厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び閑適疾患の臨床病態と治療法に問する研究高木班

平成8〜10年度研究報告書

平成11年3月（1999年）

総

括

研

主任研究者

高

究

報

告

木

昭

夫

本研究班では，筋ジストロフィーとしてはDuchenne／Becker型（DMD／BMD），
福山型（FCMD），肢帯型（LGMD），顔面肩甲上腕型（FSHMD）など，関連疾患としては筋緊張性ジストロフィー（MD），遠位型ミオパチ一，ミトコンドリア脳筋症などと幅広い疾病を対象としてきた．これらの疾病のうち，青年期以前に歩行能力を失う重症の病型はFCMD，DMD／BMD，LGMDなどである・また患者数が多く，医療サイドからのニードでは，MDが問題となる．これらの疾病に重点をおいた．この間の研究において，2−3の重要な病気の原因遺伝子が同定され，大きな前進を見た．またLGMDや先天ミオパチーでも新たに遺伝子異常が発見され，新疾患単位として注目される．治療の分野では，DMDとMELASに関して，緩和的薬物治療が検討された．以下に個々の疾患別に，研究成果と今後の問題を記述する．
1）DMD／BMD
BMDにおける心・筋症ないしⅩ染色体連鎖心筋症の病態が研究された．ジスト
ロフィン遺伝子exonl近傍の欠矢や挿入変異としばしば関係していた．この際骨格筋には，脳型やPurkinje細胞型ジストロフィンが発現するが，心筋ではこれらの発現を認めなかった．骨格筋症状が軽いのは脳型ジストロフィンなどで代償されるためと推定される．mdxマウス筋では，アラキドン酸カスケードに関与するプロスタグランジン合成酵素発現が増加しており，筋壊死への関与が推定された．mdxマウスでは，運動を負荷するとapoptosisの筋核が10倍に増加するといわれる．この現象に関連して，DMD筋では，細胞死抑制蛋白であるBc1−2の減少が証明された．ジストロフィー筋では，αSyntrOphinやnNOSの染色性の低下が証明される．前者はジストロフィンC端に，後者はN端に結合すると推定された．これら分子の欠損が病変の進行に如何に関連するかは今後の問題である．脳型ジストロフィンはシナプス後膜に発現し，POStSynaptic densityの構造を形成している．DMDではこの構造の欠落があるが，機能との対比は未解
決である．

治療研究

ジストロフィー筋にはCD8／CD4のTリンパ球の浸潤があり，筋病変の二次的増悪の原因と推定される．すなわちサイトカインを介する炎症惹起，
アラキドン酸カスケード誘発，aPOPtOSis誘発などである．臨床的にはDMD患者にコルチコステロイドが投与され，一時的には筋力を維持し，歩行可能期間を延長する事がが証明された．mdxマウスのプレドニンによる実験的治療では，長期に亘り血清CK値は低下し，筋壊死は減少した．ヒトとmdxマウスいずれ
でも，Tリンパ球の浸潤は減少していた．しかし投与中も病変は進行し，完全に抑制するものではなかった．また臨床的にはコルチコステロイドの副作用の問題があり，この点が解決される必要がある．
遺伝子治療はまだ基礎研究の段階である．mdxマウスで脳へのmini−geneの注入が試験され，シナプス膜での発現が観察された．adenovirus receptor geneの強制発現，各種promoterの検討，VeCtOrの研究が行われた．
2）LGMD
α−SarCOglycanopathy（LGMD2D）の症例が集積され，その臨床的特徴が明らかにされた・発症年齢は平均7．5（1〜23）歳，歩行不能は平均13（8〜）歳であり，DMD
より多彩である．同一遺伝子異常の症例間にも，症状の変動があり後天的要因の影響が指摘された．本邦にもcalpainopathy（LGMD2A）の症例の存在が判明した．3家系7症例の臨床経過では，発症は10歳頃，歩行不能年齢は平均38歳であった・SarCOglycanopathyに比して，経過はやや緩徐である．筋のNADH−TR染色では，網様構造の乱れや分乗（lobulated）筋線経が見られることが指摘された．
Calpain3のウェスターンプロットによる診断法が検討された．LGMDの新病型としては，50歳頃発症の兄妹において1aminin

β1鎖のミスセンス変異によることが判明した．caveolin−3の異常がLGMDの一病型であると既に報告されている．caveolin−3遺伝子異常を有するトランスジェニックマウスが作製され，病態研究に供される．
遠位型筋ジストロフィー（三好型，Miyoshimyopathy）はLGMD2Bと同一遺伝子，
2p13に局在するdysferlinの異常によることが明らかとなった．三好型ではC端に変異が集積していた．dysferlinは哺乳類には相同の遺伝子はなく，線虫のfer−1とのみホモロジーを認めた．dysrerlinの局在や機能は今後の問題である．
3）FCMD
病因遺伝子は9q31に局在する未知の遺伝子であることが判明した．コードする53．7kDaの蛋白は…fukutinと命名された．fukutinの局在と機能は未解決である．発症者は創始者変異としての3kb retropozonの挿入をホモないしヘテロに有しており，mRNAが著減する．複合ヘテロの症例では，より重症となることが注目された．hkutinの抗体作製は未成功であり，局在や機能は今後の問題である．別の研究により，本症では筋細胞外マトリックスの180kDa蛋白が骨格
筋，脳，肝臓，腎臓，肺臓などで欠損していた．この蛋白とfukutinとの関係が問題とされている（分子量が異なっている）．本症の骨格筋や中枢神経の超微形態が研究された．骨格筋では基底膜に部分的な断裂が観察される．また形質膜と基底膜間の解離を呈する箇所をみとめた．本症胎児の大脳や小脳には，グリ
ア境界膜一基底膜複合体に断裂があり，小多脳回の形成の一因と推定されている．大脳では出生後にもこの異常が観察された．本症では細胞外マトリックスに存在するであろう形態形成に関与する重要な因子の異常が推定される・
4）rimmedvacuoleを伴う遠位型ミオパチー（DMRV）
本邦で多く報告される病型である．連鎖解析から遺伝子座は9p13と判明した・
ユダヤ系イラン人にみられる遺伝性封入体ミオパチー（HIBM）と同一疾患とされた．遺伝子座はD9S1878〜D9S1859の2cMに絞り込まれた．責任遺伝子が追求されている．

5）FSHMD
責任遺伝子は4q35−qterに局在するが，未同定である・本症では同部位における（D4Z4）nの反復配列の短縮を証明する事で，ほぼ100％の遺伝子診断が可能である．10kb以下の短縮では，てんかん，精神遅滞の合併がみられた．
6）眼咽頭型筋ジストロフィー（OPMD）
原因遺伝子はpoly（A）bindingprotein2（PABP2）であり，N端側の（GCG）nリピー
トのわずかな延長のため発症している．本邦の家系では，対照の6ケから10な
いし11ケへの反復延長が観察された．本邦の症例はFrench canadianの創始者とは関係しないことが明らかとなった．筋核内にポリアラニン鎖を持つ封入体が出現する．

7）筋緊張性ジストロフィー
多系統疾患として，骨格筋，心臓，平滑筋，中枢神経，内分泌，免疫系などの多彩な症候を呈するが，myOtOnin kinase（DMPK）の遺伝子異常がどのように関与しているかは未だに解明されていない．正常者では，DMPK蛋白は筋小胞

体終槽，COrbularおよびjunctional SR（心筋），ER（神経系）に発現した．3l−UTRにおける（CTG）nリピートの病的延長により，mRNAが核内に残存貯留した．また（CTG）nの延長した遺伝子の発現は抑制された．（CTG）nの延長は隣接遺伝子（MDAHP，MDRP，ferritin L chain）の転写を抑制した．このように本疾患の多系統性を隣接遺伝子への影響とする仮説がある．また（CUG）n反復RNA結合蛋
白が病態に関与するとも指摘された．
薬物治療として，dehydroepiandrosterone sulfateのミオトニアに対する効果が検討された．in vitroでは，ミオトニアモデルやmdxマウスのミオトニア放電に対して有効であった．ヒト筋緊張性ジストロフィーにおける糖代謝異常に
troglitazoneが有効であった．
8）ミトコンドリア脳筋症
本症における臓器や組織障害とヘテロプラスミー（正常と変異ミトコンドリ
アの種々の比率での混在）の関係が各種の病型で検討された．MERFFの一剖検
例では，各臓器で変異率は約80％前後と共通していた．しかし臓器障害の程度と必ずしも一敦しなかった．ミトコンドリアDNAの5178番塩基がAまたはCかにより，ミトコンドリア遺伝子型をA型と■C型に分類した．A型にはミトコンド
リア脳筋症の発生は少ない．A型に長寿者が多いなど，他の疾病との関連も推定された．
ジクロロ酢酸ナトリウム内服はMELASの一部症状やADLの改善に有効であった．しかし難聴や脳波異常は反応しない．また肝障害や末梢神経障害の副作用が問題となった．本症の遺伝子治療に関して，基礎的検討が続けられている．
例えば，病的細胞へのアポトーシスの誘導，変異にのみ対応する制限酵素の導入，tRNAの塩基修飾により正常化する方法などである．

9）その他
先天性ミオパチーの一型において，インテグリンα7の遺伝子変異による欠損症が発見された．筋芽細胞移植治療における拒絶反応抑止を目的として，
IL−12p40遺伝子導入やCD80，CD86抗体投与の有効性が示された．筋移植に関して，骨髄にわずかに存在するmuscleprecursorcellがクローン化された．triplet
repeat病の病態に関して，アフリカツメガエル卵核に遺伝子を注入する研究方法が開発された．顔面肩甲上腕型や筋緊張性ジストロフィーに関して，FISH
法やRNAin situhybridization法が臨床応用された．近赤外分光法酸素モニターにより，疾病筋のエネルギー代謝が分析された．

10）今後の問題
研究報告数から見ても，DMD／BMDの治療への関心が高まってきている・遺伝子治療が最終目標であるにしろ，より安全な緩和治療の研究を推進すべきと考える．症例数の多さから見て，筋緊張性ジストロフィーの研究は重要であろう．病態の解明とともに，どの症状を治療上のターゲットにするかの選択が必要である．分子遺伝学の分野では，顔面肩甲上腕型ジストロフィーや遠位型ミオパチーの原因遺伝子の同定が火急のテーマとなっている．更に新発見蛋白，
DMPK，fukutin，dysferlinの機能や局在が解明されねばならない・

目

次

Ⅰ．ジストロフィン異常症

1）メチレーション特異的PCRによるDMD，BMD保因者のⅩ染色体不活化の検討
国立精神・神経センター神経研究所 加 茂

19功2）筋ジストロフィー患者生検筋における免疫組織学的検討
─ジストロフィンおよびその関連蛋白の局在とホルマリン固定パラフィン包埋標本での22
ジストロフィン染色の検討─
筑波大学臨床医学系神経内科 庄 司 進 一

3) Ⅹ連鎖拡張型心筋症(X‑linked dilated cardiomyopathy)における分子生物学的研究

26

信州大学医学部第三内科 吉 田 邦 広4）ジストロフィン異常症におけるプロスタグランジンD合成酵素の発現30

大阪大学医学部小児科 谷 池 雅 子

5）ジストロフィン遺伝子exon52ノックアウトマウス骨格筋細胞膜微細構造の解析
─mdxマウスとの比較研究─

33

昭和大学藤が丘病院神経内科 若 山 吉 弘

6) Computerized wheelを用いたmdxマウスのphenotype解析
昭和大学藤が丘病院神経内科 若 山 吉 弘

387）mdxマウスの血液中のK，Ca，とNaのイオン濃度とそれらに対するNaClの効果

40

国立精神・神経センター神経研究所 吉 田 瑞 子

8）dy/dyマウス骨格筋細胞膜微細構造の解析─mdxマウスとの比較検討─

43

昭和大学藤が丘病院神経内科 若 山 吉 弘9) αDystroglycanの糖鎖構造とその機能的役割の解明
東京都老人総合研究所

44

遠

藤

玉

夫

Ⅱ．肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）

10）肢帯型筋ジストロフィーにおけるカルパイン3遺伝子変異の検討

49

国立精神・神経センター神経研究所 後 藤 雄 一ll) Calpain 3の遺伝子異常が認められた常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィー(LGMD2A)の

4家系9症例の臨床,筋病理,遺伝子異常ならびに骨格筋におけるcalpainの発現
高松市民病院内科 川 井 尚 臣

95212）筋ジストロフィー生検筋におけるカルパインの免疫組識化学的観察
およびウエスタンブロット解析
愛知医科大学第四内科

佐

56

橋

功

13) Sarcoglycanopathyにおける遺伝子異常と各sarcoglycan欠損様式の関連についての研究60

鹿児島大学医学部第三内科 納

光 弘14) α‑Sarcoglycanopathyの遺伝子異常と臨床的heterogeneity
徳島大学医学部第1内科 川 井 尚 臣

6315)免疫多重染色によるα‑, β‑,γ‑,δ‑sarcoglycanの超微局在と相互関係の検討

67

昭和大学藤が丘病院神経内科 若 山 吉 弘16）成人発症の肢帯型筋ジストロフィーにおける臨床的，筋病理学的，分子生物学的検討

71

信州大学医学部第三内科 吉 田 邦 広17）関節拘縮を伴う常染色体優性遺伝型の肢帯型筋ジストロフィー日本人家系の臨床と遺伝子解析
九州大学医学部脳神経病研究施設内科部門

吉

良

潤

一

18) Caveolin‑3遺伝子変異トランスジェニックマウスの作製

帝京大学医学部神経内科

75

77

清

水

輝

夫

Ⅲ．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）
19）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究

81

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一20）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）における染色体再構成に関する
分子細胞遺伝学的研究

85

東京医科歯科大学難治療疾患研究所 斎 藤 深美子

21）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーにおける細胞増殖因子の免疫組織化学的研究
鹿児島大学医学部第三内科 納

87

光 弘

Ⅳ．福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）
22）福山型先天性筋ジストロフィー原因遺伝子単離と機能解析に関する研究
東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センター 戸 田 達 史

10

93

95

23）福山型筋ジストロフィーの臨床的重症度の分子レベルの解析
東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

9824）福山型先天性筋ジストロフィーにおける180kDa蛋白（p180）の欠損
帝京大学医学部神経内科

清

水

輝

夫
101

25）福山型筋ジストロフィー（FCMD）骨格筋におけるlamininα2chainの検討

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

26）福山型先天性筋ジストロフィーにおける筋細胞表面の変化．
共焦点レーザー顕微鏡と電子顕微鏡による観察

104

東京都立神経病院神経内科 松 原 四 郎

27)福山型先天性筋ジストロフィーの小多脳回
107─特にglia limitans‑基底膜複合体病変との関連について─

自治医科大学神経内科 中 野 今 治28）遺伝子診断が行なわれた福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）胎児（14週）の病理学的検索 ─胎児脳に基底膜欠損は存在するか─

112

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

29）福山型筋ジストロフィー剖検脳ガングリオシドの分析

115

国立精神・神経センター国府台病院神経内科 吉 野

英Ⅴ．ミオパチー（遠位型，インテグクンα7欠損型，その他）
11930）三好遠位型ミオパチー（筋ジストロフィー）原因遺伝子（dysferlin）の同定
国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

31）三好遠位型筋ジストロフィー2家系の臨床的，遺伝学的検討

120

鹿児島大学医学部第三内科 納

光 弘
124

32) Rimmed vacuole型遠位型ミオパチ‑の遺伝子解析

新潟大学脳研究所神経内科

田

中

恵

子

33) Rimmed‑vacuole型遠位型ミオパチーの遺伝子解析

126

金沢大学医学部神経内科 高 守 正 治34)多数のRimmed vacuoleを伴う筋病理像を示す疾患群に関する研究─臨床的，免疫組織学，遺伝学的検討─

129

北海道大学医学部附属病院神経内科 田 代 邦 雄

1135) Micro- and macro-vacuolar myopathy (a dystrophic disorder?):─とくにmyopathy with tubular aggregatesとsarcotubular myopathyとの異同に関して─

133

愛知医科大学第四内科 佐 橋

功13736) Tubulomembranous myopathyのその後に関する研究
国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信 義37）成人発症ネマリンミオパチーの筋病理学的検討

139

横浜市立大学医学部神経内科 鈴 木 ゆ め38）インテグリンα7欠損型先天性ミオパチー

142

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

Ⅵ．眼咽頭筋ジストロフィー（OPMD）
39）眼咽頭筋ジストロフィーの表現型/遺伝子型とorigin

147

熊本大学医学部附属病院神経内科 内 野誠40）眼咽頭型筋萎縮症14例の臨床病理学的検討

150

東京都立神経病院神崖内科 松 原 四 郎

Ⅶ．筋強直性ジストロフィー（DM）
41）ミオトニンキナーゼの生理機能に関する研究
東京大学大学院総合文化研究科生命環境科学系

155

石

浦

章

一

42）筋強直性ジストロフィーの分子病態発症機構に関する研究

157

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義43) Myotonin protein kinaseの3'非翻訳領域に存在する

CTGリピートの遺伝子発現に及ぼす影響158

九州大学医学部脳神経病研究施設神経内科部門 吉 良 潤 一44) Myotonic dystrophyにおけるCTG repeatの周辺遺伝子発現に与える効果の検討

161

名古屋大学医学部神経内科 永 松 正 明45）筋強直性ジストロフィー線維芽細胞，体細胞分裂におけるDMPK蛋白量
及び（CTG）nリピート数の変化

162

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義1246）筋緊張性ジストロフィー（DM）におけるDMPK転写産物の164

細胞内動態に関する分子細胞遺伝学的研究
東京医科歯科大学難治療疾患研究所 斎 藤 深美子

47）筋緊張性ジストロフィーにおけるフェリチン遺伝子
および関連遺伝子の発現について

166

虎の門病院神経内科 中 瀬 浩 史48）筋緊張性ジストロフィーの骨格筋および培養皮膚線維芽細胞における糖鎖異常

169

名古屋大学医学部神経内科 祖父江 元49）アフリカツメガエル卵に導入したCTGおよび
CAGリピート含有ルシフェラーゼ遺伝子の発現172

東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻 塩 川 光一郎

Ⅷ．ミトコンドリア異常症50）ミトコンドリアDNA多型からみた日本人およびアジア諸集団の遺伝的関係
総合研究大学院大学先導科学研究 宝 来

177

聰
179

51）ミトコンドリア脳筋症とミトコンドリア遺伝子型
岐阜国際バイオ研究所遺伝子治療研究部 田 中 雅 嗣52）こはく酸脱水素酵素欠損症の臨床病理学的，分子遺伝学的検討

180

国立精神・神経センター神経研究所 後 藤 雄 一53）ミトコンドリアDNA欠失症のミトコンドリアDNA異常の解析，
Dual−colorFISH法による病態解析に関する研究

183

大阪大学医学部小児科 岡 田 伸太郎
18554）MELAS患者の卵巣のmtDNA分析
国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信 義55）家族性ビタミンB1欠乏，心筋症，ミトコンドリアDNA3243‑to‑G変異を示す

ミトコンドリアミオパチ一例の長期経過観察
鹿児島大学医学部第三内科 納

187

光 弘

56）ミトコンドリア血小板電子伝達系酵素活性との関連の検討

190

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

57）ミトコンドリアDNA欠失疾患の培養細胞における遺伝子の動的変化
自治医科大学小児科 桃 井 真里子

13

192

58）ミトコンドリア病とアポトーシス

194

岐阜県国際バイオ研究所遺伝子治療研究部

田

中

雅

嗣

59）多重欠失を示す家族性CPEOの2症例に認められた
末梢神経内の血管病変：電顕的観察

195

国立精神・神経センター国府台病院神経内科 吉 野

英60）神経・筋疾患における長寿に関するミトコンドリア遺伝子型に関する検討

197

愛知医科大学第四内科 佐 橋

功61）長寿に伴うミトコンドリア遺伝子型

200

岐阜県国際バイオ研究所遺伝子治療研究部 田 中 雅 嗣

Ⅸ．筋の発生・分化・再生，その他
62）Triad蛋白の筋発達に伴う発現，局在，機能205

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義63）アンキリピートを持つ新規可溶性タンパク質Ⅴ‑1の骨格筋細胞における発現209

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義64)ヒト骨格筋─ラット脊髄併置培養下におけるAChRsubunitの神経支配による発現調節212

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義65）ラット骨髄からの筋様細胞のクローン化

214

国立精神・神経センター神経研究所 加 茂

功66)ラット骨髄筋再生過程におけるdystrophin, α sarcoglycan, α 1 syntrophin,nNOSの免疫組織化学的検討

216

筑波大学臨床医学系神経内科 庄 司 進 一67）筋ジストロフィーを中心とした生検筋におけるBc1‑2familyの免疫染色愛知医科大学第四内科 佐 橋

220

功68）キマーゼを指標とした病的筋における肥満細胞の局在と臨床的意義
愛知医科大学第四内科 佐 橋69)多発性筋炎の生検筋におけるTNF α発現223

功─in situ hybridizationによる検討─

名古屋大学医学部神経内科 永 松 正 明

14

228

230

70）多発性筋炎におけるMHCclassⅡ分子の発現に関する研究
名古屋大学医学部神経内科 祖父江元23271) McArdle病における虚血運動時の血管収縮物質の動態
大阪大学医学部保健学科生体情報学 依 藤 史 郎72）筋疾患における近赤外分光法酸素モニターの臨床的有用性の検討

234

大阪大学医学部保健学科生体情報学 依 藤 史 郎73）リソソーム蛋白分解系と筋萎縮：神経性セロイド様リポフスチン蓄積症における
解析から

237

順天堂大学医学部生化学第一 木 南 英 紀

Ⅹ．緩和的薬物治療および遺伝子治療
74) mdxマウスの血活creatine kinaseと筋組識に対するprednisolone長期投与の効果

241

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

75）培養筋細胞におけるジストロフィンの発現とステロイドの影響

242

東京都立神経病院神経内科 松 原 四 郎

76) Double‑mutant mdxマウスの病態生理と治療に関する研究244

東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸77）筋ジストロフィー患者に対するダントロレンナトリウムの治療効果
京都大学医学部神経内科 梶

247

龍 兒

78)皮膚線維芽細胞を用いたDuchenne型筋ジストロフィーの遺伝子治療に向けた基礎的研究

250

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義25179) Muscle specific promoter活性の定量的解析

昭和大学藤が丘病院神経内科 若 山 吉 弘80）アデノウイルスベクターを用いたアデノウイルスレセプター遺伝子導入による繰り返し遺伝子導入の試み
熊本大学医学部附属病院神経内科

内

野

253

誠

81)アデノウイルスベクターを用いたminidystrophin gene導入によるジストロフィンの中枢神経系での機能解析の試み
熊本大学医学部附属病院神経内科 内 野

15

256

誠

82）ジストロフィン遺伝子導入：多コピー発現ベクターと長期発現ベクターのmdxマウスへの応用に関する研究258

大阪大学医学部小児科 岡 田 伸太郎

83）IL‑12p40遺伝子導入と抗CD80，抗CD86抗体投与による
同種筋芽細胞移植拒絶の抑制に関する研究
国立精神・神経センター国府台病院神経内科 吉 野

260英84）筋緊張性ジストロフィーの耐糖能異常に対するtroglitazoneによる治療

262

高松市民病院内科 川 井 尚 臣

85）ミトコンドリア異常症におけるジクロロ酢酸ナトリウム治療

265

自治医科大学小児科 桃 井 真里子

86）ミトコンドリア病変異遺伝子の選択的破壊による遺伝子治療の基礎開発

266

岐阜県国際バイオ研究所達伝子治療研究部 田 中 雅 嗣

87）ミトコンドリア脳筋症の発症機序と治療に関する分子生物学的研究

268

日本医科大学老人病研究所生化学部門 太 田 成 男

273

Summary
平成8年度〜10年度研究班名簿

277

16

Ⅰ．ジストロフィン異常症

メチレーション特異的PCRによるDMD，BMD保因者のⅩ染色体不活化の検討
加研究協力者 ／J、林
久保田

茂

功＊

治＝ 後 藤 雄 一＝ 埜 中 征 哉＊
健 夫… 福 嶋 義 光…

はじめに
Ⅹ連鎖性劣性遺伝疾患で女性保因者が発病する機序とチル化シトシンは変化させない．したがって，元々の配して，Ⅹ染色体の不活化の偏りが関与していると考えられている．不活化されているⅩ染色体上では，各遺伝子

PCRを行うことでシトシンのメチル化の有無により変化のプロモーター領域や5 側に存在するCpGisland内のシトシンが5−メチルシトシンになることでその発現が抑制さのプロモーター領域にはCpGislandに挟まれた非常に多れている．これまでDMDl），伴性遺伝性免疫不全症2），ミオチュブラーミオパチー3），血友病A4）・5）等のⅩ連鎖性劣性遺伝疾患に対して，メチル化感受性制限酵素によるⅩ染は90％のアレルで区別可能である（図3）．このCpGisland
は不活性Ⅹ染色体ではメチル化され，活性Ⅹ染色体では非する（図2）．X染色体上のアンドロゲン受容体（HUMARA）
型性に富んだshorttandemrepeats（STR）があり，このSTR

メチル化されている．よって，この領域をターゲットに
Cytosine

Cytosine

SurPhonate
H

4

象

町

O

特異的PCR（WCR）を研究協力者の久保田がⅩ染色体に応用することに成功した‡）．我々はDMDならびにBMD保因者でのX染色体の不活化をWCRを用いて検討し，新しい知見を得たので報告する．
対

倉日揮OH

色体の不活化の研究がなされている6）．しかし，この方法では制限酵素の不完全消化や，スター活性，アレルのサ
イズの小さい方がより多く増幅されるというようにいく
つかの問題がある．Heman7）が報告したメチレーション

列は，SOdiumbisulnte処理後に適切なプライマーを用いた

国立精神・神経センター神経研究所のバンクに保存されているDMD保因者ならびにBMD保因者のDNA検体を

ついては血液と筋肉両方について調べた．診断に際しては，臨床所見，家族歴，筋病理所見，免疫組織学的所見，
ウエスタンプロット，半定量PCRによるジストロフィン
遺伝子検査を施行した．また血液検体例ではout or舟ame
欠矢を持つDMD保因者とin魚・ame欠矢を持つBMD保因者のみを対象とした．

㊥

く
OH

町

対象とした．DMD保因者（54例）では血液より23検体，筋肉より32検体，BMD保因者（8例）では血液より6検体，筋肉より4検体のDNAを分離し使用した．重複した計3人に￣

UracilUracil SUIphonate

図1Bisulnte treatment．Sodium bisulne（NaHSO4／
Na2S205）はアルカリ変性したDNAのシトシンをシト
シン硫酸をへてウラシル硫酸に化学変化させる．水
酸化ナトリウム処理により最終的にはウラシルに変わる．

0riginalSeuence Bisulntetreatment aRerPCR

原理ならびに方法
Sodiumbisulnteで一本鎖DNAを処理するとシトシンはウラシル硫酸となり9），さらに水酸化ナトリウムを加える
ことでウラシルに変わる（図1）．一方sodiumbisulfiteはメ＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊信州大学医学部衛生学教室−19−

CCGCAr→UUGUAr→TTGTAT

CtnCGCCT→UmCGUTT一→

TCG TrT

図2 遺伝子が不活化してないⅩ染色体ではbisulmeけeat−
mentによりシトシン（C）はウラシルⅣ）に変わり，それに対するプライマーを使いPCRすることで最終的にはチミン汀）にかわる．不活化Ⅹ染色体にある5−メ
チルシトシン（mC）はbisulmetreatmentによっても塩基の変化を受けない．変化する塩基を各々イタリック
で表した．

3，

l

G −C −r ic h

480
P o Ly m o rp h ic（CS Ah oG rt）1 T1 a−3n d1 e m R e p e a ts

G −C −r ic hMR3primersfbr MFZ
methylatedallele

Primersfbr

unmethylatedallele UFZ
図3URl

HUMARA遺伝子（GenbankacccssionnumberM35844）の構造とエクソン1内に設定したPCRプライマーセット．GCrichな配列に囲まれた多型STRは11個から31個の（CAG）の繰り返し配列から成る．これは90％のアレルで区別可能である．

Severeweakness
Gaitdisturbance
Mildweakness

CK（＞1000）

No
Weakness

CK（＜1000）

0．2

0．4

0．6

0．8

1．0

MethylatedaHeleratio
図4 DMD保因者のメチル化アレルの比率．筋症状の重症度を縦軸に表している．メチル化アレルは0，2から0．8がランダムな不活化の範囲である．

Severeweakness
Gaitdisturbance
MiJdweakness
No
Weakness

CK（＞1000）
CK（く1000）

0．2

0．4

0．6

0．8

1．0

MethyJatedalle］eratio

図5 BMD保因者のメチル化アレルの比率．症状を有する保因者は2名であるがいずれもメチル化アレル比は正常範囲にある．

ー20−

異常ジストロフィン遺伝子が活性化されたアレルが筋肉内で均等に存在すると，骨格筋は多数の核が癒合してでして，活性X由来の変化した非メチル化配列に対するプ
ライマーセットと不活性化X由来の配列に対するメチル化プライマーセットをデザインし各々PCRを行った．こきた多核体のため，正常ジストロフィン遺伝子が活性化された核で合成された正常ジストロフィンmRNAが異常ジストロフィン遺伝子が活性化された核支配領域まで到達し正常ジストロフィンを合成するため筋症状が顕性化しない．症候性保因者でランダムに不活化されている例のPCR産物をABI310（Perkin・Elmer）を用いて，両アレルを識別し，その生成比率を解析した．
結果では，逆に正常ジストロフィン遺伝子が活性化された核が偏在し，正常ジストロフィンmmAが異常ジストロフ
ィン遺伝子が活性化された核支配領域まで到達できず，蛋白欠損により筋症状を引き起こすという機序が考えら同一患者で血液と筋肉両方より調べた3例では，いずれもほぼ等しい値をとっていた．DMD保因者54例中51例でアレルの識別可能な異なる長さのPCR産物を得た（図4）．
51例のメチル化の比率は，偏りがあるもの（80％以上又はれる．いずれにしても症状のあるDMDならびにBMD保因者の中にランダムなⅩ不活化パターンの者が含まれて20％以下）12例，偏りのないもの39例であった・偏りのあるものは概して筋力低下を認め症候性であったが，CK値
1000IU几以下の無症候性ものも1例存在した．偏りのな
いもののうち13例（33％）は筋力低下を訴え，うち3例は歩行障害を認めた．BMD保因者では8例中1例が同一サイズのアレルを有しており，偏りは不明であった．残る7例は1例の例外を除きランダムにメチル化されており，うち2例は筋力低下を認めた．むしろ不活化の偏りがある例はいることは，これまで支持されていた不活化の偏りだけでは発症のメカニズムを説明できず，それ以外の因子も関与していることを示唆している．
文

献1）AzoftifaJ，etal：X−Chromosomemethylationinmani・

臨床的には高CK血症（1500IU几）のみであった（図5）．

ftstingandhealthycarriersofdystrophinopathies‥COn・

Cordanceofactivation ratiosamongnrstdegreeftmale

考察
MPCRは制限酵素を用いた従来のメチル化感受性制限

relativesandskewedinactivationascauseoftheafrtcted

酵素法に比べて，1）費用が安く，2）酵素処理に比べて化2）SchmuckerB，etal：APCRbasedX−Chromosomeinacti−

学処理のため反応効率がよく，3）DNAの純度が低くても可能で，4）同一検体に対しメチル化と非メチルの両方の評価を行えるため信頼性がより高いという利点がある．
研究協力者の久保田は同一検体を用いてMPCRとメチル

vationassayforcarrierdetectioninX−linkedimmunode・

phenotypes．HumGenet96：167−76，1995・

ncienciesusingdifrtrentialmethylationoftheandrogen
receptorgene・Immunodenciency5：187−92，1995

3）DahlN，etal：Myotubularmyopathyin agirlwitha

化感受性制限酵素法の結果の関係をみたが，従来法がやや高い値となることを除き，この二つの方法は良く相関していた‡）．従来のⅩ連鎖性劣性遺伝疾患の保因者でのⅩ

delationatXq27・q28andunbalancedXinactivationas・

染色体の不活化を調べた報告1，3川によると発症している
保因者はⅩ染色体の不活化の偏りを認めている．しかし，
我々は23例のDMD症候性保因者で10例は不活化の偏りを認めたが，13例は正常範囲であった．またBMD症候性保因者は2例ともⅩ染色体の不活化は正常範囲であった．

4）Nissen PD，et al：Nonrandom X chromosome DNA

我々の結果がAzo托ifal）の報告と一致しなかったのは，方法の違いだけでは説明できない．Azofbぬl）は11例のジス
トロフィン異常症について10例は血液より，1例のみ筋肉由来のDNAを用いて検討している．我々は62例のジスト
ロフィン異常症で筋肉より36検休のDNAを抽出し検討している．我々は筋肉と血液のメチレーションの比率の違

SlgnSthe MTMIgene to a600・kb reglOn・AmJHum
Genet56：1108・15，1995．

methylationpatternsinhemophiliacfbmales・JClinInvest
83：1400−3，1989．

5）IngerslevJ，etal：FemalehaemophiliaAinafamilywith
SeemlngeXtremebidirectionallyonizationtendency：ab・
normalpremature X−Chromosome

inactivation？Clin

Genet35：41・8，1989．
6）AllenRC，etal：MethylationofHpaIIaJldHhaIsitesnear
the polymorphic CAG repeatinthe human androgen・
receptorgenecorrelateswithXchromosomeinactivation・

AmJHumGenet51：1229−39，1992．

いについて3例で検討し，ほぼ同一の結果を得たが，少数

7）HermanJG，etal：Methylation−SpeCi蔦cPCR：anOVelPCRの検討でありさらに症例を増やせば臓器の違いによりメ
チル化パターンの差がある可能性もある．筋ジストロフ
ィーは骨格筋を標的臓器とする疾患であり，骨格筋におけるDNAのメチル化パターンの方がより病態を反映していると思われる．また，WCRは筋肉をすりつぶして行っているため，筋肉組織全体のメチレーションの状態を

assayfbrmethylation statusofCpGislands・Proc・NatL
Acad．Sci．USA．93：9821−6，1996．
8）KubotaT；et al：Anew assay fbrthe analysis ofX−
Chromosomeinactivation based on methylation・SPeCi爪c
PCR．HumGenet．（inpress）

9）SusanJC，etal：Highsensitivitymappingofmethy−lated

解析できるが，組織内での分布の偏りは評価できない．

cytosines・NucleicAcidResearch22：2990−7・1994・−21−

筋ジストロフィー患者生検筋における免疫組織学的検討−ジストロフィンおよびその関連蛋白の局在とホルマリン固定
パラフィン包埋標本でのジストロフィン染色の検討−

●
●

ヂ平

幸修

野谷

星亀

＊

伊方

雅恒

＊

遠田

渡藤

■

夫子一
紀

教亜伸

●

・亨

■

越井田

大石武

研究協力者

はじめに

対象と方法
（1）筋ジストロフィー症生検筋におけるジストロフィンおジストロフィンは筋細胞膜において複数の細胞膜蛋白と結合し・複合体dystrophin−glycoproteincomplex（DGC）をよびその関連蛋白の局在形成している・Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）では，これまでジストロフィンの欠損とともにα−サルコグ

対象：①Becker型筋ジストロフィー症例1（BMD・1）；20歳
男性．5−6歳発症，20歳歩行はかろうじて可能な比較的重リカン，α1シントロフィンなども連動して脱落すること

症例．ジストロフィン遺伝子はBeggsとChaimberlainのプが報告されている．また，神経型一酸化窒素合成酵素

ライマーを用いたPCR法にて，eXOn12・19の欠失．

（nNOS）も筋細胞膜，主にtype2線経に局在し，DMD症例
ではジストロフィン欠損と連動して脱落すること報告さ②Becker型筋ジストロフィー症例2（BMD−2）；21歳男性．
学童期より走るのが遅い程度で，筋力ほぼ正常の歩行可れているl）・Becker型筋ジストロフィー症（BMD）も，ジス
トロフィン遺伝子の欠矢を原因とする臨床的にDMDより能な軽症例．ジストロフィン遺伝子はexon49の欠失．

軽症な疾患である．DMDはジストロフィン遺伝子のouト

22歳発症で歩行可能な軽症例．ジストロフィン遺伝子検

Ofこ丘ame shiRの欠失によりジストロフィン蛋白が欠損す

索は未実施．

るのに対し，BMDではジストロフィン遺伝子のin．舟ame

方法：上記3例の生検筋凍結切片を用い，一次抗体として

Sh泊の欠失により不安定なジストロフィン蛋白が合成さモノクローナル抗ジストロフィン抗体（DYSl，DYS2，
DYS3：Novocastra社），ポリクローナル抗α1シントロフィ

れる．したがって，筋細胞膜におけるジストロフィンの③Duchenne型筋ジストロフィー発症保因者；25歳女性，

免疫組織染色性も異なり，一般にBMDでは斑状あるいはン抗体（共著者武田，亀谷作製），ポリクローナル抗nNOS

淡く染色される．今回の研究の目的は，筋ジストロフィ

抗体（ALEXIS社），モノクローナル抗αサルコグリカン抗ー症，特にBMD患者の生検筋におけるジストロフィンお体（YLEM社）を用いてABC法，DAB染色による免疫組織

よびそれに関連するジストロフィン結合蛋白の局在を明らかにすることである．

化学染色を行った．

さらに，われわれはCatalyzedSignalAmpli爪cation（CSA）
システム（DAKO社）を利用することにより，ホルマリン

パラフィン包埋標本でのジストロフィン染色の検討（2）筋ジストロフィー患者生検筋におけるホルマリン固定

固定パラフィン包埋標本でのジストロフィン免疫染色が対象： Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）6例，Becker型
筋ジストロフィー（BMD）5例，Duchenne型筋ジストロフィ

一部可能であることを見出した．これまで筋ジストロフ

ー発症保因者5例，疾患コントロール5例，正常例2例の生

ィー患者生検筋におけるホルマリン固定パラフィン包埋

検筋ホルマリン固定パラフィン包埋標本を用いた．

標本でのジストロフィン免疫染色は困難で，凍結切片で方法：上記標本を脱パラフィン後，ThrgetRetrievalsolu・の染色が余儀なくされていた．CSAシステム用いたDMD，tion（DAKO）にて95℃，20分の前処置後，Catalyzed Signal

BMD，DMD保因者のホルマリン固定パラフィン包埋標
本での検討もあわせて報告する．

Amplification（CSA）システム（DAKO社）を用いて，モノク
ローナル抗ジストロフィン抗体（DYSl，DYS2，DYS3），モ
ノクローナル抗αサルコグリカン抗体の免疫組織化学染色を行った．

＊筑波大学臨床医学系神経内科
蜘日立製作所日立総合病院神経内科＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所
ー22−図1Becker型筋ジストロフィー症例PMD−1）生検筋の免疫組織化学染色
DYSl（roddomain），DYS3（N端），nNOSの各抗体の免疫染色では全線経が陰性であり，DYS2（C端），α1syntrophin（αlsyn），
α5arCOglycan（αSG）の各抗体ではほぼ全線経が明瞭に染色された．

図2 Becker型筋ジストロフィー症例PMD−2）生検筋の免疫組織化学染色
DYSl（roddomain），αlsyntrophin（αlsyn），nNOSの各抗体の免疫染色では，全体に染色性が弱く，また不均一なbatchy）染
色性であった．DYS2（C端），DYS301端）でも不均一性がみられ，αSarCOglycan（αSG）はほぼ全線経が明瞭に染色された．

結果（1）筋ジストロフィー症生検筋におけるジストロフィンおよびその関連蛋白の局在症例BMD−1では，筋細胞膜においてDYSl（roddomain），
DYS3（N端），nNOSが全線経で陰性となり，DYS2（C端），
α1シントロフィン，αサルコグリカンは全線経で陽性に染色された（園1）．また，BMD−2では，DYSl（roddomain），
DYS2（C端），DYS3（N端），α1シントロフィン，nNOSにて一部の線経で不均一な染色性を有し，αサルコグリカ
ンはほぼ全線椎で陽性となった（図2）．一方，Ducheme型
筋ジストロフィー発症保因者では，DYSl，DYS2，DYS3
ともにモザイク状に陰性線経が認められ，α1シントロフ
ィン，αサルコグリカン，nNOSも同様にモザイク状に陰（2）筋ジストロフィー患者生検筋におけるホルマリン固定
パラフィン包埋標本でのジストロフィン染色の検討
正常，疾患コントロール例ではDYSl，DYS2が明瞭に染色されたが，DYS3，αサルコグリカンではほとんど染色されなかった．DMD，BMD，DMD保因者の症例は，
DYSl，DYS2染色についてのみ行った．DMDでは筋細胞膜に染色性がなく，BMDでは部分的な染色性を有し，保因者では陰性線経がモザイク状に染色され，凍結標本と同様の結果が得られた（図4）．なお，同時に行ったABC法の免疫染色では上記の抗体では全く染色されなかった．
考察

1994年，Kobzik，etal．2）によりnNOSが筋細胞膜，特にりpe2線経に存在していることが報告されて以来，筋組織におけるnNOSの局在や役割が注目されてきた．DMDの性を呈していた（図3）．

ー23−

t′、∴
l J、

／、

／

j

▲＼、ノ

﹁︑

J・t

＼了＼

DYS2

．

バ∵叛
十＋∴∴∴亮れ十

α1syn

図3

αSG

′

DMD発症保因者の生検筋の免疫組織化学染色
DYSl（rod domain），DYS2（C端），DYS3OJ端），α1syntrophin（αlsyn），αSarCOglycan（αSG），hNOSの各抗体の免疫染色では，陽性
線経と陰性線経がモザイク状に染色された．

DMD

BMD

図4

．．LJ

CSAシステムによるDYSl，DYS2抗体の免疫組織化学染色
コントロール（Cont）症例は，筋線経の筋細胞膜は明瞭に染色された．Duchenne型筋ジストロフィー症例PMD）ではDYSl，
DYS2とも全く染色されなかった．Becker型筋ジストロフィー症例（BMD）では，DYSl，DYS2とも全体にやや染色性が弱く，また不均一な（patchy）染色性であった．DMD発症保因者では，DYSl，DYS2とも陽性線経と陰性線経がモザイク状に染色された．

−24−

生検筋ではジストロフィンの消失とともにnNOSも消失し，

CSAシステムは，従来のABC法の反応ステップにビオ

ジストロフィンと関連して消長することが報告された．

チン標識タイラマイドとパーオキシダーゼ酵素の触媒反一方，シントロフィンは，ジストログリカン複合体やサ応ステップを加えた免疫染色システムである．ABC法に

ルコグリカン複合体と同様にジストロフィン関連蛋白を比較して超高感度であり，ホルマリン固定パラフィン包構成する蛋白の一つである．α1シントロフィンはその一埋標本に対してこれまで検出できなかったモノクローナ

つで，ジストロフィンとC端に近い部位にて結合し，DMD

ル抗体の一部が検出可能となるなど，臨床的に病変を有の生検筋ではジストロフィンの消失とともに消失する．

する組織での応用も報告されている5）．今回のわれわれのまた，骨格筋ではPDZドメインのモチーフを介してα1シ

結果は，CSAシステムを利用することによりホルマリン

ントロフィンとnNOSが結合していることが報告されてい固定パラフィン包埋標本での抗ジストロフィン抗体DYSl，る3）．また，BMDにおけるジストロフィン，α1シントロ

DYS2の免疫染色が可能となり，凍結標本が得られない症

フィン，nNOSの局在も検討されており，nNOSはジスト

例でのDMD，BMD，DMD保因者の診断やスクリーニン

ロフィン同様不均一に染色されるものや消失するものま

グに有用と考えられる．

で症例によりその染色性は異なり，一方α1シントロフィ
文

ンは陽性に染色されることが報告されている4）．

献

今回，われわれの検討では，比較的重症な症例BMD−1

1）BrenmanJE，ChaoDS，XiaH，etal：NitriCoxidesynthase

では，DYS2（C端），α1シントロフィン，αサルコグリカ

COmplexedwithdystrophinandabsent舟omskeletalmus・
cle sarcolemmain Duchenne muscular dystrophy．Ce11

ンは明瞭に染色されたが，DYSl（roddomain），DYS3（N端）のジストロフィン，nNOSの染色性がともにも消失していた．症例BMD−1のジストロフィン遺伝子は少なくとも

82：743−752，1995．
2）KobzikL，BredtDS，ReidMB，etal：Nitric oxidein
skeletalmuscle．Namre372：546−548，1994．

exon12・19が欠失しており，DYSl（rod domain），DYS3P端）のジストロフィンの染色性が陰性であることに一致し3）BrenmanJE，ChaoDS，GeeSH，etal：Interactionofnitricている．この結果はChao，etal．の報告4）に類似しているが，

OXidesynthasewiththepostsynapticdensityproteinPSD・■

N端，rOddomainのジストロフィン染色性が完全に消失し95andalsyntrophinmediatedbyPDZdomains・Cel1ているにもかかわらず，C端のジストロフィンが残存するという従来の報告とは異なる特異な染色性を有してい

4）ChaoDS，GorospeJRM，BrenmanJE，etal：Selectiveloss

る．この症例では，α1シントロフィンおよびDYS2（C端）

OfsarcolemmalnitriCoxidesynthaseinBeckermuscularは陽性に染色され，DYSl（roddomain），DYS3（N端），nNOSの染色性が陰性となったことより，筋細胞膜におけるdystrophy．JExpMed184：609・618，1996．
5）SannON，TtramotoA，SugiyamaM，etal：ApplicationofnNOSは，N端あるいはrod domainのジストロフィンとも

Catalyzedsignalampli爪cationinimmunodetectionofgo・

何らかの関連をもって存在することを示唆する結果と考

nadotropinsubunitinclinical1ynonfunctioningpituitary

えられる．軽症のBMD−2では従来の結果とほぼ同様の結adenomas．AmJClinPatholgylO6：16−21，1996．

84：757−767，1996

果と考えられる．したがって，BMDでは重症度や遺伝子の欠失部位などにより，ジストロフィン，α1シントロフ
ィン，nNOSの染色性が異なることが示された．

ー25−

X連鎖拡張型心筋症（X−linkeddilatedcardiomyopathy）における分子生物学的研究
吉田研究協力者 中 村 昭 則＊
武

話

田

伸

一…

邦

広■

矢
石

崎 正 英■ 池
原 博 幸…

言

田

修

一＊

較検討した．ジストロフィン分子種の発現に関しては骨x連鎖拡張型心筋症（X・linkeddilated cardiomyopathy；
XLDCMと略す）はジストロフィン異常症の一病型であり，臨床的に骨格筋障害が軽微でありながら10・20歳代で致死的な拡張型心筋症を呈することが特徴である．我々は本研究班においてジストロフィン遺伝子筋型exonl近傍の欠矢が疑われたXLDCM2家系に注目し，臨床病理学的およ格筋からtoblRNAを抽出した後，筋型、脳型、プルキン

び分子遺伝学的な検討を行った．同様にジストロフィン
遺伝子5I端に異常を有するXLDCM患者はMuntoniら，
Milasinらによっても報告されⅠ＞3），XLDCMの中でも1つのジストロフィン遺伝子の筋型exonlを含む〟加dIII断片はサブタイプをなすものと考えられる．このような特異な遺伝子異常と臨床表現型との関連についてはintronlに存在する転写制御配列の関与が推測されている4）．またジス
トロフィン遺伝子の発現に関連して脳型やプルキンエ細胞型など筋型以外のジストロフィン分子種の代償的発現が病態の修飾に関与する可能性も指摘されているlP）．そ
こで我々は自験例についてその詳細な欠失地図を作製するとともに骨格筋において筋型，脳型，プルキンエ細胞型の各ジストロフィン分子種の発現を検討した．

エ細胞型各分子種に特異的なexoml内にセンスプライマーを設定，eXOn4に設定したアンチセンスプライマーとの組み合わせでRT−PCRを行った ）．
結果

3．4kbとされ4），プライマーの設定上，正常対照ではhYerSe
PCR法にて2・7kbのPCR産物が予測されるが（図2A），実際に患者では約3．Okbの産物が特異的に増幅された（図28）7）．
このPCR産物の塩基配列を調べたところexonl内に603bpの挿入配列が見られ7），これにより筋型exonlは中断されていた（図2C）．この挿入配列は両端を16塩基ないしは17塩基のdirectrepeatsではさまれ，かつ一端に約70個あまりのpoly（T）tractsを有していた（図2A）．また今回検討した2家系患者で同一部位に同一の挿入配列が確認された（図3）7）．
骨格筋における各分子種の発現に関してはXLDCM患者（図1の症例1）では筋型が検出されず，脳型，プルキン

対象と方法

エ細胞型はいずれも過剰発現していた ）．疾患対照として対象は当科で経験したXLDCM2家系4患者である（図1）5ト7）・うち3名はすでに拡張型心筋症によるうっ血性心不全のためいずれも10歳代で死亡している．いずれの症例，eXOn45−48欠失症例）の骨格筋では正常対照と比べ患者も高CK血症が見られたが，臨床的に明らかな筋萎縮や筋力低下は認めなかった．

ていたが，脳型およびプルキンエ細胞型の発現はXLDCM

この2家系においては以前にmultiplexPCR法およびSouthemblot法によりジストロフィン遺伝子を解析し，筋型exonlからintronlにかけての欠矢を示唆する結果を得ていたため5），今回はその詳細な欠失範囲を決定するため
inversePCR法を用いた．方法は患者ゲノムDNAをmndTII
で完全消化し，Selflligateしたものを鋳型としてinverse
PCRを行った7）．inversePCRのプライマーは筋型ex。nlおよびその上流に設定した（図2A）．得られたPCR産物の塩基配列を決定し，正常のジストロフィン遺伝子配列と比用いたBecker型筋ジストロフィー患者2名（exon45−47欠失て筋型，脳型，プルキンエ細胞型のいずれも過剰発現し患者に比較してその程度が軽度であった（図3）6）．

KfamiJy Nfamily

品量（18yo）＊信州大学医学部第三内科＊＊国立精神・神経センター＊榊国立療養所東埼玉病院（15yo）（14yo）

図1XLDCM2家系の家系Egl．（）内は死亡時の年齢を
示す．

ー26−

A

603−bpinseHion

200

217

216

LIsequence（invelted）
173】TATTATACTC．…TAATGGGAlTACCAOCIIIIIHIATCmCmTATACACHliCAAAATGCJTT−

工、・、、し，ゴ川
L15用■■（Ah
（A）n
StORF

3−ORF

0

3

B M12

61くb

C
216

insertion
3．054−
2．036−園2

QAAGAACTTTTAC CAGGTTでTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTで

A：ジストロフィン遺伝子筋型exonl周辺の制限酵素地図とinversePCRおよびgenomicPCRに用いたプライマーの相対的位
置（上段のパネル）および筋型exonlへのヒトLlelementによる挿入変異を示す（中，下段のパネル）．ヒトLlelementの2つのOpenreading舟ameのほとんどを欠いた5l・trunCatedfbrmが筋型exonlの5一非翻訳領域に逆方向に挿入されている．
B：inversePCR（園1の症例l）．firstPCRはプライマーDMD−3とDMD−10を使用（lanel，2），SeCOnd（nested）PCRはプライマー
DMD−5とDMD−8（1anel），プライマーDMD−5とDMD−12（1ane2）を使用した．患者では約3．Okbの産物が特異的に増幅された．
プライマーの番号は図2Aに示す．LaneMはIkbDNAladder（GibcoBRL）．
C：inversePCR産物のシークエンス．筋型exonlの途中から約70あまりのTstretchが見られる．

考

M12

3

4

5

察

今回の検討により我々が従来から筋型exonlからintronl
にかけての欠夫と考えていた変異は実際は欠失ではなく筋型exonl内の挿入変異であることが判明した．この挿入
配列はホモロジー検索よりヒトLl elementの一部，すな
わち本来のLlelementから2つの0penreading＆ameを欠いた51trunCatedfbrmと考えられた．Llelementは哺乳類のゲ−884

ノムDNA中に104コピー以上存在する繰り返し配列であり，−281

通常，intronに存在しnon−pathogenicであることが多いが，血友病A，Duchenne型筋ジストロフィーなど当該遺伝子のexon内への挿入により発症した患者が報告されている．
今回，血縁のない2家系で同一の挿入変異が共通して見ら園3

genomicPCR．XLDCM患者（Iane1−3，圃1の症例番
号1−3に対応している）では正常対照（lane4，5）より明らかに大きなPCR産物を認める．プライマーは
DMD−1とDMD−18を使用した．Lane Mは1kb DNA
ladder（GibcoBRL）．

れたことからこの変異が日本人XLDCM患者に特異的な変異である可能性もあり今後，原因不明の高CK血症を伴う拡張型心筋症患者においてはこの挿入変異を検索する必要がある．

ー27−

ControT XDLCM BMDI BMD2

1 1日 ＝ 「 l
M

B

P

M

B

P

M

B

P

M

B

P

438bp（M）−
240bp（P）
219bp（B）／￣

図4 骨格筋における筋型，脳型，プルキンエ細胞型ジストロフィンの発現．XLDCM患者（図1の症例1）では筋型が検出されず，
脳型およびプルキンエ細胞型が過剰発現している．Becker型患者（BMDl（exon45−47欠失症例），BMD2（exon4548欠失症例））
では筋型のみならず脳型およびプルキンエ細胞型の過剰発現が見られる．controlは皮膚筋炎患者骨格筋．

骨格筋におけるジストロフィン分子種の発現に関しては臨床表現型のいかんにかかわらず筋型ジストロフィン

心筋に比べ骨格筋において起こりやすいことがXLDCMの減少に伴い，脳型およびプルキンエ細胞型ジストロフ
ィンが代償性に過剰発現するものと考えられる．また自験XLDCM患者において筋型が検出されなかったことは

ⅩLDCM患者においてはジストロフィン遺伝子5−端以外のexonl内に存在する特異な挿入変異が筋型の転写を阻害するものと推測される．自験XLDCM患者においてはその変異が筋型exonl内に限局するため過剰発現した脳型およXLDCMにおける分子遺伝学的および細胞生物学的検討

びプルキンエ細胞型はいずれもintactなものであり，骨格筋の変性に対して抑止的に機能する可能性が考えられる．

考える．

一方，hot・SpOtに欠矢を持つBecker型筋ジストロフィー患者においては過剰発現した脳型およびプルキンエ細胞型
も筋型と同様に構造的に，および機能的に不完全なものの特異な病像の形成に関与するものと思われる．ただし部位にも変異が複数同定されており，XLDCMの成因に関しては他にいくつかの要素が関与することは疑いない．
はジストロフィン分子の構造と骨格筋および心筋におけるその機能を解明する上で興味深いアプローチであると

文

献1）MuntoniF，WilsonL，MarrosuG，etal：Amuationinthe
dystrophingeneselectivelya飴ctingdystrophin expres−であり，結果的に筋型を代償し得ないのではないかと思われる．

2）MuntoniEMelisMA，GanauA，etal：TranSCriptionofthe

今回の検討ではXLDCM患者の心筋が入手し得なかっ

dystrophingeneinnormaltissuesandinskeletaJmuscle

たが，臨床的に心筋障害を有する他のジストロフィン異常症患者（Duchenne型2名，Becker型3名）において骨格筋
および心筋からtotalRNAを抽出し，RT−PCR法にて脳型

OfafhilywithX−linkeddilatedcardiomyopathy．AmJ

ジストロフィンの発現を正常対照と比較検討したところ
ジストロフィン異常症患者においては脳型は骨格筋では一様に過剰発現しているが，心筋では対照と有意差を認めなかった．このことはジストロフィン分子種の発現調節機構が骨格筋と心筋で異なることを示唆するものであSioninthehearLJClinInvest96：693・699，1995．

HumGenet56：151−157，1995．
3）MilasinJ，MuntoniF，SeveriniGM，etal：Apointmuta−
tioninthe5lsplicesiteofthedystrophingene鮎stintron
responsiblefor X−1inked dilated cardiomyopathy．Hum
MolecGenet5：73−79，1996．
4）Klamut HJ，Bosnoyan−Co11insLO，Worton RG，etal：
Identincation of of a tranSCriptionalenhanCerwithin

り，心筋では骨格筋に比べて脳型による機能的代償が起こりにくいことが予測される．

muscleintronl ofthe humandystrophingene．Hum

したがって筋型以外のジストロフィン分子種の代償性

5）1bshidaK，IkedaS，NakamuraA，etal：Molecularanaly−

過剰発現はジストロフィン異常症では一様に起こるが，
たまたまその遺伝子異常が筋型exonl周辺に限局する場合，
血11−lengthの脳型およびプルキンエ細胞型ジストロフィンが効果的に筋型の機能を補完すること，この代償機構がSisoftheDuchennemusculardystrophygeneinpatients−28−

MolecGenet5：1599−1606，1996．

WithBeckermusculardystrophypresentingwithdilated
Cardiomyopathy．Muscle＆Nerve16：116ト1166，1993．

6）NakamuraA，IkedaS，YbzakiM，etal：Up−regulationof7）YoshidaK，NakamuraA，YbzakiM，etal：Insertional

thebrainandPurkinje・Cellformsofdystrophintranscripts，

inBeckermusculardystrophy・AmJHumGenet60：

mutationbytransposableelement，Ll，intheDMDgene

reSultsinX−1inkeddilatedcaTdiomyopathy・HumMolec

1555−1558，1997．

Genet7：1129−1132，1998・−29−

ジストロフィン異常症におけるプロスタグランジンD合成酵素の発現谷 池 雅 子■

研究協力者

毛

利

育

子■

岡

田

伸太郎■

要 旨 ジストロフィン異常症患者（Duchenne型型筋ジストロフィー症・Becker型筋ジストロフィー症）生検筋においてプロスタグランジンD之の合成に関わる酵素群の発現を免疫組織化学法を用いて調べた．重症型のDuchenne型筋ジストロ
フィー症においては，ホスホリパーゼA2，シクロオキシゲナーゼー2，造血型プロスタグランジンD合成酵素はいずれも壊死線経に強い発現が認められたが，軽症型のBecker型筋ジストロフィー症及び対照筋線経にはこれらの酵素の発現は認められず，病態へプロスタグランジンD2が関与している可能性が考えられた．

はじめに対象および方法

エイコサノイドはホスホリパーゼAユ（PLA2）の作用により作られるアラキドン酸を前駆体とする脂質メディェ一夕ーの総称であり，炎症を含めた広範な生体反応に関与している．アラキドン酸よりシクロオキシゲナーゼ

リンパ球DNAを用いたPCRまたは生検筋のジストロフ
し，臨床的にDMDまたはBMDと診断した1歳・7歳のDMD
イン免疫染色にてジストロフィン異常症との診断を確定
患者，14歳のBMD患者の生検筋と，壊死再生を認めない
筋疾患患者の生検筋を対照として用いた．5〃m凍結切片（COX・2）の作用によりプロスタグランジンベルオキシドが合成され，さらに酵素反応により種々のプロスタグラ
ンジンが合成される．これらの合成系をアラキドン酸カをアセトンにて4℃10分間固定後に，0．3％H202／メタノー
ルにて内因性ベルオキシダーゼ活性を阻害，0．3％トラ

スケードと呼ぶ．pLA2，COXはそれぞれ構造型・誘導型

イトンX・100・20％正常血清／phosphate bufftredsaline（PBS）にて非特異的反応を抑制した後，1次抗体としてマのアイソフォームを持ち，分泌型ⅠIAPLA2，COX・2はそれぞれの誘導型である・また，プロスタフランジンD2（PGD2）についてはこれを合成するプロスタグランジンD合成酵素（PGDS）が知られている．

ウス抗ヒトⅠIAPLA2抗体（2クローン・塩野義株式会社研究所有田先生より供与），ヤギ抗ヒトCOX−2抗体（Santa
CruZ社），ウサギ抗ヒトhPGDS抗体（大阪バイオサイエン
ス研究所妾出先生より供与）を用いた．対応する2次抗体（ビオチン化抗マウス・抗ヤギ・抗ウサギIgG抗体），引き続きABC試薬（Ⅵctor）を用いて，ベルオキシダーゼ活性をDA別こて可視化した．また，連続切片にHE，Gomori−trichrome，及びtoluidineblue染色を施行した．

近年種々の筋ジストロフィー症の原因として多様な分
子生物学的異常が明らかになっているが，筋線経がなぜどのようにして壊死に陥るのかについては未だ明らかでは無い・Duchenne型（DMD）およびBecker型筋ジストロフ
ィー症（BMD）患者の筋組織でPLAZ活性が上昇していたとの報告1），ヘビ毒より抽出されたPLA王を動物に投与してDMD類似の壊死・再生を生じたとの報告2），DMD患者由来の筋組織培養上清にプロスタグランジンE2（PGE2）増加が認められたという報告があり3），筋芽細胞壊死・再生へのエイコサノイドの関与が示唆されている．一方，ジス
トロフィン異常症の壊死・筋線維化と肥満細胞浸潤が相関するとの報告があり4），しかも肥満細胞は造血型
PGDS（hPGDS）を発現して，PGD，を産生することが知られている5）・我々はPGD2がジストロフィン異常症の病態へ関与している可能性を検証するために，免疫染色を用いた予備実験を行った．

結果

対照筋・BMD患者筋・DMD患者筋全てにおいて問質
内に散在性に肝GDS陽性細胞が認められ，これらは連続
切片のtoluidine blue染色にてメタクロマジアを示す顆粒
を有することより肥満細胞と考えられたが，その数はDMD＞対照筋・BMDであった．
DMD筋ではこれらの問質の陽性細胞以外に，hPGDS陽性の筋線経を多く認め，連続切片におけるHE染色との対比により壊死線維であると考えられた．hPGDS吸収抗体との反応，また1次抗体を省略するとこれらの壊死線経は染色されず，免疫反応は特異的であると考えられた．必ずしも肥満細胞とh−PGDS陽性壊死線経の局在は一致せず，
hPGDS陽性線経は幼少患者筋では散在していたが，年長■大阪大学医学部小児科

患者筋では群を形成し，その大半はIIAPLA2またCOX−2−30−

でも陽性であった．BMD筋では壊死線経は稀であったが，局在する訳ではなく，両者の関連に関しては不明である．

hPGDS・COX−2・IIA PLA2陽性線経を認めず，対照筋でもhPGDS・COX−2・IIAPLA2陽性線経を認めなかった．

LindahlらはDMD患者筋・BMD患者筋において，PLA2活
性は年齢依存的に変化すると報告しておりり，PGD2の産生誘導も年齢（病期）依存的であることが考えられる．今後検討症例を増やすことにより，壊死線経におけるhPGDSの強発現がDMDに特異的なものであるのか或いは他の病因による筋壊死にも普遍的に認められる現象であ
るのか，また，病期との関連についても検討していく予
定である．

考
察
わずか2例のみの検討であるが，DMD患者壊死筋においてhPGDS並びにその上流酵素の誘導型が強発現しており，PGD之の産生が誘導されていると考えられた．肥満細胞はhPGDS陽性であったが，必ずしも壊死線経の近傍にヽl・ん∴・∵∵ヽ−1二、■

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図17歳DMD患者筋連続切片
AHE染色，E PGDS免疫染色．壊死線経にhPGDS陽性は強発現されている．スケールバー：39FLm￣●、1㌧†ナ戌

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図2

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7歳DMD患者連続切片
AnAPLA2免疫染色，BCOX−2免疫染色，ChPGDS免疫染色．hPGDS陽性線経はnAPLA2，COX−2も強発現している．
スケールバー：79J上m

−31−

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図3 hPGDS免疫染色
Al歳DMD患者，BBMD患者，C対照．BMD，対照筋ではhPGDS陽性線経は認められない．スケールバー：84FLm

文献3）JacksonMJ，BrookeMH，KaiSerK，etal：Creatinekinase

1）LindahlM，BacknanE，HemikssonKG，etal：Phospholi−
paseA2aCtivityindystrophinopathics．NeuromuscDisord
5：193・199，1995．

andprostagIandinE2releasc舟omisolatedDuchennemus・
Cle．Neurology41：101−104，1991．
4）GorospeJRM，TharpMD，Hinckley，etal：Aroleformast2）GutierrezJM，N臨czJ，Ijfazc，etal：Skeletalm。SCle
degenerationandregenerationa鮎riQjectionofbothrop・

CellsintheprogressionofDuchennemusculardystrophy？

JNeuroISci122：44・56，1994．

StOXin・ⅠⅠ，aphospholipaseA2isolated舟omthevenomof5）UradeY，tniharaM，HoriguchiY，etal：Mastcellscon−thesnakeBothropsJararaCuSSu．ExpMoIPath0155：217−

tainspleen・tyPeprOStaglandinD synthase．JBioIChem

229，1991．

265：371・375，1990．

ー32−

ジストロフィン遺伝子exom52ノックアウトマウス
骨格筋細胞膜微細構造の解析
一 mdxマウスとの比較検討 −
若

研究協力者

山

舌

弘＊

溢 谷 誠 二＊ 鬼 木 弘 明■■
松 崎 哲 也… 埜 中 征 哉…

要 旨 凍結割断法により，ジストロフィン遺伝子exon52ノックアウトマウス（mdx52）生後8週の筋細胞膜微細構造を解析し，mdxマウスのものと比較検討した．本研究より，生後8週のmdx52筋細胞膜微細構造変化は・CaVeOla
密度の増加，P面膜内粒子密度の減少，Orthogonalarrayおよびorthogonalarraysubunitparticle密度の減少であった・
これらの変化は，eX。。23に点変異を認めるmdxマウスの膜内粒子密度の変化と類似していたが，筋細胞膜微細構
造全体の変化は，よりDuchenne型筋ジストロフィー症に類似していた．以上から，ジストロフィン蛋白が完全欠損するジストロフィン遺伝子異常であれば，筋細胞膜微細構造学的にもほぼ類似の傾向を認めるといえた・と同様のものである3），4）．一方，抗aquaporin4抗体はペプ
チド合成装置により，aquapOdn4のC末端領域（アミノ酸はじめに最近開発されたdystrophin遺伝子exon52ノックアウトマ

損以外にDp140やDp260のdystrophinisofbrmの欠損を認め，

287−301）5）のペプチドを合成し，ウサギに免疫して得たオ
リジナル抗体を使用した．
筋細胞膜レプリカ標本は，電顕にて無作為に筋細胞膜

臨床的にはDuchenne筋ジストロフィー症（DMD）と類似した下腿の筋肥大もみられる1）．本研究では，Freeze−Fracture

写真を撮影し（各々のマウスにつき5P面，5E面），最終倍率40，000倍でcaveola密度，160，000倍でintramembranous法を用い，mdx52マウス筋細胞膜微細構造を解析し，以particle（IMP），Orthogonalarray（OA），さらにorthogonalarray

前報告したmdxマウスのもの2）と比較検討した．

subunitparticle（OASP）密度をsingleblind法にて算出し，それウス（以下mdx52マウス）は，筋力低下がみられず，その筋病理組織像もmdxマウスに近似しているが，dystrophin欠

ぞれcontrol群とmdx52群について統計的に比較検討した．

材料と方法
結

生後8週のmdx52およびcontrolマウス（C57BL／6J）各々6匹ずつの両側長址伸筋を摘出．左側は2．5％glutaraldehyde
溶液で固定し（4℃，2h．），EikoFDⅡA凍結割断装置で筋細胞膜レプリカ電頗標本を作成した．
右側はisopentane・液体窒素で凍結後，一般光顕組織標本を作成したが，筋細胞膜微細構造物であるcaveolaやorthogonalarray（OA）の密度はtypeIIC線経の割合に影響され，またOAはtype1線経にはほとんどみられないため
ATPase染色による筋細胞膜微細構造を解析した筋標本の果

1．一般光顕組織所見およびfiber type分析：生後8週のmdx52マウス長址伸筋のH＆E染色による光顕組織所見は，細胞浸潤を伴う変性・壊死線経や再生線経よりなる集塊が認められ，周辺には中心核線経が多数みられたが，結合織増生や脂肪組織はほとんどみられず，mdxマウスの組織像と非常に類似しているといえた．
Fibertype分析では，生後8週のcontrol群およびmdx52群
長址伸筋はともにサpe2線経が99％占めており，その内α−SarCOglycan，α1・SyntrOphin，aquaPOrin4に対する抗体

mdx52群ではWpe2C線経が平均で6％占めていた・
2．免疫組織化学所見（図1）：mdx52マウス長址伸筋では，を用い蛍光免疫染色標本も作成した．dystrophin抗体はdystrophinならびにα−SarCOglycanの欠損がみられ，一方，

Hofhan・Kunkel両博士より供与された羊抗60KDa抗体を
sarcoglycanはウサギに免疫して作成した抗体で，いずれも我々が以前の研究で使用したC末端領域に対する抗体

β−dystroglycanは，COntrOlマウスと比較してその染色性が乏しかったものの，筋表面膜に認められた．α1−S叩trOphinは同様にcontrolマウスよりも全体に染色性が乏しかった
ものの，筋表面膜が明瞭に染色される陽性線経もしばし＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院電顕室＊＊＊国立精神・神経センター研究所

ば観察された．aquapodn4は，全体的には欠損している線経が多いといえたが，数個の陽性線経が集塊をなしてみられる所見が散見された．

nbertypeの分析も行った・さらにdystrophin，β−dystroglycan，

使用し，β・dystroglycanとα1−SyntrOPhinは羊に，α−一33−

3．筋細胞膜微細構造変化：mdx52マウスにおける筋線経Median値およびその25〜75％midrange（括弧内）は3．34（1．54の多くは，COntrOlマウスに比べてcaveolaが増加していた〜10・34）であったが，mdx52群では1．38（0．54〜2．45）と明ら（図2）．control群におけるcaveola密度は11．6±0．2であるのかに低下していた（p＜0．01，Wilcoxonrank・SumteSt）（表）．

に対して，mdx52群では13．3±0．3であり，統計的にも有

またOAが全くみられない線経も多く認められた（図3B）．
この減少したmdx52マウスにおけるOAは，COntrOlよりも意に増加していた（p＜0．05，tWO−tailedt−teSt）（表）．mdx52
マウスのP面IWは，COntrOlマウスと比較して少なくみえ

小さなOAからなるものが多く，OASP密度はcon廿01群とる筋線椎が多くを占めたが（図3），E面IMPはあまり差が比較して有意に減少していた（p＜0．05，tWO−tailedt−teSt）（表）．

みられなかった．統計学的比較においても，mdx52群においてP面IMP密度は，OASPを除いた場合（p＜0．05，tWO−

考察

tailedt−teSt）も含んだ場合（p＜0．01）もともにcontrol群よりも本研究結果から，生後8週mdx52マウス長址伸筋細胞膜

有意に減少していた（表）．OA密度はcontrol群において，微細構造変化は，CaVeOla密度の増加，P面のIW密度減少，（10mlroi

州」二、．￣．：二th・トIl・〔）phi11

βーdystr（）gh・CnIュ

α−＄arCOglycan

Lqdhalin）

α．・Syntr（1phi11＿■lquilpOlliIl壬

図1lmmunohistochemiCalstainingwithsheepanti−dystrophin，Sheepanti−β・dystroglycan，rabbitanti−α一缶arCOglycan，
Sheepanti−α1−8yntrOphinandrabbitanti−aquaPOrin4antiserainmuscletis8uefromcontrolandmdx52mice．lm＿

munoreactionofallantiseraisobservedatthesurhcemembranesofmyo馳ersincontrolmouse．Inmdx52mouse，
theimmunoreactionsofanti−dsytrophinandanti−α−SarCOglycanantiserawereabsent；Whileaquaporin4immunore−

activitywasnotalsoseenexceptforoccasionallypositiveimmunostainlngOfsmaugroupedmyOfibers．Thereactions
Ofanti−β−dystroglycanandanti−α1・SyntrOphinantiseraweremoredecreasedthanthoseincontrolmouseexceptfor
Clearα1−SyntrOphinimmunoreactivityofsomemyofibers・0riginalmaginification X150．

−34−

OA密度およびOASP密度の減少であることが判明した．
これらの変化は，CaVeOla密度やOA密度に影響を及ぼす

マウス筋細胞膜微細構造変化は，dystrophin遺伝子のexon23の点変異を認めるmdxマウスと比較的類似してい加）e2C線経の割合がmdx52マウスではそれほど多くなかったことから，mdx52マウス筋細胞膜全体の微細構造変化を反映していると思われる．

た．しかしながら，CaVeOla密度の増加やP面とE面のIW以前報告した同適齢のmdxマウス長址伸筋細胞膜微細構造変化2）と比較した場合，mdxマウスではcaveola密度およびP面のOASPを除くIW密度は正常であったが，mdx52

dystrophin蛋白は不完全ながら保存されているBecker筋ジストロフィ．症では，IMP密度は正常で，OA密度やOASP

全体の減少を示すDMDの変化6＞＄）ともmdx52マウスは近似しているといえた．一方dystrophin遺伝子に異常があるが，密度のみ減少がみられる9）．このことから，dystrophin蛋

図2AI Lowmagn摘cationelectronphotomicr0−graPhsofthcsarcolemmaplasmamembraneBomacontroImouseEDLmuscle（A）and
amdx52mouscEDLmuscIcP）・hcrcaseddensityofcaveolaeisapparentinthemdx52mouse．riginalmagniGcation X38，000．

−35−

白が完全欠損するdystrophin遺伝子異常において，そのexon部位の異常の違いに関わらず，筋細胞膜微細構造も類似の傾向を示すといえた．

a叩apOdn45）の，筋細胞膜での発現様式を免疫組織学的に検討した．その結果mdx52マウスではα−SarCOglycanの欠また，我々は，筋細胞膜分子構築に強く影響を及ぼす

損，β−dystroglycanの免疫反応低下，同様にα1−SyntrOphin
も免疫反応低下がみられたが陽性線経も多くみられた．

と考えられるdystrophin結合蛋白および最近，OAの構成蛋白でありwaterchannelの一員であることが判明した

さらにaquaporin4は全体的に欠損していたが，陽性線経も数個の集団をなして散見された．これらの所見とmdx52

圃3A−B Highmagni鮎ationelectronphotomicr0−graPhsoffreeze一位actuTepTeparationsillustrahgintramcmbranousparticledensityand

Orthogonalarray（arrows）densityinEDLmuscleplasmamembraJleOf ontrol（A）andmdx52（B）micc．Dccreascddensitiesof
bothintramebranousparticIesandorthogonalarraysareapparentinmdx52mousemembrane．C＝Caveolae．0riginalmagni鰯ca−
tionX152，000．

−36−

表

CaveolaAlterationsofEDLmuscleplasmamembranes打omcontrolandmdx52mice

川P（Group mean±SEIの（Group mean士SEM）

P face P face E face

2177土42●●mdx52

1921±47●●13．3±0．3

2388±35●■902±18曽

2053±48●−

OASP（Hedian／midrange）

excluding OASP inGIuding OASPContr0111．6±0．2＊

OA

3．34（1．54−10．34）榊872±12書（Groupmean±SEH）
18．4土0．2●＃

1．38（0．54−2．45）＃

15．4土0．7榊EDL：eXtenSOr digitorurnlongus．P

PrOtOPlasmic，E：eXtraCelluJar，

IMP：intramembranous particle．OA

OrthogonaI array．OASP：Orthogonal array subunit particle＊pく0．05by two−taHed t−teSt．
＊＊pく0．05by two−ta‖ed t−teSt．
＊＊＊pく0．05by two−taHed t−teSt．

＃p〉0．1by two−taHed t−teSt＃＃p〉0．01by椚Icoxon rank−Sum teSt．
＃榊pく0．05by tYYO−tailed t−teSt．

マウスでみられたP面でのIM勤減少との関係は不明である

idesyntha5einnormalskeletalmyonber；andtheirrela・が，OA密度の分布状態とaquaporin4の免疫組織学的所見

tion to each otherandto dystrophin．ActaNeuropatho1

はパラレルな結果を示すといえた．最近，Frigeriらは10）

94：455−464，1997．

5）HasegawaH，MaT；SkachWetal：Molecularcloningofa

免疫組織化学による検討で，mdxマウス骨格筋ではaq・uaporin4が完全に欠損している結果を報告しているが，mercurialinsensitivewaterchannelexpressedinselected

mdxマウスにおいても，OAは不完全ながらも残存していWatertranSPOrtingtissues．JBioIChem269：5497−5500，

ることを我々は確認しており2），今後さらに検討を要する

1994．

といえる．

6）BonillaE，FishbeckKH，SchotlandDL：Freeze一舟acture
Studiesofmusclecaveolaeinhumanmusculardystrophy．

文

献

AmJPath01104：167−173，1981．

1）AJakiE，NakamuraK，NakaoK，etal：ThrgeteddisruPtion

7）SchotlandDL，BonillaE，ⅥmMeterP：Duchennedystro・

Ofexon52inthemousedytrophingeneinducedmuscle

phy：alterationinmuscleplasmamembranestruCture．Sci−

degenerationsimilartOthatobservedInDuchennemus−
Culardystrophy．BiochemBiophysResComm238：492・

ence196：1005−1007，1977．

8）WakayamaY；Okaya5u H，Shibuya S，etal：Duchenne

497，1997．

dystrophy：reduced densityoforthogonalaTray Subunit
Particles．inmuscle plasmamembrane．Neurology35：2）ShibuyaSandW奴ayamaY：Freeze・丘acturestudiesof

1587−1593，1985．

myonber plasma membranein X chromosome−1inked9）ShibuyaS，W故ayamaY；JimiT etal：Freeze一介acture

musculardystrophy（mdx）mice．ActaNeuropatho176：
179・184，1988．

analysisofmuscleplasmamembraneinBecker3）WakayamaY，InoueM，MurahashiM，etal：UltrastruCtur・
allocalizationofadhalininnormalmurineskeletalmyo・
坑benAnnNeuro139：217−223，1996．

smuscu−1ardystrophy．Neuropath01AppINeurobio120：487・494，
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10）FdgeriA，NicchiaGIミVefbavatzJM，etal：Expressionof4）VhLkayamaY；InoueM，MurahashiM，etal：Ultra5truCtur−
allocalizationofα1・SyntrOphinandneuronalnitricox−

ー37−

aquaporin−4inhst・twitch丘bersofmammalianSkeletal
muscle．JClinInvest102：695−703，1998．

Computerizedwheelを用いたmdxマウスのPhenotype解析
若研究協力者 原

要

旨

山

吉

一書

弘＊

FischbeckKH■■

BucanM■●

Mdxマウスl）はDuchenne型筋ジストロフィー症（DMD）のモデル動物として広く利用されているがそのphenotypeはDMDと異なり，骨格筋の筋力において特に若年マウスでは正常対照と大きな違いは無いと考えられてきた2）・3）．またmdxの運動耐久能の異常を示した精密な研究は報告されていない．我々はコンピューターと接続したwheelの中でのマウスの自発運動を解析し，mdxには持続走行能の著しい低下がある事を始めて発見した．
この現象に統計学的検討を加え，今後のinvivophenotypeの評価方法としての有益性を考察した・
はじめに

Behavioralcybemets）にてグラフィック化され，数値は表

MdxマウスはBulneldら1）により発見されたDMDの最初計算ソフトに移行し統計処理を行った．Genoサpeの解析のモデル動物であり，同じdystrophinopathyとして近年D
MDの病態解明や遺伝子治療の基礎研究等において頻繁には我々が独自に開発したflsscp（nuorescent−Single strand
COnformationpolimorphism）法が用いられた．

に使用され，ますます重要になりつつある．しかしそのinvivo phenotypeはDMDと異なり明らかな筋力低下をきた

結果さず，治療研究の対象として評価方法の困難さの問題がマウスの走行パターンを示すrumingactivityグラフを見浮かびつつある．我々はコンピューターと接続したwheel

ると，全てのマウスで日中は活動せず夜間に活発な走行の中でのマウスの自発運動に正常マウスとは著しく異なが見られた．また消灯後1時間は不規則な行動が多かった．
このためデーターの解析は夜8時より朝7時までとした．

る行動が見られる事を発見した．この現象をphenotypeの評価方法として利用することで，将来のより有効な治療研究に役立つと思い検討した．
目

またほぼ全てのmdxで短時間の走行〜停止パターンの繰り返しを示したがwildtypeでは長時間の連続走行を示す事が多かった（図1）．この現象を数値化するために一日の総回転数（TR：tOtalrevolution）及び平均持続走行時間

的

mdxマウスの自発的走行能力をcomputerizedwheelを用いて詳細に検討する．同じ家系内のwildtypeとmdxを比（ACRT：aVerageCOntinuousrunningtime）を求めた．ACRT

較し，この方法がinVivophenotypeの評価方法として有用

は一定速度以上（100回転／5分）で走り始めた時点を開始点とし停止した時点で終了として平均値を求めた．全経過中であるか，2つのパラメータ（持続走行時間，総回転数）に
より統計学的に解析する．

mdxのACKrは18．8〜38．5（平均26．4）wildtypeは34．6〜128（平均65．6）であり2群間の差を2標本丁検定試験にて統計処理を行うと各週毎および全期間のいずれにおいても有意差

対象と方法
マウスの家系間phenotypeの違いを避けるために同一家系内でのmdx及びwildtypelittermateを使用した．対象は全て雄で，8匹のmdxと8匹のwildtypeを用いた．全てのマウスは生後第3週に母親から離され，genOt押eの分析のため尾の一部を切除された後，4週より解析終了までwheel
付きのケージで朝7時より夜7時が照明下で，夜間は無照明で飼育・解析が行われた．解析はマウスのサーカディ
アンリズムの研究用装置4）を使用し，解析期間中は各ケージの5分毎の回転数をコンピューターが24時間連続で測定した．測定期間は5，9，13及び21週齢に1週間連続の解析を行った．データーは解析用ソフトウエア（CircadiaO20：＊昭和大学藤が丘病院神経内科
榊Pennsylvania大学Neurology＋＊＊Pennsylvania大学Psychiatryが認められた（p＜0．001）．TRは9週以降で有意差を認めたが，2群間のTR値の解離はより少なかった（図2）．
考察

1990年にCarlsonら5）はfbrcetransducerを用いて始めてmdx群とwi1dtype群の骨格筋の筋力に差がある事を示した．しかしその差は2群間で統計的有意差を示したものの，各々のデータをみてmdxとwi1dtypeとの判別ができるほど著しいものではなかった．また歴史的には様々な方法
でmdxのPhenotypeの解析が試みられたが，その殆どはwi1dWpeとの違いを兄い出せなかった2日）．今回我々が示した
ACRTの著しい差の原因として，以下の3つの可能性を考えた．1）mdxの横隔膜には骨格筋と比べ著しい変性が見られmdxはhypoxiaを呈する6）・7）．このため，走行によりmdxー38−は容易に呼吸苦を来すことが想像される．2）骨格筋には
darkness

横隔膜ほどの変性は認められないが，正常との差を生理学的に認めた報告もある．運動によりcrampや筋肉痛が生じ不快感により走行を停止する可能性もある．3）mdxの中枢神経系にはdystrophinの異常があると思われ8），これが自発運動のmotibationに影響を与える可能性も否定は出来ないが，その可能性は低いと思われる．
ま と め1）mdxマウスのInvivophenotypeについてこれまで知られていなかった自発運動耐久能の異常がcomputerized
wheelを使用し示された．2）runningactivityグラフを肉眼的に見てもmdxとwildtypeの判別はほぼ可能と思われた・
またこの現象を数値的に解析すると全期間を通じ
ACRT40以上はwildtype，30以下はmdxとの判別が可能と思われた．3）ACRTTRとも2群間の統計的解析では有意差が認めらたが，全経過を通じての評価方法としてはACRT

図1第9適齢の代表的なmdxと雨ld t叩eの走行を示す
runningactivitygraph．Wldtypeでは連続走行をしめす黒い横長のb打が消灯直後より数時間，連日続いているが，mdxでは不連続な走行を示す細かいbarが毎日続いている．四角で囲ってある短時間の不規則な走行はデータから削除されている．

がより優れていた．
AverageCOntinuousrunningtime（ACRT）

Totalrevolutlon／day

0
6

m m 00 m m

0
5
0
4

己︼∈＼ト出UV

03

hdp＼已○ココtO＞巴一d岩ト

0
2

SW
SW

9W

13W

9W

13W

21W total

21W tod●sE：Sun血dcmrorrncah●SE：51anderdemOrrn亡an‥

図2

nOS−gnificantdefferenCe

ACRTとTRの各週及びtotaJの結果いずれも黒のbarはmdxを示し白のbarはwildtyPeを示している．ACRTは全期間を通じ2群間で有意差を示しており，dataの解離もより大きい．

文献5）CarlsonCGandMaki可usRV‥Anoninvasiveprcedureto

1）BuⅢeldGS，SillerWG，WightPAL，MooreKJ，etal：X
Chromosome−linked muscular dystrophy（mdx）in themouse．Proc．Natl．Acad．Sci．81：1189−1192，1984

detectmuscleweaknessinthemdxmouse．Musclenerve
13：480・484，1990
6）StedmanHH，SweenyHL，ShragerJB，etal：Themdx

2）HudeckiMSandPollinaPC：Mdxmouseastherapeutic

mousediaphragmreproducesthedegenerativechangeof

modelsystem：developmnetandimplementationofphe−

Duchennemusculardystrophy．Nature352：536−539，1991

notypicmonitoring．Adv．Exp．Med．Biol．280：251−265，
19907）Dupont・VtrsteegdenEE，KatzMandMcCarterRJ：Bene一

月cialversus adverse e飴cts oflong−term uSe Ofclen・

3）BrownSCandLucyJA：Dystrophin；gene，prOteinandcell

buterolinmdxmice．Musclenerve18：1447・1459，1995

biology．In：eds．Cambridge：CambridgeUnivrsityPress，：

8）ChamberlainJS，PealmanJA，MuznyDM，etal：Expres・
sionofthemurineDuchennemusculardystrophygenein

1−20，19974）PickardGE，SollarsPJ，RinchikEM，etal：Mutagenesis
and behavioralscreeningfor altered circadian activity
identinesthemousemutant，Wheel．BrainResearch705：
255−266，1995−39−

muscleandbrain．Science239：1413・1418，1988

mdxマウスの血液中のK，Ca，とNaの各イオン濃度とそれらに対するNaClの効果
吉

田

研究協力者

端

和

子■

田

圭

司●

要 旨 NaClがmdxマウスの骨格筋崩壊を抑制する．その原因究明のため，mdxマウスの新鮮血液中の無機イオ
ン濃度（K，CaとNaイオン濃度）を，7日から60日齢まで調べ，それらのイオン濃度に対するNaClの影響を調べた．
その結果，mdxマウスの筋病理学的研究から知られている骨格筋崩壊過程に一致して，血液中のKイオン濃度が増加した・このKイオン濃度の増加が，NaClの摂取で抑制された．caイオン濃度は，mdx及びBlOマウスともに，
7日齢から25日齢まで減少し続けた．Naイオン濃度は，両マウス共にCaイオン濃度とは逆に増加した．
はじめに

結

私達は，Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）の骨格
筋崩壊の直接原因は，骨格筋のL一型Ca2＋・Channelの機能異常であることを，モデルマウスmdxを用いて明らかにしたl）．現在，この原因に基づいて治療方法を兄い出すことを試みている．その中で，NaClが骨格筋崩壊を抑制する
ことを見出した．NaClの骨格筋崩壊抑制機構を明らかにすれば，治療に応用出来ると考え，初めに血液中の無機
イオン濃度に対するNaClの影響を調べた．
対照と方法

果

Kイオン濃度（図1）：BlOマウスのKイオン濃度は，日齢に従う変化はあまりなく，3．6から4．OmMの間でほぼ一定していた・一方mdxマウスは，日齢と共にKイオン濃度が増加した．7日齢の濃度は，BlOの濃度に近い3．8mMを示した．しかし8日，10日齢で急激に増加し，20日齢から再び急激に濃度が増加，25日齢で最高濃度を示した．25日齢以後はKイオン濃度の大きな変化は無かった．名目齢のmdx
マウスの中には，BlOマウスに近いKイオン濃度を示すグ
ループとmdxマウスの20日齢に近いKイオン濃度を示すグ
ループがあった．

mdxとBlOマウスの新鮮血液を用いた（n：20〜30）．
血液中の無機イオン濃度に対するNaClの影響は，普通
飼料にNaClを加えた餌を親に与え，その親から生まれた仔の血液中の無機イオン濃度を調べた．
飼料は，0・3％Naが含まれる普通飼料（対照マウス用）と5％のNaを含む飼料を使用した．5％のNaを含む飼料は，
普通飼料にNaClを加えて調製した（日本クレア）．

度は，pHに左右される・i・STAT装置は，PHが変化を受ける前に，イオン濃度を測定することが出来るため採用した・採血をマウスの正常状態で行い，イオン濃度を正しく測定したとする判断は，pH，ヘマトクリット値，Glucose
量を同時に測定し，それらの値を指標にした．
血液は，マウスに軽いエーテル麻酔をかけ，心臓より採血した．採血後，すぐi−STHr装置用カートリッジに封︵∑∈︶．UUOU＋滅

血液中のNa，CaとKの無機イオン溝度は，i−STAT（扶桑薬品）を使用して，同時に測定した．血液中のCaイオン濃入し測定した．測定は採血後約3分間で終了した．採血，測定過程で，血液凝固防止剤は使用しなかった．
0

10

20

30

60

Days
図1mdxとBlOマウスの日齢に対する血液中のKイオン濃度＊国立精神・神経センター神経研究所−40−

CaとNaイオン濃度（図2）：mdxとBlOマウスのCaイオン濃度は，7日から25日齢まで急激に減少し，Naイオン濃度は増加した．mdxとBlOマウスの日齢における，Caイオ
ン濃度間に有意な差は認められず，またNaイオン濃度間にも有意な差は認められなかった．

NaClの影響：Kイオン濃度に対するのNaClの影響を図3に示す．
B10マウスの結果は，30日齢のみであるが，普通食餌のものよりも高Kイオン濃度になる傾向を示した．mdxマウスの場合，7日齢では，BlOマウスの30日齢の結果と同様に高Kイオン濃度となった．しかし10，25，30日齢では，普通食よりも有意に濃度が減少した．
Caイオン濃度に対するNaClの影響を図4に示す．

1．55

β10マウスの結果は，30日齢のみであるが，普通食餌のCaイオン濃度とほぼ同じ濃度を示した．mdxマウスの

L50
J﹁
Jt

1．45

4

場合，7日齢では普通食餌のものとほぼ同じ濃度を示した．
しかし10日齢では有意に減少し，柑日と25日齢では，有

一
4

1．」0

〇
3

1．35

J
一
．4

〇〇
′〇
0

C㌔．⁝nP︵ヨM︶

0J
5．
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一．
ヽ1﹀一0J5
J
5
．0
．1．i

4
tJ

︵≡tu︶．呂OU◆dN

〇U
′0
3
3
3

意に高Caイオン濃度になった．30日齢では，再び普通食
餌のCaイオン濃度とほぼ同じ濃度を示した．
Naイオン濃度に対するNaClの影響は，mdxマウスの場
合，18日齢から普通食餌のNaイオン濃度に対して有意に

4．d﹁

わく0．02）増加し，30日齢では普通食餌の145±0・4mMから
154±1．3mMと増加した（p＜0．0001）．BlOマウスの場合は，30日齢のみであるが，普通食餌の145±0．3mMから150±−

一■

1．1mMと有意（p＜0．0001）に増加した．

0

■■

1．35
13亨

考
察
mdxマウスの7日齢のKイオン濃度は，BlOマウスの濃

1JO
136

l．25

134

1．20

132

1．15

130
0

10

20

30

O

DayS

図2

m血とBlOマウスの日齢に対する血液中のCaとNa
イオン濃度度に近い3．8mMであった．しかし30日齢まで成長する間に2回急激にKイオン濃度が増加した．初めは8日，10日
齢で急激に増加した．mdxマウスの骨格筋は，この10日
齢頃から壊死線経が見られると言う報告がある2）．2回目
は20日齢から急激に濃度が増加し，25日齢で最高濃度を

〇

4

1

3

一ヽ︺

︵∑∈︶．U冨U＋HqU︵∑≡︶．U一HOご滅

1

0

10

20

0

30

20

30

DayS

DayS
図3

10

図4

mdxとBlOマウスの血液中のKイオン濃度に対するNaCIの影響
m血・NaとBlOJNaはNaCI摂取マウスのKイオン濃度−41−mdxとBlOマウスの血液中のCaイオン濃度に対するNaClの影響
mdx」NaとBlO．NaはNaCl摂取マウスのNaイオン濃度示した．この20日齢頃では壊死線経が多く見られ，25日
齢頃では壊死・再生が盛んに生じている．30日齢では再生線経が多く見られるようになる．しかし壊死も生じているため，25日齢以後のKイオン濃度に大きな変化はな
かった．このようにmdxマウスの日齢に従うKイオン濃度の増加は，mdxの筋病理学的研究から得られた壊死再生過程と一致した．従ってKイオン濃度の日齢に従う増加は，骨格筋崩壊により，細胞内から細胞外に流出したためと考えた．m血マウスの7日から10日齢の間に，正常に近いKイオン濃度から急激に増加することは，この期間の発育過程で，骨格筋に筋崩壊を起こす原因が生じるのではないかと考える．
このような日齢によるKイオン濃度変化を起こすmdxマウスに，NaClを摂取させると，10日，25日と30日齢で，普通食餌のm血マウスのKイオン濃度よりも有意に減少した・NaCl摂取のmdxマウスのKイオン濃度の変化の根底には，BlOマウスのように，また正常値を示すmdxマウス
7日齢のように，普通食餌のKイオン濃度より高濃度になる変化が含まれていると考えられる．しかしNaClの摂取により日齢によるKイオン濃度の増加が抑制されたことは，NaClによって筋崩壊が抑制されたためと考える．
これらの結果は，5％のNa付加の食餌を与えた親から生まー42−れた仔の，30日齢の血清中のCK値が，普通食餌のmdxマウスのCK値の約1／2の値までに有意むく0．01）に減少し，・またそれらのマウスの前脛骨筋の壊死・再生線維面積が，普通食餌のmdxマウスに比較して有意（p＜0．01）に減少した
結果3）に一致した．
CaとNaイオン濃度の日齢による変化には，筋崩壊の影
響はなかった．NaClを摂取した結果，血液中のNaイオン
濃度が増加（18日齢以降）したことは，一般に知られている事実に一敦する．Caイオン濃度に対するNaClの影響は，
今後データを加え検討する．
文

献1）YoshidaM，MatsuzakiT；DateM，etal：Skeletalmuscle
伽er degenerationin mdxmiceinduced by electriCal
Stimulation・Muscle＆Nerve20：1422−1432，1997．

2）杉田秀夫，田辺雄三，埜中征哉ら：筋ジストロフィー症モデル動物の開発mdxマウス骨格筋の病理学的研究．厚生省「筋ジストロフィー症動物開発供給に関する研究」昭和55年度報告書：13−18，1985．
3）吉田瑞子，井上勲：mdxマウス骨格筋崩壊抑制に対するNaClの効果．厚生省精神・神経疾患研究委託費
による研究報告書平成8年度：223，1996．

dy／dyマウス骨格筋細胞膜微細構造の解析−mdxマウスとの比較検討−
若

研究協力者

要

旨

山

舌

弘＊

淀 谷 誠 二＊ 小 嶋斎 藤 宗 雄… 江 藤

宏 子■ 鬼 木 弘 明‖
智 生… 埜 中 征 哉■榊

凍結割断法により，生後早期からのdy／dyマウス骨格筋細胞膜微細構造を解析し，mdxマウスのものと比較検討した．dy／dyマウスの生後7日〜28日の膜内粒子密度はいずれも正常であったが，Orthogonalarray（OA）密度は生後14日より減少がみられ，そのsubunit particle密度は生後28日で有意に減少していた．また生後28日の筋症状が著明なdy／dyマウスと無症状のmdxマウスの微細構造変化を比較したところ，dy／dyマウス骨格筋細胞膜OA
密度は，mdxマウスより著明に減少していた．従って，OA密度の変化は，特に筋ジストロフィー症の場合では，その障害程度と相関することが示唆された．尚，本研究の詳細な内容は下記論文に記述されているl）．
文

献1）ShibuyaS，VhLkayamaY；OnikiH，etal：Acomparative
舟eeze一介acturestudyofplasmamembraneOfdystrophic

Skeletalmusclesindy／dymicewithmerosin（laminin2）
denciencyandmdxmicewithdystrophinde茄ciency．Neu・

ropathoIAppINeurobi0123：123−131，1997．

＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院電顕重
榊実験中央動物研究所＊＊＊＊国立精神・神経センター研究所
ー43−αI）ystroglycanの糖鎖構造とその機能的役割の解明
遠

研究協力者

佐々木

藤

玉

夫■

翼■

木

幡

KPCampbell＋＋
金 澤 一 郎…

陽書

山

田

広

樹…

千 葉 厚 郎い＋＋楠松 村 喜一郎…■ 清 水

輝

進…
夫…＊

はじめに

→3であった．シアリダーゼにより中性化したオリゴ糖は，筋細胞膜においてαdystroglycanを含む複合体は，細胞内ではdystrophinと結合し，細胞外では細胞外マトリックスのlamininと結合し，筋細胞膜の安定化機構に深く関与

ゲル櫨過で3．9グルコース単位（GU）の位置に主要ピークを与え，このオリゴ糖はGalβ1−4GIcNAc結合のみを特異的に切断する肺炎双球菌由来のβ一ガラクトシダーゼによりすると考えられている．αdystroglycanは最初に骨格筋で2・9GUに消化され，さらに同じく肺炎双球菌由来のβこけ
アセチルヘキソサミニダーゼにより0．8GUにまで消化さ見つかったが，その後様々な組織に存在することが分かった．この分子はその由来組織によって異なる分子量を示すが，組織により結合している糖鎖が異なるためにこうした差が生じると考えられている．これまでに我々は
αdystroglycanがSchwann細胞の主要なlaminin結合蛋白であり，その結合にはαdystroglycanの0結合型シァル化糖鎖が重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた1）．
そこで本研究では，αdystroglycan糖鎖の機能的役割を明らかにする研究の一貫として，その糖鎖構造について詳
細な解析を加えた．

れた．この最終消化産物はマンノースであった．また，
β・ガラクトシダーゼ消化後の2．9GUのオリゴ糖は，逆相カラムにてGIcNAcβ1−2Manの標準品と同一の位置に溶出した・以上の結果より，末梢神経αdystroglycanの主要な0結合型シァル化オリゴ糖は，哺乳動物には珍しいマンノースを還元末端に持つSiaα2・3Galβ1・4GIcNAcβ1・2Manであることが判明した．さらに，この糖鎖と同じ末端構造を持つ3 −Sialyl・N・aCetyIlactosamine（Siaα2・3Galβ1・
4GldヾAc）により末梢神経αdystroglycanとIamininとの結合は最も強く阻害された（図2）2）．次に，ウサギ骨格筋α

材料と方法

dystroglycanについても同様に糖鎖解析を実施した結果，ウシ末梢神経の膜分画およびウサギ骨格筋の膜画分よ

やはりSiaα2−3GalβlJIGIcNAcβ1・2Man構造を含むこと

りアルカリ抽出後，WGA−SephaTOSeCOlumnおよびlaminin・が判明した3）．なお，それに加えてウサギ骨格筋α

SepharosecolumnによりαdystrogIycanを精製した．そして，

dystroglycanにはシァル化されたGalβ1−3GalNAc（コア1）構

βエリミネーション法および弱ヒドラジン分解法により造も存在した．骨格筋αdyStrOglycanは，シァル酸を除くと初めてGalβト3GalNAcと強く結合するピーナッツレク

0結合型糖鎖を切り出し，それぞれ標識後陰イオン交換，ゲル濾過，レクチン，逆相の各カラムクロマトグラフィーと特異的な酵素による逐次消化を組み合わせ，その構チン（PNA）と反応するようになることが知られており4），
我々の結果は構造的にこれを支持している．

