2019 年 日化協LRI 研究報告会
シリカファイバー三次元培養担体を用いたヒト肝臓細胞の機能発現に関する研究[日本動物実験代替法学会 第3 回LRI 賞]
古水 雄志（崇城大学 生物生命学部 応用生命科学科）

２０１9.8.30

3D培養による抗がん剤の薬剤耐性について※多剤耐性(MDR: Multi Drug Resistance)
薬剤排出 大抗がん剤
薬剤排出 小細胞実験(in vitro, 2D)

細胞実験(in vitro, 3D)
腫瘍

動物実験(in vivo)

ヒト細胞を三次元培養(3D培養)することで、MDRの機能が高まることで薬剤耐性を示す。
これは従来の単層培養(2D培養)では再現が難しいため、生体内を模倣できるようなin vitroでの新規スクリーニング系の開発が望まれる。

がん三次元培養の研究について
三次元培養（spheroid培養1)）

二次元単層培養（monolayer培養）※：MDR1などの薬物排出活性タンパク質を示す。

薬物がん
細胞

薬物三次元培養（Cellbed培養2,3)）
薬物

細胞外への排出低酸素

dish表面無処理

dish表面をpoly-L-glutamic acid被覆

薬物排出活性：低薬物排出活性：高低酸素

シリカファイバー
Cellbed
薬物排出活性：高三次元組織化培養によるがん細胞の薬物排出活性の発現
がん細胞は、薬物排出活性などが高まることで、薬剤耐性を獲得していることが確認されている。これまで本研究室では、肝がん細胞(HepG2細胞)のMDR1活性を、三次元培養で発現させることに成功している。
1) A.Oshikata, T. Matsushita, R. Ueoka, J. Biosci. Bioeng., 111. 590-593 (2011).
2) T. Mizutami, Y. Ohta, M. Nakamura, Y. Komizu, T. Iwasa, K. Sasaki, R. Watanabe, M. Kawabe, T. Matsushita,Adv. Biochem. Biotechnol., 112 (2017).
3) K. Inamura, K. Emoto, H. Ichihara, K. Sasaki, T. Iwasa, R. Kojima, M. Kawabe, Y. Komizu, Y. Matsumoto, T. Matsushita, J. Carcino. Mutagen., 9 (2018).

Cellbed®を用いたHepG2細胞の3D培養
ABCDA, 3D培養基材(シリカファイバー)の SEM,
B, 3D培養したHepG2細胞のSEM観察画像,
C, 3D培養したHepG2細胞の蛍光画像 (表面),D, Cの断面（３～４層の細胞層形成）
赤：核; 緑：アクチン
赤：核、緑：アクチン

Scalebars 10:10 µm
Scalebars:µm

Mizutami et al., Adv Biochem Biotechnol, 2017, 112

三次元培養担体Cellbed®を用いて肝臓がん細胞(HepG2細胞)を7日間培養した際に共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。細胞は、シリカファイバーの内部または上部へ積層して均一な3D培養を可能としていた。

In vitro（Cellbed® ３D培養）における薬剤耐性と薬剤耐性克服現象
モデル薬物
・抗がん剤
Doxorubicin (DOX)
・薬剤耐性克服薬(MDR1阻害剤)
Verapamil (VRP)
・曝露時間
48時間

*P < 0.05

HepG2細胞の2D培養及び3D培養におけるIC50値の比較

Mizutami et al., Adv Biochem Biotechnol, 2017, 112

2D培養(単層培養)と3D培養(Cellbed®培養)において、DOXに対するIC50値は3Dの方が高く、薬剤耐性を示した。一方で、VRPを併用することで IC50は顕著に低下し、明らかな薬剤耐性克服現象が観測された。

In vitroにおける薬剤耐性と薬剤耐性克服現象
Cellbed® 3D培養
DOX efflux activity [nmol/106 cells]

1.5

VRP (－)VRP (＋)
1.0***

0.5

*

モデル薬物
・抗がん剤
Doxorubicin (DOX)
・薬剤耐性克服薬
Verapamil (VRP)
・細胞へのDOX取り込み時間
1時間
3D培養によるDOXの排出活性0.00*p<0.05306090120
Time [ min ]150180Inamura et al., J Carcinog Mutagen 2018, 9:2

3D培養(Cellbed®培養)において細胞に取り込まれたDOXは、VRP （－）ではMDR1によって速やかに排出されるが、 VRP （＋） では排出が阻害された。そのため、低濃度のDOXで増殖が抑制されたものと思われる。

2Dおよび3D培養によるHIF-1αとMDR1の発現
2Dmonolayer

3D

monolayer
2D

CellbedHIF-1αHIF-1αMDR1
MDR1Overlay
Overlay

Overlay
Overlay

Scale ScaleBars:
bars10:10µmµm

HepG2細胞の2D培養および3D培養におけるHIF-1αの免疫染色

Cellbed3D

Scale ScaleBars:
bars10:10µmµm

HepG2細胞の2D培養および3D培養におけるMDR1の免疫染色2D培養(単層培養)では、HIF-1αおよびMDR1の発現が低い一方で、3D培養(Cellbed®培養)することにより、 HIF-1αおよびMDR1の発現が高まることが示された。
Adv Biochem Biotechnol, 2017, 112

