厚生省神経疾患研究委託費

筋ジス＿トロフィー症解明のための遺伝子発現の基礎的研究
野々 村班

昭和59年度研究報告書

昭和60年3月

⊂コ

班 長 野々村 禎 昭
総 論本研究班は従来の江橋班をひき継ぐ形で本年より新らたに発足した。新らたに発足すくに当って我々は明確に我々の目標を課題名にかゝげることにした。すなわち我々の班は筋ジストロフィー症解明の為に遺伝子発現のレベルで基礎的な研究を行うことを目指す。
筋ジストロフィー症の痕本的治療とその根絶を冒指す為には筋ジストロフィー症の病因の解明を行わねばならない。その為にこれ迄世界中で地道な研究がなされており，我国でも厚生省の委託研究を中心にして多くの成果が得られてきた。このような努力にも拘らず未だにジストロフィーの真の成因については不明のまヽにある。数年前までは欧米の研究と較べて我国の研究は遜色ないどころかむしろ進んだ研究が多かった。しかし最近状勢は急速に変化してきた。遺伝子工学，細胞工学の進歩をふまえて，欧米での研究は積極的にこれら手法をとり入れて，急速に新らしい展開をとりはじめている。現在，筋ジストロフィー症を遺伝子レベルで正に捕えんとしており，その解明も間近かに迫っている感がある。残念ながら我国の研究は遺伝子レベルの研究では非常に遅れてしまっている。
我々は筋ジストロフィー症にとりくむ基礎班として，ここで欧米の現状に追いつき，追いこす為にも根本的に班の改組を考えた。先ず従来迄生理学，生化学が中心であった班員構成を遺伝子工学，細胞工学的手法をもって研究する班員を中心に組み変えた。また班員の年令構成も思い切って若がえらせ，同時に班員数をしぼってテーマを集中するようにした。このような構成のもとに我々の新らしいストラテ
ジーで筋ジストロフィー症にせまることにした。
筋ジストロフィー症はⅩ染色体上の遺伝子情報にもとづいて，生後，除々に進行する筋細胞への侵襲，
破壊，委桁であり，この間に筋の生長，再生，が複雑にからみあっている。我々は「般的に遺伝子情報が発現する過程を検索し，特に筋細胞が発生，分化する過程で遺伝子発現が進行していく状況を生理，生化，形態レベルで追求していく。この過程で筋細胞が形成されていく状態を詳しく知ることが，実は形成の不全，欠損を知る手がかりとなり，また再生への誘因を知ることになると思う。このような理解の上で実験ジストロフィー動物と正常動物との比較を行い，ジストロフィー筋での発症原因の起点を求めていく。特にこゝで遺伝子レベル，染色体レベルの追求を加えて，遺伝子発現に到る調節機序を明らかにしていきたい。さらに細胞工学的手段を用いて，実験的ジストロフィーの発現を遺伝子導入で試みる。
以下実際に班員によるグループ構成を示す。
第1のグループは生理学的な手法を用いて筋の分化の問題にせまる。
遠藤班員，長谷川班員，大塚班員がこゝに属して，主に筋細胞膜，神経要素の関与を中心にして問題の本質に近づこうとつとめる。こゝでは細胞表面膜のみでなく小胞体膜についても扱われ，表面膜上の神経伝達物質レセプターの問題も扱われる。

第2のグループは主として生化学的手法で筋構造蛋白質の分化の問題にせまる。
′ト林班員，大日方班員，松田班員，丸山班員，嶋田班員が当る。中心は従来より行われてきた収縮蛋
白質の分化を追求するが，単に生化学的調製固定のみではなく免疫学的手法，超微形態的手法も用いられる。収縮蛋白のみでなく，コネクチンの様な細胞骨格蛋白も扱われる。またこゝで筋再生時での蛋白質変化，分化も扱われる。
第3グループは細胞生物学的手法を用いてせまるグループと蛋白質分解酵素とジストロフィーの関連を探るグループである。
石川班員，小沢班員，清水班員が細胞生物学的手法を用い，培養細胞を主に用いながら，超微形態，膜細胞内の分化による変化を明らかにしつつ，さらに染色体レベルでの変化をとらえようと試みる，勝沼
班員，鈴木班員は蛋白質分解酵素の効果，機序を従来の生化学的手法に止まらず，細胞生物学的レベル，
遺伝子工学的レベルで明らかにしようと試みる。
第4のグループはジストロフィーの遺伝子発現を種々の方法によって明らかにしようとするグループである。
黒田班員，勝木班員，香川班員，真崎班員，班長の野々村が当る。このグループはジストロフィー動
物を主として対象に選び，免疫学的手法，細胞工学的手法，分子生物学的手法を駆使して，直接ジスト
ロフィーと正常の差を明らかにしていこうと試みるグループである。
第5グループは遺伝子レベルの解析を主として行うグループで，岡田班員，藤井班員，渡辺班員，奥田班員が当る。
ここでは研究対象は遺伝子そのものに向けられる。そこでは種々の手法の開発，染色体レベルと遺伝子をつなげる試みが行われ，一部ジストロフィーそのものの遺伝子にせまることも行われる。
この5つのグループは相互に密接に連絡をとりあいながら研究を推進する。さらに我々の班だけでなく，厚生省委託研究ジストロフィーの他班とも今後は相互に情報を交換しつつ新らしい観点での共同研究を進めていきたい。第1は臨床研究との共同作業である。これはジストロフィー第2，3，4班との共同作業になっていくと思われるが，ジストロフィー家系細胞バンクの作業である。これは一部欧米で行われつつあるが，遺伝子レベルでの研究を進めていく際に絶対必要なものであり，この為には患者家族との完全な了解のもとに高い倫理性につらぬかれて進めるべきことである。一方実験動物を供給される第5班とは特に最近導入されたⅩ染色体に異常をもったmdxマウスの利用は実験動物ジストロフィー
研究にとって飛躍的進歩をもたらすことが考えられる。とくに染色体レベルでの研究に向っていこうとする時，はじめて動物を用いてのジストロフィー研究が我々の最終目標たる人のジストロフィー症解明
への足がかりとなる道を示したものといえる。
本年度の研究の概要
このようなストラテジーをもってスタートした我々の班は実際には研究の端所についたばかりであるが，本報告書にみるとおり，すでにいくつかの成果があがっている。
第1グループでは遠藤班員による骨格と心筋小胞休のCaによるCa遊離機構の詳細な比較を行い，

長谷川班員による骨格筋膜上でのアセテールコリンレセプター分布への神経要素の影響を詳しく調べた。
大塚班員は中枢神経抑制薬，興奮薬を用いて神経要素が筋発生，発達に及ぼす影響をみた。筋肉膜，表面レセプターの発達分化が発生過程でどのように変化するか，神経要素がどのように関係するかといった点で第一歩となる研究が手がけられた。
第2グループは小林班員がジストロフィー鶏筋で30Kの異常蛋白を発見し同定しつつある。大日方
班員はミオシン関連のC蛋白質にアイソフォームがあることを免疫的手法で見出しこのひとっが除神経によって発現誘発されることを明らかにした。松田班員は筋成長因子としてのトランスフェリンがジス
トロフィー鶏で細胞周辺に畜積することを見出した。丸山班員は同班員の発見，命名によるコネクチンの細胞内局在の詳細な研究を行った。嶋田班員は胚，再生，除神経でトロポニンーTアイソフォームがどう発現するかを調べた。このグループはとくに発生，再生時の筋蛋白の発現に焦点を合わせているが，ジストロフィー動物筋での発現との関連にも手をつけはじめている。
第3グループの石川班員は筋腱結合部の微細構造と膜の裏うち構造との関係を示した。小沢班員はト
ランスフェリン欠乏による筋変性との関係を培養細胞を用いて示した。この結果は第2グループの松田
班員の結果と合わせてジストロフィーへの深い関係を示すかもしれない。清水班員は上皮増殖因子（EGF）の細胞増殖作用に関して遺伝解析への可能性を示した。勝沼班員はリソゾームチオール蛋白質分
解酵素とその内在性インヒビターの各種組織局在を抗体を用いて検索した。心筋，骨格筋は少ない方に属していた。鈴木班員はカルシュウム依存性プロテアーゼのcDNAをとり，その全構造を決定した。この構造はN端側にチオール酵素，C端にCa結合蛋白の配列をもち，中間にそれらをつなぐ配列が在存す
る独得な構造をしていた。ジストロフィーと蛋白分解酵素の関連をつける為の新らしいアプローチのはじまりと考えられる。
第4グループの黒田班員はジストロフィー鶏とそのコントロールの筋細胞膜試料のモノクローン抗体をつくり，抗原性の差を示すスクリーニングを行って，かなりの差が得られた。しかし，この両鶏の遺伝子背景がかなり異っている為，ジストロフィー遺伝子に特異的なものと同定するのに問題があり，近交鶏GCN−2／amをもちいて実験が進められている。勝木班員は前述したmdxマウスとBALB／C問でキメラマウスを胚操作によってつくることに成功した。また外来遺伝子DNAをマウス受精卵に注入し，操作卵の8％に組みこますことが出来た。このような胚操作は今後遺伝子工学的研究とカップルして，大きな発展が期待出来る。香川班員は従来の筋ジストロフィーマウス（dy／dy）系骨格筋に高張食塩注入して筋再生を誘起させ，これを用いて細胞培養に成功した。これはサテライト由来細胞であり，クローン培養にも成功し．今後mdx系についても細胞培養出来る道を開いた。真崎班員はポリADPリボース合成酵素活性を筋ジストロフィー鶏骨格筋で測りその活性の高いことから未分化状態にジストロ
フィー筋ではあることを予想した。我々は小浜を中心に野村班江崎班員及び野村班長の御好意のもとmdxマウスの供給をうけ，その筋膜成分を分離し，特殊染色で高分子の糖蛋白のいくつかヾmdxマウスに存在することを発見した。現在，この局在を確かめているが，この研究はジストロフィーにおける膜蛋白異常の最初の発見といえるであろう。このグループではmdxマウスをもちいて積極的にジストiiiロフィーの異常遺伝子発現を明らかにすることに焦点が合わさってきている。
第5グループの岡田班員はα及び∂クリスタリン遺伝子のキメラを作製し，マウスの培養細胞に注入し発現させた。マウスには∂クリスタリンは存在しないので抗体で容易にその発現を知ることが出来る。
遺伝子でキメラをつくり，遺伝子発現出来たこの方法は，ジストロフィー研究の進んだ段階で応用出来るであろう。藤井班員は膜結合蛋白として小胞体に存在し薬物の解毒反応に関係するp−450のcDNAと遺伝子DNAの解析を行った。ジストロフィーの原発点は恐らく細胞膜にあると思われるので膜蛋白
遺伝子解析の手法は今後重要と考えられる。渡辺班員はヒトのリンパ球細胞の染色体を分離し，Ⅹ染色体の分離に成功した。さらにⅩ染色体の遺伝子ライブラリーを作製した。このライブラリーには80％以上のⅩ染色体上遺伝子を含んでいることを確認した。このライブラリーは今後のジストロフィー研究
にとって大きな財産となることであろう。奥田班員は筋ジストロフィー鶏及びコントロール筋からpoly（A）＋RNAを抽出し，それぞれのcDNAライブラリーを作製した0これらを用いて，dot hybridiz−
ation法でジストロフィー特異的遺伝子の分離を手がけはじめた。前述のモノクロール抗体法と共に成功すれば，容易にジストロフィー特異性遺伝子がつかまるかもしれない。
我々の班は新らしい体制をととのえて，発足してから数か月あまりであるが，新らしい班員を中心にして遺伝子工学，細胞工学を駆使した展開がなされつつある。この様な研究は我国のジストロフィー研
究としてははじめての試ろみなので，育てあげていかねばならない。今後の方向としては細胞膜とくに骨格筋の表面膜の研究と染色休を用いた研究を強化していくように我々班員の中でも研究の転換を行っていってほしいと考えるし，新らたな公募班員で強化することも考えていきたい。
ジストロフィー解明の道は厳しく遠いいが我々の地道な努力のつみ重さねによってのみ道は開かれていくであろう。

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目
緒

次
野々村 禎 昭言Ⅰ

細胞生理とその分化

1．筋小胞体の機能，とくにCaによるCa遊離機構の臓器差
遠

3

藤

実

2．筋に対する神経のtrophic効果

10

長谷川 修 司3．筋発生異常における神経側の要因

16

大

Ⅱ

塚

正

徳

筋構造蛋白質とその分化

23

4．ジストロフィー鶏胸筋に存在する特異蛋白質（30K蛋白）について
小

林

良

二

5．ニワトリ骨格筋におけるミオシンとC蛋白質アイソフォーム
32

発現に及ぼす除神経支配の影響

大日方

昂
39

6．ニワトリ正常遅筋とジストロフィー速筋にみられた筋細胞増殖因子
松

田

良

一

44

7．骨格筋の弾性タンパク質コネクチン
丸

山

工

作

48

8．胚筋，再生筋および除神経筋におけるトロポニン−T
嶋

田

裕

ⅱ

Ⅲ 細胞生物学・組胞工学的研究

9．ジストロフィー筋病態と細胞骨格

55

石

川

春

律

10．筋変性モデルに関する一考察

59

小 沢 鍈二郎
11．リソゾームチオールプロテアーゼとその内在性インヒビターの組織分布
勝

沼

信

63

彦

12．カルシウム依存性プロテアーゼの構造，機能ならびに活性に関する研究

67

鈴

木

紘

一

13．細胞の増殖と分化に関する細胞遺伝学的研究

70

清

Ⅳ

水

信

義

遺伝子発現とその研究方法

14．モノクローナル抗体を用いた筋ジストロフィー鶏筋膜と正常鶏筋膜の抗原性の差異の解析

77

黒

田

洋一郎

15．疾患モデル動物の研究における胚操作法の応用

81

勝

木

元

也

16，筋ジストロフィー症遺伝子発現の標識

84

香

川

務

17．筋ジストロフィー症における筋分化のおくれと遺伝子調節機構
真

崎

87

知

生

ⅲ

18．幼若ジストロフィー（mdx）マウスの膜分画に91検出された異常蛋白質

野々村 禎 昭

Ⅴ

遺

伝

子

解

析

99

19．クリスタリン遺伝子の組織特異的発現機構の解析
岡

田

節

人

103

20．膜結合タンパク質のcDNA及び遺伝子DNAクローニング
藤

井

義

明

107

21．ヒト染色体の分離と染色体特異的遺伝子ライブラリーの作製
渡

辺

武

110

22．筋ジストロフィー症の筋組織における遺伝子発現の解析
奥

田

拓

道

Ⅰ

細胞生理とその分化

1．筋小胞体の機能，とくにCaによるCa遊離機構の臓器差

2．筋に対する神経のtrophic効果

3．筋発生異常における神経側の要因

16

1筋小胞体の機能，とくにCaによる
Ca遊離機構の臓器差遠 藤
研究協力者 大 島 宜 子

骨格筋細胞は大きな速度で短縮することのでき賓＊
堀 内 桂 輔実

飯 野 正 光験

方法

る速筋や，短縮速度は小さいが持続的な張力発生

材料は主としてモルモットの筋を用いたが比較に適した遅筋などに分化していて，それぞれ目的のためにアフリカツメガエル骨格筋やヒト骨格筋に適した働きをしている。心筋も機能的構造的に生検標本なども用いた。モルモットの骨格筋は長

基本的には骨格筋と同じ横紋筋であるが，骨格筋，址伸筋から単一筋線経を，また心筋は心室乳頭筋とくに速筋が必要な時にだけ収縮し，また，そのを細くして直径約100上はn束をいずれも弛緩液中収縮力の調節は収縮を営む細胞数の増減によってで取り出し，50〃′g／〟のサポニンで約30分間処理行われているのに対し，心筋細胞ではすべての細し，Skinnedfiberとして用いた4，5三線維または線胞が常時はぼ一定のリズムで収縮・弛緩を繰り返

維束の両端は絹糸でしぼり，2本の金属のフックにし，かつその収縮力の増減は個々の細胞の収縮力

それぞれ固定した。一方のフックはストレーン・ゲーの増減によって調節されているなど種々の点におジ（エイカースAE80）に接続して，等尺性張力をいて差異が見られる。我々はこれらの機能の相違

測定し，ペン・レコーダー上に記録した。標本を浸が収縮並びに制御蛋白系，あるいは筋小胞体のどした溶液は図1のように，免疫反応の検出などにのような差異によって生ずるかをできるだけ生理用いるプラスチックの板にあいた穴の中に入れてあ的な条件下においてskinnedfiberを用いてまず明るが，液面が少し盛り上るようにしてあるので必らかにし，次いで発生過程においてそれらの機能

要な時に坂を水平に移動すると，速やかに液交換の分化がどのような経過で生ずるかを調べて，こができる。温度はプラスチックの板の直下を20℃

れらの機能に関係した遺伝子の発現様式を解明すの水で虐流し一定に保った。CaによるCa遊離のる手がかりを得ようと考えている。この線に沿っ実験は既に報告した通げ）図2のような手順で行て我々は従来，両生類骨格筋の速筋線経と遅筋線

った。あらかじめ標本中の′ト胞体から後述の方法

経の性質を詳しく比較し，その発生経過を追求しでCaを全部放出させてから実験を始める。まず，っっあるト3三本年度はこれと並行して骨格筋と心標本を一定濃度のCと〜十を含む液中に一定時間浸し，筋との比較を，主としてこれまで余り詳しく調べ（通常2×10J7MCa2：2分間）一定量のCaをCaられていなかった筋′ト胞体のCaによるCa遊離（CaポンプATPaseの作用により′ト胞体中に取り込ま−induced Cardease）の機構について比較を行せる。次にその中胞体に種々の濃度のCa2十を種々った。

の時間適用してCaによるCa遊離を起こさせるのであるが，この時同時にCaポンプが働くとCa遊＊東京大学医学部・薬理学第二講座

離と並行してCa取り込みも起こってしまうので，純粋にCa遊離だけを観察するために，まずMg

Ⅰ 細胞生理とその分化

図1．実験装置概要の模式図。

control

享L∴

1。inTn阻＼、・、
1

Smin 一㌦「「ト
3

min

1min

COntrol

rl鼎十

、−−

、

図2・CaによるCa遊離速度測定の実験手順。説明本文。

ATPを完全に除去してCaポンプを働かなくして この処理のあとCa2十を十分洗い流してから，′ト胞からCa2十を適用する。MgATPが十分に減少す

体中に残っているCa量を測定する。この測定にると，筋の収縮蛋白系はいわゆる硬直状態に陥るは30〜50mMの高濃度カフェインを適用すると′トので，張力発生によってそれを知ることができる。 胞体中のCaがほとんど全量一気に放出される事

1筋小胞体の機能，とくにCaによるCa遊離機構の臓器差実を利用する。放出されたCaは結局は標本の外（張力曲線下の面積）から放出されたCa量，すなへ拡散して薄まってしまうが，その途中で標本のわち，カフェイン適用時に′ト胞体中に存在したCa

収縮蛋白系を刺激するので標本は一過性に・張力を量を推定した。最初に取り込ませるCa量を一定発生する。この一過性のカフェイン収縮の大きさにしてあるので残っているCa量がすくなければTime
図3・モルモット骨格筋小胞体のCaによるCa遊離の時間経過。
説明本文。図2と同じ実験。

一・一ムー−

Human skeletal m．

（Endoetal．in prepaTatio−｛トt Xenopus sketetal m．

／

Tが上Mg◆−ト）

／′一ロー

ロ

∴三〆／⁚

（Endo．198り

ソ／

一一〇一Guhea plg Sketetalm．

T士

十Guinea plg Ventrkle

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ATP卜）

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︵TU盲︶むS巾む一山∝巾U I0空巾∝

10

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∴

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謝〒誓三屋∠芸・≦

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一▲−6

＜10−

10￣

10

げ5

164

【Ca●◆］（M）

図4・種々の筋肉から作T，たskinnedfiberの小胞体のCaによるCa遊離速度のCa2十濃度依存性。

Ⅰ 細胞生理とその分化

すくないはど多量のCaが遊離したのだというこ性を検討しなければならない。
図4のデータはMg2十の不在下にCaによるCaとが分る。
標準弛緩液はPIPES20mM，M㌔十1．5mM，Mg

遊離を行わせたものであるが，生理的に細胞内にATP3．5mM，EGTA2mM，を含み，PH7．0ではもちろんMg2 が存在し，そのMg2十はCaにる

イオン強度0．20Mとなるようメソタンスルフォン

Ca遊離を抑制することが分っている8三 そこで，

酸およびK十（KOH）を加えた。遊離Ca2十濃度は1．5mMおよび15mMのMg2十存在下でCaによる

Harafuji＆Ogawa7）によるCa−EGTAの見かCa遊離を行わせて見た。Mg2十は図5に示すようけの結合定数を用いて計算した。

に，すでに報告されているとうり8）（1）C王〜十濃度−Ca遊離速度曲線を右にずらせてCaによるCa

結果

遊離のCa感受性を下げると共に，（2）至適Caヲ十濃

図3は実験方法の項に述べたような図2の手順

皮下における最大Ca遊離速度を減少させる，とでまず小胞体に一定量のCaを取込ませ，10￣づMいう二つの作用を示した。このMg2十の抑制作用，のCa2十で1，3，5分間，CaによるCa遊離を起こ

特に上記（2）の作用は骨格筋において（図5上），させた後に′ト胞体に残っているCa量を測定し，心筋（図5下）よりも強力であった。

プロットしたものである。図に見られるように，

実験方法の項に述べたように，以上の実験では残ったCa量はCa2十を適用する時間が長くなるに

Ca遊離中にCaポンプが働くことを避けるため，従って次第に減少した。この減少の時間経過は多ATP不在下でCa遊離を起こさせている。しかし，

くの実験からほぼ指数関数的であることが分って生理的にはもちろんATPが存在し，そのATPいる。このようなCa量減少の速度定数をCa遊離

はCaによるCa遊離を着るしく促進することが分速度として測定した。

っている8三 そこで，できるだけ生理的に近い条件

図4は種々のCa2十濃皮下のCaによるCa遊離速

下セCaによるCa遊離を調べるために，ATPと度をモルモット骨格筋と心筋のskinnedfiber小胞

同様なCaによるCa遊離促進作用を示すが，Caポ体について測定した結果を示したものである。比ンプを駆動させる力の全くないATPアナログ，

較のために，ヒト骨格筋およびアフリカツメガエ

AMPPCP，を用いて9：その存在下にCa遊離速

ル骨格筋のデータも一緒に示してある。モルモッ

度を測定した。まず予備実験としてCa遊離促進

ト骨格筋，心筋は共に3×灯7M近辺からCaによ効果のAMPPCP濃度依存性を調べた所，10LLM

るCa遊離が起こり始め，C㌔十濃度の増加と共に以上で促進効果が見られ，濃度の増加と共に効果

ca遊離速度が大きくなる。しかし，骨格筋でCa2十は増大したが，約1mMでほぼ最大に近い効果が

10￣5M以上になるとかえってCa遊離速度は減少得られた。そこで1mMのAMPPCP存在下，するのに対し，心筋ではCa2十10￣lMまでCa遊離Mg2十濃度もほぼ生理的と考えられる1・5mM存在

速度は著明な減少を示さなかった0至適Ca2十濃度

下にCaによるCa遊離の速度を調べたものが図6で得られる最大Ca遊離速度は心筋で骨格筋よりである。骨格筋に比して心筋の方が生理的条件下も大きい傾向を示した。

でCaによるCa遊離速度は大きいようである。

ヒト骨格筋はモルモット骨格筋よりもCa2十濃度

骨格筋′ト胞体で，CaによるCa遊離はカフェイ

一Ca遊離速度曲線が右に寄っており，Caによるンで促進し，プロカインで抑制されることが分っCa遊離のCa感受性が少し低かった。アフリカツている8三 心筋′ト胞体でもその点が同様であるか否

メガエルはさらに低いCa感受性を示したが，こかを調べた。図7に示すように，カフェインは心

れは実験が低温下（約20C）で行われているので

筋小胞体におけるCa2十存在下のCa遊離速度を濃温度による差が見かけの種差に関係している可能

皮依存的に増大させた。Ca2十不在下ではCa遊離

1筋小胞体の機能，とくにCaによるCa遊離機構の臓器差︵TU盲︶むS句む一念﹂qU IO芸庄

Guinea pig／ノー￣￣、0三二￣二Skeletal mus

ATP（−）
〇

＼

云
○

△竺∑巴ニ

Mg●11・5mM△一一一一ノ＝￣￣／

ロー一一 二

ー7

10

10−6

10−5

10・l

［Ca檜〕（M）● （ −●︵TU盲︶む∽巾山一む∝

Gunea pHヨ
Ventr＝ニIe

ATPト）
●

／＼

巾U−0む︼q∝▲一一・・・・・・・・一一▲

葦戸：宝

10￣5

10￣4

【Ca｝〕（M）

図5．モルモット骨格筋および心筋小胞休のCaによるCa
遊離に対するMg2十の抑制作用。

速度の増大は起こさないので，カフェインのこの

ルモット骨格筋でもその点が同様であるとすれば，作用はやはりCaによるCa遊離の促進効果と言う

本実験は骨格筋一般と心筋との比較と考えてよい

ことができよう。同様にプロカインは心筋小胞体

ことになる。

においてもCaによるCa遊離を抑制した。

心筋／ト胞体のCaによるCa遊離は，その大まかなCa感受性，Mg2十およびプロカインによる抑制，

考察

ATPないしそのアナログ並びにカフェインによskinnedfiberを用いて筋小胞体のCaによるCaる促進など定性的には骨格筋小胞体のそれと全く遊離機構を骨格筋（速筋）と心筋とで比較した。

同じであった。しかし，定量的には，要約すると

ヒト骨格筋においては速筋と遅筋でCaによるCa

次の二点に心筋と骨格筋とで差異が見られた。

遊離機構の性質にほとんど差がないので67もしモ（1）Caによる最大Ca遊離速度は心筋の方が骨格筋

Ⅰ 細胞生理とその分化

AMPPCP lrnM

0Skeletal m．
一・r

￣

￣■￣

＼

∴

0

ト−t〉

′ ′ ′ ． ／

20

．よ ∴ノ
這

︵TU盲︶むS巾むl品巾U I0むl巾∝Mg■ト1・5mM

10−7

10−6

10−5
〔Ca≠】（M）

図6．モルモット骨格筋および心筋小胞体の生理的条件下（Mg2十濃度，アデニンヌクレオチド濃度に関して）におけるCaによるCa遊離。

⁚M
m︶
5ト
吋A T︒

．
′
∴

︵TU盲︶むS苫一山∝巾U−0空巾∝

Ca什ト）

一

′lt

︶

▲ 弓P一一一●▼00．050．5550
CaHeine（mM）

Ldl￣J

0

10
Procaine（mM）

図7．モルモット心筋小胞体のCaによるCa遊離機構に対するカフェインの促進作用とプロカインの抑制作用。

より大きい。（2）Ca2十濃度を十分に上げるとCa遊

んまだよく分っていないが，一つの考えとしてCa離速度がむしろ減少するが，その減少は骨格筋でによるCa遊離はCa2十によって小胞体膜に存在す

強く心筋で弱い。また，Mg2十による最大Ca遊離速度の減少も骨格筋で強く心筋では比較的弱い。

るCa2十イオンチャンネルのゲートが開く結果であ

これらの2価イオンの抑制作用の機序は，もちろ塞する，という可能性が考えられている。もし，り，2価イオンはそのCa2十イオンチャンネルを閉

1筋小胞体の機能，とくにCaによるCa遊離機構の臓器差

そのように考えるなら，上記の（1），（2）の骨格筋と心筋の定量的差異は，いずれもCa2十イオンチャン
ネルが心筋で大きいとすれば最大Ca遊離速度も大きく，また2価イオンで閉塞され難い，と説明することができる。しかし，もちろん他にも種々

筋小胞体の性質の比較，厚生省神経疾患研究委託費
筋の発生と分化に関する基礎的研究，昭和57年度研究報告書 80−87，1983．
3）遠藤 賓，堀内桂輔：幼年アフリカツメガエル腸骨
誹骨筋の収縮系と筋小胞体，厚生省神経疾患研究委
託費筋の発生と分化に関する基礎的研究，昭和58年
度研究報告書 74−79，1984．
4）Ohtsuki，Ⅰ．，Manzi，R．M．，Palade，G．E．＆Jamieson，の説明があり得よう。いずれにしても上記の骨格

J．D．：EntryofmacromoleculartraceTSintocells

筋と心筋間の定量的な差異は，CaによるCa遊離

from chick breast muscle．LWot．cellutaire
119−126．1980．

に関与する（恐らくは）小胞体膜蛋白質に差のあることを示している。CaによるCa遊離機構の生理的意義はまだ明らかでないが，この小胞体−t膜
蛋白質の臓器差は蛋白レベルではどこにあるか，発生過程でその分化はどのように進むか，他のたとえば収縮蛋白質の分化とどのような位相的関連を有するか，それらの遺伝子発現機構はどのように制御されているか，などが今後の目指すべき方向である。

5）Endo，M．＆Iino，M．：Specific perforation ofmuscle cellmembranewithpreservedSRfunctions

bysaponintreatment．J．肋scleRes．Cbll肋tili0，，
1，89−100，1980．
6）Endo，M．，Yagi，S．，Ishizuka，T．，Horiuti，K．，
Koga，Y．＆Amal1a，K．：ChangesintheCa−induced
Ca release mechanismin the sarcoplasmic re−ticulum ofthe muscle from apatientwithmalig−
nantHyperthermia．Biomed．Res．4，83−92，1983．
7）Harafuji，H．＆Ogawa，Y．：Re・eXaminationoftheapparent binding constant ofethylene glycolbis（β−aminoethyl ether）−N，N，N

献1）遠藤 質，堀内桂輔：両生頸骨格筋の遅速両筋線経の比較，厚生省神経疾患研究委託費筋の発生と分化に関する基礎的研究，昭和56年度研究報告書
69−75，1982．

2）遠藤 賓，堀内桂輔：両生頬骨格筋の遅筋と速筋：，N−

tetraaCetic acidWith calcium around neutralpH．J．Biochem．87，
1305−1312，1980．
8）Endo，M．：Mechanismofcalcium−inducedcalcium
releasein

文

31，

the

SR

membrane．In

neMechanism

Of Gated Calcium Transport acrossI如01ogical
Membranes（S，T．Ohmishi＆

M．Endo，eds．），

pp．257−264，1981．
9）Kakuta，Y．：EffectsofATPandrelatedcompounds
on the Ca−induced Ca release mechanism of the
XenopusSR．即房ger∫drc九400，72−79，1984．

102筋に対する神経のtrophic効果−Acetylcholinereceptorの分布

研究協力者

は

じ

め

長谷川 修 司＊黒 見
担＊に

運動神経は．骨格筋を少くとも二種類の信号伝

今回は，さらに神経の筋への trophic機構を理解するため，培養骨格筋細胞膜のアセチルコリ

達を通して支配していると考えられる。一つは，ン受容体（AChR）の発達過程での分布の変化と化学伝達物質（アセチルコリン）を筋に放出し，それに対する神経の役割をしらべた。