造を解析した．また，各種シァル化オリゴ糖のαdystroglycanとlamininとの結合に及ぼす阻害効果についても検討した．

考察
0マンノシル型糖鎖は，これまで其菌の細胞壁やゴカイの皮膚で中性あるいはグルクロン酸化されたものが報結告されている．一方，シァル酸を含んだものは，ラット

果

ウシ末梢神経およびウサギ骨格筋のαdystroglycanの精脳プロテオグリカン型糖蛋白にSiaα2−3Galβ1−4GIcNAc

製品の電気泳動像を図1に示す．それぞれの分子量は，前β1・3Man→Seげmrの構造が報告されているのみである5）．

者では約116K後者では約150Kであった．ウシ末梢神経α

本研究で，我々が見出した糖鎖構造はこのラット脳糖蛋

dystroglycanは，1モル当り約15モルのシァル酸（Sia）を含んでおり，そのうち約80％がN・アセチル体，残り20％が合様式が異なっていた．一方，結合阻害実験の結果から，

N−グリコリル体であった．なお，シァル酸の結合はα2糖鎖末端のSiaα2・3Galβ1・4GIcNAc構造が1amininとの結白に見られたものと極似しているが，GIcNAcとManの結合に関与していることが示唆された．lamininの欠損は，＊東京都老人総合研究所糖鎖生物学部門＊HHHlおよびlowa大学医学部＊＊＊東京大学医学部神経内科
榔陣帝京大学医学部神経内科

筋ジストロフィーや末梢神経における脱髄に関連することが良く知られている．本研究結果を踏まえると，αdystroglycan，特にそこに含まれる0マンノシル型新規糖
ー44−

202−

116−

84−

50−

．01

．1

1

10

Sugar【mM】

図2
12

αdystrogIycanとIamininの結合に及ぼすオリゴ糖の影響それぞれ各浪度の3．−SialyトN−aCetyllactosamine（3一一SLNAc），6I−Sialyl−N−aCetyllactosamine（6−SLNAc），3l−

sialyllactose（3一一SL），6l−SialylJactose（6 −SL），およびN−

図1ウシ末梢神経およびウサギ骨格筋のαdys廿OglycanのSDS−PAGE像
レーン1：ウサギ骨格筋αdystroglycan
レーン2：ウシ末梢神経αdystroglycan
左端に分子量マーカー（XlO●3Da）を示す．

鎖と1amininとの結合が，末梢神経における髄鞘形成において重要な役割を果たしている可能性が考えられた．さらに，骨格筋のαdys廿Oglycanでもこの糖鎖が見出されたことは，我々が提唱しているkmininの糖鎖リガンドとし

acetyllactosamine（LNAc）存在下αdystroglycaJlと血Ilininとの結合を測定した．96穴プレートにαdystroglycan（16ng）張り付け，各オリゴ糖存在下および非存在下ビオチン標識したlamininを反応させた．結合したlaminin量はavidin−biotincomplexkitと0−phenylenediamine dihydrochlorideの発色により定量した．オリゴ糖非存在下での値を100％とした．
3）SasakiT，YamadaH，MatsumuraK，etal：Detectionof
0−mannOSylglycanSinrabbitskeletalmuscle

α−dystr0−て役割機能説を支持するものであり非常に興味深い．我々

glycan．BiochimBiophysActa1425：599−606，1998．

が0マンノシル型糖鎖の存在を報告した後，追いかける

4）ErvastiJM，BurwellALandGeisslerAL：Tissue−SpeCi鮎

ように0マンノシル型糖鎖に関する報告が相次ぎ，興味

heterogeneityin

α−dystroglycan sial0glycosylation：

深いことにいずれも細胞接着に係わるといわれている糖

Skeletalmuscle

α−dystroglycanis alatentreceptorfor

鎖構造を含んでいた ），7）．その一つはヒツジ脳由来のαVicia villosa agglutinin B4

dys廿Oglycanに関するものであった刀．これらの結果は，modiGcation．JBioIChem272：22315・22321，1997．

動物種を越え組織を越えαdystroglycan上には哺乳動物には珍しい0マンノシル型糖鎖が結合していることを示し

5）KruSiusT，FinneJ，MargolisRK，etal：Ident班cationofanており，αdys打Oglycan機能発現におけるこの糖鎖の役割解明に興味が持たれる．さらに，0マンノシル型糖鎖のand keratBLn Sulfhte oligosaccharidesinthe chondroitin

生合成経路の解明および糖鎖異常と筋ジストロフィーや

8242，1986．

脱髄疾患などの痛態との関連の解明が急務な研究課題とmasked by sialic acid

O・glycosidic mannOSe−linked sialylated tetrasaccharide

SulfhteproteoglycanOfbrain．J BioIChem261：8237−

6）YuenC−T，ChaiRW，LovelessAM，etal：Braincontains

なっている．

HNK−1immunoreactiveO・glycansofthesulfoglucuronyl
lactosamineseriesthatterminatein2−1inkedor2，6−1inked

文献bexose（mannose）．JBioIChem272：8924−8931，1997，

1）YamadaH，ChibaA，EndoT，etal：Characterizationof7）Smalheiser NR，Haslam SM，Sutton−SmithM，etal：

dystroglycan−1aminininteractionin peripheraI nerve．J
Neurochem66：151811524，1996．

revealsanovelLewisxstruCtureincranin（dystroglycan）

2）ChibaA，MatsumuraK，YamadaH，etal：StruCtureSOf

Puri重ed丘■OmSheepbrain．JBioIChem273：23698−23703，

Sialylated0−1inkedoligosaccharidesofbovineperipheralnerve

α−dystroglycan：theroleofanovel0−mannOSyl−type oligosaccharideinthe binding ofα−dystroglycan

With1aminin．JBioIChem272：2156・2162，1997．

−45−

StruCtural

1998．

analysis of sequence0−linked to mannose

ⅠⅠ．肢帯型筋ジストロフィー匹GMD）

肢帯型筋ジストロフィーにおけるカルパイン3遺伝子変異の検討
後

研究協力者

緒

南

成

藤

雄

祐伊村

一■

山

久美子■

埜

中

方

言

肢帯型筋ジストロフィー（limb−girdlemusculardystrophy：

LGMD）は肩甲帯，腰帯などが好んで侵され，主に常染色体劣性，または常染色体優性遺伝を呈する筋ジストロフ
ィーである．近年，遺伝学的解析が進み，異なる遺伝子座を有するサブタイプが次々に明らかになった．現在，常染色体優性のLGMDIA〜1C，常染色体劣性のLGMD2A〜2Hが知られている．
15番染色体長腕に連鎖するLGMD2Aは，1995年に至って，骨格筋特異的に発現する細胞内プロテアーゼである
calpain3の遺伝子に変異があることが明らかにされたl）．
このサブタイプは当初Renion島住民から兄いだされたものだが，北米のAmish，ブラジル，フランス，イスラエ
ル，イタリア，レバノン，スイス，トルコ，アメリカのLGMD家系からも変異が兄いだされた1）・2）．
世界的な分布が明らかとなったLGMD2Aだが，本邦においてはその存在の有無すら不明であった．そこで本研究班において我々は，本邦における存在を確認することが急務であると考え，国立精神・神経センターの凍結筋バンクに保存されているLGMD患者の筋肉を使用し，

征

哉り仲

法

凍結筋より抽出した全RNAを用い，Calpdn3遺伝子の全翻訳領域を内包するRT−PCR産物を得てその塩基配列をサイクルシーケンシング法により決定し，正常配列と比較した．さらにゲノムDNAにおいて変異の存在を確認するため，患者から抽出したDNAの変異周辺部をPCR増幅
してシーケンシングを行い，また変異を見分ける制限酵
素切断法を行った．そのままでは適当な制限酵素による認識部位の変化がない変異はミスマッチプライマーを設計した．また，この制限酵素切断法を用いて正常対照群94
名のスクリーニングを行った．
結果
18名のLGMD患者を検索した結果，5名の患者から4種の塩基置換を見出した（表1）．アミノ酸置換を引き起こす
440G→C（R147P），1381C→T（R461C），2120A→G（D707G）と，intron5のスプライスドナー部位変異801＋1g→aであり，いずれもこれまでに報告のない変異である．アミノ酸置換は以下の3点より病的変異と判断した．（i）本来のアミノ酸が進化上よく保存されている，（並）側鎖の性質が変

calpain3遺伝子変異の探索を行った．また，筋病理像の検討結果から，分集線維（lobulated且ber）を高頻度に有する
LGMD患者は高率にLGMD2Aではないかという仮定を立化している，（邑）94名の対照集団（正常者と他疾患患者）からは見出されなかった．一方，スプライス部位変異は，

てられ，それを確かめるための検索を行った．

exon4＆5skippingを引き起こすことが判明し，タンパク質としてはプロテアーゼ・ドメイン中の101個のアミノ酸患

Rr−PCR産物のシーケンシングの結果，mmAにおいてが欠失することが予想された．

者

まず，国立精神・神経センターにおいて臨床所見と筋病理所見からLGMDと診断した患者より18名を無作為に選んで対象とした．LGMDはしばしばBMDと誤診断されるため，ジストロフィン抗体による免疫染色を行ってBMDではないことを確認した．また，サルコグリカン抗体による免疫染色の結果，LGMD2C〜2Fにあたるサルコ
グリカン異常症は除外された．家族歴に関しては常染色体劣性と思われる患者が4名，孤発患者が14名である．つ
ぎに，分業線経を高頻度に認めるLGMD患者9名を選び対象とした検索も行った．

＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部
榊国立精神・神経センター武蔵病院臨床検査部DM診断・情報室−49−

表1見出された変異
左列にヌクレオチドの変化を，右列にタンバク質への影響を示す．上から3つはアミノ酸置換を，一番下の変異は異常なスプライシング（CXOm4＆5
skipping）をそれぞれ引き起こす．ヌクレオチドの番号はcDNA上の翻訳開始コドンATGのAを1としている．
〃山ね〝On5ど穐CIs

440G→C

R147P

1381C→T

R461C

2120A→G

D707G

801＋1g→a AberrantspTIclng（1dnloHntron5）表2 変異が認められた患者のまとめ
円

表3＝鵬t10n Sox A908t MMT cK

R S。X A卵L認諾Od Mutatl。nS★

MBx On80t PlOX Dl劇

4＋15585R461C／Exon4＆5＄叫叩Ing日√十、二｝り‥6

80％

R461C／R461C

80％

G233V／G233V

40％

G233V／D707G

30％

G233V／G233V

一

5

2

5

1

6y

−

F

7y

V

3

V

27ylOy2

R147P／unknown M

457

一

1460

V

5

3

4

■ − 一

3＋

F

4

4＋

一

54y

M

35y

55y14y4

R461C／R461C M

579

3

D707G／D707G M

3

4＋

2

2

3＋

V

50y

9

63y

4

M

1

1R461C／R461C F

分葉線経を多数有するLGMD患者の検索結果

7669●4／8（50％）ねm‖os

√、￣・

−、

∴．乍十

l

● い

∫

．暦数．一1㌢

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・ヽ∫▲

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1

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′

■

、

図1患者4のNADH染色像 分乗線維（lobuIatedfiber）が多数認められる（矢尻）．

ゲノムDNAでの確認を行った結果，患者1と3ではR461C，
患者2ではD707Gのアレルのみを認め，ホモ接合である可能性が高いと考えられた．患者4はR147Pのヘテロ接合，

著で，とくに分乗線維（lobulatednber）の出現が4名に認められた点が特徴的であった（図1）．
分集線経を数多く有するLGMD患者8名を対象として新患者5はR461Cとスプライス部位変異801十Ig→aとのコン
パウンドヘテロ接合であることが確認された（表2）．患者
4の片方のアレルの変異は同定できていないが，その転写産物が検出されないことから，mRNAの発現量や安定性の低下を招く変異の存在が予想された．
臨床像を比較すると，アミノ酸置換のホモ接合である

たな検索を行ったところ，4名（50％）に変異を認めた（表3）．
すなわち，無作為にLGMD患者を対象としたとき（4／1摘患者1〜3よりも，より破壊的と予想されるnull変異とのヘテロ接合である患者4と5の方が発症年齢が低く，筋力低下の進行も早い，CK値も高い，といった傾向があった＝28％）よりも高率にcdpain3の変異が兄いだされた．新たに見つかったアミノ酸置換の変異698G→T（G233V）のホモ接合が2名，R461Cのホモ接合が1名，G233VとD707Gのコンパウンドへテロ接合が1名である．なお，6233V変異
も94名の対照集団には見られなかった．

（表2）．心筋症は認められなかった．患者5はまだ若く筋力低下が認められないが，筋痛と俳腹筋の仮性肥大が認められた．5名とも家族歴はなく，近親婚については患者
1の両親がいとこ婚であった．
筋病理像については，全5例で筋原線維間網の乱れが顕
ー50−

考

察

無作為に対象としたLGMD患者18名から5名（28％）に
calpain3遺伝子変異を見出した．これまで，本邦におけるLGMD2Aの存在を疑問視する考えもあったが，今回の研究によりその存在が明白になったのみならず，LGMDのなかでかなりの割合を占めることが示唆された．5名がすG233V−＝≒＝去一
R461C

D707G

Exon4＆5
Skipplng
図2 Calpain3タンパク質構造上での変異の位置
Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳはcalpain3のドメインを表す．アミノ酸置換を起こす3つの変異はドメインⅡ，Ⅲ，Ⅳに散在して存在する・
Intron5のスプライスドナー部位の変異はexon4＆5skippingを引き起こし，ドメインⅡの101個のアミノ酸を欠失させる・
ドメインⅡはプロテアーゼ活性を示し，Cys129とHis334が活性部位をなしている．ドメインⅢの機能は分かっていない・
ドメインⅣはカルシウム感受性ドメインであり，カルシウム結合モチーフであるEFhand構造を4つ持つ．NS，ISl，IS2はCalpain3以外のca】painファミリーには見られない配列である．

べて孤発例であったことも重要である．LGMDの過半数

文

献は孤発例であり，正確な頻度を知るには，より多くの患者について変異を調べる必要がある．

1）RichardI，BrouxO，AllamandVFougerousseF，Chian−

今回見つかったのべ5種の変異はcaIpain3遺伝子全域に散在しており（図2），ホットスポットはないとする報告に一致しているり・2）．しかし一方で，4名でR461Cを，3名でG233Vを認めたことは興味深い．本邦ではこれらの変異

proteolyticenzymecalpain3causelimb・girdlemuscular

nilkulchaiN，BourgN，BrenguierLetal：Mutationsinthe
dystrophytype2A．Cel181：27−40，1995
2）RichardT，BrenguierL，DincerlミRoudautC，BadyB，

BurgunderJM，ChemalyRetal：Multipleindependentが比較的高頻度に存在している可能性がある．Calpain3
抗体を用いたイムノプロットによりLGMD2A患者ではCalpain3タンパク質が欠損するとの報告があるが3㌧

molecular etiologyforlimb・girdle muscuIar dystrophy
type2Apatients丘omvariousgeographicalorigins．AmJ
HumGenet60：1128・1138，1997．

calpain3の自己消化現象から識別する方法が確立されない限り診断に応用することはできないであろう．従って，

3）SpencerMJ，Tidbal1JG，AndersonINBushbyKM，Har・LGMD2Aについては遺伝子診断が必須である状況が続くと思われる．その際，全シーケンスの解析をする前に，一次スクリーニングとしてR461CやG233Vを調べることが有効であると期待される．

pain3in a fbrm oflimb・girdle muscular dystrophy

risJB，Passos・BuenoMR，SomerHetal：Absenceofcal・（LGMD2A）．JNeuroISci146：173−178，1997．
4）OnoY；ShimadaH，SorimachiH，RichardI，SaidoTC，
BeckmannJS，IshiuraS．etal：Functionaldefbctsofamus・

最近，Calpain3の変異体の生化学的性質の解析から，プ
ロテアーゼ活性の低下がLGMD2Aの発症原因であることを示唆する報告がなされた4）．しかしながら，どのようにして筋病変へと至るのかについては未だ想像の域を出て

Cle−SpeCificcalpain，P94，CauSedbymutationsassociatedWithlimb・girdle muscuIardyStrOphytype2A．J BioI
Chem273：17073・8，1998．
5）SorimachiH，KinbaraK，KimuraS，ThkahashiM，Ishiura

いない．また，Calpain3が筋原線経の巨大弾性タンパク質であるconnectinと相互作用することも，分子レベルの病

S，SasagawaN，SorimachiNetal：Muscle−SPeCinccalpain，態を考える上で大変興味深い5）．我々の結果は，Calpain3
異常筋において分乗線経が出現しやすい傾向にあること

2A，aSSOCiateswithconnectinthroughIS2，aP94−5peCinc

p94，reSpOnSibleforlimbgirdlemusculardystrophytype
SequenCe．JBioIChem270：31158−31162，1995．

を示しているが，この分業線経を研究することでこれらの過程について情報を得られる可能性があり，今後，微細形態学的な検討などを進める必要性があるだろう．

−51−

Calpain亨の遺伝子異常が認められた常染色体劣性肢帯型
筋ジストロフィー（LGMD2A）の4家系9症例の臨床，筋病理，
遺伝子異常ならびに骨格筋におけるCalpaimの発現
川 井 尚 臣■

研究協力者

足

立

克

仁＊＊

柏

木

節

子書棚＊

Beckmann，JS輌咽＊

乾
西
石

周
浦

俊
善
章

夫榊

彦榊榊

佐

橋

功榊■衣

斐

達■■＊＊

Richard，Ⅰ■榊■＊■一＋＋＋＋＋＋■＊反

町

洋

之＊輌輌

要 約 Calpain3の遺伝子異常を有する症例の臨床，筋病理，遺伝子異常，並びに骨格筋におけるcalpain3の発現について述べた．筋萎縮は肢帯型優位で，発症年齢は10歳前後，歩行不能は40歳前後と経過は比較的緩徐であった・筋病理ではいわゆる筋ジストロフィー所見をし示したが，Opaque線維はきわめて少なく，再生筋細胞はほとんどみられなかった．遺伝子異常は，家系1と2にGlO80C，家系3には1796insAが，そして家系4の例には・
35exon12』Gが認められた・生検骨格筋を試料としたウエスタンプロットでは，家系1の症例はcalpain3はほぼ正常に残存しており，家系3と4の症例は完全に欠失していた．
はじめに
Calpain3は骨格筋に特異な蛋白分解酵素である．1991
年Richardらl）によりはじめて常染色体劣性肢帯型筋ジス

NADH−TR，ArPase（pH9．2）などの染色を行った．その他に，各種後述の膜関連蛋白（後述）を免疫組耗化学的に調べた．

トロフィー（LGMD2A）患者に本蛋白質の遺伝子異常のあることが明らかにされた．その後，我が国2）を含め世界各国から本症の遺伝子異常が報告されている礼3）．
本論文では，我々がほぼ35年前より常染色体劣性の肢ならびにDNAを試料として，Calpain3遺伝子に特異的なプライマー1），2）を用いてDNA断片の塩基配列を調べた．

帯型筋ジストロフィーとして経過を観察していた症例に検筋ホモジネート20〜40mgをSDS PAGEミニゲル（8〜Calpain3の遺伝子異常を見出したので，それらの症例について臨床像，筋病理組織像ならびに遺伝子異常を述べ，16％）にて電気泳動後，PVDF膜に転写し，抗Calpain3抗体

遺伝子解析は，培養末梢血リンパ球より抽出したRNA

骨格筋試料のウエスタンプロット方法としては凍結生（山羊抗体でcalpain3のIS2領域のN端側22個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドで免疫して得られたものを1次さらに骨格筋中のcalpain3の発現についての成績を述べる．

抗体として，4℃でインキュべ−トし，ABC法を用いてDABにて発色した．なお，筋試料解凍からSDS mGEゲ

対象と方法

ルにかけるまで20分以内で行った．

対象として，両親に近親婚があり，筋萎縮は肢帯型優位で，筋病理組織所見がいわゆるジストロフィー変化を

結筋病理組織所見：大腿四頭筋，あるいは大殿筋の生検筋で，筋細胞の大小不同，円形化があり，筋細胞の内部構

示した4家系（Ⅰ，Ⅱ，ⅢおよびⅣ）9症例である．現在の年齢は53〜糾歳（平均54．5歳）で，発症年齢は8〜12歳（平均9．7歳）である（表1）．

築もやや乱れていた．壊死・変性細胞は少なく，Opaque細胞はみられなかった．しかし，特殊な構造物もなく，問質も増生しているなど，いわゆるジストロフィー性変方法：上記4家系のうち，生検筋が得られた4症例（トⅣ−
2，2・Ⅳ・6，3・Ⅳ−4，4−Ⅲ−5）の筋病理組織像を調べた．染色はへマトキシリン・エオジン（HE），Gomoritrichrome変法，
高松市民病院内科
国立療養所徳島病院内科■＊ 国立療養所徳島病院神経内科＊＊＊■ 愛知医科大学第四内科＊＊＊＊■ 徳島県健診センター＊■＊＊■＊ 徳島大学医学部第一内科化がみられた（図1）．ミトコンドリア異常はみられなかった．免疫組織化学ではジストロフィン，サルコクリカン＊（α，β，γ），ラミニン2などは正常に染色された（図略）．電＊＊＊＊＊＊＊＊＊
榊＊＊＊＊＊＊榊＊＊＊＊＊

果

顕的にはpatchyにZ帯の崩壊がみられ，隣接するⅠ帯，そしてA帯にも崩壊像がみられた．ミトコンドリアの変形や膨化も認められた．

Genethon，France

東京大学大学院総合文化研究科
東京大学分子細胞生物学研究所
ー52−

■H

E

図1病理組織像．筋細胞の大小不同があり，壊死と再生細胞は少ないが存在し，内部構造の乱れなどもみられる・いわゆる筋ジストロフィー変化を示す．75倍．

家系1，家系2

家系3

Exon8

家系4
・35Exon12

Exon15

貝机珊止

Normal＿．1

Trp
GGAATCCGTGGGGCCAGG

AAGAAAAAAACCAAGGTAG GCTTCAGATGTGAATGAG

detetton G
nt．・35exon12

insertion A
nt．1796

G→C
nt．1080GGAATCCGTGCGGCCAGG AAGAAAAAAAACCAAGGTAG GCTTCAGATTGAATGAG
Cys
几

付

l

証甘心

／lL血

ハHL

上・・・巨 ‖

Patient

圃2 遺伝子解析．家系Ⅰ，ⅡはGlO80C，家系Ⅲには1796insAがあり，家系Ⅳには−35exon12AGの変異が認められた．
Calpain3

＋

＋

＋

￣

￣

表1症例の臨床所見
94kDa■ト叫、脱砂洲．．．．．∴

ず触晶隷・蝉寮

対照

ALS

一磁≡魔韻

ぎ

、こ「嶋‥

′ノ蝉′

ィll川8

症例1症例2症例3

GlO80C
1796insA−35exon12∠1G

図3 Calpain3のウエスタンプロット検嵐症例l（1−Ⅳ一2）ではcalpain3量は対照とほぼ同じ量，あるいはそれと似上認められ，症例2（4−Ⅲ−5）と症例3（3−Ⅲ4）とは完全に欠損していた．

年 齢
性
発症年齢
丙覇の近鯛緒同胞敷（病者数l
下肢機能儒害
歩行不能年齢

57

55

53

男
10

臭
10

舅
8

またいとこ婚
Ⅵl
40

6（3）
Ⅵ】
40

Ⅵ1
35

血清CK価（lU／L）い96174 297

世二二4
50
女

「

遺伝子興常

59

女
9

女
10

いとこ場

4（2）
Ⅵ
Ⅵl
？ 40

6（2）
Ⅵl
Ⅵ
37
39

600

日132

305

十

∩．e．

シーストロフィー変化
n．e．
∩．e

∩．e

＋

n e．

n．e，

n．e

・ナ

n．e．

n．e．

∩．e

GlO80C

64

8（2）
V
W
42
37

∩，e

∩．e

川一S llト6

またいとこ揮！いとこ館

8億18倍 20伯 15億12億
肢鞘紆優位
肢鞭郡優位
シ■朴ロブイ→変化

川−4†針4芸†呈1（47−2771∪／し〉青年期CK価
筋萎稲
筋病理所見
ジストロフィン
α−SAG
ラミニン2

4

鳳一■Hi

Ⅳ−6】＝−3

G1080C？10倍
肢帯部優位
シ▲小口フィー変化

411

596

？10僧
腹帯耶優位
シ■朴8フィー変化

∩，e．

＋

十

十

∩．e．

＋

十

十

∩．e

＋

＋

十

1796A G

一35eyOn12AG∩−e・nOte焔minnod．SqG：SarCOがycan−53−

症例HV−2（pt．1）

症例3−111−4（pt．3）﹃ ポ ∴ J ∵ 増

22歳時

54歳時（現在）

62歳

図4 症例の写真．左二つは症例1（1−Ⅳ−2）の約32年前の写真である．肢帯，腰帯，四肢近位部に優位な筋萎縮がみられる．中央はその54歳時のもので独歩は不能で全身の筋萎縮がみられるが，肢帯優位の傾向がみられる．右端は症例3（3−Ⅲ4）の現在のものであるが，筋萎縮は全身，四肢遠位部に及んでいる．

Calpajn3の遺伝子異常：遺伝子解析については，家系ⅠとIIでは，ゲノムDNAに同じGlO80Cの変異が認められ〜12歳と遅く，歩行不能年齢は35〜42歳（平均38．5歳）と緩徐であった．

た・この2家系はcalpain3遺伝子の近辺のマーカーDNA（5種類）のハプロタイプ（Dl5S514，D15S779，D15S782，
D15S780，D15S778）も同じであった．一方，家系Ⅲでは
1796insAの変異がみられた．家系Ⅳでは−35exon12△GがCalpain3の遺伝子異常を有する4家系9症例について，
臨床的な特徴は，筋萎縮はいずれも腰帯部優位であり，検出された（表1，図2）．これらの家系ではDNAハプロタ
イプはホモ接合型であった．

考察

発症年齢，経過なども同じくDuchenne型あるいは悪性肢

生検骨格筋中calpain3のりエスタンプロット：症例1（トⅣ−2）では94kDの位置に一本のバンドが認められ，これがcalpain3と考えられた（図3）．このバンドは正常対照筋，ALS筋のものに比べむしろ濃く認められた．症例2（4−Ⅲ−5）ではcalpain3に相当する94kDのバンドは全く認められず，症例3（3−Ⅲ4）でも同じく94kDのバンドは認められなかった（図3）．
臨床症状と経過：初期の青年期には筋萎縮は腰帯部，肩肝部，四肢近位などに優位に認められた（図4，左，中央）．
俳腹筋の軽度の肥大所見も認められた．顔面の筋萎縮は軽度であった・現在は，筋萎縮は全身性に認められる（図4，中央，右端）が，やはり同上部位に優位な傾向が認められた．軽度ながら関節の拘鮪も認められた．血清CK活性値は現在（50〜60歳代）ではほぼ正常値を示すが，青年期には正常の10〜20倍とDuchenne型に比べ中等度の上昇が認められた．
我々の症例の臨床経過は比較的緩徐で，互いに極めて類似していた．臨床経過は筋ジストロフィーのDuchenne型や悪性肢帯型（SCAMとほぼ同じ）に比べ発症年齢は8ー54−

帯型（MLGMD）やSCAMと比べ緩徐であった．顔面筋は比較的障害が少なかった．
筋病理所見は，基本的には筋ジストロフィー性変化であった．他の報告者4）により指摘されているlobulatednberはみられなかった．我々の症例は，年長時に採取した生検筋を用いたためこの所見がなかったのかも知れないが，必ずしも本症に特異的た所見とは云えないと思われた．
電顕的にはZ帯の崩壊，その近接のl帯，A帯にも変化が認められた．これは他の筋ジストロフィーにもみられる所見であるが，本症の筋崩壊がZ帯にはじまり，l帯，そしてA帯へと進展していくことを示唆している．この筋崩壊のプロセスとcalpain3の機能との直接の関連は今のところ明らかでない．
遺伝子異常については，自験家系はすべて両親に近親婚があり，またDNAマーカーもホモ接合型であった．そしてCalpainの遺伝子に変異が認められたことから，これらの例の病因はcalpain3の遺伝子異常によるものと考えられる．更に家系ⅠとⅡの祖父母は近隣地域の出身であること，DNAハプロタイプも同じであることより，これらの家
系例の遺伝子変異は創始者効果によることが考えられた．

自験例の遺伝子異常はいづれもcalpain3の活性ならびに構造に異常を生じ，本蛋白質の機能が異常になること

Calpain3のウエスタンプロットによる検索はすでに
Spencerら（1997）5）の報告があるが・全での例でCalpain3がが推定されるが，Calpain3分子が実際に筋細胞内にどの程度に存在するかが問題となる．これをウエスタンプロ
ットにより確かめた．その結果，3家系3症例のうち1例で欠損している．Calpain3の遺伝子異常は本遺伝子の各部はcalpain蛋白が正常筋とほぼ同じように認められた・この症例はClOgOGの遺伝子異常をもつ症例であるが，アミノ酸としては，W360Cのアミノ酸変異，すなわちトリブ

唆するものであ．り，本症の症例の臨床経過，臨床症状に位に生じ，とくにhotspotは見当たらない・このことは遺伝子異常により種々の変異caIpain3が生成することを示
かなりの多様性が生じることが推定される．
文献

トフアイがシステインに置換するものであり，この部位にSH基を有するアミノ酸が一つ増えることになる．異常

1）RichardI，BrouxO，AllamondVetal：Muttionsinthe

部位が蛋白分解酵素の活性部位に当たることから，恐らprotolyticenzyme Calpain3causelimb・girdlemuscularく酵素活性の低下したcalpain3分子が合成され，このため，代償的にcalpain3の生成が増加した可能性がある・

2）KawaiH，AkaikeM，KunishigeM，etat：Clinicalpath0・

dystrophytype2A・Cel181：27−40，1995

次に症例2（4−Ⅲ一5）であるが，この症例の塩基変異はイントロンに検出され，エクソンには認められなかった．本

logiCal，andgeneticftaturesoflimb・girdlemusculardys・

例ではスプライシング部位（Splicingsite）の近傍に変異が生じたため，スプライシング異常がおこり，蛋白生合成不patients舟omthreeJapaneSe免milies・MuscleNerve21：

全が生じたと考えられる．症例3（3−Ⅲ−4）では塩基番号

3）UrtasunM，SaenzA，RoudautC，etal：Limb・girdlemus・

1796にadenine（A）の挿入が生じたためコドン360が終止コ
ドンになり，その結果，Calpain3のCa＋結合部位を含むC
末端部分が欠損することが同蛋白質の欠損理由と考えら

culardystrophyin Guipuzcoa（Basque Country，Spain）・れる．以上のことより，CaIpain3の遺伝子異常の座位や種類によって同蛋白質に種々の生合成異常がおこり，生trophytype2Awithnewcalpain3genemutationsinseven1493−1501，1998．

Bmin121（n9），1736−1747，1998・
チ）後藤雄一‥肢帯型筋ジストロフィーにおけるカルパ
イン3遺伝子変異の検討．平成9年度厚生省精神・神経疾患研究委託費による研究報告集（2年度班・初年度

合成がむしろ冗進する例や，欠損する例のあること，さらに，同遺伝子のエクソンに異常がなくともcalpain3の欠損が生じることなどが明らかになった．国外における班）1997，p51
5）SpencerMJ，TidballJG，Andersonu／B，etal：Absenceof
calpain3inaform oflimb・girdle muscular dystrophy

LGMD2Aの報告例の中で，Calpain3の生合成の増加（減少
していない）例や，イントロンの遺伝子異常によるcalpain3の欠損例の報告はみられない．

（LGMD2A）．JNeuroISci146：173・178，1997・−55−

筋ジストロフィー生検筋におけるカルパインの免疫組織化学的観察およびウエスタンプロット解析

●

珍臣之

■
■
■
●

桂尚洋

■
■
■
■
■
●

・事
●
●
■
■

井町

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■

張川反

■

中

▲■
■
●
●
■

康夫哉

■

裕俊征

事

上

達群祐一

■
▲T
■
■
●

■

浦

井乾埜．

立成章

功い■

＊
■

橋

斐

衣任南石

研究協力者

佐

要 旨 カルパイン・ファミリー；カルパイン1，2，3の筋ジストロフィー生検筋における免疫染色と，肢帯型ジストロフィー（LGMD）2A型生検筋のカルパイン3・ウエスタンプロット（WB）解析を行なった．免疫染色ではカル
パイン1，2，3ともに筋形質にびまん性に分布し・カルパイン1，2は形質膜に，カルパイン3は核に強く発現していた．
病的筋では再生筋に多く発現し，筋の発達′分化への関与またrimmedvacuole型遠位型ミオパチーの萎縮線経での高い発現は筋構成蛋白のダウンレギュレーションとの関連を考えた．wB解析では24例中8例でカルパイン3のバンドが検出されなかったが・LGMD2A遺伝子異常が確認された一部症例でも検出／非検出例があり，WB法の問
題点や限界を考察した．
はじめに

抗力ルパインS（Smallsubunit，30kDa）抗体（マウス単クロ

カルパイン・ファミリーには普遍的カルパインと組織ーン抗休，Chemicon），抗力ルパイン2抗体（家兎抗体，

特異的なカルパインのグループに分けられる1）．前者にはカルパイン1（〟）と2（m）があり，後者には骨格筋に特異的

Chemicon社），抗力ルパイン3抗体（山羊抗体，カルパイ
ン3のIS2領域N端側22アミノ酸残基からなるオリゴペプ

なカルパイン3（nCLl、p94）があり，肢帯型ジストロフ

チドで免疫）を用い免疫染色した．

ィー（LGMD）2A型の病因として知られている2）．我々はウエスタンプロット（WB）法

カルパインの各アイソフォームに対する抗体を用い，筋

対照骨格筋にて上述の各抗体を用いWB法を行った．

ジストロフィー（PMD）の生検筋においてその局在を免疫

また抗力ルパイン3抗体によるウエスタンプロット法の対

組織化学的に検討した．またカルパイン3の自験LGMD症

象は，診断未定のLGMD24例（3例はカルパイン3遺伝子解例の生検筋凍結保存材料においてウエスタンプロット

析にてLGMD2A型と診断済3りを用いた．疾患対照として（WB）法を行い，カルパイン3欠損を確認できるか否かにつき検討をおこなった．

BMD2，FSH2，MyD2，筋萎縮性側索硬化症（ALS）1，
急性骨格筋壊死1の生検筋凍結保存標本を用いた．
WB法は，ドライアイス凍結保存生検筋ホモジネート

対象および方法

20−40FLgをSDSPAGEミニゲル（8−16％）にて電気泳動後，

免疫組織化学的検討

PVDF膜に転写し抗力ルパイン3抗体をl次抗体として4℃

PMDとしてDuchenne型PMD（DMD）4，DMD保因者4，
Becker型PMD（BMD）5，LGMD15，顔面肩甲上腕型PMD（FSH）3，筋緊張性ジストロフィー（MyD）6，rimmedvacuole型遠位型ミオパチー（DMRV）4の生検骨格筋の新鮮凍結切片を用いた．

でovemightインキュべ−トし，ABC法を用いDABにて発色し検討した．
またWB法にてLGMD2A型が疑われた6例において，カルパイン3遺伝子のRT・PCR産物よりLGMD2A遺伝子領域の塩基配列を検討した4）．

免疫組織化学染色は，生検筋新鮮凍結切片（8〟m厚）をABC法（Vectastainelitekitを使用）により，一次抗体として抗力ルパイン1抗体（マウス単クローン抗体，Chemicon），

結

果

免疫染色

＊愛知医科大学第4内科
榊愛知医科大学加齢医科学研究所
蝉＊国療徳島病院
抽峰高松市民病院
榊榊＊国立精神・神経センター＊＊＊割陣東京大学分子細胞生物学研究所
榊榊榊東京大学大学院総合文化研究科

カルパイン1の免疫染色は，筋形質内にびまん性に陽性であり形質膜と核により漠染していた．また再生線経や￣部萎縮線経の筋形質で他線経より濃染していた．MyD
でのSarcoplasmicmassやDMRVでの萎縮線経でより濃染したが，rimmedvacuoleの壁は濃染しなかった（図1）．
−56−

：・Calpainll

図1カルパイン1のミオパチ一筋における局在
ヵルパイン1の免疫染色では筋形質内にびまん性に陽性であり，形質膜と核により濃染していた・再生線経や一部萎縮線経の筋形質で他線経より濃染していた．筋緊張性ジストロフィーOVlyD）でのSarcoplasmicmassやrimmedvacuolC型遠位型ミオパチー（DMRV）での萎縮線経でより濃染したが，rimmedvacuoleの壁は漠染しなかった・

図2 カルパイン2のミオパチ一筋における局在
カルパイン2では筋形質に比し，問質膠原線経が濃染していたが，他はカルパイン1とほぼ同様の結果であった・

−57−

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且＿＿ ＿二一空二＿⊥＿＿一＿＿＿dDMRV、、寧 ここ 二二二二 ＿＿図3 カルパイン3のミオパチ一筋における局在
カルパイン3では筋形質にびまん性に染まり，カルパイン1より核に濃染していたが形質膜は明瞭ではなかった．再生線絶SaTCOPlasmicmassやDMRVについてもカルパインlとほぼ同様の結果が得られた．

Calpainl CaIpain2

カルパイン2は，筋形質に比し問質内の線維性結合織が漠染していたが，他はカルパイン1とほぼ同様の結果であった（図2）．
カルパイン3は，筋形質にびまん性に染まり，カルパイ
ン1より核に溝染していたが形質膜は明瞭ではなかった．

Calpain3

94kDa

80kDa
一十

80kDa

再生線経，SarCOplasmicmassやDMRVについてもカルパイ−一一十ン1とほぼ同様の結果が得られた（図3）．なおLGMD例についてLGMD2A型の確定診断は明らかではないが，筋形
質および核での染色性が明らかに低下した症例はみられ
なかった．

一■

カルパインSは，カルパインⅠとほぼ類似の結果を得た．
ウエスタンプロット解析
5分

対照筋のWB解析は，カルパイン1，2では分子量80kDaに各カルパインに対するバンドが見られた．カルパイン330分

図4 対照筋でのカルパイン1，2，3のウエスタンプロット
解析
カルパイン1と2では，分子量80kDaに各カルパインに対するバンドが見られた．カルパイン3は自己消化による分解が早いため，筋組織を解凍してゲルに乗せるまでの時間を5分と30分に分けて比較したが，処理時間5分ではカルパイン3に対応する
94kDaとより低分子の部位に分解産物と考えられるバンドが見られたが，処理時間30分では検出されず，分解産物のバンドのみ見られた．

は自己消化による分解が早いため，筋組織の解凍後にゲルに乗せるまでの時間を5分と30分に分けて比較したが，処理時間5分ではカルパイン3に対応する94kDaとより低分子の部位に分解産物と考えられるバンドが見られた．
しかし処理時間が30分では検出されず，分解産物のバンドのみ見られた（園4）．ゆえに本検討では20分以内で出来る限り迅速な処理を心掛けた．

ー58−

■144．OkD
紳

94kDa
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図5

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9659
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TI Tユ

LGMD24例でのウエスタンプロット解析
LGMD2Aの分子遺伝子学的な確定診断を終了していた3症例（Tl・T3）では，2例で欠損を1例でバンドを検出した．遺伝子解析が未施行21例中6例では94kDaのカルパイン3のバンドが検出されなかった．

カルパイン3のLGMD筋および疾患対照筋の結果についカルパイン3は骨格筋に特異的に存在し，カルパイン1，2ては，後者の全例に94kDaのカルパイン3のバンドが検出された．LGMD筋では，LGMD2A型の分子遺伝子学的な確定診断を終了していた3例では，2例で欠損を1例ではバンドを検出した．遺伝子解析未施行の21例中6例では，94より多量に存在する．そしてLGMD2Aの病因としてカル
パイン3遺伝子異常が指摘されているが，自験LG例での免疫染色では明らかなカルパイン3の欠損を組織学的に確認できなかった．これに関してはカルパイン3抗体の他のkDaのカルパイン3のバンドが検出されなかった（図5）．遺伝子解析が未施行例で，WBでバンドが陰性の4症例と検出量が微量であった2症例の愛知医大例において遺伝子解

カルパインへの交叉反応や非特異染色の可能性も否定で析がなされたが．陰性症例1例（後記）にのみC・565−G変異

ン3は自己消化による分解が早いとされ自験例でも処理時（Leul＄9Val）が検出された．これはカルパイン3のプロテアーゼ活性部位；ドメイン2遺伝子領域内にある変異であり，他のカルパインにおいても保存されているアミノ酸であった．

間が長いものでは検出できなかったが，短時間の処理できなかった．
つぎにWB解析の結果は，対照筋の結果ではカルパイ

は検出可能であり，LGMD2A型のスクリーニングとしての有用性が示唆された．しかしLGMD2Aの凍結保存の生検骨格筋の本解析では，遺伝子異常が証明された症例においてもカルパイン3のバンドが検出され，LGMD2Aの

愛知医大LGMD2A症例の臨床像
症例は45歳女性で両親が従兄妹婚，25歳より下肢筋力低下にて発症し，筋力低下は緩徐に進行し入院精査とな中にはカルパイン3の蛋白または類似蛋白が産生される症例が存在する可能性が示唆された．またカルパイン3が検った．入院時所見は身長162cm，体重44kg．上肢より下肢に強い近位筋の筋力低下があったが，顔面筋，前頸筋および上下肢の遠位筋の筋力はほぼ保たれていた．検査
所見はCKなどの筋逸脱酵素は軽度に増加していた．筋電図では筋原性変化であった．骨格筋CTでは体幹の傍脊柱筋や腹筋，背筋の脂肪化が著明で下肢では大腿および下腿の屈筋群の脂肪化が著明であった．大腿四頭筋での筋出されない症例で遺伝子異常が確認できなかったことは，今回のWB解析の方法論的な問題や限界，さらに検体の保存や爪brosisにより筋構成蛋白量が充分でなかった可能性などを考えた．
文献1）SuzukiK，SorimachiH，YoshiZaWaT；etal：Calpain：

生検所見はNADH−TR染色やcytochromecoxidase染色で萎縮タイプ1線経のlobulated nberが多数見られ，myOSin
ArPase染色でタイプ1線維萎縮，myOSin heavy chain
developmental，neOnatalisoforms染色で陽性の再生線経が散在していた．
考察Novel払mily members，aCtivation，and physiologiCalfunction．BioIChem376：523・529，1995．
2）RichardI，BrouxO，AllamandV；etal：Mutationsinthe
proteolyticenzymecalpain3causelimb−girdlemuscular
dystrophytype2A．Cel181：27−40，1995・
3）KawaiH，Akaike M，KuniShige M，etal：Clinical，
PathologlCal，andgeneticftaturesoflimb−girdlemuscular

カルパインの骨格筋における局在はカルパイン1，2，3ともに筋形質にびまん性に分布しており，カルパイン1，2では形質膜に，カルパイン3では核により強く発現していた．

dystrophytype2Awithnewcalpain3genemutationsin

カルパイン1，2では生体膜との，カルパイン3では核とのその機能上の関連が示された．病的筋では再生筋に多く

4）後藤雄一，南 成祐，村山久美子ら：肢帯型筋ジス
トロフィーにおけるカルパイン3遺伝子変異の検討．

発現することは筋の発達／分化への関与、またDMRVでの萎縮線経における発現は筋構成蛋白のダウンレギュレーションとの関連性が考えられた．

平成9年度厚生省精神・神経疾患研究委託費による研SeVenpatients危・Omthreej叩aneSeぬmilies・Muscle＆Nerve21：1493−1501，1998．

一59−

究報告集（2年度班・初年度班）1997．pp51．

Sarcoglycanopathyにおける遺伝子異常と各sarcoglycan欠損様式の閑適についての研究
納光 弘●

協力研究者：樋口逸郎●

中福

川井尚臣●●

川永

正 法● 岩
秀 敏…

城

宏

之●

要 旨 遺伝子異常の確定したα−SarCOglycan欠損症3例とγ・SarCOglycan欠損症1例の免疫組織化学的検索を行ったところ・遺伝子異常が存在するsarcoglycanの方が欠損の程度がより著明であった．各sarcoglycanに対する免疫
組綴化学的染色によりsarcoglycanの遺伝子異常をある程度推定できる可能性があり，今後より多くのsarcogly−
CanOPathyにおいて遺伝子異常と各sarcoglycan分子の発現異常についての詳細な検討が必要である．またγ−SarC0−
glycan欠損症の1例では6−SarCOglycanは特によく保たれており，SarCOglycanopathyの免疫組織化学的スクリーニ
ングの際に単一の抗体のみの検索では見落とす可能性があることを示唆しており，注意を要する．
はじめにはγ−S訂COglycanの染色性の低下に比べ保たれていた．こ

我々はこれまでにSarcoglycanOPathyの4症例を報告し，れらの結果は，各sarcoglycanに対する免疫組織化学的染本症の筋膜上においてSarcoglycanの欠損とともにlaminin

色によりsarcoglycanの遺伝子異常をある程度推定できる

β1，へパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）及びCD44

ことを示唆している．また注目すべき所見としてγ−（HCAM）の発現異常が見られることを明らかにLl）・2）・3），まSarCO如canの遺伝子異常がある症例4においては6・た，SarCOglycanOpathyにおいては症例により各sarcoglycanの欠損様式が異ることを報告した4）．今回我々は遺伝子異5arCOglycanは非常によく保たれていた．正常対照例では

常の確定したSarcoglycanOPathyについて，各Sarcoglycanに

α，β，γ，6−SarCOglycanおよびdystrophin C末端はすべて筋膜上に全周性に発現していた．

対する免疫組織化学的染色によりsarcoglycanの遺伝子異常を推定できるか否かについて検討した5）．

考察SarCOglycanの一つが欠損すると他のsarcoglycanも同様
方法に欠損あるいは減少すると考えられているが，α，β，γ，

免疫組織化学は，遺伝子異常の確定したα−SarCOglycan
欠損症3例（症例1，2，3）とγ−S訂COglycan欠損症1例（症例4）の6の各sarcoglycan遺伝子異常における各sarcoglycan分子の欠損の程度の詳細については報告が少ない．今回の我々

生検筋の連続凍結切片について，α−SarCOglycan，β−の検討ではα−SarCOglycan遺伝子異常が確認された3例とSarCOglycan，γ・SarCOglycan，6−SarCOglycan及びdystrophinC

γ−S訂COglycm遺伝子異常が確認された1例のsarcoglycan欠損様式には差が認められており，遺伝子異常が存在する

末端に対するモノクローナル抗体を用いてABC法にて染色し比較検討した．
結果

SarCOglycanの方が欠損の程度がより著明であった．
表1Sarcoglycanopa叫y4例の遺伝子異常と免疫組織化学

図1と表1に4症例の染色結果を示す．α・SarCOglycanの遺伝子異常がある3例では，程度の差はあるがα＿SarCOglycanに比較してγ・SarCOglycanの抗原性がより保た

BS BSH BS＝
＋

±

±

±

±0︷

±

±

N

N

6−Sarcoglycan

程度まで低下していたが，γ・SarCOglycam欠損症においてdystTOphin

N

O

±

γ−S訂COglycan

α−SarCOglycan欠損症3例ではα−SarCOglycanの染色性と同

4

α

O

β−Sarcoglycan

3■
α

＋N

原性がより保たれていた．またβ・SarCOglycanの染色性は，

α−Sarcoglycan2α︸においては，γ・SarCOglycanに比較してα・SarCOglycanの抗遺伝子異常の種類
免疫組織化学1±＋れていた・一方γ・SarCOglycanの遺伝子異常がある症例4

症例
変異Sarcoglycan

N‥nOmalexpressionI十十：mOderateexprcssion，＊鹿児島大学医学部第三内科＊■徳島大学医学部第一内科．高松市民病院
榊国立療養所南九州病院＋：Slightexpression，±‥fhintexpression，0：nOeXPreSSion●症例2の姪，Hnt40島と409の間に15塩基の挿入も伴う
BS：塩基置換，D：欠失−60−

図1S訂COglycanに対するモノクローナル抗体による免疫組織化学的染色
α・Sarcoglyc？n（a，b，C），β−Sarcoglycan（d，e，f），γ−Sarcoglycan（g，h，i），6−SarcoglycanU，k，l），DystrophinC末端（m，n，0）・

症例1（ちd，g，J，m），症例4（b，e，h，k，n），正常対照（C，い，1，0）．

−61−このことがsarcoglycanopathyに一般的に認められるのか，
あるいは一部の症例においてのみ認められるのかを明ら

2）HiguchiT，FukunagaH，MatsumuraK，etal：Abnomlal

かにするため，今後より多くのsarcoglycanopath再こおいて

naofmusclefibersintwoJapanesepatientswithadhalin

遺伝子異常と各S訂COglycan分子の発現異常についての詳

denciency．NeuromuscDisord5：467・474，1995．

expressionofheparanSulfateproteoglycanOnbasallami−

細な検討が必要であり，さらにsarcoglycanopathyの臨床的

3）HiguchiI，FukunagaH，MotokuraF；etal：Characteristic

重症度と各sarcoglycan分子欠損の程度の相関に関する検索も，本症の病態解明のため不可欠であると思われる．

expression ofcelladhesion moleculesin adhalin de爪−

また，6−SarCOglycanの発現はγ−S訂COglycanの遺伝子異常がある症例4で非常によく保たれていたが，このことは

4）HiguchiI，IwakiH，KawaiH，etal：Newmissensemuta−

SarCOglycanOPathyの免疫組織化学的スクリーニングの際にwithSeverechildhoodautosomalrecessivemusculardys・

単一の抗体のみの検索では見落とす可能性があることを示唆しており，注意を要する．

trophy withincompletealpha・SarCOglycan denciency・J

Ciency．JNeuroISci143：79−83，1996

tioninthealpha−SarCOglycangeneinaJapanesepatient

NeuroISci153：100−105，1997．
5）HiguchiI，KawaiH，UmakiY；etal：Di飴rentmannersof

文

献SarCOglycan eXPreSSion in genetically proven alpha−1）HiguchiI，Ⅵmada H，Fukunaga H，et al：Abnormal
expression oflaminin suggests disturbanCe Of saTCO・
lemma−eXtraCellular matrixinteractioninJapaneSe Pa・tientswithautosomalrecessivemusculardystrophyde爪・
Cientinadhalin．JClinInvest94：601・616，1994．

−62−

SaTCOglycan

denciency and gamma−SarCOglycan

Ciency．ActaNeuropatho196：202−206，1998．

de爪−

α−Sarcoglycanopathyの遺伝子異常と臨床的heterogeneity
川 井 尚 臣事研究協力者

足 立 克 仁＊■
柏 木 節 子＊乾西俊 夫榊 遠 藤 武
田 善 彦■ 国 重

徳＊■■♯
誠■

要 旨 α−サルコグリカンの遺伝子異常を有する自験例8家系14例と文献例55例の臨床経過の多様性について述
べた．発症年齢は1〜22歳（7．12±4．8），歩行不能年齢は，5〜22歳（13．0±4・7）と症例によってかなり異なっていた・
臥床年齢は，19−30歳とやはり幅がみられた．また発症年齢の若い例が歩行不能年齢も低いことが認められた・
これらの所見は遺伝子異常の違いによるサルコグリカン分子の違いによると考えられる．しかし，同一家系内の症例や同じ遺伝子異常（C229T）を有する症例でも症例によって，臨床経過にかなりの違いがみられるので・臨床
経過の多様性には遺伝子異常以外の要素の関与を示唆する．
はじめに

recessivemusculardystrophy（SCARMD）（BenHamida）2）は臨骨格筋よりRNAを抽出してRT−PCR法によりα・サルコク
リカンの9個の各エクソンを増幅し，また白血球を用いる
場合は，ゲノムDNAを抽出してPCR法により各エクソンを増幅し，異常PCR産物をサブクローニングし，それぞ

床経過に多様性heterogeneityがあることは原著者らによりれの塩基配列を自動解析装置（autosequencer）により調べた・

すでに記載されているが，サルコグリカン（SarCOglycan）の（詳細は先に発表した著者らの論文5）を参照のこと）ゲノム
DNAの配列を決定するためイントロンを増幅し，その塩

臨床遺伝的に悪性肢帯型（malignantlimb−girdletype）（MLGMD）（三好）l〉あるいはseverechildhood autosomal

遺伝子解析が行われ3・5），遺伝子異常が明らかになるに伴い，両者が臨床および遺伝子異常がほぼ同じものである
ことが明らかになった．本論文ではα−サルコグリカン

基配列を決定して，ゲノムDNA増幅するための特異的はプライマーを作製して用いた．

（adhalin）の遺伝子異常が解明された日放例ならびに文献
例の臨床経過を調べ，それらの遺伝子異常と臨床経過の多様性との関連について検討した．

成

績

臨床症状

対象と方法
対象は文献例と自験例を含めた45家系59症例のpdmaⅣ
α・SaTCOglycanOpathy（α・サルコグリカンの遺伝子異常を有する例）である．このうち，自験例は18家系22例である・
これらの症例についてα−サルコグリカンの遺伝子異常を検討するとともに，α−，β−，γ・サルコグリカンとβ・ジストログリカン，ジストロフィン，ラミニン2（メロシン）
を免疫組織学的に調べ，さらに発症年齢，歩行不能年齢，

臥床年齢などを検討した．
文献例は1997年4月までに報告された37家系45症例であるが，やはりα・サルコグリカンの遺伝子異常が明らかになっている症例である．これらの症例はアルジェリア人，
モロッコ人，フランス人，ドイツ人，イタリア人，アメリカ人などを含んでいる．遺伝子異常の種類は塩基の置
換，欠失，挿入，重複などが報告されている．
遺伝子解析は，試料として生検骨格筋を用いる場合は，

1．日験例：8家系14症例にα−サルコグリカンの遺伝子異常が認められた．症例の年齢は9〜56歳（29．7±17．2，平均±SD）で，両親の近親婚は8家系のうち6家系にみられた・
男女比は0．75，発症年齢は1−7歳（3．7±1．7）で，歩行不能
年齢は8〜16歳（10．9±2．7）であった．このうち4例は臥床患者あるいは車椅子患者であった．すべての症例に四肢
近位筋と腰帯筋の萎縮がみられたが，下腿の仮性肥大もみられた．■血清CK活性値は正常値の42倍までの上昇が認められた．知能障害や明らかな心障害はみられなかった．
2．文献例：45例あったが，年齢は9〜41歳であった．近親婚は15家系のうち5家系（33％）に認められた・男女比は0．87
で発症年齢は9歳から41歳（19．4±8．1）であり，歩行不能年
齢は10〜22歳（14．0±4．0）あるいはそれ以上であった・多くの例（70％）は歩行可能例であった・2家系の4例は寝たきりであった．下肢の仮性肥大は2例に記載がみられた．
3．日験例と文献例を合わせた59例の成績：症例の検索時の年齢は9歳から56歳（19．7±9．7歳）で，両親の近親婚は47．8％に認められた．男女比は0．87であった．発症年齢と歩行不能年齢は表1に示したが，前者は1〜23歳（7．1±4．8）＊徳島大学医学部第一内科＊＊国立療養所徳島病院内科
筆書＊国立療養所徳島病院神経内科＊榊徳島逓信病院内科に分布しており，後者は8〜22歳（13．0±4．7），あるいはそ−63−

表l PrimaTyα−SarCOglycanopathy例のまとめ

家系 患者 近親婚 年齢 性 発症年齢 歩行不能 歩行可能 仮性肥大 筋中α− α−SAG遺伝 変異数（n可9）（鰐34）年齢（解21）例（％） （％） SAG欠失 子の種類
エクソン 接合型
45

59

47．鍋

か56歳

男：20

（11／23）（19・7

ト23歳

8−22歳

60％

女‥23（7・1（13・0（32／53）（16／16）（41′41）（56／62）

±9・7）

±4・8）

10仇

10仇

Mk：9（粍

E3：55．8％ ホモ：51．1％（29／52）±4・7）（23／45）

comp：48．9％

ヘテロ（22／45）
SAG：＄ar60glyGan．∈：OXOn．Comp：￠OmPOUnd

口口ロ
ロ田
口口ロロロロロ
ロロロ
ロロロロロ
ロロ
ロロ

5

症 例 数

田
□

園
田

口団1回
ロコロ
ロ
日⊂臼口に口□□田

■■田口ロ

■‖■

■
■

5

0

10

年

15

20

25

30（歳）

齢

図1Primaryα・SaTCOglycanopathyの発現年齢（ロ），歩行不能年齢（国），および臥床年齢（■）．発症年齢は1〜23歳と幅がみられる．
歩行不能年齢は8−22歳である．しかし多くは歩行可能である．臥床年齢は20歳以上が多い．

図2 α−Sa∫COglycan分子上の構成アミノ酸の変異部位と変異数．種々の遺伝子異常が遺伝子全体にわたって認められる．34種類の遺伝子異常を記入してある．自験例は口で囲んである．実線は変異遺伝子数．点線および破線は，それぞれアミノ酸の欠失，挿入を示す．
−64−

：Duchenne型 （50例 ）：0 一弘G遺 伝子 異 常症
（0 −SAG完 全 欠損 ）□：8 −SAG遺 伝子 異 常症
（0 −SAG不 完全 欠 損 ）＊：複合 へ テ ロ接 合 体5

発症年齢︵歳︶

1
回．
◎

0

5

10

15

20

25

30

歩行不能年齢（歳）
図3 発症年齢と歩行不能年齢との関係．両者の間には相関関係が認められた．

下肢機能障害度ていた．ホモ按合体の変異は45家系23例（51．1％）に認められた．詳細は著者らの論文軋7）参照．
アミノ酸変異図2にα・サルコグリカン蛋白分子のアミノ酸変異をまとめて示した．C229Tの遺伝子異常によるATg77Cysの変異が最も多く，88．7％であった．ほとんどの変異はα−サルコグリカン分子の細胞外の部分に認められた．アミノ酸の欠損や挿入はコドン120と130の間に多く認められた．
発症年齢と歩行不能年齢との関係

図4 同一遺伝子異常を有する症例における臨床経過の違い（多様性）．

れ以上に分布していた．患者の多く（60％）は9〜41歳で未だ歩行可能であった．臥床年齢は19−30歳（25．S±4．5）であった．下肢の仮性肥大は，それが調べられたすべての例に認められた．図1に発症年齢，歩行不能年齢，臥床年
齢をまとめて示した．
骨格筋におけるジストロフィン関連膜蛋白
日放例ではジストロフィン，ジストログリカンそして
ラミニン2は，これらの蛋白の調べた6例全例において正常であった．α一サルコグリカンは5例で完全に欠損しており，1例で不完全欠損であった．

発症年齢と歩行不能年齢との間には相関関係（γ＝0．71）が認められた．回帰曲線はY＝0．35Ⅹ±0．92であった（図3）．
同一遺伝子を有する患者および同一家系内の患者における臨床経過の多様性
遺伝子異常の最も多いC229Tでみると発症年齢はl〜23
歳とかなり幅がみられた．2例で10歳と16歳に歩行不能になっていた．他の患者はまだ歩行可能であった．25歳と26歳でまだ歩行可能な例もあった（図4）．
同一家系内の患者においては臨床経過はよく似ている家系もあるが，別の家系ではかなりの違いがみられた（図
略）．
考

察

文献例では，これらの蛋白質が調べられた35家系43例

本論文では自験例と文献例のprimarya・SarCOgly・

全例に欠損していたが，完全欠損が34例（79％），不完全が9例（21．0％）であった．臨床経過は不完全欠損の例に臨床経過のよいものが多く認められた（図略）．
遺伝子異常
自験例と文献例をまとめるとミスセンス異常が56例

canop水hy例について遺伝子異常と臨床症状の重症度を述べ，両者の関係を検討した．
臨床的には本症はすべてα−サルコグリカンの遺伝子によるものであるにもかかわらず，発症年齢，歩行不能年（96％）に認められ，重複が1，挿入1，スプライシング異常が2であった．これらの異常はエクソン2から8の種々の位置に認められた．その中ではエクソン3の変異が最も多く，55．g％であった．挿入や欠矢は塩基番号400付近に集まっ−65−

齢，臥床年齢などにはかなりの差が認められた．遺伝子異常
は遺伝子の各部位に生じるので図2に示したごとくα−サ
ルコグリカンの蛋白分子には種々の変異が生じることになる．とくにA喝77Cysの変異が約半数と多く1）・2），この部
位は本遺伝子異常のhotspotと考えられる6川．

α，SarcoglycanOPathyの経過に多様性がみられるのは6）・8）
遺伝子異常の部位や種類によりα・サルコグリカン分子が異なっており，筋細胞膜の障害がそれぞれ異なるためと考えられる．
発症年齢が若い例は進行が早いとの成績がえられたが，これも同じくα−サルコグリカン分子の異常のあり方と極子の多様性によって説明できるが，前述のようにこれのめて密接に関係していると思われる．α−サルコグリカンの筋細胞膜上の発現との関係としては，多くは完全欠損の例が経過が早いが，必ずしもそうでない例もあり，経過を早くする何らかの要素が遺伝子異常以外にも存在する可能性がある．

トロフィー症の1病型l，Malignantlimb・girdle．．typeの2）BenHamida，FardeauMandAttitaN：Severerchildhood

遺伝子異常はエクソン3に多いが，この部位変異と臨床

3）Roberts SL，Leturcq F；AllamOnd V；etal：Missense

経過との関連も明らかでない．また，欠矢や挿入は塩基番号400近辺に多かったが，我々が調べたところでは欠矢や挿入例の方が経過が早いとの証拠はない．しかし，これらの異常は終止コドンが生じ，ミスセンス変異などに比べるとα−サルコグリカン分子が大きく変化するので，

mutationsintheadhalingenelinkedautosomalrecessive

みでは必ずしも説明できないので，他の因子の存在を考えざるを得ない．
文献l）三好和夫，西條一夫，粟生陽次郎他：進行性筋ジス

提唱（会）．臨床神経6：491，1996．
musculardystrophyafftctingbothsexesand丘equentinTu鴫ia．MuscleNerve6：400−480，1983．

musculardystrophy．Cel178：625−600，1994．
4）Piccolo F；Roberds SL，Jeanpierre M，et aI：Primary

筋細胞膜上で完全に欠損することが推定され，このような症例では経過が早くなりうる．実際，骨格筋におけるα・サルコグリカン欠失には完全なもの，不完全なものがあり，前者の経過が早い便向があることを先の研究報告書（平成7年度）で述べた．
同一遺伝子異常を有すると推定される同一家系内の例
でも，同じ遺伝子異常を有する例でも成績の項でも述べたように必ずしも進行の速さは似ていないものもあった．
このような現象は臨床経過が本遺伝子異常の関係のみでは説明できないことを示す．遺伝子異常の種類や部位の違いにより産生されるα・サルコグリカンの分子が，それぞれ異なっているので，同じくα−サルコグリカンに遺伝
子異常を有する症例でも，症例によって異常の座位や種類が異なり，このことより経過が異なることは理解できる．

adhalinopathy：aCOmmOnCauSeOfautosomalrecessive
muscular dystrophy ofvariable severity．Nature Genet
lO：243・245，1995．
5）KawaiH，AkaikeM，EndoTietal：Adhalingenemuta−
tionsinpatientswithautosomalrecessivechildhoodonset
musculardystrophywithadhalindenciency．JClinInvest
96：1200−1207，1995．

6）遠藤武徳，川井尚臣：悪性肢帯型筋ジストロフィー（MLGMD三好）のadhalin（α・SaTCOglycan）遺伝子異常．

日本臨淋55：3159・3164，1997．
7）赤池雅史，川井尚臣：筋ジストロフィーの遺伝子診断−とくに悪性肢帯型筋ジストロフィーにおけるα−SarCOglycan（adhalin）の遺伝子異常について．臨床病
理45：136・140，1997．
8）MorandiL，BomisiR，DiBlasic，etal：Clinicalheteroge・neity ofadhalin de茄ciency．AnnNeuro139：196−202，
1996．

文献的にはEymardら9）は，ナンセンス変異のホモ接合型症例では臨床経過は重症になる傾向があるとしており，

9）EymardB，RomeroNB，LeturcqF；etal：Primaryadhali−

ナンセンス変異とミスセンス変異のcompound heterozy・gote例やミスセンス変異のホモ接合型症例では臨床経過は一定とならず，多様性ができることを指摘している．

andgeneticcorrelationin20patientswithautosomalre・

なお，ほか（β，γ，6）のS訂COglycanopathyでも同様の多様性は存在する10）．

10）NcNallyEM，Passos−BuenoMR，BorremannCG，etal：

nopathy（α−SarCOglycanOpathy）：Clinical，Path010giCal

CeSSivemusculardystrophy．Neurology48：1227−1234，
1996．

MildandseveremusculaTdystrophycausedbyaslngle

以上のように，本症の臨床経過の多様性は，主として遺伝子異常の違いによって生じるα−サルコグリカンの分ー66−

γ・SarCOglycanmutation．AmJHumGenet59：1040−
1047，1996．

免疫多重染色によるα−，β−，γ−，6−SarCOglycamの超微局在と相互関係の検討

嶋谷

●

弘

穿貯

陸

橋見

村自

デブ

宏誠

▲事

小渋

＊

弘

彦 一 明

昌

木

吉

山

若

上

＊

井原鬼

研究協力者

＊

要 旨 Sarcoglycan complexの正常骨格筋における存在様式を検討するため免疫多重染色によりα−，β−，γ−，6・SarCOglycanの超微局在を検討した．免疫透過電顔的にはα−，β一，γ−，6−SarCOglycanの信号は正常骨格筋細胞膜周辺部において細胞膜を隔てその内外で，抗体を作製した抗原のepitopeの存在する細胞領域におおむね一致して存在していた・免疫3重染色においても上記4種類のsarcoglycanのうち3種が同時に出現する頻度は比較的少なく，むしろ2種のsarcoglycanが近接して存在する頻度がもっとも高かった．更にfteezeetchreplicaのα−SarCOglycanの観察
では筋細胞の真表面にα・SarCOglycanがかなりの密度で点在するのが認められた．
はじめに
Dystrophinassociated（glyco）proteinsはdystroglycanCOm−

plex（α一，β・dystroglycan），SarCOglycanCOmPlex（α・，β−，γ−，6−SarCOglycan）とsarcospan及びcytoplasmic complex（SymtrOPhin dystrobrevin）とから成る．このうち筋細胞膜ーナル抗体（IgG）を使用した．尚本実験で使用する，以前
我々の作製した1）・2）・3）ウサギ，羊抗α−，β一，γ・SG抗体はい
ずれも細胞内領域の合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体である．

貫通domainをもつものは50kdのα−SarCOglycan（SG），43kdのβ一dystroglycanとβ−SG，35kdのγ−と6−SG，25kdのいわゆるsarcospanである．このうち43kdのdoubletの1つはβ−SG，35kdのdoubletはγ一及び6−SGと呼ばれ，これ
らはけpe2ペプチドでC端が細胞外へ出ている．本研究ではα・，β−，γ−，6・SG分子の超微局在や相互位置関係を検討するため，本年度は∂・SGのcytoplaSmicdomainを認識するウサギと羊の合成ペプチド抗体を作成し，この抗体66・と今迄我々の作成したα−，β−，γ・SG抗体や市販のモノク
ローナル抗SG抗体を用いてα・，β−，γ・，6−SGの正常骨格筋細胞における超微局在を3重コロイド金標識免疫電顔法により検討した．

55・

材料と方法

40・

蜘

合成ペプチド抗体作製とその特性の検討：∂・SGはNi騨）V

霊

31・
22・

etal・（HumMoIGenet5：1179・1186，1996）による糖蛋白のCytOPlasmic domainを認識するアミノ酸残基1−17（MMPQEQYTHHRSTMPGSCJNH2）を合成し，thyroglobulin
をハブテンとして付加し，ウサギと羊に免疫して抗体を得た．これらの抗体のイムノブロットと間接蛍光抗体法
による光顕免疫染色標本を作製した．また市販抗体としlて抗α・とγ・SG抗体はウサギα一とγ・SGのそれぞれアミノ酸残基217・289と同じく167・178（いずれも細胞外領域）のそれぞれ蝕sion蛋白と合成ペプチドを抗原としたモノクロ

Rabbit

Sheep

図1抗 t訂COdycan抗体のimmunoblotを示す．組織化
学的に正常なヒト生検大腿四頭筋のホモジェネー
トに対し，ウサギ，羊抗 一訂￠Oglycan抗血清をそれぞれ500倍に希釈し反応させたもので，ウサギ，
羊抗血清とも35kDaの蛋白成分を認識する1本のbandが静められる。

＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院電顕圭−67−

図2，3 図2は1次抗体がウサギポリクローナル抗α−S訂COglycan，羊ポリクローナル抗β−SarCOglyc肌，マウスモノクローナル抗γ一
SaTCOglycan抗体，および2次抗体としてそれぞれ15nm，10nm．15run金粒子標識ヤギ抗ウサギ，ロバ抗羊，ヤギ抗マウス
抗体で3重標識した正常骨格筋細胞の比較的低倍の電顕写真で，筋細胞周辺にはsaTCOglycaJlのepitopeを示す信号がみられるが，筋腺経の内部深くには信号はみられない．図3は図2の中央部分の拡大像で，α−，β−，γ−SarOdycanそれぞれの信号がclusterを形成していたり．α−，β・SaTCOglycan，β−，γ−SarCOglycan，・y−，6−SarCOglycanの近接した所見が認められる。
（図2×72，000，図3×1朋，000）

ー68→図4 この電顕写真は1次抗体がマウスモノクローナル抗α−SarCOglycan，羊ポリクローナル抗γ−SarCOglycan，ウサギポリクローナル抗6−5arCOgtyCan抗体および2次抗体としてそれぞれ5mm，10mm，15mm金粒子標識ヤギ抗ウサギ，ロバ抗羊，ヤギ抗マウス抗体で3重標識した正常骨格筋細胞の比較的高倍の電顕写真で，筋細胞膜周辺にはsaTCOglycanのepitopeを示す信号が見られる。α−，γ・，6−SarCOglycanのうち2つのsarcoglycarIがdoubletを形成している像や，α一，γ−，6−SarCOglycanが3種とも標識されている所見（矢印）が見られる。（×144，000）

図51次抗体としてマウスモノクローナル抗α−SarCOglycan抗体と2次抗体として10mm金粒子標識ヤギ抗マウス抗体にて標識したヒト正常骨格筋のBeezeetchreplicaの電顕所見を示す．右下に筋線維内部の筋原線維（MF）が，左上には細胞外腔匹S）がみられる。その間に筋細胞膜の真表面（TS）がみられ，ここにα−SarCOglycanのepitopeを示す10nmの金粒子（矢印）がかなりの密度で分布しているのが観察される。（×144，000）−69−免疫電顕細胞学的検討：ヒト生検筋のうち組織化学的に正常な大腿四頭筋6例を冷却4％パラフォルムアルデヒド
溶液で1時間固定，凍結後クリオスタットで細切した．正常血清で非特異的反応を除去後，1次抗体としてマウスモ
ノクローナル抗α−SG抗体とウサギポリクローナル抗6−

いるが，それを裏付ける充分なデータは現在迄に示されSG抗体，及び羊ポリクローナル抗β−又はγ・SG抗体の組合せを主として使用した．更にマウスモノクローナル抗羊でポリクローナル抗6−SG抗体を作製し，α−，β・，γ−，6−SGの局在を解析した．その結果3重コロイド金標識

γ一SG抗体にはウサギポリクローナル抗α−SG抗体と羊ポ
リクローナル抗β−SG抗体を主として使用した．2次抗体はモノクローナル抗体には15mm金粒子標識ヤギ抗マウス法にて上記4種のSGのうち3種より2種のものの近接して抗体を，ウサギと羊のポリクローナル抗体には10nm又は5mm金粒子標識ヤギ抗ウサギ抗体又はロバ抗羊抗体を適度に希釈混合しcoldroomで24時間反応し電顕標本を作製した．

が同時に標識出来ないのかが問題になる．5nmなど金粒

Freeze etch replica電顕法：上記の筋組織の1部を1次抗体としてマウスモノクーロナル抗α−SG抗体，2次抗体として10nm金粒子標識ヤギ抗マウス抗体で標識し，標本をいと思われる・今後Freezeetchreplica法などを用いて更にSGの存在様式を検討してゆきたい．

既報4）の方法に従いreplica膜を作製，電顕にて解析した．

ていない．我々は本研究班3年間のうち最初の2年間にα・，β−，γ−SGの正常骨格筋における局在を2重及び3重コロ
イド金標識法により解析し，その結果はActaNeuropa−
thologicaに発表した3）．今年度はこれをextendL，ウサギ，

点在する頻度の方が多かったという興味ある知見を得た．
これがrealな所見なのか抗体の大きさのために3種のもの
子径の小さい金粒子が5〜6個以上clusterを形成し存在す
る所見もしばしば認められたことから，抗体分子の大きさのために3種の抗原が同時に標識出来ない可能性は低文

献1）WakayamaYShibuyaS，TbkedaA，etal：UltrastruCtural

結果

localizationoftheC−terminusofthe43・kddystrophin−

免疫透過電顕的にはα−，β・，γ−，6−SGのそれぞれは正常
骨格筋細胞膜周辺に局在し，上記4種のSGの信号は抗体を作製した抗原のepitopeの存在する細胞膜領域に概して一致して存在していた．すなわち市販のモノクローナル
抗α−，γ・SG抗体はα・，γ・SGのextracellulardomainをおおむね認識し，我々の作製したウサギ，羊ポリクローナル
抗α・，β−，γ−，6−SG抗体はおおむね筋細胞膜内面に局在していた．免疫3重染色においても上記4種のSGのうち3種が同時に出現する頻度は比較的少なく，むしろα−，β−，γ・，6−SGのうち2種のSGが近接して存在する頻度が最も高かった・また同じSGが複数存在することもしばしば認められた・更に舟eezeetchreplicaのα一SGのextracellulardomainの局在と分布の観察では筋細胞膜の真表面に，α−SGがかなりの密度で点在するのが認められた．

associatedglycoproteinanditsrelationtodystrophinin
nomlalmurineskeletalmyonber．AmJPath01146：189−
196，1995．
2）W披ayamaYInoueM，MurahashiM，etal：UltrastruCtur−
allocalizationofadhalininnormalmurineskeletalmyo・
丘ber．AnnNeuro139：217−223，1996．
3）WakayamaY；InoueM，KqjimaH，etal：UltrastruCtural
localization ofα・，β−and

γ−SarCOglycan andtheirmutualrelations，andtheir relation to dystrophin，β−dystroglycanaLndβ−SPeCtrininnormalskeletalmyofiber．
ActaNeuropathol．97：288−296，1999．
4）WakqyamaYandShibuyaS：Goldlabelleddystrophin
moleculeinmuscleplasmalemmaofmdxcontrolmiceas

Seenbyelectronmicroscopyofdeepetchingreplica・Acta
Neuropatho182：178−184，1991．

考察5）OzawaE，NoguchiS，Miz皿OY；etal：Fromdystrophi・

SGcomplexが正常骨格筋細胞膜周辺部でどの様な存在

nopathytosarcoglycanopathy：eVOlutionofaconceptpf

様式をとっているかについてはモデル5）が呈示されては

musculardystrophy．MuscleNerve21：421・438，1998．

−70−

成人発症の肢帯型筋ジストロフィーにおける臨床的，筋病理学的，分子生物学的検討
吉

研究協力者

緒

田

邦

広■

中 村 昭 則＊矢 崎 正 英暮

池

武

田

修

一■

田

伸

一■

方

言

法

近年，肢帯型筋ジストロフィー（1imbgirdle muscular

患者の上腕二頭筋生検筋を用いてHE，Gomoritrichrome

dystrophy，LGMD）の原因遺伝子が次々と明らかにされ，
筋形質膜周囲の構造の解明が急速に進んできている．特に細胞外マトリックス成分においてはmerosin欠損の先天性筋ジストもフィーのようにlamininの異常に起因した疾患が明らかにされている1）．さらにlamininを構成する

変法，NADH・TR染色を行った．また免疫組織化学は一laminin β1鎖の発現についても肢帯型筋ジストロフィーや福山型筋ジストロフィーなどのいくつかの筋疾患で二次抗体としてdystrophin（NCL Dys1−3），α，β，γ，6−各
sarcoglycanPCL），β・dystroglycanOICL），α2，β1，γ1各

laminin鎖（Chemicon）に対する各抗体を，また二次抗体にFITCでラベルした抗mouseIgG抗体を用いた．
結果

次的に減少していることが報告されている2）■）．今回，我々はlaminin β1鎖の選択的な発現低下を示した成人発症の肢帯型筋ジストロフィー兄妹例を経験し，その臨床1．筋病理学的検討：両患者ともHE染色では筋線経の大小不同，中心核の増加，問質の増大，壊死・再生像がみられ典型的なジストロフィー変化を呈していた．さらに的，筋病理学的，分子生物学的に検討を行った．

Gomodtrichrome変法（mGT）では多数のrimmed vacuoleを

対象

対象は長野県在住の肢帯型筋ジストロフィー兄妹例（61
歳男性と52歳女性）で，いずれも50歳前後で発症し緩徐進行性の経過をとっているが，現在も自力歩行は可能である．患者lは61歳男性．生来健康であったが，49歳頃から階段昇降時の困難を自覚．50歳頃から四肢の筋萎縮に気づいた．60歳時に動揺性歩行のため近医を受診．四肢
近位筋・傍脊柱筋の筋萎縮，深部腱反射消失，四肢近位
筋優位の筋力低下を認めた．患者2は患者1の妹で，52歳
女性．51歳時の検診で高LDH血症を指摘されたのを機に受診．神経学的に軽度の上腕二頭筋筋力低下，下肢近位認めた（図1），NADH−TR染色では高度の筋線維間網の乱れがみられた．免疫組織化学ではdys廿Ophin，α，β・saTCOglycanおよびβ・dystroglycanの染色性は両患者とも明
らかな異常はみられなかった．またγ，6・S訂COglycanにも異常はみられなかった．Laminin α2およびγ1鎖の染色性にも明らかな異常はなかったが，laminin β1鎖の染色性は両患者とも明らかに低下していた（図2）．Laminin β1鎖の染色性は毛細血管組織においても低下していたことから，1amininβ1鎖の一次的な異常である可能性も考えられ，lamininβ1鎖遺伝子について検討を行った．
2．分子生物学的検討：両患者の生検骨格筋からtoblRNAを抽出し，CDNAを作成した後，lamininβ1鎖遺伝子cDNA筋の筋力低下，動揺性歩行がみられた．両患者とも臨床的には上腕二頭筋の筋力低下が高度で，血清CK値はともに500−1000IU／1と中等度に上昇していた．筋電図ではとの全長を増幅するために作製したprimerを用いて一次おもにmyogenic changeを認めたが，心電図，胸部レントゲ
ンでは心筋障害を示唆する所見はみられなかった．筋CTに変異し，AgからCysへのアミノ酸の置換を伴っていたが，その他の箇所には異常がみられなかった（図3）．そこでは両患者に共通して上腕二頭筋，傍脊柱筋および下肢で点変異により制限酵素β乎1286Ⅰの切断部位が生じるよの抗重力筋群に強い萎縮像および虫食い像がみられた．
家族歴では両親はいとこ婚で父親は60歳代に脳卒中で，母親は50歳時に肺炎で死亡している．また検索可能であった同胞健常者1名と患者1の娘は神経学的に正常で，血清CK値も正常であった．

うに設計したmismatchprimerを用いてgenomicDNAの制限酵素解析を行った．対照では制限酵素で切断されなかったが，患者1では完全に切断され点変異を持つalleleのホモ按合体であり，患者2ではそのヘテロ按合体であった．また同胞健常者や患者1の娘もヘテロ接合体であっ＊信州大学医学部第三内科＊＊国立精神・神経センター

た（図4a）．患者2におけるcDNAのシークエンスの結果は
点変異のホモ按合体であったことから，CDNAを用いてー71−

よび二次増幅を行い，その産物についてシークエンスを行った．結果は患者1および2でexon12内のnt1564のCがt

患者1

患者2

H＆E

mGT

図1一般筋生検所見 両患者ともH＆E染色では筋線経の大小不同，中心核の増加，問質の増大，壊死・再生像がみられ典型的なジストロフィー変化を認める．またmGT染色ではrimmedvacuoleを認める．

患者1

正常対照

患者2

lamininα2

lamininβ1

lamiminYl

図2 免疫組織化学・両患者でIaminhα2およびγ1鎖の染色性に明らかな異常はないが，1amininβ1鎖の染色性は低下し
ている．

−72−

患者1；

患者2

：CA G AC A C T T GCA：CAGACACTTGCA（：

240

図3

号
230

Lamininβ1chaingene（LAMBl）cDNAのsequenceの結果．両患者でexon12内のnt1564がC→Tへ変異し，Arg→Cysへのアミノ酸置換を伴っていた．

図4a

対席

患者1

叫286［￣T

患者2

「

同胞健常者

患者1の娘

TTT二1TTM−101bp
−77bp

−24bp

図4b

坤12鮎Ⅰ「￣了甘二￣「−101bp
−
77bp

−

24bp

図4 a・点変異により制限酵素B申1286Iの切断部位が生じるように設計したmismatchp止merを用いたgenomicDNAの制限酵素
解析結果対照では制限酵素で切断されず，患者1では完全に切断され点変異を持つdldeのホモ接合体である．患者2，
同胞健常者，患者1の娘ではヘテロ按合体である．
b・CDNAのβ甲1286Ⅰ制限酵素解析結果．患者2では患者1と 同様に制限酵素で完全に切断され，この変異のホモ按合体である．

同様の制限酵素解析を行ったところ，患者2では患者1と同様に制限酵素で完全に切断され，この変異のホモ接合はどちらか片親由来のalleleがimprintされている可能性である．しかしながら両親がすでに亡くなっておりこの可体と考えられた（図4b）・すなわち患者2ではgenomicDNAとcDNAの制限酵素解析のパターンは異なっていた．な能性を証明することは困難と考えられる．もう1つは患

お対照75名の150染色体について検索したが，同様の点
変異はみられなかった．

異とmRNAの著減をもたらすような他の変異との複合ヘ者1はこの点変異のホモ接合体であり，患者2はこの点変テロ接合体である可能性である．現在この点についての検索を行っている．laminin β1鎖の発現低下を認めた筋考察疾患は，adult・OnSetのLGMD2），α−SarCOglycanOPathy3），rigid

この点変異が本症の病因でないとすれば稀なpolymor−
phismの可能性が考えられる．一方，本症の病因とすれば以下の2つの可能性が考えられる．1つは両親はこの点変異のヘテロ按合体すなわち保因者であり，子の世代でSpineを伴うmyopathy4），BMD5），merOSin陽性または陰性の先天性筋ジストロフィー5），福山型筋ジストロフィー6）で報告されている．しかし，これらの疾患では1aminhβ−73−

1鎖の発現低下はいずれも二次性に起こっており，現在

までに一次性に起こっている疾患の報告は見あたらない．

2）LiM，DicksonDWandSpiroAJ：Abnormalexpressionof

特にLiらが報告したadult−OnSet LGMD3）やTaylorらが報告

laminin

したrigid spineを伴うmyopathy5）では一次的原因について

girdlemusculardystrophy．ArchNeuro154：1457−1461，

は同定されていないが，laminin βl鎖の染色性は毛細血

1997．

βlchaininskeletalmuscleofadult−OnSetlimb・

管組織では正常であったことから筋線経での発現低下は

3）HiguchiI，YamadaH，FukunagaH，etal：Abnormalex−

二次的に起こっていると考えられている．本症例は筋病

PreSSionoflamininsuggestsdisturbanceofsarcolemma・

理学的および分子生物学的検索から，不完全欠損ではあextracellularmatrixinteractioninJapanesepatientswith

るが一次性の1aminin β1鎖異常症の可能性が考えられ，

autosomalrecessivemusculardystrophydeficientinAd・

今後類似症例の蓄積および1aminin β1鎖の検討が必要である．

halin．JClinInvest94：601・606，1994．
4）TqylorJ，MuntoniF，RobbS，etal：Earlyonsetautosomal
dominantmyopathywithrigidityofthespine：aPOSSible

謝辞roleforlaminin

最後に本研究にあたり筋病理所見について御教示いた
だいた国立精神・神経センターの埜中征哉先生，小林 治
先生に深謝いたします．

β1？Neuromusc Disord7：211−216，

19975）SewyCA，PhilpotJ，MahonyD，etal：Expressionof
lamininsubunitsincongenitalmusculardystrophy．Neu・
romuscDisord5：307−316，1995．

参考文献

6）HayashiYK，Engval1E，Adkawa−Hirasawa E，etal：

1）WewerUMandEngval1E：Merosin几aminin・2andmus−
Culardystrophy．NeuromuscDisord6：409−418，1996．

Abnormallocalization oflaminin subunitsin muscular
dystrophy．JNeuroISci119：53−64，1993．

−74−

関節拘綿を伴う常染色体優性遺伝型の肢帯型筋ジストロフィー日本人家系の臨床と遺伝子解析
吉

研究協力者

良

潤

一●

古 谷 博 和■ 田 中 公
由 村 健 夫書 山 田

結果と考察
Be仙1cm型ミオパチーは，′j、児期発症で慢性進行性の筋

はじめに肢帯型筋ジストロフィー（limb−girdlemusculardystrophy，

萎縮と関節拘柘を伴うAD・LGMDであり，比較的良性の経過をとる1）．本家系でみられたAD・LGMDは早期から関LGMD）は常染色体劣性遺伝をするものが多いが，常染色体優性遺伝型のもの（AD−LGMD）も報告されている・AD−
LGMDには臨床的にも遺伝学的にも異なるものが含まれ，AD．LGMDは単一の疾患ではない．我々は発症早期から足関節の拘箱を呈するAD・LGMDの日本人家系の臨床特徴を明らかにし，連鎖解析の結果から2q37への連鎖を考え，同領域に存在するCOL6A3遺伝子変異の有無を検索
している．
症

裕事
猛事

例

節拘箱をみとめる点で類似しているが，発症年齢がやや遅く進行が早いこと，血清CKの著明な上昇をみとめる点が異なる．最近，Bethlem型ミオパチ一について連鎖解析に続き遺伝子変異の発見がなされた．21q22．3に連鎖する家系についてはⅤⅠ型コラーゲンα1，α2サブユニット遺伝
子（COL6Al，COL6A2）の変異が報告され2），2q37に連鎖す
る家系についてはⅤⅠ型コラーゲンα3サブユニット遺伝
子（COL6A3）の変異がみいだされた3）・
本家系についても21q22．3と2q37領域について連鎖解析を行ったところ，21q22．3については全く連鎖を認めなか

本症は常染色体優性遺伝と考えられ，二世代で4人の患者がみられた（図1）．代表例を紹介する．症例Ⅲ−1は，27
歳男で，12歳頃から尖足がみられ，輸血時に血清トラン
スアミナーゼの上昇を指摘された．17歳頃から歩行障害がみられ，26歳時には支えがないと歩けなくなった．神ったが，2q37領域についてはD2S345でZmax＝1・0，D2S336
でZmax＝1．2と軽度の連鎖を認めた．この値は有意とはいえないが，サンプル数，家系数から考えると，本家系が経学的には四肢近位優位の中等度の筋萎縮と筋力低下，
足関節の尖足位拘箱がみられた．血清CK8，800U几（正常値60−160）と著明に上昇し，筋電図で筋原性パターンがみられた．排腹筋生検では，筋線経の大小不同と散在性の壊死筋線経がみとめられた．

遺伝学的に2q37領域に連鎖する可能性が示唆された・そこでこの領域に存在するCOL6A3遺伝子に関して解析を行った．これまでにアミノ酸置換が報告されているGly・
X＿Y繰り返し配列の領域を含めてCOL6A3の約2．2kbに関して塩基配列を決定した．COL6A3はCOL6Al，COL6A2

本家系の臨床特徴をまとめると，10〜20代で発症し，早期から足関節に限局した拘絹がみられ，肢帯型の筋萎
縮・筋力低下を呈する．血清CKは正常の50倍と著明に上と同様にGly・X−Y繰り返し配列領域を有しているが，この部分に6個のアミノ酸置換を兄いだしている．今後，こ昇する（表1）．
方法

本家系の患者4名を含む計7名の末梢血から抽出したゲノムDNAについて，21q22．3（D21S171，D21S266）及び2q37
lIl

P2S336，D2S345，D2S395）のマイクロサテライトマーカー
をプライマーとして連鎖解析を行った．次に症例Ⅲ−1の培養線維芽細胞から抽出したmRNAを使ってRT・PCRを行

図1家系図 ■：羅患者，□：健常者

い，COL6A3の全翻訳領域（約9kb）を4つの領域に分けて増幅し，サブクローニング後にシーケンスを行った．

症例 年齢 発症年齢 関節拘柘 現況 CK（IU几）■九州大学医学部脳神経病研究施設内科部門
ー75−

表1臨床像のまとめ
Ⅱ＿3

57

Ⅱ4

56

Ⅲ．1

27

Ⅲ．2

25

10代後半
28

足
足

車椅子

2，250

ベット上

2，000

杖歩行
8，＄00
自立歩行 8，000

れらの変異が疾患特異的なものか，日本人に多い多型であるかを明らかにするとともに，他の領域に関しても塩基配列を調べていく予定である．

2）

J6bsisGJ，KeizersH，ⅥeijlingJRetal：取peⅥcolla−
genmutationsinBethlemmyopathy，anautOSOmaldomi−
nantmyopathywithcontractures．NatureGenet14：113−

115，1996

文献3）PanT・C，ZhangR−Z，Pericak−ⅥmceMA，etal：Missense

1）BethlemJandvanWijngaardenGK：Benignmyopathy

mutationinavonWillebrandfhctortypeAdomainofthe

withautosomaldominantinl1eritanCe：arePOrtOnthreea3（Ⅵ）collagengene（COL6A3）inafamilywithBethlem

Pedigrees．Brain99：91−100，1976．

myopathy．HumMoIGenet7：807・812，1998．

−76−

Caveolin＿3遺伝子変異トランスジェニックマウスの作製
清

研究協力者

水

輝

夫●

大 井 浩 明◆＊
松 村 喜一郎●

砂 田 芳 秀■斉 藤 史 明■荒田悟…

抄 録 caYeOlinは細胞膜のcaveolaeと呼ばれる陥入部を構成する一群の膜貫通蛋白であり，そのうちcaveolin−3は主として骨格筋に発現するisobmである．最近，CaVeOlin・3遺伝子異常による常染色体優性肢帯型筋ジストロ
フィー（LGMDIC）の家系が報告された．そこでわれわれはcaveolin・3遺伝子のdominantnegative変異を検証し，その発症の分子機構を解析する目的でcaveolin−3遺伝子変異トランスジェニックマウスの作出を試みた・マウス
cave。lin．3cDNAに1アミノ酸置換ProlO5Leu，あるいは1アミノ酸欠失△Phe65の遺伝子変異を導入し，上流にマウスmusclecreatinekinase（MCK）のpromoter／enhanCer／nrstexon／firstintron／Secondexonの一部を含む6・5kbの発現調
節エレメントを接続し，下流にSV40polyadenylation配列を接続したtransgenicconstruCtを作製した・現在産出したマウスのゲノム解析を行っている．
緒

方法および結果

言

caveolinは細胞膜のcaYeOlaeと呼ばれる陥入部を構成する一群の膜貫通蛋白であり，そのうちcaveolin−3は主としてBlOマウス骨格筋よりpoly（A）＋RNAを抽出し，RT・PCRを用いてマウスcaveolin−3cDNAをクローニングした．

骨格筋に発現するisoformである13）．caveolinはG−PrOtein，

LGMDIC症例で同定された2つのcaveolin−3遺伝子変異に

eNOS，C・Src，H−Ras，prOteinkinaseCなど種々のsignaling分子と結合し，シグナル伝達を調節することが示唆されて準じて，1アミノ酸置換ProlO5Leu，1アミノ酸欠失△Phe65

いる．またcaveolin・3がジストロフィン糖蛋白複合体（DGC）の遺伝子変異をinvitrositedirectedmutagenesisによりマウスcaveolin＿3cDNAに導入した．上流にマウスmuscle

とも結合することが示され，筋ジストロフィーの病態機

creatine kinas占（MCK）のpromoter／enhanCer／Rrst exon／nrst

構への関与も推測されていた．そして本年，CaVeOlin・3遺intron／Second exonの一部を含む6．5kbの発現調節エレメン

伝子異常による常染色体優性肢帯型筋ジストロフィー

トを接続し，下流にSV40polyadenylation配列を接続した（LGMDIC）の家系3）と劣性遺伝形式の症例4）が相次いで二つのグループにより報告された．

け狐Sgeniccons血Ctを作製した．これを，C3Hマウス受精

これまでに同定された筋ジストロフィーの原因遺伝子に移植した．9匹の里親より合計41匹の生存産子を得，現の多くは構造蛋白であり，その欠損は細胞膜の脆弱性を

在ゲノム解析を行っている．表現型の解析結果について引き起こし筋ジストロフィーの発症に至ると説明されては次回の班会議にて報告したいと考えている．

卵にmicroinjectionL，偽妊娠状態にしたICRマウスの卵管いる．しかし，最近筋ジストロフィーにおける筋細胞の変性には初期の段階でアポトーシスが関与するといわれ文献ている．上述したように，CaVeOlinはシグナル伝達の調整

1）取IlgZ，etal：Molecularcloningofcaveolin−3，anOVelに関与することから，その欠損による筋ジストロフィーの発症には何らかのシグナル伝達異常の関与が推測されmemberofthecaveolingenefamilyexpressedpredomi−

る．そこでわれわれはヒトの常染色体優性肢帯型筋ジス2）SongK．S，etal：Expressionofcaveolin・3inskeletalmuscle，

トロフィー（LGMDIC）で報告されているcaveolin−3遺伝子

cardiac，and smoothmuscle cells．Caveolin・3is acom−

変異によるdominantnegative効果を検証し，その発症の分子機構を解析する目的でcaveolin・3遺伝子変異を導入した

ponentofthesarcolemmaandco鮎ctionateswithdystro−

トランスジェニックマウスを作製することにした．

271：15160−15165，1996．

nantlyinmuscle・JBioIChem271：2255・2261・1996・

phinanddystrophin・aSSOCiatedglycoproteins・JBioIChem3）MinettiC，etal：Mutationsinthecaveolin・3genecause
autosomal dominantlimb・girdle muscular dystrophy・NamreGenet18：365・36＄，1998．

4）McNal1yE．M，etal：Caveolin・3inmusculardystrophy・＊帝京大学医学部神経内科＊＊昭和大学薬学部薬剤学
榊昭和大学組換えD仙実験施設

HumMoIGenet7：871−877，1998．

−77−

ⅠⅡ．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究

村藤本

＊
＊
＊
＊
＊

松斉米

＊

奈

・蓼

子幸哉

＊
＊
＊

雄

加俊征

後熊埜

一＊

藤谷中

喜

＊
＊
＊

政

越橋藤

船佐後

研究協力者

畑

範功一

荒

剛＊
加代子輌＊＊＊
恭 三＊＊＊＊＊＊

要 旨 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD；MIM158900）は緩徐進行性の筋萎縮と筋力低下を認める常染
色体性優性遺伝形式の進行性筋疾患である．FSHD原因遺伝子は未だ同定されていないが，ほとんどの症例では第4染色体長腕のテロメア側（4q35−qter）に位置する．4q35由来の短い（＜35kb：正常は50〜300kb）EcoRIフラグメン
トがプローブp13E一日で検出され血oRI／創乃Ⅰ二重消化法にて特異性を確認できる．本研究で我々は二重消化法とハプロタイプ解析を行いFSHD遺伝子診断法を確立した．さらに遺伝子欠矢と臨床表現形の関連について検討し，それらの現況と問題点について報告した．
目

対象・方法

的

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーfacioscapulohumeral
musculardystrophy（FSHD；MIM158900）は主として顔面と上肢帯・上腕に分布する緩徐進行性の筋萎縮と筋力低下を認める常染色体性優性遺伝形式の進行性筋疾患であり，生命予後は良好であるが，進行すると筋病変は躯幹および下肢帯・下肢にも及ぶ1）・2）．FSIDでは，臨床表現型の著しい差異が家族間のみならず家族内においても認められたり，筋原性以外に神経原性変化を呈する症例も知られていることから，症候群であるとする立場もある3）．
FSHD原因遺伝子は未だ同定されていないが，ほとんどの症例（＞95％）では第4染色体長腕のテロメア側（4q35−qter）に位置することが報告されている（FSHDIA）4）．FSHD患者には4q35由来の短い（＜35kb：正常は50〜300kb）Eh鷹uフラ
グメントがプローブp13E−11／pFR−1で検出される．4番染色体と高い相同性を認める10番染色体由来の短い丘hカu
フラグメントが診断上の問題点となっていたが，10番染
色体には勾フ〃Ⅰ反復配列の80塩基上流にβ如けイトがあり，
助oM玩Ⅰ二重消化法にて消化されることで特異性を確認できることが報告されている5）．本研究で我々は二重消化法とハプロタイプ解析を行いFSHD遺伝子診断法を確立した．さらに遺伝子欠矢と臨床表現形の関連について検討した．それらの現況と問題点について報告する．

対象は臨床的にFSHDの疑われた96家系167例と正常コン
トロール200例である．インフォームド・コンセントに基づき末梢血リンパ球を得，ゲノムDNAを抽出した．すでに報告した方法を用いてサザンプロット解析を行った6）．
ハプロタイプ解析は4q35−qterの特異的マーカー（D4S163，
D4S139，D4FlO4Sl，pFR−1）と10q26−qterの特異的マーカー（DlOS590，DlOS212，DlOS555，DlOFlO4S2）を用いて行った．
血oM玩Ⅰ二重消化法はDeiddaらの方法を用い4q35由来のBlnIresistantfragmentと10q26由来のBlnIsensitive＆agmentの検出を行った．（図1）これらの結果に基づき臨床・遺伝学的データーベースを作成した．
結果

4q35由来の短い（＜35kb）βlnIresistant倉喝mentを認めた
FSHDIA家系は82家系であり，残りの14家系には認めず，
励oM玩Ⅰ二重消化法の感度は85．4％（82／96）であった．正常コントロールの4例でも4q35由来と考えられる短い（＜35kb）BlnIresistant廿agmentを認め，特異度は98％（196／

唯巧彗噌琶彗噌琶彗
Ec劇
EcoRl／8仙ECORU帥I
●

・

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■一●

≠；

：￣＿＿●冨｝「￣＿．■＝▼

壬こ＝ここ

■
■−

＊国立清神・神経センター神経研究所
榊東京慈恵会医科大学リハビリテーション科
榊＊愛知医科大学第四内科＊＊＊＊愛知県身体障害者コロニー中央病院＊＊＊＊＊東京女子医科大学小児科
稗林榊東京蔀立保健科学大学

P13E・11

PMA13

図1Southemblotanalysisofa蝕Ilily（ト77）ー81−㌫㌫餌慧㌫闇W Mぎ …；雷200）であった（表l）．表2に示す様に，Single digestionと肢帯から始まる，（2）顔面筋の筋力低下は発症した家族のdouble digestionでは感度，特異度ともに明らかに差を認50％以上に認める，（3）家族例においては常染色体性優性
遺伝形式をとる，（4）少なくとも発症した家族一人の筋電図と筋生検を行い他の疾患を除外する等である．これらの診断基準の範噂に入る患者の遺伝子診断を行ったわけ

めた．遺伝型（欠矢のサイズ）一表現形関連について検討したところ，欠矢の最も大きい群（卑〃Ⅰリピートが一個のみの群）に早期発症重症群が存在し，なおかつこの群にはてんかんと精神遅滞が効率に認められた（表3）．

