酸はそれぞれ自動分析装置（日立712型）及び高速アミノ酸分析計（月立835型）により測定した。
（3）電顕試料の作製
ラットの大腿四頭筋を採取し，2．5％ダルク
ルアルデヒド（リン酸緩衝）溶液及び1％オ（1）Serotonin myopathyの作成

スミウム酸（リン酸緩衝）溶液により二重固定を行った後，50％からの上昇アルコール系列でWistar系雄性ラット（体重120〜140g）に脱水し，プロピレンオキシドを経てEpon−812

1日1回Imipramine・HCl（Imip．）10mg／kgに包埋した。電頗観察用の超薄切片作製に際しを4日間腹腔内投与し，4日目のImip．投与の6時間後に Serotonin Creatinine Sulfateては，予め1・0〜1．5／Jmの光顕用切片を作り（Serotonin）75mg／kgを腹腔内投与した。まの視野の選定を光麒的に行った。超薄切片はラた，この4日間を1−CyCleとし3−CyCleまで

イへルトミクロトーム（OmU2）で作製し，繰り返し投与を行った。E−64−C及び対照薬としての抗セPトニソ剤Cyproheptadine・HCl

酢酸ウランと鉛の二重染色を施し，電子顕微鏡

これにトルイジンブルー染色を施し電顕的検索（日立HU−12A）で観察した。

は，1日1回Imip．投与の4時間後に毎日皮下投与した。
（2）血中酵素活性及びアミノ酸分析＊大正製薬株式会社総合研究所

結果（1）血中酵素活性
SerotoninmyopathyにおいてCPK，LDH
及び PK 活性すべてが，正常レベルより上131

Ⅳ 全身的影響に関する研究

0

1

2

4

8（HR）

図1セロトニン投与後の血祭中CPK活性の変化及び薬物の影響（1−CyCle） 横軸；セロトニソ投
与後の時間 ＊；intactratのCPX活性

0

1

2

4

8（HR）

図2 セロトニソ投与後の血祭中CPK活性の変化及び薬物の影響（2−CyCle） 横軸；セロトニン投
与後の時間 ＊；intactratのCPK活性

0

図3

132

1

2

4

8（HR）

セロトニン投与後の血祭中CPK活性の変化及び薬物の影響（3−CyCle）横軸；セロトニン投
与後の時間 ＊；intactratのCPK活性20．E−64−Cの薬効に関する研究

0

1

2

4

8（HR）

図4 セロトニン投与後の血菜中LDIi活性の変化及び薬物の影響（1−CyCle） 横軸；セロトニン投
与後の時間 ＊；intactratのLDH活性

0

1

2

4

8（HR）

図5 セロトニソ投与後の血祭中LDH活性の変化及び薬物の影響（2−CyCle） 横軸；セロトニン投
与後の時間 ＊；intactratのLDH活性

0

1

2

4

8（HR）

図6 セロトニソ投与後の血祭中LDH活性の変化及び薬物の影響（3−CyCle） 横軸；セロトニン投
与後の時間 ＊；intact ratのLI）H活性133

Ⅳ 全身的影響に関する研究

mg／kg s・C・

5

5 0
1 3

△
△
［コ
ロ
●一一一●cypro．
▲−一一▲
■一一一■

0 0 ﹁／
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0E−64−C

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×0

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−

＼
＼

▲
−●

8（HR）

図7 セロトニソ投与後の血祭中PX活性の変化及び薬物の影響（トcycle） 横軸；セロトニソ投与
後の時間 ＊；intact ratのPX活性

図8 七ロトニソ投与後の血祭中PE活性の変化及び薬物の影響（2−CyCle） 横軸；セロトニン投与
後の時間 ＊；intact ratのPK活性

0

1

2

4

8（HR）

図9 セロトニン投与後の血祭中PX活性の変化及び薬物の影響（3−CyCle） 横軸；セロトニン投与
後の時間 ＊；intact ratのPI（活性134

20．E−64−Cの薬効に関する研究

★★

LJ
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2
U
l
N

★

★★

1

★ 丁
★

■

★

★★

■

図10 血祭中の糖新生アミノ酸含量 横軸；セロニトソ投与後の時間 縦軸；intactratの血菜中含量に対する比

GLY；glycine，ALA；alanine，THREO；threonine，SER；Serine・＊；P＜0・05，＊＊；P＜0・01．
V AL

★
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」
2

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8

1

2

4

8

（
HR）

図11血祭中の側鋳型アミノ酸含量 横軸；セロトニソ投与後の時間 縦軸；intactratの血祭中含量に対する比

VAL；Valine，ISOLEU；isoleucine，LEU；leucine・＊；P＜0・05，＊＊；P＜0・01．

135

Ⅳ 全身的影響に関する研究

★★

★
★★

★★

LJ
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1

2

4

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（
H R）

図12 血祭中のN−メチルヒスチジン含量
横軸；セロトニン投与後の時間 縦軸；intactratの血祭中含量に対する比
1−MEHIS；1−メチルヒスチジソ，3−MEHIS；3−メチルヒスチジン，＊；P＜0・05・＊＊；P＜0・01

136

20．E−64−Cの薬効に関する研究

写真1大腿四頭筋，トルイジンブルー染色，250倍
セロトニンmyOPathy，COntrOl

写真3

大腿四頭筋，トルイジンブルー染色，250倍
セロトニソmyOpathy，CyprOheptadine投与

昇していた。
これらの上昇率はCyCleが進むに従って減少した。また，E−64−C（75，150及び 300
mg／kgs・C．）はこれらの活性上昇を抑制しなかった。他方，抗セロトニン剤であるCypro−
heptadine・HCl（7．5，15及び30mg／kgs．C．）
群では，血中酵素活性はPKを除いて正常レベルにあった。
（2）血中アミノ酸濃度
発症ラットにおける糖新生アミノ敵側鎖型
アミノ酸及びN−メチルアミノ酸について検討したところ，側鎖型アミノ酸及びN−メチルア
ミノ酸の著明な上昇が認められた。
（3）光顕及び電顕像
Serotoninmyopathy群での大腿四頭筋では，光顕的に筋肉細胞の大小不同及び壊死，核の中心化及び鎖状配列等が認められ，また，電顔的には，筋線経の蛇行，萎縮及び断裂，Z帯
写真2 大腿四頭筋，トルイジンブルー染色，250倍
セロトニン′myopathy，E−64−C投与の消失，ミトコンドリアの増加，Opaque線経に相当すると思われる過収縮像等が認められた。
137

Ⅳ 全身的影響に関する研究

写真4 セロトニンmyOpatbyの電子腐徴鏡写真，2，600倍
明瞭な核小体を有する核は，中心核及び鎖状配列を呈する

写真5 セロトニン・InyOpatllyの電子顕微鏡写真，2，600倍
写真上部には過収縮していると思われる節線経が認められる

138

20．E−64−Cの薬効に関する研究

また，血管内皮細胞の異常は認められなかっのところ不明である。また，E−64−C投与群はた。E−64−C投与群では，光厨，電頭像とも

これらの変化を改善しなかった。これは，E−に，これらの変化を改善しなかった。

64−Cの血中よりの消失が早いことによるもの

他方，Cyproheptadine投与群は，問質細胞かもしれない。他方，抗セロトニン剤であるの増加が観察されたこと以外はほぼ正常の状態を保持していた。

Cyproheptadineは，光顕及び電原像ともほぼ正常な像が観察された。また，Munsatら12）

考察は，Serotonin myopathyにおいて血管異常
すなわち，血管内皮細胞の空胸化あるいは血管（1）Serotoninmyopathyでは，血中酵素

内脛に水泡の存在が著明に認められることを報活性（CPK，LDH及びPK）の著明な上昇が認められた。しかし，CPK 及び LDHは告している。しかしながら，我々はそのような異常を見出すことはできなかった。

CyCleを重ねるごとに活性の上昇は減少した。

結これは，Serotoninの頻回投与により行動上の変化の程度が減少する（tacllyphylaxis）ことと関係しているかもしれない。E−64−Cはこれらの血中酵素活性の上昇を抑制しなかった。

語

ラットに Serotonin myopathy を発症させ，その血中酵素活性，血中アミノ酸量，光顕型ジストロフィー症患者

像及び電頭像における特徴を明確にし，E−64−Cの効果を抗セロトニン剤であるCyprohepta−の血中アミノ酸に変動がある7）とするものとそdineを対照薬として検討したところ，いずれ

うでないとする報告8）がある。そこで，Sero−

も，E−64−Cの有効性は，認められなかった。

（2）Duchenne

toninmyopathyにおける血中アミノ酸濃度

文を測定したところ，側鎖型アミノ酸及びN一メチルアミノ酸の著明な上昇が認められた。3−メチルヒスチジン（㌻Mehis）は，アクチンとミオシンの構成アミノ酸であり9），また，蛋白分解により遊離された㌻Mebisは再利用されず，そのまま尿中に排泄される10）11）ことより，後者に関してはおそらく筋収縮蛋白の分解ある
いは，代謝回転の促進により生じたものと推定される。しかし，前者に関しては，その成因は不明である。
（3）Serotoninmyopathyにおける大腿四頭筋の光顕及び電顕での特徴を観察した。光頗
的には筋肉細胞の大小不同及び壊死，核の中心化及び鎖状配列等，電贋的には筋線経の蛇行及び萎縮，Z帯の消失，ミトコンドリアの増加，
Opaque線経に相当すると思われる過収縮像等が認められたが，これらの変化がセロトニン投
与後，どのような順序で進行するのかは，現在

献1）J．R．Mendell，eL at．：S〇ience，172，1143，
1971．

2）J．M．Parker andJ．R．Mendell；Nature，
247，103，1974．

3）L．M．Silverman and H．D．Gruemer；Clin．
Chem，22，1710，1976．

4）昭和54年度研究研告書p．56．
5）S．B．Rosalki；J．Lab．Clin．Med．，69，696，
1967．
6）P．D．Boyer；

The

Enzymes，2nded．Vol．

6p．95，1962．
7）E．Spargo；Lancetii；1300，1979．

8）W．J・Bank，et al．；Arch．Neuro1．，24，176，
1979．
9）P．Johnson．et al．；Biochem．J．，105，361，
1967．

10）C．L．Long，etal．；Metabolism，24．929，1975．
11）V．R．Young，et al．；J．Biol．Chem．，247，3592，
1972．

12）T．L Munsat，et al．；Neuro1．，27，772，1977．

139

21．E−64−Cの一般薬理作用〜特に呼吸，循環機能及び中枢神経系に及ぼす影響〜

＊

彦

ガ研

一政

野川

＊

高官

＊

利文史

＊

＊

和書直

反

＊

藤丸村

後八木

武

原

＊

福

合

子伸三

官憲淳

口 川井

木酉亀

研究協力者

連続測定を行ないつつ，人工換気を適正レベル
日

的E−64及びその類縁体はヒトの進行性筋ジストロフィー症に対する治療薬の候補の一つと期待され，それらの有効性に関する基礎的ならびに総合的研究が推進されつつある1）。E−64及びその類縁体が治療薬として実用化されるためにはそれらの有効性，安全性及び臨床的副作用検討のための基礎的所見として薬効薬理学的所見とあわせて，それらの一般薬理学的性格が明らかにされていなければならない。E−64及びその類縁体の治療薬としての有効性評価の一環として昨年度はE−64（L体及びDL体）の一般
薬理作用を検討した2）。これにつづいて本年度は，急性実験条件下のウサギにおいて E−64−Cの循環，呼吸揆能及び中枢神経系の活動に及ぼす影響を検討し，さらにE−64（DL体，L体）
及びE−64−Cの動脈血圧に対する作用の機転について薬理学的解析を行なった。
方法

