厚生

省

神経疾患研究委託費

筋ジストロフィー症モデル動物の開発に関する研究

野村班

昭和62年度研究報告書

昭 和 63年 3 月

研究報告書作成にあたり
この報告書は、昭和60年度より発足した厚生省神経疾患研究委託費による「筋ジストロフィー症モデル動物の開発」に関する3年目の報告であります。
モデル動物の開発は、自然発生の異常形質の発見、特性の分析、遺伝的背景の均一化など、極めて長い年月を必要としております。しかし、最近では分子生物学の発展により、従来の実験動物技術と組合せた発生工学的手法を用いて、積極的にモデル動物を作出する研究も行われるようになりました。
本研究班は、従来技術によるモデル動物の開発、改良、特性の分析を行うと共に、新しい技術によるモデル動物の開発技術の研究も行いました。その結果、新しい手法による筋ジストロフィー症モデル動物を作出する可能性が示唆されております。これら、昭和62年度の班員各位の研究成果をここにまとめました。
今後とも、私どもは筋ジストロフィー症研究をすすめるため、より良いモデ
ル動物の開発改良に努力いたしますので、諸班の先生方の御協力をお願い申し上げます。

おわりに、御協力下さった班員各位、ならびに本研究費の取り扱いに種々お世話頂いた厚生省当局、国立精神神経センター神経研究所、日本筋ジストロフ
ィー協会の方々に心から感謝いたします。

昭和63年3月

野

村

達

次

目

次

筋ジストロフィー症モデル動物の開発に関する研究総括概要（3年間）
野

1

村

達

次

筋ジストロフィー症に関する文献調査（1987）

5

野

村

達

次

神経原性病変とミトコンドリア電子伝達系の異常

13

研究協力者

埜

中

征

哉

大

滝

悦

生

古

賀

靖

敏

遺伝子導入によるヒト疾患モデルの作成

27

勝

木

元

也

筋ジストロフィー（C57BL／6−dy）マウスの計画生産への体外受精法の応用

研究協力者

35

横

山

峯

介

日

置

恭

司

塩

野

博

子

長谷川

孝

徳

遠

幸

夫

藤

mdxマウスのDMD遺伝子について

39

研究協力者

高

松

塚

田

研
裕

三

筋ジストロフィーマウス（mdx）骨格筋線維の壊死と再生

研究協力者

47

菊

池

建

機

守

屋

弘

美

松 崎 哲 也

63筋ジストロフィー症研究のためのGAD・MDX複合マウス系統の育成

研究協力者

富

田

山

崎

武
一

斗

榊 原 朱 実向山

昌邦

菊 池 建 機79

筋ジストロフィー症動物モデルとしてのセロトニンミオパチー

研究協力者

三

池

輝

久

鳴

神

浩

吉

岡

毅

91

ミエリン形成異常ウズラについて

研究協力者

水

谷

布

谷

誠

鉄

夫

99

C57BL／6−dy生産方法の改良−ビニールアイソタータを用いた卵巣移植の試み

研究協力者

斉

藤

江

袋

日

置

宗

雄

進
恭

司

昭和62年度厚生省研究報告書，1−4，1988

筋ジストロフィー症モデル動物の開発に関する研究総括概要 （3年間）
主任研究者
1．3年間の研究班の研究目標とその成果

野

村

達

次■

（2）筋ジスマウスC57BL／10−m血；1983

本研究軌ま神経疾患ならびに筋ジストロフィ

年イギリスから導入して以来、ビニールアイソ

ー症モデル動物の①維持・生産、㊥開発・改良、レータで維持し、研究班員にタネ動物を供給し㊥新しい胚操作技術によるモデル動物の開発を分担研究目標とした。

ている。導入以来、60校閑に約500匹のタネ動物を供給した。

（カ モデル動物の維持・生産（3）筋ジスハムスター；1982年より810−

研究目標

14．6系、UM−Ⅹ7．1系を維持し、育種学的改筋ジストロフィー症（筋ジス）研究に汎用さ良を加えている。BI0−14．6系の筋ジス遺伝子

れる、筋ジスマウスC578L／6−dy系、C57

町を省きコントロール系の育成を試みたが、

8L／10−m血系、筋ジスハムスター、BI0−世代と共に指標とする舌白斑の発現にバラツキ

14．6系、UM−Ⅹ7．1系ならびに筋ジスニワトがみられ育成が困難となった。そこで、my因リNH−412系、NH−413系を維持・生産し、子を他の系統に導入する、新しい筋ジス系の育班員あるいは一般研究者に配布する、と共に維成を試み、現在N3に達している。

持・生産方式を改良することを目標とした。

（4）筋ジスニワトリ；NH−413系ならびに研究成果

コントロールのNH−412系（1）筋ジスマウスC57BL／6−如；1969年

を研究班員に供給している。供給数は年間約より維持し、1983年SPF化を計った。今期

10，000個である。なお、これらNH−413、（昭和60⊥62年）は、実験用またはタネ動

NH−412は、筋ジス遺伝子αm以外の遺伝的背物を合計約300匹供給した。維持生産方式の景も異なる。そこで、αm田子を77イオミ種

改良は、SPf 生産の合理化を計るため、卵巣のGsN／2系および白色レクホン種のWL−GM

移植手術用アイソレータを製作し、滅菌方法、系に導入し、GsN／2−aTTL系とWL−GH−am系

移植技術等に工夫を加え、アイソレータ内無菌を育成した。

を維持し、受精卵

的卵巣移植技術を確立した。また、発症前dy㊥ モデル動物の開発・改良

ホモマウスを得るための体外受精技術の開発は研究目標

前期（昭和57−59年）の育成率（体外受精

既存の実験動物マウス、ラット、ウズラ等の卵を移植し産仔まで育成した率）が30珍であ中から、新しいミュータント形質の探索、それったものが、技術的改良を加え、今期の育成率

らの成因の解明ならびに筋ジスモデル動物につは50ヲら以上となり実用化できる見通しがたっいては形質の比較検討を行い、モデル動物とした。

ての評価を行うことを目標とした。

・（財）実験動物中央研究所ー1−

いことが明かとなっている。

研究成果（l）GAD（gracile axonal dystro−（4）C57BL／6−dy及びC57BL／10−Tn血phy）マウス；前期CBA／NgaとRFM／Nga

マウスの骨格筋の組織学的検討；前述の体外受の交配実験F2で発見された後肢麻痺マウス．精技術により発症前の若齢如ホモマウスが得（hindlimb paralyses−hFp）は、病理られたことから、詳細な検索が可能となった。

組織学的検索の結果、延髄の薄束核およびそれ

dy、m血マウス共に生後7−10日齢頃まに続く骨髄の背索にある薄束に限局する変性病

で筋線経の発育と分化は正常であったが、それ変に起因する軸索ジストロフィー（gracil

以後に筋線経の壊死がはじまった。壊死は両者

axonal dystrophy）であることが明か

とも全ての筋に活発にみられ、症状の少ないとなった。そこでん句マウスを改めて、GAD

md∬マウスに強かった。壊死に続く再生線経は

マウスと命名した。さらに、このマウスの病因訊ねに多く、dyマウスは散在性であった。筋の解明のためC57BL／10一m血と組合せた複線経の大小不同、結合織の増生はdyマウスに合異常マウスの育成に着手し、N3に達した。

著明であったがm血マウスでは、問質結合織の（2）SRK（shaking rat kawasaki）

増生はなかった。仇血マウスでは生後2−3日

ラット；無菌ウイÅターコロニーで発見された

以後壊死線経は減少し、再生線経で置換されて後肢麻痺ラットである。遺伝様式は常染色体劣いた。両者の血管病変を検討したが、明かな差

性遺伝しホモ型は生後2遇齢頃から発症し、生は認められなかった。

後3−4適齢で死亡する。病理学的検索では末（事 新しい胚操作技術によるモデル動物の開梢神経・筋肉系に発育・分化の遅れが見られる

発以外異常のないことが明らかにされた。中枢神研究目標

経の形態学的検索により主病変が神経細胞の位発展の著しいバイオテクノロジーと従来の実置異常でノぁることが明かとなった。従って、こ験動物技術とを組合せた、新しい胚操作技術をのラットは筋ジストロフィーのモデルとはなり用いて、ヒト筋ジストロフィー鹿の疾患モデル

難いが、中枢神経系の研究に有用であると思わ動物を開発・育成することを目標とする。
研究成果

れる。
（3）糖尿病Ⅱ型ウズラ；前期発見された梼原

（1）遺伝子導入マウスの作出；退伝子DNA病Ⅱ型モデルウズラである。RW系を維持し以導入技術確認のために、免疫関連遺伝子IL−下の育種学的改良を加えた。RW系は有色卵を2のDNAをマウス受精卵に注入し遺伝子導入

産卵するので、検卵容易な白色卵系へ、RW因マウスの作出を試みた。その結果、得られた遺子を導入しRWE系を育成した。さらに、胚操伝子導入マウスの中には行動異常を示すものが作実験を容易とするためアルビノ形質をRWE

出現し、これらの解析の結果、マウス個体で発系に導入しRWA系を育成した。

現し小脳欠損を示し、この遺伝子DNA導入技

また、ミエリン形成異常ウズラが発見されて術は、ほぼ確立されたものと考えられる。

おり、この形質の退転様式は、常染色体劣性退（2）DMD遺伝子の解析；ヒトDMD変異遺転し、ホモ型は若齢時死亡率が高く受精率も低伝子の一部が明かとなったので、DMD遺伝子

一2−

の2個所に相当する遺伝子を化学合成し、これある。

をプローブとしてm血マウスの検索を行った。

（動 新しい胚操作技術によるモデル動物の開Tn血マウスではDMDmRNAの発現は正常マウ

発；ヒト遺伝子DNAを注入した遺伝子導入マスに比べ10分の1程度で染色体遺伝子ノミター

ウスの作出は、導入技術が確認され、ヒトDMD

ンは検索を行った限りでは正常との間に変化をのDNAも得られるものと思われることから、認めることはなかった。m血では、DMD遺伝

目標とするDMDのモデルマウスは胚操作によ子の軽度の異常が存在することが示唆された。

り比較的早く作出されるものと期待される。

（3）キメラマウスによる筋ジストロフィー症

3．今後当該分野の研究の進め方についての意の解析；集合法によりC578L／巧一m血とC3H／

見

ⅠもならびにBAL且確のキメラマウスを作出し、組織学的検索ならびに筋力測定による症状を検（ヨ モデル動物の維持・生産；筋ジストロフ

討した。組織学的にはC3H／／He系に特異的にィー症の研究において、これらモデル動物の維反応する抗体で筋組織等を検索した結果、筋組持生産は不可欠である。このための経費と労力

織は複雑にまざりあいキメラ状を望することがはかなりなものが必要である。一方、凍結保存

明らかとなった。筋力測定においてはキメラ個技術の最近の進歩は著しいものがあり早急にと体は正常個体に近い筋力を有することが明かとりいれるべきと考える。

なった。

㊥ モデル動物の開発・改良；自然発症の異なお、新しい試みとして、ラットにおけるセ常動物からのモデル動物の開発は今後とも期待

ロトニンミオパチーの筋崩壊機序の検討を行っされる分野である。常時フィールドを監祝しモた。1つの簡便な動物実験系となる可能性があデルとして可能性のある異常動物を抽出・検索る。．

するシステムが国家レベルで確立されることが望まれる。

2．当該研究における未解決の問題点とその解決の見通し㊥ 新しい胚操作技術によるモデル動物の開発；ヒト筋ジストロフィー症のモデル動物の開① モデル動物の維持・生産；現在、維持生発において、現在、最も積極的に実施すべき分産されているモデル動物の、遺伝的微生物的統野である。このためには、DNAをクローニン

御は充分とは言えない。筋ジスハムスターやニグし解析するグループ、DNAを注入し退伝子

ワトリはコンベンショナルで、適切なコントロ

導入マウスを作出・育成するグループ、育成さール系も育成されていない。引き続きこれらのれた遺伝子導入マウスを評価・検索するグルー改良が必要である。

プが表裏一体となって研究する必要がある。

㊥

モデル動物の開発改良；前述の様にGAD

マウス、SRKラット、糖原病Ⅱ型ウズラミェ

4．当該分野に対する国外の研究状況の概要

リン形成異常ウズラ等が発見され、病因の解明

亘）モデル動物の維持・生産；1つの研究グがなされた。しかし、モデル動物としての評価ループで、このように多種多様な筋ジスモデルの検討は不十分で、さらに研究を続ける必要が動物を維持しているところは、国外にない。

一3−

（参 モデル動物の開発・改良；アメリカの

しかし、この技術でモデル動物を開発し医学研

Jackson研究所では、毎月、維持・生産コ究に応用しようとするグループは国外にはない。

ロニーで発見される異常動物の￣市 が開かれ、研究者は、興味のあるものを選び研究・検索し、世界的に有用な多くのモデル動物を育成していモデル動物の開発・研究は、基本的に対照とる。我国には、このようなシステムはない。

する病気の研究を支援するものと考える。従っ㊥ 新しい胚操作技術によるモデル動物の開て、本研究班の継続に当たっては、筋ジス研究

発；DNAの個体レベルでの発現についての遺者（患者を理解している医者）の監視・指導の伝子導入動物の研究は、世界的に行われている。

下に運営されるべきであると思う。

−4−昭和62年度厚生省研究報告書，5−12，1988

筋ジストロフィー症に関する文献調査（1987）
野 村 達 次■筋ジストロフィー症モデル動物の開発研究の関する動物実験」について、MEDLINEに一環として「疾患モデル動物」、「哺乳類、ト入力された文献調査をおこなった。それらの中り頬における筋ジストロフィーとその近縁疾患」

から、海外における的ジストロフィーに関するならびに「筋ジストロフィーとその近縁疾患に

文献（1987年分）を以下に紹介する。

H I C E

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ー12−昭和62年度厚生省研究報告書，13−26，1988

神経原性病変とミトコンドリア電子伝達系の異常埜 中 征 哉●
研究協力者 大滝悦生：古賀靖敏■＜はじめに＞＜対象・方法＞

乳児脊髄性筋萎縮症infantile spinai
muscular atrophy

対象は、Werdnig−Hoffmann病3例（症の重症型に分類され例1．3カ月男児、症例2．6歳男児、症例3．

るWerdnig−Hoffmann病は、神経原性疾患

27生日女児）の生検骨格筋について筋病理検の中で代表的疾患として知られている。その臨

索、ミトコンドリア電子伝達系酵素を測定した。

床像は、生後3カ月以内に筋緊張低下、哺乳力

またラットではSPF−Wistar系、雄、体低下で発症しさらに筋力低下を伴い1歳未満で重180−2007、18匹を用いてエーテル麻酔

多くは死亡する予後不良の疾患である。病理学

下で右股関節のレベルで坐骨神経を1m切除し、的には脊髄前角細胞の変性、脱落がみられ骨格左側を対照とした。切除後1遇、2軋筋は、群萎縮と呼ばれる著名な神経原性萎縮所にエーテル麻酔下にて左右の赤筋主体のヒラメ筋

見を示す（図1）。

（SOL）、自筋主体の長指伸筋（EDL）を起始

3過後

最近、我々は、Werdnig−Hoffmann病

部から終始部まで摘出した。それぞれ重量測定の生検骨格筋で脂肪滴を選択的に染色するOil

したのち筋病理用とミトコンドリア分離用の2

red O染色で筋線維細胞内に著明な脂肪滴をつに分けた。

認め（図2）またミトコンドリア電子伝達系酵筋病理では生検筋をコルク片の上に筋線経の素のうちのCOmplexⅣ（cytochrome c

方向が垂直になるようにトラガカントゴムで固oxidase）染色にて群萎縮に一致して染色性定し、液体窒素中で冷却したイソペンタン中での低下（図3）を認めた症例を経験した。1986

