厚生

省

神経疾患研究委託費

筋の発生と分化に関する

基礎的研究
江

橋

班

昭和58年度研究報告書

昭和59年3月

ⅰ

目

総

括

報

次

告

3

江

Ⅰ

橋

節

郎

移植その他

1．筋ジス−小人症（dy−dw）重複症疾患マウスとdy筋病変

9

戸

塚

武

2．ジストロフィーおよび正常チキンにおける長橈側手根伸筋の神経支配

17

大

塚

正

徳

3．ジストロフィーハムスターと正常ハムスター間の筋の交換移植についての研究（第2報）および再生筋の再移植について
寺

20

尾

寿

夫

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

4．外来性トランスフェリンの体内代謝について29

小 沢 鍈二郎

5．筋芽細胞の成長を促進するラット脳由来酸性蛋白の性質
畑

35

山

一

郎

6．サテライト細胞のin vivoおよびin vitroにおける再生能
香

41

川

務

7．アフリカツメガエル初期胚の単一割球由来細胞群の選択的分離法
江

橋

47

節

郎

ⅱ

8．鳥類胸腺筋様細胞の起源について

52

仲

村

春

和

9．高分子注入法の新しい試み

57

岡

田

善

雄

10．哺乳動物の初期胚形成に影響する単クローン抗体

59

岡

Ⅲ

生

理

田

節

人

学

11．筋細胞における膜興奮機能の発生

65

高 橋 国太郎

12．培養骨格筋における膜興奮性の変化

70

加

濃

正

明

13．幼生アフリカツメガエル腸骨筋の収縮系と筋小胞体

74

遠

藤

実

14．筋収縮能の発現過程−培養による正常とジストロフィーチキン胸筋の比較

80

堀

田

健

15．哺乳動物骨格筋の損傷後のHealing−over

85

栗 山

熙

Ⅳ アセチルコリンレセプター

16．骨格筋アセチルコリン受容体の生合成と細胞内前駆体

91

杉

山

博

之

ⅲ
95

17．アセチルコリンレセプター分布に対する神経の作用

萩 原 彌四郎

Ⅴ

微

細

形

態

18．細胞骨格の分化発達−筋腱連結部の細胞骨格

103

石

川

春

律

19．ラット骨格筋の凍結割断像

107

岩

崎

祐

三

110

20．ジストロフィー鶏胸筋での異常蛋白質の発現について

野々村 禎 昭

Ⅵ

生

化

学

21．筋ジスおよび正常鶏における筋細胞内poly−ADP−ribose
含量とpoly−ADP−ribose合成酵素活性の相異
117（筋発達過程におけるその変化）
真

崎

知

生

122

22．コネクチンとミオシン，アクトミオシンとの相互作用
丸

山

工

作

23．筋発生・分化におけるアクチン結合蛋白の発現様式

125

小

林

良

二

24．除神経筋にみられる筋蛋白質分子種の変化

133

大日方

昂

ⅳ
25．ニワトリ胸筋および足筋におけるトロポニンTの発生，

モノクローナル抗体を用いた研究

138

嶋

田

裕

26．ウサギ胎仔骨格筋収縮蛋白活性に対する抗トロポニン抗体の影響
大

槻

磐

144

男

27．疾患筋筋小胞体膜の機能分類に関する一考察

152

酒

Ⅶ

プ

ロ

テ

ア

ー

井

敏

夫

ゼ

28．サル骨格筋カテプシンBの精製と性質

159

高

橋

健

治

29．内在性チオールプロテアーゼインヒビターの構造と活性発現機構

164

勝

沼

信

彦

30．ブピバカイン（マーカイン）による急性筋崩壊の機序

169

杉

田

秀

夫

31．m−CANPと天然型μ−CANPとの比較研究

173

今

堀

和

友

32．筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモデル

における酵素網の比較

177

青

柳

高

明

33．幾つかの筋神経系異常マウスに於けるアルカリプロテアーゼ活性の変化

182

松

下

宏

筋の発生と分化に関する基礎的研究班・総括報告

筋の発生と分化に関する基礎的研究班
総

括

報

告

班長 江 橋 節 郎

総論

いて如何にして分化が行われるかという発生生物

本研究班では，筋ジストロフィー症という疾患学の基本問題として広くとり組まれている問題の他

名を表面的には班の名称としては唱っていない。

に，分化した状態が如何にして保たれているかと

しかし我々の目的は，筋ジストロフィー症の病因いう問題が重要なものとして認識することになる。

を現代の基礎医学，生物学の基盤において解明す

第二点は，分化した状態の崩壊に対する別の面ることを当面の目標としつつも，終局的には本疾からの見方である。上述の分化の「若返り現象」

患の根本的治療法確立と根絶を期するものである。

が退伝子発現の質的な制御の乱れであるならば，

筋ジストロフィー症の研究の基礎として筋の発この場合は割り切った言い方をすれば量的な乱れ

生と分化の問題が重要であることは，世界的に広である。健康な筋細胞がその正常な姿を保ち機能く認められて既にかなりな年月が経つが，その重を発揮するためには．一定量の蛋白質が常に合成

要性は益々大きくなって来ている。例えば1983年

されると共に分解されていくことが必要である。

アメリカのMuscular DystrophyAssociation

すなわち蛋白質の代謝が厳重なバランスのもとに（MDA）のコロキウムにも遺伝子発現と成長因子遂行されていることが要求される。これらの制御がとり上げられている。それでは何故に本疾患のも究極に於いては遺伝子の発現の問題であろうが，研究のために筋の発生や分化の問題が重要なので

筋ジストロフィー症羅患筋に於いては筋蛋白質代あろうか。大きくいって三つの点があげられると謝の乱れが存在する。すなわち羅患筋に於ては，思われる。

蛋白質の合成が促進されているにも拘らず，分解第一点は，本疾患では発症時は筋の発生期からがそれを上まわっているという事実が知られていはかなりの年月を経ているにも拘らず羅患筋に筋る。このことは常識的には蛋白分解酵素作用の冗の発生期に見られるような種々の現象がみられる

進状態があって，それが分化の安定性を乱す要因ことである。このことは想像の巽を伸ばすと筋のの一つとなっていることが考えられる。病的な機分化が充分でないことに病因を求め得るかもしれ転をこのような立場からみる時，逆に正常な筋はないという期待を持たせたし，またそれを示唆す

如何にして昌的にも分化した状態を保つかを探る

る報告も行われても来た。しかしながら我々の班ことが，本疾患研究への一つのアプローチになる

員は，全く新しい事実を過去において観察していであろう。

る。すなわちジストロフィー筋では分化の停滞が

第三点は筋の再生の問題である。本疾患の過程あるというよりは，一度正常のように分化するにに於て再生がみられることは周知の事実である。

もかかわらず何らかの原因によって分化した状態

いうまでもなく再生は筋の衛星細胞が活性化されを保ち得ず，再び幼若時代に類似した状態に戻るて増殖し，新に筋緑経を形成するか，既存の筋線のである。こゝに於いて我々は本疾患の研究に於経にとり込まれて行く過程である。多くの考えで

4は，衛星細胞は，発生時期の筋芽細胞が活動を停

び足筋におけるトロポニンTの発生の過程を追っ

止して筋線経に接触して存在するものである。こた。小林はアクチン結合蛋白の発現について報告

れが再生の時に如何にして活性化されるかは，発した。大日方の研究は病的過程に進み，蛋白の発生生物学の根本問題の一つである。もしこの活性

現は大まかに胚型，新生児型から親型へと進む化の本態が分かれば，不幸にして再生が停止あるが，除神経やジストロフィーでは親型から新生児いは相対的に低下する本疾患の進行期の問題を解型へと逆戻りすることを示した。また杉山はアセ明するのに大きな力を示すであろう。

チルコリンレセプターの生合成について報告した。

第二点で述べた分化を保つために必要な要因，

同じ線上にある研究としては丸山及び大槻の研究

また第三点で述べた再生を促すための要因を物質がある。また酒井は筋ジストロフィー症様患者由の形で把握できるならば，それは終局の目的であ来の筋小胞体のCa−uptakeについて報告した。

る治療法の確立に何等かの光を与えることになるであろう。

一方直接の遺伝子の表現の問題とのか、わり合
いはまだ不明だが真崎はpoly−ADP−riboseとそ以上に述べたことは到達するには誠に困難な事
柄であるが，我々は此の難病の解決のアプローチ
として筋の発生と分化の問題を取り挙げることの必要性についての一端を披起した。

の合成酵素活性が，筋ジスおよび正常鶏で大きく異ることを報告した。
このようにして発現された遺伝子を蛋白という形で合成する過程の形態学的裏づけを野々村が報告

実験のないところに科学は存在しない。本疾患

し，石川は筋腱連結部について，岩崎は凍結割断の場合には通常の臨床実験のもつ困難さを遥かに像について報告を行っている。同様にアセチルコ

超えた障碍が存在する。この困難さを回避するた

リンレセプター形成の段階に於いて起る集合と分めには，できるだけ人間の筋ジストロフィー症に散について萩原が報告した。

似た動物モデルを用いなければならない。本疾患

この様にして形成される筋細胞がやがて膜興奮とモデル動物の疾患が異った面を多く持っている性を，また一方では収縮能を獲得するが，それらであろうことは充分に認識しつつも，我々はモデの基礎実験としてCaチャンネルについて高橋（国）ル動物を重要な研究材料として，その病態の解明と加濃が，また損傷後のhealingoverについてを上に述べた視点を踏まえて行ってきた。

栗山が，収縮系の分化について堀田と遠藤が報告を行った。また大塚は筋ジス筋では多神経支配と本年度の研究の概要
上記総論に述べた基本的な理解の上に立った研究が本年も引き続き行われた。

いう現象が正常よりも後々迄残ることを示した。
一方，畑山はラット脳に筋芽細胞の増殖を促す
新しい物質の存在を示唆し．小沢はトランスフェ

総論の第一点に関与して，発生の各ステップがリンのinvivo実験を行うべく予備実験としてのどのように行われるかを探ることを目的として研その体内代謝の報告を行った。また胸腺の骨格筋究が行われた。これは一つは遺伝子発現の問題でが神経冠に由来するという証明を仲村が行った。

あり，もう一つは細胞オーダーの発生生物学の立第二の点は筋の破壊効果及びおそらくそれに関場からのアプローチである。第一の問題について与すると思われるプロテアーゼとそのインヒビターの最も簡単な手段の一つは，遺伝子の発現の結果の問題である。マーカインは筋の急性破壊を惹起合成されるタンパク質について正しい記載をすることであり，まず正常動物のそれが行われた。こするが，このモデルを用いての研究が杉田によって報告された。勝沼は，リソゾーム・チオール・

れは前年度の進歩に引続いて行われたもので，嶋

プロテアーゼの内在性インヒビターについて一次

田はモノクロナル抗体を用いてニワトリ胸筋およ構造を報告し，それが普遍的に存在すること及び筋の発生と分化に関する基礎的研究班 総括報告

肝型や皮膚型が存在すること等について述べた。

5

前進しているといえる。

今堀は，チオールプロテアーゼのmCANP及び本年度は，三年に亘って行って来た「筋の発生JLCANPについての高次構造や，自己溶解などにと分化に関する基礎的研究」の最後の年に当る。

ついて報告を行った。この他青柳，高橋（健），松この間に筋蛋白の分化について，特にその基本的下らもそれぞれプロテアーゼに関する報告を行った。

なことがかなり明瞭になり，これらの結果から，第三の点に関しては，寺尾は筋ジスハムスター

さらにこれらがどのような過程により分化が修飾と正常ハムスターの交換移植を行い，筋の再生がされるか，更にそれらが病的過程がどのように現環境によって大きな影響を受けることを示した。

われるかを調べるための準備が，完全とはいえな

さらに再移植．再々移植が可能であることをも報いにしても，できて来たと思われる。また病的過告した。香川は筋ジスマウスの衛星細胞を用いて程における種々のプロテアーゼの持つ役割に対す

invivo及びinvitroでの再生を調べ，クローン培

る或る程度の見方ができ上ったようである。しか養における衛星細胞の分化をクレアチンキナーゼ

しまだ再生過程という筋ジストロフィー症の病態をマーカーとして研究した。

生理学において非常に重要な過程に対する理解はこれらの研究以外にも戸塚は筋ジスマウスの小まだ不充分であるといわなければならない。

人症変異種の筋ジス病変の発現が，野生種筋ジス

さらにこの数年間世界的に急速に普及しかつ著

マウスよりも少いことに注目し，筋と骨との成長

しいレベルの同上をみた遺伝子工学およびモノクの程度の違いが本症の修飾にかヽわっているのでロナル抗体法については，後者については一応のあろうと推論した。また，江橋，岡田（節），岡田

レベルを持つに至っているが，少くとも筋発生分（善）が本症研究の基礎的手技についての報告を行化はもちろん遺伝子疾患である筋ジストロフィーった。

症研究のためには非常に強力な武器であるにもか
かわらずまだ研究者の層が薄くこの面での研究者
結語

個々の研究の進展の度合や，筋ジストロフィー症そのものとの直接のかゝわり合いの度合などにの養成が急ぎ望まれる。前述のMDAのコロキウ
ムではこれらの手法を用いた研究が主流を占めている。

はいろいろな違いがみられる。しかし研究班全体

筋ジストロフィー症の研究の道は倹しい。しかとしては，世界の筋ジストロフィー症研究に比しし我々は一歩一歩地道な努力を重ねてゆかなけれて勝るとも劣らないレベルを保ちながら，着実にばならない。

Ⅰ

移植その他

1．筋ジスー小人症（dy−dw）重複症疾患マウスとdy筋病変
2．ジストロフィーおよび正常チキンにおける長境側手根伸筋の神経支配

17

3．ジストロフィーハムスターと正常ハムスター間の交換移植についての研究（第2報）および再生筋の再移植について20

9

1筋ジストロフィー症一小人症（dy−dw）

重複疾患マウスとdy筋病変

戸 塚

武＊

研究協力者 渡 辺 貴 美＊ 浦 本

勲＊

大 平 敦 彦＊ 伊 藤

均＊＊

マウスの筋ジストロフィー（dy）症は，筋の成初めて同定が可能であった。最近になって我々は，熟成長障害（4，6，9，12，14）による疾患であり，成電気生理学的方法によりdy−dwマウスを同定する長の止った筋が成長し続ける骨により強制的に引ことに成功した（8，10）。そこで本研究は，dy−dw

き伸ばされることが発症の直接的原因であろう，

マウスの前肢筋の組織学的分析を行った。また，と提唱してきた。その証拠として，筋は後肢筋同dy筋の結合織成分のプロテオグリカンの糖鎖グリ様異常（1．14）でありながら骨が低成長の前肢のコサミノグリカンの量の分析と，dyマウスがEhト

症状が軽いこと（7），骨を含む全身の成長も抑制

lich腹水ガン接種に対してどのような反応を示す

されたdy−dw（dw：小人症）重複疾患マウスでdyか，検討した。

症状が不顕化すること（Pro（二極αnAcαd．，57B：
材料

109−113），を報告した。同じ年（1981），ヒトとニワトリでよく似た結果が発表された。ブラジ

動

と

方法

物

ルのZatzらはdy（Duchenne型）−dw（GH欠乏に

dyマウス（C57BL／6J

4y／4y），dwマウス

よる）重複疾患児を発見し，dy症状が著しく軽い（DW／J dw／dw），dy−dwマウス（前二者の雉こと（Am．J Afe（乙Genef．，10：301−304＆305

種BL−DW4y／4y dw／dw）とそれぞれに対−307）を，アメリカのKingらは，抗甲状腺剤投応する正常マウスを用いた。

与により一種のdw症にしたdyニワトリのdy症状

dy−dwマウスの同定がやはり著しく軽いこと（上中Scより 28：577−

ウレタン麻酔したマウスの坐骨神経を電気刺激585）を発表した。骨成長の抑制が一種の対症療

し，Gastrocnemiusからの誘発筋電位（オシロス法になるだろうと考えられる。

コープ上のパターン）を写真記録した。5Hz連続

dy−dwマウスの筋にdy−SpeCificな病変が見られ刺激による誘発筋電位の振幅の経時的変化を解析

るならば，それは前臨床期のdy病変と考えられる。

したところ，dy−dwマウスはdyマウスの特徴（一残念なことに，dy−dwマウスは外見上dwマウスと種の疲労抵抗性：別の観点からは未熟性）（11，

区別できなかった。成長ホルモンとチロキシンを

13，15）を持っていることがわかった（8，10）。

授与しdw症の治療を行うと，dy−dwマウスはdy症

すなわち，正常マウスとdwマウスの誘発筋電位のを発症する（後肢を引きずる）ようになることで振幅は5Hz刺激開始後数分で，数十％も減少した
が，dyマウスとdy−dwと思われるマウスの誘発筋＊愛知県心身障害者コロニー 発達障害研究所＊＊三重大学医学部

電位の振幅は，せいぜい十数％の変化を示しただ
けであった。

10

Ⅰ移植その他

筋線経の直径測定

ク液で染色）の数を血球計算坂で測定した。

前肢筋（triceps）のパラフィン包埋切片（厚さ7／弓を，通常の方法でHE染色し，光学顕微鏡
写真を用いて筋線経の直径を測定した。
グリコサミノダリカンの定量

結果 と 考察dy−dw筋の特徴
dwマウスの前肢筋の筋線経は，正常マウスの筋結合織成分プロテオグリカンの糖鎖グリコサミ

線経と比べて著しく細いことを，昨年報告した。

ノグリカンの量としてウロン酸量を測定した。マ

今回は，dwマウスとdy−dwマウスの筋線経を比べ

ウス後肢筋のアセトン乾燥粉末を水に浸した後，た。図1に，dw筋とdydw筋の光学顕微鏡写真

充分量のプロナーゼで蛋白質を分解（40−45℃，（横断切片）を示す。dy−dw筋には，dw筋に見ら一晩）し，グリコサミノダリカンを抽出単離後，れない二つの特徴があることがわかった。筋線経かレバゾール硫酸法に従いウロン酸として定量した。

の大小不同と，中心核である。dw筋に見られる中Ehrlich腹水ガン接種

心核繰経の数は，正常筋（全線経の1％前後かそ

マウス腹腔内にEbrlich腹水ガン細胞（2×106

れ以下）に比べれば多い（約5％）が，dy−dw筋

Cells／mouse）を接種し，ガン細胞の増殖に伴う宿では更に多くの中心核線経が観察された。このこ

主マウスの体重変動を調べた。また，実際のガンとは，図2で筋線経の直径の分布の様子を見れば細胞増殖を知るため，腹水中のガン細胞（チュル

明らかである。dw筋の線経の直径は，10−40Jjの

Dwarf

DW／J dw／dw

hic−dwarf

BL：DWdy／dydw柑W

FbretimbTricepsMusctesofMice（DaylOO）
第1図 dwマウスとdy−dwマウスの前肢筋（横断）の光顕像。

1筋ジスー小人症（dy−dw）重複症疾患マウスdy筋病変
Dwarf

11

Dystrophic−dwarf

DW／Jdw／dw BL：DWdy／dydwIdw

0

20

40

0

20

40

60

Diameter of Muscte Fibers（pm）
FbrelimbTricepsMuscLesofMice（DaylOO）
Dark shading：CentralLy−nUCIeated fibers

第2図 dwマウスとdy−dwマウスの前肢筋の筋緑維直径分布。

範囲にほぼ収まっていた。ただ，今回の実験で我々の電気生理学的研究（8．10，11，13，15）からもは固定とパラフィン包哩のせいで，実際の直径よ指摘されるように，生休膜（とくに筋緑経の膜）り細めの答になっている。中心核線経の直径分布の成熟変化が停止していることが考えられる。最は図中に，黒塗りで示してある。dw筋と比べて，

近，Jaros＆Jenkisonにより神経細胞の成熟障害

dy−dw筋の線経の直径は，10−60JHこ分布し，異も報告された（瓜〃eJ叩．βrαf几月朗．，6：231−

常に肥大した線経の存在が確かめられた。しかも，242）。難病の研究には優れたモデル動物の開発

dy−dw筋には，多数の中心核線経があり，その直が重要である。成長途上に発現する難病の研究に

径分布は全線経の直径分布とほぼ似ていた。dyJは，dw症を合併させることで成長による二次的要dw筋に見られたこれらの特徴は，前臨床期のdy−素が除去されたdy−dwのようなモデル動物が，特specific筋病変と考えられる。この二つの特徴は，に重要であろう。我々のdy−dwマウスに続いて，

dy筋線経が未熟な状態に留まっているとする我々

dy−dwニワトリの開発に成功したとの菊池らの報の考えを，強く支持するものと思われる。dy筋に告（2）は，大変興味深い。

見られる線経の大小不同がdyの本質的特徴の一つ

dy筋のグリコサミノダリカン含量異常であろうとする考えは，dyニワトリを用いた杉田，、dy筋の特徴として，∫結合織の異常増殖が指摘さ

埜中らの報告（3）でも指摘されている。dy筋の成れている。たしかに，筋湿重あたりでは結合繊成

熟成長障害（我々は停止と考えているが，脱分化分の一つであるコラゲン含量がdy筋中で異常に高または変性に続く再生による可能性も否定できな

い。しかし我々は，後喝あたりの全筋中コラゲン
総量は，dy筋のほうがかえって少なめであることい）の機構の解明が待たれる。一つの可能性は，

Ⅰ

12

移植その他

を明らかにした。そこで今回，このことをさらに細胞に，成熟成長障害（5）や接着性異常があると確かめるために，やはり結合織の成分であるプロの報告があいついで発表されている。

テオグリカンの糖鎖グリコサミノグリカンの定量

少なくともコラゲンとグリコサミノダリカンのを行った。グリコサミノダリカンは，ウロン酸と量からみる限り，dy筋に結合織の異常増殖がある

して定量した。後肢あたりの全筋湿重量は，正常とは考え難い。dy筋では筋繰経の成熟成長が停止

マウスでは加令に伴って（10週令頃まで）著しくしているにもかかわらず結合織の成長は準正常に増加したけれど，dyマウスでは加令変化がほとん

進んでしまうため，見掛け上結合織が異常増殖すどなかった（10過令を過ぎると減少傾向が見られるかのようにみえるだけであろう。この考え方をた）。このことは，以前に報告した結果と同じで簡単に模式的に示したのが図6である。もしそうあるが，面白いことに，筋湿重あたりの筋乾燥重なら，筋中で筋線経と結合織細胞は別々の成長制

畳についても同様な現象が観察され，正常筋の加御を受けていると考えられ，両者の成長に差があ

令変化がdy筋では停止しているらしいことが，こるdyマウスの筋は，筋線経と結合織細胞の成長機のことからも推察された（図3）。図4からわか構を調べるための良い材料となるであろう。

るように，筋湿垂あたりでみる限りdy筋でウロン

dyマウスに対するEhrlich腹水ガンの影響

酸含量の異常高進が認められた。しかし，コラゲ

dyマウスは一種の成長障害を受けているので，ンの場合と同様に，後肢あたりの全筋中ウロン酸発症機構における成長ホルモンやテロキシンの質

総量は，dy筋と正常筋の間にほとんど差がなく，的，量的異常の関与も考えられる。もしこのようどちらかといえばdy筋のほうがかえって少なめでなことがあるとすれば，成長ホルモンやチロキシあった（図5）。最近になって，dy筋中の結合織ンに依存性を示すガン細胞の増殖は，dyマウス体︵ざ︶む⊃SSFlむき︑﹂むPきOd PむてP−むUO︸山々

HindLeg MuscLe

Normal

与

○

V■

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O
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＋1

−−−1
1

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‡与 。寸

0

10

20

weeks

Age of Mouse
第3図 dyマウス後肢筋の湿垂に対するアセトン乾燥重量の加令変化。

1筋ジスー小人症（dy−dw）重複症疾患マウスdy筋病変

13Hindleg Muscle
つきlむきgsむ一〇∈ユ︶ p．古くUでOL⊃†
Dystrophic

Normal

巨0

0

20

weeks

0

00

0

10
Age of Mouse

第4図 dyマウス後肢筋のウロン酸含量の加令変化。

Hindleg MuscLeL

ヰー

︵r

■
人

−・・・．0 ● −・−−−10

r
一

●1

0．1

Dystrophic

0︵訝一︑Sむ︼○∈ユ︶ p芯くUモ0﹂⊃

Normal01020weeks

Age of Mouse
第5図 dyマウス後肢あたりの筋中ウロン酸総量の加令変化。

竃Ml

Ⅰ 移植その他

14

NormaL Dystrophic

Maturationlr l l l ● l l l ● − ● − ● ● ● ● ● ● ■﹁ ● ● ■ − ● ● ● − ● ● ● ． ︒ ． ● ● ● ● ● ■l l l l l l ● ● ▲■ ● ● ■ ■ l 一 ● ● l ● ■ll●●●l●●■

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MusCk Fibers

Pro．GAG Contents／gwetwt．

三N：＞N：／Leg（whoLemusc．）＜N

室＝N…

■＿●＿●●●●●＿．J

第6図 dy筋における筋線経と結合織の成長性に関する模式図
A：両者とも成長停止 B：筋線維のみ成長停止 C：結合織の異常増殖によって筋線経の成長が抑制されている。我々は，Bの可能性が高いと考えている（本文参照）。

内では抑制されるであろう。それを調べるために，のかどうかを知るため，腹水中のガン細胞数を測

Ehrlich腹水ガン細胞を用いた。Ehrlich腹水ガン

定した。その結果，dyマウスでもガン細胞は正常

細胞の増殖は，宿主マウスの体内ホルモン，とくマウスなみに増殖すること，dyマウスでは腹水のに成長ホルモンとチロキシンの影響を強く受ける貯留が著しく少ないことがわかった。ガン細胞接ことが知られている。実際，下垂休の萎縮により種後13日目の腹水量と腹水中のガン細胞数は，dy

成長ホルモンとチロキシンをほとんど欠いている

マウス（成獣3匹の平均±標準偏差）の0．63±

dwマウスの腹腔内では，ガン細胞の増殖が抑制さ

0・70ml，（6・4±7．6）×108cellsに対して，正れることがわかった。生存日数も正常マウスの二常マウス（成獣9匹）では7．3±4．Oml，（13．0

倍以上であった（図7）。dyマウスも，ガン細胞±9．2）×108cellsであった。

接種後の体重変動をみる限り，ガン細胞の増殖に

Ehrlich腹水ガン細胞接種に伴う腹部の膨脹と抵抗性を持っているようにみえた。個体によって腹水の貯留に，dyマウスが抵抗性を示したことのまた日令によって異なるものの，腹水ガンによる意味は不明である。しかし現時点で，二つの可能

体重変動は，正常マウスに比べれば明らかに，dy性が考えられる。一つは，腹部の筋も骨の伸長成マウスの方が少なかった（図8）。実際，外見的長によって伸びるところまで引き伸ばされていて，にも正常マウスと比べてdyマウスの腹部の膨脹はそれ以上の引き伸ばしに抵抗性が高まっていた。

あまり目立たなかった。ただ，生存日数は，正常

もう一つは，dyマウスでは浸透圧調節能に異常がマウスとdyマウスで差はみられなかった。そこで，あるため，腹水の貯留ができないという可能性でdyマウスで腹水ガン細胞の増殖が抑制されているある。我々は今のところ前者を考えているけれど，

1筋ジスー小人症（dy−dw）重複症疾患マウスdy筋病変

15DW／J（35days old）

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10

15．6！0．8（14−16）36．3±9．1（30−55）l川（i＝7日l
1020

Days afterlnocuLation

第7図

dwマウスに対するEhrlich腹水ガンの影響。

C57BL／6J（80daysold）

C57BL／6J（45daysoLd）‖
Survival Time■■−ヽl survivaLTime＝30

ヱ
ロ1
石20

再l

＞ヽ

19．0土1．7。誌l思…吊●■．⊂き（days）

Dystrophic19・7！23
●

苫

l

てI
O

Dystrophic

18．8！0．8●■10．．11l・◆十日†
1020

Days afterInocuLation

10

20

Days afterInocutation

第8図 dyマウスに対するEhrlich腹水ガンの影響。

Ⅰ

16

移植その他

後者の可能性も充分考えられる。もし後者の考え方が正しいとすれば，それは即dy症の病因につながっているとも考えられる。最近Entrikinらは，症状軽減に有効な薬物が同時に体重減少をもたらすことに注目し，dyニワトリを数日間絶水させ，その後のようすを調べたところ，体重成長の抑制と同時にdy症状の軽減が見られたと報告している。
同じく体重成長抑制が見られるものの，絶食ではdy症状の軽減が見られないことから，彼らは，dy症の重要な発生要因として浸透圧調節能異常の可能性を指摘している（軸．〃e〟rれ79：746−
752）。

結

語

1．dy症の不顕化したdy−dw重役疾患マウスの筋に，dy−SpeCificな病変が認められた。電気生理学
的に一種の疲労抵抗性（別の観点からは未熟性），
組織学的に筋線経の大小不同と中心核，が観察された。
2．dyマウスの後肢筋で，湿重あたりのグリコサ
ミノダリカン含量は異常に多かったが，後肢あたりの全筋中グリコサミノグリカン総量に異常は認められなかった。
3．Ehrli申腹水ガン細胞の増殖はほぼ正常マウ
スなみであったが，dyマウスでは，ガン細胞の増殖に伴う腹水の貯留が著しく少なかった。下垂体萎縮により成長ホルモンとチロキシンを殆ど欠く
dwマウスでは，ガン細胞の増殖は強く抑制された。

4）Skau KA．（1983）The acetylcholinesterase ab−
nomalityin dystrophic miceis a reflection ofa
maturationaldefect．Brab7Res．．276：192T194．
5）Sweeny P．R．（1983）UltrastruCture Of the deve−
loplng myOtendinous junction of genetic dystro−
Phicchickens．JhJSCZe＆Nerye，6：207⊥217．
6）Totsuka T．，Watanabe K．，Kiyono S．（1981）
Maturational deftcts of muscle

瓜bers

in

the

musculaL dystrophic mouse．Cbng．Anom．，21：253−259．

7）Totsuka T．，Watanabe K．（1981）Some evidence
forconcurrent

invoIvement

of

the

fore＿

and

hindlimb musclesin murine muscular dystrophy．

且甲．A〃im．，30：465・470．
8）Totsuka T．，Watanabe K．，UramotoI．（1982）
Dystrophy−SpeCific alterations in muscular po−
tentials under prolonged sciatic stimuhtion of5
per secin dystTOPhic，dwarfand their crossbred
mice．Cb〃g．d〃0〝1．，22：207−210．

9）Totsuka T．，Watanabe K．（1982）EleYated free
CholesteroI contentin hindleg muscle of thedystrophic mouse during a postnatalperiodfrom
2．1to30weeks．上kp．月山血．，31：139−142．
10）Totsuka T．，Watanabe K．，UramotoI（1984）
Difftrences among dystrophic，dwarf and their

CrOSSbredmicein the time course ofchangeSin
muscular potentialsinduced by5Hz−Stimulation．
且甲．〃α仰7．，inpress．
11）UramotoI．，Watanabe K．，Totsuka T．（1983）
Contrast of time courses ofchangesinmuscular
POtentials to prolongedstimulationat5Hzinrat
medial gastTOCnemius and soleus muscles．放p．
血相Jリ80；479483．
12）Watanabe K．．Totsuka T．（1976）Developmental
defects of hindleg muscle censin hereditary
dystrophic mice．MedkitZe and BtoZogy，93：
203ヱ06．（Japanese）
13）Watanabe K・，Uramotol．，Totsuka T．（1982）
Different time courses of reduction in muscularpotentialsin dystrophic and nomal mice．J．
用γ∫わJ．助ぐ．ノ岬α乃，44：99−102．
14）Watanabe K．，Shimada K．，TotsukaT．，UTamOtO
I．，Mizutani A．，Kiyono S．（1982）Apparent ele・
Yation ofα−bungarotoxin bindingattendant uPOnmaturationaldefectofforelimbmuscleinmuscular

文献1）青柳高明（1983）筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモデルにおける酵素網の比較。本報告集，
2）菊池建機（1983）t筋ジストロフィー鶏の発症過程の品種間差。（野村班）報告集，
3）杉田秀夫，埜中征哉，岡田理美（1982）筋ジストロ
フィー鶏骨格筋の再生能。（野村班）報告集，23−43頁。

dystrophicmice．Cbng．ATZOm．，22：・199−206．
15）Watanabe K．，UramotoI．，Totsuka T．（1983）
01araCteristics of muscuhr potentials evoked bySingle shocks to sciatic nerYeS and theiT different
Changes duetorepetitiYeStimulationatamoderatefrequencyindystrophicandnormalmice．ETectro・
砂町C〃れ〟e〟rOpカタごね7．，23：103・115．
mγ0訂．C〟札肋rOpわ′∫foJり23：103−115．

172

ジストロフィーおよび正常チキンにおける長槙側手根伸筋の神経支配
大 塚 正 徳＊研究協力者 弘 中 哲 治＊＊五十里 良 生＊＊筋ジストロフィー症の発症の原因を究明する目

え，以下の実験を行なった。今回は特に貯化後2的で，ジストロフィーチキン（line412）および週間にわたるECRL筋の筋緑維数の経時的変化

正常チキン（line413）の長横側手根伸（ECRL）と，これに対応する同筋支配神経の数の経時的変筋を用いて，1）筋の交換移雇）2）生理学的およ化を調べた。

び解剖学的性質の経時的変化 について実験を行方なった。1）の実験から筋の発生・成長において筋法

外性の要因，とくに神経原性の要因が重要である

僻化後1〜14日目の正常チキン（line412）とことを示す結果が得られ，2）の実験から僻化後ジストロフィーチキン（line413）を用いた。エ初期（〜13日）における筋線維数の増加がジスト

ーテル麻酔下にチキンを腹位に固定し，実体顕微

ロフィーチキンにおいて著しく抑制されているが，鏡下でECRL筋と榛骨神経を露出し神経・筋標

その後の時期には筋の種々のパラメタ一に与える本としてaviansaline中に摘出した後，さらに結神経性の影響には特に異常を認めないという結果

合組織を取り除きECRL筋への筋枝を見出した。

を得た。しかも脾化直後にはECRL筋の諸種性標本をKarnovsky固定液に移した後，その筋枝質に正常およびジストロフィーチキンの間に差がを正中神経からの分岐部とECRL筋へ入る直前

ないことから… ジストロフィーチキンにおいて酵で切断し，さらにオスミウムで固定した。この筋化後初期に一過性の神経性異常が存在することが枝が分岐してECRL筋に入る手前で横断切片を示唆された。

っくり，ウランと鉛の二重染色を行なった後，電この節化直後の時期は，筋に対する神経支配が子顕微鏡写真を撮り（1000倍），ミエリン鞘を指polyinnevationからsingleinnervationに変わ標にして神経軸索の数を測定した。筋標本はホルるいわゆるeliminationの時期に相当し，神経・マリンで固定した後，近位端から毎の所で横断筋の相互作用の観点からも大きな変化が起こりやし，へマトキシリン・エオジン染色を施した後，すい時期であるものと思われる。この初期におけ

適当な大きさに拡大して写鄭こ撮り筋線維数を計る神経性の変化を筋発生の異常との関係において

測した。

2）

追究することにより，筋の発生の基礎的機構を窺い知ることができ，延いては筋ジストロフィー症の発症の原因を知る手掛かりが得られるものと考

結果

筋線維数の経時変化：図1に測定した筋線経の数の経時変化を示した。貯化後2〜3日目の正常＊東京医科歯科大学・医学部・薬理学教室＊＊帝京大学・医学部・薬理学教室

チキンのECRL筋の線維数は平均14375（n＝4），
ジストロフィーチキンのそれは14912（几＝4）で

I

移植その他

㌻○rX︶ SLむqM−0−US⊃E I○右q∈⊃Z
10

5Age（days）
Mean±SE

第1図 長擁側手根伸筋の線維数

SLUq⁝−む＞右u−○ bqE⊃Z

O normaI●

dystrophyAge（days）
Mean±SE

第2図 長擁側手根伸筋を支配する神経の線維数

192 ジストロフィーおよび正常チキンにおける長擁川手根伸筋の神経支配あり，両者の間に差はみられなかった。この線維数に先んじて，僻化以前の時期に起こっているのかは正常では4日目，8日目と著しく増加し12〜13

も知れない。

日目にはほぼピークに達した。13日目における線正常チキンで4日目以降，神経線経の数が減少

維数は3日目の約1．8倍に相当していた。一方ジしているが（図2），この事実は中枢神経系においてストロフィーチキンではこの僻化後の筋線維数の発生途上で細胞の自然死が起こること5 に対応す増加が強く抑制されていることが明らかとなり，るものと思われる。この神経細胞の死が対応する

8日目の筋線維数は正常のそれにくらべ有意の差

筋の活動に密接に関係していること6）から，本実を示した（P＜0．05）。

験が見出されたジストロフィーチキンの神経線経

神経線維数の経時変化：酵化後3日目まではが減少することなく残存していることは（図2）

ECRL筋を支配する神経線経の数は筋線維数のその神経細胞が筋細胞とシナプスを形成している増加に対応して増加を示し，正常チキンとジスト可能性を示唆している。

ロフィーチキンとの問に差が認められなかった本研究で明らかとなった楷化後初期におけるジ（図2）。しかし4日目以降では正常チキンでは神ストロフィー筋線維数の増加の抑制が神経側の要

経線維数が減少するのに対して，ジストロフィー

因に起因するか，筋側の要因によるかは今後さら

チキンでは減少の傾向が弱く殆んど一定値を保っに追究する必要がある。

た（図2）。
ジストロフィーチキンの神経線維数は8日目で明らかに正常チキンのそれより大であった（P＜0．05）。
この事実はジストロフィーチキンの醇化後の筋重量の増加が正常チキンのそれに比較して勝るとも
劣らか実験事実2）をよく説明しているものと思われる。しかしながら婚化後の筋線維数の増加がジストロフィーチキンで著しく抑えられている事

文

献1）Hironaka，T．，Ikari，Y．，Miyata，Y．，Morimoto，S．，
and Tsunoo，A．（1984）．Transplantation of ex・tensorcarpiradialislongusrnuscleinnormal．anddystrophicchicks．ap．Nmrott83：392−402・
2）Hironaka，T．，Ikari，Y．and Miyata，Y．（1984）．
Developmentandgrowthofextensorcarpiradialis
longus muscleinnormalanddystrophicchickens．
且岬．ルビ〟mJ．83：378−391．
3）Bennett，M．R．and Pettigrew，A．G．（1974）．The
formation of synapsesin striated muscle during

実（図1）とは明らかに食い違っている。

development．J．mysiol．241：515・545．
4）Kamovsky，M．J．（1965）．A考

察

正常チキンでは酵化後4日目までの筋線維数の増加に平行して神経線維数も増加することがわかった（図1，2）。しかし照化後∴筋緑維数は3日目から13日目にかけて1．8倍に増加したのに対して，神経線経は1日日から4日目にかけて1．25

formaldehyde一glutaraldehyde nxativeofhighosmolalityforuse
inelectronmicroscopy．J．CがtBiol．27：270A．
5）Cowan，W．M．（1973）．Neuronaldeath as a regu−
lative mechanismin the control ofceu numberin
the nervoussystem．InDevelopmentandAgingln
the NerYOuS System，ed Rockstein，M．pp．19−41，
AcademicPress，NewYork．
6）Pittman，R．and Oppenheim，R．W．（1979）．Celldeath ofmotoneuronsinthechickembryospinal
cord．lVEvidencethatafunctionalneuromu立ular倍に増加したが，13日目には1．13倍となったに過interactionisinvoIvedintheregulationofnatural−
1y occurring cell death and the stabilization of

ぎなかった。神経線維数の増加は筋線維数の増加

SynapSeS．エcomp．肋r（フ7．187：425446．

20

3

ジストロフィーハムスターと正常ハムスター間の筋の交換移植についての研究および再生筋の再移植に関する研究

研究協力者

増

寺

尾

寿

野

和

子

夫
高

津

ジストロフィー筋が正常な動物に移植された時

成美Donor（EDL）

Hostに如何なる再生を受け，また逆に正常筋がジスト

l）dystrophy contro1

ロフィー動物に移植された場合に如何なる変化を2）

control dystrophy

受けるかを知ることは，筋ジストロフィーの発症

3）controI contro1に関する筋内性または筋外性因子の存在を明らか

4）

dystrophy dystrophyにする上にきわめて重要である。

これらのgraftは移植後種々の時間を経て取り

昨年我々は筋ジストロフィーハムスターBIO

出し，直ちにcryostattにより切片を作製し，組織

14．6とコントロールハムスターFIBを用いて，骨学的および組織化学的に染色を行って再生状態を格筋の交換移植を行ってその再生現象を研究した

研究した。

が，その後もこの研究は続けられ，新しい知見を得たのでこれを報告する。

筋の再生の指標としては，今回も再生筋線経の直径と再生筋線経の数を用いた。

また筋の再生はsatellitecellが活性化されて起再生筋線経の直径は，1本の再生筋を上中下のるといわれているが，この様にして再生した筋に3部分に分けその各部より合計1，000本の直径をもsatellite ce11は形成されていると考えられ，こ測定した。また再生筋線経の数は3部分の各々のれを再び移植すれば再度再生現象が起ると思われcross−SeCtion標本につき，筋線経の数を数えそる。本年はこの再生筋の再生能力がどの程度保た

れらの平均をもってそのgraft中の再生筋線経のれているかについても検討を加えた。

数とした。

1）筋ジストロフィーハムスターの骨格筋の交換移植について結果および考察
EDLの移植後，再生筋がどの位長期間保たれるかは興味のある問題である。ジストロフィーの方法および動物

EDLを正常のhostに移植し，1年目に観察して使用した動物はジストロフィーハムスターBIO

みると第1図に示す様な1ケの筋に発育している。

14．6とコントロールハムスターBIO FIBであり，またこれを取り出しcross−SeCtionの標本を作っ

これらの動物のEDLを次の組合せで移植した。

てみると，第2図の如く新しい筋緑経の束となっ移植法は先回報告したものと同じである。

ているのが見られる。

再生筋線経の直径：＊帝京大学第1内幸斗

さて，上述の4組の組合せについて移植後4ケ3 ジストロフィーハムスターとF仁常ハムスター問の筋の交換移植についての研究（第2報）および再生筋の再移植について 21

第1図

ジストロフィーハムスターのEDLを正常ハムスターに移植し，1年目の再生筋

第2図 第1図のCrOSS−SeCtion標本（H−E）

月まで経時的に再生筋線経の直径の平均を示した でも正常のhostに移植した場合は，ほとんど差はのが第3図である。これに示す様に再生筋線経のみられなかった。またいずれのEDLでも正常の直径はジストロフィーのEDLでも，正常のEDL hostに移植された場合の方が，ジストロフィーの

Ⅰ

22

移植その他

Changeof mean用捨r diameter ofhostに移植された場合より再生筋の直径は大きかった。即ち再生筋の直径は或程度

regenerated muscle fibers

hostに依存することを示している。
04

これらの組合せの中，ジストロフィーの合は，再生筋の直径に大小不同が目立った。

0
3

第4図は正常ハムスター同志（左側）とジ
ストロフィーハムスター同志（右側）の交
02

換移植4ケ月目の再生筋を比較したものである。この様にジストロフィー同志の交換

0︵∈こしむ芯∈q毒しむqこ∪冨≡

EDLをジストロフィーのhostに移植した場移植の場合の方が再生筋線経は大小不同が明らかである。
1／2

2

4

再生筋線経の数：
一方，再生筋線経の数を数えてみると，Time after transpIantation（month）

移植後2ケ月位までは，いずれの組合せの第3図

種々の組合せによるEDLの交換移植後4ケ月までの再生筋線経の直径の変化

交換移植でも大きな差はみられなかった。

第4図 正常ハムスター問（左側）およびジストロフィーハムスター間のEDLの交換移植後4ケ月目の再生筋線維
しかし，それ以上時間が経つと変化が目立ってくる。第5図はそれを示したものである。
正常のEDLを移植した時にはhostは正常でもジスト。フィーでも再生筋線経の数は大差なく，また移植後2ケ月と4ケ月の間にも大きな差はなかった。
しかしジストロフィーのEDLを移植した場合にはhostにより非常に異る。hostが正常の時は

