抗腫瘍性ルナシンの大豆2Sアルブミンからの生成機構解明と大豆加工食品への応用
小川智久＊・平垣内一子・坪野真由美・佐藤瑠依・湯川真衣・村本光二
東北大学大学院生命科学研究科分子生命科学専攻

Molecular Mechanism of Derivation of Anti-Cancer Peptide, Lunasin, from 2SAlbumin, and Its Application to the Processed Foods of Soybean
Tomohisa OGAWA＊, Ichiko HIRAKAKIUCHI, Mayumi TSUBONO, Rui SATO,
Mai YUKAWA and Koji MURAMOTO
Department of Molecular Life Sciences, Graduate School of Life Sciences,
Tohoku University, Sendai 980-8577

ABSTRACTThe soybean peptide called lunasin, which constitutes 2S albumin together withlong (L) chain, is known to have anti-cancer and anti-inﬂammatory eﬀects. Although
lunasin has been reported to be contained in various soybean-products, it is hardly
found in raw soybean. Moreover, the derivation of lunasin from 2S albumin during
food processing has remained unclear. In this study, we investigated the formationof lunasin from 2S albumin under various processing conditions using specificantibodies against lunasin and 2S albumin. Anti-pre-2S albumin antibody was also
used to explore the formation of 2S albumin from its precursor, pre-2S albuminin maturing soybeans. Lunasin was most abundantly contained in low-fat soymilk
among various soybean-products; e.g., soymilk, boiled soybean and its soup, enzymedeactivated soyﬂour, roasted soyﬂour and soy-yogurt, though the peptide was notdetected in raw soybeans. Lunasin was produced in a time-dependent manner byheating at 90℃, meanwhile, 2S albumin was decreased by its S-S exchange reaction.
Nevertheless, lunasin could not be identified in isolated 2S albumin by the sametreatment. It was found that enzymes including protein disulfide isomerase andpurothionin (thioredoxin-like enzyme) were not participated in the cleavage. These
results suggest that other soybean components are involved in derivation of lunasinfrom soybean 2S albumin. On the other hand, pre-2S albumin was expressed inﬁlling soybean 4-6 weeks after ﬂowering and processed after 7 weeks. Soy Protein＊〒980-8577

仙台市青葉区片平2-1-1

大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）47

Research, Japan 20, 47-51, 2017.
Key words : 2S albumin, antibody, processed foods, lunasin, soybean peptide
大豆はガンの予防に役立つと考えられており，イソフラボンやサポニンなどにその効果が示されている

pre2Sアルブミン抗体の作成にはリンカー配列の合成ペプチドをKLHと架橋した抗原を用いた．

1-3）．大豆で発見されたルナシンもまた，抗腫瘍活性や抗炎症作用をもつことから近年注目を集めていウェスタンブロット法および酵素標識免疫測定

る4-8）．ルナシンは，2Sアルブミンの短鎖サブユニット（ELISA）法にあたり，ジスルフィド結合を介して長鎖（L鎖）と各サンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動結合している（Fig. 1）．これまでの研究では，リコン（PAGE）後にPVDF膜に転写し，ウェスタンブロットビナント体や化学合成ペプチド，あるいは2Sアルブミ（WB）を行った．検出には，ルミノール系化学発光試ンの還元処理により得られたルナシンが主に用いられ薬を用いた．一方，
ELISA法では抗原を固定したプレーており，大豆食品中のルナシン含有量や2Sアルブミント上に，あらかじめ抗体と反応させたサンプルを加えからの生成機構についてはまだ不明な点が多い．本研て余剰の抗体を吸着させる競合法を用いた．脱脂大豆

究では，2Sアルブミン，ルナシンおよびL鎖に特異的粉水抽出物および大豆加工食品（豆乳4種，煮豆，煮な抗体を用いて，大豆および大豆加工食品中のルナシ豆の煮汁，酵素失活処理大豆粉，きなこ，豆乳製ヨーンの定量と2Sアルブミンからのルナシンの生成条件をグルト）中のルナシン含量をELISA法で測定した．

検討した．さらに，抗プレ2Sアルブミン特異抗体を作成し，2Sアルブミンの発現とルナシンの生成機構を調

大豆抽出物の加熱および加圧加熱
脱脂大豆を水抽出後，90℃で1 〜 6時間加熱した．

べた．

また120℃で3 〜 30分間加圧加熱した．非還元系SDSPAGEに供し，抗ルナシンおよび抗2Sアルブミン抗体を用いたWBとELISA法によって遊離ルナシンを分析した．精製2Sアルブミンに対しても同様の実験を行った．
大豆登熟過程における2Sアルブミン前駆体の発現
開花後の大豆（ミヤギシロメ）を1週間おきに採取し，水抽出後，還元・非還元系SDS-PAGEに供し，抗pre2Sアルブミンおよび抗2Sアルブミン，抗ルナシン抗体を用いてWBを行った．
Fig. 1. Structure of 2S albumin. 2S albumin iscomposed of two subunits, long (L) chain andshort (S) chain corresponding to lunasin.

