厚生

省

新薬開発研究費

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

江

橋

班

昭和62年度研究報告書

昭和63年3月

目次Ⅰ．総括研究報告3

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

江橋 節郎

Ⅱ．分担研究報告
1）ホルフェニシンの生体内動態─螢光HPLCによるマウス血清および筋肉中濃度の測定─

17

九州大学薬学部 大倉 洋甫 巣

文峰 甲斐 雅亮

232）筋肉内酵素網の動態に対するベスタチンおよびその立体異性体の影響
微生物化学研究所 青柳 高明 和田 孝雄 小島 蕗子
永井真知子 原田 滋子

3）蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

33（財）大阪基礎医学研究奨励会 藤井 節郎

4）Lysosomal proteolysisのCystatinによる制御機構ならびにCystatinの大量産生

37

第1部: Cathepsin群のプロセッシングとCystatinによるLysosomal proteolysisの制御機構
第2部: Cystatinα遺伝子の大腸菌による発現とLysosomal proteolysisの抑制
徳島大学酵素科学研究センター 勝沼 信彦 木南 英紀 大和 正幸
原三井東圧化学 池

研治 板東 祥晃
祥雅5) C‑蛋白質を指標とした筋ジストロフィー症の解析

47

千葉大学理学部生物学科 丸山 工作 大日方 昂 佐野 一裕
小島崇6) CANP阻害剤の設計および合成に関する研究

53

東京理科大学理学部 向山 光昭

7) CANP阻害剤の合成

57

大正製薬総合研究所 大関 正弘 花田 和紀 横尾 千尋
村田 充男
東京都臨床医学総合研究所 鎗木 紘一
徳島大学酵素科学研究センター 勝沼 信彦

8) CANP阻害剤の一般薬理学的研究

61

─筋電図および神経活動中の呼吸運動関連成分の定量的評価法に関する基礎的研究─
東京慈恵会医科大学第二薬理学教室

ⅰ

福原

武彦

高野

一夫

加藤

総夫

木村

直史

9) CANP遺伝子のクローニングに関する研究

69

東京都臨床医学総合研究所

鈴木

紘一

川島

誠一

10)筋ジスハムスターにおけるCANP系の変動

73

東京都老人総合研究所

林

昌美

中村

愛

11）ぺスタチンの使用経験

77─特に同量固定法single blind法による治験例にbestatinを再投与した
その後の実態とdouble blind登録例について─
東京女子医科大学小児科 福山 幸夫

大沢真木子 斎藤加代子

新井 ゆみ

平沢 恭子 川井未加子

中田 恵久子 宍倉 啓子 鈴木 暘子
平山義人12) Duchenne型筋ジストロフィー症の血清酵素におよぼすべスタチン(NK421)の効果
国立療養所兵庫中央病院

高橋

桂一

西尾

83

英久

13) Duchenne型筋ジストロフィー症に対するベスタチンの効果87

─尿中3メチルヒスチジンの測定を中心とした検討─
国立療養所字多野病院 西谷裕 板垣 泰子

大阪市立大学生活科学部 平野久美子

14）ベスタチンの使用経験
─九州地区5歳以下の対象例について─
国立療養所西別府病院 三吉野産治 江田伊勢松

9315）フォルフェンシノールの筋ジストロフィー症に対する効果（第2報）

国立療養所箱根病院 村上 慶郎 岡崎隆 林
斎藤有 馬場 繁二16）ベスタチンの筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究
東邦大学医学部第四内科 木下 真男
国立精神・神経センター 里吉栄二郎
東京女子医科大学 福山 幸夫
国立療養所西別府病院 三吉野産治
国立療養所箱根病院 村上 慶郎

95

英人

99

107
17) Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過: EST投与群での検討
新潟大学脳研究所神経内科 宮武
正 桑原 武夫 湯浅 龍彦
国立療養所新潟病院 山崎 元義

国立療養所東埼玉病院 石原 傳幸
国立療養所下志津病院 中野 今治
国立療養所医王病院 本家 一也
国立精神・神経センター 杉田 秀夫

ⅱ18) ADL scoreの検討による筋ジストロフィー障害度の再評価
国立療養所東埼玉病院

111

石原

傳幸

五味慎太郎

儀武

三郎

青柳

宮川

雅仁

昭雄

東京医科歯科大学雉治疾患研究所 佐久間 昭

19）血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義

119─モノクローナル抗体によるキット化の試み─
東京大学医学部第三内科 矢崎 義雄

20）各種プロテアーゼインヒビター投与の筋ジストロフィーマウスに対する効果
和歌山県立医科大学第二生理学 辻

125

繁勝

21）E‑64誘導体による糖原病Ⅱ型ウズラの治療

129

国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部 杉田 秀夫 石浦 章一 塚原 俊文
須原芳宏

22）実験的筋炎モデル動物の作製に関する研究

菊地

建機
133

─自己免疫筋疾患抗原物質のモノクローナル抗体による解析─
国立精神・神経センター神経研究所 里吉栄二郎 古川 昭栄 赤沢左衛子
加茂功

Ⅲ．低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班分担研究者一覧

ⅲ

139

総括研究報告低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究主任研究者 江 橋 節 郎
本研究姓は，低分子蛋白分解酵素阻害物質またジアミノー4，5−エチレンジオキシベンゼン（DEB）

は，細胞膜酵素阻害物質を用いて，進行性筋ジスを用いて，プレカラム蛍光誘導体化HPLCによるトロフィー治療薬を開発するを目的とする．

ホルフェニシンの薬物モニター法を確立した．まこの数年，遺伝子工学的手法の導入により，デュた，ホルフェニシンおよびホルフェニシノールを

シェンヌ型ジストロフィーの本態研究に画期的なそれぞれマウスに経口投与したときの血清および進歩があり，本研究班珪月らの努力により，欠落

筋肉中のホルフェニシンならびにホルフェニシノがその原因となると考えられる蛋白が，少なくとールの濃度分布を調べた．

も免疫学的に同定されるに至った．この事は，本

1．ホルフェニシンのHPLC定量：マウス筋病の治療薬開発に関し，この方向の研究の進展に肉の酢酸ホモジネートおよび血清をそれぞれ過塩より，従来より遥かに具体的な指針の確立が可能

素酸で除蛋白したのち，遠心して得られた上清にとなったことを意味する．

DEBを加え，600C，30分間蛍光反応を行なう．反

このような状況下にあっても，対症的な治療法

応後，反応液をHPLCに注入し，ホルフェニシンの開発検討は，忽せにされるべきでなく，従来の蛍光体を分離，検出する．HPLCはTSKgelODS

暗中模索的段階から脱却し，実体的把握が可能と−120Tカラムを用い，アセトニトリルー30mMリなった現時点においては，本研究班め指向する治ン酸塩緩衝液（pH6．5）（1：5，Ⅴ／v）を移動相と療法の意義がより実質的なものとなり，その具体する．蛍光検出はEx350mmおよびEm420nmで化が焦眉の急となってきたことを意味する．この行なう．この方法の検出限界（S／N＝2）は血清中意味において，本研究班が目標としてきた新しい

4．9pmol／mlおよび筋肉中11．9pmol／gであった．

治療薬開発の研究に加え，本年度は従来から継続

2．ホルフェニシンならびにホル7ェニシノー

中のベスタテンおよびロキシスタテンの臨床的結ルの体内動態：ホルフェニシンを経口投与（30

果判定に関する研究にも力を注ぐこととなった．

mg／kg）したマウスの体内では，投与後，1〜8

具体的な研究結果は下記の通りである．

時間において血清中100−2mmol／mlおよび筋肉中20−2nmol／gの経時的濃度変化を示した．このと1．ホルフェニシンの生体内動態

き，ホル7ェニシンの代謝物としてホルフェニシ−蛍光HPLCによるマウス血清および筋肉

ノールが比較的高濃度（10nmol／ml or g）で観中濃度の測定−察された．一方，ホルフェニシノールを同様にマ

大倉班月は芳香族アルデヒドの蛍光試薬，1，2−

ウスに投与した場合，ホルフェニシノールの血清−3−

および筋肉中の経時的濃度変化はホルフェニシン

成基質とその阻害剤について検討を加えてきた．

投与におけるホルフェニシンの濃度変化とほぼ同

合成阻害剤についてはTrypsin，Plasmin，

じであった．この場合も，ホルフェニシノールかThrombin，Kallikreinおよび補体系のClf，ClS

らの代謝物としてホル7ユニシンの生成が認めらに対する強い阻害活性をもつものを見出し，更にれたが，その血清および筋肉中の濃度は低いレベ〃 びわ0での薬効を示すものを臨床でも応用され

ル（0．01−0．1nmol／mlorg）を示した．

てきている．今回は新しい合成阻害剤について報
告する．

2．筋肉内酵素網の動態に対するベスタチンおよ
びその立体異性体の影響

6Amin0−2−naphthyl［4−（4，5−dihydr0−1H−
imidazo1−2−yl）amino］benzoate dimethane

青柳珪眉は筋ジスマウス，ハムスターなどの筋

Sulfonate（FUT−187）はTrypsin，Plasmin，

肉を含む各臓器内の酵素活性の変動を経時的に調PancreaticKallikrein，ThrombinClfおよびCl

べ，広範囲の酵素に異常が誘起されていることを岳に対し阻害活性を有し2．3×10−5−2．9×10−7M認めた．さらに，筋ジストロフィー症の発症機序でIC5。を示す．また実験的急性膵炎モデルに対しにエキソペプチダーゼがエンドペプチダーゼと異ても効果を示す．補体系において玩J融和での古なる役割を果していることを明らかにした．

典的経路および第2経路を介する補体溶血反応をベスタナンは筋ジストロフィーマウスの発病前強力に抑制し，更に玩∴正路においてモルモットから投与することにより発症阻止効果のあることの血管内溶血反応においても強い阻害活性を示す．

が報告され，またDuchenne型筋ジストロフィー

また補体が関与しているアレルギー反応のⅠⅠ型のの5歳未満の息児における第ⅠⅠ相比較臨床試験でForssman shockおよびSLE自然発症マウスに病状改善効果のあることが認められている．本報

おいても，FUT−187は延命効果が認められてい告はアミノペプチダーゼインヒビターであるベス

る．補体の示す作用は多面的であり，病態におけタナンの作用機序を明らかにすることを目的としる意義もまた多様性を示すこととなる．多くの研て，ベスタナン（活性体）およびその立体異性体

究者の努力によりその意義は解明されつつある．

（不活性体）をマウスに連続投与し，経時的に屠

しかし生体に応用し得る適当を抗補体物質が得ら殺した筋肉（前肢筋，後肢筋）内の酵素活性の変れつつあるため（FUT−175：7サン）補体の病態動について述べる．

における意義が解明されると同時に難治性疾患へ

ベスタナン（活性体）投与および途中で中止しの応用も期待できると考えられる．

た場合は，不活性体および生理食塩水投与の場合と異なる振動状態がみられ，よりシンクロナイズ

4．LysosomalproteolysisのCystatinによる制された状態になることが確認された．

御機構ならびにCystatinの大量産生
勝沼班眉はLysosomalproteolysisの異常冗進

3．蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究に起因する，筋タンパタ崩壊疾患を色々と報告している．細胞内のリソゾーム・プロテアーゼ群（カ藤井班長は現在までに筋ジストロフィー症の発テプシン群）の量と活性の制御機構を明らかにし，症および症状の進行に種々の蛋白分解酵素が重要

その原理に基づく上記疾患の治療法を開発せんとな役割を果していることを明らかにしつつある．

するのが目的である．特にNaturalinhibitorであ

われわれはすでに各種蛋白分解酵素に対する合るCystatinの細胞内での阻害機構を明らかにし，ー4−低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

これを治療目的に利用すべく，リコンビナントにより細胞内に取込まれ，リソゾームと融合してリよる大腸菌プラスミットでの大量産生を行なった．

ソゾーム内カテプシン活性を抑制することを明ら

カテプシン群のプロセッシングに関しては，Bかにした．即ち．シスタテンは細胞質から一度分がD．Steinerら，LとHが勝沼らにより1987年に泌され，エンドサイトーシスされてリソゾームとクローニングによりプレ・プロ前駆体構造が決定

融合し，カテプシン活性を抑制することにより，された．マクロファージ培養系によりS35−Met

多くのリソゾーム酵素の半減期を長くし，且つ酵

チェイスーイムノブロッティング実験で，チェイス

素タンパク量も著増させる．

プロセスに各種Proteaseinhibitorを共存させて最後に此の原理を利用して，カテプシン作用の動態を見た．プロ部のプロセッシング・プロテア

病的冗進をシスタナンにより抑制するととに利用

ーゼは金属プロテアーゼであり、活性成熟型カテ

すべく，シスタナンαのリコンビナントcDNA

プシン群の初発限定分解はカテプシン群自身によを大腸菌プラスミッドにより大量発現することにり起ることが明らかとなった．従ってプロカテ70

成功している．菌体から簡単に精製でき，収率はシンから活性カテプシンになる過程は金属プロテ

5mg／1培地と非常に高い．今後モデル疾患動物

アーゼ阻害剤で抑制できるし，活性カテプシンのの治療実験にこれの試用を始めたい．

分解はE−64等のシステイン・プロテアーゼ阻害剤

5．C一蛋白質を指積とした筋ジストロフィー症

で止めることができる．更にβ−Galactosidase，の解析

P．Hexosamidase等大部分のリソゾーム酵素群の分解の律速にもカテプシン群が関与しており，

丸山珪月は鶏筋ジストロフィー症（筋ジス）でE−64投与で此等リソゾーム酵素群の半減期は著は，特に発症の著しい胸筋で遅筋型C一蛋白質の発明に延長し，酵素タンパク量も増加する．特定の琴が引き起こされることを免疫組織化学法によりリソゾーム酵素の低下または欠損により各種のリ

既に，明らかにした．本研究では，筋ジストロフィ

ソゾーム性蓄積症が起こることが知られている．

ー症の指標としてのC−蛋白質の変化を二次元電此等の中には特定リソゾーム酵素の分解冗進に起気泳動法およびイムノプロット法により更に詳し

因するものもあり，これらはカテ70シン阻害剤でく明らかにした．
従来，C一蛋白質の二次元電気泳動は困雉とされ抑制できる可能性が示された．
次には分解すべきタンパクを食胞に封入するていたので．まずC一蛋白質に通した電気泳動条件（Autophagy）活性の調節が大切であり，食飼条を確立した．二次元電気泳動ゲル上のC−蛋白質の件・ホルモン条件・薬物ならびに遺伝子異常で変スポットはモノクローン抗体により同定した．そ化するが，ここでは論じない．

の結果，最も塩基性の速筋型（FC）から，心筋型

第三にはリソゾーム内でのカテプシンによるタ（cc），遅筋2型（SC2），遅筋1型（SCl），の順

ンパク分解活性の調節が問題である．最近，内在で酸性側に位置する4種のC−蛋白質アイソフォ

性カテプシン・インヒビター（Cystatin）が各種発ームが，親の筋で識別された．分子量はcc，見され，且つ構造決定されたが，此等によるリソ

SCl，FC，SC2の順である．これら4種は速筋のゾーム内カテプシン活性調節の細胞生物学的な機発達過程でStage−SpeCificに発現されるが，特に構は不明であった．我々は精製したシスタチンα

SClとSC2の発現は胸筋と後広背筋−PLD−（いずやシスタチンEWを培養マクロファージや3T3

れも速筋）の発達過程で特徴的な差を示した．即細胞の培地に添加すると，エンドサイトーンスにち，ふ化直後のヒヨコでは両方の筋でFCとSCl−5−が発現されるが，成長につれ胸筋ではSClの消現在までに，N端側にエポキシコハク酸を結合失，PLDではSC2の発現が起こった．筋ジス胸筋させた，ジ（ArgTGlu），トリ（Tyr−Arg一・Glu），

では，ふ化直後に存在したSClは1ヶ月齢頃まで

テトラ（Lys−Tyr−Arg−Glu），およびヘキサ（Proに一旦消失するが，発症のみられる2ヶ月齢には−Pro−Lys−Tyr−Arg−Glu）ペプチドの合成を完了

SClさらにSC2も出現した．即ち，筋ジス胸筋は，し，活性を測定したところ，トリペプチド誘導体

C一蛋白質の発現に関してはヒヨコ胸筋とは異なが，選択性よくCANPを阻害することがわかっ

り，むしろPLD筋と類似した．従って，発症に伴た．

う胸筋での変化は幼若筋型への移行ではなく，C端側にエポキシコハク酸を結合させた誘導体

PLD型↑の移行と言える．除神経胸筋でもSCl，の合成には多少問題があったが，出発物質となる

SC2の発現が引き起こされPLD筋型パターンと

Boc−Glu（OBzl）TNHNH−Fmocの合成法が確立なった．PLD筋とALD筋でのC−蛋白質発現にできたので，近々ペプチド鎖を延長する合成に入ついては正常，筋ジス鶏の間でほとんど差異は認れる見通しである．

められなかった．

また，エポキシコハク酸に代えて導入を検討する予定のフルオロ7マル酸およびフルオロマレイ

6．CANP阻害剤の設計および合成に関する研
究

ン酸の合成が可能となったので，目下その導入法を検討中である．

向山班月はチオールプロテアーゼの特異的イン

7．CANP阻害剤の合成

ヒビターE−64の活性発現に必須な構造のうち，エ
ポキシド部分はチオールとの反応部位，L一ロイシ

大関珪月は昨年度に引き続き，CANPに対してンアミド部分を認識部位と捉えることができた．

特異性の高い阻害剤を得ることを目的とし，E−64

このアミノ酸部分を変換することにより，特定の誘導体の合成を進めた．
本年度は，鈴木址眉がCANP内在性インヒビ

プロテアーゼに対する選択性を高めることができると期待される．

ターの構造解析の研究から明らかにした，活性中

61年度に合成したE−64C中のロイシンを5，5，5

心の一次構造（−TIPPXYR−）に着目し，この部−トリフルオロロイシンに置換した化合物の生物

分構造にエポキシコハク酸を活性基として導入す活性を測定したところ，4つの異性体のうち 2S，ることを試みた．

4S一体はE−64Cと同等の活性を示した．また，2S，

まずC端側からの検討を進めTyr−Arg誘導体

4R一体は，パパインに対する効力は変わらないが，を十種合成した．これらについて，生体内の主シ

CANPに対する効力は低下した．この結果は，本ステインプロテアーゼであるカテプシンB，L，H

研究目的には反したが，フルオロアミノ酸の導入とC阜NPに対する阻害特異性を調べた．

が，酵素に対する選択性を高める手段として有効であることがわかった．

その結果，これらの化合物の中にCANPに対してE−64Cと同程度の阻害活性を示すものが，数次にCANPに対してより選択的に作用するイ種見出されたが，これらは同時にカテプシンB，

ンヒビターを得るため，内在性CANPインヒビ

Lに対しても阻害活性を有しており，特異性の高

ターのアミノ酸配列の繰り返し部分に注目し，そいものではなかった．
しかしながら，同じ考えのもとに共同で検討をの配列をもつ部分ペプチドのエポキシコハク酸誘導体の合成を検討した．

進めた向山班月の研究結果を考え併せると，エポ−6−低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

キンコハク酸にTyr−Arg誘導体を導入すること

経活動とのコヒーレンスには，高頻度同期波の帯により，カテプシンB，L及びCANPに対して阻域に明瞭などークが検出され，これらの間に，共害活性が発現し，更にC端を延ばしたTry−Arg−

通の発振源に由来する1対1に同期した高頻度同

GluはCANPに対する活性は若干低下するもの

期波が存在することを確認した．一方，頸部交感，の，特異性が非常に高まることがわかった．この

腎交感神経ならびに脳波には，これと同期した成ように，内在性CANPインヒビターの活性中心分は認められず，高頻度同期波が呼吸運動性出力のアミノ酸配列を分子設計に応用することにより，に特異的に含まれる成分であることが示唆された．

CANPに対する特異性が高められることが明ら

このような高頻度同期波のスペクトル解析法の応用によって，運動ニューロンから，神経筋伝達，かとなった．
更に本年度は，コンピュータを用いカテプシン

筋収縮に至るまでの過程における病態生理学的変Bの活性中心の三次元構造の解析を試みた．現在，化を定量的にかつ非侵襲的に評価し得る方法とし

CANP，カテプシンLについても同様の試みを行て，筋ジストロフィー症における呼吸筋変性の進なっており，今後これらの結果も分子設計に応用

行の程度，およびCANP阻害剤の治療効果の非したいと考えている．

侵襲的な定量的評価法として臨床的に応用され得る可能性があるものと考えられる．

8．CANP阻害剤の一般薬理学的研究−筋電図および神経活動中の呼吸運動関連成9．CANP遺伝子のクローニングに関する研究

分の定量的評価法に関する基礎的研究一

鈴木班月は昨年CANPインヒビターの構造解福原班眉は呼吸筋の筋電図ならびにそれを支配析を行ない，CANPインヒビター中に約140残基する遠心性神経の電気的活動の定量的解析に基づからなる4回の繰返し構造があることを明らかにいた，呼吸筋変性の程度とCANP阻害剤の治療した．肝臓や赤血球のインヒビターおよび種々の効果を評価する方法を確立するための基礎的知見

インヒビター断片の解析から，①繰返し構造がを得る目的で，横隔神経自発性遠心性発射活動に

CANPを阻害する阻害単位であること，および（∋発現する約60−130Hzの高頻度同期波について

繰返し構造に含まれる「TIPPXYR」の配列が阻害定量的解析を行なって，その生理学的性質についに直接関係することを推測した．本年度はこの成て検討した．

果に基づき，上記2点を遺伝子工学的手法等を用

麻酔下非動化動物から導出された横隔神経自発

いて直接証明することを試みた．

性遠心性発射活動の自己パワースペクトルには約

まず，ウサギCANPインヒビターのCDNAを

80−130Hzの帯域に高頻度同期波に相当する明

断片化し，「TIPPXYR」配列をNおよびC末端

瞭などークが見出された．この時，同時導出され側に近い部位に持つ断片，さらに，この配列を中た三叉，顔面，迷走ならびに舌下神経の遠心性活心にできるだけ短い断片などを調製し，これらの動の自己パワースペクトルにも横隔神経と同じ周cDNAを発現ベクターにつないで大腸菌で発現波数の高頻度同期波のピークが検出された．これ

させ，発現した断片を精製して，CANPに対するらのピーク面積は換気レベルの変化に対し極めて阻害活性を測定した．その結果，TIPPXYRを含鋭敏に変化し，ピーク周波数は横隔神経の高頻度

む配列は必ずCANPの阻害活性を有し，この配同期波のそれと一致したまま平行に遷移した．

列を持たない断片には阻害活性がなかった．また，

横隔神経活動と三叉，顔面，舌下および迷走神

この配列を持つペプチドをcDNAレベルでN，C−7−

両末端側から順次短くして活性との相関を調べた

保っていた．これらの結果は，CANPは筋ジス発

ところ，この配列が欠けると阻害活性も失なわれ症において生化学的反応の活発な比較的初期に作た．このように「TIPPXYR」は阻害活性に必須で用し，過程の進行した段階ではむしろ沈静化してはあるが，この前後につく配列，特に，その長さいることを示唆している．

も阻害活性に大きな作用を持つことがわかった．
この配列を含む約30個の合成ペプチドもCANP

11．ベスタテンの使用経験を特異的に阻害し，Ki値は〟M程度であった．現

一一特に同量固定法single bHnd法による治験

在引き続き最小のインヒビターを検索しつつ阻害例にBestatin再投与したその後の実態と機構の解析を行なっている．

double bHnd登録例について−
福山班長はBestatin（以下B）長期投与の臨床10．筋ジスハムスターにおけるCANP系の変動効果の検討を目的とした．

川島址眉は筋ジストロフィーにおける筋タンパ

昨年度まで同量固定法のSingle blind法で1年ク質の異常分解をもたらすプロテアーゼとして．

間Bまたはplacebo（以下P）投与の10例を対象とカルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）をした．Singleblind終了時に投与希望例は直ちにB考えている．そこで，本酵素系を構成する成分，

再投与予定であったが．都合により投与まで1

即ちカルシウム感受性の異なる2種類（〝CANP〜4か月無投薬期間があった2例は都合により転とmCANP）およびCANPを特異的に阻害する

院，3例はB再投与するも途中で投与中止を希

内在性インヒビターの定量法を確立した．この方

望，1例は最初P，その後も投与希望なく，全経過法を用いて，先ずラット各種組織に存在する

B無投与であった．

JLCANP，mCANP，CANPインヒビターの活性機能障害度（祖父江珪機能障害プロジェクト案）

量を定量した．多くの組織でインヒビター量が総の変化：投与開始前（0週），52週（single blind

CANP量を超えていたが，その比は組織により異終了後），その1年後の104週で判定した．Asingle

なり，肝臓，牌臓，腎臓などではインヒビター量

blind時B投与群：1例では0週より52週の方がが圧倒的に多かった．〟CANP活性は主として腎1段階改善していたが，本例は開始前が骨折後で，臓や牌臓に高波度に存在し，一方mCANPは肺臓

その回復も改善に加味している．1例は，全経過や脳に多量に存在した．したがって，〟CANPとStageは不変だが，起立所要時間はB中断で延長，mCANPの活性の相対量も組織により異なる．ま再投与により短縮を示した．3例では0週，52週

た，全ての組織でmCANP活性がpCANP活性は不変で，104週で1例は1段階，他の1例は2段より高かった．今回対象とする骨格筋は全ての活階悪化していた．残りの1例では無投薬期間に2性が比較的低い組織であり，インヒビター活性は段階悪化し．B再投与でも改善なく，94週で投与

稔CANP活性より高い．次いで，筋ジスハムスタ

中止したが，104週では同stageであった．Bsin・ー（UM一Ⅹ7．1）と正常ハムスターの骨格筋に存

gleblind時P投与群：2例は3歳で開始，うち1在するJLCANP，mCANP，CANPインヒビター

例は0週と52週は不変で，B投与後の104週には2の各活性量を測定した．4週齢においては各活性段階上昇，他の1例iま，P投与後の52週，B投与後とも筋ジス動物において高値を示した．10週齢にの104週ともに1段階ずつ上昇，1例はstageは全

おいては両CANP活性は正常動物と同じレベル

経過不変だが，運動所要時間でB投与で短縮，中に復しているが，インヒビター活性は依然高値を止により延長の傾向が見られた．1例はP投与4−8−低分子酵素阻害物質による難病治摩薬の開発研究

週より1段階低下，52週には2段階低下，3週間（102．5％，P＜0．01），ALDは前借に比し低下B投与するも104週ではさらに2段階悪化した．全（91．8％，P＜0．01）した．

経過B無投与例は，いずれも1段階ずつ低下しNK421はこの条件下で2時間でLAPを抑制した．

た．CKには影響なく，LDH，ALDが4時間およ運動所要時間（立ち上がり・20m走行・起坐）：び6時間で上昇したことは筋よりの酵素遊柾に対開始時5歳未満群では前者に変化なく，後2者でする効果ではなく，赤血球膜透過に対する影響が2例でPからBに変更後短縮をみた．5歳以上群推定された．

で，前2着とも2例でB中断で延長，再投与によPlacebo投与の結果から，この条件下ではCK

り一過性に短縮した．2例で無投薬を契機に起立の有意な変動はなく，CKの日内変動も運動を制不能，再投与でも改善はなかった．

限すれば少ないことが実証された．LAP，LDH，

血清CPK値：5歳以上例で，投与開始後4週

ALDは4時間（10時）までは変動せず，この結果

で，B例で低下，P例で上昇した．

と比較しそNK421の効果が明らかになった．

12．Duchenne型筋ジストロフィー症の血清酵素

13．Duchenne型筋ジストロフィー症に対するベにおよぽすべスタチン（NK421）の効果

スタテンの効果

高橋：旺月はDuchenne型筋ジストロフィー症−尿中3メチルヒスチジンの測定を中心とし（DMD）の血清酵素におよばすべスタテン

た検討−（NK421）の経口投与の効果を時間経過において検討する．

西谷珪月は外来での一時採尿における3メルナ
ヒスチジン（3MH）／クレアチニン（cm）の測定

対象はDMD患者，年齢9−17歳，障害度（8が，筋ジストロフィー症への薬剤投与の効果判定段階分類）3：2名，4：5名，5：7名，6：の指標として有用かどうかを検討し，ベスタナン

7名，7：4名，8：4名の計29名．前日午後9投与において応用した．

時より終了まで安静を保ち．当日午前6時に採血

本院入院中のDuchenne型PMD息児4名におし，直後にNK421100mgあるいはplaceboを経

いて排尿毎に採尿し，3MHとcmの関係をみた．

口投与し，8時，10時，12時に採血し，LAP，両者の相関は良好で，適当な食事制限を加えるな

CK，LDH，ALDをオートアナライザーで測定しらば，3MH／cmの値は常にほぼ一定である事がた．結果は前値に対する変動率で表しpairedStu・

期待でき，24時間蓄尿せずとも部分尿で可能ではdentttestで検定した．最初にNK421を授与し，ないかと思われた．ただcrnが1mg／ml以上の濃2週間以上経過してから同一患者に同条件で縮尿では，相関は乏しくなりcrnが1mg／ml以上

placeboを投与した．

の検体は除外した方がよいと考えられた．

NK421投与後2時間でLAPは有意（P＜0．01）

外因性蛋白に関しては，採尿前24時間以内の食に低下し，4時間，6時間で元のレベルに戻った．

事内容をチェックし，3MH／cmの値との関係を

CKは変動しなかった．LDH，ALDは2時間で変みた．軟体類，甲殻類の摂取，魚肉類の中等量以

動なく4時間，6時間で有意（P＜0．01）に上昇し上の摂取では3MH／cmは．かなり高値を示してた．

おり，これらの摂取が明らかな時はその検体を除Placebo投与ではCK，LDHともに有意の変動

外した．

はなか●った．6時間後（12時）LAPは上昇し−9−

このようにして1年間のベスタナンの二重盲検に応用を試みた．投与前値はベスタナン群で56．9，

ど），生化学的項目（GOT，アルドラーゼ，

プラセポ群で52．4で殆んど差を認めなかった．ベ

LDH，CPK）を選びだし，3歳以下および4歳

スタナン投与後6ヶ月位より，ベスタナン群がプ−5歳の2群にわけ比較検討したが，有意の差のラセボ群に比し，3MH／cmの値が低値となる傾

ある項目は体重，身長のみであった．

向が伺われたが，有意差は認められなかった．今

九州地区の5歳以下DMD児に対する，NK421

後は1年以上の長期投与における検討も必要ではの投与状況を班会議で述べた．投与開始より間もないかと思われた．

ないため，その実施状況の報告となったが，投薬

尿中3MH／crnと血清CK値との相関は認めら

対象児はいずれも外来通院であり，DMD児低年れなかった．

齢層の診察区分を如実に示していた．

14．ベスタテンの使用経験

15．7オルフェンシノールのDuchenne型筋ジス

一九州地区5歳以下の対象例について−トロフィー患者に対する使用（第2報）

三吉野班月は進行性筋ジストロフィー症，特に村上班員は7オルフェンシノールを前回に引きDuchenne型（以下DMDと略す）の治療開発とし続きDuchenne型筋ジストロフィー症（年齢5歳てNK421（ベスタナン）の臨床的研究を担当してから9歳）に46週から112週にわたって使用した．

きた．従来の結果をふまえ，昭和62年度よりはよ

使用量は1日50mgから150mgである．また11例

り若年のDMD児（5歳以下）に対して，全国的の患者で感冒の使用前1年間と使用による1年間に二重盲検比較試験が実施されている．今回はその罷息回数を調査した．結果は9例中5例が歩行の二重盲検比較試験の九州地区の実施状況につき，不能になり2例が立ち上がり時間が悪化した．残若干の検討を加え報告した．

りの1例は5歳の男子であったが46週間使用した方法は全てNK421二重盲検試験実施要領に従が立ち上がり時間は短縮していた．

った．九州地区よりは症例数として10例のDMD

次に感冒の羅息回数では使用前に比べて減少し児が参加した．本研究参加協力施設は国立療養所

たもの7例，増加したもの2例，不変1例で64％

沖縄病院，熊本大学発達小児科，大分医科大学小が感冒罷息回数が減少していた．

児科，久留米大学小児科，福岡大学小児科，福岡

結論（97オルフェンシノールの使用でDuchen−

子供病院の6施設であった．症例のうちわけは3ne型筋ジストロフィー症の運動機能には特別の歳以下が5例，4歳〜5歳が5例であった．

効果は見られなかった．②感冒の罷息に対して予

九州地区の5歳以下DMD児の臨床的背景とし防効果が認められた．

ては，DMD児として診断が確定，ほぼ確定しているものは8例中7例であった（発達小児科の2例

16．ベスタテンの筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究は63年4月より試験開始）．初発症状は運動発達の遅れが3例と多かった．合併症として1名に自閉

木下班月は昨年来ベスタナンのDuchenne型筋的傾向が認められた．診察区分として，5歳以下

ジストロフィーに対する効果の群間比較試験を行という年齢もあって，全て外来通院であった．機なって釆たが，本年度はその後半を実施し，1年

能障害は軽く，Stagelが2例，Stage2が6例で間の投薬の結果が集計された．症例はA群（4歳あった．さらに試験開始のプロトコールの項目よ

以下）52例，B群（5−7歳）75例．計127例で，り体重，身長，運動機能（10m走行，階段昇降な

それぞれ約半数を対照群として二群に分け，1年−10−低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

間の症状，所見，検査成績の変化について群間比

前回より息児年齢を下げ，3歳以下，4〜5歳の較を行った．その結果，主としてA群において二群について全国から各60例を集め，各々30例ず

二・三の成績で群間に有意差が確かめられた．すつに分けて盲検試験を開始することとなった．ベ

なわち，階段昇り姿勢，同降り姿勢，上肢挙上運

スタナン投与量は前回と同じとし，1日150mgの動，腱反射の保持，股関節屈曲筋力などで投薬群

ドライシロップを分3服用とした．1年間服用後の方が改善を示した．この傾向は特に3歳以下のに両群の解析を行うこととし，現在すでに予定の患者について比較した場合に明らかであり，ベス

症例数の登録をほぼ終了し，試験を開始．一部のタテンが何らかの作用を有する可能性が示唆され症例は既に3ヶ月に入っている．この集計の結果

た．

を待って本別の筋ジストロフィーに対する効果の以上の結果に基づき，本年度後半からはベスタ

有無の最終判定を行なう予定である．

テンの二重盲検試験を実施することになり，更にA群12ヶ月
薬

剤

改善

不変

軽悪

中悪

著悪

計

改 善率

N K

42 1

10

10

1

2

0

23

4 3％

ズ2

悪 化率
13 ％

P ＜ 0 ．1
プ ラセ ポ

5 18

18

1

1

0

25

2 0％

声2

N S
8％

B群12ヶ月
薬

剤

改善

不変

軽悪

中悪

著悪

計

改善率

NK

421

3

8

11

7

4

33

9％

ズ2

悪化率
67％

NS
プラセポ

5

7

12

11

1

17．Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨
床経過：EST投与群での検討

36

ズ2

14％

NS
67％

4週後に副作用が無いことを確認した後に8mgに増量した．観察期間は8カ月から3年3カ月（平宮武班月はDuchenne型進行性筋ジストロフィ

均1年11カ月±11．4カ月）である．

ー症（以下DMDと略す）に対するESTの治療効

対照群はDMD172例で，ADLの観察開始時年

果について日常生活動作能力（以下ADLと略す）

齢6歳2カ月〜28歳2カ月で各症例の観察期間はの推移を検討した．

1ヵ月〜11年5ヵ月（平均5年8ヵ月）でこの間

対象は国立療養所新潟病院・東埼玉病院・下志津病院・医王病院の4施設に入院（一部外来通院）のSampling pointは1〜60（平均33points）である．

中のDMD児（全例男子）73例で，詳細は以下に方法として対照群のADLの経過をEST投与

示す如くである．すなわち，年齢は3歳6カ月〜18 群の経過と比較検討した．
歳10ヵ月（平均10歳6ヵ月±3歳1カ月），ステー

観察開始時期のADLは対照群とEST群の間ジⅠ7例，ⅠⅠ23例，ⅠⅠⅠ3例，ⅠV14例，V18例，ⅤⅠ で差を認めず，ADL値は両群とも加齢により指数9例．

関数的に低下し，ほぼ10歳前後で50点を割った．

ESTの投与量は体重あたり4血gから開始し，全ての観察点でEST群は対照群に比し高値を示−11−

ⅤⅠ．独立平地歩行可能

したが両者の間に差を認めなかった．

ⅥⅠ．片手支持による両脚でのよりかかり立ちそこで観察開始時に歩行可能であった症例（す可能

なわちADL50点以上）に限ってADLの推移を調査した．EST群と対照群ともにADL50−60点まⅧ．四つ這い可能では指数関数的に低下するが，対照群ではADL

ⅠⅩ．四つ這い位保持可能の低下がさらに続き10点まで低下した．一方ESTⅩ．宴返りは出来ないが，横向きまで可能

群では60−50点以降低下が停滞する傾向が見られ

H．自力で坐位保持可能

た．

コ皿．自力で坐位保持不能，全介助

今回の検討では両者の観察期間が一定化されて自然歴も蓄積されており，今後DMDの投薬におらず統計学的検討を行ない得なかった．しかし，際し薬効判定に有用な障害度分類と考えられる．

このような治療的検討は比較的ADLの良好な症例に対して施行されるべきであろうという結論が19．骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発
矢崎珪眉は筋肉組織の障害過程と進展度を特異得られた．

的に反映し，定量的に推定しうる指標物質の選定

18．ADLscoreの検討による筋ジストロフィー症
障害度の再評価とその測定法の確立が，患者の病態の把握，予後の判定さらには治療法の効果判定に必須であり，石原珪眉は米・英のグルー7pと比較し日本ではその開発が緊急の課題としている．我々は血中ミ筋力評価の自然歴の蓄積がなく，DMDに対する

オシン軽鎖を測定するラジオイムノアッセイ法を

薬効判定の評価基準がなく困雉を感じてきた．今開発し，急性心筋梗塞および骨格筋変性疾患患者

回我々はADLスコアに着日し尺度解析法によりにおけるその測定の臨床的意義を検討した．急性159例のDMDにおいてADL項目を解析し，薬効

心筋梗塞患者においては梗塞サイズをよく反映し，判定に有用と思われる新障害度分類を作成し得た患者の予後の判定さらにはその治療法の効果を評ので報告する．対象は国立療養所東埼玉病院に入価する際にきわめて有用な指標となることを示し院した159例のDMD．従来より療養所で施行してた．同法を筋ジストロフィー症を中心に骨格筋変きたADLlOOサブテストを独立のアイテムと考性疾患患者において測定したところ，CPKとよくえ尺度解析を施行した．結果，従来よりよく知ら相関する高値が得られた．今後は両指標と病態とれている8段階障害度を尺度解析したところ，信の関連を検討したい．さらに，このような血中軽頼性のメルクマールであるRepO．95，PPRO．95，

