シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回

工学系で蛋白質研究を模索して熊谷 泉（くまがい いずみ）

ニワトリリゾチームから抗体へ置換による特異性の人工変換にも成功しました。また、1983 年の 7 月、東京大学工学部工業化学科の三浦謹

三浦先生は本学会創立の流れの中でも、三井先生とは一郎教授の研究室に助手として着任し、工学系への思連携を深めておられました(写真 1)。

いがけ無い遭遇となりました。三浦先生は国立遺伝学

私はニワトリリゾチームの研究に惹かれました。や研究所から転任され、工学部で遺伝子工学の研究室をはり蛋白質研究の基本であり、多くの知見に恵まれて立ち上げる時であり、国際的にも高い評価を受けていいることが研究の進展に有利だと思ったからです。ヒ

た核酸（主に RNA）研究を中心に据えながらも、新天地トリゾチームを含め、国内外で複数の研究グループがで新しい研究分野として、当時、黎明期を迎えていた研究対象として取り上げており、そのような競争が激「蛋白質工学」を取り上げられました。私は大学院・博しい研究状況に参入することに、三浦先生は少し難色

士研究員時代の蛋白質・核酸研究と組換え DNA 実験のを示されましたが、最終的には研究テーマとしてお認経験を生かして蛋白質工学研究に参画するように申しめ頂きました。

渡されましたが、技術的には未熟であり、手探り状態か主に研究対象としたのは、基質結合に関与しているら研究を始めたため、３年間関連論文は１つも発表で側鎖（特に Trp62(1)）であります。これら側鎖は、本きませんでした。三浦先生は数種類の蛋白質を研究対学会の母体の１つである「蛋白質構造討論会」では、九象として取り上げられましたが、中心は放線菌スブチ州大学農学部・薬学部、大阪大学蛋白質研究所のグルーリシンインヒビター（SSI）であり、三井幸雄先生を中プが主に化学修飾による構造変換の対象にしており、心とする SSI グループに加わり、反応部位のアミノ酸学生時代から見聞きし興味を持っておりました。類縁

写真 1 三井幸雄先生を囲む会（三井先生が長岡に赴任された 1989 年頃）
主な方々、前列中央：三井先生、右横：宮沢辰雄先生、右端：西村善文先生、２列目４番目から：大島泰郎先生、稲垣冬彦先生、荒田洋二先生、三浦先生、甲斐荘正恒先生、最後列大島先生の左奥：筆者

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回

リゾチームとの構造・機能相関も考慮して、アミノ酸置として研究を開始しました。当時は、抗体可変領域断片換を行った結果、人工的な高機能化を達成することが（Fv）(4)、一本鎖抗体（scFv）、Fab の大腸菌での発現できました(1,2)。

系の報告が相次いで行われた時期でした。

文献１のニワトリリゾチームのアミノ酸置換研究は先ず HyHEL10Fv の遺伝子約 750 塩基対を化学合成し、私の蛋白質工学研究の最初の論文でしたが、この論文SSI 研究の関連で放線菌の発現系を保有していましたを基に、1988 年の 6 月、米国 NIH の国立がん研究所でので、独自性をだそうと放線菌で発現させました。抗体

開催されたワークショップに招待されました(3)。ニワの放線菌での発現は未だにこの一例だけかと思います

トリリゾチームを抗原とした免疫学のワークショップ(5)。しかしながら生産性は高くなく、効率的な研究ので、酵素学研究は少数派でした。抗原・抗体複合体の Xために大腸菌での分泌発現系を立ち上げることにしま

線結晶解析による立体構造研究が大きな話題であったした。丁度、博士前期課程に進学した津本浩平さん（現・と思います。エピトープやパラトープの構造が原子レ東京大学・院工・医科研教授）がこのテーマに参入しま

ベルで議論されていることが、特に印象的でした。このした。生産効率は極めて高く(~30mg/L)、研究の進展にワークショップの要旨集の表紙の図は抗原ニワトリリ大いに役立ったと思います。生産系が確立しましたのゾチームに結合する３種の抗体（その 1 つは後述するで、結合定数を正確に測定したいと思い、当時、大阪大HyHEL10）のパラトープとエピトープの関係を表したも学蛋白質研究所にいらした油谷克英先生にご相談するのであり、現在ではいくつかの代表的な生化学の教科と、等温滴定型熱量測定の利用を推薦して頂きました。

