厚生省新薬開発研究事業
微生物の二次代謝産物に由来する

難病治療薬（E−64）の開発研究

昭和57年度研究報告書
班 長 今堀和友

昭和58年3月

ま

え

が

き

今回お手許にお届けする報告書は，第4年次，すなわち昭和57年4月より58年3月の問の研究成果に関するものである。
研究の発展の上からいっても，この第4年次は種々の意味で画期的な年であったといえよう。まず第−にE−64芙百線体のうち，臨床的に使用するに最も適した薬剤および投与法として，E−64−CのエチルエステルであるE−64−dを経口投与することがほぼ確立された。事実動物に混餌投与されたE−64−dは体内ですべてE−64−Cに変換され，その効果は皮下にミニポンプを用いてE−64−Cを連続授与したものに匹敵あるいは陵駕するものであった。
第二には，前年度の研究で有用性の認められたジストロフィーハムスターについてプロジェクト研究を行い，E−64−CおよびE−64−dの効果を，種々の臓器につき，種々の面から検討した。その結果は本報告書の中にまとめられているが，モデル疾患動物につき治療効果が確認できたことは特筆すべきである。
第三には，本年度より念顕の第一相臨床試験が開始されたことが挙げられる。これは福原幹事の肝煎りもあって，慈恵会医科大学の宮原正教授ならびに下条貞友講師以下宮原内科の諸先生の深い御理解と並々ならぬ御協力によって可能となったのであった。結果は本文中に示さているが，期待以上の成果が得られたものと考えている。
その他の基礎研究も昨年に引き続き着実な成果を挙げている。本研究はいわゆる目的指向的研究であることは云うをまたないが，その背骨を形成するのは基礎研究であると信じているので，今後もこれを継続してゆくつもりである。
おありに本研究に種々御援助を賜った厚生省薬務局の方々，これをうけて研究に邁進された班員の皆様，第一相臨床試験に絶大な御協力を賜った上記宮原教授ならびに宮原内科の先生方，そして班の運営につき細部に亘って御助力頂いた大正製薬開発部の方々に心からの感謝を捧げるものである。

昭和58年3月

班を代表して
今

掘

和

友

目

次

まえがき
Ⅰ E‑64類緑体の開発

1. E‑64‑d 製造法の検討

沢田 二郎

9

2. E‑64‑d の物理化学的性質および製剤化の検討

沢田

二郎

15

3. E‑64‑d の急性毒性に関する研究

大関

正弘

25

4. E‑64‑d の亜急性毒性に関する研究

大関

正弘

27

5. E‑64‑d の生殖に及ぼす影響

大関

正弘

55

6. E‑64‑d の変異原性試験(Ames test)

大関

正弘

65

7. E‑64‑d の小核試験

大関

正弘

69

8. E‑64‑d の抗原性に関する研究

大関

正弘

71

9. E‑64‑d の感覚器に及ぼす影響

大関

正弘

75

10. E‑64‑d の一般薬理作用

福原

武彦

79

11. E‑64‑d の中枢作用

大関

正弘

93

12. E‑64‑d の脊髄反射に対する作用

大関 正弘 105

13. E‑64‑d の平滑筋臓器への作用

大関 正弘 109

14. E‑64‑d の十二指腸内投与による呼吸,血圧,心拍数,前腸間膜動脈血流,大腿動脈血流および心電図に及ぼす影響

大関 正弘 119

15. E‑64‑d の一般薬理作用

大関 正弘 121

16. E‑64‑d の生体内動態に関する研究

大関 正弘 127

17. E‑64‑d のPhase 1試験

宮原

正 147

Ⅱ 酵素レベルでの効果
18. カルシウムプロテアーゼによる蛋白質燐酸化酵素の限定分解
西塚 泰美 159

19. 天然型μ‑CANPの精製と性質

今堀 和友 167

20. カルシウムプロテアーゼの機能発現機構

鈴木

紘一

173

21. リソゾームチオールカテプシン群の性質と測定法の進歩

勝沼

信彦

179

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果22．高濃度カリウムイオン溶液中における筋蛋白質代謝に及ぼす
江橋 節郎 185

E‑64‑c の影響

23．筋衛星細胞の培養について

小沢鍈二郎

189

24.急性筋崩壊におけるE‑64‑c の効果

石浦

193

25. 移植筋の再生ならびにアミノ酸代謝に対するE‑64の効果

寺尾 寿夫 201

26.ニューロフィラメント変性とμ‑CANP

杉田 秀夫 207章一

27. ヒト脳Calcium‑Activated Neutral Proteaseの部分精製およびヒト脳Myelin蛋白の分解に対するE‑64‑a の抑制効果

宮武

正 217

宮武

正 223

Ⅳ 個体レベルでの効果
28．筋ジストロフィーハムスターの治療経過観察における新しい視点 ─核磁気共鳴法の応用─
29. E‑64投与の心筋症ハムスター (UM‑X 7.1)心筋に与える影響について柴田 宜彦 229

30. 筋ジストロフィーハムスターに対するE‑64‑d の効果(共同研究)

─研究分担─
（1）血液，尿，筋肉の生化学分析

大関 正弘 239

（2）プロテアーゼ活性に及ぼす効果①

CANPに対する効果② カテプシンに対する効果

鈴木

紘一

253

大関 正弘
勝沼 信彦 257

（3）組織学的および組織化学研究杉田 秀夫① 骨格筋の病理埜中 征哉② 心筋の病理

大関 正弘
和田
昭

267

（4）筋エネルギー代謝に及ぼす影響

市原

明

271

（5）筋ガングリオシドに対する影響

宮武

正 273

（6）肝薬物代謝に及ぼす影響

北川 晴雄 277

261

I E−64類縁体の開発
1．E−64−d製造法の検討

沢田 二郎

2．E−64−dの物理化学的性質および製剤化の沢田 二郎

3．E−64−dの急性毒性に関する研究

大関 正弘

4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

大関 正弘

5．E−64−dの

大関 正弘

6．E−64−dの変異原性試験（Ames test）……・・・

大関 正弘

7．E−64−dの小核試験

大関 正弘

8．E−64−dの抗原性に関する研究

大関 正弘

9．E−64−dの感覚器に及ぼす影響

大関 正弘

10．E−64−dの一般薬理作用福原 武彦

11．E−64−dの中枢作用

大関 正弘

12．E−64−dの脊髄反射に対する作用

大関 正弘

13．E−64−dの平滑筋臓器への作用

大関 正弘

14．E−64−dの十二指腸内投与による呼吸，血圧，心拍数，前腸間膜動脈血流，
大腿動脈血流および心電図に及ぼす影響

大関 正弘

15．E−64−dの一般薬理作用

大関 正弘

16．E−64−dの生体内動態に関する研究

大関 正弘

17．E−64−dのPhasel試験宮原正1．E−64−d製造法の検討

＊
汚
点
＊

男男司

＊
＊

＊

勝充清

＊

山田熊

＊

畑村中

昭則晴

＊

慶義正

＊

辺床井

渡塩玉

二

田

馨尋紀

＊

沢

的

千和

曾横花

日

田尾田

研究協力者

また筋ジストロフィーハムスターを用いた薬効

う物性面での欠点に加えて，L−トESの水溶性が高いため溶媒抽出が困難であるなど，工業的規模ではさらに改善すべき問題点も指摘されてきた。
今年に入り，合成原料としてD一酒石酸塩が国内で比較的安価に入手可能になってきた。我々はこの塩に着目し，これを原料としたL−t−ES製造法ならびにその工業適性の検討，さらに試験においても，その有用性が明らかになっては，デヒドロアビェチルアミンに代わりうる実

きた2）。

用性のより高い分割剤の開発をも併せ検討し，昨年度我々は，生体内利用性向上を目指し
E−64−CのprOdrug化を検討した結果，E−64−Cのエチルエステル体であるE−64−dが，ラット腸管からの吸収性が優れており，経口剤としての開発の可能性が示唆された1）。さらに，

そこで我々は，E−64−d実用化のため，工業的規模でより実用性の高い製造法の改良検討を行うことにした。
E−64−dはE−64−Cの合成中間体であるため，既報の方法3）により工業的規模で製造可能

E−64−dの工場規模における製造法の改良を行ったのでここに報告する。
材料および方法
1．D一酒石酸塩類のエステル化である。しかしながら，その活性基であるL−

D−酒石酸のナトリウム・アソモニウム塩およ

トランスーエポキシコハク酸（以後L−t−ES とびナトリウム・カリウム塩（昭和化工㈹）を使略す）の生産効率をあげることは，今後化合物用した。D一酒石酸塩のェチルエステル化は，常の製品化を進めていく上で極めて有用である。

法に従い図1に示すような方法で，種々の濃度

我々は，既に報告したように，D一酒石酸よりの硫酸を触媒として加え，エタノール中で加熱

立体選択的に合成する方法およびデヒドロアビ

還流して行った。

ェチルアミンによる光学分割によるLTt−ES製造法を一応確立した4）・5）。しかしながら，合成

2．光学分割法によるレトランスーエポキシコハク酸の製造法においては，原料であるD−酒石酸が高価であ

レアルギニソ，レリジンは市販品を用い，レり，しかも大量を安定確床することが困難であ

フェニルアラニソエチルエステルはJ．P．

るという問題点も残されていた。一方，光学分Greensteinら6）の方法により合成した。また，

割法においても，分割剤であるデヒドロアビェ

DL−t−ESはG．B．Payne ら7）の方法に従ってチルアミンが，大規模での作業効率が悪いとい

フマール酸より合成した。上記アミンを分割剤として，L−t−ES とのジアステレオアイソマ一＊大正製薬株式会社総合研究所

塩を形成し分割する方法4）に準じ，DレトESの
9

．

︵

⁝⊥＋u

I E−64類縁体の開発

I

■
■

■

■
l

−

H2SO4

H2SO4

′
l

．
I

︵
・
l

Ⅹ＝NH40rK

図1Ⅰ卜酒石酸のエステル化

表l D一酒石酸塩類のェスチル化Starting materials H2SO4（molar ratio）

8
7

0

0
5

2

1

0
7

2

2

8

3
6

1

1

2

6
7

1

1

2

6
7

6

Na●K

7

acid

1

D−Tartaric

2

D−Tartaric acid Na・NH−Salt

3

〟

0

D−Tartaric acid
D−Tartaric acid Na・NH−Salt・4Ⅰも0

Yield（％）

salt

光学分割法を検討した。L−t−ESとレアルギニ

ム・アンモニウム塩およびナトリウム・カリウ

ンとのジアステレオアイソマ一塩より直接L−t

ム塩のいずれからも，遊離の酒石酸を用いた場−ES−ジェチルエステルを得る目的で，硫酸触合とほぼ同等の収率でェチルエステルが得ら媒を用いる方法を検討した。

れ，その純度も満足できるものであった。

結

2．光学分割法によるL−トランスーエポキシコハク
酸の製造

果

1．D一酒石酸塩類のエステル化
先ず，エステル化反応の触媒である硫酸の適

これまでの経験をもとに，L−フェニルアラニ
ンエチルエステル，L−リジンおよびL−7ルギ

量を，D−酒石酸ナトリウム・アンモニウム4水

ニソに焦点を絞り新たに検討した。その結果，和物を用い検討した。得られたジェチルエステ
ルは，純度の点でははば満足できるものであっ表2に示すようにレフェニルアラニソエチル

たが，表1に示すように，最高収率の場合（硫が困難であり，また，レリジンの場合は分割能

酸1．7当量）でも70．2％と，遊離のD一酒石酸を原料にした場合より低収率であった。これはが低いため実用不可能であったが，レアルギニ

原料に含まれる多量の結晶水によるものであろ

エステルはジアステレオアイソマ一塩の結晶化

ンは結晶性塩が得られ，しかも得られたt−ESの純度も高く，既に報告したL−7ェニルアラニ

うと思われたので，あらかじめ50〜600Cで真空乾燥し，ほとんどの結晶水を除去した後使用

較しても，コストおよび作業効率の両面で優れした。その結果，表1に示すようにナトリていると考えられるので，さらに，塩形成の諸10

ウ

ンアミドおよびデヒドロアビェチルアミンと比1．E−64−d製造法の検討
表2 DL−トラソスーエポキシコハク酸の光学分割
Salt

t−ES

Yield（％）［α］DResoIving agents SoIvent

LTLysine

75％MeOH

レArginine〟

L−Phenylalanine amide
Dehydroabiethylamine
表3

95％MeOH
90％Acetone

土00
＋1180
＋115．40＋115．70＝9・Ol0・54・
365

一6075
48
83

L−Phenylalanine ethylester MeOH

レアルギニンによるDレトラソスーエポキシコハク酸の光学分割

Exp・憲票憲 soIvent

Salt

L−t−ES

0verall

Yield（％）［α］Dyield（％）

52．0

＋1180

39．0

49．5

＋1210

45．0

Yield（％）

75％MeOH〝

80％MeOH

75．0
69．0

91．0

表4 DL−トランスーエポキシコハク酸のレアルギニソによる大量分割
A．Preparation of salt

DL−t−ES（g）

L−Arg（g）

SoIvent
Yield（g）

66．05

87．10

80％MeOH

73．1

［a］D

＋51．60

B．Isolation
L−t−ES

Salt（g）

Extraction
Yield（g）

73．O Acetone−Ethylacetate

条件を検討した。
表3に示すように，DL−t−ESと分割剤の比は1：1（モル比），80％メタノールを用い，結晶を析出させる条件が最も良い成績を示した。

20．9［α］D Overallyield＋122．20

63．3％

オアイソ了一塩から直接エステル化が可能であるならば抽出工程が省け，作業効率および収率の両面での大幅な改善が可能になると考えられる。かかる理由より，塩から直接エステル化を同条件下で約50倍のスケールで行った分割結果を表4に示す。

試みたところ，触媒として硫酸を塩に対して3塩からL−t−ESを単離する際，L−t−ESの水うに通算収率が大幅に上昇し，得られたL−t−ES

溶性が高いため工業的規模では抽出効率が悪か−ジェチルエステルの純度も高く，ほぼ満足のったが，水屑を塩化ナトリウムで飽和後，抽出いく結果が得られた。

溶媒としてアセトンー酢酸エチル（7−3）混液を用いることにより顕著に改善された。この
結果はL−アルギニソがデヒドPアビェチルア

当量使用することにより成功し，図2に示すよ考

察

ミンよりも優れていることを示している。

これまで我々は，E−64−dの主原料として用いるL−t−ESの合成法に関し，2通りの方法に一方，レアルギニソとし−t−ESのジアステレ

ついて報告してきた。この方法により工場レべ11I E−64煩縁体の開発

95．5％

76．6％

1）
EtO・ES・OEt

HO−ES・OH（DL）（L）

HO−ES−OH（L）

Overallyield（％）
1）73．2

ES：H＼C−C／CO一・OC′＼0／ヽH

図22）49．4いトランス一㌧コニポキシコハク酸ジェチルエステルの合成法

ルの製造を検討するにつれて，さらに改善しなければならない問題も新たに喚起されてきた。
その一つは立体選択的合成法による場合で，ム塩4水和物を，D−酒石酸の代わりに出発原料として用いることが可能となった。
2．光学分割法において，分割剤としてレア原料であるD−酒石酸にコストおよび供給面で問題が残っていた。そこで国内で安価に得られルギニソをデヒドロアビェチルアミンの代わりる酒石酸ナトリウム・アンモニウム塩に着目れた。

し，これを用いて製造法を再検討した結果，大3．L−t−ESのレアルギニソとのジアステレオ

幅なコストダウンに成功した。すなわち，この塩を用いL−トランスーエポキシコハク酸ジェ

アイソマ一塩よりェチルエステル化で可能であに用いることにより，操作上の問題点が改善さることがわかった。

チルェスチルを高収率で得ることができた。一
方，既報のDL−トESの分割剤であるデヒドロ
アピェチルアミンに代わりうる分割剤の検討を進めた結果，作業性の良いレアルギニソが実用面から優れていることが明らかになってきた。
しかもL−アルギニソの場合，L−t−ESとのジ7
ステレオアイソマ一塩を直接エステル化することが可能であることがわかり，レトランスーエ
ポキシコハク酸ジェチルエステルの通算収率が飛躍的に上昇した。
現在その工場適性に関しさらに改良検討を進めているところである。
結語

