2022年⽇化協LRI研究報告会（ウェブ）2022年8⽉26⽇

反復投与毒性の評価のための統計学的・数理科学的アプローチによる客観的なリードアクロス⼿法の開発
代表研究者：吉成浩一（静岡県大薬学部）
分担研究者：竹下潤一（産総研安全科学研究部門）：鈴木知道（東京理科大理工学部）

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研究背景
n 化学物質の安全性は主に動物実験の結果を基に評価されているが、動物実験代替法の開発が強く求められている。
n EUでの動物実験が⾏われた化粧品完成品、原料及び配合原料の販売禁⽌（2013年）、⽶国環境保護庁による哺乳類を⽤いた試験の要求及び研究費補助の30%削減（2025年まで）並びに全廃（2035年まで）の発表など、その流れは加速している。
n しかし、安全性評価、特に全⾝毒性評価に重要な反復投与毒性では、その毒性の多様さ、複雑さなどの理由から動物実験代替法の開発は全く進んでいない。
n このような複雑な毒性では、グルーピングアプローチ（カテゴリーアプローチ）とリードアクロスによる評価に期待が寄せられている。
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カテゴリーアプローチとリードアクロス• 化学構造や⽣物学的特徴が類似した化学物質群をグルーピングし、そのグルーピングに基づき毒性評価を⾏う。
• 被験物質（未評価）と同じグループに属する物質の毒性試験結果から、被験物質の毒性を類推（リードアクロス）する。
既存の⼿法における問題点• 類似性は⼈が判断→主観的であり再現性に問題あり• 類似性判断に実験データも利⽤されつつある→どのような実験データを⽤いるべ
きか不明瞭• 被験物質がいずれのグループにも当てはまらない可能性

シリコ
非シリコ︖
メンソールカテゴリー

同じ︖
異なる︖

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体系的・客観的なリードアクロス⼿法開発の課題
リードアクロス⼿法の概略
被験物質（ターゲット）

既存の毒性試験結果

課題
ステップ１• どんな指標で類似性を判断？
• 化学構造のみ？
⽣物学的情報が必要？
機序の情報は必要？

類似物質の選択（ステップ１） • どの程度までが似てる物質？
類似物質
（ソース）

被験物質の毒性評価（ステップ２）• いくつの類似物質が必要？
ステップ２• 判断基準は？
• 毒性の有無：多数決？１つでもあれば有害？
• LOAEL/NOAELの評価？

n 客観的なリードアクロスの実施には、検討すべき項⽬が多い。4

本研究の⽬的・⽬標
HESS等のラット反復投与毒性試験データベースを参照データベースとして、被験物質の化学構造情報やインビトロ試験データから参照データベース内の類似物質を同定し、同定した類似物質から被験物質の毒性を予測する⼿法を開発する。
「毒性」には、以下の２つを設定する
1. 肝毒性、腎毒性、⾎液毒性、神経毒性、呼吸器毒性などの主要臓器毒性の有無、⼜はその毒性の程度（NO(A)EL）
2. 上記臓器毒性のパターン
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実施計画概要
１．データセット整備、エンドポイント（EP）設定• ラット反復投与毒性試験データ整理︓HESS、REACHデータの利⽤• EPの整理によるグループEPの設定
２．分⼦記述⼦を利⽤した類似性評価と毒性評価• 分⼦記述⼦の種類の検討• 類似性評価⼿法（物質間距離の種類）の検討• 類似物質（ソース物質）数及び判定基準の検討• 統計学的・数理科学的アプローチによる変数選択⼿法の検討
３．インビトロ試験の実施• 薬物代謝酵素反応性試験• ラット肝細胞を⽤いたフェノタイピング試験、等
４．インシリコ、インビトロデータを統合したリードアクロスの実施• 変数選択とケーススタディの繰り返しによる最適化• 他のデータセット（異なる物質群、試験期間）での検討
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解析例• HESS搭載物質（326物質）を利⽤• 肝毒性、⾎液毒性の有無を予測• 分⼦記述⼦のユークリッド距離による類似性評価• 記述⼦の種類とソース化合物数が、毒性⼀致率に及ぼす影響を解析

