厚生

省

新薬開発研究費

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

江

橋

班

平成2年度研究報告書

平成3年3月

研究報告書の作成にあたって
今年は、五年間に亘った「低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究」姓の最終年度であり，ベスタテン及びEST，特に後者の二重盲検法による薬効判定に重点がおかれた．ジストロフィン発見によって招来された筋ジストロフィー研究の新時代において本研究班を推進することの意義は，前回及び前々回の報告書冒頭に記された通りであるが，ジストロフィン研究の進展に伴い，遺伝子欠損状況，及びそれと病状との関係が複数多岐に亘り，遺伝子治療への道は当初考えられた程平坦でないことが明らかになりつつある．他方，この線に沿った我々の希望が，いつの日か実現することもまた疑いのないところである．このような情勢の下においては，筋崩壊阻止という対症的治療法の追求は，却って緊急性を増大したというべきであろう．

今回の二重盲検法による結果の厳密な解析は更に時間を要するが，この様な解析を必要とすること自体，上記2物質が，実地に応用する対症療法薬としては理想か
ら程遠いものであることを示している．しかし，今回の判定に際してとられた調査
方法は，統計学的，臨床医学的な規準と，現場における実務的な要請とを見事に調和させたものであり，従来の薬効判定法が，墳項にすぎて現実性に乏しく，結果として有効例を見落した場合もありうることを深く反省するものである．本研究班の成果に更に改良を加えることにより，筋ジストロフィーのみならず，広く雉病一般の治療における薬効判定の標準モデルが確立されることが期待される．

平成3年3月
主任研究者

江

橋

節

郎

目

次

Ⅰ 分担研究報告
1）マルチキャタリティックプロティナーゼの構造と機能
国立精神・神経センター神経研究所

3

杉田

秀夫

石浦

章一

野村

泰広

安楽

治美

田川

一彦

東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部 鈴木 紘一
72）筋ジスマウスにおけるジペプチジルペプチダーゼ(DPP)活性の動態
徴生物化学研究所 青柳 高明 和田 孝雄 小島 蕗子
永井真知子 原田 滋子
実験動物中央研究所 斉藤 宗男

3) CANP遺伝子のクローニングに関する研究

11

東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部 鈴木 紘一 西道 隆臣 川崎 博史
羽田

明子

大野

茂男

川島

誠一

中村

愛

4）細胞の増殖･分化とCANP

13

東京都老人総合研究所

5) CANP阻害剤の合成

16

東京理科大学理学部 向山 光昭 植木 正彬
大正製薬㈱総合研究所 大関 正弘 花田 和紀 玉井 正晴
横尾 千尋 田名見 享 村田 充男
宮下さつき

6) E‑64‑CおよびESTの薬物動態

19─LC/MSによる精密計測の基礎研究─
九州大学薬学部

7

大倉

洋甫

甲斐

雅亮

高橋

利明

CANP阻害剤の一般薬理学的研究

23

─筋ジストロフィー疾患モデル動物筋電図の定量的スペクトル解析に基づく薬効評価法─
東京慈恵会医科大学第二薬理学教室 福原 武彦 加藤 總夫 木村 直史
高野

一夫

塚元

葉子

8）骨吸収疾患モデルに対するE‑64誘導体の効果

26

徳島大学酵素科学研究センター 勝沼 信彦 唐渡 孝枝 二川健

大正製薬㈱総合研究所 村田 充男 玉井 正晴 花田 和紀
横尾 千尋
9）ジストロフィンの分子形態

28

千葉大学理学部生物学科 丸山 工作 佐藤ⅰ治10)ミエリン膜局在のCaの依存性プロテアーゼ活性に対する各種脂質の影響
和歌山県立医科大学第二生理学教室 辻

30

繁勝11) mdx mouseに対するbestatinの週2回間歇投与の効果33

─電気生理学的及び病理学的検討─
東邦大学医学部第四内科 木下 眞男 岸
栗原

照幸

根本

雅彦 吉村 牧子
博之

日高

隆信

12) DMDにおける筋障害の進行過程

37

─CTによる2年間の経時的評価
国立療養所東埼玉病院

石原 傳幸 里宇 明元 江端 広樹
道免 和久 青柳 昭雄 儀武 三郎

13)培養神経細胞に及ぼす自己免疫筋抗原(SE‑antigen)の作用の検討

41

国立精神・神経センター武蔵病院 春原 経彦
国立精神・神経センター神経研究所 古川 昭栄＊ 里吉栄二郎＊岐阜薬科大学分子生物4314）比較的良好な経過を示したいわゆるDuchenne型筋ジストロフィーの臨床特徴
東京女子医科大学小児科 福山 幸夫 大沢真木子 池谷紀代子
平沢 恭子 新井 ゆみ 須加原信子
池中 晴美 炭田 沢子 斎藤加代子
宍倉 啓子 鈴木 暘子
国立精神・神経センター神経研究所機能研究部 小沢鍈二郎15）ベスタチンのDuchenne PMD投与に対する免疫グロブリンの変動
国立療養所箱根病院 村上 慶郎 岡崎46

隆 西岡 昌紀

16）EST投与対象の1症例における臨床的背景について
国立療養所西別府病院 三吉野産冶
八代綜合病院小児科 山田みどり

485217）サンドイッチ法による骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とキット化の試み
東京大学医学部第三内科 矢崎 義雄 永井 良三 加藤 裕久
国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫

18) Duchenne型筋ジストロフィー症患者の新しい理学的評価法

56

─その意義と問題点─
東京大学医学部脳研病理 中野 今治
国立精神・神経センター神経研究所 杉田 秀夫
国立療養所東埼玉病院

石原

傳幸

熊井

初穂

浅野

賢

国立療養所下志津病院

藤村

則子

土佐

千秋

石沢

真弓

松村喜一郎
新潟大学脳研究所神経内科 桑原 武夫
国立療養所新潟病院

近藤

隆春

水野

京子

山崎

元義

国立療養所医王病院

崎田

朝保

本家

一也

武田

洋子

国立療養所南九州病院

幸福

圭子

福永

秀敏

大正製薬㈱開発部

藤田

繁

青木

寛

篠

由美子

ⅱ

19) ESTのDuchenne型筋ジストロフィーに対する臨床効果に関する研究
─Scalographic

58

analysisによる薬効判走法─

国立療養所東埼玉病院

石原 傳幸

東京医科歯科大学難治疾患研究所 佐久間 昭
東京大学医学部脳研病理
中野 今治
国立療養所新潟病院

山崎 元義

国立療養所医王病院

本家 一也

国立療養所南九州病院 福永 秀敏
新潟大学脳研究所神隆内科

宮武正

国立精神･神経センター神経研究所

杉田秀夫

大正製薬㈱開発部

藤田繁 青木

寛 篠 由美子

20）デュシェンヌ型進行性筋ジストロフィー症に対するESTの臨床効果
─二重盲検試験結果報告─新潟大学脳研究所神経内科 宮武

正 山崎 元義Ⅱ 低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班分担研究者一覧

ⅲ

64

69

分担研究報告マルチキャタリティツタプロティナーゼの構造と機能

杉 田 秀 夫＊
研究協力者

石浦 章 一＊
安 楽 治 美＊田 川 一 彦＊鈴 木 紘 一＊＊

野

村

泰

広＊

は じめに

分間インキュベートした．5％SDSにて反応を

マルチキャタリティツタプロティナーゼ停止させた後，遊離したアミノメチルクマリン（MCP）はインゲンシン，プロテアソームともを蛍光光度計にて定量した．

呼ばれる細胞質中の高分子量タンパク分解酵素
で，サブユニット20数個から成り立つ巨大分子結果並びに考察である．その特徴の1つは，多くの活性部位を表1にFD−056誘導体の阻害効果を示す．

持つことで，ArgのC末端を水解するトリプシ

MCP活性はトリプシン型（Boc−Leu−Arg−Arg−

ン活性やTyrのC末端側を水解するキモトリ

MCA，BLRR），キモトリプシン型（Suc−Leu−

プシン活性をあわせ持つことが知られている1）．

Leu−Val−Tyr−MCA，SLLVY）及びメチオニ

今回，我々はCANP阻害剤として開発されンエンドペプチターゼ型（Z−Val−Lys−Met−

たE−64アナログ並びにFD−056誘導体2）の一MCA，ZVKM）に分けて測定したものである．

部がMCP活性を阻害することを見出した．ままた比較のため，細胞質酵素の代表例の1つでた，活性部位がサブユニットに分散しているのあるプロリルエンドペプチダーゼ3）の値も示しか，という点についても若干の知見を得たのでてある．これらロイシナール誘導体は低濃度で報告する．

MCPのキモトリプシン活性を抑制することがわかる．最も効果があったのはAc−Asp（OBz

実験方法l）−Glu（OBzl）−LeurHで，IC5。は1JLM以下であった．興味ある点はメチオニンエンドペプ（1）MCPの精製
MCPは従来の方法によって均一に精製した．

チダーゼ活性もこれら化合物で阻害されること

方法は，硫安沈殿，DEAE一セルロース，ハイド

で，トリプシン活性には全く影響がないこととロキシアパタイト，G−4000によるゲルろ過，並びにブルーセファロースである．材料は，ヒト
赤血球，酵母ともに新鮮なものを用いた。
（2）阻害活性の測定
ヒト赤血球MCPを用い以下のように阻害活

表l FD−056類縁体（F−64アナログ）による
MCPとPEPの活性阻害（1）Leuアナログの阻害活性はICso（FLM）で表してある．

性を測定した．MCP50unitと阻害剤（DMSO

Reagentに可溶化し，DMSOで希釈したもので，DMSO

Ac−Asp（OBzl卜Glu【OBzl上しeu一日

0180

Z−Asp【OBzl卜GIu（OBZlトLeu一日

066の最終濃度は2％以下とした）を加え，370C30

SLLVY

BLRR

Ac−Asp（OM叶Glu（08zl卜Leu−H
Ac−Aspl08叶GlJ（OM叶Leu−H

−3−

＞100
＞100

2．5

5．4

Ac−Asp（OMeトGIu（OMe）−Leu−H＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部

ZVKM

20

0・71

＞100

52

76

27

＞100

15

2・1

32
＞100

PEPase4264130好対照を示した．この値はCANPに対する値

Thr−Ileの4桂のペプチドを含む阻害剤は全くよりも小さく，CANPよりもMCPにより強く

MCPを阻害しないことが判明した。

作用する可能性が考えられた．

次に，MCPのどのサブユニットに活性が存

次に，ロイシナール部分を他のアミノ酸に置在するかを明らかにするため，サブユニットの換した化合物群の作用を検討した（表2）．ここクローニングを行った4）．材料は酵母を用いでは表1よりも強力なMCP阻害物質は見つか

genomicDNAのクローニングを行った5）．図1

らなかったが，プロリナールを持つ物質がプロに，3つのサブユニットY7，Y8，Y13の推定

リルエンドペプチダーゼを特異的に阻害すると1次構造を示す．3サブユニット共に約30％のいう結論を得た．IC5。は52J Mとかなり強力なホモロジーを示し共通の祖先の存在が示唆され阻害物質であることが判明した．

た．しかし，プロテアーゼ特有の配列は見出せなかった．

昨年来，CANPインヒビター（カルパスタナ
ン）の活性部位のアミノ酸数個とE−64の中心

これらサブユニットの重要性を検討するため，となっているエポキシコハク酸を結合させてよ

遺伝子破壊を行った5）．これらの遺伝子をり特異的なCANP阻害剤を合成する計画が進

URA3遺伝子で分断し生じたdiploidから胞められている2）．本年度はこれらCAシリーズ

子を取り出し生育を観察したところ，Y7及びの阻害剤がMCPを阻害するかどうか検討した

Y8を分断すると全く生育できなかった．このところ，Tyr−Arg（NO2），Pro−Pro，Tyr−Arg，

ことより，Y7，Y8遺伝子産物は酵母の生育に重要な役割をはたしていることが明らかとなっ

表2

FD−056類縁体によるMCPとPEPの活性阻害（2）

た．一方，Y13遺伝子を破壊した半数体は一世代が正常の1．2倍と少々遅いが生育を見た．そ表1でLeucinalの代わりに種々のア
ミノ酸のアルデヒドを導入したもの．
ProlinalがPEPの強い阻害剤であることがわかる．値はIC5。（〟M）．

こでY13遺伝子破壊体（Y13−D）と正常（N）
からMCPを精製したところ，Y13−Dでは分子量29KDのバンド1本が欠けていることが明らかとなった．これは，Y13の理論サブユニ

Reagent

sLLVY8LRRZVKMPEPaseット分子量28，700と一致した（図2）．
80C−Asp（OBヱIH罰叫OB王l）−Leu一日15

54

2．7

49

−日e・H S，4

＞100

60

140

−VaトH

54

＞100

60

87

−Phe−H

32

＞100

83

320

−Met−H

9．1

＞1（）0

7．6

そこで次にY13−D酵素の作用について検討した．まずMCPの作用と考えられるATP依036

存性タンパク分解活性を見たところ，N及びY
13−D共にタンパク分解に差がないことが判明−AJa−H

23

＞100

＞180

−Pr〇・日

＞100

＞1080

1000

8，052

＞1080

＞100

14

・Gly−H＞100＞1088

した（表3）．人工基質に対する活性もほぼ同じ

エFSpEGRエTQVET

713

HGS

IFSpEGRLT

図1酵母MCPの3つのサブユニットの推定1次構造
3つのサブユニットに共通なものには●，また共通シークエンスは囲ってある．
−4−

であったが，Y13LDでは予想に反してZVKM，

M
■r

N

D

SLLVY活性が上昇していることが明らかになった（表4）．SLLVYについてはタンパク質当「膏

たり15倍もの比活性が観察された．そこで，MCPに特徴的に見られるSDSによる活性化を観察したところ，Nでは顕著な活性化が見られたが，Y13−Dでは活性化能が低く，Confor−
mationがもともとおかしい可能性が指摘された（図3）．従来より精製段階が上がるにつれて活性化に必要なSDS濃度が低下していく傾向にあったが，これは精製に伴う酵素の変性と考えられている．本実験によってY13−DのMCPは20数個のサブユニットのうち1個を欠くものであるがこの欠夫によって特殊な活性がなくなることはないこと，逆に変性することによって活性化されることが発見された．この事実か
表4

図2

精製した酵母MCP（12％SDS）

NとY13−Dの基質特異性の検索．基質は0．1mM（DMSO1％）の条件で測定した．値はタンパク質当たりに換算してある．
NM，マーカー（96k，67k，42k，30k，
21．5k）

Boc−Leu−A「g−A「grMCA

Boc−Val−Leu−Lys−MCA

N，正常株
D，Y13−D株矢印のサブユニットがY13がコードす

437

3．70

D／N

4▲65

1．07

lr28

0．35

Suc−HIS−Gln−Lys−rlCA O．27 0．16
Suc−HIS−HlS−Gln−MCA O．11 0，11

0．58
T．00

Z−Val−Lys−Met−rlCA l．9517．2

8．80

Suc−LeurTy「−rlCA

るもの．

3．77

Suc−Leu−Leu一Val−Tv「−MCA

表3

D

4．33

9．37
63／7

24g
14．7

酵母エキス中のATP依存性タンパク分糾

解活性基質はカゼイン，BSA共に14CラNon一郎帥岬他出

40

液mg当たりのTCA可溶性部分のカウントで表現してある．

約

言u⊃︶ ト1−三10く

ベルしてあるものを用いた．活性は抽出

Y13−di肌Ptant

SubStrate
−ATP

CaSdn

9．849

＋ATP

12．111

・ATP

8．825

＋ATP

9．376
000

BSA

4．818

3．571

1．糾8

2．118

002

004

006

008

010

012

SDSl％）

図3 正常（N）と遺伝子破壊（Y13−D）酵母
中のMCPのSDS感受性，
活性はSLLUY−MCAを基質にして測定した．

CPm／mg−5−

らもY13サブユニットは生存には必須でない

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開が，構造を保つうえで重要な役割を担っている

発研究（江橋姓）平成元年度研究報告書，と考えられる．

1990，ppl1−15．

今後は，他のサブユニットについてもその作用を解明していく予定である．

3）Tsukahara，T．，etal．：J．Biol．Chem．，265：
21448−21453，1990．

4）Sorimachi，H．，et al．：Eur．J．Biochem．，
文

献193：775−781，1990．

1）Ishiura，S．，et al．：FEBSLett．，189：119−123，1985．

5）Emori，Y．，etal．：Mol．Cell．Bio1．，11：344−353，1991．

2）向山光昭ほか：厚生省「新薬開発研究費」−6−

筋ジスマウスにおけるジぺプチジルぺプチダーゼ（DPP）活性の動態

青 柳 高 明＊
研究協力者 和 田 孝 雄＊
小 島 蕗 子＊
原 田 滋 子＊
斉 藤 宗 男＝筋ジストロフィー症の発症ならびに進展の機

永 井 真知子＊

酵素活性の測定

序に，プロテアーゼを含む各種の酵素活性の異前肢筋，後肢筋および脳ホモジネートの遠心常による筋蛋白崩壊が重要な役割を演じている

上清は，それぞれの基質溶液および緩衝液を含ことが可成り明らかになり，各種の酵素阻害物

む反応管に分注し，370Cで1時間の反応を行な質を治療に用いる試みが報告されている1ト9）．

った．アミノぺプチダーゼ（5種類），エンドぺ

筆者らは筋ジスマウスの前肢筋および後肢筋に

プチダーゼ（4種類）およびグリコシターゼ（3おいて，エンドペプチターゼの他にエキソペプ

種類）について活性を測定した．各酵素活性のチダーゼが有意に増加すること10），さらに患者測定法および基質は表1に示す10）・12）〜19）．すべて

血清中のアミノペプチダーゼとエンドペプチダの酵素活性の測定には3本宛の反応管を用い，ーゼが発症機序に異なる役割を果していること

その平均値を記載した10），20〉を示唆した11）．

蛋白の測定

筋ジスマウスは後肢に麻痺を伴なう特徴的な標準蛋白としてウシ血清アルブミンを用い，症状が現われるが，酵素活性については前肢筋，Lowry法21）で測定した．

後肢筋において著しい差違は認められなかった．

統計

今回は，特にこの両者間の差違について追究した結果，DPP一ⅠⅠⅠに変化が誘起されることを認

多変量解析の一方法である主成分分析法22）
によって解析した．

めたので報告する．
結果および考察

実験動物
筋ジスマウス（C57BL／6dy／dy，雄，7週齢）筋ジスマウスの前肢筋および後肢筋の酵素活および対照マウス（C57BL／6−＋／dy，雄，7週

性の動態をアミノペプチダーゼ，エンドペプチ

齢）は実験動物中央研究所より購入した．実験

ダーゼおよびグリコシターゼについて調べ，対動物は屠殺後，直ちに前肢筋，後肢筋，脳など

照と比較した．同時に脳内の酵素活性についてを摘出し，一700Cで保有した．臓器は10倍量のも検討した．

phosphatebufferedsaline（PBS，pH7．2）中表2に示したように，筋ジスマウスの前肢筋で，組織ホモジナイザー（ultraturrax）を用いではAP−A，DPP−Ⅰ，カテプシンB，カリクレて1分間ホモジナイズした．酵素活性の測定に

イン，トリプシン，Gal−aSe，GIcNAc−aSeなど

は，ホモジュネートの3，000Xg，20分間の遠心の活性が有意に増加するのに対し，DPP−ⅠIl活

上清を用いた．

性のみ有意な低下を示した．
また後肢筋ではAP−A，DPP−Ⅰ，DPP−II，■微生物化学研究所＊＊実験動物中央研究所

DPP−IV，PEP，カテプシンB，トリプシン，Gal−7−

表1LiSt ofthe proteases measured and their substrates
En町me

Rererence ror
assay method

AbbreYiation Substrate

Aspartate aminopeptidase匹C3．4．11．7）
Dipeptidyl peptida5eI匹C3．4．14．1）

AP．A
DPP．I

Dipeptidyl peptidaseII（EC3．4．14．2）
Dipeptidyl peptidaSe刀圧（EC3．4．14．4）
Dipeptidyl peptid那eIV（EC3．4．14．引Prolyl endopeplidase 匹C3．4．21．2 ）CatbepSh B（EC3．4．22．1）
TiSSue kalukrein（EC3．4．21．35）
Trypsin（EC3．4．21．4）

DI〉P＿ⅠI
DPP．ⅠⅠI
DPP．ⅠVPEP
CalbepsinB

Glu・NAlO

Gly・Arg・NA
Lys・AIa・NA
Arg・Arg・NA
Gly・Pro・NA
Z−Gly・Pro・NA
Z−Arg・Arg・NA

12
13
14
15
1
17

Kallikrein

Pro・Phe・Arg・MCA
18
Tryp51n
Boc・Gln・Ala・Arg・MCA
19
Gal．aseNP・Ga1
10
Man・aSe NP・Mam lO

β・D−Galactosidase（EC3．2．1．23）
α・D・Mamosidase（EC3．2．1．24）
トN・Acetyl・D・glucosaminidase（EC3・2・1・30）

GIcNAc・aSe NP・GIcNAc lO

Z：benzyloxycarbonyl，Boc：t・butyloxycarbonyl，Glu・NA：L・gIutamicacidβ・naPhthylamide，
Pro・Phe・Arg・MCA；L・PrOlyI・L・phenylalanyl・L・arginine・4−mefhylcoumaryI・7・amideINP・Gal：P・
nitropbemyl P・D・galactoSidase

表2

Enzymaticchangesinlimbmusclesandbrainofdystrophicmice
Spdn亡aetiYity土5D

mndlimbe C（れ＝4）

D（n三5）C（nニ4）

D（n＝5）

C（n＝8）

D（n＝10）AP．A

0．52 土0．0，

1． 8 土0．32●●

0．55 土0．08

1．35土0．51●

0．5，土0．14

0．47

pPP・I

0．54 土0．37．21土2．22●●

0．40 土0．22

4．50土1．，0●●0．08 土0．07

0．07

土0．10

DPP．ⅠI

2．25 土1．00

2．83 土0．さ4

1．42 土0．11

2．30土0．3，●●

3．24 土0．45

3．7

土0．40●

DPP．1ⅠI

4．5，土0．57

3．35 土0．31●●

4． 4 土0．27

3．，8土1．20

7．20 土1． 8．53 土1．43

DPP．lV

0．58 土0．09

0．84

0．52 土0．0

0．，5土0．2，●

0．81土0．11

0．71土0．07

PEP

5．最少 土1．48，．，3 土0．73

8．47 土1．08●●

CalhepSin t事

1．7，土0．37

Ⅸallikrein O．022土0．007
TrypSin O．019土0．003
Gala⊂tOSida5モ

7．42 土1．1，
1

GkNAc・aSe．05

土2．，7●●●

0．057土0．011●●●0．044土0．00

0．4，土0．12

Mannosi血se O．31土0．05

土0．22

0●●●

0．43土0．10

5．48 土1．17

7．83土1．30●

1．47 土0．1，

15．00土2．‡0●●●

7．3

土0．41

．，8 土0．82

0．031土0．010

0．020土0．00

0．022土0．007

0．02

土0．0210．010土0．001

1．70土0．27●●●

0．032土0．00

0．32土0．0，

0．23土0．04

土0．92
28．05土3．81●●●UI川Aか1∫亡 ．73 〇・73土飢ワ王
ュ＝5土3・81

土0．05●

5●●●

1．37土0．2，●●●0．

1土0．12日●

0．01

土0．0010．014土0．0020・

1．4

土0．17

1．32

土0．18

0．39

土0．07

0．38

土0．10

3．51土0．42

23．44土5．糾●●●3・51土〇・4コ
23・H土5・糾…

37・13土4・00

3土壁＿●タく0・05，●●タ＜0・01，●●●♪く0．001（a⊂⊂Ording to Shdenl●5日eSt）

C：COn101，D：dystrophy

ーaSe，ManraseとGIcNAc−aSeなどが有意に

DPILIII（γ＝−0．92），カリクレイン（0．79），増加した．しかし，前肢筋でみられたDPP−ⅠⅠⅠのAP−A（γ＝0．71），トリプシン（γ＝0．66），Gal

