厚生

省

新薬開発研究費

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

江

橋

班

昭和63年度研究報告書

平成元年3月

研究報告書の作成にあたって
病気の治療は必ずしも病因の究明を必要としない．猛威をふるった結核の克服は，
結核病理の解明とは全く無縁のところで行われた．勿論この場合は外因的疾患であり，論理的にも充分予想し得た筈である．では遺伝子疾患のような内因性疾患においては，事態はどのように展開してゆ〈のであろうか．
分子遺伝学的アプローチがデュシェンヌ型筋ジストロフィー病因の解明に突破口を開くであろうことは，万人の予測したことであった．この期待は，ボストンのKunkel教授らによって見事に現実化され，我が国を初めとする世界各国の研究者がこれに続き，目を見張るような成果が次々と生まれつつある．
しかし，研究の進展とともに，その自然発生率（変異率）が異常に高いことからも予想されるように，筋ジストロフィー成立の遺伝子的要因は，まことに奥深い複雑さを持つことが明らかになりつつある．このことは，分子遺伝学的な成果を治療と直結させるためには，従来にも増した叡智と努力を必要とすることを意味する．
この様な情勢を考えると，本研究班の意図する対症的治療法の意義は，現時点において寧ろ高まってきたというべきであろう．つまり，分子遺伝学的アプローチから得られる情報を臨床症状と対比することにより，病態の立体的把握が可能となり，より具体的な指針を設定することが可能となったからである．
本研究班は，従来から手がけてきた薬物の臨床的応用に結論を下すべく努力を重ねてきたが，本年度は新しい薬物の開発にも意を注ぎ，見るべき成果を収めた．この両方のアプローチを車の両輪として，今後とも筋ジストロフィー症治療法の開発とその確立に向け，一歩一歩前進してゆきたい．

平成元年3月
主任研究者

江

橋

節

郎

目

次

Ⅰ．分担研究報告
1）筋ジスマウスの前肢，後肢筋におけるプロテアーゼ変化の相違点

3

微生物化学研究所 青柳 高明 和田 孝雄 小島 蕗子
永井真知子 原田 滋子

2) mdxマウス骨格筋中で活性変化するアルカリ･プロテアーゼの精製と性質
和歌山県立医科大学第二生理学教室 辻
東京工業大学理学部生命理学科 沢田

9

繁勝 楠本 茂夫
均

3）実験的筋炎モデル動物の作製に関する研究15─自己免疫筋抗原の筋組島内分布と精製の試み─
国立精神・神経センター神経研究所 里吉栄二郎 古川 昭栄 新井左衛子
加茂功4）1．ベスタチンの筋細胞膜安定化作用に関する実験的研究
2．ベスタチン二重盲検試進歩状況
東邦大学医学部大橋病院第四内科 岸

1922

雅彦 木下 眞男 栗原 照幸

日高 隆信 池田憲 高宮 清之

5）蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

23（財）大阪基礎医学研究奨励会 藤井 節郎 日坂 哲彦 山田晴雄

6) CANP阻害剤の合成

27

東京理科大学理学部

向山

光昭

植木

正彬

大正製薬株式会社総合研究所 大関 正弘 花田 和紀 横尾 千尋
岡崎

忠靖

村田

充男

徳島大学酵素科学研究センター 勝沼 信彦

7）筋ジスハムスターにおけるCANPインヒビターの分解

東京都老人研究所

川島

33

誠一

林

昌美

中村

愛

8) CANP遺伝子のクロー二ングに関する研究

35

─CANPインヒビターの阻害機構と阻害部位─
東京都臨床医学総合研究所 鈴木 紘一 川崎 博史 榎森 康文
西道

隆臣

反町

洋之

9) MEL細胞骨格タンパク質に対するCANPインヒビターの影響
国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫 石浦 章一 塚原 俊文

ⅰ3910) Recombinant Cystatin類の治療薬としての開発に関する基礎研究
徳島大学酵素科学センター酵素化学部門 勝沼 信彦 唐渡 孝枝 二川

三井東圧化学株式会社ライフサイエンス研究所 池

43

健

祥雅

11) E‑64‑cおよびESTの薬物動態

47

─蛍光HPLCによるモニター法の開発─
九州大学薬学部

大倉

洋甫

巣

文峰

甲斐

12）哺乳類横紋筋C‑タンパク質アイソフォーム:
二次元電気泳動法とイムノプロット法による解析
千葉大学理学部生物学科 丸山 工作 大日方 昂 小島
新保 和彦

雅亮

53

崇

13) CANP阻害剤の一般薬理学的研究

59─神経活動および筋電図の周波数分析に基づく呼吸筋機能評価法に関する基礎的研究─
東京慈恵会医科大学第二薬理学教室 福原 武彦 高野 一夫 木村 直史
加藤

総夫

65
14）骨格筋ミオシン軽鎖のラジオイムノアッセイによる測定法の開発
東京大学医学部第三内科
矢崎 義雄 永井 良三 磯部 光章
加藤 祐之

国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫
15) Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進行過程

67

─CTスキャンによる定量的評価─
国立療養所東埼玉病院内科 石原 傳幸 青柳 昭雄 儀式 三郎
川村
国立療養所東埼玉病院リハビリテーション科

潤

里宇

横田

明元

名慈

園田

茂

原

行弘

16）正常幼児の運動機能について

73

東京女子医科大学小児科 福山 幸夫 大沢真木子 斎藤加代子
新井

ゆみ

炭田

沢子

岡田

典子

鈴木

暘子

宍倉

啓子

平山

義人

17）筋ジストロフィー症患者の理学的評価法の再検討

79

東京大学医学部脳研病理 中野 今治
国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫
国立療養所東埼玉病院 石原 傳幸 熊井 初穂
国立療養所下志津病院

藤井

則子

土佐

千秋

石原

真弓

水野

京子

山崎

元義

武田

洋子

松村喜一郎
新潟大学脳研究所神経内科 桑原 武夫
国立療養所新潟病院

近藤隆春

国立療養所医王病院

崎田

朝保

本家

一也

国立療養所南九州病院

幸福

圭子

福永

秀敏

ⅱ

18) Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床的検討：

85

EST投与群5年目の経過とEST二重盲検試験の出発
新潟大学脳研究所神経内科 宮武
正 桑原 武夫 湯浅 龍彦
国立療養所新潟病院 山崎 元義 近藤 隆春

19）ベスタチン投与剤における筋疾患マーカーの変動について
国立療養所字多野病院 西谷89

裕 板垣 泰子 太田 光熙20）ベスタチンの血清LAPに及ぼす影響

L93

国立療養所兵庫中央病院

高橋

桂一

梅枝

孝之

森鼻

文朗

小林

浩子

村上

慶郎

岡崎

隆

梁

正淵

益田

喜信

林

英人

21）ベスタチンの長期投与について

97

国立療養所箱根病院

22）べスタチン服薬および非服薬DMD患者におけるT波の検討

103

国立療養所西別府病院 三吉野産治 江田伊勢松

Ⅱ．低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班分担研究者一覧ⅲ

109

分担研究報告

筋ジスマウスの前肢，後肢筋におけるプロテアーゼ変化の相違点
青 柳 高 明＊
研究協力者

和

田

孝

雄＊

小

永 井 真知子＊は じ め に島蕗子＊

原 田 滋 子＊ジェネートの3，000Ⅹg，20分間の遠心上清を用筋ジストロフィー症の発症ならびに進展の機いた．

序に，プロテアーゼの異常による筋蛋白崩壊が基質

重要な役割を演じていることが可成り明らかに酵素活性測定用の基質ならびに略語は下記になり，各種プロテアーゼ阻害物質を治療に用い示す．

る試みが，多くの研究者によって報告されていGlu・NA，L−glutamicacidβ−naphthylamide

る．筆者らは筋ジスマウスの前肢筋および後肢

hydrochloride；Arg・NA，L−arginineβ−筋のアミノペプチダーゼが有意に増加するこ

naphthylamidehydrochloride；Pro・NA，L−と1卜3），さらに患者血清中のアミノペプチダー

prolineβ−naphthylamidehydrochloride；Gly

ゼとエンドペプチダーゼが発病機序に異なる役−Arg・NA，glycyl−L−arginine

割を果していることを示唆した4）．

thylamide；Lys−Ala・NA，L−lysyl−L−alanine

β−naph−

今回の研究では筋ジスマウスの前肢筋およびβ−naphthylamide；Lys−Ala・NA，L−lysyl−L

後肢筋中のプロテアーゼ活性の動態を経時的にalanineβLnaphthylamide；Arg−Arg・NA，L追究した．また，エンドペプチダーゼに属する−arginyl−Larginineβ−naphthyl−amide；Gly−

各酵素に対しては基質特異性の高い合成基質を

Pro・NA，glycyトL−prOline

用い．さらに標的酵素の特異性を高めるため，

amide；Z−Arg−Arg・NA，N−Cbz−L−arginyl−

低分子酵素阻害物質の添加効果についても述べ

L−arginineβ−naphthylamide；ZrGly−Pro・る．

NA，N−Cbz−glycyl−L−prOline

β−naphthyト

β一naph−thylamide；Boc−Val−Leu−Lys・MCA，t−

実験動物

butyloxycarbonyl−L−Valyl−Lleucyl−L−lysine

筋ジスマウス（C57BL／6Jdy／。，）および対照

4−methy1−7−COumarylamide；Pro−Phe−Arg・マウス（C57BL／6Jdy／．and＋／．）は実験動物中

MCA，L−prOlyl−L−phenylalanyl−L−arginine4

央研究所より購入した．実験動物は生後1週か−methyト7−COumarylamide；Boc−GlnLAla−

ら11週まで，各週ごとに1匹宛屠殺したのち，Arg・MCA，t−butyloxycarbonyl−L−

直ちに前肢筋，後肢筋，心，牌，肝，腎を摘出glutaminyl−L−alanyl−L−arginine47methylT7−

し，−700Cで保有した．臓器は10倍量のphos−

COumarylamide；Suc−Leu−Leu−Va卜Tyr・phatebufferedsaline（PBS）の中で，組織ホ

MCA，SuCCinyl−L−leucyl−L−leucyl−Lvalyl−L

モジナイザー（Ultatrrax）を用いて1分間ホモ

LtyrOSin

ジナイズした．酵素活性の測定には，組織ホモ

Ala−ProTAla・MCA，SuCCinylTL−alanyl−L−

4−methyト7−COumarylamide；Suc−

prolyl−L−alanine＊微生物化学研究所

4−methylT7−COumar−ylamide；Boc−Ⅴal−Pro−Arg・MCA，t−−3−

結果および考察

butyloxycarbonyl−L−Valyl−L−prOlyトL−ar−

前肢筋および後肢筋の酵素活性を筋ジスマウ

ginine4−methy1−7−COumarylamide．
緩衝液

スと対照マウスで比較した結果，筋ジスマウス

酵素活性測定用の緩衝液は0．02M PBS

においてはアミノペプチダーゼが有意に増加す（pH7．2）を用いた．ただし，Post−Pro−Enzのることを認めた．筋ジストロフィー症において，測定には0．2MTris−HClbuffer（pH7．8）を用

アミノペプチダーゼの役割が重要であることをいた．

指摘1）・19）・20）した．さらに患者血清において，アミ酵素活性の測定

ノペプチダーゼ活性の動態は罷病期間と逆相関

ホモジネートの遠心上清画分は，それぞれのであったが，エンドペプチダーゼ活性は順相関

基質溶液および緩衝液を含む反応試験管（1．5×であった．疾病機序にユキソペプチダーゼとエ10cm）に分注し，370Cで1時間の反応を行っ

ンドペプチダーゼが異なる役割を果しているこた．Post−Pro−Enzについては，前述の緩衝液をとを示唆した4）．

用いて測定した．すべての酵素活性の測定には

今回は筋ジスマウスの前肢筋および後肢筋内3本の試験管を用い，その平均値を記載した．

のプロテアーゼの動態をアミノペプチダーゼ

各酵素活性の測定法および基質は表1に示す．

（7種類）とエンドペプチダーゼ（8種類）に蛋白の測定

ついて経時的に検討した．特に，エンドペプチ
ダーゼに属する各酵素に対しては特異的な合成

標準蛋白としてウシ血清アルブミンを用い，Lowry法17）で測定した．

基質を用い，さらに標的酵素の特異性を高める

酵素阻害物質ため，低分子酵素阻害物質の添加効果を調べ，

ベスタテン〔（2S，3R）−3−amin0−2−hydroxy−

それぞれの反応系を確立した．

4−phenylbutanoyl−（S）一Ieucine〕はAP，B，Leu−

図1にカリクレイン活性測定におけるベスタ

AP，triTandtetra−aminOpeptidaseなどを阻害

ナン添加の効果を示す．左図はカリクレイン蛋

する．

白量の変化を経時的に調べた．右図はカリクレ

統計

イン（40．76Jg）を用い，1同時に各種濃度のベ

多変量解析の一手法である主成分分析法18）

スタナン添加時の分解曲線の変化を示す．ベス
タテンは200JJg以上に加えても基質分解の低を用いて解析した．

下はみられず，直線的分解を示した．カリクレ

表l List ofthe proteasesmeasured and theirsubstrates
ReferenCe for
En王yIneAbbreviation

Substrate

aSSaymethod

CIu・NA

Arginine amimpeptidaSe（EC3．4．11．6I

AP−B

Ar9・NAPr0line h由ⅦPePtidase（EC3．I．11．5】

Pr0−1P

Pro・NA

DipeptidYlさmjnopeptjdasel（EC3．■．1I．1】

DAP−l

Gly−Arg・NA

Dipept】dyl aminopeptidasell（EC．4．川．封DAP−llLys−Ala・NA

8

Dipeptidy ammnopeptldase m tEC3．4．14．叫

DAP一日lAr9−Ar9・NA

9

Dipeptldyl amirのPePtidaSelV tEC3．4．11．5】

DAP−lV

GlrPro・NA

Cathepsin B（EC3，I．22．1】

Cath叫戚n B

Z−Arg−Arg・NA

ProlylモndopeptidaselEC3．l．21．26】

Post−Pro−EnZ

Z−Cly−Pro・NA

別asmh（EC3．I．21．7I

Plasmin

Boc−VaトLeu−LyS・MCA

Tksue ka‖ikrein（EC3．4．21．35】

Ka‖ikrモin

Pro−Phe−Arg・MCA●

Trypsin（EC3，I．21．4）

Trypsln

Boc−Gh−Ala−Arg・MCA

3

ChymotrYPSin任C3．q．21．りChy−try

SuC−LeurLeu−VaトTyr・MCA

LeukoCyte elastase（EC3，l．21．37】

臼aStaSe

Suc−Al才一Pro−Ab・MCA

rThrombin tEC3．句．21．5】

Thrombin

訓血叩呼tiddSe（EC3．I．11．7I

l

AP−A

Aspartat一∋

l
5
6
▲
U
■
さ
1
1
−
3
6

−4−

7

ヱ：⊂arbbenZOXy．boC：t−butYloxyCarbnyL Suc：SuCCjnyl

Boc−VaトPr0−Arg・MCA

筋ジスマウスの前肢，後肢掛こおけるプロテアーゼ変化の相違点
bn川汀t汀卜Iikd10・巧帽1◆臥細別ln
三〇∈d︼つ○︳ゝIP石ト YU三・PY・●王もJL

インの基質であるPro−Phe−Arg・MCAはカリ
クレイン以外のベスタナンで抑制を受ける酵素
により分解を受ける．それ故，カリクレイン活性の測定には200JJgのベスタナンを加えて行なった．
図2にはトリプシン，キモトリプシン，エラ

爪れ用

】○

】O lO StI印

行れスターゼ，トロンビンの分解曲線ならびにベス

X■mkrdn−lEk■■dIvityⅠ■tXPrB〜●d■■PrOtdn・COntent

図1

Effect of bestatinon Kallikrein−1ike

タテン（200〟g）添加時の分解曲線を示す．何れの酵素もベスタテン添加による影響を受ける

activity

が，特にトリプシン，トロンビンにおいて顕著

で︳トー巳p主YU苧ごく●■■Y●U−9UO凸

可Hと2Piくじ宇ゝトトこ■＞◆首J．ヨ一．UコSである．エンドペプチダーゼに対する合成基質
は特定酵素以外の影響を受け易い．それ故，特定酵素を阻害しない阻害物質を加えることが必
ChymOryP■∩−tIk●（坤g）

要である．
上述した結果に基づき，前肢筋および後肢筋
におけるプロテアーゼ活性を筋ジスマウスと対
照マウスとの間で比較した結果を表2に示す．

召Hと2P倉YU宇PY●2正三■＞・岩山

でHとePとーYU苧■︻Y・2㌢■■く・U⊃S

前肢筋についてみると，AP−A，DAP−Ⅰ，II，
IIIとIV，カテプシンB，Post−Pro−Enz，プラス
ミン，キモトリプシン，エラスターゼ，トロンビンなどが筋ジスマウウスで有意に上昇している．また後肢筋については，AP−A，DAP−I，
カテプシンB，プラスミン，トロンビンなどが筋ジスマウスで有意に上昇していることが認められた．

〇一一一｛D■Xtr●dこ＝＝＝￣￣1utrは◆kt暮t叫2叫9】
Entym■暮dlvltlq一円餅Prti事由■−prOtdnQDnttnt

図2

これらの各酵素活性の変化を一括して論じる

Effect of bestatin on various protease

ために多変量解析の一手法である主成分分析法

activities

を用いて解析を行った．第1主成分についてのProtease changesin forelimb andhind・
1imb muscles ofcontroland dystrophic
mice
SpociIic aCtlvity（nmoりmin仙g protein】±SD n＝11

ControI DPtrOPhy
AP一人
AP−B
Pr0−1P
DAP−l
DAP一日
DAP−HlDAP−IV
Cathepsin B

Contr01

0．538土0．095

0．，17±0．323▲●

0．5】1三0．211

7．066土1．028
1．001±0．375

Dystrophy

7．555土1．283

7．71出．帥】

0．粥2三 0．228▲▲▲
7．83把 2．Ol12

1．111±0．65！
0．691±0．413■▲暮

1．■09三0．711

1．272± 0．5tl6

0．077±0．075

8．305±1．71：け▲■

0．161！0．181■．322±1．11】

0．705±■．38■±1．25，

．】掴±

，801

1．555±0．727

2．2粥±0．810●

1．812三〇．877

1．377と0．836三0．粥l〇．Mt

0．627±0．306
3．099±2．066

0．9川±0．311▲
15．776±6．236▲▲■0．769三〇．I7：l

2．5IO±1．812

0．807■

98765432−8
23
T
−一4
Iう
PCIS人LORE

表2

岩

1

Po〜1−Pro−En王

1．631三〇．711

3．01把 0．96，

0．036±0．010．吊勺±0．511日
0．1【ほ±D．03l■●●

2．，5I±1．59】

Pla〜min

0．030±0．016

0．071三K8日lkn扇n0．0：用土．013

0．86（】±0．055

TrYPSin

0．058±0．039

0．09q±0．0■7

0．021±0．00，
0．035±0．03】

0．031± 0．015
0．063± 0．0q

ChYnlOtryP引nElastasモ

0．030三0．015

0．Oql±0．00，▲

0．826±8．012

0．033±

0．015

0．032±0．008
0．083三〇．Oq8

0．069三〇．825●★■

0．058三〇．013

0．073±

0．027

Throl¶bin

0．170±0．081t●

0．Oqq！8．01日l

0．107±

0．070●

・：Pく0．粥．・・

P＜0．01，tH：Pく0．001

2

3

4

5

6

7

8

〇．013▲▲▲

18

11

R：DAP一日＝〇・89．Thrombln＝〇・88，Trypsh＝〇・的．DAP−lV＝0，83

図3

Age related changesinmuscularenzymesindystrophicmice−5−9

碇（l瓜S）
因FCE．C 田HtN）．C 臣ヨF〔托．D 団HIND．D

11．】】能12．087▲▲

因子得点の週齢による変化を図3に示す．対照

口としたい．

マウスにおけるスコアは前肢筋および後肢筋を
文

とわず，週齢にともなって低下する．一方，筋献

ジスマウスでは第2週に1度上昇したのち低下

1）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，する．特に後肢筋において顕著であった．しかM．andUmezawa，I．：J．Clin．Invest．，67：

し，前肢筋では一旦上昇してからの低下度が少51−59，1981．

なく，常に後肢筋より高いスコアを示すことが2）Aoyagi，T．，Tobe，H．，Kojima，F．，

認められた．前肢筋の主な酵素の活性は後肢筋

Hamada，M．，Takeuchi，T．andUmeza−

より高いといえる．第1主成分と各種酵素とのwa，H．：J．Antibiot．，31：636−638，1078．

相関係数はDAP−ⅠⅠ（γ＝0．89），トロンビン

3）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Suda，H．，（γ＝0．86），トリプシン（γ＝0．84），DAP二ⅠⅤ

Hamada，M．and Takeuchi，T．：J．

（γ＝0．83）などが高い相関を示した．

Antibiot．，29：97799，1976．

この現象は，筋肉の萎縮がもっぱら後肢に起4）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，ることから一見パラドキシカルである．発病機

M．，Miyoshin0，S．and Umezawa，H．：

序とこの現象との関係を考えてみるに，プロテClin．Chim．Acta．，129：165−173，1983．

アーゼがこの疾病の主な原因とはいわないが，

5）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，

少くとも増悪因子に関与していることが示唆さ

M．，Okubo，M．，Masaki，Y．and Ume−

れる．対照マウスの週齢にともなう変化を正常

zawa，H．：J．Appl．Biochem．，と考えると，筋ジスマウスではこれらの酵素活

7：273−281，

1985．

性は生まれた時から上昇している．さらに，も6）McDonald，J．K．and Schwabe，C．：In

う1つの因子が加わると，プロテアーゼが筋蛋

proteinasesin mammalian cells and

白に作用し，萎縮を起すのではないかと思われtissues（ed．by Barrett，A．J．）EIsevier／る．しかし，一度萎縮が起ると，その筋肉細胞

North−Holland Biomedical Press，Am−の萎縮のために細胞内の酵素活性そのものも低Sterdam，p．p．314−322，1977．

下してしまうと考える．

7）McDonald，J．K．，Leibach，F．H．，Grin−deland，R．E．andEllis，S．：J．Biol．Chem．，

ま

と

め

243：4143−4150，1968．

筋ジスマウスの前肢筋および後肢筋における

8）Ellis，S．and Nuenke，J．M．：J．Biol．

15種類のプロテアーゼの動態を経時的に調べ

Chem．，242：4623−4620，1967．

た．エンドペプチダーゼに属する各酵素活性に9）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，

ついては基質特異性の高い合成基質を用いた．

M．，Osanai，M．，Imahori，K．and Ume−

さらに，上記の各酵素を阻害しないベスタテン

zawa，H．：Biotech．Appl．Biochem．，8：などを添加することにより，標的酵素の特異性

23−31，1986．

を高めた．筋ジスマウスでは前肢筋，後肢筋と10）Barrett，A．J．and Kirschke，H．：In

も対照に比べ，各種のプロテアーゼ活性が有意

methodsinenzym0logy（ed．byLorand，に増加することを認めた．主成分分析による解L．）Academicpress，NewYork，p．p．535

析では，DAPLII，トロンビン，トリプシン，DAP−561，1981．

一ⅠⅤと関係の強い成分が前肢筋と後肢筋との問11）Kato，H．，Adachi，N．，Ohno，Y．，Iwanaga，で解維することを認めた．これらのプロテアー

S．，Takada，K．and Sakakibara，S．：J．

ゼと筋萎縮との関連性を究明し，雉病解決の緒Biochem．，88：183−190，1980．

−6−

筋ジスマウスの前肢，後肢筋におけるプロテアーゼ変化の相違点

12）Nagase，H．andBarrett，A．：Biochem．J．，

enzymology（ed．by Lorand，L．）
AcademicPress，NewYork，Vol．80．p．p．

193：187−192，1981．

13）Kawabata，S．，Miura，T．，Morita，T．，

341−361，1981．

Kato，H．，Fujikawa，K．，Iwanaga，S．，

17）Lowry，0．H．，Rosebrough，N．J．，Farr，

Takada，K．，Kimura，T．andSakakibara，

A．L and Randall，R．J．：J．Biol．Chem．，

S．：Eur．J．Biochem．，172：17−25，1988．

193：265−275，1951．

14）Sawada，H．，Yokosawa，H．，Hoshi，M．

18）Kendall，M．：In multivariate analysis，andIshii，S．：Experientia，39：377−378，Charles Griffin and Co．，London，p．p．13

1983．

−29，1975．

15）Mumford，R．A．，Strauss，A．W．，Powers，

19）Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，

J．C．，Pierzchala，P．AリNishino，N．and

Aoyagi，T．andUmezawa，H．：J．Pharm．

ZimmermanM．：J．Biol．Chem．，255：2227

Dynリ4：184−190，1981．

20）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K．，−2230，1980．
16）Lottenberg，R．，Christensen，U．，Jackson，
C．M．and Coleman，P．L：Inmethodsin−7−

Kojima，F．，Nagai，M．and Umezawa，
H．：J．Pharm．Dyn．，7：312，321，1984．

mdxマウス骨格筋中で活性変化する
アルカリ・プロテアーゼの精製と性質
辻

研究協力者

繁 勝＊

楠 本 茂 夫■沢 田

均＊＊ので，粗ミトコンドリア画分中に存在する．前は じ め に進行性筋ジストロフィー症の骨格筋では症状者は20日齢のmdxマウス後肢筋を0．32M蒜

の進行に伴って種々のプロテアーゼ活性が上昇

糖液（pH7．4）中でホモジナイズし，14，000g，することが知られている．しかし，それぞれの30分間の遠心上清を分艶し，更に100，000g，90

プロテアーゼがどの様な形で疾病に関係してい分遠心分駈して得られた沈澱をミクロソーム分

るかについては不明な点が多い．これらプロテ画とした．ミクロソーム分画は更に0．1％アーゼ活性の中には症状の進行を70ロモートすBrji35を含むlMKCl液（pH8．0）で抽出し，るものもあり，あるいは発病に直接関与する活DEAE・セファローズ，ヘパリン・セファロー性増加もあり，疾病の発現に係わる機序は，かズ，アプロチニン・セファローズの順序でカラならずLも一様ではないと考えられる．我々はムクロマトグラフィーを行ない酵素精製を行な

ヒトDMDの疾患モデル動物やあるmdxマウった．後者は4ヶ月齢のmdxマウス後肢筋をスを用いて活性上昇を示す幾つかのプロテアー

同様にホモジナイズし，14，000g，30分遠心分

ゼについて酵素蛋白の精製および性質の検索を

艶後の沈澱を粗ミトコンドリア分画とした．粗行ない，それら酵素の筋ジストロフィー症発病

ミトコンドリア分画は更に1．5MNaCl液に関与する機序を探ると同時に，種々の酵素阻（pHlO．0）で抽出し，フェニール・セファロー

害物質を投与した際の治療効果のマーカーとしズ，LBTIセファローズの順にカラムクロマトて有用であるかどうかの検討を行っている．

グラフィーを行ない酵素の精製を行なった．
酵素活性測定実験方法

プロテアーゼ活性の測定はミクロソーム酵素

使用動物の場合は10JLM，Boc−Val−Pro−Arg−MCAを

C57BL／10−mdxマウスおよびその正常対照基質とし，pH8．5，370C，1時間反応後に遊放のC57BL／10系マウス・を実験に使用した．

したAMCを蛍光測定して求めた．一方粗ミト

酵素の精製

コンドリア分画の酵素活性はFITC一カゼイン

今回は2つのプロテアーゼ活性について酵素を基質とする方法と，5JLMのSuc−Leu−Leu−

蛋白の精製を行なった．いずれもアルカリ側に

VaトTyr−MCAを基質とする方法の両方を用至適pH域のある酵素で，1つは発症前の10Hいたが，いずれもpHlO．0，37℃，60分間反応

齢頃に活性のピークが現れるもので，ミクロソ

後，遊維物質を蛍光測定した．

ーム画分中に活性が認められ1），他は症状の進結果及び考察行に伴い4ヶ月齢頃に活性のピークに達するも＊和歌山県立医科大学第二生理学教室＊＊東京工業大学理学部生命理学科

酵素の性質
まずミクロソーム分画由来の精製標品では表ー9−

表l Summary ofpurificationofmicrosomal

表2

protease

Substrate specificities of

microsomal

protease

Step Proteim Activity Speciric AcL Yield（mg） （nmol／min）（mmol／min／mg）（％）

5

6

8
0

6

一100497321

7

2−

Aproti爪in−Sepharose O．034

0

3．2

Heparin−Sepharose O．084

5

DEAE−SephaTOSe

8

5．4

8

8．8

Crude extract・d﹁

9

100．000g ppt

Substrate（10JLy）

芽Ictivity

80￠−Yal−Pr0−lrg−1CA

100

TosTGly−Pr0−lrg−yCl

135

To6−6け−Pro−LH一lC1

32

Boc−Phe−Ser−1川一lC1380e−Leu−Thr−1柑−IC人

1
3

Glt−Gly−1川−lCl

くI

Doe−Leu−Gly−lrg一】C1

0
0

3

Boc118−Glu−Glr−1川−yCl＜l

Z−Pho一人用一一CA＜lPro−Phe一人rg−HCA

05︵80︑LX二二四筍≧﹂ロ一⊃Uむ一〇三

80C−Leu−Ser−Thr−1川一1CA

Boで−Y81−Leu−Ly＄−lCA

I＜1

Z−lrg一人rg−】CA＜l

Boc−Glu−LyいLys−】CA＜1

Bz一人rg−】CA＿＜1hg−HCA

＜l

40
45
50
55
FrQCtionN0．（1．1mL／fr．）〆かひ−、へ

図1Gelfiltrationofmicrosomalproteaseon′

イ

SephacrylS−300

ヽ

、、

′

声叫i芯豊
1の如く，トリプシン・インヒビターである770ロチニンを用いたアフイニティ・クロマトグ
ラフィーの抽出液中で，ミクロソーム画分の約40倍の比活性が得られ，17％のyieldを示して6

いた．この精製標品についで性質を検査したと

8

9

10

11

PH

ころ，分子量はSephacrylS−300ゲル濾過法で分画すると37±5Kであり（図1），〔3H〕で酵

7

図20ptimum pH range of

microsomal

protease

素蛋白をラベルしてSDS−PAGE電気泳動を行なった結果でも約35Kに位置することが認められたことから約35，000と推定された．基質特害されることからセリン・プロテアーゼである

異性については種々の合成基質を用いて検討しことが認められ，ヌアンチトロンビンⅠⅠⅠ，アプ

た結果，P2サイトには70ロリン残基，Plサイト

ロチニン，アンチパイン，ヒルジン，メシル酸にはアルギニン残基を要求するトリプシン型のガべキサート，ロイペプテンなどでも100％近70ロテアーゼであることが判った（表2）．又至い活性阻害を受けることが判明した2）．

適pH域はアルカリ側のpH9近傍にあり（図次に粗ミトコンドリア分画由来の精製標品の2），等電点はゲル内等電点電気泳動法により比活性を調べると表3に示す如く，LBTI−セ7

pH＝5．2であることが認められた．阻害剤に対

アローズクロマトグラフィー抽出液中で粗ミトする感受性テストではDFP，DMSFで強く阻コンドリア画分の約1，700倍になっていた．又−10−

mdxマウス骨格筋中で活性変化するアルカリ・プロテアーゼの精製と性質

表3

Summary of purification of proteasefrom mitochondrial fractionste， V。。me，，。tei。Ac．iv．t，三霊；Yierd（mt）