1）実験動物‥ウサギ（雌性，1．9〜2．6kg）
及びネコ（1．8〜2．6kg）を用いた。
2）実験条件：局麻下に非動化，人工呼吸下の急性実験条件において化合体の薬理作用を検討した。呼気ガス02及びCO2濃度ならびに
外腸骨動脈における動脈血酸素分圧（Pao2）のに維持した3）。
3）被教化合体及び適用法，適用量：E−64−Cを飽和重炭酸ナトリウム液に溶解し（濃度296．2
mg／ml），静脈内に適用した。水溶液のpHは
6．5〜7．5の範囲にあった。ウサギにおけるE−
64−Cの一回適用量は5〜226mg／kg，累積適用
総量は145〜869mg／kgの範囲にあり，ネコ
における DL−E−64 の一回適用量は 6．2〜10
mg／kgであった。
4）循環機能q）動脈血圧：圧トランスデューサーを用いて大腿動脈血圧を観血的に測定，直記式記録器を用いて他の諸現象記録と共に記録した。
（2）心電図（ECG）：標準肢第一導出によった。
（3）大腿動脈脈波：コンビ云−クーを用いる平
均加算解析法によって脈波の波型変化を検討した。
5）呼吸機能頸部で横隔神経を分離，切断中枢端から遠心性活動電位を導出した。データ レコーダー（TEAC，R81）を用い導出された電位を磁気テープに収録し，必要に応じて再生して医用電算機（三栄測器，7TO8）を用いて種々のプログラ
ムによるデータ解析を行った。
6）Pao2：ポーラログラフ法により腸骨動脈におけるPa02を連続的に測定，記録した。
7）呼気ガス酸素濃度（FEot）及び炭酸ガス濃＊東京慈恵会医科大学 第二薬理学教室

度（FEcot）：呼気ガス分析装置（三栄測器，lH
141

Ⅳ 全身的影響に関する研究

21）を用いて連続的に測定，記録した。
8）脳波（EEG）：頭皮上脳波を針電極を用いて導出，記銀した。導出された脳波を磁気テープに収録し，医用電算機を用いてパワースペク
トル分析を行なった。
9）諸現象の記録：上述の諸パラメーターを直記式オシログラフを用いポリグラフ的同時記録を行なった。他方，データレコーダを用いてこれらの諸現象を磁気テープに収録し，医用電算枚を用いて詳細なデータ解析を行なった。
10）医用電算機によるデータ解析
上述の諸現象を医用コンピューターの種々のプログラムを用いて解析，評価した。
（1）心拍数：心電図のR波の時間間隔ヒスト
グラムを作り，平均値，標準偏差を得，被験化
合体適用による心拍数変化を分析した。
（2）脈波波形：大腿動脈脈波の平均加算（100回）を行ない波形変化の有無を検討した。
（3）横隔神経活動電位：活動電位放電群を構成するスパイク電位の数と振幅についてのヒス
トグラムを清算し，平均値と標準偏差を得，両平均値の積を算出した。この値は境隔神経の呼吸性発射活動総体の増減の量的指標と考えられる。
（4）EEG：脳波のパワースペクトル分析を
行った。
結

果

1．実験条件ならびに化合体適用畳Etller麻酔下に両側迷走，交感，減圧神経切断，神経筋接合部遮断薬（gallamine triethi−
Odide）を用いて非動化し，人工呼吸下のウサ
ギにE−64−Cの静脈内適用を行ない，その影響を検討した（表1）。
1）一回適用畳及び適用総量
一回適用量は5〜226mg／kgの範囲にあり，
3〜4時間にわたる実験期間における適用総量
は145〜269mg／kgであった。
2）急性毒性：上述の適用総量を3〜4時間にわたる実験期間内に数回にわけて間歓的に静脈内適用した。化合体適用により，前述の実験
条件下のウサギにおいて，循環琉能の変化をは142

じめとして種々の影響が発現した。しかし，総量適用後3〜4時間の観察時間内において致死効果は認められなかった。
2．循環機能に及ほす影響
1）ECGi）波型には著変が認められなかったが，91
例中4例において適用後1〜15分にわたって心室性期外収縮を含め，種々の型の不整脈が発現した（図2）。しかし，これらの異常調律の発現は一過性であり，また，適用量（5−226mg／kg）の
大，小による発現率に差は認められなかった。
ii）電算校によるヒストグラム解析によって心拍数に及ぼす影響を検討した。5〜226mg／kgを適用した59実験例中9例において，適用
後2分間にわたって適用前の値の5〜10％の心拍数減少が認められたが，この変化は一過性であって以後，変化は認められなかった。また適用量（5〜226mg／kg）の大，小による発現率の差も認められなかった。大多数の例では心拍数の変化は発現しなかった。
2）脈波：電算機による100回の平均加算演算の成績を検討した。平均加算により得た化合体
適用前後の波型に差は認められなかった（図1）。
3）動脈血圧に対する作用：（1）変化の方向
本化合体5〜226mg／kgの静脈内適用直後から5〜10分後にわたって血圧上昇（23例）（表2，A，図3，4，5，図7の1），変化が認められない場合（14例）（表2，C，図5の3）および血圧下降（12例）（表2，B，図6，図7の2）の三様の変化が認められた。上昇または下降がおこる場合，収縮期圧，拡張期圧及び
平均血圧はほぼ並行して変化した。
（2）変化の程度と持続上昇例における平均血圧の変化率は適用前のレベルの10〜70％，下降例のそれは5〜30％の範囲にあり，両群における変化のピーク時の平均値と適用前の平均値の差は統計的に有意であった。血圧上昇及び下降は1〜2分間にわたる
一過性の変化であり，以後，血圧レベルの変化は発現しなかった。血圧変化の持続は用量依存的に延長するが，ここで適用した最大量による

21．E−64−Cの一般薬理作用表1E−64−Cの静脈内一回適用量と適用回数（N）
及び適用総量変化の持続は2分以内であった。
（3）適用丘と血圧変化の方向の関係
これら三型血圧反応の，すなわち血圧上昇，㌔・肌、下降，不変例のE−64−C適用量の平均値はそれぞれ136・1土52．4mg／kg（範囲20〜226mg／kg），
75．8土36．5mg／kg（10〜160mg／kg），43．8土
35．4（10〜100mg／kg）であった。また同一個

図1E−64−Cの脈波に及ぼす影響。
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。A：
E−64−C適用前，B：適用後1分，C：5分後，D：
10分後，各脈波波形はいずれも加算平均（100回）による波形。

汗十㌦・一十妄トト」・・十体2例において本化合体適用により用量依存的に三塾の血圧変化が認められたが，2例ともそ
れぞれ小量（10〜40mg／kgまたは40mg／kg）
で不変，中等量（40〜80mg／kg，またはL・

80＋十十トト工・十廿弓￣一
1

二示＋㌫照一
﹇m
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‡紅い．伊町．

＿」1＿＿＿．＿＿∴∴．▼▼■

図2 E−64−Cの心電図に及ぼす影響
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）．1：E−64−C適用前，2：適用後2分。
143

Ⅳ 全身的影響に関する研究

・：●・・一一一・．、．

図3 E−64−Cの動脈血匠に及ぼす影響
非動化ウサギ（迷患交感，減圧神経切断）。小量適用時に血圧上昇を示した例（3例，一一回適用
量20または80mg／kgi．Y．）における血圧変化の時間的経過，S：収縮期圧，D：拡張期圧，M；
平均血圧，縦軸：適用前の血圧値に対する百分率， 横軸：時間。各記号はそれぞれ1実験例を示す0mg／kg）で血圧下降，大量（113〜226mg／kg，または80〜160mg／kg）で血圧上昇を示した（図7の4）。
極）血圧変化の用量依存性
用量範囲20〜226mg／kgの本化合体適用時
144に血圧上昇のみを示した実験例（7例）において適用量と血圧上昇作用の程度及び持続との関係を比較検討した。5例において用量依存的に血圧上昇の程度は増大したが（図8，1；図9，1），2例においてはそれぞれの最大適用量160

21．E−64−Cの一般薬理作用

図4 E−64−Cの動脈血圧に及ぼす影響
非動化ウサギ（迷走，交感・減圧神経切断）0中等量適用により血圧上昇を示した例（9例，一回適用量110または113mg／kg・i・V・）における血圧変化の時間経過o s，D，M，縦軌横臥記号の説明は図3と同様。
145

Ⅳ 全身的影響に関する研究

図5 E−64−Cの動脈血圧に及ぼす影響
非勧化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。大量適用により血圧上昇を示した例における血圧
変化の時間経過（10例，一回適用量160または226mg／kg，i・Ⅴ・）。S，D，M，縦軸，横軸，記号の説明は図3と同様。

146

21．E−64−Cの一般薬理作用

図6 E−64−Cの動脈血圧に及ぼす影響
非動化ウサギ（迷嵐交感，減圧神経切断）。小量ないし中等量適用により血圧下降を示した例における血圧変化の時間経過（12例，一回適用量10〜160mg／kg．i．Y．）。S，D，M，縦軸，横臥記号の説明は図3と同様。

147

Ⅳ 全身的影響に関する研究

l
t
■
■

川 00％

3

沌⁚叩％

図7 E−641：の平均血圧に及ぼす影響
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。平均血圧変化の時間的経過を平均値で示した。縦軸；適用前の平均血圧値に対する百分率，横軸：時間。1：血圧上昇例（23例，一回適用量の平均
値136．1±52．4mg／kg），2：血圧下降例（12例，75．8±36．5mg／kg），3：有意の血圧の変化を示さなかった例（14例，43．8±35．4mg／kg），4：同一個体によって用量依存性に血圧変化方向の変化を示した3例における血圧変化の時間経過，点線，中等量適用時の変化；昇圧を示す実線，大量適用時：降圧を示す実線，中等量適用時。
148

21．E−64−Cの一般薬理作用A
3・げ226MG／XG

160肌G

10−

10●

辟競ii

伽Ⅷ1 0

80HO／KG

10■

三嶋−｛■｛『■−■｝蠣 鴫｝l｝』｛■｛■｛｝｛嶋｝■■『』『■『■■−｝●：∴・l椚間論策1品蒜箭品蒜間蘭4＋り脚酬一冊帆椚瞞瞞瞞脚脚刷棚棚晰晰％5酬酬凧酬Ⅷ酬伽酬酬鮒醐酬酬醐醐図8 E−64−Cの作用比較
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。A‥E−64−C80mg／kg適用，B：160mg／kg適用，C：226mg／kg適用。1，動脈血圧；2，EEG；3，横隔神経発射；4，FEO2；5，FECO2；
6，Pao2，（記録1上部の短かい横線は静脈内適用持続を示す）。

0
2

∴・．．

→

P
B

0
1

1

2040100

100

Vl2040100

図9 E−64−Cの用量一反応曲線
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。縦軸，変化分の適用前の値に対する百分率；横軸，用量mg／kg（対数目盛）。1，血圧上昇を示した7例における変化と用量との関係；2，大量（160または226mg／kgi・Ⅴ・）適用による反応強度低下例；3，血圧下降例；4，横隔神経活動電位放電
群のスパイク数（N）と電位振幅（M）の賃（NXM）の変化と用量との閑鼠 n，実験例数，各適用量における変化の平均値と標準誤差（短い縦線）を示してある。
149

Ⅳ 全身的影響に関する研究

D一卵価ydramm●52日芦㌻ 3

C一拍11竺2Ai蒜岩岩＿′′一・｝㌢二二二二二二二二二二二−￣▲￣・．二C

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A二一山．．．＿．

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5

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二二二二二二二二l
5㌔V

C柵岬聞州佃州冊珊佃野V朝潮腑刷拙㈱鵬鱒一
因10 E−64−Cによる血圧上昇に及ぼす諸種遮断薬の影響
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。A，動脈血圧；B，EEG；C，横隔神経活動；C，
E−64−C．1，E−64−｛226mg／kgi・V・；2，adrenaline2FEg／kgi・V・；3，Hyderginelmg／kgi・
V．後におけるE−64−C226mg／kgの作用；4，diptlenhydramine5mg／kg前処置後におけるE−64−C226mg／kgの作用；5，atrOPinelmg／kg前処直後におけるE−64−C226mg／kgの作用；6，prOpranOlollmg／kg前処置後におけるE−64−C226mg／kgの作用01〜6は同一実験
例で順次，記録された。（記録A上部の横線は適用持続を示す）0A