であるが，doubledigestionによる遺伝子診断の感度は85％であった．感度の低下した理由は臨床的にFSHDの範疇

考

プローブp13E−11（D4FlO4Sl）を開発した意義は高い7）．こに入り，遺伝子欠矢を認めなかったFSHD？群が15％も存在していたことによる．この群にはその後の検索により
BMDやLGMDが含まれていたことがわかりヘテロであることが判明した．FSHDの臨床診断の難しさを示唆している．今回の研究結果から我々はFSHDにおける遺伝子診断の重要性を再確認した．また特異度が100％にならな

察

FSHDの遺伝子診断を飛躍的に発展させた最も大きな発見は，ホメオボックス遺伝子を探索する過程で得られたD4S139近傍のコスミドクローン13Eの獲得である．とりわけ1992年にWijmengaらが4q35に高い相同性を認めるのプローブp13E−11を用いて，制限酵素EhカUにて検出さかったのは，遺伝子相談上の大きな問題となるが，これれたsingledigestion舟agmentは通常健常人においては50kb

については表2に示したように，正常人において29叫4／200）以上（〜300kb）になるが，大部分のFSHD家系では，28kbに診断上の境界群となる28〜34kbのBlnIresistant打agmentが検出されたことによる．この境界群についてはsingle
digestionのみを用いていた頃は，病気と関係するのか不より短いEh力u断片であった．また様々な長さの血oM断片のDNArearrangement現象はBk，ORJ断片内に並んでいる
3．3kbの坤〃Ⅰ反復配列の部分欠矢による．すなわち健常人
では約14〜100コピー数の3．3kb坤〃Ⅰ反復配列を持つが，FSHD患者ではこの反復配列がランダムに欠失して1〜6個と減少している．しかしFSHDの特異的な遺伝子マー明であったがdoubledigestionを行うようになってから指摘されるようになった群であり，今後のさらなる検討が必要である．

カーとされるプローブp13E・11は，lq12，10q26など，4q35
以外の遺伝子座とも相同性部分がありクロスハイブリッ

また血oM鮎gmentsizeと発症年齢に相関が有ることは，
以前我々も報告している ）．その後の検討では，FSHDの
家族間・家族内での遺伝子欠矢のサイズと臨床表現型にドすることが遺伝子診断上の問題とされてきた．幸いには多様性があったが，20例の若年発症グループは他に比も，Deiddaらにより4q35と10q26の高い相同性は認めるが，べて遺伝子欠矢のサイズが大きかった（p＜．001）．さらに
血oM断片サイズが11kb以下の遺伝子欠矢の大きい（1つの勘〃Ⅰ反復配列しか持たない）グループ（4％，8症例）は全て10q26には個々の卑〝l配列中に加えて，最初の卑〃Ⅰ配列の制限酵素部位より80塩基上流にβhIサイトが発見されている5）・このことにより，血oMhに重消化法にて，4q35
由来のEh頭u断片と10q26由来の断片を特異的に識別することが可能となった．つまり10q26由来の断片はβJ刷こよ

孤発例で，発症年齢は5歳以下であり，てんかん（50％），
精神遅滞（88％）の合併が高率であり，身体機能面でも重症であったも）．遺伝子欠矢の大きいグループにてんかん，精まず，doubledigestion法による診断精度の向上について，

神遅滞という中枢神経系の異常の合併が高率に認められたことは，境界群とともに臨床表現型の多様性を考える
上でも，FSHDにおける遺伝子欠矢による位置効果の関与が示唆された．

従来用いてきたsingledigcstionとの比較も含めて検討した．

FSHD原因遺伝子は未だ同定されていないが，発症機

FSHDの診断は臨床的に行われたが，4つの主要な診断

構については反復配列と遺伝子欠矢に関連した様々な仮基準にもとずいた．すなわち，（1）発症は顔面もしくは上説が立てられている．なかでも染色体の位置効果（position

表1FSHD患者とcontroIsにおけるBb71−reSistant舟agmentsの分布

表2 血oRIsingledigestとEtoRIWLnldoubledigestによる
p13E−11断片長分布（％）の違い

り二重消化されて消失するが（βhIsensitiYe鮎gment），4q35
由来のBkoRI断片は3kb短くなり（BlnIresistant舟agment），
特異的に検出できるわけである．本研究において我々は

血oMsingledigestでの最小断片長
F SH D

C ontroIs

家族性

弧発性

合計

B lnlresisは It
舟ag m ent（
＜35 kb）

109

41

150

4

N o B lnlresistant ．
丘ag m ent（
＜35 kb）

6

11

17

196

115

52

167

2 00

今計

血oMMdoubledigestでの最小断片長

−82−

表3

Summaryof20earlyonsetcaseswith4q35・FSHD（文献8より引用）

PatienlsNo．／
Sex／
Age，y／
Genetics＊

gc（フRI

MenlalAgeretardatio

什agment atonset

Hearingloss

Epjlepsy Severity†

Size（kb）（yrs・）（IQ）￡

EcoRI丘agmentsizesmallerthanllkb（One勾）nIunit）
Tnfantilespasms Mi）d

1／F／6／SP lO

4

2／F／14／SP lO

1

＋（45）

3／M〃／SP lO

0＋

4／M／11／SP lO

1

＋

＋

5／M／17／SP lO

5

＋（35）

＋

epilepsy

SevereMild

SymptomalicR）Cal severe

Moderate＋

Moderale＋

Symptomaticfocal＋

epilepsy

＋（26）

3

1

＋（29）
＋

つ ︼

9／閏0／SP0

8／F／25／SP＋

epilepsy

l 1
0
1
1
1

7／M／10／SP

Symptomaticfocall1

6／F／9／SP＋（38）＋（35−40）

Moderate
SevereSevereEcoRIfragmentsizelargerthan13kb（morethantwo勾フnIunits）＋

Moderate＋

Moderate

10JM〃／SP

13

11／町13／FA

13

12／M／10／EA

13

Moderate

13／fソ3／FA

13

Mild

4
5

Severe

7

1

7
1

5

7
1

5

18／M／29／FA

Mild

7

17／Mβ4／m

1

16／即20／SP

Moderateb

15／M／6／SP

4′

1

14／M／23／FA

0Moderate

170Moderate

Moderate

19／F／30／FA

20／印2／FA

20

4

Severe＊M：maleF：femaleSP：neWmutationcasesFA：familialcases￡Caseland2weremeasuredbylheTanaka−Binetintelligencetest・Case5wasmeasuredbyWechsler
AdultInlelligenceScale−Revised（WAlS−R）・Case8and9weremeasuredbyTheChildren

sdevelopment（DQ）・Case3and4werenotgivenanIQtest・†Classificationof

severityHofdiseaseas…mild，…moderate，HorHsevereHaccordingtoLunt，scriteria・22

Case9waspreviouslyreportedbyMalsuzaka・27

efftctvariegation：PEV）はDrosophilaで最初に発見された現象で，ユーロクロマチン領域がヘテロクロマチン領域と並んでいるとき，染色体配列組換えなどによって遺伝子ヨンが起こっているか，少ない反復配列がユークロマチ
ンとなりユークロマチナイゼーションがおこりなんらかの遺伝子が発現し近傍の遺伝子に影響を及ぼすと考えらの相対的位置が変わり，その結果，遺伝子の発現に変化が起こる現象である．FSHD遺伝子領域はテロメアのヘテロクロマチンに極めて密接しており，位置効果を受けやすい事が予測される．また，反復配列の欠矢の大きされている．FSHDRegionGenel（FRGl）が反復配列の100kbと発症年齢の相関についての報告は位置効果を考える上で矛盾せず興味深い．FSHD位置効果としては，少ない
反復配列がヘテロクロマチンのセントロメア側への拡が

FRGlのmRNAレベルでの検討を行ったが位置効果を示す

りを防ぐことが出来なくなるヘテロクロマチナイゼーシ

域に向けてFSHD遺伝子の検索を進めていく必要がある．

ー83−

上流に位置することが報告された．しかしFRGlの位置効
果を指示するような結果はいまだ報告されてはいない．
我々も一つしか反復配列を持たないFSHD患者と正常とような結果は得られていない．位置効果は数百kb離れた遺伝子に起こることも知られており，今後セントロメア領

文献1）Padberg GW：Facioscapulohumeral

musculatdystrophy（FSHD）．J．Med．Genet33：361−365，
Disease，Thesis，

6）GotoK，LeeJH，MatsudaC，etal：DNArearrangementSin

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JapaneSe facioscapulohumeralmuscular dystrophy pati−

Disorders，2nd ed，PP9・15，RoyalSocietyofMedicine

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3）ArallataKandSugitaH：Introduction：TbeExpanSionof7）WijmengaC，HewittE，LodewijkA，etal：ChTOmOSOme

Clinicaland Molecular Genetic KnowledgeinFacio・

4q DNA reaJTangementS aSSOCiated

SCaPulohumeral MuscularDystrophy（FSHD）．Muscle

CaPulohumeralmusculardystrophy．NatureGenetics2：

Nerve2：Sl・3，1995．

withfacios・26−30，1992．

4）WijmengaC，FrantSRR，BrouwerOF，etal：Locationof

8）FunakoshiM，GotoKandArahataK：EpilepsyandmentaI

facioscapulohumeralmusculaTdystrophygeneonchromo−

retardation

SOme4．Lancet336：651−653，1990．

CaPulohumeralmusculardystrophy．Neurology50：1791−

5）DeiddaG，CacurriS，PiazzoN，etal：Directdetectionof
4q35rearrangementSimplicatedinfacioscapulohumeral

ー84−

1794，1998．

ina subset of early onset4q35−

Lacios−顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）における染色体再構成に関する分子細胞遺伝学的研究
斎 藤 深美子＊

緒

方

言

法

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD；MIMl58900）
は，主として顔面と上肢帯〜上腕に分布する緩徐進行性

FSHD患者10例（表1）および健常者由来の末梢血から，
MTXおよびBrdUを用いた同調培養法により染色体R分染の筋萎縮と筋力低下を認める常染色体優性遺伝の進行性筋疾患である．有病率は10万人に約5人（0．2〜6．7人）で，筋ジストロフィー全体の2〜10％を占める1）．患者の臨床症状においては，家族間のみならず家族内においても著しい差異が認められている2）．原因遺伝子は未だ同定され標本を作製し，FISH法に用いた耶）．使用したプローブは，ていないが，ほとんどの症例（＞95％）では，4番染色体長telo）はCytocell社製のものを用い，それらのFISH解析は添付されたプロトコールに従って行った．

腕の末端側（4q35・qter）に遺伝子座があることが報告されており3），連鎖解析および蛍光insituハイプリグイゼーシ
ヨン（FISH）法による検索結果から，FSHD遺伝子（FSHMDIA）およびその関連領域由来の各種DNAクロー
ンは各々，4番染色体動原体側から，D4S163−D4S139

4q−telo（4q末端），MA13（FSHD領域の反復配列），および
10q・telo（10q末端）である．
MA13はNick translation法によりビオチンで標識する
標準法を用いた．また，末端プローブ（4q・teloおよび10q−

結果

FSHD患者10症例（表1）について，反復配列を含むEcoRI
断片のサザン法による検索結果により4qと10qの各々の末端間での染色体再構成の可能性が示唆されたのは，10例（pH30）−D4F35Sl（CEB8）−D4FlO4Sl（p13Ell／pFR−1）・D4Z4（FSHMDIA）・telo（4番末端）の順にマップされている．
FSHMDIA患者では，プローブp13E−11を用いたサザン
解析で4q35由来の35kb以下の短いEcoRI断片が検出され中1例であった．この症例に関して，各々の染色体の末端
表1る（健常人では40〜150kb）4）．これはEcoRl断片内に並んでいる長さ3．3kbの反復配列（MA13）（図1）の部分欠矢によるもので，健常人ではこの反復配列は約12〜50コピーある

F S H D ・N o

E c o R I s iz e （k b ）
4q

B2

19

＞5 0

10 q

B3

＞5 0

＞5 0

B 4

2 3

40

B 5

14

38

配列が10q26（末端部）にも存在するためDNA診断上の障害となっていたが，EcoRI伯lnI二重消化法を用いれば4q35
由来のEcoRI断片を特異的に識別できることが判明し4），
これによりDNA診断の精度が向上した．

B 6

2 1

＞5 0

5 0 ， ＞5 0

B 7

2 1

＞5 0

1 0 ．＞ 5 0

8 8

2 3

＞5 0

3 0 ．＞ 5 0

B 9

＞5 0

4 8

＞5 0

しかし，この二重消化法を行った場合でも未解決の問

B lO

2 4

4 5

B 11

1 7

4 5

が，患者ではこれがランダムに欠失しているため1〜6コ
ピーしか存在しない5）．ところが，この反復配列と相同な

＞5 0

2
0

して「反復配列を含む4q35と10q26の領域間での微小な染色体再構成により生ずる位置効果」を挙げる仮説もある

2 4

4

題があり，その一つとして，4q35由来と考えられるEcoRI
断片が3本（本来は2本）検出される場合，あるいは患者特有の短い断片が検出されない場合等がある．この説明と

＞5 0

8
6

喝贈上へtもふが，まだ確証はない6）．
そこで本研究では，上記仮説に関する検討を行うため，◆へ

FSHD患者10例を対象に，4q末端領域における染色体再構成の有無についてFISH法により分子細胞遺伝学的な解析を行った．

ヽ●●
◆

0

20

40

60

E∞Rl断片サイズ
図1EcoRl断片サイズと蛍光シグナル強度＊東京医科歯科大学難治疾患研究所分子細胞遺伝学

−85一

80

プローブ（4q−teloおよび10q−telo）を用いてFISH解析を行ったが，シグナルの検出部位は共に正常コントロールと同様に各染色体末端のみであり，染色体再構成を示す知見
は得られなかった．

また，今回の検索では，4q末端のtrisomy型の例での4q
末端部と10q末端部間の染色体再構成に関する検証はできなかったが，3つの4q末端部のうち疾患の原因となる
EcoRI断片の小さい（kb）部位は，本来の4番染色体末端に一方，MA13プローブを用いたFISHの結果では，反復位置していることが判明し，「反復配列を含む4q35と10q26の領域間での微小な染色体再構成により生ずる位置効果」の仮説を支持する結果であった．今後さらに症例を増やして検討を行いたい．

配列を含むEcoRI断片サイズの小さい（欠失が大きい）症例において蛍光シグナルが小さい傾向にあった．特に，断片サイズが17〜21kb以下（つまり反復配列が3〜4コピー以下）の場合（症例B2，B5，B6，B7およびBll）は，蛍光シグナルが明らかに小さいことが観察された．
考察

FSHDは原因遺伝子が未だ同定されていないため，その診断はまず臨床的に行われ，その結果を元に遺伝子診断が行われている．臨床診断の主要な基準は4つあり，①
発症は顔面もしくは肩甲帯から始まる，②顔面筋の筋力低下は発症した家族の50％以上に認める，③家族例にお尚，本研究は以下の方々との共同研究により行われたもので，ここに深謝いたします．
小杉知宏■■，後藤加奈子書，松村 剛事，稲澤譲治■●，荒畑喜一●（＊国立精神・神経センター神経研究所，糾東京医科歯科大学・難治疾患研究所）
参考文献
1）EmeryAEH：DiagnosticCriteriafbrNeuromuscularDis−

いては常染色体性優性遺伝形式をとる，④少なくとも発症した家族一人の筋電図と筋生検を行い他の疾患を除外

Orders，2nded，Pp9−15，RoyalSocietyofMedicinePress，する．重要なことは，顔面筋の羅息が顔面神経領域に限定されていることで，外眼筋や攻筋，咽頭筋，舌筋に障害はみられないことである7）．

2）Aral1ataKandSugitaH：Introduction：Theexpansionof

一方，遺伝子診断の場合には，患者由来のDNAに関しLondon，1997．

Clinicalandmoleculargeneticknowledgeintacioscapulo−
humeralmusculardystrophy（FSHD）．MuscleNerve2：
S1−3，1995．

て，FSHD特異的マーカーとされるp13E−11を用いてEcoRl伯lnI二重消化法によるサザンプロットを行い，
EcoRI断片内に存在する3．3kbの反復配列（MA13）の部分欠
矢の有無を調べる．健常人は通常約12〜50コピーの反復配列を持ち，p13E−11で検出されるEcoRl断片サイズは40〜150kbであるが，患者は1〜7コピーしか反復配列を持た

3）Wijmenga C，et al：Location of facioscapulohumeral

ず，EcoRl断片サイズは34kbより短い（90％は10〜24kbしかない）9）．この二重消化法によるサザンプロット解析法
は，近年，FSHDの遺伝子診断法として用いられているが，結果が出るまでにかなりの時間や労力が必要である．

5）後藤加奈子，荒畑喜一：「顔面肩甲上腕型筋ジストロ

今回行った，MA13プローブを用いたFISHによる解析
では，反復配列を含むEcoRI断片サイズの小さいものは
蛍光シグナルが明らかに小さく観察された．特に，断片
サイズが17〜21kb以下（つまり反復配列が3〜4コピー以

dationofthedifrtrentialdoubledigestionforFSHD．J下）の場合は，蛍光シグナルが極端に小さいことが判り，さらに，今回扱った症例の中で一番短い14kbのEc。Rl断片を持つ患者の場合は，全観察細胞の中の50％は可視的にシグナルが検出されないほどであった．このように，
EcoRl断片サイズと蛍光シグナルの大小との間にある程度の相関性が認められたことから（図1），FISH法がFSHDの遺伝子診断の迅速なスクリーニング法の一つとなりう
る可能性が示唆された．今後，症例数を増やしてさらに検討する予定である．

−86−

musculardystrophygeneonchromosome4．Lancet336：
651・653，1990．
4）DeiddaG，etal：Directdetectionof4q35rearrangementS
implicatedin facioscapulohumeralmuscuIar dystrophy（FSHD）．JMedGenet33：361・365，1996．

フィー」ミオパチ一．医歯薬出版（株），東京，1997．
6）UpadhyayaM，etal：Improvedmoleculardiagnosisof
facioscapul0−humeralmusculardystrophy（FSHD）：Vali−
MedGenet34：467−479，1997．
7）FSaito，etal：Mappingofthenewlyidentはedbiliverdin−
IXβ

reducta5e gene（BLVB）to humanChromosome

19q13・3・＞q13・2by nuorescencein situ hybridization．
CytogenetCellGenet71：179・181，1995．

8）斎藤（小原）深美子：遺伝子分析「FISH」臨床免疫29（Suppl17）：470475，1997．
9）船越政範ら：顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）．日本臨床55：3181・3185，1997．

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーにおける細胞増殖因子の免疫組織化学的研究
納
■

子良敏
■

●
﹂▼

明公秀

●

・事

藤村永

▲T

■
量﹁

尚

斉有福

▲T

法優仁

正

▲T

川瀬山

中猪新

▲T

郎一史

逸裕武

口田井

樋内笠

協力研究者

要 旨 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの生検筋内における各種細胞増殖因子の発現異常の有無について免疫
組織化学的に検討した．呼吸不全を伴う重症のFSHDの一例で，筋膜上において線維芽細胞増殖因子（acidic FGF
およびbasic FGF）の著明な発現克進が認められた．本症例は組織化学的に結合織の線維化が他の顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー例よりも強く，lobulated爪berがみられるなどの特徴があった．線維芽細胞増殖因子の過剰発現
は結合織の線維化を促進する可能性がある．
はじめに
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーFSHDの原因遺伝子は未だ同定されていないが，大部分の症例で第4染色体長腕（4q35・qter）由来の短いEcoRIフラグメントが検出される
り・2）．本症では臨床表現型の著しい差異が同じ家系内でもみられ，遺伝子欠矢のサイズのみでは表現型の差を説明できない3，4，5）．今回我々は本症の病態を明らかにするため，
生検筋内における線維芽細胞増殖因子（FGF）を含む各種細胞増殖因子の発現異常の有無について検索した．その結果重症例の一例で注目すべき所見を得たので報告する．
対象と方法
4q35由来の短いEcoRIフラグメントが証明された9例のFSHD（表1）生検筋の連続凍結切片について，aCidicFGF，basic FGF，FGF receptor，platelet−derived growth factor（PDGF），PDGFreceptorα，PDGFreceptorβ，およびへパラン硫酸プロテオグリカンに対するモノクローナル抗体を用いてABC法にて免疫組織化学染色を施行した．
FSHD各症例間およびFSHDと他のミオパチ一間で染色結果を比較検討した．生検筋はcaSelとca5e2が俳腹筋で他の症例は上腕二頭筋である．9例のFSHDの中で呼吸不全を呈しているのはcaSelのみであり，今回の報告の中心となる本症例の臨床像を簡単に提示する．症例は41歳の女性
で主訴は顔面，四肢の筋萎縮，筋力低下および呼吸不全である．家族歴では母親に顔面，四肢の軽度の筋力低下があり，82才時に肺炎で死亡している．現病歴は，小学校高学年の頃から鉄棒ができず転びやすくなり，16歳時
松葉杖歩行，22歳時車椅子，41歳時肺炎を契機に呼吸不全を呈し人工呼吸管理となり寝たきり状態となっている．
＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊国立療養所南九州病院

41歳時筋生検を施行した．現症では知能，感覚は正常で，顔面，四肢近位筋優位の筋萎縮，筋力低下を認める．腱反射は消失しており，仮性肥大はなく嘩下は可能である．
検査所見では血清CK値は98と正常であった．
結果

acidicFGF（FGFl）の免疫染色を図1に示す．DMDでも軽度克進していたが，FSHD caselにおける筋膜上の発現克進が際だっていた．ca5el以外のFSIIDではこのような著
明なacidic FGFの発現冗進は見られなかった．control筋においては血管には発現しているが，筋膜上の発現は微量であった．
baSicFGF（FGF2）の免疫染色を図2に示す．acidicFGF程ではないが，FSHDcaselにおいてbasicFGFも筋膜上の発現克進が認められた．ca5el以外のFSHDではこのような著明なbasicFGFの発現は見られなかった．
FGF以外の細胞増殖因子あるいはリセプターである
FGF receptor，PDGF，PDGF receptor

α，PDGF receptor

β，およびへパラン硫酸プロテオグリカンについては症
例間の差は見られなかった．
FSHD ca561におけるHE染色を図3に示すが，組織学的には筋線経の大小不同や少数の壊死再生線経の存在は他のFSHDと同様であったが，本症例では結合織の線純化
が他のFSHDよりも著明であった．またかなり多くの
lobulatednberがみられたことも特徴的であった．
考察

筋再生における細胞増殖因子の重要性については多くの報告により，ほぼ確立されたものとなっているが，各種細胞増殖因子の相対的重要性，疾患による相違点，および結合織の線維化との関連については不明な点が多い．

ー87−

表1FSHD9症例のまとめ

症例

年齢性別

欠失バンドのサイズ（どCORI）

発症
年齢

血清
〔K

F

1
4

l

H
F

9
1

3

幼少時

264

小学生

17◎

‖

6
1

﹁

7
1

5

310

r

4

98

3◎

M

4
5

つ 乙

16

539

M

40

正常

16

230

7
1

7 −

‖

M

0
5

6

15

F
F

5
5

0 0

5Z

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2
2

1

9

幼少時

104

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ぐ、

l

FSHD Case2

︑・

・︑

−．

J㌧

Contrdl

DMD

図1acidicFGFの免疫組織化学的染色

FGFはヘパリンに高親和性で内皮細胞，閉業系細胞，神れる例外的なものなのかを明らかにするため，他の経細胞および上皮細胞などの増殖促進作用を有しており，FGFの筋芽細胞や筋衛星細胞に対する増殖促進作用につFSHD重症例についてもFGFに関する検討が必要であるといては多くの報告がある6）・7），8）．また，mdxマウスでは筋膜上での発現が克進していることが報告されており9）・10），
その活発な筋再生を説明しうるとする考えもある．しかしヒトの骨格筋内におけるinvivoでのFGFの作用については不明な点が多く，その過剰発現の効果については筋再生を増強し有用である可能性と，結合織の線維化を誘発し有害である可能性の両者が存在する．今回のbFGF発
現克進を呈するFSHD例は臨床的に重症であり，結合織の線維化も目立つなど後者の可能性を示唆する症例であると思われる．筋膜上のFGFの発現克進がFSHDの重症例に一般的に認められるのか，本症例においてのみ認めら
−88−

思われる．

文

献

1）DeiddaG，CacurriS，GrisantiPetal：Physicalmapping
evidenceforaduplicatedreglOnOnChromosomelOqter
Showing high homology withthe払cioscapulohumeral
muscular dystrophylocus onchromosome4qter．EurJ
HumGenet3：155−167，1995．
2）DeiddaG，CacurriS，PiaLZZONetal：Directdetectionof
4q35rearrangementsimplicatedin血Cioscapulohumeral
musculardystrophy（FSHD）．JMedGenet33：361−365，1996．

図2 basicFGFの免疫組織化学的染色

図3

FSHDcaSelにおけるHE染色

3）Lunt P．WJardine PE，Koch M，etal：Phenotypic−

5）Nakagawa M，Matsuzaki T∴mguchiI，etal：Facio−

genotypic correlation wi11assist genetic counselingin

SCapulohumeralmusculardystrophy：Clinicaldiversityand

4q35一色cioscapulohumeral muscular dystrophy．Muscle

genetical）nOrmalitiesinJapaneSe patients・Intem Med
36：333−339，1997．

NerveSupp12：103−109，1995．
4）NakagaWaM，HiguchiI，YoshidomeH，etal：Fami1ial

6）Allen R．E and Boxhom L．K：Regulation of skeletal

払cioscapulohumeralmusculardystrophy：Phenotypicdi−

muscle satellite cellproli飴ration and di飴rentiation by

VerSityandgeneticabnormalitiy．ActaNeuroIScand93：

tranSfbrminggrow血fhctor・beta，insulin−likegrowthfac−

189・192，1996．

torI，and負broblastgrow血factor．JCellPhysio1138：
31ト315，1989．

ー89−7）AlterioJ，CourtoisY；RobelinJ，etal：Acidicandbasic

9）DiMarioJand StrohmanRC：Satellitecells舟omdys−

丘broblastgrow山factormRNAsareexpressedbyskeletal

trophic（mdx）mousemusclearestimulatedby瓜broblast

muscle satellite cells．Biochem．Biophys Res Commun

grow血fhctorinvitro．Di舵rentiation39：42−49，1988．

166：1205−1212，1990．

10）DiMarioJ，Bumnger N，Yamada S，etal：Fibroblast8）Groux・MuscatelliB，Bassaglia YiBarritault D，et al：
Proliftrating satellite cells express acidic fibroblast

grow仇factorduringlnVitromitogenesis．DevBiol142：
380−385，1990

ー90−

grow血∴hctorinthe extracellular matrix ofdystrophic（mdx）mousemuscle．Sience244：688−690，1989．

Ⅳ．福山型先天性筋ジストロフィー（FCMp）

福山型先天性筋ジストロフィー原因遺伝子単髄と機能解析に関する研究
史
々

木澤

■
■

淳

子い■■

真木子＊■

・■
土・

■
事
＊

堀

■
＊
▲T

勝

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▲■
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■

里子泰士

恵加

治…■
豊■■書州

▲▼

小 林 千 浩＊
中 村 祐 輔■
榊 原 洋 一梱三 宅 正 志…■■

藤藤井永

近斎高徳

研究協力者

福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）は，重度の筋ジストロフィー病変と共に，′ト多脳回を基本とする高度の脳奇形を特徴とする常染色体性劣性遺伝病であり，わが国の筋ジストロフィー中，Ducheme型の次に多い．

今日の患者の大部分へと受け継がれたものと推定され2）・6），
動く遺伝因子である「レトロトランスポゾン」であった．
古代から伝わったレトロトランスポゾンがヒトの遺伝病の原因であることがわかったのは初めてである5）．

我々は福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）遺伝子

7．フクチンは既知の蛋白質とは相同性を示さない，機座を9q31に決定した後，今回の3年間でこの班として以下のことを明らかにした．
1．遺伝子存在領域を連鎖不平衡マッピングにより一気にD9S2107を含んだ約100kb以下にlI，さらに創始者ハプ
ロタイプマッピングによりD9S2170の動原体側のごく近

能未知の新規蛋白質であり，構造予測ではフクチンはN

くに限局化した2）．
2．その多型周辺のYACならびにコスミド整列化クローンを作製し3），さらに独自にマイクロサテライト多型を単離したl）．
3．新たにFCMD8家系において出生前診断を行った4）．

測により，フクチンは細胞外に存在する蛋白質であるこ

4．ハプロタイプ解析により病気の創始者は1人でありそれが全国に広がったこと，日本のFCMD変異はそれ以外に少なくとも9回起きた2）．
5．患者ゲノムDNAには予想領域にinsertionが存在し，それはFCMD染色体の87％に認められ，FCMD患者の95％以上がinsertionを1ないし2本持つ5）．
6．このinse汁ionの付近からcDNAライブラリーのスクリーニングを続け，ついに福山型原因遺伝子を同定した．
福山型遺伝子はmRNAとして約7000塩基対，本症の病変のある骨格筋，心筋，脳で優位に発現していた．われわ
れは正常遺伝子の産物蛋白質にフクチンと名付けた5）．
フクチンは461個のアミノ酸から成る全く新しい蛋白質であった．異常染色体のほぼ90％には同一の変異が見ら

末端に分泌シグナル配列をもち，膜貫通ドメインをもたない蛋白質であった．GFPまたはHAタグをつけた強制発
現細胞では，フクチンはゴルジ系と細胞培養液中に観察され，細胞膜には見られなかった．hans如tionと構造予とが示唆された5）．
8．さらにFCMD患者において5種のフクチン点突然変異を兄い出した．レトロトランスポゾンinsertionと比較的上流exonでの変異とのcompoundheterozygoteの表現型は重症の傾向を示すと思われた．小眼球，瞳孔膜遺残を合併するWWS類似症例にもFCMD変異が証明され，本疾患のより広い臨床的スペクトラムを示唆した．今までのところinsertionを示さない症例は1ケとして点変異が見つからず，これらの診断が別のCMDであれば，点変異を2つ有する症例は胎生致死である可能性も推測される．
参考文献
1）TodaT，MiyakeM，KobayashiK，MizunoK，SaitoK，OsawaM，NakamuraY，KanazawaI，NakagomeY，
Tokunaga K and NakahoriY：Linkage−disequilibrium
mappingnarrowstheFukuyama−typecongenitalmuscular

dystrophy（FCMD）Candidate region to＜100kb．AmJ

れ，原因遺伝子内に約3000塩基対の挿入があって，正常なフクチン蛋白質の産生が妨げられていた．この挿入配

2）KobayashiK，NakahoriY，MizunoK，MiyakeM，

列は，今から約100世代（2000−2500年）前の一人の祖先から

KumagaiT，HonmaA，NonakaI，NakamuraY，

HumGenet59：1313−1320，1996．

TokunagaKandTodaT：Founder−haplotypeanalysisin■東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センター＊■東京女子医科大学小児科
榊■東京大学大学院医学系研究科小児科■挿■東京大学大学院医学系研究科産婦人科＊＊＊＊＊東京大学大学院医学系研究科人類遺伝学＊＊＊＊＊■徳島大学医学部公衆衛生学

Fukuyama・typeCOngenitalmusculardystrophy（FCMD）・
HumGenet103：323−327，1998．
3）MiyakeM，NakahoriY，MatsushitaI，KobayashiK，
Mizuno K，HiraiM，KanazawaI，Nakagome Y，ー93−TokunagaKandTodaT：YACandcosmidcontigsen・

5）KobayashiK，NakahoriY，MiyakeM，MatsumuraK，

COmPaSSingtheFukuyama−typecongenitalmusculardys−

Kondo・IidaE，NomuraY，SegawaM，YoshiokaM，Saito

trophy（FCMD）Candidate region on9q31．Genomics

K，OsawaM，HamanoK，SakakiharaY，NonakaI，

40：284−293，1997．

NakagomeY，KanaLZaWaI，NakamuraY，TokunagaKand

4）TakaiY，TsutsumiO，HaradaI，F可iiT，KashimaT，TodaT：AnanCientretrotranSPOSalinsertioncausesFuku−

KobayashiK，TodaTandTaketaniY：Prenataldiagnosisyama−tyPeCOngenitalmusculardystrophy．Nature394：

OfFukuyama−typecongenitalmusculardystrophybymi・

388・392，1998．

CrOSatelliteanalysis．HumReprod13：320・323，1998

6）EberhartDEandCurranT：YayoieramutationdisruptS
bminandmuscle．NatureMed4：1002−1003，1998−94−

福山型筋ジストロフィーの臨床的重症度の分子レベルの解析
斎 藤 加代子■

協力研究者

目河 北 有規子■ 王
治 平■ 池 谷 紀代子■
大 澤 真木子＊ 近 藤 恵 里い＊戸 田 達 史書■

的中枢神経障害を伴う先天型筋ジストロフィーには福山型筋ジストロフィー（FCMD）l），Walker−W訂burg症候群（WWS）2），muSCle−eye−brain病（MEBD）3）がある・臨床的には，FCMDの重症例は他の2疾患と鑑別が困群である．臨
床的に，FCMDの最高到達運動機能は支持なし座位または座位にての移動までである．ある時期，歩行可能な少数例と，定頚さえ獲得しない少数例も，臨床的にFCMDと考えられている．我々は，FCMDを運動機能によって軽症例，典型例，重症例に分類し，FCMD遺伝子近傍のマイクロサテライトDNA多型マーカー4）・5）を用いて，各型のハプロタイプ解析を行い，臨床所見と比較した．

より軽度であった（表1）．10家系で創始者ハプロタイプをホ
モ按合性に示したが，2家系でヘテロ按合性であった（図1）．
3）FCMD重症例のハプロタイプ解析
重症例9例では定頸なし7例，坐位に支持を要する例2例．
MRlにて進行性水頭症3例（うち2例でシャント手術施行），
MRI施行7例全例において，脳幹の低形成を認めた．9例
中7例で眼症状を示した．網膜低形成（5例），斜視（5例），
視神経低形成（3例），特に1例では′川艮球症，網膜剥離を示した（表2）．ハプロタイプ解析では1例で創始者ハプロ
タイプのホモ按合性を示していたが，8例（g9％）が1本の創始者ハプロタイプと他のハプロタイプとのヘテロ接合であった．特に，水頭症を示した3例を含む5例が同様のハ
プロタイプを示していた（図2）．

対象と方法
運動機能が支持による起立，歩行，階段昇降可能な例（レベル5以上）を軽症例，起立，歩行が不可能であり，最高到達運動機能が坐位にての移動までの例（レベル2〜4）を
典型例，定頚未獲得または坐位に支持を要する例（レベル0，1）を重症例とした．血縁関係のない日本人のFCMD典型
例35例，軽症例12例，重症例9例において臨床症状を検討し，マイクロサテライトDNA多型マーカーD9S2105，D9S
2170，D9S2171，D9S2107，D9S172を用いたハプロタイプ解析を行った．

考察

典型例，軽症例，重症例共に遺伝子的にもFCMDであることが確認できた．水頭症を示した例や／川艮球症，網膜剥離を示し，WWSやMEBDと臨床的に鑑別が困難な例
が，創始者ハプロタイプを1本示していた．有意差をもって（p＜0．005），典型例，軽症例は創始者ハプロタイプをホ
モ接合性に示し，重症例はヘテロ按合性に示すことが明らかになった（表3）．FCMDは広い臨床的スペクトラムを有し，重症例はWWSやMEBDとオーバーラップしていると考えられる．また，重症例はFCMD遺伝子変異の複合

結へテロ接合であると考えられた．

果1）FCMD典型例のハプロタイプ解析

文

35家系について調べた．27例（77％）は創始者ハプロタイ

献

プをホモ按合性に示し，7家系（20％）はヘテロ按合性に示

1）FukuyamaYiKawazuraMandHarunaH：ApeCuliarfbrm

していた．1家系は臨床的には典型例であったが，FCMD

ofcongenitalprogressivemuscuIardystrophy・Reportof
n鮎encases．PediatrUnivTbkyo4：5−8，1960．

例で認められないハプロタイプをホモ按合性に示していた．FCMDの両親の健常ハプロタイプをコントロールと

2）DobynsWB，KirkpatrickJB，HittnerHM，RobertsRMして調べたところ，79染色体がFCMDで認められないハ

and Kretzer FL：Syndromewith1issencephaly・Ⅱ：

プロタイプを示していた．

Walker・Warburgand cerebr0−OCulo・muSCular syndromes

andanewsymdromewithtypelIlissencephaly・AmJMed

2）FCMD軽症例のハプロタイプ解析

Genet22：157−195，1985．

軽症例12例のうち8例は歩行可能，4例は支持起立可能．
MMは8例に施行し，全例軽度〜中等度の変化であり，脳3）Santavu0riPandLeistiJ：Muscle，eyeandbraindisease：

幹の低形成は全例に認められなかった．眼所見も重症例

anewsyndrome．Neuropaediatrie8（Suppl）：553・558，
1977．

＊東京女子医科大学小児科
榊東京大学医科学研究所ゲノム解析センター
ー95−

慧
苧
8
8
7

a9eat
lastob・
No．sex servation

表1FCMD軽症例の臨床のまとめ
brain

16：0

2

F

20：1

3

F

20：10

4

M lO：11

＋

5

F

6

F

7

F

8

M

9

M

＋

＋

＋

＋

＋

＋

CataraCt

n

n

＋

n

n

十

十

n

n

＋

＋

＋

・ト

＋

＋

n

n

＋

＋

8／8
100

7／8
88

n

n

n

n

・

nyStagmuS

n

n

7
5
＋

5
5
n

n

n

n

5

F

n

7

12

n

7

0
3 6 7
5 7 1
手∵乱 丁∵泊 m∵と γ
1 2 2 7 1 2 2

ll F

＋

n

7

1
1
説
1

l F

lO M

e

gyral ventricularbrainstem fundiabnorm．dHatation hypoplasia abnorm．strabismus mvoDia others

POSitiverate

（％）

＋

0／8
0

1／9
11

1／12
8

4／9
44

2／9
22

黙認謂蕊悲Bty：5：maintainstandposturewjthsupport・7：ambulant・8＝Walkupstairs，
表2
motor

FCMD重症例の臨床のまとめ

brafn

ageat
lastob・ maX． gyral ventrlcu）arhydro・ bralnstem fundf
ant．chamber
No・SeX SerVatlonab‖ty ibnorm・d‖atatZon cephalus hypoplaSJa abnorm．＄trablsrTlu＄ abnormaI吋

13

M

8：2

1

14

M

4：4

0

15

M l：10

16

＋＋

＋OPe

＋

＋＋

＋＋

＋OPe

＋

0

＋＋

＋＋

＋

＋

M l：2

0

＋＋

＋＋

17

F l：3

0

十十

＋＋

nC

18

M O：4

O

＋＋

＋＋

＋

19

F l：3

0

十十

十＋

＋

20

F

0

＋＋

＋＋

＋

＋

＋＋

＋＋

＋

＋

9／9

9／9

3／9

8／8

5／9

5／9

1／9

100

100

33

56

56

11

3：5

21 日 11：8

1

POSjtiverate

＋＋

（％）

＋

＋

100

＋

＋
十

十

十＋

＋
＋
＋

max・mOtOrab
ity：0＝nOtaCqfredheadcontror・1＝aCqLJlredheadcontr01butunabJetosEtwIthoutsupport
nc＝n01con朋rmed，OPe＝Shuntoperated

表3

FCMDの重症度と創始者ハプロタイプの按合性の関係
dleletyping

Phenotype homozygosity heterozygosity others statistical勺仰ica1

27

mild lO

83％

S。，。r。

77％

111％

7
2

8

analysis

20％
17％

89％

13％］慧∩くコ。＜．005
コ p＜・005

0thers＝homoqgosityofotherhaplotypesthantheanCeStralones

N．S．＝nOtSign沌cantー96−

向mJ少2FamJ少丁

3
8
3
9
3

1

1

■

1

03949 9111112

1 一 ■

l

3

2

2

1
1
︒
団
■■■■■■■■■−■

981537230589112112⁝138帯813

11913
18諾18330

1 1l386733∧U 39499l

9827311394000
11 11 1 3

一

5 2673 7
1 3 94 9 8ロ9538689527田口95217889￡2J77098270789g†72向mJ少6
口向mJ少70向mJ少JJ

向mJか72

酬蔓

測盛

測盛

1
1
9
悶
州
摘
出

向m叶柑

■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ 1

向mfル柑

19389247∽01
111113

向m町74

19389247幻01
111113

FCMD軽症例のハプロタイプ解析

033
98
的30
92 4
1
1
9
同
間
遇
112一l121 8 2 7 二 3 二 1

図11546糾引9501
112113139480
1 11 11 3■■■■■■■■■■■■■

川13191418■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ 1

川1319141

1
︒
1
周
摘
出

一

11513191418■■■■■■■■■■一■向mf少73

1
1
︒
岡
憫
摘
出

11︒岡憫
d
冊
出
tl

川1319141

日日日日HHHHHHロ8083031578397
112112≡…●一葦≡謙l至≡≡≡ 巨∈

FamJけ77

ロ953068952†防8952I7D
pタS2I7†8952707895†72

ロ9530609ざ2JαF
8952I乃ロ9S2I7I
8952川7895172

向mf少は

向mf少柑

向mW20

Fam町2†

盛l帽

釧望

釧田

pgS306
ロ9S27ガロ952I7P
p952†7†8952†07
ロ95172895才868952I858952†7け
8952†7†8952†07895†72

園2

FCMD重症例のハプロタイプ解析

4）Tbda T；Miyake M，Kobayashi K，etal：Linkage−
disequilibrium mapping namws

5）KobayashiK，NakahoriY；MizunoK，etal：Founder・

the Fukuyama−type haplotypeanalysisinFukuyama−typeCOngenitalmuscularcongmitalmusculardystrophy（FCMD）Candidateregion dystrophy（FCMD）・HumGenetlO3：323・327，1998・

tolOOkb．AnJHumGenet59：1313−1320．1996．

ー97一

福山型先天性筋ジストロフィーにおける180kDa蛋白（p180）の欠損
清

研究協力者

水

輝

夫■

砂 田 芳 秀■斉 藤 史 明＊

樋 口 逸 郎榊松 村 喜一郎■抄 録 最近，福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）の原因遺伝子がクローニングされたが，その蛋白産物であるfukutinは未だ同定されていない．われわれは，FCMDの原因蛋白あるいはその関連蛋白は細胞外マトリック
ス蛋白であろうとの作業仮説に基づき，pH12で可溶化した細胞外マトリックス蛋白に対する単クローナル抗体を作製した・そのうち一つの抗体（Ml抗体）でFCMD骨格筋のsarcolemmaにおける有意な免疫染色性の低下が観察された・ウエスタンプロット解析ではMl抗体はウサギ骨格筋では分子量160kDaと180kDaの蛋白（各々p160，P180と呼称）を認識するが・ヒト骨格筋ではp180だけが検出された・患者生検筋材料より2％Triton・XlOO存在下でp180を抽出しウエスタンプロット解析を行い，FCMD筋ではp180が欠損していることを兄いだした．
緒言

lNHClで，PH7．4とLpH12抽出分画を調整した．またウ

最近，第9染色体長腕上9q31にマップされていた福山型

サギ心筋，脳，肝臓，腎臓，肺からも同様な方法でpH12抽出分画を調整しウエスタンプロット解析をおこなった．

先天性筋ジストロフィー（FCMD）の原因遺伝子がクローニングされ1）J），病態解明への第一歩が踏み出された．しか単クローン抗体の作製：上述したウサギ骨格野pH12抽出
分画（細胞外マトリックス蛋白を含む）でBalb／Cマウスを免疫し，その牌細胞をマウスミエローマ細胞と融合させて単クローン抗体を作製した．

し，その蛋白産物であるhkutinは未だ同定されておらず，
今後蛋白レベルでの研究の進展が期待されている．
FCMD骨格筋においては二次的にlamininα2鎖発現が減少していたり3），骨格筋4）および中枢神経系における基Hl免疫affinitybeadsの作成：Ml抗体を腹水化しIgGを
Afn・GelptoteinAbeads（Bio−Rad）を用いて精製した後に，底膜の断裂5）が報告されている．こうした所見から，われわれは，FCMDの原因蛋白あるいはその関連蛋白は細胞

mBr−Sepharose4B（Pharmacia）にcortiugateして免疫a侃nity
カラムを作製した．このカラムを用いてMl抗体に結合する蛋白をウサギ骨格筋pH12抽出分画より精製した．

外マトリックス蛋白であろうとの作業仮説を立て，免疫
生化学的手法を用いてFCMDでの欠損蛋白の同定を試みてきた・平成8年度の本班会議で既に報告したように，可抗体を作製し，そのうち一つの抗体（Ml抗体）でFCMD骨免疫組轍化学：ヒト生検骨格筋（FCMD3例，対照3例）より
8J上mの凍結切片を作製し，FITC標識抗マウス二次抗体を用いて間接免疫蛍光染色を行った．

格筋のsarcolemmaにおける有意な免疫染色性の低下が観

生検筋のウエスタンプロット解析：FCMD2例，対照2例

察された・今回，Ml抗体を用いてヒト骨格筋材料のウエについて，凍結切片を20vol．のBu飴rAでhomogenizeL，
遠心後pelletの2％mton・Ⅹ100／Bu飴rAの可溶化画分をウ
エスタンプロット解析した．

溶化した細胞外マトリックス蛋白に対する単クローナル

スタンプロット解析を行い，FCMDでは分子量180kDaの蛋白が欠損していることを兄いだしたので報告する．
方法

結ウサギ骨格筋pH12抽出分画の調整：ウサギ骨格筋のt。tal

得られた単クローン抗体の一つMl抗体を用いると対照
ヒト骨格筋凍結切片ではS訂COlemmaに一致した免疫染色がみられた．ところが3例のFCMD生検筋においては全例

microsome分画を10vol・のBufftrA（50mMTris・HCl，pH7．4，
0・15MNaCl・0・lmMPMSF・0・75mMbenzamidine，2・5mg／ml
aprotinin，2・5mg／mlleupeptin，0．5mg／mipepstatinA）にresus−

でsarcolemmaの免疫染色性が著減していた（図1）．そこで，ウサギ骨格筋のpH12可溶化分画をMl抗体を用いてウエ

pendL1MNaOHでpHllに滴定し25℃，1時間アルカリ処理した・100，000xg遠心後，不溶性pellet画分を10vol．Bu飴r

果

Aに再懸濁LpH12で25℃，1時間処理した．遠心後，スタンプロット解析したところ，180kDa（p180）と160kDa（p160）の二つのバンドが検出された（図2）．次いでウサギ＊帝京大学医学部神経内科＊＊鹿児島大学医学部第3内科の心筋，脳，肝臓，腎臓，肺からも同様にpH12可溶化分画を調整し，これらの蛋白の組織分布を検討した．p160
ー98−

は骨格筋，心筋に限局して発現していたが，p180は脳，
肝臓，腎臓，肺など非筋組織にも広く発現していた（図3）．

は検出されなかった．そこで，FCMD2例の筋生検材料
および2例の対照筋生検材料より2％mton・XlOO可溶化

ウサギpH12可溶化分画をMl抗体IgG免疫吸着カラムに通すと，p160だけが吸着し，nativeな状態ではp180は吸着しなかった．

分画を調整し，Ml抗体を用いてウエスタンプロット解析を行った．FCMD2例とも，対照に比べてp柑0の発現が著減していた（図5）．

次いで，ヒト対照骨格筋よりpH12アルカリ抽出分画を調整し，Ml抗体を用いてウエスタンプロット解析を考察

われわれはFCMD骨格筋ではMl抗体で検出される

行ったところp180のみが検出され，p160は検出されなかった（図4）．このp180は10mMEDTAあるいは2％THton−X
lOO存在下でも可溶化された．一方，非還元状態で電気180kDa蛋白（p180）が欠損していることをみいだした・p180
は，界面活性剤だけでなくpH12という強アルカリ条件，
およびEDTA存在下で可溶化されることから，膜貫通蛋泳動を行った場合にはウエスタンプロット解析で，p180

FCMD2

Control

199・一一疇一・・細■儀鴨・脾臓
■『■

106−
69−

44−
28−

FCMD3

FCMDl

図1Ml抗体によるヒト生検筋の免疫蛍光染色FCMD3
例ともS訂COlemmaにおける免疫染色性が著減している．

噂♂♂
図3 p160，p180の組織分布
Reducing

NR

199−
￣二￣

￣．

199・−

一服

二

∴

毒

■−t−

106−
69−

106−
69・−

44−

44−

28−

28−

薄が

式酵㌔

図2 Ml抗体によるウサギ骨格筋のウエスタンプロット
解析

図4

−99−

Ml抗体によるヒト骨格筋のウエスタンプロット解析自integralmembraneprOteinではなくCa2＋依存性細胞外マト
リックス蛋白であると推測される．fukutinの推定分子量は低いと思われる．われわれはpl＆0が伽k血n結合蛋白でありFCMD筋で二次的に欠損しているのではないかと推（53・6kDa）を考慮すると，p180がfukutin自体である可能性察している．今後fukutinの生理機能の解明，FCMDの痛態の解明の上からもp180の同定が必要であると思われる．

CBB

Ml
文

献

1）TbdaT；etal：LocalizationofageneforFpkuyamatype
COngenitalmusculardystrophyto chromosome9q31−33・NahreGenet5：283・286，1993．

199−2）KobayashiK，etal：AnancientretrotranSPOSalinsertion
CauSeS Fukuyama−tyPe COngenitalmuscular dystrophy・Nahre394：38＄−392，1998．

106−3）HayaShi K．Y；etal：Abnormallocalization oflaminin

69−

Subunitsinmusculardystrophies・JNeuroISci119：53−64，
1993．

4）IshiiH，etal：Electronmicroscopicexaminationofbasal

44−

laminainFukuyamacongenitalmusculardystrophy．
NeuromusDisord7：191・197，1997

28−5）Nakan0Ⅰ，etal：Arebreachesintheglialimitansthepri−

C FI F2

C FI F2

marycauseofthemicropolygyriainFukuyama−けpecon−

図5 ヒト生検筋2％Tdton・Ⅹ100抽出分画のウエスタンプ
ロット解析
CBB：ゲルのクマシープルー染色
Ml：Ml抗体による免疫染色

genitalmusculardystrophy（FCMD）？−Path010gicalstudy

OfthecerebralcortexofanFCMDf如S・ActaNeuropatho1
91：313−321，1996．

−100−

福山型筋ジストロフィー（FCMD）骨格筋におけるlamininα2chainの検討
斎 藤 加代子■FC M D 胎児＊臨床症状 の分析

＊ハ プロタイプ解析 による出生前診断 と脳の病理所 見による診断 の確認
＊胎児 同胞 の臨床症状 の分析

図1方の面積の割合をコンピューターソフトNIHimageにより計

4

F

l：3

5

F

l：4

6

F

l：5

7
8

軽症9
10
M

M O：11
14：4

F

12

F

20：0
21：0

重症13
14
15
16

F O：4
M O：4
M O：5
M O：10＋ 十 十 ＋

11

仮性肥大

関節拘縮

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

4：2
14：0

法

象

＋ ＋ ＋ ＋MM

対

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

O：10
O：11

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋F
F■FC M D 例＊骨格筋病理ルーチン染色＋ 大腿四頭筋のHE染色標本上に占める
骨格筋線維面積の割合
1amininα2chain抗体（ChemiconCo．）を用いた
免疫組織染色＋laminin α2chain陽性陽性線経の割合

これらの例について，新鮮凍結標本を作製した．骨格筋病変の程度を知るため，観察視野に占める残存筋線経

3＊chain陽性線維数を数えて，その割合を求めた．

った．羅息同胞と同じfounderhaplotypeのhomozygoteであったことから診断し，それぞれ17，18，20週での脳病理所見により診断を確認した．

2＊

Merosin，M・Chainmonoclonalantibodyを用いた螢光免疫染
色により検討した．観察視野の全筋線経とkmininα2

んなインフォームドコンセントのもとに，家族の希望により羊水細胞のハプロタイプ解析による出生前診断を行

生検時年齢（歳：か月） 顔面羅息木laminin α2 chainの発現は，Chemicon社のanti−human検討を行った．FCMD例は，男性6例，女性10例，生検時の年齢は，生後4ケ月から21歳であった．最大運動能力により歩行可能であった軽症，いざり／よつばい可能であった典型，頸定できない重症の3つに分類し，顔面筋羅息，
関節拘縮，仮性肥大の有無，知能発達について比較した．
胎児3例は，いずれも羅息同胞をもつ家系で，じゆうぶ性香子子

線経の部分を選択し，面積を測定して，取り込んだ画像
全体に対する選択された部分の面積比を求めた（図2）．

対象と方法（象図1）
FCMD16例と出生前診断で診断された胎児3例について

＃

桃啓真

●

福山型筋ジストロフィー（FCMD）の骨格筋における
1amininα2chainの発現を調べ，臨床症状と比較検討する．

典型l F O：6

川倉澤

＊

恵

■

算した．HE標本の画像をコンピューターに取込み，染色の濃淡の差を利用して，結合織よりも濃く染色される筋

的

表

宮宍大

▲T

聡子人

里義

＊

峯橋山

■

小高平

子子子
代規．
紀有場

目

谷北木

地河鈴

研究協力者

＊東京女子医科大学小児科

101

最高運動能
いざり
いざり
いざり
いざり
いざり
四つ這い
いざり
いざり

Dq（年齢）
34（1：11）
朋（1：1）nd
nd
56（1：5）nd
66（4：2）31（2：11）

歩行
歩行
歩行
歩行
頸定未
頸定未
頸定未
頸定未

62（1：6）13（10：9）22（20：0）nd
18（0：11）ndnd34（0：10）

1

2

3

4

5

6

7

8

11

年齢

図3

FCMD症例の運動発達

図2 HE染色標本における残存筋線維面積の割合の計測法結果

FCMD例の内訳は，軽症4例，典型8例，重症4例であった・いずれの型も顔面筋羅息と関節拘縮を認めたが，仮性肥大は運動能力が比較的よい軽症と典型例の一部にみられた．胎児の羅息同胞4例は，すべて典型的経過を示した（図3）．
laminin α2chainの発現はFCMD15例と胎児3例の骨格
図4 FCMD胎児（相通）骨格筋のlamininα2ch血免疫
組織染色

筋線維膜に認められた（図4，5）．すなわち，在胎17週においてlamininα2chainは骨格筋線維膜にすでに発現していた・陽性線経の割合は在胎週数とともに増加していた．
FCMD典型例の1例に筋線維膜における1amininα2chain

lan1両i11α2ch油1の免疫組織染色発現の明らかな低下が観察されたが，この例の筋紡垂内線経ははっきり染色されていた．
1amininα2chain低下例を除くFCMD15例において，年齢とともに観察視野に占める残存筋線経の面積の割合は低下する傾向をみた．しかし，1amininα2chain陽性線椎の割合と年齢には明らかな関係は認められなかった．最高運動能と残存筋線経の面積の割合，最高運動能と1amininα2chain陽性線経の割合に，はっきりした相関は認められなかった．

lan川1■11′Y2（ll訓1低下例

図5 FCMD症例骨格筋のIamininα2chain免疫組織染色

laminin α2chain低下例は，ほぼ同じ運動能のlaminin
α2chain陽性例と比べ，知能障害の程度が比較的軽度であった・筋病理所見では，残存筋線経の面積の割合が小さく，病変は高度と思われた．

積が小さく，病変は高度と考えられた．このように，
lamininα2chain低下例では，病理所見に比較して臨床像が軽度という傾向がみられた．
lamininα2chain陽性例の臨床像は，頸定不能のものか

考察ら歩行可能なものまで，多彩であった．1弧ininα2chain

FCMD16例中15例は，免疫組織染色により骨格筋線維
膜に明らかなIamininα2chainの発現を認めた．1例のみに明らかな低下をみた．この例の筋紡垂内線経には発現がみられ，欠損ではなく何らかの二次的原因による発現の低下と思われた．臨床的には，4歳2ケ月でいざり可能である典型的経過を示し，下腿に仮性肥大が認められた．

陽性線経の割合と臨床像に，はっきりした相関は認めら

知能障害は1amininα2C旭n陽性の典型例，軽症例，重症例と比較して軽度であり，4歳2ケ月で66，発達年齢は2歳

陽性例における陽性線経の割合は，小さいものでも50％8ケ月相当であった．筋病理所見では，筋線経の占める面れなかった．すなわち，lamininα2chain低下例を含む
FCMD例の臨床症状は，lamininα2chainの発現以外の要因に，より強く修飾されていると考えられた．
laminin α2chain陽性例の骨格筋の病変の程度は，
1aminin α2chainの発現にほとんど影響されていなかった．
程度はあったので，1anininα2chainは高度の低下を示す
場合にのみ，病理像に影響を与えるのかもしれない．

−102−

lamininα2chain陽性線経は在胎17週の胎児から観察された．18週，20週と週数が進むにつれてlamininα2chain

観察視野を100％とする

陽性線経の割合が上昇した．出生後，加齢とともに残存
筋線維面積は低下傾向をみたが，加Iininα2chain陽性線経の割合に一定の傾向はなく，骨格筋の病理的変化は進
行するが，lamininα2chainの発現は変化しないと思われた．
筋線維面積の測定やhnininα2chain陽性線経の計測は，生検部位や標本の状態に大きく影響されて誤差を生じやすい．誤差を小さくするためには，生検部位を統一し，状態の良い新鮮凍結標本を作製し，一つの例での検討数
図6

FCMD骨格筋標本における筋線維面積とlaminin
α2chain陽性線経の割合
横軸に年齢，縦軸に観察視野を100％としたときの筋線経の面積の割合を棒グラフで示し，そのなかでのkmininα2chain陽性線経の割合を臨床型別に色分けして示した．＊はlamininα2chain低下例である．

を増やすことが必要と思われる．
結論

FCMD16例中1例のみに，免疫組織染色により，骨格筋
線維膜の二次的と思われるlamininα2chainの発現低下をみた．低下例では，病理所見に比較して臨床像が軽度という傾向がみられた．
FCMD例の多くはlmlininα2cbain陽性であり，陽性線経の割合とFCMD例の臨床症状，骨格筋の病変の程度に，はっきりした相関は認められなかった．加齢にともない病理的変化は進行するが，lamininα2chain陽性線経の割合に一定の傾向はみられなかった．
lamininα2chain陽性線経は在胎17週の胎児から観察され，在胎週数とともに陽性線経の割合が上昇した・

図7 FCMD骨格筋線維中のlamininα2chain陽性線経の割合
横軸に年齢，縦軸に観察筋腺維中のlaminin α2
chain陽性線椎の割合を示した．臨床型別に記号を変えている．胎児では在胎週数が進むにつれて陽性線経の割合が上昇しているが，出生後には一定の傾向は見られない．
発連年鱒▼：bmlnInα2chaln

／

●12

低下例・

3

図8

4

5

8

7

8

91011暦年静FCMD症例の知能発達−103−

福山型先天性筋ジストロフィーにおける筋細胞表面の変化．
共焦点レーザー顕微鏡と電子顕微鏡による観察
松

研究協力者

原

水 野 美 彦■＊宮 本 和 人＊四郎■

北 口 哲 雄■平 井 俊 策＊

磯

崎

英

治■

要 旨 福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）の生検拓を免疫組織化学および電顕的に観察した．その結果，
1・FMCDの筋線経では筋線経を包むlamininα2chain（LA2，merOSin）が局所的に減少していた．共焦点レーザー顕微鏡によるenねce像ではLA2の局所的な破綻が観察された．
2・FCMDの筋線経では・正常の筋線経では殆ど認められない1amininα5（LA5）のepitopeが発現し，それはLA2減少
部位で観察されやすい候向があった・また・LA5の発現を見た筋線経で一部にneuralcelladhesionmolecpIe（NCAM）
が発現していた・これらの所見はFMCD筋線維表面には，発生途上筋や再生筋と共通性のある状態が存在することを示唆した．
3・電顕では筋細胞基底膜が同定できない部位を局所的にもつ筋線経があった・定量的解析の結果，基底膜が同定できる部位における形質膜の電子密度は・同定できない部位よりも高かった・さらに，基底膜と形質膜の電子密度のピークの間の距離は不規則で，分散が大きかった．
これらの所見は基底膜と形質膜の電顕上の変化が・たがいに密接に関連していることを示唆した．FMCD関連遺伝子の産物であるFukutinの分布・機能には不明な点が多いが，FMCDの病態の本質に，筋形質膜と基底膜の関連を正常に形成し・それを維持する機構の異常が関与している可能性がある．
緒言

本邦では福山型先天性筋ジストロフィー（FMCD）が先
天性筋ジストロフィーのなかでもっとも重要な病型である・しかし本疾患についての最近の分子遺伝学的研究の進歩1）にもかかわらず，筋が障害される機序については不明の点が多く残されている．形態学的にはすでに筋細胞基底膜の主な構成蛋白の一つであるlamininα2submit（LA2）すなわちmerosinが先天性筋ジストロフィー（CMD）の一部で欠損していることが報告され2），
FCMDについてもHayashiら3）によってLA2の部分的欠損が報告された・一方Ishiiら4）は筋細胞基底膜の一部に，電顕的に同定しにくい部位のあることを報告した．しかし，基底膜の変化が筋の変性に関与している証拠はこれまで見つかっていない．そこでこの問題を解く手がかりを得るために，共焦点レーザー顕微鏡で筋細胞表面を観察し，さらに筋形質膜の変化を中心に定量的方法で電顕像を解析した．
症例と方法
臨床的にFCMDと診断された4例の生検筋を対象にした・全例精神発達の遅滞と頭部MRIまたはCTの異常があり・血清CKは高値であった・Lamininに対する抗体

としては抗LA2抗体とChemicon社の抗1amininα5（LA5，
従来1amininAまたはlamininα1と記載されていたもの）
抗体を使用した．また筋再生現象との関係を調べる目
的で，再生筋で発現するneural cell adhesi。n m。le−Cule（NCAM）に対する抗体を用いた．対照として，病的所見の無い生検筋を同じ方法で観察した．
同一の方法と条件で包哩と薄切および重染色を行った生検筋の電顕用ブロックを材料として，基底膜が観察できる部位とできない部位について，形質膜の形態的な差異の有無を検討した．また，形質膜とその周辺の電子密度の分布を定量的に測定した．各例について
一つのグリッド上で電子ビームの条件を変えずに連続して筋細胞表面を6万倍の固定した倍率で20枚以上撮影した・撮影は同一条件で行い，一作業工程で現像した．
この画像を固定した条件でimageSCannerで爪leに変換しNIH・imageで解析した・各ピクセルの濃度を256段階で定量化したのち，距離を横軸にして電子密度をグラフ化した・このグラフを同一平面上に一定間隔で並べ，疑似的な鳥敢図を作製した．また基底膜と形質膜の電子密度のピークの高さとともに，両ピーク間の間隔を測定した・このよう集計したデータを推計学的に分析した．

＊東京都立神経病院神経内科＊＊水野医院ー104−

表1SummaryofquBntitativeanalysisofelectrondens吋OfdleCe11surfhce
CaSeS

bas山lamina（BL）
だraysCak（gS）

甘LPMdistancelasmamembrane
BLvisibIe（亡S）

BLinvisibIe（gs）

（sd．）
casel

76．0（14．1）（n＝177）

123．3（12．1）

lt抄．1（14．7）（n＝73）＝

48．9（22．6＝）

C乱SeZ

63．3（12．¶（m＝112）

116．3（16．8）

85．5（16．

43．9（20．0…）

c乱Se333．8（10．可（m＝100）

95．1（15．1）

73．3（10．4）（n＝23）…

38．3（10．2）

CaSe4

78．，（25．4）（m＝130）

141．8（39．2）

66．2（28．0）（n＝21）…

36．6（14．5日）

67．叫14．0）（m＝163）

130．2（18．0）

44．3（9．5）

101．2（9．4）（n＝157）

140．1（14．4）

37．3（9．2）

CO鵬r011）（m＝32）＝

comtro12

H p＜0．0001

された．一方FCMDのLA2は共焦点像でも陽性反応は弱ノーγ二讃環等．▼．こ．・・●・

く，多くの線経で全周または部分的に無反応であった．
enねce像では均質な構造を見ることは少なく，大部分の観察部位で一部欠損部を伴う不規則な像が得られた．
FCMD筋のLA2とLA5の2重染色では，同一線経に於

J二ト・、
YL

●

き一空‥T

ける両者の関係は様々で，部位によって異なっていたが，全般的には，LA2の発現が微弱な線経にLA5が発現している傾向が見られた．抗LA5抗体で染色したFCMD
筋のen払ce像では，LA2より一層不規則で断片的な分布が観察された．
NCAMの発現は正常筋ではまれであった．一方FCMD筋では，多数の線経で，筋細胞膜と一部の筋形質に発現が認められた．二重染色では，筋膜にLA5陽性部位を持つ線経の一部で筋膜あるいは筋形質にNCAMが発現している像が観察された．
電顕では筋細胞の基底膜が局所的に同定できない部

図1中山血はiveandysesofcellsu血elec打Ondemity．
Keys pm：Plasma membrane，bl：basaIlamina，AJTrOWS
Showcorrespondingreg10nOndleCellsu血ce．
結位があった．高倍率で観察すると，このような部位では，時に形質膜の外側に，不規則な厚さで基底膜類似

果

筋生検の一般組織学的な検査では，筋線経の大小不同，横断面の円形化，Opaque線維散在，問質の線維化と脂肪沈着がみられた．
LA2はFCMDでは蛍光強度は全般に弱く，しかも線経によって差が著しかった．また同一線経の周囲でも場所によって強弱が一定せず，一部または全周にわたって蛍光の見られない線経が多数あった．正常対照筋では抗LA5抗休では，筋線維周囲には極微弱な反応があの電子密度を持ったamorphousな部分が観察された・基底膜の同定できる部位でも，同膜と形質膜の間隙は不規則で密着したり，逆に異常に広がった部位がしばしば見られた．
定量的な解析の結果（1）基底膜が同定できる部位における形質膜の電子密度は，同定できない部位における電子密度よりも高かった（図1）．（2）基底膜と形質膜の電子密度のピークの間の距離は，FCMDで分散が大きい

るのみで，主に血管に強い陽性反応が認められたが，傾向が見られ，F検定で4例中3例で分散に有意な差が，FCMDでは，抗LA5抗体では一部の筋線維周囲に分布，強度ともに不規則ながら，明らかな陽性の反応をみとめた．

対照と比較して見られた（表1）．

正常筋のLA2を共焦点レーザーで観察すると，規則
正しい筋線維周囲への分布が見られた．縦断面の切片

Sewryら5）はmerosin欠損CMDで，またHayashiらは3）FCMDでLA5がupregulateされていることを報告した．
LA5は筋再生過程で出現することが知られており，そ上で得られたen払ce像では，ほぼ均質な膜構造が観察

考

ー105−

察

の発現に筋再生現象が一部関与する可能性がある．今文

献回のNCAMとの同一線経に於ける発現は，FMCD筋線
維表面に発生途上筋や再生筋と共通性のある状態が存在することを示唆した．

1）KobayashiK，NakahoriY；MiyakeM，etal：AnanCient

LA2は基底膜の最も重要な構成成分であると同時に，

2）TbmeFMS，EvangelistaL，LeclercA，etal：Congenital

形質膜とその周辺に分布する他のdyStrOglycan，SarCOgly−
Can，dystrophin等の細胞骨格蛋白と基底膜の連関の要とmusculardystrophywithmerosindeficiency．CRAcad

なる部位に位置している．基底膜及びLA2の変化がFCMDの一次的な変化であるか否かは断定できないが，今回の我々の観察結果は，基底膜の変化が形質膜の電3）HayashiYK，et al：Abnormalexpression oflaminin

顕上の形態変化と，密接に関連していることを示している・また電子密度ばかりでなく，両者間の距離が正常に保たれておらず，空間的な関係にも異常がある可

4）IshiiH，HayashiYK，NonakaIandArahataK：Electron

能性が考えられる．Fukutinl）の分布，機能には不明な点が多いが，FCMDの病態の本質に，筋形質膜と基底膜の関連を正常に形成し，それを維持する機構の異常が関与している可能性がある．

retrotranSPOSalinsertioncauses Fukuyama−type con・
genitalmusculardystrophy．Nature394：388−392，1998．

Sci（L娩Science）317：35ト357，1994．

Subunitsinmusculardystrophies．JNeuroISci119：53−
64，1993．

microscopICeXaminationofbasal1aminainFukuyama
COngenitalmusculardystrophy．NeuromuscDisord7：
191−197，1977．
5）SewryCA，PhilpotJ，MahonyD，WilsonLA，MuntoniF
and Dubowitz V：Expression oflaminin subunitsin
COngenitalmusculardystrophy．NeuromuscDisord5：
307−316，1995．

−106−

福山型先天性筋ジストロフィーの小多脳回
一特にglialimitans一基底膜複合体病変との関連について−
中

研究協力者

蒼

藤

川 井

祐

野

今

治＊

子＊＊

戸

田

達

史梱

村

山

繁

雄輌

充＊＊＊＊本 吉 慶 史＊＊＊＊＊

福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）の大脳り小脳の結

小多脳回の形成機序は，その初期像（胎児脳）の検索ができなかったことからほとんど分かっていなかった．しかし，最近FCMDの遺伝子（Fukutin）が同定され1）て本症の出生前診断が可能となったことから，脳病変の初期像が検索できるようになり，小多脳回形成機序の理解が大幅に進んだ．
脳の最表面は，アストログリアの突起からなるglia
limitans（GL）により覆われており，神経組織が脳表に露出することはない．GLの外側はアストログリアにより形成された基底膜（basallamina：BL）で覆われている（このBLはGLの要素とみなすことにする）．われわれはFCMD胎児
脳ではこのGLに破れがあることを兄だし2），さらに，出生後FCMDの大脳でもGLの破れを認め3），これが本症の小多脳回の遠因である可能性を示した．

果

1．胎児例
1）大脳皮質（1）組織所見：大脳皮質は広範に異常な組織（neuro・
gliomesenchymaltissue：NGMT）で覆われていた（図1）・前頭葉ではGLに多数の破れがあり，そこから皮質板の神経細胞が噴水状に外に出ていた（図1A）．GLが保たれている
部分では，神経細胞はGLの下に留まり，それを迂回して遁走する像は見られなかった．
GFAP染色ではGL表層が線状に染まり，破れの部分ではこれが途切れていた．BLを染める抗CO4抗体染色では，
NGMT浅層と深部白質の血管壁BLは陽性だったが，GLや皮質内の血管壁は陰性であった．対照脳も抗CO4抗体
に対して同じ染色態度を示した．

症例と方法
1．胎児例：遺伝子診断の後人工流産した胎齢18週のFCMD

後頭葉には，異形性の強い皮質と正常に見える皮質とが明瞭な境をなして隣り合っている部分があった（図18）．
前者ではGLの破れが大きくかつ多数で，GFAP染色でも胎児．10％中性ホルマリンで固定した大脳左半球をパラ
フィン包埋し，種々の染色を施した．また，抗GFAf抗体，
抗coll喝enWpeⅣ抗体（抗co4抗体）で免疫染色を行った．
正常対照として，神経疾患の無い在胎19週と23週の胎児脳を使った．FCMDでは前頭葉，後頭葉，小脳の一部をグルタール固定して電顕観察した．
2．生後例：症例は生前にFCMDと診断され，剖検にて大脳・小脳に小多脳回を認めた3例（男2例，女1例；平均年
齢15歳（12歳〜21歳）．対照はDuchenne型筋ジストロフィ
ー例を含む剖検脳3例である．前頭葉と小脳の小多脳回の部分を通常の染色に加えて抗GFAf抗体，抗co4抗体，抗laminin抗体で免疫染色した．また，l例（21歳男性）では前頭葉と小脳の小多脳回の部分をグルタール固定し，電頗検索した．

図1胎齢18週のFCMD胎児大脳
A：前頭葉皮質．表面はneurogliomesenchymaltissue
即GMT）で覆われており，皮質板神経細胞がglia
limit nSの破れから飛び出している．HE，×6．
B：後頭葉：左半分で皮質ニューロンが高度に過剰遁走している．Nissl，×3．

＊自治医科大学神経内科
榊東京大学医学部神経内科＊＊＊東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センター
杵＊＊国立精神・神経センター武蔵病院神経内科＊陣＊＊国立療養所下志津病院神経内科−107−

GLの線条の染色性は認められず，神経細胞の大半がこのではこの連続性が途切れてEGCがこぼれ出ていた．破れ

破れを通って遊走していた．この神経細胞は脳表面に垂直な柱状配列を示し，接線方向への移動は見られなかった・正常皮質部分では，GLのGFAP陽性の連続した線状構造が認められ，その外にはNGMTは観察されなかった．

たGLを有する隣合うfoliaは，連出したEGCを介して癒合し，血管を含むくも膜組織が煮ssure深部に閉じこめられていた．

（2）電子顕微鏡所見：前頭葉では，GLを形成している
astrocyteのendfbetの最表面と，このendftetに面するNGMT
部分にBLが認められた．このBLは電子密度が均質に高く，laminadensaと1aminalucidaの区別はできなかった．GL
側のBLは連続だったが，NGMT側のは不連続であった．
NGMTの深部には，Pialnbroblastsの細い突起の層が2−3層，少数のコラーゲン線経を伴ってGLと平行に走っていた．
NGMTの最表層でくも膜下腔に露出している部分にはBL（2）電顕所見：滑らかな皮質部分では，GLの表面に連続したBLが認められた．BLには1aminadensaと1aminalucidaが識別された．表面が不規則な部分ではBLが途切れており，EGCが数個〜10数個の小集塊をなしてくも膜下腔に遊出・露出し，狭い空隙を挟んでpial馳roblastの突起と対峠しているのが観察された．
2．出生後例
1）大脳皮質（1）組織所見：前頭葉の小多脳回部分では，脳表が陥入している部位に異常に大きな血管が多数認められた．抗co4は見られなかった・GLの破れの部分ではBLやpialfibro−
blastの層も断列して，神経細胞やradialgliaの突起と思われる突起が貫通していた（図2）．
後頭葉の異形皮質では，GLに相当すると思われる部分

抗体染色では，脳表のGLのBLが途切れて脳組織が外に出ている像がときどき観察された（図3A）．また，脳表の陥入部位の血管周囲腔のGLのBLにも断列が見られ，脳にはBLを有するendftetはなく，表面に平行なpialnbro−
blaStの細い突起が少数のコラーゲン線経を伴って走るのが観察されるのみであった．
2）小脳皮質組織が血管周囲腔に迷出していた（図38，6）．また，この血管近傍の脳実質に抗co4抗体陽性の顆粒状構造が認められた・対照例では，GLのBLの断列や抗CO4抗体陽性の顆
粒状構造は見られなかった．

（1）組織所見：小脳皮質は外顆粒細胞匹GC）層，分子層，
Purkirか細胞層で構成されていた．皮質にはEGC層表面が滑らかな部位と不規則な凹凸を示す部位とがあった．BL
とコラーゲン線経を染める渡辺−ナウメンコ鍍銀染色法
では，前者は連続したBLで覆われていたのに対し，後者
一茂
■

1

・

図3

図2

出生後FCMDの前頭葉の小多脳回部分
A‥脳表のdial血i也nSの基底膜（祈OWS）は途中で途切れている（double孔汀OWS）．

胎齢18週のFCMD胎児前頭葉皮質
Glialimitans（SmallamWS）の破れ（hgeaTrOWS）から皮質ニューロンが突起とともに外に出ている．

8‥脳内にトラップされた大きな血管．血管周囲腔のglial血itmSの基底膜は途中で途切れている

×1，200．

挿入図・左のlargea汀OWの部分を拡大したもの．

C：8のa汀OWの部分を拡大したもの．
A〜C：抗coll喝印加はⅣ抗体による免疫染色．

×12，000．

A．C：×65，日：×6．5（a汀OW）．

ー108−

（2）電子顕微鏡所見：脳表面のGLには一部に破れがあり，シナプス構造，アストログリアの突起，神経突起から成2）小脳皮質（1）組織所見：小多脳回の部位では，異常分子層の中心に，る中枢神経組織がそこからくも膜下腔に出て，脳表に平正常ではみられない径の大きな血管が存在し，PASでは基底膜の肥厚が観察された．抗CO4抗体，抗1aminin抗体
免疫染色では，点状陽性構造物の集簾が小多脳回内血管

行に広がっていた（図4）．とび出した脳組織の一部ではその最外層にBLが形成されていたが，大部分はBLを欠き
くも膜下腔に露出していた．皮質の陥入部位の血管周囲腔のGLに脳裏と同様に破れがあり，シナプス構造，アス
トログリアの突起，多数の微小管を含む神経突起，BLで囲まれていない有髄線経から成る脳組織がこの腔に迷入していた（図5）．しかし，くも膜下腔や血管周囲腔には神経細胞やアストログリアの細胞体の迷人は見られなかった．また，血管自体のBLには明らかな異常は見られなかった．

に接した発達異常分子層内に時に認められたが，脳表基底膜および血管周囲脳実質側の基底膜には破れや重複の所見は明らかでなかった．
（2）電子顕微鏡所見：小多脳回内の血管の基底膜は肥厚し，血管周囲腔に面した脳側の基底膜は，不規則に蛇行し，血管の基底膜にほとんど接している部位も見られたが，基底膜の破れは明らかではなかった．脳表のグリア限界
膜の破れも認められなかった．

図4 出生後FCMDの前頭葉の小多脳回部分．脳裏のglialimitansの基底膜（A；arrOWS）の外に異常組織がみられる（A）．一部（＊）拡大するとシナプス（B；a汀OWS）が認められ，脳組織が外に出たものであることが分かる．
A：×5，S20，

8：×29，100．

−109−

考

察

も正常に保たれたGL部分では神経細胞はGL下に留まっ細胞は表面にほぼ垂直に柱状配列をしており，正常皮質との境を超えて正常皮質を覆うことはなかった．以上の所見は，NGMTの形成にはその場におけるGLの破れが必要条件であり，ひいてはこの破れがFCMDで見られる小ていた．また，異形性の強い皮質では過剰遊走した神経

多脳回の原因である可能性を示すものである．BLは実質

GLの破れは他のFCMD胎児でも確認されている4）．GL
に破れのある皮質部分にのみNGMTがあり，この皮質で

図5 出生後FCMDの前頭葉の小多脳回部分．トラップされた血管の周囲腔のglialimitanSの基底膜（A；aTrOWS）が認められ．血管周囲腔には脳組織と類似した組織が占めている．Aの一部（＊）を拡大（B）するとシナプスと微小細管を含む神経突起が認められ，これは脳組織であることが分かる．
Å：×5，820，

8：×19，400．

−110−

組織を問質組織から隔離する働きがあり5），隣りあう脳回を分離する作用がある6）．NGMT表面でのBLの未形成も本症の生後例でみられる脳回癒合に寄与したものと思われる．
FCMD胎児小脳の滑らかな皮質部分は連続したBLを有文1）KobayashiK，NakahoriYiMiyakeM，etal：Anancient
retrotransposalinsertioncausesFukuyama−typeCOngenital
musculardystrophy・Nature394：388−392，1998・
2）NakanOI，FunahashiM，TakadaM，etal：Arebreachesin

し，そこではEGCの造出は認められなかったのに対し，GLの途切れた部分からはEGCの小集塊がくも膜下腔に遊出しており，大脳と同様GLの破れがEGC遊出の原因と考えられた．また，GLに破れを有するblia同士が癒合して，深部にくも膜組織を閉じこめた状態は，FCMD′M脳の′ト
多脳回の基本構造に酷似している．
本症成人例の大脳においても脳表と血管周囲腔のGLに破れがあり，脳組織がくも膜下腔や血管周囲腔に迷出していた．このことは本症大脳では出生後もGLの破れが持続的に存在あるいは新たに出現する可能性を示しており，
皮質ニューロンの遊走が停止した後も本症の大脳奇形に修飾が加わるものと推測された．
出生後FCMD小脳の小多脳回では血管周囲腔脳側と脳表のBLは走向は著明に不規則になっていたが，大脳と異なり，破れ自体は認められなかった．この大脳・小脳の所見差が何に由来するのか今後の検討が必要である．
以上，FCMDの脳奇形には胎生期におけるGLBLの形成不全が大きく関わっていることが考えられる．この形成

献theglialimitanstheprimarycauseofthemicropolygyma
in Fukuyama−type congenital muscular dystrophy（FCMD）？−−Path010giCalstudyofthecerebralcortexof

anFCMDfttus．ActaNeuropath0191：313・321，1996・
3）SaitoY，MurayamaS，KawaiM，etal：Breachedcerebral
glialimitanS・basallaminacomplexin Fukuyama・tyPe
congenitalmusculardystrophy．ActaNeuropath01・（inpress）

4）Yamamoto T，ShibataN，KanazawaM，etal：Early
ultrastruCturalchangesinthecentralnervoussystemin
Fukuyama

congenitalmuscular

dystrophy・UltrastruC一山rdPatho121：355−360，1997．
5）FurthmayrH：BasementmembrmeS・In：ClafkRAF，
HensonPM（eds），Themolecularandcellularbiologyof
woundrepair．Plenum■Press，NewYork，1988，Pp525−558．

6）SieversJ，MangoldU，BerryM，etal：Experimental不全の原因についてはFukutin蛋白の局在や機能の解明により明らかにされるものと思われる．

studiesoncerebellarfoliation．Ⅰ．Aqualitativemorph0−

10giCalanalysis ofcerebellar鮎suration deftcts after
neonataltreatmentwith6−OHDAinthe rat．J Comp
Neuro1203：751−769，1981．

−111−

遺伝子診断が行なわれた福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）胎児（14過）の病理学的検索
一胎児脳に基底膜欠損は存在するか−斎 藤 加代子＊研究協力者

小林 槙 雄＊＊ 柴 田 亮 行書＊
山 本 智 子桝 大 澤 真木子＊

福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）は，広範囲な中枢神経系の奇形を伴い進行性の筋ジストロフィーが共存致していた．皮質表層の細胞はSlOO蛋白陽性，ニューロ

する特異な病態で，常染色体劣性遺伝による家族集積がみられる．1993年，戸田らりにより第9番染色体31−33に遺フィラメント陰性，シナプトフイジン陰性，GFAP陰性で，ニューロン，グリアのいずれの形質も発現していなかった．髄膜間葉組織内に混入した細胞も同様の形質を発現

伝子座が決定された．中枢神経系の主病変は，大脳と小脳の皮質異形成で，皮質外層における細胞移動障害によしていたが，SMI31で，細胞質からのびる突起が識別された．皮質以外の海馬，線条体，視床，白質は正常であるglio−neurO・meSenChymaldysgenesis2）に原因が求められている．高田ら3）は，本症23週胎児脳を詳細に検討し，組った．小脳では，皮質内の血管を伴う髄膜閉業組織の不規則な増殖を認めた．脳幹周囲にも同様の構造が認められた．眼球の形態に異常はないが，網膜は未熟な網膜芽細胞層からなる．免疫組織化学的にGFAP陰性であるが，織学的形態を3型に分類し，皮質病変の成因をpial・glial
ba汀ierの破綻によると結論している．我々も，これまでに17，18週および20週胎児脳を検索し，FCMD胎児には大脳皮質の基底膜構造に微小欠損が多数存在し，欠損部から表層を覆う間菓組織内に脳実質の吹き出し状病変が形成されることを観察，同様の機序を想定している．

0mithineaminotranSfbrase（OAT）活性（藤田保健衛生大学生化
学松沢健夫教授より恵与）を欠如しており，ミューラー細胞の分化の遅延が想定された（図3）．心筋，骨格筋の形質

今回，胎齢14週胎児脳を検索し，基底膜欠損の意義につき考察した．
症
例
胎齢14過の21トリソミーを伴う人工死産児．家族歴で，同胞1名がFCMDと診断されている．胎齢13週に施行された遺伝子診断で，組み換えなく，FCMDと診断され，両親の希望により14週で人工的流産に至った．病理学的所
見：剖検脳は，肉眼的に17，18，20週に比べ明らかな異常はなく，大脳皮質の軟膜下は半透明の薄い膜様組織が覆う．
組織学的に，大脳皮質板と外套層が区別できた．M染色を行うと，脳表の髄膜間菓組織との境界に位置する線状の基底膜構造の部分的欠損を観察できるが，極めて限局した範囲にとどまる（図1）．さらに，閤葉組織内への脳実質の吹き出し状病変は認められないが，前頭葉の一部に，基底膜の破れに一致して脳表に向かい突出するニューロンと間薬組織内に混入した少数の細胞が識別できた（圃2）．免疫組織化学的には，ラミニン免疫活性は部分陰性であった．脳表の間葉組織を剥離し，膜状のままで抗4型コラーゲン抗体で反応させると，樹枝状に拡がる血管網の間に，無血管領域が観察され，基底膜欠損部位に−＊東京女子医科大学医学部小児科＊＊東京女子医科大学医学部第一病理

図1前頭葉皮質にみられた基底膜の部分欠損（即劇染色，360×）
−112−

LM

3
図2 基底膜の破れと髄膜閉業組織内の細胞集団（HE染色360×）

図3 網膜組織でのomi血eanlino廿as飴r鮎e（0Ar）免疫活性の欠如（抗0Ar抗体，1：500，酵素抗体法）

膜にラミニンは陽性であった．四肢骨格筋の変性，萎縮は認めない．

14過胎児脳の髄膜間葉組織内に混入した細胞は，局在および形態的にカハールレッチクス細胞と考えられ，軟考察FCMDにおける皮質異形成は，髄膜内への過剰なニュ

膜下のSMI31陽性構造は，同細胞からのびる突起網であーロンの移動で，グリア細胞突起に誘導されるニューロ
ブラストの移動が障害された位置異常として理解される．
これまでの検索4）から，病変形成は17週以前から開始されると考えられるが，14週胎児では明らかな吹き出し状病

2，palValbumin，AChE，NADPH，reelinの免疫組織化学的同定10）が必要である．reelinは，ニューロンの移動に抑制的変を欠き，基底膜欠損は限局していた．ニューロンの移動以前に，基底膜異常が存在することは極めて重要であきい．

る・神経管の形成に基底膜は重要な役割を果たし，Loop一
血15）やSplotch6）などの神経管閉鎖不全ミュータント動物の脳胞では神経上皮基底膜の不連続性が指摘されている．
皮質原基の形成とニューロンの移動には，細胞間相互作用に関与する分子の解析が必要で，inteがnα6ノックア
ウトマウスでの抗ラミニン抗体を用いた検索7）では，皮質表層にニューロンが移動した部位では，基底膜構造の不連続性が確認され，基底膜の退行あるいはリモデリング

ろう．Calbindin，Calretinin，GABA，microtubuleassociaIeproteinに作用するともいわれ，カハール レッチウス細胞の異常がFCMDにおける皮質構築の異常につながる可能性は大結14週胎児脳において，ニューロンの欠損部を超えた移動に乏しく，皮質異形成に至る初期像とする確証はない
が，基底膜構造の部分的欠損は厳密な対照例との対比が必要である．しかし網膜では，すでに10過に出現し，網膜の層構築と形態維持に関わるミューラー細胞の分化に遅延をみたことは，FCMDにおける脳一網膜病変の形成に共通のプロセスが存在する可能性を示唆している．

が想定された．最近Pax6がradialgliaの分化を調節していることが報告8）された．pax6欠損ミュータントマウスでの基底膜の解析が期待される．FCMDで異常とintegrinα6ノ
ックアウトマウスの異常が類似し，ともに網膜層構造の異常を伴うことは興味深い．胎齢6週から10週にかけて出文献l）TbdaT；SegawaM，NomuraY；etal：NatureGenet5：283−286，1993．
2）Nakan0Ⅰ，FunahashiM，ThkadaK，etal：ActaNeuropa−

現し，網膜全層を貫き，網膜の層構築と形態維持に関与するミューラー細胞の異常は，内境界膜（基底膜）の機能障害を意味する9）．

論

tho191：313−321，1996．
3）ThkadaK，NakamllraHandTもnakaJ：JNeuropath01Exp−113−

Neuro143：395−407，1984．

8）GBtZ：M，StoykovaAandPeterG：Neuron21：1031−1044，

4）Ⅵ皿amOtOT；KomoriT；ShibataN，etal：Neuropathology

199g．

16：184・189，1996．
5）WIsonDB：Virchow●sArchiv（CellularPath01）48：9−17，

9）小林桂雄，柴田亮行，澤田達男，金澤美穂，大澤1985．
6）MorrisGLandO

sheaKS：DevBrainRes．9：408・410，

1983．

7）Georges・LabouesseE，MarkM，MessadeqNand
GanSmu11erA：CurrentBiology8：983・986，1998．

ー114−

真木子：Neuropath01gy18（SupPl．）：313，1998．
10）Marin−PadillaM：TrNS21：64−71，1998．

福山型筋ジストロフィー剖検脳ガングリオシドの分析
吉

研究協力者

佐

野

藤

英＊

猛＊

荒

畑

喜

一＊＊

要 旨 福山型筋ジストロフィーの中枢病変の生化学的背景を検索するため，神経組織の分化，発達にともなって変化するガングリオシドの組成を2例のFCMD剖検脳を用いて調べた．大脳皮質においてはコントロールと比し明らかな差異をを認めなかったが，白質において1例ではGM4，GM3の減少を認め，またこの症例ではGMlガ
ングリオシドは二重バンドになっており，脂肪酸組成が正常と異なると考えられた．FCMDにおいて糖脂質の異常が中枢神経病理の背景に存在する可能性が示唆された．
はじめに
福山型筋ジストロフィー症（FCMD）は重度の精神知
能発達障害をきたし，神経病理学的には，大脳皮質のpial・glialbarrierの破綻が関与すると考えられている．すなわち大脳外表の病変と皮質が不規則に連続し，未熟な神経細胞と考えられる細胞が皮質外へ不規則に進展している所見が認められるl）．また大脳白質にはMRrCT2highintensityが認められ，白質の髄鞘の形成遅延が指摘されており2），骨格筋のみならず中枢神経も広範な先天性の異常を有する．
一方FCMDにおける中枢神経の生化学的分析は今までにほとんどなく，中枢神経の発達異常の分子的機序の解明がまたれる．ガングリオシドは中枢神経系の細胞膜表面に豊富に発現する複合糖脂質であり，その組成は中枢神経の発達に応じて大きく変化し，神経細胞の分化，遊走，シナプス形成，髄鞘形成に応じてそれぞれ特徴的なガングリオシドを発現する．本研究では，FCMD剖検脳におけるガングリオシドを分析し，本症の中枢病変の背図1大脳白質のガングリオシド薄層クロマトグラム
CaSel（FCMD（1））においてはGM4，GM3の発現が低下している．

景に特徴的なガングリオシドの変化があるか検索した．
対象と方法
対象は死亡時17歳（CaSel），25歳（case2）のFCMD児．コ
ントロールは，死亡時25歳のDMD児，56歳ALSで，疾患
コントロールは死亡時22歳のSSPEである．神経細胞の組成を反映すると予想される大脳皮質，ミエリンの変化が予想される大脳自質を検討した．
脂質は約100mgの脳組織をクロロフォルム／メタノール
にて抽出し，脱塩の後，イオン交換カラムSephadexDEAE
ん25を用いてガングリオシドを回収した．ガングリオシ
ドは薄層クロマトグラムに展開され，レゾルシノール塩
酸により発色し，組成はデンシトメーターにより測定した．GMlの確認のため，薄層免疫染色法を用いた．
図2＊国立精神・神経センター国府台病院神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

ー115−

大脳ガングリオシドに対するGMl抗体を用いた薄層免疫染色
FCMD（1）ではGMlは二重バンドになっている．

結果

今回2例のFCMD脳ガングリオシドを分析し，結果は異大脳皮質においては単純脂質，ガングリオシドとも常がある症例と，はっきりした異常が無い症例に別れ，FCMDとコントロールに差を認めなかった．sspEでは共通の異常は指摘できなかった．これはサンプリングのGMlが著しく減少し，GD3が増加した．これは高度の脱部位の問題もあると思われ，更に症例を集積し，検討する必要がある．

髄と，鮎tOrOCyticgliosisを反映していると思われた（図1）．
一方，自質のガングリオシドは，CaSelではGM3とGM4の減少を認めたが，Ca562ではこれは認められなかった．

文

またcaselの白質GMlはdoublebandになっており（図2），
脂肪酸の代謝異常が存在すると思われた．
考献1）TakadaK，NakamuraH，etal：Corticaldysplasiaina23・
WeekfttuswithFukuyamaCOngenitalmusculardystrophy（FCMD）．ActaNeuropath0174：300・306，1987．

察2）YoshiokaM，SaiWaiS，etal：MRimagingofthrbrainin

FCMDではFukutinと命名された遺伝子産物が福山型筋
ジストロフィーの責任蛋白質であることが最近明らかに

Fukuyama・tyPe COngenitalmuscular dystrophy・AmJ
Neuroradiol12：63・65，1991．

された3）・その異常がどのような機序で脳病理に関わる

3）KobayashiK，NakahoriY，etal：AnanCientretrotrans．

のか今後の課題である．本研究では，神経系の発生，分POSalinsertioncausesFukuyama−typecongenitalmuscu−化に重要な役割を果たす脳ガングリオシドを分析し，本症の病態を解析した．

lardystrophy．Nature394：388−92，1998．

ー116−

Ⅴ．ミオパチー（遠位型，インチグクンα7欠損型，その他）

三好遠位型ミオパチー（筋ジストロフィー）
原因遺伝子（dysfbrlin）の同定
荒

畑

一■

●

〃即

泰

山村

糸松

研究協力者 青 木 正 志■■
後 藤 加奈子＊

喜RobertH．BrownJr．…

平

林

久

喜…＊

船 越 政 範■●●●●

要 旨 すでに我々は，三好遠位型ミオパチー（筋ジストロフィー）（MM）が染色体2p13に連鎖する事を報告してきた1）．次いで我々は，MMの原因遺伝子を単離する事を目的に，この領域の3Mbにわたる，P1−derived artincial
chromosome（PAC）によるcontigを作製した．この領域の新しい多型マーカーと骨格筋に強く発現が見られる5つの候補遺伝子を得て，それら候補遺伝子のクローニングを行った．その結果一つの遺伝子において，患者固有の（対照群には認められない）変異（欠矢と点変異；多くはフレームシフトを伴う）を検出した．この遺伝子は，これまでに明らかにされているヒトを含めた哺乳類の遺伝子とはhomologyを示さず，線虫のftr−1遺伝子のみにhomologyが認められた．このことから，我々は，dystrophyassociatedftr・llikeprotein， dysftrlinと名付けた2）．Dysferlin
は，アミノ酸2，080，エクソン55個，ORF6，243bp，Cd56911bp，CDNA全長6．9kbであった．
文

献1）BejaouiK，HirabayashiK，HentatiF，HainesJL，

2）LiuJ，AokiM，IllaI，WuC，FardeauM，AngeliniC，Serrano C，UrtizbereaJA，HentatiF；Ben Hamida M，

BenHamidaC，BelalS，MillerRG，McKenna−1ねsekD，BohlegaS，CulperEJ，AmatoAA，BossieK，OelgenJ，

WeisscnbachJ，RowlandLP，GriggsRC，MunsatTL，

B可aouiK，McKenna−Y鮎ek D，Hosler BA，Schurr E，

Ben HamidaM，ArahataK，deJongPJand BrownJr

ArahataK，deJongPJandBrownJrRH：Dysfbrlin，aRH：LinkageofMiyoshimyopathy（distalautosomalre・

novel skeletal muscle gene，is mutatedin Miyoshi

CeSSivemusculardystrophy）locustochromosome2p12−

myopathyandlimbgirdlemusculardystrophy．NatGenet

14．Neurolo訂45：768・72，1995

20：31−6，1998＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部＊＊東北大学医学部神経内科＊＊＊マサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部
柚躊都立荏原病院神経内科＊榊東京慈恵会医科大学リハビリテーション科−119−三好遠位型筋ジストロフィー2家系の臨床的，遺伝学的検討
納

弘■

●
■

鮮好

昭

嶋月

高望

■

餅〃

敏雅

崎原

●

松末

■

法郎洋

正逸英

●
●
●
●

川口澤

中樋水

研究協力者

光

要 旨 三好遠位型筋ジストロフィー（MDMD）2家系，第1家系8例（男：女＝2：6），第2家系3例（男：女＝2：1）の計11名，の臨床的，遺伝学的検討を行った．11例中8例は下腿屈筋群障害を初発とする遠位部優位の筋障害を示したが，1例は発症初期には近位筋優位の障害を示し，その後遺位部の障害が著明となっていた．2例は肩甲下腿型筋萎縮を示した．遺伝子連鎖解析では，D2S2113，D2S292で最大lodscore3．49（0＝0．00）を得た．2p13領域のDNA
マーカーハプロタイプ分析では，発症者はすべてホモ按合体をを示した．2家系ともに沖縄県宮古・八重山地方に血縁があり，同地方におけるMDMDの集積が示唆された．最近，クローニングされたMDMD遺伝子Dysferlinの本家系における変異について検討中である．
はじめに

家系明査

三好遠位型筋ジストロフィー（MDMD）は，下腿屈筋群の障害を初発症状とする遠位部優位の筋萎縮・筋力低下

第一家系は，25歳男性を発端者とする8例（男性2名，を主症状とする常染色体劣性遺伝を示す疾患であり，女性6名）で，少なくとも，3世代にわたる血族結婚を認めた（図1A）．第2家系は，45歳女性を発端者とする3例（男Miyoshiらの報告により，ひとつの疾患単位として確立されている1）．1967年の三好らの最初の報告以来，1994

性2名，女性1名）であり，診察と採血が可能であった羅患者2名について検討した．両親は，又従兄弟婚である（図18）．

年末の時点での報告例は，国内71（男38，女33）例（50家系），
国外14（男10，女4）例（12家系）である2）．B毎aouiらは
MDMD35例の連鎖解析を行い，MDMD遺伝子座が2p12・14領域にマッピングされることを報告した3）．一方，
Bashirらは常染色体劣性遺伝を示す，Limb−GirdleMuscular
Dystrophy（LGMD2B）の遺伝子座がやはり2p13に存在することを報告した．Illarioshkinらは，同一家系内にdistal
myopath弟

LGMDおよびatypicalvariant Of Duchenne

musculardystrophyの異なる3臨床型をしめし，D2S286とD2S292の間に連鎖が認められた大家系を報告している4）．
したがって，MDMDとLGMD2Bが同一遺伝子による
dlelic v訂iantsである可能性が高いことが指摘されていた．

症

例

症例1：25歳男性（図1A−Ⅵ−3），第1家系の発端者．18歳頃
よりつま先立ちが出来ないことを自覚．下腿屈筋群の筋力低下は高度，下肢近位筋の筋力低下は中等度．上肢遠位筋の筋力低下は軽度，筋萎縮の分布はびまん性遠位部
優位，CK値は8310IU几（正常26−200），筋生検所見は筋原性変化を示した．CTにて，臨床的に認められる筋障害の分布に一致して，下腿屈筋群を主とする筋のdensi吋の低下が認められた．大腿部においても，大腿四頭筋，大腿二頭筋の障害が示された．現在，動揺性歩行で，階段昇降は手すり使用にて可能である．

がクローニングされ，Dysfとrlhと命名された ）．今回，われわれは，2家系11名のMDMD家系の臨床的，遺伝学

症例2：30歳男性（図1Å−Ⅵ−2）．発端者の兄．17歳頃より，つま先立ちが出来ないことを自覚．動揺性歩行で，階段昇降に手すりを要する．下腿屈筋群の筋力低下は高度，
下肢近位筋の筋力低下は中等度．前脛骨筋筋力はほぼ正常，上肢遠位筋の筋力低下は軽度，筋萎縮の分布はびま