E−64−dの主原料であるL−t−ESの製造法について改良検討した。この結果，以下の点で改良が可能となり生産効率および製造コストの面で大幅に改善することができた。
1．立体選択的合成法において，安価で安定供給ができるD一酒石酸ナトリウム・アン㌧モニウ
12

参考文献
1）沢田二郎：E−64−Cエステル誘導体の生物薬剤学的研究，厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p・29，1982・
2）大関正弘：E−64およびその類縁体の筋ジストロ
フィーハムスターに対する薬効に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」緻生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p．135，1982・
3）沢田二郎：E−64およびその類縁体の製造法に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究，今堀班，昭和54年度研究報告書，p・9，1980・
4）沢田二郎：レトランスーエポキシコハク酸製造法
に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」倣生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，昭和54年度研究報告書，p・15，
1980．

5）沢田二郎：DL−トランスーエポキシコハク酸の光学分割法に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」教生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬

1．E−64−d製造法の検討（E−64）の開発研究，今堀班，昭和55年度研究報告
書，P．11，1981．
6）Greenstein，J．P．andWinitz，M．：
Of the Amino Acids

7）Payne，G．B．，Wiliams，P．H．：Reaction ofhydroperoxideIV．Sodiumtangstatecatalyzed

Chemistry epoxidation ofα，β−unSaturated acid，J．Org．

2，p．763，John Wily＆Chem．，24，54，1959．

Sons，Inc．，N．Y．1961．

132．E−64−dの物理化学的性質
および製剤化の検討
＊

拝
見

＊

美夫

＊

＊

正唯

本中

根田

＊
＊

奈

雄夫子

＊

康郁美

沢山

中小法

＊

的

二

田

三親子
＊

沢

省継郁

田

扇田池

日

小書中

研究協力者

ウム錠剤法により測定した。
4．核磁気共鳴スペクトル前報1）において，優れたプロテアーゼ阻害作

本品約0．01gに重ク。ロホルム0．4mlを用を有するE−64−Cへ消化管粘膜透過性を賦与

加えて溶かした液につき，テトラメチルシランするためのProdrug化を指向し，そのエチルを内部標準として200MHzの共鳴周波数で水エステル体（E−64−d）が，実用的に有用である
可能性を示唆した。

素核について0〜10ppm
5．質量スペクトル

本報の目的は，このE−64−dの消化管吸収性の範囲を掃引した。

本品をイオン化電圧20eV

イオン加速電圧における動物種差を調査する一方で，その構造

3．5KVおよびイオン源温度2900の条件で直接および物理化学的性質を明らかにし，さらに経導入法で測定した。

口剤として製剤化に必要な基礎的検討を行い基6．分配係数

本的な処方を確立することにある。

本品約0．1gをとり pH3およびpH6の0．05Mリン酸緩衝液（イオン強度0．2）40ml

方

法

1．試料
E−64−dは著者らが合成したものを用いた。
その化学名，構造式，分子式，分子量を表1に，また日本薬局方通則および一般試験法に従って測定した各試験結果を表2に示す。
2．使用動物犬はピーグル犬雌の体重約10kg，ラットはWistar系雄の体重約150gおよびハムスター
はゴールテン系雄の体重約70gを，それぞれ用いた。
3．赤外吸収スペクトル
本品約1mgに∴KBr約150mgを加え，乳鉢で粉砕混合したものにつき，日本薬局方一般試験法の赤外吸収スペクトル測定法の臭化カリ＊大正製薬株式会社総合研究所

を加え，室温で1時間振塗する。この液をポア
サイズ0．45′上mのミリポアフィルターで炉過する。この炉液10mlに，それぞれ酢酸エチ
ル，クロロホルム各10mlを加えた後，室温で1時間振盟する。遠心分離した後，水相および有機溶媒相中のE−64−d の濃度を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）1）により測定した。
7．吸湿性
本品約0．5gを秤量ぴんにとり，デシケータ
中で24時間減圧乾燥した後，室温下相対湿度44％（K2CO3飽和水溶液），65％（Mg（CH3
COOH）2飽和水溶液）および75％（NaCl飽和水溶液）のデシケータ中にそれぞれ3週間放置し，重量増加率（％）を測定した。
8．水溶液中での安定性
2％アセトニトリル含有の0．05Mリン酸緩15

I E−64類縁体の閑発
表1E→64−dの構造
ChemicalName：Ethyl（2S，3S）−3［（S）−3−methyト1−（3−methylbutylcarbamoyl）
butylcarbamoyl］0Ⅹirane−2−Carboxylate

H＼／0＼／CONHCHCONHCH2CH2CH（CH3）2／一一＼l
l15C200C H CHCH（CH3）2
Molecular Formula
Molecular Weight：C17H3。N205：342

表2 E−64−dの性状，示性値および溶解性
AppearanCe：Whitecrystalsorcrystalline powder

Melting point：125．5Specific rotation
Solubility：［α］iS，＋50．8（1％EthanoIsol・）
freely sol．in DMSO，Chloroform，methanol，ethanoI
SOlublein acetone，dioxane

Sparingly sol．in ethylacetateslightly sol．in ether
practicallyinsol．inwater，n−hexane

衝液および塩化カリウム・塩酸緩衝液（pHl〜
8，イオン強度0．2）を用い，本品の濃度10／Jg／mlの溶液を調製する。この液を400に保存し，E−64−dの経時残存率をHPLCl）によ り測定した。また，同様にして pH8 の Britton−
Robinson緩衝液中における安定性を300，400
および500で検討し温度依存性を調査した。
9．粉末状態での安定性
本品を無色透明のガラスぴんに入れ，室温，加温（400，500の恒温器），加温・加湿（400相
対湿度75％の恒温恒湿器）および室内散光（300〜900ルクス）下に3カ月間保存し，残存率の経時的変化をHPLCl）により測定した。
10．製剤の処方および安定性
表3に示すようにポリソルベート80の添加および無添加の2処方で，日本薬局方製剤総則カ
プセル剤の製法に準じて，本品100mgを含有する硬カプセル剤を製した。
処方1のカプセル剤を無色透明のガラスぴんに入れ，粉末の場合と同様に保存して経時的変化を観察した。
11．溶出試験日本薬局方一般試験法・溶出試験法の第2法
16

表3 カプセル剤の処方
per Capsule Quantities
Ingredients

E−64−dRp．l Rp．2
lOOmg

Polysorbate80

lOOmg

5mg

Com Starcb q．S．
Crystal1ine Cellillose

q．S．
50mg

50mg

Magnesium Stearate lmg lmg

Tota1

200Ing200mg（試験液：崩壊試験法の第1液900m1，回転
速度：100rpm，温度：370）で試験し，累積溶出量をHPLCl）で測定した。
12．経口投与実験（1）ラット，ハムスター

5％アラビアゴム水溶液10ml に E−64−d（またはE−64−C）100mg を懸濁し投与検液とした。これをあらかじめ一夜絶食した動物に，体重1kg当り 50mgを投与した後，一定時間ごとに採血し血策を得た。
（2）犬あらかじめ一夜絶食したピーグル犬に，体重

2．E−64−dの物理化学的性質および製剤化の検討

1kg当り50mgとなるように，E−64−d（まほとんど吸湿性がなく，脂溶性の高い物性を持（1）水溶液中での安定性
前報1）よりさらに広域pHにおいて安定性を調査した。その結果，E−64−dは水溶液中では
pH3〜5で安定であり，その至適pHは4付
近にあることが明らかとなった。エステル化合物であるE−64−dは，至適pHの酸性側およびアルカリ性側で見掛上一次反応式に従って分解しており，酸，塩基触媒反応の存在を示唆した（図4，5）。また，pH8におけるアレニウ
スプロット（図6）の示す直線の傾きより，活性化エネルギーは19．0Kcal／moleであった。
（2）粉末状態および製剤での安定性
E−64−d原末およびカプセル剤（処方1）を室温，400，500，400相対湿度75％および室
内散光下に3カ月間保有し，外観，崩壊時間（製剤）の観察および定量の結果，いずれの場
合もほとんど経時的な変化を認めず，原末，カプセル剤共に熱，湿度および光に対して安定でつことが確認された。

あった（表7）。

たは E−64−C）をカプセルにつめて，水約50mlと共に投与した。製剤については1頭当り5カプセル（E−64−d38mg／kg）を投与した。
投与後一定時間ごとに採血し，血菜を得た。
血菜中の薬物の定量はHPLCl）を用いて行った。
結果および考察
1．構造および物理化学的性質
元素分析，赤外吸収スペクトル，核磁気共鳴
スペクトルおよび質量スペ クトルとその帰属を
表4および図1〜3に示した。これらのデータ
はE−64−dの化学構造（蓑1）を矛盾なく支持した。
また，本品の分配係数および吸湿性の測定結果を表5，6に示した。この結果，E−64−dは2．安定性

uUNく月田OS巧く

4000

3200

￣

2400

1900

1700

1500

11

Wal・enumber（cm￣1）

3270
2950
1750
1640

Al

1300

1100

900

lく＼UlHiER（rm￣I）

Assi即ment

レ N．H
ソ C．H
リC；0（COOC2日5）
リ C≡0（COXH）

1550

J N・H

890

リaS C市C図1E−64−年の赤外吸収スづクトル（KBr法）
17

I E−64類縁体の開発

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0
（ppm）

S

O．90−0．94

doublet・doublet

1．28−1．78

multiplet

Intensity（H）
2
1

CouplingPattern

9quartet（g）5．86−6．04

broad

（h）

6．30・6．66

broad

1

doublet4．24−4．30

1

3．68t3．70（f）3（d）or（e）

1

doublet1quartet3．45−3．47

2

3．22−3．29（d）or（e）

H H H H H H H H

gn U㈲吊ChemicalShift

図2 E−64−dの核磁気共鳴スペクトル表6 E−64−dの吸湿性（室温）

表4 E−64−dの元素分析
C

H

Anal．Calca．

8．18％ 59．63％ 8．83％

Found

8．04％ 59．40％ 8．65％

表5 E−64−dの分配係数（室温）

二三三二ここ、18

Weigbt gain（％）

N

EthylAcetate Chloroform

pH3

49．3

89．8

pH6

77．3

77．3

l week2weeks

3weeks

44％

0．1

0．1

0．0

65％

0．3

0．2

0．2

75％

0．1

0．0

0．0

2．E−64−dの物理化学的性質および製剤化の検討

300
m／Z

m／Z

RelativeIntensity（％）

342

2

327

2

286

15

228

86

Assignment
M＋＝トーCH3）＋（M−CH＝CHCH3）＋l

H5。2。三村：ONH＝CHC 27CH3CH3
156

100

86

84

：大がEONH＝C

CH29HCH3
CH3

N＝CHCH2甲CH3CH3

図3E−64−dの質量スペクトル000︵訳︶一Uと亡OU一芸P芯Uだ

20

40

60

80

100

120

Time（hr）

図4 E−64−dの水溶液中での安定性（400）19I E−64類縁体の開発︵TJ三
叉 言霊SuOUむ︸遥
2

3

図5

4

5

6

3．1

3．2

3．3

8

pH

安定性のpHプロファイル（400）

3．0

7

3．4

1／TxlO￣3

図6

7レニウスプロット（pH8）3．経口投与による吸収性

ったが，E−64−dは極めて吸収が良く，ピーク（1）動物種差
前報1）において，E−64−CおよびE−64−dをラットに経口投与した場合，前者がほとんど吸収されないのに対して後者が優れた吸収性を示したので，今回種差の影響を観察するために，
ハムスター，犬について同様な比較実験を行った。その結果，図7に示すように，ハムスター
では，E−64−Cはわずかな吸収しかなく1時間

血中濃度は4・9FLg／mlであり，AUCはET64−Cに比べ約8倍であった。一方，犬では，両薬物の吸収パターンは頸似しており，AUCもほぼ同等であった。なお，E−64−dを投与した場
合，脱エステル体（E−64−C）として血中に存在しており，未変化体のE−64−dは検出感度（0．1′唱／ml）以下であった。以上の結果から，両薬物を経口投与した場合，E−64−dは動物種に関係なく吸収されやすいのに対し，E−64−C

後におけるピーク血中濃度は0．81Jjg／mlであ20

2．E−64−dの物理化学的性質および製剤化の検討
表7 E−64−d原体および製剤の安定性
Bulk

Capsules（Rp．1）

Appearance ResidualAppearance Disinteg．

Content（％）
Initial

＊−1

1
2
3
1
2
3
1
2
3

M M M

1
2
3

M M M

＊一2

3〜4

100

99．8

＊＊

3〜4

98．9

100．0

＊＊

3〜4

100．0

102．0

＊＊

3〜4

99．1

100．4

96．7

＊＊

3〜4

102．1

＊＊

3〜4

97．0

101．2

＊＊

3〜4

101．3

＊＊

97．4

＊＊

3〜4

101．1

＊＊

102．4

＊＊

3〜4

100．0

＊＊

102．3

＊＊

3〜4

101．3

＊＊

97．8

＊＊

3〜4

98．9

＊＊

99．6

＊＊

3〜4

96．5

＊＊

100．0

＊＊

3〜4

100．1

3

8
9

＊
＊

1

3〜4

99．4

＊＊

3〜4

97．8

＊＊

3〜4

100．4

8

0
0
1

＊
＊

3

＊＊

7

0
0
1

＊
＊

2

M M M

Ⅰndoor Ligbt

M M M

40075％RH

M M M

Room Temperature

100

ResidualTime（min．）Content（％）＊−1：White crystalline powder＊−2：White hardcapsuleincluded white granular powder＊＊：No change was observedin appearance．

HamsterDog

1

3

Time（hr）

54u＼呈︶ U・寸で凹︵lE＼葺︶ U・寸？凹
0

0

1

2

3

5

7

Time（hr）

図7 経口投与後の血中濃度（投与量50mg／kg）（種差の影響）
21

I E−64類縁体の開発

ニ∈＼箋︶ U・芯︒︵︻∈＼誓︶ U達て凹
1

2

1

2

Time（hr）

Time（hr）

Particle Size

Surfactant

図8 経口投与後の血中濃度（投与量50mg／kg）（粒子径および界面活性剤の影響）∈＼彗J U・寸で山

0︵㌔︶P賢一OSS竃P・芯・凹

0

30

60

90

0

1

2

Time（min）
Dissolutjon Test

Absorption Test
図9

22

3

Time（hr）

カプセル剤の溶出試験およびイヌに対する経口投与試験

57

2．E−64−dの物理化学的性質および製剤化の検討の吸収には種差があることがわかった。
（2）粒子径および界面活性剤の影響
E−64−dのような，水に溶け難い疎水性の薬物の吸収を高めるためには，一般に微粉化ある
いは界面活性剤を加えて，「濡れ」を改善し溶解速度を促進する手段がとられる。
平均粒子径の異なるE−64−d（空気透過法で測定した比表面積径は，それぞれ2．2′Jmおよび7．3′Jm）を，アラビアゴムに懸濁してラットに経占授与したところ，両者間に有意な吸収の差はなかった（図8）。微細化粒子（2．2′〟n）で血中濃度が若干低くなっているが，これは粒子の凝集によるものと考えられ，E−64−dの場
合，粒子径よりむしろ「濡れ（分散性）」の改
善の必要性を示唆している。
一方，同じ粒子径（2．2〝m）を持つE−64−dにポリソルベ−ト80を0．05％添加したものと無添加の検体をラットに投与した場合も，両者の間に有意な吸収の差はなかったが，界面活性剤を添加した方が血中濃度が高くなる傾向を示し
た（図8）。
（3）製剤（カプセル剤）での吸収性（1），（2）の結果より，E−64−dは10JJm程度以下の粒子径であれば，その吸収性は粒子の大きさによるよりも「濡れ」の改善によって増進する傾向を示したので，ポリソルベ−ト80を添加した処方と無添加の処方でカプセル剤を調製して，これらについてinvitro溶出試験およびin vivo犬投与実験を行った。その結果は図9に示す通りであり，ポリソルベ−ト80の有無はin vivo試験で統計的には有意差を示さなかったものの，脂溶性の高いE−64−dの物理

化学的性質を考慮するとき，消化管液への「濡れ」を増進する界面活性物質（ポリソルベート
80，ポリェチレングリコール等）の添加は，
E−64−dを経口投与する場合，消化管からの吸収促進に有用であることが明らかである。
結論