変動は認められなかった．一方，脳内の酵素活−aSe（γ＝0．61）などである．DPP−llIがマイナ

性の動態は前記筋肉内の動態と全く異なっていスの高い相関を示すのが特徴である．さらに，た．即ち，DPP−IIのみが増加するが，AP−A，第3主成分に対してはDPP−ⅠⅠ（γ＝0．79）とPEP，ト））プシンおよびGIcNAc−aSe活性など

DPP−Ⅰ（γ＝0．64）が有意な相関を示した．

は有意に低下した．

表3

上記筋肉内の酵素活性の動態を主成分分析法

Relation to three main factors to
Various enzymesinlimb muscles ofにより，さらに解析した．表3に示すように，

dystrophicmice

第1主成分に高い相関を有する酵素はMan−

EnZyme FaCtOrl
ふ11m・iS亡

as6（γ＝0．77），DPP−IV（γ＝0．77），PEP（γ＝0．76），カテプシンB（γ＝0．73），GIcNAc−aSe（γ＝0．65）である．第2主成分に対しては，

0．77●●●

DPP・lV O．77●●●
PEP O．7●●●

Cih叩血もl．73●●●

GkNA亡・iS亡0．

5●●●●′く0．01，●●●クく0．001−8−

EnZymt F▲亡brユ
DPP・tll・0．92●●●K山Iihth l．7，●●●
AP・A l．71●●●
TrJpS川l．糾●●

Gaトase0．

1●●

EIはJme F■⊂tOrJ
DI■P．11DPP．1

0．79●●●
0．I4●●

筋肉組織の崩壊に分解酵素が大きな役割を果

leupeptin and antipain・Biochem・Bio−している．筋ジスマウスの前肢筋と後肢筋におphys．Res．Commun．，82：484−490，1978・

ける症状の差違にDPP一ⅠⅠⅠの関与が考えられる．

5）Ishiura，S．，Murofiushi，H．，Suzuki，K・

即ち，DPP−ⅠⅠⅠは前肢筋において低下するが，後andImahori，K．：Studiesofacalciumac−

肢筋では有意な低下が認められない．DPP−ⅠⅠⅠ

tivated neutral protease from chickenと他の酵素のバランスが筋ジス症の進行と深い

skeletal muscle．J．Biochem．，84：225−

関係にあると思われる．さらに検討中である．

230，1978．

6）Goll，D．E．，Okitani，A．，Dayton，W・R・and
おわ り にReville，W．J．：A Ca−aCtivated muscle

筋ジスマウスの前肢および後肢における症状

proteaseinmyofibrillarproteinturnover・の差違を明らかにすることを目的とし，12種類

Inの酵素活性の変動を検討した．前肢筋と後肢筋

Functionの酵素変動は類似しているが，主成分分析によJ．）Academic Press，Inc．，New York，り両者の差に寄因する2群の酵素を選出した．

1978，pp587−588．

Protein

Trunoverand

Lysosome（edbySegal，H．L．＆Doyle，D・

即ち，Man−aSe，DPP−IV，PEPとカテプシン

7）Bird，J．W．C．，Spanier，A．M．andSchwar−

Bのグループ，他のグループはDPP−ⅠⅠⅠ，カリク

tz，W．N．：Cathepsins B and D：

レインとAP−Aであった．これらの酵素はジス

proteolyticactivity andultra−StruCtural

トロフィー筋内で，特に低下することはないが，localizationinskeletalmuscle．In

Pro−

DPP−ⅠⅠⅠのみ前肢筋で有意に低下した．後肢筋

teinにおいてはDPP−ⅠⅠⅠの低下は認められない．筋（ed．by Segal，H．L．，＆ Doyle，D・J・）崩壊との関係が注目される．

Academic Press，Inc．，New York，1978，

Turnoverand

LysosomeFunction

pp589−604．

文8）Sanada，Y．，Yasogawa，N．and Kat−

献1）Stracher，A．，McGowan，E．B．andShafiq，

sunuma，N．：Serineproteaseinmicewith

S．A．：Invivoeffectofproteaseinhibitors

hereditary muscular dystrophy．J・Bio−indenervationatrophy．Exp．Neuro1．，66：

chemリ83：27−33，1978．

9）McGowan，E．B．，Shafiq，S．A・and

611−618，1979．
2）Iodice，A．A．：Theinhibitionbypepstatin

Stracher，A．：Delayed degeneration of

Of cathepsin D and autolysis of dystro−

dystrophic and normal muscle cellphic muscle．Life Sci．，19：1351−1358，

culturestreatedwithpepstatin，1eupeptin

1976．

andantipainExp．Neuro1．，50：649−657，3）Kar，N．C．andPearson，C．M．：Hydrolytic
enzymesandhumanmusculardystrophy．

1976．

10）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F・，Nagai，MuscularM．and Umezawa，H．：Variousenzyme

Rowland，L．P．）

activitiesinmuscle andother organsof

Excerpta Medica，Amsterdam，The

dystrophicmice．J．Clin・Invest・，67：51

Netherlands，1977，pp387−394．

−59，1981．

In

Pathogenesis

Dystrophiesof，（ed．byHuman4）Toyooka，T．，Shimizu，T．and Masaki，11）Aoyagi，TリWada，T．，Kojima，F・，Nagai，

T．：Inhibition of proteolytic activity ofM．，Miyoshino，S．and Umezawa，H・：

Calcium activated neutral protease by

Two different modes of enzymatic−9−

Changesin serum with progression of

Syndrome．J．Appl．Biochem．，7：273−

Duchenne muscular dystrophy．Clin．

281，1985．

Chim．Acta，129：165−173，1983．

17）Knight，C．C．：Human cathepsin B．

12）McDonald，J．K．and Schwabe，C．：

ApplicationofthesubstrateN−benzylo−

Intracellular exopeptidases．In

XyCarbony1−L−arginyl−L−arginine2−na−andphthylamidetoastudyoftheinhibition（ed．byBarrett，A．J．）EIsevier／byleupeptin・Biochem．J．，189：447−453，

Proteinasesin

Tissues

Mammalian

Cells

North−Holland Biomedical Press，New

1980．

York／Amsterdam，1977，pp314−322．

18）Nagase，H．and Barrett，A．：Human13）McDonald，J．K．，Leibach，F．H．，Grin−

plasmakallikrein．Biochem．J．，193：187

deland，R．E．andEllis，S．：Purificationof−192，1981．

dipeptidylaminopeptidaseII（dipeptidyl19）Sawada，H．，Yokosawa，H．，Hoshi，M．

arylamidaseII）oftheanteriorpituitary

andIshii，S・：Ascidianspermchymbtryp・・gland．Peptidase and dipeptide esterase

Sin−likeenzyme；paticipationinfertiliza−

activities．J．Biol．Chem．243：4143−4150，
1968．

tion・Experientia，39：377−378，1983．
20）Aoyagi，T．，Wada，T．，Nagai，M．，Kojima，

14）Theodore，H．D．and Kapralou，A．：A

F・，Harada，S．，T去keuchi，T．，Takahashi，

rapid assay for dipeptidyl amino−

H・，Hirokawa，K・and Tsumita，：Defi−

peptidaseIIIin human erythrocytes．

Ciency of kallikrein−like enzyme acti−

vitiesincerebraltissueofpatientswith

Anal．Biochem，■119：418−423，1982．

15）Oya，H．，Nagatsu，I．and Nagatsu，T．：

AIzheimer，sdisease・Experientia，46：94

Purification and properties ofglycylprolyl

β−naphthyl−amidasein−97，1990．

21）Lowry，0．H．，Rosebrough，N．J．，Farr，A．

human submaxillary gland．Biochim．
L

Biophys．Acta，258：591−599，1972．

andRandall，R．J．：Protein

measure●ment with the Folin phenolreagent．J．

16）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，．M．，Okubo，M．，Masaki，Y．and Ume−

Biol・Chem・，193‥265−275，1951．

22）Kendall，M．：Principle components．In

ZaWa，H・：Abnormality of the post−
proline−Cleavingenzymeactivityinmice
With systemiclupus erythematosus−like−10−MultivariateAnalysis

Charles

GriffinandCo・，London，1975，pp13−29．

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

鈴 木 紘 一＊研究協力者

西 道 隆 臣＊羽 田 明 子＊川 崎 博 史＊
大 野 茂 男＊CANPの前駆体が生体内で活性を発現する存在下でも10￣5Mのカルシウムが必要で，おおよその道筋は解明されたが，細い点では不mcANPについてはJLCANPとは別の活性化

明な点が多い．ここではCANPの活性が発現機構が存在するはずで，mCANPのカルシウムするまでの幾つかの点をさらに検討した．

感受性を上昇させる機構の検討を続けている．

（1）前駆体の活性化に及ぼすリン脂質の効果（2）CANP遺伝子の発現

CANP前駆体をわ〃かけで活性化するには昨年度までにmCANP80Kサブユニット遺非生理的な高いカルシウム濃度が必要である．

伝子の5′上流域の構造を解析し，m80K遺伝

このカルシウム濃度を下げる因子としてリン脂子にはホルポールエステルTPAで遺伝子発現

質が見出されたが，ここではさらにリン脂質のが誘導されるタンパク質に共通にみられる効果を検討した．その結果イノシトール4，5−ビスリン酸（PIP2）が最も強い効果をもち，PIP2

TRE配列の存在を明らかにした．このTRE配列を含む部分をCAT遺伝子の上流につないでの存在下では10￣7Mカルシウム存在下でもCATの発現をみる実験から，m80K中のTRE

CANPは活性を発現して基質ホドリンを切断

はTPAに応答した遺伝子の発現を誘導するこした．PIPやPIも効果を示すが，リン酸基の数とが解った．そこで，ラット線推芽細胞3Ylにが多い方が効果が強いことが解った（図）．このプロテインキナーゼCαのCDNAを発現させイノントールリン脂質の効果から，JLCANPにた細胞を使ってTPA刺激後のCANP遺伝子

ついては生理的なカルシウム濃度で生体膜上での発現を検討した．CANP関連の4種の遺伝子活性化されるが，mCANPについてはPIP2ののうち，m80K，30Kの遺伝子の発現は誘導されたが，〃80Kの発現誘導は見られなかった．
この結果，TPA刺激ではmCANPのレベルのみが特異的に上昇し，〃CANPの発現は増加し

少︵≠︶一t邑●○もー

ないことを示す．30Kと〟80K遺伝子の5′上MM P −（2 如 ′M け

．P S

（
8 如

／M l）

W

●

流域の機能の解析はしていないが，m80Kと同

lco ntr01〉

様にTPE配列を持つ．このうちJL80K遺伝子
だけがTPAに応答しないことになり，TPAや
0

7

0

5

●

回し 〟CANPによるホドリンの加水分解におよばすリン脂質の効果

その他の刺激で細胞を刺激したときのCANPの発現をさらに調べている．なお，TPA刺激でCANPインヒビターの発現も増強されるようで，今後の検討が必要である．

＊東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部−11−（3）CANP基質の活性化う関係するかは見ていないが，血小板のタンパ

CANPは細胞質で常に基質と接しているにク質でもやはりリン酸化されたタンパク質が選もかかわらず無秩序な分解がおこらないのは，択的にCANPで切断される．結局，リン酸化なCANP側の活性調節の他に，基質側の調節もあどによる基質の修飾がCANPによる被分解性

る．すなわち，プロテインキナーゼC（PKC）

を著しく上昇させる現象が見出され，基質側にはリン酸化された分子種のみが特異的に分解さもCANPの活性調節機構が存在することが判

れ，リン酸化を受けていないものは切断されな明した．

い．今年度は我々が新しく見出したカルシウム

CANPの活性発現と調節ではこれらいくつ

非依存性のnPKCもCANPの基質になるか否かの活性調節機構が複雑にからみ合ったものとかを検討した．nPKCeはJL，mCANPで共に分予想され，これらの機構がどのように影響を及解され，45KDaのキナーゼドメインを生じた．

ぼし合うかなどを解明する必要がある。

nPKCeのリン酸化がCANPによる分解とど−12−

細胞の増殖・分化とCANP

川 島 誠 一＊
研究協力者

中

村

愛＊

は じめに

実験方法

カルシウム依存性中性プロテアーゼ

正常および悪性リンパ腫患者などの骨髄・血（CANP）はCa2＋で活性化される非リソゾー液・培養細胞の塗抹標本を作成し，FECANPにム系プロテアーゼである．筋ジストロフィーで特異的なモノクロナル抗体（1A8A2）およびは筋細胞内Ca2十が上昇しているので，本疾患

mcANPに特異的なモノクロナル抗体（3Allでの筋タンパク質の異常分解にCANPが関わD12）で免疫染色した．培養細胞CANPのウェっていると考えられている．しかし，当然

スタンプロットは，一定数の細胞をSDS電気CANPには正当な生理機能があるはずである．

泳動試料用緩衝液で溶解し，電気泳動したのち筋ジストロフィーの治療薬としてCANP阻害

ニトロセルロース膜に転写し，各モノクロナル剤を授与する場合には，CANPの正常な機能も抗体でCANPを検出した．

損なわれる可能性があるので，その機能を明らかにすることはCANP阻害剤使用の妥当性を結果

主張する上で重要であろう．これまでCANP

骨髄細胞の抗CANP抗体染色の結果を図1の機能として，酵素・受容体など活性タンパクに示してある．mcANPは赤芽球・骨髄細胞・質の限定分解による活性化や細胞骨格タンパク

形質細胞で陽性であるが，赤血球・血小板では質の分解による細胞機能の調節が考えられてい検出限界以下であった．抗〟CANP抗体では巨るが，いずれも試験管内実験に基づくもので，核球が強い反応を示した．mCANPもJLCANP

実際に生体内でこれらの機能を果たしているかも細胞質に存在し，細胞核は陰性であった．表

どうかは不明である．細胞内でのCANPの機は血球・骨髄での抗体染色の結果をまとめたも能と密接な関係をもつものが，CANPの細胞内存在部位とその動きである．そこで，細胞の分化・増殖におけるCANPの動態を探るため，種々の増殖能・分化能をもつ細胞群が存在する
骨髄および造血系培養細胞系を用いて，抗CANP抗体による免疫組織的局在およびウェ
スタンプロット法による量的差異について検討した．
図1

ヒト骨髄におけるmCANPとFLCANPの局在
a，コントロール抗体：b，抗mCANP

抗体；C，抗FLCANP抗体：M，骨髄球：Mbl，赤芽球：Mgk，巨核球＊東京都老人総合研究所
−13−

表

造血系細胞の抗CANP抗体に対する反応

ArltibodY

uSed

AnいいIICAドP

Erythroblast
EfYthroCyte
兄y010blaSt
hyelocyte
St≧9爪eIlted

9ranulocyte

Monocyte
HegakaryOく：Yte竿⁝†性plate1et
plaS爪a Cell
LymphDCyteのである．傾向として，未分化で分裂能の高い

図3

巨核球系培養細胞（T−33）における
mCANPとJLCANPの局在細胞にmCANPが多く存在した．

a，コントロール抗体；b，d，e，f，これらの結果を確認するため，確立された抗mCANP抗体：C．抗JLCANP抗体

種々の造血系培養細胞のCANPを検討した．
図2のウェスタンプロットが示すように，
mCANP量は前骨髄性白血病細胞・骨髄細胞・単球系細胞に多く，T細胞系・B細胞系・リンパ球系の細胞には少なかった．〝CANP量はい
ずれの細胞系でも少なく，骨髄塗抹標本で強い免疫染色を示した巨核球系の培養細胞（T−33）
でも僅量であった．この巨核芽球系細胞は細胞の免疫染色でもFLCANP陰性であり抗mCANP抗体にのみ反応した（図3）．この傾向
は単核の状態でも巨核になった細胞でも同様で
図4あった．しかし，この培養巨核細胞は骨髄中の特発性血小板減少性紫斑病患者骨髄の巨核球におけるmCANPとJLCANPの局
在

巨核細胞に比べて未熟な状態にあり，分離膜をa，コントロール抗体：b，C，抗mCANP抗体；d，e，抗JLCANP抗体
有きない．したがって，mCANPとJLCANPの逆転は巨核細胞の成熟過程で起こるものと思われる．このことを明らかにするため，種々の成熟過程にある巨核球を含む特発性血小板減少性
紫斑病患者骨髄の塗抹標本を抗体染色したとこ
ろ，未熟な巨核球はmCANP抗体で陽性なのに対し成熟した巨核球は抗FECANP抗体で陽性であった（図4）．
図2

造血系培養細胞のmCANPとJLCANP

考のウェスタンプロット

本研究で得られた結果，即ち赤芽球・骨髄芽

a，抗mCANP抗体：b，抗JLCANP抗体

察球・未熟巨核球などの未熟な細胞がmCANPを−14−

多く含むことは，このCANP分子種が細胞分

巨核球のJLCANPは生体内で血小板の形成に裂や分化の初期の段階で機能していることを示

際し膜融合の必須因子として機能しているのか

唆している．実際，細胞分裂期にmCANPが染も知れない．

色体に局在したり1），CANPの阻害剤であるEL

いずれにせよ，細胞増殖や膜融合における64が細胞分裂を阻害すること2）が報告されて

CANPの作用機作を明らかにするためには，さいる．我々の研究室での結果でも，細胞内らに検討が必要である．

CANPを効率よく阻害する低分子性阻害剤（Cbz−Leu−Leu−Leu−al）がPC12細胞の分化をもたらした3）．したがって，mCANPは細胞増文1）Schollmeyer，J．E．：Science，240：911−

殖に関与し，その消滅あるいは阻害は増殖を止め分化が始まると仮定すると説明がつく．

献913，1988．

2）Shoji−Kasai，Y．，Senshu，M．，Iwashita，S．
andImahori，K．：Proc．Natl．Acad．Sci．

一方，もうひとつのCANP分子種である〃CANPは巨核球の成熟に伴い強く発現された．巨核球はその後血小板となる前駆細胞であUSA，85：146−150，1988．
3）Saito，Y．and Kawashima，S．：J．Bio−
Chem．，106：1035−1040，1989．

り，その際には細胞膜が千切れて融合する。人工的な赤血球の融合において細胞内の4）Glaser，T：and Kosower，N．S．：FEBS
Lett．，206：115−120，1986．

