PROCESSING PATHWAY OF DISRUPTED TRNAS IN A PRIMITIVE RED ALGACYANIDIOSCHYZON MEROLAE.
Saori Hiromoto1 and Akiko Soma1*1Graduate School of Horticulture, Chiba University, Matsudo, Chiba 271-8510, Japan.
soma@chiba-u.jp(Received: 27, July, 2017 Accepted: 1, November, 2017)
Abstract
Processing of precursors of nuclear cis-splicing tRNA
has been considered to start with the end maturation at
the acceptor stem, followed by the intron splicing. The
sequences around the intron-exon junctions in
pre-tRNAs generally form a bulge-helix-bulge (BHB)
motif, which is specifically recognized by thetRNA-splicing endonuclease. In a unicellular red alga
Cyanidioscyzon merolae, we have found that thematuration of circularly permuted pre-tRNAs, in which
the 3’-half of the tRNA coding sequence lies upstreamof the 5’-half starts with the processing of the BHB
motif at the junctions of termini to form a circular RNA
intermediate. This suggested that the processing of BHB
motifs precedes that of the acceptor stem in C. merolae.
Here, we performed sequencing analyses for processing
intermediates of various types of intronic tRNAs by
reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) followed by the sequencing of the PCR
products to clarify maturation pathway. Results showedthat the removal of introns occurred before thematuration of acceptor stem. Such non-canonicalprocessing pathway may have been prerequisite for thedevelopment of permuted tRNA genes in C. merolae
because permuted pre-tRNAs can be processed via acontinuous RNA string, but not fragments, during
maturation.
(Keywords)

tRNA processing; intron; BHB motif

始原紅藻 Cyanidioschyzon merolae における分断化 tRNA のプロセシング機構
271-8510 千葉県松戸市松戸 648
千葉大学園芸学研究科
廣本 沙織 1、相馬 亜希子 1*
Fax: +81-47-308-8871
Email: soma@chiba-u.jp
1．緒言
tRNA は様々な転写後プロセシングを受けて成熟体となり、高度に保存されたクローバーリーフ
様の 2 次構造を形成する。そのため、ゲノム配列からの tRNA 遺伝子の予測においては、検索対象の配列がクローバーリーフ様構造を形成しうるか
どうかに基づく解析方法が長らく採用されてきた。
近 年 、 Trans-splicing tRNA や Non-canonicalcis-splicing tRNAおよびCircularly permuted tRNA が発見され (Fig. 1)、これをきっかけに特殊な分断化
tRNA 遺伝子に対応した検索プログラムも用いらViva Origino 2017, 45, 1© 2017 by SSOEL Japan1

れるようになった [1-5]。また、そのような遺伝子群の発現機構の解析から、新奇プロセシング経路の存在が明らかとなり、機能性 RNA の遺伝子構造と転写後プロセシングの多様性が注目されている。
Permuted tRNA 遺 伝 子 は 、 始 原 紅 藻
Cyanidioschyzon merolae 10D の核ゲノムから初めて同定され、その後、単細胞藻類 6 種と古細菌 1種のゲノムにもその存在が確認された [3,6]。
Permuted tRNA 遺伝子では tRNA をコードする領域が２つの断片に分かれており、tRNA の 5’側半分と 3’側半分をコードする領域が入れ換わっている (Fig. 2)。この遺伝子から転写された前駆体
tRNA は、環状 RNA 中間体を介した RNA 断片の「入れ換え反応」により、通常のクローバーリー
フ様構造を取りうる成熟体 tRNA となる[3]。
Permuted tRNA の 前 駆 体 の 末 端 はBulge-Helix-Bulge (BHB)モチーフとよばれる特徴
的なステム構造を形成する (Fig. 3A)。BHB モチー
フは tRNA のイントロン‐エキソンの境界にも見られ、tRNA-splicing endonuclease (Sen) の認識部位となっていることから[7]、前駆体 Permuted tRNAの BHB モチーフがまず Sen に切断され、その末端を RNA ligase が結合することで環状化すると考えられる。次に、環状 RNA 中間体のアクセプタ
ーステムが RNase P や tRNase Z といった一般的なEndonuclease によるプロセシングを受け、新たに生じた 3’末端に CCA 配列が付加されることで成熟体 tRNA となる [3,6]。あたかも一本の鎖をつなげて輪にし、別の部位で再び切り離すことで、遺伝子に書き込まれた元々のデザインとは異なる末端をもつ鎖を作り出す作業が C. merolae の細胞内で行われている。
環状 RNA 中間体を介したプロセシングの生物学的意義は不明であるが、当該成熟化経路が C.
merolae の特異なtRNA 遺伝子の成立と維持に関与した可能性は高い。C. merolae の Cis-splicing tRNAのプロセシング経路は明らかになっていないが、Permuted tRNA の成熟化を考慮すると、BHB モチ
ーフ、すなわちイントロンのスプライシングが先行すると予想される。一方、酵母の Cis-splicing
tRNA の成熟化過程においては、アクセプタース
テムのプロセシングがイントロン（BHB モチーフ）のスプライシングに先行することが分かっている(Fig. 4A) [8,9]。C. merolae の特異な tRNA プロセシ
ングの全体像を解明するため、本研究では、Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) とシーケンシングにより Cis-splicing
tRNA のプロセシング中間体の配列を解析し、成熟化経路の同定を試みた。
真核生物の Sen は tRNA の特定の部位のイント

