技術紹介

株式会社大阪ソーダ

アダマンチル基を有する逆相系カラムの特長と分離性能
西山尚秀

1 は じ め に
現在，高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は，汎用性の高い分析方法として，様々な分野で使用されている．これまで，HPLC の分離モードは数多く存在するが，その 80 ％ 以上は，逆相系と言われている．HPLC用の逆相カラムは，オクタデシル基，ODS（C18）を代表として多くの場合，シリカゲル基材の充塡剤が採用されている．これは，シリカゲル系充塡剤が，耐圧性，溶媒安定性に優れ，シャープな細孔径分布を有している

図1

化学結合型充塡剤とポリマーコート型充塡剤の概念図

ため，分離性能が高く，適用対象試料の範囲が広いといった特長を持つからである．

2013 から 2017 年当時，ODS カラムとの差別化を図るために資生堂は，化粧品開発で培った粉末表面処理技術を応用し，アダマンチル基を有する充塡剤を開発した1）．に化学結合型充塡剤とポリマーコート型充塡剤の概念を示す．
充塡剤の評価から，パラメーターを算出することにより，その基本特性を把握することができる．本稿で示す

2017 年 12 月 か ら， 医 薬 品 精 製 材 料 分 野 で， 世 界トップレベルシェアの HPLC 用シリカゲルを持つ大阪

パラメーター算出用の HPLC の分析条件は，後述する
図 5 の条件を用いた．

ソーダが，資生堂のクロマトグラフィー事業をすべて承2･2 疎水性相互作用継することになった．
本技術紹介では，充塡剤およびカラム評価方法，そし疎水性相互作用は，ODS シリカゲルが有する本来のて，通常の逆相系 ODS（C18）とは異なる分離特性を性質を示すものであり，充塡剤にどのくらいの保持能力持つアダマンチル基を用いた弊社の特長的なカラムの紹があるかを示すパラメーターである．C18 基を導入す介をする．

る際に用いたシリル化試薬の種類，反応率等により種々2 充塡剤およびカラム評価方法の値を示す．弊社では，トルエンとベンゼンの分離係数
α（Toluene/Benzene）を用いてこの疎水性パラメーター

2･1 基本特性評価方法

2）3）を算出している．一般にハイカーボンな充塡剤ほどその逆相系カラムで最も汎用されるカラムは C18 基を有値は大きくなる傾向にあり，パラメーターの大きい充塡するカラム，すなわち ODS カラムと呼ばれるものであ剤ほど中性化合物の保持が大きくなる．すなわち，一般るが，同じ ODS カラムと言ってもメーカー各社それぞ的に，疎水性の高い化合物を分離対象とする場合，このれ性質が異なる．これは，シリカゲル物性（比表面積，パラメーターが大きなカラムを選択すると保持が長くな細孔径），シリル化試薬の種類と反応率，二次シリル化る．

試薬と反応率などにより左右される．そのため，目的物質の分析に最も適したカラムを選択するためには，メー2･3 表面極性

カー各社の充塡剤の性質を知ることが必要不可欠であ表面極性は，シリカゲル表面のシラノール基（Si─OH）

る．そこで，弊社では標準物質を用い，ある一定の条件を含め充塡剤表面の極性基が影響するパラメーターであ下において，従来からの化学結合型充塡剤および弊社ポる．この値が小さい（非極性）充塡剤ほど極性物質は早リマーコート型充塡剤の性能評価を行っている．図 1