E−64−dの物理化学的性質，安定性，および経口投与した場合の消化管吸収性の動物種差，
粒子径と添加剤の影響を明らかにし，経口剤としての基礎的な製剤化検討を行った。
その結果は次のように要約される。
1．本品は水に溶け難く，脂溶性の高い光学的に活性な化合物である。
2．本品は水溶液中で酸・塩基触媒的に分解を受け，pH4付近で最も安定である。
3．本晶は粉末状態およびカプセル剤とした状態では，熱，湿度，光に対して安定である。
4．本晶はE−64−Cと異なり，動物種に関係なく優れた消化管吸収性を有する。
5．本晶は前記の物性を持つにもかかわらず，10／Jm程度以下の粒子径であれば，粒子の大きさは余り吸収性を支配しない。
6．本品は，「濡れ（分散性）」促進作用を有する界面活性物質の添加によって，吸収性が増大する傾向がある。
参考文献
1）沢田二郎：E−64−で＝ここスチル誘導体の生物薬剤学的検討，厚生省「新薬開発研究事業」傲生物の二次代謝物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研
究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p．29〜34，
1982。

23

3．E−64−dの急性毒性に関する研究

大 関 正 弘＊
研究協力老 中・板 貞 雄＊ 櫓 本 保 男＊ 瀬戸山 蔭 義＊
小 池 正 信＊ 大 島

日

的

隆＊

ラットでは皮下および経口投与において投与
1．5〜2．0時間後に軽度の鼻出血および尿失禁に

E−64−dの安全性研究の一環として，マウス
およびラットに旗艦内，皮下および経口投与し，その急性毒性を検討する。
方法

動物は4週令のddY系雌雄マウス（静動協：体重21g前後）および6週令のWistar系
雌雄ラット（静動協：体重160g前後）をそれ
ぞれ7日間の予備飼育の後，実験に使用した。
被験薬物のE−64−dは，5％アラビアゴム液にて懸濁し，一投与段階あて10匹の動物に腹腔内，皮下および経口投与した。投与後，7日間，各動物の一般症状を観察するとともに生死を確認し，死亡例については発見後すみやかに剖検を行った。
LD50倍は，Litchfield−Wilcoxon法により
算出した。
結

果

1．−般症状マウスでは旗睦内投与において，投与10〜15
分後に歩調異常，自発運動の抑制，また2〜3
時間後には後肢麻痺，腹臥の姿勢を示し，呼吸困難を呈したのち死亡する例が散見された。他の投与経路では特に症状変化は観察されなかった。
＊大正製薬株式会社総合研究所

よる下腹部の濡れが認められた。
旗艦内投与では投与20〜30分後に歩調異常，
自発運動の抑制がみられ，投与5〜6時間後には，経口および皮下投与と疑似の症状が観察さ
れた。
2．剖 検
死亡はマウスおよびラットとも腹腔内投与例にのみ認められ，これら死亡例の剖検ではマウスで肺出血またはうっ血がみられ，ラットでは
肝踵大，胃の出血およびうっ血，ならびに旗睦
内の検体残留が観察された。7日後の屠殺例ではマウス，ラットともに皮下投与で投与部位の痴皮形成および検体残留が散見され，、経口投与
では何等異常は観察されなかった。腹腔内投与では肝踵大が認められた。
3．LD50億
LD50値を一括して表1に示す。
皮下および経口投与では，マウス，ラットとも検液調製および投与容量から考えられた最大可能量を投与しても死亡例は認められなかった。腹腔内投与では，マウスで雄3，265mg／kg，
雌3，391mg／kg，ラットで堆2，086mg／kg，
雌2，050mg／kgのLD50倍を示し，マウスとラットの間に若干の種差が示唆されたが，性差はみられなかった。
考察

E−64−dはマウスおよびラットにおいて皮下25

I E−64煩縁体の開発
表1E−64−dのマウスおよびラットにおける急性毒性
LD50Tng／kg（95％C．L．）＊

Mice

Route

Male

経 口 投 与皮 下 投 与腹睦内投与＊

Female＞10，000＞7，000
3，269＞10，000＞7，0003，391（2843−3759）（2923−3934）

Male

Female＞10，000
5，000
2，086

＞10，000
5，000
2，050

（1846−2357）（1783−2358）

Litchfield−Wilcoxon method

投与および経口投与では投与可能最大量においても死亡例がなく，また，腹腔内投与では死亡例が出現するもののいずれも2，000mg／kgを越える高いLD50値を示し，その毒性は弱いものと思われる。
一方，E−64Tdは，E−64TCのエステル体であることから生体内では速やかに加水分解され，E−64−Cに代謝されるとされている。先に下および経口投与し，その急性毒性を検討した。その結果，E−64−dのマウスおよびラットへの大量投与は投与部位の皮膚，腹腔内に局所的刺激を誘発するが，LD58値は，いずれの投与経路においても2，000mg／kg以上の値を示し，その毒性は弱いものと推察された。またマ
ウスとラットの間に若干の種差が示唆されたが性差は認められなかった。

著者ら1）は，E−64−Cの急性毒性を報告してい参考文献

るが，E−64−dの毒性はE−64−Cと質的な相違はないものと推察された。
結語

E−64−dをマウスおよびラットに腹腔内，皮

26

Rats

1）大関正弘；E−64−Cの急性毒性および亜急性毒性に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」教生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，昭和55年度研究報告書，p．99，
1981．

4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

本泉川

＊

正

樽森阪

弘

関

雄明章

＊

隆 一 文

＊

健艮

＊

＊

島木井

＊

大八筒

＊

＊

男弘司

＊

保高隆

＊

大

貞正

板村西

中木河

研究協力者

Ⅰ．ハムスター目

的E−64−dの安全性研究の一環として，ハムス
ターに14日間E−64−dを経口投与し，その亜急性毒性を検討する。
方

法

1．動 物
6週令の雄性ゴールデンハムスター（静動協：体重80〜100g）を1週間の予備飼育後，1群10匹あて群別し実験に供した。動物は温度
23土20C，湿度55土5％のオープンシステムの動物舎内で飼育し，飼料（オリェソタル酵母社
製：MF）と水は自由に摂取させた。
2．投与量および投与方法
E−64−dは水に難溶性のため5％アラビアゴ
ム水溶液に懸濁し投与量を500および1，000mg／kg とし，投与容量を体重100gあたり各々0・5mlとして1日1回定時に14日間連続経口投与した。対照群には5％アラビアゴム水溶液
を同様に投与した。
3．検査項目（1）一般症状および体重
毎日一般症状の観察および体重測定を行った。
＊大正製薬株式会社総合研究所（2）血液学的検査
14日間の投与終了後，ベントパルビタール軽麻酔下で外腸骨静脈より採血し，自動血球分析装置（コールクーカウンターSP型）により赤
血球数，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値，血小板数および白血球数を測定した。
（3）血液生化学的検査
外腸骨動・静脈より採取した新鮮血の遠心分
離血清についてオートアナライザー（日立分析装置712型）を用い，血糖量（ブドウ糖酸化法），
総蛋白量（Biuret法），アルプミソ量（BCG法），A／G比（アルブミン量／総蛋白量−アルブミン量），総コレステロ−ん量（酵素法），尿素窒素量（Urease−IndopllenOl法），クレアチ
ニソ量（Jaffe変法），GOT・GPT活性（UV法），ALP活性（Kind−King変法），LDH活性（UV法），CPK活性（01iver変法），無枚リン量（Fiske−Subbarow法）を測定し，さらに Na，K量（炎光法一島津原子吸光AA−
650）についても測定した。
匝）尿検査
投与終了後の強制排泄尿について糖，蛋白，pH，ケトン体および潜血反応（ラブスティッ
クスー日本エームス社）の半定量的検査を行った。
（5）病理学的検査
投与終了後，外観の肉眼的観察を行い，その27

I E−64額縁体の開発

後ベントパルビタール軽麻酔下で外腸骨動・静脈切断により放血致死させ，開胸腹して内部諸臓器を観察し，摘出した心，肺，肝，腎，副腎，脾，腸間膜リン㌧ペ節，胸腺，精巣および精巣上体について重量測定した。
心，肺，肝，腎，副腎，牌，腸間膜リンパ節，胸腺，精巣，精巣上体，胃，十二指腸，大腿筋および投与部皮膚については10％中性緩衝
ホルマリン液で固定後，常法に従って切片を作製し，H．E．染色を施し病理組織学的検索を行った。
（6）推計学的処理
各測定値は平均値およびその標準偏差を求め，t一検定により対照群と投与群の平均値の差の有意性を検討した。
結果

1．一般症状および体重変動
投与期間中特記すべき症状，死亡例の発現は観察されなかった。
体重変動を図1に示す。
対照群の推移に比べて500mg／kgではやや上昇，1，000mg／kgでは下降の傾向を示した
が，統計的に有意な差はみられず，体重への明らかな影響は認められなかった。
2．血液学的検査
血液学的検査所見を表1に示す。
500，1，000mg／kgともに赤血球数，ヘモグ
ロビン量およびヘマトクリット値の減少傾向がみられた。
3．血液生化学的検査
血液生化学的検査所見を表2に示す。

／
／
ノーノ
／
／づ

＿一ノ

ノー／￣

一二＼●／

図1 ハムスター亜急性毒性試験における体重変化
500，1，000mg／kgに総コレステロール量の増加，1，000mg／kgに尿素窒素量の減少が認められたが，その他の項目に著変はみられなか
った。
4．尿検査
尿検査所見を表3に示す。
いずれの投与群においても著変は認められなかった。
5．病理学的検査
剖検所見の主なものとして1，000mg／kgに腎の軽度踵張と槌色，肝の軽度睦脹が観察された。
各臓器の絶対重量を表4，相対重量を表5に示す。
500，1，000mg／kg ともに肝および腎重量の増加がみられた。
病理組織学的検査所見を表6に示す。
E−64−d投与に関連した組織変化が主として腎および肝に観察された。腎の主要変化は皮質域を中心とした尿細管上皮の硝子滴沈着であった。該硝子滴はWeigertの線維素染色で陽性

表1ハムスター亜急性毒性試験iキおける血液学的検査所見
E−64−dGroupsControl
500mg／kg l，000mg／kg

Erythrocytes（×104／mm3）

940：土 40

Hemoglobin（g／dl）

18．6土 0．6（％）

56．2 士 2．6

Platelets（×103／mm3）

Leucocytes（×102／mm3）

443土 60
65 士13

Hematocrit

Mean土S．D．
28

1；p＜0．05

876土61117．6土1．3

877±55117．6士1．11

52．5土3．71
485土3673士28

52．3土3．51
520土9556土20

4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究
表2 ハムスター亜急性毒性試験における血液生化学的検査所見
E−64−dGroupsControl
500mg／kg l，000mg／kg

No．of

animals

︶
d
／
g

︵

m

諾誌B

︵︵

︶
︶
d d
／
／
g
g

141．4 土 24．9
6．01土 0．34
2．49士 0．13
0．70 土 0．01
27．4 士1．9
0．34 ± 0．03
159．2 土17．2
113．9 土 91．8
45．8 ±18．6
3，609土2，599
22．1土1．5
506．9 土 379．2
5．79 土 0．54
147．6 土 3．8
7．28 土 0．72

UN覧mGPTCPK器Ⅳ㌘（mg／dl）（mg／dl）（mg／dl）
（Ⅹ−U）
（Ⅹ−U）
（LU）
（K．A−U）（トU）（mg／dl）（mEq／1）（mEq／1）

Mean土S・D． †：p＜0．05

lO

lO

lO

160．8±23．0
6．02士0．35
2．46：土0．15
0．69土0．03
24．7土1．9
0．37士0．04

149．3 土 30．2
6．16 土 0．37
2．56 土0．28
0．70土0．03
23．9土2．711
0．37 土0．09

203．4土35．6日
121．1±68．0
51．0士18．9

223．2土51．5日
137．1土 85．2
40．1±16．0

9，579土5，557
21．7士2，7587．0 士302．6

10，599土9，154
20．9土 5．4
629．8：土 462．6

6．78土0．93
146．2土1．8
8．37土0．90

7．14土1．92†
145．6 土3．7
8．80 土2．09

日，ll：p＜0．01

表3 ハムスター亜急性毒性試験における尿検査所見
E−64−dGroupsControl
500mg／kg

No．ofanimals

一土一士＋．
6788

Ketone bodys

lO
10

5．
5．0．5一＋一＋pH

lO

1，000mg／kg

Occult blood

反応を示す微細顆粒としてみられ，500mg／kg
では軽度，1，00Omg／kgでは中等度に観察された。肝では対照群において小葉中心性の肝細胞に限定した中等度の脂肪沈着が認められ，500，1，000mg／kgではいずれもその沈着程度が減弱されて観察された。
なお．一部の例に気管支炎，肺炎および精細管の萎縮，精子形成不全がみられたが，その他の臓器においては注目すべき組織変化は認められなかった。
29

I E−64類縁体の開発
表4 ハムスター亜急性毒性試験における臓器絶対重量
Administration of E−64−d for14days
GroupsContro1

No．ofanimals︵ ︵XidneyMesentericlymph nodes
TbymusAdrenal gland
Testis︵ ︵ ︵ ︵

Spleen︵Epididymism m︵︵m m m m︵m

Lung
Liver

Mean土S．D． †：p＜0．05

わかめかわかめかわめHeart279 士18
470：土 38
4．65土0．60
0．75：土 0．04
118士1315土 347 ± 519．9土 4．9
2．88：土 0．34
723 士 59

500mg／kg l，000mg／kg

lO

lO

lO

278 土19467±495．49±0．68日
0．88土0．07日
121土1519 土 744士 5
16．9：土1．8
2．95土 0．34
738士121298士19†482 士 37
5．64士0．85日
0．85土0．12†
140 土 30
19 士 950 士 520．2 土3．2
2．99 土 0．45
777 土132

日：p＜0．01

表5 ハムスター亜急性毒性試験における臓器相対重量
Administration of E−64−d for14days
GroupsContro1

No．ofanimals

（mg％）
（mg％）
（g％）
Xidney（g％）
Spleen（mg％）
Mesentericlymphnodes（mg％）
Tbymus（mg％）
Adrenal gland（mg％）
Testis（g％）
Epididymis
（mg％）
Heart
Lung
Liver

Mean士S．D． †；p＜0．05

288±21
485土・42
4．77士0．33
0．77±0．06
122士1016±3
49土520．5±5．0
2．97土0．29
745土65500mg／kg l，000mg／kg

lO

lO

lO

286±16287士13482 土 435．65±0．53日
0．91士0．10日
125 土1320 土 945：土 417．5士2．1
3．04 土 0．22
761士122464 ±45
5．39士0．61†
0．81：±0．08
136 土 47
18 土1048 ± 619．4 土3．2
2．87 士0．46
748 士142

日：p＜0．01

表6 ハムスター亜急性毒性試験における病理組織学的検査所見

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土

＋

一

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togenesis
Otber organs＊；number of animalS，−：nO remarknble，土：mild，＋：mOderate30

No remarkable changes

124．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

考

球体からの漏出タンパクが再吸収される結果像察といわれている2）。腎機能に関連する諸検査でE−64−dを雄性ゴールデンハムスターに14日間連続経口授与し，その亜急性毒性を検討した。
投与期間中死亡例はなく一般症状でも著変はみられなかった。また，全身性毒性をよく反映するといわれる体重への影響も認められなかった。
血液学的所見では軽度な貧血傾向が認められたが，いずれも生理的範囲内の変動であった。
血液生化学的所見では総コレステロール量が用量に依存して増加し，さらに臓器重量では肝重量の増加が認められた。しかし，血清中のGOT，GPTならびにALP活性値の上昇，A／G比の低下など肝揆能障害を示唆する所見は認められず，また病理組織学的にも脂肪沈着の減弱化が観察されるのみであった。したがって，これらの所見はJones ら1）が指摘しているようにSERの増殖に伴うコレステロール生合成の促進結果すなわち生理的機能冗進によるものであり，特に肝障害作用を示唆するものではないと考えられる。
病理組織学的な変化としては腎の尿細管上皮における硝子滴沈着があげられる。このような変化はタンノミク質代謝障害による変性所見で糸
Ⅰ．ラ