的検討を行い，臨床症状の多様性と2p13領域のDNAマー
カーD2S21113との連鎖を認めたので報告する．

ん性遠位部俵位である．CK値2462IU几（正常26−200），筋
生検所見は筋原性変化．

現在，本家系におけるDys氏rlin遺伝子異常について検討中である．

症例3：32歳女性（図1A−Ⅵ−1）．発端者の姉．20歳頃より歩行困難出現．下腿屈筋群の筋力低下は軽度，下肢近位Bashirらは，LGMD2B遺伝子を2p13領域のDNAマーカー
D2S21113とD2S2112のOcMの領域まで絞り込んでいたが5），本年ついにBrownらのグループによりMDMD遺伝子

筋の筋力低下は中等度，上肢遠位筋の筋力低下はごく軽度である．筋萎縮は，びまん性遠位部優位である．動揺＊鹿児島大学医学部第三内科■＊国立療養所沖縄病院神経内科
榊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊＊＊東京医科歯科大学神経内科

性歩行，鶏歩を示す．CK値7g60IU几（正常26・200）．

ー120−症例4：55歳女性（図1A−Ⅴ−1）．発端者の母・37歳頃より，つま先立ちが出来ないことを自覚．下腿屈筋群の筋力低下は，中等度，前脛骨筋筋力はほぼ正常，下肢近位筋の中等度の筋力低下を示す．上肢遠位筋の軽度の筋力低下，びまん性でやや遠位部優位の筋萎縮を示す．CK
値1320IU／L（正常26−200）．
症例5：57歳女性（図1A−Ⅴ一2）．発端者の叔母．31歳頃より，つま先立ちがしにくい，階段が上がりにくいなどの症状を自覚．下腿屈筋群，下肢近位筋の筋力低下は高度，

症例6：83歳女性（図1A−Ⅲ−13）．59歳頃より，歩行困難，
握力低下あり．72歳児には歩行不能．77歳までは，座位保持可能．79歳より寝たきりとなる．筋萎縮，筋力低下
はびまん性遠位部優位で高度に認められる．CK値
332IU几（正常43−146）．現在，寝たきり状態，痴呆症状あり．顔面筋羅息軽度．両側肘関節・股関節の屈曲拘縮を認める．
症例7：33歳女性（図1A−Ⅵ−7）．21歳頃より歩行困難を自覚．発症初期は近位筋優位の筋力低下があり，多発性筋

上肢遠位筋の筋力低下は中等度，前脛骨筋筋力はかなり保たれている．筋萎縮の分布はびまん性で，遠位部優位炎を疑われている．現在，動揺性歩行，鶏歩を示す．上肢は近位筋優位の筋力低下・萎縮，下肢はびまん性遠位である．CK値は640IU几（正常26−200）．現在，つかまり
歩行可能，階段は手をついて可能．顔面筋羅息はごく軽度．

部優位の筋力低下・萎縮を示す．CK値は10535IU几（正常26・200）．

ⅠⅡ

Ⅴ

Ⅵ
メ

図1人 三好遠位型筋ジストロフィーの家系図（第1家系）

ⅠⅠⅠ

IV

■●：羅患者 Eヨ0‥疑い例 ′：発端者
図1B三好遠位置型筋ジストロフィー（第2家系図）−121−症例8：56歳女性（図1A一Ⅳ−18）．20歳頃より歩行困難を自覚．現在，肩甲下腿型の筋萎縮・筋力低下を示す．動揺症例10：59歳男性（図1B−Ⅲ−3）．症例9の兄．15歳頃より，走りにくくなり，19歳頃より立ち上がり困難出現，22歳
上肢挙上困難出現．上肢はびまん性近位部優位の筋力低下・筋萎縮．下肢は，遠位部優位に腰帯部におよぶ筋力

性歩行，鶏歩．cK値は1385（正常43−146）IU瓜．
症例9：45歳女性（図18−Ⅲ−8），第2家系の発端者．14歳頃
より，走行困難，つま先立ち困難出現．30歳より片杖歩行，上肢挙上困難出現，35歳より両杖歩行．上肢はびま低下，筋萎縮を示し，足関節の背屈と底屈では，底屈障
害がやや高度である．筋生検では筋原性変化を認めた．

ん性遠位部優位の筋力低下，筋萎縮は近位部にやや優位．
下肢は，遠位部優位に腰帯部におよぶ筋力低下・筋萎縮

これら10症例のまとめを表に示す（表）．

を示す．cK値は4049IU几（25・200），筋生検では，筋原性変化を示しlobulatedfibersを認めた．
表 三好遠位型筋ジストロフィー10例の臨床所見のまとめ
第一 家 系
症例

1

2

3

4

性

男

男

女

年齢

2 5

3 0

3 2

−

第 二家 系
5

6

女

女

女

J
女

5 5

5 7

8 3

3 3

1

8
女

9
女

1 0
男

5 7

4 5

5 9

発症 年 齢

1 8

1 7

2 0

3 7

3 1

5 9

2 1

2 0 ？

1 4

1 5

初 発丘 状

つ ま先 立ちつ ま先 立 ち歩 行困 難つ ま先 立 ち歩行 困難

歩 行 国難歩行 担 離歩 行国 難走 行民 難走行 困 難が 出来 ないが 出来 な いが 出来 な い

筋力 低下
下肢 艮 筋群

高度

高度

軽度

中等 度

高度

高度

高度

高度

高度

高度

下肢 近 位筋

中等度

中等 度

中等 度

中等 度

高度

高度

高度

中等 度

中等 度

中等度

上肢 遵 位筋

軽度

軽度

ご く軽 度

軽度

中 等度

高度

中等 度

中等 度

中等 度

中等度

上肢 近 位筋

軽度

軽度

軽度

軽度

中 等度

高度

中等 度

高度

高度

高度

筋 萎縮 の 分布

びまん 性

ぴ まん性

ぴ まん性

ぴ まん性

ぴまん 性

ぴ まん 性

ぴ まん性

ぴ まん 性

ぴ まん性

ぴま ん性

違位 部優 位

選 位詳 優位

違 位部 優位や や遼 位捗

遼位 却優 位

温 色 捗優 位

上 肢 ：やや 近上肢 ：近位上 肢 ：近 位

遼 位 部優 位

位詳 優位

下肢 ：這位下肢 ：温 位優位

下厳 ：選位 辞
優位
血清 C K 岱

8 3 1 02 4 6 27 8 6 01 3 2 0

6 4 0

筋 原性

筋原性

未検

束検

未検

3 3 2

10535

1 3 8 54 0 4 93 5 6 9

未換

筋原性

未検

厳 原性

蘇原 性

（
正常 ：2 6 −200）
筋 生検 所見ヱ）2∫Jjイ

1上）2且2ク21♪2∫2JJj

3J）2∫2クJ3ヱ）2∬JJJ

2

か2∫2JJ21ヱ）2∫74∫

3

82∫2β

3

図2

・

第1家系の2p13領域におけるDNAハプロタイプ
ー122−

遺伝子連鎖解析
遺伝子連鎖解析は，これら2家系の羅患者10名と非羅患者7名の計17名について，同意を得た上で採血を行い，末梢血よりDNAを抽出し，三好遠位型筋ジストロフィーの遺伝子座領域のマイクロサテライト多型マーカー
D2S134，D2S292，D2S291，D2S2111，D2S2112，D2S2113，

美地方，鹿児島県本土にも三好型を認めており，今後，さらに疫学的，遺伝学的調査を行う必要がある．最近，MDMDの疾患遺伝子dysfbrlinがクローニングされたが，現在，本家系におけるdysfbrlin遺伝子の異常について検討中である．
文

D2S145，D2S286を用いて，連鎖解析を行った．Lodscore
はMLrNKprogramを用いて算出した・軋allele魚・equenCy
は，沖縄出身者50名より採血を行い算出した．2家系の疾患遺伝子座とMDMD遺伝子座がmappingされている第2染色体遺伝子マーカーとの2点連鎖解析では，D2S2113
で最大lod score4．00（0＝0．0）を得た．さらに，同領域のDNAハプロタイプの分析では，第一家系では，父親はヘテロ接合体で，3人の兄弟は，すべて，発症している母親と同じハプロタイプを示した．また，発端者の叔母とも共通するハプロタイプを認めた（図2）．第2家系でも，
父親はヘテロ按合体で，2名の発症者は，ホモ接合体を
を示した．

献

1）MiyoshiK，KawaiH，Iwasa M，etal：Antosomal
recessive distalmuscular dystrophy as anewtype ofprogressivemusculardystrophy：SeVenteenCaSeSineight
fhmiliesincludinganautopsiedcase・BrainlO9：31・54，
19＄6．

2）三好和夫．三好遠位型筋ジストロフィー症例の報告
例数（1967−1994）ならびに本症に早期にみられる
肢帯型筋萎縮．神経内科44：61・65，1996．
3）BqiaouiK，HirabayashiK，HentatiF；etal：Linkageof
Miyoshimyopathy（distalautosomalrecessivemuscular
dystrophy）locus to chromosome2p12−14・Neurology
45：768−72，1995．

考察4）IllarioshkinSN，Ivanova・SmolenskayaIA恥nakaH，et

両家系とも基本的には下肢遠位部屈筋群優位の筋力低下を主症状としていたが，第1家系には肢帯型筋ジスト
ロフイ類似例と肩甲下腿型筋萎縮症類似例が，第2家系

al：Clinicalandmolecularanalysisofalargeぬmilywith

は肩甲下腿型筋萎縮症類似例がみられ，当初確定診断が出来なかった．しかし，今回行った2点連鎖解析および

5）Bashir R，Keers S，StrachanT；etal：Genetic and

2p13領域のDNAマ⊥カーハプロタイプ分析より，三好遠位型筋ジストロフィー遺伝子座（2p13）との連鎖が認められた．以上より，この2家系は，三好遠位型筋ジストロ
フィーと診断された．2家系ともに沖縄県のごく狭い地域にである宮古・八重山地方にルーツがあり，この地方

locus（LGMDB）onchromosome2p．Genomics33：46・52，

における三好型の集積が示唆された．また，鹿児島県奄

ー123−three distinct phenotypes of progressive muscular
dystrophy．Brain119：1895・1909，1996

PhysicalmapplngattheLimb−Girdlemusculardystrophy

1996．

6）LiuJ，AokiM，IllaI，etal．Dysferlin，anOVelskeletal
musclegene，lSmutatedinMiyoshimyopathyandlimb
girdlemusculardystrophy．NatGenet20：31・6，1998．

RimmedvacuolC型遠位型ミオパチーの遺伝子解析

●

﹂邸

知

中賀

田浅

野紆

▲T

正省

斎辻

子■

藤

恵

▲T

砂正

●
■

内口守

池樋高

研究協力者

中

健里治

田

要 旨 Rimmed vacuolC型遠位型ミオパチー（DMRV）は常染色体劣性遺伝性で，特徴的な筋障害分布と筋線維内のrimmed vacuole形成を特徴とする．我々はDMRV9家系について連鎖解析を行い，本症の原因遺伝子がマイクロサテライト多型マーカーのD9S1868からD9S1788までの間の12．3cMに存在し，ハプロタイプ解析からD9S1804からD9S1859の1．5cM周辺が候補領域として有望であることを示した．この領域にマップされるexpressed sequencetag（EST）から筋細胞に発現する10個のESTを選択し，DMRV生検筋から抽出したRNAについて，TaqManprObeを用いて定量的PCRを行い，本候補領域に存在するESTはタイプ1線経に発現の多い遺伝子である可能性を示した．
はじめにDNAを抽出した．マイクロサテライト多型マーカーは，

RimmedvacuolC型遠位型ミオパチー（DMRV）は常染色体劣性遺伝性あるいは弧発性で，20歳前後の発症が多く，
前脛骨筋の筋力低下を初発症状とし，比較的早期に大腿D9S1868−1．9cM−D9S1853−4．3cM・D9S1788−1．1cM・D9S1878−

から腰帯部に筋力低下が進行するが，大腿前面の筋群は末期まで保たれるのに比し，後面の筋群は高度に変性する特徴的な障害分布を呈する1），ユ）．生検筋ではdmmed

エンサーにて解析した．ロッド得点は，LINKAGE（Ve柑ion

vacuoleの出現を最大の特徴とする．本症の病因や病態機序は不明であり，分子遺伝学的なアプローチにより病因遺伝子を同定することは，本症の診断に有用となるのみ
ならず，dmmedvacuoleの形成を伴う筋障害のメカニズムを解明する糸口となる可能性が期待できる．我々は本症

ついで，DMRVおよび対照各4例の生検筋からTbtalRNAの病因遺伝子の単雛にむけて，まず連鎖解析により遺伝子座位を決定し，さらに病因遺伝子を同定することを目的とした．
この間，ベルシア系ユダヤ人で報告されていたheredi．
taryinclusionbodymyopathy（HIBM）が第9染色体pl−qlに連鎖することが明らかにされた3）．HIBMは遺伝的，臨床病
理学的にDMRVに類似しているため，我々は両者がallelicな疾患である可能性を考え，第9染色体について連鎖解析を行った・さらに候補領域にマップされるExpressed
SequenCetag（EST）について，筋細胞に発現するESTを候補遺伝子として選び出し，定量的PCRにより各筋群での発現の多寡と羅息筋分布との関連について検討を加えた．

0．1cM−D9S1804−1．4cM・D9S1859・3．5cM・D9S1787−1．1cM・
D9S1844・0．5cM−D9S1799を用い，DNA多型を自動シーク5．2）とFASTuNKのMuNKならびにLrNKMAl）を用いて計算した．
を抽出し，reVerSetranSCriptaseでcDNAを作成し，連鎖解析により絞り込んだ領域を含むD9S165からD9S1874までの3cMにマップされ，StanfbrdG3hybridpanel上に登録されている12個のESTについて，筋細胞に発現するESTを候補遺伝子として選択するため，RT・PCRによる解析を行った．さらに，その発現畳がDMRVと対照で著しく異なるものが候補となりうると考え，ABI7700にて恥qMan
probeを用いた定量的PCRを行った．内部標準としてデスミン，ミオシン，アルファアクチンを用いた．定量的PCRの原理は，両端を蛍光ラベルしたThqManPrObeが，PCRの過程で一本鎖DNAに先にアニールし，ThqDNApoly・meraseによる伸長の際，Taq DNA polymeraSeの5，exo・nucleaSe活性により5，端のリポーター色素が遊離して発する蛍光を検出することによる．検量線作成のため，デスミンのcDNAを標準サンプルとして希釈系列を作り，増幅曲線をプロットし，指数関数的増幅領域内に各濃度でのthreshould cycle，Ct値を求め，対数グラフにプロットした．

対象および方法
本邦DMRV9家系，発症者18人，非発症者19人に対してマイクロサテライト多型マーカーによる連鎖解析を行っ結た．被験者の同意を得た上で，末梢血より高分子ゲノム

果

マイクロサテライト多型マーカーを用いた連鎖解析で＊新潟大学脳研究所神経内科■＊金沢大学医学部神経内科

は，2点連鎖解析によりD9S1878において，最大ロッド得点5．50（q三0）をえた．多点連鎖解析では，D9S1788におい
−124−

22

9p21
13

連鎖解析で絞り込んだ本症の候補領域，とくに複数のCd血J〜r叩仙♪r〃J馴

子の候補領域と重複しており，両疾患がdlelic diseaseで

5

S

即

−5−
7

闘

l：：＝＝＝⁚＝＝＝＝：：ニ▼

1日Mlu1M
1・

ll

21．2

l

21．1

l

l3

ll

9q

／

12

察

家系に共通する特定のハプロタイプの存在が示唆された
D9S1804とD9SI859の1．5cMの領域は，HIBMの病因遺伝
l11考Cα〃肋′ねrggO〃
Jbrか〟Ry

欄 m⁝脚 珊糾籾11

HでのRNA発現量比が高かった．

鵬㌫M 叩耶朗

12︷ ＝﹇＝︸目口﹈日日︻︺︹ユ3hamStrings（H），tibialisanterior（TA））の値をアクチンとの比で算出したところ，いずれのESTにおいてもDMRVのTA，ある可能性が高い．原因遺伝子の特定のため，今回上記領域にマップされるESTについて，筋細胞に発現しているものをRT・PCRにより選択したところ，10個のESTの発現が確認された．このうちDMRVと対照で発現量の著しく異なるものから解析するため，ThqManprobeを用いた定量的PCRを行った．骨格筋は部位により各筋線維タイプの分布比に著しい差があるため5），その構成分子の発現量も異なることが考えられる．そこで，部位別に各ESTの尭現を内部標準として用いたアクチンとの比で算出したところ，いずれのESTでもDMRVで変性の強いm，Hで発現が多かった．これらの筋ではタイプ1線椎の存在比

21Jが高いことから，定量的PCRの結果はその存在比を反映したものと思われ，DMRVの候補領域にはタイプ1線経を

図1DMRVの遺伝子座コードするDNAが集積している可能性が考えられた．

て最大ロッド得点7．40を示した．またD9S1868，D9S1787
文においてobligateな組換えを示す家系を認めた．以上より，
DMRVの遺伝子座はD9S1868からD9S1788までの間の献1）NonakaI，SunoharaN，IshiuraS，etal：Familialdistal

12．3cMに存在すると結論した4）．

myopathywithrimmedvacuoleandlamellar（myeloid）

ハプロタイプ解析では，血縁関係のない2家系において，

bodyformation．JNeuroISci51：141−155，1981．

D9S1868からD9S1859の間で共通のハプロタイプを認め

2）MizusawaH，KurisakiH，Takatsu T，etal：Rimmed

た．特にD9S1804とD9S柑59では，想定される14個のうVaCuOladistalmyopathy．Aclinical，electrophysiologiCal，

ち8個のハプロタイプが同一であり，創始者効果を有した

histopath010giCaland computedtomographic study of

共通のハプロタイプの存在が示唆され，この間の1．5cM
周辺が有力な候補領域と考えられた．

SeYenCaSeS．JNeuro1234：129−136，1987．
3）Mitrani−RosenbaumS，ATgOVZ，BlumenftldA，etal：

さらに，この領域で候補となる遺伝子を絞り込むため，

Hereditaryinclusionbodymyopathymapstochromsome
9pl−ql．HumMoIGent5：159−163，1996

生検筋から抽出したRNAからreversetranscriptaseでcDNAを作成し，このD9S1859を中心として，D9S165から

4）IkeuchiT，AsakaT，SaitoM，etal：Genelocusforauto・

D9S1874までの3cMにマップされた12個のESTでRT＿PCR

SOmalrecessivedistalmyopathywithrimmedvacuolesを行ったところ，10個のESTが筋細胞に発現しているこ

mapstochromosome9．AmNeuro141：432・437，1997．

とが確認された．この10個のESTを用いてDMRVおよび

5）JolmsonMA，PolgarJ，WeightmanD，etal：Dataonthe

対照筋のRNA発現畳を定量した．筋各部位による分子構

distributionoffibretypeSinthi正y−Sixhumanmuscles．

成の違いも考えられることから，部位別（Quadriceps（q），

Anautopsystudy．JNeuroISci18：111−129，1973．

−125−

Rimmed−VaCuOle型遠位型ミオパチーの遺伝子解析

tT

樹健子

泰

●
▲T
■
▲T

恵

●
書

沢内申

・雷

■
■

滝池田

▲T

■

一俊一

沖新田

惣永

︑也暢明次

治■

野田中

正

＊

守

知清正省

賀井藤

浅駒斉辻

研究協力者

高

■
■

要 約 Rimmed−VaCuOle型遠位型ミオパチー（DMRV）は四肢遠位部の筋力低下，筋萎縮を初発症状とする希な遺伝性筋疾患で，その疾患遺伝子座は第9染色体pl−qlに存在することが知られている．本研究ではまずrdned
mappingを行い，homozygosity mapping，2点連鎖解析，haplotype分析および連鎖不均衡の検討よりDMRVの疾患
遺伝子がマイクロサテライト多型DNAマーカーD9S1878−D9S1859間の1．5cMに存在することを示した．更に
D9S1878・D9S1859近傍にはβトロポミオシン遺伝子（TPM2）がmappingされていることから，TPM2異常の有無について検討した・その結果，1家系においてexon6Bのsplicingenhancer配列にAtoGのpointmutationを認めたが，他のDMRV症例にはTPM2の変異は認められず，TPM2はDMRVの疾患遺伝子ではないものと考えられた．現在
DMRVの疾患遺伝子を同定する目的でBAClibraryを用いてD9S1878・D9S1859間の部分的contigしている．
はじめに

Refined mapplng

鮎med−VaCuOleを伴う遠位型ミオパチー（DMRV）は比較的希な疾患単位であり本邦を中心に研究が進められてきた疾患単位である．近年DMRVと臨床像の類似する
uquadriceps−SParingmyopathyの連鎖解析がイスラエルにおいて行われ，第9染色体pl・qlに連鎖することが示された．その後本邦のDMRV家系も第9染色体に連鎖することが示され，両疾患の原因遺伝子の異同が注目されている．

発症者および非発症者のgenomeDNAを分離し，第9染
色体上のD9S1678からD9S273間，15cMについて17のマイ
クロサテライト多型DNAマーカー（D9S1678・D9S165−
D9S1845−D9S1791−D9S1805・D9S1817．D9S1878．D9S1804．
D9S1859・D9S1874−D9S1862・D9S1787・D9S1800．D9S1777＿

D9S1844−D9S273およびAFM326vdl）を用いて対象29名全例のハプロタイプをPCR法により決定した．各マーカー

DMRVの臨床的特徴は下腿では伸筋群，大腿では屈筋群に対するプライマーの塩基配列は既に報告されているもが選択的に障害されイスラエルの■，quadriceps・SParing
myopa血y と同様大腿四頭筋の筋力が比較的遅くまで保たれることである．

mSTLINKver．2．2プログラムを用いて行い，各アレル頻のを使用した．2点連鎖解析はLINKAGEver．5．1and
度は日本人正常者3鳩より得たb叩10年peより計算した．

本研究ではDMRV疾患遺伝子を同定する目的で行ってまた，6種類のマイクロサテライト多型DNAマーカー，

いるポジショナルクローニングの研究経過について報告する

D9S1791，D9S1805，D9S1817，D9S1878，D9S1804，D9S1859を対象および方法

用いてh叩1吋pe解析を行い，更にカイ二乗検定（Y如esの補正）を用いて連鎖不均衡の検討も行った．
βトロポミオシン遺伝子変異の検討

11名のDMRV症例を含む9家系29名を対象とした．9家
系は全て日本人であり，9家系中6家系は発症者の両親が近親婚であった．DMRVの診断は以下の基準を満たすものとした．

法にてTPM2cDNAを増幅，TAcloningvectorにcloning後（1）遺伝様式が常染色体劣性遺伝もしくは孤発症例

BAC contigの作成（2）病初期の筋力低下，筋萎縮が下腿遠位部の伸筋群（前脛骨筋など），大腿後面の屈筋群優位（3）筋病理学的には筋線維内にrimmed−VaCuOleを認める

DMRV2症例の骨格筋よりtotalRNAを抽出し，RT・PCR
全塩基配列を決定した．またDMRV全症例のgenomicDNA
よりTPM2の構造解析を行った．
既にD9S1878・D9S1859間にmappingされているSTS（D9S1878，BACl，D9S1804，D9S1859）を用いてBAClibrary
をスクリーニングし部分的contigを作成した．

＊金沢大学医学部神経内科学
榊新潟大学脳研究所神経内科−126−∈コてq≡nbqS岩品djUコ

S︻Sとdu七山ihlO︼ddH

臼百〇叫一句u叫q∈OUむ銘

Ⅵモー書く島屋︒コ

ぎ叫ddd言合冨買NOEOH

一

I
一

IDMRV

14SMb

図1Re罰nedgeneticlocationofDMRVgene

DMRVl
A GTGAG GAT G GG GT（〔〔A〔AGGG G G G GG AGgo

聞T GAG G G GくくくAAG G⊂A G

100

110

C

120

図2 MutaIionofintronsplicingenh ncer

D9S1859
D9S1804

D9S1878

Centromere

Telomere

BAC−l
CArepeat
図3

BACcontigbetweenD9S1878ndD9S185

−127−

結

果

考
察
原因遺伝子を決定する方法として既知の生化学的異常から原因遺伝子を推測し分子生物学的に決定する方法がHomozygosity mapping，2点連鎖解析，hapLotype分析
および連鎖不均衡（図1）
Homozygosity mappingではD9S1845，D9S1791，D9S18
78，D9S1859では両親の血族結婚の有無に関わらずDMRV
症例においてジェノタイプがホモ接合になる頻度が有意に高かった．2点連鎖解析ではD9S1859において最大LOD
得点6．53（0＝0）を得た．更にD9S1878，D9S1791，D9S1845
およびD9S165においてもそれぞれ有意なLOD得点を得た．
Haplot汀e分析では，6つのマーカーを用いたハプロタイ
プの分析でD9S1878／D9S1859のマーカーの組み合わせに於いてDMRV症例ではハプロタイプ‖9／2■−を10染色体中7有効なこともあるがDMRVに関する限り今のところ成功していない．このようなクローニングの手法に対して最近ではポジショナルクローニング法が盛んに使用され大きな成果をあげており，最近連鎖解析の結果hered血y
inclusionbodymyositisおよびDMRVの原因遺伝子が第9染
色休に存在することが示され，D9S319からD9S276の間の23．3cMの範囲にDMRV疾患遺伝子が存在すると考えら

染色体（70％）が持つのに対して両親の非疾患染色体ではれた・更に本研究でre鮎emappingを行った結果，DMRVの疾患遺伝子はD9S1878−D9S1859間の約1．5cMに存在する可能性が示唆された．

0叫0／12）であった（カイ二乗値は18．975，p＝0．0008）．更に
両親の正常染色体と比較したときD9S1878において有意D9S1878−D9S1859近傍にはいくつかの遺伝子が既にマッピングされているが，特にβトロポミオシンはDMRV

な連鎖不均衡を認めた（カイ二乗値13．382，p＝0．0374）．また，DMRV家系と関連のない正常者染色体と比較した場
合D9S165，D9S1791，D9S1817，D9S1878，D9S1859および
D9S1874において有意な連鎖不均衡が認められた．
βトロポミオシン遺伝子変異の検討

原因遺伝子のCandidateとして検討されるべき遺伝子である．トロポミオシンにはアミノ酸残基数が284の4種類のアイソフォームが存在し，そのうちTPM3の異常により2例のDMRV症例の骨格筋RNAより932bpのRT・PCR
PrOductを得た．cloning後全塩基配列を決定したが変異は認められなかった．一方，TPM2の構造解析では，1家系の異常でも何らかの遺伝性筋疾患が生じる可能性が示唆されている．しかし，本研究の結果ではTPM2はDMRVの疾患遺伝子から除外された．今後はD9S1878−D9S1859間においてTPM2exon6BのsplicingenhanCer配列にAtoG（図2）の変異を認めたが，他の家系では認められなかった．
8AC contigの作成（図3）でBAC contigを作成し，疾患遺伝子を突き止めたいと考えている．

STSを含む6つのBACcloneを分離し，部分的contigを作成した．

謝 辞 貴重な検体を御供与下さいました厚生省筋ジス
トロフィー班会議の諸先生方に深謝致します．

ネマリンミオパチーを，またTPMlの異常により遺伝性心筋症が起こることが知られており，TPM2およびTW4ー128−

多数のRimmedVacuoleを伴う筋病理像を示す
疾患群に関する研究
一臨床的，免疫組織学，遺伝学的検討−

研究協力者

田

代

邦

雄■

吉

田

一

人■

矢

部

一

郎■

東
島

琢

歳事

功

二＊＊

要 約 われわれは，今期当班において多数のrimmedvacuole（以下RV）を伴う筋病理像を特徴とする疾患群の臨床的，免疫組織学的および遺伝学的検討を行った．初年度は「多数のRVに炎症反応を伴う筋病理俊一鑑別診断
上の問題点について」の研究を行い多数のRVに炎症細胞浸潤を伴う筋病理像を呈する疾患の臨床像に注目し，これら疾患群を整理し，inclusionbodymyositis（以下IBM）との異同につき検討を加えた・次年度は「RVを特徴とする疾患群における免疫組織学的検討一細胞骨格蛋白を中心として−」の研究を行い，RVにおいて細胞骨格蛋
白のposttranSlationalmodincationに注目し，RVの免疫組織学的検索を行い・臨床病型との関連を検討した・本年度は「DMRV様筋障害分布を示した若年発症封入体筋炎の兄弟例一臨床的，免疫組織学，遺伝学的検討−」の研究を行い，臨床的に若年発症で筋障害分布はhereditaryinclusionbodyrnyopathy（以下h・IBM）およびdistalmyopathy
withrimmedvacuolefbrmation（以下DMRV）と近似するも筋病理像はRVと炎症細胞浸潤出現を特徴とLIBMに近似した兄弟例の臨床的，免疫組織学，遺伝学的検討を行いその位置づけについて報告した・
これらの研究を通して，IBMとh−IBM／DMRVなどの周辺疾患との関係，問題点を明らかにしてきた・以下，初
年度，次年度の成果の概略と今年度の成果をまとめた．
初年度（96年）の成果の概略

IBM7例，DMRV近似の臨床症状，経過を示し大腿四IBMは，欧米では成人の炎症性筋疾患中最多とされるが，本邦では炎症性筋疾患に占めるIBMの頻度は3．5％と少なく，その違いに関して人種，環境，診断基準の違いが指摘されている1）．我々の検討でも1980年から90年の11頭筋群が保持され筋病理上は炎症細胞浸潤を認めたquad一

年間にIBM症例は1例のみで炎症性筋疾患に占める割合は浸潤，RVの出現を認めたが，壊死，再生線経は乏しかった．RVは比較的保存された線椎にも多くみられた．経口ステロイド剤，免疫抑制剤で治療を行った5例は何れも治1／73（1．3％）であった．しかし，91年以降毎年1〜3例がIBMと診断され，炎症性筋疾患に占める割合は91〜96年で6／82（7．3％）と増加している．また，明らかにpolymyositis（以下PM），dermatomyositis（以下DM）と診断される症例においても多数のRVを認める例がある．IBMに関しては，以前
より疾患単位としての不均一性が指摘されている．そこ
で，多数のRVに炎症反応を伴う筋病理像を呈する疾患群を整理し，IBMとの異同につき検討を加えた．
19g0年1月より96年10月までに得られた筋生検糾6例中，炎症性筋疾患と診断された156例を対象とした．IBMについてはGriggs等の診断基準に従った2）．RVは，光学顕微
鏡観察で40倍1視野に5個以上認める症例を陽性と判断した．陽性例において臨床経過，羅息筋部位，治療に対する反応の検討と筋病理学的検索を行った．IBMと診断された2症例では治療前後で筋生検を行い治療効果の検討も試みた．
＊北海道大学医学部神経内科■＊国立療養所札幌南病院神経内科

ricepssaringtypemyositis（以下QSM）3例，PMDM3例，
HAMに伴う筋炎1例に分けられた（表1）．mM症例は高齢発症で大腿四頭筋侵葬を特徴とし，筋病理上び漫性細胞療に抵抗を示した．2例において治療前後で筋生検を行い，ステロイド剤使用例では，治療後，炎症細胞浸潤はやや減少を示したが，筋変性の進行，および結合線，RVの増加を認めた．また，1例は当初DMと診断されたが，その後の経過，筋病理所見より，IBMと診断した．大腿四頭筋が保持された例は何れも20歳代の発症であり，IBMに近似した病理所見を示すも，細胞浸潤は血管周囲に限局する傾向が認められた．PMのM症例は近位筋優位の脱力を示した．筋病理上，び漫性細胞浸潤を示し，RVの出現を認め，壊死，再生線経も多数みられた．RVは，変性した萎縮線維中心に観察された．全例経口ステロイド剤に良好に反応した．IiAMに伴う筋炎では，IBMに近似した所見であったが，m鑓edred肋erが散見された・
以上より近年のIBM発生頻度増加が疑われたが，多数例による検討が必要である．当初DMが疑われた症例は−129−

表1RVを伴う炎症性筋疾患の臨床像
lBM

DM一＞IBM

QSA

32±27
31±28
2．6±2．8

3／3

1／0

2／1

0／3

4十四to5）Kneeextensors

2十（2to4）

Hipflexors

4（3to4＋）CK（IU几meanA）SD）

803±641

IBM：inclusionbodymyositis PM：POlymyOSitis
HAM：HJMassociatedmyositis

4−（3＋to4）

4（3＋to5）

4＋（4＋to5）

4（3十to5）

4＋（4to4＋）

4（3to5）54（3to5）3（3−103）

3＋（3to4）966±1154

4291±3418

DM：demlatOmyOSitis QSM：quadriccpssparingtypemyositis

表2 本兄弟例の臨床，病理的特徴

Hipnexors

Di飴r印CeOrhmila仙ered血ymM
LlrBM h−lBM／DMRV ourcases

13525412Kneeextensors

4545397

AnkIedorsinexors

CK（IU几mean）

表3

症例1r兄26歳）症例2（弟24歳
21歳
21歳
5年
3年

Fimger打exors
Shoulderabductors

発症年令
筋障害分布
Kneeextensor
血清CK
筋病理像
炎症細胞浸潤

高齢

若年

21歳

侵襲
上昇

保持
正常

保持
上昇

Rimmedvacuole

十十

＋＋

十十

＋

＋

＋

SM1−31

病理像＋十Genelocus

h爪釘Ilmation＋＋

Rimmedvacuole

十十CD4：CD8

CD4＜CD8

3

Ankledorsinexou指4（4to5）5252214（4−tO5）

伯

23±2
3．0±2．6

163∬5
1

3

26±4
6

Fingerflexors
Shoulderabductor

発症年齢
羅病期間
筋力低下，萎縮分布

PM／DM

3

4．4±2．5445−か3863

症例数
初診時年齢
発症年齢
羅病期間
（年，平均±SD）性（男／女）
筋脱力，萎縮分布＋

7

HLADNA DRBlO301

十十

十十

9p
？

DR810302？
DRBl1302
DRBlO901

CD4＜CDS

SM1−31

十十Inclusionbody＋？

LlIBM愈milialinclusionbodymyositis
h−IBM：hereditaryinclusionbodymyopathy−？

DMWdistalmyopathywithrimmedvacuoJeformation

一」貪療効果IBMの発症に免疫的機序の関与を考える上で重要である．

検討を行った・抗体はSMI・31，32，34（STB），NF200，

大腿四頭筋が保持される例は，IBMとして診断される可能性があるが，その分類に関しては今後の検討課題であMAPlb（Sigma），MAl）2（LeinoTbclm0），タウ，ビメンチン，る・IBM，PMのMには鑑別が容易でない症例が存在し，治療感受性も異なるので，慎重な診断が必要である．

IBM，QSM，DMRV例では抗ニューロフィラメント抗体の内，リン酸化heavy chainを認識するSMI・31，34，

2年度（97年度）成果概略

NF200でRVは陽性を示したが，非リン酸化heavy chainを認識するSMI・32は陰性であった．特にIBMとqSMでは多数のRVを伴うPMとIBMの鑑別は予後，治療指針を決定する上で重要となる．また，臨床的には孤発性DMRV

SMト31でRV周囲および筋細胞質が顆粒状強陽性に染色さと近似するqSMは筋病理上ほぼIBMと同様の所見を示し，
その位置づけが問題となる．そこで，これら疾患に見らではSM1−31，32，34，NF200とも陰性であった．非リン酸化

れるRVにおいて細胞骨格蛋白のposttranSlationalmodin・
Cationに注目し，RVの免疫組織学的検索を行い，臨床病型との関連を検討した．

Thu及びMaplb，M叩2では陰性であった．全例でビメン

IBM4例，QSMl例，多数のRVを伴うPM2例，DMRV6
例の生検骨格筋組織を対象とした．これらの新鮮凍結切片にて細胞骨格蛋白のposttranSlationalmodincationの内Phosphorylationとしてニューロフィラメント及びmicro．
tubuleassociatedprotein（MAP）のThu，MAPlb，MAP2と中間系フィラメントであるビメンチン，デスミンに対してデスミン（DAKO）を用いABC法にて染色した．

れた．一方多数のRVを伴うPM例，及びコントロール例
muでRVは非特異的に陽性を示したが，リン酸化されたチン，デスミンはRVを伴う筋線経，および萎縮筋線椎で陽性を認めた．RV周囲への集積は見られなかった．
IBMとqsMは今回の免疫染色でも同様の染色性を示し，
QSMはIBMに含まれる病態と考えられる．PMにみられる
RVは抗ニューロフィラメント抗体陰性であり，IBMにみられるRVとは異なった．今回の検討結果は，IBMにおけるAskanaSら3）の報告と一致した．筋線維内へのニューロ
フィラメント出現の原因は不明である．Abeら4），はマウ

ー130−

病理俊は両者ともに，多数のRVを認め，症例1（兄）では著

っ ん

2

明な，症例2（弟）では中程度の炎症細胞浸潤がみられた・
炎症細胞はCD8優位であった．RVはSMト31染色陽性を示

1
l 1 2

1
2
1

2日2
15
21

モー±

1日4
3

2

し，症例1（兄）では電子顕微鏡検索で核内封入体も確認された．以上より筋病理学的には両症例ともIBMと診断した（表2）・両症例および両親において同意の上DNA検索を行った．田中らの報告6）に基づきD9S1868〜D9S1787間に6つのmakerを設定し，その各々をPCR法にて増幅し多型

2 1 1 つ ん 1 3

17

1 1

3

D9S1868
D9S1853
D9S1788
D9S1859
D9S1874
D9S1787

図1Haplot ee ndysisorourc鮎eSスの培養系で未分化な筋線経にニューロフィラメントが出現することを報告しており，IBMにおけるRVの出現機序を考える上で興味が持たれる．
今年度（98年度）研究成果
目的：IBMは一般的に孤発性であり，遺伝性，家族性IBMの報告は少ない．また従来報告されている遺伝性，家族性IBMは比較的高令発症で大腿四頭筋群侵襲を示し，臨床的に孤発性IBMと近似した臨床像を示す5）．一方，h−IBM／
DMRVはIBMと近似する筋病理像を示すも炎症細胞浸潤を認めないことが鑑別点とされる．今回，われわれは若年発症で筋障害分布はh−IBMのMRVと近似するも筋病理を蛍光DNAsequencerにて解析した．兄弟は二人とも共通のhaplot沖eを持ち9pに連鎖するか・否か不明であった（即）・
考察：本兄弟例は遺伝性，家族性IBMとh・IBM／DMRVとの鑑別が重要となり，血清CK高値，筋病理像はhmilial
IBMと発症年齢，筋障害分布はh−IBMのMRVと近似する（表3）・現状では本兄弟例の位置づけは困難であり，取り
あえず家族性IBMの範疇に入れ今後の遺伝子解析の進歩に伴い，h−IBMのMRVの異同の解明が進むものと期待さ
れる．
文

献

1）村上信行ら：神経筋疾患におけるrimmedvacuoleの意
義．封入体筋炎とdmmedvacuoleを伴う遠位型ミオパ
チーの免疫組織学的検討を中心として．臨床神経34：782，1994．

像ではRVと炎症細胞浸潤出現を特徴とした兄弟例を経験したので，臨床的，免疫組織学，遺伝学的検討を行いその位置づけを考察した．

2）GriggsRC，etal：Inclusionbodymyositisandmyopathies・

対象：症例1（兄）は26歳，症例2（弟）は24歳の兄弟例である・
両親，その他近親者には発症はみられない．症例1（兄）はidentifypaired−helicalmamentininclusionbodymyositis・

AnnNeuro138：705，1995．
3）AskanasVietal：Useofanti−neru0mamentantibodyto

AnnNeuro139：389，1996．

一昨年qSMとして報告した中のl例である・兄弟ともに21
歳時，歩行障害にて発症した．症例1（兄）は21歳時，坐位よりの立ち上がり困難出現し，数カ月の経過で握力低下

4）AbeM，etal：Expressionofneuro丘加IentprOteinsinが加わる．22歳時に当科初診し，上肢では遠位部，下肢では大腿四頭筋群を除き全般的に筋力低下および筋萎縮を認めた．血清CK値は1975IU／Lと上昇を示した．ステ

5）SivakumarK，etal：AninnammatOry舟nilial，inclusion

proliftratingC2C12mouSeSkeltetalmusclecells・Exp・
CellRes．229：4＄，1996．

bodymyositiswithautoimmune危aturesandaphenotype
identicaltosporadicinclusionbodymyositis・Studiesin
threehmilies．Brain．120：653，1997．

ロイド，免疫抑制剤使用にて血清CK値低下を認めるも，病状は改善せず進行し，25歳時には車椅子使用となる．
症例2（弟）は21歳時，階段昇降困難出現，続いて書字困難
加わる．23歳時当科初診．上肢では遠位尺側に強い，下肢では大腿四頭筋群を除き全般的な筋力低下および筋萎

6）田中恵子ら：常染色体劣性遺伝性dmedvacuoIC型遠位型ミオパチーの病因遺伝子の伽emapping・平成9

縮を認めた．血清CK値は1128IU几と上昇を示した．筋−131−

年度厚生省精神・神経疾患研究委託費による研究報
告集（2年度班・初年度班）p72，1997・

Micro−andmacro−VaCuOlarmyopathy（adystrophicdisorder？）：−とくにhyopathywithtubularaggregateSとsarcotubularmyopathyとの異同に関して−

紆紆

千立

栗

▲T

小任

■

康珍仁
●
■
■

●
■
■

宅

裕桂辰

上

■
●
l
▲†

井張三

＊
●

■

達樹治

直祐

斐尾込

衣中中

研究協力者

要 旨 症例：50歳，家婦．多世代にわたり血族結婚歴がある．30歳頃より四肢筋の脱力にて発症し，緩徐に進行し，顔面筋・前頸筋・腸腰筋の一部を除くほぼ全身性の高度の障害（CT上は脂肪化）を来した．四肢筋生検では
筋線経の中央部に塊状物が約10％の線維内にあり，特異な組織化学的変化を示した．電顕的に塊状物はtubular
aggregatesと明らかに異なる一層膜の嚢胞様・管状構造体（直径60mm〜6〃m以上）の集合体であり，筋原線経と分離LT管や筋小胞体との連続性が一部に示唆された．本例は肢帯型筋ジストロフィーの病態を示した特異なミオ
パチーと考えた．
はじめに進行性の筋線経の破壊を来す筋ジストロフィー（PMD）には様々な病因が存在する．とくに肢帯型筋ジストロフ
ィー（LGMD）は依然として多彩な病因が示唆されている．

神経学的所見：知能は正常．脳神経では，顔面筋の極軽度の筋力低下と，後頸筋に萎縮と筋力低下を認めた．四肢・体幹の運動系では全身性の高度の筋萎縮（弛緩性）・
筋力低下を認めた．立位は不可能，座位保持は可能であり，車椅子にて辛うじて自力移動が可能であった．線維束筋収縮・筋痛・筋無力症々状はなかった．深部腱反射

そして近年の研究進歩により，LGMDの中からquadriceps
myopathy（Becker型PMD）をはじめとし，とくに筋線維その膜異常に伴う病態が次々と明らかにされつつある．我々
は進行性・高度のLGMD様所見を主徴とした症例において，筋線維内に大小様々な嚢胞・管状様形成の集藻を伴う症例を経験したので，その臨床および骨格筋の病理組
織学的な検討結果を報告する．

主な血液検査では，LDH665（n；154・397IU／1），CK70（n；36−203IU／1），乳酸・ビルビン酸は正常．左腎臓の欠損が認められた．骨格筋CTでは前頸筋と体幹屈筋である腸腰

症例報告

筋は比較的残存していたが傍脊柱筋は完全に脂肪化し，四肢筋では若干の左右差を示したが高度の脂肪化を示し

症例は50歳の女性，両親の従姉妹結婚を含む長年・多世代にわたる近親婚があったが，調査を拒否され詳細は不明であった．幼小児期より運動能力はやや劣っていたとのことであるが，日常生活は正常にできた．32歳頃に歩行が不安定でしばしば転倒することを自覚した．その後症状は綬徐に進行し，手の脱力も出現し，物に掴まらずに立位の保持も不能となったが，45歳頃迄はしゃがん

は消失，病的反射は陰性であった．また四肢冷感を認めたが自律神経系に特別な異常はなかった．

た．針筋電図は筋原性＋神経原性で末梢神経伝導速度は異常なかった．wMSは言語性Iq＆2，動作性Iq71，総Iq75であった．
大腿直筋の生検病理所見
光顕所見

で移動可能であった．50歳時に精査目的にて当院へ入院した．

一般組織染色：筋線経の大小不同，中心核の軽度増加，
問質結合織の増生を認めた．特徴的な変化は，約10％の

身体神経所見：肥満傾向であり，小奇形として眼瞼内眼筋線経に，HEにて淡好塩基性に，Gomoritrichrome変法
染色で赤紫染する充実性の塊状構造を主に筋線維内の中

角贅皮と皮膚の先天性網状青斑（1ivedorasemosa）がみられた．

央部に認めた（図1A）．
組轍化学染色：先述の塊状構造物は，NADH・TRで紫色で＊愛知医科大学第4内科
榊愛知医科大学加齢医科学研究所＊榊愛知医科大学電顕室

周辺部にはハローが形成され（図18），コハク酸脱水素酵
素（SDH）およびcytochromecoxidase（CCO）活性は陰性であった（図1C）・これは非特異性エステラーゼ（NSE）で強陽ー132−

性（図2A），酸性フオスフアターゼ染色は陰性であった（図2B）・さらに免疫染色ではミオシン重鎖（MHC）；．ファース
トとスロー・アイソフォームは陰性でタイプ1線経に多い
もののタイプl・2両線維内に認め（図2C．D），GRP78（図2E）とクラスリンは陽性（図2G），HSP72とエビキチンは多くが陰性（図2F）であった．さらにジストロフィン染色は大部分の塊状構造部に小空胞の集合として陽性所見（図2H）を示した．
つぎにこの塊状構造物を自験例の周期性四肢麻痺の生検骨格筋に認められた山bu血喝許egがes（m）の染色性と比較検討した．mの多くは主に筋線維周辺部に局在し，多巣性に認められた．また組織化学染色では本症例における反応性に比し，濃染Lより鮮明であり，何等かの構造的な共通性を示唆したが異質性も示された（表1）．
電顕所見
光顕病理所見での塊状構造物は，縦断像は様々な直径（約60mmから6〃m以上）よりなる管状・嚢胞様構造物の集藻が筋線維内の長軸に沿い限局し，仏の様に整然としてではなく雑然と認められた（図3A，町そして強拡大横断像では約10mの一層の膜構造よりなっていた（図2A）．内容は均一無形質物質で充満され，周辺の筋原線維周辺に
は筋小胞体（SR）とT管を中心とした細管状構造が増加し，
主にT管との連続性が認められた（図28）．また異常な管状・嚢胞様構造物の近隣の筋原線維間には正常なT管の縦断像が見られた．また筋原線経の変性はなく，ミエリ
ン様構造物やリボフスチン顆粒の変性産物はほとんど見られなかった．また極一部のミトコンドリア内に非特異的と考えられる梶棒様の封入体が存在していた．
考察
本例は成人期に筋症状が顕在化し緩徐進行性の経過をとり，特異な筋病理学的変化を伴った筋ジストロフィー
類似の病態に属するミオパチーである．本例は家族内発症は聴取できなかったが累代にわたる血族結婚より浸透率の低い常染色体劣性遺伝が推定された．さて本例の特色は骨格筋病理所見にあった．光顕では一般的な筋原性変化の他に筋線経の約10％に特異的な構造物が見られ，
それは筋線経の主に中央に存在し，HEで淡塩基好性，
Gomoritrichrome変法で赤紫染し，内容は充実性であった．
さらに組織化学染色では，NADH・TR陽性やSDHやCCO
活性陰性の染色結果は，ミトコンドリア関連ではなくT管や筋小胞体（SR）l）・2）などの類縁成分が示唆された．また
免疫染色ではMHCが陰性で筋原線経では構成されず，ま

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図1【一般組織染色］筋線経の大小不同，中心核の軽度増加，問質結合織の増生を認めたが，炎症細胞浸潤，ra鑓eかred伽ers，脂質蓄積はなく，活動性の変性・再生線経も明らかではなく変性産物も殆ど認められなかった．しかし特徴的な変化として，
HEで好塩基性，Gomori扇d汀Ome変法染色の赤紫染する充実性の塊状構造（矢印）を約10％の筋線経の主に中央部に認めた（園1Å）．
【組織化学染色1先述の塊状構造物（矢印）はNADH−
TRで紫色に染まり，多くは周辺部にhaloを形成していた（図18）．これはコハク酸脱水素酵素およびcytochromecoxidase（CCO）活性は陰性であった（図1C）．
A：HE，B：NADH−TR，C：CCO（×332）．

たHSPの一種のSRに局在するとされるGRP78（BiP）3）が陽性で，さらにendocytoticvesicleと関連するクラスリン4）の陽性所見も示した．つぎにジストロフィン分子の異なった部分を認識する3種類の抗体とも塊状構造の空胞部に陽性であり，筋形質膜の裏打ち蛋白であるジストロフィン
が同部に発現していた．類似の報告は酸性マルターゼ欠損症（AMD）や低カリウム性周期性四肢麻痺の空胞膜にも報告されている5）t6）．すなわち空胞膜がexocytosisの過程で筋形質膜と融合する前段階で形質膜構成蛋白を発現する
ため5），あるいは筋収縮などによる空胞の破裂による筋細胞への障害を避けるため空胞膜を補強するためジストロ
フィンが発現するのではないかとされた6）．以上本構造は膜構造の集合体としてT管とSRを中心にendoc舛OSisとexo・
cytosisに基づく嚢胞（空胞）と管状物が混在した構造と考えられた．
つぎに電顕では本構造は1層の膜に囲まれた大小不揃い−133−

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図2【組織化学染色】この塊状構造物（矢印）は非特異性エステラーゼ脚SE）では強陽性（図2人），酸性フオスフアクーゼ染色（ACP）
は陰性であった（図2町【免疫染句充実性の塊状構造物はミオシン重鎖（MHC）アイソフォーム；ファースト（一句とスロー（−S嬢色に陰性であり，タ
イプ1，2両線経に認めた（図2C．D）・ストレス蛋白については，GRP78（図2E）やクラスリンは陽性（図26），ユビキチンは多くが陰性（園2F）であった・ジストロフィン（勒S2）顔色では陽性（図2日）であった．
A：NSE，B＝ACR C：MHC−f；D：MHC−S，E：GRP78，F‥ユビキチン，G：クラスリン，H：Dys（すべて×712）

表1Tubukag訂egateSとの各種染色所見の比較
図1・2での塊状構造物の染色性を自験周期性四肢麻痺例の生検骨格掛こ認められた山b血ag訂eg血5（m）の染色性と比較検討した・その結果，仇では多くは横断面内に主に筋線経の周辺部位に局在し，多巣性に認められた．また組織化学染色
では本症例における反応性に比し，一般的には漬染またはより鮮明であり，何等かの構造的な共通性を示唆したが異質性も示された．
Trichrome：Gomoritrichrome変法，NADH：NADH−tetraZOliumreductase，SDH：コハク酸脱水素酵素，CCO：CytOChromec
OXidase，ACP：酸性フオスフアターゼ，NSE：非特異性エステラーゼ，MHC：ミオシン重鎖

本例
局在
FibertypeHE
TrichfOme
NADH

中央＞辺縁
1＞2

淡青
赤紫
＋紫（ハロー＋／−）

SDH
CCO
ACP
NSE

＋＋

MHC
HSP27

−＞＋

HSP72

DySはOpbh

134

一十

Ubiquitin
Clatbrin

＋
十一

HSP90

／＞ ＋ 十GRP78

園3【電顕所見1横断像は様々な直径（60mmから6JJm以上）よりなる管状・嚢胞様構造物の集藻が存在し，内容は均一物質で充満され，約10mmの一層の限界膜構造よりなっていた（図3人）． 縦断像では筋線経の長軸に沿い筋線維内に限局性に存在し，山bularag訂eg釦esの様に整然としてではなく雑然と認められ， 主にT管との連続性を示した．周辺の筋原線維周辺にはSRとT管と考えられる異常微細管状構造が増加していた（図3町

A：×36，660，8：×18，＄00（Bar＝1〟m）の雑然とした直径が60mmから数〝m以上にも及ぶ嚢胞・管状構造の集合体で，主にT管を中心にSRなどが嚢胞・管状構造形成に直接関連している所見もえられた．このPathy10）につき言及する必要がある．Sarcotubularmyopathy

構造物と最も鑑別上重要な山bu血喝訂egateS（m）の特徴と比較してみる．光顛的にはmはパラフィン切片では多くは見逃され，凍結切片ではHEで塩基好性，Gomori

れた空虚な小管状空胞でありSRとT管の関連が示唆され

trichrome変法で濃赤染，NADHでは濃青紫染（difbrmazane
色）し，NSE濃染，SDHやmyoSinATPaseでは染まらず7）類
似点も多い点は本例が仇と同様にSRと関連する8）と考えれていた．これはsarcotubularmyopathyでは標本処理の段階で逸脱したことも否定できないが，自験例では光顕にられる．つぎにmについては72kDaのHSPが陽性とされ，HSP72が筋障害によるストレスにより発現しSRやT管の構成蛋白の構造変化を引き起こLmを形成するとの報告があるが9），我々の自験m症例および本例では必ずしも
HSP72が陽性ではなかった．また電顕的にmは周囲の筋
原線経とは分離され，主に筋線経に複数存在する．そして筋線椎の長軸に沿って平行し比較的整然とした山bulesの筋病理は，光顔ではタイプ2線維内に多発散在性の微小空胞を20−30％の筋線経に認め，電顕では一層の膜に囲また．またその内容物は無定形物質の痕跡を残す小空胞であったが，今回の自験例では無定形物質で内容が満たさ

おいて空胞の確認はできず，電顕的にも嚢胞（空胞）サイズが不揃いで管状構造を併せもつ集合体であるなど，多くはsarcotubulaTmyOPathyの報告所見と異なっていた．
以上，本症例は筋形態学的にはmyopathy withTAや
sarco山bularmyopa払yの類似疾患と考えたが異なる所見も多く，慢性で緩徐進行性の筋ジストロフィー様の経過などを特徴とした新たなミオパチーと考えた．
引用文献として多くは存在し，直径は60−80mmで二重膜の構造（膜間隔；6−12mm）をとるなど7）本例の電顕所見とは異なっていた．
さて本構造物がSR由来であれば，先天性ミオパチーで単一報告の非進行性の近位筋優位の障害を持つ兄弟小児例に報告され，SRの異常増殖に伴うsarcotubtllar myo−

1）DubowitzV，SewryCA，FitzSimonsRB，etal：Muscle
biopsy：apraCticalapproach．Bai11iere Tindal1，London，
1985，pp．74−752）埜中征哉：臨床のための筋病理．第2版 日本撃事新報社，東京，1993，pp15−39−135−3）MunroSandPelhamHRB：：Ac−terminalsignalprevents

8）SalviatiG，Pierobon・BormioliS，BettoR，etal：Tubular

SeCretionofluminalERproteins．Cel148：899・907，1987．

aggregates：Sarcoplasmicreticulumongln，Calciumstor・4）SchekmanRandOrciL：Coatproteinsandvesiclebud・

ageabilityandfunctionalimplications．MuscleNerve8：

ding．Science271：1526−1533，1996．

299−306，1985．

5）VitaG，Migliorato A，TbscanOA，etal：Immunocyto・9）MartinJE，MatherK，SwashM，etal：Expressionofheat

ChemiStryofmusclecytoskeletalproteinsinacidmaltase

Shock proteinepitopesin tubular aggregates．Muscle

de爪ciency．MuscleNerve17：655−661，1994．

Nerve14：219−225，1991．

6）BleeckerJLD，EngelAG，WinkelmannJC：Localization

10）JeruSalem F；EngelAGand Gomez MR：Sarcotubular

Ofdystrophinandb−SpeCtrininvacuolarmyopathies．AmJ

myopathy．Anewlyrecognizedbenign，COngenital，蝕mili・Pam01143：1200−1208，1993．

almuscledisease．Neurology23：897−906，1973．

7）FardeauMandTbmeFMS：Congenitalmyopathies．In

MyolognedbyEngelAG，FranZini−AmstrongC・Vo12・
McGraw−Hill，NewYbrk，1994，pP．1487−1532−136−

Tubulomembranousmyopathyのその後に関する研究
福

研究協力者

原

近 藤
古 井

信

義＊

浩＊＊ 中
英 介＊ 林

はじめに
S55年の筋ジス三好班の班会議において，それまで報告の無かった特異な筋構造物を有する筋疾患を先天性ミオパチーとしてTbbulomembranousmyopathy（TM）と名付けて報告した1）．その後，その構造物（tubulomembranous
StruCture）1）については，葛原ら2）によりrimmedvacuopleを有する遠位型ミオパチ一においても見られることが報告されたが，TMの様に，大きさにおいても数においても著
明なものは報告されてはいない．最初の報告から約15年を経た現在の状態を報告するとともに，同じように長期経過を経たrimmedvacuole型遠位型ミオパチー3）と比較検討した．
方法
同じように長期経過のmとRV型遠位型ミオパチ一に

島
恒

孝＊
美＊

結
果
この2例を比較してみると，TMの症例1は，発病後約20年を経過し，比較した遠位型ミオパチーの症例2は，18年を経過している．両者とも，病気の進行としては極期に達していると言えるが，現在の臨床状態は非常によく似ている．また，症例2は，初期には典型的なRV型遠位型
ミオパチーの筋萎縮の分布であったが，進行した現在ではむしろ指の動きの方が残っている．
骨格筋のCT検査所見では，糊の症例では，わずかに前頚部の筋肉が筋組織を残存しているのみで，他の四肢筋，体幹筋のほとんどが脂肪化していた．RV型ミオパチ
ーの症例でも頚部屈筋，上腕二頭筋，前腕屈筋の一部がわずかに筋組織を残すのみで，他の四肢筋，体幹筋は全て脂肪化していた．

ついて臨床経過，筋障害の分布について臨床的観点から比較検討するとともに，骨格筋の変性の状態について
Computedtomography（CT）で検査した．
対象症例は，
症例1：35歳男性（TH）l）
血族結婚（＋）．生来，運動能力が非常に劣り，15歳より歩行が不安定，16歳時に入隊 軽いミオパチ一様顔貌．四肢の近位筋と下腿のふくらはぎに軽度の筋萎縮が見られた．cKは軽度増加．筋電図はミオパチーの所見．筋力低下，筋萎縮はその後も進み，先ず大腿，下腿筋に強くなり，歩行が困難となる．上肢も筋力低下が進み，今では両側の栂指がわずかに動くのを除いて，四肢は全く動かせない．しかし，眼球運動，構音，礁下は正常のままであり，わずかに動く栂指でモールス信号によるパソコン

図1症例1を換作している（図1）．
症例2：41歳男性（RV型遺位型ミオパテー）2）血族結婚（＋）．23歳時に下肢の筋力低下で発症．次いで上肢遠位筋の筋力が低下 次第に歩行が困難，今では四肢の筋力萎縮が著明で，両側の栂指がわずかに動き，ワープロを使用することが出来るほか，四肢はほとんど動かせず，全介助状態である（図2）．眼球運動，構音，礁下には支障はない．
＊国立療養所犀潟病院＊＊国立療養所新潟病院

図2 症例2

ー137−

考

察

3）RV型遠位型ミオパチーは，病気の進行により遠位筋糊の臨床症状は遠位型ミオパテーとは異なり，近位筋

のみならず近位筋も著明に萎縮し，筋障害の分布には特が優位であり，発病の様子も先天性ミオパチーを思わせ徴が無くなる．むしろ，一部の遠位筋の動きの方が残存るものがある．また，RV型遠位型ミオパチーでみられる
tubulomembranous struCtureはTMにおけるほどには大きくされる．

はなく，数も多くはない．恐らく，tubulomembranOuS

文

献

struCtureとTMの関係はnemaline rodとネマリンミオパチーl）FukuharaN，Kumamoto T；Hirahara H，etal：A newの関係に類比することが出来るであろう．RV型遠位型ミmyopathywith tubulomembranOuSinclusions．J Neu・

オパチーの骨格筋CT像に関しては，水沢ら4），国本ら5）の研究がみられ，病初期には下腿伸筋，大腿屈筋，内転筋
が選択的に障害される，傍背柱筋も障害されやすく，臨
床的な筋力低下の分布と一致すると報告されている．このように，mとRV型遠位型ミオパチーでは発症状況，
筋障害の分布，筋生検像は明らかに異なるが，十数年を経た進行期では筋障害の分布には特徴が無くなり，骨格筋CT像も非常によく似ており，区別できなくなっている．
したがって，TMの診断には初期における筋障害の分布と筋生検が重要になる．

rologiCalSci50：95−107，1981．
2）Kuzuhara S andNakanishiT：Tubulomembranous andfingerprint・likeinclusionsin biopsied muscle ofdistal
myopathywithrimmedvacuoles．ActaNeuropatho162：
194−200，1984．
3）KumamOtOT；FukuharaN，NagashimaM，etal：Distal
myopathy．ArchNeuro139：367−371，1982．

4）水澤英洋，井上聖啓，豊倉康夫ら：鮎mmed vacuole型遠位型ミオパチ一における骨格筋障害様式：臨床的ならびにCtによる検討．臨床神経26：1174・11別，
1986．

結

論

1）Wが進行したときの病像は，RV型遠位型ミオパチーと区別が付かない．

5）国本雅也，川井充，後藤順ら：Rlmmedvacuole型distal
myopathyの骨格筋CT所見．神経内科26：287・294，

2）初期の筋障害の分布の把握と筋生検が重要である．

−138−

1997．

成人発症ネマリンミオパチーの筋病理学的検討
鈴

研究協力者

埜

中

征

木

ゆ

めり■

哉り■■井

元

千佳ヂ

黒

岩

義

之■■

要 旨 常染色体劣性遺伝形式を有するネマリンミオパチーの遺伝子座は2q21・2・22に存在することが知られている．この候補遺伝子は骨格筋の構成蛋白であるネプリンをコードする遺伝子を含んでいる・そこで，成人期に筋生検が行われた22例の臨床経過，筋病理学的所見を検討，分類した上で，抗ネプリン抗体を用いて特にネプリンの発現を中心に検討した．成人発症ネマリンミオパチ一における免疫染色ではネプリン蛋白は全ての筋線経に正常に発現しており，異常は見られなかった・
結

はじめに
ネマリン小体は，他の筋疾患でも経過中に筋原線経の乱れに伴って非特異的に生ずることがあるため，成人例
では診断に十分な検討を必要とする1）・2）．そこで今回私た
ちは，成人期に行われた筋生検でネマリン小体が多数認められ，ネマリンミオパチーと診断された症例を検討し，成人型の臨床的および筋病理学的特徴を明らかにして分類した上で，常染色体劣性遺伝形式をもつネマリンミオ
パチーの候補遺伝子中に責任遺伝子が含まれるネプリン
蛋白の異常について検討することとした．
対

象

筋生検施行時の年齢が18−84歳までで，生検筋の少なくとも1％以上の筋線経にネマリン小体を認めた患者，男11人，女11人，計22人．
方法
対象患者22例の臨床経過と、生検筋の筋病理における特徴について検討した．
臨床経過は，発症年齢，筋萎縮の分布，先天性ミオパ
チーの症例に見られる身体的特徴としての骨格異常である高口蓋，脊柱変形，関節拘緒の有無を中心に，筋病理学的には，急速凍結切片にヘマトキシリン・エオジン染色，Gomoriトリクローム変法染色，NADH染色，ATPase
染色など一連の組織化学染色を施し，また，抗αアクチ
ニン抗附），抗ネプリン抗体（Sigma）を用いた免疫染色を行った．乳児重症型ネマリンミオパチーの生検筋の蛋白にイムノプロットを行った．

果

病歴と臨床所見から，幼小児期に症状が存在したが軽微であり，特に異常とは思っていなかった者（先天型成人
期増悪群）13例，成人期に症状が明らかとなったが筋症状の分布から先天性を示唆するもの（先天型成人期発症群6例），および成人期まで全く正常で，先天型をうらづける
症状を欠く3例に分類できた．
先天型成人期増悪群13例では，全ての例で筋力低下に家族または本人が，15歳以下の若年で気付いており，処女歩行遅延の見られたものが4例あった．家族歴は3例にあり，妹1例，弟1例，同胞2人1例，また，血族婚としてはいとこ婿が1例あり常染色体劣性遺伝が推定された．症状では「先天性」を強く裏付ける高口蓋が7例，顔面筋確
息は4例，頸部屈筋群に強い筋力低下を5例，礁下障害など咽頭筋の筋力低下を4例に，さらに先天性股関節脱臼を1例に認めた．全例生検は上腕二頭筋で行われた．良性先天型ネマリンミオパチーの特徴であるタイプ1線維萎縮は5例に，タイプ1線維優位は6例に，またタイプ2B線維欠損は2例に認められた（表1）．全ての症例で上記のいずれかの所見をみた（図1）．
先天型成人期発症群の6例では顔面筋罷息は1例に，頸筋の選択的筋力低下または喋下障害を4例に認めた．1例
では眼瞼下垂と眼球運動制限が主症状だった．先天型成人期発症群の生検筋は，大腿直筋1例，上腕二頭筋5例だった．タイプ1線維萎縮は4例，タイプ1線維優位は3例，タイプ2B線維欠損は2例に認められ，6例全ての症例で先天型の特徴のいずれかがみられた（表1，図2）．
表1三群における筋線維タイプの異常
先天性
先天性
非先天型
成人期増悪群成人期発症群成人期発症群
全タイプ1
3例
0
0
タイプ1優位
6例
3例
0＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部
綿横浜市立大学医学部神経内科
榊＊国立精神・神経センター武載病院

タイプ1萎縮タイプ2B欠損
ー139−

5例
2例

4例
2例

0
0

PII

▲

Pt7

PM

A

Pt3

PM

A

P

H

AAMkb886k﹁J︑・■ ■PPGN如tれ一

横綱■り■づ虐燕総鮭■■⁝凋¶瑚椰

r二n11trd

M：MGNohllm．

N：N8bUlin
C：Connoct暮n

MHC：MyoもinH08VYCham
2−8％9￠l

図4 重症先天型3例のイムノブロッテイングを示す．
ネプリン蛋白のバンドは正常対象と同様の部位に現れている．

図1先天型成人期増悪群の筋病理像
a；HE，b；mGt，C；rOutine ATPase，d；ATPase
pH4．6（8−d；×330）

非先天型成人期発症群の3例はそれぞれ46歳，41歳，71
歳の発症で全て女性だった．1例は胸膜炎，もう1例は潰瘍性大腸炎を合併しており，特に後者では筋症状がステロイドに反応して軽快している．筋病理学的に上記二群に共通する所見はネマリン小体以外みられなかった．
抗αアクチニン抗体，抗ネプリン抗体による免疫染色では，小児におけると同様，前者はZ帯とネマリン小体，
後者はZ帯を挟んで線状に陽性となった（圃3）．乳児重症型のイムノブロットでは，ネプリン蛋白のバンドが明らかに見えた（図4）．
図2

先天型成人期発症群の筋病理像
a；HE，b；mGt，C；rOutiTleATPase，d；ATPase
pH4．6（a−d；×330）

考察
成人型ネマリンミオパチーは，臨床経過，筋病理学的所見から，先天型成人期増悪群，先天型成人期発症群，非先天型成人期発症群の三群に分けられた．良性先天型
も小児期まで全く異常に気付かれない例があることがわかった．高口蓋，足変形という特徴があったことから良性先天型が成人期に急激に増悪したと考えられ，先天型
成人期増悪群の中には成人期まで気付かれないほど筋症状の軽微な例があることは留意すべきである．先天型成人期発症群は，高口蓋，側琴，尖足といった先天性筋症の身体的特徴は有さず，筋症状も明らかに成人期に発症しているが，先天型に通ずる筋病理所見，すなわちタイ
プ1線維萎縮，タイプ1線維優位，タイプ2B線維欠損のいずれかを全例が示していて，それが本群の診断的根拠となった．
何れにおいても家族歴には欠けていたため，優性遺伝は存在しないと考えられ，多くは常染色体劣性遺伝と推察された．

芯で．．サブ ．J

一方，ネマリンミオパチーの遺伝子座は，常染色体優濁訝十夢

性遺伝形式を有するものはIq2ト234），常染色体劣性遺伝
形式を有するものは2q21．2−22に存在5）することが知られている．また，骨格筋の構成蛋白であるネプリンは，分子量800Kdの巨大なアクチン結合蛋白 ）で，コードする遺伝子は常染色体劣性遺伝形式をもつネマリンミオパチーの候補遺伝子の中にある刀．

属、頑讃㌣

■

ヽ

守
gノ

き

C

一て

図3 先天型成人発症の一例
上段は抗ネプリン抗体，中段は抗かアクチニン抗体，下段はゴモリのトリクローム変法による各染色結果を示す（×713．6）．

そこで，抗ネプリン抗体を用いてネプリン蛋白の異常をまず小児のネマリンミオパチーで調べたところ，ネプ
ー140−リン蛋白の発現異常は見られなかった8）．成人例の免疫染
色ではネプリン蛋白は全ての筋線経に′j、児例と同様正常

3）NorthKNandBeggsAH：Deficiencyofaskeletalmuscleに発現しており，免疫組織化学的検索では異常は見られなかった．乳児重症型のイムノプロットでは，ネプリン

congenitalmusculardystrophy・neurOmuSCulDis，1996・

蛋白のバンドが明らかに見えるが，量的に減っている・
この意義については不明である．
今後，乳児重症型におけるイムノプロットの結果を踏まえて，成人型ネマリンミオパチ一におけるネプリン蛋
白の異常の有無について検索を深める必要がある・
謝

isoformofα−aCtinin（α−aCtinin−3）inmerosin−POSitive4）LaingNG，WiltonSD，Å比ariPA，etal：Amutationinthe
a tropomyoSingeneTPM3associatedwithautosomal
dominantnemalinemyopathy・NatGenet9：75・79，1995・
5）Wallgren・PetterssonC，AvelaK，MarChandS，etal：A
genefbrautosomalrecessivenemalinemyopathy・EurJ
HumGenet5：229−234，1997．
6）LabeitSandKolmererB：ThecompleteprimaTyStruCture
ofhumannebulinanditscorrelationtomusclestructure．J辞

臨床症状，経過などを詳しくご連絡いただき，また各方面から本研究にご協力いただいた諸先生方に深謝いたします．

MoIBio1248：308・315，1995．
7）PelinK，RidanpaaM，DonnerK，etal：Rehedlocaliza・tionofthegenesfbrnebulinandtitinonchromosome2q
allowstheasslgnmentOfnebulinasacandidategenefor

参考文献

autosomal recessive nemaline myopathy．EurJ Hum
Genet5：229−234，1997．

1）EngelAG：Late−OnSetrOdmyopathy（anewsyndrome？），

1ightandelectronmiCroscopicobservationsintwocases・
MayoClinProc41：713−741，1966・

8）井元千佳子，川井 充，埜中征哉：ネプリン抗体を用いたネマリンミオパチーの免疫組織学的検討．脳2）EngelWK：Rod（nemaline）disease・In ScientificAp−
proachestoClinicalNeurology，edbyGoldensohnES，AppelSH，Lea＆Febiger1977，VO12，pp1667・1691・

ー141−と発達30：S254，1998．

インテグリンα7欠損型先天性ミオパチー
喜

一●

■
■
●

計紆

健

川地

上下

●

小枝

●

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弘仲

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石平

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子文哉

起

畑

由俊征

▲響

旨

原中

要

林塚埜

研究協力者

荒

骨格筋の機能ならびに恒常性の維持には，細胞膜内外のタンパク質連関が重要な役割を果たしていると考えられている．我々は，筋細胞基底膜のラミニンに異常のある先天性筋ジストロフィーにおいて，その筋細胞
膜側の受容体であるインテグリンα7βlDの発現にも二次的異常が認められることから，骨格筋におけるラミニ
ンーインテグリンの相互作用の重要性を示唆した．さらにその後の検索でインテグリンα7の遺伝子異常が，先天性ミオパチーの原因の一つになり得ることを発見した．
インテグリンα，βともに，これまでに多くのサブユニ

研究の背景
骨格筋の機能を正常に保つためには多くのタンパク質ットが報告されている．成熟骨格筋細胞においては，主としてα7βlDタイプのインチグリンが発現している．

が関わっているが，筋細胞膜内外のタンパク質連関の重要性が，筋ジストロフィーの病因解明の研究を通して，
近年徐々に明らかになってきた．筋ジストロフィーのうち最も頻度の高いDuchenne型筋ジストロフィーの原因タ

このうちインテグリンα7は主に骨格筋・心筋に発現しており，一方のβ1Dは，全身各組織に発現しているβ1サ
ブユニットの筋特異的スプライシングアイソフォームでンパク質・ジストロフィンは，筋細胞膜関連細胞骨格タある．このα7βlDインテグリンは，筋細胞基底膜のラミニンの重要な受容体の1つであり，骨格筋の形成や恒常ンパク質であり，筋細胞膜の細胞質面にこれを裏打ちするように存在する．ジストロフィンは筋細胞膜にあるジストロフィン結合タンパク質複合体（dystrophin−aSSOCiatedPrOteins；DAPs）を介して筋細胞の外側を覆っている基底膜の主成分であるラミニンと結合している．また，DAPsの一部であるサルコグリカン複合体に異常が起こった場合，肢帯型筋ジストロフィー2C〜2F型（またはサルコグリカ
ノバチー）になることが知られている．さらに，ラミニン
α2鎖に一次的異常があるとメロシン欠損型先天性筋ジス
トロフィー（MCMD）になる．このように，筋細胞膜内外を結ぶタンパク質に異常があると筋ジストロフィーを発症することが判明し，ラミニンーDAPs−ジストロフィンというタンパク質連関の重要性が指摘されてきたのである
1）（図1）．我々は，この三者以外にも筋細胞膜内外の連絡性の維持に重要な役割を担っていることがin vitroの実験で示唆されている．
CMDは，出生時，もしくは乳児期早期より筋緊張低下，
運動発達遅滞を示す先天性ミオパチーで，臨床・病理学
的に筋ジストロフィーの特徴を有するものを総称している．CMDのうち，欧米に多く認められるものがMCMDである．これは，主として骨格筋基底膜に発現しているラ
ミニンα2鎖の遺伝子に異常があり，α2鎖を含むラミニ
ン，すなわちメロシンの発現に異常を来すCMDである王制．
一方，本邦に多い福山型CMD（FCMD）の骨格筋でも，ラミニンα2鎖に二次的な異常が認めらる．MCMD，FCMD
ともに基底膜の脆弱性が認めめられ5），電顕的にも非薄・分断化した異常な基底膜を観察することができる ）．

に重要な役割を担っているタンパク質が存在するであろうと考え，ラミニンレセプターであるインチグリンに注目し，その発現を検討した．

研究結果
我々は，ラミニンに異常を認めるMCMDならびにFCMD

インテグリンは，αとβのヘテロダイマーで構成されの骨格筋について，その受容体であるインテグリンα7βlD，ならびにDAPsの発現を検討した．その結果，DAPs
およびジストロフィンの免疫反応には著しい異常は認められないが，インテグリンα7，βlDには，ともに強い変化が認められた乃島）．さらに，ラミニンα2鎖を欠損する筋細胞株においては，インチグリンα7βlDの局在が乱れ，アポトーシスが引き起こされるが，この細胞株にα2鎖を強発現させると，α7βlDの局在が正常化し生存可能となることも判明した刀．

る膜貫通型細胞接着因子であり，細胞一細胞，あるいは細胞一細胞外マトリックス（基底膜）を機械的につなぐとともに，シグナル伝達機構を介して細胞の発生・分化や増殖，さらには細胞死などにも関わっている重要な分子である．
＊国立精神・神経センター神経研究所
榊東京都立東大和療育センター＊＊＊長野県立こども病院小児科＊＊＊書聖隷三方原病院小児科

ー142−図1筋細胞膜内外のタンパク質と筋疾患

Controt Patientl Patient2

Patient3

Lamininα2chainlntegrin
α7lntegrln
β1D

Dystro・Phin

図2 インテグリンα7欠損症筋の免疫染色疾患筋では，インチグリンα7の免疫反応は欠損し，インチグリンβlDの免疫反応は減弱している・一方，ラミニンα2鎖ならびにジストロフィンの免疫反応に異常は認めない．

−143一

次いで我々は，確定診断のついていないCMDを含む先天性ミオパチー117例の生検筋について，免疫組織化学的にインテグリンα7βlDの発現を検討した．その結果，3症例でα7の免疫反応が欠損しており，同時にへテロダイ
マーを形成しているβlDの免疫反応も減弱していることを発見した（図2）．そこでヒトインテグリンα7cDNAの全塩基配列を決定し，この3症例に関して生検筋および末梢血リンパ球より抽出したRNA・DNAを用いて遺伝子変異の有無を検索した．その結果2例でヘテロな遺伝子異常

参考文献
1）Campbe11KP：Three muscular dystrophies：Loss of
CytOSkeleton−eXtraCellularmatrixlinkage・Cel180‥675・679，

1995．
2）HayashiYK，EngvallE，Arikawa・HirasawaE，GotoK，KogaR，NonakaI，SugitaHandArallataK：Abnormallo・
Calizationoflamininsubunitsinmusculardystrophies．J
NeuroISci119：53−64，1993．
3）IshiiH，HayashiYK，NonakaIandAr血ataK：Electron

が，1例ではα7mRNAの著減が認められた．3症例とも孤発例で，生下時，あるいは乳児期より運動発達遅滞を認

microscoplCanalysisofbasementmembraneinFukuyama

めているが，筋症状は緩徐進行性もしくは非進行性，血清クレアチンキナーゼ値も正常から軽度上昇程度，筋病
理像は，筋ジストロフィーの特徴である筋線椎の壊死・再生像はあってもわずかであり，臨床的には先天性ミオ

191−197，1997．

パチーの範疇に入るものであった9）．

COngenitalmusculardystrophy．NeuromuscDisord7：

4）TomeFMS，EvangelistaT，LeclercA，SunadaY，
Man01e E，Estoumet B，Barois A，CampbellKPand
FardeauM：Congenitalmusculardystrophywithmerosinde伝ciency．CRAcadSciⅢ317：351−7，1994．
5）Helbling−LeclercA，TbpalogluH，TbmeFMS，SewryC，

考察
以上のことから，インテグリンα7欠損症は，先天性ミオパチーの一原因となることが判明した．また，そのそのリガンドであるラミニンに異常が存在すると，二次的GyapayG，NaomI，MuntoniFiDubowitzV；BaroisA，にインテグリンα7βlDに強い影響を及ぼすことから，骨格筋におけるラミニンとインテグリンとの関連の重要性が示唆される．
一方，インテグリンα7遺伝子をノックアウトしたマウ

Culardystrophylocusonchromosome6q2．CRAcadSci

スもすでに報告されている10）．このマウスは，臨床的には明らかな症状は認められないが，筋病理像を見ると筋線経の大小不同，中心核線経の増加など，ミオパチーの所見を呈することが報告されており，我々の報告したヒトのα7欠損症の所見と矛盾しない．
インテグリンは，細胞の内→外へ，あるいは外→内へ

EstoumetB，UrtizbereaJA，WeissenbachJ，SchwartzK，FaTdeauMandGuicheneyP：Reaqustingthelocalization
Ofmerosin（laminin a2・Chain）de茄cientcongenitalmus・Paris318：1245−1252，1995．
6）HayashiYK，IshiharaT，DomenK，HoriHand
ArahataK：Abenignallelicformoflaminin a2chainde茄cientmusculardystrophy．LanCet349：1147，1997．

7）VachonPH，XuH，LiuL，LoechelF，HayashiY，
ArahataK，ReedJC，WewerUMandEngval1E：Integrins（α7β1）inmusclefunctionandsurvival．DisruPtedex−
PreSSioninmerosin・de瓜cientcongenitalmusculardystro−
Phy．JClinInvestlOO：1870・1881，1997．

のシグナルを伝達している．α7βlDインチグリンは筋細胞において，どの様な信号を送ったり受け取ったりし

8）HodgesBL，HayashiYK，NonakaI，WangWArahataKているのだろうか，興味が持たれる．そして，その異常がどの様に筋障害の発生に関わっているのであろうか，検討されるべき課題である．筋疾患の発症機構を考える

grininhumanandmurinemuscuIardystrophies．JCellSci

上で，インテグリンα7欠損症は大きなヒントを与えてくれるものと考えられる．

andKau蝕anSJ：Alteredexpressionoftheα7βlinte・llO：2873・2881，1997．
9）HqyashiYK，etal：Mutationsintheintegrin a7gene
CauSeCOngenitalmyopathy．NatureGenet19：94−97，1998．
10）MayerU，etal：Absenceofintegrinα7causesanovel

formofmusculardystrophy．NatureGenet17：318−323，
1997．

−144−

Ⅵ．眼咽頭筋ジストロフィー（OPMD）

眼咽頭筋ジストロフィーの表現型／遺伝子型とorigin
内

研究協力者

野

誠■

宇 山 英一郎■ 日 野
後 藤 加奈子■■ 塚 原
BraisB…

洋 健■ 有 馬
俊 文＊■ 荒 畑

寿 之■
喜 一■■

RouleauGA…

はじめに

D14S283，D14S990，R7002，MYH7．24，MYH7．1，D14SlO41

眼咽頭筋ジストロフィー（OCulophaTyngealmusculardys一を用いて解析した．3）熊本出身のOPDMl家系2兄弟（51歳

打Ophy：OPMD）は，（1）40歳以降の発症，（2）主症状は眼瞼
下垂と嘩下障害，（3）外径8．5mmの骨格筋筋鞘核内封入体と48歳）例について家系調査，臨床・筋病理学的検討を行った．疾患対照はOPMD確実例の6家系40例（平均年齢5Sを特徴とする常染色体優性の遺伝性疾患である1）・2）従来，歳）と常染色体劣性distal myopathywithrimmed vacu・

French・Canadianをはじめ欧米白人間で家系が集積され，01e（AR・DMRV）の2家系4例（平均年齢41歳）．

onefbunderefRctで世界中に広まったと推定されていた3）．
結

一方，我々は本症の日本人家系例を熊本と静岡に兄い果出し4），phenoけpeの相違などから，祖先とgeno切）eが異な

1）朗βP2遺伝子型は，熊本出身の2家系と大分出身の1家

る可能性を指摘した5）．本症の原因遺伝子に関しては，1995

系において（GCG）6／（GCG）11，静岡の1家系が（GCG）6／（GCG）1。，
大分出身の1家系が（GCG）6／（GCG），，東京在住の1家系が（GCG）6／（GCG）8であった（図1）．一方，健常な正常対照の90名（98．9％）は（GCG）6／（GCG）6で，1名（1．1％）のみが年にQuebecのFrench−Canadian家系例で14qll．2−q13に局在することがまず同定され6），その後米国在住のFrench−
CanadianとEnglish／Scottishの家系7），静岡の日本人家系8），およびGennanを祖先とするオーストラリアの家系9）においても同じ局在であることが確認された．その後カナダ，
フランス，日本など世界15カ国の共同研究を続け，今回
14qll上のpoly（A）−bindingprotein2gene（R4BP2）が原因遺伝子として同定された10）．
日的1）日本人家系例の遺伝子型を同定し，本邦OPMD患者の表現型／遺伝子型の関連性について検討する．2）先に報告した熊本の家系のハプロタイプ解析を行い，静岡の家
系および欧米白人家系と比較し，遺伝子型の結果と合わ
せ，その0riginを検討する．3）OPMDと異なる疾患として本邦で提唱された眼・咽頭・遠位型ミオパチー（OCulopha−ryngodistalmyopathy：OPDM）1りとの異同を明らかにする．
対象および方法
1）上記（1）イ3）の特徴を有し，かつ遺伝子解析の同意が得られた熊本在住の4家系（2家系は大分出身），静岡の1家系
および東京在住の1家系．正常対照者は健常日本人91名．
末梢血またはgenomicDNAを抽出し，PCR，fragment
managerを用いて朗BP2のexonlの（GCG）nをスクニーニン
グし，シークエンス解析で遺伝子型を同定した．2）ハプ
ロタイプはマイクロサテライト多型DNAマーカーの＊熊本大学医学部附属病院神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部（GCG）J（GCG），であった．2）本邦初家系例として報告した
熊本の家系では，小家系のため2点連鎖解析は困難であったが，ハプロタイプ解析では発病者2例のみにおいて原因
遺伝子領域のマーカーに対してヘテロに同じハプロタイ
プを有し，組み替えが見られないことから，14qll．2−q13の局在が示唆された（図2）．この熊本の家系と静岡の家系
は同領域のマーカーに対して，全く異なるハプロタイプを示した（図3）．さらに，静岡の家系が一部French・Canadianの家系と共通のハプロタイプを共有していたのに対し，熊本の家系は，検索し得た欧米諸国の家系例とは全く異なるハプロタイプを示した．3）OPDMの家系調査では，
両親がいとこ婚で，文政5年誕生の祖先以降，他に同様の発病者はなく，常染色体劣性遺伝が考えられた．2兄弟例
は各々40歳，35歳より，前脛骨筋の筋力低下と筋萎縮で発病し，次第に両手の筋力低下，眼瞼下垂，外筋眼筋麻痔，および喋下障害が進行した．血清CKが中等度上昇し，
針筋電図は筋原性を示した．筋組織上兄は軽度，弟は高度筋原性変化を呈し，RVを各々3％，6％認めた．電顕ではRVの近傍に15−18nmの微細管状構造の封入体（IB）を認めた（図4）．進行期のAR・DMRVの4例に礁下障害と眼症状はなく，RVが平均20％と高頻度出現し，OPDMに酷似したIBを認めた．一方，OPMDでは全例に高度外眼筋麻痔や遠位筋優位の筋力低下はなく，RVは0．1％以下と低頻度で，核内IBは外径8．5nmと小型であった．3つの疾患の比
較を表1に示す．

＊＊＊McGHl University＆Montreal General Hosp；tal

−147−

1
2
3
4
5

105

110

115

120

Aut0−5caledData：Hlnutes

l
125

130

■
135

11■
柑

図4 常染色体劣性遺伝性眼・咽頭・遠位型ミオパチー（AR−OPDM）の家系の発端者の骨格筋電顕写真（上腕二頭筋：×62．725，hs飢：×7，475）．細胞質内のrimmed
vacuoleの近傍に16−1如爪のmamentの集塊が認められる．

●

表1常染色体劣性眼・咽頭・遠位型ミオパチー（AR−OPDM），常染色体劣性のrimmed vacuoleを伴う遠位型ミオパチー（AR−DMRV），および眼咽頭筋ジストロフィー（OPMD）の比較検討．

図1フラグメント・マネージャーを用いたPoly（Aトbindingprotein2（月4BP2）の変異の解析．正常対照者
では98．9％が（GCG）6／（GCG）6（lanel）で，1．】％が（GCG）J（GCG），（lane2）であり，OPMD患者では，ヘテロに（GCG）8（東京，lane3），（GCG）9（大分，lane4），（GCG）lt（熊本，ane5）と（GCG）nの異常伸長を認めた．lane6はマーカー．

TmnsnlisSitIn

AR

Nulllberol一匹1ienh

AR

AD

つ

4

36

Meanageulexdm血血朝日yeam）
Me川埋eOronsel
Pl（18is

50

41

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ExIcrnd】ophlhutmOPkgはDysph喝ia
SemmCK十十＋＋MeilnI■requenCyOrRV

15−は−nmCy10PksnliC川CIusions
Rふ11minlranuclearinchsi n恥
Cenelocus

十

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1）

→nr†
＜1％

9pトql Hq＝ユuq

OPDM・Oeu10pharyngodisLall11yOpaLhyこDMRV・disL。n−yOPaLhy、Vilhrimmcdvacuutes：OPMD‥L）eUIor｝hTyngeu．museuhrdy刈roph）・：AR：dulo−
SOmalreCeSSi、・eこAD‥aU10Ⅶm山dominanl：CK：Crealin亡kinasc：RV：
パmmed vacuoIes．

考訂002；NBVM▲帽mDINDR．細山臥け8U的恥TCRYINMひけ用談Le仙仙肌

図2 熊本の家系4）・5）のハプロタイプ解析の結果を示す．
発病者には14qll．2−q13のマーカーに対して，共通のハプロタイプが1つのallele上に存在している（■のbox）．

1

KUMAMOTO〇 〇一9 ■V ∧
▲2
3
▲ ▼
0
9
1

WH7．24
仙IH7．1
D14＄1041

217kbの候補領域からクローニングされた月4且P2であり，
このmRNAは骨格筋に多く発現し，コードされた蛋白は核内に局在している10），12）・13）．この期且P2は核内での転写
後mRNAのポリアデニル化を誘導する3一−PrOCeSSing

MARKER＄
D145283
D14与的OR7002

察

眼咽頭筋ジストロフィーの原因遺伝子は，14qll上のSHIZuOKA

図3 熊本の家系4）・5）と静岡の家系4）15）のハプロタイプを示
す・14qll．2−q13上の各マーカーに対するハプロタ
イプは全く異なっている．

reactionで遊離3●−OH末端のpoly（A）の付加反応を刺激し，poly（A），tailが長くなるように働き，mRNAの安定性に関与すると推定されている14）．健常日本人の遺伝子型は，
French・Canadianと同様に，そのほとんどが（GCG）6／（GCG）6であり，患者は全例（GCG）6／（GCG）…と1つのalleleにGCG反復配列の短い異常伸長を認めた．Huntington病
やDRPLAなどのlongrepeat病とは対照的に，世代間促進現象は本邦家系例では明らかでなく，本症の（GCG）。の伸長は安定している点が特徴的である．

−148−

軽度上昇していた．一方，（GCG）．。の静岡の家系と（GCG），の大分出身の家系では，喋下障害が先行し，血清CKが中等度上昇し，下肢近位筋の筋力低下がある点で相違が認められた．北米在住のFrench・Canadianの多数の家系例では，従来1634年にフランスからquebecに移住した1夫婦が共通祖先であり，連鎖解析からもonefbunderefRctが示
唆され，実際一部の例外の他はほとんど（GCG）6／（GCG）9であった．これに対し本邦では6家系で4種類の遺伝子型が今回同定されたことは，本邦においては複数の祖先が存

lar dystrophyin Quebec．Neuromusc Disord7（Suppl．
1）：S22−S29，1997．
4）UyamaE，NohiraO，ChateauD，etal：OculophaTyngeal
musculardystrophyintwo unrelatedJapaneSe fhmilies．
Neurology46：773・778，1996．
5）UyamaE，NohiraO，TbmgFMS，etal：Oculopharyngeal
musculardystrophyinJapan．NeuromuscDisord7（Suppl・
1）：S4トS49，1997．
6）BraisB，XieY−G，SansonM，etal：Theoculopharyngeal

在している可能性があると思われる．特に熊本の最初の家系のハプロタイプは他の国内，国外のものとは全く異なるものであり，そのoriginは欧米からもたらされたものではなく，突然変異で独自に生じた変異と推定される．

musculardystrophylocusmapstothereglOnOfthecar−
diacα

and

β

myosinheavychaingenesonchromo・

SOme14qll．2−q13．HumMoIGenet4：429−434，1995．
7）StqjichJM，GilchristJM，LennonFletal．Confirmationof

今回，眼咽頭筋ジストロフィー（OPMD）と類縁疾患との異同が少しでも明らかにされることを目的として，常linkageofoculopharyngealmusculardystrophytochro・

mosome14qll．2・q13．AnnNeuro140：801−804，1996．

染色体劣性眼・咽頭・遠位型ミオパチー（AR−OPDM）の家系例を検討したが，電顕的に外径8．5nmの核内封入体は認められず，常染色体劣性のOPDMは，常染色体優性4）8）Uyama E，Nohira O，Brais B，etal：Oculopharyngeal

または常染色体劣性のOPMD10）とは異なる疾患である可能性が高いと思われる15）．今後，AR−OPDM家系例にお9）TthBT；SullivanA−A，FameboF；etal：Oculopharyngeal

いても月4月P2の変異の有無を検討したい．最後に，

anAustraliankindred．ClinGenet51：52・55，1997．−．rr

OPMDでは上眼瞼挙筋や輪状咽頭筋は高度（dystrophic）に障害されるが，三角筋や上腕二頭筋などは軽度の変化がみられるのみで，障害される筋に著明な選択性があり，同じ遺伝子型でも重症度に明らかな差がみられること16）10）BraisB，BouchardJ−rtXieY−G，etal：Shortexpansiopslin

musculardystrophyinJapanese：Clinicopathologicalandgeneticstudieslabstract）．AnnNeuro140：954，1996．

musculardystrophy（OPMD）・rePOrtandgeneticstudiesof

thenABP2genecauseoculophaJγngealmusculardystro・
Phy．NatureGenet18：164・167，1998．
11）SatoyoshiEand Kinoshita：Oculopharyngodistalmyo・から，月4βア2に連鎖した修飾遺伝子または因子が存在す

Pathy．ArchNeuro134：89・92，1997．

ることが推定される．今後，病態と発症機序のoriginをさらに検索する必要がある．

12）NemethA，KrauseS，BlankD，etal：IsolationofgenomiC

andcDNAclonesencodingbovinepoly（A）bindingpro・
teinII．NucleicAcidsRes23：4031・4041，1995．

謝辞13）KrauseS，FakanS，VhisKandW独IeE：Immunodetec・

本研究に御協力頂きました，静岡赤十字病院神経内科

tionofpoly（A）bindingproteinIIinthecellnucleus．Expの野平 修博士，京都府立医科大学神経内科の森 敏博
士およびフランスのTbm占博士に深謝致します．

CellRes214：75−82，1994．
14）KellerW：NoendyettomessengerRNA3

processing！

Ce1181：829−832，1995．

文献15）UyamaE，UchinoM，ChateauDandTbmiFMS：Auto−1）Tbm6FMSandFardeauM：Oculopharyngealmuscu］arSOmalrecessiveoculopharyngodistalmyopathyinlightof

dystrophy・In：EngelAG，Franzini−AmstrongC，eds・My−

distalmyopathywithrimmedvacuole andoculopharyn・

0logy，2nd ed．New York：McGraw−Hill：1233・1245，

gealmusculardystrophy．NeuromuscDisord8：119・125，

1994．

1998．

2）TbmeFMSandFardeauM：Nuclearinclusionsinoculo−16）BraisB，BouchardJ・RTbm6FMS，etal：Geneticevidence

Pharyngealdystrophy．ActaNeuropathol：49：85−87，1980．

fbr theinvoIvement ofother genesin modulating the3）BouchardJ−P，BraisB，BrunetD，GouldPVand

SeVerityofoculopharyngealmuscula∫dystrophylabstract］．

RouleauGA：Recentstudiesonoculopharyngealmuscu−−149−

AnnNeuro144：455，1998．

眼咽頭型筋萎縮症14例の臨床病理学的検討
松

研究協力者

原

四

郎■

宮 本 和 人＊ 北 口 哲 雄＊
磯 崎 英 治＊ 平 井 俊 策＊

要 旨 眼咽頭型筋萎縮症（眼咽頭型筋ジストロフィー症0PMD並びに類縁疾患）14例について，眼球運動障害を中心にして臨床像を検討した．明らかな眼球運動障害を伴う例を10例認めた．また明らかな四肢筋脱力を11例に認めた．これらの頻度および重症度は，FrenchCanadianの原著より高い．遺伝形式は，常染色体優性，同劣性，孤発例がみられ，臨床徴候が類似したいくつかの疾患群が含まれる可能性が示唆された．
はじめに結Barbeauらが報告したFrench Canadianの眼咽頭型筋ジス

果

初発年齢は，28歳から66歳（20代1例，30代2例，40代4
例，50代5例，60代2例），眼瞼下垂で発症10例，喋下障害4例．遺伝形式は，常優疑い（父母のいずれかが同症）6例（5トロフィー症（OPMD）は，常染色体性優性遺伝で眼瞼下垂にて発症し，礁下障害が出現するが，眼球運動障害と四肢筋力低下は極く軽度とされた1）．その後，世界の多くの地域から類似例が報告され，眼球運動障害や四肢筋萎縮例もあり，Barbeauの症例との異同が問題になっている2）．

家系），常劣性疑い（両親が従兄弟婚）3例（2家系），孤発例5
例．眼球運動障害は，10例存在し，常劣群に多く，眼寓部CTで外眼筋の萎縮が示された．

我が国では，Satoyosiらが報告したOculopharyngodistal
myopa血yは，優性遺伝で眼球運動障害と四肢遠位部の著明な筋萎縮を伴う疾患として注目されている3）．opMDの四肢の明らかな脱力および筋萎縮は，11例で観察され，近位優位6例，遠位優位3例，近位と遠位の差がないもの2例であった．眼球運動障害と遠位優位の筋萎縮分布が認

遺伝子異常が解明されつつあり，眼咽頭型筋萎縮症を臨床的に整理する必要があると考えた．

められた例は，2例あった．

目

筋生検の免疫染色でアミロイド前駆蛋白が陽性例が4例の検索で2例，リン酸化タウ蛋白陽性例が4例の検索で2例認められた．

的

眼咽頭型筋萎縮症を眼球運動障害を中心に臨床病理学的観点から検討する．
対象
本院に入院した14例で，眼瞼下垂または，噴下障害で初発した．

電顕は，3例の検索で全例直径15・20nmの細胞質内の封入体を確認したが，核内封入体については，さらに検討
を要する．
考

察

今回の症例群で，French CanadianCaSeに臨床的に極め方法

筋生検で組織化学染色，一部の例で電顔観察とアミロ
イド蛋白等を免疫染色した．眼瞼下垂・眼球運動障害を半定量的に検討（眼瞼下垂がなく正常5〜開眼不可を0，両眼正常で10．眼球運動は，障害がない時5〜全く動かない
時0，正常なら40，30以下を眼球運動障害とした）．喋下障害や四肢体幹の筋力低下は，日常生活動作を明らかにて近いものと，発症が若年で，外眼筋や四肢に障害が承ぶ例がみられ，遺伝的にも劣性遺伝が疑われるものも，孤発例と見なせるれいが含まれた．外眼筋麻痺や四肢筋
萎縮は，French canadian caseの剖検例で程度は軽いもののみられるとしている．Tbmeらは，筋生検の特徴的な核内封入体が疾患特異性が極めて高いとし，それにて診断を下した例で，外眼筋麻痔や四肢筋障害を容認している5）．

障害するもの・骨格筋CTは，大腿部の所見をselectiv吋
Pattemとcompactatrophypattemに分けた．眼寓部のCTscan（OMlineに平行）を参照した．

OPMD及び類似例でrimmed vacuoleは，出現頻度が低く，核内封入体がより疾患特異性が高いと考えられているため，診断的特異性や病的意義が少ないとされている．

＊東京都立神経病院神経内科

しかし，筋電図で，安静時の脱神経電位がみられる例が多く，随意運動時高振幅で干渉に乏しい放電様式みられることがあること，さらに筋生検で小角化線経がみられる頻度が高いことは，封入体筋炎やdmmedYaCuOleを伴う−150−

遠位型ミオパチーと共通の筋障害パターンの存在を示唆する．我々の検索でアミロイド前駆蛋白とリン酸化タウ
蛋白が免疫組織学的に陽性であったことは，封入体筋炎と共通のdmmedvacuole形成課程が存在することを指示する．
現在，核内封入体の構成成分や筋障害発現機構との関連は明らかになっていない．里吉らの症例では，8．5mmの核内封入体がみられるとされ，これがOPMDに果たして特異的なのか極めて興味が持たれる．今後，遺伝子異常と核内封入体の関連，さらに今回提示したような類似病態例の解明が待たれる．

文

献1）BafbeauA．：OcularmyopathyinFrenchCanada（abstrct）・
ProceedingsoftheSthInternationalCongressofNeurol・
Ogy；Vienna，September1965，Vbl．Ⅱ：257−259・2）PetermanARLi11ingtonGA，andJamplisRW：Progres−SivemusculardystrophywithptosisaJlddysphagia・Amh
NeurollO：33・41，1964．
3）Satoyoshi Eand Kinoshita M：Oculopharyngodistal
Myop如hyArchNeuro134：89・92，1977．
4）Brian WLand Daniel PP：OculophaTyngealmuscular
dystrophy；Anautopsiedcase舟omFrench−CanadianKin−
dred．JNeuroIScienc53：145・158，1982．
5）TbmeFMSandFaTdeauM：Nuclearinclusionsinoculo−
Pharyngealdystrophy．ActaNeuropath0149：85−87，1980．