3 ジストロフィーハムスターと正常ハムスター問の筋の交換移植についての研究（第2報）および再生筋の再移植について23

再生筋線経の数はもっとも多く，4ケ月でChange of numberof
regenerated muscre fibers

もなお増加を示していた。他方hostがdy−
strophyの時は再生筋線経の数は非常に減のし警≡ 山一US⊃E IO L￠qE⊃Z

少した。

2）再生筋の再移植について
骨格筋の再生がsatellite cellによって始
められることは現在通説になっている。この様にして出来た再生筋中にもまたsate−
Ilitecellが形成され含まれているわけで，これを移植すれば再び再生が起ると考えられる。この再生筋の再生能力を知るために
我々は次の実験を行った。
1／2

2

4

動物および方法

Time after transprantation（month）

第5図

この実験では動物はWister系のラットを種々の組合せによるEDLの交換移植後4ケ月までの再生筋線経の数の変化
firsttransplantation

↓

1−2W

first

1−4W

transplantation

SeCOndtransplantation

◆

◆

2−2W

2−4W

3W

†irst
transplantation◆

SeCOndtransplantation

◆

◆
3W

third
transplantation

3−2W

3−4W

3W

4W

第6図 再移植（2回移植）および再々移植実験（ラットEDL）使用した。移植に使用した筋肉はすべてEDLであ型の如く組織標本を作製して再生状態を検討した。

り，方法はすべてautotransplantationを行った。

また一部のラットは再移植筋をさらにもう一度取

EDLを取り出し，これをまずもとの位置に移植

り出し，再び反対側すなわちスタートの位置に再する。3週間を経てからその再生筋を取り出し，々移植を行った。この場合も最終の移植後2週日

他側のEDLを取り除いた場所に再び移植する。

と4週目に筋を取り出して観察した。これらの実

この再移植後，2週目と4週目にこれを取り出し，

験プランを第6図に示してある。

1

24

結

移植その他

果

ChangeofnumberofregeneratedrTRJSClefibers

この実験の結果をまとめてみると次の如くなる。

afterreoetitivetransplantation（1）再生筋も再移植を行うと再び再生過程をくり返す。再々移植の場合も同様である。
再生筋が再生する場合も，第1回移植の時のし，再び新しい筋線経が形成されてくる。
のEDLの場合，移植後の再生過程をみると，移植後4日目ではgraft周辺にintermediatezoneが形成され始めているが大部分はまだori−
ginalの筋線経で占められている。また移植後
1週目でも中心部はまだdonor本来の筋線経が残っているのが普通である。

200（2）再移植の場合は筋再生の過程が早い，ラット

SLむqG山一US⊃∈P心l巴2品2−0﹂遥∈⊃Z

様にoriginalの筋は一部を残して，変性消失

しかし，再生筋の再移植の場合は筋線経は急速に変性し，4日目では既にほとんど見られず，
graft内は増殖した細胞の核で満たされている。
そして移植後1過日には再生筋は中心部にも出現している。この様な再生過程の促進現象は再々移植の場合も同様である。
（3）次に再生筋線経の数についてみると（第7図）
初回移植と再移植の場合につき，最終移植後2

2

4

2

4

2

4

Timeafterthelasttransplantation（week）

第7図1回移植および反復移植後の再生筋線経の数の変化

週目と4週目の比較では，再移植筋の方が少い傾向がみられた。すなわち，初回移植の場合には移植後2週目と4週目の再生筋緑経の数はそらに細くなっていた。

れぞれ2052±543，2157±499であったのに対し，再移植の場合はそれぞれ1967±355，

考案

1534±487であった。しかしこの差は統計学的骨格筋を移植した場合，筋線経の再生と共に岳a−に有意ではなかった。なお，3回移植すなわち

tellite cellも新たに形成されて来ると考えられる。

再々移植の場合は再生筋線経の数は2週目，4

しかし，これらがどれだけ再生されるか，またそ

週目ともに有意に減少していた。

の活性が反復移植により変化するかについては明（4）再生筋線経の直径は再移植筋では明らかに細らかになっていない。この研究で示される様に，かった。第8図はこれを示したものである。初再移植の場合には初回移植に比し，やゝ少い再生

回移植の時の再生筋の平均直径は移植後2過日筋が形成されることから，Satellitecellの活性がと4週目でそれぞれ20．7±0．35，24．1±5．8で同じと仮定すればその数はoriginalのEDLよりあったのに対し，再移植筋の場合はそれぞれ，やゝ少なく形成されると想像される。

15．6±3．1，14．7±4．5と有意に小さかった。

一方，再生筋の直径は再移植の場合は小さくな

3回移植を行うと再生筋の平均直径は最終移植

り，とくに3回移植ではさらに細くなり数も減少

後2週目で11．6±1．1，4週目で9．7±2．0とさする。この現象は移植を反復することによりgraft3 ジストロフィーハムスターと正常ハムスター閑の筋の交換移植についての研究（第2報）および再／l三筋の再移植について 25

Changeofmeanfiberdiameterofregenerated

トロールハムスターBIO FIBとの間およびそれmuscIeafterrepetitivetransprantation

ぞれの動物問にEDLの交換移植を行い，再生筋の直径および数を比較し次の結果を得た。
常のhost内ではジストロフィーのhost内よりも大きくなる。
b）再生筋線経の数は，正常のEDLを移植した
時はhostが正常でもジストロフィーでも移植
後4ケ月までは大きな差がみられない。しかしジストロフィーのEDLを移植した場合は050

正常のhost内では数が増加するがジストロ
フィーのhost内では著しく減少する。
2）ラットのEDLの自家移植により，再生筋の再移植（2回移植）または再々移植（3回移植）を行い次の結果を得た。
a）再生筋も再移植により再び再生する。

5︵邑︶冨芸名SコEP蓋し2蕾こOL葛∈琶u忍三3530252a）再生筋線経の直径はEDLの由来に拘らず正b）再移植の場合は再生過程が初回移植より速い。
C）再生筋緑経の数は初回移植に比し再移植の場
合はや、少なく，再々移植では有意に減少し
2

4

2

4

2

4

Tirneaftertherasttransprantation（week）

第8図1回移植および反復移植後の再生筋緑経の直径の変化への神経の再支配，血液供給などの条件の悪化，結合組織の増加などの影響を受けることが大きいと考えられる。しかLsatellitecellの能力の低下も完全には否定できないだろう。この反復移植の影響がジストロフィー筋と正常筋で差があるか否とd）同様に再生筋線経の直径は再移植および再々移植で有意に′トさかった。

文

献1）Jasmin，G．and Bokdawala，F．：Muscle transplan・tationin normaland dystrophic hamsters．Rev．
αれβわJり29：197・201，1970．
2）NeeruPjun，J．S．and Dobowitz，V．：Muscle trans−
Plantation and regeneration in the dystrophic
hamster．Partl．HistologiCalstudies．J．Neurot．
Jkfり23：505「519，1974．

かについて現在研究中である。

ま

た。

め

1）ジストロフィーハムスターBIO14．6とコン

3）Neerunjun，J．S．and Dubowitz，V．：Muscle trans・Plantation and regeneration in the dystrophic
hamster．Part2．Histochemicalstudies．EbEd，23：
5211536，1974．

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

4．外来性トランスフェリンの体内代謝について

29

5．筋芽細胞の成長を促進するラット脳由来酸性蛋白の性質

35

6．サテライト細胞のinvivoおよびinvitroにおける再生能

41

7．アフリカツメガ土ル初期胚の単一割球由来細胞群の選択的分離法

47

8．鳥類胸腺筋様細胞の起源について

52

9．高分子注入法の新しい試み

57

10．哺乳動物の初期胚形成に影響する単クローン抗体

59

29

4

外来性トランスフェリンの体内代謝−ニワトリ
筋のヌードマウスへの移植のための基礎的研究

小 沢 瑛二郎
研究協力者

木

村

一

郎

斎

藤

公

司

方

培養系における筋原細胞の増殖と分化には鉄ま法

たはその供与体としての鉄結合型トランスフェリ（1）ニワトリTfの精製2）ニワトリ血清より精製

ン（Tf）が必須である。このTfのもつ筋成長したNANA2つのもの（Tf2），1つのもの（Tfl），

促進作用には綱特異性という一般別がはば成立し，Tf2をneuraminidase処理したものから分別精

哺乳類Tfは鳥類細胞には無効である岬。

製したNANAlつのもの（Tfl′），NANAを欠く

ニワトリ骨核筋をヌードマウスに移植したとき，もの（TfO′），および卵白より精製したNANAを長期にわたって活着させ，維持することは一般に欠くオボTf（oTf，TfO′と異なって末端ガラクトは困難である。これは培養系で確認されたTfの作ースも欠いている）の5種を用いた。

用の一般別から考えて，ニワトリ筋原細胞に対し（2）¶の筋成長促進活性の測定2）11日令のニワてヌードマウスのTfが無効であることに起因する

トリ胚胸筋細胞を85％イーグルMEM−15％馬血ものと思われる。従って，外から適当な方法でニ清から成る基本培養液に一定量の各種ニワトリTf

ワトリTfを投与すれば，ニワトリ筋がヌードマウ

を加えて培養し，筋成長の程度を細胞中に蓄積さス体内でも維持され，さらには成長する可能性がれたクレアチンキナーゼ活性を測定することによあるように思われる。こ．の実験条件を確立するこり調べた。

とは，in vitro系とinvivo系をつなぐ中間的実ほ）マウス血中のニワトリTfの濃度の測定7 0．15

験系としてのヌードマウス実験系の確立にとって

MNaClに溶かした各種ニワトリTfをマウス

極めて重要なことである。ここではその第一段階（BALB／cAJcl，5−6過令，雄）に尾静脈またとして，ニワトリTfをマウスに投与したとき，そは背部皮下より投与し，経時的に尾部先端を切断の血中濃度が経時的にどのように推移するかを調することにより採血し，血清を得た。血清中のニべた結果を報告する。血中糖タンパク質の血中か

ワトリTfの濃度を抗Tf2ウサギ血清を用いたMan＿らの消失の速度は，その糖鎖構造，特に末端シアciniの方法で測定した。

ール酸残基（NANA）の存在に大きく左右され（4）マウス血中のニワトリTfの等電点電気泳動にることが知られているので6），糖鎖構造の異なる

ょる分析といくつかの精製ニワトリTf種について比較するこ

0．15MNaCl，またはTfを鉄で飽和するために，とを試みた。

0．15MNaC1−0．1mMFeCl3−1mMNacitrate−

無傷なTf〝の定量8）マウス血清を

lmMNaHCO3（pH8．6）で適当に稀釈したもの＊国立武蔵療養所神経センター，機能研究部

を，平板ポリアクリルアミド等電点電気泳動した
あと，ニワトリTfを抗Tf2ウサギ血清で選択的Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

30に直接免疫固定し，固定物をCoomassie Brilliant・示された（図1）。また，in vitro系での筋成長促Blue R250で染色した。また染色されたq無傷

進活性について調べたところ，5種のTfの問にはのTf差がみられなかった（図2）。

をそのバンドをデンシトメトリーすること

により定量した。

結果 と 考察（1）各種ニワトリTfの性状糖の分析結果は，

Tfl分子あたり，NANAはTf2で2，Tfl．Tfl，で1，
TfOてoTfで0，またへキソースはTf2，Tfl，TflてTfO′で5，OTfで3にそれぞれ近い値を示し，これまでに報告されている値とよく一致した9）。また，等電点は，Tf2が5．7，Tflが5．9，。Tfが6．1であるが2ミTfl′ほTflと，TfO′はoTfとそれぞれ区別できなかった。Ouchterlony法に

第1図 各種TfのOuchterlony test．
（0）oTf；（1）Tfl；（2）Tf2；（0′）TfO′；（1′）Tfl′；より，5種のTfの問には抗原性に差がないことも（A−0）抗oTf血清；（A−2）抗Tf2血清︵工∽苛∋︶＞lち葛＜ゞ0
oTf

Tfl

Tf2

TfO■

Tfl

第2図 各種Tfの筋成長促進活性4

外来性トランスフェリンの体内代謝について

31ほ）静脈注射したときの血中濃度の往時変化

Tf2，Tfl，OTfの3種について比較した。結果

5種のTfについて調べたところ，それらの血中かは図4に示されている。この場合も血中濃度の径らの消失速度に大きな差があることがわかった（図時的推移は糖鎖構造に左右されることがわかった。

3）。消失速度はTf2＜Tfl≒Tfl′＜TfO′＜oTf

皮下部から血中への移行は，NANAの数が少いもの順であった。この結果は糖鎖の構造がTfの血中のほど速い傾向がみられた。精製も容易であり，からの消失速度に大きく影響することを示していかつ大量に得ることができるため，将来のヌードる。末端NANAの数が少いほど，またNANAを欠マウスへの投与実験では有用なTf種となることがく場合（TfO′とoTf）はその末端ガラクトースが期待されるoTfは他のTf種に比べて皮下から速かなく，N一アセチルグリコサミンが露出しているに血中に入る反面，血中に入ったものは速やかに方（oTr）がそれぞれ速かに消失することを示し消失してゆく傾向を持つということがわかった。

ている。

しかし，適当な塁のTfを適当な時間間隔で皮下かほ）皮下注射したときの血中濃度の経時変化ら投与してやれば，ある一定程度の血中濃度を維

0

3、

6

9

12

22

Hours afterlntravenousInjection

第3図 静脈注射の場合の血中濃度の経時変化

n 細胞培養および細胞生物学

32

⁝
㈹

︵∈⊃あの−○−∈盲ヱuO葛とuOd亡00−ト

0

3

0

012

24

36

48

HoursafterSubcutaneousInjectjon

第4図 皮下注射の場合の血中濃度の往時変化

持しうることが予想された。事実，ヌードマウス

実際に， 無傷なTf〝分子のみを定量してみると，に12時間毎に皮下よりoTfを投与したとき，あ

予想通り 無傷なTf〝は抗Tf抗体と反応するもの

る一定濃度以上のoTfを血中に維持できるというよりもかなり速やかに血中から消失してゆくこと

結果を得ている。

がわかった（図6）。これまで報告されたタンパク（4）循環血中のニワトリTfの性状と ≠無傷なTf〝

質の血中消失速度に関する実験の多くが，125Ⅰなの消失速度

マウス血中のニワトリTf分子の性どで標識したタンパク質を投与して血究または血状を等電点電気泳動によって径時的に調べてみる

清の放射能を測定し，その値をそのままタンパクと（図5），循環中にNANAの数が変化すること

濃度の指標としたり，lmmunoassayによって定はないこと，Tfの一部は鉄を失ってアポ型になる

量したりすることにより行われているが，今回我ことがわかった。さらに，時間とともにTfの分解物々の得た結果はそれらの報告におけるタンパク質が血中に著明に蓄積することが示された。この分の血中消失速度は真の値を与えておらず，過小評

解物が抗原性を保持していることは明らかである。

価している可能性が強いことを示唆している。

このことは抗原抗体反応に基づくManciniの方法

ところで，移植筋に有効に作用するTfは血中ので得られた上記（2），（3）の測定結果は抗体との反応

ものではなく，組織液中のものである。今回の実性をもった分解産物をも定量したものといえる。

験では組織液中のTf濃度と血中のそれとの関係は

4

外来性トランスフェリンの体内代謝について■POTf2℡lne after

holoT†2

Fe一Treatnent

工njectlon（hr）

33

「′

1

●

0．5

￣

蓼

雷

10

l

16

雷

24

雲

●

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●

一

0．5
5
l

10
l

●

l

16

●

l

21

第5図 血中Tf分子の性状の経時変化。Tf2について鉄飽和したものとしないものについて比較した。＋極側に存在するものが分解産物。

0

3

6

9

12

22

HourS afterlntravenousJnjection
第6図

無傷なTf分子の血中からの消失。実線はManciniの方法で 抗休と反応する〝Tfについて，破線は等電点電気泳動／直接免疫
固定／デンシトメーターにより 無傷な〝Tfについて測定したもの。

Ⅲ 細胞培養および細胞生物学

34

明らかではない。また，Tfの一部は循環過程で鉄を失って筋成長促進活性を持たないアポ型となる。
投与されたTfが移植筋に対して有効な形で作用しうる条件を確立することはかなり困難な作業のように思われるが，我々はこれまでに得た基礎的データをもとに今後更に検討を加えてゆきたいと思
っている。

文

献

1）Ozawa，E．，〝oc．血笹川ノ山河．，53（B）：130−132，

1977．

2）氾mum，Ⅰ．et al．，加γ．Gr。WJ力か脾r 24：369−
380，1982．−
3）Ii，Ⅰ．etれ伽yeわp．βわJり94：366・377，1982．
・4）Ozawa，E．and HagiwaJa，Y．，L＞oc．JapanAcad．．
57（B）：406409，1981．
5）Hagiwara，Y．andOzawa，Eり伽リ．Gr0−VJ力か折れ，
24：115・123，1982．
6）Ashwen，G．andHarford，J．，AJm．Renβfoc加mり
51：531429，1982．
7）Kimura，L and Ozawa，E．，Dev．GTOWthD脾T ．，
25：523j29，1983．
8）Kimum，Ⅰ．，加γ．GrolVJ力か脾′り25：531「535，1983．

9）WⅢiams，J．，βわC加刑．ん108：57・67，1968．

35

5 筋芽細胞の成長を促進するラット脳由来酸性蛋白の性質
＊
＊

郎 美

一．活

山 藤

畑 佐

研究協力者

神経栄養因子の分子的性状および生物活性に関に10％の仔午血清を添加した培養液を用い，ゼラする特徴を明らかにすることは，正常筋の分化発

チンで被膜を作った35mmプラスティックシャー

達のみならず筋ジストロフィーの発症解明に重要

レに2×1♂cells／〃ishになるように播種した。培な役割りを果すものと考えられる。神経栄養因子

養は，37℃，5％CO2卜95％空気の条件で行ったに関する研究は，種々の神経組織抽出液やその部

脳抽出液または脳由来活性物質は，培養開始時に分楕製品の培養骨格筋細胞に対する添加効果を，添加した。

細胞増殖や形態的，生化学的分化皮を指標として脳由来活性物質の精製：Sprague−Dawleyラッ

行われてきた。これまで，性質の異なる多くの神ト脳を生理食塩水で洗篠後，使用時まで−20℃に

経栄養因子が報告されてきたが，はじめて物質的保存しておいたものを用いた。Gospodarowiczに精製純化し，性状を明確にしたのはOhのグルの方法 に準じて，0．15M硫安溶液で破砕後，−プ で，この因子をSciatinと命名した。一方

pH8．5で4℃，2時間撹拝抽出した遠心上宿を脳

小沢ら がニワトリ血清に存在する筋成長因子を抽出液とした。硫安35−73％飽和で活性を沈澱部

トランスフェリン汀Pと同定し，神経組織におい分に回収し，10mMTris−HCl，PH7．4に透析てもその存在を確認して以来，SciatinやPopielaのNTFも，TfそのものあるいはTfに非常にした後，DE52イオン交換クロマトグラフィーを
NaClの段階溶液で行った。生物活性は0−0．15近い性質を有する蛋白質であることが判明した。

M NaClおよび0．25−0．50MNaClで溶出される

我々も，ラット脳にラット筋細胞の成長を促進す

二つの画分に認められた。前者はTfと区別される二種の活性物質か存在し，一つは分子員，等電なかった。後者のSephadex G−200によるゲル点，免疫学的成績よりラット血清Tfと区別されろ過で，活性はvoid付近に溶出された。そのカないことを確認したご 本研究では，もう一種の活ラム等電点電気泳動で活性は，pH3．5に回収され性物質に関し，特に生物活性に関する特徴を中心た。

5）として検索した。
結果

材料 と 方法

Tfの混入のないラット脳由来筋成長因子を筋細胞培養：出生直後または1日後のラット後肢Brain−derivedgrowth factor，以下BDGF筋をトリプシンにより細胞を分散させ，Yarreのと称する。図1にBDGFの分子的性質を示した。

方法により単核の筋細胞を集めた。EagleのMEM

ゲル内等竃分画においてpH3．5−4．0に1本の蛋白帯が認められ，BDGFは脳の酸性蛋白の一つで＊弘前大学・医学部・第二生化学教室あることが判明した。PAGEで1本の蛋白帯が認

n 細胞培養および細胞生物学

36

図1

BDGFの分子的性質
左からゲル内等電分画，ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE），0．1％SDSを含むPAGE︹？OLX︶ご恩P＼Sこの0−OL名∈⊃Z
n5

1β

15

2♪

25

LogproteinqJg／mJ）
図2

筋細胞増殖に対するBDGFの用量反応曲線

37

5 筋芽細胞の成長を促進するラット脳由来酸性蛋白の性質︹？OLX︺毒P＼Sニ00−︒L︒q∈⊃Z
0

2

4

6

8

10

12

Daysin culture
図3

BDGFによる筋細胞数の経時変化

表1

BDGFの精製

Speciflc
Protein octlvity Activity Yleld（mg） （U／rng）（Units）（Z）Purity

Crude extrQCt

5，822

DEAE−Cellulose q5
Sephodex6−200

22

10．0

58，220100．0

1．O

100．0

4，500

16．8

10．O

158．6

5ノq90

9．2

15．9

められるのに対し．SDS／払GEでは4本の蛋白発現し，以下250／上が触Zまで直線的な上昇がみ帯が検出され，4種の蛋白成分が会合した高分子られた。一方，Tfは終濃度10〝㌢勿βで最大活として生体中に存在するものと考えられる。

性が発現し，より高濃度では活性の低下傾向がみ

次に，BDGFのラット筋細胞の増殖に対するられた。図3は，BDGFlOOFLgM添加後の筋影響を調べた。図2は筋和胞増殖におけるBDGF

和胞増殖に関し，時間経過を追ったものであるが，の用量反応曲線を示す。終濃度10〃拍βで活性が培養4日目から6日目に対数的な増殖が認められ，

Ⅲ 細胞培養および細胞生物学

38

6︵ヤOLX︶エS苛＼Sこの0−︒﹂のq∈⊃Z
85

1｛）

1．5

21）

Logproteinug／ml）
図4

BDGFおよびTfの筋細胞増殖に対する相乗効果

それ以降プラトーに達した。また，BDGF未添

添加で，培養3〜5日目での細胞数は両者ではぼ加の対照では，細胞数の増減はみられなかった。

同様の値を示した。Tf濃度を一定にし，BDGF

以上の結果をもとに，BDGFの各精製段階のサ濃度を変えて添加した場合には，BDGF単独ではンプルについて精製の程度を検討した。終濃度

活性発現しないような低濃度で相乗効果が認めら100FLghBの蛋白が2×104cellsAishを培養5れ，さらに，BDGFlOOFLgM同時添加により，El目に1×105cellsAish，すなわち，培養時の5いずれの計測時においてもTf，BdGF単独の和倍に細胞増殖を促す活性を1Unit と規定した時以上の効果が発現していた。図5は，この効果をの精製度を表1に示す。Sephadex G−200の段

写真で示したものである。培養4日目で，Tf，階で，回収率9．2％，純度15．9倍であった。しかBDGF単独添加では未添加系に比較してmyoblast

し，粗抽出液には，二種の活性物質，TfとBDGFの数は多いが，一方，両者の共存した場合には，が混在しており，両者が共存した場合に強い相乗

すでにmyoblastのalignment，fusionが始まっ効果が認められることから，粗抽出液中のBDGFている。6日目には単独添加系でmyotube形成が単独の活性は表の数値よりかなり小さなものと考認められるが，共存系ではさらに大きなnwotube

えられ，Sephadex G，200での回収率，純度はが形成されていた。以上のことは，生理的にも二低く算出しているものと考えられる。そのTr，

種の活性物質が筋あるいは他の細胞に対し協同的BDGFの相乗効果発現の結果を図4に示す。

に作用している可能性を示唆する。

Tf20fLgmまたはBDGFlOOFLg／如β各々単独

5 筋芽細胞の成長を促進するラット脳由来酸性蛋白の性質

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￡鴨嘘︑・肝

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39

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l

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∴−＼∴・■￣ミ
■−．＼︑

伽

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′

ノ

鱒工学
／

＼、、＿ 攣蟻号図5

BDGFおよびTfの筋細胞成長に対する相乗効果
BDGFは100F嶋／血色，Tfは20FLg／血￡添加した。
培養4日目と6E］目の矢印はmyotubeを指す。

考察

BDGFは，Tf共存下で，筋細胞の増殖分化に

本研究において，ラット脳由来の，Tfとは異相乗的効果を発現した。Tfは鉄原子の運搬蛋白

なる筋成長因子，BDGFの分子的性状および生として，Tf受容体を介して，種々の細胞の増殖

物活性に関する特徴について検討した。このBDGF

や機能発現に関与していることが知られている。

は，脳の酸性蛋白の一つであるが，既知の蛋白質

ラットTfなしにBDGFの作用が発現することかに相当するものは認められない。1975年に，Ohら，BDGFはTfとは異なった機構で筋細胞に作は，ニワトリ脳に分子量30万以上の蛋白性の筋成用しているものと考えられるが，その詳しい機構

長因子が存在することを報告している。BDGF

については今後究明したい。

は，この因子に相当するものと推測される。BDGFの活性サブユニットの検索に先立ち，1％SDS
または6M尿素処理実験では，活性の完全な消失をもたらしたので（成績省略），SDS／今AGEで認められた4種の成分は，疏水的に結合して活性を発現しているものと考えられる。

文献1）Markelonis，G．J．，Kemerer，V．F．＆ Oh，T．H．
（1980）上月わJ．C乃e肌，255：8967−8970．
2）Kimura，I．，Hasegawa，T．，Miura，T．＆Ozawa，E．（1981）Jサoc．彪卯月Aαdリ57（B）：200−205．
3）Oh，T．H．＆Markelonis，G．J．（1982）JINeuTOSCi，
月eg．，8：535−545．

40

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

4）Beach，R．L．，Popiela，H．＆Festoff，B．W．（1983）
fEβ∫上e止，156日51−156．
5）松永宗雄，畑山一郎，佐藤清美，筋ジストロフィー症の疫学・臨床及び治療に関する研究（祖父江班）
昭和57年度研究成果報告書p．490494．

6）畑山一郎（1982）弘前医学，34，666−676．
7）GospodaTOWicz，D．，Weseman，J・＆Moran，J・（1975）肋mre，256；216・219．
8）Oh，T．H．（1975）grp．〃e〟mJ，46；432・438．

416サテライト細胞のinvitro及びinvivoに於ける再生能香 川

務＊

研究協力者 棋 永 剛 一＊ 橋 本 孝 二＊＊巽Ⅰ

典 之＊＊北 野 博◆ 司＊＊＊

マウス再生筋芽細胞のクローン培養下でのーから，紡錘形の細胞が既にパリセード形成を示

筋分化過程におけるその形態とCK（Creatine

すコロニーまで，いろいろな形態を示すコロ千一が見られた（図1Nl〜2，Dl〜2）。此等，単核Khase）アイソザイム

筋芽細胞からなるコ占ニーのCKの成分は100％
材料 と 方法

BBであった（図2Nl〜2，Dl〜2）。この時期

8週令以上の正常（C57BL／6プ4）及び筋ジストのコロニーには，既に，少数の短い筋管細胞が見ロフイ（C57BL／6Jd〝／ay）マウスを使用した。
再生筋芽細胞の採取及び筋クロン培養の方法は既られるものがあり（図1N3，D3），このコロニに報告した。今回の培養では，FM（fresh（図2N3，D3）。筋管細胞の数と大きさが増大

medium）で培養を開始し，24時間後，GM短ro−

するにつれ（図1N4〜6，D4）。MB，つづいwthm．）で培地を交換，培養9日以後はMM（ma−て，MMの比率が増加した（図2N4〜6，D4）。

intenance m．：Eagle′sMEM90％，馬血清10％）以上の結果，筋管細胞に分化して，始めて，MB，

で2〜3日毎に培地を交換した。位相差顕微鏡で，MMの合成が可能となる事を示している。培養の各分化段階のコロニーの写真を撮って後，5／川の経過と共に横紋の発現，筋線経の細小化 自発収MOPSO緩衡液（pH7．8）で各コロニーを細い硝縮が認められた（図1N7，D5）。これらのコロニ

子管内に吸引採取して，2回b凍結融解の後，ーではMMの増加，BBの減少が見られた（図2

10，000rpm で5分間遠心を行い，上宿の電気泳

N7，D5）。この培養条件では，培養17日以後，動を行った。電気泳動 酵素反応はコ一二ング社

筋緑経はその細小化や自発収縮の結果，培養叫よのCardiotrak kitを用いて行い，CKアイソザイ

り剥離，浮上し，これ以上培養を維持する事は困

ムの比率はコ一二ング杜の蛍光スキャンニングメ

難であった。培養17日目の筋コロニー（図1N8，ータで求めた。

D6）CKのMMの比率は，正常．筋ジスのいづれ

ーのCKはBBの他，少量のMB，MMを示したにおいても，約70％であり，少量のMB，BBを寿吉黒 と 検討示した（図2N8，D6）。生後8週の正常及び筋個々の再生筋芽細胞はGMで増殖し，コロニー

ジストロフイマウス骨格筋のCKはいづれも，Mを形成した。9日目の培養では，球形又は紡錘形

Mがほとんど100％を占めていた（図2N9，D7）。

の筋芽細胞が相互に距離をおいて配列したコロニ

この事は，この培養条件下で，最も分化した筋コ
ロニーでも，生後8週マウス筋に比較し，少くと＊国立療養所 刀根山病院＊＊大阪市立大学医学部＊＊＊国立循環器病センター

も，CKアイソザイムの分化に関する限り，未分化であると結論できる。なお，比較的未分化の筋42

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

図1N

正常筋細胞コロニー

6 サテライト細胞のinvivoおよびin．vitroにおける再生能

43．Jr▲『L tふ

図1D筋ジス筋細胞コロニー

コロニーのCK電気泳動で原点（Ⅰ）より陰極側に合成については既に報告されている。クロン培養

一つのピークが見られ，これは筋分化の進行と共を用いる事によって純粋な筋細胞のCKアイソザに消失した（図2Nl〜4，Dl〜3）。この成分のイムパターンが得られる乙と，各分化過程の筋和

筋分化における意義は現在不明である。
クロン培養下における正常及び筋ジストロフイ胞の形態とCKアイソザイムパターンとの関係を，より正確に知る事ができる等の利点がある。

再生筋芽和胞の筋コロニー分化の過程を形態学的及びCKアイソザイム合成能から比較したが，両Ⅱ ラジオオートグラフイによる，正常及び筋者の間で差を認めなかった。鶏胚筋芽細胞の多細ジストロフイマウス骨格筋の再生能の研究

胞培養下における筋分化過程のCKアイソザイム

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

44

tIbml

DYStrOphy

pormalDYStrOphy＋

B8

Dl（9 d．）

Ⅷ刊」丑∠迅皿皿D2（7N2（9 d．）

d．1

N7（17

d．）

DS（14

d．）

上土二＿二
H比

冊

比B BB

柾目9 d．）

且B BB

D3（9 d．）

比的

且8

88

∠誹
比H M8

Muscle ex亡．tX12．5001

∵
IIB

札B

88

D6（17 d．）B8

N4（1l d．）hh

出N8（17 d．）

Huscle ext．（X12．500I

BB

NS（ll d．）

図2

Serum（O v．）

各筋細胞コロニーのCKアイソザイムⅠ：電気泳動の原点

Serun（8V．I6サテライト和胞のinvivoおよびinvitroにおける再生能

●

モ

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＿ト

・●

′

一、−−●
′

●

−

●
ヽ

ヽ

図3−1正常筋再生3月

官

許

l

l

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■

▲・・

∴．

■

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図3−2

卓

筋ジス筋再生2月

郵

′tl
熱

■モ

さ
′

ぜ

■

●

■，

′

図3−3

筋ジス筋再生2月

245

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

46

材料 と 方法
6週令正常（C57BL／6久）及び筋ジストロフであった。しかし，その筋線経の中には，明らかな変性を示さないものも認められた。

ィ（C57BL／6JdyAy）マウスの大腿筋に0・5％以上をまとめると，1）再生開始3ケ月後ではマーカイン6）（正常：0．1両／肢，筋ジス：0．05m丘正常筋線経は未だ完全に分化していなかった。2）／肢）を注射し，約64時間後，同郡位に3H一チミジン

筋ジス筋では再生開始後，少くとも1ケ月以上を（正常：100〟C／肢，筋ジス：50ルC／肢）を注射

経過して後に，筋線維群手引こ変性の開始が認めらし，叛，1，2，3月後に同部筋を採取，組織れたが，その時期は一定でなかった，3）筋ジス

標本（各毎〜3月一標本と略称）を作製し，ティッピング法（サクラNR−M2）でラジオオート
グラフイを行った。爆射時間は2週間である。

筋線経が完全に再生するか否かについては，本実験では明らかにする事はできなかったが，再生開始後3ケ月以上変性を起さない筋線経の数は極めて少いと推定される。マウスdy一ジストロフイで結果 と 検討

は，完全に分化した筋繰経が変性する事は知られ正常マウスでは毎〜3月の全標本（毎及び1ているが，再生中の筋線経の大部分が，分化の途

月目各2肢，3月日3肢）で，核にグレインを示

中で変性，消失する事を証明したのは本研究が始す筋線維群が認められた。3月一標本でもグレイめてである。以上の各事実は，マウスdy一ジスト

ンを示す核の多くは，筋線経の中心部にあり（図ロフイの成因を考える上で重要である。

3−1），この事は，正常マウス骨格筋の再生には3月以上を要する事を示している。筋ジス筋（毎，1，2月日各2肢，3月目3肢）の場合，毎〜1月一標本では，核にグレインを示す筋線
経は変性を示していなかった。2月一標本では，核にグレインを示す一群の筋線経が明らかに変性の開始を示しており（図3−2），同じ標本の近くには，殆んど変性を示さない筋線維群の核がグレインを示していた（図3−3）。3月一標本では，核にグレインを示す筋線経の数は極めて少数

文献1）Kagawa，T．，Chikata，E．，andTani，J・：（1977）・Dev・
βわJ．55；402．
2）Kagawa，TりChikata，E・，Tani，J・，andTsutamune・

T．：（1978）．伽γ．βわエ65：526・
3）Kagawa，T．，Chikata，E．，andHamano，R・（1983）・
劫 一肌JC〟kr叫ぶ什Opわ′βわdem加J A岬eCJJ（eds．by Ebashi，S．，and Ozawa，E・）Japan Sci・
Soc．Press．Tokyo and Springer二Verlag．Berlin，HeiderbergandNewYork．

4）香川 務，北野博司，棋永剛一（1983）・第16回日
本発生生物学会（A39）．
5）Turner，D．C．，Maier，V．，andEppenberger，H・M・：（1974）．加γ．βわJ．37，63・
6）Hall・Craggs，E．C．臥（1974）．放p・肋〟rOJ・43；349・

47

7

アフリカツメガエル初期胚の単一割球由来

細胞群の選択的分離法

江 橋 節 郎＊研究協力者 三 川隆＊ 古 関 千寿子＊＊

単一剖球である受精卵は分裂をくりかえし，多場合と同様標識として使える形質が自由に選択で細胞化する。発生初期の多細胞化の特色は増殖できない。我々は最も直接的な方法としてマーカーはなく自らの細分にある。受精卵を細分することの特定割球への注入をおこなった。マーカー物質

によって卵球体上に割球が配列される。細胞系謀としては①細胞毒性のないこと，㊥gapjanctionの研究から球面上の割球の位置とそれから由来す

等を通過して隣接する細胞へ移動しないこと，㊥る細胞群が個体のどの部位を形成するかという対注入した細胞には全体に拡散すること等が必要で応関係は，明らかにされつつある（1−3）。しある。またマーカーが細胞分裂に伴い希釈されなかし特定の割球あるいはその割球を起源とする子い事も重要な条件であるが，本研究の目的は，発孫細胞群にどの様に個性が獲得され，いっ個性発

生の非常に早い時期におこる最初の細胞間の分子

現のスイッチが入るのか−発生の最初におこ的変化のスイッチの解析である。幼生の体積がほる細胞間の分子的変化に関する解析は，エアポケ

とんど変化しない幼若幼生期までの解析が重要でットの状態で手がつけられないでいる。特定割球あり，注入するマーカーの希釈は考えなくてもよから発生する子孫の細胞群は，胚の中で複雑な空い。

間配置右とり，これを初期発生の任意の時期に選マーカー物質としてはHRP（horseradishpe−

択的に集めてこなければならない。今回単一割球

roxidase）が有名である。しかし検出の為には固を標識することにより，特定割球から由来する子定，包埋し切片を作り染色するという作業が必要

孫細胞群のみを選択的に分離することが可能となで，細胞を生かしたままマーカーを検出できないったので報告する。

という欠点がある。我々は注入するマーカー物質
として蛍光標識物質を考えた。これは後で述べる

特定割球の標識検出の容易さと分離とためである。マーカー物質

特定剖球あるいはそれを起源とする子孫細胞群の細胞内の安定性の為D型アミノ酸からなるペプを他から区別する為に標識が必要である。細胞のチド（4）やD型の糖鎖に蛍光標識するのが最良と思

標識には特定の細胞に遺伝的突然変異を起こすこわれるが，簡単に入手できないし，蛍光量に限界とが最も確実な方法であるが，特別な場合を除きがある。今回用いたマーカー物質は市販されてい一般的には利用できない。キメラの利用も有用でるFn℃−BSA（fluoresceinisothiocyanate標あるが，解像力に限界のある点や突然変異利用の識ウシ血清albumin）である。FITC．−BSAを20＊岡崎国立共同研究機構・生理学研究所・分子生理研
究系・神経化学部門＊＊国立循環器病センター研究所・薬理郡・分子薬理研究室

mg／ml程度の濃度で溶かしたものを，卵割のパターンが規則的なアフリカツメがエルの初期胚の特定制球に注入した。注入量は割球体積の5％以n 細胞培養および細胞生物学

48

第1図

2細胞期の1割球へのFrrC−BSAの注入
秒2細胞期に注入を受けた胚の蛍光写真④第2分裂中③4細胞期④32細胞期下である。図1には2細胞期の片方の割球にFI注入を受けたものは，個体全体に蛍光が分布してTC−BSAを注入した結果を示した。注入されたいた（図2−1）。分裂過程で特定の細胞にマーマーカーが数分問の内に割球全体に拡散してゆく。

カーが分配されないという事や，特定の細胞群が隣の割球には移っていくことはなく．細胞分裂もマーカーを除去するという事は無い様に思われる。

異常なく進行した。

幼君幼生期まででは，FITC−BSAはそれ程代謝

図2には，受精卵から8細胞期の初期胚の1つをうけないのであろう。4細胞期の背側の1割球の細胞にFITC−BSAを注入し，30〜40時間発生をに注入をうけた場合には頭部・胸および神経管と続けた幼生の蛍光写真を示した。単一細胞の時に思われる部位に蛍光が限局して検出された（図2

7 7フリかソメガエル初期胚の単一割球由来細胞群の選択的分離法

第2園

幼若幼生期の蛍光写真①1細胞期にFrrC−BSAの注入をうけた胚（勤2細胞期の1割球に注入をうけた胚（参4細胞期の背側の一割球に注入をうけた胚④8細胞期の上部背側の一割球に注入をうけた胚49

［ 細胞培養および細胞生物学

50

3

▲

ヰ

第3図
①遊離した肺細胞の実体顕微鏡写真②8細胞期の背側上部の一割球に注入をうけた胚の遊離細胞の蛍光写真
＠㊤の透過光写貞④セルソーターで分離後の細胞群の蛍光写真
一言）④の透過光写真

51

7 アフリカツメガエル初期胚の単一割球由来細胞群の選択的分離法ー3）。8細胞期の背側上部の一割球に注入を受けた場合にはマーカーの存在部位はさらに限局された（図2−4）。

ソークーで集めることを試みた。
幼生の培養液から2価イオンを除くだけで自然に細胞が遊離してきた。内胚葉性および中胚葉性以上の結果からFI′忙−BSAは発生毒性は大きの細胞の遊離は筋肉反応期や心臓鼓動期でも容易くないと言える。実際に発生は進行し大きなオクに起こるが外胚葉性の細胞の遊離には，緩かなピ

マジャクシになってゆく。しかしながら注入後ペッティングが必要であった。図3−1に示す様

100時間以上では体積の増大に伴い蛍光強度は急に胚の細胞を遊離させる事ができた。これらの細速に減少した。また特定の細胞だけに蛍光が検出

胞の中からマーカーを保持する細胞だけをセルソされるので，代謝も急速にうけはじめるらしい○

ーターで分離することができた（図3−2−図3

しかし少なくとも幼若幼生期までに関しては，注−5）。

入を受けた割球に起源を発する子孫細胞群にマー
カー物質は限局して存在する。

以上の方法で特定の細胞を標識しその細胞から生じる子孫細胞の個体形成の過程を胚が生きたま
ま観察でき，さらに発生の任意の時期に子孫細胞

子孫細胞の選択的分離群だけを分離し集めることが可能となった。

特定割球に起源を発する細胞群だけを発生の任意の時期に分離するには，上述の様にFI′忙−B
SAでマークされた細胞だけを集めてくることが文

献細胞の持つ、蛍光塁■と 大きさ′の2情報で

1）Hi∫OSe，G．＆Jacobson．M．‥加yeわp・βわJ・，71；
191・201，1979．
2）Jacobson，M．＆Hirose，G．：ScEence，202：637・639，1978．

細胞を分離し集める装置としてセルソークーが現

3）Jacobson，M．＆Hirose，G・：J〃e〟′0∫Cも127ト
284：1981．

在利用できる。我々は胚全細胞を一旦遊離細胞と4）Weisblat，D．A．，Zackson，S．L．，BlaiT，S・S・＆Young，
J．D．：∫Cお乃Ce，209：1538−1541，1980

出来ればよい。

し，マーカー物質を保持している細胞だけをセル

52

8 鳥類胸腺筋様細胞の起源について
仲 村 春 和＊胸腺内に横紋筋様細胞が存在することはかなりけた側の胸腺を小さく切り，コラーゲンコートを以前から知 られているが，近年この筋様細胞がコ施したファルコン培養皿に入れ培養する。培養にリンレセプターに対する自己免疫疾患である重症は鶏血清を5％と，馬血清を15％の割合で含む

筋無力症の発現に関与しているのではないかといEagle sMEMを用いた。培養2−3週間後に2．5％われており興味を集めている1・2，7・8）。胸腺内のグルタールアルデヒドで固定し，野水，包哩の後，筋様細胞の機能に関しては未だに不明であり，そ超薄切片を作製し，電子顕微鏡で観察した。

の起源に関しては内胚葉性の胸腺上皮から分化し

図2と図3にウズラの筋様細胞とニワトリの筋てくるとする説6），胸腺内の結合組織に由来する様細胞を示してある。ウズラの細胞ではヘテロクとする説8）がある。胸腺の上皮は第3，第4鯉嚢ロマチンが凝集しており，これが核小体のRNAからおちこんできた内胚葉性の細胞であることは部分と接している。一方ニワトリの細胞ではヘテよく知られている。一方胸腺内の結合組織についロクロマチンと核小体のRNA部分が混在していては最近の研究により外胚葉性の神経堤由来であるために，注意深く観察すると両者を形態的に識ることが明らかにされている4）。

別することが可能である3こ

本研究は胸腺の筋様細胞が神経堤由来かどうかを明らかにする目的で行なわれた。ウズラの細胞

結果

と考察

はニワトリの細胞と形態的に識別できるので，発胸腺の筋様細胞は醇化直前にミオフィラメント

生初期にウズラの神経堤をニワトリ胚に移植してが見られるようになる5）が，その数は少なく，胸形態的に胸腺筋様細胞の由来を追求した。

腺の水平断面上に2〜3の細胞が見られるのみである。筋様細胞は髄質の方に多くみられ，多核の

材料

と方法

細胞も少数ながら存在する。

楷卵2日目で7−10体節期のニワトリ胚から変

ウズラの神経管を移植されたキメラ胚の胸腺で脳部の神経管の片側を切りとる。ここに同じ発生は確かに結合組織は神経堤より移動してきた細胞

段階のウズラ胚の菱脳の片側を挿入する（図1）。

でできている（図4，5）。筋様細胞に関しては

僻卵19〜20日（膵化直前）に移植を受けた側の胸その数が少ないことと，光顕で同定できないこと

腺を切りとって2．5％グルタールアルデヒドで固からウズラの細胞かニワトリの細胞かを同定する定する。1％オスミウム酸で後固定の後，脱水，ことは困難である。

エボン包埋後，超薄切片を作製し，酢酸ウラニル

図6にキメラ胚僻卵20日の胸腺に見られた筋様とクエン酸鉛で染色し，電子顕微鏡で観察する。

細胞を示してある。この細胞では細胞質にミオ移植を受けた胚の一部は鰐卵16日目に移植を受フィラメントが見られ，ヘテロクロマチンは凝集しているように思われるが，ウズラ細胞と断定する＊広島大学医学部第1解剖学教室

