厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究荒木班

平成3年度研究報告書

平成4年3月（1992年）

研究報告書の作成にあたって
平成3年は，本研究班発足以来第2年目に当る．初年度の本研究班の研究成果は，評価委員会において高い評価を受けたとの知らせを開きおよび，」班長として誠に喜びに耐えない．この機会をかりて研究班月の各位に心から感謝を申し上げたい．

本研究班の第2年目の班会議は，平成3年12月6日幽〜7日出の2日間，東京全共連ビルで行われた．すでに本研究班の発足時にかかげた，5つの基本戦
略，すなわち，1）geneの構造上の欠陥（defect）と変異の有無，2）遺伝子から産生されるprotein productの正常と異常，3）細胞障害の病態生理機構，
4）臨床上のphenotype，および5）phenotypeに影響を与える治療法の開発，に向かっての努力がなされ，実りある成果が発表された．

筋ジストロフィーでは，ジストロフィン欠失部位と臨床像との対比，mdxを用いての筋の壊死，再生機構ならびに分解酵素の役乱

dantrolenesodiumを用いた治療効果と，myOblastの移植の検討などについての報告がなされた．
ミトコンドリア脳筋症では，変異ミトコンドリテDNAの解析と臨床的多様性，およびMERRFやMELASの組織障害機構などが検討された．以上の2年度の研究成果は，初年度と比較して目標に向かって一段と掘り下げる試みがなされたという印象を受けた．

本研究姓としては，今後とも遺伝子，蛋白異常，細胞障害の病態生理ならびに臨床との対比を検討し，終局的には遺伝子治療を含めた治療法の開発を求めて，最大限の努力を続けて行きたいと希望している．班月各位の一層の御精進を御願いしたい．

おわりに，本研究に対し，終始懇切な御指導を賜った国立精神・神経センタ
ーの里吉葉二郎絵長，杉田秀夫所長および事務局の方々，また厚生省保健医療局国立療養所の方々に深甚の御意を表する．また日本筋ジストロフィー協会，
河端静子氏の御支援に感謝する．

平成4年3月く班長〉荒 木 淑 郎

目次

平成3年度総括研究報告7

平成3年度総合班会議研究報告抄録

19

分担研究報告29

Ⅰ．臨床・病理37

Ⅱ．ジストロフィン（No．1）

65

Ⅲ．シストロフィン（No．2）

85

Ⅳ．mdxマウス

99

Ⅴ．遺伝子・生化学

127

Ⅵ．ミトコンドリア脳筋症（No．1）

167

Ⅶ．ミトコンドリア脳筋症（No．2）

227

平成3年度研究班名簿263

平成 3 年度

総括研究報告総括研究報告
主任研究者

荒

木

淑

郎

研究目標
本研究班の研究目標は， 筋ジストロフィーおよび関連疾患を対象として，成因の解明と治療法の開発を行うこと である．関連疾患として，本姓としては，初年度に引きつづき，とくにミトコンドリア脳筋症をとりあげてい．くことにした．初年度（平成2年）の研究班発足以来，班の構成は，姓長のほか，37名の
班眉と，3名の顧問，計41名である．
第2年目の研究戦略は，次のテーマに焦点をしぼった．
Ⅰ

筋ジストロフィー

1

ジストロフィン

2

遺伝子と生化学

3mdxマウス

4

治療

ⅠⅠ ミトコンドリア脳筋症

研究成果
Ⅰ 筋ジストロフィー
1

筋ジストロフィーとジストロフィン

ジストロフィンは，3，685個のアミノ酸配列を有し，大きさ427kdの巨大蛋白質で，4つのdomainを有し，仝sarcolemmalproteinの1〜5％，全細胞蛋
白の0．01％を占めている．plasma membraneの内側に対してintramem−
branousglycoproteinを介して強く密着しており，機能的には，骨格筋線経の表面膜に対して構造上安全性を保つための細胞骨格蛋白質の役目をなしている．
このジストロフィン蛋白質は，筋ジストロフィーの各病型において検討が加えられ，すでに初年度において各病型での発現様式は明らかにされた．
2年日の研究を紹介する．
1）斉藤，池谷ら（東女医大小児科）は，Becker型筋ジストロフィー（BMD）−9−2例につき分子遺伝学的検討を行い，リンパ球由来のDNAで，eXOn45〜49の欠矢をもつ症例は，eXOn45−47の欠夫をもつ症例と比較して，筋肉痛の訴えが著明であることを認めている．
2）後藤，波多江ら（九大神経内科）は，運動時筋痛と高CK血症を呈する症
例の生検筋で，ジストロフィン含量の低下を認め，さらに末梢白血球のDNAを分析し，ジストロフィンexon45を含む部分の欠矢を認めている．
3）内野ら（国立療養所再審荘神経内科）は，低IQを示したDMD患者の剖検臓器について，ジストロフィンの発現様式をしらべた．また，16例のBMDの生検筋についても検討を加え，ジストロフィンは，DMDの脳で欠如しており，DMDの知能障害に，脳型ジストロフィンの異常が関与していることを示した．
4）清水，砂田ら（東大神経内科）は，7例のmyotubularmyopathyの生検筋でジストロフィンの発現を検討し，7例とも約400kdの正常サイズのジスト
ロフィンが発現していることを認めた．しかし生後1ケ月の重症例では，少数のジストロフィン陰性線経が散在性にみられたと報告した．
5）荒畑，有川ら（国立精神・神経センター）は，ジストロフィン分子のC末端ドメインが保たれているにもかかわらず，非常に早期に重篤な臨床症状と経過を示した小児（2歳10ケ月男）を報告した．ジストロフィンのN末端側の部分に対する抗体では，ジストロフィンは全く染色されず，今後，N末端側の臨床的重要性を見直す必要性をのべた．
6）濱軋 塩坂ら（宮崎医大衛生学）は，ジストロフィンおよびそのファミリーに属するスペグトリン，アンキリンその他の膜固有蛋白質について，DMD赤
血球膜を中心に，生理的機能を検討した．
7）小林，富武ら（東京医歯大神経内科）は，ジストロフィンの局在と機能について検討し，ジストロフィンは，成熟骨格筋では，細胞膜直下でfilamentous
networkを形成し，aCtin−1ike filamentと結合することを明らかにした．

2 筋ジストロフィーの遺伝子と生化学
1）高守，安川ら（金沢大神経内科）は，骨格筋特異的遺伝子発現に関する一ヵ
ルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）について検討した．筋の決定，分化因子としてMyoDl，Myogeninを，また筋特異的遺伝子として，CK，MLCl（ミオシン軽鎖1），MHC（ミオシン重鎖）をとりあげ，MyoDlとCKを除いてそ−10−

の発現を証明した．遺伝子発現にCGRPは影響を与えないことを認めた．
2）斉藤，福山ら（東女医大小児科）は，DMDとBMDの遺伝子診断において，CDNAプローブを用いたSouthern blot法とPCR法の結果を比較検討した．1家系において，リンパ球由来mRNAを用いたPCRにより，家系内の女性の保因者，非保因者を明らかにした．
3）荒畑ら（国立精神・神経センター）は，ジストロフィン関連遺伝のクロー
ニングの重要性を考慮し，遺伝子単離，degeneratePCR，サブクローニング，
シークエンシングでの塩基配列の決定からコンピューター解析を試み，144個のクローニングを検索し，α−アクチニン，β−スペクトリンの他に17個の不明のシークエンスを見出している．
4）川井，三ツ井ら（徳島大第一内科）は，DMD，ALSおよび非神経筋疾患患者を対象として，ミオグロビン（Mb）mRNAの局在と定量について検討した．
MbmRNAの発現部位は病変にかかわらず大差はなく，MbmRNA量はDMD
筋では高度萎縮筋以外は増加しており，Mbの生成を促進し細胞代謝障害を少なくしているとの所見が認められた．
5）庄司ら（信州大第三内科）は，動脈結紫による筋萎縮は，速筋で強く，湿重量当りのglucoseuptakeは，速筋と遅筋とでは異なり，速筋においてのみ有意な増加がみられた．
6）木南ら（順大第一生化学）は，筋細胞膜の変性・壊死に伴うリソゾームプ
ロテアーゼの増加は，筋細胞内の自食作用−リソゾーム内蛋白分解の異常に基づく場合と，浸潤してきたマクロファージ由来のプロテアーゼによる場合があることに着目して検討し，今回は，細胞成分を取り囲みながら形成されるオー
ト77ゴゾーム膜はER由来であることを報告した．
7）後藤，笹ヶ迫ら（九大神経内科）は，実験的に壊死筋を作成し，その再生の過程で，塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）が，どのように発現されるかを，免疫組織染色を用いて検討した．その結果，筋壊死が強く，細胞浸潤の著しい段階で，bFGFが局所時に増加している所見を認めた．これらはendo・
mysium中に貯蔵されている他，浸潤した会食細胞や活性化した筋衛星細胞に由来する可能性が示唆された．
8）小林，亀田ら（東京医歯大神経内科）は，ヒト成人骨格筋衛星細胞由来の培養筋細胞において，神経支配によるミオシン重鎖（MHC）isoformに対する−11−影響を検討し，adultslowMHCisoformの発現に神経支配の重要な役割を明らかにした．
9）堀ら（東京都神経科学総合研神経生化学）は骨格筋筋原線経のC蛋白質分
解酵素の局在についてしらべ，骨格筋に特異的に存在していることを明らかにした．C蛋白質は，骨格筋のAL帯にあり，aCtinとmyosinの間に介在しており，この蛋白質の分解がおこると，筋原線経の構造の安定性が弱まり，崩壊壊
死へ進むとの見解を述べた．
10）杉村，伊藤ら（名大神経内科）は，筋緊張性ジストロフィー（MyD）のIgGの糖鎖構造についてしらべ，MyDの血清IgGの低下は，ガラクトース転移酵素の機能不全による糖鎖構造の変化が関与していることを報告した．
3

mdxを用いた病態の検討

mdx miceは，1984に開発され，ジストロフィン遺伝子に点変異があり，eXOn
25でのstop codonをおこすことが明らかにされている．またジストロフィン
は，骨格筋線経と心筋細胞には欠失しており，ヒトのDMDと異なり，筋線経に再生像がみられ，筋壊死に対し再生線経の抵抗性がみられている．
本研究姓の病態に関する研究は少ない．
1）田辺，水野ら（東京都立神経病院神経内科）は，運動負荷と筋変性との関係をしらべ，mdxマウスでは，運動自体が筋変性を促進することを見出した．
2）栗原，岸ら（東邦大第四内科）は，mdxを用いて電気的病態と薬物治療，
筋活動電位の分析とミオトニーの数理的解析を行った．ヒトと先天性のヤギのミオトニーの発現にはNa channel異常やCI conductanceの低下など多くの要因の関与があることを報告した．
3）吉田ら（国立精神・神経センター）は，mdxマウス胎仔骨格筋の膜電位依
存性カルシウムチャンネルについてしらべ，カルシウムイオンが筋細胞内に流入するにあたり，カルシウムが徐々に蓄積する結果，筋細胞の壊死がおこるという考えを明らかにした．
4）若山ら（昭和大藤が丘病院神経内科）は，抗ジストロフィン抗体修飾骨格
筋標本についてQDR（quick freeze，deep etch．rotary shadow）法による
replica膜を作製し，ジストロフィン分子を観察した．細胞膜内表面にはビオテン化抗体で修飾されたジストロフィン分子の存在が電顕で確認された．

−12−

4

治

療

最近では，ジストロフィー筋線維内へ正常ジストロフィン遺伝子のコピーを導入する試みが行われている．その方法はmyoblasttransferとgenetransferである．またcorticosteroidが試みられている．わが国では，genetherapyはまだ行われていない．mdxマウスを用いて，dantrolenesodiumを投与した実験的治療と正常myoblastの注射に関する2つの発表があった．
1）高木ら（虎の門病院神経内科）は，dantrolenesodiumの効果について報告した．Dantrolenesodiumには，骨格筋の興奮・収縮連関に直接作用して収縮力を減弱させる作用が認められている．Dantrolene sodiumをmdxマウスに投与した結果，血清CK値と筋の組織変化は，投与群と非投与群との間に差はみられず，mdx筋小胞体からのCaイオン漏出冗進もおこらなかったことを述べた．
2）寺尾ら（帝京大神経内科）は，正常myoblastをmdxマウス筋に注射し，ジストロフィン陽性線経の数を目標に，ジストロフィー筋の正常化をしらべてきたが，今回は，拒絶反応を防ぐ目的で放射線処理を行ったmdxマウスの長指伸筋にmyoblastを注射し影響をしらべた．ジストロフィン陽性線経の出現率
は，1回注射群で2．0％，3回注射群で2．9％となり，若干の増加が認められた．

ⅠⅠ ミトコンドリア脳筋症
最近，ミトコンドリア遺伝子の異常によるミトコンドリア脳筋症の研究は，めざましい進展をみせている．初年度の研究成果で示された如く，本研究班の班員によってMERRFではtRNALys（8344），およびMELASではtRNALeu（3243）の点突然変異が発見されたことは，国際的な業績として高く評価をうけている．本年度は，ミトコンドリア脳筋症に関して，次の如く活発な研究活動がみられた．
1）福原ら（国立療養所犀潟病院神経内科）は，MELASと糖尿病の合併について検討し，KSSより合併頻度は少ないが，女性で，10〜30歳台の発症が多く，原因としてインスリン分泌低下の可能性をのべた．
2）福原ら（同上）は，筋生検でミトコンドリア異常を示さないMERRFの症例を検討した結果，MERRFには，筋萎縮が末期まで明らかでない例，ragged
Jred fiberのない例，胸鎖乳突筋や肩甲帯に筋萎縮のつよい例があることを認−13−

め，mtDNAの分析なくしては，MERRFを否定できないものがあることを報告した．
3）後藤，松岡ら（国立精神・神経センター）は，ミトコンドリア脳筋症における血管病変としてSSV（stronglySDH−reaCtivebloodvessels）の有無をしらべ，MERRFでは高頻度にSSVが存在し，また同じSSVでも，MELASとMERRFとでは，そのCCO（cytochrom coxidase）活性が異なることを明らかにした．
4）田中ら（新潟大神経内科）は，MERRFの選択的な組織障害の機構を明らかにするため，組織の障害程度と電子伝達系酵素各complexの発現比および変異遺伝子の存在比との相関をしらべた．結果は，いずれも相関は認められず，本症の組織障害は変異mtDNAの多寡，組織のエネルギー代謝の高低のみでは説明できないと報告した．
5）垂井ら（大手前病院）は，ミトコンドリア脳筋症について，筋運動時のプリン・尿酸代謝を分析した結果，運動時に筋プリン体の分解が克進し，血中ヒポキサンチンが著増することを認めた．このことより，ミトコンドリア脳筋症
では，運動筋にエネルギー危機が生じ，筋原性高尿酸血症が発現することが示
唆された．
6）佐揺ら（愛知医大第四内科）は，肢帯型症候群を呈したミトコンドリアミ
オパテーの1家系についてしらべた．生検筋に母子ともにミトコンドリア異常を認め，mtDNA解析ではA→Gの塩基変異mtDNAを確認し，塩基番号3，243の点変異を認めた．
7）黒田ら（徳島大小児科）は，ミトコンドリア脳筋症の病因として，PDH（ピ
ルビン酸脱水酵素）複合体の異常が注目されているが，先天性高乳酸血症を呈した女児に，PDH複合体活性の著明な低下を認めたが，培養リンパ球様細胞では活性が正常を示したという興味ある1例について，遺伝子変異，変異遺伝子の発現度，両親での変異遺伝子の有無について検討した．
8）森ら（熊本大学遺伝医学）は，ミトコンドリア形成におけるサイトゾル因子の役割について検討した．ミトコンドリアに存在する大部分の蛋白質は核遺伝子にコードされており，ミトコンドリア外部で合成された後，ミトコンドリ
ア内部へ移行するが，この蛋白質のミトコンドリア移行の障害についてしらべ
た．実験系として，尿素サイクル酵素の1つであるオルニナントランスカルバ−14−ミラーゼ（OTC）の前駆体を大腸菌で大量に精製し，これを単離ミトコンドリ
アに取りこませる方法で，このトランスポートに，サイトゾールに存在する蛋
白質因子の添加が必要であることを報告した．
9）杉札

大野ら（名大神経内科）は，ヒトミトコンドリアDNAのD−loop領域における新しい調節因子（Mt5因子）について報告した．ヒトmtDNAには，1，122bpよりなる非翻訳領域があり，mtDNA発現調節に関わる若干の因子があることが知られている．今回の研究は，コントロール7例と各種疾患11例
よりDNAを単離し，直接法により非翻訳領域の塩基配列を決定した．Mt5因子と命名される領域は，塩基多様性の高い領域に存在しながら，313例で高度に保有されており重要な因子と考えられた．
10）太田ら（自治医大第一生化学）はCPEOの大欠夫とMELASの点変異によって生じるmt蛋白質合成を比較検討した．変異の種類によって蛋白質合成低下がみられることを認め，臨床的特徴の発現の違いに関与する可能性を示した．
11）小澤，田中ら（名大第二生化学）は，ミトコンドリア脳筋症におけるミト
コンドリア遺伝子変異について報告した．MELAS症候群の多くに，ミトコン
ドリアDNA（mtDNA）のtRNALeu（UUR）遺伝子領域の塩基番号3243にA→Gの塩基転位が発見されているが，この3243の変異をヘテロプラズミーの状態で有する患者において，臨床症状が多彩であることを明らかにした．
12）荒木，箕田ら（熊本大学第一内科）はミトコンドリア脳筋症における変異
ミトコンドリアDNA（mtDNA）の解析に当り，とくにinsituhybridization（ISH）を用いて検討した．MERRFとMELASでは，CPEOと同様にSDH染
色で濃染する筋線経において全mtDNA量は増加していた．MELASでは，
SSVを示す血管で全mtDNAの著明な増加がみられた．また電顕レベルでのISHは工夫によっては今後の有力な武器になる可能性を示唆した．
13）宝釆ら（国立遺伝研）は，多数のミトコンドリア脳筋症患者において，mtDNA・Dループ領域の塩基配列を決定し，個々の配列間の塩基置換数に基づいた系統解析を行なった．それらの値より遺伝子系統樹を作成した．その結果，
CPEO，MERRFおよびMELASの患者は，複数でかつ相互に異なる母系系統に由来すると考えられ，MERRFとMELAS患者群に特異的にみられる点突然
変異は，日本人の集団のなかでも比較的に最近独立に生じたものと考えられた．
14）岡田，乾ら（大阪大小児科）は，ミトコンドリア脳筋症を里する10家系に−15−

ついて現在既知のmtDNA異常と臨床症状との関連を検討した結果，すべての家系において発端者に変異がheteroplasmyとして認められた．サザンプロット法による末梢血由来のDNAにおける変異mtDNA量は，臨床症状との相関を示さなかった．今回の検討でミトコンドリア脳筋症の臨床症状は多様であり，末梢血のmtDNA変異より臨床症状を推定するのは困難であることが明らかにされた．
15）佐藤ら（順天大神経内科）は，ミトコンドリア脳筋症の病型と遺伝子異常について検討した．
16）川井，横井ら（徳島大第一内科）は，常染色体優性遺伝を示すCPEO家系
例の発端者について骨格筋mtDNAの遺伝的解析を行った結果，異なる欠矢を有する2種類の異常mtDNAが認められた．ヒトのmtDNAは母親由来とされており，常染色体優性遺伝型を示す家系の症例でmtDNAに多重欠夫が認められたことは，mtDNAの複製に関与する核遺伝子の異常によって欠矢が生じる可能性が示唆された．
17）納，中川ら（鹿児島大第三内科）は，ミトコンドリア脳筋症におけるmtDNA
異常と臨床症状の多様性との関連を検討した．ミトコンドリア脳筋症45例中31
例にmtDNAの異常を認め，臨床病型とmtDNA異常は一定の関連を示したが，なかには対応しない症例がみられた．
18）桃井ら（自治医大小児科）はMELAS病態の細胞学的解析を行うため
MELAS細胞系より，正常と変異ミトコンドリア遺伝子をクローニングし，定量法を確立した．この方法により融合細胞における変異遺伝子の増幅機構の解析が可能であることを報告した．
19）西澤ら（自治医大神経内科）は，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の3，243
位にA→G点変異を有するMELASの母親例を3年6カ月間followupL，
この間における正常と変異mtDNA量の変動の有無と臨床症状との相関について検討した．MELASが発症するには，各組織において点変異を有する
mtDNA量が一定のthresholdを上回る必要があると考えられた．
20）水揮，白岩ら（筑波大神経内科）は，MELASの1剖検例について，各組
織でのtRNA（UUR）の塩基置換の分布をしらべた．検査された臓器すべてにおいて，正常mtDNAと変異mtDNAが混在していることを認めた．
21）後藤，作田ら（国立精神・神経センター）は，臨床的にMELASと診断さ−16−

れたが，nt3，243点変異が認められなかった例を検討し，新たにtRNALeu（UUR）領域の点変異を認めた．nt3，271点とnt3，243点変異は，▼ともにMELASの病因と考えられた．

平成3年度の研究成果の要約
筋ジストロフィーでは，ジストロフイシ欠失部位と臨床像との対比，mdxを用いた筋の壊死と■再生機構ならびに分解酵素の役割，dantrolene−sodidmを用いた治療効果とmyoblastの移植の検討が行われ，ミトコンドリア脳筋症で軋
mtDNA変異に関する臨床的（典型例，非典型例），病理学的（全身臓器での分布，raggedredfiberおよびcytochromecoxidase活性線椎との関係など）すあるいは生化学的（蛋白合成能，mtDNAル⊥ブ領域の解析など）検討がなされ，臨床的にも基礎的にも，一歩踏みこんだ研究が多かった．

平成4年度（第3年目）の研究班の研究計画
平成4年度は，本研究班としては最終の年を迎えるので，筋ジストロフィーを中心に，遺伝子および蛋白異常と臨床との対比，、筋障害の発生機構および，
遺伝子治療を含めた治療法の開発へ向かって研究を進めたいと希望している．
またミトコンドリア脳筋症に対する関心は高く，研究発表が多くなったが，mtDNA変異と臨床像の解析，筋病変ならびに治療面においての一層の解析を期待したいと思う．
B166（ダントロレン ナトリウム）に関する筋ジストロフィー治験計画について1967年にSnyderらによって合成されたヒダントイン誘導体のダントロレン
ナトリウムは，1980年以降，我国において臨床応用され，経口剤は種々の原因
による痙性麻痺の治療に，また注射剤は，麻酔時における悪性高熱症に対するすぐれた治療薬として用いられている．一方，ダントロレン ナトリウムは，
筋小胞体からのCa2＋の放出を抑制することから，筋ジストロフィーなどの筋疾患においてCa2＋濃度の上昇に伴う筋組織への破壊を軽減することが期待されている．実際，筋ジストロフィーの動物モデルであるmdxマウスにおいて本剤は血清CK値を下げることが報告され（Quinlan，etal：Muscle＆Nerve3：−17−268−269，1990），小数のDMD患者においても本剤が血清CK値を下げ，本症の進行を遅延させるとの報告がなされている（Bertorini，et al：Muscle＆NeⅣe14：503−507，1991）．
以上のことより，本研究班でも，ダントロレン ナトリウムをとり上げ，多施設共同によりDMD，BMDおよびL−G型MDを対象として，有効性および安全性を評価するための治験を行うこととなった．
治験総括者は荒木淑郎，中央委月は田代邦雄（北大），木村淳（京大），西谷裕（国立宇多野病院）後藤幾生（九大）が担当し，事務局は京大医学部神経内科（梶龍兇），これに依頼事務局は山之内製薬株式会社開発本部，開発第二部，第三室が担当することとなった．この研究は，厚生省新薬開発研究委託費研究費を受けて行うこととなる．関係各位の御協力を御願いしたい．

−18−

平成3年度厚生省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー」総合班会議

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法に関する研究

研究報告抄録Dystrophinのヒト臓器分布並びにBecker型
筋ジストロフィーにおける発現様式について
内

野

誠＊

寺

本

三 池 輝 久＊＊ 岩 下

仁

郎＊

直

江

弘

昭＊

宏＊＊＊荒 木 淑 郎＊＊＊＊（＊国立療養所再春荘病院神経内札 ＊＊熊本大学医学部発達小児札＊＊＊国立療養所筑後病院，＊＊＊＊熊本大学医学部第一内科）
骨格筋や心筋におけるdystrophin（ d ）の発現様式については，疾病の場合を含め，詳細に検討されているが，筋以外の臓器の d の発現状況については不明な点が多い．ヒト臓器特に脳における d の発現状況を明らかにするため，抗 d 抗体を用いてWesternblot（Wb）及び免疫染色による検索を行った．またBMD生検筋の d の発現様式についても同様に検索を加え，PCR分析結果と比較検討した．
対象，方法
正常対照4例（42〜74歳），筋緊張性ジストロフィー1例（54歳），及びIQ50以下の知能障害を認めたDMDl例（26歳）の各剖検臓器（骨格筋，心筋，大脳・小脳，胃，膀胱など）について，モ
ノクロナール抗 d 抗体（NOVO社のDYS−1，2，3）を用いてWb及び免疫染色による分析を行った．BMD16例（14−53歳）の生検筋についても同様に検索し，Chamberlain及びBeggsの19領域でのPCR分析（SRL）と比較検討を行った．
結果正常対照及び筋緊張性ジストロフィー例ではDYS−1，3のWbにて骨格筋，心筋のみならず，胃・膀胱などの平滑筋臓器，さらに脳においても明らかな d の発現が認められた．DYS−2（C末端抗体）では骨格筋や心筋では明らかであったが，脳や平滑筋臓器では d の発現は不明瞭であった．免疫染色では骨格筋，心筋はいずれの抗体でも表面膜に抗体の局在がみられたが，脳においてはDYS−3ではneuronの胞体が，DYS−1では主にglia系細胞が染色され，DYS−2では脳には抗体の局在は明らかではなかった．平滑筋線経はWbでは d の発現が明らかでなかったDYS−2を含め，全ての抗体で表面膜に抗体の局在が認められた．
DMDにおいてはいずれの抗体を用いてもWb上全臓器で d の発現はみられず，免疫染色上も心筋のintercalateddiscが一部染色される他は明らかな抗体の局在はみられなかった．一方BMDにおいては通常のWbでは d の分子量に変化がなく，含量のみ減少するものが多数を占めた（8／12）が，泳動時間を大幅に延長することにより，低分子化を示した．遺伝子解析では，PCRが実施できた15例中8例（53．3％）に欠夫を認めたが，Exon1−3ヶの欠矢の短い例が多く，4ヶ以上の欠失例は1例のみであった．欠矢を認めなかった7例中5例も泳動時間を延長することにより
Wb上極軽度ながら d の低分子化を認めた．

−21−

考

案
d

のmRNAは骨格筋や心筋のみならず，平滑筋組織や脳にも含まれていることが既に明らかにされているが，著者らも1988年以来

dが健常者の骨格筋，心筋のみならず，平滑筋組織，さらに脳にも存在することを報告してきた．今回のモノクローナル抗体による検索も基本的には60kd
抗体，30kd抗体での成績と一致し，平滑筋組織や脳にもdの存在が認められた．一方DMDでは高率にIQ異常が認められ皐が，今回のDMD脳では d が欠如しており，DMDの知能障害に脳型 d の異常が関与する可能性が示唆された．BMDのWb所見についてHoffmanらは54例の分析を行い，分子量330kdから600kdと広い範囲にわたることを報告しているが，今回の16例の検索では比較的短い欠矢が多く，低分子化も軽度のものが大半を占めた．本邦のBMD例は欧米より欠矢の短い症例が多いのか否かについては今後多数例での検討が必要である．
結論
dは健常者の脳においても発現しており，DMDでは欠如していた．このことはDMDの知能

障害に脳型

d

の異常が関与している可能性があり，知能障害の程度によりdの発現に違いがみられるか否かについて，今後症例を増して検討が必要である．BMDの多くはWbにて低分子化を示し，いわゆるframe−Shift仮説で説明可能であったが，欠矢の短い症例が多く，Wbの泳動条件に工夫が必要であった．

−22−

骨格筋細胞膜におけるジストロフィンの局在と
超徽形態
若

山

菖

弘

（昭和大学藤が丘病院神経内科）
ジストロフィンの光顕レベルにおける正常骨格筋線推周辺部の局在は，杉田，荒畑らによる最初の報告（ProcJpnAcad64B：37−39，1988：Nature333，861−863，1988）以来，多数の報告がある．その電顕レベルの筋細胞膜における局在と超微形態についても我々の報告を含めいくつかの報告があるので現時点においてそれらを整理し紹介してみたい．
1．ジストロフィンの正常骨格筋細胞膜における局在について
免疫透過電顕的にWatkinsら（Nature333：863−866，1988）は筋細胞膜裏打ち構造と横管周辺に，Cullenら（ProcRoySocLondB240：197−210，1990），Samittら（Muscle＆Nerve13：
493，500，1990）や著者ら（ActaNeuropatho180：618−623，1990：同82：178−184，1991）は筋
細胞膜裏打ち構造にジストロフィンの存在を証明した．またSamittらは筋腱接合部にジストロフ
ィン抗体反応が強いことを電顕的に証明した．これらは主にジストロフィンN端近辺に対する抗体を用いた結果であるが，rOddomainなど他の部位に対する抗体でも類似の結果が得られている．例
えばByersらは最近roddomainの抗体を用い筋細胞膜裏打ち構造にはジストロフィンの存在を示しているが，横管部にはジストロフィンが見られなかっ▲たことを報告（JCellBioll15：411−421，
1991）した．彼等は筋腱接合部や神経筋接合部をも免疫透過電顕的に観察しこの部にジストロフィ
ン分子密度が高く，神経筋接合部シナ70ス後膜では谷の部分に多く分布していることを記載している．
2．ジストロフィンの超微形態
生の骨格筋を液体ヘリウムで急速凍結し割断後deepetchingrotaryshadow法にてreplica膜を作製し観察しても細胞膜関連細胞骨格には特に目立った特徴をもったものは見られなかった（Wa−kayamaらActaNeuropatho180：618−623，1990）．従ってジストロフィン分子を観察同定するためにはジストロフィンを骨格筋細胞膜から分離精製Lrotary shadow法によりshadowingをして電顕にて観察する方法（PonsらProcNatlAcadSciUSA87：7851−7855，1990；Murayamaら
ProcJpnAcad66B：96−99，1990）や骨格筋細胞を抗ジストロフィン抗体とそのビチオン化二次抗体（小林ら筋ジス荒木班平成2年度報告書pp90−95；WakayamaらJ Electron Microsc40：
143−145，1991）又は金コロイド標識二次抗体（WakayamaらActa Neuropatho182：178−184，1991）で修飾しその急速凍結標本の割断後deepetchingrotaryshadow法によるreplica膜を作製して観察する方法を用いなければならない．我々の抗ジストロフィン抗体修飾検体の本法による骨格筋細胞膜付近の観察では筋細胞膜を細胞外から観る面と細胞内から観る面に2大別され，どちらも筋細胞膜関連細胞骨格を観察可能であるが，細胞膜内表面の観察可能な面でより容易であった．
細胞院内表面には抗ジストロフィン抗体とそのビチオン化二次抗体で修飾されたジストロフィン分子が存在していた．ジストロフィン分子のなかには5nmの周期をもつ筋原線維最外層のactinfil−−23−

amentと連絡するものもみられた．更に金コロイド法では筋細胞外から観ると10nm金コロイドの付着した細胞骨格は筋細胞膜P面にすぐ隣接してみられたが，部分的にしか露出しておらず，筋細胞内から筋細胞膜内表面に付着している金コロイド付着細胞骨格をみるとその全容を観察するのがより容易であった．形態は種々の形あ梓状構造物で，多くは一端が他端より細く端がやや拡大したものやしてないもの，ややcurveした梓状構造物など種々であった．この結果は他の報告とおおむね一致するが，細部ではなお微妙な違いがある．今後この点を更に検討し，またジストロフィンと他の細胞骨格分子との相互関係を検討して，ジストロフィンの機能の解明を進める必要があると考
えられる．

−24−

ダントロレンナトリウムによる筋ジストロフィー治療の
試み
木

村

秋

口

一

淳

梶

郎

濱

野

龍

兄

利

明

（京都大学医学部神経内科）
近年Duchenne型をはじめとする筋ジストロフィー症の病因が遺伝子レベルで解明されてきたが，未だ有効な治療法を確立するに到っていない．Duchenne型ではdystrophinの欠乏が示されているが，その正確な病因論的な役割は明らかではなく，その欠乏がなくとも筋破壊が進行するとの見解もある（Fischbecketal．MuscleNerve，inpress）．しかし，筋破壊の共通のメカニズムとしてカルシウムの細胞体内への異常な流入が関与していることが示唆されている（Turneretal．Nature
335：735，1988）．細胞体内のカルシウム濃度の異常な上昇は永続的な筋収縮を引き起こし，組織学的に見られるOpaque Fiberなどの所見を説明するものと考えられる．
DantroleneSodiumは，SarCOplasmicmembraneを安定化する作用を持つ抗痙縮剤でDuchenne型筋ジストロフィー症やその動物モデルのdystrophic mouseで血清CPKを有意に下げる作用があることが報告されている（Quinlainetal．MuscleNerve13：268，1990；Bertorinietal．Muscle
Nerve14：503，1991）．また本剤はステロイド剤のような長期連用時の重篤な副作用は知られていない．我々は，今回FSH型筋ジストロフィー2例，Limb−girdle型筋ジストロフィー3例において，DantroleneSodiumを12ヶ月以上授与し，その血清CK値と症状の進行に与える影響を検討し
た．

対象，方法
19−39歳の男性2名，女性3名で筋生検および筋電図で確診のついたFSH型2例およびLimb−
Girdle（L−G）型3例において，投与前1年間の臨床症状を患者の申告により現時点で評価し，投与後1年間の症状と比較した．評価法は，平成元年度厚生省「筋ジストロフ・イー症の遺伝，疫学，臨床および治療開発に関する研究」報告書にもとずいた簡易機能評価スケールによったが患者の記憶がさだかでない項目は除外した．タントロレンナトリウムは経口にて25〜50mg／日を1回〜2回にわけて投与した．CK値の統計解析は本剤の投与量との相関性をSimple Regression法（StatWorks）で検討した．
結果

5例中4例でDantrolene Sodiumの投与量は血清CK値の変動に関与しない確立は0．05以下であり何らかの関与がある，即ち低下させることが示唆された．
臨床症状の進行に関しては，FSH型2例では投与前後各1年間で上肢機能区分における評点に変化は見られなかった．L−G型のうち1例おいて前1年間で障害度区分の2a，階段昇降可（片手手すり）の評価がaからbへ進行したが後1年間ではそれ以上の進行は見られていない．残りの1例でも前1年間で動作を分起立動作で手を使わずできたものが（b）できなくなった（C）が，後1年間では変化を見なかった．

−25−

考察，結論以上，DantroleneSodiumは筋ジストロフィー患者においてCK値を低下させることが示唆された．臨床症状に関してはレトロスペクティブで症例数も少なく，統計的に結論を出すことは出来な
いが，LG型2例において，進行がタントロレンナトリウム投与後に緩除になっている可能性が示
唆され，今後さらに症例を増やして検討する価値があるものと思われる．

−26−

ミトコンドリア遺伝子変異と表現型
小

澤

高

賂

田

中

雅

嗣

大

野

欽

司

（名古屋大学医学部生化学第二講座）
ミトコンドリア（mt）脳筋症患者で検出されるmtDNAの変異は，主として点変異と欠矢である．

ヒトmtDNAは全塩基配列の数％を使った制限酵素消化断片によって解析され，多くの多型が報告されていた．今回，我々がmtミオバナーを含む30例のmtDNA全周塩基配列を決定し胡訳領域を分析した結果，244ヶ所もの塩基置換が兄いだされ，同義塩基置換（65％）と同様に，アミノ酸置換を引き起こす非同義塩基置換（35％）も高い頻度で生じており，この中には哺乳類の関で保有されているアミノ酸残基の置換を引き起こす変異も含まれていた．アミノ酸置換を伴う数多くの点変異
がヒト個体相互に存在し，mtDNA由来の蛋白サブユニットには，標準となるべき一次構造は存在しない．即ち，エネルギー産生糸の構築は，一定のゆらぎの範囲に存在すると言える．典型的なmt脳筋症患者にみられる塩基置換は個体あたり40〜60ヶ所も存在する1）．これら塩基置換の相当部分は系統的に分岐しており一部は生理的なゆらぎの範囲と考えられるが，多くはその範囲を越え点変異として病理的なものである可能性が高い．これら患者mtDNAはいずれも大小の欠夫を持っており，点変異と欠矢の校合が疾患病因と考えられる．
mt内膜から発生する活性酸素はmtDNA中のdGを8−OH−dGへ変化させる．8−OH−dGは複製の際に他の塩基に誤読されることが確認されており，8−OH−dGの蓄積と点変異の蓄積とは互いに同義である．酵母では点変異の蓄積が遺伝子の欠夫を引き起こす2）．mtDNAが同一鎖内で欠夫を起こすためには，一本鎖の状態であることが必須である．欠矢を起こす機構については，mtDNAの分子内組み換え，校製時におけるslippedmispairingは考え難く，持続的な一本鎖の状態における疑似組み換え，ないし再配列が妥当である．即ち，8−OH−dGが蓄積してミスマッチを起こし，部分的に二重鎖が破られ持続的な一本鎖の状態になり欠夫を起こすと考えられる．
実際に横隔膜のmtDNAを分析してみると，65歳以上の高齢者では加齢にともなって8−OH−dGが急増し，それに伴って欠夫が顕著になる3）．心筋においては，ATPase6遺伝子とD−ルー70上の12塩基の順方向繰り返し配列の問で7．4kbの欠矢がみられ，その頻度が加齢と共に増大することを老人心との関係で報告した4）．実際にこの欠失を定量してみると，60歳以下では仝mtDNAの0・1％程度であったものが，60歳台から急増し，80歳台で3％，90歳台で9％に達する5）．従って，加齢に伴う8−OH−dGの増加が，点変異の蓄積，遺伝子の欠矢を引き起こし，加齢に伴う筋力低下の重要因
子の一つであると考えられる．mt脳筋症，特発性心筋症患者の骨格筋，心筋mtDNAの全周塩基配列を決定したところ6），これら患者組織では発病時にすでに多くの点変異の蓄積と大小の欠矢が存在しており，組織局所で早発性加齢が進行していることを示している．
8−OH−dGは加齢とか母系遺伝された点変異の蓄積といった内部要因のみならず，毒物，薬物などの外部要因によってももたらされる．昨年，aZidothymidine（AZT）を3〜6ヶ月投与された15症
例ものエイズ患者が典型的なmtミオバナーになったことが報告された7）．そこで実験動物として組織呼吸量がヒトの10倍高いマウスを選び，患者使用量の1／10のAZTを投与したところ自発的運動
実験で運動量が50％低下し4週間で強制運動も不能となり，ほどなく死亡するに至った．筋肉−27−

mtDNAをミクロ高速液体クロマト／質量分析計で分析すると総dGの25％が8−OH−dGに変化していた8）・この大量の核酸酸化物の生成はAZTの構造，投与期間からしてmtDNAがAZTによって直接障害されたこと，それがマウスの運動障害，死亡の直接原因であることは明らかである．エ
イズ患者のAZT投与によるmtミオバナーの病因もこれで容易に説明できる．
これらの事実から，毒物，薬物といった外部要因，加齢か−し遺伝された点変異といった内部要
因による点変異の蓄積によってmtエネルギー産生系の構築が障害され，活性酸素の産生を促し
mtDNA中の8−OH−dGが増大し，mtDNAが持続した一本鎖状態となり大小の欠矢が生まれると考えられる・1細胞内に1コピーの核遺伝子と異なり，総千コピー存在するmtDNAは，変異した遺伝子の総量が一定の閉値を越すと機能の障害として顕在化する．個体発生の段階での細胞分裂に伴い，卵細胞に遺伝した変異mtDNAの偏在が生じ，偏在した細胞から発生した組織ではある時期，間借を越え症状が顕在化して・mt脳筋症，mtミオパテ−，心筋症など組織特異的な表現型を呈する．
要約すると・mtDNA変異が患者共通にみられ，それがその症状を説明でき，動物実験でも再現されるので・病因の3原則を満たしており，mtDNA変異は疾患の結果ではなく原因であることは明らかである・従ってmtミオバナーなどの疾患群は mt遺伝子病（mtDNA disease） と言えよう．

文献1）OzawaT・TanakaM・InoH・OhnoK，SanoT，WadaY，YonedaM，TannoY，MiyatakeT，
TanakaT・ItoyamaS，IkebeS・KondoTandMizunoY：BiochemBiophysResCommun，176：
938−946，1991．

2）LinnaneAW，MarzukiS，OzawaTandTanakaM：Lancetj：642−645，1989．
3）HayakawaM・ToriiK，SugiyamaS，TanakaMandOzawaT：BiochemBiophysResCommun
179：1023−1029，1991．

4）HattoriK・OzawaT，KondoT，MochizukiM，TanakaM，SugiyamaS，ItoT，SatakeTand
Ozawa T：Amer HeartJ122：866−869，1991．
5）SugiyamaS・HattoriK・HayakawaMandOzawaT：BiochemBiophysResCommum180：
894−899，1991．

6）OzawaT，TanakaM・SugiyamaS，InoH，OhnoK，HattoriK，OhbayashiT，ItoT，Deguchi
H，KawamuraK・NakaneYandHashibaK＝BiochemBiophysResCommun177：518−525，7）DalakasMC・IllaI・PezeshkpourGH・LaukaitisJP，CohenBandGriffinJL：NEnglJMed
322：1098−1105，1990．

8）HayakawaM・OgawaT，SugiyamaS，TanakaMandOzawaT：BiochemBiophysResCommun
176：87−93，1991．

−28−

分

担

研

究

報

』ヒ
rl

目

次

Ⅰ.臨床･病理
1) 筋疾患の再生線維におけるtrue acetylcholinesterase 活性像について
─Togo法による検討結果─
東京都立神経病院田邊

信州大学医学部第三内科

庄

司

39

等

2）限局性筋疾患の画像診断

43

進

一

3) Rimmed vacuoleを伴った筋症における生検筋力テプシンLの活性,

局在に関する検討

47

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

4) Rimmedvacuole myopathyにおける熱ショック蛋白hsp72の局在東京大学医学部脳研神経内科

清

水

輝

夫

5）亜性高熱，セントラルコア病などの骨格筋ライアノジンレセプター異常
虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

6) 筋疾患の治療効果について
─運動負荷試験によるAnaerobic Thresholdの検討─
北海道大学医学部神経内科

田

代

51

55

59

邦

雄

7）ダントロレンナトリウムによる筋ジストロフィー治療の試み

─1年間の臨床経験─

62

京都大学医学部神経内科 木 村淳

Ⅱ.ジストロフィン(No.1)

8) Becker型筋ジストロフィー3例の分子遺伝学的,免疫学的検討

67

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

9）ジストロフィン遺伝子欠失を伴い，運動時筋痛，高CK血症を呈した
症例73

九州大学医学部脳研神経内科 後 藤 幾 生10) Myotubular myopathyにおけるジストロフィン発現の免疫学的検討
東京大学医学部脳研神経内科 清 水 輝 夫

317611) Dystrophin :ヒト臓器分布並びにBecker型筋ジストロフィーにおける発現様式について
国立療養所再春荘病院神経内科

内

野

80

誠

Ⅲ. ジストロフィン(No.2)

12) ジストロフィン分子におけるN末端ドメインの臨床的意義

87

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

13）筋ジストロフィー組織ジストロフィンファミリーと生体膜機能
宮崎医科大学衛生学

濱

田

90

稔

14）ジストロフィンの局在と機能：急速凍結 ─ディープエッチング法による細胞骨格蛋白との相互関係の検討

95

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義
Ⅳ. mdxマウス

15) 運動負荷による成熟mdxマウス筋変性への影響
東京都立神経病院

101

田

邊

等

16) mdxマウスの電気的病態と薬物治療,筋活動電位の分析,
及びミオトニーの数理的解析
東邦大学医学部第四内科

栗

原

106

照

幸

17) mdx胎仔骨格筋の電位依存性カルシウムチャンネルについて
国立精神・神経センター神経研究所

吉

田

瑞

子

18) mdxコントロールマウス骨格筋細胞膜ジストロフィン分子のdeep etching replica法による観察
昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

111

114

弘

19) dantrolene sodiumによるmdxマウスの実験的治療

119

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

20) ジストロフィー筋への正常myoblastの注射に関する研究
─注射法の検討─
帝京大学医学部神経内科 寺 尾 寿 夫

32

123

Ⅴ．遺伝子・生化学
21）筋特異的遺伝子発現に関する神経ペプチドの研究
金沢大学医学部神経内科

高

129

守

正

治

22) Duchenne型及びBecker型筋ジストロフィー家系のPCR法を用いた遺伝子診断と保因者診断132

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

23）ジストロフィン関連遺伝子のクローニングに関する研究

137

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

24）正常人ならびに神経・筋疾患患者の骨格筋細胞におけるミオグロビンmRNAの局在
─in situ hybridizationによる成績─
徳島大学医学部第一内科

139

川

井

尚

臣

25) 動脈結紮後の速筋と遅筋のglucose uptake
信州大学医学部第三内科

144

庄

司

進

一

26）筋細胞死と自食作用

147

順天堂大学医学部生化学第一講座

木

南

英

紀

27）筋再生と塩基性線維芽細胞成長因子

151

九州大学医学部脳研神経内科 後 藤 幾 生28）培養ヒト筋細胞のミオシン重鎖発現に対する神経支配の影響

155

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義29) 筋原線雄のC‑蛋白質を分解する酵素の存在とその性質(財)東京都神経科学総合研究所分子研究系神経生化学部門 堀

160

眞一郎

30) 筋緊張性ジストロフィー患者immunoglobulin Gの糖鎖構造

164

名古屋大学医学部神経内科 杉 村 公 也

Ⅵ. ミトコンドリア脳筋症(No.1)
31) MELASと糖尿病の合併例について

169

国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信 義32) MERRFの筋生検所見
─組織学的に診断できなかった症例を中心として─
国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信 義

33

173

33）ミトコンドリア脳筋症における血管病変

178

国立精神・神経センター神経研究所 後 藤 雄 一34）Myoclonus epilepsy associated with ragged‑red fibers (MERRF)の組織障害機序に関する研究

182

新潟大学脳研究所神経内科

田

中

恵

子

35）ミトコンドリア脳筋症における筋プリン体代謝に関する研究

186

大手前病院（国家公務員等共済組合連合会） 垂 井 清一郎

36) Limb girdle syndromeを示したミトコンドリア･ミオパチー
愛知医科大学第四内科 佐 橋功37）ミトコンドリア脳筋症の病因解明
─ピルビン酸脱水素酵素欠損症女児例における分子遺伝学的
病因検索─
徳島大学医学部小児科

黒

田

泰

森

正

杉

村

公

太

田

成

小

澤

211

男

41）ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア遺伝子変異
名古屋大学医学部第二生化学

205

也40）ミトコンドリア脳筋症変異mtDNAによるタンパク質合成低下
─CPEOとMELASの比較─
自治医科大学生化学

201敬39) ヒトミトコンドリアDNA D‑loop領域における新しい調節因子（Mt5因子）名古屋大学医学部神経内科

195弘38）蛋白質のミトコンドリア移行とその異常：サイトゾル因子の役割
熊本大学医学部遺伝医学研究施設

190

216

高

將

42）ミトコンドリア脳筋症における変異ミトコンドリアDNA（mtDNA）の解析

─In situ hybridization (ISH)を用いての検討─
熊本大学医学部第一内科

荒

222

木

淑

郎

Ⅶ. ミトコンドリア脳筋症(No.2)
43)ミトコンドリア脳筋症におけるmtDNA基づいた系統解析

Dループ領域の塩基配列に

国立遺伝学研究所 宝 来229聰44) ミトコンドリアDNA異常とその臨床的多様性に関する研究
大阪大学医学部小児科 岡 田 伸太郎
3423345）ミトコンドリア脳筋症の病型と遺伝子異常
順天堂大学医学部脳神経内科

237

佐

藤

猛

46）常染色体優性遺伝を示したミトコンドリア脳筋症症例の骨格筋
ミトコンドリアDNAの解析
徳島大学医学部第一内科 川 井 尚 臣

24047) 種々のミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリアDNAの検討

244

鹿児島大学医学部第三内科

納

光

弘

48) MELAS病態の細胞学的解析

249

自治医科大学小児科 桃 井 真里子49) MELASにおける点変異ミトコンドリアDNAの変動

252

自治医科大学神経内科 西 澤 正 豊50) 変異ミトコンドリアDNAの分布
─MELAS患者の一剖検例─255

筑波大学臨床医学系神経内科 水 澤 英 洋51) MELASの点変異:塩基番号3243と3271の比較検討
国立精神・神経センター神経研究所 後 藤 雄 一

35

260

Ⅰ．臨床・病理

1）筋疾患の再生線経におけるtrue acetylcholinesterase
活性像について−Tago法による検討結果−
田

研究協力者

宮 本 和 人■■ 林
理 之＊＊
磯 崎 英 治＝ 八 木 唯 一＊＊

は じめにAcetylcholinesterase（以下AChE）活性の組織
化学的証明には，従来Karnovsky−Roots法，辻の変法が行われ，Cholinesterase活性のKoelle法もよく知られていた1ト3）．これらの方法は，検出感度が低く，神経筋接合部が陽性に出るのみで，得られる情報も限られていた．一方，nOnSpeCificesterase（以下NSE）活性は，神経筋接合部以外に，貪食細胞や小角化線経が陽性となり，さらに
type1線経も弱い陽性反応を示す4）5）．
Tago法による特異的AChE活性像は，おもに中枢神経や末梢神経の研究に用いられていた6）．
骨格筋に於ける研究も見られ，神経筋接合部に強い活性を示し，type2線経にも活性を認めることが報告された．
一方，蛇毒であるα−bungarotoxin（以下α一BT）は，nicotinicacetylcholine recetor（以下AChR）に特異的かつ非可逆的に結合する物質で，これを用いて神経筋接合部や筋細胞膜に拡散した
AChRを認識する方法が知られている7）．
今回，Duchenne型筋ジストロフィー（以下DMD），Becker型筋ジストロフィー（以下BMD），肢帯型筋ジストロフィー（以下LG）等．
に，Tago法を応用し，AChE活性像の特徴を■東京都立神経病院＊＊東京都立神経病院神経内科

等＊

通

村

橋

真＝

NSE活性像やα−BT結合試験の結果と比較検討
した．
方

法

筋生検組織でTago法を実施するには，1恥の新鮮凍結切片を，aCetylthiocholineを基質としたKarnovskyTRoots原液を100倍に希釈した反応
液に室温で60分間浸漬反応させる．次いでDAB・ニッケル法で発色させた．
α−BT結合試験の方法は，まず過ヨウ素酸法でHRP対α−BTを1：2に結合させ，次にりん酸
緩衝液でα−BT濃度を0．55pmol／JLlに調整して，新鮮凍結切片に一滴加え，湿箱で4℃にて1晩作用させる．発色法はTagoと同じくDABニッケ
ル法で行った．
次いで連続切片で通常の組織化学バッテリーと，
主に市販のC末端部に対するABC法でジストロ
フィンを染めた．
対象は，Dystrophin染色で確認されたDMD3
例，BMD3例，その他肢帯型4例等，50例の生検
骨格筋である（図1）．
結果

Tago法では，AChE活性の強陽性部が黒く見え，次いで黒味がかった紫・薄い紫と陰性部は無色に，その間無段階に変化するので便宜的に最強部を4＋とし，順次3＋・2＋とした．特に疾患−39−

α−プンガロトキシン総合試験

0 ．1H マ レ イ ン 酸 緩 衝 液

過ヨウ素酸法にて￠−プンガロトキシン（◆）

50 J川 ク ェ ン 酸 ナ ト リ ウ ム◆濃度

10JJ新鮮凍は切片に1満OVernlght ◆がAChre印t．と措合
l ◎を発色させる

MD

1

その他

O．31鑓蟄アンモニアN j

0

多発性筋炎
神経原性疾患1

0．041DAB

LG
FSH

9

0 ．05％ トリ ス 緩 衝 液◆

5

0 ．3Ⅹ 硫 酸 ア ンモ ニ ア N l◆

0．55叩01／〟1

4

0 ．04X D A B

＼

2

60分浸漬

／

筋ジストロフィー
DMD
BM D

4

18 J川 ア セ チ ル チ オ コ リ ン

1をHRP（◎）でラベル◎

5 〟H フ エ リシ ア ン 化 カ リ

象33 0 J川 硫 酸 銅

対3

10JJ新鮮凍拡切片

O．051トリス緩衝液

5分発色

図1 対象と方法とは関係なく，神経筋接合部は強いAChE活性表 結果（4＋）を有し，次に，type2線経の筋細胞膜が正常でも活性（＋）を示し，筋細胞質にもわずかに活性（±）が認められた．今回の研究によって，
DMD・BMD・LG等の進行性筋ジストロフィーのA ChE
t y p 8 1 s a 「0 P 1 8 5 月

例で，再生線経の筋細胞膜周囲にendomysiumへ酵素活性が拡散するほど強いAChE活性（3＋）
を認め，筋細胞質に中等度の活性（＋）を認めた．
これらの活性はもちろん通常のtype2線経に認−±−t yp e l s a r c o l e n m at y p e 2 s a r ∝p 1 8 S q＋−

typ 8 ￣2 8arcolemma

2 ＋

n e u rO q U S Cu 1 8 r j u n c t u jo n

4 ＋

−
2 ＋

n e c ro t j c f j b e r
r e g e ne r a t i v e f j b e r

められる活性よりも強く，type2線維萎縮時の濃縮（2＋）よりも強く，特徴的なことは，細胞膜周囲に特に強い活性が認められたことである．これらの線経が再生線経であることは，（DHE染色

α−B T

−
2 ＋

−

−
−

AChE：Ta90法 α−8T：α−プンガロトキン結合

で，中心核を有し，好塩基性に染まり，②Acid
phosphatase活性陽性，③Alkalinephosphatase
活性も一部で陽性，④ATPase活性pH4．3で中心とした観察ではほとんど高活性を示す線経は認めなかった．逆にTago法では陰性であった会食細胞が強い活性を示した．

type2Cであることから確かと思える．また，特異的AChE阻害剤を用いた阻害試験では，神経筋
接合部をはじめ全ての活性は消失した．

Acidphosphatase活性と対比すると，双方の陽性線経はよく一致する．Tago法の方が線経の輪郭が明瞭で，陽性線経の認識が容易であった．し再生線経でAChE活性が認められたことから，
acetylcholine受容体の分布を調べる目的で，α−BT結合試験を実施した．それでは，神経筋接合部に相当する部位に強い結合能を認めたが，Tago
法陽性の再生線経では，α−BT結合反応は認められなかった（表）．
NSE活性像でも稀に，再生線経に活性が認められるとの報告もあるが，今回筋ジストロフィーをかし，Acid phosphatase活性は，NSE活性と同様に貪食細胞に強い活性を示すが，前にも述べたようにTago法では陰性であった．
多発性筋炎も，筋病理上壊死再生現象の激しい疾患としてよく知られており，今回自験例でも壊死再生が日だつ症例にTago法を実施してみたが，再生線経において筋ジストロフィーほど強い
AChE活性は証明されなかった．

−40−

図2

Tago法（左）HE染色

6歳

DMD

図3 Tago法（左）α−BT結合試験（右） 45歳 LG

また，神経切断実験の結果ではTago活性はす
べて消失するとされているが，今回筋萎縮性側索硬化症，Charcot−MarieLTooth病などの神経原性疾患にTago法を応用して観察したが，神経筋
接合部やtype2線維などでAChE活性は保たれており，急性の切断実験の結果とは一致しなかった．
以上から，Tago法，NSE活性，α−BT結合試
験共，神経筋接合部に強い活性を示した．異なる
点は，Tago法は再生線経に，NSE活性は小角化線経に強い活性を示し，Tago法はtype2に
NSEはtypelにそれぞれ弱い活性を示す点であった（図2）（図3）．
考察

再生筋で強いAChE活性を証明したのは，我々が最初と思われる．このAChE活性の由来が筋なのか，神経末端からなのかは不明であり，ジスト
ロフィーマウスなどを用いて除神経実験をして確かめる必要がある．再生筋が強いAChE活性を示したのは，筋ジストロフィーが中心であり，多発性筋炎では余り強い活性を示していなかった点も興味がもたれたが，その理由も今後の課題とした
また，Engelらは，α−BT結合試験で脱神経による小角化線経の筋細胞膜にacetylcholine rece−
ptor活性の拡散や培養筋の筋管細胞表面に
acetylcholine receptor活性の発現を報告しており，再生筋でもある時期筋管細胞を経過すると考えられるので筋ジストロフィーの再生筋でもacetylcholinereceptor活性の発現は予想された．
今回検出されなかった原因は，一つには検出感度の問題，もう一つには培養筋管細胞と生体内での現象との差があることが考えられる．これについ−41−

ては今後，α−BTに対する抗体を用いて免疫組織

3）Koelle GB and FriedwaldJS：A histo−

学的に感度をあげるか，aCetylcholinereceptor自Chemicalmethodforlocalizatingcholinester−体に対する抗体を用いて染めてみるかで解決できるかと思われた．

aseactivity，ProcSocExpBioIMed70：617，
1949．

4）Davis BJ and OrnsteinL：Highresolution
結論

enzymelocalization with a new diazo

筋生検にTago法を応用することにより通常行
われる如何なる染色よりも明瞭かつ特異的に再生線経を検出することが出来た．

reagent，Hexazonium

Pararosaniline．J

Histochem Cytochem7：295，1959．

5）石原侍幸：神経筋疾患生検筋におけるnon・
SpeCific esterase染色の意義．臨床神経 24：

文248，1984．
direct−6）TagoH，KimuraH andMaedaT：Detailed

thiocholinemethodforcholinester−acetylcholinesterasefiberandneuronalstain・1）Karnovsky

COlorlng

献

MJ

and

Roots

L：A

ase．J Histochem Cytochem12：219，1964．

1nglnratbrainbyanewandhighlysensitive

2）Tsuji S and Larabi Y：A modification ofhistochemicalprocedure．J HistochemCyto−

thiocholine，ferricuanide method of Karnov・Chem34：230，1986．

Sky and Roots forlocalization of acetyl・7）BenderAN，RngerSPandEngelWK：The

Cholinesterase activity withoutinterference

acetylcholine receptorin normaland path−

byKoelle

scopperthiocholineionideprecipi・

tate．Histochem78：317，1983．

−42−010gic state．Neurology26：477，1976．

2）限局性筋疾患の画像診断
庄

研究協力者

司

進

一＊

朴 木 清 人＊ 吉 田 邦 広＊ 柳 澤 信 夫＊

は じめに
我々は，Heckmattら1）および田代ら2）の筋超い，Tl強調像（TR＝500ms，TE＝29ms），T2強調像（TR＝2400ms，TE＝90ms）を得た．全例で音波診断法（以下筋エコ一法）が神経筋疾患の診断に有効との報告以来今まで約600例の神経筋疾
患患者に筋エコー法を，約300例の神経筋疾患患者に筋CTを実施してきたが，最近それに加えて筋MRI診断を行うようになった．今回，限局性筋疾患で得られたそれぞれの画像所見について筋病理

筋エコー法と筋CTを，5例で筋生検を，3例で筋MRIを施行した．

所見と合わせて検討した．
今回の目的として，
1．限局性筋疾患におけるそれぞれの画像所見の検討
2．画像所見と筋病理所見と対比し画像所見の意
味を探る
3．それぞれの画像診断法としての有用性および特徴を明らかにする
以上のことを念豆削こおいて検討した．
対象および方法
対象は，筋サルコイドーシス2例，低カリウム
血性ミオバナー2例，タロフイプレートミオバナ

ー1例，Weber−Christian病1例の計6例である．
方法は，筋エコー法は超音波断層装置日立EUB−40を用い，GAIN30dB，NEARGAIN−30dB，
FAR GAIN3dBと一定条件で記録した．筋CT
は，SIEMENS SOMATOM2を用いLEVEL25，
WINDOW256の一定条件で撮像した．筋MRIは，0．5テスラMRI装置（島津SMT−50）を用＊信州大学医学部第三内科

結果

図1に低カリウム血清ミオバナーの下腿最大径部における左より筋エコー，筋CT，筋MRI T2
強調の横断像を示した．上段が筋力低下がめだった時期，下段が回復後のものである．筋エコー像
では，前脛骨筋で筋力低下がめだった時期には前頸骨筋の筋肉内エコーの増加を認め，筋CTでは明らかな変化はなく，筋MRIではT2強調像で前脛骨筋で著しい高信号を認めた．回復後では筋エ
コー像，筋MRIのT2強調像でそれぞれ筋肉内エコーの増加，高信号は消失した．右端は同症例の筋力低下のめだった時期の前腰骨筋の筋病理像だが，壊死，細胞浸潤等の二次性変化と考えられる
炎症所見がめだっていた．
図2に筋サルコイドーシスの下腿最大径部における筋エコー，筋CTおよび筋病理像を示した．
筋エコー像では，筋肉内に結節を認めた．筋CT像では明らかな変化を認めなかった．同症例の筋病理像では，細胞浸潤やサルコイド結節を認めた．
図3−1に健常対象の下腿三頭筋の筋エコー像
を，図3−2，3−3，3−4にWeber−Christian病の下腿三頭筋の筋エコー，筋CTおよび筋病理像を示した．筋エコー像では，健常対象に比べ特にヒラメ筋での筋肉内エコーの増加を認めた．筋CT像では，明らかな変化を認めなかった．筋病理像では，筋外膜および筋周膜の小血管周囲に炎症

−43−

二l畢三
豊∴ノ■◆亀図1US，CT，MRI and histology of the tibialis anteriorin a patient with hypokalemic
myopathy

図2

US，CTandhistologyofthegastrocnemius−SOleusinapatientwithsarcoidmyositis

性の細胞浸潤を認めた．
図4はタロフイブレートミオバナーの大腿中央部の筋エコー像だが，上段は血清CK値の異常上昇を認めた時期に撮像したものだが，筋肉内のECHOGENESITYの平均値は21と筋肉内エコーの増加を認めており，下段のものはCK値の正常化した時期に撮像したものだがECHOGENESITYの平均値17と筋肉内エコーは正常値の平均11±2（N＝20）に近づいている．
考察

以上の結果より，炎症ないし浮腫の強い病変は，筋MRIのT2強調像が筋エコー法を上回る鋭敏性を示す．筋エコー法では，これらの限局性筋疾

患すべてに有意な変化を認める鋭敏さを示し，容易に経過を追え，その簡易さと非侵襲性および低コストは特筆すべきである．これらの限局性の病
変を，筋CTでははっきりとらえられない．
限局性筋疾患ではないが，筋CTおよび筋MRIでとらえられないで筋エコー法で異常をとらえた症例をあげ筋エコー法の特性を考える．
図5−1，5−3に健常対照，図5−2，5−4に三好型遠位型ミオパテーの大腿中央部の筋エコー像を示した．上段は3．5MHzでの横断像，下段は7．5MHzでの縦断像であるが7．5MHzの像で三好型遠位型ミオバナーでは明らかに筋肉内エコーが増加している．3．5MHzでも軽度の筋肉内エコーの増加を認めるが7．5MHzの方がより強く

−44−

3− 1

3 − 2

3− 3

3− 4

図3

US of the gastrocnemius−SOleusin ahealthycontrol；US，CTandhistology
Of thatin a patient with Weber−
Christian disease

図4

USofthequadricepsinapatientwith
Clofibraterinduced myopathy

認めており，これは超音波の周波数増加にともな
う分解能の向上によると思われる．図5−5，5−6，5−7に同症例の筋CT像，筋MRIのT．
およびTZ強調像を示した．明らかな異常を認めない．図5−8は同症例の筋病理像だが，筋線経の大小不同といった軽い筋原性変化を認めるのみであった．
この三好型遠位型ミオバナーの画像診断法の比較の結果から，筋エコー法は，細胞構築の変化といった軽度の筋原性変化では筋CTおよび筋
MRIより鋭敏であると言える．MRIは，原理上水素原子核の磁気双極子モーメントに対しラジオ波を与え，切った後に発する磁気共鳴信号を画像化したものであり，これは水素原子密度が高いほど強くなる．CTはⅩ線の透過度をコンピューター
で演算してつくった像であり，物質のⅩ線透過性に依存する．故に，CTは物質の物性自体はよく検出できても微細を筋線推レベルでの構造の違いを検出するのは難しいと思われる．一方，エコー法
は超音波の物体に対する反射像を観察しており，微細な構造自体の変化に最も鋭敏であることは容易に理解できる．実際，細胞構築の規則正しい肝臓で2cm以下の肝癌では超音波診断法が最も鋭敏とされ，最近では直径4cmの高分化型肝細胞癌
でMRI，CTで描出されず超音波検査のみで描出された症例も報告されている3）．従って，超音波診断法が筋疾患でもかなり鋭敏であり，筋疾患の画像診断法として重要な位置を占めると期待される．
結論

筋の炎症ないし浮腫を伴う限局性病変をとらえるための画像診断では，筋MRIのT2強調像が最

−45−

5 −1

5 −2

5 −6

5 −3

5 −4

5− 7

5 −5

5 −8

図5

US ofthe quadricepsin a healthycontrol；US，CT，
MRIandhistologyinapatientwithdistalmyopathy（Miyoshitype）

も鋭敏であったが，筋線経の構築の変化のみを認める軽度の筋展性変化には筋エコー法が最も鋭敏であった．
筋エコー法は，これらの限局性筋疾患すべてで有意な変化を認める鋭敏さを示し，また容易に経過を追え，その検査法の簡易さと非侵襲性および低コストを考えると改めてその有用性が示された．

imagingin the diagnosis ofmuscle disease．
J PediarlOl：656，1982．

2）田代邦雄，松浦 享ほか：神経筋疾患における
ultrasoundimaging−CT所見および筋生検所
見との関連について． 厚生省「神経疾患研究委
託費」筋ジストロフィー症の臨床，病態と成因に関する研究 （杉田班）昭和59年度研究報告
書，1985，pp90−95．
3）直居 豊，富田 貴ほか：超音波検査のみで描文

献出された高分化型肝細胞癌の一症例．日本超音1）HeckmattJZ，Leeman S，et al：Ultrasound−46−

波学会講演論文集，1991，p133．

3）Rimmed vacuoleを伴った筋症における生検筋
力テプシンLの活性，局在に関する検討
若 山 吉 弘＊
研究協力者

自 見 隆 弘＊ 佐 藤
渋 谷 誠 二＊ 杉 田

塩川 武
幸二郎＝

田

篤書目

は じめに

製しカテプシンB，H，Lを精製（Schwartsand

Rimmedvacuole（RV）は，リソゾームプロテ
アーゼ活性の克進を伴う自己合食に関連した空胞

Barrett，Masonらの方法を改変），ラビットに免と考えられ，Iiら1）によりRVを伴う還位型筋症
におけるカテプシンBとHの局在の証明がなされている．一方，カテプシン Lについては，
Kominamiら2）によって，MDXマウス筋およびplasmocid−inducedmyopathyにおける報告があるが，ヒト病的筋における検討はまだなされていない．我々は，自己会食に関連が深いと考えられ
るカテ7pシンLについてRVを伴うヒト筋症生
検筋における活性，局在について検討したので報告する．

疫して得た抗体のIgG分画にベルオキシターゼ
標識したものを抗体として使用した．これらの抗体を用い酵素抗体直接法により免疫染色を施行した．生化学的には，（）内の基質を用いてカテ
プシンB（Z−Arg−Arg−MCA），カテプシンB＆L（Z−PheTArg−MCA），カテプシンH（Arg−
MCA）の活性を測定．また，CySteineproteinase
inl1ibitor，酸フオスフアターゼ，β一D−glucosidaseの活性もカテプシン群との比較のため測定した．
イムノブロットはカテプシンBとLについて施行した．12．5％ゲルを用いSDS−PAGEを行い，ホライズプロット法でクリアプロットP膜（アト一対象
対象はRVを伴う筋症4例（casel〜4）（RVを伴う遠位型筋症2例，封入体筋炎1例，既存の疾患概念には相当せずRVを伴った筋症1例），

社）に転写し，alkalinephosphataseconjugatedgoat anti−rabbit antibody（Promega biotec，USA）にて検出した．
結disease controlとしてnon−rimmed vacuolar

myopathy2例（case5，6）（hypokalemic
periodicparalysisl例，alcoholichypokalemiC
myopathyl例），正常対照筋12例の計18例につき
検索した．
方

法

剖検時採取したヒト肝よりhomogenateを作＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学医学部神経内科＊＊＊昭和大学藤が丘病院臨床病理

果

RVを伴う筋症の生検筋では一般筋病理学的に4％〜12％の筋線経にRVを認めたがいずれの症例も細胞浸潤はないか極めて軽微であった．免
疫染色ではRVおよびその周辺部に一致してカテプシンBとL，特にカテプシンLで強反応を認めた（図1）．一方，カテプシンHの染色性はfaintであった．正常対照筋では反応を見なかった．non−rimmedvacuolar myopathy生検筋ではカテプ
シンB，H，Lともvacuoleに反応を見なかった．
生化学的活性を表に示す．casel〜4はRVを伴

−47−

図1

カテプシン免疫染色
A：カテプシンB B：カテ70シンH C：カテプシンL D：カテプロシンL

巨∃A〜C：RVを伴う筋症

D：nonLrimmed vacuolar myopathy

う筋症，CaSe5，6はnon−rimmed vacuolar

Immunobbtting analysis

myopathyである．RVを伴う筋症ではカテプシンB（p＜0．05），B＆

L（p＜0．01）の活性の上昇を認めた．一方，カテプシンHについては正常対照群と比較しむしろ低い値をとる傾向が認められた．酸フオスフアターゼ，β−D−glucosidaseについては正常対照と比較し高値をとる傾向が認められたがカテプシンB，B＆