恥叫一誌ph訂00e96

LB¶−Sepharose l7．6（mg） （md▲MC／min）（・−旭川C／mn／吋 （％）

4．02

0．019

100

23

7．43

0．32

185

0．118

3．91

33．14

97

0

208

︵式︶Jl＞叫いじく

Crudeextract lOO

ー

6

7

8

9

，0

日

12

9
8
0
5

7

T・⊥工d

6

T︒⊥訳−首＞膏40

PH
O：crUdtI e■tr瓜Ct▲：du■tf≠omn、叩YlS叩lWOJ亡
0：pu川itd en■yrnO

図4

ChangesofoptimalpHrangeonpurifica−tion procedure

5するキモトリプシン型のプロテアーゼであるこ
0

5
10
15
20
Slice Number（2．5mm／sL）

0

1

2

3

4

5

とが示唆された．至通pH城の測定では図4の如く，精製酵素ではpH8．0〜9．5と，粗抽出液
6での至適pHより中性に近づいた値を示したこ

Gel（cm）

図3Isoelectric focusing of protease frommitochondrialfractionとから，生体内では酵素蛋白と結合して存在す
る内在インヒビターが至適pHをアルカリ側に引張り，活性を抑制しているが，インヒビター
が触れると，生理的条件下でも高い酵素活性がyieldは97％であった．

現われて来る可能性を示しているものと考えら

7ェニールセファローズ抽出液でのyieldがれる．

100％を大幅に越えているのは，酵素蛋白と結阻害剤に対する感受性テストではDFP，合した状態でインヒビターが内在し，精製の過PMSFで強く活性が阻害されることからセリ

程で分離したことを示している．

ン・プロテアーゼに属することが明らかである

次に精製酵素の性質を検討したところ，分子が，ヌキモスタテン，STI，LBTI，TPCKなど

量はSephacrylS−300ゲル濾過法でキモトリプ
シンA（25．2K）とほぼ同じ位置に乗ることがでも強く阻害されることが認められた．

判り，SDS−PAGEで電気泳動し，銀染色した結その存在が認められた内在インヒビターについ果でも25Kの所に単一のバンドが得られたこても検討を行なった結果この物質は図5に示さとから約25，000の単鎖ポリペプチドであるとれる如くLBTI−セファローズクロマトグラフ

推定した．又等電点はゲル内等電点電気泳動法

ィーの際の非吸着部分に抽出されるもので，分によってpI＝7．7であることが認められた（図子量1．2Kと60K以上の二つのフラクション

3）．更に基質特異性の検討結果からP2サイトにピークが存在することが認められた．そのうにバリン残基，Plサイトにチロンン残基を要求

ち圧倒的に量の多い1．2Kのものが主要なイ

一方，精製過程で酵素と分馳されることから−11−

Vat60X

20日齢以降に認められる急激な組織学的変化

ほOX fSぺ■5K2SKl15人

11

1

11

11

0
8
0
4
0
2

40

50

60

70

80

90

︵− 沢︶uOコ道三U一4030201 0−∈＼どこu虻10Ld

0
6

︵ −

0
0

30

Fr己CtOn Nl⊃．（1．4rnl／か）の際に主役の1つを演じている可能性が推測される．又正常マウスでは幼仔期にのみやや高い活性が認められることから，恐らくこの酵素は筋の成長期に特異的に働くものと推測されmdxマウスにおけるこの時期での急激な活性上昇が発病に一義的に関係している可能性は充分に考えられる．

図5Inhibitory effect ofunabsorbedfraction

一方，粗ミトコンドリア分画中の酵素活性は

toLBTLSepharoseonproteaseactivity

疾病進行に伴って活性上昇し，4ヶ月齢では正from mitochondrial fraction

常対照の約3倍の活性が認められた．又，精製

0u
3
・Oj
︵U苫OLdP∈︑∪盲二〇∈∪；号竜く

酵素標品を杉田らの方法3）で調整した筋構造蛋
白標品と混合してインキュベートし，経時的に反応液を採出して，SDS−PAGEで泳動させ，無添加の対照と比較する実験を行なうと，ミオシ
ン，アクチンなどの収縮系蛋白がすみやかに分解消失する状態が認められた．従ってこの酵素
は骨格筋中に存在し，収縮系蛋白を分解する機能を有していることが認められた．
ま

10

20

30

40

50

60

70

Age（dqY）

図6とめ

筋ジストロフィー症マウス（mdx）骨格筋において症状進行に伴って著しく活性上昇を示す

Age related changes of microsomal
protease activities from normal（Opencircle）and mdx（closed circle）mice

2つのアルカリ・プロテアーゼの精製を行ない，その性質を検討した．1つはミクロソーム画分
中に存在し，分子量約34，000，等電点6．3の糖蛋白からなるトリプシン様セリン70ロテアーゼ

ンヒビターで正常状態の体内では酵素蛋白と結であった．又活性の至適pH域は9．0〜9．5であ合し，酵素活性を抑制しているものと推測されった．mdxマウスにおいて，この酵素は10−30

る．

日齢の間に急激な活性上昇を示すことから，発酵素の機能病の早期の過程に強く関与している可能性が推

mdxマウス後肢筋からミクロソーム画分を測される．一方，他の一つの酵素は粗ミトコン

採出し，その中の酵素活性を日齢順に測定する

ドリア画分から抽出され，分子量約25，000，等と図6の如く10日齢頃から急激に活性が上昇

電点7．7の単鎖ポリペ70チドからなるキモトリ

し，25日齢頃から活性が低下し始め，40日齢頃

プシン様セリンプロテアーゼであった．又活性に正常マウスとほぼ同じレベルに戻ることが認の至適pH城は8．5−9．5であった．mdxマウめられた．一方正常マウスでは10日齢迄はややスにおいてこの酵素は症状の進行に伴ってゆっ

高い活性値を示しているが，15日齢以降になる

くりと活性上昇する，即ち通常は内在インヒビと極めて低い活性値を示す様になる．以上の結ターと結合した形で存在するため，生理的状態

果からこの酵素はmdxマウス骨格筋においてでは低い活性を示すが，疾病進行の過程で，イー12−

mdxマウス骨格筋中で活性変化するアルカリ・プロテアーゼの精製と性質

ンヒビターが遊維する状態になると酵素活性がデルマウスにおけるAlkaline Protease活上昇するものと推測される．又，この酵素は，性の変化．厚生省特定疾患「難病の疾患モ

玩乙新和で主要な収縮系蛋白を分解する機能を

デル調査研究」珪昭和59年度研究報告書，有することが認められた．以上の結果から2つ

p．p．123−127，1985．

のプロテアーゼ活性は，ともに疾病に深く関与

2）Sawada，H．，Tsuji，S．，etal：FEBSLett．，

していることが考えられ，新薬の治療効果を検定する際のマーカーとして有用なものと考えら

199（2）：193−197，1986．

3）Sugita，H．，Katagiri，T．et al：Basic

れる．

ResearchinMyology（edbyKakulas，B．A．）
Excerpta Medica Amsterdam：p・p・2917
文

1）辻

献

297，1974．

繁勝：幾つかの筋ジストロフィー症モ−13−実験的筋炎モデル動物の作製に関する研究
一自己免疫筋抗原の筋組織内分布と精製の試み一
里 書 栄二郎＊
研究協力者

古 川 昭 栄＊新 井 左衛子＊

多発性筋炎（polymyOSitis：PM），皮膚筋炎

加 茂

功＊

著者らはこれまでにこの種の抗原物質が筋肉（dematOmyOSitis：DM）は筋肉に特異的に細や心筋に存在することを明らかにし，さらに，

胞障害性免疫反応が認められる1）・2）．これら疾患

この抗原に対するモノクローナル抗体を作製し，の発症機構は未だ不明であるが，自己免疫疾患

抗体や抗原分子の特性を生化学的に明らかにしの角度から研究されている．本研究はこれら疾た．本年度は1）モノクローナル抗体を用いて筋患の病態をよく反映する実験的モデル動物を作

抗原の筋組織内分布の同定，2）77イニティク

製し，低分子酵素阻害物質の発病抑止効果，治ロマトグラフィーによる筋抗原の精製を試みた．

療薬としての効果を検討するのが目的である．
PM，DMでは筋肉が特異的にリンパ球によ方法

る細胞浸潤を受けることから，筋肉にのみ特異ラット筋肉からの抗原物質の抽出法，抗原活的に存在するなんらかの成分が自己免疫反応の性の測定法はすでに報告した方法7）によった．

標的になっていると推定される．これまでにモノクローナル抗体の調製法は昨年度報告した．

PMやDMに兄いだされている自己抗体とし筋抗原の筋組織内分布ては，抗ミオグロビン抗体3），抗ミオシン抗ラット排腹筋を液体窒素で冷却したイソペン体4），抗核抗体5）があるが，疾患特異性が低いとタンで急速冷却し，タライオスタットで10〟m

されており，PM，DMの発症の引金となる抗原切片とした．この筋組織切片を一200C冷却アセ

物質は他に存在すると考えられる．

トンで5分間固定し，0．5％スキムミルクに30

重症筋無力症（myastheniagravis：MG）は神経・筋シナプス後膜に特異的に存在するアセチ

分間浸してブロッキングした．その後，筋抗原に対するモノクローナル抗体1E7，7D9を2．5

ルコリン受容体（AChR）に対する抗体が産生さ−20JJg／mlの濃度となるように，10％ラット血れ，その抗体によってAChRが障害される疾患

清，10％ブタ血清，40％ウマ血清を含む0．01Mと考えられている6）．しかし，MG患者血清中にTris−HCIbuffer（pH7．6）で調製し，切片上には未だ未同定の筋肉抗原に対する抗体が高頻度

滴下して40Cで2日間反応させた．コントローに存在している．PMやDMでみられる筋特異

ルにはマウス血清またはマウスIgGを用いた．

的リンパ球の浸潤を考慮するとき，著者らはこ

次に抗体を除去，洗浄後，示適濃度のビオテン

れらの抗原物質の中に，細胞性免疫反応の標的化抗マウスIgG抗体，ストレプトアピジン標識となる物質が存在するのではないか，また，そhorseraddishperoxidaseを順次室温で90分間の抗原物質は筋膜または，筋特異的細胞外マト反応させた後，3−aminoT9−ethylcarbaszole，

リックスに存在するのではないかと考えた．

H202で発色させた．
筋抗原のアフイ二ティクロマトグラフィー＊国立精神・神経センター神経研究所

1）抗体カラムの調製：1ml体積のproteinA−15−

1mlを流してIgGを結合させた．1MMaClを○−雪u〇三ルモノクローナル抗体5E4を含むマウス腹水● TD OC 8

M M Oj M︒

抗筋抗原モノクローナル抗体7D9，コントロー○宣○菖●■宝■結合樹脂（Bio−Rad，MAPS）2本にそれぞれ，

含む0．05Mphosphatebuffer（pH6．5）でよく洗浄後，樹脂を取り出し，10mM1−ethy1−3−（3区11−dimethylaminopropyl）carbodiimide中で30分間反応させた．この処理によりproteinAとIgGが共有結合で架橋される．樹脂をよく洗浄
後，再びカラムに充填した．
2）アフイニティクロマトグラフィー：カラム

7 t）9

1E T

h

0 −℃ 一々0

10 1 1 0

1 0 5 1 0 ● 10 】 10 2 1 00

10 7 1か

1も5

10 4 10 3 10 2 1 0

2種のモノクローナル抗体の筋抗原との結合様式
右：モノクローナル抗体7D9を固相化し筋抗原と反応させた後，ビオテン化した1
E7（○）または同7D9（●）と反応させそれらの結合性を調べた．ストレプトアピジン
標識ベータガラクトシターゼを結合させ，結合した酵素活性によって，結合ビオテン化抗体を定量した．
左：モノクローナル抗体1E7を固相化し
た．
以下同じ．

を順次，1MNaClを含む0．1Mboratebuffer（pH8．6），0．1Macetatebuffer（pH5．0）で洗浄し，0．1M Tris−HClbuffer（pH7．6）で中和した．ゲルろ過で部分精製したラット筋抗原画
分を，抗体カラムに約5時間かけて通した．洗浄に使ったと同じbufferで非特異的結合物質
を除き，0．17M glycine−HClbuffer（pH2．3）

認識していることが確かめられた．抗体の役割

でカラムから溶出した．溶出液は直ちにNaOH

を逆にすると結合が起こらない理由は不明であで中和した．溶出液の抗原活性はモノクローナ
ル抗体で，蛋白組成は5−20％濃度勾配ゲルによるが，固相1E7と結合した抗原分子上の7D9
エピトープが固相面側に向いてしまい，7D9抗るSDS電気泳動で調べた．

体が入り込めない状態になっているのかもしれ
ない．

結

果

筋抗原の筋組織内分布2種のモノクローナル抗体は同一分子を認識す

モノクローナル抗体lE7，7D9は基本的には同一の組織染色パターンを示した．コントロ

る

モノクローナル抗体1E7，7D9が認識する分子は同一らしいこと，しかも認識エピトープール抗体や血清では特異的染色はみられなかった．

が全く異なることはすでに昨年報告した．さら

図2は筋線経の走行方向に対し直角よりややにこのことを確認するため2種のモノクローナ

斜めに切断した切片をモノクローナル抗体7

ル抗体の一方を70ラスチックの表面に物理吸着

D9で染色した時の典型的なパターンを示す．

させ，抗原を反応させた後，ビオナン化したも筋膜か細胞外マトリックスかは明確ではないが，う一方の抗体が結合するかどうかを調べた．図

筋線経を取り囲む構造体と，筋線維内の横紋構

1右に示すように，7D9を固相に用いた時，ビ造に特異的な染色がみられた．位相観察下で横オテン化1E7のみが十分に結合した．7D9は紋構造がみえない筋線椎は内部構造の染色がみ結合しなかった．また1E7を固相に用いた場

られなかった．一万，線維走行方向に平行に切合は1E7，7D9のいずれもほとんど結合しなった切片でも，筋線経の外側と内部の横紋構造

かった（図1左）．固相化された7D9抗体に結が染色された．モノクローナル抗体1E7でも合した抗原分子に，さらに1E7抗体が結合しほぼ同様な結果であったが，筋線維周囲の染色たことから，この2種の抗体は同一抗原分子を性が弱い傾向があった（図3）．この染色性の微−16−実験的筋炎モデル動物の作製に関する研究

5
4
3
2
1

2

3

4．5

6

7

8

910

1

2

3

4

5

6

7

8

910

図4 モノクローナル抗体結合カラムからの筋抗原物質の溶出とその電気泳動パターン
方法は本文に示した．A：コントロールカ
ラムからの溶出，B：モノクローナル抗体
7D9カラムからの溶出，実線は280nmでのタンパク質の吸収を，棒グラフは抗原活性の強さを表す．抗原活性は任意の値を示すのに必要な溶出液の最大希釈倍数で示してある．
図中の写真はA，BともtubeN0．2を電気泳動したものである．

モノクローナル抗体7D9による筋組織内の抗原分布
筋線維走行方向に対し直角よりやや斜めに切った切片．他の方法は本文に示した．拡
大倍率200×

ムに固相化したコントロールカラムを作り，同様の操作を加えた．カラムからの溶出パターンと溶出液の電気泳動蛋白染色パターンを図4に示す．コントロールカラムからもわずかに活性物質が溶出したが，7D9カラムからはそれより多くの抗原活性が回収された．いずれも電気泳動では複数の蛋白質バンドが認められたが
図3

モノクローナル抗体1E7による筋組織内の抗原分布
筋線経の走行方向と平行に切った切片．方法，条件は図2と同じ．

7D9カラムから特異的に溶出されたバンドは一種類しかなく，分子量210Kを示した．回収された活性の強さ，210K蛋白のバンドの濃度を検討した結果，この分子が筋抗原物質である可能性が高いと思われる．さらにいくつかのク

妙な違いは認識エピトープの違いに起因するとロマトグラフィーを重ねることによって完全精考えられた．すなわち，膜系構造部分と横紋構製を達成したい．

造部分とでこの筋抗原の存在様式が異なること

ミオシンと筋抗原の比較を反映しているのかもしれない．

1）筋抗原モノクローナル抗体は筋組織中の抗体アフイ二ティクロマトグラフィーによる抗横紋構造を認識すること（図2，3），2）アフイ

原物質の精製の試み

ニティクロマトグラフィーで特異的に結合，溶モノクローナル抗体7D9を樹脂に園相化し，出する分子の分子量が210Kであること，3）古抗原物質をア7イニティクロマトグラフィーにくから抗横紋筋抗体の抗原と考えられてきた，

よって精製しようと試みた．非特異的結合が無ことなどから，著者らの検討している筋抗原物

視できないと思われたので比較のため筋肉成分

質はミオシンH鎖ではないかという可能性が考を認識しないモノクローナル抗体を同様にカラえられた．そこで，八木8）の方法でミオシンを調−17−︿口︶研一でコご空一室V

5・
1
0
15
00
丁●﹂∈u冨N︼几⁚︒UUg古省く

図21

製し，モノクローナル抗体と筋抗原との結合を

R．：Clin．Exp．Immuno1．，18：39，1974．

阻害するかどうかを調べた．その結果，ミオシ2）Haas，D．C．andArnason，G．B．W．：Archs．

ンには阻害活性がないことが判明した．

Neurolリ31：192，1974．

3）Nishikai，M．andHonma，M．：Lancet，2：
考察

1205，1972．

以上の結果から，1）筋抗原物質は横紋構造

4）Wada，K．etal．：Clin．Exp．Immuno1．，52：と，筋線維周囲に存在する，2）分子量は210Kである，ことが明らかになった．また結果には

297，1983．

5）Nishikai，M．andReichlin，M．：Arthritis

示さなかったが，予備実験では抗原活性を含む

Rheum．，23：881，1983．

ラットまたはヒト筋肉画分をルイスラットに免6）Vincent，A．：Physiol．Rev．，60：756，1980．

疫すると筋力低下を引き起こすことが観察され

7）Akazawa，S．，Furukawa，S．，Kam0，I．，

た．今後，物質としての同定と，モデル動物作

Furukawa，Y．，Satoyoshi，E．and Haya−

製実験に力を注ぐ必要がある．

Shi，K．：J．Immunol．Methods．，94：161，
1986．

文

8）八木康一：生化学実験講座，筋肉，東京化

献1）Goust，J．M．，Castai騨Ie，A．andMoulias，−18−

学同人，1974，p．3．

1．べスタテンの筋細胞膜安定化作用に関する実験的研究
2．ベスタテン二重盲検試進歩状況
木 下 眞 男■

研究協力着

岸

雅 彦＊

池

田

虫

栗 原 照 幸＊＊

日 高 隆 信＊高 宮 清 之＊

rtエコ
■lこ■ヽ

1．ベスタチンの筋細胞膜安定化作用に関する
実験的研究

加えて，30分後に筋細胞内記録を行ない，短時間における筋細胞への直接作用も検討した．

1975年，梅沢らによりStreptomycesolivor−

1対象につき60〜100本の筋線経の静止膜電eticuliの培養液より発見されたアミノペプチ位を測定し，ヒストグラムを作成した．さらに，

ダーゼB阻害剤，すなわちBestatinは，免疫担週齢を合わせた各対象の静止膜電位に対し当細胞の表面に作用し，免疫調整作用を示すこWilcoxon検定を施行し，Bestatinの効果につとが知られており，低毒素の抗癌剤として臨床いて検討した．

的に使用されている．さらにBestatinの持つプ
ロテアーゼ阻害作用が筋ジストロフィー症の筋結果崩壊を抑制する可能性があることより，モデル

正常controlのBlO mouseの静止膜電位は動物への効果や臨床効果が検討されている．

平均一86．1mVで，ばらつきは少なかった（図我々は，微小電極法を用いて，Ⅹ−linkedmuscu−

1）．しかし，mdxmouseでは静止膜電位の低lar dystorophy（mdx）mouseにおけるBes−

い筋線経が正常に較べて多く見られ（図2）全体

tatinの効果を検討したので報告する．

としての静止膜電位も平均−78．3mV，−76．6

方法

対象として，4週齢，8過齢のmdx mouseを使用した．Bestatin治療マウスは，Bestatin
lmg／dayの腹腔内投与を一週間続けた．8週
齢のマウスには，生食0．5cc／dayの腹腔内投与を一週間施行し，これを対照とした．正常対照としては，C57BL／10Sc（BlO）mouseを使用した．これらのマウスの横隔膜標本を作成し，95％02と5％C02の混合ガスで酸素化した
Tyrode溶液に浸しながら3MKClを満たした
ガラス管微小電極を用いて筋細胞内記録を行なった．その他4週齢のmdx mouseを使用し，BestatinをTyrode溶液250mlに対し10mg

50

60

70

80

90

100

RMP（−mV）

図1＊東邦大学医学部大橋病院第四内科−19−

BlO mouseの静止膜電位（RMP）

本数

本数

5適齢

表1 各対象での静止膜電位，及びburst頻度

9週齢

RMP（−mV）
n＝100

mean＝−76．6mV

8 10 m o use

S．D．＝8．80

25

50

60

70

図2

80

901【）O
RMPトmv）

無 処理

6

30

79 ．
9

5．
02

無 処王
里

15

40

85 ．
1

4．
22

5

無 処理

36

100

86 ．
1

3．
82

9

m dx m ouse（in vivo ）

血皿
50

60

70

無処 王
里

28

30

73 ．
6

6．
82

無処 理

34

102

78 ．
3

8．
91

−ll
25

無処 理

58

103

69 ．
9

9．
63

25

無処 理

70

40

76．8

7．
03

柑

投与

71

100

76．6

8．
80

20

bestat n投 与34

60

84．1− 5 ．
85

13

besta in投 与

35

67

84 ．
9● 4．
50

17

besta in投 与

64

60

84．
7

3．
43

7

besta in投 与

65

66

87．1● 4．
68

11

saline80 90100
RMP（−mV）

mdx mouseの静止膜電位（RMP）

mdx mouse＊WHcoxontest：p＜0．005

一一十川
4適齢mdxmouse（日．8g）
本数
∩

∩

：100

45

mean：−78，1mV

insertionofeIectrodeS．D．：8．40

S．D．：7．84

30

甘地：；

WithdrawaIofelectrode

RMP（mv）

図3

NormalTyrode清涼

mdx mouseでの連続発火

5週齢（6．5g）

本数
30

図5

：115

mean：−82．9mV

」
50

60

70

80

90

lOO

RMPトmv）

Bestatin加Tyrode溶液（10q／250L，）in viiroでのBestatin投与によるmdx
mouseの静止膜電位（RMP）の変化

9週齢（16g）∩＝66mVと有意な低値を認めた．（Wilcoxon test：

mean＝一87．1mV
S．D，＝4．68

P＜0．005）

また，mdx mouseでは電極刺入時に連続発
火（myotonicburst）が高頻度に認められ，これはBlO mouseではほとんど認められなかった
（図3）．
50

60

70

80

90100

RMP（−mV）

図4

50

60

70

80

in vivoにおいてmdx mouseにBestatinを90108

RMP（−mV）

mdx mouseの静止隈電位（RMP）−Bestatin投与後−投与すると，静止膜電位の低い線経は見られな
くなり，全体としての静止膜電位は平均−84．9
mv，−87．1mVと正常化する傾向を認めた（図−20−

1．ベスタナンの筋細胞膜安定化作用に関する実験的研究 2．ベスタナン二重盲検試進歩状況

4）．そして，電極刺入時のmyotonicburstのー症の治療薬としてBestatinを考える上で，プ頻度も減少した（表1）．

ロテアーゼ阻害作用に加えて，この筋細胞膜安in vitYVにおいてmdxmouseにBestatinを定作用は重要であると考えられた．

投与した場合も，九日戒財と同様に，静止膜電位

Bestatinがdy／dy mouseに有効であったとの低い筋線椎の減少と，全体としての静止膜電いう報告4）において用いられた薬量は0．4mg／位の有意な上昇，およびmyotonicburstの減少

dayであり，我々の実験で用いた薬量の約半分を認めた（図5・表1）．

である．しかし，臨床的に用いる場合，我々が用いた投与量は約100mg／Kg／dayとなり，抗考察

癌剤として臨床的に用いられている量と比較す

我々の用いたmdx mouseは，形態学的にもると，100倍近くの投与量となる．Bestatinは副筋線経の変性と再生が認められる時期のもので作用の少ない薬剤であるが，臨床応用に向けてあり1），mdxmouseにおいて認められた筋線経

薬用量についてはさらに検討が必要と考えられの静止膜電位低下は変性・再生線経における筋る．

細胞膜の異常を反映していると考えられる．又，文

電極刺入時に認められるmyotonicburstも，同

献様に筋細胞膜の異常により生じていると考えら

1）Bulfield，G．，Siller，W．G．et al：Ⅹ

れている2）．Bestatinは，mdxmouseの低下しChromosome−linkedmusculardystrophy

た筋細胞膜の静止膜電位をBlO mouseとほと（mdx）inthe mouse．Proc．Natl．Acad．

んど変わらない状態まで回復させ，myOtOnic

Sci．，81：1189，1984．

2）栗原照幸ら：mdxマウスにみられる

burstを抑制した．
Bestatinの作用機序として，筋ジストロフィ

myotonic burstの筋細胞内記録．厚生省

ー症において活性化されているプロテアーゼを「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ

阻害し，筋変性を予防する効果が考えられていフィー症及び関連疾患の病態とその病因にる．しかし，この効果だけで今回我々の実験に関する研究（杉田珪）昭和62年度研究報告

おいて得られた結果を説明するのは困難と思わ書，1988，p．227．

れる．invitroでのBestatin投与では，30分で3）Umezawa，H．，Aoyagi，T．etal：Bestatin，

その効果が現われていることより，Bestatinはaninhibitor of aminopeptidase Bpro−

筋細胞膜に直接作用して，膜安定作用を発現す

duced by actinomycetes．J．Antibio−

るものと考えられた．

tics，29：97，1976．

Bestatinは，免疫担当細胞の表面に結合し，4）Tsuji，S．，Matsushita，H．：Successful

免疫賦活作用を示す事が知られているが3），

treatmentofmurinemusculardystrophy

mdx mouseの筋細胞膜にどのように働いていWith the proteaseinl1ibitor Bestatin．J．

るのかは不明である．しかし，筋ジストロフイ

Neurol．Sci．，72：183，1986．

−21−

2．ベスタテン二重盲検試験の進歩状況

表1

表1に示すように，昭和62年より29施設に組

おいてベスタテン二重盲検試験を実施中である．

治壊代表者
事 拉 局
軒店弄え

登録症例数は115例，現在までに66例が試験を終了，そのうち3例は脱落例である．試験継続例は49例で，全部が終了するのは平成元年10月の予定である．解鐘は12月に行い，平成2年

織

国立柏神・神注せンタ一
東邦大字医学部局l内科
東京女子医科大学小児持皇書架二郎

回立蘇糞所存捉病院
国立畏糞所宇多野病院
国立療養所兵■中央病院
国立廉暮所西別府病院
コンIローラ一 変姓大字医学部

村上 慶応

木下 真男
棺山 手夫
西谷 絡
井棟 柱一
三青野星治
小川 暢也

拾現設

早々には最終結論が出る予定になっている．
現在各症例とも10m直進歩行時間，起立時

E土豪暮所八壬病院

鏑 丘二

北濱遭社会事暴追会帯広病院 井は 景

神戸市立中央市民病院 青田三恵子▲取入苧医学部
竹下 研三間などで緩徐な症状の進行を示唆する数値を示

日立蜜暮所酉多責病院

山本 文哉 国立廉暮所涙病院

亀尾 等

巨立療暮薪若木病院

秋元 鐘巳 国立療養所筐鳥病院

松定 量

しており，また血中CKは特に3歳以下群で上東京拡立神経素R

水野 美音 変温大字医学部

長尾 秀夫

E立療養所幹度病院

飯田 光男

幕知医科大事▲支 染付

市立岡持病院

袴田 事

斉知県立子息瓦江口粛東大

浜松医科大学坂本 政信 祐阿大学医学部

講習 昭久

福井医科大学平山 幹生 福耳市立ことも病院

花井 敵男

名古且市立支市民席院

三池 輝久

官立慮糞所刀扱山窮抗

鼠買 弘腐 久官米大学医学部
萎
造
大分医科大学

国立療養所西奈良柄抗

岩壇 克己 国立療暮所沖且病院

中川 正法

昇傾向を示している．全体として疾患の進行度は緩徐ながら明らかと考えられる．
副作用は11例に見られているが，軽度の消化器症状を示すのみであり，薬剤特異性に乏しい．

台台験方缶三受裟文

−22−

2

9

平松公三郎

蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究
藤 井 節 郎＊研究協力者

白 坂 曹 彦＊山 田 晴 雄＊与する上記各筋疾患の治療の可能性についてもは じ め に本来，蛋白分解酵素の生理的役割とその活性考察したい．

発現は複雑な生体のネットワークによってその実験方法

恒常性が保たれているが，そのバランスに異常が起きると種々の疾患が生ずることになる．筋

1）動物および試薬

ジストロフィーの発症成因においても，蛋白分
解酵素の関与が明らかになり，その特異的阻害（NZBxNZW）Flマウス（B／WFlマウス）は，交配飼育後に雌を使用した．

剤の使用により治療効果が認められつつある事は周知のところである．

FUT−175（6−amidin0−2−naphthyl pTguanidinobenzoate dimethanesulfonate；

前回までにわれわれは，蛋白分解酵素の基質

nafamostat mesilate；FUTHAN）は鳥居薬品

特異性を始めとする生化学的諸性質を明らかに㈱より提供された．FUT−175の構造式とそのする目的で，各種酵素基質の合成とその測定方

生化学的特性を図1および表1に示した．

法の確立，および特異的な蛋白分解酵素阻害剤

ステロイド剤のPrednisoloneとDexameth＿であるFUTL175やFUT−187の開発とその臨

asoneはそれぞれSigma社，．Schering社から

床応用に則した基礎的検討について報告した．

入手した．

Duchenne型筋ジストロフィーを始めとする
各種筋疾患の中で，ⅠⅠⅠ型アレルギーにもとづく

ニyNH⑦C00

筋疾患には多発性筋炎や皮膚筋炎があり，その治療には抗炎症剤（副腎皮質ステロイド）や免・ZCHβOIH

分子式：C．，H．，N，0，・ZCH，SO，H（539．58）

疫抑制剤が使用されている．ⅠⅠⅠ型アレルギーは

図1

免疫異常を基盤とした自己免疫疾患で，自己抗FUT−175の構造式体により免疫複合体が形成され補体系が活性化
表l FUT−175の蛋白分解酵素阻害活性されることなど，液性および細胞性免疫に異常が認められている．

