厚生

省

新薬開発研究費

微生物の二次代謝産物に由来する
難病治療薬（ロイぺプチン）の開発研究
梅沢班

昭和57年度研究報告書

昭和58年3月

研究報告書の作成にあたって「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究」が，昭和54年度に厚生省薬務局より新薬開発研究としてとりあげられ，私が班長として本研究班が発足して第4年度を迎えた・！
第4年度は前年度に引き続き，ロイペプチソ，べスタチソおよびフォルフェニシノールの活発な基礎研究を行うとともに，臨床研究の充実を図り，新たに里舌班員を迎えた．
かくして，本邦斯界の優れた研究者により本班が編成され，私は班長として任務を全うすることができたと思う．
本年度はロイペプチソ，べスタチソ・ならびにフォルフェニシノールの生化学的，薬理学的，生理学
的，病理学的研究ならびにモデル動物に対する効果などの広範囲な基礎的研究に注目すべき成果が得ら
れ また臨床研究を対象とした薬効評価を決めるうえに，各臨床研究者の努力により大きな進展が得られた．難病治療薬開発という使命を担った本班は各班員の努力により，筋ジストロフィー症の治療薬開発に確実な前進を遂げている．
本研究班の4年間に亘る輝かしい成果を基にして，さらに研究を続けることは，筋ジストロフィー症の解決に大きな光を与えるものと信ずる．本研究を重要課題としてとりあげられた厚生省薬務局ならびに班員各位に感謝する次第である．
昭和58年3月
班長

梅

沢

浜

夫

目

次

ⅰ

梅

研究報告書の作成にあたって

沢

浜

夫

総括研究報告微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチン）
の開発研究

3

梅

沢

浜

夫

分担研究報告15

ロイペプチンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究
村

地

孝

21

高速液体クロマトグラフィーによるべスダチンの微量螢光定量
大

倉

洋

甫

アレルギー性脳炎の治療に関する実験的研究

27

岩

崎

祐

三

ロイペプチンの薬理学的研究

33

大

塚

正

徳

ロイペプチンの脱髄病変および培養筋への作用について

43

米

沢

猛

51

筋ジストロフィー症マウスに対するホルフェニシノール投与の影響
松

ⅲ

下

宏

ロイペプチンによる実験的治療

59

高

木

昭

夫

塩酸プピバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対する
ロイペプチンの影響

63

埜

中

征

哉

筋ジストロフィー動物の生産・供給

71

野

村

達

次

DMDに対するべスタチン投与効果

73

三吉野

産

治

筋萎縮症患者に対するロイペプチン，ベスタチン効果

79

村

上

慶

郎

ベスタチン，ロイペプチンの筋疾患に対する効果

83

木

下

真

男

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症患者に対するロイペプチン,
ベスタチンの影響

93

祖父江 逸 郎各種筋疾患に対するベスタチン(NK 421)投与後の経過報告

101

里

吉

栄二郎

ロイペプチンの難病治療薬としての開発研究

107

田

中

亘

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）開発研究班分担研究者一覧

119

ⅳ

総

括

研

究

報

告

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究主任研究者 梅沢

浜夫

本研究班は微生物の二次代謝産物に由来する筋

生後2週間後からの投与で50％以上にジストロ

ジストロフィー治療薬を開発することを目的としフィー症状の発現を阻止することが認められた．

て昭和54年に始まり，現在に至っている．本研

また，細胞表面にはアミノべプチダーゼの他に，究班の発足以前に，ニワトリの筋ジストロフィー

アルカリフォスファターゼなどが存在し，後者の症の筋肉でCa2十依存性中性プpチアーヤ（CA−

阻害物質として放線菌培養液中からフォルフェニ

NP）活性の昂進が報告され，またStracher教

シンを発見していたが，その誘導体であるフォル

授（New York State University）らほ，ロイべ

フェニシノールは，酵素の阻害活性はきわめて弱

プチソが筋ジストロフィーニワトリおよびマウス

いが細胞表面に結合するので，フォルフェニシノに有効であることを兄いだしていた．それゆえ，ールの筋ジストロフィーマウスに対する効果が調

まずロイペプチソの筋ジストロフィー症への効果

べられ，べスタテンと同様に著効を呈することがを調べることを第一の目的として本研究が開始さ認められた．
かくして，ロイペプチソ以外にベスタチソの臨れた．

床研究が行なわれることとなり，フォルフェニシ

上記の知見を基にして，ロイペプチンをヒトにノールの臨床研究も計画されるようになった．ま投与するための毒性が詳しく研究された．
一方，CANP以外のプロテアーゼ，例えはア

た，臨床研究者として里舌班員の参加を求め，本ミノペプチダーゼなどが筋ジストロフィーマウス

研究班の充実を図った．

筋肉および初期の患者血清中で高い活性を示すこ

本年度は，ロイペプチソ，べスタチソ，フォルとが認められた．これらの酵素はヒト，動物細胞

フェニシノールの生化学的研究，薬理学的研究，の表面に存在する．さらに，これらの酵素を阻害

生理学的研究，病理学的研究，前臨床試験，モデ

するべスタチソは本研究班の発足以前に放線菌培

ル動物に対する効果ならびに臨床研究を対象とし養液中に発見され，それは動物細胞表面に結合し，た薬効評価の基準の検討が行われた．各分担研究

癌患者で低下している免疫を増強し，癌治療のた者により施行された研究は次の通りである．

めの臨床研究が行われていた．筋ジストロフィー

1）村地孝（京都大学医学部）：−ロイペプ

チソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究の発現に細胞膜の異常が関与するという考えもあり，また上述のようにアミノペプチダーゼがジス

2）大倉洋甫（九州大学薬学部）：−高速液体トロフィー筋で上昇している．このベスタチソのクロマトグラフィーによるべスタチソの微量蛍光

筋ジストロフィーマウスに対する効果が調べられ，

定量

−

3

−

3）岩崎祐三（東北大学医学部）：−アレルギ

次に上記各班員の報告について要約する．

ー性脳炎の治療に関する実験的研究
4）大塚正徳（東京医科歯科大学医学部）：−

1・ロイぺプチンのプロテアーゼ阻書作用に関ロイペプチンの薬理学的研究

する研究

5）米沢 猛（京都脳神経研究所）：−ロイペ

村地班員はCa2＋依存性チオールプロティナー

プチソの脱髄病変および培養ジストロフィー筋へ

ゼに対するロイペプテンの阻害作用を検討する目の作用について的で，各種臓器内のカルパインおよびカルパスタ

6）松下 宏（和歌山県立医科大学）：一筋ジ

チソの分別定量法の研究を行った．
ロイペプチソ感受性のCa空＋依存性システイソ

ストロフィー症マウスに対するフォルフェニシノール投与の影響

プロティナーゼは，骨格筋のCANPはじめ，動7）高木昭夫（国立武蔵療養所神経センター）；

物諮臓器細胞に広く分布していて，カルパイン−ロイべプチンによる実験的治療
A［EC3．4．22．17］と総称される．また，カルパ

脱神経筋萎縮に対する効果

インに対する特異的内因性インヒビター蛋白質もB J〃びわro筋機能に対する影響同様に広く分布していて，われわれはこれをカル

8）埜中征哉（国立武蔵療養所神経センター）：

パスタチソと総称している．一方，カルパインに−塩酸ブビバカイン（マーカイン）処理による筋崩はその完全活性化に1mM以上のCa2＋を要求す

壊と筋再生に対するロイペプチソの影響 一′

るⅡ型と，0．1mM Ca2十で十分なⅠ型とが存在

9）野村達次（実験動物中央研究所）：一筋ジする．われわれは，カルパイン群に属するプロテ

ストロフィー動物の生産・供給

アーゼに共通なロイペプチン丹こよる阻害の機構を，

10）三善野産治（国立療養所西別府病院）：−

これまた共通なカルパスタチンによる阻害様式とDuchenne型筋ジストロフィー症に対す畠ベスタ

対比して研究する目的で，まず従来完成していな

チソの投与効果

かったヒト赤血球からのカルパスタチソの精製を

11）村上慶郎（国立療養所箱根病院）：一筋萎

試み，これに成功した．

縮症に対するロイペプチソ，べスタチソの効果

400mlのヒト血液の溶血上清を2回のDEAE−

12）木下真男（東邦大学医学部）：−A

セル。−ス，ultorogelAcA，SephacrylS−200

実験

的除神経筋に対するべスタナン投与の影響．B

クロマトグラフィーおよび熱処理を組み合せた方

神経筋疾患に対するベスタチソ，ロイペプチソの法で逐次分画し，約10，000倍の精製度で0．38

臨床効果．C

mgの均一蛋白質であるカル′ミスタチンを収得しべスタチソ，ロイペプチソの臨床効果および臨床5施設での集計

た．精製カルパスタチンは等電点4．55の酸性単

13）祖父江逸郎（名古屋大学医学部）：−Duch・

純蛋白質で，その単量体の分子量は70，000と算

enne型進行性筋ジストロフィー症患者に対する定された．きわめて集合しやすい性質を有し，通ロイペプチソ，べスタチンの影響

常は四量休の形（280kDa）で存在する．1000C，

14）里舌栄二郎（国立武蔵療養所神経センタ

15分間の熱処理でもその阻害活性を失わず，まー）：一各種疾患に対するべスタチン投与後の経た，カルパイソの阻害は反応系からのCa汁奪取

過報告に起因するものではない．アミノ酸分析の結果に15）田中 亘（日本化薬株式会社）：−ロイべ

よれば，ヒト赤血球カルパスタチソほ芳香族アミ

プチソの難病治療薬としての開発研究

ノ酸に乏しく，グルタミン酸およびプロリンに富−4−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイぺプチソ）の開発研究

む点で先に発表されたニワトリ骨格筋カルパスタ

定量に応用した．血清中0．32nmol／ml（100ng／

チソ（68kDa）に類似してはいるが，両者は明らmり以上のベスタチソが再現性よく測定しえた．

かに異なる分子である．カルパイン／カルパスタ

血清中のクーヒドロキシべスタチソは極めて低濃チソ／ロイペプチソ三者間の相互作用はまだ検討度であるため，現在のところ測定不能である．本を終えていない．

法により，三吉野産治班員より提供されたべスタ
チソ投与患者の血中濃度を測定し良好な結果を得

2．高速液体クロマトグラフィーによるベスタ

た．本法はヒト血液中ベスタチソの徴量定量が可

テンの微量蛍光定量

能で，動物体内における動態の検索に適用できる．

大倉班員はべスタチソの筋ジストロフィー症に対する薬効を判定する目的で，高感度定量法の開3．アレルギー性脳炎の治療に関する実験的研発研究を行った．

究
岩崎班員はロイペプチソの炎症性脱髄疾患に関べスタチソとそのヒトにおける主代謝物クーヒ

する基礎的研究を行った．

ドロキシベスタチソは，アルカリ性で遇ヨウ素酸
酸化され，それぞれフェニルアセトアルデヒド，

Cammerらの炎症性脱髄性疾患における髄鞘

クーヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとなる．

の破壊が，中性プロテアーゼによるミニリン塩基

これらを新規蛍光試薬4，5−ジメトキシー1，2−ジア性蛋白の破壊によることを示唆する報告，永井ら

ミノベンゼン・モノ塩酸塩（DDB・HCl）で蛍光による実験的アレルギー性脳炎のロイペプチソにラベル化し，HPLCに付すことにより定量可能よる治療成績，われわれが昨年報告したロイペプ

なことを兄いだした．

チソによるウサギ視神経の破壊阻止などの成績を測定法の概要は次の通りである．ベスタチソお

ふまえ，ロイペプチソの中枢神経の炎症性脱髄疾

よびクーヒドpキシべスタチソ溶液100／JJに1．5

MNH40H患への適応に関する基礎的実験を行った．

と0．6mg／mJNaL04を加え，定温

まず，高濃度のロイペプチソの神経毒性を調べ

で20分間放置後1．5mg／mlNa2SOSで過剰のる目的で10mg／mlまたは1mg／mlの濃度のロ

NaL04を分解するJ DDB・HCl溶液を加え37OC

イペプチソを50〟g／hr，14日間，各群5匹の成で50分間加温する．1．OMNaOHで反応を停止

熟ラットの脳内皮下に埋込み浸透圧ポンプを用いし，その100〟gをHPLCに付す．血清は，そて連続注入した．臨床的に異常を認めなかったのの50／上Jに水またはべスタチソ標準液と4．2mM

みならず，全例において組織学的検索でも全く異酢酸を加え1000C，5分間加熱後遠心して除蛋白常を認めなかった．

し，上清100／上Jを試料とする．HPLCは，カラ

次いで，脳血液関門を通過しないロイべプテン

ムにLichrosorb RP−18，溶離液にアセトニトリ

を脳実質組織に移行させる方法として，高張てこ

ルー0．1Mトリス緩衝液（pH8．7）を用い，蛍光検

トールの頸動脈内注入による脳血液関門の可逆的出（励起320nm，発光390nm）によって行う．

破壊実験を行った．ェバンスブルー標識アルブミ

標準液を用いた場合，べスタチソおよびクーヒ

ンは最初，脳内の血管にのみ限局していたが，術ドPキシべスタチソを12分以内に分離検出でき

後12−14時にはてこトール注入側の大脳皮質，

た．両物質の検出限度は，HPLC注入量100／JJ

脳幹の神経細胞にエノミソスブルーの蛍光が陽性とでともに5pg以下であった．これをヒト血清中なった．

のべスタチソおよびクーヒドロキシべスタチソの−さらにウイルス感染後脳症のモデルとしてセソ
5−ダイウイルス（HVJ）脳内接種了ウスにみられる位：後眼に単一刺数を加えると反射側前根から遅炎症，変性病変に対する効果をみた．非投与例6い時間経過の反射電位が記録され，この反射電位

匹全例に病変が出現したのに対し，ロイべプチソ

発生にはペプチドが関与していると思われる．こ

2mgを連日腹腔内に投与した群では病変の発現の電位はエンケファリンにより抑制され，この抑は6匹中3匹に減少していた．

制をロイべプチソは軽度に，べスタチソは著しく増強した．

4．ロイベプチンの薬理学的研究

d）ロイペプチソはアセチルコリンの脱分極作

大塚班員はロイペプチソおよびべスタチソの血用に顕著な括抗作用を示した．

圧，呼吸，血管平滑筋，ならびに摘出脊髄などに対する作用を検討した．

5．ロイベプテンの脱髄病変および培養ジスト

1） ウサギの血圧，呼吸，心電図に対するロイ

ロフィー筋への作用について

ペプチンの効果：ウレタン麻酔下にウサギの大腿米沢班員は脱髄疾患の特徴的病変である脱髄病

動脈から血圧を記録した．ロイペプチソ5−10mg／

変の誘起に関するプロテアーゼに対するロイペプkgを静脈内に与えると血圧は一過性に下降した

チソの効果を検討した．

が，呼吸数および心電図に変化はみられなかった．

Ⅰ．脱髄病変に及ぼすロイペプチソの影響

血圧下降の槙序としては先に報告した神経節遮断

脱髄疾患の特徴的病変である脱髄は免疫学的背作用が考えられる．

景による食細胞の賦活化を来し，髄鞘を特異的に

2）血管平滑筋に対する作用：モルモットの胸破壊する変化である．脱髄病巣でプロテアーゼ活

部下行大動脈を摘出し，らせん状に切って作った性の上昇することから，この食細胞での活性を抑条片をマグヌス管内に懸垂し，張力を記録した．

制することにより病巣の進展を阻止しうるという

ロイペプチソまたはべスタチンを2−200／喝／mJ

作業仮説が一部でなされている現状である．この．の濃度で適用したが，張力の変化は起らなかった．

ことを検討するた．め脱髄に関与する因子，抗体・しかし，べスタチソは／ルアドレナリン（0．3−2

感作リン㌧ペ球・リンフォカインのおのおのによる〟M）の血管平滑筋収縮作用を増強した．

神経組織培養での脱髄病変にロイペプチソがいか

3）幼君ラット摘出脊髄に対する作用：に影響するかを調べた．被検材料はヒトのMS，a）下行性抑制：高位同側側索の条件刺激によ

ADAM，サルやウサギのEAEより得たものでって単シナプス反射および後板電位は抑制を受けある．いずれの場合も，ロ剤前処置を行った培養たが，この抑制に対してロイペプチソ100〃g／mJ

でも，非処理培養でも，異なるところはなく，脱は顕著な影響を与えなかった．

髄の進行がみられた．

b）侵害刺激による反射電位：半裁脊髄を坐骨

プロテアーゼ活性が食細胞で上昇するにせよ，

神経，腰部および下肢が繋がったままとりだし，脱髄に関係する最初の変化は同細胞が髄鞘の層状

前根から電位を記録した．皮膚に戟械的侵害刺敦

構造を解離することにあり，髄鞘の脆弱性と相侠を加えると，L．＿さの前板から遅い時間経過の脱分って脱髄が起ると考えられる．したがって，プロ

極性反射電位が記録された．この反射電位はエン

テアーゼ活性が作用するよりも前に脱髄という現ケファリンにより抑制され，この抑制をロイペプ

象が起っているわけである．

チソおよびベスタチン200〃Mは著しく増強した．

Ⅱ．家鶏ジストロフィー筋および健康筋へのロC）ペプチド作動性シナプス伝達を含む反射電
一一

イべプチンの影響
6−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究

筋ジストロフィー家鶏（CaliforniaDavis413）

認められた．しかし，そのうち，2カ月以降徐々およびその対照動物（同412）の胚（10−13 日）に後肢の固直状態を発現する個体が現れ，4カ月の浅胸筋の培養を用いてロ剤の影響を調べた．ロ

齢で完全に正常状態を維持しているマウスは投与

剤は幼君培養細胞に対しきわめて毒性が強く，25

マウス全体の約1／3程度であった．これらの個体〟g／mgにて24時間内に中毒性顆粒の出現をみる．

では，臨床症状は全く消失し，筋の耐久力も正常

いったん病変を生じたものもロ剤投与を中止すると変わらないほど，増強されていた．また，このと回復してくるが，筋線経の発育成長の遅延が残ような完全回復個体が得られる頻度は投与開始時る．また筋原線経の発育も悪い．しかし比較的侵

期と相関性があり，生後20 日までにフォル7ェ

弟の少ない筋線経でもジストロフィー病変の出現

ニシノールの投与を開始すると約50％の個体に，がみられる．このことによりP剤によりプロテア

生後30日までに開始すると約30％の個体に完ーゼ抑制が生じてもジストロフィー病変の出現を全回復が得られた．しかし，1カ月齢を経過して阻止しえないものと思われる．

から連続投与を開始しても，もはや回復個体は得られなかった．これらの結果からimmunomodu・
laterを連続投与することによってマウスの筋ジ6．筋ジストロフィー症マウスに対するフォル

ストロフィー症の症状進行を抑制できる可能性が

7ェ二シノール投与の影響明らかになった．

松下班員は筋ジストロフィー症マウスに対する
ベスタチソの疾病回復効果の作用秩序を追求する手段の一つとして，フォルフェニシノールをべス

7．ロイベプテンによる実験的治療

タチソと同様な条件で連続投与する実験を行った．

A 脱神経萎縮に対する効果
B J乃γかro筋機能に対する影響

まず約1カ月齢ですでに症状がある程度進行している疾病マウスを用いて，1週間，2週間およ

高木班員は昨年度，ロイペプチソが脱神経後のび6週間の連続投与を行い，血清中ならびに骨格筋萎縮にわずかではあるが有意な抑制効果のある

筋中のマーカー酵素の活性変化を調べた結果，ことを認めた．本年度は例数を増やして，さらにPKおよびCPK酵素の活性は血清中で減少し，検討を行った．

骨格筋中で増加するという典型的な回復変化を示

哺乳類の骨格筋をf〝めroで反復収縮させる

し，筋線経での膜機能がフォルフェニシノール投と短時間で劣化現象が生ずる．この理由はまだ充与によって改善の方向に向かっていることが示唆分に理解されていないようだ．この経時的劣化にされた．萎縮骨格筋におけるミトコンドリア分画

対するロイべプチソ，べスタチソおよびペブスタ

中のGOT，GPT活性の著しい低下および可溶性

チソの影響を検討した．

分画中の活性増加傾向がフォル7ェニシノール投

方 法：一例坐骨神経を切断したラットにミニ

与によって，いずれも正常方向に改善されている

浸透圧ポンプを使用してロイペプチソ（30mg／ことが認められた．しかし一方，投与期間中の体kg／日）を投与した．7日目に前置骨筋（TA）長重増加は食塩水投与群と全く同じ変化を示し，臨

址伸筋（EDL）とひらめ筋（SOL）をとり出して床症状にも目立った改善の徴侯はみられなかった．

各種分析を行った．i乃如け0実験は重量20−30

そこで発症後できるだけ早い時期に投与を開始す

mgのEDLを使用した．通気（95％02−5％

るようにしたところ，投与マウスの約2／3に著しCO2）したKrebsTRinger液中で白金板電極によい体重増加および筋ジストロフィー症状の消失がり連続電気刺激を行い，等尺性張力を測定した．

−

7

−−一

また筋肉中あるいは外液中のCPK活性を測定し7，14 日目には明らかな再生線経として出現し，て，酵素遊離を検討した．

ロイペプチソ投与群ではそれぞれ平均線維径結

果：A：i）脱神経後の筋萎縮はSOLで24．4±5．3，29．9±6．4，非投与群では29．0±5．5，

最も著明で，健側の52％であった．ロイペプチ

36・5±6．2〟mであり，投与群で再生線経は有意

ソ投与群では61％であった（♪＝0．07）．TAやに小径であった．

EDLではこの効果はみられなかった．ii）pイ

BPVC処理筋でライソゾーム酵素，とくにカペプチソは健側および脱神経側で蛋白量を増加さ

テプシソB＆Lは48時間後著明に上昇し，再せる傾向を呈した．しかし統計的には有意ではな

生が進むにつれて次第に低下していった．ロイペ

かった．

プチソはカテプシソ活性の上昇は抑制せず，むしB：i）強縮張力は薬剤群ではやや低値であっろその値を上昇させた．

た・ii）1Hzの連続刺敵を継続して60分後には，

以上よりロイペプチソは筋の崩壊，処理に関与

単収縮張力は21％，強縮張力は32％に減弱した．

する貪食細胞に十分とり込まれず，ライソゾーム

薬剤投与群にも全く同程度の劣化が生じた．iii）

酵素活性は抑制しないと思われた．ロイペプチソ

60分後には両群において静止張力は約10％（p．

投与により再生筋が小径であったことは，ロイペ〇・に対して）増加した．iv）両群において筋内

プチソの大量投与による影響か，他の要因によるのCPK活性の約0−30％が喪失した．

ものか，その意味については，なお検討を要すると思われた．

8．塩酸7ビバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するロイぺプテンの9．筋ジストロフィー動物の生産・供給

影響

野村班員は筋ジストロフィー症治療薬開発研究埜中班員は過去にロイペプチソの生体に対する班の班員に筋ジストロフィー鶏の卵を供給する目

影響をみるため，筋ジストロフィー鶏，筋ジスト

的で，種卵の生産ならびに飼育の改良を行った．

ロフィーハムスターを使用し実験をしてきたが，さらに，米国産筋ジストロフィーハムスターの供陽性の結果は得られなかった．今回はヒト筋ジス

給を行うとともに，遺伝的背景の均一な筋ジスト

トロフィーと筋の崩壊像が酷似する塩酸プビバカ

ロフィーハムスターの育成を検討している．

イン（BPVC）を使用しての実験を行った．

10．Duchenme型筋ジストロフィー症に対す

Wistar系オスラット（約250g）を2群，すなわ

るベスタチンの投与効果

ちロイペプチソ50mg／kg／日（miniosmoticpump

2002使用）投与群と非投与群に分けた．各群を三吉野班員はべスタチソの臨床効果を評価する

さらに0．5％BPVC処理群と非処理群に分け，目的で，Duchennemusculardystrophy（DMD）

注射後48時間，7，14日臼に筋をとり出し，組症患児にべスタチンを投与し，臨床効果および副織学的，生化学的に検索した．

作用の検討を行った．

0．5％BPVCをヒラメ筋内に注射すると，95−1）対100％の筋線経は壊死に陥り，0．1％液ではそれ

象：年齢4−10歳，Stage1−2DMD患児13人を対象とした．

が局所的であった．壊死線経は48時間後には著

2）方法：ベスタチソは，Ausberger式を明な貪食反応を伴っていた．ロイペプチソ投与は用い，成人量30mg／日

その壊死，貪食過程に何らの影響を与えなかった．

ライシロップの形で1カ月連日朝1回投与した．

−

8

−

に相当する量を10％ド

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイぺプチソ）の開発研究

1カ月の休薬期間の後2倍に増量し，同様の方法

チソは筋ジストロフィー症では，不変または軽度で4倍量まで増量を試みた．

に悪化したもの2例，明らかに悪化したもの5例

3）結果および考察：血清CPK値を生化学的で，筋強直性ジストロフィーでは不変または軽度指標としたが，内服前後の値に一定の傾向はなく，に悪化したもの4例，悪化したもの4例であった．

各投与量問の差異もみられなかった．また，ADL，その他の筋萎縮症では有効であったもの（多発性10m走，階段昇降，立ち上がり時間でみた運動筋炎）1例，不変1例，悪化したもの4例であっ機能の改善も得られなかった．しかし，重大な副た．

作用が認められなかったことから，より大量かつ

副作用は胃障害5例，心房細動？

より長期にわたるプロトコールを計画し，今後の2例，一過性の発疹が1例であった．

研究を進める方針である．
12．筋障書に対するベスタチンおよびロイぺ
11．筋萎縮症に対するロイぺプチン，ベスタ

プチンの影響ならびに臨床施設での集計

テンの効果

木下班員はべスタチソ，ロイペプチソの筋疾患

村上班員は前年度に引き続き，種々の筋萎縮症患者に対する影響および実験的筋障害の修復過程にロイペプチソ，べスタチソを投与してその効果に及ぼす影響を検討した．さらにベスタチソ，ロについて検討を加えた．

イペプチソの臨床5施設での集計を行った．

対象としてはロイペプチソを使用したもの7例

1）実験的除神経筋に対するべスタチソ投与の（肢帯型，シャルコ一・マリー・トース病，脊髄

影響：ラット坐骨神経切断後，べスタチン2mg／

性進行性筋萎縮症，多発性筋炎，Duchenne型のkg，20mg／kgの注射を連続し，俳腹筋の変化をおのおの1例ずつ，筋強直性ジストロフィー症2

経時的に観察したが，対照との問に明らかな差は例）．べスタチソを使用したものは21例〔筋強直なく，除神経後の筋萎縮に対する本剤の効果は証性ジストロフィー症8例，筋ジストロフィー症7

明されなかった．

例（肢帯型4例，顔面肩甲上腕型2例，Duchenne2）神経筋疾患に対するべスタチソ，ロイペプ

型1例），その他6例（クーゲルベルグ・ヴェラ

チソの臨床効果一当教室での経験：現在，当教室

ソダー病2例，多発性筋炎2例，シャルコ一・マ

では17例の神経筋疾患患者にロイペプチソあるリー・トース病，Duchenne型筋ジストロフィー

いはべスタチソを継続投与中であり，最長3年に症の保因者の各1例〕であった．

及ぶが，わずかに血清CPKの低下をみた例と，投与方法はロイべプチソは100mg／dayから毎自覚症状の改善をみた例とがあるが，全体として

週50mgずつ増量して300mg／day，一部に450は著しい効果は両剤ともに認められていない．しmg／dayで維持量とした．使用期間は21遇からかし，本来進行性の病勢を示す疾患が対象である96遇であった．ベスタチソは90mg／dayから開から，本剤投与が自然の進行に対してどの程度阻始して毎週30mgずつ増量して270mg／day，一止作用を有しているかは明らかでない．
3）べスタチソ，ロイべプチソの臨床効果一臨部に480mg／dayで維持量とした．使用期間は12床5施設での集計：国立療養所西別府病院，同箱

週から87週であった．
成績はロイペプチソでは不変または軽度の悪化

根病院，国立武蔵療養所神経センター，名古屋大のみられたもの2例，明らかに悪化したもの5例

学，東邦大学の5施設の集計では，計72例のであった．副作用は特にみられなかった．べスタ

神経筋疾患患者にロイペプチソ，ベスタチソのい

−

9

−

ずれかを一定量連日，一定量間軟，漸増連日など

結果は，①運動践能とCPK活性値・ミオグロの方法で投与した結果，一部の症例で血清CPK

ブリンなどを総合的に評価すると，明らかに改善の有意の低下をみた．しかし，10m歩行，階段を示した症例やまたは進行が停止したと考えられ昇降などの運動機能で明らかな改善を示した例はる症例は存在しなかった．（彰凝固系に若干の有意

きわめて稀で，多くの判定資料のそろっているべ

な変動がみられたが，それ以外とくに薬剤投与にスタチソ群43例，ロイペプチソ群16例の投与前よる変化はなかった．また凝固系の変動も正常域後の各数値の比較では，両群とも悪化を示していでのことであり，臨床上問題とはならなかった．

た．しかし，これは前述のように進行性経過を示（め特記すべき自覚的副作用，合併症は出現しなかす症例が投与の対象であり，厳密な意味で効果をった．

検討するには投与前後の比較ではなく，基礎疾患，

以上，これら薬剤をDMD患者に投与した結初発年齢，羅息期間，投与期間に一致した観察期

果，1年間の投薬期間では今回の評価方法から明間を一致させた対照群の病勢の推移と比較する必らかな有効性は検出できなかった．安全性は高い

要があると考える．

薬剤と思われた．

14．各種疾患に対するぺスタテン（NK421）

13．Duchemne型進行性筋ジストロフィー症

投与後の経過報告

患者に対するロイベプテン，ベスタチン

里吉班員はベスタチソを各種筋疾患に投与し，の影響
祖父江班員はDuchenne型進行性筋ジストロ

臨床経過を検討した．

フィー症（DMD）患者にロイペプチソ，べスダチ

対象はLG PMD

6例，FSH PMDl例，

ソを投与して，本症患者に対する薬剤の影響をみDuchenne PMD l例，Becker PMD l例，

た．

myotonic dystrophy3例，POlymyositis5例，

対象はDMD患者17例で，これを以下の3群

dermatomyositisl例，distalmyopathyl例，に分けた．A群：ロイべプチン投与群でStage1−

ALSl例の計20例で，これらの症例に対し，4の老5例．B群：べスタチソ投与群でStage1−

NK421を30mg／日

より漸増投与した．最高投4の老5例．C群：べスタチソ投与群でStage5

与量は450mg／日

7例，360mg／日1例，270以上の老7例，薬剤は各1cap／日 から投与開始mg／日 3例，180mg／日 5例，90mg／日1例，し，3cap／日 を維持量とした．ロイペプチソは60mg／日1例，30mg／日 2例である．また経過

1cap50mg，3cap／日

観察期間は1カ月−1年7カ月である．なお，を維持量とした．ロイべ

プチンは1cap50mg，べスタチソは1cap30mg

myositisの4症例ではSterOid，Imuranを併用のものを用いた．各薬剤の影響を調べるために投した．

与前と投与後1カ月，6カ月，12カ月の時点で臨床効果判定には，1カ月ごとに10m歩行，①運動機能・：ADL，10m平地往復歩行時間，階

階段11段昇降時間，全身18筋の5段階筋力評価，

段昇降時間，G）CPK活性値，血清ミオグロブリ

血清PK，aldolase値を用いた．さらにLGPMD

ンの日内変動（午前5時30分，15時30分の2回），の4例に対し経過中2回にわたり（6カ月間隔），（め一般血液生化学，末梢血，尿の各検査，④凝

尺骨神経に電気的に低頻度反復刺激を与え，母指固・線溶機能，などの諸点に検討を加えた．また内転筋より筋張力，Stair caseの程度，収縮時間，自覚的副作用，合併症なども適宜チェックした．

1／2弛緩時間を測定し半年の推移を観察した．さ−10−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究

らに副作用監視のため末梢血一般生化学，尿蛋白プセル剤）の安定性についても，原末と同様な安を測定した．

定性が示された．

結果および考察：LG PMDの2例，myOSitis

3）薬効研究：線虫（C Ze乃Orゐ滋dffねeJggの∫）の3例の計5例に経過中一過性の自覚的な筋力改の野生株（N2）および筋肉発育異常を生ずる変善がみられ，うちLG PMDの1例，myOSitis

異株（E444）の形態および生態の観察を行い，その3例には他覚的な改善がみられた．しかし長期れに対するロイペプチソおよびその同族体，べス

的観察では臨床的改善を示した例はなかった．まタチソおよびその同族体，蛋白同化ホルモンの効た若干CPK値の低下傾向があったのはFSH

果を検討した．

PMD，myOtOnicdystrophyの各1例のみであっロイペプチソおよびその同族体に線虫の運動麻た．電気生理学的検索を施行したLG PMD4例

痺発現の遅延効果が認められたが，それは一般的のうち3例は症状の進行が示唆された（筋張力減

成長の遅延で説明のつく水準を超えなかった．ま少，収縮時間，1／2弛緩時間延長）．筋力，CPK

た，一般的成長の不全を解除できなかった．また，値とも比較的安定していた1例では，収縮時間，

ノマルスキー数分干渉顕敏鏡で観察される筋細胞

1／2弛緩時間ともに延長していたが筋張力に改善

Z線類似のデソス・ボディ配列にらいても改善はがみられた．以上の総合判定により明白な改善を認められなかった．

示した症例はなかったが，進行を遅らせている可筋ジストロフィーマウス（10−13週齢で既発症能性はある．投与中，複視，霧視，眼病，ふらつのもの）に脱毛しないままロイペプチソ軟膏をき，頭痛，消化器症状がみられたが，多くは一過

30mg／kg左右後肢部の全面にわたって1回また性でNK421との因果関係は不明であった．

は1日1回連続1カ月間塗布して一般行動と卒廻し運動とを観察したが，改善は認められなかった．

15．ロイぺプチンの難病治療薬としての開発
研究

このことは昭和55年度班研究報告に松下班員が，また，丹oc．ⅣdfJ．A

浸．gcf．UgA，1981に

田中班員はロイペプチソの難病治療薬としてのStracher博士らが記しているように，ロイペプ

開発研究の基礎研究を行うとともに，各班員にロ

チソまたはべスタチソを筋ジストロフィーマウス

イペプチソ，べスタチソを提供し，各班員から提の発症以前の幼君期（3週齢以前）から投与開始

供される血液，筋肉などの生物体試料中のロイペすることが奏効の条件であることを考慮すれば，

プチソ，べスタチソ量を測定することを目的とし，当然のことである．

ロイペプチソの1）原末試製，2）製剤研究，

ただし，同時に測定した筋肉中のロイペプチソ

3）薬効研究，4）毒性試験などを行った．それ

濃度は著しく高く，1回投与では1時間後に平均ぞれの研究結果を以下に要約する．

4．9／Jg／g，1カ月連続投与では3．1〃g／gが達せ

1）原末試製：硫酸ロイペプチソ原末4．5kgられていた．
4）毒性試験：微生物突然変異原性試験はぶ．

を製造した．3ロットを実施した．
2）製剤研究：室温18カ月の安定性を測定しiyPhimurium TA98，TAlOO，TA1535，TA

た．硫酸ロイペプチソ原末は室温18カ月で2％

1537，TA1538およびE．coliWP2uvrA

前後の力価低下を示し，その主因はC末アルギニ

6株につき，S−9ミックス添加の有無にかかわら

ナルのラセミ化であることを確かめた．

ず陰性であった．

臨床試験に提供している経口剤（散剤およびカ−11−のウサギにおける器官形成期投与試験によれば言母体に対する安全量は100−200mg／kg程度であワゼリン軟膏につき，1頭当り0．5gを剃毛したり，胎児に対しては300mg／kg程度までは著明