〟CANPが関与しているといわれてきた4）が，−15−

CANP阻害剤の合成
＊

晴男
＊

＊

＊

＊

＊

は じめに

正充

玉村

＊

井田

紆㌢

＊

正

和見

弘

関

＊

＊

田名

花田

＊

＊

大

＊

刀ロ

彬尋き
＊

光

正千さ

nHH

山

木尾下

つ

向

枯枝富

研究協力者

せ，新たな誘導体を合成しその構造活性相関をカルシウム依存性中性プロテアーゼ

検討した．

（CANP）に対する特異的阻害剤の創製を目的に，昨年度に引続き次の2種類の化合物につい方て研究を進めた．

法

表4に示した化合物については，図2に示し（1）エポキシコハク酸誘導体

た方法により合成し，他の化合物については昨．昨年度までに，内在性CANPインヒビター

年度までに報告した方法に準じた．また，酵素の活性中心のアミノ酸配列1）を含むエポキシコ

阻害活性の測定方法についても，昨年度までに報告した方法に準じた．

ハク酸誘導体を約70種合成し，CANPに対して特異性を有する化合物としてCA−092を兄いだした（表1）．しかしながらCA−092のCANP

結果及び考察阻害活性が弱いことから，本年度は更に周辺化（1）エポキシコハク酸誘導体

合物の検討を行なった．

表2に本年度合成したエポキシコハク酸誘導（2）FD−056誘導体

体の構造式およびその酵素阻害活性を示した。

昨年度より，天然由来の新規なシステインプ

主にCA−092のグルタミン酸部分とバリン部分

ロテアーゼ阻害剤FD−056（図1）2）の誘導体のを中心に構造変換させたが，現在までのところ，研究を開始し，CANPに対して比較的強い阻害

CANPに対する阻害活性を強めることには成活性と特異性を示す化合物AP−049を兄いだし

功していない．しかしながら，これらの部分のた（表1）．本年度は昨年度の研究を更に発展さ

構造上のわずかな違いが，カテプシンBおよび表l CA−092，AP−049の酵素阻害活性
I C 58 （n M ）Co mpo und No ．

S t r u c t u r e

C A −0 9 2

H O−tE S−A r g−G lu −V a1−OH

A P − 0 4 9

Bo c−A sp （OB z l）−G lu （O Bz l）−A ib−H

＊東京理科大学理学部＊＊大正製薬㈱総合研究所−16−

C A N PPa pa inCa th ep sin B

3 5．0 00

〉10 0．000〉100 ．0 00

7，8 0038 ．000

3 1．0 00

表2 エポキシコハク酸誘導体の酵素阻害活性
I C 5 8 （n M ）C o llp O u n d

Ⅳ0 ．

S

t r u

c

t u

r e

C A

N P

P a p a in

Cathep sin B

C A− 1 5 4

H O −t E S −A r g （Ⅳ0 2 ）−G l u −L e u −O H

〉10 0 ．0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0〉1 00 ，0 0 0

C A

− 1 5

5

H O −t E S−A r g （Ⅳ0 2 ）−A s p 一V a 1−O H〉10 0 ．0 0 0

1 0 ．0 0 0

3 3 ．0 0 0

C A

− 1 5

6

H O −t E S−A r g （Ⅳ0 2 ）−A s n −V a 1−O H〉10 0 ．0 0 0

3 ．1 0 0

1 0 ．0 0 0

C A

− 1 6

1

H O −t E S−A rg （Ⅳ0 2 ）−G l u （O M e ）−V a 1−O H

5 1 ．0 0 0

1．8 0 03 ．5 0 0

C A

− 1 6

2

H O −t E S −A r g−G lu （O M e ）−V a 1−0 Ⅵ

5 4 ，0 0 0

8 ，1 0 0

1 ．3 0 0

C A

− 0

2

J O −t E S −A rg −G lu 一†a 1 −0 打

3 5 ．0 0 0〉1 0 0 ，0 0 0〉1 0 0 ．0 0 0

9

い
3− 2

H

C ollP O un d が0 ．

H
N

O
C

H

N

O

−

C
H

H

C

C −
H

H
C

C

−

−

2
H

C

H
H
H
H
︵し − C − ︵し − C

H−■ ＋ ＋ ■ 2

H

C

▲

O

C

N

日

H

ハし

図1

N

O

C■−

H

C

N
O

日

0−C

H
C

H
C

（レ舶n）

表3 FD−056誘導体の酵素阻害活性（1）（レGln） （L−Luecinal）

FD−056の構造（Cn℡2…）吉：C研トム＄れ朝一山川￣Ea）D】lSO．SOrPJ，EtaT d）Et3‡
b）Pb3†＝CE002Et

亡）

e）0】

用ECトpiotlne

図2 FD−056誘導体の合成法

パパインに対する阻害活性を大きく変化させることが認められた．

C

A N

P

P a pa i n）
C lt be p s i n B

A P − 0

7 4

N

Y a

115

．1 ！

1 65

A P − 0

7 1

V

a

l

173

18

l Tl

A P − 0

6 2

N

l e

225

88

4 70

A P − 0

6 1

M

e

t

330

10 0

7 40

A

P − 0

5 9

L

e u

310

11 0

5 10

A

P − 0

5 8

G

l n

380

1 ．15 0

1．1 00

A

P − 0

6 7

I

l e

560

10 0

1 70

A

P − 0

6 5

L y s （Z ）

850

19 0

850

A

P − 0

7 5

Se r （Bz l ）

！8 7

95

987

A

P −0

7 3

T

r p

1 ．12 0

2 ．日用

527

A

P −0

6 8

A

l a

1 ．18 0

lさ

261

A

P − 0

7 7

A rg 川0 2 ）1 ．22 0

21 7

351

A

P −0

7 0

CM

（l cl ）

1 ．48 077 0

1．8 5 0

A

P −0

6 3

C L

e u

1 ．56 038 02 ．2 6 0

A

P −0

6 9

P

e

1 ．76 0

H

247

A

P −0

7 6

Th

（B zl ）

1 ．8 0 0

18 ，

3 ．1 3 0

A

P −0

3 9

A sp （O Bz l ）1 ．80 01．21 7

288

A

P −0

2 3

G lu （08 z l ）3 ．8 0 0

50 0

500

A

P −0

6 4

A

5 ．51 02 ．57 08 ．7 0 0

A

P −0

7 2

β A

7 ．73 0

1

A

P −0

6 0

P

A

P −0

7 8

A

P −0

6 6

A

P −0

7 9

F D − 0 5（2）FD−056誘導体

I C 5 ■ くれM
X

E − 6 4

C

h

l b

68 0

1 7 ．9 0 0

r o

12 ．10 0

97 0

5 ．1 0 0

Ty r （B zl ）12 ．65 0

3 ．3 10

2 ．52 012 1 ．0 0 0

6．2日

1 5 ．9 0 0〉20 0 ．00 0

1 ．0 78

1 1 ．2 0 0

2 ．00 0

3 3．00 0

7 ．30 03 ．00 0

ll

10

6

l 】
l

G

l y

S

a

r

昨年度，FD−056の脂肪酸部分をBoc基に，またAsn−Gln部分をAsp（OBzl）−Glu（OBzl）

058のみであった．そこで次にペプチド部分はに置き換え，C端ロイシナール部分を変換する

固定し脂肪酸部分を変換した化合物について検ことにより，AP−049を兄いだした．

討した．炭素数の異なる種々のβ一ヒドロキン脂

引き続き本年度は，C端をロイシナールに固肪酸（ラセミ体）を有する誘導体を比較したと定し，Glu（OBzl）部分を種々変換した化合物をころ，表4に示すように，CANPに対する阻害合成した．表3に示すように，これらの化合物

活性は炭素数12（n＝9）で極大値を示したが，の多くはCANPに対してFD−056と同等以上

カテプシンBに対する阻害活性は炭素数の増加の強い阻害活性を示したが，CANP特異性を示と共に減少した．また，パパインに対する阻害

したものはFD−056と同じGlnを有するAP−

活性も炭素数12（n＝9）で極大値を示したが，−17−

考えられる．

表4 FD−056誘導体の酵素阻害活性（2）I C M（n M ）

C o lp O U nd

No ．

rl

P

Pa p a in

A

P −0

8 9

5

1 ．2 8 0

12 ，10 0

1 ．8 0 0

A

P −0

9 0

7

160

11 ．70 0

2 ．10 0

A

P −0

8 6

9

100

10 ．10 0

2 ．70 0

A

P −0

9 4

1 0

510

川 ．10 0ll ．9（
〉0

A

P −0

9

1

1 1

550

51 ．1 0 0

15 ．1 0 0

A

P −0

9 5

1 2

1 ．1 8 0〉1 00 ．0 0 0

5 3 ．50 0

A

P −0

9 2

1 3

2 ．5 0 0〉1 80 ．0 0 0〉10 0 ．0 0 0

2 ．0 0 0

H ．0 0 0

7 ．3 0 0

3 ．0 0 0

13

10

F D − 0 5
E − 6 4

C

6

C A N

Ca t tle p S in

I）

結

語

本年度我々は，昨年度に引続きエポキシコハ
ク酸誘導体，及び新規システインプロテアーゼ
阻害剤FD−056の誘導体について研究を行い，後者の中からE−64−Cと同等以上のCANP阻
害活性を有し，かつFD−0．56などよりも特異性の高いいくつかの化合物を兄いだした．

CANPに対するよりも約25倍弱く，炭素数15（n＝12）以上ではほとんど活性を示さなか

文献った．この結果，CANPに対する特異性も炭素

1）Kawasaki，H．，Emori，Y．，Imajoh−Ohmi，

数と共に変化し，炭素数13（n＝10）以上のもS．，Minami，Y．and Suzuki，K．：J．

のはいずれも特異性が高くなった．なおFD−

Biochem．106，274−281，1989．

056が，同じ炭素数のβ−ヒドロキシ脂肪酸を有し，FD−056に対応したAP−086よりも活性が

2）向山光昭，大関正弘ほか：厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質による難病

弱い一因としては，FD−056のロイシナール部

治療薬の開発研究（江橋班）平成元年度研究報告書，1990，pll．

分が，精製過程で一部ラセミ化していることが−18−

E−64−CおよびESTの薬物動態−LC／MSによる精密計測の基礎研究−
大 倉 洋 甫＊
研究協力者

甲 斐 雅 亮＊

高 橋 利 明＊＊は じめにSecond【lectrodeR r弱【lectrode
V ap o血eT

われわれは，高選択的かつ高感度な蛍光誘導体化試薬を利用した蛍光検出・高速液体クロマ
トグラフィー（HPLC）を手段として，タンパク

置謹越VJ

Lens

l
■
式 ＼
＼
＼ l
■

質分解酵素の阻害物質（ロイぺプチン1），ベスタ

ト
一
一
一
」

テン2）3），p−ヒドロキシベスタテン3）4），ホルフェ

N鵬

M

、
＼
＼

／
tro刊

ニシノール5）6），アンチパイン7），ホルフェニシン8）．E−64−C9），EST9））の簡便な薬物モニター

図l Schematic diagram of LC／API−MS法を開発し，それらの生体内動態を検討してきinterface

た．
最近，難揮発性物質をHPLCのオンライン上（2）HPLC：Hitachi655形装置を使用した．

で質量分析（MS）するLC／MS計測法が注目さ

CapcellpakC18カラム（250×4．6mmi．d．，粒れている．上述のプロテアーゼ阻害剤は，ペプ
チド様あるいはアミノ酸様化合物であるので，

径5JJm）を使用した．溶馳液にはメタノールと0．1M酢酸アンモニウムの混液を用いた．溶離

いずれも雉揮発性物質である．そこで本年度は，液の流速は1．Oml／minとした．溶出液は，まずHPLCと直結できる大気圧イオン化インター

UV（210nm）検出器に導き，続いてMS検出器

フェイスを備えた四垂極型MS検出によるE−へ導入した．
（3）MS検出：Hitachi M−1000形LC／MS

64rcおよびESTの薬物モニター法に関する基分析計を使用した．このLC／MSインターフェ

礎的研究を行った．

イスは霧化部およびイオン化部（針電極を装備）

実験方法からなる（図1）．噴霧器の温度を2300Cに設定（1）標準試料：E−64−CおよびESTは水にし，3kvに印加した針電極のコロナ放電により洛解した．SDラット（7週齢）血清の前処理：

大気圧下イオン化させた．質量分離部は四垂極

血清100JJ＝こ1MHClO4200JJlを加え除蛋白からなる．

した．上清200／JlをODS−C18ミニカートリッジ（東ソー社製）に導入し，水2m1，0．1M塩結果および考察

酸2ml，水2mlで洗浄したのち，CH3CN，H20

MSとHPLCを直結する数種のインターフ（9：1，Ⅴ／v）1．5mlで洛出した．溶出液を減圧

ェイスが開発されているが，本研究では，図1に下乾固し，適量の水に溶解した．

示す大気圧イオン化（API）インターフェイスを＊九州大学薬学部＊＊日立計測エンジニアリング㈱使用した．このインターフェイスでは，HPLC
溶離液の脱溶媒及び溶質のイオン化が大気圧下−19−E−64−C及びESTを逆相HPLCによって分（A）ト64−CnU

選択検出を行った（図3）．MS検出によるクロ﹁狸マトグラムから，明らかに，両化合物は設定したM／Z値でそれぞれ選択的に検出された．この朋い三一SUと∪− ざ Dtg

駈し，まずUV検出し，続けてAPトMSによる

HPLC／MS条件において，ESTおよびE−64−Cの検量線を作成した場合，検出された両化合物のイオン壷はHPLC注入量（0〜100ng）に比例した．検出限界は両者とも約1ng（3pmol）／
図2 Massspectraof（心E−64−Cand（B）EST

HPLC注入量であった（図4）．この感度は既に提出した両化合物のプレカラム蛍光誘導体化で行われる．E−64−C及びESTをHPLCに用HPLC9）によるそれよりも劣る（約1／10）が，いる溶馳液（メタノールと0．1M酢酸アンモニ

MS検出は特殊な反応を必要としないので，両ュムの混液）に導入しAPI／MSによって検出化合物の簡便な同時検出が可能である．

したマススペクトルを図2に示す．E−64−C及び薬物動態研究への適用を目的として，まずラ

ESTともプロトン化分子イオンピークが基準

ット血清に添加したEST及びE−64−Cの検出ピークとして検出できた．従って，E−64−Cはを試みた．ラット血清は，骨法の除蛋白処理おM／Z＝315またESTはM／Z＝343において，

よび回相抽出処理を行いクリーンアップした．

それぞれ選択イオン検出できることが分かった．

この試料にEST及びE−64−Cを添加し，逆相き芯日月u† uOH∈u OLN ︸巾qUu雲LOSqV
l

0

l

l

l

■

−

5

5．O
Time（min）

Tjme（mjn）

図3

Chromatograms of E−64−C and EST（5JLg eaCh）Obtained by仏）UV detection and（切API−MS detection
HPLCconditions‥COlumn・CapcellpakC18（250×4・6mmI・D・，5JLm）：mobilephase，

methanol＋0・1Mammoniumacetate（9：1，V／V）：flowrate，1．Oml／min．
MS detection：a）totalion monitoring；b）selectedion monitoring at M／Z＝343；
C）selectedionmonitoringatM／Z＝315．

−20−

物質がイオン化を妨げるものと考えられる．そこで図6の条件でEST及びE−64−Cが選択検
たこ竺恵一uI 亡0−1．∴′−lJ、、い＿−リ．＼▲㌧八一／一・・rr

出された溶出液のマススペクトルを調べた（図里F■HhI M′Z朝7）．ESTの溶出液では，そのプロトン化分子イ萱

オンピークのみが検出されているが，E−64−Cの溶出液では，そのプロトン化分子イオンピーク
以外にもマスユニットの違うピークも多く存在ー∴、■■ノ・へ・・√・リー㌧′一、ノーノ 、1ノ、・′ノLJ′Z…315＿」

8・0

1・9

2カ

ニ・8

4．0

5．8

6．8

していた．これは，選択イオン検出によりその物質を高選択的に検出できることを示す．

図4

ChromatogramofE−64−CandEST（Ing，eaCh）obtainedbyHPLC／APトMS

おわ り に（selectedionmonitoring）

APIインターフェイスをそなえたMS検出
は，通常のHPLCとオンラインで直結でき，標HPLCによって分離後，UVおよびMS検出し準試料では容易にESTやEr64−Cを高感度定たときのクロマトグラムを図5に示す．この量できることが分かった．それらの検出限界はHPLC条件では，生体試料と共存させたEST

1ngレベルであり，薬物動態を研究するには十は良好に検出されたが，早く溶出するE−64−C

分な検出感度であると考えられる．しかし，芙のイオン（M／Z＝315）は検出されなかった．一

試料を計測する場合，複雑な生体マトリックス

方，HPLCの移動相中のメタノール濃度を低下

内成分が，目的化合物のAPI−MSによるイオ

させ，溶出時間を遅くさせると，E−64−Cも検出ン化を妨げることも明らかになった．したがっ可能になった（図6）．しかし，検出感度は標準て，この分析法の実用化には，試料のクリーン試料の場合よりも約1／10に低下した．

アップも含めてHPLCの分離条件の検討が必以上の結果により，生体試料に存在する爽雑要不可欠であることが示唆された．

き芯UU雲γ uOH∈u Q︻Z一m qUu月JOSqV
0

5

10

0

5．O

Time（mjn）

図5

Tjme（min）

Chromatogramsofratserum（10JLl）spikedwithE−64−CandEST（0．5FLgeaCh）Obtainedby仏）UV detection and（団API−MS detection
HPLCmobilephase：methanol＋0．1M ammonium acetate（8：2，V／V）．
The serum WaS pretreatedwith deproteinization and solid phase extraction．
−21−

（B）

合芯uヱuT uO−∈u 01Z一昭UUu巾qJOSqくE−64−C

へ叫叫岬ザ
0

5

10

15

5．n

0

l

．0

a）TIM

15

Tjme（min）

Tjme（mjn）

図6lJtナ｝′hChromatogramsofratserum（10JLl）spikedwithE−64−CandEST（0．5FEgeaCh）Obtainedby（心UV detection and（B）API−MS detection
HPLCmobilephase：methanol＋0．1M ammoniumacetate（65：35％，V／V）．
Theserumwaspretreatedwithdeproteinizationandsolidphaseextraction．
389，1984．

3）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：
三︻Suだ三一聖一lD一基

Xenobio．Metabol．Dispos．，1：397−403，
1986．

（8 ）EST

4）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：J．

3●3
（
H十日）
◆

H 7

Chromatogr．，344：267−274，1985．

5）Tamura，M．，Kai，M．and Ohkura，Y．：
3■○

l油

壷

Jap．J．Clin．Chem．，13，195−201，1984．

4品

6）Kai，M．，Tamura，K．，Ohno，M．and
図7

Mass spectra of HPLC eluates for（勾E−64，C and（B）ESTin rat serum

Ohkura，Y．：Biomed．Chromatogr．，1：143−146，1986．

7）甲斐雅亮，坂本靖浩，三浦哲朗，大倉洋甫：
分析化学，35：329−331，1986．
文

献8）Chao，W．−F．，Kai，M．andOhkura，Y．：J．

1）Kai，M．，Miura，T．，Ishida，J．andOhkura，
Y．：J．Chromatogr．，345：259−265，1985．

Chromatogr．，430：361−367，1988．

9）Chao，W．−F．，Kai，M．andOhkura，Y．：

2）Ishida，J．，Yamaguchi，M．，Kai，M．and
Ohkura，Y．：J．Chromatogr．，305：381−−22−

J．Chromatogr．，526：77−86，1990．

CANP阻害剤の一般薬理学的研究
一筋ジストロフィー疾患モデル動物筋電図の定量的スペクトル解析に基づく薬効評価法一
福 原 武 彦＊研究協力者

加 藤 絶 夫＊

木 村 直 史＊

高 野 一 夫＊

家 元 菓 子＊は じめにいて，胸腕部の電気的活動（10−1000Hz）を導筋ジストロフィー症治療薬の一般薬理学的な出したところ，著明な心電図由来性成分と，そらびに薬効薬理学的な評価を行なうにあたり，

れに重畳する筋電図由来性成分が認められた

適切な疾患モデル動物において妥当な方法によ（図1）．そのパワースペクトル上には，心電図り導出された生体活動を詳細に定量化解析する由来の成分に対応する大きいパワー値を示す成ことが有用な情報を与え得ることは言うまでも分帯域が認められた（図1下段）．15秒間の安静ない．筋ジストロフィー症の疾患モデル動物と自発呼吸下の記録をディジタル化した後，計算しては，マウス，ハムスターを初めとする小動機を用いて心電図由来成分をR披同期平均加算

物がよく用いられており，その病態生化学なら法（加算回数100回以上）によって抽出し，1心びに病態生理学的性質について多くの知見が得

拍周期分の心電図由来成分の「鋳型」を作成しられている．しかしながら，臨床・病態生理学た．これを，原波形中の総てのR波前後の波形的知見との対応の下に筋収縮機能を評価する上から減じることにより，心電図非由来性成分をで，優れた指標であると考えられる呼吸筋群の算出したところ，その大部分を占めると考えら

筋電図活動を，小動物において定量的に評価すれる胸腕部筋群の筋電図由来の成分を選択的にる際，大きな障害となるのが，呼吸筋筋電図へ抽出し得た（図2）．その抽出波形中には，同時の心電図由来成分の混入である．本年度，我々導出された胸郭の呼吸性運動と同期した呼吸筋

は，胸腕部から導出された呼吸性活動を含む電Original recording and PSD

気的活動から，この心電図由来成分を特異的に除去した上で筋電図性活動を定量的に評価する
r8−

方法を確立した．さらに，この解析法を用いて，

阿り∵筋ジストロフィー症モデル動物に対するEST

lntの薬効評価を試みた．
reSP

方法と結果

0．5 ■

1．心電図由来成分除去法の確立
Pentobarbital（50mg／kg，ip）麻酔下の雌雄のゴールデン，および，UM−Ⅹ7．1系ハムスタ
ーの左右の胸腕部から，単極性針電極1対を用＊東京慈恵会医科大学第二薬理学教室−23−（晶恥−」H．
図1胸腕部から導出された電気的活動
raw data，原波形：int，整流平滑化波
形；resp，胸郭部の呼吸運動曲線；PSD，パワースペクトル密度関数（振幅）群の筋電図活動が明瞭に検出された（図3）．

り（kurtosis）．上記統計量の1）〜3）は，ゴ

2．筋ジストロフィーハムスターの胸腕部筋電ールデンハムスターではEST適用中に増大し，図に及ぼすESTの影響

また，第40週で減少する傾向が仝群で認められ雌雄のUM−Ⅹ7．1系（10週齢，11匹）ならびた．またUM−Ⅹ7．1ハムスターにおいて，通用に，ゴールデンハムスター（9過齢，14匹）を

開始25週目に，上記の2）が，ゴールデンハム

各々2群に分け，1群の飼料中に0．375％のスターと比し，有意に低い値を示し，これに伴EST（約300mg／kg／日に相当）を加え，26週って，筋疲労の程度を反映すると考えられてい間飼育した．ESTの適用終了後，さらに15週

るH／L比が増大した．一万，5）〜7）の周波間，通常飼料で飼育した．EST通用開始後，0，数軸上の分布形を表わす統計量は，全群におい25，および40週目に上記方法にて，筋電図を導て，EST通用の有無によらず加齢に伴う低下傾

出し，パワースペクトル密度関数解析を行なっ向が認められた．この事実は，同じ実験標本にた．推定されたパワースペクトルから，筋電図

おいて，呼吸回数が加齢に伴い減少するという全体の分布を表わす以下の統計量を推定した

報告1）と併せて，興味深い新知見である．

（図4）．1）総パワー値（meansquarevalue，
MSV；0−1000Hz），2）低周波数帯紐パワー値

結語（0−30Hz），3）高周波数帯総パワー値（60−

本研究において開発された小動物の呼吸筋筋

1000Hz），4）高周波数帯／低周波数帯パワー

電図の定量化法を，さらに，BIOハムスターや比（H／L比），5）最大パワー周波数，6）平均

mdxマウスなどの疾患モデル動物から導出さ周波数（0−1000Hz），7）同上（50−1000

れた電気活動に応用することにより，健常人もHz），8）周波数の標準誤差，9）パワー密度分

しくは患者から非侵襲的に導出された筋電図と布の歪み（skewness），10）パワー密度分布の尖の対応の下に，有効な薬効の評価法として応用され得るものと期待される．

Suppression of ECG−related component

Orlglnal（10・10（刀 HZ）

ECG−SuPPreSSed recordH19and PSD

ECG
叫WeSSed0．51

一図2 心電図由来成分の除去法
上段，原波形．中段，R波同期加算平均
波形．下段，原波形から加算平均波形を引いた汲形．縦軸のスケールはいずれも
同じ．

＿．−￣

図3 図1の波形から心電図由来成分を除去した記録．×5は，図1に対し，縦軸のスケールが5倍に拡大されていることを表わす．詳細は図1参照．

−24−

Effect of EST on statistics for EMG spectrartSU（∩LL）

rlSU（Lt】U）

rlSU（Hl【；H）

H／L RRTZOMERH FREq（RLL）
lt●●一■■■l・ltI

SKEUHESSrURTPSIS

l−1．■一一■．ヲI

25

二2

0

さ一▲二5

ESTトト…．．．………，■○○■Ul▲−X7．1：ESTトI
亡STトI
Gdd■∩ ：ESTト）
ESTト〉

咄一一

ESTH
Golden：EST（・）一一一一一一一為Uu−XT．1；ES¶◆l−＝二￣

一℃鵬

図4 胸腕部筋電図のパワースペクトル密度関数の全体的分布形状を表わす統計量とそれらに及ぼす
ESTの作用
詳細は本文参照．横軸は飼育の時間経過で，EST適用開始時点を0週とした（黒横線の期間でESTを投与した）．

文

献

ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1

1）福原武彦，木村直史，高野一夫，加藤総夫，
中川辰郎，山田順子：EST（E−64−d）の筋系）の心電図に及ぼす影響．東京慈恵会医科大学雑誌，100（6）：1233−1240，1985．

−25−

骨吸収疾患モデルに対するE−64誘導体の効果

勝 沼 信 彦＊研究協力者

唐 渡 孝 枝＊川

玉 井 正 晴＊＊ 花

田 和 紀＊＊ 横 尾 千 尋＊＊

健＊

村 田 充 男＊＊研究目的と意義の増加がある．LとHには変化はない．このB

臨床的には各種の分類・定義から各種の名がの増量する機構と意義は不明であるが，この上附されている．しかし，骨吸収現象のおこる主昇は骨コラーゲンの分解には何らの関与をして因は次の2つの相違なる内容から成り立っていいないことが明らかとなった．ここで大切なこる．その第1はCa沈着に関与する要因であり，その代表例は最近著しい進歩を遂げたビタミンとはタイプⅠコラゲナーゼの活性は全く変化していないことであり，この酵素はE−64で全くD。などがある．第2は骨の支持タンパク（主に阻害されないことである．これらのラットにE−はタイプⅠ，コラーゲンである）の分解に関与