酵

そこで本研究においては，補体系の関与する

檜体系のプ■チアーゼ

ⅠⅠⅠ型アレルギーの代表的な自己免疫疾患である
全身性エリテマトーデス（SLE）の動物モデ

血空中のナ■ナアーゼ

墓穴

50％阻害濃度
日DW：M）

ん：−▲rrmtltlyl亡l亡rCi；▲亡−Trr−tlhyltll打DF■：tOr8

1．lx10−t8bu−Al■一ATr■一mlpllltけIqkr

5．8〉（lM

CYF・Bbkせ−▲t▲一人r■−■−11llhlbyl餌l即

I．3×10→lxlO▼−
Ll＞【10イ

XII▲
Ⅹ▲

ル，（NZBXNZW）Flマウスを用いて，ループス腎炎に対するFUT−175の効果について検討を素Cri

B■−p●一七Iu−▲叩−pN▲

乙IxlO￣ヽI■ソどこ′

Phトpip−▲rrpN▲■8〉り○▼lナナスモシ

Yd−hu−Ly−pNA

l＿○×10−Tカl′レイソPr一m一山才一PNAl OxlO→

その也ブ●チアーゼ■カl′レイy T叫一山rmlhylt，ttr HxlO→

Ilナシy T昭一▲∫rmt抽yl飼t亡r l．9×10■

行った．併せて，得られた知見から補体系の関

カナナシy AB．qD．札LG

1陣幕血反応＊㈲大阪基礎医学研究奨励会
−23−

＞lM
7．1xlO→古人巾跳も，×10−●

事284

5．lxlO一丁表2

B／WF．マウスにおけるFUT−175の予防効果実験の系

る3）．
1 2 41）B／WFlマウスのループス腎炎に対する
FUT−175の予防効果
高重度の蛋白尿（＞300mg／dl）群に対して

2

FUTT175は400mg／kgの投与によって発症を＋000000151300

表3補体を活性化させたラット脚浮腫に対してもFUT−175は抑制効果のある事が認められていGroup Trealment Dose（mg／kg）

C None（Control）
FI FUT−175（p．0．）
F2
FUT−175（p．0．）
F3
FUT−175（p．0．）
h FUT−175（i．p．）
DI Dexamethasone（p．0．）
D2
Dexamethasone（p．0．）
F2Dl FUT（P．0．）＋Dexa（p．0．）

素を強力に阻害する2）．また，Zymosanにより高頻度に抑えた（図2）．一方，Dexamethasone

B／WFlマウスにおけるFUT−175の治療効果実験の系

は3mg／kgの投与により潜血を10％以下に抑制した．更に，表4に示した様にBUN，Ht，形
態学的変化に対しても上記用量およびFUT−Group Treatment Dose（mg／kg）

175（200mg／kg）とDexamethasone（1mg／kg）
Cの併用により改善が認められた事から，腎機能

None（Control）

F皇

FUT−175（p．0．）

F与FUT−175（p．0．）や糸球体障害の改善が推測される．糸球体へのFi FUT−175（i．p．）
Di Dexamethasone（p．0．）
F皇Di FUT（p．0．）＋Dexa（p．0．）

IgGおよびC3の沈着は蛍光抗体法による測定

1
200＋1

により，Dexamethasone（3mg／kg）に効果が認められたが，ANA価に対しては両薬剤ともFUT（p．0．）＋Dexa（p．0．）

効果がなかった．

2）動物実験

2）B／WFlマウスのループス腎炎に対する

自然発症性自己免疫疾患動物であるB／WFl

FUT−175の治療効果

マウスは，6月齢でループス腎炎を呈するので，

表3の実験系で週6回投薬による2ヶ月の治

FUT−175による発症予防効果は表2に示した
方法で4月齢より開始し4ヶ月間投薬を行った．

療期間で，FUT−175（400mg／kg）は蛋白尿，
潜血ともに低頻度であったがDexamethasone

更に，FUT−175の治療効果を判定する実験でには効果が認められなかった（図3）．表5の結は，6月齢のマウスより開始し2ヶ月間投薬し果から，高用量のFUT−175（400mg／kg）は治た（表3）．

療に対しても効果があり事実，組織病理学的所

3）血液および生化学的検査

見においてもFUT−175は糸球体障害を軽減し

Ht，BUN，ANAおよび蛋白尿，潜血は骨法により測定した．

ていた．この様な現象はDexamethasoneにおいては認められなかった．

4）組織病理学的検査

以上の結果からFUT−175は，ヒトのSLEモ

マウス各組織はPAS染色により検索した．

デルとしてB／WFlマウスのループス腎炎に対糸球体腎炎の重度判定は1−4十に分画し，重して，予防および治療効果が認められた．実験

度3−4＋は，致死に及ぶ範囲である．

系の中で，薬剤の腹腔内投与で効果が弱かった
理由としては，薬剤の半減期に起因する血中濃結果および考察

度の低下が考えられる．また，FUT−175のマウ

本研究の詳細はわれわれが既に報告している1）．FUT−175は表1に示した様にトリプシ

スにおける安全性については，400mg／kg以下の用量で消化管障害および体重変化は認められ

ン，カリクレイン，プラスミン，トロンビンをていない．

始め補体系のClf，ClSなど各種蛋白分解酵−24−

ループス腎炎を含むSLEの治療には，炎症蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究
Group（mg八gI
ConIrol lCI

FUT H00日Fn
FUT（200日F2）
FUT（400日F3I
FUT（15）（F4）

Dox8日）（DHDoxO（3）（02）
FUT＋Doxo（F2DlI（200日l）
100

50

0

0

50

％

100

％

Percentagesofproteinuriaandoccultbloodineachgroupareindicated：（□）proteinuriagreaterthanlOO
mg／dl；（T）proteinmiagreaterthan300mg／dl．●Significanceofdi能renceinresultsbetweentreatedandnon−treated（COntrOl）
groups（P＜0・05）・ ．SigniBcanceofdi恥renceinresultsbetweentreatedandnon−treated（COntrOl）groups（P＜0・01）．

図2

表4

蛋白尿と潜血に対するFUT−175の効果

B／WFlマウスのループス腎炎に対する
FUT−175の予防効果
Glommta−d亡阿川5Group（m＆tg）（m釘d】）（7分

ANAtll−t lgG C】

表5

B／WFlマウスのループス腎炎に対する
FUT−175の治療効果

D亡gmOr

Tr亡atment BUN Ht
Group

dama騨

（m＆rkg）にkgrecor（mg．′dl）（％）

ANAt】tre glomerulardamageC
None（Contro】）
90±26 33±2・2
96±16円
FUT−175（2（粕）
46±7
37±1
87±IO
Fi FUT−175（4（氾）19±1§ 43±OL5i 57±12円
FUT−175115（ip）】
41±8
42土0・9§ 50±lO
Di D亡Xam亡thasonelり6t±12 兆±1・7
36土Ⅰ6F≦Di FUT＋D亡Xa（200＋I）29±5S 38±1・668±［0C Non亡（￠0爪r01） 57±13 刀±20
92土22 2▼7士014 2▲5±017 21士024
FI FUT−175（Ⅰ町〉 35±8 36土日 】62土邦 25土0Ⅰ6 用土018 22土0▲27
F2
FUT−175（2叫 】】土2 38土09 246±5ユ 26±014 20±0】4 2・2±0▼25
FI FUT・175（4叫 コ土25 42士0『129±21 22±0Ⅰ4 ト8土019 日士02『F−FUT−175
59士15 封土20 柑8±鳩 25±0】7 21±0−は 20土0か
日刊ip）】DI D亡Xam亡tha紺n亡 対土3，土川 159±22 27±Ol419±0−17 20±010（り
Dz D亡XameIha∽ne 24土5 42土0喝Ⅰ咄±58 日±Ol明 0▲9±Ot関 07土0▲27§（刀
F2DI FUT＋D亡1119±彗 41±07i】卯土52 21土015§ト5±M1 日±02〕§（2（鳩＋り24±0・382・4±02508土023§
1・7±0・29
21±0・42l・5＋0▲24■§Signl鮎anc亡Ord瓜renCCinreSu】lsb亡tW亡印Irealedandnon−lr亡aled（COntrOngmuPS（P＜001）．
rSign摘也nCeOrd騰托n∝inr亡Sultskt（タく0▲05），

・氏ntr亡al亡dandnOか1−亡ated（COnlrot）groups

さS】印i角qnc亡Ord】取minrBu】t5klw亡cm1−亡at亡dlndnon・maled（餌仙Ol）ぎーOupi叩く00け．

Group（mg八g）

Controt（C）

FUT（200ItF′2l

FUT（4001け′3）
FU丁目5）fF†4）
DexqH）lD り
FUT＋D〇m（F′20（200日lI
】00

50

け

0

0

50

100

％

％

図3

蛋白尿と潜血に対するFUT−175の効果

反応の抑制と免疫異常の調節の観点からステロ

FUT−175は液性免疫複合体（CICs）の形成と糸イド剤や免疫抑制剤が使用されている．更に最球体へのCICsの沈着を抑制し，糸球体障害と近ではRobenzaritやLevamisoleなどの免疫CIC値とに相関性のある事が認められている4）．

調整剤やパルス療法，全身リンパ節照射などの生体における補体系の関与は多岐にわたり，治療法が行われつつあるが，今回得られたわれ

補体受容体（CRl）は免疫複合体のクリアラン

われの結果から，SLEの治療に対し蛋白分解酵

ス，B細胞分化，免疫応答などに深く関わって素阻害剤も有用であることが示唆された．既に，いる5）．今後，FUT−175の免疫系に対する影響

ー25−

や筋疾患の病因解明等の実験が求められるととBiophys．Acta．，661：342，1981．

もに，ステロイド剤であるPrednisoneがDu−

3）Sato，T．，Ino，Y．，Koshiyama，Y．，

Chenne型筋ジストロフィーの治療に効果が認

Motoyoshi，A．，Oda，M．andIwaki，M．：

められた事から6），筋疾患に対する治療としてJapan．J．Pharmaco1．，42：587，1986．

FUT−175を含めた広範囲な多剤併用の必要性

4）Ikehara，S．，Good，R．A．，Nakamura，T．，

が示唆される．

Sekita，K．，Inoue，S．，00，M．M．，Muso，E．，
Ogawa，K．and Hamashima，Y．：Proc．
文

献

Natl．Acad．Sci．U．S．A．，82：2483，1985．

1）Ikehara，S．，Shimamura，K．，Aoyama，T．，
FujiiS．，and Hamashima Y．，：Immun0−
logy．，55：595，1985．

5）J．P．Athins：Springer Semin．Im・munopatho1．，9：179，1986．

6）Fenichel，G．M．：American．Pharmacy．

2）Fujii，S．and Hitomi，Y．：Biochim．

ー26−

NS．，27：849，1987．

CANP阻害剤の合成

研究協力者

向 山 光 昭＊大

植 木 正 彬＊勝 沼 信 彦＝■花

横 尾 千 尋＊＊岡 崎 忠 靖＊＊村 田 充 男＊＊関

は じ め に

正

Ⅰ
l

Ⅲ
l

Ⅳ
l

田

和

紀＝

Y
1

−Thrqll e−PT O−Pro−Lys−Tyr−Arg−Gl u−−Thr−Val−Pr o−Al a−Gl u−Tyr−Ar g−Leu−−Thr−tl e−Pr o−Pro−Asp−Tyr−Ar g−Leu−

我々は，筋ジストロフィー症における筋崩壊に深いかかわりがあると考えられている，カルシウム依存性中性70ロテアーゼ（CANP）に対

Ⅱ
l

弘＝

−Thr−ll

図1e−Pr

o−Pro−Glu−Tyr−Ar

g−tli

s一

内在性CANPインヒビター活性中心の一次構造1）とエポキシコハク酸の導入位置

する特異的阻害剤の創製を目的に研究を行なっ

（Ⅰ〜Ⅴ）

ている．

今年度は昨年に引き続き，鈴木班員の研究により明らかとされた内在性CANPインヒビタ

方法

ーの阻害活性中心の部分構造に，阻害活性基と1．合成

してエポキシコハク酸を導入した化合物を約

本年度新たに合成した化合物の構造を表1に40種合成し，CANPおよびカテプシンB，L，示した．合成はすべて液相法により，下記の方Hに対する阻害活性を検討した．

法に準じて行なった．

図1に内在性CANPインヒビター活性中心

t−ブトキシカルポニル（Boc）アミノ酸誘導体の一次構造と，エポキシコハク酸の導入位置をを原料とし，塩化ジメチルホス7イノチオイル

示した．

を用いた混合酸無水物（Mpt−MA）法，または
表1 本年度合成した化合物の構造式
Co ¶叩 佃 N o

S tr uc t u re

C oM PO U血 H o

S t n JC tu re

CA ・
0 14
CA −
0 15
CA ・
0 16
CA −0 17
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E tO −t ES −P ro −P r0 −0日
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0821

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034
CA−
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CA−
037
CA・
0 38

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8 2 10 −tES −T h r・H e −08 2 1

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0 19
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CA−
021
CA・
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仇・
0 23

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0 −tE S −Pr o −Pr0−0日
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T y r−A r苫−O H

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CA −
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CA−
041
CA−
0 42
CA −0 43

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T hr ・l le ・
0821
HO・
t ES ・
T hr −l te −αle
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T hr ・l le −OH
E tか t ES −T hr −I te −OH
0 2− C O −L e u ・l勅

CA −
024
CA −
025
CA −
0 26
CA −
0 27
CA −
0 28

日
0−
tES・
P ro −P ro 一什k82 10 ・t E S 一日e−P r0 −0 82 1
E tO −t E S ・lle −P r0 −O BZ t
82 10 −t E S ・lle −P ro −m e
日0−t E S ・lle −P r0 −O H

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C A ・0 45
C A −0 50
伽 −0 52
C A −0 53

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0 −t ES −T h r ・l te ・
Pro・
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0 11
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吉鵠

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ーtES−： …
・OC

O

￣O H

−IAA：・NHCHeCH2CH（CH3）2

H＊東京理科大学理学部＊＊大正製薬株式会社総合研究所＊＊＊徳島大学酵素科学研究センター−27−

ロロ酢酸ソーダ（in O．1M Acetate Buffer，pH4．3）1mlを加えて反応を止め，更に0．5mlの水を加えた後，励起波長370mm，測定波長460mmで蛍光測定を行なった．

▲卸pt一肌b）TFIC）H〜／和一Cd）lll kOlt

反応i容液0．4M Acetate Buffer pH5．5

昭一ttS一mr・lle−Pro−Pm・L挿イyr・lrさ−Gtu−OH（Containing

4mM EDTA）

250JJ1200mM Cysteine

図2 CA−031の合成法

Inl1ibitor（inDMSO）

ジフェニルリン酸アジド（DPPA）法を用いて保＊Cathepsin

護ペプチドを合成した．次いで得られた保護ペ40J

10〜10JLl

lOJLI

H20

プチドのN端Boc基を除去し，これにエポキ

totalvolume＊

シコハク酸誘導体をp一ニトロ7ェニル活性エ

750JLl

酵素量は5分間に約1．5nmAMCを生成する量にそれぞれ調整した．

ステル法により導入した．更に必要に応じて保またカテプシンLの測定の場合，100

護基を除去し，目的化合物を得た．図2に代表的な例として，オクタペプチド誘導体CA−031

JLgのBSAを添加した．

の合成法を示した．

結果および考察

2．CANP阻害活性の測定

表2−4に，今回合成した化合物のCANPお下記の反応溶液に検体溶液50JJlを加え，300Cで5分間プレインキュベーションした後，よびカテプシンB，L，Hに対する阻害活性を，

更に50JLlのCANP溶液（豚赤血球JL−CANP，50％阻害濃度で示し，エポキシコハク酸の導入

200u／mg／mi，半井化学）を加え，300Cで20分

位置ごとにまとめた．

反応させた．10％トリタロロ酢酸500〝1を加え

表2の上段には，内在性CANPインヒビタて反応を止め，60分放置後遠心し上清のA280

ーの阻害活性中心のアミノ酸配列のうち，Thr一を測定した．

Ileから始まる部分構造を有するものを示した．
反応溶液

この中では，CA−040が最も強いCANP阻害活

1．2％Casein lOOJLl

性を示した．またCA−041，045，031の比牧か

lOOmM sodiumglycerophosphate−HCl

ら，内在性CANPインヒビターの阻害活性中200〝1

心の一次構造にそってペプチド鎖を延長するこ

50mM CaC1250JL1とにより，CANP阻害活性が強まっていること

250mM2−Mercaptoethano1

50JL1がわかる．この事から，エポキシコハタ酸側鎖（pH7．5）のペプチド鎖を更に延長することにより，活性3．カテプシンB，L，H阻害活性の測定
ラット肝より単一にまで精製したカテプシンが増強される可能性が考えられる．なお．CA−

B（85u／mg），カテプシンH（500u／mg）およ031とCA−052を比べた場合，エポキシコハク

びカテプシンL（600u／mg）を用い，それぞれ酸を持たないCA−052には活性が認められない

ZTArg−Arg−MCA，Arg−MCA，Z−PheTArg−

事から，このペプチド鎖のみにより阻害活性がMCAを基質として，次のように測定した．

発現する可能性はないものと考えられる．

下記反応溶液を370Cで3分間プレインキュ

また下段のIle−Pro配列の誘導体の中で，ベーションした後，基質（0．04mM）0．25mlを

CANPに対して阻害活性を示したのは，CA−

加え，370Cで5分間反応させた．0．1Mモノタ

028，029のみであった．

−28−

CANP阻害剤の合成
表2Thr−Ile誘導体およびIle−Pro誘導体のCANPおよびカテプシンB，L，Hに対する阻害活性O m

E ・64 ・CA

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表3

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0 25

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0821

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0 28
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0 29

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t ES ・lte −Pr 0 −0日
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1，
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∝氾
43 ．
M

Pro−Pro誘導体およびLysTTyr誘導体のCANPおよびカテプシンB，L，Hに対する阻害活性lnhibi tory Ac tiYity IC50（nM）

CompoundCAW bth．8

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18，∝旧

138，0（氾152，0（旧6，8（氾1，940，㈱72，帥

CA・021 8210・tES・Pro・Pro・αleC1−018 8zIO・tB・Pro−Pro・082t

4t泊，∝旧120，【畑謝，（X的19，8（氾10，8（氾
780

5∞，（伽
55，㈱

Cl・019Cl・024

巧00川00

＞期，（伽

紺，（X氾
310．（X氾

4射，0（泊32．0（氾＞1，0（刀．tX氾＞1，000周00＞5叩，M＞50，【伽＞l（机000＞100切00

u・016

EtO・tES・Pro−Pr0−OH

u−015

110・tES・Pro−Pr0−OH
110・tES・Pro・Pro−（MeCA・0320・tES・Pro・Pro・bsイyr・Arg・Gtu−OH

巳：g崇 E嘉3意思‡滞：：3H
表422．6（氾：認諾l・彗：㌫1彗澗謂 簡閲

Tyr−Arg誘導体のCANPおよびカテプシンB，L，Hに対する阻害活性
lnb ib ito ry
Com p oun d

CANP

A et iY ity
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8

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…
．

表3のPro−Pro配列の誘導体の中では，CA−018が弱いCANP阻害活性を示したが，他のも

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0 ，
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朋
書手 測定中ころCANPに対して阻害活性を示すものは見出されていない．

のには活性は認められなかった．

表4に示したTyr−Arg配列の誘導体（昨年

Lys−Tyr配列の誘導体に関しては，現在のと度報告したものを含む）の中には，CANPに対−29−

して阻害活性を示すものが比較的多く，このアするため，それぞれのCANPに対する阻害活

ミノ酸配列が他の配列と比べ，活性発現にかな性を1とした時の，カテ70シンB，L Hに対す

り重要な働きをしていると考えられる．特にる相対活性を，図4に示した．

CA−050はE−64Cよりも約10倍強いCANP

この図より次のことが明らかとなった．

阻害活性を示しており，本年度の成果としてあTyr−Arg誘導体はいずれも，カテプシンHげられる．

に対して阻害活性が弱く，CANPとの括性分艶

このCA−050とCA−007，008，009を比較すが認められた．中でもCA−050はカテプシンBると，アルギニンC端カルボン酸を，メチル，に対する相対活性が最も低く，CANP阻害活性

エチル，ベンジルエステルに変化させるにつれの強さとともに，選択性の面からも注目すべきてCANP阻害活性が増強しており，アルギニ

化合物といえる．

ンC端への脂溶性基導入による活性増強の可また，このCA−050と他のTyr−Arg誘導体

能性が示唆された．更にこのことは，アルギニとを比較すると，アルギニンC端エステル部のンC端へグルタミン酸を導入したCA−012の違いが，CANP阻害活性の強さに与えた影響と

CANP阻害活性よりも，ロイシンを導入した

同様に，選択性に対しても大きく影響すること

CA−053の方が強いことからも推測される．

がわかった．

図3には，表2−4に示した化合物の中で，一方Thr−Ile誘導体は，Tyr−Arg誘導体とは

CANPに対する阻害活性がE−64Cの1／10以

異なった選択性を示し，カテプシンLに対する上の強さを有するものについて，活性の強い順相対活性が低下していることが特徴といえる．

にそのIC50値を示した．構造別に見ると，CA−

このうちCA−031は，カテプシンHに対しても

050，014，008，007，023の上位5種がTyr−Arg
誘導体であり，CA−040，031はThr−Ile誘導体

やや選択性が認められる点で注目に値する．

であった．

CANPインヒビター活性中心の全アミノ酸配次に，これらの化合物について選択性を比較

また，CA−031は，Thr−Ilrから始まる内在性列を導入したものであり，ペプチド鎖の短い

lCさ。（nM）
103

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図3

101

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≡
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三
】

CANP阻害活性の比較
−30−

；
；
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；
：
】

CANP阻害剤の合成
RelatlvelD￣310￣210−11101102108

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l
打
0●
C O

図4

H

カテプシンB，L，Hに対する相対活性の比較

CA−040よりも選択性が認められたことから，のペプチド部分を修飾することにより，活性お

ペプチド鎖の延長は，活性増強とともに選択性

よび選択性が容易に変化することが分かり，特の増強にも有効である可能性が考えられる．

異的CANP阻害剤開発の足掛りが得られた．
（2）エポキシコハク酸をThr−IleのN端導入結した化合物のうちCA−031に，カテプシンLお語

昨年度に引き続き，内在性CANPインヒビ

よびHに対する選択性の改善が認められた．まター活性中心の一次構造を分子設計に応用し，た，更にペプチド鎖を延長することにより，活約40種の化合物の合成と評価を行ない，次の結性および特異性を増強しうる可能性が示唆され

果を得た．

た．

（1）エポキシコハク酸をTyr−ArgのN端へ導入した化合物の中に，E−64Cよりも約10倍強

文

献

いCANP阻害活性を有し，かつカテ70シンL

1）Emori，Y．，Kawasaki，H．，Imaioh，S．，

およびBに対する選択性の面で改善が認めら

Imahori，K．andSuzuki，K．：Proc．Natl．

れた，CA−050を見出した．また，このCA−050

Acad．Sci．USA，84：3590，1987．

−31−

筋ジスハムスターにおけるCANPインヒビターの分解
川

研究協力者

島

林

日
∈ヨ

誠

一書

美＊

中 村

愛書

は じ め にー存在下でホモジェナイズし，遠心した上清を筋ジストロフィーにおける筋タンパク質の異熟処理した物をr試料とした．試料はSDS−

常分解をもたらすプロテアーゼの1つとしてカPAGEした後ニトロセルロース膜に転写し，抗ルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）がインヒビター抗体でインヒビターを検出した．

考えられている．そこで，昨年度は筋ジスハム

抗インヒビター抗体は，インヒビターのドメイ

スターUM−Ⅹ7．1を用いて，実際に筋ジストロ

ンIに含まれる34残基（Asp−105からGly−

フィーの骨格筋に含まれるCANP（JLCANPとmCANP）およびその内在性阻害物質（CANP

138）およびドメインⅠⅤに含まれる34残基

インヒビター）の活性量を測定した．その結果，

し，モルモットに免疫して作成した．

（Glu−522からPr0−555）のペプチドを抗原と筋ジス骨格筋におけるCANP活性の著しい上昇は認められなかった．しかし，CANPは通常

結

果

不活性な前駆体として存在し，この実験で測定

正常ハムスターおよび筋ジスハムスターの骨したCANP活性はこの前駆体によるものであ格筋に存在するCANPインヒビターをイムノり，前馬区体の量は必ずしも活性化されたCANP

ブロット法で検出したところ，正常ハムスター

量を反映しているとは限らない．重要なのは活

では分子量約11万のインヒビターのみであっ性化されたCANPの量であるが，それを特異たが，筋ジスハムスターではその分解物と思わ的に定量する手段の無い現状では他の方法に頼れるものも認められた（図1）．この分解物は4らざるを得ない．そこでCANPの活性化の痕

過齢および10週齢いずれの筋ジスハムスター跡を求めることにした．CANPインヒビターはにも存在し，ドメインⅠおよびドメインⅣに対CANPを特異的に阻害する物質であり，CANP

するいずれの抗体とも反応した．したがって，の阻害に伴い自身は分解を受ける1）．この筋ジスハムスター骨格筋ではCANPインヒビ

CANPインヒビターの変化から筋ジストロフ

ターはごく限定的な分解を受けていることがわ

ィーにおけるCANPの異常な活性化の有無をかる．一万，4週齢の心筋ではこの分解物は認め検討した．

られないが，10週齢になると心筋にも分解物が現われてくる（図2）．このことから，CANPイ

実験方法

ンヒビターの断片化は，時期のずれあるいは程4週齢と10週齢の正常ハムスターと筋ジス

度の差はあるが，筋ジスハムスターの筋組織にハムスター（UM一Ⅹ7．1）は大正製薬総合研究所

特徴的な現象といえる．

より恵与していただいた．それぞれの骨格筋および心筋を各種低分子プロテアーゼインヒピタ

次に，この限定的分解がどのプロテアーゼによりもたらされるかを検討した．まず，有力な候補と考えられるCANPについてインヒビタ＊東京都老人総合研究所

ーの分解パターンを追跡した．しかし，その経
−33−

4W

▲nt卜d01¶■lnl

4W

113K−
tlIK−

＿

＿

10W

10W
＿．＿＿．＿＿＿．＿＿

−

−

ト

−・−

■■．＿

−■

−

●●■−

＿．＿

轟8K−

55K■−

諾＝

u c【l C O C D C D uC D C O C D C D

Cl卜Cl〉C DHC D￠D C D￠D C O

図2▲nt卜d01れ暮Ill義Y

4W

…K一
■●K−

ー（D）心筋のCANPインヒビター
ドメインⅠに対する抗体を用いた．

10W

一：一．一・

正常ハムスター（C）および筋ジスハムスタ

−

113K−
88K−
C

O

C

O

￠

O

G

P

C

O

C

D

C

O

C

O

一一▲■●−■■■■●一一一，一事−●一・・・・一一‥

SSK■

34K一

閃−

図1正常ハムスター（C）および筋ジスハムスタ

H C D C D O Sー（D）骨格筋のCANPインヒビター

4W

時的変化のなかには，筋ジスにおける分解物に

図3

lOW

や

Tlm●

2030

4080

90120

（暮●tI

mCANPによるインヒビターの分解（時間経過）．ドメインⅠに対する抗体を用いた．

相当する断片は認められなかった（図3）．そこで，他の細胞内プロテアーゼについても検討したが，カテプシンおよびインゲンシンのいずれ示唆している．実際，CANPインヒビターはプも該当しなかった．

ロテアーゼに対する感受性が極めて高い2）．試
験管内では，他のプロテアーゼ（カテプシン・考

インゲンシン）でもこのフラグメントは生じな察

本研究で，筋ジスハムスターの筋組織ではい．従って，このフラグメントを生ぜしめるプ

CANPインヒビターの分解が起こっているこ

ロテアーゼは本研究で吟味しなかったものであとが明らかになった．この分解はプロテアーゼ

るか，あるいは生体内では試験管内と異なる切活性の昂進によるものと考えられる．CANPイ

断様式が存在するのかも知れない．

ンヒビターの本来の機能，即ちCANP活性の文

特異的抑制を考慮すると，筋ジストロフィーに献おけるCANP活性の異常な昂進を抑えるため

1）Nakamura，M．，Inomata，M．，Imajoh，S．，にCANPに作用し，自身が分解を受けたとすSuzuki，K．and Kawashima，S．：Bio−

ると理解しやすい．しかし，試験管内でインヒChemistry，28：449−455，1989．

ビターにCANPを作用させても同一のフラグ

2）Nakamura，M．，Inomata，M．，Hayashi，

メントは生じなかった．この結果は，CANP以M．，Imahori，K．and Kawashima，S．：

外のプロテアーゼ活性が関与している可能性を

J．Biochem．，98：757−765，1985．

−34−

CANP遺伝子のクローニングに関する研究−CANPインヒビターの阻害機構と阻害部位一鈴 木 紘 一＊
研究協力者

川 崎 博 史＊

榎 森 康 文書

西 道 隆 臣＊反 町 洋 之＊ーの4つのドメインのTIPPXYR配列の周辺

は じ め にカルシウム依存性中性プロテアーゼのアミノ酸配列をもとに34残基からなる4種（CANP）の内在性インヒビター（CANPイン類のペプチドをペプチド合成機により合成した．

ヒビター）はCANPに特異的な蛋白性のイン

また，酵素消化などにより，これらのペプチドヒビターである．すでに報告したように，から得た断片も使用した（図1）．E−64及び

CANPインヒビターには，アミノ酸約140残基

TIPPXYR配列をもとにしたE−64誘導体は大からなる繰り返し構造（ドメインⅠ〜Ⅳ）が兄

正製薬から供与されたものを用いた（表3）．

いだされ，各ドメインの中には特異的なアミノ

CANP活性及びCANPインヒビター活性の酸配列TIPPXYRが存在する．大腸菌で発現さ測定は，カゼインを基質にして常法によりおこせた種々の断片のCANPに対する阻害活性かなった．

ら，このTIPPXYR配列の周辺が，阻害活性に

CANPインヒビターの血小板凝集における重要な部位であることが明らかになった．本年

効果は，以下のようにして測定した．血小板は，度はこのTIPPXYR配列の周辺のアミノ酸配クエン酸採血したヒト末梢血より得た多血小板列をもとにペプチドを化学合成LCANPイン

血渠（platelet−rich plasma，PRP）を用い，ヒビターの阻害機構及び阻害部位を明らかにす

CANPインヒビター存在下における血小板凝る実験をおこなった．

集を8チャンネル凝集計（NBS社，Hema
Tracerl）で計測した．PRPは，3分間37℃で実験方法および材料

preincubationL，DMSOに溶解したCANP

すでに報告した，ウサギCANPインヒピタ

インヒビターを加え，さらに5分間incubationd血1−（18も五つ

D】P N【S S T YI

d血Ⅳ−（仰119勺

E R A E E E H X D E L（；E R D P TI P P E Y R∴H：L L】）Q O E q D E r

d血Ⅳm−ヱトー（6m棚）ヱE L G X R E Y TI r P E Y R E L L E X E T G Y A G

L G E R D P TI P r E Y R托しL D O O E q D X

d血Ⅲ−（叫E R S X E E E R E E L G E E E E T T P P D Y R L E E A E D E D GlこPd∝血Ⅱ−（m一刀勺A X】l X∴E E E V E X C O E D D E T Y r A E Y R】LI【P A T D：K D O EこP

d血nふ加−イ1労・かつ

図1合成ペプチドのアミノ酸配列＊東京都臨床医学総合研究所−35−

表3 E−64誘導体●

lC川†lnhibltor■■

ll▲lru亡Iur●C〟けF■p▲lll C■lhD

（〝H）

（鵬）

lV
l

（鵬）

0．01

1．はkメCや−Tr■一人■仙川▲−362．H〉dCO−丁目一人り（肘…
HO■C

O

H

h

500

COイr■・▲r■−OH

O

川

64

3．…

1．300

SSO

0．01

Il

0．1
1
h鵬鵬HyuI

CO・T▲■・ll●▼OHt

k一大

HO■⊂

10

12010．000 〉4日00

＞「大
HO■C

5．

24

1

仙肌血■仙川

C〇・Pr〇・Pr〇・0811

8暮lO●C O II

l．

3

0．1

H

1． …
H

川010，000

0

48
11

100

■

毒l0

した後，コラーゲン刺激をおこなった．

0

図2

結果および考察
合成ペプチドによるCANP阻害

合成ペプチドによるCANPの阻害a）mCANPに対する阻害b）JLCANPに対する阻害C）ドメインⅠⅤ／11−33ペプチドによる
mcANP，JLCANPの阻害

4種の34残基からなるペプチドのmCANP
及びJLCANPに対する阻害活性を調べた．図2
及び表1に示すようにmCANPに対しても

表1ペプチドインヒビターによるCANPの阻
害かいりd〟CANPに対してもドメインⅠペプチドが最も阻害活性が強く，次がドメインⅠⅤペプチドであった．ドメインⅠⅠⅠペプチドはmCANPを阻害するが〟CANPはほとんど阻害しなかった．ド50％阻害に必要な濃度
noinhibition

not determined

メインIIペプチドはmCANP，JLCANPどちらに対してもほとんど阻害しなかった．これらのペプチドはいずれもJLCANPよりもmCANPを強く阻害した．また，これらのペプチドはパ