放出された伝達物質が筋の受容体（Acetylchol−

培養骨格筋のAChRは，神経の支配を受ける前

ine receptor；AChRと略す）に結合すると筋は，筋細胞膜表面全体にdiffuseに分布しているに活動電位が発生し，筋収縮へといたる信号伝達が，ところどころ密度の高い部分，つまりclusterである。この過程はmsec単位で終了する現象での状態で分布しているところがある。神経が筋にある。もう一つは，比較的長期間にわたる現象を接触すると，このAChRのclusterはこわれ，支配していると考えられる，神経から骨格筋へのAChR分子はdiffuseに分布するようになる。そ信号伝達である。例えば，支配神経を切断すると，の後，神経・筋接合部にAChRのClusterが形成数日後には，筋は萎縮してくる。神経から筋維持される。3）生体においても，発生初期の骨格筋のの信号が絶えず送られていて，神経切断によって

AChR は筋線維表面全体に分布しているが，発それが絶たれたための筋萎縮だと解釈され，これ達過程において，AChRは神経・筋接合部にのみを神経の筋へのtrophic効果と呼んでいる。これ

高密度で局在するようになる。おそらく神経がこまで多くの研究が化学伝達物質を介する信号伝達のAChRの局在を制御しているであろうが．そのについてなされ，この機構はかなりよく理解され作用機序はわかっていない。本実験において，

るようになった。一方神経の骨格筋へのtrophic

AChRの分布を経時的に観察することによって，信号伝達機構については．現在ほとんどわかって神経の筋のAChR分布に対するtrophic機構をいない。筋ジストロフィー症の成因と治療を考え調べた。ミ6）

る場合，この長期的な作用を示す神経の筋へのtrophic 影響を考慮に入れることが重要と考え

実

験

方

法

られる。この点から，われわれは，骨格筋への運アフリカツメガエル（Ⅹenopuslaevis）の胚動神経のtrophic作用機構を理解するため，筋から筋細胞および脊髄神経細胞をとり出し，すでの活動電位発生のためのイオンチャンネルの性質に報告されている方法4）で培養を行った。神経・をコントロールしているtrophic substanceの筋細胞を一定時間培養後，筋細胞表面のAChR

検索を進めている。1，2）をRhodamine−a−Bungarotoxinで蛍光標識した。AChRの分布をimageintensifierを附け＊千葉大学医学部脳機能研究施設 神経薬理研究部

た蛍光顕微鏡で経時的に記録した。また，細胞表

2 筋に対する神経のtrophic効果

11

面のAChRの膜内での動きを，Fluorescence

図1b−e，4の矢印，図1b−C，5，6の矢印）。

photobleaching recorey（FPR）法で測定し神経・筋接合部でのAChR cluster形成の平均た。

速度は個々のclusterで異なり，0．1FLI〝hr以下から2．3J上Hf／hrであった（mean値は0．7prrf
結3−1／hr；N＝21）（表−1）

果神経・筋接合部でのAChR clusterの形成

3−3

FPR法によるAChRの膜内での拡散速度

培養骨格筋細胞のAChR分子の膜内での動き

図Nlに，神経・筋接合部でのAChRのclusterの速さを知るため，FPR法により，AChR分子が形成される初期のAChRの分布の変化が経時の拡散係数を測定した（表2）。その結果，（1）

的に示してある。この観察を始めた時（0：00）

AChR分子でclusterを形成しているものは，実5つのきわめて小さいAChRのcluster（7，4，5，

質上動かない；拡散係数は10￣12。丘庵ec22℃以9の矢印）が神経の走行に沿ってみられ，2つの下である。（2）diffuseに分布しているAChR 分

AChR cluster（10，11の矢印）が神経・筋接合部

子の大部分は膜内を自由に動き廻っている，（3）の外にみられた（図1のb）。8時間30分後，多diffuseに分布しているAChR 分子の膜内でのくのAChR cluster が神経の走行に沿ってみら

速さは，筋細胞だけの培養と神経支配を受けた培

れ，神経・筋接合部の外には，AChRのcluster

養とで，その拡散係数とBl飴Ch後の回復程度にはまったく見られなくなった（図1のe）。図1

差はみとめられない。

のAChR分布の経時的観察から，次の3つのこ

3−4とが結論される。（1】神経・筋接合部でAChR

除神経後のAChR分布の変化

神経・筋接合部でのAChR cluster 形成に対Clusterは，diffuseに分布している部分に，最する神経の役割をさらに明らかにするため，除神

初′トさいClusterとして現われる。接合外のAC

経後のAChRの分布をしらべた。除神経はレーザ

hR clusterが接合部に移動してくるのではない

ー光線を神経細胞体に照射して行った。図2に示（例えば，図1dの1，12の矢印，図1eの2，3，されている如く，除神経後，神経・筋接合部での13−15の矢印）。（2）小さいAChR clusterは神経

大きなAChR cluster

・筋接合部でその大きさ（図1b−e，4の矢印

し（図2，B，C3，4，5の矢印，図2C，D6の矢

図1b−C，5，6の矢印）および数が増加し，融印），消失した。また大きさが小さくなり消失した

合して大きなclusterが形成される（図12b−e，（図2B−E．7．8．9の矢印，図2B，C，1，2の矢7の矢印）。なかには，大きさが減少し（図1d−e，印）。除神経後，神経・筋接合の外に，AChRの8の矢印）または，消失する（図1b−C，9の矢印）

clusterが出現することもあった（図2，D，Ell

AChR clusterも観察された。（3）神経・筋接合の矢印，図2，DlOの矢印）。

部の外のAChR clusterは，接合部でAChR

3−5 培養日数の異った神経・筋接合部でのclusterが形成される間に，小さいclusterに分解して消失したり（図1，b−d，10の矢印），そのま
ま消失したり（図1，b−C，11の矢印）した。
3−2

神経・筋接合部でのAChR cluster

は小さいclusterに分解

AChR clusterの消失
神経細胞を加えて1日後に除神経を行うと，大部分のAChR clusterは，神経・筋接合部から消の形成速度
神経・筋接合部でのAChR cluster の形成される速さを決定するため，15個のAChR cluster
を選び，その面積を経時的に測定した（例えば，失した（図3の…○‥・，…●…）。一方神経細胞を加えてから3日後に除神経を行うと，半分近くのAChR cluster が神経・筋接合部に残った（図3−△−）。

Ⅰ 細胞生理とその分化

12

0100

3tOO

5−00

−

−

10pm
図1神経・筋接合部でのAChR clusterの出現，a；神経・筋細胞の図式（0：00時），b−e；蛍光顕微鏡写真（白いところが
AChR cluster，黒い部分はAChRがdiffuseに分布している）○（6）
カッコ内は比較的（時：分）

2 筋に対する神経のtrophic効果

神経・筋接合部でのAChR clusterの形
成速度

12

0
1

1
1
1
1
1

11
︒・
最 ︒ ・9 最 1 ・6 冒 ︒ ・5 ︒
7・

7 5 53 0 0 91 9
1 50 3519 430

5

789
01234

3456

6．6×102
6．1
2．2
2．5

︶ r4
矧霊昌1・

蓄積速度
（Sites／hr）＊Sl︵

AChR cluster番号○EHERV▲TIOH

1＊理論値は，F＝2万D￠K（a／2C）によって計算した57）

表2

■1

凍凍攣．

表1

13

AChRの拡散
TIlrl

培

養

数

拡散定数

回復値

（10，10cm2／sec）（％）

筋細胞
の

み

神経支配
をうけた筋

7

2．37±0．07

68．2±5．5

6

2．50士0．35

61．1±6．4

10 日冊

図2 除神経後のAChRclusterの変化（5）A；この筋細胞は2本の神経に接触を受けていた。B−E；蛍光顕微鏡写真
除神経前（B），除神経後1時間（C），5時間（D），7時間（E）

Ⅰ 細胞生理とその分化

14

denervQIIon

ご」ず
り2）
一一＿ム

ーI O1

3

5

7

23（hr）
t−P＜〇・001

図3 除神経後のAChR cluster消失の時間経過・縦軸；除神経前の神経・崩接合部でのAChR clusterの面積を100としてある。横軸；除神経後の時間。神経と3日共培養した4日培養筋（−△−）。神経と1日共培養した4日培養筋ト一一一〇一一一一），2日培養筋（一一一一●一一一一）㌘）

考 察 と 結論
神経・筋接合部にAChR分子が高密度（cluster）

clusterが形成される機構として現在2つの説が提出されている。（1）接合外のAChR clusterがで分布する機構としては，一時期，神経が筋の接合部に移動してくる。（2）diffuseに分布していAChR clusterを捜し，そこに接合部を形成する

るAChR分子は自由に拡散しているので，接合部ためであるとされていた。現在は，神経は筋の適に出会うとそこでtrapされる。（2）の説を排除す

当な場所に接合部を形成し，その後その接合部にる強い理由として．AChR分子の拡散の速さがAChR clusterが形成されるという説明が受け遅すぎて，実際にみられる接合部でのcluster形

入れられている。今回の実験で示されたように，成の速さを説明できないというものであった。し

経時的にAChRの分布をしらべてみると，接合部

かし，今回，AChR分子の拡散の速さをFluorTでのAChRは，それまでまったくclusterがみ

escence photobleaching Recovery

られなかったところでも，Cluster が出現して定し，それによるAChR clusterの形成速度をきた。このことは．神経・筋接合部でのAChR計算した（表1の理論値）。一方，径時的に観察

clusterは神経がもとあったAChR clusterにしたAChR clusterの面積から，実際のAChR一致したためではなく，接合部形成後に形成されcluster の形成の速さを計算した（表1の蓄積たのであるという上の説をはっきりと支持する。

速度）。その結果，これまで想像された結果と反神経・筋接合部が形成された後，そこにAChR

対に，AChR clusterの形成速度は，AChR

法で測

2

筋に対する神経のtrophic効果

分子の拡散によるもので充分説明されることが明らかになった。また経時的にAChR cluster形成を観察した結果，接合部外のAChR cluster
が移動して，接合部にAChR clusterが形成されるという知見は全く得られなかった。以上のことから，神経・筋接合部でのAChR clusterの形成は，自由に膜内に拡散しているdiffuseに分布しているAChR分子が，接合部に来るとそこでtrapされたためであるという説で充分説明できると考えられる。
また，除神経の実験の結果から，神経・筋接合部でのAChR clusterは形成後安定化されていくことが培養下で示された。

152）Gonoi，T．，Hasegawa，S．，Kuromi，H．andHagihara，Y，（1983）．The neurotTOPhic substanceregulating
the membrane properties of 永eletal muscles．
Muscledystrophy；biomedical

aspectseds．

Ebashi，S．and Ozawa，E．pp71・76，Japanese
gcfe〝r研Cgocfe伊preJg．
3）Kuromi，H．and Kidokoro，Y．（1984a）．Nerve
dispersespreexistingacetylcholinereceptorclusters
PrlOr tO induction of receptor accumulationin
Xenopus muscle cultures．DeveZop．Biot．103，
53・61．
4）Anderson，M．J．，Cohen，M．W．and Zorychta，E．
（1977）．Effects ofinnervationonthedistribution
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Cells．上川γ裏bJ．268，731−756．
5）Kuromi，H．and Kidokoro，Y．（1984b）．Denerva・tion disperses acetylcholine receptor clusters at
the neuromuscularJunCtioninXenopuscultures．
βeVeわp．βfoJ．104，421427．
6）Kuromi，H．，Brass，B．and Kidokoro，Y．Forma−tion of acetylcholine receptor clusters at neur0−
muscularJunCtioninXenopuscultures．Devetop．

文献1）Kuromi，H．andliasegawa，S．（1975）．Neurotrophic
effect of spinalcord extractonmembranepoten−
tials of organ cultured mouse 永eletalmuscle．
β〝∫〃月即．100，178・181．

βfol（inpress）．
7）Edwards，C．and Frisch，H．L．（1976）．A modelfor thelocalization of acetylcholine receptors

at the muscle endplate．J．NeuTObiol．7，377−
381．

16

3 筋発生異常における神経側の要因
大 塚 正 徳＊研究協力者

弘 中 哲 治＊＊ 五十璧 良 生＊＊

我々は筋ジストロフィー症の発症の原因を究明

枢神経系に異常興奮を示すニューロンがあり，こする目的で，正常チキン（line412）およびジの僻化後初期（筋発生の時期）に，すでにECR

ストロフィーチキン（line413）の長擁側手根伸L筋に対して異常刺激が加わっている事実を報告（ECRL）筋を用いて実験を行なってきた。EC

した。6）今回は，この支配神経による異常刺激がRL筋の交換移植の実験から，筋の発生・成長に筋の発生において抑制的に働いている可能性につおいて筋外性の要因，とくに神経原性の要因，がいて検討を行なった。もし，この異常刺激が筋の重要であることを示す結果が得られた。1）一方，発生を阻害していれば，ジストロフィーチキンでECRL筋の生理学的および解剖学的性質の経時

中枢神経の異常興奮を抑えてやれば発生してくる変化を調べた実験から，貯化後初期（〜13日）に筋線維数は増加し，正常チキンで中枢神経の異常

みられる筋線維数の増加がジストロフィーチキン

興奮を起こしてやればそれは減少するはずである。

で著しく抑制されていることが分かった㌔）

中枢抑制薬としてphenobarbital 中枢興奮薬とこれら二つの実験から，ジストロフィーチキン

してpentylenetetrazolを選び実験を行なった。

にみられる醇化後初期における筋発生の抑制が神経側の異常に基づくことは十分ありうることである。そこでまず，ECRL筋を支配する神経の発方法

鰐化後1〜13日目の正常チキン（line412）と生異常の有無を調べるために同筋に進入する神経

ジストロフィーチキン（line413）を用いた。

線経の数を測定した。3）しかし，ジストロフィー

Phenobarbital（20，30m9／kg）およびpentyle−

チキンで神経線経の数が少ないと言う証拠はなく，netetrazol（20mg／k9）を毎日1回，前者は就寝むしろ多い位であった。3）支配すべき筋を持たな

前（夕方6時頃），後者は朝（10時頃）腹腔内にい神経細胞は死滅して行くことが知られてお〆7・5）

投与した。13日目にエーテル麻酔下にECRL筋

ジストロフィーチキンで見出された噴余剰 の神を摘出し．ホルマリンで固定した後，近位端から経線維3）はECRL筋を支配しているものと思わ％の所で横断切片を作成し，へマトキシリン・エれる。このように，これまでの実験結果からは将オジンで染色した。染色標本を適当な大きさに拡化後初期における筋の発生でジストロフィーチキ

大して写真を撮り，サンプリング法により筋線維

ンに神経栄養的な意味で欠陥があることを示す積数を計測した。1・2）

極的な証拠は得られていない。
我々はこれまでに，ジストロフィーチキンの中結果

薬物がヒヨコの動態に与える急性効果：＊東京医科歯科大学医学部薬理学教室＊＊帝京大学医学部薬理学教室（研究協力者）

Phenobarbita120〜30m9／kg
きが少なくなりq眠い

投与後ヒヨコの動様子を示したが，刺激に

3 筋発生異常における神経側の要因

17

対しては十分に応じ得る状態であった。朝方には変化で調べた結果を示した。生理食塩水を投与しcontrol群と同じ動きを示した。Pentylenetet−

たcontrol群の筋緑維数は正常・ジストロフィー

razo1207咽／k9では，逆に，動きが多くなり，鳴ともに前に報告した2）ものとほぼ等しい値を示し

き声の調子が高くなり，時々飛び立ちそうな気配た。従って，注射によるストレス等の影響はなかを示した。この薬用量ではけいれんは起らなかっったものと思われる。このcontrolに対してた。

phenobarbital 投与群では二つの実験でいずれ薬物投与が成長に与える影響：図1にpheno−

も筋線維数が14，000から17，000，15，000から

barbita120mg／kg 投与群における体重増加の様

16，000 と増加する傾向がみられたが統計的な有子を示した。Exponential function をあては

意差はなかった。これに対して，pentylenete−

めて最小二乗法で算出したrate constant（k）

t razol投与群では，25，000から16，000と筋緑はcontrol（○）で0．016／day，teSt（●）で維数の著しい減少がみられ，ジストロフィーチキ

0．014／dayであった。Phenobarbita130m9／k9

ンのCOntrOlに近い値を示した。この減少は統計を投与した別の実験では，それぞれ，0．022／day，的にも有意であった（P＜0．05）。Pentylene−

0．026／dayであった。また，pentylenetetra−

tetrazol投与群の一部で将化後13日目にflip−

20120m9／k9投与では（図2），COntrOl O．014

testを行なったところ，いずれも陽性であった。

／dayに対し0．013／dayであった。これらの実験から両薬物の成長におよぼす影響は無視し得る程度と思われる。

考察

図1，2に示したように，正常チキンにおける中枢抑制薬および興奮薬が筋の発生に与える影
響：表1に薬物投与の影響を13日目に筋線維数の体重増加に対するphenobarbitalとpentylen−
etetrazol の影響はそれ程大きなものではなく︵g l鳥芯きゝ甘〇日
0

5

10

15

Time（day）

図1．Phenobarbitalが体重増加に与える影響。薬物および生理食塩水
は0．01m〃グ体重となるように容量を調整し，腹腔内に投与した。
○，COntrOl（n＝3）；●，teSt（n＝4）。縦棒．SEM。k，最小二乗法により求めた直線の公配を表わす。正常チキン

Ⅰ 細胞生理とその分化
k︵g l鳥芯字音0日

O：Satine，0．0143／旬ay●：PentylenetetrazoI，0．0129／匂ay（20mg八g）

0

5

10

15

Time（day）
図2．Pentylenetetrazolが休垂増加に与える影響。薬物および生理食
塩水は0．01m〃グ体重となるように容量を調整し，腹腔内に投与した。○，COntrOl（n＝5）；●，teSt（n＝7）。縦棒，SEM。k．最小二乗法により求めた直線の公配を表わす。正常チキン

表1・中枢抑制薬（phenobarbital）および興奮薬（pentylenetetrazol）の僻化後初期における筋発生に与える影響
Chicken

Exp．1

Normal SaHne
NormalExp．2

Treatments

25046士2530（5）Pentylenetetrazol

16189！1687（7）（20mg／kg，う．p．）＊flip test（＋）

Dystrophic Sa1ine
Dユ／StrOPhjc

NuTT．ber Of muscle fibers（ECRL）

Phenobarbjtal

13913士659（4）

15749！2294（4）く30mg／kg，う．p．）

Exp．3

Dystrophic Saline

Dystrophjc

Phenobarbital

14766±2328（3）16254！3203（4）（20mg／k9，う．p．）

Mean士SEM（n）

筋線維数は解化後13日日に測定した。

3 筋発生異常における神経側の要因

19

バラツキの範囲に入るものであった。従って，こflip test が正常チキンで陽性になったことは興れら二つの薬物の筋発生におよぼす影響も中毒作

味深いことである。このことは我々が従来主張し用の二次的結果とは考えにくいと思われる。薬物てきた代ジストロフィーチキンでみられるいろい

投与後のヒヨコの動態の観察においても．本実験

ろの病態像は中枢神経系の異常に由来する ことで使用した薬用量では，軽い鎮静作用を示す程度

をさらに支持する事実である。

であった。
表1に示した実験結果はいずれも，方向としては，我々の作業仮乱 すなわち，■中枢神経系の異常興奮が醇化後初期における筋の発生を阻害しているカ2）可能性を支持するものであった。この作業仮説に対する結論をだすためにはさらに例数を重ねるとともに，薬物によりECRL筋を支配する神経の活動が実際にどの程度抑制あるいは促進されているかを直接的に調べる必要がある。仮にジストロフィーチキンでみられる支配神経の異常興奮が筋の発生を阻害しているとすると，先に考察したように，ジストロフィーチキンでも神経
3）

支配は正常に行なわれているようであることから
例えば遺伝子発現に関わる何らかの因子が神経側

文献1）Hironaka，T．，Ikari，Y．，Miyata，Y．，Morimoto，S．，
and Tsunoo，A．（1984）．Transplantation of ex−
tensor carpiradialislongusmusclein normalanddystrophic chicks．Ekp．NeuroL 83：392−402．
2）Hironaka，T．，Ikari，Y．and Miyata，Y．（1984）．
Developmentandgrowthofextensorcarpiradialis
longusmuscleinnormalanddystrophicchickens．
放p．〃e〟rOJ．83：378−391．
3）大塚正徳，弘中哲治，五十里良生（1984）。ジスト
ロフィーおよび正常チキンにおける長横側手根伸筋の神経支配。厚生省神経疾患研究委託費，筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班），昭和58年度研究報告書
4）Cowan，W．M．（1973）．Neuronaldeathasaregula−tive mechanismin the control of cell numberin
the nervous system．In Devetopment andAgingin the Nervous旦yStem，ed Rockstein，M．，PP．
1941，AcademicPress，NewYork．
5）Pittman，R．and Oppenheim，R．W．（1979）．Cell

から過剰に分泌されている可能性も考えておく必

death ofmotoneuronsinthechick embryo spinal
cord．IV Evidence thatafunctionalneuromuscular

要がある。

interactionisinvoIvedintheregulationofnatura1−

Pentytenetetrazolで中枢神経系に異常興奮

1y occurrlng Cell death and the stdbilizaiton ofをひき起こすことにより筋発生の著しい抑制がも

6）Miyata，Y．，Morimoto，S．，Ikari，Y．，andHironaka，

たらされたことに加えて，チキンのジストロフィーの発症の診断法の一つとして用いられている

synapses．エcomp．〃e〟rOJ．187：425−446・T．（1981）．Originofthespikedischargesobservedin muscles ofdystrophic chickens．Biomed Res・
2：664・672．

Ⅱ

筋構造蛋白質とその分化

4．ジストロフィー鶏胸筋に存在する

23

特異蛋白質（30K蛋白）について
5．ニワトリ骨格筋におけるミオシンとC蛋白質
アイソフォーム発現に及ぼす除神経支配の影響

32

6．ニワトリ正常遅筋とジストロフィー速筋にみられた筋細胞増殖因子

39

7．骨格筋の弾性タンパク質コネクチン

44

8．胚筋，再生筋および除神経筋におけるトロポニンーT

48

23

4

ジストロフィー鶏胸筋に存在する特異蛋白質（30K蛋白）について

小 林 良 二＊

は

じ

め

に

研究材料及び方法

筋ジストロフィーの病因や病態を解明する上で実験動物としては，主としてジストロフィー鶏疾患モデル動物を用いた研究成果は，私達に重要（New Hampshireline413）及びそのコントな手がかりやヒントを与えてくれた。疾患モデル

ロール鶏（New Hampshireline412）を用い，とと卜の筋ジストロフィーが全く同一というわけ

必要に応じて．白色レグホンなど他の鶏を用いた。

ではなく，モデル動物における成果がそのままヒSDS−ポリアクリルアミド電気泳動は，Laemli

トに適用できるわけではないが，研究方法の開発，の系を用い二次元電気泳動は0′Farrellに従い，筋ジストロフィーの基礎的事項の解明などに極めて

イムノプロットはTowbinの方法に準じた。また

有力な武器である。筋ジストロフィー鶏について

adenylate kinaseはNobaらの方法，5）triose

も既に多くの成果が積重ねられ，収縮蛋白の発現

phosphateisom！raSeはMcVittieらの方法6）の異常，形態学的異常，膜異常などについて多様によって精製した。またトロポニン，トロポ

な検討が行われてきた。殊に収縮蛋白については，

ミオシン，ミオシンは，各々既に報告されてトロポニンT，トロポミオシン，C一蛋白，ミオいる方法によって精製した7）。ジストロフィー特

シン重鎖及び軽鎖などの発現異常が兄い出され異蛋白の抗休は，抗原を電気泳動後，バンドを

詳細でdefinitiveな成果が公表され，その概略と切り出し抽出後，ウサギに免疫することによって今後の発展方向についてもまとめられている（1得た。特異性及び抗体価は，オークタロニー法，〜4）。

イムノプロット，dot assay によって確認した。

本研究では，筋ジストロフィー鶏をモデル動物として用い，もっとも典型的な形で発症する浅胸筋を材料として，ジストロフィー筋に特異的に発実 験 結 果Ⅰ．ジストロフィー特異蛋白の検出

現する異常蛋白について追求した。その結果，分

ジストロフィー鶏浅胸筋における異常蛋白の子量約30K dalton，等電点約8．4の特異蛋白を出現（あるいは特定の蛋白の消失）を調べる目的

兄い出したので，この蛋白を漸定的に「ジスで一次元及び二次元電気泳動法によるスクリーニ

トロフィー特異蛋白」（Dystrophy−SpeCific

ングを行った。図1に示すように正常鶏胸筋とジprotein）と名づけ．主として生化学的検討を加ストロフィー胸筋の電気泳動パターンの比較では，えた。

いくつかのバンドに差異を認めるが，約30K
dalton のバンドの有無が最も明確な差異であった。二次元電気泳動の結果も，これを支持し，等電点は約8．4であった。この30K dalton，pI＊秋田大学医学部生化学第2講座

8．4の異常蛋白は異った個体でも常に観察される

n 筋構造蛋白質とその分化

24

図1．SDS／PAGEによるジストロフィー鶏浅胸筋と正常鶏浅胸筋の比較。
0．15MNaCl，10mM Tris−HCl，pH7．5のバッファーで筋をホモジナイズ後，遠心（18，000×g，20分）し上清と沈査をSDS／
PAGEによって分析した。30Kdaltonのジ
ストロフィー特異蛋白には星印を付してある。

表1．

PURIFICATION OF DYSTROPHY−SPECIFIC PROTEIN

Step

Total protejn（mg）

Dystrophy−

Purjfjcaいon

SPeCjflc

fold

Yield

日日

Proteh（mg）
l．Tris−Saline extract

960．0

32．6

l

2．Ammonium sulfate fractionation（50−80鴛saturation）

398．0

24．7

l．8

3．DEAE−Cellulose chromatography

130．0

16．8

4・Hydroxylapatite chromatography

98．0

12．9

8．0

8．0

5．EIutjon

from

SDS一gels

100

75

4

ジストロフィー鶏胸筋に存在する特異蛋白質（30K蛋白）について

25

ので，まずこの蛋白に注目し精製をすすめた。

ィー浅胸筋には存在する。しかし，正常鶏においⅡ。ジストロフィー特異蛋白の精製と抗体の作成てもジストロフィー鶏においても，浅胸筋以外の239のジストロフィー鶏浅胸筋を出発材料とし筋，たとえば，深胸筑 前広背筋，縫工筋，大腿て，ジストロフィー特異蛋白の精製をすすめた。

筋膜張筋などには存在する。大腿二頭筋，下腿三5倍量の等張溶液（0．15M NaCl，10mM Tris

頭筋においては，全く検出出来ないか極く微量で−HCl，pH7．5）で，ホモジナイズし，遠心あった。更に注目すべきことは，ジストロフィー（18，000×9，20分）後．その上活を，塩析（硫鶏のジストロフィー特異蛋白と正常鶏に存在する

安，50〜80％飽和），DEAE−Celluloseクロマ

同様の蛋白はSDS／PAGE

トグラフィー，Hydroxylapatiteクロマトグラ

鶏のものは，分子量が小さいことであった。互い

フィー，電気泳動による分画によって精製したにisoproteinと考えられるが，この差異がジス（表1）。ジストロフィー特異蛋白の生理活性は，トロフィー遺伝子と何らかの関連を持つものか，

現在のところ不明なので，SDS／PAGE

line412とIine413の遺伝子背景の差8）に起とそので泳動度が異り正常後のdensitometryによって精製度や回収率を計因するものかは，現在の段階では結論出来ない算した。Nativeな状態で完全精製するには至ら（図5）。

ず，最終ステップはSDS／PAGE

この蛋白が浅胸筋に存在することがジストロフ

後バンドを切り出し，電気泳動的に溶出することによった。

ィーの病態と関連があることを更に確認するため抗体は通常の方法によりウサギに免疫することに，遺伝子背景の全く異ると考えられる白色レグ

によって容易に得られ，特異性，抗体価について

ホン，チャボ，比内鶏などの浅胸筋についても同も十分なものであった。

様の検討を行った。これら鶏の浅胸筋中にジストⅢ。ジストロフィー特異蛋白の性状

ロフィー特異蛋白は存在しなかった（図6）。続SDS／PAGEによる推定では，この蛋白は30K

いて，骨格筋以外の臓器についても検討した。心daltonと考えられ，nativeな蛋白（Hydroxy−筋，平滑筋（砂胃），肝，脂肪細胞などにジスト

lapatiteクロマトグラフィーステップの標品）

ロフィー特異蛋白は検出できなかった（図7）。

のSephadex G−75によるゲルロ過でも同様の値

ジストロフィー筋では筋の変性に伴って脂肪細胞が得られ，mOnOmeric proteinと考えられた。

の浸潤が高度にみられるが，この蛋白が脂肪細胞

二次元電気泳動からの等電点の推定ではpI8．4に由来するものではないと考えられる。ジストロという結果を得た。より詳細な，ジストロフィー

フィー鶏及び正常鶏のembryo（15日日及び21日

特異タンパクの物理化学的性状については現在，目）についても検討を加えたが，ジストロフィー

検討中である。

特異蛋白は，ジストロフィー成鶏にのみ兄いださ

Ⅳ．ジストロフィー特異蛋白の分布

れembryoの段階では検出できなかった（図8）。

ジストロフイ」寺異蛋白に対する抗体を用い，イ

更に，同種の蛋白が他種動物の骨格筋にも存在

ムノブロット法によって，この蛋白の分布についてもするかどうか，ヒト大腿四頭筋，ラット大胸筋に検討を行った。まず正常鶏（line412）及びジスト

ついて検討した。ヒト大腿四頭筋，ラット大胸筋

ロフィー鶏（line413）の各種骨格筋（浅胸筋，深抽出物をイムノブロット法によって検討すると，胸筋，前広背筋，縫工筋，大腿筋膜張筋，大腿二この抗体で認識される同株の蛋白が存在すること

頭筋，下腿三頭筋，長排骨筋）についてジストロがわかった（図9）。

フィー特異蛋白の分布を調べた。既に述べた様に，Ⅴ。ジストロフィー特異蛋白は何か

ジストロフィー特異蛋白はイムノプロットによるジストロフィー特異蛋白が既知の筋蛋白である

検討でも，正常浅胸筋には存在せず，ジストロフ

可能性も高いので．いくつかの筋蛋白について異Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化

図2．二次元電気泳動によるジストロフィー特異蛋白の検出
筋肉可溶分画を一次元目をNEPHAGE，二次元目をSDS／PAGE
によって分析した。ジストロフィー特異蛋白又はジストロフィー
特異蛋白の出現する位置を矢印で示してある。

図3．部分精製又は完全精製されたジストロフィー特異蛋白のSDS／P
AGE
左図はHydroxylapatite chromatographystep（step4）を，右図
は最終標品（step5）を示す。各々1は筋肉粗抽出物 2は精製標
品を示す。

4

ジストロフイ十鶏胸掛こ存在する特異蛋白質（30K蛋白）について
1
2

Phosphorylase b
albumjn

3

OValbumin

4

Carbonic anhydrase

5

trypsininhibitor
lactoalbumin

6

図4．SDS／PAGEによるジストロフィー特異蛋白の分子量推定。
ジストロフィー特異蛋白は白丸及び矢印で示してある。

1

2

3

4

5

6

7

8

910Il12

二、叫Mこゝt，lこ f一こし、（

ほ働抱E GEL窮押し首鋳て更M、trい二円、〜？．JI・−予■▼ilハ〜Urd亡M prprneu〜111nnu＼︑ ︑ ﹂図5．ジストロフィー鶏及び正常鶏浅胸筋のSDS／
PAGEとイムノ・プロットによる分析。説明は本文（尚，この図には前広背筋と深胸筋についての結果は示していない）。