B

nfNI0LC

D L．10HαKG．t．V．

．−叩坤ほ．1

5

叫

ー mr

3
図11E−64（L体）の影響
非勧化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。1，動脈血圧；2，心電図；2′，EEG；3，杭隔
神経発射。記録1上部の横線はL体10mg／kg適用持続，矢印はそれぞれphentolamine2mg／kg（BとCの問），atrOPinelmg／kg前処置（CとDの問）を示す0
紺1︒︒︒椚
﹁．．．■L．■■LT2芸掌握轟董串蚕蒜‡．

畳昔

図12 Dihydroergocornine（DHC）（0．28mg／kg）前処置後におけるE−64（DL体）の影響
非勧化ネコ（迷走交感神経幹切断）1，動脈血圧；2，心電図；3，横隔神経発射。記録1上
部の横線はDL体10mg／kg適用持続を示す。
150

21．E−64−Cの一般薬理作用
表2 E−64−Cの平均血圧に及ぼす影響

非動化ウサギにおける平均血圧変化の時間経過を示した。適用前の平均血圧を100％とする。支±SD：適用前の平均血圧に対する百分率の平均値と標準偏差。：N：実験例数，A：血圧上昇例，100％＝85．9土22．5mmHg（平均適用量＝136．1土52．4mg／kg），B：血圧下降例，100％＝68．1士24．3mmHg（75．8土36．5mg／kg），C：
血圧不変例，95．2土19．9mmHg（43．8土35．4mg／kg）

mg／kg，226mg／kg適用によりかえって上昇の程度は軽度となった（図9，2）。
4）E−64 及び E−64−C 適用による血圧上昇に及ぼす諸種遮断薬の影響（1）E−64−C
E−64−C適用により血圧上昇が認められたウ
サギ（両側迷走，減圧，交感神経切断）の実験
例においてα型アドレナリン作動性効果遮断薬（phentolaminel〜4mg／kgあるいはHyder−ginelmg／kg）を前処置した14例の全実験例において，同量の化合体の適用により血圧降下がおこり，血圧反応の反転が認められた（図10，3のA）。この降圧はコリン作動性効果遮断薬（atropine，1mg／kg），β型アドレナリン作動性
効果遮断薬（proprano101，1mg／kg）前処置
によっても消失しなかった（図10，5および6のA）。さらに抗ヒスタミン薬（diphenhydra−mine，5mg／kg）前処置によっても，4例中3例においてE−64−Cによる降圧は消失しなかったが（図10，4のA），1例においては，抗ヒスタミン薬前処置による降圧の程度の減弱が認められた。
（2）E−64，L体及びDI，体i）ウサギにおけるL体の作用
E−64，L体適用により持続1〜2分間にわたる血圧上昇が認められたウサギ（非動化，迷走，減圧，交感神経切断）において，pbent0−
1aminel〜2mg／kg前処置後，同量のL体（10mg／kg）及びDL体（100mg／kg）の適用により1〜2分間持続する血圧降下が発現し，血圧反応の反転が認められた（図11，C，1）この時，心拍数およびECG波形ならびにFE。2，
FE002，Pa。2には著しい変化がなかった。この降圧は，E−64−Cの場合と同様，atrOPine（1mg／kg）適用後にも認められた（図11，D，
1）。

ii）ネコにおけるDL体の作用
非動化し両側の迷走交感，頸動脈洞神経を切断したネコにおいて，E−64，DL体（6．2〜10
mg／kgi．Y．）により軽度の血圧上昇が認められたが，dihydroergocornine（DHC）（0．28
mg／kgあるいは1．28mg／kgi．V．）前処置後，同量のDL体適用により血圧は下降し，血圧反応の反転が認められた（図12，1；図14，1；
図15，1）。DHC前処置により DL体による血圧下降が認められた時期に adrenaline（5〝g／kgi．Ⅴ．）適用によっても明瞭な血圧下降がおこり血圧反応の反転が認められた（図13，1）。このとき心拍数，ECG波形，FE。2，
FEc。2，Pa。2に著明な変化は発現しなかった。
3．呼吸機能に及ほす影響
横隔神経遠心性発射活動電位に現われる呼吸性放電群の周期及び放電群に含まれるスパイクの数及びその振幅の積に及ぼす影響を検討した。後者は横隔神経活動に現われる呼吸性成分の総体としての計量的指標と考えられ，電算機演算により得られるスパイク数及びスパイク電
位振幅の両平均値の積として表わされる。
151

Ⅳ 全身的影響に関する研究

図13 DHC（0．28mg／kgi．V．）前処置後におけるadrenalineの作用
非動化ネコ（図12における同一個体）。1，2，3は図12と同様。矢印はadrenaline5pg／kg
適用時点を示す。

lM仙伽肘神仙刷

DL．10MG／KGi．Y．
tFr．DHCl．21Mq／

了∴V二∴二二丁二二、二二5￣∴二㌦∴∵二二一二二∴■∴二二■∴二∴二■∴−∴■、
C．mRAL．予言
6ごi→㌻二二⊥1エーニ＝薔弓子宗古宇≠手品岬｝−■一一二言妄言岬l■■−●【｛岬『図14 DHC（1・28mg／kgi・V・）前処匠後におけるE−64（DL体）の作用。
非勧化ネコ（迷走交感，頸動脈洞神経切断）1，動脈血圧；2，EEG；3，杭隔神経発射；4，
FEO2；5，FECOZ；6，大内臓神経活動。記録1の上部の杭線はDL体10mg／kg適用期間を
示す。

152

21．E−64−Cの一般薬理作用
表3 E−64−Cの横隔神経活動電位に及ぼす影響

電算機演算によって得られた振幅ヒストグラムにおける電位振幅の平均値（M）及びスパイク電位の総数（N）を計測し，適用前の両者の環（NxM）を100％として変化を検討した。豆±SD：適用前の（NxMに対する百分率の平均値と標準偏差，n：実験例数，＊p＜0．05，＊＊p＜0．01
表4 E−64−Cの構隔神経活動電位の呼吸性放電群の周期に及ぼす影響

R，CX，PH−P

N：実験例数，Before：適用前の周期の平均値と標準偏差，After：適用後10分後における周期，NS：nOt
S王gni丘cant．

表5 E−64−Cの呼気ガス0，濃度（FEO2），COZ濃度（FECO2）及び動脈血02分圧（Pao2）に及ぼす影響

N：実験例数，Before：適用前の平均値と標準偏差，After：適用後10分，NS：nOt Signi丘cant．

E−64−Cの5〜50mg／kg適用により総活動量に変化は認められないが（図16，A），80mg／
kg以上の適用量では，ほとんどの例で静江直後から1〜2分間にわたって一過性の神経発射活動の増加が起った（図8，3，図16，2）。
この時，総活動量の増加率は用量依存的に増大した（図17B−E，図9，C）。表3にそれぞれ180mg／kg（N＝9），．100〜113mg／kg（N＝13），
160mg／kg（N＝7），200〜226mg／kg（N＝4）

適用による総活動量の増加率の平均値を示した。
E−64−C，5〜226mg／kg適用により横隔神経
遠心性発射活動放電群の周期に有意な変化は認められなかった（蓑4）。
4．呼吸，循環機能の化学的調節因子に及揺す影響
頸部で両側の迷走，交感及び減圧神経を切断
した非動化ウサギにおけるFE。2及びFEc。2はE−64−C適用後血圧の変化に伴い，1〜2分間にわたって一過性に軽度に変化し，FE。2 は上昇，FEc。2は下降したが，その後，有意の変化は認められなかった（表5）。また，Pa。2には適用前後をつうじて変化が認められなかった。
5．脳波（EEG）に及ほす影響
電算機によるパワースペクトル分析によって頭皮上EEGに及ぼすE−64−Cの影響を検討した（図18）。本化合物5〜226mg／kg適用によ153

Ⅳ 全身的影響に関する研究

l刷刷肘冊NA

三二二二二「二二二二二【
旧

l■●

3…
DL．6．2MG／KGh
t円：ひ1C128MWKGI

弓几〔州榔

二十∴
C．瑚亘

5∴二 二∴二二6＝轟
図15 DHC（1．28mg／kgi．Y．）前処置後におけるE−64（DL体）の作用
非動化ネコ（図14における同一個体）。1〜6は図14と同様。記紀1上部の短い横線はDL体
6．2mg／kg適用持続を示す。

り動脈血圧の上昇が認められる例では，昇圧期

ギ及びネコにおけるE−64L体及びDL体にに一致して一過性に脳波覚醒パターンが発現しよる動脈血圧上昇の機転の薬理学的性格について検討した。
急性毒性：マウス，ラットにおける皮下，腹たが，49例の中2例（10mg／kg，113mg／kg）
においては適用後5分における総パワー値の著減（対照値の30％減少）が認められたが，一過性であって，その後，有意の変化は認められな
かった。
考

察

昨年度はE−64のDL体及びL体の一般薬
理作用に関する研究を行なった。これに引続き
今年度はE−64の類縁体の一つであるE一朗−Cのウサギにおける急性毒性，ウサギの呼吸，循
環機能及び中枢神経系の電気的活動に及ぼす影響ならびに種々の自律神経遮断薬を用いてウサ
ギにおけるE−64−Cによる動脈血圧上昇，ウサ
154

腔内適用によるLD50は1000mg／kg以上と推定されている4）。今回の研究において3〜4時
間内におけるE−64−Cの累積適用総量の最大値は869mg／kgi．Ⅴ．であったが，全例において致死効果は発現しなかった。
呼吸，循環機能の化学的調節因子：E−64−C（一回適用量5〜226mg／kgi．Y．，総量145〜869mg／kgi．V．）適用後，呼気ガス02濃度，
CO2濃度及び動脈血02分圧の3化学的調節
因子には一過性の軽度の変化が現われるが，いずれも数分以内に適用前の状態に回復し，その後，有意の変化は認められなかった。この所見

21．E−64−Cの一般薬理作用

N1740
M
44
V
91

0

1．25V

5V

8V

C．100MG／KGIVI HIN．

図16 E−64−Cの横隔神経活動電位に及ぼす影響
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。1，2，
3は電算機演算によって得られた振幅ヒストグラム。
縦軸：活動電位に含まれるスパイク数，横軸：スパ
イク振幅（電圧で表示）。1：E−64−ClOOmg／kg適用前（スパイク数 N＝1740，スパイク振幅の平均
値M＝44，分散Ⅴ＝91）。2：適用後1分（N＝2245，M＝48，Ⅴ＝167）。3：適用後15分（N＝1610，M＝43，Ⅴ＝81）。1分後のNxMの値は有意に増加している。
はE−64の影響2）と共通している。
EEG：適用直後，軽度，一過性の覚醒パターンの発現及びパワー値の減少がおこる以外には変化が認められなかった。
呼吸の中枢性調節神経機構に及ぼす影響：血圧調節神経切断による反射求心路が遮断され，化学的調節因子に変化のない状態で呼吸中枢及び横隔膜支配脊髄運動ニューロン群複合系の活動状態の直接的指標と考えられる坊隔神経活動
電位5）は80mg／kg以上の用量の適用後，一過性の増加を示し，その強度は用量依存的であったことはE−64−Cが軽度ながら中枢直接作用を有することを示唆する。
循環機能に及ぼす影響：両側迷走，交感，滅圧神経を切断したウサギにおいてE−64−C適用
により，中等量で血圧下降，大量で血圧上昇が3〜5分間にわたって発現した。この時期に脈波には変化がなく，ごく少数例で不整脈，ECG
波形変化，徐脈が一過性に発現したが，大多数の例では著明な変化が認められなかった。E−
64のL体，DL体に関する昨年度の研究2）結果と比較するとE−64−C，E−64のL体及びDL体の動脈血圧に対する作用はいずれも適用後，
3〜5分以内の一過性変化に止まる点は共通している。しかし，E−64−Cの作用における用量と血圧変化の方向との関係は，血圧の変化方向
が用量よりも適用前の血圧レベルに依存する
E−64のL体，DL体のそれ2）とは異なり，同一個体においても中等量で血圧下降，大量で血圧上昇が発現し，用量依存性を示した。このよ
うな差異の原田を明らかにするには今後さらに両化合体の作用点，作用様式とともに体内における薬力学的動態との関連をも考慮しつつ検討を行なう必要がある。しかし， E−64−C と両E−64の血圧反応にこのような差異が認められる事実は両者の循環系への作用の機転，さらにその作用機序の追究をすすめる場合の重要な基
礎所見となる。
ウサギにおいて心拍数，ECG波形に及ぼす影響は一過性で，しかも軽度であった。しかしこの所見はE−64−Cの治療薬としての実用化をすすめていくための臨床的研究をすすめて行く
場合にヒトの心槙能に及ぼすE−64−Cの影響を十分に検討しておく必要があることを示唆するものと考えられる。
E−64−C，E−64のL体及びDL体の動脈血圧に対する作用の機転の薬理学的性格：両側の迷走，減圧，交感神経を切断したウサギにおいてE−64−C，E−64のL体及びDL体による昇圧はα型アドレナリン作動性効果遮断薬適用によって反転し，血圧下降に転じた。そしてこの降圧はムスカリン様コリン作動性効果遮断薬，β型アドレナリン作動性効果遮断薬およびHl
塑抗ヒスタミン薬適用後にも発現した。両側の迷走交感，頸動脈洞神経を切断したネコにおいてもE一一64のDL体による昇圧はα型遮断薬
155

