2023年⽇化協LRI 研究報告会（ウェブ開催）
2023年8⽉25⽇

シンポジウム︓リスク評価⼿法の現状と今後

アカデミアにおけるリスク評価⼿法開発研究

吉成浩⼀

静岡県⽴⼤学薬学部
衛⽣分⼦毒性学分野
1

研究内容概略

学部学⽣向けの研究紹介スライド• 化学物質の有害作用• ヒトの化学物質応答性を理解• 安全・有益な化学物質の開発• 医薬品副作用の回避• 疾病の予防・治療

化学物質：医薬品、食品、農薬、食品添加物、一般工業物質、環境汚染物質...

研究テーマ紹介 核内受容体の機能と作用機序• ステロイドホルモン• 脂肪酸• 脂溶性ビタミン• 甲状腺ホルモン• 胆汁酸• ステロール類異物• 医薬品• 食品成分
• 農薬• 環境汚染物質• 工業化学物質ER

VDR
・・・PXR

CAR

GRGR

ホルモン作用target gene
ERERGR

ホルモン作用target gene

VDR
RXR

内因性物質

標的遺伝子・機能ビタミン作用target gene

PXR
RXR受容体薬物代謝エネルギー代謝
target gene

CAR
RXR

リガンド

薬物代謝
化学発がん
target genen 生体には様々な化学物質に応答する核内受容体が存在する。
n これらの新たな機能や調節機構を明らかにしたい。

化学物質による肝発がん機構とその種差の解明
薬物・化学物質

細胞内シグナル
MST

PP2A
ERK

核内CAR
受容体

クロストーク

LATS

Hippo
パスウェイ

YAP
CAR

CAR
RXR

YAP
CYPs

P450誘導活性酸素産生

種差
肝がん

YAP

TEAD

BIRC5/API4
MYC
CTGF
CYR61
ANKRD1

細胞増殖
アポトーシス阻害n 肝発がんプロモーターであるフェノバルビタールの発がん機序はよく分かっていなかった。
n 当研究室ではその機序を明らかにしつつあり、近い将来、我々の発見が教科書に載ることを期待している。

肝障害予測・評価手法の開発
化学物質（医薬品、食品、農薬、化粧品、環境物質等）

毒性関連インビトロ試験

化学構造情報分子記述子• 薬物代謝酵素• トランスポーター• 核内受容体• 細胞傷害性• 細胞小器官（HCS）• 炎症・酸化ストレス

統計解析
機械学習
毒性予測・評価系

ヒト肝細胞

HepG2細胞毒性データ
ベース

n 様々な生体応答、毒性発現機序の理解を進め、インビトロ試験等を利用した毒性予測系を開発する。
n 究極的には化学構造からの予測を目指す。

本⽇の内容n 研究背景、当研究室の研究紹介
n 我が国における動物実験代替法開発の課題

7

研究背景
n 化学物質の安全性は主に動物実験結果を基に評価されているが、世界的に動物実験代替法の開発が強く求められている。
n EUにおける、動物実験が⾏われた化粧品完成品、原料及び配合原料の販売禁⽌（2013年）、⽶国環境保護庁による哺乳類を⽤いた試験の要求停⽌並びに研究費補助の30%削減（2025年まで）並びに全廃（2035年まで）の発表など、その流れは加速している。
n しかし、全⾝毒性の評価に重要な反復投与毒性に関しては、その毒性の多様さ、複雑さなどの理由から動物実験代替法の開発は全く進んでいない。
n AI/機械学習への期待は⼤きいが、毒性関連の学習⽤データは少なく、予測根拠情報が得られない、などの問題がある。
n このような状況において、複雑な毒性の評価に、グルーピングアプローチ（カテゴリーアプローチ）とリードアクロスが有⽤かつ現実的な⼿段と考えられている。
8

体系的・客観的なリードアクロス⼿法開発の課題
リードアクロス⼿法の概略
被験物質（ターゲット）

既存の毒性
試験結果

類似物質の選択（ステップ１）
類似物質

（ソース）

被験物質の毒性評価（ステップ２）

課題
ステップ１• どんな指標で類似性を判断︖• 化学構造のみ︖
⽣物学的情報が必要︖
機序の情報は必要︖• どの程度までが似てる物質︖• いくつの類似物質が必要︖
ステップ２• 判断基準は︖• 毒性の有無︓多数決︖１つでもあれば有害︖• LOAEL/NOAELの評価︖

n 客観的なリードアクロスの実施には、検討すべき項⽬が多い。9化学構造情報とインビトロ試験結果を利⽤した体系的なリードアクロス
参照データセット

被験物質（HESS、REACHデータ等）（ターゲット）どのような試験が有⽤なのか︖①構造⽐較①構造的類似性による抽出どのような指標が有⽤なのか︖
どのくらいの物質数が必要なのか︖

AssaysA B C D E

②インビトロ試験の実施

1 01956235221101081855751 0481 0285723451 0②⽣物学的/毒性学的類似性による抽出ü 適切なインビボ毒性データセットの整備
ü 機序の理解による適切なインビトロ試験の選択
ü ケーススタディの積み重ね、等が必⽤