Lと比較するとその上昇程度は軽度であった．non−rimmed
VaCuOlar myopathyについては，CaSe

＋20k
1
図2

2

3

カテプシンLのイムノブロット
1anel：肝homogenateのミクロゾーム分画
lane 2：RVを伴う筋症case3
1ane 3：正常対照筋

プシンB，B＆

6でカテ

Lの活性上昇を認めたが，この症例は中等度の細胞浸潤を伴い，このため特にカ
テプシンBを中心とした上昇を示したものと考えられた．また，カテプシンLの酸フオスファターゼ，β−D−glucosidaseに対する比をとるとRV群がnon−RV群より高値をとる傾向が認められた．カテプシンLのイムノブロット（図2）では，肝（lane l）においてはmature form，−48−

表 ライソゾーム酵素活性C a t hBe p s in

N o rm a l C o n t ro Ism ea n ± S D

C a t h e p s in
B ＆L
（A ）

1 ．2 1

1 ．7 6± 0 ．
57± 0 ．9 9

C a t hHe p s in
C Pl

17 ．
6

1 5 ．1 7
±

8 ．
8 9

±

4 ．
8

±

A P

β−D −G Iu

（B ）

（C ）

4 1 ．44 ．6

5 ．7± 1 ．3

ヤ B X 10 3〜C

4 2 ．50 ．
3 8■ C a sel

3 ．5 05 ．7 0

7 ．0 36 ．5

6 2 ．06 ．8

9 1 ．90 ．8 4C a se2

1 ．7 5

4 ．3 6

4 ．5 02 2 ．05 6 ．9

6 ．3

76 ．
6

0 ．6 9C a se3

2 ．8 5

4 ．4 2

1 1 ．2 1

2 3 ．44 7 ．7

1 0 ．89 2 ．
70 ．4 1

C a se4

3 ．7 3

5 ．8 02 3 ．1 0

3 6 ．83 5 ．65 ．3

1 6 2 ．9

1 ．0 9

1 0 0 ．2

0 ．
6 9

2 ．9 6m ea n ± S D

＊

＊＊
5 ．
0 7

± 0 ．8 9± 0 ．7 9

1 1 ．4 6

2 2 ．2

50 ．
6

7 ．3

8 ．2 4± 1 2 ．4

± 11 ．
6± 2 ．4±C a se5

1 ．4 4

1 ．5 2

6 ．1 15 6 ．36 ．7

2 7 ．00 ．2 3C a se65 ．5 04 ．6 97 ．1 97 9 ．411 ．
5

5 9 ．1

0 ．4 1

CPI＝cysteineproteinaseinhibitor

AP：acidphosphatase

P−D−glu：β−D−glucosidase

case1−4：RVを伴う筋症 case5，6：non−rimmedvacuolarmyopathy −ヵテプシンB，B＆L，H活性はnmol／min／mgprotein，CPI活性はJLU／min／mgprotein，酸フオス7ァターゼ活性はmU／min／mg protein，β−Drglucosidase活性はarbitrary unitで示す．
＊ ：p＜0．05＊＊：p＜0．01

proformに相当すると考えられる30kDa，39kDaのバンドを認めた．免疫組織学的にカテプシンLが強反応を認めたRVを伴う筋症case3（lane2）では30kDa，39kDaのバンドに加え36kDaの位置に陽性のバンドを認めた．正常対照筋（lane3）ではfaintなバンドにとどまった．一方，カテ
プシンBのイムノブロットでは正常筋およびRVを伴う筋症のいずれにおいても29kDaのfaintなバンドを認めた．
考察

我々は，従来より再生筋におけるカテプシン群の活性の検討を進めてきたが3），今回はRVを伴う筋症4症例につき検索した．カテプシンBについては従来のRVを伴う筋症での報告を支持す
る結果を得た．即ち，Iiら1）の報告同様，免疫組織
学的にRVおよびその周辺部で強反応を示し，また生化学的にも高活性を示した．一方，カテプシンHについては弱反応，低活性を示したが，生化学的検索のため今回用いた基質がカテプシンHのみに特異的ではないため他のアミノペプチダー
ゼの影響も考慮する必要がある．しかし，今回の検索からは，カテプシンB，Lに比較しカテプシン
HのRV形成に対する寄与は少ないものと考えられた．カテプシンLについては我々の知る限り
ヒト病的筋における検討は初めてと思われるが，−49−これらカテプシン群のなかで最も高反応，高活性を認めた．カテプシンLは最も強力なendo−

medvacuolesintheskeletalmuscle．AmJ

peptidaseの一つであり，Iiら1）のラット肝での局

2）KominamiE，IiK，etal：Activationofthe

在の検討からも主としてautophagyに関与してintramyofibralautophagiC−lysosomalsystem

いるものと考えられている．また，Kominamiら2）

inmusculardystrophy．AmJPathol127：461のplasmocidinducedmyopathyの報告も併せて−466，1987．

カテプシンL厄自己貪食のかなり初期に作用す

3）若山吉弘，武田Patho1122：193−198，1986．

篤ほか：Duchenne型筋ジスるとの考え方が妥当であるが，今回の我々の検トロフィー症生検筋のヌードマウスへの移植実索4）で少なくとも一部のRVを伴った筋症では，

験：再生筋組織のリソゾームプロテアーゼ活性完成されたRV中にもカテプシンLが存在すると含有量について． 厚生省「精神・神経疾患研ことが証明され，RV形成に深く関与することが究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の示唆された．このことの意義，作用機序の詳細に病態とその病因に関する研究 （杉田班）昭和62

ついてはさらに多数例の検索が必要である．

年度研究報告書，1987，pp176−178．
4）JimiT，Satoh Y，et al：Strongimmuno・文

献reactivityofcathepsinLatthesiteofrimmed

1）IiK，Hizawa K，etal：Abnormalincreases
Oflysosomalcysteinine proteinasesin rim−

−50−

VaCuOles in diseased muscles．Brain（inpress）．

4）Rimmedvacuolemyopathyにおける熟ショック
蛋白hsp72の局在
清 水 輝 夫＊
研究協力者

川

井

充＊

山

崎

峰

熟ショック蛋白（heatshockproteinHSP）は

雄＊

蓑

田

清

次＊＊

熟あるいはそのほかの様々なストレスによって多免疫組織化学：Methacarnで固定したパラフィ
ン包埋切片あるいはmethacarnで固定した凍結量に発現してくる一群の蛋白で，細菌から哺乳類

切片を，PAP法で染色．

にいたるまで広汎な生物種に高い相同性をもって免疫電顕：0．5％グルタールアルデヒド，2．0％パ

みられることが知られている．HSPは分子量によ

ラフォルムアルデヒドで固定した組織をMicro−ってhsp60，hsp70，hsp90などいくつかのグループ

Slicerで60pmに薄切．10nm金コロイド標識2次にわけられている．hsp70にはhsp72，hsp73，

抗体を用いたpreembedding法により標識を行った．

grp75，grp78などが含まれているが，これまでこれらの蛋白のmuscle pathologyにおける役割は殆ど検討されていない．われわれはヒトhsp72に対する特異的抗体が骨格筋1ysosomeが異常蓄積しているrimmedvacuoleに多量に集積していることを兄いだし，その病理学的意義について考察する．
対象および方法
対象：Rimmed vacuole型遠位性ミオパシー（RVDM）4例，糖原病2型（GSD2）1例，対照として病理学的に異常を認めない2例の生検筋．
抗体：ヒトhsp72recombinantproteinに対してウサギを免疫して作製したアフイニティ精製抗体．

詔一漸

本抗体は2次元電気泳動イムノ70ロッティングで
hsp72を特異的に認識しhsp73との交叉反応はみられない．
イムノブロッティング：10％SDS−PAGEを
nitrocellulose膜にtransferL，PAP法で標識した．

12
図1抗hsp72抗体によるイムノブロッティング＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊東京大学医学部第三内科

1．対照例，2．RVDM症例−51−

図2 抗hsp72抗体による免疫染色，凍結切片
上．RVDM症例，下．GSD2症例
結に染色され，また核の部分に強い標識がみられた．

果イムノブロッティング：抗hsp72抗体はRVDM，
GSD2，対照例いずれにおいても分子量72のバンドを認識した（図1）．
免疫組織化学：対照例では筋線経は弱くほぼ均一

筋周膜の動脈平滑筋は強く標識された．RVDM
では萎縮したrimmedvacuoleを持つ筋線経に強い標識がみられ，特にrimmedvacuoleが染色過程で流出しなかった標本では，rimmed vacuole

−52−

図3

杭hsp72抗体による免疫電顕
rimmed vacuoleの部分が標識されている．

の部分に強い標識がみられた（図2A）．GSD2においてもRVDM同様rimmed vacuoleの部分に強い標識が得られた（図2B）．

釈困難なものではないと考えられる．

免疫電鉄：Lysosomeと考えられるmyeloid

vacuoleをもつ萎縮した筋線経の特にrimmed

bodyの部分が強く標識された．大多数のmyeloid
bodyは染色の過程で流出してしまったため，金コロイドの標識は1ysosomeの内部であるか外部であるかの確認はできなかった．筋原線経，RVDMの細胞質線雄性封入体は標識されなかった（図vacuoleの部分に多量に存在することがわかった．

3）．

1ysosomeであり，hsp72のrimmedvacuoleへの考はこれまでの知見にてらしあわせてもそれほど解第2にhsp72はRVDMにおいて，rimmed

この所見はRVDMだけではなく，GSD2にも同様にみられ，筋のrimmedvacuoledegenerationに普遍的にみられる現象であることが推定される．
rimmed vacuoleは筋線維内に異常集積した
集積は，hsp72がlysosomeにおける物質の代謝，
特に蛋白分解に何等かの役割を果していることを察

本研究で第1に示されたことは，hsp72が正常筋においても常時発現していることである．従来示唆するものである．

hsp73は構成的に発現しているのに対して，hsp72

現してくる主要な蛋白であることはわかっている

hsp72は熟ショックなどのストレスで大量に発は構成的には殆ど発現しておらず，熟ショックな

ものの，その機能については殆ど知られていない．

どのストレスで大量に発現するといわれていた1）．

hsp70familyの機能としてこれまでに，1）細胞しかし平滑筋や骨格筋のようにたえず力学的な緊

骨格のrearrangement2），2）coated vesicleの張にさらされている細胞では，ある意味では常に

uncoating3），3）リポゾームのassembly4），4）
蛋白のオルガネラ膜通過を助ける5）6）などが知らストレス状態にあるということもでき，この事実−53−

れている．特に4）については，hsp73がATPの

Shockproteinsarestructurallyandfunction・

存在下において蛋白のlysosome内への移動を助

ally related to the uncoating protein that

け，蛋白分解を促進することが知られており7），hsp72にも同様の機能が推定される．

releases clathrin triskelia from coateduesides．EMBOJ4：3385，1985．
4）WelchWJandFeramiscoJR：JBioIChem

結論

259：1493，1984．

hsp72はrimmed vacuoleの部分に多量に存在する．hsp72はrimmedvacuoleのみられる筋変性においてhsp72が変性蛋白のlysosome内への移行に重要な役割を果していることを示唆するものである．

5）DeshaiesRJ，KochBD，Werner−Washburne
M，CraigEAandSchekmanR‥Asubfamily

Ofstress proteinfacilitates translocation of
SeCretary and mitochondrial precursor
polypeptides．Nature332：880，1988．
6）Chirico WJ，Waters G and BlobelG：70K

文

献

heatshockrelatedproteinsstimulateprotein1）LindquistS：Theheatshockresponse．Ann
Rev Biochem55：1151，1986．

translocationinto microsomes．Nature332：
805，1988．

2）NapolitanoEW，PachterJSandLiem KH：
Intracellular distribution of mammalian
StreSSprOteins・Effect．ofcytoskeletalagents．
J BioIChem262：1493，1987．

7）ChiangHL，TerleckySR，PlantCPandDice
JF：A role for a70−kilodalton heat shockproteininlysosomaldegradationofintracel＿

1ularproteins．Science246：382，1989．

3）UngewickellE：The70，KDmammalianheat−54−5）感性高熱，セントラルコア病などの骨格筋
ライアノジンレセプター異常
高 木 昭 夫＊
研究協力者

小

島
荒 木

進＊ 竹 村 玲 子＊＊ 井誠＊＊ 埜 中 征 哉＊＊＊

田

雅

祥＊

は じめに

対象及び方法Ryanodinereceptor蛋白は筋小胞体のCa2＋遊

対象は，悪性高熱5例，悪性症候群2例，熱中症1例，セントラルコア病5例，マルチコア病2例，ヒト正常対照3例である．いずれのもー80℃

離チャンネルを構成している1）2）．常染色体性優性遺伝を示す悪性高熱において，その責任遺伝子は第19染色体長腕（19q13．1）にあり，ryanOdine
receptorの遺伝子と同一であると推定された3）4）．
すなわちryanodine receptor遺伝子の突然変異
が悪性高熱の原因である可能性が指摘された4）．
また悪性高熱感受性のある豚において，ryanodine receptorのtrypsin消化によるpep−tide mapが正常豚のpatternと異なること5），その遺伝子異常がSingle point mutationであることが報告された6）．しかしヒト悪性高熱のに保有されていた検体である．また悪性高熱と悪性症候群例はskinned fiber法により確定診断した例である．
方法は1979年にYoung＆Kuharらが開発した
in viiYDlabeling 法に準じた10）．その詳細は昨年の本会議報告書で報告した8）．
その概要は6〃mのクリオスタット切片を風乾後，0．1％form−aldehydeinPBS（pH7．4）で10分間弱固定した．次に緩衝液A（20mM TrisHCl

検cryostat標本に in viiYVlabeling 法によるpH7．0，25JLM CaC12，4mM ATP，0．1MKCl）で4℃，10分間 preincubationした．その後100JLMの［3H］Ryanodine（Du Pont−New
England Nuclear）を緩衝液A中で90分間incu−
bateした．上記条件は昨年度の基礎的検討に依った．
オートラジオグラフィー（ARG）は，incubation
後のスライドグラスを乳剤（サクラNR−M2）中autoradiographyを応用し悪性高熱でその量的異へdipした後，暗箱中で4℃，4週間の露出後に現常が存在する可能性を指摘した8）9）．今回は症例数像定着した．後染色はHematoxylin＆Eosin染を増やして検討すると共にセントラルコア病，そ色を用いた．もしくは，後染色をせずに暗視野下の類縁疾患であるマルチコア病などで検討するこで観察した．

ryanodinereceptor異常の詳細はまだ明かでない．
一方，悪性高熱を合併しやすいことが知られているセントラルコア痛でやはりこのryanodine
receptor遺伝子異常が推定され，本症は悪性高熱のallelicdisorderである可能性が示唆された7）．
我々は昨年度の本班会議において，ヒトryanodinereceptor異常を検討する目的で，筋生とができたので報告する．

ARGにおいて銀粒子の密度を1標本上で無作為に30箇所選び計測し，各々計測部位とスライド＊虎の門病院神経内科＊＊沖中記念成人病研究所＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所

長軸に対し直角線上（スライドグラスの短軸上）の点でのbackground activityと比較した．
−55−

統計学的手法はWilcoxon testを用いた．
結果Autoradiography（ARG）上，筋線経に一致して銀粒子がみられた（図1）．赤筋と自筋，正常の筋線経と萎縮，肥大線経などの間に銀粒子の分布の差はなかった．
悪性高熱，悪性症候群，セントラルコア病，マルチコア病各々において疾患特異的な銀粒子の分
布異常は認められなかった個2，3）．コアの部
分においては若干銀粒子密度が低下しているコアもあったか，低下が認められないコアも存在した（図4）．各々StruCtured coreとunstructured
coreに相当すると考えられた．
半定量的検討では，悪性高熱では正常対象と比べ有意に銀粒子の密度が減少していた（P＝0．025）．セントラルコア病では正常対照と比較し有意差を認めなかった．そのほか症例数が少ない
ので統計学的検討はできないが悪性症候群では3例仝例で低下，熱中症1例でも低下を認めた．マ
ルコチア病では2例中1例では低下していた（図5，表）．
考察

今回の検討で，昨年度の報告を概ね再確認できた．ARG上の銀粒子（ryanodinereceptor）の分
図2

セントラルコア病．上段：NADH−TR
染色，×400，中段：HEで後染色した
ARG，×400，下段：暗視野下でのARG，×200．コアの部分の鋭粒子密度は少ない様にもみえるが一定していない．

布の異常は今回検索した疾患では認められなかっ
たが，量的異常の存在が示唆された．
ARGでの定量的検査は本報告で用いた乳剤をスライドグラスにdipする方法（dipping法）より
図1［3H］ryanodineを用いたautoradiogra−phy（ARG）．正常対照例．暗視野下で観察．筋線経に一敦して銀粒子がみられる．
typel，2線推共に同密度である．

もフイルムをスライドグラスに張り付ける方法（stripping法）が適している11）12）．今回はそこで乳剤の厚さによる誤差を少なくするため，スライドグラスの長軸に垂直な線上で各々のbackground
−56−

図3

悪性高熱例における［3H］ryanodine
ARG，×100．

時に分布異常を認めない．

図5

マルチコア病．上段：NADH−TR染
色×400．下段：HEで後染色した
ARGx400．やはり銀粒子とコアの部分との間に一定の関連を認めない．

表 Autoradiographにおけるsilver grainsの計測．
対象患者

正常

個／55×55JJm2（M±SD）

61±2（55〜67）

セントラルコア病
マルチコア病59±9
54．461

悪性高熱
悪性症候群
熱中症

48±2
431，501．421
421

P＝0．025Wik〕OXOnteSt

各標本で無作為に30箇所をcountした．
図4

セントラルコア病．上段：NADH−TR
染色を暗視野下で観察．×200．
コアの部分は鋭粒子密度が低下しているとは必ずしも言えない．

3Hは低エネルギーであり約1ヶ月間の感光をていても像的に差がでる可能性のあること，切片の厚さによりKd値が異なる可能性などが指摘されており，定量化にはより高エネルギーの核種が適しているとも言われている11）12）

必要とすること，組織内に同じ放射線活性を持っ今回は切片の厚さを6／Jmで施行したことや（前activityも計測した．

−57−

年度報告書で6／Jmとなっているのは10J mの誤りです．ここに訂正お詫びいたします．），Stan−
dardを置いてないことから昨年の結果と絶対値の比較はできないが，2回のSeriesにおいて少な
くとも悪性高熱例は鋭粒子が量的に減少している
結果が得られたことは意味のあることと考える．
現時点で悪性高熱のryanodine receptorの分子構造がどのように変化しているかについては判明していない．また豚の悪性高熱と同様のpoint
mutationがあるか否かについても報告がない．分子構造の異常が量的減少とどのように結びつくか
今後の検討が必要と思われる．

tionofthemalignanthyperthermiasuscepti・
bilitylocustohumanchromosome19q12−13．
2．Nature343：562，1990．
4）MacLennan・DH，Duff C，et al：Ryanodine
receptor geneis a candidate for predisposi・
tiontomalignanthyperthermia．Nature343：
559，1990．

5）Knudson CM，MickelsonJR，et al：Distinct
immunopeptide maps of the sarcoplasmic
reticulumCa2＋releasechannelinmalignant

hyperthermia．J BioIChem265：2421，1990．
6）FujiiJ，Othsu K，et al：Identification of amutationin porcine ryanodine receptor

ま

と

め

associated

1）悪性高熱，セントラルコア病などで［3H］
ryanodineを用いたautoradiographyを施行した．
2）悪性高熱，悪性症候群，熱中症，セントラル
コア病，マルチコア病の各々において疾患特有の分布異常は認められなかった．
3）銀粒子の半定量的検討では正常対照群に比較し悪性高熱では有意の減少（P＝0．025）が見られたがセントラルコア病では差を認めなかった．
悪性症候群3例，熱中症1例，マルチコア病
1例でも銀粒子密度の低下があった．
4）今後より厳密な定量的検討が必要と考える．

with malignant hyperthermia．

Science253：448，1991．
7）Kausch K，Grimm T，et al：Evidence forlinkage ofthe centralcore diseaselocusto
Chromosome19q．J NeuroI Sci98（suppl）：
549，1990．

8）高木昭夫，小島 進ほか：骨格筋ラアノジンレ
セプターのオートラジオグラフィー（ARG）．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト
ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成2年度研究報告書，
1991，pp45−50．

9）小島 進，高木昭夫ほか：悪性高熱，悪性症候群におけるライアノジンレセプター異常一生

追記：本稿脱稿後ヒトの悪性高熱の一家系で，豚と同じryanodine receptor遺伝子の一塩基置換が報告された（Gillard EF et al．Genomicsll，
751−755，1991）．

検骨格筋のオートラジオグラフィーによる検討．
麻酔と蘇生 27（別冊）：107，1991．
10）Young WS and Kuhar MJ：A new method
for receptor autoradiography，［3H］opioid

receptorsinrat brain．BrainResearch179：

文1）高木昭夫，小島献

255，1979．

進：悪性高熱研究の進歩．日

本臨淋48：197，1990．

11）重松和人：定量的invitroautoradiography法．
組織細胞化学1987｛日本組織細胞化学金瓶 学

2）Takeshima H，Nishimura S，etal：Primary
StruCture and expression from complemen・

際企画，1987，p192．
12）服部隆則，細川洋平ほか：光顕オートラジオグ

tary DNA of skeletal muscle ryanodine

ラフィーの手技と応用． 組級細胞化学1991 日

receptor．Nature339：439，1989．

本組織細胞化学会鼠 学際企画，1991，p54．

3）McCarthyTV，HealyJMS，etal：Localiza一−58−6）筋疾患の治療効果について−運動負荷試験によるAT（Anaerobic
Threshold）の検討−
田 代 邦 雄＊研究協力者

伊 藤 和 則＊ 牧 野

森 若 文 雄＊ 島

筋疾患に対して運動療法が種々の程度施行されているが患者個々の病状の差による運動強度が要求されるが，運動療法の効果を客観的に判定する
ことは比較的むずかしい．今回AT（anaerobic
threshold，嫌気性閉値）を指標として検討する．
ATは有気的，無気的代謝，緩衝作用の一連の変化に注目して，運動強度の増加に伴う乳酸の上昇，ガス交換変化の起こる直前の運動強度をATと定義した．ATの上昇が有気的代謝にもとづく運動能力が高いことを示し，また筋組織の酸化能力と関連が示唆されている．今回われわれは運動療

功 二＊＊＊

実験2 つぎに慢性進行性外眼筋麻痺を伴うミトコンドリア ミオバナー3症例の検討をした（表1）．CoQlO150mgを投与し，投与前と投与4週，8週，12週後のATを測定した．また61歳，
女性，18年間の罷病期間を有する多発性筋炎の症
例にたいして運動療法とステロイド療法の有効性についても検討した．
結

ミオパテ一，多発性筋炎のAT変化から運動能力改善等について検討
する．
方

果

実験1全被験者の運動強度は各々の初期評価時

法前後のAT変化を測定し，その妥当性を検討す
る．またミトコンドリア

均＊＊ 佐 藤 貴 一＊＊

法

表1 ミトコンドリア ミオバナーの症例
対象は年齢が45−55歳の女性2名，男性1名の3症例であり，3症例とも血液中のビルビン酸の上昇が見られ，症例1，2は共にCCOの低下が認められた．
年齢

実験1まず健常人8名（男性4名，女性4名）
20〜38歳（平均24．6±6．3）を対象として自転車エルゴメーター運動負荷を行い，初期AT測定後，7週間の期間，運動を継続した．頻度は週3回，各10分間とし，運動強度は100〜200％AT酸素摂取量でおこなった．初期ATを測定し，7週間後での比較をおこなった．

家族歴

症例1

症例2

45歳

51歳

＋

擢病期間

12年

10年

乳酸（ng／dり

12．2

10．3

0．7

0．8

3朋．5

250．2

270．8

258．＄

（9−16爪g／dりと●枇−ン酸く喝〟け（0．36／0．59ng／dl）
HADH cyt C R（78．卜170．8）
Succinate cyt C R（197．2−366．6）＊北海道大学医学部神経内科＊＊美唄労災病院リハビリテーション科＊＊＊国立療養所札幌甫病院神経内科

Cyt C Oxidase（144．7−355．6）

ー59−

93．211122．21

症例3

表2

上長李は）
aI

15

ATの結果
症例1，2共にCoQlO投与前に比較して8週，12週後は有意にATの上昇が見られた．症例3は投与前値が測定出来なかったので比較できないが，健常人と比較しても高い値を示し，CoQlOの効果が予
想された．

10

5

0

図1AT酸素摂取量と運動強度の関係
200％の運動負荷をかけた症例のAT酸
素摂取量が23％と最も高い上昇率を示したが，100％の運動強度ではAT酸素摂取量の変化は，認められなかった．

症例4（多発†生筋炎）
年齢 61歳 女†生
花病期Ⅶ 18年のAT酸素摂取量の100−200％の間にあった（図1）．運動プログラム終了時のAT酸素摂取量は200％の運動強度で施行した2例が23％と最も高い上昇率を示し，100％の運動強度を与えた例では変化がなかった．上位4名による平均上昇率は19．5％（165．3％AT酸素摂取量）であり，下位4名による平均上昇率は8．5％（114．7％AT酸素摂取量）であった．
また行った運動強度とAT酸素摂取量の上昇

RT：川．」相l一一一
図2率の間にはr＝0．86と高い相関があった．運動強度の違いによる運動療法の訓練効果を客観的に評価可能であった．
実験2 症例1，2はCoQlO投与前のATは16．71ml／kg／m，15．73ml／kg／mと健常人の正常下限ないし，低下が認められた（表2）．症例3は投与前のATを測定していなかった．症例1，2ともに8週後以後のATは投与前と比較すると有意に上昇していた．臨床症状特に外眼筋麻痺，
限瞼下垂の症状改善はみられなかったが，持久力，易疲労感の改善が見られた．症例3は4週，12週
後のATは20．46，20．88ml／kg／mと健常人と比較しても高い値をとり，CoQlOの効果が予想された．
多発性筋炎の症例はCKが1000−950IU／1を推移するため，ステロイドを投与し，CKが100−200。蕊

月丁：15．糾■18

多発性筋炎の経過
CK値が900IU／1前後を推移していたが，プレドニンを使用することで100〜200代まで改善した．この時点でATを測定した．ATは14．40mi／kg／mであり，50ワッ
トの運動負荷をかけて運動療法を施行した．運動開始20週後ATは15．04と上昇は認められなかったが，CKの上昇はなく経過した．

IU／1まで低下した時点で運動療法を開始した（図2）．運動開始時点のATは14．40mi／kg／mであり，年齢を考慮しても低下していた．
運動プログラムとして50ワットの負荷量を基準として20週間運動を継続した．20週後のATは15．04ml／kg／mとやや上昇したが有意の差は認めなかった．しかしCKの上昇は認めず，また運動能力特に腰肢帯筋の脱力の改善が見られた．
考察
Wassermannは有気的代謝，無気的代謝，緩衝作用の一連の運動変化に注目し，漸増運動負荷に−60−

より，血中の乳酸の上昇に伴う代謝性アシドーシ
ス，それに伴うガス交換変化が起こる直前の運動強度ないしVO2（酸素摂取量）のレベルをATと定義した1）．測定法としてVE（分時換気量）一VO
2曲線の変移点，VO2−VCO2（二酸化炭素排出量）（Ⅴ−Slope法），VE−VO2曲線の変移点が使用．
ATはまた血中乳酸濃度や乳酸／ピルビン酸比が急激に増加する時点でのV02である．VO2
kineticsはATを境として変化する．AT以下の強度での一定負荷運動では運動開始から数分でV02は定常状態に到達するが，AT以上の運動強度では定常状態に到達するまでの時間の遅延が起こる．この現象を利用してV02の増加の程度を指標としてATを判定可能である2）．
乳酸の蓄積により生じた代謝性アシドーシスの為に，換気ドライブが刺激される．AT以上の強度
で運動を持続した時はVEは呼吸数の増加として代償する3）．AT以下での運動強度では1時間以上も運動を持続可能である．ATは細胞代謝に関連している呼吸循環系の異常を鑑別診断する為に用いることができる．
われわれは今回健常人のATの変化を運動前後で比較し，運動効果の客観的評価をおこなったが，酸素摂取量の増加，ATの上昇は運動強度と相関が認められた．また運動時間は1日10分でもAT以上の運動で体力の増進が可能であることが示唆された．運動中に活動筋に対する酸素供給が制限されるとATは低下する．ATは組織への酸素供給の変化に敏感で，主観的な努力感とは無関
係なので治療効果判定に使用できるのではないかと考え，ミトコンドリア ミオバナーとくにエネ

多発性筋炎は筋痛，近位筋優位の筋力低下，腿
反射低下等の症状が出現し，CK，アルドラーゼ，
GOT，GPT，LDHなどの筋肉由来の酵素の上昇が見られるが，経過が長く，筋力低下に対しての運動療法をどの程度が各症例に対して最も妥当かなどの疑問がある．筋肉組織の崩壊がある程度おさまった状態で運動療法を開始するのであるが，今回CKを指標としてATを測定し，心拍数を目安にし約50ワットの運動強度で運動療法を継続した．ATの上昇は見られなかったが，酸素摂取量の改善と心拍数の減少があり，運動療法の効果があった．長期間運動療法を継続することでCKの変化，筋脱力の進行がどのように推移するか今後の課題である．
結語

1．運動強度とAT上昇率について検許した．
2．運動強度（％AT酸素摂取量）とAT上昇率には相関が認められた．ATを測定することで運動療法施行前後での訓練効果の客観的評価が可能であった．
3．ミトコンドリア ミオバナーの3症例とも
CoQlOの投与にてAT，酸素摂取量の上昇が認められ，自覚症状と相関が見られ，薬剤効果判定の尺度として有効と思われた．
4．多発性筋炎の運動負荷量をATを基準としてAT以下の運動を継続することでCK等の上昇

ルギー代謝の障害にもとづく疾患にATを指標として運動能力の改善，症状の変化を観察した．
電子伝達系の障害による障害，とくにCCO（cyto−
chrome C oxidase）の低下がみられた症例にと筋脱力の改善に有用と思われた．
文
献1）Wasserman K，HansenJE，Sue DY andWhippBJ：Principlesofexercisetestingand
interpretation．Lea＆Febiger，1987．
2）Beaver WL，Wasserman K and Whipp BJ：
A new method for detecting anaerobic

CoQlOの150mgを授与した場合，血中のCoQlOの濃度が上昇し，自覚的に症状の改善が認められた

thresholdbygasexchange．JAppPhysio160：

が，客観的に捕られる指標がなかった．今回ATを指標として使用することでATの変化を時間と共にその推移を観察することで薬剤の効果が判定可能であった．

3）WassermanK：Dypneaonexertion：Isitthe−61−

2020−2027，1986．

heart or thelung？．JAMA248：2039−2045，
1982．

7）ダントロレンナトリウムによる筋ジストロフィー
治療の試み−1年問の臨床経験−
木

研究協力者

梶

村

龍 兄＊ 秋

淳＊

口

一

郎＊

濱

野

利

明＊

／

要

約

筋ジストロフィー患者において血清CK値を低度を投与前1年間とレトロスペクティブに比較した．

下させる効果のあるタントロレンナトリウムが，本症の進行を遅延させるのに有効であるか否かを調べるために，5名の患者において，本剤（0．5〜1mg／kg体重）を授与しながら，臨床症状を1年以上追跡した．この間の症状の進行度を投与
前1年間とレトロスペクテイブに比較したところ，前1年間で進行が5例中2例で見られたのに対し，後1年間では進行は見られなかった．例数が少な
く，統計的解析も不可能であるが，今後さらに治験を試みる価値があるものと思われた．
は じめに
筋ジストロフィーにおける筋組織の破壊には細胞体内へのカルシウムの異常な流入が関与していることが指摘されているl）．近年，筋小胞体膜を安定化させる作用のあるタントロレンナトリウムがmdxマウスまたはDuchenne型筋ジストロフィーで血清CK値を低下させるとの報告がなされて
おり2）3），我々も同様の結果を他のジストロフィー
において得た4）．
今回我々は，タントロレンナトリウムが，実際に筋ジストロフィー患者において症状の進行を遅延させる効果があるか否かを調べるために，5名の患者で臨床症状を1年以上追跡し，症状の進行＊京都大学医学部神経内科

方法

19〜39歳の男性2名，女性3名で，筋生検および筋電図で確診のついたFSH型2例，およびLimb−Girdle（LG）型3例において，投与前1年間の臨床症状の変化を患者の申告により現時点で評価し，投与後1年間の症状の変化と比較した．
評価法は，平成元年度厚生省「筋ジストロフィー症の遺伝・疫学・臨床および治療開発に関する研究」報告書5）にもとづいた簡易機能評価スケー
ルを用いた．患者の記憶がさだかでない項目は除外した．
タントロレンナトリウムは経口にて25−50mg／日（0．56−0．91mg／kg体重）を1回〜2回にわけて投与した．
結果
各例のまとめを表に示す．
前年度に報告した様に症例1−4では，血清CK値の変動はタントロレンナトリウム投与量と逆の相関が見られ，本剤が血清CK値を低下させている可能性が示唆された4）．
FSH型2例（症例3，4）では，投与前後各1年間で上肢機能区分における評点に変化は見られなかった．LG型の症例1において，前1年間で障害度区分2a，階段昇降可（片手手すり）の評価−62−

のと考えられた．またタントロレンナトリウムの表作用機序からは脱力が起こりADLの悪化をきた
Case age／SeX Dose／BW lyrBEFORElyrAFTER（mg九g）

すことも考えられたが，本研究で用いた用量（＜

1LG

1mg／kg体重）では，全く問題にならなかった．

19M O．91

lV：2a：atOb NoChange

2L−G

39M O．90

1l：1：b to c NoChange

3

FSH

21F O．56

NoChange NoChange

4

FSH

34F O．96

NoChange NoChange

5LG

24F O．61

StudylncompTet8

文献1）Tumer LFG，Westwood T，et al：Increased
protein degradation results from elevatedfreecalciumlevelsfoundinmusclefrOmmdx
mouse．Nature335：735−738，1988．

がaからbへ進行したが，後1年間ではそれ以上の進行は見られていない．同じくL−G型の症例2では前1年間に動作区分一起立動作で手を使わずにできたもの（b）が，できなくなった（C）が，投与開始後1年間では変化を見なかった．
副作用としては，症例1で約1ヶ月，症例4で約1週間続いた一過性の脱力感があったほか，症
例5で軽度の肝機能障害が疑われたが，筋由来の血清酵素と重複していたため判定が困難であった．

2）QuinlainJG，Johnson SR，et al：Dantrolene
normalizes serum creatinine kinasein mdx

mouse．Muscle Nerve13：268−269，1990．
3）BertoriniTE，PalmieriGMA，etal：Effectof
dantroleneinDuchennemusculardystrophy．
Muscle Nerve14：503−507，1991．
4）木村 淳，梶 寵兄：筋ジストロフィー症におけるDantrolene Sodiumの血清CPK値に及ぼす影響． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」
筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法

考察
本研究はレトロスペクティブな聞き取り調査で，プラセポ効果が否定できず，また症例数も少なく統計的に結論を出すことはできない．しかし，その効果に否定的なデータは得られず，少なくとも今後より多くの施設で治験を行なう価値があるも−63−

開発に関する研究 （荒木旺）平成2年度研究報
告書，1991，pp43−44．
5）井形昭弘，福永秀敏ほか：筋ジストロフィー症
患者のデータベースの活用（3）．厚生省「筋ジストロフィー症の遺伝，疫学，臨床および治療開発に関する研究」報告書．pp251−265．

ⅠⅠ．ジストロフィン（No．1）

8）Becker型筋ジストロフィー3例の分子遺伝学的，免疫学的検討．
斎 藤 加代子＊
＊

■

＊

二

美郎

時銭

中沢

池小

ナ

＊

〃肘

鋸隆

内田

山．原

＊

代

子弓夫

妃真幸

＊

谷島山

地三福

研究協力者

は じめに

ち，ジャンプは可能であり，また下肢の仮性肥大がDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）とBecker型筋ジストロフィー（BMD）は共にジス
トロフィン遺伝子の異常により生じる疾患である認められる．血清CKは2593mU／ml，IQは正常．
症例2 現在18歳の男子．母方の祖父が10歳頃

が1），BMDではDMDと比較して，家系により臨床症状が大きく異なっていることが知られている．
これは変異したジストロフィン遺伝子によって，それぞれ異なった異常タンパクが作られるため，多彩な症状が出現するものと考えられる．今回
我々は，臨床的にBMDと診断された3男児例について，リンパ球由来DNAにおけるジストロフ
ィン遺伝子の欠矢の解析と生検筋の免疫学的検討を行った．遺伝子の異常とタンパクの異常について，臨床症状と比較して報告する．
対象及び方法
1．症例
東京女子医大病院小児科外来通院中で，臨床的にBMDと診断された3例を対象とした．図1にそれぞれの臨床像を簡単に示した．
症例1現在7歳の男児．家族歴に特記すべき事はなく，運動発達もほぼ正常のパターンを示した．2歳すぎより風邪などで発熟した時，下肢の筋肉痛を訴えて歩けなくなるエピソードが繰り返し見られ，4歳頃からは運動後にも下肢痛が出現から歩行障害が出現し，50歳頃までは杖を使って歩いていたが，58歳から歩行不能になった．患者の運動発達に特に遅れはなかったが，立ち上がる
時につかまって立ち，また他の子供達に比べ走るのが遅く，運動が苦手だった．4歳下の弟も同様に運動が不得意だが，二人とも筋肉痛を訴えたことはない．普通高校3年生に在学しており，IQは正常．両足跳び，片足立ちは可能で，下腿に仮性肥大を認める．患者の血清CKは3477mU／ml．
症例3 現在8歳の男児．家族歴に特記すべきことなし．座位獲得まではほぼ正常の運動発達を示したが，歩行開始が遅れ，転びやすい児であった．4歳すぎから，運動後に下肢の痛みを訴えるようになった．下肢に著しい全身の仮性肥大があり，両足跳びは可能だが，片足跳びはできない．
IQ50と遅れがあり，血清CKは17160mU／mlと著明に上昇していた．
2．免疫学的検討
どストロフィンのCDNA2）に基づく5種類のアミノ酸を用いて，ウサギで作成した4種のポリク
ローナル抗体（POO，PO4，P23，P34）と，マしている．ごく軽度の筋力低下があるが，片足立

ウスで作成された2種のモノクローナル抗体（2．5E2，4C5−富士レビオ株式会社より）を使用して＊東京女子医科大学小児科＝国立精神・神経センター神経研究所機能研究部（図2），間接蛍光抗体法による免疫組織染色とイ
ノムプロットを行った3）．
−67−

C a s e l

Cli ni c aI Pi cl u r e

li81

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Ty

8y

図1症例1−3の臨床像

3．分子遺伝学的検討

結リンパ球より高分子DNAを抽出し，ジストロフィンCDNAをプローブとしたサザンプロット

果

1．免疫学的検討と，Chamberlainら4）及びBeggsら5）の報告に基

症例1における免疫組織染色では，ポリクローナル抗体P23を除き，細胞膜が染色されたが，染づいて作成したプライマーをもちいたPCRを行った．

色性は低下していて，不連続的に染色された（図3A）．P23は筋細胞膜とまったく反応しなかっー68−

POO PO4

4C5

2，5E2

図2

免疫学的検討に使用した抗体
ジストロフィンンタンンバク模式図の上側にポリクローナル抗体の位置，下側にモノクローナル抗体の位置を示した．

た．ポリクローナル抗体を用いたイムノブロット
では，P23を除く3種の抗体でおよそ370kDaの，正常のジストロフィンより分子量の小さなバンド

子量の小さなバンドが強く検出された．抗体P04
は，患児の筋と反応しなかった（図3C）．
2．分子遺伝学的検討がやや淡く検出された．

CDNAプローブを用いたサザンプロットと，

症例2では，全ての抗体がBMDに特徴的とさ

BeggsらおよびChamberlainらの報告に基づいれる筋細胞膜の不連続染色パターンを示した（図3B）．患者の弟も同じ染色所見を示した．イムノて作成したプライマーを用いたPCRの両者で，
症例1ではexon45から49，症例2ではexon45か

ブロットでは，全てのポリクローナル抗体で正常

ら47の，いずれもin−frameの欠夫が検出されたよりわずかに分子量の小さいバンドが淡く検出さ（図4）．また，症例3においては，サザンプロッ

れた．

トでexonlOから37の広範囲の欠矢が見られた．こ

症例3では，P04を除くすべての抗体で筋細胞の例については，欠矢をもつDNAがそのまま膜は連続的に均一に染色された．ポリクローナル

mRNAに転写されていて，スプライシングは正抗体を用いたイムノブロットで，約260kDaの分常に保たれていることが，eXOn9とexon38の中にA p。。2．5E2P。。

4C5tP3。

藍
−69−

8
〇、

つここ；C

まC5．Pく。

三二．￣‖￣￣￣二・三
十二一十二

C

図3

P

C

P

C

P

C

P

症例1−3の免疫学的検討
A：症例1の免疫組織染色とHE染色（最下段左側）及びGomori−Trichrome染色（最下段右側）．P23を除き，筋細胞膜が淡く染色されている．
B：症例2の免疫組織染色とHE染色（最下段左側）及びGomorirTrichrome染色（最下段右側）．全ての抗体が筋細胞膜を淡く染色している．
C：症例3のポリクローナル抗体での免疫組織染色とイムノブロット．P04は筋と反応しな
い．イムノブロットのPは患者，Cはコントロール．

−70−

exon

「

44

「

45

47

［

［

「

48

「

50

「

Beggsらは異常ジストロフィンを持つ68例の「検討により，遺伝子と臨床的重症度との関係を示
し，Englandらの例やそのほかの例から三重螺旋構造ドメインの欠夫は，大きくても臨床的な影響は少ないとのべた8）．しかし，Arahataら7），Ohtaniら10）は我々の症例3と同じように重症の経過をとっている例を報告しており，我国においてはこの部位の大きな欠夫をもつ重症BMDの存在が確

MC12

C12

C12

C12

C12M

認されている．また，共に三重螺旋構造ドメイン

C：contro】の後半に小さなin−frameのDNA欠矢をもつ症

1：caSe1
2：caSe2
M：≠17車HaPⅢmark（汀図4

例1と2の臨床症状を比較すると，症例1は筋肉痛を主訴とし，症例2は筋肉痛がなかった．しか

症例1，2のPCR

も症例2の欠夫は症例1の欠矢に含まれる形にな

Chamberlainら及びBeggsらの報告に基づいて作成したプライマーを用いて，exon44から50における欠尖の有無について調べた．症例1においてはexon44とexon50は存在していることが確認され，症例2の欠夫はexon45からexon47であることが示された．

っている．この相違が筋肉痛の有無に直接関係があるかどうかはまだ不明であるが，興味深い2例
であり，さらに症例を増やして検討したい。さらに，図5に示した報告例3例と症例3ではジスト
ロフィンの発現量は保たれていたが，症例1と2では減少していた．
筋ジストロフィーの臨床症状は変異DNAから作成したプライマーを用いて行った，筋mRNA作られるタンパクの量と機能により決定されるとのPCRにより確認されている6）．

考えられている．ジストロフィンの機能解明のた
めには，BMDの臨床症状をDNAやタンパクの考案

ジストロフィン遺伝子の異常と，それによって異常と比較検討していくことが重要であると考えた．

生じる異常タンパクが，BMDの臨床症状とどの様な関係にあるのかを知るために，複数の抗体を結用いた免疫学的検討と，分子遺伝学的検討とが，語

1．BMD3例について，ジストロフィン遺伝子と共に行われているBMDの報告例についてまとタンパクについて調べ，臨床症状と比較した．

め7ト10），図5に示した．いずれの例においても，遺2．筋痛を主訴とした症例1では，eXOn45〜49の伝子の欠矢が抗体の作成に用いられたアミノ酸部

in←frameの欠夫と分子量およそ370kDaの異位を含んでいる場合，その抗体は生検筋と反応し常ジストロフィンを認め，その発現量は減少しない．その部位特異性の高さは，小さな欠矢を持ていた．筋痛の訴えのなかった症例2では，つ症例1と2のP23に対する反応性の差としてよ

exon45〜47のinbframeの欠夫があり，ジスト

く示されている．すなわち，P23はexon48の3′端からexon50の5′端までの配列を元に合成された

ロフィン発現量の減少を認めた．臨床症状の重い症例3では，eXOnlO〜37の大きなinLframe

アミノ酸に対する抗体であるから，eXOn45から49の欠夫と約260kDaの分子量の小さい異常ジスの欠夫を持つ症例1とは反応せず，eXOn45から47

トロフィンを認めたが，発現量は正常であった．

の欠夫を持つ症例2とは反応した．数多くの抗体

3．ジストロフィンの機能解明のためには，BMDについて検討することで，遺伝子の欠失部位の特の臨床症状とDNAやタンパクの異常との比較検討が重要であると考えた．

定がある程度可能になると思われる．
−71−

腑P−I腑一Il

脚−lV

町4／6D3

POO PO4

乙5E2

P23

60kD8

P34

30kDa

4C5

1壷

s孟8r。由）
cramps／叩algia±■8aklⅦSS

÷頂面÷

high C托lrahata＆馳ggs8t al．sevorO Blの
E咽Iand Ot al．

M）

Ohtani et al．

S8V8re BND

Pres￠nt CaS01

町alg柑†Te血ssCaS82■eakness

CaS03

S8Ver8凶の叫algia

図5

十十BMD筋組織の免疫学的反応，遺伝子欠矢と臨床像との関係
図の上より抗体の位置，Beggsらの示した遺伝子欠夫と臨床像との関係8㌧報告例における臨床像と免疫学的反応との関係7卜10），今回我々の症例における臨床像と免疫学的反応との関係を示した．図の塗り潰した部分は遺伝子欠矢を，＋．−，±はそれぞれ抗体の組織との反応性を
表わす．

文

献

6）Ikeya K，Saito K，Hayashi K，et al：1）Hoffman EP and KunkelLM：Dystrophin

Moleculargeneticandimmunologicalanaly−

abnormalitiesinDuchenne／Beckermuscular

Sisofdystrophinofa youngpatientwith X

dystrophy．Neuron2：1019qlO29，1989．

−linkedmusculardystrophy．AmJMedGenet

2）KoenigM，MonacoAPandKunkelLM：The（in press）

COmplete sequence ofdystrophin predicts a7）Arahata K，Beggs AH，Honda H，et al：

rodshapedcytoskeletalprotein．Cel153：219

PreservationoftheC−terminusofdystrophin−228，1988．

moleculeintheskeletalmusclefromBecker3）ArahataK，HoffmanEP，KunkelLM，etal：

musculardystrophy．JNeuroIScilOl：148−
156，1991．

Dystrophin diagnosis：COmparison of dys・
trophinabnormalitiesbyimmunofluorescent8）BeggsAH，HoffmanEP，SnyderJR，etal：

andimmunoblotanalysis．ProsNatlAcadSci

Exploringthemolecularbasisforvariability

USA86：7154−7158，1989．

amongpatientswithBeckermusculardystro・
phy：dystrophingeneandproteinstudies．Am

4）ChamberlainJS，GibbsRA，RanierJE，etal：

J Hum Gene49：54−67，1991．

Deletion screenlng Of Duchenne muscular
dystrophylocusviamultiplexDNAamplifi−9）EnglandSB，NicoIsonLVB，JohnsonMA，et

Cation．NucleicacidsRes16：11141−11156，

al：Verymildmusculardystrophyassociated1988．

with the deletion of5）Beggs AH，Koenig M，Boyce FM，et al：
Detection of98％of DMD／BMD deletions
by PCR．Hum Genet86：45−48，1990．

46％

of dystrophin．

Nature343：180−182，1990．
10）OhtaniH：perSOnalcommunication．

−72−9）ジストロフィン遺伝子欠矢を伴い，運動時筋痛，
高CK血症を呈した症例
後 藤 幾 生＊
研究協力者

波多江 智 子＊ 山 田
塚 本 浩 子＊＊ 内 野

は じめにジストロフィン遺伝子の異常は一般にDuchen−ne型またはBecker型筋ジストロフィーをきたすと考えられている1）．今回われわれはジストロ
フィン遺伝子の欠夫を認めるが，臨床上明らかな筋力低下はなく，運動時筋痛，俳腹筋仮性肥大，
翼状眉甲，高CK血症を呈した非進行性ミオバナ
ーの男性例を経験したので報告し，病態について
考察する．
症

例

症例：30歳，男性（NM900956）
主訴：運動時筋痛
家族歴：血族結婚なく，家族内に同様の症状の者はいない．
現病歴：小学生の頃より800m程走ると下肢に筋痛が生じ走れなくなっていた．日常生活動作では筋痛は生じず支障なかった．1990年1月，スキーを一日行なったところ，全身の筋痛，褐色尿が生じたが数日で軽快した．同年7月，動惇のため循
環器内科受診．一過性心房細動を指摘されたが，器質的心疾患は認められなかった．その際，高CK血症を指摘され精査のため，8月当科入院となった．
入院時現症：一般内科的に異常なし．神経学的には肪腹筋仮性肥大，異状肩甲を認める以外，筋力

猛＊ 小
誠＊＊＊

林

卓

郎＊

低下等なく，特に異常なかった．
検査所見：血液生化学的所見ではCKllO5（MM96％）IU／L（正常：60−160）aldolase9．3IU／L（正常：1．7〜5．7）ミオグロビン110mg／ml（正常：60以下）と上昇していた．LDHは460IU／Lと正常でisozymeの欠損はなかった．阻血下運動負荷試
験で血中乳酪 ビルビン酸は正常に増加した．60
時間絶食試験で血中CKの上昇はなかった．心電図，心エコー所見に異常なし．針筋電図では上下肢筋にshortduration，lowamplitudeMUPを認め，筋原性変化を示した．
左上腕二頭筋生検所見：H．E．染色では，筋線経の大小不同，中心核の増加，fiber、splittingがみられた．筋線経の貪食，▼壊死，再生像はみられな
かった．ATPase染色でtypegrouping，grOuped
atrophyは認めなかった．グリコーゲン，脂質の蓄積，ragged−redfiberは認めなかった．3種の抗ジストロフィン抗体2）（ジストロフィン蛋白アミノ酸配列407〜815に相当するペプチドを認識する
抗60KDa抗体，1181〜1388を認識する抗30KDa
抗体，3495〜3544を認識する抗ペプチドーⅠⅤ抗体）
による免疫組織化学的所見では筋膜はほぼ仝周性に染色されたが，染色性は低下していた．同じ抗体による生検筋のWeStern blotでは患者ジスト
ロフィンはミオシンheavychainに比較して明らかに含量が減少しているが，分子量の異常は明らかでなかった（図1）．ジストロフィン遺伝子の構＊九州大学医学部脳研神経内科＊＊大阪大学医学部小児科＊＊＊国立療養所再審荘病院神経内科

造異常をChamberlainら3）の方法によりPCR法
で末梢血白血球のDNAを増幅して検索したとこ
−73−

C

P

図2

PCR法で増幅したDNAの電気泳動パ
ターン
図中a〜iはChamberlainらの報告したDNAの断片でそれぞれジストロフィン遺伝子のexon8，17，19，44，45，
48，12，51，4に相当する．
MW：HincII digested￠Ⅹ174DNA
molecular standard
lanel，2，3二患者DNA
lane4，5，6：正常対照DNA

図1生検筋のwestern blot
生検筋をホモジュネートで可溶性分画をとりSDSゲル電気泳動後ニトロセルロース膜にプロットし，抗ジストロフィン
抗体（抗ペプチドⅠⅤ抗体）及びABC法で染色した．
C：正常コントロール

ストロフィン遺伝子の異常による臨床症状の多様性が報告されている．
Gospeら4）はジストロフィン遺伝子のexonlO

P：本症例

から22までの欠矢があり，分子量の小さい異常ジ
ストロフィンを認めるが，筋力低下はなく，筋痛，ろexon45を含む遺伝子の欠失を認めた（図2）．

筋cramp，膵腹筋仮性肥大，高CK血症のみを呈し，臨床的に筋ジストロフィーとは言い難い，Ⅹ考察

染色体劣性非進行性ミオバナーの家族例を報告し本例は運動時筋痛，排腹筋仮性肥大，異状肩甲，
高CK血症を呈した．運動時筋痛，高CK血症は，糖原病，脂質代謝異常による筋疾患でよくみられ，
特にMcArdle病，垂井病，CPT欠損症等を鑑別する必要がある．運動時筋痛はまたmyoadeny−late deaminase欠損症，typeII fiber predomi−nance，あるいは前角細胞又は末梢神経障害等でも認められる．本例は筋電図，筋生検所見 各種負荷試験の結果から以上の疾患は否定的と考えられた．
近年ジストロフィンの検索が盛んに行なわれジている．本例も欠失部位は異なるが，ジストロフ
ィン遺伝子の欠矢があり，筋生検所見は非特異的ミオバナーの所見のみで，臨床症状もGospeらの症例と非常に似ており，類似の疾患の弧発例と考えられた．
ジストロフィン遺伝子の欠夫の大きさや部位と臨床症状との関係は明らかではないが，本症例の欠失部位が含まれるジストロフィンのスペクトリ
ン様三重らせん構造の繰返しをcodeする部分に関して，この部分のinframeの欠夫では，細胞骨格蛋白等と結合しているであろうと考えられてい−74−

るジストロフィンのN末端，C末端が保たれるた

biopsy specimens from Duchenne muscular

め比較的正常機能に近いジストロフィンが生成さ

dystrophy and various neuromuscular dis−

れ，臨床上無症状例や軽症例が生ずる可能性が考えられている5）．

orders．Muscle Nerve12：1009，1989．
3）ChamberlainJS，GibbsRA，et al：Deletion

本例やGospeらの症例と同様に，筋力低下がな
く，筋痛と高CK血症のみを呈し，筋ジストロフ

screeningoftheDuchennemusculardystropy

ィーとしては非定型的な症例においても，エネル

Nucleic Acids Res16：11141，1988．

ギー代謝に異常がないような場合，ジストロフィ

locus via multiplex DNA amplification・4）Gospe

SM，Lazaro

RP，etal‥FamilialX−

ンの異常も鑑別診断として考慮する必要があるとlinkedmyalgia andcramps：A nonprogres・考えられた．

sivemyopathyassociatedwithadeletionin
the dystrophin gene．Neurology39：1277，

文

献

1989．

・1）Hoffman EP and Kunkel LM：Dystrophin
abnormalitiesin Duchenne／Becker muscu−

5）KoenigM，BeggsAH，etal：ThemolecularbasisforDuschenneversusBeckerMuscularlar dystrophy．Neuron 2：1019，1989．

dystrophy：COrrelationofseveritywithtype2）Uchino M，ArakiS，etal：Localization andofdeletion．AmJ HumGenet45：498，1989・

Characterization of dystrophinin muscle−75−10）Myotubular myopathyにおけるジストロフィン
発現の免疫学的検討

清 水 輝 夫＊
研究協力者

砂

田

芳

秀＊

金

は じめに
昨年度，先天性筋緊張性ジストロフィー（CMyD）の乳児症例では，骨格筋の成熟異常に伴うジストロフィンの発現遅延があることを報告した．正常な骨格筋の発達では，ミオシンの分化に先駆けてジストロフィンの発現がみられるのに対して，CMyDではジストロフィンの発現がミオシン分化よりも遅延していた．このようなジストロ澤回重症型3例を含む7例のmyotubular myopa−thy（MM）におけるジストロフィン発現を検討した．
対象と方法
生後1ヶ月から28歳までの7例（男6例，女1例）のMMを対象とした（表1）．症例1から3の3例は生下時よりfloppyinfantで，重篤な呼吸障害を合併した重症型である．いずれの症例にも明かな遺伝歴は認めない．なお，多発筋炎1例を疾患対照とした．
抗ジストロフィン抗体：認識部位の異なる3種類の単クローン抗体を用いた．2−5E2はroddomain
を，4−4C5はC末domainを，DYS2はC末端を認識する抗体で，前二者は富士レビオ株式会社より供与された．

＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

郎＊

埜

中

征

哉＊＊

免疫組織化学：8JLmの凍結切片を用いてABC
法により免疫組織化学を行った．3種類の単クローン抗体はいずれも室温で1時間反応させた．
ウエスタンプロット：骨格筋ホモジェネートを蛋白定量し，100／g相当量の試料をDoucet ＆Trifaro（1988）の方法により電気泳動した．泳動
後，PVDF股に転写し，抗ジストロフィン抗体
DYS2と反応させ，ABC法で検出した．

フィン発現遅延という病態が他のdysmatur−
ationalmyopathy（筋の成熟異常を特徴とする先天性ミオバナー）にも存在するのであろうか．今

一

結

果

（1）組織化学所見：今回検討した7例のMMの筋病理組織所見を表2に示す．いずれの症例も15〜30％の筋線経に（症例7では90％以上の線経に）中心核がみられた．症例1−3の重症型では80−90％の線雑にNADH−TR染色でperipheral
haloがみられた．症例4〜7でもperipheralhalo
が少数残存し，intermyofibrillarynetworkの放射状配列がみられた．ミオシンATPase染色では，typelpredominancyの傾向があり，症例1でtype2A，2Bの分化が不明瞭で，症例1，2ではtype2Cの割合が高く，ミオシン分化の遅延が示唆された．なお，いずれの症例でも填死線経はみられなかった．
（2）免疫組織化学：重症型3例を含む7例のMM
全例でジストロフィンは筋線経の形質膜全周にわたって均一に発現していることが，3種類の抗ジストロフィン抗体で確認された（図1a〜g）．症
例2においては，ジストロフィン陰性線経が散在してみられたが，これらの線経はエオジンに波染する比較的大径の線経であり，生検時の過収縮に−76−

表l Clinicalfindings ofseven patientswith myotubular myopathy
CaSe＃

age sex delivery floppy resplratOry biopsied site
infant distress

CaSel lm M

31W＋

rt．rect．femoris

CaSe2

2m M

34W

＋

lt．bicepsbrachii

CaSe3

15m M

full

＋

lt．bicepsbrachii

CaSe4

9y M

full

It．bicepsbrachii

CaSe59，5y F

f山I

Jt．bicepsbrachii

CaSe6

20y M

f山I

Jt．bicepsbrachii

CaSe7

28y M

f山l

lt．bicepsbrachii

表2

Muscle histopathologic findings of seven patients with myotubular myopathy
CaSel case2

age lm2mCentralnuclei

20−30％

Peripheralha10

100％

VPe1

60％

case3

15m

9y

20％
80％

33％

case4

case5

9・5y

case6
20y

28y

15％

20％

20−30％15−20％

＞90％

10％

10％

＜5％

96％

66％

86％

71％

case7

＞90％

80％

漂霊 ）20％ 〒設13芸1g設 0・言語 32芸 言語
type2C

20％

27％

1％

5％

3・5％

2％

15％

necroricfiber

よるartifactと考えられた（図1h）．

児症例の未熟筋線経においてはジストロフィンの（3）ウエスタンプロット：MMの7例はいずれも，発現遅延があることを報告した．CMyDでは，対照とした多発筋炎症例と同様，正常サイズのジ

NADH−TR染色でperipheral haloを持つよう

ストロフィンが発現していた（図2）．発現量につな未熟筋線維においでも，ジストロフィン発現がいてもミオシン重鎖との相対比でみると，低下し不良であった．今回重症型の乳児症例を含めてた症例はなかった．

MMにおけるジストロフィン発現を検討した．重考症型MMの乳児症例においてはperipheralhal0線経が大量に残存し，ミオシンの分化にも遅延が察

骨格筋の成熟異常を特徴とする先天性ミオバナ

みられたが，これらの未熟筋線経においてもジスーにはCMyD，MM，COngenital fiber−type

トロフィンは正常に発現していた．このように

disproportion，myOpathywithtype2hypoplasia

peripheral haloを持つ未熟筋線経におけるジスなどが知られている．昨年度の本会議でCMyD乳トロフィンの発現はこの2つの先天性ミオバナー−77−

図1抗ジストロフィン抗体DYS2による免疫組織化学
a〜g：MM症例1−7．症例2ではジストロフィン陰性線維（arrow head）が散見され
る．h：エオジンでCounterstainしてみるとジストロフィン陰性線維（arrow）は大径でエオンンに浪染する過収縮線経であることがわかる．

で全く異なる．

CMyDではperipheralhal0を持つ線経の割合

正常な骨格筋の発達では，ジストロフィンの発はMMよりも少ないものの，type

2C線経が現は，胎生11週頃より1）ミオシンの分化に先んじ55〜90％を占めミオシン分化はかなり遅延していて始まり，胎生22〜35週にかけてほぼ成人と同じレベルの発現が完成する2）3）．ミオシンの分化は胎る．そしてジストロフィンの発現はミオシンの分化よりも更に遅延している．一方，MMでは大部

生20週頃よりtypelへの分化が始まり，37週以降

分の筋線経がperipheral haloを持っているものに急速にtype2A，2Bへの分化をとげる4）．また胎の，ミオシン分化の遅延はCMyDに比べ軽度であ

生25週にほとんどの筋線経にNADH−TR染色でり，ジストロフィンの発現に遅延はみられない．

peripheralhaloがみられるが，胎生34週になるとみられなくなる5）．

この2つの疾患では，筋線経の未熟性が質的に異なることがわかる．つまり，MMでは骨格筋の成そこで両疾患の乳児症例における筋線経の未熟熟が全般に遅れているわけではなく，未熟性の主性をperipheralhalo，ミオシン分化，ジストロフ

体は骨格筋発達過程で核のperipheralmigration

ィン発現の3つの観点から比較してみる（表3）．

が障害されている点にある．これにに対して，

−78−

表3

Distinguishingfeaturesbetweenmyotubularmyopathyand
COngenital myotonic dystrophy

叫仰仙加Jar叫／Opa的y Co〃g即fIaJ
rSevere向〝nJ
几叶OIo〃ねpysrroJ）わγAge

1m・15m40d・10m

十十＋

Peripheral hal0

Myosin differentiation delayed＜

delayedDystrophin expression normal deJayed

haloやミオシン赤化の軽度遅延という未熟性は
1

乏

3

8

4

7

PM kDaあるが，CMyDでみられたようなジストロフィンの発現遅延は認めなかった．
文献1）StrongPN，ClerkA，SherrattTGandSewry
CA：Dystrophinexpressionin・foetusesatrisk
forDMDandBMD．JNeuroISci98（supple）：
23la，1990．

2）PrelleA，ChianeseL，GallantiA，MoggioM，Scarpini E，Bonilla E and Scarlato G：
AppearanCeandlocalizationofdystrophinin

図2

抗ジストロフィン抗体DYS2によるウエ
スタンプロット

normal human fetal muscle．J NeuroI Sci
98（supple）：229a，1990．

lane1−7：MM症例1−7，1ane8：
多発筋炎，下段には筋タンパク竜の指標としてMHC（ミオシン重鎖）を示した．

3）Shimizu T，Matsumura K，Hashimoto K，MannenT，IshiguroT，EguchiC，NonakaI，
Yoshida M and Ozawa E：A monoclonal
antibody against a synthetic polypeptide

CMyDでは核のmigration，peripheralhaloの消失，筋タンパクであるミオシンの分化，膜の細胞
骨格タンパクであるジストロフィン発現のすべてが遅延しており，その中でもジストロフィン発現の大幅な遅延は，CMyDに特異な病態であることが示唆される．

fragmentofdystrophin（aminoacidsequence
fromposition215to264）．ProcJapanAcad
64B：205−208，1988．
4）熊谷俊幸，袴田

亨ほか：ヒト胎児期の筋発達について−腸腰筋と大腿四頭筋の組織化学的比較−：脳と発達16：150−156，1984．
5）Schloon H，SchlottmannJ，Lenard HG and結

語

Goebel HH：The development of skeletal

7例のMM生検筋で，ジストロフィン発現を検

musclesinprematureinfants，Ⅰ．fibersizeand

討したところ，仝例でジストロフィン発現は正常

histochemical differenciation．EurJ Pediatrであった．重症型3例の筋線経にはperiphera1

131：49−60，1979．

−79−11）Dystrophin：ヒト臓器分布並びにBecker型
筋ジストロフィーにおける発現様式について
内

研究協力者

野

誠＊

寺 本 仁 郎＊ 直 江 弘 昭＊ 三 池 輝 久＊＊
岩 下
宏＊＊＊荒 木 淑 郎HH

は じめに
骨格筋や心筋におけるdystrophin（ dy ）の発
現様式については，疾痛の場合を含め，詳細に検討されているが，筋以外のヒト臓器における dyの発現状況については不明な点が多い．ヒト臓器
特に脳における dy の発現状況を明らかにするため，昨年に続き，今回はモノクロナール抗 dy抗体を用いて検索を行った．またBecker型筋ジストロフィー（BMD）生検筋の dy の発現様式についても同様の検索を行い，PCR分析結果と比較検討した．

Tefco社の3．5〜12％gradient gel（8cmX8cmxl mm）を用い，約3時間15mAの通電を行い，免疫反応にはVecstain ABC kit，発色基質にはナフトールを用いていたが，今回は通電時間を4−5時間と大幅に延長し，またミニサイズの他に16cmX16cmXl mmの7．5％均一ゲル及び3．5−12％gradient gelも用い，免疫反応には
Vecstainelite ABC kit，発色基質にはDAB，
NiC12を使用した．
結果

正常対照及び筋緊張性ジストロフィーにおいて
対象と方法
正常対照例4例（42〜77歳），筋緊張性ジストロ
フィー1例（54歳），及びIQ50以下の知能障害を認
めたDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）1例（26歳）の各剖検臓器（大脳，小脳，骨格筋，心筋，胃，腎臓，膀胱，肺など）について，抗 dy抗体（NOVO社のDYS−1，2，3）を用いて，Western blot及び免疫組織化学染色による分析を行った．またBMD16例（14〜53歳）の生検筋にはDYS−1，3のWesternblotにて骨格筋，心筋のみならず，胃・勝胱などの平滑筋組織，さらに脳においても明らかな d了の発現が認められた（図1）．DYS−2では骨格筋，心筋は dy は明瞭であったが，脳や平滑筋組織は不明瞭であった（図2）．免疫染色では骨格筋，心筋，平滑筋組織では
dy巾は筋表面膜に局在していたが，脳においては
DYS−3ではneuronの胞体，特に膜がDYS−1でついても同様の検索を行い，SRLに依頼して実施したChamberlainの9領域及びBeggsの10領域による多重PCRによる遺伝子解析l）結果と比較検討した．なおWestern blotに際しては従来

は主にglia系細胞の胞体及び突起が染色され，DYS−2では明らかな局在は認めなかった．DMD
においてはいずれの抗体を用いても全臓器でdy の発現はみられず，免疫染色でも心筋のintercalateddiscの一部が染色される他は明らかな抗体の局在はみられなかった．

■国立療養所再審荘病院神経内科＊＊熊本大学医学部発達小児科＊＊＊国立療養所筑後病院＊＊＊＊熊本大学医学部第一内科

BMDのWestern blotパターンについては従来の泳動条件では① dy バンドを検出できない
グループ，② dy の分子量異常，主として低分−80−

子守∴十㍉∴・∴二一

子化を示すグループ，及び③正常分子量で含量の減少を示すグループと3つのグループに区分される．②についてはKunkelらのframeshift仮説で説明可能であるが，①，③については説明困難である．今回検出感度を高めるため，Vecstainelite
ABC kit，DAB，NiC12を使用したところ，殆ど

dYStr叩hh一の症例は痕跡的ながら dy バンドを検出可能であった（図3）．また従来のWesternblotでは③のグループに属するものが15例中8例と最も多数を占めたが，今回SDS−PAGEの通電時間を3時間から約4〜5時間と大幅に延長してblottingを行ったところ，正常対照と明らかに差を認め，

1

図1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

正常対照剖検例（74歳♀）の各臓器のWesternblot（一次抗体にDYS−1を使用）．大脳，胃，膀胱においてもdystro−phin bandの発現は明らかである．腎．
肺は痕跡的である．

仝例低分子化しているのが明らかになった（図4）．16cmX16cmXlmmのgradient gel及び7．5％均一ゲルでも低分子化が認められたが，7．5％均一ゲルでは高分子蛋白の基点からの移動距離が短く，gradientgelに比較して軽微なdy の分子異常を検出するのは困難であった．免疫染色では仝例全体的に染色性が低下し，線推ごとに染色性が異なり，またいわゆるpatchystainの像を認め，BMDにcompatibleな所見を呈した．PCR

ご㍉亘∴ト∴∴：一一三㍉
h
i
n

嘲

如

如鉦画廊・。

12

3

月

5

8

7

8

9

用
1

図2

正常対照剖検例（74歳♀）の各組織のWesternblot（一次抗体にDYS−2を使用）．骨格筋．心筋ではdystrophinbandは明瞭であるが，大脳では不明瞭である．

図3

−81−

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Becker型（BMDl，3，4，6）及び正常対照の骨格筋のWestern blot（DYS−
1）．通常の泳動法では検出困雉であった
BMDlにおいても痕跡的ながらdystro−
phinの発現がみられる．Becker型では
仝例低分子化しているのが明らかである．

表∴パ∴㍉工■‥∴・∴了●−

1

2

3

卓

5

＄

；

8

9

Results of dystrophin analysisin16
BMD patients
W OStern blot
lm m uno一d￠l8tion r￠
du￠Od leVels Sk 8 0f
■ 成aining仙）Of dystrOP hin 吋Str叩hin（

Pati8nt

a gO
（
y）

＄
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2
ト）
C K † H E 45
Cram P
州 三三
等
1
回
当
字
CKI

は

図4 Becker型及び正常対照骨格筋のWest−ernblot（DYS−2），Becker型では全例
dystrophinの低分子化及び含量の減少がみられる．

1

18

2

28

≠

425

patChy＋410

pa tChY♯410

Patehy

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It

41 0

Pat￠
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引用

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Pa tChy

18

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≠

3M

pa tGhYnd；not done
暮Normaldystrophin mol郎utarm8扇．42Tkd
榊：＜10％NormaIt8V81．q■url由teCtablo