結果と考察
大豆および大豆加工食品中の遊離ルナシン含量方法

本研究では，遊離ルナシンとL鎖，および2Sアルブミンに対する特異抗体を作製して用いた．大豆中のル

抗2Sアルブミン抗体，抗ルナシン抗体，抗L鎖抗体および抗pre2Sアルブミン抗体の調製

ナシン含量を調べたところ，非加熱条件では遊離ルナシンは検出されず，2Sアルブミンの形で存在していた脱脂大豆粉を20%エタノールに懸濁，攪拌抽出し粗（Fig. 2）．一方，豆乳や煮豆などの大豆加工食品には抽出画分を得た．陰イオン交換クロマトグラフィー

ルナシンが存在し，特に低脂肪豆乳に多く含まれていと逆相HPLCにより，2Sアルブミンを精製した．また（Fig. 3）．ルナシンが加工過程で2Sアルブミンからた，還元後，逆相HPLCによりルナシンおよびL鎖を派生すると考えられ，2Sアルブミンから遊離ルナシン精製した．精製2Sアルブミン，ルナシンおよびL鎖をが生成する条件を調べた．

抗原としてウサギを用いて抗体を作成した．一方，抗48

大豆たん白質研究

Vol. 20（2017）

2S albumin ▶

a4000
Lunasin (μg/mL)

L-chainMiya
Ki gishnuiro
Ro saya me
bin kaEnter
prisesiniya
Ki gishnuir
Ro say omeb aka
En interprise(B)MLuna(A)4500

2S albumin ▶
L-chain ▶

350030002500b2000c1500cc

1000
500

Lunasin ▶

dddddd0
SB HSB PSM RSM LSM HSM BSB BSS DSF RSF SMY

Fig. 2. Western blot analysis of soy proteins fromvarious soybean cultivars (Miyagishirome,Kinusayaka, Robin, and Enterprise) using antilunasin (A) and anti-L chain (B) antibodies.
80℃

(A)

70℃

50℃

60℃

LunasinL-chain
2S albumin(n=6, ＜0.005)

Fig. 3. Lunasin contents in soy products. SB: soybean,
HSB: soybean heated at 80℃ for 1 h, PSM:
plain soymilk, RSM: rich soymilk, LSM: lowfat soymilk, HSM: high-fat soymilk, BSB: boiledsoybean, BSS: soup of boiled soybean, DSF:
enzyme-deactivated soyflour, RSF: roasted
soyﬂour (kinako ), SMY: soymilk yoghurt.
(A)

WB-ME
LunasinLunasin (ng/mL)

ELISA▼ 1 ▼ 2

16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
20000▼ 34▼

5 ▼ 6

▼

(h)

bcab

Lunasin

f0ef
1

2

34

56(h)

31030(min)Lunasina12000
Lunasin (ng/mL)▼ 10 ▼ 30 (min)2S albumin

de010000

脱脂大豆を50℃から80℃で加熱すると80℃以上でルナシンが検出された（Fig. 4A）．また，90℃では加熱

b6000

Fig. 5. Effect of heat treatment at 90℃ for 1-6 h(A) and at 120℃ for 3-30 min (B) on puriﬁed
2S albumin. Lunasin and 2S albumin weredetected by western blot analysis using antilunasin antibody. No release of lunasin wasobserved.
熱処理による2Sアルブミンから遊離ルナシンの生成

b

8000

時間依存的に遊離ルナシン量が増加した（Fig. 4B）．

4000

0Lun 2S Lun ▼ 3cd(C) Lunasin in soybean heated at 120℃

2000

▼ 6 (h)Lunasin(B)a(n=6, <0.005)-ME▼ 52S albumin(B) Lunasinin soybean heated at 90℃0Lun 2S Lun ▼ 1 ▼ 2 ▼ 3 ▼ 4

さらに，120℃でのオートクレーブ（加圧加熱）処理

c031030(min)Fig. 4. Formation of lunasin and L-chain in soybean
by heat treatment. Lunasin and L-chain wereanalyzed by western blotting (WB) and ELISA
using anti-lunasin and anti-L-chain antibodies.