急速凍結固定した2）。なおラットではヒラメ筋

年、Kelleyら1）は、Werdnig−Hoffmannの左右を並置し（Side￣by side）、同時に病で尿中に異常な量のアジビン酸、セバシン酸

国定した。長指伸筋も同様に固定した。凍結し等のジカルポン酸を認めミトコンドリア内の脂た標本は、厚さ10／ で連続凍結切片を作製し、

肪酸代謝系昂の異常を合併した症例を報告した。

Haematoxytin and eosin（HE），mOdi−

これらより我々は、神経原性疾患とミトコンド

fied Gomori trichromeI NADH−TRI

リア機能異常との間には関連があるのではない

SDH，CytOChrome c oxidase（cco）

かと考えその関連性を明確Iご㌻るためWerdnig−の各染色を行った2）。

Hoffmann病の生検骨格筋そして除神経操作

生化学ではBookelmanらの方法3）に従っを加えたラットの生検骨格筋について生化学的、て生検節よりミトコンドリアを分離LNADH−

病理学的検討を行ったので報告する。

Cytochrome c reductase（NCCR），●▼……日日……＝………‥＝………………MHM．●■●●●●●●●●

・国立精神神経センター 神経研究所 微細構造部−13−

SuCCinate−CytOChrome c reductase

いてのみ対凧と比較して有意に低かった（Pく（SCCR）は、Mackierの方法4）、CCOは、

0．005）。SCCRではSOL，EDL

orliの方法5）に従って分光光度計（日立320

2、3週すべて有意差は認められなかった。

形）を用いて測定した。なおNCCR測定では

CCO活性値ではSOL，EDL

ともに1、ともに1、：乙ロテノン感受性をも検索した。蛋白測定は、

3遇すべてが対照と比較して有意に低かった

Lowryらの方法6）に従った0対照側と除神経（Pく0．05）（表2）。除神経後、第1遇の対側の比較検討は、St・udentls t testsを

表2．除神経後のCCO活性（経時的変化）
キPく0．05
L：対照側

用いた。

R：除神経側＜結．果＞0（l）Werdnig−Hoffmann病の3例についてCCO活性を測定した。症例1、症例2は、コントロールに対して229も、159あと低下を

1000

2000

3000

EDL

IW L
2W L

示したが症例3の27生日女児では低下は認めなかった（表1）。CCO染色についても同様に

3W L

症例1、症例2では対照と比較して染色性の低SOL下が認められた。

I W L

表1．Werdnig−Hoffmann病3例のCCO活性

2W L
R

aCtiYIty（nrnol08／mh／m9PrOt01n）
￠■801

3m M

60．2（22％）

C加●2

0y M

40．0（15％I

ca鳥●3

27d F

212．8（79％）

3W L
R￠Ontl01

照側EDLのCCO活性値は、2289．4±548．O
nmoles／min／mg proteinであり除神経

270．7 士133．0

側EDLのCCO活性値は、1133．7±546．8（2）ラットについて（N＝18）

nmoies／min／mg proteinで、対照に比筋重量については除神経1週後では対照側と較して低値であった（P＜0．005）。同じく第1比較してSOL，EDLともに有意差は認めなか遇の対照側SOLのCCO活性値は、2326．5±

った。2週、3遇後は明らかな有意差（P＝0）

1058，9nmOles／min／mg proteinで、を認めた。ミトコンドリア分離に用いた筋の湿除神経側は、1435．5±760．5nmOles／min／

重量あたり．の蛋白濃度については、対照側と比

mg proteinであり有意に低かった（P＜較してSOL，EDLともに1週、2過、3遇す0．05）。除神経後、第2週のEDLでは対照側、べて有意差は得られなかった。

除神経側、それぞれ公26．5＋10盟．9moles／

生化学的検索ではNCCRは、すべてPチノ

min／mg protein、1203．4±506．5nmOles／

ン感受性を示し、除神経後第2遇のSOLにおmin／mg proteinであり除神経側が有意に−14−低かった（P＜0．05）。同様に第2遇のSOL

り前角細胞のみならずそれ以下の末梢神経の障では対照側、除神経側、それぞれ2832．9＋

害でもW−H病と同じ病理像を認めることが証1072．4nmoles／min／mg protein、

明された8）。

863．5±491．7nmoles／min／mg protein

今回、我々は、W−H病3例についてCCOであり除神経側が有意に低かった（Pく0．005）。

活性を測定したが症例1（3カ月男児）および第3週のEDLでも2320．6±896．4nmOles／

症例2（6歳男児）では、それぞれ正常コント

min／mg protein、1089．3±549．8

ロール値の22珍、1595の活性を示したにすrmoles／min／mg proteinであり除神経

ぎなかった。症例3（27生日女児）は、79側が有意に低かった（Pく0．05）。第3遇のSOL

珍であり低下は認められず症例を増やして検討も同様で2928．0±837．8nmOles／min／mg

すれば加齢と病態進行度とCCO活性について

protein、1054．4±664．9nmoles／min／

関連性が認められると思われる。症例2は、長mg protein

期にわたり人工呼吸器を使用され筋病理学的にで除神経側が有意に低かった（Pく0．05）。

はW−H病の病魚で筋線稚内に著明な脂肪滴を筋病理では除神経後第1遇より対照側に比較認めた例で尿中ジカルポン酸は、測定していな

してSOL，EDLともに筋線維萎縮が認められ

いが（筋力ルニチンは測定予定）ミトコンドリ

CCO 染色にて除神経側が軽度ではあるが染色ア践能に何らかの障害があると考えられる。一性の低下が認められた（図4）。第2週でも方、同例ではCCO活性は、著明な低下を認め

SOL，EDLともに対照側に比較して染色性のたが同じ電子伝達系酵素であるNCCR，SCCR低下が著明であった（図5）。第3遇にてもについては対照と比較して低下は認められなか

SOL，EDLともに対照側に比較して染色性のった。また同じくNADHおよびSDIi染色につ低下が著明であった（図6、図7）。なお図4、

いてもそれらの染色性の低下は認められなかっ5、6は、ヒラメ筋であり図7は、長指伸筋をた。最近、我々は、筋原性疾患として代表的な示す。またNADH−TR，SDH染色ではSOL，福山型筋ジストロフィーにてもcco 活性が正EDL常対照との活性比が15野、22珍と著明に低ともに1週、2遇、3週すべて対照側に比較して染色性の低下は認められなかった。

下していた2例を経験した。おそらく神経原性疾患のみならず筋原性疾患の中の重症例には＜考察＞

CCO活性が低下している症例が隠れているとWerdnig−Hoffmann病（W−H病）は、思われる。

病理学的には脊髄前角細胞の変性と脱落を主病

また我々は、成熟ラットを用いて坐骨神経切変とする考えが一般に知られているが前板が一除して神経原性病変（筋線維萎縮）を示した

次病変で前角が二次的に障害されたとする意見

EDL，SOLについてCCOもある7）。またこれは、新生児ラットの腰部神とを証明した。Krieglerら9）は、ラット排経叢を絹糸で結染し1−2カ月後、長指伸筋お腹筋を用いて持続的運動負荷または下肢固定をよびヒラメ崩にてW−H病の筋病理所見である行うことによりミトコンドリア呼吸能は変動す

1arge group atrophyを認めたことによると報告している。またNemethら10）は、モ

一15−活性が低下するこ

ルモットを用いて除神経を行った2週後よりヒ】，遇（図4）では除神経側の染色性の低下は軽ラメ筋でCCO活性が対照に比較して低下した

度だが第2週（図5）、第3週（図6）は、著と報告している。以上より除神経病愚がミトコ

明になってくる。一方それぞれの対照と除神経

ンドリア電子伝達系酵素cco活性に対して何側の活性比をみる．と表2より60界、309も、らかの影響を与えるのは事実と考えられる。今359もであり除神経側のCCO活性が正常対照

回、我々の実験結果からは他のミトコドリア電値の30−359もに低下すると染色性も低下す

子伝達系酵素NCCR，SCCRについては除神るようだ。またヒトの筋ではCCO活性低下を

経後2週間めのSOLのNCCRが有意に低下し示した19例について実際の活性値とその染色たのみで他はすべて有意差は得られなかった。

性について検討したところ対照との活性比が一方Nemethら10）は、−tルモットではCCO

30界以下に低下した症例は、その染色性も対活性同様にSDH活性も対照と比較して低下が照と比較して低下を認めた。ラットもヒトも対みられたといい、またJorfeら11）は、ラット

照とのCCOを用いて除神経された俳腹筋、前脛骨筋、俳骨

その染色性も低下すると考えられる。これより筋等を4遇後に同時にCCO活性測定したとこ

CCO染色の結果のみからでは活性低下の判定

ろcco 活性は、対照と比較して低下は明らかには不十分であり酵素活性とともに判断すべきでなかったと報告している。Nemethらは、モと思われる。また同じく表2よりSOLでは対ルモットの誹腹筋を用い、Jorfeらは、我々

照側cco活性をみると第1遇より第2遇、第活性比が30珍ほどに低下するとと同じWistar系ラットを用いたが赤筋と白3遇の方がやや高値諒しているがKriegle㌔）

筋を分けることなく同時に一緒に活性測定したの意見に従って考えるとこれはおそらく除神経

ためか明らかな原因はわからないが我々と同一側の麻痺のため対照側に負荷が増加し、狭いゲの結果は得られなかった。我々の組織化学標本

ージの中のため速筋主体のEDLより遅筋主体

は除神経側と対照側の筋を並匿し、連続凍結切のSOLのミトコンドリア機能が高められて片標本を作製し染色を行ったので全く同一の条

cco 活性が高くなったのではないかと推測し件下で比較できたが3遇までのNADH，SDHた。以上のことより筋のミトコンドリア電子伝

染色は、CCO染色の結果と異なり対照と比較

達系酵素、CCO活性は、二次的要因により変して染色性の低下は認められなかった。NCCR，

動すると思われる。またミトコンドリア関連酵

SCCR，NADH染色、SDH染色については経

素は、筋肉の活動自身により二次的酵素誘導を過観察期間をさらに延長して検討する必要性がうける12）という意見もあり除神経状態が長期にあると思われるがSOL，EDLについては除神

続く場合cco活性は、影響をうけやすく、神経側の筋線維萎縮がさらに進行した場合は同一経は、？CO活性の調節因子の一つであると考えた。

検体で組織化学用とミトコンドリア分離用の二つに分けて採取するのは量的に困難かと思われる。ラットよりも大型の動物を対象として長期＜括にわたって実験するのが望ましいと考える。

梧＞（l）werdnig−Hoffmann病の中にはミ

SOLのCCO染色についてみると除神経後第トコンドリア電子伝達系酵素CytOChrome−16−c oxidase（cco）活性が低下を示す例があAL

ることがわかった。

etal：Protein

measure＿ment with the folin phenol（2）ラット除神経筋でCCO活性の低下を認

reagent，J BioI chem，192，

めた。
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（3） cco活性は、二次的要田により影響を
7）chou SM，埜中征哉：Werdnig−

うけやすく神経は、CCO活性の調節因子の一Hofrmann病−その病理発生を中心としつであると考えた。

て−．
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㌢

芳

r裾除け如し再栗野；雫琴謁
−1′＿▲

■

㌦∵k轡績

憾州担

︑

バ
図1・Werdnig−Hoffmann病の典型的群萎縮像
HE染色

▼

．
っ
T

筋線稚内に著明な脂肪滴を認める。

1

図2．症例2のOil red O染色◆

ユ■L．さ二＿皐

■

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▲

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I■チ鴫

図3・症例2のCytochrome c oxidase（cco）染色群萎縮に一致して染色性の低下を認める。

図4・ラ・ソトCCO

染色

ヒラノ簡

除神経後1遇 左：対照側
右：除神経側除神経側に的線維萎縮が認められ軽度の染色性の低下がみられる。

図5・ラットCCO染色

ヒラメ筋

除神経後2遇
除神経側の染色性の低下を認める。

図6．ラットCCO

染色

ヒラメ的

除神経後3週
除神経側の染色性の著明な低下を認める。

￣¶貯

￣1■

1
．
．
▲
r

￣

長指伸筋

除神経側の染色性の低下を認める。

■■■■J■L■■∵巌．鰻
図7．ラットCCO染色
除神経後3遇

1

了∵針二才

■￣

一

▲▲雫．

封ニ

と

一．冬

ン

∴旗門

▲

マ

昭和62年度厚生省研究報告書，27−3，1988

遺伝子導入によるヒト疾患モデルの作成
勝 木 元 也＊
（1I 要

約ている。そのためには、いかに速く、正確に、米国のKUNKELらのグループによって、ヒトデ両も整理された形で結果を得るかの工夫が必要ュシュンヌ型筋ジストロフィー症（DMD）の遺伝であることは述べるまでもない。この工夫こそ子が単離され、最近構造が扱告された。このDMDが、新しいバイオテクノロジーそのものを生み遺伝子を導入したトランスジェこ，クマウスを作成出す可能性を秘めている。しかし、たとえヒトすれば、退転子の揆能が分かる可能性がある。

の染色体DNAの全塩基配列の決意が成功し、そこでDMDcDNAを米国のATCCからとりよせ、整理された形で結果を眺めることが出来たとし現在トランスジェニックマウスを作成する準備ても、塩基配列だけからそれらの持つ生物揆能

を始めた。今年度の報告には間に合わないので、を予測することは不可能である。DNAの生体

今回は他の遺伝子を導入して得られたトランス

での機能は、それを測定する系があって初めてジェニックマウスについて報告し、マウス受精知ることが出来るからである。さまざまの遺伝

卵への遺伝子導入法が疾患モデルを作成するの子や染色体の断片が単離され、培養系の真核細に有効であることを述べる。

胞へと導入され、遺伝子産物の同定や細胞の増マウス受精卵にヒトインターロイキン2（hIL

殖や分化に与える影響が調べられて来た。しか2）退転子DNAを導入し、トランスジェニッ

し、これまでに用いられた細胞はとうてい正常

クマウスを作成した。得られた総計9匹のhILとは言えず、むしろ培養の容易さによって用い2遺伝子導入マウスは、生後2週間目に、これられて来た面もあった。

らの子孫を含めて、すべて運動失調を示した。

新しいノミイオテクノロジーの進歩によって、その原因は、ヒトIL2が小脳で発現し、未だ哺乳動物胚を用いた先生工学または胚工学と呼不明の扱梅によってリンパ球細胞が小脳へ浸潤

ばれる分野が開かれた。胚細胞や受精卵は細胞し、激しい細胞構築の破壊をひきおこすからでの一種であるが、培養系の真核細胞と異なり個あると考えられた。この症状は導入遺伝子と100体にまで発生できる潜在的能力（全能性）を持界相関していた。

っている。したがって、受精卵にDNAを導入

得られた9匹のマウスは、すべて染色体の異した後、個体発生を起こさせることが出来れI￡なる場所の．一缶所に、異なる数の導入遺伝子を全能性を持たない細胞に対する操作とは次元の組み込んせいた。

異なる意義があると考えられる。そこで、本研
究では、哺乳動物の一種であり、実験動物とし

t2I 研究の目的と方法て最もよく使われているマウスの受精卵を対象

ヒトの染色体DNAの全塩基配列の決定が具体的な実行日標として米国で始められようとしとしてヒトインターロイキン2（hIL2）遺伝子DNAを導入することを試みた（1，2）。

・東海大学医学部DNA生物学教授−27−

マウス受精卵に導入した遺伝子DNAは、ヒ（MTgIL2）とである（図1A）。

トのゲノムから単離したhIL2遺伝子（gIL2）

導入遺伝子は、マウスの尾の一部を切断し、と、マウスメタロチオネインⅠプロモーターの下流にhIL2の構造遺伝子部分を連結したもの

DNAを抽出した後、導入DNAをプローブとしてサザン法によってその有無を解析した。

gt L2

「
◆60

◆70

◆80

◆90

CACCAGATCCCTCG叩ccTCAACTCCTGCCACA封￡TAC

gJL

moust MT−tBhumanlL2gene

−28−

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トランスジェニックマウスのサザン法による解析結果（8）。