背部皮膚25cm2に週6回1カ月間塗布して，毒な毒性を示さないと結論された．

性および血奨中ならびに筋肉内ロイペプチン濃度

ウサギにおける経皮毒性試験を10％，20％，を測定した．

−12−

分

担

研

究

報

告

ロイペプチンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

村

地

孝＊

研

研 究 日 的究

方法

ニワトリ骨格筋のCa2＋依存性中性プロテアー

材料となるヒト赤血球は，健康人からの採取血ゼ（CANP）がロイペプチソによって強く阻害さより白血球および血小板を注意深く除去して得た．

れることはよく知られている．われわれは，ラッ

5倍容量の1mM EGTAおよび5mM2−メルカ

ト肝臓，脳，腎臓，牌臓，赤血球，胸腺などに広プトエタノールを含む20mMトリス・HCl緩衝

く分布する同種のプロテアーゼが，そのCa2＋要液（pH7．5）を加えて溶血させ，30分間10，000g

求性およびSH還元剤要求性において，CANP

遠沈上清を上記の緩衝液に50mM NaClを加えと著しく類似していることを知り，これらに対す

た溶液に対して一夜透析して，これを精製の出発

る放線菌由来の一群のプロテアーゼ阻害剤の効果材料とした．
プロテアーゼ活性は，50mMトリス・HCl緩を検討したところ，とくにロイペプチソによって衝液を用いたカゼイン加水分解により定量した．

強い阻害を受けることを兄いだした．
そこで，骨格筋のCANPに関する進んだ知見

通常，pH7．5，300Cで30分間温置によるトリクと平行して，上記の全身組織細胞に広く分布してロル酢酸可溶性ペプチド等の増量をFolin−

いるCa2十依存性システイソプロティナーゼ（以Lowry法により，750nmの吸光度増加として計

下カルパインCalpainと総称する）について，そ測した．のちに述べるように，カルパインには，の精製と性質の研究を系統的に展開することにしⅠ型とⅡ型の2種があるので，Ⅰ型の定量にはた．とくに，カルパインを特異的に阻害する細胞

0．1mM CaC12を，Ⅱ型の定量には5mM CaC12

内イソヒビタータンパク質の存在を発見したので，を活性化剤として加えた．いずれの場合も5mM

これをカルパスタチソ（calpastatin）と名づけ，

L−システイソを共存させた．プロテアーゼの1単

その精製と性質についても研究を行うこととした．

位は750nmの吸光度1．0の増加を30分間で与これらの研究を通じて，ロイべプチソのプロテえるべき酵素量と定義した．

アーゼ阻害作用の一般的分子機構を解明するととカルパイソに対するカルパスタチソの作用をみもに，その生理的病態的意義を明らかにすることるためには，カルパスタチソ標品を予めカルパイ

が本研究の目的である．

ンとpH7．5，300Cで10分間接触させたのちに，反応混液のカゼイン加水分解活性を測定し，活性■ 京都大学医学部附属病院検査部の低下度を計測する方法を用いた．1単位のカル−15−スタチソとした．

パインを失活させるインヒビター活性を1単位とした．

表1に総括するとおり，400mg血液より0．38
mgの精製標品を得た．表の第（3）段階までほカ
研

究

結

果

ルパインとカルパスタチソの相互分離が達成されヒト赤血球シトソル画分よりカルパスタチソをていないので，真の精製度を直接計測することが均一タン㌧ペク質として精製し，その諸性質を明らできない・すなわち，第（3）段階からの比較ではかにした．

32・1倍にすぎない精製度であるが，溶血液から

1．カルパスタテンの精製の推定比較では約10，000倍の精製となる．第出発材料700mlを400mlのDEAE一セルロ（5）段階，すなわち熱処理が精製度を飛躍的に高ースゲルと混じこれを十分洗浄することによっめていることがわかる．熱処理でなお僅かに残ってヘモグロビンを除去したのち，カルパスタチソ

た混在タンパク質が最後のSephacrylS−200カ

活性画分を150mMNaCl含有緩衝液によって溶

ラムで除去される．

出させた．ついで溶出液をアミコソPM−10によ精製の第（3）一（6）段階でのSDS−ポリアクリ

り濃縮し，これをUltrogelAcA34ゲルカラム

ルアミドゲル電気泳動の結果を図1に示す．すでによって分画した．カルパスタチソ活性の大部分に第（4）段階の標品でも，カルパスタチソ活性はは280kDaの位置に溶出され，一方カルパイソ活

70kDa付近に局在しており，これがそれ以降の性は80kDa付近に溶出されたので，この操作に段階で純化されてゆく過程がよくわかる．最終段

よって酵素とインヒビターの完全分離の行われた階では70kDaの単一バンドを与えている．図1

ことが知られた．280kDa画分を第2回目のはFairbanksらの方法によった結果であるが，

DEAE−セルロースクロマトグラフィーにかけ，

Laemmli法によるときは，標晶によって70kDa

溶出されてくるカルパスタチソ活性画分を10mgのほかに68kDaのバンドの現われる場合があっに濃縮したのち，pH7．5で1000C，15分間の熱たが，その原因を明らかにすることはできなかっ処理を行い，その遠沈上清をコロジオンバッグでた．

濃縮してSephacrylS−200ゲルカラムにより分画した．再び280kDa画分を集めて精製カルパ

表l PurifiCationof calpastatin from human erythrocyte cytosol
Totalactivlty Specific actlVlty

Units（1）Hemolysated（supernatant）

39，900（2）lst DEAETCellulose（eluate）

271

117

（4）2nd37．4

fraction）

Units／mg protein Foldb FoldC（2，710）e（2，710）0（3）UltrogelAeA34（inhibitor fraction）
DEAE一ccllulose（inhibitor

％

2，710
1，270

（5）Heattreatment（1000C，15min；Supernatant）1．92

895（6）SephacrylS−200（peakfraction）

284

0．38

（0．068）f l（10．0）f

100
46．9

33．0
10．5

23．2
34．0

466
747

141
1

341

1．47

20．1
32．2

500

6，853
10，985＆Calculated ontheassumptionthatA主監＝10・Correctionforhemewasmadeinthecaseofhemolysate．
bAfoundspeciAcactivityof23・2units／mgproteinforstep3wastakenas unity．C Adeduced specinc
activityofO・068units／mgproteinforsteplwastakenasunity・d From400mlofblood．e Totalactivity
in these fractionscouldnotbe directly determinedand was therefore assumed to be equal to the total
activityfoundinstep3・fThevaluewasobtainedfromthededucedtotalactlVlty・−16−ロイペプチンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究
Fr．N。．（3）

（4）

（5）

（4）

（6）

MARKEREXTRACTIONFROM SDS−PAGE

一一94．01（

一一67．OK

一一43．OK

一一30．0K

H20．1K
0．2

0．1

一一BPB

0

CALPASTATIN（relaliveunits）

図1SDS−pOlyacrylamide gelelectrophoresis of human erythrocyte calpastatim Numbers
in parenthesesindicatethepuri魚cationstepslistedinTableL Theelectrophoresiswas

performed at8mA per tube forl・5hr・The proteinsmigrated from the cathode to
the anode．They were stained with Coomassie Brilliant Blue．Marker proteins usedwere phosphorylase b（94．OK），bovine serum albumin（67・OK），OValbumin（43．OK），
Carbonicanhydrase（30・OK），andsoybeantrypSininhibitor（20・lK）・BPB，BromoplenoI
Blue．The gelfor the materialafter step4was slicedin O．9−cm SegmentS，eaCh ofwhich was analyzed for the content of calpastatin・

2．精製カルパスタチンの諸性質ても γ−カルポキシグルタミン酸の存在は検出さ1）等れなかった．またへキソサミソも検出されていな

電点

7％Pharmaliteを含むアガロースゲル薄層をい．表2にはIshiuraらによるニワトリ骨格筋カ

用いた電気泳動法により，ヒト赤血球カルパスタ

ルパスタチソのアミノ酸組成を併せて掲げてある．

チソのpIは4．55と測定された．この値は，ウ両者の組成比は全般的に類似していることがわか

サギ骨格筋カルパスタチンについて予報的に示さる．
3）オリゴマー構造れたpI6．0よりはるかに酸性の値である．
2）7ミノ酸組成

図2は精製最終段階のゲルクロマトグラフィー

6N塩酸，1050C，48時間および72時間加水分

でカルパスタチソが280kDaの位置に溶出され解によるアミ／酸分析の結果を表2に掲げる・トることを示す（黒丸）とともに，一旦採取したカ

リプトファンは0．5％チオグリコール酸含有6N

ルパスタチソをSDS−ゲル電気泳動で70kDaバ

HClによる加水分解法によって定量したが，こンドとして把えたのち（図1），これをゲルかられを検出することができなかった．バリソ含量を抽出して再びゲルカラムで分析すると，また280

21．0残基として近似整数を求めると，1分子当kDaの位置に出現する（白丸）ことを示していり643残基となり，分子量は69，369と計算される．すなわち，精製カルパスタチンは70kDaのた．この値は電気泳動で得られた単量体の分子質

単量体を基本単位として，おもに四量体に集合し量70kDaとよい対応を示している．半シスチソて存在しやすい性質をもっている．このような残基は1残基以下，おそらくは0残基であったが，70kDaと280kDaとの相互移行現象は，精製のより正確な値は，たとえば過ギ酸酸化後の分析結

途中で1000C，15分間熱処理という烈しい操作を果にまたなければならない．アルカリ分解によっ加えた結果生じたものではない．一方，Ishiura

−17−

表2

Amino acid composition of calpastatinfrom human erythrocytesascomparedwiththat from chicken skeletal muscle

erythrocyte＆muscleb

18Aspartic acid

53
38
2
6

Serine52
69Glutamic acid

96
43

4
3
1
6

AlanineHalf・CyStine O．8
Valine21
Methionine

7

Isoleucine

14

Leucine51

Tyrosine

6

Phcnylalanine

8

Lysine78

Histidine

6

Arginine

20

Tryptophan

Od

Tota1

643

＆Allvalues

werebasedupon2l70

7 d 4 7 9 1 8 8 6 8 2 J 2
4 ・ n4
1 4 1
3 1 2
n 6 1

Glycine0

56ProlinevalineFractionnumber（2m】／tube）

国2 Chromatography of human erythrocyte cal−pastatinonaSephacrylS−200Column．● cal・
pastatin after the step of heat treatment；OCalpastatin extracted from the gel after SDS−
POlyacrylamide gel electrophoresis．Al．6×95
cm COlumn was used．Horizontal barindicatesthe fractions collected as theSis．70K−band protein was extracted fromthegel，COnCentrated and rechromatographed on

Sephaeryl S7200．Molecular weight markers
used were ferritin（440K），Catalase（232K），
and bovine serum albumin（67K）．

residues

4

ルパスタチソの易集合性と著しく異なっている．
性

1

量をつねに示すと報告されており，ヒト赤血球カ2などの変性剤の存在有無に拘わらず，68kDaの質3︵貢で可︶言三U■U 三〇ヱ○占らの得たニワトリ骨格筋カルパスタチソはSDS

応

final product，Which was then subjected to gel electrophore・

per molecule．b Taken fromIshiura，S．，Tsuji，S．，
Murofushi，H．，and Suzuki，K．Biochim．Biqt・hys．
Acla 701，216−223、（1982）；Calculated for MW
68，000．C Not determined．d Byhydrolysisinthe
presence of O．5％thioglycolie acid．

4）反

20

2
3

Threonine30︵lE＼S一H亡ヱuコヱS已lqU

Human Chicken skeletal

Amimo acid

1

2

3

4

5

Ca2十（mhl）

精製カルパスタチソはその添加量に応じてカル

図3

パイン活性を阻害するが，この作用は反応系に過Effect ofCa2＋concentration on theinhibition
Of calpain by calpastatin，both from humanerythrocytes．Puri丘ed calpastatin added per

剰のCa2＋を添加しても除去されない（図3）．しtubewere：O zero；△ 0．21pg；● 0．35FLg．

たがって，かねて粗標品で認められていた通り，

Each tube contained O．33units of calpain．

カルパスタチンによるカルパインの阻害はCa2＋活性化される分子桂であり，カルパインⅡは400の奪取に起因するものではない．

〟M Ca2＋を50％活性化に要する分子槙である．

図4は精製カルパスタチソが，同起源のヒト赤

図4は同量のカルパスタチソがカルパインⅡのは血球カルパインを阻害するのみならず，ラット肝うをより強く阻害しうることを示しており，赤血臓カルパインをも阻害することを示している．ラ球カルパインはこの阻害パターンからも，かねてット肝臓カルパインⅠは40′上MCa2＋により50％報告されている通り，カル′ミインⅠに屈する酵素−18−

ロイべプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

チソをヒト赤血球シトソル画分から均一タンパク質として精製することができた・精製カルパスタ
チソは等電点4．55の酸性単純タソバク質で，約643残基からなる一本鎖構造の70kDa単量体が通常四量体構造をなしたものであることが知られた．そのアミノ酸組成は，ほとんどS−S結合を含まず，トリプトファンを欠き，芳香族アミノ酸1．0に乏しく，一方，グルタミン酸およびプロリンに

HuI旺nerytbrocytec8IpaStatin（〝g／tube）

富むやや特異な組成であることが知られたが，こ0．5

図4 0rgan and species specificityofinhibitionby
human erythrocyte calpastatin・● ratlivercalpainI；O ratliver calpainII；△ human

れからだけではカルパスタチソの示す高度耐熱性

erythrocytecalpain・Theealpainsusedwerethe

四量体構造をとりやすい性質を考慮し，またそ

preparations partially purified from respective
sources；0．33
eaehunits of calpaln WaS added totube．Ca2＋concentrationsin

theincuba−の機構は明らかにしえない．

の阻害作用が反応系からのCa2十奪取によるもの
ではない点を取り入れて仮設的に描いた相互作用

tionmediumwere：0．1mlt for ratlivercalpaln
I and human erythrocyte calpain，and5mllfor
ratliver calpainII．

機構が図5である．今後この図に示された機構の正否を明らかにし，また，ロイペプチソによる阻害機構との関連を明確にすることが残された興味であることがわかる．

ある研究課題である．
考カル′リンおよびカルパスタチソに関してわれ察

カルパインに対するロイペプチソの阻害作用を

われは，ヒト赤血球カルパスタチンの精製研研究する目的でカルパインを精製するとともに，

究1・9）のほかに，広く動物および植物細胞材料に

その天然の内在性インヒビターであるカルパスタ

っき同様の研究を展開し，それぞれの成果をあげ

protein■一

一一

NOH↑Uくだ凹トNl ON

Substrate

Monomerie
Ca】pastatin

J
／
／
′

／

／⊥ca2十Calpain（Ca2＋）−CalpastatincomplexCalpain−Calpastatininteraetion

CaIpain−Substrateinteraction

図5

Hypotheticalmechanismoftheinteractionbeweencalpain，Calpastatin
and the substrate molecules as triggered by Ca2＋．

−19−

つつある卜8・10）

皮細胞のCa2＋依存性チオールプロテアーゼ（カルパイン）について．日本眼科学会誌86，717−
文

723（1982）．

献6）舌村長久，松田晴子，村地 孝，塚原 勇．培養
網膜色素上皮細胞のプロテアーゼ．生化学54，

1）Takano，E．and Murachi，T．PurifiCation andSOme prOperties of human erythrocyte cal−pastatin・J・Btochem．92，2021−2028（1982）．
2）Murachi，T．Calcium−dependent proteinases
and specific inhibitors． Abstracts，12th

796（1982）．

7）村上俊男，畑中道代，村地 孝．ニワトリ赤血球のカルパインーカルパスタチン系．生化学54，796（1982）．

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3）Murachi，T．and Kojima，K．Calcium−depen−8）菊池孝信，村地 孝，田中隆治，太田喜元．ゼニ
ゴケ（肋rCんα乃〟α♪oJプ桝0呼九αL．）培養細胞のカルノミイン．生化学54，797（1982）．

dent thiol pr・OteaSe（calpain）andits endo・

9）高野恵実子，菊池孝信，村地 孝，田中隆治．精製ヒト赤血球カルパスタチンの性状．生化学54，

genousinhibitor protein（calpastatin）in
malignant tumor cells．Abstr・aCtS，13thIn−
ternational

CancerCongress，September8→

15，1982，Seattle，USA，p．536．
4）村地 孝．カルパスタチン，蛋白質核酸酵素
27，1707−1714（1982）．

993（1982）．

10）並河千里，谷口佳子，佐々木 実，安本洋子，高野恵美子，村地 孝・ヒトα1，2TPIによる各種
組織Ca依存性チオールプロテアーゼの阻害．生
化学54，993（1982）．

5）松田晴子，吉村長久，村地 孝．培養網膜色素上−20−

高速液体クロマトグラフィーによるべスタテンの微量螢光定量

大 倉 洋 博＊
研究協力者 三吉野産治＊＊・石田淳一＊・山口政俊＊・弓場郁代＊

のみを定量しうる方法を得た．この方法をBestはじ

め

投与患者の血清Best濃度レベルモニターに実用にべスタチソ（Best）の薬効を判定するための一を試みた．この方法で用いたBestおよびクーOH

手段として，Bestおよびそのヒトにおける主要Bestの蛍光ラベル化反応のスキームを図1に示

代謝物，クーヒドpキシべスタチン（クーOHBest）

す．Bestおよび9−OH Bestをアン㌧モニ77ルの生体内濃度をモニターする方法の検討を行った．

カリ性で過ヨウ素酸酸化し，生じるフェニルアセ

まず，Bestおよび2−OH Bestの標準液を用い

トアルデヒドおよびクーヒドロキシフェニルアセ

て，高速液体クロマトグラフィー（HPLC）・蛍

トアルデヒドを，新しい芳香族アルデヒド類の選光検出法により，これらを微量定量するための基

択的蛍光ラベル化剤，3，4−ジメトキシー1，2−ジア

礎的研究を行った．つぎに，これをヒト血清中のミノベンゼンモノ塩酸塩（DDB・HCl）1）と，塩酸

Bestの定量に応用するため検討したところ，Best

酸性で蛍光ラベル化し，ラベル化体をHPLCで分離・定量する．

CH（CH3）2
1

R◎cH2−

CH2

NH2

t

1

実

CH−CH−CONH−CH−COOH

方法1）試薬溶液OH（bestatin，R＝H；P−hydroxybestatin，R＝OH）

DDB・HCl（1．3mM）溶液；DDB・HC15．3mg

蒜R◎−CH2CHO

を0．3M塩酸に溶かし，全量20mg とする．調整後3時間以内に使用する．

N、〈／OCH3

DDB・HCl

験

R−◎−C H2−♂ 二二二2）基準操作N／〉、OCH3a）試料溶液（血清の前処理操作）：血清50扉に水（あるいはBest標準液）50〆および4．2

溶：：；・HClmM酢酸500βを加え，1000Cで5分間加熱す
る．約800gで5分間遠心したのち，上活100〆

DDB・HCl

図1FluorescencelabelingofbestatinorPThydro・を試料溶液とする．
b）蛍光ラベル化反応：上記の試料溶液あるいxybestatin with DDB・HCl・＊ 九州大学薬学部薬品分析化学教室＊＊ 国立療養所西別府病院

はBest標準液100〟に1．5Mアンモニア50〃〜
および0．6Ing／mg過ヨウ素酸ナトリウム 25JJJ−21−

を加え，室温（250C）で20分間放置する．1．5
mg／mJ亜硫酸ナトリウム25由仁を加え，過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを分解する．DDB・HCl溶液200βを添加し，■370Cで50分間加温したの
ち，1．OM水酸化ナトリウム50／上Jを加えて反応を停止する．反応液100／JJをHPLCに付す．
C）HPLC：逆相分配型の充填剤であるLi・
ChrosorbRP−18（Merck；粒径5iLm）を充填し

l

l

t

1

0
4
812
Retentiontime，min

たカラム（150×4mm，i．d．）を使用する．移動相には，アセトニトリルー0．1Mトリス緩衝液（pH

図2

Chromatogram of the reaction mixture of aStandard solutionofbestatinandP−hydroxybes−

8．7）の混液（25：75，Ⅴ／v）を脱気して使用．高tatin・Peaks：1，9−hydroxybestatin（1×10￣6ふⅠ）；

速液体クロマトグラフには，東洋曹達803Dを使

2，bestatin（1×10−6hI）；3，reagent blank．

用し，流速0．8ml／minに設定した．検出器には，ソモニアアルカリ性で過ヨウ素酸酸化すると，そ島津RF−5308uorescencespectromonitor（蛍光れぞれ7ェニルアセトアルデヒドおよび♪一ヒド

励起波長320nm，発光波長390nm）を使用した．

ロキシフェニルアセトアルデヒドを生成することがわかった・したがって，BestおよびPTOH

結果および考察

Bestを定量するために，これらのアルデヒドの当分担研究者らが新たに開発した，芳香族アル

DDB・HClによる蛍光ラベル化体をHPLCによ

デヒド煩に特異的な試薬であるDDB・HClを用って分離・検出することにした：ちいる蛍光ラベル化反応は，芳香族アルデヒド煩を

1．HPLCによる分出条件

塩酸酸性下で0−1000Cで反応させる方法である．

BestおよびP−OH Bestの蛍光ラベル化体は，

本研究において，まずこの反応をBestおよびHPLCの充頃剤にLiChrosorb RP−18を，また2−OH Bestの蛍光ラベル化反応に適用するため移動相にアセトニトリルー0．1Mトリス緩衝液の検討を行った．Bestおよび9−OH Bestをア（pH8．7）を用いたとき良好に分離した．Bestお

30

35

10

25

20

亡⁝E．聖E叩一uO叩盲ヱ遥

量官で蔓占
20

40

25

AcetonitriIe，％（Ⅴ／v）

30

35

40

Acetonitrile，％（Ⅴ／v）

図3 Effect ofacetonitrile concentrationin the mobile phaseonpeak
height（A）and retention time（B）・1，bestatin（1×10￣6ふt）；2，♪−hydroxybestatin（1×10−8M）．
−22−高速液体クロマトグラフィーによるベスタチソの微量蛍光定量

亡⁝u．むE⁝︺亡0叫一宏烹虚〆ノー〝ヱィ】パ
．．⊂：
bO
む
■＝

〆一一一・⊥Lr一一

■⊥：
d
lU
L

7．0

7．5

8．0

8．5

一・⊥一一一一一一一一、1

10

9．O

7．0

7．5

pH

8．0

8．5

9．O

pH

図4 Effect of pH of the mobile phase On peak height（A）and retentiontime（B）．1，bestatin（1×10￣6M）；2，9−hydroxybestatin（1×10−6M）・

よびクーOH Bestの標準液（各1×10￣6M）を試

2．蛍光ラベル化反応

料溶液として基準操作のb）およびC）に従ってすでに述べたように，BestおよびP−OH Best処理したときに得られるクロマトグラムを，図2

は，直接にはDDB・HClと蛍光反応しないため，に示す．Bestおよび9−OH Bestの蛍光ラベル

アンモニアアルカリ性下過ヨウ素酸ナトリウムに化体は，12分以内にそれぞれ単一のピークとし

よって酸化し，それぞれフェニルアセトアルデヒて分離溶出される．使用したカラム充填剤は，シドおよびかヒドロキシフェニルアセトアルデヒ

リカゲル担体にオクタデシルシランを化学修飾しドに導く．遇ヨウ素酸ナトリウム濃度について検たものである．この充唄剤は逆相分配型であるの討し（図5），Bestおよび9−OH Bestともに最で，移動相のアセトニトリル濃度が高くなると各大のピーク高さを与える0．6mg／mJを用いた．

蛍光ラベル化体は速やかに溶出し，かつ鋭いピー

この酸化反応に要する時間および温度（図6）にクを与える（図3）．移動相のアセトニトリル濃ついて調べ，室温（250C）で18分以上放置する

度を25％とした．図4に示すように，移動相中ことにより最大かつ一定の蛍光を得た．室温で20のトリス緩衝液のpHが7．0−9．0において各ラ分放置することにした．DDB・HClによるアルデ

ベル化体の分離状態は良好であるが，Bestおよ

ヒド類の蛍光ラベル化は，残存する過ヨウ素酸ナ

びクーOH Bestの蛍光ピークは，アルカリ性側にトリウムによって妨害されることが認められた．

おいて徐々に高くなる．これは，各ラベル化体がアルカリ性で強い蛍光を発することによるものである．したがって，pH8．7の0．1Mトリス緩衝．．」＝ヒ￠液を使用することにした．このときpH8．7のト

qJ
．．」＝
J

リス緩衝液の濃度変化（0．05−1．OM）によって，

tq
q

仁一

各蛍光ピークの分離状態ならびにそれらのピークの高さには，著しい相違はみられなかった．なお，
pH9．0より高いpHの緩衝液を用いた場合，カ00．06

ラム充填剤の劣化が著しく，長時間それを使用す
るには不都合であった．

0．18

0．36

0．6

0．72

NaIO一．mg／ml

図5

Effect of NaIO▲

COnCentration on the

fluo

rescence development．1，bestatin（1×10−6M）；
2，3，−hydroxybestatin（1×10−6Ll）．
■i一一・・23−

2

0

2

5

10

15

20

25

30

図6 Effect of time and temperaturefortheoxida−
tion of bestatin and
NaIO40n

図7♪−hydroxybestatin withthefluorescencedevelopment

3

4

5

6

Na2SO3，mg／ml

Time．minEffect of Na2SOa COnCentration on the nuo・
rescence development NaIO4uSed，0．6mg／mL．
1，bestatin（1×10￣6Ll）；2，♪−hydroxybestatin

NaIO▲（1×10￣hI）．

used，0．6mg／ml．l and3，bestatin（1×10−6M）；2and4，9−hydroxybestatin（1×10￣8M）．l

and2，250C；3and4．00C．

一もて工一志d

一息官jJ更正
0

0．3

0．6

0．9

HCI，M
図9

Effect of HCI concentration on the nuores．
CenCe development NH40H used，1．5hl．1，
bestatin（1×10−6ふⅠ）；2，9−hydroxybestatin（1×10￣6M）．

図8

Relationship between the concentration of
NH40H required for the oxidationandHClforthe且uorescence derivatization．1and2，0．31I
HCl；3 and 4，0．6AI HCl．1and 3，bestatin（1×10￣6Ll）；2

and4，♪−hydroxybestatin（1×加し，室温（25eC）で20分間放置後，1．5mg／mg
亜硫酸ナトリウム25βを加える操作を設定した．
つぎに，蛍光ラベル化条件について検討した．
過ヨウ素酸酸化は，アンモニアアルカリ性下で行

10￣6ふⅠ）．

われるが，生じたフェニルアセトアルデヒドおよ

この妨害は，ラベル化反応前に亜硫酸ナトリウム

びクーヒドロキシフェニルアセトアルデヒドとを加えることにより，過ヨウ素酸を分解すれば解DDB・HClの蛍光ラベル化反応は，塩酸酸性下で消できることがわかった．この濃度について検討行う必要がある．図8および図9は，アンモニアし（図7），最大の蛍光を与える1．5mg／mJを使濃度と塩酸濃度の関係について調べたものである．

用することにした．以上の検討により，酸化反応

本法では，1．5Mアンモニアと0．3M塩酸を使用として試料溶液100J上Jに1．5Mアンモニア50β

することにした．図10は，基準操作に準じた条と0．6mg／mJ過ヨウ素酸ナトリウム25／JJを添件において，蛍光ラベル化の反応時間とその温度ー24−高速液体クロマトグラフィーによるベスタチソの微量蛍光定量

ふ‖晶

トト最長

Retentiontime，min Retentiontime，min
0

5

10

15

20

30

40

図1l Chromatograms of bestatin andクーhydroxy−50

bestatin added to human serum．A，Serum

Reaction time，min

added with bestatin（320pmol／50FLl）and♪−

図10 EfEect of reaction time and temperature onthe瓜uorescence development．1，3，andhydroxybestatin（150pmol／50FLl）；B，drug−

5，

free serum．Peaks：1，bestatin；2，2−hydroxy−

bestatin（1×10−6M）；2，4，and6，9−hydroxy−

bestatin．

bestatin（1×10−6Af）．l and2，37℃；3and4，
500C；5and6，1000C．

（各150pmol／50β血清）の回収率は，いずれもの影響をみたものである．370Cで50分間の反応78％で，これら2つの方法においてほぼ同様の条件を採用した．また，加熱後ラベル化反応液を結果を得た．また，④の方法は，そのままでは強基準操作法に述べたようにアルカリ性に導けば，酸性であるため，後の反応条件であるアン㌧モニア

生じた蛍光ラベル化体は安定で，少なくとも室温

アルカリ性に再現よくするのが困難であった・しに3時間放置しても，得られる蛍光ピークは，一たがって，操作の簡単な加熱除蛋白法を採用した・

定の高さを示した．標準試料を用いたときのBest

Bestおよび9−OHBestを添加したヒト血清なおよびクーOH Bestの検出限度（S／N比が2をらびに無添加の同一血清を，基準操作に従って処

示す濃度）は，ともに5pg／HPLC注入量である．

理したときに得られるHPLCのクロマトグラム

3．ヒト血清中のベスタチン（およびp−OHを図11に示す．保持時間11分にBestに基づ

Best）の定量

くピークが現われる．他の数本の蛍光ピークは，

ヒト血清中のべスタチソをHPLC検出する場

試薬ブランクに基づく蛍光ピーク（検出感度を上合，血清中に多量の蛋白質が存在するため，血清げた場合に観察される）と，血清中に存在する種をそのまま試料として用いることはできない．こ種の化合物および除蛋白されなかった低分子の蛋のため，血清を除蛋白処理し，これを試料溶液

白質やペプチド掛こ由来する蛍光ピークであるととして用いた．除蛋白法として，①血清に希酢酸考えられる．基準操作に従ってヒト血清に添加しを加え，はばアルブミンの等電点pH5．0に導いたBestおよび9−OHBestの検量線を調べた・て1000C，5分間加熱する方法（加熱除蛋白法），

血清に添加したBestおよびP−OH Bestの蛍光㊤血清に過塩素酸を添加し，遠心後上清に炭酸カ

ピークは，いずれも少なくとも20／唱／mJ血清まリウムを加え過剰の遇塩素酸を除去する方法，おでその添加量に比例したピーク高さを示し，原点よび④トリクロル酢酸を添加する方法を用いた．

を通る直線を示した．つぎに，検出限度について①および㊤は，同様の蛋白質除去効果が得られた．

調べた．Bestおよび2−OH Best無添加の血清

また，血清に添加したBestおよび2−OH Bestにおいても，Bestおよび9−OHBestと同じ保−25−

ことは，不可能であった．血清を用いた場合，
BestおよびPTOH Bestが十分に定量可能な，それぞれブランクのピーク高さの1．2倍を検出限度としたとき，それぞれ100ng／mJ血清，200
ng／ml血清であった．変動係数は，血清中Best
濃度が3pg／ml，および500ng／mlのとき，それぞれ1．8％および3．0％（それぞれ乃＝10）であった．
この操作法に従って，筋ジストロフィー患児にBestを経口投与し，血清Best濃度モニターを行
＝m

l

l

l

l

い，本法の有用性について検討した．血清は，三＝0 4 81216
0 4 81216
Retentiontime，Znin Retentiontime，mim

図12

吉野産治班員より供与されたものである．一例とChromatograms of bestatininhuman serum
Obtained30min after oral administration（25mg／17kg）・A，bestatin treated；B，COntrO1．
Peak：1，bestatin（3．4FLg／ml）・

投与30分後の血清により得られたクロマトグラ
ムを図12に，血清濃度曲線を図13に示す．患者13名に関する血清Best濃度については，三105

吉野班員の報告を参照されたい．

1
5
0

お

あ

り

に

本研究において，プレカラム蛍光誘導体化法に

l．
■
．ヽ︶
0
0．
0

一∈＼笠．uO叫一己lUgu8∈己品

0

図13

して，投与前の血清（コントロール血清）およびよるHPLCにより，Bestを分離・定量することが一応可能となった．本法により Bestを投与し0．51
2
3Time afteradministration，hr

た患者血清中の数量のBestをモニターすること

Serum concentration of bestatin after oralができる．9−OH Bestは，きわめて低濃度で，administration of bestatin（25mg／17kg）in

本法では投与30−60分後でも検出できなかった．

human（male，5years of age）．

定量の妨害をするピークの原田の除去，および持時間にピークが認められる（図11，B）．これは，クーOH Best定量の高感度化が必要である．

血清中に存在し，フェニルアセトアルデヒドおよびクーヒドロキシフェニルアセトアルデヒドに導かれる物質，あるいは内因性蛍光物質のいずれかに起因すると考えられる．このため，血清を試料とするとき標準系で得られた検出限度を達成する

−26−

文

献

1）Nakamura，M．，Toda，M．，Saito，H．，and Ohku−
ra，Y．A乃αJ．Cゐi肌．Acね134，39（1982）．

アレルギー性脳炎の治療に関する実験的研究

岩 崎 祐 三＊多発性硬化症，急性散在性脳脊髄炎，ワクチン接種後脳脊髄炎など，いわゆる炎症性脱髄疾患は疾患を治療する可能性を実験動物を用いて検討しつつある．

ヒトの脱髄性疾患のなかで重要な位置を占めてい

ロイペプチソは脳血流関門を通過しにくいので，る．このような炎症性脱髄疾患の発現機序として，皮下埋め込み浸透圧ポンプを用いて，直接脳内に神経組織，とくに髄鞘構成成分に対する自己免疫

持続注入した場合のラットの脳の組織学的検索の反応の関与が強く示唆されてはいるが，病変の中結果，高張液による可逆的脳血液関門破壊実験，

核をなす髄鞘破壊の機序は未だ解明されておらず，

パライソフルエソザウイルスによるマウスの脳病

これら疾患に対する適切な治療法も開発されてい変に対する治療効果について，今回報告する．

ない．

1．脳内に持続注入した薬液の脳内分布に多発性硬化症卜の，実験的急性アレルギー性脳ついて脊髄炎 ），実験的ウイルス性脳脊髄炎5川などの髄鞘破壊巣でカテプシソA，B−1，Dをはじめ種々

予備実験として，浸透圧ポンプAIzet，2ML−1のライソゾーム酵素のほか，中性プロテアーゼのをラットの背部に埋め込み，0．2％ェノミソスブル活性も上昇していることが報告されている．最近，ーを7日間，脳内に持続注入した．実験終了時の賦活化されたリソパ球により，マクロファージか脳の表面は大脳，小脳から延髄に至るまで高度ならplasminogenactivatorなどの中性プロテア，

着色がみられた．大脳および脳幹部の割面をみる

ゼの分泌が誘導されることも明らかにされていと，注入側半球が高度に着色しているほか，反対る7・8）．さらにCammer ら9）はin vitroの実験

側でも脳室を中心に脳梁，脳幹に広範な着色がみ

結果から炎症性脱髄疾患における髄鞘の破壊の揆られた．下部脳幹では着色は中脳水道や第4脳室序として，まずマクロファージからplasminogen

周辺に限局していたが，小脳は皮質，自質とも一

activatorが放出され，次いで産生されたプラス様に着色していた．次にこの標本の凍結切片を作

ミンにより髄鞘を構成する塩基性蛋白が破壊されり落射蛍光頭数鏡（励起フィルターBP546）でる過程を想定している．

観察した．図1は注入反対側の大脳皮質で，ここ

このような，脱髄過程における蛋白分解酵素のにみられるように肉限で着色の明らかでない部分

役割に関する報告をもとに，われわれは蛋白分解

でもェバソスブルーの赤色蛍光が皮質全層の細胞

酵索阻害剤であるロイペプチソ吟より炎症性脱髄に認められた．図2は脳梁の一部で，自質でもグ＊ 東北大学医学部脳研

リア細胞た色素がよくとり込まれている．以上の
−27−

・一
一

V

H．一

㌧

I

、．u■・r
■

●●事

●

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雲J・i・一一、．．．：11・、・ご′互㍗／十十㌦
袈ノ●，、い日．・