分析では15例中8例に欠夫がみられたが，うち7≠；川一別％normalIovやl＄．＋；20−58％normallev軸

例はExonl〜3ヶの欠矢で，Exon4ヶ以上の欠共は1例であった（表）．欠夫を認めなかった7に対する抗体であり，骨格筋や心筋とは反応して

例中，Westernblotでも，脳型 d了とは反応しない可能性も考えられた．一方低IQのDMD例では脳でも dyを欠如しており，DMDで高率にみられるIQ異常に脳型

dy

バンドを検出できた5例はいずれもわずかながら

dyの低分子化が確認された．
考

dy の異常が関与する可能性が示唆された．
BMDのWestern blotパターンについては前察

著者らはこれまでHoffmanらのオリジナル抗体（30kd，60kd抗体），P−20，ペブタイドⅣなどのポ1）クロナール抗体による検索で，Western
blot上

dy

は健常者の骨格筋，心筋のみならず，胃・膀胱・肺などの平滑筋組織，さらに脳でも発現しており，免疫染色では大脳のneuronや小脳のPurkinje細胞の胞体特に膜に抗体の局在が認められることを報告してきた2）3）．今回より抗原特異性の高いモノクロナール抗体による検索を行ったが，DYS−1，3の成績はポリクロナール抗体特に60kd抗体，30kd抗体での成績と基本的には一致し，平滑筋組織や脳でも dy の局在が認められた．DYS−2では脳に明らかな局在がみられなかったが，DYS−2は筋型

dyのC末端領域

述したように3つのグループが存在し，特に正常分子量で，量のみ減少を示すグループが多いことを報告してきた．この場合に想定される機序として，（1）欠失距離が短く，通常のSDS−PAGEでは移動度に差がでない，（2）N端あるいはC端の非翻訳部で d了の安定化に関係すると考えられる領域の異常，あるいは（3）上流のpromoter領域，enhan−cer領域の異常，（4）その他の異常が考えられたが，今回の検索で結果的には欠失距離が短く，通常のSDS−PAGEでは移動度に差がでない症例が大半であることが明らかになった．BMDとDMDの鑑別及び予後判定にWestern blotは重要な指標であるので，検出困難な場合もより感度の高い反応系を用いて検索すること，並びに dy の分子−82−

塁異常を証明するために泳動条件に工夫を加えることが重要と思われた．なお本邦のBMD例は欧米のBMD例より欠夫の短い症例が多い可能性があり，今後更に多数例について遺伝子解析と dyの分子量異常についての検索を集積していくことが必要と思われる．

占めたが，泳動時間延長により，低分子化を示した．PCR分析では，Exon1−3ケの短い欠失例が多く，欧米での成績と若干違いがみられた．
3）BMDの多くは dy の低分子化を示し，frame−
shift仮説で説明可能であったが，欠夫の短い症例が多く，Western blotに工夫が必要であっ
た．

要約と結論
I．Dystrophinのヒト臓器分布1）ヒト各臨器における dy の分布を明らかにするため，モノクロナール抗体を用いて，Wesト
ernblot及び免疫染色による検索を行った．
2）正常対照ではDYS−1，3にて dy は骨格筋，心筋のみならず，胃・膀胱などの平滑筋組織，さらに脳においても発現が認められた．
DYS−2では骨格筋，心筋と異なり，脳では dy

謝辞：本研究に種々御協力いただいた九州大学医学部神経内科 波多江 智子先生，山田 猛先生，
熊本大学医学部第一内科
謝いたします．

の発現はみられなかった．DMDでは全臓器でdy の発現はみられなかった．
3）DMDの知能障害に脳型 dy の異常が関与している可能性があり，今後知能障害の程度により dy の発現に違いがみられるか否かについて，症例を増して検討が必要である．
ⅠⅠ．Becker型筋ジストロフィーにおけるdystro・Phinの発現様式について
1）BMDにおける dy の発現様式について検討するため，Westernblotによる分析並びに免疫染色による検索を行った．
2）通常のWestern blotでは分子量に変化がな
く，含量のみ減少するものが多数（8／15）を

−83−

文

宇山

英一郎先生に深献1）BeggsAH，KoenigM，etal：Detectionof98％
ofDMD／BMDgenedetectionsbypolymerase
chainreaction．HumGenet86：45−48，1990．
2）UchinoM，ArakiS，etal：Localizationandcharacterization of dystrophinin muSCle
biopsy specimens from Duchenne muscular
dystrophy and various neuromuscular dis−orders．MuscleNerve12：1009−1016，1989．
3）内野誠ほか：Dystrophin：Becker型筋ジス

トロフィーにおけるdystrophinの分子異常並
びにヒト臓器におけるdystrophinの局在について． 厚生省筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）平成元年度研究報告書，1990，ppl12−115．

ⅠⅠⅠ．ジストロフィン（No．2）

12）ジストロフィン分子におけるN末端ドメインの
臨床的意義
荒

研究協力者

畑

喜

一＊

有 川 恵 理＊ 松 井
石 浦 章 一＊ 埜 中 征

潔＊
哉＊

林

由紀子＊

は じめに

一般筋病理所見：筋生検は左上腕二頭筋にて施

一昨年の本研究班において我々は，BMD（20例）
ではジストロフィンのC末端のドメインが保たれ

行．HE染色にて壊死再生像とともに問質結合織の増生，筋線維径の大小不同と円形化，多数のオているが，DMD（18例）では欠損していることを

ベータ線経を認める典型的な筋ジストロフィーの示し，ジストロフィン分子におけるC末端ドメイ

病理像を呈していた．Gomori−Trichrome変法にンの臨床的意義を提示した1）．今回我々はC末端て，ragged red fiber，ネマリン小体等は観察さドメインが保たれているが，N末端側にジストロ

れず，ミオシンATPase活性像ではtype2C線経

フィン遺伝子のエクソン2から始まる巨大な欠損が15％と増加，type2B線経が3％と減少していた．

を持ち，早朝から重篤な臨床症状と経過を示した
筋ジストロフィー患者を経験したので報告する．

方
対

象

法

抗ジストロフィン抗体：ジストロフィンのN末

症例は2歳10ヶ月男性．主訴は，高CK血症と歩行障害．生後8ヶ月時，高CK血症を指摘され（20，000〜30，000U／L），その後独歩が1歳5ヶ月と遅れ，また独歩開始後すぐにGowers，徽候を認めたことからDMDを疑われ筋生検が施行された．
筋生検時所見：低身長（−2SD）の他一般身体所見に問題は認めなかった．知能は遠城寺式で正常
範囲．近位筋優位の筋力低下あり，歩行は不安定
で，走ることは出来なかった．股関節，足関節に端からC末端までの異なる領域に対して調製された10種類の抗体（N末端から順にD1−2a，2−5E2，
3−4C4，3−4G4，D8，6−10，D9，DlO，D11，4−4C5，）を用いた（図1）．これらの抗体は同時に染色した
DMD筋の筋形質膜は染色しないことから，第6染色体によってコードされるいわゆるジストロフ
ィン関連タンパク質（B3／DRP）との交差反応性はないものと考えられた．（Dシリーズと6−10はハーバード大学Kunkel教授より供与された．）

拘絹があり，筋の仮性肥大は下腿筋，大腿四頭筋，
上腕二頭筋，三角筋に認められた．

免疫組織化学染色：6／Jの凍結切片を用いて蛍光抗体法にて免疫染色を行った2）3）．

検査結果：骨格筋CTで大内転筋，大腎筋に低吸収域を見た．心電斑上，Vl，V2，V3で陰性T波を認めた．血清CK値64285，GOT511，GPT

イムノブロット：生検筋の20JJ凍結切片15枚からのサンプルは予めミオシン重鎖の量を揃えるこ

798，LDH2，641，ALD154と何れも上昇し，尿中ミオグロビンも5mg／dlと高値を示していた．

整し，抗体4−4C5を用いてイムノブロットを行っとにより，筋タンパク質の量が一定になるよう調た．
遺伝子解析：生検筋のブロックよりDNAを抽＊国立精神・神経センター神経研究所

出し，Chamberlain4），Beggs5）らにより調製され−87−

A＄Ch帥8tte鵬gr8m0−dystrophlnshowlng加atlon80fregionsuSed
tor離別Hm軌相川（adaPtOd什OmKoenlgandKunkel）
6−10

（A）

D8

Dl・2a

罰ご葛

2・5E2

D9

DlO Dll
4・4C5
4−ql

3・4G4
24

1

3．4C4

（B）

D1．282・SE2

D8■

3＿4G46．10D9DlODll

＝

＋

＋

＋

＋

4・4CS
＋

Tbe fow main domains are：Amino−terminus（b18Ck box）・eentra・lrepeatin写rOd（repeatsland24areindicated beiov）・CySteine−ricb reglOn（diagOnallines）md earboxy−terminal domain（Openbox）．Four putatiYe hinge regions areindicatedby gray boxes・Thus，this battery of antisera allot．ed us tO determine thepresenc80r ab8enCe Of seYer81differentreglOn80f dystropbin・

図1上段（A）に用いた抗原ペプチドのジストロフィン分子に対する位置を示し，下段（B）に免疫組織化学的検討の結果のまとめを表示した．D1−2a，2−5E2，I）8・3▼4
C4，3−4G4，では全てジストロフィンの染色性は陰性であるが，6−10・D9，DlO・
Dll，4−4C5ではジストロフィンの染色性は陽性であった・これより，少なくとも免疫組織化学的にはジストロフィン蛋白分子のC末端側が保たれていることが解る・

図2

ジストロフィンの免疫組織化学染色像

A）HE染色像 B）2−5E2，C）6−10，D）4−4C5．
−88−

たmultiplexプライマーを用いたmultiplex
PCR解析を施行した．

されている．
結結果

語

C末端が保持されているにむかかわらず重篤な免疫組織化学：抗ジストロフィン抗体D卜2a，臨床経過をとる症例の存在することが示された．

2r5E2，3−4C4，3−4G4，D8ではジストロフィンが今後N末端側の臨床的重要性も見直す必要性があ

全く染色されず，抗体6−10，D9，DlO，Dll，4−4

るものと考えられた．

C5ではジストロフィンが筋形質膜に沿って確認された（図1，2）．ただし，コントロールに比べ文

献ると淡く不均一な染色であった．
イムノプロット：抗体4−4C5を用いたイムノ70

1）ArahataK，BeggsAH，etal：Preservationof

ロットではジストロフィンは検出されず，蛋白質

Skeletal muscle from Becker musculartheC−terminusofdystrophinmoleculeinthe

は検出感度以下に減少しているものと考えられた．

dystrophy．JNeuroIScilOl：148−156，1991．

遺伝子解析：ジストロフィン遺伝子のエクソン

2）ArikalVa E，Hoffman EP，et al：The fre−2−44にわたる巨大な欠損を認めた．理論上フレー

quencyofpatientswithdystrophinabnormal−

ムシフトを伴っていた．

itiesin alimb−girdle patient population．
Neurology41：1491．1496，1991．

考察3）Airkawa E，Ishihara T，etal：Immunocyto−

ジストロフィン遺伝子のエクソン2−44の巨大なChemicalanalysisofdystrophinincongenital

遺伝子欠損が存在し，免疫組織化学的にN末端側

musculardystrophy．J NeuroIScilO5：79−

を欠如する短いジストロフィンタンパク分子の存在が示された，しかも臨床的には極めて薫篤な経

4）ChamberlainJS，Gibbs RA，et al：Deletion

過をとっている重症筋ジストロフィーの一例を報SCreening ofthe Duchenne musculardystro−

告した．この症例は今後ジストロフィンと臨床症

phylocusvia multiplex DNA amplification．

状との関わりを考えていく上で重要な問題を提起

NucleicAcidResearch16：1141−1156，1991．

しているものと考えられた．特に，エクソン2に5）BeggsAH，HoffmanEP，etal：Exploringthe

始まるN末端のアクチン結合ドメインを含む領域

molecular basis for variability amongに欠損をみる場合にはジストロフィンは正常に機能しない可能性が示唆された．
また，遺伝子解析で確認されたジストロフィン

87，1991．

patientswith Becker muscular dystrophy：
dystrophin gene and protein studies．AmJ
Hum Genet49：54L67，1991．

の欠損領域を越えてさらに大きな欠損がタンパク

6）SaraB，BarneaE，etal：Anovelproductof

質レベルで存在したが，エクソン45より下流でフthe Duchenne muscul ar dystrophy gene

レームが修復された可能性が考えられた．なお，

WhichgreatlydiffersfromtheknoWnisofor−

我々がC末端領域に認めた免疫反応はYaffeらのいう第3のジストロフィン6）である可能性も残msinits structure and tissue distribution．

−89−

BiochemJ272：557−560，1990．

13）筋ジストロフィー組織ジストロフィンファミリーと生体膜機能
田

濱

＊

＊

■

＊

次

晴郎

英誌

山上

丸井

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

＊

均剛

＊
＊

＊

彦司博

孝栄道

坂田田

塩佐澄

研究協力者

は じめに

min−1，tl′2＝9minと速やかなHbの漏出が観察さ

本研究の目的は興奮，収縮ないし変形能を有すれた．また，アデニル酸キナーゼのleakage

る細胞の股構成要素の一つとして明らかにされた

kineticsでは，対照のk′＝8．5×10−5min−1，tl′2＝

ジストロフィンに注目し，ヒト赤血球膜をモデル

8．2×103minであったが，DMDではk′＝3．8×に，形質膜の直下に規則的なネットワークを形成

10￣2min￣1，tlI2＝18minと種々の分子量のタンパ

しているスペクトリンスーパーファミリーの生体

ク質の迅速な漏出が確認された．以上の基礎デー

膜機能に果たす生理的役割を解明することにある．

タに基づいて今回の検討を試みた．そのために，

ヒトのジストロフィンの欠損あるいは不完全な断Koenigら2），Bryanら3），のヒト骨格筋ジストロフ

ち切られたジストロフィンは骨格筋細胞では，臨

ィン一次構造（Res95−121），ならびに，Louvard4）が床的にはその萎縮や消失による二次的な筋力低下

報告しているヒトβ−スペクトリン（Res13。＿156）

や早期死を招くが，細胞レベルにおいては細胞内の構造に基づいてactinbinding domainの合成へのCa2＋流入，細胞質局在タンパク質そのもの

ペプチドやN一端およびC一端ペプチドの合成標やカルパインなどによる分解産物の慢性的な品，さらに抗体認識に関与する部分のペプチド5）

leakageが生じるものと考えられる．筆者の一人を合成することによってそれらのポリないしモノ（M・H・）はさきに，デュシェンヌ型筋ジストロフィ

クローナル抗体を家兎やマウスで得て，形質膜のー（DMD）患者赤血球において，へモクてロビン（Hb）およびアデニル酸キナーゼのleakage

裏打ちタンパク質との相互作用から赤血球膜

kineticsを観察して興味ある結果を明らかにし行った筋ジストロフィー患者についてChamber．

た1）．その成果を要約すると，低浸透圧ショック処

lainら6）のプライマーを合成してPCRを用いた

理〔0・05M NaCl，0．02M Tris−aCetate，0．01M

multiplex gene analysisを行ったのでその成果を併せて報告する．

Glucose（pH8．0），30C〕によって，Hbqleakage
kineticsの速度定数（k′）およびtl′2は対照がそれ

leakageの本態を明らかにする．同時に本研究をぞれk′＝3．9×10￣4min一㌧t．′2＝1．8×103minであ方るのに対して，DMDの場合はk′＝8×10−2法

人工合成ペプチドはさきの報告書7）と同じ方法（図1）に依った．ヒトジストロフィンのアクチン＊宮崎医科大学衛生学＊＊愛媛県立医療短期大学＊＊＊国立療養所宮崎東病院＊＊＊＊愛媛大学医学部生化学

結合領域はRes，5＿12．（LVNIGSTDIVDGNHK＿LTLGLIWNIILH）の27残基のフラグメントを，ヒトβ−スペクトリンのそれはRes13。＿．56（LEN−ー90−SequenCe：

LENMGSHDIVDGNHRLVLGLIWTlILR

Peptide SynthesiZer（9050〉【SyllthesiZel・（m‖i e‖／810SearCh9050）】

Fmoc−LLeu・OPfp
Fmoc・L・Leu・OPfp

餌riIicationa雨FraCtionationで（

PLC）

I

Fmoc−しこThr（But）−01T／BOP／HOBt

Syste｛：M6∞U6km1什40

F汀10C−し−Trp−OPfp

CoIu¶∩：〟80ndasphere5JICt●100人
3．9×150…（19×150mm〉
SoIvent： Å；0．はTFA，8；0．はTFAく n acetonHけiりGradient：B；30−60工（＝lVar．30m川）
Flov Rate：1．OML力in（2卸U扇∩）
Detector：W220nn

Fmoc−L−Ser（But）−0日／BOP／HOBt（活性エステル化アミノ酸誘導体）
カップリング：60分間
くキャッビング：10‡無水酢酸／DMF
Fmoc除去：2‡DBu（1，8−DiaZabicyclo［5，4，0】・7−undecene／
DMFくN，N■●・ヽ■■、○ヾ−
9010■11す．すl爛＝ヽ＋・d・○ト．Mh・⊃一〇 ロ
トM■11小1l一〇
H O tい・t）iTnethyl fomamide）

E

TFAクリーベジ：
TFA：m−Cre201：thioanisol：Et）T（Ethanedithiol）

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一N u
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（9．0：0．25 ： 0．25 ：0．5）
1 2hr，rOOl【temP，Shakin8
1 fHtration，PPt．C diethylether
PPt■1 ■●●−■ヽ−
0−1■111ヽ一一》■＝○中一nO■■■

図1 ペプチド合成

MGSHDIVDGNHRLVLGLIWTIILR）の27残基

図2のフラグメントをそれぞれ合成した（図2）．
さらに，ジストロフィ

Synthetic peptide of humanβTSpeCtrin（Res．3。＿．56）

ンのN一末端15残基（MLWWEEVEDCYERED），C−末端12残基（PGKPMRMREDTM）およびLove8）らの報告による第6染色体関連ジストロフィンのC−末端13残基ペプチド（CCCPNVPSRRQAM）の合成を行った．
結果および考察
まずヒト赤血球膜構成タンパク質の検索は，ghostの調製，さらにLaemmliらの方法による
SDS−PAGE（ポリアクリルアミドゲル濃度8％）を行った．その結果を病型別に（図3）に示した．
α一およびβ−スペクトリン，アンキリン，Band3，
4．1，4．2，アクチンなど同じタンパク質量をチャージしていても病型によって，染色（CBB）バン
ドの多寡が異なっているところから，プロテアー
ゼによる修飾を考慮に入れると，基本的な形質膜の裏打ちタンパク質の量的ないしは質的差異も考慮する必要があろう．
各合成ペプチドについて，ヘモシアニンやウシ
血清アルブミンをcarrierタンパク質としてcar−bodiimideによるcouplingで得られた抗原をもとにポリタロナ「ル抗体を家兎に形成させる型通りの数回のブーストにより，immunizationを行
い，数週間後に得られた血清の30％硫安飽和沈澱
を得て，VectastainABC kitを用いてさきの赤
血球ghostのSDS−PAGEとのimmunoblottingを行ったが，検出が十分に得られなかった．
Hoffman博士および富士レビオ杜より供与されたジストロフィン認識抗体（それぞれ抗30kD抗体および，モノクローナル4−4C5抗体）との同様のブロッテイングも十分な検出が得られず，現在
では，抗原ペプチドのC−末端のアセテル化や，VectastainABCElitekitへの変更などによる検出感度上昇の検討を行っている．
さらに，現在検出が十分に出来ないことは発現しているタンパク質の方に構造上の変異が生じていることによる検出が的確に出来ないことも考えられよう．可能であれば，赤血球ジストロフィン
スーパーファミリーを電気泳動によって分散した
後に抽出してそれを抗原にするか，線維芽細胞や筋細胞からmRNAを抽出し，逆転写酵素でcDNAを合成させてプラスミドに組み込み，その−91−

的ないし質的な差異の検出を試みる．これらの検討から，赤血球膜ジストロフィンスーパーファミ
リーが膜機能，特に赤血球内タンパク質の漏出に果たす病態生理的役割を明らかにする．これらの手がかりが得られれば，患者の早期診断，保因者の検索，患者の予後判定や合併症の特徴を識別することに臨床応用できるものと期待されよう．
遺伝子検索のPCRによる結果を最後に追加したい．

（1）末梢血単核球と好中球の分離とDNAの抽出：23名の筋ジストロフィー患者より得られた36．5 −EDTA加血液をFicollLConrey法で単核球と好中球を分艶し，その細胞をProteinase Kで処理
しフェノール抽出を行った後エタノール沈澱をL
DMD

−

97．4

一・

一鱒嶋

LG

DNAを抽出した．
（2）遺伝子増幅法：プライマーはChamberlain
らのDMD遺伝子のExon部分を認識するb，d，

FSIl

国軍∵∴琵

170

FM王）

rl r⊥rr⊥rr⊥rl﹇︻

Mr（kDa）．．＿

MMDe，g，h．iを用いた．認識するExonはそれぞれ
17，44，45，12，51，4である．反応条件はまず93度で7分間DNAの熟変性を行った後，93度熟

掛
y
㌫

紳 輔

⁝二

塁㌍縫

変性1分，56度アニーリング1分，70度ポリメラーゼ反応2分で30サイクル増幅を行った．
R−

365

一

顧′

図3

個人に固有なタンパク質を発現させることによってジストロフィンスーパーファミリーの諸特性を
生体膜機能との関連で明らかにして行く予定である．
このほか，ヒト赤血球（α十β）スペクトリンに（3）増幅したDNAは5％ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動しエチヂウムブロマイドで染色した．
DMDの患者は図4のAに示す1〜12番の患者である．すべて男性で年齢は10歳から23歳までであった．結果はジストロフィン遺伝子のExon45と51の欠夫を示すものが4例，Exon51のみの欠夫を示すものが1例，Exon44，17の欠矢を示すもの
がそれぞれ1例で7例（58．3％）にみられた．福
山型（FCMD）では6例中2例でそれぞれ
Exon12，17，45，51とExon45の欠矢がみられた．Limb−girdle型（LG）では5例のうち2例でExon45の欠損がみられたのみであった（図4のB）．

対するマウス抗スペクトリンモノクローナル抗体，

今回Chamberlainらのプライマー6組を用いヒト赤血球protein4．1に対するモノクローナルて施行したDMD型筋ジストロフィー患者12例の抗体，マウス脳スペクトリンの家兎抗体を入手しうちなんらかの遺伝子欠矢がみられたものは7例ているので，さらに抗グリコフォリンA抗体，抗グリコースー6−リン酸脱水素酵素抗体などヒト赤（58．3％）であった．これは本邦での報告とほぼ一致するものであった．欠失部位はExon45，51の欠

血球膜構成タンパク質の抗原性の差異に基づく量夫が多くみられた．これはSouthern hybridiza一

−92−

A

B

M C12

3

4

5

6

7

8

9101112C M

M C1314151617181920212223C M

DelelionSc代印i喝Or血Dy紺OphinGeneorDMDPalie鵬
byM址はpkXDNA如叩l漬ca細れ

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図4tion法で言われているようにこの部位が障害さ・れやすいホットスポットであるためと考えられた．

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9

▲

M

遺伝子の欠損がみられた．これらの患者は家族歴●

9

FMD，LGのそれぞれ2例ずつでジストロ7イン

M

9

LG

9卜08 M
91−10 M
9卜1g M

MMD

9卜02
9ト17

Fh7D

91−03 Fればさらにその欠失頻度は上がるものと考えられ，
DMDの診断に有用であると考えられた．また，H

9

カバーしえるプライマNを用いるか，Northernhybridization法でmRNAを調べることが出来U

い範囲の欠夫もみられることよりExonをすべて

Ⅰ217

M

9

囲の欠共と，ただ単一Exonの欠尖と思われる狭

■」■

H

∧

9

の欠矢はExon45，51を中心とした比較的広い範

56 7 9 − 2 3 4 5 6

今回の結果を模式的にまとめると（図5），これら

4

図5がない孤発例であった．このことについては，これらの常染色体性の遺伝形式をとるものにもジス
トロフィン遺伝子が何らかの関連性を持つのか，

F
M

DMD．Duchennemusculardystrophy：
LG，Limb−girdlemusculardystrophy：
MMD，Myotonicmusculardystrophy：
FMD，Fukuyamamusculardystrophy．

臨床診断に問題があるのか現在のところ不明である．

Processes（edbyLennonDLF，StratmanFW＆Zahlten RN）EIsevier Biomedical，New

文

献York，1983，pp303−322．

1）KubySA，HamadaM，NessetCC，TylerFH

2）Koenig M，Hoffman EP，Bertleson GJ，and Ziter FA：Biochemistry of Metabolic

MonacoAP，FeenerCCandKunkelLM：Cell−93−

50：509−517，1987．

11156，1988．

3）BryanJandKaneRE：JMoIBiol125：207

7）潰田 稔，丸山英晴，山下秀一，澄田追悼，塩坂孝彦，仲地 剛，井上諌次郎： 筋ジストロ−224，1978．

4）LouvardD：Curr．Topics CellBioll：51−

フィー及び関連疾患の成因と治療法に関する研究 （荒木址）平成2年度研究報告書，1991，

57，1989．

5）Hoffman EP and Kunkel LM：Neuron2：

pp112−115．

8）Love DR，HillDF，Dickson G，Spurr NK，1019−1029，1989．

6）ChamberlainJS，Gibbs EJ，Nguyen PN and

Byth BC，Marsden RF，Walsh SF，Edwards

Caskey CT：Nucleic Acid Res16：11141−

YHandDavisKE：Nature339：55−58，1989．

−94−14）ジストロフィンの局在と機能：急速凍結−ディープェッテング法による細胞骨格蛋白との相互関係の検討
小 林 高 義＊

研究協力者

松 本 容

秋＊

馬

健＊＊＊宮

場

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の遺伝子産物であるジストロフィン（DP）の筋細胞内での3次元的局在及びその機能は依然として未解決の問題である．それを明らかにするために，我々は未熟なマウス培養筋管細胞を使用して急速凍結−ディープェッナング（QF−DE）法によってDPの細胞内局在及びactin−likefilamentとの関係を検討し，昨年の本姓会議で発表したが，今回は成熟した筋肉内でのDPの3次元的局在及び他の細胞骨格蛋白との相互関係をみる目的で7乃
びわ0の筋組織による検討を行ったので報告する．
材料及び方法DMDのmodel動物であるmdxマウス及びそのCOntrOlマウスであるscnマウスを使用した．
Scn及びmdxマウスをネンブタール麻酔下で開胴し，左心室よりパラホルムアルデヒドで濯流固定し，下肢より筋組織を取り出し 組織細切法
あるいはサポニン処理により，細胞内可溶性蛋白質を除去した．免疫染色はDPのC−terminalに対するモノクローナル抗体（Novocastro）で染色
後，ベルオキシターゼ標識二次抗体で染色した．
免疫染色対照群として正常マウス血清とPBSを一次抗体として使用し，mdxマウス筋組織にDP＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊信州大学医学部第一解剖学＊＊＊信州大学医学部第二病理学

大

野

伸

一＊＊

武

正＊

抗体を使用した．0．25％グルタールアルデヒドで30分間再固定後DAB反応を5分間行い，レフ0リ
カ膜を作成した．通常の超薄切片は，四酸化オス
ミウム固定後，脱水，包埋した．電顕レプリカ股作成のためにメタノール浸漬後，液体窒素で冷却したイソペンタン・プロパン混合液中あるいは
JFD−RFAによる鋼ブロック庄着法で急速凍結した．更に凍結試料は液体窒素中で凍結割断を加え，FD−3S装置内でディープェッナング後，白金と炭素で回転蒸着し，型のごとくレプリカを作成し電顕観察した．
結果

Ⅰ透過電顕的観察
超薄切片による電顕免疫染色では，SCn筋組織においてDPは無染色切片で細胞膜に治って局在し（図1−A），ウラン・鉛二重染色でDPは細胞膜直下に局在することが確認された（図1−B）．対照
として，SCn筋組織にPBS及び正常マウス血清を使用したもの（図1−C）及びmdx筋組織に抗DP抗体を使用した対照群では，無染色（図トD），ウ
ラン・鉛二重染色像においても免疫反応産物は陰性であった．
ⅠIqF−DE法による観察
Scn及びmdxにおいても細胞膜直下に細胞骨格の線維構造が存在した．Scn筋組織において，抗DP抗体のみで免疫染色したものと二次抗体免疫

−95−

夢

弾

約人

手薄
誓言三
牒奉

㌦∴工立至
資だ
こ■ご

図2

Areplicaelectronmicrographforimmuno−
StainingcontroIwithnormalmouseserum．
No reaction productis observed among
filamentous networks（arrows）under cell

membranes（CM）．

図1Electron micrographs ofimmunOperOX−
idasestainillg forscn（A，B，C）andmdx（D）muscle fibers．（A）Immunoreaction
products（arrows）arelocalizedalongthe
cell membrane．Unstained section．（B）
Stained section with uranyl acetate andlead citrate．（C）and（D）No reaction
productis observed asimmunostaining
controIwithnormalmouseserum（C）andin a mdx muscle fiber（D）．
図3

染色後DAB反応したものと比較検討すると抗DP抗体のみでは，細胞骨格はわかるがDPの免
疫反応産物は不明であった．それに対してDAB反応を施すとDAB反応産物で修飾された線経が明瞭になり，DABで修飾されない細胞骨格と結合する像が観察された（図3）．一方，SCn筋組織に正常マウス血清を加えた群では，細胞膜直下の細胞骨格に図3で見られるような免疫反応産物は認められなかった（図2）．細胞膜にほぼ水平に凍結割断され細胞陵直下がよくみられるレプリカ像

Replicaelectronmicrographsforimmuno・
Stainingofdystrophininscnmusclefibers．

（A）Microfilaments（arrowheads）areregularly organized deepinside the cyto−
plasm．The DAB decorated networks（arrows）arelocalized under the cell

membrane（CM）．（B）Most of5−10nm
filaments（arrows）in subsarcolemmal
networks areimmunostained toidentify
dystrophin filaments（arrows）and otherfilementsarenotdecorated（arrowheads）．
（C）Some decorated networks（arrows）
are associated with actin−like filements（arrowheads）．M：COllagen matrix．
−96−

（図3）で細胞膜直下の構造を観察すると図3−B，Cの矢印で示すごとくDABで修飾されたDP線
経の網目状構造が散在性に認められた．また，一部で図3−B，Cの矢印のごとくアクチン様線経との結合も認められた．

告している．このことからDPの細胞膜直下での一様な配列は，筋の収縮一弛緩に対し筋肉細胞の生理的形態の保持に重要な役割を果たしていることが推測されるが，玩＝めβの成熟した筋組織でのDPの細胞膜直下での網目状の配列と，そのDPの他の細胞骨格蛋白との結合の確認は，DPの細考察
今回我々は，成熟した筋組織のわ‡わびOにおけるDPの細胞内局在をQF−DE法により検討し，
DPは細胞膜直下で細胞骨格の一部を構成し，部分的に網目状構造を呈し，その一部はアクチン様線経と結合を有することをあきらかにした．
また我々は，ヒト筋細胞−ラット脊髄片併置培

胞膜直下での裏打ち機能を明らかにする上で重要な所見と考えられる．
結論

DPは成熟した骨格筋では，その細胞膜直下に
filamentous networkを形成し，aCtinlike file−mentと結合を有する．

養系を使用して，筋の分化，成熟に伴うDPの局在について検討をおこなったが，DPは未熟な筋管細胞では，細胞内及び細胞膜直下に不規則に存在
し，innervationを受け持続的に筋収縮している細胞では，細胞膜直下にDPは連続性に存在する
ようになる．一方，tetrOdotoxinにより筋収縮を
blockすると，Chemicaltransmissionが存在していても，DPの分布は未熟な筋管細胞と同様な細胞膜直下での不規則な分布に留まることを既に報

−97−

文

献

1）Park−MatsumotoYC，KamedaN，Kobayashi
T and TsukagoshiH：Developmentalstudyof the expression of dystrophinincultured
humanmuscleaneurallyandinnervatedwith
fetal rat spinal cord．Brain Res565：280−
289，1991．

Ⅳ．mdxマウス

15）運動負荷による成熟mdxマウス筋変性への影響
田

研究協力者

目

退

等＊

水 野 美 彦＊＊的

腹中央部の全横断面切片について，初期変性所見

MDXマウス（以下MDX）は，Duchenne型筋
ジストロフィー（以下DMD）と同様にジストロフ
ィン（Dy）欠損を示しながら，臨床的にも筋病理
学上も進行性を示さないが，その機序は充分には解明されていない．これまでの研究で我々はMDXマウスに不動化あるいは運動制限を加える
ことにより，筋変性が抑制されることを報告し，筋変性は運動それ自体で促進される可能性について述べてきた．本年は逆に筋運動を負荷することによる変性への影響を調べたので報告する．

である，hyaline degeneration，及び，phago−
CytOSisの占有面積の仝横断面積に対する比率を調べた．各群の略語は，無処置群（Ux），実験群のTetanus側（Tx），同じく非Tetanus側（Cx）とする．
結果（1）筋電図
Local tetanusにおける針筋電図所見は図1にEMG（uxaH階bnushMDXmouse）

対象・方法
生後3−4ヶ月のMDX12匹，及び対照として
B−10マウス6匹を使用した．この月齢ではMDX
は再生過程を経て，変性に関してはほぼ安定期に入っていると考えられる．方法としては，MDX群
8匹，及び対照群6匹にTetanustoxinを1回，右俳腹筋（GAC）に筋注し，localtetanusを生じさせた．残りのMDX4匹は無処置にて自然飼育とした．Local tetanusを誘発したMDX群の内SOL2匹については，local tetanus発現後GAC，ヒラメ筋（SOL），前脛骨筋（TA），長母址伸筋（EDL）
について針筋電図を施行し，筋収縮の状態を観察した．実験群では，local tetanus出現後3，5，
7日後に両側SOL，EDLを採取，無処置群4匹については実験開始5日目の時点でSOL，EDLを採取し組織学的に検索した．検索内容としては筋20mS＊東京都立神経病院■十東京都立神経病院神経小児科

llmV

図1Localtetanusにおける針筋電図所見．
GAC，EDLの一部にはmyotonic dischargeも認められる．
−101−図2

A．Ux−SOL．Focalphagocytosisが認められる（→）．HE95×
B．Ux−EDL．Focalphagocytosisが認められる（→）．HE95×
C．Localtetanus7日目のCx．SOL Focalphagocytosisが認められる（→）．HE95×
D．同Tx−SOL．初期変性像は認められない．HE95×−102−

表 急性変性部の平均比率（％）
実

S O L

E D

L

験
日

U

C

x

T

x

C

x

T

x

3

1 ．0

0 ．3

2 ．3

4 ．6

5

1 ．4

0 ．2

9 ．5

0 ．8

7

2 ．5

0 ．3

1 1 ．5

0

x

0 ．4

0 ．1

5

SOLでは図2Aに示す如く4匹中3匹に，また，
図2Bに示す如くEDLでは1匹に，きわめて局所的な初期変性像が認められたが，いずれにおいてもmassive degenerationの所見は認められなかった．平均変性面積は表に示す如く0．4％であっ
た．

0

4

示す如く，検索した4つの筋全てにおいて中等度収縮に相当すると思われるNMUが観察された．
一部にはmyotonic dischargeも観察された．
（2）無処置MDXにおける筋組織所見
自然飼育した生後3−4ヶ月のMDXでは

−
3
1

3

5

7

SOL EDLU x

図4 急性変性像の比率

考察

MDXマウスでは生後3週頃から始まる変性・（3）Local tetanus時の対照B−10マウスにおける筋組織所見

再生のサイクルを経て，3ヶ月頃を過ぎるともはやmassivedegenerationは見られず，今回のUx

B−10マウスにおいては，Tx，Cxいずれにおいても変性は全く認められなかった．
（4）Localtetanus時のMDXの筋組織所見
先ず，SOLについて見ると，表に示す如くTx

群に見られた様な僅かな局所的な変性が散発する程度となり，その他の線経は大半が中心核を有す
る再生線維となる．これがMDXでは進行性を示

ではUxと比較して差がなく，一方，Cxでは3，
5，7日共Ux，Txに比較して変性部の比率が多いがその程度は軽微である．図2C，Dに7日目のCx，Txの組織像を示す．一方，EDLでは3日目
ではTxの方がCxより変性部の比率が若干高くなっているが，5，7日後ではCxで変性がかなり強く，Txでは殆ど変性は見られなくなっている．
図3A，B，C，Dに5，7日目のCx及びTxのEDLの組織像を示す．また，図4に表の結果をグラフで示す．

さない要因となっているが，同じDy欠損を示しながら何故DMDでは変性が進行し，MDXでは進行しないのかは未だ充分には解明されていない．
今回の実験ではlocal tetanus側では筋電図所見から分かるように，筋の収縮は中等度に見られるが，関節運動は伴わず固定されている．MDXのTx側で変性の冗進が見られなかったことは，関．
節運動を伴う筋収縮が変性の成立には必要である
ことを示唆していると思われる．一方，Cx側は片足で歩くため運動負荷が加わっていることになる．
Cx−SOLでの変性増強は軽度で，Cx−EDLの方が変性増強が強かった．片足での歩行を観察すると，前進時，足関節を底屈する際にはSOL及び

−103−

図3

A．Localtetanus5日目のCx−EDL．筋腹の周辺部を中心に，広汎なphagocytosisが認められる．HE95×

B．同Tx−EDL．極めて軽微なphagocytosisが認められる（→）．HE95×
C．Localtetanus7日目のCxLEDL．筋腹の周辺部を中心に，広汎なphagocytosisが認められる．HE95×

D．同Tx−EDL変性像は認められない．HE95×−104−

Plantarismuscle（PL）に強く負荷がかかること

タイプ2線経であることを考慮に入れると，先にになる．一方，EDLは底屈した足址を急I、で背屈する際に働くわけだが，負荷の程度はSOLやPLの方が強いと考えられる．それでもEDLの方が変性増強の程度が強かったことは，筋線維タイプ
による変性への態度にも違いがある可能性を否定できない．DMDではタイプ1優位が見られるが，
タイプ2線経の方が変性に陥り易いと仮定すれば説明がつく．この点は更に検討する必要があるが，述べたように筋線維タイプによる差と直径の両者

いずれにせよ，安定期にある成熟MDXマウスにおいても，運動負荷がかかれば更に変性が進むという事実は，MDXは基本的にはDMD同様進行性であることを示唆している．それでは何故非進行性を示すのかは，例えばDMDと比べて体重は500分の1位小さく，一方，筋線維直径はDMDの1）KarpatiG，CarpenterSandPrescottS：Smallcaliber skeletalmuscle fibers do not sufferが関係していることも否定できない．いずれにせよ，これらの成績を考え合わせると，DMDでは運動負荷を出来るだけ避けて生活した方が，病気の進行が遅くなるのではないかということが示唆された．

半分位もあり，更に四つ足歩行による負荷の軽減などの条件の違いが，筋線経に対する負荷の違いとなって表れ，DMDに比べて変性が起こりにくいという機序が推定される．これまでのMDXに

文

献necrosisin mdx mouse dystrophy．Muscle
Nervell：795−803，1988．
2）中村晴臣，高田邦安，加藤信介，本田誠四郎：
mdxマウス骨格克別こ対する神経切断の影響．
厚生省「神経疾患研究委託㌍」筋ジストロフィー症の臨床，病態と成因に関する研究 （杉田姓）
昭和60年度班会議報告書，1986，pp39−43．
3）田通 等，水野英彦：「lmmobilizationによるおける筋変性に与える影響に関する研究では，脱神経1）2），脊髄切断による廃用性萎縮1），不動化3），
運動制限4）による変性抑制が報告されている．

mdxマウス筋変性への影響」−Local tetanus

Karpatiら1）は，MDXの外眼筋であるrotator
muscleでは変性が全く見られず，同じ外眼筋の一つであるretractor muscleでは変性が見られる態とその病因に関する研究 （杉田班）平成元年

ことを報告している．この場合，前者は後者に比べて筋線維直径が小さく，その事が筋線推膜への単位面積当りの緊張の減少となって表れ，変性を起こさない機序ではないかと推論している．但し，前者はミトコンドリアに富みタイプ1線維であると思われ，一方，後者はミトコンドリアが少なく，−105−

法による検討一・ 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病度研究報告書，1990，pp151−155．
4）田通 等，水野美彦：「Immobilizationによる
mdxマウス筋変性への影響」−第2報− 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフ
ィー症及び関連疾患の成因とその治療法開発に関する研究 （荒木虹）平成2年度研究報告書，
1991，pp191−196．

16）mdxマウスの電気的病態と薬物治療，筋活動電位の分析，及びミオトニーの数理的解析
＊

幸

照

原

票

＊

＊

秋信
▲T

千隆

村高

西日

＊

ヤ肘

一大﹂

口

＊

＊

＊

田本

寺根

＊

彦治男

雅修眞

沢下

岸富木

研究協力者

＊

mdxマウスでは筋細胞膜の裏打ち蛋白である
dystrophinが欠如している．mdxマウスの筋細胞
膜の機能的異常としては，電気生理学的に検討した結果，膜電位の低下した筋線経と正常な筋線経が混在すること及び電気的ミオトニーが認められることである1）．
現在までミオトニーの発症機序としては，①先天性筋緊張症（Thomsen病）のように筋細胞院のCIconductanceが低下して起こるものと2），②筋
緊張性ジストロフィーやparamyotoniaのように
fastNacurrentの異常によるもの，（診recessive
generalized myotonia（Becker）のようにCI
COnductanceの低下とNa channelがrandomに開くことによってミオトニーが起こるもの3）が報告されている．
今回mdxマウスの電気的ミオトニーは神経筋
接合部のブロックによっても，興奮収縮連関阻止（EC−unCOupling）によってもミオトニーが生じる
ことから筋細胞膜の異常によって起こっていることを実験的に確認した．イオンチャンネルの異常については特にNa channelについて筋活動電位の立ち上がり時間，Vmax等を計測した．又，薬物を用いた治療的研究結果をまとめた．
ミオトニーの数理解析は，昨年度はカエルのパのパラメーターをHodgkinTHuxleyの方程式に入れてミオトニーの発症機序を解析し，ミオトニ
ーがどのような膜の異常で起こり得るかを明らか
にした．
対象と方法
1）電気生理学的実験
mdxマウス，及びコントロールのC57BL／10Sc
マウス，Wistar系ラットを対象とした．横隔膜神経を付けた横隔膜標本を作成して，ガラス管微小電極を用いて筋細胞内記録を行った．Excitatiori−
COntraCtion uncouplingは400mMの高張グリセ
ロール溶液と等張のWaShing solutionを用いて
t−tubularsystemを選択的に破壊する方法をとった．神経筋伝達blockはd−tubocurarineを用いた．
又，mdx及びBlOマウスの標本において横隔神
経刺激を施行し，細胞内筋活動電位を測定した．
活動電位波形はA／Dコンバーター及びパーソナ
ルコンピュータを用いて，サンプリングクロック
10KHzにて取り込み，10〜20本の筋線経から活動電位のpeak voltage，rising time，half decay
time，Vmaxを測定し，統計学的な検索を行った．
2）数理解析
解析を対象としたモデルは，昨年報告したカエ

ラメーターを用いたが，本年度は哺乳動物骨格筋＊東邦大学医学部第四内科＊＊東邦大学医学部医学情報学研究室＊＊＊東京大学工学部計数工学科

ルの場合4）と同じHodgkin−Huxley方程式（但しNa活性化の移動速度αmの時間微分の分母を，6．85）と置き換えた）で，主に文献6）に基づき，以−106−

下の哺乳動物骨格筋のパラメータを用いた．
gNa＝50αm＝0．08

VNa＝50Al＝0．8

gK＝22

Vm＝−55

VK＝−70αh＝0．006

Vn＝−40β、＝1．3cm＝1．9gl＝0．4

Vl＝−81

Vh＝−41〇一t、．bocurar＝nelO￣6よノmlα。＝0．0088
β、＝0．037（記号と単位は昨年と同じ．）

モデル方程式上でこれらのパラメータを変化させて，連続発火の起こりやすさを調べた．
結果」1）電気生理学的実験

ヱORV

C．15eこ図l aは，mdxマウスの電気的ミオトニーがd−tubocurarineによって神経筋接合部をblock
しても起こることを示す．図lbはE−C un−

ElectricaJmyotonia of mdx mouse

COuplingをしてもmdxマウスでは電気的ミオト
ニーが起こることを示す．

aflerE−Cuncoupling

mdxマウスの電気的ミオトニーの特徴をまとめると次の5点が特徴的である．
①臨床症状としてbehavior myotoniaはない．
（righting responseが遅くなることはない．）②低温（260C以下）で起こりやすい．
③神経筋伝達阻止でもE−C uncouplingでもburstは止まらない→筋細胞膜の異常で起こっている．
④Nachannelを阻止する薬物（tetrodotoxineやDPH）でburstは阻止できる．
⑤bestatinとmexiletineはbrustを阻止し，
RMPも改善し得る．

図1

mdxマウスでは，RMPの正常な線椎と低下した線経が混在するが，RMPの低下した線椎では筋活動電位は出現しなかった．図2に示すように，
筋活動電位の波形はmdx及びBlOマウスで差は認められなかった．又，peakvoltageにもほとん

a：mdx mouseで神経筋伝達ブロックをしても電気的ミオトニーが起こること
b：E−Cuncouplingをしても電気的ミオトニーが起こることを示す．

えられるが，今回の実験ではmdxマウスにおけど差は無く，50mV以下の波形は，測定条件不良とるfastNacurrentの異常は検出できなかった．
2）数理解析

判断し，peakvoltageが50mV以上の波形に限定

図3に，gl（Clを主とするリークコングクタン

して各パラメーターを計測した．しかし，Vmax，ス）と，Vm（Naチャンネル活性化因子mの移動度の電位依存性定数）の値の組に対し，周期発火

rising time．half decay timeのnon二matChed

tTteStを用いた比較では，表1のように検定P値はどれも5％以下であり，有意差は認められなかった．VmaxはfastNacurrentを反映すると考が生じる領域を示した．周期発火は，glの低下のみでも生じるが，同時に∇言が過分局側に変化（上昇）すると，glのより高い倍から起こるようにな−107−

る．すなわち両方の変化が起きると周期発火がより生じやすくなる．周期発火の生じる領域の周辺
では，初期刺激の強さにより，数回の連続発火が生じる．
以下，周期発火の生じるglの最大値を指標に他のパラメータについて連続発火の起こりやすさを調べたところ，パラメータが以下のように変化すると，連続発火が生じるか，または生じやすくなった．
・Clコングクタンス低下：gl低下
・Na透過性の増大：Vm上昇・gNa上昇等
・K平衡電位低下：Vx低下：2．88（msec／div）

図2

・K透過性の増大：∇ニ上昇・gx上昇等
・RMP低下：Vl低下
但し，K透過性の増大の影響は小さく，単独では連続発火を生じない．

mdxマウスとBlOマウスの筋活動電位の比較．両者に差は認められない．

5
0
4
0
2
0
1
0

ー60

察

ミオトニーの発症機序については現在までの文献をreviewすると表2のような報告がある．これをまとめると（》CI conductanceの低下による
ミオトニー，②fast Nacurrentの異常によるミオトニー，（診CIconductanceの低下とNachan−nelがrandomに再び開くということの両方でミ

30雫︑︒上皇︵代人芸文∩︵−︒︶ミ■︶−D

考

−58

−56

−54

−52

Vm（Na活性化田子移動度の電位倭存性定数）lmⅥ

図3 周期発火が生じるg．とVmの範囲．
図の三角形の領域内で生じる．

−50

オトニーが起こる3）という三つの場合が報告されている．
数理解析で求めた連続発火を起こす膜の電気特性の変化方向は，現在までに各種ミオトニーの原

表l mdx及びBlOマウス問の活動電位に関する各パラメータの比較．
Vmaxを含む各パラメータ問の検定でもP値はすべて5％以上であり，有意差は認められない．fast Na currentの異常は検出できなかった．
Parameters of action potentiaJs BlO（control）arid rndx mice

P va lue （non−
BlO m ice
mdx m ice（n ＝18）（∩＝8） matChed t−
teSt）
RM P
（
mV）86．
1 ±4．
5 8 2．
0 ±4．
9
0．
06
Vmax
（
V／
sec）118．
8 ±26．
5 113．
1 ±19．
00．
61Peak vo ltage（mV）62．
3 ±7．
3 67．
1 ±6．
4
0．
13
R is ing time（ms）1．
06 ±0．
13 1 ．
11 ±0．
11
0．
36
Ha lf−
decay t ime （ms）1．
04 ±0．
17 1 ．
06 ±0．
15
0．
80
ー108−

表2

文献的考察 ヒトのミオトニー疾患及び動物モデルにみられるミオトニーの病態生理や特徴を示した報告のまとめ．

種 々の■■ミオ トニーー
1）m yotonia con9enita （Thom sen）
2）hereditary m yotonia of goat3）A −9−
C によるm yotonia
4）低C l溶液によるm yotonia

病態生理 ・特徴

報告者
Lipicky ら （1971）と禁 霊‡ミ；≡：；

C ・conducb nce の低下

K urihara ら （1984）
R udelら （1980 ．
1989）
Lehm ann．
Horn ら（1987）
Lehm am ＿Hom ら（1987）

5）m yotonic dystrophy6）param yotonia
7）adynam ia episodica her．

fast Na currentの異常

8）hereditary generarized m yotonia（
Becker）① fastN a currentの異常
Rudelら （1989）② Na ch．
の異常とC Icond．
低下 Franke ら （1991）

9）m urine genetic m yotonia（
m to m ouse）① true m yotonia②ィ崇 諾 諾 ；のA icheTe ら （1985）
M ehrke ら （1988）

10）dystrophic chicks

筋の肥大と萎縮による

Entrikin ら （1982）11）dystrophic （dy／dy）m ouse

末梢神経の異常による

Entrikin ら （1987）12）m dx m ouse

低温で起る電気的 ミオ トニー K urihara ら （1990）

因と考えられている変化の方向を含んでいる．また現在知られているミオトニー治療薬の薬効にも考えられる．mdxマウスのようにdystrophinが欠損していても，または他のミオトニー疾患のよ合っており，生理的事実をよく説明している．
mdxマウスについては，fastNachannelの異理的変化により上記のような方向へ変化すればミ常ではないという結果を今回報告し，CI con−オトニーが生じ得ることを数理的に示した．

うにdystrophinが存在していても筋細胞膜の生ductanceの低下の有無については今後の検討に
文

侯つ．

献

1）Kurihara T，Kishi M，Saito N，et al：

結ElectricalmyotoniaandcataractinX−1inked

語

mdxマウスの電気的ミオトここは神経筋伝達musculardystrophy（mdx）mouse．JNeuroI
Sci99：83−92，1990．

ブロックをしてもE−C tlnCOuplingをしてもburstが起こるので，筋細胞膜の異常で起こるこ

2）Lipicky RJ，Bryant SH and SalmonJH：とを実験的に証明した．次に陵のどのような異常

Cable parameter，Sodium，pOtaSSium，Chlo・かについては今回fastNacurrentの異常は見出ride，andwatercontent，andpotassiumefflux

されなかったので，更にCIconductanceの低下がinisolated externalintercostal muscle ofあるか否かを中心に検索を進めればよい．

normal volunteers and patients with

数理的に哺乳動物のパラメーターを用いて検討した結果では，ミオトニーの起こる原因としては，CIconductanceの低下，Naconductanceの増大，

myotoniacongenita．JClinInvest50：2091−
2103，1971．

3）FrankeC，IaizzoPA，HattH，etal：Altered

K平衡電位低下，Kconductanceの増大，RMP低Na＋下等の変化が筋細胞膜に生じ，時には一つだけでconductancecausehyperexcitabilityinreces−

なく複数の項目が変化してミオトニーが起こるとsivegeneralizedmyotonia（Becker）．Muscle−109−

channelactivity

andreducedCl．

NeⅣe14：762−770，1991．

normalanddenervatedmammalianskeletal

4）TeradaK，YoshizawaSandNishim。raC：

musclefibers・JPhysio1280：377−410，1980．

Periodic firinginmuscle membraneatlow

6）Adrian RH and Marshall MW：S。dium

Chloride conductanCe．IEICE Trans E74：
999−1002，1991．

CurrentSin mammalian muscle．J Physio1
208：223−257，1977．

5）PapponePA：VoltageLClampexperimentsin−110−17）mdx胎仔骨格筋の電位依存性カルシウムチャンネル
について
＝ヒ
ロ

研究協力者

瑞 子＊

勲＊＊ 松 崎 哲 也＊

井 上

は じめに

の肋間筋のmyotubeを用いた．Myotubeは肋間Duchenne型ジストロフィー症（DMD）とそのモデルマウスmdxはジストロフィン欠損の膜異mg／ml trypsin（typeIII，Sigma）を含む，phos−

筋を3mg／mlcollagenage（typeI′，Sigma）と1常である．しかし未だに骨格筋壊死の原因は不明
である．これまでの報告書から，この原因が骨格筋の刺激一応答機構，特にかレンウムイオンの細胞内への流入機構にあるのではないかと考えた．

phatebufferedsaline（pH7．2）中で10〜14分間370
Cで浮置して得た．分離したmyotubeをKrebs

即ち1）筋組織内にカルシウムの蓄積がある1）．しかし2）細胞内カルシウムイオン濃度は正常値を示す2）．3）脱神経した筋細胞は壊死しない3）．4）
Z−lineの乱れがある4）．5）筋小胞体の機能は正常5）．6）筋壊死が起こるまで，筋細胞として機能している（例えばmdxは発生から誕生後3週齢頃まで壊死が起こらない）6）．これらのことから，
刺激一応答機構に異常があり，刺激を受ける度に，カルシウムチャンネル電流は，Whole−Cell volt−

細胞外から細胞内にカルシウムイオンが流入し，その一部のカルシウムイオンが，細胞内に徐徐に蓄積していく．そのため細胞内の局部に乱れが生じ，筋壊死へ陥ると考えた．
T一管の膜電位依存性L−型カルシウムチャンネ
ルは，筋細胞が刺激を受けた時，その刺激を細胞内に伝達する為に重要な役割を果たし，それと同時にカルシウムイオンが細胞内に流入する．そこ
でこのチャンネルについて調べた．
試料と方法
mdxとその対照マウスBlOの胎仔16−18日齢＊国立精神・神経センター神経研究所■■徳島大学医学部情報生物

溶液中でカバーグラス上に接着させ，カルシウムチャンネル測定用溶液に移し，顕微鏡下に置いた．
ageclamp法で，瞑電位を−80mVに固定して・
そこから脱分極を与え，内向きのBa2＋電流として記録した．L−型カルシウムチャンネル電流は，prepulse（−30mV，100ms）を与え，T一型カルシウ
ムチャンネルを不活化させた後（40ms）記録した．細胞外溶液は10mM Ba−methanesulfonate［Ba（MeSO3）2］，120mMTetraethylammonium−
MeSO。［TEA−MeSO3］，10mMMOPS−TEA，3jL

Mtetrodotoxin（TTX）（pH7．4），ピペット内溶液は，140mMCs−aSpartate，10mMMOPS−Na，5mMEGTA，5mMMgC12（pH7．2）を用いた．
電極抵抗は約1Mrlで，総ての実験は室温で測定
した．
結

果

17日齢のmdxとBlO胎仔骨格筋の膜電位を−80mVに固定し，その電位から鱒分極した各電位における，電流及び電庄一電流曲線を図1AとBに示す．mdxのL一型カルシウムチャンネルは約−40〜−30mVの膜電位で活性化した．その膜電位は対照（BlO）に比べ約10mV低い電位だった．
L一型カルシウムチャンネルが最大に活性化され

−111−

mdx

BlO

Vm（mV）
ー50

●

−40

−30

mdxlいり2

0

81O

−

SD

n王≡10

γA小F
−20

V￣10

￣＼ここ二二「■￣ 0「ここ二二二〔
￣￣

」

」

「￣10

「￣20＼

→く、．一二「一一√30￣し＿一二「−一一
40

1−＿

−￣

￣

ミ加S u叫√図1A）mdxとBlOのmyotubeのL一型カルシウムチャンネル電流
Whole−Cellvoltage clamp法で，−80mVの固定電位より脱分極した時のBa2＋電流
B）A）の電圧一電流曲線

る膜電位は約OmVで，この電位もBlOのそれに比ー型カルシウムチャンネルを測定したことを示す．

べ約10mV低い膜電位だった．図1Bの電圧一電流曲線から得られる最大コングクタンスには，mdx

考とBlO問に差がなかった．

察

mdx骨格筋の股電位依存性L一型カルシウムチ

最大コングクタンスに対する，各膜電位のコンャンネルが，対照のBlOのそれよりも低い股電位

グクタンスの比を図2に示す．17日齢のmdxは（約一40−−30mV）で活性化されることが明らか

約−40−−30mVでコングクタンスが大きくなりになった．即ちmdx骨格筋は，刺激により対照の始め，BlOのそれに比べ約10mV低い電位だった．

BlOよりも低い電位で，カルシウムイオンが細胞

1／2コングクタンス比では約6．5mVであった．16

内に流入することがわかった．

日齢のmdxとBlOでは，この差が小さくなり，約この異常はmdx骨格筋の発達により冗進する

4mVだった．18日齢は17日齢の結果とほぼ同じだった．

ことが図2より示唆されている．

▼このように異常を示すカルシウムチャンネル電流が，T一管にあるL一型カルシウムチャンネルで骨格筋は細胞内に徐徐にカルシウムの蓄積が起こあることは，その特異的阻害剤で確認した（図これらの結果より私達が予想したように，mdx
り，乱れが生じ，筋細胞は壊死に陥るのであろう．
今後この確認を行う．

3）．17日齢のmdx骨格筋に（図3A），1FLMニ7
ェジピンを作用させると10分後に，電流はほとん
ど流れなくなった（図3B）．このことは，正しくL

ま

と

め

1）mdx胎仔骨格筋の電位依存性L一型カルシウ

−112−

ー50

−40

−30

−20

−10

0

10

20

30

40

50mV

B

一幸iii去￣￣ ￣一￣￣￣ ￣￣毒TT
！

−50

図2

−10

−30

−20

−10

0

10

20

30

40

可2州F

50mV

mdxとBlOの最大コングクタンスに対する，
脱分極した各電位でのコングクタンス比A）16日齢，B）17日齢

ムチャンネルは，対照のそれよりも低い電位で活性化された．
2）1）の為にmdx骨格筋内に，BlOよりも低い膜電位で，カルシウムイオンが流入する．

図3

L一型カルシウムチャンネルに対するジ
ヒドロピリジン誘導体の効果
A）17日齢mdx胎仔骨格筋のL一型カ
ルシウムチャンネル電流（国定電位は−80mV）
B）A）の細胞に1JJMニフェジビンを作用させ，10分後のBa2十電流

3）1）の現象は，骨格筋の発達によって克進する
mousedystrophy・Muscle＆Nervell：795，

ことが示唆された．

803，1988．

文献1）DunnJFand RaddaGK：Totalioncontent
of skeletal and cardiac musclein the mdr
mousedystrophy：Ca2＋iselevatedatallages・4）Torres LFB andDuchen LW：Themutant
m血：Inheritedmyopathyinthemouse・BrainllO：269−299，1987．

5）高木昭夫ほか：mdxマウス骨格筋における（Ca）濃度調節， 厚生省「精神・神経疾患研究委

J NeuroIScilO3：226−231，1991．
2）吉田稲子，柴崎

浩：mdxマウス骨格筋内の託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の成因

Caイオン濃度．

厚生省「精神・神経疾患研究と治療法開発に関する研究（荒木姓）平成2年

委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病
態とその病因に関する研究（杉田珪）平成元年
度研究報告書 ，1990，pp145− 146．
3）Karpati G，et al：Small−Caliber skeletal
muscle fibers do not suffernecrosisinmdx−113−

度研究報告書 ，1991，pp167−169．
6）TanabeY，etal：Skeletalmusclepathology
inXchromosome−linkedmusculardystrophy（mdr）mouse．ActaNeuropathol（Berl）69：
91−95，1986．

18）mdxコントロールマウス骨格筋細胞膜ジストロフィン
分子のdeepetchingreplica法による観察
若 山 吉 弘＊

研究協力者

緒

渋 谷 誠 二＊言

Quick freeze，deep etch，rOtary Shadow（QDR）法によるreplica膜の電顕的観察は細胞骨格の3次元的観察に適しており，membrane
CytOSkeletalinteractionやcytoskeletal ele−mentsの微細構造の解明やその相互間の関連を研究するのに極めて有力な手段であり，特に細胞膜と細胞膜関連細胞骨格との相互関係を解析するには極めて有用である．従来我々はmdxコント
ロールマウスやmdxマウスを用い，QDR法によるreplica膜の電顕的観察にてジストロフィンの超微形態とその存在様式を研究してきている．本
年度は抗ジストロフィン抗体標識骨格筋標本の本法による研究を行ったので報告する．
材料と方法
6匹ずつのmdxコントロールマウス，mdxマ
ウスの大腿四頭筋を冷却した4％パラフォルムア
ルデヒドの0・1Mリン酸バッファー溶液（pH7．2）
で1時間固定後0．1Mリン酸バッファーにてよく洗浄し，液体窒素冷却イソペンタン液中で凍結徽
クリオろタットにて細切した．細切標本をよく洗浄後，非特異的反応を除去するため5％正常ロバ
ないしヤギ血清を室温にて30分間反応させた．そして1次抗体としてDrs．Hoffman，Byersより供与された羊抗60kDaジストロフィン抗体又はウサギ抗6−10抗体のそれぞれ1000倍希釈液にて40C24時間反応させ，0．1Mリン酸バッファー溶液にて4回洗浄した．2次抗体は100倍希釈ビオテ
ン化ウサギ抗羊抗体（Vectastain，Vector Lab．
U・S・A）あるいは20倍希釈10nm金コロイド標識ロ
バ抗羊（BioCell，UK）又はヤギ抗ウサギ（Amer＿
Sham，UK）抗体を40Covernightから24時間反応させ，よく洗浄後冷却した2．5％グルタールアル
デヒド溶液にて40C30分間再固定した。2次抗体
標識標本のうちビオテン化2次抗体反応標本の一部をABC法にてDAB反応させたものと，金コロイド標識標本の一部をともに冷却1％OsO4溶
液で1時間固定後エボンに包埋し超薄切片を電顕にて観察した．QDR法用には金コロイド標識2次抗体液がグリセロールを含むためにこれを除去し，またバッファーの塩類除去のため蒸留水にてよく洗浄した．急速凍結はエイコー社製RF23型急速凍結装置にて液体ヘリウムで行った．急速試料凍結装置Eiko RF23型に液体窒素と液体ヘリウムを入れ−2690Cまで冷えた純鋼blockに採取した筋の小片を庄着し急速凍結した．その後標本をEikoFD5A凍結割断装置に移し−150−−1700C，
真空度1−2×10￣7Torrで凍結面の表層を割断
した．割断後試料台の温度を−900Cまで上昇し約30分間deepetchingをおこなった．Deepetching
後試料台に装着した標本の温度を−1600C前後まで冷やし，プラチナとカーボンを回転蒸着してreplica膜を作製した．電顕写真は金コロイド抗体
標識標本のものは金粒子の判別を容易にするため
白黒反転して焼き付けた．

＊昭和大学藤が丘病院神経内科

ー114−

麗
謂

㍉■三一∵了解￣や■二∴■■∫■．￣′雫、r′2

−116−

図1mdxコントロールマウス筋細胞膜の高倍電銅像で，矢印は筋細胞股裏打ち構造を示す．（×85，800）
図2 羊抗60kDaジストロフィン抗体による
immunoperoxidase染色mdxコントロールマウス筋細胞膜の電顕像．筋細胞膜直下に陽性反応産物（矢印）がみられる．
（×42，900）

図3

図4

図5

羊抗60kDaジストロフィン抗体とビオ
ナン化ウサギ抗羊2次抗体反応mdxコントロールマウス骨格筋標本のQDR法
によるreplica掟の電顕像．筋原線推（MF）と筋細胞膜真内表面（CS）との間に細胞膜裏打ち細胞骨格が観察される．
それらのなかに矢印で示す様な抗体で太く修飾されたジストロフィン分子と考えられる細胞骨格がみられ，これは筋原線
維最外層の5nm（小さな矢印）の縞紋様
外観をもつアクチンフィラメントと考えられるものと連絡している．
E：Extracellular fracutre face，
B L：Basallamina（×139，200）
ウサギ抗6−10ジストロフィン抗体によるimmunogold染色mdxコントロール
マウス筋細胞膜の電路像．筋細胞膜に沿いそのすぐ内側に金粒子（矢印）の存在がみられる．（×49，300）

A〜C 羊抗60kDaジストロフィン抗体と金コロイド標識ロバ抗羊2次抗体修飾
mdxコントロールマウス骨格筋のQDR法によるreplica膜の電顕像．Aは低倍写真で写真上半の筋細胞院内表面に沿い
細胞膜裏打ち細胞骨格が不均一に存在す
るのがみられる．B，CはそれぞれAの小さい矢印，大きい矢印の拡大像で，それぞれ大きな矢印のような10nm金粒子の付着したジストロフィン分子と考えられる細胞骨格がみられ，多くは1端が他端より細い梓状構造で，端が拡大しているものもみられる．
CS：細胞膜真内表面，E：Extracellular
fracture face（Ax34，800；B，Cx139，
200）

結
果
mdxコントロールマウス骨格筋の通常の透過電顕写真では筋細胞膜裏打ち構造（図1矢印）は雲霞状にしか観察出来ない．これをQDR法によりreplica膜を作製し観察すると低倍像では細胞膜に付着した細胞骨格の群集としてみられその密度は細胞膜内表面に沿い一様ではなかった．更に拡大すると筋細胞膜真内表面に付着した梓状の細胞骨格が網状構造を形成しているが，特に規則的な形状の網状構造ではなかった．
次に，羊抗60kDaジストロフィン抗体のim−munoperoxidase法による染色標本の透過電顕所
見では免疫反応はmdxコントロールマウスの筋細胞膜直下にみられた（図2）．更に羊抗60kDaジ
ストロフィン抗体とビオテン化ウサギ抗羊抗体で染色した標本のQDR法によるreplicaの電顕所見では正常骨格筋細胞膜真内表面に付着する多数の細胞骨格がみられる（図3）．図3の大きい矢印
は抗ジストロフィン抗体修飾ジストロフィン分子で，これは筋原線経に組み込まれた約5nmの縞紋構造（小さな矢印）をもつアクチンフィラメン
トと連絡しているのがみられた．
一方金コロイド標識法による染色標本でも免疫反応による金粒子は透過電顕的にはmdxコント
ロールマウスの筋細胞膜直下に認められた（図4）が，mdxマウスの筋細胞膜には認められなかった．金コロイド標識mdxコントロールマウスのQDR法によるreplica膜の電顕的観察では筋細胞膜を細胞外腔から見ると筋細胞膜のprotoplas−
mic fracture faceに接し，ジストロフィン分子に付着した金コロイド粒子がみられた．他方筋細胞膜を細胞内から観察すると低倍では筋細胞膜内面に沿い筋細胞膜関連細胞骨格の付着がみられる
がその分布は一様ではなかった（図5A）．更に高拡大で観察すると個々の細胞骨格分子が明瞭にみえ，そのなかに10nm金コロイド粒子が付着した
ジストロフィン分子と考えられる細胞骨格が観察された．ジストロフィン分子の多くは1端が他端より細い梓状構造であり，端が拡大しているものもみられた（図5B）．またその多くは図5Cのように筋細胞膜付着細胞骨格の網状構造に組み込ま−117−

れていた．

文献

mdxマウス骨格筋細胞の細胞膜関連細胞骨格

1）Wakayama YandShibuyaS：Observations

は一見mdxコントロールマウスのそれと大差はOn the muscle plasma membrane−aSSOCiatedみられなかったが，金コロイド標識ジストロフィ

CytOSkeletons of mdx by quickLfreeze，deep

ン分子はみられなかった．

etch，rOtary Shadow replica method．Acta
Neuropathol（Berl）80：618r623，1990．

考察とまとめ2）Wakayama Y，Shibuya S and Oniki H：

筋細胞膜裏打ち細胞骨格にはジストロフィン，

Sarcolemma−aSSOCiated cytoskeletons as

スペクトリン，フォドリン，アンキリンなど種々

Seeninthedeepetchingreplica−Withspecialのものが含まれている．我々はここ3・4年来

reference to the ultrastructural difference

mdxコントロールマウス骨格筋の生の無化学固

betweenchemicallyunfixedandfixedmurine

定標本1），化学固定標本2）について更に化学固定標

muscles．J Clin Electron Microsc．印刷中

本の抗ジストロフィン抗体修飾標本3）4）のQDR

3）Wakayama Y and Shibuya S：Antibody

法による検討を続けているが，筋細胞膜裏打ち細decorated dystrophin molecule of murine

胞骨格には際だって特徴的な形態をとったものはSkeletalmyofiber as seenbyfreeze−etChing

なさそうである．本研究ではジストロフィン分子

electronmicroscopy．JElectronMicrosc40：

は（1）正常骨格筋細胞膜関連細胞骨格の網状構造

143−145，1991．

に組み込まれた細胞骨格であること（2）筋原線維

4）Wakayama YandShibuyaS：Gold−1abelled

最外層の5nmの縞紋様構造をもつアクチンフィ

dystrophinmoleculeinmuscleplasmalemma

ラメントと考えられるものとlinkしているもの

Of mdx controlmice as seen by electronがあること（3）その形態が梓状構造で1端が他端

microscopy of deep etching replica．Acta

より細いもの，1端ないし両端が拡大しているもNeuropathol（Berl）82：178−184，1991．

のなど種々であったことが判明した．今後更に

5）HeuserJE and Kirschner MW：Filament

種々の抗体を用い，ジストロフィン分子の筋細胞

organizationrevealedinplatinumreplicasof

膜関連細胞骨格における存在様式を研究してゆきたい．

freeze−driedcytoskeletons．JCellBio186：212−118−−234，1980．

19）dantrolenesodiumによるmdxマウスの実験的治按高 木 昭 夫＊
研究協力者

小 島
進＊ 井 田 雅 祥＊
渡 辺 知 司＊ 黒 岩 義 之＊Dantrolenesodiumは骨格筋に直接作用する筋
弛緩薬として，臨床的に応用されている1）．近年，Quinlanらは本剤によるmdxマウスの実験的治療を行い，血清creatine kinase（CK）値の低下

pentobarbitalによる深麻酔下で開胸し，心穿刺により採血した．血清を凍結保有して，CK活性を
Rosalki変法で測定した．1，000IU／L以上の場合は4％BSA生理食塩水で希釈して測定した．前を報告した2）．またBertoriniらはDuchenne型筋
ジストロフィー（DMD）の治療に使用し，有効性を報告した3）．我々は，mdxマウス骨格筋において
Ca調節異常があること，すなわち筋小胞体からのCa漏出の克進があることを既に報告した4）．今回，筋小胞体からのCa漏出がdantroleneにより影響されるかどうか？mdxマウスの血清CK
値や筋病理がdantroleneにより改善するかどうか？の2点を検討した．
方法
筋小胞体からのCa漏出速度はskinned fiber法により測定した4）．dantroleneの効果は370Cで分析した．dantroleneの全身投与は3週齢mdx
マウスで開始して，4週間に亘って行った．1日
0．3mg（15−20mg／kg／日に相当）を腹腔内に注射した．非投薬群には0．5ml蒸留水（D−mannito1
50mgを含む）を腹腔内投与した．終了時点で，
mdx