︹

叛．摘nsor faSC的†計玩柁

︐ − ︐ ヽ − ︑ ． ︐ 1

輿璃頗均纏牒酢即凝り

遠・覆尋4馬込↓：■！．二二・JiてrJ；−く＼1nPrt￣1rjdllヽ

27

Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化

28

COOMASSIE BLUE IMMJNE GEL REPLICATE

a

b

c

ミ＿≡≡≡
−■

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−

t■■−

■−一−、−■

d

e

、こ，

．．

！・．

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二：

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・：≡・し

■−−

■．1￣．

−

￣

図6．各種ニワトリ浅胸筋におけるジストロフィー特異蛋白の出現。

12

3

4

5

8

7

12

3

4

5

8

7

川MUJjE GEL REPLICATE

1・ 恥StrOPhッ瑚SCle extrるCt
Z，3． 粘るrt muSCle eXtraCt
4，51 GjZZard eXもraCt〝
L拍er extraCt
7． 舶ヾpaSeもisSUeを濱traCt

図7．各種臓器におけるジストロフィー特異蛋白の出現。

4

ジストロフィー鶏胸筋に存在する特異蛋白質（30K蛋白）について

co冊ASほBLUE
a

b

c

d

川MUほGEL REPLICAT［
e

a

b

c

N

2323
44・44

N

日⁚∪日 日∩⁚H

21day−embryo pectrdl MuSCle
21ddY−embryo pectral T¶USCle︵ ︵ ︵ ︵

15day−embryo pect一・dl mu〜⊂1e

H川N

15day−embryo pectral muSこ1e

e

り乙

l
4

8dult pectral muscle（相川．

d

図8．ジストロフィー鶏及び正常鶏embryoにおけるジストロフィー特異蛋白の出現。

C〔1卸町∬lE BLUE IMMLJNE GEL REPLICATE
a

b

c

a

b

己，冒．．413，SuPer円C柏1pectral muscle
b，human quadrjceps femorてs muscle

C，r鵡PeCtral muscle

図9．他種動物骨格筋におけるジストロフィー特異蛋白の出現。

29

Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化

30

A

B

C

D

ぼ汲設置率率轟一二一十∴雷畿霊投霊怒需㍑崇器禁諾㌣∴ノ

L U・−．・．1日￣＿．・：・・・・†fH、二・・＿、■

、■．■

・日

■「

￣￣−

し

−1〜l∵∵㌧1

図10．Adenylate kinaseとジストロフィー特異蛋白の異同。

1．はSDS／PAGEによる分析，
ロットの結果を示した。

2．はSDS／PAGEとイムノブ

同を調べた。可溶分画に存在する分子量20〜40K

ジストロフィー鶏浅胸筋には本来正常では存在しdaltonの塩基性蛋白や，塩基性蛋白ではないがないisoformが発現するが，これらⅥ異常蛋白

分子量が近似しているものを中心に検討した。

は，広背筋や下肢筋群では正常でも存在する蛋白

Adenylate kinase，triose phosphateisom−質である。

erase，更にtroponinI，trOpOninT（足型及

現在までの結果から，このジストロフィー特異び胸型），ミオシン軽鎖などをジストロフィー胸蛋白がジストロフィー発症の原因であると結論す

筋及び正常胸筋から精製し比較したが，ジストロることは，もちろん出来ないが，ジストロフィー

フィー特異蛋白は上記蛋白のいずれでもなかったの病態とは何らかの関係をもっていると考えられ（Adenylate kinaseについての結果を示し他のる。また，この様な蛋白発現の異常は従来報告さデータについては省略する）。

れた収縮蛋白及びその調節蛋白のみならず，ジス
トロフィー特異蛋白のような可溶分画に存在する

結論および今後の課題

蛋白にも及んでいることがわかった。比較的簡単

ジストロフィー鶏（413）及びコントロール鶏な方法で精製可能で，抗体も得やすく，定量法の（412）を用い，典型的な発症をみる浅胸筋を材開発も容易であることから，筋ジストロフィー症

料として，蛋白の発現異常について追求した。その病態を把握するためのマーカーとなり得ると考の結果，ジストロフィー擢患筋に特異的に出現すえられる。

る分＋用30K dalton，等電点8．4の異常蛋白をジストロフィー特異蛋白と同様の蛋白が正常鶏は出した。本報告では，漸定的にジストロフィー

骨格筋（浅胸筋には存在しないが）にも存在する

仙リー三景l′lと呼んだが，正常でもある種の骨格筋にが分子量が異なる。この差異もまた筋ジストロフ

は／〃lする出自であった。従来報告されている収ィーの病態に関連している可能性もあるが，line

縮鮒′lの発現異常についても事情は同様で，たと412とline413の遺伝子背景が全く同一ではな

えば．トロボニンTやトロポミオシンについても，

いということ8）から，lineのちがいによる偶発的な4

ジストロフィー鶏胸筋に存在する特異蛋白質（30K蛋白）についてものである可能性もある。今後congenic strain
を用いて検討を行う必要がある。またジストロフ
ィー特異蛋白の浅胸筋における出現が．一次性であるか二次性であるかも今後の検討が必要である。
ジストロフィー擢患筋においては，筋の崩解・変性に伴い筋の再生も進行する。ジストロフィー特異蛋白の出現が，再生筋細胞に起因するものかど

文

31

献

1）Obinata，T．et al．：FEBS Lett．120，195−（1980）・
2）Takeda，S．and Nonomura，Y．：Biomed．Res・，1，176−（1980）．

3）Rushbrook，J．I．and Stracher，A．：f＞oc．Natt．
Acαd．gci．捌，76，4331−（1977）．
4）野々村禎昭：厚生省「筋の発生と分化に関する基礎的研究」，江橋班，昭和58年度報告書pll0−，19845）Noda，L．etal．：仇r．⊥βわC／ほmリ51，229−（1975）．

うかなど形態学的観察を含め検討する必要がある。

6）McVittie，J．D．etal．：仇r．J．Biochem．，29，67−

さて，このジス卜占フィー特異蛋白は何かとい

7）生化学実験講座15「筋肉」日本生化学会鼠東京化学同人．1975
8）水谷誠：厚生省「筋ジストロフィー症動物の生産・開発に関する研究」，野村班，昭和55年度報告書

う問題であるが，現在までの研究からほ明確な結論を得ていない。しかし特定の筋肉酵素のサブタイプであることを示唆する結果が得られ（未発表
データ），現在ジストロフィー特異蛋白の酵素学的性状についても検討をすすめている。

（1972）．

p41−．1981

32

5ニワトリ骨格筋におけるミオシンとC蛋白質ア
イソフォーム発現に及ぼす除神経支配の影響

大日方
研究協力者

昂＊

斉 藤
新

保

ニワトリ骨格筋の発生・成長過程で筋収縮構造

修＊ 川 島 真 帆＊
和彦＊Donald A．Fischman＊＊

実

験

方

法

を構成する蛋白質の発現が著しく変化していくこ

除神経筋の作製：ふ化1日目，1カ月後，2ケ月とが最近明らかにされてきた。この変化の内容は後の白色レグホンの片側の第14・15・16頸稚神経

かなり複雑であるが，大別すれば，胚．新生児，を切断することにより，片側の胸筋のみを除神経

成体で発現される筋蛋白質に違いがみられ，蛋白した。切断された神経の末端を背部皮下に縫いつ質分子種（アイソフォーム）が成長につれて順次け．神経支配の再生を抑制した。除神経されていおきかえられていくという特徴がある。このようない側の胸筋を対照として用いた。胸筋深部の赤な蛋白質の発現の変化がどのように調節されてい色筋は筋線経のタイプが均一でないので．実験にるか未だ十分明らかではないが，少なくとも数種

は，除神経及び対照胸筋いずれの場合も，中央，類の蛋白質アイソフォームの発現に神経支配が深表層部領域の筋を用いた。

く関わっていること，即ち，除神経されたニワト

抗体：本実験では以下に示す抗体を用いた。モ

リ胸筋では新生児を特徴づけるβトロポミオシン，

ノクロナル抗体（McAb）であるMFl（速筋C

足型トロポニンT，遅筋型C蛋白質の発現が促さ

蛋白質を認識），ALD66（遅筋C蛋白質を認識）れることを既に報告した。1・2）一方，筋ジストロ

MF20（胚，新生児及び親型ミオシンH鎖を認識），

フィー鶏の骨格筋（特に胸筋）では，ジストロフ

MF30（新生児及び親型ミオシンH鎖を認識），

ィー症の発症に相応して，筋蛋白質の発現の特徴

MF14（親型ミオシンH鎖のみを認識）は，が新生児的となり，除神経筋の場合と類似していMasaki，Fischmanらにより作成されたJ・5）ることが観察された。3）

モノクロナル抗体，C315（心筋C蛋白質を認識）

本研究では，ニワトリ胸筋の発生，成長過程で及び抗速筋C蛋白質抗体（ポリクロナル抗体）は発現されるC蛋白質アイソフォームの特徴を明ら

当研究室で作成された。これらの抗体の特異性はかにし，更に，C蛋白質とミオシンH鎖アイソフ

イムノブロット法及び免疫組織化学法により，既ォームの発現が，神経支配によりどう影響されるに確かめられている。

かについて比較検討した。

ラジオイムノアッセイ（RIA）：Guba−Straub
溶液により抽出されたC蛋白質を含む粗ミオシン
をマイクロタイタープレートに乾燥固定した後，抗C蛋白質，抗ミオシンH鎖モノクロナル抗体及＊千葉大学理学部生物学科

び125トヤ吏抗マウスIgG抗体を作用させ，常＊＊コーネル大学医学部

法5）により測定した。

5ニワトリ骨格筋におけるミオシンとC蛋白質アイソフォーム発現に及ぼす除神経支配の影響

33

免疫組織化学：筋小片を液体窒素で冷却したイのミオシンを認識するのに対し，別のMcAb，

ソペンタン中で急速凍結した後，8／上mの連続凍MF30は，新生児以降のミオシンを，更に別の結切片を作成し，間接蛍光抗体法により調べ

McAb．MF14は親のミオシンH鎖に特異的に反た。

応する㌔）発生過程でのミオシンとC蛋白質アイ
ソフォームの発現の変化がどのように神経支配に

結

果（1）ニワトリ胸筋の発生・成長過程で発現される
C蛋白質アイソフォーム
本実験では，あらたに作成された抗心筋C蛋白

依存しているかを知るために，新生児及び成長したニワトリ胸筋を除神経し，発現されるミオシン
H鎖とC蛋白質のアイソフォームをミオシンH鎖とC蛋白質に対する各種抗体を用いて調べた。

質抗体（C−315）及び抗速筋及び抗遅筋C蛋白

ふ化直後に胸筋を除神経し，C蛋白質とミオシ

質抗体を用いて，発生のより早い時期の胚の胸筋

ンH鎖をラジオイムノアッセイ法により調べた結で発現されるC蛋白質を主として免疫組織化学的

果を図1・2に示す。C蛋白質に関しては．正常手法で調べた。ふ卵10〜12日目の胚の胸筋の細胞

筋ではふ化後の成長過程でALD66により認識さは，抗心筋C蛋白質抗休（C−315）と反応する

れる遅筋C蛋白質が減少し，MFlにより認識さことがみられた。以後発生が進むとC−315の反れる速筋C蛋白質が増加するのに反し，除神経さ応性は減少し，ふ化前に完全に消失する。一方，れた場合，遅筋C蛋白質は減少することなく存在

抗遅筋C蛋白質抗体（ALD66）は，12日胚でややしつづけることが明瞭に認められた。2カ月令に弱く反応するが，発生の進行につれ強く反応する

なっても，なお除神経筋には遅筋C蛋白質の存在ようになり，ふ化直後の新生児胸筋ではすべてのが持続することが確認された。筋の凍結切片を作細胞が強く染色される。しかし，既に報告6・7）した成し，個々の細胞レベルで存在するC蛋白質のタ

ように，ふ化後10日程で胸筋の細胞との反応性はイプをみると，すべての細胞が両種の抗C蛋白質

消失する。抗速筋C蛋白質抗体は若い胚の胸筋と抗体と陽性に反応することがみられた（図3）。

は全く反応せず，18日胚胸筋で反応性が出現し以

一九 ミオシンH鎖の発現は，除神経された場合後親に至るまで胸筋細胞の多くと強い反応性を示でも．C蛋白質の場合はで明瞭な影響がみられなす。3種の抗体によってそれぞれ特異的に認識さい。RIA法による測定結果では，ふ化直後にはれるわずかに分子量のことなる3種のポリペプチ

MF14とMF30の反応性は，MF20に比してかな

ド（多分心筋型・遅筋型及び速筋型C蛋白質）がり低い。ふ化後の成長期に，MF14，MF30の反発生途上の筋で，生化学的手法で識別されている。

応性は除神経筋，対照筋いずれでも徐々に上昇し，従って，胸筋では胚子期に心筋C蛋白質，胚後期

両者にほとんど差はみられなかった。このことは．

から新生児期まで主に遅筋C蛋白質，そして親で筋凍結切片の蛍光抗体法による観察でもほぼ同様

速筋C蛋白質が発現され，これらが順次おきかえであった。除神経後更に長期間経過を追えば，除られていくとみなされる。

神経の効果がみられる可能性は残されているもの（2）C蛋白質とミオシンH鎖アイソフォームの発現に及ぼす除神経支配の効果
ニワトリ胸筋の発生過程で発現されるミオシンの，ミオシンH鎖の筋成長過程の変化は，C蛋白質の場合のように強く神経支配に依存していない
ことを示す。

H鎖も，胚，新生児，親で異なることがH鎖のペ筋蛋白質アイソフォームのタイプがほぼ親型とプチドマップによる解析やモノクロナル抗体を用なっている1カ月令のニワトリ胸筋を除神経した

いた解析により既に明らかにされてきた㌔）即ち，場合にも，C蛋白質の発現は大きく影響されるのH鎖に対するMcAbの1つMF20は胚から親までに対し，ミオシンH鎖には顕著な変化は認められ

∴二∵

■
十
二
∵

D●n●rYtt●dl仙暮th●

Ag

粧

信

701×EdU

J
■
一
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で○︻×∈dO

Agd‖utjond‖utjon

Coれtr01仙■￠h■Ag

O．
？01ペ∈dO

軒

二＼斗

Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化

34

dHution

一一一uFl
三 人UD08

1㌔

デ

が

1㌔

Agd‖ution

ゴ嶋

Ag

三戸

dilution

Agdilut10∩

虹
虹

図1．新生児筋を除神経した場合にみられるC蛋白質の変化−ラジオイムノアッセイによる解析。
ふ化2日目ヒヨコ胸筋を除神経し，1週（lW），2週（2W），3退く3W）後に調べた。上段に除神経筋，下段に対照筋を示す。左端（lD）はふ化直後ヒヨコ筋の場合を示す。それぞれの図にMFIを用いた場合とALD66を用いた場合の結果を示す。
横軸，抗原量10〟．g〜10×3￣Lgの範囲で変えた。縦軸，抗休反応量。

D●｛●r▼■t●d■U●01■■

Ao dHution

Ag dilutjon

C011trd Hu●Cb●

Agdilutjon

．●−

HF14

．CトIIF】0−▲− HF 20

Agdilution

Agd‖utionAgdihH0∩

図2．新生児筋を除神経した場合にみられるミオシンH鎖の変化−ラジオノムノアッセイによる解析。図1の場合と同様の実験を3種の抗ミオシンH鎖抗体（MF14，MF30，MF
20）を用いて測定した。

∵
1
．
■
打
撃
㍗

5

ニワトリ骨格筋におけるミオシンとC蛋白質アイソフォーム発現に及ぼす除神経支配の影響

Denerval，edControt

寸L L≡

OC 山王

∪芯○ゝ≡

ON L≡
r L≡

やの凸﹂く

t U芯lOLdIU

図3．ふ化2日目ヒヨコ胸筋を除神経した場合にみられるC
蛋白質とミオシンH鎖の変化。除神経後3週の筋の連
続凍結切片を間接蛍光抗体法で調べた。図中に用いた抗体を示す。

35

36

Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化

Ag dihtion

こ
■
■
一
三

AgdihJtion

Ag d htion
図4．1カ月令ニワトリ胸筋を除神経した場合にみられるC
蛋白質とミオシンH鎖の変化−ラジオイムノアッセイによる解析。
除神経後6週に測定。a，b：除神経筋。C，d：対照筋。
a，C，C蛋白質の変化をMFI（＋）とALD66（−★）を用いて測定した；b，d，ミオシンH鎖の変化をM
F14（＋），MF30（一〇一），MF20（一▲−）
を用いて調べた。

なかった。除神経1週間後に既に遅筋C蛋白質のされた（図5）。除神経後6週の胸筋のすべての出現のきざしがみられ，2週以降ではALD66と細胞がMFlとALD66で強く染色され，速筋及MFlが同程度の反応性を示した（図4）。対照筋

び遅筋C蛋白質の共存が証明されるのに対し，ミと比べると明瞭な違いである。それに対して，ミオシンH鎖については，除神経筋では親ミオシン

オシンH鎖では，除神経後6週で除神経筋と対照

H鎖に特異的なMF14の染色性が対照筋に対して筋でわずかに差がみられた（図4）。即ち，除神やや低下しているのがみられた。2カ月令のニワ

経ではMF30とMF14の反応性がMF20の反応性

トリ胸筋を除神経した場合にも，C蛋白質とミオより低くなっている。このことは，ミオシンアイ

シンH鎖の発現に関してはぼ同様の結果が得られソフォームの内容がやや新生児型に近づいたことた。

を示唆する。しかし，その変化はC蛋白質でみら胚子期の胸筋を特徴づける心筋型C蛋白質が，れる変化に比べるとかなり小さい。RIAによっ

除神経胸筋で発現されるようになるかどうかをCて得られた結果は，免疫組織化学法により再確認−315を用いてRIAと免疫組織化学的手法で調

岳
−
−
か
結
蔭

5

ニワトリ骨格筋におけるミオシンとC蛋白質アイソフォーム発現に及ぼす除神経支配の影響

Denervated37

Control

OC 山王
ON L≡
L L≡

のり凸﹂＜

∪芯lOJd−0 1

馳謝馳■

寸﹁ 山王
∪芯○＞≡

図5．1カ月令ニワトリ胸筋を除神経した場合にみられるC
蛋白質とミオシンH鎖の変化。除神経後6週の筋の連
続凍結切片を間接蛍光抗体法で調べた。

べた結果，ふ化直後に除神経した場合でも，1カに凍結損傷を与え，人為的に筋の再生を誘起した

月令で除神経した場合でもほとんど心筋型C蛋白

時，再生過程にある多くの細胞が一時的に心筋型質の出現を認めることができなかった。このこと

C蛋白質を含むようになり，やがて遅筋型及び速はC蛋白質の発現でみる限り，除神経筋は新生児

筋型C蛋白質におきかえられていくのが観察され期に近い状態にあり，胚子期の状態へ移行するこた。このように，除神経筋と再生筋とはC蛋白質のとはないことを示している。それに対して，胸筋発現の面で異なる。なお，ニワトリ筋ジストロフ

Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化38

ィー症の場合にも遅筋型C蛋白質の出現が，かな化が顕著には起らないことである。この点は，ミり多くの細胞に観察されるが，心筋型C蛋白質は

ォシンH鎖のペプチドマップによる解析の結果8）

ごく少数の細胞に限られており，この点 除神経とも一致している。筋原線維中の太いフィラメン筋に類似していた。

トを構成するミオシンとC蛋白質の除神経筋での変化が大きく異なることは興味深い。これら蛋白まとめと考察質の発現調節の違いを反映しているであろう。

本研究で明らかになった第1の点は，除神経さ文れたニワトリ胸筋でのC蛋白質の発現が新生児型となること，即ち，遅筋C蛋白質の発現が引きおこされること，しかし，胚子期にみられる心筋型
C蛋白質の発現が引きおこされることはほとんどないことである。このように除神経筋でのC蛋白
質発現の変化は，トロポニンTやトロポミオシンにみられる変化と期を一にするものである。又，胚の胸筋で発現されている遅筋型又は心筋型ミオシン軽鎖が除神経筋に出現しないという点とも一致している。除神経筋にみられる蛋白質の変化は，
比較的短期間にほとんどすべての細胞に認められること，又，細胞間で不均一にモザイク状に起らないことから，恐らく新しい細胞によるおきかえ
ではなく，既存細胞の幼若化と推定される。本研究での第2の点は，除神経でのミオシンH鎖の変

献1）Obinata，T．，Saitoh，0．＆Takan0−Ohmuro，H・，⊥βわdZe〝1．95，585−588，1984．

2）大日方昂はか：筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班） 昭和58年度報告書133−127，1983
3）大日方昂はか：筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班） 昭和57年度報告書102−108，1982
4）Masaki，T．，Bader，D．，Reinach，F．C．，Shimizu，T．，
Obinata，T．Shafiq，S．A．＆ Fischman，D．A．In
MuscleControl

Development：MolecularandCellular（M．L．Pearson and H．F．Epstein eds．）

Pp．405・417．Cold Spring Harbor Laboratories，
CbJd即r加g肋rムor，と／別．1982．
5）Bader，D．，Masaki，T．＆Fischman，D．A．J．Cut．
βわし95，763−770．1982．
6）Obinata，T．，Reinach，F．C．，Bader，D．M．，Masaki，T．，Kitani，S．＆Fischman，D．A．DeveIop．Biol．，
101，116・124，1984．
7）Obinata，T，，Kitani，SりMasaki，T．＆Fischman，
D．A．βeyeJop．βわJ．，105，253−256，1984．
8）Matsuda，R．，Spector，D．＆ Storohman，R．C．
Jケoc．八七汀エdcαd．∫C￡81，1122−1125，1984．

39

6

ニワトリ正常遅筋とジストロフィー速筋にみられた筋細胞増殖因子
松
研究協力者

田

大日向

良

一り＊

浩＊

東中川

徹＊

リチャード．C．ストローマン＊＊

動物の体の大きさは成体時には各々の種ごとに大が起こり，発症時には活発な筋再生を伴なうこ

大体一定の範囲にある。これは発生過程で各組織とが知られている。従って筋ジスが筋細胞の増殖の構成細胞数を調節する機構が存在することを意

調節機構と何らかの関係があることが予想される。

味する。骨格筋組織は分裂能力をもつ筋芽細胞やこのことは筋ジスニワトリの速筋には正常速筋よ結合織細胞及び分裂能力を持たない収縮性の多り高い濃度でTfが存在していること（8）からも支

核筋管細胞から成っている。従って骨格筋組織の持される。本研究の目的は骨格筋組織内に存在す

構成細胞数を規定する要因は筋芽細胞や結合紹細る細胞増殖因子を調べると共に，その因子が正常

胞の分裂頻度と筋芽細胞が分化し融合してできる筋と筋ジス発症筋との間でどのような相違点があ多核筋管細胞の組織内での寿命にある。常に収縮

るかを明らかにすることにある。

を続ける遅筋は，その組織内に存在する筋芽細胞
数が速筋に比べ単位体積当り多く（1日2），筋管細胞材料 と 方法の寿命も速筋に比べ短いことが報告されているピ）①標本：ニワトリは白色レグホンの筋ジス（433

このことは遅筋が速筋より強い細胞増殖活性をも系統）とその正常（03系統）及びニューハンプシ

つことを示している。事実，ニワトリの遅筋であ

ャー系の筋ジス（413系統）と正常（412系統）

る前広背筋には速筋の大胸筋に比べ高い濃度でトを用いた。

ランスフエリン（Tf）が存在している㌘）このTf㊥酵素抗体法：ニワトリ血清からTfを硫安塩析

は培養細胞の増殖に必須であり！4）ニワトリ胚抽出及びDEAE−セルロースカラムクロマトグラフィ

液から細胞増殖のための有効成分として分離され，ーにて精製しそれを抗原としてウサギを用いて抗特に培養骨格筋細胞の増殖と分化に重要な役割を

血清を作成した。抗体は抗原結合アフイニティーもつことが示されている㌘）又，線維芽細胞増殖因

カラムを用いて精製した。二次抗体には抗ウサギ（6）子（FGF）も培養条件下で筋細胞の増殖を促進し，

IgG−パーオキシダーゼ結合抗体（DAKO，ア

ニワトリ胚抽出液からもTfと共に筋細胞の増殖メリカ）を用いた。切片は正常ニワトリ前広背筋，を促進する分子量の小さい蛋白質因子の存在が示

大胸筋及び筋ジスニワトリ大胸筋より10／上mの厚されているム7）一九ヒトやニワトリにおける筋ジさで凍結切片を作成して用いた。抗体反応後，ジストロフィー症（筋ジス）では，その初期に筋肥アミノベンチジン法により発色させ光顕観察を行なった。

＊東京都立大学理学部生物学教室＊＊米国カルフォルニア大学バークレー校動物学教室㊥筋組織抽出液の調製及び分画：413系と412系
ニワトリを用いた。照化後，両系統のヒヨコを同Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化40

一条件下で飼育し，0，10，18，27及び37日目に放組織内に存在した。前広背筋と筋ジス大胸筋は正血死させ大胸筋を採取し，−80℃に保存した。解

常大胸筋にくらべ強く染色された。

凍後4倍量のMEMを加えてホモジナイズし，10㊥ヒヨコ大胸筋抽出液中の増殖促進活性の日令に万×g，1時間遠心分離し，上宿を組織抽出液とよる変動。結果を図Ⅱに示す。AはTfを15／上9した。貯化後10日目の筋ジスニワトリの大胸筋抽／〟ふくむ培養液に各筋組織抽出液を600〟g蛋

出液（8m9／〟×4．5mg）を20mMトリス塩酸緩白質加えて培養した場合の筋細胞のCPK活性を衝液（pH8．0）に対して透析し，同緩衝液で平衡示す。従ってこの活性は抽出液中に含まれるTf

化したDEAE−セルロース（DE−52）カラムク

以外の増殖因子の活性を表わすことになる。このロマトグラフィー（1×5cm）にかけ，4mげっ

活性も大胸筋抽出液中に存在し，しかも筋ジスで分取した。分画番号6より0〜0．4MNaClのは正常に比べその活性が高い傾向にあった。Bは

直線勾配をかけた。上記の抽出液調製及び分画はTfを含まない培養液に各抽出液600勘7 蛋白質

全て無菌的に行なった。蛋白質濃度はバイオ・ラ

加えて培養した場合の筋細胞のCPK活性を示す。

ッド社製プロティン・アッセイを用い，ウシ血清培養筋細胞は鉄結合型Tfが存在しないと増殖分

アルブミンを基準に測定した。

化できない（曾従ってBにおける活性は基本的には④細胞培養：13日ニワトリ胚大胸筋よりトリプシ

抽出液中のTfまたはそれと類似した因子の活性とみン処理によって単核筋細胞を分離し，ゼラチンコ

なすことができる。醇化直後のヒヨコ大胸筋抽出ートした35皿プラスチック培養皿に1枚当り凡そ

液にはTf活性が高く，しかもそのCPK活性は105個／2．5mgまいた。培養液は15％馬血清（GTfのみの活性よりはるかに高かった。これは醇IBCO）を含むイーグルMEM（日水）を用いた。

化直後には胸筋中にTfとTf以外のすくなくと培養開始14時間後に培養液を新しいものと替え，も2種類以上の活性因子が存在することを示して

鉄結合型Tfを15〟9／〟 添加したものと加えないる。しかし貯化後日令と共にTf活性は急激にいものの2群を設けた。このTfは10J上9／〟の濃低下するが，筋ジスの大胸筋では37日目に再び活度で培養筋細胞の増殖と分化を十分に支持し，そ性の上昇が認められた。

れ以上加えても細胞増殖はさらには促進されなか③筋ジスニワトリ大胸筋抽出液中に含まれるTfった。それぞれの培養液に組織抽出液又はその分以外の増殖因子の分画。貯化後10日目の筋ジスニ画を加えた。培養皿は各サンプルにつきそれぞれ

ワトリ大胸筋の抽出液をDEAEセルロースカラム

3枚ずつ用いた。カラムによって分画した蛋白質

クロマトグラフィーにより分画し，各分画0．1mg

溶液は各々0．1mgずつTfを含む培養液に加えた。

ずつをTfを含む培養液中に加え，その増殖因子

培養4日目に筋細胞のクレアチンキナーゼ（CP

活性の分布を調べた。結果を図Ⅲに示す。AはカK）活性を培養皿毎に測定し分化した筋細胞総量

ラムからの蛋白質の溶出パターンを表わし，Bはの指標とした。

各分画を加えた培養液中で分化した筋細胞のCP
K活性を示している。Tf以外の筋細胞の増殖促
果

進活性は分画番号14〜21にみられた。これはAの①Tfの筋組織内における局在

3番目のピークに対応していた。各分画に含まれ結

ニワトリの正常前広背筋と筋ジス大胸筋及び正る蛋白質のSDS−12．5％PAGEバクpンを図

常大胸筋組織内におけるTfの局在を酵素抗体法

Ⅳに示す。分画番号12に含まれる分子量80Kダルにより調べた。その結果をそれぞれの組織のH・トンの蛋白質（図Ⅳ一Nnl乙 矢印）はペプチドマ

E染色像と共に図Ⅰに示す。Tfは筋管細胞内にップの結果Tfと同定された。増殖促進活性を示

はほとんど見られず，細胞外マトリクス又は結合

す分画番号14〜21にはまだ多くの蛋白質が存在し6■

ニワトリ正常遅筋とジストロフィー速筋にみられた筋細胞増殖因子

41

＿・

箋

誤
∴二二

l

C、親
戚
■

二：∵二∵ポ鴨e・・．・・∴■．∴∴ f二二．￣書∴∴二二
で．‥−‥一一・ナノ二・．こ∵∴J

亘二十二王ナ亘三こ
こ十王・‡．−＼＋三千二二
図Ⅰ正常ニワトリ（03系）前広背筋・筋ジス（433系）大胸筋・正常（03系）大胸筋の組織像とTfの局
在。
（a）（b）正常ニワトリ前広背筋，バーは0．1mm，（C）（d）筋ジスニワトリ大胸筋（拡大率は（e）（f）と同じ），（e）（f）正常ニワトリ大胸乳バーは0．1mm。（a）（C）（e）はH・E染色像。（b）（d）（f）は抗Tf酵素抗体法によるパーオキシダー染色像0二≠∴Ⅱ 筋構造蛋白質とその分化

42

言■三〇一五〇上鼠凸●l蔓曾︶ 至509・d 言華⊃；dU

図Ⅲ （A）10日令筋ジスニワトリ（413系）大胸筋抽出液のDEAEセルロースカラムクロマトグラフィー。（B）各分画

図Ⅱ 各日令の正常（412系）及び筋ジス（413系）
大胸筋抽出液を加えて培養した4日目の筋細胞
CPK値の変動。AはTfを15〃ghLC含む場合。
Bは含まない場合のCPK値を示す。AとBの灰色域は抽出液を加えずに培養した場
合のCPK値の範囲（平均値±S・E）を示す。

を0．1mgずつTfを含む培養液に加えて培養した筋細胞のCPK値。カラムの溶出条件は材料と方法を参照。（A）の灰色域はSDS−PAGEによりTfの存在が認められる分画を示す。破線はNaClの直線勾配を示す。
（B）の破線は分画を加えないで培養した場合のCPK
値（495±15）の平均値を示す。

ていたが，分子量65Kダルトンの蛋白質（図Ⅳ，実，筋細胞のターンオーバーが盛んな前広背筋でN山6星印）が比較的良く活性と対応していた。

は正常大胸筋に比べ多くの筋細胞間スペースが存在している。又，筋再生の盛んな筋ジス大胸筋に察おいても同様なことが観察される。今後，増殖因①Tfの骨格筋組織内での局在子の貯蔵の場として細胞間マトリクスをとらえて考