1一．・・・・．

幣●・イいJ：二言㍉昔十、；宣長轟琵妄ム転￣■モー∴ ∴栂

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一●− ■▼

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一・＼■．．1

眉覿野こ−憲．∴∴喜刻翫L㌻‥−r阜ニ∵∴二∴●∴∴弓
露㌫壱ニーt一、−こ・・−：工1●

毎rltJ持㌧．

確定し．編

図1Uptake of Evans blue by neuronsin contralateralcerebralcortex．The rat was
COntinuouslyinfusedintracerebrally with2％Evans blue for T days．A nuores・
CenCe micrograph taken with a Zeiss nuorescence microscope（BP546）×80．

図2

Uptake of Evans blue by oligodendroglialcellsin callosal radiation of the rat
Shownin Fig．1．×160．

図3
図4

A tissue defect after removal of aintracerebralcatheter，H＆E．×40．
A highpower view of the margin of the tissue defectin Fig．3，Note mild
infiltration of macrophages and the presence of hypertrophic astrocytes．H＆E．
×200．

図5

Hypertrophy of epithelial eells of the choroid plexusinipsilateral1ateral
ventricle of the ratintracerebrallyinfused with50pg／h ofleupeptin for14days・
H＆E．×100．

国6

Normalappearance of choroid plexusin the eontralaterallateral ventricle of
the rat shownin Fig．5，H＆E．×100．

結果から脳実質内に持続注入された物質は全脳に

2．ロイぺプテンのラット脳内への持続注入

よく浸透し，グリア細胞のみならず神経細胞にも体重約250gの雄ウィスターラット，15匹にフよくとり込まれることが明らかになった．

ルオセソ麻酔下に浸透圧ポンプAIzet，2ML−1を埋め込んだ．動物は3群に分け第1群には計算
上ロイペプチソが50〟g／h，14日間持続注入され−28−

アレルギー性脳炎の治療に関する実験的研究

るように，第2群はロイべプチソ5J唱／h，14日

7間注入されるように予定し，第3群には対照とし

′

毎で◎

′ ヽ
︑ ㌧

■

鱒

了●．∴
t

＼︶

l与

r

√
藩

憲．∵瑠

∴

孔以外に異常がみられなかった．脳は冠状面にそ

秘∵入後の脳の外表にはチューブ挿入による大脳の小録︒

まで全く異常がみられなかった．14 日間持続注

仝J

各群の動物とも麻酔から覚醒後は，実験終了時

p︐㍉ −﹂
済㌦∴㌧∵蓼

lt．⁚り￠．入∴㍉8了

または0．12mgである．

Yは計算上120／仏ロイペプチンの量にして1．2mg

工㌦∵．・tH．

IJ∴・J− J∂ヽte∵∵iて生理的食塩水を用いた．1日の脳内注入薬液量

ヽ

∵‰・

：

お，、着痛畿

説が

■「

．▲

▲■

って薄切，パラフィン標本を作製，H−E染色，Ⅹ一B染色を行った．標本の一部は電廊用に樹脂包理を行った．
脳内へのチューブの挿入は手術靡徴鏡下に脳表の血管を避けて行われたが，その先端の位置は動物により異なっており，側脳室内にあるものと，
尾状核，アンモソ核，大脳皮質など脳実質内にあるものに大別された．図3，4は大脳皮質内にチ●・、√

ェーブ先端があった場合のその周囲の組織像で，組織欠損部周囲にマクロファージの浸潤と星状膠細胞の増殖がみられるが，それに外接する脳実質
組織は神経細胞を含めよく保たれている．図5はチューブ先端が側脳室内にあった場合の同側側脳室の脈絡叢上皮細胞の変化で，同拡大の対側側脳室のそれ（図6）に比べ胞体の肥大が明らかであ図7る．この場合にも脳室周辺組織には全く異常がみleupeptln for14

られない．図7，8は50／堰／h注入ラットの注入
側大脳の皮質およびアンモン角錐体細胞，図9は小脳中部の皮質であるが，ここにも全く異常が認

Normalappearanceofcorticalneuronsinthe
ratintracerebrallyinfusedinith

50pg／h ofdays．Kliiver−Barrera stain−

ing．×200．
図8

Pyramidal cellsin Ammons horn of the rat

Shownin Fig．7．K＆B．×200．
図9

ccrebellar cortex of the rat shownin Fig．7．
K ＆ B．×200．

められない．5〟g／hのロイペプチソを注入した
群では脈絡叢上皮細胞の変化は明白でない．いずに右総頸動脈を露出，外頸動脈を切開，ここかられの群においても注入薬剤による細胞の変性を示

内頸動脈の分岐部までチューブを挿入，これに自唆する所見はみられなかった．

動注入器を接続した．左大腿動脈に接続したトラ
ンスデューサーにより全身血圧を観察しながら，自動注入器により1．6Mのてこトール2．5mgを3．高張マ二トール液による脳血液関門の0．083m〃secの速さで内頸動脈に注入，次いで左破壊実験
体重200−250gの堆ウィスター系ラットを用い以下の実験を行った．2％フルオセン吸入麻酔下

大腿静脈より2％ェバンスブルー

0．5mgを注入，手術創を閉じた．術後30分，1，2，3，12，24

−29−

14

15

：讐転

妄∴十へ≒
図10

Fluorescenee of Evans blue taken up by corticalneurons24

houre ater thetranscient opening of blood brain barrier byintracarotidinfusion of hypertonic
mannitol．×130．

図11A high power view of the neurons shownin Fig．10．×320．
園12 Ependymitis of the3rd ventriclein the ratinoculated with HVJ17days ago，
Untreated，H＆E．×200．

図13
図14

Dilatation oflateralventricle and rarefaction of paraventricular tissuein theShownin Fig．12．H＆E．×20．
Normalappearance of the3rd ventriclesin the ratinoculated with HVJ andtreated withleupeptin．H＆E．×200．

図15

Normalappearanceoflateralventricle inthe ratshowninFig．14，H＆E．×20．

時間後にグルタールアルデヒド・ノベラフォルム混

はエバンスブルーの蛍光は脳内血管，脳膜に局在合液による潅流固定により組織を固定した．次いしているが，術後12時間目には，脳実質細胞にで脳の凍結切片を作製，エバンスブルーアルブミ

蛍光がみられるようになり，24時間目には図10，ン結合体の脳内局在を落射蛍光顕微鏡を用いて追11にみられるように，多くの神経細胞の胞体と樹跡した．全身血圧はてこトール注入直後に一時低状突起，軸索に蛍光が認められた．術後早期にみ下するが，補液により回復した．術後3時間までられる蛍光陽性血管は脳全体に分布しているが，−30−

アレルギー性脳炎の治療に関する実験的研究

12時間以降にみられる蛍光陽性神経細胞の局在

ロイペプチソ非投与群6匹全例に図12のようなは，てこトール注入側の大脳半球皮質および脳幹

ependymitisの所見と，図13のような脳室の拡に限局していた．グリア細胞への蛍光物質のとり大と脳室周辺組織の破壊像がみられたのに対し，込みは確認できなかった．

ロイペプチソ投与群6匹のうち3匹に同様な所見

以上の実験から高張てこトールの頸動脈注入にがみられたのみで，残る3匹には図14，15に示より，注入側大脳実質組織内へ血中のエバンスブ

すように全く異常がみられなかった．つまり，ロルーーアルブミン結合体が流入すること，流入しイペプチソ投与によりウイルス接種後の炎症と変た物質は神経細胞に高濃度にとり込まれることが性が半数の動物で抑制されていた．

明らかになった．この方法はロイペプチソなど，

次にロイペプチソ投与がウイルスの増殖に及ぼ

脳血流関門を通過しにくい物質を脳実質内に送りす影響を検討する目的で以下の実験を行った．8

込む手段として着用であろう．

週齢のDBA／2マウス10匹に非不活化HVJ
O．01mg（32HAU／マウス）を脳内接種直後，そ4．ウイルスによりひきおこされる実験的の半数のマウスの対側大脳半球にロイペプチソ

脳症に対するロイベプチンの効果

0．02mg（200／jg／マウス）を注入，接種7日目にわれわれは，パラミクソウイルスの一つである

組織学的検索を行った．両群とも軽度な髄膜炎とHVJをマウスの脳内に注入すると，ウイルスの血管周囲の単核細胞浸潤のはか異常はみられず，局在が脳内に証明されなくなった注入7日目以降

ロイペプチソ投与による脳炎増悪の所見は得られに脳室周辺の自質に徐々に進行性の変性がおこるなかった．つまり，HVJ感染の特徴であるself−

こと，この日質変性は宿主の免疫抑制で防止されlimitinginfectionの機構はロイペプチソ投与にること，ヌードマウスではこのような変化がみら

より障害されなかったものと思われる．

れないことなどから，この現象を，ウイルスが引5． まき金となった自己免疫反応と考えられているヒトとめのウイルス感染後脳症の実験モデルと考え，研究

今回，中枢神経疾患に対するロイぺプチソの使をすすめてきた10・11）．今回，この実験モデルにつ用についての基礎的実験を行った．10mg／mJのいて，ロイペプチソ全身投与の効果を検討した．

濃度のロイペプチンを平均脳重量2gのラット脳

7遇齢DBA／2雌マウス36匹に紫外線不活

内に1日0．12mg，14日間連続注入したが，臨床

HVJ O．03ml（45HAU／マウス）を脳内注射，的に全く異常がみられないのみならず，組織学的その半数にHVJ注射当日から実験終了まで連日

検索でも，注入部周囲の組織を含め神経組織，細ロイペプチソ2mg（1mg／体重10g）を腹腔内投胞の変性像はみられなかった．

与した．HVJ接種後，3，10，17日目に各群5−6

高張てこトール頸動脈注入後の血中の高分子物

匹について組織学的に検索，ロイペプチソ投与群

質の脳実質組織への移行をェバンスブルーーアルと非投与群の対比を行った．両群とも神経症状のブミン結合体を指標として蛍光顕微鏡により追求

出現はみられず，ウイルス接種7日目の蛍光抗体

したが，脳血流関門破壊後12−24時間で動注側の法による検索では脳内にウイルス抗原は検出でき

大脳の皮質および脳幹部の神経細胞内への蛍光物なかった．接種後3日目，10日目の検索では軽質のとり込みが確認された．

度の髄膜炎の所見がみられたが，両群の間に差が

HVJの脳内接種後にみられるマウス脳の炎症，

認められなかった．しかし，17日目の標本では変性の発現がロイべプチソ1mg／体重10gを連−31−日腹腔内に投与することにより，半数の動物で抑肋〟rqpα摘．22，275−287（1972）．
6）Bowen，D．M．，Flack，H．A．，Martin，R．0．

制された．

et al．Biochemical studies on degenerative
neurological disorders：1．Acute experimen−

文

tal encephalitis．J．NeuYOChem．22，1099−1107

献（1974）．

1）Bowen，D．M．and Davidson，A．N．Macropha−

7）Vassalli，J−I）．andReich，E．Macrophageplas−
minogen activator：Induction by products ofactivatedlymphoid cells．J．EQ．Med．145，

ges and cathepsin A activltyin multiple
SClerosis brain．J．AkuroZ．Sci．21，227−231

429−437（1977）．

（1974）．

2）Hirsch，H．E．，Duquette，P．，and Parks，M．E，

8）Werb，Z．and Gordon，S．，Secretion of a spe−

The quantitative histochemistry of multiple

eific collagenaseby stimulated macrophages．

sclerosis plaques：Acid proteinase and other

J．Eゆ〃gd．142，346−360（1975）．
9）Cammer，W．，Bloom，B．R．，Norton，W．T．

acid hydrolases．J．Neurochem．26，505−512

eE al・Degradation ofbasicproteininmyelin（1976）．

Cal，histochemical and biochemical study ofby neutral proteases secreted by stimulated
macrophages：A possible mechanism ofin

the macroscopically normal white matterin

nammatory demyelination．Proc．肋tL．Acad．

3）Allen，Ⅰ．V．and MeKeown，S．R．A histologi−

Scf．ひ．5．75，1554−1556（1978）．

multiple sclerosis．J．Neurol．Sci．41，81，91

10）Iwasaki，Y，andKoprowski，H．Parainnuenza−（1979）．

4）Govindarajan，K．R．，Rauch，H・C．，Clausen，Virusinfectionin mouse brain：A possible

J．et al．Changesin cathepsin B−1and D，model from virus−induced demyelination．
エα〃CgJl，738−739（1974）．

neutral proteinase and2，3−CyClicnucleotide−3−phosphohydrolaseactivitiesinmonkeybrain

11）Iwasaki，Y・，Aden，D・，and Koprowski，H．

with experimentalallergicencephalomyelitis．

Thymus−dependent sensitizing processesin−
voIvedin theinduction of CNS diseasein′．Ⅳβ鋸rOJ．gcg．23，235−：06（1974）．

5）McMartin，D．N．，Koestner，A．，andLong，J・F．
Enzyme activities associated with the demy・elinating phase of canine distemper−．Acta

−32−

mice

by

parainnuenza

typel

virus．J．Zm一

例〟MJ．114，1846−1847（1975）．

ロイペプテンの薬理学的研究

大 塚 正 徳＊研究協力者

宮田堆平＊・小西史朗＊・柳沢光彦＊

赤木宏行＊・岡本司＊・村越隆之＊・玉井直＊

これまでの研究にひき続きロイペプチソおよびいことが示された1）．また運動ニューロンからのべスタチソの薬理作用を研究したが，今年度はと細胞内記録では，ロイペプチソ10￣4g／mJが静止

くに次の3種の標本について実験を行った．

膜電位をわずかに脱分極方向に移動させるが，活1）ウサギの血圧，呼吸および心電図：昭和

動電位，入力抵抗および後取の電気刺激で起こる

54年度の研究1）においてロイペプチソ0．1−10

シナプス電位には影響を与えないことが示されmg／kgをラット静脈内に与えたとき，血圧はほた8）．一方，ロイペプチソおよびべスタチソのプ

とんど変化しないか，あるいはわずかな下降がみ

ロテアーゼ阻害作用から当然期待されるように，られることを報告した．一方，田中班員らがネコ

P物質の運動ニューロン脱分極作用はロイペプチ

およびイヌの静脈内にロイペプチソ10mg／kgを

ソおよびべスタチソ（200〃M）によって増強さ投与した場合には明らかな血圧下降がみられていれ3），ノまたェ，ソケファリンの抑制作用はロイべプ

る2）．本研究ではウサギを用いてロイペプチソのチソ（200〟M）によっては影響されなかったが，血圧に対する作用を検討し，併せて心拍数，呼吸

べスタチソ（200′上M）によっては著明に増強され数，心電図に対する効果も観察した．

た4）．このべスタチソの効果はエソケファリナー

2）血管平滑筋に対する作用：上記の血圧下降

ゼ抑制によるものと思われる5）．これらの結果に作用と関連してロイペプチソの血管平滑筋に対す基づき，今年度は摘出脊髄における下行性抑制にる作用が問題となる．昭和54年度の研究では，対するロイべプチンの効果，侵害刺激による反射

モルモットの摘出小腸に対してロイペプチソは電位，およびペプチド作動性シナプス伝達を含む

10￣7g／mlから1074g／mlの範囲で収縮を起こさ

反射電位に対するロイペプチソ，べスタチソの効ないことを報告した1）．今年度の研究では，モル

果，およびェソケ7ァリンとの相互作用などを検モットの大動脈平滑筋に対するロイペプチソの作

討した．次に，ロイペプチソがアセチルコリンの用を観察し，またベスタチソの効果についても検作用を抑制することがこれまでの神経筋接合部，討を行った．

および交感神経節での研究から明らかになってい3）幼君ラット摘出脊髄に対する作用：この標本に対しては過去3年間にわたって検討してきた

るので1・3），脊髄でも同じような作用があるかどうかを検討した．

が，その結果ロイペプチソは10￣5g／mJの濃度では前択電位および単シナプス反射に影響を与えな＊ 東京医科歯科大学医学部薬理
−33−

実

験

方

3）ラット摘出脊髄法

1）ウサギの血圧，・呼吸，心電図

生後1−5日目のウイスター系ラぅトを用い，エウレタン（1g／kg）静脈注射で麻酔した雄ウサーテル麻酔下に脊髄を椎骨とともに切り出し，あギ体重（4kg）の大腿動脈から圧力トランスデュ

らかじめ95％02，5％C02で飽和させたKrebs

ーサを介して血圧を測定した．薬物は生食に溶か液または人工脳脊髄液中で実体顕微鏡下に粒体をして大腿静脈内に注入した．呼吸運動は，胸部の切り離し，脊髄を摘出した．胸髄以下の脊髄をそ動きを張力トランスデューサを介して記録した．

のまま，あるいは半裁して液梧内に固定し，人工心電図は，左右前肢皮下に注射針電極を刺入して脳脊髄液で潅流した．側索またはL8−L5後板を導出した．

吸引電柾で刺激し，反射電位をL3−L5前板から

2）血管平滑筋

神経板の大きさにぴったり合う径の吸引電極で細体重300gの雄性モルモットを撲殺後，直ちに胞外記録を行った．薬物は潅流により適用した．

胸部下行大動脈を摘出し，酸素を十分含んだ

皮膚侵害刺激によ、り誘発される脊髄反射電位を

Tyrode液中に移し，血管周囲の脂肪や結合組織記録するには，半裁脊髄を一側の坐骨神経，腰部を除去した後，大動脈をらせん状に切り，幅1．5および下肢と繋がったまま摘出し，脊髄と腰神経mm，長さ1．5cmの粂片を作製した．条片は叢，およびその支持組織を液槽内に固定し，人工37OCのTyrode液を満たしたマグヌス管内に懸脳脊髄液で潅流した・記録はL4またほしさ前根

垂し，95％02，5％C02を通気した．0．5gのから吸引電極により行った．刺激には6分間隔で負荷をかけ，ストレインゲージ（新興通信，UL−

2秒間，1・6−2kg・W／cm2のガス圧をピンセット

2−240）によりひずみ測定器（三栄測器，6W61）に加え，このピソセットでLH神経棍支配域のを介して反応をペソレコーダー上に記録した．実

皮膚の一定部位をつまみ，機械的侵害刺激とした

験は約1時間インキュベートした後に開始した．

（図6）．

Leup．

10mg／kg（10rr）
−100

Best．

Epi・

3mg／kg

4．5〟g／kg

10sec

図1ウサギ血圧に対するロイペプチン，べスタチンおよびェピネフリンの効果．ウレタ
ンで麻酔したウサギの大腿動脈から圧力トランスデューサを介して血圧を剰足した．
薬物は生食に溶かして，回申の横線で示す期間に大腿静脈内笹注入した．Leup．：ロ
イペプチン，Best・：べスタチン，Epi．：エビネフリン．
−34−

ロイべプチンの薬理学的研究
実

験

結

果

1）ウサギの血圧，￣呼吸10mg／kgを静脈内投与すると一過性の血圧下降

心電図に対するロイ

ベプチンおよびベスタチンの効果が起こった．べスタチソ3mg／kgでは血圧の変化はほとんどなく，エビネフリン4．5〟g／kgでは

図1および図2に示すように，ロイペプチソ5−
A

血圧上昇が起こった．表1はロイペプチソおよび

lmg／kg二二二∵二二二∵二一二二 ∴二二二∵二二￣￣山・・・・一一・・・・一・ナ攣攣■も0￣5D

B

5mg／kg

ご二▲千丁￣一一二＿一一一一一一二二二二二一∵二二ニー二・一一二・二仙て00
￣50

C−1

10mg／kg攣攣ゴーヒi−一一二＝＝二二二†一一一二一二二一己竺
￣50（torr）

C−2

繭華ii二二二二二二二 二二二二二二二二二二二10sec

伸哩州凧坤岬桝
0．55eC

図2 ロイべプチンのウサギ血圧，呼吸および心電図に対する効果の用量依存性．ウレタ
ンで麻酔したウサギで，図1と同様に血圧を測定した．呼吸運動および心電図の記録
法は本文参照．ロイペプチソは，回申の杭線で示す期間に大腿静脈より注入し，A
B，Cでそれぞれロイペプチソの用量を1mg，5mg，10mg／kgと増加した．AB，C−1
は血圧の記j乱 C−2，C−3はC−1の血圧記録と同時に，それぞれ呼吸運動と心電図を記録したもの．C3は，0．5秒間の心電図をトランジェソトメモリを介して記録し，ペソレコーダ上に遅い時間経過（10秒間）で描出したものである．C−3の各三角で示した位置は記録のスタートを示し，C−1，C−2の実際の時間に対応しているが，それ以後は速い時間掃引（0．5秒）による記録を示している．
蓑l pイベプチソとベスタチンの心拍数および呼吸数に対する影響
Leupeptln
Heart

r

ate

Respiration

rate

Bestatin
Heart

rate

Respiration

rate

g
m

g
k

ControI Test ControI Test ControI Test ControI Test

2
4
1

4
4
2
＊

3
3
1
＊

＊244

＊240

＊154

■1
45
＝

0
7
1

9
3
2

▲†

0
4
1

8
8
2

0
3
2

176

■

1
4
2

8
2
2
＊

6
6
2

4
3
2

0
1

3
5

1

150

薬物適用直前の1分間当りの回数をControlの欄に，ロイべプチソとベスクチン静江後1分間の回数を，それぞれTestの欄に示した．＊は2回の平均を示す．他は1回の測定値．
−35−

べスタチン投与前後の心拍数および呼吸数を示し

イペプチソ（2−200／Jg／mりおよびべスタチソ（2−ている．この実験例では呼吸数が正常域より多か

200／堵／mり を5分間適用しても血管条片に対すったが，ロイべプチソおよびベスタチソは用いたる作用は全く認められなかった．

いずれの用量でも心拍数，呼吸数に影響を与えな

図4はノルアドレナリンの血管収縮の強さをかった．図2C−3はロイべプチソ10mg／kg投与

mgで表わし，これに対するロイペプチソおよびの心電図に対する効果を示したものである．RR，

べスタチソの影響を示したものである．ロイペプ

QTおよびPR間隔などにとくに著しい変化はチン（100／JM）はノルアドレナリンの収縮作用にみられなかった．

ほとんど影響を与えなかったが，べスタチソ（1002）血管平滑筋に対する作用〃M）はノルアドレナリンの作用を著しく増強し血管条片は図3のaに示すように，ノルアドレ

た．

ナリン（0．1−2／上M）の1分間適用により収縮し，

3）幼若ラット摘出脊髄に対する作用

その大きさは濃度に依存して増大した．しかLPa）下行性抑制
図5に示すように，高位側索条件刺激により単Noradrenaline

二止照0・5mg
O・lJ

M O．3／

M O．5〝M IJルー

2〝M

た．ロイペプチン100／堵／mJを潅流液に加えた条件下で同じ実験をくり返したが，下行性抑制の程度は，単シナプス反射に対してはほとんど変化
なく，後限電位に対してはわずかに増強したが，Leupeptin
2min

0

シナプス反射および後限電位は著明な抑制を受け

220

その効果は著しいものではなかった．
LeupeptinlO，200／Ig／ml
〇℃′qヤ

g／ml

ア一㌔♪○叫○廿q、、了小、ヶー￣rJpBestatin

、1／一

b
⊥−t

■

■

1

20

20叫g／ml

9・・・・・・・・・・・d

J

0
0
4

︵も︶d出口るノルアドレナリン，ロイペプチソおよびベスタ

チソの作用．横線に示した期間薬物を適用した．

006

図3 モルモット下行大動脈らせん状粂片標本に対す

0

20

40

20

40

朗

2

﹁L

l￣ヽ￣T￣l￣1￣T￣r￣▼￣T

0

0
0
0
1

C
0
5
7

︵uE︶亡○コU空言OU

l￣1●「「￣r￣1￣T￣r￣l￣1￣￣

00．1

Concentration（〝入り

図4

ノルアドレナリンによる下行大動脈らせん状粂
片収縮の用量作用曲線と，ロイべプチソおよびべ
スクチンの影響．各点は図3aに示すような収縮曲線のピークを測りプロットした．

0

20

min

図5 ラット摘出脊髄における下行性抑制とそれに対するロイべプチン100〟g／mJの効果．上は単シ
ナプス反射，下は後根電位の大きさを示す．腰部
後掛こ単一刺激を加え，同じ分節の前板および隣接後板から細胞外記録を行った．横軸は時間を示
すが，点線の部分は1日盛が10秒，実線の部分
は1目盛が5分．プロットの下に横線と縦目盛で示した時点で，10秒間隔で3回，高位側索に条件刺激を後択刺数に250ms先立って加えた．ロ
イペプチソは図の上の横線で示した期間，潅流で
適用した．

−36−

ロイベプチソの薬理学的研究

hemisected

Le叩叩th200J

0．2

b

c

d

九人⊥っ1㌦
0215川2050〝M

L慧票［＝＝；…≡∃

0

5．0

0．05

0．2

0．5

2．0

5．0

Met−enkephalin（〝M）

図8 メチオニン・エンケファリンによる侵害刺激誘発前板反射電位の抑制†キ対するロイペプチンおよびベスタチソ各200／川の影響．横軸に示す濃度のメチオニン・エンケファリンにより反射電位が抑制される率をdose−reSpOnSe CurVe としてプロットした．コントロール（○）：メチオニン・エ
ンケファリンのみ，ロイペプチソ（△）（上段），
べスタチソロ）（下段）は各200〟Mをェソケフ
ァリンと同時に投与したもの．人工脳脊髄液は上段［Ca2＋］1．26mlt，［Mg2＋］2．Omy，下段［Ca2＋］
1．26m叫［Mg2＋］1．15mMを含む．
リン（1−5〟M）により著明に抑制された．一方ロ

5

イペプチソ200〟Mは侵害刺激による反射電位を軽度に抑制したが，これに加えてメチオニン・エ

0︵U誤・AE︶l曇uヱOdjこ︒冨Jく

Me卜EK 『M05川20l・M

0．5 1．0 2．0

0a︵訳︶亡○⁝︸ q叫 ul

図6 皮膚侵害刺激により誘発される脊髄反射電位測定の実験系を示す模式図．1−4日齢ラットより左側腰部，下肢，坐骨神経および半裁脊髄を摘出し，人工脳脊髄液潅流下の液槽中に固定した．脊髄と腰部一下肢との連絡はLト5の後板を残してすべて切断した．記録および刺激の方法については本文
参照．

M

0

︵訳︶u〇三qコ亡l

VentraI100

Spinalcord
dorsal30

60

90

120minンケファリンの作用を著しく増強した（図7，図図7 侵害刺激によって前板にひき起こされる反射電位に対する各種薬剤の作用．下段のグラフは反射
電位と基線との間に囲まれる面積を時間に対してプロットしたもの．メチオニン・エソケファリン8）．またべスタチソ（200〟M）はそれ自身では反射電位に影響を与えなかったが，メチオニン・エ
ンケファリンの作用を顕著に増強した（図8）．

（MeトEK，0．2−5．0／川），ロイベプチソ200／川および両者を，上に示す期間，人工脳青砥液に溶かして涯流した．上段は下のグラフにa，b，C，dで示す各点におけるSample recordを示す．人
工脳脊髄液中のCa2＋濃度は1．26m1−，Mg2＋濃度は2．Omlt．

C）ペプチド作動性シナプス伝達をふくむ反射電位
半裁しない摘出脊髄において一側のL4前根から細胞外記録を行いながら，同側および反対側のb）侵害刺激による反射電位

L4後根に単一刺激を加えると，いずれの側の刺図7aにみるように，侵害刺激を加えると前板激によっても速い時間経過の反射（潜時10−60（LH）から約20秒続く脱分極性反射電位が記録ms）に引き続き，遅い時間経過の脱分極性電位がされた．この反射電位はメチオニン・エソケファ

記録された（図9，A，Bl）．とくに反対側刺激に−37−

適用によって同側刺激による遅い電位の持続時間

1予」∴彗」

が短縮し（図9，A2），また反対側刺激による遅い電位の振幅が約50％減少した（図9，B2）．
べスタチン200′lMの適用によってメチオニン・

2十、㌧＿」へ、｝

エンケファリン（0．25／lM）の抑制効果は著しく

3人二王」へ㌢
4八㌧J」＿＿

増強されとくに反対側刺激による遅い電位は完全に抑制された（図9，B3）．ロイペプチソ200〟Mの添加によっても反対側刺激による遅い電位に対するメチオニン・エンケファリンの抑制効果が増強された（図9，B4）が，べスタチソの効果

図9 左側および右側の腰部後根の単一刺激によって同じ分節の前根から記録される遅い脱分極性反射
電位に対するメチオニン・エンケファリンの抑制作用と，この作用に対するロイペプチンおよびべスタチソの効果．幼君ラット摘出脊髄の左側L4
前板から吸引電極でDC電位を記録しながら，同側（5V，0．2ms）と反対側（8V，0．3ms）の後板を1分ごとに交互に刺激した．A：同側の後板刺激によって発生する反射電位．B：反対側後板を利敵したときの記録．1：薬液を加える前．2：
0．25／川メチオニン・エンケファリンによる抑制．
3：200〟lIべスタチソ存在下でのメチオニン・エ
ンケファリンによる抑制．4：200〟朋：ロイべプチン存在下でのメチオニン・エンケファリンによる抑制．

と比べると増強の程度は軽度であった．
図10Aに，反対側後坦刺激によって発生する反射電位に対するメチオニン・エンケファリンの抑制作用の用量反応曲線を示す．べスタチソ（200〟M）はメチオニン・エンケファリンの効果を約8倍に増強した．これに対してロイペプチソによる増強作用の程度は軽度であった．
d）抗アセチルコリン作用
昭和54，55年度にロイペプチンは末梢神経系においてクラーレ様の抗アセチルコリン作用があ応じて発生する遅い反射電位はピーク（刺激後2−ることを報告した1・3）．本年度は中枢においても5秒）が観察され，速い成分と区別することがで同様な作用があるか否かを検討した．

きた．多くの実験結果から，この反射電位発生に摘出脊髄のL4前板から電位を記録しながらアはペプチドとくにP物質が関与していると考えら

セチルコリン（ACh，3mM，1．5秒）およびP物

れる6）．0．25′jM

質（SP，3〟M，1．5秒）を短時間適用すると，前メチオニン・エンケファリンの

1軋

A
100

80

已○叫l叫qコ已二〇祇60

40

O C011lroI▲Leupeplin2」へしコごV●Beslath

0．01

0．1

1．0

3人＿叫＿＿Met￣enkephalinconcentrationレ叫

図10

A：反対側後板刺数による遅い反射電位に対するメチオニン・エ
ンケファリンの抑制作用の用量反応曲線．0コントロール，▲
200／川ロイペプチソ存在下，●200／点lべスタチン存在下．B：A
図中の番号で示した点のSample record．
−38−

ロイべプチソの薬理学的研究
0．2mMletJpeptin

0．2mM beStatin△SP（3′lM，1．5S）

▲

△

▲

△

▲

△

▲

△

▲

△

▲

図11幼君ラット脊髄ニューロンのアセチルコリン（ACh）とP物質（SP）
による脱分極に対するロイベプチソ（A）とべスタチソ（B）の効果．
ACh（3m叫 3秒▲）とSP（3J川，3秒）を3分ごとに適用し，運動
ニューロ∵／の脱分極をLl前板から細胞外記録した．図の上の横線で示した期間，ロイペプチソおよびべスタチソを港流適用した．

根に脱分極が生じた．200〟Mのロイペプチソ適ソの血圧下降作用が交感神経節における伝達遮断用によってアセチルコリンによる脱分極が約作用によるとすれば，あらかじめα型遮断薬によ50％ノ抑制された（図11，A）．この作用はロイペって交感神経性の血圧上昇機構を除いておけばロ

プチソの除去後速やかに回復した．ロイペプチソ

イペプチソの血圧下降は起こらなくなるはずで，の適用によってP物質の脱分極性反応の持続時間

この点は明年度の研究において検討したいと考えが軽度に延長した（図11，A）．一万，200〟Mベている．

スタチソの適用ではアセチルコリンの作用に有意

大動脈平滑筋にロイペプチソが10￣7−10￣4g／mg

な変化はみられなかったが，P物質による脱分極の濃度で全く無作用であったことは，昭和54年の持続時間は約2倍に延長した．

度のモルモット摘出小腸における所見と一致す
る1）．すなわち，一般にロイペプチソは平滑筋に考対する直接作用はないことを示唆するもので，上察

ロイペプチソ5−10mg／kgの静江で血圧の下降

記の血圧下降も神経性の機構のほうが考えやすい．

がみられたことは，田中班員らがネコおよびイヌ

一方，べスタチソがノルアドレナリンの作用を増で得た結果に一致する2）．ウサギにおける血圧下強したことは注目すべきことである．この撥序は降は昭和54年度のラットで観察したロイべプチ

現在のところ，全くわからない．一つの可能性はソの作用に比べてより著しいものである1）．このノルアドレナリンのとり込みの抑制である．

血圧下降の秩序として考えられるのは昭和54，55

幼君ラットの摘出脊髄における遅い時間経過の年度に報告した神経節遮断作用である1・8）．すな

反射に対して，メチオニン・エンケファリンは顕

わち，モルモット交感神経節におけるシナプス伝

著な抑制作用を示した．メチオニン・エンケファ

達は2×10￣5g／mJのロイペプチソによって抑制

リンの作用機序としては，1）一次知覚神経線経された．10mg／kg￣のロイペプチソ静注によっての終末に作用して伝達物質の放出を抑制する，2）

神経節における薬物の濃度がこの程度になること

後角の介在ニューロンのシナプス後膜に作用しては十分考えられることである．もし，ロイペプチ

伝達物質に対する感受性を抑制する，などの可能−39−

性がまず考えられる．べスタチンがェソケファリ

張力を記録した．ロイべプチソまたはベスタチソ

ンの作用を増強したのはおそらくェソケ7ァリナ

を2−200／Jg／mJの濃度で適用したが，張力の変ーゼの抑制によるものであろうり）．ロイペプチ

化は起こらなかった．しかし，べスタチソはノル

ソもエンケファリンの作用を増強したが，その程アドレナリン（0．3−2〟M）の血管平滑筋収縮作用

度はベスタチソよりも軽度であった．ロイペプチを増強した．

ソの濃度は200／上M と高濃度で，エソケファリナ

3）幼君ラット摘出脊髄に対する作用

ーゼを抑制する可能性も考えられる．

a）下行性抑制：高位同側側索の条件刺激によこれまで神経筋接合部および交感神経節での研って単シナプス反射および後根電位は抑制を受け究からロイペプチソは抗アセチルコリン作用をもたが，この抑制に対してロイべプチソ100／Jg／mg

つことが知られていた．これらの場所ではニコチは顕著な影響を与えなかった．
b）侵害刺激による反射電位：半裁脊髄を坐骨

ン性のアセチルコリン受容体が存在している．一方，ロイペプチンはモルモット腸管のアセチルコ神経，腰部および下肢が繋がったままとりだし，リソ収縮には影響を与えなかった1）．したがって，

前根から電位を記録した．皮膚に梯械的侵害刺激

ロイペプチソはムスカリソ性のアセチルコリソ受を加えると，L巨5の前祝から遅い時間経過の脱容体には影響を与えないのかもしれない．今回得

分極性反射電位が記録された．この反射電位はエ

られた結果はロイべプチソが末梢神経系のみなら

ンケファリンにより抑制され，この抑制をロイペ

ず，中枢神経系でもアセチルコリン受容体に抑制

プチソおよびべスタチソ200／上Mは著しく増強し作用をもつことを示している．摘出ラット脊髄でた．

みられるアセチルコリンの運動ニューロン脱分極C）ペプチド作動性シナプス伝達を含む反射電作用はアトロピソで抑制される成分とクラーレで

位：後眼に単一刺激を加えると反対側前根から遅抑制される成分とがともにあるので（未発表），ロ

い時間経過の反射電位が記録され，この反射電位

イペプチンは後者すなわちニコチン性のアセチル発生にはペプチドが関与していると思われる．こコリン受容体が関与する成分を抑制している可能の電位はエンケファリンにより抑制され，この抑性が大きい．