までにはいたらない。

8 鳥類胸腺筋様細胞の起源について
文

キメラ胚の胸膜を細切して培養すると，上皮細胞と線維芽細胞がほとんどの部分を占めるが，5〜6日たつと多核のミオチューブが見られるようになる。培養2週間後くらいになると自発的な収縮も見られるようになったが，位相差顕微鏡では横紋を確認することはできなかった。
ミオチューブのコロニーのあるところを電顕で観察すると細胞質内にミオフィラメントをもった細胞が多数存在することがわかった。ヘテロクロ
マチンがいくつかに分かれているが，どれもRNA
部分と混じることなく凝集しているので，これはウズラの細胞と思われる。
本報告書に示した筋様細胞の写真のみではこれらがウズラの細胞だと断定することはできないがウズラ様の細胞が見つかったとはいえる。すなわ
ちキメラ胚胸腺の筋様細胞は，移植されたニワト
リ神経堤から移動，分化してきた可能性が高いと
いえる。

53

献

1）Drachman，D．B．TTlebiologyofmyastheniagravis．
d〃仇月ey．〃g〟和∫C7．．4：195・225，1981．
2）Kao，Ⅰ．andDrachman，D．B．nymic musclecells
bear acetylcholine receptors：Possible relation
tomyastheniagraviS．Science，195：74−75，1977．
3）Le Douarin，N．Caracteristiques ultrastruCtumles
du noyauinterphasique chezla Canle et chezle
Poulet et utilisation de cellules de CaⅢe comme
Lmarqueuresbiologiques●enembryologie

expen・

mentale．AnnIs．Ehb7yOt．MbTPho1．，4：125−135，
1971．
4）LeLievre，C．S．andLeDouarin，N．M．Mesenchymal
derivativesoftheneuralcrest：Analysisofchimericqua辻 and chick embryos・J・Embryot・Exp・
肋rp九〇gリ34：125−154，1975．
5）Nakamura，H．，LeLievre，C．S．andLeDouarin，
N．M．Electron microscopic obserYation of the
myoid ceusin birds．Acta Anat．N＊pon，56：
316⊥317，1981．（Abstract）
6）Ravi0la，E．and Raviola，G．Striatedmuscle cells
in thethymus ofreptiles andbirds：Andectron
microscopic study．Am．J．ATZaE．．121：623・646，
1967．
7）Rimmer，J．J．Myoid ce11sandmyastheniagraviS：

A phylogenetic overview．Devetop．Cbmp．血・椚〟〝07．，4：385−394，1980．
8）Van de Velde，R．L．andFriedman，N．B．TTlymic
myoid

cells

andmyastheniagraviS．AmJ．hthotり59：347−368，1970．

図1移植の模式図。まず酵卵2日目のニワトリ胚（7−10体節期）より菱脳部神経管の片側を切りとる（A）。Bは横断図。次に同時期のウズラ胚（C）の菱脳部をディスパーゼ
処理（disp）し，神経管の片側（D）を移植する。

54

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学
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図2

ウズラ胸腺の筋様細胞。ウズラの細胞ではヘテロクロマチンが凝集し（屋印）それが図3

ニワトリ胸腺の筋様細胞0ニワトリの細胞ではヘテロクロマチンと核小体RNAが混在している。バーは0．5〝m。

核小体RNA（矢印）と接している。バーは0．5〃m。

8 鳥類胸腺筋様細胞の起源について

図4 移植を受けた胚の胸腺。結合組織の細胞はウズラの細胞よりできている（矢印）。
バーは10／上m。

図5 移植を受けた胚の胸腺中の結合組織細胞。
この細胞は神経堤由来であるのでウズラの細胞である。バーは0．5fjmo
図6 移植を受けた胚の胸腺筋様細胞。これはウズラと思われる核をもった細胞である。
バーは0．5JJm。

55

56

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

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図7−9

移植を受けた胸腺を培養したときに見られた筋様細胞。この細胞はウズラと思われる
核（図8）とミオフィラメントをもっている（図9）。バーは0．5J上m。

57

9 高分子注入法の新しい試み
岡 田 善 雄＊研究協力者 中 西 真 人＊￣内 田駿＊

細胞融合現象を利用して生体高分子物質を生きている細胞内に注入することが可能である。すでに我々の研究室で・3種類の方法が開発され，細胞細胞融合現象を物質注入に利用することを意識し始めた頃，我々は4種類の方法が可能であるとのに時間がかかってしまった。本研究はこの最後の方法に関するものである。

ひ判断していたが，その最後の方法を具体的に示す

三四芯上馬鼠聖；巾一品

遺伝生理学的研究に利用されている。

1．細胞融合現象の1側面
かって我々はHVJのリン脂質をスピン標識し

18

0

10

てと卜赤血球を反応させ，そのESRスペクトルの変化を観察したことがある（文献1）。
その目的は，HVJ外膜と赤血球膜との融合でスピ
ン標識リン脂質の赤血球膜脂質による稀釈が急速に起こる筈で，その量をESRスペクトルで定量しようとしたのである。

20

30

40

50

60

Time（min）

第1区I HVJ＊のヒト赤血球への融合反応（37℃）
でのESRスペクトルの経時的変化。
PC＊のHVJ＊内濃度は．
〔PC＊〕／総ウイルスリン脂質＝（a抽6，（bけ5，．tCI3，（d）6である。

第1図にその結果が示してある。横軸は反応時間で縦軸はHVJ外股にぎっしりつまったスピン

したがって，このような条件下で，ウイルス外股

標識リン脂質（フオスファチジールコリン）分子

リン脂質をスピン標識したインフルエンザウイルの稀釈量と考えて頂きたい。37℃で両者を反応

スとヒト赤血球を反応させても，ウイルスの赤血させると直ちにウイルスリン脂質と赤血球膜リン

球表面への吸着は勿論効率良くおこるが，外膜と脂質の混合がおこり大体60分以内に平衡に達す

赤血球膜の融合はおこらずスピン標識リン脂質のることがわかる。

稀釈もおこらない。ところがこの系に無標識のH

この実験の途中で面白い現象が観察された（第VJを加えてやるとインフルエンザウイルス外膜2図）。インフルエンザウィルスはHVJと異って，中性と赤血球膜との反応が誘発され標識リン脂質の稀

或はアルカリ側では細胞融合反応を起こさない。

釈が現われるのである。しかもその稀釈量は加えたHVJの濃度に依存している。

＊大阪大学・細胞工学センター

他のいろいろな観察からHVJにより細胞膜面

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

58

凡んどおこらないことをすでに示してある。リポゾーム表面にHVJの2種類の糖タンパク質，HNとFを分子比1：2で組込んだ場合にのみ，リポゾ
483

印してあった物質が細胞質内に注入されるのである。
然し上記の現象を考え合わせてみると単純リポ

81急石工葛監聖焉一品ームと細胞膜との融合が進み，リポゾーム内に封ゾームと細胞膜との融合をHVJの添加によって誘発さすことも可能であろうという考えが浮んでくる。これを実施したのか本研究なのである。

3．結果

未発表の部分が多いので詳細な報告の出来る段階ではないが，極めて有望な結果を得つつある。
10

20

30

40

50

60

Time（min）

フオスフアチデールコリンとコレステロールよ
りなるリポゾームを人工的に作り内部にジフテリ

第2図 インフルエンザウイルス＊外股に組込まれたPC＊の赤血球膜への移行のHVJによる誘発。
a）HVJなとb）HVJ200HA単位添加
C）HVJ800HA単位添加d）HVJ1500HA単位添加

ア毒素のフラグメントAを封印しておく。このリ全体に大きな変化が現われ，それが細胞と細胞のシル化に原因するものであった。

ポゾームは細胞表面によく吸着するがそれ以上のことは起こらない。ここにHVJを加えると細胞のタンパク合成が急激に抑えられる。勿論HVJ
のみではタンパク合成の阻害はない。この阻害はフラグメントAの細胞内注入によるEF2のリボ融合を引きおこすと理解されていたが，第2図にさらにこの人工リポゾームにレクチンを結合さ示した現象もその1つの変型として理解することせたものもHVJによって有効に反応を誘発させのできるものである。インフルエンザウイルスもれることが判明してきた。このことは人工リポゾ

HVJも細胞表面レセプターはシァル酸を末端にーム表面に特定の細胞表面だけに親和性のある物もつ糖鎖であるので，赤血球表面でインフルエン

質，例えば，或る細胞表面だけを認識する単一クザウイルスとHVJはある距離を置いて吸着してローン抗体をセンサーとして連結させておけば，いた筈である。37℃で反応を開始すると，先ずH

HVJを加えることで，その特定の細胞だけに物

VJ外膜と赤血球膜との反応が局部的におこり，質を注入することができることを示している。今その変化が赤血球膜全体に波及すると共にインフ

後大きく実用面をもつ方法と考えている。

ルエンザウイルス外股と赤血球股との融合が誘発されるのである。

文

献1）A spinlabel study on fusion of red blood cells

2．高分子物質注入への利用
我々はすでに人工リポゾームを利用した物質注入法を開発しているが，この場合単純なリポゾー
ムは細胞表面によく吸着するが細胞膜との融合はinduced by Hemagglutinating ViruS OfJapanby Maeda，T．）Asano，A．，Ohki，K．，Okada，Y．
mdOhnishi，S．βわで力e椚如け／Jタ7玖14；3736−
3741．

59

10

晴乳動物の初期胚形成に影響する
単クローン抗体

岡

田

節

人

哺乳動物の胚発生において，広い意味で収縮と期胚となり，こゝでコンパクションを起こす。

呼んでよいような現象は，マウスでいうと8細胞

ECCD−1を加えた培地でも細胞分裂は正常に進期で起こるコンパクションと呼ばれるものである。

行するが，8細胞期でコンパクションは起こらな

こゝで，それまで，はなればなれにあった割球間同

い○ コンパクションはじつは起こるのではあるが，志の接着面積が急激に増加し，そのため胚全体がそれは対照胚よりおくれ，16細胞期で初めて起こ

固くしまるようになり，いわば多細胞の系としてるようになる。しかし，その後発生は進行して一見の胚はこのときにでき上る。細胞間の接着に機能

正常胚と同様な胚盤胞が形成されてくる（第1図）。

する細胞表面分子として，いくらかのものが指摘

しかし．ECCD−1中で発生を進行してきた胚されているが，哺乳動物掛こおいて最も重要なも盤胞は正常胚とは際立った違いがある。というののは，元来はマウスの奇形がん腫細胞についてTa−は処理胚には内部細胞塊が全く出現せず，外側のkeichiらによって同定され，その機能にCaを要

栄養芽層のみからなる中空の胚が形成されてくる求する分子量124．000の蛋白分子である。この分からである。

子はTakeichiらによってカドへリンと命名された

このことはECCD−1胚にアルカリ性フオスフ

が，これに対する単クローン抗体を準備すること

アターゼの組織化学的染色を行なうとよく判る。

ができた。この抗体（以下ECCD−1というコード

この酵素は，胚盤胞では内部細胞塊の細胞にのみ名で記する）で処理されたマウス胚ではコンパク

局在しているのであるが，処理胚を染色すると，ションの現象では可逆的に阻止され．カドへリン

この組織化学で染色される細胞の全く存在してい分子が初期胚の形態形成に重要な機能をもつことないことがよく判るめである。（第2図）また，胚盤が示唆された。

胞を培養基質に接着させるような条件で．静置培それで，今回報告する実験では，マウス初期胚養を行うと違いが明らかとなる。正常胚では単層をさらに長期にわたってECCD−1で培養し，その上皮性細胞が培養基質の上に広がり，その上にの胚発生に与える効果をみたのである。

球状の細胞のクラスターがのっかった状態となる。
ECCD−1で処理された細胞では，単層の細胞層結果が広がるのみであって，球状の細胞（内部細胞塊

4細胞期の胚を妊娠マウスからとり，試験管内の細胞と見倣してよい）は全く出現してこない。

の培養に移す。標準培地はDulbecco・s modified

このような著しい胚形成の異常は，胚盤胞期にMEMに10％の牛胎児血清を加えたものである。

至るまでのどの発生期を，ECCD−1で処理した標準培地で培養された胚はやがて分裂して8細胞ときに起こるのであろうか？それを知るために発生の異なった時期のみ短時間だけECCD−1で処＊京都大学理学部 生物物理学教室理した。胚を16細胞期までECCD−1で処理して皿 細胞培養および細胞生物学
60▲11−□UU︼︒Q逓吏﹂唱巨﹂室山﹈刃︵Jqヨ∝ON︶増配時恵載り重野味噌■ゆ︵．TR串巴劇療今撃芸；長も琴監禁苗垂車重禦雲上89㌫蒜道東空軍∇ 厨︻糀

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ll一V三喜己10哺乳動物の初期胚形成に影響する単クローン抗体

第2図

61

右側はECCD−1処理によって得られた内部細胞塊を欠く胚盤胞。左は正常のもので，アルカ
リ性フオスファクーゼ染色でよく染まる内部細胞塊の存在がみられる。

から（つまり，コンパクションは未だ起こっていな手がかりになると考えられる。

ない）．正常培地に移して培養を続けると，正常にカドへリンに対する単クローン抗体であるECCD

内部細胞塊をもった胚盤胞が発生してくる。とこ−1が内部細胞塊のない胚の発生をもたらす機構

ろがもう少し処理時間を長くして，16細胞期と32はどのようなものが考えられるだろうか？Johnson

細胞期の中間期までにすると，内部細胞塊を欠いとZiomek（1981）は，マウス胚の初期の卵割期にた異常胚が発生するのである。

ある割球では，コンカナバリンAに対するレセプ

一声，16細胞期までを正常培地において，以後をECCD−1で発生させると異常胚が得られる。

ターが細胞の一方に局在し，このことがその後のしかし，16細胞期と32細胞期の中間までを正常培を示唆した三 ところがECCD−1で処理すると，地で，以後をECCD−1で発生させると，得られこのレセプターの局在が起こらず，細胞表面の全るのは正常胚である。従って，16細胞期と32細胞部に均一に分布することが観察された。このこと期の間に，ECCD−1によって異常胚の作られてからすると，カドへリン分子とそれ以外の細胞表くるための，クリティカルな時期のあることが明面分子（コンカナバリンのレセプターを含む）とらかである。

の分子間相互作用が，マウスの発生で最初に起こ

内部細胞塊と栄養芽層との分化の原因となること

る細胞分化にも重要な役割を果たしていることが考察推察されるのである。

これらの実験の結果から，カドへリンと名ずけた細胞表面蛋白がマウスの初期発生における形態
変化に極めて重要な機能をもつことが明らかであ文

献1）Takeichi，M．，Asumi，T．，Yoshida，01りUno，K．，

る。形態変化といえども，要は細胞のもつ分子のand Okada，T．S．（1981）．Selective adhesion of

機能によって規定されるものであることはいうまby CaJependent site．Develop．Biol，，87：340−

でもない。こゝで述べた実験の結果は，初期発生における形態変化に機能する特定の蛋白分子として同定された最初のものである。従って，カドへ
リン分子の性状と，その機能についてのより詳細な研究は，形態変化の分子的背景を理解する重要

embryonalcarcinoma celland differentiated ce皿
350．

2）Yoshida−Noro，01．，and Takeichi，M．（1982）．
Teratocarcinoma cell adhesion：Identincation ofacell嶋urfaceproteininvoIvedin calcium−depend−

entce11aggregation．Cdl，28：217，224．
3）Takeichi，M．Yoshida−Noro，Ch．，Ogou，S．J．
ShiTayOShi，Y．，Okada，T．S．，and Wartiovaara，J．
（1983）．A cell・Cell adhesion moleculeinvoIvedin

62

Ⅱ 細胞培養および細胞生物学

embryomiccenularinteractionsasstudiedbyusing
teratocarcinomacens．In■TeratocarcinomaCe皿S，

Cold Spring Harbor Conf．on Ce11PEOliferation，
YOl．10（Ed．F．Jacob），pp．163・171．
4）Yoshida−Noro，Ch．，Suzuki，N．，and Takeichi，M．（1984）．Molecular nature of the calcium・
dependent cell・Ceu adhesion system in mouse
teratocarcinomaand embryoniccellsstudiedwith
a monoclonal antibody．βgydoP．βわJ．，101：（inpress）．

5）Shirayoshi，Yリ

Okada，T．S．，and Takeichi，M．

（1983）．TTle CalciumJependent celトcelladhesion
SyStem regulatesinner ceu mass formation andCell surface polarizationin eadymouse deYelop−
ment．Cb〃，35；631438．
6）Johnson，M．H．，and Ziomek C．A．（1981）．Induc−tion of polarity

in

mouse

8・Cell blastomeres：

SPeCificity，geOmetry and stability．J．C甜Biol．，
91；303・308．

Ⅲ

生

理

学

11．筋細胞における膜興奮機能の発生

6512．培養骨格筋における膜興奮性の変化

70

13．幼生アフリカツメガエル腸骨筋の収縮系と筋小胞休

74

14．筋収縮能の発現過程一培養による正常とジストロフィーチキン胸筋の比較

15．哺乳動物骨格筋の損傷後のHealing一〇Ver

80

85

65

11筋細胞膜における膜興奮機能の発生
高 橋 園太郎＊
研究協力者 平 野 丈 夫＊ 三 谷 昌 平＊

脱分極によってCaイオン透過性が増加して細

研

究

方

法

胞内にCaイオン流入をひき起こす機構すなわち

低温海水槽に保存してある抱卵個体を10℃に加Caチャンネルは興奮性膜の重要な成分であり，

温すると放卵する。この卵と他の個体が放精した個体発生的にみても，系統発生的にみても広い分精子海水を混合して受精をおこなっ．た。受精後は布を示している。たとえば脊椎動物成体の骨格筋

8℃の恒温槽に受精卵を入れたシャーレを入れては従来典型的なNaスパイクを発生し，殆んどCa発生させた。受精卵のうち一部は対照としてそのチャンネルはないと考えられていたが，最近の研まま発生させ，残りは第一分裂開始前にサイトカ

究によるとTTXおよびTEA存在下で電圧固定

ラシンB2′ g／m色を含有する海水に入れて飼育をおこない電流を解析すると明らかにNa電流とした。この未分裂発生胚を対照の発生卵から幼生はことなった時間経過を示すCaイオン依存性のが贈化する時点まで飼育すると細胞膜が分化して電流が見られている。もちろん，心筋・平滑筋に興奮膜となる。

おけるCaチャンネルの存在はすでに多くの報告

未受精卵および未分裂発生胚のコリオン膜は，がある。骨格筋についても発生初期の筋管細胞膜

プロネース10mg／血相を含む海水に30分以上浸しにおいてはNaスパイクとともに良い持続をもってから解剖針をもちいて除去した。この裸になっCaプラトーからなる複合電位がみられている。

た卵あるいは胚細胞を100mMSrC12，400mM

したがって興奮性膜として骨格筋細胞が分化する

NaCl，10mMKCl，5mM PIPES−Na（pH7．0），

際に，Caチャンネルの質的・量的な変化がとも10mg／／旬但BSA，2FLg／如サイトカラシソBかなっていることは充分予想できる。

らなる基準人工海水中に入れ，電圧固定法をもちこれまで我々の研究によりホヤ卵細胞に見られいて膜電流の解析をおこなった。電圧固定は通常

るCaチャンネルと初期の1細胞胚でサイトカラの二本の3MKClガラス微小電極を刺入しておこ

シソBで分裂を停止した場合に見られるCaチャ

ない，その装置については伸にすでに発表してあンネルとはことなり，後者は他の筋細胞膜などのる。

興奮性膜にみられる分化型Caチャンネルである
ことを報告し浸，2 。この発生直後に分裂を停止し研究成果およびその考察

た未分裂ホヤ発生卵における膜の分化過程を観察（1）分化型Caチャンネルと卵細胞由来のCaチ

して，卵細胞型から分化型のCaチャンネルへのャンネル

発生にともなう変化をさらに解析する ことを目的とした。

Caチャンネルはホヤ分裂停止胚において興奮性細胞型に分化したすべての割球にみられることがわかっているが，とくに分裂停止1細胞胚をも＊東京大学医学部脳研究施設神経生物学部門

ちいて，表皮細胞型分化に伴って出現するCaチ66

A EPIDERM．TYPE
lOO

Ca

lOO

Sr

lOO

Ba

三二キ「二18lOO

EGG TYPE
Ca

lOO

Sr

lOO

Ba

16炉7師7誓二亨鵬
図1表皮細胞型に分化した1細胞胚のCaチャンネルの電流劫と卵細胞にみられる
Caチャンネルの電流（Bめ比較。膜電位は記録の左側の数字（mV）で表してある。
外液は100mMのCaあるいはSrあるいはBaを含む人工海水である。

ヤンネルにつき詳細な解析をおこなった。

は筋細胞型，あるいは神経細胞型に分化した割球

表皮細胞型の割球にみられるCaチャンネルはのものと共通した性質があり，一方では卵細胞膜

二価陽イオン選択特性としてB諾うS〜㌧C諾十に見られるものとは明瞭に区別できた。そこでホを示したが，これに対して卵細胞のCaチャンネ

ヤ胚に関する限り，この表皮型のCaチャンネル

ルはS〜㌧cg㌧B諾＋となっている。また表皮型を分化型と呼ぶことにした。

のCaチャンネルでは電流の不活性化が少く，Sr12）発生に伴うイオンチャンネルの型の変化

あるいはBa溶液ではとくに電流の持続が艮かっ発生に伴って卵細胞の膜および表層にあった特た。これは図1のAに示してある。しかし，Ca

異的な分子が各割球でどのように集積，あるいは溶液中では早い不活性化がみられた。これは細胞消失するかを知ることは必要である。イオンチャ

内に流入するCaイオンによるCaチャンネルのンネルは膜に存在する特異的な機能をもつ蛋白分

不活性化といわれるもので，他の興奮性細胞，軟子であると考えられ，かつ未受精卵の表面膜にも体動物の神経節細胞，ゾウリムシなどのCaチャ

すでに存在することがわかっているので，イオンンネルでよく知られているものである。一方，卵チャンネルの発生に伴う膜での変動を解析した。

細胞のCaチャンネルは外液によらずに一様な不ホヤ卵細胞に存在したNaチャンネル・Caチャ

活性化を示し，Naチャンネルなどで知られていンネルは受精後嚢胚期にいたる初期発生時に一度る膜電位依存性の不活性化であることがわかった。

減少するが，正常胚でNa−Ca依存性の活動変位

また表皮細胞型に分化した割球のCaチャンネルが出現する時期に対応して分裂停止16細胞胚にお11筋細胞における膜興奮機能の発生

0

20

40

60

67

80hxrs

図2 分裂停止1細胞胚におけるNaチャンネル（A）およびCaチャンネル（B）のNa−
Sr人工海水中における最大電流値の変化。横軸は8℃における受精時からの発生時問。

いてもNaチャンネル・Caチャンネルの増加がいくが，分化型のCaチャンネルは媚化直前に相おこることはすでに報告してある。本研究におい当する時点（図2のB，70時間）で急激に量的にては特に分裂を抑制した1細胞胚をもらい，受精増加した。異常整流性Kチャンネルは発生中期直後から発生後期に表皮細胞型への分化が完成すにNaチャンネルとともに増加し，後期にはCaるまでの期間におけるチャンネルの膜への集積，

チャンネルの急激な量的増大と一致した増大も膜からの消失を定量的に解析した。

観察された。後期に増加するCaチャンネルと異1細胞胚においては，卵和胞由来のNaチャン

常整流性Kチャンネルは表皮細胞型分化の特徴

ネルは嚢胚期に相当する時点までに一度減少するとなることがわかった。ここで，Actinomycinが（図2のA，20時間），神経胚の初期に相当すDを加えた海水中で飼育すると分化型Caチャン

る時点より再び増加しはじめ，尾芽期からオタマネルの出現およびそれに伴う異常整流性Kチャン

ジャクシ幼生の初期に相当する時点で極大に達しネルの増加は完全に抑制されたが，Naチャンネ

たのち（図2のA，40時間），急激に減少した。

ルとそれに伴う異常整流性Kチャンネルの一過性

またこの時点でCaチャンネルを調べてみると分の増加は不変であったので，これら発生中期に変化型のチャンネルへの交替が始っていた（図3の動するチャンネルは卵細胞由来のものではないか

B，40時間）。Naチャンネルはその後消失してと考えた。事実，増加するNaチャンネルの活性

Ⅲ

68

生

理

学

l▲
1

、ニ∴∴−

．・J∴●ヽ■：■図3 マウス2細胞胚をCO2培養装置内で培養したときの，2細胞期（左上），
4細胞期（右上），8細胞期（左下），胞胚期（右下）におけるノマルスキ
ー型倒立顕微鏡像。

化の閥値は卵細胞のNaチャンネルのものと等し

精後，CO2培養装置内で2細胞胚になるまで飼く，神経細胞型に分化した割球のNaチャンネル

育した。また2細胞胚以上に発生した卵が必要なのものとは異っていた。またアカボヤをもちいた

ときは，過排卵した雌マウスを交尾させ，受精発

場合は神経胚初期に相当する時点よりCaチャン

生した卵を2細胞期にとりだし，その時点から

ネルのわずかな増加が見られたが，これは卵細胞

CO2培養装置内で飼育した。実験は発生の各時点

型のCaチャンネルであることがわかった。こので実験槽内に胚をおき，電圧固定法により解析しように膜の分化の完成に先立って，神経胚初期よた。図3は2細胞胚でとりだしたマウス胚をC（ちり，卵細胞由来のチャンネルの表面膜への再集積培養装置で飼育し，4，8細胞および胞胚となったが示唆されたが，この集積が表皮細胞型への分化

ものを示してある。

の決定と関連するものであるかは今後の問題であマウス末受精卵には我々の研究からCaチャン

る。

ネル，および50mV以上の陽性膜電位で活性化さ（3）マウス卵における卵細胞由来のイオンチャン

れる外向き整流性チャンネルが存在する。また，ネルの初期発生に伴う変化

Caチャンネルは二価イオン選択特性としてSr

典型的なモザイク卵として知られているホヤ卵＞Ca≒Baを示し，不活性化は膜電位依存性でと異なり，調節卵である哺乳動物マウス卵をもらある。この性質はマウスの内分泌細胞などでみらい，初期発生時の卵細胞由来のイオンチャンネルれるような不活性化が少く，Ba＞Sr＞Caの選の変化を調べ，ホヤ卵の場合と比較した。マウス

択特性をもつCaチャンネルとは異っていること

未受精卵は過排卵により卵管に集積したものを切を示している。したがって，マウス卵のCaチャ

り出してもちい，発生卵については試験管内で受ンネルも卵細胞型と考えられる。

11筋細胞における膜興奮桟能の発生

この卵細胞由来のCaチャンネルと外向き整流特性チャンネルは受精直後，卵核が第2減数分裂

69

ところ，分化型のCaチャンネルを出現させることに成功していない。

の中期より後期にいたる過程で，表面膜上に集積し，1．5倍ほどに密度が増加することがわかった。
その後は8細胞胚にいたるまでの過程で減少しつづけることがわかった。これはホヤ胚において，Naチャンネルが受精直後に増加して，ただちにCaチャンネルとともに嚢胚期の初期にいたるまで減少する過程と対応するものと考えられた。また，ホヤ卵における分化にともなうCaチャンネ
ル型の変化に相当するものがマウス卵で見られるかどうかを確かめるために，マウス発生卵を2細胞期あるいは，8細胞期でとりだし，サイトカラ
シンDを含む培養液で飼育した。しかし，現在の文献l）Hirano，T．and Takahashi，K．：Determination of
excitability typesinblastomeres ofthe cleavage−
arTeStedbutdifferentiatedembryoofanascidians．
J．mysiot．（Lond．）inpress．
2）Hirano，T．andTakahashi，K．：Comparisonofpro−
Perties ofCa channelsbetween thedifferentiatedl−Cell embryo and the egg ceu of ascidians・J・朗γ￡bJ．（Lond．）hpress．
3）Hirano，T．and Takal1aShi，K．：Development ofCalcium channelsinthemembraneofthecleavage−arrestedembryoExc如bte CuLi．

ofascidians．

T7zemysiotogyof

Edit．A．Grinnel＆W．Moody．

Alan二R．Liss，lnc．，N．Y．，279−289（1983）．

70

12 培養骨格筋における膜興奮性の変化
加 濃 正 明＊細胞が分化するということは，細胞の特異性のオンチャンネルの変化を探ることは筋細胞の分化獲得であり，他の形質は発現されなくなることでを理解する上に重要なことであると考えられる。

ある。これは具体的にはその特異性に対応する蛋

ニワトリ骨格筋の場合，その成熟過程において，白を選択的に合成し，その他の蛋白の合成を停止

先づCaチャンネルが発達してその密度が増加し，することである。細胞の分化につれて，このよう遅れてNaチャンネルが発達してその密度が増加

な蛋白の分子種に変化が起るということは，同じする。その後の筋細胞成熟につれて，Naチャン

ような機能を担うと考えられる蛋白においてもみ

ネルの増加は進む一方，Caチャンネルは次第に減られ，たとえば収縮蛋白などでよく調べられてい少してゆく4こ細胞成熟に伴う同じようなイオンチ

る。

ャンネルの変化はその他の種々の細胞でみられて筋細胞の特異性の一つとして細胞膜の電気興奮いる2㌔性が挙げられるが，この興奮性は筋細胞で合成さニワトリ胚由来細胞培養骨格筋の成熟過程におれ，筋細胞膜に組み込まれたイオンチャンネル蛋

いて，Naチャンネルが発達して次第にその密度白の作用によるものであり，この蛋白も筋細胞のが増加してゆくこと，この発達に対して促進的効

分化の過程で変化していることが考えられる。

果を有する物質がニワトリ神経組織抽出液中に存

無機イオンを選択的に透過させるイオンチャン

在すること，この物質は蛋白であり，神経網胞のネルは．伝導する活動電位を起すことによって情筋細胞に対する栄養効果を担う栄養物質であると報伝播の役割を果しているが，その他に，種々の考えられること，などNaチャンネルの発達につ細胞機能に重要な役割を果していることが示唆さいては昨年度までの報告書において示してきた。

れている1）。特にCaチャンネルは，それを通っ本年度は特に筋細胞成熟に伴うCaチャンネルのて細胞内に流入したCaイオンによって，種々の変化を同じ培養筋について調べ，それに対する神細胞機能の調節に役立っていることが知られてお経組織由来物質の効果を解析したので報告する。

り，たとえば神経細胞における伝達物質の放出，筋細胞における収縮の発現などを挙げることがで
きる1）。

材料と

方法

細胞培養の方法は昭和53年度研究報告書に述べ発生過程にある筋細胞でも種々のイオンチャン

た通りである。すなわち，嫡卵11日目のニワトリ

ネルの存在が報告されており2：当然その時期の筋

胚の胸筋から筋芽細胞を分離し，これをコラーゲ細胞の機能に役立っていることが考えられ，さらン塗布したプラスチック培養皿に単層培養して筋に筋細胞の分化の制御にも重要な役割を果してい細胞を形成させる。用いた培養液は，イーグルのるものと考えられる3ここの意味で筋発生に伴うイ

合成培養液にウマ血清（10％），ニワトリ月封由出液（5％）を加えたものである。ニワトリ胚抽出液＊北里大学医学部生理は照卵10日目のニワトリ胚を用い，2倍量のタイ12 培養骨格筋における膜興奮性の変化

71●；▲．∴．
第1図 ニワトリ胚由来の細胞培養骨格筋の活動電位に対するCo2＋の効果
神経組織由来物質を含まない培養液を用いての培養4日日の筋菅。Ba塩類溶液中での記軌
通流電極より定電流を通流して膜電位を予め−80mVに移動させてイオンチャンネルの不活性化を除いた状態にした後，同じ通流電極により脱分極性のパルス電流を通流して刺激した。A
とBは同じ細胞からのもので，AはCo2＋（20mM）を加える前，Bは加えた後のもので活動電位の遮断が起こっている。活動電位は速い掃引速度（第2トレース）と遅い掃引速度（第4トレース）で示してある。第1トレースは速い掃引速度による通流電流記録であり，第3トレー
スはやはり速い掃引速度による膜電位変化の微分波形で，活動電位の立上り速度を示す。点線
は第2トレースに対する0電位を示す。

ロイド液と共にホモジナイズした後遠沈して得らの組成は次の通りである。酢酸バリウム，50．OmMれる上活であるが，ニワトリ胚全体からの抽出液；酢酸カリウム，2．7mM；酢酸マグネシウム10．Oと脳および背髄を除いた胚からの抽出液の2種類

mM；庶楓111．6mM；トリス緩衝液（マレインを調製し，前者は神経組織由来物質を含む培養液

酸でpH＝7．4に調節），10．OmM。すなわち通常のに，後者はそれを含まない培養液に用いられた。

塩類溶液中のNd＋，Ca2十を Ba2十で置換し，神経組織由来物質を含まない培養液での培養のC1−をCH3CO0−で置換したものである。Ba2＋場合は，筋細胞の形態発生が多少遅れるが，いづはCaチャンネルを通って活動電位を発生するこれにしても培養2〜4日の間に細胞融合が盛んにとができる他に，Kチャンネルを遮断するという行なわれて筋管が形成され，培養5日目から7日作用がある。この塩類溶液を用いることによって，目になると，明瞭な横紋を呈する形態的に成熟しNaチャンネルの作用による活動電位を除き，また骨格筋細胞が出現してくる。

たKチャンネル，Clチャンネルを通る電流によ

4日から14日の培養を用いその中から直径20／上mる再分極作用を抑制でき，Caチャンネルの作用に以上の筋管または筋細胞を選んで，Caチャンネル

よる活動電位を選択的に顕著に発生させることがの作用による活動電位を調べた。

できる。

培養液を塩類溶液に置換したのち，倒立顕微鏡

Caチャンネルの発達程度の指標としてCaチャ

下で1本の細胞に2本のガラス管微小電極をお互

ンネルの作用による活動電位の最大立上り速度をいに近づけて挿入し，一方で通流を行い，他方で測定した。これは活動電位発生に際してCaチャ

膜電位の導出を行った。通流に剛、た電極は酢酸

ンネルを通るイオンによる電流を示しており，細カリウムを充したものである。

胞膜におけるCaチャンネルの密度すなわち発達

この実験で用いた塩類溶液はBa塩類溶硬でその程度を反映している。

皿

72

生

理

学

B

．
．
．
．
−
仙

4

6

8

10

12

14

4

6

8

10

12

14
days

days

第2図 ニワトリ胚由来の細胞培養骨格筋におけるCaチャンネル活動電位の最大立上り
速度の変化。
Aは神経細粒由来物質を含む培養液を用いての培養の場合，Bはそれを含まない培養液での培養の場合である。
●印は成分Ⅰの最大立上り速度，○印は成分Ⅱのそれである。

結果

消失するが，閉膜電位の高い（−10mV位）方の

図1，Aは培養4日目の筋管から得られた活動

第Ⅱ成分は條件脱分極による不活性化がゆっくり

電位の一例である。この時期の筋管の活動電位はで数秒の経過を要し，また完全に不活性化するにこの例でみられるように二段階に上昇してオーバ

はOmV近くまで脱分極する必要がある。この両ーシュートし，また持続時間の非常に長いプラト

成分ともに，Caチャンネルの遮断剤であるCD2十ー型のものである？閲膜電位の異なる2つの成分からなることがわかる。この中低い閉膜電位（−45

やD600で遮断され（図1，B），Caチャンネルのmv位）で発生する第Ⅰ成分は−50mV位り候件

このようなCaチャンネルの作用による活動電脱分極によって速やかに，完全に不活性化されて位は，培養日数が進み，細胞が成熟するにつれて作用による活動電位であることが確かめられた。

73

12 培養骨格筋における膜興奮性の変化

次第に起こりにくくなる傾向がみられ・特に成分

おり，CaチャンネルからNaチャンネルへの交替

Ⅰが速やかに消失してゆき，全体としてCaチャが起こって興奮性膜が分化してゆくと考えられる0

ンネルの密度が減少していると考えられる0

筋細胞膜におけるイオンチャンネルの分化に対筋細胞成熟に伴う2つの型のCaチャンネルのして神経支配が重要な役割を果していることが考密度の変化をみるために，活動電位のそれぞれのえられる。Naチャンネルの発達に対して促進的成分の最大立上り速度（図1，第3トレース）をに作用する蛋白が神経組織抽出液中に存在すると培養日数を追って測定した（図2）0

いう昨年度までの成績から，支配神経は栄養物質

図2，Aは神経組織由来物質を含む培養液を用を介してイオンチャンネルの分化に影響している

いた培養についてのものである。成分Ⅰの最大立ことが示唆されているが，Caチャンネルに対して

上り速度は培養4日以後速やかに減少し，培養2は特に成分Ⅱの減少に対して影響していると考え

週日では殆ど0V／secにまでなってしまう0成分られる。

Ⅱのそれも0V丞ecまでにほならないがやはり減成熟過程におけるCaおよびNaチャンネルの変化は分化しつつあるホヤ卵において詳細に解析

少してゆくことがわかる。
神経組織由来物質を含まない培養液で培養したされており77特にC。チャンネルは分化そのもの

場合は（図2，B），成分Ⅰの最大立上り速度の値に重要な影響をもっていることが示されている3）0と，その減少の経過は神経組織由来物質を含む培文養の場合と大差はないが，成分Ⅱの最大立上り速度は，培養日数と共に減少することは確かである
が，培養の全経過にわたって，神経組織由来物質を含む培養の場合に比して大きな値を示している0
考察

幼君なニワトリ骨格筋細胞膜にはCaチャンネ
ルが発達しており，これは成熟するにつれて次第に減少してゆくことが確かめられた0こめCaチ
ャンネルにも，閉膜電位，不活性化の膜電位などの異なる二型がみとめられた。成熟過程にあるニヮトリ骨格筋において正常タイロイド液中で記録

1）Hagiwara，S・＆Byerly，L・：（1981）Calciumchannel・
AmLR卯．〃e〝0∫ごま，4：69・125．
2）Spitzer，N・C・：（1979）Ionchannelsindevelopment・A〃几如γ．〟e〟mJdり2：363・397．
3）Takal1aShi，K・＆Yoshii，M・：（1978）Effectsof
internalfreecalciumuponthesodiumandcalcium
channelsin the tunicate egganalysedbythein−temalperfusiontechnique・J・Lnysiot・・279：519−
549．
4）Kano，M・：（1975）Developmentofexcitabilityin
embryonic chick skeletalmuscle cells・J・αtL
上竹γ∫わJり86：503−510・5）Kano，M・＆Shimada，Y・：（1973）Tetrodotoxin−
resistant electricactivityinchickskeletalmuscle
cells differentiatedinvitro・J・αtt・PhysEoL・81‥
6）Kano，M・＆Yamamoto，M・：（1977）Developmentof
spikepotentialsind

される持続の長いプラト電位4・5）の発生にこれらのC。チャンネルが関与しているものと考えられる。
これらCaチャンネルの減少と期を同じくして
Naチャンネルは増加してゆく6）ことがみられて

献

eletalmusclecellsdifferen−

tiatedinvitrofromchickembryo・J・CbtLmysioL・
90：439−444．
7）Takal1aShi，K・＆Yoshii，M・：（1981）Developmentof
sodium，CalCium and potassiumchannelsin thecleavage−arreStedembryoofanascidian・JLnysioL・
315：515・529，

74

13

幼生アフリカツメガエル腸骨排骨筋の収縮系と筋小胞体遠 藤

寅＊研究協力者 堀 内 桂 輔＊

成長した両生頬の骨格筋には遅筋線経と速筋線

筋肉はCrィォンだけでなくSrィォンによっ経の2種類が存在する。筋線経のこのふたつの分ても収縮するが，成体アフリカツメガェルの遅筋化型の性質の違いを，アフリカツメガェルの腸骨線経と速筋線維とではそのSr感受性が著しく異俳骨筋から得た単一筋線経のスキンドファイバーなり，遅筋線経のSr感受性は速筋線経よりも約標本を用いてこれまで研究してき長，2 。今回はそ30倍高いご したがって，このSr感受性を用いて速の研究結果を基礎として，変態期の幼若アフリカ

筋線経と遅筋線維とを区別することが可能である。

ツメガェルの腸骨誹骨筋の性質について調べた。

図1は，前肢の無い後肢のみの出現した，変態

その結果，この筋肉を構成する筋線経の大部分は，期のなかでも比較的はやい時期のオタマジャクシ

成体における速筋線経とよく似たものであることから得た腸骨排骨筋を全筋で実験したときの張力が判った。

記録の一部である。筋の太さは約0．2m，長さは約2mで，サポニン300〃g／／ん8・30分の処理によ実 験 方 法既に成体アフリカツメガェルの実験で用いたのってスキンドファイバー標本とした。下段は，Sr
ィォン濃度を10朝Mから10Mまで低濃度側かと基本的には同じ方法を用いた。ただし，今回ら順に，間で一旦Srイオン濃度を下げることなの実験の材料として用いた変態期のアフリカツメ

く累積的に適用したときに発生する張力を記録しガェル（すなわちアフリカツメガエルのオタマジたものである。16￣5・9Mでもはっきりとした張力発ャクシ）の後肢はきわめて小さく，その腸骨誹骨生がみとめられるが，それは16・5・3Mあたりまでで筋は太さ数百ミクロン，良さ数ミリメートルであ一旦飽和し，1J5 OMから再び張力が大きくなりはった。小さいために，そこから単一筋線維標本をじめ，lJ4・4Mでそれが完全に飽和するという，2得ることはきわめて困難であったが，その反面筋

相性の張力発生が観察された。同じ実験を2匹の肉全体を用いても，界面活性剤による処理で細胞

オタマジャクシの4つの筋肉で繰返したときの結膜を破壊すればそのままスキンドファイバー標本

果を図2にまとめた。

として実験に用いることが可能であった。

図2は，●印でオタマジャクシの腸骨俳骨筋全筋のSrイオン濃度一張力関係を表わしているが，結果 と 考察

×印と＋印は成体における遅筋線経と速筋線経の1．幼若アフリカツメガェルの腸骨脚骨筋のSr

単一筋線維スキンドファイバーでの濃度一張力関

感受性係を示している。オタマジャクシの全筋でのデータは確かに2相性で，1J5M以上の高濃度領域で＊東京大学・医学部・薬理学第二講座

は成体速筋線経のデータときわめてよく一致し，

13 幼生アフリカツメガエル腸骨筋の収縮系と筋小胞体

甘
CalO

ー4．7

‖了ofibularis m．W3YO88（2）＿」ぺ＿トsr10−5・3

5．6

srl0−5・9

5．3

5．0

4．7

4．43．84．1

PH7・0・0。C，0・20恥Mg十十1，MgATP7，【GTA20，PIP【S20．
図1サポニン処理した，幼若アフリかノメガェル腸骨俳骨筋全筋を各種濃度のS汁イオンで活性化したときの張力の記録，校正：横軸1分，縦軸25mg垂。

／

暮

震ア◎二〇

t．（adult）

S．
O

UO領∪むl む＞；jUJ

S10Wt●（adultγ．／●

tadpoleiliotibularis

10￣6

10￣5

Sr◆◆ion

10￣4M

concentration

図2 サポニン処理した，幼若アフリカツメガェル腸骨排骨筋全筋におけるSJ十
イオン濃度一張力関係（●）。＋と×は，それぞれ成体の遅筋緑経と速筋
緑維とでの濃度一張力関係で，いずれも単一筋緑維標本のスキンドファイ
バー（各2本）で得られたもの。張力は，充分に高い濃度のSPで発生する最大の張力で基準化して相対値として表わした。シンボルとそれに付けた誤差線は何回かの測定の平均とその標準誤差（S．E．M．）である。

75

76

Ⅲ

理

生

学

一万10￣5M以下の低濃度領域では成体遅筋線経のしらべたところS凸6−5・3Mによる張力は，Ca≠データを張力軸方向に縮小した形によく似ている。

1J4■7Mによる最大張力の3〜9％であった。成体

すなわち，このオタマジャクシ全筋でのデータは，

速筋線経と遅筋線経は単位断面積当りはぼ同程度

この筋肉が少しの遅筋線経と多くの速筋線維とでの最大張力を発生し，かつその最大張力はCa廿イ構成されていると考えるとよく説明できるものでオンとSr什イオンとでほぼ同じである。したがっある。

