厚生労働省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び関連疾患の臨床病態解明と治療法開発に関する研究
荒畑班／清水班

平成11〜13年度研究報告書

平成14年3月（2002年）

研究報告書の作成にあたって

本報告書は，平成11〜13年度にわたって行なわれた「筋ジストロフィー及び関連疾
患の臨床病態解明と治療法開発に関する研究（11公一1）」の最終報告書である．

当班は，最初国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部部長荒畑喜一先生を班長とし，班員37名をもって，①未知遺伝子の単離と臨床表現型・遺伝子型の本態を解明する 診断研究 ，②疾患の病態機序解明と筋細胞の分子生物学的研究を行なう 病態研究 ，③科学的根拠に基づく有効な薬物治療と細胞治療を目指す 治療研
究 ，の3つを目標として始められた．ポストゲノムの時代を迎えfunctionalgenomics
機能解析遺伝学の観点から班構成を組み，研究促進を効率的にはかるためENMC（ヨーロッパ神経筋連合）型の小グループによる実務的目標設定型研究分科会を年数回開きつつ全体会議による討論を行なう計画とした．
当研究班の前年までは石川春律群馬大学教授を班長とする「筋ジストロフィーの分子病態学的基礎研究（8指−1）」（所謂筋ジス1班）と高木昭夫虎の門病院神経科医長を班長とする「筋ジストロフィー及び関連疾患の臨床病態と治療法に関する研究（8指＿2）」（所謂筋ジス2班）を発展的に合同・再構成して，公募班として出発したが，平成12年12月荒畑喜一班長が悪性腫瘍で急逝されたため，最終年度にあたる平成13年度に清水が引き継いだ次第である．日本の班研究の草分けである当班を高名な先達の活躍に優るべく支援し，筋ジス病態解明と治療開発の発信源とならんことを意図しつつ，
平成11〜13年度の3年間にわたる研究総括を報告する次第である．関係諸氏のご講評，ご批判をいただけると大変有り難く存じます．

締めるにあたり，永年にわたり研究促進に多大な努力をされている筋ジストロフィー協会理事長河端静子氏，様々なご助言をいただきました国立精神・神経センター総長高橋清久先生，同神経研究所長高嶋幸男先生，同武蔵病院長埜中征哉先生，筋ジス
トロフィー総合班班長杉田秀夫先生に深謝するとともに，当班の運営幹事として見えざる努力をしていただいた栗原照幸東邦大学教授に感謝申し上げる次第である．

平成14年3月

国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部

部長 荒 畑 喜 一

帝京大学医学部神経内科教授 清 水・輝 夫

目

平成11〜13年度総括研究報告

次1

分担研究報告Ⅰ．肢帯型／遠位型（三好）筋ジストロフィー

13

Ⅱ. Dystrophin‑Dystroglycan関連

43

Ⅲ．福山型およびその他の筋ジストロフィー

63

Ⅳ．ミオトニー症候群

87

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症

99

Ⅵ．筋発生・分化

105

Ⅶ．治療

117

Small Group Workshop
Summary
平成11〜13年度班員名簿

129

151

155

平成11〜13年度

総 括 研 究 報 告

総

括

研

主任研究者

荒

畑

究
喜

報

一／清

水

輝

夫

本班は筋ジストロフィー及び関連疾患のl．診断研究（未知遺伝子解析と診断法），軋 病態研究（疾患病態とその基盤解明），日．治療法開発（薬物治療と細胞治療）を3本柱とし，基礎・臨床を含む実務者による小グループワークショップsGWにより研究を促進し以下の主要結果をえた．
I．診断研究（未知遺伝子解析と診断法）
1．肢帯型筋ジストロフィーLGMDs／遠位型筋ジストロフィーに大きな進展がみられた．概略LGMDsの約2％がcaveolin−3異常などのtypel（常優），他は常劣（type2）で，約23％がtype2A（Calpain異常症），
16−30乳がtype2B（dysftrlin異常症）であり，本邦ではこの2型が最も多く，typeS2C−F（α，β，γ，6−SarCOglycan異常症）は約10％であった・
1）calpain異常症；missense変異が半数以上の患者にみられ，Calpain遺伝子の全領域に分布し，本
邦ではG233V，R461C，D707G，1796insAが多く，諸外国と異なる．これにより，約70％の患者を遺伝子診断できる．イムノブロット／免疫組織法では約90％にCalpain蛋白の消失減少があり，最も有用な早期診断法といえる．しかし，これで発見できない患者が存在することも事実である．
このため，より簡便で確実な calpastatinを基質とするcalpain活性測定法
応用を試みる段階にきた．

を開発し臨床診断に

2）DysferHn異常症；肢帯型と遠位型（三好）の2臨床型が主なもので，その変異はdysfbrlin遺伝子の全領域にわたり，約60％がG1310＋1A，C1939G，G3370T，3746delG，4870delTの5変異であった．G3370Tは軽症型，C1939G，G3510Aは重症型であった．また，3746delGは遠位型であった．
遺伝子診断は必ずしも高率でなく，生検筋の免疫染色／イムノブロット法の両者に異常がある場
合に強く疑われる．遠位型の75％は免疫組織／イムノブロットの併用で同定できるが，25％は診断できない．今後，より信頼のおける診断法の開発が望まれる．
2．福山型先天性筋ジストロフィーFCMDおよび類縁疾患；FCMD患者の9割は3 非翻訳領域に
retrotransposon挿入をもち，fukutinは産生されない．良質な抗fukutin抗体がなく，末梢血の遺伝子診断により90％以上診断できる．FCMD類縁疾患であるmuscle−eye−brain症候群（MEB）の責任遺伝子として1p33−34に局在する糖鎖修飾酵素POMGnTlが同定された．これはUDP−N−aCetylglucosamine：
potein0−1inked mannose β1，2−N−aCetylglucosaminyltranftraseで，筋・末梢神経・脳に限局する
0＿mannOSeにGIcNAcを付加する新規の糖転移酵素であった．MEB 6症例の解析から，点変異ホモ
または複合ヘテロがみつかった．
ll．病態研究（疾患病態とその基盤研究）
1．疾患病態とその基盤
1）Duchenne／Becker型筋ジストロフィーDMD／BMD；
Dystrophin／dystroglycannaminin接着系の分子構築理解がすすみ，dystrophin C端での①
syntrophin／dystrobrevin，②sarcoglycan（αβγ6）／Sarcospan，③α，β−dystroglycanの結合があった・
これに関連してcaveolin−3，MAGI−1／β−Cateninqcfsignal，dystrobrevin祀esmuslin／plectinが確認された．また，膜型matrixmetalloproteinaseがβ−dystroglycan分解に関与し，筋障害機序の1つが判明した．
2）FCMDと類縁疾患；
神経細胞の遊走異常／層構築障害や筋ジストロフィーは脳表面や筋細胞の基底膜異常に伴うもので，分子レベルでも1amininsubunits異常，未知の基底膜蛋白p180とα−dystroglycanの減少が判−3−

明，dystroglycan連関の破綻が示唆された．9p31に局在する責任遺伝子産物fukutinは，筋細胞，
神経細胞，Caja1−Retius細胞のGolgi体から細胞外に分泌され膜蛋白の糖鎖修飾を行なうと推定された・117症例の分析からfukutinの非翻訳領域exonlOのtransposon挿入ホモが90％で，重症型であり，その他の変異を持つ複合ヘテロは比較的軽症であった．類縁疾患MEB遺伝子産物は0−glycan転位酵素であり，筋で完全酵素欠損し，α−dystroglycanが激減していた点から，α−dystroglycanが筋ジス発症の枢要な要素であり，酵素療法への展望を開いた．
3）calpain異常症；
ヌル型変異は重症で，ミスセンス型変異ではG233Vはcalpain完全欠損で重症型，D707GホモとR461Cホモはcalpain減少で軽症型であった・Proteinase活性だけを失括させた変異calpainを発現するtransgenicmouseの解析から，Calpainのproteinase活性不全が筋障害の根本原因であることが判明した．calpainは筋scaff01dproteinであるconnectinを主要ターゲットとし，COnneCtin崩壊→
筋構造蛋白・筋膜（Tcap→Kchannel）・核（Murf1−3）に深甚な影響を及ぼす病態が考えられた．
4）Dysferlin異常症；
肢箱型と遠位両型があり，その遺伝子変異と臨床型との関係が注目され 変異3746delGが遠位型となることが判明しているが，今後の解明が必要である．Dysftrlinには結合蛋白の存在が示唆され，CaVeOlin−3との機能連関が考えられた．Dysferlin異常の筋障害機序は未解決であるが，dyrferlin−relatedERstressapotosisがみつかり，今後の進展が期待された．
5）筋緊張性ジストロフィー（DMl，DM2）；
非翻訳領域にあるCTGrepeat延長（DMl），ccTGrepeat延長（DM2）によりその遺伝子産物（DMkinase，ZincnngerproteinZNT9）活性を低下させる．これらのmRNAに結合するCUG／CUGG結合蛋白が2種（CUG−BP，EXP／MBNL）同定されRepeat延長したRNAとの結合の促進，当該RNAの細胞質内移行の阻害，他のRNAとの結合欠乏，その結果多様なRNA発現が障害されるとするRNA
仮説が提唱された．事実，DMl遺伝子下流にあるSIX5遺伝子発現が抑制され白内障が生じたり，別の染色体上の遺伝子発現（tau蛋白，βtubulinなど）に障害がみられ 広範な臓器の多様な病変が説明できた・この変化は筋細胞のアポトーシスを促進するが，Apotosis抑制薬で抑制できることが判明した．
2．モデル動物の作成①fukutinホモ欠損細胞をマウス月引こ注入してキメラマウス（FCMDモデル），②calpainの活性中心のCysをSerに変異させ，酵素活性だけを失括させた変異型を発現するtransgenicmouse（LGMD2Aモデル），③caveolin−3のmissense変異PlO4Lをもつtransgenicmouse（LGMDICモデル），④caveolin−3
exon2欠矢のcaveolin−3ホモ／ヘテロ欠損マウス，⑤poly（A）−bindingprotein2遺伝子のexonlの野生型ArG（GCG）6（GCA）3GCGを，‥（GCG）9 ‥に変換したtransgenicmouse（眼咽頭型筋ジスモデル）が得られ，病態解明と治療法開発に有力な武器ができつつある．
川．治療法開発（薬物治療と細胞治療）
1・StOPCOdonの読み越えをおこすアミノグリコシド系抗菌薬ネガマイシンを，mdxdystrophymouseに投与し，約10％のdystrophinを回復できた．今後dystrophydog，ヒトDMDIBMDの約10％の患者に適用しうる，毒性の少ない治療法と期待できる．当法は類似の変異をもつ多数の疾患に応用できる点からも注目される．
2・PyruVatedehydrogenasekinaseを阻害する乳酸降下薬djcMoroaceticacid（DCA）をミトコンドリア
脳筋症MELAS患者4例に，4−6年間投与された結果が発表され，乳酸／ピルビン酸値・脳梗塞様発
作・頭痛・けいれん・易疲労性の改善がみられ，頭部MRI所見・脳波異常・難聴・知能は徐々に悪化，肝障害・末梢神経障害・低Ca血症などの副作用があった．なんらの治療薬がない現段階では比較的安定した長期効果が期待できる．
3．ピルビン酸NaはMELAS，MERRFiCPEOなどミトコンドリア脳筋症の高乳酸血症症状（吐き気，嘔吐，倦怠）の改善に緊急避難的に用いると有効であった．
−4−

4．taurineは，MELASでの，3243と3271塩基に点変異をもつ変異tRNA−Leu（UUR）やMERRFでの，8344塩基に点変異をもつ変異tRNA一叫Sのanticodonに結合できず，蛋白合成が停止することが判明・
これらの変異tRNAをもつサイブリド細胞を高濃度taurine存在下に培養すると，ミトコンドリアの形態が正常化し，機能も回復した．MELAS，MERRFにtaurine大量療法の期待が得られた．
5．糖原病の第1次全国調査を行ない，2292施設のうち62％から回答を得，過去10年間の診断症例数は143例であった．内訳は，II型（acidmaltase欠損），III型（debrancherenzyme欠損），V型（筋phosphorylase欠損＝McArdle病）が主要3型で約70％を占めた・このうちV型の生検筋ではphosphoryTase結合性vitamineB6が10％以下に減少・培養筋細胞にvitamineB6投与するとphosphorylase活性が回復できることが判明し，有力な治療法である可能性が浮上した・
6．h。me。b。X遺伝子MsxIcDNAをマウス骨格筋へ導入し，脱分化して分裂増殖可能な単核細胞がえられた．幹細胞類似の機能を有し，細胞治療への端緒を得た．
7．筋緊張性ジストロフィーのmyotonia改善薬としてdehydroepiandrosteronesulfate（DHEAS）・ス
ーパーアポトーシス抑制因子Bc］−XFNKが開発できた．
主要筋疾患の遺伝子同定がおおむね出そろい，今後の展開として，dystrophin−dystroglycanと基底膜，
dysftrlin，Calpainの異常症やFCMDについて，①genotypephenotype連関，②より簡便で確実な診断法の確立，③蛋白レベルの機能病態解析，・④そこから得られる薬物治療／細胞治療の開発が急務である・
基礎と臨床の協力による成果が大きく，すでに有力な方法が示唆されており実現可能な分野がある・
また，主要筋ジスであるFSHD，emerin／lamin異常症について進展が得られず今後の重点領域と考える・
上記結果は独創性が高く，emerinnaminAJC異常症以外は諸外国をリードしている内容である・−5−

担 研 究 報 告目次Ⅰ．肢帯型／遠位型（三好）筋ジストロフィー

1）骨格筋特異的カルパイン及びコネクチンが介する情報伝達系と肢帯型筋ジストロフィー症2A型の病態機序の解析

15

東京大学大学院農学生命科学研究科 反 町 洋 之192）肢帯型筋ジストロフィー2A型の分子医学的診断法の確立と病態解明
国立精神・神経センター武蔵病院 南成 祐
223）筋ジストロフィーの表現型・遺伝型の分子医学的研究
国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一・林由起子

4) Dysferlinopathy (ジスフェルリン異常を原因とする筋ジストロフィー)
25

における遺伝子変異と臨床型
東北大学医学部神経内科

青

木

正

志
27

5) Dysferlin遺伝子異常とその臨床像についての検討
鹿児島大学医学部第三内科

樋

口

逸

郎
30

6）筋ジストロフィーおよび関連疾患の臨床病態の解析
愛知医科大学医学部神経内科

佐

橋

功

7）サルコグリカン，サルコスパン，ジスフェルリンの正常骨格筋細胞での超微局在と存在様式の検討
昭和大学藤が丘病院神経内科

若

32

山

吉

弘

8）筋細胞生存因子および細胞死抑制因子による筋ジストロフィー治療法の開発に関する研究─筋型，脳型ジスフェルリンの局在とERストレス細胞死─
国立精神・神経センター神経研究所 桃 井

35

隆
38

9）筋ジストロフィー発症機構の生化学・分子生物学的研究
川崎医科大学神経内科

砂

田

芳

秀

10）肢帯型筋ジストロフィーのモデルマウス カベオリンー3欠損マウスの作成とその病態解析

40

国立精神・神経センター神経研究所 萩 原 康 子

II. Dystrophin‑Dystroglycan関連11）dystroglycanを分解するmatrix metalloproteinaseの解析
帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫

94512）病態解明に向けたジストロフィン結合タンパク質の分子諭的研究

48

国立精神・神経センター神経研究所 吉 田 幹 晴13）筋形質膜・細胞骨格間分子連関異常による筋ジストロフィー発症機構の細胞生物学的研究

─プレクチンと筋形質膜裏打ちタンパク質と構造・分子連関性の解析─
群馬大学医学部第二解剖

50

土

方

貴

雄

吉

田

邦

広

14）ジストロフィン欠損心筋におけるシグナル伝達異常の検討

53

信州大学医学部附属病院遺伝子診療部

15)中枢神経系でのdystroglycanおよび関連蛋白質の生理機能に関する研究
鳥取大学医学部神経生物学

二

宮

55

治

明

16)中枢神経系におけるdystrophinの機能解析並びに新世代のアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療に関する研究
熊本大学医学部附属病院神経内科

内

野

57

誠

17) Mdxマウスの骨格筋浸潤細胞のflow cytometry

59

東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸18）ヒト染色体断片導入法による筋ジストロフィーモデルマウスの作出
北里大学理学部分子発生学講座

花

60

岡

和

則

Ⅲ．福山型およびその他の筋ジストロフィー

19）福山型先天性筋ジストロフィー遺伝子産物の機能解析と表現型・遺伝子型の研究
大阪大学大学院医学系研究科

65

戸

田

達

史

20）筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究と臨床への応用

68

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

21) Ullrich病の臨床病理学的検討

70

国立精神・神経センター武蔵病院 南成 祐22）眼咽頭筋ジストロフィー及び類縁疾患の遺伝子型／表現型の研究
─抗PABP2抗体による免疫組織化学的検討を加えて─
熊本大学医学部附属病院神経内科

内

72

野

誠

23) Rimmed vacuole型遠位型ミオパチ‑の臨床･分子遺伝学的研究

新潟大学脳研究所神経内科

75

田

中

恵

子

24）変異デスミンL385Pと相互作用するタンパク質の検索
新潟大学脳研究所神経内科

10

77

田

中

恵

子

25）リソソーム異常を伴う筋疾患の病態解明

79

国立精神・神経センター神経研究所 西 野 一 三8126）エメリンに関する形態学的・細胞生物学的研究
防衛医科大学校解剖学第二講座

依

藤

宏

27）筋型糖原病の遺伝子診断法の確立及び病態に即した治療法の開発

84

浜松市発達医療総合センター小児神経科 杉 江 秀 夫

Ⅳ．ミオト二ー症候群
8928）筋強直性ジストロフィー病態の分子論的解明と治療
東京大学大学院総合文化研究科

石

浦

章

一
91

29）筋緊張性ジストロフィー（DM1）の分子病態─DMAHP/Six5遺伝子の関与
自治医科大学医学部生物学教室 川 上潔30）筋緊張性ジストロフイに認められるCTGリピート延長が遺伝子発現に及ぼす影響の検討
九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設神経内科

94

吉

良

潤

一

31）低分子量熱ショックタンパク質群による骨格筋ストレス耐性系の研究，
およびその筋ジストロフィー発症機構との関連
横浜市立大学医学部第二生化学教室

鈴

96

木

厚

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症
10132）ミトコンドリア脳筋症（MELAS）の聴力障害に関する病理学的研究
国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信 義10333）ミトコンドリア異常症における細胞死とその抑制系の検討
自治医科大学小児科学 桃 井 真里子

Ⅵ．筋発生・分化
10734）筋形成における細胞間相互作用とその制御機構
京都大学再生医科学研究所再生増殖制御学分野 瀬 原 淳 子

10935）細胞成長因子に着目した筋肉再生メカニズムの解明
徳島大学工学部生物工学科

野

地

澄

晴

36）筋原線維形成制御因子の役割とその変異に起因する疾患の探索
千葉大学理学部生物学科

111

大日方

昂

37）低分子量G蛋白質とMsxlによる筋細胞分化と脱分化の制御：その筋再生への関与
千葉大学理学部生物学教室

11

114

遠

藤

剛

Ⅶ．治

療

38）未認可抗生物質ネガマイシンによるmdxマウスの治療
東京大学大学院総合文化研究科

119

松

田

良

一

39）ジストロフィン遺伝子のスプライシング制御機序の解明とその治療への応用
神戸大学大学院医学系研究科

松

尾

雅

122

文

40）細胞死抑制の蛋白治療法の開発

124

日本医科大学老人病研究所 太 田 成 男41) Dehydroepiandrosterone sulfateのミオトニーに対する治療効果と作用機序
東邦大学医学部第四内科

12

栗

原

照

126

幸

Ⅰ．肢帯型／遠位型（三好）筋ジストロフィー

骨格筋特異的カルパイン及びコネクチンが介する情報伝達系と肢帯型筋ジストロフィー2A型の病態機序の解析
反 町 洋 之●
●

一代子
●
●

●●●●

栄福啓

子■

村居部

志■

木鳥阿

●

勝順紘一

●

井木野

●

秦勝鈴西

●

．⁝二
子博美祐

弥和良成

目

野川沼

小中柿南

研究協力者

・．・．・．− ●●■●●●

方法と結果

的

肢帯型筋ジストロフィー2A型（LGMD2A）の責任遺伝
子は1995年にC4P〃J，即ち，骨格筋特異的カルパイン

1）LGMD2Aはp94のプロテアーゼ活性不全により発症するか？：

p94（カルパイン3とも呼ばれる）の遺伝子であることが報告された．現在までに100以上の病原性変異がCAP〃j遺伝子座に見出されており，その半分以上がミスセンス変この点を明らかにするために，LGMD2Aの病原性変異の中でミスセンス変異に注目し，10種類について変異p94を作成・発現し（図1A），その生化学的性質を解析した．

異である（図1A参照）．
しかしながら，その発症機構については不明な点が多

その結果，全ての変異体に共通に基質のプロセシング活性消失が観察された．さらに，p94の活性中心のCysをSerに変異させ，プロテアーゼ活性だけを消失させた変異p94

く，C4fWゴ遺伝子欠損が本質的に意味するところが不明であった．他の筋ジストロフィーでは構造蛋白質の構造的欠陥による膜構造不全が細胞外Ca2＋流入を増加し，い，
m＿カルパインの過剰活性化による筋蛋白質過剰切断がを発現するトランスジェニックマウスを作成して解析した結果，変異p94蛋白質の蓄積とLGMD2Aと類似のミオ
パチー症状が見出された．以上より，LGMD2Aの発症は筋細胞崩壊のスキームとして広く受け入れられている．
そのアナロジーでは，LGMD2Aにおいてもp94は実際には構造蛋白質として機能し，その構造破壊がLGMD2A発症の本質である，という可能性も考えられた．一方で，p94のプロテアーゼ活性不全が根本原因となることを明らかとした．
2）コネクテンの部位特異的リガンドの同定：
コネクチンの各部位をドメインごとに区切り，ヒト骨

LGMD2Aはやはりプロテアーゼであるp94の酵素活性の欠損が原因である可能性もあり，まず，このどちらが正
しいかを明確にすることがLGMD2Aの分子機構理解への第一歩であると考え，本研究の第一の目的はこの点を格筋cDNAライブラリーを用いた酵母Two−Hybrid系でス
クリーニングした．その結果，図2に示すように各部位
特異的なリガンドが多数同定された．まず，N末端（Z明確にすることにした．
我々は後述のようにプロテアーゼとしての機能が必須であることを明らかとした．そこで次に問題となるのは，

ばれる）が得られた．rrlcapは，LGMD2Gの責任遺伝子産物であり，K十一チャネルminKと特異的相互作用し，コネ
クテンキナーゼの基質となること，が報告され極めてp94のプロテアーゼ活性不全がどのように最終的に症状を引き起こすのか，という点である．これはLGMD2Aの興味深い分子であといえる．
また，コネクチンキナーゼ領域（M線付近）には，分子機構を明らかにすることであり，他の筋ジストロフ
ィーの発症機構との異動を明確にすることで，筋ジスト

MURFl（Muscle−SpeCincRING−hgerprotein）の結合を同定した．さらに，MURF2，3というホモログが存在し，互いにホモ・ヘテロダイマーを形成すること，核移行し繚部位）に結合する分子としてTcap（テレソニンとも呼ロフィー共通の機構を解明することにつながると期待される．そのためには，広範な解析が必要であるが，我々て転写因子としても機能することを明らかとした．
MURFl＿3は，ユビキチン結合酵素（E2）であるUBC9やは，p94の他にp94と特異的結合が確認されているコネク
チン（タイチン）及び組織普遍的カルパインの3分子種に焦点を当て解析を行うことを第二の目的とした．

ポリユピキチン鎖切断酵素であるISOT3とも結合すること，MURFlのノックアウトマウスは筋萎縮耐性を持つこと，等から，MURFlと骨格筋での蛋白分解との密接な関係が強く示唆されて，大変興味深い．他の知見も総合すると，コネクテンは筋原線維中で巨大な土台蛋白質＊東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命化学専攻
・・アリゾナ大学医学部（scaffbldprotein）としてシグナル伝達の交通整理を行っており，p94，TcapやMURFlなどが必要に応じて解離し，細胞膜や核へとシグナルを伝達すると考えられた（図3）．

＊＊＊CRESTJST＊一日ト・東京都老人総合研究所＊＊・・・国立精神・神経センター武蔵病院…＊…＊国立精神・神経センター神経研究所
−15−

A

P94／

Calpain3

Ca2十一Binding

DomainAク舛伊ル／けJウノの「次点感とエG〟82Aで屠舶ねた虜紺ミスセンス変身骨格筋に特異的に発現するp94
は組織普遍的カルパインである〃−，m−カルパインの活性サブユニットと高い相同性を持ち，4つのドメイン，プ
ロ龍城（I）・プロテアーゼ領域（lIa＋llb），C2様CaZ・一結合街域（IIl），及び5xEF−ハンドCaZ場合領域（IV），に分割できる・さらに・特異的なNS・ISl・IS2額域をそれぞれドメイン川b，lItに持ち・この部分を欠失するp94△は自己消化活性が弱まり安定化する・四角で囲んだ変異は本研究で作成し，解析したものである．
B肌−カル／けンの立体岸茸と上G〟か加の疲厨普ミスセンス変芽の好摩の虔薪全体として薄い楕円円盤状の構造をしており・時計方向にドメイン川a・IlいIl，ⅠVIVと並び，分子内相互作用により閉じた構造を形成している．
活性サブユニット（ドメインⅠ〜IV）の構造はp94と極めて高い相同性があるため，LMGD2Aで見出されている
p94の変異をm−カルパイン活性サブユニットの構造に投影してみた・その結果，プロテアーゼ活性中心を中心として一つの同心円上に変異の集中が見られた・これは・LGMD2Aの発症がp94のプロテアーゼ活性と強くリンク
していることを示している・p94においてNS，ISl，IS2の挿入されている位置を矢印で示した．

ー16−

N 2 ・I抽億
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戯如町好一曲調は夢；三三三ノラlデ￣三紺￠亀彪托夢曙広嗣乱す
図2 コネクテンの構造と部位特異的リガンドの同定
コネクチンの90％以上は，免疫グロブリンCZドメイン及びフイブロネクテンIIl型ドメインの両接着モチーフの各々からなるが，いくつか興味深い構造が見られる．これらの衛域に注目してそのリガンドをスクリーニングした
結果，図に示した興味深い分子との特異的相互作用が見出されさらにこれらの分子が他の分子とも相互作用することを明らかとした．これらの結果は図3に示す情報伝達システムの根拠となった．

図3 コネクチンを土台タンパク質，p94／カルパインをモジュレーターとした筋細胞情報伝達系
p94，Tcap，MURFlなどコネクチンに結合している分子は，サルコレンマからのシグナルを受容することで，コ
ネクチンから解離して核へと情報を伝達する．また，同時にp94はカルパイン系を，MURFlは，エビキチンープロ
テアソーム系を制御して，骨格筋の蛋白質分解系をモジュレートする．LGMD2Aにおけるp94のプロテアーゼ活性不全はこのシステムの機能を不全にして，症状を引き起こすと考えられる．

ー17−3）カルパインの活性化機構の解析：

考

活性化機構を明らかにするには，カルパインの立体構造の解明が不可欠である．そこで，ヒトm−カルパイン発

察

LGMD2Aの発症はp94のプロテアーゼ活性不全が本質である．LGMD2Aの診断としては，現在までに主に現系を確立し，X線結晶回折により立体構造を解明した（図1B）．その結果，Wtsternblotと免疫組織染色によるものの2種あるが，どi）一次構造上で予想された4領域（プロ領域（Ⅰ），プロ
テアーゼ領域（ⅠⅠ），未知領域（ⅠⅠⅠ），カルモジュリン様
Ca2＋結合領域（lV））は，立体構造上も保存されていた．

tiveや，LGMD2A変異によるp94の安定化に起因するfalseii）プロテアーゼ領域はさらに2つのサブドメインに分割しており，Ca2＋非存在下では活性中心が形成されない．
iii）機能未知だが分子間で配列が保存されたドメインⅠIl

正確かつ容易に行うことが可能となる．

ちらもp94の不安定性により操作中に分解する触eposi−
negativeの可能性が少なからず存在する．これに対して，
p94の活性を直接測定できれば，LGMD2Aの診断を直接，今後の展望

はβ一サンドイッチ構造をとるC2ドメインに相同な領域であり活性に重要な役割を果たすCa2＋結合調節街域であとは困難である．その原因は，（1）検出感度，（2）M王iSPることが判明した．LGMD2Aでこのドメインに最多の変異が存在する事実が説明された．

（myofibri1−boundserineprotease）による活性妨害，である．前者は蛍光基質の改良，後者は阻害剤（PMSFなど）

iv）ドメインIVは調節サブユニットの相同領域と会合しており，これはさらにN末端であるプロ領域と相互作用の使用により克服可能と考えており，近い将来に必ず実現する予定である．

現在のところ，p94の活性測定系を生検筋に適応するこする．自己消化，サブユニット解離などカルパイン活性化機構が構造的に説明された．

文

献

こうして得られた立体構造情報を基に，カルパイン活1）NakagawaK，MasumotoH，SorimachiH，andSuzukiK：性化機構を明確にするため，自己消化，サブユニット解離，Ca2十依存性，などに注目し，様々な変異体を用いて解析した．その結果，プロテアーゼドメインに直接Ca2＋を結合するという驚くべき事実と，自己消化はサブユニット解離に必要であり解離・酸化・リン酸化などの翻訳後修飾はカルパインの基質特異性を変化させること，を明らかにした．

Dissociationofm−CalpalnSubunitsoccursaflerautolysis4）p94の酵素学的性質の解析：
p94はその強い自己消化活性（半減期10分）のために，活性のある蛋白質を得ることは不可能であった．興味深

OftheN−terminusofthecatalyticsubunit，andisnotre−
quiredforactivation．J．Biochem．130：605−611，200l．
2）RichardI，RoudautC，MarchandS，BaghdiguianS，Her−
asseM，StockholmD，OnoY二SuelL，BourgN，Sorimachi

H，LefrancG，FardeauM，SibilleA，andBeckmannJ．S：
Lossofcalpain3proteolyticactlVltyleads（O muSCular
dystrophy and to apoptOSis−aSSOCiatedlrcBα／Nuclear
Factorl；B pathwayperturbationinmince．J．CellBiol．
151：1583−1590，2000．

いことに，p94特異的に存在するISl及びIS2領域（図1A参照）を欠失させると，この強力な自己消化活性は消失

3）ThgawaK，TbyaC，HayashiYK，NakagawaM，OnoY，

し安定化する・しかも，p94のaltemativesplicing産物の中にこのような分子種が存在する．そこで，この分子種（以HataS，IshiuraS，NonakaI，SeyamaYiArahataK，Yone−

下，p94△と呼ぶ）を大量発現・精製して，その酵素学的OftransgenicmiceexpresslngaCtivesite−mutated，inactive

性質を解析した．その結果，p94△の様々なプロテアーゼ
阻害剤に対する感受性は従来のカルパインと同様である

SPOnSible fbrlimb−girdle muscular dystrophy type2A．

が，その内在性阻害蛋白質カルパスタチンはp94Aを阻害
せず，しかも，これを非常によい基質とすることが判明

4）stroblS，Fernandez−CatalanC，BraunM，HuberR，Ma−

FukudaR，KarasuyamaH，rIbyama−SorimachiN，Katsui，Y，

kawaH，SorimachiH・andSuzukiK：Myopathyphenotype
p94，Skeletalmuscle−SpeC沌ccalpain，thegeneproductre−

Hum．Molec．Genet

した・カルパスタチンのp94による切断部位を解析した結果，阻害活性中心（TIPPxYR）の内部であることが明らかとなった．

9：1393−1402，2∝札

SumOtOH，NakagawaK，ⅠrieA，SorimachiH，Bourenkow

G・BartunikH，SuzukiK，andBodeW：ThecrystalstruC−
tureofcalcium−freehumanm−CalpalnSuggeStSanelectro−5）p94の酵素学的性質のLGMD2A診断への応用：

Staticswitchmechanismforactivationbycalcium．Proc．

カルパスタチンがp94の特異的基質であることを用いてp94のプロテアーゼ活性測定系を開発した．カルパスタ
チンの両端にシアン及び黄色蛍光蛋白質を融合させた蛋

5）HerasseM，OnoY，FougerousseftKimuraE，StockholmD，

白質を適当な条件で用いるとp94の活性を蛍光で検出することが可能となった．今後は直接ヒト骨格筋におけるBeckmannJ・S，andRichardI：Expressionandfunctional

p94の活性を測定し，その活性の有無をLGMD2Aの診断の基準とできるように応用する．

Sue−SpeCinctranSCnptionalandpost−tranSCnptionalevents・

Natl．Acad．Sci．U．S．A．，97：588−592．2000．

BeleyC，MontarrasD，PinsetC，SorimachiH，SuzukiK，Characteristicsofcalpain3isofbrmsgeneratedthroughtis−
Mol．Cell．Bio1．，19：4817−4055，1999．
−18−

肢帯型筋ジストロフィー2A型の分子医学的診断法の確立と病態解明
南
研究協力者

館
林

日

澤

成 祐●・…

薫■●

田

由起子■■

川

西

野

一
一

彦■■・…

小

川

三暮■

埜

中

恵●●
征

哉一

病態の解明をめざして本研究を行ってきた．それらを総括して報告する．

的

肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）は主に肩甲帯，腰帯が侵される筋ジストロフィーである．近年，原因遺伝

方法と結果
1．カルパイン3遺伝子変異の解析
臨床および筋病理所見よりLGMDと診断した患者80名

子が次々に明らかになり，多くの亜型に細分されるようになっている．1995年，LGMD2A型は骨格筋特異的な細胞内プロテアーゼであるカルパイン3の遺伝子（CAPN3）異常であることが明らかにされた．これによ（常染色体優性のLGMDとLGMD2C〜2F（サルコグリカ
ン異常症）は除外した）を対象として，凍結生検筋より抽出したRNAを用いてRTIPCRを行い，ダイレクトシー

り遺伝子診断が可能になったが，変異のホットスポットがないことや対象となる患者がLGMD患者のほとんど全体となってしまうことなどの理由から，効率的に診断す
ることは容易でなかった．一方，免疫組織化学診断は，

ケンス解析した．その結果，21名（26％）において13種類の変異を同定した（図1）．G233V，R461C，D707G，
1796insAの4種の変異は頻度が高く，合わせて患者21名中15名（71％）に認められた．

カルパイン3がin−Vitroで強い自己消化活性を示すことから困難であると予想されていた．
このような状況の中，我々は効率的な診断法の確立と

1796insA

微小挿入

8・U鍋鍋

蛋白質
RP此KKKxKP
592−61日

His nsn354

35￠

図1カルパイン3遺伝子変異の分布
LGMD2A型患者21名に兄いだされた13種類の変異について，遺伝子のエクソン構造に沿って示している．とくにホットスポッ
トは認められない．下線を引いたものは海外での報告がある変異で，それ以外は本邦でのみ見つかっている．大きな文字で表した4つの変異は高頻度に見つかった変異である．下段はカルパイン3タンパク質の4ドメイン構造である．NS，tSl，lS2は他のカルパインファミリーには存在しないカルパイン3特有な配列． Cys His，Asnの3つのアミノ酸はプロテアーゼ活性中心を成す．
ヽ⊥塾

RPxKKKKxKPは核移行シグナル配列．EF−1〜6はカルモジュリン様カルシウム結合モチーフである＊国立精神・神擢センター武蔵病院
榊国立精神・神撞センター神経研究所＊＊＊東京都神経科学総合研究所−19−2．臨床像ならびに表現型一遺伝子型相関の検討
下肢の機能障害度を指標として筋力低下の進行を調べたことである・電顕上はZ−Streamingや筋原線経の配列異常があり，進行例では筋原線経の大部分が消失して不定形物質やミトコンドリアで埋められていた．細胞核はHEたところ，ヌル型変異だけを持つ患者（3名）での発症年
令が9−32（平均18）歳とやや早期なのに対し，ミスセン

染色で肥大して見え（図3C，D），電顕上もクロマチン凝集を伴う異常が観察された．

ス変異だけを持つ患者（10名）では8＿52（平均27）歳と幅広かっだ．しかし，個々のミスセンス変異に注目すると，G233Vホモ接合性患者（2名）が8〜16歳と早期に発症しているのに対し，D707Gホモ接合性患者（2名）は30〜35歳，R461Cのホモ接合性患者（2名）は35〜52歳に発症していた（図2）．
3．筋病理像の検討
HE染色，ArPase染色，NADH染色の光学顕微鏡観察と，
電子顕微鏡観察を行った．病初期には小集団状に壊死繚

4．ミニマルチプレックスウエスタンプロット（MMW）
法による解析
Andersonらが報告した方法を田川らが／トスケールで行えるように改良した系で行った．凍結筋切片約10枚を用い，ジストロフィン，ジスフェルリン，カルパイン3，α−サルコグリカン，β−ジストログリカン，カベオリ
ンー3に対する抗体を混合してイムノプロットした．
LGMD2A型患者31名とその他のLGMD患者36名の凍結筋を対象とした．その結果，LGMD2A型患者のうち，カ経が散見されたが，OPaque線経は極めてまれであった（図3A）．病気が進行すると線維化が強い慢性的所見となった．特筆すべき点は14名（67％）に分葉線経が観察され（図3B），そのほとんどがタイプ1線経かつ萎縮していルパイン3の欠損〜減少が28名，タンパク量が保たれていてその他のLGMDと区別できなかったのが3名（うち1名は分子量異常が認められた）であった（図4）．タンパ

下肢機能障害庶事、ニヰ、−㍉、、ざ† 、ゞ了㍉メ・、

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仁一

年令

図2ミスセンス変異だけを2つ持つ患者の下肢筋力低下の進行
下肢の機能障害度を指標として，ミスセンス変異を2つ持つ患者らの筋力低下の進行を調べ，直線でプロットした．
各直線の先にその患者が持つ変異を示した．G233V／D707Gの複合ヘテロの患者以外はすべてホモ接合性の患者である．症例数が少ないものの，G233Vが早発型，D707GとR461Cが遅発型の，表現型一遺伝子型相関が示唆される．

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凍結筋サンプル

図4 マルチプレックスウエスタンプロット解析
上段右側にLGMD2Aの，左側にその他のLGMDのプロット像の例を示す．それぞれのプロット像の下にはミオシン
重鎖の染色像を示す．LGMD2A型患者ではカルパイン3のバンドが消失している．カルパイン3遺伝子由来の30kDa
断片は分解産物と考えられているが詳細は不明である．このプロットではLGMD2A型患者で30kDa断片が消失しているが，その他のLGMDで消失することも多い．下段はカル
パイン3のバンドを定量したものである．その際，ミオシン重鎖の定量値で割ることにより筋タンパク量を標準化し，さらに各プロットの同一コントロールサンプルに対する相対値として算出している．バーは平均値と標準偏差を表している．点線は，その他のLGMD群の平均値マイナス
2倍標準偏差の境界線である．

図3 骨格筋の病理変化
病初期の筋では壊死・再生線経が小集団状に認められる（A：星印）が，Opaque線維はきわめてまれにしか見つからない．進行例では分乗線経が高率に認められるようになる（B）．分業線経の核は正常な核（C）に比して肥大化して見える（D：矢印）．A，C，DはHE染色，BはNADH染色．
−20−

ク量が保たれていた患者はR461C変異ないしS581C変異を持つ患者であった．分子量の変化（88．5kDaへの減少）
として異常を検出できた患者は，CDNA上でエクソン16の欠矢が認められている．凍結固定後の融解がカルパイ
ン3の安定性に与える影響について調べるため，凍結切片を30℃で一定時間インキュベートすると，5分以内に検出が難しいレベルにまで分解された．また，ジストロフ
ィンやα一サルコグリカンの検出量も低下した．
考察人が引き金となる筋細胞壊死とは異なるメカニズムを考えるべきである．一方，分乗線経は，筋原線経の局所的崩壊と配列異常に始まり，核の異常を伴って筋細胞全体の萎縮へと至る過程が示唆される．
5．MMW法による蛋白レベルでのスクリーニングが可能
である
LGMD2A型患者31名のうち29例はカルパイン3の欠損〜減少か分子量異常として正常群と区別できた．正常群の平均値マイナス2倍標準偏差以下を異常値とると，診断上の感度は約94％，特異性は事実上100％であった・一

1．本邦のLGMDの約23％が2A型＝カルパイン3異常症
である

方，遺伝子診断に先立つスクリーニング目的として100％の感度が得られるように境界を設けても，ほとんどの正我々が検索した80名のLGMD患者のうち26％がLGMD2A型であった．検索の対象から除外した常染色体常群を除外することが可能である．ただし，サンプル調
整時の不用意な融解はカルパイン3をきわめて不安定化することが明らかになったので，避けなければならない．

優性のLGMDとLGMD2C〜2F型（サルコグリカン異常症）は，当センター生検筋バンクでは約2％と約10％と推定している．これらの値を入れて計算すると，LGMD2A
型はLGMD全体の約23％となる．
2．4種の変異のアレル頻度が約59％を占め，遺伝子診断に利用できる
本邦のカルパイン3遺伝子変異の特徴として，G233V，
R461C，D707G，1796insAの4種の変異がアレル頻度として約59％を占める．これらの変異は海外では報告がない．
おそらくは日本人の祖先に変異が生じて広まったものであろう．遺伝子診断に活用すると約71％の患者を兄いだせると期待される．
3．ミスセンス変異における表現型一遺伝子型相関の発見
従来，ヌル型変異が比較的早期発症型であるとは言われていた．しかし，本研究の結果，G233Vミスセンス変
異が早発型，D707GとR461Cが遅発型という新たな表現型一遺伝子型相関が示唆された．ミニマルチプレックス

今後の展望
まず診断法の確立であるが，血液DNAからはG233V，
R461C，D707G，1796insAについて検索し，異常がない
場合は筋生検を行う．生検筋がある場合は，まずMMW法を行い，異常が期待された患者についてRTPCR−ダイ
レクトシーケンス解析を行う手順が効率的と考えられる．
今後は，このような手順により，LGMD2A型＝カルパイン3異常症の患者の診断が進むことが期待される・
次に病態解明についてであるが，ミスセンス変異における表現型＿遺伝子型相関を兄いだした．この現象はカル
パイン3タンパクの残存量の観点から説明されうることが示唆されたが，今後ミスセンス変異体の自己消化活性などの検討が必要である．
文1）MinamiN，NishinoI，KobayashiO，IkezoeK，GotoY，
NonakaI：Mutationsofcalpain3geneinpatientswith

ウエスタンプロット解析の結果，G233V変異ではカルパ
イン3は欠損を示し，R461Cは比較的保たれていた．
D707Gは中間的な値を示した．したがって，ミスセンス
変異と重症度の関係の大部分は残存するカルパイン3タ
ンパク量から説明できるのではないかと考えられる．こ献

sporadiclimb−girdlemusculardystrophyinJapan・JNeu−
roISci171：31−37，1999．

2）sodmachiH，MinamiN，OnoY，SuzukiK，NonakaI：の点については今後の重要な検討課題である．
4．カルシウム流入による筋細胞壊死とは異なる病理発

Limb−girdlemusculardystrophywithcalpain3（p94）gene
mutations（Calpainopathy）．NeuroSciencenews3：20−27，
2000．

生機序を考えるべきである
病初期の筋では小集団状に壊死線経が散在するが，

3）chaeJ，MinamiN，JinYこNakagawaM，MurayamaK，

TgarashiRNonakaI：Calpain3genemutations：genetic

Duchenne型筋ジストロフィーなどによく見られるopaque
線経はほとんどない．したがって，それらの発症機序として通説となっている，細胞膜損傷によるカルシウム流

andclinico−pathologic hdingsinlimb−girdlemuscular
dystrophy・NeuromusculDisord・11‥547−555・2001・−21−

筋ジストロフィーの表現型・遺伝型の分子医学的研究
術

●

由起子り

●

田 知 栄●●●々

RobertH．Brown，Jr．●●●H石

南

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成

岳●

瀬 正 樹●

●

陽真

中

祐●

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原

野

一

博

幸……

川辺口本木山中藤 加奈子●

小川野辻青村埜

後松山平瀬

●

文彦剛子一

俊一

原川村良下

塚田松計森

研究協力者

三●

恵●
清

一●
悟●

敦 夫●●
正士●l＝l●
JLヽ

久美子●
征 哉●

LGMD2BとMMは，ともにdysftrlin遺伝子の異常に筋ジストロフィーの臨床病理学的特徴と遺伝子変異なよる疾患である．我々はLGMD／MM症例のdysftrlinの存在様式と蛋白質量，さらには遺伝子変異の有無をらびに責任遺伝子産物との関連について検討し，筋ジス
トロフィーの発症機序の解明に迫ることを目的とした．
特に肢帯型筋ジストロフィー（LGMD），三好遠位型筋ジストロフィー（MM），福山型先天性筋ジストロフィー
岬CMD）を中心に研究を進めた．

検索した．その結果，dysfもrlinは正常骨格筋では筋細胞膜に存在するが，疾患筋において様々な免疫染色パ
ターンをとりうること（図2），dysfbrlinの局在異常が認められながらも生化学的には異常の認められない場
合のあることを報告した．そしてIHC，MMWでとも

方法と結果

に

生検骨格筋組織を用い，免疫組織化学法（IHC）および
イムノブロット法による筋ジストロフィー関連蛋白質のdysfbrlinの発現異常が認められた症例群をdysftrlinopathy であると考え，遺伝子異常の有無を発現を検討し／また責任遺伝子の変異の有無を解析し，臨床・筋病理学的特徴とあわせ病態機序への関連を検討した．

PCR−SSCP法およびSequencingにて解析した．その結果，検索しえたほとんどの症例で遺伝子変異を確認した．このうち，G3370T 変異の頻度が高く，

1）ミニマルチウエスタンプロット（MMW）法の開発
これまでに多くの筋ジストロフィー原因遺伝子産物が同定されており，診断確定をするにあたってより簡dysftrlinopathyの19．4％，LGMD2Bの50％に認められた．
我々の検索ではLGMD55例中28は18．2％を占めてい便な方法が必要となった．そこで我々は，少量の試料で複数の原因蛋白質を同時に解析する簡便な方法としかな異常が認められなかった．さらに，dysfbrlinと結た．一方，MMの25％には生化学的にdysftrlinの明らてMMW法を開発した．現在dystrophin，dysftrlin，合する蛋白質の同定を試みた結果，dysfbrlin とLGMDICの原因遺伝子産物caveolin−3が免疫沈降法でCalpain3（p94），α−SarCOglycan，β一dystroglycanの発現

互いに共沈されることを明らかにした．また，を多検体同時に定量的に解析し，臨床診断へ応用して

LGMDICの骨格筋ではdysftrlinの筋細胞膜における発いる（図1）．
2）LGMD／MM

現の低下が認められたことより，dysferlinとcaveolin−3が相互作用していることを報告した．

LGMDは常染色体劣性あるいは優性の遺伝形式をとり，進行性に近位筋優位の筋力低下，筋萎縮を示すヘテ

3）FCMD

ロな疾患群である．これまでに多くの遺伝子座，責任退伝子産物が同定されているが，まだ原因の明らかでないた重症の先天性筋ジストロフィーである．Fukutin遺伝ものも多い．一方，MMは下腿後面筋を中心に障害される遠位型の筋ジストロフィーである．臨床的に異なるはこれまでに，FCMD骨格筋では，基底膜の構築異常＊

国立精神・神経センター神経研究所
DNAチップ研究所■●■
東京大学理学部情報科学科■■■■
東北大学医学部神経内科
■■

■■＊■暮

＊＊＊♯■■

Massachuse恍SGenera＝10SPital−East，Harvard
UnjversityMedicalSchool，USA
国療東埼玉病院

FCMDは本邦に多く認められる中枢神経障害を伴っ子の異常によるが，その発症機序は明らかでない．我々があり，筋細胞膜内外の蛋白質相互連関の異常が病態に強く関わっている可能性を示唆してきた．今回我々は新たに，FCMD骨格筋ではα−dystroglycanが選択的に欠損していることを発見し報告した．βdys什Oglycanの発現は保たれていることから翻訳後修飾，特に糖鎖修飾の異常による可能性を示唆した（図3）．
−22−

考

察

1）Dysferlinopathyの診断には，免疫組織化学法，イム
ノブロット法の併用が重要であり，双方で異常の認められた症例はprimary dysftrlinopathyである可能性が高いと考えられた．
2）Dysfbrlin遺伝子のG3370T変異は本邦では頻度が高く，特にLGMD2Bで多く認められる遺伝子変異であり，スクリーニングの際，有用であると考えられた．
3）臨床的にMMと診断されたにもかかわらずdysftrlinに明らかな異常が認められない症例が25％存在することから．遺伝的多様性も含め，今後検討してく必要があると考えられた．

図1 MMW法
MMW法による解析．コントロール筋ではいずれの抗体に対するバンドも明瞭に認められる．LGMD2AではCalpain3（p94）の，LGMD2Bではdyferlinの，DMDではdystrophinのバンドが欠損している．

4）FCMDの発症機序を考える上で，蛋白質の糖鎖修飾の異常が重要であると考えられた．
今後の展望
1）Dys俺rIinがどのような状況下で局在異常を示すのか，
またcaveoIin−3の他にどのような筋ジストロフィー関連
蛋白質と関わっているのかを検討し，dys丘rlinの機能に（
慧 購 幣 撃琶幣

竜
一
㌧十 ・
・

迫ると同時に筋ジストロフィーの共通の病態の有無ならびにその機序について検討していきたいと考えている．
2）Fukutinがどのように蛋白質特にα−dystroglycanの糖鎖修飾に関与し，また中枢神経病変をも含めどのように病態と関連しているかを検討すると共に，筋ジストロ
フィー関連蛋白質それ自体のみならず糖鎖修飾を含めた分子の総合的な機能解析を進めていく必要があると考えている．

図2 Dys鉛rlinの免疫染色パターン
Dysfbrlinは正常骨格筋では筋細胞膜に一致して認められる
叩ormal）が，疾患筋では完全に欠損しているものPegative），筋細胞膜に減弱した免疫反応の認められるもの（Faint），筋線維ごとに染色パターンが異なったり，細胞質内に強い免疫反応陽性
物質が認められるもの（Abnomal）など様々な染色パターンが認められる

3）cDNAマイクロアレイによって骨格筋における遺伝
子発現を網羅的にとらえ，疾患筋に共通の遺伝子発現バ
ターンの有無を知ることが可能となり，今後の病態解明に重要な役割を果たしていくことが期待される．

紺鷹表面波療買貴照

参考文献

rrジスト持ブリカン

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無能 十
、、■●
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軽司な払底駿璃樹脇壊死式▲一分を再生規範

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図3 FCMDの筋細胞障害過程

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筋ジストロフィーの原因蛋白質は筋細胞膜，基底膜関3）TsukaharaT，TsujinoS，OgawaM，NishiyamaA，F咄ta

連，核膜関連，ならびに細胞内酵素群などその局在や機M，Kurokawa R，Hayashi YK，and Arahata K：

能は様々である．このような蛋白質群の異常がどのようDifftrentialgene expression analysISin Emery−Dre血ssにして筋ジストロフィーという共通の病像を示すのかを

muscular dystrophy uslng CDNA microarrays．The

知る一助として，現在ヒト筋cDNAマイクロアレイをAmericanJoumalofHumanGenetics67：2227，2000．

作製中である，ー23−4）MatsudaC，HayashiYK，OgawaM，AokiM，Murayama

5）HayashiYK，OgawaM，TagawaK，NoguchiS，IshiharaT，K，NishinoI，ArahataK，BrownJrRH：Thesarcolemmal

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ー24−

Dysferlinopathy（ジスフェルリン異常を原因とする

筋ジストロフィー）における遺伝子変異と臨床型
青 木 正 志●
●
●

●

● ︑

●

●

泰

●

明美博人

好恵

寺藤藤山
順近斎糸

ヂ紆訂．一

染色体2p13領域に3MbにわたるP1−derived artincial
chromosome（PAC）によるcontigを作製することにより，その遺伝子の同定に成功した．原因遺伝子は2，080アミ

書●

三好型遠位型筋ジストロフィーはわが国の三好らの記載により臨床型が確立された疾患であり，常染色体劣性の遺伝形式を示す．1998年に我々は￣，三好型遠位型筋
ジストロフィーの原因遺伝子をクローニングするために，

資真

野山巣畑

水竪鴻荒

●

町二好甜

俊雄博征

橋沼井中

高日中埜

研究協力者

結果と考察
cDNAの情報に基づきPACを直接シークエンスする
ことによりすべてのエクソン・イントロン構造を決定した．また，これにより得られたイントロンの塩基配列に基づき，各エクソンを増幅するプライマーを全てのエク
ソンにわたり設計した．

ノ酸からなり，これまでに明らかにされているヒトを含

Dys知Iin遺伝子の解析により，三好型遠位型筋ジス
トロフィー24家系，肢帯型筋ジストロフィー13家系，

めた哺乳類の遺伝子とはhomologyを示さず，線虫のたr−1遺伝子のみにhomology が認められた．このことから，むtrophy associatedLhllikeprotein，の下線部をと

高CK血症1家系で遺伝子型が確定した．これらの変異の多くは途中に終止コドンが出現する tmncating
mutationであった．外国例ではC末端の膜貫通部位のり dysfbrlin と名づけた．同遺伝子はエクソン55個から構成され2，080アミノ酸からなり，肢帯型筋ジスト
ロフィー2B型の原因であることも判明した．

直前に変異が集積している傾向がみられたが，わが国の症例では遺伝子全体に分散して分布していた（図）．

日的

本邦dysftrlinopathy（三好型遠位型および肢帯型筋ジストロフィー2B型）患者でのdysfbrlin遺伝子変異と臨床的特徴の検討を行った．
対象と方法

一方，G1310＋1A変異とC1939G変異は3家系に，
G3370T変異は8家系に，3746delG変異と4870delT変
異は6家系に認められ，この5種類の変異は本研究で同定された変異の59％を占め，日本人に比較的頻度の高い変異と考えられた．遺伝子変異が確認された
dysfbrlinopathyの発症年齢は13歳から43歳までにわたり平均23．9±8．0歳であった．cK値の平均は5，008

患者における遺伝子解析を行うために，dysfbrlin遺伝±3，6781U／1と高値を示した．長期間経過観察できた症
例でCK値は低下していく傾向にあった．またG3370T

子のcDNA上に設計したプライマーを用いてdysftrlin
遺伝子を含むPACを直接シークエンスすることにより，そのエクソン・イントロン構造を決定した．
遺伝子解析の対象となった症例は59家系の66人である．その内訳は三好型遠位型筋ジストロフィー患者が変異をもつ症例の平均発症年齢は33歳と遅い一方，
C1939G変異を持つ症例は平均発症年齢が16歳，
G3510A変異をもつ症例は13歳と早かった．これらのことから G3370T 変異は軽症型，C1939G 変異と34家系36人，肢帯型筋ジストロフィー患者が24家系
27人，高CK血症患者が2家系2人であった（1家系は同一家系内に三好型遠位型筋ジストロフィー患者1人と肢帯型筋ジストロフィー患者1人及びdistal anterior
compartrnentmyopathy患者1人が存在）・インフォーム
ドコンセントを得た患者末梢血リンパ球からDNAを抽出し，エクソンごとにPCR法にて遺伝子を増幅した．
PCR 産物を single strand confonllation polymorphism（SSCP）法および直接塩基配列決定法にて確認した・

G3510A変異は重症型と関連している可能性があると
考えた．
今後の展望
3年間の研究にてdysftrlin遺伝子解析の方法はほぼ確立できた．ジスフェルリン異常を原因とする筋ジストロ
フィー（Dysftrlinopathy）の疾患概念も確立しつつある・
今後さらに症例を積み重ね，生検骨格筋におけるdysfbrlin蛋白発現と遺伝子変異の関係も検討する必要がある．