制をロイペプチソは軽度に，べスタチンは著しく
増強した．

総

d）ロイペプチソはアセチルコリンの脱分極作

括1） ウサギの血圧，呼吸，心電図に対するロイ用に顕著な括抗作用を示した．

ペプチソの効果文

ウレタン麻酔下にウサギの大腿動脈から血圧を記録した．ロイペプチソ5−10mg／kgを静脈内に与えると血圧は一過性に下降したが，呼吸数および心電図に変化はみられなかった．血圧下降の践序としてほ，先に報告した神経節遮断作用が考えられる．
2）血管平滑筋に対する作用

献1）大塚正徳．ロイべプチンの薬理学的研免厚生省
新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究，昭和54年度研究報告書，pp・37−43（1979）．
2）田中 亘．ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究．厚生省新薬開発研究費，傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究，昭和54年度研究報告書，pp．63−116（1979）．

モルモットの胸部下行大動脈を摘出し，らせん状に切って作った条片をマグヌス管内に懸垂し，
ー−40・−

3）大塚正徳．ロイペプチソの薬理学的研究．厚生省
新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究，昭和ロイペプチソの薬理学的研究
55年度研究報告書，pp．4ト48（1980）．
4）大塚正徳．ロイべプチンの薬理学的研究．厚生省
新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（ロイぺプチソ）の開発研究，昭和56年度研究報告書，pp．39−44（1981）．
5）Hachisu，M．，Nakamura，T．，Kawashima，H．，
Shitoh，K．，Fukatsu，S．，Koeda，T．，Sekizawa，Y．，Munakata，M．，Kawamura，K．，Umezawa，
H・，Takeuchi，T．，and Aoyagi，T．Relationshipbetween enhanCement of morphine analgesia
andinhibition of enkephalinase by2S，3R
3，amin0−2−hydroxy−4−phenylbutanoicacidde−
rivatives・Ltfk Sci．30，1739−1746（1982）．

−41−6）Yanagisawa，M．，Otsuka，M．，Konishi，S．，
Akagi，H．，Folkers，K．，and Rosell，S．A sub−
StanCe P antagonistinhibits a slow re貝ex
responsein the spinalcord of the newborn
rat．AcねPカッ言わJ．Scα乃d．116，109−112（1982）．

7）Chaillet，P．，Marcais−Collado，H．，Costentin，J．，
Yi，C．C．，Dela Baume，S．，and Schwart2：，J．C．
Inhibition of enkephalin metabolism by，and
antinociceptlVe aCtlVlty Of，bestatin，an ami−

nopeptidaseinhibitor．Eur．J．PhaYmaCOl．
86，329−336（1983）．

ロイペプテンの脱髄病変および培養筋への作用について

米

沢

猛＊

悪期および寛解期を含む），急性散在性脳脊髄炎

Ⅰ．腎髄病変に及ぼすロイベプテンの影響

1症例および実験的アレルギー性脳脊髄炎動物

脱髄疾患を特徴づける脱髄病変は賦活化因子（家兎，日本ザル）より血清を分離し，またFicoll（抗体，感作リンパ球，リンフォカイン）により法にてリンパ球を分離し，さらにリンパ球培養に活性化した食細胞が髄鞘の層状構造を解離し，破抗原を加え，上清よりリンフォカインを分離分画

壊物質を貪食するという現象である．この活性化した．この分画のうち，細胞毒性を有するもの，

した食細胞では，抗原物質の貪食作用が増強しておよび食細胞遊走阻止能を有する分画を有効分画いるのみならず，プロテアーゼをはじめとする種として検索に用いた．

種の酵素が活性化している．このような点より食

前述のロ剤にて前処理した培養組織に細胞のプロテアーゼをはじめとする酵素活性を抑① 被検血清の場合には，新鮮血清を10−25％

制することにより脱髄病変の進展をおさえ，さらの割に培養液で希釈して培養組織に投与して，生には脱髄疾患の治療にも役立てようとの試みがな

ずるf花がわroの脱髄所見を対照と比較検討した．
㊤

されている．われわれはこの脱髄病変を 乃びわro患者リンパ球およびEAE動物リンパ球のの神経組織で再現せしめ脱髄機構の解明を試みて場合には，Ficoll法にて分離したリンパ球を，さきたが，この 乃びわroでの脱髄（抗髄鞘抗体，

らにnylon columnを用いて可及的にT細胞を

感作リン㌧ペ球，リンフォカイン等による）に及ぼ

集め，107個／mJの割で培養液に浮遊せしめた後，すロ剤の影響を検討した．

培養組織に投与した．

実験方法㊥リンフォカインの場合には，上述の分画を新生仔マウス小脳をとり出し，型のごとくマキ

濃縮し，培養液に10−25％の割で混合し，培養組

シモウニ重カバーグラス法にて培養を行った．培織に投与した（このリンフォカインは七7ァデッ

養後5日よりロ剤25／堵／mgを含む培養液を投与

クスG−200，一分画は10mgの濾液をさらに1／5

し，次第にP剤を増し／培養2週以降には100に濃縮し，さらに培養液で10−25％に希釈した）．

〟g／mJのロ剤を含む培養液を用いた．このよう対照としてはロ剤前処理を行っていない培養をな培養では，ロ剤の中毒性変化を示すことなく髄用い，検体を上述の方法と同じように加えて培養

鞘形成は培養の96−100％にみられる．

組織に生ずる変化を調べた．

一方，ヒトの多発性硬化症4症例（いずれも増＊ 京都脳神経研究所

ロ剤の影響の判定は，主としてわ‡如け0の神経組織に出現する髄鞘の変性所見の時間的経過に

−43一

1．0

0．8

0．6

60

0．4

40＿

0．2

20

訳

FraCtionnumber

1231567さ，101日21日11516171819m

Neurotoxicity

一一一一一一一一一十十十＋−￣＋￣￣

図1ヒト多発性硬化症患者の末梢リンパ球より分離したリンフォカイン
分画とその生物学的活性との関係

642︵0式．白．〇︶む冨jJOS一く

FraCliol川umberl

234

5

6

Neuro【oxiCi【y

図2

7

8

910111213141516171819202122

一一＋＋＋＋一一一一一一一一一一一

EAE家兎リンパ節細胞より分離したリンフォカインの分画とその生物活性との関係

よって行い，対照群との質的病変の違いも判定のらの髄鞘破壊を生ずる食細胞の態度は同様である．

参考とした．

2）リンパ球投与の場合

実験結果

リンパ球投与を行った培養では，一部は培養液

1）患者血清ならびに兢血清による変化

中に浮遊するが，多くは培養組織に付着し，さら患者血清ならびに抗血清を補体C3添加の下ににその一部は食細胞の周囲にロゼット状に付着し培養に投与すると，それらの血清中の抗体の力価ている．投与後約2日を過ぎるころになると食細にもよるが，約30分後頃より髄鞘の腫脹が始ま胞による髄鞘貪食が認められる．その破壊の状態

る．これと同時に近傍に存在する食細胞は活発なは前述の抗血清によって生ずるものと類似していアミーバ運動を行っているが，いったんその突起るが，貪食現象がより一層顕著である．この変化が髄鞘に接触すると，固着して髄鞘の層状構造を

はリンパ球投与後少なくとも2日以降に出現する

解離し剥離してゆく．髄鞘は次第に寸断されてミ遅延型のものである．また投与するリンパ球が増ニリン滴として食細胞や髄鞘保持細胞であるオリ

加すると現れる変化は中毒性の変性像を示す．こ

ゴデソドログリア内に吸いよせられるようにとりれらの脱髄性変化および中毒性変化は，ロ剤の前込まれる．これらミニリン滴は次第に消化されて処置によっても同様にみられ，P剤による病変のしまう．そしてあとに髄鞘の消失した裸の軸索が修飾は認められない．

残る．ロ剤前処理を行った培養においても，これ−44−ロイべプチンの脱髄病変および培養筋への作用について

3）リンフォカイン投与の場合の培養を用いて検討した．被検材料はヒトの多発リンフォカインを小脳培養に投与すると，既報

性硬化症，急性散在性脳脊髄炎およびサルとウサのごとく一定の分画（分子量36，000）でとくにギの実験的アレルギー性脳脊髄炎の血清・末栴リ

著しい中毒性変化を招来する．しかしリソフォカ

ンパ球あるいはリンパ節細胞およびリンフォカイ

イソの割を低くすることにより食細胞賦活化を来ンを用い，脱髄病変に関する食細胞への影響を調す．その変化はリンパ球投与の場合と同様である．

べた．結果として食細胞への影響を認めることはしかし上述のごとき遅延型の変化ではない．そしできなかったが，これは脱髄病変の最初の現象とてロ剤前処置によっても影響されることはない．

して生ずる免疫学的現象にはロ剤が作用しないこ

考と，続いて生ずる貪食・細胞内消化はプロテアーゼ

案

以上のごとく脱髄因子と見倣されている抗髄鞘以外の種々の酵素の既活化によるものと思われる．

抗体，感作リンパ球およびリンフォカインなどに

ⅠⅠ．家鶏ジストロフィー筋および健康筋へのよる脱髄は，いずれも賦活化された食細胞によるロイベプチンの影響について

髄鞘破壊である．その機序は細胞表面にIgG抗体や補体C8の受容体が存在するため，上述の抗家鶏ジストロフィー筋に対するロイペプチソの体や補体により食細胞が賦活化するわけである．

影響は，プロテアーゼ活性を抑制してジストロフ

この活性化は細胞内の種々の酵素の活性化と相供ィー病変（ジス病変）の出現を阻止するということって食細胞の特異的隣能である貪食作用が発揮さよりも筋での中毒性病変が前景に立っている．これるわけである．しかし神経組織での脱髄では食のことはとくに幼君筋に対して著しい．この筋の細胞が髄鞘の層状構造の間へ，いわゆるカタピラ

中毒性病変を培養筋を用いてさらに検討を加えた．∵

ー現象によりその突起を侵入させ，髄鞘の脆弱性

実験方法のため髄鞘保持細胞や食細胞内でミニリン滴に破筋ジス家鶏（California Davis413）およびそ壊される．したがって，たとえプロテアーゼ等のの対照健康動物（同412）の胚浅胸筋をとり出し，L細胞内酵素活性が上昇した場合でも，その作用が細切後，ネズミコラジュン塗布を行ったカバーグ

及ぶより以前に髄鞘が破壊されてしまうものと理

ラス上に植え付け，マキシモウニ重カバーグラス

解される．このように脱髄現象を理解し，上述の法にて培養を行った．培養液の組成はデータを考えると，脱髄という現象はプロテアー

Gey塩類溶液

9ゼの関与する場と異なった場での免疫学的現象でEagle MEM

9始まり，細胞内酵素活性の作用は第2段の現象へ

馬血清

9と進むわけである．したがって，ロ剤のごとき抑50％鶏胚抽出液

9

制剤の作用するより以前の現象として脱髄病変を10％ブドウ糖

2である．

理解すべきであろう．
結

植え付け後2−14 日にロ剤25−100／Jg／mJを培養論

脱髄疾患を特徴づける脱髄病変には，食細胞の液に混じて投与し，生ずる変化を検索した．観察

プロテアーゼ活性がみられるところから，阻止剤

は主として光顕による生態観察と電厩によるもの

により脱髄病変の進展を防ぐことが一部で提唱さで，電頗試料は培養組織を塩類溶液で洗浄後，れている．この点をプロテアーゼ阻止剤であるロ

2．5％グルクール（pH7．4）および1％オスミウ

イべプチソを用いて脱髄に及ぼす影響を神経組織

ム酸にて固定，ヴェストパール包哩を行い薄切後−45−

電顕観察を行った．

〟g／mgでの変性像はみられるものの，投与を続実験結果

けても顆粒は徐々に減少してくる．しかし筋の発口剤投与量と培養日数との関係についてみると，育成長は遅延する．さらに100／g／mg投与では培養初期の幼君な筋組織はロ剤に対しきわめて敏

変性像はかなり多くなる．

感で，25J唱／mJ濃度の投与によっても容易に変培養10日以後には100／g／mg投与により，軽性像を示す．すなわち培養2日後に上述濃度のロ度の変性顆粒の出現が数日内にみられる．しかし剤を投与すると，約24時間後には筋芽細胞およ

この顆粒の出現は散在性で，筋の発育にはとくにび筋管細胞は全体に細顆粒状の変性物の出現がみ障害を与えていない．

られる．この物質は電顕観察では核近傍に始まる

これらの所見より，幼君筋細胞はロ剤に敏感で，限界睦のないオスミウム好性の不定形の物質で，容易に中毒性変性顆粒の出現を来すが，筋の成長

いわゆるdense bodyと呼ばれるものに相当する．

に伴ってその耐性は急速に上昇し，培養10日以このような所見を宝する筋芽細胞や筋管細胞では降には100／堵／mgの濃度にも耐えうるわけであ筋収縮線経の発育が障害され，培養1遇を経過しる．
また変性所見を示した筋培養にロ剤の投与を中ても収縮線椎は散在性に小集団を作って存在する

止し，その変性の回復と残された障害をみると，にすぎない．
培養5−7日以後にロ剤を同じ濃度で投与しても，投与によって生じた変性顆粒は次第に減少してく

上述の変性像の出現はきわめて軽度である．このる．それとともに遅延していた発育成長が回復す

時期には50〃g／mJの投与で摂似の変化が出現する．しかし侵裏の著しいもの，とくに初期にロ剤るが，その程度は軽い．すなわちこの時期の培養を投与したものでは成長は充分ではない，成長後

では，P剤25〟gノmJを投与しても非投与群と同の筋の径は細く，線経の長さも短い．電顕観察で様の発育と成長を示し，変性所見は少ない．50

は前述のdense bodyの貯留，さらに著しい場合

囲3

ジス筋培養，ロ剤投与なし，20DIV．筋はやや細いが横紋はよく形成さ
れている．
−46−

ロイペプチンの脱髄病変および培養筋への作用について

図4 ジス筋培嵐 25〟g／mgロ剤投与，ロ剤除去後2遇経過．中毒性病変は消退するも横紋形成は遅延している。

図5 ジス筋培嵐 50〟g／mJロ剤投与，ロ剤除去後2凰 発育の不完全な状態を示している．

−47−

図6 ジス筋培養，100J上g／mJロ剤を20日後に投与．ロ剤による変化はないが，ジス病変が出現している．

図7 ジス筋培養，ロ剤100Jg／m仁投与群にみられたジス病変．横紋の変化と壊死部が同一だ経にみられる．

−48−

ロイペプチンの脱髄病変および培養筋への作用について
J，

▼

l

1・∴義逮
訂竺■■

隷

・・二・一㌧−
■

一撃と

」奴＿

図8 ジス筋（電顕），培養2日後にロ剤25／∠g／mJ 投与，その後6日の所見．SRの破壊，dense
bodyの出現，筋柴の融解がみられる．
にはSR等の細胞内院様構造の破壊と筋梁の融解

考案

像などがみられる．そして筋の収縮線経の発育もこのようにロ剤の作用は幼君細胞にとくに著し
く，その投薬部位はSRなどの膜様物質と考えら障害をうけている．
このようにロ剤で処理された培養では，細顆粒れる．そしてその障害によって筋の発育や成長が出現，SRの破壊，筋菜の融解などの変化を釆す

妨げられるものと思われる．とくに培養日数の少が，これらの変化を来さない濃度で処理されたジない組織では，25／Jg／mJの少量でも24時間内にス筋では，やがてジス病変の出現がみられる．そ変性顆粒の出現を来す．この程慶の投与量では，の病変の特数の一つとして筋の過収縮がある．す投与を続けると次第に顆粒の減少を来し，10日

なわち，筋の形成された横紋の間隔が変化し，Ⅰ程の経過で回復する．しかし投与量がこれ以上のおよびA帯の区別ができず過収縮の状態を示した

場合には，同様の変性顆粒は永く残存し，筋の発り，また筋線経の瞳賑とともに横紋が不明瞭にな

育成長は著しく障害される．このことは単に筋培り，異状ないし塊状の壊死性変化を示してくる．

養でみられるだけでなく，他の幼君細胞にも共通

とくにジス筋の特徴として，1本の筋線経で健康してみられる現象であろう．このロ剤の夜襲部位

部，過収縮部および壊死部と連続してみられるこは細胞質内の膜様構造物と思われ，SRや細胞内とである．このような変化はロ剤の効果が仮令存

小胞の変性，ライソゾームへの障害，densebody

在するにせよ，ジス病変の出現を阻止できないこの出現などの変化が著明である．この変化が筋のとを示すものであろう．また上述の中毒性変化は発育成長の遅延ないし停止を来す形態学的裏付け

ジス筋にも，健康筋にも共通してみられる変化でといいうるであろう．p剤による中毒性変化の少ある．

ないジス筋では，後にジス病変を現してくる．これは，ロ剤のみではジス病変の出現を必ずしも抑−49−

制阻止しえないことを示すものであろう．
結語

筋ジス鶏胚の浅胸筋の培養を用いて，ロ剤の影
響を検討した．幼君筋培養では比較的容易に中毒性病変を生ずる．培養期間の長いものでは100〟g／mgのロ剤濃度にも耐えうる．その病変はSR等の膜様構造物で，densebodyの出現，SRの破壊，さらに筋菜の融解である．これらの変化は徐々に回復しうるが，発育の不充分な筋として残る．また侵襲のきわめて少ないジス筋の一部にはジス病変と見倣しうる変化を呈してくるものがあり，ロ剤による変化は中毒性変化が前景に立ち，ジス病変の出現を抑制する効果は不充分と思われ
る．

文

献

Ⅰに関し
1）Bornstein，M．B．and Appel，S．H．J．Neuro−−50−♪α比丘ゆ〃g〟rOJ．20，141−160（1961）．
2）米沢 猛．日神経病理会誌67，31−55（1978）．
3）Yonezawa，T．，Hasegawa，M．，Arizono，N．，
and Okabe，H・Acta Neurqpath．，Suppl．VII，
162−164（1981）．

4）宮路柘文．京都府立医大誌90，955−966（1981）．
5）Wisniewski，H・M・，Brosnan，C．F．，and Bloom，
B・R・inSuppressionofExperimentalAller−

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Cuzner，M．C．，

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6）Yonezawa，T・AclaNeurqpalh．，Suppl．VIII，
in press（1983）．

Ⅱに関し7）Busch，W・A・，Stromer，M．H．，Gall，D．E．，and
Suzuki，A・J・CellBioL・，53，367−381（1972）．
8）McGowan，E・B・，Shafiq，S．A．，andStracher，A．
Eゆ肋〟rOJ・50，639−657（1970）．
9）Stracher，A・，McGowan，E・B・，andShafiq，S．A．
Scわ乃Cg，200，50−51（1978）．

筋ジストロフィー症マウスに対する
ホルフェニシノール投与の影響

松

下

宏＊

研究協力者 辻繁

勝＊いないがベスタチソと同じく細胞膜表面に結合し研 究．目 的′て免疫増強作用を示すことが知られているホルフ

われわれは従来，マウスあるいはハムスターのェニシノールを用いて，べスタチソと同様な条件

筋ジストロフィー症をモデル実験動物として，ロで筋ジストロフィー症マウスに連続投与した場合

イペプチンおよびべスタチソを投与した場合の進の疾病進行に与える影響を検討した．

行性筋ジストロフィー症に対する治療効果について，主として病態生化学的手法を用いて種々の検材料 と 方法

討を重ねてきたが，その結果，筋ジストロフィー

実験にはC57BL／6J−4y系マウスの疾病個体症マウスに発症直後からべスタチソを連続投与すおよび同腹正常個体が用いられた．1カ月齢に満ることによっていったん発現した症状が完全に回たない個体は当教室で維持繁殖しているもの，1

復する場合があることを兄いだした1・2）．また，

カ月齢以上のマウスは実験動物中央研究所より購

ロイペプチソまたはべスタチソの投与によって疾入したものをそれぞれ使用した．

病の完全な回復が得られなかったマウスも長期間

すでに症状の進んだマウスに対する短期間の投投与を続けることによって著しい延命効果がある

与実験には約1カ月齢の擢患マウス30頭を3実ことが認められた．

験区各10頭ずつに分け，それぞれ1週間投与群，ロイペプチソとべスタチソはともにプロテアー

2週間投与群，および6週間投与群とした．各実

ゼ・インヒビターであるが，ベスタチンは細胞荘莫

験区は更に5頸ずつ2ケージに分け，1ケージはの表面に結合して，膜局在のエンドペプチダーゼ

ホルフェニシノール投与群，他は食塩水投与対照

活性を抑制すると同時に免疫増強作用があること群とし，それぞれの期間連日投与を行った後，屠も知られている．したがってべスタチソ投与によ殺して血清および骨格筋中のマーカー酵素群の活る疾病回復効果にはプロテアーゼ・インヒビター性を測定した．また，無処置のマウスでの酵素活としての作用の他に，膜表面に結合することによ

性測定には同齢の羅患マウスおよび正常対照マウって筋線経の生理機能を変化させる作用が関与しス各5頭が用いられた．一方，早期投与開始によている可能性が考えられる．そこで本年度はべス

る疾病回復効果をみる実験は，みヘテロ個体同

タチソの作用撥序を追求する第1歩として，プロ士の交配によって得られた新生児を生後10日目

テアーゼ・インヒビターとしての作用は知られてから連日，尾をもってつり下げ，発病の徴候をし＊ 和歌山県立医科大学第二生理学教室

らべる作業を行い，発病を確認した後直ちにホルー51−

フェニシノール投与を開始し，臨床症状の観察，

GPTはKarmen法5），LDHはWroblewskiら

体重測定，筋の耐久テストなどを行った．

の方法6），PKはTanakaらの方法7）にそれぞれ

ホル7ェニシノール粉末は使用直前に生理的食準じて行った．酵素原品中の蛋白含量はLowry
法によって測定した．

塩水に1mg／ml濃度に溶解し，1回0．25mlず
つ，1日2回，連日，背部皮下に注射した．対照群には生理的食塩水を0．25mgずつ同様に注射し

結

た．

果

1）疾病による酵素活性の変動

酵素活性測定には，被検マウスを断頭採血し，

表1は無処置の2カ月齢のC57BL／6J一々γ系

血液は30分間室温静筐後，2，000rpmlO分間遠

マウスについて血清中の遊出酵素の活性値を示し

沈し，分離した血清を直ちに酵素標品として使用たものである．LDHを除き，いずれの酵素も羅した．後肢の骨格筋は，断頭後速やかに10倍容患マウスのほうが，正常対照マウスよりも高い活の0．32M庶糖液に入れ，テフロンホモジェナイ性を示しており，中でもPKおよびCPKで著し

ザーでホモジェナイズし，通常のSchneider法

い活性上昇が認められた．LDH活性は変化がなに従って可溶性分画とミトコンドリア分画に分離かった．骨格筋中の各酵素の活性値は表2のごとし，前者はそのまま，後者はさらに低張液処理にく，CANP活性およびGOT，GPTの可溶性分

よる膜の破砕を行った後それぞれを酵素標品とし画中の活性がいずれも曜患マウスで上昇しているて使用した．

他は，すべて正常対照よりも著しく低い活性値を酵素活性の測定はCANPはDaytonらの方示しており，以前に度々行われた測定結果とよく法3），CPKはHessらのUV法4），GOTおよび一致した傾向を示している．以上の結果から，用表I Activities of various enzymesin sera from normaland dystrophic mice
Enzymes Dystrophic Normal

D／NxlOOKPKDHOTPTP C L G G

3．80±0．59

0．53±0．03716．9

8．01±0．92

4．30±0．21

186．3

2．08±0．16

2．01±0．14103．5

1．87±0．09

1．29±0．23

145．0

0．29±0．03

0．28±0．05

103．6

Units：PK，CPK，LDH；PmOles NADH／ml serum／min，GOT，GPT；KarmenU／FLI

表2

Activities of various enzymesin muscle from normaland dystrophicmice

Enzymes

Dystrophic Normal

D／NxlOO

PK

0．84± 0．27

1．62± 0．32

51．9

CPK

9．38± 3．98

14．51± 5．68

64．9

LDH

3．41±1．75

3．89±1．47

87．7

GOT cytosol
mitochondrial

3．15± 0．67

2．83± 0．60

111．3

0．24± 0．04

0．29± 0．03

82．8

GPT cytosol

76．0 ± 7．1

59．5± 5．3

127．7

mitochondrial lO2．1±19．7

126．7±25．8

CANP

6．2 ± 0．4

8．4 ± 0．7

80．6
135．5

Units：PK，CPK，LDH；FLmOles NADH／mg protein／min，GOT，GPT；Karmen U／pg
protein，CANP；AE／g protein／2hrs．
−

52

−

筋ジストロフィー症マウスに対するホルフェニシノール投与の影響
表3

Effect of forphenicinol administration on serum enZyme aCtivitiesin
dystrophicmice
Administration period
S
k
e
e
W

weeks

6

2

4

9
5

8

8

9
7

1
4

5

4

5
8

9
7

6

9

7
5

6
9

1

9

0
6

0
7

2
8

7

1

6
6

3

9
4

6
7

4

GPT

9
8

GOT

7

LDH

0

CPK

1
9

PK

k
e
e
V
ヽ

l

Enzymes

Unit：forphenicinol／saline xlOO．
表4

Effect of forphenicinol administration on muscle enzyme activitiesin
dystrophic mice

Administration period
Enzymes

1week

2weeks

6weeks

PK

104．9

164．3

171．4

CPK

163．0

223．2

188．2

LDH

76．2

85．7

94．3

GOT cytosol

89．6

54．9

78．4

mitochondrial l12．5

140．8

130．9

84・9

98．9

132．3

mitochondrial lO3．5

300．4

261．9

127．4

32．6

27．0

GPT cytoso1
CANP

Unit：forphenicinol／saline xlOO・

いられた酵素が筋ジストロフィー症の症状進行に骨格筋中での酵素活性の変化は表4に示すごとく，

伴っていずれも特異的な活性変化を示すことが確

1週間の投与でLDH，GOT，GPTの可溶性分かめられたので，これらをマーカー酵素として，画を除く各酵素に活性上昇の傾向が認められた．

ホルフェニシノールを投与した場合の疾病進行に

とくにCANP活性は，1週間投与ではむしろ活対する効果を検討した．

性上昇の傾向を示すことが注目される．2週間投2）ホル7ェ二シノール短期投与のマーカー酵

与ではCPK，PKおよびGOT，GPTのミトコ
ンドリア分画中の活性値がそれぞれ著しく高くな素活性に対する影響
まず，発症後やや時間を経過し，症状がある程り，とくに，CPKで2倍，ミトコソドリ7GPT

度進行した生後1カ月の羅患マウスを用いて，ホでは3倍の増加が認められた．CANP活性は，ルフェニシノールの短期間投与による血清中遊出2週間の連続投与で著しい減少を示し，食塩水投酵素の活性変動に与える影響を調べた．表3はそ与対照群の約1／3に低下しているのが注目される．

の結果を示したものであるが，1週間の投与です

6週間投与群では2週間投与群で認められた傾向

でに測定した全酵素でわずかながら活性の低下ががそのまま継続された状態を示していた．LDH認められる．2週間後でもこの傾向はやや増強さ活性は，ホルフェニシノールの短期間投与では血れた形で継続され，6週間の連続投与では，PK，清中でも骨格筋中でもやや減少の傾向をみせてい

CPKなどの活性値は，食塩水投与対照群の半分たが，それほど大きな変化は示さなかった．

近くにまで低下していることが認められた．一方，−53−3）ホルフェ二シノール短期投与による体重変化
約1カ月齢の羅患マウスにホル7ェニシノールを6週間連続投与することによって，疾病のマー
カー酵素群が血清ならびに骨格筋中で疾病改善の方向に変化することが認められたので体重の変化について測定を行ったところ，図1に示すごとく，同齢の正常マウスの場合は6週の間に約4gの体

06 12 18
24 30 36 42
Administrationperiod（day）

重増加がみられたのに対して，ホルフェニシノー
ル投与および食塩水投与の疾病マウスではほとん
ど体重増加が認められなかった．わずかに食塩水

図11カ月齢の筋ジストロフィー症マウスにホルフェニシノールを連続授与したときの体重変化．

投与対照マウス体重減少の傾向があるのに対して，な体重増加を示していることが認められる．このホルフェニシノール投与マウスがやや増加の方向

変化は肉眼的にも歴然と認められるが，同時にほを示しているという差異がみられる程度であった．

とんどの投与マウスでいったん筋ジストロフィー

また，臨床症状にも目立った変化は認められず，症状が消失することが確かめられた．この傾向は，わずかに食欲増進の傾向がみられる程度であった．

3カ月齢時に至っても同様に認められ，投与群の4）ホル7ェ二シノール早期投与開始による症

平均体重は無処置罷患マウスの2倍近くに増加し，状回復効果

ほは正常マウス並みの成長を示していた．一方投すでに症状の進行した筋ジストロフィー症マウ

与マウスの中に体重増加は顕著にみられるが，注スにホルフェニシノールを短期間投与した場合に射など外部からの刺激が与えられたときに，後肢疾病進行を遅らせるごとき傾向が間接的にみられの引づり，あるいは頭部の上下運動などの症状をたことから，次に発症後のできるだけ早い時期か軽度に発現する個体があり，これらはついに完全らホルフェニシノールの連続投与を行った場合のな症状の消失に至らず，3カ月齢以降になると後臨床症状に対する回復効果の有無を検討した．表肢に明らかなsticknessを起こし，歩行異常を示

5は，約2週齢からホルフェニシノールを投与開すようになった．しかしこれらの疾病回復に失敗

始した筋ジストロフィー症マウスと，無処置の同したマウス群も，投与を継続することによって無齢筋ジストロフィー症マウスの1カ月齢および3処置の罷患マウスに比較して著しい寿命の延長がカ月齢時の体重増加を比較したものであるが，1みられている．

カ月齢ですでに雌雄ともに，投与群のほうが有意
表5

図2は，ホル7ェニシノール投与筋ジストロフ

Comparison of body weight of forphenicinoltreated dystrophicmiCe withthat of untreated dystrophic miceSex Treatment l month
Male Treated

15．5±3．4（13）＊［10．0−21．5］
Untreated

Female Treated

3month

14．3±1．3（12）＊［12．0−16．0］
Untreated22．5±2．9（13）＊［17・5726・5］

9．6±1．5（10）［7．1−11．3］

12．1±0・7（10）［11・3−13・0］

17．7±1．2（12）＊［15．0−25．5］

7．8±1．1（10）［6．0−10．1］

10．8±0．8（10）［9．8−12・0］

Brackets show the range of each data．Parentheses show the numbers of mice used．
Unit：g body weight．＊♪＜0．01．

−54−

筋ジストロフィー症マウスに対するホルフェニシノール投与の影響
表6Starting age of dystrophicmicewith forphenicinoladministration and recovery rate
Starting age（day）

Numbers of mice
13−20

Treated21−30

33（820，913）

31−40

Total

24（812，912）

23（Sll，912）

80（643，937）

Succeeded

15（6

6，9

9）

7（81，9022（8Unsucceeded
Recovery rate（％）

18（814，945・5

4）17（811，929・223（811，912）
058（836，922）
27・5

20

24

6）

6）

7，915）︵u苫︶︒貞一ぎ叫PlO三三〇ト︵叫︶一事言合〇円

1

0

4

8

12

16

2

3

4

5

6

7

Time（min）

図3

Age（weet）

図2 発症直後からホルフェニシノールを投与し，症状の消失したマウスと，無処置筋ジストロフィー症マウスの成長曲線．

金網しがみつき法による筋の耐久力テスト．
N：正常マウス，Fl＿5：ホルフェニシノール投与により症状の消失した筋ジストロフィー症マウス，Cl＿5：無処置の筋ジスPフィー症マウス，いずれも約3カ月齢．

ィー症マウスと無処置筋ジストロフィー症マウス

マウス並みのホルフェニシノール投与マウスにつの典型的な例による成長曲線を示したものである

いて，骨格筋の耐久力に関しても回復が実際に起が，20遇齢でほぼ2倍の体重差を示しているこ

こっているのか否かを確かめるために運動強制負とがわかる．

荷テストを行った．600Cのホットプレート上に

表6は，現在までに実施したホルフェニシノー

被検マウスを置き，円筒状で蓋付きの金網をそのル早期投与実験の全マウスについて，投与を開始

上にかぶせておくと，マウスは足の裏が熱いためした日齢と4カ月齢以後に疾病が完全に消失して側面の金網をよじ登る．この状態を7分間継続しいることが判定された個体の出現率との関係を示て，ホットプレート上から完全に足を離し，金網したものである．その結果，20日齢までに投与にすがり付いていた時間の総和を示したものが，の開始を行えば隈患マウスの約1／2が疾病から回図3である．約2カ月齢の正常マウスは10頭試復することが認められた．また，投与開始日齢がみたが，すべていったん金網に登ると，実験時間

それより遅くなれはなるほど回復率が低下し，1中はホットプレート上に落ちることはなかったの

カ月齢以降に投与を開始しても，もはや疾病の回に対して無処置の同齢筋ジストロフィー症マウス

復が起こらないことが明らかになった．

では2／3以上の時間，ホットプレート上に落ちてそこで，症状が完全に消失し，体重増加が正常いることが判る．ところが，ホルフェニシノール−55−

投与によって完全に症状の消失した筋ジストロフ

けて測定した結果，可溶性分画で活性上昇し，ミィー症マウスではほとんど落下せず，正常に近い

トコンドリア分画で低下していることが判った．

筋の耐久力を回復していることが認められた．

これにホルフェニシノール投与を行うと血清への遊出が減少し，骨格筋中では可溶性分画で活性低考察下し，ミトコンドリア分画で上昇するという正常マーカー酵素として用いられた6酵素はいずれ方向への回復効果が認められた．しかし，この実も筋ジストロフィー症マウスにおいて，症状の進験で体重増加，あるいは臨床症状の改善などに関行に伴って特異的な活性変動を示すことがすでにして顕著な変化がみられなかったのは，症状のか確かめられている酵素群であるが，今回実験を進なり進行した状態ではホルフェニシノールによっ

めるに当って再度活性測定を行い，この事実を確てもたらされる筋線経の回復能力を越えた破壊がかめた．すなわちCANP活性は骨格筋中で著し

すでに起こっているためと考えられる．

い活性増加を示しており，PKおよびCPK活性発症直後の時期からホルフェニシノール投与をは血清中で活性が増加し，骨格筋中で低下してい開始すると，べスタチソの場合と同じく約半数のることが認められた．またGOT，GPT活性は血個休で症状の完全な消失および正常な体重あるい

清中で上昇していたが，骨格筋中では可溶性分画は筋の耐久力の護符が行われることを兄いだした

中のisozyme活性がともに増加し，逆にミトコが，回復率は投与開始が早いほど高く，1カ月齢

ンドリア分画中の活性は減少していることが判っを過ぎるともはや回復が起こらないことから，ホた．LDH活性は骨格筋中ではやや活性低下を示

ルフェニシノールの筋ジストロフィー症に対するしていたが，血清中への遊出増加はほとんど認め

効果は対症療法的効果ではなく，疾病進行の原因られなかった．

を抑制する効果であろうと考えられる．したがっ

約1カ月齢で筋ジストロフィー症状がやや進行て発症以前に投与開始を行えば，発病を完全に抑した状態の羅患マウスにホルフェニシノールを短止できる可能性を示唆しているものと思われる．