表1筋小胞体からのCa漏出速度に対するdantroleneの影響（1／min，370C，mean±S．D．）
Dantrolene（−）0．38±0．06（8）（＋）0．38±0．09（8）n．S．

＊虎の門病院神経内科

−119−

mdx

BlO

dantH dant什）dant（−）
図1mdxマウス血清creatine kinase（CK）
値に対するdantrolene投与の影響．
dant（−）：dantrolene非投与．
dant（＋）：dantroleneO．3mg／日を腹腔内注射．
BlO：対照マウス．dantrolene投与は血清CK値に影響しなかった．

図2 H．E．染色（左）とIgG免疫染色（右）（ともに200倍）．会食細胞の浸入した壊死線経やH．E．染色で濃染した筋線経は，IgG染色も陽性であった．

い，壊死線維識別に応用した5）．
結果1）筋小胞体よりのCa漏出に対する影響（表1）370Cにおけるmdx筋小胞体からのCa漏出速
度は0．38±0．06（n＝8）min▲1であった．50jLM
dantroleneを加えた時の速度は0．38±0．09（n＝8）であり，全く変化しない．BlOの筋小胞体でも同様の実験を行った．この場合にもdantroleneの影響はみとめられなかった．

図32）血清CK値に対する効果（図1）
血清CK値は薬剤投与群17，100±9，800IU／L（n＝9），非投与群16，700±15，300（n＝10）であり，両群間に有意差をみとめなかった．また薬剤
非投与の正常対照マウスの血清CKは，434，665，
292IU／Lの値であった．

opaque fiber のIgG免疫染色（200倍）．中央のopaquefiberはIgG染色で淡染した．しかLopaquefiberの染色性には種々の段階があり，全く染色されないものも存在した．

腰骨筋および大腿四頭筋を採取し，凍結切片を作製した．病理学的検索は主としてH．E．標本において，周辺核線経，壊死線維数を計測した．広範な壊死巣で個々の筋線椎が識別できない場合は，大壊死巣として計測した．
またWellerらの方法で，IgGの免疫染色を行一一120−

3）H．E．染色とIgG免疫染色の比較（図2，3）IgG染色では細胞浸潤を伴う大壊死巣，合食細胞の浸入したghostfiber（図2），一部のOpaquefiber（図3）が染色された．opaquefiberの染色性には種々の程度のものが存在した．H．E．染色のみで，組織計測は正確に行いうると判断した．
4）周辺核線経と壌死線経の定量（表2，3）周辺核線維（非壊死および非再生線経と同義）

表3 Dantroleneの効果（2）大腿四頭筋（mean±S．D．）

表2 Dantroleneの効果（1）前提菅筋（mean±S．D．）

周辺核線維（％）

周辺核線維（％）
dant （−）21．3±7．4（＋）18．7±6．3 m s・
大壊死巣（個／100本）

dant（−）10．7±6．1（＋）18．3±9．9 n．S．
大壊死巣（個／100本）
dant （−）0．6±1．0（＋）0．3±0．4
n．S．
小壊死巣（個／100本）
dant （−）1．9±4．1（＋）0．6±0．6
n．S．

dant

（r）0，8±0・6（＋）0．2±0．2
p＝0．05
小壊死巣（個／100本）
dant （−）1．0±0．8（＋）2．1±2．O n．S．

の頻度は，前脛骨筋および大腿四頭筋の両者において薬剤投与の影響を受けず同等であった．大壊死巣の頻度は前脛骨筋においてのみdantrolene
投与により有意に減少した（表2）．小壊死巣の数
は両者の筋においてdantroleneの影響を受けなかった．
考察
Dantrolenesodiumは骨格筋の興奮・収縮連関に直接作用するというユニークな筋弛緩薬である1）．その作用機序として，筋小胞体からのCa遊離機構への影響が推定されている6）7）．DMDやmdxマウス骨格筋では，筋変性・壊死の成因として，Ca調節異常の関与が推定されてきた3）．この観点から，dantroleneによる試験的治療が行なわれた．Quinlanらはmdxマウスに30mg／kg／日
dantroleneを腸管に投与して，血清CKがほぼ正常化したと報告した2）．BertoriniらはDMD症例に6mg／kg／日dantroleneを4年間に亘って投与して，筋力や血清CK値の改善を報告した3）．木村と梶は，FSH型やLG型筋ジストロフィー症例
でdantroleneが血清CK値低下をきたしたと報
告した8）．dantroleneは従来より悪性高熱の治療薬として評価されている9）．この作用機序はCa誘発性Ca遊離（CICR）を抑制するためと理解されている10）．今回我々はskinnedfiber標本を使用して，dantroleneのin vitYDでの効果を検討した．
mdx筋小胞体ではEGTAを含む溶液中でのCa
漏出克進があることを報告した4）．しかしこのCa
漏出冗進はdantroleneにより影響されなかった．

既にprocaineやMgionの影響をうけないことも判明している4）．したがってCa漏出克進にはCICRが関係ないものと思われる．
今回の実験では，Quin1anらの結果と異なり，血清CK値はdantrolene投与の影響を受けなかった．投与量，投与方法，投与時期などの条件は，両者間で相違しているので，厳密な比較はできな
い．またmdxの血清CK倍はQuinlanらの結果
ではかなり低値なことも問題となろう．
形態学的指標の比較において，前脛骨筋においてのみ，大壊死巣の出現頻度はdantroleneにより有意に減少した．しかし小壊死巣（壊死線維数に相当する）には変化なく，また周辺核線維数にも影響なかった．多くの筋線経が群集して壊死する現象（今回は大壊死巣として計測）は，DMDやmdxで時々観察される．この成因や意義には余り言及されていない．通常の散在する単細胞壊死とは異なるのか否かは今後の問題である．
Wellerらによると，IgG免疫染色はH．E．標本
では識別できぬ早期の壊死線経の確認に有効であるとされた5）．確かにH．E．標本でわずかに淡明化した筋線維内にIgGの蓄積を認める場合がある．
しかし明らかな硝子化線維（opaque fiber）でもIgG染色されないものがあり，IgG染色標本のみで定量化は困難であった．opaquefiberの場合でも，IgG染色強度には種々の段階があるようであり，今後の興味ある検討課題と思われる．
今回の実験的治療では，dantroleneの確実な有効性を証明するには至らなかった．しかし，一部有効性を示唆する結果を得ており，今後投与量やー121−

投与方法を検討する意義はあるものと考える．

平成2年度研究報告書 1991，pp167−169．
5）Weller B，Karpati G and Carpenter S：

結論

Dystrophin−deficient mdx muscle fibers are

九日府川の実験において，mdx筋小胞体からのpreferentiallyvulnerabletonecrosisinduced

Ca漏出冗進はdantroleneにより影響されなかっbyexperimentallengtheningcontractions．J

た．dantrolene（15−20mg／kg／日）を4週間に亘NeuroIScilOO：9−13，1990．

って腹腔内注射した．前脛骨筋において大壊死巣

6）MorganKGandBryantSH：Themechanism

数はdantroleneにより有意に減少した．しかし，Ofactionofdantrolenesodium．JPharmacoI

壊死線維数や再生線維数には変化をみとめなかっ

Exper Therapent201：138−147，1977．

た．血清CK値はdantrolene投与の影響をうけなかった．

7）OhtaTandEndoM：InhibitionofCalcium

induced Calcium release by dantrolene at
mammalian body temperature．ProcJapan文

献

Acad62（B）：329L332，1986．

1）Ward A，Chaffman MD and Sorkin EM：
Dantrolene‥A

review・DrugS32：130−168，

1986．

8）木村

淳，梶

龍治：筋ジストロフィー症におけるdantrolene sodiumの血清CPK値に及ぼす影響． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

2）QuinlanJG，Johnson SR and Samaha FJ：筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法

DantrOlenenormalizesserumcreatinekinase

開発に関する研究（荒木班）平成2年度研究報

in

mdx

mice・Muscle

Nerve13‥268−269，

1990．

9）Kolb ME，Horne ML and Martz R：3）BertoriniTE，PalmieriGMA，etal：Effect。fdantroleneinDuchennemusculardystrophy．
Muscle

告書 1991，pp43−44．
Dantrolenein human malignant hyperther−mia・Anesthesiology56：254−262，1982．
10）OhtaT，EndoM，etal：Ca−inducedCarelease

Nerve14‥503−507，1991．

4）高木昭夫，小島 進ほか：mdxマウス骨格筋にin malignant hyperthermia−SuSCeptible

おけるカルシウム法度調節． 厚生省「精神・神pig skeletal muscle．AmJ Physio1256

経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連（CP25）：C358−367，1989．

疾患の成因と治療法開発に関する研究（荒木班）−122−20）ジストロフィー筋への正常myoblastの注射に関する研究
一注射法の検討−寺 尾 寿 夫＊

研究協力者

日加 藤 洋 司＊ 岡

下 恭 子＊ 石 岡 邦 明＊＊

方

的

法

筋肉を移植した場合，移植された筋は一度変性

Precursorcellの培養法は，昨年報告した2）のとに陥り，乏血に強い衛星細胞が生き残り，活性化

同様に，まずC57BL／10Scの幼若マウスの下肢筋され，これらから新たな筋線経が形成されてくる．

を取り出し，これから結合織，血管などを除く．

最近このmuscleprecurcercell（mpc）または

その後これをtrypsinで処理し，炉過後collagenstemcellを培養により増殖させ，これを直接ジス

coatingdishに移し，培養を行なった．培養に用トロフィー筋に注射し，病的な筋のgenetic con−stitutionを変化させようとする試みが行なわれいたmediumはDulbecco

るようになった．ここ数年間の研究によりl）この方法を筋ジストロフィーの治療に用い得る可能性が高まると共に，その問題点も明らかになってきた．
問題点の一つは，正常mpcの注射によって起る
ジストロフィーの個体側の拒絶反応をいかに防ぐかという点と，ジストロフィー筋の中に正常mpc
をいかに多く，しかも拡散した状態で注射するかという点である．
我々は昨年度は正常のmpcを筋ジストロフィーマウス（mdxマウス）に注射し，拒絶反応を防
ぐためにhostに対する放射線の照射とcyclosporin Aの投与を行い，これらがジストロフィン陽性線経の出現に如何に影響を与えるかを比較した．
今回は，注射するmpcの数を増していった場合にジストロフィー筋に起る変化をジストロフィン
陽性線経の数を指標として調べた．
＊帝京大学医学部神経内科＊＊帝京大学医学部放射線科

smodifiedmediumである．培養が終了したら，trypSinを用いて増殖したmuscleprecursorcell（mpc）を集め，遠心した後にmediumを加えて細胞数が5×108／mlになるようにし，これをジストロフィー筋に注射した．
注射するジストロフィー筋は生後2ヶ月のmdxマウスの長持伸筋（EDL）を用いた．1本のEDLに注射する総細胞数は3×106個である．なお，先回報告したごとく2），正常mpcを注射後hostに起る拒絶反応を抑制するために注射24時
間前にmdxマウスを特殊なcageに入れ，これを回転しながら1匹当り450radのⅩ線を全身に照射した．
注射にあたってはmdxマウスを3群に分けた．
第1群は18匹より成り，これには1回のみの注射をEDLに行なった．第2群は第1回の注射後1週間目に再び同じEDLに3×106個のmpcを再度注射したもの計8匹である．
また第3群は3×106個のmpcを1週間隔で計3回行なったもの計8匹である．なお注射はい
ずれも皮膚を切開し，直視下に行なった．各群とー123−

も最後の注射後10日目にEDLを取り出し，H−E

表l DystrophinpositivefibersinmdxEDL

染色などの一般組織標本を作製し，また抗ジスト

lmonthafternormalmyoblasttransfer（wholebody Xrrayirradiation）

ロフィン抗体を用いて免疫組織学的に検討した．
なお以上の他にEDLを細切して得たmincedhost no ．

ン陽性線経の出現を観察した．方法は生後2ヶ月のmdxマウスのEDLを取り出して締切し，これCO ntrOI

m y oblasttra nsfe rCOntrOl

30／
9 17
20／
67 3
10 ／
1 19 453／
10 4 5
20／
705
15 ／
79 6
25／
12 3 5
16 ／
9 00
22／
9 10
18 ／
1 57 016 ／1 34 336 ／1 4 1720 ／
1 34 16ノ890

5／
1 39 8

3．
3
3．
0
0．
8
5．
1
2．
8
1．
9
2．
0
1．
8
2．
4
1．
2
1．
2
2．
5
1．
5
0．
7
1．
6
0．
6
1．
9

0．
4

7
8
9
10

に3×106個のmpcを混じた後，hostの元のEDLの場所に移植した．移植2ヶ月後に再生筋を

11
12
13
14
15
16
17
18

取り出し，抗ジストロフィン抗体で染色を行なった．この場合もhostに移植24時間前にⅩ線を450rad照射した．

2／
63 0
10 ／
1 27 8
0／
5 24
3／
5 41
0ノ
6 23
2／
1 04 17／8 57
12 ／
1 25 89／
1 74 812 ／1 00 228 ／
1 07 04／
1 3 13
10 ／
961

1 5／
951
3／
520

3／
1 0 00
5／
7 79
9／
899

4 0／
2 0 762 2／
1 4 06

5ノ660

aVerage果％

m yob lasttra nsfer

1
2
3
4
5
6

fragmentにmpcを混じて移植し，ジストロフィ

結

nu m bero Ipo sitive fibers／
to ta lIibers

0．
3
0．
8
0
0．
6
0
0．
2
0．
8
1．
0
0．
5
1．
2
2．
6
0，
3
1．
0
0．
3
0．
6
1．
0
0．
8

1．
6

0．
7 ±0．
6

2．
0 ±1．
1
」

pく0．
01 」

図1はmdxのEDLに正常mpcを1回注射後の抗ジストロフィン抗体によるジストロフィンの

表2のジストロフィン陽性の線維群が散在性に出現すDystrophinpositivefibersinmdxEDL
twotimesinjectionofnormalmyoblast

染色を示したものである．この様に数本〜10数本％
n um be rOt po Sitive fiber＄／
totalt berS
h t○
＄n 0． m yo blasltranSter
COntrOm yo bla sttra nsfer

るようになる．2回注射，3回注射の場合の陽性線維群も，この1回注射の場合に比べ，線維群の出現の状況は変らなかった．何れにも拒絶反応は見られていない．

eo ntr0 −

1

15 ／
702

8／
941

2．
1

0．
9

2

15 ／
765

6／
706

2．
0

0．
8

3

10 ／
697

5／
622

1．
4

0．
8

4

23 ／
980

4／
900

2．
3

0．
6

5

15 ／
1 0 26

5／
11 0 2

1．
5

0．
5

6

1 6／
726

0／
634

2．
2

0

7

2 5／
1102

9／
15 9 6

2．
3

0．
6

8

2 8／
1070

7／
14 5 9a Ve ra9e

2．
6

0．
5

2．
1±
0．
4

0．
6±0．
3

」

pく
0．
01 −」

さて，これらのジストロフィン染色標本を用いて，1本のEDLのいくつかの切片から約1000本
前後の筋線経を観察し，その中のジストロフィン
陽性線経の数を数えた．
表1は第1群18匹の結果を示したものである．
これを％でみると，myOblastをtransferした
EDLでは2．0±1．1％であった．一方生理的食塩水を注射したコントロール側は0．7±0．6％の陽性線経がみられたが，この差は推計学的に有意であった．（P＜0．01）
図1Muscle precursor ce111回注射後1ヶ

表2は第2群の8匹の結果を示したものである．

ン陽性線推（抗ジストロフィン抗体によ2回注射の場合は，myOblasttransfer筋のジスト
ロフィン陽性筋の比率は2．1±0．4％で，この場合

るimmunostaining）にもコントロールに比し有意に増加していた．し月目のmdxのEDL中のジストロフィ

−124−

表3

DystrophinpositivefibersinmdxEDL
巴むq；賢≡のOdu≡dOとS音−0ボ

threetimesinjectionofnormalmyob−
lasthost no ．

nu m ber oI pos itive れbers／
totalI be rs％

m yob last transter

CO ntrOm yo blasttran sIer

COn trOl

1

22／
859

5／
924

2．
8

0．
5

2

28／
1 1 813／
1 2 09

2．
4

0．
2

3

28／
951

9ノ
1 27 8

2．
9

0．
7

4

12／
1 15 810 ／1 14 3

1．
0

0．
9

5

25／
5 68

2ノ
601

4．
4

0．
3

6

36／
1 00 03／
1 00 7

3．
6

0．
3

7

25／
7 98

5／
9 13

3．
1

0．
5

8

46／
13 6 8

3／
68 9

3．
0

0．
4

2．
9±0．
9

0．
5±
0．
2

aV eragO」

1（∩＝18）

図2

かし，1回だけの注射の場合に比し，増加は認められなかった．
表3は3回注射の場合の結果である．この場合はmyoblast transfer側の筋では，ジストロフィン陽性線経の比率は2て9±0．9％とコントロールより有意に増加していたばかりでなく，1回注射の場合の陽性率と比較しても有意に増加していた．
図2は以上3群の結果を棒グラフで示したものである．これでもわかるように1群2群3群とも2（∩＝8）

3（n＝8）

Timesofmyob，asttransferpく0．
0 1 ＿」

Change of numbers of dystrophin
positivefibersaftermyoblasttransfer（mdx EDL）

外陽性とならないためmyoblast transferの効果を判定する指標としては都合が良い．そのためこの方面の多くの研究がこれらを指標としてなされている．しかしこれらの動物実験の成果をヒトの筋ジストロフィーの治療に使用するためには，な
お多くの基礎的な情報が必要である．

コントロールに比Lmyoblastを注射された筋ではジストロフィン陽性線経の数は増加していた．
また3回注射の場合は1回注射の場合より有意に増加を示した．
以上3群の実験ではhostのEDLの衛星細胞は休止状態にあるわけで，注射時の骨格筋の損傷

たとえばmpcのSOurCeは何が一番良いか，注射するmpcの量はどの位必要か，またどの位の範囲に注射したら良いか，ジストロフィー筋の生化がこれを活性化することが考えられる．この活性度を高めるためminced fragmentにmpcを混じて移植を行なった．この場合も陽性線維群が出現するが，各線維群の線経の数は単純注射の場合にまず拒絶反応に関してであるが，移植したmpcに対する骨核筋の拒絶反応に関してはまだ明確で比し変化はなかった．現在混ずるmpcの数を増加しつつ観察しているところである．
考察

近年DMPのgeneの異常やジストロフィンの欠損が明らかになったが，ジストロフィンの働き
やこの欠損と筋萎縮との関係は明らかになってい学的，機能的異常を補うにはどの位の割合でmpcが癒合する必要があるか，拒絶反応をいかにして防ぐかなどである．

ない点が少くない．とくにmajor histocompati−
bilitycomplex（MHC）のミスマッチはヒトでもマウスでもclassI MHC抗原が正常筋にはないとの報告があり3），問題ないとも考えられるが，一方でclassI MHC抗尉まヒト筋で炎症，変性により出現するといわれ4）5），またclassII陽性線経

ない．しかしジストロフィンはimmunostainingによる検出が容易であり，また陰性筋緑経はこのも多発性筋炎で出現しているとの報告もある6）．
さらにジストロフィンそのものもDMDの患者にとっては異種蛋白であり，陽性線経のpeptide抗原は当然問題になると考えられる．我々はⅩ線を照射することにより，拒絶反応を抑制しているが，蛋白をencodeしたgeneを有する核を入れる以拒絶反応がmyoblast transferをヒトに応用した−125−

場合どの程度障害になるかという問題の結論は必ずしも明らかになっているとは言えない．次に大きな問題となるのはmpcの注射法についてである．とくに筋肉内におけるdispersionの困難さが指摘されている．移植したmpcの効果を最高にす
るには，これを有効に散布し，できるだけ多くのジストロフィー筋細胞と癒合させる必要がある．
ここで問題となるのはmpcを筋肉内に注射した
場合，これが注射場所からどの位離れた場所まで移動し，定着するかということである．mpcはマウスの筋内では数mm以上移動するといわれ
る7）8）．しかし0．5cmを越えないともいわれ，その最大限の移動距柾は明らかになっていない．mpc
を筋肉内にいかにdisperseさせるか，また血流を介して筋内に送りこむ方法があるかなどが将来の研究目標になると思われる．なお今回の実験に使用したのは生後2ヶ月を経たmdxマウスである．
この時期の筋線椎は大部分が変性と再生を終え，その中の衛星細胞はdormantの状態にあると考えられる．これがactivateされた状態にあれば正常に筋管細胞との間により有効にfusionを起しうると考えられる．そのため我々はmdxマウス

文献1）Partridge TA：Invited review：Myoblast
transfer：A possible therapy forinherited
myopathies？MuscleandNerve14：197L212，
1991．

2）寺尾寿夫：ジストロフィー筋への正常myo−
blastの注射に関する研究−X線照射の効果．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト
ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成2年度研究報告書，
1991，pp200−203．
3）Karpati G，Pouilot Y and Carpenter S：
Expression ofimmunoreactive major his・
tocompatibility complex productsinhuman

Skeletal muscles・Ann Neuro123：64−72，
1988．

4）AppleyardST，DunnMJ，DubowitzVand
RoseML：IncreasedexpressionofHLAABC
ClassIantigensbymusclefibresinDuchenne
musculardystrophy，inflammatorymyopathy
andotherneuromusculardisorders．Lancetl：
361−363，1985．

のEDLのmincedfragmentを作り，これに3×106の正常mpcを混じて移植を行い再生筋中の5）Emslie−SmithAM・ArahataKandEngelAG；

陽性線経を観察した．この程度の数のmpcでは陽性線経の出現率は単純注射の場合と同程度だった

antigen expression，immunolocalization ofが，注射するmpcの数を増加して検討中である．

CytOtOXityin myopathies．Hum Patho120：

Major histocompatibility complex classI

interferon subtypes and T ce11−mediated224−231，1989．

ま

と

め

6）FletcherJA：Skeletalmuscleexpressiosof

1）mdxマウスのEDLにBlOの骨格筋から培養して得たmuscleprecursorcell（mpc）を1
回3×106個ずつ1〜3回注射した．
2）正常のmpc注射による拒絶反応を防ぐため，
注射24時間前にhostに450radのⅩ線を照射した．
3）最終注射後1ヶ月を経たEDLではジストロ
フィン陽性線経はいずれの注射回数でも有意に場加し，また3回注射では1回注射に比し陽性率は有意に高かった．
4）minced fragmentにmpcを混じて移植し，ジストロフィン陽性線経の出現を観察した．
−126−

ClassII histocompatibility antigens（HLA−DR）in polyomyositis．and other disorders
withirflammatoryinfiltrate．J ClinPatho1
41：410−414，1988．

7）MorganJE，CoultonGRandPartridgeTA：
Muscleprecursorce11sinvadeandrepopulate
freeze−killedmusclegrafts．JMuscleResCell
Moti18：386−396，1987．
8）Watt DJ，MorganJE，Clifford MA

andPartridge TA：The movement of muscle
precursorcellsbetweenadjacent，regenerat・
1ngmuSClesinthemouse・AnatEmbryol175：
527−536，1987．

Ⅴ．遺伝子・生化学

21）筋特異的遺伝子発現に問する神経ペプチドの研究
高 守 正 治＊
研究協力者

安

川

善

博＊

吉

は じめに

川

弘

明＊

押

野

惣

一＊

ットハイフナリグイゼーションを行った．

近年，筋細胞の決定分化因子としてLassarら

今回プローブとして，Dr．Davisより供与されによるMyoDll）やWrightらによるmyogenin2）が発見され，骨格筋細胞分化調節機構の遺伝子レ

たMyoDl，ミオシン軽鎖1（MLCl），ミオシン重ベルの解析という新たな展開が始まった．一方，鎖（MHC），Dr．Wrightより供与されたmyogenin，
Dr．Buskinより供与されたマウスクレアチンキ

運動神経終末部にはカルシトニン遺伝子関連ペプ

ナーゼの5つを選び，ランダムプライマーDNA

チド（CGRP）がアセチルコリン（ACh）と共存す

ラベリングキットにより32Pでラベルして使用しることが示され その生理作用としては筋細胞のた．

アセチルコリン受容体（AChR）の増加をmRNA
転写のレベルで促進することや，筋の張力を増強することが明らかとなった．
昨年，我々は骨格筋培養細胞におけるプロトオ
ンコジーン発現に及ぼすCGRPの影響について報告したが，本報では，筋分化制御因子である
MyoDl，myOgenin及び筋特異的遺伝子であるミ

結果

ラット下肢筋初代培養細胞では2つの筋分化制
御因子のうちmyogeninのみ発現が認められた（図1）．筋特異的遺伝子については，MLClとMHCの発現は確認されたがCKは認められなかった（図2）．

オシン，クレアチンキナーゼ（CK）に関してその発現の有無とCGRPの影響について検討した．
方法

培養筋細胞はウィスター系ラット胎児下肢筋をトリプシン処理して得られた初代培養細胞を用いた．60mmのゼラチンコートディッシュに細胞をいれ

Dulbecco改変Eagle培地に10％胎児牛血

清，1％ペニシリンーストレプトマイシン液を加えた培地で5日間培養した．10−7MのCGRP添加
群と無添加群に分け，8時間培養後，guanidine／
thiocianate液を加え細胞を回収し，CsClのクッションを置き超遠心によりtotalRNAを集めた．
このtotal RNAをサンプルとしてノーザンプロ＊金沢大学医学部神経内科

MyoDl

図1

Northemblotanalysisofratmyotube
total RNA probed with MyoDl andmyogenin−129−

myogenin

l

磨

愉

28S→

28S→

廊

廊

嘩

18S一・→

18S．・・→‡；；二！

285→1−−

18S→奮壷

CK

図2

MHC

Northemblotanalysisofratmyotube
totalRNAprobedwithCKIMLCland
MHC

myo卵nIn

図3

Northernblotanalysisofratmyotube
total RNA probed
MLCl and MHC

myogenin．MLCl，MHCの発現量はCGRP添
加群と無添加群との間で差がなかった（図3）．

紺He

MLCl

with

myogenin，

Theseexpressionwasnotchangedby
the addition of CGRP to the culture
medium考察が，いずれもその構造に共通性を有するDNA結MyoDlとmyogeninは，両者とも筋の決定もし
くは分化を誘導する細胞内因子として，MyoDlは合性蛋白であることが確認されている．我々が使用しているラットの初代培養細胞ではmyogenln

マウス線維芽細胞株C3HlOTl／2から，myOgeninはラット骨格筋細胞株L6より得られたものであの発現は認められたがMyoDlの発現は見られな
かった．これは，ラットとマウスという種の違い

る．ともに分子の中程に癌遺伝子mycファミリー
相同性の領域を持ち，それに隣接してN末端側に塩基性のアミノ酸が多数並んでいる（図4）．これ
らの部分は二量体形成とDNA結合に重要であり，両者がDNA結合性蛋白質として機能する核蛋白によると考えられるが，ちなみにMyoDlはヒト，
マウス，ニワトリ，ウズラ，アフリカツメガエル，
ショウジョウバエ，線虫から報告されており，
myogeninは，ヒト，マウス，ラット，ニワトリから分離されている．今回用いた他の3つの筋特異的遺伝子のうち，CKは発現が認められなかった質であることを示唆する．筋分化制御因子としてはこの他に，Myf群3），MRF44）が知られている

慧 仕

C／H

6162

塩基性

101102124

Myc

141162

S／T

S／T

199

246
209

74

96

113

318
260

日4

（遠藤より引用）

図4

StructureofMyoDlandmyogenin
−130−

廊

んどの筋芽細胞が筋管細胞へと分化している時期

廊であるが，AChRα−Subunitは発現増強効果が得られた．このことより，AChRの発現が筋の生化
学的分化の遅い時期に強くなる可能性が示唆される．培養時間の影響やCGRP添加の時期について

28Sl●

検討の余地が残されている．

185−・ヰ

文献1）Davis RL，Weintraub H

and Lassar AB：

Expression of a single transfected cDNA
COnVertS fibroblasts to myoblasts．Ce1151：
AChRα・Subunit

図5987−1000，1987．

Kトras2）Wright WE，Sassoon DA and Lin VK：

Northernblotanalysisofratmyotube
totalRNAprobedwithhuman AChR

Myogenin，a factor regulating myogenesis，

α厄Subunit and KiでaS

hasadomainhomologoustoMyoD．Cel156：

Theseexpressionwasincreasedbythe
addition of CGRP to the culture607−617，1989．

3）Braun T，Buschhausen−Denker G，Bober E，mediumet al：A novel human musde factor related
tobutdistinctfromMyoDlinducesmyogenic

が，これもCKのCDNAプローブがマウス由来のconversioninlOTl／2fibroblasts．EMBOJ8：

ものであることに起因すると考えられる．

701−709，1989．

我々は昨年までに，培養骨格筋細胞において，ジストロフィン，AChRα−Subunit，プロトオン

4）RhodesSJandKoniecznySF：Identificationof MRF4：A new member of the muscle

コジーンerbA，SrC，raf，Sis，fos，myC，Ha−

regulatory factor gene family．Genes

ras，KiAraSの発現が見られること，そしてそのう
ちAChR α−SubunitとKi−1aSはCGRP添加により約2倍に発現が増強されることを示してきた

5）高守正治，吉川弘明，安川善博：ジストロフィ（図5）5）6）．Ki−raSはGTP結合蛋白質をコードしており，Kiィas産物がさらに多くの遺伝子の発現を制御する可能性があり，重要な変化として注目に値すると思われる．この結果をふまえ，今回発現の見られたmyogenin，MLCl，MHCについてもCGRPの修飾を検討したが，その結果，有意な変化は認められなかった．

andDevelopment3：2050−2061，1989．
ンおよびアセチルコリン受容体mRNA発現に対するカルシトニン遺伝子関連ペプチドの修飾に関する研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委
託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田姓）平成元年度
研究報告書，1990，pp88→90．
6）高守正治，吉川弘明，安川善博，沖野惣一：骨格筋特異的蛋白発現に関する神経ペプチドの研

筋芽細胞より筋管細胞に分化する過程では，ミ究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジ

オシン，アクチン，トロポニン，トロポミオシン

ストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発などの一連の収縮蛋白質やCKなど筋特異的に発に関する研究 （荒木姓）平成2年度研究報告

現する酵素群，AChRなどの転写が誘導される．
我々の方法では，CGRPを添加しているのはほと

書，1991，pp204−206．

−131−22）Duchenne型及びBecker型筋ジストロフィー家系のPCR法を用いた遺伝子診断と保因者診断
斎 藤 加代子＊
研究協力者

山 内 あけみ＊池 谷 紀代子＊ 佐久間
福 山 幸 夫チ

原 田 隆 代＊は じめにジストロフィン遺伝子にはエクソンが70以上存在し，Koenigら1）によるとDuchennC型（DMD）
およびBecker型筋ジストロフィー（BMD）患者の104例中53例（50％）にエクソンの欠矢を認める．我々の検討でも30例中16例（53％）に認めら

泉＊の報告に基づいて，また一部はジストロフィン遺伝子cDNAの塩基配列より，図2に示す塩基配列をAppliedBiosystemsDNAsynthesiser，mOde1
381Aにて作成した．また，mRNAのnestedPCR
でも図2のprimerを使用した．
我々の行なったmultiplex PCRでは，major

れた2）．Chamberlainら3）が遺伝子欠矢を短時間に効率よくスクリーニングするmultiplex
polymerasechainreaction（multiplexPCR）法を開発し，Beggsら4）の方法とあわせて98％の欠夫を同定できるようになった．我々は，DMD，BMDの患者のリンパ球から調製した高分子
DNAについてcDNAプローブを用いたSouth−
ernblot法とPCR法を行ない，その結果を比較しhot spotにおける複数のexonを同時にチェックた．さらに，遺伝子欠矢を有する家系において，保因者が疑われる女性一特に患者の母親について
CDNAプロー70によるSouthernblot法，リンパ球由来のmRNAのnested RCR法により保因者診断を行ない，家族歴や母親のCK値とあわせて検討した．

図3に示すように，症例1ではexon45，47の欠夫を示す．症例2はexon47の，症例3はexon45

する4種類のprimer setを用いた．primer
Set1−3ではexon43〜52を，primerset4では筋型
プロモーターを調べた．exon53，eXOn54はそれぞれsingle PCRを行なった．
結果1）PCR法とSouthern bJot法の欠矢を示す．
図4のprimer setではexon47，48，50，51，
52を10家系に関して調べた．症例4a，4b，症例7a，7bはそれぞれ兄弟例である．
症例1について，eXOn47，50，51に関しては，対象と方法

図5に示すようにすべて欠失していた．exon53

DMD26家系，BMD5家系のうちSouthern法
によりmajor hot spotに欠矢を示した患者（図1）のDNAについてPCR法を行なった．exon

は，症例1では存在しており，これらのPCRの結

l〜7の欠失例では筋型プロモーターを調べた．
プライマーはChamberlainらおよびBeggsら

exon45−52の欠矢があり，PCR法の結果と一致した．

果より，欠矢の範囲はexon45−52と考えられる．
Southern blot法の結果も，症例1では，

このようにPCR法の結果とSouthern法の結＊東京女子医科大学小児科

果はほぼ一致したがjunctional fragmentを有す
−132−

宇J

⊂コ
■

■

■

■

−珊D
⊂＝コbMD

図1Mapping ofdeletions detectedwith DMD cDNA

・
mr
el

p−

Sequence（5†−3■）

PCRWITH PRTMERSETIPmF GAAGATCTAGACAGTGGATACATAACAAATGCATG

St C

PmR TTCTCCGAAGGTAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCC

1

2

3

43F GAACATGTCAAAGTCACTGGACTTCATGG
43R ATATATGTGTTACCTACCCTTGTCGGTCC
45F AAACATGGAACATCCTTGTGGGGAC
45R CATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC
47F CGTTGTTGCATTTGTCTGTTTTTCAGTTAC
47R GTCTAACCTTTATCCACTGGAGATTTG
48F TTGAATACATTGGTTAAATCCCAACATG
48R CCTGAATAAAGTCTTCCTTACCACAC
50F CACCA姐TGGATTAAGATGTTCATGAAT
50R TCTCTCTCACCCAGTCATCACTTCATAG
51F GAAATTGGCTCTTTAGCTTGTGTTTC
51R GGAGAGTAAAGTGATTGGTGGAAAATC
52F AATGCAGGATTTGGAACAGAGGCGTCC

図3

52R TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC53F CAGAATCAGTGGGATGAAGTAC
53R GCATCTACTGTATAGGGACCC

DNA amplification oflymphocyte
DNAfromhealthymale（C）andfrom
Subjects ofDMD（1，2，3）

54F ACCTCCGCCAGTGGCAGACAA
54R TGAATGCTTCTCCAAGAGGC
60F AGGAGABLATTGCGCCTCTGAAAGAGAACG
60R CTGCAGAAGCTTCCATCTGGTGTTCAGG

46F GGAGGAAGCAGATAACATTGCT46F2GAACCTGGAAAAGAGCAGCAAC

52R TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCCTC
52R2

る1例が例外だった．症例5のmultiplexPCRでは図4のようにexon48のバンドが認められた．ところが，Southern blot法では，eXOn48に相当す
る11kbのシグナルはなく，16kbの新たなシグナ
ルの出現を患者とその母親に認めた（図6）．

GGACGCCTCTGTTCCAAATCCTGCATT

図2

Sequence ofprimers

exonl〜7の欠夫を示す例（症例17）と全領域
で欠矢を全く示さないDuchenne型（症例11−16，18）について，筋型プロモーターをPCRによって調べたところ，図7のように症例17では筋型プロモーターが欠失していることがわかった．

−133−

図4

DNAamplificationoflymphocyteDNAfromsubjectsofDMD（1，3〜10）

and BMD（2）PClミWlTH PRIM化R SETj
St C

図5

1

2

4

5

16

DNA amplification oflymphocyte
DNA from subjects of DMD（1，4，5，
16）and BMD（2）

CDNA probe82）mRNAのnested PCRによる保因者診断
Robertsら5）によると，500〜1000個の））ンパ球
図6あたり1コピーのジストロフィンmRNAが存在することを利用して，PCRで2回増幅することにより分析可能な量の産物が得られ，この方法をSouthern blot analysis of thelymphocyteDNAfromsubjectsofthe
DMD family（case5）

nested PCRと言っている．ここでは，図8のように，リンパ球より調製したRNAについて，2回目のPCRのそれぞれforward primer（46exon46の塩基配列の一部をforward primer（46F2），reVerSe primer（52R2）として増幅した．

F），eXOn52の塩基配列の一部をreverse primer

患者ではPCR産物は正常より短いサイズになる．

（52R）として，1回目のPCRを行なった．その保因者ではPCR産物は正常サイズと欠夫によっ

PCR産物について46Fの3′側と52Rの5′側を，て短くなったサイズのバンドを示す．この家系で−134−

は患者は欠失により463bpのバンドのみが認めら

PCRWITHPRIMERSET4
C lO ll

12

13

14

15161718

Stれた．長女は正常サイズ860bpのバンドのみであり非保因者と判定した．次女では両方のバンドが認められ，保因者と判定した．母親は異常サイズのバンドのみ認められ，正常mRNAを検討中であるが保因者と判定した．この結果は，CDNAプ
ローブを用いたSouthernblotでgenedoseによって判定した保因者，非保因者の結果2）と一致し
ていた．

図7

DNAamplificationofthelymphocyte
DNA fromsubjectsofDMD（10−18）

考察

PCR法はDNAの熟変性，プライマーのアニー
14 6 1 4 7 ￣
lヰ恵一
l￣
率封 ￣
一
辞 冒 ミ
1 1 5■
Z l−1
146 147l
寵躊 法 難 打 紐 5￣日 5 2 l
￣ノ

感 一
三
￣三
三
義臣＝

＋
′

′

i2汽
5き
ぬ

リング，DNAポリメラーゼによる伸長反応のサ
イクルの繰り返しにより，目的のDNAを10万〜100万倍に増幅する方法である．増幅したい遺伝
子領域，遺伝子のサイズは，プライマーを任意に選択し合成することにより，設定することができる．PCRにより得られた反応液一遺伝子産物をア
ガロースゲル電気泳動にかけることにより，増幅したDNAを目的のサイズのバンドとして検出することができる．PCR法には1）非放射性検査であるため，医療廃棄物の問題が少なく扱いやすい，
2）結果が迅速に得られる，3）塩基配列の一部が明らかであれば増幅可能である，4）塩基配列の同定など研究面で発展させることができる，などの利点がある．Chamberlainら3），Beggsら4）は数ヶ所のexonの欠夫を同時に検索するmulti−
plex PCR法を発表し，これは臨床応用に有効な

図8

CarrierdetectionwiththenestedPCR方法である．しかし一方PCR法には，1）人工産物が入る可能性がある−falSepositive，2）求める領域が増幅されないこ とがある−false

Tota IFam il沌S

％

5／
31

16

3／
19

16

H igh CK titer
Spo radいc caSO▼ith no rmal CK

14／
31

45

10／
19

53

18／
31

58

9／
19

47

Carri8 r d itected

19／
31

61

14／
19

74

5／
19

26

2霊 三
下
か arrie r帖▼mUtat ion（
no 血lot ion
in mothOrS−DM ）図9

皿A d8 l8t8d
F8m ilios％

CarrierstatusofthemothersofDMD／
BMD patients

negative，3）定量性が困難である，などの欠点，限界もある．今回我々がPCR法とSouthernblot法の結果を比較したところSouthern blot法でjunCtionalfragmentを呈した1例でPCRの結果と合致しなかった．これは症例5において，exon48と49の間のイントロン内の制限酵素切断
部位が欠失により変化して，eXOn48はSouthern
blot法の16kbのシグナルとして示されていると推定される．
分子遺伝学的手法を用いた保因者診断法として−135−

は，CDNAプローブを用いたSouthern法でgene
doseを調べる方法，junctional fragmentを検出する方法2），ここに述べたmRNAのnestedPCR
法，pERT87やⅩJなどを用いたRFLPによる方法，CA repeatsの多型解析6）がある．我々はCDNAプローブ を用いたSouthern blot法とnested PCR法を行なった．これらの保因者診断の結果に家系図の分析，家族の血清CK値を合わせてまとめると（図9）のようになる．家族歴聴取により，5／31（16％）がdefiniteまたはprobablecarrierだった．14／31（45％）では，母親のCK値の高値をみた．遺伝子欠矢を示した家系の14／19（74％）で，母親にも遺伝子欠矢を有していた．
5／19（26％）はnewmutationであった．16／19家
系は孤発家系であり5／16（31％）は孤先例におけるnew mutationであった．

Molecular genetic analysis of Duchenne／
Becker muscular dystrophy families．Fetal
and Perinatal Neurology，Basel，Karger，in
preSS．

3）ChamberlainJS，GibbsRA，RanierJE，etal：
MultiplexPCRforthediagnosis＿OfDuchenne

musculardystrophy

PCR

ProtocoIs：A

GuigetoMethodsandApplications（edby

Innis MA，Gelfand DH，SninskyJJ，White
TJ）Academic Press，New York，London，
1990，pp272−281．

4）Beggs AH，Koenig M，Boyce FM，et al：
Detection of98％

of DMD／BMD genedeletionsbypolymerasechainreaction．Hum
Genet86：45−48，1990．
5）RobertsRG，BentleyDR，BarbyTFM，etal：
DirectdiagnosisofcarriersofDuchenneand文献Beckermusculardystrophybyamplification

1）KoenigM，HoffmanEP，BertelsonCJ，etal：
Complete clonlngOftheDdchennemuscular

OflymphocyteRNA．Lancet336：1523−1526，
1990．

dystrophy（DMD）cDNA and preliminary6）Clemens PR，Fenwick RG，ChamberlainJS，

genomic organization of the DMD genein

etal：Carrierdetectionandprenaldiagnosis

normalandaffectedindividuals．Cel150：509

inDuchenneandBeckermusculardystrophy−517，1987．

families，uSing dinucleotide repeat polymor−

2）Saito K，Ikeya K，Yamauchi A，et al：−136−

phisms．AmJHumGenet49：951−960，1991．

23）ジろトロフィン関連遺伝子のクローニングに関する研究＿
荒 畑 喜，一＊研究協力者￣石′浦 章 一書 林
由起子＊ 有 川 恵 理＊
後 藤 加奈子＊■ Alan H．Beggs＊ Louis M．Kunkel＊

日的DEGENERATE PCR PRIHERS

ジストロフィンはスペクトリン・スーパーファ
ENDING HETHOD：
SEQUENCE NAHE：SEQUENCE LENGTIi：

ミリーの一月である．ジストロフィンの欠陥は重

3

T
T
T C

3

ている．我々は逆行遺伝学的アプローチにより，

CCA

T
T−
T C

図1

ン関連遺伝子のクローニングの重要性が示唆され

TCG

T
G
A∵G C T

トロフィン抗体によっても検出されることが報告されている．このような事実から，ジストロフィ

GCG

仙G

MAP−1B遺伝子のコードするタンパクは，抗ジス

TGA G CでAATている．また脊髄性筋萎縮症に高い連鎖を示す

⁝G

GAG

CC（】CCATGA G C T

CGG

C巾▲

T

GAG

G

5

GCG

T
G
A

−

T C
G T
A G C T

5C T
T二G
A G C T

篤な筋疾患であるDMD／BMDを，スペクトリンの欠陥は遺伝性楕円赤血球症を来すことが知られTrityl ON
KAl ＆ EA2
30

ジストロフィン，スペクトリン，α−アクチニンにホモロジーの高い配列部位を認識するプ
ライマー．

神経筋疾患原因遺伝子の検索を進めている．
方法

遺伝子の単艶にはヒト胎児骨格筋と大脳cDNAライブラリー（Koenig＆

Kunkelらl）：

1gtlOファージ）を調製した．DegeneratePCRにはジストロフィン，スペクトリン，α−アクチニン

で共通に保有されているN末端側の配列（KTFTK／AW）より，degenerateプライマーをデザインした（図1）．サブクローニングにはpBS
IISK＋プラスミドベクターを用いた．これをTB−1にtransfection後Ⅹ一gal／IPTG selectionを行った．さらにインサートDNAのシークエンスを決定し，コンピューター解析（GenBank，
GenEmbl）を実施した．
全体のフローチャートを図2に示す．

1．脳と筋のcDNAライブラリー（入gtlO）のtitration，bacteriophageの精製を実施する．
2．DegeneratePCRを実施する．
3．pB SIIS K＋プラスミドベクターにPCR
amplifiedDNAをライゲーションする．
4．TB−1を形質転換する．
5．X−Gal／IPTG selection（Blue／White selec−tion）を実施する．
6．プライスミドミニプレップを実施する．
7．インサートDNAのシークエンシングを実施す
る．
8．コンピューター解析（GenBank，GenEmbl）にて意味のあるシークエンスを発見した時にはサブ
クローニングのためのプローブを作る（PCR
label／ランダムプライマー法）．
9．cDNAライブラリーのフィルターとハイプリタ
イゼーションする．
10．遺伝子全長を得る／特異抗体を得る．
11．染色体マッピングも試みる．

＊国立精神・神経センター神経研究所

図2
−137−

ジストロフィン関連遺伝子のクローニング

図4

図3

形質転換されたTB−1バクテリアのコロニー（Blue／White selection）．

結果

プラスミドミニプレップの制限酵素（SacI
KpnI）によるdigestion．様々のサイズのイ
ンサートDNAが確認される．

文

Degenerateプライマーのdegeneracyは1024

献1）KoeningandKunkel＝MolecularCloning2nd

通りであった．これまでに287のコロニーを得た

ed（ed by SambrookJ，Fritsch EF（図3）．このうち144のコロニーについて，プラス

Maniatis）Cold Spring Harbor Laboratory
Press，N．Y．1989．

ミドミニプレップを実施した（図4）．さらにこれらをシークエンスしたところ，17個のジストロフ
ィン関連遺伝子を得た．今後個々のクローンについてさらにサブクローニングを行って行く予定で
ある．

−138−

＆

24）正常人ならびに神経・筋疾患患者の骨格筋細胞におけるミオグロビンmRNAの局在−in situ hybridizationによる成績T
川 井 尚 臣＊研究協力者

三ツ井 貴 夫＊ 鳴 尾 隆 子＊ 有 井 敬 治＊
土 橋 孝 之＊ 玉 木 康 民事

は じめに
ミオグロビン（Mb）は筋細胞中で酸素の貯蔵やミトコンドリアへの酸素の運搬を担っているへム蛋白であり，筋細胞のエネルギー代謝にも関与している．Mbは筋細胞の崩壊時には急速に血中へ流出し，その量は筋障害の程度が大きいほど多い．
一方，筋細胞はMbが遊出し減少すると酸素の貯蔵やミトコンドリアへの酸素の補給が減少し，細胞障害がさらに増強することになる．このため筋細胞ではMbの生成を増やしこれを補充しようとする反応が生じることが推定される．筋細胞でMbの生成がどのような状態になっているかを知ることは筋細胞の障害と修復の状態を把握する上で重要である．本研究ではDuchenne型筋ジスト
ロフィー（DMD）筋と，神経原性筋萎縮症筋について，筋細胞中のMbの生合成をinsituhybridi−
zationによって調べたのでその成績を述べる．
対象と方法
対象：DMD（11歳，男性）筋と，疾患対照筋としての筋萎縮性側索硬化症（ALS）患者（56歳，女性）の生検筋，ならびに正常筋としての非神経・筋疾患患者（28歳，男性）の外科手術時に得られた骨格筋である．DMDとALSでは外側広筋を用い，正常筋は腸腰筋を用いた．
＊徳島大学医学部第一内科

方法：得られた筋組織より6耳mの新鮮凍結切片を作製し，ただちに4％パラホルムアルデヒドで固定した．プローブはブタMbのCDNAをPstlで処理して得られた209bpの断片をビオテンで標識して作成した．Ⅰn situhybridizationは組織を除蛋白処理し，後固定，脱水，prehybridizationののち37℃，14時間前記のプローブと反応させ，洗浄の後streptavidin−alkaline phosphataseで処理しNBT／BCIPで発色した．標本の一部はメチルグリーンで核染色し，一部は核染色せず顕微分光測光装置（Karl−Zeiss社）により530nmの吸光度を測定した．筋組織は採取後ただちに液体窒素
中に保有し，2−4週間以内に使用した．また，筋の凍結切片作成からin situ hybridization，そして発色の過程まではDMD筋，ALS筋，正常筋
同時に行った．
陰性対照としては切片をRNase処理した後insitu hybridizationを施行した筋組織標本を作成
し，プローブの対照としてプラスミドのpBR322
をビオテン化して用いた筋組織標本を作成した．
また肝細胞においても筋組織と同様にMbのinsitu hybridizationを行いシグナルのないことを確認した．
組織標本中のMb mRNA吸光度の測定：顕微分光測光法により筋組織標本1枚につき200細胞のMb mRNAのシグナルの530nmにおける吸光度を測定し（1細胞につき1箇所測定），陰性対照

ー139−

（pBR322）の吸光度の平均値を差し引きMb
mRNAの吸光度とした．疾患筋を非萎縮筋（直径＞4伽m）と萎縮筋（直径＜20／′m）に分け，測光面積は前者と正常対照筋は314J m2，後者は78．5〟m2とした．
成績

正常筋：横断像でMb mRNAは筋細胞質にほぼ均等に分布する小点状の赤紫色のシグナルとして認められた（図1a）．拡大像では一部の筋核にもシグナルが認められた（図2a）．縦断像ではシグナ
ルは小額粒状，網目状に筋細胞質に分布して認め
三二

図1a

b

正常筋横断面のMb mRNAのin situ
hybridization像．224倍．MbmRNAは小顆粒状のシグナルとして認められ，筋細胞質にほぼ均等に分布している．筋核はメチルグリーンで染色してある．
ビオナン化pBR322を用いた陰性対照．128
倍，MbmRNAのシグナルはほとんど認めない．筋核はメチルグリーンで染色してあ

図2a

る．

C RNase処理による陰性対照．128倍．Mb
mRNAのシグナルはほとんど認めない．
筋核はメチルグリーンで染色してある．
−140−

b

二

＿

＿1￣

＿＿＝こき

三等＝−i≡‡＝

rt−

正常筋横断面のMb mRNAのin situ
hybridization像．256倍（強拡大像）．小顆
粒状のシグナルが認められ，一部の筋核にも重なってシグナルが認められる．筋核はメチルグリーンで染色してある．
正常筋縦断面のMb mRNAのin situ
hybridization像．256倍（強拡大像）．シグ
ナルは小顆粒状，網目状に分布して認められる．筋核はメチルグリーンで染色してある．

図3a DMD筋のMbmRNAのinsituhybridization像．128倍．殆どすべての筋細胞中にほほ均等に小顆粒状のMb mRNAのシグナルが認められる．萎縮細胞では染色性の低下が認められる．
筋核はメチルグリーンで染色してある．
b 図3aの連続切片のHE像．128倍．筋細胞の大小不同と問質の増殖がみられる．
C DMD筋のMb mRNAのinsituhybridization像．128倍．Opaque線椎でもMb mRNAのシグナルが認められた．筋核はメチルグリーンで染色してある．
d 図3Cの連続切片のHE像．128倍．筋細胞の大小不同，問質の増殖，Opaque細胞がみられる．

られた（図2b）が，明らかな横紋状の分布は見られなかった．

0．022（mean±S．D．）であった．DMD筋の非萎縮
筋細胞では0．136±0．023と正常筋に対し有意の増陰性対照のビオテン化pBR322（図1b），RNase
処理（図1C）の組織標本にはMb mRNAシグナ
ルは殆ど認められなかった．
DMD筋：殆どすべての筋細胞質にほぼ均等に小顆粒状のMb mRNAのシグナルが認められた（図3a）．しかし高度の萎縮細胞ではMb mRNA加が認められた（P＜0．001）．しかし高度萎縮筋細胞では0．087±0．024と減少していた．これに対し
ALS筋では非萎縮筋細胞，高度萎縮筋細胞ともにそれぞれ0．098±0．0810，0．083±0．022と有意の減少がみられた（P＜0．001）．同一疾患の非萎縮筋細胞と萎縮筋細胞との比較ではDMD，ALSともにのシグナルの濃度はやや低下し，小額粒状のMb

萎縮筋で減少がみられた（P＜0．001）．

mRNAの分布もやや減少していた．Opaque線経でもMb mRNAのシグナルは明瞭に認められた（図3C）．
ALS筋：筋細胞は中のMb mRNA正常筋とほぼ同様の分布を示し，萎縮細胞ではやはり染色性の低下が認められた（図4）．

考察
人の骨格筋におけるMb mRNAの局在に関し，
正常筋細胞では細胞質に散在性に，ほぼ均等に小額粒状あるいは網目状のシグナルとして検出されることを示した．この分布は正常筋とDMD筋おMb mRNAのhybridizationシグナルの吸光度の比較（図5）：正常筋では吸光度は0．114±

よびALS筋で大差がなく，筋線経の縦断面にて
一部網目状に見られることより，疾患筋において−141−

（…意志ヲ・誌正常病

図5

図4

ALS筋のMb mRNAのin situ hybridiza−tion像．128倍．筋細胞中のMbmRNAは正常筋とほぼ同様の分布を示し，萎縮細胞では染色性の低下が認められる．筋核はメチルグ
リーンで染色してある．

Mb mRNAのhybridizationシグナルの吸光度の比較．DMDの非萎縮筋ではMbmRNAの増加があり，その他の疾患筋細胞では減少している．

ものと推定される．
もMbの生合成は正常とほぼ同等に行われていることが推定でき，またその存在部位は筋の収縮系と無関係ではないことが推定された．
DMDでは，Opaque線経でも他の筋細胞とほぼ同様に検出された．Opaque細胞は免疫組織学的にMbの染色性が全く認められない1）ことより
Mbは過収縮により逸脱してしまっていると考えられているが，MbのmRNAの面からみるとその生合成の機能は保持されていると思われる．
Mb以外の筋蛋白のmRNAの分布では，
myosin heavy−ChainのmRNAは筋線維中でMbと同様の顆粒状の分布を示すが，その分布は筋細胞中に均等ではなく筋鞠付近に多く局在しており，MbmRNAの局在とは若干異なっている．
また電顕的には筋原線維間に存在することが知ら
れ2）ており，myOSinheavy−ChainのmRNAも筋細胞で収縮系と密接に関連して存在すると考えられている．
MbmRNAの量については，DMD筋では正常筋に比べ非萎縮筋ではMb mRNAが平均19％増加し，萎縮筋では24％減少していた．この成績はDMD筋細胞よりMbが流出し減少すると3）酸素の供給が減り，細胞の代謝障害はさらに進むのでMbの生合成を増加させ筋細胞の障害を軽減していると考えられる．しかし筋障害が進行し細胞萎
縮が高度になると，Mbの生成も低下してしまう

ALS筋では正常筋に比べ，非萎縮筋ではMb
mRNAは平均14％，萎縮筋では27％減少し，筋細胞の障害の程度に応じて低下していた．脱神経時には，一般に急性期では蛋白分解は元進し蛋白合成も促進するが，経過と共に蛋白合成は低下し，筋細胞の萎縮が進行すると考えられている4）．Mb
については実験的な脱神経では筋細胞中の濃度は急性期には増加するが，2〜3ヶ月以後には脱神経前と同じレベルまで低下すると報告されている5）．脱神経による筋細胞の萎縮には，脱神経により軸索流の減少などにより栄養因子の供給が途絶すること，筋線経の電気的収縮能が低下すること，などが関係していると考えられており，脱神経筋に直接電気刺激を加え筋収縮をおこすと筋萎縮は抑制されることが知られている．以上の結果より，筋細胞の収縮能が低下すると酸素需要が減少し，Mbの需要が減少しその生成が低下するものと推定される．
Ⅰn situhybridizationは従来，組織中や細胞中の核酸の存在の有無の証明，局在部位の決定などに用いられており，その定量化は殆ど行われていない．わずかながらRI標識プローブを用いた研究でinsituhybridizationによる検出物質の定量化の試みが報告されており6）7），プローブが結合するmRNA量と銀粒子数，およびその吸光度には一定の相関性があるとされている．本研究のビオー142−ナン化プローブを用いたinsituhybridizationに

myosin expression．J Histochem Cytochem

よるシグナルの定量化は方法論的になお検討を要

36：1519，1988．

するが，上記のようにmRNA量と吸光度には一3）Miyoshi K，Saito S，Kawai H，Kondo A，定の関係があり，本研究ではMb mRNAの吸光

Iwasa M，Hayashi T and Yagita M：

度（530nm）を測定し定量に用いた．

Radioimmunoassay for human myoglobin；

本研究では，DMD筋，ALS筋においてMb

methodsandresultsinpatientswithskeletalmRNAの局在とその量を検討し，障害筋細胞がmuscle ormyocardialdisorders．J Lab Clin

Med92：341，1978．

その病態に応じてMb蛋白の生合成を調節し，筋4）Tawa NE and Goldberg AL：Proteinand

障害に対応していることが理解される．

aminoacidmetabolisminmuscle

Myology（edbyEngelAG＆BankeBQ）Mcgraw−hill，

おわ り にNew York，1986，p735．

Duchenne型筋ジストロフィー，筋萎縮性側索硬化症および正常者の筋細胞中のMb mRNAを

5）Askmark H，Carlson M and RoxinLE：in situ hybridization法にて調べ，それぞれの疾
患の筋細胞中の局在と量を明らかにした．これにMyoglobininrat hindlimb muscles after

よって人の骨格筋ではそれぞれの病態に応じて，

Nerve7：656，1984．

Mbの生合成を調節し障害に対応していると思わdenervationandduringreinnervation．Muscle
6）Nunez DJ，Dvenport AP，Emson PC and
Brown MJ：A quantitivein−Situ hybridiza・れた．

tion method using computer，aSSistedimage

文

献analysis．BiochemJ263：121，1989．

1）Kagawa N and Hizawa K：Immunohisto−

7）Miller MA，UrbanJH and Dorsa DM：

chemical study of myoglobinin neuromus・

Quantification of mRNAin discrete cell

cular diseases．Muscle Nerve8：9，1985．

groupsofbrainbyinsituhybridizationhisto2）DixDJandEisenbergBR：Insituhybridiza−tion andimmunocytochenistryin serial
sections of rabbit skeletal muscle to detect−143−−Chemistry

GeneProbes（edbyConnPM），

Academic Press，San Diego and California
1989，p164．

25）動脈結染後の速筋と道筋のglucoseuptake
庄

研究協力者

司

進

一＊

朴 木 清 人＊ 柳 澤 信 夫＊

は じめに

材料と方法

閉塞性動脈硬化症やBurger病の様な閉塞性末梢動脈疾患では，間欠性披行・安静時疹痛・虚血性壊症などが，疾患の程度によって現れる．この様な閉塞性末梢動脈疾患の患者の障害部骨格筋の酵素活性・毛細管濃度・基質利用能などの変化に関しての研究報告は背反するものが多い．これらの報告の中で糖質の利用能に関してのみは一致している．即ち，閉塞性末梢動脈疾患の患者の障害
下肢筋のglucose取込みが安静時で増加していた，
ないし筋運動時に増加していた．患者の生検筋で，glucoseからglucogen，lipids，Carbondioxideへの取込みが増加していた．患者生検筋で，phos−
phofructokinase活性が増加していた．これらの報告はglucoseの利用能が動脈循環不全では増加することを示唆している．
動物実験では，障害筋のhexokinasel）2），
phosphofruCtOkinase2）などの活性増加やglu−
COSe uptakeの増加3）が報告されている．

実験動物
本研究に使用したのは，体重60g位のメスのWistarラットである．ラットは水と飼料を自由に摂取できた．
動脈結条と切除軽いエーテル麻酔下で，左大腿の動脈・静脈・神経東部を開き，鈍的に大腿動脈を単離し，浅腹壁動脈の分枝より近位0．5cmで絹で結数を2ヶ所行い，その間で動脈を切除する．他の動物に，動脈の結紫と切除のみを行わない模擬手術も行った．傷を縫合し，回復させた．結数を行った動物は手術を行わない対照と変わらず活発に動き，結致した後肢も変わらず動かしていたし，体重の増加も対照と変わらなかった．
筋
ラットは動脈結紫ないし模擬手術の7ないし14日後に，頸椎脱臼で殺し，両側のヒラメ筋（Sol）と長址伸筋（EDL）を 乃め0の伸展位で腱でホルダーに固定し，切り出した．
インキュベーション

以前我々は，無酸素状態では，glucoseuptake
が速筋で増加するが，遅筋では変化しないと報告した4）．動脈循環不全の骨格筋への影響の主要な因子が無酸素ないし酸素欠乏であるならば，速筋と遅筋のglucose uptakeは速筋と遅筋で異なる筋はホルダーに国定したままで，95％02−5％
C02で飽和し軽く定立したフラスコの溶液中で370Cのインキュベートをした．溶液はKrebs−と考えられる．しかし，Challissらの報告3）では，
速筋と遅筋の差異が明らかではない．これを確め

Henseleitbicarbonate緩衝液（pH7．4）に10mM
SOdium pyruvate，3H−3−0−methylglucose（1．O

るために，動脈結紫後の速筋と遅筋のglucose
uptakeを測定した．

JLCi／ml），5mM glucose，14C−SuCrOSe（1mM，0・2〟Ci／ml）を含んでいる．この条件下ではglu−
COSe uptakeは60分まで直線状である．
放射活性＊信州大学医学部第三内科

30分のインキュベーション後，ホルダーから外−144−した筋を水冷生理的食塩水で洗浄，濾紙上で余分の水分を除き，腱を取り除いた．筋の湿重量を測定し，Soluene350（Packard）中で消化し，酢酸

takeを筋当りで表すと，EDL・Sol共に有意差は無くなった（図3）．

で中和した．筋の消化液とインキュベーション溶液のアリコートをScintisoIEX−H（和光純薬）を

mnOlルh01e muscle／hr

Glucose uptakeは，glucose spaceとsucrose

space（細胞外スぺ−ス）の差から算出した．デー
タの統計学的分析をStudentのt検定を用いて行った．有意差検定は5％のレベルで判定した．

︻ヒ

果

予備実験で，模擬手術を行った肢の筋と何も行7／わなかった肢の筋の湿重量やglucose uptakeに有意差は無かった．従って本実験では，動脈結紫肢の筋と何もしない村側肢の筋の比較を行った．
動脈循環不全肢のEDLの湿重量は動脈結紫7
日と14日後に有意に低下していた．Solは有意差は無かった（図1）．

即＼

結

0

叫︶ヨ﹁HhD 国SOUnJU HJUS2ム

加え，シンチレーション・カウンター（Packard3225）中で一晩静置後，二重放射活性を測定した．
計算

Sol

＼14／

DAYS AFTER ARTERIALINSUFF工CIENCY

図2

動脈不全の筋湿重量当りのglucose uptake
に対する影響平均±標準偏差 各カラムは6−7筋から計
算

他は図1と同様

湿重量当りのglucoseuptakeは，，動脈循環不全
肢のEDLで，動脈結紫7日と14日後に平均で29％と85％の増加がそれぞれあり，有意であった．

UmOl／g vet velght／hr

Solでは有意差は無かった（図2）．Glucose up−
uJヨ﹁トhb 国SOUDJ0 円HUSPコ

口C叩浩㌘軋

m

＋

★

甘

★
★

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く

0．01

●
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0．05

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Edl SoI Edl Sol
＼7／

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︷川順川川川Ⅷ川川川山野

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閻LICAmLm

14

DAYS AFTER ARTERIALINSUFFICIENCYpAYS AFTER ARTERIALェNSⅥ汀IC工ENCY

図1動脈不全の筋湿重量に対する影響
7，14：動脈結紫・切除7日及び14日後平均±標準偏差 各カラムは7筋から計算

＼14／

図3

−145−

動脈不全の筋当りのglucose uptakeに対す
る影響
図2と同様

考

察

動脈循環不全下では，速筋と遅筋の代謝調節は

本研究は，動脈循環不全が湿重量と湿重量当りのglucoseuptakeの変化からすると，主として速筋に影響することが明らかに示された．動脈不全

大きく異なる．

下では，速筋のglucoseuptakeが増加する．これは，glycogen合成や嫌気的解糖の基質としてglu−
coseの利用が速筋で増加していることを示唆す

1．一側の動脈結紫と切除7日と14日後の骨格筋

要

約の湿重量とglucose uptakeを測定した．
2．動脈循環不全下で筋湿重量はEDLで有意にる．この動脈不全下での筋glucoseuptakeの増加
は，患者の生検筋や下肢筋での報告でも支持される．しかし，Challissらのラットによる実験では，減少したが，Solでは有意な変化は認められなか

一側大腿動脈の結紫・切除の7日後のgastroc−
nemiusとSolでglucoseuptakeが有意に増加し，
plantarisで有意な変化が無かったと報告している3）．速筋と遅筋のglucoseuptakeに関する今回の我々の結果とChallissらの結果との相違は，方法の相違によると考えられる．彼らは加 〝わβで我々は 乃〝grPでアイソトープを付けた基質を投与している．

takeはEDLで有意に増加したが，Solでは有意な変化は認めなかった．

以前，我々は無酸素条件下ではglucoseuptake
が速筋でのみ増加し，遅筋では有意な変化が無かったと報告した4）．今回の結果はこれと一致する−aCtivitiesin the soleus muscle of the rat．

った．
3．動脈循環不全下で湿重量当りのglucose up−

4．動脈循環不全下で筋当りのglucoseuptakeは
EDLとSol共に有意な変化を認めなかった．
文献1）Bass A，Gutmann E，Hanzlikova V and
TeisingerJ：Effectsofischaemiaonenzyme
Pflugers Arch379：203−208，1979．
2）HayesDJ，ChallissRAJandRaddaGK：An速筋でのみglucose uptakeの増加が見られたことは，動脈循環不全が酸素欠乏を主要な要素として，速筋の代謝調節に影響を与えていることを示
唆する．

investigation of arterialinsufficiencyinrat

動脈循環不全下では，速筋は湿重量当りのglu−
COSe uptakeが増加するが，湿重量は主として蛋白の減少によって有意に減少する．従って，この

3）Challiss RAJ，Hayes DJ，Petty RFH and

条件下でのglucose uptakeの増加という適応的調節でも，筋蛋白の異化克進を阻止しえないこととなる．

−n．m．r．andbloodflowstudy．BiochemJ236：

動脈循環不全下の遅筋では，glucoseuptakeも湿重量も変化しない．それらの点からは，遅筋の方が動脈循環不全に抵抗性だと言える．

−146−

hindlimb．An enzymic，mitochondrial andhistochemiCalstudy．BiochemJ236：469−
473，1986．

Radda GK：Aninvestigation of arterial
insufficiencylnrathindlimb．Acombined P

461−467，1986．

4）ShojiS：Regulationofglucoseuptakeinrat
Slow

and

fast

skeletalmuscles．Comp

Biochem Physio191A：363−365，1988．

26）筋細胞死と自食作用
木 南 英 紀＊
研究協力者

上 野

隆＊ 内 山 安 男H 埜 中 征 哉＊＊＊は じめに筋の病理的変化に伴うオートファジーの冗進は，その原因から2つの型に分けることができる．1つは筋細胞に局所的障害があり，これを清掃・除去するために誘起されるオートファジーである．
各種筋ジストロフィー症や，多発性筋炎などの炎
症性ミオパテーで，筋原線維間に多数の自己会食胞の出現とその顆粒に一致してカテプシン群などのリソゾーム酵素の染色性の増加が認められる．
もう1つは何かの機転でリソゾーム内の消化が抑制された結果誘起されるオートファジーである．
自己貪食胞は普通10分ぐらいの半減期で形成・退縮しているが，食胞内の消化が進行せず，過縞が著しく遅延するため多数の自己会食胞が出現する．
その典型的な例はリソゾーム内pHが上昇することに起因するタロロキンミオバナーである．脂質や糖の障害により，二次的に蛋白質の分解も抑制
され，オートファジーが克進したようにみえる代
表的な疾患としてα−グリコシターゼ欠損症がある．
しかし正常の細胞における自己会食胞の隔離膜の由来，リソゾームとの触合の機序などオートフ
ァジーに関する機構さえ，まだわかっていない．
昨年に引き続き，自己会食胞の隔艶膜の由来に関する機序と神経・筋細胞内に自己会食胞・空胞形
成のみられるBatten病についての知見について報告する．

＊順天堂大学医学部生化学第一講座＊＊岩手医科大学解剖学第二講座＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所

材料と方法
オートリソゾーム分離：ロイペプチン投与肝よりオートリソゾーム1）分馳した．分離した小胞から膜分画を密度勾配遠心で得，さらに炭酸ナトリウ
ムで洗浄して膜標品とした．
免疫学的手法：ウエスタンブロッテイングは5−15％のグラディエントゲル（チトクロームP
450，7ルドラーゼ）および16％ゲル（サブユニットC）にSDS−PAGEを行なった後，ニトロセルロース膜に転写し，特異抗体を反応させ，ベルオキ
シターゼ標識二次抗体を用いた．抗チトクローム
P450抗体2），抗アルドラーゼ抗体2），抗サブユニット抗体3）はすべてウサギで作成したポリタロナー
ル抗体である．蛍光抗体による免疫細胞染色は木
南の方法によった3）．
対象：Batten病の筋材料は5歳男子および13歳
男子からのもの（国立精神・神経センター・埜中先生），脳および線維芽細胞はWolfe博士（モントリオール神経研究所，カナダ）から供与されたも
のである．
結