Ⅳ 全身的影響に関する研究

図17 E−64−Cの横隔神経活動電位に及ぼす影響
非勧化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。縦軸：適用前のスパイク数とスパイク振幅の平均値の窮の値を100％とした時の百分率。横軸：時間，A，E−64−C5〜50mg／kg適用例における平均値と標準偏差（実験例数N＝21）；B，80mg／kg（N＝9）；C．100〜113mg／kg（N＝13）；D，160mg／kg（N＝7）；E．220〜226mg／kg（N＝4），156

21．E−64−Cの一般薬理作用

Hl型ヒスタミン受容体が関与する機序以外の
横転の血圧下降への関与の可能性についてさらに検討を行なう必要がある。これらの事実は今後さらにE−64及びE−64−Cによる動脈血圧変化の槙序の解析をすすめていくための足場となる基礎的所見と考えられる。
要

図18 E−64−CのEEGに及ぼす影響
非動化ウサギ（迷走，交感，減圧神経切断）。1，2
はEEGのパワースペクトル。縦軸：パワー値，横軸：周波数（Hz）。1，E−64−C，適用前；2，E−64−
ClOOmg／kg適用後5分。適用前後の給パワー値（1535，1514）には有意の差がない。
によって降圧に転じた。この康な血圧反応が起こっている時期に化学的調節田子（FEo2，

約

ウサギを用い，非動化の急性実験条件下に
E−64−Cの呼吸，循環機能及び中枢神経系に及はす影響を検討した。さらにウサギ及びネコにおいてE−64（L体，DL体），E−64−Cの血圧作用の横転について薬理学的解析を行なった。
1）両側の迷走，減圧，交感神経を切断した
ウサギにおいてE−64−C145〜869mg／kgの数
時間にわたる静脈内適用による致死効果の発現は認められなかった。
2）呼気ガス02濃度，CO2濃度及び動脈血
酸素分圧は E−64−C（一回適用量 5〜226mg／
kgi．Y．）適用により著明な変化を示さなかった。
3）横隔神経活動電位はE−64−C適用後，一過性の増加を示したが，以後，有意の変化を示さなかった。
4）中等量のE−64−C適用により動脈血圧は
軽度，かつ一過性の下降，大量により上昇し，

FEco2，Pao2）の変化はいずれも軽度であった

用量依存的に上昇度が増大した。
5）E−64−C適用により全例の4．4％の実験

ことから考えて血圧反応へのこれらの諸因子の例で1〜15分にわたり不整脈が，15％の例にお関与は除外されよう。また，昇圧及びその反転は血圧調節神経の切断後にも認められているか

いて1〜2分間にわたって軽度の徐脈が認めら

ら反射性効果の関与の可能性は考え難い。昇圧

6）両側の血圧調節神経を切断したネコ及びと同時に横隔神経活動の増加及びEEGに覚醒

両側の迷走，減圧，交感神経を切断したウサギ

パターンの発現が認められている事実は昇圧ににおいてE−64，L体，DL体及びE−64−Cに関与する機転の一様式として中枢神経系の関与6）を示唆する。また，昇圧にはアドレナリン

断薬適用により血圧下降に反転し，ウサギにお作動性機序が関与していることが示されたが，れたが，脈波には変化がなかった。

よる血圧上昇はα型アドレナリン作動性効果遮中等量のE−64−C及びα型遮断薬前処置後のける反転後の血圧下降はpropranolol，atrO・
pine，diphenhydramine適用後にも発現しE−64及び大量のE−64−Cによる血圧下降の機転については今後さらに心機能変化が関与する

た。

可能性の有無，また，β型アドレナリン作動性及びムスカリン様コリン作動性機序，ならびに文

献1）今堀和友（班長）‥厚生省新薬開発研究事業 徴
157

Ⅳ 全身的影響に関する研究

生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究 昭和54年度研究報告書 昭和55年3月．
2）福原武彦ら：緻生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の呼吸・循環絞能及び脳波に及ぼす影響，慈医誌，96，701−711，1981．
3）福原武彦：Fominobenの脳幹部呼吸中枢神経概括の活動に及ぼす影響，慈医誌，91，236−251，

158

1976．

4）大関正弘ら：上記1），pp．25−36．
5）Wyss，0．A．M．：Die nerv6se Steuerung derAtmung，Ergebn．Physio1．，54，7−179．1964．
6）Koepchen，H．P．，Hilton，S．M．and Trzebski，
A．：Centralinteraction between respiratory
and cardiovascular controI systems，Berlin，
Springer・Verlag，1980．

22．取り込まれたE−64の細胞内分布と運命について

研究協力者

勝

沼

信

南

英

紀＊

木

研究日的

彦＊
橋

田

誠

一＊

ールで洗僕後，NCS（Amersham）1．Omlを加え，一晩放置後ACSI

E−64を動物に投与すると，肝リソゾーム中のチオール性プロテアーゼであるカテプシソB
及びLが阻害される1）〜3）。大関ら4）は〔3H〕−E−64

シソチレークー10mlを添加し，液体シンチレーションカウンタ
ーで放射能を測定した。メタノール上清の放射を動物に投与して組織内分布を調べたところ，活性を遊離のE−64とし，メタノール沈澱画分
をタンパク結合性のE−64とした。カテプシソ

肝に最も高濃度集まると報告している。しかし，実際に肝細胞内のリソゾームにとりこまれる

B活性はペソゾイルーDL一アルギニン・バラニ

か，取り込まれたものが阻害活性を持つ型のま測定した。

トロアニリドを基質としてOtto ら6）の方法でま入っているのか，又，どのような機構で取り込まれるのか明らかでない。本研究は，E−64
がリソゾームに選択的に集中するか否か，その結果撥横はピノサイトージスによるのか，細胞質を肝臓を細胞下分画を行ない，顆粒画分は凍結
融解後，0．38FLCi／g肝の〔3H〕一E−64をinvitro

透過してリソゾームに入るのか，カテプシソBで各分画に添加して，10分間インキュべ−ト

やLの活性の阻害との関連はどうかを明らかに後，遊離，結合及び全放射活性を測定した結果することを目的としている。

が表1に示されている。細胞質やミクロゾーム

材料及び方法分画にはタンパク結合性放射活性は極めて低く，主として軽ミトコンドリア以下（リソゾー

ウィスク一系雄ラット100〜120gを使用し，ムを主体とする）の顆粒分断こある。同時に測実験中は固形飼料により飼育した。〔3H〕−DL−

定したリソゾームの標識酵素カテプシソB活性E−64は大正製薬より提供して頂いた。

は放射活性の分布とよく一致しており，添加し標識検体は担体を加えて生理食塩水溶液とた〔3H〕−E−64は主としてリソゾーム分画のし，1mg／匹（41／疋i／匹）を腹腔内に投与した。

蛋白に結合することがわかる。なお2倍量の血清と肝臓を分離し，肝臓は生食で十分かん流した後肝臓はDe duve5）らの方法によって細〔3H〕−E−64を加えても，それ以上タンパク結合
E−64の増加はみられない。

胞下分画を行った。血清及び各分画は凍結融解

次にラットに〔3H〕−E−64を1回腹腔内投与

後3倍量のメタノールで沈澱させ，上清はそのして，経時的にラットを殺し，血清及び肝を分まま，沈澱は無標識のE−64を含む75％メタノ

離した。E−64投与後24時間の細胞下分画におけるE−64の放射活性の分布を示したのが図1＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門である。リソゾームの標識酵素としてのカテプ
159

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表1〔3H〕−（DL）−E−64のラット肝各細胞画分への結合
fractions

total

free

bound

bound／total％．9．7．
2．7．7．0
31
32
8．412
2

DPM／gliver
Homogenate

258，300

l69，000

61，800Cell debris

258，200

207，200

35，500

Heavy Mit．

257，900

217，000

21，200

LigIlt Mit．
Microsome

255，000

177，400

62，900244，500

234，200

4，100

Cytosol

196，500

173，800

3，900

各細胞画分に0．38FLCi／g肝の〔3H〕一（DL）−E−64を添加し10分，370Cでインキュべ−ト後，75％（Ⅴ／v）のメタノール沈澱を行ない，遊離E−64とタンパク結合E−64とに分離し，放射活性を測定した。

血清及び細胞質では大部分が遊離のE−64とし
1＝

20．4
n
bn
∈

う0．3
∈

2

日亡川SdむC≡︵出塁再−衷讃㌘︵110．5て存在している。この結果は，血中のE−64は一旦細胞質を経由して，リソゾームの中へ取り込まれることを示唆している。沈澱画分のタン
パク結合性放射活性の推移とリソゾームのカテ
プシソB活性との逆相関を示したのが図3である。E−64の投与によりカテプシソB活性が阻害されているが，その時問的経過はリソゾーム

1

一dUT⊥

中のタンパク結合放射活性と鏡像関係にありリソゾームに取り込まれたE−64はチオール性プ
ロテアーゼと結合して存在すると推定される。
50

10％of total amount of protein

考

図1放射活性の分布パターソ
N；核及び細胞破壊物，●

察

ラット肝ではカテプシソB及びLを合わせてM；重ミトコソドリア，

約L；軽ミトコンドリア，ている7）。リソゾームのタンパク結合部分に取P；ミクロゾーム

り込まれたE−64は放射活性より計算するとS；斉田胞

1．5〜2n mole／gliverであった。カテプシソ

シソB活性が同時に示されている。E−64の分
布はカテプシソB活性の分布とよく一致してお2〜3n mole／gliver

存在すると推定されBlモルは1モルのE−64の結合によって完全に阻害されるので，E−64投与後実際に測定しり，肝内に入ったE−64はリソゾームに集中すると考えられる。E−64投与後1時間日では遊離のE−64の放射活性が24時間目に比し高いが，タンパク結合性の放射活性の分布は24時間目の結合とほぼ一致していた。
血清，肝糸田胞質及び全沈澱画分（図1の結果たリソゾーム中の低いカテプシソB活性は，リから沈澱分画への取り込みは大部分リソゾーム
への取込みとみなし得る）への取り込み時間経

しかし，リソゾームへ取り込まれる全てのプロ

過をみると（図2），血清，細胞質，沈澱画分
への順に取り込みの増大がみられる。この時，ロイペプチソはE−64とは異なる可能性が考え

160

ソブームに取り込まれた放射活性から説明されるであろう。
今回我々の結果ではE−64は細胞質を経由してリソゾームに選択的に取り込まれる可能を示
し，ピノサイトージスによるとは考えにくい。
テアーゼ阻害剤は同じ機構ばかりでなく，特にられる。