期的に連続投与すると，骨格筋中のCANP活性は1週間投与でむしろやや活性上昇を示したが，総括6週間投与によって対照の約1／4に低下すること

1）筋ジストロフィー症マウスにホルフェニシが認められた．これは，ホルフェニシノール投与

ノールを短期間連続投与することによって，血清により，筋線維内の生理状態の改善が行われた結中ならびに骨格筋中でのマーカー酵素の活性変動

果，二次的に減少したものと考えられる．PKおを症状改善の方向に変化させることが認められた

よびCPK活性は，ホルフェニシノール投与1週が，その結果は投与期間が長いほど著しい傾向が間で早くも血清中で減少し，骨格筋中で増加するみられた．

傾向が認められ，6週間ではさらにこの傾向が強2）発症初期からホルフェニシノールを連続投調されていた．この結果は，ホルフェニシノール

与することによって疾病マウスに症状回復，体重が筋膜に結合することによって膜機能が改善され増加，筋の耐久力増強などの効果が認められた．

ることを明瞭に示しているものと考えられる．
また，GOTとGPT活性も筋ジストロフィー症

マウスでは血清中で上昇傾向を示しているが，骨格筋中では可溶性分画とミトコンドリア分画に分
−56−

文

献

1）Tsuji，S．and Matsushita，H．，Effect of pro−teaseinhibitors on the activity changes of
SeVeral enzymesin murine muscular dystro・

筋ジストロフィー症マウスに対するホルフェニシノール投与の影響

phy・′・劫プ∫foJ・goc．′郎α乃43，374（1981）．
2）辻 繁勝，松下 宏．プロテアーゼ・インヒビタ
ー連続投与によるマウス進行性筋ジストロフィー症の症状回復について．和歌山医学30（4），331（1982）．

metric method withimproved sensltlVlty，
A，乃・′．CJf押．fbJ力oJ．50，89（1968）．

5）Karmen，A・，Wroblewski，F．，and LaDue，J．S．
Transaminase activityin human blood．J．
CJf仇∫州がg∫J．34，126（1955）．

3）Dayton，W．R．，Reville，W．J．，Goll，D．E．，and
Stromer，M・H．A Ca＋＋−aCtivated protease

POSSiblyinvoIvedin myofibrillar protein
turnover：Partial characterization of thepurified enzyme．BiochemistYy15，215972167（1976）．

4）Hess，J・W．，Murdock，K．J．，and Natho，G．J．
W．Creatine phosphokinase，A spectrophoto−−57−6）Wroblewski，F．and La Due，J．S．Lactic de・hydrogenase actlVltyin blood．Proc．Soc．
E掛βioJ・〃gd．90，210−213（1955）．
7）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F．，and Morimu−
ra，H．Crystallization，Charaeterization andmetabolic regulationoftwotypesofpyruVatekinasesisolatedfromrattissues．J．Biochem．
62，7ト91（1967）．

ロイペプチンによる実験的治療

高 木 昭 夫＊
研究協力者

埜中征哉＊・石浦章一＊・宮沢寛＊

安部和子＊・小川敬子＊

結果1）ロイぺプチン濃度（表1）A．脱神経萎縮筋に対する効果
これまでロイべプチソの実験的筋萎縮に対する

血梁中，ロイペプチソ濃度は0．5−1．8〟g／mJ，効果を報告してきた1・2）．今回は前年にひき続き隣腹筋では0．1−0．6／増／gであった．脱神経側の神経切断後の筋萎縮に対するロイペプチソの効果

筋では健側より平均2倍高値であった．肝臓ではを分析した．ロイペプチソの効果は劇的なもので平均6．0〟g／gであり，かなり高値であるのが注はないが，一部で筋萎縮過程の修飾を示唆する結目される．
2）実験期間中ラット体重

果を得た．
方

ロイペプチソ投与群で平均25g，非投与群で平法

体重300g前後のウィスター系雄ラット10匹

均20g増加した．陸側の筋湿重量はロイペプチを使用した．神経切断の方法，ロイペプチソの投表1血照，肝臓，排腹筋のロイペプチソ濃度（〃g／mJまたは〟g／g）

与法は既報と同一である2）．7日間薬剤投与後に潟血により居殺し，ひらめ筋（SOL），前脛骨筋（TA）および長址伸筋（EDL）を採取し分析に供

Muscle＊Rat No．

Plasma Liver
C

1
3

2

9
．4

1

2
1

1

2
0

7
7

3

6

0

3
7

0
5
2

5

作製し，形態学的検査を行った．筋直径はKon・

0．179

0

4
3

＊ C：陸側，D：脱神経側とEDLについては凍結切片の組織標本を

0．62

1
9
1

6

0

SOL

6．06

0．60

0

9
3

1

10％TCAにより沈澱する蛋白量を測定した．

S．D．

0．246

4
5
2

5

1

9
4
8
3 8 ．4

Mean l．14

0．170

0

6
8

した．沈法分画については0．1NNaOHで可溶，

0．197
0．102

3
5
6

0

4
7
3

心後の上清と沈漆の蛋白をビューレット法で測定

663でホモジェネートを作製し，3，000rpm30分遠

4
6
3

3
6
3

した．筋蛋白測定にはTAを使用した．H20中

D

0．337

0．060 0．213

表2 健側の筋湿重量（g）

tron MOP2image analy2：erを使用して測定しロイペプチソ（−）

た．血粟，俳腹筋（僅側と脱神経側）と肝臓につロイぺプチソ（＋）

TA O．53±0．04（7）＊0．50±0．12（6）＊いてロイペプチソ濃度が測定された（日本化薬

EDL O．14±0．02（7）0．14±0．02（6）K．K．田中亘氏による）．

SOL O．13±0．02（7）0．12±0．01（6）＊ 平均土標準偏差（例数）．TA：tibialis anterior，
EDL：eXtenSOr digitorumlongus，・SO工．

＊ 国立武蔵療養所神経センター

soleus−59−

表3 筋湿重量の比（脱神経側／健側）
ロイペプチソ（−）

表6 平均筋直径の比（脱神経側／健側，D／C）

ロイペプチン（＋）

SOL L（−）
TA O・69±0．03（7）0．70土0．04（6）EDL O・74±0・08（7）0．81±0．10（6）（♪＝0．1）

SOL O・52±0・08（7）0．61±0．11（6）（♪＝0．07）

L（＋）
EDL L（−）L（＋）

0．70土0．11（5）0．70土0．09（4）（♪＞0．1）
0．87土0．06（5）0．94土0．07（4）（♪＞0．1）

表4 前脛骨筋の蛋白含量（mg／wetg）
側

脱神経側

均について投与群と非投与群で比較検討した．ま上 漬 し（−）＊

40土9（6）44土5（6）

た脱神経側に関しては健側の直径に対する比で表L（＋）

44土9（5）48土8（5）

現した．非投与群の平均直径はEDL37．4pm，

L（−）

134土17（6）118土15（6）L（＋）

139土14（5）120土6（5）健沈法

SOL38．7／Jm と両者に差はなかった．脱神経により＊ L（−）：ロイべプチソ非投与群，L（＋）：ロイべプチソ投与群．

EDLは87％に減C，SOLは70％に減じた．SOLで湿重量の減少が強いのに対応する

ンの投与，非投与にかかわらず両群で同一であっ所見である．ロイペプチソ投与により健側では直た（表2）．

径はやや増加の傾向を呈したが，有意差は認めな

3）脱神経筋に対する効果（表3）かった．同様に脱神経側においてもロイペプチン

脱神経による筋萎縮はSOLで最も著明で湿重投与の効果はみられなかった．

量は健側の52％に減少した．EDLが最も軽度考で74％であった．ロイペプチソ投与によりSOL

ロイペプチソは前回同様にミニ浸透圧ポンプでは61％に（♪＝0・07），EDLは81％に（♪＞30mg／kg／日 の予定で投与した．骨格筋内の濃度0．1）に改善した．

は肝や血巣に比してかなり低値であった．最近カ察4）筋蛋白量（表4）

テプシソB＆Lの50％活性抑制に必要なロイ

健側および脱神経側のTA蛋白量を測定した．

ペプチソ濃度は0．03〟g／mJとされた（石油章一，

脱神経により沈法分画の蛋白がより減少する傾向私信）．筋蛋白分解に関与する酵素がすべて知らを呈した．上清および沈睦分画の蛋白はロイペプ

れているわけではないが，この知見からみれば，チソ投与により有意に変化することはなかった．

筋肉でも充分有効濃度内に達しているものと推定

5）筋綾維直径に対する効果（表5）される．

節線維直径は同体重ラットにもかかわらず個体

今回の成績は，前回同様筋萎縮の阻止に非常に差がかなり認められた．それぞれの個体で筋線維劇的といえる効果は観察されなかった．しかし

200−400本について平均値を出した後で，その平SOLの筋萎縮に対しては軽度ではあるが有効性

表5 平均筋線維直径（〟m）
ロイべプチン（−）

ロイペプチン（＋）＝−60ニー−こロイべプチソによる実験的治療を示唆する所見を得た．また筋蛋白量や筋直径な

どうして筋萎縮が進行するかは重要な問題であろ

どのパラメーターに関しても検定上の有意差は認う．

めないまでも，萎縮の経過を修飾する傾向を示唆するデータを得た．従来筋萎縮の治療に関する情B．∫几p紀ro筋収縮に対する影響

報はきわめて乏しいことを考慮すれば，興味ある骨格筋をi乃〝わroで反復収縮させると，劣化

知見と思われる．今後このようなロイペプチソの現象が生じてくる．この経時的劣化には種々の要作用を筋機能の面から検索することも重要と思わ田の関与が推定される．本実験ではこの劣化現象れる．ロイペプチソ投与下でも筋萎縮は明らかにが蛋白分解酵素阻害剤であるロイべプチソ，べス

進行している．筋蛋白濃度は分解と合成のバラン

タチソやペブスタチソで修飾されるかどうかを検スの上に成り立っている．Goldspinkによれば，討した．

脱神経筋では蛋白分解と合成の両方が克進してい方るとされた8）．もし本実験で蛋白分解が完全に押

体重80−100gのウィスター系雄ラットのEDL

倒されていれば萎縮は生じないこととなる．それ（湿重量30−40mg）を使用した．摘出筋は直ちに

故，①ロイペプチソにより影響をうけない蛋白分

混合ガス（95％02−5％CO2）で飽和したクレブ解が存在する．㊤ロイペプチソは蛋白合成をも抑

スーリソゲル液中にうつし，電気刺激により等尺制する（これほど乃〝わroでは否定されている）．

性張力を記録した．電気刺激の条件は1Hz，15（丑i乃dfr（）と違ってf乃∫ff〟ではロイペプチソはmsec持寿売，約10V振幅の連続刺激を60分継続

分解酵素を阻害しない，などの可能性を追求する

した．同時に50Hz，15msec持続，10V振幅

必要があろう．

の強紹刺激を10秒ずつ5分ごとに反復し，強縮

ま

と

法

張力の時間推移を観察した（図1）．筋長は単収め

脱神経後の実験的筋萎縮がロイペプチソ投与に縮が最大となるように調節した．電気刺激後筋肉より修飾されるかどうかを検討した．筋組織内濃および外液中のCPK活性を測定した．CPk測度はカテプシソB活性を阻止できる範囲に維持さ定にはべ−リンガ一社のキットを使用した．外液れた．ひらめ筋の萎縮にはロイペプチソは若干有

中のCPK値は電気刺激中に平均約50％失活し効であった．しかしロイペプチソ投与中でもいずたためこれを補正した．クレブスーリンゲルの液れの筋肉においても筋萎縮は明瞭に進行していた．

組成は以下のように変更して使用した．118．1mM山＿．＿．叩卿岬叩哩』し」2・8g
0．40r2mim

図1Decayin twitch and tetanus tension（rat−3EDL）−61−

表7 強縮張力（g重／wetg）

NaCl，3．4mM KCl，0．8mM MgS0．，1．2mM
KH2PO4，11．1mM glucose，25mM NaHCO3，

対薬

2mM CaC12，0．1mM EDTA，10mM還元型グ
ルタチオン（pH7．4）である．酵素阻害剤の最終剤

105土14＊77土21＊＊＊ 平均土標準偏差．
＊＊ ♪＝0．05，なお1g重＝10mN．

濃度は，0．2′唱／mJペブスタチソ，10／g／mJ ロ

表8 単収縮／強縮張力の比

イべプチソ，2〟g／mJベスタチソである．
結照（〃＝5）
群（乃＝5）対薬

果1）収縮特性（表7−10）

照（れ＝5）

0．52土0．06

群（抑＝5）

0．56土0．03

剤

表9 電気刺激60分後の相対張力（ゼロタイムの張力を1．0とした）
5
0

0

0
0
土 土
2
0
3
3

9
0

6
0

0
土
8
1

1
1

0

0

は認められない．また筋拘絹のために基線は為

0
土
1
2

約20％に，j㌔は約30％に減衰した．両群に差0

間で差はなかった．60分経過後の単収縮張力は

︶
︶
5
4
こ
こ
ル
竹
︵
︵

強 縮

︶
4
こ
ル
︵

少した（P＝0．05）．twitch／tetanuSの比は，両群

︶
5
こ
乃
︵

単収縮

照剤照剤

（昂）は，105g重／wetgから77g重／wetgに減対英対案

蛋白分解酵素阻害剤を含む溶液中では強縮張力

表10 電気刺激60分後の基線の上昇（ゼロタイムの強縮張力に対する比で表現した）の約10％上昇した．これも両群で差を認めなかった．このように薬剤群で昂の低値以外には有対照（れ＝5）

0．08士0．06

薬剤（乃＝5）

0．12土0．07

表11電気刺激60分後の筋CPK活性値の喪失（％）

意の差を認めなかった．
2）筋CPK活性に対する効果（表11）60分の電気刺激中に筋CPK活性は80−94％

対照（乃＝5）

23土22％薬剤（乃＝5）

14土13％のレベルに減少した．しかしこの減少に対して薬剤の効果は認められなかった．また外液中の度が変化しないことは確認してあり，よく説明で

CPK値測定からは筋内の0．4−0．5％が漏出したきない現象であった．

と推定された．この漏出に対しても薬剤の効果はま認められなかった．

J刀がffr。で筋肉を連続刺故により反復収縮させ，

考

と

め

その経時変化（劣化）と筋肉CPK値の変化を測

察

九びわroで筋収縮を反復させると，標本の劣化定した．ロイペプチソ，べスタチソ，ペブスタテが生ずることはしばしば経験される．この劣化にンの投与はこの劣化現象を修飾することはなかっは細胞膜機能の低下，細胞の横根的破損，細胞のた．

ATP供給の低下などの田子の関与が推定される．
しかしどの因子が最も重要かは知られていないと思われる．ジストロフィー筋の特性には，一部この自然の劣化に共通するものがあろうと想像される．そこで 乃乃 わγ0での劣化現象に対して蛋白分解酵素阻害剤の影響の有無を検討した．結果としてはこの種の薬剤により修飾されるものでないことが判明した．なお薬剤群で強縮張力の低下が認められた．薬剤添加より溶液のpHやイオン強
−62−

文

献

1）高木昭夫，埜中征故，水沢英洋，助川卓行，安部和子，小川敬子．ラット実験的筋萎縮に対するロ
イペプチソの影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班），昭和55年度研究報告書，pp．63−66（1981）．
2）高木昭夫，埜中征鼓，石浦章一，宮沢 寛．脱神経による実験的筋萎縮に対するロイベプチンの効果．厚生省新薬開発研究（梅沢班），昭和56年
度研究報告書，pp．57−60（1982）．
3）Goldspink，I）．F．The effects of denervation
On prOtein turnover of rat skeletal muscle．
βioc九g桝．J．156，71−80（1976）．

塩酸ブビバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するロイペプテンの影響

埜 中 征 哉＊
研究協力者

石浦章一＊・藤田武久＊・高木昭夫＊

進行性筋ジストロフィー骨格筋の主病変は筋線し，筋線経の壊死を起こさせ，その壊死に対する経の壊死である．壊死に続いて活発な再生もみら

ロイペプチソの影響をみた。壊死の後に筋線経はれることが知られている．すなわち，筋ジストロ

速やかに再生するが，その再生に対する影響をも

フィーの病理は筋繰経の壊死と再生の繰り返し像検索した．塩酸プビバカインは局所麻酔剤であるをみていることになる．筋ジストロフィーの進行が，本剤は筋線経への毒性が強く，筋線維のみ選を阻止するためには，あるいは阻止しないまでも択的に障害する．血管，末梢神経，筋衛星細胞，

進行を遅らせるには，筋線経の壊死を抑制するか，

神経筋接合部は障害しないため速やかな均一な再あるいは再生を促す方法が考えられる・

生線経が得られることでも知られている5￣7）・

ロイペプチソは筋崩壊に何らかの形で関与すると考えられているプロテアーゼ，とくにチオルプ

対象 と 方法

ロテアーゼの活性を抑えるため，本剤の投与は筋対象としたのは約250gのWistar系雄ラット

壊死の過程を抑制ないし阻止するのではないかとである．
ロイペプチソ治療群ではロイペプチソが50mg／

期待されている．しかしながら動物実験での成績
はまだすべてが満足すべきものではない．筋ジス

kg／日となるようにminiosmotic pump2002

トロフィー鶏，筋ジストロフィーマウス何れを使（AIza，California）をラット背部皮下に挿入し用した実験でも，効果を認めたとするもの1・2）とた．挿入後，24−48時間後に左室よりロイペプチ

無効とするものい）がある．これらのモデル動物

ソの血中濃度測定のため採血した・一部のラットでは進行性筋ジストロフィーといってもヒト，とはその直後に0．1％，あるいは0．5％塩酸プビバ

くにDuchenne型筋ジストロフィーとは異なる

カイン約0．5mgをヒラメ筋内に注射した・
注射後48時間，7日，14日日にヒラメ筋を採ところが多い．そのために動物で無効といっても，それが必ずしもヒトに無効というわけではない．

取し，右は生化学用に左は組織学用に固定した・

またその逆もいえる．私たちは今まで筋ジストロ対照としたのは，①塩酸ブビバカイン注のみのも

フィー鶏や筋ジストロフィーハムスターを使用し，の，㊥ロイペプチソのみ投与し塩酸ブビバカイン

ロイペプチソの治療効果を主として病理学的にみ㊧のないもの，④全くの無処置の，3種である・てきたが，満足すべき結果を得なかった・

検体を採取する際にもロイペプチソの血中および今回は塩酸プビバやインをラット骨格筋に注射

筋内濃度を測定するため，左窒からの採血と，脾

＊ 国立武蔵療養所神経センター

腹筋の採取を行った．
一二63−

図10・1％塩酸プビバカイン注射後45時間．筋線経はかなり残ってはいるが，広範囲の壊死部を認める．
それはロイペプチソ未処理（A）でも治療中（B）でも壊死の量，質には差はない．HE染色，×1弧

深
一声一i∴
︳

ヽ

毅

●

′1′ト

一⁚ノ一

■r 一 ■

ヽ

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●

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き二・、●▲・Jyi

上声持・■戚潜

rI．い㌧．
ぜ藍幾∵ゝ ◆．†．●．1、−＞しこ！二i．ヽ

．ここ

おま．一瀧が−

i㍉「

＿●

●も■リ

．∴．ヾ

′・．：J

図2 0・5％塩酸プビバカイン注射後48時間．ほとんどすべての筋線経は壊死に陥り，強い貪食反応を伴っている．ロイべプチン治療（A）と対照（B）の間に差はない．HE染色，×15C．

−64−

塩酸ブビバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するロイペプチソの影響

園芸 0・5％塩酸プビバカイン注射後7日臥塩基好性の胞体と大型の中心核，核小体の存在によって特徴づけられる再生線維・対照（A）に比べロイペプチン治療群（B）でその直径が小である．HE染色，×300．

図4 0・5％塩酸ブビバカイン注射後14日目．再生筋は著しくその径を増している．対照（A）に比べ，
ロイペプチン治療群（B）ではその直径は小である．未処置の筋（C）を参考までにつけ加えた．HE
染色，×300・−65−

左ヒラメ筋は前脛骨筋とともにトラガカントゴ

的検討はなしえなかった．

ムでコルク栓上にたて，液体窒素で冷却したイソb）0．5％塩酸プビバカイン注

ペソタンで直ちに凍結固定した．凍結連続切片に（∋ 筋線経の壊死：0．5％塩酸ブビバカインをへてトキシリン・エオジン（HE），Gomoritrich・

ヒラメ筋に注射すると，ほとんどすべて（95％以rome変法，NADH−TR，酸フォスファターゼ染上）の筋線経は例外なく壊死に陥った．48時間

色を行い，−一部の筋にはATPase（pHlO．3，

後にはほとんどすべての壊死線経は貪食細胞で満4．5，4．3前処理）を行った8）．再生筋の状態を数たされ，問質も浮腫状で多数の多核球，単球の浸量的に検討するため，各個体のHE染色標本よ潤をみた（図2A）．この貪食細胞はすべて酸フり最終倍率250倍の写真を作成し，200本ずつのォスファクーゼで強く陽性であった．末梢神経や筋線維径をMOP2（Kontron）にて測定した．

筋紡錘はよく残存し，形態学的に異常を認めなかった．

生化学的分析
ヒラメ筋を10倍量のPBS−0．1％Triton X−

ロイペプチソをあらかじめ授与したラット（8100液にてホモジナイズし，遠心後上清を採取し匹）全例にやはり同様の壊死，貪食細胞の侵入を粗抽出液とした．Triton X−100の添加により筋認め（図2B），投与群，非投与群の間に形態学全体の95％以上のライソゾーム酵素が上清に回的な差を認めなかった．
㊤ 再生線維：壊死した筋線経は貪食細胞で清収され，本法が適当であることが確認された．
ロイペプチソの標的酵素であるカテプシソB＆掃されるが，それと同時に再生が始まり，注射後

Lは，Suc−Tyr−Met−Naphthylamide（NA）を4日日頃より再生線経としての特徴を備え始め，基質とする勝沼の方法で測定した．そのほかは既7日目では明らかな再生線経と確認できた．それ報によった7）．

はロイペプチソ非投与群（図3A）でも，投与群（図3B）でも形態学的に明らかな差はなかった．
結すなわち，塩基好性の胞体をもち，やや大型で細果1）組織学的および組織化学的所見

胞体の中心に位置する核，明瞭な核小体がしばしa）0．1％塩酸プビバカイン注：0．1％の塩酸ば存在した．この頃はまだ筋線経は未分化でプビバカインを注射したヒラメ筋（5匹全例）でATPaseでもタイプ1，とタイプ2線経の区別

は局所的に筋線経の壊死像を認め，48時間後ではなかった．ロイべプチン治療群（7匹），非治療は強い貪食反応を伴っていた（図1A）．しかし群（8匹）で7日日に線維径を測定したところ，

大半の筋線経は壊死に陥らず健在であった．

前者は平均24．4±5．3／上m，後者は29．0±5．5／ m

ロイペプチソをあらかじめminiosmoticpump（前者1，400，後者1，600本の筋線維径平均とそで与えていたラット5匹全例にやはり非治療群との偏差値）となり，前者のほうが線維径は小であ同様の変化を認めた．壊死線経は散在し，強い貪った（ク＜0．01）（表1）．

食細胞の侵入があった（図1B）．

塩酸プビバカイン注後14日目には再生線経は注射後7日目，14日日には非治療群（おのおのその径を著しく増し，ロイペプチン治療群（8匹）

5匹ずつ），治療群（おのおの5匹ずつ）何れにで平均直径29．9±6．4〃m，非治療群（8匹）・でも活発な再生像があった．その再生線経の形態は36．5±6．2〟m となっていた．その径はやはりロ両者間にあまり大差ないように思われた．再生線

イペプチン治療群で有意に小であった（♪＜0．01）．

経は散在性であり，数も少なく，両群間での数量

ロイペプチソ治療群のほうが再生線経は細かった−66−

塩酸ブピノミカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するロイペプチソの影響
表1筋緑維径（〟m）分布群＊ 再生線維径．＊＊ ♪＜0．01が，細胞内の形態に差はなく（図4），7日目のとmg）

U ／m gきと同じく中心核を高頻度に認める塩基好性の線●− ￣￣ 一 一一一 − 一 一 ￣￣− 2−0●0

経であった．また組織化学的には両群の再生線経

c 山 叩 Sin s B ＆ L

40 0

；
0

とも未分化であった．
W e l w e ig h t

ロイペプチンをラットに投与するとラットの体U ／m gα−G 】
u … id a s e

00 ．
．
24 肌

r 一一 一 一 一 一 一 一 一 一一 一gc lt h 堅 血 D

重はやや減少するが，塩酸プビバカイン非処理筋ではとくに変化はなく，また筋線維径を減ずるよ5
ト

うな傾向もみられなかった．

ー…

一 一 − 一 一 一− ●一 一 一一一一 一 一 一 一 一 一●

2）生化学的所見

U ／m g0．5％塩酸プビバカイソ処理後，48時間後にはカテプシソB＆Lの活性が正常の10倍以上

50 ・2に上昇することが明らかになった．同様にライソ「 −■ ■ ￣ナ
27

ゾーム酵素であるカテプシソD（4倍），α−ガラ
クトシダーゼ（4倍），酸フォスファターゼ（2倍）などが上昇し，48時間目にみられる筋構造
蛋白質の減少は，これらの酵素の上昇と密接な関

ーー−

ー●
．
14

t
2

l
7

l
14

図5 ロイぺプチン負荷中のヒラメ崩重量およびライ
ソゾーム酵素活性の経時的変化．0塩酸ブビバカ
イン注筋，●未処置筋．
3）

継続し，筋の再生とともに減少していくことが判￣￣

一 一 一●一 一 一 一 一 一一●Daysafterbupivaeaineinjection

係があるものと考えられた（図5）．
このライソゾーム酵素の上昇は以後7日目まで

U ／m g0 ．4 A c id p h o sp h a t−S e

α−G a h ⊂ O S id a 5 モ

ロイべプチソは筋肉内のその他のライソゾーム酵素の活性は多少上昇させるが，ほとんど影響を与えなかった．
4）ロイペプチソと塩酸プピノミカインを同時に明した．0．1％の塩酸ブビバカイン投与において筋内授与した場合，初期の筋崩壊（Z線の遊離）は，活性上昇の程度が0．5％より軽微であった．
これらの生化学的変化に対するロイペプチソ投はある程度抑制された．

与の結果は以下の通りであった．
考1）ロイべプチンほマクロファージ由来のカテ
プシソB＆Lの上昇を抑えなかった．

察

ロイペプチソが筋ジストロフィーの筋崩壊に関2）ただし，f乃びわroではロイペプチン（0．01

与すると考えられているチオルプロテアーゼ酵素mM）は完全にSuc−TyrTMeトNA水解活性を抑の活性を抑制することは九日ガかⅥの実験で確かめ制した．

られている．しかし玩＝血相での効果はまだ確定
ー67−

的でない．その理由の一つとして，ヒトの筋ジス

烈であり，筋ジストロフィーのときの壊死はもっトロフィーと等価とみなされるようなよいモデルと緩やかなものと思われ，全く同一視はされえな

動物が兄いだされていないことがあげられる．

い．しかしロイペプテンが筋の壊死と再生に何ら

筋ジストロフィー鶏では筋の崩壊機序がヒト筋かの働きをしているとするならば，本実験モデル

ジストロフィーと大きく異なっているのではないに何らかの形で影響を与えるはずである．そのよかと考えられているし9），筋ジストロフィーハム

うな考えで本実験を行った．ロイべプチソは50

スターは筋線維壊死後の再生が活発で，筋壊死をmg／kg／日となるようminiosmoticpumpを使用

よく代位しているので筋力低下がほとんどみられした．

ない．また筋ジストロフィーマウスでは神経系のロイペプチソの大量はラットの体重を減少させ異常がみられるし，何れのモデル動物も個体差がたが，2週間では重篤な副作用はなかった．pump

大きく効果の判定が大変困難であった．

挿入後48時間目とロイペプチソの血中濃度が十

局所麻酔剤である塩酸ブビバカインによる筋の分上昇したところで塩酸プビバカインを注射した．

崩壊過程は，ヒト筋ジストロフィーにみられるそ0．1％液のときも0．5％のときも壊死・貪食反応

れと類似していることが最近指摘されている卜7）．

に対しては形態学的に何らの影響もなかった．こ

塩酸ブビバカインは筋の膜にまず何らかの障害をれは，筋の壊死があまりにも激烈であるので，ロ加えるため，筋線経の過収縮（opaque線維）を

イペプチソの影響の有無はとても判断できなかっみ，次いで筋線維内に増加するCa2十の存在が組たことによると思われる．再生線経はロイペプチ

織化学的に確かめられている7）．塩酸ブビバカイ

ソ投与群で明らかに小径で，再生現象が抑制されンを注射して数時間でZ線蛋白である α−アクチていた．このことの意味は不明であり，今後の検ニソの遊離をみ，次に筋原線経は断裂する．24

討が必要であると思われた．進行性筋ジストロフ

時間日頃より貪食細胞が壊死線維内に侵入し，48

ィーでは活発な再生があるのに病気が進行するの時間目には最も活発な貪食反応をみる．

は，再生が壊死を十分代償しないからと考えられ

塩酸プピ／ミカインは末梢神経，血管，筋衛星細ている11）．もしロイペプチソが再生を遅延させる

胞を侵さないため速やかな再生をみることができとなると，筋ジストロフィー患者への投与は慎重る7・10）．注射後4日日には中心核をもつ，好塩基を期さねばならないことになる．

性の再生線経として認めることができる．塩酸ブ

本研究で生化学的に目的としたところは，ロイ

ビバカイン注では筋線維のみ壊死させ，周囲の組ペプチソがfHめ0で標的酵素活性を抑制するか織は侵されないので再生線経は大小不同が少なく否かである．今回の実験で筋肉の崩壊に主として均一であり，経時的にきわめて高い再現性を示

関与するのは，非筋細胞由来のライソゾーム酵素す10）．0．5％溶液をラットのヒラメ筋に注射するであることが明らかになったが，miniosmoticとほほ100％の筋線経が壊死に陥り，再生する．

pumpでロイべプチンを持続的に投与しても，そ0．1％液では壊死は局所的であり，0．01％液での活性を低減させることは不可能であった．玩は壊死のない場合もあり，壊死があっても狭い範

VitroではロイペプチンはSuc−Tyr−Met−NA水囲に限られる．今回0．5％塩酸ブビバカイン液を活性を抑制するのに，わ仁淀使用したのは確実に筋線経を壊死させるためであ

B＆Lの上昇を抑えないのは，ロイペプチンがマる．

クロファージに十分とり込まれないためであろう

塩酸プビバカインによる筋の壊死はあまりに激と考えられる．

−68−

ではカテプシソ塩酸ブビバカイン（マーカイン）処掛こよる筋崩壊と筋再生に対するロイべプチソの影響

ロイペプチソ投与で肝細胞のライソゾーム酵素
文

活性の上昇が報告されている．その傾向が骨格筋

献1）Stracher，A・，McGowan，E．B．，andShafiq，S．A．
Muscular dystrophy：Inhibition of degenera−tioninvtvowith proteaseinhibitors．Science

でも認められたが，これは50mg／kg／日という大量投与の結果と思われた．

200，50−51（1978）．

ロイペプチソと塩酸プビバカインを同時に筋注

2）Sher，J・H・，Stracher，A．，Shafiq，S．A．，and
打ardy−Stashin，J．Successful treatment。f

すると，細胞内ロイペプチソ濃度が一気に上昇しmurine muscular dystrophyて，早い時期に起こるZ線の消失が抑えられた．

with the pro−teinaseinhibitorleupeptin．Proc．肋tl．

これは，細胞内のCa依存性プロテアーゼを阻害

Ama5吊・打・5・78，7742−7744（1981）．
3）Enomoto，A・and Bradley，W・G．Therapeutic

した結果であると考えられる．

trialsin musculardystrophy．III．Studies of

筋壊死は，最初Ca依存性中性プロテアーゼのmicrobial proteinaseinhibitorsin murine
dystrophy・Arch・Neurol・34，7717773（1977）．

ような筋肉蛋白分解酵素によりまず構造蛋白の崩4）Nonaka，Ⅰ・，Ishiura，S・，Takagi，A・，andSugita，

壊をみ，次に変性した筋原線経は貪食細胞のカテ

H・Therapeutic trialwith proteaseinhibitor

プシソなどライソゾーム酵素により貪食清掃され（leupeptin）in chicken museular dystrophy．
A histologic and histochemical study．Acta〃紺r噌α上月oJ・（βgrJ・）58，279−285（1982）．

る．理論的には第1段階の筋の崩壊が抑制される

5）Benoit，P．W．and Belt，W．I）．Destruction andことが理想的である．今回の実験で高濃度のロイ

regenerationofskeletalmuscleafter

treat＿

ment with alocal anesthetic，bupivacaine（Marcaine）・J・AnaE・107，547−556（1970）．

べプチソがあれば，Ca依存性中性プロテアーゼの活性が抑制されα−アクチニソの遊離が抑えら

6）Jirmanov昌，S．andThesleff，S．Ultrastructural
Study of experimental muscle degeneration

れることが分った．しかし，これは同時に注射すand regenerationin the adult rat．Z ZdE．

るなどかなり限定された条件下である．

ノbrgc九131，77−97（1972）．
7）Nonaka，Ⅰ・，Takagi，A・，Ishiura，S．，Nakase，H．，

もし筋線経が壊死に陥ったときは貪食細胞によand Sugita，H・Pathophysiology of muscle

る速やかな壊死部の貪食と清掃が必要である．とfibernecrosisinducedbybupivacainehydroeh−

loride（Marcaine）・ActaNeurpPalhol．（BerE．），

いうのは，貪食反応があってこそそれに続く再生in press．

があるからである．その意味ではカテプシソなど

8）Dubowitz，V．and Brooke，M．Il．Muscle
Biopsy・のライソゾーム酵素活性の抑制がないほうがよい．

A Modern Approach．Saunders，London（1973）．
9）Nonaka，Ⅰ・and Sugita，H．Intracytoplasmic

ロイペプチンはその酵素活性を抑えないので理想

VaCuOlesinαWfibers of dystrophic ehicken的である．しかしながらロイペプチソ授与した群では再生線経はロイペプチソ非投与群に比べ小径で明らかな再生の遅れがある．このことは，ロイペプチソが高濃度すぎたことによるのかも知れない．いずれにしても，ロイべプチンがもっと筋線
稚内に高濃度に入り，第1段階の筋の壊死を少し

muscle；prObable early pathologic eventini・
tiates massive

でも抑制する方法を開発することが必要であると

4，326−333（1981）．

思われた．

ー69

丘ber necrosis．

Acta Neuro．

如上加J（βgrJ．）55，173−181（1981）．
10）小林繁一，鴨下重彦，埜中征故．Bupivacaine筋
注による実験的筋再生現象の組織化学的研究．臨床神経22，1191（1982）．
11）Nonaka，I・，Takagi，A．，and Sugita，H．The
SignifiCanCe Of type 2c muscle fibersin
Duchennemusculardystrophy．MuscleNerve→