書に掲載されています。何故、ニワトリリゾチームを抗直ぐに、津本さんが油谷先生から、ご指導・ご薫陶頂き原とした免疫学が大きく展開したかについて、ワーク良い成果をあげることができました(6)。

ショップのオーガナイザーに伺ったところ「1960 年代

東北大学に赴任後も研究室のスタッフになって頂いに立体構造が解明された単純蛋白質は唯一ニワトリリた津本さんが自家薬籠中のものとして、相互作用解析ゾチームだけだったから」と教えて頂きました。NIH をを推進しました。抗原ニワトリリゾチームとの複合体中心にニワトリリゾチームを抗原とするハイブリドーとの構造解析にも成功し(7)、構造を基盤とした精密なマは 100 種にのぼると言われております。ニワトリリ

抗原認識機構を議論できるようになったと思っておりゾチームは酵素蛋白質としてだけでなく、抗原蛋白質ます(8,9,10)。また、独自に整備したファージ提示系をとしても基本的なものとして位置づけられていたこと利用して、抗原認識能の人工変換を達成することも出になります。

来ました(11)。
1970 年代後半から始まる遺伝子からの蛋白質の発現モデル抗体としての HyHEL10系の開発は、蛋白質研究を一変させました。抗体の構造複数の蛋白質を対象にして、蛋白質工学研究と格闘は皆ほとんど同じですので、Fv 程度ならどんな抗体もしていましたが、研究の方向性では悩んでおりました。

大腸菌で分泌発現できるはずだと単純に考え、東北大工学系では「設計」「合成」「評価」が重要とされると教学では大腸菌の発現系しか利用しない、と決めていまえられましたが、蛋白質研究は「設計」には馴染みませした。HyHEL10 の発現効率の高さに幻惑されていたのでん。
「蛋白質」を「工学」するには対象分子を限定するしょう。しかしながら、色々な抗体を取り扱う内に、抗ことが現実的であると思い始めました。抗体は共通の体でさえも発現性に強い個性があることに気づき始め、枠組み構造からなるドメインの積木細工と見ることが汎用性のある発現系開発の必要性を強く感じました。

でき、抗原結合部位の CDR はモジュール構造に対応し大腸菌における異種蛋白質の細胞内発現系におけるているとされます。ドメインとモジュールを基盤とし封入体形成は未だに対処が難しい大きな問題です。利て「設計」に対応できそうな数少ない蛋白質分子だと考用するには、一旦、変性剤で可溶化して、活性型に巻きえました。

戻す必要があり、その条件検討が煩雑です。一方、大量ニワトリリゾチーム研究の実績を生かし、思い切っに生成する、安定である、封入体自身はある程度精製度て、抗ニワトリリゾチーム抗体 HyHEL10 をモデル抗体が高い、精製が容易である、などの優位な点もあります。

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回

HyHEL10 はFv では大腸菌で効率的に分泌発現しますが、二重特異性抗体とがん免疫治療一本鎖抗体（scFv：VH とVL をリンカーで繋いだ分子種）

私は基礎的な研究対象として抗体を取り上げましたの分泌発現量は大幅に低下します。そこで、が、研究を始めてみると、はからずも医学系の先生方かHyHEL10scFv の封入体の作製と巻き戻し条件の検討をら共同研究の提案を頂くようになりました。大きく発行いました。HyHEL10scFv の封入体は大量に発現しまし

展したものは、東北大学加齢医学研究所の工藤俊雄先た(~g/L)。蛋白質の巻き戻しで問題になるのは、巻き戻生（現・東北大学名誉教授）との共同研究です。がん免し途中での凝集体の生成です。津本さんを中心に、凝集疫治療への適用を目的とした二重特異性抗体の開発を体生成を抑制するため、変性剤濃度を段階的に下げて目指す研究内容でした。

行き、添加剤等の工夫を行い、HyHEL10scFv は封入体か抗体の可変領域断片(Fv)を構成する VH と VL を短いら 90％以上の効率で再生させることができました(12)。