Tfが筋細胞の問げさに存在していることはサ
テライト細胞が筋管細胞の表面にあることと考えみる必要があるように思われる。
㊥ヒヨコ大胸筋抽出液の増殖促進活性

あわせると興味深い。結合組織を含む筋細胞間マ

筋ジス発症筋において多量のTfの蓄積がみら

トリクスがTfなどの増殖因子を含むスポンジのれた㌘）この蓄積が筋ジス症状の出現と時間的にような場を提供している可能性が考えられる。事どう対応するかを調べた結果（図Ⅱ）から判断し

6
12

3

43

ニワトリ正常遅筋とジストロフィー速筋にみられた筋細胞増殖因了
4

5

6

7

8

91011121314151617181920212223242526

94叫

ニ＝芸

87卿

機
43￣！P
軋1聖霊ま㌢
準糟静轡弊蟻廠
30恥
ヂ＝＝ニ′耶H20
14機

図Ⅳ10日令筋ジスニワトリ大胸筋抽出液のDEAEセルロースカラムクロマトグラフィーによって分画された蛋白質のSDS−12．5％PAGE像。
ゲル上端の数字は分画番号を示す。左端の数字は分子量マーカーを示す。分画番号12の矢印及び16の星印については本文参照。

て筋ジス発症（卵字化後1ケ月前後）とはぼ同時期

REFERENCESにTfの蓄積が始まると思われる。一方，Tf以l）Gibson，M．C．＆Schultz，E・（1983），Muscle＆〃erye，6，574−580．

外の増殖因子活性は筋ジスにおいて常に正常筋より高い活性を示した。従ってTf活性が鰐化後1ケ月前後で上昇してくるとバックグラウンドに存在するTf以外の活性と協同的に筋細胞の増殖を促進する可能性が考えられる。これらのことが筋ジストロフィーの本態とどのように関わっているのかが，今後の課題である。このように組織内における細胞増殖促進因子の存在とその活性の変化
は組織の成長を調節する一方，その活性変化が正常と異なるパターンをとる時，その組織の恒常性の維持に何らかの異常を釆たす可能性が考えられる。

2）Matsuda，R．，etal．（1983），Develop・Biol・100，478−488．

3）Matsuda，R．，et al．（1984），Develop・Biol・103，
267−275．

4）Neuman，R．E．＆Tytell，A・A・（1961），丹oc・Soc・
且岬．βわJ．〝ed．107，876−880・5）Ii，Ⅰ．etal．（1982），βeyebp・βfoJ・94，366−377・6）Gospodarowicz，D．et al．（1976），J・CellBiol・
70，395−405．
7）Ozawa，E．etal．（1984），In

GeneExpressionin

Muscle． Wolf，S．＆ Strohman，R・C・Plenum
Press，N．Y．inpress．
8）Matsuda，R．et al．（1984），伽ye八神・βgoJ・103，
276−284．

44

7

骨格筋の弾性タンパク質コネクチン

丸 山 工 作＊研究協力者 木 村 澄 子睾 大 橋 一 世＊

骨格筋には，収縮性要素のはかに，弾性要素がというタンパク質は，単一ペプチド鎖からなって存在することが知られているが，後者の本体についるものとすれば例のないものである（綜説4）

いては，長い間なぞにつつまれていた。私たちは，

参照）。

塩不溶性の残瘡に弾性タンパク質が存在すること

本研究では，このようなきわめて長いフレキシ

を兄いだし，コネクチン（connectin）と名づけ

ブルなフィラメントのコネクチンがカエル骨格筋

た01）2）数年あとに，アメリカのWangは，筋原緑の微細構造において，どのように局在しているか

経のSDS抽出物の竃気泳動によってダブレットが追究された。

の高分子量タンパク質を兄いだし．タイチン（titin）と命名した。3）コネクテンとタイチンは同じタンパク質であることが判明した（綜説4）参照）。
1983年から1984年にかけて，コネクチンが末変

材料 と 方法
材料は，ウシガェルのsemidendinous 筋から作成したskinned fiberである。
Skinned fiberをrelaxing solution（60性のまま単離されるほおよんで，研究がいちじる

mMIくCl，2．9mMATP，3AmMMgC12，10m

しく進展するにいたった。5）6）7）コネクチンには，

M EGTA，0．1mMPMSF，5．7mMPIPES，αとβの2種頬が存在し，おのおのの分子量は，pH7．0）中でかるくホモジナイズして筋原線維束

2．8×106，2．1×106と測定された㌔）単離されたを取りだした。スライドグラス上でカバーグラスのは，β−コネクチンであって，じつは，α−コを動かして伸長した筋原線経を4％ホルマリンでネクチンの分解産物である。8）生筋のSDS抽出液

固定し，ニワトリ胸筋のβ−コネクチンに対する中には，αとβの比は4：1であるが，死后硬直

抗血清で処理し，ついで蛍光色素（FITC）ラベ

をへてほとんどβになる。α−コネクチンは塩にルの抗ウサギIgG抗体で2次処理をおこなった。

溶けにくいが．βは塩可溶性なので単離できたわ

そして，日本光学の蛍光顕微鏡下で観察した。

けである。

Skinned fiberを伸長させ，6．7mMPIPES，

β−コネクチンは，巾4〜5nm，長さ0．4／上m

pH7．0 の低イオン強度溶液で洗って筋原線経をほどの細長いフィラメント分子である㌔）7）8）たぼうじゅんさせたのち，抗体処理をおこなった。

だし，長さはフレキシブルで1／上mにもなりうる

これは，抗体の浸透をよくさせるためである。そランダムコイルとみなされる。このように巨大なれから固定，包理，染色后，切片を作成して電子

フィラメントのタンパク質は，いままで知られて顕微鏡下で観察した。また，抗体処理をせずに，いない特異的なものである。分子量が200万以上伸長したskinned fiber を直接タンニン酸で固定し，電子顕微鏡下でしらべた。

＊千彙大学理学部

7

骨格筋の弾性タンパク質コネクチン

45

1ートー璃バ⁚・へ仙図1．ニワトリ胸筋のコネクチンの抗体による検出。
左：Coomassie Blue染色による電気泳動パターン。C，コネクテン。
m，ミオシン。a，アクチン。右：ニトロセルロース紙に転写後，蛍光ラベル抗体で反応させたパターン。

図2．蛍光抗体法によるコネクチンのカエル骨格筋筋原線経における局在o a，対照。b，抗体処理後（位相差顕微鏡像）。C，同（蛍光顕微鏡像）0

結なった（図2aとb）。1．6／上mから2．5JLm にも果

私たちが用いた抗血清は，β−コネクチンに対するものであるが，immunoblot法による分析

なった。蛍光顕微鏡下で観察すると，A帯の両端からA−Ⅰ接合部にかけて，強い蛍光が認められによれば，α−コネクチンに対しても反応したた。すなわち，コネクチンは，A帯の両端からⅠ（図1）。9）図1でニワトリ胸筋のSDS抽出液の帯へかけて局在することが示唆された。

電気泳動パターンの一番上のダブレットバンドが

図3は，抗体処理をしていない伸長したカエル

コネクチンである。抗血清はこれとのみ反応した。

筋原線経の電子顕微鏡像である。2．5J上mのサル

この抗血清で処理したカエル筋原線経は，位相コメア長（休息時）から6〝mまでつよく引き伸差顕微鏡下でみると，明らかにA帯の巾が大きくばされているので，A帯のミオシンフィラメント

46

Ⅲ 筋構造蛋白質とその分化

図3t 伸長したカエル骨格筋筋原線経の電子顛微鏡像（タンニン酸固定）。
Ⅰ帯の鏑はトロポニンによる。

図4．抗コネクチンで処理したカエル骨格筋筋原線経の電子顕微鏡像。低イオン強度溶液で洗った後抗体処理した。

は左右へランダムに引きよせられている（図3挿トの形状が単離されたコネクチンと同様だからで入図）。ミオシンフィラメントの先端からアクチある。1962年にSjUstrandがgap filamentとンフィラメント側に細いフィラメントが走っていよんだものと同じである。10）このギャップ・フィるのがよくわかる。ミオシンとアクチンは接してラメントは，H。E。Huxleyの批判にあって無視いないので，この細いフィラメントが，図2の蛍されたが，1976年以来，R。H．Locker

光抗体法の結果からみて，コネクチンフィラメン

リバイバルを主張していた。11）

トであることが強く示唆される。このフイラメン

がその問題は，ミオシンフィラメントのどこからコネ

747

骨格筋の弾性タンバク質コネクチン

図5．コネクチンフィラメント構造のサルコメア・モデル○

クチンフィラメントがでて，どこまでつながって

ほミオシンフィラメントの芯の中を貫通している

いるかということである。免疫竃顕像は，あるてと述べているが，ミオシンフィラメントの表面

いどの示唆をあたえた。ただし，筋原緑維束の内（中央の0．3／tmを除き）に結合しているものと思部への抗体の浸みこみが意外にわるいため，そのわれる（図7）。

ままではごく表層しか結合がみられない。ところ

コネクチンフィラメントはフレキシブルな弾性が，低イオン強度下でふくれあがった筋原緑維束フィラメントとしてミオシンフィラメントを両側では，抗体がよういに内部の筋原線経に到達し反応がおこった（図4）。抗コネクチン処理筋原線のZ線につないでいるものと結論される。ジスト

経のサルコメアでは，A帯中央に対して対称的にになっているか，また発生の途上でつくりあげら

いくつかの鏑がみられた。中央のcentral bare

れている過程が今后の問題点である。

ロフィー筋で，この弾性フィラメントがどのようzone（0．3pm）の両端を起点に，A帯上に5本，
文

A−Ⅰ接合部に強い2本の鏑が存在した。Ⅰ帯に献

繰維（抽出していないintact標品）でも，Ⅰ帯に1）Maruyama，K．，Natori，R．and Nonomura，Y．
（1976）．Ab拍re，262：58−60．
2）Maruyama，K．，Matsubara，S．，Natori，R．，
Nonomura，Y．，Kimura，S．andOhashi，K．（1977）．
⊥βわC力eJ乃リ82：317−337．

不規則なelectron dense spotが認められZ線

3）Wang，K．，McClure，J．and Tu，A．（1979）．丹oc．

でも抗原抗体反応がおこっていた。これらのことか

4）丸山工作（1984）科学，54：747−753．

ら，コネクチンフィラメントは，ミオシンフィラ5）Kimura，S．andMaruyama，K．（1983）．J．Biochem・，
94：2083−2085．

メント上からZ線まで走っているものとみなされ

6）Wang，K．，Ramirez−Mitchell，R．and Palter，D・（1984）．介oc．〟αrJ．dcαd．gc乙比丘月．，81：3685−
3689．

は，はっきりしないがいくつかの点がみられた。
そして，Z繰上にもみられた。引き伸ばした筋原る。

肋rJ．Acαdgc￡比丘dリ76：3698−3702．

7）Trinick，J．，Knight，P．andWhiting，A．（1984）・
考察

本研究成果は，抗コネクチン抗体（ポリクロー

エ〃0．βoL180：331−356．
8）Maruyama，K．，Kimura，S．，Yoshidomi，H．，Sawada，
H．and Kkuchi，M．（1984）．J βわcJJe肌，95：
1423−1433．

ン）を用いた電子顕微鏡下での観察から，コネク

9）Maruyama，KリSawada，H．，Kimura，S．，Ohashi，

チンフィラメントは，ミオシンフィラメントからK．，Higuchi，H．and Umazume，Y．（1984）．J・C封βわ7．，99：1391−1397．

Z線まで走っていることを明らかにした。これは．

10）Sj6strand，F．S．（1962）．J・LHlrastnLC・Res・，7：225−246．

Wang12）がコネクチン（タイチン）はミオシンからネプリン（nebulin）につながり，Z線にいたると主張しているのを訂正するものである。ネプリ
ンは，未変性のまま単離されておらず，その性質も不明である。また，Lockerll）は，コネクチン

11）Locker，R．H．（1984）．fbod〃fcr0∫rmCrり

3：17−

32．

12）Wang，K．（1984）．Contractile Mechanismsin
Muscle（Pollack，G．H．and Sugi，H．eds．）pp．
285−305．〝e〃〟∽介eJ∫，NewYork．

48

8 胚筋，再生筋および除神経筋におけるトロポニンtT

嶋 田
研究協力者

は

じ

め

裕＊

清 水 法 子＊により．胸筋および後広背筋（PLD）を除神経した。

筋蛋白質は各筋で特有のアイソフォームをもつ神経の再生を防ぐため，神経の断端を短いシリコ

こと，またこれらは発生過程で変化することが知ンチューブに通し，さらにその背部の皮膚に縫いられている。トロポニンーT（TN−T）においてつけた。一部のニワトリにおいては，除神経後たも同様で，ニワトリ胸筋および足筋にはそれぞれ

だちに液体窒素温度にまで冷却した5×15mmの黄分子量の異なる特有のTN−T胸型TN−Tおよ

銅片を両側のPLDの表面に3秒間密着させて，

1）2）

び足型TN−T）が存在することが知られている。

損傷を加えた。術後5日〜2か月に胸筋およびP

また発生過程においてTN−Tが変換することは，

LDを標本として摘出した。

胸筋および足筋を識別できるモノクローナル抗体

蛍光顕微鏡的観察：胸筋およびPLDの凍結横を用いた蛍光抗体法による結果を，われわれはす

断連続切片を作製し，4％パラホルムアルデヒド

でに報告している03）すなわち正常発生において，で5分間固定した。切片はモノクローナル抗体

12日胚ではいずれの速筋（胸筋，足筋∴後広背筋）（F5D3：胸型および足型TN−T と反応する。

も足型（胚子型）のTN−Tを合成しているが．次

D5：胸型TN−Tとのみ反応する）と反応させた

第に胸型TN−Tを含む線経が現われてくる（新生後．0・4M MgC12，10mM Tris−HCl（pH児型）。その後，各筋は醇化後1週までにそれぞ7．6）で，さらにPBSで洗い，FITC標識抗マ

れの筋に特有なTN−Tの分布様式を示す方向へ

ウスIgG抗体を反応させ，間接蛍光抗体法によりと分化する（親型）。しかしこの様なアイソフォ

観察した。

ームの変換を支配する要因についてはまだ不明な
点が多い。

結

果

本研究では，神経支配がTN−Tのアイソフォ

除神経筋：正常なニワトリの胸筋においては，ームの変換にどのような影響を与えているかにつほとんどすべての線経がF5D3およびD5と反応

いて，除神経筋および除神経再生筋を用いて検討した（図1a，C）。PLDは，F5D3とD5

した結果について報告する。

方に反応する線経と，F5D3とのみ反応する線経がの両モザイク状に配置していた（図lb，d）。一方，支材料 と 方法

配神経を切除した胸筋およびPLDでは，筋線経

除神経筋および除神経再生筋：2か月齢あるいは萎縮し，抗体の染色性は正常筋緑経とは異なっは親ニワトリの片側の腕神経叢を切断することにていた。すなわち，大多数の線経はF5D3と反応したが，術後4週にはD5と反応する線経の減少＊千糞大学医学部解剖学第一講座が観察され，8週までにほとんどの線経はD5と8

胚筋，再生筋および除神経筋におけるトロポニン−T49

反応しなくなった。しかし，PLDにおいては，を示すことから，親型（特に胸型）のTN−Tの発正常筋で観察されない少数の小さな緑経がD5と現を維持するには神経が必要であると考えられる。

強く反応していた（図1C．e，r，h）。

また除神経PLDの中には，胸型TN−Tを持つ径再生筋：PLDに凍傷を与えると，損傷部付近の小さな線経がしばしば観察された。除神経筋にに正常な親の筋線椎より細く，中央に核をもち，おいて筋衛星細胞が増加することが報告されていさらに染色性が正常筋線経と異なる細胞が出現しる4）ので，これらの線経は除神経により刺激された。このような細胞は，筋衛星細胞由来の幼若なた衛星細胞由来で，新生児型まで分化した繰経で筋管細胞であると考えられる。損傷後5日に，すはないかと考えられる。

べての再生している筋管細胞はF5D3と強く反応

除神経胸筋において足型TN−Tが再び現われしたが，D5とは反応しなかった（図2a，d）。

ることは，大日方ら5）ぉよび松田ら6）によってイF5D3との強い反応性は，その後の再生期問を通ムノブロット法により報告されている。しかし，じて変化しなかった。2週間後には半数以上の再

TN−Tの胸型から足型への変換の程度において

生線経はD5とも様々な強度で染まるようになっ今回の結果と異なっている。彼らの報告によると，た（図2b，e）。このような染色性を示す線経は術後1か月および7か月でさえ，足型より胸型の徐々に数を増し（図2C，f），8週までには再生線

TN−Tの方が量的に多く存在していた。今回の経は正常な筋線経とほとんど区別できなくなった。

結果では，術後の経過と共に足型TN−Tが増加

除神経再生筋：神経支配のないPLDにおいてし，2か月までにほとんど足型TN−Tに変換し再生している線経の染色性の変化は．損傷後2週ていた。これらの結果の相違が何に起因するかはまでは神経支配を受けたPLDにおける再生緑経

今後明らかにされなければならない。

と同じであった。すなわち，すべての再生繰経は

凍傷後，神経支配のあるPLDの再生線経に見再生期間を通じてF5D3と強く反応した。一方，られる抗体反応性の変換は，同筋の発生過程に見これらの線経は最初はD5と反応しないが，次第られるものと同様であった。損傷後5日の再生線にD5とも反応する線経が増加してきた（図3a，経の反応性はPLDの発生初期（胚型）に，2〜

b，d，e）。しかし．損傷後4週では神経支配を受

4週後の再生線経の反応性は酵化前後（新生児型）

けた筋と受けない筋において，大きな相違が観察に見られるものと類似していた。これらの線経は，された。すなわち．一皮D5と反応するようにな

8週までに正常筋とほぼ同じ大きさと染色性に回った多くの除神経筋の再生繰経は，再びD5との復した。したがって，再生過程においては，発生

反応性を徐々に失っていった。しかし，なお少数過程におけるTN−Tの変換と同じ過程をくり返の小さな繰維だけはD5とも強く反応していた

していることが考えられる。この結果は，ミオシ（図3C，f）。これらの染色性は8週後でも変わン，トロポミオシン，TNに関する他の報告と一致らなかった。このように除神経再生筋も最終的にしている。7）8）9）は除神経筋と同様の染色性を示すようになった。

除神経筋の再生緑経にみられる抗体染色性の変換は，最初の2週までは神経支配のある再生線経

考察のものと類似していた。すなわち，神経支配の有胸筋およびPLDを除神経すると，8週までに無に関係なく，胸型TN−Tを合成する緑経が現両筋とも胸型TN−Tから足型TN−Tへの変換がわれた。このように，胚型から新生児型への変換おこった。すなわち，両除神経筋は大多数の線経は神経支配の有無に関係なく起こることから，Tが足型TN−Tを持つようになった。このように除

N−Tの初期の分化は神経に依存していないこと

神経筋は発生初期にみられるような染色パターンが考えられる。したがって，このような初期発生

50

Ⅱ 構造蛋白質とその分化

図1．間接蛍光抗体法による正常筋（a−d）および除神経後8週の筋（e−h）の観察。ニワトリ胸筋（a，C，e，g）およびPLD（b，d，f，h）をF5D3（a，b，e，f）およびD5（C，d，g，h）により染色した。 a−d x120；e−h x160

8

胚筋，再生筋および除神経筋におけるトロポニンーT

51

図2，3．間接蛍光抗体法による再生筋および除神経再生筋の観察。神経支配のあるPLD（図2）および無い
PLD（図3）に凍傷を与え，術後5日（a，d），2過（b，e）および4過（C，f）に再生部位をF5D3（a−C）およびD5（d−f）により染色した。上図，図2；下図，図3．×120

Ⅱ 構造蛋白質とその分化

52

は線稚内に内在的にプログラムされている可能性がある。あるいは他の因子（ホルモンなど）に依存している可能性も否定できない。実際に，サイロキシンが骨格筋10）や心筋11）に存在するミオシ
ンのアイソフォームの変換を誘引するという報告がある。その他，除神経前にすでに神経が正常な成熟筋に存在する衛星細胞に何らかの影響を与え

3）嶋田裕，清水法子：ニワトリ胸筋および足筋におけるトロポニンTの発生。モノクローナル抗体を用いた研究。筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）
昭和58年度研究報告書138−143．1984．
4）Ontell，M．：Muscle satellite ce11S：A validated
technique forlight microscopicidentification
andaquantitativestudyofchangesintheirpopula−tion following denervation．Anal．Rec．178，
21ト228，1974．
5）Obinata，TリSaitoh，0．，andTakano｛）hmuro，H．：

Effect of denervation on theisoform transitionsていた可能性も除外できない。
損傷後4週で，神経支配のあるPLDの再生線
経は親型の染色性へと回復しつつあったが，除神経筋においては再度胚型の染色性を示すようになった。これは，発生後期のTN−Tの発現は，神経依存性であることを示唆している。このように神経支配は筋の親型への成熟に必須であることが考えられる。これらの神経の影響が液性因子によるものか．あるいは機械的刺激によるものか，または神経以外の因子も同時に関与しているかなどについては今後明らかにされなければならない課
題である。

文

献

Oftropomyosln，trOPOninT and myosinisozyme
in chicken breast muscle．J．Biochem．（Tbkyoノ
95，585−588，1984．
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DenerYated永eletalmuscledisplaysdiscoordinate
regulation forthesynthesisofseveralmyofibTillaf

proteins．舟oc．∧加J．Acαd．∫Cと 飽．81，1122−
1125，1984．

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light chains in muscle regeneratingin al）SenCe
Ofthe nerve：Transient appearanceoftheembry−
Oniclight chain．Exp．NeuroZ．79，106−117，1984．
8）Matsuda，R．，Spector，D．H．，and Strohman，R．C．：
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9）Toyota，N．，andShimada，Y．：IsofomlSOftroponin
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10）Ianuzzo，D．，Patel，P．，Chen，V．，0

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2）Wilkinson，J．M．，Moir，A．J．G．，and Waterfield，
M．D．：The expression ofmultiple forms of tro−
ponin−Tinchickenfastskeletalmusclemayresult
from differential splicing of a slnglegene．Eur．J．
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11）Hoh，J，F．Y．，McGrath，P．A．，and Hale，P．T．：
Electrophoreticanalysis ofmultiple fomlSOfrat
Cardiac myosin：Effects ofhypophysectomy andthyroxine replacement．J．Mol．Cut．Cbrdiol．
10，1053−1076，1978．

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

9．ジストロフィー筋病態と細胞骨格

10．筋変性モデルに関する一考察

55

59

11．リソゾームチオールプロテアーゼとその内在性インヒビターの組織分布6312．カルシウム依存性プロテアーゼの構造，機能，ならびに活性に関する研究

13．細胞の増殖と分化に関する細胞遺伝学的研究

67

70

55

9

ジストロフィー筋病態と細胞骨格−筋脛連結部の超微形態
石
研究協力者

藤

川

巻

春
昇

−

律
神宮司

洋

一

狩 野 由美子

細胞骨格は細胞を構造的に支持するもので，主材 料 と 方法

として細胞質線維要素から構成され，細胞の外形材料として，ラット横隔膜を用いた。通常の微を維持するのみならず，内部でも各種構造体の分細構造研究のための試料作製のはかに，各種の化

布・配列や移動をコントロールしている。さらに，学処理を施したのち固定した試料も用いた。筋腱細胞骨格は細胞表面の形質膜との相互作用を通じ連結部を組織片に細切し，1％TritonX−100抽て，形質膜の機能的領域化を支持している。後者

出し，また，さらにH一メロミオシン（HMM）処は形質膜の裏打ち構造に負う・ところが大きい。筋理したのち，固定，脱水，包埋し，超薄切片を作細胞についても，これらの細胞骨格の役割は同様

製し，電子頗微鏡による観察を行なった。

で，筋の収縮活動に密接な関連を有していると考えられる。ジストロフィー擢患筋の初期変化とし

結 果 と 考 察て，オルガネラや筋原線経に障害が起こることが1．筋原線経の形質膜への付着様式

知られているが，これらの病態と細胞骨格の変化

筋腱連結部をつくる筋線維端は大・小さまざまとの関係が明らかになれば，病因究明の糸口の一な突起や琴人を形成し，基底膜を介して脛の膠原つになると信ずる。

緑経とかみ合うように連結されている。筋細胞内

骨格筋細胞において，形質膜上の機能的領域

郡では，筋原緑経がZ板レベルで筋形質膜に付い（ドメイン）は細胞骨格一膜相互作用の観点からて終る。筋原綿経の形質膜への付着様式についても把えることができる。機能的ドメインとして，は多くの研究者の関心を惹いているが，詳細は明筋腱連結部における力学的ドメインと，神経筋接らかにされていない1，2，3三合部における化学的ドメインはよく知られている

筋原線経の最終筋節のⅠ帯フィラメントは，形が，それ以外の細胞表面にも各種のマイクロドメ

質膜にほぼ垂直に付く部位では，Z板のレベルでインが存在すると考えられる。これらのドメイン膜について終ることになり，フィラメントの配列

を細胞骨格，とくに形質膜裏打ちとの相関で分析は比較的分析されやすい。形質膜直下に層構成をして行きたい。

とる暗物質が裏打ちしていて，最終のⅠ帯フィラ

本年度は，筋腱連結部について，電子顕微鏡的

メントはこの裏打ち構造に連結されている。Ⅰ帯に検索を進めたので，その結果を報告する。

フィラメントは裏打ち構造を介して形質膜に付くように見え，裏打ち構造を貫いて直接形質膜に付くことはない。裏打ち構造の微細構造は明らかで＊群馬大学医学部解剖学教室

ないが，膜の直下にや、明調の層とその下の暗質

56

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究の層からなる。明調層には垂直に向く微細柱状の異的な矢じり構造を呈する。最終筋節のⅠ帯フィ構造が認められる。Ⅰ帯のフィラメントの長さはラメントが形質膜に直角に付く部位では，フィラ

ほぼ1〟皿であるが，幾分長い部位もある。

メントの極性は矢じりが膜から遠ざかる方向であ

多くの筋原繰経は形質膜に対して斜めに付いてる（図2）。 Z板との連結と同じ極性を示す。最終る。同一の筋原線経の一部がこの様式で膜に付

終筋節ではⅠ帯フィラメントの全長に矢じり構造

着し，残りの部分はさらに次の筋節を形成するこが形成されることは困難で，20時間のHMM処とも多い。最終筋節からのⅠ帯のフィラメントは理でも，膜裏打ちとの連結帯は矢じり形成がみら

Z板のレベルより遠位では密な集合束をなし，形れないくらいであった。

質膜直下を膜に平行に走り，次第に先細りになっ集合束として形質膜に斜めに付いて終る部分でていく様式を示す。集合束の部分は暗調を呈し，は，HMMによる修飾はさらに困難である（図3）。

Z板との連続が認められる。この集合束はⅠ帯の集合束は緊密のままで，斑点状ないし横縞様の模

細いフィラメントと連続しているようにみえるが，様が残存している（図3）。束に隣接するⅠ帯フィ

束内ではフィラメントは相互に密に配列している。

ラメントが矢じりを形成していることから，反応

形質膜直下には裏打ち構造が存在し，集合束はこを妨害する構造が束内に組み込まれていると考えの裏打ち構造に側面的に付着している。束内のフィられる。実際，HMM処理時間を延長し（40時間），

ラメントは服次，裏打ち構造に付着して終り，束高濃度で処理すると，束の表面や近位部分のフィの大きさも次第に細くなると考えられる。

ラメントが反応し，矢じりを呈する。観察された2．Triton処理の筋脛連結部

限り，束のフィラメントはすべて，一方向性に配Triton処理によって，細胞膜の溶解と細胞質の列していて，矢じりを膜から遠ざける方向を示す

抽出が起こる。筋腱連結部のTriton処理でも同様（図3）。 このことは最終筋節のⅠ帯フィラメント

で，処理時間とともに膜溶解が進行し，細胞質基は連続して集合束をつくり，膜に近いフィラメン質が抽出され，線維性構造がコントラスト良く明トから順次，裏打ちを介して膜に付くことを強く瞭に観察されるようになる。筋原線経の膜付着部示唆する。したがって，最終Ⅰ帯フィラメントはでは，裏打ち構造の広がりに一致して，形質膜の1〟皿よりも長く，最高3ルmぐらいまで伸長して三層構造が比較的よく保存されている（図1）。

いると推論される。この推言鋸まさらに明確な証明

この部位の膜構築上の特異性を示唆している。加を必要とするが，フィラメントが膜に付く様式とえて，裏打ち構造も明瞭で，膜に平行な暗質層，して合理的である。集合束をなして，膜に平行にこの層と膜とを結ぶ垂直要素がとくに明瞭に観察

走りながら膜に付くことは膜の広い領域に亘ってされる。最終のⅠ帯フィラメントがこの裏打ち構力を伝えることができる。さらに，密な束内で，造を貫通しないことも確認される。

2方向性の配列をとる困難性がなく，一方向性の細いフィラメントがつくる集合束はTfiton処理

結晶様の束をつくり，かつ，矢じりを膜から遠ざによって，かなり明調になるが，集合束の緊密さ

ける方向という細胞一般の原則を守る。この集合

はTriton長時間処理でもよく保たれている。束内

束の近位端にⅠ帯が連続することになる。筋線維には不規則な横縞ないし斑点模様が明瞭に観察さ端の特徴的外形に対応した付着様式といえよう。

れる。束を維持する架橋物質によるものと考えら

今後，裏打ち構造の分子構築，および最終Ⅰ帯る。

フィラメントの集合束化に関与する蛋白質を検索

3．H−メロミオシン修飾による分析

するとともに，筋病態における筋腱連結部の変化

Triton抽出組織片をH−メロミオシン（HMM）
で処理すると，筋原線経の細いフィラメントは特を追求したい。

9

ジストロフィー筋病態と細胞骨格−筋腱連結部の超微形態−

図1．Triton処理の筋線維端十邪。A．横断像。B．縦断像。
最終筋節のⅠ帯フィラメントは延長して密な集合束をなし（FB），形質膜直下を走り，順次，膜に付いて終る。この集合束はHMMと反応し難い。また，裏打ちの存在部位の形質膜は三層構造をよく残している。

図2．Triton−HMM処理の筋線維瑞。細いアクチンフィラメントは形質膜（PM）に付いて終るが，その極性はHMMの矢じりが膜から遠ざかる方向（矢印）である。

57

Ⅱ 細胞生物学・細胞工学的研究

58

図3．Triton−HMM処理の筋線維端縦断像。
筋原線経の最終筋節（Mf）のⅠ帯から連続して，細いフィラメントの集合束が形成されている（矢印）。集合東内には暗物質の斑点ないし横縞模様が見られ，この部分はHMMで修飾され難い。
しかし，表層のフィラメントの一部は反応し，矢じりはすべて膜から遠ざかり，筋節へ向う方向
を示す。

結

語

くことはなかった。

ラット横隔膜の筋腱連結部の超微形態，とくに
筋原線経と形質膜との連結様式について電子顕微
鏡的に分析した。最終筋節のⅠ帯フィラメントはZ板のレベルで，裏打ち構造を介して形質膜に付いて終っていた。Ⅰ帯フィラメントが1〟′mを越えるいろいろな長さに延長している部位が多く，