筋ジストロフィー動物の生産・供給

野 村 達 次＊1
研究協力者

梅沢英彦＊2・斉藤宗雄＊1

するうえで疑問がある．そこで，これらのハムス

1・筋ジストロフィーチキンの飼育・生産

ターの改良を開始した．

前年度に引き続き，筋ジストロフィー症ニワト

1）正常ハムスター系統へ川〝遺伝子を導入

リ（筋ジスチキン）の維持ならびに繁殖を，山梨した筋ジスハムスター系の育成

県小淵沢町の財団法人日本生物科学研究所（日生

ハムスターにおける筋ジストロフィーは，劣性研）附属実験動物研究所に委託し，今年度は，∽ツ遺伝子で遺伝し，そのホモ型∽ツ／∽γで発症

NH413および，NH412系の種卵約3，000個する．∽y因子を正常ハムスター系統に導入するを生産し研究班員へ供給した．

には，次のような方法がとられている．

一方，筋ジスチキンの飼育管理法の開発につい

すなわち，まず，筋ジス系統∽ツ／椚γと既存のては，やがては徴生物的にクリーンな動物の生産

正常近交系ハムスター＋／＋を交配し，Fl動物

をはかるために，ビニールアイソレータを用いて＋／椚γを得る．このFl動物間の交配＋／∽ツ×の飼育を試み良好な成賃を得た．

＋／∽γにより，∽ツ／〝γ，＋／∽γ，＋／＋ のいずれかの田子を持つ仔動物群を得る．この中から，筋2．筋ジストロフィーハムスターの供給と改良

ジスの場合舌端に白斑を生ずることから，舌端の筋ジスハムスターは，BIO Research Consul−

観察によりのツ／∽γを選ふ この∽ツ／myに再び

tantsにおいて，1960年代NIH，USAから導上述の正常ハムスター＋／＋を交配し，＋／椚ツ動

入したハムスターを基に，各種近交系やミュータ物を得る．以後，同様にして世代を重ねることにソト系を育成する過程で発見されたものである．

より，my因子を徐々に既存の近交系ハムスター

この筋ジスハムスター約400匹をBIO Rese−に導入することができる．

arch Consultantsから輸入し班員に供給した．

この方法は，既存の近交系ハムスターをコント

一方，輸入できる筋ジスハムスターはBIO

ロールとして使用するため，そのハムスターの従14．6系のオスに限られ，しかもその対照として来の生理的特性を参考とすることができる．しか使用できる正常ハムスターはBIO87．20のメス

し，この方法により，遺伝的背景が近似した筋ジとBIO1．5のオスの交雑FIBIO FIBであり，

スハムスターを育成するには，戻し交配7回以上，両者は退伝的背景をまったく異にし，実験に使用期間は最短でも3−4年必要である．

＊l（財）実験動物中央研究所＊2（財）日本生物科学研究所
ー71−

2）筋ジスハムスター・BIO14．6に正常遺伝子

この方法では前述の正常ハムスターへの〝y因を導入した系統（コントロール）の育成

子の導入に比べ，世代は約倍の早さで進めること

筋ジスハムスターのコントロールとしては，既が可能である．

存の筋ジス系統から，∽y因子を除くことによっ3．今後の方向ても，遺伝的背景の均一な系統を育成することができる．

単一遺伝子で遺伝する形質または因子を，他の筋ジスハムスター椚ツ／刑ツと正常ハムスター

正常動物に導入する戻し交配は，・マウス等で通常＋／＋を交配し，Fl動物＋／∽γを得る．この行われているが，ハムスターで行った例は少ない．

＋／myに筋ジスハムスターmJ／myを交配し，今後，前述の戻し交配の過程でどのような障害が＋／〝抄と ∽ツ／椚γのいずれかの田子を持つ仔動あるか不明である．たとえば，筋ジス因子が他の物を得る．筋ジスハムスター∽ツ／∽γは舌端に白系統に導入されることによって，その表現型が変斑を生ずることから，舌端を観察し，＋／叩γを選わり，筋ジスの発症の程度，舌端の白斑の状態，

ぶ．この＋／mッにまたのツ／∽γを交配する．こならびに繁殖力等に影響することが考えられる．

のような交配により世代を重ねることによって，これらは，今後，育成の過程で解決しなければ正常因子をBIO14．6へ導入，すなわち，BIO

ならない問題である．

14．6から∽γ因子を除くことができる．

−

72−

DMDに対するべスタテン投与効果

三吉野 産 治＊研究協力者

坂口正実＊・足立尚登＊・折口美弘＊

表1
目

的

RegimenべスタチソのDuchenne型筋ジストロフィー

No・Name Age Sex Stage

Ausberger式を用い成人量30mg／日に相当する
量を10％ドライシロップの形で1カ月間連日の朝1回投与を行った．1カ月の休薬の後2倍量に増量し，同様の方法で4倍量すなわち成人量にしB

0000000500000
5555566655666
6666655066555
3333344533444
5555500255000

DMD患児13人を対象とした．べスタチソは，

A

1211212121561152112151515

表1に示すように，年齢4−9歳，Stage1−2の1111111122222

法

MMMMMMMMMMMMM

方

yyyyyyyyyyyyy
4666678945888

チソ投与を行った．

臥FTSAYIEKMKOTするために，入院中のDMD患児13人にべスタ

TKMTMKTKHMHMY

1234567890123
1111

症（DMD）に対する臨床効果および副作用を検討（mg／day）
CDて120mg／日に相当する量まで増量を試みた．各

精神神経症状その他の一般状態および早朝尿によ

症例における投与量は表1に示す．

る一般検尿，一般検血，血清電解質，血沈，血清

臨床効果および副作用の判定は以下のごとく行

蛋白値，肝機能の測定を行った．

った．
1）生化学的には血清CPK値を内服期間中1結

週毎に継時的に測定した．

果

各投与期間における血清CPK値の推移は（図2）運動機能評価として日常生活動作（ADL；1−4），個々の症例でみるといったん増加した後に整形外科的筋ジストロフィー症ADLテスト，厚減少するもの，ほとんど変化のないもの，逆に減生省基準），立ち上り時間（立ち上り動作をビデ

少した後再び増加するものがあるなど一定しない．

オ記録し，再生画像で動作時間を3回測定し平均

これを平均値の推移でみると，内服1週間後の時間を求めた），階段昇降，10m走を指標とした．

CPK値は投与期間A−Dのすべてにおいて有意3）副作用の検討には皮膚症状，消化器症状，に減少しているが，1遇以降の値は増加あるいは＊ 国立療養所西別府病院小児科

減少と一定の傾向はない（増加および減少はいず
−

73−

0

7

14

0

21day

7

図4

図I Regimen A

21day

14

Regimen D
SeC

ADL

Of

10m走

棚消し
21day

0

7

図2

14

21day

Regimen B

0

21day O

21day

図5 Regimen Aでの測定値の推移
れも投与前値に対する差で，5％危険率で有意と判定される）．次に，投与期間中の運動機能評価，
すなわちADL，階段昇降，10m走，立ち上り時
間の推移（図5−9）をみると，1，2例を除いてほとんどベスタチソ内服の影響はみられない．この関係は平均値の推移（図10，図11）でみると一
0

7

図3

14

Regimen C

21day

層明瞭となる．立ち上り時間は投与期間Cにおいて，むしろ有意に延長している．
r−74−

DMDに対するべスタチソ投与効果S蒜こ＿A＿土L S符

10血走

90

80

70

0

14day

階段昇り

60

＿干害

50

階段昇り

階段昇り

5三e

階段昇り

≡一一一一一一一一号

至≡≡
50

100

芦，

図6

50

■・、一・●

100」

Regimen Bでの測定値の推移

SCOre

0

図7

21day O

21day

Regimen Cでの測定値の推移

SeC

100

RegiⅡlenB

90
3

80

i≡≡主音
一一一一一一一．一一一一→

6

70
60

0

Sに

21day o

階段昇り

SeC

21day

階段昇り

：愕 苧

50

50

100

100

0

図8

21day

0

￣董≠
0

∵
≠
■
■
÷

50

25day

9

12

●、−

0

Regimen Dでの測定値の推移

図9 立ち上り時間の推移

−75−

14day

RegimenD

0

21day

、

21day

RegimenA

階段昇降

See

▲C

e O O．0 0 0 0 0
肝109 87 65 4

S

0

0

14day

14day O

14day

RegiInen B
SeC

階段昇降

SeC

e

r
0
C
S
O

O

1

O

9

瞳

O

蹄0…

8

O
7

O
∧U

一一昇〇・疇降

5O

亡 V

15．0土11．216．1土9月

4

14day

O

0

14day

14day O21day

図10 ベスタチソ投与による測定値の推移（平均土S．D．）

RegimenC

階段昇降

SeC

15舶lljS蒜：
0

9

0

8

0

7

0

6
■

0

．
8

0
4

0

14day

0

14day

14day O

O

21day

RegimenDe5

階段昇降 sec 立ち上り時間

9

O

O
2

O

O

O

r

e

e
S

01

8

O

O

▲

O

7

4

20．3土16j

6

O

O
O
5

O

6

26．0土27．0 ●−●昇
〇・一陣

4

0

21day

0

21day

帖
0

2．2

21day

図11ベスタチソ投与による測定値の推移（平均土S．D．）
副作用に関しては，インフルエンザ流行と時期

よび興奮，頭痛，眩堂等の精神神経症状など特別を同じくしたため，13例中5例の熱発者を認めな異常は認めなかった．一般検尿（蛋白，糖定性，

たが，他の入院中のDMD患児と比較し経過にウロビリノーゲソ，および沈睦），一般検血（Hb，

大きな相違はなかった．発疹，痛棒，出血斑等のHt，赤血球数，血小板数，白血球数および分画），

皮膚症状，腹痛，下痢，嘔気等の消化器症状，お血清電解質（Na，K，Cl．Ca），血清総蛋白量およ−76−

DMDに対するべスタチソ投与効果

び分画，血沈は投与開始前後で変化はみられなかの他の運動機能は変化が緩徐であり，かつ変動がった．また，肝機能はCCLF，ZTT，TTT，γ一あるため，1カ月という短期間の結果で結論を出

GTP，LAP，AITPについて検討したが，いずれすことは危険である．今回は血中濃度に関する報も正常範囲での変動だった．

告を割愛したが，有効血中濃度が末だ不明であり，かつ一定の血中濃度を維持すべきか否かも明らか

考でないため投与量の決定は難しく，また朝1回投察

本研究ではべスタチソの1カ月間連日の朝1回与という形式に固執する必要もない．しかし，成投与を行ったが，期待された程の効果は認められ

人量120mg／日に相当する量まで増量しても目立なかった．本来，DMDとくにStage1−2というった副作用がないことから，より大量かつより長早期の例では血清CPK値の変動が大きく，投与期の投与が可能と考えられる．今後は症例数を増

期間A−DのすべてにおいてCPKの平均値が内やすとともに，血中濃度の解析結果と照し合せ，

月艮開始1週間後に減少している事実も，その後の新たなプロトコールを計画し研究を進める方針で値に一定の傾向がないことを考えると，ベスタチ

ある．

ソの効果とみるには無理がある．また，ADLそ−77−

筋萎縮症患者に対するロイペプチン，べスタテンの効果

村 上 慶 郎＊
研究協力者

岡崎

隆＊・林

前年度に引き続き，私どもはロイペプチソを7

英人＊・石川和彦＊

2）結果

例の筋萎縮性疾患患者に，べスタチソを21例の成績は表1のごとくで，効果のうち＋は何らか

筋萎縮性疾患患者に長期間投与して，自他覚的症の自覚的，他覚的改善の認められたもの，士は不状および諸検査を行って，その効果を調べたので

変か軽度の筋力低下，日常生活動作の低下のみら報告する．

れたもの，−は明らかに悪化の認められたもの（疾病の自然経過と思われるもの）に分類した．
1．

ロイぺプチン

この分類では，効果は不変か軽度の悪化が2例，

1）対象および方法

悪化が5例であった．

対象は肢帯型筋ジストロフィー症，Duchenne
塑筋ジストロフィー症，シャルコ一・マリー・トース病，脊髄性進行性筋萎縮症，多発性筋炎のおのおの1例ずつ，筋強直性ジストロフィー症2例

検査成績では，一般血液生化学（CPKを含む），
末梢血，尿の諸検査は異常はみられなかった．
長期間の使用にも拘らず，副作用には認むべき
ものはみられなかった．

で，歩行可能患者3例，車椅子患者4例であった．
使用期間は20遇から最高96週で，1日の使用量

2．ぺ ス タ テ ン

は100mg／dayから始めて50mgずつ増量して1）対象および方法

150mg／dayから400mg／dayを維持量とした．

対象は筋強直性ジストロフィー症8例，筋ジ、ス

年齢は9−57歳で，女性2例，男性5例であった．

トロフィー症7例（内訳は，顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症2例，肢帯型筋ジストロフィー症

表l Effect ofleupeptin on various muscular atrophy
Name Age Sex I）iagnosis Weeks of administration Dose Effect Side effect CK（mg／day）

49

K．Ⅰ．

57

F Polymiositis
F MD

9

M Duchemne＊ 国立療養所箱板病院

〇
5
1

T．M．

560−41035−200−63
95−115−104
390−108

一 土 一 一

T．T．

t

CMT

M SPMA

一 土

M

55

〇
5
3

24

K．A．

〇
5
3

T．A．

〇
5
3

MD

〇
5
3

LG

M

〇
5
3

M

45

〇
0
4

38

T．Ⅰ．

幻2693 96785
252

M．N．

380−420−2SO

104−197
1，650−1，900−800

4例，Duchenne型筋ジストロフィー症1例），

軽快した．これとべスタチソとの因果関係は明ら

その他の筋萎縮性疾患6例（内訳は，クーゲルベ

かではない．

ルグ・べ−ランダー病2例，シャルコ一・マリ

検査成績では，とくに一般血液生化学では異常ー・トース病1例，多発性筋炎2例，Duchenneは認められず，CPK も一定の傾向は認められな型筋ジストロフィー症の保因者1例）であった．

かった（表2）．

使用期間は4週間から96週間に及んでいる．

7例の筋ジストロフィー症では，270mg／day

1日の使用量は30mg／dayより漸増して維持量を維持量としたが，効果は2例が不変か軽度の日として270mg／dayに至り，一部に480mg／day

常生活動作の低下をみたのみで，残りの5例は明使用した．年齢は24−69歳，男性は14例，女性

らかに悪化していた．顔面肩甲上腕型，肢帯型，は7例であった．また，歩行可能患者は9例，車Duchenne型の問の効果の相違は，症例の少ない

椅子患者は12例であった．

ためもあって明らかではなかった．

2）結副作用は胃症状が2例，1例に一過性の発疹を

果

筋強直性ジストロフィー症には全例270mg／

みたが，いずれも投薬の中止には至らなかった．

dayの維持量で使用した．効果は8例中3例に不検査成績では，尿，一般血液生化学，末梢血検

変か軽度の日常生活動作の低下をみた．残りの5査に異常を認めず，CPK も一定の傾向を示さな

例は悪化進行した．ミオトニア現象に対しては効かった（表3）．

果は認められなかった．

その他の筋萎縮性疾患6例は280mg／dayから副作用としては，胃症状が1例，また心房躍動

480mg／dayを維持量とし七用いた．1例の多発が2例にみられたが，β一ブロッカーの使用により性筋炎は歩行時間の短縮などの明らかな効果を認

表2 Effect of Bestatin on various muscular atrophy
Name Age Sex Diagnosis Weeks of administration Dose Effect Side effect CK（mg／day）
0
7
■2

0
8

5
7
5
2

M

4

F

D D D
M M M

M

7

5

−

表3

105−42210−290−110

0
7
2

0
7
2

4
3

5
7

M

2
3

M

4
3

M

7

3

■

K．Ⅰ．

D
M

F

9

3

T．M．

D D D DM M M M

M

9

2

S．M．

5
4

T．M．

6
4

S．N．

4
3

S．F．

6
5

T．S．
Y．S．

82−170−62

270−

Atrial丘brillation？

270−

Atrial丘brillation

132−265−104
104−130−106270

土42−120−63

270＋

66−145−125270

土Upset stomaeh

50−42

Effect Bestatin on various muscular atrophy

Name Age Sex Diagnosis Weeks of administration Dose Effect Side effect CK（mg／day）−

Upset stomach

59−124−52−

Upset stomach

55−165−52

一土

250−420−97

0

一

0

一

0

土

7

250−500−250

0

2

0

2
7

2

34−420−97

7

2
7

2
7

M LG

7

24

2

K．5．

0

M Duchenne

一

F LG

27

7

34

H．M．

2

T∴N．

0

M LG

2
1

30

7− 7
8
7

S．Y．

2
7

M FSH
F LG

3
7

F FSH

66
51

1
7

29

J．S．
T．0．

2
7

N∴M．

Rash

124−350−99
390−360

見方萎縮症患者に対するロイべプチソ，べスタチソの効果

尿検査にも異常は認められなかった．CPKは一定の傾向のあるものは前述の多発性筋炎のみで，Bestatin480mg／day

他は特別の傾向を示さなかった（表4）．

3．考案ならびに結語
前回に続いて，ロイべプチソおよびべスタチソ
0

10

15
20
25
WeekS aftertreatmentstart

30weekをかなり長期間投与してその結果を検討した。一部に前回発表した症例をさらに継続投与した．

図1H．Ⅰ．，48y．0・，M．polymiositis

ロイべプチソ，べスタチソいずれも，使用当初

めた．

においては自覚的には効果があると述べるものがこの患者は48歳の男性で，5年前より歩行困

かなりみられたが，他覚的に効果のあるものは比難を来たし，某医院で多発性筋炎として本院に転較的少なかった．私どもが長期間使用した例はい院．転院時にはPredoninl0mg使用しており，ずれも最初に自覚的に効果を認めたものが大部分

平行棒内歩行が可能であった．CPKも562単位

で，数カ月すると自覚的な効果を訴えなくなるもであった．入院後predoninを中止し，べスタチのが多い．他覚的に効果の認められた1例の多発

ソに切り換え，90mg／dayより漸増し480mg／

性筋炎は，べスタチソ使用時にはステロイドを中dayで維持量とした．さらにべスタチソ使用開始

止してべスタチンのみの使用で歩行時間の短縮が後1週間目に平行棒歩行からロフストランド杖にみられたが，これが直ちにべスタチソの効果と考よる歩行に変更した．

えるのは早計である．この患者はリハビリテーシ

ロフストランド杖による10m歩行時間は，図ョンも行っているため，これの効果も考えられる．

1のごとく，開始時が21秒であったが，20週後

本患者は亜急性型に属するものと思われるが，従には15．2秒と改善してきた．

来，私どもの同様の症例ではステロイドとの併用

CPKは本例は低下の傾向にあったが，握力は著明な改善はみられなかった．

効果，あるいは節約効果がみられているが，全くステロイドを中止した例はなく，今後さらに検討

1例のDuchenne型筋ジストロフィー症の保因者では不変であり，残りの4例は悪化した．
副作用では胃症状が2例にみられたが，投薬中止する程ではなかった．

が必要と思われる．その他の症例ではロイべプチ
ソ，ベスタチソともに自他覚的な著しい改善を認めたものはなく，歩行時間，握力では有効性を明らかに証明するものはみられなかった．

検査成績では，一般血液生化学，末梢血検査，
表4

副作用も消化器症状が軽度にみられたもの，一Effect of Bestatin on various muscular atrophy

Name Age Sex Diagnosis Weeks of administration Dose Effect Side effect CK（mg／day）

52
45
45

H．0．

69

H．Ⅰ．
Y．H．

48
54

F KW
M KW
M CMT
M Polymyositis
M Polymyositis
F

Duchenne

Carrier

521760693072

T．H．
U．0．
N．W．

270

−

270

−

270

−

450

−

290−500−280
Upset stomach

62，145−84

Upset stomach

50−330−52

42−124

480＋562−330−52

270

土398−180−262

適性の発病がみられた症例があったが，いずれも投薬を中止する程ではなかった・

患者に使用を試みたり，あるいはさらに使用量を変更してみるなどの試みが必要と思われる．

今後，さらに長期間使用したり，もっと初期の−82−べスタテン，ロイペプチンの筋疾患に対する効果

木 下 真 男＊
研究協力者

山田信興＊・鳥居重夫＊・馬場繁二＊

里吉栄二郎・祖父江逸郎・三青野産治・村上慶郎

べスタチソ，ロイべプチソが筋ジストロフィーうに努めた．その後，連日ベスタチソを腹腔内に症およびその他筋萎縮を主症状とする疾患群にど注射し，除神経後の実験的筋萎縮に対する影響をの程度有効であるかを明らかにするため，今回ま

経時的に観察した．

で検討を加えてきたが，今回は神経原性筋萎縮にラットは，除神経後に生食，べスタチソ2mg／

対する効果を動物実験で観察し，また臨床効果にkg，べスタチソ20mg／kgを各々投与し，計3群

ついては当教室での従来からの症例への継続投与に分けて実験を施行した．投与後1日，3日，7日；1に関する成績とともに，当班臨床5施設での結果

14日，21日，28日目に俳腹筋を採取し，各群にを，三吉野，村上，祖父江，里吉，木下の5班員

ついてNADH，Gomori⊥trichrome変法，PAS，で集計し，両剤の臨床例に対する有効性の有無をPhosphorylase，myOSinATPase染色を行い，筋判断し，次年度の研究方針を確立するための資料

線維直径の変化，筋線維構造の変化，タイプ別分とすることにした．

布状態，タイプⅠ，Ⅱの染色性の相違などについて検討を行った．べスタチソのラットへの影響をみる目的で，体重の変化についても検討した．

Ⅰ． 実験的除神経筋に対するベスタテン
投与の影響

結

果

1）体重の変化

前回まで私どもは，蛋白分解酵素阻害物質であるべスタチソおよびロイペプチソを用いて，実験

除神経後のラットにべスタチソを授与し，その的筋障害の修復過程の影響について検討を行った．

後の体重の変化について観察を行った．生食投与

今回は，除神経後の筋萎縮に対するベスタチソの群，2mg／kg投与群，20mg／kg投与群の3群の影響について検討した．

間に有意差はみられなかった．

方2）筋根維構造および組織化学的タイプの比較法

200g前後のウィスター系，雄，成熟ラットをコントロール群では，除神経後24時間，3日使用した．ラットはネソプタールで腹腔内麻酔を後では著明な変化はみられなかったが，7日後にし，その後一例下腿に切開を加え，誹腹筋に至るは，NADH，PASおよびphosphorylase染色

坐骨神経分枝を筋直前で切断し，それより中枢部で染色性が低下し，とくにタイプⅡ線維により強7−8mmにわたって神経を切除した後手術別を閉

く phosphorylaseおよびglycogenの染色性カさ

鎖した．この間，筋肉には全く侵袋を加えないよ

低下し，そのため，タイプⅠとタイプⅡ線経の＊ 東邦大学医学部第四内科学教室

差が不明瞭となってくる傾向がみられた．14日
ー83−

図1べスクチン20mg／kg／day投与7日後，染色性の低下によりタイプⅠおよび
タイフⅡ判別が不鮮明になってきた．

図2

べスタチソ20mg／kg／day投与14日後．染色性の低下によりタイプⅠおよびタイプⅡの区別が不可能になった．また，endomysialconnectivetissueの増加もみられた．

後には，タイプⅠとタイプⅡの判別がほとんど

日日ごろより，タイプⅠとタイプⅡの差が不明

不可能になってきた．このころになると，核の増瞭となり，14日日にはほとんど判別が不可能と

加および中央核をもつ筋線経の集団およびendo−

なった（図1，図2）．

mysialconnective tissueの増加も著明になって

3）筋頼経直径の変化（図3）

きた．21日後，28

除神経後の筋線維直径の変化について，生食投日後においてほ，その傾向がさらに強くなってきた．

与群，2mg／kg投与群，20mg／kg投与群の3群

ベスタチン投与群では，生食投与群と同様に7について検討を行った．

−84−

べスタチソ，ロイペプチソの筋疾患に対する効果

乃8070603
502
4010

0
3
0
2

0101520

図4

1血ys
図3

3days

7days14days21day52530

35404550

55606570

7580

ベスタチソ20mg／kg／day投与後のヒストグ
ラムの変化

28daysべスタチン投与後の筋線維径の変化
れ 8 0
7 0

除神経後7日目までの筋線経の萎縮は全体とし

6 0て緩徐であった．生食投与群とベスタチソ投与群で比較すると，若干べスタチソ投与群のほうが萎

5 0

縮が軽かったが，投与量による差はなく，7日日

4 0
3 0

には，筋線維直径は生食投与群で30．5±6．5〟m，

2 0
1 0

2mg投与群で33．5±6．Opm，20mg投与群で32．5±6．4／Jm となった．14日目は，生食投与群

0

およびべスタチン投与群とも急速に萎縮し，両者

1015

20

25

30

35

40

45

50

55

60Jl

図5 べスタチン投与7日後のヒストグラム

とも 22／上m前後を示し，両者の間に差はみられなくなった．21日目，28日目にはさらに萎縮し，目になると35／〃n前後をピークとする一峰性を

19〟m前後まで低下した．

示すようになり，7日目には筋線維径はさらに萎

4）筋綾稚径のヒストグラムによる変化

縮し，30／上m前後がピークとなった．

生食投与群では，除神経後1日目においては7日目のヒストグラムでは，20mg投与群では45〟m前後の大径線経と35〟m前後の小径線経

生食投与群に比べて，若干右方移動している（図の2つのピークがみられた．これはタイプⅠおよ5）．14日目にはさらに萎縮し20／上m前後がピー

びタイプⅡが主体をなしている．3日目には，クとなった．21日目，28

40／Jm前後と20〟m前後でピークがみられ，全に14日目と変わりなかった．

体として徐々に筋線経が萎縮してきて，グラフ上で左方移動がみられた．7日目になると左方移動

日目についてほ，とく2mg／kg投与群については，20mg／kg投与群ととくに変わりなかった．

はさらに強くなり，ヒストグラム上で25／Jm前考後をピークとする一峰性を示すに至った．その後

今回私どもは，除神経後の実験的筋萎縮に対し14日目にはさらに萎縮し，20／Jm前後がピークて，べスタチソがどのような影響を与えるかにつとなった．21日日および28日目については，といて検討を行った．その結果，険神経後の筋萎縮

くに14日目と変わりなかった．

の過程において，生食投与群，2mg／kg投与群，

案

20mg／kg投与群では，生食投与群と同様に24

20mg／kg投与群の3群において，基本的に著し時間目では2つのピークを示した（図4）．3日

い差異はなくほぼ同じ過程を示した．しかし，除−85−

神経後初期の段階においては，生食投与群に比べとの併用を行ったのは，多発筋炎3例とKen−てべスタチソ投与群では，筋線維径が若干大きく，

nedy−Alter−Sung症候群1例であった．投与期

また7日目のヒストグラムにおいて，べスタチン

間は，2カ月から24カ月間で，投与方法は，漸投与群では，生食投与群に比べ右に位置している増療法により行った．150mgまで漸増したのはことから，初期の段階では筋線経の萎縮の進行が1例，300mgまでが5例，450mgまでが3例，軽度であるが抑制されたように思われる．しかし，600mgまでが3例であった．

べスタチソの投与量による差はみられなかったこ

結とから，薬剤による影響かどうかははっきりせず，

1）ベスタチン投与群

今後の検討が必要と思われる．

べスタチソ投与群で自覚症状の改善を認めたの

果は，筋萎縮性側索硬化症患者3例であった（表1）．
ⅠⅠ．神経筋疾患に対するベスタテンおよびロ

第1例は，55歳の女性で，自覚的にfascicula−

イベプチンの効果−当教室での成績

tionの軽減を認めた．第2例は50歳の女性で，今回，私どもは17例の神経筋疾患患者に，べ筋肉の硬さがとれた．残りの1例は，60歳の女

スタチソおよびロイペプチンの投与を約2年間試性で，昭和55年8月筋力低下が出現し，その後

み，それぞれ患者に対して，自覚症状，他覚症状

昭和56年6月，筋力低下，呂律不良，櫓下困難，

および一般血液生化学検査を施行し，臨床効果に筋肉のつっはり感が認められ，入院，精査の結果，ついて検討を行った．

筋萎縮性側索硬化症と診断された．その後，メス

対象および方法

チノン，ダソトリウム等で加療をしていたが，症

べスタチソの投与を行った患者11人の内訳は，状の改善がみられず，昭和57年8月10日より，多発筋炎4例（女性2例，男性2例），筋萎縮性べスタチンの隔週投与方法を開始した（図6）．

側索硬化症3例（女性），肢帯型ジストロフィー

投与4週後より，休薬週になると，呂律不良，l燕症1例（男性），Kugelberg−Welander病1例（男下困難に改善が認められるようになった．べスタ性），脂肪蓄積性ミオパチー1例（男性），脊髄性

チソ服薬中，一過性に霧視，唾液分泌冗進を認め

進行性筋萎縮症1例（女性）であった．これらのた．

症例のうちでステロイドを併用したのは，多発筋副作用については，この1年間において，前述炎の2例についてであった．全例が筋力低下を主した症例においてみられた霧祝および唾液分泌冗訴として来院した．投与期間は2カ月から18カ

進以外認められなかった．

月間で，投与方法は隔週投薬方法（Bl法，後述）

2）ロイベプチン投与群（表1）ないし，漸増療法により行った．

投与期間中，自覚的に症状の改善を認めたのはロイぺプテンの投与を行った患者12例の内訳6例であった．6例のうち3例，すなわち多発筋

は，多発筋炎4例（女性2例，男性2例），Ken−炎2例とKennedy−Alter−Sung症候群1例につ

nedy−Alter−Sung症候群2例（男性），肢帯型ジいては，ステロイドの併用により筋力低下あるいストロフィー症2例（女性1例，男性1例），

はwaddling gaitに改善が認められた．その他

Kugelberg−Welander病1例（女性），脂肪蓄積の3例，すなわち，第1例は47歳の顔面肩甲上性ミオパチー1例（男性），顔面肩甲上腕型ジス

腕塾ジストロフィー症の女性で，階段昇降に改善

トロフィー症1例（女性），脊髄性進行性筋萎縮が認められた．第2例は，43歳の脊髄性進行性症1例（女性）であった．そのうち，ステロイド

筋萎縮症の女性で，fasciculationの改善がみらー86一べスタチソ，ロイべプチソの筋疾患に対する効果
表1神経筋疾患におけるべスタチソ，ロイべプチソ投与による臨床効果
A．

ベスタチソ

Name Age Sex Diagnosis Duration PSL Dose（mg）Symptom EFrect CPK Side effect
＋

63−61

W

−

446−497

l

W

＋

45−63

Blurred vision？

l

W

＋
33−

Palpitation？

B

W

l

B

l

＋

W

l

W

l

W

51−61

1

W

135−

1

W

4

1

一十

1

3

B B B B 4︐B B B B B B

3M M M M M M M M M M M

6

2

3

5

T．Y．

6

4

3

2

3

J．H． 3
T．U．

2
1

2

N．S． 4

3

3

N．A． 2MP
M K W SGP諾
ML

7

U．M． 2

60

S．0． 3

6

0

N．F． 52

9K．W． 6

禦禁㌫P

55

FFFFFMMFMMM

R．H．

T．T． 4−745−736−965−850W− 3，590−4，510

W−

1，579−1，504

Blurred vision？

W：Weakness，ALS：amyOtrOphiclateral sclerosis，PM：pOlymyositis， KW：Kugelberg−Welander
disease，SPMA：Spinalprogressive muscular atrophy，LG：limb−girdle muscular dystrophy，LSM：
lipid storage myopathy．

B．

ロイペプチ

Name Age Sex Diagnosis Duration PSL Dose（mg）Symptom Effect CPK Side effect

2

N．A．

2

2

349−101＋935−868−390−353

119−

土

6−

＋

170−174−406−6470ptic neuritis？

54−51

土

3

135−

一

4
5
2

T．Y． 3

3

J．H． 3
T．U． 3

7

N．S． 4＋

一U．M．

W W W W W W W W W W W W

4

05
05
0
5
2
1L
2L
25
440
．−
405
250
2■
31
8L
3Lll
L
L

hI．S．

5

4

2

3

Y．Ⅰ．

＋一十一＋一一一一一一＋

6

K．U．

MMMMMMMMMMMM
830904468120
1111221

4

PM
SK
欝A
PMFSH器■SPM㌫PM

T．Ⅰ．

FMMFFFMMFMMM

57

2

3

5．0．

N．K．

833−965→

1，850−2，090

土1，504−1，209

Epigastralgia

W：Weakness，PM；pOlymyositis，KAS：Kennedy−Alter−Sung syndrome，LG：limb−girdle muscular
dystrophy，FSH：facioscapulohumeralmusculardystr・Ophy，KW：Kugelberg−Welanderdisease，SPMA：
Spinalprogressive museularatrophy，LSM：1ipid storage myopathy．

Best8tin

CPKIU

図6 筋萎縮性側索硬化症愚老（K．W．）の臨床経過−87−

811112

10

82

2

3

4

5

6

7

8

9101112

1

83

2

1

図7 肢帯型ジストロフィー症患者（J．H．）の臨床経過れた．第3例は，32歳の多発筋炎の男性で，自を示したのは12例中6例であった．そのうち3

覚的に階段昇降に改善を認めた．

例についてはステロイドと併用しており，ロイべ

34歳の肢帯型ジストロフィー症の男性に，ロ

プチソの効果は不明であった・その他の3例に、つイべプテンを150mgより漸増法により治療を開いては，ロイべプチソ単独によりやや症状の改善

始した．600mgに増加した時点で，女性化乳房，を示した．また，肢帯型ジストロフィー症患者で心窟部痛が出現し一時休薬した．休薬中に四肢脱は，休業により症状が2回も増悪しており，ロイ

力が出現し，さらに体重も減少したため，ロイペ

ペプチソが何らかの効果を看しているように思わ

プチソの投与を再開した．その結果，四肢の脱力

れるが，なお今後の経過を観察により判定する必はやや改善した．しかし，その後，心窟部痛が出要がある．

現したためベスタチソ遇投薬方法に切り換えたところ，再び症状が増悪したため，現在，ロイペプ

ⅠⅠⅠ．ベスタチン，ロイぺプチンの臨床効果．

チソ300mg／dayにて経過観察中である（図7）．
老−臨床5施設での集計

案

現在までに，国立西別府病院，国立箱根病院，

べスタチン投与群では，自覚的に症状の改善を

国立神経センター，名古屋大学，東邦大学の5施示したのは11例中3例で，すべて筋萎縮性側索設において，各種神経筋疾患に対して，ロイペプ

硬化症患者であった．1例については，特徴的にチソおよびべスタチソの投与が試みられてきた．

休薬中に症状の改善がみられたことである．つま今回，これらの5施設の症例を集計し，臨床効果

り，投薬方法によっては症状の改善がみられる可について総合的に検討した．

能性のあることが今後の検討課題である．また，

対

べスタチソは従来，ミオパチ一に対して有効であ

対象は，Duchenne型ジスト。フィp症30例，

象るといわれていたが，今回の結果からみると，ニ

肢帯型ジストロフィー症11例，多発筋炎10例，

ューロパチ一に対しても試みていく必要があるよ筋強直性ジストロフィー症5例，顔面肩甲上腕型

うに思われた．

ジストロフィー症5例，筋萎縮性側索硬化症4例，

ロイペプテンについては，自覚的に症状の改善

Kennedy−Alter−Sung症候群2例，Becker型ジ−88−

ベスタチン，ロイペプチンの筋疾患に対する効果

ストロフィー症2例，脊髄性進行性筋萎縮症，脂後1．05±0．23 と若干上昇した．握力は，投与前，

肪蓄積性ミオパチ一，Kugelberg−Welander病

右9．8±8．1kg，左8．0±5．5kg，投与後，右8．0

各1例の計72例について検討を行った．大人±5．5kg，左9．8±6．7kg と変わりなかった．

（16歳以上）は47例，小児（15歳以下）は25例

自覚的には，休薬により3例の患者でfascicula−であった．性別では男性55例（大人30例，小児

tionの減少，熊下障害の改善がみられた．

25例），女性17例（すべて大人）であった．年（む 隔月投薬方法（3例）：血清CPK値は投与

齢は27．0±17．2歳（大人37．0±12．6歳，小児後1．81±0．28 と上昇した．握力は，投与前，右8．2±2．9歳）であった．

11．0±12．7kg，左10．5±12．0kg，投与後，右投与方法

10．5±12．0kg，左9．5±10．6kgと変わりなかっ

べスタチソに関しては，i）隔週投薬方法（Blた．

法），ii）隔月投薬方法（B2法），iii）3カ月投④

べスタチソ90mg維持療法（9例）：血清

薬1カ月休薬方法（B3法），iv）従来方法：漸増

CPK値は投与後0．64±0．42と低下した．しか療法，維持療法（B．法）の4方法をとった．

しADLは，投与前71．8±11．4，投与後60．2

ロイペプチソに関しては，i）漸増により150±20．6と低下した．また，階段昇降時間およびmgを維持する方法（Ll法），ii）漸増により片足立ち時間についても投与前におのおの44．0