目

ッ

的

E−64−dの安全性研究の一環として，ラットに1カ月間経口授与し，その亜急性毒性ならびに回復性を検討する。
方

法

1．動 物
6遇令のWistar系雌雄ラット（静動協：体重雄140〜165g，雌110〜130g）を1週間予
備飼育後，回復性を検討する動物を含めて1群22匹あて群別して実験に使用した。動物は温度
23土20C，湿度55土5％のノミリヤーシステムのは腎変性に基づく二次的脂質代謝への影響と考えられる血清中総コレステロール量の増加を除
けは横能障害を示唆する結果は得られていない。したがって該変化を上皮細胞の機能低下とみなすより，梶田2）のいうようにむしろ再吸収
枚能が維持されていることの表われであると解釈する方が他の検査結果と符合するように思われる。また，本所見はラットおよびイヌの亜急性毒性試験3）で観察されたそれと同質の変化であるがラット，イヌに比べていくぶん軽度であった。
以上のようにE−64−dのハムスターに対する影響は腎の変性所見が主体をなしており，一般に全身的な毒性を反映する体重への影響は高用量の1，000mg／kgでもみられなかった。したがってハムスターにおける毒性はラット，イヌに比べて弱いと考えられる。
結論

E−64−d500および1，000mg／kgを雄性ハムスターに14日間連続経口投与し，その亜急性毒性を検討した結果，500mg／kgからごく軽度な貧血傾向，肝および腎重量の増加，および腎の変性所見が認められた。

ト （Ⅰ）

動物重で個別に飼育し，飼料（MF：オリェソ
タル酵母社製）と水は自由に摂取させた。
2．投与量および投与方法
E−64−dは水に難溶であるため5％アラビアゴム水溶液で懸濁した。投与量は80，400および2，000mg／kgとし，投与容量は体重100g
あたり1．Omlとして1日1回1カ月間，毎日
定時に経口投与した。対照群には5％アラビアゴム水溶液を同様に投与した。
3．￣検査項目（1）一般症状投与および休薬期間を通じて毎日異常症状の有無を観察した。
31

I E−64額縁体の開発（2）体重，摂餌量および摂水量の測定
体重については投与期間中は毎日，休薬期間
中は週2回測定し，また摂餌量，摂水量は試験
期間中退1回測定した。
（3）血液学的検査
投与および休薬終了後にエーテル軽麻酔下に
外腸骨静脈より採取した新鮮血を用いて赤血球数，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値，平均

な方法で行った。
また，投与および休薬終了時の強制排泄尿について糖，蛋白，pH，ケトソ体，潜血（ラブスティックスー日本エームス社）の半定量的検査を行った。
（6）病理解剖学的検査

赤血球容積，平均赤血球血色素濃度，血小板し，摘出した脳，心，肺，肝，腎，脾，腸間膜
リンパ節，胸腺，下垂体，甲状腺，副腎，精数，白血球数（コールターカウンターSP型：
コールター），網赤血球数，白血球百分比（へマトラック

480：Geometi・ic Data（Corpporation），プロトロンビン時間（クロテック：

Hyland社），赤血球膜抵抗性（CPCシステム：三鬼エソジ、ニアリング）を測定した。

（4）血液生化学的検査
投与および休薬終了後にエーテル軽麻酔下に
外腸骨動脈および静脈を切断し，採取した新鮮血を遠心分離して得た血清についてオートアナ
ライザー（日立分析装置712型）を用い，血糖量（ブドウ糖酸化法），総蛋白質量（Biuret法），
7ルプミソ量（BCG法），A／G比（アルブミ
ン量／総蛋白量一アルブミン量），尿素窒素量（UreaseJndophenol法），クレアチニソ量（Jaだe変法），総ビリルビン量（アルカリア
ゾビリルビン法），総コレステロール量（酵素法），GOT，GPT活性（UV法），トリグリセ
ライド量（酵素法），ALP活性（Kind−King法），LDII活性（UV法），無機リン量（Fiske−
Subbarow法），チモール混濁度（肝枚能研究
班規準操作法），CPK活性（01iver変法）およびカルシウム量（0−Cresol−PhthaleinCom−
plexone法）の計17項目を測定し，さらにナト
リウム，カリウム量（炎光法：島津原子吸光AA−650）についても測定した。

（5）尿検査対照群および薬物投与群からそれぞれ無作為に選んだ11例を採尿ケージに1匹ずつ収容して24時間の蓄尿について投与開始前，投与期間は
週1回，尿量，ナトリウム量，カリウム量およびクレアチニソ量を測定した。
休薬期間中は各群3例について上記した同様
32投与および休薬終了後，エーテル軽麻酔下で放血致死させ，開胸腹して内部諸臓器を観察

巣，精巣上体，精のう，前立腺，卵巣，子宮，
顎下腹について測定した。
これらの諸臓器ならびに胸骨，舌下腺，耳下腺，下顎リンパ節，ハーダー腺，舌，喉頭，気管支，気管，大腿骨，大腿筋，脊髄，膵，食道，胃，十二指腸，回腸，結腸，皮膚，眼球，膀胱および乳腺について10％中性緩衝ホルマリ
ン液で固定後，常法に従いパラフィン切片を作製し，H．E．染色を行い，さらに肝と腎については各群の約半数例にPAS染色およびOil
redO染色を，加えて腎は各群全例にWeigertの五brinoid染色を施して病理組織学的検査を実施した。
（7）推計学的処理
各測定値は平均値および標準偏差を求め，t−検定により対照群と投与群の平均値の差の有意性を検討した。
結果1．一般症状観察
投与期間中，雌雄2，000mg／kg群に尿失禁
による下腹部の汚れ，自発運動の抑制，軽度な脱毛等がみられ，雄においてより顕著であった。
また，上記の諸変化は休薬期間中にほぼ消失した。
死亡動物は雄の2，000mg／kg群に投与開始
1遇から2週目にかけて4例観察され，いずれも削疫，衰弱を皇して死に至った0
2．体重，摂餌量および摂水量
各群の体重推移を図2，図3に示した。
体重は雄の400mg／kg群に投与初期より25

4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

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三

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期

間

図3 ラット亜急性毒性試掛こおける体重変動（雌）33I E−64額縁体の開発

日日まで軽度な増加抑制が認められ，また雌雄2，000mg／kg群では投与初期に減少し，以後回復傾向を示したが，投与終了時においても対照群との間に有意な増加抑制が認められた。
一方，休薬期間終了時においては，いずれの投与群でも対照群との間に有意な体重差は認められなかった。
摂餌量は投与初期に雌雄2，000mg／kg群で減少傾向がみられたが，以後投与終了時まで，および休薬期間中には明らかな変動は認められなかった。
また，摂水量は試験期間中，いずれの投与群においても変化が認められなかった。
3．血液学的検査
血液学的検査所見を表7，表8に示した0
雄では2，000mg／kg群のヘモグロビン量，
へマトクリッ■ト値が対照群に比して減少し，また網赤血球数の増加等も認められ，貧血傾向が示唆された。その他，80mg／kg以上の投与群
でプロトロンビン時間の短縮が認められた。一方，雌では2，000mg／kg群で赤血球数，ヘマ
トクリット値，網赤血球数および白血球数の増加が，またヘモグロビン量の減少が認められた。
上記所見以外の項目については散発的に対照群に比して有意な変動が認められるものもあったが用量反応に乏しく，また，いずれも正常範囲を逸脱するものではなかった。
休薬期間終了後では特に異常は認められなかった。
4．血液生化学的検査
血液生化学的検査所見を表9，表10に示した。

雄の80mg仲g，あるいは雌の400mg／kg
以上の投与群にコレステロール量の増加およびGOT，GPT活性値の上昇，加えて80mg／kg
以上の投与群の雄においてトリグリセライド量の減少がみられた。さらに，雌雄400mg／kg
投与群にALP活性値の上昇およびカリウム量の増加が，また，雄の400mg／kg以上および雌の2，∝旧mg／kg投与群に血糖量の減少が認められた。その他，雄の400mg／kg以上の投34

与群に無機リン量の軽徽な増加も認められた。
休薬期間終了後の成績では，雄80および400
mg／kgのGOT，GPT活性値に投与終了時と同様な，対照群に比して高い値が認められた。
5．尿検査
雌堆2，000mg／kg群で投与初期にわずかに尿量の増加，ならびに尿中のナトリウム，カリ
ウム量の減少傾向が認められた。また，投与期間終了後の半定量試験では，尿中蛋白量の増加がうかがわれた。
休薬期間およびその終了後には上記の変化はみられなかった。
6．剖検所見
死亡動物はいずれも著しい削疫を皇し，脾および腎の縫色調腫大，胃粘膜出血ならびに各種
リンパ系組織の萎縮，体腔内脂肪の著しい減少等が観察された。
投与期間終了時の屠殺例では，雌雄400mg／
kg以上で肝および腎の槌色調瞳大が認められ，当該所見は雌より雄において明瞭であった。
上記所見は休薬期終了後には観察されなかった。
7．臓器重量各群の絶対重量を表11，表12に，相対重量を
表13，表14に示した。
絶対重量ならびに相対重量の双方の値が共通して増加，あるいは減少し，さらに用量反応を伴った変化は雌雄400mg／kg以上の投与群の肝重量増加，雄の80mg／kg以上および雌の400mg／kg以上の投与群の腎重量増加であった。また，雄の400mg／kg以上および雌の2，00Omg／kg群の顎下腺減少，雄の2，町O
mg／kg群の胸腺減少も同様な変化を示した0その他，体重変動に関連した絶対重量の減少，あるいは相対重量の増加が主として雌雄2，00O
mg／kg群の種々臓器に散発的に認められた○
休薬期間終了後には，上記所見は軽減ないし回復した。
8．病理組稔学的所見
臓器ごとの病理組織学的所見を以下に示す。
肝では対照群の数例に，ごく小城の壊死巣お4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

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4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究：●．

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よび肝細胞の胞体内好酸性滴状物の沈着が軽度に観察され，薬物投与群ではこれらの変化の増強のほか，雌雄80mg／kg以上の群に肝細胞
核の多核化が窺われ，雌雄400mg／kg以上の群では肝細胞の変性，肝細胞大小不同，さらに
雌雄2，000mg／kg群では門脈周囲の壊死性肝細胞の貪喰像，あるいはごく一部の例に小葉管胆管上皮の壊死が散見された（写真1）。
腎では80mg／kg以上の投与群で皮質外帯のほぼ全域，もしくは皮質内帯の尿細管上皮の胞体内にH．E．染色では好エオジン性に，Weigertのfibrinoid染色では青紫色の滴状物の増加が用量依存的に観察された（写真2）。
休薬により，上記変化は肝における多核化現
象を除いて消失，あるいは修復像を呈し，回復傾向を示した。
考察

E−64−d80，400，2，000mg／kg をラットに1カ月間連続経口投与した結果，2，000mg／kgで死亡例があったほか，主として80mg／kg
以上の投与群に肝，腎の障害を示唆する諸変化が観察された。血液生化学的検査では80mg／
kg以上の投与群に血清トラソスアミナーゼ活性値の著しい上昇が認められ，病理学的検査では肝重量の増加，肝細胞の変性，壊死などが観察され，肝の機能的，器質的障害が示唆された。これらの変化は休薬によって回復する傾向が認められたが，血清トランスアミナーゼ活性値は依然高値に保たれていた。ラットにおける醜鼠」還無電翫i
写真2 腎（E−64d2，000mg／kg，堆ラッり
尿細管上皮の硝子滴沈着×250，Wieg・
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肝毒性の発現は質的，あるいは量的に前述のハムスターおよび後述のイヌとは著しく異なるものであるが，現在のところこのような種差の成因は明らかではない。また，同様の作用はE−64−dのラットにおける主代謝物である E−64−
C3）にも認められているが，E−64−dとは発現用量にかなりの違いがあり，今後，さらにE−64−dの生体内動態を解明することによって，ラットにおける肝毒性の発現横序が明らかになるものと思われる。その他，肝細胞に観察された多核化現象については，そのPathogenesisは明らかでないが，一般的にはその成田の可能性として，細胞融合と分裂阻害の2つが考えられる。前者の場合はウイルス性肝炎などに代表され，この際多くは胆汁うっ滞を伴い，随所に細胞浸潤がみられる。したがって，多核化は分裂阻害に起因したものとも考えられる。一方，腎においてほ重量増加のほか，尿細管上皮の硝子滴物質の沈着が80mg／kg以上の投与群において用量依存的に認められた。この変化は肝の場合と異なり，ハムスター，イヌにおいてもほぼ同じ用量から観察されている。一般的に，このような変化は上皮細胞の機能障害，あるいは
機能克進による蛋白質再吸収の結果，生ずるものと考えられているがの，今回の場合，休薬によって回復することから，比較的軽度な変化であると推察された。

43

I E−64類縁体の開発

結論

ラットにE−64−dの80，400．2，000mg／kg

を1カ月間経口投与し，その亜急性毒性を検討した結果，血清GOT，GPT活性値の上昇，肝，腎重量の増加，肝細胞の多核化，変性，壊Ⅲ．ラッ

死，腎変性所見など，主として肝，腎の障害を示唆する変化が80mg／kg以上の投与群に観察された。これら諸変化のうち，腎所見については休薬により軽減，もしくは消失したが，肝の多核化，血清GOT・GPT活性値の上昇は継続して認められた。
ト （Ⅰ）
64−dのラット亜急性毒性試験（Ⅰ）に準じて

日

的

E−64−dの安全性研究の一環として，先に実施したラット亜急性毒性試験（Ⅰ）に引き続き，
より低用量による亜急性毒性ならびに回復性を
検討する。
方

法

1．動物
6遇令のWistar系雄性ラット（静動協：体重140〜165g）を1週間予備飼育後，回復性を検討する動物を含めて1群10〜17匹あて群別して実験に使用した。動物は温度23土20C，湿度
55土5％のバリヤーシステムの動物室で個別に飼育し，飼料（MF：オリェソタル酵母社製）と水は自由に摂取させた。
2．投与宣および投与方法
E−64−dは水に難溶であるため5％アラビアゴム水溶液で懸濁した。投与量は20，40および80mg／kgとし，投与容量は体重100gあたり1mlとして1日1回1ヵ月間毎日定時に経口投与した。対照群には5％アラビアゴム水溶液
を同様に投与した。
3．検査項目（1）一般症状投与および休薬期間を通じて毎日異常症状の有無を観察した。
（2）体重，摂餌量および摂水量の測定
体重については投与期間中は毎日，休薬期間
中は週1回測定し，摂餌量，摂水量は試験期間
中退1回測定とした。
（3）血液学的検査，血液生化学的検査，尿半定量的検査および病理学的検査においてはE−
44

実施した。
￠）推計学的処理
各測定値は平均値および標準偏差を求め，ト検定により対照群と投与群の平均値の差の有意性を検討した。
結果1．一般症状観察，体重，摂餌量および摂水量
投与期間中，中毒症状は全くみられず，また死亡例も観察されなかった。
各投与群の体重の推移を図4に示した0投与期間中および休薬期間中各投与群の体重は対照群とほぼ同程度の増加曲線を示した0また摂餌量，摂水量については，いずれの投与群においても著変は認められなかった。
2．血液学的検査
各投与群の血液学的検査所見を表15に示した。
投与終了時および休薬終了時において薬物投与による著明な変動は全く認められなかった。、
3．血液生化学的検査
各投与群の血液生化学的検査所見を表16に示した。
投与終了時において20mg／kg以上の投与
群で用量依存性のあるGOT，GPT活性値の上昇および総コレステロール量の増加が，また40mg／kg以上にトリグリセライド量の減少が認められた。その他，20mg／kg群ではナトリウ
ム量およびカリウム量の増加が認められたが，用量反応関係は不明確であった。
一方，休薬終了時においては40mg／kg以上の投与群でGOT，GPT活性値の上昇がみられ，

4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

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表15 ラット亜急性毒性試験における血液学的検査所見
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86土18

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回復性は認められなかった。
4．尿検査
いずれの投与群においても投与期間終了時，休薬終了時ともすべての項目において顕著な変化は認められなかった。
5．病理学的検査（1）剖検所見投与および休薬終了時においていずれの薬物でも特に著変は認められなかった。
（2）臓器重量
各群の絶対重量を表17に，相対重量を表18に示した。

投与終了時においては20mg／kg以上の投与群で用量依存性のある腎重量の増加が認められたが，その他の臓器においては絶対重量，相対重量双方共に明らかな増減はみられなかった。一方，休薬終了時においては上記した腎重量の増加は認められなかった。
（3）病理組織学的検査
各臓器ごとの病理組織学的検査所見を以下に示す。
肝では対照群に小巣状性あるいは巣細胞性壊
死が散見され，また肝細胞胞体内に好エオジソ性の滴状物の沈着等も観察された。薬物投与群45