リードアクロスの実施

LRI 第10期〜 研究課題
反復投与毒性の評価のための統計学的・数理科学的アプローチによる客観的なリードアクロス⼿法の開発
代表研究者︓吉成浩⼀（静岡県⽴⼤学薬学部）
分担研究者︓⽵下潤⼀（産総研安全科学研究部⾨）︓鈴⽊知道（東京理科⼤学理⼯学部）
⽬的・概要
HESS等のラット反復投与毒性試験データベースを参照データセットとして、被験物質の化学構造情報やインビトロ試験結果に基づいて参照データセットから類似（ソース）物質を抽出し、それらから被験物質の反復投与毒性を予測するための、客観的なリードアクロス⼿法の開発を⽬指す。
現在、肝毒性と⾎液毒性を対象として、化学構造情報とインビトロ試験情報で順次類似性を評価する「２段階リードアクロス」⼿法の構築に向けた解析を実施している。

12

研究方法概略
NH2

Original dataset
326 substancesfrom HESS

Test dataset
32 substances······#1

Step 1:
Chemicalsimilarity
Reference dataset
294 substances

OH

#2

#3

#32

課題
Step 2: Biological similarity• 反復投与毒性のエンドポイントの発現機序は不明なものが多い。
• どのようなインビトロ試験を実施するべきか︖

Step 1

Step 2
1st source
substances

Final sourcesubstancesRAxデータセット• HESSから326物質（主に化審法既存点検物質）を選択：Original dataset• １割（32物質）を被験物質としてランダムに選択： Test dataset• 残りを類似物質（ソース物質）検索対象データセットに設定： Reference dataset
類似物質選択とリードアクロス• 分子記述子を利用して化学構造が類似する17物質を選択：1st source subst.
• 17物質のうち、インビトロ試験結果が一致する物質を選択：Final source subst.
• Final source substancesを用いて、各エンドポイントのリードアクロスを実施• 全被験物質について同様の操作を行い、予測精度を評価

13使⽤するインビトロ試験データの選択
試験データとその陽性率
Category Parameter

Positiveratio

LDH
CellTiter
GSH
CYP1A1CYP1A2CYP2B1CYP2C6
CYP2D1CYP2E1CYP3A2
NucMitFactin
TG
PL

16.0%
26.9%
25.2%
38.8%
21.4%
32.3%
29.3%
11.6%
8.2%
24.8%
31.6%
60.9%
48.6%
34.7%
34.7%

Cytotox

P450

HCA

使⽤するインビトロ試験変数の選択• gEPの有無と各実験データの関連性をFisherの正確確率検定により解析• 各カテゴリの中で、最も関連性の⾼かった変数を解析に使⽤
gEPCytotox

P450

Para.

p-valuep-valuePara.

p-value

LDH

0.3014 rCYP2B1 0.1397

Mit0.3686

LV02 CellTiter 0.1233 rCYP2D1 0.0933

TG0.0102

LV03 CellTiter 0.4636 rCYP2B1 0.0361

Nuc0.3998

LV04

GSH

0.3330 rCYP2B1 0.0141

TG0.4479

LV05

GSH

0.1376 rCYP2B1 0.0004

Mit0.0549

LV06

LDH0.0242 rCYP2B1 0.0004

TG0.0136

BL01

GSH

0.0206 rCYP3A2 0.0026

TG0.0009

BL02

GSH

0.3792 rCYP1A1 0.0087

PL0.2850

LV01

p<0.01

Para.

HCA

p<0.0514

２段階RAxの結果（その１）
1: Cytotox
2: P450
3: HCA

4: Combination A
5: Combination B
6: Ensemble

LV02

BA

LV03

Liver function ↓1

10.8

Liver function ↑Sensitivity

Specificity

LV04

LV05

Bile duct lesion

Hypertrophy

LV06
Dyslipidemia

BL021110.8

0.8

0.8

0.8

0.80.60.60.60.60.6

0.6

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.4

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.200- 1 2 3 45 60- 1 2 3 45 60- 1 2 3 45 60- 1 2 3 45 6

1Anemia0- 1 2 3 45 6- 1 2 3 45 6

n インビトロ試験結果に基づいてソース物質を選択すると、多くのEPで予測精度が向上した。
n 特に、P450試験を利⽤した場合に向上の程度が顕著であった。
n 複数の試験結果を組み合わせた場合に、必ずしも単独利⽤の場合よいもよい精度が得られることはなかった。
15

２段階RAxの結果（その２）
1: Cytotox
2: P450
3: HCA

4: Combination A
5: Combination B
6: Ensemble

LV01
1Liver cell death

0.8BASensitivity

BL01
1Coagulopathy

0.8

gEP
0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.20- 1 2 3 4 5 6Specificity