鎖測定法を一般臨床の場で使用が可能になるよう

新障害皮分類ではRepO．99，PPRO．96ちなみににキット化するためにモノクローナル抗体を導入

ADL（100点法）では0．95，0．67であった．新障害

して二抗体サンドウィッチ法を開発した．マウス

度分類の信頼性は従来より高かった．

ハイブリドーマを用いて心筋と骨格筋ミオシン軽新障害度分類は次の如くである．

鎖を広く認識するモノクローナル抗体（ML544）

Ⅰ．ゆっく りとしゃがむことができる

を中心に測定系を確立した．本法は簡便にしかもⅠⅠ．介助なく階段昇降可能

正確に血中ミオシン軽鎖を測定することが可能でHI．通常の高さの椅子より立ち上がり可能あるが，抗体の免疫組織学的な検討により白筋タⅠⅤ．介助なく床から立ち上がり可能

イプの軽鎖には全く反応しないことが判明した．

Ⅴ．手すりを用いて階段昇降可能

したがって，自筋タイプ骨格筋を主に障害する筋−12−低分子酵素阻害物質による雉病治樺薬の開発研究

ジストロフィー症では病態の把握あるいは治療効

又．排脹筋標本による組織学的観察も組織像の悪果の判定には感度が低い可能性がある．

化の程度の軽減という結果を示しマーカー酵素のそこで我々は，抗体ML544を大量生産して7活性変化に見られる改善傾向を支持していた．更7イニティーカラムを作成し，ヒト骨格筋ミオシに投与期間中の体重変化はFormestin−Aとン軽鎖より赤筋タイ70を吸着し，自筋タイプを主FUT−175で顕著な増加を示していたが他の2種とした軽鎖を分画してこれを抗尉こ，再びマウス

類の阻害物では対照と変らない変化を示していた．

ハイブリドーマを用いて，白筋タイプミオシン軽これらの結果はmdxマウスについて行なった実鎖を特異的に測定するアッセイ系を確立する準備

験結果とほぼ一致しており，今回用いられた酵素を整え，本年度中には確立する予定である．

阻害物質は程度の差はあるがいずれもmdxマウスならびにdyマウスという異なった遺伝子によ20．各種プロテアーゼ・インヒビター投与の筋ジストロフィー症マウスに対する効果って発現される2種類の疾患モデル動物に共通して症状抑制に有効であることから，筋ジストロフ

辻班月はActinonin，Diprotin−A，Formestin−
AおよびFUT−175の4種類の蛋白質分解酵素阻ィー症の治療薬として症状進行に対する軽減効果を期待出来るものと推察される．

害物質を発症初期の筋ジストロフィー症（dy）マウスに4週間および6週間連続投与する実験を行

21．糖原病ⅠⅠ型ウズラのEST治療の試み

ない，これら酵素阻害物質の筋ジストロフィー症

杉田珪眉は酸性α−グルコシターゼ欠損を示すに対する玩∴正和における疾病抑制効果について

糖原病ウズラの病態の解明と治療を目的として以検討した．

下の実験を行なった．

実験は生後4週間のC57BL／6J−dy系の疾病

本ウズラ骨格筋中の酸性α一グルコシターゼ活（dy）マウス各3頚ずつを一組とし，各阻害物質

性は胎生期より正常の20−30％と低く，これがリの食塩水溶液（1mg／1ml）を0．2mlずつ1日2

ソゾーム内のグリコーゲン蓄積の原因であると考回背部皮下に連日注射し，投与期間終了後屠殺しえられている．我々は，まずニワトリ骨格筋よりた披検マウスについて血清中ならびに骨格筋中の大量に同酵素を精製した後，家兎を用いて免疫し疾病進行のマーカー酵素であるPK，CPK，GOT抗体を得た．この抗体がウズラ酸性α−グルコシおよびLDHの活性を測定した．又，同時に採出し

ターゼと交叉することを確認し，粗抽出液での酵た被検マウスの排脹筋で光顕用組織標本を作製し，素分子種の変化をイムノプロット法を用いて検索

組織学的検索を行なった．

した．結果は以下に示す通りである．

結果はCPKおよびPKの活性に関しては4種

1）正常ウズラ骨格筋には110Kと98Kの2桂類の酵素阻害物質投与群全てについて血清中進出の免疫交叉物質が存在するが，後者が精製酸性α活性が低下し，骨格筋中に存在する活性が増加し，−グルコンターゼに対応した．

正常マウスの状態に近づくという傾向が認められ，

2）糖原病ウズラ骨格筋には110Kのみが存在

疾病抑制に有効であることを示していた．LDHし，正常筋に見られるmatureformである98K分

活性の変化に関してもDiprotin−A投与マウス骨子は検出されなかった．

格筋中の活性を唯一の例外として疾病抑制の傾向

3）両ウズラ線維芽細胞を用いた実験により，が認められたが，GOT活性に関しては対照マウ

リソゾーム中にはある程度活性を持った酵素が確スとの間にあまり顕著な差異は見られなかった．

かに存在した．
−13−

以上の事実より，糖原病ウズラにおいては前駆

昨年度，ラットやヒト筋肉の生理食塩水（PBS）

体は合成されるが，正常のプロセシングが行なわ抽出物中に，筋炎患者の一部や，重症筋無力症患れないか，又はリソゾームへの移行に一部欠陥が者の半数以上の患者血清のIgGと抗原抗体反応ある可能性が考えられた．次に，これらがヒト成を起こす物質があることを報告した．また，この

人型糖原病ⅠⅠ型に類似しているため，タンパク分抗原（muscleextractantigen：MEantigen）に解を抑えることにより酵素の異常な分解が抑制さ対するモノクローナル抗体を作製したことも報告れてグリコーゲン蓄積が軽減するのではないか，した．本年度はこのモノクローナル抗体の特性と，と考えリソゾームカテ70シン類の強力な阻害物質

それを用いて，ME antigenのいくつかの性質をであるESTを用いて同疾患の治療の試みを行な明らかにした．以下に，結果を示す．

った．

1）抗MEantigenモノクローナル抗体は3種類

まず，ウズラ線維芽細胞をESTの存在下で5得られた．1E7，2B2は同一エピトープを，7D9日間培養し，酸性α一グルコシターゼ活性の上昇は異なるエピトープを認識する．2種のエピトが見られるかどうかを検討した．その結果，EST

ープは同一分子内に存在し，患者血清中に同じ

O．lJJg／mlにおいても同酵素活性の1．5〜2倍上エピトープを認識する抗体が存在する．

Lを阻害す2）ME antigenはラットでは骨格筋と心臓に局ることにより，他のリソゾーム酵素の分解が抑制

在するが胸腺にも微量存在する．胸腺との関連され，糖尿病においても一部欠損している酵素活は自己免疫疾患の発症機序．との関連で興味深い．

昇が見られ，確かにカテプシンB＆3）ME antigenは培養筋細胞で調べると，融合性の回復が観察された．

し多核となった筋管細胞でのみ発現し，しかも22．実験的筋炎モデル動物の作製に関する研究

細胞外へ分泌される．よって，ME antigenは−自己免疫筋疾患抗原物質のモノクローナル

筋特異的細胞外マトリックス構成成分である可抗体による解析−

能性が高まった．

豊吉班長は多発性筋炎，皮膚筋炎および重症筋

4）高性能高速液体クロマトグラフィーの使用に無力症などの自己免疫筋疾患の実験モデル動物を

よってMEantigenが精製やきる見通しとなっ作製し，これらを用いて低分子酵素阻害物質の薬

た．精製品を用いて，構造解析，モチリレ動物作

効を評価することを目的とする．

製に着手しつつある．
以 上

−14−

分担研究報告ホル7ェニシンの生体内動態
螢光HPLCによるマウス血清および筋肉中濃度の測定
大 倉 洋 甫＊
研究協力者

巣

文 峰＊

甲 斐 雅 亮＊

近交系C57BLマウス（雄性，5退齢，約18g体

は じ め にわれわれは，高選択的かつ高感度な螢光誘導体重）に生理食塩水で調製したホルフェニシンある化反応を利用した螢光検出・高速液体クロマトグ

いはホルフェニシノールを30mg／kgの投与量でラフィー（HPLC）を手段として，血液ならびに筋経口授与した．投与後，水だけを与え，各時間ご

肉中ロイペプチン1㌧ベスタナン2）−3），p−ヒドロキシとにマウスを頸動脈切断によって殺し，直ちに血ベスタナン3）・4），ホルフェニシノール5），6），アンチパ

清および僧帽筋を採取した．得られた血清と筋肉

イン7）などの薬物モニター法を開発し，それらのは測定まで−800Cの冷凍庫に保存した．

生体内動態を検討してきた．また，61年度にホル血清10恥1に1．5M過塩素酸100JJlおよび水50

フェニシンのHPLC用高感度螢光試薬として1，2〟1（検量線作成時にはホルフェニシンまたはホル−ジアミノー4，5−エチレンジオキンベンゼン

フェニシノールの標準液）を加え，1000gで15分間（DEB）を開発した．この試薬はホルフェニシン

遠心し除蛋白した．また，筋肉（0．1g）を8．4mM

分子中のアルデヒド基と反応し，螢光性のベンゾ

酢酸150／Jlおよび水（検量線作成時にはホルフェイミグゾール誘導体を与える（図1）．

ニシンまたはホルフェニシノールの標準液）15叫1

本年度は，生体試料の前処理およびHPLC条件

でホモジナイズした．ホモジネートに1．5M過塩について検討し，DEB試薬を用いた螢光・HPLC

素酸250JJlを加え，1000gで20分間遠心し除蛋白によるホルフェニシンの薬物モニター法を確立しした．得られた両上清を螢光誘導体化反応に使用た．次に，ホルフェニシンを経口投与したマウス

した．

の血清および筋肉中のホル7ェニシンの経時的濃2）ホルフェニシンの螢光誘導体化反応

度変化を調べた．このとき，同試料中にホルフェ

上清100JLlに15mM DEB水溶液を200JLl加え，

ニシンの代謝物として，ホルフェニシノールの生600Cで30分間加熟した．反応液100JLlをHPLCに成が認められたので，先に報告したホルフェニシ注入した．

ノールの自然螢光検出HPLC6）によってこれも3）HPLC条件および使用機器測定した．さらに，ホルフェニシノールを経口投

高速液体クロマトグラフには，サンプルイン

与したマウスの血清および筋肉中のホル7ェニシ

ジェクター（100JJlループ）を備えた東洋曹達803

ノールならびに代謝によって生成したホル7ェニ

D型HPLC用ポンプ，12JLlフローセルを装備しシンの経時的濃度変化についても調べた．

た日立F−1000型螢光検出器および理化電機R−21型記録計を使用した．

実験方法
1）経口投与および生体試料の前処理

逆相分配型のTSKgelODS−120T（粒径5JLm）
カラム（250×4mm，i．d．）を用い，アセトニトリ
ルと30mMリン酸塩緩衝液（pH6．5）の混液（1：■九州大学薬学部

5，V／V）からなる溶離液を流速1．Oml／minで送液
−17−

HO

NH2
CH・COOH＋〔瓢Cる濫cooH〔：Ⅲ：：；H

DEB

Forphenicine

Fluorophore

図1Fluorescence derivatization of forphenicine with DEB
（B）

1

2

5

q

5

6

1

7

2

5

q

5

Perch10rlc ocld（M）

PH of phosph（】te buffer

図20︹ UコごDLごqLD二名芯二名と1≡UコごDLl一qLロ︶芸雲呈竜と（A）

Effectsof（A）pHand（B）theconcentrationofperChloricacidusedforthedeproteination
onthederivatizationofforphenicine．A，50JLleachoflOnmol／mlforphenicineand50mM
phosphate buffer（pHl．0−7．0）were treatedinplace of a biologiCalsample solution
accordingtothederivatizationprocedure；B，a50−JLlportionof25nmol／mlforphenicine
WaSaddedtolOOJLlofadrug−freeserumanddeproteinizedwithperchloricacidatvarious
COnCentrations，andtheresultingsupematant WaStreated accordingto the procedure．

した．螢光検出は励起波長350nmおよび発光波長420nmで行った．

10mM以上のDEB試薬を用いたとき，ホル7ェニシンの螢光ピークは最大かつ一定の値を示した．従って，15mMのDEBを使用した．

結果および考察

螢光反応における反応時間と温度について検討

1）螢光誘導体化条件

した（図3）．反応温度が高くなると，反応は速やDEB試薬とホル7ェニシンの螢光反応は酸性かに進行するが，最大のホル7ェニシンの螢光ピの条件で進行し，pH2．0の緩衝液中で最大のピーークを得るには，600Cまたは37°Cで反応する方がク高さが得られた（図2A）．しかし，実試料の除良かった．特に，600Cでは，30分以上の反応時間

蛋白操作に用いた過塩素酸は反応に必要な酸性条で最大の反応収率を与えた．基準操作には，600C件を提供した．1．0−5．OM過塩素酸を用いて螢光

および30分間の反応条件を選択した．

体の生成を調べた場合，濃度が低いほどホルフェ

反応後，反応液のpHを6．0−7．5にしたとき，ホニシンの螢光ピークは高くなった（図2B）．しかルフェニシンの螢光は最も強くなった．従って，

し，1．OMのそれを用いた場合，除蛋白が不完全でHPLCの移動相にはpH6．0のリン酸塩緩衝液をあったので，基準操作には，1．5Mの過塩素酸を使加えることにした．

用した．この場合，螢光反応時のpHは約1であった．
−18−

2）ホルフェニシンの定量
ホルフェニシンを投与したマウスの血清および

ホルフェニシンの生体内動態；︻uコごロ﹂ごqLロ︶ l竜−空こちと

00
0

0

10

30

20

qO

50

60

Tlme（mln）

図3

Effects ofreaction time andtemperature onthederivatization offorphenicine．A50−jLl
portion oflO nmol／mlforphenicine was added tolOOJLlof drug−free serum and thendeproteinized，andthesupematantWaStreatedasintheprocedureforvariousperiodsat
temperaturesofa，1000C；b，60●C；C，37°C．

（A）

USUOdS巴gUむUS巴○コtL

USUOds巴gUUUS巴○コtL
0

8

16

0

2上I

Tlme（mln）

図4

8

16

2q

Tlme（mIn）

Chromatogramsobtainedwith（A）serumand（B）muscleat8hafteroraladministration
Offorphenicinetoamouse．Dose：30mg／kg．Peaks：1＝forphenicine，Others＝endogenous

Substancesinserumormuscle．Concentrationsofforphenicine：A，1．85nmol／miinserum；
B，1．31nmol／ginmuscle．

筋肉試料を本法に従って処理したときに得られるウスの血清および筋肉中にそれぞれ0〜250

クロマトグラムを図4に示す．ホル7ェニシンのnmol／mlおよび0−300nmol／gの添加量まで原螢光体は生体由来の螢光物質とよく分散し，18．8

点を通る直線（相関係数＝0．998）を示した．

分の保持時間に溶出された．

S／N＝2における検出限界は血清中では4．90

このHPLC条件でホルフェニシンの添加検量線を作成したところ，少なくともコントロールマ

pmol／mlまた筋肉中では11．9pmol／gであり，HPLC注入量で表すと，約66fmolに相当した．

−19−

コントロールマウスの血清ならびに筋肉にそれは，それぞれ，ホルフェニシン濃度の約1／10であぞれ2．5nmol／ml（g）のホルフェニシンを添加しったが，約6時間後では，血清および筋肉中のホたとき，5回測定して得られた添加回収率の平均

ルフェニシンの濃度を上回り，さらに筋肉中のホ値は，血清では97．3±4．9％，筋肉では93・4±5・2

ルフェニシノール濃度は徐々に増大する結果を得％であった．また，同じサンプルを6回繰り返した．

て測定して得た相対標準偏差は5nmol／ml血清

一方，ホル7ェニシノールを同様に経口投与しの場合は5．9％で，1．5nmol／g筋肉の場合は7・6％た場合，血清および筋肉中のホルフェニシノールであった．

の経時的濃度変化（半減期，血清中1．8時間および筋肉中3．4時間）はホルフェニシンを投与したとき

3）ホルフェニシンならびにホルフェニシノー

のホルフェニシンの濃度変化曲線とほぼ同様な結ルの体内動態
図5Aはホルフユニシンをマウスに経口投与果を与えた（図5B）．この場合，ホルフェニシノ

した場合の血清および筋肉中におけるホルフェニールの代謝物としてホルフェニシンが検出された

シンおよびホルフェニシノールの時間一浪度曲線

が，その血清および筋肉中の濃度は，ホルフェニ

である．ホルフェニシンの濃度は血清および筋肉シン投与の場合に認められた代謝物ホルフェニシ中とも投与後約1時間で最大値に達し，その後，ノールの濃度に比べて極めて低かった（1／100以下）．

．徐々に減少した．血清および筋肉内におけるホルフェニシンの半減期はそれぞれ1．9時間および3．2

以上の結果から，マウスに経口投与したホル時間であった．この場合，ホルフェニシンから生

フェニシンは速やかに血清および筋肉中に分布し，成した代謝物ホルフェニシノール濃度は，血清お同時に，その代謝物として生成したホルフェニシ

よび筋肉中とも，ホルフェニシン投与後1時間でノールの濃度も高いレベルで血清および筋肉中に
（B）

（A）

100
1し■ 、

一一▲−一二茫㍉

1︻qtUS言切LO ∈己qS t∈︑t皇三

t三一U一U羞已0− PUロ ≡−U−UU竜﹂丘ち■S︑JMlユ

PUD聖−リーU苫dJOL︵心一USコ∈O L〇弓⊂讃 t∈︑一宮EV

一三一U一u雲dJO−㌔

ノーー1、豊−＼
0

2

q

6

8

2

q

6

8

Tlme（h）

Tlmeくh）

図50Concentrationsofforphenicineandforphenicinolinserumandmuscleofmice（n＝3）after
oraladministrations of（A）forphenicine and（B）forphenicin01．Dose：30mg／kg each・CurveS：Sl，forphenicineinserum；Ml，forphenicineinmuscle；S2，forphenicinolinserum；
M2，forphenicinolinmuscle．

−20−

ホルフェニシンの生体内動態

分布することが分った．従って，薬物活性の面を考慮すると，ホルフェニシンの投与はホルフェニ
シノールの投与よりも，効果がより高いことが示

文献1）Kai，M．，Miura，T．，Ishida，J．andOhkura，Y．：
J．Chromatogr．，345：2597265，1985．

2）Ishida，J．，YamagtlChi，M．，Kai，M．and唆された．

Ohkura，Y．：J．Chromatogr．，305：381−389，
1984．

おわ り に本研究において開発したDEB試薬を用いるプ
レカラム螢光誘導体化HPLCによって，ホルフェ
ニシンおよびホルフェニシノールを授与したマウ
ス血清および筋肉中の微量ホルフェニシンを簡便にモニターすることができた．また，ホルフェニ
シンおよびホル7ェごシノールをそれぞれ投与し

3）Ishida，J．，Kai，M．andOhkura，Y．：Ⅹenobio．
Metabol．Dispos．，1：397−403，1986．
4）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：J．
Chromatogr．，344：267−274，1985．

5）Tamura，M．，Kai，M．andOhkura，Y．：Jap．
J．Clin．Chehl．；13：195−201，1984．

6）Kai，W．，Tamura，K．，Ohno，M．andOhkura，たとき，それらはマウス体内で相互に代謝される

Y．：Biomed．Chromatogr．，1：143−146，1986．

ことが分った．特に，ホルフェニシンから生成し

7）甲斐雅亮，坂本靖浩，三浦哲朗，大倉洋甫：分析化学，35：329−331，1986．

たホルフェニシノールの代謝物は比較的高濃度で血清および筋肉中に分布されることが分った．

−21−

筋肉内酵素網の動態に対するベスタチン
およびその立体異性体の影響
青 柳 高 明＊
研究協力者

和 田 孝 雄■ 小 島 蕗 子◆
永 井 真知子＊・ 原 田 滋 子＊

されないのが実情である。

は じ め に筋ジストロフィー症におけるプロテアーゼの異筆者らは各種の酵素阻害物質のJ招 。わ℃とわ2

常に対して，各種のプロテアーゼ・インヒビター

びわ0との相違を酵素網の動態から追究し，生体内を治療に用いる試みが，多くの研究者によって行

においてはフィードバックやネットワークを介すわれている．なかでもStracherらはセリン・シス

る間接的な影響が加わることが両者間の相違の大ーテインプロティナーゼのインヒビターであるロイ

きなファクターとなる可能性を示唆した。

ペプナンが筋ジストロフィーマウスの発症阻止に

本報告はアミノペプチダーゼインヒビターであ役立つ可能性を報告した1）−2）．さらに，松下らは細るベスタナンの作用機序を明らかにすることを目

胞膜酵素阻害物質として見出したベスタテン，ホ的として，ベスタナンおよびその立体異性体をマルフェニシン，ホルフェニシノールなどが上記動ウスに連続30日間投与し，経時的に採取した筋肉物の発症阻止に有効であることを示唆した3），4）．

内の酵素綱の動態について検討したので，その結筆者らは筋ジストロフィーマウスおよびハムス

果について述べる．

ターなどの各種臓器内の酵素活性の変動を経時的に調べ，エンドペプチダーゼの異常のみでなく，実験方法

アミノぺプチターゼ，グリコシターゼ，ホスファ

ICRマウス（7週齢，雄）は静岡県実験動物農

ターゼ，エステラーゼなどの広範囲な酵素に異常

業協同組合から購入した．ベスタテンおよびそのが誘起されていることを報告した5ト7）．さらに，筋ジストロフィー症の発症機序にユキソぺプチダー

立体異性体（200JJg／マウス）は連続30日間腹腔内に投与した．動物は2日ないし3日間隔で屠殺し，

ゼがエンドペプチダーゼと異なる役割を果してい前肢筋，後肢筋，心，牌，肝および腎を摘出した

ることを明らかにした8）・9）．

のち，直ちに−700Cで保有した．投与法および臓正常および病態モデル動物における酵素網の変器摘出は図1に示す．肢器は10倍量のPBS（phos−

化を長期間経時的に調べ，また酵素阻害物質投与

phatebufferedsaline，pH7．2）中で，組織ホモにより誘起される酵素網の動態を究明することは，

ジナイザー（ultraturrax）を用いて1分間ホモジ

ホメオスタシス機構を明らかにするとともに，治ナイズした．酵素活性の測定には，ホモジネート

療への応用を可能にするものと考える10）．しかし，の3，000×g．20分間の遠心上清を用いた．

酵素阻害物質のど乃め0の作用と，その玩〝め和阻害物質のスづクトラムとの間には，明確な関連性が見出

ベスタテン〔（2S，3R）−3−amin0−2−hydroxy−4−phenylbutanoyl−（S）−leucine，（2S，3R）rAHPA■微生物化学研究所−（S）TLeu〕およびその立体異性体〔（2S，3S）−23−

の基質溶液および緩衝液を含む反応試験管（1．5×

AHPA一（S）TLeu〕，〔（2R，3S）AHPA−（S）−Leu〕と〔（2R，3R）AHPA−（S）−Leu〕を用いた．ベス

10cm）に分注し，370Cで1時間の反応を行った．

タナンおよび立体異性体の構造ならびに阻害活性

CP−A，CP−BおよびカテプシンDは前述の緩衝は表1に示す．

液を用い，それぞれの条件下で反応を行った．す基質

べての酵素活性の測定には3本宛の試験管を用い，その平均値を記載した．各酵素活性の測定法およ酵素活性測定用の基質は下記のものを用いた．
L−glutamic acidβ−naphthylamide hydroch10−び基質は表2に示す．

ride（Glu・NA），L−arginineβ一naphthylamide蛋白の測定
標準蛋白として，ウシ血清アルブミンを用い，（Arg・NA），L−prOlineβ−naphthylamide（Pro・NA），L−leucineβ−naphthylamide（Leu・NA），

Lowry法18）で測定した．

glycyl−L−prOlylTL−leucine β−naphthylamide

統計学的手法（Gly−Pro−Leu・NA），hippuryl−L−phenylalanine

酵素活性のある時点における動きが，それより（Hip−Phe），hippuryl−L−lysine（HipTLys），

過去または未来の時点における変動と何らかの関hippuryl−L−histidyl−L−leucine（Hip−His−Leu），

連性をもっているかを判定するためには，自己相Carbobenzoxyglycyl−L−prOline（Z−GlyTPro），N

関関数19）を用いるのが有効である．もし規則性の−benzoyl−L−arglnlne ethylester hydrochloride

ある変動であればサインカーブ様の曲線が得られ（BAEE），hemoglobin，PTnitrophenylphosphate

るはずである．

（NPP），Z）−nitrophenylacetate（NPA）．

結

緩衝液

果

酵素活性測定用の緩衛液は0．02M PBSを用い

べスタテンはその構造に3個の不斉炭素を含んた．ただし，CarboxypeptidaseA（CP−A）の測でいる．各種の立体異性体を合成し，構造と活性定には0．05M Tris−HClbuffer（0．9M NaCl含の相関を検討した．各種の立体異性体の阻害活性

有，pH7．5），CP−Bの測定には0．05MTrisTHCl

は表1に示す．AHPA（3−amin0−2−hydroxy−4−

buffer（pH8．0）およびカテプシンDの測定にはphenylbutanoicacid）の2位の配位がSである立0．2M sodium acetate buffer（pH3．2）を用いた．

体異性体はAPTB，LeuTAP，Gly−Pro−Leu−AP活性を阻害するが2位の配位がRの異性体はい酵素活性の測定

ずれの酵素に対しても阻害活性を示さない．ベス
タテンの阻害活性発現には，AHPAの2位の配位臓器ホモジネートの遠心上清分画は，それぞれ

表l Inhibitory activities of bestatin andits stereoisomers
BestatinCH3

印

CH−CH3
1

CH20H
l

CH2

l

l

H2N−CH−CH−CO−NH−CH−COOH（R）（S）（S）
Stereoisomer2

H2N−CH−CH−R（3）（2） R

R S S R

CH20H S3

IC3。（〃g／ml）

AP−B Leu・AP Gly−Pro−Leu−AP AP・A
0．05

0．01

3

4．1

0．23

40

＞200
＞200

＞200

＞200

＞200

＞200

＞200

＞200

＞200

＞200

−24−

筋肉内酵素綱の動態に対するベスタナンおよびその立体異性体の影響

述した実験で得た前肢ならびに後肢の筋肉内のがSであることが重要である．

AP−AおよびLeu−AP活性の変動を図2と図3

上述した結果に基づき，活性体である（2S，3R）に示す．

AHPA−（S）−Leu（ベスタナン）と不活性体である（2R，3R）AHPA一（S）−Leuおよび食塩水を図1

上述した実験条件下で得た結果は必ずしも顕著に示した方法で投与した．さらに，ベスタナンをな差を示さなかった．それ故，自己相関関数19）に9日間のみ連続投与したのち，投薬を中止し図1

よる解析を試みた．
図4から図7にAP−A，Leu−APの自己相関関の方法で経時的に酵素活性の変動を追究した．上
表2

LiSt of the enzymes measured and their substrates
Reference for

EnzymeAbbreviation

Substrate

assaymethod

Cathepsin D

Alkalinephosphatase（EC3．1．3．1）

Phosphatase

Hemoglobin
NPP

Arylesterase（EC3．1．1．2）

Esterase

NPA

Kallikrein＋＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿．＿一一＿−−−−Bestatin

7
1

Carboxylproteinase（EC3．4．23．5）

5

Z−Gly・Pro
BAEE

7
1

Post−Pro−Enz

5

Hip−His−Leu

Prolylendopeptidase（EC3．4．21．26）
Plasma kallikrein（EC3．4．21．34）

6
1

ACE

5

Hip−Lys

Dipeptidylcarboxypeptidase（EC3．4．15．1）

1
1

CP−B

l
1

Hip−PheCarboxypeptidase B（EC3．4．17．2）

l1

Gly・Pro・Leu・NA

CP−A

l
1

Gly−Pro・Leu・AP

Carboxypeptidase A（EC3．4．17．1）

l1

Tripeptideaminopeptidase（EC3．4．11．4）

4
5
5
1
1

Pro・NA
Leu・NA

3
1

Leu−AP

2
1

Leucine aminopeptidase（EC3．4．11．1）

5

Pro−AP

5

Arg・NA

Prolineiminopeptidase（EC3．4．11．5）

5

Glu・NA

AP−B

5

AP−A

Arginineaminopeptidase（EC3．4．11．6）

5

Aspartateaminopeptidase（EC3．4．11．7）

administration−−−−−−−−−−一一−−−−−−−−→−⁝＝−−−30・−−−−−1−−−−−・−1−−−ニー−−・・・●▼1−−−−・−−−■I
II⁝−II25−−−−−⊥■■▼−−−−−⊥▼l
I・−▲II・−▲ITI
1一−−−⁚■▼−⁝ ⁝ I I02−−−−−▲ITI−−1−−1−−−−−⊥■1−−−−■−−1−⁝−II15−−−−−▲ITI−−−−−⊥■−−・II−−1−y−−−＝・−＝■ー10

ーー ー ーIlS−−−−II
II1−−†●lllll1−−−−−・l−−−−−−▲▼15−−−−−−1

I−−−−I． − ■ t l l ▼ D■ ■ ● ● − ⊥ ▼ l

十十十十十十 十十十十十十 十十十十十十†十十†十十十十十
図1Effectsofbestatin stereoisomers on enzyme networksinmurine organs
Experimental animals：ICR mice，i．p．injection
Inhibitors：（2S，3R）−bestatin，（2R，3R）−bestatin
Organs：forelimb muscle，hindlimb muscle，heart muscle，Spleenliver，kidney
Enzymatic assays：aminopeptidase（5），endopeptidase（7），GIcNAc−aSe，phosphatase，eSteraSe−25−

AP・Ae＝●一一一・4Leu−AP

0

8

0

6

0

4

nヨ○くヨin＼mg prOtein

9

亡叫30已軸∈＼u篭＼−OEu

0

5

10

15

20

25

30

35
days

図2 各種状態における前肢筋内酵素活性の時間的変動

数曲線を示す．前肢筋におけるAP−Aの動きは定型的ではない．しかし，ベスタナン投与ならびSalineまたは不活性体（2R，3R）AHPA−（S）−Leuに投与後中止した場合は，その振動状態が規則的を投与したとき，振動状態が比較的緩除あるいは

かつ比較的速い周期になっていることが認められ−26−

筋肉内酵素網の動態に対するベスタナンおよびその立体異性体の影響
AP−A三

三

●一一一一●Leu−AP

コヨ01＼min＼ヨgprOteiコ

u召OLd寧E＼UでH＼lOEu

1．0

0．8

0．6

0

5

10

15

20

25

30

35
days

図3 各種状態における後肢筋内酵素活性の時間的変動

た．この傾向はLeu−APについても同様に認められた（図5）．

図6および図7に示したように，後肢筋についても明らかに同じ傾向である．

−27−

tDrr●hHon

qDrrtl■llo′l
−0．51

0．00

■．51

l．朝

一l・帥

〇・ll

lJl

LlO

l…Hl■●●●●●●●●●●■■●●●●●
l▲＝……＝…＝■−●●
IHH■▲…＝●■●■●●■■
l●●■●●●●●●●●●●●●■●
い■●●●●●●●●●●●●●●●■
l●●●●●●■●●●●■■●●■●■■●■
い…■▲＝…＝…●lH■●
l■■●●●●●●●●●●■●●●●■■l■■●●●●●●●●●●●●
l●●●●●●●l●●●■l●●●●●●l

…＝●l
HH●l
HM…●l
HHHHl
HHHHl

●●●●●●■●l（2R．3R】AHPA−tS卜Leu▲＝…■l▲●●■●●●●l●●●■■11●l●●●●●●l●●●●●l■‖■■ll●■●■■■●●●●lWithdrawaJ o†（芸．3R）AHPA−fS卜Leu

＝…●1
日●l

（25．3R）AHPA−tS卜Leu

●●●l
l●●●
l●●

l●●●

●■l

I◆●●

●●■l

●●■■tl●■■●●●●●●l
MH●＝●lMt●●■l

図4 前月支筋内AP−A活性の自己相関曲線
D■Mlll…■●■●l●●■●■●■l●●●●●●l

t●

●●●●l
●●●l
●●1
1●
l◆▲

11

l●■●
l■●●■
l●
…■l
●●■●■HHl●l】●………●▲l●▲＝…MMl●■▲HHMHHl………MHHl…MHH…Hl

HHH……I
H…HHlli

HMHH−●●●●●l∵∵∵∵∵∵∵∵「｝l

HMH…HHl
HH…HHl
…日日●l

■tH■l
H●l
●■●●■l

L■」L工」L∵＼

……●l

●●●l

●●●●■●■●l【2R．3R）AHPA−（S卜Leu●●●●●●●●l●●●●●●●t●●●●●●l
●●●●l
●●り

●
l▲●▲●●■■●■●●●●●●●●●●●■●●■●●●●●●●●●■●●●●●●●l●■■■●●■●●●●●●●●●●●●●●●●●・l●●●●■●■∵∵∵∵∵∵r

H…MHHl
H●●日日……l……………ll
1日●●●●■●●■●●■■I

l●●●●

l●●●●

l●■

Hl

l……■＝■●■●■●
l●●●●●●●●●●■■●●●●
l▲●●●●●●■●■■●

●1

l●●●

●●●l

t1

……●l
H……＝‥l
M……MMH●l…＝…▲…Hl
●●▲▲l
l●●■●

21

■●■●●l

（益．3R】AHPA−（S卜Leu……HHl
H……＝‥l……＝……■l……日日…tl…日日…■ll●●●●■●■●■●●■●●●■●●■ll●●●●●●●●●●●t…●ll●●●●●●l●●●●●●■l1‡…＝●l●■＝■●●l図5

前肢筋内Leu−AP活性の自己相関曲線−28−

Withdrawal o†（25．3R）AHPA−tS卜Leu

筋肉内酵素網の動態に対するベスタナンおよびその立体異性体の影響
prr●htlon
tOrr●l■‖011
D叩1

−l．51

0．M

l．SO

LM

−l．さI

l．川

1

5
●●l
l●
l●●■●■■●●l●●◆●●●▲

t●

l■■●

l●●
「∵∵∵∵∵1∵〕■●■■■●■日●■●■tl日＝▲■■l■●●●●●●l
MMH●l

H…●l

t1

MHHHHl■●■■tl●▲MHHHH1●●■●●●■●l……HHH■●l
HH…HH
20

11

日●■‖■●●●■●■■●●l

MHHHHl●●■■●●●■＝■■l

HH………●l●●■●●■■tl

H●▲…＝……Hl■＝■●●■●1●▲MMHHH●l●●●●■■■l●●●●■■■●■■■●■■■●■l

H…＝●l●■．■＝…＝…＝●l●●■●l…HMM…●l●■■l●●●●●■●＝…Hl●■●l

HMMH●l●●●l■＝■●■●■■●●●●l●l■●■■■■●tl●■‖■■■l】l【2R．3R）AHPA−（SトLeu

■■●l

：∵

■●l
●●l
●●l
●l

∵■jLコ」■】「「●●●■●■■●●l
●■I

l■●■
l●●■
●■●●●l
MMHH■lHH…Hl●ll●●tt■●●l●●●Withdrawal of（賃．3RJAHPA−（S卜Leu■■■●l∵1HJL∵∵∵■●●●l（25．3R】AHPA−【S卜Leut∵■】【1」LJL∵∴▲……●l∵■】一二∵∵「●●■l●ll

図6 後肢筋内AP−A活性の自己相関曲線
−l．H

l．ll

l．SI

l●00

−l・Sl

l・M

lJ0

1・01

l■●●●●●●●●●●●■●●■■■■●●●●
tM…＝●●■●■■●●●●●●●●l■●●●●●●●■●●●●■■●
l●●ll●●●●●●●●l■■■●■▲●l●●●l●●●●●l●●●●●●■■●l…＝…■▲■l…HHM●l……■＝…Hl●●■●tH■■t…Hl………＝■lHM…▲■■●l
HHH…l
…日日●l
…＝■＝■lt■■■■■●■l＝∵∵∵∵ココ1…＝●l●●●●t●り●■●●■●l●●●■●l

■●tl

●●●l

●l

【2R，3R）AHPA−（SトLeu

l●●●
l●●●●
l●●●
l●●●
l●●
l●

l……＝…●■■■●■●●■●●「■Tl」L∵11日
▲HH●l

HHHHl

■●■●●■●●l●●●■■＝…■＝■■−●▲●●l∵＝…＝…●−●−■●■l
H…■−▲●■lt■−▲＝●l●−……■l■▲…HHll■●●■●●●●●●
l■●●■■●●■▲●▲l●●ll…Hl■l…MHHll▲■●●●■●●●●■＝…●●●ll●■■■■●■●■●●●●

●●l

●●●l

l●●●
I●●●●●
l■●■●

…●l

l■●

l●●●●●■●
l▲▲●●●▲…●▲●l●■■●■●■（追．3R）AHPA−【SトLeu

∵∵
●l
■l

●●●●●■l
LLエコ1「∵＝∵＝l■・●●●
l■●●
l●●

図7

後肢筋内Leu−AP活性の自己相関曲線−29−

WithdraWal of（25．3R）AHPA−【S卜Leu

考

された．

察

筆者らは，低分子酵素阻害物質による阻害効果
文が玩乙融和と九日転地で異なることを明らかにしてきた20ト22）．筆者らの一連の実験成績は，生体内献において酵素阻害物質が非常に広範なスペクトル

1）Stracher，A．，McGowan，E．B．and Shafiq，
S．A．：Science．，200：50−51，1979．

にわたる酵素のネットワークを変化させること，

2）McGowan，E．B．，Shafiq，S．A．and Stracher，

ならびにその効果が恐らくその物質に固有な直接

A．：Exp．Neuro1．，50：649−657，1976．
3）Matsushita，H．：In study on the clihical

的酵素作用に端を発することを裏付けている．
本報告の研究成績もこれを裏付けるものである．
すなわち，Salineあるいは不活性体ベスタナンの投与では，殆んど同じような生体内動態がみられ

applications of secondary metabolites frommicrobes．Annualreportofmusculardystro−
phy committee，SuppOrted by Ministry ofhealth and welfare，1980，pp．45−50．

るのに対し，活性体ベスタテン投与および途中で

4）Matsushita，H．：In study on the clinical

中止した場合にも，前者とは異なる振動状態がみ

applications of secondary metabolites from

られ，よりシンクロナイズされた状態となること

microbes．Annualreportofmusculardystro・が確認された．

phy committee，SuppOrted by Ministry of

一方，ベスタテンは，その阻害作用では一見して説明しがたいほどの様々な生体内作用を示すことが知られている．例えば，ベスタテンは連続投与することにより筋ジストロフィーマウス筋肉内のエンドぺプチダーゼ活性を下げ，また高血圧ラット（SHR）の血圧を抑制することなどである．

health and welfare，1982，pp．51−57．

5）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．
andUmezawa，H．：J．Clin．Invest．，67：51−59，
1981．