O ■ −マウスメタロチオネインⅠ（MT）に変換したもの（MTgIL2）。

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ヒトゲノムIL2DNA（gIL2）およびgIL2のプロモーター部分を； ■ L O U

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図1．導入遺伝子ヒトインターロイキン2（IL2）の構造AI。

ほl 研究成果

潤し、激しい細胞構築の破壊をひきおこすから

1）ヒトインターロイキン2（hIL2）遺伝子であると考えられた。この症状は導入遺伝子とDNA導入マウス

100ヲら相関していた。そこで遺伝子の発現の確

マウス受精卵への退転子導入によって得られたgIL2導入マウスは、2匹。またMTgIL2

認には、hIL2遺伝子導入マウスでは、優勢に運動失調が認められることを標識とした。

導入マウスは7匹であった（図18：サザン法による）。これらすべてのトランスジェニック

3）導入遺伝子の子孫への伝達の安定性

マウスは、染色体の一カ所に多コピーの導入退得られた9匹のhIL2遺伝子導入マウスの内転子を一定方向に組込んでいた。したがって、4匹のMTgIL2導入オスマウスはこう丸でのなかには524や692のように1，000キロベース

IL2の発現のため、こう丸の発育不全をきた

以上の外来遺伝子が染色体の一部となったトラ

し子孫を取ることができなかった。しかし、残ンスジェニックマウスも含まれていた。

りの5匹のメスマウスは、導入遺伝子を安定にメンデルの法則にしたがって子孫へと伝達し、

2）導入遺伝子の発現

とくに524や692のように巨大で且つ繰り返し得られた総計9匹のhIL2遺伝子導入マウス構造を持つ導入退転子も、極めて安定に子孫へ

は、生後2週間目に、これらの子孫を含めて、と伝わることが証明された。また、遺伝子導入

すべて運動失調を示した。また＿運動失調を示

マウス同士の交配によって得られた導入遺伝子

すマウスは、すべてhIL2遺伝子導入マウスでをホモ型にもつマウスでも、導入遺伝子は安定あった。そこで、運動を司どる中枢神経系であに保たれていることが認められた。

る小脳を中心に調べた結果、正常に比べて明らさらに、前にも述べた通り、導入遺伝子の発かに小脳が特異的に小さいことが認められた

現は安定に子孫へと伝達されており、自然界に（図2：a；対照、b，C，d：退転子導入マ

存在しないヒト遺伝子あるいはヒト染色体の一ウス）。組織学的な検討の結果、すべてのhIL

部を自身の染色体の一部にヒト遺伝子として組2退転子導入マウスで、生後2週間目にリンパみ込んだマウスの系統が作成されたといえる。

球細胞の小脳への浸潤が認められ、激しい細胞

このような、既知の構造である導入ヒト遺伝構築の破壊が認められた（図3；退転子導入マ

子を持つマウスは、遺伝子や染色体の子孫へのウス小脳）。これらの破壊に先だって、生後4伝達の安定性から考え、導入遺伝子の発現によ日目hIL2遺伝子導入マウスの小脳の周囲のクる疾患モデルとなり得る可能性が示唆された。

モ膜下腔にリンパ球細胞の集族が認められ、日が経つにつれて数を増すとともに、小脳への浸

（4I 考

察

潤が認められた。この現象は極めて一定に繰りマウス受精卵にヒトインターロイキン2（hIL

返され、hIL2遺伝子導入マウス特有のもので

2）退転子DNAを導入し、得られたトランスジあった。

ェニックマウスを解析した結果、総計9匹のその原因は、ヒトIL2が小脳で発現し、未hIL2退転子導入マウスは、生後2週間目に、だ不明の機構によってリンパ球細胞が小脳へ浸これらの子孫を含めて、すべて運動失調を示し−29−

た。その原因は、ヒトIL2が小脳で発現し、定性とを調べた結果、非常に安定であることか

リンパ球細胞が小脳へ浸潤し、激しい細胞構築

ら、種を越えて、世代を越えて、外来遺伝子がの破壊をひきおこすからであると考えられた。

染色体上に安定化し、発現し得ることが兄いだ

この症状は、1種の自己免疫疾患と考えられる。

され、疾患モデル作成の方法が示験された。

また、この症状は、導入遺伝子が認められるマ
ウスでは必ず発現し、症状の認められるマウス

ほI 文

献

は、必ず導入遺伝子を組み込んでいた。

1）勝木元也：発生工学実験マニュアル1−

得られた9匹のマウスは、すべて染色体の異219，講談社サイェソティフイク（1987）

なる場所の一箇所に、異なる数の導入退転子を2）勝木元也：トランスジェニックマウスに組み込んでいた。このマウスの導入遺伝子の子おける導入遺伝子の発現

孫への伝達の安定性と、導入遺伝子の発現の安

生化学

−30−

59，265丁278（1987）

図2．対照およびIL2トランスジ．11＿ニックマウスの脳。
a：対照（C57BL／6）b，d：glL2DNA導入マウス。
C：MTgIL2DNA導入マウス。′‖悩の大きさが、トランス
ジェニックマウスで著しく小さいことが認められるく二、

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細胞の浸潤（生後12日目）。

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認められるリンパ球の集族と、小脳へのリンパ球

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図3．トランスジェニックマウスの小脳のクモ膜下腔に一言霊．︑ヂ

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昭和63年度厚生省研究報告書，お−38，1988
筋ジストロフィー（C57Bレ巧一句）マウスの計画生産への体外受精法の応用
t横 山 峯 介■
研究協力者 日置恭司：塩野博子＊
長谷川孝徳：遠藤幸夫ヂ
はじめに動物の飼育条件は、6時点灯、20時消灯の

ヒトの進行性筋ジストロフィー症のモデル動

14時間明：10時間暗、温度24±2℃、湿動として使用されるC578し侶−dy／エツマウス

度60−70界とした。ケージはポリプロピレ

は、常染色体劣性遺伝のホモ型で発症する。こン製で、床敦はカンナクズとした。飼料は固型のような筋ジストロフィーを発症したホモ（dj／

飼料（CA−1：日本クレア）ならびに飲水は水dy）マウスは、メス、オスとも交尾行動をとる

道水を不断給与した。なお、里親マウスにつし、ことができないために繁殖不能である。このたては、SPF条件下でオスと交配して妊娠を確

め、ホモマウスを得るには、dy遺伝子をヘテ認したものをビニールアイソレーターに収示し、ロ（−レ匂γ）で持つメスとオスを交配する方法がSPF条件で飼育した。

とられる。

体外受精

しかし、ホモ個体でも生殖細胞である卵子と精子は正常なことから、我々は体外受精によっ卵子はメスに5IUのPMSG（Pregnantて受精卵を作り、これをレシピェントメスに移

mare serum gonadotropin）とhCG

植してホモ個体を得るための検討を進めてき浸）≡）（humanChorionic gonadotropin）

今年度はさらに、徽生物学的にきれいなd少々γ

を腹腔内注射し、排卵を誘起した。hCG注射

マウスを生産することを目的に、帝王切開の手

後14−17時間にメスを殺処分して卵管を摘技を組み合せ、検討を行なった。

出し、卵管膨大部に貯留している未受精卵を実
体顧徴鏡下で採取した。

材料および方法

精子はオスを殺処分し、精巣上体尾部から採動物と飼育条件取した。これをTYHメディウ胡こ懸濁し、1体外受精のための精子を得るには、筋ジスト

時間、37℃、5芦炭酸ガス条件下でインキュベ

ロフィーを発症したC578Ⅰノ6−d〟みマウスのーションしてから媒精に供した。

4ケ月齢のオスを、卵子を得るには、C57BL／

媒精は卵子を含むTYHメディウムに、精子

6一十／7マウスの4ケ月齢のメスを使用した。

懸濁液を添加して行ない、その6時間後に第2また、胚移植を行なうためのレシピェントメス

擾体放出と雌雄前核形成の有無をもって受精をと、帝王切開した摘出仔を里子するための里親判定した。さらにその状態で24時間培養してには、Jcl：HCH（工CR）マウスを用いた。

2細胞期への発生を調べた。

■（財）実験動物中央研究所−35−2細胞期胚の移植結果および考察

2細胞期へと発生した胚は、精管絃崇オスと体外貿精成績

の交配で偽妊娠を誘起したレシピェントメスの筋ジストロフィーを発症したC578し巧一郎／

卵管に常法により移植した4之 移植胚数は片側句の精子とC578L／6−十／7

あたり5−8個で、合計10．−16個とした。

み合せで行なった体外受精とその後の発生成績の未受精卵の組は表1に示すとうりである。1回の体外受精に帝王切開と里子必要とする精子は、1匹のオスから得られるも胚移植によって妊娠が成立したレシピェント

ので十分であり、15匹以上のメスから採取しメスは妊娠20日日（睦栓確認日を第1日とすた卵子に媒精することができた。C5781／6−

る）に帝王切開して胎仔を摘出し、SPF条件＋／？メスからは平均19．8個の未受精卵を採下の里親に哺育させた。操作の手順は以下の通取できた。体外受精卵の2細胞斯匠への発生成りとした。すなわち、妊娠したレシピェントメ

績は、23．6界（64／271）−91．99も（260／

スを頸椎脱臼法によって殺処分し、ヨードチン

283）と実験群によりバラツキがみられた。こキ槽に10秒間浸して全身を消毒した。つぎに・れは媒精に使用した精子の運動性と奇形率の差

腹部を切開して、眼科用コッヘルを用いて子宮によるものと考えられ、筋ジストロフィー症の頸管部と卵管との接合部をしっかりはさみ、子宮を病状の程度なども影響していると考えられた。

取り出した。直ちに手術用アイソレータ→の■薬液tラップに浸し、10秒間放置した。これをアイソレータ

胚の移植成絞ー内に入れ、眼科用ハサミとピソセットを用い

2細胞期胚を偽妊娠1日目のレシピェントメて子宮および羊膜を切開し、．胎仔を摘出した。

スの卵管へ移植した成続は表1に示すとうりで腰帯をピンセットでつまんで止血してから切断ある。帝王切開によって得られた胎仔の値は、し、ガーゼで胎仔を摩擦して蘇生させた。完全

22．99も（55／240）−46．49も（98／211）nに蘇生させた胎仔は、あらかじめ準備しておい全体の平均は34．89♭（179／515）であった。

た里親のアイソレーターに移し、哺育させた。

この値は、正常なC57且し′乍トマウスの2細胞期

表1．C5叩L／6−みマウスの体外受精成績と移植による胎仔への発生成績
使用動物数

レシピェント数

実験他 メス オス 検査卵数 2細胞期（界）移 植 妊娠成立／使用 摘出仔数（殉
1

15

2

・14．．1

3

13

合計

42

1

1

271

64（23．6）
283

279

3、

833

64

260（91．9）
252（903）

3／4

240

211

576（69．1）

ー36−

13／15
13／14

515

29／33

26（40．6）55（229）98（46．4）

179（34．8）

表2．帝王切開にJこり摘出した胎仔の里仔での生育成績

実験肱 摘出仔数 里仔数 男親数 離乳仔数（界）1ソ匂γ（？：8）dy／dy（？：8）
1

26

2

55

54

10

51（94．4）

3

98

95

14

87（91β）

28

161（92．5）104（62：42）

合計

179

25

174

4

23（92．0）13（9：4）10（3：7）

36（19：17）・15（4：1・1）
55（34：21）32■（16：16）

57（23：34）

胚の移植成績約70界と比べると低いものであ

帝王切開等によって生じたと考えられる異常はる。この原因については今後さらに検討し、改まったく観察されなかった。

善しなければならない点と考えられる。

また、今回使用したC578Ⅰ／6一句／如ならびにC57BL／6一十／？の個体は、MHV（mouse

帝王切開成績

hepatitis virus）に汚染されたコPニー

帝王切開の成績は表2に示すとうりであるが、で生産されたものであるが、里親と離乳された

97．2界（174／179）のものが蘇生して里親にホモならびにへテロの個体を、当研究所の微生哺育させることができた。帝王切開時において、物モニタリングセンターで検査した結果、MHV

全個体とも外表的な異常はまったく認められなに感染している個体はまったく検出されなかった。

かった。

以上のことから、体外受精と帝王切開の2つの技術を組み合せ、運用することにより、繁殖離乳成績と得られた仔の性比障害を伴う筋ジストロフィーC578レ筍−d〝／み帝王切開により摘出した仔をSPF条件下のマウスを徽生物学的にきれいな状態で量産でき里親に哺育させた際の離乳成続は表2に示すとると考えられる。

うりである。すなわち、91．6界（8℃／95）−
94．4界（51／54）で、全体では92．5界（161／174）と非常に高い値であった。これは生産の

文

献1）江崎孝三郎，横山峯介：体外受精法によ場におけるC5781／6マウスの成績をも上回るる筋ジストロフィーマウス（C578Ⅰ一／巧一

ものであるが、これは里親として用いたJcl：郎／／み）の作出．厚生省神経疾患研究委託

叩：H（工CR）メスが温順で哺青のうまいことに

費「筋ジストロフィー症動物の開発・供給よるものと考えられる。

に関する研究」野村班．昭和59年度研究離乳されたホモ（如／如）ならびにへテロ（V

報告書．119−122，1985．

如）とその性比は表2に示すとうりである。こ2）横山峯介，小島博子：体外受精による筋

れらのホモ個体は、生後約2遇齢で筋ジストロ

ジストロフィー（C57811／6−dy／如）マウ

フィーを発症し、ヘテロ同士の交配で得られた

ス受精卵の作出と凍結保存．厚生省神経疾ものと同様の症状を皇した。また、体外受精や患研究委託費「筋ジストロフィー症動物の一37−

開発・供給に関する研究」野村班．昭和614）勝木元也編：発生工学実験マニュアル・

年度研究報告書．25−29．1987．

トランスジェニックマウスの作り方．講談

3）豊田 裕，横山峯介，星 冬四郎：マウス卵子の体外受精に関する研究Ⅰ．精巣上体精子による受精成績．家畜繁殖蒔，16，147−151，1971．

一38−

社サイェソティフイツク．東京，1987．

昭和62年度厚生省研究報告書，39−46，1988

mdxマウスのDMD遺伝子について研究協力者≪はじめに≫

高松 研●
塚田硲三■

法を用いた。液体窒素下で組織を粉砕し、組織

近年遺伝子工学的手法を用いて、ヒトDuch

重量の20倍量の5．5M Guanidinium

enne型筋ジストロフィー症（DMD）遺伝子のthiocyanate溶液に溶解させた。18ゲー

一部が明かとされつつある1￣5三ジの注射針を通した後、不溶物を5000×7、

一九m血マ

ウスは、症状は軽く、病理組織学的にも筋線経20分遠心して除き、CsTFA溶液に重層しての崩壊、再生像が異なっているなどヒトDMD

25000rpm、24時間遠心し、沈査を洗浄後との差異が指摘されているが6￣8〜 変異遺伝子

エタノール沈澱し、全RNA分画とした。pOlyの染色体上での他の遺伝子特にOTC退伝子と（A）RNAはオリゴdTカラムにより精製した。

の位置関係は、マウス染色体とヒト染色体の基RNAはGlyoxal変性後、1．0珍アガロー

本的違いは別としてヒトDMD遺伝子の場合とスゲルにて泳動した。泳動後、ゲルをアルカリ

極めて類似しておりト10〜筋ジスト。フィー症

処理し、20×SSCを用いてフィルター（MSI

モデル動物としての有用性が考えられる。

ナイロンフィルター）に転写した。フィルター

そこで今回は、mdxマウス（C578L／10

をprehybridization buffer（50％SeSn−mdx）ともう1つのモデルマウスとして

formamideI5XSSPEI

知られるdyマウス（C57BL／6J−dy／dy）の0．1％SDS，100ug／ml Salm on sperm

DMD遺伝子の発現について、報告されたDMDDNA）で処理した後、hybridization

cDNAの一部を合成LNorthernblot：およbuffer（50％formamide，5XSSC，2

びSouthernblotによる解析を行った。

×Denhardt，0．1％SDS，100ug／ml

5XDehhardt，Salmon sperm DNA）probe DNAを≪実験動物および方法≫

加え40℃で16時間処理した。フィルターを

mdxマウスおよび体外受精法によって作出されたdyマウスの生後3日目から28日日のも洗浄後、−70℃で10日間フJレオログラフィ
ーを行った。

のを用いた。対照としてC578L／10SeSnマウ

Dot blotはBio Dot（Bio Rad）をス（BlO）を用いた。なお、実験動物は全て実用い、Zeta probe membrane

験動物中央研究所より供給された。

を吸着させ、上記と同様にhybridization

各々のマウスから大腿部および背部の骨格筋、

にRNA

を行った。

心腋、小腸、肝臓、腎臓、胸腺を取り出し、液DNAの抽出は、胸線組織から行った。組織

体窒素で凍結した後一70℃で保存し実験に用を液体窒素中で破壊した後、SDS−prOteina−

いた。

Sek溶液に溶解した。37℃、6時間処理し各組織からのRNAの抽出はGTC／CsTFA

た後、フェノール抽出を行い、エタノール沈澱

・慶応義塾大学医学部生理学教室

ー39−

により精製した。各制限酵素で消化した後、▲Sperm DNA），T処理し、NaClを除いた0．79もアガロースゲルで泳動した。泳動後、ゲhybridization bufferとprobe DNA