I E−64類縁体の開発

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4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究

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47I E−64煩縁体の開発

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4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究でこれらの変化は増強された他20mg／kg以上の群に肝細胞の多核化が窺われた。
腎では40mg／kg以下の群において著明なた。

変化は認められなかったが，80mg／kg群で皮質外帯の尿細管上皮への硝子滴沈着の増加が観察された。

よび肝細胞の多核化，また腎重量の増加が観察

休薬終了時では薬物投与群の肝に上記所見が依然認められたが腎においては該変化は明らかに消失し，回復した。
考

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E−64−dの安全性研究の一環としてピーグル
犬に1カ月間経口授与し，亜急性毒性ならびに回復性を検討する。
方

ンスアミナーゼの上昇と壊死性肝細胞の増加おされ，E−64−dがラットにおいては低用量から
肝，腎に影響を及ぼすことを窺わせた。一方，全身の毒性をよく反映する体重，あるいは腎尿細管上皮の硝子滴変性には影響がほとんどな
く，当条件下での肝，腎への影響は比較的重篤なものではないことが推察された。

先に実施したE−64−d投与量80，400，2，000
mg／kgのラット亜急性毒性試験（Ⅰ）において，80mg／kgから肝，腎に障害性を示唆する変化がみられたため，今回，さらに低用量における毒性を検討し，特にGOT，GPT活性の上昇，ならびに肝，腎の器質的変化に着目し

日

本試験においても，20mg／kgより血清トラ法

1．動物
体重9．2〜13．7kg生後9カ月令の雄ピーグ

結論

E−64−d20，40，80mg／kgをラットに1ヵ

月間経口投与した結果，肝では20mg／kg以上に腎では80mg／kgに障害を示唆する変化が観
察された。

ヌ

3．観察および検査方法
一般症状については毎日観察を行い，摂餌量
および摂水量を毎週1回測定した。また体重は隔日に測定した。さらに投与開始前，投与1カ
月および休築後には以下の諸検査を実施した。
（1）血液学的検査
前腕静脈より採血した新鮮血を用い，赤血球数，白血球数，血小板数，血色素量，ヘマトク

土5％の動物舎でアルミ製ケージに個別飼育

リット値（コールターカウソクー），網赤血球数，白血球百分比（へマトラック），赤血球膜抵抗性（CPCシステム），プロトロソピソ時間（Quickl段法）を測定した。
（2）血液生化学的検査し，その際固型飼料（CD−5：日本クレア）および水は自由に摂取させた。

の血菜についてオートアナライザー（日立分析

2．投与方法装置712型）を用い血糖量（ブドウ糖酸化法），

ル犬（加商：ホワイトイーグル社米国）20匹を4カ月間予備飼育して環境に馴応させ実験に供した。飼育条件として，温度21土20C，湿度55

前腕静脈より採取した血液を遠心分離し，そ動物を1群4〜6匹として，E−64−dの40，

総蛋白質量（Biuret法），アルブミン量（BCG

200，1，000mg／kg群および対照群の4群に分けた。E−64−dの粉末結晶をゼラチンカプセル法），尿素窒素量（Urease−Indophenol法）．

に充填し，1日1回1カ月間にわたり経口投与

ル量（酵素法），トリグリセライド量（酵素法），

した。対照群には空のゼラチンカプセルを投与した。

GOT，GPT活性（UV法），総ビリルビン量

クレアチニソ量（Jaだe変法），総コレステロー（アルカリアゾビリルビン法），ALP活性49

I E−64類縁体の開発（Kind−King変法），LDH活性（UV法），
CPK活性（01iver変法），尿酸（酵素法），リン脂質（酵素法），無撥リソ量（Fiske−Sub・barow変法）を測定し，また，原子吸光光度計（島津AA−650）を用いてNa＋，R＋（炎光法），Cが十（原子吸光法）量についても測定した。

（3）尿検査代謝ケージにより採集した24時間尿について試験紙を用い，糖，蛋白，pH，潜血，ケトン体（ラブスティックスー日本エームス社），どリルビソ（イクトスティックスー日本エームス社），ウロビリ ノーゲソ（ウロビリスティック
不一日本エームス社）を検査するとともに，尿量，比重（尿比重計）の測定，沈注の鏡枚を行い，さらにNa＋，K＋クレアチニソについて定量した。
（4）肝および腎枚能検査
肝機能検査はBSP法（30分値），腎枚能検査はPSP法（15分，25分，35分値）によりそ
れぞれ血中停滞率の測定を行った。
（5）病理学的検査
以上の諸検査終了後，ベントパルビタール麻酔下に脛動脈より放血死させ開胸腹して諸臓器の肉眼的観察を行い，また脳，心，肺，肝，腎，脾，胸腺，鼠下垂体，甲状腺，副腎，精巣，精巣上体，前立腺，腸間膜リンパ節を摘出，秤量した。これらの諸臓器ならび眼球，ハーダー腺，舌，気管，喉頭，気管支，大動脈，
食道，胃，十二指腸，空腸，回腸，結腸，胆のう，顎下腺，上皮小体，唾液腺，脊髄，坐骨神経，大腿骨骨髄，膀胱，皮膚，乳腺について
10％中性緩衝ホルマリン液にて固定し，常法に従ってパラフィン切片を作成し，H．E．染色を行った後，病理組織学的検索を行った。
（4）回復性試験
1カ月間の投与終了後，対照群の1頭，E−64−dの200および1，000mg／kg群の各2頭，計5頭について1カ月間の休薬期間を設けて亜急性毒性試験と同様な実験条件，実験方法により回復性を検討した。
結果

投与期間中死亡例は観察されなかった。主な症状の変化としては，1，000mg／kgで黄色調の水様下痢が投与後10日より終了時まで継続し糞中には未吸収の検体もみられた。また下痢に伴い食欲の減退，元気消失および削疫がみられた。200mg／kgでは軽度の軟便が見られたのみで，40mg／kgではなんら著変はなかった．
体重変動を図5，6に諸検査の所見を表19〜22に示す。

＼
、

、

一一、、

、〜、

ControI
E・64・d

40mg／kg〝

200mg／kg〝1，000mg／kg

21

図5 イヌ亜急性毒性試験における体重変化5028（days）

4．E−6411の亜急性毒性に関する研究

ゝて・一一‥一・・・・一・・●￣●
＼
＼

＼
＼

＼
／

／

＼＼＼＼

一一一一
＼＼

′一一一−−／＼＿′一′

ControI
E・64・d200mg／kg′・1，000mg／kg

0

7

14

21

28

0

7

14

投与期間

21

28

（days）

休薬期間

図6 イヌ亜急性毒性試験における体重変化（回復性）
表19 イヌ亜急性毒性試験における血液学的検査所見
Dose（mg／kg／day）

Contro1

40

200

1，000

4

4

6

6

0

821土49728土47812士16780土791780土83713土62771土20777土86787土0（2）794士25（2）No．of animals
Time examined（Montも）Erythrocytes（101／mm3）

Recoveryo

Hemoglobin（g／dl）

727（1）
1

726（1）

798土71（2）616士238（2）017．7士1．1

16．2土1．917．7±0．6

17．1士1．4

16．8土0．5

15．8土1．2

1

16．8土0．7

17．0土1．8

16．3（1）17．1土0．6

17．3土0．7

116．4（1）

0

54．4士3．2

49．7土2．6

17．4土0．5（2） 13．3士5．2（2）54．0土1．5
52．6土4．4

1

52．7土0．5

49．5土3．952．3±1．9

RecoveryO

Hematocrit（％）
Recoveryo
Platelets（103／mm3）

151．7（1）

0

255士88291土5754．0土0．8（2） 41．1士16．0（2）280土83
290土42

270土74300土47364士102399土76†332土175（2）421土58（2）493土210（2）126土12

1
RecoYeryO

Leucocytes（10ソmmり†：p＜0．05

52．2土5．6

53．2土1．1（2） 53．5土1．4（2）52．0（1）246（1）
1

278（1）

0

150土11

160士31

275土125（2）128土44181±74151土24141±28

1

154士4

Recoveryo161（1）

157土40（2）143±33（2）1

212（1）

171土16（2）167土16（2）日：p＜0．01 （）：No．of animals51I E−64類縁体の閑発
表20 イヌ亜急性毒性試験における血液生化学的検査所見
Dose（mg／kg／day）

Contro1NO．of animals

40

200

1，000

4

4

6

6

5．21土0．29
5．52土0．39

5．29土0．10
5．49土0．20

Time examined（Montb）

Totalprotein（g／dl）

0
1

Recovery OlAlbumin（g／dl）

O
I

BUN

3．00（1）l

2．66（1）O

18．5（1）24．5（1）O

0．82土0．08
0．82土0．08
0．93（1）0．94（1）0．89土0．17
0．85士0．07

0．80土0．05
0．85土0．08
0．81士0．06
0．65士0．18
0．82土0．11（2） 0．55土0．33（2）0．80士0．09（2） 0．69土0．16（2）116土16115土23112土13104±23

114士17131土20115土1095土14、
110±12（2） 100土8（2）116土12（2） 111士28（2）
47士11
38土12
51士13
65土13日
54土13（2）71土4（2）
56士17（2）62土4（2）lO
I

Recovery O

130（1）l121（1）

O

55±13

50土9

I

34土12
25（1）

34士4

Recovery Ol

GOT（Ⅹ−U）

O
I

GPT（K−U）

ALP（KA−U）

Ⅹ＋（mEq／1）

17士2
16土3
18（1）

l

17（1）

O

16土4

21±5

19士5

22土9

Recovery O

25（1）

l

20（1）

O

8．6土2．2
6．3土2．0

Recovery O

8．9（1）l9．4（1）

7．2土0．5
4．2土0．3

O

50土33

38±6

I

39土12

29土15

l

46（1）
34（1）

O

150土4

154士4

I

148土2

148土3

Recovery O

146（1）l144（1）OI

Recovery Ol4．4±0．4
4．3土0．4
4．5（1）
3．7（1）†：p＜0．05 日：p＜0．01（）：No・Ofanimals
52

20土1
24±3日

I

Recovery O

Na＋（mEq／1）

54（1）Recovery O

I

LDH（Ⅰ−U）

18．2土3．4
16．8±1．5lRecovery O

Triglyceride（mg／dl）

18．1士4．8
17．6土3．0

3．02士0．08
2．87±0．20

Recovery O

I

Cholesterol（mg／dl）

2．98土0．10
2．88土0．14

Recovery O

I

Creatinine（mg／dl）

5．47（1）5．44（1）

5．21土0．21
5．24土0．16
5．39土0．19
3．61土0．5411
5．25土0．01（2） 3．67土0．86（2）5．30土0．12（2） 4．90±0．17（2）3．10土0．10
3．16土0．10
3．03士0．13
1．91士0．2611
2．92土0．13（2） 2．03土0．46（2）2．79土0．11（2） 2．38土0．50（2）14．1土3．2
14．1±2．7
18．9土4．3
17．8土7．7
18．1土3．3（2） 26．1土6．5（2）22．1士1．8（2） 23．7土0．1（2）4．5土0．1
4．5士0．3

16土2
17士2
18土1（2）
15土1（2）
19士3
16士4
19±1（2）
19土3（2）
6．8土2．0
4．7土1．4
4．7土1．2（2）8．7士1．0（2）
44±13
36士8
41士12（2）
50士4（2）151土2
154土4
150土1（2）
144土0（2）4．2土0．3
4．5土0．2
4．4土0．1（2）4．1土0．1（2）

16土3
21土10
17土6（2）17土0（2）16土7
17±8
21土1（2）26土6（2）
6．7士2．0
4．5土5．3
8．9士8．9（2）8．2土0．1（2）
51土21
49士8
55土6（2）48土11（2）
152±2
150土4
151（1）
145土2（2）4．3土0．3
4．2土0．3
4．5（1）
4．1土0．3（2）4．E−64−dの亜急性毒性に関する研究
表21イヌ亜急性毒性試験におけるBSP・PSP試験所見
Dose（mg／kg／day）

Contro1NO．of animals

40

200

1，000

4

6

6

4
Time examined（Montb）

BSP test30mizl．Value（％）

0

1．6土0．1

2．0土0．2† 1．7士0．4

2．3土1．0

1．8土0．4† 1．5土0．5
1．7土0．5（2）2．5土1．1（3）3．7（1）

3．3土0．0（2）16．8土1．8

4．7±1．6（2）17．5土3．1118．2±1．6 16．0土2．0
17．4土3．8
18．3（1）19．9土1．6（2）26．8土12．3（3）40．8（1）

1

18．9（1）1
1．2士0．3
RecoveryO l．2（1）10

PSP test T−を（min．）

3．1（1）
16．7土2．0

Recoveryo

18．3土2．1

17．0土3．5（2）18．2土3．7（2）（）：No．of animals†：p＜0．01
表22 イヌ亜急性毒性試験における臓器重量
Dose（mg／kg／day）

Contro1

40

200

1，000

NO・Of animals

4（1）

4

6（2）

6（2）

A．W． R．W．
282

Liver（g）
土

A．W．R．W．

249

66

士

36

315
土

24

A．W．R．W．

273
土

29

325

土

土

377

23

土

414

71±

30日

Recovery

301

276

R

25．0

22．3

26．2

22．6

27．3

23．9

23．7

26．3

士4．8

土4．1

土2．5

±0．7

土2．5

±1．1

士2．2

±1．1

311

±
Kidney（g）

43

A．W．R．W．

284

Recovery

20．4

18．7

37

253

±

ノ24．8

367

2

20．4

±1．6 土 3．9
L

25．2

22．5

士4．3 士3．6
Recovery

19．3

26．9

23．2

土2．3 ±0．7

27．8

24．3

土3．0 土1．4

17．7

26．8

22．0

土1．1 土 3．7
Thymus（g）

13．0

11．4

8．3

7．3

7．1

6．2

±5．6

±3．8

士1．1土1．3

士2．8

土2．3

8．5

7．8

5．2

4．3

Recovery士 0．4 土 0．8
Adrenals（mg）R517
土RecoveryRecovery

22

89

515
±

31

土

447

585

54

土118

444

538
士

Mesentericlymph nodes

土

484

L

Recovery

466
9

483
±

458

74

518
士

43

士

81

士120

27．5

27．3

士0．8 土3．7
25．7

28．4

士4．7 士3．4
27．7

27．6

士0．8 土5．3
2．8

3．2±1．91土2．31
5．7

5．2

：土4．9 土4．0

510

土

60

534

土

598

60：土115

502

420

711

±155

士179

±216

448

607

529

523

577

47

：±146

10．4

9．6

8．3

±1．1

土1．0

士2．4

土2．1

13．7

12．6

688

土

96

土112

±118

土100

533

444

635

623

土145

士174

8．3

420

（g）11．6

土369

土109 土

4

7．2

8．7

9．7

土2．11士1．51

土0．4

±1．0

9．3

7．6

土0．8 士0．4

8．2

8．4

土2．3 ±3．6

A．W．：absolute organ weight，R．W．：relative organ weight
R：right，L：left （）：reCOVery †：p＜0．05 日：p＜0．0153I E−64類縁体の開発

体重は1，000mg／kgで投与7日頃より著明な減少が認められ，終了時まで継続した040および200mg／kgでは対照群と有意な差は認められなかった．
血液生化学的検査，尿検査および腎機能検査において1，000mg／kgで血中の総蛋白，アルプミソの減少，血中トリグリセライド値の軽度上昇，尿量の増加，血中PSP半減期の延長がみられ，また臓器重量測定において肝相対重量の増加が認められた。40および200mg／kgでは著変は認められなかった。
病理組織検索では肝細胞内脂肪蓄積ならびに肝細胞踵大が1，000mg／kgの2例に認められた。また，腎における尿細管上皮の硝子滴沈着が40mg／kg より用量依存的に認められた0
これら肝および腎に組織変化の認められた動物
では肉眼的に色調の変化および腫張が観察された。
1カ月間の休薬により，1，000mg／kgでみられた下痢は消失し，体重の変化は軽減あるいは回復し，また諸検査にみられた変化についても同様な傾向がみられた，しかし，1，000mg／

