第8期採択課題

学習記憶障害をもたらすグルタミン酸受容体結合化合物の発達神経毒性・神経毒性を評価するインビトロ試験法の構築
研究代表者 関野祐子 東京大学大学院薬学系研究科 ヒト細胞創薬寄付講座特任教授
研究分担者 山崎博幸 群馬大学大学院医学系研究科 薬理学分野 助教
金村米博 国立病院機構大阪医療センター 先進医療研究開発部 部長
山崎大樹 国立医薬品食品衛生研究所 薬理部 第2室長

本研究で提案する神経毒性の有害性発現経路（AOP）
Molecular
Initiating Event(MIE)
Binding ofchemicals toionotropic
glutamate
receptors

Cellular effects
Overactivationof NMDAR

Inhibition of
AMPAR

Loss ofdrebrinAbnormal
synapseshape
Decreasedsynaptogenesis

Organ effects

Organismeffects

Decreased
neuronalnetwork
function

Impairment oflearning andmemory

学習記憶障害はシナプス機能不全（シナプス部位に起こる機能的構造的障害）で起こることから、”Loss of drebrin”をCellular effectsとして解析する。これまで、MIEとして化合物がNMDA型グルタミン酸受容体に結合を挙げている他のAOPと比較するとEventsが簡素である。

本研究では、培養神経細胞の樹状突起スパインからのドレブリンの消失を定量解析することが、化合物の神経毒性（学習記憶の機能障害）を予測するin vitro
評価系として有用であることを、複数の化合物を用いて検証する。

グルタミン酸イオンチャネル型受容体とAOP【AOP No. 6】 Adverse Outcome Pathway on binding of agonists to ionotropic glutamate receptors
in adult brain leading to excitotoxicity that mediates neuronal cell death, contributing to learningand memory impairment Sachana M, Munn S, Bal-Price A 09 Sep 2016

• Level of biological organization Molecularの一つとしてDrebrinがとりあげられている。
Drebrin immunocytochemistry ……..Therefore,degradation of drebrin can be used as a readout for excitotoxicity induced by
NMDAR overactivation. Degradation of drebrin can be evaluated quantitatively by Western blot analysis(mRNA ｌevel) or byimmunocytochemistry (at protein level) (Chimura et al., 2015: Sekino et al.,2006).

【研究背景】 神経細胞特異的アクチン結合タンパク質ドレブリン
発達神経毒性の評価との関連性• ドレブリンは脳の発生・発達に伴って増えるアクチン結合タンパク質である。
• 脳形成時の細胞移動の際には神経突起と成長円錐に発現してアクチン動態を制御している。

1983年：脳の発生と成長に伴って発現量が変わる大量のタン
パク質を同定してドレブリンと命名された。
1996年：アルツハイマー患者脳のドレブリンが激減することが判る。

• 脳の発達期においては、学習・記憶の分子基盤を支える構造的モジュールである樹状突起スパイン構造を作る。
成長期または成熟後の神経毒性評価との関連性• 学習・記憶の機能的基盤である神経可塑性に伴う樹状突起スパインの形態変化を担っている。
• ドレブリンが消失したスパインでは学習の分子機構が働かない。
• In vivo 実験や臨床所見から、ドレブリン消失と記憶障害がリンクしている。

https://www.springer.com/gp/book/9784431565482

神経細胞の発達におけるアクチンとドレブリンの分布の変化
NeuronNeurite outgrowthstage1

DIV4

DIV2

DIV0
NeuralStem
Cell

Axon-dendrite polarization
elongation

stage2stage3stage4F-actin Drebrin

DIV10-21

Synapse formation
Neuronalnetworkformation

In the spine
drebrin andactin are highlyconcentrated.