リンカーで繋げると、二量体化して、２価の低分子抗体

しかしながら、HyHEL10scFv の巻き戻し効率に匹敵す断片が作製できることは知られており、diabody と呼ばるまたは凌駕する効率を示す蛋白質は無かったようにれていました。この時、抗原結合能の異なった２種の Fv思います。その後は、動物細胞の発現系も研究室に導入を繋げると、２種類の抗原結合能を有する、二重特異性し、その有用性を認識することになります。

diabody を作製することが出来ます(図 1)。がん治療を目的とした二重特異性抗体の利用コンセプトは単純で、

N

N

N

N

N

N

dsHL-528

dsLH-528

chemicalN

N

HL-PEG

dsHL-OKT

N

N

N

N

N

N

N

N

N
N

scdsDb-528-Fc-LH

N

scDb

HL-tetrabody
N
N

N

N

N

5H

OL

O5

5L

OH

N

LH

5O

scFv-Fc

N

N

N

HL

N

N

scDb-Fc-HL-rev

NN

taFv-FcN

scdsDb-OKT-Fc-LHtaFv
NN

N

Db-FcN

N

N

N

scDb-Fc-HL
scDb-Fc-LH

N

N

scDb-Fc-LH-rev

図 1 二重特異性抗体 Ex3 を基盤として構築した構造フォーマット
円形で囲んだものは、典型的構造フォーマット。5H：抗 EGFR 抗体 528 H 鎖可変領域、5L：同 528 抗体 L 鎖可変領域、OH：
抗 CD3 抗体 OKT3 H 鎖可変領域、OL：同 OKT3 L 鎖可変領域。
Ex3 HL はドメインの連結順が VH-リンカー-VL、Ex3 LH は連結順が VL-リンカー-VH。tandem scFv は scFv-リンカー-scFv。

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回

がん細胞とリンパ球を直接架橋することです。副次的れまでの製造・活性評価は充分な再現性が得られ、アカには多様な細胞生物学的なイベントの相乗効果であるデミアでの研究活動に充分な手応えと自信を得ることことは想像に難くありませんが、証明する実験は見当が出来ましたが、開発継続までには至っておりません。

たりません。数種類のがん関連抗原特異抗体とリンパ残念ですが、巨額な投資判断において、大きな壁がある球表面抗原特異抗体の Fv を作製し、それらの組合せにように感じております。

よる二重特異性 diabody を数種類構築して、活性を調べましたが、特に顕著な細胞傷害性を示した分子種は、
抗 EGFR 抗体 528 と、抗 CD3 抗体 OKT3 との二重特異性インターフェイス分子への展開
がん免疫治療を目的とした二重特異性抗体の役割は、diabody（Ex3）でした(13）。この研究には浅野竜太郎さがん細胞と活性化リンパ球を架橋することであり、細ん（現・東京農工大・院工・准教授）が卒業研究時から胞間に人工的なインターフェイスを構築していること参画し、その後 Ex3 のヒト型化(hEx3)にも成功しましになります。この考えを、多岐にわたる物質間に適用すた(14)。また、Ex3、hEx3 ともマウスを用いた in vivoることを思いつきました。東京大学・工学部時代の一時治療モデルでも強い抗腫瘍活性を示すことが明らかに期は超電導フィーバーの時代であり、隣の研究室では、なりました(13,14)。良く見られる現象ですが、528 Fv

ぺロブスカイト型化合物を絨毯爆撃的に合成し、連日をヒト型化すると、抗原親和性が大きく低下しました。のように新たな物性を見出し、注目を浴びていました。

マウス、ヒト型化 528 Fv の結晶構造を解析し、それら一般社会では、何とも地味な蛋白質の世界を拡張できの構造に基づき、ヒト型化 528 Fv に無作為変異を導入ないか、と現実離れした考えが浮かんだり、消えたりししたライブラリーから、ファージ提示系を利用して、高ていました。

親和性ヒト型化 528 Fv の取得に成功しました(15)。こ2000 年頃に半導体の結晶面を認識するペプチドを、れらの変異導入を含め、Fc 領域との融合、二重特異性