6）Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，Aoyagi，T．
and Umezawa，H．：J．Pharm．Dyn．，4：184−
190，1981．

従って，本報告ならびに従来の成績を全て総合

7）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K．，

して考えるならば，恐らくはベスタテンの効果に

Kojima，F．，Nagai，M．andUmezawa，H．：J．

より生体内のペプチド分布が変化し，種々な生理Pham．Dyn．，7：312−321，1984．

活性ペプチドのアナログが出現するという機序に

8）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，

よって説明するのが最も合理的なように思われる．

Miyoshino，S．andUmezawa，H．：Clin．Chlm．
Acta．，129：165−173，1983．

まと9）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，

め

ベスタナンは筋ジストロフィーマウスの発病前から投与することにより発症阻止効果のあることが報告され，またDuchenne型筋ジストロフィー

Harada，S．，Kinoshita，M．，Yamada，N．and
Umezawa，H．：J．Clin．Biochem．Nutr．，1：65−72，1986．

10）青柳高明：自然10月号：39−47，1983．

の5歳未満の息児における第ⅠⅠ相比較臨床試験で11）Aoyagi，T．，Suda，H．，Nagai，M．，Ogawa，K．，

病状改善効果のあることが認められている．ベス

Suzuki，J．，Takeuchi，T．and Umezawa，H．：

タテンの作用機序を明らかにすることを日的とし，
ベスタテンおよびその立体異性体をマウスに連続Biochim．Biophys．Actaり452：131−143，1976．

12）Tanaka，T．，Suda，H．，Naganawa，H．，

投与することによる筋肉（前肢筋，後肢筋）内のHamada，M．，Takeuchi，T．，Aoyagi，T．and

酵素網の変動について調べた．ベスタテン（活性Umezawa，H．：J．Antibiot．，37：682−684，1984．
13）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Ogawa，K．，linuma，体）投与および途中で中止した場合は不活性体，
生理食塩水投与の場合と異なる振動状態がみられ，
よりシンクロナイズされた状態になることが確認−30−

H．，Naganawa，H．，Hamada．M．andTakeuchi，■T．：J．Antibiot．，37：1088−1090，1984．

筋肉内酵素網の動態に対するベスタナンおよびその立体異性体の影響
14）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Ogawa，K．，Ⅰinuma，

H．，Naganawa，H．，Hamada．M．and Takeuchi．

275，1951．

19）Cox，D．R．andLewiS，P．A．M．：Thestatisticalanalysisofseriesofevents，London，Methen，T．：J．Antibiot．．38：1813−1815，1985．
15）Yoshimoto，T．，Ogita，K．，Walter，R．，Koida，M．andTsuru，D．：Biochim．Biophys．Acta．，

1966．

20）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K．，
Kojima，F．，Nagai，M．，Harada，S．and

569，184−192，1979．

16）Aoyagi，T，，Kunimoto，S．，Morishima，H．，
Takeuchi，T．andUmezawa，H．：J．Antibiot．，
24：687−694，1971．

Umezawa，H．：J．Appl．Biochem．，6：212−221，
1984．

21）Aoyagi，T．，Wada，T．，Iwabuchi，M．，Kojima，

17）Aoyagi，TりNagai，M．，Iwabuchi，M．，Liaw，

W．S．，Andoh，T．and Umezawa H．：Cancer

F．，Nagai，M．and Umezawa，H．：Biochem．
Int．，5：97−103，1982．

22）Aoyagi，T．，Wada，T．，Ohuchi，S．，Kojima，F．，

Resリ38：3505−3508，1978．

18）Lowry，0．H．．Rosebrough，N．J．，Farr，A．L．
and Randal1，R．J．：J．Biol．Chem．，193：265−−31−

Nagai，M．，Harada，S．andUmezawa，H．：J．
Pharmacobio−Dyn．，7：681−687，1984．

蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

藤 井 節 郎＊混合液0．1mlを膵管内に注入し，1，2，3および7日

は じ め に筋ジストロフィー症の発症および症状の進行に目の生存例で判定した．

種々の蛋白分解酵素が重要な役割を果しているこ（2）ホスホリパーゼA2誘発急性膵炎とが最近の研究により明らかになりつつある．わ

Wistar系雄性ラット（体重190−230g）1群23

れわれはすでに各種蛋白分解酵素に対する合成基

匹を用いてFUT−187を10，30および100mg／kgを質とその阻害剤について検討し，合成基質を用い経口投与し，1時間後に膵炎誘発剤としてPhos・

た蛋白分解酵素に対するザイモグラムによる分析

pholipase A2300UとSodium taurocholatelO法を確立した．また合成阻害剤についてTrypsin，mgの混合液0．1mlを膵管内に注入し生存例で判定した．

Plasmin，Thrombin Kallikreinおよび補体系のClf，Cほに対する強い阻害活性をもつ合成剤を（3）イヌ急性膵炎

兄い出し，更に玩＝正川での薬効を示すものを兄

ピーグル犬雄性（体重8．4−13．9kg）1群7例をい出した．そこで，筋ジストロフィー症に関与し用いて膵管および胆管の開口部を含むように十二ている蛋白分解酵素の動態を解明し，蛋白分解酵

指腸の両端部で切断し，Closed−loop（盲管）を作

素合成阻害剤による酵素の阻害パターンを明確に成と同時にFUT−187を10mg／kgとして盲管内にし，病態モテりレの治療を行ない臨床効果について注入した．胃十二指腸の切離断端は縫合し，消化も検討したい．今回は新しい合成阻害剤について管を再建した．延命効果および各種酵素活性に使報告する．

用した合成基質は以下の通りである．
Trypsin：BocTPhe−Ser−Arg−MCA

実験方法

Plasmin：BocTVaトLeu−Lys−MCA
Plasma Kallikrein：Z−Phe−Arg−MCA1）蛋白分解酵素合成阻害剤

Pancreatic Kallikrein：Pro−Phe−ArgTMCA

6−Amidin0−2−naphthyl〔4一（4，57dihydr0−1H−

imidazoIT2−yl）amino〕benzoatedimethanesul−
fonate（FUT−187）については鳥居薬品㈱研究所

Thrombin：H−D−Pip−Arg−pNA3）補体溶血反応
感作羊赤血球2．5×108cells／mlおよび1／225希より供給して戴いた．構造式は図1に示した．

釈モルモット血清を用いてBaker and Coryl）の

2）動物実験

方法で行った（古典的経路）．

a）実験的急性膵炎（1）トリプシン誘発急性膵炎

ウサギ赤血球1．3×107cells／mlおよび1／55希釈

Wistar系雄性ラット（体重165−230g）1群
14−18匹を用いてFUT−187を10，30および100

モルモット血清を用いてPlatts−Mills andIshizaka2）の方法で行った（第2経路）．
九．加わの血管内溶血反応に対する効果は，mg／kgを経口投与Ll時間後に膵炎誘発剤としてトリプシン0．3mgとSodium

taurOCholateのHartley系雄性モルモット（体重300−490g）1群
5−6匹でFUT−187の30，100および300mg／kg＊㈲大阪基礎医学研究奨励会

を経口投与し，1時間後に血管内補体溶血反応を−33−

DNH◎cooC‰H2・2CH3SO3H

H

分子式：C21H19N502・2CH3SO3H
分子量：565．63
化学名：6−Amidin0−2−naphthyl【4−（4．5・dihydr0−1H・imidazo1−2−yl）
amin01benzoatedimethanesulfonate
図1

FUT−187の構造式

表2

表l FUT−187の蛋白分解酵素に対する阻害活性IC5。（〃M）
Enzyme Substrate FUT−187

FUT−187（mg／kg）

Trypsin BPSA O．34
Plasmin BVLL O．61
Kallikrein PPA O．48
Thrombin TAME
6．4
Clf AAME
23
ClS

ATEE

モルモット血管内溶血反応に対する
FUT−187の作用％Inhibition

古典経路

30

−9．5

100
300

15．3
100●●

21．1
71．5日
77．5日

Hp＜0．01

O．29

Chymotrypsin ATEECathepsin D Hemoglobin

第2経路

280
＞1000

5−dihydr0−1H−imidazo1−2−yl）amino〕benzoate

BPSA：Boc−Phe−Ser・Arg−MCA，BVLL：
Boc−Val−Leu・Lys・MCA，PPA：Pro−Phe−Arg−MCA，TAME：Tosyl・L・Arg・methy−
lester．ATEE：Acetyl・L・Tyr−ethylester．

dimethanesulfonateの構造式は図1に示した．本化合物は表1に示すように血兼中の蛋白分解酵素
およびTrypsinを阻害し，その阻害機構は本化合誘発する感作羊赤血球を静脈内投与3分後に心採

物中のエステル部位が酵素により切断され，その血を行ない吸光度541nmで測定した（古典的経酵素の活性中心であるセリン残基と結合すること路）．またイヌ血清で誘発する場合は15分後に同様により不活化する．また本化合物は細胞内に存在に測定した（第2経路）．

する蛋白分解酵素であるカテプシン群に対する阻4）Forssman shock

害活性は認められない．FUT−187の特徴は補体系

Hartley系雄性モルモット（体重250−350g）1の蛋白分解酵素を阻害し，補体溶血反応に対して

群8−23匹にFUT−187の25−200mg／kgを経口

強力な阻害活性を有していることである．補体溶

投与後1時間目に抗羊赤血球ウサギ血清

血反応に対する阻害は．古典的経路では1．7×（hemolysin）0．5mlを静脈内投与し生存例で判10￣7M，第2経路では3．2×10￣6Mの浪度でおのお定した．

の溶血反応を50％阻害する．モルモットの血管内

5）SLE自然発症マウス

溶血反応に対するFUT−187の作用は表2に示す

NZB／WFISLE自然発症モデルにFUT−187のように，古典的経路を介する補体溶血反応は100

100および300mg／kgを6ヶ月齢より毎日合計3mg／kg以上で阻害し，第2経路を介する反応に対ヶ月間経口投与し延命効果で判定した．

しても30mg／kg以上で阻害を示した．
b）FUT−187の急性膵炎モチリレにおける効果

実験結果および考察
1．蛋白分解酵素阻害物質（FUT−187）

トリプシン誘発急性膵炎に対しFUT−187を30
および100mg／kgの経口投与により明らかな延命a）FUT−187（6−Amidin0−2−naphthyl〔47◆（4， 効果を示した（図2）．またホスホリパーゼA2誘−34−

蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

′

0

1

2

3

←弓 ＊p＜0・05

01

ラット・トリプシン誘発急性膵炎に対する
FUT−187の作用AMC（nmol／min／ml）

Pre

4

8

1216

図3

！

7

3

ラットホスホリパーゼA2誘発急性膵炎に対する
FUT−187の作用AMC（nmol／min／ml）

20

2

Day

Day

図2

0 0 0

＊p＜0．05，＊＊p＜0．01
／

0

p pp

Control
l0mg／kg p．0．
30mg／kg p．0．
100mg／kg p．0．

g g gControl
l0mg／k
30mg／klOO mg／k0︵訳︶音t雲hO∑

デ弓∃≡≡至0−0−0什○

24hr

Pre4

81216

AMC（nmol／min／ml）

20

24hr

AMC（n mol／min／ml）

AMC（n mol／min／mi）

Pre4

81216

20

24hr

81216

20

24hr

Change（％）

Pancreatickallikrein

Pre4

8

1216

20

24hr

Pre

4

8

1216

20

24hr

Pre

4

Time after the operation：Control

図4

イヌ急性膵炎モデルの血中パラメーターに対するFUT−187の作用−35−＊p＜0．05

表3 イヌ急性膵炎モデルに対する
FUT−187の作用
？・
Of
an l−
a ls

C o ntro l

7

F U T −187 （
10）

7

表4

生存 動 物数
20

24
●

48

●●●

■：
p ＜
0．
05

72hr
●●

●

S召美5餌uちちhコS−OdN

D r嘱
m se
（
mg／kg．i．
d．
）

20

●
●●●●●●＊

モルモットForssman shockに対する
FUT−187の作用

m ug
（
m g ／
kg．
p．
0．
I
C o n tr o l

S llrV iv d
00 ．
5
● ● ● ●● ●● ● ● ●● ●● ● ● ●● ●● ● ● ●●

25

● ● ● ●● ●●●50

● ● ● ● ●● ●●●●a n im a ls
1≒≒三三…三二三‥三て￣●▲・−FUT・187100mg／kg＼▲一一▲FUT−187300mg／kg＊＊
p ＜0 ，
01

2 4h r＼〇一一〇Control●一一一Dexamethasone3mg／kg

＼
○＼＿。

0

5

10

14

Weeks of administration＊p＜0．05
●

●●●●

＊＊

F U T −18 7

図5

100

● ● ● ● ●●
●

●●●●●

■ ＊

200

●

●●●●●●●■ ●＊＊p＜0．01

SLE自然発生モデルNZB／W Flマウスに対するFUT−187の作用症モデルのマウスにFUT−187を3ヶ月間連続経発急性膵炎に対し100mg／kgの経口投与で明らか口投与すると生存日数において100，300mg／kgで有意の延命が認められた．

な延命効果を示した（図3）．イヌ急性誘発膵炎モ

補体の示す作用は多面的であり，病態におけるデルにおいて，FUT−187は10mg／kgの十二指腸意義もまた多様性を示すことになる．最近多くの内投与で明らかな延命効果を示した（表3）．また研究者によりその意義が解明されつつある．しかこの時の血中に於ける各種酵素活性は図4に示す

し生体に応用し得る適当な抗補体物質が得られてようにTrypsin，Plasmin，Plasma Kallikrein，

いない現在その証明が限られており先に報告した

Thrombinなど対照群の活性上昇を抑制している．

FUT−175（7サン）3）・4）の臨床適応により補体のC）Forssman shockに対する効果

病態における意義が明確になるであろう．

補体の関与するアレルギー反応でCoombsとGellらによる分類ではⅠⅠ型とⅠⅠⅠ型がある．このう
ちII型（Forssmanshock）に対するFUT−187の効果を検討した結果表4に示すように明らかに致
死時間の延長が認められた．ⅠⅠ型の病態における補体の生物学的意義が重要であることが示唆され

文

献1）Baker，B．R．andCory，M．：J．Med．Chem．，12：1049−1052，1969．

2）Platts−Mills，T．A．andIshizaka，K．：J．
Immunol．，113：348−358，1974．

3）Hitomi，Y．，Fujii，S．：Int．Arch．Allergy．

た3）．

Apple．Immun．，69：262−267，1982．

d）SLE自然発症モデルに対する効果
補体系の関与が考えられている自己免疫疾患にづいて検討した．図5に示すように，SLE自然発−36−4）Fujii，S．，Hitomi，Y．：Biochim．Biophys．
Acta．，661：342−345，1981．

＊p＜0LysosomalproteolysisのCystatinによる制御機構ならびにCystatinの大量産生
第1部：Cathepsin群のプロセッシングとCystatin
によるLysosomalproteolysisの制御機構
第2部：Cystatinα遺伝子の大腸菌による発現とLysosomalproteolysisの抑制

勝 沼 信 彦＊研究協力者

木 南 英 妃＊

大 和 正 幸■

板 東 祥 晃■

池

原

研 治＊

祥 雅＝

は じ め にKirschkeらにより初めて単姓された9）．その後にLysosomal proteolysisの異常冗進に起因する

BとHの一次構造は筆者らにより蛋白側から決定

筋タンパク崩壊疾患は色々と報告されている．細された1）．3）．前駆体構造は1986年にBがSteiner

胞内のリソゾーム・プロテアーゼ群（カテ70シン

ら4）により，LとHが1987年に筆者らによりクロ群）の量と活性の制御機構を明らかにし，その原ーニングにより決定された5）・6）．
図1には，これらのプレ・プロ部の構造を比較理に基づく上記疾患の治療法を開発せんとするの
inhibitorである

してあるが，類似性は成熟部よりはるかに少ない．

Cystatinの細胞内でのLysosomalproteolysisのプロ部には本来N−グルコシッド結合をすべき糖阻害機構を明らかにし，これを治療目的に利用す鎖結合部位が2か所あるが，1か所が欠損していが目的である．特にnatural

べく，リコンビナントによる大腸菌プラスミット

るBや，2か所とも結合できなくなっているLがでの大量産生をおこなった．

存在しており，糖鎖の役割には興味がもたれる．
仝前駆体からのプロセッシングと分解の初発切断

第1部

Cathepsin群のプロセッシングとCysta・部位が，図2に模式で示されている．

tinによるLysosomal proteolysisの制前駆体のプロセッシング9）・10）

御機構

クローニングにより得られた前駆構造から推定できるプロセッシングが実際に起こっているのか，

カテプシン前駆体構造の比較

またそれに関与するプロテアーゼはいかなるもの

リソゾームのシステイン・プロテアーゼの主なかを追求した．培養マクロファージをS35メチオ

ものはカテ70シンのB，HおよびLである．活性ニンでラベルし，チェイス後SDS電気泳動に供のある成熟型のBとHは筆者ら7）・8）により，Hはし，フルオログラフィーをカテプシンBにつき行ったものが，図3に示してある．チェイスの初期＊徳島大学酵素科学研究センター＊＊三井東圧化学には39Kのプロ型ができており，時間とともに29−37−

HOHOLOGY OF pRE−pRO−pART CATIIEpSINS

L

L B H

n

L B H

n n n
・ュ・ュ・ュ

H

CathepsCathepsCatheps
Papainn n n・⊥・ュ・ュCathepsCathepsCatheps
papainn n n・⊥・ュ・⊥CathepsCathepsCatheps
papainHature Enzyme
L B lI

Cathepsin
Cathepsin
Cathepsin
papainCH：pOSSible glucosilation site（カ
テプシンB ）
プ
レ
鵠

曾
軽
鎖

38芸 部6た
u
姦

（
カ
テ
プ
シ
ン
H）
プ
レ
慧鳥 ご
部
数
海

重鎖
C帥
O qS1

重
鎖
曾軽
鎖
成
警
諾 217 …
痘

177

（
カテ
プシ
ンL ）
プ
レ
慧 」 プロ
部票。

重鎖

曾軽
鎖

図2

39K−

29に一
26K一

産

l
糖

t H細山mCIlaSelhl
ll．llと二．二＝．＝．三・．二二二．」＿ ＿1 ChaS●lhI．、＿ ＿＿ J亡ご三三と．J ■J■＿

成熟
型部252
111Asn
47 壷

3

621．

■■−l1−

二ヽ■■■■■■
一■

O q51

3

l

6

一

21

一

一9享jK

ヽ

−69に

■■

＿46K

■■●■

ヽ．＿IOX

ヽ一加代

図3

痘178

Cathepsin Bのプロセッシング（S35−Methionineでラベル：フルオログラフィー）

カテプシンB，H，Lの前駆体構造とプロセッシングおよび分解の初発ステップ

39K：プロ・カテプシンB．29K：一本鋭成熟型，26K：分解党産物の重鎖○→メタロ・プロテアーゼ◎一→システイン・プロテアーゼ

Kの成熟型が生成している．長時間たつと26Kのであり，47番目で切断された産物が重鎖としてで分解産物重鎖ができてくる．一部分はプロ型で培き，Lは23Kで178番で切断され，Hは24Kで177

地に放出されるが，これは成熟型にプロセスされ番目で切断されている．即ち活性酵素の分解のイていない．HとLに関しても全く同様のプロセス

ニシエーションは，上記の厳密な限定分解で始まをとることが明らかとなった．

ることになる．

但し初めの分解産物はBにおいては必ず26K−38−

以上の二つのステップに関与する70ロテアーゼ

LysosomalproteolysisのCystatinによる制御機構ならびにCystatinの大量産生を検索するため，上記のチェイス実験において2

リソゾーム内酵素群の分解に果たすカテプシン

種のプロテアーゼ阻害剤を添加した場合の結果が群の役割12）

図4である．金属プロテアーゼ阻害剤オルトフェ

カテ70シン群の分解の初発反応にはカテプシン

ナントロレン（0−Ph）添加でプロ部の切断が阻害

群自身が関与していることを示した．その他のリされプロ部で止まる．システイン・プロテアーゼ

ソゾーム局在の酵素群の分解にもカテプシンが関の阻害剤E−64を加えた場合には成熟型は生成す与しているであろうか．培養肝細胞にE−64を添加

るが，成熟型から分解産物である重鎖の生成は停して，カテプシン活性を阻害した場合の半減期と止する．しかし，セリーン・プロテアーゼやアス含有量の変化を，抗体を使用して各種リソゾーム

バルテート・プロテアーゼなどのプロテアーゼ阻酵素につき測定したものが表1である．確かにE−

害剤は，これら両ステップに阻害を示さない．プ

64によりカテプシン群の半減期も含有量（蛋白量）

ロ・カテプシンのプロセッシングには金属プロテも3−5倍に増加する．さらに，蛋白分解酵素以外

アーゼが関与しており，成熟カテプシン群が重鎮の多くの酵素群の半減期も著明に長くなり，酵素に分解されるステップにはシステイン・プロテア

蛋白量が増加蓄積することにより，それぞれの酵ーゼ自身が関与していることが明らかになった．

素活性も著増している．この原理は，これらの酵・

プロ・カテプシンが成熟型になるのは，結合糖鎖素の低下に起因する各種のリソゾーム病治療の基をマーカーとしてゴルジからりソゾームへ封入さ礎となっている．細胞質内には内在性のカテプシ

れるステップで起こる．従って，糖鎖端のマンノ

ン・インヒビター（シスタテン）群が見出されてーズを燐酸化する酵素の欠損しているムコリビド

いる1仙7）．分子量は1万内外でカテプシンに特異ージスⅠⅠ型，I cell病では，ファイブロブラスト性を持つ．シスタテンを培養細胞に加えると，細培養系において，大部分は培地にプロ型のまま分胞内に取り込まれてリソゾーム内のカテプシン群

泌される．また一部の細胞内に留まっているものを阻害する．従ってE−64を添加した場合同様にリは，異常なプロセッシングを受けた中間体ができソゾーム内のβ−へキソサミダーゼ等の分解が低ていることが明らかとなった13）．

下してそれらの量を増加させる．シスタテンは分泌され易いことから考えて，この機構が，シスタ
ナンによるリソゾーム内カテプシンの自然の調節

Cath印引nlI C▲th印SlnH機構である可能性があると考えている（図5）．

吉左石左郎型嬰堕し」＿lAA＿1．川＿1，」l⊂柏鉾㈹0616
0666

リソゾームによる細胞質蛋白分解の調
l■

■■

ー
39だ−

誹＝

■■

■●

〟ト一一

節15）・l弧19）・21）

−925X

ヽ

−69K

細胞内での蛋白分解は，ホルモン条件および食

一｝

−46K

飼条件で大きく左右されることはよく知られてい

■■

ゴー

−窒‥

る．飢餓動物および再摂食動物にロイペプテンをニーヽ￣30K

ヽ−20K

＿．．＿

投与して，二次リソゾーム内での取り込み蛋白の疇

分解を止めた肝から分解したリソゾーム内に蓄積
図4

Cathepsin BとHのプロセッシングに対するprotease阻害剤の作用（図3と同一条件）
39Kと41KはそれぞれCathepsinBとHのプ
ロ型
29Kと28Kはそれぞれの一本鎖成熟型
26Kと23Kはそれぞれの分解産物重鎖した酵素蛋白量を，それぞれの抗体により定量した．本来細胞質に局在し，二次リソゾームに取り込まれた（オートファゴサイトーシス）酵素蛋白
群は飢餓時に非常に多く，摂食させると極端に少なくなる．即ちオートファジーは停止することが
表2に示されている．ヘテロファジーである細胞外から取り込んだアシアロフェチン量は大きな変−39−

化を示さない．オートファジーはインシュリン投

表l E−64投与によるリソゾーム酵素群の半減期と含有量の変化
半
無処置

減

期

E −6 4 投 与
時間

含
無処 置

有

与で冗進し，グルカゴンにより抑制される．

立

以上のように取り込みに変化を起こす上記条件

E −6 4 投 与

n g ／m g p r o t e in

カテ7 シン

B

14

50

38 0

920

カ テ 7 0シ ン

H

14

80

28 0

600

カテプ シン

L

24

100

10 5

510

答的変化をするのであろうか．カテプシンBとHは再摂食により軽度上昇するが，Lは著明な減少を起こす．これはBが特にヘテロファジーに多く

n m ol吋 m h ／m g p ro t血β−ガ ラ ク トン グ 一 一
ビ

0 ．4 50 ．9 2β−グル タ ロ ニ ダ ー ゼ

1 ．2 2

3 ．0 5β−へ キ ソ サ ミダ ー ゼ

24

100

0 ，8 6

2 ．5 8

ア リー ル ・サ ル 7 7 ター ゼ

28

90

27．
3

5 5 ，8酸 フ ォス7 7 ターゼ

65

100

32．
0

3 7 ．8の役割を持ち，Lは特にオートファジーに多く関与するためであると，筆者は多くの傍証を含めて解釈している．食作用（外来蛋白）の強いマクロファージ等はB（H）活性が他細胞より圧倒的に強く，カゼイン等で食作用を活性化すると6倍強

表2 二次リソゾーム内に取込まれた
酵素蛋白量の食飼条件による変動（194から1259ng／106cell）に誘導的増加をする事（FLg／units）

酵

オ ー トフ ァ ゴ、′− ム 内ヘ テ ロ7 7 ゴ
1′− ム 内素蛋

白で，分解を担当するカテプシン群はどのような応

飢 餓時

再摂 食時

ナロジン・
ア ミノ トラ ンス 7 ェラ ーゼ

15 ．
1

1．
27

孔 酵 脱 水素酵 素

13 ．
3

0．
49

カ タ ラー ・
ビ

0 ．
7

0．
02

ア ミア ロ フ ェ チ ン

163

15 6

実があり，カテプシン群は誘導も起こる．また病態としてはdistal myopathy

with rimmed

VaCuOle（バコール形成を起こす四肢末端型筋萎縮症）やduchennemuscledystrophy（ドセンヌカ テ 7 °シ ン

B

68 ．
5

8 5 ．9

全 リソゾー ム

カテ プ シン

H

64 ．
1

8 5 ．5内

カテ プ シン

L64 ．
6

3 9 ．5型筋ジストロフィー症）などの筋細胞内にオートファジーの冗進が起こり，カテ70シン群の異常増加が起こっていることが筆者らにより証明された20）．
文

HypotheSIsonCyStatlnFunctiononReguLatKln

献1）Takio，K．，Towatari，T．，Katsunuma，N．and

OtLy＄OSOmaは∩王ymODogradation

Titani，K．：Biochem．Biophys．Res．Commun．，
87：340−346，1980．

2）Takio，K．，Towatari，T．，Katsunuma，N．，
Teller，E．C．andTitani，K．，Proc．Natl．Acad．
Sci．USA，80：3666−3670，1983．
3）Katsunuma，N．，Kominami，E．：1nCurrTop
CellulRegul（ed．by Horecker，B．L．，Stadt−
man，E．R．）AcademicPress，NewYork1983，
Vol．22，p．71．
4）Chan，S．J．，Segundo，B．S．，McCormick，M．B．
andSteiner，D．F．：Proc．Natl．Acad．Sci．，83：
7721−7725，1986．

5）Ishidoh，K．，Imajoh，S．，Emori，Y．，Ohno，S．，
Kawasaki，H．，Minami，Y．，Kominami，E．，
Katsunuma，N．andSuzuki，K．：FEBS．Lett，
223：69−73，1987．

6）Ishidoh，K．，lmajoh，S．，Emori，Y．，Ohno，S．，

区15
−40−

LysosomalproteolysisのCystatinによる制御機構ならびにCystatinの大量産生

Kawasaki，H．，Minami，Y．，Kominami，E．，

第2部 Cystatinα遺伝子の大腸菌による発現とKatsunuma，N．andSuzuki，K．：FEBSLett：

Lysosomalproteolysisの抑制

1987（in press）．

7）Towatari，T．，Tanaka，K．，Yoshikawa，D．and

筋ジストロフィー症やジスタールミオバナー

Katsunuma，N．：FEBS Lett，67：284−288，（リンムノバコール型）等の筋タンパク崩壊の進1976．

展過程には，オートファジーの冗進がおこり，そ8）Towatari，T．，Kawabata，Y．andKatsunuma，N∴Eur．J．Biochem．，102：279−289，1979．

9）Kirschke，H．，Langner，J．，Wiederanders，B．，の内のカテプシン群の異常増加がみられることを明らかにした1）．タロロキンによるリンムノバコ

Ansorge，S．andBohley，P．：Eur．J．Biochem．，

ール形成をともなう筋タンノミク崩壊にはESTが74：293−301，1977．

著効を奏した．またDMD患者でも初期のものに10）Kominami，E．，Tsukahara，T．，Hara，K．and

はある程度の効果が証明されつつある．従ってカKatsunurna，N．：FEBS Lett，231：225−228，

テプシン群の特異的阻害タンパクであるシスタテ

1988．

ンを大量に製造して，これらの筋タンパク崩壊疾11）Hara，K．，Kominami，E．andKatsunuma，N．：
FEBS Lett，231：229−231，1988．

患に試用することにも多くの期待が持たれる．またシスタナンは，CANPとの分別阻害剤としても

12）Kominami，E．，Tsukahara，T．，Bando，Y．and
Katsunuma，N．：Biochem．Biophys．Res．
Commun．，144：749−756，1987．
13）Katsunuma，N．，Kominami，E．andOkada，S．：
Satellite Meeting ofthe4thInternational

活用できる．今回はシスタナンαの遺伝子を化学合成し，大腸菌で大量生産することに成功して，細胞培養系でこれによるリソゾーム内カテプシンの阻害ができることを明らかにしたので報告する．

Congress ofIndom Errors of Metabolism

実験方法（LysosomalDiseases），atOsaka，Japan，1987．
14）Katsunuma，N．andKominami，E．：CurrTop1．遺伝子の構築

CellulRegnl（ed．byShaltiel，S．，Chock，P．B．）

すでに決定されているシスタナンαのアミノ

Academic Press，New York，London，1985，

酸配列2）に基づき，大腸菌のCOdonusage3）に従っ

Vol．27．p．p．345−360．

て19個のオリゴヌクレオチド断片を構築した．5′

15）勝沼信彦：実験医学，5（川：50−54，1987．

及び3′末端にはそれぞれEcoRIおよびBamHI

16）勝沼信彦，木南英紀：蛋白質・核酸・酵素，33（3）：751−753，1988．

17）勝沼信彦：代謝．臨時増刊号〔代謝病ハイライによる認識部位を付加した（図1）．
2．オリゴヌクレオチドの化学合成
19個のオリゴヌクレオチドはDNA合成機ト），25：1988．

Katsunuma，N．：J．Biochem．，100：623，1986．

（Microsyn1450A）を用い，7オスホラミタイト
法4）・5）によって合成した．合成産物を国相より分19）Kominami，E．，Tsukahara，T．，Bando，Y．and

艶したのち，ポリアクリルアミドゲル電気泳動を

Katsunuma，N．：J．Biochem．，98：87，1985．

行なって精製した．ゲル上のバンドをUVで検出

20）Katsunuma，N．and Kominami，E．：Rev．

し，切り出したのち溶出し，さらにエタノール沈18）Ohshita，T．，Kominami，E．，Ii，K．and

Physiol．Biochem．PhamaCOl（Springer−
Verlag，Berlin）．，108：1−17，1987．

殿によって合成産物を取得した．
3．遺伝子断片のアセンブリーと化学合成した遺21）勝沼信彦：眼で見るページ．代謝24（2）：275，

伝子のクローニング

1987．

図2に示したようにアセンブリーを行なった．
まず断片1，2，11，12および13を混合し，りん酸化した．アニーリングしたのち，連結して二本
−41−

3

1

鵬tl印ProGlylhrThrGlyIl■hlGly
H O P G T T（；Ⅰ†
GnGlt川■111■l叩LH−tl
E†l p l Y
GGllGTTGCTGIClllGTTl

uTTCITGGICCt：GGGTICTICTGGTITC（；TTGGT

GHCCTGGGCCC▲TPTG▲cc…GCuC当呈▲CmmCmG▲TTT千ccGHG川GCCTTT▲G‡；ccTTCuCMCTGTT†＝tTGC▲GTCGACCT‡；TmTmTTGCTTTTIT▲TGCTTTTT▲▲6−TTCi圭C▲▲C一丁▲TGTTT▲当TCC▲▲C▲比uCC▲GTC‡会GG▲C▲▲GT▲mTu

甲GC▲▲…TTGCuGC壬‡▲GG▲CGTGTACTTTC▲l…C…cc▲G…G当…CTGCTGCTGMCTTT†CG▲CCTG▲TGGTCTM‡；GTTTTG▲TTT
91川IspGluLeuThrl叩Pho
〝

D

E

L

T

D

F

llCGICGMCTGICTGICTTCTIGG
TTGCTGCITTGACTGAC妄言AAGATCCCT▲G
図1Amino acid sequence andits synthetic gene of cystatinα鎖断片Aを得た．断片Aはポリアクリルアミドゲ

4．シスタチンα遺伝子の大腸菌での発現

ル電気泳動およびDE−52カラムクロマトグラフ

図3に示すように大腸菌での発現用プラスミド

ィーにより，精製，単馳した．他の二本鎖断片B，を作成した．まず，クローニングしたプラスミド

CおよびDも同様の方法によって取得した．次にpTPI−010のEcoRI−BanHI断片を含むEcoRト

断片AとBより断片ABを，断片CとDより断片

HindIII断片を切り出し，大腸菌のtacプロモータ

CDを同様にしてそれぞれ取得した．最後に断片

ー支配の発現プラスミドpKK223−36）のEcoRI−

ABとCDを連結してシスタナンαの全遺伝子

HindIII断片に連結した．次にこれを大腸菌を得た．かくして得られた遺伝子をフェノール／ク

MClO61株に導入し，3と同様の方法により形質

ロロホルムで抽出したのち，エタノール沈殿によ転換株を得た．それらのうちのひとつE204株を以って単柾した．

後の培養に用いた．

クローニングの手順も図2に示した．合成した

5．大腸菌組換え株（E204）の培養

シスタテンαの遺伝子をプラスミドpBR322のE204株をLプロス（トリブトン1％，酵母エキ

EcoRI−BamHI部位に連結したのち，大腸菌

ス＜Difco＞0．5％，塩化ナトリウム1％，アンビ

MClO61株に導入した．アンビシリン耐性の形質

シリン30／Jg／ml）を培地として，37℃で16時間，振転換株を選択し，さらにラベルしたオリゴマー1

とう培養を行なった．培養終了後，10，000×g，30

および20（図1）をプローブとしたコロニーハイ

分間の遠心分社により集菌し，シスタテンαの精

プリタイゼーション法でスクリーニングを行なっ製に供した．

た．ハイプリグイゼーション陽性の8個の形質転6．大腸菌組換え株菌体よりシスタテンαの精製と単離換株のうち5個が，シスタナンαの遺伝子を保有していることが分った．クローニングした遺伝子

まず菌体を凍結融解し，25mMのトリス・塩酸の塩基配列は，マキサム・ギルバート法によってバッファー（pH7．5）で抽出した．次に10，000

確認した．

rpm，15分間の遠心分離により遠心上清を得て，こ−42−LysosomalproteolysisのCystatinによる制御機構ならびにCystatinの大量産生
蠣1

2

5！6

7

虔二＝
11

12

16

17

i

8

＝ニ！
18

9

19

20

l
■

■
l

l

−
l

kination

l

−
l

l

−
l

l

■

l

l

ligation

l

l
▼

l

l

−U

l

l

C

l

A

Purification

1iga忘一一一一「」
purification

EbmHl

pTp1
−010

図2

ConstruCtion of a plasmid containing the synthetic gene

れを濃縮したのち，0．15M塩化ナトリウムを含む

DE−52にチャージした．同バッファーで十分に洗同バッファーで平衝化したセ7アデックスG−50

浄したのち，同バッファー中，0−0．2Mの塩化ナで精製した．シスタテンαを含む画分を集めて濃トリウムで濃度勾配溶出を行なった．シスタナン

縮し，10mMのトリス・塩酸バッファー（pH8．0）

αを含む画分を集めて濃縮し，保有した．

中で透析したのち，同バッファーで平衡化した−43−

EcoRlECORl

Hind III

BQmHl

Hind III

ECORI
Hind III

Hind

王ⅠⅠ

Eco−
Rt BGmHI EindIIIll
HClO61

屯】NA ligase

Hind I工Ⅰ

図3

Plasmid construCtion for the expression of cystatin gene undertac promoter control

7．NIH3T3細胞へのシスタテンαのマイクロイ

し，洗浄と遠心を3回くり返して細胞を集めた．

ンジェクションとリソゾーム酵素に対する効

この細胞を0．5mlのPBSに懸濁し超音波で破砕

果したのち，リソゾーム酵素の活性を測定した．

NIH3T3細胞を，6cmのペトリ皿中，10％牛血結果と考察

清を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）
で37℃，5％CO2雰囲気下で，コンフルエンス直前

1．組換え型シスタチンαの精製とその性質まで培養した．培地を除去し，37℃に保温したシシスタテンαは，凍結融解とその後のバッファ

スタテンαの溶液（2．8mg／ml）1mlを添加して，ー抽出という簡単な処理によって菌体より可溶化

直ちにスクレイブ・ローディング7）を行なった．そできた．また，その後の精製においてもG−50のみの後，15％牛血清を含む2mlのDMEMを添加し，で，かなり純度の高い標品を得ることができた．

同条件下で2日ないし3日培養した．コントロー

これは，大腸菌のつくる蛋白質で分子量が10，000

ル培養としては，シスタチン溶液の代わりに同量前後のものが比較的少ないことに起因すると考えのDMEMを添加してスクレイブを行ない，そのられる．最終的に，DE−52カラムクロマトグラフィ

後，2mlのDMEM（15％牛血清）とE−64−d（最ーにより，SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳

終濃度20Jg／ml）を添加したものを用いた．培養終動で単一バンドを示す標品を得ることができた．

了後，スクレイブにより細胞をペトリ皿よりはがこの精製工程により，1gのwet cellより約2mg−44−

Lysosomal proteolysisのCystatinによる制御機構ならびにCystatinの大量産生のシスタテンαを得た（H818株）．この精製標品

プ・ローディングによりシスタナンを細胞内に導を，1％メルカプトエタノール存在下，6NHClで入し，その後2日間培養したときの細胞破砕液中

110℃，24時間加水分解した後の，アミノ酸分析ののリソゾーム酵素活性を示した．リソゾーム内の結果を表1に示した．すでに報告されている天然

2つの糖水解酵素であるβ−へキソサミニダーゼ型シスタナンαの分析値2）と良く一致した．さら（β−Hex）およびβ−グルキュロニダーゼ（β−GIc）に，パノ，ヾインのBANA水解活性に対して天然型