ルは酸・アルカリ処理し、リン酸bufTerをを加え、hybridizationを行った。フィル

用いてフィルターに転写した。フィルターは熱

ターは洗浄後−70℃で7日間フルオPグラフ

処理後、prehybridization buffer（50％・pr。beDNAはK。nkelらの報告に従い3・！）formamide，10×Denhardt，1％SDS，10％dextran sulfate，50mM

図1に示した2カ所を合成した。合成はABⅠ

Tris，・lM NaCl，100ug／ml salmonのDNA合成機を用い、既報に従って精製した。

ab■■月に人心仙†関口ひ−∝一一1−川∝甜IIWm111臥欄ひ購16・u■▲し▲uJ；亡▲仙人▲CILCC▲人ん人肌仙人AUG▲Tu皿▲Clnて▲TGC∝l㈱▲TGTCl b 一！ L − − ■ Clilr −【Y H ▲ L 月 山 V
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HWl∝〟AmGくト仙叫nWCU〟lAIII仙ul脇目仙肌−▼

溢血粛正混品んkl眈i融h加6融lAr▲¶hMひll仙TMlll▲▲∩臥Il仙Ilm舶I仙嶋l〟亡

図1：

合成DNAプローブ
a：プローブ1

b：プローブ2

下線部分を作成した
probeの標識は合成DNAをアF・−ルした後、生後3日目から7日目まで、および14日日

T4DNA Ligaseにより連結させたOその後、から28日日までの810マウス、mdxlマウス、

Nick Translation KitまたはRandam

dyマLウスおよびBalb／Cマウスの筋肉から得Priming Kit（Amersham）によりa−32P

た全RNAをもちいたNorthan Blotを行

dCTP（6000Ci／mmol）を用いた。

った。図2A．にprObelを用いた結果を、・．Bにprobe2を用いた結果を示した。いずれの果≫

場合にも810マウスでは14から16Kbの位

1．ノーザンプロット

置にDMDmRNAが確認された。一方、mdx

≪結

ー40−

810
810

‡れ血

中

8摘

mdx dy図2：mdxおよびdyマウス骨格筋のNorthern Blota：プローブliane1−3；BlOIlane4I5；mdxIlane5；dyb：プローブ2
1anel，2；BlO，1ane3I4；mdxIlane5I6；dyナ

lane

7，8；BalbC

マウスではこれに対応したmRNAを認めるこの反応が認められたが、これより更に弱いながとはできなかった。dyマウスでは、BlOマウ

ら肝臓にも反応が認められたことからバックグスと同様の位置にmRNAの存在を認め、むしラウンドの反応である可能性も考えられる。

ろ全RNA中に占めるDMDmRNAの量はBlO

また、prObelの反応性はprobe2に較べ強い傾向が認められた。

より多い傾向がみられた。
同様のサンプルを用いたRNAのDot Blot

2．サザーンプロットの結果を図3A，Bに示した。いずれの場合に

DMDcDNA合成

プローブを用いたサザ

もBlOマウス、dyマウスではDMDmRNAのーソプロット

存在が認められた。一方mdxマウスでも、弱い

8、9、mdx、dyの胸線DNAをStu工消化ながら反応が認められ正常BlOマウスの10かし、prObelを用いた結果では、図4aに示ら20分の1量のDMDmRNAが存在している

したごとくDNA断片の大きさはいずれも同じことが示唆された。また臓器別では心筋に少量であったが、8109に8と較べて強い反応がのmRNAが存在していた。小腸には痕跡程度認められ、このDNA配列がⅩ染色体に位置しー41−の結果を図4に示した。810

a

図3：mdxおよびdyマウス骨格筋mRNAのDot Blota：プローブ1

b：プローブ2ー42−

b【80RI Hi細目I Pst18amHl

12

3

4

5

6

12

12

12

23ト
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1

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2

12

痴酪∴瀾秒

丈、鵜、礫
黎

図4：mdxマウスのSouthern Biota，b：プローブ1

1anel；BlOIlane2・；mdxllane3；BlO
lane4；BiO lane5I6；dye，d：プローブ2

1anel；BlO，1ane

2；mdx

−43−

12

ていることが示唆された。また他の制限酵素に

ザーンプロットおよびドットプロットの結果かよる消化によっても、BlOとmdxとの間に変ら、mdxマウスではDMDmRNAの発現は無い化は認められなかった（図4b）。さらにprObe

か、あっても正常の10から20分の1と極め2を用いた結果でも図4C，dに示したごとくBて少ないことが示された。さらに、サザーンプ

lOとmdxとの間に差異は認めらえなかった。

ロットの結果から、少なくとも用いたプローブによって検出できる範臥こは遺伝子の大きな欠≪考察≫矢は認められなかった。これらのことから、

DMD患者由来の培養細胞を用いて行った

mdxマウスでは染色体遺伝子上の転写調節領域

Kunkelらの「連の研究によって、DMD遺に障害があってmRNAの発現が低くdystro−

伝子の本体が明かとされつつあるl￣警DMD。

phin蛋白の存在が認められない可能性、さらDNAについてもサイズが14Kbであることにdystrophin遺伝子のeXOn部分にも欠矢が示され、その塩基配列の一部が報告された3で）があり異常mRNAが少量発現しているためにまた同時にマウスDMDcDNAについても報告

ノザーンプロットでは検出されずドットプロッ

され、両者の構造は極めてよく保存されている

トでのみ少量のmRNAが検出された可能性なことが示されている。そこで、マウスDMDe

どが考えられる。今後は、mdxマウス遺伝子上

DNAに対応する一部分の合成DNAを作成し、のdystrophin発現調節領域の解析を行って

DMDモデル動物であるmdxマウスおよびdy

いかなくてはならない。

マウスについてDMD遺伝子の検討を行った。
前述したととく、mdx∵マウスは症状および病≪文

献≫理組織像はDMDとは異なっているが6ヤ変異1）′Monaco，A．P．et

遺伝子の染色体上での位置関係が極めて煩似している9・10とまた、BMD（Becker型筋ジスト

al．，Nature，

316，842−845，1985．

2）Kunkel，L．M．et al．，Nature，

ロフィー症）とDMDとは同一遺伝子上の疾患

322，73−77，1986．

であり、変異の程度に差があるとする報告もあり、mdxマウスとBMDの関係も注目されてい3）Monoco，A．P．et al．，Nature，
323，646−650，1986．

る。
一方、HofTmannらは大腸菌を用いて作成

4）Koening，M．et al．，Cell，

したTrpEとの融合蛋白を用いて、ヒツジまたはヤギでポリク。−ナル抗体を作成した11ま

50，509−517，1987．
5）Hoffman，E．P．et al．，Science，

この抗体を用いたイムノプロットから分子量400Kdの筋小胞体でriad分画中にある膜蛋

238，347−350，1987．
6）Bulfield，G．et al．，Proc．

白（dystrophin）であると推定している12とそしてmdxNat1．Acad．Sci．USA，81，

マウスの骨格筋と心筋についても1189−1192，1984．

解析を行い、mdxマウスではこの蛋白の発現が認められないと報告した。今回我々が行ったノ

7）Tanabe，Y．et al．，Acta Neur0−−44−path．，69，91−95，1986．

Nature，328，166−168，1987．
11）Hoffman，E．P．et al．，Cell，

8）Bridges，L．A．，J．Neurol．
Sc1．，72，147−157，1986．

51，919−928，1987．

9）Heilig，R．et al．，Nature，

12）Hoffman，E．P．et al．，

328，168−170，1987．

Nature，330，754−758，1987・

10）Brockdorff，N．et al．，

ー45−

昭和62年度厚生省研究報告書，47−62，1988
筋ジストロフィーマウス（mdx）

骨格筋線椎の壊死と再生
菊
研究協力者

池

建

機■

守屋弘美：松崎哲也†■

1984年、Bulfield等1）によって発見Videoplan画像解析装置を用いて病理学的されたⅩ染色体性劣性遺伝の形式を取る筋ジス

解析と形態計測が行なわれた。測定された項目

トロフィーマウス（mdx）は、ヒトのDuchenne

は筋横断面積（um）とその度数分札筋線維当型またはBecker型筋ジストロフィー症のモ

りの中心核の出現率である。常染色体劣性退転

デル動物として注目されている。mdxマウスは、に従うdyマウス（C57BL／6J−dy／dy）は従来研究されて来た常染色体性劣性退転を示す、

生後30，60日目で検討した。骨格筋線経のいわゆるdyマウス（C57BL／6J dy／匂y）のCOllagenase酵素消化による単解はKopri−

臨床経過と異なり、体重の減少や、筋力低下は

wa＆Moss（1971）法6）によった。この場認められず、見掛け上は正常と変わらない。

合も採取時の筋の収縮を最小限とするためCar

しかし、mdxマウス骨格筋線経の壊死と、そnoy固定液で心臓より濯流固定した。

れに続く再生は誕生後比較的早期よりみられることが報告されている1￣4と 本報告はmdxマウ

結果

ス骨格崩の組織病変の形態計測および単離筋線

1．体 重経を中心に、本ミュータントにみられる筋線経

mdxマウスの体重の変化は生後正常に推移すの再生を検討した。

るが、50日齢でやや減少する。対照マウスの体重は20日と60日齢で測定したが、材料および方法

m血マウスとほほ同様の変化を示す。申日

SPFのmdxマウス（C57BL／10ScSn−mdx）

齢のdyマウスは著しく成長が抑えられておと対照正常マウス（C57月L／10SeSn）を用い、り、60日齢では約％程度にとどまる（図−1）。

それぞれ仁前脛骨筋（m．tibialis anteriol：
TA筋と略）とヒラメ的（m．soleus：SL筋と2．筋比体重値略）を採取した。mdxマウスは生後20，30，

mdxマウスのTA筋およびSL筋を測定した。

40，50，60，90日、対照マウスは生後20，・TA筋は生後60日まで増加するが、SL筋は60日日でいずれも10珍緩衝ホルマリン溶液

・40日と早い時期に値は横這いになる。

で心臓より滞流固定され、腱付きのままで筋を固定し、剥皮後そのままの状態に同液に2日間

3・筋線維横断面積の経時的変化と度数分布以上浸した。採取された筋は重量測定後、筋腹

骨格筋線維杭断面積の平均値の経時的推移はの横断H−E染色標本においてKontron MOP＿

成長とともに増加するが、TA筋は60日、●￣￣■一一日＝………＝……………………………●−●●●●●●●●●●●●●■●■●国立精神神経センター神経研究所、モデル動物開発部＝財団法人実験動物中央研究所−47−

SL筋は50日でやや減少する煩向がある（図−2）。生後60日でmdx，dy，対照マウスの7品二妄言冨＝盲点

各筋の線維横断面積の度数分布を比較したのが、
図−3である。筋ジストロフィー筋を構成する
筋線維面積の分布は広く、大小不同が著しい。
dyマウスでは萎縮した小型の約線経が多数みられる。

4．中心核の出現率
0

20

ム0

60

筋ジストPフィー筋を構成する筋線経の中心

AgeはoysI

核は20日以後みられるようになる。dyマウ

図1．・mdx，dy，対照正常マウス（BlO）の生
体重の経時的変化

スでも同様の煩向があるが、その後の増加はmdxマウスに及ばない。mdxマウスのTA筋線
経の中心核は60日までに大部分の線経でみられるようになるが．SL筋では40日でほぼ横這いになる（図−4）。

5．病理組織学的所見
mdxマウス筋組織は生後20日まで大きな異常はみられないが、この日齢の前後から小さな壊死巣が散見される。変性壊死の病変は20−
20

0

60

30日にかけて急激に顕著となる。筋線経は群AgetdoysIをなして過収縮や硝子様変性を示し、線維周辺の問質は著しく広がる。崩壊線経の清掃反応は
すばやく、線維内へのマクロ77−ジの浸潤と、引き続く再生筋管の形成が起こっている（図−5，A）。

筋の縦断切片所見によると、線経の変性、壊死は線経のある特定の部分に限局する、いわゆ
るSegmental necrosisによる。この変
20、

10
60
AgeIdoysI化は、隣接する筋線経の、同じ水準でほぼ同時

t氾に進行する條向がある。過収椿によって部分的

図2．mdxマウスの前脛骨筋（m．tibialis
anteriol）およびヒラメ筋（M．
soleus）における筋線維横断面積（皿）の経時的変化に肥大した線経は隣接する線経を押しつぶすよ
うにみえる。長大な筋線経は多くの部位で壊死に陥り、その部分が再生すると中心核を残す。

ー48−

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6．単離筋線掛こみられる形態異常単離された対照マウス約線経の核は主に線雄周辺にみられる。筋緑維核（myonuclei）と衛星細胞（satellite cell）とを区別することは困難である（図−7，A）。組織標本で観察された過収縮部は単離線経でも頻繁に認められる（図−7，8，D）。単一的線経には、胸体内
20

40

60
Agetdqyslに鎖状に配列する多数の中心核がみられ、しばしば複数の列になっている。このような鎖状配列は途中で途絶え、正常の分布に戻り、再鎖状・0▼旧O
J月に︑L月∈⊃uL眉U⊃UOL−U占配列に移行する部分が見られる。多数の中心核が鎖状配列している部分と、正常に分布している部分では収縮の度合いに差がある（図−7，C））
単離された筋線経は途中で複数の細い筋線経に分枝する。また一度親線経から分枝した線経が再び親線経に合流する場合もある（図−7，E）。
連続した組織切片で観察すると、単離筋線経で2010得られた結果と同様に、親線経から分枝する筋

60
Agefdoys）

線経が見られる（図−8，A，B，C，D）。

図4・mdx，dy，正常マウス（BlO）の前脛骨筋（m．tibialis anteriol）
およびヒラメ筋（m．soleus）における筋線維中心核の出現率の経時的
変化。

考

察

m血マウスの成長は対照マウスと特に差はみられない。Dangain＆Vrbova（1984）
は成長にともなう前脛骨筋の収縮の力学的特性を調べ、mdxマウスのtwitch tensionや

生後90日では、大部分の線経は再生部分を持

maximum tetanuS tenSion

ち鎖状配列が頻繁に見られるようになるが、そ期（2−4週）では低下するが、その後回復しれらの線経も以前と同様に壊死に陥いる（図−成獣では対照マウスと変わらなくなることを報5・月）。再生筋線経は同様に群をなす場合が多告した。逆に、haif relaxation time