〟X

加止血一ェ
Don■ln ェェ
D伽■■1m ＝tI
Don▲1m ェⅤ
如▲ln ェ／1 −21

パインを全く阻害しなかった．ドメインⅠペプ
チドをV8プロテアーゼで消化するとVTIPP−

如且1m TV／11−33

0．01l
n．d．
8．5
0．12

7．0

〇・01

b）

n．d．C）
0．32
I．4

KYREという配列の9残基のペプチドが得られる．しかしながら，このペプチドは，いずれはmCANPもJLCANPもともに阻害した．表1のCANPに対する阻害活性も示さなかった．

に示すこれらのペプチド阻害活性と図1に示し

しかし，ドメインⅠⅤペプチドからリジルエンド

たアミノ酸配列の類似性から，CANPを阻害す

ペプチターゼ消化でN末端10残基を欠いたるのに必要な部位は，LGXK（R）E（D）

23残基のペプチドが得られるが，このペプチド

ⅩTIPPXYRXLLと推定した．

−36−

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

表2

ペプチドインヒビターによるCANPの保護効果
カルシウム存在下でペプチドインヒビター（11JLM）を氷上で2分間incubateした
後，E−64（7Jg／ml）を加え室温で5分間
incubateした．EDTAを加えて反応を停止
して，限外濾過で阻害剤を除去した後，
CANP活性を測定した．回収された比活性の比率が示してある．
Spoclflく：▲ctl▼ltylt）of roeoY●rd Cm

Tnムlbltor lC▲le1Ⅶ■）

−5．3

0

5

◆

10

1nhibitor pM

Do山lnIt◆）

DohalnIV

l＋）

1，
17
10
61

（◆）
（一〉

100

加lnIt
加1nIェⅠ

図3 Dixon plot
桔抗阻害を示し，Kiは5．3JJMである．

卜）
卜）

（◆）
（◆）

0

CANPインヒビターがCANPのプロテアーゼ

Etl∝t OIvさr10∪奮CANPlnhibito柑Onpl■t01●t叫grOgation

ドメインの活性部位と相互作用することが明確になった．昨年，報告したように，TIPPXYR配列は，セリンプロテアーゼに対するインヒビタ
ーのreactivesiteと類似性が見られる．セリン
プロテアーゼのインヒビターでは，多くの場合
reactive siteにおいて切断が見られるが，
CANPインヒビターでは，TIPPXYRの周辺での切断は見られない．また，ここで用いたペプチドインヒビターもCANPによる切断は全くうけないし，TIPPXYR配列の周辺には，
CANPが好んで切断する配列が兄いだされな
い．阻害機構を考える上でこのことは重要な点である．
興味深いことに，ペプチドインヒビターの阻
○

〜

10

害活性の強さとE−64に対する競合の度合が一

15致しないことが明らかになった．E−64はカルシ
ウム存在下でCANPの活性中心のシステイン

図4 E−64誘導体による血小板凝集の阻害
番号は表3に示した各誘導体に対応している．

と反応してCANPを不可逆的に失活させることが知られている．CANPインヒビターは基質と桔抗的にCANPを阻害するから，CANPイ

比較的弱い阻害活性をもつドメインⅢペプチ

ンヒビターによってE−64によるCANPの失ドを用いてmCANPに対するKiを求めた．こ活が保護されると期待される．しかしながら，のペプチドは，基質と桔抗的にCANPを阻害

表2に示すように，ドメインⅠⅤペプチドはE−64

し，Kiは5．3〟Mであった．これはIC50の値に対してCANPの活性を保護するが，最も強とよい一致を示す．桔抗阻害を示すことから，

い阻害活性を持つドメインⅠペプチドは，保護−37−

効果がほとんどない．このことは，CANPイン
ヒビターはCANPの活性中心の近くと相互作

凝集反応に伴ってactin−binding proteinやタリンがカルシウム依存的に分解されることが知用するが，活性中心のシステイン残基との相互られており，これはCANPによると考えられ作用は強くないことを示している．TIPPXYRている．そこで，細胞内での合成CANPインヒ

配列はセリンプロテアーゼのP′側と類似性がビターの効果を検討するため，E−64及びあることを昨年報告した．TIPPXYR配列のN

CANPインヒビターのTIPPXYR配列をもと末端側にエポキシ基を持つE−64誘導体がに設計されたE−64誘導体による血小板凝集のCANPをよく阻害することも明らかになって阻害を測定した．図4に結果を示すが，阻害のいる．これらのことは，CANPインヒビターに強さは，誘導体3＞E−64d＞1＞＞5＞2＞4の順

よるCANP特異的な阻害にP′側とS′側の相互位であった．最も強い阻害活性を示した誘導体作用が重要であることを示している．現在，パ3は，CANP活性を阻害するIC50の値は高い

パインの構造をもとにCANPとCANPインが，CANPに対する特異性は最も高い．この誘ヒビターの相互作用のモデルを作成している．

導体は構造上疎水性が強く，細胞膜透過性が高CANPインヒビターによる血小板凝集の阻害

いと推測され，この点が重要であると考えられ血小板は，トロンビン刺激などによって凝集た．現在，凝集に伴って，CANPが切断すると反応を起こす際に細胞内のカルシウム濃度の上考えられるタンパク質の分解が抑えられている

昇が必要であると考えられており，カルシウム

かどうかを検討している．

による刺激伝達の経路の同定が注目されている．

−38−

MEL細胞骨格タンパク質に対するCANPインヒビターの影響
杉 田 秀 夫■
研究協力者

目

石 浦 章 一＊的

E−64誘導体の九と 乙扇形の作用を検討する目

塚 原 俊 文■漉し，再びCOldLeuと共に100／ Mの阻害剤を加え，1，3，6，9，12時間後上清のTCA可溶

的で血球細胞のタンパク分解に対する効果を検性のカウントを測定した．

索した．鈴木らによってCANPインヒビター

3）MEL分化に対する影響のドメイン構造が明らかにされ，活性部位のアMEL細胞4×104cell／mlをDMSOl．5％にミノ酸配列TIPPXYRの一部とエポキシコハ

よって前赤芽球に分化させた．4日日頃からHb

ク酸を結合させた新規化合物5種が合成された．

合成が顕著になり6日目には相当量のHbが合これらはCANPに対して比較的低濃度で阻害成され細胞も赤色に変化した．阻害剤は1日目活性を持つ物質であるが，わ∽め0のCANP作

から100JJMの濃度となるように加え，その影用に対する効果はまだ知られていない．今回，響を見た．対照にはDMSOによって分化しな

CANPのど乃いDMSO耐性MEL株を用いた．6日後，遠心びわβの基質の1つを明らかにすにより細胞を集め細胞内のカテプシンB＆L活ると共に，阻害物質の性質を検討した．

性をZ−Phe−Arg−MCAを基質として測定した．

実験方法
1）CANPの乃∽め0作用に対する影響

結果ならびに考察

実験にはマウス赤白血病細胞（Murine

1）Ca2＋によるフイラミンの分解

Erythroleukemiacell，MEL）を用いた．MELCANPのin vivoの作用を検討するため細胞（5×106cell／ml）をまず100JLMの各阻害

A23187を用いて細胞内にCa2＋を導入し，60

剤と共に60分間インキュベートし，阻害剤をと分後の細胞骨格タンパタ質の分解をウエスタン

りこませた．次いでCa2＋イオノフォアA23187

プロット法で検討した．用いた抗体は，抗7イ

10JJMを加え，再び60分間インキュベートすラミン，抗ビンキュリン，抗NF，抗α−アクチることによって，細胞内に存在するCANPを

ニン骨格筋型，及び平滑筋型である．図1にそ活性化させた．その後，遠心によって細胞を集の結果を示す．A23187を加えたものでは，細胞め，SDS電気泳動後ニトロセルロース膜に転写内のフイラミン量が減少しておりこれはさせ，抗細胞骨格タンパク質抗体で染色した．

CANPによって分解されたと考えられる．E−

2）タンパク合成，分解に対する影響

64誘導体を加えた実験ではPro−Proを持つ

MEL細胞5×105／mlをLeu−free培地で6CA−018は全く阻害効果がなかったが，Thr−Ile

時間培養した後，100JJMの阻害剤と共に3H−（CATO40）は多少分解を阻害した．一方，Try

Leu5JLCi／mlを加えタンパク質を標識した．16−Argを持つCA−003，008，023はすべて効果が時間後，RPM1−10％牛胎児血清培地で3回洗あり，特にArg（NO2）を持ち末端がエステル化されているCA−003，008の阻害作用が顕著で＊国立精神・神経センター神経研究所

あった．
−39−

0
5
0
4

uO葛P中島訂pが

針苺

30
20
10

賢一■1■F

0

1

3

6

9

12

Time（hr）

図2

3

18
8

40
23

図1抗フイラミン抗体によるイムノブロット．
controlは無処理のMEL細胞．A23187と3H−Leuで標識したMELタンパク質の分
解．一定時間後，外液をとりTCA可溶性のカウントを定量した．無添加の対照（C）よりタンパク分解を抑制するものはなかった．
実験結果は3ボトルの平均で表してある．

で標識し，その後外液にリリースされる3Hアミ

インキュベートするとフイラミン（F）が減少するのがわかる．同時に，阻害剤CA−ノ酸量をタンパク分解量と定義した．

003−040及びpAPMSFを100JLM添加したものを並べてある．CA−003，008，023では分解が抑制されているのがわかる．

ク合成に対する影響を見たところ，CA−003，

まず，3H−Leu標識時に阻害剤を加え，タンパ
008，018，023，040及びセリンプロテアーゼ阻
害剤pAPMSFlOOFEMの添加では対照の86，
100，75，78，88，80％と若干低下気味であっこの他の細胞骨格タンパク質であるビンキュ
リン，α−アクチニン，NFは全くA23187投与た．しかし，16時間では毒性は見られなかった．

で変化がなく，これらはCANPに耐性である

次いでcoldLeuでチェイスを行ったところ，ことが判明した．フイラミンは血小板においてタンパク分解を抑制するものはなく（図2），CA

も凝集時にCANPによって分解されると考え−003，008のみが対照と同程度であった．

られており，今回のMELでの結果もそれに一

3）各阻害剤の長期投与効果

致するものである．CANPに対する作用は8＞

次．に，6日間長期投与実験を行い，MEL細胞

23＞3であるにもかかわらずCA−023があの分化に対する影響，並びに毒性を検討した．

正和で効果が少ないのは膜透過性に問題があ

MELはDMSOl．5％添加により前赤芽球にるものと思われる．CA−023はカルポキシル基がエステル化されておらず，この点が透過性に

分化LHbを合成しはじめる（図3）．この時，カテプシン活性も増加することが知られている

影響を与えていると考えられ，今後の検討が必ので，阻害剤の影響をカテプシンを指標として要と思われる．

測定することが可能となる．一万，6日後のタン

2）各阻害剤のタンパク分解に対する作用．

パク量で細胞毒性を測定することができる．今

1）は60分という短期間の効果であったが，回の実験では，DMSOを加えても前赤芽球に分

次に1〜12時間でのタンパク分解に対する作用

化しないDMSO耐性MEL株を対照（阻害剤を検討した．まず，MEL細胞を16時間3H−Leuの透過性の指標）としてカテプシンB＆Lを測−40−

MEL細胞骨格タンパク質に対するCANPインヒビターの影響

表2 実験のまとめ．

EII義やtOII畑戯曲Or○○n剛ELC劇D肘Or●鵬はtIonb■80一触l●t．■ELe O：○○Jは●○▲■t●

ICS。はCANP，カテプシンB（cath．B）に対するもの（〟M）ですでに発表ずみである
ものを引用した．A23187は図1の結果を，

肋鳩l■tLe P a〇

才さ佃▲■18

聖二二二

DMSO Hbは図3，DMSO cathBLは表1の結果を表示したものである．
IC50

Ⅰ油化ltors

肌SO

一・・．二二−▲23187CAW Cath．8

t

●
＋

■ U

●

◆

9

■

●

5

叫P16F

叫．誓

舟

3

401昭一ES＿Thr−Ile●鵬一 − 血 − 一 一

小

J

司

〇

231の−【S−Tyr一人巧こOH＋，e付ettlvモ

h8ト【S−Pro−Pr0−08王

〇

18

■

3 EtO−【S−Ty−AM㈹2）−08Z
8 冊−【S巾トAr州02ト0【t〇 一

MEL細胞のDMSOによる分化DMSO耐性株及び通常のMEL細胞を1．5％DMSO（D）の存在下6日間培養した．その後，抗ヘモグロビン抗体（抗Hb）により合成Hb量を観測した．対照（C），並びにCAシリーズは番号で示してある．APはpAP−
MSF添加．

1

図3−

Hb Cath．BL

ー，nO tf佃Ct

顕著であった．
表1分化後のタンパク質とカテプシンB＆L活性．
詳細は図3参照．
EEfeetOfく）f Var⊥ous
工nhibitors on the Cell Growth
凡E工．Cells and DMSO−ResIstant Cells

DHSO−ResISLant MEエ▲
Proteln

Caとhepsln

B島L（mq／dis】1）（n Tぬ1e／mitT／m9）
None l．371

0．497

D兄SO l．561

1．38二】

】

1．388

8

1．404

18

0．008

2二3

40
pAp‡4SF

1．286

1．360
1．066

CathepslrI

0．999

タンパク量は減少するが，これは分化した証拠
が，各阻害剤はDMSO耐性株よりは効きが良

B与L（mg′dlShl（n mole／mln／mq）
1．356

目よりHbを合成し始める．6日後には細胞のである．カテプシン活性は約1．3倍に上昇する

Normal nEL
proとeitl

一方，通常のMELはDMSOによって4日

く，CA−018以外はよく阻害した．やはりCA−

0．66−1

023，040の効果がCA−003，008を上回った．

0．855

0．452

8．910

0，197

0．737

0．931

（）．305以上の結果より，分化した細胞はしないもの

0．886

0．059

よりも阻害剤の効果が上回ることから，阻害剤

0．915

0．042

0．047＊

0．544

0．010
0．200

0．076
0．630

が細胞にとり込まれ易いと考えられる．また，カテプシンB＆Lに対する阻害活性は，オ乃びブわ℃

走した（表1）．

とは異なりCA−023，040の方が高いと結論づけ

表1よりPro−Proを含むCA−018はMELられた．

に対しては細胞毒性を示し，6日後にはほとん
どの細胞が死滅した．その他の化合物には毒性

結論は見られなかった．まず，DMSO耐性株に注目

CANPのフイラミン分解に対してはCA−

すると，すべての細胞はHbは合成しないが

003，008が，カテプシンに対してはCA−023，

DMSOによってカテプシン活性は約2．8倍に040が効果があり，CA−018は長期投与には不適上昇した．CA−003，008，023，040共に効果が当であることが判明したく表2参照）．

あったが，特にCA−023，CA−040の阻害効果が−41−

Recombinant Cystatin類の治療薬としての開発に関する基礎研究
勝 沼 信 彦＊研究協力者

川

唐 渡 孝 枝＊

緒

健■

池

祥

雅＝

リコンビナント・プラスミドによる大量発現と論

LysosomeのCysteineprotease群（Cathep−

精製に成功した．また結合部位のアミノ酸をsin群）作用の異常元進，異常低下およびプロセ

cDNAレベルで変換した人工Variantを作り，ス異常に起因する疾患は多い．異常冗進に起因阻害特性の目的に沿う変換を試みている．

する疾患には筋ジストロフィーを初め各種の筋タンパク崩壊疾患，オステオポローシスなどがCystatinα遺伝子の合成とE．Coliによる発現ある．また異常低下とプロセス異常では

Cystatinaをコードした遺伝子cDNAを化

Lipofuscinosis（Batten病）がCathepsinHの欠学合成し，クローニングし，E．Coliに発現さ損でありI cell病は仝Cathepsin群がせ，更にそれを大量精製する方法を確立した．

Lysosomeに封入されずに緋包外に放出される

即ち318塩基ペアーを19のオリゴヌクレオテ

ものであり，それぞれの代表的な疾患としてあッドとして合成し，これらを酵素的に結合させげられる．従ってこれらの疾患の病因の研究やたものを大腸菌pBR322プラスミドに入れた．

治療薬開発には，Cathepsin群に特異性が高く，これのEcoRAI−BamHIフラグメントをtac強い阻害活性をもち，細胞内の目的部位に高濃promoterでコントロールすべくpKK223−3発度に到達できる，かつ毒性の弱い阻害剤が要求

現プラスミドに入れ換えて発現させた．

されている．この目的でまず取上げられたのが菌体を凍結融解することにより容易に

E−64誘導体である．現時点までのE−64誘導体

Cystatinを可溶化できる．これをSephadex

ではすべての必要条件を必ずしも満足させてはG50でワンピークとして精製できる．HPLC

いない．従って新しい阻害物質の開発は依然とDEAE−5PWを使用して更に精製する必要がして重要な課題である．

ある場合もある（発現量の少ない場合）．

最近数年間にLysosomeのCathepsin群に特異性のある細胞内のペプチド性インヒビター

CystatinAおよびこの人工Variantの場合もCystatin群が数種類，発見され，構造決定されは2mg／g湿菌量であるが，CystatinA及び，そた．その中のCystatinαとCystatinβは我々がのVariant・Cystatinの場合は0．1mg／g湿菌

同一の方法によった．収量はCystatinαの場合発見し，構造決定したものである．ラットのCystatinαとその人間型CystatinAを上記疾患の治療薬として開発する目的で以下のごとき

表l Purification of recombinant cystatinA
from E．Coli
Total Specifk
Activity ACtivitY

基礎実験をおこなってきた．
CystatinαとAの合成cDNAによる大腸菌＊徳島大学酵素科学研究センター酵素化学部門＊＊三井東圧化学・ライフサイエンス研究所

ExtraCt

22．5

Sephadex G−50

16・3

HPLC−5PW

−43−

9．0

0．12
1・56
8．05

Yield

100も
72号
qOl

量である．精製過程とその収量は表1に示されかし，実証は全く存在しなかった．我々はこれている．これらのRecombinant Cystatin群はを実証すべくCystatinAの合成cDNAの天然から精製したものと物理化学的ならびに阻QVVの中でQをKに変換したもの，二番目の害活性ともに同一である．CystatinAの精製過ⅤをTに変換したもの，および両者を変換した

程は表1のごとくである．

ものの三種のバリアントcDNAを合成して大腸菌で発現させた．その結果，QをKに変換しVarjant RecombinantCystatinAにおける阻害

たバリアントは全体としての阻害活性は大した特性の変換低下は認められなかったが，カテプシンB，H，Cystatin類はカテプシンと1モル対1モル

Lおよびパパインに対する阻害の特異性（阻害が結合して完全に失活させる．Cystatin類のカ

強度の順位）は大きな変化があった（表2）．本

テ70シンとの結合部位は数種類のCystatin群

来天然のCystatinAはCathepsinHを一番よの構造中で図1のごとく最もホモロジーの高いく阻害し，CathepsinLとPapainに対しては部位であるQVVであると推定されてきた．しCathepsinHを阻害する数倍量を必要とする．

1●

hTEYKLV回V

C−Ha−raS

2．Rat Cystatin

6

3．Rat Cystatin

α

G回GVG回sP S A T H P

団sEAE巨HDpGTでGI口＿S S P G R p

4．Human Cystatin C：：丑Ⅰ

5・Human Cystatin S

R I−

6．Bovine colostrun Cystatin

l．

エ

P

L

−

GII h D A

G

ェ

G1−

一

一

S V

Y D A D I一

日

一

五

一

E

E D

一

N D E WE A D V N E E G

一・・LIQ 日比FV朗回

p

で

ェ

2．

E

3．

E V A D R V

R R QI−

4．

E G V

R V

ー

G E Y N R A S N

H S R AもQ V

5．

R A L H F AェS E Y N X A T R

Y R RIP

工一Q V

6．

R A L Q F A

H A E Y11R A S N

工

A D R V−R S Q L E E R A N Q R F

E E R T N E R

E

一

一

V

F

K

A

一

一

K

F

R

V

S S R V V R V

IDGETCB−

DEAGO

2●

A G T N F F I R

E E K C V

3●

A G Q

1．

工

も】FII K

…自軍…

N

G

R．FI一

AGVNYF回DVE・LGR回でCで4．

九・R．AlRl A

5．

G G V N Y F F D V E V G R

ェ

ェ

C

で

SGIRYI回QVE日GR回でCP

6．

【T．Hivasa

et al・FEBSI−ett・呈主と．23−2611987日

図1．Composite alignment of anino acid
SequenCeS Ofcystatin family and CHa−
raS

−44−

RecombinantCystain類の治療薬としての開発に関する基磯研究

表2Comparison ofinhibitory activity of
VariantcystatinAfor various cysteineの更に強いもの，特異性を目的に合ったものに変換する研究を進めるつもりである．

proteases（ID50×10￣Smoles）

Cathepsln
B

Cathepsln Cathepsln
H
L

Natura1

170

0．6

0→K

290

またCystatin類は分子量が一万強であるた
Papainめに，細胞内，更にはLysosome内に取込まれ易くするために次に二つの方法を進めている．

3二手

270。

2．2

3．1

11

1．3

1．1

Cystatinを包埋したりリポゾームを作る場合

〇。

2。

6・3

にLysosome酵素群の認識シグナルであるマ
ンノース6燐酸をコレステロールに結合させた

これはCathepsinBはほとんど阻害しない．し化合物を作り，これをリポゾームのリビッド二

かしQをKに変換したバリアントではCathe−

重膜に浮かせたものを作りLysosome tropic
な製剤を作ることを試みている．今一つの方法

psinLとPapainに対する阻害剤は上昇し，逆にCathepsinHに対する阻害度は20倍程悪くなるので，CathepsinHとCathepsinLに対する阻はCystatinをSMAポリマーとの結合物にする方法を企画している．

害度は逆転する．一方で，二番目のⅤをTに変文換したものはほとんど阻害活性を失った．従っ献て分子中のQVV周辺の構造はCysteine

Katunuma，N．，Yamato，M．Kominami，E．and

protease群の中の阻害特異性の決定と阻害活性の発現に大きな関与をしていることが明らか

IkeY．：Totalsynthesisofthecystatinαgeneになった．此の部分の各種の変換により阻害度116−118，1988．

anditsexpressioninE．Coli，FEBSLett．，238：−45−

E−64−CおよびESTの薬物動態
一蛍光HPLCによるモニター法の開発一
大 倉 洋 甫■
研究協力者 巣文 峰＊

甲 斐 雅 亮■

てノ

日n

C

本年度は，ペプチド様化合物であるE−64−C

︐ヽノ

C−C

′▼＼0／▼＼‖

HOOC

HH日

H、

を開発し，それらの生体内動態を検討してきた．

Cシン8）などの実用的かつ簡便な薬物モニター法

ノへ

フェニシノール5），6），アンチパイン7），ホル7ェニ

C
2
H
C
2
7ノ
TJH
‖n
H
︵し
︻し ︻し⁚‖∩

スタナン2）・3），p−ヒドロキンベスタチン汎4），ホル

ノ K ︑ O N

びに筋肉中に分布しているロイペプチン1），ベ●

快00√0／▼＼＝

H

トグラフィー（HPLC）を手段として，血液なら

C

Htc＿了

︐日
ヽノ︐ヽノ
日
C
Cn
ノ
灯
へ
C
2
H
e
C
S
2
a
7H
ノH
▼
ヽC
ノH
r
H
‖
J
忙V
＝L
H0
e
t
CC
■
m ． L 吊 t I2
HH
C
−
C
■
＝
N

体化試薬を利用した蛍光検出・高速液体クロマ

C

日日n

N
O
C

われわれは，高選択的かつ高感度な蛍光誘導

2

日 日 ⁚

C − C

は じ め にE−6q−Cてノ
CHl

およびESTの簡便な高感度分析法を開発する
ために，蛍光ラベル化剤として当分担研究者ら

二：二二；三＿一一

が既に開発している3−プロモメチルー6，7−ジメ

C

H
N
O
C

画：；

−

‖n

…‖州（州．州川「．．／CH5
Hn0＼

由来の妨害物質と分離・蛍光検出した．

／久

る蛍光ラベル化体は逆相HPLCによって試薬

0
0
2
H
︻し

︐ヽノ
日n

ってラベル化する方法を試みた（図1）．生成す

へ／C

てノ
日

分解反応条件を検討し，同様にBr−DMEQによOを蛍光ラベルする反応条件を検討した．また，りYよDMEQ）を用い9）・10），E−64−Cのカルポキンル基
ESTのラベル化には，ESTのE−64TCへの加水

Br−DMEO︒．㍊

トキシートメチルー2（lHトキノキサリノン（Br−

CONHCH2CH2CHLcH；

Fluorophore

図1Fluorescence derivatization of EST and
E−64−C With Br−DMEQ

実験方法
1）E−64−Cの誘導体化反応

50JJlをHPLCに用いる．

2）ESTの加水分解

遮光パイヤルに5mMKHCO。の80％（V／V）
ジメチルホルムアミド（DMF）水溶液10JJl，E

ESTの水溶液100JLlに300units（10mg）／−64−CのDMF溶液20JLlおよび3mM Br−

mlカルポキシエステラーゼ（0．1Mリン酸塩後

DMEQのDMF溶液70JLlを加える．密栓し，衛液，pH8．0）10JJlを加え，室温（24±5℃）

100℃で20分間加熱したのち，冷却後，反応液で30分間放置する．この酵素反応液20〟1にア
セトンを200〟1加え，1000gで5分間遠心す＊九州大学薬学部

る．その上清20JJlを上記の蛍光誘導体化反応−47−

を含む溶馳液ではカラムから完全に溶出されなに用いる．

3）HPLC条件

いので，95％CH3CNを含む溶散液で洛出し

カラムはTSKgel ODS−120T（150×4

た．一方，大部分の有機酸（パルミテン酸，オmm，i．d．；粒径，5um）を使用した．CH，CN

レイン酸，シュウ酸，マロン酸，乳酸およびリ−H20（2：3，V／V）の溶匪液を流速0．8ml／min

ンゴ酸）のDMEQラベル化体は40％CH3CNで送放した．E−64−Cの蛍光体が溶出したのち，の溶艶液を60分間流しても，カラムから溶出し直ちにCH3CN−H20（19：1，V／V）の溶駈液をなかった．

同じ流速で流し，カラムを洗浄した．蛍光検出

そのほか，α−ケト酸（p−ヒドロキシフェニル

は，励起波長380nmおよび発光波長460nmでビルビン酸，フェニルビルビン酸），L一α−アミノ行った．

酸（アルギニン，テロシン），糖（グルコース，
フルクトース）およびアミン（ヒスタミン，テ

結果および考察ラミン）に基づく蛍光ピークは検出されなかった．

1）HPLCによる分散基準操作に従い，蛍光ラベル化したE−64−C

E−64−Cラベル化体の蛍光スペクトルは，励起のクロマトグラムを図2に示す．E−64TCのBr−および発光極大波長をそれぞれ380および460

DMEQのラベル化体は未反応の試薬および分mに示した．また，E−64−Cの蛍光ラベノHヒ体

解物のピークと良く分艶し，保持時間20．0分には，反応後，室温で24時間放置しても安定であ溶出した．試薬由来のピークは40％CH3CN

った．

（A）

（B）

Elunet a Eluent b

Eluent a Eluent b

qsGOdsUH hOJUd■中ロU∽已OdsUh hOJUUuU凸

0

8

16

24

32

40

0

16

24

32

40

でime（mln）

Time（mln）

図2

8

Chromatograms ofthe DMEQ derivative of（A）E−64−C and（B）thereagentblank
Peaks：1，E−64−Cderivative；2，thereagentblank HPLCconditions：Column，TSKgelODS−120T（150×4mm，i．d．，particlesize，5JLm）；Eluent a，CH，CN−H20（2：．3，V／V）；Eluentb，CH3CN−H20（19：1，V／V）；Flowrate，0．8mi／min；Detection，Ex＝380mm，Em＝460nm．

−48−

E−64−CおよびESTの薬物動態

2）ラベル化条件
Br−DMEQによるカルポン酸の蛍光ラベル︺上か一小月メ巾UA

CH3CN溶媒中50℃で加熱することによって行われる10）．この方法では，無水条件を必要とするので，生体試料に応用し難く，また，反応液︵小一︻ヨhh巾h■一月h巾︶化反応はK2CO3粉末と18−Crown−6の存在下をHPLCに注入したとき，K2CO，粉末がサンプ
ルルー70などに詰まり易い．したがって，少量の水を含み粉末のない反応系について検討した．

010

図3は，水（2％，Ⅴ／v）を含む反応液に可溶
0

なK2CO。，KHCO。，KClあるいは有機塩基（どリジン，トリエチルアミン，テトラ一m−プチルア
ンモニウムヒドロキシド）を加えた場合の蛍光ラベル化体の生成量について調べたものである．

20

30

40

50

X2CO3′RHCO30rXCl仙り
12

pyrldlne′3

trletbylamlne

4or

tetr8−n−butylamonlum hydroxlde（t．V／vI

図3

Effectoftheconcentrationsofthebaseson the derivatization of E−64−C

カリウム塩は有機塩基よりも効率よくE−64−C

A20−JLlportion oflOnmol／ml E−64−C

蛍光ラベル化体の生成を促進させ，特に5mM

was treated asin the recommended

KHCO。を使用したときに蛍光ラベル化体の生

procedurewithvariousbases．

成量が最大となった．
図4は，5mM KHCO3，2．5mM，K2CO3または5mM KClを用いた各反応条件において，一息やぶり馬g

ある．3者とも最終反応液中2％（Ⅴ／v）の水を含む場合に，蛍光ラベル化体の生成量が最大になった．このとき，18−CrOwn−6（5mM）をそれぞれ反応液に存在させても，蛍光体の生成は︵一可Cn hhdh一丁qHヱ