64aを1度腹腔注射をして1時間後には血中する要因である．この硬骨コラーゲンの分解克のCaもHypも遊敵が著明に抑制されて低下進に関与するプロテアーゼの特定を進めている．

してくる．この投与により，骨カテプシン群は今日迄の研究でカテプシン群のどれかがこれに

B，H，Lともに著明な阻害を受けている．こ

重要な役割をはたしていることが明らかになっの場合もコラゲナーゼ活性は全く変化しておらてきたので，E−64やCystatin類などのカテプず，これは関与していないことが明確に示されシン群の特異的阻害剤群による治療法の開発をている．骨の臓器培養でPTHにより著明な骨することを目的としている．

吸収がおこり培地へのCaとHypの遊離がお更に硬骨コラーゲン分解に大きな役割を演じこるが，これもE−64の添加により抑制できた．

ているにもかかわらず作用機構不明のPTHと従ってPTHの骨吸収冗進機構はカテプシンにカルテトニンの作用点を解明しつつある．

よるものであることが明らかとなった．
次にE−64で阻害されるプロテアーゼのうち，研究結果

どのカテプシンが最も大きな関与をしているのラットを低カルシウム食で飼育したり，PTH

かを特定する研究を進めた．まず，コラーゲン投与による骨吸収現象を使用している．これらは極めてプロテアーゼで分解されにくいものでのラットの大腿骨の重量は著明に低下し，骨折あり，Hは分解できず，コラゲノリティツタ・し易い状態になっている．この場合に，骨からカテプシンと言われるものの中ではLが圧倒的のCaの遊艶と骨コラーゲンからのハイドロオに強い分解能を持つ．我々はカテプシンBに完

キシプロリン（Hyp）の血中への遊柾が増加し全な特異性のあるE−64誘導体を2種類CA−ている．この場合に骨のカテプシン群を測定す

030とCA−074を開発した．その中でCA−030

るとカテプシンBのみは活性，量ともに50％程

はinvitroのみでBに特異性があるが，invivo■徳島大学酵素科学研究センター＊＊大正製薬㈱総合研究所

では特異性がない．CA−074は両者で極めて強いB特異性がある．さて，CA−074投与により骨−26−

表l EffectofE−64andlowCadietonserumCa，SerumhydroxyprolineandbonecathepsinSBon e
W e ig h t

巾
E
L
0
Z
帽
U
き
JO

Bon e （Fu m er）

S e ru mCaHyp

Z −F −R −M CA

Z −R −R −M C A

R −M C A

S u c T G −P −L −G −P −M C A（
B ＋L I

（
B）

（
H）

（
C 0 lla g e n 亨Se I【
n m 0 le s ／m in ／
mg）

（
gI

【
mg／
dり

（
n m o le S ／
mり

−

1．
21

10 ．
年

52 ．
6

3．
qO

O ．58

0．
37

0．
55

E −6 上
la

1 ．18

9．
8

42 ．
6

0．
58

0 ．16

0 ．18

0 ．5q

−

0 ．9tl

7．
9

86 ．
7

叫．
55

0 ．8 3

0．
q3

0 ．50

E −6 qa

0 ．96

6．
6

70 ．
8

1．
92

0 ．30

0 ．16

0．
qS

（7weeks Ca deflcIent diet．one hour after E−6qa hJectlon）

表2 Specificinhibition of cathepsin Binlnh篭bition′−・・・Ll．一・・・・、
h

ニー

vilrO

ln

Vivo

Vivo by CA−074

N。n■P亡Ciric Non SP亡CillC

トF−R−MCA Z−R−R−MCA R←MCA

川．L Eにユ†。八一。洞 Eth，ト。。率0￣■1e￣PrqControl5．1±1．I

0．的±0．27

E一問a

1．0

0．26

±0．1

土0．06

tHI

0．叩

±0．05

0．日

±0．Ol

O M mgH00g B．W．）

c…7・p．。。，柚。。∠￥0肋占

rc1−0川
M m9日0098．W．）

L
芳

∈一帥a
川mg／10098・W・】

8〜PeClflC b SPeC汗i⊂Conlrol

図l CathepsinBspecificEr64derivertives0

コIcA−07q【81れgハ0098．W．）

E −6 4．．＝日 毎申 …＝〇・07
78．6

±6．3

．0光1．日

l．38

土0．59

0．用！0．10

6．35

三〇，7王

0．3Z±0．16

購．＝1日！些上山j T．87日・6。

C A −0 3 0
9

C O n 廿d

︵雪印∈︶dO∈己OのテプシンBは骨コラーゲンの分解に関与してい8ないことになる．Lである可能性は一番高いが，

7
E −6 4

まだ直接証明はない．

6

カテプシンの抗体によるウエスタンプロット
5

E −6 4 a

C A −8 7 4｝一 一■■〜■︵−P＼m皇帽U∈≡OS

9で骨カテプシンを分析すると，大部分が活性の成熟型で存在している．恐らく活性成熟型で破8骨細胞から分泌されるものと考えている．この
7

点は大部分が不活性なプロ型で分泌されるマク
ロファージ等とは異なる．

6

更に強くはないが，大量のシスタナン（カテ

5
0

3

6

9

0

Tmeaれer叫edon（houS）

図2

3

6

9

Thean計画伽（hot■可

プシンの内在性インヒビター）A及びCで骨コTime course of serum Calevel

ラーゲンの分解抑制が見られるので，今後投与

response to E−64derivertives

法等の改良を必要としているが，カテプシンが主役を演じていることのサポートの証明にはなのカテプシンBは完全に阻害されている．しかっている．E−64誘導体でL特異性のあるもののしLは全く阻害を受けていない状態では骨から開発，ならびにCathelinの如きL特異阻害剤ののCaとHypの遊離は抑制できない．即ち，カテストも大切である．

ー27−

ジストロフィンの分子形態

丸 山 工 作＊
研究協力者

佐 藤

治＊

ジストロフィンは，そのアミノ酸配列からα合体を鉄亜鈴がくずれたのではないかと考えた．

−アクチニンと相同性の高いアクチン結合部，ス

ジストロフィンを高速液体クロマトグラフイ

ペクトリンと似た細胞膜裏打ち構造ならびに特（HPLC）でゲル濾過して各画分について調べ

有部分から成る細長い分子と考えられている1）．

てみた．図1にみられるように，素通り画分に正常な筋細胞膜下での局在性2）からみても，ジ近いところからa，b，Cの3画分を取ってみストロフィンはスペクトリンと同じように細胞た．aには鉄亜鈴が，Cはフレキシブルロッド

膜の裏打ち構造を形成しているものと思われる．

が主成分であり，bは中間形であった．いずれその意味からいっても，ジストロフィン分子のもSDSゲル電気泳動パターンは430KDaのジ形態がどのようなものであるかはたいへん興味

ストロフィンが主成分であり，抗ジストロフィが持たれる．その分子の形状は，これから解明

ン抗体と反応した．少なくとも鉄亜鈴が不純物されるべき機能の理解に重要である．

である可能性は否定できたといえよう．

ジストロフィンの低角度回転影付法による電子顕微鏡像については，すでに2つの論文が発表されている．ひとつは，私たちの結果で，ウサギ骨格筋から得られたジストロフィンは長さ100〜120mmの鉄亜鈴状ディマーが末端結合してフィラメントをつくりうるという報告である3）．これに対して，フランスのJ．L短erグループは，ニワトリ筋胃から単離されたジストロフィンが175±15nmのフィラメント（モノマー）で，末端結合や側面結合がありうるとしている4）．両者の形はまったく異なっている．
そこで，私たちのサンプルについて検討を重ねた結果をここにまとめてみたい．まず第1に，
鉄亜鈴はサンプル中にごくわずかしか存在しない．これを不純物とみなすか，大多数を占める
100nmほどのフレキシブルロッドをジストロ
フィンの真の形とするかが問題となる．私たちは，フレキシブルロッドやもつれあった球状会＊千葉大学理学部生物学科

ー28−

図1高速液体クロマトグラフイによるゲル濾過（AsahiPak GS−710）によるジスト
ロフィン分画と電子顕微鏡像
溶媒：0．5M NaCl，20mM Tris−HCl（pH7．5），0．01mM DFP，0．05％
NaN3，0．1％TritonX−100．a，b，C
画分の電顕像を上に示す．Bar，100nm．

molecules

Formationofa chain

図2

ジストロフィン分子の会合モデル図1のa画分に見られる電顕像にもとづいて（a，b，C，d），鉄亜鈴状会合体の形成過程を推論した．

ひとつの可能性は，もともとジストロフィン
分子は鉄亜鈴状ダイマーが末端結合した形で細文

献1）Koenig，M．，Monaco，A．P．andKunkel，L

胞膜下の裏打ち構造をつくっているが，可溶化

M∴Cell，53：219−228，1988．

と精製過程で大部分はフレキシブルロッドにな

2）Arahata，K．，Ishiura，S．，Ishiguro，T．，

るということである．図2は，図1のa画分でTsukahara，T．，Suhara，Y．，Eguchi，C．，

観察されたジストロフィン分子の電顕像からモIshihara，T．，Nonaka，Ⅰ．，Ozawa，E．and

ノマー（a），ずれた側面会合ダイマー（b），（b）が会

Sugita，H∴Nature，333：861，863，1988・

合したテトラマt（C），さらにテトラマーが末端

3）Murayama，Tリ

Sato，0．，Kimura，S・，

会合したオクタマーをモデルとともに示したもShimizu，TリSawada，H．andMaruyama，のである．これらの考え方が正しいかどうか，K．：Proc．Jpn．Acad．，668：96r99，1990・

さらに検討を重ねてゆきたい．

4）Pons，F．，Augier，N．，Heilig，R．，Leger，J・，Mornet，D．and Leger，J．J．：Proc．NatL
Acad．Sci．USA，87：7851r7855，1990．

−29−

ミエリン膜局在のCa依存性プロテアーゼ活性に対する各種脂質の影響
辻繁 勝＊

中枢神経組織のミエリン膜分画中にCa＋十依除去にはDEAEセルローズによる方法を行っ

存性中性蛋白分解酵素（CANP）活性が存在す

た．即ち，ミエリン膜標品3mlとDEAEセルロ

ることは，既にヒトおよび幾つかの哺乳動物にーズ（ワットマンDE52）懸濁液を3：7の割合

ついて報告されている1ト3）．又，この酵素の生理で混合し，40Cで30分間投拝した後，セルロー

作用としてミエリン膜構成蛋白のturn overにズ粒子を分艶し，これを緩衝液A（トリスー

関与している可能性が指摘されている．我々はHCl：25mM，pH7．4，EDTA：2mM，昨年度の報告でマウス中枢神経系においても同

EGTA：10mM，β−メルカプトエタノール：50

様な酵素活性が存在していることを示したが，mM，ベンザミジンーHCl：5mM）に100mM

同時にミエリン形成不全を発症するJimpyマのNaClを加えた液10mlで2回洗浄し，内在ウスの脳中でCANP活性が著しく上昇していインヒビターを除去する．更にセルローズ粒子

ることから，その症状発現の一因として，グリを緩衝液Aに250mMのNaClを加えた液5

ア細胞形質膜構成蛋白の分解克進が関与していmlで3回洗浄する．この洗浄液を合せたもの

る可能性を認めた．本年度はJimpy並びに正常（15ml）をインヒビター除去mCANP標品とマウス脳を用いてミエリン膜に局在するした．実験に用いたミエリン膜構成脂質は，

CANP活性の生理的意義を膜構成脂質との関

phosphatidylinositol（PI），galactocerebroside

連から追求する目的で研究を行った．
（GC），Sulfatide（Sul），phosphatidicacid（PD）■

で，いずれもSigma社から購入した．脂質は予材料と方法

めクロロフォルム：メタノール（2：lv／v）液に実験に使用した動物は当教室で維持している

溶かした後，窒素ガスで乾燥させ，緩衝液（トB6CBA／J−jp革マウスの2−3週齢の発病個体

リスーHCl：0．5mM，pH7．4）でソニケートし（jp／Y）及び対照個体（＋／Y）並びに5−10週齢た後使用した．ミエリン膜分画の指標として用の正常個体である．CANP活性の測定にはpe−

いたCNPase活性は01afsonらの方法4）によptidylTMCA合成基質であるSuc−Leu−Tyr−って測定した．

MCA及びSuc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCAを用い，250C，30分間インキュベートし，反応終了

結黒後，遊柾したAMCを励起波長380nm，蛍光波

まず内在性インヒビターを除去した酵素標品

長460mmで蛍光測定して行った．脳ホモジネについてSuc−Leu−Tyr−MCA及びSuc−Leu−

ートの分画には0．32M庶糖液による分画法を

Leu−Val−Tyr−MCAの2つの基質に対する水用い，又ミエリン膜の分離にはNortonらの方法を用いた．内在性のCANPインヒビターの解活性の違いを調べる実験を行った．結果は表＊和歌山県立医科大学第二生理学教室

1の如く，活性値の違いはあるが，いずれの基質でもJimpyマウスにおいて約6倍の活性上昇が認められた．活性は0．5mMのCa＋＋存在下−30−

表l Activity change of Ca＋＋−aCtivateddifferent substrate
Substrate

Jhpy

Con亡r01

A

112．6

±69．5

18．8±3．4

8

69．7

土21．8

11．7

J／C

6．0

土2．3

Pr

7く0．01

6．O pく0．01

A：SuC−teu−Tyr一宮CA︵U葛篭︶ごて霊U■︒已N占

neutral proteasein CNS myelin at

B：SuC−teu−Leu−Val−Tyr−HCA

Unit：血HAHC／30minかHC肝ase
表2

0．25

Ca＋＋−aCtivatedneutralproteaseactiv−
itiesin CNS myelin

Unitfraction from

図

0．5

The effect oflipids on Ca十十Sensitivity

Jimpyandcontrolmiceafterremoval

ofmyelinCANPactivity・●：enzymeof theinl1ibitor

alone，○：Cerebroside，▲：phosphatidic

base

CNPase131．2★★
Protein
87．5

JitnpyControI

土24．0

22．5

土4．6

土16．0

17．3土3．6

J／C
．8

5．0

acid，□：phosphatidylinositol and x：

PrⅠ〉く0．01

可能性について検討を行った．結果は表3の如

Uni亡：★；虚l A比C／30min／H CNTaset★；′sufatide

でく0．01く添加した脂質が程度は違うがいずれも無添加

AHC／30min／10mgpr。teinの場合よりも活性増加をもたらしたことを示し
表3

Lipid mediated activation of Ca十十一ている．最も増加率の高いのはphosphatidy−

activated neutral proteasein CNS

linositolで，対照の341％，最も低いのがcere−

myelinfraction
Conditions

Enzyne◆pho叩hatidylinosit01（300′沈）

brosideで145％の増加であった．次に添加す王

Stinula亡ion

340・8土21・3

るCa＋＋の濃度と脂質の濃度との相互関係を示

EnZyme・Sulfatide（80り川）

201・6土17・3したのが図である．この結果は脂質を添加する

Enzy耽・mospbatidiC aCid（250ノ皿）

178・9土18・7

Enzy髄◆CeTebroside（800ノl叫

145・2土12・3

ことによって既活と同時にCANPのCa十十依
存性にも変化が起こることを示している．

★：ValueS are E叩reSSed as nean土S．E．0f fouT
different ObSerVations．
Percent Cbnge vaS Calculated conpared tO enZyne
aCtivity a10ne．

考

アarenthes主手Shovtbe亡OnCentrationof eaChlipidSt
O．5nH Ca verE addedin eaCtl reaCtion nedi皿．

察

マウス中枢神経組織のミエリン膜中にでの値からCa十十一非依存性の活性値を差引いた

mcANP活性が存在することは昨年度の研究

値をミエリン膜の指標酵素であるCNPase活結果で報告したが，今回の実験結果によって，性単位で表したものである．次にCANPに対

この酵素活性がミエリン膜構成脂質の或るものする特異的基質である基質Aに対する活性を蛋によって既活されることが認められた．又これ

白量当りとCNPase活性当りで比較した．結果

ら脂質を添加することによって，CANPのは表2の如くであるが，Jimpyマウスと対照マ

Ca＋＋依存性が変化する可能性が示唆された．更ウスの活性差がミエリン膜単位では約6倍であにJimpyマウスにおけるミエリン隈CANP活性がミエリン膜単位で表示した場合と蛋白量単るのに対して蛋白量単位では約5倍と差が小さいことが認められた．この事はJimpyマウスにおける活性上昇の一因としてミエリン膜自体の位で表わした場合に違いが認められたことから，構造異常が係わっている可能性を示唆しているェリン隈構成脂質の異常が関わっている可能性

ものと考えられる．そこで，ミエリン膜構成脂が示唆された．Chakrabartiら5）はブタ脳中の質がそこに局在するCANP活性を既活させる

ミエリン膜CANP活性がミエリン膜構成脂質

Jimpyマウスでの活性上昇の原因の1つにミ−31−

の添加によって著しく活性増加することを報告している．今回の我々の結果はこの結果とよく一致しており，マウス脳においてもミエリン膜
脂質がCANP活性に影響を与えていることが判明した．ミエリン股構成脂質，特にPhos−
phatidylinositolがどの様な機序で膜局在のmCANPを活性上昇させ，又Ca十十一感受性を変化させるかについては更に詳細な検討が必要で
ある．

文

献

1）Sato，S．andMiyatake，T．：Biomed．Res．，
3：411，1982．

2）Banik，N．L．，etal．：J．Neurochem．，45（2）：581，1985．

3）Chakrabarti，A．K，，etal．：Neurochem．
Res．，14（3）：259，1989．
4）Olafson，R．W．，etal．：Canad．J．Biochem．，
47：961，1969．

5）Chakrabarti，A．K．，etal．：Biochem．Bio−
phys，Acta．，1038：195，1990．

−32−

mdx mouseに対するbestatinの過2回問歓投与の効果
一電気生理学的及び病理学的検討−
木 下 眞 男＊
研究協力着

岸
雅
根 本

彦＊
博＊

吉
日

我々はbestatinにはmdxマウスの静止膜電村 牧 子＊
高 隆 信＊

栗 原 照 幸＊を行った．
病理学的検索：Bestatin間駄投与を行った

位（RMP）改善作用とelectricalmyotoniaを抑制する作用があることを指摘してきた．bes−

mdxマウス及び未治療のmdxマウスの排腹筋，

tatinを筋ジスの患者に投与する場合，連日投与

長址伸筋，ヒラメ筋，前脛骨筋を採取後，すみではCKの低下は持続しないが，間敬投与ではやかに3JLの凍結切片を作製し，Hematox−

CKの低下が投与後に一過性に見られることがyline−Eosine染色を施し光顕的に観察した．

ある．このことより，今回我々はmdxマウスに対し，週2回の問駄腹腔内投与を施行し，その結影響を電気生理学的及び病理学的に検討したので報告する．

果Bestatin最終投与後2時間のmdxマウスでは，未治療のmdxマウスに比べると，electrical
myotoniaの頻度はやや低下しており，RMPの方法

ヒストグラムではlow RMP筋線経の減少と約12週齢のmdxマウス3匹に対してbes−

high RMP筋線経の増加が見られた（図1）．

tatinO．2mgの腹腔内投与を週2回施行し，約Bestatin最終投与後1日，4日と最終投与後の8週間続けた．最終投与後2時間，1日，4日に時間が長くなるにつれて，RMPに対するbes−

横隔膜の電気生理学的検索及び骨格筋の病理学

tatinの効果は減弱する傾向にあった．（図2，

的検索を行った．

3）．RMPのWilcoxontestを未治療mdxマウ

電気生理学的検索：mdxマウスの横隔膜標スと各bestatin投与マウスの間で行いそれぞ本をTyrode溶液に浸し，3MのKClを満たしれのp値をみると，最終投与後1日まではたガラス管微小電極を用いて200本の筋線経のRMPの改善が有意であることがわかる（p＜RMPおよびelectrical myotoniaの有無を調

0．01）．又，どのマウスでも測定前半のRMPにべた．200本の筋線推測定には約2時間要する

比べ後半のRMPは低下している．これは横隔ため，統計学的解析は前半の100本と後半の膜に浸透していたbestatinがwashoutされる

100本に分けて行った．Bestatinの間敬投与にためと思われた．しかしelectricalmyotoniaの伴う効果が，最終投与されたbestatinの直接効

頻度は最終投与後の時間とはあまり関係なく，

果だけによるものなのかを判断するために，同未治療のmdxマウスよりわずかに改善した状

週齢のmdxマウスに同量のbestatinの腹腔内態を維持してきた（表）．

投与を1回だけ施行し，2時間後に同様の検索＊東邦大学医学部第四内科

未治療のmdxマウスに対し，bestatinを1回だけ腹腔内投与し，投与後2時間に同様の検索を行った．RMPはヒストグラム上，ややlow

−33−

二三二

mdxtreatedebestatinfor8wks

mdx treated e bestatinfor8wks（0．2mgLp．tr．twiceaweek）（0．2ngi．p．tr．twiceaweek）

lb

RMP（mean±S．D．）−68．4±10．9mV（∩＝86）

RMP（mean±S．D，）−68．1±10．9mV（∩＝86）

bげStIreq∴10％

hr与ttreq・：40％

10

50

60

70

80

90100

二

RMP（mean±S．D．）−77．3±9．5mV（n＝tOO）

RMP（mean±S▼D．）

bursttreq：21％−71．3±10．8mV（∩＝川0）burStlroq∴19％

RMP（mモan±S．D．）−71．7±10．2mV（∩＝100）

RMP（mean±S．D．）−73．5±lhImV（n三川0）
burstlreq・：22％

bursHrやq．：15％

l＿；ニ￣一二

l0

50

60

70

80

90

tOO

RMP（−mV）
RMP（一mV）

図1

Bestatin問歓投与mdxマウス．最終投
与後2時間ではlowRMP筋線経の減少とHigh RMP筋線経の増加が明瞭である．Electricalmyotoniaの頻度（Burst
freq．）は，未治療mdxマウス（上段）よりも減少している．測定後半のRMP（下段）は測定前半のRMP（中段）と比較す
ると，bestatinの効果はwash outのために減弱している．

図2

Bestatin間歓投与mdxマウス．最終投
与後1日でもlowRMP筋線経の減少とHighRMP筋線経の増加が見られる．

表

RMPの筋線経が減少し，highRMPの筋線経BestatinのRMP改善効果は最終投与後，時間がたつにつれて減弱するが，electrical
myotoniaの頻度の減少は持続している．
Bestatinの1回投与では投与後2時間でも8週間の問歓投与していたもののように
RMPの改善作用は著明ではない．
Restinlndrane potentials（RMPs）and burst frequencyが増加する傾向を認めたが（図4），Wilcoxon（V‖coxon test betveennon−treatedadtreatedDdxmse）

of the bestatjn treated Ldx muSe

testでは有意差が認められなかった（p＜0．01）．
Electricalmyotoniaの頻度は週2回投与を続けたmdxマウスと同様にやや低下していた（表）．
病理学的には約12週齢の未治療mdxマウ
スでは，筋線経の大小不同，小さな群性の壊死線経がみられ，ほとんどの筋線経で中心核を有している．Bestatinの間敬投与mdxマウスで、