て前述の仮説がもし正しいとすると，少ないと述

成体速筋線経は全く収縮しないが遅筋線経ははべた遅筋線経のその量は，断面積にしてもその程ば完全に収縮する濃度である1㌔■3MのSr♯ィォン

度，すなわち数パーセントであろうと思われる。

をオクマジャクシの全筋に適用したときに発生すこの数パーセントという量は，組織化学的に切る張力がC謹イオン（1す4・7M）による最大張力の何片標本を用いて測定した成体腸骨排骨筋での遅筋パーセントに当るかを図1上段のようにして調べ線経の量（藤田，堀内，未発表）とオーダーは一た。3匹のオタマジャクシの5つの腸骨俳骨筋で致する。しかし，尾のなくなり始めた，あるいはFast fibers

寸

S．O

竿Oも︑戊㌘﹁○ ︻N．〇∝S u押切u羞巾∈巴LS

こ！芸豊
SLow fibers

﹁○

0

1

2

3

4

5min

Exposure to Ca4・6R

図3 成体アフリカツメガェルの筋線経の別、胞体に対するカフェインとAMPの作用。上段：速筋緑経，下段：遅筋緑経。「R」は対照「＋Caf50」は50mMのカフェインの存在下，「＋AMP25」は25mMのAMPの存在下での結果。詳細は本文を参照。

13幼生アフリカツメガエル腸骨筋の収縮系と筋小胞体

77

ほとんど無くなったオクマジャクシ，すなわち変経と遅筋線維とで少し性質を異にすることがこれ態期のなかでも比較的おそい時期のオクマジャク

までに判明している。図3に示したのは「Caにシ3匹から得た6つの腸骨郡骨筋で実験を行なっ

よるSr遊離」に関するデータであるが，これはたところ，S√←1JS・3Mで発生する張力はC云汁に「CaによるCa遊離」とほとんど同じ性質を示よる最大張力の1・1±0・6（mean±S．D．，n＝6）している。すなわち，′ト胞体に1J5 OMのS拍姪％で，前述の変態期早期で得た値6．0±3．3（n＝5）

1〜2分間Srを取込ませたあと，ATPを含ま％よりも少し小さい値を示した。・したがって，成ない164＆MのCr液に浸漬し，小胞体内Sr量長とともに，全筋に占める遅筋線経の相対員はしの経時変化を調べたものであるが，ATPが存在

だいに減少するという可能性がある。しかし，筋しない環境では，C㌔ィォンが充分にあっても，肉の大きさが実ると種々の物質の拡散速度が実る′ト胞体からのSrの遊離はきわめて起りにくく，など，実験方法の上でかなりの問題もあるので結′J、胞体中のSrの減少の時間経過は遅い。しかし，論を下すには今後もっと詳細な研究が必要である。

AMPやカフェインの存在下ではこの164・6Mのいずれにせよ，変態期のアフリカツメガエルのC占什液によるSr遊離作用が起こり易くなり，Sr

腸骨誹骨筋は，そのほとんどが，Sr感受性の低減少の時間経過が速くなる。このカフェインの効い，成体の速筋線経によく似た筋線経で構成され果が速筋線経と遅筋線維とで実り，ATPやAMPていることが判ったので，次にその筋小胞体の性等のアデニンヌクレオチドの存在しない環境では，遅質について調べた。

筋線経においてカフェイン劾果はきわめて発現しに

2．幼若アフリカツメガェルの筋小胞体の性質

くい。（ただしアデニンヌクレオチド存在下ではカ筋′ト胞体からのCa遊離のメカニズムのひとつ

フェイン効果は遅筋線経においても強く発現する。）

である「CaによるCa遊離」は，成体の速筋繰

そこで，今回は幼若アフリカツメガエルの腸骨

ml n

SeC

￣T

i

ca小一がM，30sec T什寸
l…

2mjn

十一十卜

i

■■Hn

8mjn

JMin

J

H一一

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1−−

Jこ
11

rて

−一一八

十一‥十十

丁し

二：￣二二

4。C，PH7几＝7M，Mg＋＋1帆MgATP州
図4

幼若アフリカツメガエル腸骨俳骨筋から得た細い筋束における，Ca取込
み機能の検出。標本は15粕／加のサポニンで20分間処理してある。これを10 MのC計液に1〜8分浸潰してよく洗浄したのち，EGTA2mM
中で25mMのカフェインをこれに適用した。C詔夜への浸潰時間とともに拘楯が大きくなるのが観察される。−

Ⅲ

78

生

理

学

誹骨筋の筋線経の′ト胞体の「CaによるCa遊離」

む液に標本を適当時間浸すと，そのあとで，／ト胞に対するカフェインの効果を調べてみた。実験は，体からCaを放出させるとして知られているカフ

後肢のみでなく前肢も出現しているが，尾はまだェインを適用したときに拘縞が生じ，その大きさ

ほとんど短くなっていないオタマジャクシの腸骨はC計液に浸す時間の良さとともに増大した。

誹骨筋から得た細い筋線経の束を用いて2回行な

C計液に充分浸した後のカフェイン拘綿の大きさった。結果はいずれも同様であった。

は，EGTA2mM存在下にカフェインを適用し

図4は，太さ90四花良さ約1mmの筋束で得た記た場合でも，この標本の発生し得る最大張力には録の一部である。図には示さないが，SnJ5●3M

ぼ達するものであったので，このオタマジャクシ

ではほとんど張力を発生しなかったので，この筋の筋線経にもかなりのCa取込み能力があると結束を構成する筋線経はほとんどすべてSr感受性論できる。

の低い筋線維であると判別される。サポニン15／Jg

このような標本を用いて「CaによるCa遊離」／肌色で20分間処理するという方法によって細胞膜の実験を行った実験の結果を図5に示す。結論をのみを破壊し小胞体は保存しようと試みたところ，

先にすると，この筋線維束はその中胞体の性質に

この図に示すように，小胞体のCa取込みの機能

おいても成体の速筋線経に似て，ATPの存在しを検出できた。

ない環境においてもカフェインが強く「Caによる
Ca遊離」を促進した。

すなわち，ATPと166AMのC㌔イオンとを含
両nSeC▼▼T［17▼▼▼1「tT▼†●tT¶TMl■I■

Control

．

＝

J、＼＼」

Controli H「T1−（ri90r）

ca◆＋10−4・6M
Z min

ca十十10−4・6M

Caffeine

5011M

1−h→丁十￣11−

1

㌦

‥十一

‥

1− − −」＼＼」JLca◆◆10−4・6M
AMP 25打刊−「．・．・「、†√一丁￣11−・トー一・一一

ca十十10−4・6M
2mjn

T＿→一十←1♪、一Control（rlgor）＿

十→「．」＼−
b3Y29C：40C．pH7．0．0．17M

図5

幼若アプリかノメガエル腸骨誹骨筋から得た細い筋束における「CaによるCa遊離」のメカニズムの性質。カフェインもAMPと同様に「CaによるCa遊離」を起こり易くした。詳細は本文を参照。

79

13 幼生アフリカツメガエル陽骨筋の収縮系と筋小胞体

この図の上のふたっの記録は対照で，小胞体にいるので，小胞体内に残存するCaが少なくなっ

Caを取込ませたあと何もしないでそのままカフた，すなわちCa遊離が起こったことが判る。

ェインで／ト胞体内のCaを放出させて拘鮪を起こ（註：ここには示していないが，C計イオンがほしたものである。3段目は，Caを取込ませた後とんど存在しない条件下で同様にカフェインや

カフェインを適用する前に，無ATP環境下で高AMPを適用しても，Ca遊離はほとんど起こら

濃度のC計（灯4・6M）の液を2分間適用したものない（前報）のでカフェインやAMPは「Caによであるが，そのあとに起こしたATP存在下でのるCa遊離」を起こり易くしたと考えられる。）

カフェイン拘綿の大きさにほとんど変化がないのしたがって，幼若アフリカツメガェルの脇骨俳で，′ト胞体内のCa量にほとんど変イ出iなかった，

骨筋の大部分を構成しているSr感受性の低い，つまり「CaによるCa遊離」はほとんど起こらな

成体の速筋線経によく似た筋線経においては，筋かったと考えられる。（実際の拘柿の大きさはす

小胞体の「CaによるCa遊離」のメカニズムの薬

こし小さくなっているが，これは一番あとの対照

理学的性質も，成体の速筋線椎のそれとよく似ての記録から明らかなように，大部分は標本の劣化いるようである。

のためである。）それに対して，4段目と5段目
は，ATP無しでもカフェイン（50mM）やAMP（25mM）の存在する環境で同様にCaを2分間適用したときの記録であるが，後でおこしたATP存在下でのカフェイン拘桁がかなり小さくなって文

献1）遠藤実はか：筋の発生と分化に関する基礎的研究，
昭和56年度報告書，69〜75，1982・
2）同．昭和57年度報告書，80〜87，1983・

80

14

筋収縮能の発現過程一培養による正常とジ
ストロフィーチキン胸筋の比較

堀 田

健＊

研究協力者 大 羽 利 治＊ 高 木 由美子＊

私共は鶏胚胸部からとり出した筋芽細胞を培養とって閥値，収縮高，スピードなどを計測した。

した標本についてその成長過程を電気生理的・形連続写真は毎秒3枚で，閥値は収縮の認められる

態的に追跡して構造と機能の発達ならびに正常と最小カルシウム濃度（Sensitivity），収縮高は培

ジストロイ一筋のちがいを研究してきた。今回は養10日目の試料のpCa5．5のときを1としての比

前回の報告1）と同じ材料を用いてSkinnedfiber較値，スピードは収縮が最大の90％に達するまでとし，その収縮能力の発現と発達をとらえ，電気の秒の逆数であらわした。これらはいずれも大暑的，形態的な観察との関連を考察した。

の値であり，こゝに用いた方法では再現性のある
定量的な値は得られなかった。電気刺激による収材料及び方法縮及びカフェイン拘桁については写真で追跡出来

ジストロフィー（NH413）及びコントロール

なかったので，顕微鏡下で収縮のみられた場合を（412）鶏の受精卵を37℃で11〜12日間酵化して＋，みられなかった場合を一としてあらわした。

得た鶏胚の胸部からとり出した筋芽細胞を95％
air L5％CO2，37℃で培養を開始し，2日から結果14日間にわたって形態，膜電位，電流，収縮性お培養細胞の発育過程：植付けられた筋芽細胞はよびSkinnedfiberの収縮，カルシウム感受性な培地中で急速に筋管形成をはじめ，細胞内ではどを観察した。

myofilamentの形成がすすみ，電頗観察によれば膜電流の測定は前に報告した2）ものを改良し，thin filamentsがside−by−Sideに配列しはじ3本の微小電極を用い膜電位を−70mvに固定しめていることが2日間培養の試料でみとめられた。

て脱分極パルスを与えて行った。同時に収縮を観ジストロフィーでも大体同様の経過をたどったが察した。測定はカルシウム5mMを含むGinsbo−

正常に比して若干filament の構造が不揃いで出

rg液中37℃で行った。

現がおくれている細胞が多くあった。横紋構造は筋細胞のSkinningはrelax solution（K−

培養開始後4〜5日であらわれはじめ，8日日ご

propionate，150mM：ATP，5mM；MgCl2，

ろにはすべての繰経にみられるようになった。こ

1mM：EGTA，4mM；CaC12．0．3mM；pH，のときの政和構造はthickとthinfilamentが規7．0）中で0．25％Brij15分間処理によった。

則正しくならび，Z帯がはっきりと認められ，ほ収縮は一定濃度のカルシウムを含んだ液（actト

ぼ完成した細胞となるが′ト胞体やtriadの形成はvating solution）と交換し，反応を連続写真に10日日ごろまでははっきりしない。SRは恐らく細胞構造のなかで一番おそく出現するのではない＊名古屋市立大学医学部第1生理学教室

かと思われる。ジストロフィー筋の場合，正常と14 筋収縮能の発現過程一培養による正常とジストロフィーチキン胸筋の比較

81

第1蓑 培養過程の各ステージにおける形態的・電気生理的及び力学機能の獲得の概要。
13

14

cultはionO1

15

2

16

3

17

4

19

18

5

6

7

20

21

22

8

9

10

23

24

1112
days

explantationmic，。SC。，，f宝飯ubbs（S，。。tam。。，C。霊静striation
microscopy fiLaments f aments。。崇Yi吉弘， sR慧悪霊
light

Striation

Eleclronthin

ニ慧貴。eト叫 10
POlential
membrane
CUrrent

32

−12

−45

45

53

〜55

57

55

−70￣73NORMAL

612士3．1〜70DYSTR・6a7士51

inward（TTX・SenSitive）

10ms

fiber

40
〜52

霊霊路二二＝＝＞忠霊慧CaH．
⊂0ntraCtion2α¶Melect．一SkinnedLlrregU ar

thick

一

十

十

十

＋Ca．slow

Slowcontradion
飲termlca▲●

＋

士

ン

＋

CaIast士十十＋lnCreaSe oH：asenS仙ily

COntaCtionspeed＆extent

かわらない内部構造の細胞が大部分であったがな

ルシウムの利用が可能になると思われる。カフェ

かには全く微細構造のないものや，不規則な配列

イン20mMを含む液に試料を浸すと拘綿がみとめなどのものもあった。

られるようになるのは10日日以降のものに限られ膜電流と収縮：筋管が形成されるとすぐに微小電極の刺人が可能になるが，その時点での膜電位ていた。SRのカルシウムとりこみ機能が発現するのはこのころであろうと思われる。

はひくい（表1）。通電によってゆっくりした収縮

Skinned fiberによる実験：筋管が形成され，があらわれ，長い経過の膜電流が記録される（図

細胞内部にフィラメント様の構造物があらわれは1）。これはmediumからカルシウムを除くと消じめる2日間培養標本でもskinningが可能であえ，収縮も消失するのでカルシウム電流であるとる。この標品にカルシウムを与えれば僅かながら考えられる。ストロンチウムの存在下でも同じよ収縮する。成長につれて収縮高，スピードも上昇

うな電流と収縮反応かみとめられる。この時期（発する。図2は3日，5日，10日間培養した筋につ生初期）には膜にカルシウムチャネルが出現していての他緩及び収縮状態の位相差顕微鏡写真であいると思われる。培養日数がたつにつれてこのカる。これらの計測から得られた結果をまとめて模ルシウム電流は小さくなり消失してしまう。かわ

式的に示すと図3のようになる。

りに速い経過の内向き電流があらわれはじめる。

（a）カルシウム感受性，種々のカルシウム濃度の図1に示すようにこれはTTXでブロックされ，activating solution（pCa7・0・6・7・6・5，6・2，

収縮もないのでN㌔電流であり，Na＋チャネル

6．0，5．5）を与えたとき，収縮の認められる最低が発達したことを示すものである。このときの収のカルシウム濃度と培養日数をプロットしたもの

縮ははやくなり，カルシウムを含まない液中でもが図3仏）で経時和子カルシウム感受性の増大が認収縮するので，この時期では内部ストアからのカめられる。（b）収縮高，同濃度のカルシウムに対す

Ⅲ

82

2

生

理

学

10DAYSDAYS

CONTRACTION

CURRENTCONTRACTION

NOR．G］NSBORG■NOR．GlNSBORGへ」1n￣7A士V「0−7A＋＋Ca†ree

Ci

什ee

巨

十十

Sr

ト 士
′【＼ノ【

50m sEC

50m SEC

第1図 培養開始後2日及び10日後のサンプルについての膜電流及び収縮。
固定電位−70mV．Ginsborg solutionはカルシウム5mMを含む。

Sr；10mM，′ITX：1／tM

るレスポンスは培養日数の多いものはど大きいが筋管が形成され，同時に内部には収縮蛋白のフィ

2日間のものでも収縮する。（C）収縮速度，溶液のラメントが観察されるようになる。このとき電気

pCaを7．3から5．5にかえた場合の各ステージの刺激を与えると液中にカルシウムが含まれていれ収縮の速さを時間の逆数であらわすと（C）のようにば顕微鏡下でゆっくりながら収縮がみられる。こなる。rdIカフェイン抱縮，カフェインによる収縮のことは膜に電位依存性のカルシウムチャネルがはintact fiberと異りskinned にした場合殆ん作られており，又収縮蛋白も能力をもちはじめて

どみられず，10日以降の標品にわずかにみとめらいることを示すものである。細胞膜にはその後れたに過ぎない。これはBrij処理がSRの膜を

Na＋チャネルの形成がはじまり，内部膜の発達に破壊したためであろう。

ともなって外液カルシウムに依存しない収縮が可能となる。そのころには収縮蛋白もその能力をま考察

鶏胚からとり出した筋芽細胞は2日間の培養でし，カルシウム感受性を獲得して速い収縮に適したものとなる。Na＋チャネルの発達，内部膜系の

14

3days

筋収縮能の発現過程一培養による正常とジストロフィーチキン胸筋の比較

83

10daYS

5days

PCa

7

before skinning rel．pCa 7．3

afterskinning rel．contractedpCa6．0

鮮二二二＝工やTT￣T遥訝鱒鱒

COntraCted pCa6．O reL．pca73

粕

第2図 Skinned fiberの収縮。
培養開始後3日，5日，10日の試料についての測定。Mediumをかえてから収縮，弛緩が完了したのちの撮影。通常1分〜2分後。

文形成と収縮速度の増大は平行しておこっていると献考えられる。然しながらカフェイン拘綿が10日間

1）堀田健，大羽利治，山本まり子：骨格筋の発達過培養以後にのみ認められるということは，SRの程の機能的．形態的追跡，筋の発生と分化に関する

カルシウムストアとしての機能の発現が他の能力よりも一番おそいのではないかと思われる。植付基礎的研究 昭和57年度報告書59−63（1983）
2）堀田健．大羽利治，越田信，西原己栄子，小鹿幸
正：ジストロフィー筋の生理学的研究，筋ジストロ

けから発達の概要を表1に掲げた。正常とジスト

フィーの基礎的研究 昭和53年度報告書52−58

ロフィー筋の間には，定量的に論議出来るような（1979）

際立った差異はなかったが，表1にあるようにジ
ストロフィー筋ではT−SyStemの配列がみだれていたこと，静止電位が低いことなどがあげられ
る。

Ⅲ

84

Ca SEHSITIVITY（THRESHOLOI

生

理

学

Ca CO：JCEtJTRATlm DEPENDErICE
X／pCa5．5

2

q

6

8

1012

DAYS

7

6．5

6

5・5PCaCONTRACT10N SPEEDCAFFEINE

ノ

CONTRACTL！REl／sEC pCa7．3う・よす

X／MAX

／
2

q

第3図

6

81012

DAYS

2

q

6

8

ユ0128AYS

Skinned fiberの収縮。
A：カルシウム感受性 B：カルシウム濃度依存性 C：収縮速度
D：カフェイン拘桁の発現

85

15

晴乳動物骨格筋の損傷後のHealing−0Ver

栗

山

研究協力者

緒

輿
古

口

心筋では機械的損傷により生じた損傷電位は数分以内に消失する。この現象はhealing−OVerとし川

研一郎の比抵抗（Ri）は131凸。止し震 無限ケーブルによると電気緊張電位（Ⅴ）の拡がりは，
Ⅴ＝ⅠⅠ。J手㌃音exp（一∬／A）てよく知られており，この発生機序は境界膜特に………E9mネクサスの抵抗の増大によると考えられている。

となる。（Ⅰ。；全電流，γの；膜抵抗，γ ；内部抵抗，

一方骨格筋ではこの損傷電位は長く持続し，hea卜ェ；電極間の距離，A；空間定数）。筋が切断された

ing−OVer現象は発現しないと考えられてきた0
しかし，近年になり一部骨格筋（カエルの縫工筋，時は一方端が有限の半無限長ケーブルの理論を用

モルモットの挙等筋）で損傷電位が消失するとい場合は切断端では（従って∬は負），う報告や，哺乳動物のCutmuSCleの性質はintact

いた。すなわち切断端が電気的に短絡されている

V＝√完了JI。eXp（一L／A）sinh（（L＋XVl）

muscle変わらないという報告など，骨格筋にも………E9（2）healing−OVerの存在を示唆する報告が散見されとなる（L；刺激電極から断端までの距離）。

る。そこで今回私達は哺乳動物の骨格筋にhealing−

切断端が膜で閉じている（seal）場合は，

0Ver現象が存在するか否か電気生理学的手法を

V＝√右手￣I。eXp（，L／A）cosh（（L十XVl）

用いて研究した。そして筋の切断端における電気………E9（3）的性状をケーブル理論で解析し，さらにhealing−となる。筋線経が切断された時，いずれのモデル

0Verが挙等筋に特異的なものか否かを他の骨格筋とよく一致するかを検討した。

と比較検討した。
結

果

実験と方法

挙等筋の静止膜電位は一73．6±2．OmV（n＝42），

体重300〜4009の雄のモルモットを断頭致死後

半径24．6±3．8〟．m（几＝28），入力抵抗462±147

挙等筋を摘出した。挙睾筋と比較するために長址Krl．Al．21±0．19mm，時定数2．8±0．7msec，

伸筋（EDL）および横隔膜を使用した。標本は膜の比抵抗（Rm）1660±523ncⅡ戸，そして膜のKrebs液で濯流し，温度は31〜32℃，pHは7．2

比容量（cm）1．7±0．4JLF／cm2であった。

−7．4に維持した。筋線経は銀微鏡下に小刀で切断した。

挙等筋を切断すると切断端より1mmのところでは膜は約5分後に最大の脱分極となり，その後膜の電気的受動的性質は2本の微小電極を用い徐々に回復し60分後には元のレベルまで回復した。

たsquarepulseanalysisにより求めた。細胞内液

この脱分極の程度と膜電位の回復の速度は距離により多少の差がみられた。そこで切断瑞より1mm＊九州大学医学部薬理学教室のところで最大の脱分極より毎まで回復するのに

86

m 生

要した時間をT悠とし，回復の速度のパラメータ

理学

膜電位の回復が挙皐筋に特異的なものか否かをーとした。320CのT毎は22．4±5．1分（n＝7），であった。

検討する目的で他の骨格筋を用いて実験した。

産流液の温度を220Cに下げると静止膜電位はれたが，横隔膜では脱分極後ある程度回復するが，−65．3±2．6mV（几＝10）と浅くなり，損傷後の膜EDLでは挙宰筋と同様に膜電位の回復が観察さ正常のレベルにはならなかった。

電位の回復は遅くなった。温度と膜電位の回復の速度（T杉の逆数）の関係をArrheniusプロットより求めると，回復の速度の温度係数QlOは2．1
であった。

考

察

本実験によりモルモットの挙等筋は切断後60分経過すると膜電位は元のレベルまで回復し，電気次に膜電位の回復に及ぼすCaの効果を観察し的活動性も回復する事が判った。さらに切断端はた。濯流液中のCaを正常の叛0（0．25mM）に減ケーブル理論により解析すると電気的にsealされらすと（Mg置換），−′膜電位の回復は観察されなかていることが判った。すなわちこの筋線経はheal−った。しかし正常の悠（0．75mM）では回復する傾向がみられたが，元のレベルまでは回復しなか

ing−OVer現象を有していると結論した。モルモった。これに対して正常の5倍のCa（12．5mM）筋でおおわれているという特異な構造を持っておではコントロールと差がみられなかった。すなわり，そのために他の骨格筋とは全く違った収縮を

ち膜電位の回復には少なくとも0．8mM以上のCa引きおこす。しかしこの骨格筋線経のケーブル定が必要なことが判明した。

数は他の晴乳動物の骨格筋とほぼ同じず 電気的ットの挙宰筋はアドレナリンなどで収縮する平滑RNA合成阻害剤であるactinomycinD（Sigma）

膜定数に差がみられなかった。EDLと横隔膜の0．5mg／weight kgを腹腔内に投与し，第1，2，実験から挙等筋以外にもhealing−OVer現象が存3日目に摘出した挙等筋を用いて同様の実験を行在し，healing−OVer現象が挙宰筋自体の特異性った。投与群のT毎は25．3±4．3分（几＝6）でによるものでないことが判明した。

コントロール群と差がなかった。この結果とQlO

Healing−0Ver現象の発現機構としては，心筋値より，膜電位の回復には代謝の関与が少ないとではネクサスの抵抗の増大が考えられている。

示唆された。

骨格筋にはこのような細胞間構造はなく，hea卜

膜電位が回復した時点において電気緊張電位のing−OVerの速度も心筋の数分に比べて遅いので拡がりを調べた。intact muscleではEq（1）により他の機構が考えられる。筋線経の切断端ではmem−

求めた理論値と実測値はよく一致した。CutmuS−

brane sealingやplugの形成がみられることはcleでは切断端と反対側では，すなわち無限ケー

よく知られている。またNinomiyaet al．は挙等

ブル側では，緊張電位は切断端の性状にかかわら筋の切断端よりの色素の浸透は切断後50分で止まず指数関数的に減少する。切断端側では．緊張電ると報告している。これは膜電位の回復の時期と位は切断端が電気的に短絡されていればE9（2）にほぼ同じで切断端においてdiffusionbarrierによより求めた理論値を示し，電気的にsealされているmembranesealingの存在が，healing−OVerとればE9（3）により求めた理論値を示すことになる。

密接な関係にあることを示唆している。またCa

実測値は，後者の理論値とよく一致し切断端が電がhealing−OVerに重要な役割を果たしていること

気的にsealされていることを示している。CutmuS−も判った。これらのことは，今後healing−OVer
現象の発現機構の解明の助けとなるだろう。

Cleではこの時点において，intact muscleと同様に外向き通電により活動電位が観察され，電気的活動性も回復していることがわかった。

以上をまとめると，healing−OVer現象が心筋に特有な現象ではなく哺乳動物の特定の骨格筋に

15 哺乳動物骨格筋の損傷後のHealing−0Ver87も存在することが明らかになった0このような筋 6）HeubrunnL．V．（1956）．TTleDynamicsofLiving

緑経では．cut muscleの標本を用いてその電気的膜性質を調べることが出来ると考えられる。

文献1）BoydI．A．and Martin A．R．（1959）．Membrane
COnStantS Ofmammalianmusclenbres．J．Lnysiot，
147：450457．
2）DglgzeJ．（1970）．Therecoveryofrestingpotential
andinput resistancein sheep heartinjured by
kn的orlaser．人用γ∫わ7，208；547−562．
3）DeMelloW．C．（1972）．Thehealingく〉VerPrOCeSSin
Cardiac and other muscle nbres：in Electrical
Phenomenain the Heart．ed．De Mello W．C．
AcademicPress，NewYork，pp．323−351．
4）De MelloW．C．（1973）．Membranesealinginfrog
Skeletalィnuscle nbers．伽C．Nat．Acad．Sti．【瓜4，70（4）：982−984．

5）Engelmann T．W．（1877）． Vergleichende
Untersuchungen zur Lehre von der Muskelund

Nervenelektricitgt．即Z7geTS．Arch．ges．Inysiot，
15：116−148．

Protoplasm．AcademicPress，NewYork，PP．62−84．
7）L60tyC．andLgaut占M．（1982）∴Membranepoten−
tialandcontracturesinsegmentcutfromratfast

and slow twitch muscle．胸TS．ATCh．395：

4248．
8）NinomiyaJ．G．（1975）．Some pharmacologiCal
PrOPerties ofthe cremaster muscle oftheguinea−
pig．βr．√用α′〝ほぐ，55：487495．
9）NinomiyaJ．G．and Mascher D．（1982）．Recovery
Of the membrane potential of the sectioned
Striatedmuscle Libers oftheguineai）lgCremaSter．
々れ人用γ∫わJ，32：529j39．
10）NinomiyaJ．G．，MerchantH．andAlonsoJeFloridaF．（1976）．UltrastruCturalarrangement anddistri−bution of smooth muscle and striated muscle
nbersin the cremaster of the gulneai）ig．AnGf．
Rec，186：127−132．
11）Rothschuh K．E．（1951）．t加er den funktionellen
Aufbau des Herzens aus elektrophysioIogischen
Elementen und 的er den Mechanismus der Er＿

regungsleitungim Herzen．FyTageYS．ATCh．ges．
用γ血7，253：238−251．
12）Weidmann S．（1952）The electrieal eonstants of
purk叫e爪bres．人用γ∫わ7，118：348−360．

Ⅳ

アセチルコリンレセプター

16．骨格筋アセチルコリン受容体の生合成と細胞内前馬区体9117．アセチルコリンレセプター分布に対する神経の作用

95

91

16

骨格筋アセチルコリン受容体の生合成と細胞内前駆体

杉 山 博 之＊研究協力者 山 下 幸 子＊ 八木沢

ニコチン性アセチルコリン受容体は，複数個のポリペプチドサブユニットが集合してできた膜内仁＊

プに相当すると考えられる未完成前馬区体様の成分を兄い出したので報告する2：在性糖タンパク質であり，それぞれのサブユニッ
トは別々の遺伝子に基づいて合成されることが知

材料

と方法

られている。ところが，Cell−freeのタンパク合培養細胞としては，ウィスク一系新生ラットの成系でこの受容体を合成すると，生成されるサブ

下肢筋より得た筋細胞を用いた。培養法の詳細，

ユニットは正しく集合体を形成せず，また特異的

細胞膜分画や細胞内成分の調製法等については既リガンドであるα−プンガロトキシソと結合するに報告した方法1）に従った。

こともできない。このことから，サブユニットのアセチルコリン受容体またはその前駆体成分は集合とα−ブンガロトキシソ結合能の獲得とは密

全て，放射能標識したα一プンガロトキシソとの接に関係した現象であり，サブユニットが集合す校合体として検出・解析した。従って，α・−ブン

ることによって正しいコンフォメーションができ

ガロトキシソとの結合能を持たない成分について

上り，α−ブンガロトキシソとの結合能などの生はここでは触れない。また細胞内成分については

理活性が生じてくるのであろうと想像されている。

あらかじめ細胞表面膜上の受容体を非標識α−ブ

しかし，このサブユニットの集合がどのような過ンガロトキシンでマスクした後，標識α−プンガ

程を経て行われるのか，またどのステップでα−ロトキシソを用いて検出した。

ブンガロトキシソとの結合能が生じてく るのか，という問題については余り分っていない。

結果

と考察

我々は培養骨格筋細胞におけるアセチルコリン

培養骨格筋細胞の細胞内α一ブンガロトキシソ受容体の合成と分化の問題を検討してきたが，こ結合成分を，分子量，薬理学的性質，免疫化学的れまでに（1）培養細胞表面膜上の受容体には等電点

性質，代謝制御に関する特徴，等の種々の側面かを異にする2つのタイプのものが存在すること，

ら検討した結果，次にまとめるような知見を得た誓（2）両タイプの受容体は，共通の前駆体から分化す（1）細胞内成分は，ゲル濾過やショ糖密度勾配

る形で生じて来ると考えられること，を報告した1ご

遠心によって分離される少なくとも三種類の異な

今回は，細胞内のアセチルコリン受容体前駆体成った分子サイズを持つ成分を含む（図1）。それ分について更に詳細に検討し，その生合成過程にらの沈降係数は9S，5S，および3．5Sと見積

おいてサブユニットが次第に集合して行くステッ

られる。
（2）これらの三成分はいずれも細胞表面受容体＊生理学研究所・細胞器官研究系と同様，α−ブンガロトキシソの他にカルバコー

Ⅳ

92

アセチルコリンレセプター

5︵≡d︶×uJd≡00竺0く・↑皿等﹇一完こ1020
FRACTlON NUMBER
第1図 培養筋細胞の細胞表面アセチルコリン受容体（一一一一うおよび細胞内α−プンガロトキシン
結合成分卜一一）のショ糖密度勾配遠心による分析。放射標識α−プンガロトキシンの結合はカルバミルコリン（○）またはクラーレ（＋）によって阻害される。

LlQANDCONCENTRATl0N（M）
第2図クラーレ（dTC）またはカルバミルコリン（Chrb）による放射標識α−トキシン（〔3日〕ETb）
結合の阻害。●，細胞表面アセチルコリン受容体。ロ，細胞内9S成分。○および◇，細胞内の低分子量成分（5S成分と3．5S成分の混合物）。

16 骨格筋アセチルコリン受容体の生合成と細胞内前駆体

93

ルやクラーレ等のコリン性薬と結合し，かつこれプチド鎖への糖鎖の添加を阻害するtunicamycin，

らコリン性薬とα−トキシソとの結合は括抗し合およびGolgi装置での合成後のプロセシングを阻う（図1．2）。

害するmonensinを剛、，糖タンパク合成経路上（3）これらの3成分はいずれも細胞表面受容体の異なったステップで生合成反応を阻害した。そと同じように，シビレエイ（乃甲edo mαrmOr。fαの結果，表2に示すように，細胞内の3成分は異または肋r鳥eノ叩0nkα）アセチルコリン受容体

なったやり方で影響を受けることが分った。特にに対する抗体と交差反応をする（表1）。

monensinの場合，低分子塁成分（5Sおよび3．5（4）これら3成分のうち，分子量の小さい5S

S成分）は減少するのに対して，9S成分は増大

および3．5Sの成分は，9S成分が部分的に分解することが分った。このことからも，5Sおよびして生じたものである可能性が考えられるので，3．5S成分は9S成分から部分分解によって生じこの点を検討した。すなわち，9S成分を，いろた人為的産物ではないことが支持される。

いろな条件下で保温し，その結果分子員の低下が以上の結果から，現在のところ我々は，細胞内起こるかどうか調べたところ，図3に示されるよ

α−プンガロトキシソ結合成分について次のよううに，そのような変化は見られなかった。

に考えている。すなわち，これらの成分はいずれ（5）筋細胞を種々の糖タンパク合成阻害剤の存もアセチルコリン受容体と密接に関連した成分で在下で培養し，その結果細胞内成分がどのようなある。このうち，9S成分はサブユニット集合が影響を受けるか検討した。阻害剤としては，ポリ

完了し，サイズ的に完成した直接の前駆体であろペプチドの合成を阻害するcycloheximide，ポリペう。より小さい成分は，9S成分より由来した部≡d︶×山﹂d≡00竺0く・↑習P軍﹈

第3図

細胞内の9S成分のショ糖密度勾配遠心0●，処理なし00，4℃8日間保温後更に37℃30分
保温したもの〇十・新しい培養筋細胞と共に再ホモジェナイズし20℃19時間保温したもの。
いずれの処理でも分子量の低下は見られない。

94

Ⅳ

アセチルコリンレセプター

表1シビレエイ（孤やedo mαrmOrαぬ および 血re qWCα）アセチルコリン受容体に対する抗血清と培養筋細胞α−プンガロトキシン結合成分との反応性。十分量の抗血清によって沈澱する割合で表わす。

抗 血 清
抗〃．ノαJ抑止α
抗γ．〝旭mOJⅦ血免疫沈降反応皇（％）
細胞内成分
9S
5S
40±1
45±23
40±2
46±23

細胞表面
受容休
87±1
69±4

3．5S
36±12
7±11

表2 糖タンパク合成阻害剤による細胞内α−ブンガロトキシン結合成分の増減。
コントロールの培養筋細胞に対する相対量（％）で表わす。

細胞内成分の量（％）

阻害剤
cycloheximide
tunicamycln
monensln

9S

5S

3．5S

39±14
43±19
126±15

36±10
23± 9
57±20

49±15
29±14
66± 7

分分解産物ではなく，サブユニット集合の完了していない未完成の前駆休であろう。今後更に，これらの点を確かめて行きたいと考えている。

文

献1）Sugiyama，H．，YamaShita，Y．，＆Murakami，F．：（1982）Multiplemolecularforms ofacetylcholine
receptorsin cultured muscle cells：J．NeurvcheTTZ．
93：1038−1046．
2）Sugiyama，H．，Yamagishi，S，，＆Yamashita，Y．：（1983）Multiple forms ofintracellular（1−bungaro−
toxinbindingcomponentswithdifferentmolecularsizesin cultured skeletal muscle ce11S．BioTTZed．
Re∫．4：425432．

95

17

アセチルコリンレセプター分布に対する神経の作用

萩 原 摘四郎＊
研究協力者 黒 見

土日＊

骨格筋のアセチルコリンレセプター（AchR）

分布，高密度分布（AchR cluster，図1の白くみは，発生初期の筋では筋細胞表面全体に分布してえる部分）と低密度分布（diffusereceptor，図いるが，成熟動物では神経との接合部だけに高密1ののこりの部分，AchRの密度が低いため蛍光度で存在する（AchRclusterの形成）。神経を除はみれない）に分けられる。AchRcluster は図

くとAchRは再び筋細胞全体に分布するようにな

1に示す如く，筋細胞の形が変っても，比較的同る。これらのことから神経は筋のAchRの局在をじ位置にあり，消失するものもあったが，多くのおこしていると考えられる。今回はその作用機序

clusterは長く存在した。

を明らかにするため，AchRが神経筋接合部に蓄2．AchRの分布に対する神経の効果を時間的に積していく過程を培養細胞でしらべた。

示したのが図2である。神経が筋に接触すると，すでに存在していたAchR clusterは消失し（図実 験 方 法
細胞培養；アフリカツメガエルの胚から筋およ

2のAとB），その後，神経との接触部分に多くのAchRのclusterが出現した（図2C）。

び神経管を取り出し，すでに述べられている方法

3．すでに存在するAchR clusterに対する神経で和胞培養を行った三 筋細胞を3〜4日室温中での作用を定量的に示したのが図3である。筋細胞

培養した後，神経細胞を加えた。

だけの培養でもAchRclusterは時間とともに消AchRの蛍光標識：培養筋細胞を蛍光色素ロー失したが，48時間後でも約半分のAchRcluster

ダミンをつけたα−バンガロトキシン（2〃M）

は存在した（図3白カラム）。ところが神経細胞を中に1時間浸して，細胞表面のAchRを染めた。

加えた筋細胞培養のうち，神経の接触をうけない

蛍光顕微鏡；従来の蛍光顕微鏡では相色のため，筋のAchRclusterは生存率が有意に増加し，神同一標本の写真を何回もとることは不可能であっ経の接触をうけた筋は逆にAchRclusterの生存た。しかし今回は，imageintensifier をつけたが減少させられ，神経添加後16時間で半分のAch

Videoシステムを利用することによって，同一標

R clusterは消失した。このことは，神経接触は，本から，生きたまま少くとも10数回の蛍光写真を

すでに存在するAchRclusterを破壊する効果をとることが可能であった三 3

示すことがわかる。
4．すでにあるAchR clusterをこわす神経の作

実

験

結

果

1．神経支配を受けない筋細胞のAchRは2つの用が局所的なものか全体的なものかを示したのが
図4である。AchR cluster の消失率は，神経からの距離に依存してなく，従って，神経のこの作＊千葉大学医学部脳機能研究施設神経薬理研究部

用は，接触した筋細胞全体におよぶことがわかっ与三テラ⊥音・寧賢烹去巨茎警 芸ぷ云諒恕旦警訪︒群召・媒質・聴却Q h莞Sコ︻三雲責の垂畢学昌畠軍票芸二図品

ー︳■−︼

アセチルコリンレセプター

Ⅳ

96

97

17 アセチルコリンレセプター分布に対する神経の作用

ロ◆︒憬馬車L望Sn一U ∝占Uくe害悪臣謀︒︵曽︶匪頑冥ミサ量り雲冨墨壷琴芝 J意義︒雪雲聖夏・韓吏﹂と彊頭重亘 ■麒神君覇簑↓︒ど蘭Q姪やJ莞Sコ︻U ∝宅くQPへU刃の︶避芯︵可︶尾道塀塑ユキ 図N鮪望﹂＜∝⊃︺NLO NO−ヒ凸白くの﹂﹂uU●LOI●q98lV

アセチルコリンレセプター

P巴daddの葛23竺一〇

竺0＜−00冨lu3Ja

鱒

24

40

48

hourS a†ter adがtion o†nerve
第3図 すでに存在していたAchR clusterに対する神経の作用。
縦軸は消失したAchR clusterの％，横の時間は神経を加えてからの時間（時）。
＊p＜0．001，XX＜0．005 対照接合（白カラム）との比較。

1 −．−

射∞
0

1

瑚
0
0

■

P巴d鼠ddの葛201竺一〇竺0＜−00冨lu3La

24hrs

0

40hrs
第4図

48hrs

すでに存在していたAchR clusterの消失と，神経からの距離。
縦軸は消失したAchR clusterの％，時間は神経を加えてからの時間。
白カラム（神経に接触された AchR cluster）
点カラム（2．4／ m＜ ＜16／Jm）
黒カラム（＞16JtmのAchR cluster）

17 アセチルコリンレセプター分布に対する神経の作用

99

一一一一一一一一一●一一一一一一一一一

DISAPPEARANCE OF PREEXISTING
AChRCLUSTERSt％）
くつ

N

ul

叩

⊂〉

｝

石

Ul C〉

〇
一O
NO
○○

エOURS A﹁↓ER AロロヨOZ Or ZER＜E CErrS

鼻○

⊂〉

謀

岩

讃

喜

ACCUMULAT10N OFAChR CLUSTERS
ATNERVE−CONTACTSlTESt％）

第5図 すでに存在したAchR clusterの消失（点線），と神経筋接合部でのAchR clusterの形成（実線）。
横軸：神経細胞を加えてからの時間。

た。

在するAchRclusterを破壊する作用を有するこ

5．すでにあるAchR clusterの消失と神経筋接とが見つけられた。このAchRcluster破壊作用

合部でのAchR clusterの出現の時間経過。

は，接触した筋細胞全体におよんでおり，Cluster

神経筋接合部にAchRclusterか形成されることはよく知られているので，すでに存在するAch形成作用か，その接触部位のみに限定しているのとは対照的である。

Rclusterの消失は，AchRが神経筋接合部に蓄AchRclusterが神経筋接合部に形成される機積した，その結果という可能性も考えられる。し序として，Capping現象から考えられた。まず小かし，図5に示す如く，すでに存在していたAch
Rが消失してから，後にAchRclusterが接合部

さいAchRpatchができ，それが移動して大きい
cluster が形成されるとの説が出されているが，に出現してきた。このこと1も 上の可能性を否定

今回はこれを支持する結果は得られなかった。つするものである。

まり（1）小さいAchRpatchもcluster も膜上を動くという証拠はなかった。（2）AchR clusterが

考察と

結論

以上の結果より，神経は，その筋との接合部にAchRclusterを形成する作用の他に，すでに存神経筋接合部に形成される前に，すでにあった
AchRclusterは消失した。
むしろ，trap theory（膜内を自由に動くAch

Ⅳ

100

アセチルコリンレセプター

Rが神経筋接合部でtrapされる）の方が可能性があると考えられ，それについての実験を続行中である。

acetylcholine receptors on cultured muscle cells．
JJ功γ∫わ7．268：731−756．
2）Kuromi，H．andKidokoroY．：（1982）Development
Of acetylcholine receptorclustersat nervemuscle

COntaCtSin Xenopus cultures．Sbc．Neurosci
Aおれ8：863．

文献1）Anderson，M．J．，M．W．Cohen and Zorychta E．：（1977），Effectsinnervation onthedistributionof3）Kuromi，H．and Kidokoro，Y．：（1983）Formationand dispersal of acetylcholine receptorclustersat
nerve−muSCleJunCtion in〟e〟0∫C dおれ9：1179．

Xenepus culture．Soc．

Ⅴ

微

細

形

態

18．細胞骨格の分化発達一筋腱連結部の細胞骨格

103

19．ラット骨格筋の凍結割断像

107

20．ジストロフィー鶏胸筋での異常蛋白質の発現について

110

103

18 細胞骨格の分化発達一筋腱連結部の細胞骨格

＊
＊

郎一

治洋

＊

＊

倉 司
宮
臼 神

＊
＊

子昇

骨格筋の正常な収縮活動は筋細胞内の筋原線経や膜オルガネラの規則的な分布・配列を基盤にし早塩 村 洋 子＊＊ 藤

智

承一郎＊＊

＊

田

田 巻

月

月

研究協力者

川

律

春

石

ののち，超薄切片を作製し，電子顕微鏡による観察を行なった。

て行われている。このような形態を形成し，維持する役割を担っているのが細胞骨格である三）細胞骨格の主な構成要素は，（1）微′ト管（micro−

結果と

考察

1．筋原線経と形質膜の連結

tubule）．（2）中間径フィラメント（intermediatefila一筋腱連結部をなす筋線維端は複雑な外形を示しment）．および（3）マイクロフィラメント（microfila一長軸方向に大・小の突起や等人を形成し，腰からment）である。筋細胞では微小管と中間径フィの膠原綿維束とかみ合うように連結されている（図