おける血中トリグリセライド値の上昇，肝相対
重量増加および肝細胞の腫大などの変化は肝障
害を示唆する所見であるがいずれも著明なもの
ではなく，またラットに比較するとかなり軽度なものである。腎においては尿細管上皮の硝子摘物質の沈着が40mg／kgより用量依存に認められ，また1，000mg／kgでは血中PSP半
減期の延長が認められることから腎尿細管の障害が考えられる。
回復性試験においては投与終了時にみられた下痢，体重減少等の変化は軽減あるいは回復した。一万，1，000mg／kgの1例において1カ
月休薬後にみられた貧血は慢性小腸性下痢による，消化および吸収障害に基づく栄養不良に起因したと考えられ，休薬期間に新たに生じた変化ではないと考えられた。
結論

ピーグル犬にE−64−dの40，200，1，000mg／
kgを1カ月間経口投与した結果，1，000mg／
kgで肝，40mg／kg以上で腎にそれぞれ障害を示唆する変化が観察された。

kgl例で新たに貧血が観察された。
考E−64−d40，200および1，000mg／kgをピーグル犬に1カ月間連続経口投与した結果，一般症状において，1，000mg／kgで黄色調の水様下痢が共通して認められた。この下痢は水様性であり，慢性経過をたどることを特徴とし，また血中の総蛋白およびアルブミンの減少がみられることから，E−64−dの過剰投与により消化管の消化および吸収揆能に障害が生じ下痢を呈し，下痢の持続により二次的に削疫や低蛋白血症が生じたと推察された。1，000mg／kgに

54

文

察

献

1）Jones，A．L．andArmstrong，D．T．：Increased
CholesteroIBiosynthesis Following Phenobar−
bitalInduced Hypertrophy of AgranularEn・
doplasmic ReticuluminLiver，Proc．Soc．Exp．
Biol．Med．，119，1136，1965．
2）梶田 昭：代謝障害，小病理学，南山堂，東京，
p．104，1978．

3）大関正弘：E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究，今錮班，昭和55年度研究報告書，p．25−36，
1981．

5．E−64−dの生殖に及ぼす影響（妊娠前・妊娠初期投与試験）

大

関

正

弘＊

研究協力者 中 根 貞 雄＊ 山 田
西

目

山

的

E−64−dを雌雄ラットの交配前・交配中および雌ラットの妊娠初期に経口投与し，交尾能
力，受胎能力および胎仔への影響について検討
する。
方

法

1．使用動物および飼育条件
動物は，雄6遇令，雌11遇令のWistar系ラット（静動協）を用いた。雌雄とも予備飼育により順調な体重増加を示したものを用い雌では，さらに比較的性周期の規則的なものを選択
し，いずれも1群25匹とした。
また，動物は，木屑敷プラスチックケージに入れ，温度23土20C，湿度55土5％の空調動物
室で固型飼料（オリェソタル酵母社製MF）および水（滅菌水道水）を自由に摂取させる方法で飼育した。
2．投与量および投与方法
7週令の雄ラットにE−64−d500，1，000および2，000mg／kg／日 を14日間経口投与した。
その結果，500mg／kg以上の投与量において中毒症状は観察されなかったが，いずれも体重に増加抑制が認められた。
これより，本試験期間に耐える最大投与量は500mg／kg／日であると推定し，以下100および20mg／kg／日投与量を設定した。
＊大正製薬株式会社総合研究所

隆＊

勒＊ 市 川 明 美＊

E−64−dは，5％アラビアゴム溶液に懸濁して体重100g当り1mlの割合で胃ゾンデを用い経口投与した。なお，5％アラビアゴム溶液
をE−64−dと同様に授与した群を対照群とした。
3．投与期間雄は，交配前60日間および交配期間中，雌は，交配前14日間，交配期間中および交尾後7日間投与した。
4．交配方法
交配は，約14日間とし，その間，同一群内の雌雄を1対1の割合で昼夜同居させた。毎朝（8：30〜10：30A．M．）屋内検査を行い，屋内に精子の確認された雌は，交尾成立とみなし，その日を妊娠0と定め，以後，雌雄を分離飼育した。交尾不成立の雌雄は7日ごとに同居を換えた。
5．検査項目
試験期間中，症状は毎日観察し，体重は遇3〜7回，飼料および水の摂取量は遇1〜2回間隔で測定した。また，雌は，交配前の投与期間中，屋垢を採取し，性周期を調べた。
交尾成立した雌は，成立後20日日に頸椎脱臼法で屠殺し，胸・腹部内臓器の肉眼的観察を行った後，黄体数，着床数，死胚胎仔数，生存胎仔数を調べた。死胚胎仔はその形状により吸収，初期，中期および後期死亡に分類し，生存
胎仔は，外形観察，性別判定および体重測定を行った後，一一部はBouin液に固定し，残りは胸・腹部内臓器を観察した後，99％alcollOlで55

I E−64類縁体の閲発表l 雄の体重変動
Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kg

Days after administration
142．5

0

士 5．58（25）

145．6

146．4

144．9

士 5．00（25）

土 6．79（25）± 5．73（25）

160．0

160．4

土 7．57（25）

士 6，54（25）

167．8

6

± 7．43（25）176．4

土 8．15（25）175．5

土 8．79（25）153．8＊＊± 8．26（25）160．6＊＊

土 8．66（25）166．5＊＊±10．06（25）

185．9

186．7

188．1

180．4

士 9．20（25）土12．33（25）

土12．02（25）士10．02（25）

192．2

192．5

194．4

土 9．49（25）±11．30（25）±11．88（25）185．8＊

土10．48（25）

197．5

199．1

200．8

192．4

土10．87（25）

土10．52（25）

土11．67（25）士11．66（25）

205．4

208．5

210．7

士 9．79（25）± 9．82（25）

土11．33（25）

18

216．1

211．8

214．7

士11．06（25）

土 9．70（25）

20

216．4

219．2

士11．29（25）

土 9．96（25）22

士11．60（25）220．0

土11．79（25）

220．7

224．0

224．7

土12．02（25）

土11．92（25）

土11．40（25）

25

226．6

27

±12．13（25）
230．6

29

土12．33（25）
237．3

32

±12．30（25）

229．6

229．8

土10．91（25）±11．49（25）

233．5

232．4

±11．21（25）

土11．67（25）

239．9

240．0

土10．96（25）

士11．53（25）

241．2

243．8

243．4

士13．10（25）±11．21（25）

土11．46（25）

34

244．0

246．1

245．3

士13．55（25）

土11．31（25）

士11，05（25）

36

249．5

39

土13．97（25）

250．1

250．2

土14．14（25）

253．3

255．0

土14．38（25）

士13．97（25）41

士11．27（25）253．6

土11．70（25）

256．7

257．6

255．7

士14．92（25）

士14．49（25）±12．03（25）

43

260．1

46

士13．89（25）
261．9

48

±14．55（25）
265．7

50

±15．54（25）
′

268．4

±16．54（25）

259．4

261．1

±14．05（25）

土12．48（25）

262．3

261．3

±13．35（25）267．3±12．43（25）

土13．58（25）

士11．78（25）

264．7

269．5

267．5

士13．81（25）

土11．98（25）

273．1

274．6

270．5

士16．93（25）士14．04（25）

土13．12（25）

273．5

275．9

272．5

士18．35（25）

士13．86（25）

土12．91（25）279．1

土18．22（25）

275．9

279．0

±13．87（25）Mean土S．D．（No．of animals）＊：P＜0．05

56

士 8．77（25）
168．9

175．6
士 8．66（25）

15

60

167．9

士 7．39（25）

13

57

160．8

士 7．60（25）

11

55

143．1

士 4．95（25）

146．5

4

53

143．8

土 4．68（25）± 5．73（25）

1

8

141．8

± 5．96（25）

土13．25（25）＊＊：P＜0．01

Unit：Gram

199．7

土13．25（25）205．1

士13．11（25）207．1＊

土14．00（25）211．7＊

土13．28（25）215．5＊＊±13．85（25）218．7＊＊

土14．43（25）222．4＊＊±18．03（25）224．0＊＊

士20．14（25）225．2＊＊±20．01（25）228．6＊＊±21．98（25）233．4＊＊±20．40（25）235．3＊＊

土19．33（25）238．0＊＊

士18．88（25）239．4＊＊±21．22（25）241．7＊＊

士18．82（25）244．4＊＊

士20．15（25）249．8＊＊

士21．05（25）249．9＊＊

士21．37（25）254．3＊＊

土21．81（25）5．E−64−dの生殖に及ぼす影響（妊娠前・妊娠初期投与試験）
表2 雄の摂餌量，摂水量
Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kg

Food consumption
Days after administration
17．7

18．1

17．6

士1．17（25）

土1．48（25）

士1．43（25）1

16．0＊＊

士1．55（25）

18．8

19．0

19．2

18．1

土1．22（25）

土1．08（25）±1．62（25）

土2．22（25）

8

18．4

19．3

土2．05（25）

土1．47（25）

15

19．1

19．4

土1．36（25）±1．37（25）

22

18．0

29

士1．29（25）
士1．16（25）18．4

土1．17（25）±1．78（25）
18．8＊

19．0

土1．17（25）19．3＊

土1．33（25）

18．6

43

19．5＊

±1．76（25）

20．3＊

士1．12（25）

18．4

36

20．0＊＊

土1．32（25）

士1．39（25）
18．8

18．3

土1．42（25）±1．88（25）

18．6±2．46（25）18．3

土1．66（25）17．9±1．76（25）
17．7±1．76（25）

18．3

18．5

18．0

17．7

土1．68（25）

土1．60（25）±1．66（25）±2．70（25）

50

16．7

57

土2．19（25）18．0＊

18．3＊＊

土1．41（25）±2．07（25）

16．4

土2．95（25）

Water consumption
Days after administration
1

8

21．9

21．2

±1．49（25）

土2．67（25）22．2

土2．33（25）
15

22

23．3

21．9

土3．55（25）±1．60（25）

23．6±2．74（25）
29
36

50

57

17．4＊＊

土2．69（25）

23．3

22．9

±4．64（25）

士5．21（25）

24．6

23．0

土2．54（25）±3．39（25）
24．3

23．9

士4．14（25）

22．0

22．0

23．0

土2．60（25）±3．33（25）

21．4

21．8

23．1

土2．09（25）

土2．43（25）

21．5

21．5

21．8

土2．86（25）

土2．50（25）±2．14（25）

20．2

20．9

20．0

士2．49（25）

土2．44（25）±2．23（25）18．9±1．88（25）23．3

土3．41（25）±3．38（25）

士2．60（25）

士2．44（25）43

22．1

土2．34（25）

20．3＊＊±2．18（25）24．0＊

土2．82（25）22．7

土2．76（25）
23．6＊

土3．59（25）
22．7＊＊

土3．36（25）

20．5＊

20．8＊＊

21．7＊＊

土2．72（25）

土2．49（25）

土3．91（25）

Mean土S．D．（No．of animals）＊：p＜0．05＊＊：p＜0．01

Unit：Gram（Food），Milliliter（Water）
固定した。
Bouin固定胎仔は，Wilson（1965）1）および西村（1974）2）の方法に従い，頭，胸，腹部の諸臓器を観察し，alcohol固定胎仔は，Dawson（1926）3）の方法に準じてalizarin red S染色

いずれも実体顕微鏡下に行った。
6．統計処理実験結果については，平均値の差はt−検定，出現率の差は∬2−検定を用い，いずれも危険率．1および5％で統計学的有意性を検討した。

透明骨格標本を作製し，全骨格系の異常，変異ならびに化骨進行度について観察した。観察は57

I E−64類縁体の開発
表3 雌の体重変動
Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kgI）ays after administration

163．7

0

163．1

土 5．18（25）
166．3

2

土 6．34（25）

165．6

165．3

士 5．66（25）

168．1

167．7

士 5．43（25）

171．0

7

土 5．65（25）
9

172．9

土 5．57（25）
173．1

11

土 6．06（25）

土 4．93（25）± 5．91（25）

土 5．78（25）

4

163．1

土 4．18（25）166．7

土 5．96（25）

170．2

170．4

土 5．84（25）

士 6．09（25）164．7

土 4．20（25）162．7＊＊

土 7．15（25）167．1＊

土 6．27（25）

172．6

172．3

171．3

土 6．26（25）

土 5．84（25）

士 6．42（25）

172．8

173．2

172．0

土 7．12（25）

士 5．49（25）± 6．56（25）

176．0

175．5

176．5

土 7．36（25）

士 7．44（25）

土 6．11（25）

14

163．0

± 5．28（25）175．8

土 7．71（25）Days of gestation
179．7

179．2

180．1

178．2

士 7．48（21）土 8．53（21）土 5．67（19）土 6．10（17）

0

180．1

179．0

180．4

177．7

± 7．84（21）士 8．09（21）士 5．41（19）

士 6．22（17）

1

181．7

180．9

181．7

± 7．61（21）土 8．24（21）土 5．35（19）

2

182．9

183．0

183．1

土 7．89（21）土 8．58（21）± 5．86（19）

3

185．2

184、8

185．1

土 8．03（21）土 9．08（21）土 5．68（19）

4

187．5

5

188．6

6

± 8．50（21）

201．3

202．2

± 8．17（21）222．1

土 8．74（21）1720Mean土S．D．（N0．Ofanimals）
Unit：Gram

203．0± 7．45（19）

223．7

225．3

土 9．74（19）土 9．34（21）
265．4

263．2

土15．10（21）土 6．50（19）土 7．97（21）
239．0

237．5

土 9．98（21）土 6．22（19）191．9

土 8．76（21）土 7．97（21）
15

189．3

土 8．47（21）
191．3

190．5

土 7．00（21）10

士 6．33（19）189．1

土 7．04（21）
7

187．3

187．2

土 7．76（21）士12．63（21）＊：P＜0．05

237．9

土11．23（19）264．9±15．35（19）178．5

土 6．10（17）180．3

土 5．47（17）183．5

土 5．53（17）186．2± 6．19（17）187．7

土 5．90（17）189．4

土 5．73（17）201．2

土 6．16（17）224．2

土 7．77（17）238．0

士 8．15（17）264．8

土12．22（17）＊＊：p＜0．01

1．故への影響
体重，摂餌量および摂水量を表1，2に示した。

かな影響が示された。
摂餌量は，20mg／kg群の投与後期，100mg／kg群の投与中期および後期，500mg／kg群の投与中期にそれぞれ増加が，また，500mg／
kg群の投与初期には減少がみられた。摂餌・

体重は，20，100mg／kg群では対照群と変わらぬ推移であったが，500mg／kg群では投与初期から終了時にかけ，増加抑制が現われ，明ら

摂水量の増減には，用量および投与日数と関連した一定の煩向は認められなかった。症状観察からはいずれの投与群にも異常は認められなか

結

58

果

5．E−64−dの生殖に及ぼす影響（妊娠前・妊娠初期投与試験）
表4 雌の摂餌量，摂水量
Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kg

Fod consumption
Days after administration
2

13．8

土1．82（25）

14．1

13．7

±1．55（25）

土1．64（25）

13．7

13．8

±1．25（25）

土1．48（25）

4

13．0

9

士0．99（25）

12．5＊＊

土1．19（25）

14．6＊

11．7＊＊

士1．69（25）

土1．94（25）

13．3

13．6

13．1

土1．49（25）

士2．14（25）

士1．83（25）

13．6

13．9

14．2

14．0

土0．98（25）

士1．58（25）±1．42（25）

土1．64（25）11Days of gestation
2

12．0

12．6

11．7

11．6

士1．29（21）±1．45（21）

土1．17（19）

土1．69（17）

12．5

12．7

12．0

13．0

土1．31（21）±1．82（21）

土1．39（19）±1．72（17）

4

13．9

13．6

14．5

土1．45（21）

土1．27（21）

土1．45（19）10

15．7＊＊

士1．94（17）

15．5

15，7

16．1

16．6

土2．03（21）士1．52（21）士1．62（19）±1．81（17）

15

15．5

14．8

14．9

15．4

土1．60（21）

土1．93（21）

土1．50（19）士1．17（17）20

Water consumption
Days after administration
2

4

16．9

17．2

16．9

±2．00（25）

士2．53（25）

土2．90（25）17．1

土2．29（25）9

18．0

士2．59（25）

17．7

17．1

士2．37（25）11

18．1

土2．13（25）19．0＊＊

土2．38（25）

土2．58（25）

14．8＊＊±3．30（25）15．1＊

土3．59（25）18．4

土3．01（25）

18．7

18．2

19．4

19．3

土2．54（25）±2．86（25）

土2．81（25）±2．93（25）Days of gestation
2

23．7

土4．33（21）4

22．1

土3．75（21）
10

20

23．8

土4．20（19）20．6
士2．93（21）

22．4

22．7

土3．52（19）

土3．89（17）23．4

士2．68（21）15

24．1

士4．10（21）

24．1

23．2

±1．85（21）

土2．25（19）22．0±5．10（17）24．2

土2．71（17）

25．4

26．3

25．5

26．3

士2．12（21）

土2．69（21）士2．11（19）±2．73（17）27．0

土2．92（21）
Mean土S．D．（No．of animals）

29．3＊

29．2】＊

29．4＊■

土3．61（21）

土2．07（19）

士3．18（17）＊：p＜0．05＊＊：P＜0．01

Unit：Gram（Food），milliliter（Water）

った。また交配終了したものの剖検所見からは，肉眼的異常は全く観察されず，交尾不成立の精巣，精巣上体にも組織学的な変化は認められなかった。
2．雌への影響
体重，摂餌量および摂水量を表3，4に示した。
体重は，いずれの投与群も対照群と変らぬ推移であったが，500mg／kg群の投与初期に減少が認められた。
摂水量は，100mg／kg群の投与後期および各投与群の妊娠末期に増加が，また500mg／kg
59