肌P±S．
D． burst P va lue
（
mv）
freq．
−
68．
4±10．
9 40‡ Control

・Non−
treated d x m ）Uミe・
Si叩 Ie treated 鵬x m）
USe．
0101192hrミafter bestatin i．
p．−
72．
2± 9．
9 15‡ 0．
⊥
71．
9± 9．
8 11‡ 0．
015411・Treated 【d x m se by O．
a嶋
be＄tatin i．
p．tVice a veek
0脚
2hrs after last a血
−
77．
3± 9．
5 n l 0．
∝氾116暮−74．
7＋10．
2 15‡ 0．
0 0349雷lday after last a血．
−
74．
3±10．
8 19‡ 0．
∞1αは暮
−
73．
5十10．
1 22‡ 0．
他 ys after last a血． −
72．
1±10．
4 25‡ 0．
015358
M 211
−
71．
5±10．
9 22‡ 0．
Vilcoxon test：Pく0．01暮−34−

mdx treated e bestatin

mdx treated e bestatinfor8wks（0．2mgi．p．singletx）（0．2mgi．p．tr．twiceaweek）
No

RMP（mean±S．D、）−68．4±10．9mV（n＝86）
burst什叫：40％

RMP（mean±S．D．）−68．4±軋9mV（∩＝86）
burstfreq∴40％…卜滋

RMP（mean±S，D．）−72．1±10＿9mV（∩＝川0）

RMP（moan±S．D．）
一72．2±9．9mV（∩＝川0）
bursttreq∴15％

burstfreq．：25％

三＿二∵l：一二二キ千十l

トk
30

20

一71．5±tO．9mV（∩＝100）

RMP（mean±S．D．）−71．9±9＿lmV（n＝川0〉

burstIreq∴22％

burst什eq：11％

RMP（一mV）

RMP（−mV）

RMP（mean±S．D．）

10

0

40

図3

50

60

70

80

90

川O

図4

Bestatin間歓投与mdxマウス．最終投
与後4日ではlowRMP筋線経の減少とhighRMP筋線経の増加はわずかに見られるが，末治療mdxマウスとの差は明瞭ではない．

Bestatin1回投与mdxマウス．Bestatin
投与後2時間ではRMPのパターンには明瞭な変化は現れない．electrical
myotoniaの頻度は減少している．

も同様の所見を呈し差は認められなかった（図

5）．
考

察

我々は最初，bestatinlOmg／day腹腔内投与を1週間連続してmdxマウスに対して行ない，
RMP改善とelectrical myotoniaが抑制される事を兄いだした1）・2）．しかし，このようなbes−
tatinの作用機序は不明である．ただ，抗不整脈剤であるが，DM性ニューロバナーやpar・amyotoniaに有効であると言われているmex・iletineにはmdxマウスのRMPを改善する作用があるとする，意見もある3）．
−35−

図5

HE染色，Bestatin間敬投与mdxマウス
でも筋線経の大小不同，小さな群性の壊死線経がみられ，末治療mdxマウスとの差はない．

今回は間歓的投与を行ったが，生下時より1カ月連続投与を行った埜中らの報告4）と同様に，病理学的改善は認められなかった．今匝＝ま前回の連続投与よりも少用量のbestatinを間歓投

文献1）木下眞男，岸雅彦ほか：ベスタテンの筋細胞膜安定化作用に関する実験的研究．厚生

与に用いたが，この用量でも電気生理学的には

省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質
による雉病治療薬の開発研究（江桧珪）昭electricalmyotoniaの抑制は見られ，これは投

和63年度研究報告書，pp19−21，1989．

与間駄時にも持続して見られた．しかし，RMP2）Kishi，M．，■Kurihara，K．，Hidaka，T．，etの改善作用は投与後の時間が長くなると徐々に

al．：Thestabilizingeffectofbestatinon

減弱してくる．このことは，RMP改善作用は

the resting membrane potentials of X−

bestatinの体内浪度の影響を受けており，さらlinkedmusculardystrophymice．JpJPsyにRMP改善を認めるbestatin濃度はelectri−

Neurol，44：595−600，1990．

Cal myotoniaの抑制を認めるbestatin濃度よ3）栗原照幸，日高隆信ほか：mdxマウスの電りも高いため5）と思われた．末治療のmdxマウ

気生理学的及び治療的研究．厚生省「精神・スに同用量のbestatinを1回腹月空内投与した

神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症

だけではelectrical myotoniaの抑制は見られるが，RMP改善作用は明確には見られない．こ及び関連疾患の成因と治療法開発に関するの投与量でRMP改善作用を出現させるために研究（荒木班）平成2年度研究報告書，印刷中．

は，間歓的bestatin投与により体内のbestatin4）埜中征哉，田辺雄三：mdxマウスに対する濃度が上昇している必要があると考えられた．

ロイペプナン，ベスタナンの投与成績．厚間歓的bestatin投与は電気生理学的に有効

生省「新薬開発研究費」微生物の二次代謝と考えられたが，病理学的に変化はなく，一時産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）的効果と思われた．Bestatinは高価な薬であの開発研究（梅沢班）昭和59年度研究報告

り，このような方法が今後残された方法ではな

書，pp71−75，1985．

いかと思われた．

5）木下眞男，岸雅彦ほか：mdxマウスに対するbestatinの効果．厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究（江桧証）平成元年度研究報告書，pp49−52，199d．1−36−

DM：Dにおける筋障害の進行過程−CTによる2年問の経時的評価−
石 原 博 幸＊
研究協力者

里 芋 明 元＊江 端 広 樹■青 柳 昭 雄＊

儀 式 三 郎＊道 免 和 久＊は じめにた．スウインヤードステージは開始時がステー

我々はCTによる定量的評価法を用いて，ジ2が6例，3が2例，2年後は2が5例，5がDMD例の筋障害の進行過程を検討し，71例を2例，6が1例で，ステージ不変が5例（ステー

対象とした横断的研究により表1のような結果

ジ2→2），2段階悪化が1例（3→5），3段階悪を得た1）．さらに昨年の本会議ではEST治験例

化が2例（2→5，3→6）であった．

10例を対象に1年間の縦断的追跡を行い，1）筋CTによる評価は初回と1年後，2年後の3回障害の進行過程に関して先の横断的研究と同様行った．CTスキャナーは日立CTW−500を用の結果が得られたこと，2）進行が速い例と遅い

い，撮影条件はスライス帽5mm，スキャン時間

例が見られたこと，および3）CT所見の推移と

6秒，Ⅹ線120KVp，200mAとした．また，CT

筋力やADLの推移との間にある程度の相関が値の安定性を確認するための校正を定期的に行認められたことを報告した2）．今回はさらに長った．スライス部位は大腿中央部と下腿最大径期間の追跡を行ったのでその結果を報告する．

部とし，大腿と下腿各筋のCT値と％断面積を求めた．％断面積はCT倍が30から120HUの対象および方法
対象はCTの評価を含めて2年間追跡し得た範囲に入る筋の％断面積と一60から−200HU

EST治験例8例で，開始時の年齢は5歳から8筋の割合と脂肪置換の程度を評価した．評価法

歳，最終評価時の年齢は7歳から10歳であっの詳細は文献を参照されたい1）．さらにESTプの範囲に入る脂肪の％断面積を求め，残存する

ロトコールで用いられたADLスコアおよび徒表l Duchenne型進行性筋ジストロフィー症
における筋障害の進行過程−CTによる評価のまとめ
茄 群

初

期

中

期

晩

骨盤帯
体 幹

大賢筋
中腎筋
大腿筋膜張筋

腸腰茄
腰方形筋
傍脊柱筋

腹直筋
腰斜筋

大 腿

大腿二頭筋
内転筋群
大腿四頸茄

半殿様筋
半膜様茄

縫工筋
薄 筋

研骨筋
研贋茄

前脛骨筋
ヒラメ筋

後脛骨筋

手筋力テストによる筋力の推移とCT所見の推移との比較を行った．

期

結

下 腿

果

1．下肢筋の障害の経時的変化
図laに下腿筋の筋と脂肪の％断面積の8例の平均値の経時的変化を示す．各筋とも経過とともに筋の％断面積が低下し，脂肪の％断面積が増加する傾向が認められたが，その程度は俳腹筋が最も著しく，俳骨筋，ヒラメ筋がこれに続き，前脛骨筋と後脛骨筋は変化が比較的少な＊国立療養所東埼玉病院

かった．大腿筋においても同様に経過とともに
−37−

0
9

筋の％断面積の経時的変化（下腿筋：N＝8）筋の％断面積の経時的変化（大腿筋：N＝8）筋の％断面積駄

0
7
0
6
0
5
0
4

筋の％断面積㈲

0
0U
0
3
0

初回

2年後
評価時点
◇律竪骨筋 口前膣骨筋 △ヒラメ筋 ＋錘骨筋 ∇錘耶
（TP）
（TA）
（SL）
（PN） （GA

初回

1年後

1年後

2年後
評価時点

十捜工筋 ◇耳筋 △半農横筋（SA）（GC）（ST′30

脂肪の％断面積の経時的変化（下腿筋：N＝8）∇内転筋□大鹿四頭筋（AD）（QD）

×大盟二頭筋はF）

脂肪の％断面積の経時的変化（大腿筋：N＝8）

2
2

1−

■l

2
●

︻J

・
I

nU

t
−

5

諺

≦

∧U

初固

妄

宗

／

＝ ≦

：ニ

産後

2‥◇T
≠ 後TAP・・
評価時点∇牌腹筋 △ヒラメ箭（GA） （SL）＋脾蜃芯 ⊂目盛拍憫
（PN） （TA）

脂肪の％断面糟五0

脂肪の％断面積％52

一一 p G A／ ￣／ 一／ ￣
タ ′■

◇穣匹青筋
（TP）

評価時点
×大腿二頭筋 ∇内転笥 口大脇四頭筋 △半農様筍 十縫工筋 ◇薄茶（8日（AD） （QD）（ST） （SA）（GC）

ab

図1筋および脂肪の％断面積の経時的変化
a．下腿筋
b．大腿筋

筋の％断面積が減少し，脂肪の％断面積が増加
する傾向が認められたが，その程度は大腿二頭筋，大腿四頭筋，内転筋群で著しく，ついで半腱様筋，半膜様筋と続き，縫工筋と薄筋は変化が比較的少なかった（図1b）．実際のCT像を図2に示す．
2．筋障害の進行速度の個人差
図3に示すように筋障害の進行程度には個人差があり，図中の症例A，B，Fは変化が速いのに対し，症例C，E，Dは変化が軽度であった．ただし，EST実薬群とプラセボ群の間にはCT所見からみた筋障害の進行の程度に関し，有意差は認められなかった（表2）．
3・CT所見の推移とADLスコア，筋力の推移との関係
図4に代表的な症例の各評価項目の初回評価
時，1年後，2年後の値を示すが，ステージが2から5と進行が速かった症例Aでは，ステージの進行，ADLスコア，膝伸筋筋力の低下と大−38−

図2 障害程度の筋による差：ステージ5の症
例の薄筋と大腿二頭筋のCT像を示す．
薄筋は筋の％断面積が50．9％，脂肪の％断面積が5．2％であるのに対し，大腿二頭筋はそれぞれ3．0％，70．9％と，両筋には大きな差が見られる．

腿，下腿の筋の％断面積の低下および脂肪の％茄の％断面積の廷喝変化（下腹全体）
旬間

断面積の増加が平行して進んでいた．これに対田し，ステージが初回評価時，2年後ともに2と不

切

∵

二°
二■
二二

・
含

こ・
ご − 、

C

変であった症例Eでは他の評価項目も大きな変−■ 「8 8化が見られなかった．他の症例においてもCT

‥ 一・O
、

＋＿
．
．

咽

一 一一

一
、 、

詞

−朋の％断面積ーム − 一一 −

∇
■
一
、十 ・
、．

劫

所見の推移はステージ，ADL，筋力の推移とよ

▲
〜

柑

￣
￣
■−
ト B

0

く一致していた．
初

由

D症例A

l 年

目

2

年

巨

評価時点
＋症例B o症例C A症例D x症例E ∇症例F考察およびまとめ
今回我々はCTによる定量的評価法を用いて脂肪の％断面積の建時変化（下座全体）
Ⅷ

DMD8例の下肢筋の障害の進行過程を2年閉

髄

経時的に追跡した．その結果，以前の横断的研

閉

脂肪の％折︸雅

∇・
一・

．
〆

究とほぼ同様の結果が得られ（表1），従来の

切

一・
々

F

．
・・

人 ，B

■
一■
■
′

詞

．
＿・
・
′
・
一・・
† ・
一・
・
〆 ′

我々の報告の妥当性を確認することができた．

甜

今回の対象例ではCT上筋障害の進行が速い群
ロ

′ ＿
−■ D

18

〇・・・・

○ …

8

初 由

□症例A

…

…

…

…

…

・一日

と遅い群の2群が見られたが，EST実薬群とプや C臼

ラセボ群の間に差は認められなかった．このよ

評価時点
0．症例C A症例D x症例E ▼症例F

うに筋障害の進行は一定の順序をたどるにもか

1 卓

＋症例B

…

E

日

2 年

かわらず，その進行速度には症例により差があ

図3 筋障害の進行速度の個人差

る理由は不明だが，今後さらに多数例の縦断的追跡を行い，解明していく必要がある．また，

表2

CT所見の増悪と平行して，ステージの進行，CT所見の推移とEST治験薬との関係

ADLスコアおよび筋力の低下が認められたこ（N＝8）とは，我々のCTによる定量的評価法の妥当性

ブラ
セ
ポ群

実薬群

C T 所見悪化

12

量的評価は疾患の自然経過の把握，薬物や訓練

C T 所見不変

4

1の効果判定などの補助手段として有用と考えらを示すものと思われる．筋障害のCTによる定れ，今後さらに長期間の追跡を行っていきたい．
＊ズ2＝1．74（NS）

MCTl〕（ST艦2→5〉MCT E（ST白：∈2−2）（アラ快、群）（アラ怯 許〉

一初回

一初回 一一1年後 一・−2年後

Hl年後

図4 CT所見の推移とステージ，ADL，筋力の推移との関係（本文参照）−39−

一・一2年後文献2）石原博幸，里芋明元ほか：Duchenne型進1）里芋明元：Duchenne型進行性筋ジストロ

行性筋ジストロフィー症における筋障害のフィー症（DMD）における筋障害の進行過進行過程−CTによる経時的評価−．厚生

程−CTスキャンによる定量的評価一．リハ

省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質

医学，26：159−171，1989．

による難病治療薬の開発研究（江橋旺）平
成元年度研究報告書，pp61−64，1990．

−40−

培養神経細胞に及ぼす自己免疫筋抗原（SE−antigen）の作用の検討春 原 経 彦＊
研究協力者

古

川

昭

栄叫…里

重症筋無力症や多発性筋炎の約半数の患者血

吉

栄二郎＊＊

mediumの1：1混合培地にinsulin5JLg／ml，中に，骨格筋から生理食塩水で抽出される物質

transferrin5JLg／ml，2×10．8Mprogesterone，に対する抗体が存在する1）．以後この抗原物質

3x10−8MNa2SeO3，0．5％牛血清アルブミン

をsalineextract（SE）−antigenとよぶ．我々を含む）．

はこれまでにSE−antigenに対するモノクロー

実験1：神経細胞の培養開始と同時にneⅣeナル抗体を作製し，これを用いて以下に示すよ

growthfactor（NGF）や，種々の筋抗原画分

うなSE−antigenのいくつかの分子特性，組織を培養液に添加し，5％CO2下，370Cで2日間

内分布を明らかにしてきた．1）SE−antigenは培養後生存する神経細胞数を数えた．

骨格筋，心筋に分布し胸腺にも微量存在する．

実験2：培養液で予め希釈した筋抗原を培養

2）分子量は210kda，3）培養下では融合した多ウエルに添加，40Cで15時間インキュベートし

角筋管細胞が合成し，分裂中の細胞には存在した後，よく洗浄し，分散した神経細胞を添加しない，4）細胞外に分泌される，5）筋組織の細た．実験1と同じ条件で2日間培養し，細胞の胞外マトリックスと横紋構造に相関する構造に直径より長い突起を持つ神経細胞数を数えた．

存在する．6）ヒト血中に存在するが疾患特異性

筋抗原サンプル：これまで行ってきた筋抗原の各部分精製画分を用いた．M−1（ラット骨格はなく血中濃度は年齢とある程度相関する．
以上の知見からSE−antigenは横紋筋細胞の筋のPBS抽出物），M−2（セ77ロース6Bク

細胞外マトリックス成分として，神経細胞の生ロマト溶出の高分子画分），M−3（高速液体クロ

存や突起形成になんらかの機能を果たすのでは

マトグラフィーで溶出された活性画分の一つ），

ないかと推定し検討した．

M−4（抗原認識モノクローナル抗体の同相アフィニテイクロマト画分），M−5（抗庶非認識抗体

方によるア7イニテイクロマト画分）．

法

神経細胞の培養：ふ化10日の鶏胚から交感神経節を摘出し，0．08％トリプシンで370C30

結果と考察

分間インキュベートしたのち，ピペッティング

神経細胞生存維持活性：実験1の結果を図1

操作で個々の細胞に分散し，予めpoly−L−Or−に示した．単位面積当たりの生存神経細胞数はnithineコートした96穴マルチウエルプレート

nervegrOWthfactor（NGF）の存在下で最大に播種した．培養液は無血清完全合成培地を用値を示した．M−1画分は1．4mgprotein／mlでいた（Dulbecco，SMEMmedium／Ham

NGFとほぼ同等の活性を示すことから，筋抽＊国立精神・神経センター武蔵病院＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊岐阜薬科大学分子生物

sF−12

出物中には交感神経細胞の維持に関与する因子が存在することを示している．しかしNGFと同一物質かどうかは確認していない．M−4画分
−41−

300

011GF（511g／ml〉

OL細く靭／鵬）●■・111．●lIⅦFOt●■l／叫●u・1（1．4lluHyOt●叫d）□uJt0．叫FO仙／叫▲lL2（2．か叫＝町○伽／鵬）
口附く叫FObhノ叫m●一−iiP一i●P︳一石■一t三〇竜王

1000●附くM叫FOt倒n／叫
Ou・5（〇・〇叫FOtdl／l叫●−（0．051IⅦFOt騨l／叫
Ou・5（〇・〇叫FOtO■l／mq

一連一編＿三吉＞●／
ヂ

ヂ

ヂ

仙OtS叫

D仙01叫
図1各骨格筋分画成分の培養交感神経細胞に対する生存維持作用
骨格筋から調製した各画分を段階希釈し，交感神経細胞の培養液に添加した．
2日間培養後，ウエル中心部の4mm2に存在する生細胞数を位相差顕微鏡下で数えた．

には抗原物質と非抗原物質が含まれるがM−53130

図2 各骨格筋分画成分の培養交感神経細胞に対する神経突起伸展作用
骨格筋から調製した各画分を予めウェ
ルにコートしておき，交感神経細胞を培養した．24時間培養後，ウェル中心部の4mm2に存在する生細胞のうち突起をもつ細胞数を位相差顕微鏡下で数えた．

たく神経突起形成を促進しなかった．

画分はそのうち非抗原物質だけを含むことがわ

以上の結果から，自己抗原物質SEには弱いかっている．この両者の比較によって筋抗原のながら交感神経細胞の生存維持作用があるが，作用を類推することができるはずである．図1

神経突起伸展作用はないと推定した．自己免疫下段に示すように0．05mg protein／mlのM−4疾患において自己抗体にさらされることにより画分に弱いながら活性が兄いだされるがM−5

SEが崩壊し，神経機能維持作用が妨害されるには兄いだせない．またラミニンにもこの活性可能性が示唆された．

はない．このことから筋抗原SEは弱いながら交感神経細胞の生存維持活性をもつと推定され
る．

文

献

1）Akazawa，S．，Furukawa，S．，Kamo，I．，

神経突起伸展作用：実験2の結果を図2に示Satoyoshi，E．and Hayashi，K．：An

した．この実験系で強い作用を持つラミニンはenzyme−linkedimmunosorbentassayfor

50JJg／mlで最大作用を示した．M−1画分は非antibodiesagainstsaline−SOluklemuscle

濃度依存的に，M−3画分は0．2mg／mlでラミ

COmpOnentS

ニンに比眉し得る活性を示した．しかし，M−4，

Immunol．Methods，94：161，1986．

M−5画分ともに実験に供した浪皮内ではまっ

−42−

in

myasthenia gravis．J．

比較的良好な経過を示したいわゆるDuchenne型筋ジストロフィーの臨床特徴
福 山 幸 夫＊

＊
＊

方

的

＊

小 沢 銭二郎＊＊

子美子

子＊

恭晴啓

斎 藤 加代子＊

沢中倉

■

平地宍

＊

池 谷 紀代子＊
須加原 信 子■

木

子み子

真ゆ沢暢

目

沢井田木

大新炭鈴

研究協力者

法

薬効評価を通じ，Duchenne型筋ジストロフ

女子医大小児科を受診し，半年毎に10m走

ィー（DMD）の経過にはかなりの変異があり，行・立ちあがり所要時間を測定しえた小児腰帯

いわゆる良性例が存在することが判明してきた．

型筋ジストロフィー（ト20歳：延べ283回数）

欧米では境界型，中間型ともいわれる．小児腰例を，その経過によりDucherme，良性型，Beck−

帯型筋ジストロフィーの良性経過例の臨床特徴

er型に分け同動作所要時間の平均±標準偏差を検討し，予後判定を小児期早期に可能とするを算出した．またDMD／Becker型（BMD）両ための基準を確立する．

型の中間的位置を占める4例につきその臨床特徴を分析検討した．また3例で，Dystrophin蛋

RequiredtimetDStandup

白分子の部分に相当する合成ペプチドを用いてウサギで作成したポリクローナル抗体PO4，
POO，P23，P34を用いて免疫組織染色を施行した．

＊東京女子医科大学小児科＊＊国立精神・神経センター神経研究所−43−

表 良好な経過を示したいわゆるDuchenne型の臨床

初診年齢

OH

Kl

lOy7m

12y4m

18ylm
低下中
定頸
坐位保持
いざりはい
四つ這い
歩行開始
走り方

SM

MK

6yOm

4yllm

16y6m死亡
7yllm lly6m
低下中
上昇中
低下中
3m

4m

7m

10m

十

1y8m
速歩様
（6Y〜）

両足とび不可両足とび獲得両足とび不能
片足交互
両足揃え
片手手摺要
立ち挙がり不能（支え無しで）歩行不能
臥位・→坐位
腹筋使用

〜3cm

12y3m

ly8m

走れる

走れる

（5y〜）

（6y〜）

4〜5Y

5cm：6〜7y

20〜30cm：6〜8y

7yllm可10y7m〜7yllm〜11y6m

／

／

／■

／

7yllm可11y6m可18ylm一応可13y5m

7yllm可11y6m可〜15ylm〜7yllm〜11y6m

前屈＜後屈
前屈＜後屈
伸展＜屈曲
軽度

前屈＝後屈
前屈＜後屈
伸展＝屈曲
軽度

14y2m

12yllm

前屈＞後屈
伸展＜屈曲
軽度
＋

下腿・大腿
7yllm

＋

7yllm

＋

lly−12y

兄
80康P
539
9健∩±

心拡大
CPK
I Q

家族歴
母CK
Dystrophin

＋

下腿
初診時−
16y6m

＋

m

17y4m減弱

m m時
脳川畑熱〜±下1010発車

⊥

腿再

一＋下17

巨舌
下顎前突
仮性肥大
PTR
ATR
下肢痛

1y

ly9m

5y

2

前屈＞後屈
前屈＞後屈
伸展＞屈曲
軽度

力顔箭程患

1y餌
つま先で
小走り

16y3m
5070

11380

7709

86

88

健康兄

健康兄

健康妹

n P

n

±（剖検筋）

＋

P

n

P

未施行

果

は5．5−7．5歳に3−4秒，BMDでは6．5−14歳に

1．立ち挙がり所要時間（図1）3秒，7．5−12歳に2−4秒と最短値を示していた．

DMDでは2−5．5歳で4−5秒とほぼ横這い，
良性DMDでは5．5−7．5歳で，BMDでは7．5−
12歳でいずれも2−4秒の最短値を示していた．

3．良性経過をとったDMDの臨床2．10m走行時間（図2）

結論できない．MKは両足跳躍の力が強く，や結DMDでは4．5−5．5歳は5秒，良性DMDで

1）表に良性の経過をとった4例の臨床像を示す．この4例が均一なものか否かは現段階ではや異質な印象をうけている．共通点は乳児期発−44−

症の腰帯筋優位の筋ジストロフィーであること，であることが問題となり，将来の臨床経過を予乳児期の低緊張が目立つことであった．例えば

測可能な小児期早期における指標が望まれていOHでは，4ヵ月より定頸開始するも腹臥位で頭る．今回の我々の検討結果からは，立ち挙がり

部挙上不可，5カ月過ぎても陽性支持反応無く所要時間が6歳以上の時点で約3秒ないしそれ下肢を屈曲してしまい，7カ月：坐位保持可と

以下，10m走行時間が7歳以上の時点で約4秒なるも，背が丸くなった．6歳より状態改善する

ないしそれ以下であれば良性の経過をとるであも，8歳より再び筋力低下に気付いている．10歳

ろうことが推測された．

6カ月初診時，筋力：頸部の前屈4／後屈3，股関節屈曲伸展3，他は4であり，仰臥位から坐位

DMDとBMDの中間的経過を呈する例の特徴として乳児期に筋緊張低下が日だつこと，6−への変換は腹筋使用，その後蹄裾姿勢となり上8歳頃に息児なりの最高機能を呈し，頸部・脳幹

