向科学技術振興財団

研究助成成果報告書

サイズソートチップを用いた血漿交換、血球分離の効率化
Improving efficiencies of plasma exchange and blood cell separation using microfluidic
chip devices

助成年度

令和３年度研究助成

助成番号

MZR2022005

研究期間

2022/04/01

代表研究者

松浦 宏治
岡山理科大学～2023/03/31(Koji Matsuura)
生命科学部

生物科学科

共同研究者

高田 耕児

(Koji Takata)

キーワード

チップデバイス, 血球分離, 血漿交換, Deterministic lateral displacement

１．研究の背景と目的

富山県産業技術研究開発センター

生活科学研究所達成されている[2]。また、この微細構造をポリプ

血漿交換療法において、細胞や血球を患者に戻ロピレン(PP)エラストマーの射出成形で作製です際に培養液や体液から病原性因子・不要物を除きるため、低コストの量産化が可能であるととも去する必要がある。血漿交換療法で用いられる中に、生体適合性の問題もクリアしている。本研究

空糸の細孔は 200-500 nm であり、直径数百 nm のでは、目的に対応したチップ構造・材料の最適化

病原性エクソソームの除去には適しておらず、そを行い、本デバイスの血漿交換療法への適用可能れらの除去は吸着材による吸着療法にも対応し性の検討を行う。ていない。吸着材やセルソーターと比較すると、
マイクロデバイスを用いた分離方法では効率良２．研究の内容・方法

く、細胞のダメージが少ない状態で不要物の除去

直径が 6-8 µm のヒト赤血球が右側の出口に来が可能であり、我々が開発している直径数十 µmる場合と左側の出口に来る場合を切り分ける方

以下のピラーを周期的に多数配置したサイズソ法として、経験的計算上の分離閾値(Dc)が異なるートチップ（以下、「本チップ」と省略）を用いてチップを用いる。用途に応じて Dc の異なるチップ課題解決を図る。このチップでは、図 1A に示すを作製・使用した。

Deterministic lateral displacement (DLD)に基

図 1B に本チップの基本システムの図を示す。

づく原理によって、ピラー間隔や角度の違いで粒チップデバイスとシリンジ Z を繰り返し押した際子のサイズ分離を行う[1]。本チップを血液中のにシリンジ X と Y の気相に負荷される陽圧による循環腫瘍細胞、Circulating Tumor Cells (CTC)

流体駆動デバイスにより、チップ内に流れを作る。の分離に用いた結果、平均して 97%の分離効率が初めにシリンジ X と Y に PBS を入れて、プライミングを行い、シリンジ X 側に血液を入れて分離を３．研究の成果行った。本研究ではヒト血液は市販品を使用した。

(1) Dc=10, 9, 8 µm のチップの分離特性

本報告書では、以下(1)(2)(3)の結果について記

これらのチップを用いてビーズを分離した場載する。

合、分離サイズの閾値がほぼ Dc 値であった。ヒ

(1) 赤血球と白血球の分離を目的とした場合、Dc

ト血液の分離において、Dc=10 µm のチップを用い=10, 9, 8 µm のチップを用いる。本研究では、血た場合、ヒトの赤血球と白血球のうち好中球は完球分離の評価をディフ・クイック染色法で行うと全に分離されるが、Dc=8µm の場合は左側に赤血球ともに、ハイスピードカメラを用いて 200 fps でが回収される場合が見られた。本シリンジデバイの流路内観察を行った。

スを用いた流体駆動においてはレイノルズ数が(2) 血漿交換療法においては赤血球と白血球両10 以下になり、実際の Dc 値が計算値とほぼ同じ方を回収する必要があるため、Dc は赤血球の直径であった。従って、Dc=10 µm 近傍においては、細よりも小さくする必要がある。今回、Dc=2 µm の胞直径に応じた細胞分離が成功したといえる。

チップの場合の分離特性評価を行った。この実験においては、血液をシリンジ X と Y に入れた場合A両方評価した。また、当療法においては、回収した血球を再度チップに通す方法も考えられる。
(3)連続流体システムの開発結果についても簡単に説明する。

AB

B
図2(A) 今回用いたヒト血液のディフ・クイック染色像白血球は紫色に染色された。

(B) ヒト血球のサイズ分布[3]と用いたチップの Dc 値との関係

ハイスピードカメラを用いた出口近傍の Dc=8µm を有するチップの流路内観察結果を図 3 に示す。入口側における右側と左側の流路の割合は１：１であることから、赤血球は図 3 の出口番号10-20 に見られた結果は妥当であった。また、サ
図1(A)分離の原理と(B)本実験の基本システムイズの大きい白血球が左側の出口に移動することが確認された。同様の現象が Dc＝10 µm のチップでも観察されたため、この Dc 領域では血球がA直径に応じて分離されたと言える。