文

献1）Ishikawa，H．：Fine struCture Ofskeletal muSCle．
CeJJα〃d肋JCJe肋〟〃ゆ ，Vol．4（由．by M．
Dowben andJ．W．Shay），1−84，Plenum Publ．
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2）Trotter，J．A．，Eberhard，S．andSomora，A．：StruC−
tural domains of the muscle−tendonJunCtion．

延長部分は密な集合束をなし，膜に平行に走り付

1・Theinternallaminaandtheconnectingdomain．
A〃が．尺ecリ207，573−591（1983）．

着していた。そのフィラメントはHMMによる矢3）石川春律：細胞骨格の分化発達一筋腱連結部の細胞骨格。筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班）一昭和58年度研究報告書，103−106（1984）．

じりを常に膜から遠ざける方向で配列していた。
フィラメントと膜とを仲介する裏打ち構造は膜直下に2層構成をなし，フィラメントがこの層を貫

59

10

筋変性モデルに関する一考察−トランスフエリン欠乏による筋変性

小 沢 瑛二郎＊筋ジストロフィー症（以下筋ジス）の研究に当得させるに至っていない。このように病的筋の培っての大きな障害の一つは，実験的な変性の生物養によって病的過程が再現されないのは，もとも学がないに等しいことである。ガンや炎症の生物とこれらの筋には病的な過程を発現することがな

学については，それがまた完成したものでないにいのか，培養という人工的な条件下では，病的なしても多くの研究者によってかなりのレベルの生状態を発現する迄分化しないのかあるいは下に述物学が作り上げられている。

べることと関連するが，現在用いられている培養

われわれの目的は，変性の生物学を作り，筋ジ液の供給する何物かが発症を抑えているのか，更スの本態の解明や治療に役立てようとするものでに生体内で与えられるかもしれない毒素がこの条あり，さらには多くの変性病変を主体とする難病件では与えられないためなのか，色々な可能性が研究の基礎を作りあげようとするものである。

考えられるであろう。しかし現在迄の結果がこのためには，実験系を単純化することがまず

negativeだからといって培養法の改善によって重要であり，従って現在の細胞生物学的方法，特将来において病的発現の可能性がないと断言するに培養細胞を用いた各種の方法を用いることが必ことはできない。

要となる。

もう一つの立場は病気の本質が筋細胞の外にあ筋ジスの本体を解明するために用いられる細胞って，筋細胞の病変はそれを取巻く環境の変化に

生物学的な研究は大きくいって二つの立場に分け

よって起こると考える立場からの実験である。こることができる。一つは筋そのものの中に疾病のの立場はさらに考え方によって二つに分れる。一原因が存在するという仮定に立って，羅患筋をつは神経系に病因があると考えるもの，他は体液

in vitroで培養することによって何等かの病的性の影響に原因を求めるものである。神経因性とな変化があることを期待するものである。この緑考える場合の実験法としては，筋の移植や培養皿にそって，ヒトの筋ジスの筋を生検し，その衛星の上で神経筋接合部を作ったりする方法．更に細胞を培養したり，いわゆる筋ジスモデル動物の培養液に神経由来の物質を加える方法などが考え

筋芽細胞や衛星細胞を培養したりすることが行わられる。体液性因子を考える場合には，神経以外

れて来ている。しかしながら現在迄確実に病的なの生体成分の筋細胞への作用を調べることになる。

過程をin vitroで再現していると思われる像は

この場合は，培養細胞を用いるのが普通であって，得られていない。Blauらl）は，Duchenne型筋

その培養液中に生体因子を添加することによってジス筋の衛星細胞の培養によって得られた筋管細

起る培養細胞の変化を観察することになる。

胞の萎縮について報告しているが，多くの人を納われわれは，生体因子を十数年に渡って研究している。2）筋細胞の材料としては主としてニワト＊国立武蔵療養所 神経センター 機能研究部

リ胚胸筋を用い，基本培養液としてほEagle′S

60

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

MEM85％ウマ血清15％を用いている。ニワトリ

した。6）従って成鶏の血液を材料とし，活性の強筋芽細胞は基本培養液中で培養しても成長しない。

い分画を集めるという方法で種々の方法を併用し

しかしこれに少量のニワトリ胚抽出物を添加するて精製を行った。得られた分画は，紅褐色をしたことによって非常によい成長が起ることに着目し蛋白で分子量80Kであった。酸性で無色となり蛋た。このことはニワトリ胚抽出物中に筋細胞の成白分画は活性を持たないが，その時の液性成分と長を促進する物質を含んでいることを示していた。

混じて中性に戻すと紅褐色の色調を回復すると共この研究を始めた1971年には，大塚，弘中ら3）に，活性も回復した。

によって筋ジスマウスの交叉移植が行われ，細胞

分子量や色調などが，トランスフエリン（Tf）

外因子の重要性が認識されていた。彼らの解釈でによく似ているので，既知の方法で血清および卵はむしろ神経因子が重要視されたが，上述のよう白から精製したTf（sTfとoTf）と，われわ

な液性因子が関与している可能性も否定できなかれの標品を比較した。その結果，異った材料からった。現在では当時用いられていた筋ジスマウス

異った方法で得た標品の蛋白当りの筋成長促進効のヒト筋ジスのモデルとしての有用性は低くなっ果が同じであること，上記の酸処理の効果が定量てしまったけれども，この実験は私の発想の引き的に同じであることなどから，われわれの標品の金としては有用であった。すなわち，eXtraCe1−

有効成分はTfであることがわかった。7）8）9）さら

1ularの因子でin vitroのassay systemを用にFeを結合しないapo Tfは無効であることがいて筋の成長に関与する物質を調べてそれらを列挙

明らかとなり，一方FeイオンはTfタンパクと結することは可能であろうし，それらは必ずしも筋合しなくとも，高濃度では筋の成長を促進したし，

ジスの病因と関連しているとは限らないにしても，さらにTfにFeの代りに他の遷移元素を結合さ数多い原因不明の筋疾患の中にはそれらの欠乏にせたものには．筋の成長を促進する作用がないこよるものもあるかもしれないというものであった。

とが分った。10）11）このことは細胞に必要なもの

しかもそういう疾患の場合には，原因となる欠乏はFeであって，Tfタンパクは必要でないかもし物質を「物」として捏むことができるのであるか

れないことを示唆した。しかしTfと結合した

ら，治療に用いることができると考えられる。こFeは，遊離Feイオンの200倍も有効であるので，

れは上述の原因論のうち，もし可能ならば得られ

TfはFeのキャリアーであることが考えられた。

る物質がそのまま古典的な意味での薬物療法と直これに関係しては後にKarinとMinz12）によっ結し得る数少い例であろう。

て奇形腫幹細胞を用いて，Fe−Tf はリセプタ

まずニワトリ胚抽出物に含まれる有効成分を抽ーに結合して細胞内にとり込まれ，Feを放出し出することとしたが，この際の方法は活性のあるた後apoTfはリセプターに結合したまま細胞表

分画を種々の方法で精製してゆくことになるが，面へ戻りapoTr

その際重要なのは生理活性を定量とすることであう過程が明らかにされた。

はやがて細胞から離れるといる。このためには初めは核の数を算えることを行上に述べたように，Feのみでも適当な条件下ったが，4）後にはより簡単のために，筋管細胞内ではCK活性をマーカTとして筋の成長を調べるに蓄積されるクレアチアキナーゼ（CK）の活性

限り，Fe−Tfと同じような成長促進作用を示しを測定することによって，筋の成長の定量を行った。しかし筋細胞の機能的な分化がFe添加培養

た。5）

液中でも，Fe−Tf添加培養液中の場合と同様に胚抽出物は複雑な混合物なので，有効成分がど行われているか否かを調べることが必要であった。

の臓器に由来しているかを検索した結果血清（成この問題について種々の方面から検索を行った。13）

鶏のものでも）が最も強い活性を含むことを見出

まず筋収縮の要素である筋原線経を形づくってい10筋変性モデルに関する一考察−トランスフェリン欠乏による筋変性

61

る種々のプロテインの二次元電気泳動法による検出，

うになり，細胞膜の透過性が増加して細胞質が泡

ミオシンB ATP ase活性の検出，電顕による状のいわゆるblebを作って漏出するようになる。

筋原綿維および筋′ト胞体の検索．グリコーゲンホ

Blebは数〟mから数十JLm程度の大きさで，一ケ

スホリラーゼキナーゼ活性の検札 CKアイソザの筋管細胞に多数出現する。Blebが漏出するとイムの分化様式の検索等においてFe イオン添加

細胞は急速に痩せて培養皿から剥離する。

によって育った筋管細胞も，Fe−Tf添加によっ徐々に起る変性としてはまず無数の脂肪滴が現て育った筋管細胞もほぼ同様な成績を示した。さわれ，あるものは空胞化し．あるものは痩せ細り，らにこれらの成績は培養細胞の場合も，本質的にあるものは細胞の厚さが薄くなる。薄くなった細胞

成筋における収縮と同様な機構によって収縮が行の中にはかなり形の変ったものが見られる。これわれている可能性を示している。そしてこの段階

らの細胞も多くは十数日後にはポロポロになってまでの分化にはTf タンパクは事実上要求されな死滅する。一方筋芽細胞や未分化の細い筋管細胞，

い。さらに．細胞膜の興奮性の分化や．われわれ

あるいは痩せて細くなった筋管細胞は比較的丈夫のグループの斉藤14）が創始した培養筋細胞の収であり，かなり生き残り，FeTf の添加により縮を測定する方法によって検討した。細胞全体と再び分裂や融合が起り，遂には桟紋がみられる迄

して観察すると．興奮収縮連関は，段階的に成筋発達する。

のものに近づいているが．この分化の過程も上記の二種の筋管細胞でほぼ同じようであった。

これらの事実は．筋細胞の変性と治癒が，細胞にFeを与えるか，与えないかで起るというモデ

これまでニワトリ筋に対するニワトリのFeTf

ルを提供することになる。このプロセスは，これについて述べて来た。しかしわれわれの基本培養迄あまり注目を引かなかったFeと筋の病変とを関液にはウマ血清が入っているので．血清中にはウ係づけたものである。われわれはこのプロセスをマTrが非常に高濃度に入っていた筈である。この諸種の方法で分析することによって，変性病変の際ニワトリ筋の成長がみられなかったのは，例外

攻め方を確立したいと考えている。

を除いて晴乳類のFe−Tfは鳥頬のTfリセプタ

色々な物質の欠乏症では，多くの場合その物質

ーと結合できないために，ニワトリ筋細胞はウマは分解されて足りなくなる様な性質のものである。

Tfを利用できなかったためである。5）なお，われこのモデルではFeという分解不可能な物質も常われはニワトリ胚抽出液中からFe−Tfを精製し時与えておかなければ，細胞は破壊されるという同定している。15）

ことが示された。このような場合に，Feは細胞

さて主題を始めに戻して筋の変性とTfとの関が必要としているにもかかわらず細胞から細胞外

連16）17）について述べる。筋原細胞にFeの供給へと放出されるのであろうか，それとも利用不可が行われると，筋芽細胞の増殖がみられるし，筋能な状態になって蓄積されてしまうのであろうか。

管細胞の成長，分化がみられる。それでは一度成そしてFeそのものは生命の過程のどこに組込ま長した筋管細胞は，Feの供給が失われた場合はれているのであろうか。そして形態的にみられる成長は当然とまるだろうが．細胞はそのままの状変性とは，生命の過程のどこがどのように修飾さ態を保つであろうか。

れた時に起るのであろうか。このような問題が解

基本培養液にニワトリTfを添加した培養液中で成長したニワトリ筋菅細胞を，Tfを含まない
基本培養液中で培養を続けると，細胞は変性し遂に死に至る。急速に細胞が死に至る場合には，数
日後には大きな筋管細胞の核が凝縮して米粒のよ

決されてゆく過程に於いて，筋ジスの本態解明の手がかりが得られてゆくのではなかろうか。

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

62

文

献

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17）Ozawa，E．＆Hagiwara，Y．：BiomedicatResearch
3，16−23，1982．

63

11リソゾ一旦チオールプロテアーゼとその内在性インヒビターの組織分布

勝 沼 信 彦＊研究協力者 木 南 英 紀＊ 板 東 祥 晃♯
塚 原 俊 文＊はじめ定着マクロファージは，腔腔を洗源して集めた。

に筋ジストロフィー症における壊死性崩壊の機序

多核白血球及び浸出マクロファージは6％のカゼと強い筋タンパクの分解能をもつリソゾームのチ

イネイト15mgを腔腔内投与後6時間後及び4日後

オール性カテプシン群との関連を追求している。

に採取した。白血球及びマクロファージはパコー

カテプシンLを除き，カテプシンB及びHに関しルを用いた密度勾配遠心により，顕微鏡的に95％ては精製．諸性質，アミノ酸配列も決定され，プ以上各々の細胞を含む標品を得た。リンパ球はラ

ロテアーゼ自体の性質は明らかになってきた。しット血液からフイコールパックを用いて分離した。

かし，機能面の研究はまだ不十分であり，骨格筋をはじめ諸組織におけるプロテアーゼの濃度につ結果 と 考察

いても全く報告がない。今回，カテプシンB，H

1．リソゾームのチオールプロテアーゼとその内及びその制御因子としてのチオールプロテアーゼ

在性インヒビター

インヒピタT（TPI−aとTPI一β）に対するリソゾームの代表的なチオールプロテアーゼで特異抗体を得，それぞれの酵素免疫測定法を確立

あるカテプシンB及びHの諸性質，アミノ酸配列，し，各種組織における濃度を測定した。

糖鎖構造に関する知見が増えてきているのに対し，もう一つの最も強力なエンドペプチド作用をもつ

材料 と 方 法

カテプシンLの構造に関する研究は遅れている。

ラット肝よりカテプシンBl），カテプシンH2）

その大きな理由はカテプシンB，Hに比べ著しく4垣

含有量が低いことと不安定なため精製が非常に困

精製し，それぞれに対する抗体を作製した。ベル

難なことによる。我々は最も含有量の高いラットォキシダーゼ標識抗体の調製は石川らの方法5）

腎より迅速な精製法を確立し，以前の報告より分に従った。即ち，F（ab）Zを調製し，ヒンジ郡の子量の大きい型のものを精製することができた。

SH基を露出させる一方，ベルオキシダーゼにマ

しかし，電気泳動のパターンを感度の高い銀染色

レイミド誘導体を導入し，両者を反応させ，ベルを行ってみると精製途上の分解産物とみられる

オキターゼ標識抗体を作製するものである。このminorバンドが認められる。現時点では，natine

標識抗体を用いてサンドウィッチ法で抗原の定量なカテプシソLの精製は極めて難しいと思われるのを行った。

で，一次構造の決定はDNAの配列を決める方向かTP卜63）をラット皮膚上皮よりTP1−

らのアプローチも検討しなければならないと考えている。
＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学

チオールプロテアーゼ群の制御因子として内在64

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

性インヒビターは，ここ数年の研究によって概要

ベカテプシンBのレベルが圧倒的に高く，カテプ

がほぼ明らかになってきた。血中に存在する大き

シンB＋Hの量はほぼTPIと括抗している。目な分子量のTPI（実は低分子キニノーゲンと同標である骨格筋及び心筋はプロテアーゼ，インヒ

じ物）とは別に分子量11，000〜13，000のTPI

ビター共に少ない組織であることが明白である。

が存在するが，現在までに4種固定されている。

ベルオキシダーゼ標識抗体を用いて免疫組織学的

TPI−αとTPI−Pが非分泌性であるのに対し．

にそれらの局在を調べると正常な骨格筋ではカテ

TPI−T（別名r−traCe，シスタチンーC）及プシンB，H及びTPI−β

びシスタチンSは分泌性であり，TPI−r

は血backgroundレベルの染色で濃染される部分はみ液，脳脊髄液，精液等へ．シスタテンBは唾液にられなかった。むしろ問質のマクロファージ及び分泌される。ラットのTPI−α6）とTPI−J9，7）

血管内皮細胞け）がいずれも陽性であった。

ヒトのTPI−膏シスタチンS9）はすでに一次3 末梢血細胞におけるカテプシンとインヒピタ

6）u）

いずれも筋細胞内は構造が決定されている。

の分布

2 骨格筋と全身臓器におけるカテプシンB．カ

筋ジストロフィーハムスターの擢患筋及び急性

テプシンHとチオールプロテアーゼインヒビタ

筋壊死のモデルとしてのプラスモシドミオパチー

ーの分布では，リソゾームのカテプシンB＋L活性及びT

カテプシンH及びLには選択的な基質が開発さPIの著明な活性増加がみられる。この増加は主れておらず，組織の阻抽出液を用いて，それらをとして問質及び筋細胞内へ浸潤してきた細胞群と特異的に測定することは極めて難しい。又．TP

くにマクロファージ由来であることを免疫組織学

Iも阻害活性だけでは4種のTPIを区別できな的及び生化学的に証明した。10）今回は，壊死筋にい。最も優れた方法は．抗体を用いてそれぞれを遊走してきたマクロファージではなく．腹腔内マ定量することである。我々はラットのカテプシン

クロファージ及びその他の末梢血細胞のチオール

B，H．TPI−a及びTPI−βに特異的な抗体

プロテアーゼとインヒビターの量を測定した。マ

4種を得て，これらの酵素免疫測定法を確立した。

クロファージ及び好中球はラット腹腔より採取し，いずれも高感度で，それぞれの抗原のみを定量でさらにパコールの密度勾配遠心で分離精製した。

き，しかもプロテアーゼはインヒビターの存在にリンパ球は血液よりフイコールパックを用いて分よって影響を受けることなく又，インヒビターは離した。表1に示すように，カテプシンB及びH

プロテアーゼの存在によって影響を受けることなのレベルはマクロファージが圧倒的に高い。カテく測定が可能であった。ラット各種組織におけるプシンBはリンパ球及び好中球の50〜30倍，カテプロテアーゼとインヒビターの分布を図1に示す。

プシンHは約10倍であった。TPI一β

上段はカテプシンB及びHの量の多い組織であり，

クロファージ好中球．リンパ球問でそれほど大き腎が単位タンパク当り最も含有量は高い。腎．晩な差はみられない。TPI−α

肝，肺などではカテプシンB＋Hの量がTPI−められた。マクロファージではTPI塁に比し．

α十βの量を上廻っている。TPI−αは皮膚上皮，

カテプシンB，及びHの塁が圧倒的に高いことは及び重層偏平上皮に多量に存在し．中段に示され注目に価する。カゼイネイト（表1），チオグリている臓器など限定した組織しか存在しない。こコレート，グリコーゲン（表に示されていない）

れらの組織ではTPI−αが多いため一見TPIの等で，誘起されたマクロファージではカテプシン

方がプロテアーゼ量を上廻っているが，必ずしもBの量が著しく増えている。TPI及び同じリソ

同じ細胞にプロテアーゼをインヒビターが局在す

ゾームのプロテアーゼであるカテプシンHの量はるとは限らない。脳と副腎ではカテプシンHに比それほど増えない。おそらく炎症性マクロファーの量はマ

は好中球にのみ認

11リソゾームチオールプロテアーゼとその内在性インヒビターの組織分布

H ct

β

B H ctKidney

B H

α

Skin

β

B H cE

SpIeenβ

B H cLβ

Esophagusβ

B H oLLiver

B H cEβ

Lungβ

Stomach65β

B H cLIntestine

B H ctVaginaβ∪⁝り10Ld
mE︑mu

B

H

q

β

B

H

α

β

B

H

α

β

B

H

α

8

日eart Skeletal muscle

Brain Adrenalgland

図1．ラット各種組織におけるカテプシンB，カテプシソH，TPI−α及びTPI−βのレ
ベル。

表1．

Levels of Cathepsin B，Cathepsin H，TPI−CL and TPI−βin Rat Peripheral Blood Cells

cells

Cathepsin

B

Cathepsin

H

TPI−CLTPI−βng／106cells
Lymphocytes

4・1±1・2

16±3●20．006±0．002

7．67±1．25

Neutrophlles

6・2±1・8

16±4・40．55±0．08

9．53±1．30

Macropbages
resident
elicited

194
1259

Erythrocytes o・5±28

158±360．027±0．004

28．7

±3．9

±350

298±440．039±0．008

56．2

±7．8

0●5

0．001

0．56±1．1

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

66

ジの食作用と関係ある変化と思われる。実際に，ジストロフィー筋に浸潤してきたマクロファージ
も炎症性マクロファージとしての性質を示すのかどうか，しかも，それらが筋タンパクを取り込み分解しているかどうかも今後の重要な課題である。

3）Kominami，E．，Wakamatsu，N．，and Xatsunuma，
Nり上月わエαem．257：14648，1982．
4）Kominami，E．，Bando，Y．，Wakamatsu，N．，and
Katsunuma，N．，J．Biochem．96：1437，1984．
5）Ishikawa，E．，Imagawa，M．，Hashida，S．，Yoshitake，
S・，Hamaguchi，Y．，andUeno，T．，J．hnmunoassay
4：209，1983．

再に，マクロファージを遊走させる骨格筋の変化

6）Takio，T．，Kominami，E．，Wakamatsu，N．，and
Katsunuma，N．，βわC加桝．βわp妙∫．Re∫．Cb〝Im〟札
121：149，1984．

は何かも重要な問題である。

7）Takio，K．，Kominami，E．，Wakamatsu，N．，and
Katsunuma，N．，βぬぐ加刑．βわp力γ∫．月即．CbJmm〟軋
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10）Kominami，E．，Bando，Y．，Ii，K．，Hizawa，K．，and
Katsunuma，N．，√βfoc力e肌96：1841，1984．

67

12 カルシウム依存性プロテアーゼの構造，
機能，ならびに活性に関する研究

文史

康博

森崎

英

忍光

＊一榎川

紘男

木茂

鈴野城原

大今杉

研究協力者

カルシウム依存性の中性プロテアーゼ（CANP）

各1個からなるダイマーであるが，現在知られては高等動物細胞の細胞膜に大量に存在するプロテ

いるCANPの性質はすべて80Kサブユニットだけアーゼで，活性発現にCaを必要とする。CANPはで説明できる。これらの事実から，ニワトリ80K

単に種々のタンパク質をアミノ酸やペプチドに分

サブユニットのクローニングを行い，その構造を解するいわゆる消化酵素として作用する以外に，解析した。

タンパク質のプロセシングを通じて多くの細胞機

ニワトリ骨格筋よりグアニジンチオシアネート

能と密接に関係していると考えられる。CANPは法でmRNAを精製し，これからcDNAバンクを細胞質に存在し，常に基質と接しうる状態にある。

作製した。既に明らかにしたニワトリCANPのア

このため，CANPは普通の状態では活性を持たず，

ミノ酸配列の一部に相当する3種類のオリゴヌク

必要な時だけ活性を持つように活性が厳密に制御

レオチドを合成し，これをプローブとしてスクリーされているはずである。この活性制御系が不調にニングを行った。その結果えられた2個のクローなると，CANP活性の異常が生で種々の疾患に通ンを使って約3．5kbのCANP cDNAの全構造をじる。筋ジストロフィー症ではCANP活性の顕著明らかにした。この結果と，タンパク質レベルでな上昇がみられ，このために筋タンパク質の崩壊の構造解析の結果から，CANPは705個のアミノがおこる。このCANP活性の上昇は活性制御系の酸からなるprimarytranslationproductのN末

不調にもとづくものであり，CANPの活性制御系

端メチオニン残基がとれたものであることが判明とその異常を明らかにし，筋ジストロフィー症のした（図1）1三

原因を探索する目的で研究を行っている。
ニワトリCANPのドメイン構造

方法および結果決定したCANPの構造をDayhoffのProtein

ニワトリCANPの構造決定

Sequence Data Bankを使って解析した。その結哺乳類ではCa感受性を異にする2種のアイソザ

果，CANPは図1に示すように明らかなドメイン

イムmおよびルが存在する。しかし，ニワトリに構造を持つことが解った。

はmとルの中間の性質を示すものがただ一種頬存

CANPはチオールプロテアーゼで，活性中心Cys

在する。また，CANPは80Kと30Kのサブユニット

近傍のアミノ酸配列はパパインやカテプシソBなど他の代表的なチオールプロテアーゼと似ている＊東京都臨床医学総合研究所退伝情報研究部

ことが知られている2三ここで全構造を比べて詳細

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

68

OrigjnalTranslationProduct（CANPPrecursor）
1

81
l

331

561

、
・
一
■
事
￣
−
￣
＝
㌧−
一
￣
：
∴
＝
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≠
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∵
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二
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一
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＝
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＿
＝
一
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一
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二
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一
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■
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1−
￣
′
仇
′

705

IIl

Caldumbindingprotein

thiolprotease（calmodulin）

PrOCeSSlng

Mature CANP
2（704re＄idues）

81

561

705

∵
※
㌧
∴
∴
￣
一
∴
一
幅
r
−
・
て
￣
′
〜
；
、
一
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．
長
：
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二
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■
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￣
．
7￣
＝
∴
∵
：
く
1
気
1：
二
￣
二
さ
二
＝
r
：
＿
一
i
I

＝

thiolprotease

Calmodulin

図1．CANPのドメイン構造。図中の番号は残基番号を示す。

な比較検討をした結果，活性中心CysやHis近傍

相同性から考えると，この部分だけを切り離せばを中心により広い範囲でCANPと他のチオールプ

Caがなくても活性を持つと思われる。しかし，

ロテアーゼとの間にアミノ酸配列の相同性が見出

CANP分子の中に組込まれると不活性な状態で存された。この結果，CANPのNo．81−330の部分は在している。CANPのCa結合部位にCaが結合す

チオールプロテアーゼドメインであると結論した。

ると，Ca結合部位に構造変化がおこり，これがプカルシウムを結合する構造としてカルモデユリ

ロテアーゼ部位の構造変化を誘起し，CANPがプンなどに見られるEFハンド構造がCANP中に見ロテアーゼとしての活性を持つと考えられる。

られるか否かを次に検討した。図2に示すように

今までカルモデュリンの存在状態としては遊離

CANPのC末端に近い部分に4ヶ所のEFハンドの状態のものと，標的酵素のサブユニットになっ構造をとる部分が見出された。これらの部位はいているものの2種が知られている。CANPでは，

ずれもC末端に近い部分に存在し，ペプチド鎖上カルモデュリンが標的酵素であるCANPと共有結の分布はカルモデュリンの場合と非常に良く似て合で結ばれた形で存在している。このようなカルいた。以上の結果，この部分（Na561−705）をモデュリンの存在形式は今まで全く知られていな

CANPにおけるカルシウム結合部位であると判定い。共有結合でカルモデュリンと標的酵素が結合した。

していれば，その制御は最も簡単かつ確実である。

CANPはチオールプロテアーゼとカルシウム結CANPがペプチド結合の水解という不可逆反応を合部位を持ち，図2に示すように4つの部分から行うこと，CANPが細胞質に存在し，CANPの活なる明確なドメイン構造を持つことが明らかに性異常は細胞にとって極めて有害であることなどなった。

を考えると，この活性制御機構は非常に合理的な制御機構である。
CANPの活性制御機構

CANPのチオールプロテアーゼ部分は，構造の12 カルシウム依存性プロテアーゼの構造，機能，ならびに活性に関する研究

一
I

亡 L

≡

P

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7⊥
Y

Z

L

A

Y

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F

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K

S

26

K

K

K

S

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R

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K

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Y
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K

G

◎◎︵ル︶

nU
日 日
P

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冨≡鍼≡

KS◎FOE

D−D Q

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D

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T

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一口K

CANP

Y

−Y A

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hU

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T

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7L

X Y Z

F

亡 L

65。 ㊥

−X
S

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25

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S

L

24

﹇削n回目凹

．
．
DD
．
．
削

X Y Z

勘

DOs㊥K

TROPONIN C

61， ①

削

T

V HK

G

T

CALMODULIN

︵旧︶O

R

CANP

ーX

㊤−

−Y

㊥︵㈲︶㊥

X Y Z

て﹇旧

58， O

69

K◎−29
S◎−29

図2．CANP中のカルモデュリン様構造
Ⅰ〜ⅣはN末端側から順につけたCANP中のカルシウム結合部位。X，Y，Z，−Y，−X，−Z：
カルシウムの配位する位置。Xの上側の数字はCANPにおけるアミノ酸の残基番号。一ZとXの間，または−Zの後にある数字は，そこに存在するアミノ酸の残基数を示す0

考

察

CANP活性の異常の原因を明らかにするには，こ現在ニワトリCANPの構造解析に続きヒト，ウの複椎な制御系の全体像を明らかにする必要があ

サギのmおよびLLCANPの構造決定を行っている。

り，それにはかなりの時間が必要である。しかし，

こうして得られる結果を比較検討すれば，mおよ

その制御系の中心をなすCANPの構造と機能の概びJLCANPの構造と活性の相関，Ca感受性の差異

要は近い将来に明らかになるであろう。

などが分子レベルで明らかになるものと考えてい文る。また，CANPの活性制御機構は簡単かつ確実ではあるものの，この機構では酵素活性がCaの存在のみによって左右される。Caの存在下でも

献

1）Ohno，S．，Emori，Y．，Im毎Oh，S・，Kawasaki，H・，
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活性を制御したり，Caの感受性を変化させるため

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4）Suzuki，K．＆Ishiura，S．：J．Btochem．，93，1463−
1471（1983）．

ェフェクターなどが存在するのであろう3 4三従って，CANPの活性はこれらの因子が相互作用をする複雑な制御系で制御されている。そのため，

70

13 細胞の増殖と分化に関する細胞遺伝学的研究

清水研 究 目 的EGF（上皮増殖因子）やインスリンなどのポリ

信

義え，EGF作用の分子機構に関してDualpathway
モデルを提唱している（卜4）（図−1）。

ペプチドは，膜の特異的レセプターに結合するこ

このような生化学的・分子生物学的研究をおぎとによってシグナルを誘導し細胞の代謝・増殖やなうアプローチとして，我々は細胞遺伝学の立場

分裂を調節している。本研究はEGFやインスリンからの研究も数年前に開始したぎ遺伝子クロの細胞増殖促進作用の分子機構や遺伝制御を細胞ーニングなどの技術の導入によって，遺伝子DNA

遺伝学的アプローチを用いて追究し，筋細胞の増の構造解析は急速に進んでいるが，細胞側の殖や分化の解明の基礎とすることを目的とする。

変異とそれに伴なう増殖や分化の調節機構に関す

この目的のためにEGFやインスリンに応答しないる研究は，これからの加速度的な進展が期待され変異株や異常な仕方で応答する変異株を分離する

る段階であるといえる。殊に，ポリペプチドホル必要がある。これらの変異株には膜レセプター機

モン作用の遺伝解析は，それに応答する種々の細能欠陥に関与する種々の蛋白因子・酵素の欠損や胞株が確立されてきたことと相挨って，今後の細ポリペプチドホルモンあるいはそのレセプターの胞生物学・細胞遺伝学における最も重要な課題の細胞内プロセッシングに関する細胞骨格やオルガ一つである。