く、先に再生を終了した線経との協調性も極め

は生後2−3遇齢では正常であるが、3−4遇

てよい0さらに、筋線雄の束で構成される筋束

で一時的に長くなり、以後再び正常に戻る2㌔（muscle fascicie）は正常な結合織で包まれ、顕著なfibrosisや脂肪組織の増生は

ー50−

は若い時

mdxマウスの筋組織変化は、Dangain＆Vrbova（1984）22

Tanab。et al（1986）3），Bridge（1986）5）等によって解

3）Tanabe，Y．，Esaki，K．and析されている。これらの報告は、先の収縮性のNomura，T．（1986）：Skeletal

結果とよく一致している。・half relaxation

muscle pathologyin X chromo−

timeが長くなる時期は筋の壊死および再生がSOme−1inked muscular dystrophy

激しく起こっている時期であり、大部分の線経（mdx）mouse．Acta NeurOpathol

は未熟な状態にあったことを裏付けている。我（Berl），69，91−95．

々が得た結果も前脛骨筋は20−60日、ヒラメ筋は20−40日日までをこの特定の時期と4）埜中征哉（1986）：筋ジストロフィー筋

することができる。両筋を比較すると、ヒラメの発育分化と壊死発現に関する組織学的，筋の崩壊する時期は前脛骨筋よりも早い。

組織化学的研究．昭和60年度厚生省研究報告書，11−31．

従来のdyマウス骨格掛ま、比較的正常な形態を有する小型の筋線経を多数含み、隣接する

5）Bridges，L．R．（1986）：The線維間での壊死、再生の同調性は悪く、全体と

association of cardiac muscle

して崩の再生反応に乏しい。mdxマウス骨格筋

necrosis andinflamation withの変性壊死は、生後の特定の時期に激しく起こ
thedegenerative

andpersis一り、隣接する線経のほぼ同じ水準で同時に起こ
七ent myopathy of MDX mice．J．

るため、同調性がよく、続く再生反応も優れて

Neurol．Sci．，72，147−157．

いる。この線経の壊死再生は一度再生した筋線6）Kopriwa，B．M．and Moss，F．P．

経にも再び起こる。筋線経の周辺の問質にribrosisや脂肪組織の増生が見られないの（1971）：A radioautographic

は、この再生反応に優れる点と関連があると思technique for whole mounts ofわれる。

muscle fibers．J．Histochem．
Cytochem．，19，51−55．

文献1）Bulfield，G．，Siller，W．G．，
Wight，P．1A．L．and Moore，K．J．
（1984）：X chromosomelinked
muscular dystrophy（mdx）in
the mouse．Proc．Natl．Acad．
Sci．USA，81，1189−1192．

2）Dangain，J．and Vrbova，G．
（1984）；Muscle development
in mdx mutant mice．Muscle
Nerve，7，700−704．

−51−

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図5．mdxマウスの生後30日（A）及び90日（B）における前脛骨柄にみられる
変性壊死所見。 矢頭印：再生線維中心核の鎖状配列 Ⅹ277

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図6・mdxマウスの生後60日におけるヒラメ矧A）及び前脛骨矧B）にみられる
再生線経と筋束の構築
Ⅹ277

、
」

A

図7・生後47日の正常AL mdx（8−E）前脛骨柄より単離された節線経にみられる形態異常。A図における矢頗印は過収縮部分、E図における12，3は視線経から分枝した細い線経を示す。 Bar二100um

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図8・mdx マウスのヒラメ筋にみられる筋線経の分枝。矢印の一本の筋繰維A）が標本の位置を変えるにしたがい二本になる（8−D）。 Bar＝100um¶

昭和62年度厚生省研究報告書，63−78，1988

筋ジストロフィー症研究のためのGAD・MDX複合マウス系統ゐ育成
富 田

武●

研究協力者 山崎一斗：榊原朱美■
向山昌邦；●菊地僚機…
Ⅰ．緒言

muscular dystrophy（Tndx）がある

ヒトにおいて数多くの神経系及び筋系に異常（Bulfield el aZ．1984）。n血では神をきたす遺伝性の難病が知られているが、進行経系の異常は認められておらず、また伴性劣性性筋ジストロフィー症もその1つである。筋ジ遺伝様式をとるためDuchenne型筋ジスト。

ストロフィー症とは、中枢神経系や末梢神経系フィー症のモデル動物として期待されている。

の異常を伴わずに骨格筋の進行性の変性・崩壊

またDuchenne型筋ジストロフィー症とm血を示す一連の遺伝性の疾患群であると定義されで共通に欠損しているタンバク質dystrophin

る。なかでもDuchenne型筋ジストPフィー

も兄い出された（Hoffman症（Duchenne muscular dystrophy）

しかし伴性劣性遺伝様式をとるヒトの進行性筋は著名な伴性劣性疾患である。頻度は筋ジスト

ジストロフィー症は他にも知られており、ロフィー症の70界を占める程高く、また症状

Duchenne型筋ジストPフィー症とn血の遺も早期に発症し、進行が早く、予後不良であり伝的な相当性は明らかでない（Avene etal．

最も重篤である。しかしながら、この遺伝性疾

1987，Brockdorf、f

αJ．1987）。

αJ．1987，

患に関する病因も治療法も判明していない。故Heiling gとαJ．1987）。また、mdよにおいに病因解析と根本的な治療法の確立のために、ては生後3−4週齢で膨大な筋線維壊死が生じ

よく似た病態を示す多くの疾患モデル動物の育運動障害も認められるが、続いて量的にも構造成が望まれている。

的にもほぼ完全な筋線維再生が起こり、壊死線

筋ジストロフィー症を示すマウスの突然変異経を補うことが可能である。その後はごく軽いには、dystrophia mu畠cularis（dy）

壊死と再生がくりかえされ、進行性の筋萎縮をとmyodystrophy（Tnyd）があり、いずれも示さない点がDuchenne型筋ジスト。フィー

常染色体性劣性遺伝様式をとる。しかしこれら症と大きく異なる（Dangain and Vrbova，のマウスについては、脊髄前板及び後取にミエ

1984）。したがって，n血はDuchenne型筋

リン形成不全などの神経病理学的所見が報告さジストロフィー症のモ≠ル動物として用いる場

れ、これらの疾患の初期変化が神経系の欠損に合には注意を要するが、筋の壊死・再生の横構起因する可能性も示唆されている。

を研究するには非常に興味深いミュ⊥タントでさらに貞近発見された突然変異にⅩ＿1inked●●●●…■一日……HH

あるといえる。

M●●MMMMH…MMMHH●●●●●●■●●●●●●●●●●●■■●●●● 名首足大学農学部家畜育種学教室＊■ 国立精神・神経センター、神経研究所疾病研究第四部…・国立精神・神経センター、神経研究所モデル動物開発部−63−

Ⅱ．材料及び方法

またgraCile axonal dystrophy

1．マウス（∫αd）は、1984年に名古屋大学農学部に

本研究には以下に示す4系統のマウスを使用

おいてCBA／Nga系統とRFM／Nga系統より出現した神経異常を示すミュータントで、この形した。

質は常染色体性劣性遺伝様式をとる。異常個体（1）C57BL／10−m血系統（810−mね系統）

は生後約80日齢より後肢を引きずり始め、振1987年1月に実験動物中央研究所より導戦及び後肢筋萎縮を示す。病理形態学的には延入し、当研究室において兄妹交配により維持さ髄薄核（graciie nucleus）及び脊髄薄束れている。実験には導入後2世代以降のマウス（gracile fasdicules）に限局した軸索を用いた。

ジストPフィー（axonal dystrophy）を（2）Gad／Nga（Gad系統）

主徴とする変性所見が認められている。軸索ジ

1984年1月に名古屋大学農学部において、ストロフィーはヒトの2つの遺伝病、すなわち

CBA／NgaとRFM／NgaのF2世代に生じた自Znfantile neuroaxonal dystrophy

然突然変異個体（雌2匹、推1匹）をもとに当とHallervorden−Spat2：病、さらにビタ研究室において兄妹交配により維持されている。

ミンE欠乏症と老化などにおいても観察されて（3）DBA／2系統（D2系統）いる。故にその病態モデルとしての検索が進め1985年6月に東北歯科大学より導入し、られている。またマウスにおいて薄核及び薄束

当研究室において兄妹交配により維持している。

は後肢からの上向性の感覚神経錆に相当する。

（4）C57BL／10系統（BlO系統）

したがって∫α山こみられる後肢の引きずりと筋

1987年4月に国立遺伝学研究所より導入

萎縮はこの神経路の異常に起因する廃用性萎縮し、当研究室において兄妹交配により維持して（disuse atrophy）であると考えられ、そいる。実験には導入後2世代以降のマウスを用の病態生理の解明にも有用であろうと予想されいた。

る（Yamazaki et aZ．1988）。

2．飼育方法以上に述べた2つの突然変異遺伝子∫αdと木製あるいはプラスチック製ケージで飼育し、訊ねを同時に持つ個体（以下GAD・MDX複合

巣材としてワラ及びチップを使用した。飼料はマウスと呼ぶ）を育成することにより、筋線維

市販の固形飼料と成缶用粒餌を与え、水は自由変性及び再生に対する廃用（disuse）の影響摂取とした。室内の光・温度・湿度は調整しななど、新しい知見が得られる可能性がある。本

かったが、冬期には温風ヒーターによる暖房で研究ではタαd遺伝子座と緊密に連鎖するPhos−

室温の著しい低下を防いだ。

phoglucomutase−1（P97n−1）を遺臣的マ

3．実験方法ーカーとして、その電気泳動により曹d個体を（1）血妓CK活性値測定

識別し、さらに筋ジストロフィー症でみられる

m血においてCKを代表とする筋肉由来酵素

血疑Creatine kinase（CK）活性値の上の血渠活性値の上昇が報告されている。そこで昇を指標にして、その測定によりm血個体を識

CKをMDXマウスの指標酵素として用いるこ

別して、GAD・MDX複合マウスの育成を試みた。

とにした。マウス眼下静脈叢よりヘパリン付き−64−ヘマトクリット管にて採血し、14007で冷却的マーカーとして用いることが可能になる。選遠心して得た血環をサンプルとした。凝血・溶抜したマウス（秒Jlシpgm−lbかつmd／Y）

血が肉限で認められた血液は使用しなかった。

をGadと交配する（MatingⅢ，Ⅳ）。その測定はCPK−Test Wako（Oliver変法）

N2世代から巧m−1シ拘れ−laすなわちタα4〃αd（和光純薬工業株式会社）により行った。810，

かつnむ／Y個体を選抜し、GAD・MDX複合

D2，Bl0−mdx系3系統及び（Bl0−mdxxD2）

マウスとする。

Fl個体の中から、60、90日齢のマウスにつ（4）組織学的観察

いて測定した。これらの値よりMDXマウス（珊如／血焚■cK活性値の上昇を指標として選抜した

爪血及びmdJ／Y）の選抜基準値を決定した。

マウスがMDXマウスであることの確認のため、Gad系統について異常個体（タαみ旬αd）及び同筋の組織学的観察を行った。使用したマウスは腹正常個体（タαd／差卜又は−レ年）の中から、60

810，810−m血，系統の雄個体、Gad系統の−90日齢のものと120日齢以上のものにつ正常及び異常雄個体、（810−m血XD2）Fl X

いてそれぞれ測定した。これにより、■GADマ

D2のN2世代で活性値の上昇が顕著に認められウス（∫αd／∫αd）での血妓CK活性値の上昇のた堆個体及び正常と判定された雄個体である。

有無を調べた。

これらのマウスから前頸骨筋を採取し、′プアソ（2）Pgm−1電気泳動

液で国定し、バラブラストで包埋後、8〝厚の∫αd遺伝子座と句叩−1遺伝子座は、マウス切片を作製した。へマトキシリン・エオシソ染

第5染色体上で3．0士0．1界の近距離で連鎖し色後、光学顕微鏡で観察した。

ている（Yama2：aki elaZ．1987）。したがって拘れ−1を∫αdの遺伝的マーカーとして用Ⅲ．結果いた。f，gm−1遺伝子型の判定にはセルPrスア（1）血照CK活性値

セテート膜を使ったTitanⅢ電気泳動法（Herena

BlO，D2，810−m血系統及び（810−m血×

laboratories，U．S．A．）を用いた￣。マD2）Fl個体について？血渠CK活性値の測定

ウス眼下静脈叢よりへ′くリン付きヘマトクリッ

結果をTablelに示した。MDXマウス（810−

ト管にて採血し、1，4007で冷却遠心して得たふ血系統及び机の雄個体）では、BlO，D2系

赤血球をサンプルとした。泳動条件、発色方法

統及びFlの雌個体に対して活性値が有意に高等は、Nomura

かった。またGad系統についての血渠CK活fαJ．（1984）に従った。

（3）交配方法

性値の測定結果をTable

交配方法をFig．1に示した。810−m血，Gadマウス（∫￠み／gd）では生後約120日齢で病

両系統は句四一1シ拘れ−laで固定されている。

理学的異常が認められる。しかしGADマウス

そこで810−m血をP四一か卵一㌔で固定さと同腹正常マウス（＋．／」）の間には、日齢（すれているD2と交配した（MatingI，元）。

￣なわち病状）に関係なく有意差はみられなかっそのbackcross世代（以下N2世代と略す）

た。このことはGADマウスで血疑CK活性値

から伽一極mJかつmd旦／Yである個体の上昇がないことを示唆している。

を選抜することにより、旦押rlをタαdの遺伝ー65−2に示した。GAD

以上の結果より、血渠CX活性値の上昇を指Moling No．

L

OTJ

−66−

O q 一

Chfomo50me

Y ハ

Chromosome

b＋＋
十 I

5

m．嘘

Chromosome

50．塾聖空：b．堅血連
9．9空

・

−T
OTJ

gO
IO
引1

−L

Fig・1・MQting SdlCrne tOr bTOduchg gcd／god．rndxlYindivkluQtS．

Tablel．

Plasmacreatlne

klnase（CIく）actlvlty．

Genotypo No．
●
StX

Str■lnOf

mdxloeus−

DBA／21ロ2I H

C578L／101810I

S．E．H．

Rangt

7．716】．】◆

28．1

16．7−1】2．1

183．2

●

38．0

36．0

＿】11．2

ll

65．5

1】0．8

◆

3】．7

5】．0

−180．1

1】

62．5

17t．8

◆

28．6

堕／Y lO

67．3

6670．2◆／Ynd★／mdx

FlH別0一也X D2I H
F

土

6，．8

◆／◆

F

tdayさI Mean

9H

810−mdx H

CX▲etlvl亡yln plHmtmU／hlI

Of nlco

15

◆／◆

F

Hoan a90

ex抽Ined

◆／Y
r

0f

hlC8

堕／Y
◆／也

lO

79．1

12
9

66．7

◆

2617．90．8

2695．6◆1239．1】57，．1◆
0．3

18．6

◆，．1

12．1−】26．1

1180．8−29197．1

572．1−11885．6

1】79．52】．3−7755．7−108．1●H●nal的；F′femal朗．lY′Y−Chr仙OSOnO●

Table

2．

pla引na Creatlne klnaSe（CIりGtnotypoSexof

望蛙10eu暮

mllo

N0．0f

nlc0

Hoan

0I

a90

actlvltyln GAD mlce．

CX■etlYltyln〇mPlned tdaySl Hean◆◆／−

80．1◆l】．7

163．5

115．9

67．9

99．0

202．0

femaloS．E．H．

65．0

ヨ旦旦／1生色

皇旦旦／ユ里旦

9−127．150．9−】62．1

38．1−

．1◆

20．8

50．8

−137．730．1

50．9−178．0

◆15．5

59．3

−152．680．5−】92．0

96．5
201．0

◆

95．l
1

11．5

40．1

66．3

133．0

◆19．6

ねn9●

◆

13】．0
64．6

◆／一

PlHnltnU／nlI

nlC○

5．3

◆

75．7

254．3

●／一．◆／◆Or◆／皇皇旦．

標としたMDXマウスの選抜が可能であること

また文献参考値においてもそれが認められる。

が判明した。しかし血渠CK活性値は動物の生したがってm血／′Y及びmdみ旬∬個体を確実理状態（ストレス、運動負荷等）により変勤しに選抜するため、その選抜基準値を1000mV／