B

図3

Dc=8 µm のチップを用いた際の出口近傍のハイスピー

ドカメラ像 (200 fps) 黄色四角内は白血球である。赤文字は赤血球が到着した流路を示す。スケールバーは 0.1 mm で

図4(A) Dc=2 µm のチップ内のハイスピードカメラ像(1000ある。

fps)

黄色四角部分は分離血球の軌跡である。スケールバー

は 0.05 mm である。(B) Dc=2 µm のチップのマイクロスコープ(2) Dc=2 m のチップの場合の分離特性

像

左側は入口、右側は出口を示す。

市販のヒト血液をシリンジ X に入れて血球分離実験を行った際、右側の出口と左側の出口から見ら(3) 連続流体システム開発れた血球の割合を比較したところ、右:左=最大一度回収した血球をもう一度サイズソートチッ

50:50 であった。図 4A の Dc=2 µm を有するチップ

プで分離可能な連測流体システムの構成案を図５の流路内観察像からは血球はまっすぐ進んでおり、に示す。図 5A のように血液リザーバーを用いた際大きな粒子として流体内を移動していた。図 4B にには、出口側と入口側の圧力をポンプの駆動力で制示す当チップの入口と出口近傍の像からは、出口側御できるが、解放流路系であり血液が空気に接触すは左側の割合が大きいために、右側に入れた血球のるという問題がある。そこで、図 5B に示す連続流一部がまっすぐ流体内を移動したことにより左側体システムを作製し、流路内を緩衝液でプライミンの出口に到達したものと考えている。流路内の観察グした後、回収した血液分散液を再度分離できるかによる血球移動の評価を今後も継続する。

検証した。しかし、右側の入口のある緩衝液側と、一方、ヒト血液をシリンジ Y に入れてチップ内に左側の入口の手前のポンプによる圧力の調整が不血液を流した際、ほぼ全ての血球は左側の回収液内十分であり、このシステムでは血球分離能を発揮でに見られた。血漿交換療法への適用可能性についてきなかった。用いるポンプの流量バランスを検討すは、回収された血球分散液が再度繰り返し分離できる必要がある。

ることが必要と考えている。

白血球増加症の分析に本チップの活用は有益と考えている。血漿交換療法については全血球を小スケールかつ低ダメージで回収することに価値のある症例を発見し、その適用を目指す。また、実際の診断・治療に適した溶液系を用いて想定した血球・血漿分離機能発揮を確認する。

６．参考文献[1] 1. Huang, L.R.; Cox, E.C.; Austin, R.H.;
Sturm, J.C. Science 2004, 304, 987–990.
(A)血液リザーバーを用いた連続流体システムと(B)血[2] Bao, H.; Bai, T.; Takata, K.; Yokobori,

球分散液側の閉鎖回路における連続流体システムの模式図

T.; Ohnaga, T.; Hisada, T. Oncology Lett.

図5

2018, 15, 3061–3067.
４．結び
血球分離については、Dc=10 µm のチップを用いた場合には原理通り達成できた。しかし Dc=2 µm[3] Bergman, R.A.; Afifi, A.K.; Heidger, Jr,P.M. Atlas of Microscopic Anatomy

Section

4: Blood. 1995.のチップを用いた場合には、血球は原理通りの振る舞いはするものの、流路内の血球数が多いなど

６．論文・発表の理由で血球分離がうまくいかなかった場合が・原著論文見られた。また、２層流のポンプ圧・流量の調整

Blood Cell Separation Using Polypropylene-にも課題があることが分かり、サイズソートチッ

Based

プの血漿交換療法への適用については技術的なDeterministic課題が現存する。また、Dc 値が低下した場合にはMicromachines, 2023, 14, 238.

流路の抵抗が上昇するために、流量が低下する点はこの論文 Figure 6, 8 からの転載である。(CCも課題である。

BY 4.0)５．今後の研究方向性・課題・ポスター発表

数年で終了する予定の短期的課題と長期的課
題に分けて記載する。
短期的課題：Dc が小さい場合に血球分離効率がさらに上昇する方法を、チップ成型プロセスと流体操作の両面から検討する。赤血球や血小板を大きい粒子として効率的に回収するために必要な流路・流体特性の発見につながると考えている。
長期的課題：診断・治療への展開として、採血後の臨床サンプルを用いて、回収した白血球の遺伝子、蛋白質発現を評価することにより、本技術で有用な診断対象を発見する。血球分離においてはKoji Matsuura and Koji Takata,

Microfluidic

Devices

LateralBasedonDisplacement,
図 2 および 3

OUS フォーラム「サイズソート

チップによる血球分離」２０２２年１１月２８日
岡山市