くシャープに溶出する傾向がある．このパラメーター

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図 2 パラメーターマップ：疎水性と表面極性の評価結果

は，安息香酸メチルとトルエンの分離係数 α（Methyl-

図 3 アダマンチルエチル基（ADME 基）の構造benzoate/Toluene） で 評 価 し て い る． 例 え ば， 弊 社

CAPCELL PAK（カプセルパック）は，シリカゲルをシリコーンポリマーで被膜しているため，市販のカラムに異なる，アダマンタンを官能基として使用することをの中においても相対的に小さな値となるが，C18 基の考えた．アダマンタンは，10 個の炭素がダイヤモンド導入量を精密にコントロールすることにより，表面極性の構造と同様に配置されているカゴ型の C10 分子であのパラメーターを自在に設計できる．通常，メーカー各り，このアダマンタンとシリカゲル基材とをエチル基を社 の 水 系 100 ％ 移 動 相 下 で 使 用 可 能 な 高 極 性 ODSスペーサーとして結合させた充塡剤を開発した．図 3（C18）カラムと呼ばれているものも C18 基の導入量をにアダマンタン，アダマンチルエチル基（ADME 基）コントロールして調製される．の構造を示す．ADME 基を狙った密度で充塡剤表面に導入し，これまでの逆相カラムとは異なる特長的な分離
4）2･4 パラメーターマップとカラムの開発を達成することに成功した．ADME カラムは，ある程

図 2 に弊社カラムの位置づけおよび他社カラムの性度の疎水性を保ちながら，表面極性も高く設計され，こ質を調査するために先のパラメーターを算出し，疎水性れまでにないマッピングポジションを持った充塡剤とと表面極性の値をプロットした充塡剤のパラメーターなった．

マップを示す．最適なカラム選択におけるポイントは，充塡剤の疎水性と表面極性のバランスでカラムの分離特性の違いが生じるため，目的化合物の疎水性と極性を考3･2 ADME カラムのメカニズム

図 4 に ADME カラムと C18 カラムにおける充塡剤慮することが重要である．弊社 CAPCELL PAK C18表面のイメージ図を示す．C18 カラムの場合，一般的スを最適化したカラムで，弊社標準の逆相系 C18 カラ

相の種類によっては寝込み状態にあると考えられてい

MGII と呼ばれるカラムは，疎水性と表面極性のバランに C18 基は直立しているのではなく，絡み合い，移動ムである．本カラムのパラメーター及び実際の目的化合る．極性化合物が近づいてきた場合，C18 基がもたら物の分離挙動を基準とすると，他のカラムに変えたときす疎水場の影響で極性化合物が充塡剤の表面と相互作用の分離挙動が想像しやすい．これまで弊社が上市した逆をしようとするが，その際に非常に大きなエネルギーを相カラムは，図 2 のバンドから抜けるものは見られない．当時の資生堂は，新しい充塡剤，カラムの開発をするにあたり，疎水性と表面極性に注目して開発を進めてきたが，疎水性と表面極性は，トレードオフの関係であり，疎水性を犠牲にしながら，表面極性を上げるよう工夫をした．

3 アダマンチル基を用いた特長的なカラム
3･1 開発コンセプト
当時の資生堂の開発コンセプトは，通常の逆相充塡剤に多く使われている直鎖官能基（C18，C8，C4 など）を使用せず，他社製品と異なる分離性能を発現させ，差別化を図るということであった．そこで，構造が立体的
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図4

ADME カラムと ODS（C18）カラムにおける充塡剤表面のイメージ図149

表 1 ADME カラムの物性値

準物質中の安息香酸メチルが先に溶出し，続いてベンゼ

粒子径 細孔径 比表面積
密度
使用 pH 耐圧
C％（μm） （nm） （m2/g） （μmol/m2）
範囲 （Mpa）ンが溶出する．一方，ADME カラムの場合，ベンゼン，る．安息香酸メチルが極性部位を持つため ADME カラ2103102.7122～9100310310

2.7122～920510310

2.7122～920

安息香酸メチルの順に物質が溶出し，溶出順序が逆転すムでの保持が大きくなり，その結果，ベンゼンと安息香酸メチルの分離が，大きく改善される．また，ADMEカラムの疎水性が C18 カラムより低いため，トルエンの保持が短くなる．これらの物質の保持時間から算出さ要する．そのため，極性化合物は，充塡剤表面に近づくことができず，相互作用の影響を受けにくい．一方，
ADME カラムの場合，ADME 基は，カゴ型で立体的にれる ADME カラムの疎水性パラメーターは 1.91，表面極性 0.73 と算出される（図 2 参照）．