反応液中の水の含量による影響を調べたもので促進されなかった．
反応の溶媒として用いたDMFのかわりに，

0

アセトニトリルおよびジメチルスルホキンドを用いた場合には，蛍光ラベル化体の生成量は

2

4

6

8

10

Water（t．Ⅴ／v）

図4

Effect of the amount of water

in

the

DMFの場合に比べてそれぞれ24および40％

reactionmixtureonthederivatizationofと低く，メタノール，ジオキサンおよびアセト

E−64−Cンではほとんど生成しなかった．したがって，

A20−JLl portion oflOnmol／ml E−64−C
was treated as

DMFを反応溶媒として選択した．

inthe recommended

procedureatvariousamountsofwaterin

2．5mM以上のBr−DMEQ試薬を用いたと

the reaction mixture．

き，E−64−Cの蛍光ラベル化体の生成量は最大になったので，基準操作では3mMを使用した．

下でも進行するが，遮光した場合約1．2倍生成

ラベル化反応は，図5に示すように，反応温量が増大したので，遮光バイアル中で反応を行度が高いほど速やかに進行した．最大の生成量った．

を得るために，基準操作では，100℃で20分間

3）ESTの加水分解の反応条件を選択した．なお，本反応は室内光

ESTは酸性（1．OM HCl）およびアルカリー49−

性（0．5M NaOH）溶液中では，効率よくE−

4）検量線および感度

64−Cに変換されず，ブタ肝臓の精製カルポキシ

本法によるE−64TCおよびESTの検出限界

エステラーゼを用いて加水分解したとき，ほぼ（S／N＝3）は，HPLC注入量（50JLl）中，両者完全にE−64−Cへ変換した（図6）．また，酵素濃とも500fmolであった．また，両者の検量線は度を100−500units／mlの範囲で変化させた場

原点を通り，少なく

合（室温で30分間のインキュベーション），いnmolまで直線性を示した．

ともHPLC注入量中100

ずれも100％の反応収率を与えた．
おわ り に
1

本研究において，E−64−Cを含水溶媒中で効率よくBr−DMEQにより蛍光ラベル化できるこ
一息早雲∴扁g︵一可65hh可HJ可qh巾︶とが分かった．このラベル化体は容易に逆相HPLCによって分柾され，高感度に蛍光検出された．検出感度は500fmolレベルであった．また，ESTのE−64−Cへの加水分解反応を検討した結果，酵素を用いる加水分解により100％の反応収率を得ることができた．以上により，本
10

20

30

40

50

60

でime（min）

図5

Effect ofreactiontimeandtemperature

法は生体試料中のE−64−CおよびESTの微量分析に十分応用できるものと考える．

on the derivatization of E−64−C

文

A20JLlportionoflOnmol／mlE−64−CWaS

献treatedasintherecommendedprocedure1）Kai，M．，Miura，T．，Ishida，J．andOhkura，

forvariousperiodsat37，60andlO0℃．

Y．：J．Chromatogr．，345：259−265，1985．
2）Ishida，J．，Yamaguchi，M．，Kai，M．and
Ohkura，Y．：J．Chromatogr．，305：381−
389，1984．

雲忘一望エリつぶh︵︺叫亡p hhdhJ可qh三3）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：
Xenobio．Metabol．Dispos．，1：3977403，
1986．

4）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：J．
Chromatogr．，344：267−274，1985．
5）Tamura，M．，Kai，M．and Ohkura，Y．：
15

30

45

60

Jap．J．Clin．Chem．，13：195−201，1984．

でlme（mln〉

図6

Time course of the hydrolysis of EST
with esterase，SOdium hydroxide or6）Kai，M．，Tamura，K．，0lm0，M．and
Ohkura，Y．：Biomed．Chromatogr．，1：143−146，1986．

hydrochloric acidAlOOJLlportionoflOnmol／mlESTwas

7）甲斐雅亮，坂本清治，三浦哲朗，大倉洋甫：

treatedwith（a）10JLl of300units／ml
esterase atroomtemperature（25℃），

分析化学，35：329−331，1986．
8）Chao，W．−F．，Kai，M．andOhkura，Y．：J．

（b）100／JlofO．5MNaOH atlOO℃and（C）100JLl ofl．OM HCl atlO0℃
Various periods．

for

Chromatogrリ430：361−367，1988．

9）Yamaguchi，M．，Hara，S．，Matsunaga，Rリ

ー50−

Er64−CおよびESTの薬物動態

Nakamura，M・and Ohkura，Y．：Anal．
Sci・・1：295−296，1985・

Nakamura，M．and Ohkura，Y．：J．
Chromatogr．，346：227−236，1985．

10）Yamaguchi，M．，Hara，S．，Matsunaga，R．，−51−

哺乳類横紋筋C−タンパク質アイソフォーム：
二次元電気泳動法とイムノブロット法による解析
丸 山 工 作●
研究協力者

大日方

昂＊

小 島

崇＊

新 保 和 彦＊C一タンパク質は横紋筋の筋原繊維上に存在

二次元電気泳動法とイムノブロット法の組合せする筋特異タンパク質である．最近までの研究により明らかにし，筋ジストロフィー症におけで，鶏の心筋，遅筋，速筋に存在する特徴的なる変化を探る足がかりとすることを目的とした．

アイソフォームが免疫学的な手法と1・2），二次元電気泳動法によって3・4）明瞭に区別され，親の鶏

実験の方法

では心筋と速筋に各一ケ（それぞれccと

主にウサギとラットを材料とし，速筋としてFC），遅筋にはニケのアイソフォーム（SC。，

は長指伸筋（EDL），遅筋としてヒラメ鼠 およSC．）（胚の筋では更に2ケの遅筋アイソフォー

び心筋（心室）を用いた．電気泳動用試料は，

ム，SCl，SC2）が明らかになっている．これら

タンパク質の分解を避けるため，新鮮な筋を8のアイソフォームの発現は，鶏骨格筋では発生

MグアニジンHCl抽出しそれを5M尿素−1の過程5）や筋が除神経された場合6），さらに筋ジMチオ尿素液に透析して作成した8）．等電点電ストロフィー症が発症した場合7りこ著しく変化

気泳動は平林の方法（1981）8）に従い，支持体はすることが明らかにされている．鶏胸筋では正アガロースを用い，pH領域の異なる酸性，中常には速筋型C−タンパク質のみが発現される性，塩基性の3屑のゲルを重ねて行った．そののに反して，筋ジストロフィー症が発症した場

後，二次元目の電気泳動法をSDS−7％アクリ

合には，速筋型C−タンパク質に加えて遅筋型C

ルアミドゲル上に展開し，CBB染色するか，ニ−タンパク質も発現される7）．これらのことか

トロセルロース膜に転写した後，C−タンパク質

ら，鶏では遅筋型C−タンパク質の発現は筋ジスに対するMcAbを作用させて，その反応からC

トロフィー症の発症過程をみるための良い指標−タンパク質のスポットを同定した（イムノブロになることが指摘された7）．

ット法）．イムノブロット法の詳細は既に記し

哺乳類でも，鶏の場合のようにC−タンパク質た4），9）．

の発現変化を指標として筋ジストロフィーの発症を見ることが可能かどうかはっきりしていな
い．哺乳類のC−タンパク質アイソフォームを調結果（1）哺乳類のC−タンパク質を認識するモノクロ

べるために適切なモノクローン抗体（McAb）がーン抗体の検索準備されていないことが一つの理由である．そ今まで我々が進めてきた研究の中で既にC−

こで本研究においては，まず哺乳類のC−タンパ

タンパク質に対するモノクローン抗体が6種類

ク質に反応性のあるMcAbを検索し，更にC−作成されている（表1）が，それらはいずれも鶏タンパク質アイソフォームの基本的パターンをのタンパク質を免疫原として作成されたものである．これらの中に，哺乳類のC−タンパク質に■千葉大学理学部生物学科も反応するものがあるかどうかを調べた．ラッ−53−

トの速筋（EDL），遅筋（soleus），心筋（心室）

全く反応しなかった（表1）．C−タンパク質の抗の全タンパク質抽出液をSDSrPAGEで展開し原性は，鳥類と晴乳類間ではかなり異なるようた後ニトロセルロース膜に転写し，イムノブロに見える．以上の結果から，FC−18を用いるこット法により6種類の抗体を検定したところ，とにより晴乳類の適う凱心筋のC一タンパク質を一つのクローン（FC−18）が速筋と心筋と反応解析することは可能であることがわかったが，し，単一のバンドを与えることがわかった（図遅筋C−タンパク質のための免疫学的プローブ

1）．そのサイズは分子量約140kDaで，鶏のCは見つけられなかった．

一タンパク質のバンドと移動度が一致した．この（2）二次元電気泳動法による解析

抗体はヒヨコの胸筋のC−タンパク質を免疫原

ウサギの心筋，EDL，ヒラメ筋の全タンパクとして作成されたものであるが，鶏の場合，速質抽出液を二次元電気泳動法で展開し，ニトロ筋と心筋のC−タンパク質を特異的に認識する

セルロース膜に転写した後，FC−18を作用させことが，既にわかっている10）．これらのことからることにより心筋C−タンパク質（cc）と速筋C考えて，FC−18は輔乳類の速筋型，心筋型C−タ−タンパク質（FC）それぞれに一ケずつのスポッ

ンパク質とも交差反応するが，遅筋C一タンパクトを検出することができた（図2）．C−タンパク質とは反応しないものと判断された．特異性は質のスポットはCBB染色でも明瞭に見ること

筋凍結切片を用いた蛍光抗体法による解析によができた．分子量的にはccがFCより若干大っても確かめられた．ウサギおよびマウスのC−

きい．比較のために，同一ゲル上でミオシンHタンパク質も全く同様な反応性を示した．他の一鎖（MHC）のスポットをMcAb（MF−20）を

5種類のMcAbは哨乳類のCrタンパク質とは用いて検出したところ，C−タンパク質のスポッ
トはMHCよI）やや塩基性側に位置した．まCardiacC
R

Fast（EDL）

a b＊

a（）＊

C

a b＊
讐野

R

1

a e＊

Slow（soleus）

た．心筋とEDLの抽出液を混合して電気泳動

CRし，ccとFCを同一ゲル上で比較してみると，

a d＊

a d＊

両者の等電点はほぼ等しいことがわかった．鶏日￣−−ではccとFCは等電点電気泳動で明らかに区

一

■

息

義

鼻

一

一

⁚m

条塩

儀

犠

ヨ
イ■

表l C−タンパク質に対するモノクローン抗体ニやす

ワトリとウサギのC−タンパク質アイソフォームとの反応性

議鈍
も

▼

怨が
萱盛

禦瀾遇溺憫

深遠誓

感滋徽

C−タンバク賞のタイプ

ニワトリ
應筋型

図1哺乳類C一タンパク質を認識するモノクローン抗体FC−18の検定

MF−1

＋

トTF−21

＋

FC−18

＋

F C−20十ノクロ〜ン抗体C−315（b），MF−1（C），ALD

ALD−66−−66（d），FC−18（＊）による反応を示す．
抗体については表1を参照のこと．

C−315

鶏（C）またはウサギ（R）の心筋，速筋，道筋の全タンパク質抽出液をSDS−PAGE（7％ゲル）に展開し，イムノブロット法により抗体の反応性を調べた．a，アミドブラ
ック染色による電気泳動パターン（a）とモ

−54−

屈筋型

ウサギ
心筋型

−

＋

＋

一

一

＋

速筋聖

＋

遅筋型

心筋聖

十

哺乳類横紋筋C−タンハク門アイソフォーム

1

Card

1

Fast（EDL）

仁

OH
仙仁

■■■

■｝ト

㌻

CC

SIow（soleus）

card＋Fastこ●▲mmunoblots

⁚¶

r1−ニ

l

︺腐り↓︷■∫騨▲﹁■凶■d−ね■翳常且7㌢

こBB stain請

図2

ウサギのC−タンパク質の二次元電気泳動
による解析

▲▲
図4

心筋（Card），速筋（Fast），道筋（Slow）の抽出タンパク質を二次元に展開し，CBB

鶏とウサギの各種C一タンパク質アイソフォームのペプチドマップによる比較二次元電気泳動で分離されたC−タンパク質スポットを切り出し，Clevelandの方法11）に従ってⅤ−8プロテアーゼにより分解，フラグメによる染色（上段）またはFC−18とミオシンH一鎖（MHC）に対するMcAb（MF−20）の二重処理によるイムノブロット（下段）よ

ントを13．5％アタリアミドゲル内でSDS−
PAGEにより展開した．1，2，3，4は鶏のり，心筋（cc），速筋（FC）C−タンパク質

FC，cc，SC3，SC4，5，6，7はウサギのFC，cc，SCのパターン．

を同定した．遅筋C−タンパク質（SC）は電気泳動パターンから推測した．図にはミオ
シンH一鎖とC−タンパク質領域のみを示し
ている．

l．▲

かなりよく似ていた（図4）．このSC様スポッ
トはFC，ccより酸性の等電点をもつ．

別され，前者が後者より少し塩基性の等電点をラット，マウスのC−タンパク質についても，示すことが観察されており，この点では鶏と晴同様に二次元電気泳動法で解析したところ，ウ

乳類が異なる．抗体（FC−18）が反応しないためサギの筋の場合とよく似たパターンを示したに，遅筋（ヒラメ筋）のC−タンパク質（SC）の（図3）．C−タンパク質は種が異なっても晴乳類

スポットを明確に特定することはできなかった

共通のパターンを示すと思われる．

が，ミオシンH−鎖の近傍に位置し分子量14万筋ジストロフィー症（mdx）マウスと正常マ程度の明らかなスポットは一個しかなかったのウスのEDL筋の間で，C−タンパク質のタイ70でとりあえずこれをSCとみなした．このタン（二次元電気泳動法パターン）に差がみられる

パク質スポットのV8プロテアーゼによるペかどうかを予備的に調べてみたが，FC−18で検

プチドマップを，鶏SCのそれと比べたところ，出されるFCのスポットについては両者で明ら−55−

Cardjac Fast（EDL）
H十

OH￣

■
−￣■■■−

察

本研究において，晴乳類筋ジストロフィー症◆●︑

一・
ご「ニ＿二三一二ぎー

考S10Wtsoleus）「

をC−タンパク質を指標として追跡するための第一歩として，横紋筋C−タンパク質の二次元電1＿⊥套芋蔓メ一二￣弓き≠⊥享

気泳動における基本パターンをおおよそ明らかにした．筋ジストロフィー鶏では，遅筋型C−タンパク質（SC）の発現が促されていることが特徴として知られる．哨乳類の場合ではどうかを明らかにすることが，当面の最終目標である．

図3 ラットのC−タンパク質の検出
心筋（Card），速筋（Fast），遅筋（Slow）の抽出タンパク質を二次元に展開し，図2の場合と同様に，心筋（cc），速筋（FC）
C−タンパク質を同定，MHCとの位置関係を比較した．矢印がC−タンパク質と考えられるスポット．

SCのスポットは電気泳動法のパターンからもある程度わかるが，鶏の例からするとSCには複数の変異体があることが推測され，晴乳類の遅筋C−タンパク質を認識するMcAbを手にしていない現状では，確かな結論を下すことはできない．現在，目的に合うMcAbの作成を進めている．作成に成功次第，イムノブロット法とnormal

mdx

寺C

r：

『．

免疫組織化学の手法を組み合わせて，筋ジスト
ロフィー症に伴うC一タンパク質の変動について最終的な結論を得たい．

●

FC

−

FC

文

■■

l■

献

●
1）Reinach，F．CリMasaki，T．，Shafig，S．，

MHC

MHC

FC

Obinata，T．andFischman，D．A．：J．Cell
FC

Biolリ95：78−84，1982．

■−

2）Kawashima，M．，Kitani，S．，Tanaka，T．，
図5

正常およびmdxマウスの速筋（EDL）におand Obinata，T．：J．Biochem．，9：1037−

けるC−タンパク質の比較

1047，1986．

筋の仝抽出タンパク質を図2同様に，解析した．上段はCBB染色，下段はイムノブロ
ットのパターン．＊印が道筋C一タンパク質

3）TakanorOhmuro，H．，Goldfine，S．M．，
Kojima，T．，Obinata，T．，Fischman，D．A．：
J．Muscle Res．CellMotil．in press．

と推定されるスポット．

4）丸山工作：厚生省「低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究」（江橋址），62
かな違いは兄いだされなかった（図5）．遅筋C−タンパク質（SC）については抗体による確かな

年度研究報告書，1988，p．p．47−51．
5）Obinata，TリReinach，F．CリBader，D．，

同定はできないが，CBB染色で見られるタンパ

Masaki，T．，Kitani，S．and Fischman，

ク質スポットの内＊印のものがSCと推測されD．A．：Dev．Bio1．，101：116−124，1984．

る．このスポットはmdx，正常いずれにも見ら

6）Obinata，T．：Zool．Sci．，2：833r847，1986．

れるがmdxの方が量的に多いように見える．

7）Obinata，T．andShinbo，K．：Muscleand

抗SC抗体を作成し厳密に検討したい．

Nerve，10：351−358，1987．
8）Hirabayashi，T．：Anal．Biochem．，117：−56−

哺乳類横紋筋C一タンパク質アイソフォーム
443−451，1981．

Sci．，5：1227，1988．

9）Ogasawara，YリKomiya，T．andObinata，11）Cleveland，D．W．，Fischer，G．S．，Kirschner，

T・：J・Biochem・，102：25−30，1987．
10）Kojima，T．，Shinbo，K．，Obinata，T．：Zool．

−57−

W．and Laemmli，U．K．：J．Biol．Chem．，
252：1102−1106．

CANP阻寄剤の一般薬理学的研究
一神経活動および筋電図の周波数分析に基づく
呼吸筋機能評価法に関する基礎的研究一
福 原 武 彦＊研究協力者

日木 村 直 史書 加 藤 絶 夫＊

高 野 一 夫■的に発現する成分である可能性を計量的方法に的

ヒト筋ジストロフィー症に対する治療薬の開よって示した8），11）．

発と研究を推進するにあたり，生理学ならびに一方，高頻度同期波が神経筋伝達を介して呼病態生理学的基盤に立った薬効の定量的評価法

吸筋の筋電図中にも発現することは，ウサギ以を確立することが急務であることはいうまでも外の高等哺乳動物種においても確認されておない．その第一歩として，疾患モデル動物におり5），6），さらに，健常人の肋間筋もしくは横隔膜ける病態および薬効の評価を可能とする信頼度の筋電図から，これに相当する成分を検出したの高い方法を確立し，その上で，モデル動物に報告もある1）・3抽12），13）．したがって，ヒトにおいおいて治療薬の効果を定量的に評価し，臨床応ても，呼吸筋筋電図を非侵襲的に導出すること用のもととなる基礎的知見を得ることは，研究によって，高頻度同期波を同定し，呼吸機能，推進の重要な基礎である．さらに，その評価法

神経筋伝達，および筋収縮機能との関連のもとにおいて用いられる指標が可及的に非侵婆的なに，これらの機能的な異常を定量的に評価し得

計測手法によって測定することができ，しかも，る可能性がある．

実際の臨床症例に対しても適用可能であり，さこの評価法が，一つの臨床検査法として確立

らに治療薬の薬効のみならず病態，およびそのされれば，筋ジストロフィー，重症筋無力症あ進行もしくは改善の程度の評価方法としても応るいは筋萎縮性側索硬化症などの運動単位の障用され得ることが確認されるならば，その評価害をきたす疾患の病態やその治療薬の薬効を，法の有用性は，極めて高いものとなるものと考機能的かつ非侵襲的に評価する方法として応用えられる．

し得る可能性が期待される．

我々は既に，高等哺乳動物の横隔神経活動電

今年度，我々は，筋電図に発現する高頻度同位中に発現する約60−130Hzの成分，すなわ

期波の定量的解析法の臨床的検査ならびに診断，

ち「高頻度同期波」と1対1に対応した成分が，および治療薬の薬効評価への応用に際して必須

横隔膜の筋電図中にも検出され得ること，そしの理論的基礎となる高頻度同期波の基本的な生てこの成分が，炭酸ガス負荷による呼吸性ドラ

理学的性質を明らかにすることを目的として，イブの増大に伴って増加することをウサギで確動物における呼吸運動性出力を含む遠心性神経認し，報告した7）・9）．また，昨年度，我々は，こ活動の導出とそのコヒーレンス解析を行なった．

の研究成績を踏まえて，この「高頻度同期波」

コヒーレンス（関連度関数）解析は，二つの信成分が，呼吸中枢からの呼吸運動性出力に特異号の間に共通の周期性成分を検出し，その同期の程度，すなわち相関関数を各周波数ごとに定＊東京慈恵会医科大学第二薬理学教室

量的に推定することを可能とする解析法であ一59−る2）．さらに，その臨床応用の可能性を検討する

CONTROLことを目的として，健常人における呼吸筋およl

HYPERVENTILATJON⊥「

び呼吸に補助的に関与する骨格筋の筋電図の導▲l

仁＿山山▲山j…・・…＝」L」

出とコヒーレンス解析を行なった．

l

COHEAEHCE

≡±二

1．1

0．1
◆¶

PHASE ANGL【

Ⅰ動物において導出された遠心性神経活動中−¶の高頻度同期波の定量的解析
図1麻酔下に非動化され人工換気下に維持されたウサギから導出された横隔神経活動と舌下神経活動の周波数解析．いずれも70−130
Hz，PNA，横隔神経活動の自己パワースペ
クトル．XII，舌下神経活動の自己パワース
ペクトル．CROSS−SPECTRUM，横隔神経活動と舌下神経活動の相互パワースペクト
ル．COHERENCE，同コヒーレンス，

Ⅰ−1）方法
体重2．0〜3．0kgの両性のウサギをDiethyl−
ether麻酔下にgallamine（5mg／kg，i．V．）により非動化した後，呼気ガスCO2および02濃度の連続監視下に，人工呼吸により換気を適正に維持した．両側の迷走，減圧および頸部交感神経，
ならびに両側の頸動脈洞神経を切断した．直腸PHASE ANGLE，同位相角．左：適正換気．右：過換気．

塩を37℃前後に維持し大腿動脈血圧を監視した．頸部において横隔神経ならびに舌下神経の遠心性発射活動を導出し，これらをデータレコ

CONTROL
PNA

ーダー（TEAC，RT210）を用いて磁気テープに収録した．

HYPOVENTILAT10N

＿▲‥コ

XH
l

実験終了後，医用電算機（日本電気三栄，

CROSi−SPECTRUl▲＿＿＿▲▲．＿＿＿＿．＿l

l

▲

1

二五コ

7T17）を用いて，横隔神経活動と舌下神経活動

l

＿⊥

】

上▲」L山一Jl＿⊥

1の自己パワースペクトル密度関数およびコヒー

L0
0．0
◆下
■¶

レンスを，0−200Hzの周波数帯城について，
FFT法により推定した（0．25Hz／bin，20−45

図2回加算）2）．この解析には本教室において本研究のために作成されたプログラムを用いた．
Ⅰ−2）実験成績
舌下神経活動と横隔神経活動のコヒーレン

麻酔下に非動化され人工換気下に維持されたウサギから導出された横隔神経活動と舌下神経活動の周波数解析．いずれも70−130
Hz．PNA，横隔神経活動の自己パワースペ
クトル．狐舌下神経活動の自己パワースペ
クトル．CROSS−SPECTRUM，横隔神経活動と舌下神経活動の相互パワースペクトル．
COHERENCE，同コヒーレンス．PHASE

ス・スペクトルには，両神経活動中に1対1に同期した約100Hzの周期性成分が存在するこANGLE，同位相角．左：適正換気．右：換
気低下．

とを示唆する明瞭などークが見出された（図1，
図2それぞれ左）．過換気によって，このピークの高さならびに幅は，減少し（図1右），換気低下によって増大した（図2右）．横隔神経活動とに変化した．

舌下神経活動の高頻度同期波帯域における最大コヒーレンスは，適正換気下（呼気炭酸ガス終ⅠⅠヒト呼吸筋筋電図中の高頻度同期波関連成

末濃度：3．7±0．1％，平均値±標準偏差：n＝11〜14）で，0．82±0．12，高炭酸状態（5．2±0．1分の導出と解析ⅠⅠ−1）方法％）で，0．87±0．05（P＜0．05），低炭酸下で健常男子二名（30−41歳）を被験者とし，一（2．4±0．1％），0．79±0．11（P＜0．01）と有意例においては，左顎二腹筋前腹上（図4，5右下

ー60−

CANP阻害剤の一般薬理学的研究の模式図の1㌧横隔膜胸骨部近傍上の剣状突起（図3右）．のコヒーレンス・スペクトルには，両側（同2，3）および第7，第8肋間前腋萬線

0〜200Hzの広範な帯域において同期した成分

上の左右肋間部（同4，5）における表面集合筋が存在することを示唆する複数のピークが検出

電図を，また，もう一例においては，横隔膜肋された（図5）．このようなピークは，顎部およ骨部の起始部近傍である第12〜第7肋軟骨下び胸部筋群の非呼吸性の随意的な収縮運動によ

綾上の左右計六箇所における表面集合筋電図をっては発現しなかった．

（図7，8右下の模式図の1−6），それぞれ表面皿

一方，安静呼吸下に横隔膜周縁の六箇所から電極により双極性に同時導出した．これら筋電導出された筋電図（図6左）の間のコヒーレン

図の記録を呼気中炭酸ガス濃度の連続記録ととス・スペクトルには，20Hz以下の低周波数帯域

もにデータレコーダ（SONY，PC−108）に収録

において，高いコヒーレンスを示すピークが認し，実験終了後，筋電図中に混入する心電図成‖害≡

分をR一波同期FFT法により除去した上で13），

EUPNEA

これらのすべての組合せについてコヒーレンスを演算した（0−200Hz，2Hz／bin；集合平均加算回数≧45）．
ⅠⅠ−2）実験成績
安静呼吸下において導出された左顎二腹筋，
左右剣状突起部および左右肋間部の筋電図（図3左）の間のコヒーレンス・スペクトルには，左右の刺状突起の両側部の問を除き，商用交流電源に由来する50Hzおよびその高調波以外に

図4 安静呼吸下に導出された筋電図群問のコヒーレンス・スペクトル．0−200Hz．縦軸は各筋電図記録に共通の成分の存在を示唆する特徴的なピークは見出されなかった（図4）．しか

いずれもコヒーレンス（0．0−1．0）．各スペ

し，努力呼吸中に導出されたこれらの筋電図間

クトル中の数字の組は，それぞれ，図中右下に示した各導出部位の筋電図間のコヒーレンスであることを示す．図3と同じ被験者の記録の解析結果．
FORCED BREATHlNG

2十トト川一汁汁1十十冊中州叶十琳十1冊■

3冊十什十什什¶冊冊冊冊−叫叫小串叫・
佃舟両州仲佃・

00

uUZ︼正︸一〇〇％）．校正は，10／JV（1）ならびに50〝Ⅴ（2−5）．時標は1S．A，安静呼吸．B，努力呼吸．筋電図の導出部位については本文および図4，5を参照されたい．記録2−5中のスパイク様電位は，ECGの混入．

0

図31−5，健常人から導出された筋電図記録．
FECO2，呼気炭酸ガス濃度（校正は0〜5

図5

−61−

努力呼吸下に導出された筋電図群間のコヒーレンス・スペクトル．詳細は図4に準ずる．

刷ト 小山」一心1▲＋」仙トl

2」」↓一付目十廿廿

ん↓↓

皿．

3 二三一÷十山一⊥十・L・土1・寸⊥・二・一・・一一‥・．一一

4」4−LtL主トトし畠一＿し

5

棉岬叫・

闇憫闇

傭闇闇闇

l

EUPNEA6

図61−6，健常人から導出された筋電図記鼠FECO2，呼気炭酸ガス濃度（校正は0〜5％）．校正は，50JJV．時標は1S．A，安静
呼吸，B，努力呼吸．筋電図の導出部位については本文および図7，8を参照されたい．
記録の1−6中のスパイク様電位は，ECGの混入．

菌︼OZ山∝︼ェOU

FECO2

図7

安静呼吸下に導出された筋電図群間のコヒーレンス・スペクトル．0−200Hz．縦軸は
いずれもコヒーレンス（0．0−1．0）．各スペ
クトル中の数字の組は，それぞれ，図中右下に示した各導出部位の筋電図間のコヒーレンスであることを示す．図6と同じ被験者の記録の解析結果．

められたが，これ以外に特徴的な共通成分は検出されなかった（図7）．しかしながら，努力呼吸下，あるいは，深呼吸下（図8）において導出

DEEP BREArHING

されたこれらの筋電図のコヒーレンスには，いずれの筋電図間の組合せにおいても，0−200
Hzまでの広い帯域において，高い値を示す複数のピークが発現した．

考

察

菌

動物実験の成績より，呼吸運動に直接関与す
る骨格筋を支配する遠心性神経活動に特徴的な成分である高頻度同期波は，上気道，ことに舌筋を支配する舌下神経活動中にも，横隔神経活
動中の高頻度同期波と同期して発現することが

図8 深呼吸下に導出された筋電図群間のコヒー
レンス・スペクトル．詳細は図7に準ずる．

明らかとなった．しかも，その同期の程度が，血中炭酸ガス分圧の上昇による呼吸性ドライブ低下させると考えられているpentobarbital14）の増加にともなって増大する事実は，このコヒの静脈内小用量適用によって，有意に減少する

ーレンス解析を炭酸ガス応答などの従来から用事実を報告している10）．この事実は，このコヒーいられている種々の呼吸生理学的検査法と組合レンスによる解析法が，導出する2つの生体信せることによって，呼吸筋支配神経から呼吸筋

号中の同期性活動が発現するまでの過程におけ筋線維までを含む運動単位の機能検査法としてるいずれかの箇所においてその伝達特性が損わ

応用し得る可能性を示すものである．

れた場合に，その変化を鋭敏に検出し得る解析

我々は既に，横隔神経活動と舌下神経活動の法であることを示すものである．

高頻度同期波帯域におけるコヒーレンスが，主一方，健常人において，努力呼吸下という，として中枢神経系におけるシナプス伝達効率を呼吸性ドライブを意識的に高めた状態において−62−

CANP阻害剤の一般薬理学的研究導出された呼吸筋群の筋電図中に，互いに同期した成分が存在することをコヒーレンス法によ

参考文献
1）Ackerson，LM．andBruce，E．N．：Bilater−って確認し得た事実は，この高頻度同期波に相ally synchronized oscillationsin human当すると推定される成分が，呼吸筋を支配する

diaphragmandintercostalEMGsduring

神経の発射活動だけではなく，−その筋電図に基SpOntaneOusbreathing．Brain Research，

づいても，定量的に解析され得る可能性を示す・

271：346−348，1983．

ものである．従って，筋電図を導出している部

2）Bendat，J．S．andPiersol，A．G．：

Random位の近傍において，筋線経の萎縮や，神経筋接Data：AnalysisandMeasurementProce−

合部の機能的障害などの病態生理学的な変化がdures生じた場合，その筋電図中における発現の様式

1971．

ならびに程度は，定性的かつ定量的に変化する，JohnWileyandSons，NewYork，

3）Bruce，E．N．andGoldman，M．D．：High−ものと推察される．

frequency oscillationsinhuman respir−

しかしながら，本研究においては，安静呼吸

atoryelectromyogramSduringvoluntary

下に導出された左右横隔膜表面筋電図のコヒー

breathing．BrainResearch，269：259−265，

レンス中に高頻度同期波性のピークが存在する1983．

としたAckerson and Bruceの報告1）とは異な

4）BruCe，E．N．andAckerson，LM．：High−り，安静呼吸下において動物の高頻度同期波に

frequencyoscillationsinhumanelectr0−

相当すると考えられる成分は検出し得なかった

myograms during voluntary contrac・（しかし彼らの示したコヒーレンス値は極めてtions．J．Neurophysio1．，56：542−553，