ネラ機能の欠陥などが含まれる。得られた変異株

我々はこれまでにEGFの細胞増殖作用に関しに関して，その変異の分子レベルでの性状を調べて次のようなことを明らかにした。EGftレセプ

ると共に，雑種細胞形成法やDNAトランスファー

ターを欠損するマウス細胞とヒト正常細胞との間法などを組み合わせて，それらの遺伝子の発現ので雑種細胞を形成し，それらの遺伝解析から，レ

調節や遺伝子マッピング，遺伝子のクローニング

セプター機能の発現にはヒトの第7染色体が関与などを行なう。

していること，さらに，EGFレセプターの遺伝子は第7染色体のp13−p22領域にマップされるこ

現在までの研究状況とを明らかにした6・7）（図−2）。ヒトのEGFレセ

EGFやインスリンの作用の分子機構に関して，プターに特異的なモノクロナール抗体を用いて，レセプターの集合機構やリン酸化反応が最近注目雑種細胞で発現されたレセプターがヒト由来の遺されているが，核のDNA複製に連なるプロセスは伝子産物であることも証明し定三雑種細胞におけ全く判っていない。最近我々はEGFを運搬する新るEGFのプロセッシングとDNA合成促進の関

しい細胞顆粒，Mitosomeを発見し，それが従来連も解析した。このような一連の成果によって，のリソソームを経由する分解系と異なって，細胞

ポリペプチドホルモン様増殖因子とレセプター系のDNA複製の促進に関与する新しい系であると考の機能に関して遺伝解析が可能であることを初めて示した。遺伝解析をさらに遂行するためには適＊慶応義塾大学医学部

切な変異株の分離が必須である。我々はジフテリ

13 細胞の増殖と分化に関する細胞遺伝学的研究

71

コーテッド
物
1 − 1 − ▲ 1 解 1 Ⅰ
分

l

◎EV

軍学守一ム／ノ＼、、、、L／＼＼◎㊧一一′▼細胞骨格＼I

成熟リソソーム

酵素・蛋白因子

㌢√＼

＼ヱ＿

；チ＼
ふふふ記法

ノ「

I

mRNA

染色体−＿＿一一一細胞分裂＼
図1EGF作用の模式図
CV：COatedvesicle，EV：endocyticvesicle．E：endosome，MVB：muItiplevesicularbody，mRNA：メッセンジャーRNA，M：mitosome（マイトソーム）

A
B

4

COLjAJPSPl■ ノ ー 23日⁚n H H H

7

図2ヒトの第7染色体上にマップされたEGFレセプ
ター（EGFR）などの遺伝子

S7：細胞表面抗原．

ASエ：間充組織不全，∝m：増殖速度調節因子1，GS：
Greig症候群，βエγだ：ビリルビン還元酵素，〔／P：ウリ
ジンホスホリラーゼ，〟Aか〝：ヒドロキシアシルCoA脱水素酵素，〟か〟2：リンゴ酸脱水素酵素ミトコンドリ
ア型．Gと塔β：β−プルタロニダーゼ，皿A2：ジアホラー
ゼ2，〃〟：血友病転移，〃〃CPJ：非ヒストン性クロマ
チン蛋白質1．g：ヒストン，COエJA2：コラーゲンⅠα
2麦乱COエ3AJ：コラーゲンⅢα1乱用P：ホスホセリ
ンホスファターゼ，g相月：トリ赤芽症ウイルス由来の腫瘍遺伝子に相補なオンコジーン

Ⅲ 細胞生物学・細胞工学的研究

72

EGF

コ；：∑享諾

牢

t
t
C
iC
i

‖ H N

P

H抑＜⊃ぺ00日

無水
シトラコン西安cooH PH6・9
COOH

N H

SPDP

0

COOH

」

厨SSC礪HもH＜＞00H

COOH
NCCH2CH2SS
O

r

PH2．0

◎
H
CS

二三‥‥琵…二￡二票∑了…ESHS

iD
図3（分子量引．422）HOOC＜D一隅・く＞cooHb

HNCCHおH20﹁ ■﹁㍉宰

牢

NH

t
t
C
iC
i

HN

F

SPDP

インスリンやEGFのアミノ基にリシンのAサブユニット（R忙a）を接合する方法
EGFレセプターに対するモノクローナル抗体にもRICaを接合できる

C 卜3
％
0

望思王で恕仙胡￣

6A 1 −14

3

4

lコ
1、 丘

H35

50

3T3

0

1

2

5

6

tNS−OTa，×10●aM

図4 インスリンーDTa薙合体やリシンA一モノクローナル抗体ヰ合体に社扶性の変異凍Cト3はマウス線維芽細胞Swiss／3T3珠から得た．6A1−14はラットへパトーマH35株から分離した．87はヒトA431珠から得た．

13 細胞の増殖と分化に関する細胞遺伝学的研究

ア毒素のAフラグメントやリシンのAサブユニッ
トに，EGFやインスリンを連結させた毒性ホルモンを合成し9，10）（図−3），それらを用いてレセ
プター欠損株，エンドサイトーシス欠陥株，シグナル応答不能株など数種の変異株をすでに分離している（1ト13）（図−4）。今後，これらの変異の性状を生化学的・分子生物学的に解析することによって，詳しいメカニズムと遺伝制御の解明を進め
ていく。

73

∫rmCJ〟re α〝d 凡〃Crわ〃，（ed）Hruby，VJ．pp．
681・684，PierceChem．Co．（1983）．
5）Shhlku，N∴ 如 月ecepror∫ α〝d Recog〃frわ〃，（ed）Goodfellow，P．N．，B・16，Pp．109−142，
ChapmanandHau（1984）．
6）Shimizu，N．，Behzadian，M．A．and Shimizu，Y．：
PIOC．肋rJ．dcαd．gcム闇，77：3600−3604（1980）．
7）Kondo，I．andShimizu，N．：Cytogenet．CellGenet．，
35：9・14（1983）．
8）Behzadian，M．A．，Shimizu，Y．，Kondo，I．and
Shimku，N．：ぷ〃m〟．C切J Ge〃erリ 8：347−362（1982）．

9）Mid（imins，W．K．and Shimiz11，N．：Biochem．
βfop力γ￡ReJ．α）椚m以〃．，91：143−151（1979）．

文献10）Shimizu，N．，Miskimins，W．K．and Shimizu，Y．：
FFβ∫上eJLl18：274−278（1980）．
11）Mid（imins，W．K．and Shimizu，N．：Proc．Natl．
dcαd．gc．∽鼠4，78：445−449（1981）．

1）Mi永imins，W．K．andShimizu，N．：J．Cbttmysiot．，

12）Shimizu，N．，Mid（imins，W．K．，Gamou，S．and

112：327−338（1982）．
2）Miskimins，W．K．andShimizu，N．：J CbtlBiochem．，
20：41−50（1982）．
3）Miskimins，W．K．andShimizu，N．：J．CbltPhysi07．．

SHm加，Y・‥αJd砂山g肋占orCo所r印feのCegJ丹0日♪rα山0m，Grot山九 q／CeJ山 川
肋rmOrdJγかげgwd肋dgα，9：397−402（1始2）．
13）Shimizu，N．，Shimizu，Y．and Miskimins，W．K．：
CbJJgh凡〝Crリ9：203−212（1984）．

118：305−316（1984）．

4）Miskimins，W．K．and Shimizu，N．：in Peptides；

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法

14．モノクローナル抗体を用いた筋ジストロフィー鶏筋膜と正常鶏筋膜の抗原性の差異の解析

77

ほ 疾患モデル動物の研究における胚操作法の応用

81

16．筋ジストロフィー症遺伝子発現の標識

84

17．筋ジストロフィー症における筋分化のおくれと遺伝子調節機構

87

膜分画に検出された異常蛋白質

91

18．幼若ジストロフィー（mdx）マウスの

77

14

モノクローナル抗体を用いた筋ジストロフィー

鶏筋膜と正常鶏筋膜の抗原性の差異の解析

黒

は

じ

め

田

に

洋一郎

ナル抗体が含まれるはずである。

K6hlerとMilstein（1984年ノーベル医学生理学

図1のように，モデル動物でも，筋ジストロフィー賞受賞）によって開発されたモノクローナル抗ば

鶏（Line413）は単一の不完全優性筋ジス遺伝子をは，ガンの治療への応用をはじめ，医学・生物学

もち，対照正常鶏（Line412）は対立正常遺伝子をの分野で盛んに利用されている。モノクローナル

持っている。これらの遺伝子は発生分化の過程で抗体の利点として，特異性の単一な抗体がとれる

発現し，筋ジス遺伝子由来の遺伝子産物は欠損のことの他に，良いスクリーニング法があれば，抗場合を含め，おそらく他の遺伝子産物と2次的，原を精製せずに，すなわち目的の抗原が未知で3次的な影響を引き起こしながら筋ジス発症させ，あっても，その抗原に対する特異抗体が得られる

一方，対立正常遺伝子は，正常な筋肉を作ってい可能性があることが指摘できざ ，3三ここで述べる

く，と思われる。

研究は，モノクローナル抗体のこの利点を利用し筋ジストロフィー症の発症の部位と分子機序はて，ジストロフィー遺伝子と対立正常遺伝子の遺伝不明であるが，筋細胞膜の何らかの異常によると子産物の差をモノクローナル抗体を用いて検出し，の推定が多い。宇尾野らがすでに報告したようさど ，その遺伝子産物の本体を明らかにする目的で開始

筋ジス鶏培養細胞からのCPKの遊離が，細胞のされた。まず予備実験として，Duchenne型筋ジ破壊による非特異的なものでないと考えられたこ

ストロフィー症モデル動物としての研究が良く行とも筋ジス細胞膜の異常を示唆している。

なわれており，充分な数の個体が入手できた筋ジ筋ジス遺伝子由来と考えられる筋膜異常を探る

ス鶏（Line413），正常鶏（Line412）を用いた。

Strategyとして，筋ジス鶏と対照正常鶏のそれぞれの筋膜の間で抗原性の差を示すモノクローナル

Strategy

抗体をスクリーニングすることが考えられる。しDuchenne型筋ジストロフィー症は遺伝性疾患

かしながら，Line413，412の鶏の問では，筋ジスであるので，筋ジストロフィー症（筋ジス）遺伝

関連遺伝子以外の遺伝子もいくつか異なっているこ子と対照正常遺伝子産物の差が発症の有無を決定とが知られていざ ため，予備実験をかねてまず筋していると考えられる。そこでさまざまな遺伝子

ジス鶏（Line413），対照正常鶏（Line412）の筋産物に対するモノクローナル抗体の中からi筋ジ膜画分の間に，どのくらい抗原性の差があるかをストロフィー症に相関した抗原性の差を示すもの

モノクローナル抗体を使って調べてみた。

を選択すれば，筋ジスに相関した遺伝子産物が抗原性をもつ限り，その中に筋ジス特異モノクロー方法

1．免疫法とハイブリドーマの選択＊東京都神経科学総合研究所神経生化学研究室

筋ジス鶏（Line413），対照正常鶏（Line412）の

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法

78

Dystrophy Chick

gene千二（Line413）
I

gene

／／

⊂＝＝コ−感一一に＝コPrimaryDefectproducts去ヨ 圧志田 巴左S。C。ndaけDe一。Ct
lcpK，。Iease
Dystrophy

NormaL Chick〔＋／＋〕（Line412）」■■デ■▲Lr二プ十1￣一≡崇。CtS＝￣≡」≡N。rma一
Devetopment

図1．筋ジストロフィー鶏筋ジス遺伝子の遺伝子産物と発症機序の模式図

表1．筋ジス鶏，対照正常鶏の筋膜抗原に対するモノクローナル抗体
Dys−M ELISA‥筋ジス鶏筋膜を用いたELISAによるOD値
Nor−M ELISA：正常鶏筋膜を用いたELISAによるOD値

SpIeen cell

lst Test

immunized

No．orpositive No．ofpositive

lVith

lVell

DyStrOPhy

Dys−M ELISA Dys−M ELISA

membrane（＋＋＋，＋＋）Nor−M ELISA
42／192

2nd Test
lVell

2／42

NormalNor−M ELISA Nor−M ELISA

membrane（十＋＋．＋＋）Dys−M ELISA
51／192

＞3

1／51

＞3

14 モノクローナル抗休を用いた筋ジストロフィー鶏筋膜と正常鶏筋膜の抗原性の差異の解析

79

野化直後の胸筋からBarchiらの万感 に従づて筋膜を産生するもの192well中51wellとかなり高率

画分を調製した。この筋膜画分をそれぞれ蛋白量に見つかり，免疫が良好なことを示していた。

で200LLgずつ，BALB／Cマウスに2週間隔で3回

これらの陽性ハイブリドーマの上清を，第2段免疫した。最終免疫の4日後にマウスから牌膿細テストとして，筋ジス，対照正常の筋膜画分を結胞をとり，ポリエチレングリコールの存在下でミ合させたELISAプレートでアッセイし，両者のエローマ細胞（NS−1）と隔合させ，ハイブリドー

OD値の比が3以上のものを抗原性の差が有意でマをHAT法で選択した。

あるものとした。筋ジス筋膜画分に対して抗原性

2．ELISA（Enjyme−LinkedImmunosorbentが高いwellは42well中2well，対照正常筋膜画

Assay）分に対して抗原性の高いwellは51well中lwell

96穴プレートのwellの底に5′唱蛋白の筋ジス存在した。

鶏，および対照正常鶏の筋膜画分を結合させた

2．モノクローナル抗体の作製

ELISAプレートを用い，各ハイブリドーマの培

OD値の比が2以上のものを含めてホモELISA

養上宿液をアッセイした。第1段では，筋ジス筋系のみを使って試みにクローニングを行なったと膜画分で免疫したマウス由来のハイブリドーマはころ，・最終的に7個のクローンがとれた。これら

筋ジス筋膜画分ELISAプレートを用いる，といを腹水中で増殖させ，抗体を大量に得た。これら

うようにホモの系で，免疫した抗原に対する抗体を希釈し2種のELISAプレートを使って抗原性を産生しているハイブリドーマを選択した。第2の差を見た。ELISA陽性となる最大希釈皮を段では，第1段でそれぞれの筋膜画分に対する抗ELISAtitreとすると，筋ジス筋膜画分と対照

体産生が確認されたハイブリドーマの培養上活液

正常筋膜画分ELISAtitre値の差は最も大きなもを筋ジス筋膜画分，対照正常筋画分のそれぞれのので4倍であった。

ELISAプレートを用いてアッセイし，両者の反応性の差を，一定条件下のフェニレンジアミン発考察

実験結果はLine413とLine412の筋膜の抗原

色のOD値の差で測定した。
3．クローニングと抗体の大量調製

性が筋ジス遺伝子産物の有無以外にも大きく異っ筋ジスと対照正常筋画分で抗原性の差を示すハていることを示している。すなわち．Line413とイブリドーマのクローニングを試みた。限界希釈

Line412の筋膜画分の間で抗原性の差を示すモノ法を用い，クローニングは2回以上行なった。ククロナール抗体産生ハイブリドーマの出現率は，ローン化されたハイブリドーマをBALB／Cマウス

どちらの筋膜で免疫した場合も約2−5％とかなの腹腔内に注入して数週間増殖させ，蓄積したモり高率であった。この原因としては，①筋ジス関連

ノクロナール抗体を大量に含む腹水を得た。

遺伝子の発現が貯化以前にかなり早く起こっており，
2次3次的影響がすでに筋膜に及んでいる，㊥Line結

果1．ハイブリドーマのスクリーニング

413とLine412の間の遺伝子背景はかなり異なっており，筋ジス関連遺伝子以外の遺伝子が，筋膜画免疫マウスから採血し，血清中の抗体価が一番分にも発現して差を生じている，ことなどが考えら高いマウスの牌臓細胞を用いたハイブリドーマのれる。今回の予備実験の結果では，そのどちらか

スクリーニングの結果を表1に示す。第1段のテは断言できないが，もともとLir紀413，Line412

ストで，それぞれ陽性皮の高いハイブリドーマは，は近交系をbaseにしたものではなく，遺伝子背景

筋ジス筋膜画分に対する抗体を産生するもの192

についての考慮はなしに継代されてきたものなの

well中42well，対照正常筋膜画分に対する抗体

で，㊥の可能性はかなり高いと考えられる。

80

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法

最近，Line413，Line412のこの欠点を補うた

御援助下さった芋尾野先生に感謝いたします。

め，近交系鶏GSN−2にLine413の筋ジス遺伝子をcross−inter cross法で導入したGSN−2／amが開発されつつある。これらの鶏を使って㊤の可能性を少なくすることにより，さらに筋ジス特異モノクローナル抗体の検索を検討しようとしたが，現在までのところ，この方法によるモノクローナ
ル抗体のスクリーニングに充分な実験系が得られていない。良い実験動物系がこの種の疾患研究のキーポイントであり継続的な開発が切望される。
今回は将化直後の筋膜画分を抗原として用いたが，抗原の種類，抗原をとり出す発生段階については原理的には制限がない。ただ，抗原が粗であればあるほど，発生段階が筋ジス遺伝子発現後遅くなればなるほど，筋ジス遺伝子産物に対するモ
ノクローナル抗体がとれる確率は相対的に低くなることは自明である。また試験的に行なったクロー
ン化の実験結果は当然のことながら，抗原性の差を目安にクローン化を行なう必要性を示している。
本研究は，国立静岡病院院長 芋尾野公義先生，
都立神経病院神経内科 高元喜代美先生との共同研究として開始されたものであり，ことに御指導，

文献1）K6hler，G．＆Milstein，C．：Continuousculturesof
fuSed cells screenlng antibodies of predefined
SPeCificity．Nature，256：495−497，1975．
2）小林和夫，黒田洋一郎：細胞表面抗原に対するモノ
クローナル抗体（1トELISAを用いた」欠スクリー
ニング，神経化学，21：378−380，1982．
3）黒田洋「郎：神経系機能分子のモノクローナル抗体
一新しいStrategyとその可能性。「生理情報発現の分子機構」公開シンポジウム要録，文部省総合研
究「生理情報変換システムの研究の展開」．1−18，
1983．
4）Wilson，B．W．，Randall，W．R．，Patterson，G．T．＆Entrikin，R．K．：Majorphysiologicandhistochemi−
Cal characterics ofinherited dystrophy of the

Chicken．Ann．NY．Acad．ScL 317：224−246，
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5）字尾野公義，黒田洋一一郎，高元喜代美：ジストロ
フィー鶏・培養筋細胞からのCPKの遊離。厚生省「筋ジストロフィー症の発症機序に関する臨床的研究」。三好班，昭和57年度研究報告書：75−77，
1983．

6）水谷誠：筋ジストロフィー鶏413とコントロール鶏
412の遺伝的背景の差異とcongenic strain の必要性。厚生省「筋ジストロフィー症動物の生産・開発に関する研究」。野村班，昭和55年度研究報告書：1981．
7）Barchi，R．L．，Bonilla，E．＆Wong M．：Isolationand characterization ofmuscle membranesuslng
Surface−SPeCificldbels．L｝oc．jVatt．Acad Sci．

服1，74：34・38，1977．

81

15 疾患モデル動物の研究における胚操作法の応用

勝

木

元

也

研 究 目 的

できることを示して来た。筋原性として知られ

ヒト筋ジストロフィー症の治療法を研究するにるヒト疾患のモデルとしては，やはり筋原性のは，疾患の機構がヒトと共通性をもつモデル動物

モデル動物が必要であると考えられ，まず診断をを作ることが動物実験にとって必要なことである。

する必要があるからである。キメラ法は，実験動従来，ニワトリ，ハムスター，マウスなど，症状がき物班の作成したものを解析することによって本研わめてヒト疾患と類似している実験動物を用いた究に重要な役割を果すものと考えられる。

筋ジストロフィー症の研究がなされて釆たが，必㊥胚操作法によるモデル動物開発法として有望

ずしも症状の類似性によるモデル動物の選択が有なものの一つは，外来遺伝子DNAをもつマウス用であったとはいえない。自然界又は飼育コロ●（transgenicmouse）を作ることである。とくにニー中に出現する筋ジストロフィー症様のモデル

ヒト筋ジストロフィー症と遺伝的背景が原理的に動物を，これからも探索することは必要且つ有意同一のマウスを作ることができれば理想的である

義であるが，一方近年の胚操作技術を用いてヒトといえる。そこで，tranSgenicmouse作成のた疾患と機構論的に要因を同じくするモデル動物をめの技術の確立を，すでに我々がクロン化したミ作る方法が検討されてもよいと考えられる。

土リン塩基性タンパク質遺伝子DNAを用いて検組換えDNA技術，細胞工学技術，胚操作技術

討した。

は，それぞれ独自の方法論と原理にもとづく進歩ばかりでなく，相互の技術を総合的に使いこなせ

研 究 成 果るまでに発達した。これらの技術を，疾患モデル①新しく見出されたマウスの筋ジストロフィー

動物の開発に適用する目的で，本年度は技術開発症様系統であるmdxは，Ⅹ染色体に生じた突然変と，ヒト筋ジストロフィー症のモデル動物作成の異である。ヒト筋ジストロフィー症のモデルとな可能性についての検討を行なった。

り得るかどうかの一つの指標は筋原性であるか否かであろう。そこで，mdxとBALB／Cとの間でキ研 究 方 法メラマウスを作り，筋原性であるか神経に由来す①ヒト筋ジストロフィー症の実験動物の開発とるものであるかの決定を試みた。C57BL／10mdx

供給に関する班では，マウスの筋ジストロフィー

HBALB／Cは，それぞれの系統のGPIのパターンが症として知られるdyおよびmdx系統が，健常な

btypeおよびatype，被毛の色が黒および白であ近交系マウスとキメラを作ることによって，筋ジることから，生まれた個体キメラ性は，酵素および被ストロフィー症の症状を示す原因となる組織（例

毛の色によって確認できる。今回の実験では，14個のえば神経，筋，消化管など）が何であるかを診断

集合胚を移殖し，5匹のキメラマウス（82匹，♀
3匹）を得た。披毛の色から判断する限り，mdx＊東海大学医学部＊（兼）（財）実験動物中央研究所

由来の細胞の方がキメラ個体に占める割合が多く．

82

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法
8

pBR322

姐一血ユ1
3．3出）

hll
PP

＿

＿，卿¶jeqNA⊂：ここコcoN▲
E＝＝コSV▲O DNA

叫厄日
図1．BP遺伝子導入用プラスミド

キメラのパターンに偏よりが見られた。今後は，当該遺伝子のプロモーター部分に，CDNAを連結

個体数を増やし，組織化学的に，症状の原因となし，受精卵へ注入した。（図1）

る組織を調べる予定である。

注入法は常法によると）その結果，操作卵の約20㊤外来遺伝子DNAのマウス受精卵への注入法の検％，64匹が仔動物として得られ，合計5匹にDN討を，マウスミエリン塩基性タンパク質遺伝子DAが組み込まれていることがわかった（表1）。

NAを用いて行なった。PBR322をベクターとし，ミエリン塩基性タンパク質遺伝子に大きな欠失15 疾患モデル動物の研究における胚操作法の応用

83

表1．BP遺伝子導入マウスの作成
strah lJllectlon traJlSferred tDm tranS官enlc

BAl月／0−り十223

B皿8／e一十／sl止37

BA1月／C−Shl／sh1259

138（61．！痛）16

14
2−3（10．1）（14．2−21．4）

2

1−2（43．2）（12．5）（50−1∞）

159（61．4）

13
（8．2）

0
（0）

があることが証明されたシバラー2）では，行動異た部分を含むDNAを分離する必要がある。他の常が認められるが，この突然変異系統にも同様に班員によってなされることを期待し，単離できれDNAを注入し，行動異常の回復が起るか否かを検ば，すぐにマウス胚への導入は可能である。

討した。その結果Shi／shiのようにホモ型の遺伝子

今後は，ヒト型のモデル動物を作ることを第Ⅰをもつ仔動物への外来遺伝子の導入には末だ成功の目標として研究を進めたい。また，キメラ法はしていないが，Shi／十のようにへテロ型のものは少診断法として有力であることを付け加える。

なくとも1匹生まれた（表1）。現在，それらの仔最後に，ヒト型でないと解かった動物は，疾患動物からFlを作り（約20匹誕生），Shi／shiに外来の動物ではあっても，疾患モデル動物ではない。しミエリン塩基性タンパク質遺伝子が組み込まれた

たがって，筋ジストロフィーに苦しむ人々の事を場合の行動について検討中である。

考えればヒト型の実験動物を見極めることが重要であると考える。

討論と今後の課題
胚操作による疾患モデル動物の開発法は，筋ジストロフィー症研究の場合にも重要な方法の一つであると考えられる。その方法および技術は，ほぼ確立したといえる。そこで実際に筋ジストロフィー症動物を胚操作によって作るには，ヒトの変異し文

献1）マウス初期胚の培養と厩徴操作
勝木元也 生体の科学室，90−95（1984）．
2）Molecular Genetic Analysis of Myelin Deficient
Mice：ShiveTmutantmiceshowdeletioningene（S）
COding for myelin basic protein．Kimura，M．etal．：′〃e〟rOC力em．inpress．

84

16

筋ジストロフイ症遺伝子発現の標識
我々の研究の現況と今後の方向

香

研究協力者

務＊

川

棋 永 剛

一＊

望

之＊＊＊

Ⅰ 筋ジストロフィ遺伝子発現とその病像

典

北

野

博

司＊＊

経の変性に至る過程については，未だ全く解明さ筋ジストロフイ（筋ジスと略す）症は骨格筋のれていない。この過程が明らかにされれば，遺伝進行性の破壊と再生を主徴とする遺伝性疾患であ子の異常を直す事が出来ないとしても，本疾患のる。本症では骨格筋の他．神経細胞，線維芽細胞，発症を予防する事が可能になるかもしれない。

赤血球等の諸細胞にも，形態学的，あるいは，生筋ジス骨格筋内では，以上述べた様に，筋線経

理学的な異常の存する事が報告されている。本症の変性と再生が，同時に平行して進行しており，の骨格筋の病像は，（1）筋ジス遺伝子の発現から，その病的過程は極めて複雑である。従って，筋ジ筋緑経の変性に至る過程，（2）それにつづく筋緑経

ス動物骨格筋は，そのままでは，遺伝子発現からの再生とその再生筋線経の変性の過程．の二つに筋変性に至る過程の解析のための研究材料として，分ける事が出来る。筋ジス筋の再生については．

必らずLも適当であるとは言えない。

近年多くの報告がある。我々は，ラジオオートグ

Ⅱ 筋ジストロフイ症研究におけるin vivoでのラフイの方法を用いて，In vivoにおける正常及筋線維分化の実験系の意味

び筋ジス筋の再生の研究を行い報告した。1）その我々は正常，筋ジス発症マウス骨格筋に高張食結果は下記の通りである。（1）再生筋線経は再生の塩水を注射して，筋の再生を人工的に誘起し，そ早い時期から，その平均の直径が異常に大きく，の過程で出現する各筋由来筋芽細胞を分離し．多直径の大小不同がみられた。（2】殆んど全ての再生細胞培養，及び，クロン培養下で筋線経に分化す

筋線経の直径は，次第に細小化し，再生開始3ケ

る実験系を開発した予3・4）両培養条件下で，正月以内に変性，消滅した。（3）再生3ケ月後においても，極めて少数であるが，殆んど変性を示さな

常（C57BL／6㌦），筋ジス（C57BL／6J
dy／dy）動物由来の筋芽細胞は，いずれも．構紋

い再生筋線経が認められた。以上の結果から，元を有し，自発収縮を示す筋線経に分化した。しかの筋線経の変性と再生筋緑経の変性の過程が非常し，いづれの筋線経も多細胞培養下で，1ケ月以に類似しており，この事は，両者の変性の機作が内．クロン培養下で，20日以内に細小化し変性し同一である事を示唆している。筋ジス筋の再生過た。正常．筋ジス間で，明らかな差を認めなかっ程については，以上の如く，次第に明らかにされた。この培養条件下における筋線経の変性の過程つつあるが，一方，筋ジス遺伝子の発現から筋緑は，筋ジス動物内における変性とは形態学的に明＊国立療養所 刀根山病院＊＊国立循環器病センター＊＊＊大阪市立大学医学部

らかに異っていた。この筋線経は．いづれも，サ
テライト細胞に由来しており，従ってこの筋線維分化の過程は．in vivoにおける筋の再生過程に

16 筋ジストロフィー症遺伝子発現の標識−我々の研究の現況と今後の方向85相当すると考えられる。前記した如く．invivoの筋芽細胞のクロン培養を行ない，各分化段階のにおける元の筋緑経の変性と再生筋線経の変性の筋繰経のCKアイソザイムパターンを両者の間で機作が同じものであれば．この実験系も．筋ジス比較した。その結果，両者の問で遺伝子の相異が遺伝子発現のモデルとして．使用出来ると考えてあるにも拘らず．各分化段階にある筋緑経のCKいる。この系では二次的な筋線経の再生も見られアイソザイムパターンは，正常，筋ジス問で完全ず，特にクロン培養では．線維芽細胞の介在がなに一致した。この事は，CKアイソザイムに関す

く．同一コロニー内での筋線経の分化は，比較的る遺伝子は筋ジス遺伝子座にある遺伝子とは関係同期的に進行する等，in vivo における筋ジス

ない事を示している。正常，筋ジスマウスの血清

筋組織に比し，はるかに単純な実験系である。我や筋組織のCKアイソザイムパターンの相異は，々は，今後も，この実験系を用いて，以下の細胞

筋ジス遺伝子発現の直接の表現ではなく，恐らく，生物学的，生化学的，免疫学的な研究を進めたい

筋ジス動物内での筋線維変性に伴って，二次的にと考えている。

再生された未分化筋線経の存在によるものと推定

Ⅲ 今後の研究の方向される。Duchenne型筋ジス患者の血清や筋組織a）細胞生物学的研究のCKは，正常人のそれに比し，MB成分の多い

上記の様に，我々の実験系での筋緑経の分化の事が報告されている。我々の結果から，これら，過程や，分化した筋線経の形態は．正常と筋ジス

筋ジス患者のCKアイソザイムの異常も，Duch−との問で差を認めなかった。しかし，両者は相互

enne型筋ジス遺伝子発現の直接の表現ではなく．

に異った遺伝子を有している事は明らかな事実で再生した未分化筋線経の存在によるものと考えらある。この培養条件下では，（1）筋ジス遺伝子が未れる。In vitroで分化した，変性も再生も伴わだ発現していない。（2）すでに発現し．筋ジス筋緑ない状態での正常，筋ジス筋緑経の各細胞成分の経に蛋白の異常があってもこの培養条件下では，生化学的な比較は，筋ジス遺伝子発現の研究の一

筋緑経の変性が起こらない，の二つの可能性が考つの重要な方向であると考える。しかし，筋細胞えられる，今後筋ジス筋緑維のみが，変性を起こ

でdy−遺伝子が発現しない場合，この研究は無意す培養条件を検討する事を考えている。筋ジス遺味である。

伝子発現の形態的標識としては．筋線維経の増大

C）免疫学的研究

や，大小不同をとるべきであると考えている。

筋ジストロフイ症の様に．遺伝子の働きも又そb）生化学的研究の発現の標識も知られていない場合，この遺伝子

我々は，微量の筋線経のCKアイソザイム解析

あるいは，その発現の標識を特定する方法として，の方法を開発した。5）その結果，クロン培養下で分（1）遺伝子工学により，正常動物と筋ジス動物の遺化した筋繰経のCKアイソザイムをコロニー単位

伝子を直接比較する，（2）免疫学的方法によって，で解析する事が可能となり，筋緑経の分化の程度

この遺伝子の突然変異に対応した蛋白の変化を検と，CKアイソザイムのパターンとの相関を，よ出する，の二つの方法が考えられる。

り明確に，とらえる事が可能になった。正常，筋
ジスマウス血清のCKアイソザイムは，いづれも．

dy−locusの遺伝子だけが異り，そのバックグ
ラウンドの遺伝子がすべて同じである一組の動物

MM．MB，BBの三つの成分からなる。しかし，があれば，その間で，相互に免疫する事は，dy−

後者ではBBの比率が明らかに高い。正常．筋ジlocus 上の遺伝子の突然変異に対応した蛋白をスマウス問のCKアイソザイムパターンの違いが，純粋に取り出して，免疫するのと，理論的には同筋ジス遺伝子発現の直接の表現か否かを判定するじである。我々はこの考えをもとにして，免疫学為に，次の実験を行った。6）両マウス再生筋由来的な実験を始めているが，その問題点につき，次86