やすく、Tablel，Table2

においても、mBとした。

−67−

BlO一mぬ系統では、鋸0系統に見られなかでable千・ClaSSlflcaヒふofCK▲actMとle＝nd

った筋線経の大小不同、貪食反応を伴う壊死筋

9enOtype50f＿Pqm−1・

Genotype of pqM−1

線維群、中心核線維群が認められた。また（810−

Total

m血×D2）nxD2のN2世代から血策CK活性
a／b

b／b

値の上昇を指標として選抜されたマウスでは、
810−mdJ系統とよく似た筋線維組織像を示し．

CK aeuvlty

mぬノY個体であることが確認された（Fig．2−4）。

（3）交 配（1810一読dよ×D2）FlXD2のN2世代雄個体

norlna1

9

15

24

hlgh

4

6

10

Total

13

21

】4

におけるタダmTl遺伝子型分離比及び血環CK
活性の選抜基準値での分離比をTable

3に示

Y個体が含まれている可能性はある。また、各した。ともに1：1分離比とは有意差はなかっ

交配での繁殖成績（2月6日現在）をTable

た。しかし血疑CX活性の選抜基準値が高めにに示した。MatingⅢでiitter sizeが決定してあるため、nOIrmalグループにmdq／

小さくなっている。これはGADマウス雌個体

Table

4

4．Breedln9data of the matln9S tO prOduce GAD．MDX mlce
Ⅳ0．

Matln9No．

dellverln9No．

weaned pro9eny

Weanedfemalelltter sIze

Of

N0．

pr09eny

male

0．5

64

28

36

◆

0．7

76

42

34

4．3

◆

0．6

24

14

10．

8．6

◆

0．2

31

18

39

Hatln9

工

7

10．1◆

Hatlngエ工

98．4

Matln9ェェェ

7

Matin9

ェV

5

Hean

S．E．H．

★
◆

では1itter sizeが有意に小さくなるとのⅣ．考

GAD・MDX複合マウスの育成は今回報告し報告（Yamazaki el aZ．1988）とよく一致している。

察た方法で可能であると考えられる。しかし実験動物として利用するには、今後このマウスを維−68−

持し■ていく必要がある。維持に関して問誼とな選抜して、mdJlocusの固定は完了する。後

るのはし第1にGAD・MDX複合マウスの繁殖はgadlocusとPgTn−llocusのreCOmbi−

力である。810−m血系統の繁殖力は正常とほnantに注意しながら、先に述べた維持方法にぼ変わら▼ないが、Gad系統においては異常個従う。

体は生後約80日齢までしか繁殖できず、さらに異常雌個体は1itter sizeが小さい。故にGAD・MDX複合マウスの繁殖力が正常より育成したGAD・MDX複合マウスの動物モデ
ルとしての有用性を検討してみた。

劣ることは十分考えられる。第2に両形質の遺筋ジストロフィー症を示すマウス及びハムス

伝子型判定である。gad形質については伽一ター個体に、除神経（denervation）．後肢電気泳動により∫αd／与と十／十の識別は可能での不動化（immobilization）、■腱切断ある。しかし爪血形質についてはTablel（tenotomy）、及び脊髄切断（cordtomy）に示される様■に血葦CK活性値の上昇を指原と等の処置を施した実験は何例かある 。dyマウ

した方法では打出／十と七／十の識別は不可能でス及び筋ジ、ストロフィー症ハームスターに坐骨神ある。以上の2点から考えてmdxlocusは経の切断処置（除神経に相当する）を施すと・、

m血／m血及びmdち／Yで固定し、gadlocus

後肢に生じるはずの筋変性が阻止される（Eve−は繁殖期問、1itter size等考慮して、

lyn andJohnstone，1983）（Kar−∫αd／ダdと∫αd／与をうまく組合わせて維持す

pati et al．1982）。mdxマウスに関してもるのが適切であると考えられる。

同様の実験があり、この場合さらに神経の再支

Fig．1のMatingⅣより雄雌各4種類の配（renervation）の完成とともに、筋ジス遺伝子型を持つ個体が分難しでくる。雄についトロフィー症に特徴的な病理像が観察されるよては4種の識別は可能であるが、∫αd／句αd，うになったと報告された（中村ら、1985）。筋

7ndみ／Y個体（GAD・MDX複合マウス）は病理

線経の壊死は、構造的かつ生化学的に一定のレ

形態学的検査に供試するため、タαd／＋，m血／ベルの成長段階に達した筋線経に限って生じるY個体を選抜して維持に用いる。雌についてはと考えられている。また筋線経の成熟には、正mk′1−と＋／十の識別が不可能なため、∫αd／

常な筋の収縮活動と、興奮伝導以外の神経支配＋，乃血／＋個体を選抜できない。そこでMatingの2つが必要であることが知られている。

Ⅲより育成した雌、∫αd／／寸，m血／十個体を維Karpatiらは、先に述べた除神経処置が筋か持に用いる。（∫αd／＋，mdみ／＋個体）×（∫αd／らこれらの必要因子を欠如させるため、処置を＋，mdJ／／Y個体）の交配よりダd遺伝子型は受けた動物は筋ジストロフィー症の病態を免れ∫αd／ダαd個体、ダd／＋個体、七／＋個体が分ることができたと解釈している。さらに、除神離する。したがって、∫αd／＋雄個体と∫αd／十経処理による筋線維壊死の阻止が、筋の収縮活

雌個体又は∫αd／押d雄個体と∫αd／什雌個体を動の欠如、神経支配の欠如、あるいはその両方選抜する。また訊ね遺伝子型は血わん止個体、の欠如のどれに起因するものかを調べるため、mk′十個体、m血／T個体、＋／Y個体が分離

dy マウスの後肢を不動化する実験が試みられする。そこでmdめ血個体とmdJ／Y個体をている（Loermans and Wirtz，1983）

ー69−

（Wirtz

αJ．1986）。不動化処置とは、化学的に進めていく必要性があると思われる。

dyマウスの後肢をプラスチック製のギプスで以上に述べてきたことより、GAD・MDX複国定したもので、筋の収縮活動のみを欠如させ合マウスは筋の壊死、さらに再生に対する廃用ると考えられる。この実験においても、不動化の影響を調べるのに良いモデルであろうと考えによる筋線経の萎縮は生じるが筋線維壊死は阻られる。

止された。これによりLoermansと

Wirtz

Ⅴ．要

はdyマウスの病態は筋原性のものであるとし、

約

さらに按枕的、特に収縮性の活動が筋線維膜に

mdJはヒト進行性筋ジストロフィー症と良く障害を与える重要な因子であると述べている。

似た症状を示すが、活発な筋線維再生能力をも不動化及び腱切断等の筋の収縮活動を欠如さつミュータントである。またタαdは後肢からのせる処置により筋肉に萎縮が生じる。一般的に上向性感覚神経錆の異常による後肢の廃用性萎

これを廃用性萎縮（disuse atrophy）とみ縮を示すミュータントである。筋線経の変性・なしている。特に不動化による萎縮は、廃用性再生に対する廃用の影響などの新たな知見を得萎縮のモデルとして整形外科領域やリハビリテ

るため、この2つの遺伝子を同時に持つ個体

ーション医学において、また神経・筋の相互作

GAD・MDX複合マウスの育成を試みた。

用の研究においてよく用いられる（助川、1983）。
しかしFournier et aZ．（

）はギプスで

1・タαd遺伝子座に緊密に連鎖するpgm−1をの不動化は完全に筋の収縮活動を欠如させられマーカーとしたGAD個体の識別及び血渠CKないため、必ずしも廃用性のモデルとはならすこ

活性値の上昇を指標にしたMDX個体の識別は、むしろ脊髄切断処置の方が良いモデルであろう

ともに可能であった。したがって以下に述べると述べている。脊髄切断処置は末梢での神経支方法でGAD・MDX複合マウスは育成できるこ配は残すが、中枢との興奮伝達錆を断つものでとが示唆された。まず810−m血系統とD2系ある。dyマウスに脊髄切断処置を施した報告

統の交配のN2世代からP∫爪−1シわれ−たれ血／によると、除神経、不動化処置と同様に筋線維Y個体を選抜する。さらに選抜個体とGad系統

壊死が阻止されている（の交配のN2世代から巧叩−1翫）四一la（すなわ）。しかし脊髄切断処置による筋萎縮が、人為的に運動性及ち∫αd′7αd）m血／Y個体を選抜し、GAD・び感覚性の神経露を全て遮断することに起因しMDX複合マウスとする。

ているのに対し、GADマウスにみられる筋萎
縮は、遺伝的に下肢の感覚神経路のみが遮断さ

2．上記の計画交配中に育成したマウスを用いれることに起因する廃用性萎縮であると考えらてGAD・MDX複合マウスを維持していくことれる。故に脊髄切断処置を受けたdyマウスと、が可能であると考えられる。

本研究で育成するGAD・MDX複合マウスの病態の比較に興味が持たれる。さらに∫αdマウス

3．遺伝的に下肢の感覚神経路のみを遮断したの廃用性萎縮と、不動化、腱切断処置による人ことによる廃用性萎縮が、筋の変性・再生に与為的な廃用性萎縮の比較を、病理形態学的、生える影響を調べるのに良いモデルとなるであろー70−

うと思われる。

4）FournieI、，M．，Roy，R．R．，

Perham，H．，Simard，C．P．，andlI．謝辞

Edgerton，V．R．（1983）Zslimb

本研究は名古屋大学農学部畜産学科の卒業論

immobflization a model of muscle￣文のテーマとして行ったものであり、この研究
disuse？Exp．Neurol．80，147−を遂行するにあたり、終始懇篤なる御指導を賜156．

わった富田武教授に対し深く感謝の意を表します。また本研究に有益かつ適切なる御助言をく

5）Harrison，S．D．Jr．，Burdeshaw，

ださった若杉昇助教授、並河鷹夫博士、川本芳

J・A・，Crosby，R．G．，Cusic，A．M．，

博士に深く感謝いたします。実験を進めるにあand Denine，E．P．（1978）Hemat0−

たり、多くの御指導をいただいた山崎一斗先輩

10gy and clinical chemistryに深く感謝いたします。さらに動物の飼育に関し多大な御苦労をおかけした成田志織技官に心referPnCe■values

for

C57BL／6

X DBA／2F．mice．Cancer Res．

から御礼を申しあげます。また貴重な動物を分与してくださった実験動物中央研究所の斉藤宗

38，2636−2639．′

6）Hoffman，E．P．，Kundson，C．M．，

雄氏に厚く御礼を申しあげます。

Campbell，K．P．，and Kunkei，Ⅶ．Referencesl）Bulfield，G．，LSiller，W．G．，

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fractio＿nationtheofdystrophin

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T（5mitaI T・l MukoyamaI M．，andProc．Soc．Exp．Biol．Med．in

Kikuchi，T．（1987）LocationL

preSS・

Of gracile axonal dystrophy

ZZ）Yamazaki，K．，Wakasugi，N．，（gad）on chromosome

50f theSakakibara，−A．，and Tomita，T．

mouse・Jpn．J．Genet．

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479−484．

Reduced fertilityin

gracile axonal dystrophy（9ad）21）Yama2：aki，K．，Wakasugi，N．，

−73−

mice．

Exp．Anim．in press．

︳
■

Lt
︑

L・．

1
−

恵∵∪卑㌣
∴竺草■骨⁚さ

Fig．2

Cross−SeCtion of anterior tibial muscles
Of a BIO male mollSe at（HE−Staining，8

217

days after birthm〟section，100X■）

「
し
l

●

∴∵∴㍉
●

ト㌧
l

一

Fig．3

一・

Cr・OSS−SeCtion of anterior tibial muscles ofa Bl0−mdx male mouse at（HE−Staining，8267

days after birthm．il section，100X）

t

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Fig．4

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Cross−SeCtiCIn Of ant，erior tibial muscles ofamdxノ′mdx

male

mouse

（BIO−mdx X D2）F．X D2（HE−Staining．8

from

at

backCrO：ミS

257

generation，dayS af−ter birthm section，100X）

昭和62年度厚生省研究報告書，乃−90，1988

筋ジストロフィー症動物モデルとしてのセロトニンミオパチー
三 池 輝 久＊研究協力者 鳴神 浩：吉岡 毅＊
Duchenne型進行性筋ジストPフィー症

Stageの3症例（8ケ月、10ケ月、14ケ（以下DMDと噂）の筋病理の特徴は壊死線経月）の筋組織中血管を電子顕徽鏡的に観察し、と再生筋線経が混在することである。preCli−1）血管内皮細胞の変化、特に水腫様膨化、2）nical stageにおいてはこの所見が最も顕

血小板付着、凝集による血管腔閉塞などの所見

著に認められ、本症初期の筋病理はこの現象にを認め（図1）、これらの変化は血流障害を引尽きるといっても過言ではないように思われる。

き起すに十分なものと思われた≡）さらに2万倍

しかもpreclinical stageにおいては壊写真を用いた画像解析装置によるmOr・phome七一

死、再生節線経のほとんどが共に10−50本

ricな検討で、同年齢の対照群に比し統計学的程度のグループをなして存在するのが特徴であにきわめて低い危険率（Pく0．0001）で、MDる三）これらの特数から本症の原田病理として、の血管内皮細胞面積、血管面着、血管周囲細胞

血管系の障害が大きく関っていることが示唆さ

面積が増大していることが確かめられた喜）このれると考えた著者らは、preClinical

ような著しい血管変化は、それが一次的にせよ

図1・DMD：8ケ月男児。著しく膨化して水腫状を呈する筋組織内毛細
血管内皮細胞（E）。血管腔はほとんど閉塞状態を示す。
●●●●●■■■一日………一●●■●●■●●●●●●■●●■●■■●

・熊本大学医学部小児発達学ー79−

二次的にせよ、DMDの筋の成熟、再生に大小腔内に投与した。

関与していると考えられる。1977年．Munsat（1）セロトニン投与量と筋障害の程度との関らは、ラットに誘導された実験的七￣ロトニンミ

係を知る目的で、28遇令、400㌢のラットに、オパチ一において、typel，Ⅱa選択的な障害

50叩／晦、100呼／晦、200叩／鞄のセロトおよび活発な再生現象とともに血管内皮細胞のニンを投与し5日日に生検を行い、ヒラメ筋変性を観察している。この血管内皮細胞の変性（以下soleus）、長址伸筋（以下EDL）には、肥厚化、水腫様膨化、辺縁層の増殖、ミを採取した。

ト。ソトリアの溶解が認められたという≡）（2）筋障害の分布を知るために、4週令、

私達がpreclinical stageのDMDで100−150㌢のラットにセロトニン100蛾

観察した血管内皮細胞変性と、Munsat

らがラットの実験的セロトニンミオバチ一に兄いだを投与し12時間後に生検、SOleusとEDLの他5種の骨格筋を採取した。
（3）セロトニンミオパチーの時間的経過を観した血管内皮細胞変性との間の類似性は、DMDの原因病理に血管性の変化が大きく関与する可察するために、4遇令、100−150クのラッ能性を示唆すると同時に、ラットに誘導される

トに75呼／晦のセロトニンを投与し、投与後セロトニンミオパチーがDMDの動物モデルた

6時臥12時間、1日、2日、5日、7日、り得ることを示すものと考えられる。

30日にそれぞれ生検を行い、SOleusと今回私達は、1）ラットに誘導されるセロトニ

EDL を採取した。

ンミオバチーがDMDの適切な動物モデルたり（4）セロトニンの慢性的投与による筋障害を得るか否か、2）その筋崩壊のノミターン、および検討する目的で、4遇令の動物に4週毎にセロ