22，取り込まれたE−64の細胞内分布と運命についてTime（h）
図2〔3H〕−（DL）−E−64の血清及び肝への分布の時間経過

013

6

12

24

48

72

Time（h）
図3〔3H〕−（DL）−E−64投与後の肝リソゾーム分画におけるタンパク結合性
放射活性とカテプシソB活性の時間経過

161

Ⅳ 全身的影響に関する研究

文献1）Kominami．E．，Hashida，S・and Katunma，N．：Inhibiting of degradation of ratliver
aldolase andlactic dehydrogenase by E−640r
leupeptinin vivoI Biochem・Biocphys・Res・
Communり93，713−719，1980．

2）勝沼信彦，橋田誠一，唐渡孝枝，木南英紀：E−
64及びE−64誘導体によるラット肝カテプシソB
及びLの阻害について（in vivo andin vitro）
昭和54年度厚生省新薬開発研究報告書，109−115，
1979．

4）大関正弘，野津隆司，諏訪俊男，河野喜郎：E−64及び類縁体の生体内動態に関する研究，昭和54
年度厚生省新薬開発研究報告書，145−154，1979．
5）I）eDuve，C．，Pressman，B・C・，Gianetto，R・，
Wattiaux，R．andAppelmans，F・：Intracellular
distribution patterns of enzymesinratlivertissue，Biochem．J．，60，604−617，1955．
6）Otto，K．and

Bhakdi，S・‥ZurkenntnisdeskathepSins BI SpZititatllnd eigenschaften，
Hoppe−Seyler，s Z・PhysioL Chem・，350・1577−
1588，1969．

7）Kirschke，H．，Langner，J・，Riemann，S・，

3）Hashida，S．，Towatari，T・，Kominami，E・and
Xatunma，N，：Inhibitions by E−64derivesof

Wiederanders，B．，Ansorge，S．and Bohley，P・：

ratlivercathepsinBandcathepsinLin vitro

adationin Health andDisease（CibaFounda・

andin vivo，J．Biochem．．88．1805−1811，1980・

tion Symposium75），P．15−25，1980．

162

Lysosomlcyseine−PrOteinases，inProteinDegr−

23．E−64−Cの生体内動態に関する研究

大
研究協力者

野
浦

日

津
野

隆
英

関

司＊
俊＊

正

弘＊

福

島

清

実＊

吉

田

英

生＊

的

E−64−CはE−64の類縁化合物のスクリーニ
ングにより選出されたもので，筋ジストロフィーに対する治療効果が期待されている。先に著者1）はE−64−Cの生体内動態について，3H標
識体を用いて予備的検討を行ったが，今回前臨
床試験の一環として新たに14C標識体を合成

河

野

喜

郎＊

供した。
標識検体は予め少量の1／10N重曹水に溶解
後，生理食塩水で一定量とし，特記する場合を除いて5mg／kgを単回文は10日間連続して動物背部へ皮下投与又は経口ゾンデを用いて胃内へ直接投与した。別にラットは大腿静脈，ウサギは耳介静脈から静脈内投与も行った。なお定量実験では概ね1群4匹を使用し，単回経口投来白色種雄ウサギを使用した。別にラットにつ与時は投与前16hr及び投与後6Ilr絶食した。
3．血中濃度の測定〔14C〕E−64−Cをラット及びウサギに静脈内及び皮下投与，並びに5，20，100mg／kgをラットに経口投与した後，ラットは尾静脈より，ウ
サギは耳介静脈より経時的に20J 1ずつ採血し，その放射能を測定した。
4．尿，糞及び胆汁中排泄率の測定
ラット及びウサギに〔HC〕E−64−Cを経口又は皮下投与し，代謝ケージに収めて24Ilrごとに5日後までの尿と糞を分別採取し，放射能を測定した。一方，胆汁中への排泄はエーテル麻酔下に開腹し，胆管cannulaを施した後薬物投
与し，ラットはポールマンケージに収め，ウサ

いて性差検討のため同週令の雌ラット，胎仔移

ギは固定台に保足してlhrごとに6br・まで，

行及び乳汁中移行検討のため妊娠18日日及び分
娩後15日目の雌ラットを使用した。ラットは日及び別，30hr後までの胆汁を採集し，放射能を測定した。更に採取したラットの胆汁の一本チャールス・リバー（株），ウサギは金丸動

部を別のラットの十二指腸内へ投与し，同様に物（株）から購入し，1週間予備飼育後実験に

胆汁中放射能を測定することにより腸肝循環の有無を調べた。

し，これを用いてラット及びウサギにおける吸収，分布，代謝及び排泄について検討した。
実験材料及び実験方法
1．標識化合物実験に使用した〔lJC〕E−64，CはL−〔U−ldC〕
1eucine（The RadiochemicalCentre）から
沢田2）により当社総合研究所で合成された。
〔14C〕E−64−Cの比放射能は9．13pCi／mgであり，薄層クロマトグラフィーによる放射化学的
純度はほぼ100％であった。
2．実験動物及び検体投与法
動物は体重180〜200g の Sprague−Daw−ley系雄ラット及び体重2．5−3．0kgの日本在＊大正製薬株式会社総合研究所
163

Ⅳ 全身的影響に関する研究

5．組織内濃度の測定
ラットに〔HC〕E一朗−Cを経口及び皮下投与後の各所定時間に放血死させた後，各種組織を摘出して放射能を測定した。血液は一部を採取
後，残部を遠心分配して血涙を得た。なお妊娠
ラットについても経口及び皮下投与後の所定時間に同様に処理した。
6．乳汁中濃度の測定

中濃度，並びに最終投与後120brまでの血中濃度推移を3，と同様にして測定した。また最終投与後経口投与では6，別，120hr皮下投与
では1／6，24，120hrの組織内濃度，更に投与
期間中2411rごとに10日間及びその後5日間の尿糞中への排泄についても単回投与時と同様に測定した。

分娩後15日目のラットに〔HC〕E−64−Cを投与し，所定の採乳時間の1hr前に予め0ⅩytOCin

8．代謝物の検索〔HC〕E−64−Cをラット及びウサギに皮下又は経口投与し，24brまでの尿及び胆汁中代謝物（ノミルトミン注射液，持田製薬）0．5U／匹を腹腔内投与して20Jjlずつ採乳し，同時に尾静脈から採血して放射能を測定した。

をチャート1に示す操作に従い，またラットに20mg／kgを単回又は5mg／kgを10日間連続
皮下及び経口投与したときの血渠及び筋肉中代

7．連続投与実験
ラットに〔14C〕E−64−Cを1日1回10日間連続
経口及び皮下授与し，投与期間中各日の経口投
与後6，別hr及び皮下投与後1／6，別hrの血謝物をチャート2に示す操作に従って抽出精製
後，シリカゲルプレート（Merk，Silicage160
precorted）上で展開した後，蒋層クロマトス
キャンナー（Aloka，JTC−202B型）で走査す

Bile，Urine

I adjustedtopH3withlO％

H2SO一Amberlite XAD−2column
WaShed with H20

eluted with MeOIl

evaporated to dryness

dissoIvedin H20and adjusted to pH3withlO％H2SO。
extracted with AcOEt
Extractl

TLC SoIvent system：（a）CHC13−MeOH−AcOH（9：1：2）（b）AcOEt−EtOH−AcOH（4：3：1）

チャート1尿及び胆汁中の〔HC〕E−64−C代謝物の分離方法
MusclePlasmaadded4volumes of EtOH

homogenizedin EtOH

Centrifugedevaporated to dryness
added H20

adjusted to pH3withlO％H2SO−
extracted with AcOEtl

Aq

Extractr

TLC

チャート2 血祭及び筋肉中の〔HC〕E−64−C代謝物の分離方法
16423．E−64−Cの生体内動態に関する研究

るとともに，各西分の放射能を測定した。
9．放射能の測定
血液はSoluene−350（Packard）−イソプロ′リール（1：1）0．5mlで可溶化後，30％
過酸化水素水0．4mlを添加して脱色し，0．5
N塩酸−Insta−Gel（Packard）（1：9）10mlを加えて液体シンチレーションカウン∵クー（Packard，3255塑）で放射能を測定した。また血策は100／Jlに，尿は50ml，胆汁は10ml

Carb−0−Sil（Packard）400mg添加後，いずれもInsta−Fluor（Packard）10mlを加えて液体シンチレーションカウンターで測定した。
10．オートラジオグラフィー
ラットに〔14C〕E−64−C20mg／kgを経口及び皮下投与後，各所定時問に動物をェーテル麻酔
死させ，直ちにドライアイス一m−ヘキサン中で凍結した。凍結動物は−180のPMVクライ
オミクロトーム（LKB，2250塑）で40〝厚のにメスアップしてその200JJlに，乳汁はSol−

全身切片を作成した。切片は凍結乾燥後マクロ

uene−3500．5mlを添加して可溶化後，またオートラジオグラフィー用フィルム（サクラ，

代謝物の水溶性西分及び酢酸エチル画分200／Jlに，いずれもInsta−Ge17mlを加え，はかに
糞は乾燥後2倍量の蒸留水を加えて乳鉢で均質

MARGフィルム3Hタイプ）と1週間露出し，全身オートラジオグラムを得た。
また皮下投与後30minの大腿四頭筋につい化し，50−100mgの一定量を採取してSoluene
一誌01mlで溶解後，30％過酸化水素水0．4ml

所，NA−300型）内でミクロトーム（Leiz，

で脱色してからInsta−GellOmlを加えて液体1300型）にて5／上厚の凍結切片を作成し，−200

シンチレーションカウンターで測定した。一方，組織は蒸留水を添加して20％ホモジネート

下で原子核乾板（フジ）に20日間露出し，現像，液を調製し，その0．5mlを分取して減圧乾国
後蒸留水0．1mlを加え，あるいは湿重量100mg又は小臓器はそのままを用い，Soluene−
3501mlで可溶化後，蛋白沈澱画分も Solu−ene−3501mlで可溶化後，また薄層クロマト
坂上の代謝物存在部位かきとりシリカゲルはて，凍結後−150のクリオスタット（中川製作

定着後Hematoxylin−Eosin染色を施して光学顕徴鏡で500倍のミクロオートラジオグラムを得た。
結1．血中濃度ラット及びウサギに〔14C〕E−64−C5mg／kg
Rabbit

4

4

Rat
1．V．

C

〇

S．C．

ロ−一・一口

p・0・●一一一t−●

2

3

6

9

−E＼b︒晋1

1．V．

〇・・・・．・一・・・・．・．一O S．C．

3

●一一一一・一

果

1

2

3

6

hr

9

hr

図1ラット及びウサギに〔HC〕E−64−C5mg／kgを投与後の血中放射能濃度
各点は4匹の平均値を示す。
165

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表1 ラット及びウサギに〔1−C〕E−64−C投与時の薬動力学的パラメーター
Rat5mg／kgi．V．Rat5mg／kgs．C．

Rat p．0．

Male

Rabbit5mg／kg

FemaleMale Female Male Female

L Y．

5

0
7

5
2

6．74

9
8

5．25

0

38．87

0
5

13．49

9
7

5．75

1

43．6

＊

23．2

0

6

24．5

0
3

0．28

9

0

2．53

9

7
1

0．88

S．C．

8
1

5mg／kg
4

1

＊

5．74

100

3
3

6．68

（〃gbr／ml）

0．9公

0．㌘＊

AUCo→24hr

293358590t扱（br）

19173033
20〇一4

0．17

0

3．77

tmは（hr）

19 1735

2

C皿は（〝g／ml）

20

tl色α

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5
days

days

図2 ラット及びウサギに〔HC〕E−64−C5mg／kgを経口又は皮下投与後の放射能の尿糞中排泄 各点は4匹の平均値を示すを投与したときの血中濃度推移を図1に，また血中放射能濃度の薬動力学パラメーターを表1認めた。別に雌ラットでは雄に比べて最高血中に示す。静脈内投与時のlhr後までの半減期（t抜α）はラット，ウサギそれぞれ16．0，18．1
minであり，両種はぼ同レベルで速やかに減差異は少なかった。また5，20，100mg／kgを衰した。皮下投与時の最高血中濃度はラットでは10min後，ウサギでは30min後にそれぞれ2．19，1．79〃geq／mlであり，初期の半減期はそれぞれ17．7，53，6minで，濃度レベルは近似していたが，ウサギの方が血中への移行，消失とも遅延する傾向がみられた。
また経口投与時のラットの血中濃度は漸増，漸減し，9hr後に0．33fJgeq／mlの最高値を166