ファージ提示法を利用して取得し、このようなペプチ

tandem-scFv（２種類の scFv をリンカーで繋げた分子ドの融合で、２種類の材料を集合・組織化する提案も成種で、diabody とは異なる構造）など極めて多数の構造されました(18)。このような断片を、抗体のフレームワフォーマットを作製し、抗腫瘍活性を測定して、医薬品ークに入れ込むことにより、より結合定数の高い分子としての最適化研究も展開しました（図 1）。重要なこの構築が可能になると、発想しました。このような材料とは、これら構造フォーマットの改変により、抗腫瘍活表面認識抗体の取得はファージ提示系のような生体外性が大幅に変化することを見出したことです。Ex3 は、選択系を適用するしか方法はありません。研究室で長

元々は VH－VL の順でドメインを連結していましたが、年培って来た技術が生かせる点も魅力的でした。梅津

これを VL－VH（Ex3 LH 型）に並べ変えるだけで、活性光央さん（現・東北大学・院工・教授）がスタッフとしが 3 桁近く上昇しまし(16)。
低分子二重特異性抗体で、て着任された際、ご相談させて頂きこのような方向性

唯一 FDA で認可されている blinatumomab は、抗 CD19 との研究を開始しました。梅津さんは、生物系以外での研抗 CD3 抗体の一本鎖抗体をリンカーで繋いだ二重特異究経験も豊富な守備範囲の広い研究者です。

性 tandem-scFv であり、悪性リンパ腫の治療薬として幾つかの有機・無機材料表面特異抗体断片の取得に開発されました。標準治療薬の一つである IgG 型キメ

挑戦し報告しましたが、ここでは金表面特異抗体に関ラ抗体のリツキサンと比較して 105 倍活性が高いと報連する成果を紹介します。先ず、ヒト抗体ライブラリー告されており(17)、現在国内製薬企業にて臨床研究がより、蒸着金表面に選択的な抗体断片を取得できまし進められております。固形がんを治療対象と想定してた(19)。金属や半導体化合物に特異的に結合するペプ

いる Ex3 とは単純な比較はできませんが、Ex3 LH 型はチドの報告がなされていましたが、その解離定数は 10-blinatumomab に匹敵、または凌駕する活性を有してい5～-6ると考えています。

M 程度でありインターフェイス分子として充分な結このような実績を背景として、2011 年から２年間、合性を有していません。しかし、私どもが選択した金表

国内大手製薬企業に評価して頂く機会を得ました。そ面特異的抗体の解離定数は 10-10M 程度と格段に強い結209

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回合性を示し、高い特異性も確認することができました。

得することができ、材料特異的抗体の網羅的、かつ簡便また、より簡便な材料特異的抗体の取得方法の試みな取得法として、新規性が高く、独創的な手法であるととして、材料認識ペプチドを CDR 移植することによる言えます。

機能発現を行いました。具体的には、様々な金属酸化物

ナノ工学材料に関しては、金と酸化亜鉛に特異的機に結合するペプチドをファージ提示法より独自に選択能を持つ抗体断片を構成単位とした二重特異性抗体分した結果、多機能セラミックスである酸化亜鉛を用い子を創ることによって、抗体断片間の架橋構造によって選択されたペプチドの結合活性は既に報告されていては金ナノ粒子のプラズモン機能を損なわない状態で、-7るペプチドに比べて結合定数が 10 程度と非常に強く、金・酸化亜鉛ナノ粒子を会合させることだけで、また、明瞭な材料選択性も示しました(20)。続いて、マウス抗酸化亜鉛結晶表面に金ナノ粒子を接着させることも行

体やラクダ抗体の可変領域断片中にある CDR 領域の一いました(22, 図 2）。

つのループ構造に、選択された酸化亜鉛認識ペプチド

最近では、この二重特異性抗体を利用して、金微粒子の移植を行いました。結果、酸化亜鉛への結合と材料選と酸化亜鉛ナノ粒子を会合させ、高温にて金を溶融（蛋択性の両機能が発現され、材料認識ペプチドを用いた白質分子は焼失）し、内部の酸化亜鉛ナノ粒子を希硫酸抗体への材料表面結合抗体の作製は可能であることがで溶解することにより、ナノレベルの細孔を有する金確認されました(21,22)。特に、ラクダ抗体へ移植した材料を創成し、その表面による効率的な酸化反応を観ものは、移植に用いなかった CDR 領域をランダム化し測しております（投稿中）。