■東北大学医学部神経内科■■国立療養所西多賀病院＝■国立精神・神経センター神経研究所−25−

C6497I

DysferHn mutations

G6372人6353insA
G6319＋lA
C6086丁607卜2detAG
5966delG
A59436

Non−Japanese

61036＋1C

1837deIT

G3016＋1人

C1064T C19396
G1310＋1A
G1538T

Japanese

4333insA

4870deけ65882人63048A G4376T C5069T

G2090I

65093T

T3347C

C2131A

G3370T

2331delG

63510人6048deけ6071−2delAG

5122−3de】CA 6159−62insGATC
C5129T G6508A
G5409人3746delG

図これまでに同定されたdysfbrlin遺伝子変異
中央はdysferlin蛋白の構造を示し・C末端部分に膜貫通部位を認める・外国例（上側）ではC末端の膜貫通部位の直前に変異が集積している傾向がみられたが，わが国の症例（下側）では遺伝子全体に分散して分布しており，太線で示した5つの変異（G1310＋1A，C1939G，G3370T，3746delG，4870delT）の頻度が高かった．

文

献3）MatsudaC，AokiM，HayashiYKetal：Dysftrlinisa

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CaVeOlin−3gene causes a peculiar

myopathy．Neurology58，323−325，2002−26−

form of distalDysftrlin遺伝子異常とその臨床像についての検討
樋 口 逸 郎●

●

方法と結果

日

討を行い，臨床症状の多様性とみ￠r肋異常との関連について検討したので報告する．

好打

うに，み￠r肋異常症は臨床的に多様性であることが明らかとなった．今回，われわれは，み￠rJJ〝異常が認められた自験例9家系18名についての臨床的，遺伝子学的検峰明

また，高CK血症のみを示す例も報告されている．このよ

藤野らにより，み卸肋はLGMD2Bの原因遺伝子であることも同時に解明され 同一遺伝子の変異により三好ミオパ
チーとLGMD2Bの臨床型を示す家系が明らかとなった3）．

●

クローニングされ，￠￠r肋と命名された2）・また，Bashir

斉黒体劣性遺伝を示す疾患であり，Miyoshiらの報告により疾患単位として確立された1）．Brownらにより原因遺伝子が■●三好ミオパチーは，下腿屈筋群の障害を初発症状とする遠位部優位の筋萎縮・筋力低下を主症状とする常染色

■
●

的

●

●
●

●

子人弘

明雅光

藤原

●

斉未納

●

法子志

正圭正

目

川田木

中平青

研究協力者

3）結 果
臨床症状：18例の検査時の平均年齢朋．1±16．3歳，平均発症年齢22．6±11．8歳であった．初発症状は，つま先立ち不能9例，歩行障害7例，高CK血症のみが2例であった．歩
行不能は6例で，平均歩行不能年齢は48．7±7．7歳であった．
18例中13例は下腿屈筋群障害を中心に遠位部優位の筋障害を示したが，5例は肩甲下腿型筋萎縮を示し，1例は発症初期には近位筋優位の障害を示し，その後遠位部の障害が著明となっていた．
初発症状が高CK血症のみであった2例中，1例は初診後約2年後より下肢遠位部の筋力低下が出現した．他の1例
は，25歳の現在でも筋力低下を認めていない（表2）．また，85歳に肺炎で死亡した例は，少なくと80歳前より高度の痴呆症状を示していた．63歳男性例に心拡大を（CTR64％）を認めた．平均血清CK値は，3732±3142IU／Lであった（表1）．
生検筋の免疫組織学的検討：筋生検の検討を行った9例全例で，抗Dysfbrlin抗体による免疫染色で異常が認められた．そのうち，3例は全く染色性を示さず，2例はpathyに染色され4例は全体的に若干の染色性を示した（図1A，1）対 象 臨床症状，検査所見，肪生検所見等より
み中仙異常と診断された9家系18例（男性5例，女13例）
について検討した（表1）．
2）方 法

B）．

生検筋の免疫組織学的検討：抗dysferlinモノクローナル
抗体（HamlnB6，Novocastra社）を一次抗体，ベルオキ

ウエスタンプロット法：検討した8例全例でdysftrlin蛋白は検出されなかった．

シダーゼ標識ウサギ抗マウスIgGl抗体を二次抗体として免疫組織学的検討を行った．
ウエスタンプロット法：生検筋ホモジネートをボリアク

遺伝子連鎖解析：2p13領域のDNAマーカーとの2点連鎖解析を行った2家系では，D2S2113で最大lodscore4．00（0リアミドゲル電気泳導後，PVDFフィルターに転写し，q作飴伽異常：遺伝子検索を行った13例中，eXOn19のG2090T（Glu573Stop）ホモ接合変異を1家系8名，eXOn6のGlO36＋lCホモ接合変異を1家系2名，eXOn31のG3746del＝0．0）を得た．

抗dysferlinモノクローナル抗体と反応させdysferlin蛋白の検出を行った．

を1家系1名，eXOnlO G1310＋lAとexon18

q作飴仙l解析：同意を得た上で採血を行い，末梢血よりDNAを抽出した．功頑加伽をコードする55個のエクソンを増幅するPCRプライマーを作成し，PCRを行い，PCR

C1939G（乃r522Stop）のヘテロ接合を1家系1名に認めた・1例は，
exon26G3048Aへテロ接合を認めたが，他のアレルには産物をSSCP法にてスクリーニングした．異常バンドが認められたエクソンについて，シークエンスを行い遺伝子

現在までのところ変異を認めていない（表1，2）．

変異の有無を検討した．2家系については，三好ミオパチ

考察

遺伝子解析または免疫組織学的検討によりみ￠r肋異常と診断された18例の臨床症状について検討した．

ー遺伝子座領域（2p13）との連鎖解析を行った・

基本的には下肢遠位部屈筋群優位の筋力低下を主症状とし，三好ミオパチーと診断されたが，同一家系内に肢帯型筋ジストロフィー類似例と肩甲下腿型筋萎縮症類似＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊国立療養所沖縄病院神経内科
手書■東北大学医学部神経内科−27−

例が見られた4）．1例では，筋力低下はなく高CK血症のみであった．

表2 臨床症状，検査所見免疫組織染色，Wes【emblot法，
めや〟血遺伝子解析の結果

功￠rJJ乃変異により，終止コドンを来していた例では，
免疫組織染色にてまったく染色性を示さなかったが，他の変晃では部分的に染色されていた．

2）初発症状：つま先立ち不能9例、歩行障害7例、高CK血症のみ2例

1）検査時の平均年齢44．は16．3歳、平均発症年齢22．6土11．8歳

3）平均歩行不能年齢：48．7土7．7歳（6例）

5
1
一
1
1

今後の展望および研究の意義

34）臨床所見下腿屈筋群障害中心の遺位部優位の陣喜
肩甲下眉型筋萎縮
発症初期に近位筋優位の障害．その後遺位部障害
高度の痴呆症状を示し．85歳で死亡した例
心拡大（CTR6硝）を示した63歳男性例

例例例例例

勒￠r肋異常症は，家系札 家系間で臨床的多様性を示すが，これはめ￠rJ加の変晃部位による違いだけでは説明できず，他の何らかの修飾因子が関与している可能性がある．

5）平均血漬CK任：3752土3126IU／L（332−10535）

句中r仙異常症は臨床症状が多様であり，同一症例でも進行のステージにより臨床症状が変化している．この

6）生検筋の抗dysfeHjn抗体による免疫組織学的検討
3例‥染色性なし2例：Pa叫染色4例：全体的に若干の染色性
7）ウエスタンプロット法：検討した8例全例でdysfeHin蛋白は検出されず．

臨床的多様性の原因として，め￠rJJ〝発現の経時的変化
やみ￠rJJ〝に関連する未知の遺伝子の発現様式の変化などが推定される．臨床的，分子疫学的研究を続け，

8）遺伝子連鎖解析：02S2113で最大lod＄COr84．m（β功．0）9）Dyster伽遺伝子異常（18例中13例の検討．5例は換田中）
Exon19／G2090丁（Glu573Stop）
Exon6／GlO36◆tC

み卸血虜常症におけるphenotype／genotypecorrelationを明らかにすることは，み￠rJJ〝異常症の病態解明と治療法の開発のために不可欠であると考える．

Exon31／G3746delExonlO／G1310◆1Aとex18／C1939G（Tyr522Stop）
Exon26／G3048A（ヘテロは合のみ）

1家系8名
1家系2名
1家系1名
1家系1名
1家系1名

表1町中rJi〃異常症の臨床所見および検査所見
A g 竺a t
P a U e n F a m ily A g e 書／ A g e a t
N o．
N o．
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O n S e t ln a b lllty
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免 疫 組 織染 色

W e S t e rnb lo t

遺 伝 子解 析E x o n 1 9 ／G 2 0 9 0 T（
E 〉s t o l⊃）

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53 5

5

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十十十

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W a d d lin g g a jt

71

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十十十

十十十

G D

1．
38 5

JJ

W a d d n g a n d s t e p p a g e g a it w 仙 h e lp

81

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59

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十十十

十十十

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GD

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4．
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十十十

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lS T

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W h e e lc h a ir 」）
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十十

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十十
十十

e x o n 3 1 ／G 3 7 4 6 d e l
E x o n lO ／G 1 3 1 0 ＋1
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体 に 低 下（− ）u nkn ow n

3，
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体 に 低下（− ）u nkno w n

1．
4 00

（± ）全
休 に低 下GD−．土．＋．＋＋，十十＋：訂a由ofmuscloweahessintNsorder．
Age■：ageatOXa鵬nadon
lST：inabiJitytostandontoes：GD：gakdistLrbanceー28−

W a d d n g a n d s t e p p a g e g a it

D M （H b A I c 6 ．
0 ），C T R 6 4 1 ．E C G ：Ⅱ，Ⅲ ．
a V fで Q ．W h e e lc h a ir−b o u n d
C a lf m u s c le h y p o H r o p h y

E x o n 2 6 ／G 3 0 4 8 人
C a げ m u s c l8 h y p e 止l・
O Phy
変異 （
ヘテロ接合 ）lS T

C K −e nn ia

C O n tr a C t U re d ie d a t 8 5

W h e e lc h a ir −b o u n d

138

B e d −rid d e n e d ．d e m e n tは．
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J

5 3 ／F17

S t e p p a g 8 g a it〔x o n 6 ／G lO 3 6 十1C

3

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（− ）

12

C K −e nn ia

JJ
JJ

U n k e d t o 2 p 13

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H y por−W a d d lin g g a it（− ）D a tC h v
10

Jl

lJ
（土 ）

W a d d lin g a n d s t e p p a g O g a itu nkno w n

自律 神 経 障 害

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図1生検筋の抗dysftrlin抗体による免疫組織染色
A：Patient13（G3746del）．筋線維周囲は全く染色されない．
B：Patientll（G1036＋lC）．節線推周囲が部分的に染色されること。
C：正常対照，筋線維周囲が連続的に染色される．
（×200）ー29−

筋ジストロフィーおよび関連疾患の臨床病態の解析

●
●

●

●
●

●
●
●
●

●
●

■
雷

志 一 二

●

●

●

●

●

■

正喜陽

木畑藤

●

青荒加

■

■

●
■

●

丸 山 和佳子…… 直

嗣祐信

田
南

雅成

衣 斐
達■
高 橋 俊 明…

功●

井

橋

中

研究協力者

佐

GeorglneFaulkner……■

本研究班の「筋ジストロフィーおよび関連疾患の臨床
病態の解析」を目的とし・3年間にわたり以下のA）−D）の研究結果をえた．
A）常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィーの病態解析
全筋ジストロフィー（PMD）生検筋においてcalpain3，
dysfirljn，telethoninの免疫染色をし，とくに過去17年間に診断された自験骨格筋生検915例中でのLGMD
48例を中心に検討をした．そして病因遺伝子蛋白である calpain 3，dysferlin の免疫染色の有用性をCalpainopathy（LGMD2A）■）およびdysfbrlinopathy（LGMD2B，三好型2））について確認し，臨床像・筋病
理像・遺伝子解析結果を比較した．そして免疫染色の結果を下に，LGMD2A：4例と2B：8軌三好型：4例を診断した・そして羅患筋の選択性，免疫染色の態
度等つき分析し，これら疾患について本邦における臨床データの基礎を供給した．骨格筋CTによる分析ではLGMD2A3｝にて大腿屈筋群の選択的障害が明らかに

図1LGMD2Aおよび2Bにおける骨格筋CT所見
LGMD2Aでは大腿屈筋群の脂肪化が特異的であり，傍脊柱筋および下腿ヒラメ筋の脂肪化がみられる（2A），LGMD2Bでは初期例から大腿および，下腿後面の深部と傍脊柱筋外側の脂肪化が見られ（2BlJ，特殊例では大腿四頭筋の萎縮が高度であった（2B2）・三好型では各筋の脂肪化が高度であった（MM）．

された・またLGMD28では自覚筋症状のない症例か
ら筋病変が確認され，初期病変として下肢屈筋優位の深部筋と傍脊柱筋の異常が明らかになり，特異例として大腿四頭筋の選択的障害例が1例があった（図1）．
一般筋病理所見では各タイプに特異的所見を得ることができなかった・しかし免疫染色でcaIpain3は対照筋の筋形質が染色されるのに対し，LGMD2A患者では陰性であった．Dysferlinは筋形質膜が濃く，筋形質が薄く染まったが，LGMD2B全例と三好型2例で陰性，三好型1例でごく微弱に筋形質膜が陽性であった（図2）．
これらのうち遺伝子解析を行った症例は全例dysfirlin
遺伝子異常が確認され，免疫染色が簡便な診断法の一助となると考えた．
●

愛知医科大学医学部神経内科
岐阜県国際バイオ研究所●●●
東北大学神経内科■■●■
国立精神・神経センター■＊尊書＊
国療中部病院長寿医療研究センター◆●●■●●
応用生化学研究所■●●Hl●●■
姫路工業大学環境人間学部

図2 Calpainopathy，dysferllinopathyにおける免疫染色事＊

ABC法によるcatpain3染色では対照筋では筋形質が染まるのに対し（A），LGMD2A筋では筋形質は染まらない・Dysfbrlin
染色では対照筋では筋形質膜が強く，筋形質が薄く染まるが（C）・LGMD2Bよび三好型では全く染色されなかった（D）．（×160）■■■＊＊＊＊＊
PaduvaUniversitylUnitedNationsCentre．●ta．yー30−B）PMDの治療
DMD・BMDの生検筋内に組織の緑維化を促すキ
マーゼ陽性肥満細胞の遊出があることより，キマーゼの抑制を目的に降圧薬でもあるロサルタン；AIトRl括抗作用をBMD例に対し了解をえて経口投与した．一部のBMDで臨床的な有効性が確認され 長期的な観察の必要性を考えた．副作用はフワフワ感であった．
C）ミトコンドリア病の治療
1）ミトコンドリア病4）の経口薬物治療として，生化学的な理論的な背景と基礎実験よりピルビン酸ナトリウ
ム（15g／日）を患者へ了解を得て投与し，とくにMELAS患者において臨床検査上及び臨床症状の完全を確認し，副作用は少なく今後の希望ある治療と考えた．
2）治療の基礎研究として，NARP病ではMt8993T−G，ATP合成酵素のアミノ酸置換Leu156Argがあり同変異はLeigh脳症でも検出され変異型mtDNAレベルがある開値を越えると疾患が顕在化する．mtDNA変異を有する患者への有効な治療法はなく，制限酵素の遺伝子導入により変異型mtDNA を選択的に破壊し，野生型
mtDNAだけを増殖させ治療する可能性を検討した．
mtDNA変異を持つミトコンドリアを導入した培養細胞
にてその有用性を確認し，動物実験モデルでの今後の研究の展開が期待された．
D）ミトコンドリア病の基礎病態の研究
1）酸化ストレスによる蛋白障害では，蛋白質のlysine残基が，過酸化脂質である13−hydroperOXy−
octadecadienoic acidによりN∈−（hexanonyl）lysine（HEL）
へ変化する．このHELへの抗体を作成し，ミトコンド
リア病とPMDの生検筋において観察し有用な結果を得た．とくにミトコンドリア病ではHEL はMnSOD，
HSP60，GRP75などのストレス蛋白と同様にragged red
nbersに強く染色され酸化ストレスによる蛋白障害の局在を確認した．
2）ミトコンドリア筋症ではチトクロームム（Cytム）遺伝子の変異が報告されている．しかしCy仏遺伝子は多型性が高く，患者におけるアミノ酸置換が多型か病的変異かの判断は困難である．日本人における標準Cy仏多型を明らかにするために，百寿者64名，パーキンソン病患者96名，若年成人96名についてCytム遺伝子の塩基配列を決定し、そのアミノ酸置換を比較検討した．
N260Dは百寿者群に，G251S置換は患者群に有意に多く，長寿との関連で貴重なデータを得た．
以上の3年間の結果より，筋ジストロフィーとミトコ
ンドリア病における今後の病因的また治療的な発展を目
指す．
文

献

1）衣斐 達，井 玲他：臨床神経 亜：1023，2000・
2）MatsunagaT，AokiM，etal：ProcJapAcad75：20，1999・
3）衣斐 嵐 中尾直樹他：神経内科53（Supp12）：156，2000・
4）SahashiK，YonedaM，etal：JMedGenet38：703，2001・ー31−

サルコグリカン，サルコスパン，ジスフェルリンの正常骨格筋細胞での超微局在と存在様式の検討
若 山 吉 弘＊
＊

彦弘幸
＊

＊
蠣

韓
＊

■

＊
＊

昌隆俊

ヰ

上見谷

井白熊

＊

＊
■

＊

●
＊

●
ヰ

■
＊

＊

一兵正明

＊

純敏

＊

橋下島

■

原村山中

＊

二子明紀

誠宏弘英

谷嶋木南

渋小鬼木

研究協力者

●

はじめに

考

我々は骨格筋細胞膜異常による筋疾患を中心に研究しているが，最近三年間に本研究委託費の支援で実施した研究の主要なものの概要を報告する．

察

DAGの筋細胞膜における局在と分子相互間の空間的配列関係の超微局在に関する研究は極めて少なく，この検討はdystrophinopathy，SarCOglycanopathyなどの疾患の病態解明には重要な課題である．本研究にて生化学的研究

1）SarcogJycan．Sarcospan，dysferlinの正常骨格筋における局在の検討
日的を基に想定されたDAGのモデルが基本的には正しいことが証明された・更にdysferlinの局在が筋細胞膜のcostamereに多いことは本研究により初めて証明された．

Dystrophinassociatedglycoproteins（DAG）はdystroglycan

Dysferlinと他の細胞膜成分との関係は現在ほとんど未知

COmPlex，SarCOglycancomplexとSarcospan及びsyntrophinやなので，本研究結果は有意義な示唆を与えるものと考えられる．

dystrobrevinなどのcytoplasmic complexから成っている．
このうちβ−dystroglycanとα−，β−，γ−，6−SarCOglycan
それぞれの局在と相互関係及びこれらのsarcoglycan分子

今後の展望とSarcospanなどとの相互関係を検討する．更にdysferlin

Dystrophinとその関連蛋白質に関してはsyntrophinがその局在とそのdystrophin，β−SpeCtrin，CaVeOlin3などとの相互関係を検討する，のPDZdomainを介してaquaporin4（AQP4）と結合していることが報告されている．実際Duchenne筋ジストロフィー症生検筋ではAQP4の著滅していることを我々は発見

方法と結果
組織化学的に正常なヒト生検筋組織や正常マウス筋組

した3）・骨格筋におけるAQP4の役割に関しては不明なことが多いが，この所見はmdxマウスでも認められている織を対象とした．抗体の多くはDAGの各成分の雑誌に発ので，AqP4過剰発現変異マウスを作製し，mdxマウスと表されたアミノ酸配列から抗体産生に適した部位を合成

かけ合わせmdxマウスの運動能の変化を解析する予定である．

し，ウサギや羊に免疫して得た．また一部の抗体は市販のマウスモノクロナル抗体を用いた．免疫電顕的には異なる粒子径のコロイド金粒子で標識する2重ないし3重標
識免疫電顕法を用いた．その結果α一，β＿，γ＿，∂＿SarCOglycan分子やSarcospan分子は筋細胞の基底膜ではなく筋細胞膜に沿って存在し，COStamereに多い傾向がみられた．またこれらの分子は互いに近接して存在し（図1），dystrophin，β−dystroglycanやnitricoxidesynthaseとも近接して存在することが示された1）2）．一方dysferlinも筋細胞膜に沿って局在し，COStamereに多い傾向がみられたが，dystrophin，β−dystroglycanやcaveolin3とはcolocalizeしな
いと考えられる結果が得られた．

図1ヒト正常骨格筋のマウスモノクロナル抗α−Sa托Oglycan（15nmgold），ウサギ抗β−SarCOglycan（5mmgold）と羊抗
γ−SarCOglycan（10nmgold）抗体によるコロイド金3重標識による免疫電顧所見．筋細胞表面に沿ってα＿，β−SarCOglycan（小矢印），β−，γ−SarCOglycan（小矢印）やα−，β−，γ−SarCOglycan（大矢印）の信号がclusterを形成して存在している． BaFO．1〃m＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊
同電顕圭＊＊＊神奈川こども医療センター神経内科＊＊＊＊愛知県コロニー中央病院小児神経科＊＊＊＊＊順天堂大学医学部第1生化学教室＊＊＊＊＊＊東京大学医学部循環器内科
ー32−

方法と結果正常骨格筋caveolin3の局在とmdxマウスでの変化を，
コラpゲナーゼ処理を加えたfracturelabel法により詳細）正常骨格筋におけるAQP4の局在とDuchenne筋ジス
トロフィー症における発現の減少の検討
日的正常骨格筋におけるAqP4の局在に開しいわゆるC。Stamere領域に多いかどうかを共焦点レーザ顕微鏡でに解析した．正常骨格筋細胞膜でcaveolin3はcaveola様構
造を取り囲むように存在し，その特異的配列構造は観察する．またAQP4がDuchenne筋ジストロフィー症

caveola様構造のない細胞膜においてもみられた5）（図2A）．
一方，mdxマウスにおいては正常対照マウスよりもcaveolin3が多く発現しており，その分子配列の乱れがみ（DMD）でどのように発現されているのかを蛋白レベル，
RNAレベルで検討する．

られた（図2B）．
方法と結果

考察と今後の展望
正常骨格筋においてcaveolin3が細胞膜の局所に集合した後にcaveolaを形成することが推測され，mdxマウス

組織化学的に正常なヒト生検筋とDMD生検筋の6例ずつを対象とした．A（2P4抗体は既報のラットAqP4のアミノ酸配列に基づきウサギに免疫して作製した．共焦点レ

ウサギ抗AQP4抗体，ウサギ抗β−SPeCtrin抗阻 マウス抗ではその動員は活発であるが乱れていた．今後caveolin3と相互作用を示す細胞膜関連蛋白との関係や，CaVeOlin3に影響を及ぼす外的因子の刺激下での存在様式の変化に

dystrophinモノクロナル抗体（Novocastra DYSl）を使用

ついて検討したい．

ーザ顕微鏡ではAQP4はdystrophinとcolocalizeL筋細胞膜のcostamere領域に多かった4）．次に免疫組織化学染色はし間接蛍光抗体法にて作製した．抗AQP4抗体ではDMD筋はほとんどの筋線経で染色性が陰性で，一部細胞膜がpatchyに染色される筋線経がみられた・抗β−SpeCtrin抗体と抗DYSl抗体ではDMD筋線経はそれぞれ陽性染色所見と陰性染色所見を示した．イムノプロットでは抗AQP4抗体では正常筋の抽出物は31kDaの1本のbandを示すが，DMD筋の抽出物はこのbandの染色性が著減していた．更にRNAレベルでは6例ずつの正常筋とDMD筋から抽出したtotalRNAをβ−SpeCtrinのgeneをhousekeepinggeneとして半定量的に解析した所，AQP4のmRNAのDMD筋における有意の低下が認められた3）．
考察

DMDでAQP4分子が減少していることは直接的には抗
AQP4抗体でDMD生検筋を免疫染色した我々の研究3）で明らかとなった．DMDではdystrophinが欠損し，これらの生検筋でAqP4分子が著減していることからAqP4とdystrophinとの関係が示唆されるが，最近Adamsらはdystrophinと結合するsyntrophinのPDZdomainがAQP4と結合することを報告（JCellBio1155：113−122，2001）した．
今後の展望
プロジェクトⅠ）と同様，AQP4過剰発現変異マウスを作製Lmdxマウスとかけ合わせ，mdxマウスのlつの遺伝子治療を試みたい．
図2 マウス骨格筋細胞膜におけるcaveolin3標識金
コロイド粒子の分布，正常マウス（図A）では，金コロイド粒子の多くはcaveola様構造物を取り囲む様に分布しており，しばしばcaveola様構造物とは無関係の額域にもサークル状の配列がみられた（白矢印）．一方mdxマウス（図B）では，金コロイド粒
子が正常対照マウスよりも多数存在しており，その配列も乱れていた．
Bar＝0．511m‖）FracturelabeI法による骨格筋細胞膜のcaveolin3の存在様式とmdxマウスにおける変化
日

的

DMDやmdxマウス筋細胞膜でcaveolin3発現増加が報告されており，病態への関与も推測されるのでfracturelabel法にて正常骨格筋細胞膜のcaveolin3の存在様式とmdxマウスにおける変化を定量的に解析する．
−33−Ⅳ）アデノ随伴ウイルスベクターを用いたミオト二アのin−Vivo遺伝子治療研究日文

献1）wakayamaY，InoueM，KqjimaH，etal：UltrastruCtural
的localizationofα−，β−，γ−SarCOglycanandtheirmutual

我々はアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）を用い肉眼的な症状の改善を目標に，先天性ミオトニアのモデル

relation，andtheirrelationtodystrophin，β−dystroglycanandβ一SpeCtrininnormalskeletalmyonber．ActaNeu−

動物であるADRマウスに遺伝子導入をおこなう．

ropatho197：288・296，1999．

2）whkayamaY，InoueM，KqjimaH，etal：Localizationof

方法と結果

SarCOglycan，neurOnal

nitric oxide synthase，βCMV promoter，CIC−1，GFPを組み込んだAAV vector−dystroglycan，anddystrophinmoleculesinnormalskeletalを作成した・次にpatchclamp法にて導入遺伝子の正常なCIchannel機能を確認した．2匹のADRマウスの下肢筋に対し，標準的濃度のベクターを筋注した．2週間後の針筋

myofiber：tripleimmunogoldlabelingelectronmicroscopy．
MicroscResrItch55：154−163，2001．
3）wakayamaY，JimiT，InoueM，etal：Reducedaquaporin4

電図ではmyotonicdischargeに変化がなかった．組織学的にはGFP陽性筋線経の割合は数％であった．より効率よく遺伝子導入するため高濃度のベクターを対照マウスのexpressioninthemuscleplasmamembraneofDuchenne
musculardystrophy．ArchNeurol（Inpress）
4）W址ayamaY，KqjimaH，InoueM，etal：Confbcallaserand

下肢筋へ投与し2週間後に検討を行なったところ導入効率は約70％であった．

immunoelectron microscoplC Studies ofaquaporin410−

考察と今後の展望
初期実験では治療効果が得られず遺伝子導入効率の低さが問題であった．今後高濃度の実験でADRマウスでも治療効果が得られる可能性がある．

5）shibuya S，WakayamaY，tnOue M，et al：Quantitative

Calizationin normalskeletalmyonber．Acta MyologlCa
20：125−129，2001．

analysIS Ofcaveolin3molecularlocalizationin the rat
SkeletalmuscleuslngamOdinedfracture−labeltechnique．
Ac（aMyologica（Inpress）

おわUに
以上の研究課題それぞれにつき今後更に研究を展開していきたい．

ー34一筋細胞生存因子および細胞死抑制因子による筋ジストロフィー
治療法の開発に関する研究
一筋型，脳型ジスフェルリンの局在とERストレス細胞死一
隆●

鹿井

高挑

デ
．
一

理

井

恵喜

田畑

藤荒

研究協力者

桃

依 子● 林

由紀子●●

真里子…

緒

言

ジマーカーであるGM130，ミトコンドリアのマーカー

本研究は筋ジストロフィーにみられる細胞死および生であるFOATPase抗体，ジスフェルリン抗体（テキサ存に関与する情報伝達系の解析を通して，ネクローシス

スレッド標識赤）との二重染色で局在を検討した．cosとアポトーシスの関係の分子機構を明らかにするととも細胞に発現したBDysf，MDysfは細胞膜よりむしろに，その治療法の開発を目的としている．三好型遠位筋

Golgi，ERに局在が観察され 時間が経つにつれ，8，

ジストロフィー（MDMD）の責任遺伝子であるジス

MDysrは凝集し，細胞は細胞縮小，などアポトーシス

フェルリン（Dysf）は55個のエクソンより構成されに典型的な像を示し，細胞死をおこすことが明らかと

骨格筋（8．5kb mRNA）などに選択的に発現し（以下なった（図2）．神経芽細胞腫であるNeuro2A，筋芽細Mdysf），6243塩基（2080アミノ酸）からなる翻訳領域

胞であるC2C12細胞に発現させても同様な局在と凝集を有し，C末端に膜貫通領域をもち，4箇所のカルシウをしめし，細胞死を誘導した．
′ト胞体（ER）で折り畳み不全や糖鎖不全の蛋白が蓄ム結合部位であるC2ドメインを有する．MDysrは線虫の ftr一遺伝子や先天性難聴のDFNB9 の原因遺伝子

積すると，ERストレスシグナル（mK）を活性化し，過OtoたⅠ・linやFERIL3 と高い相同性をもち Rr−1ファミ

度のERストレスは細胞死を誘導することが知られていリーを形成している．しかし，その機能に関しては膜融る．このERストレスによる細胞死はERに局在するカ合に関与する可能性が示唆されているものの，未だ不明

スパーゼ12の活性化が関与している．カスパーゼの活である．一方，脳では 3．8kb の mRNA からなる性化がプロセッシングにより活性化することから，切断

DysqBdysf）の発現が示唆されている．われわれはDysf

点に特異的な抗体を作成することによりカスパーゼ12の機能および疾患との関連を明らかにする目的で，脳にの活性型に特異的な抗体を作成した．この抗体を用いて，発現するBDysfおよび骨格筋に発現するMDysfを分離

Dysfの強発現がカス／トゼ12の活性化をひきおこすかし，細胞内での局在を調べた．

どうかを検討した．その結果，BDysf，MDysfは凝集するにつれ，JNKの活性化，カスパーゼ12の活性化を方法と結果誘導することが明らかとなった（図3）．また，DysrのMDysf，BDysfはヒト骨格筋，および脳のcDNAラ

どの領域が凝集，カスパーゼ12の活性化，細胞死を誘イブラリーより分離した．BDysrは膜貫通領域を有し，導するかを検討した結果，細胞膜領域を含むC末端部

2つのC2ドメインをもち，少なくとも2つの異なった分で引き起こしていることが明かとなった．

スプライシング産物から構成されており，脳に特異的にこの領域にはカベオリンが結合するscafEbldbinding

発現していた（図1）．分離したヒトMDysf，BDysrを

domainが存在することが最近Matudaらによって報告

EFGP−Nlベクターにin丘ameつなげ，COS細胞にトラされた．そこで，カベオリンの結合による凝集が細胞

ンスフェクトし，発現させた．細胞内発現を明らかにす

死を誘導するか否かを調べた結果，カベオリンはB，るため，EGFP（緑）とER（小胞体）のマーカーであるオ

Mdysfとともにゴルジに局在するものの，Dysfが凝集

リゴ糖転移酵素βサブユニット抗体，KDEL抗体，ゴルすると，ゴルジから離脱するものの，カベオリンはゴ
ルジにとどまることが明らかとなり，カベオリンに事国立精神神経センター神経研究所疾病第五部■■国立精神神経センター神経研究所疾病第一部…■ 自治医科大学小児科

よって，Dysrが凝集するのではないことが明らかと
なった．
ー35−

StructureofMuscleandBrain

The RegionofDysfbrlinInducing
CeuDeath

typeofDysfbrlin＝帖日日日日日日日日囲‖ Muscletype

Ⅱ工工恥rainty。。
l伽m血トー
Braimtype
DyS鎚rlin amti一m12D341Merge

12

3

4

5

6

7

8

田口ロ．二
騙日
旨i等質

9101112

図1BDysrの構造と発現
BDysfはMdysfのC端側に相当し，膜貫通領域と二つのC2ドメインをもつ．BdysfはMdysfと異なり，脳に特異的に発現する．
lanel：片臥lane2：心臓，lane3：腎臓，lane4：脾抒乱
lane5：肝臓，
1ane6：小腸，lane7：筋肉，lane8：肺，lane9：胎盤，
1anelO：精巣，
lanell：胃，lane12：大腸．

図3 DysfによるERストレスシグナルの活性化とカスパーゼ12，
細胞死を誘導するDysfの領域
ERストレスによる細胞死ではストレスシグナルであるmK
ERに局在するカスパーゼ12が活性化される．Mdysf，Bdysf，だけでなく，膜貫通領域とC端だけのDysf（＿C2ドメイン）だけでもmKの活性化とカスパーゼ12の活性化をもたらした．

Brain−tyPeI）ysfbrlin
Braintyp e

EGFP

考

Braimtype察

MDysrは筋組織では細胞膜に局在することが知られ

Dys鮎rlin Antibodies Merge Phaseている．もしDysfが臨r−1ファミリーとしての構造から推定されるようにカルシウム依存性の膜融合の機構に関与していると考えると，細胞間での融合，すなわち，筋芽細胞が筋管細胞へと融合する過程で関与する可能性が示唆される・しかし，われわれの結果はBDysf，Mdysr
も細胞膜より，むしろER−ゴルジにその局在がみられる
ことから，ER輸送やゴルジ，細胞膜，エンドゾームとの融合，membrane recycleに関与している可能性が示唆された．
こうしたゴルジ膜蛋白の過剰発現はERへの逆輸送をもたらし，ERストレスを引き起こしたものと考えることができる．

図2 BDysfの細胞内局在
C末端にEGFP標識（緑）したBDysfをCOS細胞に発現させたところ，ERとゴルジに局在が観察された．また，Mdysr
も同様にER，ゴルジに局在が観察された．

最近，Matudaらは，カベオリンがDysfと結合している可能性を示唆する報告をしているが，カベオリンは細胞膜だけでなく，ゴルジにも存在し，細胞膜への輸送や
membranerecycleに関係しているとの多数の報告がある．

−36−

今後，この仮説を証明すべく，膜融合過程でのDysr

なぜ，筋組織ではDySfやカベオリンは細胞膜にしか局在しないのかについての説明は，今後の課題であるが，一つはアセトン固定により，コレステロール除去されの機能について研究をすすめいき，他のジストロフィーの原因蛋白との接点をさがすことが重要と思われる．

ラフト，カベオラに存在するDySrが抗体と反応できるようになった可能性も考えられる．また，筋細胞分化の参考文献
1）lnadaH，IzawaI，NishizawaM，FujitaE・KiyonoT・段階では膜輸送が低下し，membranerecycleが定常状態

TakahashiT，MomoiT，InagakiM：Keratinattenuatesになって，細胞膜に局在するのかもしれない．

tumor necrosis factor−induced cytotoxicity throughassociationwithTRADD．JCellBiol．155（3）：415426，

しかし，注意しなければならないのは，Dysrはシグ

2001．

ナルペプチドをもたないTypelIの膜蛋白であることである．すなわち，N端は細胞質側にある可能性が高い．

2）FujitaE，EgashiraJ，UraseK，KuidaK and Momoi
T：Caspase−9processlngViaftedbackamplincationloop

そうとすれば，分泌顆粒だけでなく，細胞膜に存在したとしてもC2ドメインは細胞質側にあり，細胞内での膜融合に関与していることが考えられる．ジストログリカ

invivo．CellDeathandDifftrentiation8，335−344，2001．
3）Zheng，KuidaK，MomoiT，NichoIson，YLezbek・
Fravell：Denciencyofcaspase−90rCaSpaSe−3inducestheンなどとは反対方向で機能していることになる．Dysr

compenSationofcaspase・NatureMedicine6，1241−1247，

が他の筋ジストロフィーの原因蛋白に対し，相互作用するのか，どこで接点をもつのか，あるいは独立した疾患

2000．

4）Fujita E，Soyama A，Kawabata H and MomoiT：
BMPA and RA synergisticallyinduce activation of

なのかは今後大いに論議の対象となるものと思われる．

caspase−9andcauseapoptosisofP19ECcellsculturedas
monolayer・CellDeathandDiffbr・6，1109−1116・1999・

研究の意義，今後の課題
DysrはERゴルジに存在し，カルシウム存在下での膜5）MukasaT，MomoiTandMomoiM：K・Activationof
caspase−3apoptoticpathwaysinskeletalmuscle丘bersin

輸送，membranerecycleでの膜融合に関与していること

lamininが考えられ，Dysfの機能やMDMDの原因，治療をを考え

Commun．2∝），139−142，1999．

る上で十分注意を払わなくてはならないことと思われる．

−37−

2−dencientmice．Biochem．Biophys Res・

筋ジストロフィー発症機構の生化学・分子生物学的研究
田

砂

●

●

郎
■悟 文

喜

■

■
●

●

●

龍

●

村田上

●
●

●

●

生

松荒村

●
●

●

子明子

●

博浩弥

■

井井川

大大市

●

和

子夫裕恵

麻輝

●

日

谷水沢本

長晴大森

研究協力者

芳 秀●

的

この10年で次々と筋ジス病因遺伝子が単離され その病因の多様性が示されてきた．しかし，その遺伝子異常
や原因蛋白欠損がどのような分子機構で筋細胞死を引き起こすのか解明されてはいない．遺伝子治療や幹細胞を用いた再生医療などを臨床応用して行くには，分子病態

けるceveola密度の解析をおこなったところ，Tgマウスではcaveolaの数が著減しており，野生型に比しその密度は有意に減少していた．
Caveoljnおよび関連蛋白発現の解析：ノーザンプロット
法によりTgマウス骨格筋では内因性の正常caveolin＿3
mRNA発現に加えて変異caveolin−3mRNAの過剰発現が機序の解明が重要である．■ゎれわれは筋細胞変性死の分子機構を解明するために，CaVeOlin−3という分子に着目して研究を進めてきた．caveolinは細胞膜の特殊陥入部
caveolaを構成する膜蛋白であり，CaVeOlin−3は主として骨確認された．一方，免疫組織染色では，筋形質膜に局在

格筋に発現している・CaVeOlinはG−PrO（ein，NOS，C−Src，
H−Ras，prOteinkinaseCなど種々のシグナル分子と結合し，シグナル伝達を調節する．またcaveolin−3がジストロフィ
ン糖蛋白複合体とも結合することが示され 筋ジストロ
フィーの病態への関与が推測されていたが，1998年，
caveolin−3迫伝子異常による常染色体優性肢帯型筋ジス

なかった．ジストロフィン，メロシン，サルコグリカン

トロフィー（LGMDIC）の家系が報告された．そこで筋ジストロフィーの発症機構におけるcaveolin−3の役割を解明する目的で，ヒトcaveolin−3遺伝子変異を導入したト
ランスジェニック（Tg）マウスを作製し，その病態を解析した．

するcaveolin−3がほとんどの線経で欠損していた（図1）．
ウエスタンプロットでもcaveolin−3の欠損が確認されたが，CaVeOlin−3欠損に伴うcaveolin−1の代償性発現はみられなどのジストロフィン結合蛋白の発現は正常であった．
またcaveolin−3に結合するシグナル分子のうち，H＿Ras，
C−Srk，EGF受容体のmRNA発現量は正常であった．一方，
nNOS蛋白量はコントロールとの間に差を認めなかったが，NDP染色ではTgマウス骨格筋でnNOS活性が有意に増加していた（図2）．
DNAarrayによる遺伝子発現プロフ7イル解析：4週齢と24週齢の野生型マウス及びTgマウス骨格筋について
AtlasMousel．2DNAArray（Clone（ech）メンプレンを用いて発現に差異のある病態関連候補遺伝子群を同定した．
Tgマウスでの発現上昇遺伝子として，C−Jun，ubiquitin

方法と結果

COrかgateE2β，G−prOtein−COupledreceptor25，1amininβ2，

変異caveolin−3Tgマウスの作出：LGMDIC患者で同定されたPlO4Lミスセンス変異をマウスcaveolin−3cDNAに導入し，上流にマウスmusclecreatinekinase（MCK）の発現

defenderagainstapoptoticcelldeath（dad−］）など8種類，

調節エレメントを，下流にSV40polyadenylation配列を接続したtransgenicconstruCtを作製した．これをC3Hマウス
受精卵にmicro叫eclionL，ICRマウスの卵管に移植し，Tgマウスを作出した．Tgマウスは出生後の体重増加不良，
全般的な骨格筋の萎縮，後肢の麻疫が観察された．骨格筋病理像は筋線経の大小不同が顕著であり著明に萎縮した筋線経がみられ 中心核線経が増加していた（図1）．
問質は軽度増加していた．壊死再生像は見られなかった．

発現低下遺伝子として，GlucocorticoidreceptorformA，
TNFreceptorlなど4種類を同定した．
考察

変真caveolin−3Tgマウスは病理組織学的にも明らかなミオパチー症状を発症しており，モデルマウスとして有用である．Tgマウスがcaveolin−3欠損を生じたことから
CaVeOlin−3遺伝子変異がdominantnegative効果を持つことが確認された・CaVeOlin−3はhom0−Oligomerを形成して機能するが，変異caveolin−3存在下では正常なhomo・Oligomerが形成されないためと考えられる（図3）．筋変性の分子電子顕微鏡を用いてfreezefracture法により筋細胞膜にお機構に関連して最も興味深いのは，CaVeOlin＿3欠損筋におり川崎医科大学神経内科■＊帝京大学医学部神経内科…昭和大学薬学部薬剤宇目…昭和大学薬学部組換えD仙実験施設

いてnNOS活性が上昇したことである．これまで筋ジスト
ロフィー変化とnNOS欠損すなわちnNOS活性低下の関連が議論されてきたが，われわれのデータはむしろnNOS−38−

COntr01

tranSgenic

Nomat Tran喝enieMouSe
nomはleaveoIilト3

mⅥtantCaYeOlilト3

Cav−3

図1野生型（conlrol）およびTgマウス（transgenic）骨格筋凍結切片のへマトキシリン・エオジン染色（H＆E）
による筋病理像（上段）と抗caveolin−3抗体による免疫蛍光染色像（下段）．バーは各々50pmを示す．

αn（．rmulint噸rity muscledegcnemtjMl
図3 caveolin−3欠損筋における筋変性の病態機序
（仮説）．

み

C

nNOS

nNOS

（kDa）

（％〉

NDP

control

224−
蝉細曝■■−

109−
72−
46−
29−
18−
14−
C Tg

N

P

SP

図2 野生型（C）およびTgマウス（Tg）骨格筋における a．nNOSのウエスタンプロット解帆b．nNOS免疫蛍光染色（nNOS）とNDP染色（NDP），C・NDP染色によるrLNOS活性陰性線維（N；negative），陽性線維（P；POSitive），
強陽性線維（SP；StrOnglypositive）の割合．

活性の上昇が筋細胞変性に関与する可能性を示唆しておる手掛かりが得られると期待される．

り（図3），今後さらに検討して行きたい．さらに，DNA
文

amy解析によりアポトーシス抑制遺伝子であるdddJの発現増加を認め，今後抗アポトーシス治療への応用の可能性が考えられる．

献1）sunadaY，OhiH，HaseA，OhiH，HosonoT；ArataS，
Higuchi S，Matsumura K，and Shimizu T：Transgenic
miceexpresslngmutantCaVeOlin−3showseveremyopathy

今後の展望

associatedwithincreasednNOSactivlty．HumMoIGenetcaveolin−3は細胞内シグナル伝達を調整するkey mole−culeの1つであり，その異常が筋ジストロフィー発症に深く関与することが明らかになりつつある．さらに

2）sunadaY，SaitofミHiguchil，MatsumuraK，ShimizuT：

dysfbrlinがcaveolin結合蛋白であることからもFukuyama type congenitalmuscular dystrophy skeletallO（3）：173−178，2001．

Denciencyofa180−kDa extracellularmatrix proteinin

dysftrlinopathyのpathogenesisにもかかわる可能性が考えられる．今後，われわれのモデルマウスを用いてその病態生理を解析することにより，より普遍的な筋変性におけるシグナル伝達異常を解明し，新たな治療法を確立す

muscle．NeuromuscDisord（inpress）
3）sunadaY，OhsawaY，MurakamiT，MatsumuraK，Shimizu
T：Caveolin−3andmusculardystrophy．ActaMyologica（inpress）

一39−

肢帯型筋ジストロフィーのモデルマウス
カベオリンー3欠損マウス の作成とその病態解析
萩 原 康 子●
●
●

二

博郎

道扶

村澤

今小

●

二訂

健征

石中

新埜

●

邦宏機

俊

●

建

岡藤池

日

笹依菊

研究協力者

的

法で調べた．筋病理組織所見は，HE染色およびEvans

カベオリンー3遺伝子異常による肢帯型筋ジストロ

bluedye（EBD）による生体染色で観察した．
2．カベオリンー3とジストロフィンの二重欠損マウスの作成

フイ￣（LGMDIC orcaveolinopathy）の2家系が1998年にMinettiらによって報告されて以来，カベオリン＿3
遺伝子変異の症例が報告されてきているが，その病態

例血マウス ♀とカベオリンー3ホモ変異マウス♂と解明および発症に至る機構はまだ不明である．カベオの交配で得たFl同士をさらに交配したF2で二重欠損マウスが得られた．しかし，F2では二重欠損および比較する同腹の抑血マウスともに♀，♂それぞれの1／8とリンは，カベオラと呼ばれる細胞膜の陥入部の主要なタンパク質で，カベオリンー3は分化した横紋筋細胞にはぼ特異的に発現している．カベオリンは，シグナルいう低頻度でしか得られない．カベオリンー3ヘテロ変異の椚血マウスF2同士を交配したF3では1／4の頻度で得られるので，今後はF3での解析を予定している．
今回はF2でのパイロット実験で解析した．カベオリン＿

分子をはじめ種々のタンパク質や脂質と結合することから，様々な細胞現象に関与していることが示唆されているが，筋ジストロフィー発症に関わる機構はまだ解明されていない．

3およびジストロフィンの遺伝子変異は，PCR法により同定した．

本研究においては，CaVeOlinopathyのモデルマウスとしてのカベオリンー3欠損マウスを作成しその病態を解析して，CaVeOlinopathyの発症機序および治療法に関す

結1．カベオリンー3欠損マウス

る手掛かりを得ることを目的とする．さらに，カベオ

果

リンー3とジストロフィンの二重欠損マウスを作成しそ

遺伝子型をサザンプロットおよびPCR解析によりの解析によって，筋ジストロフィー病態におけるカベ
オリンー3の関与を検討したい．

調べた結果，ヘテロ変異マウス間の交配により誕生し方た仔マウスの割合は，メンデルの分離比にはぼ一致していた・ヘテロおよびホモ変異マウスは共に30週令法

1．カベオリンー3欠損マウスの作成と解析まで発育および繁殖に異常はなく，正常型マウスとはマウスのカベオリンー3遺伝子をクローニングし，重要な機能領域をコードしているエクソン2 敵城（MinettiらのLGMDICの変異はこの領域内に存在）をNeoカセット置換によって欠失させるターゲテイン

ぼ同様に体重が増加した．ホモ変異マウスはノーザン
プロット，イムノブロット解析でカベオリンー3の
mRNA，タンパク質共に検出されなかった．ヘテロ変異マウスでは正常サイズのmRNA，タンパク質共に検グベクターを作成した・129系統マウス胚幹（ES）細胞にターゲテイングベクターDNAを導入し，相同組み換えES細胞3クローンを得た・C57BL′6J（86）系統マ
ウス胚盤胞への顕微注入法により，キメラマウスを作成し，キメラマウスと86マウスとの交配でヘテロ変出されたが，その量は約半分であった（図1）．骨格筋
細胞膜のカベオラ密度はカベオリンー3発現量の減少に伴って減少していた（図2）．ホモ変異マウスの横隔膜ではEBD染色性の筋線経がみられたが，ヘテロ変異マウスを得た．ヘテロ変異マウス間の交配により，ホモ変異マウスを得た．同腹マウス骨格筋でのカベオ

異マウスでは正常型マウスとほぼ同様にみられなかっリンー3mRNAおよびタンパク質の発現をノーザンプ

マウスヒラメ筋で壊死・再生像がみられ，12週令では

ロット，イムノプロット法および免疫組織化学で解析した．骨格筋細胞膜のカベオラ数を丘eeze＿丘acture

中心核筋線経がみられた（図3）が，ジストロフィン■国立精神・神経センター神経研究所＝防衛医科大学校解剖学第二た．下肢筋組織のHE染色像では，8週令のホモ変異やサルコグリカンの欠損マウスに比べ軽度であった．
ヘテロ変異マウスでは，筋組織に顕著な病理像がみられなかった．ヘテロおよびホモ変異マウスでのカベオ−40−リンー1の代償性発現は認められず，またnNOSおよびジストロフィンーDAP複合体の筋細胞膜への発現は∴＿￣三㍉装置溢踪聾葉調節需鍔

正常型との差がみられなかった．
2．カベオリンー3とジストロフィンの二重欠損マウス
イムノブロッ、トおよび免疫組織化学による予備的な解析において，二重欠損マウスの骨格筋には，ジスト
ロフィンおよびカベオリンー3は発現していなかった・
またHE染色では，壊死・再生像，中心核筋線経がみ
られた．

◆／◆

＋／・
／・・・一・・一一＋／＋＋／．￣／・

t0

5

2

10

￣／−

日日■￣一・5r￣￣■一一・一■▲￣

21時

5

■

2

鵬

甜18坊

Cさ舶

図3 カベオリンー3欠損マウスの筋病理像
A：ホモ変異マウス6週令（a），8週令（b），12週令（C）のヒラ
メ筋HE染色像8過令では，壊死（矢印）再生（矢頭）像がみられ12週令
では中心核線維（矢頭）がみられる．
B：横隔膜のエバンスブルー生体染色像 ホモ変異型（CaV3−／−）ではエバンスブルー陽性筋線経の束が認められるが・ヘテロ変異型（CaV3＋／−），正常型（Ⅵ几）では染まっていない・
考察

本分担研究課題のカベオリンー3欠損マウス作成と第一段階としての解析を達成することができたので，結果を発表したり．われわれの発表に続いて，2001年に報告されたGalbiatiらの欠損マウスでもこれらの結果は，定性的には同様であった．
われわれのマウスの作成と解析からは，1）遺伝子異常によるカベオリン＿3欠損がミオパチーを引き起こす．2）
遺伝子変異のサイズによってはdominantnegative効果が起図1マウス骨格筋におけるカベオリンー3mRNAおよびタンパク質の解析結果
A：ノーザンプロット解析において，ホモ変異型（−／−）ではmRNAの発現が認められず，ヘテロ変異型（＋／−）では，正常型（＋／＋）と同サイズのmRNAが約半量発現していた・ホモ
およびヘテロ変異型では，サイズの異なる変異mRNAの発現は検出されなかった．
B：イムノプロット解析において，ホモ変異型（−／−）では〜
20kDaのタンパク質が認められず，ヘテロ変異型（＋／−）では，正常型（＋／＋）と同サイズのタンパク質が約半量認められた・
C：免疫組織染色像における筋細胞膜の染色性は，ヘテロ変異（cav3＋／一）で正常型（両）に比べて弱く，ホモ変異型（cav3−／−）
では染まらなかった．

こらない．3）カベオリンー3がカペオラ形成に直接関与している．ことを，実験的に個体レベルで明らかにした．
LGMDICがautosomaldominantに対し，このマウスではrecessiYeである．それは，Minettiらの変異が1塩基置換のミスセンス変異と9bpの短い欠矢であり，培養細胞での彼らの実験およびSunadaらのトランスジェニック（Tg）マウスに基づくと，domainantnegative効果により筋細胞膜に正常カベオリンー3が殆ど発現しない・
われわれのマウスは，787bpの大きい欠矢であり，変異mRNAおよびタンパク質は発現していない．ホモ
変異マウスでは筋細胞膜にカベオリンー3が発現せずに筋変性が起こる．ヘテロ変異マウスでは，正常な
mRNAおよびタンパク質が50％発現して正常形態が保納≡賢頂き三、立岩宝を賀，帯戦き食う脚．■！、、ここJ；・こ∴才．＿千㌔貰、こ，二；■‡三：てこ、灘たれる．正常カベオリンー3が筋細胞膜に50％発現していると発症しないことが明らかになった．
カベオリンー3とジストロフィンは密接に関係している．Galbiatiらは，正常カベオリンー3を過剰発現させた

14．，±1．

8．0±0．7
C利的kr鵬鵬坤（m土＄叫nl）

1．♯土OjTgマウスで，カベオリンー3およびカベオラ数の増加と・
ジストロフィンの筋細胞膜への発現減少およびDMD様の筋病理像を報告している．一方，ジストロフィンの欠損している椚血マウスでは，カベオリン3およびカベ

図2マウスヒラメ筋のフリーズフラクチャー像とカぺオラ数
カベオラ数が，ヘテロ変異型（CAV3＋／−）で正常型（WT）の約半分に減少し，ホモ変異型（CAV3−／−）で激減している・スケー
ル：200mm

オラ数の増加が報告されている．筋ジストロフィー病態機構へのカベオリンー3の関与を調べる二重欠損マウスの解析が必要である．

ー41−

今後の展望今回の解析で，問題点として次の事項が明らかになった．1）骨格筋細胞膜のカベオラ密度が，カベオリン＿3
発現量の減少に伴って減少していたがホモ変異マウスで0ではなかった結果は，筋細胞の分化におけるカベオリ
ンアイソフォーム（1から3へ）の変換とカベオラ形成の問題を含むので，発生期の解析が必要である．2）T＿る，遺伝的背景が統一されると詳細な解析が可能になる
ので，遺伝検査の後に繁殖させ，解析に用いる予定である．また，筋ジストロフィー病態でのカベオリンー3とジストロフィンの相互作用を明らかにするために，作成した二重欠損マウスの解析を予定している．
発表文献

山bules形態形成の問題も骨格筋の分化および成長に関連した解析が必要である．3）筋変性の分子機構に関連

1）HagiwaraY，SasaokaT，AraishiK，ImamuraM，Yori旬i

するであろうnNOSおよびシグナル伝達関連分子の重要な問題が残されている．しかしながら，これらの実験解

denciency causes muscle degenerationinmice．Hum．

析の為には，遺伝的背景が統一されたマウスが必要である・ われわれのマウスは129系統と86系統の混合系
なので，86系統への戻し交配を実施し，現在，第9世
代目を得ている．一般的には第10世代（戻り理論値
99．9％）で承認され 本年度中には第10世代が得られ

ー42−

H，NonakaI，Ozawa

E

andKikuchi

T：Caveolin＿3

Mol．Genet．，9：3047−3054，2000．

2）萩原康子：骨格筋細胞のカベオリン．生体の科学，
52巻4号：314−320，2001．
3）Hagiwara Y，Nishina Y，Yori叫i H and KikuchiT：lmmunolocalization of caveolin−1and caveolin−3inmonkeyskeletal，CardiacandsmoothmuscIes．投稿中

Ⅱ．Dystrophin−Dystroglycan関連

dystroglycanを分解するmatrixmetalloproteinaseの解析
清 水 輝 夫♯
鏑＊ 大 井 博 子畢謙＊ 松 村 喜一郎＊

研究協力者 山 田 広 樹＊ 鐘
長 谷 麻 子＊ 新 井

基底膜の構成成分である，1aminin，perlecan，agrinに結合

a・遍醸鮎

する．β一dystroglycanは細胞膜貫通性の糖蛋白であり・

43−

目

的

dystroglycanはα−dystroglycanとβ−dystroglycanから成る細胞膜蛋白複合体である．α−dystroglycanは細胞膜外表面に発現するperipheralmembraneglycoproteinであり・