低く約0．1以下である）．また，本研究では努力

1986．

呼吸下において発現したコヒーレンス・スペク

5）Dittler，R．undGarten，S．：Diezeitliche

トル中の高頻度同期波に相当すると考えられる

Folge der Aktionsstr6mein Phrenicus

ピークの形状およびその周波数帯域にも，個体

und Zwerchfell bei der natiirlichen

差や，時間経過に伴う変動が認められた．

Innervation．Z．Bio1．，133：420−450，1912．

従って，次の研究課題は，本研究において得

6）Gasser，H．S．and Newcomer，H．S．：

られた成果をふまえ，様々な生理的条件下におPhysiologlCal action currents

ける高頻度同期波の性質を，動物ならびにヒト

phrenic nerve．An application of the

においてさらに検討を加え，その結果に基づき，

thermionic vacuum tube to nerve

適正かつ最適な測定条件，筋電図の導出方法な

physiology．Amer．J．Physio1．，57：1726，とを初めとした標準的な計測ならびに解析方法

1921．

in

the

および測定結果の解釈（臨床的所見との対応を

7）福原武彦：CANP阻害剤の一般薬理学的含む）につき十分な知見を積み重ねることであ研究−スペクトル解析を用いた筋電図およる．このような検討の結果に基づき確立される

び神経活動の定量的評価法一，厚生省新薬解析法は，筋ジストロフィー症における呼吸筋

開発研究費「低分子酵素阻害物質による難変性の進行の程度の機能面からの判定および病治療薬の開発研究」（江橋姓）昭和61年

CANP阻害剤の治療効果に関する非侵襲的な度研究報告書，1987．

定量的評価方法としても有効な臨床的応用が期

8）福原武彦：CANP阻害剤の一般薬理学的研究一筋電図および神経活動中の呼吸運動待される．

関連成分の定量的評価法に関する基礎的研究−，厚生省新薬開発研究費「低分子酵素−63−

阻害物質による難病治療薬の開発研究」（江11）加藤絶夫，木村直史，福原武彦：呼吸リズ
ムを発現する遠心性神経活動における高頻度同期波の局在とその機能的意義．自律神橋証）昭和62年度研究報告書，1988．
9）Kato，F．，Kimura，N．，Takano，K．and

経，25：503−510，1988．

Hukuhara，T．，Jr．：Quantitative spectral

analysisofhighfrequencyoscillationsin

12）SapuntSOV，L．E．：Correlationanalysisof

efferentnerveactivitieswithrespiratory

electrical activity ofhuman muSCles ofrhythm，In：

respiration．Bull．Exp．Biol．Med．，71：

Respiratory

theirNeuromotorControl

Musclesand604−606，1971．

，（edby，G．C．

Sieck，S．C．GandeviaandW．E．Cameron．）

13）Schweitzer，T．W．，Fitzgerald，J．W．，

Alan R．Liss，New York，1987，pp．263−

Bowden，J．A．and Lynne−Davies，P．：

267．

Spectral analysis of humaninspiratory10）Kato，F．，Kimura，N．，Takano，K．and

diaphragmatic electrograms．J．Appl．

Hukuhara，T．，Jr．：Effect of pentobar−

Physio1．，46：152−165，1979．

bital on coherent relationship between14）WillowM．andJohnston，G．A．R．：Phar・

high−frequencyoscillationsininspiratory

macology of barbiturates：electro−

discharges of the phrenic and cranial

physiologicalandneurochemicalstudies．

nerveS．JapanJ．Pharmaco1．，43suppl．：59

Int．Rev．Neurobio1．，24：15−49，1983．

1987．

ー64−

骨格筋ミオシン軽鎖のラジオイムノアッセイによる測定法の開発
矢 崎 義 雄＊研究協力者

永 井 良 三■磯 部 光 章■

加 藤 祐 之■杉 田 秀 夫＊＊骨格筋の変性疾患の際に，障害された骨格筋

た診断法になるばかりでなく，その血中濃度のより血中に逸脱した骨格筋蛋白を測定して生化

経時的な変動は，障害された骨格筋の崩壊と治学的に診断する方法が，感度と特異性にすぐれ，療過程を反映し，病態の正確な把握ばかりでな

しかも非侵襲的であることから臨床に広く用い

く，薬物による治療効果を定量的に評価するこられている．特に骨格筋障害の程度と範囲が，とが可能となり，臨床的に極めて有用である．

その血中濃度ないしは流出量から定量的に測定

このような観点から我々が開発したのが骨格筋

することが可能であるとして注目されている．

ミオシン軽鎖測定用のラジオイムノアッセイ法

このような生化学的診断の指標となる蛋白としである．すなわち，ミオシンは筋細胞におけるて，従来から骨格筋細胞中に存在するCPKや構造蛋白の約60％を占め，最も含有量の多い蛋GOTなどの酵素やミオグロビンなどが検討さ白である．その分子量の小さなサブユニットでれた．

ある軽鎖は容易にミオシン分子より解離して細しかし，これら指標物質は細胞中に可溶性蛋

胞外に逸脱し血中に流出する．しかもきわめて白として存在しているために，骨格筋の障害な安定な蛋白であることから，われわれは筋組織

いしは変性による細胞膜透過性冗進によって細障害の指標物質としてその測定を試みた．今回

胞外に逸脱して血中に流出するものであり，骨はその方法の解説と臨床応用およびその限界に格筋障害を検出する感度は高いが，骨格筋細胞

ついて報告する．

の構造崩壊過程を経時的に反映する指標とはならない．．特に筋ジストロフィー症においては，Ⅰ． 骨格筋ミオシン軽鎖抗体の作成

骨格筋の病変がまず細胞膜障害として出現する

ミオシンは死後4時間以内に剖検された，何ために，CPKなどの指標物質が早期に細胞外に等病変を有しない大腿筋より改良せる希釈法に逸脱してしまい，その血中濃度と骨格筋障害のより抽出し，DEAE A25のカラムにより精製程度との相関が，重症な患者ほど失われる可能

した．軽鎖は5モル塩酸グアニジンによりミオ性がある．

シン分子から分匪し，アルコール分画法によっ

一方，骨格筋における主たる細月包構築は筋原て重鎖を遠沈後，透析と凍結乾燥により得た．

線経であり，特異的な構造蛋白によって構成さ

抗ミオシン軽鎖抗体は，ウサギを精製した軽鎖れている．もし骨格筋疾患において，障害されにて免疫することにより作製した．すなわち，た骨格筋からこのような構造蛋白が血中に流出

軽鎖をリン酸緩衝液に1mg／mlとなるようにし，しかもこれを測定できれば特異性にすぐれ溶解した後，等量の完全フロイントアジュバン＊東京大学医学部第三内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

ドを加えて混和し，その500〝1をウサギの皮内に2週間おきに6回注入し抗体価の上昇をみた．
−65−

ⅠⅠ． ミオシン軽鎖のラジオイムノアッセイ法
3羽のウサギを免疫して，もっとも抗体価の

表1骨格筋ミオシン軽鎖のラジオイムノアッセ
イ法

上昇したウサギより採血し，抗体血清を得た．

試料血清又は標準溶液
標識抗原（125り溶液
血清抗体溶液（200倍）

ラジオイムノアッセイ法は，表1に示すような方法により行った．すなわち，試料血清ないし

100JJ
100JJf
100JJJ1は精製した標準液を100JJl，タロラミンT法にインキュベーション

18時間

1

より125Ⅰで標識した軽鎖を10，000cpm／100JJl，第2抗体（ヤギ杭マウスIgG抗体） 5001」

200倍希釈の抗血清100JJl，そして1％ウシ血1インキュベーション

清アルブミンを含んだリン酸緩衝液100JJlを1時間l

混和し，4℃で18時間インキュベーションした．

遠心（3000rpm20分）

そしてB／F分散をヤギ抗ウサギIgG血清を用

放射能をrカウンターにて測定l

いた二抗体法により行い，遠沈して結合した放射能をγシンチレーションカウンターにより測定し，試料血清中のミオシン軽鎖濃度を算出した．
図1は骨格筋ミオシン軽鎖ラジオイムノアッ
セイ法の標準曲線である．測定限界は7ngと，

20

貢15
品10

われわれがすでに確立した心筋ミオシン軽鎖測5

定法の1ngと比べて感度は低かった．抗血清の希釈を低めて抗体濃度を上昇させても，これ以10上の測定感度を得ることはできなかった．

100

1000

骨格筋ミオシン軽鎖（ng／れりⅢⅠ． 筋ジストロフィー患者における血中骨格

図1骨格筋ミオシン軽鎖ラジォイムノアッセイの標準曲線

筋ミオシン軽鎖値0

健常者の血清では，今回のラジオイムノアッ
セイ法によって検出される軽鎖値は10ng／ml

200

400

600

ng／J

手
健常人

以下であった．一万，10名の筋ジストロフィー
患者の血清においては，図2に示すように，200

筋ジス
患 者

ngから600ngの広い範囲に渡って高値を呈していた．そして全ての患者血清において骨格筋

●

●
・

r

・● ．
●

図2 血中骨格筋ミオシン軽鎖濃度の比較
一健常者と筋ジストロフィー患者−

ミオシン軽鎖は検出され，10mg／ml以下の症例はなく，診断の感度は100％となることが判明した．今後は多数の症例で測定し，病態との関るためには通していないのが現状である．今後

連，経時的変化の観察，薬物療法の効果の評価

は測定方法をキット化すべく，骨格筋ミオシン
軽鎖を更に抽出分画し，多数のウサギをより多などに用いて検討を進めていく予定である．

量の抗原蛋白を用いて免疫を行い，抗体価の極

ⅠV． 今後の課題

めて高い抗血清を作成し，測定感度も1mg／ml

今回12週間に渡り免疫を施行したが，抗体価のレベルになるよう新しくラジオイムノアッセの上昇が十分でなく，用いた抗血清の最終倍率

イ系の確立を試み，改めて免疫することをすでは200倍と低く，多数の症例を多施設で測定すに開始している．

−66−

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進行過程−CTスキャンによる定量的評価
石 原 博 幸＊
弘

＊

＊

潤

＊

行

武

村

儀

慈

川

田

＊

原

園

雄

＊

＊

名

招

元

昭

田

茂 郎

明

柳

横

三

字

青

＊

里

研究協力者

表1Subjects

は じ め にCTを用いて骨格筋を形態学的に評価する方

S w in ya rd sta ge

N o ．0f c a sesAge
6．
7 士0 ．
8

法は，従来からいくつか試みられてきた1ト6）．しかし，筋病変の程度，分布および進行過程を定

2

7

3

6

8．
8 士 ト7

量的に評価する方法は，まだ充分確立していな

4

3

11．
3 土 1．
5
1ト4 士2 ．
7

5

14

6

16

13 ．
6 ±3 ．1

716

14．
8 士2 ．
0

価するための指標として，筋および脂肪の％断

8

9

17．
7 土6．
0

面積（正常の筋および脂肪のCT値を有する部

T otal71

い．我々は，従来のCT値と断面積の測定に加えて，残存する筋の割合と脂肪置換の程度を評分の全体に占める割合）を求める方法を考案し，方法の信頼性と再現性を確認した上で疾患群に応用してきた7）8）．今回は，この方法を用いて，Duchenne型進行性筋ジストロフィー症（DMD）例の下肢筋の障害の進行過程を検討し，自然歴の解明と治療効果判定への応用を試みたので報告する．

MuscEe density Fat denSlty
H2折30＝15．6■ゎ）（−60−280＝10．γJ

Biceps femoris（Stage4）

対象および方法
対象は臨床所見，血清CPK値，筋電図，筋生

図1The procedures（see text）

検によりDMDと確診されたSwinyard stage
2から8までの71例で，Stage別の例数および

大径部とし，大腿と下腿各筋のCT値の平均，平均年齢は表1に示すとおりである．

断面積および％断面積を求めた，％断面積は，

CTスキャナーは，Hitachi CTW−500を用正常例での検討結果をもとに7），CT値が30か

い，撮影条件は，スライス幅5mm，スキャン時

ら120の筋の部分と，−60から−200の脂肪の間6秒，Ⅹ線120KVp，200mAとした．また，部分各々について求めた．図1に実際の方法を

CT値の安定性を確認するための較正を毎週行示す．トラックボールで目的とする筋を囲うこった．スライス部位は大腿中央部および下腿最とにより，CT値の平均と断面積が表示される．

＊国立療養所東埼玉病院内科＊＊国立療養所東埼玉病院リハビリテーション科

次に，leveldetectionを用いて30から120の正常の筋CT値を有する部分の割合を求める．こ−67−

の例では，15．6％と表示されている．さらに右がみられた．各筋ごとに検討すると，大腿二頭に示すように−60から−200の脂肪のCT値を筋，内転筋群，大腿四頭筋は早期から脂肪化が有する部分の割合を求める．本例では10．7％と進むのに対し，内側ハムストリングスはstage5

表示されている．以上の操作を下肢の各筋におより脂肪化が進行し，縫工筋，薄筋は脂肪化のいて行い，各筋のCT値，断面積，筋および脂進行が遅い傾向を示した．
個々の筋についてみると，図3に縫工筋の例

肪の％断面積を求めた．

を示すが，同一Stageでも測定値にはある程度結の幅が認められた．しかし全体的には，Stageの果

測定期間を通じてCT値は充分安定していた．

進行とともにCT値と筋の％断面積は減少し，各測定値の再現性も4％以内の変動で良好であ脂肪の％断面積は増加する傾向が認められた．

った．図2aにSwinyard stageと大腿各筋の以上，Stageの進行とともに筋線維部分の減

CT値の平均との関係を示すが，Stageの進行と少と月旨肪置換が進むことがCT上確かめられたともにCT値が低下していく傾向が認められた．

が，次にどのような順序で筋障害が進展するか

また，CT値の低下の程度には各筋間に差異がを検討するためにFriedmanの順位検定を行っ存在し，大腿二頭筋，内転筋群，大腿四頭筋はた．結果を表2に示すが，CT値，筋の％断面早期より低下するのに対し，内側ハムストリン

積，月旨肪の％断面積ともに一部を除いて各筋間

グスはstage5以降低下を示し，縫工筋，薄筋
は比較的末期まで高いCT値を示していた．

に有意差が認められ，全体としてみると障害は
大腿二頭筋→内転筋群，大腿四頭筋→内側ハム

次にstageと％断面積の関係をみると（図2

ストリングス→縫工筋，蒋筋の順に進行していく傾向が認められた．

b，2C），正常の筋CT値を有す、る部分の割合
は，Stageの進行とともに減少するのに対し，脂図4にStage5の症例を示す．比較的残存し肪のCT値を有する部分の割合は増加する傾向ている縫工筋では筋の％断面積が63．5％，脂肪ST：S抑ltendmOSUS

SM：Sennln・帽nnb・■nOSUS：Gr●仁山S

S▲R：S■rtOrlUS：S尉nlt●rdlnOSUS

ST：SmItOndlnO〜U〜

SM：S針nlmerntr■r旧SU〜

SM：S〇mlnntnnb・■lヽOSUS

ST

BF：8lCeP〜Im√l〜
ADD：Adductor〜
OD：QLゆdrlC●PS

9：quddrlCeP〜GC

0

ADD：Adductors
QD：GraCl帖

SAR：brtorlU〜

BF：BlCOP〜l帥OrlS
ADD：Adductors
qD：q血IC印〜

▲
‖
Y
U

nU

︵lqこ．く．S．0㌔

8F：B■CePSfem0nS

GC

瑚00

二G√■ClllS

SAR：SdrtOnUi

瑚00908070

O
6

0
0

S
A
Rq
D
S
T
㌘

即ADD 誌QD SAR

7

O︵中一OS⊃E︶．く．S．0㌔

GC

0

−100

2

3

4

5

6

7

8

2

3

4

5

Stage

6

7

8

Stage

2

3

4

5

6

7

8

Stage

a．C．T．number b．％C．S．A．of muscle c．％C．S．A．of fat
図2

Swinyard stage and CT parameters（thigh）−68−

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進行過程
C）％C．S．A．（fat）％ 00a）C・T・Number b）％C．S．A．（muscle）

2

3

4

5

6

7

8

2

3

SwinY即ds也ge

図3

4

5

6

7

8

2

SwhYards愴9e

3

4

5

6

7

8

Swinyardstag8

SwinyardstagevsC．T．number，％C．S．A．ofmuscleandfatforsartoriusmuscle（means±
SD are shown）．

表2 Friedmanrank test（thighーSee teXt）
I CT nutbtr

賢弟■， 竺＿−†Muscle denslty Fatdensity（120．／30＝63．5㌔）（−60／−200＝0．3七・．））Sartorius（Stage5）

亘∵lMuscFe density Fat density（120／30＝1．5㌔）（−68／−280＝46．0㌔）

Bicepsfemoris（Stage5）
図4

−69−

Anillustrative case（see text）

二Tl日暮lis■nt●T10r

TA：TlbbIIS■ハter・10r

TA

PN：Peront■lmu5Clos

PN

ニPoront■ln¶JSCles

PN：Peronealmu〜Cle〜‡lSひ∝咋m●仏

G−し：Ltrさ佃加d押財脚馴血
G−M：H朗hlkado†‡貼trOCW一・∪〜0

G−M：Md・alhd○：TlbaJis■ntOrl∝

TP：TbbIISPO〜terlOr0090 幻 70 60

G−L：utFa川ed0†PSu∝ntm・賂

︵−巾こ．V．S．0㌔

SOL：Soleus

TP：Tlbia帖poSten0r
SOL：Sokus

0

TP：T心alispost●nOr︵〇一USコ∈︶．V．S．0㌔

TA

SOL：501eus
G￣し：bt的Ihed○†【85tr∝稚mUS
G￣M：肌由・さIh如○†iaStr∝nrn・山

5

0

4

0

、し．ノ，A 40
3

0

−．SOL

30
2

0

一

0

l

2

3

4

5

6

7

8

2

3

4

5

Stage

6

7

8

2

3

4

5

Stage

6

7

8

Stage

a．C．T．number b．％C．S．A．of muscle c．％C．S．A．of fat
図5

Swinyard stage and CT parameters（lowerleg）の％断面積が0．3％であるのに対して，最も障討5）などいくつかの報告がなされている．我々

害の強い大腿二頭筋では筋の％断面積が1．5％，

は，残存する筋の割合と脂肪置換の程度を定量

脂肪の％断面積が46％と，両筋に大きな差が認的に評価する目的で筋および脂肪の％断面積とめられた．

いう指標を導入し，正常例において再現性，信下腿においても同様の検討を行なったところ，

頼性の検討を行った上で，神経筋疾患例の筋障

Swinyard stageの進行とともにCT値と筋の害の評価に応用してきた7）8）．今回はDMD例の％断面積は低下し，脂肪の％断面積は増加する

下肢筋の障害の進行過程を分析したが，各筋間傾向が認められた．その程度には筋により差異に障害の進行に関して一定の順序があることがが存在し，膝骨筋と膵腹筋は比較的早期から脂判明し，大腿では筋障害は，大腿二頭筋→内転肪化が進むのに対し，後脛骨筋は比較的末期ま筋群，大腿四頭筋→内側ハムストリングス→縫で保たれていた（図5a，b，C）．次に，下腿に工筋，薄筋の順に，下腿では肪骨筋，排腹筋→

おける筋障害の進行過程を検討するために大腿前脛骨筋一→ヒラメ筋→後脛骨筋の順に進行してと同様にしてFriedmanの順位検定を行なった．

い〈傾向が認められた．従来の報告と比べると．

結果を表3に示すが，各指標とも一部を除いて早期より侵される筋および比較的末期まで残存有意差があり，全体としてみると障害は，月井骨する筋については大体の傾向は一致するが，筋，排腹筋→前脛骨筋→ヒラメ筋→後脛骨筋の個々の筋の障害の進行過程について本研究のよ順に進行していく傾向が認められた．

うに系統的に検討した報告は少ない．
今回我々が報告した方法は，充分なquality

考

COntrOlを行なえば，測定値の再現性もよく，深察

近年，CTスキャンは神経筋疾患の筋病変を部の筋の評価も容易であり，筋力の評価と合わ

非侵襲的に評価する方法としてその有用性が認せて，疾患の自然経過を知る上で有用と考えらめられており9），DMD例においても筋障害のパれる．図6に本方法を用いて，EST治験例11例

ターン分類1）2），CT値の検討3）4），CTindexの検において投与前の評価を行なった結果を示すが，−70−

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症における筋障害の進行過程
i

三一一三Berore

EST

Lrial

卜●−1A【ter EST Lパat

（％）

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乱
6
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40

7

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50

︸q︸−0くSU訳

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80
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T P → − ◆ 1

3

む一USコ∈貰︶くSU訳︵⊃エ二心qE⊃Zト0

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50

PNI1−1

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90

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100

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20
10
0

Thechangeso【CTnumberOf
eaChlower reg musclein one
Year．（N三三日）

図6

Thechangesof％CSAof Thechangesof％CSAoHat
muscIe ofeachlowerTeg or each rower−eg musclein
muscleinoneyear・（N＝11）

oneyear．（N；11）

QuantitativeCTevaluationofmuscledamageinESTcases（means±SDareshown）．

本方法による継時的評価が自然歴の解明や各種筋力および血清CK値との対比一筋ジストの治療効果の判定に有用な可能性があると思わロフィー症の疫学，病態および治療開発にれ，今後さらに追跡を行なっていく予定である．

関する研究，昭和59年度報告書，p．181．
6）Stern，L．M．，Caudrey，D．J．et al．：

文
1）0

献

Progression of muscular dystrophyal．：

assessed by computed tomography．

Computed tomographic patterns ofDevelopmentalMed．Child Neuro1．，26：

pseudohypertrophicmusculardystrophy：

569，1984．

Doherty，D．S．，Schellinger，D．et

preliminaryresults．J．ComputerAssisted

7）石原博幸，里芋明元ら：CTスキャンによTomography，14：482，1977．

る筋障害の定量的評価法．第1報 正常例2）川井充，Bl本雅也ら：Duchenne型筋ジスでの検討，筋ジストロフィー症の疫学，病トロフィー症の骨格筋CT所見とこれにも態および治療開発に関する研究，昭和61年とづく病期分類，臨床神経，25：578，

度研究報告書，p．184．
8）石原博幸，里芋明元ら：CTスキャンによ1985．

3）立野勝彦，西村敦ら：進行性筋ジストロフ

る筋障害の定量的評価法．第2報

Du・ィー症の下肢筋群のCTパターンについて，Chenne型進行性筋ジストロフィー症にお総合リハ，10：525，1982．

ける下腿筋の障害の進展過程，筋ジストロ4）山田重昭，西村正明：進行性筋ジストロフ

フィー症の疫学，病態および治療開発に関

ィー症における下肢骨格筋CT所見の検討．

する研究，昭和62年度研究報告書

筋ジストロフィー症の疫学，病態および治114．

療開発に関する研究，昭和60年度報告書，
p．26．

p．

9）川井充，中野今治：骨格筋CT−神経・筋疾
患の新しい画像診断報−CT研究 7（5）：5）岩垣克己，堀川博誠ら：Duchenne型筋ジストロフィー下肢筋CT像の定量的解析一ー71−

485，1985．

正常幼児の運動機能について
福 山 幸 夫＊
ゆ

み

＊

腸

子

＊

井 木

新 鈴

＊

山

＊

田

平

＊

藤

岡

＊

医学の進歩に伴い，筋ジストロフィー症の1

子 子 入
代
加 典 義

斎

＊

倉

＊

田

子 子 子
木
真 沢 啓

沢

大 炭 宍

研究協力者

表1対象
保育園に通っている健康乳幼児

歳未満での診断例も増加した．乳幼児期から新薬治療開始例も多く，効果判定の指標として湛返り，起坐，起立，10m走行などの日常動作の計

所要時間測定およびその様式の観察が行われてきた．しかし，正常児におけるそれらの基礎資料が不足しており，屡判定に困雉を要する．また乳幼児例では同日常動作誘発が困難で観察不能のことも多い．我々は健康幼児における各日
常動作の所要時間測定と動作様式の観察，さら3 ：00 、 3 ：1 1

3 ：7

10

10

20

4 ：00 〜 4 ：1 1

4 ：4

16

6

22

5 ：00 〜 5 ：1 1

5 ：4

11

12

23

6 ：0 0 〜 6 ：1 1

6 ：4

9

10

19

64

54

1 18

に効果的動作誘発法について検討したので報告

計する．

対象ならびに方法

各動作の誘発方法は，1．口頭説明，2．検対象（表1）は，某保育園通園中の1歳以上

査者が動作を示しての説明，3．担当保母の口頭説明，介助による児の受動的動作体験および7歳未満の健康な幼児，計118名である．
雇返り（腹臥位から背臥位およびその逆），起その後の口頭指示，4．保母の口頭説明と，児坐，起立，10m走行を誘発し，その所要時間測と並んで担当保母が該当動作を実行することに定と起坐・起立様式の観察を行った．さらに効よる児の模倣動作誘発によった．

果的な各動作の誘発法を検討した．
所要時間測定はセイコーとカシオのデジタル

結果型ストノブウォッチを用い，各年齢別平均値と1）各動作所要時間（表2）

標準偏差および所要時間と児の月齢間の単相関

A．背臥位から腹臥位への凄返り（図1）：図にを検討し回帰曲線を求めた．

散布図，平均値±SD，回帰曲線を示した．所要

起坐・起立動作様式の観察は，肉眼により，時間は0．30から2．81秒までで，2，3，4歳間お一部の例で（1，2歳各7例）Victorvideomovie

よび5，6歳問の差は認められなかった．所要時

GR−A30での撮影および反復再生の観察によ間（y）と月齢（Ⅹ）との単相関では相関係数r＝った．

−0．31634，危険率（P）＜0．001でy＝1．21979−0．00736Xの負の相関を示した．

■東京女子医科大学小児科

B．腹臥位から背臥位への浸返り（図2）：所要−73−

表2 年齢別各動作所要時間の平均
背臥位→腹臥位

腹臥位→背臥位

起

坐

起

立

10m走行

所要秒数
例数

1．16±0．43
日0）0．61±0．06（3）2．57±0．88
日3）3．27±0．92（11）8．40±2．39
（10）

所要秒数
例数

0．83±0．22

0．98±0．48

（20）

（19）

1．89±0．70
日9）3．00±0．96（19）4．82±1．17
（20）

所要秒数
例数

0．84±0．31

1．03±0．36

2．17±1．07

2．32±1．32

3．83±0．52

（21）

（22）

（22）

（22）

（22）

所要秒数
例数

0．83±0．32

0．92±0．37

1．32±0．47

1．71±0．40

3．25±0．29

（23）

（24）

（24）

（24）

（25）

所要秒数
例数

0．74±0．26

0．59±0．19

1．25±0．43

1．76±0．45

3．04±0．39

（23）

（19）

（23）

（23）

（20）

6歳〜！所要秒数

0．64±0．24

0．65±0．31

0．96±0．21

1．51±0．27

2．94±0．16

（20）

（21）

（20）

（20）

（18）

6

7的8（−rS）

2歳〜

3歳〜

4歳〜

5歳〜

】例数

02．81
02．54●2．38

1

2

3

4

5

図1雇返り：背臥位→腹臥位の所要時間
縦のbarは各年齢における平均±SD値
を，斜の線は所要時間と月齢との相関について回帰曲線を示す．相関係数r＝−0．
31634であった．

図2 凄返り：腹臥位→背臥位の所要時間
縦のbarは各年齢における平均±SP値を
斜の線は所要時閑と月齢の相関についての回帰曲線を示す．相関係数r＝−0．29586−74−

正常幼児の運動機能について

時間は0．34から3．44秒まで．1歳児では動作群でみると，1歳児では1秒未満0％，1秒台10

誘発可能性例が3例であったが，1，2，3，4歳％，2秒台40％，3秒台30％，4秒台20％，2

問および5，6歳問での差はなかった．所要時間

歳児では順に0％，23％，46％，23％，2％，と月齢との単相関ではr＝−0．29586，P＜0．01

3歳児では5％，50％，39％，5％，0％，4歳で回帰曲線y＝1．28458−0．00823Xであった．

児では4％，68％，27％，0％，0％，5歳児

C．背臥位から起坐（図3）：所要時間は0．47かでは0％，65％，35％，0％，0％，6歳児ではら8．82秒であった．各年齢群でみると1歳児で0％，95％，5％，0％，0％であり，所要時間は1秒未満0％，1秒台44％，2秒台33％，3と月齢との単相関ではr＝−0．58480，P＜

秒台22％，2歳児では順に17％，58％，25

0．00001で回帰曲線y＝3．84773−0．03342Xで％，0％，3歳児では11％，29％，24％，5

負の相関を示した．

％，4歳児では24％，71％，4％，0％，5歳児

E．10m走行（図5）：平均値±SDをみると，では33％，57％，4％，0％，6歳児では58

加齢とともに所要時間の短縮をみ，標準偏差も％，42％，0％，0％であり，2，3歳間と4，5

3歳以上では1秒未満の値を示していた．所要歳間は差がなかった．所要時間と月齢との単相

時間と月齢との単相関ではr＝−0．65427，P＜

関ではr＝−0．48786，P＜0．00001で回帰曲線

0．00001で回帰曲線y＝8．07919−0．08100×で，y＝3．05823−0．02818Xであった．

5項目中最も強い負の相関を示した．

D．背臥位から起立（図4）：所要時間を各年齢

●8．82

0
3
5
2

1

2

3

4

5

6

7Age（Yr‡）

図3 背臥位から起座の所要時間
縦のbarは各年齢における平均±SD値を，
斜の線は所要時関と月齢の相関についての回帰曲線を示す．相関係数r＝−0．48786

1

2

3

5

6

7両山一rS）

図4 背臥位から起立の所要時間
縦のbarは各年齢における平均±SD値を，
斜の線は所要時間と月齢の相関についての回帰曲線を示す．相関係数r＝−0．58480で
あった．

−75−

高這い位→起立様式2．臥位→上体（半）回旋→四つ這い位→片膝立て（手を膝上に当てる）→起立
様式3．臥位→上体（半）回旋→坐位→四つ這い位一→片膝立て→起立
様式4．臥位→（上肢の反動＋腹筋）利用→起坐→躊堀→起立

1歳児では2／9例が様式2，他7／9例は様式1を示した．2歳児では7／9例は様式1を示し，様式3，4を示した例が各1例いた．3歳児では2／23例で様式1，他の例は様式3，4，4歳児以上
では全例が様式3または4を示した．
3）動作誘発法の検討結果
A．藩返りの誘発：児が理解し稚い動作であり，特に腹臥位から背臥位への湛返りが最も理解され雉かった．5，6歳児でも誘発方法1に加えて誘発方法2が必要なこともあった．3，4歳児では誘発方法2に加えて誘発方法3，時には4が必要なこともあった．1，2歳児では誘発方法3，
4を要し，しかも反復が必要で，特に腹臥位から
1

図5

2

3

4

5

6

7Aqe（−ri）

10m走行所要時間
縦のbarは平均±SD値を示し，斜の線は所要時間と月齢の関係の回帰曲線を示す．
相関係数r＝−0．65427であった．

背臥位は一部を除き1歳児では誘発不能であった．
B．起坐の誘発：宴返りに比し容易であったが，2，3歳では長坐位より正座の方が速く到達可能な例もあり，可及的に速く坐位をとることを指示したところ，年長例では正座なのか長坐位な