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Fig. 1. The BHB-mediated disruption of tRNA. (A) Canonical cis-splicing tRNAs contain a single intron exclusively at the
canonical position (positions between 37 and 38) 3’ adjacent to the anticodon. The intron-exon junctions in the precursor tRNAs
comprise a bulge-helix-bulge (BHB) motif, which is the determinant for the tRNA-splicing endonuclease. (B) Non-canonicalcis-splicing tRNAs contain a single or multiple introns at various positions in the cloverleaf structure. (C) Trans-splicing tRNAs
are composed of two or three RNA fragments and found only in archaea. (D) Circularly permuted tRNAs are found in six
unicellular algae and one archaea. The termini of the pre-tRNA comprise the BHB motif.

Fig. 2. A model for the maturation of the permuted pre-tRNAs. Maturation of the permuted pre-tRNA starts with processing of
the BHB motif (boxed) by the tRNA-splicing machinery, resulting in formation of a circular RNA intermediate. The intervening
sequence is removed by RNase P and tRNase Z, followed by the CCA-addition. Fig. 3F from Reference 3 was arranged.

ロンのみを認識するため、藻類以外の真核生物のイントロン挿入部位は一か所に限定される[10,11]。
また、真核生物ではイントロンを含む tRNA はそれほど多くなく、酵母では全 tRNA 遺伝子（286
コピー）のうち Cis-splicing tRNA 遺伝子（59 コピ

2ー）が占める割合は 20％程度である。一方、C.
merolaeの核ゲノムではtRNA遺伝子全体の約60％がイントロンを持ち、かつ、挿入位置が限定されていない[4]。さらに、複数のイントロンをもつ
tRNA や、
Permuted 構造をもつ Cis-splicing tRNA もViva Origino 2017, 45, 1

存在する (Fig. 3B)。特殊な Cis-splicing tRNA のプ
ロセシングの解明により、最小クラスのゲノムを持つ C. merolae に大規模な tRNA 遺伝子の分断化が生じた背景の理解につながると期待される。本
実験では、1, 2 または 3 つのイントロンを含む
tRNAPhe(GAA),
お よ びtRNALeu(CAA),
IletRNA (UAU)について解析を行った。

DNA 断片を 10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
L(CAA)3’-p1: 5’-CGACTTGCCACCGTCTTGTG-3’
L(CAA)5’-p1: 5’-GCTTGACACCCTCGCACAG-3’
F(GAA)3’-p1: 5’-TTGCCATCGCGCGGGATC-3’
F(GAA)5’-p1:
5’-TGCAATCGATATCACATGAATGTTGC-3’
I(UAU)3’-p1: 5’-TATATCCGTGCGCGTACTCCC-3’
I(UAU)3’-p2: 5’-TACTCCCGGCGAGGCTC-3’
I(UAU)5’-p1:
5’-GCGACGCTTGTCCGTTTGCGACGCAC-3’