その細胞外ドメインはα−dystroglycanを細胞膜につなぎ
とめ，細胞内ドメインは，dystrophin，utrOPhinを介して

β−DGfull

28一

柳邦

題㌫絆級く朴′堵綬顎罵宗論妙β−DG30

細胞膜下細胞骨格のF−aCtinと結合する．このように
dystroglycanは細胞膜内外で，細胞外マトリックスと細胞骨格を架橋すると同時に，β−dystroglycanが，CaVeOlin−3，
Grb−2，C−Srcなどと結合することにより信号伝達系にも何らかの役割を有していると考えられている・
一方このように強固な架橋構造は，細胞が基底膜上を，あるいは基底膜を通って移動する状況，すなわち，発生，

b 綽潜
Q●

S P S P S P S P

分化や，病的状態ではガン細胞の浸潤，転移などの過程

43−、蜘加で効率良くこわされねばならない．従って生体はこのよ

納β−DGMI鵬β−DG30

うな架橋構造をこわす機構を自らそなえているはずである．
我々は，以上の仮説をもとに研究を行い，βC．

−dystroglycanの細胞外ドメインを特異的に切断する
matrixmetalloproteinase（MMP）の活性を兄いだした・
以下，このMMP活性について報告する．また，この活性が，SarCOglycanopathyの発病機序に果たす役割について考察する．

㌔■ ォ×
S

方法と結果

￣p

s

43■

頚観

劇■齢▼

28−

−｛l・−

p

β−DGful1

ウシ臓器（主に末梢神経）および，ラットSchwannoma
由来の細胞株RT4を材料とし，生化学的分析を行った・

β−DG30

図1aにウシの各種臓器のtotalhomogenateをSDS−PAGE
後，PVDF膜に転写し，抗β−dystroglycanモノクローナル

図1β−DG，。の組織分布と抽出実験
a，同重量のウシの各種組織を粉砕懸濁し，抗β−dystroglycanモノクローナル抗体8D5／43DAGで
immunoblotを行った．
b．ウシ末梢神経の粗膜分画を，pHll．2％TritonX100150
nlMNaCl（TX＋0．15MNaCl），2％甘itonXlOO500mM
NaCl（TX＋0．5MNaCl），および10mMEDTA鱒DTA）の条件で抽出した．遠心の後，沈殿（P）および上清（S）
を8D5／43DAGによるimmunoblotで分析した．
C．ラットschwannoma由来の株細胞RT4の粗膜分画から，

抗体8D5でimmunoblotを行ったものを示す．末梢神経，
腎，肺などの組織では，43kDaのβ−dystroglycanのバンド（β−DGfull）以外に，約30kDaのバンド（β−DG30）が出現
したが，骨格筋では認めなかった．
次に，β−DGう。の生化学的性質を明らかにするため，ウ
シ末梢神経から各種条件で抽出を行った・β−DG30はβ−DGf。1．と全く同じ挙動を示し，detergentでよく抽出されたが，高アルカリでは全く抽出されなかった（図1b）・

pH11，2％TritonXlOO150mMNaCl（TX＋0・15MNaCl）の条件で抽出し，同様に分析した．

＊帝京大学医学部神経内科
一45−このことから，β−DG，。はβ一dystroglycanの細胞膜貫通部を保持していることが分かる．検出に用いた8D5が，β−dystroglycanの最もC末端すなわち細胞内ドメインの末端に対する抗体であることを考え合わせると，β−DG30は細胞外ドメインで切断されたβ−dystroglycanの細胞膜側の断片であると推測される．

α−dystroglycanの出現も抑制された．これらの実験は，この活性がMMP活性であることだけでなく，このプロセ
シングによってα−dystroglycanがβ−dystrogIycanからだ
けでなく，細胞膜から遊離することを示している．

a．

以下の実験にRT4細胞を用いるため，培養RT4細胞の粗膜分画中のβ−dyslroglycanの組成および生化学的性質を検討した・RT4細胞の粗膜分画中にも約30kD。のβ−dystroglycan断片と考えられるバンドが存在し，抽出実

totalhomo43■一

汗一二一一∵一二謝′memb
柵

験での挙動もウシ末梢神経の場合と同様であった（図28−￣■こ艶⊥二∴−￣1C）．

∴二二二二1−−−−−−−■こ＝叫

01

3

612

013

一嘩DGfu一■βDG30612hr

ウシ組織の場合も，m細胞の場合も，何らかのプロ
テアーゼ活性がβ−dystroglycanを分解するものと考え，次の実験を行った・すなわちRT4細胞のtotalhomogenate
を室温でインキュベートすると，時間の経過と共にβ

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

−DGI・u日が減少し・β−DG3Oが増加した・tOta］homogenateから粗膜分画を調製し同様にインキュベートすると，この分解はより迅速に進行した．このことはこのプロテアー
ゼ活性が膜分画中に濃縮されることを示唆する．
一方，RT4膜分画のdigitonin抽出物から，lamininamnity
Chromatographyないし・WGAafhitychromatographyからanion exchangechromatographyと2段階のクロマトグラフ
イ￣によってdystroglycanCOmplexを分離すると，COmPlex
中にはいずれも・β−DG30は含まれず，α−dystroglycanとはβ−DGM■のみが共分離した（図2b）．また肌の膜分画のThton XlOO抽出物からは，一段階のWGA amnity
Chromatographyによって，α−dystroglycanとβ−DG3。が解離した（図3b）．これらの結果は，このプロテアーゼ活性によって，dysけOglycan

複合体が断裂し，α−dystroglycanがβ−dystroglycanの膜貫通部分および細胞内ドメインから分離することを示している．
次にこの活性の阻害実験を行った．この活性は，RT41071■

43￣繊＃艶麗崇βDGfuH

培養上清中に，MMPの特異的阻害剤であるBPHAを加え28−磨欒熟ることによって抑制された（図3a）．この阻害は濃度依

βDG30

存性であり，また他のMMP阻害剤である，SI−27，
phenanthrolineでも同様の結果であったが，阻害活性のス
ペクトラムの狭いMMI−16では抑制されなかった（実験結
果は示さず）．
一方，BPHAによる阻害実験で用いた，RT4のt。tal
homogenateから粗膜分画を調製し，その際に生じた遠心
上清と共に分析すると．BPHAを加えないcontr。1では遠心
上清中にα−dystroglycanを検出したが，このα−dystroglycanの出現はBPHAにより完全に抑制された（図3a）・またRT4細胞の粗膜分画を生理的条件で再懸濁した後，室温でインキュベートし，再度遠心して，膜分画と上清に分けると，時間経過と共にβ−dystroglycanが分解されると同時に膜分画中ではα−dystroglycanが減少し，
上清中に出現した．BPHAを加えて同じ実験を行うと，
β−dystroglycanの分解が抑制されると同時に，上暗中の−46−

図2 β−dystroglycanプロセシングの時間経過
および，dystroglycan複合体
a・RT4細胞を収穫後，tOtalhomogenateを37℃で0，1，3，6，12
時間インキュペpトし，8D5／43DAGによるimmun。bl。tにより分析した（totalhomo）．同様にRT4細胞を収穫後，粗膜分画を調製し，それを再懸濁したものをやはり，0，1，
3，6，12時間インキュベートし同様に分析した（memb）．
b・m細胞の粗膜分画の1％digito血抽出物（Ianelおよび4）を出発材料として，lamininamnitychromatographyにより単離したdystroglycancomplex（lane2および5），WGA
afhity chromatographyの結合分画をanion exchange
Chromatographyにかけ，0．35MNaClにより溶出した分画（lane3および6）を示す・α−dystroglycan（α−DG）はモノ
クローナル抗体ⅠIH6により検出した．
C．RT4細胞の粗膜分画の2％T血onXlOO抽出物（lanelおよび3）および・それをWGAafnnitychromatographyにかけた，結合分画（lane2および4）を示す．

−dystroglycanのプロセシングは，以下のような病態に関与している可能性があるものと思われる，
1．ガンの浸潤，転移：各種の培養細胞株で悪性度の高い

a．

totalhomo sup memb
225−

●● −

ものほど，β−dystroglycanの30kDa断片が多く見られたとの報告がある．

一■uDG

107−

43■ここここ

精一βDGfuII

28−増敵

組

2．感染防御：α−dystroglycanはライ菌の，またラッサ熱
ウイルスを含む一部のアレナウイルスが感染する際に細胞側のレセプターとして作用することが明らかになっている．また，MMP−了が腸粘膜への感染の際に一声DG30簡略協発現先進することから，感染防御的に働いているのではないかと考えられている．
3・Sarcoglycanopathy・

以下，3．について考察する．Sarcoglycanopathyでは，

鵜●●義曽鯵厳制
COntrOl

一αDG■抽・・・・加一βDGfuIl

Sarcoglycanの欠損がどのようにして筋細胞死につながるのかが不明であった．一方，ヒトのsarcoglycan欠損症の症例で，β−dystroglycanが保たれているにもかかわらず，

一βDG30・I−●●●● ■●l●−●一uDG
一PDGMl・叫・岬一一鼎・・、〜・一βDG30

013

612

013

612hr

図3 β一dystroglycanプロセシングによるα一dystroglycanの膜分画からの遊離
a．Fm細胞をmatrix metalloproteinaseの特異的阻害剤であるBPHAの存在下（BPHA）および非存在下（COntrOl）で培養し，収穫後一部をtotalhomogenate（【Otalhomo）とし，残りを遠心し上酒（Sup）と粗膜分画（memb）に分けて分析した．
b．再懸濁したRT4粗膜分画をBPHAの存在下（BPHA）および非存在下（contml）で，0，1，3，6，12時間インキュベートし，遠心して上清（sup）と．再沈殿した粗膜分画（memb）に分けて分析した．

α−dystroglycanが減少している例が報告されていること，∂−SarCOglycanの欠損動物モデルであるB1014・6ハムスタ
ーでは，α−dystroglycanとβ−dystroglycanが解離しており，
膜分画にα−dystroglycanが回収されないこと，が報告されていた．さらに最近，多数の筋疾患例生検筋のmultiple
westernblotの報告でsarcoglycanopathy例でのみ30kDaβ−dystroglycanの出現が報告されている・我々の結果でも，β−DG，。はα−SarCOglycanを含むsarcoglycanの組成を持つ骨格筋では見られず，他の臓器に見られている．
これらの結果をもとに，我々は，骨格筋のsarcoglycan複合体は，β−dystroglycanのプロセシングを抑制する方向にMMP活性を調節する機能を有しており，この機能の異常が，SarCOglycanopathyにおけるdystroglycan複合体の破綻，筋細胞死にながる，という仮説を提唱した．
今後の展望
今後，上記の仮説を元に関与するMMPの同定，

考察

sarcoglycanが活性を調節する機構を明らかにしていくことを目標とする．これらが明らかになれば，上記の結果は以下を示唆する，●末梢神経，肺，腎臓などの臓器にはβ−dystroglycanのsarcoglycanopathyの治療法の開発につながる可能性がある．

約30kDaの断片が発現する．
●この断片は，β−dystroglycanの細胞外ドメインがmatrix

文

metalloproteinaseによって切断されることにより生じる．

献1）YamadaH，etal．：J．Biol．Chem．271：23418−23423，1996．

●このMMP活性は膜分画中に濃縮されている．

2）chibaA，etal．：J．Biol．Chem．272：2156−2162，1997，●この切断により，dystroglycan複合体は断裂し，α3）MatsumuraK，etal．：J．Biol．Chem．272：13904−13910，
1997．

−dystroglycanは単にβ−dystroglycanの30kDa断片から離れるだけではなく細胞膜から遊離する．

4）Saitofミetal．：J．Biol．Chem．274：8240−8246，1999，

5）Yamada H，et al．：Hum．Molec．Genet．10：1563−1569，

前述したようにdystroglycan複合体の機能が，今日多くの疾患の発病機構に関与していることが明らかになり2001．

つつあるが，今回我々の兄いだしたMMPによるβー47−

病態解明に向けたジストロフィン結合タンパク質の分子論的研究
吉 田 幹 晴●・●●
研究協力者

緒

小

澤

扶二郎●●

武

田

伸

一●

結果と考察
1．DBのN末端はSG複合体と結合している

口

我々はこれまでジストロフィン（dys）とdys結合タンパク質（DAP）からなる大きな複合体（dys複合体）の構造について詳細な検討を行い，その分子構築を明ら精製したdys複合体のカルパイン消化物を様々な抗体を用いて解析した・カルパインによりdysは断片化したが，DBを除くDAPの方は殆ど変化が認められなかった．DBはC末端側が分解され，N末端側38kDa程のかにしてきた・その結果として「細胞膜はdys複合体が基底膜と細胞膜骨格を連結することにより保護されている」ことが理解されるようになった．Dysの変異によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）やサルコグ
リカン（SG）複合体の発現異常によって発症するサル断片になることが見出された．消化物をWGAゲルで分画するとDB断片は糖鎖がないにもかかわらず結合画分に検出されたが，Synの方は殆どが非結合分画にあった．

コグリカノバチー（SGP）は結果的にdys複合体の構造が崩れるために保護機能が失われ 細胞膜が脆弱化した結果と考えることができる．こうした機械的な発症機構とは別にdys複合体を経由するシグナル伝達が絶たれ発DB断片はdys結合部位を，また結合画分中のdys断片
はDB結合部位を喪失している．従ってDB断片はジス
トログリカン（DG）複合体／SG複合体に結合してゲルに保持されているものと考えられた．次にDB断片が症を促すとの考え方もされているが，具体的な証拠はな

SG複合体と結合しているかどうかをみるため，消化物のWGA結合画分を高塩濃度下37℃で熱処理した．こい・我々はdys複合体においてシントロフィン（syn）／
α−ジストロプレビン（DB）がSG複合体と結合していることを明らかにしたが日，こうした背景からその結合の処理は以前我々がDys複合体からDBとsynが結合したSG複合体を得た時のものであるり．処理後SG複合体を分離してDBを解析したところ，それが検出された・SynはWGA分画で既に失われていることから，SG複合体と結合しているのはDBであり，そのN末端側が結合に関与していると結論した4）．

状態をより詳細に示したいと考えた．synがシグナル伝
達分子nNOSと結合することが知られているからである．
その結果を前半で述べる．
今日まで様々な筋ジストロフィーの原因遺伝子が明らかになっているが，ジスフェルリン（dysF）もその一つである．dysFは三好型ミオパテー及び肢体型筋ジスト
ロフィー2B型の責任遺伝子であり，同一遺伝子の変異によって症状の異なる二つの筋ジストロフィーが発症す筋におけるDBは選択的スプライシングにより共通のN末を持つ3種（D8−1，−2，−3）が発現している（図1）．
今回の結果からその何れもがSG複合体と結合しているはずである・DB−3を除くDBはC末端側にsyn及びdys結合部位を持っており，従ってdysとSG複合体を連結し，その間でsynと結合していることになる（図2）・α−SynはnNOSと結合することが知られており，る点で興味深い分子であるユ）．その機能は不明であるが，最近DMD患者の一部やSGP患者の約半分で減少していることが報告されdys複合体との相互作用が示唆された】）．広い意味でDAPとなるかもしれない分子であ従ってSG複合体とnNOSがDBとsynを挟んでつながっていると考えられる．

る・我々はその真偽を判定すると共に，dysF欠損症の病態解明のためdysFの機能を明らかにしたいと思い
dysF結合タンパク質の存在についても検討した．その結果を後半で述べる．

EF・hn由ヱZ＄叩・8亡Cl

亡d pY

方法と材料
Dys複合体はウサギ骨格筋細胞膜より司製した．カル
パイン消化及び小麦胚芽レクチン（WGA）ゲルクロマ
トグラフィーと消化物WGA結合画分の熱処理は文献4）に記載した．DysFのイムノプロットによる解析は細胞膜のジギトニン抽出液より得られた試料について行った．
●国立精神・神技センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部＝国立精神・神経センター神技研究所旧線能研究部

図1骨格筋において発現しているα−ジストロプレビン3つの分子種
WW：WWドメイン，EF−hands：2つのEF−handモチ，フを含むドメイン・ZZ：Znフィンガードメイン，Syn−B：Syn結合領域，CCl／cc2：COiled−COil結合領域，PY：チロシンリン酸化酵素の基質となる配列を含む敵城−48−

NOはその作用に二面性を持ち，過剰では細胞障害が予想され 筋ジストロフィーの発症を促す可能性がある．
この仮説を試すには収縮に伴うNO星の測定が必要と思われる．1一方D8−3はsyn及びdys結合部位を持たず，
従ってnNOSとの結合も成立しない．この様な分子種が存在することもDBの機能を考える上で逆に興味深いと思われる．
dysFは分子内にC2ドメインを複数持ち，従ってこの分子のCa2＋存在下での挙動が注目されていた．今回の研究でdysFがWGA結合性の糖タンパク質とCa2＋依存的に結合することが示唆されたことは興味深い．dysFはたト1ファミリーの一員であり，たト1は線虫で発見された
受精不能変異体の原因遺伝子として発見されたものである．知−1変真はMOと呼ばれる細胞内小胞と精子細胞膜の融合不全を起こす．一方同じくC2ドメインを持つシ
ナプトタグミンはたト1ファミリーとは少し異なる分子であるがシナプス小胞に存在し，神経伝達物質放出の際のCa2＋センサーとして機能すると言われている．こうしたことを考慮すればdysFは筋細胞中に存在するある種の小胞が細胞膜と融合する際のCa2＋センサーとして働くのではと想定される．その際今回示唆された糖タンパク質との結合がキーポイントである可能性も考えられる．WGA
ゲルで二分されるようなdysFが存在することはこの分子

図2 骨格筋表面膜上に存在するジストロフィン複合体の様子
文献4）の図を少し改変したものである．DGC：DG複合体，
SGC：SG複合体，SPN：サルコスパン，Cav：カベオリンー3の動的挙勤を反映するものかもしれない．

2．dysF結合タンバク質の存在予想されたdys複合体とdysFの結合を調べるために，それをC妃＋存在下で検討したが，結合する様子は認め

1）吉田幹晴‥ジストロフィンとその結合タンパク質の分子論的研究．厚生省精神・神経疾患研究委託費られなかった．一方dysFはその一部がWGAゲルと結合することが認められた．この場合C虚十を必要とし，従って結合したdysFはN−アセチルグルコサミンを使わず，EGTAで溶出された．このことからdysFはWGA
結合性の糖タンパク質とCa2＋依存的に結合することが文

献「筋ジストロフィーの分子病態学的基礎研究」総括
研究報告書（平成8年度〜10年度）7−11，1999．
2）LiuJ，AokiM，111aIetal：Dysftrlin，anOVelskeletal
musclegene，ismutatedinMiyoshimyopathyandlimb
girdlemusculardystrophy・NatureGenet20：31−36・1998・
3）PiccoloF，MooreSA，GwendotynCetal：Intracellularaccumulation and reduced sarcolemmal expression of

示唆された．

dysftrlininlimbpgirdle muscular dystrophies・Ann
Neurol：Jは：902−912，2000．

今後の展望
SG複合体がDB−SynをとおしてnNOSと結合していることがわかった．sG複合体がレセプターであり，何4）Yoshida M，Hama H，Ishikawa−Sakurai

M et al：Biochemical evidencefor association of dystrobrevin

らかのリガンドがこれに結合してnNOSの活性を制御遮断すると仮定してみよう．この場合SG複合体が失われwiththe sarcoglycan−SarCOSPanCOmplex as abasisfbr

ると持続する収縮においてNO量が過剰となりうる．

1033−1040，2000．

understanding−49−

sarcoglycanopathy・Hum

MoI

Genet9‥筋形質膜一細胞骨格問分子連関異常による筋ジストロフィー
発症機構の細胞生物学的研究
プレクチンと筋形質膜裏打ちタンパク質との構造・分子連関性の解析
土 方 貴 雄＊研究協力者

日磯 川 桂太郎… 瀬 嶋
中 村 彰 男… 村 上

的

仁

美…
徹●

プレクチンの局在をスキンドファイバーを用いた免疫電顕

皮膚疾患を伴う筋ジストロフィー（Epidemolysis
Bullosa Simplex−Muscular Dystrophy）の原因がプレクチ
ン欠損によることが1996年に明らかになり，骨格筋ににより調べた，その結果プレクチン抗体でゴールドラベル
された細いストランドがデスミン中間径フィラメントとdenseplaquesの間を連結しているのが観察された（図？）．

おけるプレクチンの役割が注目されるようになった．その後主に骨格筋内でのプレクチンの局在様式から以下の役割が提唱された．1）プレクチンはデスミン中間径

共焦点レーザー顕微鏡の観察によりZ線延長上の筋
形質膜下のプレクチン存在領域にはジストロフィンとピ
ンキュリンも局在していることが明らかなので，電顕レ

フィラメントネットワークとともに隣接する筋原線経をZ盤で連結し並列する筋原線経の同調収縮を保障している（Hijikata et al．，1999）．2）ミトコンドリアの細胞内適所での保持をデスミンネットワークとともに担い，in
Situでの呼吸活性に関与している．3）筋形質膜の支持

ベルでのジストロフィンやビンキュリンとプレクチンの相対的局在関係を免疫電顕により観察した．その結果，ジストロフィン，ビンキュリンは共にプレクチン・ストランドが結合しているdense plaques内に存在していた（図3A）．

や構造保持．これら役割の内，「筋形質膜の支持や保持」という説はプレクチンが筋形質膜下に局在するとい

微細形態学的に観察されたプレクチンとジストロフィ
ン・ピンキュリンとの連関性を生化学的に確かめるためう観察からジストロフィンと同じであろうという類推に基づくもので，実質的なプレクチンと筋形質膜との構造的あるいは分子レベルでの結合関係は未だ不明である．

に，筋形質膜を含む軽いマイクロゾーム分画を可溶化しそこで本研究ではプレクチンと筋形質膜との関係を筋形
質膜裏打ちタンパク質であるジストロフィンやピンキュリンとの関係を中心に解析した．

た（図38）．興味深いことに，軽いマイクロゾーム分画にはビンキュリンとメタピンキュリンが等量比で混在しプレクチン抗体で免疫沈降した．その結果，確かにジス
トロフィン，ピンキュリンはともにプレクチンと共沈しているのに対し，プレクチン免疫沈降物内にはメタピン
キュリンがより多く含まれていた．このことはプレクチ

方法と結果
ラット骨格筋において筋形質膜裏打ちタンパク質のジンは主としてメタビンキュリンと連関していることを示唆している．

ストロフィンやピンキュリンとプレクチンの相対的局在関係を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した．その結果，プレクチンはZ線レベルと縦ストランドからなる
格子状の領域の筋形質膜下にジストロフィンとビンキュ
リンとともに共存した（図1）．一方，ジストロフィンとビンキュリンはM線街域に相当する筋形質膜下にも局在したが，プレクチンは存在しなかった．
電子顕微鏡によりZ線レベルの筋形質膜下のプレクチ
ン局在簡域を精査した結果，へミデスモゾーム様の構造が兄い出された．この部位では基底膜をともなう筋形質
膜の直下に膜裏打ちdenseplaquesがみられ これに数本の中間径フィラメントが平行に近接する．そこで次に＊群馬大学医学部第二解剖書＊ 日本大学歯学部第二解剖
印書群馬大学医学部薬理学

図1プレクチン，ジストロフィンおよびピンキュリンの筋形
質膜下での二次元的局在様式と相対的な局在関係．プレクチン（a，d）はZ線延長上領域と縦のストランドからなる目の粗い格
子状の領域に分布するが，ジストロフィン仲）やピンキュリン（e）は上記領域にM線延長上領域を加えた目の細かい格子状の領域に分布する．両方向矢印（a，d）は筋線経の長軸を示す．重ね合わせ像（d，Oの一部拡大（insets）で矢印はプレクチンとジス
トロフィン・ビンキュリンが共局在するZ線延長上領域を示し，矢尻はジストロフィン・ピンキュリンのみが局在するM
線延長上領域を示す．Bars5〟mー50−

ることから中間径フィラメント関連タンパク質であると帯考えられた．
つぎにこの分子量約150kDaのプレクチン結合タンパ
ク質の部分アミノ酸配列を決定した．ブラストサーチの結果，この部分アミノ酸配列はKIAAO353およびデスマ
スリンのそれに一致していた．デスマスリンは最近ジス
トロプレピン結合タンパク質として明らかにされた新規タンパク質で，シネミンやパラネミンと同じタイプ6の中間径フィラメントタンパク質である．我々が同定した
プレクチン結合タンパク質がデスマスリンであるならば，
プレクチンはデスマスリン／ジストロプレピンを介しジ
ストロフィンと結合する可能性があり，アクチンを介さないプレクチンとジストロフィンのもう一つの連関軸と考えられる．現在このデスマスリンと思われる150kDaのプレクチン結合タンパク質のクローニングを行っているところである．

図2 プレクチンはデスミン中間径フィラメントと膜裏打ち
denseplaquesをリンクする．Aプレクチンを示す5nmゴールド
は中間径フィラメント（lF）と膜裏打ち（DP）の間や中間径フィラメントとZ盤の間にみられる．矢尻はプレクチンラベルされた細いストランドを示している．Bプレクチン（10mmゴール
ド）はデスミンラベル（5mmゴールド）された中間径フィラメント
と膜裏打ち（DP）の間に介在している（矢尻参照）・Bar50・1〝m
プレクチン，ジストロフィン，ピンキュリンはいずれもアクチン結合ドメインをもつ．また，プレクチン免疫沈降実験によりアクチンも共沈することが確かめられた．
これらのことから，アクチンがプレクチンとジストロ
フィンおよびピンキュリンの間を直接あるいは間接的に繋いでいることが考えられる．そこでこの可能性を検討するためにプレクチン免疫沈降物をゲルゾリンで処理してみた．この結果，プレクチン免疫沈降物内に含まれるジストロフィンおよびピンキュリンの量は1／2−2／3に減
少した．このことはアクチンが部分的にはプレクチンとジストロフィンおよびビンキュリンとの連関性を担っていることを示唆している．
一方，ゲルゾリンにより完全にジストロフィンがプレ
クチン免疫沈降物から除去できないことからアクチンを介さないプレクチンとジストロフィンとの分子連関性も考えられる．そこでどのような分子がプレクチンに結合するかプレクチンN末のリコンビナントタンパク質を用いたオーバーレイアッセイによりスクリーニングをおこなった．その結果，分子量約150kDaのタンパク質がプレクチンN末リコンビナントタンパク質に結合することが明らかになった（土方2001）．このタンパク質は
粗中間径フィラメントタンパク質分画に多く含まれてい図3 Aプレクチン（10mmゴールド）がアソシエイトする膜裏
打ちはジストロフィン（5nmゴールド）を含む（矢尻参照）・
BarO．11上m Bジストロフィン・メタピンキュリンはプレクチン抗体で免疫沈降する．左：銀染色右：イムノプロット

−51一

考

察

ム様構造はそのストレスを緩衝するストレス吸収の役割

本研究により，以下のことが明らかになった．

をしているのではないかと考えられた．

1）プレクチンはデスミン中間径フィラメントをZ線の今後の展望

延長鎖域の筋形質股裏打ちdenseplaquesに繋いでいる．
全体としてへミデスモゾームの相似構造を呈している．

中間径フィラメントネットワークとジストロフィンを

2）プレクチンはジストロフィンや（メタ）ビンキュリ

含む筋形質膜裏打ちとの構造・分子連関性が明らかにな

ンに部位特異的にアソシエイトする．プレクチンはZりつつある．このことは一方ではこれまで知られている

線の延長鏡域の筋形質股下のdenseplaques内のジスト
ロフィンやビンキュリンにはアソシエイトするが，その筋ジストロフィーあるいはミオパチーの責任タンパク質

他のM線延長上領域のジストロフィンやピンキュリン

研究の延長上には，これまで責任タンパク質の不明な筋にはアソシエイトしない．

疾患の原因タンパク質が見出されていく可能性も大きい．

3）アクチンがプレクチンとジストロフィン・ビンキュ

また，治療の面においても連関構造の解明によりバイパリンのアソシエイトに直接的あるいは間接的に関与してス・キメラ分子などの設計が可能となり，代替分子を用いることが示唆された．

いた遺伝子治療の基盤となっていくことを期待している．

が相互に連関していることを意味する．この連関構造の

4）プレクチンとジストロフィンのアソシエイトには別の連関軸の存在も示唆された．プレクチンはジストロブ
レビン結合タンパク質であるデスマスリンに結合し，そ

文
1）土方

献

貴雄：骨格筋における中間径フィラメント

の結果ジストロフィンにアソシエイトする連関軸である．

ネットワークの分子構築 一発生過程における再編

これについては今後詳細に検討していく．

成の分子機構，機能的意義そして筋疾患との関連性

筋形質膜と中間径フィラメントネットワークとのプレ

生体の科学，52（4）：287−293，2001．

クチンを介した連関構造は上皮でみられるへミデスモ

2）H可ikata T，Murakami

T，lmamura M，F可imaki N，

ゾームに構造的に相似であり，機能的にも相似と推察さIshikawaH：Plectinisalinkerofintemlediatenlamentsれる．すなわち，筋形質膜は筋収縮により機械的ストレtoスを絶えず隣接する筋線経から被るが，へミデスモゾー

76，1999．

−52−

Z−discsin

skeIetalmusclenbers．J

CellSci．112：867＿

ジストロフィン欠損心筋におけるシグナル伝達異常の検討
吉 田 邦1広研究協力者 中 村 昭 則●■ 池

田

修

一◆■

武

田

伸

一…

HarrodGViDaviesKE…●

日てCalcineurinの蛋白レベルはmdx，dkoでC57BIJlOの約2倍と増加し，個々のマウスにおいてそのmRNAのレベルを反映していた．活性化型（リン酸化型）JNKlは椚血で的拡張型心筋症に基づくうっ血性心不全は呼吸不全と並んでジストロフィン異常症患者の重要な死因である．骨格筋障害の軽症なBecker型筋ジストロフィーでは心筋障害を呈する頻度が高いことが報告されているが，この理有意な上昇はみられなかったが，dkoではC57BUlOの約7倍に増加していた．また活性化型（リン酸化型）p38

由として従来から運動負荷による心負荷の増大が要因と推測されてきた．これまでにジストロフィン欠損骨格筋り心筋では運動などの機械的ストレスにより障害され

MAPKは12週のmdxでwi1dtypeの約6倍，dkoで約9倍に増加していた．以上からdko心筋においてcalcineurinとそれぞれ活性化型JNKl，p38MAPKの発現が増加していること，椚血心筋においては個体差がみられるものの易いこと，また機械的ストレスにより心筋細胞内のstresscalcineurinおよび活性化型p38MAPKの発現が増加していることが明らかになった．
2）次にC578UlOおよびm血に運動負荷をかけて，心筋病

activatedproteinkinase（SAPK）の活性化やCa濃度の上昇を来すことや一部の肥大型および拡張型心筋症モデルマ
ウスにおいて心筋細胞内のSAPKやCa依存性のprotein
phosophataseであるCalcineurinなどのシグナル伝達分子異常が明らかにされていることから，ジストロフィン欠損による心筋障害の発症機序においても同様のシグナル伝
達異常が関与している可能性が考えられる．そこで我々はジストロフィン異常症における心筋障害の発症機序，理の変化と心筋におけるシグナル伝達分子p38MAPK，
JNKl，eXtra−Cellularsignalregulatedkinasel／2（ERKl／2）およびcalcineurinの発現を比較検討した．6週のC57BL／10および∽血をそれぞれ運動負荷群，非運動負荷群（各6匹ずつ）の計4群に分け，運動負荷群にはトレッドミルを用いて傾斜7度，15m／min（5週），続いて23m／min（5週）を1
時間，週2回の計10週間の運動負荷を行った．経時的な体病態生理を明らかにするためにジストロフィン欠損モデ
ルマウスの心筋においてSAPKやp38mitogen activatedproteinkinase（MAPK），Calcineurinの異常の有無について検討し，さらに肌血マウスに運動負荷を掛けてその心筋病理変化と同シグナル伝達分子の発現について検討した．
方法と結果
1）6，12，24週のC57BUlO，J血マウスおよび6，12週の重測定と終了後の心体重比を求め，心筋組織を用いて一般病理学的検討を行った．またcalcineurinとそれぞれ活性化型JNKl，p38MAPK，ERKl／2の発現をWestemblot法と免疫組織化学を用いて比較検討した．結果はC57BUlOお
よびm血の運動負荷群，非運動負荷群のそれぞれの間に体重の有意差はなかったが，負荷終了時の心体重比は
仙女運動負荷群で有意に大きかった．一般病理ではm血運動負荷群は非運動負荷群に比して心筋細胞の壊死，結utrophin−dystrophin欠損（dko）マウスの心筋を用いて
calcineurinとSAPK（JNKl）／p38MAPKの上流に位置する

合織増加，細胞浸潤の程度が強い傾向を認めた．またangiotensinIIreceptorla（ATla），さらに両分子の下流に位置するbraintypenatriureticpeptide（BNP）のmRNAレベルを比較・検討した．またwestern blot法を用いて

calcineurinとそれぞれ活性化型p38MAPK，ERKl／2の発現はC57BUlOおよびm血ともに運動負荷群で増加していた

calcineurin，活性化型および非活性化型のJNKl，P38
MAPKの蛋白レベルの比較・検討を行った．結果はが，m血運動負荷群でより増加していた．また∽血での活性型JNKlの発現増加は見られなかった．免疫組織化学でcalcineurin，Arla，BNPのmRNAレベルは12週以降のmdx
および6週以降のdkoではC57BL／10に比べ有意に増加しはcalcineurinとそれぞれ活性化型p38MAPK，ERKl／2はれ血心筋の変性・壊死線経に強く染色され，またその程度は運動負荷群で強い傾向を示した．

ていたが，mdrではcalcineurinおよびJ3NP値は増加しているものの値にばらつきがみられた．12週のマウスにおい考察Dko心筋ではcalcineurinとJNKlおよびp38MAPKのpathwayが活性化しており，これらのpathwayが心筋障害の病態に関与している可能性が示唆された．また椚血心＊信州大学医学部附属病院遺伝子診療部…信州大学医学部第三内科…＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＋＊DepartmentofHumanAnatomyandGenetics，University

筋でもcalcineurinおよびp38MAPKのpathwayが活性化さ

OfOxford−53−

れていたが，その程度は個々のマウスによって異なっていた．この可能性の一つとして個々のマウスにおいて運動量の差異による心筋障害への関与が考えられるため運の変化を確認する必要があると考えられる．このことは

動負荷実験を行ったところ，m血運動負荷群の心筋では非運勤負荷群より強いジストロフィー変化を呈し，活性筋においても同シグナル伝達分子の発現について検討を括抗剤を用いた治療の可能性を検討する上でも重要な知見が得られると思われる．またジストロフィン欠損骨格行う予定である．

化型p38MAPK，ERKl／2およびcalcineurinの発現がさらに増加していた．以上からジストロフィン欠損心筋では運動負荷により細胞内のシグナル伝達分子がより強く活性

文献1）NakamuraA，HarrodGVIDaviesKE：Activationofca1−

化され，心筋症の進展に関与している可能性が考えられた．

Cineurin and SAPK／p38−MAPKin heart of Duchenne

今後の展望
上記のシグナル伝達分子が運動負荷に伴う心筋病変の2）TasakiN，YoshidaK，HarutaS，etal：AcaseofX−1inked

musculardystrophymice．NeuromuscDisordll：251−259，
2001．

dilated cardiomyopathy with a hot−SPOt dele（ionin the

進展に関与している可能性を証明するためには，それぞれのシグナル伝達分子に対する括抗剤の投与による病態

dystrophingene．IntemMed40：1215−1221，2001．

ー54−中枢神経系でのdystroglycanおよび関連蛋白質の生理機能に関する研究
二 宮 治 明■
研究協力者

目

的

細

川

浩◆◆

＿Catenin免疫染色），マウス骨格筋抽出物から抗βDG／抗一般に非筋細胞においてdystroglycan（DG）はutrophinと結合すると考えられているが，いくつかの細胞種におMAGト1のいずれによっても共免沈された．培養細胞でのいて，DGとutrophinの細胞内局在が異なっており，

Tcellfactor（Tcf）reportergene活性を誘導した・これらの結果は，βDGからMAGl−1／β−Cateninを経てTcfに至るシ

utrophin以外の蛋白質がDGの細胞内ドメインに結合して発現系において，MAGI−1はβ−Cateninのstabilityを増強し，いることが予想された．そこで，dystrophin／utrophin以外

グナル伝達系が存在することを示唆する．

のDG−bindingproteinを同定し，その生理的意義を明らかにする事を目的とした．

3．再生骨格筋の形質膜ではMAGl−1／β−Cateninの発現が方法と結果

抗β＿Cateninのいずれの染色性も増強しており，その増強

1．MAGl＿1はそのWWdomainを介してβDGに結合する．

は再生線経で特に顕著だった．これらの結果は，MAGト1／

DG cDNAの細胞内ドメイン（△βDG）をprey，ヒト

β＿Cateninを経てTcfに至るシグナル伝達系が骨格筋の再増強している．
mdxマウス，ヒトDMD骨格筋の形質膜では，抗MAGl−1／

骨格筋cDNAlibraryをbaitとして，yeaSt tWO hybdd

生過程において活性化されていることを示唆する．

screeningを行った．得られたcloneに，MAGUK（membrane−aSSOCiatedguanylatekinase）fhmilyに属する蛋4．MAGト1ノックアウトマウスの作製

白質MAG1−1（membrane−aSSOCiatedguanylatekinasewithan

マウスの樹立に成功した段階である．これまでのFlへテ

invertedarrangementofprotein−PrOteininteractiondomains）の部分cDNAが含まれていた．MAGI−1は，N端側から，ロマウスのmatingにおいてホモマウスが得られていないが，これが単に出生数が少ないためか，embryoniclethal

guanylatekinasedomain，2つのWWdomain，POlyQrepeat・であるためか検討中である．

MAGト1ノックアウトマウスの作製を試み，Flヘテロ

5つのPDZdomainを持ち，異なる蛋白質を架橋することが予想されたが，その生理機能は全く不明だった．
MAGI＿1のWW domainに対応する6xHis標識蛋白質と，GST融合AβDG蛋白質を作製し，invitroでのMAGト1と△βDGの結合を確認した．さらに，MAGI−1がマウス，
ヒト骨格筋形質膜に存在すること（抗MAG1−1免疫染色），
ラット網膜においてβDGとその発現部位が一致すること（抗βDG／抗MAGI−1二重染色）を確認し，マウス骨格筋
抽出物を用いた免疫沈降実験において，抗βDGでMAGI＿1を，逆に抗MAG1−1でβDGを共免沈することができた．これらの結果は，MAG1−1がin vivoでβDGと結合することを強く示唆する．
2．MAGト1はそのPDZdomainを介してβ・Cateninに結合
し，β−CateninのstabHityを調節する・
MAGI＿1の機能を明らかにする目的で，そのPDZ do一
mainに結合する蛋白質をyeasttwo−hybridにより検索し，候補蛋白質としてβ＿Cateninを同定した．Invitroでの結合

Dystrophin欠損骨格筋でのMAGl・1の機能に関するわれわれの仮説
MAGl＿1はβDGとβ＜ateninをリンクし、βヾateninを安定化することによりβヾatenin／托f複合体による転写活性を冗進させる。このシグナル伝達がdys的phin欠損骨格筋の再生／分化に必要である。Dystmphin欠損骨格筋において
MAGト1／βぺateninの発現が冗進している理由は不明だが、
ub叩hinの発現を克進させているのと同じようなメカニズ
ムが働いているのかもしれない。

実験において，β・CateninはそのC末端のPDZ−binding
motifにより，MAGt−1の5番目のPDZdomainに結合した．
β＿Cateninはマウス，ヒト骨格筋形質膜に存在し（抗β＊鳥取大学医学部・神経生物学＊■CenterforCardiovascularResearch，UniversityofRochester

−55−

考

察

altemativespliceforma，b，CのひとつでC末端が異なる）

上記1−3の結果から「βDG／MAGI＿1／β．catenin〝cfシグが同定され（S（rochlic et al．，JCB，28，1127，2001），

ナル伝達系が骨格筋の再生に必要である」という仮説をMAGト1が神経筋接合部の形成に関与する事が示唆され提唱した．胎生期の骨格筋発生においてWintlの刺激によた．われわれのノックアウトマウスを用いて，MAGト1

りβ−CateniIl汀cfシグナル伝達系が活性化されMyf5などの筋特異的転写因子を誘導する事が知られているが，わが胎生期の神経筋接合部形成に関与する可能性の検証も行う予定である．

れわれの仮説は同様のシグナル伝達がmdxマウス／ヒト
DMD再生骨格筋において働いている事を提唱するもの
である．

文

献

l）shimizuH，HosokawaH，NinomiyaH，MinerJ．H．and
MasakiT：Adhesionofculturedbovineaorticendothelial

今後の展望

Cells（01aminin−lmediatedbydystroglycan．JBioIChem

この仮説を直接的に証明するためにはmdxマウスにお274：11995−12000，1999．

いてMAGト1遺伝子をノックアウトし，筋再生に異常をき

2）HosokawaH，NinomiyaH，KitamuraY，FujiwaraK．and

たすか否かを確かめればよい．もし，MAGl＿1ノックアウ

MasakiT：ⅥlSCularendothelialcellsthatexpressdystr0−

トマウスがembryoniclethalであった場合この目的には使

glycanareinvoIvedinang10geneSis．J．Ce11Sci．inpress

えないので，Cre−loxPシステムを用いた筋特異的ノック

3）HosokawaH，NinomiyaH，ImamuraM，KaidohTIFLOi−
WaraK．andMasakiT：RoleofMAGト1asalinkbetween

アウトのような新たな手段による検証が必要となる．一方，神経筋接合部においてmuscle−SpeCincproteinkinase（MuSK）と共存する蛋白質としてMAGI＿lc（MAGI−1のー56−

β−dystroglycanandβ−Cateninin the skeletalmuscle．

投稿中中枢神経系におけるdystrophinの機能解析並びに新世代のアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療に関する研究
内

誠●

寧即
■

英

田山

前宇

打好

●

洋

村野

木目

●

之二治

寿友修

●

馬田田

目

有内箕

研究協力者

野

的

端とrodのみの変異体では神経細胞の細胞質に均一に

dystrophinは骨格筋，心筋，平滑筋のみならず中枢神経においても大脳および小脳皮質に豊富に存在し，しかもシナプス後膜に局在している．中枢神経では発現が認められた．mini−dystrophinで認められた細胞膜に沿ったdot状の発現領域がシナプス後膜と一致す
るかPSD＿95 と二重染色を施行した結果，発現領域がdystrophinは筋組織とは違うpromoterにより制御されており中枢神経においては筋組織と異なる役割を担っている可能性があるが，現在のところその役割は不明
である．また，DMD患者の約30％にmental retardation

ほぼ一致することが確できた．

が認められるがdystrophinとの関連については現在のところ明らかではない．我々はAdenoviruS VeCtOrを使

glutamatereceptor（NMDARl，GluR2）が沈降することを確認した．

さらにdystrophinの抗体を用いた免疫沈降を行った
結果，β−dystroglycan，SyntrOphinとともにシナプス後膜に存在する PSD−95 や学習や長期記憶と関連する

いmini−dystrophinを中枢神経で発現させ組織学的検討
AとDystrophinの中枢神経における役割について解析を
行った．

hI咽e

巾巧lWhl

hI曙e

htnge

hiⅧe

日日日日日日日日日日日日日日日日日日日日日日‖′」l ll仙（427n134血小小畑Whin l日日日日日日日日日日rJ l6・3kbl22も
1

方法と結果

3

4

日1㌢

km）

kDa）

山河dlSI間）Nn l日日日日日日日日日日Ln t叫［6．3kb（2寄H

1．mini−dystrophincDNAおよびC未端からの欠失変異
体のcDNA（N末端のみのcDNA，N末端とrodのみのcDNA）（図1A）を導入したAdenoviruS VeCtOr作製
した．

kDa）

nSL l日日日日日日日日目口H

恥NH

4．7kb（167kDa）−周1・9kb（御kDa）

B

2．作製したウイルスを培養細胞に感染させ目的のウイ
1

2

3

4

5

ルスであることを免疫染色およびwestem blo任hg（図1B）を行い確認した．
3．作製したウイルスをMdx mouseの前脛骨筋に感染させそれぞれの局在を検討した．▲
4．作製したウイルスをMdx mouseの海馬に感染させそれぞれの局在を検討し97．−．．．．・．■■
4

66■■■−（図2），PSD−95の抗体と二重染色を行った．

図1

5．dystrophinがシナプス後膜においてどのような蛋白
A：futHengthdystrophin，mini−dystrophinおよび今回作製した
deletionmutantcDNAの構造
mini−dystrophinH：mini−dystrophinのC末端領域にHistidine
tagを導入したcDNA，DysLH：C末端領域とDdomainを欠損させたcDNA，DysNH：rOddomain以下を欠損させたcDNA
blackbox：N末端領域，0penbox：rOddomain，dottedbox：hinge
segment，thedashedline：Ddomainの一部，largeopenbox：C末端領域と結合しているか調べるためdystrophinの抗体を用いて免疫沈降を行った．（図3）
骨格筋においては，miniJystrophinは主に細胞膜に局在し，またN末端のみの変異体は細胞質，N末端とrodのみの変異体では細胞膜と細胞質両方に局在が認められた．

B：Westernblottingによる発現確認
Lanel：COntrOl，lane2：mini−dystrophin，lane3：mini−dystrophin
H，lane4：DysLH，lane5：DysNH
各々が予想された分子量の蛋白を発現していることを確認した。

中枢神経（海馬）においてはmini−dystrophinのみが細胞膜に沿ってdot状に発現し，N末端のみおよびN末●熊本大学医学部附属病院神経内科−57−

への局在にdystrophinのN末端領域，rOd鎖域，C末端
蘭域のどの額域が最も重要な役割を担っているか検討するためminiJystTOphin cDNAのC末端からdeletionさせたcDNAをAdenoviruS VeCtOrに導入しMdx mouseの中枢神経（海馬）に発現させ発現部位の比較検討を行った．
その結果，C末端領域を欠損させた欠失変異体ではシナプス後膜へ限局した発現を呈することなく細胞質に均一に発現することを確認した．最近，dystrophinの遠位部（C末端額域）がDMD患者のmental retardationと特に関連しているとの報告がある1）2）3）．今回，我々の実験結果は，dystmphinの遠位部の重要性を組織学的に示したものである．さらに，dystrophinの抗体を用いた免疫沈降を行った結果，PSD−95やglutamatereceptorが共
図2
contTOlmouseおよび作製したadenovirusvectorを感染させた
mdxmouseの海馬における蛍光免疫染色
1：COntrOlmouse，2：COntrOlmouse一次抗体（−），3：mdxTTlOuSe，4：rnini−dystrophin，5：DysLH，6：DysNHBar：20LLmcOntrOlrnouseとmini−dystrophinを発現させた場合のみ細胞膜に沿ったdot状の染色像が認められた。

沈することを確認した．この知見は，dystrophinが学習

PSD．f．

GluR2）の抗体を用いてdystrophinがこれらの蛋白と結合や長期記憶と何らかの関連性を有することを示唆するも
のである．
今後の展望
今後はさらにPSD−95やglutamatereceptor（NMDARl，

NoAb DysAb

しているか確認する必要がある．また，培養細胞（COS7，
PC12等）に今回作製した4種類AdenoviruS VeCtOrとDystrophin・＋Synapt．f NoAb DysAb

PSD−95およびglutamatereceptorを共発現させそれぞれの組織学的検討と免疫沈降を施行することにより中枢神経においてdystrophinがどの蛋白と結合しているか詳細に検討する予定である．併せて，Mdx mouse brainの

β一Dystroglycan

slice cultureに今回作製した4種類Adenovirus vectorを
Syntrophin→

PSD−95−

感染させ電気生理学的検討（LTP，LTD）を行う予定で
ある．
文

献

1）SyLvie Tu脆ry，Uwelenk，Roland G．Robert，Christine
Coubes，JacquesDemaille，andMireilleClaustres：Protein
TrunCationTest：AnalysisofTwoNovelPointMutationsat

NMDARl｛lthe CarboxyTerminus of the Human Dystrophin Gene
Associated With Mental Retardation Human Mutation6：
126−135，1995．

GluR22）Uwe Lenk，komrad Oexle，Thomas voit，Ulrike Ancker，｛

KarトAntonHellner，AstddspeerandChristophHubner：A
1

2

CyStein 3340 substitutionin the dystroglycan−binding3

domainofdystrophinassociatedwithDuchennemuscuIar

図3 dystrophin抗体を用いた免疫沈降
lanel：SymaptOSOmefraction，lane2：一次抗体（一），lane3：
一次抗体（＋）

dystrophy，mentalretardationandabsenceofERGb−WaVe．
HumMoIGen5（7）：973−975，1996．
3）NFelisari，GMartinelliBoneschi，FBardoni，ASironi，M考察Comi，GP Robotti，M Turconi，AC Lai，M Corrao，G
Bresolin：Loss of Dp140

dystrophinは，骨格筋以外に中枢神経のシナプス後膜

dystrophinisoform andにも豊富に存在することが分かっているがその機能はまintellectualimpalrmentinDuchennedystrophy．Neurology

だ不明である．我々は，まずdystrophinのシナプス後膜55（4）：559−64，2000．

ー58−

Mdxマウスの骨格筋浸潤細胞のflowcytometry
栗 原 照 幸●

研究協力者 藤 岡 俊 樹● 岸

目

雅

彦●

根

本

博●

的

Dystrophin欠損から骨格筋崩壊に至る過程は未だ不明
確である．Mdxマウス1，2骨格筋内にみられる浸潤細胞の種類を，nOWCytOmetry岬ACS）を応用して分析した・
方■rdT義虚CⅨ汚◆□rdT儀烏CD25・
8αβT義塾CD25◆
暮αβT｛胞CD25・法

生後4週のmdxマウスの骨格筋から，濃度勾配法により単核細胞分画を分離し，FACSCalibur（3カラー）で解析した．同時に採取した末梢血と牌を対照とした・
結果

骨格筋内からは，他の部分とは異なった細胞群が分離された．その内容は，CDllb−CD3−CD25＋，CD3＋CD25＋，
CD3＋CD4−CD45RB＋，TCRβ−CD3＋CD25＋等であった・

CD25は活性化したTおよびBリンパ球に発現するとされ，またCD45RBはBリンパ球や細胞障害性リンパ球，ヘルパーT細胞の一部などに発現していると考えられている．したがって，mdxマウス骨格筋内には活性化したBリンパ球が特異的にみられる可能性がある．さらに，γ∂T細胞の比率が多く，その多くがCD25陽性
であり免疫学的に活性化していると考えられた．

図2 骨格筋内のT細胞の分類．
リンパ球の形態的特徴を有する細胞のなかでCD3が陽性である細胞を選び，T細胞受容体β鎖とCD25の発現について解析した．CD3＋TCRβ一細胞をγ6T細胞とみなした．骨格筋内では活性化マーカーCD25が陽性のT細胞が他の組織内よりも多い傾向があり，活性化したγ肝細胞も多い傾向がある．
考察

これらの結果から，mdxマウスの骨格筋障害の過程に免疫学的な機序が関与していることが明らかになった・
また，分離した骨格筋内浸潤細胞に対するFACS分析は有用であった．
研究の意義本研究で、dystrophinの欠損しているmdxマウスでは、活性化したγ∂T細胞が特異的に見られるので、骨口Ct侍◆q坤〇・日q〉3◆∝櫓◆格筋障害の機序に免疫が関与していると考えられ、筋ジストロフィーにおいても今後の展望として骨格筋内浸潤■CD3◆CD4◆
tC011b◆
釘○廿l椚

細胞の免疫学的検索及びその結果に基づく治療開発が必要と考える。
参考文献
1）BulneldG，SillerWG，WightPAL，etat：X＜hromosome−
1inkedmusculardystrophy（rrLdx）inthemouse・ProcNatl

図1骨格筋から分離した単核細胞分画内でのCD3陽性細胞とCDllb陽性細胞の割合．
濃度勾配法で分離した細胞の中で，CD45（teukocyte common
antigen；LCA）が陽性な細胞について，CD3とCDllbの発現を
nowcytometryにて検討した．更に，CD3陽性細胞群のなかでcD4とCD8陽性細胞，CD4CD8双方が陰性の細胞が占める割
り合いについて検討した結果とあわせて示す．CDllb陽性細胞が占める割合は骨格筋内において，他の組織よりも高い．骨格筋内のCD4CD8doublenegativeなT細胞が多いのも目立つ・

AcadSciUSA，81：1189−1192，1984．
2）KuriharaT，KishiM，SaitoM，etal‥Electricalmyotonia

and cataractin X−linked muscular dystrophy（mdx）
mouse．JNeuroISci99：83−92，1990．

＊東邦大学医学部第四内科−59−

ヒト染色体断片導入法による筋ジストロフィーモデルマウスの作出
花 岡 和 則●研究協力者 富 塚 一 磨… 黒 岩 義 己●● 押 村 光 雄●●●目

的

ヒト人工染色体HAC SC20に転座させ，それをES細胞に導入することを計画した．方法の概要を図2に示す．

Duchenne型（DMD）およびBecker型筋ジストロフィー（BMD）の原因迫伝子がX染色体短腕にあるジストロ
フィンとよばれる遺伝子であることが明らかにされてか

インターネット上で公開されている塩基配列をもとに，二つのベクターを作成した．一つはジストロフィン遺伝
子座（DMD）より約2Mbの位置にあると報告されていら筋ジストロフィーの研究は飛躍的に進展した．しかし，ジストもフィンの生理機能や筋ジストロフィーの発症期
序たは依然不明な点が多く，有効な治療法も全く開発されていないのが現状である．

るGK迫伝子座からテロメア側を相同組み換えにより切断するためのベクター（TelomeretrunCation vector）であり，もう一つはDMD近傍セントロメア側にある
TCTEIL遺伝子座で切断してHAC SC20に転座させるた．

ジストロフィン遺伝子は全長2．3MBにも及ぶ巨大な退伝子であり，このような巨大な遺伝子を通常の遺伝子

めに，TCTEIL遺伝子座にLoxP配列を挿入するための操作により細胞内に導入することは．ベクターに組み込む退伝子サイズの制約によりきわめて困難である．本研
究は，ミクロセル融合法を用いてヒト染色体の断片を細ベクターである．相同組み換えの効率を高めるために，
ミクロセル法でヒトX染色体断片を移入したトリDT40
細胞株を作成し，これらの細胞にベクターを作用させた．
現在までに得られた結果は以下の通り．

胞に直接導入するという新しい遺伝子導入法を応用して，
筋ジストロフィーモデル動物の作成や遺伝子治療のための基本技術の確立を目標とするものである．

ヒI加数

方法と結果

＠＿

1）ヒト染色体断片のマウスES細胞への移入およびキメ
ラマウスの作成

マウス琵幹蝉拇

ネオマイシン耐性遺伝子をhnskctしたヒト由来培養
細胞株HFL−1をマウスA9細胞と融合した後，コルセミ

ヒト染色体噺片を仔持した仔マウス

ドおよびサイトカラシンB処理によりミクロセル化し，マウスA9細胞に移入した．これらの細胞約300株をPCRでスクリーニングし，ヒトⅩ染色体断片を含む細胞株F17を得た．この細胞株を再度ミクロセル化し，

図1

ミクロセル融合法によるヒトX染色体断片のマウスへの導入
ジストロフィン遺伝子領域のみを含む
ヒト染色体断骨のマウス膵への導入

貯…仙叩l▼W桐山鵬
御iH七みAえを利用してl01pi付人するマウスES細胞株TT2−Fに移入し，通常の方法でキメラ

雑Crt

riJi＝山■■■■■

マウスを作成した（図1）．
未分化なES細胞では，ジストロフィン遺伝子を含む
ヒトⅩ染色体断片が安定に保持されていることが確認できたが，キメラマウスでは，これらの染色体は著しくCl10ノdyトIl▲Cl監慧笈