3）筋ジストロフィー症の発生病因における血管

トニン75叩／晦を投与し、投与後4遇と8遇

性田子の役割について検討する目的で以下の実にSOleusとEDLを採取した。

採取した生検筋は夫々二分し、光頚的および験を行った。

電顕的観察を行った。光顕用として、′クリオス
タットで凍結切片を作製し（10／川）、H−E、〔研究方法〕
実験動物はすべてウィスター系雄性ラットをATPase、アクリジンオレンジ、Gomori−用いた。一部28遇令、体重4007のラットを

trichromeを含めた一連の組織化学的染色用いた他はす、べて4週令、100−150タの動物を行い検討した。電顕的には型通り固定、抱埋を使用した。セロトニンは、Sef、OtOnin−

後、超薄切片を作製しウラニール、鉛の二重染

creatinin complex（Sigma No．H−

色を行った後、日立H−300にて観察した。

7752，Mol．wt．387．4）を1N塩酸に溶解した後、NaOH溶液でPH7．4に調製した。

〔結

投与量はSerOtOnin−Creatinin comp−（1）セロトニン投与量と筋障害の程度

1exとしての量を示す（serotoninの力価

筋障害はセロトニン投与量に比例して増強しは、SerOtOnin−Creatinin complex

ていたく図2）。50叩／KFを投与したラット

量の約45界である）。セロトニンはすべて腹では、SOleusは軽度ながらmaSSiveに障

−80−

果】

図2・セロトニン投与後5日目のSOleus：数字は投与量を示すが筋病変はdose dependentに増強している。

−81−

図3．セロトニン投与後5日目のEDL：50鯛では全く筋病変は認めない。
100−20（押／晦で出現する筋病変はSOleusに比して軽度である。

−82−

図4・筋病変の分布：セロトニン75喝／Kg投与後12時間のSOleus（S），EDL（E），
上腕三頭鰍T），上腕二頭筋（BJ。（S）とrT）のみに変化が見られる。

ー83−HistoJogical Changes of Soleus Muscle

tNECROSIS EDEMA O．F＊1

6hours（n＝5）

R G．＊2

Clヂ3

十十十

十十

＋＋

＋

十十

十

十十

十

十十

十＋＋

十

十十

＋

＋＋＋

＋

＋＋

…芯悪iveI一

十十十…農芸触†一十十

controT（n＝2）

12hours（n＝5）
control（n＝2）

1day（n＝5）
COntrOl（∩＝2）

2days（n＝5）

十十十control（n＝2）

5days（n＝5）
control（n＝2）

Tdays（n＝5）
control（n＝2）＋＋

14dayS（n＝3）
control（n＝2）

30days（n＝2）

一

子恵JatedcontroHn＝2）＊10paque fiber＊2Regeneration

ー84−＊3CellinfHtration

害され、100呵／鞄あるいは200叩／Kyを投目にははじまっており、5日目に最も盛んとな与された動物では、筋障害の程度も範囲も50

り以後14日目までは持続してみとめられるが叩／Kgに比較してdose−dependentに著し30日目には消失している。セロトニン投与後くなっている。壊死に陥った筋線経はグループ

5−7日に2−3の標本で、軽度の結合織の増を形成し、phagocytosisと細胞浸潤にみ

加がめとめられた。30日後にはきわめて少数

まわれている。その周囲を正常の筋線経が取りのangulated fiberがみられるものの、囲んでいるように見える。筋障害はSOleus

筋緑経のセロトニンによる障害からの回復はほに選択的につよく、EDLは50刀呪′／晦投与動物

ぼ完全といってよい。

では全く障害されていない。100呵／Kク以上

図5は、セロトニン75醐投与後6時間、の投与量ではじめてSOleus

12時間、1日、2日に生検採取したSOleusと同じような所見が認められるものの、その程度と広がりはのH−E染色標本である。壊死に陥った筋線経

SOleusが一群を形成しているのがわかる。細胞浸潤とに比較して軽度である（図3）。

（2）筋障害の分布

問質の浮腫が認められ、これらの所見はセロト

セロトニン腹腔内投与後12時間に、SOleus

ニン投与後2日目に最も著しかった。

とEDLの他上腕二頭筋、上腕三頭筋、誹腹筋

筋の再生現象はセロトニン投与後2日目から等を生検採取した。筋病変は専らSOleusに見られるようになり14日目まで持続して認め強く、上腕三頭筋に軽度の変化を認めるもののられた。ATPase染色ではTypeIlc反応を

EDLを含む他の骨格筋にはなんらの変化も認伴う活発な再生現象が認められ、これら再生線

めなかった（図4）。

経もまたグループ形成している（図6）。

（3）セロトニンミオパチーの時間的経過（表）acridine orange染色でも同様の所見をセロトニン75万吼′／Kクを4遇令のラットに腹腔確認したけ

内授与し、投与後6時間、12時間、1日、2

セロトニン投与後30日には、この再生現象

日、5日、7日、14日、30日にそれぞれ生は完了し筋組織はほぼ正常に復するが、H−E

検LSOleusとEDLを採取した。75呵／Kg

染色およびGomori trichrome染色で少の投与量は、適当な筋障害を惹起できる量とし数の中心核を持つ線経とangulated fiberて、（1）の実験から50万牧／晦と100瑠／KFの中が認められた（図7、但し回はH−E染色標本

間の量という意味で採択したものである。

のみ示す）。

投与後6時間にはすでに筋線経の壊死と問質（4）セロトニン反復投与（4週毎75昭／KP）の浮腫および細胸浸潤が認められ、これらは2による筋障害は単独投与によるそれと異なると日日まで持続する。この時期にはまたOpaque

ころはなかった。

fiberも認められ6時間から12時間に顕著（5）電顕所見であるが2日目には殆ど見られなくなる。筋線

セロトニン投与後12時間と24時間（1日）

経の壊死と問質の浮腫は6時間から2日目に著のSOleusに筋組織内血管の変化が認められ明となる。細胞浸潤は6時間後より次第に増強た（図8）。血管基底膜の肥厚と血管内皮細胞し2日日に最も強くなる。筋の再生現象は2日の水腫様膨化が認められそのために血管内脛は−85−

図5．セロトニン75野／鞄投与後：6時間（61，12時間（12），24時間（24），48時間（48）のSOleus。

一86−

二慧
＿

dh

鈎

−

5㌔．

図6・セロトニン75喝／晦投与後5日目のSOleus：タイプ2C反応を伴う再生現象が著明。ATPase染色；上からpH4．2，4．6，rOutin。

ー87−

図7．セPトニン投与後30日目のSOleus：少数のangulated fiberが見られる。

図8．セロトニン投与後24時間のSOleus：血管内皮細胞（Elの水腫様膨化が著しくヒトDMDと同様の変化（図1）が見られる0一88−

著しく狭陰化している。

り込みの障害ご）5㌔ロトニンを含むbiogenic
amineの代謝障害6）等々によって示唆されて〔考察〕きたが、何れも血管性田子を介するものである。

DMD preciinical stageにおいて私またDMDでplasminogenおよびPlasmi−

達が観察した筋組蔵内小血管の内皮細胞を中心

nogeninhibitorの異常があるという、とした著しい変化は、本症において徴小循環障

DMDの血管内凝固に対する線溶系の関与を示

害が何らかの形で関与していることを示唆して唆する報告7）もある。更に、血管内皮細胞にもいると考えられる。一方、Munsatらの報告

筋細胞同様に多くの収縮蛋白が認められ、それしたセロトニンミオパチ一における血管内皮細らはミオシンやアクチン線経に類似していると胞の変化は、DMD preclinical stage

いう報告8）もある。このようにDMDの発生病で私達が兄いだした所見と酷似している。

因論における血管因子の関与を伺わせる知見は

Munsatらはセロトニンミオバチーのpath0−

多く、DMDと血管因子の関係は今後追求すべ

genesisは第一義的にはischemicなもの

き課題であると同時に、実験的セロトニンミオである故をもって、DMDの動物モデルとはな

バチーはその好個の動物モデルであると考える。

り得ないと結論している3）のであるが、私達はこの故にこそ、DMDのpathogenesisにお文

ける血管因子の役割を再認識すべきであると考

1）T．Miike：Maturational defectえる。

献Of regenerating muscle fibers

今回の実験によるセロトニンミオバチーの筋

in cases with Duchenne

病理の特徴は、壊死に陥った筋線経と再生筋線

andCOngenitai muscuiar dystro−

経が混在し、しかもそれらがグループをなして
phies．Muscle

存在するという、DMDの初期の筋病理ときわ＆Nerve6：545−

552，1983

めて類似性の高いものである。更に筋組織内血管の内皮細胞の水屋様膨化とそれに伴う血管内2）T．Miike，S．Sugino，T．Taku

腔の狭小化も、DMD preclinical stageand K．Yoshioka：Vascularの血管病変とよく一致する。セロトニンミオバ

endotherial cellinJury andチーが、セロトニンの筋に対する直接的な作用

platelet embolismin Duchenne

によって引き起こされるものなのか、あるいはmuscular dystrophy at the

血管性因子を介するものなのかは不明であるが．

preclinical stage．

上述した筋組織像の特徴や血管の変化は、詳細
J．Neurologicai Scienses

は不明ながらなんらかの形で血管を介するもの

82：

67−80，1987のように思われる。
セPトニンがDMDのpathogenesisに

3）T．MunSat，P．Hudgson and関与している可能性はその血管作用による揆能

M．Johnson：Experimental

的な虚血あるいは血小板によるセロトニンの取

tonin myopathy．Neurology

−89−

sero一

7）Z．Shomura，N．Nagao and27：772−782，1977

Y．Sawada：Plasma fibrinoly−

4）D．Murphy，J．Mendel and
W．Engel：Serotonin and plate−

Sisin patients with prog−

let funCtion in Duchenne

ressive muscular dystrophy．

muscular dystrophy．Arch．

Kumamoto Medical Journa1

Neur01．28：239−242，1973

36：55−61，1983

5）R．Arora，R．Kuncl，J．Morgan，

8）D．Drenckhahn andJ．Wagner：

L．Cohen and H．Meltzer：

Stress fibersin the splenic

Serotonin uptakein blood

Sinus endotherium in situ：

piatelets of Duchenne

molecullar structure，

muscular dystrophy patients．

relationship to the extra−

MuscleCellular matrix，and contra−＆

NervelO：359−362，

1987

Ctiiity．J．of Ceii Bioiogy
lO2：1739−1747，1986

6）M．Yu，T．Wright，W・Dettbarn
and W．OIson：Pargyline−
induced myopathy with hist0−
Chemical characteristics ofDuchenne muscular dystrophy．
Neurology24：237−244，1974−90−

昭和63年度厚生省研究報告書，91−98，1988

ミエリン形成異常ウズラについて
■

誠ガ

鉄

谷谷

水布
研究協力者
当研究所で維持しているWE系において全身激しい個体では足の指の曲がりもひどい傾向がの振戦を特徴とするミュータントの雌が出現しある。そして、これらの異常は一生を通じて治た。本報告はこのミュータントの臨床症状、病ゆしない。

理組織学的検索、遺伝的分析および繁殖成績に関する結果である。

2．病理組織学的検索
1・5カ月齢の異常ウズラの中枢神経系を組織

1，臨床症状学的ならびに電顕的に検索した。

本ミュータントはふ化時より種々の外的刺激

脊髄パラフィン切片の抗M8P抗体を用いたにより足の指を曲げながら振戦を示し、ひどい

PAP法ならびに視神経、脊髄のェボン厚切り

個体では起立不能（図1）となる。振戦の程度

標本トルイジンブルー染色で髄鞘の明らかな減には個体差が存在し、軽症の個体ではわずかに少を認めた。視神経の電顕的検索では、有髄線

頭部および頸部が振戦するのみである。振戦の経は単位面積当り15−30界程度対照に比べ少図2．正常ウズラの視神経＊（財）日本生物科学研究所−91−

図3．異常ウズラの視神経

図4．異常ウズラの視神経。 ミニリンラメラの厚さは軸索の太さに関係なく不均一で、裸の線経も存在する。

一92−

図5．異常ウズラ視神経。 異常に延長した髄鞘と崩壊した髄岡を示す。

図6．オリゴデソドpサイト細胞質内にみられる脂肪滴状物。

ー93−

図7．核染色質の凝集。 核周囲脛ならびに細胞内小器官の拡張した変性性オリゴデンドpサイト。
なく、小径の軸索に無髄のものが多かった（図小脳の組織学的検索は未検索であるが、上述

2，3）。しかし、中には比較的太い線経で髄の所見ならびに末梢神経系には著変を認めない輪のみられないものも存在し、軸索の直径に対ことからこのウズラには中枢性のミエリン形成するミエリンラメラの厚さは不均一であった異常の存在することが示唆された。

（図4）。形成されているラメラの多くにはMajor denselineが存在しCOmPaC一3．遺伝的分析

七ionに異常はなかったが、ラメラ形成の緩い

WE系において出現した振戦を示す雌と正常

もの、髄鞘の異常な延長、髄鞘内空 形成、軸の雄とを交配し47羽のFlを得た。

索周囲腔の拡張、髄鞘の顆粒状あるいは塊状崩

羽はすべて正常であった。そこで、FlXFlお壊などさまざまな異常を示す髄鞘が存在した

よびFlX振戦雌親の交配を行い、後代におけ（図5）。変異体のグリア細胞数に大きな変動

る振戦個体の出現頻度を初生雛において観察しはみられなかったが、オリゴデンドPサイトとた。結果は衰1に示したごとく、F．×Flの交思われる細胞に核顔色質の凝集や核膜の不規則

配からは434羽の雛が得られ．正常個体と振な陥凹、核周囲脛の拡張などを伴った変性性の戦個体はそれぞれ329，105で3：1の比にものを認めた。また、ゴルジ嚢および租面小胸適合した。一方、FlX振戦雌親のもどし交配か体の拡張や脂肪滴状物をもったオリゴデンドP

らは38羽の雛が得られ正常個体と振戦個体はサイトも頻繁に観察された（図6，7）。

それぞれ17，21で1：1の比に適合した。

ー94−

この47

表1．ミエリン形成異常ウズラの遺伝子分析
−￣

￣

￣−

交

￣￣

￣

一一

×

−

より支配されていることを示している。

−

子

4．繁殖成績

雌

正常

異常

異常

47

0

ミエリン形成異常系（Shv系）、糖原病皿型

329

105

系（RW系）および8種の正常系の繁殖成績を

1721

表2に示した。表からも明らかなようにShv

Fl X F1

Fl X

￣

配

雄
正常

￣￣￣

異常

系はミエリLン形成異常形質以外の形質に関して
これらの交配における振戦個体の出現頻度は、は無選抜であるにもかかわらず、糖原病Ⅱ型形

このミュータントが常染色体性の劣性遺伝子に質あるいは自卵産卵形質以外の形質に関して無表2．ミエリン形成異常ウズラ（Shv系）およびその他の系統の繁殖成績
系

統

名Shv RW WE PSN AMRP PNN SBPN SBPP TKP CWE

受 精 率24．5 48β 822 33．0 70．3 27．7 24．9 42．0 40．515．3

ふ 化 率

43．5 42．7 77．1393 535 50J）67．4 44．5 37．136．3

育

成

率

（0−3遇齢）

19月

84．1

91．0

39．7

537

49．7

62月

70．8

614

41．6

選抜のRW系あるいはWE系に比較し受精率お発作は休息時にはみられない。ほとんどの個体

よび育成率が極端に低い。また、このShも系

はふ化後1週間以内に死亡するが、少数のものの繁殖成績は、約20年間血液型、血清アイソは成鳥となる。常染色体性の劣性遺伝子によりザイムおよび羽裳などについて選抜を加えてき支配されている（Sittmann，1965）。