果

1）自己会食胞の隔離膜の由来
絶食した動物の肝では自己貪食胞が多数出現する．絶食12時間後の肝より得た自己貪食胞の膜分画には小胞体膜のマーカーが認められるが，長時間絶食した肝の自己貪食胞画には小胞体膜のマーカーが認められないことを昨年報告した4）．より
厳密な食事コントロールの下での自己貪食胞の形
成過程を調べるため，24時間絶食後，夜9−12時の3時間餌を食べさせ，自己貪食を抑制した．そ−147−

こから再び絶食を開始した．図1に示した各時間の1時間前にロイペプテンを注射しこ肝よ り自己会食胞を分匪し，膜標品を得た．段上の小器官おビキチン複合体が局在することを昨年報告した．
ユビキチンー複合体のリソゾーム内蓄積はリソゾーム内蛋白分解の抑制による可能性が考えられ，それを調べる一つの方法として，培養ヒト線維芽細胞にタロロキン，E−64，あるいは庶糖を加えて，リソゾーム内消化を阻害した．それらの中でタロロキンが最も強い効果を示した．ユビキチン抗体を用いた免疫染色を行なうと，対照細胞ではぴまんに染まるのに対して，タロPキン処理細胞

よび取り込まれたタンパク質のイムノブロッティ
ングによる解析結果をデンシドメーターでスキャ
ンし，定量的に現した．ここでは小胞体のマーカーとしてチトクロームP450をみているが，絶食後12時間くらいにピークがあり，その後急速に減少した．他の小胞体マーカーについても同じ動態を示した．貪食胞への取込の指標として細胞質局在の酵素をみると（これは膜分画ではなく，沈殿分画に回収され−る），15時間後にピークがあり，やはり時間と共に減少している．しかし，貪食胞全体の蛋白量は長時間の絶食の間変化なく，取り込まれた蛋白量も変化しないと考えられる．カタラーでは細胞全体に渡り顆粒状に強く染色された．又，イムノプロティングによる解析でも細胞内のエビ
キチン複合体の増加が確認できた．
3）Batten病におけるミトコンドリアATP合成酵素サブユニットCの蓄積
Batten病は筋細胞に自己会食胞が多数出現する病態の一つである．しかし，原因は勿論のこと

ゼなどは絶食の経過につれて大きな変化はなく，用いたアルドラーゼは良いマーカーでないかもしれない．今回の結果も自己会食の隔離膜の由来は小胞体膜である可能性を強く示唆した．
2）ユビキチンー蛋白質複合体のリソソーム内
蓄積

蓄積物の本体については全く不明であった．最近，羊のモデル動物で蓄積物の主たるものはミトコン
ドリアATP合成酵素のサブユニットCであることがわかった．遅幼児型および若年型Batten痛
患者脳のホモジネートのサブユニットCの量を免Rimmedvacuoleを伴う遠位性筋炎（DMRV）
および封入体筋炎にみられるRVに一致してユ10

疫学的に調べてみると，図2−aに示すように，両病型ではサブユニットCのバンド（1−6）が

20
Hours

㈱

30

40

（C）

図1．摂食後の絶食過程におけるチトクロームP450の出現，アルドラーゼの取込み及び自己貪食胞の蓄積
佃■ 膜分画のチトクロームP450（○），沈殿分画のアルドラーゼ（●）（功 貪食胞の蛋白量（C）膜分画の蛋白量−148−

＄ubunlt c O†ATP SynthaSein Brain H昏m◎9台nate冬

MoleCUkr
mas＄（kDa）12

3

4

5

6

7

8

袋

潤巨利12

17．2＿

14．6−
8．24−
6．38￣

2．56−

b

図2

Batten病におけるATP合成酵素サブユニットCの蓄積（a）ヒト脳ホモジネートにおける蓄積のイムノプロテイングによる解析．レーン1−3，
遅幼児型；レーン4−6，若年型；レーン7，幼児型：レーン8−12，対顔（b）封入体筋炎（左），若年型Batten病（右）筋における免疫組織学的検査（C）対照（左）および幼児型Batten病線維芽細胞（右）におけるサブユニットCの局在−149−

対用脳（8−12）よりずっと濃いことがわかった．
幼児型（7）ではサブユニットの量はむしろ正常よりも低い．骨格筋におけるサブユニットCの局
在を免疫組織学的に観察すると，対照では全く染色されないのに対して，若年型では小顆粒状の染程の異常もない可能性が高く，結局分解の異常の色象が見える（図2−b）．線維芽細胞でも，対照では染色性が極めて低いのに対し，患者細胞では非常に強い顆粒状の染色像が得られた（図2−
C）．パコール密度勾配遠心におけるサブユニット
Cとマーカー酵素の分布から患者細胞では主としてサブユニットCはリソゾームに存在すると思われた．また，ATP合成酵素の他のサブユニット

1）KominamiE，HashidaS，KhairallahEAand

仮設が立てられている．本症の原因については今後の研究の発展を待ちたい．

（α）の蓄積はないことを確認している．

文

献Katunuma N：Sequestration ofcytoplasmic
enzymesin a autophagicvacuole−lysosomal
SySteminduced byinjection ofleupeptin．J
BioI Chem258：6093−6100，1983．
2）Ueno T，Muno D and Kominami

E：

Membranemarkersofendoplasmicreticulum
preservedinautophagicvacolarmembranes
isolated fromleupeptintreated ratliver．J

考察

BioIChem266：18895−18999，1991．

自己会食は細胞内の局所的な障害の修復のための応答と思われる．筋ジストロフィー症の筋変性の初期過程がこれにあたる．DMRVや封入体筋炎でみられるRVはリソゾームの種々の酵素活性や量は著しく増えてはいるが，その中での消化は阻害されていると思われる．でなければ，自己会食胞が多数融合あるいは集合したRVは形成されない．エビキチン複合体の蓄積もこれを支持

3）KominamiE，EzakiJ，Muno D，ishidoh K，する結果であろう．しかし，同時にカテプシン陽性の小さな小胞（自己貪食胞）も筋細胞内に多数兄いだされ，初期には局所的な筋蛋白の崩壊が先行していると想定される．
Batten病も酸五ス7アターゼ陽性の多数の自厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト

Ueno T and Wolfe LS：Specific storage ofSubunitcofmitochondrialATPsynthasein
lysosomes of neuronal ceroidlipofuscinosis（Battensdisease）．JBiochem112：278−282，
1992．

4）木南英紀，上野 隆，武野大作，埜中征哉，内山安男：筋細胞死とリソゾームプロテアーゼ．
ロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木珪）平成2年度研究報告書，
1991，pp211−214．

5）PalmerDN，FearnleyIM，MeddSM，Walker

己貪食胞が出現する疾患の一つであるが，これは今回の結果からいえば，ミトコンドリア合成酵素
サブユニットCのリソゾーム内蓄積の結果生じたものであり，筋細胞障害のために誘起されたもの
でない．患者細胞のサブユニットC遺伝子のコー

JE，MartinusRD，BaylissSL，HallNA，Lake

ディング領域の塩基配列には異常がなく5），またmRNAの産性量も正常細胞と変わりないこと5），
ミトコンドリアへの輸入およびアセンブリーの過Exp Med Bio1266：211−224．1990．

ー150−

BD，WolfeLS

andJolly

RD：′Lysosomal

StOrage Of the DCCD reactive proteolipid
Subunit of mitochondria ATP synthasein
humanand ovineceroidlipofuscinoses．Adv27）筋再生と塩基性線維芽紳胞成長因子
後 藤 幾 生＊
研究協力者

笹ヶ迫 直
山 田

一＊ 神 武 直 子＊
猛＊ 小 林 卓 郎＊

は じめに
塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）は様々な生
理活性を持つが，培養筋芽細胞に対してはその増殖を促進させる効果を持つ1）．昨年度我々は生体の筋壊死・再生の過程におけるbFGFの果たす役割を検討するため，実験的壊死筋およびmdxマ
ウス筋のbFGF量をradio−immunOaSSayをもちいて測定した2）．今年度は実験的壊死筋および
mdxマウス筋のbFGFを免疫組織化学染色を用

IgGAb（Vector社）をPBSで100倍に希釈したものを用いた．
結果正常マウス筋では，bFGFはendomysiumに限局して均一に染色された（図1A）．bFGFで一次抗体を吸収すると蛍光は僅かであった（図1B）．

いて検討したので報告する．
対象・方法
実験的壊死筋作成
8週齢のC57BLマウスを用いた．ネンブター
ル麻酔下に右後脚を切開，ヒラメ筋を露出し直視下に0．5％bupivacainehydrochloridelOOJLlを注入，皮膚を縫合した．1，3，5，11日目に屠殺しヒラメ筋を採取した．
ジストロフィー筋
3，40週齢のmdxマウスのヒラメ筋を用いた．
正常対照筋として，同週齢のC57BL／10ScSnマウ
スのヒラメ筋を用いた．
組織染色
凍結切片に対しHE染色および免疫染色をおこなった．免疫染色は凍結切片を蛍光抗体法で染色した．一次抗体はanti−bovine bFGF Ab（monoclonalIgGl，Promega社）をPBSで50倍に希釈したものを，二次抗体はFITCanti−mOuSe＊九州大学医学部脳研神経内科−151−

図1正常マウスヒラメ筋（C57BL，8週齢）におけるbFGF免疫蛍光染色 ×50
A：endomysiumに限局して染色性がみられる．
B：bFGFによる一次抗体の吸収後．

Bupivacaine注入1日後では広範に壊死線経が存在し，少数のマクロファージと思われる細胞の浸潤がみられた．免疫染色ではendomysiumのみ
ならず壊死に陥った筋線経の，細胞質にも淡く
bFGFが染色された（図2A）．注入3日後の壊死
巣では多数の会食細胞が浸潤し壊死線経を埋めつくしていた．bFGFは壊死巣に，侵入した会食細胞の核の周囲にほぼびまん性に染色された（図2B）．この段階では細胞質，細胞間質の染色性に差は無かった．注入5日後の壊死巣ではHE染色にて好塩基性の胞体を持つ再生線経の出現が認められた．会食細胞の数は3日後に比べて減少していた．免疫染色では再生線経の周囲を困むようにbFGFが染色され，またその細胞質にも淡い染色

図2

性が見られた（図2C）．会食細胞の多い部分ではやはりびまん性にbFGFが染色されていた．注入
後11日後では壊死巣はほぼ再生線経に置換されていた．免疫染色ではbFGFは再びenodomysiumに限局して染色され，正常筋と比べて染色性の程度に差は無かった（図2D）．注入5日後と違って再生線経の細胞質は染色されなかった．
3週齢のmdxマウスではすでに筋壊死・再生の過程が始まっていたが，bFGFは正常対照筋と同程度にendomysiumに限局して染色された（図3A）．40週齢のmdxマウスでは強いジストロフ
ィー性変化が認め．られ，bFGFはendomysiumのみならず増生した問質結合組織にも染色された（図3B）．少数見られた壊死線経では実験的壊死

実験的壊死筋におけるbFGF免疫蛍光染色（×50）
A：bupivacaine注入1日後．図の左側は壊死巣であり，同部の筋線経の胞体が淡く染色されている．会食細胞の核の部分は点状に抜けている．
B：注入3日後．壊死巣では会食細胞の核以外の部分がびまん性にかなり強く染色されている．
C：注入5日後．壊死巣に再生線経が出現し始めている．再生線経の胞体にも淡い染色性がある．
D：注入11日後．ほぼ再生線経に置換され，ふたたびendomysiumに限局して染色されている，染色性は正常筋・（図1A）と比べて同程度であった．胞体は染色されなくなっている．
−152−

胞外基質中のプロテオグリカンに結合した形で貯蔵され，その結合がproteaseやheparinase等の酵素により切れ，遊離の状態になって初めて活性を示すことが明らかになってきている4）．bFGFはすでに正常筋のendomysiumに認められたことから，壊死巣のbFGFはこれらのendomysium中のものが筋線維壊死に伴う酵素の活性化により放出された可能性が考えられる．一方，bFGFはマク
ロファージでも産生される5）こと，培養筋芽細胞
では増殖の段階でmRNA量が増えている6〉ことが報告されている．これらのことからは，壊死巣に侵入したマクロファージや，活性化された筋衛星細胞が自己刺激的に塵生している可能性も考えられる．
3週齢のmdxマウスにおいては正常対照と比べてendomysium中のbFGFの染色性に大差はなく，このジストロフィーマウスの示す活発な筋
再生能とbFGFの関わりについては不明であった．
図3

mdxマウス筋におけるbFGF免疫蛍光染色（×50）
A：3過齢．endomysiumに限局して染色されている．
B：40週齢．endomysiumおよび問質結合織に染色されている．＊印の壊死
線経の胞体にも染色性が見られる．

今後はbFGFのmRNAレベルでの検討を行い，壊死・再生筋において発現が促進されるか否か検討を行いたい．
文献1）GospodarowiczD，WesemanJ，MoranJS，etal：Effectoffibroblastgrowthfactoronthe筋と同様に細胞質も淡く染色されていた．

division and fusion of bovine myoblasts．J
Cell Bio170：395−405，1976．

考察2）後藤幾生，笹ヶ迫直一，宮田清典ほか：筋再生

今回の免疫組織化学染色を用いた検討ではと成長因子． 厚生省「精神・神経疾患研究委託

bFGFは正常筋ではendomysiumに限局して染色がみられること，実験的壊死筋では壊死線維および初期の再生途上の線経の細胞質にも染色性がみられること，合食細胞の浸潤の強い部分ではか費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治なり強く染色されること，mdxマウス筋では基本
的にはendomysiumに限局されるが壊死線経の細胞質や増生した問質結合織にも染色性がみられることが分かった．
bFGFはparacrine的，つまり局所で産生されその近傍で生理活性を示すことがわかっており，
正常血寒中にはほとんど存在しない3）．bFGFは細−153−

療法開発に関する研究（荒木攻）平成2年度研究報告書M1991，pp207−208．
3）BurgessWH and Maciag T：Theheparin−binding（fibroblast）growthfactorfamilyof
proteins．Annu Rev Biochem58：575−606，
1989．

4）KlagsbrunMandBairdA：Adualreceptor
SyStemisrequiredforbasicfibroblastfactor
activity．Cel167：229−231，1991．
5）BairdA，PierreM andBohlenP：Immunor−eactive fibroblast growth factorin cells ofand basic fibroblast growth factor mRNAs

peritonealexudatesuggestsitsidentitywith

are expressed by skeletal muscle satellite

macrophagederivedgrowthfactor．Biochem

Cells．Biochem Biophys Res Commun166：

Biophys Res Commun126：358−364，1985．

1205−1212，1990．

6）AlterioJ，CourtoisY，RobelinJ，etal：Acidic−154−28）培養ヒト筋細胞のミオシン垂鎖発現に対する神経支配の影響
小 林 高 義＊
研究協力者

亀 田
官 武

典

正＊ 清 水 輝 夫■＊

骨格筋細胞は運動神経細胞からの神経支配によってtype別分化が生じると考えられているが，その詳細は不明である．今回我々は，ヒト筋細胞のタイプ別分化を検討するため，最近我々が確立したヒト筋細胞−ラット脊髄片併置培養法（Kobayashietal，1987）によって，培養下で継時的にヒト筋細胞のミオシン重鎖（MHC）isoformに対するモノクローナル抗体（McAb）を使用し，免疫組織化学的手法で検討したので報告する．
材料及び方法診断目的で行われた19例の神経筋疾患（筋萎縮性側索硬化症5例；脊髄性進行性筋萎縮症3例：
筋緊張性ジストロフィー症2例：Joseph病，Charcot−Marie−Tooth病，多発筋炎，慢性関節リ
ウマチ，リウマチ性多発筋痛症，顔面一肩甲一上腕型筋ジストロフィー，サルコイドーシス，血管炎，rigidspinesyndrome各1例）の生検筋の一部を培養用に使用した．既に報告した方法で筋単層培養を行い，未熟な筋管細胞が出現する筋単独
培養約7〜10日日に妊娠13日日の後根神経節を付けた胎児ラット脊髄片を併置培養した．単独培養
ヒト筋細胞（AM）は3週間培養したものを使用
し，神経付加成熟ヒト筋細胞は脊髄片付加後約2週間培養し自発収縮し横紋を形成した筋細胞（ICM）を使用した．
攣東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊東京大学医学部脳研神経内科

佳＊ 松 ￣本 春 秋＊

免疫組織化学に使用する一次抗体として4種類のMcAbすなわちtypeI，IIA，IIB，＆IICのす
べてのmyosinを認識するMcAb−1（QM355），
typeIIA，IIB＆IICを認識するMcAb−2（E35−3）とMY32（Sigma），そしてtypeIだけを認識するMcAb−3（SM1−11−2）を用い，培養皿上で染色を行った．更にmyosinisoformの発現率を計算するために，培養筋細胞をラット俳腹筋内に挟み凍結した筋肉ブロックから連続凍結切片を作製し，これらの切片に対してmyosinATPase染
色と，免疫組織化学染色を行った．培養筋細胞数
全体に対するMcAbT2，McAb−3陽性細胞の発現率を計算するために，まずMcAb−2またはMcAb−3を使用して酵素抗体法により筋細胞を染色した
後，同じ切片をMcAb−1を使用し蛍光抗体法を行い二重染色した．更に，同一筋細胞におけるfast
及びslow MHCisoformの発現を検討するために，McAb−2とMcAb−3を各々FITC及Ul
rodamineでラベルし二重染色を行い蛍光免疫組
織化学的に検討を行った．
結果

培養皿上での観察では，一部の筋芽細胞，及び大多数のAM，ICMでMcAb−1は陽性であった（図1）．また多くのAM及びICMはMcAb−2に対しても陽性であった（図2−A，B）．一方McAb−
3に対しては，AMでは陽性細胞は小数であり，ICMでは陽性細胞の数がAMに比し増加した（図2−C，D）．

−155−

図2Immunocytochemicalperoxidasestain−
ing using anti−rabbit fast myosin（MY32：A＆B）andantトhumanslow
MHC（McAb−3：C ＆ D）on entire
human muscle culture dishes．Bar＝50〃m・（心Somemyotubeshavediffusestain−
ing of fast myosinin48days ofculture．

（B）Fast MHC−pOSitive stainingis
welllocalized on cross−Striations

図1IndirectimmunOfluorescence stainingof McAb−l on cultured dishes ofaneurally（A＆in manyinnervated well cross−
Striatedcontractingmusclefibers

B）andinnervatedin17days of co−Culture．

COntraCting cultured human muscle（C）Onlyafewmyotubeshaspositive

Cells（C）．Bar＝50JLm．

（朗

Staining ofslow MHCin19days

Myosin−pOSitivereactionisobser−of culture．

Vedonamyoblast（arrow）andan
immature multinucleated cells（IB Someinnervated contracting
muscle fibers have positive stain−
ing of slow MHC on cross−Stria−
tionsin17days of co−Culture．

with4nuclei（arrowhead）in12
days of culture．
（B）Ⅰntense diffuse myosin−pOSitive
Stalnlngis observed on myotubes

Ⅰ，6％がtypeIIA，91％がtypeIIB＋Cの染色性を示した．McAb−2あるいはMcAb−3とin12days of culture．

（C）Myosin−pOSitive stainingislocal−
ized on cross−Striationsininner−

McAb−1の二重染色では，McAb−2陽性筋細胞はVatedwellcrossMStriatedcontract−
ingmusclefibersinlOdaysofco

AMで92．1±4．1％，ICMで88．8±5．0％と神経付−Culturewith rat spinalcord．

加による差は認められなかったが，McAb−3とMcAb．1の二重染色ではMcAb−3陽性細胞は凍結切片による定量的観察では，pHlO．6，pH

AMで0．9±0．6％であったのに対しICMで4．6でpreincubateしたmyosin ATPase染色による組織化学的検討では，全てのAMは酸性，ア8．3±2．6％と神経付加によりMcAb−3陽性細胞

ルカリ性の両方で濃く染色されtypeIIcの染色
patternを示した．一方，ICMでは3％がtype

同一筋細胞のMcAb−2とMcAb−3による二重の数は有意に上昇した（図3：表），
染色では，AMではほとんどの筋細胞がMcAb−2

ー156−

FaSt myOSin

図3Pan悶y⑳審査閑DoublestainingofimmunocytochemicalperoxidaseusingMcAb−2（A，C）＆McAb−3（E，G）andimmunofluorescenceusingMcAb−1（B，D，F＆H）oncross．sectionsofaneurally（A，B，E＆F）andinnervated contractingcultured human musclecells（C，D，G＆H）．
Bar＝50JLm．

A−D：Manyaneural（A）andinnervated（C）musclecellshavepositivereactionoffast
MHCin12daysofcultureand22daysofco−Culture，reSpeCtively．However，SeVeralmuscle
fiberswithnegative peroxidase staining offast MHC had positiveimmunofluorescent
reaction of McAb−1（D：pOSSibly slow MHC−pOSitivecells）．
E−H：Inaneuralcultures，manymyOSin−pOSitivemusclecellsareobserved（F），however
noslowmyosin−pOSitivemusclecellsaredetectedinthissection（E）in18daysofculture．
Some darkimmuno−perOXidase positive muscle fibers are observedininnervated
COntraCtingmusclefibers（G）in22daysofco−Culture．Thenumberofmyosinpositive
musclecellsareconsideredasthenumberofMcAb−1positivemusclecells（B，D，F＆H）＋thenumberofMcAb−20r−3positivecells（A，C，E＆G）becauseperoxidaseimmuno−reaCtion positive muscle cells have no more fluorescent positiveimmuno−reaCtion of
McAb．20r−3（see dark DAB stainingin B，D，F＆H）．
−157−

こ1ヽ†

図4

ざ‥リV、

DoubleFITC（A，C，E）androdamine（B．D，F）immunofluorescencestainingusingMcAbs−2andL3incrossrsectionsofaneural（A，B）andinnervatedcontractingmusclefibers（C，D，E＆F）in18daysofculture and22daysofcorculture，reSpeCtively．Bar＝50FEm．
In aneurally cultured muscle，Only fast myosin−pOSitive cells are observed．Ininnervtaed
COntraCtingculturedmuscle，however，SOmemuSClefibershavepositivestainingofbothfast

andslowMHC（arrowheads）andafewmusclefibershavepositivestainlngofslowMHC
with negative staining of fast MHC（C＆D，arrOWS）．

にのみ陽性でMcAb−3には陰性であったが，ICM
ではMcAbr2とMcAb−3の両方に陽性な筋細胞
及びMcAb−3のみに陽性な筋細胞の出現が認められた（図4）．
考察Ecob−Princeら（1989）は，ヒト筋肉片とマウ
ス脊髄片とのOrganOtypic co−Cultureを使用し，MHCisoformの検討を行い，Slow MHCはin−nervationにより変化を受けないことを報告している．我々の系による検討では，ICMにおいてAMに比して有意にslow MHCを発現する筋細胞が増加した．この系ではICMは平均5Hzで，ほぼ持続性に収縮しており，一方Ecob−Princeらの培養系では，横紋を形成している筋細胞は平均20％で，収縮している筋細胞は10％以下であるため，筋収縮あるいはinnervationの影響が反映されていない可能性が考えられる．我々の系におけるSlow MHCのICMにおける増加が，機械的な筋収縮のみによるのか，あるいはchemical trans−missionによる影響があるのか，更にadult typeのfastMHCの発現がinnervationにより影響を

−158−

表

The expression ofslow and fast MHCisoformsin cultured humanmuscle㌔ o f

C a ses low

M H C −p O S l t l Y e
A Mee l ls

ヽ o f

工C M

fa st

M tlC −p O S l t l v eAM

ce l ls

工C M

1

0 ．0

（n J 8 7 9 ）7 ．8（n −1 9 3 ）1 0 0 ．0

（n t l 1 2 9 ） 9 5 ．7

（n 】1 1 7 ）

2

2 ．6

（n ！1 1 7 ）4 ，0（n 1 8 5 8 ）

8 9 ．5（n ■1 0 5 ）9 9 ．3（n ！1 1 7 ）

3

0 ．0

（n ヨ
・2 5 ）

1 0 ．0（n −2 0 ）7 5 ．0（n ■8 ）

1 0 0 ．04−

1 0 ．7（n ヨ1 2 1 ）

9 0 ・I（n ・1 7 乙）

8 3 ．3（n I 1 7 4 ）

7 0 ．7（n −1 1 6 ）9 ．1（n ■3 3 ）7 7 ．1（n 暮2 1 4 ）

5
6
7

0 ．0

（n 暮7 5 ）8

2 ．9

（n ＝3 4 ）90 ．0

（n 雷4 2 ）ロe a n1 0 0 ．0

（n t 3 5 ）−8 8 ．1（n t 4 2 ）−1 0 0 ．0

（n T 4 2 ）9 2 ．1● 4 ．1 ・−（n t 7 ）

−
−
−

（ 土 0
S E．9
M ）± 0 ．6
2 0 ．8

土 1 2 ．5

8 8 ．8◆ 5 ．0．The percent：age Of slow MHC−POSltlve or faSt MtlC−Pt）Sltlve cells
lrldlcates the nuJTlber of slolY MHC（McAb−3）or fast MlIC（Mc一＾b−2）

posltlve cells／the number of McAb−1−pOSltlve cells（seeln
Flg．3）ln a

51ngle seetlon xlOO．

AM：aneural muscle．ICM：lnnervated contraCtlng tnuscle
●

P

く

0．01．

受けるかどうか，更に今後検討をする予定である．

文

献1）KobayashiT，Askanas V and EngelWK：

結論
1．今回初めてヒト成人骨格筋衛生細胞由来の培養筋細胞において，神経支配によるMHC
isoformに対する影響を検討した．

Humanmuscleculturedinmonolayerandco

2．この系の中で，adultslowMHCisoformの発現に神経支配が重要な役割を果たしていることを初めて明らかにした．

3141，1987．

−Culturedwithfetalratspinalcord：impor−tance of dorsalroot ganglia for achieving
SuCCeSSfulinnervation．J Neurosci7：3131−

2）Ecob−Prince M，Hill M and Brown W：
Myosin heavy chainexpressionin humanmuscleco−Culturedwithmousespinalcord．
J NeuroI Sci90：167−177，1989．

−159−29）筋原線経のC一蛋白質を分解する酵素の存在と
その性質
堀

研究協力者

眞一郎■

小 島

崇＊ 大 谷 幸 子＊

は じめに液で3回洗ったものを酵素標品として使用した．

筋ジストロフィーマウス（C57BL／10ScSn−

C−蛋白質分解酵素の活性検定：精製した速筋型C一蛋白質に酵素標品を加えたものを，5M尿素存在下で，25℃，1時間インキュベーションした
後，SDS処理し，SDS−PAGEとイムノブロット法
を組合せ，C−蛋白質の変化を検出した．イムノプ
ロットには，SDS−PAGE終了後，48mMTris−39

MDX，MDX−マウス）はヒトのDuchenne型筋ジストロフィーと同様に，ジストロフィン遺伝子に異常を持った動物である．我々は，このマウスを用いて，筋蛋白質における遺伝子の情報発現の異常を二次元電気泳動で検討している過程で，MDX−マウスの速筋型C−蛋白質のスポットが消失あるいは正常対照マウスに比べ量的に減少していることを兄いだしたl）．さらに，このC−蛋白質の変化はヒラメ筋や心筋では見られず，速筋型C−蛋白質に特異的であることが分かった．また，このC一蛋白質の変化はC−蛋白質を分解する酵素の存在によっていること，このC一蛋白質を分解する
酵素の活性は，生体内に一様に存在するのではな
く，骨格筋に特異的に存在していることが，明らかになった2）3）．ここでは，阻害剤による活性の阻害効果からセリンプロテアーゼの性質をもっていることが分かったので報告する．
実験方法
速筋型C一蛋白質の精製：速筋型C一蛋白質は，ウサギ（NewZealandwhite）の背筋から，Starr
ら4）の方法に従って精製した．
C一蛋白質分解酵素の調整：生後120日のマウス（C57BL／10ScSn及びC57BL／10ScSn−MDX）の骨格筋を0．6MKC1−10mM EDTATlOmM Tris−

mM glycine，1．3mM SDS−20％methanol溶液（pH8．8）中で電気的にニトロセルロース膜に転写した．このニトロセルロース膜を1．5％ゼラチンー
TBS（Trisbuffered saline：0．5M NaClq20mM
Tris−HCl，pH7．5）溶液に浸しブロッキングした
後，一次抗体と1時間インキュベーション，次い
で，TBSで洗浄後，二次抗体と1時間インキュベーションし，再度TBSで洗浄の後，Ni＋＋，Co＋＋T
DAB法で発色させた．一次抗体には，千葉大学理学部の大日方教授より供与された，速筋型C−蛋白質に対するモノクローナル抗体Fc−18を，二次抗体にはTBSで3000倍希釈したBio−Red社のHRP−GAMIgMを用いた．酵素活性の定量化にはresorufin標識をしたcaseinを基質として用いた．Resorfin標識caseinを酵素標品と共に，25℃，1時間インキュベーションした後，5％
TCAで酵素反応を停止し，遠心後，上清（80JJl）
を0．75M Tris−HCl，pH8．8，120JL＝こ移し，574
nmでの吸光度から，分解されたcasein量を定量し，酵素活性を測定した．

HCl（pH7．8）に懸濁し，不溶性画分をさらに同溶結＊㈲東京都神経科学総合研究所分子研究系神経生化学部門

果

図1はMDX−マウスの骨格筋から調整した酵−160−

図1 蛋白分解酵素阻害剤の効果精製したC一蛋白質（0，2mg／ml），5M尿素，10mMDTT及び各種蛋白質分解酵素阻害剤を含んだ反応液に酵素を加えて，反応を開始し，250C，
1時間インキュベションした後，SDS処理液を加え，沸騰水中に1．5分浸して酵素反応を停止した．遠心後，各々の上清をSDS−PAGEで分乾した
後，Coomassie Briliant Blue染色（A），FC−18抗体によるイムノブロット（B）をした．1：C一蛋白質のみで酵素を加え無かったもの，2，3：C
一蛋白質に酵素を加えたもので，2は酵素を加えた直後に，SDS処理液を加えたもの，3は酵素を加えて1時間後に，SDS処理液を加えたもの，
4−9：C一蛋白質，酵素に，蛋白分解酵素阻害剤を加えたもので，4はchymostatinlOOFEg／ml，5，6はそれぞれpepstatinを8および0・8FLg／
ml，7，8はそれぞれbestatinを400および40Jg／ml加えた．

素標品とウサギ骨格筋から精製したC一蛋白質とを5M尿素存在下でインキュベーションした後，
SDS−PAGEにより分離し，Coomassie Briliant
Blue染色（図1A）およびFCL18によるイムノブ
ロット（図1B）したものである．調製したC一蛋
白質は分子量約140kdで95％以上の純度である．
（図1A及びB，1列）．C一蛋白質と酵素標品を混ぜた直後にSDS処理した場合にはC一蛋白質の分子量の変化はなかった（図1B，2列）が，25℃，1時間インキュベーションした後には，低分子量に分解されていた（図1B，3列）．Chymos−
tatin（100FLg／ml）はこの分解を抑制した（図1
B，4列）．Pepstatin（8，0．8FLg／ml），bestatin（400，40〟g／ml）はこの分解を抑制しなかった（図1B，5，6，7，8列）．なお，Chymostatinの濃度が10JJg／mlでは分解抑制効果は弱かった．図2はPMSF，APMSFの作用をみたものである
が，PMSFは17．4FLg／mlで，C．蛋白質の分解を抑制したが，APMSFは1mg／mlでも分解を抑制しなかった（図2B，5，6，7，8列）．その他，TPCK（0．1，1mg／ml），TLCK（10，100Jg／ml），Er64（1，10／Jg／ml），antipain（60，600FEg／ml），leupeptin（1，10JLg／ml），phosphoramidon（30，300JLg／ml），aprOtinin（1，10JLg／ml）のいずれも分解活性を阻害しなかった．また，金属キレ
HターであるEDTA（1，10mM），EGTA（1，10mM），0−phenanthroline（1mM），α，αLdipyridyl（1mM），SH阻害剤であるNEM（0．1，1mM），
PCMB（10，100JJM），DTNB（0．1，1mM）のいずれによっても分解は抑制されなかった．なお，

−161−

図2

PMSFとAPMSFによる阻害効果
実験ノJ法は図1に同じ．1；C一蛋白質のみで酵素を加え無かったもの，
2．3，4：C一蛋白質に酵素を加えたもので，2は酵素を加えた直後に，SDS
処理液を加えたもの，3，4は酵素を加えて1時間後に，SDS処理液を加えたもの．4にはPMSFを溶解するのに使用したethanolを5，6と同じ濃度に加えてある．5−8：C−蛋白質，酵素に，蛋白分解酵素阻害剤を加えたもので，5，6はそれぞれPMSFを174および17．4Jg／ml，7．
8はそれぞれAPMSFを1および0．1mg／ml加えた．

SH阻害剤の効果を検討するときには，酵素反応
液にDTTは加えなかった．阻害効果を定量化す

Sinによる分解産物と同じであり，trypSinとは異なっていた．

るため，reSOrufinで標識したcaseinを基質として，阻害剤の効果を検討してみたところ，ここで考察用いた酵素標品は，尿素が無くてもcaseinを分解

骨格筋にはcathepsin，Calpainの様な蛋白分解

することが分かった．その分解の至過pHは尿素酵素が存在しており，筋崩壊との関連が検討され存在下ではpH8にあり，尿素無しでは，pHlO以上ているが，ここで報告したC一蛋白質分解酵素は，のアルカリにあった．また，C一蛋白質を基質とし阻害剤による阻害効果の特異性から，Serineて，SDSrPAGEで観察した阻害剤の効果を，

proteaseであり，Cathepsin，Calpainとは異なっ

resorufin標識caseinを基質としてしらべたとこ

た蛋白質分解酵素であると考えられる．また，ころ，表で示すように，Chymostatin（10FLg／ml），の酵素はα−Chymotrypsin様の活性を持っていることも分かった．

PMSF（0．1mM）は完全に阻害したが，他の阻害剤は効果がなかった．ただし，TPCKは尿素存在

遺伝的進行性筋ジストロフィーの病理学的特徴

下で弱い阻害効果を示した．Casein分解に対するは自筋あるいは赤筋の変性壊死である．筋原線椎阻害剤の抑制効果の特異性はC一蛋白質を用いたの崩壊にはlysosomal

時と同じであった．

していると考えられている．殊に，筋原線維内のproteaseが重要な働きを

C一蛋白質の分解様式をSDS−PAGEによって，CathepsinBあるいはLの活性増強はこの筋変性

ここで用いた酵素標品とα−Chymotrypsin及びの引金になっているのではないかと報告されていtrypsinとの間で比較したところ，αLChymotryp−るが，筋ジストロフィーの病態における蛋白分解

−162−

表

Effect ofinhibitoer

グロブリンスーパーファミリーに属しており5），
この酵素が免疫グロ70リンにも作用する可能性もInhibi10r

U rea （＋）

U rea （
−）

1∞ ％

1（
X）
％

l認 諾 慧41

29
13

p M SF

O・
i慧

0
0

35
20

∬ M SF

4錨

113
115

96
93

A p ro血山

武 鎧

1 10
102

96
93

n cK

2…
諾

98
66

1（
X）
91

W CK

OZ …慧

57
59

83
91

村瑞穂：筋ジストロフィーマウス（MDX）にお

E一
朗

2…
：
昌㌫

98
94

111
125

ける筋蛋白質の高分子領域における異常についL c岬 山1

2‡
需 ㌶

114
92

106
105

A n dpM

9；
岩㌫

10 1
107

105
94

に関する研究 （杉田班），昭和62年度研究報告

p cⅦ

1蒜

102
107

10 6
10 6

NEM

0．
1m M
lm M

89
79

112
116

書，1988，pp69−73．
2）堀眞一郎，杉浦弘子，大谷幸子，平林民雄：筋P ho sp hoTam 血

55 ドM
5 50 1朗

98
109

109
10 6

EDTA

l mM
10 m M

92
94

84
75

E G TA

0．
2m M
2．
Om M

69
80

1（
X）
83

n

？
霊 慧

10 1
77

gg
66

3）堀眞一郎，小島 崇，田中知仁，大谷幸子：骨Pepsta血

1圭
：
鍔

102
66

64
70

格筋筋原緑経の構成成分であるC一蛋白質を変

N one
勒 ⅦOStadn

B血考え得る．この酵素の生理的役割を考える上で検討すべき問題である．
まとめ

C一蛋白質分解酵素はα−Chymotrypsin様の活性をもったserine proteaseである．
文献1）堀眞一郎，杉浦弘子，大谷幸子，平林民雄，中て． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジ
ストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因

ジストロフィーマウス（MDX）筋のC−プロテ
インの動態について． 厚生省「精神・神経疾患
研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班），昭
和63年度研究報告書，1989，pp243−246．

換する因子について． 厚生省「精神・神経疾患
研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患

酵素の役割は未だ不明である．ここで報告したC
一蛋白質分解酵素は先に，明らかにしたように3），の成因と治療法開発に関する研究 （荒木珪），

骨格筋に特異的に局在している．C一蛋白質は骨格筋のAL帯に局在し，aCtinとmyosinの間に介在している蛋白質である．この蛋白質が分解されると筋原線経の構造の安定性は弱まり，崩壊壊死は促進されると想像される．このことから，この酵
素は進行性筋ジストロフィーの病態に関連しているのではないかと予想される．故に，この酵素の筋原線維構成成分のそれぞれに対する作用の特異性，筋肉内における局在，活性調節について，研究を更に進める必要がある．

4）Starr R and Offer G：Preparation of C−
protein，HLprOtein，Ⅹ−prOtein，and phospho−

また，この酵素の基質であるC一蛋白質は，免疫−163−

平成2年度研究報告書，1991，pp215−218．

fructokinase．Meth Enzymo185：130r138，
1982．

5）EinheberSandFischmanDA：Isolationand
Characterization ofa cDNA cloneencoding
avianskeletalmuscleCLprOtein：Anintrace1−
1ularmember oftheimmunoglobulinsuper−family．Proc NatlAcadSciUSA87：2157r
2161，1990．

30）筋緊張性ジストロフィー患者immunoglobulin Gの糖鎖構造
杉 村 公 也＊研究協力者

伊 藤 慶 大＊ 高 橋 示豊 子＊＊ 米 山
本 田仁＊ 高 橋
昭＊

は じめに

方

筋緊張性ジストロフィー（以下MyD）は，筋萎
縮やミオトニアに加え，白内障や耐糖能低下，知能低下など多彩な症状を呈する疾患である．その多彩な症候の中で，古くより血清immunog−
lobulinG（以下IgG）の低下が報告されており，
いままで様々な角度より検討が加えられてきたが，その成因は明らかになっていない．IgGは，基本的に，Fc部分に一対の糖鎖を持っていることが知られている．糖鎖はⅩ線解析により，立体構造上は

法

患者群及び対照血清1〜2mlを40％硫酸アン
モニウムにて塩析し，さらにそれをMonoQcol−
umn及びprotein Gを用いてのaffinity chro−
matographyによりIgGを精製した．精製度はSOdium dodesyl sulfate／polyacrylamide gelelectrophoresisにより確認した．

中心付近に位置し，いろいろなIgGの機能に関与していることが推定されているが詳細については不明の点が多い．
今回我々はMyDの低IgG血症の成因に関して糖蛋白質であるIgGの糖鎖に着目し，検討を加えたのでここに報告する．
対

柴＊

象．

思春期以降に診断されたMyD14例（男性6例，女性8例）および20歳のCOngenital myotonic
dystrophyの女性例を対象とした．対照には健康
成人9例（男性6例，女性3例）を用いた．年齢
はMyD群が24−53歳，平均40．7歳であり，対照の健康成人9例では年齢20−45歳，平均33．4歳であった．血清IgGの平均値はMyD群で992mg／dl
であり1000mg／dl以下の症例が7例あった．

＊名古屋大学医学部神経内科＊＊名古屋市立看護短期大学−164−

8ROUPll精製したIgGをペプシンにて消化し糖ペプチに関し詳細に検討すると，agalactosyl oligosac−

ドにした後，アーモンドより精製したglycope−charide，digalactosyloligosaccharideのみならず，mOnOgalactosyloligosacchrideの割合にも正常対照群と有意差を持って，相違が見られた（表）．

ptidaseを作用させオリゴ糖を遊離した．遊維させたオリゴ糖をBio−Gel P4columnにてゲル濾過し，オリゴ糖画分を集め，2−アミノピリジル化
し，ODS−Silica，及びAmide−80columnを用いて2次元マップ法にて糖鎖構造の解析を行った．
結果1）正常対照より精製したpolyclonalIgGの糖鎖構造は大別すると，単純な二本鎖群（groupI），フコースを持った二本鎖群（groupII），フコ

3）MyD群における血清IgG濃度とagalactosyl oligosaccharide（01igosaccharide
E）との関係を調べてみると，agalactosyl
oligosaccharideの割合も少ないものは全体として血清濃度は低い傾向にあり，逆にagalactosyl
oligosaccharideの割合の多いものでは，血清濃度が正常域のものが多かった（図3）．

ース及びbisecting N−aCetylglucosamineを持った二本鎖群（groupIV）の3群に分けられた（図1）．＿各groupの糖鎖全体に占める割合はgroup
IIが約80％で，grOupI，grOupIVはおのおの約10％程度であった．各訂Oup間の糖鎖の割合の比較
ではagalactosyl oligosaccharideの割合がdiga−
1actosyloligosaccharideに比し，相対的に少なかった．以上の結果は今まで報告されたhumanpolyclonalIgGの01igosaccharideのpatternと一致していた1）．

考察

筋緊張性ジストロフィーにおける血清IgGの低下は1956年にZinnemanらによって記載されて以来知られ，Catabolismの冗進2）であるとか血管外への漏出3）であるとか，おもに血清IgGの動態に関しての検討がなされてきた．しかし，IgG分子そのものに着目してその変化をとらえたという研究は今までほとんどなかった．IgG分子におけ2）MyD群血清より精製したpolyclonalIgG

る糖鎖の機能に関しては，依然として明らかでないことが多い．これまでに糖鎖の変化により補体

oligosaccharideのpatternは，正常対照群に比しへの結合性が変わる4）などの事実が明らかになっ明らかな差異を持っていた（図2）．各groupともてきている．

agalactosyloligosaccharide（01igosaccharideA，E，M）の増加とdigalactosyl oligosaccharideの表

ComparisonofoligosaccharidemoietyofIgG（％）between MyD and control

減少が見られた．全体の約80％を占めるgroupII

MyD

Group1

7・50

0日gosa亡亡harlde A

2．88

0日gosa亡でharIde p l・57

h一層3dH 3303ト〇三h011gogaCrhar川t C l．20±

OllgosatChar川e D l・00

土Group1101igo58⊂tharlde E
oHgo柑 丸山de F
0日go印CChaHdt G

図2

l

l

l

l

l

l

±

0．15

0．57

±

32．15

5．00
±

5．97

GrouplV ll．88

±4．03

1．87

±

0．23

±

0・22

±

±

78・78

±

4・94

18t53

±

3・30

28・03

±1・39

01短OS且tCh肝Ide O

0．87

±

011goSaCtharldt P

2．32

±1．17

0・TO H−165−

pく0・05…

±5・71…

±3・80

3・51±
5・川

±

0・40

〇・47

l

01igosaccharidemoietyofIgGfromMyD

●●

2・52

11・87

±1．00

〇・37

山一

22．70 ± 4・25 ●●g・87 土1・10 ●●●

±4・18

5．08

4，15

2・12
2．17

0・80

17．72 ± 2．28
13．19 ± 3．01

5・90

9・31±

0．16

15・33

01毎osaCC打Idt N
l

80．83

Conlrol（n＝，）

3．04

oHgo開∝血山肌e H

0110ユー〔arldt M
l

±

n＝14）

±

0．29

…p＜0・01

0・85

土

0・12

2．55

±

0・38

●‥pく0・001

…

0
0
7

しないままであった．しかし，今回の研究により

005少なくともMyD患者の血清IgG濃度を規定する因子の1つとして，IgG分子中のgalactose量が

0
0
3
0
0
1

文

0
0
9

献

1）Takahashi N，IshiiI，Ishihara H，et al：00
7︵■P︑n∈V q空∈2品

関与していることが推察された．

ComparativestructuralstudyoftheNLlinked
Oligosaccharides of human normal and

20

25

30

35

40

45

pathologicalImmuglobulinG．Biochemistry

01igoSaCCharlde E ratjo（％）

図3

Relationship between oligosaccharide E
ratioandserumIgGconcentrationinMyD

26：1137−1144，1987．

2）Wochner RD，Drews G，Strober W and
Waldman TA：Accelerated breakdown of

糖蛋白質糖鎖の機能に関してはその蛋白質ごとに異なり，機能の解析はいままでにごく少数の糖蛋白質を除いてほとんどなされていない．血清中

immunoglobulinG（IgG）inmyotonicdystro−phy‥Ahereditaryerrorofimmunoglobulin

Catabolism．JClinInvest45：321−329，1966．

の糖蛋白質において，特にセルロプラスミン等で脱シァル化したものでは，血中半減期が激減する

3）SuzumuraA，HYamadaHMatuokaY，et

ことが知られている．この現象を説明する理由として，肝臓に存在するgalactosereceptorが表面に露出したgalactoseを特異的に認識して取り込
むという事実がわかっている5）．このことに関連

withmyotonicdystrophy．ActaNeuroIScand

して表面のgalactoseをgalactosidaseによりはずしてN−aCetylglucosamineを露出させると半減期は脱シァル化の90％までに回復することから生体内におけるgalactosereceptorの重要性がわ
かる5）．人におけるIgGの糖鎖は立体構造上酵素処理も難しく，かつほとんどアシアロの状態で存在するにもかかわらず高い血清濃度を維持しておりgalactosereceptorの関与に関してははっきり−166−

al：Immunoglobulinabnormalitiesinpatients
74：132−139，1986．

4）JefferisR，LundJandPoundJ：MoleculardefinitionofinteractionsitesonhumanIgG
for Fc receptors（huFc gamma R）．Source（BibliographicCitation）：MolImmuno127‥

1237−40，1990．
5）AshwellGandMorellAG：

BloodcellsandPlasma

Glycoproteinsof（edbyJamiesonGA＆Greenwalt TJ）Lippincott Philadelphia，
1971，pp173−189．

Ⅵ．ミトコンドリア脳筋症（No．1）

31）MELASと糖尿病の合併例について
福 原 信 義＊
研究協力者

新 田 永 俊＊ 石 黒 英
樋 口 砂 里＊ 中 島

は じめに
ミトコンドリア脳筋症はKearns−Sayre症候群（KSS），MELAS，MERRFに大別されているが，筋症状以外に種々の臓器の合併症を伴うことがあり，Eggerらl）は全身のミトコンドリア異常症と捉えてmitochondrialcytopathyなる概念を

明＊ 多
孝＊

久

肇

一書

の異和感，けいれん発作が出現したため当科へ入院した．
入院時現症：身長158cm，体重41kgと全体に痩せているが低身長はない．一般内科的には特に問題はなかった．神経学的に意識は清明で痴呆はなく，眼底も正常．両側の側方注視性水平性限振，感音

我々は，糖尿病とけいれん垂積発作で発症した性雉聴，軽度の構音障害，全身の軽度筋萎縮を認
め，深部腱反射は低下していたが，筋力低下や病的反射はなく，筋緊張の低下，上肢の軽い運動失調と歩行時のふらつきを認めた．感覚障害はなかMELASの症例を経験したが，本例をもとにミトった．

コンドリア脳筋症における糖尿病の発生機序につ

入院時検査所見（表1）：尿糖陽性，血糖，いて若干の文献的考察を加え報告する．

HbA．。，フルクトサミンの上昇を認め，血液および髄液中の乳酸，ピルビン酸は高値を示した．心電図は正常，脳波では徐波の混入と発作波を認め，提唱している．種々の合併症の1つとして糖尿病が知られている1ト10）が，ミトコンドリア脳筋症における糖尿病の発生機序についての報告は少ない．

症

例

症 例：34歳，女性．
主 訴：けいれん発作．
既往歴：特記すべきことなし．
家族歴：母，糖尿病，脳卒中にて死亡．姉，けいれん発作にて37歳で死亡．母方従姉妹，20歳で死亡（詳細不明）．
現病歴：22歳時に糖尿病を指摘され，25歳よりインシュリン療法を行っている．33歳の時全身硬直，意識消失が出現しけいれん重積状態にて近医に入院．この時，血糖265mg／dlで，以後糖尿病のコントロールは極めて不良となった．当科外来初診時，両側難聴，全身の軽度筋萎縮，深部腱反射の低下と発作波を含む脳波異常がみられ，その後右視野

神経伝導速度は俳骨神経34．5m／S，脛骨神経33．0
m／S，俳腹神経35．6m／Sと下肢で低下していた．頭部CT（図1）では両側後頭葉の萎縮と自質の低吸収域を認め，99mTc HMTPAOによるSPECTに
表1 検査成績尿糖1．0g／dt

尿中C一閃Ptido

F8S

128日／dl

イ乃ユリン受容体抗体

く3・2〟‡／日
陽性

Hbl，。

9．8％

麟島細胞抗体陰性Fruct130〝l／L

霹島担胞蹟抗体陰性

乳酸

20．6t川／dlと●Iビン潔 0．93日／dt
髄液：蛋白241g／dl、乳酸30．2日／dl、ヒ Iヒ ン酸1・65日／dl■国立療養所犀潟病院神経内科−169−【グルカゴン負荷試験】

前C−pOPtido（nl／■‖

0．7

￣3分

6分

10分

1．2

1．2

1・1

て頭部CTで異常のない部位にも血流低下域が散在していた．右大腿四頭筋筋生検（図2）にて筋の大小不同と中心核のほかraggedrred fiberを多く認め，電顕では結晶状封入体を含む多数の巨
大異常ミトコンドリアとグリコーゲンの増加を認めた．また患者白血球のミトコンドリア遺伝子の検索ではtRNALeu（UUR）の点変異が確認され，以上よりMELASと診断した．糖尿病に関して本
例では，尿中C−peptideの1日排泄量は3．2JLg以下と少なく，グルカゴン負荷試験でも血中C−pe−ptideの低反応を認め，インシュ1）ン受容体抗体，
膵島細胞抗体，膵島細胞膜抗体は陰性であった．
考察

ミトコンドリア脳筋症の中ではKSSで糖尿病の合併が多く，MELASでの報告は稀である．
Tanabeら2）はKSSを含むミトコンドリア筋症
で糖尿病や耐糖能異常を合併した17例を総括しており，糖尿病の平均発症年齢は21．6歳，半数以上は30歳以下の発症で糖尿病のコントロールにイン

図1頭部CT：両側後頭葉の萎縮と白質の低吸収域を認める．

シュリンを必要とした．6例は糖尿病の発症がミトコンドリア筋症に先行し，両者の合併は単なる

図2 右大腿四頭筋（HE染色 ×280）：筋の大小不同と多くのragged−redfiberを認める・
−170−

表2
告

者

Shhojiらい（1987）

石達ら●l（1987）

今井らTI（1989）
小コら●，
（199日
田田ら●）
（199日
西澤らIM
（1ggl）
本

例症一冊 冊 冊 闇 冊⁝冊

報

糖尿病（DM）を合併したMELASの報告例

でもミトコンドリア酵素の異常が指摘されており，
ミトコンドリアの異常と糖尿病を関連づけるうえ例

腔u発症年齢Dl発症年齢

男

21黛

26歳

男

22績

女

小児閏

24歳
（イ沖ユリン非依存性）
33織

女

騨坤不明

騨坤不明

女

6貴

女

41歳

18繊
（22黛†沖1の療法）
36歳

女

34慮

で興味深く，今後の検索が必要と思われる．
まとめ

1．糖尿病とけいれん重積発作で発症した
MELASの症例を報告した．
2．KSSと同様，MELASでも糖尿病の発生機序としてインシュリンの分泌低下が示唆された．

22歳（25餞イ乃1リン療法）

文献1）EggerJ，Lake BD，et al：Mitochondrial

偶然ではないとしている．KSSにおける糖尿病の

CytOpathy，A multisystem disorder

発生機序に関してToppetら3）は糖負荷試験でインシュリンの分泌低下を認めており，Tanabeら2）

raggedredfibresonmusclebiopsy．ArchDis

はグルカゴン負荷試験で血中C−peptideが低反応にもかかわらず，euglycemic glucose clamp
techniqueにてインシュリン感受性が正常なことから糖尿病の発生機序としてインシュリンの分泌低下を考えた．またPiccoloら4）も糖負荷試験や

2）Tanabe Y，Miyamoto S，et al：Diabetes

グルカゴン負荷試験でのインシュリンやC−pe−ptideの分泌低下を認める一方，患者の白血球や線維芽細胞ではインシュリン受容体の数やインシwith hypoparathyroidism．AmJ Dis Childュリンに対する親和性が正常なことから，糖尿病の発生機序に関してTanabeらと同様，インシュリン分泌障害を示唆した．
MELASで糖尿病を合併した症例は検索した限り現在までに6例あり5ト10），女性に多く，糖尿病の発症は10−30歳代と若く，MELASの発症に先行するものもあった（表2）．しかし糖尿病の発生機序については言及していない．本例ではインシュリンの感受性や結合能についての十分な検索は行なっていないが，インシュリン受容体抗体、膵
島細胞抗体，膵島細胞膜抗体が陰性で，尿中C−peptide1日排泄量が少なく，グルカゴン負荷試
験での血中C−peptideの低反応からMELASでもKSSと同様，インシュリン分泌低下が糖尿病の原因となる可能性が考えられた．ミトコンドリ
アの異常がインシュリン分泌低下による糖尿病を引き起こす機序の詳細は不明であるが，糖尿病を合併する神経筋疾患の一つであるFriedreich病
−171−

with

Child56：741，1981．

mellitusin Kearns−Sayre syndrome．Eur
Neuro128：34，1988．
3）Toppet M，Telerman−Toppet N，et al：
Oculocraniosomatic neuromuscular disease

131：437，1977．

4）Piccolo G，AscheiM，etal：Normalinsulin
receptorsin mitochondrial myopathieswith
Ophthalmoplegia．J NeuroISci94：163，1989．
5）Shimoji A，Katsuragi

S，et al：Familial

mitochondrial encephalomyopathy with
StrOke−1ike episodes and episodic distur−bancesofconsciousness．Astudyofpedigreeincluding three generations with multisys−temicabnormalities．JNeuroIPsychiatry41：
47，1987．

6）石津棟喋，松田一郎ほか：Mitochondrial
CytOpathyの1家系例．臨床神経27：9q3，
1987．

7）今井博之，木本圭一ほか：母と母方祖母にも類似の症状がみられた複合体1欠損症の1例．日児誌93：967，1989．
8）′J、澤高将，田中雅嗣ほか：MELASたおけるミ
トコンドリアtRNALeu（UUR）変異． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジス・トロフィー

及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木攻上平成2年度研究報告書，1991，

10）西澤正豊，大塚美恵子ほか：MELAS母娘例におけるミトコンドリアDNAの解析．

pp129−133．

9）岡田仲太郎，乾1991，pp254−257．

厚生省

幸治ほか：MELAS症候群の「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー

臨床的検討とミトコンドリアDNAの解析． 厚及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ

究 （荒木班）平成2年度研究報告書，1991，

フィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関す

pp258−260．

る研究 （荒木班）平成2年度研究報告書，ー172−32）MERRF′の筋生検所見

組織学的に診断できなかった症例を中心と、して
福 原 イ言 義＊

研究協力者

多 久 肇 二一＊ 新 田 永 俊＊ 中 島、、 孝＊
樋 口 砂 里＊ 丹 野 芳 範＊＊

MERRF（mitochondrialencephalomyopathy
associatedwithragged−redfibers）1）は，本来，DRPLA（dentatorubral−pallidoluysiail
atrophy）2）より分離，確立された疾患であるが，その名前のようにragged−red fiberを伴うことが，DRPLAとの重要な鑑別点の1つと考えられてき

おらず，筋萎縮についても認められてはいない．

た．しかし，我々は筋生検でraggedTredfiberを認めることの出来なかったDRPLAの症例を経験したので報告するとともに，我々が過去に経験り，眼球運動はsaccadic．限振（−），軟口蓋の挙上不全，構普障害を認めた．全身の筋萎縮があり，

本年4月3日に2回日の入院となっ

たこ
入院時所見
全身理学的所見：特記すべき事はない．

神経学的所見：意識は清明だが，痴呆があり，IQ（WAIS）59．脳神経系では両側視神経萎縮があしたMERRFの7症例と比較，検討した．

筋トーヌスは低下していたが，特に胸鎖乳突筋と屑甲帯に強い筋萎縮を認めた．しかし，筋力はほぼ正常であった．抗てんかん剤を服用しているこ症
例
症例 58歳 男性
家族歴：両親は従兄結婚であるが，母，姉，姪（姉ともあり，不随意運動はみられなかった．腱反射は全体に冗進していたが，病的反射は認められなかった．歩行は小脳失調性であったが，感覚にはの子），姪の子など家系内に同様の症状をもつ人が5人いる．何れの症例も今までDRPLAと診断されていた．遺伝形式は常染色体優性遺伝も考えられるが，maternalinl1eritanceでも説明可能である．
既往歴：特記すべきものはない．

異常を認めなかった．足の変形はなかった．
臨床検査成績：一般検査では特に異常はなかった．
髄液は細胞数0／3，蛋白33mg／dl．乳酪．ビルビン
酸値は血液でそれぞれ6．5，0．67mg／dl，髄液ではそれぞれ12．2，0．86mg／dlと正常であった．末梢神経伝導速度はMCVが俳骨神経26．1，脛骨神経

現病歴：45歳頃より言語がもたつくようになったが，徐々に悪化してきた．47歳には意識消失発作があり，ミオクローヌスが出現してきた．50歳時に新潟大学神経内科を受診し，変性型のミオク′ローヌスてんかんと多発性脳梗塞の診断を受けている．その後，当科を紹介され，外来で経過を観察

39．6m／secで，SCVは俳腹神経21．2m／secと低下していた．

されてきたが，この間，筋力低下には気付かれて感覚神経誘発電位：giantSEPは認められなかった．

＊国立療養所犀潟病院神経内科＊■新潟大学脳研究所神経内科

脳CT（図1）：小脳の萎縮と大脳基底核に多発性の小梗塞巣がみられた．
脳波：全体に徐波化し，全誘導で多煉徐波結合が認められた．

筋生検所見：MERRFを疑ったため，かなり大き−173−

図1脳CT．小脳，脳幹部の萎縮と大脳基底核部の多発性小梗塞巣がみられる．

図2 大腿四頭筋の生検組織．Raggedrredfiberは見られない．
A：Gomoritrichrome染色 ×180，B：NADH−TR染色

ー174−

×95

図1脳CT．小脳，脳幹部の萎縮と大脳基底核部の多発性小梗塞巣がみられる．

図2 大腿四頭筋の生検組織．Ragged−redfiberは見られない．
A：Gomoritrichrome染色 ×180，B：NADH−TR染色

−174−

×95

なブロックの生検をしたが，Gomori trichrome
染色（図2）では小角化線経が散在していたが，ragged−redfiberは全く見られなかった．NADH−TR染色でも同様であった．ただ，CytOChromec
OXidase染色で，3．5％の線経で陰性であった．
CytOChromecoxidasenegativefiberはタイプⅠ
線経にもタイプⅠⅠ線経にもある．ATPase染色では，小さなtypegroupingがみられた．電顕（図3）で筋膜下にミトコンドリアの異常な集積が無いことは勿論のこと，通常，ミトコンドリアがよく見られるZ帯の周辺のミトコンドリアの形態にも異常はなかった．
白血球のミトコンドリアDNA分析（図4）：
primer423とprimer530（mismatchedprimer）を用いPCRをおこなった3I．Pはこの症例，A，Bはそれぞれ，すでにMERRFとして我々1）が報告している20歳男性と21歳女性の骨格筋である．Aでは正常人にまれにあるといわれる9bpのdele−tionを伴っている．MERRF患者のDNAは制限
酵素NaeIによりdigestされたとき，塩基番号8344におけるAからGへのpoint mutation4）のため156bpと18bpの2つに切断されるが，この症例のDNAも9bpのdeletionのある患者Aと同じパターンで切断されており，同じpointmuta−tionがあると診断された．
その後の臨床経過：この患者は入院後，急速に筋萎縮が進行し，今ではねたきりとなっている．
症例のまとめ：この症例は，それまで臨床的にDRPLAと考えられてきたが，胸鎖乳突筋と肩甲帯部に特に強い筋萎縮があるため，DRPLAとしても特異であり，MERRFの可能性も否定できず，筋生検を行った．筋生検の所見は基本的には神経原性の変化であり，形態的にミトコンドリア
異常は認められず，ミトコンドリアDNAの分析によりはじめてMERRFの診断が確定された．この症例では，脳CTで大脳基底核に小梗塞巣が見られ，いわゆるstrokelikeepisodesによるもの5）も考えられるが，今までの報告で脳CTで認められるほど大きな梗塞巣の見られた症例はない6）ので，この症例の梗塞もMERRFとは無関係の偶発

図3 大腿四頭筋の電顕像：ミトコンドリア異常は見られない．×8，000
−175−

表

S

P

A

B

年齢

MERRFの筋生検所見

臨床

CCOH angular tYM tyPe tMe tar98t

症例 ／性 経過 RRF tibQr fiber grO叩．at．hyMrtr．†iber

3

21F

＋

＋

l

一
一

一
一

58M13

一

8

一

6．7

一

6．7 川．9

20

＋

5

22日

一

62 F

7

＋

6

＋

20．0

一

一

．7

8

＋

22M

＋

52M H

5

一

一

＋

（十）（十）

＋

3．5

一

0

一
十

mtDNAの電気泳動像．S：Sizemarker（￠rHaeIII）．P（患者：症例8），A（症例1），B（症例3）はそれぞれ，NaeIII
で未処理のものと，NaeIIIにより切断したものとの2種類の泳動が示されている．
W，Mはそれぞれwild type，mutant
typeの位置を示している．患者（症例8）は9bpdeletionをともなうA（症例1）と同じ泳動パターンである．

4

＋

一

3．6

712．0

一

9．0

＋

V→

図4

一

28

＋

ほy12．4％5．0％

25H

−

20日

＋

1
2

↓

十

㌔付．＿＿→．

0卜）（−）（＋）

RRF；ngg8d−r8d fibor；ccOH；CytOChrom8C OXidase n呵atiYe；
grO叩．三grOuPing：atr．＝atr叩恒；hyMHr．＝hypertrOPhy；

DRPLAとは臨床的には区別できない症例は的なものと思われる．

MERRFとしても稀である．筋の組織学的検索でもragged−red fiberが全く0％というのは稀か

MERRF症例の筋生検所見の比較もしれないが，ミトコンドリア異常という点を除

我々は，上記症例の他に，7例のMERRFを経験している．それらの組織学的にも診断の出来た症例と筋生検所見について比較，検討してみた（表）．

けば基本的には神経原性の所見であり，DRPLA

結果：年齢，臨床経過は様々であるが，ragged−
red fiberの出現頻度は1例で0．7％というのを除とは区別できない．この症例では，ミトコンドリ
アDNAの分析によりMERRFの診断が確定された．家族歴でもDRPLAとは矛盾せず，ミトコ
ンドリアDNAの分析無くしてはMERRFを否定することはできなかった．

き，6％から20％であった．全例でSmallangul−
ated fiberがみられ，タイプⅠ線維またはタイプ
II線経のtypegrouping，タイプII線維萎縮，tar−
get fiberなどがみられた．Ragged−red fiberという点を除いては筋線経の内部構築の異常など

結論

1）MERRFの筋生検所見は，ragged−red fiberという点を除いては基本的には神経原性変化である．RaggedLredfiberがみられず，ミト
コ ンドリ アDNAの分析な く しては

myopathicの所見はほとんど見られず，基本的には神経展性の変化であった．

MERRFの診断が出来ない症例がある．
2）MERRFの症例には，深部反射が克進し，筋考察
MERRFでは60％以上の患者で深部反射は消失しており，深部反射の元進する症例は稀である6）．したがって，今回の症例のように深部反射が元進し，筋萎縮が末期まで明らかではなく，
ー176−

萎縮が末期まで明らかではなく，DRPLAとは区別の出来ない症例がある．
文

献1）Fukuhara N，TokiguchiS，ShirakawaK，etal：Myoclonus epilepsy associated withpolymerase chainreaction with a mismat−

ragged−redfibres（mitochondrialabnormal−

Chedprimer．Neurology41：1838−1840，1991．

ities）：Diseaseentityorasyndrome？Light4）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，et al：

Tandelectron−miCroscpicstudiesoftwocases

Myoclonus epilepsy and ragged−red fiber

andreviewofliterature．JNeuroISci47：117

diease（MERRF）is associated with a−133，1980．

mitochondrial DNA tRNALysmutation．Cel1

2）NaitoHandOyanagiS：Fami1ialmyoclonus
epilepsy and choreoathetosis；hereditarydentatorubral−pallidoluyslan atrOphy．Neu−

61：931−937，1990．

5）FukuharaN：StrokelikeepisodesinMERRF．
Ann Neuro118：368，1985．
6）FukuharaN：MERRF：aClinicopathologicalrology32：798−807，1982．

3）YonedaM，TannoT，NonakaI，MiyatakeT

Study．Relationships between myoclonus

and Tsuji S：Simple detection of tRNALys

epilepsiesandmitochondrialmyopathies．Rev

mutationin myoclonus epilepsy associated

Neurol（Paris）147：476−479，1991．

with ragged−red fibers（MERRF）by−177−

33）ミトコンドリア脳筋症における血管病変後 藤 雄 一＊研究協力者

松 岡 太 郎＊ 作 田 亮 一＊
長谷川ひとみ＊ 埜 中 征 哉＊

は じめに

StrOnglySDH−reaCtivebloodvessels（SSV）と卒中様症状を伴うミトコンドリア病（mito−
Chondrial myopathy，enCephalopathy，lactic
acidosisandstrokeLlikeepisodes；MELAS）の剖検例の電顕による検索で，その中枢神経系の小・中動脈の平滑筋細胞内に異常なミトコンドリ
アの集積が観察された．中枢神経系のこの血管病
変と，MELASに特徴的な反復する卒中様症状との関連が注目された1）．
その後，MELASの骨格筋においても，その筋内小動脈の平滑筋細胞にミトコンドリアの数およ
び形態の異常が電顕レベルで確認された．
MELASにおける血管病変は中枢神経系に限局したものではなく，全身性のものである可能性が示唆されたのである2）．
私達は，MELASの骨格筋を組織化学的，および電顕的に検索し，以下の所見を得た3）．
①MELASの骨格筋の凍結切片に，SuCCinate
dehydrogenase（SDH）染色を行うと，動脈壁が顆粒状に泣く染まる筋内小動脈が観察される．
（診連続切片を電顕的に処理すると，このSDH染
色で濃染する動脈壁では，その平滑筋細胞に異常なミトコンドリアの集積が確認される．
③すなわち，小動脈の平滑筋細胞におけるミトコ
ンドリアの数および形態異常を，SDH染色にて光顕レベルで確認できる．
私達はこの異常な筋内小動脈をMELASの診断，および病態の解明上有用な所見と考え，＊国立精神・神経センター神経研究所

呼び報告してきた3）．今回私達は，MELAS以外のミトコンドリア脳筋症におけるSSVの有無を調べ，その病型による違いにつき検討したので報告
する．
対象と方法
臨床所見および筋病理所見より診断した以下の症例を対象とした．
①MELAS50例（ミトコンドリアDNAの検索を行った47例中，38例に塩基番号3243の，3例に
塩基番号3271の点変異有り）②ragged−red fibersを伴うミオクローヌスてんかん（MERRF；myOClonus epilepsy withragged−redfibers）7例（全例にミトコンドリ
アDNA塩基番号8344の点変異有り）③慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO；Choronicpr0−
gressiveexternalophthalmoplegia）50例（ミトコンドリアDNAの検索を行った45例中37例にサザン法にて欠矢を検出）④臨床的にいわゆるLeigh脳症が疑われ，骨格筋を用いた組織化学的および生化学的検討にてチ
トクロームC酸化酵素（CCO）欠損が確認された8例⑤ミトコンドリア脳筋症以外の神経筋疾患100例（進行性筋ジストロフィー57例，遠位型ミオバナ
ー2例，筋緊張性ジストロフィー8例，先天性
非進行性ミオバナー10例，糖原病3例，炎症性筋疾患10例，神経原性筋疾患10例）
生検骨格筋の連続凍結切片にGomoriトリタロ−178−

ーム変法染色とSDH染色を行い，前者で小動脈と同定された血管につき，後者にてSSVかどうかの判定を行った．SSVを多数認めたMELASとMERRFにおいては，さらに連続凍結切片にSDH染色とCCO染色を行い，前者で確認された
SSVにつき，後者にてその動脈壁のCCO活性を
組織化学的に検討した．

に明らかなSSVが認められた以外，SSV陽性のものはなかった．
次にSSVが多数認められたMELASとMERRFにつき，SSVの動脈壁のCCO活性を組
織化学的に検討した．図に示すように，MELAS
においては，SDH染色で表出されるミトコンド
リアの集積に対応して，CCO染色で動脈壁が強く陽性に染まっていた．これに対し，同じく図に示結果

すように，MERRFにおいては，ミトコンドリア

各病型におけるSSVの陽性率を表1に示す．
MELASにおいては，50例中42例，84％の症例にSSVを認めた．小動脈あたりでは，502本中175の集矧こもかかわらず，SSVの動脈壁はCCO活

本，35％がSSVであった．
MERRFにおいては，7例中6例にSSVが陽性であった．高乳酸血症および脳波異常が認めら

壁のCCO染色性を表2に示す．MELASでは，検れるものの無症状で経過している，患者の母の生検骨格筋にもSSVが存在した．卒中様症状を合併したものはいなかった．小動脈あたりでは，80た28本のSSV中，CCO活性陽性のものはなかっ性が陰性であった4）．
MELASおよびMERRFにおけるSSV動脈討した175本のうち，82％のSSVがCCO活性陽性であった．これに対し，MERRFでは，検討した4）．
考