濃度が若干低い傾向がみられたが，AUC上の経口投与した場合の血中濃度では用量に依存した増加傾向を認めた。
2．尿糞及び胆汁中への排泄〔14C〕E−64−Cをラットに経口投与したときの尿糞中への排泄，並びにラット及びウサギに皮下投与したときの尿中排泄を図2に，また胆汁中への排泄を図3に示す。ラットに経口投与
後速やかに主に糞中へ，一部が尿中へ排泄された。皮下投与時の尿中排泄は5日後までにラットでは投与放射能の50．7％であるのに対し，ウ23．E一朗−Cの生体内動態に関する研究

Rat14C−E−64−C5mg／kg

P．

Rabhit14C−E−64−C5mg／kg￣￣ご†一／一一一ノ
p・0・

2

4

6

24

30
hr

図3 ラット及びウサギに〔HC〕E−64−Cを皮下又は経口投与後の放射能の胆汁中排泄
各点は4匹の平均値を示す

サギでは87．8％が排泄された。またラットの胆汁中への排泄率は30Ilr後までに皮下及び経口投与でそれぞれ，50．1，31．1％に達し，これに対しウサギでは皮下投与時9．7％に過ぎなかった0なおラットから採集した胆汁を別のラッ
トの十二指腸内に注入して胆汁中排泄を調べた
ところ26．4％が回収された。
3．オートラジオグラフィー〔HC〕E，64−Cをラットに経口投与後3，9hr，皮下投与後，30min，3brの全身オートラジオグラムを図4，図5に示す。両投与時とも肝，腎及び消化管内容に高濃度の分布があり，ほかに経口投与時は骨髄，消化管壁等，皮下投与時は投与部位，血液等にも分布を認めた。筋肉はマクロオートラジオグラムでは特に黒化像としては検出されなかったが，皮下投与後30minの大腿四頭筋のミクロオートラジオグラ
ムを作成した結果，筋細胞上並びに血管内，血管壁及びその周辺の結合組織に黒化銀粒子を認めた（図6）。
4．組樟内濃度〔HC〕E−64−Cをラットに経口投与後3，6，24
hr，及び皮下投与後1／6，3，以brの組織内放射能濃度を表2及び表3に示す。経口投与時は肝と腎に最も高濃度の分布があり，ほかに骨髄，胃壁，副腎，膵にも若干の分布を認めた。
皮下投与時も肝と腎に著明な分布があり，骨髄と膵にも若干の移行がみられたが，それらを除き血中濃度推移に従って速やかに減衰した。
5．連続投与時の吸収，分布及び排泄〔HC〕E−64−Cをラットに10日間連続経口及び皮下投与したときの血中濃度推移を図7に示す。両投与時とも5−7日日以後ほぼ定常状態に達し，連続投与により血中濃度の明らかな増加と投与中止後も長時間持続する傾向がみられた。すなわち10回投与後24brの値は単回投与に比較して経口投与時は約4倍，皮下投与時は約7倍に上昇し，等質性と残留性が認められた。
167

Ⅳ 全身的影響に関する研究

3

Intestlnal mucosa

hrSkjn Bone marroW

Intestjnal muCOSa

9

hr

図4

168

ラットに〔HC〕EL64−C20mg／kgを経口投与後，3，9hrの全身オートラジオグラム

23．E一朗−Cの生体内動態に関する研究

30 両n

3 nI・

Bone marrow

図5

ラットに〔HC〕E−64−C20mg／kgを皮下投与後，30min，3hrの全身オートラジオグラム

169

Ⅳ 全身的影響に関する研究

図6

170

ラットに〔14C〕E−64−C20mg／kgを皮下投与後，30minの大腿四頭筋のミクロオートラジオグラム23．E−64−Cの生体内動態に関する研究
表2 ラットに〔HC〕E−64−C5mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLg E−64−C eq／mlorg）

Tissue3

Blood
PlasmaMuscleLiver
Xidney
Heart
Lung
Brain
SpleenBone・marrOW
ThymusAdrenalThyroid
Testis
Prostate
Hyp9physis
Pancreas
Stomacb
Smallintestine
Skin
Fat

0．180士0．023
0．210：土0．045
0．109：土0．059
1．537± 0．166
1．215土0．074
0．065土0．003
0．110土0．012
0．057：土0．004
0．139士0．026
0．406±0．053
0．078土0．008
0．362土0．073
0．131± 0．023
0．052±0．004
0．175土0．039
0．189土0．036
0．440土0．094
0．583 土 0．082
0．172：±0．015
0．180：土0．011
0．091土0．018

6

0．194 士 0．031
0．114 士 0．018
0．038 土 0．014
1．431± 0．206
1．318 士0．193
0．050 ± 0．008
0．091士 0．023
0．044：土 0．005
0．125 士 0．032
0．389 ± 0．095
0．074 士 0．010
0．267 土 0．065
0．108：土 0．036
0．042 土 0．012
0．145 士 0．048
0．182 ± 0．079
0．260 土 0．028
0．312 士0．079
0．193 士 0．055
0．099 士 0．023
0．048士 0．014

24br

0．138 土 0．034
0．044土0．007
0．069土0．012
0．825±0．137
1．714 土 0．168
0．082± 0．013
0．155±0．012
0．066士0．012
0．112± 0，005
0．474士0．171
0．114 土 0．032
0．391±0．026
0．259土0．048
0．097士0．018
0．282±0．070
0．353 ± 0．018
0．129 ± 0．041
0．058土0．004
0．067士 0．000
0．210 土 0．051
0．066 土 0．018

数値は4匹の平均値±S．E．を示す
表3 ラットに〔HC〕E−64−C5mg／kgを皮下投与後の放射能の組織内分布
Radioactiveconcentration（FLg E−64−C eq／mlorg）

Blood
PlasmaMuscleLiver
Xidney
Heart
Lung
Brain
SpleenBone一marrOW

ThymusAdrenalThyroid
Testis
Prostate
HypopllySis
Pancreas
StoInaCh
Smallintestine
Skin
Fat

1／6

3

24もr

1．937 ± 0．142
3．463：±0．168
0．610土0．109
16．785土2．348
19．368±1．271
1．653土0．171
1．679±0．179
0．116土0．046
1．683 土0．339
0．609±0．050
1．678± 0．383
1．077土 0．248
0．512 土 0．078
1．065土0．121
0．549土 0．174
0．000土 0．000
1．780±0．311
1．125土 0，138
1．127土 0．032
1．188± 0．090
1．007± 0．055

0．110 士 0．011
0．180 ± 0．019
0．091士 0．023
2．220 ± 0．132
9．358：土 0．543
0．078 ± 0．008
0．171士0．017
0．058士0．005
0．159 土0．013
0．452 士0．028
0．110士0．028
0．259±0．014
0．000士0．000
0．085士0．004
0．194±0．021
0．000 士 0．000
0．471士0．012
0．166士0．006
0．242：土 0．021
0．186 ±0．006
0．103士0．039

0．163 ± 0．032
0．208士 0．020
0．088土0．009
1．435土0．059
7．463士0．126
0．099 土 0．016
0．170±0．016
0．060 土 0．000
0．225 ± 0．023
0．464 士0．018
0．151± 0．016
0．277 土 0．032
0．000土0．000
0．094±0．000
0．070 士 0．006
0．000士0．000
0．309 土 0．028
0．117 ± 0．019
0．162 ± 0．053
0．230 ± 0．011
0．047士0．005

数値は4匹の平均値士S．E．を示す
171

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表4 ラットに〔HC〕E−64−C5mg／kgを1日1回10日間連続経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLg E−64−C eq／mlorg）
6

Blood
PlasmaMuscleLiver
Kidney
Heart
Lung
Brain
SpleenBone−marrOW
ThymusAdrenalThyroid
Testis
Prostate
HypopllySis
Pancreas
StomachSmallintestine
Skin
Fat

24

0．713±0．082
0．161士 0．017
0．460 ± 0．018
2．206 ±0．090
4．779 土 0．312
0．569 土 0．041
0．832：± 0．046
0．363 士 0．022
0．804 ± 0．031
1．339 士 0．100
0．700 土 0．047
1．431土 0．064
0．866 士 0．047
0．442 士 0．030
1．031土 0．119
1．100 土 0．037
1．218 士 0．064
1．499 ± 0．039
1．302 士 0．182
0．608 士 0．077
0．503 士 0．112120

0．704 士 0．021
0．140 土 0．012
0．326 土 0．099
1．549 土 0．098
3．855 土 0．131
0．459 土 0．024
0．666 ± 0．019
0．264 土 0．003
0．669 士 0．055
1．012 ± 0．051
0．548 ± 0．008
1．143士 0．139
0．763 ± 0．056
0．405 ± 0．039
0．751士 0．055
0．806 ± 0．047
0．728土 0．022
0．715 士 0．046
0．715士 0．064
0．568：± 0．018
0．536士 0．009

0．573± 0．034
0．049±0．001
0．435 ±0．047
0．848：土 0．100
1．984 士 0．265
0．523 士0．123
0．389士0．042
0．238士 0．018
0．431±0．052
0．533 土0．050
0．261±0．025
0．726 土0．132
0．511士 0．142
0．302 土 0．024
0．536 土0．053
0．608 ± 0．157
0．489±0．049
0．428±0．035
0．367土0．087
0．348士0．037
0．445±0．019

数値は4匹の平均値土S．E．を示す
表5 ラットに〔HC〕E−64−C5mg／kgを1日1回10日間連続皮下投与後の放射能の組織内分布
Radioactiveconcentration（FLg E−64−C eq／mlorg）
1／6

Blood
PlasmaMuscleLiver
Xidney
Heart
Lung
Brain
SpleenBone一marrOW

ThymusAdrenalThyroid
Testis
Prostate
Hypophysis
Pancreas
StomachSmallintestine
Skin
Fat

3．956
6．467
0．978
21．33668．468

±
土
土
士
±

0．275
0．139
0．047
2．143
5．244

1．608

＝ヒ

0．172

2．597 土 0．216
0．538 ± 0．014
1．591± 0．041
2．851士 0．195
1．550 土 0．149
2．730：土 0．268
2．335 ± 0．190
0．953 土 0．053
1．874 ± 0．110
3．008 ± 0．572
1．761士 0．152
1．762 土 0．089
3．301±1．103
2．077：± 0．228
0．915 土 0．198

数値は4匹の平均値±S．E．を示す
172

24

120

1．119士 0．049
0．395 土 0．131
0．865 ± 0．070
3．220 土1．295
44．014 ± 5．830
0．941土 0．085
1．576 土 0．101
0．548 土 0．168
1．361土 0．087
2．015 土 0．195
1．194 ± 0．129
2．578 土 0．166
1．583 士 0．170
0．796

＝ヒ

0．042

1．639 ± 0．094
1．973 土 0．137
1．850 ± 0．211
1．040 ± 0．150
1．127 土 0．144
0．875 ± 0．115
1．006 土 0．119

1．152±0．036
0．095±0．013
1．029±0．049
2．091士0．586
23．349土3．892
0．969土0．087
1．078±0．034
0．569士 0．020
0．896±0．080
1．472±0．167
0．856 士0．061
1．836土0．219
1．358士0．115
0．742 土 0．022
1．182土0．068
1．550 ± 0．213
1．347±0．193
0．892 士 0．056
0．916 土 0．048
・1．056±0．120
1．107 土 0．069