たPSN，AMRP，PNN，SBPN，SBPP，TKP

b．Star gazing：外的刺激により頭をおよびCWEの各系統のそれらより悪い。特に

背につけ星をみあげるような姿勢の発作をおこ

3遇齢までの育成率の低いことはShv系の特す。繁殖力は正常である。常染色体性の劣性遺徴である。

伝子により支配されている（Savage andShv系の繁殖成績の悪いことはこの系統のCollins，1972）。

維持の際重要な問題である。今後、Shv系のe．wry neck：頭部を腹側にまげ、前に維持にはn（正常×異常）雄に異常ウズラの雌

転倒する発作をおこす。ふ化後4日以内にほとを交配し、受精率をあげるとともに異常ウズラ

んどの個体が死亡する。常染色体性の2つの劣の育成率を良くする方法を検索する予定である。

性遺伝子により支配されている（Savage andウズラにおいて行動異常を示すミュータントCollins，1971）。

d．暗色羽神経異常：暗色羽とともに神経異には以下の4報告がある。
a．congenitalloco：外的刺激によ常を併発する。主な症状は振扱であるが、そのり頭および頸部を背側にまげ頭を振戦する発作

程度には個体差が存在する。組織学的には小脳をおこし、時にはバランスをくずして回転する。

に異常がみられる。常染色体性の劣性遺伝子にー95−

より支配されている（河原、1980）。

2）Savage，T．F．，and Collins，

今回報告したShv系は上述のいずれのミュータントとも異なり、鳥類においては最初のミエリン形成異常を示すミュータントであり、疾W．M．，工nheritanCe Of star
gazinginJapanese quail．
J．Hered．

63：87−90，1972．

患モデルとして有望と考えられる。
3）Savage，T．F．，and C011ins，

文

W．M．，Wry

献

neck，anabnor一mality ofJapanese quail．

1）Sittmann，K，W．，Richards，

Poultry Sci．50，1627，1971．

C．P．，and Abplanalp，H．，
Congenitaliocoin a third4）河原孝息：家禽煩，特にウズラにおけるSpeCies of domestic fowl．

神経異常突然変異． 実験動物．29：

Can．J．Genet．Cyto1．

93−98，1980．

7：

636−640，1965．

ー96−

一斗
図1．ミニリン形成異常ウズラ、足の指が曲がっている。起立不能。

昭和63年度厚生省研究報告書，，99−106，1988

C57BL／6−車生産方法の改良−ビニールアイソレータを用いた卵巣移植の試み一斉 藤 宗 雄■研究協力者 江袋 進ご日置恭司攣
筋ジストロフィー（以下筋ジスと略）研究に行われ、SPFの動物がアイソレータ内で生産

おいて、モデル動物の開発・改良は極めて重要

され供給されるようになった。しかし、アイソである。私どもは、この班に参加して以来、筋レータはスペースが狭く、無菌的手術も困難で、ジスマウスC57BL／6−dy（以下B6−dyと略）、

前述の卵巣移植を利用するのが極めて難しくな

C57BL／10−扇J、筋ジスハムスターBI0−っている現状である。卵巣移植がアイソレータ

14．6、UM−Ⅹ7．1の維持と生産を行っている。

の中で行えれば、SPFのB6−dyの生産は極これらの維持状況を昭和61年度には詳しく報めて合理化されるものと期待される。

告した。今年度は筋ジスマウスB6−dyの生産

私どもは、従来の無菌動物の作出経験を基に、方式合理化の一環として、ビニールアイソレー

アイソレータならびに無菌手術操作に改良を加タ（以下アイソレータと略）内の卵巣移植につえ、無菌的卵巣移植技術の確立を目的とし本研いて検討したのでその成績を報告する。

究を行った。

目的方法

B6−dyマウスはメス・オス共に劣性ホモ検討した卵巣移植手術は、ドナーの卵巣をア（dy／dy）で発症し、発症個体は繁殖不能であイソレータ外で無菌的に摘出し、アイソレータ

る。通常、繁殖はヘテロ（＋／dy）間交配により内に搬入し、レシピェントの卵巣と交換手術す行なわれ、次世代はホモと同腹のメス・オス

るものである。移植手術の確認は、手術メスマ（遺伝的に＋／＋または＋／dy）を無作為に交ウスを、異なる毛色のオスと交配し得られる子

配し子どもにホモが出現するペアを選ぶもので、の毛色から推定するものである。なお、手術に

86−dyマウスの繁殖には多くの労力が必要であたって予めレシピェントの系統はSPF化さある。江崎らは、1970年代維持・生産の合れていなければならない。

理化のためにB6−dyの卵巣をC57BL／6−血（以下86−Awと略）に移植することによりG）卵巣移植用アイソレータ

B6−dyの卵巣を持つメス親を作出し、このマ基本としたアイソレータは、日本クレア製撤

ウスにC57BL／6（以下86と略）オスを交配10型である。すなわち、間口115（Ⅶ奥行50し、効率的にヘテロマウスを得る技術を確立しC〝！高さ50の刀のビニール本体に、直径25cmのた。

給気・排気用円盤型フィルターを各1個、直径

その後、B6−dyマウスは微生物的清浄化が30爪の物品搬入用ステリールロックを1個、書（財）実験動物中央研究所ー99−ネオプレソ製手袋を1双取り付けたものである。

実体顕微鏡が内部に設置されているため、ア

このアイソレータに、卵巣移植用として以下のイソレータの滅菌に通常用いられる過酢酸は腐改良を加えた。

食性が強いため使うことはできず、ビニール本

手袋：既存手袋の先端に外科用ラテックス手体の滅菌にはエチレンオキサイドガスを用いた。

袋を取付け、また、ステリルロック側に1双追滅菌に当たって、ハサミ、ピンセット等の手術

加し2双とした。これら手袋の取付は、従来法用具は予め高圧滅菌し、顕微鏡や光源は出来るに準じ手袋リングを使い接合部に接着剤を詰めだけ解体した。アルコール、ネンブタール等のテープで固定した。

試薬は無菌的なものを選んだ。滅菌は、ビニー

観察窓：アイソレータ本体は透明であるがフル本体を凹ませてから209らェチレンオキサイ

ィルムのゆがみで内部の手術操作が行いにくい

ドガスを噴き込み、膨らんだところで止め、アために、硬質プラスチエノク板を手袋側に接着剤

イソレータ手袋を使って内部を擾拝し、そのまで貼り付けし、チープで固定し観察窓とした。

ま8時間以上放置した。

薬液トラップ：卵巣を無菌的かつ迅速にアイ滅菌効果の確認は、滅菌ガス噴き込んで8時

ソレータ内へ搬入するために、ビニール本体の間放置後換気を始め、24時間換気し滅菌ガス

右側に無菌動物手術用アイソレータに用いられが充分排除されてから、実体顕微鏡、アイソレ

る薬液トラップを取り付けた。薬液はマイクロータ内壁、手術用具等の表面を綿球でふきとり、

カット50倍液を用いた。

無菌検査用培地で37℃14日間培養した。
なお、その他のアイソレータの滅菌は、従来

実体顕微鏡の取付：卵巣移植手術は約40倍の実体顕微鏡下で行われる。アイソレータへのの無菌飼育技術によった。

実体顕徴鏡の取付は、従来、無菌動物の胸腺摘出手術の場合、顕微鏡本体を外に置きビニール（参 動 物

フィルムに対物レンズが接するよう取付けられ

本実験（昭和62年9月から12月）に用いる。この卵巣移植実験においては、顕微鏡の機たドナーとなるB6−dyは、当研究所コンベン能を重視し、腐食性の少ない滅菌法もあること

ショナル飼育室で繁殖された6週齢16匹を、から、顕微鏡本体をアイソレータ内に置き、ビレシピェントのB6−AwはSPF飼育室で繁殖

ニール本体を接限部の鏡筒で通し、接限レンズ

された8週齢メス16匹を用いた。移植後の交を外に出すようにした。使用した顕徽鏡はオリ

配実験にはSPFの86オス14匹を用いた。

ンノミス実体顕微鏡206418型である。

（9 卵巣移植手技

光源用電源：顕微鏡用光源はアイソレータに置き、電源はビニール本体消毒薬噴茅口用ゴム

卵巣の摘出は、B6−dyを脊髄切断により殺栓の中央に電気コードを通し接着剤で止めた。

処分後、希ヨードチンキ薬液層に浸し全身を消以上の改良を加えた卵巣移植用アイソレータ

毒、解剖台上に背位に保定、腹部をハサミで切を写真1に示す。

開し、子宮と共に切除・摘出した。アイソレー
タへは、摘出した卵巣付き子宮を滅菌試験管に（参 アイソレータの滅菌

入れ薬液トラップに浸積し搬入した。

−100−

つぎに、予め搬入してあるレシピェントの術者は、アイソレータ外操作に1名、アイソ

B6−Awの体重を測定、これを基に109もネン

レータ内操作に1名の2名で行い、全操作は1

プタールip投与麻酔し、実体顕微鏡下に旗位匹当たり10分程を要した。

に置き、背部皮膚（片側）を切開、卵巣を周囲移植の確認は、卵巣移植したメスマウスを飼の脂肪組織と共に引き出し、卵胞を切開、レシ

育用アイ▲ソレ一夕に移し、術後2週目に86オピェントの卵巣を摘除した。

スと交配した。生まれてくる仔の毛色が、野生試験管に入った卵巣付き子宮を取り出し、実色の場合遺伝子がAaとなり残置B6−Awの体顕微鏡下で卵巣のみとし、前述のB6−Awの卵巣仔と推定し、黒色の場合遺伝子がaaとな卵巣を外した位置にはめ、脂肪層で包み体内たりB6−dyの卵巣仔と推定した。清浄度につい戻した。

ては育成された動物について実験動物の微生物

対する側も同様に手術し、縫合クレノメで皮モニタリングを行った。

膚を止めた。術後ケージに1匹づつ収零しアイ

以上のビニールアイソレータを用いた卵巣移

ソレータ外部からライト照射で保温し蘇生を計植技術の概要を図1に示した。

った。

卵 巣 移 雄一アイソレータ内手術操作−

ドナー卵巣の精出−アイソレータ外無菌的操作−

美 紀 実 験−アイソレータ内−

C訂Ⅳノ6の推持感［∠ ＝⊃ ・

実血 糊 下 ■ と 塵⊃

一かu86−ル×∽
l

盛了》了日

管7詣忘紙

卵巣を子音に
付けて所出

ヽ

城諸共親
に入れる

薬液ト ラップ
を介し て、
アイソ レ一夕内へ

C57軋ノ㌻Jy♀ 8週由（
g F）
ネンプタ
1 ール
抒部皮膚を
切開、卵巣
腐酔
嫡出
l
■
・一一
→
dy卵巣移植血u l娼」レ
の・
…
† ンメ
縫合クレ
閲定

爪毛色仔が
抄旭卯瓜仔

図1．ビニールアイソレータを用いた卵巣移植技術

結果と考案

あった。

9月から12月までにかけて行われた卵巣移植成績を表1に示す。

交配実験は14匹について行い12月末日までに出産したのは6匹で出産率42．8ヲ乙であっ

卵巣移植手術は5回16匹について行い、蘇た。総産仔数は36匹で平均産仔数は6匹であ生し交配できたのは14匹で成功率87．5界でった。産仔のなかで黒色毛（aa）は19匹、野−101−

表1．アイソレータ内卵巣移植の成績−dyOVC57BL／6−血×C57BL用の繁殖成績から−
産仔数 黒毛色＋／匂γ（界） 野生毛色＋／十1

10／15日5匹（83．3）〝

11／20

3（42月）

12／10

″

〝

12／／つ6〝

妊娠

2（40．0）4（44．4）2

7

5（71．4）

0

2

l
l
l

〝 S 〝 ぴ 〝 S 〝

〝

5

9

〝パ〝

1仇／6

3

11／16

5

11／6

〝

4

7

〝

〝

匹

10／5日

6

出産日

匹

RH

パ〝

交配日

0

−

10／30

12／23

12／28
〝

合計

14匹

14匹

6匹

36匹

19匹（52．8）

15匹

1986年Cbnv成績

22匹

56匹

225匹

124匹（55．1）

47匹（1987）

生色種は（Aa）15匹で、総産仔数に対する黒色検査ならびに手術動物でも無菌が維持されていた。

毛の出現率は52．89あであった。
これらの成績を昨年度試みたアイソレータ外

ま（コンベンショナル）の成続と比べると黒色毛とめ

SPFの筋ジスマウスB6−dy生産の合理化のためにアイソレータ内の卵巣移植手術についの出現率は55界で、差が見られなかった。
卵巣移植前後の、微生物検査成績を表2に示て検討した。
実体顕微鏡を取り付けた卵巣移植用アイソレした。ドナーとなるB6−dyの微生物グレードはコンベンショナルで ね8te㍑re乙乙α

ータを試作し、その滅菌、消毒法を検討した。

pれe乙仰〇七m〆たα，殆純血moれα8αer㍑一

このアイソレータを用いて卵巣移植を行った結gもれ08α，寄生虫のG宜αrdfαm紺乞8J果、微生物的清浄度の高い手術が行われ、術後

Syhacia spp等が検出されている。卵巣移動物の交配実験では、効率よくへテロマウスを植後のアイソレータ内のB6−dyコーニーでは、得ることが出来た。これらの成績は、従来のア

これらが全てフリーとなりSPFが維持されてイソレータ外で行われた成績とほぼ同等であった。
このようなことから、この技術はSPF筋ジ

いた。
また、技術の確認のために行った無菌IQI系への卵巣移植手術では、アイソレータの無菌

スマウス生産に有効に応用できるものと期待さ
れる。

ー102−

表2． アイソレータ内卵巣移植マウスの微生物検査成績
動

物

微

生

物

βのr

e f e 乙 α ゐr o 乃e た 8 e P 弱 C α

C o r 〟乃e あαe ね r f 祝乃 た祝亡8 e わe P 乞g
8 e 力e r 五e みね C O Z f 0 1 1 5 a ，C培
ね 8 亡e 紺 e 乙乙α p 乃e 乙m O ±㌘呼 もe α
P 8 g ㍑d o m o 乃α8 αe m g もれ0 8 α
βα乙m o 乃e 乙乙α 8 P P
養 β吉昭 わ訂乙o e o e e 加古 α㍑r e 祝8βと㌘呼 わ e o e e ㍑8 P 乃e 乙仰 の花王αe〟おe 甲 乙α8 m α p ㍑乙m o 花王8血C o r ぉ明e ゐαe ね ア五㍍柁 たれ士8 e わe r f
βα乙m o 乃e 乙乙α 旬 P 九五m 祝P で乙招Ty z ze r ls or g a n i sm
清 勒 e 甲 乙α8 m d P ㍑乙m o 花王8E ct r o m e l ia v i r u s
M ou se a de n o v i ru s
応 M ou s e h ep a t i t i s v ir u s
Sendai virus
反鏡G f αr d 乞α 仰視p f 8

5 p r o 乃祝e e 祝8 m 祝㌘ 8
検 和 みαe 克 8 P P

ドナー（c o n v ）卵 巣移 植 （S P F ） 卵 巣 移植 （G F ）C 57 B L ／℃−d y

dy 皿C 57 8 レ 巧一ん

−
−

−

−
＋
＋
−
−
−
−

−
−
−
ー
−
−
ー
−

−
−
−
−
−

−
−
−
−
−

−
−

−
−

＋．

−
−
−

−−
＋

ー103−

dy仝y I Q I

無 菌検査
全 例 （−）
無菌維 持

J

写真1．

卵巣移植用アイソレータ

昭和62年度第5班（野村班）名簿
区

分

班

長

野

村 達

次

運営幹事

埜

中 征

哉

幹

事

野 々村

禎

昭

班

員

勝

大

元

也

高

松

横

山

富

田

菊

池

水

谷

監

事

公募班 員

氏

所

名

研

峯

介

武 一

建

機

誠

￣斉 藤

宗

堆

三

輝

久

池

所

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〒213

属

校

閲

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