2．方法
実験方法は引用文献 [3]にしたがった。

2.1 C. merolae 細胞からの粗画分 RNA の抽出
42℃、連続光下で対数増殖期まで培養した C.
merolae の細胞から、ISOGEN (NIPPON GENE)を用いて粗画分 RNA を得た。

2.3 DNA 断片のクローニングと配列解析
pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) を用いて
2.1 の DNA 断片をクローニングし、Big Dye Cycle
sequencing Mix (ABI)によるシーケンシングおよび配列解析を行った。各 DNA 断片に対し、5 個以上のクローンの解析を行った。

2.2 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)
2.1 の粗画分 RNA と解析対象の tRNA に対応するReverse primer (3’-p) を 用 い て 、 ReverTraAce(TOYOBO) による逆転写反応を行った。得られた
cDNA に対し、対応する Reverse primer (3’-p)とForward primer (5’-p) を 用 い て 、 Blend Taq(TOYOBO)による PCR 反応を行った。増幅された

3．結果
3.1 tRNALeu(CAA)
前駆体 tRNALeu(CAA)のアクセプターステムに隣接する 3’-トレーラー配列と 5’-リーダー配列にそれぞれ相補的な L(CAA)3’-p1 と L(CAA)5’-p1 をFig. 3. Distribution of BHB motifs in intronic and/or permuted tRNAs in C. merolae. (A) The BHB motif is classified by one
or two 3-nt-bulges (denoted as B=3) separated by a central 4-bp-helix (denoted as H=4) and flanked by two helices (denoted
as h or h’), each with more than two base-pairings. (B) Arrows indicate the positions of the BHB motifs. The length of theintron, number and type of BHB motifs is indicated for each tRNA. For example, “Ile(TAT) 22 3/3 hBHBh’” at the position
between 53 and 54 means that the BHB is from tRNAIle(UAU), is 22 nt long, and is the third of three BHB motifs. BHB
motifs at the termini of the permuted pre-tRNAs are shown in double squares. The numbering of the tRNA positions follows
that outlined in Reference 16. Fig. 2 from Reference 4 was arranged.

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た中間体 (Pre-tRNAPhe⊿intron1,2) が検出された(Fig. 5D, Fig. 6B)。以上の結果は、tRNAPhe(GAA)のイントロンのスプライシングが 5’-リーダー配列のプロセシングに先行すること、また、イントロ
ン 1 がイントロン 2 より先に除去されることを示
唆する。
RT-PCR により、期待される前駆体や中間体とは異なるサイズのバンドが増幅された (Fig. 5D)。回収可能な PCR 産物の配列解析の結果、イントロン
やエキソンが途中で切断された tRNAPhe(GAA)の配列に一致した。
逆転写の際に鋳型となった tRNA
分子の高次構造の変性が不完全なために合成された cDNA に由来する PCR 産物や、既定の位置でス
プライシングされず生じた tRNAPhe に由来する
PCR 産物と推測される。

用いて、RT-PCR およびその DNA 配列の解析を行ったところ (Fig. 5A)、 (i) 5’-リーダー配列、3’-ト
レーラー配列およびイントロンを含む前駆体
tRNA (Pre-tRNALeu) に加え、(ii) 5’-リーダー配列と3’-トレーラー配列を残したままイントロンが除去されたプロセシング中間体 (Pre-tRNALeu⊿intron1)に由来する PCR 産物が検出された (Fig. 5B, Fig.
6A)。以上の結果から、tRNALeu(CAA)のイントロ
ンのスプライシングは、アクセプターステムのプ
ロセシングに先行することが分かった。
3.2 tRNAPhe(GAA)
ターミネーター配列の位置を考えると、2 つのイントロンを有する tRNAPhe(GAA)の 3’-トレーラ
ー配列は非常に短いと予想される (Fig. 5C)。そこで、前駆体 tRNAPhe(GAA)の 3’側領域に相補的なF(GAA)3’-p1 と 5’- リ ー ダ ー 配 列 に 相 補 的 な
F(GAA)5’-p1 を用いて RT-PCR を行った。PCR 産物の配列解析の結果、(i) 5’-リーダー配列とイント
ロン 1,2 を含む前駆体 tRNA (Pre-tRNAPhe)、(ii) イ
ントロン 1 が除去された中間体 (Pre-tRNAPhe⊿intron1)、および (iii) イントロン 1 と 2 が除去され3.3 tRNAIle(UAU)
3 つのイントロンを持つ前駆体 tRNAIle(UAU)の
3’-トレーラー配列と 5’-リーダー配列に相補的なI(UAU)3’-p1 と I(UAU)5’-p1 を用いて RT-PCR を行い(Fig. 5E)、
その DNA 配列を解析した。
その結果、(i) 3 つのイントロンすべてが除去された中間体