I E−64類縁体の閑発表5 雌の交配成績
Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kg

25

25

Copulating
1−7Days

22

24

22

8−15Days3

1

3Over16Days

0

0

0

100．0

100．0

100．0

●

Copulative rate（％）

25

85 00乃25

2
9No．of female mated2

8−15Days
Over16Days
Pregnancy rate（％）
Estrous cycle（Day）
Frequency of cycle／2weeks

25／25

25／25

19

20

18

12

2

1

1

5

0

0

0

0

84．0

84．0

76．0

73．9

21／25

21／25

19／25

17／23

4．1

4．1

4．2

4．4

3

25／25

Pregnancy
1−7Days

土0．6（52） ±0．6（50） 土0．6（50） 土1．0（47）
2．1

2．0

2．0

1．9

±0．6（25） 土0．3（25） 土0．4（25） ±0．7（25）Duration of mating（Day）

3．6

4．0

4．3

5．6＊

土3．2（25） 土2．1（25） 土2．6（25） 土3．6（25）
Mean士S．D．

＊：p＜0．05（）：No．of observedanimals

群の投与初期に減少が認められた。しかし，いずれの投与群にも異常な症状は観察されなかった。
交配終了したものの剖検所見では肉眼的異常は全く観察されず，交尾不成立の雌の卵巣にも組織学的変化は認められなかった。
3．交尾，妊娠への影響
交配，交尾および妊娠所見を表5に示した。
各投与群の交尾率および受胎率に影響はみられなかったが，交配日数（交尾成立に要した日数）では，500mg／kg群に延長が認められた。
交配前の雌の性周期観察では，各投与群とも平均4日前後で大きな変化はみられなかった。
4．胎仔への影響
交尾成立後20日目に子宮内および胎仔の観察
結果を表6に示した。
各投与群の黄体数，着床数，着床率（総着床数／総黄体数×100），生存胎仔数，死胚胎仔数，
死胚胎仔率（総死胚胎仔数／総着床数×100）および性比は各投与群とも対照群と変わらぬ数値であったが，100，500mg／kg群の生存胎仔体
60

重にいずれも増加が認められた。
生存胎仔の外形検査では，20mg／kg群に浮腫および胎盤癒合が各1例みられたが，内臓検
査では異常は1例も認められなかった。
胎仔の骨格観察所見を表7−1，7−2に示した。
異常骨としては，20mg／kg群に肋骨癒合と胸椎体不整の合併症が1例観察された。変異骨としては椎体のくびれ・分離，頸・腰肋骨が各群に散見された。しかし，これらの出現はいずれも有意的でなく，用量との関連も認められなかった。化骨状態では，いずれの群にも遅延的変化はみられなかったが，100，500mg／kg群の第7頸椎体，5・6胸骨および前肢の基節骨に，また100mg／kg群の尾椎骨数にいずれも対照群と比べて有意な促進がみられた。
考察

Wistar系ラットを用い，E−64−dの妊娠前および妊娠初期投与試験を行った。
交配前の投与では，雌雄とも500mg／kg群に体重増加の抑制が現われ，明らかに投与によ5．E−64−dの生殖に及ぼす影響（妊娠前・妊娠初期投与試験）
表6 子宮内および胎仔所見Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kg

No．of mothers

21

21

19

17

No．of corporalutea

274

287

251

208

Corporalutea perlitter

13．0

13．7

13．2

12．2

土 2．2

士 1．0

士 1．4

土 1．5

No．ofimplants

227

249

205

177

Implants perlitter

10．8

11．9

10，8

士 3．6

士 2．4

士 3．5

10．4
土 2．7

82．8

86．8

81．7

85．1

227／274

249／287

205／251

177／208

Implant rate（％）
No．of resorbed and deadfetuses

Total

6く5〉

14〈8〉

8〈7〉

Resorption

5〈4〉

8〈4〉

5〈4〉

3〈3〉

Early death

1く1〉

4く4〉

2〈2〉

2〈2〉

Middle death

0〈0〉

1〈1〉

1〈1〉

0〈0〉

Late death

0〈0〉

1〈1〉

0く0〉

No．oflive fetllSeS

221

Fetuses perlitter

235

197

5〈4〉

0く0〉
172

10．5

11．2

10．4

10．1

士 3．7

土 2．8

土 3．3

土 2．7

Sex ratio

0．92

1．03

1．01

1．02

Male／female

106／115

119／116

99／98

Body weigbt（G）
Male

3．08

土0．31（106）
Female2．86

土0．36（115）Male＋Female

2．97±0．35（221）External anomalies

0〈0〉
0〈0〉

Visceral anomalies
Mean土S．D．

＊：p＜0．05＊＊：p＜0．01

3．07

士0．27（119）2．88

士0．24（116）
2．98

3．17＊

士0．24（99）2．96＊

士0．22（98）3．07＊＊

87／85

3．19＊＊

土0．25（87）3．03＊＊

土0．21（85）
3．11＊＊

士0．27（235）±0．26（197）

士0．24（172）

2着く2〉
0〈0〉

0く0〉
0く0〉

0〈0〉
0〈0〉

♯：Fused placenta，Edema（）：No．of observed animals
く〉：No．of conceived motherswith caseる影響が認められた。しかし，一般症状においてはいずれの投与群にも異常はみられず，剖検
においても肉眼的異常は観察されなかった。
交配所見では，交配日数において500mg／kg
群に延長がみられたが，性周期，交尾率，受胎率に影響は認められなかった。本試験の交配日
数（3．6〜5．6日）は，いずれの群もバックグラ
ンドデータ（7．2〜10．0日）に比較し短くむしろ良好な成績であった。
これらの結果より，E−64−dは500mg／kg
投与において交配前の体重を抑制するが，雌雄の交尾，妊娠能には影響を与えないと推察された。
交尾成立後20日目の子宮内観察からは，いずれの投与群においても黄体数，着床数，着床率，生存胎仔数，死胚胎仔数，死胚胎仔率および性比に変化はみられなかった。しかし胎仔の外形観察からは，20mg／kg群に浮腫および胎盤癒合が各1例観察され，また，100，500mg／kg群に体重の増加が認められた。外形異常については例数および用量との関連からみて，また体重については，母体重および胎仔数との関連からみていずれも偶発的なものと考えられた。胎仔の内臓観察からは，1例の異常仔も認61

I E−64類縁体の閲発
表7−1胎仔の骨格検査所見一異常および変異−Groups Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

500mg／kg

No．of motbers

21

21

19

17

No．of examined fetllSeS

150

156

130

109

Abnormalities
Fusion and／or deformity
vertebral centers

0〈0〉

1く1〉

0〈0〉

0く0〉

Fusion of ribs

0く0〉

1く1〉

0く0〉

0く0〉

Waved ribs

0く0〉

0〈0〉

0く0〉

0く0〉

Otbers

0く0〉

0く0〉

0く0〉

0〈0〉

0く0〉

1く1〉

0〈0〉

0〈0〉

Bilobed vertebral centers

81〈7〉

10く7〉

7〈6〉

11〈9〉

Split of vertebralcenters
Cervical ribs

1く1〉

4く4〉

1〈1〉

1〈1〉

3〈3〉

1く1〉

0く0〉

2く2〉

Lllmbar ribs

2く1〉

4〈4〉

3く2〉

3く3〉

Asymmetry of sternebrae

0〈0〉

0〈0〉

0く0〉

0〈0〉

Shortening of13th rib

0く0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

14く10〉

18〈11〉

11〈8〉16〈12〉

No．of abnormal fetuses
Variations

No．of abnormal fetuse＄〈 〉：No．of conceived motherswith case
められなかった。
骨格検査では異常骨として20mg／kg群に肋群に交配日数の延長が認められた。

骨癒合と胸椎体不整の合併症が，また変異骨として各群に椎体のくびれ・分離，頸・腰肋骨が観察された。しかし，これらの出現はいずれも有意でなく，用量との関連も認められないとこ
ろからE−64−dに起因したものではないと考えられた。化骨状態は，100，500mg／kg群に有意な促進がみられたが，これは胎仔体重の増加に基づくものと思われた。
以上の結果により，E−64−d は雌雄ラットにれ，胚発育への影響は示されなかった。

毒性を発現する500mg／kg投与においても，交尾，妊娠ならびに胚発育には影響しないものと推察された。

1）Wilson，J．G．：Methods for ad甲inistering
agents and detecting malformationsin expe−2）いずれの投与群においても妊娠は維持さ
3）胎仔の観察において偶発と考えられる外形（2例）および骨格（1例）の異常仔が観察された。
以上の結果より，本試験における安全域は毒性発現を考慮し，100mg／kg以下になるものと考えられた。
文

rimental

animals．In

and′Teclmiques

結

論

献

Teratology

editedPrinciples

byWilsonJ・G・and

Warkany，262−277，Univ．of Chicago Press，
Cbicago and London，1965．

E−64−dの20，100および500kg／mgを
Wistar系ラットの交配前・交配中および妊娠初期に経口授与した。
1）交配前の投与において雌雄ラットの体重に増加抑制が現われたが，性周期，交尾率および受胎率への影響は認められなかった。ただしバックグランド範囲内ではあるが，500mg／kg
622）西村耕一：マウスおよびラット胎仔の胸部内臓奇形観察のための段数解剖法，先天異常，14，23−
40，1974．

3）Dawson，A．B．：Anoteon the staining of
theskeletonofclearedspecimenswithalizarin
red S，Stain Teclm0logy．1，123−124，1926．

5．E−64−dの生殖に及ぼす影響（妊娠前・妊娠初期投与試験）
表7−2 胎仔の骨格検査所見一化骨状態−
Group Contro1

20mg／kg lOOmg／kg

No．of motbers
No．of examined fetuses

500mg／kg

21

21

19

17

150

156

130

109

150〈21〉

156〈21〉

130く19〉Skull
Supraoccipital Bone

109く17〉

Cervical vertebrae

2nd metacarpu9（Rigbt）（Left）

3rd metacarpus（Rigbt）

3rd metacarpus（Left）

4tb metacarpus（Rigbt）

4th metacarpus（Left）

5th metacarpus（Rigbt）

5th metacarpus（Left）（Ri的t）

130〈19〉

109〈17〉130く19〉

109〈17〉130く19〉

109〈17〉

129〈19〉

109く17〉

71＊〈18〉59＊〈16〉95＊＊〈19〉

88綿〈17〉

0く0〉
0く0〉

0く0〉

130く19〉

109〈17〉

0く0〉

130〈19〉

109〈17〉

130〈19〉

109〈17〉

く21〉

130〈19〉

109く17〉〈21〉

130く19〉

109〈17〉〈21〉

130く19〉

109く17〉〈21〉

130〈19〉

109〈17〉〈21〉

130く19〉

109〈17〉

0．7＊＊

0．9＊＊

土0．6

土 0．6

0．4

0．8＊＊

0．6＊

土0．6

土0．6

土0．6

9
0
1

﹀

9 9 9 9 9 9 90 0 0 0 0 0 0
1 1 1 1 1 1 1﹀001717171717171717
く く く く く く ︿ く く く0

0 0 0 0 0 0 0
3 3 3 3 3 3 3
1 1 1 1 1 1 1

0

0
3
1

﹀

く く く く く く く く く く

0﹀のの抄炒抄抄抄ゆ炒炒

0﹀＊：p＜0．05

94＊〈17〉

﹀

く

11〈8〉

113＊く19〉﹀

Mean土S．D．

10〈7〉

〈20〉

﹀

（Left）

No．of proximal phalanges（Rigbt）
No．of proximalphalangeg（Left）
No．of caudal vertebrae

〈11〉

﹀

5tb metatarsus

1く1〉

﹀

（Rigbt）

0
5
1（Left）

5th metatarsus

0
5
1

4th metatarsus

0く0〉

父遠望諾遠望還（Rigbt）

0 0
5 5
1 1

（Left）

4th metatarsus

0〈0〉

く1〉

〈21〉

6 6 6 6 6 6 6
5 5 5 5 5 5 5
1 1 1 1 1 1 1（Rigbt）

3rd metatarsus

0〈0〉

〈21〉

6
5
1

（Left）

3rd metatarsus

0く0〉

く0〉

〈21〉

0

2nd metatarsus

0く0〉

0く0〉
0く0〉

0

（Rigbt）

0〈0〉

〈0〉

土0．6

002121212121212121（Left）

2nd metatarsug

11く6〉

0く0〉

0．5

く く く く く く ︿ く く く（Rigbt）

Ist metatarsus

00505050 0
5
1 1 1 1

lst metatarSuS

土

No．of proximalphalanges（Left）
Hindlimb

土

No．of proximal pbalanges

57 57
00

2nd metacarpus

14〈8〉

〈1〉

2 2 2 2 1 2く
く く く く く（Left）

5665
565656565656
11111111（Rigbt）

Ist metacarpus

005050505050504949
1 1 1 1 1 1 1 1 00

lst metacarpus

48Forelimb

黒重器禦挙芸6th sternebra〈10〉

じ八Ypn 即の5tII Stemebra

3 5 5 45 5 5 5
1 1 1

6 8 9
4 5 7
1

4th sternebra

6
5
1

8
4
1

3rd sternebra

2
1 2
1

7
4
1

2nd stemebra

2

0
5
1

lst stemebra

心≠心仇≠榔

Sternebrae

1

7th cervical center

0

4
9 1
1 1
1

6th cervical center01

5th cervical center

10

4th cervical center2
12

3rd cervicalcenter﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀﹀920131121
く くくくくく ︿51

lst cervicalcenter2nd cervical center

榊：p＜0．01〉：No．of conceived motherswith case63

6．E−64−dの変異原性試験（Amestest）

大

関研究協力者 安 井
中

日

根

正

弘＊

一＊ 後 藤 宏 三＊
貞

的

雄＊

trientBroth，DIFCOLab．）を用いて37OC

Amesら1）のサルモネラ／ラット・ミクロゾー

で一夜振立培養したものを試験菌液とした。
培養終了時の菌濃度はおおよそ109細胞／mlであった。

ム系により変異原性試験を実施したので報告する。

SalmonellatyphimuriumTAlOO，TA
1535，TA98およびTA1537

筋ジストロフィー治療薬E−64−dについて

方法

1．非代謝処理測定
被検液＊10・lml，M／10リン酸緩衝液（pH7・4）0・5ml，試験菌液＊20．1ml，ならびに軟寒
天液＊32mlを順次試験管に注ぎ入れて軽く授
拝の後，別に用意した9cm径べトリ皿中の最少栄養寒天平板＊4の上にこの混液を重層した。
放置固化の後，この重層平板を370Cで約45時間培養し，平板上に生じた栄養非要求復帰変
異＊Sの集落数を算定した。なお，上述の被検液に代えて溶媒（DMSO＊1を使用）0．1mlを用いたものを溶媒対照とし，同じく被検液に代えて適当な既知変異原物質＊6の溶液0．1mlを用いた場合を陽性対照とした。
＊l Dimethylsulfoxide（以下 DMSO と略す）を溶媒としてE−64−d被検液を調製した。80mg／mlを最大濃度とし，DMSOを用いて公比2で順次希釈して0．08mg／mlを最少濃度とした。
＊2 下記の各試験菌珠を普通ブイヨン（Nu−＊大正製薬株式会社総合研究所