は，E−64−dによっていずれも分解が抑制された．

と同程度の阻害活性を示した（データ省略）．以上

これは培養マクロファージ系での結果と一致しの結果，組換え型シスタナンは天然型と同じ性質

た8）．卵白シスタナンは，β−HexについてはE−64を持つことが分った．

−dと同程度の，β−GIcについてはより強い分解抑

2．シスタテンによるリソゾーム酵素の分解抑制

制効果を示した．また，シスタチンαは，β−Hex

効果の予備検討については若干弱いものの，β−GIcについてはE−

シスタテンαの新薬としての可能性を探るた

64−dと同程度の分解抑制効果を示した．これらのめ，マウスNIH3T3培養細胞を用いてリソゾーム

結果は，シスタテンが細胞内でE−64−dと同様な酵素の分解抑制効果を調べた．表2に，スクレイ作用をすることを示唆している．一方，カテプシ
ンLはマクロファージ系でE−64−Cにより，その表l Amino acid composition of cystatinα

レベルが約5倍に上昇することが判明しているので8），本実験系でもそのレベルが上昇する可能性

Residues

Recombinant

Native●

5

2
1
7

3

3

3

4
1

4

6．7（7）法を用いたカテプシンLのレベルの定量は行なわ

3．9（3）ず，細胞破砕液中の活性を測定するにとどめた．

3

13．8（14）2

今後，同位元素または蛍光性化合物で標識した

9
3

2．9（3）

72

2．7（3）

63

8．7（11）69を把握し，かつ細胞内での移行や局在を明らかに

04シスタテンを用いて細胞内に取り込まれた分子数

5．0（4）

8．8（9）

5

したいと考えている．さらに，シスタテンのより効率的な導入法として，シスタナンをマンノース
ー6−リン酸などのマーカーを結合させたリポソー

1．3（1）

する予定である．

11．6（13）

3

ムに封入し，これを細胞と接触させる方法を検討

82

4．0（4）

61

2．9（3）

2

4

4t鮎k︒麗HiS霊9．4（9）

59

4．1（3）

6

慧誌Pr︒慧ⅧMe

AGは大きい．しかし，今回の予備実験では酵素免疫11．3（13）1

3．3（3）

文

献：Takio，K．et．al．，
B．B．R．C．，121（1），149−154，1984

1）勝沼信彦：眼で見るページ．代謝，24（2）：275，

表22）Takio，K．，Kominami，E．，Bando，Y．，

1987．

Lysosomal enzyme activities of2

Katsunuma，N．and Titani，K．：Biochem．

days●culture

β−Hex
9
3
1

0
0
2

0
3
1

2
8
1

0
8
2

6
1
2

6
5
2

2
2
3

4
9
1

0
4
2

9
8
2

5
7

ControI

Biophys．Res．Commun．，121：149，1984．

βLGIc Cath．L

3）Grantham，RりGantier，C．and

Nucl．Acids．Res．，9：43，1981．

Cystatinα

EggWhite Cystatin
E−64−d（20Jg／ml）

Gouy，M．：

4）Froehler，B．C．andMatteucci，M．D．：Tetrahe・dron Lett．，27：469，1986．

Enzyme aCtivities were expressed as units／mg

5）Froehler，B．C．and Matteucci，M．D．：Nucl．

protein．

Acids．Res．，14：5399，1986．
−45−6）de Boer，H．A．，Comstock，L．J．and Vasser，M．：Proc．Natl．Acad．Sci．，80：21，1983．
7）McNeil，P．L．，Murphy，R．F．，Lanni，F．and
Taylor，D．L．：J．Cell．Bio1．，98：1556，1984．

−46−8）Kominami，E．，Tsukahara，T．，Bando，Y．and
Katsunuma．N．：Biochem．Biophys．Res．
Commun．，144：749，1987．

C一蛋白質を指標とした筋ジストロフィー症の解析
丸 山 工 作■
研究協力者

大日方

昂●

佐 野 一 裕＊ 小 島

C−蛋白質はミオシンに結合して横紋筋の収縮

月ま ■
フJて

的とした．

構造を支持する調節蛋白質として知られる．免疫学的特徴から数種のアイソフォームの存在が知ら実験方法

れた1）・2）．そして，鶏骨格筋（特に胸筋）ではそれ

C−蛋白質の解析のために，白色レグホンの種々らの発現は筋の成長段階に依存的であり，かつ筋の横紋筋組織，または正常（NH412）および筋ジジストロフィー症の発症や筋の除神経に際してもストロフィー鶏（NH413）の種々の成長段階の胸著しく変化することが既に示されてきた2ト5）．こ筋白色部を用いた．電気泳動用試料は，新鮮なこのようにC一蛋白質は筋の成長段階や病変をみる

れら組織から蛋白質の分解をさけるため，8Mグ

良い指標と言える．そして，この変化を免疫組織

アニジンHClで全蛋白質を抽出しそれを5M尿

化学的に可視化するための70ロープ（モノクロー

素−lMチオ尿素液に透析して作成した10）．等電点

ン抗体）を作成したl）−2）．筋ジストロフィー症での電気泳動は平林の方法（1981）10）に従い，支持体

筋蛋白質の変化の特徴は，発症に伴ない発現されはアガロースを用い，pH領域の異なる酸性，中る蛋白質のタイプが幼若筋のものに類似すること

性，塩基性のゲル3層を重ねて行った（詳しくはである5ト9）．例えば，成熟した鶏胸筋では速筋型C

文献10を参照）．その後，二次元目をSDS−10％ア

蛋白質のみが発現されているが，ジストロフィー

クリルアミドゲル上に展開し，ニトロセルロース

筋では，これに加えて，ヒヨコ筋に類似して遅筋膜に転写した後，C−蛋白質のスポットは3種の抗型C蛋白質の発現が誘起される5）．これらのこと

C一蛋白質モノクローン抗体（McAb）（C−315，からすると，筋ジストロフィー症での変化は筋のALD66，MF−1：それぞれ心筋，遅筋，速筋C一蛋

崩壊，再生過程で引き起こされる筋の幼君化である

白質を認識する1）・2りを用いてイムノプロット法にとも言える．しかし，ジストロフィー筋で発現さより同定した．即ち，ニトロセルロース膜は3％れる蛋白質が幼君筋のものと同一であるかどうか

ゼラチンーTBS液（0．6MNaClを含むトリス緩衝

は，かならずLも明確ではない．我々は今迄，C−液）でブロッキング後，McAbを反応させ，次に蛋白質の変化を，各アイソフォームを特異的に認

ベルオキンダーゼ標識の抗マウスIgG抗体を反識するモノクローン抗体を用いて明らかにしてき応させ，ニッケル，コバルトの存在下でのDAB反た2ト5）．しかし，より詳細な解析のためには二次元応により抗C一蛋白質McAbの結合したスポット

電気泳動による蛋白質の解析が必要である．そこを同定した11）．

で，本研究ではC一蛋白質を二次元電気泳動で解析結する系を確立し，それにより鶏ジストワフィー筋のC−蛋白質を幼若筋のものと比較検討し，筋ジス

果（1）成鶏横紋筋のC一蛋白質アイソフォームの二トロフィー症に特異的な変化を把握することを目

次元電気泳動による解析
従来，C−蛋白質の二次元電気泳動は困雉とされ＊千葉大学理学部生物学科ていたので，まずC−蛋白質に通した電気泳動条件−47−

を確立した．心筋，遅筋（前広背筋：ALD筋と略

66，MF−1を作用させてC一蛋白質のスポットをす），速筋（後広背筋：PLD筋と略す，および胸筋）

同定することができた．

からの抽出蛋白質を二次元電気泳動に展開し，ニ

図1に鶏胸筋の蛋白質の典型的な電気泳動パタ

トロセルロース睦に転写した後，心筋型，遅筋型，ーンを示す．抗体（MF−1）によって同定された速速筋型C一蛋白質アイソフォームをそれぞれ特異筋C一蛋白質を矢印でマークした．この手法によ的に認識するモノクローン抗体，C−315，ALDL

り，心筋型として1個のスポット（cc），速筋型と

tEF
OH

H＋

馴・●・■ruO＜d−の凸の山口くd−S凸S

図1二次元電気泳動によるC一蛋白質の解析
親鶏胸筋の二次元電気泳動パターンと抗体（MIL1）により同定されたC一蛋白質のスポット．

MHC：ミオシン重鎮，FC：C一蛋白質．
A：アクチン，TM：トロポミオシン，
TNT：トロポニンT

図3 各C−蛋白質の分子量，PIの比較
心鼠 ALD筋．PLD筋の抽出蛋白質を混合し，それを二次元に展開し，心筋型（cc），
速筋型（FC），遅筋型（SCl，SC2）アイソ
フォームを3稜のMcAb で検出し．それらの相互の位置関係を比較した．

lEF
H◆

OH￣

関蔓感普ふ還遂−■・三、．言駄IJ
二∴・∴

図2

Pr）一・t．

筋の種類によるC一蛋白質の違い
鶏心筋（Card），胸筋（Pect），前広背筋（ALD），後広背筋（PLD）からの抽出蛋白質を二次元に展開し1
C一蛋白質アイソフォーム：心筋型（cc），速筋型（FC），遅筋型（SCl，SC2）を3種のMcAbによ．）
識別した．矢印がC一蛋白質を示す．上段に蛋白質の染色パターン，下段にイムノブロットの結果を示す・−48−

C一蛋白質を指標とした筋ジストロフィー症の解析

して1個のスポット（FC），遅筋型として2個のス成長過程でC一蛋白質のタイプが大きく変化してポット（SCl，SC2）が見出された（図2）．C

いくことが知られている．特に，ふ化直後には速一蛋白質がスポットを作るpH領域はミオシンの筋型および遅筋型C−蛋白質が発現され，成長につpIに近く，おおよそ中性付近であった．各C一蛋白

れ遅筋型が消失する．そこで，このような過程で質アイソフォームは等電点と分子量により区別さ発現されるC一蛋白質の内容を2次元電気泳動にれた．即ち，塩基性側から酸性側へFC，cc，SCより調べた．その結果，ヒヨコ胸筋にはFCとSC

2，SClの順であり，分子量の大きさから言うとlが存在し，成長に伴い後者が消失してFCのみ

cc，SCl，FC，SC2の順であった（図3）．成になっていくことがわかった（図4）．一方，PLD

鶏では心筋にcc，ALD筋にSCl，胸筋にFCの筋の場合には，ふ化直後は胸筋と同様FCとSCみであるのに対して，興味あることに，PLD筋（速lが存在するが，ふ化後の成長過程で新たにSC筋）にはFCに加えて更にSCl，SC2が見出さ

2が発現され，3種のC−蛋白質が共存するようにれた（図2）．

なることがわかった（図5）．

各C−蛋白質アイソフォーム相互の関係を知る（3）ジストロフィー筋のC−蛋白質

ために，アルファキモトリプシンにより限定分解

種々の成長段階の筋ジスト

しペプチドマップ法（Cleaveland法）により比較（NH413）の胸筋，PLD筋，ALD筋のC一蛋白質

ロフィ

ー鶏

したところ，SClとSC2の間では2個ほどのフを同様の方法で解析した．胸筋では，ふ化直後にラグメントが異なるのみで，他はよく一致を示し存在したSClは1ケ月齢頃までに一旦消失するた．それに対してccとFCはSCl，SC2とはが，筋ジストロフィー症の発症する2ケ月齢には大きく異なっていた．このことはSClとSC2

SClさらにSC2も出現してくるのが認められは同一遺伝子由来で選択的スプライシングなどにた（図4）．これらがSCl，SC2であることはより生じた産物である可能性を示唆する．

McAbの反応性，ALD筋，PLD筋内のC一蛋白質（2）筋成長に伴うC一蛋白質アイソフォームの発（SCl，SC2）と二次元ゲル上での一致から確認された．従来の免疫組織化学的研究はジストロ

現変化
既に，免疫組織化学的手法により，胸筋の発生，

Nor．

フィー胸筋への遅筋型C一蛋白質の出現を見たに

1m

ヽ＊

増｝鹸

FC

Dys．
図4

鶏筋ジストロフィー症の発症に伴うC一蛋白質の変化
1ケ月（1m），2ケ月（2m），4ケ月（4m）齢の正常（上段）とジストロフィー鶏（下段）胸筋のC一蛋白質．左端はヒヨコ胸筋（この時期にはジストロフィーおよび正常筋で差はない）．
＊はモノクローン抗体（MF−20）で検出したミオシンH鎖を示す．

−49−

とどまったが，今回の二次元電気泳動による解析

考察は遅筋型C−蛋白質の中味を明確にした．その結本研究では，筋ジストロフィー症の指標として

果，ジストロフィー胸筋は，C−蛋白質の発現に関

C−蛋白質の変化をとりあげた．その結果，鶏でのしてはヒヨコ胸筋とは異なり，むしろPLD筋と筋ジストロフィー症の発症時のC一蛋白質の変化

類似することが結論される．除神経胸筋でもSCの実体が明確となった．従来，鶏ジストロフィー

l，SC2の発現が引き起こされPLD筋型パター筋は筋蛋白質のタイプからみて，幼若化した筋のンとなった．鶏ジストロフィー筋は除神経筋と相性質をもつことが，指摘されてきた5ト9）．しかし，通ずるところがある．PLD筋とALD筋でのC−

本研究で得られたC一蛋白質についての結果は，鶏

蛋白質発現については正常（NH412），筋ジス鶏

筋ジストロフィー症の発症が単純に筋の幼若化を（NH413）の間でほとんど差異は認められなかっもたらすのではないことを示す．即ち，ジストロ

た（図5）．以上をまとめると，筋ジストロフィー

フィー鶏胸筋は，C−蛋白質についてヒヨコ胸筋と症にともなうC一蛋白質の変化は，1）胸筋では顕著

同様の面（SClの発現）をもちつつ，一方，正常に起こるがPLD筋やALD筋ではほとんど起こ

胸筋では現れることのないPLD筋型のC−蛋白らず，また，2）胸筋での変化は幼君筋型への移行

質（SC2）の発現をも示した．ジストロフィー筋

ではなく，PLD型への移行を示すのである．

では遺伝子発現の制御系に変化が生じていると思

1m
SCl、∴＿二二二二∵Sq

FC・∵二二二・

FC

と 蒜二

Dys．

In ALD
2m

1m

Nor．

増繭畔
SCl

Dys・

−

柵

SCl

図5

正常および筋ジストロフィー鶏のPLD筋，ALD筋C一蛋白質の比較
ふ化後の成長過程で．PLD筋ではSC2の発現が起こっていくが，ALD 筋では変化がみられない．いずれの筋でも，正常鶏（上段）および筋ジストロフィー鶏（下段）の間で大きな違いは見られない．
−50−

C一蛋白質を指標とした筋ジストロフィー症の解析

われる．データは示さなかったが，除神経筋はC一

文

献蛋白質の発現に関してジストロフィー筋と極めて

1）Reinach，F．C．，Masaki，T．，Shafiq，SりObinata，

類似していた．従って，鶏の場合には除神経筋はT．andFischman，D．A．：J．CellBio1．，95：78

ジストロフィー筋のモデルとしての面を含んでい−84，1982．

る．鶏ジストロフィー筋と幼君筋とが同一でない

2）Kawashima，M．，Kitani，S．，Tanaka，T．and

ことは，TNTの場合についても既に報告した12）．

Obinata，T．：J．Biochem．，9：1037−1047，1986・

今後の問題として，ほ乳頬の筋ジストロフィー3）Obinata，T．，Reinach，F．C．，Bader，D．，Masaki，T．，Kitani，S．andFischman，D．A．：Dev．Biol・，症の発症，進行過程でC一蛋白質に変化が生ずるか否か．特にMDXと関連して重要である．しかし，現在のところ一連のモノクローン抗体が，ほ101，116−124，1984．

4）Obinata，T．：Zool．Sci．，2：833−847，1986．
5）Obinata，T．and Shinbo，K．：Muscle and乳類C一蛋白質にはほとんど反応性を示さないので解析がうまくいっていない．あらたな抗体を作

Nerve，10：351−358，1987．
6）Takeda，S．andNonomura，Y．：Biomed．Res・，成するなどの準備が必要とされる．

1：931−935，1980．

前年度，筋ジストロフィー症を探る指標蛋白質

7）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H．andとしてTNTをとりあげ，ほ乳類（マウス）筋ジMatsuda，R．：FEBSLett．，120：195−198，1980．

ストロフィー症でもTNTアイソフォームの変化

8）Huszar，G．，Vigue，LandHaines，J．：J．BioL
Chem．，260：9957−9960，1985．

が起こることを予報として述べた．今年度この点をさらに確認するために，2つの筋ジストロフィー症マウス（dy，mdx）について，成長過程，発症過程をおって詳しく検討した．その結果，生後9）Bandman，E．：Science，27：780−782，1985・
10）Hirabayashi，T．：Anal．Biochem・，117：443−
451，1981．

11）Ogasawara，Y．，Komiya，T．andObinata，T・：の成長過程でTNTの変化は起こるものの，正常と筋ジストロフィー症マウスの間でTNTの発現にはほとんど差がないという結論に到達した．筋ジストロフィー症動物では筋の萎縮が著しい故，J．Biochem．，102：25−30，1987．

12）丸山工作：厚生省「低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究」（江橋珪），61年度研究報告書，1987，p．p．57−62．

特に筋の採取部位に注意を払うことが必要である．

−51−

CANP阻害剤の設計および合成に関する研究

向 山 光 昭■

インヒビター活性を測定した結果を表1に示した．

は じ め に筋ジストロフィー症にみられる筋崩壊は，細胞2S，4S一体はE−64Fと同等の活性を示した．

中に存在し，カルシウムイオンによって活性化さ

また，2S，4R一体および2R，4S一体は，パれる中性プロテアーゼ（CANP）によって引き起

パインに対する効力は変わらないが，CANPに対こされるとされ，その特異的阻害剤は，筋ジストする効力は低下した．この結果は，CANPに特異ロフィー症の治療薬として期待される．

的に作用するインヒビターを検索する本研究目的

本研究は，チオールプロテアーゼの特異的インには反したが，フルオロアミノ酸の導入が，酵素ヒビターであるE−64をリード化合物として，に対する選択性を高める手段として有効であると

CANPに特異的なインヒビターの開発を，合成化いう特質を明らかにすることができた．

学を基盤に検討したものである．
E−64の活性発現に必須な構造のうち，エポキシ
ド部分はチオールとの反応部位，L−ロイシンアミ
ド部分を認識部位と捉えることができる．このア

表l Inhibitory activity of fluorinatedE−64c
derivatives against CANPand papain

ミノ酸部分を変換することにより，特定のプロテ

InhibitoryActivitylD，。（10−6M）

アーゼに対する選択性を高めることができるもの

Entry Compoundと期待できるので，以下の検討を試みた．

1

2S，4S・E−64C（F3）

6

10

2

2S，4R・E−64C（FB）

50

7

3

2R，4S・E−64C（F，）

100

9

4

2R，4R・E−64C（F，）

100

60

5

E−64C

2

7

結果および考察1．フルオロアミノ酸を含む類縁体の活性
フッ素原子は，立体的には水素原子に次いで小CANP Papain

さいことに加え，電気陰性度は仝原子中最大であCH3 CH3＼／CHる．従って，ある分子中の水素原子をフッ素原子CH2Iに置換することにより，分子の立体的な変化を伴わずに分子内の静電的分布を大きく変化させるこ

H。2：）等Cくご￣N −C ￣CO￣Nとができる．この手法は，プロテアーゼ間の選択性を見極め，より高い選択性をもったインヒビタ

cH3

C 2 2C

E・64c

C 3 2

CF3

＼ ／

ーを開発する有力な手段となり得る．そのようなCH
I

目的で，昨年度にE−64C中のロイシンを5，5，5−トCH2リフルオロロイシンに置換した誘導体（E−64C（F3）と表す）を合成した．その4つの異性体のH。芸＞▽Cく㌃N ，C ￣CO￣N （C 2）2C （C 3）2
E−64C（F3）★東京理科大学理学部−53−

2．内在性CANPインヒビターのアミノ酸配列の1に示した．

繰り返し部分の配列をもつペプチドフラグメ
ントのエポキシコハク酸誘導体の合成

現在までに，N端側にエポキシコハク酸エチル
エステルを結合させた，ジ（Et0−15−Arg−Glu−

榎森らによりcDNAの解析から明らかにされOH），トリ（EtO−ES−Tyr−Arg−Glu−OH），テトラ

た内在性のCANPインヒビターのアミノ酸配列（EtO−B−Lys−TyrTArg−GluTOH），ヘキサ（EtO−には4回の繰り返し構造がある．この繰り返し部

ES−Pro−Pro−Lys−Tyr−Arg−GluTOH），およびオ分が阻害活性に直接係わっていると思われるが．

クタ（EtO」S−Thr−Ile−Pro−Pro−Lys−Tyr−Arg−

その阻害の機構は明らかでない．本研究において

Glu−OH）ペプチドを合成することができた．それは，これらの繰り返し部分は活性中心を物理的にらの一部について活性を測定した結果を表2に示

ふさぐだけであるとの仮定に立ち，反応部位としした．
今回CANPの対照として用いたカテプシンにてエポキシコハク酸を導入したペプチドの合成を対して，ジ，トリ，テトラペプチド誘導体は，い行った．
合成はすべて液相法で行った．第三プチルオキ

ずれも阻害活性を示さなかった．これに対して

シカルポニル（Boc）−アミノ酸を，塩化ジメチル

CANPに対する作用は，ペプチドの構造により大ホスフイノチオイルを用いる混合酸無水物（Mpt−

きく異なり，トリペプチド誘導体が特に高い選択MA）法で逐次延長して得た保護ペ70チドのN端性をもってCANPを阻害することがわかった．

保護基を除去したのち，エポキシコハク酸エチル

この結果は，C端の，繰り返し部分に含まれない，エステル（EtO−B−）部分をp一ニトロフェニル活

グルタミン酸を他のアミノ酸に変換することによ性エステル法により導入した．最後にすべての保り，より高活性なインヒビターが得られる可能性

護基を還元により除去して目的物を得た．代表的を示しており，今後詳細に検討するに値する課題な例として，ヘキサペプチド誘導体の合成例を図である．

図l Synthetic scheme of epoxysuccinoyl−hexapeptide−54−

CANP阻害剤の設計および合成に関する研究
表21mhibitory activity of epoxysuccinic acid derivatives against CANPand cathepsins

ⅠnhibitoryActivityID5。（10−6M）

Entry

CompoundCathepsin
CANP

B

・H
0
0
0
5

2

EtO・ES・Tyr−Arg−Glu

3

EtO・ES・Lys−Tyr−Arg・Glu

0
0
0
1

EtO・ES−Arg−Glu

0
0
0
2

1

L

＞400

＞1000

＞400

200

＞400

1200

もフッ素による修飾を検討した．現在までに；合3．エポキシコハク酸部分のフッ素による修飾
E−64の活性発現に必須なエポキシコハク酸部

成中間体であるジフルオロフマル酸およびマレイ

分の他のグループへの変換も，構造と活性の関係

ン酸を合成することができたので，それらのエポを調べる上で重要な課題である．さきに，ロイシ

キシ化および，E−64Cとの活性比較のためロイシンをフルオロロイシンに置き換え，興味ある結果

ンのイソアミルアミドにそれらを結合させる反応を得たことから，エポキシコハタ酸部分についてを検討中である．

−55−

CANP阻害剤の合成
大 関 正 弘＊
研究協力者

花 田 和 紀■横 尾 千 尋＊ 村 田 充 男■

鈴

勝 沼 信 彦＝＊

木

紘

一＝

しかしながら，E−64CはCANPと同時にカテは じ め に筋ジストロフィー症における筋崩壊には，カルプシンをも強く阻害することから，上記の目的にシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）の関与

適したものとは言えない．このようなことから，が大きいと考えられている．そこで，本症におけ

現在我々はE−64誘導体において，CANP阻害活

る筋崩壊の機作を明らかにし，CANPの役割を解性とカテプシン阻害活性を分散し，筋ジストロフ

明するためには，CANPに対する特異的阻害剤のィー症に対してより選択性の高い薬剤の開発を目開発が望まれている．

的に，新たなE−64誘導体の合成研究を進めてい我々は既に，CANP，カテプシンB，L，Hなどのシステインプロテアーゼを選択的に阻害する
E−64C，さらにそのプロドラッグであるESTを−T h r ・I l e −P r o −P r o −L y s ・T y r −A
−T h r −V a l ・P r o −A l a −G l u −T y r −A
−T h r −1 1 e −P r o ・P r o −A s p −T y r −A
・T h r ・l l e −P r o −P r o −G l u ・T y r −A

開発し1），．現在筋ジストロフィー症を対象として
臨床治験中である．

図1

r g ・G l u −r g ・L e u −r g −L e u −r g −H i s −内在性CANPインヒビター活性中心の一次構造2）

H CO2Np＼ノ
Rlo2C O H
（1）

H CO−L−Tyr−L−Arg（NO2）・OR2

Rl：Et，BzI㌔J
R102C O H
（4）

Boc・L−Tyr−OH（2）（Rland／orR2＝Bzl）

Ⅹ−H−L−Arg（NO2）−OR2

10％Pd−C／HCO2NH一（3）H CO・L−Tyr・Arg（NO2）−OR4
Me
Et
Bz1

Xメ

HCI
HCI
2TsOH

R302C O H
（5）

Np：p−Nitrophenyl（R3and／orR4＝H）

Bzl：Benzyl
DPPA：Diphenylphosphoroazidate
TFA：Trifluoroacetic acid

図2 E−64誘導体の合成法＊大正製薬総合研究所■＊東京都臨床医学総合研究所＊■＊徳島大学酵素科学研究センター

−57−

る．
昨年度は，エポキシコハク酸に種々のアミノ酸

ture300JLlを加え，更に5JLlのCANP溶液（ニワトリCANP，Ca200u／mg，A28。＝0．220）を加え誘導体を結合した化合物についてスクリーニングて30℃で反応させた．20分後に15％トリタロロ酢

したが，本年度は，鈴木班月の研究により明らか

酸300JJlを加えて反応を止め，15分放置後18，000とされた，内在性CANPインヒビターの活性中rpmで10分遠心し，上清のA28。を測定した．ブラ

心の一次構造（図1）2）に着目し．この部分構造にンクとしては，全く同様に処理しCANPの代わ

エポキシコハク酸を活性基として導入することをりにCANPを調製した時の透析外液を加えたも

向山姓月と分担し試みた．まず我々はTyr−Arg誘のを使い，このA28。値を差し引いた．

導体にエポキシコハク酸を導入した化合物を合成

AssaymiⅩture

し，CANP，カテプシンB，L，Hに対する阻害

Casein30mg／ml

特異性を検討した．

inlM TriS・HCl，pH7．5
H20

方

法

460JJllM CaCl2aq．SOln．

1．E−64誘導体の合成
図2に示す方法に従い，Boc・しテロシン（2）とNG−ニトローL−アルギニン誘導体（3）をジフェニル

40JLI

3JL1

2−Mercaptoethanol l．5JL1
3．カテプシンB，L，H阻害活性の測定

リン酸アジド（DPPA）を用いて縮合後，トリフル

カテプシンBとLについては，Z・Phe・Arg・
MCAを基質として，またカテ70シンHについて

オロ酢酸で脱Boc化した．得られたトリフルオロ

は，Arg−MCAを基質として，Barrettらの方法3）

酢酸塩とL−トランスエポキシコハク酸♪−ニトロに従い測定した．

フェニルエステル誘導体（1）を，トリエチルアミン
存在下反応させ4（CA−001−006）を得た．更に，結果および考察

ベンジルエステル基を有するものは，CTH

表1に，今回合成した化合物（CA−001−010）（CatalyticTransferHydrogenation）法によりと比較のために向山姓月の合成した化合物（CA−

還元的にこれを除去し5（CA−007−010）とした．

011−013）の構造式を示した．また表2には，そ

2．CANP阻害活性の測定

れらのCANP及びカテプシンB，L，Hに対する種々の濃度の検体溶液に，下記のAssay mix・阻害活性を示した．

表l StruCture Of Epoxysuccinic acid de−rivatives
H C0−R2六J
R102C O H

Comppund

EtEtEtBZBZBZHHHEtEtEtEt

CA−001CA−002CA−003CA−004CA−005CA−006CA−007CA−008CA−009CA−010CA−011CA−012CA−013

No．

RI

R2

−Tyr−Arg（NO2）−OMe
〃
−OEt
J′

−OBzl

〃
−OMe
Jl
−OEt
〃
−OBzl
JJ
−OMe
〃
−OEt
JJ
−OH
JJ
−OH
TArg−Glu−OH・2H20−Tyr−Arg−Glu−OH・2H20
TLys−Tyr−Arg−Glu−OH・2AcOH・3H20−58−

CANP阻害剤の合成
表2Inhibitory activity of Epoxysuccinic acidderivativesagainstCathepsinsandCANP
Inhibitory ActivityIC50（10−6M）
Compound

2
2
2
2

4

2

4
4
4
4
4
4
4

▲

4

2

4

2

⁚

2

0000074490555

4

2

4

いずれの化合物もカテ70シンHに対しては，阻害活性を示さなかった．

H
4

9．0
2．2
7．0
0．77
0．92
0．95
0．018
0．016
0．44
14．4
＞1000
200
1200

＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞ ＞

40．
25．
5．4
5．2
9．0
1．6
0．17
0．15
2．4
2．3
5000
2000
1000

0000000000000
0000000000000

CA−001CA−002CA−003CA−004CA−005CA−006CA−007CA−008CA−009CA−010CA−011CA−012CA−013＞＞＞＞＞㌻8＞M M

ChatepsinLB

更に注目すべき事には，Tyr−ArgのC端にGluを延ばしたCA−012はCA−006−009と比べ，

CANPに対しては，Tyr−Argを導入した誘導体

CANPに対する阻害活性が1／5−1／2程度低下し

CA−001〜010のうち，CA−001〜005およびCA−010ている一方，カテプシンB，Lに対しては1／1，000は阻害活性を示さなかったが，CA−006−009はE〜1／10．000も低下しており，CA−012はCANPに−64Cと同程度の阻害活性を示した．これらの結果

対してかなり特異性が高まっているといえる．

から，一般的にはエポキシコハク酸部分のカルポ

なおCA−012は、エポキシコハク酸部分がエチン酸はフリーの方が良く，ペプチド部分C端のカ

ルエステルであることから，これを加水分解する

ルポン酸は，エステル化されていた方が良いと思ことにより，CANPに対する阻害活性が高められわれる．

ることが期待でき，今後検討する必要があると思

ただしCA−006のように，エポキシコハク酸部

われる．またこのCA−012については，更にC端の分，ペプチド部分C端のカルポン酸がともにエス

延長，Gluの変換などの検討も必要と思われる．

テル化されたジエステル体のなかに，CANPに対結して阻害活性を示すものがあり，更に，構造と活語

CANPに対する特異的阻害剤の開発を目的と性の関係について精査してゆく必要があると考えして，鈴木珪月の研究により明らかとされた，内ている．
しかしながら，これらの化合物はいずれも，カ

在性CANPインヒビターの活性中心のアミノ酸

テプシンB，Lに対しても阻害活性を有しており，配列を分子設計に応用した．その結果，カテプシ

CANPに特異性の高いものではなかった．

ンとCANPに対する阻害活性を分推しうること

次に，CA−006−009と向山班月の合成したCA−がわかった．このため今後更に，内在性CANPイ

011−013を比較してみる と，Tyr・ArgのN端にエンヒビターのN端側のアミノ酸配列についても，

ポキシコハク酸があるもののみが，カテプシンB，

同様の検討を進める予定である．

LおよびCANPに対して阻害活性を示しており，

また我々は，このような検討とは別に，より効

このアミノ酸配列が活性発現に重要であることが率的な分子設計を目的として，コンピューターをうかがえる．

用いて酵素および阻害剤の三次元構造を解析するこ−59−

とを試みている．本年度はカテプシンBについて検討したが，更に現在CANP，カテプシンLにつ文

献られ次第，分子設計に応用してゆきたいと考えて

1）花耶口妃，横尾千尋，村田充男，小熊清司，玉井正晴，大村貞文，渡遽慶昭，曽田馨，松本和子：基礎と臨床，20：6295，1986．

いる．

2）Emori，Y．，Kawasaki，H．，Imajoh，S．，Imahori，

いても検討を進めている．今後これらの結果が得K．and Suzuki，K．：Proc．Natl．Acad．Sci．
USA，84：3590，1987．
3）Barrett，A．J．and Kirschke，H．：Methods
Enzymol．，80：535．1981．

−60−

CANP阻軍剤の一般薬理学的研究
筋電図および神経活動中の呼吸運動関連成分の定量的評価法に関する基礎的研究−
福 原 武 彦＊研究協力者

加 藤 総 夫■

日

木

村

直

史書

高

野

一

夫＊

と呼ばれている5）．高頻度同期波は神経筋伝達を的

ヒト筋ジストロフィー症に対する治療薬開発研介して呼吸筋の筋電図中にも発現することが知ら究において，その有効性評価法に関する研究推進

れており6）−8），随意呼吸中の健常人の肋間筋筋電図の重要な一環として，疾患モデル動物におけるヒから，これに相当する成分を検出したとする報告

トに応用可能な可及的に非侵襲的であって，しかもある1）・3川・川．また，昨年度我々は，麻酔下のウも信頼度の高い薬効評価方法の確立が強く要請さ

サギから横隔膜自発性筋電図，ならびに横隔神経れている．我々は既に，心電図の定量的解析に基の自発性発射活動を同時導出し，横隔筋電図中に，づいた心筋変性の非侵襲的評価法を確立するため

横隔神経の高頻度同期波帯域成分と1対1に対応の基礎的知見を報告した7）．また，昨年度の研究にした周期約10msの同期波が存在すること（図おいて，動物の横隔神経活動電位中に発現する約1），ならびに，加算平均法によって得られた横隔60−130Hzの成分，すなわち「高頻度同期波」と1

膜筋電図中の高頻度同期波の振幅が，炭酸ガス吸対1に対応した成分が，横隔膜の筋電図中にも検入によって増大し（図2），神経筋接合部遮断英の出され得ることをウサギで確認し，報告した8）．この研究成績を踏まえ，今年度は，呼吸性リズム活動を示すが，呼吸運動に一次的には関与しない遠心性神経，すなわち，交感神経および諸還心性神経の活動との対比を行ないつつ，呼吸運動に直接関与する骨格筋を支配する還心性神経の活動電位を定量的に解析することによって，この高頻度同期波の生理的意義を検討するとともに，筋電図に発現する高頻度同期波の定量的解析法の臨床的診断および治療薬の薬効評価への応用に際して必須の理論的基礎となる高頻度同期波の基本的な生理学的性質を明らかにすることを目的とした．
横隔神経活動電位中の遠心性吸息性発射が約60−130Hzの高い周波数で同期する現象はウサギ，
ネコおよびイヌにおいて確認されており5）・6），これは高頻度同期波（high−frequency oscillations）

60−140Hz BPF＿＿20mは

図1 ウレタンータロラロース麻酔下，自発呼吸下のウサギから導出された右側横隔神経活動（rPNA），
右側横隔膜筋電図（rEMG）および左側横隔膜
筋電図（lEMG）．60−140Hzの帯域濾波後の波
形．破線で示した通り，横隔神経活動と横隔膜
筋電図中に1対1に対応した周期約10msの周期性成分が検出されている．時標は20ms．

＊東京慈恵会医科大学第二薬理学教室

−61−

A

rPNA

rEMG

lEMG
10ms

N王500．60−140Hz

図2 ウレタンータロラロース麻酔下，自発呼吸下のウサギから導出された右側梼隔神経活動（rPNA），右側横隔膜筋電図（rEMG）および左側梼隔膜筋電EgI（lEMG）を60−140Hzの帯域濾波後，横隔神経活動中の高頻度同期波を同期信号として500回加算した波形．破線は同期時点を示す．時標，10ms．A，室内空気
換気時．B，93％酸素＋7％炭酸ガス吸入時．

適用によって著明に小さくなること（図3）を報部で切断した．換気回数を変化させて過換気と換

告した8）．これらは，ヒトにおいても，呼吸筋筋電気低下状態を起こす実験においては，両側の頸動図を非侵襲的に導出することによって，高頻度同

脈洞神経も切断した．直腸温を37℃前後に維持し期波を同定し，呼吸機能，神経筋伝達，および筋た．頸部において横隔神経の切断中枢端からその収縮機能との関連のもとに，これを定量的に評価

遠心性発射活動を導出し，併せて，以下の神経のし得る可能性があることを意味する重要な所見で遠心性放電を，それぞれ同時に導出した．

ある．この評価法が，一つの臨床検査法として確

1）三叉，顔面（第3枝），舌下神経

立されれば，筋ジストロフィーのような骨格筋変

2）頸部交感，腎交感神経性，重症筋無力症などの神経筋伝達障害，さらに

3）迷走神経（頸部において導出．したがって筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの運動ニューロ

反回神経杖を含む）

ン障害をきたす疾患の病態やその治療薬の薬効を，また，迷走神経活動と同時に前頭後頭頭皮上脳

機能的かつ非侵襲的に評価する方法として応用し波も導出した．導出された各神経の自発性還心性得る可能性が期待される．

発射活動，ならびに脳波をデータレコーダー（TEAC，R−210，R−81）を用いて磁気テープに収
録した．

実験方法
体重2．0−2．8kgの成熟，両性のウサギを用いた．

実験終了後，医用電算機（日本電気三栄，7T17）

Diethylether麻酔下にgallamine（5mg／kg，i・V・）を用いて，以下の解析を行った．解析には本教室

により非動化後，呼気ガスCO2および02膿度のにおいて本研究のために作成されたプログラムを連続監視下に，人工呼吸により換気を適正に維持用いた．

した．両側の迷走，減圧および頸部交感神経を頸−62−1）コヒーレンスおよび位相角解析による高頻CANP阻害剤の一般薬理学的研究

rEMG

IEMG

N壬500．60−140Ht

図3

加算平均結果．詳細は図2に準ずる．A，対照．横隔神経高頻度同期波を同期信号として加算．B，ラン
ダム間隔パルス列を同期信号として加算．C，50Hz交流信号を同期信号として加算．D，ga11amine
triethiodide5mg／kg通用後．BとCの加算平均結果において高頻度同期波が検出されていないこと，ならびに神経筋接合部速断薬の適用によって筋電図中の高頻度同期波成分のみ消失しているこ車に注目されたい．

度同期披成分の検出：0−200Hzの周波数帯域

2）パワースペクトル法による高頻度同期波成における神経活動の自己パワースペクトル密度関分の定量化： 自己パワースペクトル上の高頻度数，ならびに横隔神経活動と他の神経活動間の相同期波のピークのピーク周波数およびピーク面積