では，短時間で遊離ルナシンが生成したが，30分処理では減少した（Fig. 4C）．また，精製2Sアルブミンを用いて同様の実験を行ったところ，ELISAとWBの両方法において遊離ルナシンは検出できなかった（Fig.
5A）．一方，120℃の加圧加熱処理ではELISAで検出されるルナシン量が有意に増加したが，WBでは検出されなかった（Fig. 5B）．90℃と120℃での処理で大豆たん白質研究

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ELISAにみられた抗ルナシン抗体への反応性の違い

2S albumin

lunasin

は，2Sアルブミンの立体構造変化によるものと推定さ

L-chainCAM-lunasin

れた．実際，WB解析で移動度の異なる成分が観察され，よりコンパクトな構造への変化や酸性領域（ポリ4アスパラギン酸配列）の構造変化が示唆された．加熱
3.5たことから，ルナシンの生成には大豆に含まれる因子が関与することが示唆された．
ルナシンと2Sアルブミンの生理機能
ルナシンと2Sアルブミンの細胞毒性とインテグリンへの結合能を調べた．ヒト乳腺癌由来細胞MCF7およびマウス線維芽NIH/3T3に対して，いずれも毒性をAmount of binding (μmol)

により精製2Sアルブミンからルナシンが遊離しなかっ

32.5
21.51

示したが，白血球系細胞（HL60, Jurkat, L1201）には毒性を示さず，細胞特異性がみられた．一方，ルナシ

0.5ンはインテグリンαvβ3とαvβ5に結合するのに対し0て，2Sアルブミンは結合しなかった（Fig. 6）．これは

αvβ3

αvβ5
Integrin

2SアルブミンのRGD配列が分子内部に埋もれていることを示す．
プレ2Sアルブミンの発現とプロセッシング
プレ2Sアルブミン特異抗体を作成し，登熟時の大豆を調査した．開花4 〜 6週後に，抗体と反応する約17Fig. 6. Integrin binding activities of lunasin, L-chain
and intact 2S albumin. The amount of boundsamples was calculated by using a calibration
curve for each sample. The data arepresented as the mean±SD of three diﬀerent
determinations.

(A)+ME
17 kDa(B)M

2345678910 11 12 13(week)
Ala21Lunasin

Asp64 Asn81

L-chain

11 kDaPre-2S albumin+ME
17 kDaM

2345678910 11 12 13Lunasin

After ﬂowering

S-S bound

11 kDaL-chain

Pre-2S albumin+ME
17 kDaM

23456789Lunasin

11 kDaS-S bound

2S albumin+ME
17 kDa4〜6 weeks

10 11 12 13M

234567L-chain

891011 12 13Lunasin

7 weeks〜

S-S bound

11 kDaL-chainlunasin

Fig. 7. Western blot analysis of the extracts of soybeans collected after ﬂowering using anti-pre-2S albumin,
anti-2S albumin, and anti-lunasin antibodies (A) and schematic representation of processing of pre-2Salbumin (B). The numbers (2-13) indicate the weeks after ﬂowering. +ME: reducing condition, -ME: nonreducing condition.
50

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kDaの前駆体の発現が見られ，開花7週後から成熟2S

ンカー部は先ずルナシン側で切断されると考えられアルブミンへと変化した（Fig. 7）．還元条件で開花4る．

〜 6週後にルナシンに相当するバンドが検出され，リ要約

ルナシンは，抗腫瘍活性や抗炎症作用を持つが，2Sアルブミンからどのように派生するのか不明な点が多く，そのメカニズムは明らかでない．本研究では，ルナシンの生成機構解明を目的とし，抗2Sアルブミン抗体および抗ルナシン特異抗体を用いて，食品加工過程におけるルナシンの生成を調べた．また，抗pre2Sアルブミン特異抗体を用いて，大豆登熟時の前駆体から2Sアルブミンへの生成過程も調べた．非加熱大豆にはルナシンは含まれていないが，90℃加熱により時間依存的にルナシンが増加した．しかし，精製2Sアルブミンの処理ではルナシン生成はみられず，大豆の何らかの成分が関与していることが判明した．ルナシンと2Sアルブミンは，同様の細胞特異的毒性を示したが，インテグリンに対する結合能はルナシンにのみみられ，その理由としてRGD配列部分の立体構造の違いが考えられる．

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