Fig. 4. Comparison of the processing pathways for cis-splicing pre-tRNAs in (A) yeast and (B) C. merolae.

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Fig. 5. RT-PCR amplification of precursors and processing intermediates of C. merolae cis-splicing tRNAs. Inferred secondary
structures of three pre-tRNAs are shown. (A) tRNALeu(CAA) with a single intron at the canonical position 37/38. (C)tRNAPhe(GAA) with two introns, one in the D-stem (intron 1) and the other at 37/38 (intron 2). (E) tRNAIle(UAU) with three
introns, one in the D-stem (intron 1), one at 37/38 (intron 2), and the third in the TΨC-loop (intron 3). Pre-tRNAIle was amplified
with 5’-p1 and 3’-p1, while Pre-tRNAIle* with 5’-p1 and 3’-p2. 5’- and 3’-primers for RT-PCR are indicated. Arrowheads indicate
the positions to be processed. Intron sequences are shown in lower case. The numbering of the tRNA positions follows Reference
16. (B, D and F) PCR products amplified from the cDNA of precursors and processing intermediates are indicated. Annotation ofeach PCR product was based on gel purification of the bands, cloning and sequencing analysis. Lane M: DNA molecular marker(20 bp Ladder).

(Pre-tRNAIle ⊿intron1,2,3) が検出された (Fig. 5F,
Fig. 6C)。5’-リーダー配列および 3’-トレーラー配列を残したままイントロンが除去された中間体の存在は、tRNALeu(CAA)や tRNAPhe(GAA)と同様、

tRNAIle(UAU)のイントロンのスプライシングがア
クセプターステムのプロセシングに先行することを示唆する。
I(UAU)3’-p1 と I(UAU)5’-p1 を用いた RT-PCR に

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より、1 つまたは 2 つのイントロンが除去された
プロセシング中間体と予想されるバンドも増幅されたが、その DNA 断片の配列解析により、イン
トロンやエキソンが途中で切断された配列のクローンが検出された。逆転写の際に鋳型 tRNA の高次構造の不完全な変性により合成された cDNA に由来する PCR 産物や、tRNAIle(UAU)内の類似配列へのプライマーの非特異的な結合により生じた
PCR 産物と予想される。または、既定の位置でス
プライシングされなかった tRNA に由来する PCR
産物の可能性も考えられる。そこで、I(UAU)3’-p2と I(UAU)5’-p1 を用いて RT-PCR を行った (Fig.
5E)。PCR 産物の配列解析の結果、(ii) 5’-リーダー
配列と 3 つ全てのイントロンを含む前駆体 tRNA
(Pre-tRNAIle*)、(iii) イントロン 3 が除去された中間体 (Pre-tRNAIle*⊿intron3)、(iv) イントロン 1 と3 が除去された中間体 (Pre-tRNAIle*⊿intron1, 3)、
および (v) 3 つのイントロン全てが除去された中間 体 (Pre-tRNAIle* ⊿ intron1,2,3) が 検 出 さ れ た(Fig. 5F, Fig. 6D)。以上の結果から、イントロン 3が最初に除去され、続いてイントロン 1 が、最後にイントロン 2 が除去されると予想される。