2）起坐・起立様式のか形にこだわる例もありゃやとまどいがあっ

A．起坐様式：次の5通りを示した．

た．3−6歳児では方法1に加えて方法2が必要

様式1．臥位→上体回旋→四つ這い位→起坐なことがあった．1，2歳では方法4．が非常に様式2．臥位→上体半回旋→片手支持→起坐有効であった．

様式3．臥位→片手支持→起坐

C．起立の誘発：5，6歳児では誘発方法1で可様式4．臥位→上肢の反動利用＋腹筋→起坐能，3，4歳児では時に方法2が必要であった．

様式5．臥位→腹筋→起坐D．10m走行の誘発：4，5，6歳児では方法1で1歳児は様式1，または2，2歳児は様式1，可能であり，同時走者の存在が走行速度を速め

2，3，3歳児は様式1，2，3，4，4歳児は様式るのに有効であった．3歳では，児が好む人物が

3，4，5，の夫々いづれかを5歳児は主に様式4

笑顔でゴール地点で児を呼び招くことと，同時

または5，まれに様式3を，6歳児は全例様式4

走者の存在が有効であった．1，2歳では同時走

または5を示した．

者の存在はかえって混乱を招くこともあり，児B．起立様式：次の4通りを示した．

が好む人物が笑みを湛えてゴール地点で児を呼様式1．臥位→上体（半）回旋→四つ這い位→

び招くことが有効であった．

ー76−

正常幼児の運動機能について

考

表3 立上り動作の大筋

察

各動作所要時間と月齢の単相関では，例数が多いためかいずれも負の相関が認められたが，寝返りではpも低くなく，平均値をみると，背臥位から腹臥位への所要時間は2，3，4歳が殆ど同程度の値を示し，腹臥位から背臥位への所

開始前

tll準備開始

背臥位faI 体幹の全回旋（ね返り）（b） 体幹の半回旋
（側臥位）
（CI
無【司 旋
（坐位上肢前方挙上反動）
刷
無 回 旋（上肢後方伸展支持）r2）立ち上り開始

し31立上り中期

高這い

両膝半屈
上体挙立
片辱立ち
上体挙立
両膝伸展
上体前傾
両膝半屈
上体軽度前傾四つ這い坪 躇
上肢後方伸展支持
膝半屈曲生位

要時間は年齢とは無関係に変動している．雇返■のみ．bのみ．などの組合せが多いが．さ・卜→b・2→b3やb・1・→C・2→C・3などのほ遇をとる例も稀ではない．・さは3蔵以下．bは2−5慮．C・．bは4織以後が圭。

り機能自体は1歳代には充分獲得済でその後は

文献1）より引用

殆んど変化しないことが推測される．発達により余り影響を受けないという点では，状態改善

様式3を1歳児9例中2例で認めた．この動作の有無の指標としては適当とも考えられる．し様式が正常か否か問題である．観察例が少なく

かし特に腹臥位から背臥位は乳幼児には理解し断定はできないが，この2例では他に異常所見

稚い誘発困難な運動でもあるので，運動機能のは認めず，『軽く膝の上方に手を添える』こと低下してきた年長のDuchenne型筋ジストロフ

は，児が起立に際し1歳という年齢にしては高ィー症（以下DMDと略）児用の指標としては

級な起立様式をとっていることに起因すると推有用であるが，乳幼児の機能改善の指標とはな

測した．梅沢珪珪会議でr1歳前から新薬服用例

り難いと思われた．これに対し起坐・起立動作が始めての起立時に軽く膝に手を当てて起立しは2，3歳間と4，5歳間の所要時間平均値にはたが，同剤服用中に膝に手を当てずに起立する差がないが，腹筋力その他の改善による動作様ようになり薬効と考えるか否か迷う』という報式の変化に伴い短縮されるものと思われる．又告があった2）．正常児でも一過性に同様動作を

特に1，2歳児では坐位姿勢にとどまらず起立しとり得るのか否かさらに例数を増して検討したてしまう例もみられ，起立動作は誘発し易い運い．躯幹筋筋力低下に伴い起立能力が低下した動であり，総合的な筋力増強，運動神経系の発DMDで屡観察する動作様式は，様式1．に『高達の指標としては有用と思われた．また10m

這い位において上肢で自分の下肢を把握し徐々走行は4，5，6歳間の差はないが，加齢とともに把握位置を上昇させ，上肢の支持により上半に所要時間の短縮をみ，また誘発し易い運動で身を挙上するいわゆる登はん性起立の要素』のあるので，DMDの乳幼児例での評価には部分を加えたもの，あるいは様式2．に片膝立ち（DMDの場合最大速度の歩行ということになから起立途中で『片手あるいは両手を膝上につるが）有用と思われた．

いて手の力で自分の上体を支持して挙上するJ

乳幼児の日常動作様式についての観察の報告という要素を強めたものである．印東3）は，は余りない．北原ら1）は起立動作について表3

DMDの機能障害の進行は正常児の運動発達のの如くまとめている．我々の今回の観察でも大方向とちょうど正反対の方向を取ると述べてい要は同じであるが，（d）は認めなかった．1，2，

る．起立様式についても病気の進展過程におい3歳児では，様式1．上体回旋→四這い位→高這て，運動発達として獲得してきた行動様式をちい位→起立，様式2．上体回旋→四這い位→片膝ょうど正反対の方向で喪失し，さらに筋力低下

立ち→起立をとる．北原らは四這い位→片膝立による修飾が加味しているものと思われた．低

ち→起立の（b）様式は2−5歳で観察されると述べ

年齢のDMD児の起立様式を観察する場合には，ているが，この際の上肢の動きについては言及

運動発達段階として様式1，2，3，の型をとってしていない．我々は同様様式で起立するが，そいる例もあるので，喪失期の型か発達期の型かの際『軽く膝の上方に手を添える例』すなわち区別を要する．

−77−

結

語

1，2歳児の動作誘発には，各児が好む人間が1歳以上7歳未満の正常幼児計118名を対象に，宴返り，起坐，起立10m走行の所要時間測

同時に同じ動作を行ない模倣させることが最も効果的であった．

定と，起坐・起立様式の観察を肉眼と一部videoを用いて行い，同時に1，2歳児で最も効果的な動作の誘発法を検討した．各所要時間について文

献は平均値±標準偏差，および所要時間と月齢と1）北原倍，有馬正高：小児の姿勢．診断と治療社，東京，1980．

の単相関をみた．特に起坐・起立動作，10m走

2）村上慶郎他：2，3の筋萎縮症患者に対する

行はp＜0．00001で負の相関をみ，同動作は誘発が容易であった．1，2歳でほぼ仝例に，3歳

べスタテンの効果．厚生省新薬開発研究費「微生物治療薬（ロイペプチン）の開発研では約1割に起立および起坐時の上体回旋また究」（梅沢班），昭和58年度研究報告書．

は半回旋がみられ，1歳では仝例，2，3歳では1984，p．p．89−92．

9割に四つ這い位→高這い位または四つ這位→
片膝立てからの起立が見られた．

3）印東利勝：運動障害評価の方法一運動年齢評価法について．祖父江逸郎，西谷裕（編）

1歳の四つ這位→片膝立て→起立動作例で『片手を軽く膝に添える』動作が認められた．

−78−

筋ジストロフィー症の臨床．医歯薬出版，
東京，1985，p．p．135−141．

筋ジストロフィー症患者の理学的評価法の再検討
中 野 今 治♯叶竹¶i秀 敏††††トl

一 也†††

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弓 春 保 子

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†

田 野 沢 藤 田 福木

杉 浅 右 近 崎 幸青

研究協力者

寛‡

篠

由美子‡

は じ め ににしているので，入院患者だけでは必要な患者

ESTの臨床治験は従来倫理的な観点から数の確保が困雉である．そこで，今回は全国筋

open studyが行なわれ，副作用の詳細が不明

ジス施設の入院患者と外来患者の双方を対象とであったため入院患者を対象としていた．Openすることにした．

Studyであることから，理学的評価は詳細を要

つまり，新しい治験では1．患者の数が増え，し，入院患者を対象としたため参加者が少なく，かつ全国の療養所にまたがること，2．外来患者

多数項目の評価も可能であった．例えば日常生であるため，評価に時間的制約があること，が活動作（ADLと略す）を取り上げてみると上肢問題になる．これらの点を踏まえて，新治験の機能も含めて25項目を100点満点で評価する

為の評価法を作成したので，その概要と，作成という手間のかかる評価も可能であった．

に到る経過とを報告する．

このOpen Study に対し，1986年11月の薬事審議会でopen studyでは不十分であり，比旧評価法の問題点

較試験が必要との回答が出された．これを受け新治験に評価法を適用するにあたっての問題て翌年2月28H，筋ジス施設の医師，OT，PT

点として，以下のような点が上げ古れる．

を構成メンバーとして比較試験の為の実務委月

1）評価項目が多すぎる．例えば，前述したが，ADL25項目では項目が多すぎて時間的に不会が発足した．そこでの検討の結果，二重盲検試験が最適との結論に達し，統計処理上最低1可能である．

群50人，両群で100人の患者の参加が必要と考

2）旧評価方では下肢機能以外にも相当なウェえられた．しかも，歩行可能な軽症患者を対象

イトが置かれていた．例えばADL25項目中12項目が上肢挙上，手拭を絞るなど下肢以外t＊東京大学医学部脳研病理■＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊■国立療養所東埼玉病院＊＊＊＊国立療養所下志津病院†新潟大学脳研究所神経内科††国立療養所新潟病院†††国立療養所医王病院††††国立療養所南九州病院‡大正製薬㈱開発部の機能をはかる項目であるが，これらは軽症
患者では短期間では変化しない．
3）Scalogramでエラーが大きい．旧評価法は入念に検討して作成されたものであるが，実際に通用してみると評価基準が不明瞭な項目，−79−

学習効果が大きく作用する項目などが含まれうな評価基準が必要となる．そのためには時ており，そのため，ある項目では軽症者（総間測定などを含めた出来るだけ客観的な評価

得点の多い患者）は出来ないのにかえって重基準を作成する事が望まれる．

症者（総得点の少ない患者）が出来るという

4）Scalogram上エラーの少ないもの．エラーの大きい項目は3）の 評価基準 に問題があ

矛盾が生じていた．
表1に，旧評価法のADL中のる場合もあるのでこのことも考慮して検討す

階段を昇るる必要がある．

を評価基準の不明瞭な項目の例として取り上げてみた． 片手を手すりに掛ければ昇れる 患者

この様な条件を満たす項目を選ぶためにはまには2点を与え， 横向きになって両手で手摺にず問題項目を排除する必要が有る．問題項目のすがって昇る 患者には1点を与えているが，例として，坂道を昇るなど斜面の傾きの統一がそれでは 前向きになってかつ両手を手摺に掛

困雉なため，測定方法の統一化が困難な項目や，けて昇る 患者には何点を与えればよいのか不車椅子使用，手ぬぐいを絞るなど病態や筋力以明である．一方，手摺を使わず一歩で一段を昇外の要因に大きく左右される項目などが挙げらる患者は 普通に昇れるMゎけであるが，やはれる．さらに項目としては必要だが，設問あるり手摺は使わないけれども二歩で一段しか昇れいは判定基準が不適切で判断に迷う項目の判定
基準の改訂が必要となる．

ない患者に対する評価点は示されていない．
また，旧評価法の機能テストでは 車椅子で10m進むのに要する時間

新評価法の決定と評価基準の統一の試み

を計る項目が有る

このような諸条件を勘案して，1988年3月，が，治験対象者の大部分は普段車椅子を使わず，かつその使用には習熟を要するのでこれも適切

実務委員会で新評価法を決定した．
ADLでは，旧評価法の25項目から一気に9な項目ではない．

項目に減らした．1）立っている，2）椅子に新評価法の条件

座る，3）椅子から立ち上がる，4）しゃがむ，

上述のような問題点を考慮すると，新評価法

5）這う，6）床から立ち上がる，7）階段をの条件として以下のことが上げられる．即ち，

昇る，8）階段を降りる，9）歩くの9項目で1）簡略であること．そのためには項目数を減ある． 這う を除いて8項目が主に下肢機能に関するものである事が分かる．

らす必要がある．

表2には新評価法のADLの1項目，

2）軽症例で短期間に変化する項目を選ぶこと．

階段を

具体的には下肢機能が中心となる．

昇る の評価基準を示してある．ここで2点を3）再現性を有すること．全国の筋ジス施設に与えてある 両手を手摺に掛ければ昇れる（前またがる治験であるから，誰が何時行なって

表2も同じ動作や機能には同じ評価点を出せるよ
表1
旧ADLの中の 階段を昇る
4：普通に昇れる3：手で膝を押えて昇る
2：片手を手摺にかければ昇れる
1：横向きになって両手で手摺にすがって昇る
0：介助なしには昇れないー80−

新ADLの中の 階段を昇る
6：普通に昇れる（1足1段）
5：普通に昇れる（2足1段）
4：手で膝を押さえて昇る
3：片手を手摺にかければ昇れる
2：両手を手摺にかければ昇れる（前向き）
1：両手を手摺にかければ昇れる（横向き）
0：介助なしには昇れない筋ジストロフィー症患者の理学的評価法の再検討

向き） の項が旧評価法（表1）にはなく， 片手

表3を手摺にかければ昇れる から， 両手で手摺に新評価法の決定における運動機能
1）仰臥位からの立ち上がり
2）仰臥位からの起きあがり
3）椅子からの立ち上がり
4）階段4段昇り
5）10m走行，歩行6）3m這行

すがって横向きに昇る に跳んでいる．
また，旧評価法（表1）では6点と5点の 普通に昇れる のところを一まとめにしているが，新評価法では 普通に昇れる のところを一段を一歩で昇るか，二歩で昇るかに分けて評価点を変えている．
これは些末な事のように見えるが，一段を一にその点数を与えた検者の数を示してある．こ歩で昇るのと二歩で昇るのでは後者の方が明られによると特にN0．1とN0．5の2人の患者でかに機能的に劣っており，この2着は区別しては評価点が1点と2点の2つに大きく割れてい評価する必要が有るのは言うまでもない．同様るのが分かる．2点は 手を膝についてゆっくりに，両手に手摺にかけるにしても前向きに昇る

座る 動作であり，1点は 支えきれずにドスンのか横向きに昇るのかでも，機能に明らかな差と座る 動作であるが，患者によってはこの2つがある．

の動作を判別するのがかなり難しいことが予想

次に徒手筋力テストだが，旧評価法の7項目される．このような評価の割れる動作に対してのうち首，肘関節，手関節の3つを削除して肩はその評価基準に対して補足項目を加えて基準関節と下肢の3関節（股関節，膝関節，足関節）をより明確にするように努めた．

のみを残した．また，関節可動域は旧評価法の以上の諸点を踏まえて新しい評価基準に基づ

屑関節，肘関節など6関節から股関節伸展と足く新評価法を作成し（表4），1988年9月10日，関節背屈の2項目だけに減らした．削除した関国立療養所22施設のOT，PTを一堂に集め，節は，軽症例では短期間では変化しないか，評

新評価法の説明会を患者のVTRを用いて行い，

価基準の統一が困難な関節である．

OT，PT全員の評価基準の統一を図った．

表3には新評価法の運動機能テスト項目を示してある．前述のように車椅子走行は不適切で考案あるので削除した．旧評価法では歩行不音別こな

DMDの理学的評価基準としては，日本ではった患者用の機能テスト項目が含まれていない

厚生省筋ジス研究班のものがあり1），また，海外ので， 仰臥位からの起きあがり と 3m這行ではBrookeらのプロトコール作成の試みが知を加えた．その為に新評価法では，旧評価法のられている2）．我々の旧評価法はこれらを基準

5項目から6項目にむしろ増えているが実施上にして作成されたものである．

は特に問題にはなっていない．

しかし，旧評価法はほぼ全ステージの筋ジス

このようにして作成した新評価法の信頼性を

患者をカバーしようとしているために，ESTの確かめる目的で入院患者11名をVTRに掠り，

dpen studyに参加した軽症患者に実際に通用実務委員会に持ち寄って検討した．意見の分かしてみると種々不都合な点が見出された．前述

れるような場面では評価方法の統一を図り，ましたように，軽症患者では殆ど変化しない上肢た一部では評価基準の見直しを行なった．

機能に関する項目が多く含まれていたり，手拭図1はその時の結果の一部を示したものであを絞るなど習熟を要する項目が含まれている．

る．11人の患者の 椅子に座る 動作をVTRに

ESTはDMDの原因治療薬ではなく，またこ

撮り，OT，PT9人が採点し，患者別に棒グラ

れまでのOPen Studyから症状の著名な改善もフにしたものである．横軸に点数を示し，縦軸期待できない．今回の二重盲検試験では外来息ー81−

表4 新評価法によるADL 徒手筋力テスト，関節可動域，機能テストの一覧
日常生活動作（ ADL）テスト （．抜ける田所（，汁仙日に川日をHH一）
項

r I

評

価

状
一

筋力テスト
批出 口

畔

項
1 ．／一
三ん の 腑 を ＝ い に つ
（D

よ

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る

廿日1 上J ：リ て い J J L る ．
上 立 リ そ し、J，
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八 る．

雷

抄 未 済 な ら 立 っ て い られ る ．

ll狛 上付 保 持 ．
t・．休 の 華 ち汁 t lHH，な い 】

拍・r ・に 坐る（￣＝Ⅲ の l：■ほ＝ 帥に ゆ っ く り坐 る ． （旺 拙 屈 曲 川 l釣 4 5●は で 一一時 け lL が で きる ）る ． （膵 l対即 日川＝約 4 5●位 で 一一時 仔 Il二が で き る ）
っ くl

位 ）

の 持 1−
・）（推 服 前 川 曲 約 45 位 で 一 時 停 止 が で き な い ）スン と（ス タン ス を は け て も良 い ）

持 イ ・か月 関 節
徒ら 立 ち 上 が る

トが る

手

右
股 関 節

筋

左

力

右
膝 関 節

（背 も た れ の な い 柏 √ ）・が る 。

（ス タン ス を 広 げ て い l い ）館 を 汀 か せ る が 立 ち 1こか れ な い 。

テ

左

かせ る こと もで きな い。
し ゃがわ る．
項 ）し

ゃ

が

左 外転

L で は生 れな い。
で きる

③

測定者
右 外転

1 ．物 に つ か ま れ ば ＿立っ てい られ る．
0 ．物 に つ か ま っ て も 立 っ て い ら Iしな い 。

②

目

む

で −D っ く り と し ゃ が め る 。

l2 ．吊 れ る よ う に し ゃの 篭 り （ス クrJ ・ソ日 一
打 困 二 手 を つ い て も可 ）が l果 て る ．
1 ．1茹目 しる よ うス
右ト 足 関 節左その まま 生 って しま う。

0 ． 介助 な しに は し ゃ が め な い 。
4 ． 3 nり⑤

這う

（マ ッ ト l二）

仙 j欄 を 町 で王と す る 1

行

5 秒 来 i軋

3 ．

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5 秒 L廿 3（
1秒 未 満Z．

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3 り抄 以 卜仙 抄 未 満 。

1．

Jl

6 0 秒 以 l・。 丈 は 川 つ iLh 、位 の r l力 某持 IiJ 稔 。

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（I．川 つ ほ い 位 の n 力 俣 †‡不 能 。
こか れ る 。
⑥

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（j l二坐 ．む：ち
位 ）上
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F で 膵 を 押 し て 立 ち トが る 。
を押 して ＿
立 ち上が る．
・が 止 る
き ない。
汁 ハ る 日 仏 l 柁 ）。
一

⑦

階

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る．

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八

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伸 J しな い ．

降 り ら れ る 日 比 lほ ）。
⑧

階

段

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2 岨
られ る
ら れ る ． （滞日向 き ）（5 ほ 金 指 ）か ってる 。 （帆 Jりき ）リられな い。
も．
（勃 Jレ

く

（：11両 A lJ

2

物 に′

▼ 1：
l 一 ／・い 川 1 り ■
￣一●
H Iる
い ない．
￣け な い 。

関節可動域（ROM）テスト−82−

運動機能テスト

屈曲
伸展
屈曲
伸展
屈曲
伸展
屈曲
伸展
底屈
背属
庇届
背屈

筋ジストロフィー症患者の理学的評価法の再検討．

椅子 に坐 る
症例2

判定吉敷 症例1
9

9

8

8

7

7

6

6

5

5

4

4

3

3

2

2

1

1

0

症例3

症例4

症例6

症例5

0
0123

？

▼012

−川一

作

症

症例8

判定吉敷 症例7
99

8

8

7

7

6

6

5

5

4

4

3

3

2

2

1

1

：

3

椅子に座る

2

0

′●

3
2

図111人の筋ジス患者の00

動作のVTRを計9人のOT，PTが評価して患者別に棒グラフにしたもの．患者によっては評価が大きく割れることが分かる．横軸に評価点を示す（0：介助無し
では座れない，1：支えきれずドスンと座る，2：手を膝についてゆっくり座る，3：手を使わずにゆっくり座る）．

者の参加ということもあり，検査できる項目数

文

献

軽症患者を評価するに当たっては，この年齢の1）野島元雄，松家豊，松田芳郎，他：関節機能障害，脊柱運動障害，恥骨機能障害，拘患者の評価に適した項目のみを選び，かつそれ露について．筋ジストロフィー症の臨床．

ぞれの項目の評価基準を出来るだけ客観化し再祖父江逸郎，西谷裕編，医歯薬出版，東京，現性を有するものにする必要がある．我々は1

1985，p．p．88−106．

にも限りがある．従って，この治験に参加する

年半の歳月をかけ，日常，筋ジス患者の評価，

2）Brooke，M．H．，Griggs，R．C．，Mendell，J．R．

指導に当たっている筋ジス施設の多数のOT，etal：ClinicaltrialinDuchennedystro・

PTの知識と経験を生かして，軽症患者を目的

phy．I．Thedesignoftheprotocol．Muscleにして，全国の外来患者をも対象とできるよう

Nerve，4：186−197，1981．

な理学的評価法の作成に努めた結果，一応の成果を得たのでその概要を報告した．

ー83−Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床的検討：
EST投与群5年日の経過とEST二重盲検試験の出発
宮

研究協力者

正＊

武

山 崎 元 義■＊

近 藤 隆 春＊＊

桑 原 武 夫■

湯 浅 龍 彦＊は じ め に症例で投与期間は4年9カ月，投与量は体重当

厚生省新薬開発事業研究班により，Duchenne

たり4mg／日で開始し，副作用のないことを確型進行性筋ジストロフィー症（以下DMD）に対認した後に4週間後より8mg／kg／日に増量ししてE−64（以下EST）投与による臨床治験が開た．

始されて約5年が経過した．昨年，桑原らは

対照群は上記7例とほぼ同年齢で体重にあま

EST投与群73例と非投与群172例の臨床的検り差のない同院のDMD児24例である．

討を日常生活動作能力（ADL）の全得点による方法は厚生省研究班制定のADL25項目中よ経年推移から行い，全ての観察時点でEST投り，本研究班で新たに選定された，下肢機能の与群が非投与群に比して高値を取る傾向にあっ推移を経年的に順当に反映すると思われた8項

たことを報告した．

目合計32点満点を100％とする方法で経年推しかし全ADL scoreでは症例間のばらつき

移を検討した．8項目は①立っている，②椅子にが大きいため，治療効果の判定は容易ではない．

すわる，③椅子から立ちあがる，④しゃがむ，

ESTの治療効果があらわれるとすれば，下肢機⑤床から立ちあがる，⑥階段を登れる，⑦階段

能に強く反映するのではないかという前提にたをおりる，（診歩く，である．また最大努力歩行

ち，今回私達は，歩行可能な比較的下肢機能の10mの時間を2回連続して測定した平均歩行保たれているDMD児について，下肢ADLに速度も検討した．

よる検討をEST投与群と非投与群において行い，ESTがDMDの下肢ADLの推移に及ぼす

結影響について検討したので報告する．

果

平均下肢ADL scoreの経年変化を図1に示す．縦軸には下肢ADL8項目32点を100％と対象と方法して表示しており，10％以下になると歩行不能

対象は国立療養所新潟病院に入院中のDMD

なわち歩行可能であった7例である．投与開始￠O−¶

月±1歳1カ月），開始時体重は16．4より41．0

＼
ヽ

r●

時年齢は8歳5カ月より12歳（平均9歳6カ＼鵠

名中，EST投与開始時ADLscore50点以上す■R−リL

児（全例男子）であり，同院でのEST投与児24

EST授与有無によるレE観柁￠差

●
■
一
●
、■
一
一
一
ヽ
t
、
、
叫
●
＿
●
．
3．
由

kg（平均23．2±7．9kg），ステージⅠ〜IVまでの＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立療養所新潟病院

8，
由

0．
b

Il二
的

lき
ニ
ー
8

1〇
二
捏

年烏（オ）

図1平均下肢ADL scoreの経時的推移
−85−

9

10

11

12

13

▲ge（y／○）

図21年間の個々の症例における下肢ADLscoreの推移となる．EST投与群は投与開始時すでに80％

息患児の平均を健常住とした．（平均2．58±と低下していた．減少率に差異は認められなか

0．13m／S）EST投与群3例において，1年後のった．次に個々の症例における下肢ADLscore

歩行速度に若干の改善を認めた．

の約1年間の推移につき，みてみると（図2），
非投与群では全例経年毎に下肢ADL機能が低考案下していたのに対して，EST投与群では7例中進行性の疾患であるDMDに対する治療効果

3例で若干の改善を，2例でその減少率が非投与

判定は非常に困雉な問題を含んでいるが，石原，群に比して軽い傾向にあった．しかし開始時低

桑原らは，①Naturalhistoryの把握の重要性，値であった2例は早期に歩行不能となっていた．

②歩行可能で筋萎縮が高度でない患児に対象を次にEST投与開始時歩行可能であった7例中，しぼること，（∋観察期間を統一かつ限定するこ

1年後も歩行可能であった5例につき，その歩と，⑥ADL項目をより簡便で合理的なものに

行速度を示す．（図3）同院入院中の小児慢性疾すること，⑤動作時間の項目を導入すること，などを提唱した，従来の厚生省筋ジス姓のADL25項目での評価では，EST投与群と非投与群の推移に明らかな差異は認めなかった．この点については，非投与群のDMD児の中にも比較的機能の保たれる症例も少数ながらみられること，及び今までの治験方法では上記（∋〜⑤の点について若干統一を欠く面があり，十分な
薬効判定が困雉であると思われる．
今回，新たにEST二重盲検試験が開始されたが，自然な発達で，みかけ上機能が改善されたようにみえる例が混入するおそれのある5歳

8

9

10

以下を除外し，ステージⅠ〜ⅠⅠⅠに対象をしぼり，▲亡●（y／○）

図31年間の個々の症例における歩行速度の推移期間を1年間に限定し，より簡便かつ合理的な基準を共通の効果判定としたプロトコールが作−86−Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床的検討

製された．下肢機能に重点をおいたプロトコー

る問題点．厚生省新薬開発研究費「低分子ルに採用された下肢ADL機能8項目について，

酵素阻害物質による難病治療薬の開発研

EST投与時歩行可能であった7例について検究」昭和61年度研究報告書，1987，p．p．99

討しなおしたところ，1年間経過しても比較的−103．

機能が維持された3例を経験した．私達の施設

2）宮武 正ほか：Duchenne型進行性筋ジス

では，naturalcourseの中でこのような症例のトロフィー症の臨床経過：日常生活動作能

経験はなく，とりわけ発達の終了したと考えら

力（ADL）の経年推移．同報告書1987，p．p．

れる8−10歳のDMD児において認めたことは，

93−97．

今後の検討を，より機能のよい，より筋肉量の3）石原博幸ほか：ADL scoreの検討による筋保たれている，より多数の症例において，さらジストロフィー障害度の再評価．厚生省新に検討を要する必要性を再確認させるものと思

薬開発研究費．「低分子酵素阻害物質によるわれる．

難病治療薬の開発研究」昭和62年度研究報
結告書，1988，p．p．111−117．
4）宮武 正ほか：Duchenne型進行性筋ジス

論トロフィー症の臨床経過：EST投与群でEST投与開始時歩行可能群7例につき下肢機能の推移を検討した．3例に下肢ADLscoreの検討．同報告書，1988，p．p．107−109．

の改善を認めた．今後は，より多数の歩行可能

5）Cohen，L．，Morgan，J．，et al．：Fast

群につき検討していくことが必要と思われた．

WalkingvelocityinhealthandDuchenne
musculardystrophy：Astatisticalanaly−

文

献Sis．Arch．Phys．Med．Rehabi1．，65：5737

1）石原博幸ほか：治療薬の効果判定法におけー87−

578，1984．

ベスタチン投与例における筋疾患マーカーの変動について
西

研究協力者

谷

裕＊

板 垣 泰 子＝ 太 田 光 照H＊結は じ め に果

従来薬物投与における血清酵素のマーカーと血清CK値は，投与1ケ月では前例が投与前してはcreatine kinase（CK）を中心とした主値よりも低値を示していた．投与2ケ月目では，として白筋酵素を用いることが多かった．今回

やや増加して投与前借に近くなるものもあり，

我々は，5例のデュシャンヌ型筋ジストロフィ投与3ケ月目では特に一定の傾向は見られなかー症患者にベスタテンを授与し，その筋病変にった．血清ALDは，ほぼ血清CKイ直と同様の経及ぼす影響の有無を赤筋酵素においても観察し，過で，投与1ケ月目では前例低下，投与2ケ月

自筋酵素との相違の有無を注目した．

目より前値に戻る傾向を示すものもあるが，大部分の例で投与前値を下回っていた（表2）．

対象ならびに方法

赤筋酵素であるCA−ⅠⅠⅠでは，ベスタテン投与

対象は6歳から10歳までのデュシャンヌ型

後1ケ月で，1例は大幅な上昇を示していたが，筋ジストロフィー症患者5例である．機能障害

他の4例では軽度に低下したもの2例，軽度の度はⅠ度ないしⅠⅠ度であった（表1）．ベスタテ

上昇を認めた物2例で，ほぼ投与前値に近い値

ン投与量は300mg／日で，投与期間は4ないしを示した．投与3ケ月後からは投与前借よりも5ケ月間である．4週間毎に採血を行い，白筋酵

むしろ高い値を示すものが多かった．Mbでは，素としては，血清CK値とaldolase（ALD）を投与後上昇した例が2例，低下した例が3例で測定し，赤筋酵素としてはcarbonicanhydrase

CA−ⅠⅠⅠの動きとほぼ似ているが，その変動幅はIII（CA，ⅠII）とmyoglobin（Mb）とを測定しより大きかった（表3）．
5例における投与前値よりの変化率の平均をた．また機能的には，採血前に10m走行時間と表にしてみると，CK，ALDでは低下，CA−III，

起立時間を測定した．

Mbでは上昇，機能的には軽度進行という結果

表l
N0．

症例

l H．F．

であった（表4）．

年令
6

障害皮
1

2

X．S．

7

ⅠⅠ

3

D．H．

8

1

4

X．T．

8

［

5

F．M．

10

Ⅱ

このように自筋酵素と赤筋酵素では，かなりその動きが異なることが示されたが，個別にその違いが大きかった症例を見てみると，症例4ではCK，ALDは投与後下降し，投与4ケ月後に前値に筏帰しているが，CA−lII，Mbはむしろ投与初期より逆に上昇していた．この症例における機能的な側面を見てみると，10m走行では大きな変化は見られなかったが，起立時間は＊国立療養所宇多野病院＊＊国立療養所宇多野病院小児科＊＊＊国立療養所宇多野病院臨床研究部