300mgを維持（L2法），iii）漸増により600mg±6．9秒，8．9±10．4秒であったが，投与後47．2を維持（L。法）の3方法で行った．

±2．8秒，9．8±10．2秒と若干延長した．自覚的効果判定方法に症状の改善のみられた患者はいなかったが，1

血清CPK，ADL，10m歩行時間，階段昇降時

例において，症状はほとんど進行しなかった．

間，立ち上り時間，片足立ち時間，捉力，自覚症④

べスタチソ漸増療法（30例）：血清CPK状について，投与前および投与経過中に検討を行

値は投与後1．23±0．51と上昇した．ADL，10m

った．なお，血清CPKについては各施設によっ

歩行時間，捉力，階段昇降時間，立ち上り時間にて測定方法が異なるため，投与前の血清CPK値

ついては，投与前と投与後にとくに変化はみられを1として換算した．

なかった（表2）．

結果

自覚症状では，投与経過中に一時的に階段昇降

1）投与方法による比較検討や樵下が改善された患者が2例あった．

a）べスタチソb）ロイペプチソ① 隔週投与方法（9例）：血清CPK値は投与① ロイペプチソ漸増療法（10例）：Ll法，L2

表2 べスタチソ漸増療法（乃＝30）

1（1，063．1土866．6）

力

㈲㈲

問

時

行

CPK 崇捏前

階段昇降時間立 ち上 り 時間

81．8土 9．2
8．6土 4．0

後

1．23土 0．51
（1，310．9土928．1）
79．9 土12．2
8．8土 3．1（sec）

14，9土10．2

13．9土

15．9土10，0

15．7土11．4（kg）

44．0土41．8

48．8土43．8（SeC）

2．3土 0．7

3．6土 2．8（SeC）−89−

9．6（kg）

法，La法それぞれの症例が少ないため，まとめ10m歩行時間については，投与前におのおのて検討した．

40．0±34．3秒，17．7±6．1秒であったが，投与後血清CPK値は，投与後1．04±0．16 と若干上には87．6±94．5秒，21．6±11．4秒と延長した．
自覚的には不変ないし進行性であった．

昇した．提力は投与前，右11．8±10．2kg，左12．2±9．7kg，投与後，右11．7±10．4kg，左2）疾患別による検討

12．3±10．5kg と変わりなかった．自覚的に1例a）Duchenne塾ジストロフィー症（35例）（表3）で，投与経過中に一時的に階段の昇降に改善がみられた．

（D べスタチソ：血清CPK値は投与後1．01㊤ ロイペプチソ150mg維持療法（5例）：血±0．57 と若干上昇した．ADL，10m歩行時間，

清CPK値は投与後0．66±0．17と有意に低下し階段昇降時間，立ち上り時間，片足立ち時間につた．ADLは投与前72．6±18．0であったが，投

いては，投与後に低下ないし延長がみられた．
（夢 ロイペプチソ：血清CPK値は有意に低下

与後87．6±94．5 と低下した．階段昇降時間，
表3

Duchenne型ジストロフィ，症（n＝35）
前後

ベスタテン（押＝30）

1

1．01土

（1，540．76土868．1）（1，399．8土 980．8）

CPK

0．57

ADL

78．0 土10．5

73．6 土 16．9

lOm 歩 行 時 間
階段昇降時間立 ち上 り 時間
片 足立 ち時間

10．8土

9．6

11．4土

12．6（SeC）

29．7土20．8

41．7土

31．3（SeC）

3．6土

2．8（sec）

2．3土

0．7

10．4 土11．9

ロイペプチソ（ル＝5）
CPK

1

0．66土

（3，228．0土628．5）（2，105．4土1，019．7）

ADL

72．6 土18．0

階段昇降時間10m 歩 行 時 間
片 足立 ち時間

40．0

表4

14．4 土 11．3（SeC）

65．4 土 12，5

土34．3

17．7土

6．1

6．4土

4．7

0．17

87．6土

94．5（sec）

21．6土

11．4（SeC）

14．2土

8．6（SeC）

肢帯型ジストロフィー症（乃＝11）
前

後

べスタチソ（乃＝8）

階掟

降

1．45土

（1．241．3土601．0）

昇1（850．4土472．1）

段

CPK

0．43

時間

71．5土64．5

74．5土64．5（sec）

力 （右）16．0土12．0

14．2土10．8（SeC）（左）
10m 歩 行 時 間

16．6土11．9

16．7土13．7（kg）

13．3土 4．6

11．9土 2．8（sec）

ロイべプチソ（乃＝3）
CPK
捏

力

1

1．06土

0．42

（551．0土245．0）（572，0土276．1）（右）9．3土11．0

8．7 土 9．8（kg）（左）9．3土 9．3

8．0土 8．7（kg）−90−

ベスタチソ，ロイペプチソの筋疾患に対する効果がみられたが，ADL，階段昇降時間，10m歩行±2．8秒ととくに変わりなかった．握力について

時間，片足立ち時間については低下ないし延長しは，投与前，右16．0±12．0kg，左16．6±11．9kg

た．

で，投与後，右14．2±10．8kg，左16．7±13．7kgと変わりなかった．

b）肢帯型ジストロフィー症（11例）（表4）（∋（むべスタチソ：血清CPK値は投与後1．45

ロイペプチソ：血清CPK値は，投与後±0．43 と上昇した．階段昇降時間，10m歩行時

1．06±0．42と上昇した．捉力は投与前，右9．3±間については，投与前におのおの71．5±64．5秒，

11．0kg，左9．3±9．3kgで，投与後，右8．7±13．3±4．6秒で，投与後は74．5±64．5秒，11．9±9．8kg，左8．0±8．7kg と変わりなかった．

表5

各種疾患のべスタチソ投与後のCPKの変動
前Duchenne type dystrophy

後
1．01土

1

（1，540．8土 868．1）
Limb−girdle dystrophy

1．45土

1

（850．4土 472．1）

0．97土（1，477．5土1，254．9）
Myotonic dystrophy（146．6土 95．9）（116．6土 38．2）
1．24土
0．68

1

（

（ 80．0土 37．0）
1

Amyotrophiclateral sclerosis

89．3土 34．5）
1．10土
0．2

（123．0土105．6）（119．3土153．5）

表6 べスタチソ投与による効果（乃＝43）
前
CPK

段ち足
階立片握

lOm

問問問問郁釦
時時時時︵︵
行降りち
歩昇上立力

ADL

表7

後

1

1．05土

（1，252．7土1，052．0）（1，197．8土1，117．4）

0．49

72．9 土 17．1

78．1土

10．5

7．7土

3．8

9．3 土

48．1土

43．5

52．6土 44．8（SeC）

2．4土

0．7

3．6土

8．9土

10．8

9．8土 10．2（SeC）

11．9土

9．0

10．8土

8．2（kg）

13．6土

10．2

13．3土

11．1（kg）

5．3（SeC）
2．9（SeC）

ロイべプチソ投与による効果（乃＝16）
前

後

問間間引お
時時時︵︵

降り ち
昇上立力

L段ち足
AD階立片撞

1

0．96土（1，341．3土1，342．9）
72．6土 18．0

（1，087．5土1，025．2）
65．4 土
22．5

0．35

40．0土

34．4

87．6土

94．5（SeC）

7．7土

6．1

21．6土

11．4（SeC）

6．4土

4．7

14．2土

8．6（SeC）

3．3土

0．6

3．0土

0．0（kg）

3．7土

0．6

3．0土

0．0（kg）

ー91−

0．36

（1，504．0土1，572．1）
0．86土
0．24

1

Facioscapulohumeralmuscular dystrophy

0．43（1，242．3土 661．0）

1

Polymyositis

0．57（1，399．8土 980．8）

C）疾患別のCPKの変動：べスタチソについては，投与前に比べて投与後に上昇したのは，肢

ま

と

め

帯型ジストロフィー症，顔面肩甲上腕型ジストロ

72例の神経筋疾患患者にべスタチソ，ロイべ

フィー症，筋萎縮性側索硬化症であった．逆に低プチソのいずれか，あるいは両者を交互に投与し下したのは，多発筋炎および筋強直性ジストロフ

た成績を集計した．従来各施設での投与方法がそィー症であったが，自覚症状の改善はみられなか

れぞれ異なっていたため，全体の集計が困難であった．変化がほとんどみられなかったのは，った．今回は，少しでも共通な方法にしたいと考Duchenne型ジストロフィー症であった（表5）．

え，一応のモデル投与法を設定したが，なおかな

ロイペプチンについては，多発筋炎，肢帯型ジり多様な投与法が行われている．今後はさらにこ

ストロフィー症，顔面肩甲上腕型ジストロフィー

れらのうちから有効な可能性のあるものを選んで症，Kugelberg−Welander病，Kennedy−Alter−

投与法の統一をはかるべきと考えられる．
ベスタチソに関しては，Duchenne型で血清Sung症候群，脂肪蓄積性ミオパチ一について行

CPKのわずかな低下がみられたが，運動機能はわれたが，とくに変化はみられなかった．
3）ベスタテンおよびロイベプチン投与による悪化した．ロイべプチンでは血清CPKの改善はなかったが，一部の例では服用により自覚症状の効果
ベスタチソおよびロイペプチソを投与した疾患改善をみている．また，隔週法も一部の例で自覚症状の改善をみているが，これらがplacebo効果について，それぞれ集計し検討した．
a）べスタチソ：血清CPK値は，投与後1．05

か否か判断は必ずしも容易でない．また，本来進±0．49と上昇した，ADL，10m歩行時間，階段行性を示す疾患であるため，投与中悪化したとし

昇降時間，立ち上り時間，片足立ち時間，握力にても本来の経過とどの程度異なるのかも簡単には

ついては，投与後，増悪ないし変化なしであった

判断できない．

（表6）．

投与量としては両剤とも最低60mgから最高b）ロイペプチソ：血清CPK値は，投与後600mgまでと幅が広いが，明らかなdose−reS・ponseの関係を示唆する成績はなかった．

0．96±0．35 と若干低下がみられた．しかし，ADL，階段昇降時間∴立ち上り時間，片足立ち

集計開始後，なお日が浅く，分析はきわめて不時間，握力については，増悪ないし変わりなかっ

充分な段階であるが，今後の治験に若干の参考とた（表7）．

なる事実が得られたと思われる．投与法の選択とともに年齢，疾患の一致したコントロール群を選び投与群との経過の比較を行う必要がある．

−92−

Duchenne塑進行性筋ジストロフィー症患者に対するロイペプテン，べスタチンの影響

祖父江 逸 郎＊研究協力着

陸重雄＊・印寛利勝＊・松岡幸彦＊

例で以下の3群に分けた．A群：運動機能障害度はじめ（stage）1−4でロイペプチソ投与群（5例），Bに蛋白分解酵素阻害剤による筋ジストロフィー症

群：同stageでべスタチソ投与群（5例），Cの治療には大きな関心が寄せられてきた．一部の群：stage5以上でべスタチソ投与群（7例）・各動物実験でその有効性が報じられているが，臨床薬剤はいずれも1日3カプセルを毎食後経口で連的応用についてはまだ研究の歴史が浅く，しかも日投与した．ロイペプチソとべスタチソはそれぞ

効果判定が必ずしも容易でないことなどから一定

れ1カプセル50mgと30mgのものを用いた・
2）検索項目の評価がなされていない．
われわれは，約1年前からロイペプチソやべスa）臨床評価：ADL（100点法），10m平地往

タチソをDuchenne型進行性筋ジストロフィー

復歩行時間（砂），階段昇降時間（秒），片足立ち症（DMD）患者に投与し，これら薬剤の本症患

時間（秒）．またstageの変化も合せて観察した・！

者に与える影響について検討を加えてきた．本研b）CPK活性値の日内変動：昨年度は5回坪究では，より客観的かつ定量的に薬効判定を行う

血法によったが，患者に対する負担が大きいためとの意図から，多方面にわたっていくつかの評価

早朝離床前の5時30分と，多くの例で最高値を項目を設け，患者の選択も十分な観察が可能であ示した15時30分の2回測定をし，それぞれ最低る入院患者に限った．

値，最高値とした．ミオグロブリンについても同時刻に採取した血清を用いて定量を行った・

昨年度は短期間の投与経験について述べたが，本年度はこれを継続させ，1年間連続投与した結C）一般血液生化学，末梢血 尿の諸検査・果を報告する．

d）血液凝固機能（線溶因子・阻止因子を含む）．

対象 と 方法

これらの各評価項目は原則として薬剤投与前，

対象は昨年と同一症例であり，方法もCPK活

投与後1カ月，6カ月，12カ月の時点で検討され，i性値の評価で一部変更がある以外はほぼ同様であc），d）については状況に応じてその他のときにるため，簡単に要点のみを記す．

も適宜検査した．

1）対象e）その他：自覚的副作用，投与期間中に生じ

国立療養所鈴鹿病院に入院中のDMD患者17

た合併症など・＊ 名古屋大学医学部第一内科−93−

動が大きく，評価が困難であったため今回の結果には含めなかった．

果結1）臨床評価（図1A−C）

2）CPK活性値の月内変動（図2−4）

症例による差が大きく，また途中で実施不能とG）A群：症例による差がかなり大きいが，全なった種目も存在するので，各群全体としての処体としてみると6カ月までほとんど変化がなかっ理は行わなかった．

た．12カ月の時点で最低値が低下していたが有①

ADL score：A，B両群とも2例で明らか意ではなく，最高値はほとんど変化がなかったに悪化したが，残りの3例ではほとんど変化がな（図2A，B）．

かった（図1A）．

（参 B群：症例によっては次第に低下していく㊤10m平地往復歩行時間：A群は4例で実ものもあったが，全体としてはほとんど変化がな

施され，ほぼ不変2例，軽度悪化1例，他の1例

く，12カ月最低・最高値とも下降していたが，は途中で歩行不能となった．B群では，5例中1有意な低下ではなかった（図3A，B）．

例がほは不変であった以外，他は全例悪化，うち（参

2例が途中で独歩不能となった（図1B）．

C群：前2群に比べCPK活性値は全体的に低く，月内変動も少なかった．7例中3例が途中で脱落したが，12カ月まで評価できた残り4した．両群とも2例はほぼ不変であったが，他の例では，CPK活性値が若干低下する傾向にあっ2例は著しく悪化した（図1C）．

た（図4A，B）．

なお，片足立ち時間は検査を施行するつどに変④ 血清ミオグロブリンの変化：今回は6カ月

m
H
P−
▲−
P
u
一−

0

Best▲tinL

B

Le叩印Ih﹄

階段昇降時間：A，B両群とも4例で検索

㊥

V
■ ヽ ︺

0
0

・ 4
3

0
2

0
1

0

01M

0

芦宰

6M l鈷I OIM

鈷t l畠山

01M

6M

BestatinLeupeptin
221．1

26才生

＿

J

一
160
140
120
100
80
60
40
20
0

01M

6M

12M

∵

図1各運動機能の推移．A：10m往復歩行時間（砂），B：ADL seore，C：階段昇降時間．
−94−

Duchenne塑進行性筋ジストロフィー症患者に対するロイべプチソ，ベスタチソの影響
A Leupeptin（Stage1−4）5：3015：305：3015：305：3015：305：30

Before lM

6M

15：30

12M

図2 A群のCPK活性値の月内変動．個々の症例によってかなりばらつきがある（A）が，全体としては有意な変化はない（B）・
B BestaHn（Stage1−4）5：3015：305：3015：305：3015：305：30

Before lM

6M

図3

15：30

5：3015：305：3015：305：3015：305：30

12M Before lM

6M

15：30

12M

B群のCPK活性値の日内変動とその推移までの結果について述べる．A群では6カ月後の（Max）は改善がなかった．またStageの変化は値が全体として下降していたが，有意な変化ではなく，各運動機能評価でも進行は認められなかっ

なかった（図5A）．B，C群では目立った変化はた．他の3例ではMin，Max両CPK活性値が示さなかった（図5B，C）．

下降したが，いずれも機能障害の悪化が明瞭であ

総合評価一運動機能とCPK活性値−：投与しった．

た薬剤の効果を分析する目的で，A，B両群につ㊤B群（表lB）：症例1−3はMin，Max両

いて1），2）で述べた運動機能とCPK活性値が

CPK活性値とも低下する経過をとったが，運動どのような関連をもって変化しているか比較した．

機能障害の進展がいずれも高度であった．症例4

A群（表lA）：症例1，2では，CPK活は症例ト3と同年代であり，これまで類似の臨床性値のうち最低値（Min）は低下したが最高値

経過をとってきた症例であったにもかかわらず，

（∋

−95−

Bestalin（Stage5以上）

A Leupepti几（Slageト4）

B Bestatin（Slage1−4）

MyogIob．
（ng／ml）

Myoglob．
（ng／mI）

Bestatim（Stage5以上）

C

Myoglob．
（ng／ml）

5：30

15：30

5：30

15：30

Before ll1

5：30

15：30

6M

図5 血清ミオグロブリンの日内変動．6カ月間の評価では各群とも有意な改善はない．
A：A群，B：B群，C：C群−96−

Duchenne型進行性筋ジストロフィ，症患者に対するロイベプチソ，ベスタチソの影響
表1総合評価−A，B群のCPK活性値の推移（矢印は薬剤投与前，投与後6カ月・12カ月の各時点での相対的な変化を示す）と運動機能障害度との関鼠AB

ロイペプチソ

べスタチソ

CPK活性値はむしろ上昇傾向にあり，運動機能

3）一般血液生化学・未輸血・尿検査もほとんど変化しなかった．症例5はBecker型

各群とも薬剤投与後2遇，1カ月，2カ月，6と思われ，これまで進行が緩徐であった・CPK

カ月，9カ月，12カ月のいずれの時点でも，▼投活性値は低下傾向を示し，Stageの変化もないが，与前の値と比べ特記すべき異常を認めなかった．

階段昇降や平地歩行時間が軽度悪化傾向をとった・
Le叩叩tin小一AT。−

Bestatin．＿ATIlI

JrAT◆

ProtL−

Proth．サ

●mg

11

11

9

9

卜十一i

5

5

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叶」

7

7

一一ATm

400

B

A

3

3

T．．

＿」

8efore lM

6M

図6

T．．
Belore lM

＿⊥」

6M

し．Ⅰ＿
BehrelM」
6M

丁目
Before lM

Leupeptin

Bestatim

三ニー訂一一一「−Before lM／i！。‥こ。：㌻一日一石r
Bebre lM＿⊥＿J
6M

血液凝固践能の変化．ロイべプチソ投与群（A群，6A），ベスタチソ投与群（B，C群，6B）とも有
意な変動を示す項目がみられる．＊♪＜0・02，＊＊♪＜0・05・−97−4）血液凝固機能（図6）

次の問題となる．そこでもう一つの評価基準であ

A群では，フィプリノーゲソとα1−ATが有意り，しかもCPK活性値に影響を与えやすい運動に低下した（♪＜0．02，♪＜0．05）．B，C群のべ ス

機能との関係をみてみると，これらの症例ではいタチン投与群でもプロトロンビン，αrAT，プ

ずれも運動機能が明らかに悪化しており，CPK

ラスミノーゲソなどに変化がみられた（♪＜0．05）．

活性値の低下が症状の改善につながったとはいい

しかしながら，これらの変動はいずれも正常範囲

難い・むしろ機能障害が進行したため運動量が減内でのことであり，臨床的に問題となるような異少し，二次的にCPK活性値が下降したと考える

常は生じなかった．

のが妥当であろう．事実，最も運動機能障害の悪

5）そ

の

他

化が著しかったB群の症例1においてCPK活性薬剤投与による自覚的副作用は特記すべきもの

値の低下の割合が最大であった．A群の症例1，がなかった．C群の1例で腹部不快感を訴えた者

2では5時30分のCPK活性値の低下があり，があり，一時休薬したが，再開後とくに異常はみ

運動機能障害の進行もなかったが，薬剤の効果にられなかった．A群の1例で肺炎を併発し，そのよるとは断じ難く，まだ若年であるためDMDの間休薬をした．C群の3例がこの1年間で死亡し，自然経過であろうと思われる．これとは対照的に本研究から脱落した．直接死因はいずれも心肺機B群の症例4は，年齢的にかなり急速に悪化する能不全によるものであった．

状態にあると考えられるが，CPK活性値は高値を保ったまま，運動機能の悪化もなく，その解釈

考察に問題を残している．この症例に関しては注意深

DMD患者17例に対し，1年間にわたってロ

く経過をみる必要があろう．

イべプチソまたはべスタチソの長期連続投与を行

副作用に関しては，自覚的にも検査結果のうえい，運動機能とCPK活性値などの生化学的検査

でもほとんど問題がなかった．そのうちで，一部の両面から有効性を検討した．その際，最も重要の凝固系検査において有意な変動がみられたこと視したのはCPK活性値の変化である．なぜなら，は注目される・もともとDMD患者には軽度な一般に多発性筋炎など薬剤反応性のミオパチーでがら線溶活性に異常が存在するとする報告があり，はまずCPK活性値の下降があり，次いで臨床症

われわれの結果をこうした背景と合せて考えてみ状の改善が得られるという事実が知られており，

ると，投与した蛋白分解酵素阻害剤がこれら患者

本症でもそれが適用されるであろうと推測されたの有している何らかの凝固・線溶機能の異常に作ためである．そこでより正確に判断するために，用し，変化が生じたものと推察される．しかしこ

われわれは5回採血によるCPK活性値の日内変の変化は異常域に達するものではなく，臨床的に動パターンを分析したが，患者への負担が大きい問題とはならないであろう．またDMD患者のことから，最低値と最高値および両者の比をみる

線溶異常は二次的な現象であるとされており，こことで評価を試みた．仮に薬剤が有効であった場れの変動が直接本症の治療に結びつく可能性も少合，安静時のみならず運動負荷後のCPK活性値

ないと思われる．その他，1例に肺炎の発生があも低下することが期待される．このような観点かったが，これは細菌性のものであり抗生剤に反応

らCPK活性値の推移をみると，A，B両群ともし速やかに回復した．投与していた薬剤との関係明らかに低下する経過をとった症例が存在した．

は明らかでないが，偶然の合併と理解している．

これが薬剤によるものか他の要因によるものかがまた不幸にして3例の患者が死亡したが，その最−98−Duchenne型進行性筋ジストロフィー症患者に対する。イべプチソ，ベスタチソの影響期は一般のDMD患者と同様の経過をとっておて評価した限り，明らかにこれらの薬剤が有効でり，治験薬との関係はないものと考えられる．

あると判定された症例は存在しなかった．特記すべき副作用は認められず，安全性は高いと思われ

ま

と

め

た．

DMD患者17例にロイべプチソ，べスタチソ

機能障害度の軽い症例について，さらに長期間，を投与し，1年間その影響を観察した．運動機能

多数例分析することが望ましいと考えられた．

とCPK活性値などの生化学的データとを総合し−99−

各種筋疾患に対するべスタテン（NK421）投与後の経過報告

里 吉 栄二郎＊
研究協力者

春原経彦＊・富英明＊

昭和56年より筋ジストロフィーなどを中心と間2−23年，皮膚筋炎（dermatomyositis）1例，する筋疾患に対しNK421を経口授与し，その65歳，羅病期間18年，遠位筋ミオパチー（distal

後の臨床経過を観察した．ここでは，その結果とmyopathy）1例，33歳，罷病期間13年，筋萎

今後の問題点につき検討した．

縮性側索硬化症（ALS）1例，37歳，罷病期間2年の計20例を対象とした（表1）．なお，投与開対

始時点では全例歩行可能であった．

象

肢帯型筋ジストロフィー（LG．PMD）6例，

年齢は34−51歳，罷病期間は9−24年，顔面肩甲

方上腕型筋ジストロフィー（F．S．H．PMD）1例，法

上記の症例に対してNK421を30mg／日

より

27歳，罷病期間16年，Duchenne型筋ジストロ

経口投与し，症例に応じて1カ月単位で漸増した．

フィー（Duchenne PMD）1例，4歳，羅病期

最高投与量は表2のごとくであるが，現在のとこ

間1年，Becker型筋ジストロフィー（Becker

ろ450mg／日1カ月がpolymyositisの1例，

PMD）1例，40歳，羅病期間35年，筋強直性2カ月がL．G．PMDの2例，pOlymyositis，

ジストロフィー（myotonic dystrophy）3例，年

dermatomyositis

齢は30−42歳，羅病期間12−18年，多発筋炎

PMD，myOtOnic dystrophyの各1例である．

（polymyositis）5例，年齢は29−47歳，羅病期

360mg／日2カ月がL．G．PMDの1例．270mg／

表1対
病の各1例，3カ月が

象
年齢（歳）

名

5

多発筋炎（polymyositis）

1

皮膚筋炎（dermato myositis）

1

遠位筋ミオパチー（distalmyopathy）

1

筋萎縮側索硬化症（ALS）

0
2

計＊ 国立武蔵療養所神経センター
−101−

42
5
●7440〇4一94一653336
74一

3

筋強直性ジストロフィー（myotonic dystrophy）

1

Becker型ジストロフィー（Becker PMD）

1

Duchenne型ジストロフィー（Duchenne PMD）

1

顔面肩甲上腕型ジストロフィー（F．S．H．PMD）

332

6

肢帯塑筋ジストロフィー（LG．PMD）

L．G．

表2

最大投与量

投与量（mg／日）

期間（月）表3 ＝測 定 項 目

1

1．10m歩行時間
2．階段11段昇降時間
3．筋力検査（5段階方式徒手筋力テスり
僧帽筋，三角筋，大胸筋，凍上筋，前鋸筋，広背筋，上腕二頭筋，三頸筋，腕境骨筋，手関節屈筋，伸筋，捉九 腸脛筋，大腿内転筋，外転筋，大腿四頭筋，大腿屈筋，前旺骨筋，下腿三頭筋
4．体重5． 自覚症状
6．副作用
7．血液RBC，WBC，Hb，Plat．，CPK，aldolase，ESR，T．Prot．，T．Bil．，GOT，GPT，LDH，Al−P，
BUN，Creat．
8．尿蛋白

450
2
3
2
1
2
3
1
1
2

180

3
3
2
1
1
2

日1カ月がALSの1例，2カ月がpolymyositis

経過観察期間は1カ月−1年7カ月（平均10・9カ

l例，13カ月がL．G．PMDの1例．180mg／日月）である．

1カ月がBecker PMDの1例，2カ月がDu・

臨床効果判定には1カ月ごとに10m歩行時間，

chennePMD，myOtOnic dystrophyの各1例，

階段11段昇降時間，全身18筋の5段階方式によ3カ月がdistalmyopathyの1例，13カ月がF・る筋力評価と，午前中一定時刻での血清CPK値，S．H．PMDの各1例である．90mg／日

aldolase値を用いた（表3）．

2カ月がmyotonicdystrophyl例・60mg／日1カ月がL・10m歩行，階段昇降時間，CPK値については

G．PMDl例．30mg／E］2カ月がpolymyositis

投与前を1として投与後，現在での値との比をとの2例である．

った．比が1より小さけれは改善を示したことに

なおpolymyositisの症例No・13，16，r17のなる．一方，筋力に関しては全身の筋力評価の値

3例，dermatomyositisの1例の計4例では，（5段階方式）の総和を求めて投与前との比をとsteroid，Imuranが併用された．これら20例のった．この場合1より大きければ筋力改善を示しElectricalSt昔tionJL
2Hz

O．lms

図1
−102−

各種筋疾患に対するベスタチン投与後の経過報告

たことになる．

PMDのN0．9の1例，myOtOnic dystrophyのさらにL．G．PMDのNo．2，3，5，6の4例にのNo．10，11の2例，POlymyositis

の

No．17

対し，経過中2回にわたり（6カ月間隔）尺骨神の1例，distalmyopathyのNo．18の1例の計経を肘部にて電気的に低頻度反復刺激（0．1msec，

6例では，投与前後で筋力に大きな変化がみられ

矩形波，2Hz1分30秒）を与え，母指内転筋よなかった．とくにLG．PMDのNo．6，myOtOnic

り筋張力，Staircaseの程度，収縮時間，1／2弛緩

dystrophyのNo．11，POlymyositisのNo．17で時間を測定し，半年間の推移を観察した（図1）．

は，いずれも18カ月以上筋力が保持されておNK421投与中の副作用監視のため，血液よりり注目される．一方，LG．PMDのNo．3，4，5，

赤血球数，ヘモグロビン，白血球数，血小板数，

F．S．H．PMDの No．7，POlymyositis の No．

血沈，CPK，aldolase，総蛋白，総ビリルビン，

14，15では，中等度の筋力低下がみられた．こGOT，GPT，LDH，ALP，BUN，CRNを，尿のように長期間の観察で筋力改善を示した症例はより尿蛋白を測定した．

なかったが，L G．PMDのNo．1，2の2例，
polymyositisのNo．16，17の2例，dermato

結果および考察myositisのNo．19の計5例に経過中一過性の自各症例につき′10m歩行時間，階段昇降時間，覚的な筋力改善がみられ，このうちN0．1の症例

筋力，血清CPK値をNK421投与前と比較しを除く4例には他覚的な筋力改善もみられた．

表4に示した．

10m歩行，階段昇降時間がともに改善したの

筋力に関しては投与後改善を示した症例はなかった．L．G．PMDのN0．6の1例，Becker
表4 経

1．00

19

19

450

4

270

0・96

0．96

＿−

1．00

3
1

180

1

450

9

一1
︒・
4諾1・51096・重し15諾一1︒・︒空はⅧ1． ︒45︒108
．．8露9
0一
8
．

450

−103−

No．2，5の2例，

C

19

Ll l
︒l
︒．
元竺相竺

30
270

5
5
7
8
0．0．

6
10

1

30

0
3

90

1

1

4

450

1

1
4

一

180

18

9
0

7

180

1

5

180

ー1
︒・
︒麺一

180

一1
︒
・
2空0・ 88重用1．︒︒一︒︒1麺．
0．96一竺

0
9・
5
80
︒7
・
0︒7
・0︒9
・0︒81
・一09
0．5
．︒1︒︒
．一︒1麺．9
02．

6

Dermatomyositis
ALS

1
1

19
20

3

Distalmyopathy

7

／／

18

2

／／

7
4

17

Polymyositis

9
2

14

8
3

13

1

／／

9

12

1

／／

9

11

1

lO Myotonic dys．

9

Becker PMD

5
4
82
3 1 1 1

Duchenne PMD

9

450
450

1

8

1

F．S．H．PMD

6
1

7

4
2

／／

450
7
1

6

360
4
1

／／

270

9

5

60

4
1

／／

2
2

／／

4

265150344536
7244030364239

3

M M F F M M F M M M M F F M F F M M M M

J／

の

蓑

性纂罷背間投讃問雫譜詳筋力芸蒜

l L．G．PMD
2

過LG．PMD

PK値

名

度のものが

段降
階昇

病

はL．G．PMDのN0．3のみで，投与前と同程

副

作

用

胃痛

吐気，ふらつきmyotonic dystrophyのNo．10の1例，pOly−

たものの，観察期間が4カ月と短く，効果判定には不十分と思われた．図2は，投与期間中一過性myositisのNo．15の計4例にみられた・
CPK値の改善は，LG．PMDのNo．6，F．S．

に自他覚的筋力改善を認めたLG．PMDのNo・

H．PMDのNo．7，myOtOnic dystrophyのNo・2の症例の経過表である．NK421180mg／日投

10，12，distalmyopathyのNo．18，ALSのNo・

与中一過性にCPK値が低下し，階段昇降時間の20の計6例にみられ，さらにそのうちF．S．H．

軽度短縮がみられている．図3は同じく L G．

PMDのNo．7，myOtOnic dystrophyのNo・10

PMDのN0．6の症例の経過表であるが，投与開の各1例には経過を通じての減少傾向がみられた．

始より一過性にCPK値が減少し，その後NK

しかしN0．7の症例では有意差がみられず，また421を増量したにもかかわらずCPK値は徐々にNo．10の症例は，CPK値自体かなり改善を示し

増加し，階段昇降時間にも延長がみられている・

270

CPK
（U）
700

で＼√／

500

わ8070600
504
S

︑ ノ

eC5
S

0
0

4

0

3

6
56

81012

2
57

4

6

81012

2
58

6
56

81012

2
57

4

6

81012

2
58

図3 No．6，LG．PMD，36y・0・male

図2 No．2，LG．PMD，5ly．0．male

了∴∴㌻●∴⁚

I‡霊豊．。−）

ⅠⅠⅠⅠS58
S57

図5 No．6，L．G．PMD，36y．0．male

図4 No．2，LG．PMD，51y・0・male−104−

各種筋疾患に対するベスタチソ投与後の経過報告

表5 副 作 用

ただし，この症例は，MMTによる筋力検査では
症例No．

0
3
0
6
0
9

8

痛祝視疹心

0
6

麻

0
5
4

5
1

4
1

では筋張力の減少がみられ，さらに収縮時間，21No．2，3，5，6の4例のうち，No．2，3，5の3例

6

電気生理学的検索を施行したL．G．PMDの投与量（mg／日）

胃複霧等悪投与前後で大きな変化がみられなかった．

1

1／2弛緩時間の延長もみられ，症状の進行が示唆された．図4は一過性に自他覚的筋力改善をみた

roid，免疫抑制剤のみの場合に比較してNK421

LG．PMDのN0．2の症例の低頻度反復刺激のの併用により臨床症状の改善傾向がうかがわれた．

結果である．横軸に2Hzの刺激回数，縦軸に筋その他の疾患群の間には臨床効果に差異がなく，収縮力Pt（g），1／2弛緩時間Tl／2R（msec），収また性別，罷病期間，投与期間，投与量とも無関

縮時間CT（msec）をとってある．帯の部分は正係であった．このように，NK421による明らか常人の平均値±1SDの領域を意味している．こな効果はみられなかったが，疾患の自然経過を遅の症例での筋収縮力Pt（g）は経過中正常範囲内らせている可能性があり，今後さらに長期的な観であったが，2回日の測定では低下がみられた．

察が必要であると思われる．

さらにCT，Tl／2Rの延長もみられ症状の進行

NK421投与中の副作用では，LG．PMDのが示唆された．図5は，図3で呈示した，比較的

No・6で450mg／日 投与中に胃痛が，myOtOnic

筋力，CPK値が安定していたL G．PMDのdystrophyのNo．12で60mg／日投与中に複視N0．6の症例の低頻度反復刺激の結果である．こが，POlymyositisのNo．14で30mg／日 投与中の症例では，CT，rl／2Rがともに延長していに霧祝が，またNo．15で60mg／日投与中に毒るにもかかわらずPtが改善しており，また麻疹が，distalmyopathyのNo．18で90mg／日

staircase（低頻度連続刺激による筋収縮力の漸増

投与中に悪心がみられている（表5）．しかしこ現象）にも改善がみられており，筋収縮機能の改れらの症例では，NK421を持続的に投与したに善が示唆された．

もかかわらず症状が自然消失しており，上記の副以上，臨床症状，血液生化学所見，電気生理学的所見を総合して明らかに改善を示した症例はみ作用との因果関係については不明であった．血液生化学，尿検査では異常はみられなかった．