ラメントが細胞骨格要素として問題になる。わ1）。筋線維端のこの凹凸構造は筋節長にして3れわれはまず，中間径フィラメントの存在様式−4個以内に限定されている。筋線維内部では，を微細形態学的に分析した。ヒト筋をはじめ，筋原緑椎がZ板のレベで筋形質膜に付いて終る様

いろいろな動物の筋について観察した結果，サ式をとる。しかし，詳細に観察すると，最終の筋

ル横隔膜の筋繰経にとくに中間径フィラメント

筋のⅠ帯の細いフィラメントは通常の筋節内の1〟．mがよく発達し，隣接筋原綿経のZ坂相互を結ぶよ

長を超えて，したがってZ板のレベルを超えて，

ぅな配列をとることを見出し，前報で報告した≡

さらに伸び，形質膜内面に付いているように見え

今回，筋腱連結部における細胞骨格要素についる（図1）。おそらく，最終Ⅰ帯の細いフィラメてその分布・配列を電子顕微鏡的に観察したのでントの全長は多くが1刷れより長いと考えられる。

報告する。この部位は筋線維端であり，筋原綿経

その上 この伸長部分のフィラメント束は通常のの収縮力が筋形質膜を介して腱に伝えられる特殊

Ⅰ帯に比してかなり密な集合束をなしている。フ

な部分である三ィラメント束にはその末端の膜付着郡のみならずミ
束内にも散在して暗物質の小斑が認められた。こ材料 と 方法の暗物質の性質は不明であるが，Z坂構成成分と材料として，マウス横隔膜およびサル横隔膜を共通の蛋白質である可能性が強い。実際，暗物質用いた。型のどとく，グルタルアルデヒドおよびはZ坂と連続しているのが観察でき，また電子密四酸化オスミウムの二重固定を施し，脱水・包埋度もほぼ同等である。この部位の細いフィラメン
トがどのくらい長いのか，また，形質膜に付く途＊群馬大学医学部解剖学教室＊＊東京大学医学部解剖学教室

中でフイラメシト極性を変えるかどうかについて
現在分析中である。

104

V

第1図

微

細

形

態

筋線維端の縦断像
筋線維端には多数の突起や彗人が形成されている。筋原線経の最終筋節のⅠ帯の細いフィラメントは長く伸びて，突起や彗人の形質膜に付いて終る。サル横
隔膜。

第2図

筋線維端の横断像
筋原線経の細いフィラメント束は裏打ち（矢印）構造を介して形質膜に付く。
裏打ちの部位に一致して基底膜も厚く発達している。
マウス横隔膜。

18 細胞骨格の分化発達一筋腱連結部の細胞骨格

第3図

筋線維端の横断像
線維端の突起（1，2，3）内に多数の微小管が見出される。また，糸粒体（Mit）の集積がみられる突起もある（1．2）。マウス横隔膜。

第4図

筋線維端の横断像
筋線維端には多数の横断微小管（矢印）が見出され，すべて縦方向に配列している。
マウス横隔膜。

105

106

V

微

上記のように，最終筋節の細いフィラメント束

細

形

態

機能的特異性を反映しているにちがいない。

は暗物質を介して形質膜内面に付く。暗物質は形

中間径フィラメントは筋線維端で，横方向およ

質膜内面上に層をなしているが，両者甲問には約び縦方向の走行を示し，数も増加している。この

15nmの明調層が介在しており，ここに橋渡し構

フィラメントは筋原線維相互間をZ板のレベルで造が認められる（図2）。この時物質層は一種の裏連結するのみでなく，筋細胞突起の中央を縦走し打ち構造（形質膜裏打ちplasmalemmal under−

筋線維瑞の形態を維持するのはも働いているようcoat）とみなすことができる。その上，この層構にみえる。

成は他のいろいろな細胞の形質膜裏打ちにも共通している。細いフィラメントはこの裏打ちに付い

以上 筋腱連結部における筋線維端の細胞骨格て終るように見え，決してこれを貫通して膜自体に関する観察結果を記述した。とくに，筋原繰維に直接付く像は得られなかった。今後，フィラメ

付着部をなす形質膜裏打ち構造，筋原線絶間の微ントの形質膜への付着の分子機構を分析していき

小管および中間径フィラメントについて興味あるたい。

所見を得た。今後，この観察を分子構築の観点か

興味深いことに，裏打ち構造としての暗物質層
はフィラメント束の付着部位以外の部位にも斑状にら進めるとともに，病筋における筋腱連結部の形
態変化を検索したい。

存在し，その多くは付着部位と連続していると考

われわれは，この研究に平行して，現在（1）急速えられる。付着部位以外の裏打ち構造がどのよう

凍結デープエッチングレプリカ法による筋収縮機な機能を果すかも今後の問題として残る。

構4），および（2）急速凍結置換法による筋原繰維および別、胞体の微細構造5）について研究を進めて

2．筋線維端の細胞骨格要素
まず微小管について検索した。筋緑維端では，いる。

他部に比して微小管の数が多く，かつ，長軸方向に配列しているのが観察される（図3）。形質膜
直下や筋原繰維間の筋形質内に見出され，しばしば束をなして走っている（図4）。微小管は糸粒体などの膜オルガネラと密接な位置関係を示し，また，微小管に富む筋細胞突起内には糸粒体の集文献f）石川春律：細胞骨格の微細構造。蛋白質核酸酵素，
28，624・635（1983）．

2）石川春律・月田承一郎・月田早智子・白倉治郎：細胞骨格の分化発達一中間径フィラメントの存在様式。厚生省神経疾患研究委託費。筋の発生と分化に関する基礎的研究（江桔斑），昭和57年度報告書，は，微小管が構走する傾向を示し，横細管と平行

35−38（1983）．
3）Ishikawa，H．：Fine struCture Of skeletalmuscle．
InCetLandMuscteMotiliLy，4：PP．1−84，（Dowben，

して走る像がしばしば認められる。部位によるこR・M・andShay，J・W．，eds．），PlenumPublishingCo．，
NewYork．1983．

のような微小管配列の差は何を意味するのか明ら

4）月田承一郎・矢野雅文・月田早智子・田仲広明・石川春律・清水博：急速凍結法を用いた筋収縮過程の観察，Ⅱ．第36回日本細胞生物学会大会講演要旨集，積が認められる（図3）。筋線維端以外の部位でかでないが，筋線経における微小管の役割を考える上で重要な所見である。一般に微小管は細胞に機械的な支持を与えるのみでなく，物質輸送や膜オルガネラの移動にも関与している。筋細胞端における微小管の数の増加と長軸配列はこの部位のp．74，1983．

5）塩村洋子・白倉治郎・石川春律：急速凍結置換法によるカエル骨格筋線経の微細形態，第36回日本細胞生物学大会講演要旨集，p．75，1983．

107

19

ラット骨格筋の凍結割断像について

岩

崎

祐

成熟した骨格筋においては，細胞内への物質のレプリカは日立H−6000電子顕微鏡を用い加速移動は主として桟管系を介して行なわれており，

電圧100Kvで写真撮影を行なった。小筒の密度のpinoeytosisによる物質の取込みはほとんどないも算定には筋線経の横断面との連続性が確認でき，のと考えられている。一般に細胞膜に観察される

それが筋膜であることが明らかに膜の割断面をえ

小高はpinocytoticvesieleと考えられているが．

らび，最終倍率3万の写真を用いた。実測した面

筋細胞膜にみられるそれは上述のような理由から，

積は各サンプルについて104−229ルm2である。

その大部分は横菅系の開口部に対応するものでp卜
nocytotic vesieleではないであろうと思われてい結果と・考察る。事実，一般の細胞の凍結割断像でみられる小Figs1，2に幼弱ラットのFig3に成熟ラットの高はその径が50〟．m以下であるのに対し，成熟骨

骨格筋膜の代表的像を示す。Fig3にみられるどと格筋にみられる小高の多くは70〜100〟mの径をく成熟ラットの骨格筋膜では小高は群をなしてみもつ。しかし病的状態では，骨格筋に50J↓m 以

られる。一方，幼弱動物の骨格筋膜の小高はFi−

下申径の小高が多くみられる。Bonillaらはヒト

gs1，2に示すごと▼く散在性にみられる。Fig4はの筋ジストロフィー筋について′トさな径の′ト嵩が単位面積（10J⊥m2）あたりの小高の数を示してい

増加していることを報告したが，われわれはジスるが．成長にともない数が増える傾向があるが，トロフィー鶏について同様な観察結果を得ている。

その程度はトリの骨格筋の場合ほど顕著でない。

今回は1）骨格筋の成熟にともなう筋膜構造の変今回の実験では，筋が完全にちかんした状態で固化，2）速筋と遅筋における膜構造の差異の有無を定し標本を作製するよう留意したが，このような明らかにする目的で以下の実験を行なった。

状態では2週令の動物と6週令の動物の問に小筒の密度に有意な差はないものと思われる。この点

材料および方法
ウイスター系ラットのひらめ筋と後肢長伸筋にについては更に検体をふやし検討をつづける予定である。

ついて検索した。エーテル過麻酔によりと殺した

次に小高の大きさであるが，幼弱では50ルm以

生後7日，14日，6過日のラットを30分室温で放下の小さなものが多い。特に今回，検索した7日

置したのち，筋組織を2％グルタールアルデヒド

令のラットひらめ筋ではFiglに示すように大多で固定後紹切し，30％グリセリンで処理したのち，数が50〟m以下のもので，これらは筋以外の細胞

液体窒素で凍結した。エイコー社製凍結試料作製の膜にみられるpinocytoticvesicleと全く同じ形装置を用い試料台温度−110℃，2×10q7Torrの真態を示している。同じ7日令のラットでもEDL

空度のもとで割断し，白金レプリカを作製した。

では大型の小高がかなりみられ，14日令ではS0−
1eus，EDLとも大型小高の方が多く，6週令で＊東北大・医・脳研は，その大多数は大型の小高であった。

V

微

細

形

態

Figl

正常7日令ラットsoleusの凍結割断像×45，000

Fig2

正常14日令ラットのEDL x45，000

このような加令にともなう小高の質的な変化に

CytOSisが活発に行なわれており，横管系が正常

ついては今のところ明白な説明はできない。しかに機能している成熟正常筋ではpinocytosisはほとしながら，横管系の楷築が著しく乱れていると言んど行なわれておらず，桟管系の直接開口部と考われるジストロフィー筋や横管系の発達が充分行えられる大型の小高が大多数を占めていると考え

なわれていない幼弱な筋で小型でpinocytoticve−

られないであろうか。また今回の検索ではFig4

sicleと区別しがたい小高が多くみられる事実は，に示すようにsoleusとEDLの小高の密度に有意

筋細胞においても病的状態や未熟な筋ではpino−の差を認めなかった。

19 ラット骨格筋の凍結割断像109

チ 毎諾完鳶
声一二．・√−

一三gキーノーダ￣．〆㌔≠訝′サー′●‥帝葦｛毒灘餅・r；r

一、・・￣−

一㌧岬●

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↑

Fig3

正常6過令ラットのEDL

7 DAYSILI DAYS

6 wEEKS

152

1川

96●

SoLEUS（80 −108 ） （12q − 157 ）
96

ED L

150

（71 − 117 ） （1肋 −1叫 ）●per lO 声 2

Fig4

セダ争Jd

■・一・・′

∴．〔‥サ
＿

′ ヂ
二・て】さ等．・㌫・（
108 −155）
115（
100 − 155）

．104 −2 29 rm 2

・i

豆さ

110

20

ジストロフィー鶏胸筋での異常蛋白質の発現について

野々村 禎 昭＊

は

じ

め

に

でも胚ではかなり存在し，むしろ39Kの方が少い。

筋ジストロフィー症を攻めていく為に我々は実膵化後，脚型は減少し，10日位で消失し，39Kの

験動物と鶏ジストロフィーを主として用いてきた。

胸型だけになる。ジストロフィー鶏の胸筋では鶏ジストロフィーと人ジストロフィー，特にDuchenne

この脚型が再出現してくるわけである。

型ジストロフィーの類似を議論していくことは重一方トロポミオシンは胸崩にはβ鋭だけしかな

要ではあるが，仮に類似点が認められないとしてく，胚ではα鎖とβ鎖がほぼ同量あり，これが膵も遺伝子疾患の本質をついている問題であれば，化後15日目位でβ鎖は減少，消失する。我々は今後人ジストロフィーを攻めていく為の参考にはジストロフィー鶏胸筋ではβ鎖が存在することをなる。その様な意味で本研究班によって発見され

見出し4），さらにこの出現は実は剛ヒ後15日目でた鶏ジストロフィー症に発見された収縮蛋白質にもジストロフィー鶏ではβ鎖が僅かに残り，20−

おける3つの異常は，人ジストロフィーにはその25日目では一旦消失したかにみえるが45日目にはような収縮蛋白質の異常は見出されていないにせ再出現してくることを発見した。しかもこれはよ今後の追求方法への多くゐ示唆を与えるであろ細胞差によるのではなく単一線経をわけてもジスう。本年度で本研究班が一応しめくくられるに当トロフィーー胸筋ではβ鎖が存在していた。

って，本研究班で発見された収縮蛋白質異常につ最近，大日方らはC蛋白質が後期胚では抗体型

いて概観し，今後の研究方向についても論じておでは胸筋型（遠筋型）とは異った遅筋型が存在しきたい。

膵化後直ちに消失していくことをみた。ジストロ
フィー鶏胸筋では抗体によって遅筋型が出現して

1．鶏ジストロフィーにおける収縮
蛋白質異常−トロボミオシンβ墓乱
トロボ二ンT，C蛋白質

いることを認めた（私信）。
少くともニューハンプシャ413系では収縮蛋白
質に胸筋でコントロールの412系と較べて以上のジストロフィー鶏413において，もっとも典型

3つの異常が見出されている。他の収縮蛋白質の的な発症をみる胸筋について本研究班では大日方

異常報告としては，Bardmanがコントロール03系

によって1），先ずトロポニンTの異常が報告されとジストロフィー433系のPLD筋を比較して非た。すなわち胸筋には分子量39KのトロポニンT

変性ゲル電気泳動の結果からコントロールでは成が存在するが，ジストロフィー鶏には分子量35K

鶏ではFMl，FM2，FMiの三本の帯があるのにのトロポニンTが共存する。35KのトロポニンT

ジストロフィーではFM2とFM3の二本の帯しかは胸筋には普通に存在するものであり，一方胸筋認められない。これは膵化後はんの暫くは二本帯であるが，10日日頃から三本帯になるのに較べて＊東大・医・薬理ジストロフィーではいわゆる新生児型のまつ成鶏20 ジストロフィー鶏胸筋での異常蛋白質の発現について

111になっているとしている。しかしこのような結すことが出来る。第1の時期は胚15日日頃で生理

果は少くとも412，413系の胸筋ではみられてお的細胞死（PhysiologiCalCellDeath，PCD）とらず不確かとも思われる。

名付けても良い時期である。この頃筋細胞内では大きな変化がおこっており，例えば，中心になる

2．鶏骨格筋収縮蛋白質の分化を示す模式図

未分化筋細胞はさらに小さい未分化筋細胞へのおきかえがはじまり胚17日日迄にほとんど完了する。

今，413系ジストロフィー鶏胸筋に限って議論

図では矢印1で示してある。もうひとつの転期はを進めよう。最近収縮蛋白質の発生過程における膵化であり（Hatch，Hで示す。PCDを境にして分化の問題は非常に進んでおり，特に材料の入手

新らしく出現する収縮蛋白質があり，図では2垂し易さから胸筋がもちいられる確率が高いので都矢印，1′で示してある。第3の転期は膵化後15日合が良い。胸筋について収縮蛋白質の発現と消滅

目のところで，胚トロポミオシンの終了という意の模式図を第1図に示す。3つの大きな時点を示

味でEET（End ofembryonic tropomyosin）

1

．1

2

＝＝＝∃二二夢二茸二二二
＼
／
′

′H

ヽ

＼

ヽ

−−−■■■

第1図 鶏骨格筋収縮蛋白質の分化を示す模式図
PCD；生理的細胞死，H；尉ヒ，EET；胚型トロポミオシンの終了としてある。ここでいくつかの収縮蛋白質が消滅在する。これは胚20日で消失する。最近大日方する。矢印2で示してある。

は骨格筋にもこの胚型（eIが存在することを示した

1に相当する収縮蛋白質を考えてみよう。典型（私信，本研究班班会議）。E13，CBに示された的な例かミオシン軽鎖（LC）で第2図CBに示eは恐らくこの平滑筋共通胚型を示しているのですように胚13日目ではL3がなく，Ll近傍に胚遅あろう。この胚型23KLCは平滑筋では胚17日頃に筋型Ll（sel）とL2近傍に胚遅筋型L2（se2）消失する。胸筋においても同じ頃消失するらしい。

が存在する。胚20日日頃からL3が出現Lsel，Se2

これでeLCは1型で，LC3は1′型であることがは消失し成鶏型Ll，L2，L3が完成する。矢印でわかる。また遅筋形LCはLsel，Lse2共1型で示した痕跡はselの残存かもしれない。同じ時期ある。このようにしてみるとアクチンのβ，rはの平滑筋（砂嚢，CG）では胚13日目はリン酸化

いずれも1型であり，平滑筋では上述したeLC

軽鎖（PL）と17K軽鎖の他に約23K胚型（e）が存が1型で別にトロポミオシンの′鎖に胚型（ETM′）

112

V

微

細

形

態

E13

E20

e
8『

＿
Ll

CB
L2

CG
PL

PL
−−

牽〈

17K

17K

第2図 ミオシン軽鎖を示す二次元電気泳動像
CB：鶏胸乳 CG：鶏砂諷 E13胚13日目，E20胚20日目（東大医学部学生櫻井隆君の協力による）があり1型を示し′鎖にETM′の消失に対応し在し，そのまま成鶏につづいていくものは示しててふえていくものがありTM′′で1′型であるが，いないが，アクチンα，トロポミオシンⅠ，C，

これは成鶏型TM′と区別はつかない。一方非筋

ミオシン軽鎖1，2がある。平滑筋でここに示し型TMがあって（NMTM），これは胚に存在してたものは星印をつけた。

17日日頃で消失する1型である。ミオシン重鎖には，最近，胚型，新生児型，成鶏型に分ける仕事がでている。が，あく迄も非変性ゲル電気泳動

3．何がジストロフィー鶏で異常をひきおこすかパターンからいくものであって，あえていうなら上述の模式図で明瞭なことは2型が全てジスト

胚型は1型に，新生児型は2に対応すると言える。

ロフィー鶏413系で異常をひきおこすということ

我々の班会議で小林は抗体を用いて骨格筋胚にα●である。トロポミオシンβ，トロポニンT脚型，アクチニン，ビンキュリン，フイラミンが存在す

C蛋白質緩筋型であるが，これらの特徴は胚に存ること。それらは膵イヒ前に消失することを示した。

在し，膵化後ほ日日頃迄に消失する型のものであ

いずれも1型ということになる。

り，いずれも胸筋には（例えば遅筋としても）成これらの結果をまとめると第3図のようになる。

鶏でも存在するものばかりである。ジストロフィー

1型，1′型，2型をそれぞれ示した。胚の時に存筋では少くともトロポミオシンβでは正常に較ベ

20 ジストロフィー筍胸筋での異常蛋白質の発現について

113

云 ＼ヽ

ヽ
ヽ
1（ヽ．
hl与
ノ 0
5
10 ＼鳴
†
I
EET
PC D
e舶 V；
AAr
謂
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E明 ；
12
1☆
旺

−■■■−−

謁軌
第3図 第1図に具体的に収縮蛋白質を示した模式図
F；フイラミン，Ⅴ；ビンキコリン．ELCl，2；胚型軽鎖遅筋型1．2，A；アクチン，eaA，胚型a−アクチニン，ELC胚型軽鎖，TNTl；トロポニンT脚型，CPs；C蛋
白質遅筋型。他は文中に示した。

て多少遅くはなるが一旦消失する。そして再び出の蛋白染色を行ったもの，Bは免疫反応を行った

現する。これらを全て合わせて考えると遺伝子発ものである。412系も413系も成鶏α−アクチニン

現機構がジストロフィーでは2型を示すものにつ位置（A矢印）に反応は出ているが胚α＿テクチニ

いて突然ONの状態に30日日頃からなったことをン（E矢印）には全く反応が出ていない。やはり意味する。

1型ではジストロフィーによる異常遺伝子発現は2型以外の収縮蛋白質に異常はおこり得ないでないと考えられる。

あろうか。この点について1型でLC1，2の胚遅筋型，アクチンβ，rについてはこれ迄の二次元電

お

わ

り

に

気泳動の結果から先ずおこりえないことはわかっ

ジストロフィー鶏にみられた収縮蛋白質異常にている。そこで小林の報告した胚型α−アクチニン

ついて概観した。胚型収縮蛋白質のうち2型のもである。小林によれば，α−アクチニン抗体の免疫ののみに異常が現われるのは興味深い。遺伝子発転写法の結果は胚15日頃はSDS電気泳動でα⊥ア

現がその消失も含めてセットになっているという

クチニンより少し遅い位置に反応が出ており，小ことは例えば染色体上位置についてこれらの遺伝

林はこれを胚型α−アクチニンと呼んだ。そこで，

子位置が関係深いところにあるのかもしれない。

小林博士，武田博士と共に成鶏のα−アクチニンをまた蛋白質としてはトロポミオシンは胚型βも脚抽出し，小林のα−アクチニンで免疫転写法を行っ型βもジストロフィーβも区別出来ないが，実はた（第4図）。この結果はAでニトロセルロース膜

遺伝子クローニングを行い，遺伝子上のDNA配

114

V

微

細

形

態

三

一一一E

←A

C

D

C

D

第4図 α−アクチ二ンの免疫転写
A：SDSゲル電気泳動をニトロセルロpス膜の転写後蛋白染色 Bはα一アクチ二ン抗体
による免疫反応後ベルオキシターゼ発応発色C‥コントロール，D：ジストロフィー
Eは胚型α−アクチニン位軋 Aは正常α−アクチニン位置。
（小林博士武田博士との共同実験による，未発表）

列は異なるものかもしれない。いずれにしても我かっている遺伝子の解析に手がけるべきであろう。

我は次の段階としては蛋白質レベルからひとっ上

そしてその手段を用いて次の膜への接近をはかるったDNAレベルで収縮蛋白質異常を追求すべきべきであろう。

ところにきていると思う。人ジストロフィーでは収縮蛋白質の異常は見出されていない。恐らくもつとも重要な場所は細胞表面膜であろうし，膜蛋
白質の異常がその重要なポイントであろう。しかし，このような蛋白質レベルの異常の発見は直ちにに遺伝子レベルでその発現を求めねばならない。
この2，3年国際的に収縮蛋白質の遺伝子クロー文献1）Obinata，T．etal．：FEBS Lett．120，195（1980）．
2）Matsuda，R．etal．：Devel．Biol．82，11（1981）．
3）Roy，R．K．etal．：Devel．Biol．69，15（1979）．
4）Takeda，S・＆Nonomura，Y．：Biomed．Res．1，
176（1980）．
5）Nonomura，Y・＆Takeda，S．：In HMuscularDys−
trophyed・Ebashi，S・P117，Univ．Tokyo

Press，

Tokyo（1982）．

ニングの仕事は非常にさかんなのに我国では非常に遅れている。遺伝子疾患としてのジストロフィーを攻めるのに先ず我々もこのように異常発現がわ

6）Bandmun，E．：Muscle＆Nerve，inpress．
7）Obinata，T・etal．：Devel．Biol．，inpress．
8）Buder，D・etal．：J．CellBiol．95，763（1982）．

Ⅵ

生

化

学

21・筋ジスおよび正常鶏における筋細胞内poly−ADP−ribose
含量とpoly−ADP−ribose合成酵素活性の相異（筋発達過程におけるその変化）

117

22・コネクチンとミオシン，アクトミオシンとその相互作用

122

23・筋発生・分化におけるアクチン結合蛋白の発現様式

125

24・除神経筋にみられる筋蛋白質分子種の変化

133

25・ニワトリ胸筋および足筋におけるトロポニンTの発生，
モノクローナル抗体を用いた研究

138

26．ウサギ胎孔骨格筋収縮蛋白活性に対する
抗トロポニン抗体の影響

27．疾患筋筋小胞体膜の機能分類に関する一考察

144

152

117

21

筋ジストロフィーおよび正常鶏における筋細胞内NADおよびpoly−ADP−ribose含量とpoly−ADP−ribose合成酵素活性（筋発達過程におけるその変化）

真 崎 知 生＊
研究協力者 吉 川昭＊＊

遺伝的に筋ジストロフィー症状を呈するニワト

ポリADPリボpス合成酵素はNADをポリADP

リ（筋ジス鶏）の筋は婿化後5週を過ぎると，光

リボースに変換すると同時に核内の蛋白をポリA

学顕微鏡によってもはっきりとその異常を認める

DPリボシル化することによってその機能をあらことができる。しかし発症前の筋では通常形態学

ゎすと考えられている≡）一方，細胞内のNADレ的な異常は著名ではない。しかしながら最近生化

ベルが筋細胞分化に関連深いことも報告されてい学的方法を用いた検索により，この発症前のジスるためヲ 本研究計画では，細胞内NADレベル，

トロフィー筋にも異常があることが報告されてい核のポリADPリボース合成酵素活性，核内のポるr7 たとえば細胞質内酵素である乳酸脱水素酵

リADPリボース員の間の関係が，正常筋とジス

素さ〜4）構造蛋白であるミオシン，トロポニン，トトロフィー筋でどのように異なっているかというロポミオシンC一蛋白についても，その分子種が点を検討することを目的とした。

正常のものとは異なっていることが報告されている三〜7 しかし，これらはいづれも成長するに従っ

方

法て正常のものとの間に差かなくなることが示され

New Hampshireline413の筋ジス鶏および正ている。したがって，正常筋とジストロフィー筋

常鶏NewHampshireline412の各発育段階にの問の大きな差は，その筋細胞分化の過程に異常ぉける胸筋からChauveauの方法10）で核を調製があるのではないかと考えられる。

した。ポリADPリボース合成酵素活性は三輪の

このような筋分化のプログラムは実は筋細胞内方法11）で測定した。

の遺伝子上に組み込まれていることはあさらかで核中のポリADPリボース量は次のような方法あり，筋ジストロフィー症の筋ではこの調節機構で測定した。まず核を20％トリクロール酢酸（Tに異常があることが当然推測される。しかしこのCA）でよく洗った後遠心し，その沈恋を0．3N K

核内の遺伝子発現調節機構に関してはほとんど何

OHに浮遊させ，37℃で16時間反応させる。反応もわかっていないというのが現状である。

後20％TCAを加えて遠沈し，その沈恋を0．25M

このような状況の下で，最近核内のポリADP

酢酸ナトリウム緩衝液（pH8．8），6M塩酸グアニ

リポース合成酵素活性が，細胞分化ときわ■めて深ジン溶液に溶かす。これをあらかじめ同溶液で平い関連性があるのではないかと考えられている≡

衝させておいたジヒドロキシボロン酸セファロー＊筑波大学基礎医学系＊＊東京都臨床医学総合研究所

スのアフイニティーカラムに通す。DNA はこれに結合しないので，通過した溶液をDNAの定量

Ⅵ

118

生

化

学

酢酸ナ

増加する。特に僻化後最初の一週間の増加が着る

トリウム緩衝液（pH4．1）で溶出される。これをしい（表1）。ジストロフィー筋のNAD昌は正常蒸溜水に透析した後，凍結乾燥，酢酸緩衝液に溶にくらべると多少低いことか認められる。しかしかし，蛇毒ホスホジエステラーゼで分解する（37僻化前の20日日胚胸筋においては正常との間にほ℃，3時間）。反応後そのまま凍結乾燥，これをト

とんど差がない。そこで核あたりのNAD畠を正リエチルアミン緩衝液（pH8．0）に溶解させ，ア

常筋とジストロフィー筋で比較したところジスト

ビセルSFの薄層クロマトグラフィーで展開，ホロフィー筋における値の方がかなり小さくなるこ

スホリボシルAMPと5′−AMPのスポットをそとがわかった。その理由はジストロフィー筋の方

れぞれ集める。それぞれを10mMHCl溶出させたが正常筋より湿重量あたりのDNA量が多いため後，蛍光分光光度計，あるいは14C標識NADよである（表2）。このようにNADレベルはジスト

り合成させた場合には液体シンチレーションカウ

ロフィー筋の方が正常筋より低いと考えてよいよ

ンターを用いてそれぞれ定量を行なう。これにように思われる。またジストロフィー筋では湿重量って核内ポリADPリボース量が測定出来る。

あたりの核数が正常筋に比して多いという事実を，に用いる。ポリADPリボースは0．25M

DNA畠はFl。Ck12 の方法を用いて測定した。

ジストロフィー筋では発症前ですでに蛋白合成能

細胞よりのNADの抽出，およびその量の測定が高いという以前に報告した結果と考えあわせると興味が深い。ジストロフィー筋における筋細胞

はKling。nb。rg13b方法を用いた。

の幼若性を示唆しているのかも知れない。

結果とさてそれでは核内のポリADPリボース合成酵

考案

素活性とその量はどうであろうか。図1に示すよ筋の湿重量あたりのNAD量は筋の発達と共に
第1蓑

正常およびジストロフィー筋におけるNAD濃度

TableI．NAI）concentrationinnormaland dystrophicmusde2−Week−Old

5−Week−01d0・932±0・060

1・183土0・耶320−day−01d l−Week−01deふbryo（8）（8）

Nor O．193±0．008

0．765±0．036

Dys O・197±0・009

0・578±0・042■（5）8−Week−01d

0・舵8±0・065

（4）

（4）
1・268±0・030

0・968±0・0571・148±0・055

湿重量（g）あたりのDNA（mg）量。
平均値±標準誤差，試料数を括弧内に示す。＊統計学的有意（P＜0・05）

第2蓑

正常およびジストロフィー筋におけるDNA濃度

TableII．DNAconcentrationinnormalanddystrophicmuscle
20二空y−
Old
embryo
（5）

Nor
Dys

1＿Week＿2−Week−01d（5）かweek−
old（4）＆week−
01d（4）

1−year−old（4）

0．94士0．16 0．99土0．の3．27±0．061．93土0．08■1．52土0．14■1・盛土0・04● 1．33土0．13 0．亜土0．鋸●

3．34±0．09

1．闘士0．08

1．05土0．の

1・01±0・握湿重量（g）あたりのNAD（〟g）量。
平均値±標準誤差，試料数を括弧内に示す。＊統計学的有意（P＜0・05）

21筋ジスおよび正常鶏における筋細胞内poly−ADP→ribose含量とpoly−ADP−ribose合成酵素活性の相異119︵nbr X∈dU︶
5∞扇〇三∪訂 ︵OのOqてよ白く；−Od

0／19DE IW

2W

3W

4W

8W

5W

■

IY

Age

第1図

︵＜Z凸研∈＼∽−○∈u︶ 0∽Oqニーd白く
htch
′・

19DE

1W

8W

2W

Age
第2図

■

IY

Ⅵ

120

生

化

学

うに正常筋とジストロフィー筋の間のポリADPはないことになる。つまり筋が幼若型でありながリボース合成酵素活性の差は胚筋では認められなら，骨などの他の器官の発達のために筋が成長しい。しかし脛化後正常筋では低下するのに対し，なければいけない状況下におかれることが筋ジス

ジストロフィー筋では低下せず5過をすぎてやっトロフィー症の発症につながるかも知れない。ことその低下がみられる。この間筋の成長発達はき？ことはジストロフィー症と小人症が合併した場

わめて着るしく，筋重量は増加する。

合には筋ジストロフィーの症状の発現が抑制され正常筋とジストロフィー筋の核内のポリADPるという報告26）とある点で一致している。

リポース量も筋発達成長に伴ない同様の変化をす

以上ジストロフィー筋におけるポリADPリボる（図2）。脛化後1−2週目の核では正常筋にくース合成酵素活性およびポリADPリポース含量

らべてジストロフィー筋の方がポリADPリボーについて報告した。この結果の一部はすでに報告

ス塁はあさらかに高い。しかし図2の場合には，されている≡7

ポリADPリボース合成酵素活性がまだ高い4週前後のジストロフィー筋で，すでにジストロフィー筋核内のポリADPリボニス量は減少している。
まだ実験例が少ないのでポリADP．リポース量とその合成酵素活性の間の関係についてはあまり多くのことが言えない。また図2中に示してあるように，僻化後1年の親正常筋でポリADPリポー
ス量がジストロフィー筋より多くなっているが，この理由についても不明である。
真核細胞において核内蛋白が翻訳された後ポリ
ADPリボシル化される三4

この現象はDNA合成，細胞分化 ヒストンの機能の修飾，あるいは文

献1）Kaplan，N・0・andCahn，R・D・：（1962）BLochemLsり′
48：2123−2130．

2）Emery，A．F．H．：（1964）．肋（uTe201：1044−10453）peafSOn，C．M．et al∴（1965）dm肌J〟は39：
91−97．

4）TsYetanOYa，E・and Ognianov．M．：（1967）．ain．
αfmAcね18：87・88．
5）Obinata，T・，Ohmuro，T．H．and Matsuda，R．：（1980）AFβ∫上grJ，120；195−198．
6）Takeda，S．and Nonomura，Y．：（1980）BLomed．
Re∫．1：176−179．
7）大日方，他，（1983）筋の発生と分化に関する基礎的研究，昭和57年度報告書．
8）Hayaishi，0．andUeda，K．：（1977）Ann．Rey．Bfo・C加爪．46：95−116．

DNA修復等に何らかの関係があるのではないか

9）Capl叫，A・Ⅰ・and Rosemberg，M．J．：（1975）加C．
胸J．d〃d．jkf．比丘，2：1852・1957．

と考えられている三5〜20）ジストロフィー筋が正常10）Chauveau，J・Maul占，Y．andRounler，C．：（1956）
丘kp〟．Cb〃Re∫．11：317・321．

筋にくらべてこのようにポリADPリポース含量11）三輪正直・杉村 隆：生化学実験講座8巻，が多く，またその合成活性が多いということは，筋発達に伴なうジストロフィー筋の分化が正常筋の場合とくらべて遅れている■のではないかと考えられる。フレンドの赤芽白血球細胞においても細胞分化の際，ポリADPリボース合成酵素活性が低下する事実はよく知られている三1）ジストロフィー筋の筋蛋白分子種のパターンが婿化後しばらくの間幼若型をとることさ〜7）蛋白合成能が正常筋より高いことなどもこれと一致する三2〜25

528−543．

12）Fleck，A・and Munro，H．N．：（1962）Biochem．
Biophys．Acta55：571−583．
13）Klingemberg，M．：（1974），MethodsofEnzymatic
Analysis（ed．BergmeyerH．V．）4：AcademicPress
N．Y．2045・2072．
14）Nishizuka，Y．etal．：（1967）J BLLJ．Chem．242：
3164−3171．
15）Caplan，A．Ⅰ．etal．：（1979）Dey．Biol．72：102・109．

16）Burzio，L and Koide，S．S．：（1971）βわC加mβわーp々γ∫．Re∫．Cb〝lm．42；1185−1190．
17）Robberts，J．Hリ

StaLtk，R．and Smulson，M．：（1973），βわcJJem．βわクわ・∫．Re∫．CbJ乃肌52：43−50．
18）Miuer，E．G．（1975）Biochem．Biophys．Act0．，395：
191・200．

筋の分化発達の最終段階である筋発達成長の段19）Durkacz，B．W．etal．：（1980）肋tuTe283：593−596．

階で，もし筋重量増加前に，筋発達に伴なうポリ

20）Juarz−Salinas，H．，Sims．，J．L andJacobson M．K．
（1980）Ab山′e282：740・741．
21）Terada，M．etal．（1979）L＞oc．jVbt．Accd．Sci．US1
76：6411−6414．

ADPリボース量の低下が必要であるとすると，ジストロフィー筋では筋が成長発達する条件下に

22）Yoshikawa，A．andMasaki，T．：（1981）J．Biochem．

21筋ジスおよび正常鶏における筋細胞内poly−ADP−ribose含量とpoly−ADP−ribose合成酵素活性の相異121≡二二二三∴二二；二￣二∴∴二二125）Yoshikawa，A．，Takan0−Ohmuro，H．and Masaki，

122

22

コネクチンとミオシン，アクトミオシンとの相互作用

丸 山 工 作＊研究協力者 木 村 澄 子＊

は

じ

め

に

コネクテン分子について

背椎動物骨格筋の筋原線稚内弾性要素として兄

ニワトリ筋原綿経を直接SDSで抽出してSDSいだされたコネクチンは，塩不溶性のため，変性電気泳動にかけると，移動度のおそい2本のコネしたあとでなければ単離できなかったご2）3 した

クチン・バンド（α，β）がみられる≡ 3 分子量ががって，蛍光抗体法による筋原線稚内の局在をしあまりに大きいため，未変性のまま単離したコネ

らべるはかは，生理的な研究はできなかった。まクチンがいずれに相当するかを決定することは容た，その分子量が巨大（〜106）なため，タンパク

易ではなかった。アルブミン，ヘモシアニンなど化学の研究も進まなかった。

の架橋ポリマーをマーカーにしておよその分子量

私たちは，コネクチンを未変性のままニワトリを見積ったところ，α−コネクテンは2800K（3筋原線経から単離することに成功し，その方法を×106），β−コネクチンは2100K（2．×106）と昨年当研究班会議で報告した。ここでは，ミオシ判明した。抽出したコネクチンの分子量は2100

ンとアクトミオシンとコネクチンとの相互作用のKで，β−コネクチンと判明した。

研究成果について述べるとともに，コネクチンのβ−コネクテン分子は，300−400nmの長さ

筋肉構造における生理的意義についてもふれたい。

で，巾は約40nmのflexible rodである。沈降定数（Sち0，W）は約16Sである。ごく低い速度勾

材料と

方法

配下で大きな構造粘性を示すがこれは分子（フィニワトリ胸筋から筋原線経を調製し，コネクチラメント）が溶液内でからまりあうためのようでンを私たちの方法によって単離した三）よく洗ったある。濃縮すると，側面結合してひも状になり，

筋原線経を0．1Mphosphate buffer（pH5．6）で弾性を示す。コネクチンを弾性タンパク質とよぶ処理して変性アクチンなどを除去したあと，0．1Mのはふさわしいといえよう。これらnative con−phosphate buffer（pH6．6）で抽出すると，コネnectin分子の形と大きさについてはまもなく発表

クテンが得られる。

する予定である≡

ミオシンとの相互作用は，320nmでの吸光度測定，流動複屈折法，電子顕微鏡法などで研究しミオシンとコネクテン

た。アクトミオシンーATP系は，660nmでの吸pH7．0，20℃で，ミオシンはコネクチンと結合

光度測定とATPase活性測定でしらべられた。

して巨大な会合体を形成する。30mMKClから150mMKClまでの間で，濁度が上昇し，20％（重量比）以上のコネクチンが存在すると，放置中に＊千葉大学理学部沈殿する。この沈殿は，KCl濃度を0．15M以上に

22 コネクチンとミオシン，アクトミオシンとの相互作用

123

あげると溶解し，75mMに下げるとふたたび生ず

アーゼ活性がコネクテンによって促進された。こる。

れらの事実は，コネクチンがアクトミオシンの超80mMKCl存在下で流動複屈折法を用いてミオ
シン・フィラメントの長さを測定すると，0．8〜1．3

沈殿を促進して，そのMg−ATPアーゼ活性を増加させることを示している。

〃mに分布していたが，5，10，20％コネクテン存

コネクチンのアクトミオシン系への効果はα−在下では，0．9−1．6，1．1−2．0，1．2−2．8／柵と長アクチニンの場合と同様に，アクチンを束にするくなった。これは，ミオシン・フィラメントが会ことによっておこるin vitroにおけるartifact

合したためである。酢酸ウランで逆染色して電子であろう。

顕微鏡下で観察したところ，ミオシン・フィラメ
ントがからまりあっているのがみられた。コネク

コネクテンの生理的意義

チン分子は酢酸ウラン法でははっきりみることが本研究によって，コネクテンは，分子員が〜106できない（グリセリン存在下でマイカに吹きつけ，という線維状タンパク質であることがわかった。

低角度回転シャドーウィング法で見えるようにな単離されたのは分子量のやや小さいβ−コネクテ

る）。

ンであるが，おそらくα−コネクテンが一部切断

ミオシン・フィラメントとコネクテンの結合はされたものと思われる。抗体抗原反応やアミノ酸

イオン強度に依存するだけなので，アクチン・フ

組成からみてたしかなものと思われる。コネクチィラメントとの結合も同様に静電的なイオン結合

ンはミオシンやアクチンのフィラメントと結合すによるものであろう…

ることが示された。いったい，この巨大なフィラ
メントタンパク質は，筋原線稚内にあって，どうアクトミオシンとコネクテン

いう役割を荷なっているのであろうか？

アクトミオシンのATPによる超沈殿がコネク

まず，コネクテンの筋原線維内の局在について

テンによって促進されることが濁度法でたしかめ

みてみよう。蛍光抗体法によれば，コネクテンは，られた。ただし，α−アクチニンに比べると，そA帯の両端−A−Ⅰ接合部一にもっとも多量に存の効果はずっと小さい。

在し，A岸の中央部にむかって少ない。Ⅰ帯にはアクトミオシンのATPase作用におよぼすコネ

ごく少し存在し，Z線にはほとんどない三 2 3 ヵ

クチンの影響をみると，0．1MKCl以下の低イオン

エル骨格筋のスキンド・ファイバーを引き伸ばし

強度，pH7〜8．5でかなり増加させることがわかてアクチン・フィラメントとミオシン・フィラメった。しかし，この場合もα−アクチニンより効

ントを引き離すと，その部分に抗コネクテンと反果が小さかった。

応する部域があり，ミオシンに結合した細いフィ

80mMKCl存在下で，pH8．0でコネクチンの量

ラメントが多数みられ，コネクチンとみなされる。

を増加させたところ，50％で最大値に達し，対照

他端はアクチン・フィラメントか，Z線につながのほぼ3．5倍に上昇した。5mMCaC12存在下のっているものと思われる。ミオシンを部分的に抽ミオシン（アクトミオシンとしてではなく）特有

出するにつれ，引き伸ばしたスキンド・ファイバのATPアーゼ活性はコネクチンの影響をまったーの受動的張力の発生が減少することから7 コネ

く受けなかった。1MKCl，10mMEDTA存在下

クチンがミオシン・フィラメントを引っぼっていのK−活性ATPアーゼ作用もコネグテン浸よっるものと思われる。

て変化しなかった。また，トロポニンートロポミ

コネクチンは，ミオシン・フィラメントに結合

オシン系を加えてカルシウム感受性を与えると，

して，A−Ⅰ・接合部に多数存在し，他端は結局Z緑カルシウム（10￣4M）存在下においてのみ，ATPにつながり，A帯をサルコメアの中央部に位置さ

Ⅵ

124

生

化

学

せている弾性構造といえよう。その意味で，20年

mura，Y．，Kimura，K．，Ohashi，K．，Murakami，F．，

以上前にSjostrandが主張したギャップ・フィラ

Handa，S．，4 Eguchi，G．（1977）Connectin，anelastic protein of muscle．ChafaCterization andfunction．上月わC加爪．82：317−337．

メント のリバイバルということができる。

2）Wang，K．，McClure，J．，＆Tu，A．：（1979）Titin：

最近，Wangらは，筋原線経のたて方向の連結構造として筋原線経の表面をZ線問に走る数本のmaJOrmyOfibrillar component ofstriatedmuscle・
jサoc．血沈dc〃J．∫cf．【エ且A．76：3698−3702．
3）Maruyama，K．，Kimura，S．，Ohashi，K．，＆Kuwano，

中間径フィラメントの重要性を強調した三 たしか

Y．：（1981）Connectin，anelasticproteinofmuscle．

にTokuyasuによって免疫電顕法によってデスミ

cJは爪．89：701−709．

ン・フィラメントが筋原線絶間のスペースにたて方向に走り，Z線につながっていることが示された㌘）しかし，デスミン・フィラメントは中性塩に不溶性であるから，樋口・馬語の実験からみて弾性に大きく寄与しているとは思えない。それに，弛緩状態でも大きくたるんでなければならない。
Wangの示したKI残盛の竃顕像にみられるたて方向のフィラメントは，デスミンも存在していようが，コネクチンやアクチンがからまりあったものであろう。いずれにしても，Tbkuyasuの方法を用いて，コネクテンフィラメントの存在を電顕下でたしかめる必要がある。