半身前屈のまま腎部挙上し，上肢の力を借りての前屈筋の筋力が3以上あり，臥位から坐位へ

上体を起こしていた．他の3例とも共通して頸腹筋利用による起き挙がりが長期に可能である．

部・脳幹の前屈筋が3以上あり，頸の前屈・臥両足とび可能あるいは他児とほぼ同様に走行可

位から坐位時の腹筋使用が可能であった時期が能である時期を有することがあげられる．

ある．

Dystrophinに対するポリクローナル抗体

2）筋CT

P04による免疫組織染色の結果から，SM例はKIを除く3例の筋CT倍をみると，SMと肢帯型と考えられる．HOは臨床像からは肢帯

MKはBMDのそれと近似しており，いずれも型と考えていたがBeckerと診断すべきなのか

gracillisよりもquadriceps femorisの方が高もしれない．いずれにせよこれら良性経過をとCT値を示していた．

った4例が同一疾患に属するか否かは今後の検討を待ちたい．

3）Dystrophinを用いた免疫組織染色
HOは正常に比し細胞膜の染色性が弱く不均以前我々は乳児期に筋緊張低下が目だち，著

一な染色性（荒畑らのpathyordiscontinuous

明な筋の仮性肥大を呈する例をsevere Du−pattern）を示し，SMは細胞膜が連続的に一様

chenneとして報告した．乳児期に筋緊張低下がに強く染色された．

目だつ点では今回良性経過を呈した例と類似しているが，これらの例ではdystrophinは陰性で

考

あった．

案

薬効評価に際LDMDではその経過が不均一−45−ベスタテンのDuchenme PMD投与に対する免疫グロブリンの変動

村 上 慶 郎＊

研究協力者

岡 崎

隆＊

は じめに

西 岡 昌 紀＊り変化はなかった．

私どもは酵素阻害物質であるフオルフェノシ

フオルフェンシノールの投与による感冒罷患

ノール，ベスタテンをDuchenne PMDに長期回数の減少は昭和62年度の本研究班でも発表間投与した．投与期間中，DuchennePMD患者

したが，これはフオルフェンシノールが免疫抵から，感冒に罷思しなくなった．或いは感冒に抗を増強さすためであると思われる．

曜息しても軽症で恢復するようになったという

ベスタテンについての成績では使用前の1年ことを多くの投与患者から聞くようになった．

間の感冒罷患回数に比べて使用中は，11例のう

そこでこれらの薬物の感冒に対する効果をみ，

ち8例が感冒罷息回数が減少しており，使用中また投与時及び投与後の免疫グロブリンの変動止後の1年間での感冒罷患回数は使用中と同様

について検討を加えた．

であったもの2例，1例は減少していた（表）．
免疫グロブリンのうちIg−Gは使用中に比し対象及び方法て，全例に使用後は減少していた．Ig−Mでは11

対象は年齢4歳から8歳までのDuchenne

例中10例が使用後減少していた．また呼吸器感

PMD患者で全例歩行可能であった．7オルフ染症に関係があるとされているIg−Aでは11ェンシノールは50〜150mg／day，ベスタテン

例中10例に投与中より投与後に減少しており，は150mg／dayを投与した．投与期間は14〜27

うち4例はかなりの減少であった．

月であった．免疫グロブリンの測定はベスタナ

これらの点からベスタテンもフオルフェンシンの投与期間中及び投与中止後約1カ月後で測ノールと同様Duchenne PMDの感冒罷息回数定した．免疫グロブリンの測定法は，Ig−G，を減少または症状を軽減するようである．
DuchemmePMDは学齢期に休暇，或いは感冒

Ig−M，Ig−Aはネフェメトリー法，Ig−DはSRID
法，Ig−EはEIA法によった．

などの疾病で臥床した後歩行能力が落ち，歩行不能になることが良く知られている．このため結果及び考察感冒などによる感染症のための臥床をできるだ

フオルフェンシノールの投与では，1年間にけ短期間にすることが望まれる．ベスタナン，

10例中8例に感冒の罷患回数が減少し，うち3

7オルフェンシノール等の投与は感冒などの感例はまったく1年間感冒に罷らなかった．さら染症による臥床期間を短縮するために，間接的に使用を中止後の1年間の感冒罷息回数についにDuchenne PMDの歩行期間を延長するともては，1例は再び感冒曜息回数が増加したが，残考えられる．

りの6例は感冒罷患回数は投与中と比べてあま
おわ り に＊国立療養所箱根病院

1．べスタナン，7オルフェンシノールはDu−−46−

表 ベスタナン使用者の感冒罷患回数と免疫グロブリン
感冒羅重回数
使用的 中
後

lg−G

前

JI／dt

中

後

l

g−M

前

■（／dl

中

後

61

lg−A

LE／lt

中

後

前

前

Ig−D）f／dl

中後Ig−ElV／■l

前

中

後

症例
1

3

1

3

1日0

10日

81

2．

4

2

3

17日

lH0

71

3

3

0

2

lTH lH0

4

4

2

3

川‖

5

2

2

2

1…

6

2

1

2

1日

川50

l川

7

2

2

1

121l lH

り

15

8

2

2

3

HSl

HM

H

H

9

3

2

3

1311

1日0

lH

1日0

l…

1日

日1

日

HT HZ

110
王1！

302

日

76

tH

1

1

2

1ユ50

10日

Hl lM

11

1

0

1

2650

2170

11王

！．0

t．8

．0

2．0

H H

日亨

ZM

日S Hl

251

11

lH H
日

281

2．0

三日

2．0

2．0

日

25

日暮

2．0

2．0

25

Z5

TI

llS

lll

tM

lり

H

102

chennePMDの感冒罷患回数を減少，あるいは曜患しても症状を軽減する．

日0

326

日1

日1

王11

！．0

2．0

．I H

25

2．0

！．1

H z5

811

7日

2．ベスタテンはDuchennePMDの免疫グ
ロブリンIg−G，Ig−M，Ig−Aを増加させる．

−17−

EST投与対象の1症例における臨床的背景について

三吉野
研究協力者

産治＊

山 田 みどり＊＊

表1

EST投与対象となった1症例の臨床的な背景について，約束されたプロトコールの各条項の他に，PCR法による遺伝子診断，CTスキャン
による筋の画像診断，動作による分析のなかで，立ち上がりの型と所要時間について検討を加え，幼児期の疾患と発育の問題つまり疾患による正常な発達の障害と，発育が疾患のdownn hill
COurSeをマスクして押し上げる事の絡み合い，
これが幼児期の薬効評価の推しさについて述べ

患者 T．U． 男 6才
生年月日 昭和59．12．16．
家族歴；兄弟2人の弟で他にDMDの点者はいない。
病歴：昭和60．12．18．38℃の発熱
喧声、呼吸困難、が意化し、点滴処理
中にケイレン発作、全身チアノー
ゼ等あり
入院．
入院時検査により GOT、GPT、LDHの上昇があった。
その後、Infantile He門titiSの疑いにて経過観察中8カ月
間GOT、GPT、LDH、は高値のまま殆ど変動しなかった．
63．4、CPX高値により筋疾患を疑われた．
筋生検の結果DMDと診断された

る．
患者は現在6歳2ヵ月男子
家族歴現症；4才10カ月（入院時年齢）
Go甘erS Sigmあり、動揺性歩行、仮性肥大
GOT354、GPT643、LDH3826
CPX1415（母、CPK19、父、21）
I Q．79

両親，兄1名，本人以外にDMDの患者はいない．
病歴

昭和60年12月18日満1歳の時，38度の発熱，嘆声，呼吸困難，全身チアノーゼ，

遺伝子診断（九大生医研鈴木教皇PCR法）

けいれん発作があり抗けいれん剤を月艮用，脳波

EXOMに異常なく熱性けいれんの類，一過性の脳虚血

本人（5）

pg／11
4
8
2．57
十 一

等があったものと思われる，某病院に入院，点母（40）3．02

◆

◆

＋

◆

滴処置などを受けたときに，GOT，GPT，LDH

父（35）2．48

◆

十

十

十

の病的な異常高値があり，Infantilehepatitisの疑いで8カ月間経過観察，異常高値は殆ど変動

現在，RFLPにより分析中である．
CT画像なく，63年4月，3歳6月の時，たまたまCKの

12

17

19

44
45
一
十

48
◆

51
＋

◆

◆

十

十

十

十

十

◆

◆

◆

両側大腿中央部及び下腿最大周囲検査で異常高値を示した事から筋疾患を疑われ部の画像では前者に強い虫食い状のlow den−

た，筋生検の結果DMDと診断された．表1

Sityareaがみられた．9月の画像経過ではやや進んでいるようであった．

現病歴

4歳10月，EST投与の目的にて入院，表2に示すように，CK1415で母：19，父：立ち上がり時間21であった．IQ：79，遺伝子診断ではPCR法に

1年6月間，毎月1回の割合でVTRに撮り，床よりExon，8，12，17，19，44，の欠損，両親から手が離れた時からどちらかの足が床を離れはNormalPCRであった．突然変異についてはる時，あるいは躯幹が真直ぐに立ち上がった時＊国立療養所西別府病院＊＊八代総合病院小児科

表3のように第1回Hからまでの時間を繰り返し3回測定し平均した値をだした．平均所用時間は，1回日1．04秒，2回−48−

表3 立ち上がり時間
河 定 回 数
平 均

日 時
男

1

回

男

2

回

雰

3

楕 考

＿二二

回

1

n l ．1 0 ．2 6

0 ．9 8

1 ．0 3

1 ．1 3

1 ．0 42

1 1 ．2 2

0 ．8 20 ．9 2

0 ．7 5

0 ．8 33

1 2 ．2 0

0 ．6 7

0 ．7 5

0 ．6 8

0 ．6 94

口．2 ．1 ．1 7

2 ．5 5

2 ．8 82 ．8 82 ．7 8 ．

5

3 ．1 4

1 ．0 80 ．8 91 ．0 00 ．9 88

4 ．1 1

0 ．8 5

1 ．0 50 ．9 50 ．9 57

5 ． 8

0 ．8 20 ．8 20 ．8 00 ．8 1

88 ． 6

0 ．7 30 ．8 1

0 ．8 6

0 ．8 097 ． 4

0 ．7 7

0 ．7 1

0 ．8 5

0 ．7 1

1 0

8 ． 1

1 ．5 0

1 ．6 01 ．7 91 ．8 31 1

9 ． 5

0 ．8 2

0 ．7 80 ．8 5

0 ．8 112

1 1 ．1 4

0 ．8 20 ．8 00 ．8 1

0 ．8 113

1 2 ．1 2

0 ．8 5

1 ．0 00 ．9 20 ．9 2

14

Ⅶ．3 ．2 ．1 5

1 ．0 3

1 ．0 7

0 ．9 7

1 ．0 2

A型

B

型 他 A

空

匡11

B型
l eg

pa in

∵十三
図2

目0．83秒，4回目は感冒，10回目は遠足の後でC型

下肢痛があり時間がかかっているのでこの2項

ビス目を除くと短くて0．69−0．95，大体0．70−0．85〜0．92〜1．02秒となりもっと測定方法を考え

乙を食ないと当てになる数ではない．（表2）

￠こ＜L」
考

察

図3

昭和56年度及び昭和57年度筋ジス昇3班成果報告書にまとめた成績をしめす．すなわち，
DMD息児が筋力の低下にともなう立ち上がり

表4

1歳半（within貢±SD）
貢（平均値）＝1．￣1SDtα）＝0．4

方の異常と，正常な幼児の立ち上がり動作の分析について，まとめたもので，対象は別府保健所乳幼児健診を訪れた健康な1歳6月児42例，

A

型

B

型

C

型

混

性別

型

人 数

時間粉

人 数

時 間 辱劉

人 致

時間 叫

人 数

合

男

16

0．
9

0

女

13

1．
0

1

汁

29

1．
0

1

型

時 間抄

j十
人 数

時間取

0

0

16

0．
g

1．
5

0

0

14

1．0

1．
5

0

0

30

1．0

2歳児51例，3歳児65例，計158例についてVTRに録画し，後に再現し繰り返し動作の分析を行い，立ち上がりの型をみて次のように分類した．A型は仰臥位から腹臥位となり四つ這いになり立ち上がる（図1）．B型は四つ這いにな

表5るまではA型と同じであるが，片足を一歩前に出して立ち上がる（図2）．C型は仰臥位から腹臥位をとらずしゃがみこんで立ち上がる（図型

2歳（within雷±SD）貢Ll．4
A

型

B

型

C

型

人 放

時間抄

人 数

時間（
扮

人 数

時間抄

男

14

1．
4

2

1．
6

0

女

16

1．
3

3

1．
4

三十

30

1．
3

5

1．
5

産別 ＼

混

SD＝0．5合 型

人 数 時 間抄

三
十
人 数

時間取
1．
4

−

0

−

16

0

−

1

1．
5

20

1．
3

0

−

1

1．
5

3 6

1．
4

3）．その他BとCの中間型があった．表4は158例の集計から1歳6月，2歳，3歳のそれぞれの平均値から±lSDをはずれる例を除いてー49−

集計したものである．1歳6月，30例中A型29
例（96．6％），時間1．0秒．表5は同様にして2歳児でA型36例中30例（83．3％），B型5例，
時間平均A型，1．4秒，B型1．5秒．表6は3

図6，10m疾走と立ち上がり時間では，平均4．8秒で測定した11月間では有意差なく立ち上がりの所要時間は，1981年8月平均1．5秒，4月後約2秒と延長し，1982年3月から個人差

歳児，A型52例中18例（34．6％），B型52例
中16例（30．7％），C型52例中14例（26．9％）
であり立ち上がり形式の多様化がみられる．時間は，A型0．4−0．6秒，B型0．4−0．5秒，C型0．3−0．6秒，平均して0．5〜0．6秒であった．
まとめると1歳6月で0．6秒±0．4，2歳で1．4秒±0．5，3歳で0．6秒0．4である．
表7はDMD患児9例の内容で，4歳〜9歳，Stagel〜3でStagel；5例，Stage2；3例，
Stage3：1例について14月間の経過を，ADL
8（100点法），階段昇降，立ち上がり時間，10m

10

17

1

3

5

7

図4

ADLlOO点法の推移

9

血te

疾走につき検討した．
図4にしめすように，ADLでは有意差なく図5，階段昇降で，昇り下りの間に有意差はなく，変動の幅が大きくなり症例によってバラエティーがある．
表6 3歳（within雷±SD）訂0．6 SD＝0．4
型

A

型

B

性別

人 数

時間鰯

人 数

型

C

型

混

時 間柳

人 数

閤拗

人数

男

1 1

0．
6

8

0．
5

2

時 間取

0．3

1

0．
4

22

0 ．5

女

7

0．4

8

0．
4

12

0 ．6

3

0．6

30

0．
5

計

18

0 ．5

16

0．
4

14

0＿
5

4

0．5

52

0．
5

時 間秒l 人 数

合

型

！十

腎

．。．2■9P2

。

5

，

9
date

図5 階段昇降用時間の推移

表7 調査対象者
E
M
A
N

E

A
C
1

Y
K

2

M
M

4
5
6
7
8

K I O A T S E
H T M M M T K

3

AGE

SEX

STAGE

7

M

1

4

M

2

7

M

2

7

M

2

8

M

3

5

M

1

6

M

1

5

M

1

10
1982

8

M

12

1

3

5

7

9
」一上e

9

9

10

図6

I

M：MALE−50−

立ち上がり時間10m走所用時間の推移

表8立ち上がり時間 ADLlOm走 階段
昇降の各月別推移（平均値±SD）n＝9
10m走抄l

酢愚がa ADL侃

階段昇降
昇 抄】
降 抄）

S56．8

1．61士0．91

84土6

5．4±1．4

12．2土7．5

10．7±6．5

9

1．73土0．53

84土5

5．2士1．5

10，4士6．1

11．0士5．3

10

1．63土0．53

85士6

5．2士1．7

12．0士6．3

11．8士5．7

12

1．92土0．55

85土5

5．3土1．6

13．8土9．1

9．4土3．7

14．6土185

10．8土5．2

84士6

4．8士1．8

3

2．48士1．17※

84土6

5．7土1．6

14．5士9．3

9．1土3．3

4

2．39土1．51冗

84土7

5．4土1．5

13．7士8．1

10．1士4．0

5

2．78士1．36叛辣

83土7

5．7士1．9

14．4土10．2

10．4土5．4

6

3．16±2．31叛※

83土6

5．6士1．8

17．0士11．8

10．0士6．3

7

2．93土1．65※穎

82土7

5．4士1．8

23．6士18．9

15．6士13．9

21．9士19．9

14．1士9．7

S57．1

1．89士0，54

8

3．11土2．31※

83士7

5．9土1．99

3．37士2．76媒

81土9

6．0士2．1

21．1士19．9

19．8±19．3

10

3．97士3．15業

80±8

6．3土2．1

22．8土21．4

16．9土14．3

濱等≡ P＜0．01※
P＜0．05が著しくなり平均で4．0秒，最も悪い例では7．

立ち上がる，立つ，歩く，走る，昇る，降るなどの様々な動作はDMD患者の年齢，Stageに2秒と延長している．
表8に，以上の事をまとめてみた．立ち上がより異なってくるが，3歳から6歳頃までの立り時間，ADL，10m疾走，階段昇り，下りの5

ち上がり時間の測定は比較的短い期間，6月

項目中有意差のあったのは立ち上がり時間の延〜10月間の評価に応用できるのではないかと長であった．

思われる．

以上述べたように，DMDの機能障害進展過程の評価法については，すでに多くの報告があり，

ま

と

め

Stageの分類も幾つか報告され，利用されていEST投与対象の1例についてdystrophin遺るが，正常幼児期の正常発達との比較，すなわ

伝子の欠損（Exon8，12，17，19，44）が証明

ち，DMD患児の病状の進行と重症化が正常児のされ，CT画像上low density areaの存在と9発達からどの部分がどのような遅れを示すのか，

月間の経過上やや進展のみられたIQ79の患児

また，訓練や治療の効果判定の指標として何がについて報告した．

適当であるのか，殊に乳幼児期の小児では，意志，理解力など客観的，定量的評価は困難であ
る．

−51−

Duchenne型筋ジストロフィー症患者の新しい理学的評価法−その意義と問題点−

野 京 子††崎 田 朝 保††† 本

家 一 也†††隆春††

幸 福 圭 子††††福 永 秀 敏††††
青 木
寛‡ 篠
由美子‡

竹 ⁝ ⁝ ‡

水藤†

村 喜一郎＊＊＊＊近＊＊

石 沢 真 弓＊＊＊＊松＊村 則 子＊＊＊＊＊

賢＊＊＊ 藤浅 野＊

原 博 幸＊＊＊

秀

積秋夫義子繁

石

田

初千武元洋

夫＊＊

杉

井佐原崎田田野熊土桑山武藤研究協力者

中は じめ に

験に旧評価法を適用するにあたっての問題点とDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）におして，1）評価項目が多すぎる．例えば，ADL25

ける薬効評価の指標としては理学的評価，中で項目では項目が多すぎて時間的に不可能である．

も日常生活動作（ADL）が重要である．今回

2）旧評価法では下肢機能以外にも相当なウェイ

ESTの二重盲検試験を全国的に行うにあたり，

トが置かれていた．例えばADL25￣項目中12項

従来のADL評価法の再検討を迫られて，新し目が上肢挙上，手拭を絞るなど下肢以外の機能い評価基準を作成したことは一昨年の本姓会議をはかる項目であるが，これらは軽症患者ではで報告した1）．新評価法は細心の注意を払って短期間では変化しない．3）評価基準が暖味であ作成したので，実施してみて予想通りの利点がる．旧評価法は入念に検討して作成されたもの認められた．一方，新評価法はいくつかの問題であるが，実際に適用してみると評価基準が不を含んでいることも分かった．そこで，今回は明瞭な項目，学習効果が大きく作用する項目なこれらの点について検討した．

どが含まれており，そのため，ある項目では軽症者（総得点の多い患者）は出来ないのにかえって重症者（総得点の少ない患者）が出来ると新評価法作成の概略
二重盲検試験では，1）統計処理上多数患者のいう矛盾が生じていた．