−151−

Ⅶ．筋強直性ジストロフィーPM）ミオトニンキナーゼの生理機能に問する研究
石

浦

はじめに

章

一■

3．6TGリピートの人工的増加

筋強直性ジストロフィー（DM）の責任遺伝子ミオトニン
キナーゼ（MtPK）には，その31非翻訳領域にCTGリピートが存在し，その伸長とDM症状との間に相関があると考えられているが，正確な発症機構については未知のままである．3年間の本研究により，蛋白質としてのMtPKの性状，局在などを明らかにした．また，MtPK過剰発現細胞
で新しく発現が強化される新規遺伝子DMRP（DM−related

現在まで，CTGリピートが100を越えると，PCRがうま
くいかない，大腸菌のトランスフォーメーションがうま
くいかない，などの問題が出てくるために，長いリピートを持つ細胞株の確立が容易ではなかった．私たちは，PCRをうまく応用することによって，試験管内でCTGリ
ピートを増加させることに成功し，現在，CTG190まで伸長させることができた．このPCRによる伸長には奇妙なprotein）の同定や，塩素チャネルへの影響についての生理学的知見を得ることに成功した．本年度は，人工的にCTGリ
ピートを増幅させる手法を開発し，CTG140を含むMtPK
cDNAを安定形質発現する筋芽細胞株C2C12を確立した．

法則があり，リピートが20単位で伸びることが明らかになっている．これはCTG20を単位とする高次構造が存在することを示唆するものであった．

この株は，治療の開発にも有用であることが示された．
以下に，3年間の研究の総括をする．

3の手法を応用して，マウス筋芽細胞株C2C12に長い
CTGリピートを持つMtPKcDNAを導入した．現在，CTG

1．MtPKの精製

数が0，5，46，60，140，160の株が得られている．
特に，リピートが長いcDNAを導入した株では，血清

私たちは，ラットを用いてMtPKの精製に世界で初めて成功した．筋′ト胞体画分から，各種のクロマトグラフィーによって，分子量7万のMtPKを精製した．MtPKにはC末端が異なる2つのアイソフォームの存在がcDNAの構造から指摘されていたが，それぞれに応じたペプチド
uⅥyWRFtPGAAM（RAP型）とSGAAQEPf仏LPEP（PEP型）

に対するウサギポリクローン抗体を作製し検討したとこ
ろ，M型が大半を占める（筋小胞体1mg当たり0．54mg）ことが明らかになった．
2．日tPKの生理作用
MtPKの生理作用を明らかにする目的でMtPKcDNAをバ
キュロウイルスに発現させ，自己リン酸化活性を検討した結果，確かに活性を持つことが明らかになった．
MtPKcDNAを過剰発現させたC2C12細胞では，塩素チャネルの開口確率が増加した．
次に，MtPK（CTG5）過剰発現株とベクターのみを導入
した株を用いてディファレンシャル・ディスプレイを行い，ノーザン解析で顕著に発現が上昇している遺伝子を探索した．その結果，フェリチン重鎖と新規の遺伝子
DM・related protein（DMRP）の発現が上昇することを発見した．マウスとヒトに，DMRPに相同な遺伝子が存在することも確認した．ノーザンプロットによって，MtPK発
現が少ないDM患者筋肉では，DMRPの発現が有意に少ないことが明らかになった．

4．長いCTGリピートを持つ安定形質発現細胞の取得

除去後の筋分化が遅れることがわかった．また，酸化ス
トレス（重金属）を与えたところ，リピート数が伸びるに従ってアポトーシスすることが判明した．水銀などの重金属を投与すると，細胞内の活性酸素の量が増大した．
このアポトーシスは，Nアセチルシステインや可溶性ビ
タミンDによって回避することができた．
5．CUGリピート結合蛋白質の同定
MtPK遺伝子は，エクソン1がテロメア側に，CTGリピートを含むエクソン15がセントロメア側に配置している．
MtPKの3−末端の停止コドンより外側の非翻訳領域に存在するCTGリピートは確かに転写されることが確認されており，MtPKmmAの3，側にあってCUGリピートとなっている．
私たちは一重鎖のCUGリピートが翻訳レベルで影響を与えているのではないかと考え，CUG結合蛋白質（CUG−
BP）のクローニングを行った．その結果，ヒトcDNAライ
ブラリーより2種類のCUG・BPの存在を確認した．酵母
three・hybrid法を用いてCUG−BPの特異性を検討した結果，
CUG・BPは，CUGリピートだけではなく，UGリピートにも結合することが明らかになった．
おわりにDMがなぜ優性遺伝するかについては，現在にところ確かな理論は得られていない．いったん転写された
CTG／GACリピートがMtPKmRNAにのみCUGリピートとして存在するため，gainorRmctionの考え方を優先すれば＊東京大学大学院総合文化研究科

このCUGリピートが何かを行っているはずである．第一−155−

の可能性が翻訳阻害で，DM患者でのMtPK蛋白質の減少

3）SuzukiA，SugiyamaY；HayashiY；Nyu・iN，YbshidaM，が確かに報告されている．しかしながらMtPK mRNA中

NonakaI，IshiuraS，ArahataKand Olmo S：MKBR aのCUGリピートがTF−Imやアンドロゲン受容体など他のnovelmember ofthe smallheat shock protein血mily，

遺伝子中のCAGリピートと相補的に結合して，翻訳に影bindsandactivatesthemyotonicdystrophykinase．J．Cell

響を与える場合もある．この3年間の研究により，Biol．140：1113−1124，1998．

CTG／GACリピート，CUG・BP，DMRPなど，役者がそろ

4）KamedaN，UedaH，0lmo S，ShimokawaM，UsuklFl

った感がある．DMの病態は，今後数年の間に明らかになるであろう．

IshiuraSandKobayashiT：Developmentalregulationof
myotonicdystrophyproteinkina5einhumanmusclecells
invitro．Neuroscience85：311−322，1998．

文献5）UedaH，KamedaN，Bal）aT；TbradaN，ShimokawaM，

1）Koike H，SaitohN，SasagawaN，Watanabe T，YmlamOtOM，IshiuraS，KobayashiTandOhnoS：Im−

ShimokawaM，SorimachiH，IshiuraSandSuzukiK：munolocalizationofmyotonicdystrophyproteinkinasein

Ident抗cationandpuri丘cationofmyotoninproteinkinase

COrbularandjunctionalSarcoplasmicreticulumofhuman（MtPK）丘omratskeletalmusclesarCOPlasmicreticulum．

Cardiacmuscle．Histochem．J．30：245．251

Biomed．Res．19：93・99，1998．

6）UsukiFandIshiuraS：ExpandedCTGrepeatsinmyo−2）SaitohN，Usukif；SasagaWaN，KoikeH，SorimachiH，toninproteinkinaseincreaLSe SuSCePtibilityto oxidative

Y血eI，IshiuraSandSuzukiK：Myotoninproteinkinase（MtPK）a飴ctsthechloridepermeabilityofC2C12my0−
geniccells．Biomed．Res．19：191−198，1998．

ー156−

StreSS．NewoReport9：2291−2296，199g．

筋強直性ジストロフィーの分子病態発症機構に関する研究
小 林 高 義■

●

彦穂之

●
●

雅秀洋

●
■
●

●
●
■

本田町

■

山積反

●

●
●

●
●
▲■

●

紘

佳洋昇一

典英

●
■

田澤川木

■

亀水笹鈴

■

丈 明 一 一

雅宏伸章

川中野浦

下田大石

研究協力者

要 旨 我々は筋強直性ジストロフィー（DM）の分子病態発症機構を明らかにするために（1）DMの原因遺伝子蛋白と考えられているDM protein kinase（DMPK）のポリクローナル抗体を作製し，この抗体が，fu111engthのDMPKを認識すること．成熟した骨格筋では，従来の報告にある神経筋接合部，筋紡錘のみでなく，骨格筋のけpeI筋
線経に強く局在することを明らかにし，更に免疫組織化学的，免疫電頗的に筋小胞体（SR）のterminalcistemaeに局在することを初めて明らかにした（Shimokawaeta1．，1997；Kobayashieta1．，1997）．また，心筋では，COrbular及びjunctionalSRに局在することを免疫組織化学的，免疫電顕的に初めて明らかにした（Uedaeta1．，1998）．（2）DM骨格筋において，Western blotによる検討でDMPKの発現は低下し，形態学的にはDMPKはDM筋おいてもSRに局在するが，DMPK陽性の筋小胞体は筋病変の初期から変化すること．更に古典的なDM筋病理上，DM筋の特徴的変化と考えられているcentralnuclei，nuClearchains，SarCOplasmicmass，typeIatrophyはいずれもDMPK陽性筋線
経に多く存在することを明らかにし，DM筋変性の基本はDMPKの機能異常によるものであることを初めて明らかにした（Uedaetal，1999）．（4）更に，ヒト骨格筋−ラット脊髄併置培養系を使用して，ヒト骨格筋の発達段階におけるDMPK mRNAの変化及びDMPKの局在の変化に関して，RT−PCR法，Western blot法及び免疫組織学的，電顕的検討を行い，神経支配後一過性にDMPKmRNAが減少すること．DMPKは神経支配によって細胞内の局在を変えSRに限局していくことを初めて明らかにした（Kamedaeta1．，1998）．
文献4）KamedaN，UedaH，Ohno S，ShimokawaM，UsukiF；1）Shimokawa M，Ishiura S，Kameda N，YimamOtO M，IshiuraSandKob ashiT：Developmentalregulationof

SasagawaN，SaitohN，SorimachiH，UedaH，OhnoS，

myotonicdystrophyproetinkinaseinhumanmuSClecells

SuzukiKandKobayashiT：Novelisoformofmyotonin

invitro．Neuroscience85（1）：311・322，1998．

PrOteinkinaseGeneproductofmyotomicdystrophyislo−

5）UedaH，ShimokawaM，YamamotoM，KamedaN，

Calizedinthesarcoplasmicreticulumofskeletalmuscle．

MizusawaH，BabaT；TtradaN，FltjiiY；OhnoS，IshiuraS，

AmJP叙ho1150：1285−1295，1997．

andKobayashiT：Decreasedexpressionofmyotonicdys−2）KobqyashiT；ShimokawaM，KamedaN，YmamotoM，trophyproteinkinaseanddisorganizationofsarcopla5mic

nIlakaH，MizusawaH，IshiuraS，UedaHandOhnoS：

reticulumin skeletalmuscle ofmyotonic dystrophy・J

Myotonicdystrophyproteinkinaseisasarcoplasmicre・

NeuroISci162：38・50，1999．

ticulumproteinspeci爪callylocalizedintypeImuscle重・
berswithoutcolocalizationofSERCA

Ⅱ

ArPase．BasicandAppliedMyology7（5）：311−316，1997．
3）UedaH，KamedaN，BabaT；TtradaN，ShimokawaM，
YmlamOtOM，IshiuraS，KobqyashiTandOhnoS：Im・munlocalizationofmyotonicdystrophyproteinkinasein
COrbularandjunctionalsarcoplasmicreticulumofhuman
Cardiacmuscle．HistochemJ30（4）：245・251，1998．

■東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊山梨医科大学第1解剖学教室
榊＊東京大学分子細胞生物学研究所生体超高分子分野−157−

Myotoninproteinkinaseの3一非翻訳領域に存在する
CTGリピートの遺伝子発現に及ぼす影響
吉良

研究協力者 古 谷 博 和■
大 野 みずき＝

はじめに

潤

一書

長 野 祐 久■ 山
佐々木 裕 之●■ 林

田
健

猛＊
志＊＊

激末梢血リンパ球を2例ずつ使用した．

筋緊張性ジストロフィー（DM）はmyotoninprotein kinase

線維芽細胞と筋芽細胞はトリプシン処理により細胞を（DMPK）遺伝子の3．非翻訳領域にあるCTGリピートの延長

回収し，一メタノール・酢酸液により前固定と後固定を行い，核標本を作成した．cDNAプローブは，DMPKは第14により生じるリピート病であるが，DMの発症機序に関しては未だ不明である．DMPK遺伝子の5■上流にはgene59，

イントロンからCTGリピートを含む第15エキソン部分を，3．下流にはDMassociatedhomeodomainprotein（DMAliP）遺DMAHPは開始コドンの下流部分のエキソンからイント

伝子が近接して存在しており，CTGリピートの異常延長

ロン部分を，ビオチンあるいはジゴキシンでランダムプ

はこれらの遺伝子の発現を増加させる，影響しない，減ライムラベルしたものを使用した．また，異常伸長CTG

少させるという様々な報告があり，意見の一敦をみていない1）■）．臨床的にDMは全身性の疾患で，DMPK遺伝子

リピートを検出するために，合成オリゴCAG（30mer）をジゴキシンで末端ラベルしたものを使用した．cDNAは最のみならず隣接遺伝子の発現異常が病態に関与している

終濃度10ng／〟1，オリゴDNAは10pmol／〃1になるように可能性も考えられる．我々は，CTGリピートの遺伝子発現に及ぼす影響について，リポーター遺伝子の3■非翻訳hybrimix（35％formamide，2×SSC）を調整した．RNA−FISH
は通常の方法に従って行い，未変性標本に対して熱変性領域にCTGリピートを挿入した発現ベクターを作製し，処理した1本鎖DNAを37℃，2時間ハイプリグイズさせ，CTGリピートの延長が強力に5●上流のリポーター遺伝子

2XSSCで3分間2回，0．5％TX−100／PBSで3分間1回洗浄した．

の発現を抑制することを明らかにした．また，mlOreSCenCe

3％BSA／0．1％TX・100／4XSSC液でブロッキングし，avidin・

insituhybridization（FISH）法によりDM細胞におけるDMPK，
DMAHP遺伝子の発現変化を単一核レベルで明らかにした．

rhodamin，aVidin−FITCあるいはFITC標識抗ジゴキシン抗体を反応させ，蛍光顕微鏡にて観察した．

結

方

法

果

1）CTGリピートを含むリポーター遺伝子の構築と発現

1）CTGリピートを含むリポーター遺伝子の構築と発現サブクローニングにより，リピート部分はしばしば短リポーター遺伝子としてルシフェラーゼ（LUC）とリソ

縮され，LUCでは85回および135回のCTG，CAGリピー

ソーム酵素のgalactosylceramidase（GALC）を用いた．135回
CTGリピートを有するDM患者のゲノムDNAからリピーンが得られた．細胞の種類によらず，LUCではCTGリピト，GALCでは58回のCTG，CAGリピートを含むクロートを含む領域（約500bp）をPCR法で増幅して，プラスミドートの方がCAGリピートよりもLUC活性の発現を抑制しpUc19にサブクローニングした．CTGリピート部分を制た（図1A）．GALCでもCTGリピートにより活性の発現が明限酵素で切り出し，LUCの発現ベクターPGL・LUC，GALC

らかに抑制された（図18）．

の発現ベクターpCAGGS・GALCの3．非翻訳領域に挿入した．シーケンスによりリピートの方向とリピート数を確2）培養細胞におけるDMPKとD肌HP転写産物の剛Å−FISH解析

認した．発現ベクターを1ipoftctamineを用いて，COS・1，

CAGプローブのシグナルは正常線維芽細胞では検出さグリオーマ細胞（U251），筋芽細胞（L6）に導入して，LUC
活性とGALC活性を測定した．

れず，DM線維芽細胞ではCAGプローブのシグナルが多2）培養細胞を用いたDNPKとDNAHPのRNA−FISH解析

数のスポットとして検出され，異常伸長CUGリピートを含むRNAのみを検出することが確認された．したがって細胞はDM患者および正常コントロール由来の線維芽CAGシグナルとDMPKあるいはDMAIIPシグナルの関係

細胞，不死化線維芽細胞，筋芽細胞を各1例ずつ，PIiA刺はDM細胞のみで評価した．DMPKあるいはDMAHPcDNA＊九州大学医学部脳神経病研究施設内科部門＊＊九州大学遺伝情報実験施設

プローブのシグナルはlないし2領域にみられ，CAGプロー
ブのシグナルと重なるものと重ならないものがみられた．
−158−

A

︵雪︑×⊃﹂こ岩苛S空選0⊃﹂

冠
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Cont

85

135

1

l

CAG

Con1

85

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1

Con1

58

58

CTG

1

CTG

図1リピートを含むリポーター遺伝子の発現
A：筋芽細胞L6とルシフェラーゼリポーター
B：COS−1細胞とgaIactocerebrosidaSeリボ一夕

CAG

リポーター遺伝子の発現をβ−galactosida5eにて繍正．

DMPKとDMAHPのシグナルは，正常線維芽細胞では異ナルより多くみられシグナルの重ならないものが多いこなる領域あるいは同一領域にみられた．DM線維芽細胞
では，両方のシグナルが同一核内で1〜数スポット検出され，それらの分布は一致していることが多かった．正常とから，CAGプローブはDMPKmRNA以外にも分解されたCUGRNA断片を認識していると考えられた．正常細胞
ではDMAHPのシグナルはl領域にみられることが多く，筋芽細胞ではどちらか一方のシグナルだけが一つの核内で検出され，DM筋芽細胞では両方のシグナルが同一核内で検出されることが多かった．
正常リンパ球ではDMPKの発現は低かったが，DMAHP
は20〜30％の核で1個のスポット状シグナルとして検出さ

DMAHP遺伝子は一方のアレルからのみ発現しているこれた．DMリンパ球ではDMpKの発現はやはり低かったが，
DMAHPは60〜80％の核でシグナルが検出され，30〜50％で2個のスポットが検出された．

DMPK転写産物と一緒に核内にスタッグしている可能性とが多いと考えられた．DM細胞ではDMAI廿のシグナルが複数みられることから，DMAHP遺伝子が両方のアレ
ルから発現している可能性が考えられた．また，DMPKのシグナルとよく重なることから，DMAHP転写産物がもある．
リンパ球ではDMPKのシグナルは検出されなかったが，核l個あたりのDMAIlpのシグナル数はコントロールに比考察
リピートの存在とその方向性により遺伝子の発現が影響を受け，CTGリピートでリピート数が大きくなるほど

べてDMで多く，CTGリピートの異常伸長がDMAHPの発遺伝子発現の抑制効果が強くなることが示された．また，その抑制効果は遺伝子の種類にはよらなかった．これまでに短いCTGリピートで遺伝子発現の抑制効果を示した
報告5）はあるが，DMが発症するほどのCTGリピート数で制されているという報告3），4）とは異なるが，単一核レベル現を促進している可能性が考えられた．これは筋芽細胞
ではCTGリピートの異常伸長によりDMAHPの発現が抑と核・細胞質を一緒に分析するという実験系の違い，あるいは細胞の種類が異なるためかもしれない．

の証明は初めてである．その機序については不明な点が多いが，異常伸長リピートをもつmmAは核内にとどまって核外に輸送されないため，発現が低下するのではな
いかという考え方が提唱されている6）．
本研究では，DMPKとDMAHPの遺伝子由来の転写産物

文献1）SabouriLA，MahadevanMS，NarangM，etal：E飴ctof
themyotonicdystrophy（DM）mutationonmRNAlevels
OftheDMgene．NatureGenet4：233・238，1993．
2）HamshereMG，NewnanEE，AlW乱乙aIIM，etal：Tbs・を単一核内で同時に検出することにより，両者の分布を比較することが可能であった．DMAHPの発現が筋芽細Criptional

胞では線維芽細胞より少なかった以外は，RNA−FISH上のDMPKとDMAHPの発現パターンは両細胞で類似していた．DM細胞ではCAGとDMAHPシグナルが重なること，
およびDMAHPシグナルは二つの領域にみられる場合があることから，DMAHPは変異アリルからも転写されていると考えられた．CAGのシグナルの方がDMPKのシグ

USA94：7394・7399，1997．

al）nOrmalityin myotonic dystrophy afRcts

DMPKbut notneighboringgenes．ProcNatlAcad Sci3）KlesertTR，OttenAD，BirdTD，etal：THnucleotiderepeat
expansion at

the myotonic dystrophylocus reduces

expressionofDMAHRNatureGenet16：402−406，1997・

4）ThomtonCA，1町merJRSimmonsZ，etal：Expansionof−159−

themyotonicdystrophyCTGrepeatreducesexpressionof

theflankhgDMAHPgene．NatureGenet16：407・409，

6）DavisBM，McCurrachME，1blqiaKL，etal：ExpanSion

1997．

OfaCUGtrinucleotiderepeatinthe3

untranSlatedregiOn5）SasagawaN，SaitohN，ShimokawaM，etal：E脆ctof

OfmyotonicdystrophyproteinkinasetranSCriPtsresultsin

arti重cial（CTG）repeatexpanSiononthe expression of

nuclearretentionoftranscripts．ProcNatlAcadSciUSA

myotoninproteinkinase（MtPK）inCOS−lcells．Biochem

94：7388・7393，1997．

BiophysAぬ1315：112−116，1996．

ー160−

MyotonicdystrophyにおけるCTGrepeatの周辺遺伝子発現に与える効果の検討
永 松 正 明■

研究協力者

目

犬 飼
高 野

晃■ 久 留明 美● 祖父江

聡■ 染
元◆

亦

結

的

即事

果

Myotonic dystrophy（DM）の遺伝子異常として，MTPK遺伝子の3一一UTRのCTGrepeatの延長が同定されてはいるも①6例すべてのDNAで非常にexpandしたDMPKalleleが観のの1），いまだその異常が疾患を惹起する機構は明らかに②各mRNA畳（attomoles／0．2FLgtOtalRNA）は，DMPK：DM

されていない．またDMはmultisystemに障害が及ぶ疾患と

l．0267±0．4801，NC O．6970±0．5104（p＝0．3367），DMAHP：

して知られており2），単にCTGrepeatがMTPK遺伝子の発現だけに影響をおよぼすものとは考えがたい．今回は，DMO．1538±0．1129，NCl．1834±1．0386（p＝0．0250），またCTGrepeatの延長が近接の遺伝子発現レベルに影響を及ぼすか否かを検討してみた．

DMO．0106±0．0147，NCO．0030±0．0023（p＝0．1495），

察された．Repeat数は4000−4gOOと計算された・

その内部スタンダードとの比は，DMPK／β・aCtin：

DMAHP／β・aCtin：DMO．0016±0．0023，NCO．0048±0．0032（p＝0．0374）

対考象

DM6例，正常対象者岬C）6例の生検筋組織より抽出したDNA＆RNA．

察

今回の検討では，CTGrepeatの延長はすくなくともその3■に近接するDMAHP遺伝子の発現に影響をあたえている（発現低下）ことが示された．すなわちCTG repeatは

方法①DM6例のDNA各5FLgを制限酵素EcoRI，BglⅠで消化し，

DMPK以外の遺伝子に影響をあたえmultisystemな疾患を形成していると思われる．その機序が，DNA orRNAの

PFGで分離し，膜に転写後，32pでラベルしたp5Bl．4probe

confbmationalcangeによるものか，結合蛋白の影響によでhybridizationを行いCTGexpanSionを確認した．

るものかは不明である．

②筋組織よりtotalRNAを抽出し，DMPK，DMAHP，β−aCtinのprimerを用いてcompetitive Rr−PCR3）を行い，そのFtNA量を定量した．
各々のPCR舟agmentをpGEM−TEasyvectorにsubcloning

結論

CTGrepeatの延長は，周辺遺伝子の発現に影響をおよぽしていた．

L，その配列の中に無関係な83bpのDNAを挿入し，SP60r

参考文献

T7RNApolymeraSeでinvitrotranscriptionを行いcRNAを作
製Lcompetitorとした．このcRNAを定量し，Serialdilution1）BrookJD，McCurrachME，HarleyHG，etal：Molecularを行い，SamPleRNAに加え，その混合液をtemplateとしbasisofmyotonicdystrophy・eXpanSionofatrinucleotide

たRT−PCR後，反応物を2％アガロースゲルで分離，エチ（CTG）repeatatthe3

ジウムブロマイド染色し，各bandの濃さをNIHimageで読取ってその比よりRNA量を定量した．

endofatranscriptencodingapro・

teinkinase血milymemberlCe1168：799・808，1992．
2）HarperPS：Myotonicdystrophy．2ndedn，WBSaunders，PhiladeIphia，19g9．

3）ClatkMSandRussoAF：Tissue・SpeCはcglucocorticoid
regulationoftryptophanhydroxylascmRNAlevels．MoI
BminRes48：346・354，1997．

＊名古屋大学医学部神経内科

ー161−筋強直性ジストロフィー線維芽細胞，体細胞分裂におけるI）MPK蛋白塁及び（CTG）nリピート数の変化
小

研究協力者

林

下 川
五十嵐

高

雅

義＊

丈●

水

澤

英

洋■

晃日

石

浦

章

一…

要 旨 筋強直性ジストロフィー（DM）患者，正常対象の生検筋を初代培養し線維芽細胞を分離した．これを更に分裂増殖させ，前後でDMPK遺伝子の（CTG）nリピート数およびDMPK蛋白量を各々サザン法，ウエスタン法で検討した・DM患者1例において（CTG）nリピート数の増大とDMPK蛋白量の減少を認めた・DMPK遺伝子（CTG）n
リピート数は体細胞分裂により増大し，リピートの増大によりDMPK蛋白量が減少することが明らかにされた．
はじめに

結筋強直性ジストロフィー（myotonicdystrophy；DM）は常染色体優性の遺伝性疾患で，筋強直，筋力低下，筋萎縮などの骨格筋症状のほか種々の臓器を障害し，多彩な症状を呈する全身疾患である．また，DMは成人型筋ジス
トロフィーの中で最も発症頻度が高いことでも重要な疾患である．DMの原因遺伝子は，1992年にクローニング
された第19染色体長腕13．3のDMプロテインキナーゼ（DMPK）遺伝子である．その3，非翻訳領域に存在する（CTG）nリピートは，正常人のリピート数が5〜37回に対して，患者では50〜数千回となっており，そのリピート数の伸長がDMの発症と深く関わっていると考えられている・DM家系では表現促進現象がみられるが，これは（CTG）nリピート数の増大現象と置き換えることができる．

果

4例のDMの内，1例（CaSe2）においてβdm HI断片はmidpointで7．1kb（7週）から10kb（13週）へ増大し，体細胞分裂に伴う（CTG）nリピート数の増大が確認された．更に21週まで培養したところ，BamHI断片は10．25kb（midpoint）まで
増大した（図2）．また，DMPK蛋白畳は13週において7週との比較で著しい減少がみられた（図3）．コントロール3
例及び他の3例のDM由来の線維芽細胞では7週と13週において助椚HI断片の大きさ及びDMPK蛋白畳に変化は認
められなかった．
考察

従来（CTG）nリピート数の増大は減数分裂の際におこると考えられてきた．しかし，我々の検討の結果，DM患（CTG）nリピート数の増大は体細胞分裂ではなく，減数分裂時に生じると推測されているが詳細は未だ不明である．

者骨格筋由来線維芽細胞では体細胞分裂においても我々は体細胞分裂に伴って（CTG）nリピート数および
DMPK蛋白量が変化するか否かを検討した．

かにされた．4例のDMの患者の内，リピート数の比較的対象および方法（CTG）nリピート数の増大が起こり得ることが初めて明ら少ない（約1500〜2700回）cas62でのみ（CTG）nリピート数の増大が見られたのは，他の3例のリピート数が限界まで伸びていたためと考えられる．

ヒト生検筋（コントロール3例，DM4例）を初代培養し，線維芽細胞を分離した．これらを更に13週以上培養し，分裂増殖させた．培養7週と13週の線維芽細胞よりDNAを抽出した．各20膵のDNAをβα椚HIで消化し，32PでラベルしたDMPK遺伝子のプローブ（BML社製：図1）を用いてサザン法で（CTG）nリピート数の変化を検討した（助mHI断片は（CTG）nリピTトを含む）．また，7週と13週の線維芽細胞を膜分画と可溶性分画に分画した後，DMpKのC末端に対するポリクローナル抗休1）を用いて，ウエスタン法により蛋白畳の変化を検討した．

8dmH1

βか1
E60R1

1．3kb

3．Okb

8．6／9．8Kb

DNAprobe＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊■BML研究開発本部＊＊■東京大学分子細胞生物学研究所生体超高分子研究分野

図1DMPK遺伝子の構造及び使用したプローブの位置−162−

図2 DM患者由来線維芽細胞のサザン法による検討
BamI屯倉agment

圃3 線維芽細胞のウエスタン法による検討

lanel：CaSe 1（7weeks）

1．3kbandlO．5kb

lane2：CaSe 1（13W8ekS）

l．3kbandlO．5kb

Ie食panel：membrane倉actiom

lan63：CaSe 2（7W由b）

l．3kband5．7−8．5kb

rightpanel：SOluble丘action

lane4：CaSe 2（13weeks）

l．3kband8．5−11．5kb

lむIe5：CaSe 2（21weeks）

l．3kband9．0−11．5kb

Pr：7weeb n：13weeks
DM：C鮎e2in図2

l訂Ie6：CaSe 3（7weeks）

l．3kband13kb

NC：nOmalcon打01

lane7：C鮎e 3（13weeb）

l．3kb釘Id13kb

Arrow：DMPK．Eachlancincludesequalproteinamountlane8：CaSe 4（7weeb）

l．3kbむId13．5kb
l．3kband13，5kb

lane9：CaSe4（13weeb）

OrmyOSinhe耶γChah

一方，DM患者筋におけるDMPK蛋白量は減少している文

献との見解が主流であるが，（CTG）nリピート数の増大とDMPK蛋白量の減少の関係は明らかでなかった．今回のl）ShimokawaM，lshiuraS，KamedaN，etal：Novelisoform

結果から（CTG）nリピート数の増大が直接DMPK蛋白量のdystrophyislocalizedinthe sarcoplasmicreticulumof

減少につながることが明らかとなった．現在，DMの病

Skeletalmuscle．AmJPathol150：1285−1295，1997．

態にはDMPK遺伝子の他にDMAHP遺伝子などの関与が指摘されている．我々の系は今後DM病態解明のモデルとなり得ると考えられる．

ー163−

Ofmyotonic protein kinase Gene product ofmyotonic

筋緊張性ジストロフィー（DM）におけるDMPK転写産物の細胞内動態に関する分子細胞遺伝学的研究
斎 藤 深美子■緒

言から成るCTG・30を合成し，ローダミン（赤色）あるいはMyotonicdystrophy（DM）は常染色体優性の疾患であるが，FITC（緑色）で標識し，逆相HPLC精製を行ったものである．

3塩基反復配列の異常伸長という新しいタイプの突然変異

・DMPK遺伝子転写産物bre−mRNA，mRNA）由来のRNAによって発症する疾患（トリプレットリピート病）の一つ

プローブ（アンチセンス鎖およびセンス鎖）の作製：SP6〝7である．この種の疾患としては，現在約10種類同定されプロモーターを持つ転写ベクターに，pre−mRNA（int2／Ex3ているが，リピートの伸長する部位は疾患により異なる．

およびint9／ExlOの領域の2種類）およびmRNA（Ex2n：x3およDMの場合は，PrOtein kinaseの一種であるDMPK（DM
bnaSe）の3■側非翻訳領域で，CTGリピートが異常伸長しびEx9／ExlO領域の2種類）に対応するテンプレートている．ハンチントン舞踏病など，翻訳領域でリピート

DNA（PCR産物）をサブクローニングした後，RNAポリメ
ラーゼを用いてin vitroで転写を行い，その際に基質としが異常伸長している疾患の場合は，それに起因する異常てFITC−UTPを用いて転写産物をダイレクトにFITCラベ蛋白の産生で疾患の発症が説明されている．しかし，非ルし，精製する．上記のCTG（CAG）リピートオリゴプ

翻訳領域での異常の場合は，本来，スプライシングされローブ（ローダミン標識）およびDMPKmRNAあるいはpre・て蛋白に翻訳されない部位での異常であるから，蛋白レ

niRNAに対応するRNAプローブ（FITC標識）を用いて，患者および健常人の細胞核内での抽0・COlorISH法を行った．

ベルの異常では説明できない．転写時あるいは転写後の異常（つまりRNAレベルでの異常）が想定されるが，mRNAの発現量に関しては，正常細胞と比較して増大あるいは減少しているという相反する報告り・2日），4）がなされており，発症機構の詳細はまだ不明である．

結果（1）のプローブを用いてISH法を行った結果，アンチセンスのシグナルは，核内の数カ所以上で明るい明確なシ本研究では，RNAレベルでの異常の検索に焦点を当て，グナルとして検出された．一方，核DNAをdenatureした

RNAの転写後の核内動態に関して検索することを目的と後にISH法を行った場合は，アンチセンスおよびセンス

して，まず，リピートのオリゴヌクレオチドプローブを

プローブのシグナルは，患者の細胞核内の一カ所にco．

用いたinsituhybridization（ISH）法を行い，異常なリピート

localizeして存在することが観察された．また，アンチセを有するDMPK遺伝子転写産物の細胞核内での局在を調ンスシグナル陽性の細胞の割合は，健常者では0〜1％でべることにした・次に，リピートシグナルだけでなく，2あるが，患者では43〜93％と明らかに高い値であった．

種類の転写産物（pre・mRNA，mRNA）の局在をも併せて検また，hybridizationの時間を経時的に変化させた場合，細討を行うため，各種RNAプローブ（アンチセンス鎖および胞核のアンチセンスシグナル陽性率は時間に依存して増加し，6〜7時間でほぼプラトーに達した．

センス鎖）を作製し，ISH法により分子細胞遺伝学的検索を行った．

さらに（2）のプローブを用いてISH法を行った結果，
DMPKmRNAあるいはpre・mRNAに対するアンチセンス

方法

RNAプローブは，それぞれ核内にFITC（黄緑色）のシグナ

検索の対象としては，DM患者8例および健常者6例にルとして観察された．そして，異常なdleleから由来した由来したリンパ芽球細胞株（LCL）を用いた．これらの細胞は，0・075MKClで処理し，アルコール・酢酸固定した
後，スライド上に展開させる．これら標本に関して，以下のプローブを用いてISH法5）を行った．

RNAのシグナルは正常なそれと比較して相対的に多く，その條向はpre−mRNAよりもmRNAでの方がさらに増大していた（図1）．

使用した検出プローブは，以下の通りである．
・異常伸長したトリプレットリピートを検出するための考察
CTGリピートの異常伸張を含むMTPK遺伝子転写産物

プローブ（オリゴヌクレオチドプローブ）の合成：アンチ
センスプローブとしてCAGの10リピートから成るCAG＿
30，およびセンスプローブとしてのCTGの10回リピート胞の核内で明るいスポットとして検出され，健常人の細は，アンチセンスプローブにより，患者のリンパ芽球細胞核ではこのようなスポットは観察されなかった．3塩基
反復配列へのセンスおよびアンチセンスのプローブを同＊東京医科歯科大学難治疾患研究所分子細胞遺伝学時に用いた実験から，アンチセンスプローブは異常伸張−164−今後は，その実態を分子生物学的に検証すると共に，核内集積したmRNAの動態についてさらに検討を加え，DMの多様な病態について解明すべく分子細胞遺伝学的に解析する予定である．
尚，本研究は以下の方々との共同研究により行われたもので，ここに深謝いたします．
塚原俊文書，古城 徹轟，後藤加奈子＊，池内達郎榊，稲澤譲治榊，荒畑喜一■（＊国立精神・神経センター神経研究所，＊＊東京医科歯科大学・発給疾患研究所）
圃l DM細胞核内でのallele−SPeCifictranscriptの検出

参考文献

した遺伝子とその転写産物の両方を示していると考えらl）FuYH，FriedmanDL，RichardsS，PearlmanJA，れる．つまり，患者の細胞核内に明るく散在するアンチ

GibbsRA，PizzutiA，AshizawaT，PerrymanMB，

センスシグナルの中で，1つのスポットのみ遺伝子DNA

ScarlatoG，FenwickRGJr．，etal：DecreasedexpressionofとRNAを含み，他のシグナルはpost−tranSCriptionalRNAを示していることになる．この患者細胞の核内で観察されmyotonin−PrOteinkinasemessengerRNAandproteinin

た転写産物の集積性は，RNAの異常なプロセシングを示

235・8，1993．

している可能性がある．

adultformofmyotonicdystrophy．Science260（5105）：2）CarangOnNobleJE，MarksHGandFunanageVL：Ab・

そこで，転写産物の核内集積性と患者の病態との関連

Sence ofmyotonic dystrophy protein kinase（DMPK）

性を考えるためにもさらに検討必要と思われ，（2）のCTG

mRNAasaresultofatripletrepeatexpansioninmyo・（CAG）リピート・オリゴプローブ（ローダミン標識）および

tonicdystrophy．Genomics18（2）：340−8，1993・

DMPKmRNAあるいはpre・mRNAに対応するRNAプロー

3）SabouriLA，MahadevanMS，NarangM，LeeDS，

ブげITC標識）を用いて，患者および健常人の細胞核内でのtwo−COlorISH法を行った．その結果，異常なalleleからSurhLCandKomelukRG：E飴ctofthemyotonicdystro−phy（DM）mutationonmRNAlevelsoftheDMgene・由来したRNAのシグナルは正常なそれと比較して相対的N釦ureGenet4（3）：233−8，1993．

に多く，その傾向はpre−mRNAよりもmRNAでの方がさらに増大していた．つまり，DMPK転写産物のプロセシン

4）KogaR，NakaoY；KuranoY，TsukaharaTiNakamuraA，

グはある程度，正常遺伝子のそれと同様に行われており．

PrOtein kinaseinthe skeletaland cardiac musclesin

核内集積しているRNAは異常なallele由来のpre・mRNAよりもmRNAが主であることが示唆された．

myotonicdystrophy・BiochemBiophysResCommun202

以上のことから，リピート伸長を伴う異常なalleIe由来

5）¶m軸KL，McCurrachM，Schal1ingM，HousmanDandのDMPK遺伝子転写産物（RNA）は，転写後にほぼ正常に
スプライシングを受けるが，mRNAのレベルで核内に集SingerRH：FocioftrinucleotiderepeattranSCriptsinnu−

積するという動態異常を示すことを，分子細胞遺伝学的128（6）：995−1002，1995．

IshiuraS，NonakaIandArahataK：Decrea5edmyotonin・（1）：577−85，1994・

手法により検出することができた．

−165−

Cleiofmyotonicdystrophycellsandtissues・JCe11Biol筋緊張性ジストロフィーにおけるフェリチン遺伝子
および関連遺伝子の発現について
中 瀬 浩 史■

研究協力者

渡 辺 知 司■ 笹 川
尾 形 克 久リ＝高 木

昇■■ 石
昭 夫い…

浦

章

一＝

要 旨 筋緊張性ジストロフィー患者組織におけるftrritin，および関連遺伝子の発現について検討した．対象として患者生検筋，白血球および唾披腺腫瘍組織，正常者骨格筋および白血球を用いた．サザンプロット法によってCTGリピート長を決定した・ノザンプロット法によりFerritin（Heavychain；FN−H，Lightchain；FN−L），Interleukin
Onealpha（ILl・α），Tumornecrosisfactoralpha（TNFα）遺伝子の発現量を調べた．発現量とCTGリピート長との関係についても検討した・その結果，FN一日，ILトα，TNFαの各遺伝子については，発現畳の差は認められなかったがFN−L遺伝子の発現量は患者骨格筋において減少していた．また，発現量はリピート長が長くなるにつれ減少する傾向が認められた・FN−L遺伝子座はDMPK遺伝子の近傍にあり，CTGリピートがその発現に影響を及ぼしている可能性も考えられた．
はじめに

イロンフィルターにアルカリトランスファーし紫外線固昨年度までに，筋緊張性ジストロフィー遺伝子（DMPK遺伝子）を導入したC2C12培養筋芽細胞において，Femitin

定した・2）DMPK遺伝子のCTGrepeatを含む3，端の317bp
をPCRによって増幅しサブクローニングした．これを制

heavychain（FN・H），Interleukinonealpha（ILl・α）のmRNA限酵素で切り出し【321pでラベルしてプローブとして用いの発現量が変化したことを明らかにした．すなわち3・非た・3）バンドはBa52000イメージアナライザー（FUJIX）で可視化した．

翻訳領域にCTGrepeatを5個つけたヒトDMPK遺伝子を導入した細胞ではFN・Hの発現畳が増加した．repeatを46に延長すると発現が減少した1）・ヲ）・3）．N．HはTumornecr。Sis

Nothern BJotting：1）AGPC法でtotalRNAを調製した．

factoralpha（TNFα）やILl−αなどによって発現が規定さ

れをポジティブチャージナイロンフィルターにトランス

DnaSelで処理した後，10〃gを変性ゲルに泳動した．これる4）・5）・そこでこれらのcytokineの発現量についても検ファーし紫外線固定した．2）正常白血球から調製したtd且I討した結果，ILl−αが和一Hと同様の変化を示した．このことから，少なくともvitroではCTGrepeatの延長がFN−H

RNAを用いてcDNAnrststrandを調製した．これをtemplete
としてm・H，m・L，ILl−α，TNr＋αのそれぞれについの発現を抑制したこと，これにILトαが関与している可てその配列の一部をPCRによって増幅した．得られたPCR能性があることが示唆された（WatanabeT，SasagawaN，etd・投稿中）・今年度，筋緊張性ジストロフィー患者組織に産物をサブクローニングし，これを制限酵素で切り出し【珂pでラベルしてプローブとして用いた．FN・H，m＿Lについては骨格筋及び唾液腺腫瘍での発現畳を調べた．

おける氏汀itinおよび関連遺伝子の発現について検討した．

ILトα，mαについては骨格筋ではシグナルがきわめ

対象・方法て微弱であるため，白血球での発現畳を調べた．各々の対象：筋緊張性ジストロフィー患者生検骨格筋5例，白分子の発現量はG3PDHプローブで標準化した．3）バンド
はBas2000イメージアナライザー（FUJIX）で可視化した．

血球6例，唾液腺腫瘍組織1例．対照として剖検骨格筋4例，生検骨格筋2例，正常白血球6例を用いた．剖検例は，バンドの濃度をNIH血喝eによって測定し定量化した．

すべて脳血管障害・対照生検筋は，鱒症候性高CK血症（粗放学的にほぼ正常）である．

結果Southern Blotting：1）各組織をproteinKで処理しDNAを調製した・このうち10〝gをBamHlで消化し1％アガロースゲルに電気泳動した．これをポジティブチャージナ

Southern BJotting：正常alleleのバンドとともに，CTG＊虎の門病院神経内科♯東京大学教養学部生命・認知科学科＊＊■東京大学医学部神経内科＊＊＊＊大蔵省診療所に認められた・DM患者では，CTGrepeatのサイズは50〜
5000と推定された．

expansionを有する変異dleleのバンドが高分子域に認められた（図1A，B）．一部では，変異alleleのバンドはスメア状

ー166−

C

1

2

3

4

5

6

C：nOmalskeletalmuscle
1−5：DMbiopsiedmuscle
6：Palient5paTOtidtumor

1

3

4

DMmuscle

5

7

8

9

10

11

4

5

6

図18白血球におけるSou血emblo血gの結果
骨格筋と同様だが，変異dl616のbandは一部の患者
ではsme訂状になっている．

一望d巴ロ↑U

2

3

1−6：DMW8C

図1A骨格筋・唾液腺腫瘍におけるSouthemblottingの結果DM患者では，正常aJleleのbandとともにsizeの増大した変異alleleのbandを認める．CTGrepeatのsize
は50〜5000と推定された．同一患者の骨格筋と唾液腺腫瘍では後者の方がrepeatのsizeが大きい．

1

2

12

morma1muscle

DMparotidtumor

FN＿L／G3PDIIl・○

図3 Fcrritinlightchainの発現量とCTGrepeatsizeとの関係
患者骨格筋におけるFe汀itinli由t chahの発現量はCTGrcpeatのサイズが増大するにつれ減少する候向が認められる．
対照骨格筋よりは減少していた（図4）．FN−HはDM骨格筋において，ILl−α，m−αはDM白血球においてそれぞれ減少傾向が認められたが有意差はなかった．
考DM cont．

案

DMPK遺伝子周辺には多くの遺伝子があり6），CTG

図2 骨格筋におけるNothemblottingの結果DM患者では，Ferritinlightchainの発現量が対照に比して減少しているげ＜0．05）．

repeatがそれらの遺伝子の転写に影響を及ぼしている可能性が示唆されている．すなわち，repeatが延長するとnu−
cleosomeの安定性が増し7），mA高次構造に変化が生ずるて対照骨格筋に比し減少していた（P＜0．05）（図2）．DM骨可能性がある8）79），10）．例えばCTGrepeatのすぐ下流には
DMAHP遺伝子が存在し，患者ではその発現が減少して格筋における発現量はCTGrepeatのサイズが増大するにいるという報告がある11）．今回われわれは，和一L遺伝子

つれ減少する傾向が認められた（図3）．患者唾液腺腫瘍においては，同患者骨格筋に比し発現が増加していたが，の発現量が患者骨格筋において減少していることを明ら

Nothern Blotting：FN−Lの発現量は，DM骨格筋においかにした．その発現量はリピート長が長くなるにつれ減

ー167−

DMPK遺伝子の周辺にはFOS・BなどFN−Lの発現に影響を及ぼしうる遺伝子が存在する．これらの遺伝子の発現についても検討する必要があると考えられる．
文献1）WatanabeT；SasagawaN，etal：Overexpressionofmyo・
tonicdystrophyproteinkinase（DMPK）inC2C12myo・
geniccultureinvoIvedintheexpressionofferritinheavy
ChainmRNA・MUSCLENERVEsuppl．7：S189，1998
2）渡辺知司，笹川昇ほか：筋緊張性ジストロフィーの細胞生物学・神経研究の進歩41：471・477，1997
3）笹川昇，渡辺知司ほか：筋緊張性ジストロフィー（培姜細胞系を用いた発症機構解明への試み）．細胞工学
16：1446・1452，1997
4）MillerLL，MillerSC，etal：Iron−independentinductionof
fbrritinHchainbytumornecrosis免ctor．ProcNatlAcad
SciUSA88：4946−4950，1991
5）WtiV∴Miller SC，et al：hterleukinlinduces免rritin
heavychaininhumanmusclecells・BiochemBiophysRes
Commun169：289・296，1990

DM DM normal
muscle parotis muscle

6）BoucherCA，NillesenW；etal：Anovelhomeodomein−
encodinggeneisassociatedwithalargeCpGislandinter−

図4 唾液腺腫瘍におけるNo鵬mblo鵬ngの結果
唾液腺腫瘍においては同患者骨格筋に比し発現量が増加しているが，対照骨格筋に比べると減少している．

ruPtedbythemyotonicdystrophyunstable（CTG）nrepeat．
HumMoIGenet4：1919−1925，1995
7）OttenAD，ThpscottSJ，etal：TtipletrepeatexpanSionin
myotonicdystrophyalterstheaqjacentchromatinstruC−

少する傾向が認められた．和一L遺伝子はDMPK遺伝子とture．ProcNatlAcadSciUSA92：5465−5469，1995

同じく第19染色体長腕13．3に存在する．しかし，DMPK

8）HarrisS，MoncriefrC，etal．Myotonicdystrophy：Willthe

遺伝子との距離は約1000kb離れておりDMAHP遺伝子がrealgenepleasestepforward！HumMoIGenet4：1417・

DMPK遺伝子にほとんど隣接しているのとは異なる．し1423，1996

たがって，DMPK遺伝子のCTGrepeatが直接FN−L遺伝子の発現に影響を及ぼしている可能性は低いと考えられる．

9）HenikotrS：DoS喝e・dependentmodi鮎ationofposition−e飴ctvanegationinDrosophilialBioEssays18：401−409，

また，DM患者における骨格筋の分化の障害や変性にと1996

もなう二次的な発現量の減少である可能性も否定できな

10）WallrathLLandElginSC：Positione飽ctvariegationin

いと思われる．一方，患者腫瘍組織では同患者の骨格筋

DrosophiliaisassociatedwithanalteredchroTnatinstruC．

に比し発現量が増加していたが対照骨格筋よりは減少し

ture．GenesDev9：1263−1277，1995ていた・一般に腫瘍組織ではm−L遺伝子の発現量は増加

11）ThomtonCAandl的merJP：Expansionofthemyotonic

することが報告されている12）．具臓器での比較であり慎重な解釈が必要だが，DM患者においては何らかの形でdystrophyCTGrepeatreducesexpressionofthenanking

m・L遺伝子の発現が抑制されていることが示唆される．

DMAHPgene．NatGenet16：407・9，1997
12）BomfordABandMunroHN：Ferritingeneexpressionin
hcalthandmalignanCy・Pathobiology60：10−8，1992

ー168−筋緊張性ジストロフィーの骨格筋および培養皮膚線維芽細胞における糖鎖異常
祖父江

留田

久本

●

好評

飼林

犬小

■

美郡太
■
●

明亦慶

藤

目

野

高梁伊

研究協力者

元■

的

筋緊張性ジストロフィー（MyD）においてmyotonin pro−tosylatedcomplexの量を，ODSシリカカラムを用いHPLC
にて測定した．

teinkinase（MT−PK）の3．端非翻訳領域に存在するCTGrepeat

CTGexpansionの測定：筋組織よりDNAを抽出し，EcoRI，の延長が最終的にどのような生化学的変化をもたらし，

BglⅠで処理し，P5Bl．4probeを用いた用いSouthemblot法で確認した．

MyDの発症へと結びつくかは不明である・Repeatの延長がcisやけansに転写や蛋白質への翻訳が障害されるという報告がある一方，MT・PKのRNACUGrepeatに特異的に結培養皮膚線維芽細胞はMyD8例，対照4例・FITC−SWGA，
FITC＿RCん1で染色を行うとともに，一部は固定後β・変化にともなう複製，転写障害が推定されている．私達

galactosidase，endo・β・galasctosidaseにて処理し染色性の変化を検討した．また，SWGAの細胞内結合部位を焦点はこれまでに，MyD患者の免疫グロブリンG（TgG）の糖蛋

レーザー顕微鏡で観察した．

合するnuclearproteinの存在が報告され，Chromatin構造の白における非還元末端のN・aCetylglucosamin（GIcNAc）にβ結

1・4結合するgalactoSeで終わる糖鎖の相対的低下（hypoga−lactosylation），およびGIcNAcの非還元末端に露出する糖鎖の相対的増加，という糖鎖異常が見られることを指摘

果

筋細胞膜／基底膜のsWGA染色性はMyDで31．4±10．7／256

したり．また，同様の糖鎖の変化はMyD患者の筋組織や

訂aySCale，NCで14．7±3．0／256訂aySCdeとMyDで有意に増加していた（p＜0．001）．MyDの筋病理変化を筋線維径

赤血球膜においても存在することを報告した．これらのの大小，中心核線経の割合，問質の線維化の程度を指標

hypogalactosylationをきたす原因の一つとしてβ1−として軽度，中等度，重度の3群に分類し，病理変化の程

4galactosyltransftrase（GalT）活性の低下が推定される・従度とsWGA染色性を検討した．sWGA染色性は病理変化ってMyD患者の筋組織におけるhypogalactosylationの程度，の強い例で増加していた（図1）．筋胞膜／基底膜のsWGA染

GalT活性，MT−PKのCTGrepeat数との関係を検討した．
また骨格筋におけるlectin染色性の差異を，核について詳

色性と筋MT−PKのCTGrepeat数との関係は，筋CTGrepeat

細に検討するとともに，糖鎖異常が遺伝子異常の結果と筋組織のsWGA染色で筋核はMyD群でより強く染色され，しての生化学的変化か否か明かにする目的で，培養皮膚MyD群では26．8±5．0／256訂aySCale，NC群で18・77±8・3／256

線維芽細胞のlectin染色性を検討した．

訂aySCaleとMyD群で有意に増加していた（図3）・MyD群において筋核のsWGA結合性と筋MT・PKのCTG repeat数との長い例で筋sWGA染色性は強い傾向が見られた（図2）．

対象・方法の関係を検討すると，repeat数の長い例でsWGA染色性はレクチン組織化学：成人発症型MyD28例，正常対照岬C）6
例の四肢筋より採取した生検筋の凍結切片を，固定後ビ増強していた（図4）．GIcNAcにgalactoseが結合した糖鎖を認識するRCん1では筋組織では細胞膜や結合識がMyD，

オチン化succinylatedwheatgermagglutinin（SWGA）と反応
させ，ABC法を用い，diaminobenzidineにて発色させ，光NC群とも同様に強く染色されたが，両群とも筋核は染色顕で観察した．光顕画像上の筋細胞膜／基底膜と筋核の輝筋組織におけるGalT活性は反応物であるpyridylaminat・されず，染色性の差は見られなかった．

度をNIHimageで測定した．

edgalactosylatedcomplexの丑を測定することにより得た・

TotalGalT活性：MyDlO例，NC6例の凍結生検筋を可

MyDで3．28±1．15pg／50mg protein，NCでは2・67±0・62pg／

溶化し，UDP−galactose，pyridylaminatedagalactosylcomplex

50mgproteinとMyDとNCとの間に差は見られなかった・
またGalT活性と筋組織のsWGA染色性，筋MT−PKのCTGと37℃で反応させた．反応物であるpyridylaminatedgalac

repeat数との間に有意な相関を認めなかった・＊名古屋大学医学部神経内科
榊福井医科大学内科学第二講座−169−

培養皮膚線維芽細胞のsWGA染色性はMyD群，対照群
とも非常に淡く染色されたが，その染色性は骨格筋とは異なり，細胞膜の染色性は目立たず，核および核周辺の細胞質により強く染まる傾向があった．培養皮膚線維芽細胞のRCA−1染色はMyD群では対照群より染色性が低下していた・β−galactosidaseあるいはendo−β・galascosidase
処理後にsWGA染色を行うと，共に未処理のsWGA染色に比べ染色性は増加したが，endo−β一galactosidase処理後（血相（Unit）

r pく仇鮎1
0
0

iエ

80

0RHYenロU

7−

O

T▲H

●‡●

加

Normd

T−士

0 0凸ロU︵HHU

側

叫雇白鵬8S七日きShe倉岩虐貞

p＜0．01

M剥dInteト

me亜ate（n＝6）（n＝11）（n＝12）（n三5）NC

PathologicdChange

葦鵠

（∩三6）

園1筋細胞膜におけるSWGA染色性
左はNC，右3群はMyD．MyD群ではNC群よりsWGA
染色性は強く，MyD群のなかでは筋病理変化の強い群でより強く染色された．

図3

筋核のsWGA染色MyD群では有意にsWGA染色性が増加していた禦W（unit）

ハリ
5

3

側

0

30

3

■
−
︺

却

2

uu鵬亡鵬虐∽du旨∽−〇台叫芸虐∈H

50

如月u噴き∽七日夢Ⅵhe倉芸uld−

40

0

1000

2000

4000

5000

NumberofMuscleCTGRepeat

NumberofMuscleCTGRepeat
図2

3000

（repeat）（柁peal）

筋細胞膜のsWGA染色性と筋CTGrepeat
Repeat数が多い例で染色性が強い傾向が見られた，

図4 筋核のsWGA染色性と筋CTGrepeat数
Repeat数が多い例で染色性が強い傾向が見られた．

≒−：二喜二図5 共焦点レーザー顕微鏡による培養皮膚腺維芽細胞のsWGA染色A MyDでは核内および核周辺の細胞質が強く染色された．
B NCでは核内，細胞質とも淡く蒲漫性に染色された．
−170−

の染色性はβ一galactosidaSe処理後の染色性より低下していた．この染色性の変化からswGAが認識している糖鎖はポリラクトサミンと推定される．sWGAの細胞内結合部位を焦点レーザー顕微鏡で観察すると，対照群では核結論

MyDでは筋細胞膜のsWGA染色性はNCと比べ有意な増強を認め，かつその染色性は病理変化の程度と正相関し，筋MT・PKのCTG repeat数が増大しているものはsWGA染

内が滴慢性に淡く染色されるのに対し，MyD群では強く凝色性は強い傾向が見られた．MyDの筋核，培養皮膚線推集して染色され，細胞内小器官がより強く染色された（図5）．

芽細胞の核においてsWGA染色性はが増加しており，MyD
では核においても一部の糖蛋白質の糖鎖構造に変化が生考察じている可能性が示唆された．

MyD患者の筋組織（筋胞膜／基底膜と筋核）ではsWGAによる染色性の増加，線維芽細胞ではRCA−1による染色性の低下がみられたことはともに糖鎖の非還元末端に結合するガラクトースの転移障害を示唆している．MyD患者
では骨格筋細胞膜，筋核，および培養皮膚線維芽細胞において糖鎖異常が認められたことより我々が観察した糖鎖異常は，遺伝子異常の結果生じる現象である可能性が考えられる．糖蛋白質の糖鎖部分はさまざまな働きをし筋組織のtotalGalT活性はMyDとNCとの間で有意な差は見られず，かつ筋MT・PKのCTG repeat数との関係は明らかではなかったが，今後GalTの基質の問題，GalTのiso町meに関し検討する必要があると思われた．
MyD培養皮膚線維芽細胞においてsWGA染色性の著明な増加が認められたことより，我々の観察してきた糖鎖異常が環境因子によるものではなく，遺伝子異常の結果
直接的に生じた生化学的変化であることが推定された．

ており，細胞表面のreceptor機能や，蛋白質を特定のsub−cellularcompartmentへ輸送するtaTgettingsignalとして働くことも知られているが，核においてはRNA polymerase
transcriptionfactorの活性や，maCrOmOleculeのnucleartranS−portにも関与していると報告されている礼3）．MyDにおける多臓器障害は糖鎖の多様な機能の障害である可能性が考えられる．
筋組織においてhypogalactosylationが認められたにもかかわらずMyD患者において筋totalGalT活性の低下は認められなかった原因として，ゴルジ体におけるGalTの基質

参考文献
1）ItoK，TakaltaShiN，HirayamaM，etal：Abnormalitiesin
theoligosaccharidemoietiesofimmunoglobulinGinpa−
tientswithmyotonicdystrophy．ClinBiochemNutri14：
60・69，1993．
2）JacksonSPandTjianR：0−glycationofeukaryotictran−
SCription factors：implicationsfor mechanisms oftran−
SCriptionalregulation．Cel155：125−133，1988．

3）YonedaY，Imamoto−SonobeN，YamaizumiM，et al：であるUDP−galactoseのavailal）ilityの問題や，GalTの各
isozymeの比率の問題があると考えられた．しかし，MyDの筋組織においてhypogalactosylationは存在し，その程度
は筋病理変化と相関し，筋MT−PKのCTG repeat数との関連も推定されることから，MT−PKが何らかの機序で糖代謝を調整している可能性が推定される．

ー171−

Reversibleinhibitionofproteinimportintothenucleusby
Wheatgerm agglutininidectedintoculturedce11S．Exp
CellRes173：586・595，1987．

アフリカツメガエル卵に導入したCTGおよび
CAGリピート含有ルシフェラーゼ遺伝子の発現

研究協力者

塩

川

光一郎暮

今

井

直

志●

深

町

博

史事

古

谷

博

和■■

吉

良

潤

一■■

要 旨 本研究では，リピート構造を3■−UTRに持つ遺伝子の発現が阻害される仕組みの解析を目指し，まず実験系を確立することを試みた．135回の繰り返し構造を持つCTGリピートおよび比較のため準備したCAGリピー
トを，3●・UTR内に持つルシフェラーゼ遺伝子をツメガェル卵母細胞の核に注入し4・9時間後に調べた．何れの場
合にも，これらのリピートを含む遺伝子では，対照遺伝子に比べ，ルシフェラーゼ活性の発現が阻害された．ところが，アフリカツメガェル受精卵にこれらのDNAを注入し，卵割期から胞胚期（約6時間後）にかけて調べたところ，対照に比べてほとんど差がなかった．卵母細胞は，用いた実験条件では分裂することがなく，従って，核膜は実験期間中消失することはない．しかし，受精卵は活発に卵割を行うため，その核膜は約30分ごとに消失す
る．この違いを考慮すると，得られた結果は，リピート構造を持つ遺伝子では，転写よりも，mRNAの核から細胞質へのトランスポートが強く阻害されている可能性が高いと思われる．そこで今後は，この方向で，リピート構造を持つ遺伝子の発現阻害の機構を検討する必要があると思われる．
はじめに
筋緊張性ジストロフィー（MyD）は，いわゆる常染色体の異常に基づく優性型の筋疾患で，CTGヌクレオチドの増加によることが知られている．MyD患者においては，
ミオトニン・カイネース（MK）遺伝子の3■−非翻訳領域（3■−UTR）に50から2000個のタンデムに増殖したCTGリピートが含まれ，これが疾患の原因であると目されている．
この遺伝子は染色体19q13．2−13．3に位置し，ゲノム遺伝
子構造については，既に明らかにされている（Mahadevm
ら，1993；HamShereandBrook，1996）．しかし，この遺伝子の異常（リピートの増幅）がどのようにして筋ジストロ
フィーを生じるかについては明らかになっていない．他
方で，MyD以外でも，いわゆるリピート病については多くの研究がなされており，例えば，CGGリピート病であるFragileX−症の患者ではmRNAの5■非翻訳領域に含まれるメチル化されたCpGが増加していることがつき止められ，これが病因であると考えられている（恥頑，1997）．また，ハンチントン病，その他ではCGGリピート部位から翻訳されて生じるポリグルタミン酸がニューロンやグリ
ア細胞の細胞死を引き起こすことが明らかにされている（恥頑，1997）．我々は筋ジストロフィーの病態解明・治療法開発の一助となることを期待して，MK遺伝子mRNAの3，−UTRに存在するCTGリピートの転写調節に注目し，この研究の基礎的実験系の開発という観点から，アフリカ
ツメガェル卵母細胞および受精卵を用いて研究を行った．
■東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻分子発生学研究室＊＊九州大学医学部脳神経病研究施設神経内科−172−

ツメガェル卵は巨大な細胞である（直径1．2mm）ため，マイクロインジェクションなどの操作が容易に行える．また，卵母細胞の場合，核と細胞質を手術によって容易に分離することができるという利点もある．そこでまず，上記の各遺伝子およびそれがつくるmmAあるいはタンパク質が受精卵の発生，および胚の筋組織構築に及ぼす作用を調べる実験系の開発の基礎研究として，各種のプラス
ミド，CAT遺伝子，あるいはカエルから単離した各種遺伝子を環状または直鎖状にして，受精卵，未受精卵，および卵母細胞に注入し，その挙動を検討した．次にMK遺伝子の3．・UTRに含まれるCTGリピートを持つルシフェ
ラーゼ遺伝子を作製し，卵母細胞および受精卵に注入し，分子細胞生物学的検討を行ない，以下の結果を得た．
材料と方法
リピート構造を持つ遺伝子として，MyD患者のゲノムDNAからPCRにより分離した135回のCTGリピートを3．・
UTRにもつルシフェラーゼ遺伝子を作製した（図1）．これをツメガェル卵母細胞の核に注入して，ルシフェラーゼの酵素活性の発現を調べた．対照として135回のCAGリ
ピートを持つルシフェラーゼ遺伝子を作製し，CTGリピートの結果と比較した．卵母細胞は，ツメガェルの雌の卵巣を掃出し，これをハサミで小さな塊に切り分けた後，B訂thの培養液中でコラゲナーゼ処理して得た．マイクロインジェクションは，B打払の培養液中の卵母細胞の核（卵核胞）に，環状の上記プラスミドをマイクロインジェクシ
ョンすることにより行った．注入した遺伝子の発現は，

04︵訳︶世相⁝甲ImHトムミ

P01y笹）

0
2

リンカーありCTGリピートなし

リンカーありCTGリピートあり

図3 卵母細胞への注入実験（2）

0

4

×

日誌召盲誓あ。
0

×

4

2

×

0

6 0
4 0

2

2 0

︵沢︶鯉無料−mHhふミ

4

塑贈甲−mHトムミ

3◆㌫召盲竺てなし

4

6

hour

図4 初期胚への注入実験

0

リンカーなしリピートなしリンカーありCAGリピートあり（2）CTGあるいはCAGリピートを含むルシフェラーゼ遺伝子

リンカーありCTGリピートあり

図2 卵母細胞への注入実験（1）ルシフェラーゼ活性を測定して調べた．ツメガェルの雌に生殖腺刺激ホルモンを注入して排卵させ，未受精卵をの卵母細胞および受精卵への注入実験の成績
卵母細胞の核に135個のリピート構造を持つ上記2種類のルシフェラーゼ遺伝子を注入し，9時間後のルシフェラー
ゼ活性を調べたところ，対照に比べ，CTGリピートを持プラスミドを環状DNAとして注入した（Shiokawaら，1997）．

つ遺伝子を注入した場合では，対照の約20％，CAGリピートを含む遺伝子注入の場合には，約50％のルシフェラ

結果（1）卵母細胞，未受精卵および受精卵への外来性CAT DNA

ーゼ活性が見られた（図2）．これらの結果は，3■・mにCTG
リピートを含む遺伝子の場合，その発現が阻害されることを示している．次に卵母細胞を用いて，CTGを含む遺採取して人工授精を行った卵を準備した．これらに各種注入実験の成績
1〜30ngの種々のCAr遺伝子を含むプラスミドDNAあ
るいは含まないプラスミドDNAを卵母細胞の核および未受精卵および受精卵の細胞質に注入し，その発現を調べるため，時間あるいは発生の時期を迫って，CATアッセイを行ったところ，注入された外来性DNAは複製され，実際にmRNAに転写されること，この系で遺伝子プロモーターの機能解析が可能なことが明らかとなった．また，受精卵と未受精卵の細胞質に多量の外来性DNAを注入す
ると，核様構造が形成されることも明らかにした．更に，受精卵に注入したmmA（アクチビンレセプター，β−ガ
ラクトシダーゼ，およびS−アデノシルメチオニンの各
mRNA）は安定に保たれ，タンパク質に翻訳され，胚体内で機能することが確認された．

伝子の構造と発現の関係を更に詳細に検討するために，リンカーを含むルシフェラーゼ遺伝子を対照として，上記の結果を検討した．リピート構造導入の際にyUTRにリンカーを導入するので，これを含むルシフェラーゼ遺伝子を対照として調べたわけである．リンカーを含むルシフェラーゼ遺伝子を注入すると，それを含まない遺伝子に比べて，ルシフェラーゼ活性が低くなる（図省略）が，CTGが含まれているとこれが更に低下することが判明した（図3に注入後3時間の結果をリンカーありリピートなしの場合を対照として示す）．そこで，この結果を踏まえ，リンカーを含む遺伝子を対照として，ツメガエル卵母細胞と受精卵の両方について，CTGリピートの作用を検討した．その結果，卵割を全く行わない卵母細胞では，これまでと同様にCTGリピートによって遺伝子発現が阻零されることが確認できた（図省略）が，平均25分に1回の割合で活発に分裂を行う受精卵では，CTGリピートによるー173−

阻害はほとんど見られないという興味ある結果が得られ験によって得られた結果は，予備的なものではあるが，この（3）の，CTGリピートを含むmRNAは核から細胞質へ輸送されないという仮説を支持するものと思われる．即ち，核が速やかに消失し続ける初期発生でリピートによた（図4）．
考察

本実験では，我々はまず，ツメガェル卵母細胞，未受
精卵，および受精卵へ外来性のDNAを注入した際のDNAの挙動，転写活性，およびその際のプロモーター活性なる遺伝子の発現阻害がほとんど見られないのは，核膜が消失する度に核から直接にmRNAが細胞質の翻訳の場に移されるためであり，核膜の消失が起こらない卵母細胞

どについて検討した．その結果を踏まえ，MyDの原因と目されるMK遺伝子の3．−UTRに含まれるCTGリピートのでは，この移動が阻害されているのではないかと考えられるのである．今後，この考えに沿って実験を進めていく予定である．

持つ作用，および比較検討のためにCAGリピートの持つ作用，について検討を行った．そして卵母細胞ではリピートの存在がレポーター遺伝子の発現を阻害するが，卵割中の胚ではほとんど阻害しないという結果を得た．
MyDの場合，CTGリピートの作用機序について，3つの仮説が提唱されている．即ち，（1）CTGリピートによって，それを含む遺伝子の転写，またはそのmRNAからのタン

引用文献l）MahaderanM．S，etal：Hum．Mol．Genet．2：299−304，
1993．

2）HamshereM．G．andBrookJ．R：TtendsGenet．12：332−
334，1996．

パク質の発現（翻訳）が阻害されるという説，（2）CTGリピートを持つ遺伝子が近隣の遺伝子の発現を阻害するとい

3）TbttiiS：Int．Med．36：3・8，1997．

う説（HarriSら，1996）および，（3）CTGリピートを持つmRNAは核内から細胞質へ輸送されないという説（Hamsheres，1997）がある．今回のツメガェル卵を用いた実

5）ShiokawaK，etal：Meth．Mol．Biol．62：247・270，1997．

4）HarrisC，etal：Hum．Mol．Genet．5：1417−1423，1996．
6）HamshereM．G，etal：Proc．Natl．Acad．Sci．USA94：

ー174一

7393−7399，1997．

トコンドリア異常症

ミトコンドリアDNA多型からみた日本人
およびアジア諸集団の遺伝的関係
宝

来

聴■

緒
言
現在の日本列島に住むわれわれ日本人は，いつ何処からやってきたのか．われわれ日本人はどのようにして形ともに縄文人の直系の子孫であると考えられているが，共有する塩基配列のタイプが一つも観察されないということは注目に値する．二集団間で共通したタイプが存在成されたのであろうか．日本人の起源をめぐる研究とその論争には長い歴史があり，いくつかの仮説が提唱された．本研究では，現在論争となっている縄文人の「東南アジア起源」あるいは「北東アジア起源」の仮説を検証するということは，それら二集団が遺伝的により近い関係があるか，二集団間での移住が比較的最近あったことを示すものであろう．アイヌと沖縄の人々は，本土日本
人に比べて，韓国人と共有するタイプの種類は少ない．
本土日本人と韓国人で共通するタイプが数多く兄い出さするため，東南アジアおよび北東アジアの集団に着目し，ミトコンドリアDNAの塩基配列の決定と分析により，日本人およびアジア諸集団の遺伝的関係を検討した．
対象・方法
本研究では、タイの3集団（コンケン、チェンマイ、少数民族サカイ）、マレーシアおよびインドネシア集団を含む東南アジアの5人集団について，ミトコンドリアDNAのDループ領域の塩基配列を分析した．159人の東南アジ
ア人について563bpの塩基配列を比較したところ，119の異なる配列のタイプが見られた．これらのうち98タイプ
は，それぞれの集団に特有のものであり，残りの21タイプは集団間に共通して見られた．系統樹分析によって，れることは，朝鮮半島からの日本列島に人々の移住があった考えるのが自然であろう。
結果

それではアジアの人々は、他の地域の人々とはどのような関係にあるのだろうか。アフリカ人、ヨーロッパ人
そしてアメリカ先住民などとの関係である。これらの塩
基配列のデータはすでに分析ずみだったので，直ちにアジアの集団との比較が可能であった．これら以外に，新たに分析したハルビンの中国人（60人），アフリカ人，ヨーロッパ人，アメリカ先住民のデータを併せて解析した．
ミトコンドリアDNAの多型解析の利点は，個々の配列に基づいた分析のほかに集団としてまとめた分析もできる
ところにある．一つの集団から多数のヒトの塩基配列が東南アジア人鱒少なくとも6個の単系統クラスターに分類されるが，5集団からの系統は各クラスター中に完全に混じりあっていた．東アジアの5集団（本土日本人62人，ア
イヌ51人，沖縄の人々50人，韓国人64人，台湾中国人66人）の分析では，全体では207種類の異なる配列のタイプが観察された．このうち189種類のタイプはそれぞれの集調べられたとき，平均的な塩基配列の違いを知る指標として「塩基多様度」という値を計算することが出来る．
調べた個体間で総当たりの塩基置換数をカウントし，その平均値が「塩基多様度」となる．まずそれぞれの集団

団に固有のものである．つまりタイプの大部分は一つの集団でのみ観察され，他の集団では見られないということである．残りの18種類のタイプだけが集団間で共通し内での塩基多様度をみてみた．東アジアの五集団間での塩基多様度は，中国人1．65％，韓国人1．22％，本土日本人
1．32％，沖縄の人々は1．01％，アイヌ1．26％であった．こて見られるもので，これらのタイプのうち2集団間に共通して観察されるタイプを検討した．本土日本人と韓国人には，8種類のタイプが共通して見られることは注目された．これらのタイプを持った個体数は，14人の本土日本

れら五集団では中国人の値が最も高く，中国人は遺伝的には多様な人々はの集まりということになり，値の最も低い沖縄の人々は比較的近縁な人々の集まりということになる．アフリカ人は2．98％，ヨーロッパ人は0．95％，ア

人（集団の23％に当たる）と17人の韓国人（集団の27％に当メリカ先住民は1．29％であり，どの集団よりも大きな値を示すアフリカ人が遺伝的にもっとも多様性の高い集団であることが明らかとなった．

たる）である．本土日本人はアイヌとも四種類のタイプを共通してもつが，その他の集団間の比較では共有するタ
イプの三種類以下である．また10人のアイヌは4人の韓国人と共通のタイプを三種類持っているが，これらの3タイプのうちの一種類は8人のアイヌとたった1人の韓国人が共有しているので，必ずしもアイヌと韓国人が近縁な関係があることを示すのではない．アイヌと沖縄の人々は，＊総合研究大学院大学先導科学研究科

考察

さて集団間での近縁度をみる尺度して塩基多様度のネット値（DA）というものを利用することができる・アフリ
カ人は，他のどの集団と比較しても大きなDAをもっていた．これとは対照的に東アジアの五集団は，それぞれのー177一

プには，本土日本人，韓国人，ハルビンの中国人，琉球人とアイヌが含まれた．北グループでは東アジア人五集団が単一系統のクラスターを形成して枝分かれしている．

AJrJc■nAme血dEur叩β卯CJl〟185e・TiJ〝an

このクラスターでは，アイヌが最初に分岐し，続いてハ
ルビンの中国人が枝分かれしてきたことが読み取れる．
続いて沖縄の人々が枝分かれし，最後に韓国人と本土日mgJ・Cわ血〃g〟aJ〟l血〃βきぬ〃m■J・肋〇月細さ〝
月〟1〟

本人が緊密なグループとして分岐してくる．しかし近隣

Ch加e古さ・〃副止血I〝○√印n結合法による系統樹（図1b）では，アイヌは南グループと北グループの中間に現れるという微妙な系統的位置を示した．本研究の結果は，日本人の起源に関する仮説のうち，混血説を支持するものである．

J叩8ne古さ
句WAy山〃
0．05

0Amerind文献1）HomiS，Kondo R，SonodaSandT毎imaK：The茄rst
AmeriCanS：Di蝕rent waves ofmigration to the New
Wbrld

infヒrred舟om mitochondrial

DNA sequence

POlymOrphisms．In：PrehistoricdispersalofMongoloids．T
Akazawa＆E．Szathmary（eds．），OxfordUniversityPress，
pp．270−283，1996．

2）HomiS，OdaniS，NakamwaNandOtsukaR：Theorigin
and dispersal

Europeanof modem humanS aS Viewed

丘om

mitochondrialDNA．In：EthnoepidemiOlogyonCanCer．

図1現代人12集団の系統樹（わ平均距離法，匝）近隣按合法

T坤maK＆SonodaS（eds．），GannMonographonCancer
ResearchNo・44，JapanScientはcSocietiesPress，pp．97−
105，1996．

集団間のDAが非常に小さいことがわかった．特に韓国人と本土日本人の二集団間のDAはゼロであった．やはりこの分析でも韓国人と本土日本人は遺伝的に究めてかつ近

3）HoraiS，Murqyama K，Hayasaka K，MatsubayashiS，

縁な関係にあることが明らかとなったのである．塩基多様度のネット値（DA）に基づき集団の系統樹を作成した．
系統樹では，アフリカ人が他の人類集団に先駆けて分岐

AsianPOPulations，withspecialreftrencetothepeopling

し，続いてヨーロッパ人が分かれ，さらにアメリカ先住民が分岐している．最後に東アジアと東南アジアの各集団は単系統クラスターを形成するが，アジア人集団はさらに南と北のグループに分割される傾向が読み取れた．

HattoriY；FucharoenG，HariharaS，ParkK−S，OmotoK
andPanⅠ−H：MitochondrialDNApolymOrPhisminEast

OfJ叩an．Am．J．Hum．Genet．59：579・590，1996．

4）宝来 聴：DNA人類進化学、岩波科学ライブラリー（52），120貢、岩波書店：1997．
5）HomiSandOmotoK：PeoplingofJapaninfとrredfrom

平均距離法による系統樹（図1a）では，南グループには台湾中国人，インドネシア人とタイ人が含まれ，北グルーー178−

mitochondrialDNApolymOrphismsinEastAsians．In：
The onglnand past ofmodem humanS−Tbwards a
reconciliatiom Omoto K＆TbbiasRV（eds．），pP54・73，
WorldScienti爪C，1998．

ミトコンドリア脳筋症とミトコンドリア遺伝子型
田

雅

嗣＊

▲T

量T

誠功哉
▲†

■

▲†

▲†

●
●

征

▲T

●

田橋中

米佐埜

目

来

●
■
■
●

宝

■
●

宮 林 重 明…■後 藤雄Jian−ShengGong JinZhang●
八 木 国 夫■ 衣 斐

達
．
﹂

研究協力者

中

聴■＊■■■■

頻度が高かった（P司．006，Oddsratio＝1．69，Fisher法）・

的

宝来らはミトコンドリア遺伝子変異を伴う患者のミトTg993G変異を伴ったLeigh脳症の患者13例のうち全例

コンドリアDNA（mtDNA）のDループ領域の塩基配列を決定し，その系統樹から個々の症例がそれぞれ別の分岐に属し，多くの家系において独立に新規の変異（ゐ〃0VOがMt5178C型であり（Mt5178A：C＝0：13，MtypeA：B：

mut飢ion）が生じていることを報告した．ミトコンドリア
脳筋症に関連する遺伝子変異の発生にどのような遺伝的

p三．005）あるいは対照群での頻度（Mt5178A：C＝277：356，

背景が関与しているかを明らかにするために，ミトコン
ドリア遺伝子の翻訳領域の塩基置換に基づいて遺伝子型を分類し，患者における遺伝子型の頻度を調べた．

C＝0：3：10），T8993G変異以外を伴ったミトコンドリ
ア脳筋症患者117例の患者での頻度（Mt5178A：C＝41；76，
p＝0．0006）と比較して統計学的に有意にM178Cの頻度が高かった．
考察

DNA鎖における8・OXO・Aの生成およびDNA合成の前駆方法・対象体であるdGTPから8・OXO・dGTPの生成にヒドロキシラジカ

mtDNAの2つの領域（塩基番号5131−5369，および10345・
10518）をPCR法により増幅し，制限酵素A血Ⅰを用いて消化し，それらの断片長（PCR・RFLP）に基づいてMtype A

ルが関与している．T→GあるいはA一→C transversionは，
8−OXO−Aとグアニンの対合（A：T→8・OXO−A：T→ 8・
oxo−A：G→C：G）あるいは，アデニンと8−OXO−dGTPとの対合（A：T→A：8・OXO・G→C：G）によって生じうる．

（Mt5178A＋MtlO398G），MtypeB（Mt5178C＋MtlO398G），

Mtype C（Mt5178C＋MtlO398A）の3型に大別した．ミトコ
ンドリア脳筋症患者群：既知のミトコンドリア遺伝子変ミトコンドリア脳筋症患者群において対照群と比較してMt5178C型の頻度が高かったことは，mtDNA変異の発生
頻度にミトコンドリア遺伝子型が影響を与えていること異を有する患者130例（A3243G60例，Singledeletion39例，T8993G13例，T9176C5例，A8344Gll例，G8363A3例）．
対照群：愛知県の男性献血者252名および岐阜県の健康診を示している．特にT8993G変異に基づくLe帥脳症の患者におけるMt5178C型の頻度が，他のmiDNA変異の患者

断受診者381名（女性197名，男性184名），計633名．

群あるいは対照群での頻度と比較して高かったことは，この部位におけるT→Gtransversionの発生頻度がMt5178C

結

果型の遺伝的背景によって上昇することを示唆している．

ミトコンドリア脳筋症患者群における遺伝子型の頻度はMt5178A：C＝41：89であり，対照群における頻度
Mt5178A：C＝277：356と比較して，有意にMt5178C型の

文
発表準備中

■財団法人岐阜県国際バイオ研究所＊＊福井医科大学医学部第二内科＊＊＊愛知医科大学第四内科
筆書＊＊東北大学大学院医学系研究科小児病態分野
榊榊＊国立精神・神経センター神経研究所＊陣綿＊総合研究大学院大学先導科学研究科
ー179−

献

こはく酸脱水素酵素欠損症の臨床病理学的，分子遺伝学的検討
後藤雄

研究協力者 村 山 久美子■
依 藤 史 郎…

北

大

緒

澤

一＊

二

瓶

潔■■

平

訳

浩

子＊■

次…■

下

平

雅

之…■＊

由記子…■■

方言

生検骨格筋をSDH染色，CytOChromecoxidase（CCO）染色を含む各種染色を施し，光学顕微鏡で観察した．また，
凍結検体から遠心分離法で，ミトコンドリア分画を採取し，電子伝達系酵素活性を生化学的に測定した．

からなり，SDH活性に直接的に関与するFlavoprotein（Fp）
サブユニットおよびIron−Sulfurprotein（Ip）サブユニットと，これらを膜に結合させておくヘムを含む2つのサブユニット（CybL，CybS）から成っている（図1）．現在までに4家系6例が単独SDH欠損症として報告されておりl）→），最近Fp内の点変異を有する症例がはじめて報告された5）．

（2）生検骨格筋からMAを分離し，4つのサブユニットのCDNAをRT・PCR法で増幅したあと，塩基配列をABI377
Autosequencerで決定した．得られた配列を既知の配列と比較した．

われわれは，組織化学および生化学検査でSDH活性低下を認めた4家系5症例について，その臨床像と骨格筋生検所見を基に，その臨床的，生化学的多様性について考察した．さらに，これらの患者に関して，骨格筋から得たRNAを用いて，複合体Ⅱを構成するFp，Ip，CybL，CybS
遺伝子について，遺伝子異常の有無を検討した．
者

法（1）生検筋の病理学的，生化学的検査

こはく酸脱水素酵素（SuCCinatedehydrogenase：SDH）は，
電子伝達系酵素複合体の一つである複合体Ⅲ（COmplexⅢ）の主要な活性成分である．複合体Ⅱは4つのサブユニット

患

健

結
果
（1）生検筋の病理学的，生化学的検査結果
4家系5症例の生検筋所見を表2にまとめる．病理学的には，同胞例でありながら症例1ではm毘ed・red鮎er（M）
が30％であったのに対して，症例2は0．1％以下であった．
また，高CK血症を示した症例4も約30％の筋線経がMであった．sDH染色では，検査したいずれの症例も活性

骨格筋のSDH活性の低下を示した4家系5名（男4名，女1名）の年齢，発症症状，主症状を表1にまとめた．

が低下していたが，興味深いことに，症例2，3，4では，骨格筋問質内に存在する小血管には，活性が残っていた．

症例1と症例2は兄弟例である．共に乳児期に喘鳴・喋下障害で発症し，精神運動発達遅延，筋力低下を主症状とする．症例3は，生後7ケ月時に意識障害，多呼吸，眼坂で発症し，9ケ月時に心不全で死亡した．症例4は，37
歳発症の女性で，症状は筋力低下のみで，中枢神経症状はない．症例5は，股関節脱臼を既往歴にもつ2歳男児例

一方，症例5は，血管にも活性を認めなかった（図2）．
また，CCO活性では，症例1，2，3では，明らかに低下していた．症例4では，全般性の低下を認めたが，MでCCO
活性の残存するものも存在していた．症例5には，CCO
活性の低下は認めなかった（図2）．
生化学的には，SDH活性を含む複合体Ⅱ＋Ⅲ活性の低下が，全例で認められた．さらに，組織化学検査で認めたCCO活性の低下は，生化学的にも確認できた．

であり，現在筋力低下はあるものの，中枢神経症状はない．
検査所見としては，血清CK値，血中乳酸値，脳CT所見をまとめた（表1）．CKが明らかに高かったのは，症例4のみであり，乳酸値は症例3で高度上昇，症例4で軽度上昇していた．明らかなCT所見を示したのは症例3のみで，脳室周囲の低吸収域が認められた．

＊国立精神・神経センター神経研究所■＊東京大学大学院医学系研究科生物医科学教室＊＊＊大阪大学医学部保健学科＊＊＊＊国立小児病院神経科■＊＊＊＊東京医科歯科大学医学部小児科（2）複合体Ⅱを構成する4つの遺伝子の検査
各症例の骨格筋からRNAを分離し，複合体Ⅱの4つのサブユニット遺伝子のcDNA配列を決定したところ，症例5のFp遺伝子に変異を発見した（表3）．その遺伝子変異
は，Compound heterozygousな点変異であり，1つは塩基番号1181のC→T変異，もう1つは塩基番号1793のGdeletionであった．1181変異は386番のThrがIleへ変化し，1793変
異は590番のglyがdaに変化したあとoutor倉ameになり，54個下流でstopcodonが生じる．

ー180−表1SDH欠損症5例の臨床所見

ComplexIl

Pat■entNo

1

2

3

A9e／Sex ZySm・M Sm・M

4

9m，M

5

37y−F

2y7m．M

onset 誤設定ia 崇琵Sne55二三；誌ss慧監ss
Chief MentalRetardation cardiacfaiFure Dfs70Cation
manifestations Muscleweakness（Deadat9M）

ヲerumCK→一十Lactate・一ヰofhipjoint

→

寸

††→〜／

†十

†

＋

BTainCT WNL WNL，et霊慧霊ea wNL
Membraneanchoringsubunits
CybL（169aa）＆CybS（160aa）

表2

SDH欠損症5例の生検筋所見

症例1

図1複合体Ⅱの全体図
こはく酸脱水素酵素（SDH）は，電子伝達系複合体・活性の部分反応であるとともにTCA回路の一反応でもある．SDH活性は4つのサブユニットのうちの，和訓OprOtein（Fp）に存在している・他の3つのサブユニット（iron−Su仙rprotein，2つのmembraneanchoring
proteins）は，直接SDH活性には関係ないとされているが，電子がコエンザイムq（CoQ）に伝わるためには必
須である．

年齢／性

症例2

症例3

症例4

症例5

ZySm，M Sm，M

9m，M

37y．F

2y7m，M

3（）％

く01％

30％

＜01％

RRF

く01％

芸SDH活性榔血軌きたぁる血計霊ぁる血管．！とある血凱！とない
CCO活性Id帆se
筋目Hl惰性＋d●帆seId帆se

乗施行

芝目・相性

7％

学cco活性10％

表3

165％

＼

→

10％

280％

134％

8％

23％

46％

38％

64％

20％

14％

52％

SDH欠損症5例のcDNA配列異常

Subunit Size（bp）症例l症例2症例3症例4症例5

B l潜詳

Fp

1995

Ip

843

CybL

507

CybS

480

−

表4

−

13y F Keams−Sayresynd・感甘図2 症例5の筋病理所見
HE染色（A），SDH染色（B），CCO染色（C），年齢相当の正常コントロールのSDH染色（D）．症例5では，正常に比して，SDH活性が極端に低下している．しかし，CCO活性は色素顆粒が比較的よく保たれ，正常に近い活性を示している．

M＋

Musclepathology
SDHstain RRF
mOSaic21y F Myoglo輔uria ldiffuse
19m

ー

単独SDH欠損症

Age Sex C伽ica＝）iagnoSiS感
こ志㌻㌣−D ∴示、け∴ここ−

Leighencepha■opathy＋＋＋−

Rivneretal．

L・nderhormetal・

N・D・N・D・Bourgeojseta．・……；巨 霊蒜：…票霊慧霊簑J的se− Tay■0retal・
2y M Myopathy ldiffuse

考−

Ourcase察

これらcDNA上での変異がゲノムDNA上に存在するか

筋SDH活性が低下する原因は4つに大別され，①sDH活

どうかを確認するために，変異部位を含む領域をゲノム性を担うFpサブユニットとそれを含む複合体Ⅱの異常，②他の酵素複合体との共通のコンポーネントの異常，③ミトコンドリアへの酵素蛋白の移送障害，④2次的に障害DNAを鋳型としてpolymeraSeChainreaction（PCR）を行い，塩基配列を調べた．その結果，確かに変異を有するDNA断片を確認できたが，1793変異近辺のPCRでは，いくつものDNA断片が得られ，偽遺伝子の存在が強く疑われた．
また家族のDNAの検査で，1181変異は父から，1193変異
は母から伝わったものである証拠を得た．

をうける場合，が考えられる．今回の症例のうち，症例5は①の単独SDH欠損症にあたり，症例1から4までは②も
しくは④の可能性が高い．したがって，臨床症状に大きな違いがあることに矛盾がない．

−181−

一方，症例5は，今回の症例の中で単独SDH欠損を示した．現在までに，単独SDH欠損症として報告されているのは，4家系6例である1）■）（表4）．発症年齢，中枢神経症状，Mの存在などの筋病理所見など，症例によって様々である．このなかで，Leigh脳症を示したBourgeoisらの報告した兄妹例でも，Fp遺伝子の異常が見つけられており，同じ遺伝子に異常を有しながらも，われわれの症例は明ら
かな中枢神経症状は認めていない5）．このような臨床症状の多様性は，同じ遺伝子異常をもつ場合にも認められる．
われわれが今回見出したFp遺伝子の異常は，Bourgeronらが報告したミスセンス変異（A唱554T叩）とは異なり，
nr386Ileというミスセンス変異と1756番のGが欠失する
ナンセンス変異とのコンパウンドへテロ接合体であった．
しかし，ナンセンス変異とはいっても，変異部位（叫g589）
から54個下流のアミノ酸ではじめて終始コドンが出現する．そのため，全665アミノ酸のうち，588までは正常と同じペプチド，5g9から632までは異常な配列となり，ペプチドの長さとしては33アミノ酸しか短くない．

患者cDNA上で認めた変異をゲノムDNAで確認する実験で，少なくとも4つのFp遺伝子もしくはその偽遺伝子が存在することを発見した．それは，1756G近傍のPCR
で，4つのDNA断片が得られ，しかも塩基配列の結果，
イントロンを含めて極めて類似した構造をもつことを突き止めた．これらのうち，発現されているものはどれなのかなどの問題は，Fp遺伝子のゲノム構造の全体を把握することが必要であり，今後はその点を明らかにしてゆく予定である．
文

献1）RiYnerMH，etal：Neurology39：693・696，1989．
2）LinderholmH，etal：JIntemMed228：43−52，1990．
3）BourgeoisM，etal：BrainDev14：404・408，1992．
4）1もylorRWetal：AnnNeuro139：224・232，1996．
5）BourgeronTletal：NatGenetll：144・149，1995．

−182−

ミトコンドリアDNA欠失症のミトコンドリアDNA異常の解析，
Dual＿COlorFISH法による病態解析に関する研究
岡 田 伸太郎●

研究協力者 乾
大

幸 治■
薗

恵

柳 原
倉 橋

一■■

浩

格■■
樹■

柳

原

恵

子綿

要 旨 ミトコンドリアDNAの欠矢を伴うPearson・Marrow syndrome（PS），Kearns・Sayre syndrome（KSS）・Chronic
ProgressiveExternalOpthalmoplegia（CPEO）患者における病態を明らかにするため・欠失部位の同定を行い・また・
臨床症状と正常ミトコンドリアDNA（mtDNA）量との相関についての検討した．その結果今までに報告されていない領域の欠矢を同定したが，病態とは相関がなかった．しかし，正常ミトコンドリアDNAの絶対丑が病態に相関することが判明した．さらに，異常と正常mtDNAの経時的変化，組織でのヘテロプラスミーの状態，病態との関連を検討するため，Dual−COlorFISH法を用いて正常，異常mtDNAの分布をPS患者，KSS，CPEO患者において解析した．その結果，末梢血では，乳児期発症のPSでは，正常と異常mtDNAは細胞内でヘテロプラスミーの状態で，KSS，CPEOでは細胞間へテロプラスミーの状態であることが判明した．異常mtDNAの組織での存在様式が病態に大きく影響を与えると考えられた．
はじめに

FISH法は，PS患者2名，KSS，CPEO患者それぞれ1名

ミトコンドリアDNA異常症においては，mのNAの点突
然変異と臨床病型はある程度知られているが1），特にmtDNA欠矢を伴う疾患においては，欠失部位が同じでも臨床的に大いに異なることが知られているヱ）．また，乳児期にPSで発症し，PSが綬解後，KSSとなった症例が報告されている3）．このため，mtDNA欠失患者における異常
mtDNAの同定，正常mtDNAの定量，組織内でのヘテロプ
ラスミーの状態を検討することは，mtDNAの欠矢における病態を検討する上で重要である．このため，PS，KSS，の末梢血リンパ球をPIiA下で培養し，低張処理後酢酸メ
タノールで火炎固定した．PS息児1名においては，リンパ芽球化し，経時的にDud・COlorFISHを行った．また，CPEO患者の筋生検の凍結切片を用いDual・COlorFISH法にて検討した．FISHに用いたプローブは，欠失部位，非欠失部位をPCRにて増幅し（約3kb），ジゴケシギニンまたはビオチンラベルし，それぞれローダミン標識の抗ジゴケ
シギニン抗体とFITC標識のアピジンを用いDual・COlorFISHを行った．

CPEOにおける，異常mtDNAの同定，異常，正常mtDNAの定量，細胞内での分布をFISH法にて行ったので報告する．
対象および方法
患者末梢血DNAに対してミトコンドリア特異的プライマーを用いてlongdistmCePCRを行い，PCR産物の直接塩
基配列決定を行い，欠失領域の決定を行った．また欠失領域以外の部分にプローブを設計し，胎盤より細胞分画法により別々に抽出した核分画由来の核DNA及びミトコ
ンドリア分画由来のミトコンドリアDNA（mtDNA）を適当な割合で混合し（tota110mg）制限酵素PvuⅡにて消化後，サザンプロット解析にて標準曲線を作製し，ハイプリグ
イゼーション後コンピューターによってバンドの濃さを解析し，患者由来のミトコンドリアDNAの定量的サザンプロットを行った．
＊大阪大学医学部＊＊大阪府立母子保健総合医療センター

結果シークエンスの結果，3例のPS患者において，mtDNAに塩基番号（10158−10169）と（15405・15415）の間の約5．2kb，（10942−10951）と（15362−15371）の間の約4．4kb，（11034・
11036）と（14595−14597）の間の約3．6kbに欠矢を認めた・またサザンプロット上，異常ミトコンドリアDNAの末梢血における頻度はそれぞれ68％，65％，91％であった．定量的サザンプロットの結果，9カ月で死亡した5．2kbの欠矢を認めた症例では，正常ミトコンドリア畳は抽出DNA
lOmg当たり31％，現在ほぼ健康な4．4kbの欠矢を認めた症例では，正常ミトコンドリア量は抽出DNAlOmg当たり103％，著明な汎血球減少を認める3．6kbの欠矢を認めた症例では，正常ミトコンドリア量は抽出DNAlOmg当たり10％であった．以上の結果，正常ミトコンドリアDNAの絶対量が臨床的症状の重症度に負に相関していることが推測された．
Dual．colorFISH法では，正常ではFITCとローダミンの−183−

混ざった色であるオレンジの色を示し，欠失mtDNAでは

mtDNAに対するFISH法は最初VandeCorputらにより報F汀Cの緑色を示した．ps患者におけるリンパ球では，1

告された4）．FISH法は感度良く，比較的簡便であり，ミ細胞内で正常と異常mtDNAが混在すること（オレンジ，緑色）を兄いだした（細胞内へテロプラスミー）．一方，KSS，

スミーの状態で存在する疾患の病態解析に有力な手段でトコンドリア病のように正常，異常mtDNAがヘテロプラ

CPEO患者でのリンパ球では，異常mtDNA（緑色）を優位に持つ細胞と，正常mtDNA（オレンジ）を優位に持つ細胞が分布しており，細胞間へテロプラスミーのパターンを認あると考えられた．ps息児が血液所見が改善した後，KSSになった症例が報告されているが，今回のFISH法から，
異常mtDNAの分布が細胞内へテロプラスミーから細胞間めた・さらにPS患者の細胞内へテロプラスミーを認めた
リンパ球をリンパ芽球化を行った後に100日間培養を行うと，細胞内へテロプラスミーから細胞間へテロプラスミのヘテロプラスミーへと移行することが，KSSへの病態への移行になることが判明した．リンパ球のような分裂の盛んな臓器ではミトコンドリアDNAは細胞内へテロプ

ーのパターンに次第に変化することが確認された．また細胞内へテロプラスミーを認めたPS患者末梢血リンパ球の約1年に渡る経時的mtDNAのヘテロプラスミーパター

ラスミーの状態から細胞間へテロプラスミーへ分裂を通して移行し，最終分化段階にある筋肉では，筋細胞内で異常mtDNAが蓄積していき，細胞内へテロプラスミーがンの変化を検討すると，血液病変の所見を示す時には，正常，異常mtDNAが混在する細胞が多数を占めるのに対保たれているものと考えられた．

し，血液所見が軽快するに従い，正常mtDNAを持つ細胞と異常mtDNAを持つ細胞に2極化を示すようになり，加γ加に於いても細胞内へテロプラスミーから細胞間へテ
ロプラスミーへの移行を認めた．KSS生検筋でのDual＿
COlorFISH法による検討では，Gomoriトリクロム染色でMを示す部位に異常mtDNAの集積が認められた．また謝

辞：検体をお送り下さった奈良県立大小児科朴永末先生，堺市立病院小児科田中順子先生，東大阪市立中央病院小児科赤澤英樹先生，大阪厚生年金病院神経内科
深田慶先生に深謝致します．
文

Mを示さない部位でも異常mtDNAの存在があり，この方法は感度が良いと思われた．

献1）SchefherJMandWal1aceDA：Oxidativephosphorylation
diSeaSeS．In The metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease．Scriver CR et al．eds McGraw．Hill

考察

NewYork．pp1535・1609，1995．

Pearson・M餌TOWSyndrome（PS）3例に報告のない新たな遺伝子欠矢を認めた．欠失部位は，いわゆるcomm。ndeleti。n部位よりはやや塩基番号で後ろよりの部分に集中していた・これまでの報告から欠失部位と欠矢の大きさは，臨床症状とあまり相関しないとされている．さらに血液における欠矢の割合は必ずしも臨床症状を反映しないとされてきた・しかしながらPearSOn症候群において主要羅息臓器である造血系を検討すると，定量的サザンプロット
法にて，欠失mtDNAの割合は臨床的重症度とは相関せず正常なmtDNA畳と相関することが示された．このことは2）MorasCT，DimauroS，ZevianiA，etal：Mitochondrial
DNAdeletionsinprogressiveextemalophthalmoplegia
andKeams・Sayresyndrome・NEnglJMed320：1293・
1299，1989．

3）McShaneMA，HammanSM，SweeneyIJ，etal：Pearson
Syndromeandmitochondrialencephalopathyinapatient

withadeletionofmtDNA・AmJHumGenet48：39・42，
1991．

4）VandeCoputMPC，VandenOuwelandJMW，DirksRW，

ミトコンドリア病の病態を考える上でも重要な所見と考える．

etal：DetectionofmitochondrialDNAdeletionsinhuman
Skin nbroblastswithPearson．s syndromebytwo−COlor
fluorescenceinsituhybridazation・JHistochemCytochem
45：55・61，1997．