徐々に延長していた．特に投与3ケ月目の時点
では，体調が悪く起立，走行ともかなりの時間−89−

血清CK値の変動

表2
Ald

血清Ald値の変動（lU／L）

∈二束

200

10000

100

§〆フォ一一

転∃

表3
Mbの変動

CA−Ⅲの変動CA−Ⅲ（n9／mt）
2000

1000

J

●一一一●一一一一・→

．芦た・

Mb
（ng／ml
2000

1000

．盛●幸

−90−

ベスタナン投与例における筋疾患マーカーの変動について

表4

表5

変化率

症例4

CK Ald

（％）
＋100

K．T

8Y

（lU／L）（暮U／L）

0

1

2

3

4

monthsduration after beginnln90f Bestatin

表6 各種筋疾患マーカーの比較（島らによる）を要した．この時，CK，ALD値にはさほどのよりまず血中に流出してくるのはCA−ⅠⅠⅠと動きはみられなかったが，CA−IIIとMbはかな

Mbであるが，その流出量はMbがCA一ⅠⅠⅠの2りの上昇を認めた（表5）．

倍以上であったとしている．それに比LCKは，
CATIII，Mbより遅れて血中に流出し運動負荷考

中止後も上昇を続け最大のピークは24時間後

察

CA−III，Mbは，主としてⅠ型繊維に多く含まであったとしている．またCA−III，Mbは翌朝れその血中での動態は，ⅠⅠ型繊維に多く含まれには運動負荷前の値に戻っていたのに比べ，CK

るCK，ALD，LDH等とは異なる点を有するこ

では前値に復帰するのに48時間以上要したととが知られている．Ostermannらの健康成人でしている．LDHはCKよりさらに前借に戻るの運動負荷によるデーターでは，運動負荷直後のに時間を要している（表6）．

−91−Duchenne型筋ジストロフィー症においては性もあるものと思われた．CA−llI，Mbに対する各種の運動負荷により容易にこれらの蛋白が血影響はプラセボー投与との比較がなく，はっき

中に流出してくることが知られている．特に歩りしなかった．

行可能な年少者では種々の筋疾患マーカーの日文

内変動の大きさは常に指摘されるところである．

献

従って薬物投与での治験には，CK，LDHとい1）島功二，日比望ら：CarbonicanhydraselIIった白筋酵素（ⅠⅠ型紙推酵素）を中心とした測（CA−ⅢⅠ）．神経内科，28：464，1988．

定では検査前日までの運動負荷による血中酵素2）川井尚臣，足立克仁ら：Myoglobinの影響をかなり考慮しなければならないと思わ（Mb）．神経内科，28：474，1988．

れる．その点ALDのほうがむしろ安定した情

3）Ostermann，P．0．，Askmark，H．，et al：

報を提供してくれるのではないかと考えられる

SerumCarbonic anhydraselIIinneur0−

が，臓器特異性の点から考慮すると必ずしも

muscular disorders andin healthy

CKより優れたマーカーとは言いにくいとも思

persons after along−distance run．J

われる．それに比LCA−III，Mbでは検査当日

Neuro Sci，70：347，1985．

の起床時より採血までの運動負荷がほぼ一定で4）Florence，J．M．，Fox，P．T．，etal：Activity，

あれば，より安定した指標として有用ではない

Creatine kinase，and myoglobinin

かと考えられた．今後の治験においてはCK等

Duchennemusculardystrophy：aCluetoの白筋酵素と同時に赤筋酵素も測定することがetiology？Neurology，35：758，1985．

5）木下真男，里書栄二郎ら：ベスタテンの筋

望ましいと思われた．
今回のベスタテン投与において機能的な結果

ジストロフィーに対する臨床効果に対するは，不変が2例，軽度悪化したもの3例であっ

研究．厚生省新薬開発研究費「低分子酵素

た．検査値では血清CK，ALD値が投与1ケ月阻害物質による難病治療薬の開発研究」（江で全例とも低下しており薬剤の影響も考えられ

橋珪）昭和62年度研究報告書，1988，

たが，患児らの年齢から考えて自然経過の可能

p．99．

ー92−

ベスタテンの血清LAPに及ぼす影響
高 橋 桂 一＊研究協力者

目梅 枝 孝 之＊＊益 田 書 信＊＊森 鼻 文 朗＊＊小 林 浩 子＊＊的

〟1のサンプル，250／Jlの反応液，250〝1の基質

昨年度，我々はDuchenne型筋ジストロフィー症（DMD）にベスタテンを投与すると2時間

液，600／505nmで，同様の反応時間で行った（セラテスタムM LAP 日立化成）．

後に血清1eucineaminopeptidase活性（LAP）

サンプルとして血清の100分の1容量の生食が有意に低下し，placeboでは低下しないことに溶かしたNK421を示した最終濃度（サンプを報告した1）．

ルでの）になるよう添加した．

今回はこの現象が体内での現象であることをまた現在進行中のベスタナンの二重盲験の患証明するために，LAP測定系におけるベスタテ

者血清のLAP活性を測定し，検討した．

ン（NK421）の影響を検討した．

NK421ドライシロップ50mgを1日3回食後

またベスタナンの長期投与の結果を検討する

服薬およびplaceboの投与である．

ため，現在進行中の二重盲験の患者血清のLAP活性を測定した．

結果

図1にNK421の比較的低濃度のアッセイ系
方法に及ぼす影響を示す．3，5−Brで2ノJg／1におい

市売の3種の基質を異にするアッセイキットてすでに抑制効果がみられ，濃度に依存して抑を用い，血清にNK421を添加し，日立736オー
トアナライザーを用いてLAP活性を測定した．

制が増加している．p−nitroおよびLSPAでは抑制はみられなかった．

測定法AはL−ロイシルーp−NN−ジスルフォ

図2にはさらに高濃度のNK421の影響を示

プロピルアミノアニリドを基質（LSPAと略）す．著明な抑制が3，5−Brの基質でみられた．

とし370C，5〝1のサンプルを反応液300／上目こ添
加後3分間プリインキュベートし150JJlの基

E什ect or臨tatin on LFp触ヨソ質を加え，700／600nm4．5分間のrate assayを行った（デタミナtLAP協和）．
測定法Bはトロイシルーp−ニトロアニリド（p−nitroと略）を基質に用い，7JLlのサンプ
ル，反応液250JJl，基質250／Jl，480／415nm
で，同様の反応時間で行った（シノテスト）．測定法CはL−ロイシルー3．5−ジプロムー4−ヒドロキシアニリド（3，5−Brと略）を基質とし，10＊国立療養所兵庫中央病院＝国立療養所兵庫中央病院研究検査料

−93−

臥0

8．5 1．8

2．8

4．8

6．0

8．8 18．8

図1ベスタナン（低濃度）のLAP測定系におよばす影響

Err∝t Of Bestatin on L〔p毎Sa16（ナーし錮◎−Fnltr0
ム−3．5づr

血清LAPは夏期に上昇することが知られている．従って夏期におけるLAPの薬効判定は慎重であらねばならない．ここには夏期のデー
ターは除外した．事実8月から9月にかけて上昇のみられた例があった．DMDでLAPの低下
した例があるが，これがベスタテン投与例であるかどうか，まだ二重盲験が進行中であるので，今後の検討に待たねばならない．臨床症状の判

図2 ベスタナン（高濃度）のLAP測定系におよぼす影響

定も全国規模の対照データーが蓄積されつつあるので，いずれ明らかになる筈である．
なお測定法Aは肝，胆道系の閉息疾患時に上EIfヶ⊃t Of Bestatinon Lf〉Hn m10帖nredi伝trOphy田tientS

昇するアリルアミダーゼを特異的に測定するもので，trueLAPやcystineaminopeptidaseは測定しない．従って筋疾患の検索には適しない．
AoyagiらはDMDの血清でLAPの上昇することを報告し2），山本らはカラムクロマトグ
ラフィーを用いてDMDの血清中に認められる
図3

デュシャンヌ型筋ジストロフィー症におけるベスタテン長期投与の血清LAP活性におよぼす影響活性は骨格筋由来のaminopeptidaseで，leucine methylcoumarinamideとarginine

methylcoumarinamideを同程度に分解すること，およびDMDの障害皮5ないし6まで漸増

図3に5例のDMDにおける血清LAPの変

し，その後低下することを報告している．また

動を示した．No53とNo96ではLAPの低下

この活性はベスタテンによりinvitroで抑制をがみられ，No19とNo21では低下は明らかでうける3）．

なく，No20は12週の高値のためどちらとも判結定出来ない例である．いずれも冬季の開始で，

論

LAP測定系に及ぼすベスタテンの影響を検夏期に至るまでのデータである．
昨年度のLAPの測定結果および今回の臨床討した．L−ロイシルー3，5−ジプロムー4−ヒドロ

データーは測定法Bのp−nitroによる方法でキンアニリドを基質とする方法ではベスタテン

ある．

の低濃度で抑制を受けた．我々が用いているL−
ロイシルーp−ニトロアニリドを基質とする測定考察法では，抑制はみられず，先に報告したDuchen−

昨年度の結果は測定法Bによるもので，今回ne型筋ジストロフィー症でのベスタナンによの結果より，服薬により血中に増加したベスタ

る血清LAPの低下は生体内での現象であるこ

ナンのLAP測定系に及ぼす影響によるものでとが明らかになった．
ベスタテンの長期投与例の血清LAPの変動はないことが明らかになった．従ってベスタテ
ン投与後のLAP値の低下は生体内での現象とについても報告した．

言える．服薬後に発現した組織内でのLAP抑
制効果の反映か，血中に増加したベスタテンの血中での抑制効果かは断定できない．

文献1）高橋桂一，西尾芙久：Duchenne型筋ジス−94−ベスタナンの血清LAPに及ぼす影響

トロフィー症の血清酵素におよぼすべスタ

muscular dystrophy．Clin．Chim．Acta．，

テン（NK421）の効果．厚生省新薬開発研
究費・低分子酵素阻害物質による難病治療

129：165−173，1983．

3）山本真理，佐藤 猛，杉田秀夫：Duchenne

薬の開発研究（江橋班），昭和62年度研究型筋ジストロフィー患者血清のAminope・

報告書，1988，p．p．83−85．
2）Aoyagi，T．，Wada，T．et al．：Twoptidase活性一骨格筋に由来する酵素の同differentmodesofenzymaticchangesin
Serum With progression of Duchenne−95−

定および活性について−．臨床神経学，28：
735−741，1988．

べスタテンの長期投与について
村 上 慶 郎＊
研究協力者

岡 崎

隆書

林

は じ め に

英 人＊

染

正 淵＊

漸増して300mg／日に至った．その後は150

一昨年の本研究班の報告で，私どもはpre−

mg／日を3回に分けて授与した．投与期間は，5ClinicalなDuchenne型筋ジストロフィー患者

年間（60か月）であった．

に長期間，ベスタナンを使用した一症例を報告したが，今回は，歩行可能な時期から5年間ベ評価及び検査スタナンを使用したDuchenne型筋ジストロフ

服用前と投与開始後，3か月毎にクレアチン

ィー症8例について報告する．

キナーゼ（CK）を含む血清酵素（LDH，GOT，
GPT），血液生化学，末梢血，尿などの一般検査対象を行った．また，運動機能評価としては，立ちBl立療養所箱根病院外来通院中のDuchenne

上がり時間，握力，20m走行時聞及び日常生活活動としてバーテル指数を測定した．

型筋ジストロフィー症8例で，いずれも歩行可
能な患者である．年齢は4歳6か月1例（症例1），5歳1か月2例（症例2，3），5歳6か月1

結例（症例4），以上4例を5歳群とした．

果

クレアチンキナーゼ（CK）

次に6歳1か月1例（症例5），6歳8か月1例

CKは，5歳からの使用群では，使用前に4例（症例6），6歳10か月2例（症例7，8）の4例

とも10000単位前後であったが，5年後にはを6歳群とした．

5000単位前後に半減していた（図1）．
6歳から使用したグループでも，同様に5年

投与方法

後には半減していた（図2）．

ベスタナンは最初の2年間は30mg／日から
甲は：

使 用 前
一

症 例 1

一・

症 閃 2

一一
日

も か 月

1 2 か 月

1 8 か 月

2 4 カ、
月

3 0 か 月3 6 か 月4 2 か 月

4 8 か 月

5 4 か 月6 0 か 月

9 相6

9468

■ 8352

8975

糾 40

6792

8501

3962

1121

4021

1231

＝）2 【
和

9購 l

792D

5288

7293

7068

5286

52川

4351

60川

1964

症 例 ∃

8 2 317 2 96鳥1 6 9

7 72！

6g90

6730

5718

山 ㈹

3開 6

3 4 0 ti

269【
l

甘 n l

鳥6 7 57 9 95

IO12

7 230

5462

4gm

5919

1 623

3751

1620

l ：9 P

図1ベスタナンの長期使用成績

使用開始5歳からCKの推移

ホ国立療養所箱根病院

−97−

一

症 例5

一
一
一 症 例6

荊

6

1 2

1 8

2 4

3 0

3 6

4

729 2

5 5 18

3632

H 32

l開 2

172【
l

899息

1 1 ：書

2

8

5 4

6 0

1 2

1 8

2 4

3 0

3 6

4 2

4 8

5 4

30 39

3 ▲8 息

3 D32

一

症例 5

8

t

8

5

5

l

5

8

4

5

l

2 さT l

4

荊

6

6 0

5 15 2

4870

3130

2別 0

H 60

i552

22 8 13152

2 8 252927

・・・ 症例 6

丁

l

l

l

丁

l

丁

丁

丁

l

l

一一 症 例 7

H G l

6328

5378

5314

5500

1292

16 52

4 7 も01 0 20‡8 2 0

山 61

一一 症例 7

丁

丁

T

8

丁

￠

6

l

5

5

5

一・ 症 例 8

482 0

1020

3912

l川 2

88 0 8

i500

81川

25川

3 12 1

3020

26 12

一一
・ 症例 8

暮

l

l

丁

8

l

5

l

l

l

3

図4 ベスタナンの長期使用成績
使用開始6歳から握力の推移（右側）

図2 ベスタテンの長期使用成績
使用開始6歳からCKの推移
拉
攣
l
l
l
l
t ■

k
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慮−
■ ■
■
−
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使 用 前
ー

6

1 2

1 8

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4 8

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庄 内 l

2

2

l

4

4

5

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l

l

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・
・
・
・ 症 例 2

8

8

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5

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4

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8

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−一 正 伊は

1

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l

l

l

l

3

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5

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一一
一 症 例 4

8

l

l

5

6

丁

丁

＄

l

l

図3 ベスタテンの長期使用成績 使用開始5歳から握力の推移（右側）握力

化していた（図5）．

5歳より開始した症例群では，2例に増加の傾

6歳から使用したグループでは，1例は使用開向が見られたが，残りの2例は特別な傾向は見

始後1年（7歳）で立ち上がり不能となり，残りられなかった（図3）．

の3例のうち2例は，使用開始後4年（9歳）で6歳から開始した群では，4例ともベスタテン

立ち上がりが出来なくなった．
残りの1例も使用開始後5年目（11歳）にはの使用期間中，増加は見られなかった（図4）．
立ち上がり時間相当悪化していた（図6）．

5歳からの使用開始群では，5年後に4例と歩行時間

も，立ち上がり可能であったが，1例はかなり悪−98−

5歳で使用開始した4例は，いずれも5年後

ベスタナンの長期投与について
岬は：抄

歩
行
時
間

前
一

症 例

6

1 2

1 8

2 4

3 0

3 6

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5 4

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前

1

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2 4

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3 6

4 2

4 8

5 4

6 0

l

13

11

川

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13

13

川

18

14

15

川

症桝 2

12

川

ほ

ll

17

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20

2 1

22

23

25

l

川

13

11

川

川

lT

lT

川

28

21

3，

一一 症 例 」

12

11

ll

16

13

11

lT

17

20

l書

22

一

1▼一一 症 例 2
一一

症 例 3

組例

1 − u M一一・ 症 阿 4

図5 ベスタナンの長期使用成績
使用開始5歳から立ち上がり時間の推移

6

図7 ベスタテンの長期使用成績
使用開始5歳から歩行時間の推移（20m歩行）

歩
行
時
間

′
−
−
−
′
′
′
′
／

桐

1 2

1 8

2 4

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定 闘う

12

11

は

11

11

16

22

21

11

15

ll

11 ・
・ 症例 6・・・・ 症 例6

ll

lt

l】

川

lT

2【
l

2 書

38

12

‥

症例 7

一一 庄 内 7

11

ll

柑

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2 0

！l

3 1

12

51

一・
一 lE桝 8

−1・ 症 例 8

21

糾

粥

ll

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一

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1 2

1 8

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3 6

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2

4

8

5 4

6

0

荊

症例 5

一

6

4

図8 ベスタテンの長期使用成績
使用開始6歳から歩行時間の推移（20m）

図6 ベスタテンの長期使用成績
使用開始6歳から立ち上がり時間の推移

−99−

6

1 2

1 8

2 4

3 0

3 6

4 2

4 8

54

6 0

2 4

3 0

3 6

4 2

4 8

5 4

6 0

症例 1

爪
15

15

90

90

90

15

ti

15

‖

15

‖

一

錠■ 5

‖

li

‖

引I

7 5

75

7 5

TO

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60

55

・・
・ 症例 2

90

90

90

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川

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11

‖

川

75

I5

・・・ 症 欄 6

書5

以l

lO

抽

7 5

TS

T O

15

lO

55

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一一 症例 3

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15

15

90

90

90

11

轟5

‖

TO

TO

一一 症 桝 7

暮○

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T O

65

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帖

60

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・ 症椚 4

90

98

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い

い

75

・■・ 症 例 8

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†5

TS

T O

65

8 0

55

50

5 （l

措

ー

前

図9 ベスタテンの長期使用成績
使用開始5歳からバーテル指数の推移

6

1 2

1 8

図10 ベスタテンの長期使用成績
使用開始6歳からバーテル指数の推移（10歳）歩行可能であった（図7）．

考案ならびに結語

6歳から使用開始した群では，1例が使用開始
後2年（8歳）で歩行不能に，2例が，使用開始

進行性の経過をとる疾患については，治療薬や後4年半（10歳6か月）で歩行不能になった（図

治療法の効果の判定については，種々の問題が

8）．

ある．

進行性筋ジストロフィー症のように，慢性でバーテル指数

一般に，長期間の薬物の使用の効果を見るに5歳から使用開始した群では，5年後にはいずれも，軽度の減少を示していた（図9）．

は，運動機能に及ぼす影響を見る方法が行われている．

6歳からの使用群では，5年後にはかなりの減今回の実験では長期間のベスタナン投与の効少がみられていた（図10）．

果を主として運動機能の面から見る目的で行っその他た．また，ベスタテンの使用開始年齢を5歳群感冒の羅息回数の減少，症状の軽減は全例に見られた．

と6歳群に分けたが，これはDuchenne型筋ジストロフィーに対して長期間の70ラセポ投与の実験が非常に困難であると言うこと及びDu−

副 作 用

Chenne型筋ジストロフィーの自然歴がわが国

特別のものはみられなかった．また，一般血，に少ないこと，長期間歩行可能な時期を見るに尿，血液生化学についても異常は認められなかは，5−6歳が適当である，1〜5歳では成長の因った．

子が強くこれの効果の除外が困難であるなどの理由による．
CKについては，従来の報告と変わりなく，年齢−100−ベスタナンの長期投与についてと共に減少が見られている．握力については，のに対して，6歳群では，ほぼ半減していた．

5年間のベスタテンの使用で，あまり変化が見

辻らは，ベスタチンの早期投与が了動物の筋られていない．今回使用した通常の握力計は成ジストロフィーで有効であったと報告している

人用のものを使用したために，細かい変動が明が，ヒトではあまりはっきりしていない．今回

らかでなかったものと思われる．立ち上がり時の私どもの成績では6歳群と5歳群とでは5歳間については，6歳から使用したグループの4群の方が歩行期間は延長していたが，個体差も例中3例が途中で立ち上がり不能になっているあり，断定は出来ない．さらに多数の症例の積が，5歳から開始した群は4例とも時間は増加

み重ねが必要である．

しているが，起立可能であったことは興味深い．

以上，比較的少数例ではあるが，Duchenne型

20m歩行でも，5歳から使用していた例は，仝

筋ジストロフィーに対するベスタチンの5年間

例（4例）共歩行可能であったが，6歳群では4の長期投与では，早期の投与開始で，多少の運例中3例が歩行不能となっている．バーテル指動機能の延長が見られる可能性を示唆している．

数では5歳群が比較的軽度の減少を示していた−101−

ベスタテン服薬および非服薬DMD患者におけるT波の検討
三吉野 産 治＊研究協力者

江 田 伊勢松＊は じ め に上のベスタテンを服薬している．又べスタテン

アキレス腱反射は，重要な臨床神経学的所見

非服薬群は過去において一度も，期間中を含めの一つとして表現されている．その客観的評価てその内服はない．ベスタテン服薬息児は300の一つとして活動電位記録法を用いて得られる

mg／日の量を内服しており，量的な差はない．

T波の分析がある．小児におけるT波の正常パ

T波測定はモジュール式筋電計MS6（三栄）

ターンの研究は既に報告されており，高倉ら1）を用い，高倉らの方法に準じてなされた．測定によれば，その潜時は身長の伸びに極めて良く

は22〜240Cの室温でなされ，T波の分析は黄相関する．又進行性筋ジストロフィー症に対しも早い，最も高い波形を対象として分析した（図てのT波の分析も少ないながらあり，笠木ら2）

1）．

はDuchenne型ではかなり年長においてもその振幅の存在を認めることを報告している．我々

表1 対象も3）以前にDuchenne型筋ジストロフィー症に

進行性筋ジストロフィー症（Duchenne型）
10名（8オー18オ）（1）ベスタテン服薬児
5名（8才〜12オ）
昭和61年度歩行可能児
4名
昭和63年度歩行可能児
2名（2）ベスタテン非服薬児 5名（11オー18才）
昭和61年度歩行可能児
2名
昭和63年度歩行可能児
0名

おいて，その振幅は機能進行度と極めて良く相関すること，T波活動持続時間は正常対照に比して有意に延長することを述べてきた．
今回我々は昭和61年度から昭和63年度の間に少なくとも1年以上ベスタテンを内服した息児5名と今まで一度もベスタナンを服薬した経験のないDMD児5名について，昭和61年の9月と昭和63年の9月にアキレス腱反射の活動
電位波形（いわゆるT波）を分析し，両群間の比較を行ったので報告をする．
対象および方法
対象はベスタナン服薬群としての5名のDMD児と，ベスタテン非服薬群としての5名のDMD児である（表1）．ベスタテン服薬群の5名のうち3名は昭和61年度にはplaceboを服薬しており，昭和62年度よりベスタチンを月艮薬している．いずれの症例も少なくとも1年以＊国立療養所西別府病院

図1方法（1）装置はモジュール式筋電計MS6（三栄）を使用（2）測定は室温22−240Cにて実施した（3）T波測定は各版とも，少なくとも10回以上実施したー103−

結動機能の変化を昭和61年度と63年度で比較し

果

図2に正常対照児のT波波形を示す．正常でたものである．ベスタテンを期間中に服薬したはT波の振幅は約1−10mVと柾めて広いば児を○で示し，非服薬を●で示してある．又′らつきを示し，一般的に右足の振幅が高い．たのある症例はこの期間を通じてベスタテンを服だ正常児の多くは3〜5mVの振幅を示した．

薬していたDMD児である．ベスタテンを服薬

図3はその正常対照児とDMD児の身長としている2名とstage7の非内服児1名がこのT波の潜時を示したものである．正常対照児と期間中，Stage分類での進行は認められないが，DMD児ともにT波の潜時は身長と正の相関
Stagoをもっていることがわかる．

○ベスタチン服薬児

図4は今回の対象であるDMD児10名の運●ベスタテン非服薬児
1

2

刀「

3

4

5

≠Ⅰ2mV

6

7

8

一一恥一

61年度
図4

010

20

30

40帖∝

′＼√＼阜箋

右図2 正常対照児のT波の波形
G¶

●
●●

．毎
●
0
●●
○●

○ベスタテン服薬児●ベスタチン非据藁児

J∈＝

ODMD

0

61年度 63年度
1490

図3

左

●No汀nal

0

10

63年度

DMD児10名の運動機能の変化

20

30Msec±1171

図5

正常対照児のT波潜時と身長との関係−104−

61年度 63年度

660

1230

±572

±829

805
±706（〟†）DMD児のT波振幅の継時的変化

ベスタナン服薬および非服薬DMD患者におけるT波の検討○ベスタチン服薬児た．しかし，両群間では63年度の結果よりみて●ベスタチン非服薬児もわかるように差は認められない．

ヱSOC

25

最後に波形の変化を図7に示す．症例1がベ■■−；♪；イト●

スタナン服薬児であり，どろんとした波形がま●

すます，その振幅を下げている．？スタナン非服薬児の波形は症例2，3である．やはり服薬児

0

0■盲
●

○●

●

○●
○て●

と同様の結果を示している．これら3名の他の症例はここには示さなかったがいずれも同様で
あった．

●●●
●●●●●
●●●●

考

●

案

ベスタテン服薬，非服薬のDMD児各々5名
正常対照群

61年度

についてT波を検討し，その結果を報告した．

63年度

ベスタナン服薬群，非服薬群の両群の間には13．3±1．7nSeC17．7±2．6皿SeC18．8±2．5Ⅰ】SeC

図6

T波の振幅，活動持続時間，潜時および波形のDMD児のT波活動時間の継時的変化差は認められず，経年的変化（61年，63年）に
おいてもそれらの差は認められないように思われた．ただ我々の症例ではベスタテン服薬児の＿N聖▼

年齢が非服薬群に比して若干若いこと，又ベス

1．8才．St叫●2一一St■I■5

タテンもより劫若なころより服薬している症例

ゴレごて二へ√一一
2．11才．St叩13■●St叫●5がないことなどにより，今回の結果でベスタテンの効果を単純には結論は出せないと考える．
ただ臨床的機能進行度の変化のないベスタテ（ぺスタチン非相葉児〉

ン服薬児においても，T波振幅でみるとその程

プ〔二二■：

度は著しく進行しており，いずれはその臨床的3．14才．St■I●5一・一StlIlT機能の低下を認めることが推測される．いずれ（ぺスタチン弗用藁児）にしても，このことはDMDのベスタテンの薬

一一ノヽ／｛一一一一一一＼′一一一
図7

DMD児T波の波形の継時的変化

効判定にT波が有効な検査であることを裏付けるものであると思われた．

他の7症例はいずれも運動機能が低下している．

文

献

図5は同様にベスタテン内服児と非服薬児と

1）高倉広喜，笠木重人ら：アキレス腱反射−TのT波振幅の変化を比較したものである．ベス

波一の正常発達および病的冗進例との比較．

タチン服薬児は仝例，ベスタテン非服薬児は左足の振幅が上昇した1例を除く4例がその振幅

脳波と筋電図，12：190，1984．
2）笠木重人，高倉広喜ら：筋疾患におけるMを減じていた．その減少率よりみても両者間の波，T波の臨床的検討．厚生省神経疾患研

差はない．

究委託費「筋ジストロフィー症の疫学，病図6は両者間のT波活動持続時間の差をみ

態および治療開発に関する研究」（杉田蛙）たものである．正常対照群に比してDMD群では有意の差をもって活動持続時間が延長してい昭和61年度報告書，1986，p．292．
3）三青野産治，江田伊勢松ら：筋ジストロ7−105−

イー症のT波に関する研究．厚生省神経疾病態および治療開発に関する研究」（杉田患研究委託費「筋ジストロフィー症め疫学，班）昭和61年度報告書，1986，p．289．

−106−

分担研究者一覧

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班・班長名簿
氏

名

所

属

所

在

地

電

話

番

号

班長 江橋 節郎

岡崎国立共同研究機構
生理学研究所

444 岡崎市明大寺西郷中380564−53−7345

幹事 青柳 高明微生物化学研究所
酵素研究部

141品川区上大崎3−14−23

03−441−4173

幹事 木下 真男

東邦大学医学部大橋病院
第四内科

153 目黒区大橋2−17−6

03−468−1251

幹事 勝沼 信彦

徳島大学酵素科学研究センター

770 徳島市蔵本町3−18−15

0886−31−3111

（直）

内2550

東京慈恵会医科大学
第二薬理学教室

105 港区西新橋3−25−8

運営 杉田 秀夫
幹事

国立精神・神経センター
神経研究所

187 小平市小川東町4−1−1

0423−4：卜2711
内5101

班長 丸山 工作千葉大学理学部生物学科

260 千葉市弥生町1−33

0472−51−1111

班長 藤井 節郎

大阪基礎医学研究奨励会
九州大学薬学部
薬品分析化学教室

520−01大津市唐崎1−11−1

0775−79−2280

812 福岡市東区馬出3−1−1

092−641−1151

和歌山県立医科大学
第二生理学教室

640 和歌山市9番丁90734−31−2151

国立精神・神経センター

187 小平市小川東町4−1−1

0423−41−2711

監事 福原 武彦

03−433−1111

内2255

内2622

班月 大倉 洋甫
班眉 辻繁勝

班月 旦吉栄二郎

内6151

内319
内2100

班眉 福山 幸夫

向山

治 郎 一

姓月

野

川島

産慶 紘

三 村 鈴

書上木

員⁚員⁚員
班 班 班

班員

誠一
光昭

：旺月 大関 正弘

東京女子医科大学
小児科教室

162 新宿区河田町8−103−353−8111

国立療養所西別府病院
国立療養所箱根病院

874 別府市大字鶴見4548

0977−24−1221

250 小田原市風祭412

0465−22−3196

東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報研究部

113 文京区本駒込3−18−22

03−823−2101

東京都老人総合研究所
生化学部臨床第一研究室長

173 板橋区栄町35−2

03−964−1131

東京理科大学
理学部化学教室

162 新宿区神楽坂1−3

大正製薬㈱ 総合研究所

330 大宮市吉野町1−403

内3068
03−260−4271

内268
0486−63−1111

内351

班員 矢崎 義雄 東京大学医学部第三内科

113 文京区本郷7−3−1

班員 宮武

951新潟市旭町通一番町757

03−815−5411

内8274，8278
正 新潟大学脳研究所神経内科

0252−23−6161

内5180
0487−68−1161

班月 西谷

裕 国立療養所字多野病院

075−461−5121

披

一治 男 広友桂今靖正和

616 京都市右京区
鳴滝音戸山町8

国立療養所兵庫中央病院
東京大学医学部脳研病理669−13 三田市大原1314

07956−3−2121

113 文京区本郷7−3−1

03−815−5411

日本化薬株式会社

03−237−5154

鳥居薬品株式会社

102 千代田区富士見町1−11−2
272 市川市南八幡3−14−3

三菱化成生命科学研究所

194 町田市南大谷110427−26−1211

班班班顧

椋野井城堀
高中石岩今

349−01蓮田市大字黒浜4147

月 日月 友 友 開：旺眉 石原 博幸 国立療養所東埼玉病院
第三内科

−109−

0473−78−4121