互パワースペクトル，コヒーレンス，およびに位を，非線形最小二乗法を用いて推定した9）・10）．この相角をFFT法により清算した（0．25Hz／bin，20−

解析を適正換気，換気低下，および過換気下のデ30回加算）．横隔神経活動中の高頻度同期波と同期

ータについて行ないこれらのパラメータに及ぼすした成分の存否を定量的に確認するため，高頻度影響を定量的に検討した．

同期波のピーク周波数におけるコヒーレンス値（ピーク・コヒーレンス）を正規分布に従うよう

実験成績

変換した後2），t−検定によって比較検討した．

1）適正換気下において，三叉（図4），顔面，−63−

Trigemina］nerve

activity

AUTO POWER SPECTRUM
Of

PNA
Cxx

・
i

AUTO POWER SPECTRUM
O†

TNA
CYY

CROSS POWER SPE⊂TRUM
IcxYI⊂OHERENC三IcxY12CxX・CYYPHASE

ar⊂lancxvlmage

GxYreal

120

60

図4

Hz

横隔神経活動と同時導出された三叉神経活動のスペクトル解析．60−120Hzの帯域を示す．上段より，横隔神経活動の自己パワースペクトル，三叉活動の自己パワースペクトル，両神経活動の相互パワースペク
トル，コヒーレンズ，および位相角スペクトル．

表1 諸神経活動と横隔神経活動間のピーク・舌下および迷走神経活動と横隔神経活動との間のコヒーレンス

コヒーレンス（関連度関数）には，高頻度同期波

0．75±0．03＊

舌下神経
腎交感神経

0．76土0．03＊

5）．一方，頸部交感，腎交感神経活動および脳波中には，呼吸リズム性活動は検出されたものの，

頸部交感神経

0，04土0．03

横隔神経高頻度同期波と同期した成分は，検出さ脳波
ランダム白色経書（対照）0．04土0．01

間に定常的な位相関係があることを示した（図

9

迷走神経

トルは，その帯域において，これらの神経活動の

例数

0
1

0．69土0．05＊

01

平均値±標準偏差

顔面神経

4
1

神経活動

の帯域に明瞭などークが検出され，位相角スペク

0．04±0．01
92
15

れなかった（図5）．顔面，舌下，および迷走神経

0．04土0．01＊，P＜0．001と横隔神経の間のピーク・コヒーレンスは，ランダム白色雑音と横隔神経間のピーク・コヒーレン−ク・コヒーレンスの間には有意な差は認められ

スより有意に大きい値を示し，一方，交感神経，なかった（表1）．

脳波，およびランダム白色雑音と横隔神経間のピ−64−2）顔面，舌下ならびに横隔神経活動中の高頻CANP阻害剤の一般薬理学的研究
PHRENlC NERVE ACTIVITY

EEG

CERVlCAL SYMPATHETJC▲UTO POWER
SPミ⊂TRUM

COH帥ENC三三PH▲SE

HYPOCLOSSALRENAL SYMPATHETIC

図5 最上段は3実験例における横隔神経活動の60−140Hzの帯域におけるパワースペクトルを示す．それぞれの下に，同時導出された脳波（左列上段），迷走神経活動（左列下段），顔面神経活動（中列上段），舌下神経活動（中列下段），頸部交感神経活動（右列上段），ならびに腎交感神経活動（右列下段）の，各々，自己パワースペクトル（第1行），横隔神経活動とのコヒーレンス（第2行），および位相角スペクトル（第3行）を示す．

度同期波に対する，過換気ならびに換気低下の影

ズム性動揺を示す総ての神経活動中に必ず発現す響を検討した．高頻度同期波のピーク両横は，適るのではなく，呼吸運動に直接関連した骨格筋を正換気下（呼気炭酸ガス終末濃度：3．7±0．1％，

支配する神経活動に共通して発現する成分である

平均値±標準偏差）と比し，高炭酸状態（5．2±0．1ことが示唆される．BruCeおよびAckersonは，ヒ％）で，3神経活動ともに有意に増加，低炭酸

トにおいて，努力呼吸下もしくは加重負荷下に，（2．4±0．1％）により，有意に減少した．またピ

横隔膜，肋間筋，嘆筋，胸鎖乳突筋および上腕二ーク周波数は，3神経活動ともに，高炭酸で有意頭筋について，それぞれの左右両側から導出されに上昇，低炭酸により有意に下降した．この時，た筋電図間のコヒーレンス解析を行なった結果，

ピーク周波数は，3神経活動ともに互いにほぼ一横隔膜，嘆筋および肋間筋にのみ左右に共通な60

致したまま，有意な差を示さずに遷移した（図−84Hzの成分が検出されたことを報告しており，

6）．

これが，呼吸筋の呼吸性の収縮に関連して発現する成分であろうと推察している4）．彼らは，その成考察分が互いに異なる筋の活動間に共通かどうか検討

コヒーレンスならびに位相角解析の結果は，横していないが，我々が得た結果は呼吸運動に関連

隔神経と共通の高頻度同期波が三叉，顔面，舌下した骨格筋を支配する神経活動それぞれに発現すおよび迷走神経活動中には存在するが，脳波およる高頻度同期波を同期させる神経機構の存在を示

び交感神経活動中に存在しない，という事実を示唆している．

している．したがって，高頻度同期波は，呼吸リ−65−

また，横隔，顔面ならびに舌下神経活動中の高PEAK FREQUENCYPEAK AREA POWER
PNA
ControI x＝
Vll

一 一
一
一

十

HYPOVentilation

l

一
一
一

PNA
ControI XII
VH

＋

一
一
・
一
一
一
−

Hyperventilation
PNA X‖

10Vll

110 HI
MEAN±S．E．，N＝12−15

MEAN±S．E．，N＝12−14

図6 非線形最小2乗法によって推定された，換気低下および過換気における横隔神経（PNA），舌下神経（ⅩⅠⅠ）および顔面神経活動（ⅤⅠⅠ）中の高頻度同期波のピーク面積（左）およびピーク周波数（右）の平均値および標準誤差を示す．

頻度同期波のピーク周波数が，炭酸ガス濃度の変従って，次の研究課題は，本研究の動物失験で化に伴って，高周波数側，もしくは低周波数側に，得られた成果をふまえ，様々な生理的条件下にお3神経活動とも，そのピーク周波数が一致したまける高頻度同期波の性質を，まず動物において，ま遷移した事実は，炭酸ガス浪度によって影響さ

その後さらにヒトにおいて検討を加え，その結果れる高頻度同期波の単一の発振源の存在を示唆すに基づき，適正な測定条件，試験方法，解析方法

る意義深い所見である．

および測定結果の解釈（臨床的所見との対応を含

呼吸筋筋電図中の高頻度同期波を定量的に解析む）につき十分な知見を積み重ねることである．

することが，運動ニューロンから，神経筋伝達，

このような検討の結果に基づき確立される解析法

筋収縮に至るまでの過程における病態生理学的変は，筋ジストロフィー症における呼吸筋変性の進化を定量的にかつ非侵襲的に評価し得る検査法と行の程度の機能面からの判定およびCANP阻害

して，将来，臨床的に有望である理由は次の通り

剤の治療効果に関する非侵襲的な定量的評価方法である．第一に，それが，常に一定の周波数帯域

としても有効な臨床的応用が期待される．

に発現し，しかも本研究で明らかになったように，
呼吸運動に関連する骨格筋の筋電図もしくはその支配神経活動中にのみ，互いに同期して発現する文

献ため，その同定が，確実に，かつ正確に行ない得

1）Ackerson，LM．andBruCe，E．N．：Bilaterally

ること，そして第二に，それが，呼吸運動調節機

SynChronized oscillationsin human dia−

能と密接に関連していることから，すでに臨床呼phragmandintercostalEMGsduringsponta−

吸生理学の分野で確立されている様々な呼吸機能

neousbreathing．BrainResearch，27：346−348，

検査法とその結果の意味付け，および臨床例との対応と併せて考察することによって，適切な測定条件を満たした上で，機能障害の部位と程度を判

1983．
2）Bendat，J．S．and

dures

定することが可能であること，の二点である．

1971．

−66−

Piersol，A．G．：

RandomData：Analysis and Measurement Proce−
．John

Wiley

and

Sons，NewYork，

CANP阻害剤の一般薬理学的研究

3）Bruce，E．N．and Goldman，M．D．：High−8）福原武彦：CANP阻害剤の一般薬理学的研究

frequency oscillationsinhuman respiratory

一スペクトル解析を用いた筋電図および神経活

electromyogramsduringvoluntarybreathing．

動の定量的評価法−．厚生省新薬開発研究費「低BrainResearch，269：259−265，1983．

分子酵素阻害物質による雉病治療薬の開発研

4）BruCe，E．N．and Ackerson，LM．：High−究」江橋姓昭和61年度研究報告書，1987．

frequencyoscillationsinhumanelectromy0−9）Kato，F．，Kimura，N．，Takano，K．and

grams during voluntary contractions．J．

Fukuhara．T．，Jr．：Quantitative spectral

Neurophysio1．，56：542−553，1986．

analysis of high frequency oscillationsin

5）Cohen，M．I．：Synchronizationofdischarges，
SpOntaneOuSandevoked，betweeninspiratoryneurons．ActaNeurobiol．Exp．，33：189−218，

efferent nerve aCtivities with respiratory
rhythm．In：

Neuromotor

Respiratory

Control

Musclesandtheir，eds，Sieck，G．C．，

Gandevia，S．C．andCameron，W．E．，p．p．263−

1973．

6）Dittler，R．undGarten，S．：DiezeitlicheFolge
der Aktionsstrbmein Phrenicus und Zwer．

267，Alan R．Liss，New York．
10）中川徹，小柳義夫：最小2乗法による実験デー

Chfell bei der natBrlichenInnervation．Z．

タ解析一プログラムSALS．UP応用数学，東京

Bio1．，133：420−450，1912．

大学出版会，東京，1982．

7）福原武彦．木村直丸 高野一夫，加藤稔夫，中11）Schweitzer，T．W．，Fitzgerald，J．W．，Bowden，川辰郎，山田順子：EST（E−64−d）の筋ジスト

J．A．andLynne−Davies，P．：Spectralanalysis

ロ7■ィーハムスター（UM−Ⅹ7．1系）の心電図にOfhumaninspiratorydiaphragmaticelectro・

及ぼす影響．慈恵医大誌．100：1233−1240，

myograms．J．Appl．Physio1．，46：152−165，

1985．

1979．

−67−

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

鈴

木

紘

一■

は じ め に

2（X〉

4〔0

6（0

718

カルシウム依存性プロテアーゼ（CANP）の特
異的タンパク性阻害剤（CANPインヒビター）の回れ■ry
Tl■れ●l■tlon Produtt

構造を昨年度決定して報告した．この中にはアミ
lnh拍】t01troMノ酸140残基からなる4回の繰返し構造が見出さ

80

LlY●■．し川g▲H●■lt tGb

れ（図1参照），各繰返し構造中には特異的なアミ
ElythlO叩t●lnh掴t〝ノ酸配列「TIPPXYR」が見出された．肝臓，赤血球及び遺伝子工学的に調製した断片は，この繰返R●亡Ombh■nt Fr■9m●nt

し構造をそれぞれ4，3，2個持つが，これらの＊1TIPPXYRl

インヒビターはそれぞれ4，3，2分子のCANP

図1CANPインヒビターの模式図を阻害した．この事実から，140残基の繰返し構造
は阻害の機能単位であり，各繰返ドメインが1分

クトビラノシドで新しい培地中で発現を誘導した．

子のCANPを阻害すると推定した．また，140残発現した大腸菌は集菌後，超音波で破壊し，粗抽

基の配列中に含まれる特異な配列「TIPPXYR」が出液を100℃で10分間処理した．冷却後沈殿を遠心阻害作用の活性部位であろうと推定した．本年度

で除き，上清に0．02Nの塩酸を加え，中性にもどはこれらの知見にもとづき，遺伝子工学的に上記してから，再び沈殿を除いた．こうして得た部分の事実を証明する実験を行った．

精製品を用いて阻害活性を測定した．

実験方法・材料

結果および討論

昨年度単離したウサギCANPインヒビターの

1．インヒビター断片の阻害活性

CDNAクローンを使い（pC1−213，pCI−11）これをBstNl，Sau

3Alで切断してえられる断片を

TIPPXYR配列（以後T配列と呼ぶ）が阻害の作用部位であると考え，このT配列を中心に種々

pUC9，又は18に組み込み図2，3のようにして発現のインヒビター断片を設計した（図2．3）．Bシリ

用のプラスミドを調製した．前者をBシリーズ断ーズ（図2）はT配列のC末端を短くし，N末端片（B1−4），後者をSシリーズ断片（S1−4）と側に長い配列をとったもの，S配列（図3）は逆呼ぶ．また，BシリーズのプラスミドをBamHlとにT配列のC末端側を長くしたものである．これ

Pstl又はBamHlとSau3Alで消化してえられるらの断片の阻害活性を調べたのが表1である．B，

断片をpUC18につなぎ，BSシリーズ用の発現ベ

Sシリーズとも，1−4の各ドメインは阻害活性クターを作った．

を持つ．即ち，1分子中に少なくとも阻害活性を持

これらの組換えプラスミドを含む大腸菌を定常

つ4つの部位があることが判明した．1−4のド期まで培養し，集菌後，イソプロピルーβ−チオガラ

メインのうち特に3番目のドメインの活性は他のドメインに比べて弱い．また，ドメイン1は4つ■東京都臨床医学総合研究所のドメインの中では最も活性が強い．mCANPは−69−

PC卜11

▼

●

▼

嶋

83
▼

●

っ二言︶

83

■

○

−一〇小一；血こ〇〇一；一三8200−一；三笠○︶

0
0
4

−

− ひい〇二〇▲シ−一〇〇；○︸三二F■︶

ー Nm◆︵○○︶

■
8

▲l h

は．劃

L

⊥印●○芯一〇︶L⊥冨二〇苫︶00−かい一言中三l P〇一二伸こ

諒e00⊥iO；巴︶

0
0
2

●一父

N

8

SI S2
81

◆

■

pUC18／8■mHl

PUC18／H川Cll pUC9JHlnt川▼●●E．co編H8101

E．601iH8101
CDNA h暮●11笥′Hind■■■lp81）orEcoRllp82−4日l叩●tbn▼F仙d￣hbyKkn小目119m●吼

▼Fill●d−hbyKl●八〇Wt−叫m■nt・▼叫1抽∩鵬th12T仙●−▼Liq・ti。∩−ith12▼…●−

E．C01YA21

E．亡01iY▲2t

図2

Hildul dl00aHon

CANPインヒビターの発現用プラスミドの調製（B配列）図3

CANPインヒビターの発現用プラスミドの調整（S配列）表l CANPインヒビター断片の阻害活性（1）CANPの残存活性（％）
m

CANP

lOJJ12）

5恥1

JLCANP
10JJ1

50JJl

Bシリーズ
7
3

9

8

6

8
9
＞

5
9

1
1

0
1

2
4

0
1

7

0
2

1（122−277）1）
2

＜

6
1

2（278−381）

3
4

5
6

■

3（381−516）82
14（516−628）
Sシリーズ

2

＜

8
2

6
6

2
1

1
5

2（311−451）＞981）残基番号．1〜4のTIPPXYR配列はそれぞれNo．200，337，487，617からはじまる．
2）cANPインヒビター（5−20Jg／ml）の添加量

−70−

5
3

＞98

5
5

4
1

＞98

6
8

3
1

pUC18

5
3

4（589−718）5
13（451−588）

8 ．4−
2
7

1（187−311）

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

どの断片でもよく阻害されるが，〃CANPはmCANPに比べると阻害がかかりにくい．

る．結局，T配列が阻害活性に必須な配列で，こT配列の前後の配列をさらに短くするとどうなを示さない．T配列は1分子中に4分子あるので，るかをBSシリーズで検討した．BSシリーズは

CANPインヒビターは4分子のCANPを阻害す

T配列のN末端側をSシリーズからC末端側をBる．

の配列を含まないインヒビターの断片は阻害活性シリーズからとってつなぎ合せたもので，全体の以上の解析で，昨年度推定した2点，すなわち，長さは41−71残基である．表2の結果からBSシ

CANPインヒビター中の140残基の繰返しドメイ

リーズもすべて阻害活性を示す．しかしドメインンが阻害の機能単位で，TIPPXYRが阻害に必須

3は〟CANPに対してはほとんど阻害活性を持たない．また，興味あることに，ドメイン4はであることが証明された．
3．T配列と他のプロテアーゼインヒビターとの類似性

mCANPよりJLCANPを強く阻害する．この傾向
は他のドメインとは逆である．T配列の前後で共CANPインヒビターは他のタンパク質インヒ

通する最小の長さを求めると，T配列の前に16残ビターとアミノ酸配列が全く異なることから，今基，後側に6残基，T配列は7残基なので，合計までのインヒビターとは違った全く新しい型のプ29残基が最小の阻害断片になる．

ロテアーゼインヒビターと考え，その阻害の機構

2．インヒビター断片のNおよびC末端側からのも他のプロテアーゼインヒビターの場合とは異なきりつめる可能性があることを指摘した．CANPと1番強い阻害活性を持つドメイン1を選び，N，

CANPインヒビターはカルシウムの存在下に複C末端からきりつめて，T配列を欠くようにした合体を形成する．複合体としては単に両者が会合

ら阻害活性はどうなるかを検討した．C末端側にしている場合と，両者が共有結合ないしはそれに長い配列を持つSlをN末端から切断すると，T配近い形で結合したものがある．後者の例としては，列が失なわれると阻害活性も消失する．N末端かインヒビターが擬基質として働き，CANPの活性

らきりつめても，全体の長さはそれほど変化しな

中心に結合した状態が国定されたものがもっともいので，T配列が活性に必須で，T配列がないと考えやすい．この場合には，酵素が阻害剤を見分阻害活性がない．またBlをC末端から切りつめてける特定のアミノ酸配列の存在が予想されるが，いった場合も，T配列がなくなると活性がなくな

前者の場合は一次構造より，高次構造が両者間のる．この場合も，阻害活性が消失する前後で，ペ識別でより有効に作用するであろう．CANPイン

プチドの長さには著しい変化はないので，T配列ヒビターの場合，T配列が阻害に必須であることの消失が阻害活性の消失を意味するものと思われは，後者の可能性を示唆すると思われる．その瘍

表2 CANPインヒビター断片の阻害活性（2）残存CANP活性（％）
m CANP
10〟11）

〝CANP

50d

10Jll

50Jd

BSシリーズ
5
1

3
2

1
2

2
1

3
2

3
00
9
6

8
9
＞

0 qU
2
9
＞

3
6

7
5

4
8

4（588−628）8
9＞3（451−516）2
22（311−381）

911（184−242）2）

1）cANPインヒビター（5−20Jg／ml）の添加量
2）残基番号．1．2．3，4のTIPPXYR配列は各々No．200．337，487，617からはじまる．
−71−

合，CANPがT配列のどこかを認識して活性中心

ヒビターのreactive siteの配列の問に類似性ががその部位に結合するであろう．いいかえると，みられる．これが有意の類似性であるか否かは現

TIPPXYRのどこかがreactive siteである．T配時点では不明だが，図4のならべ方が正しいとす

列を他のプロテアーゼインヒビターのreactive

れば，T配列の前がPl部位，すなわち，reaCtivesiteの配列と比較したのが図4である．図から明Siteに相当する．
一方，CANPの作用の第一の特徴が限定分解でらかなように，T配列とセリンプロテアーゼイン

あることから，CANPはアミノ酸配列を見分ける
CANPInhibltor

T

COnSenSllS
くmil10r）

I P P・E Y（V） （A）（D．X〉

R

十分考えられる．事実，CANf）が切断する結合の近傍の配列には共通なものが見られない．結局，

Serine Proleaselllhibitor8
5erpin Family
Human α1−AT
Chieken Ovalb

豊里習習厨上島Bovman−Birk Famlly
HAI−DE−3 Regionl
Region2

Kazal（PSTI）Family
OIUPq3
PotatoInhibitor l Family
C1−2

図4

より，高次構造を見分けて基質を切断することも圭団員翌日甲A C

厄Ⅰ（皿田凪ⅠエT H

CANPは一次構造と高次構造の両方を見分けて切断するのが事実であろうが，今後，T配列がreactivesiteの一部であることが固定できれば，この配列をもとにCANPに特異的な小分子の合成阻害剤の設計が可能になろう．

厄日句風

T配列と他のプロテアーゼインヒビターの配応
部位の比較

現在，T配列を含む約30残基のペプチドを合成し，阻害の機構と反応部位の検索を続けている．

−72−

筋ジスハムスターにおけるCANP系の変動
川

研究協力者

林

島

誠

一＊

昌 美■

中 村

愛書

は じ め にmCANPのいずれによるものか，あるいはインヒ

筋ジストロフィーにおける筋肉タンパク質の異ビター活性の変動による相対的なものなのかは不常分解をひき起こすプロテアーゼの1つとしてカル明である．そこで，このような現状を打破し，筋シウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）が考え

ジストロフィーの発症・進行におけるCANPのられている．その根拠として，玩＝戒ねで骨格筋関与を検討するため，CANP系を構成するにCANPを作用させると，筋ジス骨格筋における特徴であるα−アクチニンの遊離一Z線の崩壊

JLCANP，mCANP，インヒビターの各活性を個別定量する方法を確立し，ラット各種臓器および筋が起こり，さらに筋ジス骨格筋では細胞内Ca2＋

ジスモデル実験動物（ハムスター）骨格筋につい濃度が上昇していることが挙げられる．このようて応用した．

な視点から筋ジス骨格筋のCANP活性を測定し実験方法た結果がいくつか報告されている．CANPには材料

Ca2＋感受性の異なる2種類（高感受性のJLCANP

4週齢と10週齢の正常ハムスターと筋と低感受性のmCANP）が存在し，さらにCANP

ジスハムスター（UM−Ⅹ7．1）は大正製薬総合研究を特異的に阻害するタンパタ性物質（インヒビタ

所より恵与していただいた．CANPおよびインヒー）が共存LCa2十と併せてCANP活性を制御しビターの臓器分布測定には6カ月齢のフィッシャている．このようにCANP系は複雑な因子からー系ラットを用いた．標準とした精製〟CANPお成っているにもかかわらず，既報の多くは単に骨よびmCANPは既報の方法でウサギ骨格筋より

格筋粗抽出液をそのまま酵素源として用い，精製した1）・2）．

CANP活性の多寡を論じている．その結果は筋ジ

CANPおよびインヒビターの部分精製−摘スにおいてCANP活性は著しく上昇していると出した組織に3客の20mMトリスー5mM EDTAするものである．しかし通常は骨格筋には総（pH7．5）（緩衝液A）を加えホモゲナイズ後，35，

CANP活性を上まわるインヒビター活性が存在

000×gで20分間遠心して粗抽出液を得た．粗抽出するため，CANP活性は検出し得ないはずであ液（10ml以下）を3mlのDET52カラムに流し，る．そのため，これまでの報告では酵素学的に非吸着したタンパク質を0．15M食塩および0．40M

常識と考えられる長時間の反応を行い食塩で順次溶出する．0．15M分画に4M食塩を加CANP活性〝の変動を論じている．このような活性測定か

え0．40Mとしたのちlmlのフェニルセ7ァロー

ら得られる結果はインヒビターの分解・不活性化

スカラムに流し，0．4M食塩一緩衝液Aで充分洗いによるもので，真のCANP活性を反映しているとは考え難い．よしんばこの測定方法が適切であ

インヒビターを除去する．次いでJLCANPを60％
エチレングリコールー緩衝液Aで溶出する．インヒっても，ビター試料としては，その熟安定性を利用し粗抽

CANP活性〝の変化がJLCANP，出液を100℃，5分間処理したのち熟変性したタン＊東京都老人総合研究所

パク質を遠心除去した上清を用いた．この熱処理−73−

でCANPや他のプロテアーゼおよび血清由来の明らかであった．しかし，活性の分散を抑えるた

チオールプロテアーゼインヒビターは失活する．

めには，両者を個別に段階的溶出することが必要

活性測定−CANP活性は11C−無水コハク酸である．精製したJLCANPとmCANPをそれぞでラベルしたウシ血清アルブミン3）を基質としてれDE−52カラムに吸着させ，食塩濃度を段階的に用い，図1の方法で測定した．この方法では0．1単位以下の粗CANP活性を定量的に検出可能であ上昇させると，〟CANPは0．13Mと0．15Mの分
画に，mCANPは0．20Mと0．25Mの分画にそれる．インヒビター活性は，外から加えた一定量のぞれ洛出された（図2）．そこで，0．15M食塩で精製mCANP活性を阻害する活性として測定し

JLCANPを溶出したのち0．40M食塩でmCANP

た．

を溶出することにした．この方法をラット肺臓の粗抽出液に適用した結果が図3である．0．40M分
結画にmCANP活性が溶出されるが，0．15M分画

果

まずJLCANPとmCANPをそれぞれ括性的ににはインヒビターが共に溶出されるため純化し得る必要最小限の過程を決定した．過去の

JLCANP活性は検出されない．しかし，0．15M分

CANP精製の経験から，両者はDEAE−セルロー

画をさらに7ェニルセファロースカラムに吸着さスカラムクロマトにより分艶が可能であることはせ，エチレングリコールで溶出することにより

AsSay mixtur0

14C−8uCChylatod BSA
28mM ll−ME
6mM CaCl2
0．1M TrlS（pH7．4）
88mPl00r 8tandard
l30。C．5min
I50％TCAlOいい0．000rpm，5min

COUntOd0

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0

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20

30

Fraction Number
0．0

0．1

0．2

CANP（unit）

図1

B）2

CANPの活性測定法と定量直線−74−精製したJLCANPとmCANPのDE−52カ
ラムからの溶出．
矢印の数値は食塩濃度（M）を示す．

筋ジスハムスターにおけるCANP系の変動高かった．インヒビター活性は肝臓・牌践・腎臓〟CANP活性を得ることができた．
方法が確立したので，ラット各種臓器に存在すで著しく高く，捻CANP活性をはるかに上回っ

るJLCANP，mCANPおよびインヒビターの各活ていた．骨格筋は各活性が比較的低い組織である性を定量した（図4）．それぞれの活性は臓器に特ことがわかる．

異的な分布を示した．JLCANP活性は脾臓・腎臓

この方法の有効さが実証されたので，筋ジスハに，mCANP活性は肺瓶・脳に多かったが，全てムスターの骨格筋について応用し，CANP系の変の臓器でmCANP活性の方がJLCANP活性より動を検討した（図5）．病理的変化には至っていな
いが生化学的変化が活発である4週齢の筋ジスハ
ムスターではJLCANP・mCANP・インヒビターのいずれの活性も上昇していた．しかし，筋ジスト
ロフィーが進行し筋肉の壊死・再生が繰り返されていき10週齢の筋ジスハムスターでは・インヒ
ビター活性は高値を保っていたが，〟CANPおよ√b︻×∈dp︶き＞宅くり詔︒−︒左EuOのN ld02LqqJOのqV ︵ − ︶びmCANPの活性は正常ハムスターにおける値に復していた．

考察

本研究での測定結果では，筋ジス骨格筋におけるCANP活性の著しい上昇は認められなかった．
筋ジス発症の初期においてCANP活性は有意に上昇していたが，進行に従い正常に復していた．
この初期における上昇が筋ジス骨格筋タンパク質

図3JLCANPおよびmCANP分画の調製の異常分解開始の引き金（不可逆的過程）であり，その後の進行は他のプロテアーゼ（例えばリソゾームのカテプシン類）に依るとすると，これまで

扁︳七d EA亡■tコー一名u一1b一一rI一■iUb■毒U桝伽； 2 己 − H u ■ ∈ 〇二●1−u⊃︶II≡lqVもl一q三u

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図5

帥【鵬■t L叫図4

仙■叫…仙増慧㍗鵬

ラット各種隈器に存在するFLCANP，mCANP
およびインヒビターの活性量
−75−

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H

D

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D

H

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H

D

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D

4週齢および10週齢の正常および筋ジスハム
スターの骨格筋粗抽出液に存在する〟CANP．
mcANPおよびCANpインヒビターの各活
性

の諸結果の多くが説明できる．また，実際にCANP活性は正確にはCANP前駆体の活性であCANP阻害剤であるESTを筋ジス患者に投与しり，必ずしも活性化されたCANP量を反映してた場合，発症初期あるいは若齢の患者には効果的いない．閉鎖系を仮定すると，CANP（前駆体）

であるが症状の進行した患者には効果が少ないと活性の減少はむしろCANPが活性化され消失しする臨床結果とも合致する．筋ジスではCANPたことを意味するのかも知れない．10週齢においインヒビター活性も上昇するが，生体内での局在てCANP（前駆体）活性が4週齢より減少してい部位やCANP活性の阻害機構が解明されるまでるのは，10週齢でより多くのCANPが活性化さは，単に算術的に判断するのは危険である．もしれた結果とも解釈できる．これらの複雑な問題を

CANP活性とインヒビター活性の差を生体内で解決するためには抗CANP抗体および抗インヒのCANP活性とするならば，多くの組織でビター抗体を用いた解析が必要であり，目下検討

CANPは機能し得ないことになるからである．

中である．

骨格筋は本来CANP活性の低い組織であり，昨年度報告したように抗CANP抗体による免疫文

献組織染色でも骨格筋自身の反応は弱く血管が強く

1）Inomata，M．，Hayashi，M．，Nakamura，M．，

染色される．そこでCANP活性が骨格筋組織のlmahori，K．andKawashima，S．：J．Biochemりどの部位で上昇しているかが問題となる．もしCANPを多く含む細胞が侵潤すれば，容易に
CANP活性の上昇として表われてくる．また，
CANPは生体内で不活性前駆体として存在し，Ca2十で活性化されたのち自己消化して失活すると考えられている．したがって本研究で測定した

ー76−

93：29ト294，1983．
2）Kawashima，S．，Nomoto，M．，Hayashi，M．，
Inomata，MリNakamura，M．andImahori，K．：

J．Biochemり95：95−101，1984．

3）Mellgren，R．L．，Repetti，A．，Muck，T．C．and
Easly，J．：J．Biol．Chem．，257：7203−7209，1982．

ベスタチンの使用経験
特に同量固定法single blind法による治験例にbestatinを再投与したその後の実態とdouble blind登録例について−
福 山 幸 夫＊
＊
＊

田

＊

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み 子 人
久
ゆ 恵 義

井

新 中 平

＊

表1対象および投与方法

は じ め に

昨年度我々はBestatin（以下B）または

もー聯
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郎搾Placebo（以下P）を同量固走法のSingleblind法
により1年間授与した治療効果および副作用につl

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る治験に登録し治験を開始した．前者10例のその後の臨床像の実態を報告し，doubleblind例10例

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7 r Imのうち投与継続希望例にはさらにBを投与し，また新たに6歳未満の症例をdouble blind法によ

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lさh

き10例で検討し報告した．今年度は，この10症例

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ll 一日

ll − 15m

Oにて来院し，臨床拝価と機壬書行なう●8●Statin投与
OPlさC●bo掠与の投与前の背景につき簡単に紹介する．
Ⅰ．Duchenne型筋ジストロフィー症（以下D型
PMD）におけるベスタテン治療開始後2年の
実態
目

＊

＊

子 子 子
代 加

加未 場

＊

藤 井 木

斎 川 鈴

＊

子 子 子
木
真 恭 啓

沢 沢 倉

大 平 宍

研究協力者

的

B長期投与の臨床効果を検討する．
対象ならびに方法

ト1階段昇降可 手すり不要 手の介助不要
ト2 階段昇降可 手すり不要 手の膝おさえ要Ⅰト13 階段昇降可 手すり要 片手手すり
Ⅲ−14 階段昇降可 手すり要 片手手すり手の昧おさえ要
H−15 階段昇降可 手すり要 両手手すりm
イスからの立ち上がり可能
Ⅳ
歩行可能
Ⅴ
四つ這い可能 車椅子上ADL独立
Ⅵ
四つ這い不能 いざり可 車椅子上ADL介助要
Ⅶ
坐位保持可能 車椅子作動可 背部支持要Ⅶl
坐位保持不能 ねたきり全介助

表1に対象症例を示す．昨年度まで同量固定法のSingle blind法で1年間BまたはP投与の10例である．case4−8はSingleblind時にB投与，CaSe

生産の関係で供給不能の状態があり，実際には再9−13はP投与例である．原則として，1年間のSin−投与までに，症例により1カ月から4カ月を要し

gle blind終了時にいずれの群も投与希望があれた．case5，CaSe12は都合により転院，およびばそのまま直ちにB再投与予定であったが，薬剤

case7，8，11はB再投与するも途中から希望により投与中止，CaSe13は最初P，その後も投与を希★東京女子医科大学小児科、望せず，全経過B無投与であった．
−77−

臨床評価は原則として，4週間ごとに筋力，運週ではステージⅤ：歩行不能であった．

動機能，各運動（立ち上がり，起坐，20m走行）

仝経過B無投与のCaSe13は，開始時Iト14：階

所要時間，副作用などについて行なった．血清

段昇りに片手手摺と膝手，52週時Ⅰト15：両手手

CPKその他の血液・尿検査はSingleblind中は4摺，104週時ⅠⅤ歩行可能なるも椅子からの立ち上が週間ごとに，その後は8週間ごとに施行した．

り不能と低下した．

また，投与開始前（0週），52週（single blind

以上各症例経過の概略を示したが，7歳でしか終了時），その1年後の104週で機能障害度を判定

も開始時機能レベルがほぼ同様であったcase8とした．年齢は開始時のものであるので，52週，104
週はそれぞれ1年および2年後の年齢に相当する．

CaSe13について注目して比較してみると，いずれもII−14で投与開始したのに，CaSe8は不変，CaSe

機能障害度基準には，祖父江姓の機能障害プロ13は104週時最初からみると3段階低下していた．

ジェクトチーム案l）を用いた．

この両者の相違は，意味があるように思える．
2．運動所要時間の変化

結A．立ち上がり所要時間（図1）果

1．機能障害度の変化

開始時5歳未満の群では，いずれの場合もあまA．singleblind時B投与群：case5では，0週ではstageII−15：階段昇りに両手手摺を要していり大きな変化は見られなかった．
5歳以上の群では，CaSe6では上気道炎を反復たが，52週時にはⅠト13片手手摺のみで可能となした44週頃から無投薬の66週まで所要時間が延長

り，52週の方が1段階改善していた．しかし，本し，再投与によりやや短縮したが，88週より目だ

例は開始前が骨折後で，その回復も改善に加味し立ち上がり新手時間（4▲以下）ている．case8は，全経過stageは不変だが，起立した．3例すなわちcase4，6，7は0週，52週は不変で，104週でcase4は1段階悪化，すなわち階段
昇りに手の介助不要であったのが，手の膝おさえを要するようになり，CaSe6は2段階悪化し，手の7では無投薬期間に2段階悪化し，歩行不能にな

一・・．・・一■■■l■ln●■●・・・●∩■鵬t暮．11枚■■●．−︒

膝おさえで階段を昇れたのが不能となった．case

芯≠⁝垂＝≠：≠：≠玉串慧串認定崇

所要時間はB中断で延長，再投与により短縮を示

り，B再投与にても改善はなく，その後94週で投■●

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与中止したが，104週では同stageであった．

−1わサー寺i一一一一一・▲▲とこ竜￣一一‥▼￣￣−￣▼■B．singIeblind時P投与群：2例は3歳で投与開始，階段の1段の高さが息児にとっては高過ぎた

階上昇し片手手摺で可能，CaSelOは，52週，104週と1段階ずつ上昇した．casellはstageは全経過より延長の傾向が見られた．case12は開始時で両手で手摺に掴まれば階段が昇れたが，P投与4週

併用川■川け1︒●・．▼．〇

不変だが，運動所要時間でB投与で短縮，中止に■︼仰山二一l九二芸九こけ糾カ

いでしか階段が昇れなかったのが，104週には2段；i㌢慧

可能性もあるが，CaSe9は0週，52週では，四つ這●より1段階低下して不能となり，52週時2段階低下してステージⅠⅠⅠ，その後3カ月B投与するも104−78−

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図1 起立所要時間

1，∞l仇Il■lけ1111劇HJM1al二uベスタナンの使用経験って延長し，108週からは立ち上がり不能となっの所要時間はほぼ同じなのに，その後はB投与例

た．case7ではB投与中から，立ち上がり困難であ（case7）の方が，PのCaSe12よりも所要時間がったが，無投薬を契機に不能となっており．その長い傾向が認められた．

後再投与でも改善は得られていない．case8でも，

C．起坐所要時間（図3）

B中止により所要時間延長，再投与によりやや短5歳未満の群では，20m走行の場合と同様に，縮，その後無投薬期に延長という経過がみられた．

CaSe9，10では，PからBに変更後，所要時間の短

casellではBとPの差がほとんどなく，CaSe12で縮が見られている．
5歳以上の群では，症例によってはB中止で悪は，P投与中に立ちあがり困難から不能となり，再投与によっても改善はみられてなかった．case

化，再投与でやや改善を思わせる例もあったが，13は全経過無投薬だが，8歳頃より特に延長した．

PやB投与中でも変動がみられ，薬剤の影響を強

B．20m走行時間（図2）く思わせる例はなかった．

5歳未満の群では，CaSe9，10では，PからBに

3．血清CPK借
5歳以上の例では，投与開始4週の時点で，B変更後，所要時間の短縮が見られたが，CaSe4では投与例は低下，P例ではやや上昇という両者の違あまり大きな変動はなかった．
5歳以上の群では，CaSe6では投薬の有無の影
響はほとんど無く，CaSe8，CaSellではB中止にいがみられたが，その他は全く両者に差を認めなかった．

より延長，再投与によりやや短縮，その後無投薬考期に延長という傾向が少し認められた．しかし逆ベスタナンは，アミノペプチダーゼBおよびロにCaSe7とcase12を比較すると，投薬前には両者