本中28本，35％がSSVであった4）．
CPEOにおいては，50例中2例にSSVを認めた．SSV陽性の2例では，それぞれ小動脈10本中5本，5本中3本がSSVであった．この2例にはともに卒中様症状はなかったものの，うち1例に明らかな知能障害があった5）．
CCO欠損を伴ういわゆるLeigh脳症［Leigh（CCO def．）］では，8例中2例にSSVが陽性であった．卒中様症状の既往のあるものはなかった．
小動脈あたりでは，79本中11本，14％がSSVであった．
ミトコンドリア脳筋症以外の神経筋疾患（Con−trol）では，筋緊張性ジストロフィー8例中の1例

察

今回の検討で，MELASのみならずMERRFにもSSVが高率に認められること，他のミトコン
ドリア脳筋症においても頻度は低いもののSSVが存在すること，そしてSSVはミトコンドリア
脳筋症以外の神経筋疾患では例外的にしか認められないこと，が明らかになった．私達はこのこと
より，SSVはミトコンドリアの機能異常を強く反映する形態異常所見で，ミトコンドリア脳筋症の有力な診断根拠になると考えた．この意味で，血管におけるSSVの所見は，筋線経におけるrag−
ged−redfibers（RRF）の所見と同じ意義をもつものと思われた．
RRFがミ．トコンドリア脳筋症以外の神経筋疾

表1今回対象とした症例のSSV陽性率．各病型ごとに症例あたり，および′ト動脈あたりの値を示す．
Pau●nt●患でも時に認められることは，よく知られている．
表2

V…●l●

MELASとMERRFのSSVのCCO染色性．
はっきりと陽性（十），あるいは陰性（一）と判定できないものは，（±）とした．

Totar wIth SSV Total SSV

MELAS

50

42（84％）

502175（35％I

MERRF

7

6（86％）

80

CPEO

50

2（4％）

289

8（3％I

79

11日4％I

L●lgh（CCOd〇日
Contr0181002（25％）
1（1％）

763

SSV

28（35％）

5（1％）

−179−

MELAS

175

MERRF

28

ccO StainIng（＋）（±） ト）
144（82％）
0

0％1

26

5

4

24

図

MELASとMERRFのSSV．MELASのSSV紬は，連続切片でみると，その動脈壁のミト
コンドリアの集積に対応してCCO活性が強陽性である（B）．これに対し，MERRFのSSV（C）
では，その動脈壁のミトコンドリアの集積にもかかわらず，CCO活性が陰性である（切．
A，C：SDH染色．B，D：CCO染色．A，B：×300，C，D：×400．

特に，筋緊張性ジストロフィーは，筋病理学的に

MERRFにおけるSSVも，その動脈壁のCCO活

しばしばRRFやCCOの部分欠損を呈し，またミ
トコンドリアDNAの検索にて欠矢が認められる性は対照的であった4）．すなわち，同じ形態異常となど，ミトコンドリア異常が指摘されている疾患

ることが示唆された．このMELASとMERRF

である．この筋緊張性ジストロフィーの一例で明における血管平滑筋細胞のミトコンドリア酵素異常の違いは，それぞれの筋線経のミトコンドリア

らかなSSVが認められたことは注目される．

して現れるSSVでも，その機能的な面では異なミトコンドリア脳筋症各病型におけるSSVの

酵素異常の違いを再現している可能性が高い．今

陽性率は，MELASやMERRFと，他の病型との後は，このSSVのミトコンドリアの酵素異常の間には明らかな差があった．この違いが，MELAS

違いが，血管全体としてどのような機能異常の違やMERRFにおける卒中様症状や知能障害など

いを引き起こすのかの解明が課題であると思われの中枢神経系症状の出現に関与している可能性はた．

否定できない4・5）．今後は，この骨格筋にみられた血管病変が中寸区神経系にも同じく存在することの確認を，剖検例にて行う必要がある．さらに，

文献1）Ohama E，Ohara S，et al：Mitochondrial

CPEOやLeigh脳症でみられた少数のSSV陽性
例につき，その臨床経過の詳細な追跡が必要と思われた．

angiopathyin cerebral blood vessels of

mitochondrial encephalomyopathy．Acta
Neuropathol（Berl）74：226，1987．

SDH染色だけでは区別のできないMELASと−180−

2）SakutaR，NonakaI：VascularinvoIvementinmitochondrialmyopathy．AnnNeuro125：

4）Hasegawa H，Matsuoka T，et al：Cyto−

3）Hasegawa H，Matsuoka T，et al：Strongly

Chrome c oxidase deficiencyin MERRF
blood vessels．（submitted）．

SuCCinate dehydrogenase−reaCtive blood5）長谷川ひとみ，松岡太郎ほか：Ragged−red

VeSSelsin muscles from patients withfiberを伴なう慢性進行性外眼筋麻痺症候群に

mitochondrial myopathy，enCephalopathy，おける血管病変一生検筋での検討−．臨床神経lacticacidosis，andstroke−1ikeepisodes．Ann

学（印刷中）．

594，1989．

Neuro129：601，1991．

−181−34）Myoclonusepilepsyassociatedwithragged−redfibers（MERRF）の組織障害機序に問する研究

＊

次 一 嗣

＊

■

＊

＊

＊

＊

＊

省孝雅

＊

＊

林中

＊

＊

＊

＊

辻君田

＊

樹書目

誠則弘

茂

光房

田

＊

武

範＊
正＊＊

田 田 田

芳

子

野

宮 武

米山生

丹

恵

中

田

研究協力者

小 澤 高 賂＊＊＊＊Myoclonusepilepsyassociatedwithragged−
red fibers（MERRF）は，動作性ミオクローヌ
ス，小脳失調，てんかん 筋萎縮を中核症状として緩徐に進行するミトコンドリア脳筋症の一型である1）．本症は病理学的に，歯状核一赤核系，淡蒼球「視床下核系，黒質，橋被蓋，小脳皮質，下オリーブ核，青斑核，さらにFriedreich病でみられる脊髄後索，後根，クラーク柱などに病変を認める系統変性疾患である2）．MERRFは母系遺伝を呈することから，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常が考えられていたが，Schoffnerら3），米田
ら4）により本症患者mtDNAのtRNALys塩基番号8344のAがGに置換していることが明らかになり，本症診断の hallmark として頻用されるようになった．
神経変性疾患は，それぞれ一定の組織系統に変性を生じることから病型が分類されるが，その選択的組織障害機序は不明のままである．そこで，MERRFにおいて姐級障害の程度とmtDNA異常に基づく組織のエネルギー代謝障害のレベルの関係を明らかにする目的で以下の検討を行った．

＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊真義医科歯科大学医学部神経内科＊＊＊新潟大学脳研究所実験神経病理＊＊＊＊名古屋大学医学部第二生化学

対象と方法
対象
臨床像および病理学的所見，mtDNA解析の結果から典型的であったMERRFの2症例の剖検
組織各部位を分析対象とした．
方法
1）変異mtDNAの組織内存在比の定量
患者の剖検臓器よりgenomic DNAを抽出した後，後述するようなPCRの変法を用いて，各臓器における変異型mtDNAの割合を定量した．
使用したprimerは，SenSe（5，−AAAC−CACAGTTTCATGCCCA：塩基番号8，190−8，210）及びantisense（5，−TCACTGTAAAGAG−GTGCCGG：塩基番号8，345−8，364のmismat−
Chedprimer）である．このmismatchedprimer
を用いることにより，PCRの結果，変異型
mtDNAは新たに制限酵素NaeIの認識部位が出現し，2本のDNA断片に切断される．しかしながら変異型と野生型がannealingしたheterodu−
plexが定量性をそこなうことが考えられ，その解決のためPCRの最後のl cycleにのみγ−32P−
ATPにより5Lendlabelingしたprimerを加え良好な定量性を得ることができた．定量性の確認のため，MERRF患者のtRNALys領域を含む塩
基番号8，191−8，364の領域をクローン化し，正常のクローンと変異を持ったクローンを種々の比率で混合してPCRを行い，富士のimaging analyser−182−

を用いて回帰直線を求め，実際にtemplateとして使用した比率によく一致する結果が得られた．
2）電子伝達系酵素各複合体に対する抗体を用いた免疫組織化学剖検時採取されたMERRFの各組織は，4％パラフォルムアルデヒドで固定後，パラフィンに包埋し，10耳m厚の切片を作製した．抗体は牛心筋から精製した複合体Ⅰ・ⅠⅠⅠ・ⅠⅤ・Vを家兎に免疫して得られた抗体を用い，200倍に希釈して40Cで一夜反応させた後，ABC法，ジアミノベンチジンで染色した．連続切片をKluver−Barreraで染色し，神経細胞を計数し，免疫染色された神経細胞数の比率を求めた．
結

果1）変異型mtDNAの組織内存在比の定量（表）症例1では，大脳皮質のmtDNAの96％，小脳皮質97％，腎臓97％，骨格筋97％が変異型mtDNAであった．症例2では，変異型mtDNAの比率は前頭葉皮質82％，同日質97％，側頭葉皮質93％，
小脳皮質94％，小脳白質95％，脊髄93％，後根神
経節95％，心筋94％，腎皮質90％，腎髄質91％，
表 変異mDNAの臓器別存在比症

例1

副腎80％，横隔膜92％と部位にかかわらず高率であった．
2）電子伝達系酵素各複合体に村する抗体を用いた免疫組織化学症例1および2の生検時得られた骨格筋では，
2例とも複合体ⅠⅤの活性が著明に低下していたた
め，対照として組織学的に正常な剖検脳各部位で複合体ⅠⅤに対する抗体で免疫染色を行ったが，どの部位も神経細胞は明瞭に染色された．次に剖検
時得られたMERRFの前頭葉，淡蒼球，歯状核，
海馬について，複合体Ⅰ・ⅠⅠⅠ・ⅠⅤ・Ⅴそれぞれに対する抗体で免疫染色を行ったところ，組織学的にほぼ正常な前頭葉・海馬でも，神経細胞の中等度脱落を認める歯状核・淡蒼球でも同様に，複合体ⅠおよびⅠⅤの染色性が著明に低下しており（Ⅰ：1〜2％，ⅠⅤ：6〜48％），ⅠⅠⅠおよびⅤに対する染色性は保たれていた（ⅠⅠⅠ：63−86％，Ⅴ：
62〜74％）．（図1，2）
考察

MERRFは臨床的・病理学的に系統変性疾患としての病像を呈し，母系遺伝の明らかなミトコン
ドリア脳筋症である．本症ではmtDNAのtRNALysに点変異が存在することが明らかになり，さらに組織内で変異型と野生型mtDNAがheteroplasmyの状態で存在することが明らかにされている3）．我々は本症の選択的組織障害が変
異mtDNAの存在量，ひいてはその結果として生じる電子伝達系酵素の合成障害によるエネルギー代謝障害の程度と並行関係にあるか否かを検討した．そのためには，変異mtDNAの定量を正確に

症

例

2

前 頭 葉 皮 質82

後 根 神 経 節95

側 頭 葉 皮 質

93

心 臓

94

前■ 頭 葉 自 質

97

腎 皮 質

90

小 脳 皮 質

94

腎 髄 質

91

小 脳 自 質

95

副 腎

80

脊 髄

93

横 隔 膜

92

行う必要があるが，昨年度報告したmismatchedprimerを用いたPCR−RFLP法では，PCRの増幅過程で正常mtDNA同士，変異mtDNA同士のhomoduplex以外に野生型と変異型がannealing
するheteroduplexが生じると考えられ，このheteroduplexはNaeIで消化されないことから
変異型mtDNAの比率をunderestimateする可能性があった．そこで今回は，PCRをlabelingされていないprimerにて開始し，最後のCyCleのみに5 −endlabelingしたprimerを加えることでこー183−

図1MERRF患者前頭葉の抗複合体抗体での免疫染色
左上：抗複合体Ⅰ抗体，左下：抗複合体Ⅳ抗体，右上：抗複合体ⅠⅠⅠ抗体，右下：抗複合体Ⅴ抗体

図2 MERRF患者歯状核の抗複合体抗体での免疫染色
左上二抗複合体Ⅰ抗体，左下：抗複合体Ⅳ抗体，右上：抗複合体Ⅲ抗体，右下：抗複合体Ⅴ抗体−184−

の問題を解決した5）．この方法で定量した変異型

Ikuta F：Neuropathology of myoclonus

mtDNAの量は，組織障害の程度にかかわらずほ
ぼ一定で82〜98％と高比率であった．PCRを用いる定量法では，組織を一塊として処理するため個々の神経細胞における動態も確認しておく必要があり，抗体を用いて電子伝達系酵素各複合体の合成を細胞レベルで検討した．この免疫染色の結epilepsy associatedwith ragged−red fibers

果も組織の変性程度と無関係で，複合体ⅠおよびⅠⅤに対する抗体の染色性は一様に低下し，ⅠⅠⅠおよびⅤは保たれており，mtDNAにコードされる
Subunitの数に依存するという結果であった．以上のように本症の組織障害は変異mtDNA量の多寡のみでは説明が困難であるが，ミトコンドリ
ア脳筋症各病型の中枢神経組織内変異mtDNAの存在比の報告と比べてみると，MELASでは84％6），KSSの欠失mtDNAは45％7）と され
MERRFの93％は特に多い．そのためMERRF
では組織のエネルギー代謝障害に対する代償能力が乏しいと考えられ，虚血やエネルギー需要に感受性が高い一連の組織に障害が生ずる可能性はある．しかしながら，エネルギー産生能力の高低のみでMERRFとMELASやKSSといった病像の差が生ずるとは考えにくい．unclearDNAによる制御機構など，いまだ明らかにされていない組
織固有のfactorについても今後検討が必要と思われた．

（Fukuhara，sdisease）．ActaNeuropatho175：
433−440，1988．

3）ShoffnerJM，LottMT，LezzaAMS，Seibel
P，BallingerSWandWallaceDC：Myoclonic
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DiMauroS：Widespreadtissuedistributionof
atRNALeu（UUR）mutationinthemitochondrial
DNA of a patientwith MELAS syndrome．
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文献1）FukuharaN，TokiguchiS，ShirakawaKand

7）ShanskeS，MoreasCT，LombesA，Miranda

Tsubaki T：Myoclonus epilepsy associatedwithragged−redfibers（mitochondrialabnor−

Ellsworth CA and DiMauro S：Widespread

malities）；disease entity or a syndrome．J

deletionsinKearns−Sayresyndrome．Neuro1−

NeuroI Sci47：117−133，1980．

Ogy40：24−28，1990．

2）Takeda S，WakabayashiK，Ohama E and−185−

AF，Bonilla E，Lewis P，Whelan MA，tissue distribution of mitochondrial DNA35）ミトコンドリア脳筋症における筋プリン体代謝に
問する研究
垂

清一郎＊
＊

＊

＊

＊

通遺聡

隆正

＊

＊

＊

＊

村島野

＊

西桑上

＊
＊

＊

ATPを合成する細胞内小器官であり，細胞のエ
ネルギー工場とi＞呼ばれる．heterogenousな疾患群からなるミトコンドリア脳筋症の臨床像は多様であるが，ミトコンドリアの機能異常に基づいて，＊

ミトコンドリアは，TCAサイクル，脂肪酸β酸
化 電子伝達系に関する酵素群を内包し活発に

＊

は じめに

夫典郎

嶺 尾 郁 夫＊＊ 河
大 野
昭＝ 川
曽 我 文 久＊＊＊西依 藤 史 郎＊＊＊

典雅嘉

野知川

研究協力者

井

方
法
患者：臨床像，筋生検，ミトコンドリアDNA分析
を通じて診断確定した5例のミトコンドリア脳筋症患者を対象とした．それぞれの特徴を表に示した．仝例で，eXerCiseintoleranceを認めている．
症例N．N．は高尿酸血症（7．2mg／dl）を呈する
が，他の症例では血清尿酸値は正常であった．コントロール群として，6例の健常人（男性5名，女性1名）を検索した．

骨格筋や脳などエネルギー要求の強い組織に障害が現われ易い点で共通している．私どもは，グリコーゲン病ⅠⅠⅠ型（脱分枝酵素欠損症），Ⅴ型（筋ホスホリラーゼ欠損症），VH型（筋ホスホフルクトキ
ナーゼ欠損症）において運動時に筋肉のプリン分解が著しく冗進する結果，高尿酸血症が発現する

方法：昼食を絶食し，少なくとも30分以上の安静の後，自転車エルゴメーター運動を実施した．運動負荷壷は15Wから開始し，患者の運動能力に応じて漸次増加した．各負荷量について運動時間はことを明らかにしてきた（筋原性高尿酸血症，
myogenichyperuricemia）1ト3）．同様の病態は，副甲状腺機能低下症や甲状腺機能低下症など内分泌疾患に伴う続発性ミオパテ一においても発現することを兄いだし4）5），筋原性高尿酸血症が筋肉のエ
ネルギー代謝の障害（ェネルギー危機）に広く共

5−15分間とし，5分間の休息の後，次の運動負荷を再開した．患者が疲労を訴えたところで運動試験を終了した．症例S．S．とH．Y．は15W，症例
N．N．は20W，症例M．K．は35W，症例N．T．は50
Wまでの運動を行うことがきた．健常コントロー
ルについては，症例N．T．に準じた運動負荷を行通する病態と考えるに至った．そこで本研究では，．
ミトコンドリア脳筋症について，筋運動時のプリン・尿酸代謝を分析した．

なった．運動後は安静を保ち，肘静脈より経時的に採血した．既に報告したように1），血清尿酸・血
柴乳酸・血渠アンモニアは酸素法で，血染ヒポキ
サンチンはHPLC法で測定した．

＊大手前病院（国家公務員等共済組合連合会）＊＊大阪大学医学部第二内科＊＊＊大阪大学医学部神経内科

結果
図に，自転車エルゴメーター運動による，各メ
タポライトの血中変動を示した．いずれの患者に−186−

表 ミトコンドリア脳筋症患者の特徴
Patlent（Age／Sex

H．Y．

S．S．

N．T．

M．K．

N．N．

（36／F）（36／M）

（30／円

仰／円

（39／R

DlagnOSIs

KSS

Ra9ged・redIibors

◆

KSS

CPEO

ocubpha叩1g組I■＋

bereis01ntoleraneo

◆

◆

＋

mtDNAAbnormall吋●

N．D．

N．D．

＋
◆

Del甜On15．2kblMEUIS◆◆

tRNAforLeu
3243AtoG

KSS：KearnS一おyroSyndromoICPEO：￠hrontee血rna10Phthalmoplegla
MELAS：mltochor．drialencephalornyopathywIthJactTcacfdosTsandstroke−llkoep，sodeS
N．D．：nOtdetermIned，・：nOtdetected

おいても乳酸は運動後に著しく増加した（図−A）．
一方，通常コントロールでは，この程度の運動負荷に対して乳酸はほとんど変動しなかった．
アンモニアやヒポキサンチン（図−B，C）も，
健常コントロールでは筋運動による変動をほとん
ど認めないのに対して，患者では明瞭に増加した．
特に症例H．Y．では，患者群の中で最も軽い負荷量にかかわらず，アンモニアやヒポキサンチンの増加が顕著であった．
血清尿酸は，症例H．Y．とM．K．とN．N．において運動後の増加を認めた（図−D）．

ネルギー危機に陥り筋プリン分解が冗進すると考えられる．
ミトコンドリア脳筋症におけるg乃 〃加の筋エ
ネルギー代謝について，これまで31P−NMRを用いた分析がなされている7）8）．その結果アデニンヌ
クレオチド代謝の異常が示唆されているが，筋プ
リン分解の冗進を示した本研究の成績はこれを立証するものである．
筋グリコーゲン病では，筋肉のプリン分解が著
しく冗進する結果，運動後に高尿酸血症が発現する．私どもはこの病態を筋原性高尿酸血症（myogenichyperuricemia）と呼んでいる．本研

考察

本研究で検討したミトコンドリア脳筋症患者は，いずれも，筋運動に対しアンモニアやヒポキサン
チンの過大な増加反応を示した．アンモニアやヒ
ポキサンチンは，筋肉におけるプリン分解に由来するメタポライトでありATP→ADP→AMP→IMP（＋アンモニア）→イノシン→ヒポキサン
チン→→尿酸の反応により生じる．私共は，エネルギー代謝障害を示す代表的な筋疾患であるグリコーゲン病ⅠⅠⅠ型，Ⅴ型，Ⅵl型において，運動によってプリン分解が著しく冗進することを明らかにした1ト3）．その後，グリコーゲンと並ぶ重要な筋肉のエネルギー基質である脂肪酸の利用が障害されるカルニナン・パルミトイルトランスフェラーゼ
欠損症においても，筋プリン分解の克進することが報告されている6）．ミトコンドリア脳筋症では，
ミトコンドリア機能の異常によって，運動時にエ究においても，3例の患者で運動後に血清尿酸の増加が認められた．筋肉での乳酸産生が欠如する
筋グリコーゲン病とは対照的に，筋運動後に著しい高乳酸血症を呈するのがミトコンドリア脳筋症の特徴である．このため，ミトコンドリア脳筋症
においては腎からの尿酸排泄が阻害される結果，運動後に血清尿酸が増加する可能性が考えられる（腎性機序）．実際，本研究で検討した患者においても，運動後に高乳酸血症（図−A）と尿酸排泄の低下（datanotshown）が認められた．しかし，
血清尿酸値の上昇は，患者群の中で特に筋プリン分解の著しい症例（H．Y．，M．K．）で明瞭に認められた．一方，これらの症例と同等の高乳酸血症を呈したがプリン分解はそれほど激しくない症例S．
S．においては，血清尿酸の上昇は認められなかった．また，症例M．K．と同程度の筋プリン分解を示したグリコーゲン病ⅥI型患者は，やはり症例M．

−187−

薫
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N
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︵≡○∈ユ︶勺−UO∈∈ふく

く仙 凡
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︵章DE︶V⊃

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く】

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umo（m叫60

120

ume（m叫〉

図 ミトコンドリア脳筋症における自転車エルゴメーター運動後の乳酸とプリン代謝物の血中変動．斜線部は，健常コントロール（M±SD）を示す．

K．と同程度の血清尿酸の増加であった（未発表）．したがって，ミトコンドリア脳筋症においても，筋プリン分解冗進に基づいた筋原性高尿酸血症が発現すると考えられる．
まとめ

5例のミトコンドリア脳筋症患者において自転

イトの変動を分析した．アンモニアやヒポキサン
チンは，運動後に異常増加し，運動筋におけるエネルギー危機に基づいてプリン体分解が克進することを明らかにした．特に著しい筋肉のプリン分解を示した患者では，運動後に血清尿酸も増加し，本症においても筋原性高尿酸血症が発現すると考えられた．

車エルゴメーター運動試験を行い，血中メタポラ
−188−

参考文献

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purinedegradationinexercisingmusclesof
glycogenstoragediseasetypestypesV andoidism．

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5）Nishimura T，MineoI，Shimizu T，et al：

−189−

1987．

36）Limbgirdle syndromeを示したミトコンドリア・ミオパテー

佐

量T

拡嗣
＊

＊

＊

雅

防中

＊
＊＊
＊＊

周田

＊

樹司

直欽

♯

尾野

＊

＊

＊

＊

Limbgirdlesyndrome（L−G Sy）は大凡6群に大別され炎症性ミオバナーである多発性筋炎や筋ジストロフイである大腿四頭筋ミオバナー（Becker型PMD）などがある1）．またL−GSyの中で代謝性ミオパテーとして一部ミトコンドリア病の報告もなされている1）．本研究はL−GSyを主徴とし，母系遺伝を示しミトコンドリア異常が世代を越え同一であった一家系に関し詳細な臨床・病理・分子遺伝学的検索結果を報告する．
症例報告
愛知医科大学第四内科で過去5年間に実施した
主な431生検筋のうち，L−GSyは28例であり，その内7例は最近Becker型PMDと判明し，さらに本家系例も含まれた．
症例1：発端者，52歳，女性．先祖代々，愛知県
一地方の在住者である（図1）．近親婚はなく，発端者の兄弟や子供の多数が乳幼児期に原因不明にて死亡し，生存中の実子の一名が症例2である．
主訴は頭部下垂，頸部痛としゃがみ立ち困難．現
病歴では38歳，重い物を持ち上げ難くなり，両上肢の筋力低下は次第に進行し，頭部が前下がり（首下がり）となり自転車の昇降に際し転倒するようになった．45歳で自転車に乗れなくなり，48歳には万歳・しゃがみ立ちが困難となり入院．小柄（148■愛知医科大学第四内科
・i名古屋大学医学部神経内科＊＊＊名古屋大学医学部第二生化学

功＊

中大

達為将

言

伯高

衣田小

緒

斐代揮

研究協力者

橋

cm，体重34kg）であり，肝・牌腫なし．前傾姿勢と円背，下腹部は突出．二次性徴は正常で閉経は48歳．神経所見は知能障害・性格異常なし．眼瞼
下垂・眼球運動障害は極軽度あったが，雉聡を含
みこれらの自覚的愁訴はなかった．視九白内障・網膜変性なし．囁下・梼語は正常．顔面筋の軽度筋力低下，広頸筋を含む頸部諸筋の高度の筋萎
縮・筋力低下を認め，四肢・体幹運動系の筋萎縮・筋力低下は近位筋とくに上肢帯筋により優位であった．動揺性歩行，爪先・踵立ち可能，しゃがみ立ち不能．筋トーヌスは低下し，筋緊張反応・不随意運動・運動失調はなかった．深部反射消失，
病的反射陰性，感覚・自律神経障害はなかった．
主な異常検査所見では，軽度ないし中等度のS￣LDH，S￣CK，S−myoglob．，myOSin軽鎖Ⅰの増加（12ng／ml）をみた．血清葉酸の低値，染色体は14q，1を含み異常なかった．脳波異常なし．筋電図は筋原性で一部に筋緊張反応をみた．胸Ⅹ−Pは
軽度の心拡大，心電図はp−Cardialeを認めた．骨格筋CTでは四肢近位筋優位（上肢帯＞下肢帯）に低吸収・萎縮が認められた．頭部CTでは限局性（stroke様）病変はなかった．内分泌検査はACTH，COrtisolの軽度異常，甲状腺・副甲状腺ホ
ルモン・耐糖能は正常．自転車運動負荷試験は，血清中の乳酸（L値）12．2｛48．2mg／dl，ビルビン酸（P値）0．88｝1．58mg／dl，L／P比13．86｛
30．51，心拍数は85■104／分へ夫々異常増加した．
髄液ではL値（24．2mg／dl），P値（1．26mg／dl）の増加をみたが，蛋白量は正常．テンシロン・テ−190−

った．筋CTでは腎筋の軽度萎縮があったが，大腿・下腿筋はほぼ正常．頭部MRIはやや年齢対照【Family Tree】

iFamilY AI tFamily MI
ロ

【l】

○

［］

□

□

□

．丁．

に比し皮質は萎縮傾向を認めたが，梗塞様病変はなかった．内分泌検査では17−KSのやや低値．自

O

．「」＝

転車運動負荷試験では血清中のL値21．3⇒57．0、●∴ここ−￣＿‥′

〔‖］

○口○□

○

−●＼

□

ロ

mg／dl，Pイ直1．27｛2．30mg／dl，L／P比は16．77｛
24．87，心拍数は54｛150／分へ変化した．血清アミ

一、−、＿こ￣

オ

回

◎

■

回

⊥
【1V】

□

○

■・●：Limb girdle sYnd「ome田・∈）：De8thin perinatal period＼ ：Pr。P。Situs

図1家系図：斜線は検索された健常者を示す．
スト陰性．
症例2：症例1の第4子，24歳，男性．高卒．主訴は運動能力の低下．現病歴は幼小児期より小柄で痩せており，左限外斜視があった．学校は休み

ノ酸分析はtaurine，phosphoethanolamine，
asparate，glutamate，CyStine，arginineの軽度の異常がみられた．髄液中L値（59．6mg／dl），P値（1．78mg／dl）は高値であった．神経耳科検査にて
耳小骨筋反応異常（あぶみ骨筋障害）による低音域の伝晋性難聴に加え高音域の神経性難聴が軽度示されたが，ABRは正常であった．なお家系内で検索した症例1の兄・弟，症例2の兄は身体また臨床検査上の異常はなかった．

がち，駆けっこは何時もどり．10歳（小4）の冬，
風邪引き後，四肢脱力が出現し，しゃがみ立ち・箸の持ち上げが出来なくなり筋生検にて 筋炎と診断され，約2か月間の入院で緩解した．なお
筋力低下の左右差，大脳の局所症状はなかった．
高校卒業後に運動時に頭部下垂・円背が出現し，24歳入院．身体所見では小柄（156cm，32．5kg）
であり，脈拍・心音に異常なし．扁平胸・円背で，肝・牌腫なく二次性徴は良好．神経所見は，知能正常，性格温厚．軽度の遠視，眼瞼下垂はなく，軽度の先天性左外斜視以外に眼球運動は正常，白内障・網膜変性なし．眼輪筋・口端筋の極軽度筋
力低下，広頸筋の軽度筋萎縮・筋力低下，囁下良
好，胸鎖乳突筋は中等度の筋萎縮・筋力低下．四肢・体幹運動系は上肢帯優位にび慢性筋萎縮があったが，握九 歩行，小走り，しゃがみ立ち・爪先・踵立ち，階段昇降は正常であった．運動失調

骨格筋病理所見
光顕筋生検は両症例とも上腕二等筋にて実施し，
高度のragged−redfibers［RRF］，CytOChoromec oxidase活性陰性［CCO（−）］線経があり，
RRFは必ずしもCCO（一）線経と対応しなかった．その他strongly succinate dehydrogenase
reactive blood vesselsは明瞭ではなかった．な
お症例1では変性線経が多くまた問質結合織の増生に加え，rOdformationまたcytoplasmicbodyをみた（図2）．なお症例2の10歳時パラフィン包
埋切片のレビューでは炎症性病変はなく，中等度のRRFが確認された．電顕では巨大ミトコンド
リア，梓棒状・線維様のミトコンドリア内封入体が明らかであった（図3）．

はなく，深部反射は軽度減弱．すなわち症例1と極めて近似した臨床所見を呈した．異常検査所見

ミトコンドリアDNA（mtDNA）解析
mtDNA解析は，骨格筋または末梢血より抽出して行った．サザン・プロット法では欠矢はなく，ではS−LDH，S￣CK（MB型6．4％），SJmyosin軽鎖Ⅰ，S−myoglob．，S￣aldolase．の軽度増加と葉酸低値があり，抗mt抗体は陰性．その他血清銅の低PCR産物のApaI消化をtRNALeu上の塩基番
号3，243を含む530bpの領域にて実施した所，症例
1，2の骨格筋にて3，243のA■Gtransitionを

低IgG，IgEの増加．染色体に異常なく，代謝性
acidosisなく，心電図・脳波・ERGに異常なかった．筋電図は軽度の筋原性変化，NCVは正常であ

heteroplasmy型に確認したが3，271変異はなかった．なお母親の末梢血また検索しえた母方兄弟，
症例2の兄にその変異を認めなかった（図4）．ま−191−

図2 骨格筋凍結連続切片所見（上腕二頭筋）Originalmag．（×200）
左列1，2，3：症例1（母），右列4，5，6：症例2（子）上段1，4：Gomori s modified trichrome
中段2．5：Succinatedehydrogenase活性染色下段3，6：Cytochrome c oxidase活性染色

たmtDNAの仝周シークエンスを症例2で行な
いAnderson3）の報告した塩基配列に比し変異した配列がtRNALeu上の3，243mutationを含み合計48個あり，mtDNAの翻訳領域においてアミノ酸の非同義置換をもたらす変異が12個，同義置換をもたらす変異が16個，その他リボゾームRNA
部に4個，D−loopを含む非翻訳領域に15個の一塩基置換を認めた（表）．
考察及びまとめ
緩徐進行性のL−G Syを呈したミトコンドリ
ア・ミオパテーの母子例を報告した．ミトコンド
リア・ミオバナーは慢性進行性外眼筋麻痺，
MELAS，MERRF，LHON，労作性ミオグロビン−192−

二二一三三妄言増瀾済琶尿症などを呈し多彩な臨床徴候が報告され，その病態にmtDNAの単一・多重欠失また点変異などが深く関与していることが明らかにされつつある．
さてミトコンド1）ア・ミオバナーの中でL−G Syを示す例が時に報告されている．しかしその病像
は他の身体・神経症候（進行性外眼筋麻痺，知能低下，白内障，網膜変性，運動失調など）をむしろ主体とし，LG Syは強調されておらず，かつ
詳細な記載もない．そして遺伝形式は孤発例1），常染色体性劣性1）または優性遺伝3）をとる疾患群に加え，神経原性所見の一部としてL−GSyを来した疾患4）などがある．今回報告した母・子例は長期間におよぶ臨床経過にて進行性LGSyを示し，筋症を主体としたほぼ唯一の共通病態を呈し，痙

図4

図3 電顕所見（上腕二頭筋）
上段1：症例1（母），中段2，3：症例
2（子）1．筋鞘膜下に異常ミトコンドリアの集積と変性産物を認める．×4，500
2．ParkingLlot型の封入体が巨大ミト
コンドリア内に観察される．×11，250
3．線維性またはamorphousな封入体を含む巨大ミトコンドリアが観察される．（×11，250）−193−

ミトコンドリアDNA（mtDNA）解析
骨格筋または末梢血より抽出して実施した．サザン・プロット法では欠夫はなく，PCR産物のApa Z消化をtRNALeu上の塩基番号3，243を含む530bpの領域にて実施した．
症例1，2の骨格筋mtDNAおよび症例
2の末梢血mtDNAにて3，243のA｛Gtransitionにより新たな切断点が確認された．なおmutant mtDNAとwild
mtDNAはheteroplasmyを呈した．また母親の末梢血または検索した母方兄弟，
症例2の兄にはその点変異を認めなかった．矢印：発端者，斜線：検索正常者．

表

NucleotidemutationsinwholemtDNA
症例2の全周mtDNA解析におけるmtDNA点変異った．故にこのL−GSyは比較的低浸透率の母系遺伝が示唆された．またmtDNA解析結果は多くのMELAS例での変異の一指標と報告5）されてRegionいるtRNALeu上の塩基番号3，243のA｛G点変異（heteroplasmy型）を確認したが，他の多くの点変異も認めた．以上LLGSyの中には母系遺伝をとり家系内で同一病態を呈し，点変異を有する
ミトコンドリア病の存在が確認された．

Mutationsケ 一 ll 3 3 1 2 1

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drial DNA mutationsin

mitochondrial

myopathy，enCephalopathy，lactic acidosis，
andstroke−1ikeepisodes（MELAS）．Biochem
BiophysResComm174：861，1991．

37）ミトコンドリア脳筋症の病因解明−ピルビン酸脱水素酵素欠損症女児例における分子遺伝学的病因検索−
黒 田 泰 弘＊

研究協力者

緒伊 藤 道 徳＊ 内 藤 悦 雄＊
西 候 隆 彦＊ 武 田 英 二＊

らに患児の培養皮膚線維芽細胞と培養リンパ芽球

言

ピルビン酸脱水素酵素複合体（PDHC）は6つの成分，すなわちピルビン酸脱水素酵素（El），リ
ボ酸アセチルトランスフェラーゼ（E2），リボアミ
ド脱水素酵素（E3），PDHホスファターゼ，PDH
キナーゼおよびProtein−Ⅹ（Ⅹ）から構成されて様細胞，末梢リンパ球およびIL2で増殖させたTおり，その活性はPDHホス77ターゼおよびPDHキナーゼによる脱リン酸化−リン酸化機構
によって調節されている．また，PDHはαおよび対象は培養皮膚線維芽細胞PDHC活性が著明βの2種類のサブユニット（Elα・，Elβ）の4量体として存在している．ミトコンドリア脳筋症の病因としてPDHC異常が報告されている．PDHC

細胞での変異遺伝子の発現について検討したので
報告する．
研究対象
に低下していたにもかかわらず，EBウィルスで株化した培養リンパ芽球様細胞PDHC活性が正常であった先天性高乳酸血症の2歳女児例（表）とその両親からえた培養細胞および末梢リンパ球である．

異常の中ではEl欠損症が最も多く報告されている．最近Elのαサブユニット（Elα）の遺伝子変異が明らかにされており，我々もPDH欠損症の1例において4塩基対の挿入を見出している1）．
Elαに対する遺伝子はⅩ染色体上にあり，女児患者では変異遺伝子の発現度は症例により，また臓器によって異なっていることが報告されている2）．最近，我々は培養皮膚線維芽細胞のPDHC
活性が著明に低下しているにもかかわらず，EB
ウィルスで珠化した培養リンパ芽球様細胞のPDHC活性が正常であった先天性高乳酸血症の1女児例を見出した．そこで，本症例および両親についてElαに対する遺伝子の変異を検索し，さ＊徳島大学医学部小児科−195−

表 先天性高乳酸血症1女児例における培養皮膚
線維芽細胞および培養リンパ芽球様細胞のビ
ルビン醸脱水素酵素複合体（PDHC）活性．
ピルビン酸脱水素酵素複合体活性を無処理での活性（Native），ジタロル酢酸で活性化した活性（DCA−aCtivated）およびBroad
SpeCificity protein phosphataseで活性化した全活性（Total）として測定した．
PI）EC activity（nnol／1ln／力g prOteln）

yatiYe DCA−aCIYated Total
Pibroblast＄Patient O．08
ConlroIs

0，13．0．19

1．44±0．46

2．号8±0．60

0．86

2．41士0，59

LytlpboblaStOld
eellS
Patient

2．91

3．69．2．87．3．66

t．98

Controlき

1．94±0．25

3．60±0．62

3．59±0」7

研究方法

配列を参考にして，4種類のプライマーを合成し牛心臓から精製したElα，Elβに対する抗血清を用いたⅠmmunoblot法で培養皮膚線維芽細胞，培養リンパ芽球様細胞のElα，Elβ蛋白質の量およびサイズを検討した．
培養皮膚線維芽細胞からChomczynskiらの方法3）でtotal RNAを抽出した．このtotal RNA
を鋳型にして単鎖cDNAを作製してこれをPCRの鋳型にした．ついですでに報告されている塩基

た．それぞれのプライマーには2または3塩基を置換してほぼ中央にEco RIの認識部位を作製した．これらのプライマーを用いたPCR法により
Elαに対するcDNAを−30から705までと641から1205までの2つのフラグメントに分けて増幅した（図1A）．PCR法はTaqDNApolymeraseを利用したGene AmpTMキット（Perkin−Elmer
Cetus社）を用い，変性940C1分間，アニー））ン

IA）
705

TCCTCTTCCTCTTAAGTATGGAAGT
1205

lBI

EXON1日

lC）
EXON

図1

8

9

10

11

PCRによるcDNAおよびDNAフラグメントの増幅
仏）塩基配列決定のためのtotalRNAから作製した単鎖DNAを鋳型としたElαCDNAの増幅（＊はEco RI認識部位作製のための塩基置換部位を示す．）（B）患者のゲノムDNAを鋳型とした変異部位を含むDNAフラグメントの増幅に）患者の単鎖cDNAを鋳型とした変異部位を含むcDNAフラグメントの増幅
矢印は変異部位を示す．
−196−

Aj Ant卜El戎antibodY

f伽b−astl瀧…；。う。

「 1

「

「

図3 患者と対照の培養皮膚線維芽細胞のElαに対するcDNAの塩基配列の比較
患者において塩基配列を決定した20クローン
すべてが18塩基対の挿入を示した．
図2Immunoblot分析
培養皮膚線維芽細胞および培養リンパ芽球様細胞のミトコンドリア分画をSDS−PAGE後，抗Elα抗体と抗Elβ抗体を用いてIm−munoblot分析を行った．
レーン1
精製Elのアミドブラック染色
レーン2
精製E1
レーン3， 5：対照の培養皮膚線維芽細胞
レーン4
患者の培養皮膚線維芽細胞
レーン6， 8：対照の培養リンパ芽球様細胞
レーン7
患者の培養リンパ芽球様細胞

変異がゲノムDNA上に存在することを確認するために培養皮膚線推芽細胞，培養リンパ芽球様細胞から抽出精製したゲノムDNAを鋳型としてこの変異部分を含むDNAフラグメントをPCR法

グ609C2分間，伸長反応720C3分間を1サイクル
として30回の増幅を行った．増幅したcDNAの両芽細胞，培養リンパ芽球様細胞，末梢リンパ球およびIL2で増殖させたT細胞から抽出精製した
total RNAを鋳型として単鎖cDNAを作製し，で増幅し（図1B），2％アガロースゲル電気泳動で増幅されたフラグメントのサイズの決定を行った．
さらに，ProteinaseK処理，フェノール抽出，エ
タノール沈澱法をもちいて両親の末梢リンパ球から得られたゲノムDNAを用いて両親における変異遺伝子の有無を検討した．また，培養皮膚線維

端をEco RIで切断後，低融点アガロースゲルで分散精製した．これをプラスミッドベクター
BluescriptIIのEco RI認識部位に組み込み，大腸菌ⅩL1−Blueに移入して得られたクローンを単離して，dideoxy法によりcDNAの塩基配列を決定した．
患者cDNAの塩基配列決定により推定された

これを鋳型として変異部分を含むcDNAをPCR法で増幅し（図1C），変異遺伝子と正常遺伝子の発現度を検討した．

−197−

Control

PheAlaThrAlaAspProGluProProLeuGiuGiuLeuGlyTyrHIsZleTyrSerSer
1054TTTGCCACGGCCGATCCTGAGCCACCTTTGGAAGAGCTGGGCTACCACATCTACTCCAGC1113

二二二台

patient lO54TTTGCCACGGCCGATCCTGAGCCACCTTTGGAAGAGCTGGGC1113
PheAlaThrAlaAspProGluProProLeuGluAspGluProProLeuGluGiuLeuGly

Control

Patient＿．‥

AspProProPheGluVaiArgGlyAlaAsnGlnTrp工1eLysPheLysSerVaiSerH●

八．〈｛八．｛八一【＿＿【．．＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

1114

1114

GACCCACCTTTで GAAGTTCGTGGTGCCAATCAGTGGATCAAGTACCACATCTACTCCAG GACCCACCTTTTGAAGTTCGTGGT

三千±三三

TyrHIsIleTyrSerSerAspProProPheGluVaiArgGlyAlaAsnGlnTrp工leLys

二二：慧PheLysSerValSer＋＊＋

図4 患者における遺伝子変異とアミノ酸配列の変異

fibr0−lympho−

fjbr0−1ymph0−1ymphい T Cell
blast blastoid cyte

1ympho−12
図6
図5

ゲノムDNAを鋳型としてPCR法で増幅した変異部位を含むDNAフラグメントの電気泳動パターン
レーン1：サイズマーカー
レーン2，3：培養皮膚線維芽細胞
レーン4，5：培養リンパ芽球様細胞
レーン6，7，8：末梢リンパ球
レーン2，4，6：対照
レーン3，5：患者
レーン7：母親
レーン8：父親

−198−

3

4

5

6

7

8

9

total RNAから作製した単鎖cDNAを鋳型としてPCR法で増幅した変異部位を含む
CDNAフラグメントの電気泳動パターン
レーン1：サイズマーカー
レーン2，3
培養皮膚線維芽細胞
レーン4，5
培養リンパ芽球様細胞
レーン6，7末梢リンパ球レーン8，9IL−2で増殖したT細胞
レーン2，4， 6，8：対照
レーン3，5， 7，9：患者

結果
Immunoblot分析では患児由来の培養皮膚線維芽細胞のElα，Elβ蛋白質量はともに著明に減少していたが，培養リンパ芽球様細胞のElα，Elβ
蛋白質量およびサイズはともに対照と差を認めなかった（図2）．
息児由来の培養皮膚線維芽細胞から作製した
cDNAの塩基配列では，塩基配列を決定した20クローン全てにおいて塩基番号1089の位置に18塩基対の挿入が認められた（図3）．この18塩基対の挿入ではフレームシフトは生じなかったが，6アミノ酸残基が挿入された（図4）．ゲノムDNAの解析では培養皮膚線維芽細胞，培養リンパ芽球様細胞ともに正常遺伝子由来の203塩基対のDNAフ
ラグメントに加えて変異遺伝子由来の221塩基対のDNAフラグメントを認め忠児が変異遺伝子と正常遺伝子をもつヘテロ接合体であることが明らかとなった（図5）．さらに，230塩基対のDNAフ
ラグメントも認められた（図5）が培養皮膚線維芽細胞，培養リンパ芽球様細胞の染色体分析では息児は46XXであり，この230塩基対のDNAフラグメントは正常DNA鎖と変異DNA鎖のヘテロ
デュプレックスと考えられた．両親のゲノム
DNAの解析では両親ともに正常遺伝子由来の203塩基対のDNAフラグメントだけが認められた（図5）．
恩児のCDNA解析において培養皮膚線維芽細胞では，変異遺伝子由来の237塩基対のCDNAフ
ラグメントのみが認められたのに対して，培養リ
ンパ芽球様細胞では，正常遺伝子由来の219塩基
対のCDNAフラグメントしか認められなかった（図6）．また，末梢リンパ球とT細胞では，正常遺伝子由来の219塩基対のCDNAフラグメントに加えて変異遺伝子由来の237塩基対のCDNAフラ考案

今回，我々は培養皮膚線維芽細胞のPDHC活性が著明に低下しているにもかかわらず，EBウ
イルスで株化した培養リンパ芽球様細胞のPDHC活性が正常であった先天性高乳酸血症の
1女児においてElαに対する遺伝子の変異を検討した．患児は18塩基対の挿入をもつElαの変異
遺伝子と正常遺伝子のヘテロ接合体であり，培養
皮膚線維芽細月包ではこの正常遺伝子をもつⅩ染
色体が，また培養リンパ芽球様細胞では変異遺伝子をもつⅩ染色体が優位に不活性化されているものと考えられた．今回，本症忠児の諸臓器での変異遺伝子の発現皮は検討できなかったが，脳，
肝臓，筋肉などの組織においても培養皮膚線維芽細胞と同様に変異遺伝子が優位に発現しているために，本患児はヘテロ接合体であるにもかかわらず高乳酸血症，中枢神経障害などの臨床症状をきたしたものと考えられる．また，恩児の両親はともに変異遺伝子をもっていなかったことから，恩児の変異は突然変異によるものと考えられた．
最近，女性におけるⅩ染色体の不活性化には組織による偏りが認められることが報告されている2）．本症例では培養皮膚線維芽細胞で変異遺伝子をもつⅩ染色体がほとんどの細胞で発現しており診断が可能であったが，脳など生検が困難な組織においてのみ変異遺伝子が発現している女児
例の可能性もある．実際，脳においてのみPDHC
活性が低下していた女児例が報告されている4）．
したがって，Elαの異常によるPDH欠損症の女児例の診断のためには遺伝子診断法の確立が必要と考えられる．

グメントと，正常cDNA鎖と変異cDNA鎖のヘテロデュプレックスと，考えられる250塩基対のCDNAフラグメントが認められたが，正常遺伝子
由来の219塩基対のCDNAフラグメントが優位であった（図6）．

文献1）黒田泰弘，伊藤道徳，内藤悦雄ほか：ミトコン
ドリア脳筋症の病因解明−ビルビン酸脱水素酵素複合体異常症における変異遺伝子解析−． 厚
生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ
フィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木珪）平成2年度研究報告書，
1991，pplO7−111．

−199−2）Brown RM，Fraser NJ and Brown GK：

methodofRNAisolationbyacidguanidium

Differentialmethylationofthehypervariablethiocyanate−phenol−Chioroform extraction．

Locus DXS255

AnalBiochem162：156−159，1987．

0n aCtive andinactive X

Chromosomescorrelateswiththeexpression4）Prick M，Gabreels F，Renier W，etal：OfahumanX−linkedgene．Genomics7：215

Pyruvatedehydrogenasedeficiencyrestricted−221，1990．

tobrain．Neurology（Ny）31：398−404，1981．

3）ChomczynskiP and SacchiN：Singlestep−200−38）蛋白質のミトコンドリア移行とその異常：
サイトゾル因子の役割
正 敬＊

森

研究協力者

村 上

は じめに

薫＊

蛋白質のミトコンドリア移行のシステムを構成すミトコンドリアは細胞のエネルギー産生，アミる因子の異常に分けて考えることが出来る．①にノ酸代謝，糖代謝（TCAサイクル），脂肪酸β酸

ついては症例が報告されはじめているが，（参につ化，尿素合成前半などを担う重要な細胞小器官（オいては先ず蛋白質のミトコンドリア局在化の分子

ルガネラ）の一つである．ミトコンドリアはそれ機構を明らかにすることが重要である．我々は肝自身が複雑な構造を持っており，サイトソルに面臓のミトコンドリアマトリックスに局在する2つしている方から外膜，膜間分画，内膜およびマトの尿素サイクル酵素−カルバミルリン酸合成酵素

リックスの4つの区画より成っている．ミトコン

Ⅰ（CPSI）とオルニテントランスカルバミラーゼ

ドリアの大きな特徴の一つは，固有の遺伝子（OTC）−を実験系として蛋白質のミトコンドリ

DNAと蛋白質合成系を持ち，部分的には自律性

ア局在化とその異常の研究を進めている1）．

を備えていることである．しかしミトコンドリア

我々はまずラットCPSIとOTCのin vitn合DNAはきわめて小さく，2種のリポソーム成を行い，両酵素が分子量の大きい前駆体の形でRNA，22桂のtRNAおよび呼吸鎖に関与する13合成されることを明らかにした．引き続いて多く種のポリペプチドのみがコードされていることがの研究室で種々のミトコンドリア蛋白質について分っている．最近ミトコンドリアDNAの異常に同様の実験が行われ，ミトコンドリア蛋白質の大よるミトコンドリア病（ミトコンドリア脳筋症）

部分が前駆体として合成されることが明らかとなが発見され，その研究が急速に進んでいる．一方，った．さらにミトコンドリア蛋白質の合成部位が外股，股間分画，マトリックスに存在する全ての遊馳リポソームであること，前駆体がサイトゾル

蛋白質および内膜の大部分の蛋白質は核染色体のプールより数分以内にミトコンドリアに移行し，

DNAにコードされており，ミトコンドリア外部

ミトコンドリアに存在するプロセシングプロテア

で合成されたのち，1枚または2枚のミトコンドーゼによって成熟蛋白質に転換されることを明ら

リア膜を通過して内部へ移行し，または膜に組みかにした．

込まれる．すなわち，ミトコンドリアの形成はミ

さらに玩1新和で合成した蛋白質前駆体を単維

トコンドリア遺伝子と核染色体遺伝子の2重支配

ミトコンドリアに取り込ませて成熟酵素に転換すを受けている．したがって核支配ミトコンドリア

る玩㍑融和のトランスポート再構成系を開発し，蛋白質のミトコンドリア移行の障害はミトコンド；のトランスポートとプロセシングの系が①組織
特異性がなくどのミトコンドリアでも使用出来る，

リア病を釆たす．蛋白質のミトコンドリア移行の異常は①個々のミトコンドリア蛋白質の異常と（∋＊熊本大学医学部遺伝医学研究施設②種特異性が喚く，ラットやマウスのミトコンド
リアが使用出来る，③複数の前駆体に共通である，④トランスポートのステップにエネルギーが必要

−201−

︵

X∈dp︶0トOd

N．OT×∈dp︶0トOd

TOL

B1

5

10

14

B1

Fraction

5

10

14

Fraction

図10TC前駆体とPBFの複合体形成．［35S］
標識OTC前駆体（pOTC，70ng）と種々の量の精製PBFを混ぜ，蕉糖蜜席勾配
遠心法で解析した．PBFの量はOng（▲），50mg（□），100ng（■），200ng（●），400mg（△），2J g（○）．Bは遠心管の底を示す．

図2

合成延長ペプチドによる複合体形成の阻
害．精製［35S］OTC前駆体80ng，精製
PBF200ngと種々の渋皮の合成延長ペプ
チドを混ぜ，庶糖密度勾配遠心法で解析した．延長ペプチドの濃度はOJ M（○），0・2J M（□），2J M（●），5J M（△），20〟M（∫），5恥M（×）．

であることなどを明らかにした．ついでOTC前方法と結果

駆体cDNAをクローン化し，成熟酵素のN末端に32アミノ酸残基の 延長ペプチド（presequen−Ce） が付着していることを明らかにした．この前駆体の性状およびミトコンドリアへの移行の仕組
みを明らかにするためには前駆体を大量調製する必要がある．そこで遺伝子工学の手法を用いて大腸菌でOTC前駆体の大量発現させ，均一に精製すると共に，精製前駆体を用いる玩J滋和のトラ

OTC前駆体を大腸菌で大量に発現させ，尿素存在下に均一に精製した．PBFはウサギ網状赤血球
ライセートよりOTC前駆体セファローズクロマ
トグラフィー，DEAE高速液体クロマトグラフィー，蕉糖密度勾配遠心法により均一に精製した．

ンスポート系を開発した2）．そして，精製前駆体のミトコンドリア移行にサイトゾルに存在するタン
パク質因子が必要であることを発見し，この因子をPBF（presequencebindingfactor）と名付けると共に，それを均一に精製した3）．この精製PBFを用いてタンパク質の移行におけるPBFの役割を解析した．

OTC前駆体とPBFの相互作用を蕉糖密度勾
配遠心法で解析した．OTC前駆体のみを遠心すると，凝集体を形成し，遠心管の底に沈澱した（図1）．ところがOTC前駆体とPBFを混ぜた後に遠心すると，沈降係数7Sの可溶性の複合体を形成した．70ngのOTC前駆体を用いた場合，PBFlOO
ngで中程度の複合体形成が見られ，400ngでほぼ最大の複合体形成が見られた．
この複合体にPBFが含まれていることを確かめるためにSDS−PAGEで解析したところ，OTC
前駆体とPBFが共沈降することが明らかとなった．複合体中でのOTC前駆体とPBFの比はほぼ−202−

ついで，精製OTC前駆体のミトコンドリア移行に対するPBFの効果を調べた．精製前駆体は単独ではミトコンドリアに取り込まれないが，精製PBFを添加すると，効率のよい取り込みが見られた（図3）．このことより，精製OTC前駆体のミトコンドリア移行にはPBFが必要であることが示された．
考

0100

200

300

400

500

前駆体タンパク質がミトコンドリア膜を透過して内部へ移行するためには，ほどけた状態になければならない．延長ペプチド部分が成熟タンパク

600

PBF（ng）
0

10

20

ReticurocyteLysate

図3

察

質部分のfoldingを防ぐ可能性も考えられたが，OTC前駆体の延長ペプチドは成熟酵素部分の30

foldingを直接には強く阻害しないことが分った4）．前駆体蛋白質がリポソームで合成されて延長ペプチド部分がリポソームより出てくるとPBFが結合し，可溶性の複合体を形成して前駆体の凝集を防ぎ，前駆体を院透過可能な状態に保つ
ものと思われる5）．この複合体は恐らくミトコン
ドリア表層に存在すると思われる PBFレセプタ

q」［）

精製OTC前駆体のミトコンドリア移行に対する精製PBFの効果．精製OTC前駆体を精製PBF（●）または透析網状赤血球ライ七一ト（○）存在下にラット肝ミトコンドリアと250C，90分インキュベートし，ミトコンドリアへの取り込みを測定した．

1：1と推定された．
PBFがOTC前駆体の延長ペプチド部分に結合するのか，あるいは成熟酵素部分に結合するのかを明らかにするために，化学合成延長ペプチドによる複合体形成の阻害実験を行った．複合体形
成は数〟Mの延長ペプチドで中程度阻害され，50

ー に結合し，延長ペプチド部分が次いでPBFから延長ペプチドに対する別のレセプターに移された後，外股と内膜のコンタクトサイトを通ってマトリックスに移行すると考えている．今後PBFの性質を更に明らかにすると共に，遺伝子を単離し， PBFレセプター の検索を行う予定である．
これらの基礎に基いて蛋白質のミトコンドリア局
在化の障害を解析したい．

〃Mで完全に阻害された（図2）．一方，複合体形
成は精製成熟型OTCではほとんど阻害されなかった．したがって，PBFはOTC前駆体の延長ペプチド部分に結合することが明らかとなった．
PBFが他の前駆体のミトコンドリア移行にも関与するか否かを明らかにするために，他の延長ペプチドの阻害効果を調べた．アスパラギン酸ア
ミノトランスフェラーゼおよびリンゴ酸脱水素酵素の化学合成延長ペプチドは，OTC前駆体とPBFの複合体形成を強く阻害した．したがって，
PBFは少くとも一群の前駆体タンパク質のミト
コンドリア移行に関与することが示唆された．
−203−

文

献

1）森 正敏：蛋白質のミトコンドリア膜識別とミトコンドリア内移行． タンパク質の細胞内輸送と膜透過 ．現代化学，増刊10：1987，pp174−
185．

2）MurakamiK，AmayaY，TakiguchiM，Ebina
Y and MoriM：Reconstitution of mitochon−
drialproteintransportwithpurifiedornithinetranscarbamylase precursor expressedin
EscheYichhz coli．J BioI Chem263：18437−

proteinandisessentialforassociationwith

18442，1988．

3）Murakami K and Mori M：Purified prese−

areticulocytecytosolicfactor（S）．JBiochem

quencebindingfactor（PBF）formsanimport

lO8：207−214，1990．

−COmPetent COmplexwith a purified mito−

5）Mori M and Murakami

K：Transport ofChondrialprecursorprotein．EMBOJ9：3201

mitochondrial precursor proteinS；their−3208，1990．

conformational competence and related4）Murakami K，Tokunaga F，Iwanaga S andMori M：Presequence does not prevent
foldingofapurifiedmitochondrialprecursor−204−

factors（Minireview）．CellStruCt Funct14：
643−647，1989．

39）ヒトミトコンドリアDNA D−loop領域における新しい調節因子（Mt5因子）
杉 村 公 也＊研究協力者

大 野 欽 司書

田 中 雅 嗣＊＊ 鈴 木

Sanjeev Kumar＊＊

佐

橋

寛＊＊

功＊＊＊高 橋昭＊

小 澤一 高 将車

日

我々は，これら調節因子の種内での塩基配列保的

ヒトミトコンドリアDNA（mtDNA）は，電子伝達系複合体の13種のサブユニットをコードして
おり1），他のサブユニットは核DNAによりコード存の有無を検討し，さらに，新たな調節因子を見出す目的で，ヒトmtDNAの1，122bpの非翻訳領域の直接塩基配列決定を行った．

されている．従って，ミトコンドリア電子伝達系の分子構築のためには，両者の協調発現が必要と対象と方法なる．ヒトmtDNAには，1，122bpの非翻訳領域があり，mtDNA複製・転写に重要な役割を担ういコントロール7例と患者11例（MELAS2例12），
乳児致死型心筋症1例13），パーキンソン氏病2例，肥大型心筋症4例，拡張型心筋症2例）よりDNAを単離した．PCR法を用いて，非翻訳領域全長を含むmtDNA断片を増幅した．さらに，M13ファージのユニバーサル配列を5′末端に持つ38−merのプライマー7種類を用いて，非対称PCR法により1本鎖DNAを増幅した．増幅された1本鎖

くつかの調節因子がこの領域に存在する．これらの調節因子はその機能により3つのクラスに分けられる．第1のクラスには，L鎖とH鎖のプロモータ（LSP，HSP）から構成され，ともにmtDNAの転写に必須の因子である2ト4）．第2のクラスには，mtTFl（L−Starnd），mtTFl（H−Strand），
Mt3，Mt4が含まれ，これらは核によってコードされたトランス因子と協調し発現調節を行うシス因子として提唱されたものである5ト8）．第3のクラスには，CSB−I，−II，−III（controI sequence

DNAを蛍光プライマー法による自動化塩基配列決定の鋳型として用いた．この方法により得られた非翻訳領域塩基配列をGenetyx−Macを用いて解析を行った．

block），TAS（terminationassociatedsequence）
が含まれ，種問で保有された配列として提唱されたものである9）10）．第3のクラスの内，CSB−ⅠⅠとCSB−ⅠIIはRNaseMRPによるミトコンドリア

RNAの切断に必須であることが最近解明された川．一方，CSB−ⅠとTASの機能は現在不明である．
■名古屋大学医学部神経内科＊＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊＊愛知医科大学第四内科

結果

非翻訳領域において塩基変異を有する部位を表1に示す．18例のmtDNA非翻訳領域塩基配列決定にて，Andersonら1）の塩基配列と異なる部位が66ヶ所存在した．変異は45ヶ所の塩基転位，4ヶ所の塩基転換，7ヶ所の挿入，10ヶ所の欠夫から構成されていた．塩基変異はこの1，122bpの領域
内で不均一に分布しており，34ヶ所（52％）の変異
部位がtRNA−Proline側の400bpの領域に存在

−205−

表1

ヒトミトコンドリアDNA非翻訳領域における塩基多様性
Andersonらの報告した塩基配列と異なる塩基のみを示す．トントはAndersonらの塩基と同一であることを示す．ハイフンは塩基挿
入および欠失を示す．cambはAndersonらの塩基配列を示す．
Ct■d
2

1

4

I l T

暮

9

川

11H l114

15

日111

川

考

察

亡

今回の研究により，非翻訳領域における調節因
子を種内塩基配列保有の程度から3つのグループに分類することができた（表2）．第1のグループ

■
■
T

C

■
C

C

T

T

T

T

C
U

は，種内で完全に保有された因子で，LSP，HSP，
Mt3，Mt3（H），mtTFl（H−Strand）が含まれる．
第2のグループは，比較的桂内保存が認められる

C
C
C
C
U

C

調節因子で，CSB−III，Mt4（H），mtTFl（L−strand）が含まれる．これらの調節因子はそれぞれ1ヶ所の変異部位を認め，その変異を有する頻度

C

C

U

C

C

G

G

G

O

O

G

G−−

G G

G

G

Q

O

G

C

G

G

C

C

U

T

も低かった．すなわち，CSB−IlIとMt4（H）の1塩基変異は，ともに70例中1例のみに認めた．一

T
T

T

C
C

U

C

▲

▲TC

▲TU

C

G

・・G亡・UC．．G▲し．C一しC． ． 6 ． ． C ▲ し．．GC．cc−・GC・亡く⊂．C・▲G・・U・

CC

CC

GC

．．GC．﹁G▲U

G CCCC

6ccCC

G rこしC

G

G

．．∩

G

▲

▲

6人

表2 各種調節因子の種内塩基配列保存
VaぬbbsiteS Frequoncy
Perrength amonghumans
1．St血tlyconseⅣOddemOntSLSP
HSP
mtTFl forHSP
M13
Mt3（H）

0／16
0／14
0／22
0／8
0／8

2・ROlatjvelyconseⅣedolemOntS
Mt4（H）CSB・‖
mtTFlforLSP

1／9
1／15
1／23

3．VariabledQmOntS
TAS
CSB−l
CSB・‖

mtDNA非翻訳領域の一部の塩基配列が，主として分子進化の解析の目的で行われており14）一19），
これら289例のデータを加えるとさらに150ヶ所の変異部位が加わる．我々が決定した変異部位と，既報告の変異部位を，この領域における調節因子と合わせて図1に示す．

U

TTGT▲T▲

m椚31
−
62
2
I
闇9
服
︸
11
1血皿胴胴川肌用扁mM獅2〜帖70M
冊
紺0O
は日9
25
5
70
1
用
85
別
⁝■
叫
禦n
9
川8
9
︸叩
‖m
Mmは
⁝MM獅⁝

Nl上b血
■血C■爪b．1

した．

8／15
6／24
2ノ15

方，mtTFl（L−Strand）の変異は28例中2例に認めたが，その部位はこの調節因子の端に存在していた．第3グループは，種内塩基配列保存が認められない因子で，CSB−Ⅰ，CSB−II，TASが含まれる．CSB−Ⅰでは24塩基中6塩基，CSB−IIでは15塩基中2塩基，TASでは15塩基中8塩基に変異を認めた．さらに，これらの変異を有する例の頻度も高く，CSBLIでは95例中6例，CSB−IIでは
95例中91例，CSB−Ⅰでは313例中47例に変異を認めた．
TASは，ヒトとマウスのD−loopstrandの3′側
終始点近傍に認められる繰り返し配列10）で，その機能は解明されていない．CSB−Ⅰは，非翻訳領域
において種間で保有された配列として提唱された
が9），RNase MRPによるミトコンドリアRNAの消化には不必要な因子である11）．CSB一ⅠⅠの塩基変異は特異で，塩基挿入のみが認められている．
CSB−ⅠⅠにおけるシトンンの繰り返し配列における塩基挿入と塩基欠夫は，RNaseMRPによる認識に影響を与えないことが知られている11）．一方，第1と第2のグループに属する種内で塩基配列が−206−

rrMCrCCACCArnAGCACCCAAAGCmGArrCTAArrnAAACrArrCrCrGTでCTTTtR〃A一夕ro
CATGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACAACCGCTATG
A

G

T

T

C

TATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATAAATACTTGACCA
CC

T

C

C

T

T

T

T

CC

A

T

C

C

AG

T

CCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAA一一−−CCCCC℡一ccccATGCTTACAAGCAAGT16，209
T

A

G

CGGG

TTT

C

T

T

TG

rAS

一一ccCCTTTTACC

G

TTT

A

G

ACAGCAATCAACCCTCAACTATCACACATCAACTGCAACTCCAAAGCCA−CCCCTCACCCAGAT CTGGTTTC G GCAGTGT TTGTC T G C G GATA C TT CT
℡
C
T
G
G
A

16，269GCTAGGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACATAAAGCCATTTACCGTC A T G G TT GTTTGTTTCCG G CC G CG G TAT CC TT
C

16，329TACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCCTCAGATAGG
GA
CGT
T
TCC
CTAC
TT
C
C
A

16，389GGTCCCTTGACCACGATCCTCCGTGAAATCAATATCCCGCACAAGAGTGCTACTCTCCTC
A
T
G
C
T
C

16，449GCTCCGGGCCCATAACACTTGGGGGTAGCTAAAGTGAACTGTATCCGACATCTGGTTCCT
G
G〃亡j

16，509ACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGCCCACACGTTCCCCTTAAATAAGACATCACGATG
C

16，569GATCACAGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCT−ccATGCATTTGGTA−TTTT
G
A
C
C

60

CGTCTGGGGGGTATGCACGCGATAGCATTGCGAGACGCTGGAGCCGGAGCACCCTATGTC
TG
G
G

120

GCAGTATCTGTCTTTGATTCCTGCCTCATCCTATTATTTATCGCACCTACGTTCAATATT
C
C
C
TTCG

180

ACAGGCGAACA−TACTTACTAAAGTGTGTTAATTAArrTAATGCTTGTAGGACATAATAATAT AT GG A GTC TCG G A G GG AC A G C C

240

C

Orjg

C58一丁

ACAATTGAATGTCTGCACAGCCACTTTCCACACAGACATCATAACAAAAAA−TTTCCACCA
AG

G

C

T

AA−−−CCCCCCCT−CCCCCGCTTCTGGCCACAGCACTTAAACACATCTCTGCCAAACCCCAAAA
ccc

c58−77

C

A

300

T

C58−JJJ360GACAAAGAACCCTPLACACCAGCCTAACCAGATTTCAAATTTTATCTTTTGGCGGTATGCAC

420

G〃亡4〔fり〃亡jrJリムSP

TTTTAACAGTCACCCCCCAACTAACACATTATTTTCCCCTCCCACTCCCATACTACTAAT
mtrFユ

G T

CTCATCAATACAACCCCCGCCCATCCTACCCAGCACACACACACCGCT（〕CTAACCCCATA
C A

皿とrFユ

CCCCGAACCAACCAAACCCCAAAGACA−一一ccCCCCACAGTTTATGmGCTTACCTCCTCAAA

月SP CCC

図1

亡R〃A−Pムe

ヒトミトコンドリアDNA非翻訳領域における塩基多様性と各種調節因子
上段にAndersonらの報告した塩基配列を示し，下段にヒト桂内における塩基多様性を示す．太字は我々が決定した塩基多様性を示す．tRNA領域を斜体で示す．既報告の調節因子を下線で示
す．
−207−

16・024

16，20016，400

1

200

400

576

耶即空間聞，．．剛喝冊・…．．
D−loop

M Mt3

01iH M【4（H）M【3（H）

一一一十．
図2

ヒトミトコンドリアDNA非翻訳領域における塩基多様性の分布
10塩基対ごとの塩基多様性を棒グラフで示す．黒塗りの部分は我々が決定した塩基多様性を示す．
Mt5因子を星印で示す．

A

D・loopHuman

mmAmmmm★★★★★★★★ ★★ ★★★★★★★★★★★

★

BoYinemAlT闘虹nTGに

Pig

m打mTm

★

★★★★★★★★★★★★★★★★★ ★★★★★★

★★★★★★ ★★★★★★★★★★ ★★★★★★★

Mouse

Amm
TrIロコこ脚uA★★★★★★★★★★★★★★★★★★★

Rat★★★ ★★

★

C

CCCC

A

l

HumanD・hop511エOm虹にⅣ娼Ⅶ班罰はコト3I16，190★★★★★★ ★★★★★★★★★

hIFN・α11

★

T＝A

ATCAA
l

16，220★★

5−「毘刀日脚uGICrKn−3−
1

1

l

−21

・7

1

図3 h）哺乳糞別こおけるMt5因子およびその周囲の塩基配列保存．下線はヒトのMt5因子を示す．
（B）Mt5因子周囲の核酸二次構造予測．Mt5因子を太字および下線で示す．
（OMt5因子とヒトインターフェロンα5′上流域のホモロジー比較．インターフェロン遺伝子の塩

基番号1は，転写開始部位を示す．
保有された因子（LSP，HSP，mtTFIs，Mt3，Mt4，
CSB−ⅠⅠⅠ）は核によってコードされた蛋白因子と結合することが知られている2ト7）11）．逆の視点で見ると，新しい調節因子が存在するとすれば，その塩基配列は桂内で保有されていることが期待される．すなわち，種内での塩基配列保存はmtDNAの複写・転写調節における重要性を反映していると期待される．
10塩基ごとの変異部位の数を図2に示す．この図よりMt3とMt3（H）の周囲の2ヶ所に桂内保有されたクラスタを認めることができる．一方で，TASとori−Hの周囲の2ヶ所には変異の多いク
ラスタが存在する．図2において，TASの周囲の変異の多いクラスタの中心部に校内で塩基配列保有された領域が存在する．この領域は図1では，塩基番号16，197から16，208の5′−CTTACAAG−
CAAG−3′の配列に相当する．この12bpの塩基配
列は313例で完全に保存されていた14ト19）．さらに，−208−