参加が必要であること，2）短期間で評価しやす

上述のような問題点を考慮すると，新評価法

い進行の速い年齢の歩行可能な軽症患者を対象の条件として，1）簡略であること．そのためにとするなどの条件があるため，入院患者と外来は項目数を減らす必要がある．2）軽症例で短期患者の双方を対象とする必要があった．この治間に変化する項目を選ぶこと．具体的には下肢＊東京大学医学部脳研病理＊■国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊国立療養所東埼玉病院
糊＊国立療養所下志津病院†新潟大学脳研究所神経内科††国立療養所新潟病院†††国立療養所医王病院††††国立療養所南九州病院‡大正製薬㈱開発部

機能が中心となる．3）再現性，均質性を有すること．全国の筋ジス施設にまたがる治験であるから誰が何時行なっても同じ動作や機台削こは同
じ評価点を出せるような評価基準が必要となる．
そのためには時間測定などを含めた出来るだけ客観的な評価基準を作成する事が望まれる．
−52−

表l DMD患者に対するFST二重盲検試験の為の新しい理学的評価法作成とビデオ判定までの経緯

新評価法の決定，評価基準の統一とビデオ判定
以上のような諸条件を勘案して，1988年3月，実務委月会で新評価法の原案を作成した．
特に，ADLは旧評価法の25項目から一気に9●日．1．17：Opm‡lu巾に参加した国療6施設の研究会にて、実務検討委員会（杉田秀夫委Å良）の設置を決定

項目に減らした．1）立っている，2）椅子に座

2．28：第1回実務委員会

る，3）椅子から立ち上がる，4）しゃがむ，5）！．ll：第2回実環委Å会l）試験アサインとして二重首輪試験を採用

這う，6）床から立ち上がる，7）階段を昇る，

2）理学的評価項目の検打
OT．PT，医師により、AD Lテスト、筋力テスト、運

8）階段を降りる，9）歩くの9項目である． 這動機能テスト、関節可動域テストの再検討開始

う を除いて8項目が主に下肢機能に関するも5月−10月：SCilogra■（尺度解析法）によ〜日日A D Lテスト項目の見直し（東京医科歯科大学 佐久間昭教授）のであることが分かる．

！1．1．日；実梼委員会にてノン′ヾ−の拡大を決定。
2．

このようにして作成した新評価法の信頼性を：第1回拡大委員会

1．1：第2回拡大委員会
Sc▲lo‡rltによる評価項目と実地評価面からの項目の比較検

確かめる目的で，入院患者をVTRに撮り，実務

討

委月会に持ち寄って検討した．意見の分かれる→

評価基坤の改訂！．H：第3回拡大委員会
ビデオを用いて、斬評価法の信職性（再現性、均質性）の確認ような場面では評価方法の統一を図り，また一

1．15：第4回拡大委員会

部では評価基準の見直しを行なった．

新評価法に基づくプロトコール、ケースカードの正賓

これらの点を踏まえて新評価法に基づく評価

治験時にビデオ檀那をし、ビデオでの判定を行なうことを決定

基準を作成し，1988年9月10日，国立療養所22

7．22：第1回世話人会

施設のOT，PTが集まって，患者のVTRを用！．10：参加全施設のOT．PTによる打ち合せ全いて新評価法の説明会を開き，全月の評価基準！．11；参加全施設による全体会議の統一を図った（表1）．

10月から：治験順次開始

ADLポ評価法の説明、および信Ⅶ性の謙王芝

プロトコール、ケースカードの固定

ADL評価の正確を期する為に，その各項目毎●M．，．！：第2回世話人会 ＿の患者の動作を，投薬開始前と終了時にビデオ

ビデオによる統一判定のための実環委員会設置を決定
90年！月：治験膵7に撮り，治験終了後，拡大実務委月会のOT，10月5．6．7日：ビデオ統一判定委員会によるビデオ判定
10．1】；ビデオ判定小委員会によるビデオ最終判定

PT15人が3人ずつ5つのグループに分かれて3日間かけて患者仝月のビデオを見，主治医とは別に，ビデオ判定を出した．この段階ではいが容易になった．この2つの要因が相まって，

くつか問題点が残ったので，後に実務小委月会

新評価法には高い再現性，均質性が認められた．

を開き，問題症例の問題項目のビデオを再チェ

その例として，主治医判定とビデオ判定の高い一致率が挙げられる．開始時のADLに関しックした（表1）．

て主治医（実際には各施設のOT，PT）の評価

新評価法を実施してとビデオ判定委員会との一致率を見てみると，

1）利点：新評価法の利点として，次の様なこ

一致率が一番低い「しゃがむ」でも81％と高率とが分かった．1）項目が少ないので1回の評価であり，平均で91％と非常に高い値を示していの時間が少なくてすむ．旧評価法では1人1回る（表2）．これは，終了時についても同様であ当り約2時間かかっていたのが，新評価法ではった．
2）問題点：この新評価法を実際に通用してい約40分で済んだ．旧評価法で2時間続けて評価すると患者も検者も疲れてしまうので，2日にく場面や，ビデオ判定の際に，新評価法自体に分けて実施していたのが実状であった．2）各項

関していくつか問題点があることが分かった．

目毎に考え得る限りの患者の動作を想定して評（1）基準以外の動作をする場合が時々見られ価基準を作ったので，曖昧な部分が少なく判定た．例えば「階段を上る」際に，片手を手摺に−53−

表2 主治医とビデオ判定の一致率（開始時）＊立っている94％＊椅子に座る

87

考

DMDの理学的評価基準としては，日本では
厚生省筋ジス研究班のもの2），海外ではBrooke
らのプロトコールが知られており3），我々の旧＊椅子から評価法はこれらを基準にして作成されたもので立ち上がるある．今回，ESTの二重盲検試験を実施するに

90

＊しゃがむ
＊這う

案

当り，それにふさわしい理学的評価基準の作成

81
：100

を試み，実際にそれに則って治験を行なった．

〝

中でもADLを最も重視し，その評価に統一性＊床から立ち上がる：

89〝

をもたせるために，最善を尽くした．その結果＊階段を昇る

92

は，新評価法の高い再現性と均質性に現われて＊階段を降りる

94〝

＊歩く

91

平均

いる．

新評価法を実施してみての問題点の多くは実施上の手技の問題であって，我々の作成した評91

価法自体の問題は多くはなかった．しかし，いくつか問題点を有していることも確かである．
今後解決して行くべき問題と思われる．

かけ，片手は階段の床に付けて上ったり，「歩く」

運動器官に障害を持つ患者が，その障害を克の際，小走りをしたり，「しゃがむ」際，関節拘月艮するために工夫する動作は健康な人間の想像

露のため，しゃがんだ姿勢が取れなかった患者を越えたものがある．そのような患者の動作をがいた．また，「椅子からの立ち上がり」の際，一定の枠で評価しようとする事に限界を感じつ

体幹を捻ることによって腰を浮かせる患者がいつも，「新評価法は今回の治験の大きな成果であたが，この動作には評価点が設定されていなかる」と参加者全月の自負するところである．

った．

今回の二重盲検試験で，全国の筋ジス療養所（2）評価基準に曖昧さを残していた．一つにがこの新評価法を使用した．これを契機に，現は評価の指標に主観的な判断が入る項目があっ

在これらの施設のOT，PTが，この評価法を普た．例えば，「椅子にすわる」や「しゃがむ」の及させ，さらにはより良いものにしようとする

際に， ゆっくりと の表現を優っているが，実動きが自然に生じてきている．この機運も，今際場面では判定が困難な例があった．また，動回の評価法の利点が認められ，大きな関心をも

揺性歩行の基準が曖昧で，ビデオ判定でも一部たれたことの現れと思われる．新しい評価法をの患者では議論になった．二つめとして，基準土台にしてより完全なものが出来ることを願うの設定が不十分な項目があった．例えば，「床か次第である．

らの立ち上がり」で，つかまるものを規定していなかったために，同じ能力でも，つかまるものによって評価点が違ってしまった．

文献（3）知的に低い息児では協力が得にくい動作

1）中野今治，杉田秀夫，石原博幸ほか：筋ジストロフィー症患者の理学的評価法の再検があった．そのような動作として，ゆっくり座

討．厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素

る，30秒じっと立っている，しゃがむ姿勢をと阻害物質による粍病治療薬の開発研究（江るなどが挙げられる．

椅証）昭和63年度研究報告書，pp79−83，
1989．

−54−

2）野島元雄，松家豊，松田芳郎ほか：関節機3）Brooke，M．H．，Griggs，R．C．，Mendell，J．

能障害，脊柱運動障害，恥骨機能障害，拘R．，et al．：Clinical trialin Duchenne

縞について．

dystrophy．I．Thedesignoftheprotocol．

筋ジストロフィー症の臨床（祖父江逸郎，西谷裕編）医歯薬出版，東京，pp88−106，1985．

−55−

Muscle Nerve，4：186−197，1981．

サンドイッチ法による骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とキット化の試み
矢 崎 義 雄＊研究協力者

永 井 良 三＊緒

加 藤 裕 久＊言

杉 田 秀 夫＊＊方筋ジストロフィー症をはじめとする骨格筋障

法（1）骨格筋ミオシンとモノクローナル抗体の作害の診断に，現在，クレアチンキナーゼ（CK）

製等の酵素活性を血中で測定する方法が一般的に

ヒト大腿筋よりミオシン軽鎖をGubba−

行なわれている．しかしながらこれらの酵素のStraub法によって抽出，25JLgを完全7ロイン

多くは細胞質内に存在するため，血中の活性値

トアジュパントと共にBalb／Cマウスに2週間が筋細胞の壊死過程や重症度を反映するとは限おきに3回腹腔内に投与し，最後に10JJgを静らない可能性がある．さらに骨格筋障害の治療注した，静注3日後にマウスのSpleenCellsを法を開発する場合は，治療効果をいかにして評摘出，ポリエチレングリコール存在下で，マウ価するかという問題を避けて通ることはできな

スミエローマ細胞（P3Ul）と10：1の割合で細胞融合を行なった．抗体のスクリーニングは

我々は心筋梗塞や心筋炎において，CKや

ヒト骨格筋ミオシン軽鎖を用いたELISA法に

GOTだけでなく，心筋ミオシン軽鎖のようなよって行なった．

構造蛋白を血中で測定することにより，従来の（2）モノクローナル抗体の特異性の検討

方法では得られなかった新しい診断法あるいは

96ウエルマイクロプレートにヒト骨格筋ミ

重症度評価が可能となることを示してきた．す

オシン軽鎖またはヒト心筋軽鎖を吸着し，抗ヒでに心筋ミオシン軽鎖はモノクローナル抗体をト骨格筋ミオシン軽鎖抗体（3G3，4Hl，6用いた簡便な測定法がキット化されており，広E4，10H7）を1ノJg／mlから連続的に5倍希釈

く臨床応用されている．心筋ミオシン軽鎖は骨し反応させた．さらにビオテン化マウスIgG，ア格筋のなかの赤筋と同一のミオシンを発現する

ピジン西洋ワサビパーオキシターゼを反応させ，ため，本キットによって骨格筋障害を診断する

基質（ABTS）を加え発色させた．

ことも可能である．しかしながら心筋ミオシン（3）サンドイッチアッセイの検討

軽鎖測定用に用いられている抗体は自筋に存在4種類の抗体を固相化抗体，または標識抗体するミオシン軽鎖とはクロスしない．すなわちとして16通りの組み合わせでサンドイッチア

骨格筋障害をより正しく診断するためには，新ッセイを検討した．96ウエルマイクロプレート

たに赤筋と白筋のミオシン軽鎖を等しく認識すに4桂類の抗体を吸着し，ヒト骨格筋ミオシンる抗体と，アッセイ系の開発が必要である．そ軽鎖を反応させた．さらに過ヨウ素酸法により

こで我々はヒト大腿筋を試料として，骨格筋ミ西洋ワサビパーオキシターゼ（HRPO）で標識

オシン軽鎖の簡便な測定方法の開発を試みた．

した4種顆の抗体を反応させ，基質（ABTS）＊東京大学医学部第三内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

を加えて発色させた．

−56−

結

OD450

果

1回の細胞融合でヒト骨格筋ミオシン軽鎖に反応する抗体4種類（3G3，4Hl，6E4，10H7）を確立した．いずれの抗体も心室筋ミオシ

0．5

0．4

0．3

ン軽鎖に比べ，骨格筋とより強く反応した（20−100倍）（図1）．またイムノブロットによる検討を行なったところ，いずれの抗体も骨格筋ミ
オシン軽鎖1と軽鎖2に同等に反応した，これ

0．2

0．1

0

0

らの抗体を用いたサンドイッチ法による測定系
では，骨格筋ミオシン軽鎖の測定感度の下限は

図2

現在50−100ng／mlである（図2）．
抗体

100

1000

骨格筋ミオシン軽鎖 （ng／ml）

モノクローナル抗体4Hlと10H7を用いた骨格筋ミオシン軽鎖のサンドウィッチ法
による測定

4日l

考

察

ヒト骨格筋ミオシン軽鎖をマウスに免疫することにより，軽鎖1と軽鎖2の双方を認識する
モノクローナル抗体が得られた．今回確立した
4種類のモノクローナル抗体は，骨格筋により特異性が高く，赤筋だけでなく自筋も認識して
0

0．2

0・04

0，008

0．00160．00032抗体濃度 （Pg／mt）

図1

モノクローナル抗体4Hlの骨格筋および心筋ミオシン軽鎖との結合反応曲線いると考えられる．しかしながら測定範囲が50mg／ml以上であるため，現時点ではやや感度が不十分であると思われる．測定系を改良すると共に，できるだけ多くの抗体を開発して検討を重ねる必要がある．

ー57−

ESTのDuchemne型筋ジストロフィーに対する臨床効果に問する研究−Scalographic analysisによる薬効判定法−

今秀

＊
＊

⁝ ⁝ ⁝ 王

義正寛

元

崎武木

山宮青

書

酎訂紆

¶

¶

幸

l

野永田

中福藤

＊

■

昭也夫子
⁚
■

英
一秀由

博

原

石

久

間家田

佐本杉篠

研究協力者

‡

は じめに

分類が12段階評価と実用には面倒なことから

ESTの第2相臨床試験は1984年に開始され全く実用に使われなかった．

た．Duchenne型筋ジストロフィー（以下DMD）

今回は二重盲検試験をDMD多数例で行ったは常に進行性の経過を取る上，ESTはDMDのので，その薬効判定法の一つとしてGuttmann

本態を直接に攻撃する薬剤ではないので，筋力のScalographic analysisによる客観的な尺度低下の進行を逆転する効果は期待できないこと（障害皮分類）を作成し役立てようとした．．

は当初より予想されてきた．臨床家にとっては，
このような進行性に悪化して行く疾患での薬効対象と方法判定はどうするのかは困難な問題であった．

今回のdouble blind testには約170名の患

さて薬効判定を企図する以上は自然歴を知る者が参加した．今回は歩行可能児で試験を行う

ことが第一である．これまでに当班では種々のため従来のままのADLスコアでは妥当ではな

試みがなされてきたが詳細は昭和62年度の報

いと考え，実務委月会でPTやOTの意見を聞告書を参照して欲しい1）．客観的な判定方法ときながら新しい下肢機能中心のADLを作成しして第2相試験に参加したDMD患者のADLた（表1）．この評価法は9項目よりなり，各項を，神経筋疾患では一度も試みられなかった

目は1点から4点に分けられている．このサブ

GuttmannのScalographicanalysis（尺度分析法）で分析し，昭和62年度の珪会議で発表し項目は合計38個ありこれを独立の項目と考え尺度分析を行った．

た．その際に我々が選んだ12段階新障害度分類

今回の判定は前後に撮影したVTRを全国よ

はRepやPPR◆の値が優れており信頼性のあり集まったPTとOTよりなるVTR判定委月
全で判定した評点を使用した．

る障害度分類として発表した．しかし従来の8度分類と称されている四肢機能障害度分類があまりに広く行きわたっていたこと，またこの新＊国立療養所東埼玉病院＊＊東京医科歯科大学難治疾患研究所＊＊＊東京大学医学部脳研病理
繰＊国立療墓所新潟病院†国立療養所医王病院††国立療養所南九州病院†††新潟大学脳研究所神経内科††††国立精神・神経センター神経研究所‡大正製薬㈱開発部

結果

図1は全項目におけるscalogramである．
PPR轟も0．7097とよい結果とは言えない．そこ
で誤反応が最小になるように11のアイテムを選んでscalogramを作ると図2に示すように
PPR■は0．9428とよい結果が得られた．
表2は上で選んだアイテムからなる歩行可能
DMD患者の障害度新分類である．やはり12段−58−表1 日常生活動作テスト項目
1 （か 立 ってい る：4． 左 右 の 踵 を 互 い に つ けて 3 0秒 以 上 立 って い ら れ る 。

2：3． ス タ ンス を 広 げ れ ば 30秒 以 上 立 って い られ る 。

3：2． ス タ ンス を 広 げ れ ば 30秒 未 満 な ら立 って い ら れ る 。

4：1． 物 に つ か まれ ば 立 っ て い ら れ る 。

5（∋ 椅子 に坐 る：1．支 え きれ す ドス ン と 坐 る 。 （膝 関節 屈 曲 約 450 位 で 一 時 停 止 が で き な い ）78：3． 手 を 使 わ ず に ゆ っ く り坐 る 。 （膝 関節 屈 曲 約 450 位 で 一 時 停 止 が で き る ）：2． 手 に 膝 を つ い て ゆ っ く り坐 る 。 （膝 関 節 屈 曲 約 4 50 位 で 一 時停 止 が で き る）6（
参 椅 子 か ら立 ち上 が る：4 ．普 通 にで き る 。

9：3 ．度 に 手 をつ い て 立 ち 上 が る 。

1 0：2 ．坐 面 を使 っ て 立 ち 上 が る 。
：1． 立 ち上 が ろ う と して 腰 を 浮 か せ るが 立 ち 上 か れ な い 。

1 1
1 2

④

し ゃが む：4 ． 最 後 ま で ゆ っ く り と し ゃが め る

1 3：3 ． 手 で 膝 を支 え れ ば 、最 後 ま で ゆ っ く りと し ゃが め る 。

1 4：2 ． 崩 れ る よ う に し ゃが む が 、そ の姿 勢 （ス ク ワ ッ ト位 ．床 に 手 を つ い て も可 ）が 保 て る 。
：1． 崩 れ る よ う に し ゃが む が 、そ の ま ま坐 って し ま う 。

1 5：4． 3 m 這 行

5秒 未 満 。

1 7：3． 3 m 這 行

5秒 以 上1 8：2． 3 m 這 行 3 0秒 以 上 60 秒 未 満 。

1 9：1． 3 m 這 行 6 0秒 以 上 。又 は 四 つ 這 い位 の 自 力 保 持 可 能 。

1 6

2 0

（
診 這 う

⑥

2 1

床 （
正 坐 位 ）か ら

：4． 手 を使 わ ず に 立 ち 上 が れ る

立 ち上 が る：3． 床 に手 を 使 わ ず に 立 ち上 が れ る 。

2 2：2． 床 に手 を つ き 、手 で倭 を押 して 立 ち 上 が る 。
：1． 物 に つ か ま れ ば 立 ち上 が れ る 。

2 3
2 4

30 秒 未 満 。

⑦

階段 を昇る：6． 普 通 に 昇 れ る 。 （1 足 1 段 ）2 5：5． 普 通 に 昇 れ る 。 く2 足 1 段 ）2 6：4． 手 で 膝 を 押 え て 昇 る 。

2 7：3． 片 手 を 手 摺 にか け れ ば昇 れ る 。

2 8：2． 両 手 を 手 摺 にか け れ ば昇 れ る 。 （前 向 き）
：1． 両 手 で 手 摺 にす が っ て昇 る 。 （横 向 き）

2 9
3 0

⑧

階 段 を 降 りる

：5． 普 通 に 降 り られ る 。 （1 足 1 段 ）3 1：4． 普 通 に 降 り られ る 。 （2 足 1 段 ）3 2：3． 片 手 を 手 摺 にか け れ ば降 りら れ る 。

3 3：2． 両 手 を 手 摺 にか け れ ば降 りら れ る 。 （前 向 き ）：1． 両 手 で 手 摺 にす が っ て降 りる 。 （横 向 き）

3 4
3 5

⑨ 歩 く

：4． 普 通 に歩 け る 。

3 6：3． 動 揺 性 歩 行 をす る 。

3 7：2． 物 に つ か ま れ ぱ く手 摺 ， 璧 づ た い ） 独 りで 歩 け る 。

3 8：1． 何 等 か の 補 助 （平 行 棒 ・車 椅 子 押 し￣，介 助 な ど） か あ れ ば 歩 け る 。
た だ し 、B r 8C H ま用 い な い 。

−59−

188

SCORE

8

CRSES

−18−12
lq

−14

2

−16

−18

5

16

5

−2日−22
6

13

−24
7

−26
13

−28

12

−38−32

15

15

−34

−36

14

14

−38
ユ3

PPR＊0．7097

図1ADL（38項目：VTR判定）のscalogram（開始時＋終了時データ）

・
・
イ
J
l・；

ノ
ノ
′
′ ／

／
／
ノ／

／
J
十
J ・
J
／
J
／
J
J
J
／
J
…
′
′／

召
′
リ
章・
／
・
／ ／
／
／
／
／
二
／・

．
／

l
l
l
l

／

／

」
J
I
J
J
J
J

ノ

J
l
l
l

／：
′：
′
Lシ ′

／

J
l
：
J

1

CRSES

2
17

3
14

q
16

5
18

28

‥」
J
J
l
J
J
l
J
J
／
l
J
I
l
l
J
′
ト・
l
リ
L匂 ．

J
J

守
一／
十

／
J
ノ
／
十

1

／ノ ／

l
SCORE B

⊂
n

／三
＼

／
／

6

7

18

16

8
21

9

18

11

13

17

16

PPR＊0．9428

図2

ADL（11項目：VTR判定）のscalogram（開始時＋終了時データ）−60−

表2 日常生活動作テスト項目 新基準
1

（
診

歩く

：2． 物 につ か まれ ば （手 摺 ・壁 づた い） 独 りで歩 ける

2②

椅 子 に坐 る：1． 支 え きれ す に ドス ンと坐 る

3③

椅 子か ら立 ち上 が る：2． 坐 面 を使 って立 ち上が る

4⑧

階 段 を降 りる：3． 片 手 を手 摺 に か けれ ば降 り られ る

5（∋

階段 を昇 る：3 ． 片手 を手 摺 にか けれ ば昇 れ る

6（
診

階段 を 降 り る：4． 普通 に降 りられ る （2 足 1 段 ）7（∋

階段 を 昇 る：5． 普通 に昇 れ る （2 足 1 段 ）8（》

階段 を 昇 る：6． 普 通 に昇 れ る （1 足 1 段 ）9③

椅子 か ら立 ち上 が る：4． 普 通 に で きる

1 0⑥

床 （正 坐位 ）か ら立 ち上 が る：3． 床 に 手 をつ か す に 、手 で倭 お押 して 立 ち上 が る

1 1⑥

床 く正 坐 位 ） か ら立 ち上 が る：4．手 を使 わ ず に立 ち上が れ る階と煩雑ではあるが，客観的な障害度分類としこともあり，これまで行われてきた薬効判定法て信頼性が高い．