ADME カラムの基本特性と分離比較小さい構造を取ると考えられ，ADME 基間の相互作用4･2が弱い．極性化合物は，C18 基と比較して充塡剤表面

図 6 に同条件で一般的なコアシェル型 C18 カラム，高極性逆相カラム（弊社との相互作用，すなわち表面極性の影響を受けやすく， （弊社 CAPCELL CORE C18）
CAPCELL CORE AQ），ADME カラム（弊社 CAPCELL保持が大きくなると考えられる．
5）

3･3 ADME カラムの仕様および物性値

表 1 に ADME カラムに使用する充塡剤の物性値を示

CORE ADME）の分離比較したクロマトグラムを示す．
分析試料は，ホルモン薬であるエチニルエストラジオー
ル（ピーク 3）とその代謝物である 17β─エストラジオー

す．原料シリカゲルには，弊社製品の中でも粒子径，細ル（エストロゲン）（ピーク 1）とエストロン（ピーク孔径が精密にコントロールされた高純度で金属分が少な2）を用いた．2，3 は，化学的構造が類似しているたく，アルカリに対しても耐性がある高強度シリカゲルをめ一般的な C18 カラムでは分離が困難であった．高極用いて調製した．

4 ADME カラムの分析例及び基本性能評価
4･1 ADME カラムと C18 カラムの分離比較

図 5 に一般的な C18 カラム（弊社 MG II）と ADMEカラムの分離比較したクロマトグラムを示す．これは，カラム以外の分析条件を同じにして，10 種類の標準物質をプロットしたものである．C18 カラムの場合，標図 5 ADME カラムと C18 カラムの分離比較
HPLC 条件：カラム，固定相は図中に表示，4.6 mm i.d.×150
mm，5 μm； 移動相，水／メタノール＝50/50； 流速，1.0mL/min； カラム温度，40 ℃； 検出：UV 254 nm； ピーク，1. ウラシル，2. カフェイン，3. フェノール，4. 2- エチル
ピリジン，5. 安息香酸メチル，6. ベンゼン，7. N,N ─ジメチル

アニリン，8. トルエン，9. フェニルアセチルアセトン，10. ナ
フタレン

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図 6 ADME カラムの基本特性と分離比較
HPLC 条件：カラム，コアシェル型カラム固定相は図中に表示，2.1 mm i.d.×50 mm； 移 動 相， 水／ ア セ ト ニ ト リ ル＝70/30 ； 流速，0.4 mL/min； カラム温度，40 ℃； 検出器，PDA，220 nm； ピーク，1. 17β─エストラジオール（エストロゲン）（E2），2. エストロン（E1），3. エチニルエストラジオール（EE）．
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性逆相カラムは，炭素含有率（C ％）を一般的な C18ン（ピーク 3）及びドパミン（ピーク 5），その前駆体能と最適化したカラムである．この高極性逆相カラムをであるノルメタネフリン（ピーク 6）及び極性の高い生使用した場合，全体的に他のカラムと比較して保持が短体アミンのクレアチニン（ピーク 1）である．分析に使くなるが，2，3 のピークの分離が，改善の傾向を示し用したカラムは，図 7 中に示した．検出器として，ユ充塡剤よりも小さくし，水系 100 ％ の移動相で使用可た．ADME カラムを用いた場合，全体的に他のカラムと比較して保持も大きくなり，2 と 3 の完全分離の達成を可能にした．この分離例から ADME カラムは，極性基に対して認識能が高いと言える．

4･3である l ─ドパ（ピーク 4），ノルエピネフリンの代謝物

ニバーサルなエアロゾルベース検出器である NQAD（Nano Quantity Analyte Detector）（大阪ソーダ製）を用いた．高極性 C18 カラムでは，1 及び 2 のピークが重なり，水系 100 ％ 移動相が使用可能なハイブリッド
C18 カラムでは，4 と 5 のピークが重なり分離不良な