担がんモデルマウスによる薬剤耐性現象
In vitro実験と同じ細胞、同じ薬剤を使って、in vivo実験でも同じ薬剤耐性現象が起こるかを検証
Cell line-derived xenograft（CDX）モデル
体重測定・腫瘍サイズ測定 (腫瘍体積＝腫瘍長径×腫瘍短径×腫瘍短径×1/2), 1日ごとに測定
0 day

7 day

14 day21 day

VRP 投与(腹腔内)DOX 投与(尾静脈)VRP 投与(腹腔内)DOX 投与(尾静脈)VRP 投与(腹腔内)DOX 投与(尾静脈)28 day皮下腫瘍摘出投与方法
HepG2細胞皮下移植

VRP 25 mg/ kg 腹腔内投与
or
生理食塩水 腹腔内投与

1 時間後
1 時間後

DOX 1 mg/ kg 尾静脈投与
or
生理食塩水 尾静脈投与

皮下腫瘍摘出後、腫瘍重量の測定

使用動物
高度免疫不全マウス(NOD/ Scid/ Jak3-KO), ♀, 5週齢
移殖細胞
HepG2細胞 (肝がん細胞)
皮下移植
細胞懸濁液：マトリゲル = 1：9
5×106 cells/ body (100 µL)で皮下移植・薬効の評価：腫瘍体積の算出
腫瘍重量・薬毒性評価：体重測定

In vivo（（CDX）モデル）における体重変化と腫瘍体積の変化
2,500

Tumor volume (mm3)Body weight (g)2015Control (n=9, ± S.D.)
10VRP (n=7, ± S.D.)
DOX (n=7, ± S.D.)
VRP + DOX (n=7, ± S.D.)

5017142128

Time after HepG2 inoculation (days)

Control (n=9, ± S.D.)
VRP (n=7, ± S.D.)
DOX (n=7, ± S.D.)
VRP + DOX (n=7, ± S.D.)

2,000
1,500

**

1,000500017142128

Time after HepG2 inoculation (days)**p<0.01 (vs. other 3 groups)

HepG2細胞を皮下移植した後の体重変化

HepG2細胞を皮下移植した後の腫瘍体積変化

薬剤投与により毒性が出ない濃度で(体重減少が起こらない濃度範囲)、DOX単独では薬剤耐性を示した一方で、VRP+DOX併用により薬剤耐性克服現象が観測された。
J Carcinog Mutagen 2018, 9:2

（CDX）モデルから摘出した腫瘍の重量と大きさの比較
Control
2.5

Tumor weight (g)

VRP

DOX

VRP+DOX* P<0.05 (vs. Control)

2.0
1.5

*

1.00.50.0

Control

VRP

DOX

VRP+DOX

HepG2細胞を皮下移植して28日目に摘出した腫瘍の重量

Scale bars：1 cm

HepG2細胞を皮下移植して28日目に摘出した腫瘍の写真

DOX単剤では腫瘍重量はControl(未治療群)と差が無かったが、VRP+DOX併用群ではControlと比べて有意に重量が減少したことからも、薬剤耐性克服現象が認められた。
J Carcinog Mutagen 2018, 9:2

In vitro と In vivo （CDX）モデルにおけるMDR1発現A

B

C

In vitro(Cellbed®
3D培養)
20 µm

20 µm

D20 µmFEIn vivo(腫瘍)
20 µm

20 µm

In vitro (三次元培養担体断面)とin vivo (腫瘍断面)のMDR1発現の比較
A. In vitroのHE染色 B. In vitroのMDR1の免疫染色 C. Bの拡大
D. In vivoのHE染色 E. In vitroのMDR1の免疫染色 F. Eの拡大
J Carcinog Mutagen 2018, 9:220 µm

まとめin vitro 細胞実験

○ 肝がん細胞(HepG2細胞)の monolayer(2D)培養では薬剤排出活性が低く、薬剤耐性克服現象が明確に観測できない。
○ Cellbed®で3D培養することにより、 DOXに対するIC50値が大きくなり、DOXの細胞外排出量が増加するが、VRPを用いた薬剤耐性克服現象が明確に観測された。
○ 培養基材切片より、MDR1が細胞周囲に発現していた。
in vivo 動物実験 （CDXモデル）○ DOX単独投与群では、腫瘍体積変化・腫瘍重量ともに未治療群(Control)と比較して薬効が見られず、高い薬剤耐性を示したと考えられる。
○ VRP+DOX併用群では、腫瘍体積変化・腫瘍重量ともに未治療群(Control)と比較して腫瘍の縮小効果が見られ、薬剤耐性克服現象が観測された。
○ 腫瘍切片より、MDR1が細胞周囲に発現していた。

【結論】
Cellbed®３D培養による肝がん細胞のin vitro評価系は、in vivoでの薬剤耐性現象を再現でき、薬剤耐性克服薬スクリーニングに有望である。