20m走行所要時間（4歳以下）

起坐所蔓時間（4歳以下）

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20m走行所要時間（5歳以上）

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図2●・．・．・．・一8●tt■帥書●

図3 起坐所要時間

20m走行所要時間
−79−

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■鶉1叫1叫1眞Ill川日用

イシンアミノぺプチダーゼの活性を桔抗阻害する作用をもつと同時に，細胞表面に結合する．従来

S．63．2．2

Y S S．591．20

S．62．10．20

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K Y S．59，，．28 S．63．4予定■

験でも，血清CPK値は初回投与の初期には低下

S O S．60．6．tl S．63．2．2

S．62．12．9

H

Y K S60．1．26

2

始すると効果があるという4〉・5）．59年度の我々の経

H日〜l S．59．10．16 S．62．日．20

2Hった3）．PMDマウスの実験では発症初期に投与開ー−

H T S．58．2．19

ttag・篭ど5 彗管 品 歩葺芸垢 歪孟
2

本剤がPMDの治療薬として使用されるようにな

配給年月B
S，62．日．21

日

性が正常群に比して異常に上昇していることから，

生年月日

H K S．56．1021■

およびニワトリの筋肉内のアミノペプチダーゼ活症例

Double blind登録症例

2

免疫増強剤として開発されてきた．PMDマウス

表2

m
u

2
−

T S S．6【I 9．30 5．62．10．20

3がみられ，偽薬による上昇・真英による低下を示3したのは，機能が良好な症例であり，より進行した症例に投与するよりも軽症例に投与する方が効始し経過観察中である．

果が出る可能性が示唆された6）．しかしながら，昭和60年度臨床分科会のプロトコールに基づく検討

文

献では，B投与例とP投与例では特に差は見られな

1）福山幸夫，高柳哲也，野島元雄，松家豊，上田

かった7）・8）．今回の我々の検討では，5歳未満の例

敏，湊治郎，井形昭弘，堀三津夫：筋ジス患者

でPからBに変更後経過良好な傾向があったが，における機能障害の進展過程に関する研究．厚発達の要素も含まれ，結論は下せなかった．

生省神経疾患研究委託費，筋ジストロフィー症の臨床病態および疫学的研究（祖父江珪），昭和

結

55年度研究成果報告書，1981，p．p．4−7．

語

昨年より引き続き10例においてベスタナン投与の臨床効果を検討した．

2）福山幸夫，大沢真木子，宍倉啓子，鈴木陽子，
陶山亜理子，森本武彦：進行性筋ジストロフィー症に対するペスタナンの使用経験．厚生省新開始時5歳未満の症例で，PからBに変更した薬開発研究贅，微生物の二次代謝産物に由来す群においては，20m歩行と起坐所要時間においてる難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅改善傾向が認められた．

沢姓），昭和58年度研究報告書，1984，p．p．101−

開始時5歳以上の症例では立ち上がり所要時間，20m走行においてB中断により悪化，再投与によ114．

3）梅沢浜夫，微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究．厚生省

り改善の傾向が認められた．
血清CPKにおいては薬剤による影響を同定し得なかった．

新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来
する難病治療薬（ロイぺプチン）の開発研究（梅沢珪），昭和55年度研究報告書，1981，p．p．3−
14．

ⅠⅠ．double blind登録例（登録時6歳未満）

4）松下 宏，辻 繁勝：筋ジストロフィーマウス
にみられる種々な酵素活性変動に対するロイペ

投与前の背景を表2に示した．年齢分布は2歳か

プチンおよびベスタナン投与の影響，昭和55年

ら6歳であるが，2歳代と3歳代が各4名いる．

度研究報告書，1981，p．p．55−61．

運動機能では年少の2例を除き全例階段昇降可能
で，床からの立ち上がりに手の介助を要さない症例が3例，両足跳躍が可能な症例が1例のみおり，
この両足跳躍が可能な症例についてはBecker型との鑑別が問題になる．現在1例を除き投与を開
−80−

5）松下

宏，辻

繁勝：ハムスター筋ジストロ

フィー症に対するロイペプチンおよびベスタナ
ン投与の影響．厚生省新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来する稚病治療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢珪），昭和56年度研究ベスタナンの使用経験報告書，1982，p．p．51−56．

するベスタナンの使用経験．厚生省新薬開発研6）福山幸夫，大沢真木子，川井未加子，中田恵久

究費，微生物の二次代謝産物に由来する難病治子，宍倉啓子，鈴木陽子，平山義人，斎藤加代

療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢珪），昭子，岡田典子：進行性筋ジストロフィー症に対

和60年度研究報告書，1986．

するベスタナンの使用経験．厚生省新薬開発研8）福山幸夫，斎藤加代子，大沢真木子，川井未加

究費，微生物の二次代謝産物に由来する難病治子，中田恵久子，宍倉啓子，鈴木場子，平山義療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢珪），昭人，岡田典子：進行性筋ジストロフィー症に対

和59年度研究報告書，1985，

するベスタテンの使用経験．厚生省新薬開発研7）福山幸夫，大沢真木子，川井未加子，中田恵久

究費，微生物の二次代謝産物に由来する稚病治子，宍倉啓子，鈴木陽子，平山義人，斎藤加代

療薬（ロイペプチン）の開発研究（江橋姓），昭子，岡田典子：進行性筋ジストロフィー症に対

和61年度研究報告書，1987．

ー81−

Duchenne型筋ジストロフィー症の血清酵素におよぼす
べスタチン（NK421）の効果
高 橋 桂 一＊研究協力者

目西 尾 英 久＊的表1Effect of Bestatin on serum enZymeSin
Duchenne muscular dystrophy．

Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）の血清酵素におよばすべスタテンの経口投与の効果を

Enzyme Time6：00

時間経過において検討する．

10：00

2

4

法

CK lOO

99．9± 6．6

99．8±12．3

103．6±18．7

n．S．

対象は入院中のDMD患者で，年齢9〜17歳，障害度（8段階分類）3：2名，4：5名，5：7名，6：7名，7：4名，8：4名の計29名．

LDH lOO

hour

102，1± 6．2
n．S．

m．S．

104．2±20．7
n．S．

n．S．

99．6±12．7

110．3士14．4
p＜0．01116．5±25．9
p＜0．01

ALD lOO lO2．5土16．4

116．1±21．3
p＜0．01124．0土36．2
p＜0．01n．S．

前日牛後9時より終了まで安静を保ち，当日午前6時に採血し，直後にベスタテン（NK421）100mg

12：00A．M．
6

94．6±5．2
p＜0．01LAP lOO

方

8：00

0

The number of patients＝29．

n．S．：nOt Significant．

あるいはPlaceboを経口投与し，8時，10時，12時に採血し，leucine aminopeptidase（LAP），

表2

Creatine kinase（CK），1actic dehydrogenase（LDH），aIdolase（ALD）をオートアナライザー
で測定した．結果は前値に対する変動率で表わし
pairedstudentttestで検定した．最初にベスタ
ナンを投与し，2週間以上経過してから同一患者に同条件でPlaceboを投与した．

Serum enZymeS after oral administrationof Placedoin DMD．

EnzymeTime6：（氾

8：00

0

10：00

2

LAP lOO lOl．7±5．O

102．1± 5．6
n．S．

n．S．

CK lOO lOl．2土14．5

102．4士19．5

n．S．

LDH lOO

98．3±9．6

果

ALD lOO

ベスタナン投与の結果を表1に示す．経口投与後2時間でLAPは有意（p＜0．01）に低下し，499．3±11．8

96．4±12．l
94．9±15．2
m．S．

hour

102．5土 4．3
p＜0．01103．3±25．9
n．S．

98．4±12．9

n．S．

m．S．

The number of patients＝29．

6

m．S

m．S

結

12：00A．M．

4

n．S．

91．8±14．5
p＜0．01

n．S．：nOt Signficant．

時間，6時間で元のレベルに戻った．CKは変動しなかった．LDH，ALDは2時間で変動なく4時

ALDは前借に比し低下（p＜0．01）した．

間，6時間で有意（p＜0．01）に上昇した．
Placebo投与の結果を表2に示す．Placebo経考察

口投与ではCK，LDHともに有意の変動はなかっ

ベスタテンはこの条件下で，2時間でLAPをた．6時間後（12時）LAPは上昇し（p＜0．01），

抑制した．血中ベスタチン濃度は60−480mgの経口投与後2時間でピークを示し，4時間後には低＊国立療養所兵庫中央病院

下してくる1）．従ってこのLAPの低下は組織内で−83−

酵素阻害が起きた結果が血中に反映したか，ある

有意な影響を示さなかった．各酵素で時間経過にいは血中に増加したベスタナンが血中でLAP活

おける変動が相違することは興味があり，その機性を抑制したか，もしくは血中に増加したベスタ

構を解明することは，ベスタナンの有用性の検討

テンが酵素活性測定系の中で直接酵素阻害を示しにも重要であると思われる．

たかのいずれかであり，今後確かめる予定である．
結

CKはベスタナン投与により変動しなかった．

論

LDHおよびALDが4時間および6時間後上昇

DMD患者に安静下でベスタテン100mgを経口し，Placebo投与の結果と対比して明らかな差が投与した．投与後2時間でLAPは低下したがCKありベスタテンの影響であると言える．血球成分には影響なく，LDH，ALDが4時間および6時間

を含めいかなる組織や臓器に由来した結果であるで上昇した．
Placeboの投与では4時間まではこれらの酵素

かは今後検討を要する．ベスタナンが細胞表面に結合し，抗腫瘍作用を持つことから考えて，恐らの有意な変動はみられなかった．

く膜透過性の変化による結果と推定され更に検討する予定である．
松下らは筋ジストロフィーハムスターにベスタ

文

献テンを授与し6週間後生理的食塩水投与群と比較

1）木下真男，山田信雄ら：筋疾患に対するベスタ

したが，CKは筋肉内，血中共に有意な低下を示さ

ナンの効果に関する臨床的研究．Ⅰ．神経筋疾なかった．ロイペプナンでは低下を示した2）．祖父

患におけるベスタナン投与後の尿中アミパ蝮の江らはベスタナンがDMDの血清CKのH内変動を抑制する傾向のあることを報告しているが3），
その後の報告ではCKやmuscle−SpeCificenolase（MSE）の遊艶がベスタナンで阻止された

変動．厚生省新薬開発研究費・微生物の二次代謝産物に由来する雉病治療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢班），昭和58年度研究報告書，
1984，p．p．115−118．

2）松下 宏，辻 繁勝：ハムスター筋ジストロとはいいがたいと述べている4）．更にその後，指標フィー症に対するロイペプチンおよびベスタナンにCarbonic anhydraseIII（CA−lII）を加えて，投与の影響．厚生省新薬開発研究費・微生物の歩行可能なDMDlO名でのCrOSS OVer試験（8二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプ週＋8週）ではベスタナン投与で6週後に血清チン）の開発研究（梅沢班），昭和56年度研究報

CKのみが有意に低下し（8週目は有意差なし），
Placeboにしてから4週後にCK，MSE，CA−11Ⅰ
は8週目に比し有意に上昇し，あと低下したと報告している．しかし階段昇降の可能な6例ではベスタナン投与後のこれらの酵素の低下は有意でな
く，Placeboに替えてから4週後の上昇は有意で告書，1982，p．p．51−56．
3）祖父江逸郎，陸 重雄ら：Duchenne型進行性
筋ジストロフィー患者に対するロイペプナン，
ベスタテンの影響．厚生省新薬開発研究費・微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢姓），昭和56年度

あった5）．木下らは運動によるCKの上昇に対し研究報告書，1982，p．p．85−90．
4）祖父江逸郎，陸 重雄ら：筋ジストロフィーにてベスタナンは抑制的に作用すると報告してい対するベスタナンの影響．血清CKとmuscle−

る6）．一方，高木らは玩 誠わの還流実験で，ジspecificenolaseを指標として．厚生省新薬開発

ストロフィーハムスターの長肢伸筋からのCK遊研究費・微生物の二次代謝産物に由来する雉病

艶がベスタナンとロイペプテンの添加で2倍以上治療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢班），に増加することを報告しているが，どちらの薬剤

昭和58年度研究報告書，1984，p．p．123−130．
5）祖父江逸郎，陸 重雄ら：筋ジス卜占7．イ一にの影響かは明らかでない7）．我々のここに示した
短時間の観察ではベスタナンは血清CKに対して−84−

対するベスタナンの影響．新しい筋障害のmar・mchenne型筋ジストロフィー症の血清酵素におよばすべスタナン（NK421）の効果

kerを用いて．厚生省新薬開発研究費・微生物の59年度研究報告書，1985，p．p．121−125．

二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプ7）高木昭夫，荒木 誠ら：ジストロフィー筋よりチン）の開発研究（梅沢班），昭和59年度研究報のcreatine kinase（CK）遊離に対する各種薬告書，1985，p．p．127−134．
6）木下真男，山田信興ら：血清CPKの変動に対剤の影響．厚生省新薬開発研究費・微生物の二するベスタテンの効果．厚生省新薬開発研究

ン）の開発研究（梅沢珪），昭和59年度研究報告

費・微生物の二次代謝産物に由来する難病治療書，1985，p．p．65−69．

薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢姓），昭和−85−

次代謝産物に由来する雉病治療薬（ロイペプチ

Duchenne型筋ジストロフィー症に対するベスタチンの効果−尿中3メチルヒスチジンの測定を中心とした検討−
西

研究協力者

裕＊

谷

板 垣 泰 子＊ 平 野 久美子＝筋ジストロフィー症における薬剤の治療効果のる外因性蛋白の占める割合の指標にならないかと判定をどのようにするかは大きな課題である．

考えた．しかし，図2のごとく3MHとlMHは必

我々は外来採尿にて尿中3メチルヒスチジン

ずしも相関を見なかった．24時間以内に食べた食（3MH）を測定し，その有用性について検討した．外事内容との関係を見てみると，イカ，タコ，エビ

来で3MHの測定を行なう場合の問題点としては，等を食べたときは少量でも3MHの値は高値を示

おおきくは外因性蛋白と部分尿の問題と考えられしたが1MHは低値で，鮭，鶏肉等では逆に1MHるが，これらを考慮しつつベスタテンの二重盲検が高値となることが分かった．牛肉，豚肉等では試験においてその応用を試みたので報告する．

1MHと3MHはほぼ相関していた．従って3MH

1）部分尿に関してにおける外因性蛋白を考慮するには，1MHの測病棟入院中のDuchenne型PMD患者4名にお定は余り役に立たず，食事内容とその摂取量を十いて排尿毎に採尿し，3MHとクレアチニンとの分に聴取し検討を加えたほうがいいと判断された．

関係をみた（図1）．食事制限は特にしなかった．

従って，イカ，タコ，エビ等や多量の魚肉の飲食

4例とも3MHとクレアチニンは良好な正の相関をしたことがわかり，尿中3MHの値がかなり高を示しており，相関係数も0．91〜0．99と高値であ値を示している検体は除外して考えたほうがいいった．適当な食事制限を加えるならば，恐らくクと判断された．本例においては4週（エビの摂レアチニンに対する3MHの値は常に一定である

取），52週（肉の摂取）の検体を除外した．

ことが期待できるものと思われた．ただクレアチ

3）ベスタテン二重盲検試験での試み

ニンが1mg以上の濃縮尿では相関は薄くなる傾1），2）の結果より，クレアチニンが1mg／ml

向が見られ，クレアチニンが1mg／ml以上の検体

以上の検体，軟体類や甲殻類，魚肉類の摂取が明は除外したほうがいいと推測された．

らかな検体は省くことにして，ベスタナンの1年間の二重盲検試験にて応用した．
対象は4歳から6歳までのデュシャンヌ型

2）外因性蛋白に関して外来患者において4週毎に1年間採尿し，3MH

PMD患者10名で，そのうち4名がべスタテン服と1MHとを測定した．また24時間以内の食事内用者で，6名がプラセポ服用者である．4歳以下

容をチェックし，3MHと1MHの値との関連を検は1日150mg，5歳以上は300mgを服用した（表討した．lMHは3MHと同様その殆どが筋肉中に1）．投与期間は1年間であり，4週毎に尿中3MH存在するが，尿中では内因性のものに比し外因性の測定を行ない，同時に血清CK活性を測定した．

の物の占める割合が多いとされている．我々は尿は前日の夕食より魚肉禁止とし，当日の昼食前

lMHを同時に測定することにより，3MHにおけに採尿した．また夕食，朝食の食事内容をチェッ＊国立療養所宇多野病院＊＊大阪市立大学生活科学部

クした．
結果は図3で示したが，服薬前値はベスタテン
−87−

●−

M】：Y＝35．7x十0．39

か…−

MT：y＝41．5x＋0．45

r＝0．98r＝0．91︵一E︑冒︶害萱lS茎宣言≡Iの

0一・一

YM：Y＝47．Ox＋2．O
r＝0．91

×一一

DH：Y＝38．6x−1．4
r＝0．990．5

1．0

Creatinn8（mg／mり

図1

Relation between urinary3−methylhistidine and creatinine
in single untimed urine samples

明両Crn

0
図2

4

8

1216

20

24

28

32

36

40

44

48

52

weeks

Relation between urinary3−methylhistidine andl一methylhistidine

群で56．9mg／gCreatinine，プラセボ群で52．4

測定週毎にかなり動揺が認められるが，投与前mg／gCreatinineであり殆ど差はなかった．現在までの報告からはDuchenne型PMDにおいて24の平均値からの各測定週の平均値の差でみた図4

時間畜尿，3日間魚肉禁止にて測定されている値

投与初期に低下傾向があり，その後10カ月を過ぎ（67．4±10．9熊谷ら，86．7±35．6McKeranら）とたころより再び低下してくる傾向が窺えた．それほぼ同じか，または若干低値であると思われた．

に比し，プラセポ群では投与前値より＋19．1−

同様の条件における正常人のコントロールは−11．1mg／g Creatinineの間での動揺で，ベス27．4±11．4mg／gCreatinineであり，約2倍の高タナン群に比して投与前値との差が少ないように値であった．

思われた．しかしT一検定を試みたが，有為差を得

よりは，大まかな傾向としてベスタテン群では，

−88−

0

4

図3

81216

20

24

28

32

36

40

44

48

52

weeks

Changesin mean excretion rate of3−MeH／Crn

考表1 対象および投与方法
CASE

AGE

STAGE

1．KF
2．MU

4y3m I
4ylOm I

3．SH

5y7m

4．KT

6y2m

察

筋ジストロフィー症のように進行性の経過をたどる疾患において，特に対症的な治療を行う場合，

DOSE

その評価をどのように行なうかは常に問題となるとBestatin

150mg／day
150mg／dayI〜ⅠⅠ300mg／day

O
b
e
C
a

P

1

2
3
4
5

F M S M T O
H S K D T K

1

y5m
4y9m

I

われる．3MHはアクチンやミオシンの分解中に

Ⅰ
1−ⅠI

ylOm

I〜ⅠⅠ

る．ベスタナンの投与においては，現在までの報り，それに変わる客観的な指標が要求されると思I

y3m

困難な場合，確かな指標となるものが不可欠であ
告では血清CKの値は著変ないことが示されてお

Ⅰ〜ⅠⅠ

4yllm
5y2m

300mg／day

ころである．特に評価期間が短く機能的な判定が存在するメチル化したヒスチジン残基であり，蛋6

白合成に再利用されずそのまま尿中に排泄される．
そのため尿中3MHの測定は筋蛋白の崩壊を直接反映するものと考えられている．現在までの報告

ることは出来なかった．検体数が少ない週もあるでは尿中3MHの75−90％は筋肉組織に由来する

ため服薬後3カ月毎の群間比較で再度検討したものと考えられ，3MH量と筋肉蛋白量との相関（図5，図6）．全体としてベスタテン群では服薬が示されている．また尿中クレアチニン量が筋肉

前借より低い値を示しており（−0．5〜一20．1

量を反映するものとして3MHをクレアチニンでmg／gCreatinine），プラセポ群では服薬前値とほ割った値は筋組織の直接の異化率を表わすと考え

ぼ同じか高値を示していた（−7．6〜＋14．5

られるほか，血清CK値のように病勢の進行につmg／gCreatinine）．

れて低下せず，ほぼ一定の値を取ることも報告さ

血清CK値との関係では特に相関は見られなかった（図7）．

れており，薬剤効果の判定の指標としては好まし
いと考えられる点も多い．ただ内因性の3MHの

−89−

4

図4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

52

weeks

Comparison of mean excretion rate of3MeH／Crn bef。re andduring administration of drugS

0

図5

4

8

1216

20

24

28

32

36

40

44

48

52

weeks

Changesin mean excretion rate of3−MeH／Crn（3month mean）

測定のためには，約3日間の魚肉禁止，24時間蓄とし，さらに検体量を増やすことで外来で行なえる尿が必要とされるため外来での検査として行なうに

簡易な検査法として有用ではないかと考えられた．

は無理があった．今回の我々の結果では，クレア

ベスタテン投与における3MHの測定の結果か

チニン1mg／ml以上の濃縮尿は省くこととし，24

らは，有意差は無かったもののプラセポ群に比し時間の食事制限を行ない，もし摂取が明らかで3MHて投与前値より低下する傾向が窺われ，特に10カの値がかなり高値を呈しているときはその値をカ月を過ぎたころより明らかなように思われた．今ットする事で比較的安定した結果が得られたようまでの報告からも，本剤の作用はかなり緩徐なもに思われた．今後食事に関しては軟体類，甲殻類のと思われるが，1年以上の長期的な投与におけは2日間，他の魚肉葉剤ま一日間の禁止とすること

る検索も興味が持たれるものと思われた．

−90−

mchenne型筋ジストロフィー症に対するベスタナンの効果

国Bestatin

A3MeH／Crn（mg／g）

図6⊂コPtaceboComparison of mean excretion rate of3MeH／Crn before and（3month mean）

during administration of drugS

0

図7

文

4

8

1216

20

24

28

32

36

40

44

48

52

weekS

Time course of urinary3MeH／Crn and serum CKlevels

献1）McKeran，R．0．，Halliday，D．etal：Clin．Sci．
Mol．Med．，54：471−475，1978．

4）Mussini，E．，Comelio，F．etal：MuscleNerve，
7：388−391，1984．

2）Tomas，F．M，，Ballard，F．J．et al：Clin．Sci．，
56：341−346，1979．

5）熊谷俊幸，竹内達生ら：脳と発達，16：445−
449，1984．

3）Stewart，P．M．，Walser，M．et al：Muscle
Nerve，5：197−201，1982．

−91−

ベスタテンの使用経験
九州地区5歳以下の対象例について
三吉野 産 治＊研究協力者 ．江田 伊勢松＊は じ めに

表1 九州地区登録症例

我々は進行性筋ジストロフィー症，特にDu・登

Chenne型筋ジストロフィー症（以下DMDと略

録

施

設

名

登

録

症

例

数

〜3才

4 −5才

国立 療 養所 沖 縄 病院

2

1

3

熊 本 大学 医学 部 小 児 発達 科

（
2）

0

（
2）

大 分 医科 大 学 小 児 科

1

0

1

久 留 米大 学 医 学 部 小 児科

0

2

2

福 岡 大学 医 学 部 小 児科

0

1

1

福 岡 市立 子 供病 院感 染 症
セ ンター

0

1

1

5

5

10

す）の治療開発としてNK421（以下ベスタテン）

合計の臨床的研究を担当してきた．過去においては，
ベスタナンを投与するにあたり，血中濃度を測定
し，人では1日3回投与，1日300mgが可能であること，又その効果判定のための10m走行時間，床面よりの立ちあがり時間の必要性などを指摘してきた．62年度よりは5歳以下のDMD児に対して，過去と同様のプロトコールに従った二重盲検比較を実施している．今回はその二重盲検試験の九州地区の実施状況につき，若干の検討を加え報

合

計

告をする．
（）：4月試験開始症例

対象および方法
被験薬として1包中ベスタテン50mg含有の細結果粒剤を1日3回，計150mgを服薬させる．対照薬

表2は発達小児科の2例を除く，8例の試験開としては乳糖細粒剤を用いる．その他も実施要領

始時の背景である．DMDとして診断が確定あるに従った．九州地区の症例は総計10名であり，全いはほぼ確定している症例は8例中7例である．

て男児である（表1）．その内わけは3歳以下が5

年齢構成は先に述べたので省略する．初発症状は例，4歳〜5歳が5例である．本研究参加協力施運動党達遅滞が3例と最も多く，ころぴやすい，

設は国立療養所沖縄病院，熊本大学発達小児科，

歩行異常，仮性肥大，筋萎縮が各1例であった．

大分医科大学小児科，久留米大学小児科，福岡大

既往症では腎孟腎炎，股関節開排制限，けいれん学小児科，福岡子供病院である．登録症例のうち，発作が各1例に認められた．合併症としては自閉

熊本大学発達小児科の症例は63年4月の試験開始

的傾向をもつものが1例存在した．8例中全てはとなっている．

その5歳以下という年齢よりみて外来通院であった．機能障害度は軽く，Stagelが2例，Stage2が6例であった．
次に試験開始時のプロトコールの項目より，い＊国立療養所西別府病院

くつかの項目を抜き出したものが表3である．そー93−

表2 試験開始症例の背景項
診断 確 定度

年齢

目
確定

5

ほぼ 確 定

2

記載無 し

1

2

初 発 症状

例数

歳
歳

2

4

歳

3

5

歳

2

運 動 党 達 遅滞

3

易 転 倒性

1

歩行異常

1

仮性肥大

1

筋萎縮

1

記載無 し

1

無し
有

1

3

目

既 往症

り
合 併症

診 断 区分機 能障 害 度

例数5

腎孟 腎 炎1

股 関節 閲排 制 限

1

強 直性 発作

1

無し

■
J7

有り

表3 試験開始時の値
項

項

自閉 症

1

外来

8

入院

0

Stage

l

2

Stage

2

6

れぞれの値を3歳以下，4−5歳と分けてある．

平 均 値 ± 標 準 偏 差 （症 例 数 ）体重および身長は当然3歳以下が小さいものとな

3 歳以 下4 〜 5 歳っている．以下10m走行，階段昇降，起立時間の3項目には両者間の差はない．さらにGOT，目体重 （k g ）1 2 ．8 土 0 ．5 （3）

15 ．5 ± 1 ．7 （
5）

身

長 （cm ）

9 0 ．0 ±2 ．4 （3）

98 ．7 ± 5 ．
8 （5）

10 m 走 行 時 間 （秒 ）9 ．2 土 1 ．
5 （3）

8 ．1 土 3 ．
3 （5）

階

昇 り時 間 （秒 ）2 6 ．0 ± 1 2 ．
6（
3）

16 ．2 ± 5 ．
8 （
5）

段

降 り時 間 （秒 ）2 3 ．3 ±8 ．7 （3）

13 ．1 土 5 ．
7 （
5）

起

立

間 （秒 ）

8 ．8 土0 ．
9 （2）

6 ．0 土 2 ．
6 （5）

T （U ）

2 7 2 士5 2（3）

284 土97

（
5）

（U ）

1 2 7 土5 5（3）

11 7 土 4 0（
3）

Aldolase，LDH，CPKの各生化学的項目にも両者間の差異はないと思われる．
考案

今回は九州地区におけるNK421投与筋ジスト
ロフィー症児の登録状況および投与開始時のその背景を報告した．投与開始より期間がまだ浅く，

G

時

O

その後のデータは現在加算中である．又今回の結果は全国集計されるべきものであり，その結果がまたれる．ただ九州地区の登録背景をみると，やA ld o la se

L

D

H

（U ）

2 ，0 17 土 1 ，33 5 （3）

2 ．6 9 5 土 9 5 2 （
5）

C

P

K

（U ） 1 1 ．4 3 2 土1 3 ，6 9 9 （3 ） 10 ，5 5 5 ＋ 9 ，16 0 （5）

はり外来通院が全てであり，療養所は沖縄病院を除くと認められず，DMD児低年齢層の診療区分を明確に示しているものと推測される．

−94−

7オルフェンシノールの筋ジストロフィー症に対する効果（第2報）
村 上 塵 郎＊
研究協力者

崎

隆書

林

斎 藤

有＊

馬 場 繁 二＊

岡

英 人＊

結

は じめに

果（表1）

私どもは昭和62年度に引き続き，フオルフェン

9例中5例が歩行不能となった．残りの3例はシノールをDuchenne型筋ジストロフィー症に使歩行可能であったが，一例を除いては立ち上がり用して，長期間投与の効果を検討した．

時間は増加していた．体重は，症例1，4，9は歩行不能になった後急速に増加してきたが，歩行可能である症例2，5，6，8は余り増加しなかった対象および方法
年齢は5〜9歳でフオルフェンシノールの投与
量は50−150mg／dayで，使用期間は46週から112（図1）．
CKは前回述べたように投与後，一時減少する
ものが多かったが，その後は薬物の影響としての週であった．
検査は，一般血液検査，CK等の血清酵素を含む

一定の傾向は見られなかった．歩行不能時には低血清生化学的検査，尿検査を行い，更に握力，立下していた．立ち上がり時間については，歩行不ち上がり時間等の運動機能を含む臨床症状をチェ能になる前に，急速に悪化するものが多かった．
症例1は，使用前3．92秒から69週後には16．6秒

ックした．

表l Duchenne型筋ジストロフィー症に対するBF−121の効果
Nn 症例 年齢（開始時）体重（開始時）（現在）投与量
投与期間
CKの動き
歳
kg kg ng／day
退unit／16
2

8

1．N．T．

69

10840→2095

3．92→不能 進行−

27

50−→150

88

8962

→6918

2．28→4．06 進行−

33

50−→150

104

3898

→2774

16．15→不能 進行−

26

50一→1009214630→6821

5．92→不能 進行

−

17

50

72

7314

→4332

4．84→5．32 進行−

25

50→1509614750→6297

3．56一→10．58進行−

2250−→150112

8660

4．41→不能 進行−

17

50→15046

11466→8217

3．42→3．32

2250→15048

6909→4104

7．62→不能0
2

5．S．0，

58
1

6．H．K．

7

4
2

7．A．S．

7

9
1

8．T．S．

5

6
1

9．S．0．

7

02＊国立療養所箱根病院

50→100

2
3

6

4．K．M．

9

3．K．K．

36
52

8

2．D．Ⅰ．

起立時間の動き 効果 副作用
秒

→4974

進行

−

CaSel case2

case3

case4

case5

case6

case7

case8

case9

回1 体重の推移

図2 立上がり時間（症例1）

図3 立上がり時間（症例6）で，4週後に来院した時は起立不能になっていた

次に右手の握力の変化は図4に示すごとくであ（図2）．

る．症例1と6に増加が見られたが，残りは減少

症例6は，使用前3．56秒から96週後10．6秒とな か使用前値にとどまっていた・っていたが現在なお歩行可能である（図3）．
図5はフオルフェンシノール使用前の一年間お−96−フォル7ェンシノールの筋ジストロフィー症に対する効果（第2報）
■拉：kg

症例 1
［
コ 使用 前

口

使用後

症例 2
＄

l

り

症例3
＄

l

症例 4

症例 5

加

症例6

6

6

3

5

61

5l

21

6

7

症例 8
3

6

図4 BF−121使用に因る握力の変化（右手）よび使用開始後一年間の感冒の罷患回数である．
症例10，および11は歩行不能の串椅子患者で14歳

臨床検査成績では，血清酵素以外は特別な異常値を認めず，副作用も特に認められなかった．

と16歳でかなり重度であり，使用量は50mg／day
考であった．
症例1は使用前は年間3回の感冒罷息から使用

案

Duchenne型筋ジストロフィー症に対して，
種々のプロテアーゼ阻害剤の使用が試みられていにより年間2回となり，しかも軽症であった．
症例2は年間5回の感冒羅息から使用により年間3回と減少し，しかも軽症であった．

るが，7オルフェンシノールもプロテアーゼ阻害作用を有するものの一つである．

症例10はフオルフェンシノール50mg／dayの使

今回私どもは前年度に続いて，フオルフェンシ用であったが年間2回の感冒羅息から，使用によ

ノールをDuchenne型筋ジストロフィー症に長期り全く罷らなくなった．

間使用して効果を検討したが，臨床面を主とした11例中，9例に感冒の罷息回数の減少を見た．

この様な方法では，効果をはっきりと示すことはまた罷っても軽度であることが多かったと，フオ

出来なかった．しかし，感冒羅患回数は著明に減ルフェンシノールを使用した患者全てが述べてい少し，かつ羅息しても軽症で終わる例が多く見ら

た．

れた．
ー97−

10

庄鋼 1 1

［
］ 使用前

3

5

ユ

3

1

1

3

2

1

2

l

【
コ

2

1

3

1

2

2

1

l

l

l

○

症例 1
使用中

症例3

症例 2

図5

症例 4

棚

5

症例6

細

7

症例9

症例8

甜

BF−121使用後の感冒罷恩回数

進行性筋ジストロフィー症，特にDuchenne型
筋ジストロフィー症は，死因として呼吸不全によ

強作用によるものと思われるが，更に検討が必要である．

るものが多く，呼吸不全の原因としての呼吸器感
結染症の予防・治療は非常に重要な問題である．

語

またDuchenne型筋ジストロフィー症の歩行不1．9例の歩行可能なDuchenne型筋ジストロ

能になる要因として，感冒等の呼吸器感染症によフィー症に対してフオルフェンシノールを長る臥床の後，歩行不能に陥る事が多く，臥床期間期間授与して，その効果を検討した．

を出来るだけ短期間にすることが望ましい．

2．臨床的には，Duchenne型筋ジストロフィ

7オルフェンシノールは，免疫抵抗を増強することが動物実験で証明されており，ヒトに対してー症の運動機能には特別の効果は見られなかった．

も免疫性疾患に効果を示す可能性があり，今後の3．認むべき副作用は見られなかった．

検討が必要である．このフオルフェンシノールの4．Duchenne型筋ジストロフィー症の感冒のDuchenne型筋ジストロフィー症に対する感冒の罷息回数の減少，症状の軽症化は，免疫抵抗の増−98−程忠に対して予防効果が認められた．

ベスタチンの筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究
木 下 真 男＊研究協力者

里 吉 栄二郎＝ 福 山 幸 夫＊＊＊
三吉野 産 治日日■＊ 村 上 慶 郎＊HH

ベスタナンが筋ジストロフィーの治療薬剤たり

表1 群間比較試験参加施設

得るか否かについては，既に昭和56年以来研究が続けられているl卜3）．動物モテリレに対してはかな
りはっきりした効果が報告されている4）にもかかわらず，臨床例についてはそれほど明確な成績は得られていないのが現状である．これはもちろん
筋ジストロフィーが長期経過を有する疾患であり，
本来短時日での治療効果を示し得る性質のものではないためにもよるが，またひとつには投与対象としている疾患が多岐にわたるためと，投与方法，
期間，効果判定法などが研究者毎に不定であるためなどもある．そうした意味から，対象を筋ジス
トロフィーのうちDuchenne型にしぼり，また投与方法，評価方法を一定にした全国規模での研究が要求され，昭和60年5）以来多施設協同の研究が行われた．その結果，幼児Duchenne型について若干の有効性が示唆されたので，61年度から本年度にかけて，表1に示すような施設の症例について

国立療養所八雲病院

南良二

国立療養所西多賀病院

佐

藤

元

国立精神・神経センター

里

菅

栄二郎

東京女子医科大学

福

山

幸

夫

東邦大学医学部大橋病院

木

下

真

男

国立療養所箱根病院

村

上

慶

郎

国立療養所中部病院

祖父江

逸

郎

国立療養所鈴鹿病院

飯

田

光

男

国立標養所宇多野病院

西谷

国立療養所刀根山病院

姜

国立療養所徳島病院

松家

愛媛大学医学部

小川

国立療養所」京病院

亀尾

国立療養所西別府病院

三吉野

産

治

熊本大学医学部

三

池

輝

久

鹿児島大学医学部

井

形

昭

弘

裕
進
豊
暢

也
等

対照群を設定しての群間比較試験を行った．昨年
度研究報告書には9ヶ月終了までの集計を記載しを対象とし，A群に対しては150mg／日，B群に対たが，今回1ヶ年間治療継続後の成績が集計されしては300mg／日のベスタナンを投与，各群の対照たので以下に報告し，且つそれ以後の研究方針に

群には外観からは識別不能な剤型とした乳糖を投ついて簡単にまとめた．

与した．52週連続投薬後，前回通りの方法で両群の比較を試みた．

1．1年間投薬による群間比較試験

また，前回若年児ほど効果があらわれやすい傾症例と方法向が散見されたので，今回は上記A，B群の分け

前回の報告書に記した通り，表2に示した症例方とは別に，3歳以下，4〜6歳，7歳以上の3群に年令屑を分け，それぞれ対照群との比較も行＊東邦大学医学部第日内科＊＊国立精神・神経センター＊＊＊東京女子医科大学＊＊＊＊国立療養所西別府病院＊＊＊＊＊国立療養所箱根病院ったのであわせて報告する．
A，B2群の分け方においては，A群において階段昇り姿勢，階段降り時間，20m走行時間などー99−

二，三の検査項目で薬剤群と対照群の間に有意差

ものの影響はあまり明らかではなかった．これにが見られ，総合改善率でもA群で有意な成績が得

対して3歳以下，4−6歳，7歳以上の3群に分られた（表3）．また血清CPKはB群において有けての検討では．階段降り姿勢，同昇り姿勢，上意な低下を示した．しかしその他の値はあまり大肢挙上運動（図1），上腕三頸筋腱反射，榛骨反

きな変動はなく，僅かに薬剤の効果はうかがえる射，膝蓋随反射（図2）の各項目で3歳以下は有表2 対 象 症・例

A

B

群：4才以下群：5−7才除外理由①

Duchenne型でない症例② 試験開始時に独歩不可能な症例

表3

A・B両群の1年服薬後の総合判定

A群12ケ月
薬

剤

改 善

不 変

N K 421

10

10

7Pラセポ

5

18

軽

悪

中 悪

著 悪

計

改善率

1

2

0

23

43％

1

1

0

25

20％

中 悪

著 悪

計

改善率

7

4

33

9％

ズ2

P＜
0．
1

悪化率

ズ2

13％
N S
8％

B群12ケ月薬剤

N K 4 21

改

善 不 変
3

8

軽

悪

11

ズ
2

悪化率
67％

N S
プラセポ

5

7

12

11

−100−

1

36

14％

ズ2

N S
67％

ベスタナンの筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究…Miプラセ珊−；ベス，ナン＃
分類値の変動」二枚挙」二i封カ

二三二≒三
改

●
5

ヰ

● ● −− ● −
●
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才
−

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●

l

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1

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1

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2

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鼓暮7㌔以■㌔事

図1 年齢別臨床所見の変化（1）

機雷対す
Tl

01

51

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11

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ll

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l

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完3
暮事才㌔下覇事

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・●●

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2

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一

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義
6

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事

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l

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1

1

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●l●〃u二W

W

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u●川

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川山∵別山二川川l●●1●2●朔日旬H

小Ⅶ一卸

河山∴︻川畑仙●l●●川川加二γ

竹山二

大義7′以義㌔●

図2 年齢別臨床所見の変化（2）

−101−

薬剤

意に対照に優り，また腱反射の保持は4〜6歳で試験薬剤：NK421ドライシロップも見られた．また階段降り時間でも3歳以下で有意（図3），肺活量は4−6歳で有意差が見られた（1包中ベスタテン50mg含有）（図4）．検査値では血清CK値が3歳以下，4対照薬：プラセボドライシロップ−6歳で投与開始3ヶ月で有意の低下を示してい（マンニトールを調整）る（図5）．

但し，味・におい・色・剤型などにより両剤を識別することは困難であることはコントローラ

2．ベスタテン二重盲検試験

ーにより確認されている．

以上の群間比較試験の結果，幼君例において効

薬剤割付

果があらわれ易いとの印象が得られたので，更に薬剤はコントローラーが無作為に薬剤番号1

年令を下げた症例群において以下の要領でベスタ〜60番，61−120番でそれぞれNK421群，プラナンの二重盲検試験を行うこととした．

セポ群が同数になるように割り付けた．

対象疾患

キーコードは密封され，試験終了までコントロ

進行性筋ジストロフィー症のDuchenne型と診ーラーが保管する．

断された5歳以下の独歩可能な患者を対象とし登録た．

試験担当医師は，患者が対象として適格である
皆皆段昇り打者陀打
●
l
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1
．