−184−

MELAS患者の卵巣のmtDNA分析
福 原 信 義■

研究協力者

中 島
巻 淵

隆

孝■ 石 田 千夫＊＊ 丹 野 芳

はじめに
ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様

穂■
範輌

遠

藤

稔■

傾眠状態で，左肩にミオクローヌスが連続して出現し，内容のおかしい暴言を吐くようになる．左上肢に拘柘が発作症候群（MELAS）はmtDNAの点変異を原因として，母系遺伝を呈する疾患である．患者のmtDNAはwi1dtypeと強まった．脳MRI検査では，右側頭葉，頭頂葉に浮腫がmutanttyPeとのheteroplasmyを呈しており，heteroplasmyの程度が患者の臨床症状の発現に関係しているものと考えられるが，その詳細は明らかではない．その手がかりを得るためにMELAS患者の卵細胞のmtDNAを分析し，右側頭葉の血流が著明に増加していた．1月後には暴言はなくなった．左上肢の筋力はかなり良いが，運動失調，または運動失行，感覚障害のために左手は動かさない．

そのheteroplasmyについて検討した．
症
患者は死亡時41歳女性

あり，新鮮な脳梗塞と考えられた．脳SPECT検査では，ミオクローヌスは次第に目立たなくなった．4月後に，全失語，相貌失認，運動失行が著明となり，脳Mm検査で左側頭葉，頭頂葉に新しい病巣が出現．右上肢，顔面，
左上肢にミオクローヌスが頻発して死亡した．

例剖検では，大脳の左頭頂葉，左側頭葉，両側後頭葉に新旧，様々な程度の層状皮質壊死が認められたが，特に家族歴：姉，母方伯父，母方いとこが類似疾患で死亡．
一人娘は無症状である．

脳回の頂部に強かった．小脳顆粒細胞の減少が見られ，

現病歴：1979年（22歳時）に糖尿病を指摘され，25歳よりインシュリン療法を開始．32歳時より難聴が始まる．33
歳時，Jackson型痙攣発作があり，痙攣重積状態となる．
34歳時の所見では，四肢は蒲漫性に筋萎縮し，軽度の運動失調があった．血液乳酸20．6mg／dl，ピルビン酸0．93m釘dl，
Ln22．2，髄液乳酸30．2mg／dl，ピルビン酸1．65mg／dl，L／P18．3
筋生検：ragged・red伽ers（＋），白血球DNA分析によりmtDNA
3243のG→A変異があり，MELASと診断した．頭部CTで，
右後頭葉（鳥距皮質）に低吸収域が見られた．脳SPECT検査では，左頭頂部，右頭頂・後頭部右側頭部，右小脳の血流低下があり，その後，右下1／4盲，小脳性運動失調の増強が生じ，痴呆（Iq57）が生じた．36歳時の全身痙攣後，両側視力が光覚弁となり，失調性構音障害，全身の筋萎縮が著明となり，左不全片麻痺が新たに出現した．脳波：

骨格筋の萎縮，変成が顕著であった．心筋ではびまん性の繊維化が見られた．膵臓では，びまん性の繊維化とランゲルハンス島の萎縮がみられ，MELASの典型例と診断された．
卵細胞のmtDNAの分析
1）予備実験
方法：卵細胞の一つからミトコンドリアDNAをPCR可能
か，卵細胞からmtDNAを分離するときのPCR条件はどうか知るために，豚卵巣を用いて検討した．妊娠歴のない
生後6月の雌豚より卵巣を取り出し，実体顕微鏡下で周囲組織を取り除き1個ずつ卵細胞を取り出し，マイクロチューブに入れ一g0℃で凍結保存した．凍結卵細胞に1／15mol

右優位のsharp＆slowcomplex（＋），脳SPECT：右後頭葉の血流が増加．1週間後に視力が右視野で手動弁となり，麻痺は回復した．約2月後には，左視野は以前の状態に戻る
も，右視野は回復せず．低血糖が頻発した．時に拍動性の頭痛が後頭部にあり，相貌失認が生じた．脳MRI検査
では，両側後頭葉内側部に萎縮が見られ，外側部の皮質はm一高信号であった．その後，相貌失認は軽快していた
が，難聴は次第に増強していた．41歳時に＃聴が増強，頭痛，ふらつき，全身痙攣のために入院．意識は錯乱，のPBS20Jllを入れて100℃10分加熱した後，チューブ内ですりつぶし，さらに5分間100℃にて加熱処理した．遠心後上滑を希釈LPCR用サンプルとした．
PCR用primerとしては豚のmtDNAのD・loop regionを
GENEBANK，ABO15920kinawa native pigとABO15093
ⅦkatanminiaturepigのDNA配列より最低限，Primer部分がhomologousでサイズが同じ部分のものから選び出し，
prlmer・F：3l−TGAAACCAGCAACCCGCTTGGCAG・5

pnmer−R：3l−TNGCGCGTGTACGCACGmTGTCCC−
3．をPCGENE／PCRPLANで作成した．targetDNAのサイズ＊国立療養所犀潟病院神経内科＊＊国立療養所犀潟病院神経病理榊＊新潟大学神経内科

は383bpであった・−185−

lymp110Cyle（cllild）
lymP110Cyle（pali￠nl）
liver

00C舛ell
OOCyle1000Cy189
00Cylc800Cylc700CylC600Cylc5006叫e400Gyle300Cyle200CytCl

0

10

20

30

40

50

60

70

mutant mtDNA％（補正後）
図100Cyteのheteroplasmyの割合

結果：アガロースゲル電気泳動で目標となるバンドが増いる．母のmtDNAにおける変異が卵細胞に伝えられると幅され，そのゲル中のDNAを蛍光シークエンサーでDNAき，randomに生じるのか，それともnonrandomに生じる配列を確認したところYukatanminiaturepigと同様であり，
豚卵巣ではその単一の卵細胞から十分に判断可能なミトコンドリアDNAのPCRが可能であった．

のかは不明である．すでに生まれている娘のリンパ球における変異率に比べ，11個の卵細胞での変異率がいずれも低く，この変異が卵細胞にrmdomに伝えられるだけの

2）脛uS患者の卵細胞の分析

ものかどうかは問題がある．これまでMELAS患者の卵細方法：剖検開始後直ちに卵巣より11個の卵細胞をとりだ胞でmtDNAの変異を検討した報告は見られないが，し，・80℃にて凍結保存した．上記の予備実験のPCR条件と同じ条件でPCR用サンプルを作成した．

MaTChingtonら3）はKeams−Sayre症候群患者で我々と同じ様に個々の卵細胞のmtDNA分析を行い，変異mtDNAの比率

MELASのnp・3243A→Gの変異の検出は，Gotoら（1990）l）の方法により以下のpdmerを用いた．

が0〜50％近くまで様々であったという．
結prlmer−F：5■−AGGACAAGAGAAAmAGGCC．3．

Prlmer−R：5

輪

MELAS患者の卵細胞のmtDNAを解析した．

−TAGAAGAGCGArGGTGAGAG．3．

lF】d−UTPを混和LPCR後，制限酵素ApaIで消化をおこな
い・アガロース電気泳動と同時にPRISM310（Perkinelmer社）蛍光DNA自動解析装置フラグメント解析でピークを面積を計算して変異の割合を出した．

1）卵細胞の1個ずつから十分に判断可能なmtNDAをPCRすることは可能であった．
2）MELAS患者の卵細胞11個のmtDNA3243における変異の比率は，患者のリンパ球におけるよりも低かった．

検量曲線（図1）は，T加noら（1995）2）の方法により丹野よりPCR資料を待て行った．

文

献

結果‥卵細胞のmtDNA3243変異の比率は，図2の如くで，

1）GotoY；NonakaIandHoraiS：AmutationinthetRNA．

分析した11個の卵細胞はいずれも患者の末梢リンパ球とLeu（UUR）geneaLSSOCiatedwiththeMELASsusbgroupof
mitohcondrialencephalomyopallties・Nature348：651−653，
1990．

肝臓における変異率よりも低かった．一方，未発症の娘のリンパ球における変異の比率はそれらに比べて，66％と高率であった．

2）取IlnO Y；YonedaM，ThakaK，etal：Quantitation ofheteroplasmyofmitochondrialtRNALeu（UUR）geneus・

考察

ingPCR−SSCP・MuscleNerve18：1390−1397，1995．

恥rlnOら2）は，卵細胞の分析は行っていないが，MELAS

3）MarchingtonD・R，MacaulayViHartshorneG．M，etal：

患者2例における種々の組織でのheteroplasmyを検討し，EvidenceBomhuman00CyteSfbrageneticbottleneckin

何れの組織でも82・95％と一様に高率であったと報告してanmtDNAdisease．Am．J．Hum．Genet．63：769・775，1998．

−186−

家族性ビタミンBl欠乏，心筋症，ミトコンドリア
DNA3243A＿tO−G変異を示すミトコンドリア
オパチ一例の長期経過観察

研究協力者

中

川

正

納

光 弘■

法＊

佐

藤

能

啓＝

樋

口

逸

肘

要 旨 ビタミンBl（Bl）欠乏を家族性に認め，心筋症，ミトコンドリアDNA（mtDNA）3243A・tO・G変異（3243変異）を示し，17年間の経過中，何らの中枢神経異常を認めなかったミトコンドリアミオパチーの兄弟例を報告した・
Ragged・rednbers（RRFs）は10・40％と高率であったが，CytOChromecoxidase欠損線維・StrOnglySDH−reaCtiveblood，eSS。lsは認めなかった．血液mtDNAにおける3243変異の割合は，症例1：87％，症例2：89％，母親：57％であった．本家系のBl欠乏の原因は明らかに出来なかったが，両症例ともに慢性のBl欠乏状態にあり，成長に伴うBl
必要量の増加が脚気症状を引き起こし，それに伴ってmtDNA変異によるミトコンドリア機能障害が顕在化した可能性が考えられた．
はじめに難出現．握力30kg，脈拍110／分，Bl：98mg／ml，CK81IU（正ミトコンドリアDNA（mtDNA）3243A−tO・G変異は，その常0〜85），胸部XP上心陰影は拡大なし・32歳時より，ユビデカレノン投与．動悸改善，心拍数は108／分から90／分

臨床病型として，MELAS，Chronic progressive extemal

今回，ビタミンBl（以下Bl）欠乏を家族性に認め，脚気心にて発症したmtDNA3243A−tO−G変異（3243変異）を示すミ
トコンドリアミオパチーの兄弟例2）を17年間に渡って経過へ低下したが，筋力は変化なし．CK182mU（正常0〜85）．
33歳時より，近位筋筋力低下が進行．36歳再評価のため
久留米大学医療センター入院．
36歳時再入院時の所見：身長16＄cm，体重41kg．近位筋
優位の筋力低下・萎縮，Bl：1090（正常20〜50n釘ml），乳観察し，その経過中，何ら中枢神経症状を認めなかったので，その臨床経過，筋病理所見，mtDNAの検討結果について報告する．

酸39mg／dl，ビルビン酸0．89mg／dl，CK134（正常62−287），
CKMB19％，心拍数104／分．Bl投与中止にて，動悸，易疲労感性，脱力が悪化．髄液中乳酸17．3mg／dl，ビルビン

OPhthalmoplegia，Diabetes mellitus，Renalfailure，Cardi0−
myopathy，Sensorineuralhearinglossなどが知られている1）．

症

例

症例1：36歳，男性．主訴：呼吸困難，四肢筋力低下．家族歴：両親は又従兄弟結婚．両親は神経学的に異常なし．
末弟は小児期に原因不明の心疾患で急死している．現病
歴：小学生の頃より易疲労性あり．15歳頃より下腿浮腫
出現．19歳時，久留米大学第三内科初診．下腿浮腫，腹部膨満，呼吸困井出現し入院．脳神経系に異常なし．四肢近位筋優位の筋力低下・萎縮を認めた．Creatineki・nase（CK）73．2IU（正常40以下），血中Bl値34（正常50・70
ng／ml）と低値．心拡大（CTR63％），心抽出量増加，TranSke−
tolase活性（TKA）低下，サイアミン投与にて急速に症状が改善したことより，脚気心と診断された．心内膜心筋生検施行．高乳酸・ビルビン酸血症を認や，筋生検施行．
退院後，日常生活に問題なし．この間Bl製剤を時々服用，中止すると筋脱力増悪，動悸が生じていた．30歳頃より，
四肢近位部・体幹・顔面の筋萎縮が目立ち，階段昇降困酸1．03mg／dl．HbAl：正常．頭部CT，MRI：異常なし・末梢神経伝導検査：正常範囲．全経過を通して，精神症状，
知的障害，脳卒中様発作，外眼筋麻痺，難聴，四肢感覚障害，耐糖能異常はみられていない．アルコール多飲歴なし．
症例2：34歳，男性．症例1の弟．15歳頃より時々下腿浮腫出現．脈庄増加（14g／40mmHg）を指摘されている．18歳
時，知能は正常で自覚症状はないが，四肢近位筋の軽度の萎縮を認め，四肢深部反射は減弱．胸部XP，心電図，
血液ガス分析に異常なし．血中CK値は正常，血中クレアチン0．62mg／dlと軽度上昇．血中乳酸19．3mg／dl，ビルビン酸1．24mg／dlと軽度上昇．上下肢近位部と肩甲帯に軽度筋萎縮をみるが日常生活には支障なし．事務員として勤務．症例1と同様に，全経過を通して，精神症状，知的障
害，脳卒中様発作，外眼筋麻痺，難聴，四肢感覚障害，
耐糖能異常はみられていない．アルコール多飲歴なし．

＊鹿児島大学医学部第三内科■■久留米大学医学部付属医療センター神経内科−187−

表1本家系のBl欠乏，乳酸・ピルビン酸代謝および筋障害に関する血液検査成績〔1981年9月におけるデータ，文献1より引用〕

父親

母親

Thiamine（ng／mi〕 28．1
TKA（g／ml．RBC瓜r．）248

39．1
363

286

TPPef鈷ct（％）

14．5

50．9

102．6

14．5

0、15

PyruVate（mg／dl）

0．64

0．77

2．43

1．24

0．3〜0．9

Lactate（mg／dl）

8．8

9．1

32．8

19．3

5．4

5．7

1．3〜4．9
7．35〜7．45

Alamine（mg／dl）

症例1

症例2

Normalvalue

40．6

21．5

50〜70

439

500〜1000

4〜16PH（arterialblood）

，7．39

7．40

7．38

7．37

CPK（IU）

17．2

15．8

15．7

23．4

40以下

Creatine（mg／dl）

0．58

0．52

0・98

0・62

0．17〜0．50（M）

52．2

67．5

0．35〜0．93（F）

Carnitine（nmol／ml）

48一一63

TKA：Transketolaseactivityinerythrocytes，TPPeffect：Thiaminepyrophosphateeffbctoftransketolaseinerythrocytes

表2 症例1の36歳時の生検筋におけるミトコンドリア電子伝達系酵素活性

症例1

NADHcytochromecreductase

Control（n＝20）（mean±S．D．andrange）

8．51

7．80士1．94

3．04

2．07士0．62 1．30．2．92

Cytochromecoxidase（complexIV）

5．61

7．55±2．47 4．50−11．70

Citratesynthase

28．86

9．03±1．64 6．69t12．50

5．41＿12．01（complexI＋ⅠⅠⅠ）

Succinatecytochromecreductase（complexIⅠ＋ⅠⅠⅠ）

EnzymeaCtivitiesareexpressedas LLmol／min／goftissue

ビタミン81代謝に関する検討
症例1の初回入院時における本家系の，Bl欠乏，乳酸・ピルビン酸代謝および筋障害に関する血液検査では，両親，弟の血中Bl値，TXAは低く，さらに母親はTPP効果がreactivebloodvessels，CytOChromecoxidase欠損線経を認めていない．症例2はは歳時に，Msを5〜12％に認めた．
症例1の20歳時の心筋生検所見では，グリコーゲンの蓄積と異常ミトコンドリアの集積を認めた．

高く，全例Bl欠乏と診断された（表1）2）．ビタミンB175mg／日
1週間内服投与にて，2症例ともに，乳酸，ピルビン酸，
CKの改善を認めた．症例1の初回入院時おける骨格筋のMtDNA分析およびミトコンドリア

PymVate dehydrogenase complex（PDHC），

PymVatedecarboxylase（PDC），α・ketoglutarate dehydr0−genaSe COm−plex（KGDHC），α・ketoglutaratedecarboxylase（KGDC），リン

パ球のα−1，4・glucosidase活性の測定では，症例1ではPDHC
活性が正常下限，症例2ではPDHCとPDC活性が低下して
いた2）．
筋生検所見

電子伝達系複合体活性2症例および両親の末梢血よりDNAを抽出し，mtDNA分析を行った．3243変異を症例1，2およびその母親に認めた．変異mtDNAの全mtDNAに対する割合は，症例1の血液で87％，筋肉で96％，症例2の血液で89％，母親の血液で57％であった（図）．36歳時に行った症例1の生検筋を用いたミトコンドリア電子伝達系複合体活性の測定では，複合体Ⅰ＋Ⅲ，Ⅱ＋Ⅲ，Ⅳともに正常範囲であったが，Citrate
SynthaSe活性が正常の3倍に上昇していた（表2）．

症例1は，20歳時R喝ged−redm）erSを3〜12％の筋線経に，36歳時には40％に認めている．なお，StrOnglySDH−
−188−

血液
＋

−

89

症例1

生検筋
−

＋

親液
父血

bP︑

M

慧霊
＋

親液
母血

症例2

血液

一

十

96

￣

87

十

一

57

十

一

0

47〟】

MutanlrntDNA（％）

O

′O

0

O

0

．↓

0
▲

へJ

U

つ︼
O

∧U

1

O
O

国

PCR−RFLPによるmtDNA3243A・tO・G変異の検出

考察
本家系例はmtDNA3243A−tO・G変異を伴うミトコンドリ
アミオパチーであるが，−その特徴は家族性にBl低下がみられること，3243変異を有しながら17年間の経過期間中，中枢神経症状を全く示していないことである．3243変異

ま

と

め

ビタミンBl欠乏を家族性に認め，脚気心にて発症した
mtDNA3243A−tO−G変異を示すミトコンドリアミオパチーの兄弟例を報告した．初診時より，17年間に渡って経過観察したが，全経過を通じて，心筋症の進行もなく，外は，主にMELASに見られるmtDNA変異であり，種々の中枢神経症状を伴うことが多い．しかし，本例のように中枢神経症状を長期間に渡って示さない例の報告もあり3），
MELASとの違いが何によっているのか，今後，分子病態

眼筋麻痺，難聴，四肢感覚障害，脳卒中様発作，精神症的検討が必要である．症例1の心筋症については，ビタミンBl投与により改善し，その後症状の進行をみていない

ることを指摘した．

ことより，脚気心の可能性が高い．また，その後，心機能の悪化も見ていない．しかし，心筋にミトコンドリア
異常が存在することは，心筋生検所見からみて疑いはな
いものと考える．症例1は，脚気心発症を契機として，ミコンドリアミオパチーの症状が顕在化したものと考えられる．両症例ともに慢性のBl欠乏状態にあり，成長に伴いBl必要量が増加し，TCAサイクルの機能低下，mtDNA
変異によるミトコンドリア機能障害の顕在化とつながって行った可能性が考えられる．本家系のBl欠乏の原因として，食事性，Bl吸収障害，Bl需要量増加などが考えられるが，遺伝的要因やミトコンドリア異常との直接の関連も否定できない．これまで高乳酸，高ピルピン酸血症を伴うミトコンドリアミオパチーで，高抽出性心不全を合併し，サイアミン投与が有効であった例がMaStagliaら4）
およびRowleSら5）によって報告されている．われわれも，
脚気にて発症し，肥大型心筋症をきたしたMERRF例を経験している（Ananの症例10）6）．発症時の症例の栄養状態や生活習慣などによるBl摂取不良が存在した可能性も考えられるが，ミトコンドリア異常症が基礎に存在する場合には脚気を発症しやすい可能性も否定できない．

状，知的障害，耐糖能異常は認められなかった．ミトコ
ンドリア3243変異の臨床病型のひとつとして，今後，筋症状のみを示す例や脚気との関連にも注目する必要があ

文献1）DiMauroSandBonillaE：Mitochondrialencephalomy−
Opathies．In：Rosenbeg RN，PruSiner SB，DiMauro S，
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rologiCaldisease，Secondedition．Butterwor也・Heinemann，BostonOxfordJohannesbuIgMelboumcNewDelhiSin−
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2）佐藤能啓，納 光弘，松石畳次郎，糸川嘉則，加地正郎：ビタミンBl欠乏を有する家系内にみられた高乳酸，高ピルビン酸血症を伴うミトコンドリアミオ
パチーの同胞例．臨床神経23：668−677，1983
3）DamianMS，HertelA，・etal：Follow−upincarriersofthe■MELAS●mutationwithOutstrokes．EurNeuro139：9・15，

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pathywithcardiomyopathy，lacticacidosisandresponse
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5）RowlesJMandWellerRO：Familialassociationofme・tabolicmyopathy，1acticacidosisandsideroblasticanemia．

AmJMed56：891，1974．
6）AnanR，Nakagawa M，etal：CardiacinvoIvementin
mitochondrialdiseases：aStudyon17patientswithdocu−
mentedmitochondrialDNAdefbcts．Circulation91：955−
961，1995．

一189−

ミトコンドリア血小板電子伝達系酵素活性との関連の検討
斎 藤 加代子■

ヂヂ

賀美
知由

藤本

伊坂

●

鋸軒

紀崇

井

目王

●

俊博子
●

木

和智真

緒

野山澤

中中大

研究協力者

論

結

果（図1．2）

mitochondria（mt）脳筋症において電子伝達系酵素の経時

PU「Ⅱ＋Ⅲはcytochromecを投与中から中枢神経症状の的評価は，患者におけるmt機能の変化を客観的に評価すた．私達はこれまで末梢血から血′J、板を分離し，さらに出現とともに次第に低下し，卒中様症状（頑固な頭痛）出現時およびDCA投与直後が最も低値となった．DCA投与
後は上昇が認められた．pIJ ⅣはPurⅡ＋Ⅲと同様にmitの分離を行い，一部microplatereaderを用いた測定法をCy【ochromecを投与中から中枢神経症状の出現とともに次用いた（第38回先天代謝異常学会（1995年）に発表した．こ第に低下し，卒中様症状（頑固な頭痛）出現時が最も低値となりDCA投与後は上昇が認められた．CSも卒中様症状る意味で重要セあるが，十分な検討が為されてこなかっの度，私達は比較的少量（5・10ml）の末梢血から分離した血小板（PIJ）で，microplatereaderでcomplexII＋Ⅲ（II＋Ⅲ），
Ⅳ（Ⅳ），Citratesynthetase（CS），蛋白を測定するシステムを開発した・この方法を応用し，MELAS（mitochondrialencephalo・
myopathywithlacticacidosisandstroke−likeepisodes）患児の（頑固な頭痛）出現時に低下傾向となりDCA投与後は上昇傾向が認められたがPu Ⅱ＋Ⅲ，Ⅳほどその傾向は明ら
かではなかった．pIJ Ⅱ＋ⅢとⅣの比較では，Ⅳがよりmt酵素の変化を経時的に測定した．その結果を臨床症状，

卒中様症状（頑固な頭痛）に相関しているようであった．
Pu Ⅱ＋Ⅲ，Ⅳは血小板蛋白単位の酵素活性であり治療と対応させて検討し，息児の卒中様症状とPu・mt機
能との相関を評価したので報告する．

mitochondria蛋白単位の酵素活性を反映しない可能性がある．これを補正するために，mitochondria量を反映すると対言われているCSでPIJⅡ＋ⅢとⅣを除して，PIJ Ⅱ＋Ⅲ／CSとⅣ／CSで検討した．pLrII＋Ⅲ／CSは卒中様症状出現に象

症例は7歳女児．3歳時より筋力低下を認め，歩行，立位保持が不可能になったため5歳時当科受診した．筋生検でraggedrednbers，Ⅳの低下を認め，血液mtDNAの検討でnp3243（A→G）の点変異を認めた．入院後cytochromecの点滴および経口投与を行い筋力は改善したが軽い頭痛，
視覚異常が出現し，6歳1カ月時に頑固な頭痛が出現した
ためジクロロ酢酸ナトリウム（DCA）を徳島大小児科方式に従って投与した．DCA投与後は頑固な頭痛は消失し軽い頭痛，視覚異常も軽減した．血中乳酸値はDCA投与前が50・100mg／mlと高値を呈していたが，DCA投与後は20．
50m釘mlと低下が認められた．

明らかに低下なく，Ⅳ／CSの検討ではⅣ／CSが卒中様症状出現に明らかに低下したことから卒中様症状出現時の電子伝達系酵素複合体Ⅳの特異的低下が示唆された．
叫8Ction

CytOChrome c

望砦撤拙悪」山肌

DCA

P．0．

m。S崇とW豊＝ユニ⊥＿＿＿l！hqadach・V．Si：ndisturbance
Sl川叩Wnht叩POn V■眈Wllho山■uP O即t

叫m0

5yT■叩

6yl■れ00y7mo Trl■叩

図1CytochromecandDCATreatmentinMELAS

方

DCA

法

息児末梢血5・10mlを血沈用citrateとともに採血し低速の遠心を繰り返してPIJの分離し液体窒素で保存した．

headachviSiopdisIurbanCe■

microplatereader（iEMSリーダーMF；大日本製薬株式会社）を用いてⅢ＋Ⅲ，Ⅳ，CS，蛋白を測定した．pIJ分離法，
Ⅱ＋Ⅲ，CS，蛋白の測定法はRHHa鮎ら（1995）の方法に準じ，Ⅳは新たにmicroplatereaderでの測定法に改良した．

5ylm0＊東京女子医科大学小児科

5y7■¶0図2

ー190−8yl■【06y7■nO

PIJmitochondrialactivitiesinMELAS

Tylmo

考

謝

察

辞

ミトコンドリアDNAを測定いただいた国立精神・神経

今回の結果から卒中様症状時のPIJ Ⅱ＋Ⅲ，Ⅳ，CS，
Ⅳ／CSの低下が示唆された．従来，中枢神経とPu 電子伝センター，埜中征哉先生，後藤雄一先生に感謝します．

達系酵素の異常ではParkinson病（Haas，1995），AIzheimer病，
特発性ジストニアがあるがMELASにおいてもPIJ電子伝

文

献

達系酵素の異常が中枢神経mitochondria機能を反映してい1）HaasRJl，NakanoK，etal：Lowplateletmitochondrial

る可能性がある．また，PIJ機能低下と卒中様症状とのCOmPlexIaJldcomlexⅡ／Ⅲacticityinearlyuntreated

関連の可能性も考慮する必要があると思われた．

Parkinson．sdisease．AnnNeuro137：714・722，1995．

結論

卒中様症状とPIJ Ⅱ＋Ⅲ，Ⅳ，Ⅳ／CSとの相関，DCAに
よるPIJ Ⅱ＋Ⅲ，Ⅳの改善が認められMELASにおけるPIJ
電子伝達系酵素測定の有用性が示唆された．

−191−

ミトコンドリアDNA欠失疾患の培養細胞における遺伝子の動的変化
桃 井 真里子■

研究協力者 斎 藤 茂 子■

要 旨 Pearson症候群患者とKearns−Sayre症候群患者からのリンパ球，継代培養したリンパ芽球，筋芽細胞，線維芽細胞の変異mtDNAの割合の変化を明らかにした．Pearson症候群患者のinvivoでのリンパ球の変異mtDNAは，
日齢313では82％，464では65％，662では47％と減少しており，臨床的な血液学的異常の改善と相関していた．
Pearson症候群のリンパ芽球細胞株では，継代培養により変異mtDNAが82％から急激に減少し，Passage4では消失した．Kearns−Sayre症候群のリンパ芽球細胞株では培養による変動はなかった．これらは1個の細胞内の変異
mtDNA量が異なることによると推定された．また，Kearns−Sayre症候群筋芽細胞での変異mtDNAは，68％から3passageで10％まで減少したが，細胞の継代を続け，発育速度が遅くなるにつれて，再び変異mtDNAが増加した．
埠維芽細胞は30％から15％前後まで減少し，継代を続けてもほぼ一定の値を示した．このような疾患または組織による変異遺伝子の割合の変化様式の違いは，変異遺伝子の複製速度と細胞の分裂増殖速度の違いによると推察
した．
はじめに

一定にし，分裂回数を計算した．症例2は，リンパ芽球とミトコンドリア異常症の一つであるPearson症候群は，乳児期に汎血球減少と膵外分泌不全，高乳酸血症を呈す

遺伝子解析：PCRdirectsequenceにより欠失部位を同定しる致死率の高い疾患であるが，生存例では貧血が自然綬解する．自然緩解するメカニズムの解明はミトコンドリ
ア異常症の治療に結びつく可能性があることから，我々は症状の改善と関連した変異mtDNAの動的変化について検討した．はじめに患者の血液学的異常の改善と変異
mtDNAの割合の変化をinvivoのリンパ球を用いて明らかにした．また，細胞分裂能を高くするためリンパ球をEB

皮膚線維芽細胞，筋芽細胞の培養を行った．
た．定量解析は，DNAをPvuIIで切断後Southem blot法を行い，Fldix Bioimaging analyzer（BAS2000）を用いて全mtDNAに対する変異mtDNAの割合を測定した．
結果（1）mtDNA欠失部位：症例1はmtDNA塩基番号10942−15361の4420bpの欠矢であり，欠失部位の両端には10bpの繰りウイルスにより形質転換させ，細胞増殖に伴う変異
mtDNAの推移をみた．疾患の違いによる変異mtDNAの推返し配列を認めた．症例2は8826・14818の5993bpの欠矢で移を比較するため，Keams−Sayre症候群（KSS）患者のリンパ球から同様の培養リンパ芽球の系を確立した．さらに，KSS患者の線維芽細胞，筋芽細胞を継代培養し，組織毎の相違を検討した．

（2）リンパ球（in vivo）の経時的変化（図1−a）：症例1のリあり，繰り返し配列は存在していなかった．
ンパ球の変異mtDNAは，日齢313では82％，′464では65％，662では47％と減少していた．
（3）リンパ芽球培養細胞の経時的変化（図1−b，2−a）：症例1のリンパ芽球細胞株での変異mtDNAは，継代培養により，

方法

82％から急激に減少し，Passage4では消失した．培養リン症例：症例1は8か月から発熱，汎血球減少症，肝機能障害を呈し，mtDNA欠矢からPearson症候群と診断された．
1歳2か月から貧血は改善したが，1歳9か月，感染に伴うアシドーシスの悪化のため死亡した．症例2は10歳男児．

パ芽球での分裂回数を計算すると，PaSSagelから4までの間は15．5回であった．症例2では，リンパ球の変異mtDNA

貧血の既往はなく，8歳から小脳失調が顕著となったKSS患者である．

での変異mtDNAは，68％から3passageで10％まで減少したが，細胞の継代を続け，発育速度が遅くなるにつれて，検体と培養：症例1は，生後313日と輸血が不要となった464
日，662日にリンパ球分離し，一部を形質転換させリンパ再び変異mtDNAが増加した．線維芽細胞は30％から15％

量は5％で，培養による変動はなかった．
（4）各培養細胞の経時的変化（図2−b，C）：症例2の筋芽細胞前後まで減少し，継代を続けてもほぼ一定の値を示した．

芽球細胞株を継代培養した．paSSageの際には，細胞数を＊自治医科大学小児科
ー192−

（a）

90
80
70
60

二二二曇‥∴ 50
40
30
20
10
0

313

464

662

5

円齢

10

passage number

図1症例1のリンパ球と培養リンパ芽球中の変異mtDNAの経時的変化
サザンプロット法によって得られた全mtDNA（正常mtDNAフラグメント十変異mtDNAフラグメント）に対する変異rntDNAフ
ラグメントの割合を計算し，経時的推移をグラフ化した．
（わリンパ球（invivo）
仲）培養リンパ芽球 ■：日齢313のリンパ球の培養，○：日齢662のリンパ球の培養

（a）

％
90
80
70
60

て芸≡三二、 50
40
30
20
10
0

巨∃E

0

5

10

0

5

passage number

図2

10passagenumber

0

5

10

15

passagenumber

症例2の各培養細胞における変異mtDNAの変化
継代培養した細胞から抽出したDNAのサザンプロット法を行い，検出された全mtDNAに対する変異mtDNAの割合の推移を示した．
（a）リンパ芽球 仲）筋芽細胞 （C）腺維芽細胞考案ると推察される．Pearson症候群のような血液学的異常がPearson症候群のinvivoでのリンパ球の変異mtDNAの推移は，本症の血液所見の改善と相関していた．
症例1と2の培養リンパ芽球の変異mtDNAの経時的変化の様式は異なっており，病態の違いにより変化の様式にも違いがみられた．欠失mtDNAは，複製速度が正常mtDNAよりも速いと考えられるが，変異遺伝子を多く有する細胞と正常遺伝子を多く有する細胞では分裂増殖能が異なるため，細胞集団あるいは組織の変異mtDNA量は，変異遺伝子の複製速度と細胞の分裂増殖速度により規定され前面に立つ疾患では，1個のリンパ球内の変異mtDNAの割合が非常に高く，機能的に劣ると考えられる．細胞増殖に伴って正常mtDNAが優位になることは，変異遺伝子を多く有する細胞のアポトーシスが起こり細胞が淘汰されているか，または増殖が停止し，正常細胞のみが速い
速度で分裂を繰り返していることが考えられる．アポト
ーシスとの関連性に関してはさらに検討する必要性があ
る．

ー193−

ミトコンドリア病とアポトーシス
田

研究協力者

緒

米

田

中

雅

誠…

嗣■

JinZha吋成瀬Harm−JanW．Borgeld…＋Jian−ShengGong＋

八

言

結

木

恵

治…

囲

三好

果

H33342を用いた観察では，酸素負荷2日以降に核の分ミトコンドリア病の病因・病態に関しては，病型特異的なミトコンドリア遺伝子（mtDNA）変異と，それに伴う呼吸鎖の機能的障害が明らかとなっている．しかし，呼業化・クロマチン濃縮等の明らかなアポトーシスを示す細胞が出現し，Syn￣細胞ではp＋細胞やpO細胞に比し強い変化が認められた．正常大気圧下においても，Syn￣細吸鎖異常がいかなる機構で細胞障害，しいては細胞死をもたらすかは明らかにされていない．ミトコンドリア病
患者の細胞は，呼吸鎖機能の障害によって好気的エネル
ギー供給が低下すると共に，電子伝達の障害によって活胞はp＋細胞に比し，perOXide産生の上昇が認められた・
逆に，β0細胞ではperoxide産生が著明に低下していた・△￠mは，Syn￣細胞，pO細胞共に〆細胞に比し低下していた．さらに，酸素負荷開始後6時間目に，S叩￣細胞で著性酸素種（ROS）の漏出が高まっていると考えられる・この考えに基づき，我々は，患者の変異型mtDNAを細胞質
融合によって導入したサイプリッドにおいて，高濃度酸

明なperoxide産生の増大（ROSburst）が認められたが，△4，mの低下はこれに比し軽微であった．NAC添加によって，素下の培養による酸素ストレスによって，細胞死が誘導されることを報告してきた．今回，この細胞死がアポトーシスの範疇に属することを明らかにすると共に，アポトーシスを引き起こすミトコンドリア内での早期変化を

S叶細胞における酸素負荷時のアポトーシスは約50％抑えられたが，ROSburst後にNACを添加しても，アポトー

検討した．

観察された．

方シスの抑制は観察されなかった．さらに，アポトーシスの出現に先行して，CaSpaSe・3の発現および活性の上昇が

考法

細胞株として，正常mtDNAを有する培養細胞（P＋細胞），察

酸素ストレスによってsyn￣細胞に強く誘導されるアポトーシスは，ミトコンドリア内での早期のROS burStが引

mtDNAを欠損した培養細胞（PO細胞），MELAS3243あるき金になっており，ROS burstの方がミトコンドリアの膜

いはMERRF8344変異を導入したサイプリッド（Syn￣細胞）を用い，95％酸素下で4日間培養し細胞死を誘導した．ア

電位の低下より，酸素ストレス誘導性アポトーシスにおポトーシスに伴う，核の分業化・クロマチン濃縮を蛍光いて重要と考えられた．また，アポトーシスの分子機構

色素H33342を用い解析した．正常大気圧および酸素ストの上で注目されているプロテアーゼであるca5paSe・3との関連も認められた．実際の患者細胞においても，慢性的レス下におけるperoxide産生を，蛍光色素dichloronuorescin
diacetate（H2DCF・DA）を用い，蛍光顕微鏡下あるいは共焦点レーザー顕微鏡下で形態学的および定量的解析を行っ酸素ストレスによって，ROSの増大が繰り返されることた．また，ミトコンドリアの膜電位（△￠m）を蛍光色素JC・1れる．

で，アポトーシスを含めた細胞死が生じていると考えらを用い同様に解析した．さらに，ROS産生を抑制するル
acetyl・J・CySteine（NAC）が，アポトーシスに及ぼす影響を解析した．また，アポトーシスとの関連が注目されてい文

献1）ZhangJ，YonedaM，NaruSeK，BorgeldH−JW，GongJS，ObataS，TanakaMandYagiK：Peroxideproductionand

るプロテアーゼであるcaSpaSe−3の発現および活性の変動も検討した．

apoptosisincultured cells carylng mtDNA mutation
CauSlngenCephalomyopathy．Biochem・Molec・BioLht・
46：71−79，1998．

＊財団法人岐阜県国際バイオ研究所＊＊福井医科大学第二内科＊■＊名古屋大学医学部第二生理学＊＊榊名古屋大学医学部第二生化学−194−

多重欠矢を示す家族性CPEOの2症例に認められた
末梢神経内の血管病変：電顕的観察
吉

野

英■

研究協力者 宗 像

紳■

佐

藤

猛◆

要 旨 ミトコンドリア遺伝子の多重欠矢を有し，常染色体優性遺伝形式を示すCPEOの2家系，2例の末梢神経を電子顕微鏡で観察した．2例とも末梢神経有髄線経の脱落，残存線経の軸索の変性が認められた．末梢神経内の小血管の平滑筋内および内皮細胞内にミトコンドリアの著明な集積を認めた．これらのミトコンドリアには顆
粒状封入体や空砲状変性を示すものがあり，電子密度の高い顆粒を多数含む壊死に陥った平滑筋細胞も多数存在していた・mtDNAの多重欠矢を示すCPEOに合併する末梢神経障害の成立機転として，小血管の平滑筋や内皮細胞のミトコンドリア異常による末梢神経の微小な循環障害も関与していることが示唆された．
はじめに進行性外眼筋麻痺症候群（CPEO）の中にミトコンドリア
DNA（mtDNA）の多重欠矢を示し，常染色体性優性遺伝形
式を示す症例が存在する．われわれはこの家系内の1例において感覚障害と運動障害とを混在する末梢神経障害をきたした1例を経験した．この症例の末梢神経を電子顕微鏡で観察し，血管内の平滑筋細胞にミトコンドリアの集積と形態異常とを認めた．他の家族性CPEOの1剖検例の末梢神経も電顕で観察し，内皮細胞内のミトコンドリアに形態異常を認めた．末梢神経病変の成因としてミトコ
ンドリア異常による神経節細胞，シュワン細胞などの代謝異常に加え，血管の変化も加わっていると考えたので
報告する．
症

例

【症例1】60歳，男性
家族歴では母親および妹2名がCPEO，1名の妹の生検筋のミトコンドリア遺伝子解析にて多重欠矢が認められている．本例は44歳頃より外眼筋障害が発症した．59歳時より下肢にgIobe＆stocking型の末梢神経障害が生じた．膝蓋腱およびアキレス反射は消失，末梢に強い感覚障害および運動障害が認められた．症状は徐々に進行し，手指の末端にもしびれ感が生じ，歩行障害を呈するようになった・末梢神経伝導速度は俳腹神経において反応は導出不能であった．境骨神経の伝導速度も低下していた．臨末梢神経伝導速度の低下を認めた．47歳心不全で死亡し剖検を行った．
結症例1，2とも筋生検ではragged・rednberが認められ，チトクロームC酸化酵素（CCO）の反応は陰性，抗CCO抗体を用いた免疫組織化学では酵素蛋白の低下を示す線経も存在していた．しかし，生検筋内にはMELASで記載されているようなSSVを示す血管は認められなかった．
骨格筋から抽出したmtDNA解析では多重欠矢を示した．
症例2の妹も全く同様の臨床症状と経過を示し，筋のmtDNA解析でも全く同じサイズの多重欠矢を示した．
症例1の排腹神経生検では光頭上，大径線椎を主体にした神経線経の高度の減少が見られた．電顕では末梢神経内の′J、血管の平滑筋内にミトコンドリアの著明な集積を認めた（写真1）．この増加したミトコンドリアには顆粒状封入体や空胞状変性を示すものがあり，さらに電子密度の高い顆粒を多数含む壊死に陥った平滑筋細胞も多数存在していた．末梢神経では有髄線経の脱落が著明，残存
線経では軸索の変性が認められた．
症例2では光顔では，脊髄後根部で有髄線経の脱落が認められた．俳腹神経の電顕では末梢神経の小血管の内皮細胞にてミトコンドリアの増加とその内部に顆粒状封入体を認めた（写真2）．

床検査では血中，髄液の乳酸，ピルビン酸値は正常，耐糖能も正常であった．
【症例2】47歳，男性（剖検例）
家族歴では妹2名に同病．3歳時より難聴，34歳より四肢筋萎縮，45歳入院時には外眼筋麻痔，全身の骨格筋の軽度萎縮，性腺機能低下，腎機能障害，易疲労性，軽度の＊国立精神・神経センター国府台病院神経内科

果

考

察

常染色体性優性遺伝を示す家族性CPEOではミトコン
ドリアDNAの多重欠矢が特徴である．家族例においてmtDNAの欠失サイズが同一であること，臓器毎に欠失ミ
トコンドリアのパターンが同一であることなどから，核由来のミトコンドリア遺伝子異常の関与も推定されているが，まだ実証されていない．われわれはミトコンドリ−195−写真1症例1の末梢神経内の小血管の電子顕微鏡写真．
平滑筋細胞内にミトコンドリアが集積している．（×8，450）

写真2 症例2の末梢神経内の小血管．
内皮細胞内のミトコンドリアの増加と額粒状封
入体か静められる．（×7，800）

アDNAの多重欠矢を示す2家系の2症例に末梢神経障害をン細胞のミトコンドリアの電子伝達系酵素の代謝障害が認め，電顕的に末梢神経内の小血管の平滑筋内にミトコ
ンドリアの増加と変性，あるいは内皮細胞内のミトコン
ドリアの増加を認めた．
MtDNAの多重欠矢を示すCPEOに合併する末梢神経障考えられる．さらに，電顕で観察されたように軽度ではあるが小血管の平滑筋や内皮細胞のミトコンドリア異常による末梢神経の微小な循環障害も関与していることを示唆した．

害の成立機転として，神経節細胞や軸索，さらにシュワ

ー196−

神経・筋疾患における長寿に関するミトコンドリア
遺伝子型に問する検討
佐研究協力者 衣 斐
岸
田

要

旨

中

橋

功い■

達伊 中 尾 直 樹書や清 水 宏 伸…
孝

彦…Jian−ShenGong

雅嗣…■■JinZhang…＊

ヒトの長寿関連mtDNA型としてLeu→Metアミノ酸置換をもたらすmtDNAのND2領域内のMt5178C→A塩

基置換が報告され，C型に疾病羅息率が高いとされた．我々は神経筋疾患308例の冷凍血球より総DNAを抽出し，mtDNAのPCR産物を制限酵素AluIを用いて消化しMt5178C／Aを鑑別し健常対照者の結果と比較した．結果：
Mt5178A型に比し有意なMt5178C型の増加が重症筋無力症，パーキンソン病，脳血管障害にあり，進行性筋ジストロフィーは有意でなかった．結語：成人疾患に伴うmtDNA遺伝子のMt5178C型は，ミトコンドリアからのラジカル産生量や電子伝達系の機能低下などにより，神経筋疾患の病態に関連している可能性を考えた．
はじめにミトコンドリア脳筋症l川，心筋症4），5），糖尿病6用などにおけるミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常が報告されて久しい．他方，老化や変性疾患とのmtDNA変異について加齢との関連で注目されている9）．また百寿者の研究を通じ，ヒトの長寿（longevity）に関連したミトコンドリア遺伝子（mtDNA）型としてLeu−tO−Metアミノ酸置換をもたらす
mtDNAのNADHdehydrogenaseの第2サブユニット遺伝子
脚D2）領域内の塩基番号5178のC−tO・A塩基置換（多型）が報告され，本邦成人とくに壮年以降の例ではMt5178C型に疾病羅息率が高く，Mt5178A型は百寿者を含む高齢健常者が多いとされた10）．しかしmtDNAの変異速度は早く11），
ゆえに個々人の間でのmtDNAの多様性は大きく12），さらにMt5178A型は全世界レベルでは少なく13），本邦では比較的多い傾向が指摘されている14）．またつい最近では
Mt5178A型とC型はND2のLeu→Met置換に加え，ATP合成
酵素の第8サブユニット（ATP8）のLeu→Phe置換および16S

対象および方法
対象：神経・筋疾患の308例であり，内訳はPMDとしてBecker型（BMD），肢帯型（LGMD），筋緊張性（MyD），顔面
肩甲上腕型（FSHD），rimmedvacuoleを伴う遠位型（DMRV）
を含むPMD（40．8±12．3歳），CPEOやMELAS症候群などのミトコンドリア病（Mt・D；42．1±13．9歳），運動ニューロン疾患（MND；57．6±7．5歳），脊髄小脳失調症（SCA；61・1±
12．8歳），アルツハイマー病（AIz；74．0±9．86歳），パーキンソン病（PD；65．2±13．5歳），脳血管障害（CVD；70・0±
9．6歳），自己免疫性神経筋疾患（〟D；53．6±15．5歳）の重症筋無力症（MG），多発・皮膚筋炎げMのM），その他などである．対照は愛知・岐阜県在住からの健常者633例（男436，女197；44±12．4歳；男41．3±12．5歳，女49．9±9．7
歳）であった．すなわち愛知県の男性400ml献血サンプルからの252例，岐阜県の鹿診受診の男184例と女197例であり施設の許可をえた残り血球である．なお今回はPMDも少なく症例数のバラつきが大きく，さらに疾患サンプルに関連するミトコンドリア遺伝子型Mt5178A型（以下A型）

を多数分析中であり現時点での結果を記す．
方法：本研究3年間の当初2年間に渡り，その臨床経過中に何等かの理由で末梢血検査を行なった後の破棄血球を凍結保存したものを用いた．そして血液資料を解凍し総DNAを抽出し，一部はnuorescence−based automated directとMt5178C型（以下C型）が神経筋疾患に如何に修飾しているかを検討するために，各疾患におけるmtDNAのMt5178

sequencing15）で，また多くはmtDNAをPCRで増幅し制限酵
素dJ〟Ⅰを用いMt5178C→A型を検出し，対照者の結果と比型を解析した．

較した．

リボソームRNAの塩基置換Mt3010G→Aという2カ所の置換との関連で研究が進行している．
本報告は進行性筋ジストロフィーPMD）を含む神経筋疾患の発症に関わる遺伝的背景を解明するために，長寿

なお対照者のA型：C型の比率は277：356であった．そして各疾患のMt5178A／C型の頻度や臨床パラメーターと＊愛知医科大学第4内科＊＊愛知医科大学加齢医科学研究所＊＊＊愛知医科大学中央検査部
書林＝岐阜県国際バイオ研究所

比較検討した．また可能な症例につき，ミトコンドリアを中心とした細胞機能の低下や細胞死をもたらす血中の過酸化脂質（LPO；lipidperoxide）を八木法にて測定し検討−197−

した．統計処理はFisher法およびOdds比にて行なった．
結A型の症例における年齢は高く，有意ではないが，C型SCAの若年性が示された．またSCAの遺伝歴「あり」・「なし」

果全体の疾患対象の年齢分布は40歳代以上の症例が多い
が，より高齢者にA型が多い傍向があり（80歳代，A型：C
型＝20：14），70歳代以下（70歳代，A型：C型＝34：69；60
歳代，A型：C型＝9：63；50歳代，A型：C型＝12：41；40
歳代，A型：C型＝11：27；30歳代以下，A型：C型＝8：31）
はC型が多く（A型：C型司9：193）で80歳代との比較ではC型が有意に多く（P＝0．0000067，Odds比＝5．63），C型の成人
壮年疾患に対する高頻度が示唆された．以下に疾患別の結果を記す（表1）．
1）PMD：症例数が少ないが，A型が多く男女差や年齢と群の比較では，遺伝歴「あり」群（A型：C型＝2：2）に比し遺伝歴の「なし」の弧発群（A型：C型＝3：12）にC型が多かった．
6）CVD：CVDでは有意にC型が多くb＜0．001），男性（A型：
C型＝11：31）に比し女性（A型：C型＝3：20）にその傾向が強かった．CVDのLPO値と加齢と間には相関はなかった．
CVDにおける糖尿病rあり」群（A型：C型＝1：9）と「なし」群（A型：C型＝13：41）または高血圧「あり」群（A型：C型司：18）と「なし」群（A型：C型＝10：34）では，ともに合併群にC型が高かった．
7）その他の疾患：MNDなど，何れの疾患でもC型がより高かった．

の関連は不明であった・LPO値はC型に高く（p＜0．05），
年齢と正の有意な相関がみられた．pMDの病型別では，
BMD（n＝3）はA型：C型＝2：1，MyD（n＝3）はA型：C型＝2：1，DMRV（n＝1）はA型＝1，LGMD（n＝2）はC型2，FSHD（n＝2）はA型：C型＝1：1であったが，症例数が少なく結果の記載に留める．

2）批−D：共同演者田中が前演題で発表し詳細は割愛する．
今回の症例ではC型がより有意に頻度が高く，LPOは加齢と正の有意な相関を示した．
3）AID：MG：C型が有意に多く（p＜0．01），症例数の男女差でも女性例に有意にC型が多かった（p＜0．03）．右側の年齢
比較ではA型とC型には平均年齢に差はなく，LPO値も同様であった・MGにおける胸腺の過形成（hyperplasia）および胸腺腫（thymOma）合併群の比較では，過形成例（A型：C
型＝8：21）に比し胸腺腫例（A型：C型＝1：9）によりC型に多い傾向がみられた（p＝0．250，Odds比＝5．63）．また血清中考
察
今回の検討を通じ，ヒトmtDNAのND2遺伝子領域内のmtDNAの塩基番号5178（Mt5178）C型は神経・筋難病のう
ち，とくに壮年期前後に発症する成人疾患であるCVD，PD，MGなどで有意に頻度が高く，その症状の発現に影響を及ぼしている可能性が示唆された．すなわち本結果
はmtDNA多型であるA型とC型の間で，おそらくミトコ
ンドリアからのラジカル産生量，加齢に伴うmtDNA変異の蓄積および電子伝達系の機能低下の経過が異なり，疾患が顕在化するためのl条件となっている可能性が考えられた．
また本検討では疾患別の症例数が異なり，一概に全ての疾患にC型が決定的であるとの断定は現時点では差し控えたい．とくにPMDではA型が高かったが，今回は検の抗AChR抗体価はC型（68．79±150．8nMol／ml）はA型（18．71±24．76nmol／ml）に比し高かったが，分散幅が大きく有意ではなかった．LPOの結果も，加齢と正の有意な相関を示した．

索症例数が多い疾患ほどC型が高い傾向がえられ，この結果現時点では記載に留めたい．また男女差ではMGとPMn）Mを含むAlDやPDで有意に女性に多いC型があったが，しかしこれら2疾患群は，本来女性例が多い疾患であPMのM：C型が男女ともに多く，加齢との関連も示唆されたが，LPOは，加齢と共にむしろ減少していた．
4）PD：中枢神経の代表的な変性疾患であるPDでは，有意る点を考慮する必要があろう．とくにPDでは発症年齢と性差間に有意差があるとの結果が一部に示されており，
Mt5178C／A塩基置換と年齢を含む性差の検討は更に追及
課題と考える．

なC型の増加が男女を含吟てあったが（p＜0．002），LPOと加齢と間には相関はなかった．
5）SCA：全て外来通院中の症例で経過年数は大部分5年以内の症例であった．より女性を中心にC型が多かったが，
表1
p＝0．錮

らすが，PMDを含む多くの疾患群で加齢とともに正の相関を示した．しかし正常者加齢や糖尿病などにもみられる事実でもあり，疾患特異的な意味づけは更に検討が必要と考えられる．

p＝Oj5

1

t J

危険率げisher）OddS比

7

人 V

p＝0．1841

45

p＝0．16

3

p＝0．的

0

3

1 J

p＝0．…

3．89

0

5

2．78

p＝0．0032．17

p＝0．003

2．85

ヽ
J

3

1

p＝0．0004

5

1

4 9

′ 0

3

9

7

2

p＝0．31
5

′0

3

2

7
7

対照（633

Mt5178A Mt517gC
5

疾患名／総数
PMD（11）Mt−D（10）
MND（5）
SCA（19）Ak（6）PD（36）CⅥ）（朗）
Am（72）
MG（42）PM心M（9）

血中の過酸化脂質（LPO）は，血中のフリーラジカルや活性酸素を通じて生成され種々疾病の引き金となりミトコンドリアを中心とした細胞機能の低下や細胞死をもた最後に先天性疾患であるPMDは症例数が少なくA型とC型が本症の修飾因子になっていると判断しえなかった．
しかし症例数を増し心機能や予後などの臨床所見との比較を通し，PMDにおいてミトコンドリア酵素活性の低下，欠矢を有するmtDNAの蓄積，脂質アルデヒド4・hydroxy・
2−nOnenalが付加した蛋白質の増加などの関与も考慮し，
ー198−

PMDの症状進行（寿命延長）に関し酸化的ストレスと
mtDNA多型との関与につき検討してゆきたい．

8）KadowakiH，TbbeK，MoriYetal：Mitochondrialgene

引用文献9）LinnaneAWMar2nkiS，Ozawatetal：Mitochondrial

mutationandinsulin・dependenttypeofdiabetesmellitus・
Lancet341：893・894，1993．

DNAmutationsasanimportantcontributortoagelngand

1）GotoYiNonakaIandHoraiS：Amutationinthetransftr

degenerativediseases・LancetI：642・645，1989・

RNALeuⅣUR）geneassociatedwiththeMELASsubgroupofmitochondrialencephal0−myO−pathies．Nature348：

10）恥Ilaka M，GongJ・C，ZhangJ etal：Mitochondrial
genotypeassociatedwithlongevity・Lancet351：185・186，

651・653，1990．

1998．

2）InoH，TねakaM，OhnoK，etal‥MithochondrialleucinetRNAmutationinamitochondrialencephalomyopathy．

11）ⅥwterLandBrovmW：NuclearandmitochondrialDNA

Lancet337：234−235，1991．

comparisons reveal

3）TanakaM，InoH，OhnoK，etal：MitochondrialDNA

extreme rate variationinthemolecularclock．Science234：194・196，1986．

mutationsinmitochon・drialmyopathy，enCephalopathy，

12）HomiS，HayasakaK，KondoR，etal：RecentABican

lacticacidosis，andstroke・likeepisodes（MELAS）．

Originofmodemhumansrevealedbycompletesequences

BiochemBiophysResCommun174：861−868，1991・

ofhominoidmitochondrialDNAs．Proc Natl Acad Sci4）取nakaM，InoH，OhnoK，etal：Mitochondrialmutation
in血talinfhtilecardiomiopathy．LanCet336：1452，1990．

5）Zeviani M，Gellera C，Antozzi C，etal：Matemallyinheritedmyopathyandcardiomyopathy：Associationwith
mutationinmitochondrialDNA tRNALcu（UUR）．Lancet（USA）92：532・536，1995．
13）CannRL，StonekingMandWilsonAC：Mito・Chondrial
DNAandhumanevolution．Nature325：31−36，1987．
14）恥rlakaMandOzawaT：StrandasymmetryinhumanmitochondrialDNAmutations．Genomics22：327・335，
1994．

338：143・147，1991．

6）ⅥmdenOuwelandJMW，LemkesHH，etal：Mutationin

15）取Ilaka M，Hayakawa M and Ozawa T：AutomatedmitochondrialtRNALA）（tJUR）geneinalargepedigreewith

sequencing ofmitochondrial DNA，in Methodsin

matemally tranSmittedtype

En町mOlogy・MitochonmdrialGeneticsandBiogenesis，Ⅱ

diabetes mellitusand

Vbl．264，edbyAttardiG・andChomymA Academic

deahess．NatureGenetl：368・371，1992．
7）Kishimoto M，Hashiramoto M，Kanda Fi etal：

Mitochondrialmutationin diabeticpatientwithgastro・
intestinalSymPtOmS．Lancet345：452，1995．

一199−

Press，OrlandoFL，1996pp．407−421

長寿に伴うミトコンドリア遺伝子型
田

研究協力者

緒

中

雅

嗣■

Jian−ShengGong＋ 米 田
宮 嶋 裕 明… 佐 橋

誠＊＊JinZhang
功…■ 八 木 国夫■

これらの塩基置換の中からMt5178Aに注目し，PCR−

言

ミトコンドリアDNA（mtDNA）の変異がミトコンドリア

脳筋症，心筋症，糖尿病で報告されている．体細胞におけるmtDNA変異の蓄積が加齢と変性疾患に関与している
ことが提唱されている．mtDNAの進化速度は核DNAの進化速度の5・10倍高いために，mtDNAの塩基配列の多様性
は個体間で顕著である．冠動脈心疾患に関する疫学的研究によれば，寿命は父親の死亡年齢よりも母親の死亡年齢によって強い影響を受ける．母系遺伝によって伝えられたミトコンドリア遺伝子型が，mtDNAに対する酸化的損傷，mtDNA変異の蓄積速度，変性疾患に対する罷り易さ，さらには個体の寿命に影響を及ぼしている可能性がある．この仮説を検証するために，我々は37例の日本人の百寿者のmtDNAを分析した．

RFLP法によって，37例の百寿者と252例の愛知県内の健康な献血者の試料をスクリーニングした．Mt5178Aの百寿者における頻度（23／37，62％）は，献血者における頻度（114／252，45％）より統計学的に有意に高かった（FO．04，オ
ッズ比＝1．99）．このことはMt5178Aが長寿に関連していることを示唆している．
これらのmtDNAの塩基置換が疾患の発生に及ぼす影響を評価するために，Mt5178AとMt5178Cの頻度を，無作為抽出した大学病院の入院患者および外来患者338例において調べた．Mt5178AまたはMt5178Cを有する患者の年齢分布から，46歳未満の若い患者におけるMt5178Cの頻度はMt5178Aの頻度とほぼ等しかったのに対し（A：C＝46：40），46歳以上の高齢の患者におけるMt5178Cの頻度は

方法と結果

Mt5178Aの頻度と比較してより顕著な増加を示し（A：C＝86：166），45歳において明瞭な屈折点を示すことが明らか

はじめに，11例の百寿者において，mtDNAの全塩基配列を蛍光を利用した自動塩基配列決定法によって解析した．多様な塩基置換が存在したが，mtDNAの全塩基配列が既に決定されていた43例の対照群と比較して，これらになった．高齢の患者におけるMt5178〟C比（86：166）は，百寿者（23：14，p司・001）および健常人対照（114：138，p司．01）と比較して統計学的に有意に低かった．この結果はの百寿者において数個の塩基置換がより高い頻度で検出

Mt5178Cを有する個体が，Mt5178Aを有する個体と比較して，成人発症性の疾患に羅息しやすいことを示唆している．

された・アミノ酸置換を伴う2ヶ所の塩基置換（第1はND2
遺伝子領域内の塩基番号5178のC→A転換に基づくLeu→
Met置換，第2はArP8遺伝子領域内の塩基番号8414のC→
T転位に基づくLeu→Phe置換）および16SrRNA遺伝子領域
内の塩基番号3010のG→A塩基転位が，対照群と比較して百寿者群でより高い頻度で検出された．Mt517＆Aは百寿
者の11例中9例で検出されたのに対し，対照群では43例中12例にのみ検出された（p＜0．01）．Mt8414Tは百寿者の11例中7例で検出されたのに対し，対照群では43例中11例にのみ検出されたb＜0．05）．Mt3010Aは百寿者の11例中7例で検出されたのに対し，対照群では42例中11例にのみ検出された付く0．05）．Mt8414TとMt3010Aの両者と有する百寿者7例はMt5178Aを有する百寿者9例に含まれていたので，これらの塩基置換の大部分は連鎖していることが示唆された．
＊財団法人岐阜県国際バイオ研究所
榊福井医科大学医学部第二内科
榊＊浜松医科大学第一内科■■■＊愛知医科大学第四内科

考察Cannらはヒトの進化に関する研究において，世界中から集めた147例の試料の中で，わずかに5例のアジア人と1例のヨーロッパ人がMt5178Aを有していたと報告した．
この観察はMt5178Aが世界のヒト集団の中で比較的稀であることを示している．Mt5178Aの頻度が日本人集団の中で45％と高いことは，日本の平均余命（女性83．59歳，男性77．01歳）が世界中で最も高いことと関連している可能性がある．
我々の知見は，成人発症性の疾患を発症しにくい
mtDNA遺伝子型を有することが長寿となる遺伝的要因の一つであるという考えを支持する．今後，mtDNA遺伝子型の間の機能的相違を明らかにする必要がある．また，
Mt517gCを有する個体がどのような成人発症性の疾患に羅息Lやすいかを明らかにすることも興味ある課題である．ミトコンドリア脳筋症の病態に対するMt5178AおよびMt5178Cの関与を明らかにする必要がある．

ー200−

文

献

2）GongJ・S，ZhangJ，YonedaM，SahashiK，Miy再imaH，
YamauchiK，YagiK and Tanaka M：Mitochondrial

1）TanakaM，GongJ−S，ZhangJ，YonedaMandYagiK：
Mitochondrialgenotypeassociatedwithlongevity．Lan−genotype危■equentincentenarianSpredisposesresistance

Cet351：185−186，1998．

toadult．onsetdiseases．J．Clin．Biochem．Nutr．24：105＿

111，1998．

−201−

Ⅸ．筋の発生・分化・再生，その他

Triad蛋白の筋発達に伴う発現，局在，機能
小 林 高 義＊

研究協力者

田 中 宏 明＊
亀 田 典 佳＊

古 屋 徳 郎＊
水 澤 英 洋＊要 旨 成熟筋においてtriadに局在し，興奮収縮連関において重要な役割を果たす蛋白であるdihydropyridine
receptor，ryanOdine receptor及びtriadinのヒト培養筋細胞の発達に伴う発現，局在，機能について検討した．これ
らの蛋白が，筋芽細胞の融合による筋管細胞の形成に伴い機能的に発現し，神経支配による収縮と横紋状の収縮装置の形成に伴って成熟筋に類似した分布および機能に変化することが示唆された．
はじめに筋の興奮収縮連関における細胞内ストアからのカルシ
ウムイオン（Ca2十）放出は，T管系と筋小胞体（SR）終末槽の接合部である三つ組（血如）において，T管系の電位センサ
ーであるdihydropyridine受容体PHPR）と，SRのカルシウ
ム放出チャンネルであるⅣmOdine受容体（町R）の分子間相互作用によって引き起こされると考えられているl）．
DHPRはL型カルシウムチャンネルであり，また町Rは細胞内Ca2＋濃度の上昇によって刺激されCa2＋を放出する（Cal−Cium・induced calciumrelease：CICR）ことが知られているが，成熟骨格筋における興奮収縮連関においては，細胞外からのCa2＋流入は重要な関与をしないとされている．
また，SR終末槽に存在する膜蛋白triadinは，DHPRないし
RyRと結合することが報告され，カルシウム放出に関与して機能することが示唆されている2）・3）・4）．疾患との関連成した段階（innervatedmuscle瓜bers：IMF）で各々全mRNAを分離してRr−PCRにより各mRNAの発現を調べた．RyR
及びtriadinは骨格筋型アイソフォームに関して検討し，
DHPRについては骨格筋型アイソフォームに加え心筋型
アイソフォームについても検討した．また筋細胞への分化のマーカーとして，筋特異的中間径フィラメントdesminの発現を同時に調べた．蛋白レベルでは，蛍光免疫染色を行い，共焦点レーザー顕微鏡を使用し，各発達段階の筋細胞における発現，局在を検討した．一次抗体は，骨格筋型アイソフォームのDHPRを認識するmonoclonal抗体，
心筋型アイソフォームのDHPRを認識するウサギ抗ペプ
チド抗体，骨格筋および心筋型のRyRを認識するmono−clonal抗体，骨格筋および心筋型の血adinを認識するmon0−

では，DHPRは家族性低カルシウム性周期性四肢麻痺の原因遺伝子であり，RyRは悪性高熱症及びセントラルコ
ア病の原因遺伝子であることが報告されている5）．しかし，これらのtiradに局在する蛋白のヒト骨格筋における発達については現在まで報告がない．そこで，これらの疾患の発症機序を解明するための基礎的研究として，ヒト培養筋細胞の発達に伴うmRNAの発現，蛋白の発現と局在，更にその機能について細胞内Ca2＋濃度制御の発達を含めて検討した，

123
0l

lrlニ】

b

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C

d

多発筋炎，運動ニューロン疾患など筋細胞自身に内因性の異常がないと考えられる疾患16例の筋生検材料より
ヒト筋細胞を培養した6）．更に筋細胞をラット胎児脊髄と共培養することにより神経支配を形成させた勺．単核細胞のみの段階（mononucleatedcells：MC），筋芽細胞の融合により多核の筋管細胞を形成した段階（aneuralmyotubes：AM），神経支配により反復する筋収縮を認め，横紋を形＊東京医科歯科大学医学部神経内科
ー205−

T￣▼「n

や

e EI＝：コf

材料及び方法i己コ⊂「＝コ

図1DeYdopmen血ch肌geS Of血e accunulation of仙e
SkeletalmuSdeisofbnmofDHPR（a），RyR（b），扇如in（C），aLldthecardiacisoぬmofDrIPR（d）transcriptsin
aneufalandinnervatedculturedishes．eandfaredes＿

minandGAPDHtranSCripts・Agaroscgelshowingthe
ethidiumbromidestainedproductsofRr−PCR．Lanel，mOnOnuCleatedcclls；lane2，anCurallyculttJtedmus−
Clecclls；lane3，iJtnervatedmusclecells．TheskeletalmuscIeisofbrmsofDHPR，RyR，md扇dh訂eatlow
levelsinmononucIcatedcells，butincreascremalkably
虹也elaterst喝eS，Whereas也ecardiaCisofbmorDHPR
isdetectedatsimilaTleYelsamongallthreestageS．

cIonal抗体及びdesminに対するウサギpolyclonal抗体を使用した．細胞内Ca2十濃度については，蛍光指示薬爪u0−3を用い，潅流下でレーザー顕微鏡を用いて観察した．細胞
内ストアからのCICRによるCa2＋放出能を検討するため，
カフェインによる刺激実験を行った．また脱分極による認められなかった．心筋型アイソフォームのDHPRが3段階の培養のいずれにおいても検出されたが，心筋型DHPR
は皮膚線維芽細胞においても発現しており筋芽細胞での発現については確証は得られなかった．
2，蛋白の発現と局在（図2．3）

細胞内ストアからのカルシウム放出に対する細胞外カル

骨格筋型DHPR，RyRおよびtriadinはdesimin陽性のシウム流入の影響を検討するため，カルシウムを含む海MC（筋芽細胞）には染色されず，AMでは主に細胞質領域に染色された．骨格筋型DHPRは筋管細胞の両端の細胞質領域に強く染色され，また細胞膜に一致して染色され流液での潅流下における脱分極の効果とカルシウムを加えない海流液での潅流下における脱分極の効果を比較し検討した．更に，カルシウムチャンネル阻害薬nifbdipine
及びcadmiumの効果も検討した．
結果

1．mRNAの発現（図1）
骨格筋型DHPR，骨格筋型RyR，骨格筋型血adinのmRNAは，MCにおいてはほとんど検出されず，AMの形成により著明に増加した．AMとIMFの間では明らかな変化はた．RyRおよび扇adinは，主に細胞質領域に額粒状に染色され，その一部は細胞膜に一致して分布した．また，MC及びAMにおいては心筋型DHPRも細胞質領域に染色され，AMでは一部，細胞膜に一致して染色された（国2）．m肝においては，DHPRは主に細胞膜に一致して染色され，一部，細胞質領域にも染色された．更に，長期共培養では細胞質領域に横紋状に染色された．RyRは，短期共培
養におけるIMFの細胞質領域に横紋状に染色され，長期

図2 FluorescentimmunolabelingoftheskeletalmuscleisofbrmsofDHPR（a），RyR（b），triadin（C），andthecaTdiacisoformofDHPR（d）inaneurallyculturedmusclecells・TheskeletaImuscIcisofbrmofDHPR（a）ismainlylocalizedwithinthccy（Oplasmofmyotubes，
paTticularlydenseIyatthebothcnds（afrOW），butpartJycorrespondstothcplasmamembrane（amwheads）．RyR（b）isvisualizedas
SmaIlgranulesmainlywithinthecytoplasmicareaofmyotubes，butanumbcrofimmunoreactiYedotsarealsolocatedattheperiphery
Ofthemyotubes，VeryCloseorcorrespondingtotheplasmamembraJle（arrows）．Triadin（C）isIocalizedwithinthccytoplasJnOfmyo−tubespredominantlyaroundthenucleiandpartlycorrespondstotheplasmamembrane（arrow）．ThecardiacisofoTmOfDHpR（d）ismainlylocalizedwithinthecytoplasmofmyotubesbutpartlyalongtheplasmamembrane（mws）Bar，50mm．

園3 FluorescentimmunolabeIingoftheskeletalmuscleisoformsofDHPR（a，b），RyR（C），and扇adin（d）incontinuouslycontractingin−
nervatedmuscletibersco−CulturedwithfetalraIspinalcord・TheskeletalmuscleisoformofDHPRislocalizcdmainlyalongtheplas−mamembrane（arrowsina）andpartlyinthecytoplasm（arrowheadina）incon血uouslycontractingirLnerVatCdmuscle伽ers．hhighlydi飴rentiatedpartsofcontinuouslycontractinglrLnerVatedmuscleiibcrsinlong−termCO−Culttm，theskeletalmuscleisoformof
DHPRisstainedwithinthecytoplasmicareawithacross−StriatedpattemaswellasalongtheplasmamembraJlewithperiodicen−
hancement（arrowsinb）・RyRislocalizedinacross−StriatedpaltemandpaJtlyappearsashdistinctdoublerowsincontinuouslycon−
tractinginnervatedrnusclefibersinlong−termCO−Culture（arrowsinc）．Triadin（d）immunoreactivitydistributesalsoinacross−StriatedpattemincontinuouslycontractinginnervatedmuscIcfibersintong−termCO−Culture．Bar，25mm（a）；12，5mm（b−J）．

−206−

EI

0

10

20

30

40

50

Time（SeC）

0

200

100

600

0

gOO l000120014001600

200

400

600

800

1000

1200

Time（SeC）

0

200

400

600

g00

200

1000

600

gOO lOOO¶me（SeC）

Time（SeC）

図4400

CalCiumtransientsinculturedhumanmuscIecellsmonitoredusing幻u0−3．SlowlCa21iOSCillationsaTeObservedspontaneousIyin
aneurallyculturedmyotubeswithirregularintervalsandwithoutapparentcontractions（a）．IncontinuouslycontractingmuscIcnbers，
regularfhstlCa2＋】iOSCillationsareobservedaccompanyingspontaTLeOuSnerve−drivencontractions（b）・lCa2
sequentialstimuIationwithhigh−K＋inCa2＋−COntaining（2．2mM）solution，high−K

inCa2

LtranSientsareinducedby−fieesolution，10mMca飴inesolutionandhigh−K＋inCaZ＋−COntainingsolutionagaininaneuralIyculturedmyotubes（C，e）andinnervatedmusclefibers（D・Depolarization−inducedlCa2＋】itranSientsarehighlydependentonextracellularCa2

inmanyaneuTallycuIturedmyotubesandrelativelyindependent

inthesma11populationofaneuralIyculturedmyotubesinlonger−termCulture（e）．DepoIarization−inducedlCaZ］ibTanSientsarepartly

blockedbylmMniftdipine（●ind）andlOOmMcadmium（＋＋ind）inaneurallyculturedmyotubes．DepoIarization・inducedlCa2transientsincontTaCtinginnervatedmusclefibersreachsimilarlevelsinCa2＋−＆eesolution（●iJlf）andCaZ

non−CrOSSStriatedonesinshort−termCO−Culture．EI，emissionintensity

−207−

】i

−COntainingso］utionevenin

ット筋初代培養系における結果とほぼ一致するものであRF′C

るが，ヒト筋細胞培養系においては収縮および横紋状の収縮装置の形成には神経支酉己を要するのと同様に，dd蛋白の分布においても神経支配によってより成熟した分布へ変化する現象が認められる点で異なっていた．また，
神経支配前の筋管細胞においても，DHPRおよび町Rが機能的に発現していること，神経支配前の筋管細胞においては，脱分極刺激による細胞内へのCa2＋放出において，

AM

細胞外からのCa2＋流入を必要とするが，神経支配後は細胞外Ca2＋流入への依存性が減少し，成熟筋に近い特性に変化することが示された．この細胞外Ca2＋流入への依存

IMF

図5InnervationaltersextracellulaTCa2性は心筋における興奮収縮連関に類似し，心筋型DI℡Rの関与の可能性も考えられる．現在まで，神経支配以前の収縮開始前の未熟な筋管細胞における扇ad蛋白の機能については知られていないが，細胞内Ca2十の制御を通じて筋管細胞の発達に関与する可能性が考えられ，特に−dependenceofde−

polarization−inducedCa2＋transientsinculturedhumanmusclecells．ThepeakampIitude ratioofdepolariZa−tion＿induced Ca2＋transientsin CaZ＋．丘ee vs．Ca2＋＿

COntaining extemal solutionsis signincantly higherb＜0．001byttest）ininnervatedmusclenbers（n〒20）thaJlaneurallyculturedmyotubes（n＝58）．Opencircles，COngenitalmyopa血yであるセントラルコア病の発症機序を解明する上で重要と考えられる．

meanofRF／C；bars，±SD．RF／C＝AF／AC．AFandAC，peak amplitude ofdepolaTization・inducedintracellular
Ca2＋transientinCa2＋・BeeandCa2＋−COntainingcxtemal
SOlutions，reSpeCtively．AM，aneurally

culturedmyo一

文山bes；IMEinnervatedmuscIe爪bers．

献1）FranZini−AmstrongCandJorgensenAO：StruCtureand
培養では，一部の横紋が2重（doublet）に染色された．triadin
は短期共培養のIMFでは，細胞質領域に染色され，ごくわずかな横紋状の分布が認められたが，長期共培養のIMF

development ofE・C coupling unitsin skeletalmuscle．
AnnuRevPhysio156：509・534，1994．
2）BrandtNR，CaswellAH，WenSRetal：MoleculaLrinter−

では，横紋状に染色された（図3）．
3．細胞内カルシウム濃度変化（図4）

actionsofthejunctionalfootproteinanddihydropyridine

AMにおいては，時に不規則で周期の遅い（0．5Hz程度）
calcium oscillationが観察された．神経支配を受けた筋管細胞においては，自発収縮開始前から規則的なcalcium

Biology113：237−251，1990．

receptorinskeletalmuscletriads．JoumalofMembrane

oscillationが観察され，IMFでは収縮に同期した速い（2Hz前後）oscillaionが持続的に観察された．刺激実験では，AM
およびIMFにおいて脱分極およびカフェイン刺激による細胞内Ca2 濃度の一過性上昇（Calciumtransient：CT）を認めた．MCにおいては明らかなCTは認められなかった．
AMにおいては，CTの振幅は明らかに細胞外Ca2＋濃度に依存したが，神経支配形成後はこの依存性は有意に減少した（p＜0．001byStudentttest）（図5）．AMにおいては，カルシウムチャンネル阻害薬によってCTの抑制がみられ，細胞外からのCa2＋流入がCTの形成に関与していることが示唆された．

3）BrandtNR，CaswellAH，BrunSChwigJ・Petal：E飴ctsof
anti−triadinantibodyonCa2＋release録omsarcoplasmic

reticulum．FEBSLetters299：57・59，1992．
4）KimKC，CaswellAH，ThlvenheimoJAetal：Ⅰ501ationof

aterminalcistemaproteinwhichmaylinkthedihydropy−
ridinereceptortothejunctionalfootproteininskeletal
musCle．Biochemistry29：9281・9289，1990．
5）GreenbergDA：Calciu叩ChannelsinneurologiCaldisease．
Neurology42：275・282，1997．
6）AskanasVandEngelWK：Anewprogramforinvesti−
gatingadulthumanSkeletalmusclegrownaneurallyintis・

SueCulture．Neurolo訂25：58・67，1975．
7）KobayashiT；AskanasVandEngelWK：HumanmuSCle
Culturedinmonolayerandcoculturedwithfttalratspinal考察

COrd：importanCeOfdorsalrootgangliaforachievingsuc−

だr−PCR及び免疫染色により，雨ad蛋白が筋芽細胞の融合による筋管細胞の形成に伴い発現することが示された．
この結果は，過去に報告されたmyogeniccelllineおよびラー208−

CeSSfu1functionalinnervation．JNeurosci7：3131・3141，
1987．

アンキリンリピートを持つ新規可溶性タンパク質Ⅴ−1の骨格筋細胞における発現

中木国

▲・

▲T

●
▲・
●
●
■

治

人知郎

■
一

浩行栄

ケ

●
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■

●
■

崎田達

藤石安

■

明英徹

宏伸

●
＊

義

■

田鈴山

■
■

●

子洋栄

高

林

小

優英時

川澤

古水宋

研究代表者

要 旨 V−1はタンパク質問相互作用に必要な分子モチーフであるアンキリンリピートを2回半繰り返して持つ
アミノ酸117個から成るタンパク質である．Ⅴ−1分子は，神経細胞や卵巣，副腎に加えて，胎生期のラット骨格筋組織でも発現している．我々は骨格筋分化におけるⅤ−1分子の機能を調べるため，骨格筋株細胞（CユC12および
R615細胞）とヒト筋細胞−ラット胎児脊髄共培養系を用いてⅤ−1分子の発現変化を分析した．その結果，骨格筋細胞の分化・発達に伴いⅤ−1遺伝子の発現が抑制されていることが判った．以上の結果から，Ⅴ−1分子は骨格筋細胞の分化制御に関与していることが推察された．
はじめに
Ⅴ−1は我々のグループがラット脳より発見した新規可

対象と方法

リンリピートは酵母の細胞周期調節因子であるcdclO，ショウジョウバェの細胞運命決定因子であるNotch，哺乳類

株細胞としてC2C12筋芽細胞刀，R615筋細胞8）を用いて，増殖培地（growmmedium：GM）から分化培地（di飴rentiation
medium：DM）に換えて1週間培養し，筋芽細胞のみの段
階から筋芽細胞の融合による多核の筋管細胞へ分化誘導
した．これらの株細胞の分化段階におけるⅤ・1分子の発現変化をウエスタンプロット分析で検討すると共に，抗の赤血球の構造タンパク質である吋inや，免疫グロブ
リンに鎖遺伝子の転写調節因子NF一KBの阻害分子である

Ⅴ一1抗体による免疫蛍光染色を行い，共焦点レーザー顕微鏡で観察した．更に筋細胞自身に内因性の疾患がない

IKBを含む種々のタンパク質に認められ，これらの分子はアンキリンリピートタンパク質スーパーファミリーをと考えられるヒトの筋生検材料を用いて，eXplant−reeXplant法（AskanaS＆Engel）により筋細胞を培養し，筋細胞をラット脊髄片と併置培養することによって，神経筋接合を形

溶性タンパク質であるl）．我々は，分子クローニングによりⅤ・1分子がアンキリンリピートを2回半繰り返して持ち，
アミノ酸117個からなることを明らかにした1）J）．アンキ

形成し，真核細胞生物の多様な生物学的現象に関わっている．また，IKBタンパク質のアンキリンリピートはタ
ンパク質問相互作用に必須であることが証明されている
3），4）．したがって，Ⅴ・1分子全体の73％がアンキリンリピートで占められるという構造上の特徴から，Ⅴ−1分子は何らかのタンパク質と結合して生理的機能を発現するものと推察される．Ⅴ−1分子は神経細胞に広範に分布し，海馬や小脳では主に神経軸索および樹状突起に存在する．
また，卵巣や副腎を含む神経以外の組織でも発現が認められる2）・5）・6）・10）．更に最近になって，胎生期のラット骨格筋組織においてⅤ−1遺伝子が強く発現していることが判ってきた．そこで我々は骨格筋分化におけるⅤ＿1分子の機能的役割を調べるため，骨格筋株細胞の発達に伴うⅤ−1分子の発現変化を分析した．更にヒト筋細胞−ラット胎児脊髄共培養下でのⅤ・1分子の発現についても検討した．

成させた9）．本培養下では，筋芽細胞のみの段階（myoblasts），
筋管細胞を形成した段階（aneuralmyotubes：AM），更に神経支配による反復する収縮を示して横紋を形成した段階（innervatedmusclefibers：IM）の3つの分化段階が観察され，これらの細胞でのⅤ・1分子の発現変化を免疫蛍光染色を行い，共焦点レーザー顕微鏡で観察した．
結果

C2C12細胞の分化誘導前と後でのⅤ−1分子の発現変化をウエスタンプロット分析で検討した結果，増殖培地中で培養したC2ClZ筋芽細胞の細胞抽出液中に，分子量12kDaの免疫陽性のシグナルが検出された（図1）．一方，増殖培
地から分化培地に変えて1週間培養し，分化誘導して筋管細胞を形成させると，このⅤ−1免疫陽性のシグナルの強度は著明に低下した．すなわち，C2C．2細胞の分化に伴ってⅤ−1分子の発現は減少した（図1）．

＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊三菱化学生命科学研究所＊＊＊北里大学大学院

次にC2C．2筋芽細胞の分化誘導前と後でのⅤ−1分子の細胞内分布を，抗Ⅴ−1抗体による免疫蛍光染色を行い共焦−209−

GM DM V−1

図1C2C12筋芽細胞の分化誘導に伴うV−1分子発現の変動
増殖培地（GM）および分化培地（DM）中で培養した
C2C12細胞の全細胞抽出液タンパク質（28〝g）を18％
SDS−PAGEで分離した後PVDF膜に転写して，V−1分子を抗V・1抗体を用いて検出した．
点レーザー顕微鏡で観察した．未分化な紡錘形の筋芽細胞の細胞質は強く染色されたが，核は染色されなかった

図2 C2C12筋芽細胞の抗V−1抗体による免疫蛍光染色
a：共焦点レーザー顕微鏡強拡大像 図のスケール
は50〝mを示す
b：パネルaの位相差顕微鏡強拡大像
C：共焦点レーザー顕微鏡弱拡大像 図のスケール
は100〝mを示す（図2）．また，筋芽細胞が敵合して細長い多核の筋管細胞へ分化すると抗Ⅴ・1抗体での染色性は低下した（図2）．
本実験で得られた，未分化な筋芽細胞ではV・1分子が強く発現し，筋管細胞に分化すると発現が低下するという所見はウエスタンプロット分析の結果と一致した．一一方，
R615筋細胞の抗V−1抗体による免疫蛍光染色を行ったが，陽性所見は得られなかった．
また，ヒト筋細胞−ラット胎児脊髄共培養の抗V・1抗体による免疫蛍光染色の結果（図3），筋芽細胞と神経支配を受ける前の幼君な筋管細胞の細胞質でV−1が強く染色された．一方，既に神経支配を受けて反復収縮する横紋を形成した筋管細胞では，V−1の染色反応は低下し，細胞質にびまん性に分布していた．共培養に用いたラットの脊髄神経細胞や後根神経節の大型細胞では比較的強い
Ⅴ・1の発現が認められた．
更に，上記の免疫蛍光染色反応の特異性を確かめるため，胎生13日目のラット後根神経節，骨格筋組織及び脊髄の組織抽出液を用いて，ウエスタンプロットを行ってⅤ−1の発現を分析した．その結果，後根神経節，骨格筋
及び脊髄いずれの組織でも分子量12kDaのⅤ−1免疫陽性の
単一のシグナルが検出された（図4）．このことは免疫染色反応がV・1特異的であることを示している．
考察

C2C12細胞およびヒト筋細胞−ラット胎児脊髄共培養系を用いた本研究により，V−1遺伝子の発現が，骨格筋細胞の分化・発達に伴い抑制されることが示唆された．Ⅴ＿
1は分子全体の73％がアンキリンリピートで占められている．アンキリンリピートはタンパク質問相互作用に必要な分子モチーフであることが報告されていることから4）・5），
我々は，Ⅴ・1分子が筋細胞の細胞質においてある種のタンパク質と結合して機能を発挿するものと推察する．興味深いことに，神経分化のモデル系であるPC12細胞の細ー210−

図3 ヒト筋細胞−ラット胎児脊髄共培養の抗Ⅴ−1抗体による免疫蛍光染色もb，C，e：共焦点レーザー顕微鏡像
d，f：位相差顕微鏡像
パネルちbは，筋芽細胞（矢印）と幼君な筋管細胞（矢頭）の細胞質でV−1が強く染色されている所見である．パネル亡に示した細胞は，既に神経支配を受けて成熟した筋管細胞（矢印）で，反復する収縮が観察され，横紋を形成している．上に見える移動した
脊髄神経細胞及びその神経線維（夫頭）でもV−1が強く発現している．一方，神経支配を受けた筋管細胞では，筋芽細胞と比べると，Ⅴ−1の発現は低下して，細胞にびまん性に分布している．パネルCに示す後根神経節（DRG：dorsalrootgangIia）の大型細胞（矢印）でもV−1が発現している．
パネルdとrは各々パネルCとeの位相差顕微鏡の写真である．
胞抽出液を抗V−1抗体で免疫沈降すると，実際にⅤ・1分子と共に沈降するタンパク質が検出された（未発表データ）．
また，PC12細胞を用いたV−1遺伝子過剰実験からは，Ⅴ・1

4）InoueJ−I，KerrLD，RashidD，etal：Directassociationof
pp40′IrcBbetawithrelrNF・fCBtranscriptionfactors‥rOle

ofankyrinrepeatsintheinhibitionofDNAbindingactiv−
ity．ProcNatlAcadSciUSA89：4333−4337，1992，
5）FltjigasakiH，Song S・Y，KobayashiT，et al：Murine
centralneuronsexpressanovelmemberofthecdclO／
SWI6motif・COntaining protein fhmily・Mol brain Res
40：203−213，1996．

6）SongS−YiAsakaiR，KenmotsuN，etal：Changesinthe

一V−1geneexpressionofaproteinwiththecdclO／SW16motit
V−1，duringratfblliculardevelopmentandcorpusluteum

図4 胎生13日目のラット後根神経節，骨格筋及び脊髄におけるⅤ一1分子発現のウエスタンプロット分析の結果
各組織抽出液は図1に記載した実験方法に従ってウ
エスタンプロット法で分析された．

formation．Endocrinology137：1423・1428，1996・
7）BlauHM，ChiuC−PandVhbsterC：Cytolpasmicactiva−
tionofhumannucleargenesinstableheterocaryons・Cel1
32：117ト1180，1983．

分子が神経型遺伝子の発現制御に関与することを示唆す

8）KobayashiTiSanOM，TbkagoshiH，etal：Muscleinac−

る有力な証拠が得られている10）・11）．以上の実験事実に基tivityreducesthecontentofparvalbumininratthymic

づいて，細胞質のprotein／protein adapterとして機能する
Ⅴ−1分子はⅤ−1結合タンパク質とのタンパク質問相互作用

myoidcellsinvitro．NeurosciLett131：221−224，1991・
9）KobayashiT；AskanasVandEngleWK：Humanmuscle

により細胞質シグナル伝達系と共役し，筋細胞の分化制

culturedinmonolayerandcoculturedwithfetalratspinal御に関わっていると推察される．

cord：tmpOrtanCeOfdorsalrootgangliaforachievingsuc−cessfu1functionalinnervation．JNeurosci7：3131−3141，

文

1987．

献

1）1hokaM，1ねmakuniT；SongS−Y，etal：Aratcerebellar10）1ねmakuniTi1ねmamotoT；HoshinoM，etal：Anovel

proteincontainingthecdc10／SWI6motifこEurJBiochem

proteincontainingcdclO／SWI6motifregulatesexpression

207：615−620，1992．

OfmRNA

encoding

catecholamine

biosymthesizing

en一町meS．JBioIChem273：27051−27054，1998．

2）ThokaM，IsobeTiOkuyamaTietal：Murinecerebellar
neuronsexpressanovelgeneencodingaproteinrelatedto11）ⅥunakuniT；「hmamOtO T；Hoshino M，etal：A new

CellcyclecontrolandcellfatedeterminationproteinS・J

regulatoryproteinofcatecholaminesynthesizing−enZyme

BioIChem269：9946−9951，1994．

expression．InAdvanCeSinPharmacology，edbyGold−3）BlankVKourilskyPandIsraelA：NF−rCBandrelated
proteins：Rel／dorsalhomologleSmeetankyrin−1ikerepeats．
TtendsBiochemSci17：135・140，1992．

−211−

Stein DS，Eisenho食r G，McCartyR，Vo142，Catechol−amines，AcademicPress，SanDiego，1998，pp30−32

ヒト骨格筋−ラット脊髄併置培養下における
AChRsubunitの神経支配による発現調節
小 林 高 義＊

研究協力者

下 川 雅 丈＊臼 杵 扶美子＊＊

水 澤 英 洋書
石 浦 章 一榊

要 旨 ヒト骨格筋−ラット脊髄併置培養系で，AChR subunit mRNAの神経支配による発現調節をRT＿PCR法で検討した・筋単独培養では，†−SubunitmRNAは出現していたが，e−SubunitmRNAは存在していなかった．脊髄との併置培養下では，筋収縮のない状態でもC・SubunitmRNAは出現していたが，†−SubunitmRNAの抑制は認められなかった・一方，持続的な筋収縮のある培養系では，経過と共にe−SubunitmRNAが増加し，†・SubunitmRNAの明
らかな発現抑制が認められ，neurOnalregulationが存在していることが明らかにされた．
はじめにAcetylcholine受容体（AChR）は，神経終末から放出されたAChと結合し，化学的信号を電気的信号に変換し，筋RT−PCR法によって，筋単独培養，脊髄との併置培養の初期，長期培養で，横紋形成し持続的に収縮している培養
皿と，筋収縮のない培養皿に関して検討を行った．

細胞膜が脱分極することによりT管系に存在するdihydro・
Pyridine受容体の立体構造が変化し，SRに存在するryano−dine受容体に情報を伝え，SRからカルシウムが放出されるというEC couplingの一連の変化の窓口になる重要な受容体である．そのα−Subumitに対する自己抗体が，重症筋無力症（MG）で出現し，また仁一Subunitの点変異が，先天性MGで知られている．また，最も単純なシナプスと考えられている神経筋接合部の生理機構の解明は，神経細胞
一標的器官あるいは中枢における神経細胞一神経細胞のシナプス機構の解明のために極めて重要である．Mishim
ら1）は，AChRsubunitsのcloningを行い，5つのsubunitsのうち，γ−SubunitがinnervationによりS−Subunitに変換されることを明らかにしているが，ヒトでは，詳細は明らかでなく，また一般的にいって，その変換に及ぼす因子に関しての詳細は未だ不明である．今回，我々はin vitroでヒト
神経筋接合部の発生，分化，成熟過程におけるAChR
Subunitsの変化を，神経筋接合部の形態学的，電気生理学的変化と共に，RT・PCR法で検討を行った．
材料及び方法ヒト生検筋を初代培養し，2−3週間後，ラット脊髄片を併置培養後，2・3ケ月培養を続け，継時的に，微少電極法
により細胞内電位を記録すると共に，形態学的に，AChE
を組織化学的方法で検討し，AChRをI125a−BungarOtOXinを使用したautoradiographyによって検討した．AChRsubunitsのうち，ヒト特異的な†及び6−Subunitのprimerを作成し，結果筋単独培養では，AChRcluster，AchE活性は認められず，
図1に示すごとく†−Subudt mRNAは出現していたが，かSubunitmRNAは存在しなかった．脊髄との併置培養後，24時間以内にmeppは記録され，数日後にはeppが出現し，筋細胞が持続的に収縮し始める数日前にはspo血皿eOuS
餌ngが記録された．AchE染色は，培養の経過と共に複雑

12

3

4

5
AchR cAchRY
G3PDH
図1DevelopmentdchmgeSin鵬拡CumulationofAchR†−
adld6−SubunittraTLSCriptinaneuralandinnervatedcul−
ture dishes．G3PDHwas uscd as apositive control．
AgarosegcIshowingthccthidiumbromidestainedpro−
ductsofRT−PCR・Lmcl，aneuraJculttm（41daysof
Culture）；lane2，e訂lyinmerv釦ionculmrew仙outmu5−
6lecontraction丘om20daysofmusclecu血redone
and21daysofco−CulturewithspiJlalcord；1ane3，early
inn餌Y飢ioncultu托undergolngCOnthuouSmuSCl￠COn−
traction危■Om27d町SOfmuscleculturealoneand31
d町SOrCO−Cul加代南瓜spindOOrd；1肌e4，10mg・tem
innerr叙ion血血rewi也outmuscleCOn知恵ons舟om17
daysofmusc］ccuIturealoneand59daysof

o−Cultrue

withspinalcord；1ane5，long・terminnervationculttm
皿dergolngCOntinuousmuscleco血adon舟om17d町S
muscleCu血redome的d59d町SOfco−Cy加代Wi也
Spina co止＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊国立水俣病センター
榊東京大学大学院生命環境科学−212−

な形態をとるようになった．脊髄片との併置培養下では，筋が全く収縮していない培養皿においても8−5ubunit
mRNAの出現が認められたが，†−SubunitmRNAの抑制は初期の併置培養では認められなかった．一方，持続的に筋が収縮している培養皿では，培養の経過と共にE・Subunit
mRNAの出現が増加し，†−SubunitmRNAの明らかな発現抑制が認められた．

あることが示唆された．しかし，筋が持続的に収縮している培養系では，培養の経過と共にe・SubunitmRNAの発現が増加し，†−Subunitの発現が抑制されることから，尭
全に†・Subunitからe−Subunitへ変換する発現調節には，筋収縮が大きく関与していると考えられる．筋の収縮，E・C
couplingに重要な役割を果たすと考えられている蛋白としては，骨格筋のTsystem上に存在し，筋細胞膜が脱分極した時に立体構造が変化し情報を伝えると考えられてい考るCachannelであるdihydropyridine受容体，またSarcoplas−察

今まで，発生学的に筋が神経支配を受けるとAChRは，

micreticulumからCaを遊離させるryanodine受容体などが†・SubunitからC−Subunitに変換が起ることが知られていた・
今回の我々のinvitroにおける実験により，ヒトの神経筋
接合部の形成に伴いAChRsubunitsのmRNAの発現は，他あり，これらの蛋白と関連したカルシウムによる細胞内の情報伝達機構が，†−SubunitからC−SubunitへのAChRsub−
unitsの変換に重要な役割を果たしていると推察される．

の哺乳類と同様にinnervationによって，†−SubunitからC・
subunitに変換が起ることが明らかにされた．この変換は，脊髄神経が添加されているが，筋が全く収縮していない系においても生じていることから，6・Subunitの発現には，筋の収縮活動は必要でなく，筋と神経との接触が重要で

文

献1）MishinaM，TakaiT，ImotoK，etal：MoleculaTdistinction
betweenfttalandadultformsofmuscleacetylcholinere−−213−

ceptor．Nah汀e32：1−6，1986・

ラット骨髄からの筋様細胞のクローン化
加

功■

■
・■

肘討

太征

岡中

松埜

●

ヂ﹂

弘雄

井藤

●
●
●
●

石後

●

子栄一

愛昭章

池川浦

菊古石

研究協力者

茂

＊
●
●
●
●

目

的

AChRの存在を同定した．免疫化学的筋蛋白の同定：家1個の受精卵から出発した生体細胞は多くの系列の臓器

兎抗ヒトmyosinHchainIgG，家兎抗ヒトa・aCtininIgGによるイムノブロッテイングで，筋特異的蛋白を同定した．
筋細胞の形態学的同定：電子顕微鏡によって筋構造蛋白を同定した．

や器官の幹細胞へと分化増殖し，そこからさらに，分化段階と増殖を繰り返し，最終的な機能を有する生体構成
細胞へと分化成熟する．各系列の幹細胞の起源と制御因子群は基礎並びに疾病治療の観点からも興味が持たれ，多数の報告がなされている．このなかでも，骨髄は成体型の血球系細胞が多能性造血幹細胞から分化増殖してくる器官として知られている．骨髄が，他の系譜の幹細胞を含有するのか否かに関しては，殆ど知られていない．
我々は骨髄浮遊細胞培養中に，希にストロマ細胞が骨格筋の様に敵合し，多核細胞に分化する現象を観察してきた．そこで，この様な細胞が骨格筋の特徴を持つ細胞へと分化する能力を有するのか否か，もしそうだとしたら血球系細胞と共通した系列から分化してくるのか，独立した筋への分化系列の幹細胞が骨髄に存在するのか等の疑問に解答する手段として，筋へと分化する細胞をクローン化し，その筋分化能について検討したので報告する．

結果と考察
骨髄細胞からの筋様細胞の発達：骨髄浮遊細胞を培養開始後，1週間目位から2−3核の細胞が観察される．この様な細胞には周囲に融合に参画する前の単核細胞も存在するので，数10個になった時点で，滅菌シリコングリー
スを付着させたペニシリンカップで，周囲の細胞と目的とする細胞をを隔離し，トリプシンで，目的細胞集団を回収し，さらに96穴マイクロプレートに1穴につき1個以下になるように培養し，数時間後に，1個入っている箇所をマークし，1〜2週培養し，3〜4核になる細胞を含むものをクローンとして，樹立．継代は，融合を避けるため2
日ごとに分散して維持した．骨格筋由来でないことを確認するために用いた空洞化した大腿骨からは細胞の増殖

材料と方法

は長期培養しても全く認められなかった．このことは樹立された筋様細胞は骨髄内から発達してきたことを示唆している．樹立細胞の生化学的，形態学的特徴：本細胞は対数増殖期には織維芽細胞様単核細胞として約24時間のサイクルで増殖し，分散継代せず長期培養すると，融合し，骨格筋と同様，長軸方向に伸展した多核細胞となる．この過程は10−100nMのデキサメサゾンの添加でより

動物：8日令ウイスターラット．大腿骨の分離：筋肉組
織から大腿骨を分離し，滅菌ガーゼで，残存筋組織片をこすりとり，数秒間エタノールに浸演後，バーナーの火
焔を瞬時通過させ，即時に，冷培地中に戻す．大腿骨の両端を切断後，予め用意したRPMI1640＋10％FCSを充たした23G針付き5ml注射器で，内腔細胞をフラッシュア
ウトして，細胞浮遊液を作成する．2度遠心洗浄後，細胞数を調整し，24穴プレートにてRPMI1640＋10％FCS中で培養．筋様細胞のクローニング：約1周間程培養後，非付着性細胞を洗浄除去し，ストロマ細胞中に融合する細胞集団を位相差顕微鏡下で確認し，ペニシリンカップで一次クローン化し，さらに96穴マイクロプレートで1〜2
週培養後融合能を指標に2次クローニングした．AChRのアッセイ：クローン化融合細胞を1％トリトンxlOOで可溶化し，125Ⅰ−αbungarotoxinの結合丑を測定し，nicotinic＊国立橋神・神経センター神経研究所
榊東京都立東大和療育センター＊＊＊大阪大学医学部附属病院
榊舶＊岐阜薬科大学＊■＊＊＊東京大学大学院総合文化研究科生命環境科学系