不安定であり発生の過程で多くは消失することが判明した・その原甲は不明であるが，Ⅹ染色体不活性化と関連していることが示唆された．

DT40／

○

r勾塾

▲hll・

（：■in●lk…■亡

MD由来

厳芽繍嵐

2）ジストロフィン遺伝子領域のと卜人工染色体HAC
SC20 への転座

図2

上記の結果に基づき，ジストロフィン遺伝子領域だけを，ヒトおよびマウ女の細胞で安定性が確認されている■鵬d汁H▲C

ジストロフィン迫伝子領域が転座した人工染色体の作成およびその応用

a）TelomeretTunCation■北里大学理学部分子発生学講座＝キリンビール医薬探索研■■●鳥取大学医学部

Telomere trunCationベクターを導入したDT40細胞株からビューロマイシン選択により約200株をクローニン−60−

グした．うち100株についてPCRでスクリーニングし，11株で相同組み換えが生じていることを確認した．さ考察
現在までの研究により，ヒトX染色体断片よりDMD

らにFISH解析により実際にテロメア側が切断されていることを染色体レベルで確認した（図3），b）LoxP配列の挿入
次いで，TCTEIL遺伝子座にLoxP配列を挿入するた領域だけを安定なヒト人工染色体HAC SC20に転座させる実験がほぼ完成した．今後，この染色体をES細胞めのベクターを導入した．ビューロマイシン選択で得た100株の細胞株についてPCRでスクリーニングし，30に導入し，キメラマウスを作成する予定である．HAC
SC20は，生殖系列への伝達も確認されているのでmdx
マウスと交配することによりジストロフィン遺伝子鎖域だけがと卜化されたマウスを作成することが可能になる．

株で相同組み換えが生じていることを確認した．FISH
解析でloxP配列が挿入されていることを染色体レベルで確認した（図3）．

同様な操作をDMD患者由来のⅩ染色体を用いて行うC）HACSC20を保持したDT40細胞株との細胞融合

ヒトジストロフィン遺伝子が転座したHAC SC20は，DMDの遺伝子治療のための染色体ベクターにもなり得b）で得られた，DMD遺伝子テロメア側でtrunCateされセントロメア側にLoxP配列が挿入されたX染色体を保持したDT40細胞株とHAC SC20を保持したDT40細胞株をPEG を用いて融合した．選択培養で得られたクローン100株をPCRでスクリーニングし，19株で両者の染色体が存在していることを確認した．現在，ジスト
ロフィン遺伝子嶺域のみを転座したHAC SC20をもつ細胞株を得るためにCre recombinase遺伝子を作用させている段階である．

ことにより究極的な疾患モデル系を構築できると期待される．

る．現在，DMD患者由来筋細胞に導入してその発現を解析するための準備を進めている．本研究で用いられた手法は，導入する遺伝子サイズに制限がなくゲノム自体を導入することができる点に特徴があり，今後，この方向の研究をさらに進めていきたいと考えている．
研究の意義
本研究は，最近の遺伝子操作技術，胚操作技術の発展
やゲノムプロジェクトの進展を背景に，ヒト染色体を直接操作してDMDの疾患モデルマウス作成や遺伝子治療
ベクターの開発に発展させる試みであり，その意義は大きいと考える．
文

献Tomizuka K，et al：Functional expression and germline
transmissionofahumanchromosomeffagmentin chimaeric
mice．NatGenet16：133−143，1997．

図3 染色体操作過程のFISHによる解析
DX1−1ミクロセル融合法によりヒト由来HFL−1細胞株から分離したX染色体断片 DXT30−7 TelomeretrunCation
によりDMD遺伝子座よりテロメア側を切断したX染色体
断片（末端のシグナルはビューロマイシン遺伝子の存在を示す）
DXL92−1さらにLoxP配列を相同組み換えにより挿入したX染色体断片（シグナルはLoxP配列の存在を示す）−61−

Ⅲ．福山型およびその他の筋ジストロフィー

福山型先天性筋ジストロフィー遺伝子産物の機能解析と表現型・遺伝子型の研究
戸 田 達 史●立

千博万賢道俊玉

林野藤山村島藤小鹿近仲今寺遠

研究協力者

浩●
亀●

佐々木 淳 子●
谷

里●●

妃代美●

武

…・

博…＝●

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人………●萬谷

佳寿代…●●…●
博●……●●●●

夫●●…●●●●●●

緒

福山型先天性筋ジストロフィーげCMD）は，重症の筋ジストロフィー病変に′ト多脳回を基本とする脳奇形および眼病変を伴う常染色体劣性遺伝疾患であり，我々はその原因遺伝子を9q31にマップし，ポジシヨナルク
ローニングにより同定してきた．
FCMD遺伝子の翻訳産物は461アミノ酸残基からなる推定分子量fukutin

53．7kDaのタンパク質であり，と命名された．大部分のFCMD患者では

mkutin遺伝子の3

結果と考察

言

非翻訳領域にレトロトランスポゾ

ン挿入変異が認められ，それ以外の変異を両アレルに持つ症例は知られておらず，この場合は胚致死となることが考えられる．
一方，muSCle−eye−brain病（サンタヴオリ嵐MEB）・
Walker−Warburg症候群は，先天性筋ジストロフイ￣にIl型滑脳症と，眼奇形を伴う常染色体劣性疾患であり，福山型もあわせてこれら3疾患は病変部位，症状とも非常に似ており類縁疾患とされており，同じメカニズムにより発症すると考えられている．また0−mannOSe型糖鎖
は噴乳類においては，脳，神経，骨格筋の限られた糖タンパク質でのみ認められており，その1つとしてα−dystroglycanがあり，その糖鎖により基底膜のlaminina2と結合していることがわかっている．
我々は，今回の3年間でこの班として以下のことを明（1）山kutin遺伝子の脳における発現の検討
脳病変への関与を検討するためにFCMD遺伝子の脳における発現を解析した．ノーザン解析においては，胎児組織，成人脳各部位で，同程度fCMD遺伝子の発現が確認された．RT−PCRでも，胎生早期から成人まで発現に大きな差は認められず，FCMD患者において発現の著明な低下が認められた．
insituhybridizationでは，胎児脳で神経前駆細胞を含む発生過程の全ての神経細胞とC如1−Retzius細胞に発現が見られ成人脳でも神経細胞に発現が継続して認められた．小脳のプルキンエ細胞，顆粒細胞にも発現していた・
glialimitans−基底膜複合体には発現を認めず・分子層・白質のグリア細胞にも発現を認めなかった．FCMD胎児
脳では，正常部では弱く発現する細胞を比較的連続的に認め，病変部では著明に発現が低下していた・
FCMD胎児，成人の病理所見の検討により，病変部でglialimhns−基底膜に破れがあり，この破れが病変の遠因であり，hbtinはアストロサイトが主な役割を担う基底膜に関与するのではないかと考えられている．しかしながら，今回のデータは発生過程から成人まで，神経細胞に発現が認められた．すなわち基底膜と接していない
ニューロンで発現が見られており，フクチン蛋白質が神経細胞の遁走自体に関与する可能性や，ニューロンで産生され分泌され基底膜の形成に関与する可能性もある．
（2）マウスFCMD遺伝子の単難とノックアウト
マウスの解析
マウスFcmd遺伝子は，翻訳領域において核酸レベル

らかにした．
大阪大学院医ゲノム機能分野
大塚製薬大塚GEN研究所●●●
東京医科歯科大学神経内科●●●●
産業技術総合研究所
●

■●

●●●●●

Univ．ofEssen●●●●●●
HacettepeChildren

sHospital

国立精神・神経センター神経研究所●●●●●●●●
大阪大学院医眼科・感覚機能形成学●●●●●●●●●
神戸大学院医第一解剖●●●●●●●●●●
キリンビール基盤技術研究所＝…＝事■ 東京都老人総合研究所積鎖生物学部門●●●●●■●

で87．5％，また，アミノ酸レベルでは89．6％と，ヒト
FCMD遺伝子に高い相同性を示した．
ジーンターゲッテイングにより作製されたFcmd遺伝
子のFlへテロ欠損マウスは，見かけ上は正常であり，また，繁殖可能であった．このFlへテロ欠損マウス間の交配により得られるF2離乳マウスのgenotypingを行ったと
ころ，ワイルドタイプマウス：ヘテロ欠損マウス：ホモ−65−

欠損マウス＝35：62：0であり，ホモ変異マウスが胎生

電位は消失していた．毛色によるキメラ率と各組織のキ
メラ率は測定できた範囲では比較的よく一致していた．

致死であることが明らかとなった．さらに，F2マウス胚のgenotypeを調べた結果．8．5日胚，9．5日払10．5日胚，13．5 日胚で，ワイルドタイプマウス胚：ヘテロ欠損マウ

餌kutinは骨格筋の機能維持や脳，眼の正常な発生に不可欠であることが示唆された．これらのキメラマウス

ス胚：ホモ欠損マウス胚が，それぞれ8：13：2，24：
34：2，2：7：0，14：27：0であった．

は，中枢神経系，眼および骨格筋の異常を併発する疾患
作CMD，muSCle−eye−brain病，Walker−Wa血rg症候群）の発症機構を解明し，さらには治療法を開発するためのモデルとして有用であると思われる．

Fcmd遺伝子のホモ欠損マウス（nullallele）は胎生
8．5以前に死亡することが明らかとなり，Fcmd遺伝子がマウスの胚発生に必須であることが示唆された．これ
らの事実は，ヒトFCMD遺伝子にノンセンス点変異をホモで持つ患者が，これまでのところ見つかっていない
疫学的事実と合致するものである．
（3）hkutinの機能についての検討
fukutinのアミノ酸配列，FCMD患者の脳・筋組織における病理像（基底膜の破れ，メロシンの染色性の低下）などから考えられる，hkutinの細胞外基質に結合する可能性を調べるため，タイプIVコラーゲン，フイ
ブロネクチン，メロシンを含むラミニン三種の各細胞外
基質タンパク質と，hkutinの全長および部分配列を発現させた組み換えタンパク質を用いてプロットオーバー
レイ法により結合の有無をみたが，fukutinはこれらのどの細胞外基質タンパク質とも結合しなかった．
Aravind らは，fukutinの配列に出芽酵母，線虫，およびいくつかの種のバクテリアに保存されたドメイン
G［TS］hhGhhxxxxhhxaxxDxDがあり，これら一連のタン
パク質hkudnタンパク質ファミリー）は細胞表面の糖鎖修飾に携わっていると考えられると報告した．患者
および正常コントロールのリンパ球を用いて構成タンバ
ク質の糖鎖修飾をDIGグリカン検出法を用いて調べた

図1hkutin欠損細胞キメラマウスの大脳皮質第V層ニューロンのHRPによる逆行性標識．
層構造が乱れ第V層ニューロンも正常の位置に存在しない．
大脳半球の癒合も認められる．

ところ，Triton X−100分画で高分子量側に患者で反応の薄くなっているバンドがみられた．正常コントロールと
FCMD患者とで糖鎖修飾の異なっているタンパク質があることが示唆された．

（5）MEB病原困遺伝子の同定とその意義
0−mannOSeにGIcNAcを付加する新規の糖転移酵素，
UDP−N嶋aCetylgIucosamine＝prOtein0−1inkedmannoseβ1，2−N−aCetylglucosaminyttranSferase（POMGnTl）の遺伝子をク
ローニングし，本遺伝子がMEB病の原因遺伝子である（4）hku伽欠損細胞キメラマウスの病態解析
成体における軋kudnの機能解明，ならびにFCMD病態モデルとしての利用を目的として，餌kutinホモ欠損
型ES細胞に由来するキメラマウスを作製した．

ことを同定した．
POMGnTlは660アミノ酸からなるⅡ型の膜タンパク質で，N−型糖鎖の生合成に関わる糖転移酵素β＿3＿D＿

hkutin欠損細胞の占める割合が高いことが毛色から予想されるキメラマウスでは，出生後の体重増加が小さく，一部の個体は離乳後に死亡した．生存したキメラマ

mannoside

β−1，2−N−aCety1glucosaminyltransfbraseI（GnT−I）と23．2％相同であった．poMGnTlをHEK293T細胞に発現させるとPOMGnT活性は約100倍増大し，一方ウスは筋力低下，運動失調様行動を呈した．骨格筋では
筋線経の大小不軌 問質の増大，壊死および再生像が観

GnT−Ⅰ活性は検出されなかった．本遺伝子はlp33づ4にマップされMEB病原因遺伝子の存在領域IcMの中に察され，免疫組織染色によりαdysけOglycan発現低下が認められた．大脳では左右半球の癒合，大脳皮質および海馬の構造異常が見られ，第V層ニューロンは皮質存在した．そこでMEB病患者において本遺伝子を解析したところ6例の症例で6種の変異を見出した．

深部から表層にかけて広く分布していた（図1）．小脳では小葉間ならびに小葉t下丘間の癒合，顆粒層の構築異常が認められた・脳表ラミニンの那Semblyも異常であった．眼では眼球の奇形的形成，角膜の混濁および水晶体との癒合，網膜剥離と層構造異常が認められ，網膜3例のsplicingdonorsite変異のホモ（2例：IVS17＋lG＞T，l
例：IVS17＋lG＞A），l例のミスセンス変異のホモ（1743G＞A，Ser550Asn），1例の1塩基欠矢によるフレー
ムシフト変異のホモ（1813delC），1例のミスセンス変異（1572C＞G，Pro493Arg）と1塩基欠失（1970delG）によるフ
レームシフト変異の複合へテロであった（図2）．変異ー66−

遺伝子産物の酵素活性は最も多く見られた変異を調べた

LamInindit一等認諾￠an（諾慧崇ニ｝拘瑚y脚 Dy呵htq

ところ著しく低下していた．α−dystroglycanはその0−
mannose型糖鎖により，基底膜のラミニンα2鎖と結合していることがわかっているが，本酵素のtargetとしてMEB骨格筋ではα−dystroglycanが選択的に欠損していた（図3）．以上より POMGnTl糖転移酵素遺伝子はMEB病の原因遺伝子であり，哺乳類の0−mannOSe型糖鎖が筋および神経で重要な働きを果たしていることが考えられる．また本遺伝子ではFCMDの原因のfukutin遺FCMO圏■■鵬鵠

伝子の3UTRの挿入変異のような特殊な変異ではなく単純な点突然変異が見られたことから，フィンランドに

図3 MEB骨格筋におけるα−dystroglycanの選択的欠損．
FCMDと同様の所見．本酵素の糖鎖修飾のtargetの1つとしてα−dystroglycanが考えられる．

限らず日本を含む世界各国にもMEB患者がいるはずであると考えられる．筋ジストロフィーの原因遺伝子として糖鎖転移酵素が同定され，実際に患者で変異が確認さl）Kondo−Iida E，Kobayashi K，Watanabe M，SasakiJ，

文

れたのは初めてのことになる．

献

KumagaiT，KoideH，SaitoK，OsawaM，NakamuraY，

MEB病の他に，最近myodystrophy mouseの原因がToda T：Novel mutations and genotype−phenotype

Largeというputativeな糖転移酵素であることが報告された．さらにFCMDの原因であるfukutinも糖鎖修飾に関

relationshipsinlO7

わる酵素と推測されており，またごく最近，ある型の先
天性筋ジストロフィーの原因がfhkutinと相同性のある
FKRP という糖鎖修飾酵素と考えられるタンパク質であGenet8：2303−2309，1999
2）SasakiJ，Ishikawa K，Kobayashi K，Kondo−Iida E，ることが報告された．これらすべての疾患においてα−Nakamura Y，Toda T：Neuronal expression of thedystroglycanになんらかの異常が見られている．以上より，
筋ジスやneuronalmigradondisorderの1つの発症メカニズムとして「糖鎖修飾の異常」を提唱した．酵素である
のでジストロフィンなどの純粋な構造蛋白と違って治療的アプローチも行いやすいのではないか，と考えられる．

families with Fukuyama−type

COngenital muscular dystrophy（FCMD）．Hum MoI

FukayamaM，MizusawaH，TakashimaS，SakakiharaY，

fukutingene．HumMoIGenet9：3083−3090，2000
3）Colombo R，Bignamini AA，Carobene A，SasakiJ，
TachikawaM，KobayashiK，TodaT：AgeandoriglnOf
the FCMD

3−untranSlated−reglOn retrOtranSpOSal

insertion mutation causing Fukuyama−type COngenital
muscuIardystrophyinJapanesepopulatiom HumGenet

完工請∴冠

lO7：559−567，2000
4）

Kobayashi K，SasakiJ，Kond0−Iida E，Fukuda Y，
Kinoshita M，Sunada Y，Nakamura Y，Toda T：

印加血YA pd的nlKO l岨uOntSA

Structural organization，COmplete genomic sequences，and mutational analyses of the Fukuyama−type℡℡M空mmme℡℡臥Q℡Q

mqmO℡Q

COngenitalmusculardystrophygene，fukutin．FEBSLett
Jは9：192−196，2001＝＝で＝よ去5）YoshidaA，KobayashiK，ManyaH，TaniguchiK，Kano
H，Mizuno M，Inazu T，Mitsuhashi H，Takahashi S，●Ⅳ17 −−伽11ト一

TakeuchiM，Herrmann R，Straub V，Talim B，VoitT，

塩等D岩忘

TopalogluH，TodaT，EndoT‥Musculardystrophyand

neuronal mlgration disorder caused by mutationsin anovelglycosyltranSftrase，POMGnTl．Dev Celll：717−
724，2001

彗澄㌍

脚，＝㌻廿c m誉鱒iii≡三戸＝i元

図2 MEB病患者におけるUDP−N−aCetylglucosamine：prOteim
0−1inkedmannoseβ1，2−N−aCetylglucosaminyltransftrase（POMGmTl）遺伝子の6種類の変異．
−67−

筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究と臨床への応用（1）福山型筋ジストロフィーの臨床と遺伝子変異の関連の検討（2）福山型筋ジストロフィーの中枢神経系病変の形成機序一神経病理学的検討
斎 藤 加代子●

ヂ

遺伝子検査を受けたFCMD患者のうち東京女子医科
大学小児科にて診察または主治医へのアンケート調査に回答があった117例において，以下の検討を行った．（lI
FCMD遺伝子検査：対象家系のDNAにてハプロタイプ
解析を行い，創始者変異のヘテロ接合を確認した例について，FCMD遺伝子の翻訳街域を直接塩基配列決定法
にて解析した．（2）遺伝子変異を認めた例において，①運動機能獲得および喪失年齢，②死亡年齢，③creatine
kinase（CK）値の経年的推移，④津守式発達検査，⑤眼所
見⑥けいれん，⑦MRI所見について検討した．

例中29例（64％），N群の7例中5例（71％）に見られ2群間の有意差はなかった．⑦MRI所見ではN群で刷脳回などの皮質形成障害の程度が重度であった．
考察

FCMDにおいて，創始者ハプロタイプをホモ接合性に示す例の臨床像は軽症または典型的であり，創始者ハプ
ロタイプを一方の染色体だけに示す例は重症であることを報告したり．本研究においては，FCMD症例の遺伝子変異と臨床の関連の解析を行った．F群はN群より臨床的に軽症であり，M5群はその中間的な臨床像であった．
M6群はN群と同レベルの重症度であった．M6群はmissense変異ではあるが，システインはS−S結合をもつ
重要なアミノ酸であること，N群では鮎htin蛋白が量的に少ないことが症状の重症化の理由として考えられる．

果（1）創始者変異（F群）は94例，eXOn3におけるC250T仏rg47Stopのnonsense変異（N群）は14例，exon5におけるA626G／His172Argのmissense変異（M5群）は1例・eXOn6におけるT859G／Cys250Glyのmissense変異（M6群）は2例に認めた．6例では翻訳領域に変異を兄いだせなかった．

従って，これらFCMDの臨床像と遺伝子変異の関連の解析の結果，fukutin蛋白の欠損の程度がFCMD患児の臨床像と予後を決める可能性を示唆した．

（2）運動機能獲得年齢は，F群では定頸獲得なし（レベル0）が94例中2例（2％）であったが，N群では14（2）福山型肪ジストロフィーの中枢神経系病変の形成機序一神経病理学的検討例中8例（57％），M6群では2例中1例であった．座■東京女子医科大学小児科＝東京女子医科大学第一病理●

言語面において有意に高い結果であった（p＜0．0001）．⑤
眼所見はF群ではN群より軽く，Walker−Warburg症候
群やMuscle−eye−brain病類似の所見はN群やM6群で認められた．⑥有熱性または無熱性けいれんはF群の45

法

F群（16例）12y7m士3y8m，N群（1例）7yOm，定頚好（1）福山型肪ジストロフィーの臨床と遺伝子変異の関連の検討

位獲得（レベル2）年齢はN群で2ylOm±ly5mであり，F群lylm±7mより有意に遅かったb＜0．0001）．M5群の1例ではlyOm，M6群の1例でly3mであった．N
群ではレベル3以上を獲得した例はなかった．独歩可能
例は16例であり，全例F群であった．座位喪失年齢は

規有槙

喪失年齢はF群14y8m±4y5m，N群（1例）11y3mであった・②死亡年齢はF群（6例）15y5m±9y2m，N群（2例）ly4m±2m，M6群（1例）2yllmであった．③
運動機能障害の進展に並行してCK値は推移しているが，変異との関係は兄いだせなかった．④発達テストではF
群ではN群よりDq，探索・操作，社会性，生活・習慣，

おける神経病理学的検討を行った．

結

LrL
﹂﹂﹁

ヂ
代
紀

林

●

的

福山型筋ジストロフィー（FCMD）の臨床病態の解明のために，その臨床型と遺伝子型の関連の解析，剖検例に

方

河

谷

小

●

（2）研究協力者

日

池

●

木

里子子

恵真智

藤澤本

近大山

（1）研究協力者

FCMDの中枢神経系病変として，胎児例ではglia
limitans（GL）の部分的な欠損が観察される．検索した症例においては，胎齢17−18週までの大脳の構築はほぼ正常で，一部に微小なGLの欠損がみられるにとどまり，神経細胞の遁走そのものは大きくは障害されていない可能性が考えられる2）．小児，成人例では大脳，小脳の小多脳回を主体とした病変がみられるが，胎児〜成人例いずれの時期においても，脳病変は表層部分に優位で，深一68−

部構造は比較的よく保たれている．脊髄病変は通常軽微であるが，重症例ではGLの欠損を伴う場合がある．こ
れらの所見から，GLの破綻がFCMD中枢神経系病変の形成に大きく関与していると考えられる．
FCMD胎児〜成人例のGLでは，電子頗微鏡的に基底膜やアストロサイト足突起の細胞膜の構造異常が認めら

今後の展望
FCMDにおいて遺伝子変異と臨床像の検討の結果，
mkutin蛋白の塁が臨床像を決める可能性が考えられた．
分子遺伝学，生化学レベルにおける解析によって治療への応用の可能性が開かれると考えられる．一方，FCMDの中枢神経病変の形成機序として，Fukutin蛋白の生合れ3㌧免疫組織化学的に基底膜関連蛋白のmerosinやβ−成障害が，アストロサイトの変化をどのように引き起dy如Oglycanの二次的な発現の低下が観察された4）・同様の異常は骨格筋においても認められている．また，小児，
成人例のアストロサイトにはGFAP染色で細胞突起に形態変化がみられることが多く，酸化ストレス終末産物のこすのか解析を発展させることが必要である．

carboxymethyllysineの蓄積等も認められた・また・GFAPとfukutin蛋白の二重染色でアストロサイトでのfukutinの発現が確認された．これらの所見から基底膜の異常がGLの破綻の原因となり，その背景にアストロサイトの関与が考えられる．Fubtin蛋白は基底膜構成に関連した機能を有していると思われるが，未然な神経細胞等での発現からは，他の機能を有する可能性も考えられる．
FCMD脳病変は，分布や程度に症例内でも差異がみられる等，多様である．この多様性の少なくとも一部は
hkutinの発現との関連で説明可能と思われる．例として，FCMD小児，成人例の大脳では表面に強いgliosis
を伴うが，コントロール小児，成人例の大脳ではGLを形成するⅠ層のアストロサイトに餌kutinの発現がみられることから，発現低下を補うための代償性のgliosisと考えられる．一方，コントロール小児，成人の小脳で文

献

1）SaitoK，OsawaM，WangZhi−ping，tkeyaK，Fukuyama
Y，Kond0−1ida E，Toda T，Ohashi H，Kurosawa K，WakaiS，KanekoK：Haplotype−PhenotypeCOrrelation
inFukuyamacongenitalmusculardystrophy・AmJMed
Genet92：184−190，2000．
2）YamamotoT，ToyodaC，KobayashiM，KondoE，Saito
K，OsawaM：Pia1−glialbarrierabnomlalitiesinfbtuseswith Fukuyama congenitalmuscular dystrophy・Brain
Dev19：3542，1997
3）YamamotoT，ShibataN，KanazawaM，KobayashiM，
Komori T，Kondo E，Saito K，Osawa M：Early
ultrastruCturalchangesinthecentralnervoussystemin
Fukuyama congenital muscular dystrophy・UltrastruCt
Patho121：355−360，1997

4）YamamotoT，ShibataN，KanazawaM，KobayashiM，
Komod T，Tkeya K，Kondo E，Saito K，Osawa M：

はGLを形成するBergmanngliaにfukutinの発現はなく，FCMD例でも小脳においては小児，成人期には十分なGLが形成されると考えられる．しかしながら，単純には説明のつかない病変もみられ 脳病変の解明には発達過程での種々の要因も考慮する必要があると考えられる．

Localization oflaminin subunitsin the centralnervous
systeminFukuyamacongenitalmusculardystrophy：an

immunohistochemicalinvestigation・Acta Neuropath01
94：173−179，1997−69−

Ullrich病の臨床病理学的検討
南成 祐＊t＊＊

研究協力者 石 川 暗 君＊ 村 山 恵 子…館 澤
杉

日

江

和

好＊

西

野

的

Ullrich病は，生下時からの，近位関節の拘縮と遠位関節の過伸展を主徴とする疾患である．しかし，その疾患概念

一

ご寧

埜

中

征

宥・
哉＊・韓＊

子顕微鏡による観察では基底膜そのものには異常を認めなかった．

CouagenⅥ

を疑う研究者も存在した・最近・その原因がcollagenVI遺伝子の劣性変異であることが報告されたl・2）．そこで，当施設でU11dch病と診断されていた9症例を対象として，
COllagen VIの免疫組織学的検討および遺伝子変異解析を行うとともに・臨床症状および筋病理所見の検討を行った．
方法と結果
1・免疫組織化学および電子顕微鏡観察
抗collagenV托ノクローナル抗体を用いて発色法による染色を行った・その結果，正常には筋鞘膜と問質にCOllagenVIが存在していた．UIJrich病の9症例のうち，1例
でco11agenVIの完全欠損，8例に筋鞘膜における染色性の低下（部分欠損）を認めた（図1）．また，基底膜コラーゲ
ンであるcollagenIVのポリクローナル抗体との蛍光二重染色を行ったところ・正常には筋鞘膜にcollagenIVとVIが共局在するのに対し，Ulldch病の部分欠損例では，
COllagenIVは筋鞘膜に存在するものの，COIlagenVIは筋鞘膜に局在せず，むしろ問質にぼろ状の染色性を認めた．電図1抗collagenVl抗体による免疫組織化学染色
正常筋（左上）では筋鞘膜と問質に繊維状の染色性を認める．
uldch病の完全欠損例（左下）では全く染色性が認められない．部
分欠損例（右下）では筋鞘膜での染色性が低下し，むしろ問質にぼろ状の染色性が認められる・福山型先天性筋ジストロフィー（右上）ではuldch病と同様に筋複雑の円形化が認められるが，COllagenVIの染色性は筋鞘膜・問質とも保たれており，非常に対照的である．

COL6A2genemutation
incompletecolIagenCollagenⅥde爪ciency
Exo14
b X Ol1 1年
e G ▲
（
、

亡
■
JT㌻
■
■

E xon 15

IntroI114

Exon15lIltr01123

Exom24

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、
＿ヽ
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6 ⊂G ▲ 盲で亡』

二へ■亡■て▲■G

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＿′
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＿
＼
〈
＿
∠
さ
E xom 14

E xom 15

C→G／C

＊国立精神 神経センター武蔵病院＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊心身障害児総合医療療育センター

図2

完全欠損例におけるCOL6A2遺伝子変異−70−

2．遺伝子変異解析

膜への局在異常？）が存在し，むしろ症例数が多いことを明らかにしたことである．両者の間で，臨床症状や筋Collagen VI分子は3つのサブユニットからなるへテロ
トリマーで，COL6Al，COL6A2，COL6A3によりコードされている．このうち，これまでに遺伝子変異が報告さ病理所見に目立った違いを認めるわけではなかった．部
分欠損例についてはまだ確実に病因といえる遺伝子変異れているCOL6A2についてRTIPCR増幅し，directsequence
解析を行った．異常を認めた場合，ゲノムDNAの解析も行った．その結果，完全欠損例で，2箇所のスプライシンは見つかっていないが，残るCOL6AlとCOL6A3の検索をさらに進める必要がある．

グ異常（intron14の挿入と，eXOn24のスキップ）を認めた（図2）．部分欠損例については，今のところ変異と断定できる変化は見つかっていない．

今後の展望
CollagenVIは多くの組織の問質に存在する太さ3nmの微細線経の本体であると言われている．骨格筋組織にお3．臨床症状および筋病理
全症例に生下時からの障害を認め，近位関節の拘絹とける機能は明らかではない．しかし，COllagenIVとの二重染色より，筋基底膜と問質を結合する重要な因子であ

遠位関節の過伸展を認めた．知能は正常で，高率に踵骨の突出，高口蓋，斜頚を認めた．cK値は正常〜軽微上昇であった．
筋病理学的にはご 大小不同と線維化を全ての症例に認ることが示唆され，今後この視点から研究を進めること
でUllrich病の特異な病態の発生機序が，解明されるものと期待される．

め，壊死・再生線経を認める筋ジストロフィー様変化を7例に，残る2例には再生線維のみを伴うミオパチ一様変化を認めた．また，typelnberpredominanceを5例に，nber
typeの分布異常を3例に認めた．しかし，疾患特異的な所
見は存在しなかった．

文献1）camachoVane甲SO・BertiniE・ZhangRZ，PetriniS・
MinosseC，SabatellittGiustiB，ChuML，PepeG：U11−
richscleroatonicmusculardystrophyiscausedbyreces−
Sive mutationsincollagen typeVL ProcNatlAcadSci
USA98：7516−21，2001．

考察
文献的にも，また我々の完全欠損例においても，

2）HiguchiI，ShiraishiTIHashiguchiTISueharaM，Niiyama
T Nakagawa M，Arimura K，Maruyama T，Osame M：

collagen VIの遺伝子異常が見つかったことから，Ullrich病という疾患単位が存在することは確実である．本研究の最も重要な成果は，・完全欠損以外に，部分欠損（基底FrameshiftmutationinthecollagenVIgenecausesUl1−
richlsdisease．AnnNeuro150：261−5，2001．

一71−

眼咽頭筋ジストロフィー及び類縁疾患の遺伝子型／表現型の研究
一抗PABP2抗体による免疫組織化学的検討を加えて−
内
研究協力者

目

野

宇 山 英一郎書後 藤 加奈子●◆

誠●

日

野

洋

健●

荒

畑

喜

一■■

前

田

寧●

討した41．

的眼咽頭筋ジストロフィー（OCulopharyngealmuscular

その結果，1）眼咽頭筋ジストロフィー患者では，用いた抗PABP2抗体に対して，5例7カ所のすべての骨格筋
筋鞘核内に，平均2％の頻度で陽性に染色される蓄積物を認めた（図1）．モノクローナル抗emedn抗体に対して

dystrophy：OPMD）は，（1沖0歳以降の発症，（2）主症状は眼瞼
下垂と囁下障害，（3）外径8．5nmの骨格筋筋鞘核内封入体（ITFI），（4）poly（A）−bindingprotein2（PABP2）を原因遺伝子とする常染色体優性の遺伝性筋疾患である1）．発病者の遺伝子型は，（GCG）6／（GCG）8−13であり，French−CanadianとBukharaJewsでは（GCG）9の創始者効果を認める．私共はこれまでに，本邦にもOPMDの確実な家系が複数存在
し，欧米白人家系と異なり創始者効果は認めないことをは，抗PABP2陽性の筋線維核を含め，正常な染色性を呈した・核以外の細胞質，筋膜，血管内皮細目軌結合組織など筋鞘核以外はすべて陰性であった．2）予想に反して，正常対照3例および疾患対照14例の筋組織では，
全例筋鞘核内・核外ともにすべて抗PABP2抗体に対し，陰性であった．3）骨格筋を対象にイムノブロットを施行報告した2）．また，常染色体劣性遺伝性の眼咽頭遠位型ミオパチー（autosomaI recessive oculopharyngodistal
myopathy：AR−OPDM）では電顕的にITFIは陰性であることを初めて証明し，OPMDとは病因が異なる可能性を指摘した3）．

したが眼咽頭筋ジストロフィー患者，疾患対照，正常対照のいずれにおいても，陰性であった（表1）4）．

今回は，OPMDの病理指標であるITFIと変異PABP2との関連性を明らかにするため，まず抗PABP2抗体を作製し，OPMD及び類縁疾患の免疫組織化学的診断への有用性を検討した．さらにその抗体を用い，OPMD確定
例だけでなく，知見が極めて乏しい類縁疾患の病態・成因解明のため，OPMDに類似した表現型の家系例と孤発例，および新たなAR−OPDM家系例の表現型／遺伝子型についても検討した．
方法と結果
ll］抗PABP2抗体の作製と免疫組織化学的検討：
上記診断基準（1）−（3）を満たし，PABP2exonlの（GCG）n
リピートの異常伸長を同定した日本人OPMD患者5例，封入体筋炎，筋緊張性ジストロフィーなどのOPMD以外の神経筋疾患14例，及び正常対照3例の凍結筋切片を用いた．ヒトPABP2

cDNAをもとに正常C端部近図1
Cryosections

were

doubleimmunoreactedfor

anti＿PABP2rabbit

antiserum（greenFITC）andanti−emerinrnonoclonalantibody（redrhodamin）・Emerin was used as a speci鮎markerfor theinner
nuclear membrane（B，E，H）・Note the clearly positive green

傍の22アミノ酸（TNYNSSRSRFYSGFNSRPRGR）よりな
るペプチドを合成し，そのポリクローナル抗体をNew
Zealand white rabbitを用いて作成した．pABP2融合蛋白

OfpatientswithgenetlCallycon氏rmedOPMD（A，C，G．［）．（C）and（l）

作成には，GST発現ベクターPGEX−6Pを用いた．また，コントロールとして抗eme血抗体を用いた二重染色をOrOtherneuromusculardiseases・（F）isadoubleexposureof（D）and（E）・CoarseyellowishgranulesinA，Dand Gareautonuorescent

施行し，骨格筋を対象にイムノブロット法についても検＊熊本大学医学部附属病院神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

immunostainingofintranuclearaggregates（arrows）inthemyonuclei
aredoubleexposuresof（A，B）and（G，H），reSpeCtively．Incontrast，
therewasnoimmunostainingofmyonucleiforPABP2inIBM（D，F）

materialsinmuscle・Pre−absorpbonoftheprimaryantiserumwith
Synthetic peptide or fusion protein fbr PABP2 abolished theimmunoreaction・and preimmune rabbit serum Showed negative
Staining（datanotshown）．
Bar＝40mm（A−F），101▲m（G−Ⅰ）．

ー72−表2 日本における眼咽頭筋ジストロフィーの表現型／
遺伝型の検討表1眼咽頭筋ジストロフィーと他の神経筋疾患における抗PABP2抗体による免疫組織化学的検討
CIiniCalOPMD（Paden11）

紹

F AD

（m日

PABPヱ

加tll吊
Sはrnl−hyUid

Disulmy叩山ywim
AR−OPDM
DuchenrleMD
Beek亡−htD
Fuci1−5CaP】unhumCral
Em叩−DrCiruぉMD

NllrmJ cII山rいIs

筋力低下

CK

抗PABP2染色

（∝G膵

東京

別

男

十十（76）＋◆（7日

tGCG）9大分揖男◆＋＋（甜）＋十十14R） 四肢近位 切は四肢近位 相lGCG）り宮城錯

女◆十（55）

十（57）

∝苗川

静岡

5Ⅰ

女

十十（胡1

十十日（け 四肢近位 215

4〜l 男 ◆十（45）＋＋十（朝） 四肢近位 お目5女十十（59） 上肢近位 69

∝mH

熊本

佗

bic叩S
hic印S
b血堅
quad血叩S◆◆＋（52）

四肢近位IM別i 女 十十十（48）

十ぺ55） 上肢近位 約

熊本

61

女

十十十頼り

十可42）

大分

55

女

十十◆（44）十十（47） 上肢近位 乃

hir叩Squ山ric叩S

臥限咽頭筋ジストロフィー械い例

bic叩S（GCG沌 熊本 6

四肢近位4日六

家系例（両親は非血繰）

hic叩i

男 ＋＋＋145I■ ＋十十I55） 近位4−51（HtGCG沌 熊本 65 女 十十十（4よ）■ ＋可抑） 近位4−51日

hiぐ叩S
hiCCPS孤宍例（両親は非血持）

biぐ叩S（GCG）6熊本

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p血朕祝mius（GCGlも熊本：51女7tI

男（GCG沌 熊本 仰 女

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（GCG伸

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長崎

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男

＋＋（151●◆（49）◆可55）●◆＋（58）±（刃）（GCG16 東京 74 女 十十十（叫●JSlrLに∩ビmius

◆（651

＋＋HJl

＋十川I
＋可63）

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Hyl）lhylnidhm

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5
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35

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■ 掛5 5
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16cc）一 hic叩S

C IGCG）．

年齢

検N亡m山in亡my叩止y（GCG）1． aSmだ1−cmu5

︒慧

MELAS

Cdc叩h叩ngCal（GCG）．．bi叩S本柁

ん取咽頭崩ジストロフィー■

My仙−nkdym甲hy

A︒AD
︒悪
A芸慧器A

OPMDth11cm14）
OPMD（Pallent5）

FFMMMMMMMMMMFMMFM∵FFMF

OPMD（Pa血n13I

17mm∵UM二朝川 7
〃卸
川4
山5
1佗
27
5祁
1種山1川
R
VMD

OPMD（Pauen12I

遺伝子型

eXnrCSSIいn＋・・禁㌻誓孟Ag亡鮎x Mt血扉 Mula血n Mu∝khh亡rll∬灯EinPん飢円け⁝T．こ∵

diaEnOSis・眼瞼下垂に加えて明らかな外眼筋麻聾を認めた例

川H

Nuckari−nmunいre∝liv■tylnmuSelenkrs岬・Si山′eWilhI呵uCnCyW汀h十十十：2・5・l・絹；十十，l．5−（一．5腎：◆．dl・5％：−．n亡giltiYC・OPMD＝LCulophaTYngCatmuSeuhTdystTOPhy・AD：auLOSOm山考

dllminanLAR：川IllSnmユtr亡ぐ亡S5iv亡．XR：X−linkedr∝亡5Sive．RV：dmmdl・aCul−kOPDM：
tCulいPhuryngLJistAl ny叩aLhy，MD＝muSCular dyslr叩hy・MELAS：miLot＝hL，ndrjJ］
即叩h山my叩athy，laclicacidnSis●ands加k亡−likc叩iSl血S・●5日山pユneSCCmLmlindivuukbd（GCGIJIGCG）．

［2】 眼咽頭筋ジストロフィー及び類縁疾患の表現型／
遺伝子型の検討：
上記診断基準（1）イ3）を満たし，（GCG）nの異常伸長を同定したOPMD確定7家系45例，（1）（2）を満たすOPMD
疑い5家系7例，及び常染色体劣性のAR−OPDM2家系
4例について家系調査，診察，採血，筋電図，筋生検，筋CT，流体力学的検査，VTR咽頭食道造影，誤喋シンチ，
PABP2解析，及び抗PABP2抗体の免疫組織化学染色を可能な限り施行した．
その結果，

察

OPMDの原因遺伝子であるPABP2は，mRNA前駆体
3，端修飾反応に関わる核内因子の1つであり，遊離3L
OH末端のpoly（A）付加反応を刺激し，Poly（A）尾部を伸長させることでmRNAの安定性に関与すると推定されている．各組織にユビキタスに発現しているが，mRNAは骨格筋において特に豊富である．ヒトPABP2は6002
bpで，7つのexonから構成され，306アミノ酸からなる蛋白をコードしている．正常なアリルでは，N端側1285
番〜1292番目にGCGの3塩基配列（アラニンをコード）
が6回連続しているが，OPMD患者では，全例これがヘテロに8〜13回伸長している．すなわち，発病者の遺伝
子型は（GCG）6／（GCG）8〜13となるが，これまで表現型／
遺伝子型の検討は不十分であった．

1）OPMDの（GCG）nは，n＝8：1家系，n＝9：2家系，n＝10：
1家系，n＝11：3家系で，うちn＝9のl家系は孤発例であった．リピート数と重症度との相関は，n＝9−11間では

今回私共が検討したOPMDの7家系の結果に，他の施設で検討された3家系を加えて表現型／遺伝型を検討

明らかではなかった．全例外眼筋麻痔は軽微で，遠位筋優位の筋力低下は認めなかった．

すると，日本人10家系のうち，（GCG）リピート数が8回では晩発・軽症例であり，13回では四肢遠位筋まで侵さ

2）OPMD疑い7例中N家系2同胞例は，臨床的にはOPMDに酷似していたが，PABP2変異はなく，抗PABP2抗体の染色性も陰性で，電顕上ITFIも認めな
かった．その他の5 例はいずれも PABP2 変異／抗れる重症例であったが，9〜11回ではリピート数と重症度の相関は明らかではなかった．本邦で最初に同定された熊本と静岡の家系では，初発症状と血清CKの相違か

PABP2抗体染色は陰性であり，全例孤発例であった．

ら異なる遺伝子型を想定したが，実際各々11回と10回であり，ハプロタイプも全く異なっていた．しかし，他

3）常染色体劣性のAR−OPDMの2家系はいずれも抗PABP2抗体染色は陰性で，うち1家系はPABP2変異
も陰性であった．

の家系では必ずしも同様ではなく，（GCG）リピートが9〜11回の家系間で初発症状と血清CKの相違から遺伝

4）筋生検上，全例ミトコンドリア病を示唆する所見は認めなかった（表2）．

OPMDの7家系45例には，明らかな外眼筋麻痺を呈した例はなかったのに対し，OPMD様の表現型を呈するもPABP2変異がなかった7例では，5例に中等度〜高度の子型を想定するのは困難と思われる．今回検討した−73−

外眼筋麻痺を認めたことから，限瞼下垂が高度な割に外性の部分が蛋白のfoldingによって通常内側に包まれた眼筋麻痺は目立たない点が，OPMDの臨床診断の鑑別点になると思われた．

形になっている（推定）のが，変異蛋白の場合は，それがくずれるので染色性がでてくるという可能性などが想定

また，孤発例ではPABP2変異は認めなかった．今回のされる．しかし，恐らく今回の合成ペプチドが偶然にも，メチル化を受けるアルギニンが集中するPABP2のC端検討で特に注目されるのは， OPMDに表現型が酷似した同胞例である∴遺伝形式は，常染色体劣性の可能性が側のものであったことが主要な原因と思われる．本抗体

高いが，常染色体優性も完全には否定できない．この家
系例のように，OPMDと表現型が酷似するも，PABP2変
異と外径8．5mmの骨格筋筋鞘核内封入体を欠く家系例

はその分，OPMDの診断に有用性を十分発揮している．

が存在することが初めて立証された．また，AR−OPDMの2家系では，PABP2変異や抗PABP2抗体に染色され次年度以降は，OPMDのモデル動物を作製し，本症の発症機序に係わるPABP2以外の修飾遺伝子を検索する

る核はないことが初めて証明された．このことから，AR−
OPDMはOPMD と異なる病因を有する別の疾患であることが示唆された．

明し，有効な治療法の開発を目指したい．

今後の展望と同時に，筋細胞死の機序と障害筋の選択性の原因を解

さらに今回，私共はOPMDに特異的な核内封入体と文

献

変異PABP2の関連性を想定し，メチル化を受けるアル
ギニンが集中するPABP2のC端側271番〜291番目のアミノ酸から合成したペプチドに対する抗PABP2ポリ

1）BraisB，BouchardJ−P，XieY−G，etal：Shortexpansions

クローナル抗体を作製し，免疫組織化学的検討を試みた．
その結果，OPMD患者の骨格筋筋線維核内のみに強陽性を示す異常蓄積物質が約2％存在することが明らかに

2）UyamaE，NohiraO，ChateauD，TokunagaM，UchinoM，なった．他の研究グループも別の抗体を用いて，核内封入体が構成蛋白としてPABP2を含有していることを証
明した5）．これで，OPMDに特異的な核内封入体（ITFl）は
変異PABP2が構成蛋白のlつであり，これが筋細胞死に深く関与していることが示唆される．ただ，今回作製した抗PABP2抗体は，融合蛋白の吸収試験でもその特異性は確実であり，骨格筋の核内に染色性陽性の正常なin the PABP2gene cause oculopharyngeal muscular
dystrophy．NatureGenet18：164−167，1998．
Okabe T，Ando M，Tome FMS：Oculopharyngeal
musculardystrophyin two unrelatedJapanese families．
Neurology46：773−778，1996．
3）Uyama E，Uchino M，Chateau D，Tome FMS：
Autosomal recessive oculopharyngodistal myopathyinlight of distal myopathy

withrimmed vacuoles andOCCulopharyngeal muscular dystrophy．Neuromusc
Disord8：119−125，1998．
4）Uyama E，Tsukahara T，Goto K，etal：Nuclear

PABP2蛋白が局在していると推定されたが，結果は陰性であった．その理由としては，1）正常筋核内PABP2蛋
白の濃度が極めて低いか，代謝回転が非常に早く，（GCG）nリピートの延長にコードされる変異蛋白では，

5）CaladoA，TomeFMS，BraisB，etal：Nuclearinclusions

正常型の蛋白の量が増えている可能性，2）今回偶然にも，
変異PABP2蛋白のみを認識する特異抗体ができてしPOly（A）binding protein2aggregates which sequester

まった可能性，3）正常PABP2蛋白の立体構造上，親水POly（A）RNA．HumMoIGenet9；2321−2328，2000．

accumulation of expanded PABP2

gene productin

OCulopharyngeal muscular dystrophy．Muscle Nerve
2000；23：1549−1554．

in oculopharyngeal muscular dystrophy consist of−74−

Rimmedvacuole型遠位型ミオパチーの臨床・分子遺伝学的研究
田 中 恵 子●
研究協力者

目

新 井 亜
池 内

希● 五十嵐
健● 辻

修 一◆
省 次暮

小

林

央●

erozygoteの形で異なるmutationが報告されている・

的

rimmedvacuole型遠位型ミオパチー（DMRV）は常染色Phenotype−genOtyPeCOrrelationについては今後の検討が体劣性遺伝性疾患で，筋細胞での多数のrimmed vacuole
形成と，特異な筋障害分布を特徴とする原因不明の疾患必要だが，typicalDMRVとMiddle EastemJewsのtypical
HIBMでは臨床経過がやや異なっている可能性が指摘でである．本症の診断法の確立およびrimmedvacuole形成を介する筋変性機序を解明し，その治療法を確立するため，最初のステップとして病因遺伝子を同定することを日的とし，これまでに私達はDMRVと診断した家系の連鎖解

きる．DMRV症例の発症年齢は15−40才（平均26才）で，前脛骨筋の筋力低下で気付かれる例が多く，発症からnon＿ambulantになるまでが平均12年であると報告されているが，Middle EasternJewsのtypical HIBMでは，
non＿ambulantになるまで経過がDMRVよりもやや緩徐で析の結果から，原因遺伝子の候補領域はD9S1868から
D9S1787の12．3cMに存在することを報告してきた1）．更に候補領域の絞り込みを行うため連鎖不均衡マッピングを行うとともに，候補街域内に存在する遺伝子について原あるとされている．Indiaのnon−Jewsに由来する症例では
mutationの部位もvariableであるとともにtypicalHlBMと比べるとかなり筋障害分布も広範であり，quaddcepsにも軽度のinvoIvementがあると報告されている．こういった因遺伝子である可能性を検討してきた2）．本年になり，
a11elic diseaseと考えられるhereditaryinclusion body

臨床像の差異を今後genotypeを検索することによって更に検討していく必要があると思われる．

myopathy（HIBM）の原因遺伝子として，UDP−N
acetylglucosamine 2−epimerasem−aCetylmannosamine kinase

DMRY【dtblゆ（GNE）geneが同定されたことから本邦DMRV症例の
GNEgeneにおける変異についても検索し，原因遺伝子としての可能性を検討した．これによりDMRVとHIBM

1

1

1Mtl

♂

〆♂

や〆〆♂

♂

の臨床遺伝学的特徴について考察し，創始者効果についても検討した．
M▲11

GYE

▼

7▼GTJ
▼

8サ511サ1

▼

▼

方法と結果
本症7家系を用い，GNEgeneの翻訳街域の直接塩基配列決定を行った．その結果，今回解析した家系ではHIBMで報告された変異は見られず，全ての家系においてGNE▲LJかユ41

1●JM■▲U5●事｝王国l DMRVlocusのphysicalmap

gene exonlOでvalineから1eucineへ置換する新たな変異（V572L）を認めた．連鎖不平衡について検討するため，

表

ハプロタイプ解析．ワク内はDMRV遺伝子とcosegregateするハプロタイプ．

GNEgene周辺に新たなmicrosatellitemarkerを作製し，ハ
プロタイプ解析を行ったところ，共通するハプロタイプ
を認め，強い創始者効果を認めた．（図1，表）

掴

igl∝
262

考

▲上川け11▲⊥158■】●察

5 〜3C A 12

D 9 5 は 78

27∝ ：
▲2 0

4
4

3
12

3
7

27 4m
5
3

l

さ34 C ▲ 1079 2G T 151）95 17 別

D 9S 187 4

4
4

＿
1
j

11
8

7
4

1

484

l

l 13

7

2

4

3

今回，近親婚を有す，日本人家系のDMRVではkinase

544

4

1 13

7

2

4

3

domainに共通する，新たなmissensemutation（V572L）を

75 1

4

3

1

7

2

4

3

1

見出した．一方，HIBM症例では原著の症例に代表されⅠ54 さるMiddleEastemJewsではkinasedomainにhomozygousな

2 180

missense mutationが報告されているが，異なるethnic

三相 lgroupsに由来すると思われる症例では，COpOund het−

−75−

9

4 l

1

2

9

4 1

1

11

7

2

4

3

9

4

三

品

；

三

巨 …∃

；

i…

；

4
4

12
3

7
2

4
4

1
1

3
二
I

9
リ

l叫輌…ey亡l山tMhMY肌bldl＊新潟大学脳研究所神経内科

1
1

4
4

1
1

2
2

1

今後の展望

発表論文

今後，より多数の家系についてGNEgeneの解析を行い，
本遺伝子変異が本症に共通な特異的なものであるかを確認する必要がある．さらに，本遺伝子の臓器発現パター
ンや細胞内局在を検討し，本遺伝子のノックアウト操作

1）IkeuchilこAsakaT；SaitoMetal：Genelocusfbrautosomalや変異遺伝子の培養細胞導入などにより，本遺伝子がコードする分子の細胞内機能を明らかにし，変異遺伝子が細胞に及ぼす影響を検討する．これによりDMRVの発症

recessivedistalmyopathywithrimmedvacuolesmapsto
Chromosome9．AnnNeuro141：432−437，1997．

2）AsakaT，IkeuchiK，OkinoSetal：Homozygosityand
linkage disequilibrium mapplng Of atosomal recessive
distalmyoapthy（Nonakadistalmyopathy）．JHumGenet；
inpress

機序およびrimmedvacuole形成を介する筋細胞傷害機序を明らかにしたい．

−76−

変異デスミンL385Pと相互作用するタンパク質の検索
田 中 恵 子●
研究協力者

目

大

川

聡…

菅

的

中間径フィラメントに属するデスミンの異常蓄積の見られるミオパチー（desmin−relatedmyopathy）のうちデスミンの遺伝子変異によって生じるものをデスミンミオパ
チーと呼ぶ（図1）．現在までエクソン3の欠失，ロッド
1Bの7アミノ酸欠失，9種のミスセンス変異が知られており，ミスセンス変異はロッドドメインのC端側に集中していることがわかっている．
私たちはデスミン遺伝子のdenovo変異（L385P）によるデスミンミオパテー患者を報告し，このデスミン変異による筋細胞傷害のメカニズムを明らかにすることを目的とした．そしてL385P変異デスミンは細胞内に凝集体を形成し細胞死を引き起こすか否か，細胞死にアポトー
シスが関与しているのか，デスミン凝集体を形成するにはデスミンのどの部分が重要か，凝集体が結合してその機能を阻害する可能性のある関連タンパクは何かなどを
検討した．

原

正

伯●■

豊

島

至…

維状の構造がわずかながら認められた．また，核内にも蛍光が認められた．正常型，変異型とも部分デスミンは筋線経の長軸方向に線維状の構造を形成し，一部の細胞ではZ板に集まり，横紋を呈した．変異部分デスミンは細胞質に凝集体を生じ，細胞死を引き起こした．テール
ドメインの有無は凝集体形成，凝集体の細胞内分布に影響を与えなかった．より短い部分変異デスミンで凝集体を形成した．
4）凝集体形成に関連するデスミン以外のタンパクを
Yeasトtwohybrid法を用いて検索した・ベイトベクターにはデスミンのロッド2後半部のみとロッド2後半部から尾部の変異型，正常型を組み込み，ヒト骨格筋ライブラリーをスクリーニングした．ロッド2のみの変異型で22個，正常型で19個，ロッド2から尾部の変異型で30個，正常型
で28個の陽性クローンを得た．まだすべてのクローンの同定は終えていないが，ロッド2変異型に特異的なのは
toroponinT3・Carbonicanhydrase・FHIIFH2domainproteinであった．ロッド2正常型，変異型に共通して，aCtinα，

方法と結果
1）22歳時下肢遠位筋の筋力低下，筋萎縮で発症し，23
歳時，完全房室ブロックでペースメーカー移植術を受けた患者生検筋の筋蛋白2次元電気泳動を行い，デスミンの著しい増加を認めた．生検筋からDNAを抽出し，デスミ
ン遺伝子を増幅し，直接塩基配列決定法で遺伝子変異を検索した．デスミン遺伝子のExon6にTからCへの
missense変異（L385P）を見出した．L385P変異は両親には認められず，血液型，血清型，DNA型を用いた親子鑑定の結果にもとづきdenovo変異と考えられた．

myomegalin類似タンパク，myOSin−bindingproteinCが同定された．ロッド2から尾部の変異型で同定を終えたタンパ
クの中で，正常型でも相互作用が確認されたものはいまのところない．ロッド2から尾部の正常型では，CryStallin
αBや最近デスミンとの相互作用が証明された
desmuslinも同定された．変異デスミンは様々な筋タンパ
クと相互作用することが兄いだされた．RFPラベル変異型デスミンロッド2から尾部とGFPラベルmyosin−binding
proteinCはCOS−7細胞内でC0−localizationを示した・（図3）2）cos−7細胞にgreennoresceinprotein（GFP）ラベルした部分デスミンを発現させると，正常型では細胞質にび
まん性に発現がみられたのに対して，変異型では細胞質に凝集体が形成され 核酸の濃縮，断片化を伴う細胞死が引き起こされた．（図2）3）長さの異なる正常と変異デスミンコンストラクト（全長，ヘッドからロッド2，ロッド1からテール，ロッド2
からテール，ロッド2のみ）を得，GFPとの融合蛋白を，MFM：myOnbr甘armyopalhy，A．EngeL，NEJM1竹，DRM：desminrdaledmyOpathyIDSM：deSmi几510ra酢myOpathyIDes鵬mopalhyI
Goehl，CurrOphNeurot1，，7

ウズラの心筋初代培養細胞に発現させ，細胞内分布を検討した．正常型デスミン，変異型デスミンとも全長を発現させたときには凝集体形成，細胞死は認められなかった．デスミンは細胞質にびまん性に発現し，その中に線

D亡Sminmyopalhy，DiIaka5elal．，NEJM2000
ⅠもM‥imduSionbodymyosil。爪印palhes，DMRV：disblmyopalhyⅥ・ilhrimmed
Vacuole，AskanaSe181．，lnぐlusionbdymyostii andmyopalhe51998