文

献

Identification oftitinwith connectin．J．BLo・

4）Kimura，S．＆Maruyama，K．：（1983）Preparationof
native connectin from chicken breast muscle．
上月わC加〝．94：2083−2085．
5）Maruyama，K．，Kimura，S．，Sawada，H．，Kikuchi，
M．，＆Yoshidomi，H．：（1984）MoleculaL Size andshapeofP−COnneCtin，anelasticproteinofstriatedmuscleJ．Biochem．inpress．．
6）Kimura，S．＆Maruyama，K．：（1983）Interactionof native connectin with myosinand actin．Bio・
mgd．Re∫．4：607−610．
7）樋口秀男・馬桔良樹（1983）・スキンドファイバーの弾性要素の局在 生物物理，23，S79．
8）Sjastr nd，F．S．（1962）TheconnectionsbetweenA−
andI−band filaments in striated frog muscle．
エ∽Jrd∫J川CL月e∫．7；225−246．
9）Wang，K．，＆Ramirez−Mitchell（1983）Anetworkof
transverse andlongitudinalintermediate fuamentis associated with sarcomeres of adult vertebrateskeletalmuscleJ．C封tBiot．96：562−570．
10）Tokuyasu，K．T．（1983）Visualization oflongi−
tudinally−Orientedintermediatefilamentsinfrozen
sectionsofchickencardiacmusclebyanewstain−
hgme仙od．エαJJβわJ・97：562・565・

1）Maruyama，K．，Matsubara，S．，Natori，Y．，Nono一

125

23 筋発生・分化におけるアクチン結合蛋白の
発現様式

小

は

じ

め

林

に

良

Cyl sulfate−POlyacrylamide電気泳動（SDS／筋の発生・分化にともなう筋蛋白の発現形式にPAGE）を行い，短時間の染色後，バンドを切りっいては，既に多くの成果が公表されているご殊

だし，ホモゲナイズ後，抗原として用いた。免疫に，myOSin，aCtin，trOpOmyOSin，trOpOnin とは，抗原液とcomplete adjvantをよく混和した

いった主要構成蛋白については，ほぼ解明され，後，ウサギ背部数個所に筋注又は皮下注すること

発現の異常についても明らかになりつつある。しによって行った。2週間の問かくで更に2回追加

かし，微塁であったり精製が困難であったりする

免疫した後，10日後に採血を行い抗血清を得た。

蛋白については，その生理的意義の重要性は指摘

抗体の純度は，オークタロ一二一法および後に述されながらも，筋発生・分化における役割は，いべるimmuno−blot法によって確認した。尚，
gelsolin抗体は，九州大学農学部六車三治男博士

まだ明らかではない。
そこで，本研究においては，aCtin結合蛋白の御好意により供与を受けた。

（actin調節蛋白）の筋発生・分化における発現b．電気泳動の形式を追求した。最近，非筋肉細胞から，数多一次元のSDS／mGEはLaemmliの方法4）にくのactin調節蛋白が発見されいずれも興味深い

準じ2次元電気泳動は，0・Farr。Ilの方彦 によっ機能を有しているが，本研究では，これらの中かた。

ら，まずα−aCtinin，filamin，Vinculin，gel−

C．Immuno−blot法

SOlinの4種の蛋白について，ニワトリembryo

Towbinらの方法に従って，immuno−biotを材料としてin ovoでの発現様式に検討を加えを行ったが，泳動バッファーのメタノールは5％た。

に下げた。尚，immuno−blotに用いたニトロ
セルロース膜は東洋口紙より入手し，第2抗体は実験方法および実験材料
a．抗体の調製

用い，ジアミノベンチジン（和光）を基質として

α一ActininはPinttrらの方法2）を用いて，成鶏胸筋より精製し，filamin，Vinculinは，Fer−amisco and Burridgg

ベルオキダーゼ標識抗ウサギIgG（カッベル）を発色させた。
d．ペプチド・マッピングの方法により成鶏gi−

一次元ペプチド・マッピングはV8プロテアー

ZZard（筋胃）から精製した。各蛋白は，98％以ゼを用いCl。V。1andらの方d によって行った。

上の純度であったが，抗原用としては，この純度二次元ペプチド・マッピングは，SDS／PAGE

でも必Lも十分でないため，更にSodiumdode−後，必要な蛋白バンドを切り出し，125Ⅰでラベルした後，trypSinで16時間処理後，薄層上で一次＊秋田大学医学部生化学第2講座

元を電気泳動 二次元をクロマトグラフィーで展

Ⅵ

126

生

化

学

閑し，オートラジオグラフィーによりペプチドをニワトリ骨格筋，ウサギ骨格筋等のα一aCtinin検出した。詳細は田部によって報告されている。

に多様性のあることは既に報告したが，これら

e．その他

isoformsがembryogenesisのどの段階で，どの

lmmuno−preCipitationは，Kesslerの方法に様に発現するかを知る目的で実験を行った。ニワ

準じ，prOtein Abearing Staph・aurenSを用

トリembryoの各段階（ふ卵8E］，10日，12日，

いて行い，enZymeimmuno−aSSayは，ニトロ

15日，21日）で骨格筋を，とりだし，二次元電気セルロース膜を固定化担体として用い，いわゆる泳動後，immuno−blot法により，α−aCtininを

dot assayによった。

検出した。使用したα−aCtinin抗体は，ニワトリ
赤乱心筋，平滑乳 マウス骨格筋，ヒト骨格筋，

実

験

結

ヒト血小板，ブタ腎から精製されたα−aCtinin

果（又はα−aCtinin様蛋白）とも交叉した。結果

a．α−Actininの発現■ lE F
C

B

A

／
■
■

／
▲■

D

一

／
■
■

H

G

一／
◆

M

■
■

J

l

▲
■
■

＿
■
■

K

／
■l
●

／
■l
●

l．
∪
（）
宣
＼
∽ F
⊂l
∽

E

J■
■

N

一

0

一
■
′

−
−

図1α−Actininのimmuno−blotによる検出
骨格筋と2次元電気泳動後immuno−blotを行った。矢印はembryonic formを示すo
A，8日日骨格筋：B，10E】目胸筋：C，15日目上肢筋：D，15日日背筋：
E．15日日胸筋：F，15日目下肢筋：G・21日昌上肢筋：H・21日日背筋：
Ⅰ，21日目胸筋 ：J，21日日下肢筋：K，Adult胸筋：L，Adult広背筋：
M，Adult，SOleus：N，Adult sartorius：0，Adult gizzard

23 筋発生・分化におけるアクチン結合蛋白の発現様式

127は，図1に示されているが，8日目及び10日目された。以後21日embryo，adultにおいてはembryo−embryoの骨格筋では，分子量112Kdalton，

nicformは消失Ladultformのみが検出された。

pI5．80の蛋白（以後，仮にembryonic form

以上の結果から，少くとも免疫学的方法による検と呼ぶ）が検出されたが，15日目embryo骨格筋

索では，成鶏にみられるα−aCtinin以外こ，em−

では，embryonic formに加えて，分子量100K

bryoの早いstageでは，やや分子量が大きく

dalton，pI5．85のspotadultformも同時に検出

acidic なisoformが存在し．ふ卵15日〜21日の●図2125Ⅰラベル法によるα−aCtininのペプチドマップ
A，15E］目embryo胸筋のembryonic form
B，15日日embryo胸筋のadult form

Ⅵ

128

生

化

学

間にこのembryonic formは消失することがわことから，骨格筋（15日目embryo）の低イオン強かった。免疫学的同定法に加え，このembryonic

度抽出物をDEAE−Cellulose chromatography

form が蛋白化学的にも α−aCtinin−related

で部分精製の後，α一aCtinin抗体を用いてimm−

proteinかどうかを検討した。embryonic form

uno−preCipitationを行い，その後SDS／／乍AGE

が少量しか存在せず通常の精製法が用いられないによってembryonicformとadult formを分離

A a b c d e f g h

i j kl m n o・・，●■−〇㌢■■「■B a b c d e f g h iJ kI m n9

嵐】＿山∴＿雨・∴lf

c a b c d e f g hii klm n o

ヽ■■′−

図3

−■■一一一t■−■−■■■、−r

Filamin，VinculinのimmunoLblotによる検出
Aは蛋白染色，Bは抗filamin抗体によるimmuno−blot，Cは抗vinculin抗体によるimmunorblotを示す。
a，8日目骨格筋：b，10日目上肢筋：C，10日日胸背筋：d，10日目下肢筋
h，15日目下肢筋
e，15日目上肢筋：r，15日目背筋
g，15日日胸筋
1．21日目下肢筋
i，21日目上肢筋：j，21日目背筋
k，21日日胸筋
m，adult胸筋 ： n，adult広背筋
0，adult，SOleus

23 筋発生・分化におけるアクチン結合蛋白の発現様式

129α−Actinin同様，immuno−blot法を用いてし，125Ⅰラベル法で，ペプチド・マップを作成しと検索した。SDS／PAGE，immuno−blotの結果

embryonic formは互いに良く似たパターンを示

を図3に示すがfilamin，Vinculinともに8日〜

すことが明らかになった。同時に異ったspot も15日日embryo骨格筋には，大量に存在することみられ，蛋白の一次構造上，多くの類似があるとがわかる。21日目embryo又成熟動物骨格筋ではともに異った蛋白であることが明らかとなった。

極く微量に存在するか又は検出不能であった。尚更に，COntrOlとして成鶏胸筋，gizzardのα−vinculinについては，平滑筋組織では，meta−actininについても同様のペプチド・マップを作

vinculinとも呼ばれる約150Kdaltonのvin−成したが，gizzardのものはembryonic form

culin−related proteinの存在が報告されているともadult formとも異り，胸筋a−aCtininは15が，15E］目及び21日日embryoで，この meta−

日目embryo胸筋のもの（adult form）と完全に

vinculinが，わずかながら検出された。しかし，一致した。

極く微量であるため，細部にわたる解析は不可能

b．Filaminおよびvinculinの発現であった。

た。図2にその結果を示すが，adult form

Filaminやvinculinは元来平滑筋において発Immuno−blot法による定性的解析に加えて，見されたactin結合蛋白であるが，成熟動物の骨filamin，vinculinの消長を定量的に調べた。筋

格筋や非筋肉細胞にも微量ながら存在することが組織の8M urea抽出液をニトロセルロース膜に明らかになっている。

固定したのち，いわゆるdot assayにより定量L

giZZardaembryonic

b

c

d

e

二∴
＝ご∴∴￣…二＝二

￣
−
恥

￣
欄■
騨

、l一・、 ■−■−
r 搬
＝● 職

−−く■
り
≠

鵬■

図4

潟

挙

曾

◆

乍

二一一一▼
二

■■←■−

■■■■■

サ

Filamin

二

一二

二

二二

b

c

d

e

一

一二∵

・…

二

二＝二二二

■■

■■一一一＼

一

Jも

一

■

■−→■

t

＿＿二

■＿．

二

二二二∴二二「＿−一一￣￣￣

−

−・一−

卿

戒

1

二

a

t

■←一一一

＝■ず〜

〉瀞

の1次元ペプチドマップ

aはorlglnal，bは1FLgのV8prOteaSe，Cは0・5fLg，dは0・2FLg，eは0．1FLg，fは0．05FLgのproteaseを使用した。

−

130

Ⅵ
蓑1ニワトリembryo

生

化

学

骨格筋のVinwlin，Filaminの畠的変化

Vjnculjn

Fllamln

Muscle Source（ng／mg proteうn）8d．embryo，lO d．embryo，

1083

6278

uPPerljmb

1139

5972

back

1125

5569

1056

5944

＆breastlowerljmb

1
8
1

0
8
6
4

9 2
3
4
1
0

8
2
5
4

5
2
1

9
1
8
4

15d．embryo，（ng／mg proteln）

WholelRuSCle

uPPerlimb
backlowerljmb

18
1
4

breast4
9UPperllmb

U21d．embry0，

7
9
5

back

5
4

8
7

PeCtOral2

Adult，

1
1

1
8

SOleus3
5anterjorlatjssjmus dorsj★

6
8

lowerljmb00breastnot detected

た。結果は，表1に示されているが，fila血n，た。

vinculin とも15日日embryoまでははぼ一定量

C．Gelsolinの発現存在するが，21日目では激減し，adultでは更に低濃度しか存在しない。

GelsolinはStosselらによってマクロファージから発見されたアクチン調節蛋白で，aCtinの初期embryo骨格筋に比較的大量に含まれてい核形成を促進するとともに，F−aCtinの切断因

るfilaminやvinculinが筋細胞に由来するのか，子である。その後同様の蛋白が血′ト板，甲状腺，又は他の細胞に由来するかという問題が残るが，

如ZZard等々からも発見されている。小腸粘膜かin ovoの実験からは直接的解答は得られない。

ら見出されたvillinや粘菌から発見されたfragmin

embryoの脳，肝臓について骨格筋と同様にim−も同様の機能を持っている。gizzard gelsolinに

muno−blot法で検出を行ったが，traCe amO−

対する抗体を用いてimmuno−blot法によりgel−

untLか検出出来なかった。従って，間接的な証

solin出現の経過を調べた。10日，12日，15日，

明法ではあるものの，骨格筋に兄いだされたvin−

17日，21日目のembryo骨格筋（ジストロフィー

culinやfilaminが，血管平滑筋や非筋細胞の混

鶏及びコントロール鶏）を開いた。gelsolinは在に由来するとは考えにくい。

embryoの成長に伴い除々に増員するという結果

更に，embryo骨格筋のvinculinやfilaminを得た。したがって，α−aCtinin，filamin，が，gizzard由来の蛋白と異なるかどうかを知る

vinculinの様に15日目〜21日目の間にembryo−

目的で，一次元ペプチド，マッピングを行った。

nic formからadult formへの変換又は消失

図4，5に示す様にembryo骨格筋のfilaminやするといった劇的な変化は，gelsolinでは起こら

Vinculinはgizzard由来のも6）と差異がなかっないと考えられた。

23 筋発生・分化におけるアクチン結合蛋白の発現様式

gizzardab

131

embryonic
C

d

e

f

a

b

c

d

e

f

●●■︐

一▲一●

●

●†

↑●r

l ︻ ∵

疇

一︻

■『I『樗㌻う■●●凝⁚＝■釆娠

Vinculinの1次元ペプチドマップa〜fまでは図4と同様に処理した。

ま

と

め

．
轟
．
鮮
・
．

図5

時期に分子種の変換又は消失といった大きな変化

Actin結合蛋白（α−aCtinin，filamin，Vin−が起こると考えられる。④しかしgelsolinの様に

culin，gelsolin）について，骨格筋発生・分化に

embryo初期から後期まで徐々に増加しつづけ明

ともなう形式をin ovoで検討したが，実験結果

確な変換点を持たないものも存在する。この様なから以下の様な結論が引き出せる。

結論の上に今後の問題を考えてみると，まず，よ①α−aCtininには，従来明らかにされなかっり多くの筋蛋白を検討した上で，上記の結論が普たembryo特有のisoform（embryonic form）

遍的であるかどうか検証すべきであるが，それにが存在し，tl後期embryo （15〜21El）では消失

加えて，筋蛋白の発現型式を，蛋白レベルのみなLadult formに置き換わる。②平滑筋に特有でらずmRNA又DNAレベルで明らかにすべきで成熟動物骨格筋には微量しか含まれていないと考あろう。また個々の蛋白の発現の解析とともに，えられるfilaminやvinculinは，15日目までの

いかにこれらの蛋白が統合され収縮装置を形成す

embryoには大量に存在するが，以後急激に消失るかを解明する必要があろう。

する。③他の多くの筋蛋白やactin結合蛋白につ文

いても検討した上でなければ，明確なスキームは提出できないが，少くとも上記3種の蛋白を含む，いくつかの筋蛋白においては，一t後期embryo の献

1）大日方 昂：筋発生の細胞生物学（小沢瑛二郎他編）
pp．153−181，学会出版センター（1983）．

132

Ⅵ

生

2）Pinter，K．，etal．：Acta Biochem．BEophys．AcGd．
∫C乙肋〃＆15．：217−222，1980．
3）Feramisco，J．R．，and Burridge，K：J．BioL．Chem．
255：1194−1199，1980．
βわJ．C乃em．250：4007・4021，

6）Towbin，H．，eJd∴Jケoc．血沈Acαd．gc乙

学

76：43504354，1979．
7）Cleveland，D．W．，et．al．：J BLoJ．Chem．252：
1102−1106，1977．

8）田部一史：生化学 53：337−340，1981．

4）Laemmli，U．K．：NbtuTe227；680i85，1970．
5）0 faJreu，P．H．：J
1975．

化

比丘A．

9）Kessler，S．W∴J血m〟乃OJ．117：1482・1489，1976
10）Kobayashi，R．，et．山．：血れJ βわdIgm．113：
607411，1983．

133

24 除神経筋にみられる筋蛋白質分子種の変化
大日方
研究協力者 斉 藤日＊修＊ 大 室 弘 美＊＊

筋原繊維を構成する蛋白質には数種の異なるア

ことにより，片側の胸筋のみを除神経した。神経イソフォームが存在すること，及び胚（又は胎児）の再生を妨げるために切断された神経の末端を背の発生過程や，生後の成長過程に発現される筋蛋部の皮膚に縫いつけた。この処理により，手術さ白質のタイプが著しく変化することが最近の多数れた側の翼の運動は全く不能となり，胸筋は約1の研究により明らかにされてきた。ニワトリ胸筋週間以上経過すると白みを帯びた。ヒヨコの場合

では，このような蛋白質の変化が特に顕著にみらは，胸筋の湿東員の増加が著しく阻害された。ほれる。発生に伴う蛋白質の変化を大別すると，そとんどすべての実験において，除神経された筋との変化は胚型→新生児型→親型に整理される。種除神経手術を施されなかった側の胸筋（対照筋）々の筋蛋白質について，発生過程での変化がみらについて，胸筋のほぼ中央の表層部から小片を採れる時期は，すべてが協調しているわけではない。

取し，蛋白質のタイプを比較検討した。胸部の深ミオシンL鎖についてみると，胚の初期には速筋部の赤色領域を除けば，他の領域の胸筋でも基本型，遅筋型が共存するが，胚の成長過程で変化し，的には同様の結果を得ている。

ふ化前に胸筋では速筋型のみとなる。それに対し筋蛋白質のタイプの解析：検討した蛋白質は，てトロポミオシン，トロポニンT，C蛋白質，ミトロポミオシン，トロポニンT，C蛋白質，ミオ

オシンアイソザイムなどの組成は，胸筋のふ化後シンアイソザイム，ミオシンL鎖である。トロポの成長期にはぼ協調して，顕著に変化することをミオシンとミオシンL鎖は0′Farrellの二次元電既に報告した。本研究では，ニワトリ胸筋の成気泳動法により，ミオシンアイソザイムはピロリ

長に伴う蛋白質アイソフォーム変化を支配する要

ン酸ゲル電気泳動法により調べた。トロポニンT因を採ると同時に，筋ジストロフィー鶏でみられのタイプは，筋からのSDS溶液による粗蛋白抽

るような蛋白質の変化を引き起す条件を探る意図

出液をSDS−PAGEにより展開した後，ニトロで，神経支配が筋蛋白質アイソフォームにどのよ

セルロース膜に転写し，抗トロポニンTと抗トうな効果をもつのかを検討した。

ロポミオシン抗体とを用いたイムノプロット法にょり解析したご）胸筋トロポニンTと足型トロポニ

実

験

方

法

ンTは抗原性がほとんど区別されないが，分子員筋の除神経：実験にはすべて白色レグホンを用が異なり，低分子員の後者の移動度がトロポミオ

い，ふ化2日目のヒヨコ，又は2〜4カ月令のニ

シンの場合とはぼ一致することから容易に識別可

ワトリの片側の第14，15，16頚椎神経を切断する能であった。C蛋白質のタイプは，筋の凍結切片に，抗速筋C蛋白質（ポリクローナル）と抗遅筋＊千葉大学理学部生物学科＊＊東京都臨床医学総合研究所

C蛋白質（モノクローナル）を作用させ，間接蛍光抗体法で調べた。

134

Ⅵ

生

化

学
結

果

トロポミオシン，トロポニンT，ミオシンアイ

ソザイム，C蛋白質のいずれについてみても，ふ●TMβ化直後のヒヨコに除神経手術を施した場合，蛋●TMa

白質のタイプが新生児型から親型への移行が著し
く阻害された。又，成鶏の胸筋を除神経した場合には，これらの蛋白質のタイプが親型から再び新新生児型へ逆行することがみられた。以下，個々の蛋白質の場合についてのべる。
トロポミオシン：既に報告されているようにデ，6）
ふ化直後のヒヨコ胸筋にはα，β両種のトロポミ
オシンが共存する（図1a）。正常な筋の成長につれ，βトロポミオシンは除々に消失し，ふ化1

■−

●

●

カ月後には胸型の主要部分にはほとんど全くみられなくなる。このことは，本実験で用いた対照筋，
即ち，一方の胸筋が除神経されているようなケースでも，無傷の側の筋では全く同様にみられた（図●1・b，d，f）。ところが，ふ化直後に除神経された胸筋では，ヒヨコが1カ月令まで成長してもな
おβトロポミオシンは，ふ化直後のヒヨコ同様に存在しつづけることが認められた。一方，βトロ
ポミオシンをほとんど全く含まなくなっている2●●〜4カ月令のニワトリ胸筋（図1．h，j，1）を除神経したところ，2週間後にはβトロポミオシンが微量ながら出現し（図1．k），1カ月後には非常に明瞭にβトロポミオシンの存在が認められた（図1．m）。この時のα，βトロポミオシンの量●●比は，ふ化直後のヒヨコの場合とはぼ同様であった。

k

トロポニンT：ふ化直後のヒヨコの胸筋は胸型
卜ロボニンT（MW38K）の他に，足型トロポニ

・■■

1■

◆

a
m

ンT（MW35K）が共存し，成長を続けると2週間後位までに足型トロポニンTが顕著に減少していく（図2e）。ふ化直後に除神経し，成長させ

図1正常筋と除神経筋のトロポミオシンの二次元電気泳動パターン：ニワトリ胸筋をふ
化2日後（b一g）又は3か月後（h一m）に除神経し，手術後，1週間後（b，C，h，i），2週間後（d，e，j，k）又は，3週間後（f，g，1，m）に調べた。図の左半分は対照筋を，右半分は除神経筋を示す。aはふ化2日目の胸筋におけるトロポミオシンのパターン。

24 除神経筋にみられる筋蛋白質分子種の変化

135

T在￣一一ヽ■−■・一●■嶋「■
2

1
一
l
l

■ ︼ l

h

129

1fT

12e

12d

2C

1

2b

1

2a

l

図2

12、12

除神経筋（d，f，h，j）と対照筋（C，e，g，i）におけるトロポニンTのタイプ：ふ化2日後（CLf）又は2か月後（g−j）に除神経し，1過（C，d），
2週（e，f，g，h）及び1か月（i，j）後に，筋蛋白質抽出物を得，SDS−PAGEを行ない，イムノプロット法で調べた。それぞれの場合について（1）は抗トロポニン抗体で処理したもの，（2）は分子量マーカーとしてトロポミオシンの泳動位置をみるために，抗トロポミオシン抗体で処理したもの。

た胸筋から抽出された蛋白質について，抗トロポ

FM3であるのが成長するとFMl＞FM2＞FM3

ニンT抗体を用いて，イムノプロットを行なったに変化することが既に知られている。ふ化2日

ところ，対照筋では，陶型トロポニンTに相当す

目に除神経した場合，ニワトリの成長が進んでも，るはぼ単一のバンドのみが得られたのに反し，除ミオシンアイソザイムの量的関係は変化せず，新神経された筋の場合には，1カ月令になっても分生児期と同様のパターンを示した（図3．C，e）。

子量のことなる2本のバンドがみられた（図2．f）。

3カ月令の成鶏胸筋を除神経したところ，FMl

これらのバンドを抗トロポミオシン抗体により得の顕著な減少がみられ，ミオシンアイソザイムのられたバンドと比較した結果，抗トロポニンT抗パターンは，ふ化直後のヒヨコ同様，FMlくFM2体により生じた低分子量のバンドは，分子量から

くFM3となった。FMlの相対量の減少は，ミオ

判断して，足型トロポニンTであると判定された。

シンL鎖のうち速筋型L鎖（Lf3）の減少と対応し即ち，除神経筋では成長しても足型トロポニンTていることが認められた。しかし，除神経に遅筋をもちつづけるとみなされる。成鶏胸筋を除神経した場合には，約2週間後に再び足型トロポニン型ミオシンL鎖が出現することは，特にみられなかった。

Tの出現を認めることができたく図2．h）。1カ月

C蛋白質：ふ化直後の胸筋のほとんどの細胞は，後には足型トロポニンTは更に顕著となった（図速筋型C蛋白質と遅筋型C蛋白質を共にもってい2．j）。

るが，2週令までに後者がほぼ完全に消失する。

ミオシンアイソザイム：ニワトリ胸筋には，速しかし，ふ化直後に除神経された場合，1カ月令

筋型の3種のミオシンアイソザイム（移動度の順となってもほとんどの細胞が，両方のタイプのCにFMl，FM2，FM3）が存在することがピロリ

蛋白質を含むことが胸筋の連続凍結切片に抗速筋

ン酸ゲル電気泳動法により検出される。正常筋の型，及び抗遅筋型C蛋白質抗体を作用させ，間接発生過程では，ふ化直後には，FMlくFM2く蛍光抗体法により調べた結果明らかになった。又，

136

Ⅵ

生

化

学

Tt日暮膨幣；器…
a bc de f g
図3

除神経筋（C，e，g）と対照筋から得られるミオシンアイソザイム（FMl，FM2，
FM3）のピロリン酸ゲル電気泳動パターン。ふ化2日（b，C，d，e）又は3か月（f，g）に除神経し，2過（b，C）又は1か月後（d，e，f，g）に調べた。aは無処理のふ化2日日のヒヨコのパターン。

図4 除神経によって引きおこされたC蛋白質アイソフォームの変化。2か月令のニワト
リ胸筋を除神経し，1週間後に凍結切片を作成し，抗速筋C蛋白質抗体（A，B）
又は，抗遅筋C蛋白質抗体（C，D）を作用させて間接蛍光抗体法で調べた。上段（A，C）は対賂軌下段（B，D）は除神経筋を示す。スケール，100fLm。

24 除神経筋にみられる筋蛋白質分子種の変化

137

2カ月令の胸筋を除神経したところ，約1週間にー症のニワトリ胸筋でのタンパク質の変化とよくは，多くの細胞が再び遅筋型C蛋白質を含むよう一致している。筋ジストロフィー筋との類似性は，になり・（図4．D），時間を経るほつれ，更に明瞭

単なる現象的一致にすぎないかもしれないが，今になった。このように除神経された胸筋に遅筋型

後，ニワトリにおける筋ジストロフィー症筋におC蛋白質が出現してくる場合，再生細胞と思われる小型の細胞に特異的に出現してくるというのでける筋蛋白質遺伝子発現の問題を考えていく上での示唆となるであろう。

はなく，大きさからみて既存細胞と思われるものにかなり一様に出現してくるようである。このことはC蛋白質でみる限り，成熟分化した細胞が除神経されることにより幼若化するという印象が強
い。

文

献

1）大日方 昂（1983）筋肉の分化一筋蛋白質の多塑性と可変性 科学53；689−696．
2）Matsuda，R．，Obinata，T．＆Shimada，Y．（1981）
Types

of

troponincomponents

duringdevelop一

ment of chicken skeletalmuscle．Devetop．BEo7．．
82：11−19．

考察

本研究での観察結果から判断すると，トロポミ
オシン，トロポニンT，ミオシンアイソザイム，

C蛋白質などで顕著にみられるふ化直後の新生児型の筋タンパク質組成から親型の筋タンパク質組成への移行はかなり可塑性があり，また，この変化および親型の筋タンパク質組成の維持には神経支配が深く関わっていると思われる。しかし，胚から新生児期への過程でタンパク質アイソフォー
ムの変化がおこるミオシンL鎖の場合は，神経切断の影響をほとんど受けない。このことは，神経切断によってタンパク質組成が胚型までは戻らないことを示す。いいかえれば，胚型→新生児型と，新生児型→規型のタンパク質アイソフォーム変異に関わる要因は同一ではない可能性を示している。
最近，筋ジストロフィー症の発症に相応して，一群の筋構造タンパク質のタイプが顕著に変化し，幼若筋の特徴を示すようになることが明らかになった。本研究でみられた除神経筋におけるタン
パク質アイソフォームの変化は，筋ジストロフイ

3）Obinata，T．，Reinach，F．C．，Bader，I）．M．，Masaki，T．，Kitani，S．＆Fischman，D．A．（1984）Immuno−
chemicalanalysis ofC−PTOteinisoformtransitions
duringthedeYelopmentofchickenskeletalrnuscle・
伽yebp．βfoJ．101：inpress．
4）Takano｛）hmuro，H．Obinata，T．Masaki，T．＆Mikawa，T．（1983）Changesin myosinisozymes
during development of chicken breast muscle・エβわCカeJれ91；1305・1311．

5）Reinach，F．C．，Masaki，T．，Shaflq，S．，Obinata，T．＆Fischman，D．A．（1982）Isofoms ofC−PrOteinin
adult chicken skeletal muscle：Detection withmonoclonalantibodies．J．CbttBiot．95：78−84．
6）Roy，R．K．，Streter，F．A．＆ SarkaT，S．（1979）
Changesin．tropomyoslin subunits and myosin
light chains during development of chicken andrabbitstriatedmuscles．Dev．Biot．69：15・30．
7）Obinata，T．，Saitoh，0．＆Takan0−Ohmuro，H．
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tions of tropornyosln，trOpOninand myosiniso・
zymein chicken breast muscle・J・BEochem・95；
585−588．
8）Hoh，J．F．Y．：DevelopmentalChangesin chickenskeletalmyosinisozymes．FEBSLetl．98：267−270．
9）Obinata，T．，Takano・Ohmuro，H．＆Matsuda，R・（1980）OlangeSintroponinT and myosiniso・
zymes during development of normal and dys−

trophic chicken muscles・ETBSLett・，120：195−
198．
10）Takeda，S．＆Nonomura，Y．（1980）Presenceofthe
tropomyosinβヾhainindystrophicchickenbreast

muscle．朗omed．ReJ．，1：176・179．

138

25

ニワトリ胸筋および足筋におけるトロポニン
Tの発生−モノクローン抗体を用いた研究−

嶋 田

裕＊

研究協力者 清 水 法 子＊

は

じ

め

材料 と 方法にニワトリの胸筋および足筋には，それぞれ特有抗体の調製：僻化後5日のヒヨコ胸筋からTNのトロポニンT（TN−T）が存在する。すなわち，−Tを分離精製し，これを抗原としてBALB／C

胸筋のTN−T（胸型TN−T）の分子量は38，000

マウスに注射した。その脾細胞とミエローマ細胞であり，足筋のTN−T（足型TN−T）の分子量はをポリエチレングリコールにより融合させ，HAT

34．000である1：しかし各々の一次構造は非常に培地によりハイブリドーマを選択した。特異抗体

類似している ため，従来のポリクローン抗体で活性は，固相ラジオイムノアッセイ（RIA）法には両者を区別することができなかった。

より行った。クローニングは限定希釈声を2〜3筋の発生過程で筋蛋白質の型（』00rm）は変化回行った。活性を持つハイブリドーマをマウス腹することが知られてきている。TN−Tにおいて腔内に注射し，その腹水から抗体を精製して使用も同様のことが明らかにされている。すなわち，した。

胚の骨格筋は胸筋TN−Tに対する抗体だけでな

イムノプロット法：SDS−アクリルアミド電気

く，心筋TN−Tに対する抗体とも反応するが，発泳動（13％ゲル使用）で蛋白を分離した後，ニト生が進むと抗心筋TN−T抗体に対する反応性はロセルロース膜に転写し，これに抗TN−Tモノ

消失する。また胚の時期には胸筋も足筋も足型のクローン抗体およびベルオキシダーゼ標識抗マウ

分子量をもつTN−Tを合成しているが，醇化後スIgG抗体を反応させ，発色させた。

には胸筋は胸型TN−Tに変換し，足筋は足型TN

蛍光顕微鏡的観察：成体および幼若（楷卵12日，−Tのままである。さらに免疫電子顕微鏡的にも17日）ニワトリ胸筋，足筋（m．iliotibialis

筋原線維上にできる縞の幅の相違により，前者のPOSterior）および後広背筋（PLD）の横断連続変換が確認されている。しかし組織内での分布様

凍結切片を作製し，2％パラホルムアルデヒドで式や細胞レベルでの変換などは知られていない。

5分間固定した。切片はモノクローン抗体と反応

本研究では胸型TN−Tと足型TN−Tを区別させた後，0．4MMgC12，10mMtris−HCl

できるモノクローン抗体を作製し，これを用いて（pH7．6）で，さらにPBSで洗い，FITC標識

胸筋，足筋および後広背筋（PLD）における胸型

抗マウスIgG抗体を反応させ，間接蛍光抗体法

および足型TN−Tの分布を免疫組織学的に発生により観察した。

段階を追って調べた。
結＊千葉大学医学部解剖学第1講座

果得られたモノクローン抗体の反応性をイムノブ

25ニワトリ胸筋および足筋におけるトロポニンTの発生・モノクローナル抗体を用いた研究

139

Tris−HCl（pH7．6）で洗うことにより除去することができた。F5D3およびG5G4は，この条件

BreastLeg下でも反応性に相違はみられなかった。これらの抗体のうち，F5D3とD5を用いて，成体および幼若ニワトリの胸筋，足筋およびPLDを間接蛍

l■l■■■』■媚｛■光抗体法により観察した。
−』鴨｝

12日胚における胸筋，足筋，PLDはいずれも
F5D3とのみ反応した。15日胚頃からF5D3とともに，D5とも反応する線経が現われ始めた。その後は各筋でそれぞれ異なる変化を示した。
胸筋では貯卵15日頃よりF5D3とともにD5とも反応する線経が増加し，成体の筋線経はすべて

a

図1

D

c

d

e

f

イムノプロット法によるモノクローン抗体の反応性。成体胸筋TN−T（a，b．C）および成体足筋TN−T（d，e，f）電気泳動をニトロセルロース膜に転写し，アミドブラック（a，d），F5
D3（b，e），D5（C，f）で処理した。

両抗体と反応するようになった（図2）。足筋では筋卵17日頃にF5D3で染まると同時に，一時的にD5とも反応する線経が増加したが，貯化後にはこのような線経は著しく減少した。成体では足筋の線経はF5D3とのみ反応した（図3）。PLD
では胸筋と同様に，F5D3とD5の両者に反応する線経は15日頃より増加した。成体においてはF5

ロット法（図1）および間接蛍光抗体法により調べ

D3およびD5と反応する線経と，F5D3とのみ反た結果，反応性の異なるつぎの3種類の抗体が得応する線維とがあり，この2型の線経の分布はモられた（衰1）。①胸筋および足筋のTN−Tと反ザイク状であった（図4）。胸筋および足筋にお応する抗体（F5D3）②胸筋TN−Tとのみ反応

いては，D5に反応する線経は，径の小さな線経する抗体（D5）③すべての骨格筋（胸筋，足筋，から染まり始める傾向があったが，PLDではそ

前広背筋ALD）および心筋と反応する抗体（G5のような所見は観察されなかった。

G4）。D5はイムノブロット法では胸型TN−Tとだけ反応し，足型TN−Tとは反応しない（図考案1）が，間接蛍光抗体法やRIA法では弱く反応用いた抗原は酵化後5日の胸筋で，胸型・足型

した。この弱い反応性はモノクローン抗体を低濃の両型のTN−Tを含んでいる。合計4回の融合度（2〜5〝g／忘恩）で使用し，反応後0．4M鳩Cも，を行ったが，胸型TN−Tのみを認識する抗体は得られたが，足型TN−Tを認識する抗体は得ら

表1モノクローン抗体の反応性れなかった。これは胸型TN−Tは一次構造のN末端で足型TN−Tよりやや良いだけで，残りはAntjbody

大部分同じである1）ためであると考えられる。まReactivity with

Monoclonal

Breast Leg ALD Cardiac

た胚のTN−Tのみを認識するような胚型TN−T抗体も得られなかった。

F5D3

＋

D5

＋

G5G4

十

＋

胸型TN−Tと強く反応する抗体（D5）はイム
十＋＋ノブロット法では足型TN−Tとは全く反応しな
かったが，間接蛍光抗体法やRIA法では弱く反

Ⅵ

140

生

化

学

Breast
F5D3

r

→′

⊥▼

∴

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．．ヽ・

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一

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一一一ざ・

C一・巨∵∵豆予㍉昌・

−

モ

l

l

＼

（図2）
図2−4 間接蛍光抗体法による筋発生段階の観察。12日胚（a，d），17日胚（b，e）および成体（C，f）の胸筋（図2 ），足筋（図3）およびPLD（図4）を，
F5D3（a，b，C）およびD5 （d，e，f）により染色した。
応した。この反応を防ぐためには，モノクローン

片に存在するTN−Tの種類には①足型のTN−抗体反応後，通常より塩濃度を上げた溶液で洗う

Tおよび②新しい型のTN−Tの存在の2つの可ことが効果的であった。これは胸型・足型両TN能性が考えられる。成体の足筋の場合は前者であ−Tは高次構造が類似しているので，その構造がるといえる。幼若胚の場合，電気泳動の結果では保たれるような方法（間接蛍光抗体法，RIA法）

足型TN−Tと同分子量を持つ2）が，抗心筋TN

ではD5が足型TN−Tとも弱く反応するためで−T抗休とも反応する ことから後者の可能性もあると考えられる。

残る。

間接蛍光抗体法において，胸型TN−Tだけを胸筋，足筋，PLDのいずれにおいても，発生認識する抗体（D5）とは反応せず胸型・足型両TNの初期には足型TN−Tの線維のみがみられた。

−Tを認識する抗体（F5D3）と反応した場合、切そして脾卵15日前後には胸型TN−Tを持つ線維25

ニワトリ胸筋および足筋におけるトロポニンTの発生・モノクローナル抗体を用いた研究

141

Leg
F5D3

D5

（図3）

が現われ始めた。特に胸筋，足筋においては，こ一Tが存在する）の3段階に分けることができる。

の時期に新生された′ト径の細胞が胸型TN−Tを胸筋TN−Tにおいても同様の変換の行われてい合成し始めると考えられた。胸筋では足型TN−る可能性はあるが，本研究では区別できなかった。

Tに対する反応性は胸型に変換して行った。この成体のPLDは，ATPaseおよびミオシンに関所見は松田ら2）により報告された電気泳動によるしては速筋型を示し，C一蛋白質に関してはすべ結果と一致する。一方，足筋では再び胸型TN−ての線経が同時に遅筋型と速筋型（胸筋型）を呈

Tは減少した。この所見は発生過程の胸筋におけしている。また二次元電気泳動法ではPLDはるミオシンH鎖にみられる胚型→新生児型→親型

胸型と足型のTN−Tを含むことが示されていという3段階の変化 に類似している。すなわち，る雲本研究ではPLDのTN−Tは胸型と足型の足筋の発生は胚期（胸型TN−Tを持たず，抗心筋TNrT抗体と反応する）→新生児期（胸型TN2型を有すること，またそれらは同一線経に存在するのではなく，各線経はモザイク状に配置され−Tを持つ線経が出現する）→成熟期（足型TNていることを示した。

5，6）

142

Ⅵ

生

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（図4）

筋の特性は神経に依存しているのであろうという報告は数多くみられる。この考えに従えば，な修飾の可能性も考えられ，これらは今後に残された課題である。

ATPase，ミオシン，C−蛋白質の表現型から判断すると，PLDのすべての線経は同一の性質を有する神経の支配をうけているようにみえる。ところがTN−Tについてみると矛盾が生ずる。さらに胸筋のミオシンH鎖と足筋のTN−Tは3段階の変換を示すが，胸筋のTN−Tは2段階であるというように，遺伝子の発現は非常に複雑である。これらを調節している因子には神経性のものの存在を除外することはできないが，さらに別の因子の関与による表現型の直接的あるいは間接的文

献1）Wilkinson，J．M．：Thecomponentsoftropominfrom
Chicken fast skeletal muscle．A compariSon of
troponin T and troponinI from breast andleg
muscle．βわ虎em．ん169：229−238，1978．
2）Matsuda，R．，Obinata，T．andShimada，Y．：Types
Of troponin components during developmentin
Chickenskeletalmuscle．DeveZop．Biol．，81：11−19，
1981．
3）Toyota，N．and Shimada，Y．：Differentiation of
troponinincardiacandskeletalmusclesinchicken
embryosasstudiedbyimmunofluorescencemicro−
SCOpy．よα〃βfoJ．，91；497−504，1981．

25 ニワトリ胸筋および屈筋におけるトロポニンTの発生．モノクローナル抗体を用いた研究 143
4）Bader，D・，Masaki，T．and Fischman，D．A．：Im−
munochemical analysis of myosin heavy chain
duringavianmyogenesisinvEyoandET7Vitro．J．αtL
βわし95：763−770，1982．

5）Reinach，F・C・，Masaki，T．，Shafiq，S．，Obinata，T．
and Fischman，D・A・：Isoforms of C−prOteinin
adult chicken skeletal muscle：detection withmonoclonal antibodies・J αtlBioL，95：78−84，
1982．

6）Reinach，F．C．，Masaki，T．and Fischman D．A．：
Characterization of the C，PrOtein fromposterior

1atissimus dorsi muscle of the adult chicken：
heterogeneity within a single sarcomere．J：Cblt
βbL96：297−300，1983．
7）野々村禎昭・武田伸一：ジストロフィー鶏筋の構造
蛋白IEF・SDS二次元電気泳動による分析。筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）。昭和55年
度研究報告書，114−123，1981．
8）Toyota，N・andShimada，Y．：Isoformoftroponinin skeletaland cardiac muscle cells culturedwith
andwithoutnerves．Cbtt，33：297・304，1983．

144

26

ウサギ胎仔骨格筋構造蛋白に対する抗トロ
ポニンの影響大 槻 磐 男＊研究協力者 小野山 住 道＊

骨格筋の細いフィラメントは，アクチン・トロ

特異抗体はトロポニンC又はⅠの77イニティク

ポミオシン・トロポニンの三種の蛋白の規則的なロマトグラフィーによって作製した。成熟ウサギ

重合体で，筋肉内では約1ミクロンの一定の長さ・ミオシンBは江橋の方法に従って調製した。24に揃って配列している。この細いフィラメントの日及び28日目の胎仔骨格筋のミオシンBは構造形成についてこれまで次の様な所見を得てきHitchcockの方法に従って調製した。アクトミオ

た。抗トロポニンのサポニン法によるニワトリ胸シンATP ase活性の測定条件は，0．1mg／ml

筋内における局在部位から，胚筋ではフィラメン

ミオシンB，50mMKCl，2mMMgC12，20rnM

ト長が長くまちまちであること，そして膵化後3

Tris−maleate（pH6．8）及び4．6×16￣5M（又は週間以内に一定のフィラメント長に揃うことを見

2．4×16−8M）Ca2十（1mMC。・EGTAb。ff。r）中出した。ニワトリ骨格筋より約0．1′上長いウサギで行なった。加える抗体量は0〜100J唱／mlで骨格筋細いフィラメントにおいても誕生前後に同あった。抗体を加えて25℃15分間置いたのちに2様の変化のおこることを観察した。このように一mMATPを加えてATP ase反応を開始し，TCA

旦長いフィラメントが形成されたのちに短縮する

で6分後に停止させた。そしてATPから分解放機序については，筋肉線経の収縮反応が重要な役出されたリンをBaginskiとZakの方法で測定し割を果しているのではないかと考えられるが，未た。

だ確証が得られる段階に達していない。
今回，我々は，細いフィラメントを形成するト

結果

と考察

ロポニン三成分のうちトロポニンⅠとトロポニン

先ず，成熟ウサギ骨格筋アクトミオシンATP

Cについて特異的な抗体を作製し，そのトロポニ

ase活性に対する抗体の作用を，高カルシウムおンに対する作用を，ATP aseCa感受性を指標よび低カル，シウム濃皮下で測定した（図1）。コンにして，胎後期と成熟ウサギ骨格筋について比較