その上流に存在する塩基番号16，194から16，196のtionofeachstrandofhumanmitochondrial

5′−ATG−3′は，313例中1例のみで5′−ATA−3′に変DNA．Ce1136：635−643，1984．

異しており17），この3bpを含めた塩基番号16，194から16，208の15bp（5′−ATGCTTACAAG−
CAAG−3′）を我々は新しい調節因子（Mt5因子）として決定することができた．
他のほ乳顆のmtDNA非翻訳領域を調べるこ

3）ChangDDandClaytonDA：Preciseassign−とにより，mt5因子とその前後の配列は種間でも4）ChangDDandClaytonDA：Preciseassign・保有されていることが明らかになった（図3A）．

mentofthelight−Strandpromoterofmouse

mtDNA非翻訳領域の塩基配列は一般に柱間で多mitochondrialDNA；a functionalpromoter

様なため，Mt5因子が種間保有されていたことは，

consistsofmultipleupstreamdomainS・MoI

その機能的重要性を示唆している．Mt5因子とそCell Bio16：3253−3261，1986．

mentoftheheavy−StrandpromoterofmousemitochondrialDNA；COgnateStartSitesare
not required for transcriptionalinitiation・

MoICe11Bio16：3262−3267，1986．

の前後の塩基配列のコンピュータによる検索では，

5）FisherRPandClaytonDA：Atranscription

7bpのステムよりなる二次構造が予測された（図3

factorrequiredforpromoterrecognitionbyB）．Mt5を含む領域はD−loopstrandの存在によhuman mitochondrial RNA polymerase．

り一本鎖DNAとなっており，この二次構造は生

Accurateinitiation at the heavy−andlight−

理的な意味を持っていると考えられた．

strandpromotersdissectedandreconstituted

Mt5因子は，D−loopstrandが終結するTASのinvitro．JBioIChem260：11330−11338，1985・

近傍に位置している10）．この位置と，TASには認

6）Fisher RP，TopperJN and Clayton DA：

められない種内・種問塩基配列保存1）21ト23）によPromoter selectioninhumanmitochondria

り，Mt5因子はD−loopstrandの終結に関与してinvoIvesbindingofatranscriptionfactorto

いる可能性が考えられる．遺伝子データベースのorientation−independentupstreamregulatory

コンピュータによる検索では，Mt5類似配列がヒelements．Cel150：247−258，1987．

トインターフェロンαクラス2遺伝子24）の5′上

7）Suzuki H，Hosokawa Y，Toda H，et al：

流領域に存在した（図3C）．Mt5を認識する蛋白因

Common protein−binding sitesin the

子が，ウイルスに感染した細胞内で発現し，イン

5′−flanking

regiOns

of

human

genes

for

ターフェロンの発現を増加させるとともに，感染

cytochrome cland ubiquinonerbinding pro・細胞のミトコンドリア機能を抑制することにより

tein．J BioIChem265：8159，63，1990・

8）SuzukiH，Hosokawa Y，NishikimiM and

感染細胞を殺す機序が考えられた．
非翻訳領域における種内塩基配列保有の検索は，

OzawaT：Existenceofcommonhomologous

ミトコンドリアDNAの複製・転写調節因子の機

elementsinthe transcriptional regulatory

能的重要性を検討する上で，また新たな調節因子

reglOnS Of human nuclear genes and mit0−を同定する上で有効な方法であった25）．

chondrialgenefortheoxidativephosphoryla−tion system．J BioIChem266：2333−2338，

文

献

1991．

1）AndersonS，BankierAT，BarrellBG，etal：

9）WalbergMWandClaytonDA：Sequenceand

Sequence and organization of the humanpropertiesofthehumanKBce11andmousemitochondrial genome．Nature 290：457−

LcellD−loopreglOnSOfmitochondrialDNA・

465，1981．

NucleicAcidsResearch9：5411−5421，1981．

2）ChangDDandClaytonDA：Preciseidentifi−
cationofindividualpromotersfortranscrip−−209−10）ClaytonDA：Replicationofanimalmitochon−
drial DNA．Cel128：693−705，1982．

11）BennettJLandClaytonDA：Efficientsite−al：Population variation of human mtDNA

SPeCific cleavage by RNase MRP requires

COntrOl region sequences detected by en−interactionwithtwoevolutionarilyconserved

ZymaticamplificationandsequenceLSpeCificmitochondrialRNAsequences．MoICellBiol

Oligonucleotide probes．AmJ Hum Genet

lO：2191−201，1990．

48：370−382，1991．

12）InoH，TanakaM，OhnoK，etal：Mitochon・
drialleucinetRNAmutationinamitochon＿drialencephalomyopathy．Lancet337：234−
235，1991．

20）BibbMJ，VanEttenRA，WrightCT，etal：
Sequence and Gene Organization of Mouse
MitochondrialDNA．Cel126：167−180，1981．
21）AndersonS，deBruijnMH，CoulsonAR，etal：

13）TanakaM，InoH，OhnoK，etal：Mitochon−Complete sequence of bovinemitochondrial

drial mutationin fatalinfantile car−DNA．Conservedfeaturesofthemammalian

diomyopathy．Lancet336：1452，1990．

mitochondrialgenome．JMoIBiol156：683−

14）Aquadro CF and Greenberg：BD：Human
mitpchondrialDNAvariationandevolution；

717，1982．

22）MacKay SL，01ivo PD，Laipis PJ

andanalysisofnucleotidesequencesfromseven

HauswirthWW：Template−directedarrestof

individuals．GeneticslO3：287−312，1983．

mammalianmitochondrial DNA synthesis．

15）Greenberg BD，NewboldJEandSuginoA：

MoICellBio16：1261−1267，1986．

Intraspecificnucleotidesequencevariability23）GadaletaG，PepeG，DeCandiaG，etal：The

SurrOunding the orlgln Of replicationin

COmplete nucleotide sequence of the rattus

humanmitochodrialDNA．Gene21：33−49，

norveglCuS mitochondrial genome；CryPtic

1983．

Signals revealed by comparative analaysIS16）VigilantL，PenningtonR，HarpendingH，etal：MitochondrialDNAsequencesinslngle

between vertebrates．J MoI Evo128：497−
516，1989．

hairs from a southern African population．

24）Capon DJ，Shepard HM and GoeddelDV：

Proc Natl Acad Sci USA86：9350−9354，

Two distinct families of human and bovine

1989．

interferon−alpha genes are coordinately17）Horai S and Hayasaka K：Intraspecificexpressed and encode functional polype−

nucleotidesequencedifferencesinthemajor

ptides，MoICell Bio15：768−779，1985．

noncoding region of human mitochondrial25）Ohno K，Tanaka M，Suzuki H，et al：

DNA．AmJ HumGenet46：828−842，1990．

Identificaitionofapossiblecontrolelement，18）DiRienzo A and Wilson AC：Branching

Mt5，inthemajornoncodingregionofhumanpatternin the evolutionary tree for humanmitochondrial DNA asintraspecific nu−

mitochondrial DNA．Proc Natl Acad Sci

Cleotideconservation．BiochemInt24：263−

USA88：1597−1601，1991．

272，1991．

19）StonekingM，HedgecockD，HiguchiRG，et−210−40）ミトコンドリア脳筋症変異mtDNAによるタンパク質合成低下−CPEOとMELASの比較−
太 田 成 男＊研究協力者

小 林 菓 子＝ 桃 井 真里子＊＊
林

純

は じめに
ミトコンドリア脳筋症の原因遺伝子の同定に関する研究は最近急速に進展し，ミトコンドリア脳筋症の病型とmtDNAの変異の種類と部位がよく対応することが判明した，しかしながら，
mtDNAの変異によっていかにして各々の病型に特徴的な症状があらわれるかは依然として不明である．mtDNAの変異によって生じるミトコンド
リア機能異常と各々に特徴的な症状の発症機序を解明することが必要である．今回，MELASとCPEOの変異によってミトコンドリアのタンパ
ク質合成がどの様に影響されるのかを調べ，病型の違いを呈する分子的基礎を確立することを目的とした．ここでは，タンパク質合成について述べる．
方法
CPEO由来欠失mtDNAをもつ細胞の分離1）

CPEO患者由来線維芽細胞で，欠失mtDNAを17％持つ培養細胞をサイトカラシンBで処理し，遠心によって核を除去した．次に，mtDNAが完全に失われたHeLa細胞と脱核した細胞質をポリエチレングリコール存在下で融合した．増殖して＊自治医科大学生化学＊＊自治医科大学小児科＊＊＊埼玉ガンセンター＊＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所

一＊＊＊埜

中

征

哉＊＊＊＊

きた細胞塊を分社して増殖させ，全DNAを抽出しサザンプロットによりmtDNAと欠失mtDNAの有無を検出した．正常mtDNAと欠失mtDNAの割合もサザンプロットにより判定した．
MELAS点変異mtDNA3243Gをもつ培養細胞の分離
MELAS患者生検試料細胞を培養し，SV40
DNAを導入することによって株化した2）3）．このなかで，大部分が塩基番号3243Gの点変異
mtDNAである細胞株と大部分が正常mtDNAをもつ細胞株を分離した．さらに，これらの細胞株を再びクローニングし，様々な割合で変異
mtDNAをもつ細胞株を分散した．変異mtDNAと正常mtDNAの割合はPCRで増幅したDNA
断片を制限酵素ApaIで切断し，ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にて分艶した．一方のPCRプ
ライマーをアイソトープラベルし，定量に用いた．
ミトコンドリアタンパク質合成の測定
培養細胞をメチオニン不含培地で30分培養し，エメナン（細胞質タンパク質合成阻害剤）を加え10分さらに培養する．ついで，メチオニン不含培
地にアイソトープラベルメチオニンとエメナンを加え，1時間培養し，アイソトープをとりこませた．ミトコンドリア画分を分離し，6M尿素を含む12．5％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にてタンパク質を分画した．定量はFuji−Film
BioimagingAnalyzerBAS2000によって行った．

−211−

結

果

CPEO由来欠失mtDNAをもつ細胞の分離欠失mtDNAとして用いたmtDNAは図1に示すように13塩基のdirect repeatがあるhot
SpOtで欠矢がおこったものである4）．この欠矢によって，ATP合成酵素サブユニット6と8遺伝
子をN端側にもち，ND5遺伝子の別枠をコードするタンパク質をC端側に持つ融合タンパク質の遺伝子が新たに形成される．また，この欠失領域には5つのtRNA遺伝子がコードされている．欠失mtDNAを持つCPEO患者由来線維芽細胞の細胞質とmtDNAを完全に失ったHeLa細胞の融合細胞（サイプリッド）を長期にわたって培養すると，図2に示すように欠失mtDNAの割合が次第に増加し，80％以上に達した．線維芽細胞では欠失mtDNAの割合は17％で長期にわたってほぼ安定であった．長期の培養によって欠失
mtDNAが増加したが，欠失mtDNAと正常
mtDNAの合計はほぼ不変であった．さらに，80％
欠失mtDNAを含む細胞を再びクローニングすると，73−92％の範囲に分布した細胞が得られた．
このようにして，さまざまな割合で欠失mtDNAを含む，細胞が得られた1）．

欠失mtDNAを含むmtDNAに於けるタンパク質
合成
様々な割合で欠失mtDNAを含む細胞においてミトコンドリアのタンパク質合成を測定した．
その結果を図3に，定量結果を図4に示す．これ
によって，以下の点が明らかとなった．
1．mtDNAの部分欠矢によって，ATP合成酵
素サ7●ユニット6と8遺伝子をN端側にもち，
ND5遺伝子を別枠をコードするタンパク質をC端側に持つ融合タンパク質が合成されている．
2．欠矢部に含まれている遺伝子，COXIIIやND4の合成量は相対的に低下している．
3．欠失mtDNAの割合が63％をこえると急激にタンパク質合成全体が低下する．
MELAS由来点変異3243Gをもつ細胞のミトコン
ドリアタンパク質合成
3243G点変異mtDNAが大部分を占める細胞
再クローニングすると再び96％変異mtDNAを含む細胞が得られた．しかし，変異mtDNAを100％持つ細胞と88％含む細胞も僅かながら得られた．
正常mtDNAを主に持つ細胞からは100％正常
mtDNAを持つ細胞のみがクローニングされた．
これらの細胞を用いてミトコンドリアタンパク質合成をおこなわせた．合成タンパク質を図5に示す．正常mtDNAのみを持つ細胞の合成した値を5196bpdeletion

FuSlonmRNA（1292nucleotideS）

FusionprotehS∬PaSe8／ND5（什meSH叫A（778mhoaci由）

856213758

8（1418minoacids）

14148（8．9kDa）（16．OkDa）

一相「PaSe6／ND5

図1あるCPEO患者由来線維芽細胞に含まれたmtDNAの欠失部位．欠矢によって融合タンパク質遺伝子が2つ形成される．また，この間には5つのtRNA遺伝子がコードされている．
−212−

︵誉u︒−1空︒旨2−苫至星だのーUOlUOO＜Z凸l∈↓■む＞葛一￠∝

図2

HeLa細胞核の支配下における欠失
mtDNAと正常mtDNAの割合の変化．
長期培養によって欠失mtDNAは17％から次第に増加した．▲は，クローン5をさらに再クローニングによって得られた細胞株の欠失mtDNAの割合である．
0は，グルコース欠損培地における変動
を示す．

1

2

3

4

5

EB He

図4

タンパク質合成相対量．図3の結果をグ
ラフにまとめた．63％を境に急激にタン
パク質合成が低下した．

mutan1961009688

0。ふ

濫帥群数還

′ク／夕／ ＼＼ ノJJ

Ddetion（1）0％（2）55％（3）引％（4）67％（5）78％

図3

図5

様々な割合の欠失mtDNA存在下でのタンパク質合成．アイソトープラベルされたタンパク質をオートラジオグラフィ
ーにした図．NDl，ATP6，COXI，Cytb
は，それぞれ，複合体Ⅰのサブユニット
1，ATP合成酵素サブユニット6，複合体ⅠⅤサブユニット1，CytOChromebをしめす．新たに融合タンパク質が合成されているのが観察できる．
−213−

MELAS3243G変異mtDNAによるタンパク質合成．変異mtDNAを様々な割合
で含む細胞におけるミトコンドリアタン
パク質合成．略号は図3と同一である．

100とした相対値を図6に示す．
変異mtDNAを100％もつ培養細胞では，正常
mtDNAlO0％をもつ細胞に比べ，タンパク質合成
自身は20分の1に低下していた．正常mtDNA96％，変異mtDNAが4％の細胞では，低分子タン
パク質の合成はほぼ正常におこなわれるものの，
高分子タンパク質は4分の1に低下した．また，88％変異mtDNAを含む細胞では，96％変異
mtDNAをもつ細胞と低分子タンパク質側では違いが見られなかったが高分子タンパク質側では，やや合成能は高かった．
考察
欠失mtDNAを含む細胞質とmtDNAを失ったHeLa細胞を融合し，サイブリッドを作製した．こうすることによって，核を置換し，核がミトコンドリアに及ぼす影響を調べることが可能となった．実際，欠失mtDNA線維芽細胞では欠失
mtDNAが17％で安定な状態であったのにたいし，
HeLa細胞の核のもとでは，80％まで欠失
mtDNAが次第に増加した．この現象は以下のように説明できる．欠失mtDNAは正常mtDNAにくらペ，複製速度が相対的に速くある程度まで増加する．しかし，細胞にとって欠失mtDNAは不利に働くのである程度まで増加すると生育できな
くなる．そこである一定の割合で定常状態となる．

核の遺伝子発現の状態によってその割合は規定される，と考えられる．
さらに，欠失mtDNAによって形成した融合遺伝子の産物である融合タンパク質の合成が検出できた．欠失mtDNA部分には5つのtRNA遺伝子を含んでいるので，融合タンパク質が合成されるには，欠失mtDNAと正常mtDNAが1つのオルガネラに共存していることが必要である．
欠失mtDNAによるタンパク質合成低下の型はほとんどall or none式であった．この間値は63％前後である．MELASの点変異mtDNAによる点変異では4％の正常mtDNAでも低分子タ
ンパク質の合成はほぼ正常に行われた．ところが，
高分子タンパク質の合成は著しく低下し，タンパ
ク質合成のアンバランスによって，タンパク質複合体が正常に形成されないことが示唆された．この点がCPEOとMELASの違いであると言える．
MERRFにおいて，Attardiらは，サイブリッドを作製し，タンパク質合成の低下を測定した5）．そして，高分子タンパク質側の合成が相対的に低下していることを兄いだしている．この点はMELASと似ているが，MERRFでは未同定タンパク質が新たに合成されていた．MELASでは，新たにタンパク質が合成されることはない．この点がMELASとMERRFとの違いである．
このように，CPEO，MELAS，MERRF間でのタンパク質合成低下の様式が各々異なることが明らかにされた．この違いが細胞，組織，個体でどのように反映されるかは今後の課題である．
献1）HayashiJrI，OhtaS，KikuchiA，Takemitsu

0ゝl−のu0−u−聖章票丘文

M，Goto Y，and NonakaI：Ⅰntroduction of

disease−relatedmitochondrialDNAdeletions
into HeLacellslackingmitochondrialDNA
resultsin

mutant％％％％ち海戦もち象

■
図6

0％

』88％

＋96％

mitochondrial dysfunction Proc

NatlAcadSciUSA88：10614−10618，1991．
2）Kobayashi Y，Momoi M Y，Tominaga K，団1001i

MomoiT，NiheiK，YanaglSaWaM，Kagawa

タンパク貿合成相対値．図5の結果をグ
ラフにまとめた．

Y and Ohta S：A point mutationinthe
mitochondrialtRNALeu（UUR）geneinMEALAS−214−

（mitochondrial myopathy，enCepholopathy，

590−599，1991．

1actic acidosis and strokeloke episodes）

4）SchonEA，RizzutoR，MoraesC，NakaseH，Biochem Biophys Res Commun173：816−

ZevianiM andDiMauro S：Adirectrepeat

822，1990．

is a hotspot for alarge−SCale deletion ofhuman mitochondrial DNA，Science3）Kobayashi Y，Momoi M Y，Tominaga K，Shimoizumi
KagawaH，Nihei K，Yanagisawa M，

Y，and

Ohta

S‥Respiration−defi−244：

246−349，1989．

5）Chomyn A，Meola G，Bresolin N，LaiS T，

cient colles are caused by a single point

Scarlato G，andAttardiG：Invitrogenetic

mutationinthe mitochondrial tRNALeu（UUR）

transferofproteinSymthesisandrespiration

geneinmitochondrial myopathy，enCe・

defectstomitochondrialDNA−lesscellswith

pholopathy，lactic acidosis and strokelike

myopathy−Patient mitochondria MoI Cell

episodes（MELAS）AmJ HumGenet49：

Biolll：2236−2244，1991．

−215−41）ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア遺伝子変異
小 澤 高 賂＊
＊

理郎枝
■
紳由
＊
＊

＊

山辺田

＊

杉池太

＊

＊

佳司三

夫欽啓

＊
＊

＊

は じめに

を再現する事によって証明する．

我々は，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の世代に対して水平な変異の蓄積，即ち個人がその生涯に獲得する体細胞変異は各世代にわたって伝えられた垂直な変異の蓄積よりも遥かに速い速度で起き，この両方向からの変異の蓄積が加齢変化および退行性疾患を起こす重要な因子であると提唱した1）．
この命題を検証するために本年度は次の三つの方法によって人体標品および実験動物について検索を行い結論的な成績を得た．
1．微量の標品中のmtDNAをPCRによって増幅し，個人別にmtDNA全周塩基配列を決定す
る．点変異の系統的な分岐を解析することにより垂直な変異の蓄積を検索し，個人に固有の点変異から水平な変異（体細胞変異）の蓄積を検索する．
2．PCR増幅したmtDNAでは失われる体細胞
変異の情報，特に活性酸素によって生成し，複製に際して誤読される事が確認されており，体細胞変異の原因となる8−hydroxy−deoxyguanosine（8−OH−dG）を，mtDNAの加水分解物を直接質量分析することによって定量する．
3．mtDNA変異の蓄積が加齢変化や退行性疾患の結果でなく原因であることを，外部要因により短期間に体細胞変異を起こした実験動物で症状＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊名古屋市立大学医学部小児科

川野居

＊

早大鳥

嗣樹博正

雅和利

中部林野

田服大佐

研究協力者

岳
果
1．図1に，典型的なmt脳筋症，パーキンソン氏病および乳児致死型心筋症患者のmtDNA全周塩基配列にみられた塩基置換を示した2）．これ
ら塩基置換の集積には顕著なクラスターが認めら
れ，変異が順次系線的に分岐したことを示しており患者達はいわば一つの遺伝子ファミリーを形成している．患者相互に共有している塩基置換の集積，■即ちクラスター1から5は遠い近いの差はあるが世代に垂直な遺伝された変異の蓄積と考えられ，一方，患者固有の変異の蓄積の内少なくともその一部は患者の体細胞変異と考えられる．
MELASの患者二名の固有の変異の内tRNALeu（UUR）遺伝子領域の塩基番号3243にA→
Gの変異があり患者に共通であったので，病態への関与が注目され速報した3）4）．相前後して
MELASの患者について同一の変異が報告された5）6）．しかし，この塩基置換のない患者も兄いだ
され，逆に全塩基配列決定の例数が蓄積するにつれて，全く神経症状を伴わない特発性心筋症患者7）のmtDNAにもこの塩基置換が見られた所から，この単一の塩基置換のみが病因ではなく，他の多くの点変異（図1），欠矢との複合が多彩な臨床症状として発現されるものと考えられる．mt
脳筋症はしばしば肥大型心筋症を併発するが，神経症状の見られない特発性心筋症患者のmtDNA−216−

系統的に分岐した点変異のクラスター（C−1からC−5）と患者固有の点変異を示した．塩基番号で示した塩基と置換した塩基が表示してある．＃はAnderson配列の誤り，／はtransition
mutation，−はtransversionmutation，Insは塩基挿入，Delは塩基欠失，＊はアミノ酸置換を伴う変異，！は動物種間で保有されているアミノ酸置換を伴う変異，＠はtRNA遺伝子上の変異，＾は先祖帰り変異，Pは患者，MERRFはMERRF症候群，PDはパーキンソン氏病，MELASはMELAS症候群，FICMは乳児致死性心筋症を示す．
（Ozawa Tetal：Biochem Biqpjv＄Res Commun176：938−946，1991）−217−

仝周塩基配列においても，その点変異の一部は図1のmt脳筋症の系統的に分岐した塩基置換のクラスターを共有している7）．即ち世代に垂直に遺伝された変異の蓄積があり，これに加えて患者固有の変異の蓄積があった．これら塩基置換には同（図2）．この欠夫は皮質よりも有意に多い．黒質・線条体にはドーパミンと鉄が多いため活性酸素が作られ易くmtDNAの欠矢の原因となる8−OH−
dG，点変異が蓄積し易いためと考えられる．実際に欠失したmtDNAの正常mtDNAに対する割義塩基置換と同様に，アミノ酸置換を引き起こす
非同義塩基置換も高い頻度で生じており，晴乳類
で保存されているアミノ酸残基の置換を引き起こすものも含まれていた．従って，これら塩基置換の一部は生理的な範囲と考えられるが，−音別まこの範囲を越えた点変異として病理的なものである
可能性が高い．これら患者のmtDNAは発病時に合を定量してみると，30歳台で事故死した人の黒質・線条休部で0．3％，患者では5％であった9）．
この変異mtDNA量は，mtミオパテ一息者骨格筋で時に50％以上に達するmtDNA変異量と比較すると低いとの指摘10）もあるが，神経細胞は高すでに多くの母系遺伝された点変異の蓄積と小欠矢が存在し，それに伴って老化組織に見られる大きな欠失8）（図2）を体細胞変異として獲得しており，組織局所で早発性加齢が進行していることを示している．
2．高齢者の多くは筋力低下，パーキンソン氏病（PD）様運動障害，震えを示し，心拍出塁が減少す
る老人心（presbycardia）となり，横隔膜筋力の低下に伴って肺活量が減少する．これらはmtDNAの体細胞変異の蓄積による細胞エネルギー産生能の低下であろうと考え以下の分析を行った．
我々はPD患者および高齢者の剖検脳の異質・線条休部においてmtDNAのATPase8遺伝子からND5遺伝子にわたる5kbpの欠矢を報告した8）ControIs

1

図2

2

3

4

5

Patients

6

7

8

91011

パーキンソン氏病患者および高齢者の異質線
条休部にみられるmtDNAの欠損患者（Patients）および正常対照人（Control）
は番号順に若年から高齢へと配列してある．
患者全例および高齢者で矢印で示した正常
mtDNAと＊でしめした5kbp欠失した
mtDNAが混在している．
（Ikebe S et al：Biochem Bipi）jp Res
Co机研Zf77170：1044−1048，1990）度に分化しており，細胞間の変異mtDNAの偏在を考えれば，閥値として充分に意味あるものである．我々が使用したプライマーを優って，この欠夫が加齢によって各種臓器に蓄積することが報告
され8）11）12），mtミオバナーに共通に兄いだされるので共通欠夫と呼ばれている．
心臓においては，共通欠矢の外に，ATPase6遺伝子とD−ループ上の12塩基の順方向繰り返し配列の間で7．4kbpの欠夫がみられ，その頻度が加齢と共に増大することを老人心との関係で報告した13）．欠失量を定量してみると，60歳以下では全mtDNAの0．1％程度であったものが，60歳台から急増し，80歳台で3％，90歳台で9％に達する14）（図3）．
剖検例の横隔膜からはミクロ高速液体クロマ
ト／質量分析に充分な量の筋肉が得られるので，
そのmtDNA中の8LOHrdGを定量してみると，65歳以上の高齢者では加齢によって8−OH−dG量が急増し，これに伴ってmtDNAの欠矢が顕著になる15）（図4）．酵母では点変異の蓄積が遺伝子の欠夫を引き起こす事が知られている．mtDNAが同一鎖内で欠矢を起こすためには，その部分が一本鎖の状態であることが必須である．mtDNA二本鎖中に8−OH−dGが所々に生成すると，その部分は相補鎖とミスマッチを起こし，結果的に二本鎖の一定範囲が解け持続的な一本鎖になった状態
での疑似組み換え，ないし再配列が欠矢を起こす機構として考えられる．従って，8−OH−dGの増加
が，体細胞変異の蓄積，遺伝子の欠矢を引き起こ
し，加齢に伴う筋力低下をもたらす重要因子の一つであると考えられる．

−218−

40542【3−2￥・1012

e・領∧24

如15か

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40

60

80

50

60

70

80

90

Age

100

Age（year）

図3

ヒト心筋の加齢に伴う欠失mtDNA量の増加
各年齢層にわたる47の剖検例について心筋の加齢に伴う欠失mtDNAの増加を確認した13）．そのうち，充分な試料の得られる10例について，kineticPCR法97によって7．4kbpの欠尖を有するmtDNAの正常mtDNAに対する比率を定量した．
60歳台から加齢に伴って欠失mtDNA量が急増する点はヒト横隔膜筋mtDNAと軌を図4一にしている．
（Sugiyama S et al：Biochem B座）／ひS Res
Co乃〃乃〟乃180：894，1991）

3．1990年azidothymidine（AZT）を投与された15症例ものエイズ患者が典型的なmtミオバナーを発症したことが報告された16）．そこで組織呼吸量がヒトの10倍高いマウスを選び，患者使用量

ヒト横隔投筋mtDNAの加齢に伴う8−OH−
dGの蓄積と欠失の増加
各年齢層にわたる34の剖検体について横隔膜筋mtDNAの加齢に伴う欠矢の増加を確認した．その中，充分量な試料の得られた6例について，ミクロ高速液体クロマト／質量分析17）を行い8−OH−dGを定量し（上段），同時にmtDNAの欠夫を検索した（下段）．Aは正常mtDNA断片，B，Cはそれぞれ欠失した
mtDNA断片である．右端は標準DNA断片．
40歳台では8−OH−dG及び欠尖は検出されないが，加齢に伴って8−OH−dGが急増し，多重欠失を生ずる．
（HayakawaMetal：BiochemBiqp毎SResの1／10のAZTを投与した所，自発的運動実験で運動量が50％低下し4週間で強制運動実験も不能となり，ついには死亡するに至った．骨格筋には
mt脳筋症の典型的な形態変化，ragged−redfibersの集積がみられた．mtDNAをミクロ高速
液体クロマト／質量分析計で分析すると絵dGの25％が8−OH−dGに変化していた17）．即ち実験動物の体細胞変異によってmtミオパチーの症状が再現された．この大量の8−OH−dG生成はAZTの構造，4週間の投与期間から考えて，mtDNAがAZT投与によって直接活性酸素障害を受けマウ大させることはよく知られており，活性酸素障害

スmtが急速に加齢した事が運動障害，死亡の直接原因であることを示している．

がPD患者脳に見られるmtDNA欠夫の直接的要因と考えられる．

Cのク用7〝乃179：1023−1029，1991）

実験的にPDを引き起こす1−methyト4r
phenylpyridiniumion（MPP＋）は，ロテノンが結合する複合体ⅠのNDlサブユニット18）に結合することが確かめられており，PD患者のND遺伝
子点変異の蓄積2）（図1）によく対応している．ロ
テノンは複合体Ⅰからの活性酸素産生を著しく増−219一

これらの事実を総合すると，AZT，MPP＋，毒物などの外部要因，世代に対して垂直および水平な変異の集積などの内部要因によりエネルギー産
生系の構築が障害され，活性酸素の産生を促し

清Coenzyme Q．。濃度の低下がcoronary risk
factorである所見20）と相関するものと考えられる．

mtDNA中の8−OH−dGが増大しmtDNAが数千
塩基対にわたって持続した一本鎖状態となること
により大小の欠矢が新たな体細胞変異として獲得され，点変異の蓄積と複合した変異mtDNA量がその細胞の閲値を越すと，機能の障害として顕在化し症状として発現するものと考えられる（下模
式図）．

文

献

1）Linnane AW，Marzuki S，Ozawa T and
Tanaka M：LanCetl：642−645，1989．
2）OzawaT，TanakaM，Ino H，OhnoK，Sano
T，WadaY，YonedaM，TannoY，Miyatake
T，TanakaT，ItoyamaS，IkebeS，KondoTand Mizuno Y：Biochem Biophys Res
Commun176：938L946，1991．
3）InoH，TanakaM，OhnoK，HattoriK，Ikebe

外部要因＼（点変異丁8…−dい￣梢→竿卜症状
内部要因／

S，SanoT，OzawaT，IchikiT，KobayashiM
andWada Y：Lancet337：234−235，1991．
4）Tanaka M，Ino H，Ohno K，Ohbayashi T，治療にむけて本年度までの成果によって，世代に垂直および水平な変異の蓄積とそれによってもたらされる体Ikebe S，Sano T，Ichiki T，Kobayashi M，細胞変異，欠矢の獲得とその機構が明らかになり，
動物実験によって変異による病態が再現できたの

5）GotoY，NonakaJandHoraiS：Nature348：

で，治療の試みを開始する条件は整ったと考えら
れる．
mt脳筋症の治療はいろいろ雉しい面のある遺伝子治療よりもmtの特徴を理解した治療法が現実的であろう．その一つはmtが酸化還元によってエネルギーを得ている所から，エネルギー産生6）Kobayashi Y，Momoi M，Tominaga K，糸の必須成分で経口補給が可能なCoenzyme Ql。
のように電子伝達複合体と類似の酸化還元電位を持つ物質を投与するredoxtherapy19）が考えられる．特発性心筋症では心筋虚血の指標である陰性
丁波が心電図にしばしば出現し，本症の成因として虚血説が唱えられていた．我々がmtDNAの全

Deguchi H，Kawamura K，Nakane Y and

周塩基配列から多くの変異を証明し心筋虚血と同じ状態にあると考えられ，実際に陰性で波が見られた久留米大学の症例では，Coenzyme Ql。の単剤投与によって，従来憎悪するのみで治療不可能であった陰性で波を陽性化することができた．
ヒトの体細胞変異の速さは心乳癌隔膜筋での欠失，8−OH−dGの蓄積速度として突刺された14）15）．これはLDL一コレステロールに対する血−220−

WadaYandOzawaT：BiochemBiophysRes
Commum174：861L868，1991．
651−652，1990．

MomoiT，NiheiK，YanagisawaM，Kagawa
Y and Ohta S：Biochem Biophys Res
Commun173：816L822，1990．
7）Ozawa T，Tanaka M，Sugiyama S，Ino H，Ohno K，Hattori K，Ohbayashi T，Ito T，
Hashiba K：Biochem Biophys ResCommun
177：518−525，1991．

8）IkebeS，TanakaM，OhnoK，SatoW，Hattori
K，Kondo T，Mizuno Y and Ozawa T：
Biochem Biophys ResCommun170：1044−
1048，1990．

9）Ozawa T，Tanaka M，Ikebe S，Ohno K，Kondo T and Mizuno Y：Biochem Biophys
Res Commun172：483−489，1990．
10）ZevianiM andDiDonato S：Neuromuscular
Disordersl：165L172，1991．

11）Linnane AW，Baumer A，Maxwell RJ，PrestonH，ZhangCandMarzukiS：Biochem

Commun179：1023−1029，1991．

Int22：1067−1076，1990．

12）Yen TC，SuJH，King KL and Wei YH：16）Dalakas MC，IllaI，Pezeshkpour GH，Biochem Biophys Res Commun178：124r

LaukaitisJP，Cohen．BandGriffinJL：NEngl

131，1991．

J Med322：1098−1105，1990．

13）HattoriK，OgawaT，KondoT，MochizukiM，

17）Hayakawa M，Ogawa T，Sugiyama S，TanakaM，SugiyamaS，ItoT，SatakeTand
Ozawa T：Amer HeartJ122：866−869，

Tanaka M andOzawaT：Biochem Biophys
Res Commun176：87−93，1991．
18）EarlyFGP，PatelSD，RaganCIandAttardi

1991．

14）Sugiyama S，HattoriK，Hayakawa M andOzawa T：Biochem Biophys Res Commun

G：FEBS Lett219：108−113，1987．
19）Ozawa T，Tanaka M，Suzuki H and
Nishikimi M：Brain Dev

180：894−899，1991．

15）HayakawaM，ToriiK，SugiyamaS，Tanaka
M and Ozawa T：Biochem Biophys Res−221−

9：76−81，1987．

20）HanakiY，SugiyamaS，OzawaTandOhno
M：N EnglJ Med325：814−815，1991．

42）ミトコンドリア脳筋症における変異ミトコンドリア

DNA（mtDNA）の解析−In situ hybridization（ISH）を用いての検討−
荒 木 淑 郎＊
研究協力者

箕

田

修

治＊

徳

永

誠＊

石 井 弘 子＊＊ 埜 中 征 哉＊＊

近年ミトコンドリア脳筋症として，mtDNAの対象及び方法異常が相次いで報告され，CPEOではmtDNAのが明らかになった．しかしながら，これらの対象は，mtDNAの欠矢が4977bpで断端に13bpのdirect repeat（common deletion）を有する
CPEO患者，上記mtDNA変異をもつMERRF
及びMELAS患者の生検筋各1症例である．用いたprobeはCPEO患者の欠矢部に含まれる
CPEO患者では正常mtDNAのみを検出する
prob61と非欠失部で正常と変異mtDNAの両

mtDNA変異とミトコンドリア脳筋症の主要な筋方（totalmtDNA）を検出するprobe2である．

大きな欠失（欠失部位に少なくとも一つのtRNAを含む）1）2），MERRFではtRNALys（8344）3），
MELASではtRNALeu（3243）4）のpoint muta−tionが兄い出された．そして，これらは正常と変異mtDNAが混在するheteroplasmyであること

病理学的特徴であるragged red fibers（RRF）
及びcytochrome c oxidase（CCO）欠損線経との関係，さらにはmtDNA変異と神経症候との関連については，未だ不明な点も多い．本研究の目
的はこの点を明らかにし，ミトコンドリア脳筋症の病態解明を目指すものである．先に，我々は，CPEO患者筋において欠失mtDNAとRRFとの関係を明らかにした5）．今回の研究ではMERRF
及びMELASにおいてpoint mutationを有する
変異mtDNAとRRFとの関連をISH法を用いて光顕レベルで検討するとともに，個々のミトコ
ンドリアと変異mtDNAとの関係を明らかにするために，電子顕微鏡レベルでのISH（電顕ISH）法の応用を検討した．
lRNA

Lys

（83朋J
十熊本大学医学部第一内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

図1

−222−

ミトコンドリア脳筋症患者のmtDNA変異部とmtDNAprobe図2

35SpdCTP標識mtDNAprobeを用いたISHとSDH染色CPEO（a，b），MERRF（C，d），MELAS（e，f）患者筋肉におけるprobelによるISH（a，C，e）と，連続切片のSDH染色（b，d，f）．

このprobel，prObe2はMERRF及びMELAS
においては，そのいずれを用いても正常及び変異
mtDNAの両方，すなわちtotal mtDNAを検出する（図1）．ISH法としては以下の方法を用いた．
（1）上記3患者筋において35S−dCTP標識mtDNA
probeを用いてISHを行い，乳剤を用いてmtDNAをsilver grainとして検出した．同時

zidine（DAB），H202により発色させた．C）Gold
法：抗DIG抗体と用いGold付加二次抗体を用いて検出し，光顕での観察のためsilver en−
hancementを行った．
（3）（2）の方法のうちb）C）の光顕レベルでISHがう
まくいったことが確認された筋切片をエボン包埋し電顕にて観察した（pre−embedding法）．
（4）CPEO患者筋組織を樹脂包埋して作成した超に．連続切片をCCO染色，SuCCinate dehyTdrogenase（SDH）染色を行い比較検討した．
（2）CPEO患者筋において，非RI標識である
Digoxigenin（DIG）−dUTPで標識した
mtDNAprobeを用いてISHを行い，以下の検薄切片をDIG標識mtDNA probeを用いてISHを行った後，GoldでmtDNAを検出し，電顕にて観察した（post−embedding法）．

出法を検討した．a）Alkalinephosphatase（AP）
法：AP付加抗DIG抗体を用いて，nitroblue

結果（1）CPEO患者筋では，先に報告したようにCCO
活性のないRRFにおいてtotal mtDNAが著

tetrazoliumsalt（NBT），Ⅹ−phosphateを基質として発色させた．b）Peroxidase（POD）法：
POD付加抗DIG抗体を用いて，diaminoben−

明に増加しており，正常のmtDNAはCCO活
性陽性線経に多く認めたことから，RRFにおけるmtDNAの増加は主に変異mtDNA由来で

−223−

図3

非RI標識（DIG−dUTP）mtDNAprobeを用いたISHprobelを用いてCPEO患者筋連
続切片のISHを行いAP法，POD法，Gold法にて検出した．・はRRFを示す．

考あることが推察された（図2a，b）．MERRF及びMELAS患者筋においても，CPEO患者筋と同様にRRFに対応してtotal mtDNA量は増加していた（図2C，d及びe，f）．MELASでは，SSV（stronglySDHrreactivebloodves−sels）を示す血管6）でtotalmtDNAの著明な増加が見られた．（2）非RI標識mtDNA probeを用いた光顕レベルにおけるISH法では，AP法，POD法，Gold法いずれの検出法においても，その検出感度に多少の差異はあるものの
mtDNAの検出が可能であった（図3）．

察MERRF，MELASにおいてRRFではtotal
mtDNAの著明な増加が認められた．そして，
Southemblot法及びPCR法による変異mtDNAの解析の結果，MERRF及びMELAS患者筋ともに約90％程度の比率で変異mtDNAの混在を認め，これらのRRFにおいて増加したmtDNAは，
主に変異mtDNA由来であることが示唆された．
total mtDNAの増加したRRFは，CPEO及びMERRFではCCO活性が消失していたが，MELASにおいてはCCO活性は陽性であり，そ（3）しかし，これらの組織切片の電顕観察（pre−em−
bedding法）では，光顕レベルで見られた
mtDNAのシグナルは形態の保持が悪くシグナ
ルとmtDNAの対応ができなかった．

の染色パターンはtotal mtDNAが増加していな（4）Goldを用いたpost−embedding法では，シグナルの多くはミトコンドリア存在部位に対応しているように思われたが，場所によってはミトコンドリアと対応しない部位にもシグナルを認めた．

MERRF患者ではこのような所見を認めなかっ

いCCO活性陽性線経のそれと異なっていた．また，MELASではSSVに一致してtotalmtDNAの著明な増加を認めたが，今回検討したCPEO，
た．このような相違が何故生じるのか病態生理を考える上で興味深いことであり，今後検討したい．
電顕ISHのpreAembedding法において光顕レベ
ルではmtDNAのシグナルが明らかに認められ−224−

た筋切片が，電顕観察ではミトコンドリアとシグナルとの対応が出来なかった．固定法等形態の保持のためいろいろ検討したが，形態を保つとmtDNAのシグナルが消失するという結果が得られ，今後，この形態保持とシグナルの強さとの相3）SchoffnerJM，etal：Myoclonicepilepsyand

反する関係をどのように解決するか問題として残った．postLembedding法では得られたシグナル
がmtDNAに特異的なものであるか否か今後の検討が必要と思われる．

gene associatedwith the MELAS subgroupragged−red fiber disease（MERRF）is as−
socisated with a mitochondrial DNA
tRNALys mutation．Cel161：931−937，1990．
4）GotoYetal：AmutationinthetRNALeu（UUR）
Of

mitochondrial encephalomyopathies．

Nature348：651−653，1990．
5）MitaS，etal：Detectionofdeletedmitochon−
drial genomes

文

献

in

cytochrome c oxidase

deficient muscle fibers of a patient1）Moraes CT，et al：Mitochondrial DNA
deletionsinprogressiveextemalophthalmo−
plegia and Kearns−Sayre symdrome．New
EnglJ Med320：1293r1299，1989．

with

Kearns−Sayresyndrome．ProcNatlAcadSci
USA86：9505−9513，1989．
6）Hasegawa H，et al：Strongly succinate
dehydrogenase−reaCtive blood vesselsin2）Mita S et al：Recombinationvia flanking

muscles from patients withmitochondrial

directrepeatisamajdrcauseoflarge，SCale

myopathy，enCephalopathy，lactic acidosis

delections of human mitochondrial DNA．

andstroke−1ikeepisodes．AnnNeuro129：601

NucI Acids Res18：561−567，1990．

−605，1991．

−225−

Ⅶ．ミトコンドリア脳筋症（No．2）

43）ミトコンドリア脳筋症におけるmtDNA・Dループ領域の塩基配列に基づいた系統解析
宝

研究協力者

釆

後 藤 雄 一＊＊ 埜 中 征 哉＊＊

ミトコンドリア脳筋症は，Kearn−Sayre症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症候群（CPEO），ミ
オクローヌスを特徴とするMyoclonus epilepsy
withragged−redfibers（MERRF），卒中様症状を特徴とするmitochondrial myopathy，enCe−
phalopathy，lactic acidosis and stroke−like

episodes（MELAS）の3型に大きく分類できる．
1988年に，まずCPEOにおいて，ミトコンドリア
DNA（mtDNA）に欠矢があることが発見され，その後1990年には，相次いで，MERRF，MELASにmtDNAのtRNA遺伝子上の点突然変異が証明された1ト3）．散発例の多いCPEOを除けば，
MERRF，MELASでは，変異遺伝子の母性遺伝も明らかにされている．本研究では，これら疾患の遺伝的背景を明らかにするため，多数の脳筋症患者に■おいて，mtDNA・Dループ領域の塩基配列を決定し，個々の配列間の塩基置換数に基づいた系
統解析を行った．
材料および方法
mtDNA・Dループ領域に関しては，宝来らにより，日本人62人を含む，正常現代人128人の塩基配列データが得られている4）．さらに制限酵素切断型多型でミトコンドリア全ゲノムを解析した場合の塩基多様性の度合が，0．4％であるのに対し，この領域ではその約4倍の値を示し，ヒトの集団内変異および系統解析には極めて有効な領域である4）5）．図1には，Dループ領域における正常人＊国立遺伝学研究所■●国立精神・神経センター神経研究所

聴＊（128人）で観察された多型部位および本研究で用いた2種類のPCRプライマーを示した．正常人
集団全体では125ヶ所で多型が観察されたが，多型部位はこの配列中の5，側に多く集積していることが明らかである．また，それぞれのプライマーを作成した20塩基内には多型は全く観察されない．
プライマー11はL鎖プライマーで，プライマー14
はH鎖プライマーである．これら2種類のプライ
マーで増幅される断片の長さは413塩基対で，この領域には全領域中に観察される変異のうちの90％以上が含まれている．ミトコンドリア脳筋症の患者で塩基配列の決定は，非対称PCR産物のダイ
レクトシークエンス法により行った．配列を決定したのは，CPEO（欠矢のあるもの21例および，欠夫のないもの2例）23例，MERRF（塩基番号8344のtRNAリジン遺伝子に変異をもつ）3例および，MELAS（塩基番号3243のtRNAロイシン（UUR）遺伝子に変異をもつ）9例である．
結果と考察
図2には，ミトコンドリア脳筋症計35例の配列中に観察された多型部位を示した．Andersonら（1981）の標準配列と比較すると全体で41ヶ所で多型が観察された．表1にはHPrai＆Hayasaka（1990）によって分析された3大人種よりなる100名の正常人対照と，35名のミトコンドリア脳筋症患者の比較分析による，Dループ領域における塩基置換のパターンを示した．この結果，観察された全塩基置換に占めるトランジッション型置換の割合は，正常人対照では97％であり，患者群では−229−

bp15988lrl．一・．JPrl■rrll

ACCCAA▲mAm

lm▲GC▲GATml

餌；TACC＾ccC AAGTATrG＾C TuCCm ACAACCGCrA TGTATrrCGT ACATTACrGC
C
c
cc
c

C
−

−

C
一
一
−

C

−
■
︼

C

■

C

T
T

2
2
1

Totat

■

C

C■

G

1

G→C

■

一一

T
T
A
T

T

6

A→T

■

一一

C

C

−

C

−

ミトコンドリア脳筋症患者におけるDループ
領域の多型
ANDERはAndersonら（1981）の標準配列における塩基Population Sample
Size

Human

128

Japanese

62

Myo．patients

35

2
9

9
0
1

7
9

6
4
4

C→G
A→C

■

C

T
C

Transversion：
C→A

■

A

一一

C一一

G一｝A

Total

■

c

N王＝35

4844892291373446

A一｝G

■

C

C一一

表2 Nucleotidediversity
Transition：
T→c
c→T

ー

T

C C

n▲

A

Nomal Myopathy
N＝100

ー

−

Å∵A

T−

T

A

C

c

G

TypoofSubstitution

T

C

No．ObseⅣed

A

c一一

T

MELAS3
HEl．AS4HELAS5HELAS6HELAS7
HEl．AS8HELAS9日ERRFIHERRF2HERRF3

図2

表l Analysis ofnucleotidesubstitutions

一一
c

T

HE工一AS2

C

上段の配列はAndersdnら（1981）による配列
で，少なくとも1個体で多型の観察された塩基を下段に示したプライマー11およびプライマー14は本研究で用いた2種類のプライマー

T

ミトコンドリアDNA・Dループ領域の多型部
位

C一一

T

CTC

C
C

T T
C
C

図1

mCGGG▲G
Al

TT

T

m▲Am

C一一

T

CTAAATAGCC C▲mCGrIt：C CCTT▲AATAA GACATC▲CG＾TGGATCACAG GmTCACC
T
G
A

G

T

G

m人血IGC
G c c

T

C

m

T二T﹇一T

T

CAm

T

m

T︻▲

C

CrA山ImA
▲

T

I

mG

T

m仙¶MmCCC GCAC▲AG▲GT mAm mCGGG mmM

C C

TGGAm疋cc CmGAm GGmm G▲∝払∝hTC
T＾C
C
A
T
C
I
T
」

−Prl■er14r

T

C

C

Tr m C CC G C TAT CC T G T

T

T＾CetXCm T▲▲CAmACA T＾GT＾C＾TAA AGCCATITAC CGTAC＾TAGC AC＾TT＾CACr

G T
Gcc▲AG■AACC
G A T G G TT

A

mmC凡C▲lWm CrCCA▲▲GCC▲一cmCC CACrAWA
GCAGT Gl℃
C G G▲C TT CT T G
A

CPEOI
CPEO2
CPE03
CPEO4
CPEO5
CPEO6
CPEO7
CPEO8
CPEO9
CPEOlO
CPEOllCPEO12
CPEO13CPEO14CPEO15CPEO16CPEO17CPEO18CPEO19CPEO20
CPEO21
CPEO22CPEO23HELASI︻▲GTACAGC▲AT CA▲mT C GAT C m GGT

CMmCA m仙一一一一cccc＋CTCCCm mG郁CAAT C T T
一一m AC TT▲GANDER GAGCCATCCCTAATTCAGCCCCCGATCCCCTTAAGTTTTGTT TCCmGCC▲cc▲T GAATNrTCr＾cm▲ATACrrtLLC C▲mGT▲CATAAJuAC
T▲
A T C A T C C▲
T T A G GGG T

CuA11XX汀T m
T
TC●●■一●一〜1■●ト●○ト●−′■トーのト〇一一一一一〇一▼一▼一一一■■■l r■lヽ一■〜【▼一椚一トトト●●000−→【■H■▼・●■《一一一一●■■●■〇〇一一一■′一lヽ1〜小一−【■→￣ →■■1一一一一■一一■一■■〜′■■■■▼ru…′■■■■■■■■●hl ■■11■■〜●1■ヽ【＝【lr■■l．′l■ヽ【【■t■1■一一●●●●一一●●■■一一●●●■一一●●■●●●■一●一一一一●■■＿一●こ「mA人山：TATl℃m％Nucleotide
diversity予㍉∴二∵工∵＋∴十∴．いし

0．02

0．01
il丘的臣霞図3

ミトコンドリア脳筋症患者のDループ領域の塩基配列に基づくUPGMA法による遺伝子系
統樹

92％とやや低値を示すものの有意の差異はなかった．さらにトランジッション型置換の中では，ピリミジン塩基（TおよびC）間の置換は，患者群では84％，正常人群では82％と両者の間に差はな
かった．表2には，正常人集団および患者集団におけるこの領域での塩基多様性の度合（Nu−Cleotidediversity）を示した．この値は，集団中からランダムに抽出した2人の塩基配列間の塩基
置換数の平均である．3大人種からなる128名の正常人集団の値（Horai，etal．1991）は，2．26％であった4）．このうち62名のうち日本人集団での値
は2．03％となり，患者集団で観察された値1．98％とはほとんど差はなかった．このことは，今回検討したミトコンドリア脳筋症の日本人患者における塩基多様性は，正常人のそれと同じレベルであることを示している．

0．01
遺伝的距縦

図4 正常日本人（62名）およびミトコンドリア脳筋症患者（35名）のDループ領域の塩基配列に基づくUPGMA法による遺伝子系統樹

Ozawaら（1991）は，ミトコンドリア脳筋症を含む神経筋変性疾患患者10名におけるミトコンド
リアDNA仝塩基配列を報告している6）．それぞれ
ミトコンドリア仝ゲノムおよびDループ領域のデータを基にして，各配列間の塩基置換数を算出
し，遺伝子系統樹を作成したところ，2種類の系
統樹の樹型および各系統のしめる位置はほぼ一致した．このことは，変異性のきわめて高いDルー
プ領域の塩基配列の情報は，おおむねミトコンド
リア全ゲノムの情報を反映していると考えられる．

ー231−

本研究でDループ領域の塩基配列を決定した，35
名のミトコンドリア脳筋症患者の配列間で塩基置

disease（MERRF）is associated

換数を算出し，それを基にUPGMA（unweighted

mitochondrial DNA tRNALysmutation．Cel1

pair一grOupmethodwitharithmeticmean）法

61：931−937，1990．

Myoclonie epilepsy and ragged−red fiber
withaで作成した遺伝子系統樹を図3に示した．この系
統樹からは3大病型，すなわちCPEO，MELAS，
MERRFに特異的なクラスターは存在せず，各疾患は様々な母系系統において発症していることを示している．さらに正常日本人62名およびミトコ

3）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation

ンドリア脳筋症患者35名の計97名の塩基配列を基に遺伝子系統樹を作成した（図4）．その結果，散発性の多いCPEOだけでなく，MERRFおよびMELASの患者は，複数でかつ相互に異なる母系系統に由来することが示唆された．このことより，
MERRFおよびMELAS患者群に特異的に見ら

4）Horai S，Kondo R，Murayama K，et al：

れる点突然変異は，日本人集団の中でも，ごく最近に独立に生じた遺伝的変異であると考えられる．

nucleotidesequencedifferencesinthemajor

文献1）HoltIJ，Harding AE and Morgan−Hughes6）Ozawa T，Tanaka M，Sugiyama S，et al：

JA：DeletionsofmusclemitochondrialDNA

belongtothesamemitochondrialgenefamily

inpatientswithmitochoondrialmyopathies．

Of Parkinson，s disease and mitochondrial

Nature331：717−719，1988．

encephalomyopathy．Biochem Biophys Res

in the transfer RNALys（UUR）gene associatedWiththeMELASsubgroupofmitochondrial
encephalomyopathies．Nature348：651L653，
1990．

Phylogenetic affiliation of ancient and
COntempOrary humansinferred from mit0−
Chondrial DNA．Phil Trans R Soc Lond B
333：409−417，1991．

5）Horai S and Hayasaka K：Intraspecificnoncoding reglOn Of human mitochondrial

DNA．AmJ HumGenet46：828−842，1990．

2）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，etal：−232−

Patient

withidiopathic cardi0−myOpathy

Commum177：518−525，1991．

44）ミトコンドリアDNA異常とその臨床的多様性に問する研究
岡 田 仲太郎＊

研究協力者

乾幸 治＊ 福 島 久 雄＊
谷 池 雅 子＊ 田 中 順 子＊

は・じめにミトコンドリア脳筋症を呈する10家系（典型的MELAS2家系，非典型的MELAS4家系，脳筋症3
家系，KSSl家系）において現在知られているミト
コンドリアDNA（mtDNA）異常と，臨床症状との関連を検討した．
症

例

いずれの家系も発端者は高乳酸血症，筋生検にてRRF（ragged−red fibers）を示した．10家系の臨床所見，筋生検所見を表に示す．発端者は，
家系3，6は典型的MELAS病像を呈し，家系
1，2，4，5，はそれぞれ心症状を里する，外眼筋麻痺を呈する，卒中様症状を欠く，周期性嘔
吐を欠き心症状を呈する点において非典型的とした．家系7，8はMELAS，MERRF，KSSのいずれにも分類不能でミトコンドリア脳筋症とした．
家系9はKSSの病像を呈したが，家系10は網膜色素変性を里したが外眼筋麻痺，心症状を欠きミ
トコンドリア脳筋症とした．家系2の姉，家系10の発端者はインスリン依存型糖尿病を合併していた．家系1，7の発端者は蛋白尿を示し，腎生検で巣状糸球体硬化症と診断されていた．家系2の姉，母は筋弱力を含む神経症状を呈し，家系3の母，母方叔母は同様に筋症状，神経症状を呈したがMELASに認められる症状と大きく異なっていた．
いずれの症例も呼吸鎖酵素（ComplexI，II，

塚

本

浩

子＊

III，ⅠⅤ）は正常であったがCytochromeCOxidase
染色にて部分欠損を家系7，8，9，10の発端者
に認めた．
実験方法
末梢全血，筋生検材料より骨法によりDNAを抽出した．
PCR法によるtRNALeu（UUR）の変異の検出
tRNALeu（UUR）を含むmtDNA＃3130〜4262の領域を1サイクル（940C30秒，550C30秒，720C2分）
を30回行い，その後PCR産物を抽出後，制限酵素
ApaIで消化し，1．5％のアガロースゲルにて電気泳導し解析した．
PCR法によるtRNALysの変異の検出
tRNALysを含むmtDNA8278〜8375の領域をZevianiら1）が報告した2ヶ所のmissmatchを含
むantisenceプライマーを用い上記の方法にて増幅し，制限酵素BglIにて消化後，3％のアガロ
ースゲルにて電気泳導し解析した．
サザンプロット法による解析
mtDNA＃3243変異の量的解析は，抽出DNAを
ApaIにて消化後，PCR法にて増幅した産物（＃
3305〜4262）をプローブとして用い骨法にてサザンプロットを行い，スポットを切りとり液体シン
チレーションカウンターにて測定した．mtDNAの欠夫の検索は，抽出DNAをPvuIIにて消化後，胎盤よりの抽出mtDNAをプローブとして同様に行った．
mtDNAの塩基配列の決定■大阪大学医学部小児科

家系10の発端者においてはPCR法，ABI社の−233−

シークエンサーを用い直接法にてmtDNAの塩基配列の決定を行った．

FamHy

3

結果と考察
PCR study
仝血，筋よりのDNAを用い，＃3130−4262の領域は1．1kbpとして増幅され，＃3243に変異（A→G）があると新たなApaI切断部位が形成され2），
1．Okbpのバンドが生じる．家系1−6の発端者，
家系1−4，6の母，家系3の母方の親族，家系
2，5，6の姉，妹に1．Okbpのバンドが認められた（図上 これらの結果は検索できた筋生検材料にても確認された．一方，MERRFの変異はいずれの家系においても兄いだされなかった．正常人においてはMELAS，MERRFの変異は兄いだされなかった．
サザンプロット解析

では典型的MELASの発端者では，28％，70％であったが，非典型例では50−58％であった．一方，何らかの症状を呈した親族では9−51％であり，正常の母では0〜17％であった．父，臨床的に正常な弟では0％であった．mtDNAの欠夫は家系の発端者9，10で認められたが，母においては認められなかった．欠失DNA量は筋では両者とも80％であったが（表），家系9の発端者では血液では認められなかったが，家系10の発端者では60％認められた．家系9の発端者での欠失範囲はおおよそmtDNA＃5900−12000，約5．6kbpであった．
また家系10の発端者での欠失範囲は，
mtDNA8469−13460，4977bpの欠矢でその両端はいままで報告されているacctccctcaccaの13
bpの繰り返し配列を含んでいた3）．
本研究にてmtDNA3234のA→G変異は家系1−6の発端者，家系5の母を除く母，およびその母方の親族，姉，妹においてheteroplasmyの状態で存在することがあきらかとなった．家系5では変異は母では兄いだされなかったが，無症状のFami暮y4

早憲号日詰即薗51口蓋3 感5如Fami萱Y「「F即†1巾 7

5

ノ′、ヽ

」．i30

rH「
LJ

＼ノ82

′￣＼
Lノ

さ一一一一一一一一一一一一∵ 「二〇亀†PCRの結果を確認し，mtDNA変異を量的に評価するためサザンプロットを行った．測定した異常ミトコンドリア量を表に示す．筋における異常
mtDNAは60％以上であった．しかし仝血の検索

FamHy2

己 ヨ曹
F訂涌y

6

．・￣■＼

828

H
図

〕

ヨ己

835

FamiIy

8

コ

〇

二

二

■

己 巳ほ

ミトコンドリア脳筋症家系図とmtDNA3243変
異のPCR検索黒く塗りつぶしてあるのが発端者，斜線は何らかの症状をもつ家族．1．1kbpのPCR増幅産物
は正常ではApal消化後変化無いが．3243に変異（A→G）があると新たな1．Okbpのバンドを生じる．家系シンボル右側の数字はサザンプロ
ットでの変異mtDNA量（M：筋，B：全血）．

姉に変異が認められたことより，germlineのmosaicismが考えられる．以上の結果は，mtDNA3243変異が母系遺伝することを示し，この変異がMELASの主な変異ではあるが，成人でこの変異を持ち症状を示す場合には筋弱九 精神症状などMELASと異なった症状を呈し臨床症状は多彩であることが判明した．この症状の多彩

−234−

表

Summary ofclinicalandlaboratoryfeaturesinlO families
F−4

F−2
P

CytochromeC

RRF；Raged

OxidaseRed

Fibers■SSV：

Stron91y

Staining■？：Uncertain′
features

of

37

MELAS

6

19

17

：：：＋：：：十十＋：和●00■8︒6︒

nA：Haternal Aunt
CCO…

determined・＊：Characteristic

p

D＋
O＋
O十−−＋︼＋＋■●−十十■＋●F−00■8
＋

nOt

P

11 11
19
16
（dead）

D■●一＋●−＋十一一■■◆◆■＋＋F●00●00
−

ND…

7

D−＋−■一＋＋＋＋＋7−十十−＋一F■00■00■

Vesseles′p11−■−■●一十十十＋十十＋■＋十十？つ・＋D8●00

十N＋30−00
7 5

Positive7
16⁚＋＝⁚＋十二＋十十＋＋＋？つ．．m56■00

十P；prOband．h；Hother

Deficiency′

一●＋●一■＋−＋十十十●十十−＋▼N＋48■00

十FD：Focal2
1＋

F：Famlly．

DehydrogenaSe

8；二＝●十二＋⁚−十二＋？？十m18●00＋

tRNA（Lys）mtationin bloodt Of deletionin muscle
in blood

18

8
TJ

＋

CCO
leu（UUR）mutatlon篭
Of mutationin muscle

43＋

Low density on Cで
RRF
SSV

28

⁚■＝＝−＋＋二．一＋＋？．？＝？＋m9■00−0●7■●−■十十十●＋十十＋＋＋＋●¶＋80■00′＋

hemianopsia

Hearin9loss
Lactic acidosis■．J十vomitin9★Hemiparesis′■ヽ−十statlユre

F−6

p

2

52

●ュ
−●−−−＋−十十●一■一十●●−N＋20−00
8ー■−■●−＋●＋＋−−■＋＋●−＋N＋81●00＋＝⁚■＋＋＋＋＋＋＋■十十十●N
3＋
一7
〇5
〇5

十

Short

tCortlcal blindne55

一

十一●一＋

Dementia

■ノー

■ノー

−●

Opbthalmople91a
Retinal de9eneration
Cardiomyopathy
CSF proteinlOOm9／dl
Myoclonus
AtaxiaHuscle weakness
Seizure2

Family history
Features

6

F−5

M
一b

6

Å9e at OnSet（Y）
Present a9e★Episodic

S

N；Normal

性は異常mtDNAと正常mtDNAがheteroplas−

KSSにおいてはmtDNAの欠矢が，MELAS

myの状態で存在すること，臓器によるミトコン
ドリアによるエネルギー依存度の違いによると考えられる．
筋での異常mtDNA量は68％〜84％でありにおいてはtRNALeu（UUR）3243に，MERRFにおい（表），この量は筋弱力来すに充分な量であると考えられ，Gotoらの報告2）とも一致する．一方血液での異常mtDNA量は様々であり，必ずしも臨床症状との相関を認めなかった．罷息臓器での異常
mtDNAの定量が今後重要と考えられる．
mtDNA欠夫に関して，家系9，10の発端者ではKSSによく認められる領域の欠夫を認めたが，家系1−8では欠矢を認め無かった．家系9の発端てはtRNA（Lys）8344に点突然変異が認められ，症
候群と遺伝子異常はよく一致すると報告されてきた2ト5）．しかしPCR解析やサザンプロットにより簡便にmtDNA解析がされるようになると逆に表現型の多様性が認識されるようになってきた．
今後mtDNAの異常がいかにして発病にいたるかという点に関し研究を進めていきたい．

者はKSSと考えられるが，家系10では外眼筋麻痺，心伝導障害を欠き，糖尿病，軽度の膵外分泌
異常を伴なっていた．また異常mtDNA量は筋では両症例とも80％と差異を認めなかったが，血液では家系9では0％，家系10では60％であった．
一方母では欠矢を認めなかった．最近mtDNAの欠夫が明らかにされたPearson Marrow Syn−dromeでは汎血球減少を伴うが，その後にKSSの症状を呈した症例も報告されており4），家系10はこれに近似した症例ではないかと考えている．
−235−

文

献

1）ZevianiM，et al：Rapid detection ofthe A
一→G（8344）mutation

of

mtDNAinItalianfami1ieswithmyoclonusepilepsyandragged−redfibers（MERRF）．AmJHumGenet48：
203，1991．

2）GotoY，etal：AmutationinthetRNALeu（UUR）
gene associated withthe MELAS subgroupof mitochondrial ecephalomyopathies．
Nature348：651，1990．
3）Schon E A，et al：A direct repeatis a hot
spot forlarge−SCale deletion of humanmitochondrialDNA．Science244：346，1989．

4）McshaneMA，etal：Pearsonsymdromeand5）ShoffnerJM，etal：Myoclonicepilepsyand

mitochondrial encephalomyopathyin aragged red fiber disease（MERRF）is

patientwithadeletionofmtDNA．AmJHum

associated with a mitochondrial DNA

Genet48：39，1991．

tRNALys mutation．Cel161：931，1990．

−236−45）ミトコンドリア脳筋症の病型と遺伝子異常
佐

研究協力者

平 訳
北

浩

子＊ 山
潔＊＊り11は じめにミトコンドリア脳筋症ではすでに慢性進行性外眼筋麻痔症候群（CPEO）におけるmtDNAの大欠失，MELASやMERRFにおけるtRNALeuやtRNALysの変異が報告されている．我々はこれらのミトコンドリア脳筋症の症例に加え，非定型例
も含め詳細なmtDNAの解析を施行中であるが，現在までに得られた成績の概要を報告する．
対象と方法
対象症例は典型的なミトコンドリア脳筋症29例（CPEO19例，MELAS7例，MERRF疑3例），
生検筋の組織化学やMit．酵素活性測定などでMit．異常が見出されたHMSNなど4例，急性筋壊死症9例，その他の疾患39例，計82例である．
Southernblotting：mtDNAを宝来聴博士から供与を受けた．これをPvuⅠⅠでIinearize後，α一32
PTdCTPまたはα−32P−dATPをmultiprimelabeling法で標識したものを用いた．さらにtotal
mtDNAを適当な制限分解酵素で切断した16種の断片をpUC19ベクターにてサブクローンしたものを用いた．凍結骨格筋から抽出したDNAを制限分解酵素で切断，電泳後，geneSCreenplus睦に転写し，ハイプリタイゼーションを行った．
さらにpolymeraSeChain reaction（PCR）法により，欠失DNAの両端をはさむように合成し＊暇天堂大学医学部脳神経内科＊＊順天堂大学医学部共同病理＊＊＊東京大学医科学研究所寄生虫学＊＊＊●山口大学医学部神経内科＊＊■＊＊京都市立病院神経内科

猛＊

藤

本

剛

司書

中

村

眞

二…

井 元 春＊…立 岡 良 久綿＊＊＊たorigoprimerを用いて，mtDNAの一部を，1，000〜2，000kb増幅し，適当な制限分解酵素で切断した後，Southernblothybridizaitionを施行し，欠失部位をより正確に同定した．
tRNAの変異は合成primerを用い，PCRで変異部を中心に増幅したmtDNAを用い，適当な制限分解酵素で切断し，電気泳動した（Shoffner
19901），Goto19902））．
mtDNAの塩基配列の解析は，mtDNAの一部をPCR法により300〜400kb毎に増幅し，得られたDNAをTaqdyeterminator法にてABI373A
DNAsequencerにより解析した．
結果と考察
1．mtDNAの欠失．一部の成績は既に本研究
姓で報告してあるが，検索したCPEO19例中12例にmtDNAの大欠失を認めた（表1）．KearnsT
Sayre症候群不全型および全身ミオバナーを伴う症例では11例中9例，眼筋ミオバナーのみのもの
では8例中3例に欠失がみられた．前者の3例と後者の1例に多重欠矢が見出された．眼筋ミオバ
ナーのみの2症例では四肢の筋力が正常にもかかわらず変異mtDNAを30−68％混在していた．な
お，tOtalmtDNAを用いたSouthernblottingでは表1のように他の疾患では欠失mtDNAは全く検出されなかった．
2．MELAS．臨床的にMELASと診断された症例全例に報告されているようなMit．遺伝子番号3423bpのA→G点変異，すなわちtRNALeuの変異を認めた（図）．検索した2例はリンパ球にも−237−

うに，ミオクローヌスを伴い，高乳酸血症および生検筋のミトコンドリアの呼吸鎖酵素活性の低下を認めた2例（症例1，2），同様に生検筋のミトコンドリア酵素異常を伴った父子例（症例3，

表1Mitochondrial DNA deletionsin mit・
encephalomyopathies
GroupsNo．

Dele亡ions

1．CpEO
KSS

4

Ocular十general

7

Ocular834），および対照として多発性筋炎の1例（症例5）について現在までのところmtDNA4048〜10609

6
（19）

つ

く12）

2．Definiヒe miLeTICephalomyopa亡hies
トtELAS

7

0

ト旺RRF susp・

30までの塩基配列の解析を行った．Anderson，etal（1981）4），Ozawa，etal（1991）5），Kobayashi，etal（1991）6）に記載されているmtDNAの塩基配列を参考とした．
その結果，5例すべてにAndersonの記載とは異なる部位に多くの塩基置換が見出された．アミノ酸レベルでの変換を表4に示す．mtDNA4769，

3．Undefined miL．encephaloInyOpa亡hies
6

HlL nyOpa亡hi＿eS
O亡hers

12

34

19

5

6

7

8

0
（25）

0

9101112131415

5253および9559の変異は全例に共通しており，日
本人特有かAndersonのSequenCeのerrorかも知れない．アミノ酸の性質からみて大きな変換を示したのは，症例1では遺伝子番号10609のND4領域の疎水性であるisoleucineで，親水性である
arginineへ変換した．症例2では遺伝子番号
図

表2 9bp deletionin8272−8280

MELAS6例のPCR
症例1〜6は遺伝子番号3423bpのA→G変
異を示す

CPEO

2

MELAS

3

mSN

2

工工

同様のmtDNA変異が見出された．1例では変異

SCD

mtDNA部を直接に塩基配列を解析して確認した．

AIcohol

3．tRNALysの変異の有無．ミオクローヌスにミ2lMyoglobinuria′l

オバナーを伴いMERRFが疑われた3例，非定型

Elevated

CK

I

的SCDやHSMNにMit．異常を伴った症例など

C011agenl

計10例について，MERRFで報告されている

13／83

examlnedtRNALysの変異の有無を検索した．しかし，我々の症例ではこの部の変異は1例も見出せなかった．

表3

MitochondrialDNAvariationsinpatients
withmyoclonusepilepsyandlacticacidosis

PCRにて遺伝子番号8344の近傍を検索している
際にmtDNA8278−8280，もしくは8281〜8289bp
間の非コード領域の9bpの欠夫がしばしば認められた．この部の欠夫は正常者に見出されるvaria・tionとしてすでに記載されているが（Wrischnik，
1987）3㌧我々の82例の生検筋のmtDNAについて
この9bp欠矢の有無を検索した．その結果，表2のように種々の疾患に見出されることが判明した．
4．mtDNAの塩基配列の解析．表3に示すよDiagnosis HyoclollUS HyoClolluS tiHSN n mSNII Myosi亡is
A8e