図1デスミンミオパテーの関連疾患の中での位置づけ＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊秋田大学医学部第一内科−77−

が本邦で最初である．その後も，心筋症の原因としてスクリーニングはされているが，骨格筋傷害での報告はな
い．
変異デスミンを強制発現させると，非筋細胞においてもアポトーシスを来す点から，デスミンミオパチーはア
ツセンプリ一障害が主因ではなく，変異デスミン凝集体
が細胞毒性を示し，細胞死を引き起こす凝集体病と考えられた．

図2 変異型デスミンによって引き起こされるCOS●7の細胞死

変異型デスミンも筋細胞内で線維状の構造を示し，横紋の形成が認められた．ヘッドドメインを欠く変異デス
ミンは凝集体を形成し，細胞死を生じたのに対して，ヘッドドメインを有する変異デスミンでは凝集体形成が起こらなかった・中間径フィラメントがどのような分解過程をとるのか不明だが，断片化した変異デスミンが蓄積して形成される凝集体が，細胞毒性を示す可能性が示唆された．
今後の展望または研究の意義

R2Tm・RFP

現在，デスミンのプロセッシングに関する検討，4）で得られた関連タンパクの機能解析をすすめている．変異
タンパクの蓄積・凝集に伴うアポトーシスは，ポリグル
タミン病，アルツハイマー病，／トキンソン病などのコ

my血n−bkdi一喝
pmlehC・GF暮〉

図3 変異型デスミンとミオシン結合プロテインCの二重発現
考察

デスミンミオパチーは優性遺伝性疾患で，20から30歳代に発症し・骨格筋傷害は下肢遠位に始まり大腿四頭筋も傷害される・心筋傷害はほぼ必発で，伝導ブロックによる突然死をきたし，後期では心筋症による心不全をき
たす・筋生検像はGomoh染色で青色細胞質内封入体（cytoplasmiC，SarCOPlasmiC，OrSpheroidbodies）とrimmed
VaCuOleを特徴とし・電顕ではelectrondenseでamorphousな凝集体がみられる．デスミンミオパテーの報告は本例

ー78−

ンホメーション病に共通する発症メカニズムの存在を示唆している・筋疾患におけるコンホメーション病としてデスミンミオパテーをとらえて検討することにより，他のコンホメーション病の病態解明，また治療法開発にも寄与することが期待される．
文

献Sugawara，M・etal‥Anoveldenovornutationinthedesmin

gene CauSeS desmin myopathy
Neurology55：986−990，2000．

with toxic aggregates・リソソーム異常を伴う筋疾患の病態解明
好ヂ

晴久

●

美

川山

●

石村

馬祐哉
●

中

●

和成征

江

●

杉南埜

●

美

香子枝

彩裕富

日

本橋松

山大植

研究協力者

表1見出されたLAMP−2遺伝子変異

的1．Danonらにより「酸性マルターゼが正常なリソソーム患者性糖原病」として報告された，肥大型心筋症，ミオパチ
一，精神遅滞を臨床的特徴とするDanon病の原因遺伝子とその分子病態を明らかにする．
2．Danon病と確定した例について，臨床・病理学的特徴

人樗

エクソン・

変異

mRNAへの影響

2塩基欠失●

フレーム・シフトイントロンt I］本人
2

E9b
日本人

3

口本人

4

イタリア人

16

g5c Eもスキッビング

E4
出

T440人

ナンセンス変異丁卯4AA

フレーム・シフト
ナンセンス変異5アフリカ系アメリカ人

E3

C別3G

を明らかにする．
3．Danon病と同じ病名で報告されている2例の乳児型「酸性マルターゼが正常なリソソーム性糖原病」がDanon病

6

日本人

t5

gl8

7

アフリカ系アメリカ人

15

8

アングロ・サクソン

15

9

日本人

と同じ疾患であるかどうかを検討する．

川

ギリシャ系

15／砧境界6塩基挿入

gla

6塩基挿入●

glA

6塩基挿入●

10塩基欠失I IO塩慕欠失l

EI Gt4欠失

フレーム・シフト

オーストラリア人

エクソン内の変異は大文字，イントロン内の変異は小文字で記した．エクソンの変異は．LAMP−2bcDNA内のヌクレオチドの位置で表している．イントロンの変異は，それぞれのイントロン内でのヌクレオチドの位置を表している．患者7は，Danonらが最初に報告した例．
E：エクソン．1：イントロン．
・第1097番目と1098番目のAAの欠失．
115の3・端における4塩基欠矢とE6の5，端における6塩基欠失．
§E6の5∵端の10塩基に相当する配列の欠失．
†患者6においてのみ確認．

方法と結果
1．Danon病は，従来よりX連鎖性遺伝が疑われているので，原著例を含む10家系を用いX染色体上のマーカーについて連鎖解析を行った．その候補領域の中で，1ysosome−aSSOCiatedmembraneprotein−2（LAMP−2）に注目し，全オープンリーディングフレームのシークエンスを行った．その結果，全ての発端者でLAMP−2遺伝子上に変異を兄い出した（表1）．エクソン6のエクソンスッキ
ビング変異の一例を除いて，すべてナンセンス変異また

表2はフレームシフト変異であった．これらの例では，リソ
ソーム膜貫通ドメインのコード配列を失っていた．興味深いことに，1例で変異はエクソン9bに存在していた．骨格筋のウェスタンプロットおよび免疫染色では，エクソ

遺伝学的に診断が確定したDanon病患者の臨床的特徴
患者芦【診断時年■（虔）
発症時期
乳児期
幼時期
10代

ンスッキビング変異の一例を含めて，LAMP−2はほぼ完全に欠損していた．エクソン9bに変異があった例では，ウェスタンプロットにて，LAMP−2aアイソフォームを反映すると思われる極めて薄いバンドを認めた．心筋を調べ得た一例においても，LAMP−2は完全に欠損していた．
2．Danon病と確定した13家系38人の患者（男性20人，女性18人）が対象．発端者は全例で筋生検が施行された．
全患者における筋病理学的所見，臨床症状，臨床検査所
見について検討を行った（表2）．Danon病の発端者は全例男性で，肥大型心筋症，ミオパチ一，知的遅滞が臨床症状の3主徴であった．血清クレアチニンキナーゼ値は全・国立精神・神経センター神経研究所−79−

女
38霊12（14人）

▲18人

4人
11人
5人

死亡l寺年■l（ヰ）死因
心不全

1916（7人）

40▲7（6人）

7／7（100％）

6／6（100％）

ミオパチー
肪力低下
易疲労性のみ18′20（90％）

6／18（33％）

16′20（80％）

6／18（33％）
0／18（0％）

心筋症
肥大型
拡張型
混合型

20／20（100％）
16／19（84％）

18′18（100％）2′19（11％）
1／19（5％）

5／7（71％）

知的遵l蕎

14／20（70％）

1′18（6％）

発達遅滞
肝農大
脾五大
足変形

例で上昇していた（平均1570IU∧）．知的遅滞は約70％に認めたのみが，あっても軽微であった．発端者の母親の大部分が心筋症を示した．発症年齢は，男性患者の多く

弔

20人
1717（20人）

2／20（10％）2′7（29％）3／8（38％）
5／14（3696）
1／13（8％）
3／8（38％）

高CK血症

18／18（100％）

血清CK伍（IU／t）

1574土790（n】・18）

心t回異常
肪t回：病原性変化

17／17（100％）9／9（1∝〉％）

脳波異常

2／7（29％）

母親の発症

1一事／20（70％）

5／8（63％）
10／10（100％）

6／18（33％）

が10代であるのに対し女性患者では成人期であった．死
亡患者の死因は全例心不全であった．肥大型心筋症に対する最も効果的な治療方法は心臓移植であった．筋病理学的には，筋線維内に多数の好塩基性小空胞を認め酸性
フオスフアターゼ活性が冗進し，空胞壁はアセチルコリ
ンエステラーゼや非特異的エステラーゼの組織化学で陽性に染まり，またジストロフィン，メロシン，サルコグ
リカンなど筋鞘膜特異的蛋白が存在していた．これらの空胞は電顕的には細胞質崩壊産物やグリコーゲンを含み
自己会食空胞であった．LAMP−2b欠損のみの1家系ではDanon病は発症するものの臨床症状はいずれも軽症であった．
3・【患者1】男児・生直後よりnoppyinfantで発達遅滞を認めた．軽度の心肥大．2ケ月時に筋生検を施行．2歳3ケ月時，肺炎にて死亡 骨格筋の酸性マルターゼ活性は正常であった．【患者2】男児．新生児期より筋緊張低下．
進行性の肥大型心筋症により，生後41日目に死亡．心，骨格筋，肝におけるグリコーゲンは増加していたが，酸性マルターゼ活性は正常であった．光顕ではH＆Eで患者
1，2ともに空胞を伴う筋線経を多数認めた．免疫染色を行ったところ，患者1，2ともにLAMP＿2は欠損していな
かった．LAMP−2遺伝子解析では，両例ともに変異は認めなかった．また，患者1では，筋線経の周囲に補体C5b＿9の沈着を認めた・電顕では・患者1でX−1inkedmyopathy
With excessive autophagy（XMEA）で報告されているのと同様の基底膜の層状化が見られた．

が兄いだされなかったことから，Danon病とは異なる疾患であると結論付けた．従って「酸性マルターゼが正常なリソソーム性糖原病」ではなく，乳児型自己貪食空胞性ミオパチー（infantileautophagicvacuolarmyopathy）と呼ばれるべきである．特に患者1では補体C5b−9の沈着，基底膜の層状化がみられることからDanon病よりもむし
ろXMEAに近いことが示唆された．
今後の展望
乳児型のように，Danon病類似の自己貪食空胞を有しながらDanon病ではない例が，今後さらに兄いだされると考えられる．今後は，自己会食空胞性ミオパテー（au10Phagicvacuolarmyopathy）という疾患概念でDan。n病，XMEA，乳児型自己貪食空胞性ミオパテーなどの疾患が整理されていくものと思われる（表3）．
表3 自己貪食空胞性ミオパテー
遺伝形式■ 原因遺伝子産物

栃原病Il型

AR Acidmaltase

Danon病XD L仙MP−2

過剰自己会食を伴うⅩ連鎖性ミオパチー

ⅩR

不明

AR？

不明

乳児型自己貪食空胞性ミオパチー
その他

不明

不明

■AR：常染色体劣性・XD：X染色体便性、XkX染色体劣性

研究の意義
従来原因不明であったDanon病が，リソソーム膜タン
パクLAMP・2の原発性欠損で起こることを明らかにし，考察

遺伝学的にDanon病との診断が確定した例における臨

1・全例において，nu11変異またはそれと同等と思われる
変異が兄いだされ蛋白レベルにおいてもLAMP＿2の欠損が兄いだされたことは，原発性のLAMP＿2欠損症によ著で用いられたのと同じ病名で報告されてきた乳児例が，りDanon病を発症することを強く示唆している．同時期の我々の研究結果から，自己貪食空胞の出現を主徴とすに・ドイツ・ゲッティンゲン大学のSarligらのグループにより，LAMP−2ノックアウトマウスが作製され心筋のる一連の遺伝性筋疾患が存在することが明らかとなり，肥大に加えて，骨格筋・心筋を含む組織に多数の自己合
食空胞を認めることが報告された・我々の結果とSaRigらの結果を併せて，原発性LAMP−2欠損症がDan。n病の原因であると結論づけた．

床・病理学的特徴を明らかにした．また，Dano。病の原
Danon病とは別の疾患であることを明らかにした．一連

自己会食空胞ミオパテーという疾患概念を初めて提唱した．
文

献1）Nishino L etal：PrimaryLAMP−2denciencycauses

2・Danon病は，X連鎖性優性遺伝形式をとる疾患で，主に骨格筋・心筋障害を呈する以外に肝臓，血小板，中枢神経障害を伴う全身性疾患であることが再確認された．

2）YamamotoA，etal：Infantileautophagicvacuolarmyopa−

特に女性患者においても，致死性の心筋症を来す点には，注意が必要である．

thyis distinct from Danon disease・Neurology57：
903−905，2001．

3・乳児型「酸性マルターゼが正常なリソソーム性栃原病」
はLAMP−2蛋白が存在すること，またLAMP−2遺伝子変異

X−linedvacuolarcardiomyopalhyandmyopathy（Danondisease）．Nature406：906−910，2000．

3）sugieK・etal‥ClinicopathologicalfeaturesofgeneticallyCOnnrmedDanOndisease・Neurology，lnPreSS−80−

エメリンに関する形態学的・細胞生物学的研究
依 藤
研究協力者

目

宏■

鹿

島

晃■ 仁 科 裕 史■

只

野

豊●

ているが，これらの蛋白の変異がどうして筋の萎縮，関節の拘縮，心筋の伝導障害につながるのかは明かではない．我々はこの発症機序の手がかりを得るため，①エメリンの全身の種々の器官における細胞レベルの発現量の比較，②哺乳類細胞における核ラミナの構築，③細胞分裂時のエメリンとラミンA，Bの挙動の3点につき検索を行った．
方法と結果①工メリンの細胞レベルの発現量の比較材料としては成熟ラットを用い種々の器官を摘出・細切後，凍結切片を作製した．切片は抗エメリンモノ
クローン抗体，抗ラミンA／Cヤギポリクローン抗体で二重染色を施し，共焦点レーザー顕微鏡により観察を行った．
エメリンは皮膚，食道粘膜などの重層扁平上皮や平

田

隆

博●

表1NCL−抗エメリン抗体によるエメリンのラット
体内における分布（蛍光抗体法）

的

Em即y−Dre血ss型筋ジストロフィーはⅩ染色体性の遺伝形式によるものが核膜内膜の蛋白であるエメリンの変異により，常染色体性のものが核ラミナの構成蛋
白であるラミンA／Cの変異により起きることが知られ中

重 層 扁 平 上 皮 （皮 膚 ・口腔 粘 膜 ・食 道 粘 膜 ・膣 粘 膜 ）十 十 ＋ 及 びそ の下 層 の 結 合 組 織 の 中 の線 維 芽細 胞
平 滑 筋 （血 管 壁 ・消 化 管 壁 ・膀 胱 壁 ・気 管 ・子 宮 ・卵〜
＋ ＋ 管壁 ）
腱 細胞
＋

骨格筋
膀 胱 移 行 上 皮 ，膵 外 分 泌 部 導管 上 皮 ，口腔 底 の ′ト唾 液 腺

粘 液 分 泌細 胞
＋ 〜 土 下 垂体 前葉
消 化 管 単 層 円 柱 上 皮 （膵外 分 泌 導 管 上 皮 を除 く） ，気 道
多 列 上 皮 ， 甲 状 腺 ，副 腎 ，精 巣 ，卵 巣 ，腎 臓 ，中 枢 神 経 ，肝 臓 ，肺，顎 下腹 ，膵外 分 泌 細 胞 ，汗 腺 ，皮 脂 腺
蛍 光 抗体 法 によ る 各 種 の 器 官 の エ メ リ ン発現 量 の 相 対 比 較 ．

エメリンは力学的ストレスを受けやすい部位に多く発現している傾向が認められる．ラミン〟Cは基本的にはエメリン陽性（＋以上）の部位では陽性．但し，細胞株のRajicell（Burkitt
lymphoma由来）ではラミン〟C：−，エメリン‥＋・血管内皮はエメリン（±），ラミン〟C（十十十）；二重染色の際の細胞ごとの色調（平滑筋），lつの核での部位による色調（陸細胞）も一窟しておらず，ラミン〟Cとエメリンの星比は細胞種に応じて一定している訳ではない．
②哺乳類細胞における核ラミナの構築
材料には3T3，3Ylなどの培養細胞及びラット肝臓を用いホモジェナイズ後，粗核分画とし，DNaseI，滑筋，腱細胞などの核に最も強い蛍光を示し，それに次ぐ強度を示したのは骨格筋，膀胱の移行上皮，膵外
分泌部導管上皮，口腔の小唾液腺粘液分泌細胞などでRNaseA，TritonX−100，高塩濃度処掛こよる抽出を行いあった（表1）．全体としては機械的刺激を受けやすい部位に強い発現を示す傾向があり，このことは問質のンプルでは抗ラミン〟Cヤギポリクローン抗体，抗ラ線椎芽細胞と考えられる細胞についても皮膚，膀胱などでは強い染色を示すのに対し，肝臓や腎臓の問質の細胞はほとんど染まらないことからも支持された．

粗核分画を得るにあたり，Polytmnによるホモジェナ
イズを用いると核膜と核ラミナの間で解離し，核膜孔核低角度回転蒸着法，急速凍結ディープエッチ法，超薄切片法，ネガティブ染色法などにより観察した．一部のサミンB2抗体などによる免疫染色を施して観察した．

膜複合体を観察することはできなかったが，核ラミナは

ラミンA／Cとの二重染色では，多くの部位でエメリンの蛍光強度はラミンA／Cの強度と平行関係を示した

電子顕微鏡的には保たれており，ウエスタンブロッテイ

が，叫icellではエメリン（＋），ラミンA／C（−），
血管内皮ではエメリン（±），ラミンA／C（＋＋＋）であり，両者の解離が見られた．また染色陽性の同種の細ナ分画に検出された．TritonX−100処理後の核ラミナには10mm径のフィラメントは観察されず，急速ディー胞でもその二重染色の際の色調は細胞毎に異なり，また1つの細胞の核をとっても部位による色調の差も認められるのでエメリンとラミンA／Cが厳密にl：1のが網工を形成していた．この同じ分画にグリセリンを添

対応関係を示すのではないようである．

造を示していた（図1）．この線経は断片化した核ラミ

ングでもラミンA／C，Bのほかエメリンの一部も核ラミ

プエッチ法のレプリカ上では約5mm径のフィラメント
加し低角度回転蒸着法で観察すると，核ラミナは約3〜5nm径の多数の線経に径約10nmの粒状物が付着した構
ナの辺綾部においては，そのサブユニットと考えられる
短い繰経に分散していることもあり，この短い線経には■防衛医科大学校解剖学第二講座

AbeiらがラミンA／C，Bの単分子構造として報告してー81−いるものと形，ディメンジョンとも一致するものも認められた・また場所によってはこれらの短い線経が縦につながったものを見ることができ，in vitr。で示されているラミンのheadtotailpolymerに一致する所見と考えられた・この分画を抗ラミン〟C，抗ラミンB2で二重染色すると，両者のラベルは互いに混在し，また10。m
以下の距離でラベルが近接している場所も観察された．

考察①エメリンの細胞レベルの体内分布
エメリンは主としてノーザンブロッテイングにより
ubiquitousな蛋白と言われていたが，細胞レベルで蛋白の存在から見ると発現しているものとしていないものがあることが解った・蛍光抗体法によるエメリンの分布を
その染色強度から見ると，機能的刺激を受けやすい部位に強く発現している傾向があり，また核ラミナを形成しているラミンA／Cの蛍光強度ともおおよその平行関係が認められた・このことはエメリン，ラミン〟Cが外力に対する核の維持に役立っているという仮説を支持す
るものと考えられる．また主として線維芽細胞からなる
問質の細胞では，外力を筆けやすい部位でエメリンの発現が強いことは外部環境によってエメリンの発現が調節されている可能性が示唆される．
②核ラミナの構築
核ラミナは核膜を内側から機械的に補強するとともにクロマチンの分布をも決定していることが考えられているが，その構造についてはAbeiらが1986年のNatu陀

図1核ラミナ分画の低角度回転蒸着像
核ラミナは3〜5nm径の細いフィラメントの網工と径約10mmの球状物からなっている．
③細胞分裂時のエメリンとラミンA，Bの挙動に関して
過剰チミジンで同調したHeLa細胞において抗エメリ
ン，抗ラミンA，8抗体による免疫ラベルを行った．細
胞分裂時前期に核膜が崩壊するとエメリン，ラミンA，
ラミンBの染色は細胞質に移行し，その状態は分裂後期になるまで維持される．分裂終期に入り核膜の再構築の頃になると，クロマチンの周囲に染色の凝集が見られこの際強く染色される輝点も出現するが，これらの部位にはエメリン，ラミンA，ラミンBの3者がともに共存
し，その強度もほぼ平行することが認められた・（図2）
以ne打点

誌に発表した10nm径の線経が格子状に配列している仮説が広く受け入れられ多くの細胞生物学の教科書にも引用されている・ところが・このデータはXenopus卵という特殊な細胞を材料として研究が行われたものであり，今回我々が晴乳類細胞において検索したのでは10nm径の線経は認められず．ラミンdimerを基本単位として細かい網目が形成されており，またラミンA／CとラミンBは互いに混在しながらこの網目を作っていることが示唆された．
③細胞分裂時のエメリンとラミンA，Bの挙動
この3着の関係を調べたものとしてGFPをつけたエ
メリン，ラミンB受容体などを強制発現した細胞で観察した結果が提出されていた・それによると核膜内膜蛋白であるエメリンとラミンB受容体は細胞分裂終期に異なる部位に集積することが示されており，両者を分離する機構を考えねばならなかった．ところが今回我々が強制発現等をおこなっていない細胞で観察するとエメリ
ン・ラミンB（ラミンB受容体と結合を保つと考えら

血m血Aれている），及びラミンAは細胞分裂の終期に同じ部位に同時期に集積してくることが明らかになり，②に示した両者が電子顕微鏡レベルでも共存することを支持するものと考えられた．
今後の展望
Emery−Dreifuss型筋ジストロフィーは常染色体性のも既mのは主として優性遺伝するが，このことは将来遺伝子治療を行う際問題になると考えられその解明は発症機構の究明とともに重要な課題である．これらの問題，すな

血m血か

図2 細胞分裂終期のHeLa細胞
エメリン（a），ラミンA（b）の二重染色とエメリン（C），ラミンB（d）の二重染色の共焦点レーザー顕微鏡の写真．エメリン，ラミン
A，Bの染色はそれぞれ核膜再構築部位において完全に重なる．

わち変異ラミン〟Cが正常ラミンに対して何故
dominantnegativeな作用を持つのか，また核の脆弱化の仮説に立てばエメリン，ラミンA／Cの変異がどのよう−82−

に核膜，核ラミナの破綻をもたらすのかを説明する上で，核ラミナの分子構築を明らかにし，in vitroの再構成系

to refbrmingfunctional nuclear enveIopeS・J Cell Sciを作成することは肝要なことであると考えられる．

113：779−794，2000．

earlyrecruitmentofemerin，LBR，RanBP2，andNup153

3）Narita S and Yori叫i H：Centrally nucleated nbers
参考文献（CNFs）compensate the什agility ofmyo爪bersin mdx1）AbeiU，et al：The nuclearlaminais a meshwork ofintermediate−tyPenlaments．Nature323：560−564，1986・

mouse．NeruoReportlO：3233−3235，1999・
4）NakataT，et al：CytoplasmiCγActin as a Z−Disc

2）HaraguchiT，et al：Live tluorescenceimaging reveals

PrOtein・BiochemBiophysResComm286：156−163，2001・−83−

筋型糖原病の遺伝子診断法の確立及び病態に即した治療法の開発
杉 江 秀 夫●・●◆
研究協力者 伊 藤 政 孝●・■◆ 福 田 冬季子リ■ 杉 江 陽 子●●日ii）GSD‖型（脱分枝鎖酵素欠損症）：29例のうち筋症状を示す例は11例で，小児期より筋力低下が認められた．

的筋型栃原病（以下GSD）の多くは運動負荷等で容易に筋細胞崩壊を来たし，重症例では横紋筋融解症，腎不全などの合併症を呈する．従って正確な診断のもと医療面で生活指導を行う事は，重篤な合併症を予防する意味で重要である．本研究では日本人のGSDに関して主要な（頻度の多い）病型について遺伝子変異の検索を行い，本症の遺伝子診断法を確立する事を目的としている．またGSDの発症病態に即した有効な治療法を開発し，患者の進行性の経過を持つものは7例で，筋力低下の進行は全例
成人期からであった．循環器症状を合併した例は6例で，肥大型心筋症，左室肥大，伝導障害などであった．突然死が1例認められた．①IVS572A＞C，②4234delA，③
IVS21＋1G＞A，④1117delAACTの遺伝子変異が4例で認められたが，日本人に好発の遺伝子変異は認めなかった．
3）M病の病態生理に即した治療法の開発

qoLの改善に寄与する事も本研究の大きな目的である．
このため（1）日本におけるGSDの病型頻度の調査（2）

筋組織にはVit．B6（pyridoxalphosphate：PP）のtOtalbody
poolの約80％が分布し，筋phosphorylaseと結合している．
M病の大部分では筋phosphorylase活性が10％以下であり筋組織のPP含量に影響を及ぼすことが類推される．

頻度の高いGSDの臨床症状∴遺伝子変異の検討（3）GSD
V型：McArdle病（以下M病）の病態生理に即した治療法の開発，の3点に重点をおき研究を行った．

i）ヒト生検筋におけるPP含量：M病9例，GSDII型7例，ⅠⅠⅠ型5例，Duchenne型筋ジストロフイ症6例，正常筋8例
において生検筋PP含量を測定した．pp含量はM病では正方法と結果
1）日本におけるGSDの病型頻度の調査
浜松市発達医療総合センターで検索した日本人GSD
98例の病型について分析した．GSDIl型（27例），lIl（29），IV（6），V（26），VH（2），Vlll（2），IX（4），PGM（2）でH，ⅠⅠⅠ，V型の3病型で約84％を占めていた．この結果をふまえ日本全体での本症の頻度を確認するため，清水輝夫班長，斎藤加代子班員，西野一三班員の協力の元，
平成13年10月にGSD12種類の過去10年間における症例数について一次全国調査を行った．大学病院，国公立病院およびベッド数200床以上の小児科，神経内科を調査対常の約20％以下に低下していたが，他のGSDでは減少していなかった（図2A）．
ij）pp添加によるL6細胞phosphoryIase活性への影響：血清の1倍から10倍までの濃度でPPを添加し培養後
phosphorylase活性を測定した．ppの添加によって
phosphorylase活性は有意に増加していた（図2B）．
iii）ヒトでの応用：M病患者1例で同意のもと経口でPPを50mg／day投与した．投与後血晴CKの低下が認められた．
臨床的には幼児のため詳細は不明確であった．特に副作用は認めなかった．

象とした（2299件）．回収率は62％であった．症例数はGSDII型（47例），IIt（24），lV（5），V（28），VII（7），iv）糖尿病を合併したM病患者で，糖尿病のコントロー

VIII（20），IX（6），X（2），XI（2），PGM欠損（2），総計143例であった．ⅠⅠ，IH，V型の3病型で約70％を占めた（図1）．

ルが良好な時期に運動時の筋痛，筋硬直が出現し，コン
トロール不良な時期に筋症状が軽快した例が存在した．

2）頻度の高いGSDの臨床症状，遺伝子変異の検討
i）GSD V型（M病）：分析可能な20例の症状は労作時筋痛，ミオグロビン尿症が13名，無症候性高CK血症4名，その他2名で，発症時期は小児期が12名，成人発症が1名であった．生検筋を用いた迫伝子変異の検索では708nO9delTTCの変異が20例中（＋／＋）9例，（＋／一）2例，すなわち40a11ele中20allele（50％）に認められ 日本人M病における好発遺伝子変異と考えられた．
ロ

Bl

Ⅳ

V

Ⅵ1

Vm LX X Xl PGM

図1筋型梼原病全国調査結果＊浜松市発達医療総合センター小児神経科＊＊浜松医科大学小児科ー84−

草phosphorYlase

nmole／mg

nmoIe／mg

上LDH≡pFK

7
6
5
4

︑

3

〜

2
1

貴HヾHSS

HHHSS

〜

0

糖原病V

糖原病日

精原綿Ⅷ

Duchenne control

1X

2×

5X

10X

Pyridoxalphosphate（PP）濃度＊＊、P＜0．01（糖原病V vsII、ⅠⅠⅠ、Duchenne、COntrOl）
LDH，raCtatedehydrogenase；
PFK．phosphofructokinase＊、P＜0．05（phosphorylaselXvslOX）

A．生検筋におけるpyridoxalphosphate（PP）含量 B・L6細胞へのPP添加による解糖系酵素活性への影響
図2

McArdle病とpyridoxalphosphate

今後の展望

考
察
GSDの病型頻度ではⅠⅠ，1日，V型が主要なものである事
が全国調査で判明した．また日本人M病の50％のa11eleに708nO9delTTCが認められる事から，日本人M病の半数は筋生検が必要なく，末梢血での遺伝子検索で診断できる
事も明らかとなった．M病の病態として筋ではPPが2次的な欠乏状態にある事が証明できた．さらにL6細胞でPP添加によりphosphorylase活性の上昇が見られたことは，残存酵素活性が認められるM病において，PP投与を行うことで残存phosphorylaseをわずかでも活性化しうる可能性がある．さらに血糖が上昇しているM病で筋症状が改善した事は，グルコースが筋細胞内で嫌気性解糖に動員され利用されている可能性を示唆している．グルコースが利用できるG−6−Pより上流の第1段階の解糖系酵素異常に起因するGSD（Ⅴ型，Ill型など）の治療の開発を考える上で重要である（図3）．

3年間の研究の中で本邦において主要なGSDはⅠL
IlI，V型であることが判明し，診断，治療戦略を立てるにはまずこの3病型が重点対象であろう．診断については
M病では好発変異が判明したことから，酵素診断，遺伝
子診断を利用すると主要病型（ⅠⅠ，ⅠⅠⅠ，V型）の84％は末梢血で診断可能である．この事実を元にGSDの合理的な診断方法についてガイドラインを今後作成する事も可能である．治療面ではM病の生検筋でPP欠乏状態が認められた事から，患者にⅥt．B6を投与して運動負荷に対する耐性の増加を期待する試みが考えられる．治療計画を策定し全国調査で同意を得た症例について多施設共同での治験を実施し，患者のqOLの向上が可能かどうか検討したいと考えている．さらに血中のグルコース利用を促進することで嫌気性解糖に利用できる可能性があり，Vit．B6＋glucosederivativeのcombinedtherapyについてもV
型，ⅠⅠⅠ型への適応も含め今後検討する価値がある．

glycogen
Iphosphorylase

文

G−1−P

glucose†HKl）sugieH，FukudaTlItoM，SugieY，KqjohT；NonakaI：I

Novelexonllskippingmutationinanpatientwithgly−

g山cose二二二二三G−6−P

cogenstoragediseasetypeIIId・JInheritMetabDis24：（lnsulinl535−545，2001．

PF／
pyruvate二

献一Iactate

2）TsujinoS，HuieM，KanazawaN，SugieH，GotoY，Kawai
M，NonakaI，Hirschhom R，Sakuragawa N．Frequent

図3 グルコース代謝と嫌気性解糖系

mutationsinJapanese patients with acid maltase de丘−
ciency．NeuromusculDisordlO：599−603，2000・〔㌫諾筑豊設定●認踪慧i。aS。〕

3）FukudaT，SugieH，ItoM：NovelmutationsintwoJapa−
nesecasesofglycogenstoragediseasetypeIIIaandare−−85−

viewoftheIiteratureofthemolecularbasisofglycogen
StOragediseasetypeHI．JInheritMetabDis23：95−106，4）HamanOTIMutohTSugieH，KogaH，KuriyamaM：
Phosphoglyceratekinasedenciency‥anadul【myopathic

formwithanovelmutation・Neurology54：1188−1190，

5）NishioTこSunoharaN，NonakaI，TsujinoS，SugieH：
Myophosphorylase

denciency

andlimb一girdle

musculardystrophyinthesamepedigree．ActaNeuroIScand98：
364−367，1998．

−86−

Ⅳ．ミオトニー症候群

筋強直性ジストロフィー病態の分子論的解明と治療
好打

嘉裕

下

紀竹

好打

いうタンパク質をクローニングすることに成功した．
EXP／MBNLは5つのスプライシングアイソフォームを的

筋強直性ジストロフィー1型PMl）は，筋強直，精巣萎縮，白内障，耐糖能異常などを特徴とする全身性疾患である．責任遺伝子は，DMキナーゼ（DMPK）という
セリン・スレオニンキナーゼであり，その3，非翻訳領域にあるCTGトリプレットの伸長が原因と考えられている．また最近，筋強直性ジストロフィー2型（DM2）も発見されたが，これはジンクフィンガータンパク質であるZNT9遺伝子中のイントロン1にあるCCTGテトラ

章

展

川橋

目

浦

笹高

研究協力者

石

持っていたが，我々のスリーハイブリッドの系ではそう
強い結合は認められなかった．− しかし，GFP−
EXP几4BNL42 を細胞に発現させたところ，核に特異的に局在することを発見した．これは核と細胞質をシャトルする CUG−BP とは異なるところで，EXP／MBNLがmRNAを核に留めおく機能がある仮定すると，DM発病の鍵がここにあると考えられる．

ヌクレオチドリピートの伸長であることが判明した．すなわち，DM という症状が塩基リピートの伸長に深く関係しており，2 つのDM の共通項としてリピート治療の見込みに関しても大幅の進歩があった．我々はDMPKの3非翻訳領域にCTGリピート0，5，30，
130，150，170，190個を組み込んだcDNAを作成し，RNA結合タンパク質が浮かび上がってきた．これらDMの原因を明らかにするとともに，DMの新しい治療法を開発するのが本研究の目的であった．
方法と結果

そのうちのいくつかをマウス筋芽細胞C2C12 に組み込んだ安定形質発現細胞を樹立した．リピート130の細胞はリピート 5 の細胞に比べて，血清除去後の筋分化が遅れることがわかったが，これはDM患者の骨格筋が未分化な状態にあることに対応しているものと考え

我々は，DMの原因はRNAの異常ではないかと考えた．そこで，DMl のリピートがmRNAではCUGリ
ピートに転写されること考慮して，CUGリピートに結合するタンパク質をスクリーニングすることから始めた．

られた．またこれらの細胞を用いて，リピート伸長が細胞機能に及ぼす影響を検討したところ，リピートが伸びるに従って過酸化水素やメナジオンなどによる酸化ストレスに脆弱になることを発見した．この脆弱性

その結果，2種類のRNA結合タンパク質のクローニン

はアポトーシスによるものであり，ビタミンEやN−ア
セチルシステインの投与で細胞死が抑えられることもグと性質の解明に成功した．1つはCUG−binding protein（CUG−BP）である．CUG−BPは全身臓器に発現している
50kDaのタンパク質である．CUG−BP とDMPK cDNA
をCOS細胞に共発現させると，DMPKのCTGリピー

発見した．
考

察

トが30から130と長くなるにつれてDMPKの翻訳量が減少することが判明した．これは，患者において骨格筋
内のDMPK量が減っていることに対応すると考えられ

ルのスプライシングによって筋強直を説明できることかた．次に，CUG−BPの基質特異性を酵母スリーハイブ
リッド法という RNA−タンパク質相互作用を測定するやまたはCCUG）が病気の本体である「RNA病」であることが明らかになってきた．すなわち，リピートが伸びるり方で定量化したところ，CUG−BPはCUGリピートよりもUGジヌクレオチドリピートの方に強く結合することがわかった．ここでCUG−BPの新しい生理機能も示とそこにCUG＿BPやEXP／MBNLなどのリピートRNA

唆された．cUG−BP と CCUGテトラヌクレオチドリ
ピートとの結合についても同じスリーハイブリッド法で調べたが，結合能はCUGリピートと同じ程度であった．
我々は，CUG−BPの他にRNAリピートに結合するものはないかとスクリーニングし，新たにEXP侶MBL とDM2の発見と，DMlではCUG−BPによる塩素チャネ
ら，DMという疾患は長く伸びたRNAリピート（CUG

結合タンパク質が結合して，本来それらが必要な場所で欠乏することがスプライシング異常や翻訳阻害を引き起こし，最終的に全身性疾患を生み出す可能性があること
が，多くの研究で明らかにされてきた．我々のCUG−BP，
EXP／MBNLの仕事はDM研究の核心をついたものであり，平成11年から13年度の3年間の研究で，基質特異性を世界で初めて明らかにできたことはDM研究の一＊東京大学大学院総合文化研究科・生命環境科学系助になったのではないかと考えている．
−89−

また，長いCTGリピートを組み込んだモデル筋芽細胞が，筋分化の遅れという DMの症状を良く再現することが判明した．この細胞を用いた実験から，DM筋は酸化ストレスに弱いことも明らかになった．これらの研究から，抗酸化剤の大量投与が遺伝性疾患であ文

献1）Takahashi N，Sasagawa N，Suzuki KandIshiura S：
Synthesis oflong trinucleotide repeatsin vitro．
Neurosci．Lett．262，45−48，1999．
2）Sasagawa N，Watanabe T，Usuki F，Saito N，Ito M，るDMの症状を和らげる可能性があることを指摘しておきたい．

KoikeH，SuzukiKandlshiuraS：Anovelgenethatis
activated by myotonin protein kinase（MtPK）．
Biomed．Res．20，99−108，1999．

今後の展望
DMのいろいろな症状を1つの欠陥から説明するこ3）SasagawaN，TakahashiN，SuzukiKandlshiuraS：Anとは不可能であると思われていたが，リピート RNA
結合タンパク質の発見で思わぬ展開になった．しかし，
現在見つかっているCUG−BPやEXP〟MBNLだけではinterftrence：Anew hypothesis fbrthe pathogenesis of

リピートとの反応特異性が説明できず，この他にも
CUG またはCCUGリピートに結合するタンパク質が見つかる可能性がある．薬剤の標的としての役者が出

4）TakahashiN，SasagawaN，SuzukiKandIshiuraS：Theそろうまでには，今すこし時間がかかりそうである．
最後に，研究が3年間で欧米に肩を並べるまでに進んだのも，本姓会議からの研究補助のおかげである．
厚生省清水班の方々，ならびに研究遂行のきっかけを与えていただき，折に触れて議論し励ましていただいexpanded CTG trinucleotide repeat causes trans RNA

myotonic dystrophy．Biochem．Biophys．Res．Commun．
264，76−80，1999．

CUG−binding protein（CUG−BP）binds specificalIy to
UGdinucleotiderepeatsin ayeastthree−hybridsystem．
Biochem．Biophys．Res．Commun．277，518−523，2000．
5）TakahashiN，SasagawaN，UsukiF，KinoY，Kawahara
H，Sorimachi H，Maeda T，Suzuki K，Ishiura S：
CoexpressionoftheCUG−BindingProteinReducesDM
ProteinKinaseExpressioninCOSCells．J．Biochem．130，

た（故）荒畑喜一博士に深く感謝したい．

581−587，2001．

一90一

筋緊張性ジストロフィー（DMl）の分子病態−DMAHP／Six5遺伝子の関与

研究協力者

目

佐

藤

川

上

滋●

中

潔●

村

美

和●steve Tapscott

数十倍の転写活性化が観察された．その反応エレメントの位置をプロモーター領域の欠失変異を作成し，転写開始点上流−106〜−70の領域に同定した．反応エレメントにはSix5タンパク質が直接結合する事をゲルシフト法
で明らかにした（図1BC）．さらに，DNaselフットプリ
ント法，メチル化干渉法を用いてその結合部位を詳細に解析した．同定された結合部位は，ヒトおよびマウス，

的DMlはDMPK遺伝子下流のCTGリピートの伸長によっておこる．リピート伸長がDMlの病態に関与する機構については，CUG−RNA転写産物によるドミナント
ネガティブ効果（CUG結合タンバク質の異常によるス
プライシング異常やRNAの核一細胞質の分布の異常が起こる）とCTGリピート周辺の遺伝子，DMWD，DMPK

ラットのIgfbp5プロモーターで完全に保存されており，
既に知られていたMyogeninおよびNa，K−ATPaseα1サブユニット迫伝子のSix5結合部位との比較からコンセン
サス配列を提唱することができた．

およびSIX5の発現低下によるLoss ofRInCtionの効果が原因と考えられている．Six5遺伝子欠損マウスの表現
型からはSlX5遺伝子の発現低下がDMlの一部の症状（白内障や不妊）に関与していると示唆された．本研究Aは，転写因子Six5が制御する標的遺伝子群を同定し，それらの遺伝子群の発現異常によるDMlの諸症状発症の機構を明確にすることを目的とした．

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方法と結果

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Six5タンパク質の標的遺伝子群をマイクロアレーを用いて同定する方法を開発した．強力な転写活性化能をもつ，ヘルペスウイルスVP16タンパク質を融合させた野生型Six5タンパク質（VP16−Six5），及び特異的DNA結合能を欠く変異型Six5 タンパク質（VP16−Six5W241R）
をアデノウイルスベクターに組み込み，胚性癌腫細胞■ Vptト傘出川は■ln
O VrI他事■■￠仰●▼■tl・叫

4こ晶で。＿＿＿＿ミ＿J rl・− ▼▲▼▲ ●t ●Jl■1濾■1．・・・・．・．・・・・−
門血書 ■−

押■I

P19と筋芽細胞株C2C12とに感染させ，野生型融合タン
パク質で特異的に誘導され，変異型タンパク質では誘導されない遺伝子群をマイクロアレーを用いてスクリーニ
ングした．野生型と変異型とで2倍以上発現増加した遺で発現する転写因子やシグナル分子，さらに神経伝達物
質の輸送体や受容体が同定された．C2C12細胞においては，既知の標的遺伝子myogeninおよび骨格筋の収縮に直接関与する遺伝子，アセチルコリン受容体などの遺伝子が同定された．これらのうちIgfbp5，Igf2遺伝子については，マイクロアレーで観察されたVP16−Six5による誘導をノザン法にて確認した．さらに，Igfbp5遺伝子
プロモーターのVP16−Six5タンパク質による転写活性化をレポーター遺伝子法にて検証した（図1心．vp16−Six5の共発現によって，VP16−Six5W241Rの共発現に比べて−

図1Igfbp5遺伝子プロモーターの解析
AマウスIgfbp5遺伝子プロモーターとルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子の融合遺伝子に対する，VP16−Six5およびVP16＿Six5W241Rの転写促進効果を測定した．Bゲルシフト法に用いたプローブDNAの領域を示した．C各
プローブDNA断片を32pで標識し，GST−Six5タンパク質との結合を観察した．

伝子を標的遺伝子候補として表1にまとめた．
P19細胞においては，中胚葉分化に伴って発現する転写因子やシグナル分子及びそのリセプター，また神経系● 自治医科大学医学部生物学教室
H FredHuchinsonCancerResearchCenter▲Ir

く▲∝t▲●■

生体内でIgfbp5およびIgf2がSix5の標的遺伝子になっていることを確認するために，Six5遺伝子欠損マウスから培養繊維芽細胞を樹立し，内在性Six5mRNAをノザン法で定量したところ，いずれも2分の1以上の低下がみられた．従って，生体内ではSix5タンバク質の働きによってこれらの遺伝子が正の調節を受けていることが確認された．
Igfbp5遺伝子プロモーターの活性化機構を知るために，
Six5，SixlとEya2，Eya3を組み合わせて細胞に導入し，Igfbp5−ルシフェラーゼレポーター退伝子の活性化を観察したところ，Six5とEya3の組み合わせで最大の活性化が見られた．sixlは単独では活性化が観察できなかったが，Eya2を同時に加えると数倍の活性化が観察できた・−91−

表1同定されたSix5の標的遺伝子候補．遺伝子と誘導倍率を主な発現部位とともに表示した．

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rWt／W241Rl

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鶉鐘伝1鴨鷺彙書体と嶋遺体
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義貞嶋籍と霊鳥1月
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シグナル分子と責書体

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2．86
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2．01

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DMl患者細胞でのIGFBP5遺伝子の制御異常を検出する目的で，CTGリピートの数が1000以上のDMl患者の絨維芽細胞と健常人からの繊維芽細胞をMyoDの強制発現によって骨格筋に分化させた時のIGFBP5の発
現様式を比較した．健常人では約2倍の発現増加が見られたのに対し，3種類のDMl患者由来細胞ではIGFBP5の発現増加はいずれも低下していた．lGFBP5遺伝子の制御の様相が変化していることが確認された（図2）．

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8．08

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89
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2
︷ 一7

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11．20
＞9．00

9xZ

中正1纂

000000P19嘉島で2個以上『暮された遇伝手
伝亨日子
餌2

考
察
1本スクリーニング法の特徴
VP■16−Six5融合タンパク質をアデノウイルスベクターを用いて細胞に発現させ感染後短時間の誘導でスクリーニング行うので，二次的に誘導される遺伝子や形質転換株を選択したためにおこる影響を排除できる．VP16に由来する強力な転写活性化ドメインを使用することで，Six5 の直接の標的遺伝子を効率よく検出できる．
W241R変異をコントロールの用いることで，アデノウ
イルスの感染やSix5タンパク質およびVP16活性化ド
メインの過剰発現による一般的な影響を最小限におさえることができる．

寧軍資芸扇壷膏挙璽顎更芸品毒召Jや紳↓詳麒帝と薫りー琴芝芸蔓盲琴琵至芸壷

2Igf2の発現低下によって期待される成長不全，Igf2
およびIg町p5の低下で期待される骨格筋その他の中胚
葉組織の欠損などがSix5遺伝子欠損マウスで観察されない理由として次の3つが考えられた．1）sixl，Six4など他のSix遺伝子メンバーによる機能補償．2）胚発生が正常に進むのに足るIgfbp5遺伝子の発現レベルが，Igfbp5遺伝子プロモーター内のSix5結合部位以外の部位に結合する他の転写因子によって達成されている．
3）six5遺伝子の働きは筋肉の再生や負荷をかけた場
合にのみ観察できる．
3 インスリン抵抗性や白内障形成への関与の可能性
DMl患者へのtGFlの投与によってインスリン抵抗性に改善がみられることから，IGFシグナルの構成要素であるIGF2やIGFBP5の発現レベルがインスリン抵抗性餞♯患者1患者之走者3

図2 骨格筋分化に伴ったヒトIGFBP5遺伝子の発現星の変化．
健常人由来細胞とDMl患者由来細胞をMyoDの強制発現によって筋分化させた．筋分化前後のIGFBP5の発現をノザン法で検出し，相対比であらわした．

に関与する可能性が考えられた．18位とIgfbp5の発現はレンズには見られないが，毛様体，角膜，網膜，強膜に見られるのでIGF シグナリングの異常が引き起こされ白内障につながりうると考えられた．lGF−2 や
IGFBP5などのSix5の標的遺伝子産物がレンズの周りの−92−

組織から分泌されてDMl患者及びSix5迫伝子欠損マウ2）KawakamiK，SatoS，OzakiHandlkedaK：Sixfamily

スの白内障に関与する可能性がある．

genes−StruCtureandfunctionastranscnptionfhctorsand

4P19細胞で同定された21個の標的迫伝子のうち10

theirrolesindevelopment．BioEssays22：616−626，2000．

個が発生中の体節や骨格筋で発現するので，SIX5遺伝

3）OzakiH，WatanabeY，TakahashiK，KitamuraK，Tanaka子の発現低下がmyogeninに加えてこれらの遺伝子発現異常を介して筋の融合や成熟を遅らせることが先天

A，UraseK，MomoiT，SudoK，SakagamiJ，AsanoM，性のDMlにおいては考えられる．

gene regulator，is not essentiat fbr mouse embryonal

IwakuraYandKawakamiK：Six4，aPutativemyogenin
development．Mol．Cell．Biol．21：3343−3350，2001・

今後の展望

4）Ozaki H，Watanabe Y，Ikeda K and Kawakami

K：

レンズや生殖系列の細胞を用いて標的遺伝子群を同定

Impairedinteractions between mouse Eyal harboring

し，白内障および生殖細胞の形成不全などの症状を引き

mutations fbundin patients with branchi0−OtO−renal起こす機構を明らかにしてゆきたい．

SyndromeandSix，DachandGproteins・J・Hum・Genet・
inpress，2002．

文献5）Sato S，NakamuraM，ChoDH，TapscottSJ，OzakiH1）OhtoH，KamadaS，TagoK，TominagaS，OzakiH，SatoandKawakamiK：TdentificationoftranscnptlOnaltargets

S and KawakamiK：Cooperation ofSix and Eyain

forSix5：Implicationfor the pathogenesis ofmyotonic

activation of their target genes through nuclear

dystrophy type1・Hum・Molec・Genet・underrevision，translocation of Eya．Mol．Cell．Biol．19：6815−6824，

2002．

1999．

ー93−

筋緊張性ジストロフィーに認められるCTGリピート延長が遺伝子発現に及ぼす影響の検討
吉

良

潤

一●

研究協力者 古 谷 博 和■ 菊 池 仁 志● 新 納 信 江■
山 田
猛■ 田 代 康 介◆●久 原哲■●

目

対象・方法・結果
1．アフリカツメガエル卵での検討

的

筋緊張性ジストロフィー（以下DM）では筋組続にミオトニア現象と筋力低下，筋萎縮が生じるが，それ以外に難治性糖尿病，甲状腺機能障害，良性・悪性腫瘍の合DM患者ゲノムDNAからPCR法で増幅したCTGリピー
ト（136回繰り返し）をサブクローニングし，これらの併，脂肪肝などの全身症状を認め，中枢神経系では異常CTG／CAGベクターからtnvLtrotranslationkit（ProMega）
を用いてCAP構造を付着したmRNAを作成し，これとウリン酸化したタウ蛋白が沈着する2次性のtauopathyが生じる事が知られている．
DMは常染色体優性の遺伝性疾患であり，DMPK遺伝子の3，非翻訳領域に存在するCTGリピートが延長すること

ミシイタケルシフェラーゼ（RL）mRNAをアフリカツメガ
エル卵母細胞に直接インジェクションしてRL活性を測定した．この場合，RL活性はリピートのJm那一効果を直によって発症するが，この際正常のDMPK遺伝子からは正常のDMPKが翻訳されているのに疾患が発症するという事実から，リピート延長が自分自身（この場合DYSTROPHIA MYOTONICA PROTEIN KINASE（以下接反映していると考えられる．
結果は図1に示すように，インジェクション2時間でCAGリピート（J）でもCTGリピート（●）でもコント
ロール（◆）に比べて発現の抑制が認められ，2時間ではDMPK）遺伝子）に影響を及ぼすcJ∫−効果だけでは発症の機序や全身諸臓器に疾患を起こす機序を説明できず，
DMPK遺伝子の下流にあるSIX5迫伝子，対立DMPK遺伝
子，さらには同時に発現する他の遺伝子の発現に影響を及ぼすという〃m几卜効果を考えなければならない．しかし，

CUGリピートの方がその抑制効果は強かった．しかしその後はCTG，CAGリピートの間で2時間目ほどの大きな差は認められなくなった．DNAで同じような実験を行った際には6時間目に同じような効果が認められたことか
ら，mRNAをインジェクションした場合はその効果が2時間目に現れるものと考えられた．

このことをきちんと証明できるhVJJmのシステムはなく，リピートがどの遺伝子にどのような機序で影響を及ぼすかについての詳細な検討は行われていない．
私どもはこれまでにリポーター迫伝子の3，非翻訳領域にCTGリピートを挿入したベクターを作成し，f乃VJJmでリピートの遺伝子発現に及ぼす影響を調べるシステムを開発し，これを種々の培養細胞やアフリカツメガエル卵

0．6
0．5
0．4
0．3

母細胞や受精卵に直接導入することで，（1）CTGリピート
はCAGリピートよりも強力にその5，上流の遺伝子発現を

0．2
0．1

抑制し，リピートのサイズが大きくなるほどその効果は0強くなる．（2）この現象には種による違いや，培養細胞の種類による違いなどは認められず，普遍的な現象であOhr lhrる．（3）この現象の発現には核膜が重要な働きをする等の事実を明らかにしてきた．そこでこのシステムを用いてCUGリピートの延長したmRNAがcis−，tTmS−に作用する機序を詳細に検討するとともに，中枢神経系に生じる2次性のtauopathyの機序についても解析を行うことにした．

2hr

4hr

6hr

8hr

12hr

図1リピートのtmns−効果とその経時的変化．アフリカツ
メガエル卵にCAG／CTGリピートのmRNAを直接打ち込み，同時に打ち込んだルシフェラーゼ活性を測定して，リピートのJm那一効果を調べた．cAGリピー
ト（L），CTGリピート（●），コントロpル（Mock）（◆）のJm那一効果を示す．トランスフェツクション
2時間後にCTGリピートのJm〃∫一効果が最も強く出ていることがわかる．

2．神経系培糞細胞での検討
次に，CTGリピートとtauopathyとの関連について調べるために，CTG136回リピートをルシフェラーゼ（LUC）発
現ベクター（pGL3）に正・逆の方向にサブクローニングし■九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設神経内科＊＊九州大学大学院生物資源環境科学研究科ー94−たプラスミドを作成した．それとウミシイタケルシフェ

白は重合して管状構造物を構成しているが，PC12細胞でラーゼ（RL）発現ベクター（pRL）を同時にPC12には，プラスミドのトランスフェクシヨンと同時にNGFにょる分化誘導をかける．これにより樹状突起や軸索形成のために多量のtau蛋白や8−tubulin蛋白の発現誘導がかか

lipoftctamineplusを用いてトランスフェクシヨンし・NGF（nervegrowthfactor）によるニュpロンへの分化誘導を行い，培養24，36，48，60時間後にLUC，RLの活性測定と中枢神経系マーカー蛋白（MAP−2，CaSpaSe3，8−tubulin，tau）の免疫組織染色，ウェスタンプロッテイングによる発現の定量，B＿tubulin，tauのmRNAレベルでの発現，RT・PCR
法によるtau mRNAのattemativesplicingの違いを検討した．この場合，LUC活性がリピートのcf∫一効果，RL活性がrm那＿効果を反映していると考えられる．
cAG／CTGリピートをトランスフエクシヨンした場合，免疫組織染色でコントロールに比較して細胞数の減るが，この時同時に核内にCUGリピートの延長した
mRNAが多量に存在するために，tau蛋白に異常な
altemativesplicingが起こったり・核膜のところで他のmRNAの核・細胞質輸送に障害をきたし，そのために，必要な時期に必要な量のtau蛋白と6−tubulin蛋白をうまく生産出来ず，この時期のPC12細胞には形態異常が生じるものと考えられる．また，この時期，うまく重合できなかったtau蛋白に異常リン酸化が起こり，2次位のtauopathyを起こすのではないかと予想された・
棟

少およびtau蛋白の発現量低下が認められた・

内

■

■

■

一方ウェスタンプロッテイングでは，トランスフエク
シヨン48時間後にCTGリピートで特異的に8−tubulinの有意な発現低下が認められた（図2）．しかし，tau蛋白のリ
ン酸化のパターンにこれら3者の間で大きな差は検出さ■tリン暮七れなかった．またLUCおよびRL活性では，RL活性の測定がトランスフェクシヨン48時間後にCTGリピートで有意に低下することが明らかになるとともに，RTPCRを用

図3 PC12細胞で認められたtauopathyの機序いた実験で，CTGをトランスフェクシヨンしたPC12細胞

今後の展望

ではエクソン2，3がスプライスアウトされたtauの今後はこのシステムを用いてPC12細胞での異常リンmRNAがコントロールに比較して増加していることが判

酸化の有無やその機序をcDNAマイクロアレ一法などを用いて解析してゆく予定である．PC12を用いたシステム
は簡便である上に，DM患者脳やモデル動物の脳を用いる場合に比較して，他の要素の影響を受けにくく，純粋明した．これはDMの脳，DMのモデルマウスの脳でも認められる所見と一致していた．

にtauopathyに関与する要因を解析することが出来る・
tau遺伝子自体に異常をきたしたEn vitn）でのtauopathyの実験系は存在するものの，最も数多く存在する2次性
tauopathyの良いhv血でのモデルは存在しない・私どもの開発したこのシステムは，今後DMの疾患発症機序を解明してゆく上でも，またtauopathyの発症機序を解明してゆく上でも有用なものになると考えられる・
参考文献
1）HirokazuFuruya，NaoshiImai，EriK頑ta，≠kutoⅥsu−

図2リピートを含むリポート遺伝子をPC12細胞にトラン
スフェクションして48時間後にウェスタンプロッテ
ィングによって測定した脳のマーカー蛋白の発現・
Ll＿tubulirLの発現がCTGlJピートで選択的に抑制されていることがわかる．

hiko，SukehisaNagano，rIbkeshiYamada・KenshiHayashi・
Jun＿ichiKiraandKoichiroShiokawa：Expressionofre−

porter genes contalnlng CTG and CAG repeatsin
3・−untranSlatedreglOninmammalianculturedcellsand