促進される．敵合した細胞を1％トリトンxlOOで可溶化し，家兎抗ヒトmyosinHchainIgG，家兎抗ヒトα・aCtininIgG
によるイムノブロッテイングでmyosinHchain，α−aCtininが確認でき，125Ⅰ・abungarOtOXinにより，nicotinicAChRの存在を定量的に確認した．さらに，電子顕微鏡による観察で，Z蛋白などの筋細胞固有の構造も観察された．以上のように，骨髄から筋様細胞としてクローン化した細胞は骨格筋へとして分化する性質を有していた．このこと
は骨髄が骨格筋に分化する幹細胞を含む臓器である可能性が考えられる．この様な幹細胞が，筋の再生分化にどの様にコミットするのか，血球系細胞と同一のさらに上流の幹細胞から分化してきたのか，または血球系細胞とは全く異なる系譜から分化してきたのか興味がもたれる．
ー214−

参考文献
1）KamoI，KikuchiA，IshiiH，MatsuokaT；FurukawaSand
Ishiura S：Establishement of myoid cells舟om bonemarrOW．CellBiologyInternationalReports14：595−600，
1990．

ー215−

ラット骨格筋再生過程におけるdystrophin，αsarcoglycan，
αlsyntrophin，nNOSの免疫組織化学的検討
庄

進

一＊

研究協力者 星 野 幸 子＊

大

越

教

亀

武

田

伸

谷

修

司

平■＊

夫＊

石

井

亜紀子●

一＊■

要 旨 カルジオトキシンを用いたラットの実験的骨格筋壊死再生過程におけるdystrophin（DYS），αSarCOglycan（αSG），αl syntrophin（αlS），神経型NOS（nNOS）の動態について免疫組織化学的検討を行った．再生筋の筋形質
膜においてDYS，αSGが最も早く3日後に形態学的に発現し，ついでαlSが5日後に，nNOSが最も遅く10日後に発現した．発現開始時期および全ての再生線経が陽性線維化する時期を検討すると，DYS，αSG，alSは筋線経のtypel，type2への分化の前に発現を終了し，nNOSはtypel，type2への分化とともに発現が進む特徴を認めた．
nNOSは再生筋線経のタイプ分化の結果，生ずる可能性が考えられた．
はじめに

次抗体は抗dystorphin抗体（DYS2lC−terminal：Novo castra社】），抗αlsyntrophin抗体（共著者武田，亀谷作製），抗ジストロフィン結合蛋白質は，細胞膜蛋白質群である
ジストロフィン結合糖蛋白質（ジストログリカン複合体，サルコグリカン複合体），細胞内蛋白質群であるシントロ
フィン複合体から構成される．神経型一酸化窒素合成酵
素（nNOS）は骨格筋の筋形質膜に存在し，Duchenne型筋ジストロフィーやmdxマウスではジストロフィンの消失とともに筋形質膜からのnNOSの消失が報告されており，筋変性と関連している可能性も示唆されている1）．動物実験
で，骨格筋壊死，再生におけるジストロフィン，ジスト
ロフィン結合糖蛋白質の発現，局在，両者の関係が検討されている．ラット骨格筋では，再生開始後の比較的遅い時期にジストロフィンが筋形質膜に発現したと報告されている2）．また，ジストロフィン結合糖蛋白質との関連
では，β・dystroglycanはジストロフィンよりも早期に発現したことから，ジストロフィン結合糖蛋白質はジストロ
フィンが筋形質膜に付着するための固定装置であると考えられている3）．
今回，我々はラット骨格筋再生過程におけるdystrophin（DYS），αl syntrophin（alS），αSarCOglycan（αSG），nNOSの発現，動態について免疫組織化学染色を用いて検討した．
対象と方法
8週齢のwister系雄ラットの右前脛骨筋にカルジオトキ
シン10llM，lmlを筋注し，壊死再生モデルを作成した．
コントロールは対側前脛骨筋に生理食塩水lmlを筋注し作成した．1，3，5，7，10，21，32日後に両側前脛骨筋を採取した．
凍結標本より81上の切片を作り，免疫組織化学染色は一次抗体（後記）反応後，ABC法，DAB反応にて施行した．一■筑波大学臨床医学系神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

αSarCOglycan（Adhalin）抗体（Ylem社），抗neuronalNOS抗体（Alexis社）を用いた．免疫組織染色性の評価は各日数において免疫組織染色性が弱陽性ないし陽性である再生筋線
経のうち比較的小さい20個の再生筋線経の直径を測定した．弱陽性，陽性の各々の平均直径を各免疫組織染色において経時的に表に示した．

結果

今回のラット骨格筋の再生過程における免疫組織化学
染色を用いた検討において，1日後はH＆E染色は薬剤浸潤部位では壊死に陥った線経と細胞浸潤が認められた．
抗αSG抗体，抗DYS2抗体，抗αlS抗体，抗nNOS抗体は壊死線経の筋鞘膜に染色されなかった．3日後（図1）にH＆E
染色では筋衛星細胞の浸潤を認め，少数の小径の再生筋
線経が出現した．抗αSG抗体で一部の再生筋線経の筋鞘膜が不連続に淡く染色された（弱陽性）．抗DYS2抗体では一部の再生筋線経で筋鞘膜が弱陽性に染色された．抗αlS抗体は再生筋線経の筋鞘膜に染色されなかった．抗
nNOS抗体は再生筋線経の筋鞘膜に染色されなかった．5
日後（図1）にはH＆E染色では，中心核を持つ小径の再生筋
線経が確認されるようになった．抗αSG抗体，抗DYS2抗体では再生筋線経の筋形質膜が弱陽性に染色された．
抗α1S抗体では抗αSG抗体，抗DYS2抗体よりも径の大きい再生筋線経の筋形質膜に弱陽性に染色された．抗nNOS抗体は再生筋線経の筋形質膜には染色されなかった．
7日後（図1）には，H＆E染色では中心核を持つ大型な再生
筋線経が認められるようになった．抗αSG抗体，抗DYS2抗体，抗αlS抗体は比較的小さい径の再生筋線経の筋形
質膜は弱陽性に染色され，大きい径の再生筋線経の筋形

一216−

質膜は連続性に明瞭に染色された（陽性），抗nNOS抗体は大きい径の再生筋線経の筋形質膜に弱陽性に染色された．10

はH＆E染色では正常径に近い再生筋線経の数が増加した．
抗αSG抗体，抗DYS2抗体で弱陽性に染色される再生筋

日後（図2）はH＆E染色では再生筋線経は中等度以上の径の再生筋線経が主体となった．抗αSG抗体，抗DYS2抗体
では弱陽性に染色される線経は消失しほぼ全てが陽性に染色された．抗αlS抗体は中等度の径の再生筋線経では弱陽性に染色され，比較的大きい再生筋線経の筋形質膜

線経は消失し，全ての再生筋線経が陽性に染色されるようになった．抗αlS抗体は弱陽性に染色される再生筋線
経はごく少数となり，ほぼ全ての再生筋線経が陽性に染色されるようになった．抗nNOS抗体では中等度の径の再に陽性に染色された．抗nNOS抗体では比較的大きい再生
筋線経の筋形質膜には弱陽性に染色された．14日後（園2）筋線経の筋形質膜は陽性に染色された．21日後（図2）はH＆E染色では中心核は残っているがほぼ正常径に近い再3日後

生線椎では筋形質膜は弱陽性に，比較的大きい径の再生

5日後

7日後

αSG

DYSZ

nNOS

図1カルジオトキシン筋注ラット生検筋におけるH＆E染色，各種免疫組織染色の経時的変化（×60；3日，5日，7日）

ー217−

生筋線経が主体となった．抗αSG抗体，抗DYS2抗体，
抗αlS抗体は弱陽性に染色される再生筋線経は消失し，期とその線維径を表にしたものが表1であり，ジストロフ
ィン結合蛋白質の中では，αSG，DYS2が最も早く，α15

全ての再生筋線経が陽性に染色されるようになった．抗
nNOS抗体では比較的大きい径の再生線経でも弱陽性に染色されるものを認めたが，陽性に染色されるものも増加した．図に提示していないが，各日数においてÅⅣ鮎e染が次ぎに，nNOSは最も遅く筋形質膜に発現した．なお，
表中の同日採取の再生筋線維平均径が各免疫組織染色により異なる理由は，計測した筋線経が壊死を免れた残存色を施行した・14日日頃から，サpel，明）e2への分化が確認されるようになり，32日目には明確になった．
以上の結果を各染色ごとに弱陽性，陽性線経の発現時

10日後

14日後

緑維ではなく，壊死後の再生筋線経であることはH＆E染色で確認しており，手技のうえでカルジオトキシンによる筋の傷害程度に差が生じてしまうため，各筋線維により再生速度にばらつきが生じたためである．

21日後

32日後

αSG

DYSZ

α1S

図2 カルジオトキシン筋注ラット生検筋におけるH＆E染色，各種免疫組織染色の経時的変化（×60；10日，14日，21日，32日）

ー218−

表

ラット骨格筋再生線経の免疫組織染色性
弱陽性，陽性を呈する再生線経の平均直径の経時的変化

筋 注 後 日数

3

5

7

10

14

21

32

弱 陽 性 αS G

5．
2≦

5．
3≦

12 ．
6 ≦

＊

＊

＊

＊

D Y S2

5．
7≦

5．
1≦

12 ．
6 ≦

＊

＊

＊

＊

α lS

−

12 ．
5≦

14 ．
2 ≦

13．
0≦

＊

＊

＊

nN O S

ー

−

2 0．
0 ≦

3 2．
0≦

28．
7≦

27．
4 ≦

32 ．
7≦

αSG

ー

−

2 0．
2 ≦

2 9．
0≦

22．
5≦

23．
3≦

2 0．
8≦

3 0．
2≦

30．
9≦

2g．
9≦

2 6．
1≦

3 7．
3≦

38．
6≦

26．
7≦

4 1．
g≦

ー

3 7 ．1 ≦

41．
3≦

4 6．
7≦

陽性

DY S2

−

−

2 8．
1≦

α lS

−

−

2 8．
8≦

nN O S−−−−：出現せず＊：弱陽性筋線経は消失し，陽性線維となった
免疫組織染色性の評価は各日数において免疫組織染色性が弱陽性，陽性である再生筋線経のうち比較的小さい20個の再生筋線経の直径を測定し，平均直径を経時的に表に示した．
より大きい筋線経も弱陽性ないし陽性に観察されており，≦を付記した．

結論および考察
今回のラット骨格筋の再生過程における免疫組織化学

再生線経のうち一部が陽性に染色された．この14日目の時点においてもαSG，ジストロフィン，αlSと異なり，染色を用いた検討において，ジストロフィン結合蛋白質の中では，αSG，DYS2が最も速く，αlSが次ぎに，nNOS
は最も遅く筋形質膜に発現した．塩酸プビバカインを用いたラットの実験的筋壊死後の筋再生過程に関する報告

大きい径の再生線経でも陰性線経，弱陽性線経が多数認められた．21日目，32日目と陽性線経の数は増加したが，大径の弱陽性線経，陰性線椎が混在した．32日日のÅⅣaseでは4），12時間日頃より貪食細胞が出現し，1日から2日後に食食細胞や分裂を開始した筋衛生細胞で満たされる．3
日後にはHEで好塩基性の胞体で大型の核をもつ再生線経として確認でき，5日から7日目には中心核を有する明らかな再生線維となる．この時期の再生筋は未分化でATP・
鮎e染色ではタイプ2C反応を示す．壊死後10から15日日頃には直径はほぼ壊死前に近くなり筋線維タイプも次第に分化し始める．ラットの白筋では21日日頃，赤筋では28
日日弓削こ完了する．今回の実験では，表に示すように，
αSG，Dys2は3日目に，直径5pと小さく，H＆E染色でも未熟な再生段階の筋線経に弱陽性に発現した．7日目には
直径20−30JJ程度の進んだ段階の再生筋線経に陽性に発現し，10日日以後は全ての筋線経において陽性に発現し染色ではt汀e2筋線経は陽性に染色された．これらの結果
から，nNOSはジストロフィン，ジストロフィン結合蛋白質と異なり，タイプ分化の途中で発現が始まり，タイプ
分化の終了した筋線経では，強い発現，弱い発現，発現しない線椎が混在することが示唆された．nNOSは筋線経のタイプ分化の結果に付随して生ずる可能性が考えられた．nNOSがt汀e2線経の筋形質膜に陽性に免疫組織化学
染色されることが報告されており5），上記の結果はこれに矛盾しないと思われる．
参考文献
1）BrenmanJE，ChaoDS，XiaH，etal：NitriCoxidesynthase
COmPlexedwithdystrophinandabsent丘omskeletalmus
Cle sarcolemmain DuchennemuscuIardystrophy．Ce11

た．我々の研究ではカルジオトキシンを用いて壊死を惹起しており条件が異なるが，ラットの筋再生においては

2）V如erR，CullenMJ，NichoIsonLVB，etal：Thefhteof

ジストロフィン，αSGは再生の極初期の段階から形態学

dystrophinduringthedegenerationandregenerationofthe

的に発現が開始し，tyPel，type2への分化前のタイプ2Cの段階で発現は進行し，t沖el，t汀e2への分化開始時には発現が終了している可能性が考えられた．αlSは5日目

82：743−752，1995．

SOleusmuscleoftherat．ActaNeuropath0183：140・148，
1992．
3）V如erR，HarrisJB，AndersonLVB，etal：TTleeXPreSSionに直径12．5FL，H＆E染色でもαSG，DYSiに比べ進んだ
再生段階の筋線経に初めて弱陽性に発現し，14日目に全ての再生筋線経が陽性となった．これらの結果からαlSの形態学的な発現の動向は，りpel，t汀e2への分化前に進行し終了する点ではジストロフィンやαSGと同様である
が，開始時期や終了時期はジストロフィンとαSGに比べ遅れると考えられた．nNOSは7日目に直径20Ilの再生筋

Of dystrophin−aSSOCiated glycoproteins during skeletal

muscle degenerationand regeneration．Animmunonuo−
rescencestudy．JNeuropathoIExpNeuro154：557・569，
1995．

4）槍澤一夫，埜中征歳，小沢瑛二郎：筋病理学．第1版，
文光堂，東京，1989，p65．
5）Kobzik L，Reid MB，Bredt DS，etal：Nitric oxidein

線経に初めて弱陽性に染色され，14日目に30〟と大きい−219−

SkeletalmuscIe．Nature372：546−548，1994．

筋ジストロフィーを中心とした生検筋におけるBc1−2hmilyの免疫染色
佐

研究協力者

衣

橋

斐

功リ■

達い■

張

桂

珍■

要 旨 細胞死関連蛋白であるBc1−2とその相同蛋白であるBcl・X，Baxの局在についてジストロフイノバチーを含む筋ジストロフィー生検筋において免疫組織学的に検討した．Bcl−Xは骨格筋線経には発現が見られなかったが，Bcl・2はタイプ2線経に強く染まり，再生線経に染まらず，一方Baxはタイプ1線経，再生線経に強く染まり，
Bc1−2とBaxがヘテロダイマーを形成し細胞死の抑制とその促進という相反した作用を有することと関連し，興味深い事実が得られた．
緒言

結bc1−2遺伝子はヒト濾胞性リンパ腫にみられる癌遺伝子

Bc卜2：対照筋ではタイプ2線維（とくにタイプ28線維）の細胞質に強く染まり核により漠染した．病的筋ではジスであるが1），Bc1−2蛋白は細胞死を抑制する蛋白2）であることが知られている．近年それに関連し，bcl−X】），b水4）な

トロフイノバチーではDMDでのBcl・2の筋線経への発現は乏しく，DMDcではBc1−2陰性線経がジストロフィン陰どが相同遺伝子としてクローニングされてきている．Bax
はBc1−2とヘテロダイマーを形成LBc1−2の細胞死抑制活性果

我々は本班会議で細胞死関連蛋白であるFas，Bc1−2の性であることが多くLG，MyDとも萎縮線経にBcl・2の強い発現が見られた（図1）．これらのミオパチーではタイプ
2C・再生線経への発現は乏しかった．また神経原性疾患
では萎縮線経に強く発現していた．
Bax：対照筋では筋線経が全般的に染まったが，細胞膜・ジストロフイノバチーなどの病的筋における局在を免疫核により濃染した．筋線維タイプではタイプ1線経がやや

組織化学的に検討してきた．今回はBcl−X，Baxの局在に濃染した・病的筋では再生線経に強く染まった（図2）．Bc1−2と連続切片で比較すると筋線経には相補的に発現していた（図3）．

を阻害する4）．Bcl−XはBcl・XLとして細胞死を抑制するが，細胞分化においてBc1−2とともに排他的に発現する3）とされている．

ついてBc1−2と対比し検討を行った．
方法

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD），Becker型筋ジス
トロフィー（BMD），DMD保因者（DMDc）などのジストロ

Bc卜x：対照筋病的筋ともに筋線経にはほとんど発現が見られなかったが，神経・筋接合部や末梢神経に発現していた（図4）．

フイノバチ一に加え，肢帯型筋ジストロフィー（LG），筋考

緊張性ジストロフィー（MyD），dmmedvacuole型遠位型ミオパチー（DMRV），慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO），多発細胞死抑制蛋白であるBcl・2は染色体18q21上にコードされ，ヒト温胞性Bリンパ腫の染色体転座点t（14；18）

筋炎（PM）と対照筋計70筋の生検筋を用いた．新鮮凍結連
続切片（8〟m厚）にてBcl−X，Baxに対する家兎多クローン察

modiLied Gomoritrichrome染色，myOSinÅⅣase pHlO．4，（q32；q21）の解析から同定された遺伝子（bcl・2：B−Celllym−
PhomaJleukemia・2）でありl），Fas抗原5）が細胞死（アポトーシス）を誘導するのに対し，それを抑制する作用を有する2）．
そしてbc1−2遺伝子から産生されるBcl・2蛋白は分子量

4・5，4・2染色およびABC法にてmyosinheavychainisoforms（neonatal，developmental，fhst，Slow）を染色した．

26kDaでありC末端には膜局在シグナルを持つ膜蛋白6）であり，ミトコンドリア膜の他に核膜，小胞体膜などに局抗体（SanbCmZ），Bcl・2に対するマウス単クローン抗体（D止0）を用いABC法にて染色した．対比染色として，HE，在するという2）調）．Bcl・2はリンパ系と神経系組続での発現が顕著であり，皮膚真皮の基底層や腸粘膜の腺寓などにも発現をみるが，骨格筋での発現は乏しいとされてい＊愛知医科大学第4内科＊■愛知医科大学加齢医科学研究所

る9）．Bcl・2にはBcl・X，Bax，Bad，Mc1−1などの数多くの相同蛋白が発見されてきている．Baxは分子量21．4kDaでありC末端には膜局在シグナルを持ち，Bcl・2とヘテロダ
ー220−

イマーを形成LBc1−2とは逆に細胞死を誘導する4）．またBcl・XはBc1−2と同様に細胞死を抑制するが，組織分布および発生段階においてBcト2とは異なった分布をする3）・10）．

再生線経に染まらず，一方Baxはタイプ1線経，再生線経に強く染まり，Bcト2とBaxがヘテロダイマーを形成し細胞死の抑制とその促進という相反した作用を有すること

Bc1−2の細胞内局在はミトコンドリア，小胞体，核膜な
どの膜・細管系に認められるというが2m8），我々の結果
はおもに筋形質と陽性線維核膜に発現していた．

と関連し，興味深い事実が得られた．これはBcト2は成熟リンパ球や神経細胞など長寿命を有する細胞に発現し未熟なリンパ球には発現しないという事実9はり，筋細胞もいっぽうBaxは筋形質と細胞膜・核により濃染した．
筋線経のタイプではBc1−2がタイプ2線経に強く染まり，

幼弱な再生線経には発現せず成熟筋線経には発現し，筋細胞の分化との関連が考えられた．

LG．Tl
●●

●

ll・′1
i

♪

サ屯．・一一÷
鋸−2

鴻一

l

】

W

mCl−ム

図1BcIJの各疾患筋における局在
DuchennC型筋ジストロフィーPMD）でのBc1−2の筋線経への発現は乏しく，DMD保因者pMDc）では
Bc1−2陰性線経がジストロフィン陰性であることが多く肢帯型筋ジストロフィー匹G），筋緊張性ジス
トロフィー（MyD）とも萎縮線経にBcト2の強い発現が見られた．

図3 Bc1−2とBaxの連続切片における局在の相違
対照筋（COntrOl）ではBc1−2はタイプ2線経にBaxはタ
イプ1線経に相補的に発現しており，Becker型筋ジストロフィーPMD）病でも両者は相補的に発現し
ている．

図2

図4 Bckの各疾患筋における局在
対照筋病的筋ともに筋線経にはほとんど発現が見られなかったが，神経・筋接合部や末梢神経に発現している．

Baxの各疾患筋における局在
Baxは筋形質が全般的に染まったが，細胞膜・核により浪染し，タイプ1線経がやや濃染した．病的筋では再生線経に強く染まった．

表 Bcト2B耽，Bcl−Xの筋組織における局在
Bc1−2

Bax Bcl．x

Typelnber
lype2負ber

再生腺維

＋／−

萎縮腺維
神経・筋接合部
末梢神経
血管壁

ー221−

またBcl−Xは骨格筋線経には軽度発現が見られるとされる10）が，今回の検討では発現が見られなかった．これは組絞分布における機能上の相違あるいは抗体の力価の相

5）Ybnehara S，IshiiA and YbneharaM：A cel1−killingmonoclonalantibody（anti・Fas）toacellsurfaceantigen
co−downregulatedwiththe receptor oftumOr neCrOSis
血ctor．JExpMed169：1747−1756，1989・

違が推察された．

6）TbttjimotoYandCroccCM：AnalysisofthestruCture，結桔
Bcl・Xは骨格筋線経には発現が見られなかったが，Baxはタイプ1線経，再生線経に強く染まり，一方Bcl・2がタ
イプ2線経に強く染まり，再生線経に染まらないことより，
Bc1．2とBaxがヘテロダイマーを形成し細胞死の抑制とその促進という相反した作用を有することと関連し，興味

tranSCripts，andproteinproductsofbcl・2，thegenein−voIvedinhumanfo11icularlymPhoma．ProcNatlAcadSci（USA）83：5214−52は，19g6．
7）KrqiewskiS，恥IakaS，ThkayamaS，etal：Investigationof
thesubcellulardistributionofthebc1−20nCOPrOtein：Resi−denceindlenuClearenvelope，endoplasmiCreticulum，and

深い事実が得られた．

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1993．

文

献

8）AboY；OtsukiY；KataokaS，etal：MultiplesubcellulaT

1）TbttiimotoY；CossmanJ，Ja晩E，etal：InvoIvementofthebcl・2geneinhumanfo11icularlymphoma．Science228：

localizaitonofbcl・2：Detectioninnuclearoutermembrane，endoplasmic reticulum membrane，andmitochondrial
mcmbraneS．CanCRes54：2468・2471，1994．

1440−1443，1985．

2）HockenberyD，NunezG，MillimanC，etal：Bcl−2isan

9）HockenberyDM，ZutterM，HickeyWetal：BCL2pro・

inner mitochondrialmembrane PrOteinthat blocks pro・teinistopo卵phical1yrestrictedintissueschamcterizedgrammedcelldeath．Nature348：334・336，1990．

byapoptoticcelldeath．ProcNatlAcadSci（USA）88：
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3）BoiseLH，Gonzalez・GarCiaM，PostemaCE，etal：bcl・X，abc1−2・relatedgenethatfunctionsasadominantregulator

10）KrqjewskiS，KrqjewskaM，ShabaikA，etal：Immuno・
histochemiCalanalysisofinvivopatternsofBcl・X ex・

Ofapoptoticcelldeath．Cel174：597・608，1993．
4）01tvaiZN，MillimanCLandKorsmeyerSJ：Bcl・2hetero・dimerizesinvivowithaconservedhomolog，bax，thatac・
Celeratesprogramedcelldeath．Cel174：609−619，1993．

−222−

PreSSion．CancRes54：5501，1994．

キマーゼを指標とした病的筋における肥満細胞の局在と臨床的意義
佐橋研究協力者 衣 斐

功＊・＝

達リ■

張

桂

珍■

要 旨 神経筋疾患の91四肢生検筋につきキマーゼ（Chymase）を指標とし肥満細胞の免疫染色を行なった．対照
筋に比し再生や細胞浸潤が多い病的筋の筋線維間に散在し，キマーゼはユビキチンとの一部対応性が示された．
またジストロフイノバチーや炎症性筋疾患に頻度が多く高活性であり，筋強直性ジストロフィーや神経原性疾患
では少なく低活性であった．骨格筋組織中の結合組織型キマーゼ陽性肥満細胞は組織破壊に伴い増加し，さらにアンギオテンシン系を介した慢性増殖性変化や筋内血流量の低下は病的筋の修復阻害を惹起するものと考えた．
ゆえにキマーゼの抑制すなわちACE阻害薬治療は，筋ジストロフィー（PMD）に対し有効である可能性が示された．
はじめに
Duchenne型PMD（DMD）の終末期には，心不全が予後を決定する場合が多い．そして一般的な心不全の治療を含みDMDにおける心不全の治療薬として，循環動態の改善面からアンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬1）・2）が報告されてきた．また近年ジストロフイノバチイーの治療選
択枝としては，他の側面より副腎皮質ステロイドの有効性3）・4）も指摘されている．
さてACE阻害薬はアンギオテンシンⅠ（AI）からアンギ
オテンシンⅡ（AⅡ）への変換に作用するが，各組織の障害
局所におけるAⅡ産生にはACEを介する産生系より，肥満細胞桝においてほぼ特異的に増殖・分泌（脱顆粒）される中性セリン・プロテアーゼであるキマーゼ（Chyma5e；
以下Chym．）がAI→AⅡへの変換により深く関与しているという叶9）．本報告はジストロフイノバチーを含む主に慢性経過を示す骨格筋疾患の生検筋標本において，肥満細胞におけるChym．を指標とした免疫染色を行い，その臨床的意義について考察した．
対象および方法
代表的な神経筋疾患のうち，文書にて承諾をえて実施
した保存期間の比較的短期間の91症例からの生検筋
PMD：DMD4，DMD保因者（DMD−C）4，Becker型（BMD）10，
肢帯型（LG）7，顔面肩甲上腕型（FSH）5，筋強直型（MyD）8，
rimmedvacuoleを伴う遠位型（DMRV）2，炎症性筋疾患（多発筋炎；PM5，皮膚筋炎；DMlO，封入体筋炎；IBM4，筋サルコイドーシス；SarCOidosis8，ミトコンドリア筋症（Mtを含む脊髄性筋萎縮症（SPMA）5】と対照筋6症例の四肢生検骨格筋（主に上腕2頭筋）の6J上m厚の横断凍結連続切片を用いた．
肥満細胞内のChym．に対する免疫染色は1次抗体としてヒト特異的な抗Chym．単クローン抗体（Chemicon；1：2，000
希釈）を用い，ABC法にて免疫染色した．なお本抗体に関
Ll次抗体を除く対照実験も平行して実施した．また細胞死関連蛋白（FasIgG；MBL，1：2，000希釈，Bcl・2；DAKO，
1：1，000希釈），組織適合性抗原ClassI：HLA・ABC（DAKO；1：2，000希釈），ClassI：HLR−DR（DAKO；1：2，000希釈），CD3（DAKO；1：2，000希釈）やCD68（DAKO；1：2，000
希釈）などの各種のリンパ球マーカーに加え，リンパ球分泌成分であるグランザイムA（荒畑喜一先生より供与；
1：2，000希釈）やパーフォリン（荒畑喜一先生より供与；
1：2，000希釈），さらに非特異的に細胞内に存在し時に増加するユビキチン（Chemicon；1：2，000希釈）などの対比染色も実施した．
ついでChym．陽性の肥満細胞を，直視下に全視野面積中の陽性数をカウントし，NIHイメージを利用し標本の全横断面積を計測し，単位骨格筋面積当たり（1mm2）のChym．陽性肥満細胞の頻度を各疾患毎に算出した．また染色に先立ちBMDおよび多発筋炎の生骨格筋材料のウエ
スタン・プロットを行い，MW約25，000のChym．の存在を予め確認した．
結果

骨格筋の免疫染色

Myop）4，低カリウム性ミオパチー（HypoK）4，原因不明

対照筋では全疾患筋に比較してChym．陽性細胞の頻度な急性骨格筋壊死症（ARムab）3，神経原性筋疾患【筋萎縮は少なく，また染色標本上では活性の領域（脱顆粒）も狭性側索硬化症（ALS）6，Kennedy病とCharcot−Marie・Tboth病＊愛知医科大学第4内科
榊愛知医科大学加齢医科学研究所

くかつ低く（図1Å−1），また一部はユビキチンに対し陽性を示した（図1A−2）．またChym．陽性部位とFa5抗原，Bcト2，
グランザイムA，Chym．やリンパ球マーカーであるCD3，−223−

CD68陽性細胞とも対応しなかった．

Marie−Tboth病を含むSPMAでは，MyD同様に筋線維間に存在した陽性細胞の活性は低く頻度も少ない傾向を示し

疾患筋の結果を以下に記す．DMDでは検索数が少なかったが，光頗上で極めてChym．高活性な陽性肥満細胞が多数観察されたが（園1C），Opaquef拍erとの関連はなかっ
た・また一部は強陽性のユビキチン（図1D）染色結果と対応したが，他の細胞死関連蛋白，免疫マーカーなどとはた（図2D）．
疾患別キマーゼ陽性肥満細胞の頻度（図3）
症例数の多い疾患での結果を強調するが，陽性細胞数の頻度はDMD，BMD，DMRVまた炎症性筋疾患で多く，MyDや神経原性疾患で低いことが確認された．なお疾患群と関連しなかった・BMDでもChym．陽性細胞は多く（図1B），
エビキチン染色の結果もDMDに類似であった．すなわちDMD・Cを除くジストロフイノバチーでは明らかにその頻度は増加していた．そして陽性細胞は主に筋線経に接したペリミジウム，エンドミジウム内の問質や一部血管周囲に存在した．なおDMD−Cでは頻度が少なかった．

対照群との比較では前者で明らかに分散も頻度も前者に高かった・骨格筋標本上の単位面積（1mm2）当たりのChym．
陽性肥満細胞の頻度は，多くは数個以内（最高値はPM）であった．なお疾患別の頻度差は大きかったが，陽性細胞が少なかったMyDでの結果は一般組織染色における再生・変性現象の乏しさとの関連が示唆された．しかし筋原性また神経原性の病因はともあれ，病的骨格筋中へ肥DMD，BMD以外のPMDまた自己免疫性炎症性ミオパチーのPMのMとIBMでも頻度は高く，陽性細胞はしばしば
筋束周辺領域のペリミジウムの結合組織内や血管に接し満細胞が程度差をもって増殖・脱顆粒化されていることが示された．

て出現していた（図2A）．またsarcoidosisでは多くはサルコ
イド結節に接して陽性細胞が観察された（図28）．なおこ
れら高頻度を示した疾患群は，一般光顕上では再生線経考や線維化傾向も多く，またマクロファージなどの細胞浸潤を認める疾患が多く，浸潤細胞の一部が肥満細胞であ察

肥満細胞は1889年Ehrlichにて塩基好性顆粒を有する細胞として発見され，その起源は骨髄系幹細胞からの前駆細胞から血中に入り組織に行き着き，線維芽細胞から分ることが示された．なお他のPMDでは，約半数のLGやDMRVでも高い出現をみた．

泌されるstemcell伽tor（肥満細胞増殖因子）により分化し成熟する5），10）・11）．肥満細胞は各種のサイトカインをはじめ
ヘパリン，ヒスタミン，プロテアーゼなどの多彩な炎症

一方，いわゆる筋原性疾患の中でMyDでは陽性頻度が低かった（図2C）．さらに神経原性筋疾患であるALS，Charcot−
A−Ⅰ・ニ
t

C

D

岬Chym ∴㍉㍉三一：、i￣ ∴i・坤D・坤軸園1対照筋とジストロフイノバチ一におけるキマーゼ・ユビキチン免疫染色
対照筋（Control）ではキマーゼ（Chym）陽性細胞は極めて少なく活性は低く（図1A−1）一部はエビキチン（肌iq）％色（図1A−2）と陽性所見と対応した（矢印）・Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）では高活性な陽性細胞が多数観察され（園1C），一部はユビキチン（Ubiq）陽性所見と対応していた（図1D）・BeckeT型筋ジストロフィーPMD）ではキマーゼ陽性細胞は主にエンドミジ
ウムやペリミジウム内で筋線経に接して多くは存在していた（図18）．Odginalm喝．通00−224−

修飾物質の宝庫であり12），動脈硬化などの線維性増殖や修復に対し中心的な役割を担うとされる7）￣13）．また肥満細胞内で合成・貯蔵・分泌されるプロテアーゼはトリブ
ターゼとChym．そしてカルポキシダーゼがあり，後2者は結合組織型に琴現し，固定化酵素として内因性プロテアーゼ阻害物質（Se叩in）や自己分解および他のプロテアーゼの攻撃から防護され細胞外空間で長期間にわたり酵素活性を発揮する7）．chym．は分子量約25，000の中性セリン・
プロテアーゼであり，Chymサブファミリーとしてカテ
プシンG，グランザイムとともに染色体14qlに近接してコードされ，炎症時に誘導され相互に協調して酵素機能を発揮するものという．またChym．の発現は遺伝子上で転写因子GATAにより制御されている14），15）
さてChym．はほぼ選択的かつ多量に肥満細胞（極一部はマクロファージや血管内皮のWeibel−Palade体に発現）で合成・貯蔵され7）・1 ），細胞外へ緩徐で持続的な脱顆粒（Piece−
meal脱顆粒）により放出される17）．chym．のin vitroの機能
は問質の線維化や血管の新生などを中心に極めて多様と考えられ，臨床的には動脈硬化や心肥大や高血圧症の発症などへの関与に注目されている7）．すなわち細胞増殖作用を有するペプチドのプロセッシング；すなわち潜在性の血管収縮因子（AIからAⅡへ）や血管収縮因子（ビッグ・エンドセリンからエンドセリンへ），またサイトカイン・
ネットワークへはIL−1〜6，m−α，INF−γなどへの作用，
またコラーゲン，フプロネクチンなどの関連細胞外マトリックスを限定分解する作用などを有するという．
つぎにChym．陽性肥満細胞は心筋や消化管の平滑筋を含む種々の組織への分布が報告されているが6），骨格筋の分布には触れられていない．今回のChym．の骨格筋免疫染色の検討では，肥満細胞は対照筋に比し高頻度に疾患筋に出現し高活性なChym．染色性がみられ，何等かの生理的役割を担っていることが示された．そして免疫学的異常や遺伝的筋膜疾患すなわち変性過程とともに再生現
象が強い慢性骨格筋疾患としてのジストロフイノバチ一，
DMRVまた炎症性骨格筋疾患，SarCOidosisなどの疾患により多かった．病的筋における肥満細胞に関連しては，筋形質膜ジストロフィン異常によるDMDについて問質内の線維性結合織・血管の増生また小径変性線維群の出現に対応した増加が報告されている岬．今回の検討ではDMD
症例数は少なかったが，その傾向を確認した．しかしChym．
陽性肥満細胞頻度はジストロフイノバチー以外の疾患筋にも多く，疾患特異性に乏しかったが，これは種々の役割を示す肥満細胞の性質を考えた時，当然の結果とも思
われた．

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攣Sarco．八園2 ジストロフイノバチー以外の筋ジストロフイと炎症性ミオパチーのキマーゼ免疫染色
自己免疫性炎症性ミオパチーである皮膚筋炎（DM）（図2A）では，しばしば陽性細胞はべリミジウム内の筋束周辺領域や血管周囲のペリミジウム内に出現していた．サルコイドーシス（S訂CO．）（図28）では，結節周辺部に多くが観察された．またこれら疾患では再生線経や結合織の増生，細胞浸潤が多い傾向があり，その中の一部が肥満細胞であることが示された．
筋強直性ジストロフィー（MyD）（図2C）や神経原性疾患筋である筋萎縮性側索酎ヒ症（ALS）（図2D）では，筋線維間に存在するキマーゼ陽性細胞の活性は低く頻度も少なかった．Origina】mag．戒00

−225−

（n）

16．5土2．8

4

＝

DMD

●● ●

●
●

9，3士3．9●

9、4土46● ● ●4．3±1．5−■●

3．6士1．4

含むユビキチン陽性所見は，肥満細胞内のChym．発現がユビキチンを介する蛋白分解の処理と関連していることが推察された．すなわちChym．の高活性肥満細胞がマク

8

●

●●

●

4

FSH
MyD

●−●

7

LG

●

0

●

る20）．しかし通常の組織化学染色ではユビキチンは明らかな染色性を示さず，故に肥満細胞においては対照筋を

4

4．8土1．8

DMD−C
BMD

命細胞内に存在することを考えると当然の結果と思われ

mean土SD

ロファージやリンパ球などとは異なる作用を示しており，

2

DMRV

●

●

14．8±3．0

ARhab

●●

● ●●

●
●

●

● ●■●

●

●

●

●

8．6土4．5

4．3土1．9

同薬のDMDに対する臨床効果も指摘されている訟）．他方，
免疫抑制薬であるアザチオプリンではDMDへ筋病理学変2．4土0．91020

ンが皮膚への抗炎症作用を示すことが報告され21），また

6

0

ll．1土7．0

3．9土1．4●■■−

Control

態などを臨床的に改善することが期待される．事実，免疫抑制薬で肥満細胞の阻害作用を有するサイクロスポリ

5●−●●●●● ●●●●

7．5土4．1

6

ALS
SPMA

●
●

●

13．6±9．6

●

8

●
●●

●

最後に更に強力なChym．に伴うAⅡ産生と脱顆粒の抑制
は，慢性骨格筋疾患におけるPMDの心血管系への循環動

4

旧M
Sarcoidosis

5．8士6．Ⅰ

0●DM

5．6士3．3

5PM

4．7土1．7

●

3

…

4

HypoK

4

− ●●

Mt Myop

筋病理組織の評価上のChym．染色の有用性を考えた．

化への有効性が否定されている23）．故により選択的な肥満細胞の抑制すなわち全身性の抗Chym．作用は，慢性骨格筋疾患の一部で，特に病理学的に再生所見が強い疾患

30

／m2

図3 骨格筋の疾患別キマーゼ陽性頻度
筋生検断面内の単位面積（1mmユ内）当たりのキマー
ゼ陽性肥満細胞を示す．
ジストロフイノバチー（DMD，BMD）や炎症性筋疾
患に多く，MyDや神経原性疾患で頻度が少ないことが確認された．なお疾患群と対照筋との比較では，前者に高く骨格筋障害との関連が示された．

群において治療の開発につながる可能性を考えた．
引用文献
1）MassieBM，KramerBLandTbpicN：Long−termCaptO−
Pri11therapyforchronic congestiveheart免ilure．AmJ
Cardio153：1316・1320，1984

さてChym．はAII産生に対し組織間で結合組織型に存在

2）田村拓久，渋谷統寿：Duchenne型筋ジストロフィー

し，AⅡを含む炎症修飾因子を介し血管などの慢性増殖の慢性心不全の治療にcaptoprilは有効である．神経性変化をもたらす．それは組織破壊に伴う二次的変化と内科42：22・26，1995

も考えられるが，MyDやMNDでは病理学的に骨格筋の変3）FenichelGM，FlorenceJM，PestronkA，etal：Long・term

性が存在するにもかかわらず肥満細胞の頻度は少なかっ

benem＆om predisonetherapyin Duchenne muscular

た・これはMyDやMNDでは筋病変部位に細胞浸潤が比較

dystrophy．Neurology41：1874−1877，1991．

的少なく，かつ筋線維また核の変化を含み再生への所見

4）Griggs RC，MoxleyRTiMendellJR，etal：Duchenne

も乏しく，さらにMyDでは分子遺伝学的にはミ トコンド

dystrophy：Randomized，COntrOlledtrialofprednisone（18リアDNA解析にて小欠矢も多く19），故にこれら疾患では

months）andazathioprine（12months）．Neurology43：

障害筋の再生現象が少ないことと関連しているものとも

520−527，1993．

考えた．すなわち細胞浸潤＋再生現象と肥満細胞の出現

5）EnerbackLandNorrbyK：Themastcells．CurrTbpとはおそらく相互に関連し，肥満細胞から分泌される

Pa山0179：169−204，1989

Chym．は組織破壊に伴い出現したマクロファージやリン6）UrataH，StrobelFandGantenD：Vndespreadtissuedis・パ球などとサイトカイン・ネットワークを構成する細胞

tributionofhumanchymase．JHypertens12（SupP19）：

成分と協調し，骨格筋病変の修復や障害の一端を担って517−522，1994．

を含む各種の顆粒は線維芽細胞に取り込まれ，線維芽細

7）奥西秀樹，塩田直孝：特集；循環器系と免疫．動脈硬化と肥満細胞．免疫薬理13：29・34，1995

胞のコラゲナーゼ発現を誘導して細胞外マトリックスの

8）ReillyCF；TtwsksburyDA，Schecht占rNM，etal：Rapid

いることが示唆された・事実肥満細胞から遊離したChym．

構築を改変し，線維化（障害機構？）も引き起こすという刀．

COnVerSionofangiOtensinItoangiotensinlIbyneutrophil

一方，Chym．はAⅡ産生を介して筋萎縮に伴う骨格筋組絞内の血流異常を助長し筋修復機構を障害する可能性があaJldmastcellproteinases．JBioIChem257：8619−8622，

る・これは臨床的には本現象に抗するACE阻害薬とサイ

9）宮崎瑞夫，守口知則：アンジオテンシンⅡの産生酵トカインなどを抑制する副腎皮質ステロイドの有効性を

素−ACEとキマーゼ．日和田邦男，猿田享男（著者）：
アンジオテンシンⅡ受容体括抗薬．東京，医薬ジャーナル社．1996．ppl1−21．

1982．

支持する結果とも考えられた．
またChym．染色は一部のユビキチン陽性細胞と対応したが，ユビキチンが蛋白の分解と処理に関わり全ての生ー226−10）DenburgJA：Vasophilandmastcelllineagesinvitroand17）UrataH，BoehmKD，PhilipA，etal：CelluIarlocalization
and reglOnaldistribution ofan angiotensinlI−forming

invivo．Blood79：846−860，1992．
11）Ga11iSJ，TtaiMandWtrshilBK：Regulationofmastcell

chymaseintheheart・JClinInvest91：1269・1281，1993・

proliftration，maturationandfunctionbystemcellfactor；18）GorospeJRM，TharpMD，HinckleyJ，etal：Arolefbr

aligandforthec・kitReceptozIIntArchAllergyImmuno1

mastcellsintheprogressionofDuchennemuSCulardys−

99：234・237，1992．

trophy？・Correlationsin dystrophin・dencient humanS，

12）GalliSJ，GordonJRaJldWershilBK：Cytokineproduction
bymastcellsandbasophils．CurrOpinImmuno13：865−

dogs，andmice・JNeuroISci122‥44・56，1994

19）SahashiK，恥nakaM，ThshiroM，etal：Increasedmito・chondrialDNAdeletionsinskeletalmuscleofmyotonic

873，1993．

dystrophy．Gerontology38：18・29，1992・

13）SchellinglミFischerHandGantenD：Angiotensinandcell
grow山：alinktocardiovaSCularhypertrophy？．JHyper−20）RawnJD（川上 潔訳）：Biochemistry（ローン生化学）・
JDavidRawqEd（監訳：長野

tens9：3・15，1991．

敬，吉田賢右），医学書院，東京．1991，pp942−955．

14）CaugheyGH，SchaumbergTH，ZerweckEH，etal：The
humanmaStCellchymaSegene（CMAl）：Mappingtothe21）StelIato C，de Paulis A，CiccaTelli A，et al：Anti−

CatePSinG／訂anzymegene Clusterandlineage・reStricted

infkmmatorye飴ctofcyclosporinAonhumanskinmast
Cells．JInvestDennato198：800−804，1992

expression．Genomics15：614−620，1993．
15）WoodardSL，JacksonDS，AbuelyamanAS，etal：Chy・22）SharmaKR，MynhierMAandMillerRG：Cyclosporine

mase・directedserineproteaseinhibitorthatreacteswitha

increasesmuscularforcegenerationinDuchennemuscu−
lardystrophy．Neurology43：527−532，1993．

Single30−kDagranzymeandblocksNK−mediated cyto−23）KisselJT；小nDJ，RammOhanKWetal：Mononuclear

toxicity．JImmunol153：5016−5025，1995．
16）JenneDE，TbchoppJ：AngiotensinⅠⅠ−formingheartchy−

Cellanalysisofmusclebiopsiesinprednisone−andazathi・

maseis amast−Cell−SpeCific enzyme．BiochemJ276：

OPrine・treatedDuchennemusculardystrophy・Neurology

567−568，1991，

43：532・536，1993．

−227−

多発性筋炎の生検筋におけるTNTα発現−insituhybridizationによる検討−
永 松 正 明■

研究協力者

目

久 留
犬 飼

聡●
晃■

梁
祖父江

亦

邦書
元＊

高

野

結

的

多発性筋炎（PM）における筋障害は細胞障害性T細胞によるとされており，その過程にmFαの関与が想定されているが明確な証明はない．今回insituhybridizationを用いて筋組紋におけるmFαmRNAの発現を調べ，その病態形成における役割を検討した．

明

美◆

果

PM12例，DM5例全例にTNFαmRNA陽性の浸潤単核細胞が認められた．TNFαmRNA陽性浸潤細胞の比率はPMとDMとで比較すると，全体でみても部位別でみても有意な差はみられなかった（図1）．Endomysiumとperimysiumとで比較すると，PMではperimysiumの方が比率が高く，DMでは差がみられなかった（図2）．

対象・方法

PMでは単核細胞が非壊死線経を取り囲み浸潤する像

対象はPM12例（男性7例，女性5例，平均61．8±14．5歳），
皮膚筋炎（DM）5例（男性2例，女性3例，平均54．0±10．5歳）．
生検筋より10〟mの凍結切片を作成して以下の方法によ（図3a）がみられたが，この場面における浸潤細胞の中にりinsituhybridization（ISH）を施行した．TNFαmRNAに対するオリゴDNAプローブ（48mer）を4種類作製しジゴキシのとがみられた（図4）．またこれらの細胞は免疫染色におTNFamRNAの発現（図3b）を認めた．これらの細胞にはCD鋸TNFa二重陽性のものとCD68rrNFα二重陽性のもいても抗TNFα抗体にて陽性に染色された（図3C）．

ゲニン（DIG）で標識した・4％PFAnBSで固定し，0．2NHCl，proteinaseKにより前処理を行なった後42℃にて一晩hy−
bridizationした．2×SSCで洗浄後，アルカリフオスフア
ターゼ標識抗DIG抗体を反応させ，X−Phosphate朋BTで発色を行なった．対照としてセンス・プローブを用いたISH
を連続切片に対して施行した．一部の症例ではmFα
mRNA陽性細胞のphen吋pe解析のため免疫染色による二重染色を施行した・二重染色はISH終了後に抗CD8，CD68に対するモノクローナル抗体を用いてABC法により行った・さらにTNFαに対するモノクローナル抗体を用いた免疫染色も行った．計数は筋線維500本当たりの全浸潤細胞数，およびmFα陽性細胞数を測定し比率を求めた．

考察

炎症性ミオパチーの浸潤細胞におけるTNFαの発現を調べた研究は，これまでに免疫染色l）やRT・PCR2）を用いて検討したものなどいくつかの報告があるがinsituhybridi・
ationを用いたのは本研究が初めてである．報告により結果がかなり異なっており，特に免疫染色での結果は灯＿PCRやわれわれのinsituhybridizationの結果と比較して陽性細胞のみられた症例数が少ない傾向がある．これはTNfαが分泌性の蛋白であるためmRNAレベルでの発現と蛋白レベルでの発現とに解離があり，それを反映したものと考えられる．この中でTNFαのPMの病態機序における役割について言及したものは恥teryamaらの報告1）のみであり，筋萎縮との関係を推定している．

8

8

弔

0

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0
3

0

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8 8

08

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35

●

0
−

0

柑

0 〇 二 〇日PMDM

％約70的〜0叫30孤柑

％棚

％

DM

N．S．
0

0
0

図1浸潤細胞に占めるTNfα陽性細胞の比率

一228−

0

0

0
0

PM

Endomyslum＊名古屋大学医学部神経内科

毒

DM

Perimy引umPく0．05

N．S．

％
0
6

0

0
5

0
0
4

0

0

0
0

0
0

EndomySium Perimyslurn

Endomys，Um Perimyslum

PM
図2

DM

TNFα陽性細胞の比率の部位別比較

本研究の結果に基づいてmαのPMの病態機序における役割を考えると，まず第一に筋障害への関与が挙げられる．PMは細胞性免疫機序が関与することが知られおり，、 二．∫「」もl

巨．

導′蚕

a．HE b．ISH
C．町PE三U●▲Ull▼ による免疫染色
国3

非壊死腺経に浸潤する細胞におけるTNFα発現

その筋障害は細胞障害性T細胞によるMHC拘束性細胞障害であると考えられている．CD8陽性細胞が非壊死線経に浸潤する像はPMに特徴的な所見であるが，そのCD8陽性細胞にmFαmRNAの発現が認められた．これはTNF
αがPMにおける筋障害に関与することを強く示唆するものと考えられる．従来細胞性免疫における細胞障害性T細胞による細胞障害の機序に関してはpe血rinや騨m2ymeのexoc叩OSisによる経路とFa5−FasLの関与する経路の二つが考えられてきた．最近これ以外にTNFαが関係するとの報告が出ており，我々の結果もそれを支持している．
しかし細胞障害機序が異なるとされるPM，DMいずれにも同様の発現がみられること，endomysiumよりもperimy−
Siumで陽性細胞の比率が高いという結果が出ており，筋障害以外の作用についても今後検討する必要がある．

a．TNFα＋CD8

b．TNFα＋CD68

図4 TNFα陽性細胞のサブセット

参考文献
1）T如eyamaM，NaganOI，etal：Expressionoftumornecro・Sis fhctor−αin muscles ofpolymyoSitis．JNeuroI Sci
146：45・51，1997．

2）Andreetta F，Bernasconi R Tbrchiana E，etal：T cell
inmtrationin polymyOSitisis characterized by co・
expression ofcytotoxicand T−Cell activating cytokine

tranSCripts．AmNYAcadSci756：418−420，1995．

ー229−

多発性筋炎におけるMHCclassⅡ分子の発現に関する研究
祖父江

研究協力者

目

犬 飼
高 野

明

元■

晃■ 久 留
美＊ 梁

的

亦

聡■
邦書

②pM群，NC群それぞれの筋組織におけるmRNAの発現

多発性筋炎が自己免疫性疾患であることは以前より多畳は（relativemit），CIITA：84．80±32．23，60．57±11．61

数の事実，実験結果の報告から明らかにされてはいるが1），（p＜0・05），HLA−DMB：158．79±111．51，59．47±19．95（p＜0．01），

いまだその自己抗原を含めpathomechmiSmは明らかでは

Ii：246・34±189．42，62．21±21．37（p＜0．01），HLA・DRA：117．45

ない．今回，多発性筋炎患者の生検筋組織の筋細胞での±110．36，41．23±20．29（p＜0．05），IFN・γ：138．17±133．54，

MHCclassII分子発現の状態及び抗原提示に必要とされる
種々の分子を観察することを通して筋細胞自体の炎症機29．00±14．94（p＜0．01）であり，いずれのmRNAもPM群でその発現畳は増加していた．

転への係りを検討した．

③各々のprimerによるPCRで，筋細胞のsubsarcolemmaを中心に染色される陽性線椎と推察されるものがPM群に存対象在した（図2）．

ConventionalCriteriaに基づき診断された多発性筋炎患者（PM）20例2），非炎症性神経筋疾患患者岬C）6例より診断目的で得た生検筋組織とそれより抽出したmA．
方

考

察①の結果より，PMでは，その筋細胞膜上に正常では発現されていないMHCclassⅡ分子が発現していることが確認

法された．そのclassⅡ分子発現は②の結果から，Im−γに①Immunohistochemistry：・凍結生検筋より，厚さ8FLmの切片を作製し，抗HLA−DR（MHCclassⅡ）抗体を一次抗体

よりup・regulateされたもので，PrOfessionalantigenpresent・
ingcellと同様に，CIITA，HLA・DM，Iiの各分子の発現が伴とし，ABC法を用いDABで発色する免疫染色を行った．

っていることが推察され，③の結果より，それら分子が②semiquantitativeRT・PCR：PM16例，NC6例の筋組織よ筋細胞で産生されていることが推察された．以上の事実

りTRIzolを用いてtotalRNAを抽出し，ClassⅡtranSaCtivator

は，PM筋において，筋細胞はpro危ssionalantigenpresenting
Cellと同様の機序で，充分な抗原撞示能を持つClaSSⅡ分子（CⅡTA），HLA−DMB，InYariantChain（Ii），HLA・DRA，IFN・γ，β・aCtinのprimerを用いsemiquantitativeRT・PCRを行った．

を発現し，筋細胞それ自身が炎症を惹起させている可能あらかじめ各々のprimersetにおいて定量された初期投与性を強く示唆しているものと考えられた．

ClonedPCRproductを用いPCRを施行し，そのproductのgel
上のbandの濃度をNIHimageにて解析し検量線を作製した．

結その検量可能範囲において各RNAsampleのPCRproductを同方法にて定量し，そのniRNA発現畳をβ−aCtinmRNA発

べく抗原提示を行っている可能性が考えられた．

論

PM患者の筋組織において，筋細胞は炎症を惹起させる

現畳との比（relativeunits）で表現した3）．
③InsituRT−PCR：凍結生検筋より切片を作製．3％PFA

dUTPを含むPCR反応液にてPCR施行．AP標識抗dig抗体を反応させ・NBT／Ⅹ−Phosphateにて発色した・Negative
COntrOlとしてRT反応を除いたものを用いた4）．
結Polymyositis
DuchennemusculaTdystrophy
Beckermusculardystrophyfhsioscapulohumeral
myotonicdystrophy

果①pMでは19／20例，NCでは0／6例が筋細胞膜でHLA．DRが陽性である筋線経が存在した（図1，表1）．

amyOtrOPhiclateralsclerosis
Splnalmuscula丘aけOphy

一■■▲

incubation・3■primerを用いてRT反応後，各primerとdig−11・

表1HLA−DR陽性筋細胞頻度

犯肌肌∽∽∽∽M

にて固定後，PrOteinaseK処理し，DNaseIで42℃，OVemight

nomalcontrol

HLA−DR陽性筋腺経の存在する筋サンプル数／検索サンプル数＊名古屋大学医学部神経内科

ー230−

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、も予

図1HLA−DR染色
A陰性コントロール，B多発性筋炎，CDuchenne型筋ジストロフィー，DBecker型筋ジストロフィー，E顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー，F筋緊張性ジストロフィー，G筋萎縮性側索酎ヒ症，H脊髄性筋萎縮症（Scalebaris50pm・）

図2

多発性筋炎患者の筋組織におけるhsituRT−PCR
A CIITA，B HLA−DMB，CIi，D HLA−DRA，E CITTAの陰性コントロール，FI皿A−DMBの陰性コントロール，GIiの陰性コントロール，HHLA−DRAの陰性コントロール（Scalebaris50pm．）

参考文献

3）RieckmanftAlbrechtM，KitzeB，etal：Tbmornecrosis1）RoweDJ，IsenbergDA，McdougallJ，etal：Characteriza−

血ctor−ameSSengerRNAexpressioninpatientswithre−tionofpolymyOSitisinmtratesuslngmOnOClonalantibodi−

lapsmg−remittingmultiplesclerosisisassociatedwithdis−

estohiman1eucocyteantigens．ClinexpImmun0145：
290・298，19g1．

easeactivity．AmNeuro137：82−88，1995．
4）PatelVG，Shum−SiuA，HenifordB町etal：Detectionof2）BohanAandPeterJB：PolymyOSitisanddermatomyositis．

epidermalgrowmfactorreceptormRNAintissuesections

NEnglJMed292：344−347，403−407，1975．

丘ombiopsyspeCimensuslnginsitupolymeraSeChainre−

action．AmJPathol144：7−14，1994．

−231−

McArdle病における虚血運動時の血管収縮物質の動態
依 藤 史 郎■研究協力者

平 野 千 景＝
草 野 恵美子■

中 西・

史■■

今

之■●

岡

弘

要 旨 McArdle病で前腕虚血運動負荷試験を行なうと，運動終了直後に肘静脈より採血した血液中のノルエビ
ネフリンが過剰に上昇していた．この結果は先に行った近赤外分光法による酸素モニターによって示された，運動後に筋肉内血流が低下し酸素回復が遅延するという結果と生化学的に合致すると考えた．
はじめに
近赤外分光法による酸素モニターにて筋内の酸素動態を調べるなかで，McArdle病では前腕虚血運動後に筋内の酸素回復が遅れており筋内血流の回復が障害されていると考えられる結果を得た1）．そこで血管収縮物質の変動
を虚血運動前後で測定した．
方に，何らかの原因で血管が収縮して血流がすぐに回復していないことを示しているのではないかと考えた．そのため候補に上がる血管収縮物質を経時的に測定したとこ
ろノルエビネフリンが有意に過大に上昇を示した．すな
わちこの度測定した物質のなかではノルエビネフリンのみが虚血運動と関連して著しい上昇を示し，今回兄い出した酸素濃度の変化をうまく説明出来ると考えられた．
なおこの他の血管収縮物質としては，アンギオテンシ

法

虚血運動負荷試験を行い経時的に静脈採血して血管収縮物質の測定を行った．すなわち15分間の安静の後，前腕で2分間semi−ischemicexercisetestを行い，その前と直後，2分後，4分後，6分後に前腕肘静脈より経時的にEDTAを加えて採血し，nOrepinephrine，ePinephrine，dopamine，ンⅡ，ADPとJmP2purinereceptor），バソプレッシン，
トロンボキサンA2，セロトニン，ムスカリン，ヒスタミ
ンなどが知られているがいずれも骨格筋中では大きく関与しているとは考えにくく測定の対象には含めなかった．

及びendothelin（1・21）の変動を測定した．測定方法はnorepi・本症を含め解糖系酵素欠損による代謝性ミオパチーは，
虚血運動負荷中から後に有痛性筋拘柘や筋のこわばりを

nephrine，epinephrine，dopamineはHPLC，endothelinはELISAで行った．

感じるとともに横紋筋融解を生じることがあるが，この現象のメカニズムは十分には明らかにされていない．今
4
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0

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8
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6
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O

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O

2分後で著しい上昇を認めた（図1）．しかしその他の4物質については，epinepMneは正常対照でも変動しており両

2

norepinephrineであった．正常対照に比し運動負荷直後と0

結果
測定した4種類の物質の中で有意な変動を示したのはO

2●者の間に差は認めず（図2），dopamineも殆ど変動を認めな

O

4
■
O

かった（図3）・endo山elinも同じく変動を認めなかった（図4）．

●

6
O

考

察

図1ChangCSOfplasmanorepincphrinea鮎rsemi−ischemic
eXerCISeMcArdle病の骨格筋に近赤外酸素モニターをつけて前■∈＼巴50 00 30 20 10

腕虚血運動負荷試験を行い正常対照と比較したところ，組織の相対的な酸素濃度は運動中までは対照と変らなかったが，運動終了後元の値に戻るのがきわめて遅くなっていることを兄い出した1）．このことは運動が終了し上腕ー◆−COntrOl1−1トーCOntrO12−戚「・COnt「813−★−COnlrOt4

での虚血負荷も解除されて本来なら正常対照の様に血流が回復して組紋の酸素濃度も回復しなければならないの＊大阪大学医学部保健学科生体情報学＊＊大阪大学医学部看護学■■l■・．McArdle

図2

ChangCOfplasmacpinephrineleYCla鮎rsemi−ischemic
eXerCISe

−232−

盲︑冨
■
●

009080706050の3020柑0102050

回認められた血管の過剰収縮による血流障害及びその結果として生じる持続性の低酸素状態が，筋拘緒や筋崩壊を生じさせているのではないかと考えられた．
一・◆−COntr011−1トCnOtrO12

結・・・・ござ−CnOtrOl：！

−づ片−MCA「dle論

McArdle病では虚血運動後に血流が回復せず，過剰な−うヰ・．COntr014

血管収縮が見られその時期に一致してノルエビネフリンが有意に上昇した．

−

図3

文

Changes of plasma dopamine aRer semi−ischemic

献1）依藤史郎，阿部和夫，松尾善美ら：近赤外光法による代謝性ミオパチーの運動筋内酸素動態．平成8年度

eXerCISe1

厚生省精神・神経疾患研究委託費による研究報告集，

0＿8

国立精神・神経センター：p．226，1997．

盲0．6
、ヽ

−◆一一COnt「011⊂〉−−日−COnt「012∈ 0．4−ふHCOnt「0130．2−うそ−COnt「8140−づ貯・．McA「dle

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minutes

図4

Changc of plasma endothelin aAer semi−ischemic
eXerCISe−233−

筋疾患における近赤外分光法酸素モニターの臨床的有用性の検討

部岡

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和弘

●
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阿今

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景悟子

千

史

藤

依
●

美
恵

野上野

平井草

研究協力者

要 旨 代謝性筋症を中心に種々の筋疾患に対して，近赤外分光法による酸素モニターの臨床的有用性について分析した．解糖系障害及びミトコンドリア異常の病態を反映した筋内酸素動態を非侵襲的に測定出来ていると考えられる結果が得られた．特にMcArdle病では虚血運動後に筋内の血流が低下しており酸素回復が遅延していた．
本検査はエネルギー代謝病や関連疾患の病態解析，経過観察，治療効果判定に役立つと考えられた．
はじめに

1：完全虚血2分間での酸素消費速度と虚血解除後の酸素回復速度，2：Semi・ischemiCforeamexercisetestで，中間血圧で上腕を圧迫しながら2分間最大力で握力計を繰り我々は本研究班において筋疾患に対する近赤外分光法
による酸素モニターの臨床的有用性を検討した．本検査の長所は非侵襲的に生体組織内の酸化還元状態の変動を
リアルタイムに測定できることであるが，測定開始時からの変動を測定するので絶対値が求まらない欠点がある1）．

返し握る運動を行い酸素消費と回復速度を測定した．
グラフの黒線は組織中の酸化ヘモグロビンから還元ヘ
モグロビンを引いたものであり，組絃内の酸化還元状態の指標となり酸素が減ると値が減少する．一方破線は酸

これらの点をふまえ筋疾患に負荷試験を行いながら測定を行った．

化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの和で組織中の血液量の指標となり血液量が増えると値が増加する．

対象と方法
対象は代謝性ミオパチーを中心に各種の筋疾患で検討した．

結方法はオムロン社製酸素モニターHEO．200を用いた．
ゴム製の板にプローブがはめ込んであり，測定原理はプ
ローブに付いた発光ダイオードから特定の波長の近赤外光がパルス状に出て組織内を通過しフォトダイオードがついた受光部でその吸収値を経時的に測定するものである．近赤外光は生体組紋による散乱が比較的少なく，また生体を透過しやすい性質がある．測定時の光路は発光部と受光部を結ぶバナナ型の部分であり平均の深さは発光部と受光部の距離の約半分になるので今回使用したプ
ローブでは3cm間隔のため約半分の1．5cmの深度までの測定になる．筋組織内の酸化及び還元ヘモグロビンの変動を2波長法の原理で測定するようにソフトが組み込まれている．
握力計を握る際に収縮する筋肉で皮下脂肪の少ない部
分の上にプローブを装着し，皮膚に密着させて運動中ずれない様に巻き付け，ベッド上安静でベースライン値を取り込んだ後に以下の2つの条件で測定した．
■大阪大学医学部保健学科生体情報学＊＊大阪大学医学部神経内科＊＊■大阪大学医学部理学療法部

果

正常者では安静虚血時には酸素消費はほぼ直線状に進んだが，McArdle病では完全虚血開始後徐々に酸素消費速度は遅くなった．組織中に残った酸素の利用が障害されていると考えられた．McArdle病で2分間完全虚血後にどの程度酸素消費速度が遅くなるかを見るためにグラフ上に初速度のままで直線を引き2分間虚血にした時点での実測値との差を見ると，正常対照は殆ど0となり虚血開始時の酸素消費速度のまま直線状に進んでいくが，McArdle
病では明らかに酸素利用が障害されていた（図1）．
一方semi・ischemicfbre訂meXerCiseテストをMcArdle病に行うと，終了後に筋組織中の酸素が正常者ではすぐに回復するのに比べ明らかに遅延していた（図2）．これは平成9年度に報告したが，虚血下で運動すると血液中のノルア
ドレナリンが過剰に上昇しており筋肉内の血管が収縮して血流速度遅延を生じたことに対応した結果と考えられた．以上の結果は時期を空けて繰り返したが同様の結果を示した．
次にミトコンドリアミオパチーのなかで極めて稀な
TCAサイクルの障害であるコハク酸脱水素酵素欠損症（SDHdenciency）について検討した．本検討時41才の女性で，病歴は29才頃から近位筋の筋力低下によると考えらー234−

れる運動機能障害が徐々に出現し，膝の痛みのため整形外科で測定したCKが5427と高値を示したため，約4年前に近医へ入院し筋生検などの精査を行った．筋生検の結ハク酸シトクロムC還元酵素も低下していた．一方NADH

果は組織化学染色でコハク酸脱水素酵素の染色性が低下していた．近医より紹介を受け白血球を用いて測定した
ミトコンドリア関連酵素活性はコハク酸脱水素酵素活性

このような生化学的異常を持つ症例に本検査を行なった．

とともにミトコンドリア内膜電子伝達系複合体2であるコ

めて軽度に遅くなったのみであった．一方握力計を3回最シトクロムC還元酵素活性は正常であり，TCAサイクルのクエン酸合成酵素活性は正常対照より高値を示していた．
臨床病型はlimb−girdle型を示しており，酸素モニターによる完全虚血時の酸素消費速度は開始後約1分半頃から極

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図1

CPEO549日

SDHdeficiency41y．F

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SDHdeficiency4ly，F20％

5exerciseinmitochondrialmyopalhy．

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910111213（m行り●rnitochondrialmyopathy（つhealthycontrol

図3

図4

−235−

の理由として次の2つの可能性が考えられた．1つは筋肉内の酸素が消費されてしまったというもの．もう一つは酸素を利用して分解される基質がなくなってしまったこ

Diffe「encialvalueofmuscTedeoxygenationrate
betweennitialandfinalstateinanoxic．oading・●muotonicdgst「op旬−！−

he州hりCOntrOl（m…n土SD）とである．正常対照のデータから組絃内酸素はまだ十分に残っていると考えられるのではじめの可能性はないと思われ，2つ目の駆血後3分頃から酸素を利用する基質がなくなった所謂燃料切れの状態になったと考えられた．
￣

：l

●●

●

本症では従来から嫌気性解糖のみでなく好気性解糖も障害されている2）といわれており，筋内のグリコーゲンは分解されないので，血液からブドウ糖などの基質が持続的に供給されなければ筋肉内の基質が枯渇してしまう可8％

図5exercisetestを行なったところ，2分間の握力計を反復握能性が考えられた．ただ一般的には安静時は解糖系よりも脂肪酸の分解でエネルギーを得ているといわれているので本症ではこの点に興味がもたれる．
CPEO患者では酸素濃度は徐々に低下していくものの正常対照と比べて低下する速度がおそく酸素の利用が悪る運動中も酸素の低下はわずかであった（図3下）．本例ではミトコンドリア電子伝達系のNADH oxidationは保たれいことを示していた．このデータは検査している部分の筋肉内ミトコンドリアの酸化的リン酸化の速度をそのまているがコハク酸脱水素酵素の活性低下によりTCAcycleの代謝の流れが障害され結果としてはNADHが産生されないことを示している結果と考えられた．

ま反映していると考えられた．しかし四肢の筋症状が比較的軽いCPEO症例でも行うと正常の範囲の値を示しており臨床症状や重症度を反映する可能性もあると考えられた．

大力で握る運動では力は出ているのに，酸素消費が少な
くベースラインよりわずかに低下したのみであった（図3上）．次にさらに激しい運動としてsemi・ischemiCfoream

一方CPEOではsemi−ischemicfbreamexercisetest中の酸

素消費は少なく，正常対照との間に差を認めた（図4上）．
4例のCPEOに対してsemi−ischemiCforeamexercisetestの組

結論

織内酸素の減少値をグラフに示した（図4下）．ミトコンド

筋疾患の骨格筋内の酸化還元動態を近赤外酸素モニタ

リアミオパチーでは運動時にも酸素が減らず病態を反映ーで検討した．筋組絃内の酸化還元状態の変動が非侵襲的にリアルタイムで記録できていると考えられた．このしていると考えられた．しかし一部の例では正常と差がなくミトコンドリアミオパチーの筋病変が均一でないことを反映していると考えた．

測定法はエネルギー代謝病や関連疾患の病態解析，経過観察，治療効果判定に役立つと考えられた．

次に筋緊張性ジストロフィー5例について安静虚血状態
で組織の酸素消費をみると正常対照の様に直線的に低下

文しない例が見られた（図5）．

献l）HamaokaT；IwaneH，ShimomitsuT；etal：Noninvasive

しかしその他の筋疾患に対して行った同様の検討では正常対照との間に差は認められなかった．

measures ofoxidative metal）01ism on working humanmusclesbynear−in舟訂edspectroscopy・JAppIPhysio1
81：1410−1417，1996．

考察2）DeSte伽oN，ArgovZ；MatthewsIミetal：Impairm去ntof

McArdle病では完全に駆血すると組織内の酸素は途中から直線的には下がらず酸素消費速度が遅くなった．こ−236−

musclemitochondrialoxidativemetobolisminMcArdle．s
diseaSe．MuscleNeⅣ619：764・769，1996．

リソソーム蛋白分解系と筋委縮：
神経性セロイド様リボフスチン蓄積症における解析から

研究協力者

江

木

南

英

崎

淳

二＊

はじめに
神経・筋細胞内に自己食食胞・空胞形成のみられる神

紀■

谷

田

以

誠＊

材料と方法
対象：神経性セロイド様リボフスチン蓄積症（遅幼児型，

経性セロイド様リボフスチン蓄積症岬CL）は疎水性蛋白のリソソーム蓄積症である可能性が非常に強くなってきた．Batten病は，主に乳児期から小児期ならびに青年期

すべてカナダおよびアメリカ合衆国の施設より供与）およの初期に神経系に障害が発生する致命的な疾患であり，その特徴として，神経細胞や骨格筋およびその他の細胞中に自家蛍光を発するリボフスチン様顆粒が蓄積する．

分画を分離し，pH5．0で一定時間インキュべ−ト後，残存
サブユニットC量をSDS・PAGEとWestemblotで解析した．

最近の研究によって，本症は発症年齢，臨床症状，連鎖解析から，6グループに分けられることが提唱され，その内4つの型について原因遺伝子が判明した（表1）．乳児型（CLNl）では，スフィンゴ脂質活性化タンパクAとDが蓄積しており，リソソーム酵素であるPalmitoylprotein
仏ioeteraSeの欠損に基づく．他の5つの型はミトコンドリ
ア内膜に局在するATP合成酵素のサブユニットCの蓄積が主体であり，遅幼児型（CLN2）ではリソソームのプロテアーゼ（？）の欠損，幼児型（CLN3）と遅幼児型のFinish
Yariant（CLN5）では膜貫通蛋白，おそらくリソソーム膜蛋
白をコードする遺伝子の変異によることが明らかになっび対照線維芽細胞は10％胎児牛血清で培養した．試験内
分解実験：線維芽細胞からミトコンドリアーリソソーム

結果1）特異的なサブユニットC分解遅延の試験管内実験による再現
遅幼児型NCL細胞でのサブユニットCの特異的分解遅延というIn vivoの実験の結果は無細胞系のin vh0の実験でも再現できた．正常，患者細胞からリソソームーミトコ
ンドリア分画を調製し，pH5．0でインキュべ−トすると，ミトコンドリアのArP合成酵素のβ・サブユニット，シト
クロームオキシダーゼのサブユニットⅠVといった内膜タ
ンパクだけでなく，マトリックス酵素であるMn2十一SODの分解速度は正常と患者細胞間では差がない．それに対た・我々はこれまでに，遅幼児型（CLN2）の線維芽細胞を用いて，サブユニットCはリソソーム内に蓄積しており，その蓄積機構はサブユニットCの特異的な分解の遅延によし，サブユニットCの分解速度は患者細胞では大きく遅延ることを明らかにしてきたlH）．今回の研究によって，リソソームに運搬された疎水性蛋白の分解には新しい分解系が必要であり，このシステムの不調によりセロイド様リボフスチン蓄積症がおこり，やがて神経・筋細胞内に自己食食胞・空胞形成に至ると考えられた．

異常によるのか，基質サブユニットCの構造異常によるのした．
次に，サブユニットC分解遅延がリソソームの分解系のかを同様にinvitroの実験系で調べた．今度は，正常および患者細胞からリソソームとミトコンドリア分画をそれぞれ単離し，組み合わせ実験を行なった．リソソームとミトコンドリア分画にはそれぞれ混入がないことを確認

表1神経性セロイド様リボフスチン蓄積症の分類
原因遺伝子

名称

蓄積物

原因遺伝子座位

原因遺伝子産物

CLNI

幼児型

SAP−A，D

lp32

PPT

CLN2

遅幼児型

subnitc

11p15．5

Cln2p（PICP）

CLN3

若年型

subnitc

16p12

Cln3p恥8．m．p）

CLN4

成人型

subnite

CLN5

遅幼児型variant subnitc

13q21

Cln5p（Ⅰ〟3．m．p）

CLN6

早期若年型

15q21・3？

subnitc

SAP：Sphingolipidactivatorprotein，PPT：Palmytoylproteinthioesterase
PICP：pepStatinsensitivecarbokylpeptidase，Lus．m．p．：lysosomalmembraneprotein＊順天堂大学医学部生化学第−−237−

Subs廿al鵬
lys8SOm alm 川tl川tS
lm 畑旭蜘川
a137℃i

M il伽 nt仙日和川el】とを確認した．そこで，正常細胞のミトコンドリアーリ

11鰐川euソソーム分画からCLN2遺伝子産物を免疫的に除去し，前− IM 此‖l膵u

ー 【60nt】川eu 一 朗nu l帖 u】
− ＋ 一 十 一十 − ＋ 一 十 一 ＋ − ＋ 一十 一 ＋】

4A l 一一■嶋一

述のようにinvitroでのサブユニットCの分解速度を調べた．
CLN2遺伝子産物を除去した抽出液と除去していない抽出液の間でAn＞合成酵素のβ・サブユニットの分解速度には差がなかったが，サブユニットCの分解はCLN2遺伝子産一物の除去によって大きく遅延した．この結果はCLN2遺伝子産物がサブユニットCの分解に関与していることを指示している．

図1遅幼児性神経性セロイド様リボフスチン蓄積症では，ATP合成酵素サブユニットCの分解システムに欠陥がある．正常および患者細胞からリソソームとミトコンドリア分画をそれぞれ単離し，図のよ
うな組み合わせで，pH5でインキュべ−トし，サブユニットC分解能を調べた．

考察

ヒトのCLN2遺伝子産物の酵素学的な性質はまだ全くわ
かっていない．本当に細菌にみられるペブスタチン非感してある．図1に示すように，正常細胞から分離したリソ

受性カルポキシルプロテアーゼのような性質をもつのか，

ソーム分画は正常および患者細胞ミトコンドリア分画中

タンパク基質に対してどんな切断特異性を示すのかは興のサブユニットCを分解できるのに対して，患者細胞から味あるところである．大腸菌で発現したCLN2遺伝子産物

分離したリソソーム分画は正常および患者細胞いづれのの性質を現在検討している．サブユニットCの蓄積は遅幼ミトコンドリア分画中のサブユニットCをも分解できない．

児型だけではなく，若年型など他のNCLでも蓄積する．

このことは患者細胞ではリソソームのサブユニットC分解能に欠陥があることを強く示唆する．図1に示されるよう

若年型（CLN3）と遅幼児型variant（CLN5）の原因遺伝子が同定されているが，いずれも膜貫通ドメインをもつ膜蛋白に，患者細胞のリソソームに蓄積したサブユニットCは変質で，おそらくリソソーム膜タンパクと推定されている．

性し，凝集体をつくっているため正常細胞のリソソーム

サブユニットCのように非常に疎水性の高い蛋白質の分

分画でも分解されない．

解には通常のリソソーム分解系に加えて，新しいプロテ2）既知のリソソームプロテアーゼ群の活性

アーゼ（群？）と膜系からなる特殊な分解系が必要なのであろう．サブユニットCのリソソーム内蓄積と病態の発現

遅幼児型NCLではリソソームの分解系に異常があることは判明したが，ではリソソームプロテアーゼ群に異常の関連については別のアプローチが必要である．

が，ひいては遺伝子変異があるのだろうか？そこで正常および患者細胞のリソソームの既知のエンドぺプチダーゼ

文

献とェキソぺプチダーゼの活性，タンパクおよびmRNAのl）KominamiE，EzakiJ，MunOD，etal：SpeciBcstorageof

レベルを調べた，カテプシンB，L，H，C，Dジペプチジールペ

SubunitcofmitochondrialATPsynthaseinlysosomesof

プチダーゼⅠおよびⅡ，カルポキシペプチダーゼA（保護neuronalceroidlipofscinosis（Battenrsdisease）．J
Biochemlll：278−282，1992．

タンパク），アミノペプチダーゼなど調べた限り，正常と患者細胞細胞間には有意な差はなかった．

2）EzakiJ，WolfbLS，Higutit et al：Speci重c Delay of3）遅幼児型NCLの原因遺伝子産物

DegradationofMitochondrialArPSynthaseSubunitcin

遅幼児型NCLの原因遺伝子の連鎖解析から，その座位

Lateln払ntile NeuronalCeroid Lipofuscinosis（Batten

はllp15にあることがことが確認され，さらにその局在のDisease）．J．Neurochem．64：733−741，1995．

範囲を狭ばめるべく努力されていた．一方，我々の研究

3）EzakiJ，WolfとLSandKominamiE：SpeciBcdelayintheの進展をみていたSleatら5）のグループは非常に巧妙な方法

degradationofmitochondrialArPsynthasesubunitcinを使って，タンパクレベルの解析から遅幼児型NCLの原

latein蝕ltile neuronalceroidlipofuscinosisis derived因遺伝子を突き止めた．コードする推定アミノ酸配列か

倉omcellularproteolyticdysfunctionratherthanstruCtural

ら，原因遺伝子産物（CLN2）は細菌にみられるペブスタチ
ン非感受性カルポキシルプロテアーゼにホモロジーがあalteration of subunit c．J．Neurochem．67：1677・1687，

り，高等動物では全く発見されていないタンパクである

4）EzakiJ，WolftLSandKominamiE：Decreasedlysosomal

1996

ことが判明した．

Subunitc−degradingactivityin丘broblasts危ompatients

4）CLN2遺伝子産物の削除によるサブユニットC分解遅延

withlateinfantileneuronalceroidlipofuscinosis．

我々は，ヒトのCLN2遺伝子産物に対する特異抗体を作

Neuropediatrics28：53−55，1997．

成し，この遺伝子産物がサブユニットCの分解に関与する

5）SleatD．E，DonnellyRJ，etal：AssociationofMutationsin

かどうか調べてみた．作成した抗体が正常細胞では46kDa

aLysosomalProteinwith ClassicalLate−In免ntileNeu−のタンパクを特異的に認識し，4例の異なる遅幼児型NCL

ronalCeroid Lipofuscinosis．Science277：1802−1805，

繊維芽細胞では，CLN2遺伝子産物を全く欠損しているこ

1997．

−238−

Ⅹ．緩和的薬物治療および遺伝子治療

mdxマウスの血清creatinekinaseと筋組織に対するprednisolone長期投与の効果
高

研究協力者

渡

辺

知

木

司書

昭

小

夫■

島

進…

遠

藤

雄

三■■

要 旨 Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の緩和的治療のため，COrticosteroid製剤が投与されることがある・
筋脱力の進行を抑え，歩行期間を延長させたと言われる．しかしその作用機序には不明な点が多い．本報告では，
DMDのモデルであるmdxマウスにprednisolone（PSL）を30週に亘って間軟投与し，血清creatine kinase（CK）値や筋組織への影響を分析した．投与期間中，血清CK値は対照の23％に低下した．これに比して，筋組絆上の改善は軽微であったが，筋壊死の減少を示唆する結果を得た．骨格筋以外では，肝臓の細胞質障害が疑われた．PSLは筋細胞膜破綻後に生ずる二次的組織反応を抑制し，病変の拡大を制御する可能性を推定した．この機序の解明は今後の治療法開発上の重要な課題と思われた．
発表論文
高木昭夫，渡辺知司，小島 進，遠藤雄三：mdxマウスの血清creatine kinasaeと筋組織に対するprednisolone長期投与の効果．臨床神経38：724−728，1998．

＊虎ノ門病院神経内科＊＊虎ノ門病院病理学科
榊三宿病院神経内科−241−

培養筋細胞におけるジストロフィンの発現とステロイドの影響

研究協力者

緒

北

松

原

四

口

哲

雄＊

言

Duchenne型筋ジストロフィー症ではジストロフィンの欠損によりmusclefiberdegenerationをきたすが，その詳細なメカニズムについては解明すべき不明な点も未だ残さ
れている．

郎＊

平

井

俊

策■

形成されたmyotubeの数を計測した．細胞死もtrypanblue
dyeexlusionassqyで推定した．
培養上清から血清を取り除き無血清・成長因子の欠乏

mbulationの延長に効果があるとして再評価されてきてい状態におくと4g時間後から細胞死（apoptosis）が起こるが，これがPDNによって抑制されるかも検討した．24時間後に増殖培地から血清を除去し，0．1％BSAを含む1：l
DMEM仔12培地にて24時間培養した．その後は同様に分化培地に交換して培養を継続し，培養開始から7日目に形る（BackmanE他，1995）．われわれはDMDの動物モデル

成されたmyotubeの数を計測した．

治療に関してはステロイドの投与が有用であるとの指摘が以前よりあったが，最近少量の長期投与が患者のであるmdxマウスをもちいてステロイドの効果を検討してきたが，本年も筋細胞の発育・分化にどのように影響

結果するかをinvitro初代筋培養系を用いて検討した．

培養開始後4日目でmyotubeの形成がみられるが，ジス

方トロフィンに対するimmunoreactivityは細胞質全体でdifL
鮎seに陽性に染色されmamreなmusclenberにみられるよう法

初代培養はmdxマウス（C57BL／10ScSn−mdx）と，対照として野生種であるC57BL／10SnJマウス（BlO）の新生仔マウ
スから後肢筋・背筋を採取し，細切した後にトリプシン

な細胞膜への局在はみとめられなかった．pDN存在下，非存在下でも明らかな差異はなかった．そこでPDNと筋細胞の初期発生・分化に対する影響を検討した．pDNは48

酵素処理で分散した．細胞数は105／cm2となるように調製

時間後，72時間後，96時間後に添加し7日後のmyotubeのした．pLL，サpelコラーゲンでコーティングした培養器を使い，同時に採取した脊髄とともにDMEM＋F121：lmixture−托川・匝辺和M肋r Eコ印HT加⊂コP洲勤rに由来するmyoblastを細胞数1：1でco−Cultureして上記と同様の条件で培養Lheteromyotubeを形成させた．培養開始から120時間以上培養を継続して形態学的変化とともにジストロフィンやミオシンなど筋特異蛋白の発現を免疫組
織化学的に観察した．
ステロイドはα一Methylprednisolone（PDN）を用い，最終苫寧変言屋雇主

む分化培地に交換して蝕sionさせた．またBlO，mdx双方

叩 00 榊 側 30 20 10 0に15％fttalbovineserum（FBS），5％horseserum（HS）を含む
増殖培地の条件下で48時間培養した．その後2％HSを含

96時間後に培地中に添加した．上記の条件で培養開始か

−pDH・

tV
S
一
3
2
一1
0

し，PDNを添加した群と非添加群で培養開始から7日後に■l

後H20を含まない分化培地に交換して培養をさらに継続

6578L＊東京都立神経病院神経内科

図2

ー242−

繹臣DH仙r8

PDNの効果を検討した・培養開始から48時間後にH202を0・5mMとなるように培地中に添加して8時間暴露し，その官主亀ujj■琶−王るhydrogenperoxideをもちいてoxidativestressの影響と

Hobro

8

ら7日後に形成されたmyotubeの数，細胞長を計測し推計があることから，鮎eradicalを生じる代表的なものであMDX

図1ProliftrativeActiYity

濃度が10■5Mとなるように培養開始後48時間後，72時間後，学的な有意差を検討した．またPDNにはanti．oxidantaCti。n

C57BL

MDX

Hobm

Mo叩hologicalChange

及ぼす影響をグラフに示す（図3）．m血群がmyo山beの形成が最も少なく，これと逆相関の関係で細胞死もいちばん■■H202・匿ヨH2020．5mMt；：ヨ H2020．5mM●Pm
榊仙川鵬
関川W油二刀仙川03占︼邑＄q月Oi

多かった．次いでheteromyotube群であり，BlO群でもっとも影響が少なかった．pDNを添加後に3群とも形成数の増加がみられたが推計学的に有意ではなかった．
増殖培地で24時間培養した後，血清を一切含まない
DMEM培地のみのGF除去の条件下ではmyoblastは
C5TBL
図3

HDX

apoptosisをおこし，形成されるmyotubeが大幅に減少することが知られている．mdx群において7日後のmyotube数の減少が著明であるがBlO群ではmyotubeの減少はそれに比して軽度であった．pDN添加によってmyotubeの形成数の増加がわずかにみとめられるが統計学的に有意なもHotoro

FreeRadicals

苫屋−邑誓号葛i

帥70榊別棚卸卸100■伽鵬t 圃GF． EヨGF．PD肘のではなく抑制効果はみられなかった（図4）．
考

￠訂BL
図4

察

初代培養筋細胞においてPDNは明らかにmdx mouseのmuscleの分化・増殖に作用していると考えられた．またMdx mouseは少なくとも培養条件下ではoxidative stressに対して感受性が克進していることもわかった．pDNの添加でこのoxidatiYe S加SSは抑制されたが推計学的には有意HDXなものではなく，PDNのmuscleに対する効果がanti−0Xidante飴ctによると考えられる確証は得られなかった．また同

GrowmFactorDeprivation

形成の数を示す（図1）．BlO群ではmyotubeの数は72時間後
PDNを添加群した群が7日後のmyotubeの形成が最も多く，次いで48時間後に添加した場合であり72時間後のみ推計学的に有意差があった．Mdx群では48時間後に添加した
場合に最も増加し，次いで72時間後の順で，いずれも推計学的に有意であった．しかし96時間後に添加した場合には効果はみとめなかった．BlO／mdxのco−Cultureでhet・様に叩OptOSisによるとされる細胞死の抑制も有意なものではなかった．今後さらにPDNの作用がそのほかのメカ
ニズムの関与によるものかどうか検討が必要と考えられた．
文

献1）BackmanEandHenrikssonK．G：Low−doseprednisolone

eromyotubeを形成させた群でもmdxと同様の結果でBlO，

treatmentinDuchenneandBeckermusculardystrophy．

mdx群の丁度中間となった．またmyotubesizeの計測ではBlO，mdx，heteroのいずれにも大きな有意差はなく，形

Neuromuscul．Disord．5：233・241，1995．
2）RandoT．A，DisahikM−H，YuYandFrarLCOA：Muscle

態学的に大きな差はないと考えられた（図2）．

Cells舟ommdxmicehaveanincreasedsusceptibilityto

Myotubeの形成に対して什eeradical，hydrogenperoxideの−243−

OXidativestress．Neuromuscul．Disord．8：14・21，1998．

Double−mutantmdxマウスの病態生理と治療に関する研究
栗 原 照 幸■

研究協力者

要

旨

大 迫
岸

正 行＊ 杉 本 英 樹■
雅 彦■ 木 下 真 男■

Mdxマウスでは，Duchenne型筋ジストロフィーと同様にdystrophinが欠損しているが，再生が活発で，進行性の筋力低下は起こさない・筋崩壊を来す要因が，dystrophinの欠損以外にないかどうか，強皮症のモデル
マウスであるtight−Skinnedmouseとmdxマウスを交配したdouble・mutantmdxマウスを用いて筋細胞内記録を行い，病態生理の検討とdehydroepiandrosteronesulfate（DHEAS）を用いてミオトニーの治療の試みをした．d。uble＿mutant
mdxマウスでは，組織学的には細胞浸潤，脂肪浸潤，壊死・再生線経が見られ，変化がmdxマウスより強かったが，膜電位は正常であった・微小電極刺入時のinsertion myotoniaは15％の筋線経で認められたが，DHEASを用いると，insertionmyotoniaを完全に抑制することができた．
はじめに

日

的

Mdxマウスでdystrophinの欠損があることは，Duchenne

Mdxおよびtight−Skinned mouseの交配によってできた型筋ジストロフィーと同様であるが，再生が活発に起こ

double−mutantmdx mouseでは，筋力低下が起こるので，るため進行性の筋力低下をきたさない．mdxマウスでは，筋肉の線推化が起こらないことが，再生能力がある理由とも考えられている．

い，静止膜電位および，微小電極刺入時のinsenion
myotoniaを記録した．Myotonic burstにたいしては，線維化が強く起こる病気として，強皮症がある．強皮Dehydroepiandrosterone su肋te（DHEAS）を用いて治療の試症の実験モデルとして，tight・Skinned（tsk）mouseがある1）．

みをした．筋組織については，4，12，17週齢のdouble−mutant

Mastcellの分泌顆粒の中にtryptaseがあり，これはnbroblastの強力なmitogenである2）．Tkkmouseでは，maSt Ce11の活

mdx mouseの前脛骨筋について凍結切片をつくり検討しこのマウスを用いて，横隔膜標本より筋細胞内記録を行たので合わせて結果を報告する．

動によって膠原線経が増生し，これが他の炎症細胞も引き寄せる．そして組織の破壊も起こる．Mdxマウスとbk

方法

マウスを交配すると，dystrophinの欠損したマウスにmast
Ce11が作用して，鮎rosis，muSClenecrosisが強く起こると考メスのmdxマウスと，オスのtight・Skinned mouse（tskmouSe）を交配した．12週齢Flのオスを用いて実験をおこえられるユ）．ジストロフィー様の変化が筋肉に起こり，mdx

なった．ガラス管微小電極を用いて横隔膜標本の筋細胞

マウスよりdouble−mutaLntmdxマウス1），4）の方が進行性筋ジ内記録を行った・治療開発の目的で，dehydro−

ストロフィーのモデルとしてより適切ではないかと考え

epiandrosteronesulfate（DHEAS）を160mg／1の濃度でTyrode溶液に加えて横隔膜標本の静止膜電位と，微小電極刺入時られるので，これを用いて筋細胞内記録と筋組織所見を検討したので報告する．

のinsertion myotoniaに対する効果をみた．筋肉の組織標
本は，4，12，17週齢Flのオスの前脛骨筋を用いてHE染色とdystrophin染色をして検討を加えた．

表1Double・mutantmdxマウスの膜電位，微小電極刺入時のinsertionmyotoniaの頻度および治療の試みとして，DHEASを160mgnでTyrode溶液に加えたときの膜電位および，insertionmyotoniaの頻度をしめす．Double−mutantmdxマウスの膜電位は正常であった・Insertionmyotoniaは8・20％の筋線経に認められ，DHEASを用いると，ミオトニーは完全に抑制された．
実験 1

D H E A S 16 0m g／
1

実験2

79．
0

8 1．
04

83 ．
96

82 ．
05

±6．
50

± 7．
32

±4．
38

±4．
89

n＝総 数

80

100

50

55

in sertion m yo to n ia の 頻 度

20．
0％

0％

8．
0％

0％

平均M

（
一
m V ）

±S．
D ．

＊東邦大学医学部第四内科−244−

D H E A S 160 m g ／
1

結

果

かった．Dystrophinが欠損していることに加え，double−

Double−mutant mdxマウスでは，膜電位は計測できた筋
線経では，表1の様に正常であった．Inse血onmyotoniaは
図1のように見られたが，短いburstであった．DHEASは，

mutantではmast cellの活動が高いために，tryPtaSeの活性が高まって筋崩壊の所見が強いものと考えられる．

図2，3のようにmyotonic burstを抑制することに有効であった．正常な膜電位に対しては，表1のようにDHEASは変化を与えなかった．
筋組織については，図4のようにdouble−mutantmdxマウ
スでは，筋の壊死，脂肪浸潤，細胞浸潤が見られた．17
週齢mdxマウスでは，この時期ほとんどすべて再生筋に置き換わっているのに対してdouble−mutantでは変化が強：Ftだ崇霊慧誌3EOnWithdT当
I sec

図3

Double−mutant mdxの横隔膜標本で，DHEASを160mがの濃度でmuscle chamberのなかの坤rode溶液に加えると，筋細胞内に入っている微小電極を抜き去る時の機械的刺激でもmyotonicbu乃tは抑制されることを示す．

l SeC

図1Double−mutaJltmdxの横隔膜標本で，微小電極刺入時のinsertionmyotomiを3つの筋線経で示す．どれもmyotonicburstの持続は短かった．

園2

図4 Double・mutantmdxの前脛骨筋のHE染色標本．
Aは4適齢のHE標本（200Ⅹ），Bは12適齢のHE標本（200x），Cは17週齢のHE標本（100x）である．M血マ
ウスより，単核球の細胞浸潤が強く，脂肪浸潤，壊死・再生線経がみられ，変性が時間的にもm血マウスより遷延する．

Double−mutant mdxの横隔膜標本で，DHEASを160mgM）濃度でmuscle chamberのなかの1争Ode溶液に加えると，微小電極刺入時にもhsed0m
myotoniaは抑制されたことを2つの筋線経を例にし
て示す．

ー245−

考

察

オトニーを抑制する効果が認められている．Doublemutant

Dystrophinが欠損している場合に，genetherapyによってdystrophinを発現させることは，直接的な治療法で現在も試みられている．もう1つの方法は，今回の実験で考えられたようにdystrophinが欠損している上にさらに他の要因が加わって筋崩壊が起こるならば，その要因を抑えることも重要である．例えば，maSt Cellの活動を抑制す
るような薬剤の試みも意味があると考えられる．Ma5tCellの活動を抑制する薬剤は，Cromolynsodiumや，その新しい誘導体nedocromilという薬剤がある．これらは，気管支喘息の治療薬として現在のところ吸入薬の形でだけ有効なものがある．これらの薬が筋ジストロフィーにも有効であるかどうかは，今後検討すべきものと考えられる．
Dehydroepiandrosterone sulfhteのmyotoniaに対する治療効果‥Suginoらによるmyotonicdystrophyに対するPilot
Studyがあり5），11人の患者で200mg／dayivで8週間用いてみて，1）ADL改善，2）筋力改善，3）ミオトニーが減少または消失，4）心臓ではPVC減少，AVblockの改善などが報告されている．
我々が，昨年度の班研究で示したように筋細胞内記録
では，Nachannelの不活化阻止によるミオトニーにも，
またCIchannelblockerによるミオトニーにもDHEASはミ−246−

mdxマウスのinsertionmyotoniaは，mdxマウスでみられたものより短いburstであるが，DHEASはミオトニーを完全に抑制する効果が認められた．
文献1）GranChelliJA，PollinaCandHudeckiMS：Duchenne−likemyopathyindouble・mutantmdxmiceexpresslngeXag−geratedmastcellactivity．JNeuroISci131：1−7，1995．

2）RuossSJ，HamannTandCaugheyGH：Mastcelltryp・
taseisamitogenforcultured爪broblasts．JClinInvest
88：493・499，1991．

3）GorospeJM，TharpM，DemitsuT；etal：Dystrophin・
de鮎ientmyonbersarevulnerabletomastcellgranule−
inducednecrosis．NeuromuscDisord4：325−333，1994．
4）GorospeJRM，TharpMD，HinckleyJ，etal：Arolefor
mastcellsintheprogressionofDuchennemusculardys−
trophy？JNeuroISci122：44・56，1994．

5）SuginoM，OhsawaN，ItoT；etal：Apilotstudyofdehy−
droepiandrosteronesulfateinmyotonicdystrophy・
Neurolo訂51：586−589，1998．

筋ジストロフィー患者に対するダントロレンナトリウムの治療効果
龍 見●

梶

研究協力者

小

島

康

祐●

木

はじめに
Duchenne型筋ジストロフィーでは，ジストロフィン蛋
白の欠損のために，細胞内への過剰なCa流入が生じ，筋壊死をもたらすことが推察されている．ダントロレンナ
トリウムは骨格筋に作用し，筋小胞体からのCa放出を抑制する作用がある薬物であり，Ca濃度の上昇に伴う筋崩壊を軽減する効果が期待される．
実際に，Duchenne型筋ジストロフィーのモデル動物であるmdxマウスに対してダントロレンナトリウムを投与し，血清CK値の低下が認められたとする結果が1990年
Quinlanらにより報告された1）．1991年にBertoriniらは，6−
13歳のDMD患者7例にダントロレンナトリウムを2年間投与し，血清CK値の低下および臨床症状の悪化軽減が認められたことを報告している2）．
そこで本邦でも，ダントロレンナトリウムの筋ジスト
ロフィーにおける血清CK値ならびに臨床症状に及ぼす効果について検討を行い，筋ジストロフィーの進行を遅延させるのに有効かどうか，また筋ジストロフィー患者における安全性を検討する目的として，多施設共同により臨床試験を施行した．
投与終了後の追跡調査として，臨床試験に参加した患者を対象に，歩行不能となった時期等にダントロレンナ
トリウム投与が影響を与えたかどうか，また投与終了後の血清CK値の変化についても検討を行った．
対象・方法
対象軋Duchenne型（以下，DMDと略），Becker型（以下，BMD），Limb・Girdle型（以下，L・G）の筋ジストロフィーで，投与開始時に機能障害度1−3度の独立歩行可能な患者を対象とした．DMDでは，投与開始時年齢6−12歳の患者を対象とした．
治験参加の同意は患者本人から文書あるいは口頭で得た．患者が未成年の場合は法定代理人等患者に代わって同意をなし得る者の同意を得た．
DMDおよび，BMDまたはL・Gの各病型において，高用量投与群（H群）と低用量投与群（L群：プラセボ相当）に無作為に割り付け，多施設二重盲検比較試験をおこなった．
＊京都大学医学部神経内科
綿三井大牟田病院神経病総合医療センター

村

淳＊

荒

木

淑

郎■●

H群では20・100mg／日（体重1kgあたり約2mg），L群では0．4m釘日のダントロレンナトリウムを維持畳として，2年間にわたり投与を行った．
臨床的な評価項目として，ADLに基づく機能検査，筋力テスト，機能障害度，およびROMテストを用いた．副作用および随伴症状においては随時観察を行った．投与12カ月後，24カ月後および投与終了時において，機能検査，総合改善度，総合安全度，有用度および血清CK借の変化
を各病型において比較検討した．
追跡調査は，投与終了後の平成8年から9年にかけて，調査表を治験参加施設に郵送し施行した．独立歩行不能となった時期および血清CK値（原則として投与終了3ケ月後の値）について調査を行い，両群間で比較検討を行った・
血清CK値においては，治験期間中は同一検査施設にて集中測定を行ったが，追跡調査時点では各施設により測定された値を用いた．
結果（1）患者内訳
本治験の総症例数はDMD124名，BMD38例，L・G19例の合計180例であった．
DMD124例の内訳は，H群65例，L群59例であり，このうち中止症例は26例で，H群13例，L群13例であった．BMD
およびL−G群57例の内訳はH群29例，L群28例であり，このうち中止症例は11例で，H群6例，L群5例であった．中止理由は，副作用出現，症状悪化，合併症併発などが大半であった．
（2）有効性の検討
A．機能検査：機能検査の合計点数は，DMDにおける投与
前借に対する最終時点の変化量は，H群は一14．00＋／−6．33，
L群は−12．87＋ト7．22であり，H群とL群間で有意な差は認められなかった：BMD・L・Gにおいても，H群は−4．04＋ト
6．19，L群は−1．83＋／−3．66であり，両群間に有意差は認めなかった（図1）．
B．血清CK値：DMDにおける血清CK値（対数値）の投与前値に対する最終時点の変化率は，H群は−8．帥ト6．2％，L群は−4．5＋ト8．4％であり，H群ではL群に比べて有意な低下が認められた（FO．023）．投与12，24カ月においてもH群はL群に比べて低下する傾向にあり，投与12カ月後ではその低下が有意であった．（12カ月後：p司．001，24カ月後：p＝0・079）・