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法に述べる。

必要である。なお．筋ジス筋を抗原として用いる日）実験動物C57BL／6J系，129ReJ

場合，筋線経の変性の結果．変性した蛋白が筋ジ系マウスとそれぞス遺伝子の発現と関係のない抗原になる可能性がれの突然変異（dy／dy又はdy2J／dy2J）：バあり，注意を要する。この場合．in vitroで分ックグラウンドの遺伝子が，出来るだけ同じであ化した，変性筋線経を含まない筋ジス筋線経を抗る為に，同胞中の正常（＋／＋）個体と筋ジス動物

原として，使用すべきである。正常動物組織を抗が必要である。上記突然変異は，いづれも．常染原とする場合，この種の問題はない。

色体性劣性遺伝であるため．正常（＋／＋）個体を我々は，以上の考えに基づき，近交系の正常，得ることは一般に困難である。最近C57BL／10

筋ジスマウス問で相互に免疫し，筋ジス遺伝子発系マウスで伴性劣性遺伝を示す筋ジスの突然変異現の結果，産生される異常な蛋乱 あるいは，そ（mdx）が発見された。この系谷とキアリアとのFlのの結果．産生されなくなる正常蛋白に対するモノ

正常谷と発症谷の組み合わせは，この研究のため，

クロナール抗体を作る事を当面の目標にして，研現在考えられる最も理想的な組み合わせであろう。

究を進めている。

日日 近交系動物問での免疫成立の可能性
極めて少数の遺伝子だけが互いに異なる近交系
動物間で免疫が成立するかの疑問がある。皮膚移植に関してEichwaldらは，ある純系マウス間で，谷の皮膚を♀に移植した場合．移植片は拒絶されたと報告している。これは，皮膚移植という特別な例であるが，この事実は，純系動物間においても，遺伝子が異なれば免疫が成立する可能性を示

文1）橋本孝二北野博司，山崎君江，巽典之，香川務（1984） 第17回日本発生生物学会
2）Kagawa，T．，Chikata，E．，and Tani，J．（1977）．
pgyebp．βわエ55，402．
3）Kagawa，T・，Chikata，E．，Tani，J．，andTsutamune，T．（1978）．伽yebp．βわ165，526．
4）Kagawa，T．，Chikata，E．，andHamano，R．（1983）．
In 肋∫C〟kr勒JけOpカタ，βわC如m血Jd岬eCJ∫（eds・byしている。

（iji）抗原の条件
筋ジス遺伝子の発現は筋組織で起るとの証拠は現在なく，筋以外の組織を抗原として用いる事も献

Ebashi，SリandOzawa，E．）Japan

Sci．

Soc・Press・Tokyo and Springer−VeTlag．Berlin，HeiderbergandNewYork．

5）香川務，北野博司，楳永剛一（1983） 第16回日本
発生生物学会6）棋永剛一，北野博司，香川務（1984） 第17回日本
発生生物学会87

17筋ジストロフィー症における筋分化のおくれと遺伝子調節機構
真 崎 知 生＊
研究協力者

吉 川

昭＊＊

筋ジストロフィー症は遺伝性の疾患であり，そにおいても認められる筋蛋白分子種の胚あるいはの筋は若い時期には正常であるにもかかわらず成胎児型から新生児型へ，さらには親型への変換が，長に伴ない進行性の筋萎縮をおこす。最終的に．

ジストロフィー筋では遅延するという現象である。

筋細胞は萎縮，崩壊をおこし消失して行くが形態

この現象はLDHアイソザイム，ミオシン，トロ

学的に異常が認められる以前の状態では筋細胞そ

ポミオシン，C−蛋白などの蛋白に於いて観察さのものの異常は認めにくいのが特徴である。したれる。1・2）同様に筋細胞がジストロフィー筋に於がって形態学的異常の見出されない発症前におけいて幼若型にとどまる，あるいは筋分化が遅延する研究もある一時期の状態を比較するかぎり発生るという事実は以下に述べるように筋蛋白合成速に伴なう変化あるいは疾患による二次変化を混同

度，DNA量の問題，筋細胞核のポリADPリボする可能性があり，これまでの研究報告の中にもース合成酵素活性に於いて認められる。本報告で研究者間の不一致が生ずる原因となったと考えらはこれらの成果をまとめて報告し．さらに今後これる。すなわち筋細胞の構成要素は質的にも量的れをどのように発展させて筋ジストロフィー症のにもその発生分化の過程で，あるいは，疾患，外病因解明のための研究を展開させるかについて述部環境の変化等でかなりの程度変化しうることがべる。

わかっているので，このことを考慮した病因解明

筋ジストロフィー症の罷患筋に於いて蛋白分解のための研究がなされなければならない。しかし，

酵素すなわちカルシュウム依存性．中性プロテア

このような研究は疾患筋の各発育段階の筋の試料

ーゼ，セリンプロテアーゼなどの活性が高まってをある程度の量必要とすることから今までは研究いることは知られている㌔，4，5）

がなかなか発展しなかった。ところが過去十年間

しかし，発症以前のかなりはやい時期の筋ジスにおけると卜の筋ジストロフィー症類似の症状を

鶏胸筋では蛋白分解酵素活性はそれほど高くない示す筋ジストロフィー鶏（筋ジス鶏），筋ジスト（表1）。これに対してジストロフィー鶏胸筋にロフィーマウス（筋ジスマウス），同ハムスター

おける筋蛋白合成能は，胚の頃にすでに高い値をなどのモデル動物の開発によってこの間題はほぼ示していることが示された。7）さらにこの蛋白合

除かれて，この観点にたった研究が数多く報告さ成能の増加の原因として，少くともアミノアシル

れるようになった。これらの研究成果の中で特にtRNA合成酵素活性の上昇，蛋白合成延長因子

注目すべきことは，筋の発生分化に伴ない正常筋

1および2（EFl，EF2）の細胞質中での活性が高いことがわかった了）またさらに細胞質中のE＊筑波大学基礎医学系

F2の定量によりこの細胞質中のEF2の活性の＊＊埼玉赤十字血液センター研究部

高まりは，その量的増加に帰せられることが示さⅣ 遺伝子発現とその研究方法

88

表1．筋全体の蛋白分解活性筋スライスを訂OC2時間反応させることによって反応液中に遊離された全テロシン塁を測定した。6）nmole tyrosine／mgprotein／hr
平均値±標準誤差 筋ジス鶏胸筋（Dys）正常鶏胸筋（Nor）
19−day−tnbry0

4一reek一〇ld

Nor（6）

4．83士0．40

2．67士0．19

Dy8（6）

4．29士0．17

2．83士0．1，

表2．正常および筋ジス鶏胸筋の筋湿重量とミオシン含量

19−血y一拍bryo IIor（3）

Rr亡88t nu8Cle
V針［Velght

Br亡▲Jt nu■亡lt／
Body vd主bt

く8）

（8）

（工）

25．4±2．50・33±0・03

1．34±0．2234．3±0・67

Body Vdgh亡町081tl／br
nu且Cl亡■t（ng）／（g）

24．3±1．1

0．39＋0．03

1． 0±0．12

33・0±0・80

4−Ⅴ亡七七一01d tbr（5）214 ±1414．5 士0．92．78±0．06

26．2±0．87

Dyさ く5）181±817．4 ±0．58

9．46±0．57＊

2 ・2±1・41

8−Vetk−01d yor（3）792 ±32

67．7 ±7．2

8．50±0・68

20．3＋2．80

Dy8（4）

606 ±27

63．7 ±2．6

1n・57±0・84

18．4＋0．71

Dyさ く4）

t St8tl■tlC811y81gnlflCmt（Pく0．05）

れた㌔）このような結果から考えると発症以前の発症後に認められる筋細胞の崩壊に伴なう筋細胞

筋細胞では正常筋に比して，蛋白の蓄積が大きくの再生現象と同一のものか否かという問題を提起なければならない。事実，筋ジス鶏においては19する。しかし再生現象に先行する筋細胞崩壊像が日胚，13日胚と若い程細胞質蛋白質量が多く，醇

形態学的にも．この段階ではきわめて少ないこと

化後日を追って次第に下り発症後は，正常よりもなどからジストロフィー筋に於けるこのような細胞質蛋白質の密度は低くなってゆくJ）しかし，筋の幼若化現象は，ジストロフィー筋特有なもの

構造蛋白であるミオシン量に関しては筋ジス鶏胸と考えたい。この事実はさらにジストロフィー筋

筋湿重量あたりの値は正常鶏のものと変わりがない

細胞核におけるポリADPリボース合成酵素活性（表2）。さらに表3に示されるように筋ジス鶏と，その産物ポリADPリボースが正常に比して胸筋では筋の湿重壷あたりのDNA量が多いこと高いという事実からもわかる11，12）（図1）。このが示されている。しかし20日胚の胸筋では，筋ジ酵素の機能と筋分化に直接の関連があるか否かはス，正常鶏共にほぼ同じ値を示している。このよ

明確ではないが，細胞核のこの活性が高いと筋細うな事実は，いずれも筋ジス鶏胸筋が正常筋にく胞は未分化な状態にあり，筋分化に伴ってこの活らべて幼若型であることを示していると思われる。

性が低下することが知られている。13）ジストロフ

しかしこのことは同時にこの筋ジス鶏胸筋が萎縮

ィー筋では筋成長に伴なうこの酵素活性低下はか

17 筋ジストロフィー症における筋分化のおくれと遺伝子調節機構

89

表3．正常および筋ジス鶏胸筋におけるRNAとDNAの濃度。
RNAはFlek9）らの，DNAはBurtonlO）の方法で測定した。平均値±標準誤差，用いた試料数は（）の中に示してある。
Rl払／V．V．
（pg−P／g）

m札〜．V．
（喝／名）RNA／D仙（翔一？／叩）もTea■t t肌柑elt
ム﹁
7

1

く ノ
8

2

▲ 8

2．23±0．14
2．03＋0．06〇 ′161± 3
165＋ 8

1

（5）

′ ○

（5）

Dy8

t 一

Nor

2

0．43±0．04★

1

124±15■

5

（4）

9

（4）

Dy8

1

（4）

Nor

8

（4）

Dy8

9

Yor

1

（5）

′ 0

l−year−01d

（5）

Dy8

く5）

︻ J

5−Vetk一〇ld

柚汀

（5）

Dyさ

t ノ

2−Veet一〇ld

185± 93．34±0．09
215±113．27±0．06
198± 61．05±0．18242±13★ 1．52±0．1小233±11 1．01±0．06
279±251．42±0．04★
183±160．99±0．07

yor

t 一

20−day−enbry08CardlaC nu8Cle
2▲■J

2−Ve亡k−01d

l

一 7
8

★St且t18亡1亡ally dgtllfl⊂8nt（▼く0．05）︵？Qr X∈dU︶

ヱ冨王u＞の ∝dq＜IhlOd

btCh

190E IWうW

3W

4W

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￣

1Y

Age

図1．筋ジス鶏卜）と正常鶏（0）胸筋における細胞核のポリADPリポース合成酸素活性の筋分化，成長に伴なう変化。

90

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法なり遅延する。前述の正常の筋分化に伴なうアイ

うにして調節されているかという問題を研究する

ソザイムの変化や蛋白合成速度の促進は正常細胞ことであるように思われる。筋分化の過程におけ核におけるポリADPリボース合成酵素活性の低るミオシン分子種の変化の問題は蛋白レベルで大下がおこるかなり以前から認められる現象である

変よく研究されており，また最近は遺伝子レベル

が，これに引続いておこるこの酵素活性低下の現の研究も進んでいる。したがってまずこの問題を象においてもジストロフィー筋は正常筋にかなり追究することによって方法論的な確立を行うこと遅れている。しかも筋病変がはじまり筋萎縮がはが良策であるように考えられる。しかしヒト筋ジじまると，筋再生が盛んになるにもかかわらずか

ストロフィー症の異常はⅩ染色体上にあることがえってこの酵素活性が低下することは再生核によ指摘されていることから，いずれはその最もよいるポリADPリボース合成酵素活性の上昇が発症指標を選択してそれによって研究を進展させねば前の筋核のそれに対してそれほど大きく寄与してならないと考えている。

いないことを示していると考えられる。このよう
文に正常筋におけるアイソザイムの変化や蛋白合成能の変化は筋分化と密接に関連しており，筋ジス
鶏胸筋においてはこれが遅延していることがかな
り明確に示された。14）そこでこのような筋構成蛋
白質の合成と分解による量的バランスを欠く状態に長くとどまっているということが成長過程における環境変化への形態的，生化学的不適応を生じ，筋萎縮，筋崩壊をもたらすことがまず考えられる。
しかし，最も基本的な問題は筋ジス鶏筋が何故このような幼若形にとどまるかという問題である。この幼若化のために筋細胞がそれ自身であるいはそれに伴なう外的要因によって萎縮して行くと考えられる。
この真の原因はやはり遺伝子とその発現の機構に求められなければならない。蛋白代謝あるいは
polyADPリボース合成，あるいは蛋白分子種の変遷における筋ジスと正常鶏の前述のような差はこれから先の遺伝子レベルにおける研究においてよい指標となり得ることが考えられる。そこでひとつの方法は今までよく研究されてきたミオ
シン分子種に注目し，その遺伝子の発現がどのよ

献1）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H．and Matsuda，R．（1980）．fEβ∫上e払，120，195−198．
2）Takeda，S．and Nonomura，Y．（1980）．Biomed，ReJ．，1，176−179．

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4）Sanada，Y．，Yasogawa，N．and Katsunuma，N．
（1978）．√βbc鮎川．，83，27−33．
5）Suzuki，K．，Ishiura，S．，Tsuji，S．，KatamOtO，T．，
Sugita，H．andImahovi，K，（1979）．fEβSLetf．，
104，355−358．

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7）Yoshikawa，A．andMasaki，T．（1981）．J．Biochem．，
90，1775−1786．
8）Yoshikawa，A．，Takan0−Ohmuro，H．and Masaki，T．（1983）．〃〟JCJe

7（7Ak〝β，7，733−740．

9）Fleck，A．and Munso，H．N．（1962）．BiochEm・
βわp力yg．Ac細り55，571−583．
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PP．163−166，AcademicPress，N．Y．
11）Yoshikawa，A．and Masaki，T，（1983）．」叶oc・
九戸〃〃dcdリ59，198−202．
12）Yoshikawa，A．and Masaki，T．，（1984）．FEBS
エerrリinpress．

13）Caplan，A．I．，Niedergang，C．，Okazaki，H．and
Mandel，P．（1979）．伽リ．βわ7．，72，102−109．
14）Masaki，T．and Yoshikawa，A．（1983）．Muscular
Dystrophy．BiomedicatAspecl，99−107．

91

18

幼若ジストロフィー（mdx）マウスの膜分画．に検出された異常蛋白質
野々村 禎 昭＊
研究協力者 小 浜 一 弘＊ 江 崎 孝三郎＊＊野 村 達 次＊＊

新しく利用が可能となったmdxマウスは，筋ジ7，000×gの沈殿は4倍量の0．2mMATPを含ストロフィー症のモデル動物として種々の利点をむGuba，Straub液にsuspendL，1．5時間の問持つ1三 そのひとつに生まれた子孫は，100％発症

0℃に保ち，収縮性蛋白質を抽出した。15，000×g，する事が保証されている事があげられる。我々は15分遠心により末抽出物を除去した上清に10倍非常に幼若な時期において，まず最初に出現する量の冷水を加えた。生成した沈殿を遠心により集徴候を発見する目的で若い週齢のmdxマウスの筋

め，2mMNaHC03を含む0．5MNaClに溶解し細胞膜及び小胞体の分画を試み，同じ週齢のコンた。これをMyosinBと呼ぶ。

トロールマウスと比較した。

membrane fractionは特に酢酸ウランによる負筋成長及び微細形態上異常の検出されない若い時期に，膜分画を構成するいくつかの異常糖蛋白

染色後，電子顕微鏡により膜分画であることを確認した。（図2）

質がすでにあることを報告する。
2．SDS存在下のポリアクリルアミド電気泳動
実

験

方

法

1．膜分画・その他の調製（図1）（SDS PAGE）。
Laemmliの開発したSDS PAGE2）をmini−

3．5週齢と6週齢のジストロフィーmdxマウス（割Slabを用いて行った。上段を8％，下段を16％とと，コントロールC57BLマウス（封の両後肢を股するアクリルアミドゲルを用い，同時に高分子量

関節より切断し，筋をすべて遊離した。重量を測と低分子量の蛋白質を分離できる様にした。

定後，3倍量のTKM液（20mMTris−HC160m
MKCl，5mMMgCl2，pH7．5，生化学的取扱い

染色はCoomassiebrilliantblue，又は，Stains
一allを用いた。

時に蛋白質分解酵素の阻害及び蛋白質の腐敗を予防する目的でDFPとAF2を加えている）中でポ

3．電子顕微鏡観察のための標本作成。

リトロンを用いて筋を破壊した。このhomogenate

後肢筋遊離時に縫工筋の一部（約1cmxO．5cm）

を7，000×gで10分遠心した。得られた上宿をさを別にして，型通りグルタール・アルデヒド固定

らに100，000×gで30分遠心し沈殿を得た。このを行った。オスミウム酸処理後，酢酸ウランブロッ

沈殿をTKMにsuspendしたものをmembrane

ク染色，エタノール，アセトン脱水後，エポキシ

fractionと呼ぶ。この分画は主として筋小胞体膜

樹脂に包埋し，ミクロトームを用い超薄切片を作

で細胞膜も含んでいると考えられる。

成し鉛染色を行った。これをJEOLlOOB型電子＊東京大学医学部薬理学教室＊＊実験動物中央研究所

顕微鏡にて観察した。

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法

92

表1．コントロール・マウス（C）ジストロフィー・マウス（D）の筋重量（weight）と全蛋白質量（totalprotein）
の比較。

3．5週齢

Weight（mg）

8週齢

C

D

300

300

13601970

48

228

totalprotein（mg）48

C

D

339

Tris−HCI pH7．5

Leg muscles

3voI TMK

MgC12DFP／AF2

Tに」−（total protein）

7，qOO x910mjn
4voI
Guba−Straub

§

＋ATP

00Cl h王

30mjn

1001000xg30mjn

I

15，000xg15mjn

l

L

P
一一一一

一」rlOvol−．き記…0．5min（membrane）「」
P−（myosjn B）

図1．ジストロフィー及びコントロール筋の各分画の調製法。

実

験

結

果

1．ジストロフィーマウスにみられた筋肥大（表1）。

であった。8適齢になるとジストロフィー・マウ
スの筋重量は1970mgとなりコントロール・マウス（1360mg）の1．4倍となっていた。

ジストロフィー・マウスを同一の誕生日のコン

筋蛋白質量をtotal protein（図1）を測定する

トロール・マウスと同一条件で飼育し筋の成長をことにより比較しても，3．5過齢ではジストロフィー

比較した。

はコントロールと同一であるが，8遇齢ではジス

3．5週齢のジストロフィー・マウスの筋重量（湿重量）は300mgで，コントロール・マウスと同一

トロフィーはコントロールの1．5倍であった。
この様なジストロフィーの筋肥大はすでに6週

18

幼若ジストロフィー（mdx）マウスの膜分画に検出された異常蛋白質

図2．membranefractionの負染色後の電子顕微鏡像。全てマイクロゾームから成っている。

図3．6適齢ジストロフィー筋にみられた典型的な病変像。矢印のところで膜破壊がおこっている。

93

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法

94

線経の変性が一部に観察された（図3）。 他に中齢でも検出することができた。

心核をもった細胞も観察された。しかしこれら病
変又は異常をもった細胞は極く僅かであった。一

2．電子顕微鏡にみられる病変1．に述べた様に6週齢になったジストロフィー

万，3．5過齢では数多くの視野を観察したにもか・マウスに僅かに筋肥大がみられるが，これに対かわらず，ジストロフィー筋特有の病変又は異常

応して6過齢のジストロフィー・マウスの筋の超像はみられなかった。

薄切片を電子顕微鏡で観察すると膜の断裂と筋原C

D

m●mbraneCD

myosln B

図4．6週齢のジストロフィー（D）とコントローノHC）筋のmembrane fraction及びmyosin BのSDS
PAGEのCBB全蛋白質染色。

18

幼君ジストロフィー（mdx）マウスの膜分画に検出された異常蛋白質

C

鵜縄

3．5W

D

−ト

￠W

図5．3．5過及び6週のジストロフィー（D）とコントローノLIC）筋のmembrane
fractionのSDS PAGE後，Stains−allによる特殊染色。矢印で示されるbandsがジストロフィーとコントロール間で異なっている。
6週目の上から3番目のブルーバンドは少し流しすぎた為15％ケル内に入ってしまった為，みにくくなっている。

95

96

Ⅳ 遺伝子発現とその研究方法

3．SDS PAGEによる異常蛋白質の検出。

性蛋白質であると考えられている3三A．CBB染色による全蛋白質染色（図4）。

異常バンドがmembranefractionにある事，及6週齢筋より抽出した収縮性蛋白質（MyosinB）

び分子量の大きい事を考えると，膜構成糖タンパ

は，2．に示した様に電子顕微鏡観察により筋原線

ク質上に異常があると考えられる。またすべての維上の病変がみつかるにもかかわらずコントロー

生化学的取扱い時に蛋白質分解酵素阻害剤が十分

ルとジストロフィーで差はなかった。

用いられているので上述の異常バンドはmembrane

同時期のmembranefractionではSDS PAGE

fraction調製時に蛋白質分解酵素が作用してでき上，高分子領域にコントロールとジストロフィー

た人工産物ではないと考えられる。さらに膜蛋白で異なっているbandsがある印象が得られたもの

質で糖鎖がついている為にSDSPAGE上で高いのminor bandsであるための確実性を欠いていた

分子量をもつようにみられ，その量比も少いこと（下記3B参照）。

を考え合わせると，この異常bandsがおそらくは

B．stains−allによる特殊染色（図5）。

細胞表面膜に由来するものと考えられる。

membrane fractionのSDS PAGEをstains−

今後は糖蛋白質の，と■くに糖類の性質の解析，

anにより染色すると高分子領域で青色に染色され抗体をつくってその局在の決定から，遺伝子レベるbandsのうち図4の矢印で示される少くとも3ルでの追求も行っていきたい。若し表面膜にあるつのものが，ジストロフィー筋に特異的に含まれ異常とすれば，従来から考えられていたジストロていた。

フィー筋の初期異常発生の原因として興味ある結青色に染色されるbandsのうち低分子領域のも果である。

ので矢印で示されるものはジストロフィーに欠損していた。
この変化は6適齢ばかりでなく1，2で検出されたジストロフィー病変又は異常の出ていない3．5
週齢でも明瞭に検出された（図5）。
Stains−allにより青色に染色されるタンパク質
は，糖タンパク質，りんタンパク質及びC諾十結合

文献1）Bulfield，G．etal．，（1984日ケ0．JNbt．Acad．SU，tLu
81，1189−1192．
2）Laemmli，U．K．（1970）Nature，277，680−685
3）Campbell，K．P．etal．，（1983）J．Biol，C乃sm．258，
11267−11273

Ⅴ

遺

伝

子

解

析

19．クリスタリン遺伝子の組織特異的発現機構の解析

99

20．膜結合タンパク質のcDNA及び遺伝子DNAのクローニング

103

21． ヒト染色体の分離と染色体特異的遺伝子ライブラリーの作製

107

22．筋ジストロフィー症の筋組織における遺伝子発現の解析

110

99

19クリスタリン遺伝子の組織特異的発現機構の解析
安 田 国 雄＊研究協力者

岡 田 節 人＊一個の受精卵が細胞分裂をくり返し，各細胞は−クリスタリンは鳥類と爬虫類を除く脊椎動物に

時間的・空間的に規定されて多様に分化し，複雑存在する。これらの蛋白質は，抗原の共通性から，な組織を形成して多細胞生物体はつくられる。こまた一部はアミノ酸配列の結果から，保守的であのような複雑多彩な細胞の個性は，発現されていり種問でよく保存されていることが明らかとなっる遺伝子によって決定されているといえる。高等ている。

動物では免疫系の細胞を除けば発生過程を通じて，眼の水晶体の分化は，胚発生の初期にみられる遺伝子の構成は変化しないと考えられている。従際立った現象の一つであり，特にニワトリ胚を用って細胞の分化とは特定の遺伝子（群）が特定の細いて詳細に研究されてきた。例えば．∂一クリス

胞群でのみ発現し，他の細胞群では発現しないとタリンはレンズプラコードと呼ばれる眼の形成以いう遺伝子の発現制御の問題と考えられる。

前の時期にすでに合成が開始されていること，ま筋ジストロフィー症を含めて一群の病気は，こた水晶体は上皮と織維部の両方から形成されていれら遺伝子の異常またはその発現調節の異常に起るが，クリスタリンの合成は両者でちがう形で調因すると考えられる。このような一群の病気の治

節されていることなど。

療方法を確立するうえで，遺伝子の構造や発現調

このようなクリスタリン遺伝子の発現制御を研

節を調べる基礎的研究は欠かせないといえる。従究するために．遺伝子のクローニングを開始した。

って，以下に述べる筋ジストロフィー症とは一見先に述べたように，クリスタリンは水晶体に多量

無関係と思われる眼の水晶体のクリスタリン遺伝に含まれるため，そのmRNAの分離精製も比較

子の組織特異的発現機構の解析から明らかになっ

的容易であり，我々の所で，ほぼ全長に近い∂−たことが，筋ジストロフィー症の病因解明とそのcDNA及びα−CDNAを作製した。これらをニッ

治療方法の確立に役立つ事を期待している。

クトランスレーションで32pで標識して．ニワト（1）クリスタリン

リ遺伝子ライブラリーから各々の遺伝子を分離しクリスタリンは脊椎動物の眼の水晶体に特異的た。∂−クリスタリン遺伝子の組織特異的発現のに存在する水溶性構造蛋白質の総称であり，生化

解析結果は他で述べているので，ここではα−ク

学的性質と抗原性のちがいにより，α，β，γ，∂

リスタリン遺伝子について述べる。

の4つのクラスに分類される。これらのクラスの（2）α−∂−クリスタリン・キメラ遺伝子の作製

うち，α，β−クリスタリンは種問を通して共通∂−クリスタリン遺伝子の場合は．マウスの種にあり，∂−クリスタリンは鳥類と爬虫類に，γ々の組織の初代培養の核内に注入し，その発現を調べた。これは，先に述べたように，∂−クリス＊京都大学理学部生物物理

タリン遺伝子はマウスにはないため，導入された

100

Ⅴ 遺伝子解析

遺伝子の発現を∂−クリスタリン抗体を用いて感られる。これは，キメラ遺伝子の翻訳産物が∂−度よく検定できたという利点があったためである。

クリスタリンよりも59個余分なアミノ酸を含んでところが，α−クリスタリン遺伝子は共にあるたいるからである。これらのことから，α−∂−キメ

めα−クリスタリン抗体を用いる方法は使えない。

ラ遺伝子は，マウス水晶体細胞で∂−クリスタリ

従って，α−クリスタリン遺伝子の発現調節の解ン遺伝子と同様に，効率よく発現され，正しくス

析には，次の点に留意した。∂−クリスタリンを

プライシングされ蛋白質を合成することが明らか含め多くの遺伝子の転写活性制御領域が，5′上流になった。

にあり遺伝子の内部にはないことと，マウス細胞

同様の方法を用いて，マウスの種々の組織細胞で発現させるために蛋白部分を∂−クリスタリンや株細胞で，キメラ遺伝子の発現を解析したが，に置換すること。

発現はほとんどみられなかった。従って，このαこれらの目的のために，図1に示すような5′上流はα−クリスタリン遺伝子から，ペプチドをコー−∂−キメラ遺伝子はマウス水晶体細胞でのみ効
率よく発現しているといえる。

ドする大部分のエクソンを∂−クリスタリン遺伝（4）組織特異的発現に必要な遺伝子領域

子から成るキメラ遺伝子を作製した。このα−∂遺伝子の転写活性を制御する領域は，5′上流にキメラ遺伝子は，α−遺伝子の1番目のエクソンあることが多くの研究から明らかになっている。

と∂一遺伝子の3番から17番までエクソンを含む。

では前述した組織特異的発現を規定する遺伝子領

この遺伝子から転写翻訳されるペプチドは，∂−

域はどこにあるのであろうか？ α−クリスタリ

クリスタリンのN末端の4個のアミノ酸が，−αクン遺伝子の5′上流を欠失した変異遺伝子を作製しリスタリンのN末端の63個のアミノ酸で置換されて，遺伝子導入をしてその活性を検討した。そのた全長504個のアミノ酸から成っている。このよ

結見 転写開始点から上流−162bp の位置まで

うなペプチドが合成されるためには，キメラ遺伝

欠失すると水晶体細胞での発現はなくなり，上流子が転写されスプライシングがうまく行なわれる

一376bpの位置までを含むと効率よく発現する。

必要がある。

従ってこの領域（図3MboⅡ−BglⅡDNA断片）が，（3）α−∂−キメラ遺伝子の発現

水晶体細胞での特異的発現に必要といえる。では，α−∂キメラ遺伝子をプラスミドにクローン化，

この領域は，ウイルスのLTRや免疫グロブリン

約100コピーのキメラ遺伝子をマウス水晶体の初遺伝子のエンハンサー配列と同等の効果をもつで代培養細胞の核中に顕微注入した。転写活性の一あろうか？ エンハンサー配列は，その方向や退番高い遺伝子導入後48時間に固定し，∂−クリス

伝子上での位置（数K6以内）によらず，その遺タリン抗体を用いて免疫組織化学法（PAP法）

伝子の転写活性を高める効果をもつ。

で染色した。図2Aがその写真で，矢印で示してこれらのことを検討するために，前述したMbo

ある濃く着色した細胞は，退伝子の注入を受け∂

Ⅱ−BglIl DNA断片を，元の位置で方向を逆転−クリスタリン抗体と反応する蛋白質を合成してしたり，この断片をキメラ遺伝子の2番目のインいることを示している。その分子量を同定するたトロンの中に，同方向，逆方向に挿入した変異遺めに，遺伝子導入を受けた約100個の細胞を，S伝子を作製し，その転写翻訳活性を測定した。そDSで可溶化しポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を，図3に，簡略化して示した。このDNで分離した。これをWestern blot法で検定したA断片を本来の位置で方向を変えても発現に変化

結果が，図2Bレーン2に示してある。∂−クリはなかった。しかし，位置を変える（本来の位置

スタリンの分子量48Kより約6K大きい54Kのバから約2Kb下流）と発現は低下したが，喪失はンドの位置にキメラ遺伝子からの翻訳産物が認めしなかった。このような点から，クリスタリン退19 クリスタリン遺伝子の組織特異的発現機構の解析
Cons†ruc†jon of101