考察

Xenqpusoocytesandembryos・2bologicaLSclerzce・Sub−
mlttlng

以上の結果から，CUGリピートの延長したmRNAが核

2）古谷博和：CTGリピート病と遺伝子発現．神経進歩内に存在すると血肝効果で，ある一定時臥比較的選択

45（6），927−卵3，2001・

的に遺伝子の発現が抑制されたり，altemative splicingの異常が生じると考えられた（図3）．tau蛋白と8−tubulin蛋−95−低分子量熱ショックタンパク質群による骨格筋ストレス耐性系の研究，およびその筋ジストロフィー発症機構との関連

研究協力者

岸

川

鈴

木

優＊

山

厚＊

路

小井手 裕 一書 林

1）MKBP結合タンパク箕の検索
日

聡＊＊
由紀子榊

杉

山

由

樹＊

大

野

茂

男嚢

る・また，BAG−3はアポトーシス抑制タンパク質，B。1

的−2に結合しその機能を助けることも報告されており，筋

これまで我々は，筋強直性ジストロフィーの原因遺伝
子産物，DMキナーゼの特異的結合タンパク質として新規低分子量熱ショックタンパク質（sHSP），MKBP，を同定し，それを契機として，筋肉細胞のストレス耐性，
およびその複雑な筋原線維構造の構築・維持にsHSPが重要な役割を果たしていることを指摘してきた．本研究課
題においては，MKBPの結合タンパク質を検索し，MKBPの分子レベルの作用機序を解明する手がかりを得ることを目指した．

肉のストレス耐性系とアポトーシス系の相互関連についても新たな知見をもたらすことが予想される．
研究の意義
哺乳類sHSPの一種，αB−CryStallin遺伝子における点変異が遺伝性のDesmin−relatedmyopathyの原因の一つとなっていることが示されているが，MK月PはこのαB−CryStallinよりもより筋肉に対する発現特異性が高い．
従って，その筋細胞中での作用機構に手がかりを与えた
今回のBAG−3との相互作用の発見は，筋肉特有のストレ方法と結果

ス耐性系，細胞死抑制系の解明につながることが期待できる．

Yeast two−hybrid screeningによりヒト心筋cDNAライ
ブラリーからMK月P結合タンパク質を検索した結果，すでに「HSP70に結合し，その活性を制御するタンパク質」
として報告されていたBAG−3が同定された．詳細な解析から，MKBPはBAG−3のN末端側，a．a．60−218の飯域にShock protein complex composed of MKBPnlSPB2arLd

結合することがわかった・HSP70はBAG−3のC末端側のBAGドメイン（糾4−490）に結合することがわかってい

HSPB3duringmyogenicdifferenciation．J．Biol．Chem．275：
1095−1104，2000．

るので・BAG−3に対するこれら2種のHSPの結合は独立であり，これらが同時に同じBAG−3分子に結合することが予想された（図1）．そして実際，ラット骨格筋抽出
液からの免疫沈降実験によって，これら内在性タンパク文

献SugiyamaetaLMuscledevelopsaspecificformofsmallheat

型
RACト3

＋

HSC70

−

質が3者複合体を形成していること，およびその結合は熱ショックによって増強されることが明らかとなった．一方，NorthemBlot解析からはこのBAG73が心筋・骨格筋に特異性高く発現していることが示された．

GST−MKBP
−

＋

＋
＋

十

一

十

−

＋

＋

−＊・

−

U別d

考

GST−prOtelm

察以上の結果より，BAG−3分子は筋肉細胞の2種のシャペロン系であるsHSP系とHSP70系を統合し，効率よいタン
パク質管理を行なう筋細胞特異的なシステムを形成する
スカフオールドタンパク質である可能性が強く示唆された・こうした異なるシャペロン系を統合するシステムと

図1BAG73はMKBPとHSP70をつなぐscaffbldタンパク質として機能する．
精製BAG−3およびHSP70タンパク質とGSrIこMKBPを図に示したような組合せで混合し．それらの試験管内での結合の有無を検討した．グルタチオン樹脂によってGSTLMKBPとともに沈降するタンパク質をWestem blot法によって検出した・Controlとしては精製GSTタンパク質を用いた（左側パネル）．

いう考え方は全く新しい概念であるとともに，今後の筋細胞ストレス耐性の解明に新たな視点を与えるものであ＊横浜市立大学医学部第二生化学教室＊＊横浜市立大学医学部内科学第一教皇＊＊＊国立精神神経センター，神経研究所，疾病研究第一部
ー96−

よびそれに伴う細胞一基質接着形成過程におけるa抗xinの役

2）lLK結合タンパク葺の検索
目

割を検討したところ，①afhinはILKとともにcellspreading

的

これまでの筋ジストロフィーの研究の中で，筋細胞と基底膜との結合に障害が生ずることが発症の大きな原因の非常に初期に，Vinculin，FAKなどよりも早く細胞と基質の揺する細胞膜伸展領域に濃縮し，細胞がよく広がった後の一つであることが明らかとされてきている．

には接着斑（FA）に局在するようになる．②cH2domainのDystroglycan系とともにこの筋肉と基底膜をつなぐ主要みを有するaffixin変異体を高発現すると，Cellspreading，おな分子構造を形成するinteghn系の分子機構の解析を目よびそれに伴うFA形成が阻害されることがわかった．また，

指して，ILK（integhn−1inkedkinase）の結合タンパク質を検索した．

③細胞が十分spreadした後にCH2変異体を高発現してもmの破壊が弱いながらも見られるが，そこにILKを共発現させた場合にその効果が顕著に増大することも明らかとな

方法と結果

った．

鴨asttwo−hybridscreeningによりヒト心筋cDNAライブラ
リーからMKBP結合タンパク質を検索した．その結果，

考

spectrin，dystrophin，α−aClininなどのN末端のactin結合ドメ

察以上の結果は，arRxinがintegrin−ILKsignalingの下流で，細胞一基質接着の初期形成に必須な役割りを果たしておインに見られる2つのCalponin homology（CH）domainのみから構成されているという，これまで見られなかったユニ

り，哺乳動物骨格筋の形成，・維持に積極的に働いている
可能性を示唆している．

ークな構造を有した分子量約50kDaの新規タンパク質が同定された．そこでこれをafnxinと名づけて報告した．ILKはその後半のCHdomainに結合し，その部位をリン酸化する．

研究の意義

興味深いことに，RNA干渉法によりこのタンパク質の線虫

骨格筋のintegrinαsubunitにおける変異がやはり先天性ホモログの発現を線虫初期胚において抑制すると，体壁筋のmyopathyにつながることも知られている・従って，今回の基質との接着異常に起因するといわれるpatphenotypeと呼ばれる筋細胞発生の晃常が現われた．このことから哺乳新たにこのintegdn系とアクチン系をつなぐ新しい分子機
構，シグナル系を明らかとしたことは，dystroglycan系の障害に由来するものとは異なる筋ジストロフィーの病態

動物においてもこのaf駄inがintegrinを介した基底膜と筋細胞の結合，およびそれを介したシグナル伝達に重要な役割

解明に大きな手がかりを与えるものと考えられる．

りを果たしていることが予想された．実際，amXinは骨格文筋・心筋に高い特異的発現を示すだけではなく，組織染色

献の結果，ILKとともに筋細胞形質膜に局在し，特にZ膜が細Yamqji，S．et al．A novelintegnn−linked kinase−binding

胞膜と連結している領域に濃縮していた（図2）．一方，CHO

PrOtein，amXin，isinvoIvedintheearlystageofcell−Substrateinteraction．（2001）J．C．B．153：1251−1264，2001．

細胞を用いて細胞をseedする際に見られるcellspreading，おαAffixinAb

αlLKAbMerge

図2 A臨xinはmKとともに，骨格筋形質膜とZ膜の連結部に濃縮している．
抗a指xin，および抗mK抗体を用いて正常ヒト骨格筋標晶（同意を得て入手した剖検標品）における両タンパク質の局在を検討した．（A〜C）横断面（D〜F）縦断面A托xin，ILKともに形質膜に局在していることがわかる．縦断面において観察される縞状染
色は，Z膜構造が形質膜に結合している額域に対応することが，αTaC血inとの共染色によって別途示唆された（dabnotshown）．
−97−

トコンドリア脳筋症

ミトコンドリア脳筋症（MELAS）の聴力障害に関する病理学的研究
福 原 信 義●
研究協力者

目

巻

渕

隆

夫…

中

島

孝■

石

田

千

穂■

があり，次第に構書障害，痴呆が増強するとともに，尿的Mitochondrial

蛋白が高度となり，低蛋白血症，全身 浮腫，胸腹水が生じて52歳時に死亡した．

myopathy，enCePhalopathy，lactic acidosis and stroke−1ike剖検所見：脳脊髄はび慢性に軽度萎縮があり，橋底部のepisodes（MELAS）では糖尿病と並んで難聴の合併頻度が高い．このMELASの難聴については一般に，脳卒中様の神経症状が生じるよりもずっと前に難聴の症状が始ま′ト梗塞巣（＋），淡蒼球に中等度の仮性石灰沈着（＋）であった．一般臓器では膵臓ランゲルハンス島の萎縮と糖尿病

ミトコンドリア脳筋症では，多彩な症状を示し，難聴を生じるものが少なくないが，特にることが多く，感音性難聴と記載されているものの，その障害部位についての病理学的な報告はない．今回，
MELASの2剖検例で内耳について病理学的に検討したので報告する．
対象と方法
症例141歳（死亡時）女性．家族歴：母，母方伯父，
母方いとこが類似疾患で死亡．
現病歴：22歳時，糖尿病と診断される．32歳時，難性腎症が認められた．
両例ともに，家族歴，臨床経過，検査所見，病理所見などが定型的なMELASであり，生検材料，剖検材料でmtDNAの3243変異が認められている．生前の聴力検査
で平均聴力は，症例1は60〜65dB，症例2 は80〜
100dBと高度の聴力低下が見られていた．ABRでは波形が低く検査の信頼性が今ひとつであったが，各波形の潜時の遅れは認められなかった．
病理学的検査は，剖検時に側頭骨錐体部の内耳を含む部分を切り出し，脱灰した後に，通常の如く処理し，聴，全身痙攣，びまん性筋萎縮， 次いで，右下1／4盲，
小脳性運動失調などの症状を生じる，国立療養所犀潟病

HE，K月，Bodian染色を施し，光顕で観察した．
結院に入院し，筋生検：RRF（＋），mtDNAの点変異（3243）が認められ MELASと診断される．その後も41歳時，拍動性頭痛，相貌失認，左片麻痔，失語，失行などを生じ，死亡した．
剖検所見：大脳皮質の層性壊死があり，左頭頂葉，左側頭葉，両側後頭葉に新旧様々のものが認められる．この病変は特に脳回の頂部に強い．ほかに，小脳顆粒細胞の減少が認められた．一般臓器では，骨格筋の変性，萎果

図1のように的牛神経，ラセン神経節の神経細胞の保持は良好であり，蛸牛神経には脱髄や軸索変性などの明
らかな異常所見はみられなかった．蛸牛管の構造は保たれ，蛸牛の有毛細胞も保持されていた．わずかに血管条の組織が粗となっていた（図2）が，MELASの脳血管で報告されているような異常血管は認められなかった．

縮，心筋のびまん性線維化，膵臓のびまん性線維化とランゲルハンス島の萎縮などの所見が認められた．
症例2 52歳（死亡時）男性．家族歴：母方叔父（2人），母方叔母の子に糖尿病，母の白血球mtDNAには
3243変異（−）
現病歴：37歳時，糖尿病と診断される．40歳時，難聴．42歳時，糖尿病のコントロールが不良となる．49
歳，るい疫が著明で，言語障害，歩行障害，運動失調，痴呆が強くなり，国立療養所犀潟病院に紹介された．脳CT・MRI検査：びまん性脳萎縮で，白質には多発性ラクネ（＋），淡蒼球の石灰化（＋）．筋生検：RRF（＋），
SSV（十），mtDNA3243点変異（＋）が認められ，MELASと診断された．その後，精神的不穏，暴力行為，夜間排掴＊国立療養所犀潟病院神経内科♯＊ 国立療養所犀潟病院神経病理

−101−

図1
HE染色，Ⅹ14 血管条はやや粗であるが，蛸牛管の有毛細胞は保持されている．

Keams−Sayre症候群のl例で内耳の変化が報告され，ラセン神経節細胞の大部分が変性脱落していた．今軌検
索した症例ではこのような変化はみられず，また，
MELASの脳病変の原因とも推定されている血管変化もみられなかった．
結論

MELASの内耳は光顕レベルでは異常が認められない．
今後，電顕レベルの検討をする必要がある．
研究の意義
図2
貼染色 X145 ラセン神経節と的牛神経．神経細胞と有髄神経はきちんと保持されている

MELASの発症病理機序については未だ明らかではな
いため・各臓器の変性機序について検討することが重要である・特に筋症状と聴力障害との関係を明らかにする
ことは筋障害の本質を追究するためにも重要である．

考察変異，欠矢など種々のmのNAの異常で聴力障害が報告されている・それらは，臨床的に感覚性難聴とされているものの，その障害部位，障害機序についてはほとん
ど報告されていない・因みに，mtDNA1555のA→G点
変異はaminoglicoside系抗生物質により内耳障害を生じるといわれmtDNAI555点変異では的牛有毛細胞の脱落とそれによるラセン神経節の変性，脱落，が報告され

文

献1）OhamaE，OharaS，IkutaF，TanakaK，NishizawaM，
MiyatakeT：Mitochondrialang10PathyincerebralbIood
VeSSels ofmitochondrialencephaIomyopathy（MELAS）．
ActaNeuropathol・，74‥226−233，1987．

2）HutchinTP，Cortopassi，G．A∴Mitochondrialdefbctsand
heanngIoss・CMLS，Cell・Mol・Liftている・また，老化にはmtDNAの異常も関係しているとされるが，老人性難聴では的牛有毛細胞の脱落が生じるとされている・ミトコンドリア脳筋症では唯一，

Sci・，57＝1927−1937，

2000．
3）Lindsay，J・R・，Hinqjosa，R・：Histopathologicftaturesofthe
inner ear associatedwith Kearns−Sayre syndrome．

Arch・OtolaryngoL，102：747−752，1976．

−102−

ミトコンドリア異常症における細胞死とその抑制系の検討
桃 井 真里子■
研究協力者

森雅 人■ 永 井 真由美■ 山 形 崇 倫■
諏 訪 清 隆◆ 野 崎 靖 之● 斉 藤 茂 子

背景・目的11％から41％に用量依存的に増加していた（図2）．チト

我々はこれまでMELASにおける遺伝子異常の解析1），
MELAS患者におけるDCAの効果2）などを報告してきた．

クロームCを加えた検討では加えない場合と変化はなかった（図3）．

近年，ミトコンドリアにはエネルギー産生の場としての機能の他にアポトーシスにおける関与が明らかとなった・
多くの進行性の神経筋疾患において細胞死は基本的な細胞病態であり，細胞死の抑制は治療法開発のための重要な課題と思われる．そのミトコンドリア機能障害である
MELASにおいてもアポトーシスは病態の形成に大きく関与していると思われる．しかし，これまで3243A→G生繹事（発）
tOO

80

60

■くI

ZO

0

6

12

24 （■t〉

図1各クローン毎の生存率の変化
縦軸に生存率，横軸に培養液変更後の時間を示した．変異mtDNAの含有量が80％の細胞でのみ細胞死が誘導され12時間で約40％，24時間で約10％の生存率であった．
0％；変異mtDNA0％のクロpン．50％；変異mtDNA50％のクローン．70％；変異mtDNA0％のクローン．80％；変異mtDNA80％のクロpン．
（＋）；グルコース含有培地．（−）；グルコース欠乏培地．

変異を持つMELASにおけるアポトーシスの検討は少なく，その関与は十分に証明されていない．ミトコンドリ
ア異常症における細胞死の検討はその病態解明さらには治療法開発の重要なポイントと考えられる．MELAS筋細胞を用いて細胞死の存在，そのプロセスを証明し，その生胃事（％〉
100抑制の検討を行い，治療の可能性について検討した．また，ミトコンドリア異常症患者のDCA治療の効果について検討した．

80

60

■

、

■0

1．MELAS筋細胞における細胞死の検討
方
法

20

0

MELAS患者よりインフォームドコンセントのもとに採取した生検筋細胞を0ri．SV40DNAにて不死化し，クローン化して用いた．細胞を通常培地による培養からグルコース欠乏培地に変更して細胞死を誘導した．細胞死はトリバン
プルー分染にて生存率を計数し比較した．誘導された細胞死に対して経時的に抗活性型Caspase−3，8，9，12抗体による蛍光抗体染色とTUNEL法を用いてアポトーシスプロセ
スを検討した．また，DCAを培養液に濃度を変えて加え，

0

6

12

24 （書冊〉

図2DCA添加によるの生存率の変化
縦軸に生存率，横軸に培養液変更後の時間を示した．変異mtDNAの含有量が80％の細胞を用い，グルコース欠乏培
地にDCAを加え，生存率の変化を観察した．12時間後の生存率が40％から60％に増加し，24時間では50pg／mlでは無添加の細胞と変わらなかったが，100pg／ml以上では30一【0％に生存率が増加した．
培養液中のDCA濃度：DCA5050pg／ml，DCAlOOlOOpg／mI，
DCA250250pg／ml，DCA500500pg／ml
生存事（％）
100

生存率を計測し，DCAの細胞死に及ぼす効果を検討した．

80

60

結

果

■○

1．グルコース欠乏条件では細胞内の変異mtDNA量が約80％以上のクローンで24時間後の生存率が11％であった・
その他のクローンは約80〜90％であった（図1）．2．誘導された細胞死プロセスの検討では，6時間，12時間でTUNEL陽性のアポトーシス細胞が確認された．また，1．5
時間でチトクロームCが細胞質に染色され3時間で活性型Caspase−9が，4．5時間で活性型Caspase3が染色された・
3．DCAを加えた検討では24時間後の生存率が無添加の

〜0

＼・

0

図3チトクロームC（cytc）添加によるの生存率の変化
縦軸に生存率，横軸に培養液変更後の時間を示した．変異mtDNAの含有量が80％の細胞を用い，グルコpス欠乏培地にcytcを加え，生存率の変化を観察した・
生存率の変化は無添加の細胞と比較して明らかではなかった．
培養液中のcytclOlOpg／ml，CytC5050pg／ml，CytClOO
lOOpg／ml，CytC500500pg／ml

・自治医科大学小児科学
−103−

考
察
グルコース欠乏条件によりMELAS筋細胞において細われる知能，難聴には改善はみられず，副作用と思われるものとして肝機能障害，末梢神経障害，低カルシウム血症が認められた．MELASの病態に対する作用機序は不明であるがMELASの急性進行性の臨床症状には明らか

胞内mtDNA変異量は約80％以上の細胞で選択的に細胞死は誘導された．この閲値効果はこれまでの臨床的な検討の報告ともよく合致していた．ミトコンドリア見常症に有効であり，コントロールスタディが困難であり，さらに長期的な効果，副作用を検討していく必要があるとにおける細胞障害プロセスには1．活性酸素による障害，
2．ノ汀P減少による障害，3．アポトーシス，4．代謝異常によ思われた．また，状態の悪化した例では急激な状態の悪化を招く可能性があり，治療不応例，死亡例などの検討が必要と思われた．

る増加物質による障害などが考えられるが，今回の細胞
死のプロセスにはチトクロームC放出とそれに続く，
Caspase−9，−3の活性化が伴っていた．また，DCAはこの細胞死を完全に抑制することはできないが，間接的に抑制している可能性が示唆された．ミトコンドリア異常症の細胞死の検討はミトコンドリアが細胞内へテロプラス
ミーであり，散発的な細胞死は同定しにくいなどJ〃Vfv ）研究の意義・今後の展望
MELAS筋細胞におけるグルコース欠乏条件での細胞死は，約80％以上の変異mlDNAを含むクローンにおいて誘導され，TUNEL陽性のミトコンドリアを介したアポトでは困難である．この実験系では，細胞内変異mtDNAの割合と細胞外条件を自由に設定でき，各種条件による細ーシスの経路が存在することが証明された．MELAS病態解明における細胞死とその抑制系の検討は必要不可欠であり，今回我々の用いた筋細胞クローンの実験系はその胞死闘値の変化や細胞死の抑制系を検討でき，MELAS
病態の解明には有用な系であることが証明できた．

解明に有用と思われた．さらにこの細胞死の抑制系の検討が治療の可能性を兄いだすものと期待される．

2．ミトコンドリア異常症におけるDCA治療の効果4）
症例・方法

また，MELAS患者へのDCA治療では6年間の長期にわたり脳卒中様発作，頭痛，けいれん，易疲労といった症状は著明に改善した．しかし，電気生理学的検査，難聴，
知能といった慢性進行性の病変には効果は乏しいと思わ4例のミトコンドリアDNA3243A→G変異をもつ
MELAS患者2），1例の8993T→G変異を持つ重症Leigh脳症の4か月の男児3）にDCA治療を行った．DCAは徳島大学小児科方式に準じて，50mg／kg／回を12時間毎に内服し，半量に減量，以後，血中濃度，乳酸値を指標に維持量を決定した．症状の評価に加え，血液検査，知能検査，頭部画像所見，脳波，末梢神経伝導速度，聴力検査などを行い，効果の判定と副作用の検討を行った．

れた・DCAはMELAS患児において明らかにQOLを改善しており，早期から比較的安全に使用できる薬剤と考えられた・一方，状態の悪化したLeigh脳症の患児で死亡した例を経験し，DCA治療を効果的に行うために治療不応
例，死亡例などの大規模な検討が必要と思われた．
文結果1）KobayashiY，MomoiYM，rIbminagaK，ShimoizumiH，
NiheiK，1bnaglSaWa M，Kagawa YlOhta S：Respira−tion−dencientcellsarecausedbyaslnglepolntmutation

MELAS4例では4年2か月から6年1か月の投与期間に4例とも臨床症状の改善と乳酸・ピルビン酸値の低下がみられた．2例において治療中に脳梗塞様発作がみられた．
いずれの例も発作出現前に血中乳酸，ピルピン酸の増加があり，髄液中の乳酸，ピルビン酸値は高値であった．
しかし，いずれの例においても頭部画像所見，脳波，難聴，知能検査には改善がみられず，徐々に悪化していた．

献inthemitOChondrialtRNA−Leu（UUR）geneinmitochon−
drial myopathy，enCephalopathy，1actic acidosis

andStrOke−like episodes（MELAS）．AmJ Hum Genet49：
590−9，1991．

2）SaitohS，MomoiYM，YamagataT，ImaiM：Effectsof

DCAの副作用と考えられるものとして全例に軽度の肝機能障害と1例に末梢神経障害，3例に低カルシウム血症

dichloroacetateinthreepatientswithMELAS．Neurologyが認められた．重症Leigh脳症の乳児では治療前より肥大型心筋症を認め，循環動態が不良であり，人工呼吸管理のもと使用した．一時，意識状態が改善したが開始3日後に死亡した．

3）斉藤茂子，桃井真里子，中村美樹，中島尚美，市橋光，

50：531−4，1998．

水口雅：ミトコンドリアDNA塩基番号8993の一塩基置換の相違により異なる臨床経過を呈したと考えられたLeigh脳症の2例．日児誌104：53−5，2000．
4）MoriM，NagaiM，ⅥmagataTMomoiYM：Longterm

考察
DCAはMELASの治療薬として比較的長期的にも安定した効果があると思われた．しかし，慢性的な経過と思ー104−

effectsofDCAtherapyforpatientswilhMELAS．Bmin
andDevsubmitted．

Ⅵ．筋発生・分化

筋形成における細胞問相互作用とその制御機構
瀬 原 淳 子●研究協力者

目栗 崎 知 浩● 黒 原 一 人● 増 田 亜 紀●
若 月 修 二● 白 壁 恭 子● 内 田 光 で方法および結果

的

1）メルトリンα遺伝子のマウス個休における役割

筋形成は，中胚葉由来の多能性幹細胞から筋芽細胞

メルトリンαはマウス発生過程において筋，骨，血管，肺等様々な組織で一過的に発現し，これらの細胞の分化や形態形成に何らかの役割を果たしていることが予想された．メルトリンαに対する抗体を得て，この膜蛋白質が生じ，それが互いに融合して筋管を形成する過程であり，この過程の分子機構を知ることは，筋ジストロ
フィーの解明，治療への分子生物学的基盤をなすものであろう．

が筋再生時にも誘導されることがわかった．また，メルトリンα遺伝子の個体における機能を探るためにその近年，MyoD，myOgeninをはじめとする4つの筋分化誘導国子の cDNAが相次いで単離され，これらのノックアウトマウスを作製し，その解析をおこなった．
まず，メルトリンα遺伝子のノックアウトマウスに関しては，褐色脂肪組織の減少がみられ，それらの組織に隣接する骨格筋の形成が低下していることが観察されることから，メルトリンαがそれらの組織構築に共通した過発現によって非筋細胞が筋芽細胞に質的に変化すること，さらに多くの筋特異的に発現する遺伝子の活性化にこれらの遺伝子産物が関与していることが示された．
しかし，このような転写・翻訳の制御だけでは秩序だった筋形成や再生過程を説明することは出来ない．

程を制御しているものと考えられた．さらにこれらの組織では，間葉細胞が組織形成部位に遊走したのち細胞凝集がおこるが，ノックアウトマウスでは，細胞凝集に先行する組織形成部位での細胞増殖が著しく減少することがわかった．これらのことから，メルトリンαが褐色脂肪組織およびその周辺の筋組織形成の際の細胞増殖の制翻訳後制御，特に，タンバク質のリン酸化などの修飾とともに，タンパク質のプロセシングによる機能ドメ
インの活性化とその制御が，これらの過程に関わる多くの遺伝子の働くタイミングや細胞特異性の決定に重要な役割を果たしていることがわかってきている．
私達はそのような役割を担いうる遺伝子群のひとつ，

御に関与していることが示唆された．
2）メルトリンβ遺伝子の機能と役割
メルトリンβは後根神経節など末梢神経の生ずる領域，
及び分化後の胎仔・新生仔期の筋細胞で強い発現が見らADAM（aMetalloproteaseandDisintegrin）ファミリーに関する研究を行っている．ADAMファミリーは，メタロ
プロテアーゼドメイン・ディスインテグリンドメインを有するユニークなタンパク質群で，このファミリー

れ，メルトリンαとは異なる役割を果たしていると考えられた．そこでまず，個体におけるメルトリンβの役割を調べるため，メルトリンβ遺伝子を単離し，メルトリに属する可溶性分子へど毒ディスインテグリンは血液凝固阻害活性を，膜タンパク質ファーティリンはディ
スインテグリンドメインを介して受精に関与することが知られる．一方，同じファミリーに属するmCEの
メタロプロテアーゼは膜型TNFα前駆体を可溶化型にンβ遺伝子ノックアウトマウスを作成した．その結果，メルトリンβ遺伝子のノックアウトマウスは，新生仔の段階で80〜90％が死んでしまうことがわかった．その変換し，ショウジョウバエのneurogenicgeneクズバニ
アンはNotchあるいはDeltaを切断活性化するとの報解析から，これらのマウスでは形態形成に異常がみられた．メルトリンα・βはいずれも細胞外にプロテアーゼ

告がなされ，これらは，細胞間シグナリングをプロセ
シングという形で制御する新しいタイプの分化因子とドメインをもつ膜蛋白質であり，なんらかの基質の分解制御がこれらの形態形成に必須であることが考えられる．

見なすことができる．
私達は，筋形成機構の研究のなかでADAMファミリーに属する遺伝子群メルトリンα，β，γをクロー

メルトリンβ遺伝子の場合，そのノックアウトマウスの表現型や発生過程における発現パターンの類似性から，ニングし，形態形成におけるこれらの遺伝子の役割を探るとともに，これらの遺伝子産物のプロテアーゼとしての機能を解析した．

心臓形成，神経筋接合部の形成や神経分化に関与することが知られる細胞膜貫通型増殖因子でErbBリガンドのニューレギュリン（NRG）が，メルトリンβの基質となりうる可能性が考えられたので検討した．NRGのプ
ロセシングが野生型メルトリンβを細胞内に共発現する

・京都大学・再生医科学研究所・再生増殖制御学分野

事により増強し，プロテアーゼ活性を持たない変異型メー107−

ルトリンβを共発現すると抑制されること，神経特異的
なNRGβを効率良く切断するのに対しNRGαの切断は効率が悪く，メルトリンβは基質特異性のあるプロテアーゼ活性がみられることがわかった．さらに細胞表面のNRGの発現が，野生型メルトリンβの共発現によって消失し，メルトリンプロテアーゼがいわゆるectodomein sheddingに関与しうることを示した．以上
メルトリンβがNRGあるいは類似リガンドのプロセシ
ングを制御することによって組織形成にかかわることを示唆した．

今後メルトリンα・βのダブルノックアウトマウスを作成することにより，それを検証していきたいと考える．
文

献1）Shirakabe K，WakatsukiS，KurisakiT，and Fujisawa−
Sehara A：Role ofMeltrin

βinthe processing ofneureguIin・Jβわ／．C方emり276．，9352−9358，2001．

2）Eto K，Puzon−McLaughlin W，Sheppard D，FLtiisawa−
Sehara A，Zhang X−P，and Takada Y：The RGD−
independentbindingofintegrin

α9βltotheADAM−12

and−15disintegrindomainsmediatescell−Cellinteraction．

考察・今後の展望

Jβわ1C力em．，275，34922−30，2000．

以上のように，メルトリンが発生後期の細胞増殖や組絨形成を制御する因子であること，その際メルトリンβの場合は，そのプロテアーゼドメインの機能が重要であることを明らかにすることができた．
骨格筋では，メルトリンβが強く発現しているにも関わらず，そのノックアウトマウスでは表現型を兄い出すことができなかった．また，メルトリンαの場合も，その表現型を示す部位は限局していた．これは，メルトリ
ンαおよびβが重複していることによる可能性もある．

ー108−3）BomemannA，KuschelRandAtsukoF可isawa−Sehara：
AnaIysisoftranscnptexpressionofmeltrin

αinnormaI，regeneratlng，and denervated rat muscle．J 肋sc／eReT．
CeJ／肋JJ／ 21，475−80，2000．
4）Kurohara K，Matsuda Y，Nagabukuro A，Tsuji A，Amagasa T and Fujisawa−Sehara A：Chromosomal
mappingofthemeltrinβ（ADAM19）gene，CIoningand
analysisofitsregulatoryregion・Biochem・Biqpj甲・Res・
C（｝m椚〟仇，270，522−527，2000．

細胞成長因子に着日した筋肉再生メカニズムの解明
野

澄

晴●
■

●

暮

■
●

ガ貯

●

光伸

●

倉松

■

板西

●

博司

事
■

一†

●

●

●

考

的

通常の状態で形成される筋肉の量はある一定に保たれているが，刺激などによりその量は増減する．従って，筋肉の量を調節するメカニズムが存在することが示唆されている．しかし，そのメカニズムはまだほとんどに解明されていない．そこで，本分担研究では，筋肉の量を調節する因子として働くことが示唆されている細胞成長因子であるMyostatin（GDF8）に着目し，その機能を解明することを試みた．Myostatinのノックアウトマウスにおいては，筋肉の形成が促進されることが報告されているが，そのメカニズムはまだ解明されていない．そこで，発生にともなうMyostatin遺伝子発現を解析した・また，肉牛において発見された点突然変異によるMyostatinの作用を解明する目的で，同じ点突然変異を持つMyostatinを発現するトランスジェニックマウスを作製し，筋肉の変化を解析した．
方法と結果
Myostatinの発現をinsitu hybridization法などにより調べた．ニワトリMyostatinの点突然変異タンパク質（C313Y）をコードするcDNAを作製し，CAGエンハン
サー・プロモタ一により発現するトランスジェニックマ
ウスを作製した．得られたマウスについて，表現型を解析した．
Myostatin遺伝子の発現は，体節に観察され，肢芽の発生に応じて肢芽内に移動し，筋肉形成に関与することがわかった．肢芽においては筋芽細胞に発現しているが，総ての細胞ではなく，表皮に近い細胞に特異的に発現していることがわかった．発生の進行にともない，その傾向は顕著になった．
一方，トランスジェニックマウスは体重が約30−40％
増加しており，その原因は筋肉量の増加であると予想された．筋肉切片を用いて解析した結果，筋肉量の増加は筋細胞の肥大化よりも筋線経の増加が原因であることが示唆された．

章啓

●

●

江山

泰森

▲I

●

美孝勉

寿
真

目

岡野

西山濃

研究協力者

地

察

Myostatinは筋肉の形成を抑制する作用があることが示唆されていたが，発生の初期から発現し，筋肉形成にも関与していることが示唆された．しかも，筋肉細胞に総て発現していないことから，何らかの因子により発現が制御されている可能性が示唆された．従って，発生初期のMyostatinの役割は，筋肉の形成を一部抑制すること
により筋肉の形を作ることに関与している可能性がある．
一方，MyostatinC313Y型突然変異トランスジェニック
マウスの解析により，筋肉量が増加することから，この突然変異型はドミナントネガティティプ型として作用していることが示唆された．この点突然変異のタイプでは，筋繊維の数が増加し，筋細胞の大きさは変化なかった．
このことは，肉牛においても観察されており，マウスの結果をサポートするものである．さらに興味ありことに，
同じドミナントネガティティプ型であるプロセッシング
異常Myostatinの場合は，筋細胞の肥大が生じており，今回のケースとは異なっていた．Myostatinノックアウトマ
ウスでは，両方の現象が生じていることから，筋細胞肥大と筋繊維増加は別々にMyostatinにより調節されていることが示唆された．このような現象を説明するために，
図1のようなモデルを考えた（図1）．最近の研究から，Myostatinの受容体は，aCtivintypelIreceptor（ActRIIB）
であり，fbllistatinが結合し，その作用を抑制することが報告された（LeeSJandMcPherronAC．Proc．Natl．Acad．
Sci．USA，98：9306−11（2001））．正常なMyostatinは，筋肉細胞（筋芽細胞）の受容体に結合し，筋細胞の肥大と筋線経の増加を抑制するシグナルを細胞内に伝達する．
Myostatinが無い場合は，どちらのシグナル伝達も抑制されず，筋肉は増大する．点突然変異型のMyostatinは受容体には結合し，筋肉細胞肥大化を抑制するシグナルは細胞内へ伝達できるが，筋繊維増加を抑制するシグナルを細胞内へ伝達できないと考えられる．一九 プロセッシ
ング異常型Myostatinの場合は，逆に筋肉細胞肥大化を抑制するシグナルは細胞内へ伝達できないが，筋繊維増加を抑制するシグナルを細胞内べ伝達できると考えられる．

・徳島大学工学部生物工学科＊＊徳島大学歯学部矯正学教室…・徳島大学ゲノム梯能研究センター＊…りIl崎医大学分子生物学教室−109−

今後の展望Myostatinに突然変異をもつヒトについての報告があり，そのヒトは筋肉が増大している以外は健康であることが報告されている．従って，ドミナントネガティブ型のMyostatinを用いて迫伝子治療を行なうことができる
可能性がある．このことをまずモデルマウスを用いて検証することが必要である．そこで，筋ジストロフィーのモデルマウスを用いて，ドミナントネガティブ型のMyosta血recep10r：ActivinreceptortypcIIB，AlU
BindingproIcin：払uiStatin

図1筋肉形成におけるMyosladnの役割のモデル
Myostatinの受容体はactivin受容触ypellBとAlk5である
ことが報告されていることおよびこれまで得られた情報を基に，受容体を介したMyoslalinの作用機序についての単純なモデルを図示した．正常なMyostatinが受容体に結合した場合は，hypertrophyもhyperPlasiaも抑制される．Myostatinがない場合（KOtype）は，hypertrOPhyとhyperPlasiaが促進される．点突然変異型ドミナントネガティブ型（DN（C313Y））が受容体に結合すると，hypertrophyは抑制されhyperplasiaは促進される．一方，プロセッシング異常型ドミナントネ
ガティブ型（DN（GLDR））が受容体に結合するとhypertrOPhyが促進されhyp叩1aSiaは抑制される．

Myostatinの効果を調べる予定である．一方，筋量を調節するメカニズムを解明するためには，Myostatinにより調節されている遺伝子群を同定する必要がある．そこで，
マウスDNAマイクロアレイなどを用いて，正常およびト
ランスジェニックマウスからmRNAを抽出し，両者に発現していない遺伝子について解析することにより，目的の遺伝子を同定できる可能性がある．
文献1）泰江華博，西松伸一郎，波野 勉，森山啓司，野地澄

晴：骨格筋形成におけるマイオスタテンの役割，生体の科学，52：256−260，2001．

−110−

筋原線維形成制御因子の役割とその変異に起因する疾患の探索
大日方

●

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和征

利山野

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毛中西

樹勉則哉

成

藤上岡中

日

佐川花埜

研究協力者

昂●

質が主要な役割を果たすことを既に報告している．し的

かし，ほ乳類では心筋型C−蛋白質は心筋でのみ寄与す
ることを我々は明らかにした文献1）．マウス心筋型C一蛋
白質の研究過程で，この蛋白質のC端側のコネクチン
結合に関わる領域（ドメインIX）に10アミノ酸の挿入配列を含むC−蛋白質変異体を発見した．この挿入

横紋筋筋原線経の形成と維持には，アクチン・ミオ
シン相互作用が重要で文献2）アクチン結合蛋白質，ミオシン結合蛋白質が深く関わっている．これらはアクチンおよびミオシンの分子集合の制御，生じた繊維の横紋構造へ構築や維持に重要な役割を果たす．本研究では，アクチン結合蛋白質であるコフイリン，ミオシン
結合蛋白質であるC−蛋白質に着日した．
C＿蛋白質は横紋筋に特異的なミオシン結合蛋白質で，ミオシンのフィラメント形成に関わるが，コネクチン
とも結合し，ミオシンフィラメントをサルコメア内で配列以外は既知のマウス心筋C一蛋白質と構造は完全に一致しており，この変異体は単一の心筋C−蛋白質遺伝
子からRNAの選択的スプライシングにより生ずるも正しく配置させる上でも重要な役割を果たすと考えられる．近年，ヒト心筋型C一蛋白質遺伝子の変異が家族性の肥大型心筋症の原因の一つであることが知られ，筋の機能維持での重要性が注目されている．C−蛋白質の分子の機能ドメイン，分子機能はまだ未解明の点が抽出したRNAに対してRT−PCRを行って発現を解析した結果，挿入配列を含むC一蛋白質は主に心房に発現し，加齢に従ってその発現量が増えることがわかった．

のと考えられる．挿入配列の前後，および挿入配列内をコードする塩基配列をプライマーにして，心筋から多い．一方，コフイリンは細胞内で活性制御を受けながらアクチンの集合およびアクチン絨経の動的な再編成を担う文献】）最も重要なアクチン結合蛋白質として，
近年，とりわけ注目されている．我々は，これまでヒトを含め哺乳類には非筋組織に広く分布する非筋型コ

また，C一蛋白質のN端側にGFPをもつ融合蛋白質を発現するように設計された発現ベクターを培養心筋細胞にトランスフェクションして，細胞内で発現された
蛍光C一蛋白質の動態を解析の結果，挿入配列を含まな
いC＿蛋白質は正常に横紋構造に組み込まれたが，挿入配列を含むC一蛋白質は細胞内に一様に拡散して観察さフイリンに加え，筋で顕著に発現する筋型コフイリン（以下MCFと略す）の存在を見出している．MCFが筋原繊維の形成過程でのアクチン絨維形成の制御に重れ，横紋構造へは組み込まれにくいことがわかった．
また，バキュロウイルス発現系を用いて，挿入配列を含まないC−蛋白質および挿入配列を含むC−蛋白質を作成してその機能を調べた結果，挿入由列を含むC一要な役割を果たすと考えている．
本研究では，特にこれらの蛋白質が筋原繊維の形成と維持にどう関わるか，その分子機構を明らかにしつ

蛋白質は，ミオシンへの結合能が低いことが認められた．挿入配列を含むC−蛋白質の発現が起こる老齢期の心筋では機能的，構造的脆弱化がもたらされる可能つ，これらの変異や欠矢が筋原繊維にどのような障害をもたらすかを探り，これらの変異に起因する筋疾患の可能性を探求することを目的とした．

性がある．
2．筋原線経の形成と維持におけるコフイリンの役割とその変異に起因する障害

方法と結果
1．ミオシン結合蛋白質（C一蛋白質）の変異が筋原繊
維形成に及ぼす影響について
ニワトリの骨格筋形成の初期過程では心筋型C−蛋白■千葉大学理学部生物学科
傷●北里大学理学部分子発生学講座＝国立精神・神経センター（1）ほ乳矧こおける筋型コフイリンの発現特性
マウス胎児での筋分化とコフイリンの発現の関係を
in situハイプリグイゼーション法で解析した結果，筋分化が開始される筋節および肢芽の筋形成域に，筋分化因子（myogenin）や筋原練維蛋白質（トロボニン）
と共に筋型コフイリン（MCF）が発現されることを見出した文献4）．培養骨格筋細胞の免疫細胞化学的手法による解析の結果，増殖期にある筋芽細胞には非筋型コー111−

フイリン（NMCF）しか発現しないが，筋分化した筋管でMCFの発現が開始されることが認められた．こ（2）筋型，非筋型コフイリンとアクチンとの相互作用の比較

れらの観察は，筋分化に伴って起こる筋原線維形成に成熟筋でMCFのみが存在する生理的意義を推測するために，大腸菌発現系で作製した組み換え体コフイリン（MCF，NMCF）を用いて，それぞれの骨格筋アクチンとの相互作用の度合いについて共沈実験により定量的に解析した．F−アクチンにMCF，NMCFを単独で，あるいは両者を同時に加えて反応させた後，超遠心し，F−ア
クチンに結合して沈殿してくるコフイリンの量を調べると，沈殿に見られるコフイリン塁はNMCFに比して，MCFの方が多く見られた（図1）．このことは，F−アクチンに対する結合能はMCFのほうがNMCFより高く，
MCFがより強く，効率的にアクチンに作用すること，
即ち機能的に重要であることが推測された文献！）

MCFが深く関与することを強く示唆している．骨格筋と心筋の発生過程でのMCFとNMCFの発現特性をノーザンプロットで調べた結果，骨格筋では発生途上の幼若期には2種のコフイリンとが共存するものの，生後の成長過程でMCFのみに限定されることを確認した文献4）・しかし，心筋では発生を通じてMCF，
NMCF両者が共存し続ける．このように，心筋と骨格筋とでは関与するコフイリンに違いがある．MCFの欠損や変異は成黙した骨格筋に特有の障害を導く可能性が想定された．

F・aCtin（4pM）＋MCF（4LIM）＋NMCF（4pM）︵≡ユ︶−ddJOdコSuこ0

F・aCtin（4LIM）＋MCF（2LIM）＋NMCF（2pM）

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図1共沈法による筋型，非筋型コフイリンとF−アクチンとの結合の解析
最終濃度4LLMのF−アクチン（骨格筋α−アクチン）に筋型コフイリン（MCF）と非筋型コフイリン（NMCFを2〟Mずつ（計4上tM）あるいは4〟Mずつ（計8〝M）を反応させた後，超遠心によりF＿アクチンを沈殿させ，沈殿と上清にあるMCF，NMCFを各コフイリン（CF）に特異的な抗体を用いて検量した結果を示す．
MCFが優先的にアクチンに結合し．共沈されることがわかる．

（3）筋型コフイリン（MF）欠損が骨格筋にもたらす障害

マウスの骨格筋では成体でもほとんどこの様な異常は

MCFの働きをほ乳類の個体レベルで明らかにするた

観察されなかった（図2，左図）．電顕レベルの観察では，

めに，MCF遺伝子のコード域を相同組み替え法によりLaCZとneoRで置き換えてMCF欠損ES細胞（MCF＿／一細胞）を作成した．このES細胞をマウス胚（胚盤

新生児期の骨格筋でもサルコメア形成の異常が所々観察され（図3A），生後数カ月を経た骨格筋では完全な胞）に注入して仮親で発生させ，MCト／一細胞をもつキメラマウスを作成した．MCF−ん細胞に由来する骨格筋をⅩ−gal染色より顕在化し，その部位を組織学的に解析した・キメラマウス成体の骨格筋でMCF（−／一）に由来する細胞が集中する敵城では，筋絨経の径の極端な大小不同や，単核細胞の増加，結合組織の増加など，筋ジストロフィー症筋に類似した顕著な筋繊維の壊死・再生が観察された（図2，右図）．新生時のマウスでは組織
学的には大きな障害は見られなかった．また，MCF遺伝子をヘテロに欠損する細胞（MCF（＋り）を持つキメラマ

筋原紙経をもつ筋細胞と，横紋筋原繊維をほとんど含
まない大きなダメージを受けた筋細胞とがキメラ状に混在しているのが見られた（図3B）．MCFの欠損により，筋原繊維の形成や維持機構に異常をきたし，その結果，筋繊維に重篤な障害を与えるものと考えられる．新生児ではMCF（イ・）細胞のキメラ率のかなり高い
骨格筋においても筋原繊維の障害は軽微であった．
従って，生後の骨格筋の成長過程にMCFが不可欠になってくると考えられる．また，これらの結果から，
MCFが実際に骨格筋組織において重要な役割を担っていることが明らかとなった−112−

ン（MCF）を欠く骨格筋においても筋原繊維の障害が軽微なこと，MCF欠損によるキメラマウスの筋の異常が，NMCFが存在しない成熟した骨格筋で特に顕著に現れるという結果は，NMCFがMCFの代替機能をある程度果たしていることを示唆する．しかし，MCFがより有効にアクチンフィラメントに作用するという結果を考えると，MCFの欠損や変異が筋に影響を及ぼす影響は大きいことが推測され，ヒト
図2 キメラマウスのMCF（＋／−）細胞（左図）およびMC叶／−）細胞（右図）が集中している領域の筋の横断組織像．MCF（−／−）細胞由来の骨格筋では筋繊維の径の極端な大小不同や，単核細胞の増加など，筋ジストロフィー症に類似した筋繊維の壊死・再生像がみられる．

を含めては乳類では筋型コフイリン変異に起因する筋疾患が存在するる可能性を示唆している．成熟したマウスではMCF欠損骨格筋ではなぜ筋原繊維の著しい崩壊が起こるかその分子機構が興味深いとこ
ろである．
今後の展望
1）マウスで観察された心筋C一蛋白質変異体およびその発現特性に関する事実がヒトの心筋での問題に示唆を与えるかもしれない．今後の検討課題となろう．
2）ヒトにも筋型コフイリン，非筋型コフイリンが存在し，それらの発現パターンはマウスの場合に似ていることが報告されている．本研究で改めて筋の形成と維持におけるコフイリン（とりわけ筋型コフィー」
ン）の重要性が明らかになった．筋の形成と維持におけるコフイリンの分子機作（活性制御も含め文献3））の解明が重要な課題となってきた．また，本研究はコフイリンにおける変異に起因する疾患の存在の可能性を示唆していると思われる．
文l）KurasawaM，SatoN，MatsudaA，KoshidaS，TotsukaTand Obinata T：Difftrentialexpression ofC−prOtein

図3 MCF（−／−）細胞をもつキメラマウス骨格筋の電子顕微鏡
像．A図は生後10日，B図は生後6月齢の骨格筋である．
生後10日では所々に横紋サルコメアが明確に形成されていない部位が見られる．生後6月齢では完全な横紋像をもつ筋細胞の隣に横紋筋原繊維を欠く筋細胞がみられる．肪
原紙経の崩壊の程度は一律でなく，ミオフィラメントが並列している場合，横紋像が散在する場合も見られる．バーは4〝mを示す．
考献

isofbrmsin deveIoplng and degeneratlng mOuSe
Striataedmuscles．Muscle＆Nerve22：196−207，1999．
2）

Soeno Y，Shimada Yand Obinata T：BDM（2，3−
Butanedionemonoxime），aninhibitorformyosin−aCtin
interaction，SuPPreSSeS myOnbrillogenesisin skeletal
muscle ceHsin culture．Cell Tiss．Res．295：307−16，
1999．

察

1）マウスでは単一の心筋C−蛋白質遺伝子から，2つ

3）MaekawaM，IshizakiT，BokuS，WatanabeN，F可itaA，のC−蛋白質が作られること，その内の一方は，重要

Jwamatsu A，Obinata T，Mizuno K，Narumlya S：

な機能部位に挿入配列を含み，コネクチンやミオシ

Activation ofLIM−kinasefor cofilin phosphorylation

ンとの反応性が弱いことを見出した．老齢マウスのby Rho−aSSOCiated kinasein Rh0−mediated actin

心筋（特に心房）では，挿入配列を含むC一蛋白質のreorganization．Science285：895−898，1999．

発現上昇するので，心筋の機能低下と形態的変化が

4）

MohriK，Takan0−OhmuroH，NakashimaK，Hayakawa

生ずる可能性がある．老齢マウスやラット心筋ではK，EndoT，HanaokaKandObinataT：Expressionof

微細形態に変異が起こるという報告がある．このこ

CO創inisoforms during developmentofmouse striatedととC一蛋白質の変化が関連するか興味深い．また，

muscles．J．MuscleResCelIMoti1．21：49−57，2000．

ヒトを含む他のは乳類でどうかも関心事となる．
2）コフイリンが筋原繊維の形成と維持に極めて重要で

5）毛利 蔵人，中島紀代子，細田敦子，佐藤成樹，大日方 昂：筋型コフイリンの分子機能 生体の科学あることを明らかにした．非筋コフイリン脚MCF）を発現している新生児の骨格筋では，筋型コフイリ

52，273−279，2001．

ー113−低分子量G蛋白質とMsxlによる筋細胞分化と脱分化の制御：
その筋再生への関与
芳子

恵暁

田木

徳鈴

ており，またC2細胞の分化の過程でも恒常的に発現していた．一方，TclOは骨格筋と心臓に高く発現しており．C2細胞の分化の過程で発現量が著しく増加した．
RhoTは心臓と子宮にほぼ特異的に発現しており，C2細胞の分化の過程では恒常的な発現がみられた．
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に発現している低分子量G蛋白質を同定して，これらの蛋白質が筋細胞分化の過程でどのような働きをしているかを明らかにすることを目的とした．
一方，最終分化をした筋管細胞は不可逆的に分裂を停止していると考えられていた．しかし私たちはマウス骨2448728
2：
持；SnLQ−⊃

，
≡

をup蛍

2

JQ＞コ

u濁し皿

と考えられるが，具体的にどの蛋白質がどのような働きをしているかはほとんど不明である．そこで本研究では，筋細胞に特異的に発現しているか，あるいは特定の時期￠で￠n芝

筋再生の過程では，筋原細胞あるいは筋衛星細胞が分裂して数を増した後に，細胞分化が起こり多核筋管細胞が形成される．この発生や再生における筋細胞分化の過程
では，低分子量G蛋白質が重要な働きをになっている

打﹂的個体発生における筋形成の過程，および成体における

剛●

智有

部越

日

藤

阿大

研究協力者

遠

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格筋細胞にSV401argeT抗原を発現させることにより，筋管細胞が再び細胞周期に入り細胞分裂をすること，すなわち脱分化をすることを明らかにしている．巌近，ホ

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メオドメイン蛋白質のMsxlによってもlargeT抗原と同様に骨格筋細胞に脱分化を誘導することが報告された．

〉
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しかし骨格筋組織内の成熟筋細胞においても脱分化を誘導することができるかどうかは不明である．そこで成熟筋細胞の脱分化の可能性について検討した．

5

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蚕軒 ∴
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方法と結果
（1）低分子量G蛋白質の筋細胞分化への関与
骨格筋細胞分化の過程でみられる細胞融合を始めとして，さまざまな細胞融合が起こる際には，細胞表層の融合する面に細胞突起が形成され これらの突起が細胞融合に重要な役割を演じていると考えられている．Rho
ファミリー低分子量G蛋白質のうちCdc42サブファミ
リーのCdc42とTclOはアクチン再構成を介した細胞突起の形成を誘導することが知られている．そこでTc10とそれに相同性の高い新規の蛋白質のcDNAをマウス
骨格筋細胞株C2筋管細胞cDNAライブラリーからク
ローニングLRhoTと名付けた．cdc42，TclO，RhdTの機能を知る目的で，さまざまな組織とC2細胞分化の過程
におけるこれらの発現をノーザンプロッテイングで解析した（図1）．Cdc42はさまざまな組織に普遍的に発現し＊千彙大学理学部生物学教室

図1さまざまなマウス組織とC2細胞の分化の過程および
C3HlOTl／2細胞におけるCdc42サブファミリー蛋白質の発現．
ノーザンブロッテイングでCdc42（A），TclO（B），およびRhoT（C）の発現のようすをみた．C2筋芽細胞（Mb）を分化培地に移して24，48，72，96時間おいた．96時間後までには最終分化をした筋管細胞（Mt）が発達した．TclOは48時間後以降発現量が著しく増加した．（D）はエチジウムブロマイドの染色による28S と18S rRNAの位置を示す．左側の数値はmRNAsのサイズ（kb）を示す．
これらの蛋白質を線維芽細胞（C3HlOTl／2とBalb／3T3）にトランスフェクトしたところ，いずれも細胞表層にそれぞれ特徴的な突起を形成した（図2jD．Cdc42は10LLm
程度のマイクロスパイク（フイロボディア）を形成したのに対し，TclOはより長い10−20上tmの突起を形成した．またRhoTは先端が膨化した20〟m以上の長く太ー114−

い突起を形成した．これらの突起は長さや形態が異なっ

アッセイにより示された（図3）．一方，RhoDはN−ているものの，いずれもローダミンフアロイジンで染色

WASPに結合しなかった．またドミナントネガティブされることから，アクチンフィラメントを含んでいることが示された．一方，私たちが以前同定したRhoDも，
10Tl／2細胞にアクチンフィラメントを含む突起を形成

N＿WASP をTc10やRhdT と共トランスフェクトしたとした．この突起は20〟m程度で，Cdc42サブファミ
リー蛋白質が形成する突起とは異なり，細くしなやかでに，N−WASPに結合してArp2／3複合体を介したアクチあった（図2町 興味深いことに，RhoDによって形成される突起は細胞が隣接する面に形成された．したがってることが明らかになった．しかしTclOやRhoTによっ

この突起は細胞同士のコミュニケーションにかかわっていることが強く示唆される．さらにこれらの蛋白質の神ロスパイクとは明らかに形態が異なっている．このこと

ころ，いずれの場合にも細胞突起形成と神経突起形成は抑制された．したがってTclOとRhoTはCdc42と同様
ン重合を引き起こすことにより，これらの突起を形成すて形成される突起は，Cdc42によって形成されるマイクは，TclOとRhoTの場合にはN−WASPに加えてさらに経突起形成への関与を調べるために，NIE−115神経芽細胞腫細胞とPC12褐色細胞腫細胞にトランスフェクトした．いずれの細胞においてもCdc42とRhoDは神経突起

別の蛋白質が突起形成にかかわっていることを示唆して形成を誘導しなかったのに対し，Tc10

発現しているPar6アイソフォームをRT−PCRによりクいる．Par6はCdc42の標的蛋白質として知られており，上皮細胞の細胞極性にかかわっている．そこで骨格筋にとRhdTは長い

ローニングした．このPar6はTc10とRhoTには結合す

神経突起を形成した（図2月．
Cde42

Tと10

るが，Cdc42には結合しないことがtwo−hybrid systemにより示された．このPar6アイソフォームがN−WASP

RhoT

璧︻トロ︻ COとともにTc10やRhoTによる独自の細胞突起形成にか

二二かわっている可能性が考えられる．

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図2 Cdc42サブファミリー蛋白質と RhoDによる細胞突起と神経突起の形成．
C3HlOTl／2線維芽細胞とNIE−115神経芽細胞にMyc−tagを付加したそれぞれのcDNAをトランスフェクトした．48時間
後の突起形成のようすを，抗Mycモノクローナル抗体Myc1−
9ElOによる染色で示す．（A）Cdc42サブファミリー．（B）
RhoD．ローダミンフアロイジンとの二重染色を示す．スケー
ルバー，20〟m．