トロールIgGでは，ミオシンBと同濃度の100FLg

し，細いフィラメント構造形成に伴うトロポニン／mlまで加えても，いずれのカルシウム濃度に三成分の分子配置の変化を議論した。

おいても，活性に影響を及ぼさなかった（図1−A）。
抗トロポニンCを加えると，低カルシウム濃匿で方法の活性が1．9倍，高カルシウム漁匿では2．3倍にウサギ骨格筋から調製したトロポニンⅠとトロそれぞれ上昇した（図1−B）。 いずれの場合もポニンCをヤギに対して免疫し，抗血清を得た。

75〃g／mlで最大効果がみられた。抗トロポニン
Ⅰ抗体を加えた場合は，低カルシウム濃度では抗＊九州大学医学部臨床薬理学教室

トロポニンC抗体の場合と同じく，濃度依存性に∈＼邑︶uu〇〇■⊃一〇一号亡き∈−
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145

26 ウサギ胎仔骨格筋収縮蛋白活性に対する抗トロポニン抗体の影響

146

Ⅵ

生

化

学

活性の上昇を認めた（図1−C）。しかし高カルシ依存して総合量は増加しており，二相性の変化はウム濃度では二相性の反応を示した。即ち，抗体認められなかった。

量が低濃度の場合に活性高著明に促進し，20J鸞／

次に抗体の作用がトロポニンの一成分に対するmlで最大活性（1．7倍）となった。更に抗体濃度作用のみによるのか，あるいは他成分との相互関を増加させると活性は却って抑制したが，100〝g

係にも依存しているのかをみるため，トロポニン／mlでも抗体非存在下より高い値を示した。但の再構成系について検討した。図2は，抗トロポ

長期間保存した抗体では，高濃度下での抑制作用

ニンⅠ抗体を20〝g／ml作用させた例であるが，が弱まり，結果的には抗体量20J唱／ml以上では脱感作アクトミオシンートロポミオシンに，トロ一定値を示した。又，ミオシンBに対する抗体のポニンⅠもしくはトロポニンⅠ・Cのみを加えた

総合量を電気泳動にて検討したが，抗体の濃度に系では，カルシウム濃度にかかわらず抗体による︵U帽ミぎー＼E a●○∈l︶ご； Ud a芸dトV

P Ca
第2図

抗トロポニンl抗体のトロポニン再構成系成熟ウサギ骨格筋アクトミオシンATPase
活性に対する作用
条件；0．1mg／ml脱感作アクトミオシン，0．01mg／miトロポミオシン，
0．05mg／mlトロポニンⅠ（口，r），0．05mg／mlトロポニンⅠ十0．043mg／hlトロポニンC（△，▲），0．05mg／mlトロポニンI＋0．043mg／ml
トロポニンC＋0．0073mg／mlトロポニンT（○，●）。0．02mg／hl
コントロールⅠが（■，▲，●），又は0．02mg／hl・抗トロポニンⅠ抗体（口，△，○）存在下。

26 ウサギ胎仔骨格筋収縮蛋白活性に対する抗トロポニン抗体の影響

第3図 胎仔および成熟ウサギ骨格筋ミオシンBの電気泳動パタン
A，胎令28日胎仔ウサギ骨格筋ミオシンB；B一成熟ウサギ骨格筋ミオシンB；C，成熟ウサギ骨格筋トロポニン00・1％SDS−10％ポリアクリルアミドゲル，
Tris−Glycine（pH8・8）でPorzio＆Pearsonの方法による0147

Ⅵ−生 化

148

活性促進作用はわずかしか認められなかった。ト学／mlでは0．75でやや低下した。

ロポニンⅠ・Tの系についても同様であった。そ以上述べたように，高カルシウム濃皮下でも抗してトロポニンⅠ・C・Tの三成分が揃った場合体が存在すると活性が更に上昇すること，つまりにだけ充分な抗体の作用が発現した。これは抗体

アクトミオシンATP aseの最大活性を増強するの作用が発現するためには，Ⅰ・C・Tの三成分

現象は，この他にも知られでいる。心筋の脱感作が一定の配置をとることが必要なことを示していアクトミオシンおよびトロポミオシンに，心筋のる。

トロポニンTと骨格筋のトロポニンⅠ・Cを加え抗トロポニンC抗体では最大効果のみられる75

ると，ATP ase活性は高カルシウム濃度で生理から100〃g／mlにおいて，カルシウム感受性は的なレベルより更に促進がみられる。また骨格筋

抗体非存在下では0．78に対し，抗体存在下で0．82

脱感作アクトミオシンに，ホヤのトロポミオシン

で殆んど変化しなかった。抗トロポニンⅠ抗体でとトロポニンを加えると，活性はトロポニン非存

も，抗体非存在下で0．92に対し，抗体20J唱／ml

在下のときよりも上昇することが報告されている。

存在下では0．89で同じく殆んど変化せず，100〃g

これらの問には何らかの相関があると思われるが

20
001−−1010．

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P Ca
第4図 胎仔および成熟ウサギ骨格筋アクトミオシンATP ase活性のカルシウム依存性△，胎令28日胎仔；○，成熟ウサギ，
矢印は50％活性時のカルシウム濃度を示す。

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149

26 ウサギ胎仔骨格筋収縮蛋白活性に対する抗トロポニン抗体の影響

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生
Ⅵ

150

151

26 ウサギ胎仔骨格筋収縮蛋白活性に対する抗トロポニン抗体の影響

詳細は将来の問題として残されている。

（図5中央），コントロールIgGでは影響は殆ん

抗トロポニンⅠ抗体が，高カルシウム濃度で二どみられないが，抗体存在下では，低カルシウム

相性の変化を示すことは，トロポニンⅠに二種類

濃度では成熟筋と同じく促進作用があり，しかも以上の抗原性決定部位が存在し，最初に結合する

抗体量が多い程強い。しかし高カルシウム濃度で抗体で活性は促進され，次に他の抗体が抑制の方の促進作剛ま成熟筋の場合の約毎で，作用は明ら向に作用することを示唆する。

かに弱い。ATPaseカルシウム感受性は，胎令24

次に胎仔ウサギ骨格筋に対するこれらの抗体の日及び28日では，成熟筋に比較すると低感受性を作用を，アクトミオシンATP ase活性を用いて示した。（図5右）。抗体を加えると胎仔筋，成熟筋検討した。ミオシンBの抽出時間は成熟筋の場合

共にCa感受性は滅弱傾向を示した。

は2時間であるが，胎令24日，及び28日の場合は

抗トロポニンCの作用を示す（図6）。活性の促

約20時間とした。図3に胎令28日及び成熟ウサギ

進効果はいずれのカルシウム濃度においても認め骨格筋ミオシンBの電気泳動パターンを示す。ミられたが，その作用発現程度は成熟筋に比べるとオシン重鎖／アクチン比は，胎仔筋で3．4，成熟

明らかに弱い。胎令24日では作用が認められなか筋で2．8であった。トロポニンTは成熟筋と同じった。カルシウム感受性は成熟筋では殆んど変化位置に認め，アクチンに対する量比も両者で同様しなかったが胎仔筋では低下が抗体によって認めであった。トロポミオシンは，胎仔筋ではかなりられる。

少なく，そのやや低分子側に別のピークを認めた。

以上のことから，抗トロポニンⅠ及び抗トロポ

胎仔筋（胎令28日）および成熟筋のアクトミオ

ニンC抗体の胎仔筋に対する作用は，成熟筋に比シンATP ase 活性のカノレシウム依存性を図4にべると明らかに弱くしか発現しないと結論できる。

示す。胎仔筋ATPase活性は成熟筋の15から20

現段階では，胎仔筋においてはトロポニンの構成％程度であり，50％活性を示すカルシウム濃蔭は成分の分子種が成熟筋のものとは異なるか，もし成熟筋が4×1√7Mに対し，胎仔筋では8×10￣7M

くは多種類のアイソフォームが混在している可能とやや高濃度を要した。

性と，トロポニン三成分の分子配置が成熟筋の場

胎仔筋のアクトミオシンATPase活性に対す合とは異なっている可能性が考えられる。

る抗トロポニンⅠ抗体の作用を，成熟筋の場合と比較してみると，活性の絶対値は低カルシウム濃度では時期によってもそれ程大きくは変化しない文

献1）Ohtsuki，Ⅰ．J．βfoc加mり85；1377・1378，1979・（図5左）。一方高カルシウム濃度でのATP ase

2）Ohtsuki，Ⅰ．ChqentResearchMuscuZdrLDstrophy，

活性は成長と伴に著明に上昇することを示してい

3）Ohtsuki，Ⅰ．andOnoyama，Y．MuscularDystrophy：

る。又抗体を加えても，胎仔の場合は効果が著明Biomedical Aspects（Ebashi，S．and Ozawa，E・eds．），Pp．193−200，JapanSci．Soc・Press，Tokyo／

でない。高カルシウム濃度でIgGを加えないときの活性値を基準にして，それにコントロールIgG，
または抗体を作用させたときの活性比をみると

力p踊，2：23−24，1981．

Springer−Verlag，Bedin，1983・
4）Toyota，N．and Shimada，Y．J・CbZtBiot・，91：497−504，1981．

152

27

疾患筋筋小胞体膜の機能分類に関する一考察

＊

夫明

敏博

＊

筋構成内部股としての筋小胞体膜は筋収縮・弛

井島

酒西
研究協力者

C）ヒト各種疾患筋は下腿四頭筋又は上腕二頭緩機構の過程でその引金となるCa2十の遊離．取り筋を試料とした。

込み能を持つ重要な部位である。我々はこれまで，

2．分離筋小胞体膜の調整

この筋小胞体膜のC諾＋魂節機能を各種骨格臥疾

各種温血動物の骨格筋は摘出後，直ちIこ，15℃

患筋から分離し比較検討してきた。一般に筋ジス

前後の20mM−Tris−HClbuffer（pH6．8）で十分トロフィー症筋ではこの筋′ト胞体膜のC芸十調節能

洗浄し，細切りした後，筋1g当り20m且の割合が低下しているといわれている。しかし，この原畠の20mM−Tris−Hcl buffer（pH7．2）中でテ因については筋自身に生因が有るのか，神経又はフロンホモジナイザ一にて低回転でホモジネイト

筋接合部における神経筋伝達系機能の低下に在るを行なう。10秒毎にpH6．8〜6．9となる様にホモかの判定は明確になされていない。

ジネイトを行なう。このホモジネイトを粗穴テフ

そこで，我々は温血動物（ラット，鶏）や各種

ロン綱で淀過し，濾液を遠心し，筋小胞体膜を得

ヒト筋疾患筋からの筋小胞体膜を分離し，そのCaる。分離した筋小胞体膜（FSR）のfraction は−uptake能を比較検討し，各々の成因による筋8500−48000×Gまでの試料で有り，従来我々が疾患時の筋小胞体膜の機能がどの様な変化を示す

用いてきたH−fructionの他に2〜3割のL−かを検討した。

fr。。ti。nの混入が有i，4）。
3．Ca−uptake能の測定

材料及び方法
1．実験動物a）ラット下腿筋（EDL）を使用した実験

Ca−uPtake能は従来我々が用いている方法にょった05）反応溶液条件は0・1MKcl．3mMMgc12，
20mMTris一maleat

bufferpH6B，1mMATP，i）ラットの成長にともなう骨格筋を各週別

90−120FLmoles CaC12とした。実験はmilliporeに試料とした。

filt。，諾 によった。また，FSR内4℃。−Ca量はii）成熟ラット（250g）を用い座骨神経切断
によって，その支配筋を各周齢別に試料と液体シンチレーションにて，FSR内及び反応液
中のCa量は原子吸光法によって測定した。

2）した。
b）ジストロフィーチキン（New Hampshire

結果 と 考察412．413）の幼鶏（3〜5週）及び成鶏のPLD

温血動物のFSRの調整は冷血動物とは異なりを試料とした。

分離操作中の液性変化が著しく，特に数百ミリグ
ラムの筋から得られた試料では，L−fructionの＊東京慈恵会医科大学第二生理学教室

混入が有る事，そのCaruptake能はH−fruction

27 疾患筋筋小胞休暇の機能分頓に関する一考察

153のみの場合より遅延する傾向を示した。従って，と同程度か，または，わずかに低い程度であった。

本実験ではATP添加後60秒以内に最大Ca−uP

一方，筋ジストロフィーチキンのPLD筋からtake量を示し，その1／2の時間で最大量の80％のFSRのCa−uPtake能を測定した結果，幼若鶏

程度のCa員を取り込むこと，最大Ca塁は2分からのFSRのCa−uPtake能は，その初期にお前後は一定値を保つこと，最大値を示した後，l

いて著明な抑制を示すが最大量は正常鶏FSRとmMc。ff。in。で最大員の7〜8％程度のCa十品を同程皮のCa畠にまで達した。またジストロフィ

遊離すること，以上の四点を満足するCa−uPtakeーの進行した成鶏のFSRではCa−uPtake能初能を示すFSRを正常FSRとした。

期での抑制と，最大Ca量の抑制が示されていた。

温血動物骨格筋の筋機能は加齢にともなって変ジストロフィーチキンでは幼若鶏，幼熟鶏からの動する事は良く知られている。従って，FSRのFSRのいずれもがcaffeineによるCa−release

Ca−uptake能も加齢によって変動する事が考慮

は正常鶏FSRに比し著明であった。

されねばならない。そこで，加齢にともなうFSR

ラットの除神経による支配筋の萎縮はその期間のCa−uPtake能の変動をラットを用いて実験しの延長によって進行し，支配筋からのFSRのCaた。その結果，幼若ラット骨格筋のFSRでは，−uptake能は抑制される事が知られている。こ

成熟ラット骨格筋FSRのCa−uPtake能に比較の除神経筋のFSRのCa−uPtake能は除神経の初して，初期のCa−uPtake能及び最大Ca塁もと期過程ではCa二uPtake初期における抑制と最大もに，平衡的に低値を示していた。また，Carf一

Ca塁の平衡的な低下が示された。しかし，除神。in。によるFSR内Cg＋の遊離は成熟ラットFSR

経の進行と共にCa−uPtake初期における抑制よC a−

C a −re Iea s e

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型
ⅠⅠ

土

土

幼鶏

Ⅰ

土

＋

成 鶏

Ⅳ

＋

＋＋

1W

1 ．幼 若 筋 （R a t）
2 ．筋 ジ ス チ キ ン

3 ．除 神 経 筋

4 ．筋 無 力症

Ⅰ
Ⅰ

土

土

4 W

Ⅰ
Ⅰ

土

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土

A

H

土

B

111

土

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土

土

5 ．甲状 腺 稜 能 瓦 進 症

Ⅰ

土

＋

A

Ⅳ

＋

＋

B

Ⅳ

＋

＋＋

6 ．周 期 性 四 肢 麻 痺
7 ．D M P

土（図1）
図1・Ca−uptakeの型は図2中のⅠ〜Ⅳ型の分頬から判別したO
・Ca−releaseはS；CaffeineなしでsteadystateにおけるCa−releaseを示した。
R；Caffeine（lmM）添加によるCa−
releaseを示した。

154

Ⅵ

生

化

学

む上勺芸⊃・qO

A：Maximum value of Ca・uPtake

B‥言B．

7・uPtakerate
R：Ca−release by caffeine
S：Ca−VarUein steady state￠Jqldコ・qU

む上空d⊃・QU

匿むJq宣⊃・qU…￣≡（図2）

りも，最大Ca量の低下が著しくなり，また，

よるCa−releaseは示されなかった。

CaffeineによるCa−releaseは抑制される。すな

一方，甲状腺機能元進症と診断され，下腿筋のわち，除神経筋FSRは幼若筋FSRと同傾向の萎縮が示された46才の女性では筋無力症と診断さCa−uptake能を示すが，Caffeineに対するCaれた筋のFSRと同様なCa−uptake能を示して−release能が著しく異なる事から，除神経によいた。また，低血党性の周期性四肢麻痺と診るFSR膜内構成成分の変化が予測される。

断された24才の男性の下腿四頭筋からのFSRでヒトの各種疾患筋からのFSRの調整に際し，
我々はラットの加齢にともなうFSRのCa−uptake

は正常FSRと比較してCa−uptake初期に抑制されるが最大Ca畠は正常であった。

能が変動する事実1）を参考にして，対照疾患患者

筋原性疾患とされているDuchenne型筋ジストと，同年令，同体重の筋疾患のないと卜骨格筋

ロフィーと診断された7才男児（図ト7A）及び6

FSRを用い，正常対照FSRとした。

才男児（双生児図ト7B）の上腕二頭筋から分離

神経原性の筋疾患とされる筋無力症と診断されしたFSRではジストロフィー成鶏筋から得られた46才の男性（図ト4A）の大腿四頭筋からのFSR

たFSRと同様なCa−uPtake能を示し，Ca−では初期Ca−uPtake能と最大Ca量が平衡的にuptake能初期の強い抑制と最大量の低下が示さ抑制される，幼若鶏と同様なCa−uptake能を示したが，CaffeineによるCa−release量は極めてれ，またcaffeineによるCa−releaseの冗進を認めた。

低値であった。また全身型筋無力症と診断された以上の実験結果から，我々は各種疾患筋FSRの29才の男性の大腿四頭筋からのFSRでは，図1

Ca−uptake能を基本的な四つのパターンに分類し中の除神経筋8週ラット下腿筋のFSRと同様なてみた。この四つの基本的パターンに改めて本実験

Ca−uptake能を示していた。また，Caffeineに結果を適用すると図2に示した様になった。この27疾患筋筋小胞体膜の機能分頬に関する一考察

結果から我々は神経原性に由来するとされる萎縮からのFSRのCa−uPtake能は1型又はⅢ型に分類された。すなわち，疾患初期又は筋萎縮初期
ではCa−uPtake初期，及び最大Ca塁の抑制が示され，萎縮の進行した筋では最大Ca−uPtake
員の著明な低下が示される。またcaffeineによる
Ca−releaseは萎縮の進行と共に低下した。一九

文

155

献

1）Ogino，U・Takahashi，A．andNis的imaH．Develop−
mentalchangesinthefunctionoffragmentalsarco−
plasmic reticulum from skeletal muscle of rat．
詔加丑αf〟edJ30；335・345，1983．

2）Nis的imaH・Nagano・T．andImaiT．Tnechanges
Of ca−uptake on fragmented saLCOplasmic reti・
Culumfromthedenervatedandinnervatedmuscle
Orrat．Inpreparation．
3）Sakai・T・andNishijima，H．：Changesintheamount

筋原性疾患とされ筋からのFSRCa−uPtake能Ofca−uptakeandproteinandlipidcompositionon
SarCOPlasmic reticulum from denervated ratandは図1中のⅠ型又はⅣ型に分類された。すなわち，

dystrophic chicken muscles musculaL dystrophy（Biochemicalaspects）Ed．Ebashi．S．andOzawaE．

初期Ca−uptakeの抑制のみが示される型（I型）と，最大Ca−uptake量の抑制も示される型（Ⅳ型）であり，最大Ca量を示した後に，Ca−re−leaseと想定されるFSR内Ca員の減少が示される。また，CaffeineによるCa−releaseが元進している事から，我々はCa−induced Ca−rele−
aseが正常FSRよりも引き起こされやすい条件
が具っているものと考えた。

九戸α乃gcf．Jbc．介e∫∫7わめ，0／5pr血ger一作′わg，助′肋177・183，1983．

4）Nishijima，H．，Shiba，R．，and Ogino，U．：The
methOd for theprepaTation offragmented sarco−
PlasmiCreticulumfromsmallpiecesoflegskeletal
musclesorrat．此ef〟edエ25：287−290，1978．
5）Nishijima，H，，Ito，U．，and Kuriyama，H．：Onthe
abilityofca−uPtakeinthefragmentedsarcoplasmic
reticulum extracted from the guinea pig mastic−

atory muscles．舟肛‥小机
1973．

ノ拍止

49：367−371，

6）Nis的ima，H．：The passive ca−bound to themi11i−
POrefiltermembraneandfragmentedsarcoplasmic
reticulum．此e肋J〟ed．エ22：267−275，1975．

Ⅶ

プ

ロ

テ

ア

ー

ゼ

28．サル骨格筋カテプシンBの精製と性質

159

29．内在性チオールプロテアーゼインヒビターの構造と活性発現機構

164

30．ブビバカイン（マーカイン）による急性筋崩壊の機序

169

31．m−CANPと天然型p−CANPとの比較研究

173

32．筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモデル
における酵素網の比較

177

33．幾つかの筋神経系異常マウスに於けるアルカリプロテアーゼ活性の変化

182

159

28

サル骨格筋カテプシンBの精製と性質

高 橋 健 治＊研究協力者 平′尾 哲 二＊ 原

薫＊

筋組織中に存在するプロテアーゼの精製と性状

1．5MNaCl附近で溶出する宿性分画を集め，再の検索は，筋ジストロフィー症等の筋組織病態のクロマトグラフィーを行なった後，セファデック

成因を追究する上で基礎的に重要である。筋組織

スG−75カラム（1．5×125cm）で2回ゲルろ過の蛋白質の分解には，非リソゾーム系プロテアー

する。最後に活性分画を有機水銀セファロースカ

ゼであるCa2＋依存性中性プロテアーゼ（CANP）

ラム（1×8cm）によるアフイニティークロマト等とともに．リソゾーム系のプロテアーゼ，とくグラフィーにかけ，50mM2−メルカプトエタノーにカテプシンB，L等が重要な役割を果たしていルで溶出される分画を集める。

ると考えられる。カテプシソBに関しては，従来

酵素活性の測定ニBarrFttの方法5）を一部改

主にラット肝臓起源の酵素等について詳しい研究

変して用いた。すなわち，Z−phe−Arg−MCAをがなされている1）が，筋組織のカテプシンBの精基質に用い，8mML−システインおよび4mM製と性質に関する研究は意外に少なく，ラット骨EDTA存在下，pH6．0で37℃，10分間反応を

格筋酵素の精製と性状の一部の報告2 3 がある程

行ない，遊離されるアミノメチルクマリンを蛍光度である。そこで，ヒトに近いサルの筋組織のカ

分光光度計により測定する（励起波長，380nm；

テプシンBを精製し，その諸性状をくわしく比較

測定波長，460nm）。

検索しておくことは基本的に重要であると考え，

蛋白質およびペプチドへの作用−0．1M酢酸ナ

本研究4）では，ニホンザル骨格筋を用いて実験をトリウム緩衝液−lmM EDTA−2mM行なった。

レイトール中，種々のpH（3，4，5および6）

ジチオト

で37cc，6時間反応させ，蛋白基質の場合はSDS
実験材料および方法

ポリアクリルアミドゲル電気泳動で，またペプ

カテプシンBの精製−こホンザノレ旨格筋（1．3チド基質の場合はTSK−ゲルLS−410Kカラムkg）を3gの0．1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH（4×250mm）を用いる逆相系高速液体クロマ5．0）−1mM EDTA−lmM2−メルカプトエ

トグラフィーにより反応混合物を分析した。

タノール中でホモジナイズした後，10，000×蔓，
15分間の遠心で粗抽出液を得る。硫安分画（pH実 額 結 果5．5，40〜70％飽和）で生じる沈殿を集め，0．02

表1にカテプシンBの精製の結果を示した。こM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5．0）一1mM EDTAの方法により粗抽出液から約11，000倍精製されに透析した後，CM−32セルロースカラム（3た標品が得られた（収率，13．1％）。精製標品は×35cm）によるクロマトグラフィーを行なう。

SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを与え，セファデックスG−75カラムでのゲ＊京都大学霊長類研究所生化学研究部門

ルろ過法で分子量24，000を与えた。Z−Phe−Arg

Ⅶ

160

第1蓑

ステップ

プロテアーゼ

サル骨格筋カテプシンBの精製

雫。1）量雪莞戸 も漫遊（慧晶見∂活等貯精（熟度

粗

抽

出

液

2．750

68．750

4，675

0．068

100

1

硫

安

分

画

450

35，100

3，690

0．105

78．9

1．54

1，180

1，326

1，758

1．33

37．6

19．6

6．92

24．6

102

CM−32（1st）CM−32（2nd）494

セファデックスG−75（lst）

30

6．30

875

122

18．7

1，790

セファデックスG−75（2nd）

40

3．20

928

290

19．8

4，260

有機水銀セファロース4B

30

0．81

611

754

13．111，100

375．4

1，151

出発試料：1．3kg

第2表 カテプシンB活性に対する種々のプロテアーゼ阻害剤の影響。
酵素と阻害剤は活性測定前に20℃で60分間インキュペートした。

阻

害

剤

最終濃度（mM）

E−64

阻害皮（％）
100．0

ヨード酢酸

99．7

TLCK

95．2

TPCK

95．6

pCMB

71．2

p−クロルメルクリフェニルスルホン酸

58．7

N−エチルマレイミド

18．1
l
0

ロイペプチン
10

アンチノヾイン

100．0
97．8

キモスタチン97．0

ペブスタテン

0．0

DFP

7．2

大豆トリプシンインヒビター＿−MCAに対する最適pHは6．5であり，活性発現

0．001

2．1

2mMシステイン存在下での活性を100％とするに還元剤の存在を必要とした。還元剤の効果は，と，還元型グルタチオンでは2mMで10．2％，0．2

ジチオトレイトール＞システイン＞2一メルカプ

mMで3．3％であった。表1には種々のプロテア

トエタノール＞還元型グルタチオンの順序であり，ーゼ阻害剤の効果を示してある。活性はヨード酢

161

28 サル骨格筋カテプシンBの精製と性質

Leu−enkephalin

Ty，三Gl，＿G一，！phe＿Le。
：

S（55ヽ）！

ト−日15亀）一一」ト‖（23雪目
卜Il」
（t）

T，，＿Gl，＿Gly＿Phe＿Le。！A，g＿Lys！Ty，−P，。
三一日（33ヽ）：＋lV（22も）一一世Il（89tI」

一！トl（21も）」

α−Neoendorphjn

Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Lys竺Tyrざpro−Lys
S（73も）川（10も）

Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys！Leu−Lysll（82も）日100亀M

Arg−Pro−Lys−Pro−Gln！Gln！phe！phe−Gly！Leu−Met−NH2：…l（15ヽト

：ll（57ヽ）：ト＞（35もHHV（42雪目川l（65亀H
ト一・・・Vl（47ヽ）」

第1図 種々の神経ペプチドに対するカテプシンBの作用。
各ペプチドの下に生成したペプチド断片とその収率が示してある0

Ⅶ

162

プロテアーゼ駿，TLCK，TPCK，アンチパイン，キモスタチ

ないにもかかわらず，同じ骨格筋由来のミオシン

ン，ロイペプテン等のチオールプロテアーゼ阻害・等の筋蛋白には作用することが示されており，こ剤で強く阻害された。また，PCMB，P−クロルの結果は，骨格筋カテプシンBが筋組織中で筋蛋

メルクリフェニルスルホン酸は中程度の阻害作用

白の分解に実際に関与しうることを示していよう。

を示したが，N−エチルマレイミドの阻害作用はミオシンやミオフィブリルへの作用の最適pHが弱かった。また，エポキシコハク酸誘導体により酸性側にずれているのは，酸性pHで筋蛋白のコ強く阻害され，50％阻害濃度はE−64，NP−176

ンホメーション変化が起こり，酵素作用を受けや（R，R），NC0−700でそれぞれ1．2×10

すくなるためと解釈される。

1．2×10M，

M，3．5×1d￣5Mであった。

種々の蛋白質に対する作用を調べたところ，カカテプシンB活性の発現には還元剤の存在が必要であり，その効果は，サル心筋m−CANPのゼイン，アゾカゼイン，ヘモグロビン，ウシ血清

場合6）と類似している。組織中の還元型グルタチ

アルブミンにはほとんど作用しなかった。ウサギ

オン濃度が平均数mMのオーダーであり，一方こ骨格筋ミオシンには作用し，H鎖が分解されて分の濃度ではカテプシンB（m−CANPも同様）は

子量のやや低い分解産物を生じたほか，L2鎖が完全に活性化されないことを考えると，組織内の分解を受けた。ミオシン分解の最適pHは4−5還元型グルタチオン濃度がこれらのチオールプロであった。一方，ニホンザル骨格筋ミオフィブリ

テアーゼの活性調節に関与している可能性も考えルに作用させたところ，ミオシンH鎖とアクチンられる。また，各種プロテアーゼ阻害剤の効果はの分解が認められ，分解はpH4−6でも起こっ心筋m−CANPの場合6・7）と定性的にみてかなりたが最適pHは3付近であった。α−アクチニン

類似している。一方，基質特異性の面からみるとは分解されなかった。

mqCANPはミオシンも分解するが，カゼイン分

また種々の神経ペプチドを基質に用いてそれら解活性もあり： また各種の神経ペプチドに対しての分解活性を調べたところ，図1に示したようなェンドペプチダーゼとして作用する… したがって，結果が得られた。すなわち，多くの場合，カテプ

カテプシンBの活性部位チオール基の反応性はm

シンBはジペプチジルカルポキシペプチダーゼ活−CANPとかなり煩似しているが，特異性決定に性によりC末端からジペプチドを順次遊離するよ関与する基質結合部位の性状は両者でかなり異なうに作用したが，一部エンドペプチダーゼ活性をっているものと推定される。なお，E−64に対すも示すようであった。なお，本カテプシンBは

る感受性はカテプシンBはm−CANPよりも高Arg−MCAには作用しなかった。

く，パパインと同程度であった。
本精製酵素はアゾカゼインやArg−MCAに作考察

用しないことから，同じリソゾーム系チオールプ

以上サル骨格筋カテプシンBについて得られた

ロテアーゼであるカテプシンLおよびHの混入は結果を他動物あるいは他組織由来のカテプシンBないと考えられる。今後，筋組織におけるカテプと比較すると，それらの性状には微妙な相違はあシンL，H等他のリソゾームプロテアーゼの精製るが基本的kは非常に煩似しているということがと性状の比較解析が必要である。また，これらのできる。これは，リソゾーム酵素であり，比較的酵素に対する内在性インヒビターの性状の比較検限定された生理的機能を持つ酵素であることを考索も重要な課題となろう。

えれば当然ともいえる。本実験では，骨格筋カテ
プシンBがプロテアーゼ基質として通常用いられるカゼインやヘモグロビン等にはほとんど作用し28 サル骨格筋カテプシンBの精製と性質

文

献1）勝沼信彦‥リソゾームチオールプロテアーゼの構造
・機能・活性調節，生化学，55：77・89，1983．
2）Schmrtz，W．N．＆Bird，J．W．C．：Degradation of
Myonbri11ar Proteins by Cathepsins B and DI
βわぐみem．ん167：811−820，1977．
3）Hardy，M．F．＆Pemington，R．J・T・：Separationof
CathepsinBl and Related Enzymes from Rat
Skeletd Muscle，βわで鋸吼 βfopカγ∫・AcJα■577；
253−266，1979．
4）Hirao，T．＆Takal1aShi，K．：PurincationandOlraC−
terization ofCathespin B from Monkey Skeletal
Muscle，エβfoc九g刑．，95：1984，inpress・
5）Barrett，A．J．：FluorometriCAssaysfor（hthepsin

163

B and Cathepsin Hwith Methylcoumarylamide
Substrates，βbc加吼エ187‥909−912，1980・
6）Hara，K．，Ichihara，Y．，＆Takahashi，K・：Purifica−
tionandCharacterization ofa Calcium・ActivatedNeutralProtease flom Monkey Catdiac Muscle．
√βわC加爪．，93；1435−1445，1983．
7）Hara，K．＆Takal1aShi，K．：Ⅰnhibition ofcalcium・
activated neutral protease of monkey cardiac
muscleby epoxysuccinicacidderiYatiYeS・BEomed・Rg∫り4：121・124，1983．

8）Hirao，T．，Hafa，K．，＆Takahashi，K．：Degradationof Neuroやeptides by Calcium−ActiYated Neutral
Protease．エβわC如mり94；2071−2074，1983．

164

29

内在性チオールプロテアーゼインヒビターの構造と活性発現機構
勝 沼 信 彦＊研究協力者 木 南 英 紀＊ 若 松 延 昭＊

は

じ

め

に

筋ジストロフィー症における筋タンパクの崩壊

結果

1．肝型インヒビターの構造とリソゾームのチオール性プロテアーゼ群との関ラット肝より精製したチオールプロテアーゼイ

連を追求している。ジストロフィーハムスターのンヒビターの一次構造を決定したところ，98残基

大腿四頭筋においてカテプシンB＆Lの活性が著からなり，アミノ末端の配列はAc−Met−Met−

明に増加すると共に，内在性インヒビターも平行

cysと非常に特有なものであった。2個のシステ

して増加していることを兄い出し，昨年度報告しイン残基はcys−3とcys−64に存在した。

た。その後，内在性インヒビターの酵素化学的な2．肝型TPIの多様性

検索により，インヒビターは2つのシスティン残肝臓のホモジネートの10万×g遠心上清をカル

基の中，分子表面の1つのSH残基が複合ジスル

ポキシメチル化したパパインをリガンドとしたア

フイドを形成したり，S−S結合を介して2量体

フイニティクロマトグラフィーを行った後，セフを形成すると不活性となり，システィン残基が遊ァデックスG−75のカラムクロマトグラフィーを離であると活性であることがわかった。さらに，行うと，2つの阻害ピークが得られた。先に溶出

このチオールプロテアーゼインヒビター（ここでしてくるピークは分子量24．000で，SDS存在下，は肝型インヒビターと呼ぶ）とは別に，もう一種

非存在下のPAGEで共に1本のバンドを示す。し類のチオール性プロテアーゼインヒビターが存在

かし，SDS−PAGEで還元剤があると12，000，

することを明確にした。肝型インヒビターの活性ないと24，000であり，S−S結合を介した二量体調節機構と2種類のインヒビターの諸性質についと考えられた。後に溶出してくるピークは分子量て報告する。

12，000で，SDS−PAGEでは1本のバンドを示
し，分子量は12，000であったがNormal PAGE
では2本の蛋白バンドを示した。これをDEAE−

肝型TPIの精製は木南らの方法2）により，ラッセルロースで分離し，溶出順に従い，TPI−1及ト肝より，皮膚型TPIは武田らの方法3）でラット

びTPI−2と名づけた。

の皮膚上皮細胞より，それぞれ精製した。インヒ

3．肝型TPIの3型の諸性質

ビターの活性はパパインに対する阻害で測定し，活性の表現は木南らの方法2）に従った。

TPI−1はシスティン，ジチオスレイトールなどの還元剤を加えてもNormal−PAGE上の移動
皮の変化はなく，還元剤の存在，非存在にかかわらず，カテプシンHと複合体を形成する（図−1＊徳島大学医学部酵素研・酵素化学−A）。TP1−2は還元剤の添加でTP1−1に変29 内在性チオールプロテアーゼインヒビターの構造と活性発現機構

165

表1肝型インヒビターと皮膚型インヒビターの諸性質の比較

Properties

TP1−L

TPI−S

Mr．W

11，00011，000pI

5．1（4．9，4．7）

5．1

Cysteine content
Inhibition spectra

ID50（リg）

Papain（3・7mU）

0．11

0．07

Ficin（4．7

0．35

0．28

Cathepsin L（3．8mU）

0．43

0．19

Cathepsin B（4・4mU）

0．63

Cathepsin H（4．7

mU）

0．25

Cathepsin C（3．6mU）

0．97

mU）

Immunological properties
Distribution

10．0
1．73
10．4

no cross reaction
ubiquitous skinl G−1tract

換し，複合体の形成能を回復する。還元剤なしで（酸性）を加えると，複合ジスルフイドを形成し，は複合体を形成しない（図−1−B）。二塁体のイ

それぞれ等電点の異なった電気泳動的移動度を示

ンヒビター（TPI−D）も還元剤なしでは複合体のす。

形成能がなく，還元剤の添加によって，はじめて

3）TPI，2を還元後〔3H〕−GSSGと反応させ活性をもつ（図−1−C）。

ると，インヒビター分子に放射活性は取り込まれ，

TP卜2は分子表面のシスティン残基（cys−3）が負の電荷をもつチオール化合物と複合ジスルフ

︶

h ソ

▲ 1
︐

より明らかになった。

される。
4

ィドを形成していることが，次のような実験事実

還元剤とのインキュベートで，放射活性は追い出肝型インヒビターは98のアミノ酸残基からな
2個のシスティン残基（cys−3，CyS−64）を1）還元後，グアニジン非存在下でカルポキシメ

含むが，複合体形成に関与するのはcys−3である

チル（CM）化すると1個／モルのS−CM−システ

ことを明らかにした。変性剤存在下及び非存在下ィンが，グアニジン存在下では2個／モルが検出

でCM化（アイソトープを用いて）後，CNBr消された。

化し，消化物をセファデックスG−25で分けて，

2）還元剤存在下で過剰のジスルフイドであるシ放射活性を測定することにより証明した。メチオ

スタミン（塩基性），ホモシスチン（中性），GSSG

ニンがN末端より1，2及び10番目に含まれるこプロテアーゼ
Ⅶ
166

l

l

l
藍轡

●
●

●

l ■

d

▼

●

寸

N
−⊥d↑

▲

l

n

．︒● ●

▲

l・

L

▲

l・

唇⊥反し

べむ−きこ︑∴し︼−L−

エ亡一票︼土二・

書芸−：u釜叫

1Hヽ1∵トtトや＋↑↑凸＋−丹ヤごごふ言1苫再lゴ八へトート只＋1軋む＝てハ†望ふよ⊂d一▲↑ト凸＋1hL＝丁八三＝→1当月．煎Q−若山︑芸丁賞︻霜雪還Q︵トトe卓上三代セ恥へ時小夜∪義のーヘbJ︑†神1卜小口トミーセ小品

N

凸⊥d↑

rd押

ェu嘗羞噂≡書芸盲○ごeuO竜宣虎ue苫巴OI書亡言−○壱

29 内在性チオールプロテアーゼインヒビターの構造と活性発現機構

lnterconYertfon ofnree Fbrm●Of
ThloJ ProteIna雷elnhlbItor

TPI・1

Ina．etive

l暮0latedIorm曇

図2 チオールプロテアーゼインヒビター3型のシステイン残基の酸化・還元状態の修飾による相互変換と活性調節

167

168

Ⅶ

プロテアーゼとを利用した。

考察

TPI−1のcys−3は還元剤とインキュベpト

肝TPIは肝臓の細胞分画的手法によって細胞質しても遊離のSH基は露出さず，CM化もされなに存在することが確かめられている。しかし，形い。従って複合ジスルフイドを形成してないこと

態学的手法による確認は行なわれていない。又，は確かであり，CyS−3を含むアミノ末端が切除

肝TPIは広く組織に分布するが，肝以外での組織されている可能性もアミノ酸分析より否定されてでの細胞内局在は不明である。カテプシンと局在いる。今までに得られた情報を元に，3つの型のを異にするとすれば，どのようにしてTPIが阻害

TPIの相互変換と活性調節を図2に模式的に示す。、因子として働くか現在のところ明らかでない。も合成されたインヒビターはcys−3が遊離の活性し両者が作用する時には，GSHなどのチオール剤型と考えられるが，組織内のチオール剤（とくにが必要であることを示した。TP卜2からTP1−1

GSH）が除かれる段階で，3つの型が生じたと思への完全な変換には2mMのGSHが必要だが，われる。従って，細胞内GSH／GSSG比がインヒ

肝では，GSHはmMオーダーレベルであるのでビターの活性調節に重要な役割を荷っていると想インヒビターは常に活性型であろう。骨格筋での像される。

GSHレベルは1オーダー低いという結果を得て

3．肝型インヒビターと皮膚型インヒビターの比

おり，プロテアーゼとインヒビターの反応には1較つの調節因子となるかもしれない。
チオールプロテアーゼのインヒビターは，いろ

ラット骨格筋のホモジネートのカテプシンB，

いろの組織より精製されてきたが，その異同は，

肝TPI，皮膚TPIの量を酵素抗体法により測定す

はっきりしなかった。我々はラットの皮膚上皮よると，それぞれ2．1，3．0，0．01FLg逐tissueといりインヒビターを精製し，その性質を肝のものとう値が得られた。カテプシンBと肝TPl量ははば比較した。分子量はともに11，∝旧で，等電点は52匹適するが，皮膚TPIは極めて少ない。この骨格で肝のTP1−1と一諸であった。アミノ酸分析で筋のカテプシンBの壷は肝の1／70であり，骨格筋

とくに注目すべきことは，肝TPIが2残基のシスはリソゾームが少なく，リソゾームのプロテアー

ティンを含むのに対し，皮膚TPIは全くシスティ

ゼも少ないことを示している。

ンを含まないことである。従って，上記の肝TPIにみられるシスティン残基の修飾を介する活性調節は皮膚TPIにはなく，常に活性である。阻害のスペクトルに対しても大きな差があり，エクソペ
プチダーゼ性の強いカテプシンB，Hを肝TPIがよく阻害するのに対し，皮膚TPIは殆んど阻害しない。エンドペプチダーゼ作用の強い，カテプシ
ンL，パパインなど（享両者ともよく阻害する。又，両者は免疫学的に全く異なり，組織の分布も大いに異なっている。

文献1）勝沼信彦：筋ジストロフィー・ハムスターにおけるリソゾームプロテアーゼ活性調節の異常：筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班）57年度研究報
告書，pp．145・148．1982．
2）Kominami，E・，Wakamatsu，N．，＆Katunuma，N．：
JβわJ．αem．257；14648，1982．
3）Takeda，A．，Kobayashi，S．，／＆ Samqjima，T．：
上月わ亡加爪．94；811，1983．
4）Takio，K，Kominami，E．，Wakamatsu，N．，Katsu−
numa，N・，＆Titani，K．：BLochem．BLophys．Res．
Cb〝l〝㍑〃刀．115：902，1983．

169

30

ブビバカイン（マーカイン）による急性筋崩壊の機序
杉、田 秀 夫＊
研究協力者 石 浦 章 一＊ 藤 田 武 久＊
埜 中 征 哉＊ 高 木 明 夫＊

は

じ

め

に

局し筋繰維単位で進行するため，筋ホモジネート筋タンヾク質の分解活性元進が特徴である筋ジ

ではその寄与を明確に同定することは困難であっストロフィー症に代表される壊死性筋崩壊の機構た。本モデルではヒラメ筋全体に一様な壊死が起を明らかにする目的で，新しい実験モデルを開発

こりマクロファージも均一に浸潤するため，解析した。

が容易になったことがポイントである。
図2は，カテプシンBの筋内局在を示す。図1
実験

によりブビバカインによって誘導される急性筋壊ラットヒラメ筋に，局所麻酔薬である塩酸プビ

死は，細胞外からのマクロファTジの浸入を伴う

バカイン（マーカイン，0．5％溶液）を筋注することが明らかになったが，筋ホモジネート内のラことによって急性筋崩壊を惹起させたま 2 3との方イソゾーム酵素活性の上昇が浸潤細胞数に比例し法により，筋崩壊は2日目には最大となり，以後ていることからライソゾーム酵素が浸潤マクロフ

徐々に再生し，1ケ月後には完全にプビバカイン

ァージ由来であることが推測された。そこで，最投与前と同じ像を呈した。

も急激に上昇するカテプシンBの局在を抗体（徳シクロへキシイミドは，プビバカイン投与と同時に腹腔内にlml（2mM／生食）注入した。

島大学，勝沼信彦，木南美紀両先生にいただいたもの）を用いて検討した。図2より明らかなよう

カテプシンBは筋細胞内に一様には染色され結果 と 考察
図1は，ブビバカイン投与後48時間目における特定の大きさを持った粒子状に存在していることが判明した。連続切片を用いて局在を調べる

ヒラメ筋のH＆E染色像である。生理的食塩水筋と，マクロファージ内が濃染しており，変性筋細注により，ヒラメ筋には一時的な膨張が見られる

胞内や末梢神経内の存在はごくわずかであった。

が，2，3時間後には再び正常状態に戻り，48時間

急性筋崩壊に非筋由来の細胞が関与している可後には何の変化も認められないのに対し，プビバカ

能性を更に確認する目的で次に，マクロファージ

イン筋注ヒラメ筋では多くの浸潤細胞が見られ，の増生を抑制することを試みた。方法は，ブビバ筋の崩壊が顕著である。マクロファージの浸潤は

カイン筋注と同時に腹腔内にタンパク合成阻害剤

Duchenne型筋ジストロフィー症，多発筋炎などであるシクロへキシイミドを投与し，プビバカイ

特に後者に於て著明であるが筋細胞の一部分に限ン筋注によって急激に誘導される血中マクロファージの増加を阻止しようというものである。図1＊国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部の下段にその結果を示す。プビバカインの筋毒性