せて RT-PCR を行った場合にも、イントロンを残したままアクセプターステムがプロセシングされた中間体の検出には至っていないことから[4]、本研究結果が C. merolae での主たる経路であると考えられる。
真核生物の tRNA プロセシング経路は酵母においてよく研究されており、前駆体 tRNA は、核内に局在する RNase P、tRNase Z および CCA 付加酵
素によりアクセプターステムがプロセスされ、核外に輸送された後、ミトコンドリア外膜表面に存在する Sen によってイントロンが除去されることが分かっている[8]。このように、tRNA プロセシ
ング経路はプロセシング酵素の局在場所に依存する。C. merolae の tRNA プロセシング酵素の細胞内局在は不明であるが、予測プログラムを用いた解析から、RNase P や tRNase Z が細胞質に存在する可能性が示唆された (Sugita, et al., unpublished)。また、C. merolae の Sen にはオルガネラへの輸送を指示するシグナル配列は見出されない。したがって、
C. merolae の前駆体 tRNA は BHB モチーフ（イントロン）のプロセシングを受けた後に、細胞質でアクセプターステムがプロセシングされると予想される。5’-リーダー配列と 3’-トレーラー配列のプ
ロセシングの順番に関わる LA タンパク質遺伝子[8]が C. merolae ゲノムには見当たらないことから、
5’-リーダー配列と 3’-トレーラー配列の切断の順
番は無作為であるかもしれない。
2 つのイントロンを有する tRNAPhe(GAA)では、
イントロン 1 が除去された後にイントロン 2 が除去されることが分かった。イントロン 1 は典型的な BHB モチーフ (hBHBh’)を形成し、イントロン

4．討論
C. merolaeのCis-splicing tRNAのプロセシング中間体の配列解析から、イントロン（BHB モチーフ）のスプライシングがアクセプターステムのプロセ
シングに先行することが示された (Fig. 4B)。既知の真核生物に見られるようなアクセプターステムのプロセシングが先行する経路の存在を完全には否定できないが、tRNA の末端を人為的に結合さFig. 6. DNA sequencing analysis of RT-PCR products of (A) Pre-tRNALeu(⊿intron1) , (B) Pre-tRNAPhe(⊿intron1,2), (C)Pre-tRNAIle(⊿intron1,2,3) and (D) Pre-tRNAIle*(⊿intron1,2,3).

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2 のように中央のヘリックスを形成しないBHB モ
チーフ (no H)よりも安定であるために、先にスプ
ライシングされると予想される。
tRNAIle(UAU)の 3
つのイントロンはいずれも安定な hBHBh’を形成しうるが、イントロン 2 に比べてイントロン 1 と3 の⊿G の値が小さい [4]。BHB モチーフの安定性にしたがってイントロンがスプライシングされるため、イントロン 2 の除去が最後になっていると考えられる。
C. merolae 以 外 の 単 細 胞 藻 類 に お い て もPermuted tRNA は環状RNA 中間体を介して成熟化することから、藻類では BHB モチーフのプロセシングが先行する tRNA 成熟化経路が保存されている可能性が高い[12] 。Permuted tRNA が環状 RNA
中間体を介して成熟化することで、プロセシングの途中で tRNA の断片同士が乖離するのを防ぎ、また、多様な生理活性を示す tRNA 由来の断片(tRF; Transfer RNA-Related Fragments) [13]の生成を回避することが藻類の生育に有利に働いたのかもしれない。したがって、藻類における多数のPermuted tRNA 遺伝子群の成立は、このようなプ
ロセシング機構と共進化したと推察される。今後
は C. merolae の細胞に tRNA の断片を導入し、その影響を観察することで上述の可能性を検討することが必要である。C. merolae や藻類の tRNA プロ
セシング酵素の特性や細胞内局在の解明は、tRNA
遺伝子の進化の理解につながると考えられる。また、分断化 tRNA に結合するプロセシング酵素の解析により、ミニヘアピンに由来するとされるク
ローバーリーフ様構造の進化について、新たな知見が得られると期待される[14,15]。

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5. 謝辞
本研究は、JSPS 科研費 (25440003) および公益財団法人旭硝子財団の研究助成を受けて行われました。深く感謝いたします。また、C. merolae を用いた実験を行うにあたり、立教大学 黒岩常祥博
士、および東京工業大学 田中寛博士にご協力を頂きましたのでお礼申し上げます。

引用文献
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