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GTP GDP GTP GDP GTP：GDP GTP GDP

Cdc42は標的蛋白質であるN−WASP に結合して活性C【b42化状態にする．その結果，N−WASPにA叩2／3複合体が結合し，迅速なアクチン重合が引き起こされる．こうしてマイクロスパイクが形成される．そこでTc10 やRhoTによって誘導される突起形成が，N−WASPを介しているかどうかを調べた．GTP を結合して活性化状態にあるTc10とRhdTは，Cdc42と同様にN−WASPに結合することが，酵母のtwo−hybrid systemとプルダウン

1℃10

RhoT RhoA

図3 Cdc42サブファミリーとN−WASPとの結合．
（A）酵母two−hybrid systemのβ−ガラクトーシダーゼアッセイ
による結合解析．cdc42サブファミリーとRhoA（コントロール）の野生型（融），恒常的活性変異体（CA），およびドミナン
トネガティブ変異体（DN）とN−WASPとの結合を解析した．
（B）プルダウンアッセイによる結合解析．大腸菌に発現させた
GST標識低分子量G蛋白質にGTPγSまたはGDPを結合させ，細胞に発現させたHA−tag付加N−WASPとの結合を解
析した．

−115−

（2）Msxlによる成熟筋細胞の脱分化
RT−PCR によりクローニングした MsxI cDNA に

RhoDは細くしなやかな細胞突起を形成した．しかもこれらの突起は細胞が隣接する面に形成された．した

Myc−tagを付加し，AAVベクターの系で成体マウス骨格筋に導入した．導入して7日ごとに，凍結切片を作製がってこの突起は細胞同士のコミュニケーションにかかして筋組織の様子を観察した．導入7 日後には，成熟生過程で胚の肢芽細胞にみられる突起に類似している．

わっていることが強く示唆される．この突起の形態は発筋細胞から分裂してMyc−Msxlを発現している単核の細胞が兄いだされた．28日後には非常に多数の単核細胞が生じていた．ただしこの時期には単核の細胞でもMyc−Msxl を発現しているものはほとんどみれらなくなった．これはエピソームの状態で存在しているAAV

この肢芽細胞の突起がどのような働きをしているかまだ明らかではないが，RhoDがこの突起形成にかかわっているならば，RhoDが肢芽形成に重要な役割を果たしている可能性が考えられる．
Msxlを骨格筋組織に導入したところ，成熟筋細胞がベクターが，細胞の分裂により希釈されたためであると考えられる．これらの単核の細胞はミオシン重鎖などの筋特異的蛋白質をもはや発現していなかった．これらの分裂することにより多数の単核細胞が生じた．これによ細胞はまたBrdUを取り込んだことから，細胞周期を生じた単核細胞がやがて最終分化をして筋再生を引き起回っていることが示された．以上の結果から，成熟筋細胞もMsxlを過剰発現させることにより脱分化をすることが明らかになった．

こすかどうかを，現在検討中である．筋再生が起こるこ
Msxlを導入して生じた多数の単核細胞に正常な原因遺考察と今後の展望伝子を導入することにより，筋ジストロフィー症の治療に応用することが可能であろう．

り培養骨格筋細胞だけでなく，組織の成熟筋細胞にも脱分化がもたらされることが実証された．このようにしてとが明らかになれば，筋ジストロフィー症の骨格筋に

TclOは骨格筋と心臓に高く発現しており，C2細胞の分化の過程で発現量が著しく増加した．このように筋細胞分化の過程で著しく誘導される低分子量G蛋白質は
これまでに知られていなかった．これらの結果から，TclOの骨格筋細胞分化における役割が強く示唆される．
細胞融合においては細胞表層の突起が不可欠な役割を演じていると考えられている．したがってTclOはその突起形成を介して骨格筋細胞融合にかかわっている可能性が考えられる．このことをTclOのトランスフェクショ
ンにより検証するためには，低血清濃度の分化条件下でも骨格筋細胞へのトランスフェクションの効率が高くなければならない．そのために現在，TclOの恒常的活性
変異体やドミナントネガティブ変異体をC2細胞に効率よく導入する系を用いて解析を進めている．
一方，RhdTは心臓と子宮にほぼ特異的に発現していたことから，Rh正は心筋や平滑筋で特異的な機能をになっている可能性が考えられる．骨格筋細胞も含めてこれらの筋細胞には長軸方向と短軸方向の細胞極性が認められる．細胞極性はこれらの筋細胞が機能するうえで不可欠である．TclOとRhoTは骨格筋に発現している
Par6アイソフォームに結合したことから，何らかの細文

献1）EndoTand Nadal−Ginard，B：Reversalofmyogenic
terminaldifftrentiationbySV401argeTantigenresults
inmitosisand apoptosis．J．CetlSci．111：1081−1093，
1998．

2）

Tsubakimoto K，Matsumoto K，Abe H，IshiiJ，Amano
M，Kaibuchi Kand Endo T：Small GTPase RhoD
SuPPreSSeSCellmlgrationandcytokinesis．Oncogene18：
2431−2440，1999．

3）

FukuokaM，SuetsuguS，MikiH，FukamiK，EndoTand
TakenawaT：AnovelneuralWiskott−AIdrichsyndrome
PrOtein（N−WASP）−binding protein，WISH，induces
Arp2／3Complex activationindependent ofCdc42・J・
CellBiol．152：471482，2001．

4）EndoT：Reversalofterminally difftrentiated statein
Skeletal myocytes by SV40large T antigen・In
Reactivation of

the Cell Cyclein TerminaIly

Diffbrentiated CelIs（Crescenzi，M．，ed．）Landes
Bioscience，Georgetown，Texas・pP・61−73，2001・
5）胞極性に関与していることは明らかである．現在，TclOが骨格筋細胞と心筋細胞の細胞極性の形成を，そしてRhdTが心筋細胞と平滑筋細胞の細胞極性の形成を制御しているかどうかを解析中である．

−116−

Abe T，Miki H，Takenawa T and Endo T：Small
GTPaseTclOanditsnovelhomologueRhdTinduceN−
WASP−mediatedlong process fbrmationand neurite
OutgrOWth．SubmittedtoJ．Biol．Chem，2002．

Ⅶ． 治

療

未認可抗生物質ネガマイシンによるmdxマウスの治療
松

■

●

●
●

■

■
●

●

●
●

一

●
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■
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●

尾田

●
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一彦文一

■

●

章孝雅伸

浦

石原松武

●

隆紀雅孝

政

君

正由

我

一●

名山田塚

荒 川 正 子宇
笹 川昇●
近 藤 信 一…
斎 藤 加代子…■●
加

良

川中浜塩

研究協力者

田

孝………

ロット法によりジストロフィンタンパク質の蓄積，2）エバンスブルー陽性細胞数の減少を認めた．さらに，はじめにデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の患者の5〜15％は遺伝子の途中にストップコドンが生じた，いわゆ
るナンセンス型突然変異によるものとされている．もし，

sv40＿T遺伝子を導入したmdxマウス骨格筋細胞にネガマ
イシンを加えて培養したところ，ジストロフィンタンパ
ク質の蓄積を認めた．

点突然変異で生じたストップコドンを読み越えてmRNAを翻訳させることができれば，このナンセンス突然変異型DMDの治療が可能になる．ナンセンス突然変異型の材料と方法
ネガマイシン；微生物化学研究所に所蔵されているネガ

CysticFibrosisやHurlersyndromeにおいては・すでにアミノグリコシド系抗生物質ゲンタマイシンのもつストップ
コドン読み越え作用を応用して培養細胞レベルおよび患者の個体レベルでの治療研究が行われており，その薬効が証明されつつある．1999年，ペンシルバニア大のBarton＿Davisらは同じゲンタマイシンをジストロフィン

マイシン白色結晶（力価100％のもの）を用いた．溶液中での分解を避けるため，ネガマイシンは完全乾燥状態で低温保存し，投与直前にPBSに溶解，ろ過滅菌し使用した．用いたネガマイシンの濃度は1．2XlO￣5あるいは
2．4X10−5mol耽g体重／day．
Mdxマウス；実験動物中央研究所および精神・神経セン遺伝子にナンセンス突然変異を有するmdxマウスに投与し，ジストロフィンタンパク質の骨格筋内蓄積と筋症状の改善が起きたことを報告した．これらは，ナンセンス
突然変異型遺伝子病の治療薬としてゲンタマイシンが有望であることを示している．しかし，感染症の場合と異ター神経研究所由来のmdxマウスを繁殖させ，その7〜8
週令のオスを用いた．
抗体；ジストロフィンC端40アミノ酸の合成ペプチドを抗原としてウサギに免疫して得たポリクロナル抗体およびなり，遺伝子病の治療薬として用いる場合には長期間投与が必須となる．その際，問題となるのが，ゲンタマイ
シンのもつ強い副作用（聴力障害，腎毒性など）である．
さらに，耐性菌の問題も大きい．それでは，ゲンタマイ

ノポカストラ社のモノクロナル抗体Dys2，Dys3を用いた・
蛍光抗体法；前頚骨筋（m）を液体窒素中で粥状に冷却したイソペンタン内で急速凍結後，クリオスタットにて凍結切片を作成した．無固定あるいは低温アセトン固定しシンと同様にストップコドンの読み越え作用があり，ゲンタマイシンより副作用が小さい別の抗生物質はないだ
ろうか？

た凍結切片に200倍希釈したポリクロナル抗体を室温1時間反応させ，洗浄後，200倍希釈した抗ウサギIgGヤギ抗体FITC標識抗体（Amersham）でさらに室温1時間反応させた．観察はツァイス・アキシオプランを用い，富士フ

我々は文献検索の結果，1970年に（財）微生物化学研
究会附属微生物化学研究所で発見されたジペプチド系抗生物質ネガマイシンがストップコドンの読み越え作用を

イルムプロビア400を用いて写真指影した．
イムノプロット；クリオスタットで薄切した20ミクロン持つと報告されていることを見出した．そこで，早速，同研究所からネガマイシンを入手し，mdxマウスへの投与実験を開始した．その結果，ネガマイシンを投与されたmdxマウスの骨格筋において1）蛍光抗体法とイムノブ
東京大学大学院総合文化研究科生命環境科学系（財）東京都臨床医学総合研究所＊■■（財）微生物化学研究会微生物化学研究所菌学研究部■＊＊＊
神戸大学医学部小児科学教室■■■＊＊
東京女子医科大学医学部小児科学教室●■●●●■
早稲田大学人間科学部基礎生物学●●●●●Hl●
国立精神・神経センター神経研究所遺伝子治療研究部＊＊＊＊＊＊＊＊
東京大学医学部耳鼻咽喉科＊

厚の切片30枚を各種タンパク質分解酵素阻害剤（TPCK，
TLCK，PMSF，EDTA）を含む抽出溶液（20mM TriS−HCI
pH7．6，150mM NaCl，1％NP40，100pg／mlDNaseI）400pl
中でホモジナイズし，その10，000rpm上清を採取し，そのタンパク質濃度を測定後，上清に対し3plの抗ジストロフィン・ポリクロナル抗体を加え，室温で30分間反応させ，■●さらにプロテインA−SepharoseCし4Bを加えて室温30分間反応させた．反応後，プロテインA−SepharoseCL−4Bを0．2％NP40を含むPBSで入念に洗浄し，SDSサンプル溶液−119−にて沸騰水中で処理し，抗体添加前の溶液20pgタンパク

質分に相当するサンプルを5●10％sDSリニアグラジェン
ト・ポリアクリルアミド・ゲル中で電気泳動した．泳動
後，ニトロセルロース膜に転写し，5％スキムミルクPBS

いジストロフィンタンパク質の蓄積が蛍光抗体法およびイムノプロット法によって認められた．

溶液にてブロッキングし，100倍希釈した抗ジストロフィ

マイシンを連日投与したところ，ジストロフィンの蓄積

ン・モノクロナル抗体Dys2またはDys3にて室温1時間反をもたらす量（1．2×10￣5mo肱g体重佃ay）の10倍畳まではマウスの体重は増加を続けた．50，100倍量においては体重の減少が認められたが，死亡には至らなかった．しか応させ，入念な洗浄後，ECLキット（Amersham）に含まれる100倍希釈した抗マウスIgGパーオキシターゼ標識抗体を室温1時間反応させ，洗浄後，マニュアルに従い発光
基質を加え化学発光させX線フイルムに感光させた．
Mdxマウス骨格筋からの衛星細胞の採取とSV40−T遺伝
子導入による準株化；2ケ月令のオスmdxマウスの下腿筋を5％トリプシンinPBSで37度30分間処理し，ピペッティ
ングにより細胞を遊離させ初代培養細胞を得た．その細胞に易熱分解性SV40−T遺伝子をレトロウイルスベクタ
ーを用いて導入した．32度にて20％胎児牛血清inDMEM4000中で増殖培養し，38度にて10％馬血清in査の結果，ゲンタマイシン投与マウスでは80dB以下の音に対する聴覚は明らかに喪失していたが，ネガマイシン投与マウスでは同様な聴力の喪失は認められなかった．
％

810

6｝2

6・汀Idx HHI NH2

Gl11

GM2

10

8

0

5

蓄積；非投与mdxマウスのm筋にはジストロフィン陽性
線経は1％以下しか認められなかった．しかし，ネガマイ
シン処理されたmdxマウス由来のm筋では5％以上のジストロフィン陽性線経が認められた．ジストロフィン陽の低下も認められた（図1A，B）．イムノプロット法を用い，ジストロフィンの存在および相対濃度を検討した
ところ，無処理mdxマウスm筋では全くジストロフィンは検出されなかったが，ネガマイシン処理mdxマウスではジストロフィンが正常対照であるBlOマウスのものと

Gl11

15

言上 ●上首Tdm︼

結果mdxマウス骨格筋におけるジストロフィンタンパク質の性線経はクラスター状に存在した．エバンスブルー陽性
線経は無処理mdxマウスでは18％存在したが，ネガマイ
シン処理マウスでは5％以下となり，変性筋ファイバー数

C・mdx llHI Hu2

加力試験をShapiroら（1984）の方法をもちいてauditorybrain
StemreSpOnSeを測定した．

初回投与の4時間後には全員死亡した．したがって，ネガ
マイシンのLD50はゲンタマイシンのそれに比べはるかに高い，つまり，毒性が低いことが示唆された．聴力検

おネガマイシンの毒性検査；mdxマウスに種々の量のネガ
マイシンあるいはゲンタマイシンを2週間にわたり皮下投与し，経目的に体重を測定した．また，7日間ネガマイ
シンあるいはゲンタマイシンを投与したmdxマウスの聴し，100倍量のゲンタマイシンを投与されたmdxマウスは︳●き●墓等邑さす

MEM（抗生物質不合）中で分化させた．分化条件で7日間培養し／筋管細胞が十分形成したことを確認後，ネガマイシンを加え，さらに7日間培養を続けた．その後，細胞を固定し蛍光抗体法あるいはイムノプロット法をおこなった．

ネガマイシンの毒性検査；mdxマウスに種々の量のネガ

810

図1A：DystrophinexpressioninTAmuscIeGbersofandbi−
Otic−trea（edmice・B：EvansBlueDye−POSitiYenbersinTA
muscle伝bers ofantibiotic−treatedmice．Mdxmice（7Weeksold，3miceeach）weregivenasubcutaneousirjec−
lionofNMorGMatdosesof2・4×10−5moLkg／day（NMl，GMl）oratl．2×10▲5moukg／day（NM2，GM2）in
PBS fbr tWO Weeks．Control mdx

mice（n＝3）andC57BUlO（B10）（n＝3）mice wereirtiectedwith PBS（0・1ml）only．Anerantibiotictreatmentfortwoweeks，al1
animalsweregivenanirtiectionofEYanSBlueDye（EBD，2％EBDirlPBS，0．1mi）intraperitoneally．About350to
550muscle航bers were countedin each mouse（n＝3）．

BarsindicateLhemeans士thestandaTddeviadons．

同じ分子量として検出できた．そのBlOマウスm筋のジストロフィンとの相対的比較をしたところ，ネガマイシ
ン処理mdxマウスではBlOのおよそ10％量のジストロフ
ィンが蓄積しているものと思われた（図2）．
培養mdx骨格筋細胞におけるジストロフィンタンパクの蓄積；易熱分解性SV40−T迫伝子の導入により準株化されたmdxマウス骨格筋細胞を用いてin vitroでのネガマイシンの効果を検討したところ，無処理細胞では認められな
−120−

A

B

C

D

E

図2Jmmunoblotofdystrophinprotein（427kDa）inTAmus−
CIe．A，BlOcontrolmouse；B，NM一晩atedmdxmouse；C，

NM−trea（edmdxmouse（（entimestheamountofprotein
Bin slot wasloaded）；D，unb・eated mdx mouse；E，GM−treatedmdxmouse・Dystrophinindicatedbyarrow
WaSVisualizedbyECL，andonIythedystrophinareaof
山egelisshown．

考察と今後の展望
グラムネガティブなカナマイシン耐性菌に効く抗生物質として30年以上も前に発見されたネガマイシンは，リジンのC端にヒドラジド酢酸が結合したジペプチド系抗生物質である．ネガマイシンは大腸菌由来の無細胞翻訳系においてストップコドンの読み越え作用を示すユニー
クな抗生物質であったが，毒性試験中に投与犬が1匹死亡したこと，構造上，ヒドラジド酢酸が遊離した場合に予想される毒性などのため，臨床試験プロセスの初期に治療薬としての開発を断念された経緯をもつ未認可抗生物質である．しかし，上に述べたとおり，その毒性は適切な保存法と溶液作成法を用いれば，認可抗生物質である
ゲンタマイシンより，（少なくともマウスにおいては）はるかに毒性は低く，そのLD50の1％以下でmdxマウスの骨格筋にジストロフィンタンパク質の蓄積を起こさせる程の有効性をもっている．この点については今後，投与法，投与期間等について検討すると共に犬を用いた大規模な毒性試験を行う必要がある．
今回の一連の実験により，ネガマイシンを投与された
mdxマウスの骨格筋において，in vitroでもin vivoでもジ
ストロフィンタンパク質の蓄積を認めたことから，この抗生物質は真核細胞においてもストップコドンの読み越え作用を有することが初めて証明された．さらに，投与されたマウスの体重変化，聴力検査などからゲンタマイ
シンより毒性がはるかに低く，ナンセンス突然変異型の遺伝子病に有効な抗生物質であることが示唆された．
微生物化学研究所ではネガマイシンを産生する放線菌はいくつか分離されており，その中にはネガマイシン本体以外にもいくつかの天然類縁体を産生するものがある
ことが知られている．これまで，ネガマイシンのスクリーニングはすべて抗菌活性をもとに行われてきたが，抗の協力を得て，ネガマイシンの大量生産，類縁体の生産を行い，それらの活性や毒性の検討を行いたい．
これまでジストロフィンタンパク質の蓄積をマーカーにmdxマウスや同マウス由来骨格筋細胞を用いて研究してきた．しかし，ジストロフィンの蓄積量はもともと低
く，さらに分子量も通常のタンパク質より大きいため，実験の遂行にしばしば困難が伴った．そこで，今後の抗生物質のストップコドン読み越え活性の測定にはルシフ
ェラーゼなどのレポーター遺伝子にストップコドンを挿入した遺伝子をCOS細胞等に導入したものを用いる必要がある．さらに，そのストップコドンの種類や周辺の塩基配列がネガマイシンの作用にどのような影響を及ぼすかを検討する必要がある．
今回の実験では，mdx骨格筋衛星細胞由来の準株化細胞を作成し，その細胞を用いて，ネガマイシンの効果検定を行った．同様に，ヒトDMD患者の生検資料由来の衛星細胞を分化能をもったまま準株化することができれば，それを用いて個々の患者に最適な治療法の選定を行うことができる．つまりオーダーメードの遺伝子治療を行う
上で，このような個々の患者由来の細胞株の作成は基本的手段となるものである．今後はナンセンス突然変異型のヒト筋ジストロフィー患者由来の筋細胞を易熱分解性
SV40＿T遺伝子を導入し，準株化した細胞を用いて，ネガ
マイシン等の抗生物質の作用をinvitroで調べ，個々の患者にとって副作用がより少ない，ストップコドン読み越
え活性がより高い抗生物質の検索を行っていきたい．
発表論文等
1）Arakawa，M．etal：Negamycincanrestoredystrophinin
mdx skeletal muscle．Acta MyologlCa．XX；154−158・
2001．

菌活性とともに真核細胞におけるストップコドン読み越え活性をスクリーニングに加えていけば，ネガマイシンの類縁体の中にさらに有望な抗生物質が見つかる可能性

2）荒川正行，松田良一：筋ジストロフィーの分子病態ともある．これら類縁体の活性とその分子構造の比較から，さらに人為的化学修飾（ドラッグ・デザイン）を行うヒ
ントが得られる可能性もある．今後は微生物化学研究所

モレキュラー・メディシン38：1284−1289，2001．

治療の可能性−Duchenne型筋ジストロフィーを中心に
3）荒川正行，松田良一：ネガマイシンにより筋ジストロ−121−

フィーの治療 難病と在宅ケア7：256−29，2001．

ジストロフィン遺伝子のスプライシング制御機序の解明とその治療への応用
松 尾 雅 文●
研究協力者

日

竹

島

泰

弘●

的

Agus Surono●

グ能を解析した．ショウジョウバエのdsx遺伝子のエク

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の責任遺伝

ソン3，イントロン3及びエクソン4とアダプター配列子としてジストロフィン遺伝子がクローニングされてからなるミニ造伝子を作成する（図1a）．このアダプ以来10年以上経過するが，未だDMDの治療法は確立

ター配列にジストロフィン遺伝子の各エクソン内のスプされていない．しかし，DMDに関する分子病態の解ライシング促進配列の候補となる配列を挿入したキメラ

明は進み，多くでジストロフィンmRNAのアミノ酸読遺伝子を構築した．このキメラ遺伝子からin vitroの転み取り枠にずれがあることが明らかとなってきた．私

写反応によりP32でラベルしたpre−mRNAを合成した．
この合成pre−mRNAをHeLa細胞核抽出液と混じin

たちは，DMDの治療法として，このアミノ酸読み取
り枠のずれを修正してジストロフィンの産生を回復させる方法について検討してきた．

vitroのスプライシング反応を進行させた．そして，産生される成熟mRNA量を測定し，各配列のスプライシ
ング促進能とした．

これまでに私たちは，ジストロフィン遺伝子のエク
ソン19にはスプライシング促進配列があり日，この配

エクソン19内のスプライシング促進配列の解析

列の機能を阻害することによりエクソン19のスキッ
ビングを誘導することが可能なことを明らかにした2）．

配列内の31塩基にスプライシング促進機能があること

さらに，ジストロフィン遺伝子のエクソン20が欠失を報告してきた1）．今回，その配列の活性部位を明らか

これまでに，ジストロフィン造伝子のエクソン19のしてmRNAのアミノ酸読み取り枠にずれを有するにするため，エクソン19内に様々な欠矢を人工的に加DMD患者から筋細胞を分離し，その細胞にエクソン19のスプライシング促進配列の機能を阻害するアンチ

えたミニ遺伝子を作製し，その遺伝子産物のスプライシ

センスオリゴヌクレオチドを導入した．すると，エク

た・そのため，ジストロフィン遺伝子のエクソン18，
イントロン18，エクソン19，イントロン19とエクソン

ソン19のスキッビングが誘導されて，アミノ酸読み
取り枠のずれが修正されるとともに，この修正された

ング反応を細胞内で実際に起こさせる系を用いて解析し20からなるミニ遺伝子を作製した．このエクソン19のジストロフィンmRNAからジストロフィンが産生されることを確認した3）．

配列部位にジストロフィン神戸で欠失していた52塩基，

これらの成果は，ジストロフィン遺伝子のエクソンはこの31塩基を3分割した配列のそれぞれを欠失させ内のスプライシング促進配列を解明することにより，たものを用いた．そして，各種のエクソン19の配列をこうした治療法のさらなる展開が可能となることを示した．

持ったミニ遺伝子をHeLa細胞内に導入した．導入後に本研究は，ジストロフィン遺伝子の各エクソンの配スプライシング促進配列と考えられる31塩基，あるいミニ遺伝子から転写されたジストロフィンmRNAをRT−PCR法を用いて解析した．

列が有するスプライシング促進配列を明らかにするも結のである．また，ジストロフィン遺伝子のエクソン19

果

ジストロフィン遺伝子のポリプリン配列のスプライシン
グ促進能内のスプライシング促進配列の活性部について検討を加えた．

ジストロフィン遺伝子の欠矢のホットスポットに隣接
方法するエクソン43，46，53から抽出したポリプリン配列を含む31塩基について，そのスプライシング促進能をスプライシング促進能の解析
本研究では，ショウジョウバエのdsx遺伝子のイント
ロン3のスプライシングがその下流にある配列に依存して進行することを利用した反応系を用いてスプライシン● 神戸大学大学院医学系研究科遺伝病統御学解析した（図1b）・各キメラ退伝子のpre−mRNAからはイントロンが切り取られた成熟mRNAが産生されたが，エクソン43から由来した配列を挿入したミニ造伝子から最も多くのmRNAが産生され この配列にスプライ
シング促進機能があることが判明した4）．

ー122−ComlroI

内のポリプリン配列が必ずしもスプライシング促進配列

P鵬iliYe NegaIiYe

ではないことを示し，本遺伝子のスプライシング制御機「「「「

序の複雑さを示した．

010

また，ジストロフィン遺伝子のエクソン19内のスプ⊂三二コーロ：］→ライシング促進配列についてはよりその機能部位が特定1314l→

でき，今後の治療法の開発に重要な情報となった．

図1スプライシング促進能の解析
a．キメラ遺伝子の構造
ジョウショウバ工のdsx遺伝子のエクソン3・イントロン
3・エクソン4 と黒枠で示すアダプター配列からなるキメラ遺伝子を作製した．
b．スプライシング反応産物解析
P32でラベルしたキメラ遺伝子からのpre−mRNAをHeLa細
胞核抽出液と混じ，産生されたmRNA量を電気泳動で分離した．キメラ遺伝子の下流に何も入れない時にはスプラ
イシング産生はみられず（Control），エクソン43由来の配列を挿入したものからは明らかなmRNAが検出されたが，エクソン46と53由来の配列を挿入したものからはあまり
mRNAは産生されなかった．

今後の展望
今回の研究において，ジストロフィン遺伝子の1部のエクソン配列内にスプライシングを促進する能力を有する配列があることが判明した，このことは，ジストロ
フィン遺伝子の欠矢のホットスポットに遺伝子の欠矢を有するDMD例でもスプライシング促進配列の機能を阻害してエクソンのスキッビングを誘導する治療法が可能であることを示唆した．今後，この方面での研究がさらに進展し，多くのDMD症例でも治療が可能となることを期待する．

エクソン19のスプライシング促進配列
様々なエクソン19の配列をもつミニ遺伝子のスプラ

研究業績

イシング産物を解析した．その結果，ジストロフィン神
戸で欠失したのと同じ52塩基が欠失したものではエク

1）TakeshimaY，etal：Modulation ofin vitro splicing of

ソン19のスキッビングがすべてのmRNAで生じた．一

theupstreamintronbymodifyinganintra−eXOnSequenCe
Whichisdeleted丘omthedystrophingeneindystrophin

方，スプライシング促進配列と考えられた31塩基を欠Kobe．J．Clin．Invest．95：515−520，1995．

失させたものでは，一部のmRNAでのみエクソンのス
キッビングがみられた．また，31塩基を3分割した配2）PrarnonoZ・A，etal：lnductionofexonskippingofthe

列のうち，中央部を欠失させた配列ではすべてのdystrophin transcrlptinlymphoblastoid ce11s by

mRNAからエクソン19が消失し，この領域が最も強い

transftctlng an antisense oligodeoxynucleotide

スプライシング促進能を有するものと考えられた．この

COmplernentary to an exon recognltion sequence．
Biochem．Biophys．Res．Commun．226：445−449，1996．

街域は，特にプリンに富むわけでもなく，そのスプライ

3）TakeshimaY，etal：Oligonucleotidesagainstasplicing

シング促進能の由来については不明であった．

enhancer sequenceled to dystrophin productionin

考

muscle ce11S察from a Duchenne muscular dystrophy

Patient．BrainDev．23：788−790，2001．

ジストロフィン遺伝子はイントロンのサイズが極めて大きく，巨大なイントロンを切り取る際にはスプライシ

4）lto T，et al：One ofthree examined purine−rich

ング促進配列の機能が特に重要な役割を果しているもの

SequenCeS Selected 丘om dystrophin exons exhibitsと考えられるが，その詳細は未だ不明である．今回，遺Splicingenhanceractivity．ActaMyologica．20：15日53，

伝子欠矢のホットスポット周辺のエクソンではエクソン

−123−

2001．

細胞死抑制の蛋白治療法の開発
太 田 成 男＊
＊
■

也朗郎

＊
＊
■

＊
・事

＊

＊

大都研

崎澤

■

韓

●

●

＊
・▼

尾大桂

●

＊

▲事

智

■

美恵晴

久

■

・寧

梅村出

♯

山木平

●

秦

光々隆朗

定梨

山

目

生澤

麻北森片

研究協力者

を形成可能な構造をしていた．中央のチャンネル形成領的筋ジストロフィーやミトコンドリア脳筋症をはじめと域（α5とα6）は周囲のへリックスからの9本の水素結合によって維持されている．このへリックス間の水素結合を消失させるとさらにイオンチャンネルを形成されやす

する筋疾患では，細胞死が促進されて組織が萎縮する．
細胞死には能動的なアポトーシス（細胞自滅）と事故的なネクローシス（壊死）があり，アポトーシスが実行される経路は明らかにされつつある．ミトコンドリア脳筋症患者組織でもアポトーシスを制御する因子発現の変動が観察され，アポトーシスによって細胞死が進行していることを予測させる．一時的にでも細胞死を抑制することが可能になれば，細胞死が促進されている筋疾患の病態を改善することも可能になるはずである．
そこで細胞死を強力に抑制するアポトーシス抑制因子
を人為的に作成することが重要である．細胞内で発現させ細胞死を抑制することによって筋疾患の改善治療に適用することが考えられる．しかし，遺伝子導入法では，方法自身の開発状況，社会的状況より判断して，現時点では現実的とは思えない．HIVのもつTN蛋白のPTDは蛋
白質を膜通過させる能力を持つ．そこで，FTDと融合した蛋白を作成し，蛋白質を細胞外から細胞内へ導入できくなると考えた．水素結合を形成しているアミノ酸を同義アミノ酸に変化させることで，水素結合を消失させた．
実際にはBcl−Xの22番目のチロシンをフェ二ルアラニンに，26番目のグルタミンをアスパラギンに，165番目のア
ルギニンをリジンになるようにbc1−X遺伝子に変異を導入し，この蛋白をBcl−XFNKと命名した（3）．この遺伝子を導入したJurkat細胞はヒドロキシウレア（1mM），カン
プトテシン（1mM），トリコスタチンA（lmM），TN＿16（10mM），スタウロスポリン（20nM），パラコート（1mM），過酸化水素（0．1mM）に対しBcトxLを導入した細胞より耐性になった．さらに，加熱（45度C，10分）にも耐性になった．
さらに無血清培地でも細胞の増殖を可能にした．図1
はbcl−XFNK遺伝子を導入したCHO細胞の無血清培地におけるコロニー形成の様子を示す．

るかどうか検討した．さらに，実験動物を用いて細胞死を抑制する臨床的な応用が可能かどうかを検討した．
その結果，人為的に作成したPTD−Bcl●XFNKは実験動物において，様々な障害に対して細胞を良好に維持できることを示すことができた．

A

B

方法と結果
（1）スーパーアポトーシス抑制因子の作成
まず，強力に細胞死を抑制する因子の遺伝子を人為的に作成することを試みた．アポトーシを制御する因子にPar鴨CBd・XFNK
勝踊→はBc1−2ファミリーとよばれる一群の因子があり，そのな
かでもBc1−XLはアポトーシスを抑制する能力が強い．ラットBc1−XLは我々によって遺伝子がクローニングされ（1），精製蛋白が結晶化された．さらに，X線結晶解析
によって，BcトxLの立体構造が決定された（2）．その基本構造は7本のα−へリックスから成り立ち，チャンネル＊日本医科大学老人病研究所生化学部門＊＊ 日本医大老研生化学＊＊＊ 日本医大・第二内科
ー124−

図1Bcl−XFNKの強力な細胞死抑制効果．
CHOにBcトxFNK，Bcl−XL，コントロールベクターを導入し，安定的に蛋白を発現する細胞クローンを分離した．
HamF12／DMEM培地（血清無し）でコロニーを形成させた，
A：Bcl−CFNK遺伝子導入細胞（コロニーを形成し，死細胞はほとんど見られない）．B：Bc1−XL遺伝子導入細胞（コロニーは形成するが死細胞が混在している）．C：コントリール
ベクター導入細胞．D：Wstemblotにより発現量が同じであることを確認している．

（2）スーパーアポトーシス抑制因子の細胞内への導入
bcl−XL改良型遺伝子，bcl−XFNKのN末端側に，HIVのrrAr
蛋白質のPTDドメイン遺伝子を結合させ，大腸菌で誘導

ControI

pTD−BcトxFNK

四塩化炭素（10％匹塩化炭素
オリーブ油温液
1mI／k9BW）発現させた．不溶性のPTD＿Bcl＿XFNK蛋白質は，7M尿素
で可溶化し，SDS電気泳動によって精製した．
培養細胞に添加するだけでPTD−Bcl−XFNKが細胞に取

テ手サメタゾン（0．5m9／20gBW〉

り込まれ，ミトコンドリア上へ移行することが免疫染色で確認され，細胞死を抑制することが確かめられた．
また，培養しにくい軟骨細胞をスライス培養し，培養液にPTD＿Bcl＿XFNKを加えて長期培養した．対照軟骨，
PTD＿Bcl＿XLを導入した軟骨に比べ，培養後の細胞変性・

図2 PTD−Bcl−XFNK蛋白のマウス腹腔内投与の効果．
PTD−Bcl−XFNKをマウスに0．4mg，0．1mg投与し，四塩化炭
素あるいはデキサメタゾンを投与した．一日後に環流固定
し，組織をへマトキシリンエオジン染色した．

死が明らかに抑制され，長期間の維持が可能になった．
さらに，スライス培養中も軟骨組織の弾性を保ち自らの環境を形成する傾向がみられた．
（3）スーパーアポトーシス抑制国子の適用
マウスの腹腔投与で少なくとも肝臓，小腸，脾臓の各組
織の細胞に取り込まれることを免疫組織染色で確認した．
放射線照射・薬剤処理された実験動物でその細胞死抑PTD−Bcl−XFNK（0．4mg／80gBW）

：r■
説：
：

制効果や病態の改善を組織化学的検討した．致死量の4倍のX線照射したマウスにPTD−Bcl−XFNKを連E］投与することで，照射後の生存時間が有意に延長され，牌臓細

＋
薫

藁

≡

瑚

．
牧
隼
諺
き弊 一
毒
W

寡

享
′

琵

史】

胞の変性と牌臓組織の萎縮が著しく抑制されていた．肝障害のモデルとして，マウスに四塩化炭素，デキサメタ
ゾン，エタノールを投与した．図2は四塩化炭素，あるいはデキサメタゾン投与後の肝臓の組織である．
PTD＿Bcl＿XFNKをあらかじめ投与したマウスでは脂質沈
着などの肝臓細胞の障害がほとんど見られない．スナネ
ズミの5分間前脳虚血モデルでは，PTD−Bcl−XFNK前投与

；
■
￥祝：

註技

‡
十

法 禅

赤矢印：変性慮抱．瞥矢印：正常親胞
正常神経縄胞密度①左側韻葉：2／mrn
右側譲扁：1／mm②左側頭葉：38／mm
右側頭葉：31／mm

右側頭葉：179／mm

図3

脳虚血モデルのスナネズミの海馬へのPTD＿Bcl−XFNK投与の効果．
PTD＿Bcl＿XFNK蛋白を腹腔投与後，前脳虚血5分処理をし，一週間後に脳組織をへマトキシン エオジン染色した対照スナネズミのCAl領域の神経細胞はほぼ死滅したが，
PTD−Bcl−XFNK投与スナネズミの神経は生き残った．

することで海馬神経細胞の遅発性神経細胞死が顕著に抑制された．図3は，CAl領域の神経細胞が虚血によってほぼ死滅するのに対し，円、D●Bcl−XFNK投与スナネズミでは神経細胞は生存している．
考察と今後の展望
以上の結果より，スーパーアポトーシス抑制因子
m−Bcl−XFNXは広い範囲で細胞死を抑制することができる．動物実験によりPTD＿Bcl＿XFNKの適用がかなり現実的であることが示唆された．
培養のしにくい細胞の培養，無血晴培地における培養，

文

献l）shiraiwaetal：JBioIChem．271：13258−13265．1996．
2）Aritomietal：JBioIChem 272：27886−27892．1997．
3）Asohetal：．J BioI Chem275：37240−37245．2000．

臓器移植の際の臓器の維持，火傷，肝臓疾患，心臓疾患，
脳梗塞，放射線障害などの急性疾患に適用可能と思われる．

ー125−

琶

のミオトニーに対する治療効果

Dehydroeplandrosterone sulfate

と作用機序
栗

原

照 幸●

研究協力者 井 本 敬
根

目

本

的

二●● 森

誠 之●●

博●

雅

岸

彦●

表1mtoマウスはstopcodonによって筋細胞膜にCIchannelが発現していないミオトニーのモデルマウスである．mt。マウスの横隔膜標本をTyrode溶紋に浸して，95％01と5％CO王の混合ガスを通じて酸素化し，ガラス管微小電極をもちいて筋細胞内記録を行った．微小電極が筋細胞内に刺入されるとすべての筋線経でmyotonic burstが起こった（表の最上段）．次にDHEAS40mg几から320mg几の濃度で加えると膜電位は次第に−89・8mvへと過分極した． ＊印はTyrode溶液中の膜電位一79．7mvに比べて優位に過分樋している場合を示す．ミオト
ニーは濃度依存性に抑制されDHEAS320mg／Lの高濃度では，
insertionmyotoniaは完全に抑制された．

杉野らはl）1998年に筋強直性シ●ストロフィー（MD）11例の患者にdehydroepiandrosteronesuIfate（DHEAS）200mgを8週間連日静江したところ，治療開始4週後にミ才に−の軽減及び日常生活動作の改善がみられたことを報告した．その作用機序は不明である．そこで，DHEAS
がミ才に−を抑制する効果の有無を筋細胞内記録で明らかにし，ミオトニーの成因から考えて2・3）Na＋channelをター
ゲットの候補として取り上げ，組換えNa十channelを発現した系を用いてDHEASの効果をpatchclamp法で
検討した．

RM P

S ．
D ．

No．

≠ o f in s 〇八 jo n

−7 9 ．7 m v

5．
5 m v

40

10 0 〜−8 0 ．
8

5．
2

40

98

−7 9 ．
9

4．
8

40

55

−7 9 ．1

5 ．8

40

53

−8 3 ．1 書

5 ．3

40

30

−8 7 ．3 ■

7 ．1

40

20

−8 9 ．8 ■

5．
6

40

0

m Y O t O n iさT y ro d e
S o Iut io n
◆D H E A S

方法

4 0 m g ／L1）筋細胞記録では，C57BL／10Scマウスの横隔膜標本を用＋D H E A S

いて，細胞内記録を行った．ミオトニーはCIchannelbl。Cker＋D H E A S

8 0 m g ／L

1 2 0 m g ′Lであるanthracene−9−Carboxylic acid（A9C）を10JM几
でTyrode液に加えて起こし，またNachannel不活性＋D H E A S
1 6（h lg ／L◆D H E A S

化を阻止するanemone toxinを0．02−0．04LLM／Lの濃度

2 ∝ ）m g ／L
＋O H E A S

でTyrode液に加えてもミオト＝−を起こすことができる4）．
その他CIchannelが発現していないSWR／J＿CIcnlldr咄0

3 2 0 m g ′L
＊stadSUcaHYSi貞n浦cantdi汗erence（mtomouse）の横隔膜標本についても，検討を加えた．
2）patch clampについては，ラット骨格筋Na十channelのCDNAをHEK293細胞に一過性に発現させ，Na＋電流を

脱分極はなく，0．02LLM几のanemonetoxinでは，69本

WholecellモードのpatchcIamp法で測定した．

の筋細胞中22本（31．9％）にinse而onmyotoniaを認め，Anemone toxinによって起こしたミかニーでは，RMPの0．04LLM几のanemone toxinでは70本の筋細胞中61本
結

果（87・1％）にinsertion myotoniaを認めた．DHEASを加える

1）筋細胞内記録では，C57BL／SclOマウスの横隔膜標本で，Tyrode液ではRMPは−82．2−l．1mVから−88．2−3．5mVでと，insertionmyotoniaは筋細胞90本中19本（21．1％）まで抑制された．

あるが，A9Cを加えてミ才に−を起こすと，RMPは＿2）patch clamp法では，Na＋Channelを発現したHEK細74．2−7．1mVから−76．6−8．5mVに脱分極した．DHEASを胞には，数nAの電流が観察された．DHEASを投与し160−320mg几加えると，RMPは夫々−81．OmV，−82．OmVに改善した．

たところ電流は濃度依存的に減少したが，WaShoutによ微小電極刺入時のinsertionmyotoniaは，A9Cによっ化の速度に著変は観察されなかったが，不活性化の電位

り電流の大きさは即座に回復した．また活性化と不活性依存性がマイナスの方向に約10mVシフトしていた．

て筋細胞50本中76％にみられていたものが，DHEAS160mg瓜を加えることによって，18％までに抑考制された．Mto mouseについても，DHEASは表1のよ
うにミ才に−の抑制効果を示した．
●東邦大学医学部第四内科●●岡崎国立共同研究機構生理学研究所液性情報研究部門

察CIchannelの異常によるミオに−とNa channelの不活性化障害によるミ才に−の両者にDHEASはミ朴ニー軽減作用が認められた．patchclamp法による検索から，DHEASは，
Na＋channelに作用してミ才に−を軽減している．
ー126−

研究の意義nbre segmentsfrom patientswith myotonic dystrophy・

筋細胞内記録によってDHEASは，Na channelの異常

JPhysio1425＝391405，1990・

によって起こるミ寸に−とCIchannelの異常によって起こ

3）MounseyJP，Xu P，JohnIIIE etaI：Modulation of

るミ才に−の両者にミオト二十軽減効果のあることを示した5）．

skeIetalmuscle sodium channels by human myotonin

またその作用機序は，Na channelに作用してミ朴ニーを軽proteinkinase．JClinInvest95：2379−2384，1995・減している事を明らかにした6）．このような結果から，

4）栗原照幸：ミオトニーとチヤネロパチ一・臨床神経今後の展望としては，筋力を低下させずにミ才に−を抑制

39：1219−1221，1999．

することのできるNachannelblockerの開発が重要で，

5）経口投与可能な薬物開発が必要である．

Kurihara T，Kishi M，Nemoto H：The efrtct ofdehydroepiandrosteronesulfateonmyotonia‥Tntracellularstudy・Proceedings ofthe third hternationat Myotonic

参考文献

DystrophyConftrence，Kyoto，Japan：58，2001・

1）Sugino M，Ohsawa N，lto T et al：A pilot study of6）lmotoK，KuriharaT，MoriM，NemotoH：Suppressive

dehydroepiandrosterone sulfhtein myotonic dystrophy・

efrtctofdehydroepiandrosteronesulfateonmyotoniaby

Neurology51：586−689，1998．

interactlngwith Na channel・Proceedings ofthe third

2）FrankeCH，HattH，laizzo

Na＋

ChanneIs

and

CIJ

PA

et

al‥Charactehsticsof

conductancein

resealed

muscIeー127−

Intemational Myotonic Dystrophy Confbrence，Kyoto，Japan：58（Cornments），2001・

Small Group Workshop
1）2000．2．9

131

Emery‑Dreifuss muscular dystrophy（EDMD）

東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸2）2000．2．10

Calpainopathy（LGMD2A）
東京大学大学院農学生命科学研究科

133

反 町 洋 之3）2000．8．29 ミオトニー疾患の病態治療

139

東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸
1414）2000．11．20 FCMDの病態解明
大阪大学大学院医学系研究科 戸 田 達 史

5)2001. 3. 22 Perspectives
to studies
of muscular diseases in 21st century.

on myogenesis

and therapeutics

144

京都大学再生医科学研究所再生増殖制御学分野 瀬 原 淳 子

6)

2001.

12. 147）2002．1．17

A Small Group Workshop on Dysferlinoparhy
東北大学医学部神経内科 青 木 正 志

146

Development of New Therapy for Muscular Dystrophy

─Progress in Basic Research─（武田班との合同）

150

Emery−Dreifussmusculardystrophy（EDMD）（Moderator：KiichiArahata，TbruyukiKurihara）

Time：February9，2000（Wednesday）

OfficialLanguage：English

Place：ConferenceRoom18（BIFloorofZenkyorenBuilding）

10：00・10：05

VVelcomeaddress K立chiArahata

Keynotelecture（Chairperson：TeruyukiKurihara）
10：05−10：45

ClinicalspectrumandpathogenesisofEDMD（Prof．EmeritusAlanE．H．Emery）／〟COFFEEBREAK〟／
Emerinopathy（Ⅹ・EDMD）
11：00−11：15

Casepresentation（TakafumiHasegawa，Neurology，TbhokuU．）

11：15−11：30

Casepresentation（TatsuyaIshikawa，Pediatrics，NagoyaCityU．）

11：30−11：45

Cardiac manifestations ofEDMD（Ybshihito Hata，Cardiovascular Center，Iwate

MedicalCo11ege）
11：45−12：00 Discussion〟／LUNCH〟／

Laminopathy（AD・EDMD）
13：00−13：40 Clinicalgenetics（GiseleBonne，PariS）
13：40−14：00

GenestructureandexpressionoflaminA／C（NoboruNaknjima，BiomolecularEngineeringInstitute，Osaka）
Structureandfunctionofthenuclearenvelopeproteins
14：00−14：15 Emerin （YuichiTsuchiya，Biochemitry，TbhoUniversity）

14：15−14：25 Additionalcomments：Emerin−bindingproteins（ShoichiIshiura，Universityof％kyo）
14：25−14：40

Morphologicalstudyonemerin（HiroshiYbrifuji，Anatomy，NationalDefenseMedicalCollege）
14：40−15：00

Discussion〟／COFFEEBREAK〟／
DNAmicroarrayanalysis
15：20−15：40（TbshifumiTsukahara，NationalInstituteofNeuroscience，NCNP）
Genetherapy
15：40−16：55（SeiichiTsujino，NationalInstituteofNeuroscience，NCNP）
Generaldiscussionsandsummary
15：55−16：30

一131−

Emery−Dreifussmusculardystrophy（EDMD）
栗 原 照 幸●

Emery−Dreifussmusculardystrophyは，1966年にEmeryとDreifussによってUnusualtypeofbenignX−linkedmuscular

さいので遺伝子治療，plasmidの導入がし易い可能性がある．

dystrophyとしてはじめて報告された．
このワークショップでは，Emery先生が出席され本疾患をはじめて1疾患単位として確立するに至った家系

Bonne先生の講演では，Emery−Dreifuss muscular
dystrophyと臨床症状が同じであるが，遺伝形式が常染色体優性遺伝を示し，内側の核膜の下にメッシュ状に存在するLamin A，Lamin Cの遺伝子変異によって起こる

調査，臨床徴候，疾患の原因としてemednが骨格筋および心筋の核膜で欠損していること，突然死をすることのあるこの疾患では，心ペースメーカー植え込みが救命のために必要であることを話された．またフランスのLaminopathyが兄いだされている．やはり早期の心ぺ−ス
メーカー植え込みが突然死予防の大切な治療である．
本邦にもこの疾患は存在し，東北大学の長谷川らによBonne先生がLaminopathy（常染色体優性Emery−Dreifuss
筋ジストロフィー）について講演されて，本疾患と臨床症状は同じであるが，遺伝形式が常染色体優性でemerinの欠損はなく1aminopathyである症例を分子遺伝学を中心に述べられた．
EmeryとDreifussによりはじめに報告された疾患は，Ⅹ染色体劣性遺伝の疾患で，3徴として1）早期発症の肘，
アキレス腱，後頸部の拘縮，2）上腕，排骨筋の萎縮と筋力低下，3）右心房優位の心筋症，心伝導障害を来たす．
この疾患では筋細胞の核膜に存在するemerinという蛋白が欠損していることがあきらかにされ，emerin欠損を証明するには生検筋，生検皮膚，リンパ球，口腔粘膜を用いる．本疾患では心伝導障害による突然死の報告があり，心電図では，P波振幅低下や，胸写では右心房拡大がみられるが，臨床症状と照らして早期の心ペースメーカー
植え込みが延命につながる．核膜の2重のIayerのうち，
emerinは内側のinner nuclear membraneに付く蛋白質である．emedn欠損による筋ジストロフィーの発現機序は不明である．emerinは254個のアミノ酸からなり分子量が小り，23歳の男性症例で，意識消失発作，心不整脈，足関節の拘縞を来した症例がこのワークショップでも発表された．名古屋市立医大の石川ら，および岩手医大の心血管センターのHataらにより本疾患の心機能について詳細に発表され，洞性徐脈，AV block，房室解離，右房の肥大，LVEFの低下などを来した症例の提示と，心ペースメ
ーカー植え込みによって突然死を予防することの重要性
を述べた．
今後の研究
l）筋および心筋の核膜に存在するemerinが欠損すると
なぜ筋ジストロフィーが起こるかの病態生理は不明
であり，今後明らかにしていく必要がある．
2）Emerinは，254個のアミノ酸からなり分子量が小さい
ので遺伝子治療，Plasmidの導入がし易い可能性があるので治療的研究が必要である．
3）早期診断をして心ペースメーカー植え込みが延命につながるので，本疾患の存在と診断法の周知が必要
である．

＊東邦大学第四内科−132−Calpainopathy（LGMD2A）（Moderator：Drs．HiroyukiSorimac隼KoSahashi）
FebruarylO，2000（Thursday）

Specia＝nvitedlecture（Chairperson：Dr．TeruyukiKurihara）

10：00−1l：00

SuccessfulorganizationoftheENMCWorkshopson

neuromusculardiseases

Prof．Emeritus AlanE．H．Emery，ENMC．
11：00−11：30

Discussions

11：30−13：00 ／／／／／LUNCH／／／／／

Sma

Group Workshop−2

CaJpainopathy（LGMDZA）（Moderator：Drs．HiroyukiSorimachi，KoSahashi）

13：00−13：05

VVeJcomeaddress Dr．KoSahashi

Keynotelecture（Chairperson：Dr．HiroyukiSorimachi）
13：05−14：00

日istoryoffindingcaTpalnSandcurrentstudieson

Calpatns
Prof．KoichiSuzuki，UniversityofTokyo

Molecularbiochemistryandpathol．ogyofcalpains
14：00−14：30

Pathologyofnon−SkeletalmusclecalpalnS
Dr．TakaomiC．Saido．RIKENBrainSciencelnstitute14：30−15：00

MusclePathoIogyofcatpain3deficiency
Dr．KoSahashi，AichiMedica＝Jniversity−133−

／／／／／COFFEEBREAK／／／／／

UpdateoncJinicalandmoleculargeneticstudies−1
15：20−15：40

NationalCenterHospitalforMental，Nervousand

MuscularDisorders，NCNP
Dr．lkuyaNonaka
UpdateoncIinica）andmolecu］argeneticstudies−2

15：40−16：00

TakamatsuCityHospital
Dr．HisaomiKawai

DoesapoptosisoccurincaIpalnOPathy？
16：00−16：20lmmunohistochemicalinvestigation
Dr．YukikoK．Hayashi，NCNP
MolecuIarbiologyofcalpainopathy
16：20−16：40

Pathomechanism
Dr・HiroyukiSorimachi，UniversityofTokyo

16：40−17：00

17：00

Generaldiscussionsandsummary

Closingremarks

ー134−ReportoftheSmaHGroupWorkshoponCa】painopathy（LGMD2A）
HSorimachi．，KArahata．＋，TIbiMandKSahashi…

ThedomainIIIhas fburanti−parallelβ−Strands，With a

1．lntroduction
Thissmallgroupworkshop（SGW），Whichwasthenrstin

topologyresemblingtheC2domain，Which，aSinthecaseof

Japan to focus on calpainopathy（LGMD2A），WaS heldinproteinkinaseC，bindsCa2＋andplaysimportantrolesin

TbkyoonlOFebruary2000．Theaimoftheworkshopwastotranslocation

to

the

membrane．The

twonve−EF−handdo一reviewvariousstudiesoncalpalnOpathyfromdifferentper−

mainsofthelargeandsmallsubunitsinteractwithonean−

SpeCtives，bysharingtheknowledgeofdifftrentkindsofre−

OtherlTheC−terminiofbothsubunitsareinclosecontact，and

SearChers，1eadingtoclarifymolecularmechanismofcalpal−

playanimportantrolefbrhetero−dimerization．

AsShownin Fig．1A，Calpain3／p94hasthree specincre−

nopathy，andfinallytoestablishitsdiagnosisandtherapy・

DrSahashiintroducedtheworkshop，bystatingthatWalton

glOnS，inadditiontothebasicfbur−domainstruCture・TheNS

andNattrassnrstclassinedLGMDin1954．LGMDisapr0−

rereglOnlocates at the N−terminusinstead of domainI・

gressivesymmetriCalatrophyandweaknessoftheproximal

Sincecalpain3／p94doesnotassociatewiththe30Ksubunit，

limb muscles with elevated serum enZymeS from skeletal

NSmayoccupythespacefor30K，displaclngit・ISlandIS2

musclewithaneStimatedprevalenceoflO・5，andtheonsetof

areinsertedintoaloopofthesub−domainIIb，andthelinker

illnessisusuallyduringthenrsttwodecadesoflift，reSulting

COnneCtingdomainsIIIandIVlrespectivety．Ttispossiblethat，

inlossofwalkingabilitylOor20yearsaneronset・

because ofinteractions among these3SpeCinc reglOnS，theproteasedomainofcalpain3／p94isalreadyhsedintheab−2．唖虚鹿∩∋山a〟dcalpin御訂dm伽IcatF蔦ins

senceorca2＋．

DrSuzukigaveakeynotelectureonthehistoryofdiscov−enng calpalnS and outlined current studies，fbllowed by a

4．PathologlCalandmotecurarGeneticStudies

lecturefromDrSaidoonthepathologyofconventionalcal−

DrNonakareportedtheiranalyseson80recessivesporadic

pains・CalpalnWaSnrStdiscoveredin1964，aSanOVelprote−

JapaneseLGMD2patients，210fwhichharboredamutation

asein thebrain，and，also，aS a nOVel factorlhat activates

inthecalpain3／p94gene3）・Theaverageageofonsetwas20・3

phosphorylasekinase・In1978，Suzuki

years．Amongsgrouppurinedca1−

painfbrtheRrsttime，andtheoccurrenceofaninhibitorof
Calpaln，Calpastatinthese，3missensepoint

mutations，G233VこK461C，andD707G，andlinsertionmutation，1795−1796ins
A，Whichcausesframe−Shiflat631，aCCOuntfbrmorethan70

wasreported・％ofcalpalnOpathyinJapan．Heemphasizedthatabundant
lobulatednberwereobservedintypelnbersof70％ofthe

3．ConformationalstructureofcalpalnS
Conventionalcalpainhastwoubiquitousisozymes，P−andpatientwithcalpalnOpathy，Whichmaybeahallmarkofthem−Calpain・Bothhavedistinctlargecatalyticsubunitsofca・80

disease，ifnotspecinc．OpaquenberswerealmostnegativeinkDa（pCLandmCL），andcommonsmallerregulatorysubunit