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⽅法︓データセット
被験物質• HESSに含まれる326物質を使⽤• 32物質を被験物質としてランダムに選択• 残りの294物質を参照物質（ソース物質の候補）として使⽤
毒性試験情報• 雄性ラットの28⽇間/42⽇間反復投与毒性試験データを使⽤• 類似所⾒をグループ化し、グループエンドポイント（gEP）
を定義（次スライド）• ６種の肝毒性関連gEP、２種の⾎液毒性関連gEPを使⽤• ある化合物について、あるgEPに含まれる所⾒のいずれかでLOELが報告されていた（陽性であった）場合、その化合物はそのgEPで陽性と判断
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グループエンドポイント（gEP）
Target organ

肝臓Liver

⾎液BloodID

Description

Positiveratio

LV01

細胞死/炎症 Cell death/inflammation

31.6%

LV02

肝機能低下 Reduced liver function

18.7%

LV03

肝機能亢進 Enhanced liver function

27.0%

LV04

胆管障害 Bile duct-associated lesion

37.7%

LV05

肥⼤ Hypertrophy

54.9%

LV06

脂質代謝異常 Dyslipidemia

44.2%

BL01

凝固障害 Coagulopathy

20.6%

BL02

貧⾎ Anemia

29.8%

n ６種の肝毒性関連gEP、２種の⾎液毒性関連gEP
n 陽性率︓gEPにより偏りあり（18%〜55%）

9⽅法︓類似度評価とリードアクロス
分⼦記述⼦• ⼆次元構造（SMILES）に基づきalvaDescソフトウェアを利⽤して分⼦記述⼦を計算• 計算可能な3000程度の記述⼦のうち、化学構造との関連が分かりやすい６グループの記述⼦セットを使⽤• ①相関の⾼い（>0.9）記述⼦を削除したセット、②各gEPと関連性が⾼い記述⼦を選択したセット、で⽐較
ソース物質選択とリードアクロス• 記述⼦の値を正規化し、物質間のユークリッド距離を計算• 各被験物質と近い５〜11物質をソース物質として選択• 32被験物質の各gEPの有無を、ソース物質のデータから予測︓①過半数、②各gEPの陽性率を閾値として評価
10結果の例：LV01（肝細胞死・炎症）
感度⼀致率 （32物質の平均値）

特異度

記述⼦選択︓

相関係数 <0.9

P < 0.10（205種）

P < 0.20（31種）（76種）

1.01.01.00.80.80.80.60.60.6（閾値︓50%） 0.40.40.40.20.20.20.00.00.0

判定基準

多数決

57951179111.01.01.00.80.80.80.60.60.6（閾値︓31%） 0.40.40.40.20.20.20.00.00.0

陽性率57911579115791157911

ソース物質数n 特異度は⾼いが、感度は低かった。その傾向は多数決判断で顕著であった。
n 記述⼦の種類による⼤きな影響は認められなかった。

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結果の例：BL02（貧血）感度

⼀致率 （32物質の平均値）

特異度

記述⼦選択︓

相関係数 <0.9P < 0.10（205種）

P < 0.20（75種）（118種）

1.01.01.00.80.80.80.60.60.6（閾値︓50%） 0.40.40.40.20.20.20.00.00.0

判定基準

多数決

57911579111.01.01.00.80.80.80.60.60.6（閾値︓30%） 0.40.40.40.20.20.20.00.00.0

陽性率57911579115791157911

ソース物質数n 特異度は⾼いが、感度は低かった。その傾向は多数決判断で顕著であった。
n 多数決判断では、相関係数に基づく記述⼦選択でより⾼い精度が得られた。

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まとめと今後の予定
n HESSに搭載されている326物質を対象に、分⼦記述⼦を⽤いたリードアクロスによる肝毒性及び⾎液毒性の評価を実施した。
n ⽤いる記述⼦の種類、ソース物質数、判定基準（閾値）の毒性評価への影響を解析したところ、判定基準は、多くのgEPにおいて予測精度に⼤きな影響を与えることが明らかになった。⼀⽅、記述⼦の種類やソース物質数の影響は、毒性gEPの種類により異なった。
n 今後、データベース物質数、gEPの種類、分⼦記述⼦数を拡⼤し、同様の解析を⾏う。
n ケーススタディを繰り返して適切な変数や物質間距離（e.g. ユークリッド距離/p-ミンコフスキー距離、コサイン距離、拡張Jaccard距離）を選択し、リードアクロスによる毒性予測⼿法の確⽴を⽬指す。

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