0Cytotox
Para. p-value

P450
HCA
Para.
p-value Para. p-value

LV01 LDH 0.3014 rCYP2B1 0.1397

Mit0.3686

BL01 GSH 0.0206 rCYP3A2 0.0026

TG0.0009- 1 2 3 4 5 6n LV01とBL01では、インビトロ試験結果によるソース物質選択は、予測精度を向上しなかった。試験の種類によってはむしろ低下させた。
n LV01では、いずれの試験カテゴリーにおいてもgEPとの関連性が⾼い試
験がなく、関連性の低い試験を⽤いたことが原因かもしれない。
n BL01では、分⼦記述⼦を⽤いたRAxで既に⾼い予測精度が得られていたために、精度向上が認められなかった可能性がある。

16

⼩括
n 毒性発現機序が複雑な全⾝毒性においては、リードアクロスによる予測・評価がレギュラトリーサイエンスの観点からも現実的なアプローチになると考えられる。
n リードアクロスの実施には検討すべき事項は多いが、これまでの報告は毒性物質のケーススタディが中⼼であり、陰性物質も含めた体系的・網羅的な研究が必要と考えている。
n 反復投与毒性、発がん性、発達神経毒性などを対象に、化学構造情報とインビトロ試験情報に基づいた体系的なリードアクロス⼿法の基礎研究を実施している。
n インビトロ試験結果が精度向上に有⽤であることは⽰されつつあるが、機序が不明なエンドポイントも多く、さらなる精度向上には毒性発現機序の解明研究も必要である。
21

本⽇の内容n 研究背景、当研究室の研究紹介
n 我が国における動物実験代替法開発の課題

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科研費における動物実験代替法研究
KAKEN︓科学研究費助成事業
データベース
検索対象研究• 基盤研究S、A、B、C• 2010年以降採択

S︓5,000万円〜２億円/５年間
A︓2,000万円〜 5,000万円/３〜 ５年間
B︓500万円〜 2,000万円/３〜 ５年間
C︓500万円以下/３〜５年間

SA

BC

1,177

8,583

41,108159,257

動物実験代替法

182780

機械学習

89489

1,455

3,304

機械学習 ＋ 動物実験代替法

11

14

三次元培養

424137392

三次元培養 ＋ 動物実験代替法

01

4

14

iPS細胞

29191

738

1,785

iPS細胞 + 動物実験代替法

051021

キーワード-「リードアクロス」は２件のみ
23

開催概要
特別講演︓３題
シンポジウム︓９セッション
参加者数︓589名（招待者含む）
ポスター発表︓74演題
シンポジウム• Update on skin sensitisation and photoallergy• 3Rsの原則に貢献するシミュレーションの戦略的活⽤• 発達神経毒性の現状と今後の課題• Strategy for development of in vitro
immunotoxicity• Context of Useから考えるmicrophysiologicalsystem• 動物実験代替法はどこまで活⽤可能か︖ 業界における活⽤の現状と課題• 動物実験教育に係るアーカイブからの3Rs• 動物を⽤いない新たなリスク評価アプローチ法(Next Generation Risk Assessment)の開発 〜化
粧品の全⾝毒性評価に向けて〜• ヒトiPS細胞技術を活⽤した創薬応⽤研究の最前線

参加者数の割には⼀般演題数が少ない︖

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⽇本毒性学会における代替法研究
検索⽅法• 対象︓第50回⽇本毒性学会 学術年会（2023年、横浜）• ⼀般演題 ポスター︓318題、⼝頭︓43題、計361題• 要旨集を「代替法or代替」、「リードアクロス」、「IATA」で検索
結果「代替法/代替」
ポスター︓16演題、⼝頭発表︓５演題
⼤学︓13題（10機関）、企業︓４題、PMDA︓１題、国⽴衛研︓２題（１演題は内容的に代替法ではない）「リードアクロス」
ポスター発表︓５演題（３題︓吉成研、１題︓コーセー株式会社、１題︓サンスター株式会社「IATA」
ポスター発表︓１演題（国⽴衛研︓勝⾕、⼭⽥ら）

25演題/361演題（6.9%）
25

The Toxicology Forum: Understanding through Dialogue

The Toxicology Forum is an international non-profit organization that isdevoted to fostering deliberative dialogue which shapes decision-making
and outcomes on critical issues in toxicology and its applications forpurposes of promoting and protecting public health.

https://toxforum.site-ym.com

LRI研究の⼀環として、ディスカッションの場を作ろうと考えています。
ご興味のある⽅はご連絡ください。

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まとめn 世界的な動物実験削減の要求に対応するため、多くの基礎・応⽤研究が必要である。
n しかし、我が国においては研究費・研究⼈⼝の両⾯において欧⽶に⽐べて⼤きく遅れている。
n ⽇化協LRI等の⽀援を受けながら、私達はリードアクロスの基礎研究に取り組んでいるが、解決すべき課題は多く、１研究グループでできることは限られている。
n 我が国における、動物実験によらない化学物質のリスク評価体制の構築には、個々の研究の進展だけでなく、産官学の研究者・関係者の対話と協働が必須である。

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