α−8−Chimerlc Gene

αA−Crys†仙Ingeno

48−Crys†仙ngen01

5

6

7

89101112131415

16

17

くさ一
助−8−C川m帥Cg…

一七．＝一一l H Hl−一一日「HH：」⊇」

6−CryS†仙ng即el

1

4

〟e′

GfU

ATG・一・・GAG

1

α▲−8−Chlmerlcgon

医＝

63

〃ef

Gf〟

ATG‥一・‥・・GAG

だ∵∴∵

6㍍月も

ぷニ

ー GGGGAG・… 個≡コα−∂−クリスタリン・キメラ遺伝子の作製法
キメラ遺伝子はα−クリスタリン遺伝子の1番号のイントロン中にあるHindⅢの部位に，∂−ク
リスタリン遺伝子の3番目以下のエクソンを完全に含むKpnI断片を結合して作製された。従って，
このキメラ遺伝子からは下図に示すように，∂−クリスタリンの最初（N末端）の4個のアミノ酸が，α−クリスタリンのN末端の63個のアミノ酸に置換されたペプチドを合成される。その分子量は∂−クリスタリンの分子量48，000より約6，000大きい54，000となる。

A

8

12

3

図2 マウス水晶休細胞の核内に注入されたキメラ遺伝子の発現A・マウス水晶休の初体培養細胞にキメラ遺伝子を核内注入したのち，48時間後に固定し，PAP法により遺伝子産物を検出した。矢印の着色した細胞が外来遺伝子を発現している。
B．約100個の遺伝子が核内注入された細胞をSDSで可溶化し，SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動したのちWesternblot法により翻訳産物を同定した。（1）8−クリスタリン（2）αL∂−キメラ遺伝子を注入された細胞（3）遺伝子の注入を受けない細胞。キメラ遺伝子の産物は∂−クリスタリンの分子量48kより約6k大きい54kのバンドとなって検出されている。

Ⅴ 遺伝子解析

102

Orien†Qlion clndPosけion Ef†ec†of MboIJ−BguIFr（】gmen†
OnTjssue−Speclfjc Expression

5」−3
Mb011

B 川

LeveLof Exp「ession

Kpnl

」：＝コ1

a−Crys†cuin gene→J

［コ

」−メ

r…

＋＋＋＋

r…

＋＋＋＋

ロー一㌦一一＋8−Crys†Quingenel

図3 組織特異的発現に必要な領域とその方向及び位置効果
α−クリスタリン遺伝子の水晶体細胞における組織特異的発現には，5′上流のMboⅡ−BglII
DNA断片が必要である。（1）元の遺伝子（2）同位置で方向を変えたもの，（3）（4）キメラ遺伝子のの2番目のイントロン中にMboII−BglⅡDNA断片を方向を変えていたもの，（5）MboⅡ−
BglⅡDNA断片を欠失したもの。

伝子の組織特異的発現に必要なDNA領域は，エンハンサー配列とは異なった効果をもっている。
このことはエンハンサー機能に必要といわれているコアー配列が，上に述べたクリスタリン遺伝子のMboⅡ−BglIlDNA断片中に兄い出されないことからも示唆される。

2）Xondoh，H．，Yasuda，K．，and Okada，T．S．Tissue−
SPeCific expression of a cloned chick6ヾryStallin

genein mousecells．NaTure301．440−442（1983）．
3）Yasuda，K．，Nak毎ima，N．，Isobe，T．，Okada，T．S．，
and Shimura，Y．The nucleotide sequence of a
COmplete chick 6−CryStal1in cDNA，T77e且WβO
J3，1397−1402（1984）．
4）Kondoh，H．，Takahashi，Y．and Okada，T．S．Dif・
ferentiationJependent expression of the chicken
6−CryStallin geneintroducedinto mouse terato−

carcinoma stem cells．Tyle EMBOJ．3，2009−
文献1）Yasuda，K．，Kondoh，H．，Okada，T．S．，Nakajima，N．，and Shimura，Y．Organization of6−CTyStallin
genesin the chicken．Nucleic Acids Res．10，2879−2891（1982）．

2014（1984）．

5）Ohno，M．，Sakamoto，H．，Yasuda，K．，Okada，
T．S．and Shin1ura，Y．Nucleotide sequence of a
Chicken 6，CryStallin gene．JuCteic Acids Res．
（inpresq．

103

20

膜結合タンパク質のCDNA及び遺伝子DNAクローニング

藤 井 義 明＊

肝細胞において薬物の酸化的解毒反応に関与す誘導されるがイソサフロールはP−450dの合成のるチトクロームP−450はER膜に結合した膜結合みを選択的に誘導する。また基質特異性もP−

タンパク質である。外来の莫大な種類の化合物が450Cは芳香族多環炭化水素化合物の水酸化反応

このヘム蛋白質によって水酸化，脱メチル化，脱に強い活性を示すのに対し，P−450dはGluP−

ハロゲン化，脱ニトロ化などの反応をうけて解毒2などの複素環化合物のN水酸化反応に活性を示代謝されるわけであるが，この反応は一分子種のすことが知られている。

P−450によって触媒されるのではなくて．一群のP−450の分担的作用によって行われることが判って来た。一つの分子種のP−450の基質特異メチルコラントレンで誘導されるチトクローム
P−450d cDNAクローンの分離と構造解析

性はかなり広いが一定の限られた範囲の基質に対して反応しまた他の分子量のP−450は異なった

ラット肝ホモケざネートのポストミトコンドリア

基質スペクトルの特異性を持って．ある場合には

分画より105，000990分の遠心によりミクロソー

オーバーラップした基質特異性を示しながら網羅

ム分画を得て，これよりSDS一フェノール・クロ

的に外来の低分子物質に対する生体防御系を作っ

ロホルム法によってRNAを抽出した。RNAをオている。またこのような薬物代謝に関与している

リゴdTセルロースカラムによってrRNAやtRNA

P−450は多くの場合誘導酸素である，ある薬物からポリ（A）RNA（mRNA）を分離した。 さらにを投与すると特定の分子種のP−450が特異的

ポリ（刃RNAを5−25％のショ糖密度勾配遠心にに誘導合成される。このようなP−450の分子多よって分画し，各フラクションのmRNA活性を無様性，薬物による誘導機構，膜えの組み込み機構

細胞タンパク質合成系を用いて測定した。その結などを研究するために我々はこの数年間遺伝子ク

果P−450を合成する活性は18S付近にピークを

ローニングの方法を用いて，いくつかの種類のP

持って局在することを認めた。この18SRNAか−450のcDNAクローンと遺伝子DNAクローンのらAMV逆転写酵素によりcDNAを合成して，解析を行って来た。本年度はメチルコラントレンによPBR322をベクターとしてGC−tail法によってって誘導される2種類のP−450のcDNAクロー

そのPstI切断部位に挿入してCaZ†法によって処ン及び遺伝子DNAクローンの解析を行ったので報告理した大腸菌よりP−450のCDNAの挿入された

したしもこの2種類のP−450（P−450C及びP−

組換え体プララミドを持ったクローンの同定は450d）はメチルコラントレン，ベンツピレン，

hybridization−Selected translation

ポリ塩化ビニルなどの化合物によって同じように行った。Maxam−Gillbert

によりの塩基配列決定法に

よりcDNAの塩基配列を決定したところ精製P＊癌研・生化学部−450dで報告されているN末端の30個のアミノ酸

104

Ⅴ遺伝子解析

一入CCC
lO20
helAl▲PheSやrGlnTyrHeSerLeuAlaP【〉GluLeuLeuLeuAlaThr▲1■HIPhhCyyLeuV▲lM鳩Tr
ATGGCGTrCTCCCAGTAでATCTCCTT▲∝CCCACACCTGCTAmGCCACTCCC▲TCmTGTTTAGTGTTCTGG】040〜0V■lLeu▲r9GlyThr▲rqThrClnV■lProLysGlyLeuLy〜SerProProGlyproTrpGlyLeuProPheHe
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CCC⊂ACATCeTC肌CTGCCC人AGAACCCACACCTATCTCTGACAA人CeTGACTCAGCAGTATGGGG▲CGTGCTG
8090100
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話語は設計崇宗昔㍑；崇㌶設漂ま封霊㌶豊吉㌫計器豊沼㍑設語き一議
話芸訟霊き諾き記紀王諾訟㍊王童謡崇畏謡訟畏黒宗謡㌫崇三塁設詫㌫壬480190500
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TTCCTCTCCeA⊂CTCCIrAATeTACTTTTTCA⊂TCAATACATTTGCCAACTCTCGCTC‥l
図−1．チトクロムP−450dcDNAの塩基配列とアミノ酸配列，アンダーライ
ンされた部分は各種P−450分子間で保存された部分を示す。

配列をコードする塩基配列を含むことが判った。

Pseudomonas Putida P−450camの構造の比

cDNAの構造解析より図−1に示すように513

校から推定した保存されたシステイン残基を含む個のアミノ酸よりなるP−450d の全一次構造を

アミノ酸配列を含んでいた。この部分のシステイ

決定することができた。このP−450dには我々がン残基（456）がヘムの第5配位子となっている

先にフェノバルビタール誘導型P−450bとと考えられる。

20

膜結合タン′ヾク質のcDNA及び遺伝子DNAのクローニング

105

メチルコラントレンで誘導される二つのP450の遺伝子の全構造を示すが．両遺伝子問で塩基配（P−450CとP−450d）の遺伝子クローンの分離列の比較をしてみるとエクソン部分，特に第2エと構造解析

クソンの部分が両遺伝子でホモロジーが高いことが判った。この部分のホモロジーのためにP−450

ラットのDNAのHaeⅢ部分水解物よりcharond cDNAをプローブにして．：遺伝子ライブラリ

4Aをベクターとして作られた遺伝子ライブラリ

ーより両遺伝子が選別されたことが理解された。

ーの約106個のプラークを上記cDNAをプロー

遺伝子の5′又は3′隣接塩基配列あるいはイントブにしてスクリーニングを行い制限酵素マップかロン部分には広い領域にわたる塩基配列でホモロ

らみて2種類の遺伝子クローンを単離した。構造

ジーのある部分は認められなかったが5′ 隣接部

解析の結果一つはプローブとして用いたチトクロ

位のプロモーター領域に，10−15スクレオチドかームP−450dの遺伝子であり，他はチトクローム

らなる塩基配列で両遺伝子間で共通の構造が見出

P−450Cの遺伝子であることが判った。遺伝子のされた。また第1イントロンには両遺伝子共にZ

全長は各々P−450dの場合は6，7Kb，P−450C

DNA構造をとることが知られているGTGT・・・・・・の場合は6．OKbであった。図−2にチトクローの繰り返し構造も認められた。今後この共通構造

ムP−450Cの遺伝子の概略と塩基配列決定の方法

が薬物による誘導にどのような役割を果すかinを示すが両遺伝子共にその概略はよく似ていて，

Vitro geneticsの方法を用いて検討する予定で遺伝子は6個のイントロンにより7個のエクソンある。

に分れた分断構造をしている。図一3にP−450C

図一2．MC誘導型チトクロムP−450遺伝子の概略と塩基配列決定法。矢印を塩基配列決定の方向，及びその長さは決定された塩基配列の長さを示す。実線で囲まれた部分はエクソン部分を示し，黒くぬられている部
分はリーダー及びトレイラー部分を示す。A，AccI；B，βαmHI；D，
DdeI；E，EcoRI；F，FokI；H，mndⅢ；Ⅰ，EbtI；K，Kpnl；L，

即aⅡ；P，PvuⅡ；R，DTtlI；S，SsEI；T，BstEⅡ；U，Sau3AI；
Ⅴ，AγαⅡ；X，ガムαⅠの制限酵素切断部位を示す。

Ⅴ 遺伝子解析

106

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図−3．ラットMC誘導型チトクロムP−450遺伝子の塩基配列。イタリック体はアミノ酸配列を示す。実線で囲まれた部分はTATA配列及びポリ（A）シグナルを示す。
波線は単純な繰り返し配列が示されている。矢印は転写開始点及びポリA鎖結合部位を示す。

107

21ヒト染色体の分離と染色体特異的遺伝子ライブラリーの作製

渡

目

遠

的

武＊

ype（Flow cytometry法による各染色体の蛍光

ヒトリンパ球，線維芽細胞をはじめとする種々

強度分布）を調べてみると，我々の用いた条件でのと卜細胞から染色体を分離し，Flow cytometry

は，15〜16個のピークが得られた。すなわち，第法により分析すると共に，そのSorting 機能を

1，乙3，4，5，6，7，X，8，13，21．22番の染色用いて，各染色体を分離精製する。さらに分離さ体は1個の独立したピークとして認識され，9〜れた染色体よりDNAを抽出し，染色体特異的遺12番は一つのピークにグループとして出現し，伝子ライブラリーを確立する。Duchenne型筋ジ（14，15，16），（17，18），（19，20）番は個々の独

ストロフィーのどとく，伴性劣性型の遺伝形式を立したピークとして得られることもあれば，一つとるジストロフィーを遺伝子レベルにて解析するのグループとして得られることもあった。Y染色ために．特にと卜Ⅹ染色体遺伝子ライブラリーを体のピークは，通常は22番染色体のピークの左側確立する。確立したライブラリーよりユニーク配に現われるが，必ずしも位置は一定していない。

列を有するクローンを選択抽出し，それらのクロ

我々は，20名の正常の女性のFlowkaryotype

ーン中から，Duchenne型筋ジストロフィー（Dを調べ，つねにほぼ一定のパターンが得られるこMD）の遺伝子座と強く遵鎖したクローンを兄いとを確認した。
48XXXXの染色体異常を有する患者の末梢血出す。

リンパ球を，EBウイルスにてトランスフォーム

成果し，B細胞株として樹立した。この株化細胞より（1）ヒト末梢血リンパ球，Epstein−Barrウィル

染色体を調製し，Flowkaryotypeを調べてみる

スによりトランスホームとしたB細胞株，線維芽と，Ⅹ染色体の位置に大きなピークが得られる。

細胞を用いて染色体分離を行った。すなわち，コ

このピークをソーティングすることにより，Ⅹ染

ルセミド処理によりM期の細胞を濃縮し，ポリア

色体のみを純度高く得ることが出来た。得られたミンージギトニン法により染色体を調製した。得

Ⅹ染色体をもう一皮，セルソータ一により解析をられた染色体をエチジウムプロミドにより染色し行ったところ，周辺の染色体（7番と8番）の混た。セルソーターはコTルター社EPICS−Ⅴ型

入は非常に少く，90％以上の純度でⅩ染色体が得を使用し，アルゴンレーザー管を用いた。レーザられていると考えられた。

ー波長は515nmと488nmの合成波で，レーザー

このほか21トリソミー患者の染色体解析におい出力は．1．5W，540nm emission filterを用ても，良好な分析分離の結果が得られた。このよいた。正常ヒト末梢血リンパ球のFlowkaryot−

うに我々は．ヒト染色体（全てではないが）を，＊佐賀医科大学免疫血清学（昭和60年4月より，九州大学生体防御医学研究所）

個々に分離精製する技術を確立した。染色体分離に関して大切なことは，（1）細胞から出来るだけ

108

Ⅴ 遺伝子解析

intactな形で染色体を取り出すこと，（2）セルソー

うに，一枚のフィルターはラベルした46XY−DN

クーの調製を厳密に行なうことである。Flow

Aとラベルしていない48XXXX−DNAを，同じプ

cytometry 法による染色体パターンの解析は，レートからレプリケートしたもう一枚のフィルタ

染色体をいかにうまく細胞から取り出すかに大きーはラベルした48XXⅩⅩ−DNA

く左右される。

ない46XY−DNAを混合してプローブとして用いとラベルしてい分離の際に核・染色体の断片化，凝集を出来るた。両者のフィルターを比較することによりⅩ染だけ防ぎ．長時間染色体の構造，生化学的特性を

色体特異的クローンを多数同定し得た。このうち維持することが肝要である。また，セルソーター

強いシグナルを示すクローンは，反復配列を含んのコンディショニングは入念に行うべきであり，でいると考えられ，ユニーク遺伝子のみから成る

フィルターのスリット巾，CV値，レーザー出力

クローンは，非常に弱いシグナルを示すと考えら等によってその精度は大きく左右される。

れるので，弱いシグナルを示すクローンを一つ一（2）精製されたと卜Ⅹ染色体1×107個を用いて，つ丹念に拾いあげ，Ⅹ染色体由来のユニーク配列

セトX染色体特異的遺伝子ライブラリーの作製を

DNAのみを含むクローンのストックを作製した。

行った。約1×107個のⅩ染色体を，プロティナー

このようにして得たクローンからのDNAをプロ

ゼK処理，SDS処理，フェノールクロロホルムーブとして．ヒト46XY−DNAおよび48XXXX

処理，エタノール沈澱により高分子DNA約150−DNAのSouthern blot analysisを行った。

ngを得た。このDNAを制限酵素EcoRIにて完

ヒトゲノムDNAを制限酵素で切断し，ハイプリ

全分解し，lgtwESベクターアームに1igation

ダイゼーションを行うと，48ⅩXXX−DNA

L，Hohnの方法に従ってin vitro packagingって得られるハンドは，46XY−DNAによって得によをおこなった。E．coliK12LE392菌を指示菌られるバンドよりも数倍濃いバンドとして検出さとして，約1×105個の種々の大きさのプラークをれる。

得た。プラークの大きさが種々であることから，

この方法によって，用いたクローンのDNAが，インサートの大きさが様々（2〜15kb）であるこ

Ⅹ染色体特異的ユニーク配列を含むことが確認さとが示唆された。こうして得られたクローンのうれた。また，用いたプローブがRFLP（ristric−

ち，ヒトDNAを含むクローンの割合を算定する

tion enzyme fragmentlength polymorphi−

ために，反復配列KpnI familyのDNAをプロ

Sm）を認識し得るかどうかも，種々のヒトⅩ−ーブとして，プラークハイブリダイゼーションをDNAとのSouthern hybridization

行なった。その結果，インサートの平均の長さを出されるであろう。この点については次年度にお8kbと考えると，Ⅹ染色体遺伝子の少くとも80％

いて検討を加える予定である。

によって検が我々のライブラリーに含まれていることがわか？た。

まⅩ染色体由来のユニーク退伝子のDNAを含む

め

ヒト末梢血リンパ球をEBウイルスを用いて細および胞株化し，その細胞よりⅩ染色体をセルソータ一のような反復配列DNAを用いてにより分離精製した。90％以上の純度によって得クローンを同定するために．まずKpnI
Alu fami1yとpre−hybridizationを行った後に，48XXXXたX染色体よりDNAを抽出し．制限酵素Ecoの全DNA，46XYの全DNAをプローブとして，

RIにより完全分解した後，スファージのアーム

プラークハイブリダイゼーションを行った。それに組み込み，Ⅹ染色体特異的遺伝子ライブラリー

ぞれのプローブでⅩ染色体の比活性の差を大きくを作製した。得られたライブラリーは，Ⅹ染色体し，同時にX染色休以外の比活性は等しくなるよ

上の遺伝子の少くとも80％以上を含んでいること

21 ヒト染色体の分離と染色体特異的遺伝子ライブラリーの作製がわかった。ライブラリー中からユニーク配列遺伝子を含むクローンの単離と，それを用いた遺伝子の制限酵素断片の多様性について検討中である。

1093）Kudo，A．，Ishihara，T．，Nishimura，Y．and
Watanabe，T．：A cloned humanimmunoglobulin
heavy chain genewith a noveldirect repeat se−quencein5 nankingregion．Gene（1984）（印刷中）．
4）Saito，H．，Ishihara，TリSuzuki，H．andWatanabe，

次年度は，これらのクローンを用いて．伴性劣T．：Production and characterization of a murine

性型遺伝を示すと思われる筋ジストロフィーの遺

monoclonal antibody against a heavy chain of

伝子解析を行いたいと考えている。

Hagemanfactor（factorXII）．Bl00d（印刷中）．
5）Watanabe，T．，Maeda，H．，Kudo，A．，Ishihara，
T．，Ohara，J．，Eda，Y．and Kitamura，D．：Micr0−
11りeCtion ofcytoplasmiC and nuclear factorsinto文献1）Harita，S．，Sugimura，K．andWatanabe，T．：Macro−
Phage−Chemotactic factor−PrOducingTcellhybrid−
OmareaCtivetophosphorylcholineinI−Erestricted
manner．血r．JJmm〟〃OJ．，14，692・697（1984）．
2）tshihara，T．，Kudo，A．andWatanabe，T．：Induction
Ofimmunoglobulin gene expression in mouse
fibroblasts by cycloheximide treatment．J．Exp．
〃gd，160（12），1937．（1984）．

Cells

of

theimmunesystem．

Lymphoki77eS

Ed・E・Pick（AcademicPress），Vo1．11（印刷中）．
6）渡辺 武：Flow cytometry法による染色休の分離，医学のあゆみ128（9），T−65．（1984）

110

22

筋ジストロフィー症の筋組織における遺伝子発現の解析
＊

博

造

田

澄

＊

道彦稔

＊
＊
＊
＊
＊

何らかの形でその転写に影響を及ぼすものと考え，

拓 孝

田 坂 田

奥塩濱
私達は，数年前より，細胞の遺伝子の異常は，先程の白血病細胞での研究方法を筋ジスの病態解明に応用する。

白血病細胞を中心にその転写を研究してきた。こすでに多くの研究者によって，筋ジスにおけるのような考えに基づく研究は，以前より，とくに遺伝子の表現型としての蛋白質の解析は十分なさ

癌研究を中心に行われているが，最近の遺伝子操れている。たとえば，共同研究者の濱田らはアデ作法の開発されるまでは，個々の転写RNAの識

ニレート・キナーゼの研究を行い，その筋ジスに別が難しく，特定のRNAを除き．別個に各々の特異的なアイソザイムが存在する可能性を兄い出しRNAの転写を調べることは困難であった。私達報告している。2）が，しかし，これらの研究でも，は種々の白血病細胞の転写RNAレベルでの性格

まだ筋ジスの病因を決定していない。

づけを行い，白血病の病因を検討するとともに，私達は，転写RNAレベルの研究の利点として，それらを利用して，それぞれの白血病細胞の①cDNAlibraryを用いることにより，比較的制癌剤に対する反応等の検討を行っている。

簡単に筋ジスのpoly（Al＋RNAの異常の有無を

白血病細胞の種々の遺伝子に対する転写RNA量検討できる，②翻訳段階の異常は少ないため，遺の比較のため，その性質が比較的正常リンパ球に伝子の異常は転写RNAレベルで捕えることがで類似している慢性リンパ性白血病細胞よりpoly

きる，㊥cDNAlibraryの利用なので，すぐD（A）十RNAを分離して，そのRNAよりcDNA

NAの構造解析が行える，と考えている。

libraryを作製し，白血病細胞の個々の遺伝子の材料は筋ジス・チキンの胸筋を選らび，その転写量を胎盤組織を対照に比較した。その結果，poly（A）＋RNAを正常のpoly（A）＋RNAと比較

白血病細胞に比較的特徴的に転写される数種の遺した。これらの比較にあたり，筋ジスに見られる

伝子を単離した。それらの単離した遺伝子を用い，遺伝子の異常は，種々のことが考えられるが，大白血病細胞の転写パターンを比較し，各々の白血きく分けて，二通りの可能性が考えられる。一つは，病の性格づけを行っている。1）筋ジス・チキンにのみ特徴的に転写されるRNA筋ジストロフィー症（以下，筋ジス）が遺伝子が存在する場合，他は，筋ジス・チキンに正常チキの何らかの異常によって引き起こされる遺伝子病

ンに見られる転写RNAの一部が欠除している場合でであることはよく知られている。そこで，今回はある。そこで，これらのいずれかの異常の有無を＊愛媛大学医学部生化学第2＊＊愛媛大学医学部第1内科＊＊＊宮崎医科大学衛生学

明らかにするため，二通りの，CDNAlibraryの作製が必要となる。すなわち，筋ジス・チキンにのみ発現される遺伝子があるとすれば筋ジス・

22 筋ジストロフィー症の筋組織における遺伝子発現の解析

111

チキンからのpoly（A）＋RNAよりcDNAlibrary

正常チキンのpoly刷＋RNAより合成した32pを作らなければならない。他方，正常には発現さ標識cDNAとハイプリダイゼーションした。洗れ筋ジスにおいて特異的に発現されない遺伝子の浄後，オートラジオグラフィーにて転写RNA量

存在は．正常チキンのpoly（A）＋RNAでCDNAを比較した。その結果の確認および定量的比較のlibrary を作製しなければならない。これらのため，Dot hybridizationを行った。方法は分ことを考え．実験計画を図1に示す。

離・精製した組換えプラスミドの一定量をアルカ

次に作られた二通りのCDNAlibraryを利用

リ又は熱処理後ニトロセルロース膜に塗布し，筋して，正常および筋ジス・チキンの個々の遺伝子ジスまたは正常チキンのpoly（A）＋RNAの断端をに対するpoly（A）＋RNA量の比較を行い，正常お32pで標識し．ノ、イブリダイゼーションした。又よび筋ジスの間で，明らかなpoly（創＋RNA 量

これより先の分離した遺伝子の解析は，現在使用の差が見られる遺伝子の分離・精製を行う。さらされている一般的方法で行った。

に，そのRNAへの転写量の差が確実なものかどうか，Dot hybridization 法を用い定量的に確認結果および考察する。そこで．問題となる遺伝子が分離できれば，現在まで，筋ジス・チキンまたは正常チキンのその遺伝子の染色体での位置をin situhybri−
dization法で解析する。最終的にその遺伝子の胸筋よりpoly（A）＋RNAを抽出して，そのcDNA

DNA配列を決定し．その遺伝子の性格および細ものではなく，筋ジス・チキンのpoly（A）＋RNA

胞内での役割りを明らかにする。

よりは約1300個のクローンが得られたのみだった。

libraryを作製した。その結果はあまり満足する

この程度のcDNAlibraryでは両者の差を導き方法

混在する転写RNAの情報を個々の単一情報に出すには不十分であるためcDNAlibraryの作製が再度必要となり，現在その実験を繰り返して分離するためのCDNAlibrary作製を行った。

いる。一方このcDNAlibraryで，何か正常お筋ジスまたは正常チキンの胸筋をフェノール・プ

よび筋ジスの転写RNA量に差が見られるかも知

ロテネースKを用いてRNAを調整し，オリゴれないと考え，筋ジスのこの1300クローンの（dT）セルロースによるアフイニティ・カラムでlibraryを用い，Colony hybridizationを行

poly（A）＋RNAを調整した。このpoly（Aj＋RNA

った。比較するRNAは，細胞の分化皮の差によより逆転写酵素を用い，二重鎖・相補的DNAる変化も追究したく筋ジスのチキンの成鶏と顆化（cDNA）を合成し，一般的な方法であるG−C

後14日目および正常チキンの成鶏と醇化後14日目

homopolymer tailing法にてプラスミドpBRの胸筋4種類のpol仏）＋RNAで行った。その結322のpstl切断端にクローニングした。

果は，図2，3に主な所を示した。今回のcDNA

筋ジスに特徴的に読まれる転写RNAのク

libraryに意味のないフラグメントが多く組み込

リーニングには簡便なのCOlony hybridiza−

まれたためかハイブリダイゼーションの効率は悪tion法を使用した。この方法は，シャーレの寒かった。筋ジス・チキン（成鶏および貯化後14日

天培地の上に滅菌ニトロセルロース膜を置き，そ日）に現われ，正常チキン（成鶏および貯化後14の上に組換えプラスミドを含む大腸菌をスタンプ

日日）に現われない写真のスポットは2個存在しし，培養した。同様のニトロセルロース膜を複数た。これらのスポットをさらにDot hybridiza−

枚作り，アルカリ・高塩濃度緩衝液にて洗浄後，tion法にて定量的に確認を行っている。

2時間のbakingL，プラスミドをニトロ

なお，今回は準備段階でまだ実験に入っていな

セルロース膜に固定し，各々の膜は筋ジスまたはいが共同研究者の濱田らの筋ジスに特異的なアイ

80℃

Ⅴ 遺伝子解析
112．二回

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22 筋ジストロフィー症の筋組織における遺伝子発現の解析●
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114

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22 筋ジストロフィー症の筋組織における遺伝子発現の解析

ソザイムが存在する可能性のあるアデニレート・

115

る予定である。

キナーゼに関し，一部その酵素のアミノ酸配列も明らかになっているため，このアデニレート●キナーゼの特定DNA配列を化学合成し，これをプローブとしてこの酵素の遺伝子の構造解析も合わせて行い，筋ジスとの係わりについても検討す文

献1）ShiosakaT・and SaundersG．F．，丹os．NbTLAcad∫C乙仇別，79，4668−4671，（1982）．
2）Hamada M・et al・J．BioL Ozem．，257，13120・
13128，（1982）．

117「筋ジストロフィー症解明のための遺伝子発現の基礎的研究」
班分担研究者一覧
氏

名

所

属

住

所

班長

野々村禎昭

東京大学医学部薬理学教室第−
−
−
・
講座

113

東京都文京区本郷03
7−
（
812）
3−1 2111

幹事

大塚 正徳

東京医科歯科大学医学部薬理学教室

113

東京都文京区湯島1−5−45

大日方

千葉大学理学部生物学教室

昂

03 （
813）
6111

器

小沢瑛二郎

国立武蔵療養所神経センター
機能研究部

監事

勝沼 信彦

徳島大学医学部酵素研究施設

770
260

班員

石川 春律

群馬大学医学部解剖学教室

371

遠藤

東京大学医学部薬理学教室第二講座

113

岡田 節人

京都大学理学部生物物理学教室

606

香川

務

国立療養所刀根山病院

560

勝木

元也

実

東海大学医学部細胞生物学教室

徳島市蔵本町3−
千葉市弥生町
1−18−
33 15
0886（
31）
3111
前橋市昭和町3−39−22
0272（
31）
7221
東京都文京区本郷7−3−
1 1111
0472（
51）
03（
812）
2111
京都市左京区北白川追分町
075（
751）
2111

豊中市刀根山5−1−1
06（
853）
2001
259−
187 11 神奈川県伊勢原市望星台
東京都小平市小川東町4−1−1
0463（
93）1121黒田洋一郎

東京都神経科学総合研究所生化学

183

府中市武蔵台 2−6
0423（
25）
3881

小林

良二

秋田大学医学部生化学第二講座

010

秋田市本道1−1−1
0188（
33）
1166

嶋田

裕

千葉大学医学部解剖学教室

280

0423（
2711
千葉市亥鼻1−8−
1 41）
0472（
22）
7171

清水 信義

慶応大学医学部分子生物学教室

160

新宿区信濃町35鈴木 紘一

東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研 113
究部
千葉大学脳機能研究施設神経薬理研究 280
部

03（
353）
1211

藤井 義明

がん研究会生化学部

170

文京区本駒込3−18−22
03（
823）
2101
千葉市亥鼻 1−8−1
0472（
22）
7171
豊島区上池袋 1−37−03（918）
1 0111

真崎 知生

筑波大学基礎医学系

305

茨城県新治郡桜村

丸山 工作

千葉大学理学部生物学教室

松田 良一

都立大学理学部発生

長谷川修司

0298（
53）
3277

260

千葉市弥生町1−33

118

氏
班員 渡辺

名
武

所

住

属

所

佐賀医大免疫血清

840−
01 佐賀市鍋島町
0952（
大字鍋
31）
島6511

諾

奥田 拓遺

愛媛大学医学部生化学二791−
02 愛媛県温泉郡重信町

顧問

江橋 節郎

岡崎国立共同研究機構生理学研究所444

岡崎市明大寺
0564（
町字西
53）
郷7345
中38
0899
（
64）
5111

今堀 和友

東京都老人総合研究所

173

東京都板橋区栄町35−2
03（
964）
1131