23．E−64−Cの生体内動態に関する研究

2

tE＼b工等トAdministration J days

15

図7 ラットに〔HC〕E−64−C5mg／kgを1日1回10日間連続皮下又は経口投与時の血中
放射能濃度
各点は4匹の平均値を示す

一方，経口及び皮下連続投与後の組織内放射能濃度を表4及び表5に示す。血中濃度に対応
してすべての組織で単回投与時より高い濃度を示し，最終投与後120hrも残留傾向を認めた。
血中濃度は皮下連続投与後10minを除き，皮下及び経口投与時とも血策よりはるかに高く，血球中への移行性が示唆された。また筋肉への分布も両投与時とも連続投与により単回投与時に比べて5−10倍の濃度増加がみられ，心筋でも同様な傾向が認められた。はかに肝では連続投与により2倍弱であったが，腎，小腸，骨髄そのはかほとんどの組織で数倍ないし10倍の濃度増加がみられ，全身的にある程度の蓄積性があるものと考えられる。
また尿糞中への排泄に関しては，尿中排泄は
累積投与量に対する回収率が経口投与後4日目
以降11−12％のほぼ一定値を示し，皮下投与の場合は経目的に若干増加する傾向がみられた
が，40−50％の範囲内であった。また糞中排泄も経口投与後6日目以降81−83％，皮下投与時やや低く，−一部が体内に残留する傾向が示唆された。
6．胎仔及び乳汁中への移行〔14C〕E−64−Cを妊娠ラットに経口及び皮下投与したときの組織への分布を表6に示す。胎仔への移行は初期には少ないが，出hr後には母獣血中濃度と同レベルになり，胎盤関門の存在とある程度の移行性を認めた。
また乳汁中濃度は皮下投与20min後では極めて低いが，血中濃度推移に遅れて乳汁中への移行が認められ，経口，皮下投与時とも 3Ilr
以降は血中濃度の1．4−3．7倍程度であった（表7）。

7．血策，筋肉，尿及び胆汁中代謝物〔1−C〕E−64−Cをラットに経口及び皮下投与後，またウサギに皮下投与後別hrの尿及び胆汁
中代謝物の酢酸エチル抽出層の薄層クロマトス
キャンニングの結果を図8及び図9に示す。酢酸エチル層中に尿中放射能の85−90％が抽出され，ラットに経口投与したときは極性の低い未は全期間を通じて31−35％とはぼ一定値を示した。経口投与の場合は単回投与時と異なり，非絶食だったため，連続投与初期に吸収，排泄の知代謝物が大量に生じ 未変化のE−64−Cは酢遅延がみられ，また皮下投与の場合は回収率がし，ウサギの場合は更に72．2％と高率であっ酸エチル居中放射能の7．3％に過ぎなかったが，皮下投与時は50％以上が未変化体として存在

173

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表6 妊娠ラットに〔14C〕E−64−C5mg／kgを皮下又は経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLg E−64−C eq／mlorg）

1／3

24br

6

24br

Blood

2．533（1．00）

0．147（1．00）

0．289（1．00）

0．170（1．00）

Liver

18．476（7．29）

1．333（9．07）

0．879（3．04）

0．783（4．61）

Xidney38．292（15．12）

9．707（66．03）

1．809（6．26）

1．143（6．72）

Muscle0．614（0．24）

0．02汀（0．18）

0．036（0．12）

0．044（0．26）

Placenta

0．849（0．34）

0．191（1．30）

0．153（0．53）

0．別3（1．43）

Amnioticfluid

0．036（0．01）

0．017（0．12）

0．011（0．04）

0．012（0．07）

Fetus

0．024（0．01）

0．170（1．16）

0．069（0．24）

0．243（1．43）

Fetal blood

0．110（0．04）

0．139（0．95）

0．094（0．33）

0．146（0．86）

Fetalliver

0．110（0．04）

0．314（2．14）

0．229（0．79）

0．469（2．76）

Fetal kidney

0．091（0．04）

0．228（1．55）

0．158（0．55）

0．323（1．90）

数値は4匹の平均値士S．E．を示す（）は血中濃度を1としたときの相対値を示す
表7 授乳期のラットに〔1−C〕E−64−C5mg／kgを経口又は皮下投与後の乳汁中及び血中
放射能濃度Radioactive concentration（FLg E−64−C eq／mlor g）

Time（br）

Blood

0．288 士 0．039

0．213 土 0．069

6

0．589 土 0．089

0．216 土 0．020

0．737 士 0．154

0．197 土 0．015

1／3

0．077 土 0．033

1．577 土 0．167

3

0．378士0．043

0．239±0．065

24

0．402± 0．053

0．201± 0．043

4
2

3

S．C．

Milk

数値は4匹の平均値士S．E．を示す
た。また胆汁中放射能の酢酸エチル層中への抽出率は31−34％であり，抱合体等水溶性代謝物
が多いものと推定されるが，ラットに経口授与
した場合は酢酸エチル抽出代謝物中の42．3％が未変化体であったのに対し，皮下投与時はラット，ウサギともほとんどが未変化体であった。
一方，ラットに〔HC〕E−64−Cを皮下及び経口投与後の血渠中代謝パターンを図10に示す。皮下投与後の血中動態は血疑中総放射能に対して未変化体が10minでは76．6％，30minでは40．0％存在するが，経時的にその存在率は低下
し，逆に蛋白沈澱画分とそのほかの代謝物の割合が増大した。また経口投与時は未変化体の割合が少なく，蛋白結合画分の割合が多かった。
174

血祭中総放射能に対する未変化体の割合をAUCで比較すると，皮下投与時は45．4％であるのに対し，経口投与時は7．3％となり，経口投与時の代謝が著しいことが示唆された。
またラットに〔HC〕E−64−Cを単回又は10日間連続して皮下及び経口投与したときの筋肉内代謝パターンを表8に示す。皮下投与時は単回投
与後10minでは酢酸エチル層中へ筋肉中放射能の58．4％が，連続投与後10minでは17．0％が抽出され，いずれもそのほとんどが末変化体であった。一方，経口投与時は単回投与後6hrでは蛋白結合画分に多く，未変化体はほとんど存在しなかったが，連続投与後6brでは酢酸エチル層中に15．1％が抽出され，その大部分が

23．E−64−Cの生体内動態に関する研究
表8

ラットに〔HC〕E−64−C20mg／kgを単回又は5mg／kgを1日1回10日間連続皮下又は経口投与後の筋肉内放射能の代謝パターソ
AcOEt extract

Muscle EtOHppt（〃g eq／g）

E−64−C％

4

1

8

9
7

0

7
5
1 1

0

8
7

2

1

8
5

8

Repeated p．0．6hr lOO（0．46）

97−

Repeated s．C．10min lOO（0．98）

9Single p．0．6br lOO（0．16）

Total％

1
2

Single s．C．10min lOO（2．70）％

Rat p，0．

7．25％

○

○

E−64−C Leu

1．0

0．5

図8

0

E−64−C Leu

E−64−C Leu

Solvent system：（a）

ラット及びウサギに〔1−C〕E−64−C5mg／kgを経口又は皮下投与後以brの尿抽出物のラジオ薄屑クロマトグラム

Rat p．0．

1．0

42．43％

74．24％

E−64−C Leu

E−64−C Leu

0．5

図9

0

ラット及びウサギに〔1−C〕E−64−C5mg／kgを経口又は皮下投与後以brの胆汁抽
出物のラジオ蒋層クロマトグラム
175

Ⅳ 全身的影響に関する研究

HE＼bむ翌
1／21

hr

3／

図10 ラットに〔HC〕E−64−C20mg／kgを皮下又は経口投与後の血祭中放射能の代謝パターン

E−64−Cであったことから，単回投与時の結果
は酢酸エチル抽出が不十分だったことに起因して末変化体が少なかったものと考えられる。
別に蛋白結合率を限外炉適法で調べた結果，
ヒト血清アルブミンと〔14C〕E−64−C との 玩
γか0での蛋白結合率は40％程度であり，ラットの血祭蛋白との 乃γfroでの結合率は皮下投与後3Ilr，経口投与後6hrでそれぞれ84．5，
75．3％であった。
考察〔HC〕E−64−Cをラット及びウサギに静脈内及び皮下投与した際の血中放射能濃度は速やかに減衰し，本薬物の非経口投与時の血中からの消失は速やかであった。しかしながらウサギに皮下投与した時の血中濃度推移はラットに比べて遅延する傾向が認められ，皮下投与時の消失速度には種差があるものと考えられる。またラットに経口投与した時の最高血中濃度は前回1）は3hr後に0・16FLgeq／mlを示したのに対し，今回は9hr後に0．33／唱eq／mlの結果を得た。これは経口投与時の血中濃度レベルが低いための実験誤差とも考えられるが，後述するように経口投与では皮下投与の場合より代謝が著
るしく，放射能標識が前回はWilzbach法3）176

による3H標識であったのに対し，今回はロイ
シン部位のHC標識であることが関与している可能性が考えられる。
またラットに〔HC〕E−64−C経口投与後の尿中
及び胆汁中排泄率はそれぞれ18．3，31．1％であり，前回の，11．7，38．7％と若干異なる結果を得たが，両者を加算するといずれの場合も約50％となり，消化管吸収率は50％程度と推定される。ウサギはラットに比べて尿中排泄率が高
く，胆汁中排泄率が低い結果を得，排泄ルートに種差を認めた。更に尿中未変化体の割合がラットより多かったことから，ウサギではラットの場合より代謝速度が遅いことが示唆された。
なおラットでは一部腸肝循環の形成が認められた。
全身オートラジオグラムの結果から，E−64−Cは肝と腎で速やかに代謝，排泄されることが推定された。また経口投与時に消化管壁と骨髄に分布が認められ，これらの組織は蛋白合成活性が高いことから，〔HC〕E−64−Cの標識ロイシン
部分が一部遊離して蛋白に取り込まれた可能性が考えられる。
更に尿中及び胆汁中代謝物に閑し，皮下投与に比べて経口投与時の代謝が著しいこと，また経口投与時に血祭及び筋肉中放射能の蛋白結合

23．E−64−Cの生体内動態に関する研究

画分の比率が高いことから，投与ルートによる時は血中から速やかに消失するが，消失速度及代謝パターンの差異が推定され，経口投与の場
合は消化管内で腸内細菌による代謝あるいは肝における初回通過効果が関与している可能性が考えられる。

び排泄ルートには種差が認められた。またラットにおいて一部腸肝循環の形成，胎仔及び乳汁中への移行性も認められた。一方，経口投与した場合は皮下投与時に比べて代謝が著しい傾向

一方，連続投与により経口及び皮下投与時とも血中濃度は5−7日以降定常状態に達し，多にあった。またE−64−C投与後その放射能は尿くの組織で単回投与時の数倍から10倍程度の蓄積傾向を示した。筋肉への移行も単回投与では少ないが，連続投与により増大し，また単回投与時のミクPオートラジオグラムで筋細胞内への分布を確認し，薬効を期待し得るものと考えられる。

により蓄積する傾向がみられた。筋肉への分布

結論

E−64−Cの14C標識体を用いてラット及びウ
サギにおける生体内動態を検討した。E−64−C
は消化管から50％程度が吸収され，非経口投与

及び胆汁中へ速やかに排泄されるが，連続投与は連投により高まり，未変化体としての移行並
びに筋細胞内への分布を確認した。
文献1）大関正弘：E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究，昭和54年度研究報告書，p．149，1980．
2）沢田二郎：E−64−C標識体の製造，本誌，1981．
3）Wilzbach，K．E．：Tritium−labelling by ex−
POSureOforganic

compounds

totritiumgas

J．Am．Chem．Soc．，79，1013，1957．

177

24．E−64−Cの薬物代謝酵素活性への影響

研究協力者

佐

北

川

晴

藤

哲

男＊

研究目的

雄＊
北

田

光

一＊＊

の1．15％KClに懸濁し，窒素気流中に−800Cで保存した。Invitro実験では，未処理ラット

昨年度はE−64の薬物代謝酵素に対する影響を検索した。それに引続き，本年度はE−64の誘導体の一つであるE−64−Cの薬物代謝酵素
活性に対する影響をinvitroならびにinvivoから上記の方法により調製した肝Msを酵素材料として用いた。