︻一

．
．
．

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1

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闘葺き 受I壬牢り時間

一

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l
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l
才

l

上

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l

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l
l
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以

化

l
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l
l
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l

変

l
l
●
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l︐▲2
︳■

図3 年齢別臨床所見の変化（3）
−102−

￣卜▼
−1】＿

￣−う￣￣
＿＿

＿■

ベスタナンの筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究

ことを確認し，保護者に試験参加の承諾を得た

刀巾活螢

後，登録センターに登録する．登録センターは4〜5歳は薬剤番号1番より60番まで，3歳以下は薬剤番号61番より120番まで登録順に割り付け，該当する番号の薬剤を発送する（登録期
間 昭和62年9月〜昭和64年8月）．
投与方法
用法・用量：1回1包，1日3回食後投与する
投与期間：52週間（364日）
全国に表4の世話人を置き，現在までに表5の登録症例を得て，試験を開始している現状である．
おわ り にべスタテンは現在までの多数の使用例において■一t一重篤な副作用は全く見られず，安全性では問題の■ない薬剤と考えられる．今回の二重盲検試験で投09■▼

薬による直接の影響を検討すると共に，幼時に本l▲剤を服用した息児の病情がその後どのような推移

t一llを示すか，長期の追跡調査も極めて重要と考えている．

図4 年齢別臨床所見の変化（4）
L D H

∴一一一」

化

l一一一七一

l

変

・」−＿榊

に二「」二弓一▼−l一卜▲一一一一l
十一▼【・＿1

串L一一一一一→一一一
t一一一

仁二コ

7
変
才
化
以
率
上

図5 年齢別臨床所見の変化（5）
−103−

表4

二重盲検試験全国世話人

治験代表者

里

書

コントローラー

′ト

事

局

務

栄二郎

国立精神・神経センター

川

暢

也

愛媛大学医学部薬理学教室

木

下

真

男

東邦大学医学部大橋病院

幸夫

東京女子医科大学小児科

裕

国立療養所宇多野病院

二国立頼義所八雲病院

元

国立療養所西多賀病院

評

価

委

員

福

山

評

価

委

員

西

谷

北海道地区

南

良

束

北

地

区

佐一藤

関

東

地

区

村

上

慶

郎

国立療養所箱根病院

中

部

地

区

飯

田

光

男

国立療養所鈴鹿嫡院

関

西

地

区

高

橋

桂

一

国立療養所兵庫中央病院

山

陽

地

区

亀

尾

等

国立蝶養所瞭病院

山

陰

地

区

竹

下

三

鳥取大学医学部脳研

四

回

地

区

松

家

豊

国立瞭養所徳島病院

九

州

地

区

三吉野

治

田立療養所西別府病院

研

産

表5 二重盲検試験参加施設と対象症例
昭和63年3月10日現在
登
施

設

録

症

例

数

登

名

施
〜3 才

4 −5 才

計
18

設

録

症

例

数

名

H 立療 養 所 原 病 院

〜3才

4−5才

計

6

2

8

5

3

8

1

国 立 療 養 所 八雲 病 院

1

5

6

2

国 立 療 養 所 西 多賀 病 院

5

5

10

3

国 立 療 養 所 岩 木病 院

1

2

3

4

東京女 子医科大学′
ト児 科

8

2

10

20

愛媛大学医学部小児科

2

3

5

5

国 立 精 神 ・神 経 セ ン ター

0

7

7

21

高知医科大学′
ト児 科

1

0

1

鳥取大学医学部付属脳幹
19
性疾患研

6

都立神経病 院

2

4

6

22

国立療養所徳島病院

0

1

1

7

国立探 査所箱根病院

3

2

5

23

高知県立′
ト鹿 園

1

0

1

8

国立療 養所鈴鹿病院

1

3

4

24

国 立 療 養 所 沖 縄病 院

2

1

3

9

名古屋 市立東市民病院

0

2

2

25

久留 米 大 学 医 学 部 小 児科

0

2

2

10

福井医 科大学第 2 内科

0

1

1

26

大分医科大学小児科

1

0

1

11

浜松医 手
斗大 学 第 1 内科

0

1

1

27

熊本大 学医学 部小 児発達 科

2

0

2

12

市立 岡崎病院

1

0

1

28

福 岡 大 学 医 学 部 小 児科

0

1

1

13

国 立 療 養 所 刀 根 山病 院

3

4

7

29

0

1

1

14

国 立 療 養 所 兵 庫 中央 病 院

1

4

5

15

国 立 探 査 所 字 多野 病 院

4

1

5

51

60

1 11

16

神戸市 立中央市民病院

1

2

3

17

国 立 療 養所 西 奈 良 病 院

0

1

1

福岡市立子供病院感染症

−104−

センター
・
計

ベスタナンの筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究

文

献

影響．厚生省新薬開発研究費・微生物の二次代

1）木下真男：筋障害に対するベスタテン，ロイペ

謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）

プテンの影響．−実験的および臨味的検討．厚の開発研究，梅沢珪昭和56年度研究報告書，

生省新薬開発研究費・微生物の二次代謝産物に1982．p．85．

由来する雉病治療薬（ロイペプチン）の開発研

4）Tsuji，S．andMatsushima，H．：Successful

究，梅沢班昭和56年度研究報告書，1982，p．

treatmentofmurinemusculardystrophywith

77．

theproteaseinhibitorbestatin．J．Neurol．Sci．，

2）村上慶郎：種々の筋萎縮症患者に対するロイペ

72：183，1986．

プナン，ベスタテンの効果．厚生省新薬開発研5）木下真男他：Duchenne型進行性ジストロフィ

究費・微生物の二次代謝産物に由来する難病治ーに対するベスタナンの効果．厚生省新薬開発

療薬（ロイペプチン）の開発研究，梅沢姓昭和

研究費・微生物の二次代謝産物に由来する稚病

56年度研究報告書，1982，p．73．

治療薬（ロイペプチン）の開発研究，梅沢姓昭3）祖父江逸郎：Duchenne型進行性筋ジストロ
フィー患者に対するロイペプナン，ベスタテンの−105−

和61年度研究報告書，1987，p．127．

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過：
EST投与群での検討
宮

研究協力者

武

正＊

桑 原 武 夫＊揚
石 原 博 幸＊川中
杉 田 秀 夫HHH

浅 龍 彦＊

山 崎 元 義日野本は じ め に週間投与し，副作用が無いことを確認した後に8

近年わが国において厚生省新薬開発事業研究班

今

治■1日川

家

一

也HH■

が組織され，べスタナンやE−64による治療が開始

mgに増量した．
観察期間は8カ月から3年3カ月（平均1年11された．E−64研究班では昭和59年度より第二相臨カ月±11．4カ月）である．

床試験が開始された．我々も第二相臨床試験の開対照群（以下非投与群と略す）はDMD172例の始時よりE−64（以下EST）治験に関与し，日常生

historiCaldataを用いた．ADLの観察開始時年齢

活動作能力（以下ADL），徒手筋力検査（以下6歳2カ月〜28歳2カ月で各症例の観察期間は1

MMT），Creatine kinase（以下CK）値，3−メ

カ月〜11年5カ月（平均5年8カ月）でこの間のチルヒスチジン／クレアチニン（3−MeH／Cre）

samplingpointは1−60（平均33points）である．
方法としては（D非投与群のADLの経過と比などの指標を用いて検討してきたl）．
今回はESTがDMDのADLの推移に及ぼす

EST投与全症例の経過の対比，（∋観察開始時の影響についてこれまでの治療経過について報告す

ADLが50点以上であった非投与群（n＝40）とる．

EST群（n＝40）の経過の比較を行なった．
ADLは厚生省研究班制定のものを用いた．
対象と方法

対象は国立療養所新潟病院・東埼玉病院・下志結

果津病院・医王病院の4施設に入院（一部外来通院）

非投与群のADLの経年変化を図1−Aに，そし中のDMD児（全例男子）73例で，詳細は以下にてその平均±標準偏差値（M±SD）を図2−Bに示示す如くである．すなわち，年齢は3歳6カ月〜18

す．昨年度の本姓会議にて示した如くADLの推

歳10カ月（平均10歳6カ月±3歳1カ月），ステー

移は症例によって異なるがほぼ10歳前後で50点をジⅠ7例，ⅠⅠ23例，ⅠⅠⅠ3例，ⅠV14例，V18例，ⅤⅠ割った（歩行不能となった）2）．

9例である．

EST群のADLの推移を図2−Aに，そしてそ投与開始時体重は11．9−55．0kg（平均26．2±のM±SDを図2−Bに示す．推移の傾向は非投与

8．72kg）で，ESTの投与量は体重あたり4mgを4群と同様で暫時減少するが50点を割る時期は11歳＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立療養所新潟病院＊＊＊国立療養所東埼玉病院
日日国立療養所下志津病院＊＊＊＊＊国立療養所医王病院＊＊＊＊＊＊国立精神・神経センター

前後であった．
EST群と非投与群のADLを比較したものを図3に示す．ADL値は観察開始時期は両群の間に差異を認めなかったが，加齢により指数関数的に−107−

00 90 80 70 60 朗 40 30 罰 10

00 90 80 乃 60 渕 40 30 20 10D8n︵己○リーて︼〇〇J白く

Q
nU

8

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︵巴〇〇一一三〇−︶Jn﹁ず

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0

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6

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15

28

25

38
A■●

2

18

O

∴二二

月

d ﹁

5

35
日日

5

18

28

25

38

35

At●（▼）

（B）

囲
図1

15

EST非投与群のADLの経年推移．
（A）個々の推移と（B）そのMean±SD

図2

EST群のADLの経年推移．
（A）個々の推移と（B）そのMean±SD︵巴3功一付言こJロイ

Ⅰ8日
98
80
76
68
58
18
38
28
18

￣8

8

図3

5

18

15

28

25

38
35
Ag e（Y）

図4

EST非投与群（……）とEST群（−）のADLの経年推移（Mean±SD）．
−108−

5

10

15

28

25

38

35（才）

観察開始時に歩行可能であった症例のADLの推移．［……：EST非投与群，一一EST群（Mean±SE）］Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過低下した．歩行不能に陥る時期は，非投与群では与を開始した症例ではADLが良好な時期から観ほぼ10歳前後であったが，EST群ではほぼ11歳前察を行ない得た非投与群に比べてADLの低下が後であった．また全ての観察点でEST群は非投緩徐であり，しかも歩行不能となる時期が11歳前与群に比し高値を示したが両者間には有意の差は後と遅くなる傾向を認めた．

認められなかった．

しかしながら，今回の検討では両者の観察開始

観察開始時に歩行可能であった症例（すなわち時年齢が一定でなく，しかも単一症例で仝経過のADL50点以上）のADLの推移を図4に示す．

ADLを検討していない．さらにEST投与群と非EST群と非投与群ともにADL50−60点までは指投与群のmassとしての平均値を比較しているた

数関数的に低下するが，その後も非投与群ではめ統計学的検討を行ない得ず，今回，両群問で認ADLの低下がさらに続き10点まで低下した．いっ

められた経過の違いを単純に有意の差として評価

ぼう，EST群では減少が緩やかな傾向があり，さすることが出来なかった．

らに60−50点以降低下が停滞する傾向が見られた．

したがって，今後はこのような治療的検討は観察期間を一定化し，比較的ADLの良好な症例にまとめと考察対して施行されるべきであると考えられた．

今臥約2年間のESTのOpenStudyの結果をADLの推移について示した．

文

EST非投与群のADLの経年推移は昨年度の本姓会議で報告したごとく症例によって異なり，

献1）宮武正ほか：EST臨床試験．厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病

歩行不能となる年齢は8歳前後から15歳頃までと治療薬（E−64）の開発研究」班会議（今掘

広がっており，平均は10歳前後であった．

班），昭和60年度研究報告書，1986，109−121．

EST投与群のADLの経年推移も対照群と同様な経過を取り，歩行不能となる年齢も8歳前後
から15歳と症例によって異なっており，非投与群との間に差を認めなかった．

2）吉武正ほか：Duchenne型進行性筋ジストロ
フィー症の臨床経過：日常生活動作能力（ADL）の経年推移．厚生省新薬開発研究費「低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究」：旺会
議（江橋］旺），昭和61年度研究報告書，1987，93

いっばう，比較的ADLが良好な時期にEST投

−109−

−97．

ADLscoreの検討による筋ジストロフィー障害度の再評価
石 原 博 幸＊
研究協力者

佐久間

昭＝ 五 味 慎太郎＊ 宮 川 雅 仁＊

儀 式 三 郎＊目

青 柳 昭 雄■Guttmanの尺度分析法は，すでに1976年研究協

的昨年度はDuchenne型筋ジストロフィー

力者の佐久間らにより片麻痔機能テストの標準化（DMD）の薬剤治療における薬効判定上の問題点に応用された方法である．表3に示すようなSlを，西欧における事情を紹介しながら発表し，さ〜S4のアイテムがあり，そのアイテムが可能な場

らに国立療養所東埼玉病院における過去十数年の合を1点，不可能な場合を0点と評価する．表3

各種パラメーター値をDMDの自然歴と考えの中段のように0−4の5人がいて重症者より順に

EST投与を行ったDMD児における各値と比較並べ積算すれば下段のように可能率Pjが計算でしたところ，EST投与群において機能障害度（8きる．表3のように順序よく並べば，どのアイテム

度分類）4度通過期間が平均6ケ月程度自然経過まで可能でどこで不能になるかを知ることによりより延長していたことを発表した1）．

重症度が決定できる．理想的にアイテムが並んでしかし，本院でのデータは客観性および普偏性

いれば，重症度，合計点は同義語となる．理想的につき疑問がなげかけられ，何らかの客観的基準な場合は，図1の左側のグラフのように，反応型の設定が求められた．これに答えるため，本年は0では全てSjに対し可能率0％，反応型1では種々のパラメーターの中から特にADLスコアを

Slで100％，しかしS2では0％となりすっきりしとりあげ，Guttman scalographic analysis（尺た右上がりの特性曲線が出来上がる．一方，理想度分析）を行った結果，薬効判定にも有用と思わ的でなかった場合は，右端のグラフのようにSl

れる新しいDMDの障害度分類を作成し得たのでについてみると重症度が高い人で可能率が高く，報告する．

軽症の人で低くなるという結果となり，このSlというアイテムは不適当と測定できる2）・3）．

対象と方法

今回，100アイテム別に可能率を算出し，可能率

対象は，昭和50年より昭和61年までに当院に入の高い方から順に並べ，全く同じものがあれば1院したDMD患者159例（7歳から24歳まで），25

つとし，1の領域への0の混入数，又その逆を誤

歳以上の患者および入院6ケ月以内の症例は除き，反応とし誤反応が最小となりまたその間隔が等し各症例で2回のADL検査（厚生省研究班の作成

くなるように11のアイテムをピックアップし，アによるもので，25項目100点満点）の各100項目をイテム行例を固定した．

独立の変数と考え尺度分析法を施行した表1，2に示す通りの25項目であるが，この各項目のサブ

結国立療養所東埼玉病院入院DMD患者のADL

テストを全て独立変数と考え，各サブテストをす
べて表1，2の通り番号をつけ分析した．
＊ 国立療養所束埼玉病院内科＊＊ 東京医科歯科大学難治疾患研究所

果

スコアを縦軸に，年齢を横軸にとり図示すると図2のようになる．年齢が進行するに従いADLス
コアは低下して行くことが明らかであった．
−111−

表1厚生省研究粧作成のADL（丁）両脚でよりかかり立ち（目立っていも11は暮つけ気■つけの姿勢で楽に立っておれも3 3 スタンス暮広げれば楽に立ってわれも2 2 スタンス暮広げても的胡抄位しか立っておれない
11大鏡鬱tおさえれば辛うじて立っておれi
O・介助なしでは立っておれない

281 介助t雷しないで立っておれも
27 3 片手で支持すれば立っておれも
26 2 1一手で支持すれば立っておれも
25 1 鋤によりかかれば立っておれも0 よりかかつても立っておれない（2）片足で立？（便利な足を使って）
8 1 片鱒で峯に立っておれも
7 コl 月欄でしばらく（ほ抄−1分）しか立っておれない
6 2 物につかまれば片脚でしばらく 日分以上）立っておれも51軸につかよれば辛うじて片川立ちができも0 他人の介助があっても．片川立ちができない

12 1 讐通に昇れも313 年で慮tおさえて井も
30 2 片手t手摺りにかければ鼻九も291横向きになって丙手で手摺りにすがって昇も○ 介助なしには昇れない（3）捕手に生も（膝の高さの絹子で）12 1手魯使わずにゆっくりと生れi（尻書浮かしてイス暮はずしてもモの姿勢が保て■）
113 手t便わ丁にゆっくりと．生れも（尻も浮かしてイスtはTTと半の姿勢が保てない）
10 2 手を膝についてゆっくりと生れも91支えきれすにrスンと崩れもように生も0 介助なしでは生れない（4）杓子から立ち上も
16 1 讐通じでさも
15 3 農に手tついて立ち上古
川 2 物につかよって立ち上も門111立ち上ろうとよt浮かせもが立ち上れない
0 立ち上も動作もできない（0）搾段を昇も（9）は段を降も
36 1 讐通に降れも35 3 手で隷書支えて降も34 2 片手書手磁りにかけねば降れない
331 憤向きになって丙手で手探りにすがって降も○ 介助なしには降れない（10）抜道を量も401鼻な城でも曽通に量れi（博引角度15度）
39 3 ゆIやかな堰なら普通に曇れ古く 〝 5鷹）
38 2 ゆもやかな偵t．ゆっくりと丑も311t轟装していない鈷i歩けi（lOm）
0（‖）走も・駆けろ（5）しゃがむ
20 1 ゆっくりとしやがめも
19 3 事で隷書支えて．ゆっくりとしゃがむ
10 2 くずれもように床に手書ついてしやがむが．号の姿勢が保てi
171 くずれもように床に手書ついてしゃがCが．そのまま倒れてLよう
0 介助なしには全くできない（6）床から立ち上も
24 1膝に手1つかないで．讐通の速さで立ち上れも
23 3 手書使わ丁に，往く前かがみになって立ち上i
22 2 手で拝tおして立ち上もが．15秒禾糞でできi
211手で隷tおして．又は鴎つ遭い位から立ち上れもが15秒以上貫丁
鶴につかiれば立ち上れもが．非鷺に疇間（苅抄以上）賽T
O 全くできない

14 4 18mt全力で重も5秒以内で
13 3〟
6■−川砂葺丁
12 2〝
11■−15秒零す＝ 1〝
18−20秒葦↑
0〟
21秒以上賽すく○印）．駈けられちれない（×印）（12）歩く㈹ 1 讐通に歩けも軽度の鮎推性歩行を丁も17 3 著明な〝
16 2 物につかまれば独りで歩けも451介助著なしでは歩けない
0 全く歩けない（13）沫迄も52 1 ぐちぐち迫れも51 3 讐通の速さで寝返れ古手と足暮償って寝返もが，やや国数t感丁も50 2 疇同書かければ（15一刀抄），やつと寝返りができも191寝返りはできないが桃内さまではなれi
O 横向きにもなれない

このADLスコアの100サブテストをscal0−んだ．この100項目のうち11項目を選んで作成したgramに図示すると図3のようになる．縦軸が可のが，図4のグララである．大体右上がりの特性

能率で横軸はADL総点である．最下段は症例数曲線が作られた．この11のアイテムは後で表5にを示す．右下がりに図示されるアイテムがいくつ

示すⅠ〜Ⅹ1の項目である．従来行われてきた8度か存在することがわかった．これらは不適当なア

分類での結果を図5に示す．

イテムとし削除された．
表4は前述の各アイテムの可能率を高い方から

考察

低い方に順に並びかえた表である．各アイテム番

尺度解析の検定法としては，表5に示すRep号は表1，2に示す通りである．ERは反応数，ER（Guttmanの再現性指数）とPPR■が使われる．

％は反応率である．誤反応率10％以上を四角で囲

Repは0．9以上となれば，1次元的尺度を張ると−112−

ADLscoreの検討による筋ジストロフィー障害度の再評価
表2

厚生省研究姓作成のADL（2）（14）遭う56 1 四つ遭いで曽通の速さ以上で遭えも55 3 筆書ついて．稚先1外方以上に量わして．讐通の速さで彊えも54 2 肘tついて遭う
四つ遭いせtとiのに時間t賽し．遭うのも遭い
531四つ遭い拉（肘暮ついての葵勢も）暮保持できちが遭えない
0 四つ遭い位t保持丁もことも遭うことも．いざi
こともできない（15）上肢寧上
68
59
58
57

1
3
2
1
O

生血でバンザイができも生色で上親書雷の嘉さまで攣上可杜
皇位で上鼠を4rよで讐上可蛇
臥位で上反書めかせi
上虻遍動不糀

（20）寝転ぶ（坐位◆仰臥位）
801 手書償わずにゆっくりと仰向けに寝l王ペも79 】 けtついて〝・一旦娩向きになってから寝I王ぷ
78 2 一旦Ⅱばいじなってから寝I王ぷ
771 手で支えきれ丁に．そのエま崩れもよ，に寝l王ぷ
0 介助なしには寝I王ペない（2り起き上も（臥位◆坐位）
811 手書償わずに起き上も83 3 手書償って起き上i
ロ 2 まず．正臥也となリセき上も
引11l まず．正臥也となり時間（20秒−1分）t賽T
O 付与ついて■幹キわずかでも起こすことはできもが生せまでにはなれない
義幹書紀こすこともできない（2）坐位姿勢を保つ（16）甘のすわり
64 1 仰向けで曽通にできも
63 3 Ⅱばいては印書もたけられもが．仰向けではできない
62 2 丑ばいでも鵠tもたげられない
611生位では曾が丁わっていちが．少しでも礫に輝け
もとはが倒れる
0 曾のすわり不批

均1′くランスが崩れても立ち止れも（灯以上上梓書付
けても）87 3 事少の′くランスがとれも（10●〜35●虹幹を傾けても）拓 2 少しのバランスを崩すとすぐ倒れも（10●未濃の傾きで）
85 1 少しの支えがあれば坐っておれもO よりかからなければ生っておれない（17）政を洗う（23）手杖を枚も681立位で．両手でFt洗う
61】立位では．片手で身体暮支え．他方の手で講書洗う

66 2 生色で両手で∬t洗う
651手はHまで届くが，洗うことができない
O dt洗えない

92 4 充分に絞り切れも91 3 位れもが充分でない
90 2 絞った手杖から水分が濡ちも891 タオル奮持てもが．絞れない○ タオルも持てない（24）字を雷く（18）ズボンをはく
72 1 立ってズボンがはけも711 坐って大且覇王ではさ．立って又は臥位で度量ではく70 2 大腿鬱量でしかはけない
69 1 生って足先よで手は貫くがはけない〇 五先王でも事が雇かない

1

2

3

1

0

12■

3・1

0

1

1 肘書上げて字が雷けち
3 肘キつき．前兢奮動かして字が雷けち
2 手雷キ使って辛が雷けi
1 やっと雷けち○ 字が雷けない（25）茶碗を持って食事をすさ

100 1 曽通の茶碗と曹キ持って藁に食事ができも99 3 肘で支えて某隕書持ち霊事を丁も湘；2 上妃の機にして彙事tTもが．くたびれて途中でやめも971 美幌は持てないが讐又はスプーンでやっと霊雷書
寸も○ 雷も持てない（19）息が続く（3回の平均）
761 7−と連枝発雷．20秒以上軟く
75 3〟
15−20秒乗糞712〝
1トー15秒未糞731〝
5−10秒兼糞
0
〝
5秒未糞

0

96
95
94
93

2

3

4

￣0

（1）

（2）

（3）合計点

10

15

20

25

30

35

Age（Y）

図2
図15

合格率特性曲線（文献2より引用）−113−

東埼玉病院入院DMD患者のADLスコアの自然歴いわれている．表5の通り，本方法はRepO．997，
PPR■0．96と100項目のADLsore，8段階障害度
Guttmanのscalographic analysis

アイテム行列といえよう．この11アイテム行列のSl：1人でベットに起きあがれるか
S2：1人でトイレまで歩けるか
S3：1人で買い物にでかけられるか
S4：1人で1泊程度の旅行が出来るか

最後に1項目を加え，12段階とした新障害度分類（Sj：アイテム，サブテスト）

判定に筋力を定量的に測定したり，筋力検査，時表3

分類よりもよい数値を得ており，信頼性の優れたはよくできた分類ではあるが，今回の解析からわ

0

0

nl

1

0

0

n2

0

1℃

1

n4
1
1

1

ADLlOO項目における可能数と誤反応数

表4

PPR＝1／p∑Repj−MRj／1−MRj

P4
＞
P3
＞
P2
＞
Pl
可能率

新評価法
8段階
lOO項目ADL一

AT7 62
32

1 7 0
12 1

1 8 9

〇一h一2

2

4

4

100

3 AT 2 1 0

0 3 0 0
2

■

■

7

1

3

5

9

5

2

2

2

4

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1

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9
3
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752
9

mSU 四郎mSU

駅剛m⁝訳剛

mSU
駅剛

114

ratio）
PPR●（plusperCentage

0．96
0．95
0．67
PPR■

0．99
0．95
Rep O．95

反応1の例数（可能率，合格率）
全例数 n

Rep＝∑ej／pn（ej：誤反応数）

0

Guttmanの再現性指数

no表5 信敵性の検討

0

現状である．広く行われてきた8段階分類（表7）0DMDの自然塩が日本では蓄積されていないのが0

1

間機能テスト，ADL測定などを組み合わせている
S4
S3
SI S2

を表6に示す．

さて，昨年報告した通り西欧ではD山Dの薬効が，残念ながら薬効判定に利用できるような

ADL scoreの検討による筋ジストロフィー障害度の再評価

1 8

一′ 左：
●
▼
′ 一●
： ● y崇 ■
′
ゝ
′
イ
′
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二 ■
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11
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点了 ／′ ・
・
・
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ADLスコア全体の尺度分析

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図4 今回選んだ11項目による尺度分析

−115−

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−3
54

図5 8段階分顆法による尺度分析

表6 新ステージ分頬の判定には不適当であろう．我々は結局ADLに

Ⅰ．ゆっくりとしゃがむことができる
IL 介助なく階段昇降可能（手で膝を押しても良いが，手すりは用いない）
m．通常の高さの椅子から立ち上がり可能（手で膝を押しても良い）
Ⅳ．介助なく床から立ち上がり可能（手で膝を押しても良いが，15秒未満でできる）
Ⅴ．手すりを用いて階段昇降可能（介助なし）
Ⅵ．独立平地歩行可能（動揺性歩行でも良い）
Ⅶ．片手支持による両脚でのよりかかり立ち可能
Ⅷ．四つ這い可能（肘をついても良い）
Ⅸ．四つ這い位保持可能（肘をついても良い）
Ⅹ．裏返りはできないが，横向きまでは可能
刀．自力で坐位保持可能
Ⅲ．自力で坐位保持不能，仝介助

着目せざるを得ない立場に追いこまれたが，ADL
スコアはscalogramからもわかる通り不適切なアイテムを多数含んでおり，このままでは使用できなかった．このような理由から新障害度分類を作成したが，各障害度の通過期間は比較的短かいと考えられ，薬効判定のためには有用な分類法と考えられる．
結論

国立療養所束埼玉病院入院159名のADLスコ
アを尺度解析法で検討した結果，DMD薬効判定に有用と思われるDMD12段階障害度分類を作成し得た．

かる通り，階段昇降と椅子よりの立ち上がりの動
作の難易度は，実際には逆となり不適当な障害度分類であることが今回の結果から明らかとなった．
また8段階分類は，RepやPPR◆は比較的よいが，間隔が広くラフな分類であることから，薬効−116−

ADL scoreの検討による筋ジストロフィー障害度の再評価

表7 従来の8段階分類
ニューヨーク大学（NYU）式障害ステージ分類

日本的生活様式に則した障害ステージ分類

ステージⅠ：歩行可能：介助なく階段昇降可能（手すりも用いない）ⅠⅠ：階段昇降に介助（手すりなど）を必要とす

ステージⅠ：歩行可能：介助なく階段昇降可能（手すりも用いない）ⅠⅠ：階段昇降に介助（手すりなど）を必要とする
m：F普段昇降不能：平地歩行可能：通常の高さの椅子からの立ち上がり可能
Ⅳ：平地歩行可能：椅子からの立ち上がり不能
Ⅴ：歩行不能：四つ這い可能
Ⅵ：四つ這い不能だが，それ以外の這いかた（いざり這い）可能
Ⅶ：這うことはできないが，自力で坐位保持可能
Ⅷ：自力で坐位保持不能，全介助る

m：階段昇降不能：平地歩行可能：通常の高さの椅子からの立ち上がり可能
Ⅳ：歩行可能：椅子からの立ち上がり不能
Ⅴ：歩行不能：車椅子上日常生活動作独立（移乗−tranSfer一動作も含む）
Ⅵ：歩行不能：車椅子上日常生活動作に介助を要する
Ⅶ：車椅子を動かすことはできるが遅く，姿勢が悪く．背部支持（コルセットなど）
必要
Ⅷ：雇たきりで最大限の介助を要する文

献報告書，1987，p．p．99−103．

1）石原博幸，富川雅仁，儀式三郎，青柳昭雄，杉田秀夫：治療薬の効果判定法における問題点．
厚生省新薬開発研究費・「低分子酵素阻害物質
による難病治療薬の開発研究，昭和61年度研究−117−2）佐久間昭：薬効評価．一計画と解析−ⅠⅠ，東京
大学出版会，1981，p．p．328−339．
3）上田 敏：片麻痺の評価．武田薬品工業，1978，
p，p．15−19．

血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義−モノクロナール抗体によるキット化の試み−

矢 崎 義 雄＊筋肉組織の障害過程と進展度を定量的に反映すた骨格筋疾患においても血中軽鎖値の上昇を認め，る指標の選択と，その特異性と感度の高い測定法

骨格筋組織の障害程度をよく反映する指標になりを確立することは，筋疾患の治療法の効果判定，得ることも示した．しかし，このように臨床的に特に治療薬開発にあたって欠くことのできないき

有用な血中軽鎖値の測定法は我々が開発したラジ

わめて重要な課題である．従来から，筋組織の障

オイムノアッセイ系で行われるが，抗体量に制限

害時に細胞内より血中に逸脱してくるCPKを中のあること，標準蛋白としてヒトミオシン軽鎖を心とした酵素蛋白を指標に病態の把握が行われて用いなければならないことから，一般の臨床に導きた．最近は筋組織の崩壊時に血中に流出してく入することが可能なキット化ができず，多施設にる3メチルヒスチジンを測定する方法が開発され，よる検討も行われなかった．

治療薬の効果判定の基準として用いられるように

今回，我々はモノクローナル抗体を用いた血中なった．しかしCPKなどの酵素蛋白は細胞質中

ミオシン軽鎖の測定法をはじめて開発し，キットに可溶性分画として存在するために，細胞膜透過化に成功した．そして急性心筋梗塞患者で実際に性冗進のみによっても細胞外に逸脱し，その血中測定を行い，ラジオイムノアッセイ法と同等の性濃度の上昇は必ずしも筋細胞の崩壊を反映しない．

能を有すること，骨格筋ではタイプⅠ筋細胞の障さらには，メチルヒスチジンではその測定法がき害を特異的に反映することが明らかとなったのでわめて繁雑であり，多数の試料の測定には通さな報告する．

い．また肉類の摂取による値の変動が大きいことも臨床的に問題である．我々は，筋原線経を構成

モノクローナル抗体を用いたミオシン軽鎖法の確する構造蛋白のミオシンに注目し，障害時に血中立に流出してくる分子量の小さなサブユニットの軽モノクローナル抗体の作成は図1のように行っ鎖を指標に，特異性と感度に優れたラジオイムノ

た1）．免疫に用いた抗原蛋白は，ヒト心室筋ミオシ

アッセイ法を確立してその臨床的意義を明らかに

ン軽鎖である．心疾患を有きない患者の剖検心よした．

り稀釈法にて抽出し，Sephadex DEAE25カラム

すなわち，血清軽鎖値は長期間高値を保つ特徴

により精製後の心筋ミオシンより塩酸グアニジン

ある変動パターンを示し，梗塞部心筋の崩壊と治法により軽鎖を分画した．この軽鎖蛋白を

癒過程を反映すると共に，その景高値から梗塞サBALB／Cマウスに2週間おきに腹腔内にFreund

イズを正確に推定できる指標としてきわめて臨床のアジュバントに混じて注入して免疫し，十分に的に有用であることが示された．さらには心筋梗

抗体価が上昇した時点で脾臓を摘出して牌細胞を塞ばかりでなく，筋ジストロフィー症を中心とし分離し，マウス骨髄腫細胞であるP3Ul株と融合してハイブリドーマを作成した．HAT培地を経＊東京大学医学部第三内科て増殖するハイブリドーマの中から，ELISA法に−119−

よりミオシン軽鎖と最も結合親和性と特異性の高挙心筋ミオシンによる免疫い抗体を産生するクローンを選別した．そして互
いに結合特性を干渉し合わない，軽鎖蛋白において触れた抗原決定基を認識して結合する2種類の

肇

9脾良摘出
l

簗脾細胞の分離モノクローナル抗体（ML508，ML544）を選択し専骨髄胴胞（P品）て，二抗体サンドウィッチ法（ラジオメトリック
アッセイ法）による血中軽鎖測定法を確立した．

l：ま；鵬融∴i。。e．け

その原理は図2に示すように，まずモノクロー○

ナル抗体A（ML508）をポリエチレンチュー7小に十一抗体の検出（ELISA法）

吸着させ，これに試料血清10叫1と125Ⅰで標識した
他方のモノクローナル抗体B（ML544）を混じて0

抗体産生綿胞のクローン化加えて340C1時間インキュベートした後，洗源してγシンチレーションカウンターにてカウント

1

する．標識した抗体ML544が，ミオシン軽鎖蛋白′壱変蓼＼書写崇至抗体の産生を介して抗体ML508に結合して試験管に吸着す
図1

マウスハイ7すりドーマを用いたモノクローナ
ル抗休る．したがって，試料血清に存在する軽鎖量に比例して試験管にアイソトープが集積するところとなり，放射能が得られる．その結果，試料血清中の軽鎖量に比例してカウントが増加し，図3に示す標準曲線が得られ，感度よく血中軽鎖量の測定が可能となった2）．その測定感度は1mg／mlとラジオイムノアッセイと同程度の値が得られた．本法によれば，B／F分敵のための二抗体沈降法によるインキュベーションあるいは遠沈法も必要としない操作のきわめて簡便な短時間での測定が可能となった．さらにはモノクローナル抗体が培養系

Solid surface
図2

二種類のモノクローナル抗体を用いた二抗体
サンドウィッチ法（イムノラジオメトリック
アッセイ法）の原理

01

図3

−120−

510

50100

5001・000∩帥I

血中軽鎖値（LCI）のイムノラジオメトリック
アッセイによる標準曲線

血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義
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Radioimmunoassay
図4

血中軽鎖値（LCI）のラジオイムノアッセイ法とイムノラジオメトリックアッセイ法による比較
両者の測定系でよい相関が得られている．

血中ミオシン軽鎖測定キットの評価
我々は心筋ミオシン軽鎖（アルカリ軽鎖）を抗S一心＞心 u牒七二主著∈⊃しぶ

原にして測定系を確立した．図4は従来のラジオ
イムノアッセイ法とイムノラジオメトリックアッ
セイ法で得られた血中軽鎖値の比較を示している．
相関係数γ＝0．92とよい相関が得られた．図5は急性心筋梗塞症における血中ミオシン軽鎖値の変動をイムノラジオメトリック法とラジオイムノア
ッセイ法で比較したもので，両者はよく一致し，長期間血中の軽鎖値は高値を推持していることがよくわかる．図6，7は実際の症例でCPK値と比較したものである．図6のM1−92症例で示すように，CPKの血中への逸脱は迅速で24時間以内で最図5

急性心筋梗塞患者における血中軽鎖値の変動．
ラジオイムノアッセイ法とイムノラジオメトリックアッセイ法の比較

高値に達し，数日で発作前のレベルに戻る．一方
軽鎖値は，徐々に上昇して4−5日で最高値に達し，1週間以上高値を保持している．CPKは3〜6時間間隔で採血しないと正確な最高値は得らにより大量に産生できることから，抗体も量的なれないが，軽鎖値はこのように1日1回の採血で制限を受けることもなくなった．またこの系では血中変動パターンがとらえられ，最高値の測定も標準蛋白としてブタのミオシン軽鎖がヒトと変り可能となり，心筋障害の程度と治療過程が正確にない結合特性を有することから，標準蛋白として推定でき，患者の予後の判定や治療効果の評価に用いられることも明らかとなった．このようにモ

きわめて有用な指標であることがわかる．患者のノクローナル抗体を導入することにより測定系のリハビリテーションのプログラムの設定にも有用

大量生産が可能となり，はじめてキット化され一である．M1−77（図7）の症例は発作後24時間経て般臨床においても使用できるようになった．

入院した患者である．CPKはすでに最高値を過ぎ
−121−

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川dayS

After admission

図6

急性心筋梗塞患者における血中CPKと軽鎖値の変動パターン（Mト92）

図7

急性心筋梗塞患者における血中CPKと軽鎖値の変動パターン（M−77）ており，このような症例では梗塞サイズの推定は

唐音

才才

A．㌔ぎ

B．㌔ぎ

不可能である．ところが血中軽鎖値を測定すればこのような症例においても最高値がとらえられ，梗塞の大きさの推定が可能となる．さらにはCPK
値が正常域に戻ってしまった，発作後数日を経過した症例でも急性心筋梗塞がretrospectiveに診断することが出来，従来の指標では得られない臨28S−

床的に有用な情報を知ることが可能となった．
測定キットによる骨格筋障害の診断

18S−

このように我々が確立した血中ミオシン軽鎖の測定系が，血中に逸脱した骨格筋ミオシン軽鎖を検出し，骨格筋組織の障害を診断し，しかも定量的に推定できるかが，本研究≡旺において我々がなすべき課題である．そこで我々が開発した
ML508，ML544のモノクローナル抗体が骨格筋ミオシンとどのような反応を示すかまず検討する必要がある．
本研究班の杉田秀夫披見の御協力で組織染色が行われた結果，これらモノクローナル抗体はタイプⅠ筋細胞のミオシン軽鎖とよく反応することが

図8 ヒト心筋ミオシン軽鎖cDNAによる胎児およ：び成人骨格筋mRNAのNorthernblot解析
A．心房筋ミオシン軽鎖cDNAによる解析，
B．心室筋ミオシン軽鎖cDNAによる解析成人骨格筋において心室筋ミオシン軽錆遺伝子がよく発現されていることを示す．心房筋ミオシン軽鎖は胎児型軽鎖と言える．