生体アミン類の溶出挙動の比較

傾 向 を 示 し た． 一 方，ADME カ ラ ム を 用 い た 場 合，

図 7 に水系 100 ％ 移動相での生体アミン 6 種の溶出

各々 5 μm，3 μm の粒子径とも良好なピーク形状と充分挙動を示す．用いた試料は，カテコール骨格を有する神な分離能が得られた．これは，ADME が極性化合物に経伝達物質ノルエピネフリン（ピーク 2），エピネフリ対して大きな保持力を発現でき，そのため，良好な分離を達成し，髙理論段数を示したと考えられる．

4･4

有機酸の溶出挙動の比較

図 8 にカルボキシル基を有する 10 種類の有機酸を分

図 7 生体アミン類の溶出挙動比較
HPLC 条件：カラム，固定相は図中に表示，4.6 mm i.d.×150mm； 移 動 相，0.1 ％ ギ 酸 水 溶 液； 流 速，1.0 mL/min；
カ ラ ム 温 度，40 ℃； 検 出 器，NQAD（Evaporation 60 ℃，Nebulizer 30 ℃）； 注入量，3 μL ピーク，1. クレアチニン，
2. ノルエピネフリン，3. エピネフリン，4. l ─ドパ，5. ドパミン，6. ノルメタネフリン．
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図 8 有機酸の溶出挙動の比較HPLC 条件：カラム，固定相は図中に表示，4.6 mm i.d.×150mm； 移 動 相： 0.2 ％ リ ン 酸 溶 液， 流 速：1.0 mL/min；
カ ラ ム 温 度，35 ℃； 検 出：UV 215 nm； 注 入 量：20μL； ピーク，1. 酒石酸，2. ギ酸，3. リンゴ酸，4. マロン酸，5. 乳酸，6. 酢酸，7. マレイン酸，8. クエン酸，9. コハク酸，10. フマル酸．

151析した例を示す．水系 100 ％ 移動相を使用可能なハイブリッド C18 カラムでは，酒石酸（ピーク 1）とギ酸

5 ADME カラムの核酸分析例及び評価（ピーク 2）の分離度は RS（1－2）C18＝1.18 でベースライ

5･1 核酸塩基とオリゴ核酸の分析の意義

ン分離を達成させることは困難であった．一方，同条件

近年，新型コロナウイルス感染症対策としてコロナワで ADME カラムを用いた場合，RS（1－2）ADME＝1.93 のクチンが開発され，核酸医薬が注目されるようになって完全分離を達成させることができた．カラム長を伸ばす

きた．核酸医薬は，オリゴ核酸を基本骨格とした医薬品ことで C18 カラムでも分離改善が可能と考えられたが，である．核酸塩基，ヌクレオシド及びヌクレオチドは，分析時間が長くなることが示唆された．一方，クエン酸

極性の高い化合物であり，ADME カラムを分析に用い（ピーク 8）は，測定に用いた試料の中で最も分子量がることで，特徴的な分離が可能であることが示唆され大きく，炭素数も最も多い 6 個であることから，アダた．そこで，ADME カラムを使用した分析例及び他のマンチルエチル基（アルキル基）の作用による表面極性官能基の溶出挙動を示す．

よりも C18 基（アルキル鎖）の疎水性による保持力が優位に働き，保持時間が同等であったと推察される．また，マレイン酸（ピーク 7）とフマル酸（ピーク 10）のクロマトグラムの比較から，ADME カラムはシス－トランス異性体に対する高い分離能が示唆された．

5･2 核酸塩基及びヌクレオシドのグラジエント溶出を用いた分析
図 9 に 7 種類の核酸塩基及びヌクレオシドの分析した例を示す．高極性 C18 カラムや水系 100 ％ 移動相を使用可能なハイブリッド C18 カラムは，1 から 7 までのピークの溶出パターンが類似し，グアノシン（ピーク 5）及びアデニン（ピーク 6）の保持時間も近い関係性を示した．それに対して，ADME カラムは異なる選択性を示し，特にチミン（ピーク 4），ピーク 5，6，ア