DIV21

Synapsin I
5μm20μm

staining faces tothem成熟した神経細胞の形態と細胞内アクチンの分布模式図
大脳皮質の錐体細胞（ゴルジ染色像）

海馬の錐体細胞（ゴルジ染色像）

Dendritic Actin Cytoskeleton: Structure, Functions, and Regulations
Anja Konietzny, Julia Bär, and Marina Mikhaylova*
Front Cell Neurosci. 2017; 11: 147. Published online 2017 May 18. doi:
10.3389/fncel.2017.00147

学習記憶が起こる部位（シナプス）とドレブリンの関係
ドレブリンは樹状突起スパイン（シナプス後部）の形態を作る
脳全体像：MRI画像

大脳皮質を構成する神経細胞の形（ゴルジ染色像）

培養神経細胞：神経細胞の形と細胞骨格タンパク分布

シナプスの構造の名称と細胞骨格タンパク

ドレブリンは受容体などのシナプス後部の機能タンパクの局在を安定化する役割を果たすアクチン結合タンパク質である。

成熟した培養神経細胞（ラット）のドレブリンの分布：
緑色の構造が、樹状突起スパイン（シナプス後部構造）に集積するドレブリンの免疫細胞化学染色像

アルツハイマー病における脳内ドレブリンの減少（シナプス機能不全の原因）
Western Blotting

Immunohistochemistry of Hippocampus
drebrinsynaptophysin

Aged control
Harigaya et al., J Neurosci Res (1996)よりdrebrinsynaptophysin

AD

化学物質による学習記憶機能への有害反応を調べるために、免疫組織染色や免疫細胞染色などでドレブリンの減少を調べることが、時間とコストの節約になる。

グルタミン酸投与によるスパインからのドレブリンクラスター消失（NMDA受容体活動依存性：ドレブリンエクソダスと命名）
A. コントロール（DIV21)の分布

B. 100 μM グルタミン酸 10分間投与後

ラット海馬培養神経細胞のドレブリン分布：NMDA受容体刺激による局在変化（unpublished photos)
A; 樹状突起スパインにドレブリンが局在しているので、ドレブリンクラスターとして定量的に測定することが出来る。
B. グルタミン酸を投与すると、ドレブリンがスパインから樹状突起の幹の方に移動する。
ドレブリンクラスター数の減少として定量的に評価できる。

化合物の毒性試験のためのハイスループット法
細胞播種
１万個／穴

細胞数測定
細胞融解

SKYニューロン（アルメッド社）
凍結神経細胞AraC添加血清を使わないので、再現性が向上する
ハイコンテントアナリシス

画像取得・解析の完全自動化により、再現性が向上する

薬物投与

免疫染色(drebrin, MAP2, DAPI)

5 µm

同一ロットの細胞を使えるので、再現性が向上するハイスループット解析のためのアルゴリズム構築
Ⅰ. Identification of neuronal cell bodies：Neuronal cell bodies were identified by nuclear (DAPI) and MAP2 staining.
Ⅱ. Identification of dendrites：Dendrites were identified by segmentation of the MAP2-positive regions.
Ⅲ. Identification of dendritic peripheral area .
Ⅳ. Identification drebrin clusters

解析アルゴリズムは、群馬大学大学院医学系研究科D2 間瀬省吾氏により構築されたものを採択した。
解析、グラフ化は間瀬氏が担当
11

成熟した培養神経細胞のドレブリンクラスターの自動認識(A - D) Fluorescence images of drebrin (green), MAP2 (red) and DAPI (blue) in cultured hippocampal neurons. (A-C: control, D-F: 100 μM glutamate)(B and E) Dendritic skeltons (blue lines) mapped on fluorescence images. (B: control, E: 100 μM glutamate)scale bar : 10μm(C and F) Drebrin clusters (white areas) mapped on fluorescence images. (C: control, F: 100 μM glutamate)12まとめ• 本研究では、ドレブリンの消失をKey Event(KE)とする発達神経毒性や学習障害を有害事象（AO）とする有害性発現経路（AOP）を提案する。
• 神経毒性によるドレブリン消失は学習記憶障害に直結することから、神経細胞死をKEとする既存のAOPに比べて簡便な神経毒性評価法となる。
• 実験の再現性を高めるために、ラット胎児海馬から作成した凍結神経細胞を使い、実験プロトコルはすでに多施設でバリデートされた96ウエルプレートへの播種法を採用する。現在はグルタミン酸の作用の濃度依存性を解析中である。
• 画像解析の迅速性を高めるために、共焦点定量イメージサイトメーター（CQ1;yokogawa）で撮像した画像から、画像解析ソフト（セルパスファインダー）でドレブリンクラスターを自動認識するアルゴリズムを構築し、グルタミン酸処理によるドレブリンクラスター数の減少を定量的に測定できることを示した。
• 今後、AIを用いて、その他の特徴抽出を行っていく。ヒトiPS細胞の利用については、年度の後半に取り掛かる予定である。