で検討した。又，東大，杉田先生よりE−64投与の筋ジストロフィーチキンの肝を恵与され，その薬物代謝酵素活性をも測定した。

法1）にて，アニリン水酸化活性は生成するパラ

実験材料及び方法
体重180〜200gのSD系雄性ラ；トを使用
し，飼育期間中は230Cの恒温，湿度60％の下で飼育した。動物は日本クレアKKのラット・マウス用飼料（CE−2）を与え，飲料水は自由に摂取させた。すべての場合，動物は実験に使用する20時間前から絶食した。E−64−Cは
必要最少量のNaHCO3溶液に溶解し50mg／kgの割合で皮下投与した。なお対照群には生理食塩水を0．5ml／100g体重の割合で同様に授与した。
Invivo実験の場合，動物は断頭潟血後肝をとり出し，肝重量を測定後1．15％KClにて潅流し，肝重量の3倍容の1．15％KClを加えてホモジナイズした。この様にして得られた25％ホモジネートを常法に従い超遠心分離によりミクロゾーム（Ms）西分を分離し，一定量＊千葉大学薬学部薬効・安全性学講座薬物学研究室＊＊千葉大学薬学部医療薬学講座病院薬剤部

N−脱メチル化活性の測定は，インキュベー
ション後に生成するホルムアルデヒドをNasb
ヒドロキシアニリンをImaiらの方法2）で各々測定した。又，チトクロムP450，チトクロム
bS及びNADPH−チトクロムCレダクク＿ゼ
活性は各々OmuraとSato3）及びPhillipsとLangdonの方法4）に準じて行った。NADH−
フェリシアナイドレダククーゼ活性はMiharaとSatoの方法5）に従って行った。なお蛋白量は，Gornallの方法6）により定量した。
結果1）In Yitro試験
脱メチル化活性の測定には基質として，アミノピリン，ベンツフェタミン及びェチルモルヒ

ネを・水酎ヒ活性測定にはアニリンを基質として用いた。4濃度のE−64−CをNaHCO3溶液に溶解しインキュベーション混液に加え一定時
間インキュべ−ト後の薬物代謝酵素活性を測定した。その結果，表1に示す様に，E−64−Cの0・05mMから1・00mMの問では無添加群と比較して殆ど差は認められず，E−64の場合と同様にinvitroでは薬物代謝酵素活性に対する影響は認められなかった。
さらに4濃度（0・025mM〜0．500mM）の179

Ⅳ 全身的影響に関する研究
表1In vitroにおけるE−64−Cのラット肝ミクロゾーム薬物代謝酵素活性に及ぼす影響
Substrate
Concentration（mM）

Aminopyrine＊

Benzphetamine＊

Ethylmorphine＊

Aniline＊＊

None

85．80

121．66247．3418．9

0．05

88．67（103．3）

126．39（103．9）

219．88（88．9）

18．7（98．9）

0．10

89．24（104．0）

126．90（104．3）

222．69（90．0）

19．0（100．5）

0．50

85．37（99．5）

127．63（104．9）

226．67（91．6）

17．8（94．2）

1．00

87．12（101．5）

122．29（100．5）

221．41（89．5）

18．3（96．8）＊nmole HCHO formed per mg of protein per20min・＊＊nmoleかaminophenolformed per mgof protein per20min・
Numbersin parentheses represent per cent of control・

表2In vitroにおけるE−64−Cのラット肝ミクロゾームの薬物代謝に関連する
電子伝達系に及ぼす影響
NADPH・Cytochrome c reductase NADH−Ferricyanide reductase
Concentration（mM）（units per mg of protein）

None

0．132

3．541

O．025

0．137（103．8）

3．484（98．3）

0．050

0．134（101．5）

3．427（96．8）

0．250

0．133（100．8）

3．313（93．6）

0．500

0．138（104．5）

3．484（98．4）

Numbersin parentheses represent per cent of control・

表3In vivoにおけるE−64ぺのラット肝ミクロゾーム薬物代謝酵素活性に及ぼす影響
Control（n＝10）

Treated（n＝10）pAminopyrine
N−demethylation（nmoles／mg／20min）

55．73土2．99

63．64士6．14

ms．

Anilinehydroxylation（nmoles／mg／20min）

30．24土0．99

34．20土1．03＜0．02

0．089士0．003

0．116土0．006＜0．0012．571±0．111

2．736±0．157

ms．

Cytochrorne P−450（nmoles／mg）

0．908土0．034

1．059土0．093

m．S．

Cytochrome b5（nmoles／mg）

0．438土0．020

0．487土0．027

ms．

NADPH−Cytcchrome creductase（units／mg）
NADIi−Ferricyanide
reductase（units／mg）

Rats were treated with E−64−C at a dose of50mg／kg，SC．for5days．

180

24．E−64−Cの薬物代謝酵素活性への影響
表4InvivoにおけるE−64の先天性筋ジストロフィーチキンの肝ミクロゾーム薬物
代謝酵素活性に及ぼす影響

Line

Sex

E−64

nAminopyrine （nmolesN−demethylation
Aniline hydroxylation
product／mg prot．／20min）

Male Treated412

Female Untreated412

Female Treated

2

▲
4
−

4

4

3
1

Female Treated

2

4

1

．

3

Female Untreated

13．94±2．71

73．20土7．34 ms．

20．85±1．64 n．S．

41．98

10．91

75．07

24．38

41．73±6．19

10．42土1．69

78．81土9．44 p＜0．01

22．40士2．67

56．65

15．23

84．67土8．18

23．84士2．52

7

．

3
1

Male Treated

8

A

3
1

Male Untreated

51．41土8．61

3

Male Untreated

412

2

7

412

p＜0．01E−64（20mg／kg，SC）was administered tochickens3timesweeklyforlOOdays．
Normalline412and dystropllyline413chickens were used．
蓑5InvivoにおけるE−64の先天性筋ジストロフィーチキンの肝ミクロゾームチトク
ロムP450量及びNADPH−チトクロムCレダククーゼ活性に及ぼす影響
NADPH−Cytochrome c redllCtaSe Cytochrome P−450
Line

Sex

（unit／mg prot．）

E＿64

Male Untreated

7−

412

Male Treated3412

Female Untreated2412

Female Treated413

Male Untreated413

Male Treated413

Female Untreated413

Female Treated2412

0．078±0．007
0．102土0．011（nmole／mg prot．）

0．239土0．011

ms．

0．246±0．031 m．S．

0．068

0．2汀4

0．104

0．238

8

0．055土0．005

0．252士0．023

7

0．087■±0．007

n．S．

0．225土0．021 n．S．

2
4

0．087

0．218

0．107±0．006

0．189土0．012

Fordetails，See thelegend to Fig・4・

E−64−Cをインキュベーション混液に添加して薬物代謝酵素の電子伝達系の一つであるNA−

3）先天性筋ジストロフィーチキンへのE−64投与による肝薬物代謝酵素活性の影響

DPH−チトクロムCレダクターゼ及び肝Msチ

先天性筋ジストロフィー雌雄チキンにE−64

トクロムP450量の変動を検討した結果，無（20mg／kg，SC）を連続投与（一週3回，100

添加群との問に有意差は認められなかった（表日間）した際の肝薬物代謝酵素活性への影響を2）。

検索した。その結果，麦4から明らかな様に，

2）In YiYO試験

アミノピリン脱メチル化活性及びアニリン水酸

E−64−Cを可及的少量のNaHCO3溶液に溶化活性は正常チキンではE−64の影響が何ら認められないのに対して筋ジストロフィーチキン

解し50mg／kgの割合で連続5日間皮下授与した。その結果，蓑3に示す様に，アニリン
水酸化活性は対照群に比較して有意に増加し，

では雄性においてのみE−64投与により代謝活

NADPH−チトクロムCレダククーゼ活性は有性の有意な増加がみられた。又，同一条件下においてチトクロム P450 量及びNADPH−チ

意に上昇した。その他のパラメーターはすべて

トクロムCレダククーゼ活性は何れの群におい対照群との問に有意差はみられなかった。

てもE−64による有意な変動は認められなかっ181

Ⅳ 全身的影響に関する研究
formaldehyde by means of the Hantzsch

た（表5）。

reaction，Biochem．J．，55，416−421，1953．

考察及び結語2）Y．Imai，A．Ito．and R．Sato．：Evidence forIn vitro試験において，E−64−Cを添加する
ことにより薬物代謝酵素活性ならびにそれに開通する電子伝達系及びチトクロム

biochemically different types of vesiclesin
the hepatic microsomalfraction，J．Biochem．，
60．417−428，1966．

P450量の

3）T．OmuraandR．Sato．：Thecarbonmonoxide

何れも無添加群との間に有意差はみられなかっbinding pigment ofliver microsomes，J．Biol．

た。これに対してinvivoでE−64−Cを投与した場合，アニリソ水酸化活性ならびに∴NA−
DPH−チトクロムCレダククーゼ活性は対照群

Chem．，239，2370−2378，1964．
4）A．H．Phillips and R．G．Langdon．：Hepatic
triphosphopyridine nucleotide−CytOChrome creductase：Isolation，Characterization，andに比べて有意に増加した。しかし，チトクロム

kinetic studies．J．Biol．Chem．，237，2652−2660，

P450量，アミノピリン脱メチル化活性などは1962．

全く影響がみられないことから，E−64−Cによる上記の活性増加は薬物代謝酵素活性の一般的な増加とは考え難く，又E−64−Cによる本酵素の誘導現象はないものと思われる。
文

献1）T．Nash：The colorimetric estimation of

182

5）K．Mihara and R．Sato．Partialpuriacation
Of NAI）H−CytOChrome b5

reductase fromrabbit microsomes with detergents andits
PrOperties，J．Biochem．，71，7257735，1972．
6）A．G．Gornall，C．S．Badawill and M・M・
David．：Determination of serum prOteins bymeans of the biuret reaction，J．Biol．Chem．，
177．751−759，1949．

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究班
班員 及び 関係者名簿
氏

名

施

設

名

所

在

地

主任研究者

東京大学医学部第二生化学〒113文京区本郷7−3−1

江橋 節郎

東京大学医学部第一薬理学〒113文京区本郷7−3−1

杉田 秀夫〒113文京区本郷7−3−1

西塚 春美

東京大学医学部附属脳研究施設 神経内科
徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素化学部門
神戸大学医学部第二生化学

福原 武彦（幹事）

東京慈恵会医科大学第二薬理学〒105港区西新橋3−25−8

小沢瑛二郎〒187小平市小川東町2620

野村 達次

国立武蔵療養所
神経センター 機能研究部
実験動物中央研究所

北川 晴雄（監事）

千葉大学薬学部薬物学〒280千葉市弥生町1−33

市原明〒770徳島市蔵本町3−18−15

石浦

章一

官武

正

徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素病理部門
国立武蔵療養所
神経センター 疾病研究第一部
自治医科大学神経内科

今掘 和友（班長）
分担研究者

勝沼 信彦

〒770徳島市蔵本町3−18−15〒650神戸市中央区楠町7−5−1〒213川崎市高津区野川1430〒187小平市小川東町2620

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科〒329−04栃木県河内郡
南河内町薬師寺331ト1〒173板橋区加賀2−11−1

大関 正弘（幹事）

大正製薬㈹総合研究所〒330埼玉県大官市吉野町1−403

沢田 二郎

大正製薬囲総合研究所〒330埼玉県大官市吉野町1−403

国立武蔵療養所神経センター〒187小平市小川東町2620

班友

星書栄二郎

183