−247−

DMD

∩
蛸
ゝ
．
」
ヽ
■
．
・
．
尉
e 官圃
t
∫
−
l
n
撃
R

BMD・L−G

N
．
S
．N
．
S
．N
．
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．
「
「 ［ ［

4
聖。
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臣団
量4
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主
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8

彊
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2n

−
12 l 稔り欄

l 投
リ
■
前 I 1
2カ
日
経 1 24カ
〃
後l 終
／
時 l

■N．
S． N．
S． N．
S．
［
「
「 ［
T

l I2射】
後 1 24力日経 l

時
期

終了時

l

時期

図1機能検査（投与前値からの変化量）．
DMD，BMD・L−Gとも，両群間に有意差を認めなかった．
DMD

BMD・L−G

図2血清CK値（対数値）の変化率
DMD，BMD・L−Gとも，H群ではダントロレンナトリウム投与により血清CK値の低下をみとめた．
ltlI
匡比べて有意に改善度が低かった（p朝朋0）．最終時点における「不変」以上の改善率は，H群7．8％L群15．2％であった．
BMD・L・Gにおいては両群間で改善率に有意差は認めら

園

lO
r
d⊂
苦 印
軽
ti
（I
磐 JO

れなかった．最終時点における「不変」以上の改善率は，H群54．2％，L群72．7％であった．

こと患

D．棲能障害度，RONテスト DMI），BMD・L・Gとも，両群間で有意な差は認められなかった．
（3）有害事象20
D r円
昭 与期 間○01）
投 与開 始 か らの 期 間

4

，

●

l年 ）

図3歩行可能な患者の割合PMD）
両群間で有意差を認めなかった．
BMD・L・Gにおいても，血清CK値（対数値）の投与前値に副作用は，DMDではH群に21例27件，L群に10例12件，
BMD・L−GではH群に15例20件，L群に6例10件発現した．
主な副作用は，ダントロレンナトリウムの薬理作用に基づくと考えられる脱力，脱力感で，副作用の半数以上をめられた（p三0．000）．投与12，24カ月後においても，H群は占めた．その他には，ダントロレンナトリウムの筋弛緩作用に基づくと推察される，倦怠感，筋力低下，ふらつき，筋痛などの副作用などが見られた．

L群に比べて有意に血清CK値の低下が見られた（12カ月
後：FO．013，24カ月後：p＝0．000）（図2）．

臨床検査値異常はDMDではH群の13例24件，L群の12
例19件，BMD・L−GではH群に6例15件，L群に4例7件認C．筋力テスト

められたが，特に発現頻度の高い項目はなかった．

対する最終時点の変化率は，H群は−9．1＋／づ．5％，L群は4．6＋ト11．7％であり，H群ではL群に比べて有意な低下が認

DMDにおいては最終時点で，H群はL群に−248一

差は認められなかった．L−Gにおいては，H群では835＋／−（4）主治医判定
A．総合改善度：DMDにおいては，最終時点での「不変」
以上の改善率は，H群7．5％，L群10．9％，BMD・L−Gでは，502IU几L群では2533＋ト2422IU／1で，平均値ではH群で低下傾向にはあるが，有意差は認められなかった．

H群50．0％，L群65．2％で，いずれも有意差は認められなかった．
B．総合安全度：DMD，BMD・L−Gとも，安全率ではH群はL群に比べて低い値を示した．最終時点における「安全である」異常の安全率は，DMDではH群57．8％，L群70．7％，
BMD・L−GではH群44．8％，L群77．8％であった．群間の比

まとめ
筋ジストロフィーの根本的な治療法は現在のところ見っかっていない．これまでビタミンE，蛋白同化ホルモンなどが用いられてきたが，効果は不定のままである．
ダントロレンナトリウムは筋小胞体からのCa放出を抑較では，DMDでは12カ月後，BMD・L・Gでは12，24カ月
後および最終総合安全度において，H群はL群に比べて有意に安全性が低かった．
C．有用度：DMD，BMD・L・Gとも，有用度はH群とL群で有意差を認めなかった．
（5）追跡調査
追跡調査は，回答が得られたDMD86例，BMD31例，LG15例の合計132例について検討を行った．
追跡調査時点で歩行可能な患者の割合は，DMDにおい

制する作用があり，Ca濃度の上昇に伴う筋崩壊を軽減するては，H群で43例中6例，L群で37例中7例であり，両群間で有意差を認めなかった．投与開始から歩行不能となったまでの期間についても，H群，L群間で有意な差は認め

追跡調査においても歩行不能となった時期に対する改られなかった（図3）．
BMDでは，H群で14例中12例，L群では16例中14例で歩行可能で，両群間に差は認めなかった．L・Gにおいても同様に両群間に差は認められなかった．
投与終了後の血清CK値は，DMDにおいては，H群では6411＋／−4391IU／1，L群では6021＋ト3236IU／1で，両群間に有意差を認めなかった．BMDにおいては，H群では2603＋／−1164IU／1，L群では1964＋ト1556IU／1であり，両群間に有意効果が期待されることからこの治験が計画・施行された・
結果として，ダントロレンナトリウムは筋ジストロフ
ィー患者において血清CK値を有意に低下させるものの，その他の有効性の評価項目では改善が認められなかった．
本治験では，血清CK値の低下と筋ジストロフィーの病態の進行抑制との相関を立証できず，ダントロレンナトリ
ウムは筋ジストロフィー治療薬として有用とは判断できなかった．
善効果は認められなかった．投与終了3ケ月後の血清CK値にも有意差を認めなかった．
文献1）QuinlanJG，Johnson SR and Samaha FJ：Dantrolene
normalizesserumCreatinekinaseinMDXmice．MuSCle
Nerve13：2689−269，1990．
2）BertoriniTE，PalmieriGMA，Gri餌nJ，etal：E飴ctof−249−

dantrOlenein Duchenne musculardystrophy．Muscle
Nerve14：503・507，1991．

皮膚線維芽細胞を用いたDuchenne型筋ジストロフィーの遺伝子治療に向けた基礎的研究
小 林 高 義＊

研究協力者

古 屋 徳 郎■ 田 中 宏 明■
亀 田 典 佳■ 水 澤 英 洋■

要 旨 Duchenne型筋ジストロフィーの治療として筋芽細胞移植が試みられてきたが，免疫学的拒絶反応の問題もあり，現在までのところ臨床的に有効であるとの結果は得られていない．また患者本人の筋芽細胞を用いる
ex viYO遺伝子治療の研究も行われているが，筋ジストロフィーの患者筋芽細胞は正常の筋芽細胞に比べて増殖能が劣り，充分な筋芽細胞を培養することは困難である．本研究では，筋ジストロフィーの患者においても大量に培養することが可能な皮膚線維芽細胞を筋芽細胞の代わりにex Yivo遺伝子治療に応用できるかを検討するた
めに，線維芽細胞と筋細胞の共培養の系を用いて，線維芽細胞の筋細胞への変換の機構について検討した．皮膚及び筋生検よりヒトの皮膚線維芽細胞，筋細胞の初代培養を行った．線維芽細胞は10代以上総代したものを使用，筋系細胞の混在を完全に除外するために限外希釈法によるクローニングも施行した・細胞株としてC2C12筋芽細胞，NIH，T，線維芽細胞，C3Hl。Tl′2線維芽細胞を用いた．線維芽細胞にレトロウイルスBAGを用いてマーカー遺伝
子LacZ（βgal）を導入し，G418にて安定に遺伝子が導入された細胞を選別した．LacZ導入線維芽細胞を筋細胞と一定期間共培養後，Ⅹgal染色，免疫組織化学的染色を施行した．ヒトの筋細胞に対しては胎性ラット脊髄片を用いて神経筋支配を形成させた・LacZ遺伝子を導入した線維芽細胞と筋細胞を共培養LXgal染色を行うと，細胞株・初代培養のいずれの場合でもβgal陽性の筋管細胞が観察された・各種のLacZ導入線維芽細胞とC2C12細胞を共培養し・βgal陽性筋管細胞の出現頻度を定量的に比較すると，ヒト線維芽細胞ゝC3H．。Tl′2＞NIH3T3の順であっ
た・筋細胞のconditioned mediumでLacZ導入ヒト皮膚線維芽細胞を培養すると，培養後1週間で皮膚線維芽細胞の中からβgal陽性筋管細胞が少量出現した．LacZ遺伝子導入ヒト皮膚線維芽細胞とヒト筋細胞の共培養に対して，ラット脊髄片の併置培養を行うと，神経支配を受け自発収縮を伴い横紋を形成した成熟した筋線維群の一部にXgal染色陽性の筋管細胞が出現した．LacZ遺伝子を導入した正常ヒト皮膚緑維芽細胞とDMD筋細胞を共培養し，抗βgalモノクローナル抗体と抗ジストロフィンポリクローナル抗体を用いて免疫2重染色を行うと，βgal
陽性の筋管細胞の一部にジストロフィン陽性細胞が認められた．以上の我々の研究により，線維芽細胞は筋細胞に変換するpotentialを有しており，変換には筋細胞によって培養液中に産出される可溶性因子が関与していることが推定された・今後，変換の機序を解明し，線維芽細胞から筋細胞に変換する頻度を上げることができれば，DMDのexvivo遺伝子治療への臨床応用も可能であると考えられる．

＊東京医科歯科大学医学榊経内科
ー250−

Musclespecincpromoter活性の定量的解析
若

研究協力者

山

原

貴

弘●

一事

青

FischbeckKH■●

木

和

子■

pattersonTH■■

要 旨 筋肉内に特異的に発現をもたらすhumanskeletalmuscleα−aCtinpromoter（HSA）1に対し・やはり筋肉特異的な遺伝子発現に対する増強効果をもつmyosinlightchainenhancer（mlc−e）2を組み合わせることでHSAの活性を増強するか否かを筋培養細胞を用いて検討した．HSA単独及びHSA＋mlc・eを含む発現ベクターを作成し・H9C2細胞へtranSfecti。nL培養細胞を回収，蛋白を精製後CATasseyを行った．アセチル化／非アセチル化のバンドの濃度を測定し，HSAとHSA＋mlc・Cの比較を行った．HSA＋mlc・CはHSA単独に比べ約3・7倍のアセチル化／非アセチル化濃度を示した．結果よりmiC−eはHSApromoterの活性を増強させると思われた・
はじめに筋疾患の病態解明や治療研究にとり，様々な蛋白を筋肉内に発現させるトランスジェニックマウスは大変重要であり，今日さまざまなトランスジェニックマウスが開発され研究されている3）・4）・5）．これらのトランスジェニッ
クマウスのgene construCtには蛋白に翻訳されるcoding
regionの他に転写を調節するpromoter領域が必要であるが，内在性のpromoterよりも発現活性の強い外来性の筋肉特
異的なpromoterが組み込まれることも多い・これらのpromoterの中で最も頻繁に利用されるものとしてHSAやmusclecreatinekinase（MCK）3）のpromoterがある．また同じ
く筋肉特異的な発現増強をもつmlc−亡も高い筋組織特異性を持ち注目を集めている．これらのpromoter間での活性危rase）がすでに組み込まれており，これを制限酵素BamHI
にて切断，同じくBamHIの断片として供与されたmlc・e2
をstickyendligationした．得られたplasmid（pHH・1：図1参照）を増殖後，接合部位の塩基配列を確認した・ラット心筋培養細胞であるH9C2を通常の培養プレート上でほぼconnuentになるまで培養LHSA，pHH・1，及びコントロール（pBR322：backbone）plasmid各100FLgをリン酸Ca法にて各3枚のプレートにtransftctionL48時間培養後細胞を回収，蛋白を精製LC14Chloramphenicol及びacetyl−CoAの存在下でCAr assayを行った．TLC plateを泳動後
autoradiographyを行いアセチル化／非アセチル化のChloramPhenicolバンドの濃度をimageprosystemを用いて測定し，HSAとpHH・1の比較をした・の相対的比較は重要と思われるが，現在まで定量的な比較研究は無い．我々はトランスジェニックマウスの開発
や将来のgene也erapyの基礎的研究として本研究の必要性を強く認識しpromoter間の活性の相対比を定量化できる

PBR322

ように研究をデザインした．
目

4015bp的

筋肉内に特異的な発現とdevelopmentalregulationをもつ
promoterとして今日広く使用されているHSAに対し，やはり筋肉組織特異的な遺伝子発現に対する増強効果をもつmlc−eを組み合わせることによりHSAのpromoterとしての活性をmlc−eが増強するか否かを筋培養細胞を用いて検討する．

11629bpSV40

皐

SD／SA＋

POlyA
929bp

mlcenhancerBamHl
fragment

対象と方法
Dr．Fischbeckより供与されたplasmid（pHSA／CAr）l）にはHSApromoter及びCArgene（Chloramphenicol−aCetyltrans・＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊Nationallnstitutes of Health■中書HHC HahneTnann University−251−

図1pHH−1の作成方法と構造・HSAのplぉmidはPBR322をbackboneとLHSA及びCAⅣSV40polyAが図に示す様に連結した構造で供与された．
PolyAtde構造の終末にはBmlHIsiteがあり，ここにBamHIの断片として得られたmlH七を
1喝ationLpHH・1を作成した・

事が知られており，トランスジェニックマウスではHSAにmlc・eを組み合わせた構造がHSA単独のpromoterよりもはるかに強い発現活性を有すると考えられる．筋肉内での導入遺伝子の強い発現を必要とする実験ではこの構造
は従来のものより有利と考えられる．また今後HSA，
HSA＋mlc・e，MCKの3着の比較を計画しており，現時点での利用可能な筋肉特異的プロモターの相対的活性及び発生学的検討が有用と思われる．
文

献1）BrennmannKJandHardemanEC：Quantitativeanalysis
Ofthehuman

図2 Control，pHH−1，0riginal（mlc−eを持たないpromotcrのみ）によるCAT ass町の結果．mlc−eを含むpHH−1では，含まないorighdplaSmidに比べ明らかにアセチ
ル化Chloramphenicolバンドの濃度が増強している．

α−SkeletalactingeneintranSgenicmice．

J．Biol．Chem268：712・725，1993．

2）RosenthalN，KornhauserJM，DonoghueM，etal：Myosin
lightchain enhancer activates muscle・SPeCiBc dcvelop−
mentally regulated gene expressionintransgenicmice．

結果Proc．Natl，Acad．Sci86：7780−7784，1989．

各々3枚の培養細胞プレートにおいてpHH−1はHSAに比3）JymeSJB，JohnsonJE，BuskinJN，et al：The muscle

べ肉眼的にも明らかにアセチル化したChloramphenicolのバンド濃度の上昇がみられた，すなわちCATの活性の上Creatininekinasegeneisregulatedbymultipleupstream

昇が認められた・これを定量し比較するとpHH−1はHSAよりも約3．7倍のアセチル化／非アセチル化濃度を示した．

Biol．8：62・70，1988．

コントロールにはアセチル化ChloramPhenicolのバンドは見られなかった（図2）．

elements，includingamusclespeci鮎enhanCer．Mol．Cell．

4）Dahler A，Vhde RFt Muscat GEO，et al：Expression
VeCtOrS enCOding humangrOwih hormone（hGH）con−
trolledbyhumanmuSCle−SPeCifiCpromoters：PrOSPeCtSfor
regulatedproductionofhGHdeliveredbymyoblasttranS一

考察とまとめ食rorintravenousirtiection．Gene145：305−310，1994．

実験結果ではpHH−1ではよりCATの活性が高く，mlc＿e5）FazeliS，WellDJ，Hobbs C，etal：Altered secondary

はHSAのpromoter活性を増強させると思われる．今後試myogenesisintranSgenicanimalsexpressingtheneural

行回数をふやし統計学的に検討する必要がある．またよCell adhesion moleculeunderthe control ofa skeletal

り精密な結果を得るためtransftction後のDNAn。rmaliza＿

rnuscletionのためHIRTassayを行うべきである．一般にenhanCer

1996．

の増強効果はin・Vitroよりもin・Vivoにおいてより増幅する−252−

α−aCtinpromoter．J．Cell．Biol．135：241−251，アデノウイルスベクターを用いたアデノウイルスレセプター
遺伝子導入による繰り返し遺伝子導入の試み
誠■

■

どガ

寿龍

馬上

有村

■
■

＊

田

暁修

＊

寧生治

田

前原箕

＊

円斗郎
■
泰英

村田山

木西宇

研究協力者

要 旨 アデノウイルスベクター（Adv）を用いた骨格筋への遺伝子導入法を改良するために，我々はヒトコクサ
ッキーグループB，アデノウイルス2及び5型レセプター（hCAR）1）に着目した．生理的にヒトやマウスでは骨格筋にCARの発現はみられない．invitroで，CARnegativeの培養細胞にhCARを導入し強制発現させるとAdvに対する感受性が増強した．C2C12myotubeとマウス骨格筋に，AdvでhCARを強制発現させAdvを用いた繰り返し遺伝子導入を行った．我々はhCAR遺伝子を用いて，Advを用いた遺伝性骨格筋疾患の遺伝子治療のための一つの方法を提示した．
はじめに

プラスミド；CMVPromoterとIRES（intemalribosomeentry

アデノウイルスベクター（Adv）を用いた遺伝性筋疾患，
特にDuchennC型筋ジストロフィーに対する遺伝子治療はsite）およびSV40polyAsignalによりlacZを同時に発現する

既に多くの研究が行われ導入遺伝子の発現によって部分的ながら機能的な改善を得るなど，一定の成果を上げてphCAR・lacZとし精製した．

いる2）・3）．Advは他のベクターに比べて比較的効率がよく製・濃縮を行った．293でtitercheckを行った（7．5×1010

transgeneがepisomalに存在するために危険性も少ない．しかし一回の遺伝子導入では目的遺伝子を長期的に発現さpfu／ml）．AdlacZ及びAdGFPs6，，：同様の方法でCMVpr0−

せ続けることは困難である．また長期的な発現を目的とした繰り返し導入は，ベクターの免疫原性と筋組織側のアデノウイルス（Ad）感受性が低下するために，2回目以降の導入効率が極めて悪くなることが知られている．このことが実際の臨床応用上問題となっている．ベクターの免疫原性はアデノウイルスゲノムの大部分を欠く次世代
Advにより改善されて＿いる4）・5）．さらに筋組織の感受性を上げるために，我々はヒトコクサッキーグループB，アデノウイルス2及び5型レセプター（hCAR）1）に着目した．
hCARはpentOnnberと特異的に接着する膜蛋白質で，細胞表面に吸着したウイルス粒子はαVCOntainingintegrinを介してendo叫OSisを受け細胞内に取り込まれる．生理的に
CARは骨格筋には存在しない．我々は，hCARを骨格筋にあらかじめ導入しAdvに対する感受性を上げ2回目以降の遺伝子導入効率を良くすることを目的としている．

ウイルス；AdhCAR−lacZ：COS・TPC法に従って作製，精moter及びSV40polyAsignalを用い作製した（2×1011，
5×1010p蝕／ml）．

hCARの生物学的活性；NIH3T3を播き（2×105cells／
60mmdish）1日後にphCAR・lacZをリン酸カルシウム法にて導入，さらに1日後にAdGFPs65Tを感染させた．ウイルス
液はPBS（＋）で2MOI＝2×105，10MOI＝1×106，50MOI＝5×106（p魚〟200〃1）に調整した．2日後に共焦点レーザー顕微鏡（LSM410，ZEISS社製）を用いて観察し，X・gal染色を行った．
RT−PCR；筋系細胞のCARの発現を確認するために，生後
1，2，3，5，14日目のBALB／Cnu／−マウス骨格筋及び脳，C2C12，
NIH3T3からtotalRNAを抽出，mCAR及びGAPDHのmRNAを特異的primersetを用いてRT・PCRを行った．
培養筋管細胞へのhCARの導入；C2C12を2×104cells／
1．6cm2に播き1日後に分化誘導した．5日後にAdhCAR−
lacZ及びAdlacZをそれぞれlxlO6pfu／501Llの濃度で感染させた．さらに2日後にAdGFPs6，，をlxlO5pfu／501Llの濃度で感染させ2日後に回収し，4％PFAで固定，抗GFP抗体及び材料と方法
細胞；293，NIH3T3，C2C12はDMEM，10％FCS，1％PSに発現する発現カセットpCITE−1acZにhCAR cDNAを組みで維持した．C2C12の分化誘導は，DMEM，1％FCS，1％PSを用いた．
＊熊本大学医学部附属病院神経内科

発現カセットpCITE−lacZにhCAR cDNAを組み込み

抗β−gal抗体で免疫染色をした．
動物への注入；生後4日目のBALB／Cnu／nuマウス下腿に，33G針を用いて2×109pfu（2．5FLl）のAdhCAR・lacZを直接注入した．さらに7日後に2×109p鮎（4〃1）のAdGFPs6汀をほぼ同じ場所に注入した．さらに7日後に屠殺し下腿筋をイソ
ペンタンと液体窒素を用いて凍結したのちにcryostatを用−253−

いて10／上mの連続切片を作製した．共焦点レーザー顕微

β−gal

鏡で観察し，隣の切片はX−ga傑色を行った．
結果

NIH3T3にphCAR−lacZおよびpCITE−lacZを導入した効率
は，X−gal染色の結果はどちらも10％程度だった．
AdGFPs65Tを感染させた結果，10MOI，50MOIでは
phCAR−lacZを導入した細胞でGFPの蛍光を観察できたが，コントロールのpCITE−lacZを導入したものでは蛍光は認めなかった（図1）．C2C12，生後1，2，3，5，14日のマウス骨格筋及び脳でのmCARのmRNAは，脳を除いて発現はみら
図3 C2C12（2xlO4cells／1．6cm2）を分化誘導LAdhCAR−
lacZ（lX106p餌50〟1）を感染させた．さらに48時間
後AdGFPs85，（lxlO5p魚〟50両）を感染させた．2日後に回収し，4％PFAで固定，抗GFP抗体及び抗β−gd抗体で免疫染色した．CARを強制発現させたmyo一
山beにGFPの発現がみられた．倍率は300倍れなかった（図2）．C2C12myotubeにAdhCAR−lacZを用い
hCARを強制発現させ，β一gal陽性のhCARを発現した
myotubeは低濃度（5−10MOI）のAdGFPs65，に感染した（図3）．
さらにin vivoの実験を行った．BALB／C nu／nuマウス骨格筋にAdhCAR・lacZを注入し，さらに7日後にAdGFPs65Tをほぼ同部位に注入した結果，前脛骨筋を中心に広範囲のAdhCAR−lacZ AdGFP

感染を認め，hCARpositiveの骨格筋には比較的広範囲に
GFPの発現を観察できた（図4）．

図4 生後4日目のBALB／C mJ／nuマウス下腿にAdhCAR−
lacZ（2xlO9p蝕ノ2．5上目）を直接注入し，さらに7日後に
AdGFPs65T（2x109pfu／4FLl）をほぼ同じ場所に注入した，さらに7日後に屠殺して観察した．倍率は100倍

CAR＋
3T3

AdGFPs65T2MOl lOMO1

50HOl

考

察

hCARのAdvの感染性に対する効果は，TbmkoらがCARのcDNAを導入した細胞はAdによる感染性が約1000倍も

CAR−
3T3

改善したと報告している6）が我々も同様の結果を得た．
hCARを発現した細胞は低いMOIでもかなりよく感染したと考えられる．またRT−PCRの結果は，myOblast，immature

国1NtH3T3にphCAR−lacZをtransfbctionL2MOI，10MOI，
50MOIのAdGFPs6汀を感染させた（上段）．下段はコントロールとしてpCITE−1acZをtrans飴ctionした．
hCAR posi・血eの細胞は10MOI，50MOIで感染した．倍率は75倍

myotube，mature myO茄berのいずれもmCARの発現はみられなかった，これは骨格筋に対するAdvによる遺伝子導入の有効性を否定するものではない．われわれが行った実験の結果では，筋系細胞は低濃度では感染効率が低い

RT

＋

−

＋

−

＋

−

＋

−

■

−

嘉

一

■

−

＋

−

が，高濃度では比較的よく感染する．mCAR以外にpen−
ton重berと弱いながら親和性がある膜蛋白がレセプターとして働いている可能性が示唆される．また培養系では
myoblast，myOtubeのいずれにおいてもAdvへの感受性は

鸞臨

習＿

l■

●■

−

−■

■書

−

■■■

認められたが，比較的低濃度（5−20MOI程度）ではほとんど●■感染しなかった．比較的高濃度のAdhCAR・lacZを感染させhCARを発現させたものは，低濃度のAdvにも感受性を

M PI P2

P3

PS P14

P2

示した．invivoにおいては，X一gal陽性かつhCAR陽性のmH‡T3

m岬b18St SくeぬImlぶCk B帽in

図2 C2C12．Nm3T3，生後1，2，3，5，14日目のBALB／C
n山一マウス骨格筋及び脳からtotdRNAを抽出し
mCARのmRNAを特異的primcrsetを用いてRr−PCRを行った．筋系の細胞ではCARの発現はみられな
かった．

骨格筋には比較的広範囲にGFPの発現を観察でき，hCARによる感染効率の増強効果が示唆された．しかし現時点
では，ウイルスの投与量や部位，投与方法などさらに検討が必要である．一方で免sciaを越える感染は弱く，物理的または生化学的なバリアに阻まれることが伺われた刀．
−254−

また高濃度のウイルスはそれ自体が細胞毒性があると考えられていたが，我々の方法ではinYi廿0でも，おそらく3）DeconinckN，RagotT；GillisJMetal：Functionalprotec・はinYivoでも，高濃度である必要はないと考えられ，毒性を抑えることも期待できる．
現在，Advは治療目的に最も期待される遺伝子導入方法であるが，骨格筋疾患の治療のためには患者の一生涯という長い期間，治療遺伝子の発現を可能にすることがmediated transfer ofa dystrophin mlnlgene・Proc Natl

望まれている．廿mSgeneがepisomeとしてとどまる現在の方法では，治療遺伝子を繰り返して投与し発現量を維持する必要があるだろう．我々の研究の結果は，hCAR遺伝子を用いることで一つの方法を提示している．

tionofdystrophicmouse（mdx）musclesaReradenoviru5−

AcadSciUSA93：3570・3574，1996．
4）HaeckerSE，StedmanHH，WilsonJM，etal：Invivoex−
pressionoffu11・1engthhumandystrophinkomadenoviral
vectorsdeletedofal1viralgenes．HumanGeneTherapy7（15）：1907−1914，1996．

5）ChenH，MackL，Clemensftetal：Persistenceinmuscle
ofanadenoviralvectorthatlacksallviralgenes．ProcNatl
AcadSciUSA94：1645・1650，1997．
6）TbmkoRnXuR，PhilipsonL．：HCARandMCAR：The文

献humanandmousecellularreceptorsforsubgroupCadeno−

1）BergelsonJ，CunninghamJ，FinbergR，etal：Isolationof

virousesandgroupBcoxsackieviruSeS・ProcNatlAcadSci
USA94：3352・3356，1997．

acommonreceptorfbrCoxsackieBviruSeSandadenovi・7）AcsadiG，JaniA，KarpatiG，etal：Adi飴rentialemcien・

mses2and5．Science275（5304）：1320・1323，1997．
2）QuantinB，PerricaudetLD，MandelJ・Letal：AdenoviruSCy Of adenoviru5−mediatedinvivo gene tranSfとrinto

asaneXPreSSionvectorinmusclecellinvivo．ProcNatl

Skeletalmusclecellofdi飴rentmaturity．HumMoIGenet

AcadSciUSA89：2581・2584，1992．

3（4）：579・584，1994．

−255−

アデノウイルスベクターを用いたminidystrophingene導入

によるジストロフィンの中枢神経系での機能解析の試み

即ガ

龍

村上

●

木村

■
■

暁修

＊

田

寧生治

田

■

前原箕

■

之斗郎
⁝
寿泰英

馬田山

有西宇

研究協力者

要 旨 controlマウス（B−10）におけるdystrophinおよびβ−dystroglycanの発現は，おもにシナプス後膜に局在していたが，mdxマウスにおけるβ−dystroglycanの発現は，COntrOlマウス（B−10）と比較してシナプス後膜において減少していた・dystrophinの中枢神経における役割について検討するためにadenoviralvectorにdystrophin・minigeneを導入しmdxマウスの中枢神経にて発現させたところcontrolマウスと同様にシナプス後膜に強くBeckertypedystro−
Phinの発現を認め，それに引き続きβ−dystroglycanの発現もシナプス後膜において増強されていた．
mdxマウスの中枢神経では，形態学的異常は報告されていないが記憶の獲得に障害があるとの報告がある．今回の実験は，dystrophinが欠損することにより主にシナプス後膜に局在すると考えられる蛋白の局在に違いが生じ，その結果，記憶学習の障害がおこる可能性を示唆する．
はじめに

5）叫ectionしたmdxマウスとcontrolマウスP−10）の中枢神

ジストロフィンは骨格筋，心筋，平滑筋のみならず中経でのβ−dystroglycanの発現様式を蛍光免疫染色にて比較検討した．

枢神経においても大脳および小脳皮質に豊富に存在し，
主にシナプス後膜に局在している1）・2）．中枢神経ではdystro−
Phinは筋組織とは異なるpromotorにより制御されており中

6）controlマウス（B−10）とm血マウスの中枢神経でのβ−

枢神経においては筋組按と異なる生理機能を担っている

後膜分画においてWestemblotにて比較した．

dys廿Oglycanの発現畳を膜分画，シナプス分画，シナプス可能性があるが，現在のところその正確な役割は不明である．
lstgenerationadenoviralvectorは効率良くinvivoにて中枢神経細胞に外来遺伝子を導入できるため，dystrophin−minigeneを中枢神経で発現させ，dystrophinの中枢神経における機能を解明するための実験を行った．

結果1）CMVプロモーターをもったBeckertypedystorphinは，培養細胞に発現を認めた．
2）invivoでも中枢神経でのBeckertypedystrophinは，効率良く発現していた．（図1，図2）
3）導入したBeckertypedystrophinは，COntrOlマウス（B・10）

対象と方法
1）adenoviralvectorにdystrophin−minigeneを導入し培養細と同様に主にシナプス後膜に局在していた．（図3）4）controlマウス（8−10）における中枢神経でのβ−胞（COS7）に感染させBeckertypedystrophin（約220KDa）の発
現をWestemblotにて確認した．

dyStrOglycanの発現は，m血マウスと比較してシナプス後膜において強い発現が認められた．

2）invivoにてdystrophin・minigeneを導入したadenoviral5）irかctionしたm血マウスにおいては中枢神経でのβ−VeCtOrをmdxマウス（生後3から5日）のbrainにiLtiectionL7日
後に蛍光免疫染色にて発現を確認した．

dystroglycanの発現はcontrolマウス＠−10）と同様にシナプス
後膜に強い発現が認められた．

3）irかctionしたmdxマウスのbminにおけるBeckertype6）Westem blotによる検索でcontrolマウスと比較してmdx

dystrophinとcontrolマウスP・10）のdystrophinの発現様式を
蛍光免疫染色にて比較検討した．

マウスのβ・dystroglycanの発現は，シナプス後膜分画において減少していた．（図4）4）mdxマウスとcontrolマウス（B・10）の中枢神経でのβ−dystroglycanの発現様式を蛍光免疫染色にて比較した．

考察

dystrophinの中枢神経での機能解析の為にCMVプロモー＊熊本大学医学部附属病院神経内科

ターをもつdystrophin・minigeneをadenoviralvectorを用いて中枢神経へ導入し検討した．

−256−

国l Controlmouse（B−10）のdystrophin蛍光免疫染色（110×）．海馬に強い発現が認められた．

図3

MdxmouseにBeCkerWpedystrophinを発現させた
dystrophin蛍光免疫染色（220×）．
Controlmouseと同様に細胞膜に沿って斑状にdys−
けOphinの発現が認められる．

靭Ⅶ叩t朋Om￠f・

43KDa．→

癖努鮮

PSDf・

…鮨窒主潮

磯靡

Co血．M血．Co鵬．M血．
10杜glO拉gl甚g l甚g
図2 Controlmouse（B−10）のdystrophin蛍光免疫染色（朋0×）．海馬CA3領域．細胞膜に沿って斑状にdys一打Ophinの発現が認められる．

図4 Controlmouse（B−10），Mdx mouse br血（大脳）のβ−
dys打OglycanのWestemblot・
coI肘Olマウスと比較してmdxマウスのβtdys打Oglycanの発現は，シナプス後膜分画において減少している．

COntrOlマウス（B−10）の中枢神経におけるdys仕Ophhの発結果から，mdxマウスの中枢神経では，形態学的な差異

現はシナプス後膜に局在しており蛍光免疫染色により斑状にはなくてもdystrophinが欠損することにより主にシナプス染色された．また，β−dys廿OgIycanも同様に主にシナプス後膜に局在すると考えられる蛋白の局在に違いが生じ，後膜に局在Ldystrophinとの二重染色では完全に分布が一

その結果，記憶学習の障害がおこる可能性が考えられる．

致した．一方，mdxマウスにおけるβ一dystroglycanの発現

今後，シナプス後膜に発現しているその他の蛋白も含をcontrolマウスと比較してみたところ，蛍光免疫染色でめてさらにdystrophinの中枢神経での機能解析を行う予定である．

は，細胞膜において特に強く染色される部位は認められず，WeStem blotではシナプス後膜分画において発現量の減少が認められた．

文

次に，導入したBeckertype dystrophinは，COntrOlマウスと同様に主にシナプス後膜に局在することが確認できた．

1）HartG．WLidov，TimoyhyJ．Byers，etal：Localizationof
dystrophintopostsynapticreglOnSOfcentralnervoussys−

また，Beckertypedystrophinを導入することによりmdxマ

temcorticalneurons．Nature．348：20／27725−728Decem＿

ウスの中枢神経細胞でのβ−dys廿Oglycanの局在が変化し
吋StrOphinが強発現している部位に一致してβ−献

ber1990．

2）H．G．WLidov，LM．Kunkel，etal：The distribution ofdystroglyc弧の発現が認められた．

dystrophininthemurinecentralnervoussystem．Anim−

これまで，mdxマウスの中枢神経における形態学的異munocytochemicalstudy，Neuroscience．54（1）：167−187，

常は報告されていない．また，機能に関する報告として

1993．

長期記憶に関連すると考えられているlJPは，異常がなく，

3）A．K．Sesa洪M．L．Emington，etal：Spatialleaming and

空間認識試験である水迷路試験でも有意差は認められな

hippocampallong−term pOtentiation are notimpairedin

いとの報告3）がある一方，受動的回避試験であるステップ
スルー試験法では，COntrOlマウスと比較してmdxマウスで

mdxmice．NeuroscienceLetters．211：203−206，1996．
4）FranCeSCOMuntoniandAmaMateddu：PassiveavoidanCeは著明に反応遷時が延長し，mdxマウスでは記憶の獲得

behaviour de重citinthe mdx mouse．NeuromuscularDis・に障害があるとの報告がある4）．以上の報告と今回の実験

Orders．1（2）：121−123，1993．

−257−

ジストロフィン遺伝子導入：多コピー発現ベクターと長期発現ベクターのmdxマウスへの応用に関する研究
岡 田 伸太郎●

研究協力者

要

旨

塚

本

浩

子●

乾

幸

治●

多コピーの核内プラスミドとして複製し，挿入遺伝子を安定して高発現させることが可能である，ウシ

パピローマウイルス（bovine papilloma virus，BPV）ベクター1）と複製機能と核内保留機能を合わせ持ち，挿入遺伝
子の組続での長期発現が期待できるEpstein・Barrvirus（EBV）ベクター2）をジストロフィン遺伝子導入に応用してその発現の持続効果を検討した．その結果BPVベクターを用いたとき，血γか0のLacZの発現は1日目では差を認めなかったが，7日目では約3倍となった．一方EBVベクターでは仙血マウスを用いたジストロフィン発現を7日日と28日目で比較すると，約1．5倍に上昇していた．これら2種のベクターを組み合わせ，多コピーでかつ長期発現が可能なベクターを作製すれば，遺伝子治療への応用が考えられる．
はじめにによる発現実験を行い，Ⅹ・gal染色によってβ−gal陽性細BPVベクターの利点は，レトロウイルスのように染色体DNAに影響を及ぼさず，多コピーの核内プラスミドとして複製し，挿入した遺伝子を安定して高発現させることが可能である．またヒトに対して感染性がないことも
遺伝子治療ベクターとして優れた特徴であり期待される胞数を比較検討した．β−gal活性の経時的変化はC2C12と点ではあるが，欠点として細胞への遺伝子導入効率が低いことがあげられる．

pCMVβ，BPV−Pの2種類のプラスミドを用いて比較検討した．さらにSV40プロモーターと6．3kbのBecker型ミニジ
ストロフィン遺伝子を入れたpRSVDyB，これに同じく51％BPV−1フラグメントを挿入したpRSVDyBBを作製して，C2C12を利用して2つのプラスミドのジストロフィン

発現の差異を免疫蛍光抗体染色（12B2，6C5；mOuSe

EBVベクターは複製機能と核内保留機能を併せ持つため，挿入外来遺伝子の組織での長期発現を期待できる．
また，EBVの核内保留機能はいずれの種の細胞にも働き

monoclonalantibody）を行い，蛍光顕微鏡・共焦点顕微鏡
にて比較検討した．

うる3）．非分裂細胞からなる筋組織では，細胞分裂によるプラスミドDNAの希釈がさけられるので，分裂細胞組織に比べさらに核内保留機能の効果を期待することができる．

PCMVβ，pRSVβ，PPGKβにInvitrogen杜のEBVベクタ

以上の点より，非ウイルスベクターを用いた筋ジスト

日でX・ga塵色による比較を行った．続いてpRSVβ，PRSV
β＋EBを用いて，C2C12，NIH3T3，ヒト胎児腎由来細胞

ロフィーの遺伝子治療の試みとして，BPV帥el（BPV−1）
遺伝子を含むBPVベクターを用いて，ジストロフィン遺伝子を導入した多コピー発現ベクターを開発し筋肉への遺伝子治療を目的とする研究と，EBNA＋oriP遺伝子を含むEBVベクターを用いたジストロフィン遺伝子導入を目的とする長期発現複製ベクターの開発を試みた．

EBVベクターの応用：3種類のLacZ遺伝子発現ベクター，
ーREPlOのEBNA−1＋0riPのEBフラグメント（EBF14．2kb）を挿入し，これら6種類のLacZベクターを用いて，lipofbc−
tAMNEによるC2C12への導入を行い，導入後3日目と7日

293細胞への遺伝子導入を行い，β・gal活性の経時的変化を比較した．またミニジストロフィンを組み込んだPRSVDyB（N）とこれにEBFを挿入したpRSVDyBP汁EBを作製し，C2C12とNIH3T3への遺伝子導入を行った．続いて，週令7．5週・10週の〃〟ゐ血血（9匹）の左右前脛骨筋を1．2％
塩化バリウム溶液を用いて変性し，5日後左側にpRSVDyB

方法P）＋EB，右側にpRSVDyBP）を直接注入した．7日目，28

BPVベクターの応用：マイアミ大学Dr．Podackより供与さ日日に両脛骨筋を取り出し，凍結切片を作製し，P6（mbbit

れたBPV45neoNot（−）をもとに，pCMVβにlongPCRによって作製した4kbの51％BPV−1フラグメントを挿入したLacZ

polyclonalantibody）による抗ジストロフィン抗体染色を行い，ジストロフィン陽性線維数について比較検討した．

遺伝子発現ベクター（BPV−β，BPV−P）を作製し，CMVをプ
ロモーターに持つpCMVβとともに筋芽細胞C2C12とヒト皮膚線維芽細胞NIH3T3へのlipofectAMrNE（GIBCO）使用＊大阪大学医学部

ー258−

結

果

考

察

BPVベクターの応用：LacZ発現ベクター（pCMVβ，BPV−

BPVベクターについては，短期間の結果ではあるが，P）をトランスフェクション後1日日のβ−gal陽性細胞は，それぞれ40％，35％であり，筋管細胞出現後の7日目にもLacZ発現ベクターの検討で，筋管細胞の出現後にはBPV・

pcMVβとBPV・Pには同程度の陽性筋管細胞を認めた．

確認できた．このことは次にBPVフラグメントを含むジ

β・gal活性の経時的変化は，2日目のOD値を100％とした
場合，7日目はそれぞれ8％と23％となり，BPV−1フラグメ

ストロフィン発現ベクターを作成し，筋肉での血Vi加や加

1フラグメント挿入によるLacZ遺伝子発現の持続効果がントの挿入効果を認めた．NIH3T3を用いた発現実験でもVか0での検討を行っていくべき可能性を示唆するものであった．

C2C12の結果と同じ傾向を認めた．2種類のミニジストロ

EBVベクターについては，LacZ発現ベクターを用いたれ

フィン発現ベクター（PRSVDyB，pRSVDyBB）のC2C12に対するトランスフェクションの結果は，7日目にはN端・γ血）の実験でマウス（C2C12，NIH3T3），ヒト（293）いずれの細胞についても挿入遺伝子LacZの有意な発現持続を確認

C端いずれの抗体でも染まるジストロフィン陽性筋管細することができた．ミニジストロフィンの遺伝子導入に胞を，低率ではあるがほぼ同程度に認め，共焦点顕微鏡でもジストロフィンの筋細胞膜への局在を確認した．

ついては，7日目と28日目ともにpRSVDyB（N汁EBに，より多くの陽性細胞を持続的に認めることができた．投与

EBVベクターの応用：6種類のLacZ遺伝子発現ベクターを対照数を増やし，投与観察期間を延長することでジスト用いたC2C12への遺伝子導入では，いずれのプロモータ
ーでも導入後3日目のⅩ−ga塵色で，＋EBベクターに有意

ロフィン遺伝子導入に対するEBVベクターの有効性をさらに確認する予定である．直接投与・リボフェクション・なβ一gal陽性細胞を認めた．7日日（筋管細胞形成後）にも同様な傾向を見たが，CMVプロモーターを持つ2つのベ

HVJ・liposome法といった方法とともに，非ウイルスベク
ターの欠点である遺伝子導入効率を改善するためリガン

クター（pCMVβ，pCMVβ＋EB）の陽性細胞数は他のプロドを用いた導入方法の開発や導入効率が良いとされる横モーターを持つ4種類のベクターに比べ低率であったので，隔膜への投与なども行ってみたい．多コピー発現ベクタ

その後の経時的なⅩ−ga染色とβ・gal活性の観察にはpRSVβとpRSVβ十EBを用いた．いずれの3種類の細胞についーと長期発現複製ベクターの開発は，筋ジストロフィー遺伝子治療の有効な手段の1つとなりうるものと考えられる．

ても，pRSVβ＋EB導入3日目以降，染色性優位，活性上昇の有意な持続を認めた．ミニジストロフィン遺伝子導文

献

入後のC2C12，293細胞でも導入後6日目に，それぞれ筋

1）OheY，ZhaoD，Sa可ON，etal：ConstruCtionofanovel

細胞膜へのジストロフィンの局在と有意なジストロフィ

bovinepapillomaviruS VeCtOrwithoutdetectal）le tranS・ン陽性細胞の増加を認めた．また〝〟鹿′旬血へのプラスミ

forming activitysuitablefor gene transfbr．Hum Gene

ド直接注入後7日目，28日日の各筋の最高ジストロフィン

ner6：325i333，1995．

陽性細胞数を比較すると7日目（109±39vs154±24），28日

2）YateJLandGuanN：Stablereplicationofplasmidderived

日（100±21vs151±37）ともにpRSVDyBPJ）＋EBに陽性線維をより多く認め効果の持続も確認した．

舟omEpstein−BarrviruSinvariOusmammalianCelIs．Na・れ汀e313：812・815，1985．
3）WohlgemuthJG，KangSH，BulboacaGH，etal：Long・temgeneexpression丘omautonomouslyreplicatingvec−
torsinmammalianCells．GeneTher3：503−512，1996．

一259−

ⅠLl2p40遺伝子導入と抗CD80，抗CD86抗体投与による
同種筋芽細胞移植拒絶の抑制に関する研究
吉

研究協力者

星
下

研
里

野

一■
修榊

英■

佐 藤
八木田

秀

猛＊ 加 藤 和雄■＊ 奥 村則＊■康榊

要 約 筋ジストロフィーの将来の治療方の一つとして正常筋芽細胞の移植が考えられているが，拒絶反応により長期生着が困難である．そこで移植筋芽細胞の拒絶反応に関わる免疫反応を抑制することで長期の生者を試みた．移植免疫拒絶に関わる細胞性免疫Thlを誘導するサイトカインの1つにIL−12があるが，IL・12の働きを阻害す
るp40を組み込んだ筋芽細胞を同系マウスに移植したところ，拒絶反応を抑制することを兄いだした・更に
costimulatory分子に対する特異抗体である，抗CD80抗体，抗CD86抗体を併用したところ，筋芽細胞のmdxマウスへの長期生者効果が認められた．
はじめに遺伝性や＃治性疾患の遺伝子治療がこころみられているが，必要な遺伝子をどのように導入するかがひとつの課題となっている．導入した遺伝子の産生するタンパク質等は宿主すなわち患者自身の免疫反応を通じて異物と認識されて排除される場合があることが報告されている．
我々の実験はその解決法として免疫反応の初期段階を修飾すること，すなわち抗原特異的T細胞不応答状態（antigen−SPeC摘cTce11unresponsiveness）を導入することで免疫拒絶を抑制する試みである．対象として昨年度に引き続いて筋芽細胞移植による筋ジストロフィーの治療をし，1と同様にLacZ，IL12・p40遺伝子を導入しmdxマウスの後肢大腿四頭筋に同様に5×106個注入し，同時に抗CD80抗体と抗CD86抗体をともに50lLgづつ移植後3日間連続して腹腔内投与し，経時的に組絞学的に筋組織中の移植筋芽細胞を検討した．
結
果
1．同種移植（C3H由来C2／4筋芽細胞→C57BU6マウス）ではIL−12p40と抗体併用群で少なくとも4週間後の移植筋芽細胞の生者が認められた．
2．同系移植（C57BL／10ScSn由来筋細胞→mdxマウス）では4週間後同様にIL−12〆0と抗体併用群でさらに強い生者を認めた．

目標にマウスを用いて検討した．
方

2．次にC57BL／10ScSnマウスの骨格筋より筋細胞を分離法

センター神経研究所鍋島先生より供与）およびマウスとし

3．IL−12p40遺伝子導入と抗CD80，抗CD86抗体併用投与は同種及び同系筋芽細胞移植拒絶反応を抑制するために有てC57BL／6（H−2Kb），C57BL／10ScSn（H−2Kb），mdx（H・2Kb

効な方法である．

C3Hマウス（H−2Kk）由来筋芽細胞C2／4（国立精神・神経筋ジストロフィーのモデル）を本実験に用いた．
1．LacZJMFGを用いてマーカーLacZ遺伝子を導入した筋芽細胞を作成し（C2／4β−gal），さらにIL−12p40／MFG（癌研
究会附属病院濱田，脇本先生より供与）を用いてⅠし12p40
サブユニットを導入した筋芽細胞を作成した（C2／4β・gal−p40）．次にC2川β−gal細胞またはC2／4β一gal−p40細胞をそれぞれ5×106個づつC57BL／6マウス後肢大腿四頭筋に直視下にシリンジを用いて筋肉内注入した．同時に抗CD80抗体（1GlO）と抗CD86抗体（GL・l）をともに50FLgづつ移植
後3日間連続して腹腔内投与した．その後経時的に組織切片を作製し，H＆E染色やⅩ一gal染色により組織学的に筋組織中の移植筋芽細胞を検討した．
＊国立精神・神経センター国府台病院神経内科＊＊順天堂大学医学部免疫学

考察
筋ジストロフィーに対する治療方法のひとつとして正常筋芽細胞の移植方法が報告されているが実際は，細胞導入効率の低さ，拒絶反応などにより長期生者は困難である．そこで移植筋芽細胞拒絶に関わる免疫反応を抑制することでより長期の移植細胞の生者を試みた．拒絶反応を引き起こすT細胞の活性化には移植筋芽細胞を認識した抗原提示細胞が，MHCを介して抗原刺激をTcell
receptorからT細胞へ伝えられる第一シグナルだけではな
く，第二のシグナルである共刺激costimulatoⅣ分子が必要である．このシグナルとしてはCD28，CTLA−4／CD80，CD87などの細胞接着分子が知られている．さらに抗原提示を受けたThelper細胞はThlまたはTh2に分化する・このう
ち移植細胞拒絶におもに関与する細胞性免疫はThlによー260−

り強められ，Thlに分化させるサイトカインのひとつにた．そこで今回はさらにcostimulatoⅣ分子に対する特異的

IL＿12がある．我々ははじめにIL−12に着目した．InYiYOで抗体を用いてブロックすることを併用して，移植細胞拒そのサブユニットp40のみを働かせるとIL−12のアンタゴニストとなることが報告されていたが，我々はこのⅠし絶の抑制ひいては長期生者に向けての抗原特異的T細胞
不応答状態の導入を試み，その効果を確認した・

12p40サブユニットを筋芽細胞に移植し，invivoにおいて
IL12−p40サブユニットがnl型の免疫反応を抑制し移植細胞拒絶の初期を抑制することを見出し報告した1）．しかし

参考文献
1）KKato，OShimozato，KHoshi，etal：PNAS93：9085・

同種細胞移植の拒絶に対する抑制効果には不十分であっー261−

9089，1996．

筋緊張性ジストロフィーの耐糖能異常に対する
troglitazoneによる治療

■
■
●
■

仁

克

言

結

筋緊張性ジストロフィー（MyD）は，ミオトニアを伴う
筋萎縮を特徴とする遺伝性筋疾患であるが，多系統にわたる全身症状の1つとして耐糖能異常も高頻度に併発する

立

足

●
事
●
●

本

●
●

松乾

●
●
■

対対

訝封

俊俊

臣■

■

尚

代

井

善千

緒

田村

西木

研究協力者

川

果

1）耐糖能異常の判定（図1）：75gOGTrで血糖のパターンが正常型であったものは5例，境界型は5例，糖尿病型は6態を明らかにし，インスリン抵抗性改善剤である加glita・ZOne（TGZ）2）の治療効果を検討した．

例（5例はNIDDM，1例はIDDM）であった．IRIの分泌反応は正常型では過剰を示し，境界型，糖尿病型となるに伴い徐々に低下した．各型とBMI，下肢機能障害度，CTGリ
ピート数の間には明らかな関係は認められなかった．

対象と方法

2）インスリン分泌能とインスリン抵抗性（図2）：Ⅰ．Ⅰ．は正常型では2．28から7．13，境界型では1．77から3．02といずれことが知られているl）．本研究では本症の耐糖能異常の病

1）症例：MyDの16例で，年齢は31歳から66歳（46．3±8．1歳，平均±標準偏差）で男性9例，女性7例である．3例はすでも高値であるのに対し，糖尿病型では0．006から0．34と全例低下していた．一方，FIMは正常型の2例を除き高値を示した．

に糖尿病の治療を受けていた．肥満度を表すbodymass
index（BMI）3）は14・3から29．3（22．5±3．4，同）であり，2例に肥満が認められた．Ruskによる下肢機能障害度のステー

3）TGZによる耐糖能異常の治療（図3）：NDDMと診断された3例には，TGZの投与を行い，1ケ月後より空腹時血糖ジ4）はⅠが2例，Ⅱが3例，Ⅲが3例，Ⅳが2例，Vが1例，Ⅵが5例であった．またCTGリピート数は400から2400（1400±670，同）であった．

値の低下が，次いでHbAIcの低下も認められた．75gOGTrの再検では，血糖の総和（∑BG）は著明に減少し，耐糖能
異常の改善が認められた．

2）耐糖能異常の判定：75g経口ブドウ糖負荷試験（75gOGTr）を行い，血糖とimmunoreactiveinsulin（IRl）を負荷前から30分，60分，120分，180分まで経時的に測定し，
日本糖尿病学会の診断基準5）に従ってそのパターンより正常型，境界型，糖尿病型に分類した．各症例についてイ
ンスリンの初期分泌能の指標であるinsulinogenic
index（Ⅰ・Ⅰ・）6）とインスリン抵抗性の指標であるfhstinginsulin
resistanCeindex（FIRI）7）を算出した．
3）TGZによる耐糖能異常の治療：糖尿病型を示した症例のうちNIDDMで投与を希望する症例には，TGZをl回200mg，
1日2回朝夕食後に投与し，1カ月毎に血糖，mAk，握九
肺活量などを測定し，3カ月後に75gOGTTを再検した．
4）TGZの長期投与：3カ月間の投与期間終了後もさらに治療の継続を希望する症例については，1カ月に一度肝機能を検査しながら投与を継続した．

＊高松市民病院＊＊伊月病院
榊＊徳島大学第一内科＊＊■■国立療養所徳島病院内科＊＊＊■■国立療養所徳島病院神経内科

4）TGZの長期投与（図4）：TGZの長期投与例は2例で，HbAIc
は正常化していたが，l例は14カ月以上投与を継続したのに対して，もう1例では肝障害のため8カ月で中止した．
なお，この期間内に両例とも握力や肺活量に有意な変動はなかった．
考察

筋緊張性ジストロフィー（MyD）には，高インスリン血症と耐糖能異常が高頻度にみられることが知られているl）
が，本研究でも75gOGTrで糖尿病型を示す症例が高頻度（37・5％）にみられ，さらに血糖の変動パターンが前記のどの型であってもIM分泌は大部分の症例で過剰反応がみられ，
インスリン抵抗性が存在することが示された．
TGZは，骨格筋においてもインスリン受容体のチロシンキナーゼを活性化し，骨格筋への糖の取り込みを促進させるなどの作用を示し，インスリン抵抗性を改善させるチアゾリン系薬剤である2）．MyDでは，インスリン分
泌の過剰反応が長年にわたり存在すると考えられるが，その結果，膵β−細胞の疲弊がおこり，インスリン分泌の減少あるいは標的器官の骨格筋の障害によるインスリン作用の減弱などが生じ，糖尿病を発症するものと考えら

ー262−

れる．TGZは，本症において骨格筋の萎縮や障害があるにもかかわらずインスリンの分泌を増加させることなくう二次的筋萎縮を予防できるものと考えられる．一方，
MoxIcyら8）は，本症のインスリン抵抗性の機序として骨格筋におけるブドウ糖摂取能の低下をあげており，TGZの投与が筋の糖利用の増加につながれば本症にみられる

負荷後の過血糖を抑えてHbAIcを正常化させることができ，本症の糖尿病に対して有効な治療薬と思われる．そしてさらに本薬を耐糖能異常の早期から投与することに
より境界型から糖尿病への進展を遅延させ糖尿病に伴

0

80

120

（分）1800（正常型，n＝5）

筋症状その他を改善させる可能性も考えられる．

120 （，Hl的

印（境界型，∩＝5）

0

80

（別120

（糖尿病型，HIDDH，n＝5）

図1筋緊張性ジストロフィー（MyD）症例に対する75gOGTTの結果
16例中5例が正常型，5例が境界型，6例が糖尿病型（5例はNIDDM，1例はmDM）と判定された．図には各型の血糖とmの平均値を示した．正常型ではインスリン分泌反応は明らかに過剰で，境界型でも分泌は多いが，糖尿病型では分泌反応が低下している．

●
：

●：

●

●
●

●

I
−●●一・ト一一一一一・一一一一一・一一一・一一一一一一一一

0

1

FIRl

5

l．…．．．…＿＿．．．………．＿．＿＿…鼻01

01FIR1

［正常型］
図2

5

［糖尿病型］

MyD症例の75gOGTT各型におけるインスリン分泌能とインスリン抵抗性
縦軸にはインスリン分泌能を表すinsulinogenicindex（日．）＃を，横軸にはインスリン抵抗性を表すfhstinginsulinregistanceindex
げIRI）Sを示した．日．は正常型から境界型，糖尿病型となるに伴い徐々に低下し，糖尿病型では全例低下している．一方，
FIRIは正常型の2例を除き高値を示した．
＃：△IRI（30分）／△血糖（30分）（0．4以下でインスリンの初期分泌の低下）‡：（空腹時血糖（m釘dl）÷18）×空腹時RI÷22．5（1．0以上でインスリン抵抗性）

一263−

図3 MyD症例の糖尿病に対するtroglitazoncCrGZ）の治療効果
A（治療経過）‥TGZの投与を行ったのは3例で，投与開始後1カ月頃から空腹時血糖O；BG）が，次いでHbAlCが徐々に低下傾向を示した．
B（75gOGTTによる前後の比較）：75gOGTT検査時の軌30分，60分，120分の血糖あるいはIRIの総和（それぞれ∑BG，∑m）で比較したが，∑BGは3例とも投与後に著明な減少が認められた．一方，∑mは2例では減少，1例では軽度増加しいずれも正常参考域下限のよく似た数値を示した．
A文献1）Harper PS：Myotonic Dystrophy．Philadelphia，WB
Saunders：115・138，1979．
2）LeeM・K，MilesPDG，KhoursheedM，etal：MetabムIic
e脆ctsoftroglitazoneonfluctose・inducedinsulinresis−
tanCeintherat．Diabetes43：1435・1439，1994
モカ（lJ 4
％鈴音1 58・9

8
52も

1
臼7

3
554

5
19．8

3
糾1

3）KeysA，etal：Indicesofrelativeweightandobesity．J
ChronicDis25：329，1972．

¶l∴l∴l，リ，リ‖l−，l，llHト（月，4）RuskHA：RehabilitationMedicine．Mosby；StLouis，USA，1977：440．

B5） 小坂樹徳ほか：糖尿病の診断に関する委員会報告．
糖尿病25：857，1982．
6）

SeltzerHS，AllenEW，HerronAlandBrennanMT：
InsulinsecretioninresponsetoglycemiCstimulus：
relationofdelayedinitialreleasetocarbohydrate｛力くり8％肺話1 712

10
784

1
m↓

9
叩．1

intoleranCeinmilddiabetes・JClinInvest46：323・335，

10
71．8

｝ナTl2l。リ5I。l，l。l．，l2l（月，図4 糖尿病症例に対するtroglitazone（TGZ）の長期治療効果
現53歳，女性）：14カ月にわたり投与を続けている．
空腹時血糖（FBG）はやや高値を持続しているが，
HbAIcは3カ月めより正常域に戻っている．なお握力や肺活量などには有意な改善は認められていな
い．
B（購歳，男性）：投与開始6カ月めに肝障害が出現したため投与量を半畳に減らし，耐糖能異常と肝障害の両者が改善したが，gカ月後に肝障害が再発したため投与を中止した．その後耐糖能異常は徐々に増悪している．

1967．

7）

DuncanMH，SinghBM，WisePH，CarterGand
Alaghband−ZadehJ：Asimplemeasureofinsulinresis−
tance．Lancet346：120・121，1995．

8）

MoxleyRTiCorbettAJ，MinakerKLandRoweJW：
Wh01e bodyinsulin resistanCein myotonic dystrophy・
AnnNeurol15：157・162，19＆4．

−264−

ミトコンドリア異常症におけるジクロロ酢酸ナトリウム治療
桃 井 真里子■

研究協力者 斎 藤 茂 子事

要 旨 MELAS患者4例に1年1カ月〜3年2カ月間ジクロロ酢酸ナトリウム（DCA）を投与し，有効性と副作用を評価した．治療開始後，脳卒中様発作はなく，頭痛，腹痛が軽減しており，臨床的に可逆性を示す血管性病変には明らかに有効であった．すでに障害のある神経細胞への効果は乏しく，＃聴，知能障害や脳波異常は改善しなかった．DCAの作用はピルビン酸脱水素酵素の不活化の阻害であるが，MELASのような電子伝達系の障害であっても，残存する正常mtDNAによる代謝系の活性化が起こるため，periodicな臨床像に効果を示したと考えられる．
さらに，ミトコンドリアDNA（mtDNA）塩基番号8993のT→G変異に起因するLeigh脳症1例へのDCA治療を行った．治療により意識レベルはやや改善したが心不全が進行し死亡した．剖検組織では，検索した全ての組織で90％以上の変異mtDNAを有しており，このことは，個々の細胞レベルにおいても変異mtDNAが大部分を占め，ATPaseの機能障害を有すると考えられる．残存する正常代謝系が一定レベル以下では，DCA投与によりTCA cycleへのAcetylCoAの供給が増えてもATPが産生されず，かえって電子伝達系からの活性酸素増大を引き起こし，細胞障害性に働くことが推察された．
DCAは，MELASでは有効な治療であるが，Leigh脳症では症例毎の検討が必要である．今後，残存正常mtDNAとDCAの有効性の関係など，細胞レベルでのDCAによる代謝変化についての検討も必要と考えられる．
文献1）SaitohS，MomoiMY，YamagataT，MoriYand
ImaiM：Efftcts ofdichloroacetateinthree patients
withMELAS．Neurology50：531−534，1998．

■自治医科大学小児科

一265−

ミトコンドリア病変異遺伝子の選択的破頓による遺伝子治療の基礎開発
田

研究協力者

緒

中

雅

嗣＊

米 田
誠輌 Harm−JanBorgeld醐JinZhang＊
Jian−ShengGong書 宮 林 重 明掴＊瀬戸口 靖 弘＊＊梱

3．SmaI遺伝子の発現とミトコンドリア内への移入の確

言

ミトコンドリアゲノムは1細胞あたり数千コピー存在し，
ミトコンドリア病患者の組織・細胞においては，変異型
mtDNAと正常型mtDNAが共存している（ヘテロプラスミー）．変異型mtDNAの割合が一定の開催を越えた場合にミトコンドリア機能異常がもたらされる．従って，変異型mtDNAのみを選択的に破壊・減少させ．正常型mtDNAを細胞内で優位に立たせることができれば，機能回復が期待できる．本研究では，変異型mtDNAのみを切断する
制限酵素を，ミトコンドリアへの移入に必要な特異的シ
グナルペプチドと結合させ，融合タンパクとして細胞質内で合成させ，ミトコンドリア内へ選択的に運び入れる．

認：8993T→G変異を有するサイプリッドにsOTC−GFP融合遺伝子を持つ哺乳類発現プラスミドを導入した．蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顛微鏡を用いて観察した結果，細胞質に顆粒状に蛍光が観察され，SOTCによってGFPを選択的にミトコンドリアに移入できることを確認した（図1）．sOTC−SmaI−GFPプラスミドを導入した場合にも，蛍光強度は低いものの，細胞質に顆粒状に蛍光が観察された．soTC・S椚dI−GFPプラスミドを導入した細胞から，ネオマイシン耐性を指標として選択を行い，安定形質発現株が得られた．現在，安定形質発現株における変異
mtDNAを解析中である．

ミトコンドリアには，組換え修復の機構が存在しないため，二重鎖切断を受けた変異型mのNAは複製不能となり，正常型mtDNAが増加し，ミトコンドリア機能が回復する
ものと期待される．

考察
本研究によって，ミトコンドリアゲノムを外来遺伝子の導入によって制御する基礎が得られた．従来，ミトコ
ンドリア脳筋症に対する遺伝子治療として，1）遺伝子銃

方法および結果
1・8993変異を有するサイプリッドの構築：Leigh脳症の患者より採取された線維芽細胞を骨肉腫由来のmtDNAを欠如した細胞（pO206）と細胞質融合させ，8993T→G変異を有する不死化細胞系を確立した．
2・制限酵素伽αⅠとミトコンドリアシグナルペプチド
CDNAの融合遺伝子の構築：制限酵素5加旧Ⅰ遺伝子を助〝d血椚dCe∫CeWの菌株のDNAからPCR増幅しクローン化した．
ラットの0mitinetranSCarbamylase（OTC）のシグナルペプチド（SOTC）の遺伝子に制限酵素ShlaI遺伝子をrecombinant
PCR法を用いて結合した．この融合遺伝子をCMVプロモ
ーターを持つ哺乳類発現ベクターbCR3−Uni）に挿入し発
現プラスミドを得た（SOTC−Sb2aI／pCR3−Uni）．また，同時にsOTC−SmaIの下流にGFP（greenfluorenscentprotein）遺伝子を結合させたプラスミド（SOTC・SmaI−GFP／pCR3−Uni）
およびsOTCに直接GFP連結したプラスミド（SOTC−GFP／
pCR3−Uni）を構築した．
＊財団法人岐阜県国際バイオ研究所＊＊福井医科大学第二内科
榊名古屋大学医学部第二生化学＊躊＊東北大学大学院医学系研究科小児病態分野＊榊＊順天堂大学医学部呼吸羊内科

ー266−

を用いてミトコンドリアにDNAを打ち込む，2）シグナルペプチドをDNAに結合しその複合体をミトコンドリアに

8）KovalenkoSA，HaTmSPJ，TanakaM，BaumerA，KelsoJ，運び入れる，などの方法が提唱されてきた．前者は到達

OzawaTandLinnaneAW：MethodforinsEtuinvestiga・tion ofmitochondrialDNAdeletions．Hum．Mutat．10：

深度の浅さと細胞障害性のために培養細胞レベルの実験

489・95，1997．

に止まる．後者は運び込むことのできるDNAの長さに限9）IslamMM，SuzukiH，YonedaMandTanakaM：Primary

界があることと，残存する変異mtDNAの影響を消すことができない点で問題がある．

StruCtureOfthesmallest（6．4−kDa）subunitofhumanand

本研究は制限酵素の特異性を利用して変異型mtDNAのCDNAsequences．Biochem．Mol．Biol．Int．41：1109−1119，

bovineubiquin01・CytOChrome creducta5e deduced倉om

選択的除去をめざすものである．制限酵素を細胞核に導1997．

入すると相同組換えが促進されると報告されている．哺10）YoritakaA，HattoriN，UchidaK，TanakaM，Mizuno

乳類のミトコンドリアでは相同組換えがないとされていY and StadtmanER：Immunohistochemicaldetection ofる．ミトコンドリアへの制限酵素の移入によって，欠失4・hydroxynonenalproteinadductsinParkinson disease．

mtDNAの生成が促進されるか，あるいは切断をうけた

Proc．Natl．Acad．Sci．USA93：2696−2701，1996．

mのNAがDNaseによって処理されるかなど，細胞内の11）TanakaM，Kovalenko S，GongJ−S，BorgeldH−J，

mtDNAの動態に関する基礎研究を行っていく必要がある．

KatsumataK，HayakawaM，YonedaMandOzawaT：
Accumulationofdeletionsandpointmutationsinmito−

文

献Chondrialgenomeindegenerativediseases．Tn．

1）ThakaM，GongJ−S，ZhangJ，YonedaMandlねgiK：Annalsof

NewYorkAcademyofSciences：PhamacologicalInter−

Mitochondrialgenotypeassociatedwithlongevity．Lancet

VentioninAgingandAge・aSSOCiatedDisorders

351：185−186，1998．

（K．Ki−

tani，A．Aoba，andS．Goto，eds．），Pp．102・111，NewYork

2）GongJ−S，ZhangJ，YbnedaM，Sal1aShiK，MiyqiimaH，
Ⅵ汀nauChiK，1ねgiKandnIlakaM：Mitochondrialgeno−

AcademyofSciences，NewYork，（1996）
12．TanakaM，HayakawaMandOzawaT：Automatedse−

type舟equentincentenarianS predisposes resistanCe tO

quenclngOfmitochondrialDNA．In

adult−OnSetdiseases．J．Clin．Biochem．Nutr．24：105・111，

mology，MitochondrialGenetics

1998．

．MethodsinEnzy−andBiogenesis（G．M．

Attardiand A．Chomyn，eds．），Pp．407・421，Academic3）ZhangJ，YonedaM，NaruSeK，BorgeldH−JWGongJ−S，Press，Orlando，FL，（1996）

ObataS−Ⅰ，1加akaMand「ねgiK：Peroxideproductionand13）SawanoT，TanakaM，OhnoK，YonedaM，OtaY，apoptosisincultured cells carrylng mtDNA mutation

TerasakiH，AwayaSandOzawaT：MitochondrialDNA
mutations associatedwith thel1778mutationin Leberls

CauSlng enCePhalomyopathy．Biochem．Mol．Biol．Int．
46：71−79，1998．

disease．Biochem．Mol．Biol．Int．38：693−700，1996．

4）MiuraJ，UchigataY，SatoA，MatsunagaR，FLtjito T，

14）OnoueS，SuzukiH，NimuraY，ShimizuY，NaginoM，Borgeld H・J，Tanaka M，Babazono T，Takal1aShi andTanakaMand OzawaT：Increase ofmtDNA−binding

IwamotoY：AnIDDMpatientwhocomplainedofc脆st

proteinsandmitochondrialmRNAsinregeneratingliver．

OpPreSSionwithischemic changes on ECGininsulin・

J．Surg．Res．62：172・178，1996．

inducedhypoglycemia．Diabetes．Res．Clin．Pract．39：

15）NakamuraN，HattoriN，TanakaMandMiz皿OY：SpeCi−

31−37，1998．

ficdetectionofdeletedmitochondrialDNAbyinsituhy−5）HattoriN，YoshinoH，TanakaM，SuzukiHandMizuno

bridization uslng a Chimera probe．Biochim．Biophys．
Acta1308：215−221，1996．

Y：Genotypeinthe24・kDasubunitgenePDUFV2）of
mitochondrialcomplexIandsusceptibilitytoParkinson16）KovalenkoSA，TanakaM，YonedaM，IakovlevAFanddisease．Genomics49：52・58，1998．

OzawaT：Accumulationofsomaticnucleotidesubstitu＿

6）YoshinoH，HattoriN，UrabeT，UchidaK，TanakaMandtionsinmitochondrialDNAassociatedwiththe3243

MizunoY：Postischemicaccumulationofthelipidperoxi−

A−＞GtRNALeu（UUR）mutationinencephalopathyand

dation productsinthe rat brain：immunohistochemiCal

Cardiomyopathy．Biochem．Biophys．Res．Commun．

detection of4・hydroxy−2−nOnenal modified proteins・

222：201・207，1996．

17）HayakawaM，KatsumataK，YonedaM，TanakaM，BrainRes．767：81−86，1997．

7）MorikawaS，KurauchiO，TanakaM，YonedaM，

SugiyamaS andOzawaT：Age−relatedextensive丘ag−

UchidaK，ItakuraA，FurugOriK，MizutaniSandTomoda

mentation

Y：Tncreasedmitochondrialdamagebylipidperoxidation

Chem，Biophys．Res．Commun．226：369・377，1996．

introphoblastcellsofpreec］ampticplacentas，Biochem．

MoLBiolJnt．41：767−775，1997．

−267−

ofmitochondrialDNAinto

minicircles．Bio＿ミトコンドリア脳筋症の発症機序と治療に問する
分子生物学的研究
太 田 成 男●研究協力者 安 川 武 宏い■渡 辺 公 綱●■

要 旨 ミトコンドリア脳筋症のMELASの原因遺伝子変異はミトコンドリアtRNALcu（UUR）遺伝子の変異によることが判明しているが，その変異によって何故呼吸鎖酵素活性が低下するかの分子機構は不明であった．そこで，
塩基番号3243あるいは3271に変異をもつtRNAを精製して修飾塩基を含む塩基配列構造を決定した．すると3243，
3271いずれの変異によってもアンチコドンの第一塩基が修飾されなくなることが判明した．アンチコドンは
mRNAのコドンを識別する場所であり，修飾塩基が変化することによって，取り込まれるアミノ酸が変化し，異常蛋白が合成され，呼吸鎖酵素の活性が低下したり，活性酸素を放出することが推定された．
はじめにミトコンドリア脳筋症の原因遺伝子が同定され，ミトコンドリアtRNA遺伝子の変異が多数同定されている．
MELAS，MERRF，心筋症の原因変異としてそれぞれミトコンドリアtRNALeu（UUR）遺伝子，tRNALys遺伝子，tRNAIIc
遺伝子に変異が同定されているl）．しかしながら，何故，tRNAの遺伝子の変異によってミトコンドリアの機能異常が現われるのかなど不明な点は依然多い．従来の研究によって，ミトコンドリアtRNA遺伝子の点変異あるいは欠失変異によって核の遺伝子とは独立に呼吸鎖活性が低下することが判明している．この証明はミトコンドリア
DNAを完全に消失させた細胞に脱核した細胞質を融合させ，完全に核の影響をなくすことによってなされたヱ）・3）．
この人為的に作成された細胞株は細胞質（サイトゾル）の融合であるのでサイブリドと呼ばれる．このサイプリ
ドはHeLa細胞の核をもつため，無限増殖が可能であり，変異mtDNAをもつ細胞を大量に培養することが可能になった．従来変異tRNA分子を精製してその構造を決定する必要があると思われていたが技術的困難さから，変異tRNAを実際に精製したという報告はない．渡辺らによって，固相ハイプリグイズ法によって極微量なtRNAを精製する方法が確立された4）．
tRNAは転写後に塩基が修飾され変化することが知られている．tRNAにはAGUCの他に塩基が修飾された修飾塩基が多く兄い出されるが，ヒトのミトコンドリアtRNAでは現在までに22種類のtRNAのうち2種類のtRNAの塩基配列のみが決定されているにすぎない5）・6）．tRNAh（UUR）はまだ正常tRNAの塩基配列も決定されていないかった．そこで，A3243G，C3271T変異をそれぞれもつtRNALLu（UUR）と対象および方法
サイブリド：変異mtDNAをもつ細胞はサイプリドを用いた．すなわち，MELAS患者由来の培養細胞を脱核して，
mtDNAを完全に消失したHeLa細胞と融合した．3271変異をもつサイブリドはほぼ100％変異mtDNAを有し，3243
変異をもつサイプリドは90％変異mtDNA，正常mtDNA
10％であった．対照正常細胞はmtDNAを失った細胞に胎児由来ミトコンドリアを導入したサイプリドを用いた．
tRNAの精製：サイブリドクローンをそれぞれ109細胞培養した．まず，酸グアニジンチオシアネート法によってRNA分画を分離し，イオン交換カラムクロマトグラフィー法
によって精製度をあげ，固相ハイプリダイゼーション法4）
により精製した．さらにアガロース電気泳動法により最終精製tRNAを得た．
塩基配列決定：Donis−Kellerの方法刀にしたがって，RNA
塩基配列を決定した．すなわち，RNaseTl（G特異的に切断），RNaseU2（AとGを切断，Aにより特異的），RNasePhyM（AとUに特異的），RNaseCL3（Cに特異的）のような塩基特
異的にRNAを切断する酵素で5■ラベルしたRNAを部分消化して塩基配列決定用の電気泳動ゲルで泳動した．これ
らの酵素では修飾塩基部位は切断されない．
修飾塩基の同定：Kuchinoらの方法8）にしたがって修飾塩基を同定した．具体的には5■ラベルした侃NAをアルカリ処理して部分切断し，電気泳動により一塩基ずつ異なる断片を分離し，5ラベルを除去してから3■ラベルし，ヌク
レオチドまで分解した．こうすることによって3，末端のヌクレオシドにのみラベルされることになり，二次元薄層クロマトにより塩基を同定した．

正常tRNALeu（UUR）を精製してその塩基配列を決定した．
＊日本医科大学老人病研究所生化学部門
榊東京大学大学院工学系研究科生命工学

結果
哺乳類ミトコンドリアtRNALeu（UUR）の塩基配列が初めて決定された．結果は図1のようであった．修飾塩基はmlG
ー268−

lが

C

U

A

G

A一・U

H▼

A−U
A−U

＿CA ㌔

cA CA
U
A

V

lll

．AGAGGT、＿．C

m5e

G

Tv

bDJd CGCA定諮呂
C

C

。珊

OAA

b言

A3243G

T3271C跳言

UU

UCUCCUhllAilll t A

GG

A−U
A−U

WiTd・Type

U

GU肛宗炉

C−・G
C−・G
U−A
CIG
UIA

礪

㌦

AGAGGT、．TCq

III

LGAGGTvC㌔DAAUCGCA㌣競呂
U

ccACAAUUCU．
鞋茫蒙

m

A
G

ccACAAUUCUCCACAAUUCU

鞋臣監
GG

U

両脚IC一
CIG
A−C
G︐U

㌔

CCG

ucUcc用1A
日 日l A

増翫C笥転。甜

図1ヒトミトコンドリアtRNALeuⅣUR）の塩基配列およびA3243G，C3271T変異をもつtRNALLtm）の塩基配列．

′

N I
＼

／

H

C

＼

CHHC

2

N − C
／

NIC

2

ノ

H

㌔

H ♂

H

CIC

＼

／

NIC

H ♂

0＝C

D

U・

m5C

さらに変異tRNA分子がはじめて精製され構造が決定された．正常tRNA遺伝子3243変異，3271変異とも共通にアン
チコドンの第一文字の塩基が修飾されていなかった．こlの塩基はmRNAを識別するアンチコドンの一文字にあたり，tRNAがmRNAを識別するのに多いに影響を及ぼすはずである9L10）．ミトコンドリアtRNAは22種類のtRNALか
存在せず，一種類のtmAで4つのコドンを識別するのはアンチコドンの一文字目がUであることが必要であるこ

日
吋
∝

N

日

〆‖
＼

／

0日C

3
H
C

3

一

N −

H

了‖
＼

0日C
／

T

￠mnm5U

考察
ヒトtmA叫m）ははじめて精製されその塩基構造が決定された．結果で述べたように9塩基が修飾されていた．
G

す㌦／C、N′H
CH3、ト
I
H

A

l

H げ1

C 3、r＼厨／㌔H

化することが初めて示された．さらに，3243変異，3271
変異tRNAいづれもアンチコドンの第一文字に対応する
3265の塩基は修飾されておらず，Uのままであった．

鴨︒√■

︒
⁚
軒
賦

mlG

一

H

♂C＼N／

♂C＼N／C

図2ヒトミトコンドリア侃NAl仰）に認められた修飾
塩基の構造とが判明している．この未修飾塩基UをもつtRNAが，mRNAの識別を誤り，蛋白合成の際にアミノ酸の取り込みが正常に機能せず，異常蛋白が生じて酵素活性が低下
したり活性酸素を生じさせたりすることが示唆された．

また，この発見は遺伝子を変化させなくても，tRNAの塩（塩基番号3238），m2G（3239），D（3250），甲（3258），cm5nU（3265），m5C（3279），T（3286），V（3287），mlA（3290）に認められた．た 基の修飾を促進すれば，変異tRNAが正常tRNAにするこ
だし，cm5nUについては薄層クロマトによって移動度が一致しただけで，新規修飾Uである可能性も残されている．修飾塩基の構造式を図2に示す．

とが可能であることを示している．今後，tRNAの塩基修飾の研究を進めることで，治療への道が開かれるものと期待される．

塩基番号3265はアンチコドンの第一文字にあたり，こ文の塩基が修飾されていることによって，コドンの第3文字

献のAとGだけを識別していることが推定された．さらに，

1）SchonEA，BonillaEandDiMauroS：MitochondrialDNA

3243変異をもつサイプリドと3271変異をもつサイプリド

Mutationsand Pathogenesis．JBioenerBiomemb29：

を大量に培養し，変異tRNAを精製に同じように修飾塩基

131−149，1997．

を含むtRNAの塩基配列を決定した．mtDNAの遺伝子変

2）HayashiJ・I，Ohta S，KagawaY；etal：Functionaland

異によって対応するtRNAの塩基もAからG，CからUに変morphologiCalabnormalities ofmitochondriain human

化した．遺伝子の変異によってtmAの塩基が対応して変Cells containingmitochondrial DNAwith

ー269−

pathogenic

pointmutationsintRNAgenes・JBioIChem269‥19060−

requiredforcloverleaffoldingofahumanmitochondrial

19066，1994．

tRNA．NucleicAcidsRes26：1636−1643，1998．

3）HayashiJ・Ⅰ，Ohta S，ThkaiD，etal：Accumulation of7）Donis−KellerHandPhyM：anRNaseactivityspec摘Cfor

mtDNAwithamutationatposition3271intRNA（Leu）

UandAresiduesusefu1inRNAsequenceanalysis．Nu−（UUR）geneintroduced舟omaMELASpatienttoHeLa

CleicAcidsRes8：313342，1980．

CellslackingmtDNAresultsinprogressiveinhibitionof8）KuchinoY；HanyuNandNishimuraS：Analysisofmodi・

mitochondrialresplratOryfunction．BiochemBiophyRes

nednucleosidesandnucleotidesequenceoftRNA．Meth

Commun．197：1049−1055，1993．

En町mOl155：379・396，1987．

4）ThmiH，KumazawaY；SanOkawaR，etal：Batchwise−9）AndachiY；ⅥlmaOF；IwamiM，MutoA，etal．Occurrence

Purincation ofspecinc tRNAsby a solid・Phase DNA

Ofunmodinedadenineanduracilatthenrstpositionof

PrObe．AnalBiochem221：166・172，1994．

anticodoninthreoninetRNAsinMycoplasmacapricolum．

5）BruleH，HolmesWM，KeithG，GiegeRandFlorentz

ProcNatAcadSciUSA84：7398−7402，1987．

C：E舵ctofamutationintheanticodonofhumanmito−10）MatsuyamaS，UedaT；CrainPF；etal：Anovelwobble

ChondrialtRNAProonitspost・tranSCriptionalmodinca−

rulefoundinstarnshmitochondria．Presenceof7−meth．

tionpattem．NucleicAcidsRes26：537・43，1998．

ylguanOSineattheanticodonwobblepositionexpandsde・6）HelmM，BruleH，DegoulF；CepaneCC，LerouxJnGiege

COdingcapabilityoftRNA．JBioIChem273：3363・3368，

RandFlorentzC：Thepresenceofmodifiednucleotidesis

ー270−

1998．

SummarySummary of activities of working group on pathogenesis andtreatmentofmusculardystrophyandrelateddisorders

by Akiolもkagi，M．D．

Duchenne／Becker muscular dystrophy In some cases ofBecker muscular dystrophy
PreSentingpredominantcardiacsymptoms，dystrophinofbraintypewasamplyexpressedin
the skeletal muscle，but notin the cardiac muscle．Bc1−2，a PrOteCting protein against
apoptosis was reducedin muscle of Duchenne muscular dystrophy．In relation to thearachidonate cascade，PrOStagrandin D synthetase was markedly expressedin mdxmousemuscle．Inmdxmice，treatmentwithprednisolonereducedserumCKvalues，muSClenecrosis
andlymphocyteinnltration．However，muSCle degeneration was nevertheless progressive
duringthetreatment・Mini−dystrophingenewassuccessfu11yintroducedintothebrainofmdx
mice・Concernlggenetherapy，Variouspromoters，VeCtOrSOradenoviralreceptorgenewere
investigated．

Limb一girdle

musculardystrophy

Cases

with

α−SarCOglycanopathy（LGMD2D）or

Calpainopathy（LGMD2A）Werecollectedandclinicalfbaturesweresummarized．Averageage
Oflossofambulationwas13yearsforLGMD2Dand38yearsforLGMD2A．Lobulated
musclefibersweremoreprominentinLGMD2A・InafamilywithverymildformofLGMD，
mis−SenSemutationoflaminin

β1chainwasdiscovered．

Fukuyama congenitalmuscular dystrophy A new geneforthis disease was cloned，Whichwaslocatedin9q31・Afbundermutationwasaretropozonalinsertionof3kb，WhichmarkedlyreducedmRNAlevel・Theresponsibleproteinwas53．7kDaandnamed・・fukutin・・．
So far，function andlocalization offukutinis not clear．In another research，180kDa
extracellularmatricalproteinwaslostintheskeletalmuscle，brain，kidney，liverandlungof
thisdisease・Itsrelationtofukutinisunderstudy・Distalmyopathywithrimmedvacuoles Thegeneticlocuswas9p13andthesamewith
hereditaryinclusionbodymyopathyofIranianJeWishpeople・Theresponsiblegenewasnot
identifiedyet．

−273一

Myotonic dystrophy In normalcontroIs，MDPK protein waslocatedin the terminal
Cisternaofsarcoplasmicreticulum（SR），COrbularandjunctionalSRofheartandendoplasmic
reticulumofbrain．Duetotheelongationof（CTG）nrepeat，mRNAwasaccumulatedinnuclei

and amount ofDMPK was reduced．Expression ofneighboring genes（MDAHP，MDRft
ferritinLchain）was alsoaf托cted．Myotonic dischargesinvitroofmdxmousemuscleor
experimentalmyotoniamodelwerecorrectedbydehydroepiandrosteronesulfhte．

Mitochondrial encephaIomyopathy In an autopsy case with MERFF，pOPulation of
mutatedmitochondriawas about80％inal1theorganSandtissuesexamined．Butextentof
Pathologicalchanges wasnotthe same amongthesetissuesirrespective ofthe constantheteroplasmy．MitochondrialDNAtypewasclassedtoAandC，aCCOrdingtothe5178thbase．
InthetypeA，incidenceofmitochondrialdiseasewasmuchlessandlongevityofliftwas

more marked・Intreatment ofMELAS，SOdium dichloroacetatewas partlyc脆ctive，butdifficultyofhearingandabnormalEEGdidnotrespondtothedrug・FacioscapuIohumeralmusculardystrophy DNAdiagnosisbythesouthernblotmethod
WaS aPPlicablein most cases・The responsible geneis notidentined yet．In caseswith
extremeshorteningof4q35〜qter，ePilepsy

ormentalretardation

wasassociatedwiththedisease．

Oculopharyngealmusculardystrophy Injapanesefamilieswiththedisease，（GCG）nof
mBP2repeatedlOorlltimes，incomparisontocontroIsof6times・ThehaplotypeofthesefamilieswasdifftrentfromFrenchcanadianCaSeS，SuggeStingaseperateoriginofmutation．

Others In aform ofcongenitalmyopathy，mutation ofgene ofintegrln

α7was

discovered・Geneswithelongated（CTG）nrepeatswereirtjectedintonucleiofzenopasovum
andprocesslngOfRNAwasanalyzed・Oxygenmonitoringbynearin丘aredspectroscopywas
aplliedtovariousmetabolicmusclediseases．1

ー274−平成8〜10年度研究班員名簿

筋ジストロフィー及び関連疾患の臨床病態と治療法に関する研究
平成8〜10年度 高木班 名簿
区

分

氏

主

任

高

木

幹

事

内

監

事

幹

事

所
所

名
昭

属

施
在

設

名
地

所属 にお
け る地位

連 絡の際の電話

夫

大蔵省 診 療所
〒 10 0・89 4 0 東 京 都 千 代 田 区 霞 が 関 3 −1−1 −所

長

03 ・35 g l・4 111（内 2 9 73 ）野誠

熊 本 大学 医 学部 附属 病 院神 経 内科
〒 8 60 ・08 1 1 熊 本 県 熊 本 市 本 荘 ト1・1

教

授

0 96 ・
373・
5890

岡

田

伸太 郎

大 阪 大学 医 学部 小児 科
〒 56 5 ・087 1 大 阪府 吹 田市 山 田丘2・2

教授

0 6−6 87 9 ・
3 9 32川井尚臣

高松 市民病 院〒 76 0 ・85 3 8 香 川 県 高 松 市 宮 脇 町 2 −36 −1

院

長

0 87 ・＄3 4 ・
2 18 1

JJ

清

水

・
輝

夫

帝京 大学 医学 部 神経 内 科〒 17 3 −8 6 0 5 東 京 都 板 橋 区 加 賀 2 ・11−1

教授

0 3−3 96 4 ・12 11（内 19 10 ）

JJ

若

山

吉

弘

昭和 大 学藤 が丘 病院神 経 内科
〒2 2 7 −0 0 4 3 神 奈 川 県 横 浜 市 青 葉 区 藤 が 丘 1−
30

教

授

04 5 −
974−
6 2 69運 営幹 事 − 荒

畑

喜

一

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所

部

長

0 42 ・
3 4 1−
2 7 11（内 5 1 11）

信 州 大 学 医学 部神 経 内科
〒3 9 0 ・
8 62 1 長 野 県 松 本 市 旭 3 −ト1

講師

0 2 6 3−
3 7・
2 67 3

信 州 大学 医 学部 神 経 内科
〒3 9 0・8 62 1 長 野 県 松 本 市 旭 3 ・ト1

助手

0 2 6 3・
3 7−2673

〒 18 7 −g 5 02
分

担

池

田

修

一

（平 成 8 〜 9 年 ）田 邦 広（平 成 1 0 年 ）東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 −1−1

JJ

吉

JJ

石

浦

章

一

東 京 大学 大 学院 総 合文 化研 究 科〒 153 −8 90 2 東 京 都 目 黒 区 駒 場 3 ・
g ・1

教

授

03・
5 4 54 ・
6739

JJ

太

田

成

男

日本 医 科 大 学 老 人 病 研 究 所〒2 1 1−8 5 53 神 奈 川 県 川 崎 市 中 原 区 小 杉 町 1−
3 96

教

授

0 44 ・
73 3 ・
9267

JJ

納

光

弘

鹿児 島大 学 医学 部第 三 内科
〒8 9 0 −g 5 2 0 鹿 児 島 県 鹿 児 島 市 桜 ヶ 丘 8−3 5 ・1

教授

0 9 9−27 5 ・
5 3 30

JJ

梶

龍

見

京都 大 学 大学 院 医学 研 究科
〒6 0 6 ・
8507 京 都府 京 都 市左 京 区聖 議 院川 原 町54

講師

0 75 −
7 5 1−
3 7 72

JJ

栗

照

幸

東 邦 大 学 医学 部 第4内 科〒 15 3 −g 5 15 東 京 都 目黒 区 大 橋 2 −17 ・6

教授

03 −34 6 8 ・12 5 1（内 2 32 2 ）

JJ

後 藤
雄 一
（平 成 8 〜 9 年 ）国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所〒 18 7−8 5 02 東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4−ト1

室長

0 4 2・34 1−
2 7 11（内 52 14 ）JJ加

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所〒 18 7・8 50 2 東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 −1−1

室

長

原

茂
功
（
平 成 10 年 ）−0 42 −34 1・
2 7 11（内 52 14 ）

JJ

小

林

高

義

東 京 医科 歯科 大 学 医学 部神 経 内科
〒 1 13 −85 10 東 京 都 文 京 区 湯 島 1−5 −
45

講

師

0 3 −58 0 3 ・
5 2 35

JJ

木

南

英

紀

順 天 堂大 学 医学 部 第一 生化 学
〒 1 13 −由 2 1 東 京 都 文 京 区 本 郷 2 ．1＿1

教

授

03・
5 8 0 2 ・10 30

JJ

斎

藤

加代子

東京 女 子 医科 大 学小 児 科〒 16 2 ・S6 6 6 東 京 都 新 宿 区 河 田 町 8 −1

助 教 授

0 3−3 35 3 ・
8 11 1（内 3 12 3 0）

JJ

斎

藤

深美子

東京 医科 歯科 大 学難 治 疾患研 究 所

助

手

03−
5803・
58 2 1

助 教 授

05 6 1＿62．
3 3 11（内 2 176 ）〒 1 13−8 5 10
〝

佐

橋

功

東 京 都 文 京 区 湯 島 1・5−45

愛 知 医科 大 学 第 4 内 科〒4 8 0 −1 10 3 愛 知 県 愛 知 郡 長 久 手 町 岩 作 雁 又 2 1

−277−

区

分

分

担

JJ

氏

所
所

名

属

施
在

設

名
地

所 属 におけ る地位

連 絡 の 際 の 電話

塩

川

光 一郎

東 京 大 学 大学 院 理学 系研 究 科〒 1 13 ・
0 03 3 東 京 都 文 京 区 本 郷 7 −
3 ・1

教

授

03・
3 8 12 −2 1 11
（内 44 3 1）

庄

司

進

筑 波大 学 臨床 医 学系 神経 内 科教

授

0 2 9 8−5 3 −32 2 3一〒3 0 5 −85 7 5

茨 城 県 つ く ば 市 天 王 台 1−1−1

JJ

祖父江
刀
（
平 成8 〜9年）

名 古屋 大 学 医学 部神 経 内科
〒4 6 6 ・85 5 0 愛 知 県 名 古 屋 市 昭 和 区 鶴 舞 町 6 5

教

授

0 52 ・
74 4 −2 1 11
（内 23 8 7 ）JJ永

名 古屋 大 学 医学 部神 経 内科
〒4 6 6 ・85 5 0 愛 知 県 名 古 屋 市 昭 和 区 鶴 舞 町 6 5

講

師

052・
74 4 −2 1 11
（内 23 8 7 ）

〃

高

守

正

治

金 沢大 学 医学 部 神経 内 科〒 92 0 ・86 4 1 石 川 県 金 沢 市 宝 町 13 −1

教

授

076−
265−
22 90

JJ

田

代

邦

雄

北海 道 大 学 医学 部神 経 内科
〒 0 60 ・86 3 8 北 海 道 札 幌 市 北 区 北 14 粂 西 5 丁 目

教

授

0 11・
7 16 ・1 16 1
（内 60 2 7 ）

JJ

田

中

恵

子

新 潟大 学 医学 部 附属 病 院神 経 内科
〒 9 5 1・g5 8 5 新 潟 県 新 潟 市 旭 町 通 1番 町 75 4

助

手

025−
227・
0 6 66

JJ

田

中

雅

嗣

岐 阜県 国 際バ イ オ研 究 所遺 伝子 治 療研 究部〒 50 5 −0 116 岐 阜 県 可 児 郡 御 嵩 町 八 木 記 念 パ ー ク

部

長

0 5 7 4−6 8 −0 0 73

JJ

戸

田

達

史

東 京 大 学 医 科 学 研 究 所 ヒ トゲ ノ ム 解 析 セ ン タ ー〒 10 8 ・貼 3 9 東 京 都 港 区 白金 台 4 ・6 ・1

助 教 授

03−
5 44 9 ・
52 3 7

JJ

中

野

今

治

自治 医科 大学神 経内 科
〒3 2 9 ・
0 4 9 8 栃 木 県 河 内 郡 南 河 内 町 薬 師 寺 3 3 1 1−1

拳授

0 2 台5−5 8−73 5 1

JJ

福

原

信

義

国 立療養 所 犀 潟病 院

副 院 長

0 2 5 5−34−
3 13 1（内 6 0 1）

松 正
明（
平 成 10 年 ）〒9 4 9 −3 193

新 潟 県 中 頸 城 郡 大 潟 町 犀 潟 4 6 8 ・1

JJ

小林 卓 郎 l 九州 大 学 医学 部神 経 内科（
平 成 ＄年 ）〒8 12 −
8 5 82 福 岡 県 福 岡 市 東 区 馬 出 3−1−1

教

授

0 92 ・
642−
5337

JJ

古 谷 博
和 ・九 州 大 学 医 学 部 神 経 内 科〒 8 12j 5 82 福 岡 県 福 岡 市 東 区 馬 出 3＿1＿1（平 成 8 〜 9 年 ）助

手

09 2 ・
642・
5337

JJ

吉

九 州 大学 医学部 神経 内科〒 8 12・8 5 82 福 岡 県 福 岡 市 東 区 馬 出 3−ト 1

教授

09 2 ・
642−
5337

JJ

宝

総 合研 究 大 学院 先導 科 学 研 究科教

授

04 6 8 −
5 8 −15 52部

長

04 2 ・
323・
5 110（内 34 6 2 ）自治医 科 大学 小 児科
〒3 2 9 −0 4 9 8 栃 木 県 河 内 郡 南 河 内 町 薬 師 寺 3 3 1 1．1

教

授

0 2 g 5−5 8−73 6 5良 潤
一（平 成 10 年 ）来聴〒 2 4 0−0 19 3
JJ

松

原

四

郎

東 京都 立神 経 病 院神 経 内 科〒 183 ・00 4 2

井

美 里子

神奈 川 県 三浦 郡 葉 山町 湘南 国 際村

東 京 都 府 中 市 武 蔵 台 2 ・6−1

JJ

桃

JJ

吉
田 瑞 子
（
平成 8−9 年）

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 東 所〒 18 7 ・
g 5 02 東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 −1．1

室

長

042・
3 4 1−2 7 1 1（内 5 14 6）

JJ

吉 野
英
（平 成 8 〜 9 年 ）国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 国 府 台 病 院 神 経 内 科〒 2 7 2−8 5 16 千 葉 県 市 川 市 国 府 台 1＿
7 ＿1

医

長

04 7 3 −7 2 −18 5 8

JJ

依

藤

■
史

郎

大 阪 大 学 医学部 保 健 学科
〒 5 6 5・0 8 7 1 ．大 阪 府 吹 田 市 山 田丘 1−
7

教

授

0 6−
6879−
2 5 83

JJ

遠

藤

玉

夫

東 京都 老人 総合 研 究所 糖 鎖 生物 部 門〒 17 3・0 0 15 東 京 都 板 橋 区 栄 町 3 5 −
2

研 究室長

03 −
3964−
3241
（内 3 08 0 ）

JJ

鈴

木
ゆ め
（平 成 10 年 ）横 浜 市 立大 学 医学 部 附属 病院 神 経 内科
〒 2 3 6−0 00 4 神 奈 川 県 横 浜 市 金 沢 区 福 浦 3 ・
9

講

師

045・
787−
2 8 00（内 2 72 5 ）谷

池 雅
子 大 阪大 学 医学 部 小児 科
（平 成 10 年 ）・
〒 5 65 −0 87 1 大 阪 府 吹 田 市 山 田丘 2 −
2

助

手

06・
6879−
3 9 32

−278−

区

分

氏

分

担

中

顧

問

荒

所
所

名

瀬
浩 史
（平 成 10 年 ）
木

淑

郎

属

施
在

設

名
地

所 属 におけ る地位

連 絡 の 際 の 電話

虎 の 門病 院神 経 内科
〒 10 5 ・84 7 0 東 京 都 港 区 虎 ノ 門 2 −
2−
2

部

長

0 3・3 58 各一日1 1（内 2 0 16 ）熊 本大 学名誉 教 皮0 96 ・
3 4 4−2 111〒 86 0 ・
08 11

熊 本 県 熊 本 市 本 荘 ト1−1

義国立静 岡 病院
〒4 2 0 ・
0 8 4 6 静 岡 県 静 岡 市 城 東 町 2 4 ・1

名誉 院 長0 54 2 −45・
0 10 1猛

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 国 府 台 病 院 神 経 内科
〒2 7 2 −＄5 16 千 葉 県 市 川 市 国 府 台 1−7−1

名誉 院 長

0 4 73 −72−
3501（内2 1 11）

夫

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー〒 1 8 7−85 0 2 東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 ・1−1

名誉 総 長042・
3 4 1−
2 7 11清一 郎

国家公 務 員 共済 組合 連 合会 大 手前 病 院〒 54 0 −00 0 8 大 阪 府 大 阪 市 中 央 区 大 手 前 1−5 ・
34

院

長

06・
6 94 1・
0 4 g4尾寿夫

北 東京 寿 栄 園〒 17 3 ・00 0 3 東 京 都 板 橋 区 加 賀 2 −1−1

園

長

03−
3 5 79 ・
0661

豊

倉

康

夫

東京 都 老 人 医療 セ ン ター
〒 17 3 ・
0 0 15 東 京 都 板 橋 区 栄 町 3 5−2

名誉 院 長03−
3 9 64 −1 13 1

三

好

和

夫

徳 島大 学〒7 7 0 −0042

名誉 数 段

0 88 6 −3 ト3 111

JJ

宇尾野

公

JJ

佐

藤

JJ

杉

田

秀

JJ

垂

井

JJ

寺

JJ

JJ

徳 島 県 徳 島 市 蔵 本 町 3 ・18−279−