CaSeSOfcalpalnOPathy．Thosemorphologicalnndingscould

Ofca．30kDa（30K）．Theyaredividedinto4and2domains

beusefulfbrdiagnosisofcalpalnOpathy．

（I−IV and V−VI），reSpeCtively（Fig．1）．The3D struCtureOf

DrsSahashiandKawaireportedontheclinico−PathologlCal

m−Calpainhasrecentlybeendescribed，aSShowninFig・1Bl・2）・

aspectOftheirownpatientswithcalpalnOpathy．InmuscleCT

DomainIpenetratesintodomainVIof30K，COntaCtlngthe

images，prOminent proximal muscle wasting（pelvic＞＞

2ndand5thEF−handmotifs．Theproteasedomainisdivided

Shouldergirdle）wasobserved，andmusclebulksattheposte−

intotwo sub−domains，ⅠIaandIlb，WhichcontainC129，andriorpartsin theneck，limb，and trunkweremoreseverely

H262n）286，reSPeCtively，reSultinglnnOaCtive sitefbrmed

invoIvedthan attheanterior（Fig．2）．Muscle sectionsofa

withoutCa2＋，Whichaccountsfbrthelatencyofcalpain・Upon

patientwithaL189Vmutationincalpain3／p94wasstained

Ca2＋−binding，tWO Sub−domains probablyfuseinto a pa−

Withfburdifferentantibodies，SpeCinctodistinctpositionsof

pain−likecatalyticdomain・Calpain3／p94，aS Wellas with an antibody agalnSt COn−

＊GraduateSchoolofAgriculturalandufeSciences，

TheUniversityoflbkyo＋＊NationaHnstituteofNeuroscience，NCNP

nectin／titin．Signals obtainedby anti−N−term antibody wereabsentinthemusclenbresofthepatient，and westernblot
analysesalsoshowednoimmunoreactivitybyanti−pIS2anti−＊…NthDepartmentofInternalMedicine，AichiMedicalUniversity

bodyin the patient（Fig，3）．Dystrophin，SarCOglycan andー135−lamininα2werenormallyreactive，butoneoftheconven−todiagnosis．However，thisnndingcontradictsthebiochemi−tionalcalpalnS，P−Calpaln，SlightlyincreasedincalpalnOPathy

CaldatathateightoutoflOmissensepolntmutantSOfcal−

musclesasinthecaseofDMD．AnotherpatientwithW360C

Pain3／p94IosttheirrapidautolyticactlVlty，reSultinglnStable

alsoshowednegativestainlngWithanti−PIS2antibody．Thisis

expressioninculturedcells4）．Inotherwords，thesemissense

inaccordwithotherreportsthatsignalsofcalpain3／p94are

mutanlcalpain3／p94sshouldbemorestableinskeletalmus−

negativeinmostcalpainopathypatients．

Clethanthewild−typeforms・Why，then，didtheydisappear

Theseobservationsareveryintrigulngandcouldbeapplied

fromthepatients

muscle？

1
；
三
；
‡
：
■
薫
：
：
；
≡
‡
≡
：
≡
；
≡
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謹
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、
く
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…

Ⅰ
Ⅴ ・

V

Protoa80

C。t馬紆㌫㌫ai郁b

Cata暮ytkD01≠如血

Domdni J

CaImodl川n・＝柁
Caれ8爪印鱒メ

準〜′≠ゝ

轟寧窮腰．ノ競ま蕊。。mai。

fS盈還乱蒜、
P94暮S2CallnOdulin．暮ik8

Cが◆・馴ndin9D01naln

くLa呵○＄ubun呵

】ナⅣ

AcMicLink叫Fig・1SchematicstruCtureOrCalpain3／p94andconventionalcalpalnS
A・Primarystructure：EachthinellipseinDomainsIVandVIrepresentsoneEF−handmotif・Thicklinesunderthecalpain3／p94
StruCtureindicatethelocationoftheantigenpeptides（2C4，MPTVISFrVAPRTGAEPRS；PNS，PTVISPTVAPRTGAEPRSC；
12A2，RLRNPWGQVEWNGSWS；plS2，KRNTISVDRPVKKKKNKPlIFVC）usedinlhisstudy．
B・3Dstructureofhumanm・Calpain：Seetexlforexplanation・

一136−

theTUNELmethod，andanti−aCtivatedcaspase3and9anti−
bodies，ThefrequencylSlessthanO・01％butnotzero，Whichis muchless than that reported by Baghdigulan et al・（0．1％−0．7％）．Wild−typenbersalsoshowedpositivesignalS，althoughthefrequencywasextremelylow・Itseemsthatwe
willhavetowaitforsuccessivestudiesonapoptosisofskele−
talmusclecellsbeforeweknowaclearanSWer．

6．Conclusionsandperspective
FromthedatashownbyvariousscientistsinlhisSGW，thefollowmglmpOrtantpOlntShavetobeurgentlylnVeStlgated：（1）identincation ofif

ivo substrates forcalpain3／p94，（2）relationships between connectin／［itin andcalpain3／p94，and（3）relationshipsbetweencalpain3／p94andconventionalcal−
pains．（1）isimportanl，becausedencientproteolyticactivity
Ofcalpain3／p94isthecauseofcalpainopathy・（2）isessential，
becauseconnectin／titinprobablyregulatesproteolyticactivity
Ofcalpain3／p94．（3）isanovelviewpoint，becausepreliminary
datasuggestedthatcalpain3／p94inhibitsconnectin／titinpro−
teoLysis by those calpalnS・PathologlCalterations of cal−
pain3／p94substratesandconnectin／titinaswellasproteolytic
activlty OfconventionalcalpalnSin calpalnOpathy muscles

Fig．2 SkeletalmucleCTonthechrotlicstageofLGMD2A
Allpicturesofthebottompartshowtheposteriorfhceoffour
extremitiesandtrunk，WheremarkedinvasionoffattyconnecTshouldbeclearlyelucidated・Thesewouldunveiltheunder−

tivetissueelementinskeletalmuscleisnoted．

Cules．

lyingslgnaltransductionsystemsmodulatedbythesemole−

Anotheressentialpolntis relationship between genotype
andphenotype・Characteristicsofseveralmutantcalpain3／p94
伽膨く閥警野尊さ筆触血潮○鵬○禦警備伊ノ00

have been examined so far，Showlng unlque biochemicalCil騨i■き

■‥
−
二・
⊇＝ 蕪

∴

・
一

一

組

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菜 摘

鋸

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幸

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一・

：＝二
＝：
＝一丈：、ガ：≡や財三91二H m■

閃I W

propertiescomparedwiththewild−typeprOtein4）・Differences

がきl k D ●in proteolytlC aCtivities between normaland calpalnOpa−
轡

㌫

蕪
＝

象

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・襲撃 二 郎 や
人

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の20

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一童

ヽ・ − 叩

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二

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￣葵

毅

凝
一
・

Iも：S W・ 一一く：融索

thologlCalStatesarelikelytobeverysubtle・Thisshouldbe
closelyrelatedtotheclinicalfactthatthetimecourseincaト
palnOpathicmusclenberdegenerationisslowaswellasin

Fig．3 WesternBlot（W−B）AnalysisonCalpain3
TwentyonepatientswithLGMDintheAichiMedicalUni−
VerSitywereanalysedbyusinganti−PIS2arLtibody・Sixwere
negative，2false−POSitive，and13Positive・Afterwards，OneOf
6negativepatients（彬625）wasidenti鮎dasLGMD2Abythe
genetic analysIS Ofcalpain3／p94gene・When analysed，theVeryquickthawingstored frozenmuscle samples were proc−
essedtothenextfewsteps，becauseofpreventionfromrapid
autolyticprope托yofcalpain3／p94・

the other types of muscular dystrophy・The experimental
StrategyregardingthispolntisverydifnculLHowever，eXten−
siveJOlnt−WOrks fromdifferentviewpolntSOfclinical，bio−
Chemical，biological，genetic and pathologiCalstudieswill
ultimatelyclarifythemolecularmechanismofcalpalnOpathy・

7．WorkshopparticIPantS
Dr．KiichiArahata（Tbkyo，Japan）；Dr．GiseleBonne（Paris，
FranCe）；Prof．EmeritusAlanE．H．Emery（Devon，UK）；Dr・

5．ApoptosisandcalpalnOPathy
DrHayashireportedapoptosisincalpalnOPathicmusclen−

1山kikoK．Hayashi（Tbkyo，Japan）；Dr．1bhruIbi（Aichi，Ja−

bers．Recently，Baghdigulanetal．reportedthatcalpalnOpathypan）；Dr．HisaomiKawai（恥kamatsu，Japan）；Dr・Tbruyuki

isassociatedwithmyonuclearapOptOSis5）・Thefrequencyof

Kurihara（Tbkyo，Japan）；Dr．IkuyaNonaka（rIbkyo，Japan）；

apoptoticcellsisverylowandthereisnodirectevidencethat

Prof．EuiroOzawa（Tbkyo，Japan）；Dr．Ko Sahashi（Aichi，destruCtionofaftwnucleicausesthe nnaldegenerationof

Japan）；Dr．1泡kaomiC・Saido（Saitama，Japan）；Dr・Hiroyuki

wholemusclecells．Ithasbeenofinterestwhethermuscular

Sorimachi（Tbkyo，Japan）；Prof．HideoSugita（Tbkyo，Japan）；

dystrophyisdirectlycausedbynecrosisorapoptosis・DrHa−

Prof．KoichiSuzuki（Tbkyo，Japan）（Alphabeticalorder）

yashishowedresultsof15CalpalnOpathycasesexaminedby

ー137一References〃と〟mJ∫ci1999；171：3ト37．

l・HosneldCM・EIceJS，DaviesPL，etal‥JiaZ・Crystal

StruCture Of calpaln reVeals the struCtural

4・OnoY，ShimadaH，SorimachiH，etal：RichardI，SaidoTC，

basis forBeckmannJS，IshiuraS，SuzukiK．Functionaldefectsofa

Ca2＋−dependentproteaseactlVltyandanovelmodeofen−

muscle−SPeC摘ccalpain，p94，CauSedbymutationsassoci−

ZymeaCtivatiom．E〟βOJ1999；18：6880−6889．

atedwilhlimb−girdle muscular dystrophy type2A．J

2・StroblS，Femandez−CatalanC，BraunM，etal：HuberR，

βbJC九gm1998；273：17073−17078．

Masumoto H，Nakagawa K，Ⅰrie A，Sorimachi H，5・BaghdiguianS，MartinM，RichardI，etal：PonsFtAstierC，BourenkowG，BartunikH，SuzukiK，BodeWThecrys−

Bourg N，Hay RT Chemaly R，Halaby G，LoiseletJ，talstruCtureOfcalcium−freehumanm−CalpalnSuggeStSan

AndersonlNLopezdeMunainA，FardeauM，MangeatⅠミ

electrostaticswitchmechanismforactivationbycalcium．

BeckmannJS，LefrancG・Calpain3denciencylSaSSOCi−

Pmc肋JJAcdd∫ciU∫A2000；97：588−592．

atedwithmyonuclearapoptosisandprofbundperturbation

3・MinamiN，NishinoI，KobayashiO，etal：IkezoeK，GotoY，
NonakaI・Mutationsofcalpain3geneinpatientswith
SpOradiclimb一girdle

musculardystrophyinJapan・J−138−

OftheI．Bα爪F一・Bpathwayinlimb−girdlemusculardys−

trophytype2A．NbEMed1999；5：503−511．

ミオトニー疾患の病態治療（Moderator：栗原照幸，石浦章一）
日時

平成12年8月29日（火）10：00−16：30

場所 全共連ビル地下1階Room18 東京都千代田区平河町2−ト9
電 話 03−3265−3111 FAX 03−3237−1370
班長

荒畑喜一

10：00−10：05 開会挨拶，この会の目標

栗原照幸

座長 栗原照幸
10：10−11：00 特別講演 骨格筋Na channelの生理学とミオトニーの病態
岡崎国立生理学研究所 液性情報部門
井本敬二 教授
11：00−11：20 ミオトニーの病態治療
東邦大学第四内科 栗原照幸
座長 内野 誠11：20−11：35 Myotonic dystrophyのDHEAS治療経験 熊本大学神経内科 内野 誠
11：35−11：50 MyotonicdystrophyのDHEAS治療1大阪医科大学第一内科，2藍野加齢医学研究所1杉野正一．1石田志門．1伊藤巧，1花房俊昭，2大澤仲昭
11：50−12：05 DHEAS多施設臨床試験 大阪医科大学第1内科 名誉教授 大澤仲昭
12：05−13：15 昼食
座長 石浦章一13：15−13：35 Adrマウスを用いたmyotoniaの遺伝子治療1昭和大学藤が丘病院
神経内科．2東京大学循環器内科 1原 −．2中島敏明，1若山吉弘
13：35−13：55 Myotonicdystrophyの分子遺伝学 埼玉医科大学第四内科 木下正信
13：55−14：15 CTG repeat延長と遺伝子発現 九州大学大学院医学系研究科脳神経研究施設内科部門 古谷博和．山田猛，吉良潤一
14：15−14：35 D肝K発現に影響するCUG結合蛋白

東京大学・大学院総合文化研究科
石浦章一

14：35−14：55 CTG repeat下流のホメオボックス遺伝子 自治医科大学医学部生物学教室の筋強直性ジストロフィー病態への関与
佐藤 滋，川上 潔
14：55−15：25 コーヒーブレーク
座長 栗原照幸．石浦章一
15：25−16：25全体討論 遺伝子異常一病態発現の梯構」病態に基すく治療の開発
1） チャンネル異常とミオトニー 2）MDにおける筋力低下のメカニズム
16：25
閉会挨拶

−139−

ミオトニー疾患の病態治療
栗 原 照 幸●

このワークショップでは，まず特別講演で国立生理学

Nachannelblockerを用いて治療すればよい．しかし，筋研究所の井本教授よりvoltage−gatedNachannelの詳しい講義があり，現在使用されているミオトニーの薬剤はも強直性ジストロフィーでは，ミオトニーのほかに筋力低下が進行性に見られるので，筋力を低下させないような
Nachannelblockerを開発する必要がある．

ともと心筋や中枢神経系のNachannelblockerとして開発されたものであり，心不整脈やてんかんの治療に使われて来たが，これを骨格筋にも流用しようとすると，筋力低下を来たしたりして都合のわるい事もある．そこで今後骨格筋用に適した薬剤を開発する必要があることを述べられた．
筋強直性ジストロフィーに対してdehydroepiandrosterone
Sulfate（DHEAS）用いると，ミオトニーを軽減し，日常生
活動作もよくなり，また心不整脈も改善するということから，治療経験を熊本大学の内野教授，大阪医科大学の杉野講師らが発表し，東邦大学の栗原教授は，DHEAS
を用いると，筋細胞内記録により，微小電極を筋細胞内に刺入した時に起こるinsertion myotoniaが抑制される事を示した・さらに井本教授のpatchclampによる研究で，DHEASの作用機序としてはNa channelを抑制することによってミオトニーを抑制することが明らかになった．
DHEASは現在静脈内投与の薬物が市販されているが，経口薬は日本にはなく，杉野らが，経口的に投与してみてもミオトニーを抑制する効果がみられない点，また内野らの経験では，有効でない症例もあることなど，今後の更なる検討を要する．
先天性ミオトニーでは，病態としてはCIchannelの異常により起こり，Thomsen病（AD）でも，autOSOmalrecessive
generaIizedmyotonia（Beckerlype）でも筋力低下はないので，日常生活上必要なら，Nachannelblockerを用いて治療すればよい・ParamyotoniaはNachannelの異常によっておこり，寒冷によりミオトニーが起こるが筋力低下はな
いので，秋から冬の寒冷時期だけメキシレテンのような＊東邦大学第四内科
ー140−

昭和大学の原らは，StOpCOdonのためにCIchannelの発現していないmyotonic mouse（mto mouse）に対して，
adenoviruSを用いたgenetherapyの試みを発表した．
筋強直性ジストロフィー分子遺伝学的研究では，本疾患ではDMPKの非翻訳街域にCTGrepeateXPanSionがみら
れ 東京大学の石浦教授は，CTGはmRNAになるとCUGとなり，筋強直性ジストロフィーでは，CUG repeat
expansionが起こって，BP．（BindingProlein）と結合し細胞の核の中に大きな分子量の蛋白がたまり，細胞質に出ることが困難となる．DMPKの発現は低下する．自治医大の川上教授はCTGrepeatexpansionがおこると，DMPK下流のホメオボックス遺伝子であるSIX5に影響を及ぼして，その発現が低下し，白内障を来たすはか，SIX5のターゲット遺伝子であるIgfbp5，Ignおよびその他の遺伝子にも影響して筋の発達や分化に障害を来すと述べている．
後者はtrans effectでDMPK以外の遺伝子にも障害を来していることを示す．
筋肉の疾患のみでなく，本疾患の全身症状である白内障，内分泌障害，中枢神経障害などの発症機序も次第に明らかになってくると考えられる．
今後の研究
筋力低下させないでミオトニーを抑制する薬の開発，
進行性の筋萎縮と脱力を食い止める治療法を開発すること，および本疾患でみられるCTGrepeatexpansionを短縮する治療法の開発が望まれる．

FCMDの病態解明（Moderator：斎藤加代子，戸田達史）
日時

平成12年11月20日（月）場所

9：30−16：30

全共連ビル1階RoomlOl

東京都千代田区平河町2−7−9
電話

03−3265−3111EAX O3−3237−1370
班長 荒灯喜一

司会

斎藤加代子

訣30

斎藤加代子（東京女子医大小児科）

5m山Gm呼Wo血h叩開催にあたって
ロコuDの臨床訣45

R：MDの臨床スペクトラムと遺伝について

吉岡三恵子（神戸市せ合療育センター）

10：の

戸田連史（大阪大臨床遺伝）

別の分子遺伝学10：15

林 由定子、荒畑喜一、埜中征哉

別の筋病理（田立精神神経センター）
1α35筋敲胞表面の形波的変化とその意味

松原四郎（東京都立神経病院）

一基底腕と形質涙を中心に
1α55

ブレーク

ll：05

砂田芳秀（川崎医大神鞋内科）

R：MD骨格筋における欠損蛋白の生化学的解析

11三三5

寺嶋俊雄（神戸大東一層鋼）

特別講演：大脳皮質形成異常を梓徴とする
ミュータント動物の神経回路
12：2； 昼食

司会

戸田達史

u：30

中野今治（自治医大神経内科）

RコtDの脳病理−G肋Iini旭一基底農の破れが厨奇型の原因か−u：刃

W此−W町h曙症候群と措山型先天性筋

木村清次（横浜療育薗）ジストロフィーの比較検討

14：10

浦山型筋ジストロフィーにおけるbl『袷也y村山繁雄（東京新宅人総合研究所）

14：刃 佐々木淳子、戸甲達史（大阪大臨床遺伝）

フクテン遺伝子の脳における発現の検討

14：男

福山型先天性筋ジストロフィー：F止血h

山本智子、小林扶雄（東京女子医大第一病理）

mRNAの発現からみた皮質形成異常の病態
一山血叫伽他虚血による解析一15：10

触血蛋白のヒト脳における発現の発達的変化

斎藤義朗（東京女子医大小児科）
高嶋幸男く国立精神神経センター）

15：30

福山型先天性筋ジストロフィーの阻病変の日野なおみ（東京女子医大小児科）

病理学的検討

15：40
15：刃

ブレーク
Rユ正目打払のwo血喝h叩血由

全体討論：司会 斎藤加代子．戸田達史−141−

FCMDの病態解明
戸 田 達 史■

FCMDのSGWのまとめ

あって，そこから飛び出した脳組織の基底膜の形成が不十分であり，このことが脳回癒合を促進している．本来

FCMDにおいて，フクチン遺伝子変異によるフクテン
蛋白合成障害が生じている．その結果，脳，骨格筋，眼に，それぞれ皮質形成障害，筋ジストロフィー，網膜形
成障害による症状を発現している．神経病理学検討によのクモ膜血管をトラップして，その血管周囲腔にも脳組織が迷入している．基底膜は隣り合う脳回を分離する働きがある．Glialimitans一基底膜複合体が完全であること
が，COrticalneuroblastや脳組織が正常の位置に留まるためには必須であると述べた．

って，神経細胞遊走障害はglialimitamsと基底膜に異常が起こっていることが明らかになっているが，フクチン蛋
白と基底膜の異常との閑尉まブラックボックスにある．

木村晴次（横浜療育園）は・6例のWalker−Vhrburg症候群（WWS）について，FCMDと比較した結果を報告した．

神経細胞の遁走障害，グリアの異常との関係も不明である．

WWSは新生児期からの呼吸障害，囁下障害，筋力低下，「FCMDの病態解明」のワークショップでは，FCMDの臨床，病理，フクテン蛋白の機能，FCMDの病態メカ
ニズムについて，発表と討議を行った．
1）FCMDの臨床進行性水頭症，痙攣，白内障が臨床的特徴であり，2歳以内に死亡する．神経病理学的にはWWSにおいて重度の無斎藤加代子（東京女子医大小児科）はFCMD120例の臨床と遺伝子解析について報告した．重症度によって分類
すると，軽症31例25％，典型66例55％，重症23例20％という割合であり，軽症，典型の85％では創始者変異である3kb挿入配列をホモ接合性に示し，重症例の74％がヘテロ接合性を示していた．

胞が脳表に突出している像は認められないことを報告し，
WWSとFCMDは遺伝子的にも異なった疾患であることを示した．

脳回（滑脳症）を示し，FCMDでは大脳の層構造を認めるのに対し，WWSでは基本構築が乱れグリアや神経細山本智子，小林槙雄（東京女子医大第一病理）はFCMD
胎児，成人例のglialimitansでは，電子顕微鏡的に基底膜異を示す5例の臨床スペクトラムについて述べた．また，
FCMDの臨床像を呈したが，遺伝子とmRNAに変異が兄やアストロサイト足突起の細胞膜の構造異常が認められ免疫組織化学的に基底膜関連蛋白のメロシンやβ＿ジス
トログリカンの二次的な発現の低下が観察された．同様の異常は骨格筋においても認められていた．また，小児，
成人例のアストロサイトにはGFAP染色で細胞突起に形いだされなかった2例を呈示して，臨床的・遺伝子的異質性について呈示した．

態変化がみられることが多かった・Insituhybridizationによりアストロサイトでのフクチンの発現が確認された．

2）FCMDにおける病理 基底膜の異常

これらの所見から基底膜の異常がglialimi（ansの破綻の原因となり，その背景にアストロサイトの関与が考えられる．

吉岡三恵子（神戸市総合医療センター小児科）は兄弟
発症のFCMD例の臨床の比較，eXOn3におけるn。nSenSe変松原四郎（都立神経病院）は電顕での定量的解析にて，
FCMD骨格筋の基底膜の破れ，ならびに基底膜のない細胞膜での電子密度の低下を兄い出した．

一方，佐々木淳子，戸田達史（大阪大ゲノム機能）は

斎藤加代子（東京女子医大小児科）はFCMD胎児例の

FCMD遺伝子は，脳では発生過程からCqjal−Re（Zius細胞を含む遊走に関与する神経細胞に発現が認められ，基底膜と接しその形成に主要な役割を担うアストロサイトにはほとんど発現していない，とした．

大脳表面のmM染色において，14週，17週，20週と経時的に断裂部は数が増え，断裂の領域が拡大していることを指摘した．皮質形成異常の領域は在胎週数を経るに従い，その面積は広がり，程度も重度であった．
中野今治（自治医科大学神経内科）はglialimitans一基底膜複合体の破れが高度の街域と正常に形成されている領域が接している部分があることを述べ，前者ではC。rticalneurobla5tの大部分が遊出しているのに対し，後者では皮質構造が正常に保たれていること，細胞遊出の部位の基底膜や軟膜のnbroblastの突起は反り返ることはないことを示した・さらに，脳表のglialimilansと基底膜に破れがヰ大阪大学大学院医学系研究科

斎藤義朗（東京女子医大小児科），高嶋幸男（国立精神神経センター）はフクチン蛋白の抗体によって，胎児期に大脳のCqia1−Re【zius細胞，軟膜下顆粒層，辺縁帯の神経
線経，皮質板の神経細胞，脳室帯の神経上衣，小脳の外顆粒層，分子層，Purkirde細胞，内顆粒層の細胞に発現していたが，出生後のコントロールの脳と胎齢23週の
FCMD脳では発現していなかったことを報告した．
日野なおみ（東京女子医大小児科）はFCMDの眼病変について述べた．網膜においても基底膜の異常と層構造の異常が認められその成立機序には構造的，機能的に−142−

Cqjal−Retzius細胞に類似する網膜ミューラー細胞の異常が関与していると考えられる．
3）フクテンの機能とFCMDの病態メカニズム村山繁雄（都老人研神経病理）はFCMD脳では胎児期からtauの異常リン酸化が生じていることを報告し，病態への関与を示唆した．
砂田芳秀（川崎医大神経内科）は，骨格筋細胞外マト
リックス成分からFCMDで特異的に欠損している蛋白p180を兄い出し・分子量が異なるのでフクチンそのものではないが，フクチン結合蛋白ではないかと推察した．
寺島俊雄（神戸大第一解剖）は，「大脳皮質形成異常を特徴とするミュータント動物の神経回路」と題する特別講演を行い，FCMDでは，ニューロンがフクチンを分泌しないことより，フクチン・シグナル伝達系の活性が低下
し，放射状細胞の形質が十分に誘導されない結果，軟膜直下のグリア性境界膜や基底膜の形成が不十分となる・
また軟膜側の細胞膜表面のストップ・シグナルの提示がなく，移動中のニューロンは移動を停止できず，さらに表層に向かう．そして脆弱となった脳表面のバリアーを越えてニューロンが脳表面に湧き出す，とした・
フクチンは，アミノ酸相同性からフクチン蛋白ファミ
リーを形成し，細胞表面の糖蛋白ないしは糖脂質を修飾する酵素と推定される（Aravind）．また林由起子（国立
精神神経センター）は，FCMD筋では，ラミニンd鎖，
インテグリンよりもαジストログリカンが最も発現が低下しているとし，しかも使用した抗体はαジストログリ
カンの糖鎖部分を認識する抗体である．これらはフクチンが糖鎖修飾に関係があることを示している・FCMDでは糖鎖修飾がうまくいかないためこれらの蛋白が不安定になることが考えられる．

−143−

PerspectivestoStudiesonMyogenesisandTherapeuticsof
MuscularDiseasesin21stCentury
AtsukoSehara

日時：平成13年3月22日（木）場所：キャンパスプラザ京都（JR京都駅、京都中央郵便局西側）
9：30〜Registration
lO：00〜10：10

Introduction

Atsuko Sehara（Kyoto Univ．）

1）current Topics OnMuscle Development AndRegeneration
Chair Person：Atsuko Sehara（Kyoto Univ．）
10：10〜10：30

Kazuki Kuroda（Kyoto Univ．）
Notch Signaling And Cell Fate Determination
lO：30〜10：50

Sumihare Noji（Tokushima Univ．）
Roles Of FGFlO And MyostatinIn Muscle Formation
lO：50〜11：10

Yukiko K．Hayashi（NCNP）
Pathomechanism Of Fukuyama Type Congenital Muscular Dystrophy
ll：10〜11：30
Atsuko Sehara（Kyoto Univ．）
Roles Of ADAM ProteasesIn Myogenesis
ll：30〜12：10

Michael A．Rudnicki（PrograminMolecularGenetics，OttawaHospitalResearchInstitute，Ottaw。）
Pluripotent Stem CellsIn Adult Skeletal Muscle

12：10〜13：30

Lunch2）current Topics On Myogenic StemCells
Chair

Person：Shinichi

Takeda（NCNP）

13：30〜13：50

Shosei Yoshida（Kyoto Univ．）
Stem Cell PooI Maintenance And Transcription Factors：Learning From SkeletalMuscle
13：50〜14：10

Jun Yamashita（Kyoto Univ．）
Stem Cells And Blood Vessel Formation
14：10〜14：30
Keiichi Fukuda（Keio Univ．）
Stem Cells And Heart Formation
14：30〜15：10

Margaret A．Goodell（Center forCellandGeneTherapy，BaylorCollege OfMedicine，Houston）−144−

Stem CellsAmd Muscle And Bone Marrow Regeneration
15：10〜15：40

Coffee Break3）perspectives To Novel Diagnoses And Therapy Of Muscular Diseases
Chair Person：Ryoichi Matsuda（Univ．Tokyo）

15：40〜16：00

Ryoichi Matsuda（Univ．Tokyo）
A Novel Type Of Chemotherapy
16：00〜16：20

Masafumi Matsuo（Kobe Univ．）
A Novel Therapy Based On The Regulatory Mechanism Of Splicing
16：20〜16：40
Steve Wilton（Australian Neuromuscular ResearchInstitute，QEII
Medical Centre，Western Australia）
AntisenseInduced Dystrophin Expressionin the Mdx
Mouse
16：40〜17：00
Shin

ichi

Takeda（NCNP）

New Therapeutic Approaches Of Muscular Dystrophy
17：00〜17：20
Toshifumi Tsukahara（NCNP）
Development OfHuman Muscle cDNAMicroarray AndAnalysis OfGene Expression Profile
17：20〜18：00
Terry Partridge（MRC Clinical Sciences Centre，Imperial College School of Medicine，Harnmersmith Hospital，London）

Stem CellsAnd Transplantation
18：00〜18：10

18：30〜19：40

Conclusion Remarks：Shinichi Takeda（NCNP）

Banquet平成13年度ワークショップ報告書［概略］

21世紀の幕開けとともに、幹細胞の分化能や組織再生能を利用した疾患治療への展望が開けてきた。そこで、「筋ジストロフィー及び関連疾患の臨床病態解明と治療法開発に関する研究」班（主任 荒畑喜一）では、武田伸一班と協力し、次のような国際ワークショップを開催した。そこにおいて、筋形成・再生に関する研究のトピックスから、筋疾患の分野での再生医学への展望を具体的に考察し、150人以上の参加者による活発な議論がかわされた。

−145一

AsmallgroupworkshoponDysftrlinopathy（Moderator：青木正志）

2001年12月14日（金）東京・全共連ビル（地下1階R18）10：∝ト16：30
December14，2001（Friday）0mciaILanguage：EnglishandJapaneSe

問い合わせ先 phoneO22−717−7189（東北大学神経内科 青木正志）
PROGRAM
ASmal1GroupWbtkshoponDysftrlinopathy

10：00tlO：050pen血gRemarks
I）Clinicalsp∝trumOfdysftrlinopathy（Chair：MasashiAokizndHiroshiSai（0）10：05−10：35MasanoriNakagawaandItsuroHiguchi（KagoshimaUniversity）
Molecularepidemi010gyofMiyoshimyopathyinSouthempartofJapan：
Clinicalphenotypesanddysftrlinmutations
10：35−11：05TbhmrbiandKoSahashi（AichiMedicalUniversity）
Clinico−pathologiCalaspectwithdysftrlinopathy
ll：05−11：35YhkikoKHayashi（NationalhsdtuteofNeuroscience，NCNP）
Clinicalandproteinanalysisofdysftrlinopadly

ll：35−12：05MasashiAokiandTbshiakilbkahashi（TbhokuUniversityandNishitaga
NationalHospital）
Relatively prevalent mutations

and genotype−phenotype correlation ofdysferlinopathyinJq）aneSePOPulation
12：05−12：20Discussion（hlnCh）−146−

ⅠⅠ）SpecialLecture−1（13：20−14‥20）（Chair：YbkikoKHayashi）

RobertHBrownJzl（MassachusettsGeneralHospital，Boston）
榔′〟〃ご点gC川J伽∫g′川〟川∫血肋gα〃d助川α′甲〃お舷Ck胎HI）SpecialLecture−2（14：20−15：（氾）（Chair：KoSahashi）
Shin一ichiroYasunaga（DepartmentofBiochemis叫SagaMedicalSchool）
mg∫gCβ〃オ椚g〃−鮎′げ昭一JJ紘ggg朋♪椚勒07pF匝〃亡び戯〃g〃／q々rJ叫，亡α肘が。
〃〃〃刃′〃drO椚止血〃iI〟ちかfⅣβクⅣ）Updateondysftrlinresearch（Chair：IchizoNishin0）
15：20−15：35MikiharuYbshida（NationalhstihteOfNeuroscience，NCNP）
Attemptstodiscoverdysfbrlin−aSSOCiatedproteinS
15：35−15：50rmkashiMomoi（NationalhstituteofNeuroscience，NCNP）
BrainisofbrmOfdysftrlinandapoptosis
l主：50−16：20YbshihiroⅥねkayama（ShowaUniversityFLtjigaokaHospital）
Localizationofdysftrlininnomalskeletalmyofibers：COnfoCallazerandelectron
microscopicstudies
16：20−16：30ConclusionRemarks

−147−

清水班

Dysftrlinopathyに関するSmallGroupWbrkshop報告書
青 木 正 志■日時：平成13年12月14日10：00＿16：30
場所：東京・全共連ビル 地下1階Rm18
班長：清水輝夫

経過が大きく異なることを報告した．また国療西多賀病
院入院中のLGMD症例15例のうち5例にdysferlin遺伝子異常が確認されたことを報告した．総合討論においては，発表者（発表順）：中川正法，樋口逸郎（鹿児島大学第3内科），衣斐 達，佐橋 功（愛知医大神経内科），林 由
起子（国立精神神経センター神経研究所），高橋俊明，青木正志（東北大学神経内科，国療西多賀病院神経内科），
RobertHBrownJr．（MassachusettsGeneralHospital），安永
晋一郎（佐賀医大生化学），吉田幹晴（国立精神神経セン
ター神経研究所），桃井 隆（国立精神神経センター神経研究所），若山吉弘（昭和大学藤が丘病院神経内科）
座長：（発表者，青木，林の他に）斉藤 博（国療西多賀病院），西野一三（国立精神神経センター神経研究所）

dysftrlinopathyは多彩な臨床像を示すことが再確認され
特にLGMD2A型との臨床的な鑑別の難しさが示された．
発症年齢は13−51歳におよび，CK値は経過と共に低下がみられたが，発症時には最低でも1，000IU／1以上を呈することが明らかになった．また，筋病理学的な特徴ならびに診断にいたるための適切なスクリーニング方法を検討するためにはさらなる症例の蓄積および多施設共同による解析が必要であるという提案がなされた．
Il．特別講演特別講演2題では，まず故荒畑喜一先生との共同により1998年にdysferlin遺伝子のクローニングに成功した米国

J．DysferHnopathyの臨床型
鹿児島大学，愛知医大，国立精神神経センターおよび
東北大学の4施設からの報告があり，その後に総合討論がMassachusetts GeneralHospitalq）DL Brownが講演を行っ
た・Dr．Brownはdysferlinopathyの位置づけ，dysferlinとcaveolin−3との関連，末梢血のうちCD14陽性のリンパ球行われた．鹿児島大学第3内科の中川らは，遺伝子解析まを用いることによりdysferlin蛋白発現のスクリーニングが可能であること1），さらにはGene−Chipによるdysferlin
欠損マウス（SJLマウスなど）の遺伝子発現解析などを報告した．次にフランスPasteur研究所に留学中に遺伝性難聴の原因遺伝子としてotorerlinを同定した安永先生（現，たは免疫組織学的検討によりdysrerlin異常と診断された18例についてphenotype／genotypeCOrrelationを検討した．
多くの症例は基本的には下肢遠位部屈筋群優位の筋力低下を主症状とし三好ミオパチーと診断されたが，同一家系内に肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）類似例と肩甲下腿型筋萎縮症類似例が見られた．愛知医大神経内科の衣斐らは愛知医科大学附属病院における過去16年間の筋生検916例の検討を行い，LGMDはsyndromeを含め48例でありそのうち，dysftrlinの免疫染色で陰性でLGMD2Bと診断した症例は8例16．6％であったこと，三好遠位型ミオパテー（MM）は4例であったことを筋病理所見と共に報告した．また骨格筋CTでは筋症状のない症例でも大腿下腿の屈筋優位にまた傍脊柱筋外側部に脂肪化を認めたことを佐賀医大生化学）が，同遺伝子同定までの経緯ならびにOtofbrlinは蛸牛では内有毛細胞・前庭部ではⅠ型有毛細胞
といった内耳でもシナプス活動の盛んな細胞に強く発現していること，さらには組織特異的な発現パターンを示す長さの大きく異なるsplice variantやallemative splicingが存在し，longformこそが聴覚障害の発生に重要である
こと2）などの講演を行った．

報告した．国立精神神経センターの林は生検筋における

llL Dysferljn基礎研究のupdate
このセッションでは3施設からの報告があった．国立精dysferlin蛋白の発現を免疫組織化学法（IHC），イムノブロ
ット法（Wb）を用いて検討し，LGMD55例中2B型は18．2％を占めることを報告した．またIHC，Wbで共に異常が認められた症例群ではほとんどの症例で遺伝子変異を神神経センターの吉田からはdysftrlin精製の試みが報告され，dysferlinはWGA結合性の糖タンパク質とCa2＋依存的に結合することが示唆された．またdysferlinがエキソ
サイトーシスに関与する可能性が提案された．また同セ確認したことを報告した．その一方，MMのうち25％のンターの桃井はdysftrlinの機能を調べる目的で，脳に特症例では生化学的にdysferlinの明らかな異常が認められなかったことより，遺伝的多様性を含め今後検討していく必要性を報告した．東北大学の高橋らは59家系の異的に発現する脳型ジスフェルリン（Bdysf）と筋型ジス
フェルリン（Mdysf）遺伝子を分離し，EGFP融合蛋白として，さまざまな細胞に発現させた．発現させたBdysf
およびMdysrは細胞膜よりむしろゴルジ，ERに局在が観察され，アポトーシスに典型的な像を示し細胞死をおこすことならびに，ERストレスの関与が報告された．昭和

dysferlin遺伝子解析の結果から，日本人に比較的頻度の高い5種類の変異を報告し，遺伝子変異の種類により臨床■東北大学医学部神技内科

ー148−大学藤が丘病院の若山からはdysferlinの正常骨格筋における局在の共焦点レーザー顕微鏡及び免疫電顕による検討が示され，dysftrlinはcostamereに局在し，Hamletマウ
ス単クローン抗体を用いた免疫竃顕による検討では
dystrophin，β−dystroglycan・β−SpeCtrinおよびcaveolin−3とは共存しないことが報告された．
文

献1）HoMetal：Anovel，blood−baseddiagnosticassayfbrlimb
girdlemusculardystrophy2BandMiyoshimyopathy・Ann
NeurolinpTt！SS

2）YasunagaSetal：OTOFencodesmultiplelongansshortisoforms：genetic evidence that thelong ones underlie

recessivedeahessDFNB9．AmJHumGenet，67：591−600，
2000

一149−

DevelopmentofNewTherapyfbrMuscularDystrophy−ProgressInBasicResearch−（武田班との合同）

17Janu叩，2002（nursd叩）
atTokyoSabou−kaikan（Sch6nbachSabou）
0庁kidlan糾喝e‥English
I．0verdew：
ShhJichiTakeda，NadonalhstituteofNeuroscience，NadonalCenterofNeurology
andPsychiaby

肋W助〝甲紺お嘲，r〟deJJ抄椚鮎川血r少か甲妙，ⅠⅠ・GEne仙er叩y：
10：00・10：45

JohnHoweJl，MtudochUmiversity
乃gdわ血はおおJhGM血cg血で〝ケタ鮎加血励即血m励桝嘩gd血所のαお〃OVか払！〝dAdP，

KeiyaOzawa，Shin−ichiMochizuki，LかnWaJlg，YanymLu，Shin−ichiMuramatsu，Imah∬uN血0，TakashiOkada，托roakiMimkami，JichiMedicalSchool
Ⅵgα〃Jpr研∬￠揖rrhお〃㈹OCおおd叫vgcぬr憫g肋Jed騨〃g助〝職）′，，YasufumiKaneda，GmduateSchoolofMedicine，OsahUniversity
加V〜J如mg〃Jげ〃0VgJ〃0〃一ⅤねJ併〃g虎〟V〝γ卿my
12：00−13：30
1unCh
IⅡ．St亡mCdllnd5kdetdmu5de：
GiuJioCossu，U山versityofRome

LaSapienza．・

HiromitsuNakauchi，TsukubaUhiversity
塩db血〃血嘲如〃血如〃ク0加加わげカ肋α坤0ね触感伽α∫肋Jα肋
14：45・15：15

KeiichiFukuda，DaihikoHahno，YuichiTomita，hsdtutefbrAdvanced Cardiac
Therapcudcs．KeioUniverdtySchoolofMedicine

伽Vg坤mg〃Jす作廓〃㍗おdα肌か叩印加か椚me∫e〃殉桝α日加Ce〟舟

αydoⅥmb・絃Ⅲ′ggW〃g叫

ⅠVDkvtlopmentol山imdmodd5：
15：30・16：00

Yo−ichiNabeshima，KyotoUhiversity

Ⅷ血血明桓血肌卸肌加脚血中血如吻画材
NorioNakatsL帆InstitutcfbrFrontierMedicalSciences，KyotoUniversity
16：30
Closingrem訂ks−150−Summary

Clinico−PathophysiologlCa］researchanddevelopmentofmedical

treatmentformusculardystrophyandtherelateddisorders
pf柁CJed占ッ幻Jc力fA凡4Jm7礼〟．8．。〃d花mo∫〃ルタだ坊肱β・Theaimsoftheprqectaredesignedtoachieveduring3years，Lgeneanalysisandestablishmentofdiagnosticproceduresfbr
musculardystrophyandtherelateddisorders，・pathophysiologlCalinvestlgation；Clinico一genOtyplCCOrrelation，mOlecularanalysis

ofmusclecelldegenerationanddeath，l・developmentofmedicalandcelltherapy・Smal1groupworkshopisheldtopromoteanew

breakonspecialissuesbyyoungclinico−basicresearchers・M可OrreSultsarelistedbetow・（・GeneanalysISandestablishmentofdiagnosticproceduresformusculardystrophyandtheretateddisorders；limb一girdlemusculardystrophies（LGMDs）andaspecialformofdistalmusculardystrophy（Miyoshi）areextensively

analysed．Calpainothy（approximately23％），dysferlinopthy（16−30％）andsarcoglycanopathies（aroundlO％）weremqior
3fbrmsinJapan・Westemblot／immunohistochemistryandgeneticdiagnosisarefbundtobeeffectveinmorelhan70％ofLGMD
patients．Distalmusculardystrophy（Miyoshi）isfbundtobeaspeCialfbrmofdysferlinopathy・GenesfbrFukuyamatypecon−
genitalmusculardystrophyFCMDandtherelatedmuscle−eye−braindiseaseMEBarefbundtobethefukutingeneon9q31and
theO一glycantranferasePOMGnTlonlp33−34，reSpeCtively・TransposoninsertionatexonlOisthemqormutationfbrFCMD

andnonsensemutationsweredetectedinPOMGnTlfbr6MEBpatients・OthermutaionswerefbundinGNEfbrdistalmyopathy
withrimmedvacuoles，COllagenVIαsubunit（UllriChmyopathy），tnBP2forJapanesefamiliesofoculopharyngealmuscular
dystrophy．

．Pathophysiologicalinvestigation；clinic0−genOtypiccorrelation，mOlecularanalysisofmusclecelldegenerationanddeath・Molecularcharacterizationofcalpaln
suggeststhat10SSOfproteinaseactivltylSeSSentialformuscledamageofcalpalnOpathy，Whichmaycausederangementsofa
scaffbldprotein，COnneCtin，followedby damagesinmyonb血ls，SarCOlemmaandnucleus・Thisprocessisappearedtobediffer−entfromapoptosis．

Incontrast，thepathomechanismfbrdysfbrlinopathyissti11undetermined・Thenrstistheclinicalvariabilityoflimb−girdle
type，distalposteriortype（Miyoshi），distalanteriortypeandquadricepsmyopathytype・Thesecondisthemotecularpatho−
Physiologyofmuscledegenerationindysferlinopathy・Incongenitalmusculardystrophy，thephysiologicalactlVltyOffukutinisthemainissue・Itis suggestedtobeaglycocyltransferasebecauseofalteredglyco−mOietyofaperipherallymphocytemembranePrOteinandreductionofα−dystroglycanof
muscle．InMEB，themutated0−glycantransftraseresultedinthelossofα−dystroglycanimmunoreactlVlty・rIbkentogether，apOSSiblehypothesisisthattheglycosylationdefect（S）ofα−dystroglycandisruPttheinteractionofsar−

colemma−basalmatdx，WhichraiSestheftasibilityofenzymetherapyforFCMD，WWSandMEB・
Inmyotonicdystrophy，tightbindingofregulatoryproteins（CUG−BItEXP伽BNL）toelongatedCUG／CUGGrepeatSOf
RNAsresultsinthederangementsofotherRNAexpressionandtheresultingvariablephenotypessuchasStX5−CataraCtand
tau／tubulin−neurOnbri11arychanges（RNAtheory）・ThesechangeSCanbeinhibitedbyanti−apOptOticchemicals・

lll．Deveropmentofmedicalandce

therapy

Negamycln，anunapprOVedaminoglycode，isshowntoovercomethedystrophinstopcodonofmdxmousewithuptolO％re−coveryofnormalsizeddystrophininbothinvivoandinculturedmyotubes・Negamyclnandtherelatedchemicalsaregoodcan−
didates for〜10％of DMD／BMDand other nonsense mutations，becauseitis not accompanied by serious side efl
fects・DehydroepiandrosteroやeSulfateDHEAShastumedouttobeaNachannelblocker withnoinductionofmuscleweakness

and thusisagoodcandidatefbrmyotoniaofmyotonicdystrophy．Dichloroaceticacid（DCA）andsodiumpymVatearetriedto
mitochondrial encepalomyopathy patients with promlSlng reSults・Tburineis another better medical for MELASand
MERRESurveyofglycogenstoragediseasepatientsfbrtherecentlOyearsdemonstratedthat typesIt，VlIIIandVIIIarethe4

両Orfbrms（morethan83％），andvitamineB6willbetriedin28patientsoftypeV（McArdle）・
Asuper−apOptOSisproteinfactor，Bcl−XFNK，isdevelopedfbrseveralmuscledamagessuchasmyotonicdystrophy，DMD／BMD
andLGMDs．Stemce11−1ikemononuclearcellsarepreparedbyinductionofahomeodomainMsxIcDNAintoamouseskeletal
muscle．

WeliketofurtheracceleratetheresearChsonclinico−genOtyPICCOrrelation，pathophysiologicalanalysisandestablishmentofre−
alisticmedicaltreatmentsfbrmusculardystrophies．
−153−平成11〜13年度班員名簿

筋ジストロフィー及び関連疾患の臨床病態解明と治療法開発に関する研究
平成11〜13年度 清水班 名簿
所
区

分

主

任

氏

荒

名

畑

喜

一

（
平成 12 年 12 月逝去 ）
清

〝

水

輝

夫

（
平成 13 年 4 月よ り）
分

担

栗

原

照

幸

（
監

r石

浦

章

一

（幹

斎

藤

加代子

（幹

佐

橋

功

（
幹

瀬

原

淳

子

（
幹

戸

田

達

史

（
幹

吉

田

幹

晴

青

木

正

志

遠

藤

剛

福

原

信

義

萩

原

康

子

花

岡

和

則

樋

口

逸

郎

〝

土

方

貴

雄

川

上

潔

吉

良

潤

一

教

授

0 3−
5 45 4 −
67 39

教

授

0 3−335 3 −
8 1 11（内 3 82 11 ）教授

0 5 6 1−
62 −33 11
（内 2 380 ）

教

授

07 5−
7 5 ト3 82 6

教

授

06 −
6 879 −
3 3 80室

長04 2−34 6−17 20（
内 5 96 2 ）

助

手

0 22−
7 17−
7 189

宮 城 県 仙 台 市 青 葉 区 星 陵 町 ト1
．助 教 授04 3 −
29 0 −39 11

千 葉 県 千 葉 市 稲 毛 区 弥 生 町 1−33
副院長

室

長

0 42 −
34 1−
27 11（内 5 15 5）

東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 −1−1

北 里 大 学理 学 部 生命 科 学 科

0 25 5−34−
3 13 1（内 6 0 1）

新 潟 県 中 頸 城 郡 大 潟 町 犀 潟 4 68 −1

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所

教

授

0 4 2−
7 78 −
8 864

講

師

09 9−
2 75 −
5 33 2

助手教

授

0 285 −
5 8−
7311

教

授

0 92 −
64 2−53 37

神 奈 川 県 相 模 原 市 北 里 1−15 −1

鹿 児 島 大 学 医 学 部第 三 内 科
鹿 児 島 県 鹿 児 島 市 桜 ヶ 丘 8−
35 −1

群馬大学医学部第二解剖学講座． 02 7−2 2 0−
7 9 12群 馬 県 前 橋 市 昭 和 町 3−39−22

自治 医 科 大 学 医 学 部 生 物 学 教 室
栃 木 県 河 内 郡 南 河 内 町 薬 師 寺 33 1 1−1

九州大学大学院医学研究院〒 8 12 ＿
85 82

0 3−
3 46 8 −12 5 1（内 2 3 22 ）東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 −1−1

国 立 療 養所 犀 潟 病 院〒 32 9 ●0 4 98〝授

大 阪 府 吹 田市 山 田丘 2−2−B9

千 葉大 学 理 学 部 生 物 学 教 室〒 37 1＿8511〝

教

京 都 府 京 都 市 左 京 区 聖 護 院 川 原 町 53

東北大学医学部附属病院神経内科〒 89 0＿8 52 00 3−
3 96 4 −12 11（内 19 10 ）愛 知 県 愛 知 郡 長 久 手 町 岩 作 雁 又 21

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所〒 22 8−8 55 5〝授

東 京 都 新 宿 区 河 田 町 8−1

大 阪 大 学 大 学 院 医 学 系 研 究 科 ボ スげ ノム疾 患 解 析 学 講 座〒 18 7●
S 50 2〝教

東 京 都 目 黒 区 駒 場 3−
8 −1

京都大学再生医科学研究所〒 9 4 9＿3 19 3〝長

東 京 都 板 橋 区 加 賀 2−1 ト1

愛知医科大学医学部神経内科学講座〒 2 6 3＿
S 52 2〝

部

連 絡 の 際 の電 話

東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 −1−
1

東京女子医科大学小児科〒 9 80 ●85 74〝

け る 地位

東 京 大 学大 学 院 総合 文 化 研 究 科〒 187 −
85 02

事）
〝

所属 に お地

東 邦 大 学 医 学 部第 四 内科．
〒 56 5 ＿
0871

事）
〝

〒 17 3−8 60 5〒 60 6 ＿
85 07

事）
〝

名

帝 京 大 学 医学 部 神 経 内科

〒480＿
1 19 5事）〝〒 187 ＿
8 502

〒 16 2＿8 66 6事）〝

設

在

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所〒 15 3＿8 90 2事）〝

施〒 15 3＿8 5 15 東 京 都 目 黒 区 大 橋 2 −
17 −
6

（
運 営 幹事 ）〝属所

福 岡 県 福 岡 市 東 区 馬 出 3−1−1

ー157−

区

分

分

担

氏

松

所

名

田

良

一

松

尾

雅

文

南

〝

桃

成

井

祐

真 里子

桃

井

〝

二

富

治

西

野

一

野

地

澄

大 日方

連絡の際の電話

教

授

07 8−
3 8 2−
5 700

国 立 精 神 ・神 経 セ ン ター 武 蔵 病 院〒 187 −
85 5 1 東 京 都 小平 市 小 川 東 町 4 −1●1

医療技術
職員

0 4 2−
3 4 1−
2711（内 35 9 0）

自治 医 科 大 学 小 児 科教

授

0 28 5 −58−
73 65

東 京 都 目黒 区駒 場 3＿
8 ＿1

兵 庫 県 神戸 市 中央 区楠 町 7 ＿5 ＿1

栃 木 県 河 内郡 南 河 内 町 薬 師 寺 3 3 1 1＿1

国 立 精 神 ・神 経 セ ン ター 神 経 研 究 所〒 187−85 02 東 京 都 小平 市 小 川 東 町 4 ＿1＿1

室長

04 2 −
34 1−
2 7 11（内 5 27 3 ）明

鳥取大学医学部生命科学科神経生物学

助教授

0 859 −
34 −8 27 6

部

長

0 4 2−
3 4 1−
2711（内 5 1 1 1）

教授

0 8 8−
6 56 −
75 2 8教授

04 3 −
29 0 −
28 04

三

晴

昂

鳥 取 県 米 子 市 西 町 86

国 立 精 神 ・神 経 セ ンタ ー神 経研 究 所〒 18 7−8 50 2

東 京 都 小 平 市小 川 東 町 4 ＿1＿1

徳 島 大学 工学 部 生 物 工 学科
〒7 70 −
85 0 6〝

け る 地位隆（
平成 12 年4 月より）〝所属 に お地神 戸 大 学 医 学 部 附属 医学 研 究 国際 交 流 セ ン ター

〒 6 83−850 3
〝

名

0 3−
54 5 4 −6 6 37〒3 29 −
04 9 8
〝

設

在

助教授

〒6 50 −00 17〝

施

東 京 大 学大 学 院 総 合 文 化研 究 科〒 15 3−8 90 2〝

属所

徳 島県 徳 島市 南 常 三 島 町 2 ＿1

千 葉 大 学 理 学 部 生物 学 教 室〒2 63 −
85 2 2

千 葉 県 千葉 市 稲 毛 区 弥 生 町 1●33

〝

太

田

成

男

日本 医 科 大 学 老 人病 研 究 所〒2 1 ト85 3 3 神 奈 川 県 川 崎 市 中原 区 小 杉 町 1●
396

教

授

04 4 −
7 3 3−
9 2 67

〝

反

町

洋

之

東 京 大 学 大 学 院 農 学 生 命 科 学研 究科 応 用 生 命 化 学 専 攻

助 教授

03 −
58 4 1−8 2 18所

長

0 5 3−
5 86 −
8 80 1（内 100 ）教授

0 8 6・
4 62 −11 11（内 60 87 ）講師

0 45 −
7 87 −
25 97

助教授

0 25 −
22 7−
0 6 64

教授

0 9 6−
3 7 3−
5 89 0教授

0 4 5−
9 7 1−115 1（内 6 26 9）

教授

0 4 2−
9 95 −14 7 8

助教授

0 26 3−37 −32 15（内 6 8 8 1）

室

04 2 −
34 1−
2711（内 5 113 ）〒 113−865 7
〝

杉

江

秀

夫

浜 松 市 発 達 医 療 総 合 セ ンタ ー
〒4 34 −
00 2 3

〝

砂

田

芳

秀

鈴

木

1 厚

田

中

恵

子

内

野

誠

若

山

吉

弘

依

藤

宏

吉

田

邦

広

林

由起 子

（
平成 13 年4 月より）埼 玉 県 所 沢市 並 木 3 ＿2

信 州 大 学 医学 部 附属 病 院遺 伝 子 診 療 部〒3 90 −
86 2 1〝神 奈 川 県 横 浜 市 青彙 区藤 が丘 ト3 0

防衛 医科 大 学 校 解 剖 学 第二 講 座〒3 59 −
8 5 13〝

熊 本 県 熊 本 市 本 荘 1●1＿1

昭和大学藤が丘病院神経内科〒 22 7−8501〝

新 潟 県 新 潟 市 旭 町 通 一 番 町 75 7

熊本大学医学部附属病院神経内科〒 86 0 −0 8 11〝

神 奈川 県 横 浜 市 金 沢 区 福 浦 3 ＿9

新 潟 大 学 脳 研 究 所 神 経 内科
〒9 5 1−85 8 5〝

岡 山県 倉敷 市 松 島 5 77

横 浜 市立 大 学 医学 部第 2 生 化 学 教 室〒2 36 −
00 0 4〝

静 岡 県 浜 北 市高 薗 7 75 ●1

川 崎 医科 大 学 神 経 内 科〒7 0 1−
0 19 2〝

東 京 都 文 京 区弥 生 ト1＿1

長 野県 松 本 市 旭 3 −1＿1

国 立 精 神 ・神 経 セ ン ター 神 経 研 究 所〒 187 −
85 0 2

東 京 都 小 平 市 小 川 東 町 4 ＿1＿1

−158−長