には決定的なものはない．1980年にDubowitz
らは，効果判定に必要な条件として，1．診断基考準の作成．2．適当な対照群の設定，3．二重盲察

表3はこの機能障害度分類を使って今回の対検試験．4．簡単な臨床検査に加え詳細な検査に象患者の分類を行ったものである．EはESTよる評価．5．2年またはそれ以上の期間，の5投与群でPはplacebo群を示す．開始前も終了

つの点をあげた2）．今回の二重盲検試験はこの時も全く両群には有意差がない．しかし，下段

うち最後の2年間という条件は欠いているがあのように変化点数をとるとEST群の方が悪化との条件は満たしている．
一万1983年にBrookeらは治療効果判定に率が高いようである．この点についてはまだ結必要な条件として，1．診断の確実性を増すため論をくだすことは避けたい．
このように今回のVTRによるコントロールの診断基準の作成，2．二重盲検試験，3．power

された客観的判定法を使うことにより，障害度

算出，4．データのばらつきをモニターできるこ分類が確立されたこと，1年間の障害度の低下と，の4点をあげた3）．そしてBrookeを含むア度が計算できたことにより，同じ程度の患者群

メリカの研究者グループは徒手筋力測定法

であれば1年間の実薬testだけで薬効評価が（MMT）を判定基準として採用した．我々は可能となった．このことはESTが有効でない

MMTはあまりにグローブな判定基準であるという結論が出されたとしても今後のtrialにことを理由に採用しなかった．

対しては重大な貢献をすることとなる．DMD

1989年にアメリカでは筋ジストロフィー協には従来決定的な治療手段が兄いだせなかった会の後援でEvaluating Muscle Strength and

−61−

表3

ADL−VTR判定scalogramによる検討

選択したADL項目 易・歩く
：物につかまれぱく手摺・畳づたい）独りで歩ける。
椅子に座る：支えきれずにドスンと座る椅子から立ち 上がる；底面を使って立ち上がる
階段を降りる
1片手を手軌こかければ降りられる
階段を昇る；片手を手手酌こかければ昇れる
階段を降りる；普通に降りられるく2足1段）
階段を昇る：普選に昇れる（2足1段）
階段を昇る；普卦こ昇れる（1足1段〉
椅子から立ち上がる；普通にできる
床く正座位）から立ち上がる；床に手をつかずに、手で膝お押して立ち上がる
難・床（正座位）から立ち上がる：手を使わずに立ち上がれる
械植民を可佗な項目の数とした場合
A
0
澤

篭

■1

D

L

機

能

度

の

分

布

m ea 几

2

3

4

5

6

7 ．

8

9

1 0

1 1

± S ．D ．

E
爪等5 7

2 ＿
3．5

0

1
1 ．8

6
1 0 ．5

58 ．8

11
1 9 ．3

4
7 ．0

4
7 ．0

6
1 0．8

5
8 ．8

9
1 5 ．84
7 ．0

7 6± 2 ：9

P
折 る5

0

2
3 ．6

4
7 ．3

6
1 0 ．9

2
8 ．6

7
1 2．7

8
5 ．5

7
1 2，7

さ
14 ．5

3
5．5

7
1 2．7

6
1 0 ．97 6± 3 ：0E
れ＝4 4

5
1 1 ．1

36 ．8

5
1 1 ．45
1 1 ．1

4
9 ．1

3
6．8

5
1 1．4

3
6．8

5
11 ．4

1
2 ．3

1
2 ．3

4
9．1

5 8
± 3 ：4

P

＄
1【
I．2

3￣
7
6 こ1
1 1．8

2
4 ．1

2
4 ．1

3
6．1

8
1 6．3

4
8 ．2

4
8 ．2

5
1 0 ．2

1
2 ．0

5
10 ．2

6 4
士 3：5

4

士 S ．D ．

n ＝1 9

A D
− 6

t

5

L 機 能度 の変 化

（終 了 時 一 開 始 時 ）

nean

− 4

− 8

− 2

− 1

0

1

2

さ

E
れ＝4 3

1
2．3

l
5
2 ．＄ 1 1 ．6

11
25 ．6

9
2 0 ．97
1 6 ．3

6
14 ．0

2
4 ．7

1
2 ．3

0

0

−2 0
± 1 ：7P
n ＝4 6

○

1
2 ．2

8
1 7 ．49
1 9 ．6丁
1 5 ．211
2 3 ．95
1 0 ．9

0

0

1
2 ．2

−1 3
土 1 ：さ4
8 ．7

FunctionというWorkshopが開催されMMTした．

の客観性に疑問が投げかけられ，少数の筋群をアメリカのグループでは，先ほど述べた

測定するなら筋力計による測定すなわち

powerの概念の重要性を相変わらず重視してquantiativemuscletesting（QMT）の必要性いる．我々はまだ今回の結果をpower tableでが重要視された4）．1989年のBrookeらのNeu＿

計算できなかったが，今後のtrialにはぜひ必要

rologyに掲載された論文では従来から発表しな概念であろう．

てきたMMTスコアについては触れておらず，

さて客観的な薬効判定法については，最近発われわれと同様に障害皮分類を下肢と上肢用に達がめざましい画像診断が採用できるのではな

別々に作成し，通過期間を測定した5）．この点でいかと考え一昨年よりこの班で発表してきた．

は我々が最初に考えたのと同様で感慨深いものがある．

当院の里芋が発表した通りかなりの定量性が認

英国では従来より筋力計を使用してきたが，められるので今後のtrialには採用すべき判定法として推賞したいと思う．

器械が高価であること，たくさんの筋力測定はGuttmannのScalographic analysisについ出来ない，体位のちょっとした変換でtrickyなては神経筋疾患の進行の評価や薬効判定に通用筋力を測定してしまう可能性などが考えられ，されたのは本試験が最初であり，従来ADLな

日本では器械による筋力測定は早い段階で断念

どの評点をどう評価するかは困難で，通常は捻−62−

点で評価してしまうが，実際には各評点間での文

献

進行度は違うわけで単純に合計点で比較するの

1）石原博幸，佐久間昭ほか：ADLscoreの検は論理的ではない．この点でこの評価法では数討による筋ジストロフィー障害度の再評価．

学的に各アイテムがかなり等間隔に設定できる

厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害ため，従来の8度分類に比べより論理的な評価

物質による難病治療薬の開発研究（江橋班）法であると考えられる．今後のtrialにはぜひ採

昭和62年度研究報告書，ppl11−117，1988．

用されるべき評価法といえよう．

2）DubowiZ，Ⅴ．，Heckmatt，J．，et al．：
Management of muscular dystrophy：

結論

Pharmacological and physical aspects．

1．日本には従来より，ADLのデータが国立療Br．Med．Bul1．，36：139−144，1980．

養所に蓄積されていたため，ADL評点を薬効判

3）Brooke，M，H．，Fenichel，G．M．，et al．：

定に使うことに決定した．

Clinicalinvestigationin Duchenne mus−2．Double blind testのためには新しい歩行可

Cular dystrophy：2．Dtermination ofthe

能児用の下肢機能中心のADL評価法を作成すPower

oftherapeutic

trialsbased

the

る必要があった．

natural history．Muscle Nerve，6：91−

3．ADLデータにはばらつきが大きかったが103，1983．

SCalographic analysisを導入することにより，

4）Evaluatingmusclestrengthandfunction．

DMDの障害度新分類が作成できた．

Proceeding of a workshop．Muscle

4．Scalographic analysisが神経筋疾患の臨床
薬効評価に取り入れられたのは初めての試みで

Nerve，13（suppl）：S1−S57，1990．
5）Brooke，M．H．，Fenichel，G．M．，et al．：

あり，今後他の神経筋疾患の薬効評価には有効

Duchennemusculardystrophy：Patterns

な手段となり得る．

Of clinical progression and effects ofSuppOrtivetherapy．Neurology，39：475−
481，1989．

−63−デュシェンヌ型進行性筋ジストロフィー症に対するESTの臨床効果
一二重盲検試験結果報告−
宮 武
研究協力者

山

正＊
崎

元

義＊

は じめに

方

法

デュシェンヌ型進行性筋ジストロフィー症

対象は独立歩行可能なDMD患者で，投与開（以下DMD）に対して，ESTによる臨床治験

始時5〜10歳で機能障害皮1〜IIⅠの171例であが昭和59年度よりオープン試験で開始され約

る．被検薬はEST25，50mgカプセルで，127年が経過した．平成元年度より，この結果1ト3）

mg／kg／日を1日2回朝，夕食後に内月艮した．対をふまえて，全国規模の二重盲検試験が開始さ

照薬はデン70ンを用い，投与期間は48週間としれ，平成2年度に終了したので報告する．参加

た．効果判定は，3カ月毎に，臨床評価として体施設は表1に示す通りである．

重，機能障害皮，日常生活動作テスト，筋力テ
スト，握力，運動機能テスト，関節可動域テス

表1 二重盲検比較試験参加施設
国立指神・神控センター
東京大学
新潟大学
国立療養所道北病院
国立痩毛所札幌南病院
国立痩支所八雲病院
国立療養所岩木病院
国立療養所西多賀病院
国立療養所東埼玉病院
日立療養所下志達病院
国立療養所箱根病院
国立疫葺所新潟病院
国立痩菜所医王病院
国立疾董所中証病院
国立療養所長良病院
国立療養所鈴鹿病院
国立疫糞所宇多野病院
国立療養所刀槙山病院
国立療養所兵庫中央病院
国立壌某所西奈良病院
国立療養所松江病院
国立療養所原病院
国立療養所徳島病院
国立療養所東高知病院
国立療養所筑後病院
国立療養所川棚病院
国立療養所西別府病院
区立療養所再春荘病院
国立療養所富岨東病院
国立療養所南九州病院
日立疫贅所沖縄病院トを行い，同時に血液，生化学，尿検査を行っ

杉田秀夫
中野今治
宮武正．湯浅龍彦
橋本和幸
島功二
南良二．石川幸辰
大竹進．石川玲
大村請．五十嵐投光石原愕幸．浅野芸．熊井初穂
松村喜一郎，土佐千秋．藤村則子．石澤真弓
村上辰郎
山崎元義．近藤隆春
本家一也．嶋田朝保
加知輝彦．市村京子
西村正明
飯田光男．高井揮雄．本田仁．米山栄．浅野康彦
宮城秀一，空前裕二
西谷裕．板垣泰子
美進．植田能茂
高橋桂一
宕垣克巳．舟川格．安東範明
笠木重人
亀尾等．唐川式典
松家主．斉藤孝子
谷淳吉
岩下宏
渋谷統寿，金澤−．中川真吾
三吉野産治
寺本亡郎．内野誠
井上注治郎．仲地肌 井上忍
福永秀敏．幸福圭子
中川正法，竹永智（神経内科）

た．試験終了時に，臨床効果，概括安全度，有用皮の総合評価を行った．
結果

解析対象例は，除外例をのぞいた134例である（図1）．日常生活動作，筋力の推移に両群間■1￣ミニ・】

眺姑時年おユ反8例
眠時咽書度；l反 4例
供用租反1例
協力度；非協力的
3例
服菓不遇守
3例
棚間中の手術・骨折3例
軌岨不足3割

帥姶時年劇1反8例
開始時11帳簿害度1辰 4例
供用菓ユ1反1例
協力度；非協力的
3例
岨藁不遵守
3例
賦臓期間中の手術・骨折3例
瑚閑不足
3例

瑚阻

3例

捜査日のズレ

楓i日のズレ

4例

脇
臨床効果
解析対モ例

〔正司
EST群：81例
プラセポ群：73例＊新潟大学脳研究所神経内科

3例
4例
■紘安全度
解折封書削

有用度
解析対1例

口三重〔正司
EST群：83例 【ST群：61例
プラセポ群：83例 プラセポ群：73割

図1 解析対象例の内訳−64−

表3 副作用で差を認めなかった（図2）．臨床効果，有用度（）：％については，EST群で若干良好な結果であった
薬が統計的な有意差は認めなかった（表2）．副作

剤

E S T

プラセポ

8 3

8 3

用は，EST群に嘔気，嘔吐を投与初期に21．7％

解 析 対 象 例 数認めた．そのため3例は服用を中止した（表副 作 用 莞 現 例 数

1 8 （
2 1．7）

副作用による中止例数

3 （3．6）3）．血液，生化学的には異常所見を認めなかっ3 （3．6）
0

た．
副

SCOre

40

作

30

ヒ

致

嘔気 ・嘔吐腹痛
軟便 ・下痢
食欲不振

症
状
内

35

用

訳

2 0 （
24．り

6 （7．2）1 8 （
2 1．7）
0
1 日 ．2）
1 日 ．2）

1
2
2
1

日 ．2）
（2．41
（2．4）
（1．2）

25
20

考

15

察

10

DMDにおいては自然発達によりみかけ上，

5

機能が改善したようにみえる例が知られており，

0

0

12

24

36

48week

SCOre

本試験では5歳未満を除外した．しかしながら
今回解析した全症例の開始時の日常生活動作能をみると，6歳に至るまで自然発達の影響がみ120

られ，正確な比較検討には6歳未満を除外する
110必要があると思われる（図3）．
我々は，下肢機能の保たれた時期にESTを100投与されたDMD例の中に良好な経過をとる例
90があることを報告2）・3）してきたが，全体の経過の中ではDMDのnatural courseに含まれる80ことも指摘してきた．症例間の重症度にかなり

70

0

12

24

36

48week

表2

総合評価

（ADL）

巳床効果
重
刑
E

lI：％

改

■

2
l l． 1】

不＿変

2 2
t3 l． 1〉

軽

度

中 等J

￥

老

化

老

圭

2 3
（日 ．り

化

明
化

1 4
tH ．1 】

0

Ⅰ十

6 t

ヰ

判 定

2
【！． 7）

1 9
日 l． り3 6（l l ．刈1 4
い ．7 〉

2（1 ．1I

7 3

40

定y L ー t一一t

不 忙
不 変以 上
2 2

1 0

35

程 度 悪 化 長1 上

2 4
P I． りl t l ∴‖ lPのVariation4）がある本症において，正しく薬効を評価するには，ほぼ同じ機能を有する2群間

図2 日菅生活動作テスト，筋力テスト総点数の推移

4 7
け I ．1 〉
l I l ．‖

P t ．0 1

2 1【ヱL l I

5 7

30

tT l ．り

25
t
■
∈

安

全

7 1
（l L 5）

は

rJ

安

全

l l
t1 L I I

安 全 性
に 問 題
か あ る

安 全 で
な

1
日 ．！）

い
0

楕
lI
｝ i lM l M
8 ：】定
Y ■一 t l t t

安

全

20

rr 安 全 以 上

T l【H ．5 】

（

2
bI

8 1
lH ．1 〉

3（ l叫

l・l ．1 5 IP

8 1l日 ．lI

■

極 め て

椚

有

用

E

0

P

1
（1．1 1

2
け．1 】

有

用

0

0

8 3

や

や

有 用 性

好 ま し

有

用

な

くな い

し

1 5

2 3

2 3

【2 1．り（日 ． 7〉即 ．丁）t t
l l l，り3 2【1 3． 1I

2 0
0 IJ I

計

■
判定
不 能

0

0 1

2 2

0

7 3

1 0

15

■i l く○… ■

1q Y

壬

5Y

6Y

7Y

8Y

9Y lOY llY

x ■− tl l t
有 用 Gl上t 5（2 1．りl ・l．5 日や や 有 用 以上

図3 開始時総点数による日常動作テストの自然経過

3 8
作 ！． 】）
l ・l ．！l

1 2
日 l．巾

l ・l．＝
4 4
川 l． 3〉−65−

で，障害皮別に比較検討することが重要と思わ文

献れる5）．そこで開始時年齢6歳未満の症例をの

1）宮武正，桑原武夫，湯浅龍彦ほか：Duchen−

ぞいた118例で，機能障害度別に両群間の臨床

ne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過：EST投与群での検討．厚生省「新薬開効果を比較検討した（表4）．各機能障害度でみると，EST投与群で若干良好な結果が認められた．その結果，開始時重症度等の影響を補正す

発研究費」低分子酵素阻害物質による雉病治療薬の開発研究（江橋班）昭和62年度研る層別Wilcoxon法で解析すると，EST群で臨究報告書，1988，pplO7−109．

床効果の有意な改善を認めた．この結果が具体的に日常生活動作能や筋力などのどのような機

2）宮武正，山崎元義，近藤隆春ほか：Duchen−ne型進行性筋ジストロフィー症の臨床的能の改善を反映しているのかについては，解析

検討：EST投与群5年目の経過とEST
二重盲検試験の出発．厚生省「新薬開発研中である．

究費」低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究（江橋班）昭和63年度研究報

表4 背景因子別臨床効果（開始時年齢6歳未満の症例を除く）

告書，1989，pp85−87．
3）宮武正，山崎元義，近藤隆春ほか：EST投与Duchenne型筋ジストロフィー症患者の開始時機能外書廣一1度
蓬
刑

改

暮

不

変

控

度
．

中 等 腐

t

明

悪

化

悪

良

化

化

検
l十

E

t
t5 ，l I

1 0（
5 l ．り○（1 5 ．1 ）

0

0

2 0

P

0

1 0
即 ．‖

2 1
川I ．7 ）

003

■l l i ●■l ■不 要 以 上

刑

改

E

暮

1
（
1 7】

不

変

l重

度

中 等 度

書

明

叢

化

老

悪

化

6
（
7 2 ．日9tl 1 ．1 ）

化

l l
（
川 ．丁）

0

1

0

4
（
1 5 ．1 】

7（
2 t ．1 ）1 3（
5 1 ．1 ）

2
（丁
．り

1

日 朝

治療薬の開発研究（江橋班）平成元年度研

定：

2 7

丁
（
2 i．1 ）

2 0

責l

改

E

t

不

0

翼

1 6
15！
．I ）
l 司．5一l ＝0 ．川4（1 5．1 ）

1 1
tl！
．1 ）

軽

狂
．

中 幕 正

看

甲l

暴

化

喜

g

化

0

0

0

化
2
日川

0

Ⅰナ

0

3
日 叫

0

0

定
l l− ■■t ■■i l■〇日 ■不 饗 以 上2

096

P ＝1 ．t l

3

0

3
日 明

改

変

稽姓）昭和61年度研究報告書，1987，

（）：％
軽

度

中 等 度

暮

暮

化

書

層

明

機

暮

不

E

0

2
り 0 ．日2
仰 ．1 ）

1（2 l ．1 ）

0

5

P

0

0

3
t7 5 ．1 ）1（
1 5 ．1 ）0■†剤

移．厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素
阻害物質による難病治療薬の開発研究（江経 度 悪 †U ；1上

0

開始時杜絶■警度−4度薬

ne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経
過：日常生活活動能力（ADL）の経年推（】：％
検l ；l JP

究報告書，1990，pp77−80．
4）宮武正，桑原武夫，近藤隆春ほか：Duchen−

不 変以 上開始時丸佐隷書廣一3度菓

臨床経過−6年目の報告−．厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質による雉病l ；1 ．川3l l − t ■＝▼日印 1 …

I t l ．日 5
P

2 0
い 01I
l ＝I．ほ

1 0（
3 2．1）

検Ⅰナ

経 度 慧 化 以 上

t t
t 5 5．01
l暮0．日 2重定
x l − t e 〜t

化

化

宜

l十

pp93−97．

x ■− t● S t■ i ll l ■l ■不 変 以 上経 度 悪 化 以 上

2

4（
1 8 ．1 ）H l ．1 】
l 可 ．H l

ト 0 ．日05）石原博幸，宮川雅仁，儀武三郎ほか：治l ＝1 ．仙療薬の効果判定法における問題点．厚生省「新薬開発研究費」低分子酵素阻害物質による雉病治療薬の開発研究（江桧班）昭和3（
T l．1 ）

開始時暮症鷹のftを1正すろく■別■ilfl▲ln〉：E＞P（トl，13り

61年度研究報告書，1987，pp99−103．

−66−

分担研究者一覧

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班・班月名簿
氏

珪長

名

江梧

所

節郎

属

所

在

地

電

話

番

号

岡崎国立共同研究機構
生理学研究所

444 岡崎市明大寺西郷中38

幹事 青柳 高明微生物化学研究所
酵素研究部

141品川区上大崎3−14−23

03−3441−4173

幹事 木下 真男

東邦大学医学部大橋病院
第四内科

153 目黒区大橋2−17−6

03−3468−1251

幹事 勝沼 信彦

徳島大学酵素科学研究センター

770 徳島市蔵本町3−18−15

0886−31−3111

0564−53−7345

（直）

内2550

東京慈恵会医科大学
第二薬理学教室

105 港区西新橋3−25−8

運営 杉田 秀夫
幹事

国立精神・神経センター
神経研究所

187 小平市小川東町4−ト1

班月 丸山 工作千葉大学理学部生物学科

260 千葉市弥生町ト33

監事 福原 武彦

03−3433−1111

内2255
0423−41−2711

内5101
0472−51−1111

内2622

九州大学薬学部
薬品分析化学教室

812 福岡市東区馬出3−ト1

和歌山県立医科大学
第二生理学教室

640 和歌山市9番丁9

班月 福山 幸夫

東京女子医科大学
小児科教室

162 新宿区河田町8−103−3353−8111

班月 三吉野産治

国立療養所西別府病院

874 別府市大字鶴見4548

0977−24−1221

班月 村上 慶郎

国立療養所箱根病院

250 小田原市風祭412

0465−22−3196

班月 鈴木 紘一東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報研究部

113 文京区本駒込3−18−22

03−3823−2101

班員 川島 誠一

東京都老人総合研究所
生化学部臨床第一研究室

173 板橋区栄町35−2

03−3964−3241

東京理科大学
理学部化学教室

162 新宿区神楽坂1−3

大正製薬㈱ 総合研究所

330 大宮市吉野町1−403

班月 大倉 洋甫
班月 辻繁勝

班月 向山 光昭
班月 大関 正弘

092−641−1151

内6151
0734−31−2151

内319

内3068
03−3260−4271

内268
0486−63−1111

内351

班月 矢崎 義雄 東京大学医学部第三内科

113 文京区本郷7−3−1

班月 宮武

951新潟市旭町通一番町757

03−3815−5411

内8274，8278
正 新潟大学脳研究所神経内科

0252−23−6161

内5180

班月 石原 博幸

国立療養所東埼玉病院
第三内科

349−01蓮田市大字黒浜4147

0487−68−1161

班月 中野 今治

東京大学医学部脳研病理

113 文京区本郷7−3−1

03−3815−5411

内3542

班眉 春原 経彦

国立精神・神経センター
武蔵病院放射線診療部

187 小平市小川東町4−1−1：旺友 石井 靖男

日本化薬株式会社

102 千代田区富士見町1−11−2 03−3237−5154

班友 岩城 正広

鳥居薬品株式会社

272 市川市南八幡3−14−3

0473−78−4121

顧問 今堀 和友

三菱化成生命科学研究所

194 町田市南大谷110427−26−1211−69−0423−41−2711