170

Ⅶ

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ー右離

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誓学事打∴千・・、・、ヽ−、阜

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プロテアーゼ

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←

第1図

ラットヒラメ筋組織像。上より生食注入対照乳プビバカイン筋注亜時間後．
及びプビバカイン＋シクロへキシイミド投与亜時間後。

30 プビバカイン（マーカイン）による急性筋崩壊の機序

ヽ − ‥・

、壷￣

▼

171

−

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■

．

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鼠

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こ

第2図

■

．

ブビバカイン筋注48時間後の乳抗力テプシンB抗体
蛍光染色像。

作用により，筋細胞の一部は脱落してはいるが，ライソゾーム酵素活性は対照の0．9〜13倍に上昇

全体として形は保っているのがわかる。ブビバカした。ここで上昇の割合が酵素によって異なるの

イン単独投与に比べての明らかな相違は，シクロ

は次の理由による。（1）カテプシンB＆L，カテプ

へキシイミドによって筋内へのマクロファージ浸シンD，α−ガラクトシダーゼはマクロファージ

潤が完全に阻止されていることである。表1に種に大量に含まれており，筋ホモジネート中の酵素々のライソゾーム酵素への影響，並びに筋構造タ

活性パターンはマクロファージの混入を示唆する。

ンパク質の減少に対する効果をまとめた。ブビバ（2）酸性ホスファターゼとα−グルコシダーゼは筋カイン投与により48時間後の筋ホモジネート中のライソゾーム内に比較的多く存在しご）プビバカイ

蓑1．ライソゾーム酵素宿便に対するシクロへキシイミド投与の効果（n＝10）

投与48時間後筋ホモジネート中の比活性（U／mg）

プビバカイン投与群脚対カテプシンB＆L

314±16＊照群（C）

B＋シクロへキシイシド投与群

24±3

72±14＊

0．163±0．013

0．215±0．018＊

α−グルコシダーゼpH4

1．85±0．19＊

2．20±0．12

0．64±0．05＊

α−ガラクトシダーゼ

3．89±0．36＊

1．03±0．08

1．37±0．10＊

酸性ホスファターゼ

0．175±0．011＊

0．174±0．008

0，122±0．009＊

4．03±0．29＊

9．08±0．74

6．87±0．26＊

カテプシン

D O．499±0．042＊

アルカリ可溶性
筋タンパク量（mg／soleus）＊

P＜0．01

172

Ⅶ

プロテアーゼン投与によってこれらの活性が減少又は不変なのその中に含まれるタンパク分解酵素が急性筋崩壊

は筋ライソゾーム由来の酵素が少ないことを意味に深く関与していることを示唆するものである。

する。これらの酵素活性の変化と共に，筋構造タ
お

ンパク量は対照の44％に低下していることからも，

わ

り

に

マクロファージ由来のライソゾーム酵素によって塩酸ブビバカインによる急性筋壊死の実験モデ

筋構造タンパク質が消化されているものと思われルを用いライソゾーム酵素特に筋外のマクロファる。

ージ由来ライソゾーム酵素が重要な役割をはたし

ところが，シクロへキシイミドの投与により，ているものと想定した。この結果は進行性筋ジス

ホモジネート中のライソゾーム酵素活性の減少とトロフィー症に於ける筋壊死機構の解明に重要な共に，筋構造タンパク質の減少が76％と，かなり示唆を興へるものと考える。

抑制された（表1）。これらを完全に阻止できない理由としては，シクロへキシイミドの効果が持続的ではないこと，プビバカインの筋毒性によって必然的に20％位の筋細胞が破壊されてしまLl
それらが分解してしまうこと，などが考えられる。
しかしながら，結果として，マクロファージの文

献1）Nonaka，1．，Takagi，A．，Ishiura，S．，Nakase，H．，＆
Su由ね，H．：Ach NeuIOpa仇01．60：167−174，
1983．
2）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．，Nakase，H．，Tsuchiya，K・，

Okada，S．＆Sugita，H．：JlBiochem．94：311−314，
1983．

増生を防ぐことにより筋タンパク質の分解が抑制

3）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．，Fujita，T．＆Sugita，H・：エβわC如爪．94：1631−1636，1983．

されたことになる。これは，マクロファージ及び

4）MiyaZaWa，H．，Ishiura，S．，Yonemoto，K．，Takagi，
A．＆Sugita，H．：Biomed．Res．，1983inpress・

173

31

m−CANPとJL−CANPとの比較研究

今 堀 和 友＊研究協力者 川 島 誠 一＊

1．は じめに

しかし，昨年の報告書では，われわれが筋細胞

筋の発生分化に伴ない筋タンパク質のタイプがより直接JL−CANPを精製してみた所，その分子変ることが知られているが，このためにはその代塁はm−CANPのものより大きいことを発見した三謝パターンの変更が必要である。一方，ジストロ

筋細胞中に存在するp−CANPを，天然型iL−C

フィーのような病変は筋蛋白質の合成分解のバラ

ANPとよぶことにすれば，天然型JL−CANPはンスの崩壊によると考えられる。いづれの場合にm−CANPの自己消化によって生じたものではな

おいても，筋細胞中のプロテアーゼが重要な役割

いことになる。m−CANPの自己消化によって生を果していることが考えられる。この考えから，じたものは，誘導型〃−CANPとよぶことにす

われわれは細胞質中に存在し，Ca21ォォンで活性る。

化される中性プロテアーゼ（以下CANPと略す）

本年度は天然型FE−CANPの諸性質を精しくしが鍵をにざるプロテアーゼであろうという想定のらべ，これをm−CANPのものと比較したので，下で研究を進めてきた。まずCANPにはmM程以下にその結果をのべる。

度のCa2te：活性化されるm−CANPと，PM程度の‡Ca2十七活性化されるp−CANPとがあることが明らかになった。細胞内のCa21震度から判断

2．結果

m−CANPのCa2＋依存性を説明するためのモして，後者が生理的な意味をもち，前者は病理的デルが図1である。この場合CANPにおける意味をもつと考えられる。

ca2庖合部位は1，2と2つあり，そのgdはそれ

しかしながら正常の筋細胞中には必ずm−，〟

ぞれ，10￣3，5×10●5であると考える。しかし，−CANPが共に存在することから，m−CANPも
また何か生理的役割を有することが考えられる。

部位2は活性部位内にあり，しかもこの部位は，部位1にCa2㌔場合しない限り買出しないと考その1つは，m−CANPはLL−CANPの前等区体でぇればよい。すなわち部位1に結合するCa21まあるという考え方である。前駆体は生理的条件下

コンホーメーション変化の役割を，部位2に結合では〟−CANPに変換されない限り活性をもたなするCa2十は触媒に関与していると考えられる。

いが，異常条件下，高Ca2＋の場合には活性を発一方，〃−qlNPは図の活性型に固定されたもの現するため，ジストロフィーの様な病変を起こすと考えれば妥当な解釈ができる。事実一昨年の本と考えられるから，部位2のgd，5×10￣5M程
度のCa21モ活性化されるのである。

報告書でものべた様に，m−CANPを自己消化さ

このモデルの証明のために行った実験が図2にせるとjL−CANPになるのである三

示されている。図1のモデルが正しければ，m−
CANPの場合，活性部位に含まれるSH基も＊東京都老人総合研究所

C㌔＋を加えない限り露出せず，したがって滴定さ

174

Ⅶ

CJo＄ed Form

プロテアーゼOpen Form

十dlpM）

ア
リーCANP

第1図ActiYe Formm−CANPとJLJCANPのモデル︵dZ＜UOち∈︑小石∈︶ P2巴一仁■ ∽dコ0占工S

1020Reaction Time（min）

第2図

30

m−CANPおよびp−CANPのSHの滴定

4031m＿CANPと天然型LL−CANPとの比較研究175ことはないはずである。事実，m−CANPのSHある。例えばjL−CANPに対するE−64のとり込

基をDTNBで滴定してみると，最初から外部に露出しているもの，C諾＋を加えることにより露出

みに，50川のC㌔㌔必要とするということは，
E−64とSH基との反応には，部位2に結合したするもの，尿素で変性して始めて露出するもののCa21b触媒作用を必要とすると考えればよく説明

3種矧こ分けられるのが，図2より分る。これにできる。

反し，P−CANPの場合には，C才も添加で露出

次に表1に示すように，両CANPの基質特異するSH基が存在しないことが明らかである。す

性を比較検討した。表から明らかなように，各基

なわち活性部位は最初から霜出しており，これは質に対するKTn値はm−CANPとJL−CANPと

図1の活性型に対応するわけである。

でかなりよい一致を示している。このことは図1

このように，m−CANPとjL−CANPとの差はのモデルを支持するものである。すなわち図に示活性部位がふさがっているか，空いているのかのすように，活性部位の構造が両CANPで本質的にちがいだけということになると，C。21感受性を除同一であるのなら，gm値も同じであるべきだか

く酵素学的性質は，両CANPでよく類似していらである。一万，1万Ⅶ∬に関しては両CANPのることが予想される。

問に差があり，大体においてJL−CANPのもののまず第一に両CANPとも活性部位にSH基を方が大きい値を示している。カッコ中のⅥⅦばの含む，いわゆるチオールプロテアーゼであるから，

値はカゼインを基質にした瘍合を，両CANPとともにモノヨード酢酸やE−64を1モルとり込んも100に揃えてあるから，・カゼイン基質の場合とだ所で失活する。ただし，これらのとり込みにはの相対値を示してし 、る。〝−CANPのⅥmはが2＋それぞれのCANPの活性発現に必要な塁のCa

m−CANPのそれより大きい理由は不明である。

の存在を必要とする。このことは図1における部

以上のように，FL−CANPとm−CANPとは，位1へ結合するCa21ぁ役割についての上述のモデ

C㌔＋感受性を励ば，蛋白化学的ならびに酵素学

ルを支持するとともに，部位2に結合するCa2十的性質がすこぶる類似していることから，両者はが，触媒作用に関与することをも示唆するもので共通の前駆体から生じるものであるか，さもなく蓑1．種々の基質に対する両CANPの動力学的パラメーター
肋基）

Th a xm −CA N P

ルー C A N P

m

（ル M

（N

m o l パ Tlin ／も n i t）

質ル ーC A N P− C A N P

ア

ル

カ

リ

変

性

カ

ゼ

イ

ン

2 2 ．03 4 ．43 5 4 ・6 （ 7 7 ・7 ）3 7 7 ．3 （1 0 2 ．1 ）

ス

ク

シ

ニ

ル

化

カ

ゼ

イ

ン

8 ．1

．1 0 ．0

5 8 8 ．6 （ 9 8 ．4 ）1 3 6 ．0 （ 4 3 ．9 ）

ス

ク シ ニ

ル 化

シ 牛

血

清

ア

ル

プ

ン

2 ．0

2．2

37 6．
．
9 （ 6 3 ．6 ）1 1 0 ．8 （ 3 5 ．8 ）ス ク ン ニ ル 化 イ￣ン シ ュ リ ン B 鎖

2 8 3 ．5

4 5 3 ．7

1 0 2 0 ．6 （2 2 3 ．6 ）2 9 2 ．8 （ ▲7 9 ．2 ）ス

＿6 3 ．01 0 1．3

9 0 ．6 （ 2 0 ．0 ）・4 0 ．6 （、1 1 ．0 ）ク シ ニ ル

化

ウ

プ

ロ

タ

ミ

ン

．

176

Ⅶ

プロテアーゼm−CANP●

Pl；AHP

●

1′

−

30K−

■■■

、一・・

20．1K−

0

4

8

10

32

0

4

8

10

第3図m−CANPおよびp−CANPの80Kサブユニットのペプチドマップ。各サブ
ユニットをS・aureuSV8プロテアーゼとともに，下段に示した時間（分）加温
した後・文献（3）の方法でSDS−PAGEした

ば一方が他方の前駆体になっている可能性が強いと考えられる。事実，m−CANPとp−CANPとは免疫学的に交さするし，両者のアミノ酸組成もきわめて類似している。

的に交さするなど近縁の関係にあることも明らかである。これらのことは，両CANPが同一の前駆体から作られるか，一方が他方の前駆体になっているかなど，いづれにせよ細胞内では必要に応そこで決定的な実験として，両CANPのペプ
チドマップを比較した，両CANPとも80Kと30

じてどちらかのCANPのみを主成分とできるように設計されていることを示唆するものであった。

gの2つのサブユニットからなるので，それぞれそれにもかかわらず，両CANPの80gサブユニのサブユニット同志の比較を行った。このうち80

ットのペプチドマップがかなりの相違を示すこと

gサブユニットについての比較を図3に示す。図は，蛋白質レベルでの両者の相互変換の可能性をは分離したサブユニットをV8のプロテアーゼで否定するものであり，それぞれのCANPの活性

消化し，消化物のゲル電気泳動を消化時間を変えは転写もしくは翻訳のレベルで制御されているとながら測定したものである≡）明らかに，m−CAN

考えられる。今後CANP遺伝子がクローニング

PとLL−CANPとではパターンを異にするから，されれば，この問題はさらに明らかになるであろ

その一次構造はかなり異っていることが示唆され
る0これに反し，30gについてのペプチドマップ

う0一万・30Kのサブユニットが，m−CANP，〟￣CANPについて共通らしいという事実は，こは・両CANPについてよい一致を示しており，従っのサブユニットの起源と，その役割の解明に一つて両者の一次構造もほぼ同一であると結論できる。

の手がかりを与えるものと思われる。

3．考案

本年度の研究によって，m−CANPとp−CAN
Pとは・図1に示したような関係にあることが明らかにされた。酵素的にいえば両者のちがいはC摘受性だけであり，反応機構そのものは同＿であると考えられる0また蛋白化学的にも，免疫文

献1）Suzuki，K・，Ts頑，S・，Ⅹubota，S．，Ⅹ血uTa，Y．and
Imahori，KJβわdem・90275−278，1981．
2日nomata，軋，Hay出血i・M・，Nakamura，M・，h血）d，
K・弧dXawashha・S・：J助e加肌93；・291−293，
1983．

3）Cleveland，D・W・，Fischer，S・G．，Kirschner，M．W．
乱nd Laemmh，U．X∴Jβわエαe汎 252；1102●
1106，1977．

177

32

筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモデルにおける酵素網の比較

青 柳 高 明＊
研究協力者 和 田 孝 雄＊雄）と対照ハムスター（BIOFIBhybrid，7週令，
緒言雄）はBIO−ResearchConsultantsInc，Boston，筋ジストロフィーのマウスとハムスターは典型

U．S．Aより購入した。筋肉および臓器は10倍塁

的な筋ジストロフィー症のモデル動物である。このPBS（pH7．2）を加え，Ultra−turraXで1分

れらのモデル動物はヒトの筋ジストロフィー症に間ホモジナイズしたのち，3，000Xg，20分間の遠可成り類似した筋肉変化を示すものとして基礎的心上清を酵素活性の測定に用いた。

研究に汎用されている。しかし，ヒトの代用として用いられるためには，少くとも代謝面での共通性がなくてはならない。すでに，筆者らは筋ジス

基質：L−Glutamic acidβ−naphthylamidohydrochloride（Glu・NA）．Arg・NA，Pro●NA，

Leu・NA，fMet・NA．Phe・NA，Gly−Pro−Leu●

マウスの筋肉内において，各種のアミノペプチダ

NA，Ser−Tyr・NAを基質として用い，アミノーゼ，グリコシダーゼ，エステラーゼ，RNase

ペプチダーゼ活性を測定した。エンドペプチダーなどの活性が上昇するのに比べ，筋崩壊の主役とゼの基質としてほBAEE（Na−benzoyl−L−a−

考えられているエンドペプチダーゼ活性の変動が少

rginineethylester・HCl），ATEE（Nα−aCetyl

ないことを見出したこ●3さらに，D。。h。nn。m。SC−−L−tyrOSineethylester）．Ac（Ala）3・ME

ulardystrophy（DMS）患者血清中の酵素活性（acetyl−L−alanyl−L−alanyl−L−alanineを調べた結果，上記の酵素の異常が疾病の進行とmethylester），ヘモグロビンを用いた。グリコシ

密接な関係を有していることを報告した三ダーゼの基質としてはNP−GIc（p−nitrophenyl

本報告は筋ジスマウスおよびハムスターモデル−α一D−glucopyranoside），NP−Man（p−の筋肉を含む諸臓器の酵素活性の変化を調べ，酵nitrophenyl一α−D−mannOpyranOSide），NP−

素網の変動という面から両者の類似性を検討した

GIc NAc（p−nitrophenyl−N−aCetyl−β−Dので，その結果について述べる。

−glucosaminide）を用いた。さらに，クレアチン
キナーゼ（CK）の測定には1−14C−クレアチン

実験材料および方法

を，ホスファターゼの測定にはNPP（p−nitrophe−

動物：筋ジスマウス（C57BL／6J，dy／dy，7nylphosphate）を，そしてエステラーゼの測定に

過令，雄）と対照マウス（C57BL／6J，dy／＋とはNPA（p−nitrophenylacetate）をそれぞれの

ヤ＋，7週令，雄）は実験動物中央研究所より購基質として用いた。

入した。筋ジスハムスター（BIO14．6，7週令，

測定：組織ホモジネートの遠心上宿をPBS，基質を含む反応試験管に分注し，37℃，1時間の測＊微生物化学研究所

定を行なった三 また各酵素活性の変化を対照を基

178

Ⅶ

プロテアーゼ

TablelEnzyrnaticChangesinForelimbMuscleofDystrophicMiceandHamsters

Specificactivity±SD（nrnoT／min／mg protein）

EnzymeMouse【N＝6）

Hamster（N＝5）

ControT DystrophY
AP−A

o．71±

AP−B

q．ql±1．22

Leu−AP

3．61±

Phe−AP ll．ql±

Tryp引n一日ke

0．2q

0．L19
0．82

川．27±

叫．（川

ControI Dystrophy

1．88±1．11★

0．20±0．03

6．01±1．50（★）

叫．81±1．22

2．97±0．77★

7．33±

0．29女川3．08±0．53

叫．q6±0．q6★★

11．11±

0．77貴女★

0．69±0．14★★★

5．28±1．07

7．69±1．15★象

19．9q±12．67

17．811±2．90

30．00±5．28★★

Chy−try一日ke

13．59±

3．20

15．qq±

叫．11

21．81±3．60

31．37±叫．33★★

EIastase−like

8．99±

叫．65

17．20±

9．76【★）

1叫．36±1．qO

21．83±2．23★★貴・、Cathepsin C

0．36±

0．07

1．62±

0．53★★★

0．Sq±0．23

1．06±0．56（りGluCOSidase

0．18±

0．11

0．qO±

0．0上Ⅰ★★

0．111±0．01

0．25±0．03★象★

Mannosidase

0．07±

0．07

0．111±

0．09

0．18±0．01

0．211±0．02…★

GIcNAcase

0．23±

0．111

0．79±

0．28央★

0．16±0．02

0．qS±0．07★★央

Phosphatase

1．28

0．37

1．62±

0．叫5

1．22±0．32

1．78±0．q3★

±

Esterase qo．29±26．09

1川．句9±50．31貴★

37．q5±7．30

32．00±叫．句7（＊）：Pく0・1，＊：Pく0．05，＊＊：Pく0．01，＊＊＊：P＜0．001
NS：Pro二AP・fMet−AP′Cly−Pro−Leu−AP，CathepsinD，CK

準としてStudentのt値で表わし，そのプラス値の大きいものから，マイナス値の大きいものへと順位づけし，その順位についての相関をSpea一

rmanの順位相関係数（rs）として表わした。

れた。

脾臓における酵素活性の変化は表2に示す。筋
ジスマウスではtrypsin−like，Chy−try−like5）の活性上昇がみられた。一方，筋ジスハムスター
ではAP−Aのみ上昇するが，AP−B，Pro−AP

結果および考察Leu−AP，Phe−AP，Gly−Pro−Leu−AP，tr−

筋ジスモデル動物の前肢筋における酵素活性のypsin−like，Chy−try−like，elastase−like，C−変化を表1に示す。筋ジスマウスにおいてはAP

athepsinC，mannOSidaseな己

多くの酵素の活−A，Leu−AP，Phe−AP，CathepsinC，glucosi−性が有意に低下した。牌脇を含む他の臓器においdase，lGIcNAcJase，eSteraSeなどの活性が有意ても，筋ジスハムスターの方が筋ジスマウスよりに上昇している。筋ジスハムスターにおいては

広範囲な酵素活性の変化することが認められた。

AP−A，Leu−AP，Phe−AP，trypSin−like，

上述したように，各臓器内の酵素活性の変化は

Chy−try−like，eSteraSe−like．glucosidase，

非常に巾広く，単一な酵素変化のみに注目するよmannosidase，GIc NAc−aSe，Phosphataseな

りも，むしろ酵素網の変化をパターンとして捉えどが有意に上昇しているが，AP−Bの活性のみ低ることが必要と思われた。この目的のために，対下する。筋ジスハムスターは筋ジスマウスに比べ，照群と疾患群の間の差を検定するために用いた

はるかに多くの酵素活性が変動することが認めらStudentのt値を用い，順位相関係数を求め，両32筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモデルにおける酵素網の比較

TabIe

179

2

Enzymatic

ChangesinSp暮een

ofDYStrOPhicMiceand

Hamsters

Specificactivity±SD（nmol／rnin／rTlg PrOtein）

EnZymeMouse（N＝6）

Controt

Hamster（N＝5）

DystrophY

Controt

DYStrOPhy

AP−A

0．78

±

0．25

2．57±

4．6q

2．55±

0．72

5．64±

0．q2★…

AP−B

12．72

±

2．38

13．73±

2．59

8．93±1．19

0．98 ±

0．29★★★

Pro−AP

1．51±

0．25

1．70±

0．31

1．17±

0．13

0．20 ±

0．03★★★

Leu−AP

7．85±

0．76

7．97±

3．02

叫．56±

0．qq

3．33 ±

0．23★★象

8．8上1±

7．59

7．50±1．07

5．06土

0．37★★

1．71±

0．82

0．6上l±

0．08★★★

Phe−AP

7．01±

1．qO

GIY−Pro−Leu−AP

1．57±

0．33

Trypsln−tike

35・55±12・88

ChY−trY−like31・58±11・66

77．07±15．38★★★

叫5．79±

167．51±25．58

89．93±26．12★t

106．18±23．79

50．90±

9．25貴★

36．23±15．13

38．89

Cathepsin C

2・83±1・37

3．73

Phosphatase

0．3q

2・68±1・q7【★）：Pく0．1．

★：P＜0．05，

0．08

160．70±15．57

日astase−like

Mannosidase O．q2±

1．21±

81．50±q2．q6★
5．q3★

±12．51
1．72

1．30±

0．21

0．78±

0．26貴★

0．10±

0．18（★）

0．37±

0．08

0．19±

0．1q★

2．76

1．75

1．叫3±

0．qq

2．75±1．qqt★）±±＊＊：P＜0．01．

＊＊＊：P＜0．001

NS：fMet−AP，Cathepsin D，CIucosidase，ClcNAc−aSe．CK，Esterase

TabIe3
Correlation among enzymaticchangesin variousorgansofdystrophicmice

MuscIeOrganS

ForeTimb Hindlimb Forelimb Hindlimb

MuscIeForetimb
HindHmb

0．92★★★

0．65…

0．65★★

0．76貴女★

O．92＊＊＊

Heart Spleen Liver KidneY

−0．19

−0．22

−0．07

−0．38

0．77彙貴女

−0．07

−0．13

−0．111−0．39

0．86大夫象

−0．32

0．25

−0．18

−0．37

−0．01

−0．12

・−0．31

−0．06

0．日

0．19

−

−0．30

−0．08

Bone
ForeHmb O．65…

0．76★★★

−

Hindtimb O．65＊＊

0．77＊＊＊

0・86★★★

−0．19

−0．07

→0．32

−0．15

−

−0．22

−0．13

0．25

−0．01

−0．06

−0．07

−0．11l

−0．18

−0．12

0．11

−0．30

−0．38

−0．39

−0．31

−0．31

0．19

−0．08

Heart
SpleenLiver
Kidney（＊）：P＜0．1，＊：P＜0．05，＊＊：Pと0．01，−0．15＊＊＊：P＜0．001

0．37
0．37

Ⅶ

180

プロテアーゼ

Table qCorrelation among enzyrnatic changesin variousorgansofdYStrOPhic hamsters

MuscteOrgans

Bone
Heart Spleen Liver Kidney

Forelimb HindIimb Forelimb Hindlirnb

MuscleForeIimb

O．93彙★★

HindIimb O．93＊＊＊

0．26

0．15

0．63…

0．31

0．19

0．62★★

O．73抽象

0．63…

0．36

0．20

0．・q7★

Bone
Forelimb O．26

0．31

Hindlimb O．15

0，19

つ．73★★よ0．62…

0．63★央0．ql

0．51l★

0．65★象

0．50★

0．23

0．16

0．07

0．q2（★）

0．q3（★）

0．18

Heart

O．63★★

SpIeen

O・36

0・q7★

Liver O．20

0．211

−0．02

Kidney O・11

0・2q

0．36

【★）：Pく0．1．

★：Pく0．05．

よ★：P＜0．01．

者間における各臓器の比較を行った。

0．5上l★

0．ql O．65…

★★央：P

O．50★

0．2q O．2q

−0．02

0．23

0．16

0．11

0．36
0．q2（★）

0．q3（★）

0．07

0．18

0．25

0．25

く0．001

可能性も否定できない三表3には筋ジスマウスの各臓器間における相関係数をSpearmanのJIB位相関係数として表わした。
筋ジスマウスの酵素変化のパターンは前肢および結論

筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモ

後肢の筋肉，骨の問で非常に高い相関がみられ，デルの前肢，後肢の筋肉と骨および心，牌，肝，相互に可成り類似していると考えられる。しかも，腎の酵素網の変動を比較検討した。筋ジスマウス

これらの変化は心筋，晩 肝，腎などとは明らかの酵素変化は筋肉と骨で観察された。一方，筋ジに異なるパターンであることが認められた。

スハムスターでは筋肉のみでなく骨，心肺，肝表4は筋ジスハムスターにおける各臓器間の関腎などで明かな変化が認められた。この結果，筋係を示したものである。このモデルは筋ジスマウ

ジスマウスは筋骨格症により特異的なモデル動物

スに比べ，前肢，後肢の筋肉と骨との相互関係がと思われる。また筋ジスハムスターは免疫をともうすれ，その代りに心筋，牌などにも関連性が広なった全身的疾患と思われる酵素変化が観察されがる傾向を示した。すなわち，筋ジスハムスター

た。

における酵素変化は必ずしも筋肉，骨などに特有なものではなく，より全身の臓器に及んでいると考えられる。この結果，ハムスターモデルは筋肉に原発した筋ジストロフィーのモデルというよりは，より全身病のモデルとして再評価すべきではないかと考える。ことに牌の変化が筋肉，骨などの変化と類似性をもつことから，自己免疫疾患の文

献1）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F・，Nagai，M・and
Umezawa，H．：エロ血．血pe比，67；5ト59，1981．
2）Aoyagi，T．，Wada，T．and Umezawa，H．Catabohc
enzymesin dystrophic muscle．In：Ebashi，S．ed．，

此JSCuLaTLD／StrOPhy．UniY．OfTokyoPress，Tokyo．
239−252，1982．

3）Aoyagi，T．，Wada，T．，Iwabuchi，M．，Kqjima，F．，

32 筋ジストロフィーのマウスおよびハムスターモチリレにおける酵素網の比較

181

Nagai，M・and Umezawa，H．：βぬぐ如桝．♪軋，5：
97・103，1982．

Procedures or Statistics．〟ew yorた〟存GmW・4）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，
Miyoshin0，S．and Umezawa，H．：Clin．Chim．
Acta，129：165−173，1983．
5）Steel，R．G．D．and Tomie，J．H．：Principles and6）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K．，Kojima，F・，
Nagai，M．and Umezawa，H∴エ」勒〃r〝L頻れhpress，1984．

〟fJJβ00たCbJ乃pのリ血ごりJJ2・J45，1960．

182

33

幾つかの筋神経系異常マウスに於けるアルカリプロテアーゼ活性の変化

松 下宏＊
研究協力者 辻繁 勝＊ 楠 本 茂 夫＊

マウスに見出されている幾つかの筋神経系異常

所より輸入し，当教室で自家繁殖したものを，又突然変異体は臨床症状疾病進行の経過或いは遺伝

SM／J系に見出されたmutantは金沢大学医学部的背景などの面で互いに相違している。我々はこ動物実験施設より提供して載いたものを実験に使れらの変異体マウスを用いて血清，骨格筋，中枢用した。使用時のマウスの週令は6〜12週であ神経系などの臓器に於ける疾病進行の指標酵素群

る。各臓器はマウスを断頭採血後速やかに採出しの活性変動を測定し，正常対照マウスと比較検討

20倍容の0．32M庶糖液に加えホモジナイズする。

することによって筋の分化に対する神経系異常の以下ホモジネートは通常のSchneider法に従って影響に就いて研究を進めている。今回はアルカリ

cytaso1分画を分離し，酵素標品として使用した。

側に至適pHの在るプロテアーゼ活性の症状進行

アルカリ・プロテアーゼ活性の測定はEdmundsに伴う変化とその原因に就いて若干の考察を行っ＆P。nningt。nの方法6iこ従ってカゼインを基質とた結果を報告する。

してglycine−NaOHbuffer（pHlO）中でインキ骨格筋ホモジネート中にアルカリプロテアーゼ

ュベートし，TCA処理上清の吸光度を224nmが存在することは既に多数の研究者によって報告

波長で比色定量した。筋のAutolyticactivityはされているが，一方この酵素がmastcell中に存May。r等の方法71こ従って，my。fibrillarf，aC−在する酵素と同一であること1）がラットの骨格筋

tionをインキュベートすることによって測定した。

から精製された酵素蛋白によって確かめられた≡

mastcellの量的変化は，組織中のヒスタミン

更にdyマウス萎縮筋中でも，この酵素活性が上含量の変化を測定することによって間接的に計量昇していることが報告され3）4）以前から知られていした。ヒスタミン定量はShoreらの0−フタール

るdyマウス萎縮筋中でのmastc。11の増加5といァルデヒド法を基にしたAntonらの変法8）に従っう現象と結び付いて骨格筋中のアルカリ・プロテて測定した。酵素標品中の蛋白含量はLowry法

アーゼ活性の変化は，dyマウスの疾病進行と強いによって測定した。

関連があり，更にこの変化はmastcell増加に依mastce11の脱顆粒による細胞数減少とアルカ存している可能性が考えられている。

リ・プロテアーゼ活性の変化との相関を見る実験にはSigma社より購入したCompound48／80

材料 と 方法（apolymerofN一methylhomoanisylamine

dyマウスはC57BL／6J−dy系を，mydマウ

andformaldehyde）を食塩水に溶かし，4ケ月

スはMYD／J−myd系をそれぞれJackson研究

令のC57BL′6J一系正常マウスの腹腔中に毎日1回直線的に増量しながら5日間投与し（1−5咤＊和歌山県立医科大学・第2生理学教室／g体重），6日目に投与マウスを殺し，骨格筋中33 幾つかの筋神経系異常マウスに於けるアルカリプロテアーゼ活性の変化

183

第1表
AlkalLine protease activitiesin skeletal muscle of several strains
Of

mice

with▲genetic

muscular

Normaldystrophy

Affected

A／H

Pr．

C57BL／6J−dy

21．4‡9．5（7）58．4

士13．6（7）2．73

Pく0．001

SM／J−mUt

22．1土5．9（6）51．9±13．5（5）2．35

Pく0．001

MYD／J−myd

33．6

69．4

土28．3（6）2．07

Pく0．001

土12．2（6）Unit：0．D．／mg protein
Parenthesis show numbers of mice used．

第2表
Alkaline protease activitiesin heart nuscle of several strains
Of mice with genetic muscular dystrophy

NormalAffected

A／N

Pr．

C57BL／6J−dy

5．0

3．6（4）

6．7

土4．6（4）

1．34

日．5．

SM／J−mut

9．4士2．1■（4）8．6

士2．3（4）

0．91

日．5．

MYD／J−myd

6．2

7．4

土2．1（6）

1．19

N．S．

士

土1．1（6）

Unit：0．D．／mg protein
Parenthesis show numbers of mice used．

第3蓑Alkaline protease activitiesinliver of several strains

Of mice

両th genetic muscular dystrophy
NormalAffected

A／N

Pr−．

C578L／6J−dy

3．6±1．6（4）4．9

土3．7（4）

1．36

日．S．

SM／J−mut

6．5

士

2．2（5）

5・1．j3・1（5）

0．78

N．S．

MYD／J−myd7．0

土

2，4（5）

7．1土1．3（6）

1．01

N．S．

Unit：0．D．／m9 PrOteln
Parenthesis show numbers of mice used．

184

Ⅶ

プロテアーゼ

第4去Histamine concentrationsin TnuSCle，heart andliver
Of several neuronuscular mutations

NormalAffected

A／N

C57BL／6J−dy Muscle

3．52

12．35

3．51

日eart

1．52

2．00

1．32

O．42

0．35

0．83

4．52

16．89

3．74

Liver

SM／J−mut Muscle
Heart

l．30

1．32

1．02

Ljver

O．42

0．81

1．93

3．35

6．56

1．96

Heart

O．98

1．15

1．17

Ljver

O．44

0．43

0．98

MYD／J−myd Muscle

Unit：r／g wet tissue weight＊；Average value of three trialsのアルカリ・プロテアーゼ活性およびAutolytic
activityの測定を行った。

更に．肝臓中にもmastcellがかなりの量存在することが知られているので，肝臓に於けるアルカリ・プロテアーゼ活性に就いても測定したが結結果 と 考察果は表3の如く，やはり3系統マウス共に疾患にdyマウス，mydマウス並びにmutantマウス

よる有意な変化は認められなかった。以上の結果の後肢，骨格筋に就いてアルカリ・プロテアーゼ

から，アルカリ・プロテアーゼ活性は，測定に用活性を測定した処表1の如き結果を得た。3つのいた筋疾患マウスのいずれに於ても骨格筋で特異筋疾患突然変異体マウスの骨格筋中でいずれも2的に活性増加を示していることが判明したので，倍以上の活性増加が起っていることが認められた

次にこの活性変化がmast cellの畠的変化と直接が，活性増加の程度はdyマウスが最も高く，myd

関連しているか否かを，検討するために各臓器中マウスが最も低かった。これは症状進行の速度にのヒスタミン含量を測定する実験を行った。

比例した変化とも考えられる。一方心筋に関して

mastcellがヒスタミンを特異的に産生する事はもmast cellタイプのアルカリ・プロテアーゼ活

衆知の事であるが，脳を除く各臓器中のヒスタミ

性が存在することが認められているので，筋萎縮

ン含量の少なくとも2／3以上はmastcell由来で症発病による変化が存るか否かを知るために3系あるという報告9）から，組織中のヒスタミン含量

統の疾病マウスに就いて活性の測定を行った。結の変化をmast cellの数の変化ととらえることは

果は表2の如く，いずれの疾患マウスに就いても可能と考えられる。測定結果は表4に示される如

有意な活性変化は認められなかった。

く，3系統の疾病マウスいずれに於ても骨格筋中33 幾つかの筋神経系異常マウスに於けるアルカリプロテアーゼ活性の変化

185

第5表
Effect of Cornpound

48／80

treatment on proteolytlc and autolytlc actlvltles

in mouse muscle and heart

Prdteolytlc

ControI

actlvlty

TreatedMuscle29．7土12．3日0）17．9士4．2（5）Heart

7．8土1．6日0）4．9±1．1（5）

T／C

60．3

Autolytlc

ControI

88．1土21．7（8）actlvlty

TreatedT／C

27．6±11．5（6）31．3

62．8

Unlts：ProteolysIs；A224／mg proteln
Aut01ysis；JL9 tyrOSlne equivalent／g proteln
Parenthesjs show numbers of mlce used

で著しくヒスタミン含塁が増加していることが認要約められた。一方肝臓と心臓でのヒスタミン含量に

マウスにそれぞれ独立に見出された筋ジストロ

就いてはいずれの系統マウスでもあまり大きな変フィー症を発現する突然変異体の幾つかに就いて化を示していなかった。更に，dyマウスと，SM症状進行に関連して活性変化を示すことが知られ／J一mutantマウスの骨格筋中では4倍近い増加ているアルカリ・プロテアーゼの活性変動と，同じを示すのに対してmydマウスの骨格筋では約2くアルカリ・プロテアーゼ活性の存在が知られて倍の増加にとどまっているなど変化の程度に遺伝いるmastcelIの員的変化との関係を検討した。

的背景による差異が存ることが示唆された。

その結果，dyマウス，SM／J−mutantマウス，

そこで，骨格筋中のアルカリ・プロテアーゼ活並びにmydマウスの3突然変異体に就いてはい

性の変化がmastcell数の変化と確実に関連してずれもアルカリ・プロテアーゼ活性が骨格中で特いるか否かを実証するために，maStCellに作用異的に増加している事実が確かめられた。又同時して脱顆粒をひきおこすことが知られているCo一に王としてmastcellによって産生される臓器中

mpound48／80を腹腔内に注射した後，アルカリのヒスタミン含量がやはり骨格筋で著しく増加し・プロテアーゼ活性の変化を見る実験を行った。

ていることが判明した。更に，この2つの事象の結果は表5の如く，この物質を投与して，maSt間の関連性を確かめるために，Compound48／80

cellの数を強制的に減少させる事により，骨格筋を連続投与して，maStCell数を抑制する実験を並びに心筋中のアルカリ・プロテアーゼ活性が無行った所，maStCell数の減少と連動してアルカ

処置対照マウスの約60％に減少していること，

リ・プロテアーゼ活性並びにアルカリ側に至適pH

又骨格筋のmyofibrillarfractionをインキュベの存るAutolyticactivityが大幅に低下する結果

ートすることによって測定されるautolyticact−が得られた。即ち，マウスの筋ジストロフィー症

ivityが無処置対照の約30％に迄低下しているこでは一般に骨格筋中のアルカリ・プロテアーゼ活とが認められた。

性が上昇しているが，これはmastcellの増加に依存した変化であるという事が確かめられた。

Ⅶ

186

文

プロテアーゼ

献1）Woodbury，R．G．EYeritt，M．Sanada，Y．，Katunuma，N．，hgunoff，D．andNeurath，H．：Am再OrSerine
PrOteaSein rat skeletal muscle．Evidence forits
mast ceu origin．丹oc．〟正dcd．gcf．払方．A．，
75：5311・5313，1978．
2）Sanada，Y．，Yasogawa，N．and Katunuma，N．：
Crystal1ization and amino acid composition ofa
Serineproteasefromratskeletalmuscle．Biochem．
βf叩力yJ．Re∫．Cbmm〟仇，82：108−113，1978．

3）Pennington，R．J．：Biochemistry of dystrophic
muscle：2．Some enzyme changesin dystrophic
mousemuscle．βfoc鮎川．′り88：64・88，1963．
4）Sanada，Y．，Yasogawa，N．and Katunuma，N．：
SeTine proteaseinmicewith hereditary muscular
dystrophy．J．Biochem．／TbkyqJ，83：27−33，1978．
5）Bois，P．：Mast cells and histamineconcentrationin muscleandliYer Of dystrophic mice．Am．J．
J功γ∫わ7．，206；338・340，1964．

6）Edmund，T．andPennington，R．J．T．：Mastcen
OriginofmyonbrⅢaLPrOteaSeOfratskeletal
andheartmuscle．BLochem．Bio
わ々ys．Acta，661；
28−31，1981．
7）Mayer，M．，Amin，R．aJldShaftir，E．：Rat
myofibrnlarprotease：Enzyme＿PrOPeTtiesand
adaptiYeChangesinconditionsofmuscleprotein
degradation．Arch．Btochem．BEophys．．161：
20−25，1974．
8）Anton，A．H．，Sayre，D．F．：Amodifiedfluorometric
procedurefbrtissuehistamineanditsdistdbution
inYadousa血mds．√J璃〃r椚dCOJ．且甲．乃er．，
166：285−292，1969．
9）YamatOdani，A．，Maeyama，K．，Watanabe，T．，
Wada，H．andKitamura，Y．：Tissuedistribution
Ofhistamineinmutantmousede丘cientinmast
Cells：CleaJeYidenceforthepresenceofnon−maSt−
Cellhistamine．Biochem．marmaco7．，31：305−
309，1982．

187「筋の発生と分化に関する基礎的研究」班分担研究者一覧
氏

名

所

属

住

所

班長

江橋

節郎

岡崎国立共同研 究機 構生理学研究所444

岡崎市 明大寺町字西郷中0564（53）734
38 5

監事

今掘

和友

東京都老人総合研 究所

173

東京都板橋区栄町 35−2

幹事

勝沼

信彦

徳 島大学医学 部酵素研 究施設

03（964）113 1

野 々村 禎 昭

東京 大学医学部 薬理学教 室第一講座

雷雲

小 沢鋲二郎

国立武蔵療 養所神経 セ ンター
機 能研 究部

770

徳 島市蔵本町 3−18−150423（4 1）27 11

班員

青柳

高明

微 生物化学研究所酵素研 究部

14 1

東京都品川区上大崎 3−14−23
03 （44 1）4173

石川春律

群馬大学医学部解剖学教室

37 1

前橋市昭和町 3−3
9−22
0886（
3 1）3 111
027 2（3 1）722 1

岩崎祐三

東北大学医学部脳研脳微細構造部門

980

仙台市星陵町 2−10222（74）11 11遠藤賓

東京大学医学部薬理学教室第二講座

113

東京都文京区本郷 7−3−1
03 （8 12）21 11大塚正徳

東京医科歯科大学医学部薬理学教室

113
113

一 大 日方昂

東京都文京区湯島45
東京都文京区本郷 1−5−
7−3−103（8 13）61 11

千葉大学理学部生物学教室

280

千葉市弥生町 1−3 3
047 2（5 1）1111

岡田

節人

京都大学理学部生物物理学教室

606

京都市左京 区北白川 追分町
075（75 1）2111

岡田善雄

大阪大学細胞工学セ ンター

565

大阪府吹田市山田丘
3−12 111
03（8 12）06（8 77）
5 121

香川

務

国立療養所刀根山病院

560

豊中市刀 根山 5−1−106（8 53）2001

加濃

正明

北里大学医学部生理学教室

228

相模原市 北里 1−15−1
0424 （78）
9 158

栗山

湛

九州大学医学部薬理学教 室812

福岡市東 区馬出 3 −1−1
092（64 1）1151

酒井

敏夫

東京慈 恵会 医科大学生理 学教室

105
187

東京都 港区西新橋 3−25−8
東京都小平市小川 東町 2620
03（4 33）1111

嶋田裕

千葉大学 医学部解剖学教 室280

千 葉市亥鼻 1−8−10472 （22）7171

杉田秀夫

国立武蔵療養所神経 セ ンター
疾 病研 究第一部

187

東京都小平 市小川東 町 2620
0423 （4 1）2711

杉山博之

岡崎国立共 同研 究機構生 理学 研究所
細胞器官研究系

444

愛知県岡崎市明大寺町西郷中 380564 （54）1111

高橋健治

京 都大学 霊長類 研究所484

愛知県犬 山市宮林0568 （68）138 7

188

氏
班員

蓋喜

名

所

属

住

所

高橋囲太郎

東京大学医学部脳研神経生物学教室

113

東京都文京区本郷7−
3−1
03（
812）
2111

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科学教室

173

東京都板橋区加賀2−11−1
03（
964）
1211

戸塚

愛知県心身障害者コロニー発達障害研 4釦−
03 愛知県春日井市神屋町713−8
0568（
88）
0811

武

萩原摘四郎

千葉大学医学部脳機能研究施設

280

千葉市亥鼻1−8−1
0472（
22）
7171

堀田

名古屋市立大医学部生理学教室467

愛知県名古屋市瑞穂区川澄町1
052（
851）
5511

真崎 知生

筑波大学基礎医学系

30
0一
31 茨城県新治郡桜村
0298（
53）
3277

松下

宏

和歌山県立医大生理学教室

640

和歌山市九番丁9
0734（
31）
2151

丸山 工作

千葉大学医学部生物学教室

280

千葉市弥生町1−33
0472（
51）
1111

大槻 磐男

九州大学医学部臨床薬理学教室

812

福岡市東区馬出3−1−1
092（
641）
1151

小林 良二

秋田大学医学部生化学第二講座

010

秋田市本道1−
0188（
1−1 ＿
33）
1166

仲村 春和

広島大学医学部第一解剖学教室734

広島市南区霞1−2−3

畑山 一
一
郎

弘前大学医学部生化学第二講座

健

082（
251）
1111

036

弘前市在府町5

0172（
33）
5111