図9

核酸塩基及びヌクレオシドのグラジエント溶出を用いた
分析
HPLC 条 件： カ ラ ム， 固 定 相 は 図 中 に 表 示，2.0 or 2.1 mm
i.d.×150 mm ； 移動相：A）10 mmol/L ギ酸アンモニウム水溶液，B）アセトニトリル， B のグラジエント： 1 ％（0 min）
→ 1 ％（1 min）→ 40 ％（15 min）→ 1 ％（15.1 min）； 流
速 ：0.2 mL/min； カラム温度：40 ℃； 検出：UV 254 nm ；注入量：2 μL； ピーク，1. シトシン，2. ウラシル，3. グアニン，4. チミン，5. グアノシン，6. アデニン，7. アデノシン．

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図 10 オリゴ核酸のグラジエント溶出を用いた分析
HPLC 条件：固定相は図中に表示，カラム，C18 MGII S3，
C8 DD S3，Ph UG120 S5；2.0 mm i.d×150 mm，ADMEHR S3；2.1 mm i.d.×150 mm，移動相：A）100 mmol/L トリ
エチルアミン─酢酸緩衝液（TEAA），B）100 mmol/L TEAA,アセトニトリル（CH3CN），流速：300 μL/min，カラム温度：50 ℃， 検 出：UV 260 nm， 注 入 量：2 μL， ピ ー ク，1. 14mer，2. 17 mer，3. 20 mer，4. 21 mer．
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デノシン（ピーク 7）の保持も大きくなり，良好な分離

ADME カラムは，ODS（C18）カラムで保持が小さい，を達成した．

分離ができない場合には，条件はそのままでカラムを交換することで分離改善の可能性を示した．ODS カラム

5･3 オリゴ核酸の官能基の相違による溶出挙動の比較と比較して優れた保持力，異なる選択性及び良好なピー

図 10 にオリゴ核酸の分離検討をした結果を示す．グク形状を示すため，医薬品業界など，あらゆる分野の核ラジエント時間は 30 分間に固定した．この条件下での酸関連化合物の分析，分取への適用が期待される．

官能基ごとに有機溶媒であるアセトニトリルの初期比率及び最終比率が異なるが，20 mer（ピーク 3）及び 21mer（ピーク 4）の適度な保持と分離を両立する有機溶媒の勾配は，C8 カラムを除いて，約 5 ％ であった．この条件下で C8 は，ピーク 3，4 のベースライン分離を達成することはできなかった．また，有機溶媒比率は，Ph＜C8＜C18＜ADME の順番となった．本条件下において，オリゴ核酸の保持は，ADME カラムが最も大きく，ピーク 3，4 の分離度も RS（3－4）ADME＝2.24 と有機溶媒比率を大きくしても良好な分離結果が得られた．オ文

献1） 株式会社 資生堂：廣江宜久，特許 6199140 号，“充填剤の製造方法，充填剤及びカラム”（2017. 9. 20）．
2） 神田武利：分析化学（Bunseki Kagaku）, 59, 175（2010）.
3） Taketoshi Kanda：Chromatography, 32, 95（2011）.
4） 株式会社 大阪ソーダ：“高速液体クロマトグラフ用カラム総合カタログ”，（2018 年 2 月発行）．
5） 株式会社大阪ソーダ：“HPLC 用カラム主要グレードカタログ”，（2021 年 4 月発行）．
●

リゴ核酸分析においても ADME カラムは，有効に使用可能であることを示した．

●西山 尚秀（Takahide Nishiyama）
株式会社大阪ソーダ（〒551─0011 大阪
府大阪市西区阿波座 1─12─18）．東京都立大学大学院工学研究科応用化学専攻博士

6 ま と め充塡剤評価方法，そして，特長的な官能基であるアダマンチルエチル基を修飾したカラムについて紹介した．

課程修了．博士（工学）．《現在の研究テー
マ》新規 HPLC 用充填剤開発．《趣味》音楽鑑賞，スノーボード，水泳．

E-mail : tnishiya@osaka-soda.co.jp

会社ホームページ URL：

http://www.osaka-soda.co.jp

関連製品ページ URL：

https://sub.osaka-soda.co.jp/HPLC/

URL：

https://sub.osaka-soda.co.jp/HPLC/column/cpadme.html

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