ファージ提示法により解離定数が 10-9M 程度の抗体を取終わりに蛋白質として基本的な分子に素朴な興味を抱き、模索する中、抗体研究に辿り着き、はからずも、抗体医薬の進展を背景に、各種の公的資金のご支援を頂きました。現役最終年度（2012 年度）には、科学研究費補助金特別推進研究「ナノインターフェイス構築のバイオデザイン」に採択され、2017 年 3 月に終了致しました。
この成果の学術発信はまだ途上にありますが、進捗もあります(23)。
工学系の伝統的分野の研究者の方から、「社会が我々の研究の道場である」と聞かされたことがあります。また、研究者も晩年となると「人から感謝される研究」に心を動かされるとも聞きます。抗体研究を通じて、一瞬ですが、このような方向性を垣間見る体験は、研究生活を豊かにしてくれました。基礎から応用まで、分野横断的な知見・視点を包含した蛋白質研究の発展を期待しております。

図２ (2012) Bioconjugate Chemistry Vol 23 の 表紙

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シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回

文 献40421) Kumagai,I., Kojima,S., Tamaki,E. & Miura,K.,

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4) Skerra,A., & Pluckthun,A. (1989) Science 240,

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1038－1041

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626－627

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36038

9) Shiroishi,M., Tsumoto,K., Tanaka,Y., Yokota,A.,20) Umetsu,M., Mizuta,M., Tsumoto,K., Ohara,S.,Nakanishi,T., Kondo,H., & Kumagai,I., (2007) J.

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2575

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21) Hattori,T., Umetsu,M., Nakanishi,T.,

Biol. Chem. 285, 7686－7696

Tsumoto,K., Ohara,S., Abe,H., Asano,R.,11) Nishimiya,Y., Tsumoto,K., Shiroishi,M.,

Adschiri,T., & Kumagai,I., (2008) Biochem.

Yutani,K., & Kumagai,I., (2000) J. Biol. Chem. 275,

Biophys. Res. Commu., 365, 751－757

12813－12820

22) Hattori,T., Umetsu,M., Nakanishi,T., Sawai,S.,

12) Tsumoto,K., Shinoki,K., Kondo,H., Uchikawa,M.,

Kikuchi,S., Asano,R., & Kumagai,I., (2012)

Juji,T., & Kumagai,I., (1998) J. Immunol. Methods.

Bioconjug. Chem. 23, 1934－1944

219, 119－129

23) Sugiyama,A., Umetsu,M., Nakazawa,H.,

13) Hayashi,H., Asano,R., Tsumoto,K., Katayose,Y.,

Niide,T., Onodera,T., Hosokawa,K., Hattori,S.,

Suzuki,M., Unno,M., Kodama,H., Takemura,S.,

Asano,R.,& Kumagai,I.,(2017) Sci. Rep. 7, 2862

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14) Asano,R., Sone,Y., Makabe,K., Tsumoto,K.,
Hayashi,H., Katayose,Y., Unno,M., Kudo,T., &Kumagai,I., (2006) Clin. Cancer. Res. 12, 4036－211

シリーズ「わが国の蛋白質科学研究発展の歴史」第25回

熊谷先生ご略歴
1948 年 新潟市に生まれる
1972 年 東京大学教養学部基礎科学科 卒業
1977 年 東京大学大学院理学系研究科相関理化学課程
博士課程 修了
理学博士
1977 年 日本学術振興会奨励研究員
1978 年 三菱化成生命科学研究所 特別研究員
1980 年 マックスプランク分子遺伝学研究所 研究員
1982 年 ベルリン自由大学生物化学研究所 研究員
1983 年 東京大学工学部工業化学科 助手
1988 年 東京大学工学部工業化学科 講師
1990 年 東京大学工学部工業化学科 助教授
1994 年 東京大学工学部化学生命工学科 助教授
1995 年 東北大学大学院工学研究科生物工学専攻教授
2004 年 東北大学大学院工学研究科バイオ工学専攻教授
2013 年 東北大学名誉教授
2013 年 東北大学大学院工学研究科バイオ工学専攻客員教授
2017 年 東京農工大学大学院工学研究院

客員教授

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