明らかにされた．すなわち，ATPase染色により

ン軽鎖に特異的に反応することが示されたわけで陽性と判定されたタイプⅠ筋細胞に一致して，モある．我々がクローニングした心筋ミオシンのア

ノクローナル抗体による蛍光抗体染色での発色がルカリ軽鎖遺伝子の特異的な塩基配列をプローブ観察された．他方のタイプⅠⅠ筋細胞には全く反応に，骨格筋のmRNAをNorthern blot解析したを認めなかった．したがって我々のモノクローナ

結果からも，図8に示すように、心室筋ミオシン

ル抗体はタイプⅠ，すなわち赤筋タイプのミオシ

軽鎖cDNAと骨格筋mRNAが強く反応するこ−122−

血中骨格筋ミオシン軽班測定法の開発とその臨床的意義とが示され，骨格筋タイプⅠのミオシン軽鎖は遺の上昇を認めた．運動負荷に対する骨格筋の感受伝子レベルにおいては同一であり，少なくとも蛋白性が個人によって異なることが示され，そのようレベルでも転写後の修飾がない限り同一とみなしな症例では運動により骨格筋組織の一部が損傷さてよいものと思われる．したがって，我々のモノれる可能性が示唆されたわけである．

クローナル抗体が，心筋ミオシン軽鎖ばかりでな

今後この測定系を用いて筋ジストロフィー患者

く骨格筋ミオシン軽鎖のタイプⅠもよく認識するの血中ミオシン軽鎖を検討すると共に，ML544のことは当然と言える．
以上の結果から，骨格筋疾患患者における血中77イニティークロマトカラムによって骨格筋ミ

軽鎖値の変動は，骨格筋組織障害の中でタイプⅠ画を占める蛋白によって新たにマウスを免疫して，筋細胞の障害を反映するものである．一方タイプ

タイプⅠⅠ筋細胞ミオシン軽鎖測定系を確立し，そⅠⅠ筋細胞，すなわち自筋タイプの筋細胞には全くの障害程度を推定できることを示し，筋ジストロ

反応しないことから，その障害に関する情報を得

フィー症の病態の解析と治療薬の効果判定に役立ることはできない．

つ方法論を開発し，珪研究の推進に努めたい．

オシン軽鎖よりタイプⅠを除き，タイプⅠⅠが主分

この測定系で健常者の血清を測定してもミオシ
文

ン軽鎖を検出することはなかった．前回ラジオイ
ムノアッセイ系を用いて，93時間行軍訓練後に血中のCPK値の上昇をみると共に，血中軽鎖値の献

1）Tsuchimochi，H．et al：Isozymicchangesin
myosinof human atrial myocardiumby

有意の上昇を認めることを報告した．今回運動部

OVerload．J．Clin．Invest．，74：662，1984．

学生30名のトレーニングの前後で，東大保健診療

2）Yazaki，Y．et al：Diagnosis of myocardial

所長遠藤康夫教授の要請にて測定したところ，4名の学生にトレーニング後に3ng／ml以上の有意−123−

infarction uslng mOnOClonal antibodies．

Asian Med．J．，29：510，1986．

各種プロテアーゼインヒビター投与の筋ジストロフィーマウスに対する効果

辻

楽 勝＊

研究目的

PK2），CPK3），GOT4），LDH5）の活性を測定した．

新しく開発された種々の低分子酵素阻害物質に対照として生理食塩水投与群を4週間と6週間でついて難病治療薬としての可能性を探る研究の第各1組づつ作り同様の測定を行い投与実験群との一歩として，筋ジストロフィー症のモデル動物に酵素活性の比較を行った．又，各被検マウスから発症初期から連続的に皮下投与することによって，

屠殺後直ちに排脹筋を採出し，光顕用標本を作製

これら物質のわ‡め0における疾病抑制効果を検し，組織学的検索を行った．投与に用いる各蛋白討する実験を行っている．昨年度は8種類の低分

質分解酵素阻害物質は使用直前に1mg／mlの濃度

子酵素阻害物質を用いてmdxマウスを対象とし

で生理食塩水中に溶解し，1回0．2mlずつを1Elてそれぞれの物質の連続投与の疾病進行に対する

2回背部皮下に注射した．

抑制効果を検討する実験を行い，そのうち結

aminopeptidaseTMのインヒビターである

果

Actinonin，dipeptidyl aminopeptidaseIVのイン

図1は投与期間中の披検マウスの体重変化を示

ヒビターであるDiprotinTA，f．Met−amino−

したものである．生理食塩水投与の対照マウスのpeptidaseのインヒビターであるFormeStin−A

体重は投与期間中には殆んど変化が見られなかっ

およびKallikreinのインヒビターであるFUT−

たのに対してFUT−175，およびFormestin−A投

175に関して症状改善の効果があることを認め

与のマウスでは投与開始後に明らかな体重増加がた1）．そこで本年度は引続いて上記の4種類の蛋認められた．一方Diprotin−AおよびActinonin

白質分解酵素阻害物質について筋ジスモデル動物

投与マウスでは対照と同じく大きな体重変化は認の一つであるdyマウスを対象として再度発症初められなかった．表1は各蛋白質分解酵素阻害物

期からの連続投与実験を行い，筋ジストロフィー

質を4週間並びに6週間投与した後の血清中の症の症状進行に対する抑制効果の有無を検査した．

CPK活性とPK活性を示したものである．対照群との比較ではCPK活性はActinoninおよびDi−

材料と方法

protinーA投与群で4週間並びに6週間投与で共実験に使用された動物は4週齢のC57BL／6J−に著しい活性低下を示しているのに対してFUT

dy系の疾病（dy）マウスである．dyマウス各3頭−175投与群ではいずれの投与期間でも，やや活性ずつを一組とし，各蛋白質分解酵素阻害物質を4増加の傾向が認められた．又FormeStin−A投与

週間および6週間にわたって連続投与し，投与期群では4週間投与で活性低下を示しているが，6間終了後屠殺した各マウスについて，血清中なら週間投与では逆にやや活性増加の傾向が認められびに骨格筋中の疾病進行のマーカー酵素である

た．一方PK活性については，Formestin−A投与群のうち4週間投与でやや活性増加を示したのを＊和歌山県立医科大学第二生理除いて全て活性低下の傾向が認められた．表2は−125−

血清中のGOT活性とLDH活性を示したものでActinonin投与群でLDH活性が低下している以あるがDiprotin−A投与群とFormestin−A投与

外は全て増加の傾向が認められた．

群の4週間投与では両酵素の活性が共に著しく低次に各披検マウスの後肢筋ホモジネートの下している事が認められた．又6週間投与ではCytOSOl画分中のマーカー酵素の活性について測Administration period（day）

図1Body weight changes of dystrophicmice byinhibitor administration

表l Effectsofinhibitoradministrations
onserumCPK and PK activitiesin
dystrophicmice
Cl，R

A亡豆nonin
Dipro亡in−A
forPe5tin−A

m−175

士0．02

piprotin−A O．16±0．02
rorneStin−A O．23士0．16
rVT−17i O．20

Uni亡…′mleSM的inhlSerun

±0．02

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1．12士0．05

1．08

0．71士0．02

1．23

1．35±0．14

1．77

1．44士0．161．54

1．12±0．12

Uni亡；′mles H瓜E／min／ml serun

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っ
00000

piprotin−A

fX

Effectsofinhibitor administrations
OnSerum GOTandLDHactivitiesin
dystrophic mice

一〇
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8・
川

AC【inonin

工／S

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7・5相川311・
一〇
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Inhibi亡Or

4veek

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ヽ07
一02
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0
7
00001
・−0011

period表2

各種プロテアーゼインヒビター投与の筋ジストロフィーマウスに対する効果走を行った．表3はそのうちCPK活性とPK活と考えられている4ケの酵素活性の変動について性を示したものであるが，全ての蛋白質分解酵素

血清中の活性低下と骨格筋中の活性増加を疾病の阻害物質投与群について4週間並びに6週間投与

改善傾向を示すもの（＋），その逆（−），投与にで両酵素が共に活性増加の傾向を示していた．特よる影響がはっきりしない（±）と考えてまとめにFormestin−A投与群とFUT，175投与群ではたものが表5である．

対照群に比較して著しく高い活性が認められた．

又投与実験が行なわれた仝マウスについて排脹

又，GOTおよびLDH活性につい七は表4の如筋を採出し，H・E染色標本による組織学的検索をく，Actinonin投与群，Formestin−A投与群，お行った結果，いずれの投与群についても対照の生

よびFUT−175投与群ではLDH活性が増加の傾

理食塩水投与マウスとの間に歴然とした回復状態

向を示していたがDiprotin−A投与群では活性低は認めら れなかったが，総体的にマーカー酵素の下が認められた．これに対してGOT活性は全てl活性変化に見られると同様な疾病進行抑制の傾向の蛋白質分解酵素阻害物質投与群について無変化が認められた．

又は活性低下の傾向を示していた．
考以上の実験で得られた疾病進行のマーカー酵素

察

4種類の蛋白質分解酵素阻害物質について筋ジ
ストロフィー症に対する治療効果の有無を7乃
表3

PeriodEffectsofinhibitoradministrations
onmuscleCPKandPKActivitiesin

ひど〝0で検討するため疾患モデル動物の一つであ

dystrophic mice

るdyマウス（4週齢）を対象として4週間および6週間にわたる連続皮下投与実験を行った．結果

ェntlibitoで49eek Saline

C王，K I／S t■K

工／S

16．8

土4．3

−

0．43

19．7

±1．3

1．17

0．5】土

Diprotin−A

21．9士5．7

1，30

0．76

±

0．44

1．77

Fornestin−A

27．9士9．5

1．66

0．88

±0．26

2．05

1．84

0．89

±0．16

Actinonin

m−175

】0．9

m−t75

−
t．23

一⁝1
1︒．
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Formestin−A

0．07

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1
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ACtinonin

0．3

くノ −80′b◆一◆−◆●◆−士
8ノ■U891
1つノ8156veek SaliTle

土

土0．16

は昨年度にmdxマウスを対象として行った同様な実験で得られた結果1）とほぼ一致した．即ち，測定したマーカー酵素のうちCPKおよびPKの活性に関しては，4種類の蛋白質分解酵素阻害物質を投与した群の全てについて明らかに血清中に遊出される酵素の活性が低下し，骨格筋中に存在する酵素の活性が増加し，いずれも正常マウスの活性値に近づくという傾向を示した．このことは，

UnitソnOlesNAD軋hin／ngprotein

これらの物質が少なくともmdxマウス並びにdy
表4

Effectsofinhibitorladministrations
onmuscleGOTandLDHactivitiesin

表5

dystrophic mice

FormeStin−A

m−175

lかⅥ

A
A
一
n
■
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・
⊥
n
n
・
⊥
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Uni亡：′nOlesM的in血gprotein

一．
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DipTO【in−A

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AC亡inonin

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8
▲UOnV00nV0000

PeriodSummary of the effects ofinhibitorson
the enzyme activitiesin dystrophicmice

Inbibito弓霊；。アK P乏er器T L。。。，K P芸uS誌；uE
A亡tinonin

4

◆

6

◆

◆

◆

一

士

一

◆

4

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◆

◆

◆

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土

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◆

一

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上

土

Diprotin−A

Fornestin−A

6
4

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◆

6

−

◆

−

一

￣

土

◆

◆

−

土

◆

1士

◆

◆

◆：Serl皿；deCreaSe．nuS⊂leiinCreaSe−：Serum；inCreaSE，nuSCle；deCreaSe
土：nO−Cbangeマウスという遺伝子座位の異なる2種類の疾患モ機能を有することを確認している7）．更に今回のデル動物における筋ジストロフィー症に共通して投与実験においても予備的所見ではあるが各酵素発現する一般症状を抑制するのに有効であるとい阻害物質の投与によってこの酵素の活性が低下すうことを示しているものと思われる．LDH活性ることを見ているので，この酵素を将来筋ジストの変化に関しても，Diprotin−A投与群における骨ロフィー症状進行のマーカー酵素として治療薬の格筋中活性の低下のように例外は見られるものの効果検定の研究に利用出来る様に目下開発中であ全体としてCPKおよびPK両酵素の活性変化とる．

ほぼ同様な傾向が認められた．一方，GOT活性に関しては対照マウスと比較してあまり顕著な変化は認められなかった（表5）．又，これらのマーカ

文
1）辻

献

繁勝：各種酵素阻害剤投与のmdxマウス

ー酵素群の活性変化のパターンに見られる改善傾病態に与える影響について．厚生省新薬開発研

向は全披検マウスの肪脹筋について行った組織学

究費イ低分子酵素阻害物質による雉病治療薬的観察によって得られた組織像の悪化の程度の軽の開発研究」江椋班，昭和61年度研究報告書，減という結果によって支持された．更に，投与期
間中の体重変化に関する測定結果は今回用いられた4種類の蛋白質分解酵素阻害物質のうち，特にFUT−175とFormestin−Aを投与した披検ウウス
で顕著な体重増加が起っていることを示している

1987，p．p．63−67．

2）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F．andMorimura，H．：Crystallization，Characteriza・
tionandmetabolicregulationoftwotypesof
pyruVatekinasesisolatedfromrattissues．J．

Biochem．62：7卜91，1967．

が，このことはFUT−175とFormestinーAがin3）Hess，J．W．，Murdock，K．J．and Natho，

正和における疾病に対する作用機序に関して他

G．J．W．：Creatinephosphokinase．Aspectro・の2物質とは若干異なる面を持っていることを示

photometric method withimproved sen・Sitivity．Am．J．Clin．Pathol．50：89，1968．

唆しているものと考えられる．
今回得られた結果を総合的に判断すると，用い4）Wroblewski，F．and LaDue，J．S．：Lactic

られた4種類の蛋白質分解酵素阻害物質は程度のdehydrogenase activityin blood．Proc．Soc．

差はあるが，いずれも筋ジストロフィー症の治療薬として症状進行の軽減という面で効果が得られる可能性が示唆されたものと考えられ，更に玩加わりにおける薬理効果或いは作用機序などを追求するための多角的な実験を行う価値があるものと推察される．
又mdx，dy，myd，CrOなどの筋ジストロフィー症の疾患モデルマウスにおいて，症状の進行に

Exp．Biol．Med．90：210−213，1955．
5）Karmen，A．，Wroblewski，F．andLaDue，J．S．：
Transaminase activityin human blood．J．
Clin．Invest．34：126，1955．
6）辻 繁勝：幾つかの筋ジストロフィー症モデル
マウスにおけるAlkaline protease活性の変化．
厚生省特定疾患・「難病の疾患モデル調査研究」
京極鑑，昭和59年度研究報告書，1985，p．p．123−127．

伴って著しく活性上昇を示すアルカリ・プロテア

7）Kusumoto，S．，Doi，Y．，Sawade，H．andTsuji，ーゼが存在することが知られているが），我々はS．：Purification and properties of alkaline

この酵素の精製に成功し，J刀 が∫′和の実験系で筋proteaseinmurine muscular dystrophy．J．

の収縮系蛋白（ミオシン，アクチン）を分解する−128−

Physiol．Soc．Japan49：485，1987．

E−64誘導体による糖原病ⅠⅠ型ウズラの治療
杉 田 秀 夫＊

研究協力者

石 浦 章 一＊塚 原 俊 文＊須 原 芳 宏＊

菊 地 建 機＊動物への投与はE−64−C（10mg／kg）を連日背部は じ め に日本ウズラに発見された糖原病ⅠⅠ型は，ヒト成
人型モデルとして有用であると考えられてい皮下に14日間行った．実験終了後，胸筋をとり出し，種々の酵素活性を測定した．

る1ト6）．今回我々は，培養系，および疾患ウズラを結果ならびに考察用いて，蛋白分解酵素阻害剤投与の効果を検討し培養細胞に対する効果

た．
本疾患モデルでは，リソゾーム酵素の一種であ実験はまず，正常ウズラ1種および疾患ウズラる酸性α−グルコングーゼ（酸性マルターゼとも2種の計3種の線維芽細胞を用いて行った．EST呼ばれる）活性が胎生期より正常の15−20％と低は2種類（10および50JJg／ml）の濃度を用いた（表値を示すことが明らかにされており，イムノブロ

1）．表より明らかなように，リソゾーム酵素であット法によって98kの正常酵素分子が存在しない

る酸性α−グルコンターゼ（α−Glu，aCid）とα−ガことが判明している．しかしながら，前駆体と考ラクトシターゼ（α−Gal）は，3種の細胞共にEST

えられる110k分子は正常と同程度発現されてお投与によって活性が数倍に上昇しているのがわかり，これがわずかながら活性を持つため一見酵素

る．特に2種類の糖原病ウズラ線維芽細胞量が少ないかのごとく見えることがわかっている．

（AMD，N07と8）ではα−グルコシターゼ活性

そこで，最も適当であると思われる説は，何らかの異常により酵素のプロセシング又は代謝が正常

表1に比べて速い，というものであり，本研究はこの仮説を出発点とし，異常酵素の分解を抑制するこ

培養線維芽細胞に対するEST投与の効果（実験1）
活性はすべてEST非投与を100として相対値で表してある．

とによって酵素活性の回復をはかり，症状を改善
Cells

することを目的として行われた．

Rela亡ive

Actlvl亡y0−Gl11α−Gal Q−Gltl（aCld）

方法★

no addlt10n
EST lO ug／血1（90％Eagle，s MEM−10％Fetalcalf serum）
し，COnfluentな状態でESTを投与した．ESTは

183

279

94

no addltlon

25

137

EST lO vg／n1

48

605

55

781

no addlt10n

22

225

EST lO ug／m1

36

477

50Vg／m1

39

466

劇D flbroblast N0．750vg／m1
★

ノ

⊥

2
0
8

2

−129−

0

＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部

蛸D flt〉rOblast No．81とにとり換え，投与は5日間とした．

105

3とのないように調節した．なお，培養液は1日ご

（100）

345

9
6

DMSOに溶解し，DMSO濃度は1％を越えるこ

（100）

165

50pg／nl
★

（100）

つ J
7
5

正常，並びに疾患ウズラより線維芽細胞を培養（neutral）

Norma1flt〉rOblas仁

が2倍近くにも上昇しており，ESTにより酵素前時に明らかとなった．この事実は，リソゾーム酵

駆体の分解が抑えられていることが明らかである．

素の代謝にカテプシン類，特にBとLが重要な役

一方，小胞体酵素と考えられている中性α−グル割をになっていることを示す直接的な証拠ともな

コシダーゼ（α−Glu．neutral）活性はEST投与のると考えられる．

影響を受けないことがわかる．以上の結果より，

次に，EST投与の前段階として活性型E−64−C

ESTはりソゾーム内の蛋白分解を抑制すること

を糖原病ウズラに投与し，筋肉を採取後，α−グルによりリソゾーム酵素の蓄積を誘導することが実

コシダーゼ活性を測定した．投与量は10mg／kgと証された．

し，背中皮下に連日投与した．結果を表3に示す．

次に，ヒトEST投与実験より血中E−64−C濃度

E−64−C投与群（n＝9）では，体重は有意に上昇

が1Jg／mlを越えないことを考慮してEST濃度

し，ウズラに対する副作用はないと考えられた．

を下げ，効果が出るかどうかを検討した．表2に

酸性α−グルコシターゼ値は，上昇はしている

その結果を示す．ESTは0．1〜10JLg／mlの5段階

ものの個体差が大きく，有意差は検出されなかっとし，対照として細胞内可溶性分画に存在するア

た．個々のウズラについては値を図1に示す．こミノペ70チターゼB（AP−B）もつけ加えた．このの実験では，酸性α一グルコシダーゼ以外のリソ

表より明らかなように，酸性α一グルコシターゼ

ゾーム酵素活性も上昇せず，明らかに培養系と異活性は，ESTO．1J g／ml投与においても上昇してなる結果が得られたため今後投与法，投与量など

おり，低濃度のESTでも効果が認められることに検討の余地があると考えられた．

が判明した．また，実験1（表1）と同様にリソゾーム酵素活性のみを上昇させていることも明ら

おわ り にかになりESTの有効性が培養条件下では常に再本研究より，リソゾーム病においても適量の現可能であることが示された．

E−64誘導体を使用することにより，欠損酵素の分

一方，実験2（表2）においてESTO．1FLg／ml

解を抑制し反応物質の蓄積を防ぐことが可能であで抑えられるシステインプロテアーゼはカテプシることが明らかとなった．今後動物モデルを用い

ンB，Lであり，カテプシンHではないことも同て効果的な投与法を検討すると共に，発症機構を明らかにしたい．

表2 培養線維芽細胞に対するEST投与の効果（実験2）
値は表1を参照．
Cells

Relative

8−Glu（acid）

′

0

q

9

7

9

l

9

5

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☆Body veight

AHD＋

へ

9

1

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E−64−亡（n＝−9）

J

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′

0

0

︸

′

8
8
8

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8

N−Ac−8−gluC05amlnidase

8

5
5

′

l

9

7

79．0＋

〇一galacとOSldase

neutral☆Enzyme aC亡ivity

7
5
0

′ q

0
1

9

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0
1

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■ ヽ 一 8

1
1

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1

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1

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1

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4
′ 0

l

2
1

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2

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7

★ P く 0．25

−130−36．0＋14．8

47，5＋35．1

12．7士

4．1

13．3士

4．1

3．2

12．6士

3．5曳

45．7士10．7

39．8士

6．5☆

14．5＋

いgluCOSldase

8

′

1

0
1

一 ヽ ノ

0 0 0
1
1
1

8

− 5

亡 ノ

0

ム 7

Ug／ml

糖尿病ウズラに対するE−64−C投与の効果
E−64−CはSalineに溶解し，10mg／kgを連日14日間投与した．各酵素活性は，骨格筋中のmgタンパク質当りの活性として表してある．

acld q一glucosldase

ノ

lO．0

く 一

pg／ml

0

5．0

3

l．O ug／m1

3

Ug／ml

3

O．5

8

t

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O．1vg／ml⊥
5

7

fibroblastS
no addiとion

0

t

2

4 一 b
l

′ 0

皿

pg／ml

0

5
′ ○
つ J
5
1
1
1

9

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l

lO．0

2

0
1

′ 嶋

5．0 Vg／ml

O

0
0
1

′ 埠
工
⊥

Ug／ml

l．0 嶋／m1

l

0

O．5

7

O
1

EST O．l Ug／ml

no addltlon☆

8−Gal q−Glu Af−b（neu亡ral）

Normal fibTOblasts

n

★

表3

Activity

38．1＋

6．7

33．7！14．0

E−64誘導体による梼原病ⅠⅠ型ウズラの治療

文Acld

Q−glucoSida＄e

献1）Murakami，H．，Takagi，A．，Nonaka，I．，

aCtlYFty

Ishiura，S．，Sugita，H．and Mizutani，M．：

rlnquaHrTluSCIe

Type2glycogenstoragediseaseinJapaneser71120

quails（ed．by Ebashi，S．），in Muscular
Dystrophy，1982，p．p．37−48．

2）Usuki，FJshiura，S．andSugita，H．：Isolationand characterization ofα−glucosidase from0●Japanese●quails，J．Biochemリ99：985−988，

1986．

40

3）Usuki，F．，Ishiura，S．and Sugita，H．：

Y

Developmental study ofO

α−glucosidasein

Japanesequailswithacidmaltasedeficiency．

Muscle Nerve，9：537−543，1986．
4）Higuchi，Ⅰ．，Nonaka，Ⅰ．，Usuki，F．，Ishiura，S．

AMD

AMD

and Sugita，H．：Acid maltase deficiencyln

E64−treatedJapanese quails；early morphologicalevent
inskeletalmuscle．Acta．Neuropatho1．，73：32

図1E−64，C非投与群（AMD）並びに投与群（E−64treated）の骨格筋酸性α−グルコシターゼ活性（U／mg）●：グリコーゲン蓄積ウズラ○：グリコーゲン非蓄積ウズラ−37，1987．

5）Usuki，F．，Ishiura，S．，Nonaka，I．andSugita，
H．：α−Glucosidaseisoenzymeinnormalandacid maltase−deficient human skeletal mus−Cle．Muscle Nerve，1988，in press．
6）Usuki，F．，Ishiura，S．，Higuchi，Ⅰ．andSugita，
H．：Reappearance ofembryonic neutralα一glucosidaseisozymeinacidmaltase−deficientmuscleofJapanesequail．Exp．Neurolリ1988，

inpress．

−131−

実験的筋炎モデル動物の作製に関する研究−自己免疫筋疾患抗原物質のモノクローナル抗体による解析一里 舌 栄二郎＊
研究協力者

古 川 昭 栄＊赤 沢 左衛子＊ 加 茂

功＊

多発性筋炎（polymyositis：PM），皮膚筋炎

昨年度は，この様な抗原物質の存在と，ある抗（dermatomyositis：DM）は筋肉に特異的に細原に対するモノクローナル（MC）抗体を作製し得

胞障害性免疫反応が認められる1）・2）．これら疾患のたことを報告した．本年度は，このMC抗体の特発症機構は未だ不明であるが，自己免疫疾患の角

異性と，その認識する抗原物質のいくつかの特性度から研究されている．本研究はこれら疾患の病を明らかにしたので報告する．また，抗原物質

態をよく反映する実験的モデル動物を作製し，低そのものの精製も試みたので，その結果について

分子酵素阻害物質の発病抑止効果，治療薬としても報告する．

の効果を検討するのが目的である．
PM，DMでは筋肉が特異的にリンパ球による方法

細胞浸潤を受けることから，筋肉にのみ特異的に抗原物質のラット筋肉からの抽出法，抗原活性存在するなんらかの成分が自己免疫反応の標的にの測定法はすでに報告した方法7）によった．抗原

なっていると推定される．これまでにPMやDM

感作リンパ球とミエローマとのハイブリドーマ作に兄いだされている自己抗体としては，抗ミオグ製法，MC抗体のスクリーニング法は昨年度報告

ロビン抗体3），抗ミオシン抗体4），抗核抗体5）がある

した．

が，疾患特異性が低いとされており，PM，DMのMC抗体の大量調製

発症の引金となる抗原物質は他に存在すると考え

すでに昨年度確立した3種のハイブリドーマ

られる．
重症筋無力症（myastheniagravis：MG）は神（1E7，2B2，7D9）を10％仔牛胎児血清（fetalcalf
serum：FCS） を含むDulbecco，s MEM

経・筋シナプス後膜に特異的に存在するAChRに（DMEM）液で拡大培養し，各細胞約5×106個を対する抗体が産生され，その抗体によってAChR

あらかじめプリスタン投与しておいたBalb／Cマが障害される疾患と考えられている6）．しかし，ウスの腹腔内へ移入した．約10日後に腹水を集め，MG患者血清中には未だ未同定の筋肉抗原に対す

これらのMC抗体はIgGであることが判っている抗体が高頻度に存在している．PMやDMでみるので，遠心分社上清をproteinAカラムによるられる筋特異的リンパ球の浸潤を考慮するとき，アフイニティクロマトグラフィーを行って，IgG

著者らはこれらの抗原物質の中に，細胞性免疫反を精製し以下の実験に用いた．

応の標的となる物質が存在するのではないか，まMC抗体のビオチン標識た，その抗原物質は筋膜または，筋特異的細胞外精製MC抗体50JLgを含むPBS液100JL＝こ2

マトリックスすなわち，筋基底膜に存在するので

jLlのN，N−dimethylformamideに溶解した20JLg

はないかと考えた．

のbiotinyl−aminocapric acid N−hydroxy−SuC−

cinimideを添加し，300Cで2時間反応させた．
畿国立精神・神経センター神経研究所

0．1mlの1．5MトリスーHCl緩衝液（pH8．8）を加−133−

えて反応を止めた後，0．1％牛血清アルブミン，0．1に検討した．抗原を検出する抗体として，典型的％NaN3を含む0．1MトリスーHCl緩衝液を0．8なMC患者血清を用いた．6週齢ラットの各臓器ml添加して40Cで保有した．この方法で，1E7，
2B2，7D9の各MC抗体と，対照となる他のMC抗をPBSでホモジナイズ，10万×g遠心分馳した上清中の抗原をチューブに物理吸着させて調べたの体を2種類ビオナン化した．

が図1である．抗原活性は骨格筋と，心筋に多く，MC抗体一抗原間の結合の阻害実験

微量ながら胸線にも存在していた．胸線には筋様昨年度報告した方法でポリスチレンチューブに細胞があることが知られており，胸線筋様細胞に物理吸着した粗抗原（骨格筋のPBS抽出物）とビもこの抗原分子があることを示唆している．胸線

オテン化MC抗体との結合を調べたところ，約50は自己免疫疾患の発症機序に深く関わっているとng／mlのMC抗体濃度が示通であった．抗体の特推定されており興味深い．

異性を調べるために，この濃度の各ビオテン化

MC抗体の特異性の検討

MC抗体を，あらかじめ種々の濃度に希釈した非次に，筋抗原認識MC抗体の特異性を調べた．

標識MC抗体，またはMC患者血清とプレイン

チューブに固相吸着した抗原へのビオテン化MC

キュベートした抗庶被覆チューブに添加した．

抗体の結合を阻害する程度を各MC抗体についチューブに結合したビオテン化抗体量はその後スてみたのが図2である．MC抗体lE7，2B2は互い

トレプトアピジン標識−horseraddish peroxidaseに同程度の結合阻害を示し，7D9やコントロール（HRP）または，同標識一beta−D−galactosidase

は結合を全く阻害しないところから，同一のエビを反応させ，各々の酵素活性を測定することによトー70を認識する抗体と考えられた．7D9はそれって定量した．
筋抽出物の二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）とウエスタンプロット
Manabeらの方法8）で，一次元目を等電点電気泳動，二次元目をpH9．4の系でPAGEした後，ゲのタンパク質をセルロース膜に転写した．膜上に転写された抗原活性は，順次，ビオナン化抗体，
ストレフ0トアピジンーHRPを反応させ，4−タロ
ロナフトールを発色剤として可視化した．

∈u8巾一句00uOqJO●qくルをニトロセルロース膜に一夜密着させてゲル中

培養胸線筋様細胞における抗原の発現
Kamoらによってラット胸線から樹立された
0．0001

珠化細胞R651B29）を10％FCSを含むDMEMで

0．001

0．01

0．1

1．0

10

hot●hc01に●nh引on日用′l鵬）

培養した．部分的に細胞が融合，筋管を形成した
時点で，細胞を純メタノールで3分間固定し，順次，ビオナン化MC抗体（1JLg／ml），ストレプト
アピジンーalkaline phosphataseと反応させ，Vector Redで発色させた．

結果と考察
抗原分子の生体内分布

図1 抗原活性のラット臓器分布
6週齢ラットの各臓器を冷却PBSでホモジ
ナイズ（5％W／v）後，10万×gで遠心分艶した上清を順次3倍希釈し，チューブに被覆した．1000倍希釈したMG患者血清P−1をチューブに加え反応させたのち，チューブに結合したIgGをABC法で定量した．
縦軸：peroxidase活性の吸光速度
横軸：チューブ被覆に用いた臓器抽出物のタ
ンパク濃度

まず，対象とする抗原の生体内での分布を詳細
ー134−実験的筋炎モデ／レ動物の作鋸二関する研究
O RIE7
●R282

0R7Dg
t RCl
□RC2

010￣510▼410−310−210−11

010−510−410−310−210−11

010−510−410−310−210−111gG（pg／tube）
図2

モノクローナル抗体の特異性
筋肉抽出物を被覆したチューブに各種モノクローナル抗体を種々の濃度で添加（横軸），反応させた後，125Ⅰ標識した1E7，2B2，7D9抗体を反応させた．チューブに結合した放射活性を計測し，抗体無添加
での値を100％として表現した（縦軸）．

自体でのみ結合が阻害されることから，1E7，2B2
る．同様の結合阻害実験を，MC患者血清についても行ったところ，1E7，7D9いずれのエピトープに4

光￥鉱空室芸とは異なるエピトープを認識する抗体と考えられ

7

対する抗体も一部の患者血清中に存在することが判った．患者血清中の存在頻度は1E7エピトープ
が約50％，7D9エピトープが約15％であった．
MC抗体認識抗原の解析
この2種のMC抗体の認識するエピトープが同一の分子上にあるのか，異なる分子上にあるのNCかを検討した．筋肉抽出物を二次元電気泳動し，ニトロセルロース掟にウエスタンプロット後，抗図3体と反応させて抗原分子の分布をみた．図3に示すように，3つの等電点の異なる位置に，縦に長く抗原が分布しており，分子多様性がきわめて高いことが判る．しかも1E7，7D9，患者P−1血清が認識する抗原の分布は全く同じであった．即ち，この2種のMC抗体と患者P−1の認識する抗原−135−

抗原分子の2次元電気泳動による解析
筋肉抽出物（50／塔タンパク）を二次元電気泳動後，ニトロセルロース陣に転写した．暇をモノクローナ′レ抗体またはMG患者血清P−1と反抗させ，ビオナン化抗マウスまたはヒト
IgG抗体と反応させた後，ABC法で4一クロ
ロナフトールにより発色させた．

分子の精製を試みた．SepharoseCL−6Bカラムによるゲルろ過を2回，高速液体クロマトグラフィ
ー下，モノQカラムによるイオン交換クロマトグ
ラフィーを2回行って得られた試料をpH9．4系
一次元電気泳動で調べた．教本のMC抗体陽性のバンドが検出され，これらを加算すると抗原分子の存在比が80％以上となった．今後，ゲルからの抽出または，逆相カラムによって，さらに精製し，アミノ酸構造解析を行う予定である．その結果，
この抗原の物質としての同定ができるものと期待
図4

培養的線筋様細胞における抗原物質の酵素抗体法による染色される．

培養胸線筋様細胞（R651B2株）を純メタノー
ルで固定後，順次，ビオナン化モノクローナル
抗体7D9．ストレフ：トアピジンーalkaline ph−

文1）Goust，J．M．，Castaigne，A．and Moulias，R．：
Clin．Exp．ImmunOl．，18：39，1974．
2）Haas，D．C．and ArnaSOn，G．B．W．：Archs．

osphataseと反応させ．Vecter Red で発色させた．
A：位相差写真： B：透過光写真：倍率200
×．

献

Neuro1．，31：192，1974．
3）Nishikai，M．and Honma，M．：Lancet，2：1205，1972，

分子は全く同じであると考えられた．

4）Wada，K．etal．：Clin．Exp．Immuno1．，52：297，

胸線筋様細胞における抗原の分布

1983．

ほぼ器壁いっぱいに増殖し，部分的に細胞融合5）Nishikai，M．and Reichlin，M．：Arthritis

のみられる状態のラット胸線筋様細胞を1E7，7D9
MC抗体で染色した．図4に示すように，何れの抗Rheumり23：881，1983．

6）Vincent，A．：Physiol．Rev．，60：756，1980．
7）Akazawa，S．，Furukawa，S．，Kamo，Ⅰ．，

体でも融合細胞のみに染色が認められた．即ち，
この抗原分子は筋芽細胞には存在せず，筋管形成

Furukawa，Y．，Satoyoshi，E．andHayashi，K．：
J．Immunol．Methods，94：161，1986．

後にはじめて遺伝子が発現されてくると推定され
8）Manabe，Tる．

Tachi，K．，Kojima，K．and

Okuyama，T．：J．Biochemリ85：649，1979．

抗原物質の精製の試み

9）Kamo，I．，Nonaka，I．，Furukawa，S．and

骨格筋のPSB抽出物を出発材料として，抗原−136−

Satoyoshi，E∴Biosci．Rep．，4：925，1984．

分担研究者一覧

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班・班眉名簿
氏

地

電 話 番号

岡崎国立共同研究機構
生理学研究所

444 岡崎市明大寺西郷中380564−53−7345

幹事 青柳 高明微生物化学研究所
酵素研究部

141品川区上大崎3−14−23

03−441−4173

幹事 木下 真男

東邦大学医学部大橋病院
第四内科

153 目黒区大橋2−17−6

03−468−1251

幹事 勝沼 信彦

徳島大学酵素科学研究センター

770 徳島市蔵本町3−18−15

0886−31−3111

監事 福原 武彦

東京慈恵会医科大学
第二薬理学教室

105 港区西新橋3−25−8

03−433−1111

運営 杉田 秀夫
幹事

国立精神・神経センター
神経研究所

187 小平市小川東町4−1−1

0423−41−2711

班眉 丸山 工作千葉大学理学部生物学科

260 千葉市弥生町1−33

0472−51−1111：旺眉 藤井 節郎

大阪基礎医学研究奨励会

520−01大津市唐崎1−11−1

0775−79−2280

珪眉 大倉 洋甫

九州大学薬学部
薬品分析化学教室

812 福岡市東区馬出3−1−1

092−64ト1151
内6151

姓貝

和歌山県立医科大学
第二生理学教室

640 和歌山市9番丁90734−31−2151

国立精神・神経センター
神経研究所

187 小平市小川東町4−1−1

0423−4ト2711
内5101

東京女子医科大学
小児科教室

162 新宿区河田町8−103−353−8111

国立療養所西別府病院

874 別府市大字鶴見4548

0977−24−1221

国立療養所箱根病院

250 小田原市風祭412

0465−22−3196

東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報研究部

113 文京区本駒込3−18−22

03−823−2101

東京都老人総合研究所
生化学部臨床第一研究室

173 板橋区栄町35−2

03−964−1131

班員 向山 光昭

東京理科大学
理学部化学教主

162 新宿区神楽坂1−3

03−260−4271

班員 大関 正弘

大正製薬㈱ 総合研究所

330 大富市吉野町ト403

0486−63−1111

113 文京区本郷7−3−1

03−815−5411

班長

名
江橋

所

節郎

属

所

在

（直）

内2550
内2255

内5111
内2622

社員

辻

繁勝

里舌栄二郎

：旺月 福山 幸夫
治 郎一
産 慶 紘
野
吉 上 木
三 村 鈴

月 日只 ︻員班 珪 姓班眉 川島 誠一

珪眉 矢崎 義雄 東京大学医学部第三内科

内319

内3068

内268
内351

内8274，8278

951新潟市旭町通一番町757

0252−23−6161：旺員 石原 博幸 斑立療養所東埼玉病院
第三内科

349−01蓮田市大字黒浜4147

0487−68−1161

班員 西谷

裕 国立療養所字多野病院

075−461−5121

月 友 友 開
披 班二枚 顧桂靖 正 和616 京都市右京区
鳴滝普戸山町8

国立療養所兵庫中央病院

669−13 三田市大原1314

07956−3−2121

日本化薬株式会社
鳥居薬品株式会社

102 千代田区富士見町1−11−2
272 市川市南八幡3−14−3

03−237−5154

三菱化成命化学研究所

194 町田市南大谷110427−26−1211

班月 宮武

正 新潟大学脳研究所神経内科

一男 広 友橋 井 城 堀高 石 岩 今

−139−

内5180

0473−78−4121