30

22

Sex
Age a亡

32

64

‡】
OnSe亡

10

日yoClonus
MeIはal reCardaEion
A亡axia

＋
＋

14

6

3ん

＋

＋

＋
十

＋

十

【ieuropa亡hy
Hyopa亡hyLac⊂i亡aCidosIs

8eCreaSed

Of皿it．enZyneS

−238−

十
ac⊂iviEy＋
Complex士
COX

26
F M H F

COX

COX

26

表4

MitochondrialDNAvariationsinpatients2）GotoY，etal：AmutationinthetRNALeu（UUR）

Withmyoclonusepilepsyandlacticacidosis

gene associatedwith the MELAS subgroup

Anln0

of

8Cld ln

工

へリ

¶▲1

8 一 斗

′ ︸
′ b ■

1

Val

9

Met Het Het IlethumanmitochondrialDNA；direct sequenc・
ingofenzymaticallyamplifiedDNA．Nucleic

Het MetAcids Res15：529，1987．

Vr lm aP 崇r

▼ ﹈
p

′

D

W M

○ 酢
r
r
p A

日

9

m

T

0

X

T▲

T ▲

C

V

T ▲

X

n

C

9

q

▲ U

8 5 6
′0 7 9 0
1

U ＋ ■ ヽ 一 く 一 5

ミ 一 3

4
5

4）OritaM，etal：Rapidandsensitivedetection
ofpointmutationsandDNApolymorphisms

⊥

Ala

a

A

A

5

〇

★
a r u 1 0
1 h e a r

a
l
A

9

つ 一

2

l
a
V

9

′ 0

Ala

3）Wrischnik LA，et al：Length mutationsin

m

m2

t
e
H

▲ j

′ ︸

O 1 2 7 8 1 2 4ム﹁︐q・4．・A・ん．−⊃ 5

Het★

R

4

O

3

S
崇

2
Asrl★

A
p

1

A

5

NⅦnber Reglon

mitochondrial encephalomyopathies．

Nature348：651，1990．

using the polymerase chain reaction・
Genomics5：874，1989．
5）Ozawa T，et al：Patientswithidiopathic
cardiomyopathy belong to the same mito・︒

chondrial

4161のisoleucineがmethionineに変換していた．

dieseandmitochondrialencephalomyopathy．

これらの2症例の遺伝子変異の意義についてはさ

Biochem Biophys Res Commun177：518，

らに検討を続ける予定である．

1991．

餌

4048，NDl領域のarginineがaspsaginic acid，

DNA

gene

fami1yofParkinsonsPb6）Kobayashi Y，et al：Respiration−deficient

献

e

文

cells are caused by a slngle point mutation

A1）ShoffnerJM，et al：Myoclonicepilepsyand

in themitochondrial tRNALeu（UUR）genein

raggedlred fiber disease（MERRF）is as・sociatedwithamitochondrialDNAtRNALys

mitochondrial myopathy，enCephalopathy，

mutation．Cel161：931，1990．

（MELAS）．AmJ Hum Genet49：590，1991．

−239−

lactic acidosis，and strokelike episodes

46）常染色体優性遺伝を示したミトコンドリア脳筋症
症例の骨格筋ミトコンドリアDNAの解析
川 井 尚 臣＊
研究協力者

赤

池

雅

史＊

横

井

健

治＊

横

越

西

田

善

彦＊

増

田

健二郎＊

斎

藤

は じめに
ミトコンドリア病は母性遺伝を示すものが多い
が，その中の慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）は多
くが孤発例であり遺伝型は不明である．しかし，

浩＊
史

□十（ゴ

郎＊

ロ十（ゴ

拍長日F諾開極めて稀であるが常染色体優性遺伝を示す
CPEOの家系例のあることが知られている1ト3）．

○ ●T■ ●

CPEOの多くはミトコンドリアDNA（mtDNA）

f」に大きい欠夫があり4），このような家系の存在は細胞の核DNAとmtDNAとの密接な関連を示
唆する，と考えられているが，両者の具体的な関係については不明である．われわれは常染色体優性遺伝を示すCPEOの家系例を経験し，その発端者について骨格筋mtDNAの遺伝子解析を行ったのでその成績を述べる．
症例：58歳，男性．既往歴には特記事項なし，発端者の父と姉，妹の各1名に眼除下垂と噴下困難があり，妹と息子，娘の各1名に眼瞼下垂がある（図1）．20歳頃より両側の眼瞭下垂，38歳頃より畷下困難，41歳頃より上肢の筋力低下があり，これらの症状が次第に進行するため49歳のとき当科に入院し，三角筋の筋生検をうけた．その後，噴下性肺炎を繰り返している．
一般理学所見：体格中等度，栄養はやや不良である．脈拍70／分，整．血圧130／70mmHg．眼底，胸腹部などに異常所見はなく，下腿浮腫もない．
神経学的所見：意識は清明で，知能は正常である．
＊徳島大学医学部第一内科

図1 Ka家家系図，三代にわたり病者がみられ，男
女ともに発症している．発端者の父親，息子
はともに病者である．β，■，●：診察済み．
■，●：眼瞼下垂＋（外眼筋麻痺）．

両側の眼瞭下垂，外眼筋麻痺がみられ，鼻声，嘆下困雉などもある．肩甲部及び上月支の筋萎縮と筋力低下がみられるが，ミオクローヌスなどの不随
意運動はみられない．協同運動は正常で，Romber一g微候もない．四肢の深部反射は正常で，病的反射
はなく，知覚系，自律神経系にも異常所見はなかった．

検査成績：血清CK活性値，血清Mb倍は正常で，血中乳酸値11．95mg／dl，ピルビン酸値0．82
mg／dlと正常値である．阻血下前腕試験では負荷
後1分で乳酸値が32．23mg／dlと前借の約3倍の上昇を示した．心電図では伝導障害などの異常所見はなかった．頭部CTでは脳梗塞を示唆する低吸収域はなかった．脳波には全般にslowα一WaVeが認められた．運動神経伝導速度は正常で，筋電図でも異常所見はなかった．テンシロンテストは−240−

陰性．三角筋の生検組織のHE染色では筋紳胞の軽度の大小不同がみられ，一部の筋細胞で外郭の不正形を示す細胞がみられた．GomorirTri−
Chrome染色でraggedrredfiberが散在性に認められた（図2）．以上の家系検索，病者の臨床症状
ならびに筋生検所見より本症例を常染色体優性のミトコンドリア脳筋症と診断した．

（bp）23，130−9．416−

ミトコンドリアDNAの解析：生検三角筋から抽出したDNAを鋳型として，プライマーL981：5L

6，557・−〜

4．361−・、

CGGACTTCACGTCATTATTGG−3，（塩基番号9818−9838）とプライ

マーH1505：5，一2，322〜

TCTGAGTAGAGAAATGATCCG−3，（塩基番2，027鵬号15078−15058）を用いてpolymerasechainreac−tion（PCR）による増幅を行い，得られたDNAを
一■一一・aアガロースゲル電気泳動にて分離し，異常バンドを切り出し精製した後，2本鎖mtDNAを鋳型と一鴫一・b

して7−deaza sequenaseを用いたダイデオキシ法
により塩基配列を調べた．
成績

ミトコンドリアDNAの解析
1．PCRの成績：上記のプライマーを用いて

図3

PCRで増幅したDNAを電気泳動した結果，
1．OKbpと600bpの2個の短い異常バンドが認められた．この成績より，mtDNAの複製開始点
間に4．2Kbpと4．6Kbpの2種類の欠矢がある
ことが推定された（図3）．

PCR法の成績．プライマーL981とプライマ
ーH1505を用いたPCRによる増幅．1．OKb（a）と600bp（b）の2個の短い異常バンドが認められた．

2．PCR一直接シークエンス法：上記で得られた2つの異常バンドの塩基配列を調べたところ，
1・OKbpのバンドは塩基番号10，063から14，274
までの4，212bpの欠夫によることがわかった（図4）．そして，この欠失断端には5LAA−3，の2bpの反復配列が認められた．もう一方の600bpのバンドについては現在塩基配列を解析中であるが，塩基番号10，360近傍から15，060近傍までの欠矢のあることが判明している（図5）
考察

本家系では三代にわたり病者がみられ，男女と図2三角筋筋生検のGomori−Trichrome染色．
200倍．Ragged−red fiberが散在性にみられる（＊）．

もに発症し，また発端者の父親，息子ともに病者であることより，本家系のCPEOの遺伝型は常染
色体優性と考えられる．このような遺伝型を示す−241−

家系例は現在までにZevianiらの3家系2），Otsu−kaらの1家系3）の報告があるのみである．Zeviani
らは当初，彼らの家系においてmtDNAのD−
loop領域を起始部とする多重欠矢があると報告したが），その後常染色体優性遺伝を示す3家系の患者のmtDNAを分析し，その多くはmtDNAの重鎖複製開始点と軽鎖複製開始点の中間に複数の大欠矢が認められたと報告している2）．また，
Otsukaらは常染色体優性遺伝を示すCPEOの1家系において，やはりmtDNAの複製開始点間に多重欠矢があることを報告している3）．我々の症例でもmtDNAの複製開始点間に2種類の大欠失が認められた．本例，文献例ともに常染色体優図4

PCR法により増幅された異常バンド（a）の塩基配列（PCR一直接シークエンス法）．塩基番
号10063から14274までの4212bpの欠矢が認められた．

性遺伝のCPEOではmtDNAの複製開始点間に複数の大欠矢があり，これが常染色体優性遺伝を示すCPEOのmtDNA異常の特徴かも知れか−．
人のミトコンドリアについては，受精時に精子由来のミトコンドリアは卵子の中に入らないため，
人のmtDNAはすべて母親由来であるとされている．我々のCPEOの家系では異常形質が父親を通じてその子へ遺伝しているが，上記の理由により欠夫を有する異常mtDNAが父から子へ伝わり発症したとは考え難い．これについては現時点
では，受精卵から個体が形成されていく過程で異常を有する核遺伝子がmtDNAに作用L
mtDNAに欠矢が生じるのではないかと推定されている2）．我々の症例を含め従来報告された症
例2）3）で，欠失部位がmtDNAの重鎖複製開始点と軽鎖複製開始点の間に存在することや，欠失断端にしばしば反復配列が認められることなどは，
mtDNAの複製とこの欠夫が密接に関係していることを示唆する成績である．このような欠夫を起こす機序としては，核遺伝子に異常が生じ，その核遺伝子にコードされるmtDNA結合蛋白質に異常（欠損，欠失）がおこり，その結果としてmtDNAにstrand slippageあるいはmispairing

図5

本例におけるミトコンドリアDNAの欠失部
位・2個の欠夫はともに複製開始点間にある．

がおこるという報告5）がある．すなわち常染色体
優性遺伝を示すCPEOではmtDNAの複製に関与している蛋白質をコードしている核遺伝子の異常のあることが推定される．
一方，Gyllenstenらは，マウスにおいて低頻度−242−

ながら父親のmtDNAが受精卵へはいることを報告6）し，父親の異常mtDNAが遺伝することによりミトコンドリア病が発症する可能性を指摘している．
以上のように常染色体遺伝を示すミトコンドリ
ア脳筋症におけるmtDNA欠失発生の機序についてはいくつか推定されているが未だ解明されていないのが現状である．しかし，このような症例は核によるmtDNA複製の制御機構が存在する
ことを示唆する症例であり，CPEOのmtDNA異常を起こす機序の解明に役立つのみならず，核とミトコンドリアDNAとの相互関係を明らかにする上で貴重と考えられる．

deletionsofmitochondrialDNAstartingat
the D−loop region．Nature339：309，1989．
2）Zeviani M，BresolinN，Gellera C，et al：
Nucleus−driven multiplelarge−SCale dele・
tionsofthehumanmitochondrialgenome；anewautosomaldominantdisease．AmJIJum
Genet47：904，1990．
3）Otsuka M，Niijima K，Mizuno Y，et al：MarkeddecreaseofmitochondrialDNAwith
multipledeletionnsinapatientwithfamilial
mitochondrial myopathy．Biochem Biophys
Res Commun167：680，1990．

4）HoltIJ，HardingAEandMorganHughes
JA：Deletion ofmuscle mitochondrialDNA

ま

と

め

in patientswith mitochondrial myopathies．

常染色体優性遺伝を示す慢性進行性外眼筋麻痺

Nature331：717，1988．

家系を呈示し，発端者のmtDNAにて複製開始点

5）Mignotte B，Barat M and MounolouJC：

間に4．2Kbpと4．6Kbpの2種類の欠夫のあるこCharacterrizationofamitochondrialproteinとを明らかにした．これらの成績はmtDNAの複

binding to single−Stranded DNA．Nucleic

製に核遺伝子の関与を示唆する．

Acid Res13：1703．1985．

6）GyllenstenU，WhartonD，JosefssonA，etal：
文

献Paternalinheritance of mitochondrial DNA

1）Zeviani M，Servidi S，Gellera C，et al：An
autosomal dominant disorderwith multiple−243−

in mice．Nature352：255，1991．

47）種々のミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア
DNAの検討

光 弘＊

納

研究協力者

中 川 正
栗 山

員

法＊ 山 田 博
勝＊ 伊佐敷的ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア
DNA（mtDNA）異常が明らかとなってきているが，遺伝子レベルでの異常が不明な症例も少なくない．今回，自験例を中心にミトコンドリア脳筋症の臨床的多様性とmtDNA異常との関連について検討した．
対象および方法
臨床的，病理学的にミトコンドリア脳筋症と診断された45例（Kearns−Sayre症候群（KSS）5
例，眼筋型ミオバナー（眼筋型）17例，MERRF5
例，MELAS8例，Leigh脳症疑い3例，病型未定7例）の生検筋，末梢血または培養線推芽細胞よりDNAを抽出し，mtDNAの欠失および点変異（np32431），np83442））の検索を行い，臨床症状・検査所見との比較検討を行った．
結果

慢性進行性外眼筋麻痔：不全型を含むKSS5例
全例と眼筋型11例にmtDNAの欠矢を認めた．臨
床症状および検査所見との比較では，KSS典型例
4例の平均発症年令が9．8歳とmtDNA欠夫を認めた眼筋型の26歳，認めなかった眼筋型の39歳と比較して明らかに若年発症であった．特に，KSS
では，知能障害，MRI異常，下肢SEPの中枢伝導■鹿児島大学医学部第三内科■＊鹿児島大学医学部眼科＊＊■鹿児島大学医学部第一内科

久＊ 樋 口 逸 郎＊
靖＊＊ 宮 田 昌 明＊＝

時間遅延，脳波異常，髄液蛋白高値が明らかであった3）．mtDNA欠矢を認めた眼筋型と認めなかった眼筋型とでは，脳波異常がmtDNA欠矢を認めた群でやや多い以外には明らかな相違を認めなかった．
MERRF：5例中3例で，塩基番号8344のAtoGの点変異を認めた．点変異を認めなかった2例は，姉妹例であり，臨床症状はMERRFとして矛盾する点はなく，家族歴も母性遺伝を示唆していた．
点変異を認めた3例中2例に明らかな心症状を認めた点が注目された．1例は拡張型心筋症を示し心不全にて死亡し，他の1例は後述する症例3であるが非閉塞性肥大型心筋症を示した．
MELAS：8例中7例で塩基番号3243の点変異を認めた．1例は，経過中明らかな脳卒中様発作を認めなかったが，剖検にて多数の脳梗塞巣を認めた．MERRFと比較して低身長（148cm），低体重（34kg）の傾向にあり，発作性頭痛・嘔吐，脳卒中様発作，けいれん発作がほぼ仝例に認められた．
なお，Leigh脳症3例と病型未定例では，mtDNAの欠失および8344と3243の点変異を認めなかった（表）．
以下，特異な臨床症状を示した例について報告する．
症例1：14歳女性，診断名KSS，主訴は歩行障害．
現病歴：4歳10ヶ月，けいれん発作が出現．11歳
下垂体性小人症と診断され成長ホルモンの投与を受けるも効果なし．13歳ごろより，学業成績の低

−244−

表

ミトコンドリア脳筋症の臨床症状とmtDNA異常

0

0

0
0

0
6
0

2

5

0

0

2

0

2

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／
0

一

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l
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／ ／ ／ ／ ／
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6
6
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／ ／ ／ ／ ／

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／

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11／11

0

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1

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／

5

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1／11

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6
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／ ／ ／ ／ ／ ／・4

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l
l
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0

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■

／

．

︻

l

7

0

3000112ハバハバハバハバハバハバパパ一16

0

11

病型未定

50034618ハバハバハバハバパパハバハバ一38

6

11

MERRF MELAS Leigh脳症

70003932〃〃〃〃〃〃〃〃〃〃〃〃パパ一31眼筋型

5

ミ オク ロー ヌ ス

2

頭痛・唱吐
心伝導障害
心筋症
頭部CT／MRl異常
脳波異常
下肢SSEP遅延
髄液蛋白（mg／dl）

眼筋型

5

症例数
mtDNA欠失3243点変異8344点変異
年令
発症年令
家族歴
外眼筋麻痺
網膜色素変性
小脳症状
難聴
知能障害
脳卒中様発作
けいれん発作

XSS

80703423〃〃ハバハバハバハバハバハバ1 43

病型

6

下，書字の乱れが出現し，当院小児科受診．ミトコンドリアミオバナーを疑われ，当科紹介となる．
現症：身長136．5cm，体重36．6kg，IQ＝74，限瞼
下垂，軽度の眼球運動制限，網膜色素変性，小脳症状，びまん性の筋萎縮・筋力低下を認める．耐糖能異常，血中および髄液中の乳酸・ビルビン酸
高値，脳波異常，MRIT2強調画像にて，自質にび
まん性の高信号域を認める．脛骨神経刺激によるん性の変化を示した点が注目される．mtDNAの欠夫は，KSSの症例1にのみ認められたが，2例に共通した小欠矢や点変異の有無については今後の検索が必要である．
症例3：38歳男性，診断名MERRF，主訴は全身倦怠感．
家族歴：母親が66歳時に完全房室ブロックにて，ペースメーカー挿入．甥が類似疾患（てんかん，

下肢SSEPにて，中枢伝導時間の遅延を認めた．
症例2：13歳女性，症例1と祖父が兄弟，診断名
白質ジストロフィー，主訴はけいれん発作．
現病歴：歩行開始は1歳6ヶ月と遅れていた．2
歳より全身けいれん発作が出現し，当院小児科受心疾患）にて死亡．
現病歴：小学校の頃より走るのは苦手であった．
19歳時に全身倦怠感，浮腫出現，21歳時に下腿浮腫，下肢筋力低下，心肥大を指摘される．22歳時に脚気心と診断され，ビタミンBl投与により心症

診．CT，MRIにて後頭葉優位の白質の変性が示唆されたため，当科紹介となる．
現症：身長145cm，体重35kg，知能障害（IQ＝40），小脳症状，視力低下（皮質性）を認める以外には，特記すべき異常なし．
コメント：図1に示すように，祖父同士が兄弟で状，神経症状ともに軽快した．27歳頃より徐々に下肢および上肢の脱力を自覚し，32歳時に当科にあり，MRIT2強調画像にて，いずれも白質のびまて，ミトコンドリアミオパテーと診断された．同
時に心エコー等の所見より，非閉塞型肥大型心筋症の診断を受ける．34歳全身けいれん発作，脳波異常を指摘され，36歳時より上肢・顔面のミオク
ローヌスが出現している．

−245−

PCR−RFLP
●
、
t
＼▼

＼1／

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恥」で鳶百〇。

＿′

『‡）

194

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118一・・」ノ二〕

暮V】ヨ圭，

他et

吏］自
図2

＿23kb

−9．4kb−＋ −＋ 一十 一十
SD SDM HK IS

一＋ −＋ −＋MK IT ITMMERRFにおける塩基番号8344の点変異の検出．SD：症例3の末梢血，SDM：症例3の母親の末梢血，HK，IS：8344の点変異を認めないMERRFの姉妹例，ITM：ITの母親の生検筋．

20歳半ばより，痛風．34歳時に若年性白内障の手術を受ける．29歳記銘力・集中力低下，31歳右不全麻痺が反復して出現し，このころより頭痛・堰吐および右上肢の不随運動を自覚．36歳当科入院，筋生検等よりMELASと診断．合併症として，高血圧，高尿酸血症が認められた．入院中に全身け図1症例1，2の家族歴および生検筋mtDNAのSouthern blot／DIGrlabeled DNAlumines−
cent Detection．（muII digestion）

現症：身長165cm，体重70kg．知能低下（IQ＝57），視神経萎縮，小脳失調，病的反射出現，ミオ
クローヌス，神経性難聴，四肢筋萎縮・筋力低下を認める．心電図では，伝導障害はなく，頭部MRI
では，小脳・脳幹・頸髄に萎縮を認め，T2強調画
像にて，白質に点状・非対称性の高信号域を認めた．
コメント：本症例は，患者本人と母親の末梢血
DNAの分析にて，塩基番号8344の点変異を●認め，最終的にMERRFと診断された（図2）．しかし，臨床経過では非閉塞型肥大型心筋症による心不全
症状が先行しており，約15年後にミオクロースヌ
やけいれん発作が出現した点が注目される．
症例4：43歳男性，診断名MELAS，主訴は右上肢の筋力低下．
現病歴：中学校の時に神経性難聴を指摘される．

いれん発作出乳39歳左不全麻痺出現し，CTにて外側型脳出血と診断され，血隆除去術を受ける．
現症：身長154cm，体重47kg，血圧150／100．知能低下，精神症状，軽度の外眼筋麻痔，左不全麻痺，
網膜色素変性，難聴，小脳症状を認める．BUN23．
1mg／dl，尿酸12．0mg／dlと軽度高値を示した．
MRIにて，左右の被殻外側部に陳旧性脳出血巣を認めた．
コメント：臨床経過，検査所見よりは，MELASと考えられたが，MELASに高率に認められる3243の点変異はなかった（図3）．高血圧，高尿酸血症が脳出血の危険因子であるが，ミトコンドリ
ア異常が高血圧，高尿酸血症および脳出血に関与した可能性も否定できない．
症例5：70歳女性，
診断名：未定．主訴は歩行障害．
家族歴：弟（68歳）にミトコンドリアミオバナー，
心筋梗塞，高脂血症を認める．
現病歴：50歳頃より階段昇降困難を自覚し，63歳
当科受診．高血圧，高脂血症（血中稔コレステロ
ールは250mg／dl）があり，神経学的には，四肢近−246−

位筋の筋萎縮・筋力低下を示す以外には，中枢神経系に異常を認めなかった．筋生検にて，ミトコ

PCR−RFLP

ンドリアミオパテーと診断された．69歳（1990年
5月11日）小脳梗塞出現，1991年4月12日MRIT2
強調画像にて，自質に多発性の高信号域を認めた．
1991年6月30日，脳出血にて死亡した（図4）．
一1357
一■

603

両

310

現症（1991年4月12日）：身長145cm，体重45kg，
血圧150／94．軽度の小脳失調，四肢近位筋筋力低下，深部腱反射克進を認めた．
コメント：小脳梗塞出現時までは，肢帯型筋萎縮を示すミトコンドリアミオパテーと考えられていたが，最終的には脳出血にて死亡した．塩基番号3243および8344の点変異は認められなかった．脳血管障害の危険因子として，高血圧，高脂血症が。誓霊要望藁葺婆蔓掬旭日晦桝由m
図3

MELASにおける塩基番号3243の点変異の検出．KN：症例4の生検筋，C：COntrOl．

図4

合併していたが，ミトコンドリア異常による血管系も含めたエネルギー代謝障害が関与している可能性も考えられる．弟にも，ミトコンドリアミオ
バナーがあり，遺伝子レベルでの共通した異常が推定された．

症例5のMRIおよびCT像．
左：1991年4月のMRI T2強調画像．
右：1991年6月30日死亡時のCT像．
−247【

ま

と

文

め

献

今回検討したミトコンドリア脳筋症45例中26例にmtDNAの異常を認め，臨床病型とmtDNAの1）Kobayashi Y，Momoi M，et al：A point

異常は一定の関連を示した．しかし，mtDNA異常と臨床症状が対応していない症例もあり，今後これらの症例のmtDNAの全塩基配列の検討が必要である．

genein MELAS（mitochondrial myopathy，

mutationin the mitochondrial tRNALeu（UUR）

encephalopathy，1actic acidosis and stroke−
1ike episodes）．Biochem Biophys Res Com−
mun173：816−822，1990．

2）YonedaM，TsujiS，etal：Moleculargenetic

謝辞：貴重な症例を紹介して頂いた北里大学斉藤豊和先生，東邦大学岸 雅彦先生，九州大学大野雅治先生，久留米大学松石豊次郎先生，大手町病院須藤憤治先生，大分医科大学後藤勝政先生，大分県立病院永松啓繭先生，国立療養所南九州病院
福永秀敏先生，沖縄県立中部病院西平竹夫先生，
国立療養所沖縄病院竹永 智先生，県立宮崎病院
末原雅人先生，鹿児島大学小八重秀彦先生に深謝
致します．

−248−

analysis of myoclonus epilepsy associatedWith

ragged−red

Opathology

fibers．

Progressin

Neur−（edby Sato T＆DiMauro S）

1991，VO17，pp169−180．

3）中川正法，時村美香ほか：慢性進行性外眼筋麻痺：頭部MRIおよび電気生理学的異常とミトコンドリアDNA欠夫との関連についての検討．
臨床神経31：981−986，1991．

48）MELAS病態の細胞学的解析
桃 井 真里子＊

研究協力者

小 林 菓 子＊ 伊 東 茂 子＊
小 黒 範 子＊ 太 田 成 男＊＊

我々は1990年に，MELASの遺伝子変異を同定

試料を昨年度報告した方法で32P標識PCR増幅した．．！トコンドリアDNA（mtDNA）上のし，ApaI処理をした．ApaI処理は48時間行った．処理後は6％ポリアクリルアミドケリレ上に泳tRNA−Leu（UUR）遺伝子内の塩基番号3，243のA−G変異であった1）2）Jこの変異により，変異を含む遺伝子断片は制限酵素ApaIにより切断されることを利用し，MELAS遺伝子変異はPCR増
幅mtDNA断片のApaI切断DNAの解析により容易に同定されることになった．mtDNA遺伝
子変異による病態は，DNAが1細胞内に数千のコピーを有することから，その局在のみならず，量が重要な要素である点に特徴がある．すなわち，細胞の変異形質発現には，変異mtDNAが一定程度存在する必要がある．さらに，患者の診断のみ
ならず，健康保因者が発症する可能性があるか否かの診断，または，出生児診断を可能にするには，変異遺伝子の定量が正確である必要がある．本研
究では，PCR増幅，制限酵素処理という方法でMELAS変異遺伝子が正確に定量可能であることを示した．さらに，変異遺伝子発現の修飾の可能性を提示した．
方法① MELAS患者骨格筋から癌遺伝子導入により得たクローン化細胞3）4）のうち，チトクロームC
酸化酵素活性正常クローンと活性欠損クローンより，正常，変異mtDNAをクローニングした．おのおののmtDNAを0〜100％の割合に混在した＊自治医科大学小児科＊＊自治医科大学第一生化学

動し，標識DNA断片を定量した．切断断片を変異
mtDNA断片とし，非切断断片＋切断断片似対する割合を求めた．求めた変異mtDNAの割合と試料中の変異mtDNA断片の％を比較した．
（∋ MELAS患者とその家族のリンパ球の変異
mtDNAの割合を上記の方法で求め，実際にある
べき％を検量線の式より求めた．
（9 MELAS患者剖検組織の変異mtDNAの％を（卦と同様に求めた．
④ 正常クローン化細胞とチトクロームC酸化酵素（COX）活性欠損細胞の通常培養条件に，Dex−amethasone（500ng／m1−50ug／ml），T4（500ng／
ml〜50ug／ml），Retinoicacid（10￣4−10￣6M）を加えて72時間培養後，COX活性染色をし，その変化を検討した．
結果（》 クローニングした正常mtDNA，変異mtDNAによう定量性検討の結果を図1に示す．
実際に検出したmtDNAと試料中の変異
mtDNAの相関係数は図に示すように0．99であり，用いた方法の定量性が確認された．変異mtDNAが100％の際はわずかに非切断断片が残り，正常
mtDNAが100％の場合は切断断片はなかった．この結果は，ApaIによる切断が100％ではないことを示唆したが，相関係数からは，定量性は充分であると考えられた．
1
＿．＿】

−249−

H
−
■
一
一
⁚
︑
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川
棚

0
0

＼
9．1％

0

20

40

60

80

首鮎

0

言︶＜Z凸l∈PgS亀苛

The mutant mtDNAin Lymphocytes

64％

100

（MELAS）

added mutant mtDNA（％）

A・＋Gin tRNA−Leu

図1

図2② 患者及びその家族のリンパ球中の変異
mtDNAの割合を，図1の式より換算して（Xに相当する数値を）求めた．結果を図2に示す．

細胞はかなりの割合が変異遺伝子を有すること，母の卵細胞とリンパ球に変異遺伝子が局在するこ（診 組織の変異mtDNaの割合は，（②と同様にxに相当する％を示す），大脳（前頭葉）皮質100％，
白質100％，心筋96％，肝94％，腎皮質83％，腎髄質82％，骨格筋2個所（70％，76％）横隔膜72％，
牌40％であった．各組織内の3個所の試料はいずれも同様の割合を示した．
④ T4では活性に変化はみられなかった．
RAlO￣5Mで一部にCOX活性の染色が認められた．正常活性に比して染色性は弱かった．Dex−
amethasone50ug／mlでもRAよりは弱く活性染
色が認められた．
考察
PCR増幅，ApaI処理による変異mtDNAの定量性は，クローン化したDNAを用いての実験が相関係数0．99に示すように，定量的解析に使用し得ると考えられた．
家族の変異mtDNAの定量解析は，変異遺伝子の母系遺伝を示すのみならず，変異遺伝子の割合が母とその子（患者と正常保因者の同胞）の2代を経る過程で増幅していること，母親は種々の割合の変異mtDNAをヘテロプラスミ一に持つ卵細胞を有するこ．と，また，変異遺伝子を持たない子が図2に示すように少なかったことは，母の卵とは，遺伝し変異が母の発生過程の初期か，祖母の卵細胞，あるいはそれ以前に発生していることを示唆することを示している．さらに，健康同胞の一人が32％の変異遺伝子を有したことは，リンパ球でみる限り，発症の閥値は32％以上であること，を示唆している．組織間で明かに変異遺伝子の割合に差があり，同一組織内では差がなかった
ことは，変異遺伝子の分配が組織発生の初期に決定される機構があるか，または，各組織により，変異遺伝子の増幅率がことなるかの可能性を示唆した．後者とすると，組織特異的な機構は核遺伝
子支配であると考えられ，病態決定に核遺伝子がどの様に関与するかは重要な視点であると考えられる．患者，または正常保因者にいて変異遺伝子が細胞内にヘテロプラスミーを形成するかホモプ
ラスミーであるかは重要な問題であるが，前者であれば，上記の増幅機構の解析が重要であり，後者であれば，変異形質の発現調節機構の解析が重要となる．後者の視点からまず，培養細胞に於て変異形質の一つであるCOX活性の変化をみる系を検索した．MELASの治療にステロイドホルモンが用いられ，一部の症例には有効である報告もあることから，ステロイドをはじめとして，核遺伝子の発現調節作用が知られるステロイドスーパ
ーファミリーのT4，RA，dexamethasoneを検討−250−

した．一部の条件下でCOX染色性の上昇がみら

1990．

れた．これらがどの様に機構によるものか今後検2）KobayashiY，MomoiM，TominagaK，etal：

討することにより，治療への可能性を探ることはAmJ Hum Genet49：590−599，1991．
3）NakamigawaT，MomoiM，MomoiT，etal：

重要であると考えられた．

J NeuroI Sci83：305−319，1988．

文4）ShimoizumiH，MomoiM，OhtaS，etal：Ann

献1）KobayashiY，MomoiM，TominagaK，etal：
Biochem BiophyReCommun173：816−822，−251−

Neuro125：615−621，1989．

49）MELASにおける点変異ミトコンドリアDNAの変動
西 澤 正 豊＊
研究協力者

吉 田 充 男＊ 太 田 成 男＊＊ 白 岩 仲 子＊＊

MELASの80％の症例では，ミトコンド））アDNA（mtDNA）の3243位，tRNALeu（UUR）のDHU
ループ領域にA→G点変異が同定される1）．この3243を含む領域は16S ribosomal RNAの転写終了部位を識別するtermination factorが結合する部位に相当しており，MELASにおいては点変異のためにこの結合が阻害されていることが明らかにされた2）．そこで，このような分子レベルの異常がMELASという特定のphenotypeを発症させる機序を解明することが次の課題となる．このためには，1）MELAS患者の諸組織において，
正常mtDNAと変異mtDNAのheteroplasmyの割合を定量し，各組織における機能障害の発症と変異mtDNAの存在量との関連性を検討する，
いわば横断面を捉えた分析と，2）家系例を用いて各世代での変異mtDNA量を定量することにより変異mtDNAの遺伝様式を明らかにし，さらに，同一個体においても，変異mtDNA量がいかに変動するか，臨床症状の発現には一定の城値が存在しているのかを検討する縦断面からの分析が必要である．いずれのアプローチにも正常
mtDNAと変異mtDNA壷を正確に定量できる
測定系が不可欠であるが，今回は，共同研究者の太田が確立した定量法を応用し，MELASにおける変異mtDNA量の経時的変化を追跡した結果，
興味ある知見を得たので報告する．

対象と方法
対象は昨年度の本姓会議において報告した
MELASの母娘例である．娘は25歳で，1982年（14歳）より難治性の痙攣発作，16歳より発作性の頭痛，嘔吐がある．17歳時に脳卒中様発作をおこした際，高乳酸血症とragged−red fiber（RRF）が確認され，MELASと診断された．その後，進行性の痴呆と糖尿病を合併している．母は52歳で，1975年（30歳）より′糖尿病，46歳より感音性難聴がある．娘がMELASと診断された際に高乳酸血症の存在を確認されている．50歳頃より進行性の痴呆が目立ちはじめ，51歳には脳卒中様発作をおこし，RRFも認められたため，MELASの診断が確定した．母娘ともに生検筋のmtDNAの3243位にA→G点変異が確認されている3）．
今回はこの母娘より1986年6月と1990年12月の時点でそれぞれ末梢血単核球（MNC）からDNAを得，3年6ヶ月間の時間経過におけるMELAS
点変異mtDNAの変動の有無を検索した．
正常および変異mtDNAの定量は以下のように行なった．すなわち，
1）mtDNAのH3153−3172に相当する20merと，T4 kinaseにより5，−endをラベルした
L3374−3353に相当する22merを，前者13：
後者1の割合でprimer pairとし，非対称PCRを．行ない，3153〜3374の領域を増幅した．
2）PCR産物をApaIによりdigestionL，10％＊自治医科大学神経内科＊＊自治医科大学第一生化学

polyacrylamide gelにて電気泳動した．
3）Autoradiographyとdensitometryはフジフ−252−

イルム社製image analyzerを用いて行なっ

表

た．

末梢血単核球におけるMELAS点変異ミト
コンドリアDNAの定量構（％）

4）検量線を作成するためのStandardとしては，
母娘

1986年6月

6．0

40・5

1990年12月

5．9

31・3

正常およびMELAS点変異mtDNAよりそれぞれ3153〜3374を含む領域をplasmidにcloningL，これらを0−100％の関の適当な割合で混合したものを用いた．
結果Autoradiography上，正常mtDNAは222
bp，MELAS点変異mtDNAはこれより94bp短い128bpのバンドを示した（図）．
検量線は変異mtDNAの割合が全体量の0％〜100％の問で完全に1inearとなったので，変異mtDNA量の定量もこの範囲内で行なった．
MELAS点変異を有する異常mtDNA量が3
年6ヶ月の間にどのように変動するか，末梢血
MNCにおいて検討した（図）こ 母親はこの期間中に明らかな脳卒中様発作を生じ，臨床症状に変化が認められたが，MNCにおいては変異mtDNAが全休に占める割合は6．0％から5．9％へと変化を認めなかった．一方，娘はこの期間中に臨床上，緩徐ながら痴呆症状が進行したが，MNCにおい

12

3

4

徽響●蠣

●

一

5

6

鱒′正常mtDNA●

変異mtDNA

手車三二回

正常および変異mtDNA最の定量ては変異mtDNAの割合は全休の40．5％から31．
3％へと明らかに減少していた（表）．
考察MELASの患者生検筋において3243位にA→
G点変異を有する変異mtDNA託は従来の報告では全体の60％〜70％前後であり，残り約40％〜30％は正常mtDNAからなるとするものが多い．MELASは臨床的には進行性の経過をとり，また，保有されていた患者臍帯を用いての分析ではMELAS発症時の生検筋に比して変異
mtDNA量は明らかに少ない．そこで，MELAS
においては変異mtDNA量は何らかの機構により経過とともに増加しており，各組織のエネルギ
ー需要と供給能力のバランスから決定されるある城値を変異mtDNA量が上回るとその組織においてenergycrisisが発生し，臨床症状が発症するのではないかと想定されてきた．今回の結果はこうした予測には反するものであり，変異mtDNA
講は末梢血MNCにおいてはむしろ減少する場
合があることが確かめられた．もとより，今回の分析はMELASの1家系例について，時間的にも3年6ヶ月という一時点で比較したのみであるので，結論を下すには憤重でなければならず，以下のような問題点をさらに検討する必要がある．
第一に，変異mtDNAの量を規定する組織特異的な要因の存在が考えられるので，筋組織について同様の検索が当然必要である．臨床の現場では筋症状の発症の前後で2回にわたり筋組織を得る
ことは非常に困難であるが，MELASにおいて障害される主要な組織である筋肉についての情報は−253−欠かせない．MNCは試料としては容易に入手できるが，変異mtDNA量の変動を分析する対象として適切か否かは明らかでなく，MELASにおいては末梢血MNCの機能障害は臨床的には認められない．
第二に，MELASが発症するためには当該組織における変異mtDNA量が一定の域値を越えることが必要条件であるのか否かを明らかにする必要がある．このためにはまず，患者の各組織において変異mtDNA量を定量し，臨床的にその組織では不変であったのに対して，娘では量的変化が認められた．従って，世代間でも組織特異的な要因について考慮する必要があること，かつ変異
mtDNA量は単純に増加するものでないことが確かめられた．
MELASにおける変異mtDNA量を正確に定量することができ測定系が今回確立されたので，今後以上のような諸問題について順次検討を加えていく予定である．

の機能障害が発症しているか否かとの相関を詳細に分析しなければならない．MERRFにおいてもtRNALysに点変異が同定され変異mtDNA量について同様の分析がなされているが，MELASの場合とは異なり，変異mtDNA量はいずれの組織においても90％以上の高率を占めており，臨床症状を里しているか否かとは関連性がみられない．
第三に，変異mtDNAの量がどのような機構で決定され，維持されているかを明らかにしなければならない．これには世代間での変動と個体レベ
ルでの変動とを規定する要因をそれぞれ分析する必要がある．今回の母娘例においても，筋組織における変異mtDNA量はともに約60％で，母と娘の間に差異はみられないのに対して，末梢血
MNCにおいては娘では母の5−6倍に増加していた．しかもMNCにおける変異mtDNA量は母

−254−

引用文献
1）GotoY，etal：AmulationinthetRNALeu（UUR）
gene associatedwiththe MELAS subgroup
Of mitochondrial encephalomyopathies．
Nature348：651〜653，1990．

2）HessJF，etal：Impairmentofmitochondrial
franscriptionterminationbyapointmutation
associatedwith the MELAS subgroup of

mitochondrialencephalomyopathies．Nature
351：236−239，1991．

3）西澤正望ほか：MELAS母娘例におけるミト
コンドリアDNAの解析． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）
平成2年度研究報告書，1991，pp258−260．

50）変異ミトコンドリアDNAの分布−MELAS患者の一剖検例−
水 澤 英 洋＊研究協力者

白 岩 伸 子＊ 太 田 成 男＊＊

は じめに
ミトコンドリア脳筋症はCPEO，MERRF，
MELASなどさまざまな病型を持つ遺伝子病である．MELASはtRNALeu（UUR）の塩基番号3243におけるAからGへの点変異が本疾患の原因として兄いだされている1）2）．また，MELASにおいて認めた他に大きな変化はなく，27歳時，心タンボ
ナーデのため急死した．
筑波大学神経内科入院当時の身体所見は，−2SDの低身長，高度のるいそうあり．胸腹部に異常と変異mtDNAの関係についてはまだ十分検討されていない．我々は下垂体の機能異常が認められたMELAS患者の一剖検例で，32試料において
上記塩基置換を調べて変異mtDNAと正常所見はなく，陰毛発達は正常だったが，乳房の発達はきわめて不良．神経学的には中等度の知能低下を認め，性格は未熟で幼稚な振る舞いが目だった．脳神経系では求心性視野狭窄，感覚系では左半身感覚障害，運動系ではびまん性筋萎縮，筋トーヌスの低下を認めた．明らかな筋力低下はなく，
外眼筋麻痺，限瞼下垂も認めなかった．検査所見では血中乳酸，ピルビン酸の高値，髄液中乳酸のmtDNAの比率を求め，臨床検査所見と比較した結果，興味ある知見を得たので報告した．

高値，上腕二頭筋筋生検では多数のragged−redfiberおよび電顕で異常ミトコンドリアの集積像

は変異mtDNAはheteroplasmyを示すことが報告されている．しかし，MELASの臨床的表現型症

例

27歳女性．主訴はけいれん発作，行動異常，身体発育不全．両親，同胞に特記すべき神経筋疾患
なし．出生時，幼少児期には特に問題なかった．
思春期ごろより低身長が明らかとなり，月経の初乗はなかった．17歳より同名半盲，閃輝時点を伴う発作性頭痛・おう吐を頻回に認め，学業成績も次第に低下．19歳時，全身性けいれん発作が出現を認めた．頭部CT・MRIでは大脳，小脳のぴまん性萎縮に加えて両側後頭葉に脳梗塞様病変を認めた．内分泌機能検査は甲状腺機能，副腎機能は正常だったが，性腺機能としてエストラジオール，
プロゲステロンの低下を認めた．また，本例に特異な点として下垂体機能検査におけるGH，LH，FSHの分泌障害を認めた（図1）．
方法

し，またこの頃から日常生活における異常行動が目だつようになった．24歳時，大発作を呈し筑波

正常mtDNAと変異mtDNAの比を得るためのスタンダードとして正常mtDNAと変異

大学神経内科に入院した際，MELASと診断された．その後は知能低下と精神症状の多少の進行を

mtDNAをプラスミドにクローン化した．それらを様々な割合で混合してプラスミドDNAをとり，
塩基番号3243を含む領域をPCRで増幅した＊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊自治医科大学第一生化学（Primerl：塩基番号3153〜3172，Primer2：塩基番号3374−3353）．その際，Primerlを5，末端ラべ
−255−

GH
アルギニン負荷試験

LH−RH負荷試験
GRF負荷試験

0153060

90120

0153060

90120（分）図1下垂体機能検査．GHはアルギニン負荷試験，L−DOPA負荷試験では無反応，GRF（growth
hormonereleasipg factor）負荷試験ではGHの上昇は見られたが，分泌遅延を認めた．また，
LH−RH負荷試験ではLH及びFSHの分泌遅延，低反応を呈した．

0
8
0
6

0
4
0
2

3243変異1000︵辞︶hl扇ugu 00焉∝

標準DNA
プラスミド

PCR
二

日…………・‥‥・‥

0

黒pラベル

20

40

60

80

100

ContentofmutantDNA（％）
図3

番号3374−3353）．その際，Primerlを5，末端ラベ
ルし，ヘテロデュプレックスを防ぐために他方のプライマーの1／13量を用いた．制限酵素Apalで

◆

電気泳動
図2

スタンダード・カーブ（プラスミドDNA5
pg，PCR25サイクル）．このようにスタンダー
ドDNAの混合比と，切断断片と末切断断片の比は直線関係にある．

標準DNA．プチスミドDNAを，変異mtDNAが0，20，40，60，80，90，95，100％になるように混合し，塩基番号3243を含む領域をPCRで増幅した．Apalで切断し，電気泳動autoradiographyで解析した．

切断し，12％polyacrylamide gel上で電気泳動
後，切断断片と未切断断片の比を求め，スタンダ
ードDNAの混合比と直線関係にある条件を設定した（図2）．プラスミド量5pgでPCRは25サイ
クルすると良好な直線関係が得られた（図3）．な−256−

No．部位MELAS変異mtDNAの分布

1．前頭葉皮質

27

側喪章皮質
頭頂葉皮質1
磯料 庵威碗庵離鱒頑綿密醜調錦群舞 正常mtDNA
喪頂葉皮質2
後頭葉皮質
尾状核
変異mtDNA
被殻
淡蒼球
視床
45678910
前額葵深部自薦 WM123
下垂体1
下垂体2
小脳鹿茸
醜威嚇科領陛痍鄭藩が㊥密華鱒
歯状核
肺腺神経
坐骨神橙
上腕二頭筋
腸腰細
心筋
11121314151617181920212223
胸鎖乳突筋
太胸崩
肋間筋
横隔膜
甲状腺
軸譲軒領嗟鱒
副腎
腎膿
肝膿

28

胃

29

脾腹
肺腺
大腸
空腸

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
25

3〕
31
32

図4

騨

242526272829303132WM

MELAS患者剖検32試料の電気泳動．（W）wildtypeDNA，（M）mutanttypeDNA・1〜10：
大脳，3：梗塞様病変隣接部，4，5：梗塞様病変部，11，12：下垂体，13，14：小脳，15，16：
末梢神経，17〜23：筋肉，24−32：その他の全身臓器，以上の全ての鼠器で，222bpの未切断断片と94bpの切断断片（変異mtDNA由来）が認められ，正常mtDNAと変異mtDNAのheteroplas−myであることがわかった．

−257−

お，プラスミド量を0．5pgと一けた少量にしたり，10pg用いてサイクル数を5回増やすと1ineality
は悪くなった．また，剖検試料は約10ngの全DNA画分を用い，予備実験をし，スタンダード量と同じになるように増減した．
結果

図4に示すように，本症例の剖検32試料は全て，
正常mtDNAと変異mtDNAのheteroplasmyであることが明かにされた．これら各臓器のmtDNAの比率を図5に示した．DNA量をいろ
いろ変えて3回測定し標準偏差を取ったが，ばらつきは多くても1．9％だった．脳下垂体で最も変異
mtDNAの比率が高く，95％だった．この症例では視床下部〜下垂体系の機能低下が確認されていることから興味深く思われる．また，大脳皮質は前菜頭に85％，側頭葉に88％，頭頂菜に87％の変異
mtDNAを認めたのに対し，深部自質，大脳基底核はいずれも70％台だった．末梢神経では俳腹神経で88％と高い比率で変異mtDNAを認めたが，臨床的には末梢神経障害は認められなかった．副腎，
甲状腺はそれぞれ83％，87％の変異mtDNAを認めたが，臨床的には機能は正常だった．筋は骨格筋，心筋を調べたが骨格筋は上腕二頭筋83％を除
いて70％前後と神経組織より低めであった．心筋は61％と比較的低値だった．最も変異mtDNAの比率が低かったのは牌臓で，22％だった．
本症例の病理的検索については現在検討中であるが，その一部を述べると，大脳では光顕的には皮質から皮質〜白質境界部にかけての梗塞様病変が散在性に認められた．下垂体組織の電顕像は下垂体細胞の中にミトコンドリアが非常に多いものがあるが，個々のミトコンドリアは膨化しているのみで，Cristaeの増加や封入体は認められなかった．また，ミトコンドリアの多くない細胞も多数認められた．このように下垂体電顕像では明らかなミトコンドリア異常は確認できなかったが，光顕的に下垂体ホルモンの免疫染色などを現在進めている．

DistributionofMELASmutantmtDNA

図5

MELAS患者剖検組織内の変異mtDNAの分布．
−258−

考

察

文

献

CPEOにおいては既に欠失mtDNAが多臓器にわたり存在する例が報告されているが3）4），践器
が臨床的に異常を示すか否かは以下の3点に依存していると考えられる．すなわち，（a）欠失mtDNA1）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutationの比率，（b）欠夫に対し各随器が機能異常を起こす，
間借があるのではないかという考え方，（C）
mtDNAの絶対量が臓器によって異なり，正常
mtDNAが十分にあれば代償しうるという考え方がある．

2）Kobayashi Y，Momoi MY，Tominaga K，inthetRNALeu（UUR）geneassociatedwiththe
MELAS subgroup of mitochondrial ence・
phalomyopathies．Nature348：651−653，1990．
MomoiT，NiheiK，YanagisawaM，Kagawa
Y and Ohta S：A point mutationin the
mitochondrialtRNALeT（UUR）genein MELAS（mitochondrial myopathy，enCephalopathy，

MELASではこれまで変異mtDNAの比率を
全身の各臓器にわたって細かく調べた例はなかった．最近，骨格筋・心筋・肝・腎・脳の5臓器を

1actic acidosis and stroke−like episodes）．

調べた報告があるが，変異mtDNAの比率には各臓器間の差異ははっきりしなかったとされてい3）Shanske S，Moraes CT，Lombes A，et al：る5）．また，特に脳の中での分布に関する報告はまだない．本例では下垂体機能異常と高率の変異
mtDNAの存在が関連している可能性が示唆された．また，脳全体の中では大脳皮質により高率の異常を認めたが，これは従来のMELASの病理報

drial DNA deletionsin Kearns，Sayre syn・

告で脳梗塞様病変は大脳自質や基底核より大脳皮質に強いといわれていることと一致している6）．
一方，脳以外の臓器では変異mtDNAの割合は必
ずしも臨床検査所見と一致しなかった．本例で示された変異mtDNAの比率と臨床的な表現型との関連には（a）の他に（bXc）のような機序を考える必要があると思われる．また，さらに症例を重ねて，下垂体細胞の変異mtDNAが一般にMELASやその他のミトコンドリア脳筋症でどの位の比率で存在するものなのか調べる必要がある．今後多くの検討すべき点が残されている領域であると考え
られる．

−259−

Biochem Biophys Res Commun173：816−
822，1990．

Widespread tissue distribution ofmitochon・drome．Neurology40：24−28，1990．
4）Zeviani M，Gellera C，Pannacci M，et al：
Tissue distribution and transmission of
mitochondrial DNA delesionsin mitochon−
drial myopathies．Ann Neuro128：94−97，
1990．

5）Ciafaloni E，Ricci E，Servidei S，et al：
Widespread tissue distribution of atRNALeu（ULTR）mutationin the mitochondrial
DNA of a patientwith MELAS syndrome．
Neurology41：1663−1665，1991．
6）OhamaE，OharaS，IkutaF，etal：Mitochon・
drialangiopathyincerebralbloodvesselsof
mitochondrial encephalomyopathy．Acta
Neuropathol（Berl）74：226−233，1987．

51）MELASの点変異：塩基番号3243と3271の
04

比較検討
後

研究協力者

藤

雄

一＊

作 田 亮 一＊ 松 岡埜 中 征 哉＊ 宝 来

は じめに

太

郎＊
聴＊＊

Pationtl Patient2

ミトコンドリア脳筋症における変興ミトコンド
リアDNA（mtDNA）の報告が次々と行なわれて

A

A

G

C

千一・千一一＼／添操

TTTCAA

3，271−−▼■

＿．．由

T

．‥

了≡
′、き・3・27−

一一：一一＼三串叩き

塩基番号（nt）3243にAからGの一塩基置換が報

3，243−

荒城榊

了一二

‥三二

霊／勒pe
一、＼

CCCGAG

我々は，この結果に基づいてPCR−RFLP法を用髄鞘

癖

CCCGGG

Mutant

いて40例のMELASの診断を行ない80％の患者

T

Mutantstroke−like episodes）においてtRNALeu（UⅢ）の告されMELASの診断は飛躍的に進歩した1ト3）

CWild−tyPOいる．特に，昨年，MELAS（mitochondrial

myopathy，enCephalopathy，lacticacidosis，andG・ト8，243

う芦；J二号にnt3243の変異を認めたが，残りの症例には異常は見られなかった4）．今回，我々は，11t3243の変異のない臨床的にMELASと診断された症例につ図1PCR一直接塩基配列決走法．Patientl
はnt3243変異のMELAS．Patient2はnt3271のT：チミンがC：シトシンに一塩基置換している．

いてさらにmtDNAの異常の有無を検討し，新たな点変異を認めたので報告する5）．
対象・方法

人や牛ではnt3271はTに保有されており臨床的にMELASと診断されているがnt3243

nt3261のAと相補的塩基対を形成している．しかの変異を認めない例についてmtDNAの仝し，nt3271のTがCに変異することによってtRNAを含む領域をPCR法を用いて増幅し，サnt3261のAとの相補性は保たれなくなる（図3）．
以上より，nt3271の点変異はtRNALeu（LTUR）の構

ンガ一法にて塩基配列を決定した．

造や機能に大きな影響を与えるものと考えられた．

結果・考察

この変異は，ミスマッチプライマーを用いた

アンダーソンの塩基配列と比較検討しPCR法と制限酵素を用いることにより簡便に検tRNAl−eu（UUR）領域のnt3271にTからCへの一塩

出することができる．既ち，変異部位を含む

基置換を認めた（図1）．この部位は，tRNAl−eU（LUR）

nt3130からnt3301までを増幅し，得られた170bpのアンチコドンステムに位置していた（図2）．

のPCR産物をAflIIで消化する．もしnt3271に変異があれば140bpと30bpの二つの断片に切断＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊国立遺伝学研究所

される（図4）．変異のバンドは骨に正常なバンド
−260−

℡

慧

2

3

穏

5

8

7

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A

C − G

A
C

C IIG

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1
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℡疋叩

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℡ −A

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℡−A

C

HU肋CIGDS一AC
G℡
CGDHUl00p

ACAAで℡C℡●−●−−−■G℡℡AAGA
℡
G
Aem
AS t

1

℡

■
−

A A

C℡

変異を有するMELASの間に臨床的な差が存在するのかどうか検討した．nt3271変異のMELAS

亀

−

⇒

A ℡ ℡ ℡ C■篭℡A A A A

慧

図4 制限酵素AflIIで硝化後の電気泳動．8例のnt3243変異のないMELASのうち症例2，
7，8に変異が見られる．

4家系5例とnt3243変異のMELAS32例を対象とした．表のごとく，脳卒中様発作はnt3271変異
でも全例に認められ，その中でも頭痛・嘔吐，意け入山
図2 tRNALeu（し■Ul。の二次元構造．nt3271はアンチ
コドンステムに存在する．

識障害，痙撃が多く見られた．また，筋力低下，精神遅滞，低身長が多く，これらはnt3243のMELAS患者と同様の傾向であった．

と同時に認められた（ヘテロプラスミー）．このnt3271変異が他のミトコンドリアミオパテ一にも筋病理学的にも，nt3271変異ではragged−redfiber，SSVが全例で認められ，CytOChrome coxidase欠損も 3例にあ りnt3243変異の認められるのかどうか、nt3243に変異のある

MELASと同様の傾向であった．
電子伝達系酵素の検討では，nt3271変異ではMELAS32例，nt8344に変異のあるMERRF6
例，欠矢のあるCPEO32例，欠矢のないCPEO8
例およびコントロール50例について検索した．その結果，nt3271変異は一例も認められず，この変異がnt3243変異のないMELASにのみ存在していることが明らかになった．
さらに，nt3271変異を有するMELASとnt3243
A．A．

DHU DHU DHU A．C．

Stem Stem loop stem stemll
HUMAN−C［「「 l lcomplexI欠損が1例，ⅠⅤ欠損が1イ軋Ⅰ＋ⅠⅤ欠損が1例，生化学的には異常を認めないもの2例であった．nt3243変異では，COmplexI欠損が11
例，ⅠⅤ欠損が4例，Ⅰ＋ⅠⅤ欠損が5例，異常なしが12例であり両者に大きな差は認められなかった．
A．C．A．C．V．

TvC TvC TvC A・A・

100p Stemloop stem loop stem s捷m［l l「 「 l lRU払N−MIGTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA■ACTTAAAAC雪TTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACAGTTAAGATGGCAGQGCCCGGTAATCGCATAA▲ACTTAAAAC習TTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACA

HU比AN−M2

GTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAA▲ACTTAAAACCTTACAGTCAGAGGTTCAATTCCTCTTCTTAACABOVINEGTTAAGGTGGCAGAGCCCGGTAATTGCATA．AJLACTTAAACT習TTATATCCAGAGATTCAAATCCTCTCCTTAACAATTAGGGTGGCAGAGCCAGGAAATTGCGTAAGACTTAAAAC＠TTGTTCCCAGAGGTTCAAATCCTCTCCCTAATA

MOUSE
CflICKEN

ATTAGGGTGGCAGAGCCAAGTAATTGCGTAAGCATTAAAAC亀TTGTTCCCAGAGGTTCAAATCCTCTCCCTAATAGCTAGCGTGGCAGAGCTCGGCAAATGCAAAAGGCTTAAGCC麿TTTAT−CCAGAGGTTCAAATCCTCTCCCTAGCTFROGGCTAGCGTGGCAGAGCCTGGCTAATGCGAAAGACCTAAGCT層TTTTTATCAGGGGTTCAAATCCCCTCGCTAACT

D．YAKUBATCTAATATGGCAGAT一一−−一一TAGTCCAATGGATTTAAGCT魯CATAT−ATAAAGTAT−−TTTACTTTTATTAGAA

D．MEl‥TCTAATATGGCAGAT−−7−−−TAGTGCAATAGATTTAAGCT＠TATAT→ATAAAGTAT−−TTTACTTTTATTAGAA

S．U．（Pエ」）

GCTAAAATAGCAAAG一一TGGTTAATGCAGAAGGCCTAAGAC電TTCCTATCAAAGGTTCAACTCCCTTTTTTAGCT

RAT

†
3243

図3

¶

甘

3261

3271

ミトコンドリアtRNALeu（UL一R）の塩基配列．

一261−

表

nt3243変異とnt3271変異の患者の臨床症状の比較

Strok8−11ke episodes

文献1）GotoY，NonakaI，etal：AmutationinthetransferRNALeu（UUR）geneassociatedwiththe

32（100篭）

5（100篭）Eplsodic headaebe
Witb vcm止tin9
Un（：OnSCiouBneS830（93．8〉5（100）MELAS subgroup of mitochondrial ence−

27（84．4）3（60）phalopathys．Nature348：651−653，1990．

Convulsion
ViBual distufVanCe

27（84．4）

3（60）TrEnBient bemlplegia2）KobayashiY，MomoiMY，et al：A point
mutationin the mitochondrialtRNALeu（UUR）

16く50．0）1（20）7（21．9）1（20）Additlonal s叩tOmS
抽需把1e weと止ne88

28（87．5）3（60）geneinMELAS（mitochondrial myopathy，Hental retardation

23（71．9）3（60）Short stature

encephalopathy，lactic acidosis and stroke−

20（62．5）2（40）Eearin91055

9（28．日 1（20）Cardi叩Opathy3（9．4）

1（20）

ptoSis3（9．4）

2（40）Bearヒblock1（3．1）
1（3．1）0（0）0（0）

De18yed develo騨nt

likeepisodes）．BiocheBiophysResCommun
173：816−822，1990．

3）TanakaM，InoH，etal：MitochondrialDNA
mutationinmitochondrialmyopathy，enCe−

Retinal T）iqmentation

phalopathy，lactic acidosis and stroke」ike

以上より，nt3271変異の患者は，nt3243変異を有するMELASの臨床症状，筋病理所見，電子伝達系酵素活性において同様であり，このことから
nt3271変異はnt3243変異とともにMELASの病因となると考えられた．
最後に，nt3243変異では，この変異の位置が転写終結因子結合部に存在することから，この異常がRNA合成に影響を与えると考えられている．しかし，今回報告したnt3271変異は，この転写終結因子から外れている．にもかかわらず，両者が同様な臨床症状や生化学的異常を示すことは
tRNALeu（UUR）自体の機能や構造の異常が病態に関与していることも考えられる．

−262−

episodes（MELAS）．Bioche Biophys Res
Commun174：816−868，1991．
4）Goto Y，Horai S，et al：Mitochondrial
myopathy，enCephalopathy，lactic acidosis

and stroke−like episodes（MELAS）：A
COrrelativestudyoftheclinicalfeaturesand

mitochondrialDNAmutation．Neurology42：
1992（inpress）．
5）Goto Y，NonakaⅠ，et al：A new mtDNA

mutation associatedwith mitochondrial

myopathy，enCePhalopathy，lactic acidosis
andstroke−likeepisodes（MELAS）．Biochim
BiophysActalO97：238−240，1991．

平成3年度研究班名簿

平成3年度 荒木姓 名簿
区

分

氏

所

名

主

任

荒

木

淑

郎

監

事

垂

井

清 一郎

寺

尾

寿

夫

〝

藤

猛

〝

澤

高

格

後

藤

幾

生

高

木

昭

夫

班

月

荒

畑

内

野

喜

〝

太

田

成

棄

庶

照

国 立療 養 所 再 春 荘 病 院神 経 内 科

〝

木

南

英

紀

〝

斎

藤

加 代子

〝

佐

橋

功

田

通

等

〝

西

澤

正

豊

後

藤

雄

一

（
内 2031）
教授部長

0 3 −3 5 8 8 −1 1 1 1室

長

0 42 3 −4 1 −2 7 1 1

医長

0 96 −2 4 2 −1 0 0 0（
内 2016）（内5 1 1 4 ）（内5 3 6 ）
講

師

教

授

教

授

0 3 −3 8 1 3 −3 1 1 1

講師

0 3 −3 3 5 3 −8 1 1 1

助 教 授

0 56 1 −6 2 −3 3 1 1（内3 5 1 4 ）（内3 1 2 3 0 ）（内2 1 7 6 ）

長

−265−

0 42 3 −2 3 −5 1 1 1（
内3 2 0 1 ）助 教 授

0 28 5 −4 4 −2 1 1 1（
内3 5 2 2 ）

栃木
薬
師寺
県河
3 3 1内1 −郡南1河内町

小 平 市小 川東 町 4 − 1 − 1

0 3 −3 4 6 8 −1 2 5 1（内3 3 2 4 ）

府 中 市 武蔵 台 2 − 6 − 1

国 立精 神 ・神 経 セ ン ター神 経 研 究所

0 2 8 5 −4 4 −2 1 1 1（
内 3151）院

自治 医科 大 学 神経 内科

0 92 −6 4 1 −1 1 5 1（
内 2281）

愛知 雁
岩作
県愛
又2知郡
1 長久手町

東 京都 立 神 経 病院

〒 18 7（
内 3322）

新 宿 区 河 田町 8 − 1

愛知 医科 大 学 神経 内科〒3 2 9 −0 4〝

0 52 −7 4 1 −2 1 1 1授

文 京 区 本郷 2 − 1 − 1

東 京女 子医 科 大学 小 児科

〒 18 3教

目黒 区 大橋 2 −17 − 6〒4 8 0 −1 1〝

0 3 −3 8 1 3 −3 1 1 1

栃師
薬
木 寺3
県河
3 1内郡
1− 南
1 河内 町順 天堂 大学 医 学 部 生化 学

〒 16 2（
内 3000）助 教 授

熊 本 県 菊池 郡 西合 志 町2 6 5 9

東 邦 大 学 医学 部 第 四 内科

〒 1 130 3 −3 9 6 4 −1 2 1 1

授

小 平 市 小 川 東町 4 − 1 − 1

自治 医科 大 学 生 化 学〒 15 3

教（
内 5611）

港区虎の門 2 −2 − 2誠幸

0 6 −9 4 1 − 0 4 8 4

福 岡 市 来 区 馬出 3 − 1 − 1〒3 2 9−0 4

〝

副 院 長

名 古 屋 市 昭和 区 鶴 舞町 6 5

国 立 精神 ・神 経 セ ン ター 神 経研 究 所男

0 96 −3 4 4 − 2 1 1 1

文 京 区 本郷 2 − 1 − 1〒8 6 1−1 1〝

授

板 橋 区 加 賀 2 −1 1 − 1

一〒 18 7連 結 の際 の 電 話

大 阪 市 中 央 区大 手 前 1 − 5 −3 4

虎 の 門病 院 神 経 内 科〒 10 5教

熊本 市 本庄 1 − 1 − 1

九 州 大学 医学 部 脳 研神 経 内 手
斗〒8 12

道 営 幹 事け る地 位

名 古 屋 大学 医 学 部 第 二生 化学〒 46 6〝

所 属 にお地

順 天 堂 大学 医 学 部 脳神 経 内 科〒 1 13

小名

帝 京 大 学 医学 部神 経 内科
〒 1 73佐設

在

国 家 公務 月 等 共 済 組合 連 合 会 大手 前病 院
〒 540

事

施

熊 本 大 学 医学 部 第 一 内科
〒 86 0

幹

属

所

研 究 月

0 42 3 −4 1 −2 7 1 1（
内5 2 14 ）

区

分

ル

氏
福

所

名
悦

イ
言 義

堀

眞一 郎

／
／

井

嘉里 子

吉

田

端

子

若

山

吉

弘

岡

ル

納

田

鹿 児島 大学 医学 部 第 三 内科

ル

川

井

尚

臣

〒 770
ル

木

村

淳

ル

黒

川

泰

弘

／
／

小

林

高

義

J／

清

水

輝

夫

ル

庄

司

進

一

ル

杉

村

公

也

ル

高

守

正

治

ル

田

代

邦

雄

田

稔

宮 崎 医 科 大学 衛 生 学

ル

宝

来

聴

国 立 遺 伝学 研 究 所 人知 遺 伝 研 究〒8 89−16

教

授06−45 1−005 1（
直通）（内269）（内2330）教

授

0 992 −64 −2211（
内 2146）

助 教 授

0886 −31− 3111

数段

075 −75 1−3770

教授0886 −3 1−3 11 1（
内 32 04）（
内2320）
講師

03 −3813−6 111

講師

03 −3964 − 1211

助 教 授

0263−35 −4600（
内3385）（
内8763）（内5321）
講師

教

授

0 762 −62 −8151

教‡受

0 11−716 −1161

教授0985 −85 −08 73（
内 3950）（
内 6027）

（
直通）
助

手

0559 −75−077 1

助 教 授

0298 −53 −3224

助025−223 −6 161

三 島市 谷 Ⅲ1111

水

澤

英

洋

筑 波大 学 臨 床 医 学 系神 経 内 科

／
／

田

中

恵

子

新 潟大 学 神 経 内 手斗052−74 1−2111（内2297）

宮 崎 県宮 崎 郡 清 武 町木 原 5200

ル

〒95 1

045−97 1−1151

札幌 市 北 区北 14条 西 5 T H

濱

〒3 05

授

金 沢市 宝 町 13 − 1

J／

〒4 11

教

名 古屋 市 昭 和 区鶴 舞 町 65

北 海 道 大 学 医学 部 神 経 内科
〒 0600423−46 − 1715

松 本市 旭 3 − 1 − 1

金沢 大 学 医学 部 神 経明 科
〒920

長

文 京 区本 郷 7 − 3 − 1

名古 屋 大 学 医学 部 神 経明 科
〒466

室

文 京 区湯 島 1 − 5 −45

信州 大 学 医 学部 第三 内 子
斗
〒390

（
内3445）

徳 島 市蔵 本 町 3 −18 −15

東 京大 学 医 学 部 脳研 神 経 内 科〒 1130285−4 4−2 111

京 都 市左 京区 聖 護 院 河原 町 54

東 京 医科 歯 科 大 学医 学 部 神 経 内科
〒 113（
内4002）

助 教 授

徳 島 市蔵 本町 3 丁 目

徳 島大 学 医 学 部 小 児科
〒7700423 −2 5−388 1

鹿児 島 市 宇宿 町 1208− 1

京 都 大学 医 学 部 神経 内科
〒606

副 参 事

大阪 市 福 島 区福 島 1 − 1 −50

徳 島 大 学 医学 部 第一 内科

0255 −34− 313 1

研 究 只

横浜 市 緑 区 藤 が 丘 1 −30

光連 絡 の際 の 電 話（
内5 53）

小平 市 小 川 火町 4 − 1 − 1

大阪 大 学 医学 部 小 児 科

〒 890

長

栃師
薬
木寺
県 3311−
河内郡南
1 河内 町

昭和 大 学 藤 が丘 病 院 神 経 内科

〒 553

医

新
犀潟
潟468
粕 I−
】
翫1城 郡 大潟 町

仲太郎

弘

け る地 位

国立 精 神 ・神 経 セ ン ター神 経 研 究 所

〒227
ル

所属にお

地

自治 医科 大 学小 児科

〒187
ル

名

府 中 市武 蔵 台 2 − 6〒329−04／／設在馴 東 京都 神 経 科学 総 合 研 究所 生 化 学
〒 183

桃

施

国 立療 養 所 犀 潟病 院 神 経 内 科〒949−31

ル

属

所

（
内568）

茨 城 県 つ くば 了‡
J天 王 台 1 − 1 − 1

新 潟 市旭 町 通 1 番町 757
−266−

手

（
内5 183）

区

分

：
旺

氏

員

所

名

森

正

敬

所

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三

好

和

夫

施

公

義

国 立 静 岡病 院

〝

盟

康

夫

東 京 都 老 人医 療 セ ン ター

〒420

〒 173
部

和

子

け る地 位授096 −344−2 111（内6771）

名誉 教 授0886 −31−3 111

院

長0542 −45−0 10 1

院

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03−3964− 113 1

静 岡 市城 東町 24 − 1

板 橋 区 栄 町35 − 2

沖 中記 念成 人 病 研 究所
〒 105

教

連 結 の際 の 電 話

徳 島 市 蔵 本町 3 丁 目

字尾野安

所 属 にお熊本市九■‡71寺 4 −24 − 1

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事 務 担 当者名地

徳 島大学 医 学 部 第 一 内科
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