られなかった．しかしmyositisの症例ではSte・一105−

ロイペプチンの難病治療薬としての開発研究

田

中

実＊2

寺田

首＊1

Ⅰ．製 剤 研 究
硫酸ロイべプチンとその製剤の安定性
研究協力者

石問戸秀之＊2 中田
島津 忠寿＊2

隆＊2

二宮

宏＊2

新井

貞男＊2

Ⅰ．薬 効 研 究
1・線虫（Cαg乃Or力αみdfJkeJggαが）の野生株（N2）および筋肉発育異常を生ずる変異株（E444）に対する薬物の作用
轟 研究協力者 薮内 正彦＊2 八木 敬子＊2 加藤 和夫＊2 高橋 泰＊2
2・筋ジストロフィーマウスの運動障害に対するロイペプチソ軟膏の作用研究協力者 中村 散大＊2 小沢 義人＊2 山下 幸和事2 水口 茂＊2 高山 秀樹＊2
石橋 正冗＊2 宮崎 浩＊

Ⅲ．毒 性 試 験
1・硫酸ロイべプチンの微生物突然変異原性試験
研究協力者 塩崎 光春＊2 鈴木寿美江＊2 松尾 薫＊2 島津 息寿＊2
2・ロイぺプチン（NK381）のウサギにおける器官形成期投与試験（その2）
試験責任者 水谷 正寛＊3
実験計西指導者 井筒 稔＊3
試験実施担当者 松田 洋＊8 橋本 豊＊！長尾 暫二＊8 代田真理子＊‡畔上 敦子＊3
藤木 南＊3 宮内 量久＊3
3・ロイべプチン軟膏のウサギにおける35日間経皮毒性試験
試験責任若 井坂 英彦＊3
実験計画指導者 大滝 恒夫＊8
試験実施担当者 山口 一書＊8．松井 英一＊‡今井 清＊＄＊l 日本化薬（株）医薬事業部＊2 日本化薬（株）医薬事業部総合研究所＊8（財）食品薬品安全セソクー秦野研究所−107−

ロイペプテンの難病治療薬としての開発研究

室温18カ月密封保存後に試料中のL体の含有

Ⅰ．製 剤 研 究率は97．8−98．4％，D体の含有率は1．6−2．5％であり，Leupの原末は安定であった．
一万，400C，6カ月密封保存後にL体の含有率

硫酸ロイベブテンとその製剤の安定性は93．ト95．6％と含量低下が認められたが，D体

1）硫酸ロイぺプチンの安定性の含有率は4．ト5．2％であり，L体の含有率の低前報（梅沢班，昭和56年度研究報告）に引き

下はほとんどラセミ化によることがわかった．な

続き硫酸ロイペプチソ（Leup）原末の室温長期おお，いずれの温度下の保存においても原末の外観

よび40cc下の保存における安定性を検討した．

は変化しなかった．

結果を表1に示す．
蓑I The stability ofleupeptin bulk underL the room temperature and400C

Content ofleupeptin（residual％toinitial）
Room temperature

Lot Nb．

80

12

ワ
一

4
9
l

7

4

8

1

1

6

5
9

9

0

9
3

Storage time（months）
12

8
2

3

7

9

1

一

2

0

9

7
9

9

1

2

3
2

−108−

2

D−form0

D−formL−form8
9

L−form（LeuplO％in D−mannitol）

18

2

5

0

Content ofleupeptin（residual％toinitial）（Leup；50mg）

4

一

9

5

under the room temperatue

Capsulel2

表2 The stability of the oralpreparation ofleupeptin for the clinicaltrial

Powder

3
9

6

2

2

6

9
9

3

8

1

7

5

8
9

1

2

9

9

2

8
9

6

1

7
9

1

1

2

5

9
9

8
9

3

3

2

0

1

7
9

8

1

1

6

2

0

8
9

4

9
9

5

8

8
9

1

98．9

D−form l．8

8

L−form

9
9

36

2

99．5

D−form l．6

1

L十rOrm6

35

8

L−form lOl．2
D−form l．2

7
9

32

120
（days）（months）

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究

2）硫酸ロイぺプチン製剤の安定性
00

治験用経口製剤である散剤（D−マンニトール1004ついて室温長期保存の安定性を検討した．結果を

06

ウム1．5mgを2号ゼラチンカプセルに充填）に

uu一dEnd盲りUhりd

ニトール98．5mgおよびステアリン酸マグネシ

08倍散）およびカプセル剤（Leup50mg，D−マン02

表2に示す．
いずれの治験用経口製剤とも室温18カ月密封保存で安定であり，外観変化も認められなかった．
00Ⅰ．薬 効 研 究
0
8

A． 目

0
2

ずる変異株（E444）に対する薬物の作用

0AT

野生株（Ⅳ2）および筋肉発育異常を生06

ぎ且End︼uBhqh

1．線虫（CαenOr鳥αbdffねeJegα几8）の的

C．gJggd〃∫は体長1mm程の土壌自活性線虫
で，細胞数は生殖系を除いて約1，000個と少ないが，筋肉，神経，消化管，生殖線，表皮をもち，遇を，脱皮の時期および虫の大きさから観察した

細胞レベルでよく分化している．また，運動およものである．C．gJggdがは，4回の脱皮（各幼虫び形態異常変異株を中心に多数の変異株1）が知らの段階をLl，L2，L3，L4と呼ぶ）を経て成虫

れ，薫物の作用点を探求するに際し，よいモデルとなるが，脱皮のときには餌をとらなくなり，咽生物となる可能性が示されている．そこで，筋肉頭のPumpingの回数が減るので，その時期を知の発達異常により段階的な麻痺を起こす運動異常

ることができる．N2と比較すると，E444ではの変異株2）（〟〝C−52，E444）の形態観察と，それ全体的な脱皮時間の遅延と乱れを観察することが・に対するLeup等の薬物の作用を検討した．

できた．一方，成長（長さの増加）に関しても，時間的な遅延と体の倭小化が認められた．とくに，L4 と成虫の段階における旗小化が著しい．

B．C．egegαれさの発育過程とその形態についてまた，L4で運動機能が低下し，成虫では動けな

1）結果と考察くなることから，発育と筋肉の発達には強い相関

変異株E444は，生育の初期においては正常ののあることが兄いだされた．

運動機能をもつが，ある時期から段階的な麻痺を一方，図2は，筋細胞の発達をdense body

起こし，成虫では動けなくなる．このE444の段（横紋筋ではZ帯に対応）の配列数から追跡した階的な運動異常現象を野生株N2との比較を通しものである．線虫の筋肉は，斜紋筋と呼ばれる特て，形態上から観察した．

異な構造から成っており，Z線上にdense body

図1は，C．gJggd那（N2，E444）の生育の経と呼ばれる密度の高い顆粒が配列している．この−109→

Developmentofdensebodyrows
DeveIopmental
Stage

N2

E444

1
2
3
4
L L L L Adu

図2

Schematic drawing of body wallmuscle cells and dense bodiesin N2
C．etegans（A）and development of dense body rows of N2and E444
C．gわgαが（B）

顆粒は，生きている虫をNomarski微分干渉顕

これら観察結果はE444の遺伝子（〟〃仁一52）が傲鏡を用いて顕鏡することにより確認することがSarcomereの構成を制御している可能性を示してでき，これは，筋細胞の発達の様子を直接反映しいる2・＄）．もし，この過程に何らかのプロテアーている．

ゼが関与しているならば，Leup等の阻害剤の効

N2成虫の筋細胞およびdense bodyの配列数
は図2Aのようであり，体の部位により発達の果が期待できる．このような考察のもとに，次にE444に対する薬物の投与を検討した．

度合が異なることがわかる．また，虫の咽頭部位

C．Leup等の薬物の作用（図2Aの拡大部分）の筋細胞の発達の経過を，
図2Bに示した．N2では，成長とともにdense

1）実験方法bodyの配列数が2一→5と段階的に増加するのにC．gJggα乃∫は寒天培地上で培養した且roJi

対し，E444では，2→3で止まり，L3段階で（OP50）を餌として飼育される1）が，このとき薬筋細胞の生育は停止していた．

物を培地に添加することにより，経口的にとり込

また，E444成虫の動けなくなった部位の筋細ませた．そして，醇化してから死ぬまでの成長，胞を，N2のそれと比較したものを図3に示した．

形態，生殖系などへの影響をNomarski微分干上段の．Nomarski微分干渉顕微鏡像によると，

渉顕微鏡，および実体顕微鏡を用いて観察した．

N2の規則的なdense bodyの配列がE444で2）結果は認められず，下段の偏光顕微鏡像では，SarC0−a）実験の信頼性に及ぼす因子の検討

mereの走行の乱れ（図中の矢印）が観察された．

E444を用いて，同一条件下におけるプレート

以上，E444の形態上の観察結果をまとめると，間の変動と薬物等による餌の量の減少が，生育にどのように影響するかを調べた（表3）．その結以下の通りである．
（D 筋細胞の発達はL3で止まる．

果，プレート間の変動はほとんどなく，結果の信（む し4で運動が乱れ，成虫で動けなくなる．

頼性は高いといえるが，餌の量の減少（peptone（参 勤けなくなった虫の筋肉構造（Sarcomere）の量を減少させ，E． 蘭の生育を悪くする）は，は大きく乱れている．

虫の生育，生殖系に大きく影響した．また，運勤−110−ロイペプチソの難病治療薬としての開発研究

N2

E444

r二＿ニ∵
図3

Body−Wa11muscle of C．eLegans，（upper）Nomarskilightmicroscopy，（lower）polarizedlightmieroscopy

表3 Efrect of E．coliconcentration on the exhibition time of paralysis（E444）
Peptone Growth of

E．coJf（g／J）

Hatch
Brood size（B）／（A）

（hr）

5

2

9
6

1

5

4
7

2

9
6

0

1

5

3
7

1

9
6

0

1

5

6
7

9

4
5

0

0

8
7

9

4
5

5

0

0

9
7

79．5−98．3
100．5−122．3

8

9
4

0

79．5
79．5−98．3

0

7
8

79．5

8

9
4

0

78．8

0

7
8

78．8

≠≠≠≠ ＋ ＋ ＋

0

5

0

1 0 nJ
6
6
6

0．1

2
6

0．2

2
6

0．4

Exhibition ofparalysis（hr）
LB）

1
6

0．8

Time（hr）Length（A） （mm）
161．5（plate B）

仙⁝⁝冊≠≠ ＋ ＋ ＋1．5（plate A）

Maximumlength表4
StrainLeupeptin Growth
SurvivalMaximumlength
afterof
Exhibition 慧言 Hatch
of（mM）

E・COLthatching Time（hr）Length（％）

。ar誌，SISlaid ▲▲qLL▲l慧（B）／（A）（mm）（hr）（B）

7

9

一

1

（hr）

70・5

78

94．5−147

94．5−147

94．5

94．5−147

912

70．5−94．5

0

1

78

5

70

94．5

2

1

0
0
1
0
5
5
2
0
5
1

≠一≠≠≠≠

0

4
4
4
E

100

≠

0

（hr）

＋≠≠≠

0

2
9

5

0
9

8
0
1

0
1

0
4
1

5
2

1．25

0
0

0
5

86

0

0
0
1

一≠≠≠≠

≠

（A）

0
6
4
6 8 9

0
0
1

0

N2

Effect ofleupeptin on development of N2and E444C．etcgans

0・84

64・5−72・5−

70．5−94．5

72．5−116．5 ≠ 0．9−1．0

0
75

82

0．68

72．5−116．5−−

0．9＿1．4＋

0．9−1．5

88

78

0．73

72．5−116．5−

116．5−142．5

97
100

76
76

0・80
72・5
0・84
62・5−72・5−−

72．5−116．5 廿
1．0
72．5−116．5 ≠ 0．8−1．0

E444

50

100

150

Hours fromEgg

図4 Effect ofleupeptin on growth of C．elegansの段階的麻痔現象の発乳すなわち虫が動けなくれ，見かけ上の効果が認められるが，E． 茄のなるまでの時間は，生育の不全に伴って見かけ上量を減少させるだけでも同様のことが起こり〔表遅延することが明らかとなった．

3，表4の（B）／（A）で比較〕，Leupの段階的麻b）Leupとその同族体の作用

痺抑制作用とは判断できない．また，筋細胞のN2，E444のいずれに対しても，5mM以上でNomarski像からも改善は認められなかった．

Leup濃度に依存する下記の変化が認められた（表4）．

一方，Leupでは全く変化の認められない濃度（1mM以下）で，E444に対するLeup同族体① 醇化後の死亡虫数の増加（LD5。50−100の作用を検討したところ，Z−L−PheTDL−Arg
CHO，Z−D−Phe−DL−Arg CHOにLeup同様の，

mM）㊤ 成長の遅延，および生育不全（図4）

運動の段階的麻痺現象発現の遅延効果が認められ㊥ 産卵および醇化開始時間の遅延

た（表5）．

④ 酵化した小虫数（Brood size）の低下

d）ベスタテンおよびその他の薬物㊥ E444の動けなくなるまでの時間の遅延

アミノペプチダーゼの阻害剤であるべスタチンE444では，運動の段階的麻痺現象の発現が遅（AHPA−Leu），AHPA−Arg，および免疫増強作−112−

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究
表5

E仔ect ofleupeptin analogues on development of E444C・eteganS
Concentration Growth Maximum

1ength Exhibition

Hatch

Of drug of Time（hr）（mⅦ）
五・COJf （A）

Length Of paralysis（mm） （hr）（B）

（hr）

0

4

Z−Val−Pro−ArgCHO O

0

H−Phe−Leu−ArgCHO I

1什

73

1廿

92

1≠

100

≠ト

80

≠

73

≠

73

73．5−91．5」≠ 0．7−1．0

73．5

91．5

88

47．5−73．5

73．5−91．5

1≠ 0．5−0．8

8647．5−73．5

73．5−91．5

89

47．5−73．5

73．5−91．5≠ 0．7−1．0
1≠ 0．5−0．8

73．5

91．5

1≠

≠

0．8

86
91

47．5−73．5 73．5−91．5 1≠ 0．6−0．9

8647．5−73．5 73．5−91．5 1≠ 0．7−1．0

73

47．5−73．5 91．5−114．5 ≠ 0．7−1．0O0Bestatin9247．5−73．5

O

7

0

0

Z−Pro−ArgCH（OBu）2

1什

91
86

O

l

Z−Pro−ArgCHO I

92

O

0

Z−Phe−ArgCHO（DI一）

73

≠

O

2

Z−Phe−Leu−ArgCHO O

†什

O

1

nu

0

Z−D−Phe−ArgCHO（DI」）

nV

Control

慧（B）／（A）

0．7

Allamino acids were L−COnBguration unless otherwise stated．
表6

Effect of bestatin on development of E444Cetcgans

Concentration Gr。Wth Survival・Maxim。mlength ▲雪聖聖讐＿ Hatch Br。。dof drug

Of paralysis〈f after

ControI
Bestatin

20
10．1
5．0
2．1
0．54

Leupeptin≠≠≠≠≠Hm≠

三二二占 E鳥f h哲gTi等r）怒ド鳶「（hr）Size

lO

100

76

0．90

52．5−65．3

75

90

0．82

65．3−77．8

86

90

0．90

52．5−65．3

100

73

0．92

52．5−65．3

100

73

0．91

52．5−65．3

56

90

0．80

65．3−77．8

89．8（B）／（A）≠

0．7−0．9

89．8−113．3 壮
89．9−113．3」廿
89．8
≠
89．8
1廿
113．3
＋

0．7−0．9
0．6−0．7
0．7−0．9
0．7−0．9
0．7−0．90に大きく寄与するものと思われる．

用のあるforphenicinolについても検討したが，Leup類似の作用が有るのみで，運動の段階的麻2．筋ジストロフィーマウスの運動障書に対痔現象の改善は認められなかった・また，蛋白質するロイベプチン軟膏の作用

同化ホルモンであるmestanoloneは，培地に全筋ジストロフィー症病態動物においては，蛋白く溶解しないこともあるが，飽和濃度で何の変化

質分解酵素であるlysosomalproteaseあるいはも示さなかった（蓑6）．

Calcium activated neutralprotease活性の著しD．考察

い克進が認められており，筋肉組織におけるLeupの薬効を評価するにあたり，C．gJggdがLeup濃度が効果に大きく影響すると考えられる．

の筋肉発達異常変異株（E444）を用いて，薬物の筋ジストロフィーマウスにLeupを皮下投与した作用および作用部位の探求を試みたが，Leupを際の血菓および筋肉中動態については，昭和55

はじめ，他の薬剤についても，C．eJegd那（E444）

年度にすでに報告した．今回，血奨および筋肉内の運動の段階的な麻痺を改善するに至らず，満足

濃度と効果との関係を明らかにするため，Leup

する結果は得られなかった．しかしながら，N2

軟膏を筋ジストロフィーマウスに1カ月間連続投とE444株におけるdense body配列状態の違与し，運動障害に対する効果を行動薬理学的に観いなど新しい知見が得られ，今後異なる観点から察するとともに，血祭および筋肉内Leup濃度のの C．eJgg Z乃∫の利用により，筋肉異常等の解明測定を行った．

−113−

表7
実

験

方

0：全観察時間にわたり，正常マウスとの差異なし．
1；肢関節，膝関節はかなり動き，協調歩行可能．
ただし，足板関節の機能が不全で，歩行時に足板骨の返しが円滑でなく，指が体躯と直角に外側方向に向き，後肢を開きぎみにヨチヨチ歩行したり，ときに体躯の移動に付いて行けず，足が後方へ流れる．

法

1）実験動物および投与方法
C57BL／6J−め′／め′（雄性，10−13週齢）の筋ジストロフィーおよび正常マウスに，Leup−ワセ

リン軟膏（20％W／W）を1日1回，両肢大腿部に2：肢関節はかなり動くが，膝関節，足板関節の屈伸機能が不十分で，カェル泳ぎのような歩行を呈するときがある．ただし，正常マウスと同様の体位に後肢を戻すことは可能．
3：肢関節，膝関節および足板関節の絞能不全が進行し，後肢がのびてひきずるような歩行が発現する・このとき，SCOre1，2の症状も同時に観察されうる．

30mg／kgの割合で1カ月間塗布した．単回投与群においては，ワセリン軟膏を1カ月間塗布し，最終日にLeup−ワセリン軟膏を投与し，単回投与とした．
2）運動障害に対する作用
Leup軟膏塗布開始前および塗布開始2週間，4：全観察時間にわたり後肢がのびっぱなしとなる．
ただし，股，膝，足棍関節はわずかに動き，後肢を開いたまま腰を振るように前進する．
5：全観察時間にわたり，後肢は完全に固く屈曲したままで全く動かない．麻痔が両後肢に及ぶ場
合は，脊柱攣曲も伴い，後肢は交叉して腰から下は全く動かない．

4週間後に下記の観察を行った．
a）症状観察および平面の運動量測定
直径60cm，底面を同心円状に41区画に仕切った円筒状のopenfield装置を使用し，VTRで行動を録画した．観察時間は3分間とし，表7の基準によるscoreと，移動区画数を数えて運動量症状scoreいる方法に従って行った．

の測定を行った．なお，測定は2人の観察者が行い，￣■その平均値を被験マウスの測定値とした．

実験結果および考察b）回転籠法による運動量の測定

実験結果を蓑8にまとめた．投与前の測定値とマウスを回転篭に入れ，その直後から30分間の回転数を計測した．

処置2週および4週後の測定値をpaired t検定
により比較し，障害の進行度を検討した．Leup3）血撲および筋肉内Leup濃度

軟膏連続投与群で，塗布2週間後と投与前の回転最終投与1時間後に屠殺し，筋肉および血液を数に有意な差が認められなかった．さらに，Leup

採取した．Leupの測定は，前年度報告書の軟膏連続投与群においては，対照群に比較して著「RIAによるLeupの敏量定量法」に記載されて明な体重増加は認められなかった．全般的には対表8Leupの筋ジストロフィーマウス運動障害に対する作用

Open鮎ld法
症

回転管法

状

移動量／3分

回転数／30分対照群（11例）
処

置前

処置2週間後処置4週間後Leup群（11例）
処置前

処置2週間後処置4週間後1．20土0．28

59．8土 6．7

104．9土16．6

2．66土0．25■＊

46，2土 6．6

72．9土18．5＊

3．11土0．30＊＊

28．7土

50．8土18．5＊＊

2．05土0，40

52．5土 8．8

109．7土22．6

2．66土0．41…

48．0土10．6

82．6土19．3

3．05土0．39■＊

36．8土10．8＊

53．4土16．0＊＊

数値は平均土標準誤差．＊♪＜0．05，■＊ ♪＜0．01対前処置．
−114−

4．1■＊

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究
表9

Plasma and muscle concentration ofleupeptin（lhr）and body weight after
percutaneousrepeatedadministration ofleupeptininmusculardystrophymice

Administration （霊琵S） 農語ら

震； Bod描ight

S
R

8．3

10．7

12，3

2．3

3．3

20．9

3．8

4．4

12．7

6．4

4．3

11．7

9．3

2．5

12．9

2．1

2．7

11．0

1．9

2．0

10．9

1．4

2．2

12．2

5．8土3．5

4．9土4．0

12．4土1．1

3．1土2．3

3．2土0．9

11．4土1．9

13

S
R

12

S
R

11

S
R

10

S
10−13

R

S；Single administration，R：repeated administration forl month．

照群，Leup投与群とも同様の症状進行が認めら
れた．

試

験

方

法

筋ジストロフィーマウスにLeup−ワセリン軟

硫酸ロイべプチソはLot FLP−19を用いて試

膏を単回および連続投与し，1時間後における血験を行った．変異原性陽性物質は，ペソゾ［a］ピ

菜中濃度および筋肉内濃度を表9に示す．血凍おレン（B［a］P），2一アミノアントラセン（2−AAN），

よび筋肉内のLeup濃度は連続投与よりも単回投

2−（2−フリル）−3−（5−ニトロー2−フリル）アクリルア

与のほうがいずれも高い値を示し，意外な結果とミド（AF−2），Ⅳ−エチルーⅣしニトロ「入Lニトロ

なったが，両者に有意差は認められなかった．

ソグアニジン（ENNG），9−アミノアクリジン（9−以上の結果から，軟膏1カ月間連続投与においAAC）および2−ニトロフルオレン（2−NF）を用てはLeupにより筋ジストロフィーマウスの運動いた．被験菌株は国立がんセンター研究所の杉村

障害の進行および症状は抑制ないし改善はみられ

隆博士より分与されたぶ．わや最∽〟r〃∽TA98，

なかった．

TAlOO，TA1535，TA1537，TA1538
E．

Ⅲ．毒 性 試 験および前WP2〟r〟Aを使用した．試験方法は矢作ら5）によって報告された突然変異原性試験法に従い，以下の手順により行った．
①

1．硫酸ロイぺプチンの微生物突然変異原性

硫酸ロイペプチソのDMSO溶液0．1mZを滅菌試験管に入れる．

試験㊤

Amesら4）が開発したヒスチジン要求株および①にS−9Mixまたは0．1Mリン酸塩緩衝液（pH7．4）0．5mgを加える．

トリプトファン要求株（∫dm0乃eJαわや最∽〟・㊥、（夢被験菌培養液0．1mgを加える．

山元呪力壷￣およびE．coJf fr♪￣）を用いて硫酸ロ（夢（彰に450Cの軟寒天を2mg加え，グルコ

イペプチソの遺伝子．（復帰）突然変異試験を行っ

ース最小寒天平板上に往く∴ これを370Cで2日た．

間培養し，ヒスチジン非要求性またはトリブトフ−115−

表11硫酸ロイべプチソの変異原性試験

表10 硫酸ロイペプチソの変異原性試験
5．秒が山肌げhm TA98

検体濃度

S−9Mixあり（〃g／プレート）コロニ
凛yr

バック′プ■二三．、ノ1●

5，000 去…（55）1，000 ≡喜（41）500 霊（46）
100 …蓋（34）バック
し′′ここ、ノグランド…塁（35）……（37）…去（24）
三笠（22）……（24）

プレーり 三P姦 雰蒜を 三口姦；蒜を10，000 壬…2（161）
5，000 壬喜…（165）
1，000 壬；…（147）500 禁…（152）
100 壬三吉（147）
50 壬喜…（164）……（23）
DMSO

96
41
55

︶
3
3
5
︵

S−9Mixあり
コロニ
＿
料
′′二、ノ
バック
1◆

S−9Mixなし

100 壬…（14）50‡2（17）

バック
＿ノ tl

′′ニ

グランド

喜（6）
言（7）
…（7）
；（5）

壬岩（11）

壬……（170）壬≡…（163）

コロニ

ッ

ク

10，0001…（10）5，0001…（9）1，0001…（10）5001芋（10）100 壬‡（12）50 壬…（14）

コロニ

バ

ッ

ク

1岩（9）
喜（6）
岩（7）
≡（7）
；（5）

壬岩（11）

13（8）

︶
8
8
1

≠≠≠≠

DMSO l…（12）

≠≠

︵
24
70
12

︶
7
9
1
︵

03
18
21

2

バ

S−9Mixなし

プレーり 二r姦 夕ん十 二「姦 タヂン十

9￣AAg

≠≠

5

≠≠≠甘

︶
0
2
︵

55
12

ENNG
2−AAN

数

1岩（9）

≠≠

DMSO ≡桓9）

壬…3（180）＋十≠甘≠≠≠≠≠＝廿≠≠

5001；（10）

コロニ
＿
ガr

ー

（〃g／

＋＋≠≠≠≠≠≠≠廿≠≠1，000 壬喜（15）壬……（180）

5．gツタ九i桝祝rhm TA1537

S−9Mixあり＋＋≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠

5，000‡三脚）

グランド＋＋≠廿≠≠≠≠≠廿≠≠

10，000 壬…（18）

重器（191）≡壬3（560）

検体濃度

（〟g／

数

壬苧3（180）

表13 硫酸ロイペプチソの変異原性試験

5．gプ♪九i桝〟rhm TA1535ー諾（147）

恥］ミ 写芸写（872）‡

表12 硫酸ロイペプチソの変異原性試験

プレーり

壬…3（149）

AF●3．。1

三言；（475）‡

検体濃度

≠≠

≠≠≠≠

︶
6
2

︵
92
22

≠≠

呈宇（37）

AF−2
0．1
B［a］P
5

数

≠≠≠≠

50 款37）

コロニ
＿
粗

ー

≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠

10，000 崇（38）DMSO

S−9Mixなし≠≠≠≠≠≠≠≠≠廿≠≠

グランド≠≠≠≠≠≠≠廿≠廿≠廿

数

S−9Mixあり

S−9Mixなし（〟g／≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠廿ー

5．功坤血朋有朋TAlOO

検体濃度l去（10）

B［a］ミ1宇…（89）‡

性試験結果は表9−15に示したとおりである．すァソ非要求性の復帰変異株の集落を数える．

なわち，陽性対照として加えたB［a］Pおよび
結果および考察2−AANはS−9Mix存在下で，また，AF−2，

硫酸ロイペプチソの6菌株に対する突然変異原

ENNG，9−AACおよび2−NFは，S−9Mix非ー116−

ロイべプチソの難病治療薬としての開発研究

表15 硫酸ロイペプチソの変異原性試験

表14 硫酸ロイべプチソの変異原性試験
5．功坤血朋有朋TA1538

検体濃度

S−9Mixあり

椚〝A

S−9Mixあり

S−9Mixなし

S−9Mixなし

（〟g／

（〃g／

プレーり

コロニ
＿
軌

ー

数

バック

′′二、．1●

グランド

100 …3（27）50 ……（26）

壬；（17）13（9）
壬雲（15）
壬吉（15）

1，000 ‡…（20）500 壬≡（14）100 壬冨（18）50 壬…（17）DMSO

圭岩（19）

AF￣3．。1
︶
2
5
5

1
︵

B［a］ミ …壬…（215）‡

壬；（15）…孟（20）雛5）
去3（18）

去約9）……（66）

30
82
46
11

2−AAN

…2（24）≠≠……持54）

5，000 完（24）

雛5）

≠≠≠≠

壬…（16）

10，000 ……（24）

≠≠

2￣NFl

圭呈（20）≠≠……（27）

壬≡（15）

プレート）三口姦 雰蒜を 三口姦 雰㌫；≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠

500 …≡（25）

バック′′ニ、ノ tl

グランド≠≠甘≠≠≠≠≠≠≠≠≠

1，000 …喜（24）

数≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠≠ ≠≠≠≠

5，000 ……（22）

コロニ
軌

ー

≠廿≠甘≠甘≠廿≠≠≠≠10，000 ……（31）DMSO

E．coJf WP2

検体濃度

80

存在下で，いずれも強い突然変異活性を示した．

ギの妊娠6−18日（13日間）に，NK381，0（蒸これに対し硫酸ロイべプチソは，被験菌6菌株に留水），30，100および300mg／kg／dayを連続強対し，いずれも，S−9Mixの有無にかかわりなく，

制経口投与した．帝王切開は，妊娠28日に行った．

自然復帰変異株の集落数以上の集落を出現させず，
硫酸ロイペプチンは且秒少尉の〟r〟m TA98，

観

察

結

果

TAlOO，TA1535，TA1537，TA1538および

1）母動物に対する影響

E．

粛WP2〟がrAに対し突然変異作用を示さな

妊娠28日において解剖した各群の動物数（交いと判断した．ただし，試験濃度は試験菌に対し

尾確認動物数）および姓，不妊等の内訳は，表16て毒性を示さない限度値である10，000／唱／プレに示す通りである．
300mg／kg群で23例中6例が投与開始2回まートを最高濃度とした．

たは，3回後に死亡した．主な剖検所見は，ショ2．ロイぺプチン（NK381）のウサギにおけック腎様変化，肺のうっ血などであった．

る器官形成期投与試験（その2）＊

また，流産例が100mg／kg群に1例，300mg／

JW一KBL ウサギを用い，胎児器官形成期に相当する妊娠時期にNK381を経口投与し，母体な群

らびに胎児に対する影響を検討した．

300

2

6

3
0
2

3
2

1

1
0

4

1

3

7
1

5
0

1
0

6
1

0

−117−

100

0

＊ この報告は，昭和56年度研究報告書の一部にも報告されている．

1

ウサ

30

6

予備試験の成績を参考にして，JW一KBL

交尾確認動物数
不妊動物数
妊娠動物数
死亡または切迫
屠殺動物数
流産動物数

NK381（mg／kg）

0

験

対照群
6
1

試

表16 使用動物数（交尾確認動物数）

kg群に2例認められた．その他，300mg／kg群

ン10，20および30％を含有する軟膏を背部皮で投与初期における投薬終了後，一時的な自発運

膚に1匹当り0．5gを35日間連続塗布（6回／週）動の低下が認められた．

による経皮毒性試験を開始し，現在3週間を経過

体重推移については，300mg／kg群で投与開始

した．

後（妊娠10−23日）の体重増加が有意に抑制され実験には，以下の3項目の実験系を設けた．

る傾向を示し，妊娠28日においても有意ではな① 各種ロイペプチソ濃度軟膏の1回塗布後にいが，体重増加が引き続き抑制される傾向が認めおける筋肉中ロイペプチソ濃度測定

られた．

動物試験は終了し，筋肉中ロイべプチソ定量分

飼料摂取量は，300mg／kg群で対照群と比較し析を実施中（日本化薬）．

て，はば投薬期間中を通じて有意に減少し，体重の増加の抑制と相関関係を示した．

㊤ 各種ロイペプチン濃度軟膏の塗布後における血液中ロイペプチソ濃度の推移

2）胎児に対する影響

第1回目の塗布後・連続2週間塗布後および5胚・胎児死亡率が有意ではないが，用量一反応

週間塗布後の血液中ロイペプチソ濃度推移を調べの関係を示して増加する傾向が認められた．またる目的で，各期における塗布後1，2，4，6お

胎児体重も有意の差ではないが，300mg／kg群でよび24時間目の血液中ロイペプチソレベルの測わずかに抑制される傾向が認められ，さらにNK定を実施中．

381投与群内で用量一反応性に減少する傾向にあ（め 35日間塗布における経度毒性試験

った．

試験期間の一般症状の観察，体重，摂餌量の測

胎盤重量は，NK381投与群内で用量一反応の定を実施中である．塗布期間終了時には尿検査，関係を示して減少する傾向が認められたが，対照血液学的検査，血液生化学的検査および病理組織群と比較するといずれのNK381投与群におい学的検査を行う予定で試験を継続中である．

ても胎盤重量は重かった．
外形異常は，対照群を含むすべての群において成立しなかった．

文献1）Brenner，S．GgれgJic∫，77，71（1974）．

骨格，内臓の異常または変異の出現頻度には，
NK381投与の影響は認められなかった．

評価2）Mackenzie，J．M．，Garcea，R．L．，Zengel，J．M．，
and Epstein，H．E．Cell，15，751（1978）．
3）Zengel，J．M．and Epstein，H．F．Proc．NatL．
Ac〃d．Scf．USA，77，852（1980）．
4）Ames，B，N．，McCann，J．M．，and Yamasaki，E．
几ht」札持．，31，347−368（1975）．
5）Yahagi，T

以上の結果から本試験条件下においては，NK381の母体に対する安全量は100−200mg／kg程Dagawa，M．，Seino，Y．，Matsushi・

ma，T．，Nagao，M．，Sugimura，T．，andHoshimo−
to，Y．C伽Cgrエg〃

1，91−96（1975）．

度と考えられる．また，胎児に対しては，300
mg／kg までの量は著明な発生毒性を示さないと結論される．
3．ロイベプチン軟膏のウサギにおける35
日間桂皮毒性試験＊
日本白色種家兎雄40匹を使用し，ロイペプチ
ー118一＊ 途中経過報告，昭和58年3月31日現在

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）開発研究班分担研究者一覧
氏

名

所

班長 梅沢 浜夫

属

l

微生物化学研究所

住

141

所

東京都品川区上大崎3−14−23
03（441）4173

幹事 木下 真男′′

田中亘

東邦大学医学部附属大橋病院第四内科

153

日本化薬株式会社薬品研究所

115

東京都目黒区大橋2−17−603（468）1251

東京都北区志茂3−31−1203（901）7171

′′

青柳

高明

141

微生物化学研究所

東京都品川区上大崎3−14−23
03（441）4173

監事 米沢

猛

615

京都脳神経研究所

京都市西京区上桂森下町ト95
075（391）0292

班友 江橋 節郎

東京大学医学部薬理学教室

113

東京都文京区本郷7−3−103（812）2111

・′ 勝沼 信彦

徳島大学医学部酵素研究施設

770

徳島市蔵本町3−18−15
0886（31）3111

班員 岩崎 祐三

東北大学医学部脳疾患研究施設

980

仙台市星陵町2−10222（74）1111′′ 大倉 洋甫

九州大学薬学部薬品分析化学教室812

福岡市東区馬出3−1−1092（641）1151′′ 大塚 正徳

東京医科歯科大学医学部薬理学教室

113

東京都文京区湯島1−5−45
03（813）6111′／ 里舌栄二郎

国立武蔵療養所神経センター

187

東京都小平市小川東町2620
0423（41）2711′′ 祖父江逸郎

名古屋大学医学部第一内科

466

名古屋市昭和区鶴舞町65052（741）2111

・′ 高木 昭夫

国立武蔵療養所神経センター

187

東京都小平市小川東町2620
0423（41）2711

・／ 埜中 征哉

国立武蔵療養所神経センター

187

東京都小平市小川東町2620
0423（41）2711

・′ 野村 達次213

実験動物中央研究所

川崎市宮前区野川1430
044（755）5441

′′ 松下

宏

和歌山県立医科大学第二生理学教室

640

和歌山市九番丁90734（31）2151′′ 三青野産治

国立療養所西別府病院

874

別府市大字鶴見4548
0977（24）1221／′ ■村上 慶郎

国立療養所箱根病院

250

小田原市風祭412
0465（22）3196

′′ 村地

孝

京都大学医学部附属病院検査部606

京都市左京区聖護院川原町
075（751）3502（五十音順）−119−