Escherichia coliWP2uvrA＊3

約400Cに保った0．6％の寒天液であって，この中に食塩0．5％ならびに各50〝M
濃度のL−histidineおよびbiotin（以上S．
typhim・培養の場合），あるいは50〃M濃度のL−tryptOphan（E．coliの場合）を含む。
＊4

Vogel−Bonner最少培地Eにブドウ糖を添加した寒天平板であって，次の組成をも
つ。

ブドウ糖

2％

リン酸水素アンモニウム・ナトリウム

・4水和物

0．35％

クェソ酸・1水和物
0．2％
リン酸2カリウム
1％
硫酸マグネγウム・7水和物
0．02％
寒天
1．5％
pH7．4，25ml／平板＊5 S．typllimuriumの場合はhistidine
要求性から非要求性への復帰変異であり，
E．coliの場合はtryptophan要求性のそれである。
＊6 下記化合物をいずれもDMSO溶液として用いた。なお，供試量ならびに該当の菌株に関しては後述結果表に示す。
65

I E−64類縁体の閑発
表1非代謝処理部定（S9う

7

6

7

0

1

2

7

一
6

9

2

1

5

0

1

2

5

1

3

8

1

1

1

9

5

2

2

1

6

一

4

2

C

C

C

7

9

0

一

236

C

390

1

15

7

8

13

4

2

2

1

2

6

12

6

7

9

1

1

1

2

8
11

C

40

9
1

9AA

2218

3
1

1

231611

9

17

5

2NF

C83391008
11111111

533

2119
9

41
31
91
01
2395
1

8

555

14

7

O1
61
81
91
1431
1

．4

7487訂訂76708580
11111111

2

92
48
95乃74777781
11111111

1

831は弼㈱00︒㈹弼
2

ENNG3

8

1
1

81010

173168TA15376

0〝g／plate l98172167

WP2uvrA TA98

6

忘㌻＼一撃L TAlOO TA1535

385

241

224−156

C；検鏡により培養平板上に被検体の沈澱あるいは析出を認めたもの
表2 代謝活性化処理測定（S9＋）

慧1ここ：：9−芸篭 器 ご 言崇封；A：≡OJ唱／plate

l82196

24

10

342

20

300

42314739444149亜

105

1

2
4
5

103

47

13 1 71224252130公

0
8

2

21

14 2 2 1 5 2 2 1 9 Ⅳ 2 0 脚

0
4

O2
71
−2
71
71
一3
950
2

0
2

41
42
71
93
11
82
0
2

0
1

3
1
6 1 7 1971
18162015
5

5

67
67
58
76
67
88
57
8
6
l
ll
ll
ll
l一

1

8 3125 00 00 00 00 的

0．5
2AN

19

265

55

10

6

255

C：検鏡により培養平板上に被検体の沈澱あるいは析出を認めたもの
C

N−ethyl−Nl−nitro−N−nitrosoguanidine

0．5mlを用い，以下同様に操作した。なお，
2−aminoanthracene（略2−AN）の（ENNGと略）

DMSO

2−nitroauorene（2−NF）

溶液0．1mlを陽性対照とした（供試濃度は結9−aminoacridine（9−AA）

果表中に示す）。
CC

2．代謝活性化処理測定

前述の非代謝測定における緩衝液に代えて
in vitroの代謝賦活系として

S9−Mix66＊7＊7

Phenobarbitalおよび5，6−benzoaa−

VOneで誘導したS−D系雄ラット肝臓ミクロゾームの薬物代謝酵素系であって，S9−Mix

CCC

6．E−64−dの変異原性試験（Ames test）

20ml当りの組成は下記のごとくである。
S9（肝磨砕物の9，000G遠沈上清，オリェ
ソタル酵母工業，Lot．680280） 2ml
O．lMニコチナミド・アデニン・ジヌクレオ

チドリン酸，還元型（NADPH）0．8m1
0．1Mニコチナミド・アデニン・ジヌクレ

オチド，還元型（NADH）

0．8ml

lMブドウ糖6リン酸（G6P）
1．65M塩化カリウム
0．4M塩化マグネシウム

0．1m1
0．4m1
0．4m1

0．2Mリン酸緩衝液，pH7．4
蒸留水

10ml
残量

結果および考察
培養2日後の平板（plate）上の栄養非要求復帰変異集落数を表示する（表1，2）。
両表にみるように本被検体はその不溶解ない
しは溶解後析出が認められた8mg／plate迄の供試濃度範囲において，試験菌株の塩基対置換
変異検出型（S．typhimuriumTAlOO，TA
1535，および E．coliWP2uvrA）ならびに塩基枠移動変異検出型（TA98およびTA
1537）を通じ，またラット肝ミクロゾーム酵素

び非処理試験を通じて，それぞれ当該の溶媒対照値に比して有意な変異集落形成増を全く惹起していない。一方，各陽性対照値はいずれも妥
当な域の変異形成増を示している。
本被検体の溶解性をみると，培養開始前，被検体のDMSO琴液0・lmlとリン酸緩衝液0・5mlの接触時点で2mg以上の被検体溶液はすべて明瞭な白濁沈澱を生じたが，2日間培養後の平板の検鏡観察では多くの場合最高濃度（8mg／plate）においてのみ塊状沈澱，あるいは，
一たん溶解後針状晶出の形での被検体の不溶化が認められた。
なお，同じく検鏡の結果，試験菌株に対する本被検体による生育阻害現象は全く検知されな
かった．
結

論

E−64TdはAmesの方式による細菌株の復帰
突然変異試験において陰性であった。
文

献1）Ames，B．N．et al．：Mutation Reseach，31，347−364，1975．

系による代謝活性化に関してその処理試験およ677．E−64−dの小核試験

大 関 正 弘＊
研究協力者 鈴 木
安

目

井

的

動物を用いる変異原性試験の一つである小核試験によりE−64−dの染色体異常誘発性について検討する。
方法

生後7週令のddY系雄マウスを静動協より購入し，1週間の予備飼育後，8〜10週令で実験に供した。
E−64−dの投与量は急性毒性試験の結果1）を参考に，ddY系雄マウスの腹艦内投与によるLD50値のおよそ韻量である1，600mg／kgを最高投与量に，以下800，400mg／kgの1回投与
群，ならびに400mg／kgの4回投与群を設けた。
陽性対照として用いたマイトマイシンCは2mg／kgとし，生理食塩水に溶解して腹睦内投与とした。
投与容量は10〜15ml／kgとした。
標本作製は薬物投与の24時間後とし，頸椎脱臼により動物を屠殺した。◆
屠殺後，直ちに大腿骨両端を切断し，ウシ胎
仔血清（Fetalbovineserum，FBS）約0．3ml
で骨髄細胞を遠沈管に洗い出した。
次いで，1，000rpmで5分間遠心後，上清をとり除き，わずかに残ったFBSで一様の細胞

洋＊

酒

井

一＊

中

根

茂＊
貞

雄＊

夜風乾の後，2．5％ギムザ液（pH6．8，S6ren−Senbuffer希釈）で染色し，標本を作製した。
観察は1個体あたり1，000個の多染性赤血球（polychromatic erythrocyte，PCE）を観察し，小核をもつ赤血球数をチェックした。同時に全赤血球1，000個を観察し，多染性赤血球比（PCE比）も算出した。
小核赤血球の出現頻度の陰性対照との有意性の検定はKastenbaum，M．A．らの方法2）に従った。
結果および考察
表1に試験結果を示した。
E−64−dの1回，4回投与群とも小核出現率
は0．3％以下であり，陰性対照と比べて小核の有意な誘発はみられなかった。
一方，陽性対照として用いたマイトマイシン
C群では，小核出現率は平均3．38％で陰性対照と比べて有意な誘発であった。（p＜0．01）
結論

以上の結果より，E−64−dは本実験条件下ではマウス骨髄細胞染色体に異常を誘発する可能性はないものと考えられた。

浮遊液とし，スライドグラスにスメアーし，一＊大正製薬株式会社総合研究所
69

I E−64類縁体の開発
表1E−64−dの堆マウスにおける小核試験成績（競g） Scbedule

慧孟S

l
×

6

1
×

6

4
×

6

1
×

6

0．22土0．13

1×6

0．18土0．10

1
×

6

1M

400400800600MC2Ol〉a）5％gum arabic b）Mitomycin C文献1）大関正弘，瀬戸山蔭義，小池正信，大島 隆，
樽本保男，中根貞雄：E−64Tdの急性毒性に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代70％Micronuclei ％諾霊蒜慧e
0．12土0．10

48．5士2．5

0．18土0．10
0．15土0．05

50．8士3．1
46．0士4．3
41．7土5．4
39．4土3．2

3．38±0．63＊＊

35．2士4．4＊＊：p＜0．01

謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，
今堀班，昭和57年度研究報告書，p．25，1983・
2）Kastenbaum，M・A・and Bowman，K・0・：
MutationResearch，9，527−549，1970・

8．E−64−dの抗原性に関する研究

大 関 正 弘＊
研究協力者 中 根 貞 雄＊ 山 田
阿

部

訓

志＊

岩

瀬

隆＊
のぞみ＊

性ラットを用いたPCA3）により，E−64−dに
日的対する抗体価を測定した。惹起抗原としては，

E−64−dの安全性検討の一環として，ウサギ，
マウス，モルモットに対する抗原性を検討する。

のincubationmixtureを用いた。
3．モルモットにおける遅延型皮膚反応

材料および実験方法

Hartley系雄性モルモット（350〜400g）を

1．ウサギにおける抗体産生
NZW種雄性ウサギ（2．5〜3．5kg）を用いた。感作抗原としてE−64−dと正常ウサギ血清のincubationmixture（37OC，30分）を用い，図1に示すスケジュールで感作した。一次，二次
感作とも抗原液と等量のFreund

E−64−dとBSA（BovineSerumAlbumin）

s complete

adjuvant（Difco）の懸濁液をE−64−d換算で用いた○感作抗原としては，E−64−dの5％ア
セトソ溶液を用い刈毛した背部皮膚に0．1mlを塗布した012日後，E−64Jの5％アセトン溶液を誘発抗原として背部皮膚に0．1ml塗布
し，遅延型皮膚反応4）を観察した。
結果および考察

1mg／kgもしくは5mg／kg，四肢足農に皮内1．ウサギにおける兢体産生投与した。感作後経目的に採血し，得られた血PCAの結果，表1，2に示すように，E−64−d

清について，Hartley系雄性モルモットを用いを投与したウサギの血清ではいずれも色素の漏た受身皮膚アナフイラキシー（PCA）1）および間接血球凝集反応2）により検討した。惹起抗原

出は認められなかった。また，タンニン酸処理としてE−64−dと卵アルブミンのincubation
mixtureを用いた。

陰性であり，E−64−dに対する抗体は産生されないものと考えられる。

2．マウスにおける抗体産生

2．マウスにおける抗体産生

した緬羊赤血球の間接凝集反応では，いずれも

BDFl系雄性マウスを用いた。感作抗原とし

PCAの結果，蓑3に示すとおり，E−64−dをてE−64−dと卵アルブミンのincubationmix−

投与したいずれのマウスの血清においても色素ture（37OC30分）を用い，図1に示すスケジュールで感作した。一次，二次感作とも抗原液漏出は認められず，E−64−dに対するIgE型抗体の産生はないものと考えられる。

と水酸化アルミニウムゲルの懸濁液をE−6411

3．モルモットにお【ナる遅延型皮膚反応

換算で4′唱腹腔内投与した。感作後経目的に

表4に示すとおり，E−64−dを塗布したモル

採血し，得られた血清についてWistar系堆

モットでは，遅延型皮膚反応は認められなかった。このことから，E−64−dに細胞性免疫反応＊大正製薬株式会社総合研究所は認められないものと考えられる。
71I E−64類縁体の開発
1．Rabbits

day O

7

14

21

P‖mary SenSitization

28

secondarySenSilization

ll．Mice
day

0

10

1417

十

20

30

33

40

43

47

50

†11日＝

Ill
bIeedingbIeeding

secondarysensitization

prlmary SenSitlZatlOn

III．Guineapigs

day O

12

．仁

十
chalIenge

SenSltlZat10n

図1実験スケジュール
表1

ウサギ抗血清のPCA反応
Serum dilution

言霊篭発g）

慧霊k day

×2

×4

×8

Primary1

6

14

0

0

0

0

28

0

0

0

0

14

0

0

0

0

28

0

0

0

0

＋secondary1Primary5

6＋secondary5

表2

ウサギ抗血清の間接血球凝集反応

Primary5＋secondary5

72

6

e
O！iI

6

＋secondary1％p︒

Serum dilution

Sensitizing No．ofdose（mg／kg）
animals

Primary1

×16

×2

×4

×8

×16

14

0

0

0

0

0

28

0

0

0

0

0

14

0

0

0

0

0

28

0

0

0

0

0

8．E−64−dの抗原性に関する研究
表3

マウス抗血清のPCA反応

×40

0
0
0

0

0

0

0

7
1

0

0

4
1

12

＋secondary4

×20

e
O−i
iI

×10
0
1

Primary4％p︒

Serum dilution

Sensitizing No．ofdose（FEg／mouse） animals

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 3 7 04 4 ．4 5

表4 モルモット遅延型皮膚反応
No．of Challenging Timeanimals antigen（br）Sensitizing
doze＋acetone

10

0

0

48

10

0

0

24

5％

0．1％

24

10

0

0

0

0

0

48

10

0

0

0

0

0

0

0

48

以上より，E−64−dが抗原性物質になる可能性は極めて低いものと考えられる。
結論

E−64−dの抗原性について，ウサギによる抗体産生，マウスによる抗体産生およびモルモッ
ト遅延型皮膚反応の試験方法により検討したが，E−64−dに対する液性および細胞性免疫反
応は認められなかった。したがって，E−64−dが抗原性物質になる可能性は極めて低いものと考えられる。

0

DNCB lO DNCB

0

0

2．5％

0

0

0

10

0

10

0

10

48

0

24

0

5％

0

10

0

100％

0

10

0

24

†＋
0

士

0

一

1

0

5

0

文

4

2

6

0

2

0

献

1）岡田秀親：モルモットにおけるPCA反応，免疫操作実験法A，p．6261970．
2）松橋直・他：受身赤血球凝集反応，免疫学実験入門，p．125，1981．
3）多田富雄・他：PCA反応，Homocytotropic
antibodyを中心として，免疫操作実験法A，p．621，
1970．

4）富沢偵二：接触アレルギー，免疫学アレルギー学
実験法，p．479，1971．

739．E−64−dの感覚器に及ぼす影響

大 関 正 弘＊
研究協力者 中 根 貞 雄＊
阿

目

部

訓

的

E−64−dの安全性研究の一環として，E−64−dの視覚および聴覚に及ぼす影響を検討する。
方法

1．網膜機能に対する作用
試験動物として，8遇令のWistar系雄性ラット（静動協）体重150〜200gを使用し，1群6例とした。
E−64−dは水に難潜のため，静脈内投与に際し，50％エタノール・生理食塩液に溶解後，pH7．4，濃度1％に調製した○網膜機能の指標としては網膜電図（ERG）を用い，蓮井の方法1）により観察記録した0ラットには16時間以上の暗順応を与え，操作は暗い赤色光照明下にて行った。ERGの記録
は投与前，投与後2，5，10，15，20，30，
45，60分に行った。
2．視党系および聴党系に及ほす影響
試験動物として7遇令のWistar系雄性ラット（静動協）体重170〜190gを使用した。
E−64−d は5％アラビアゴム液にて懸濁し，1，000mg／kgおよび2，000mg／kgを30日間経口投与した。
視覚系に及ぼす影響として，投与期間終了
後，眼底観察し，ERG，早期受容電位（ERP），
脳波視覚誘導電位（VEP）を暗順応下および明

志＊

山 田
書

贋

隆＊
朗

美＊

順応下で観察した。
聴器に及ぼす影響としては，投与前および投与終了後に耳介反射を利用した聴力検査を行った。
さらに組織学的検索のため按能検査終了後，眼球および内耳を摘出し，樹脂包理を経て薄切標本を作製した。
結果および考察
1．網膜機能に対する作用
E一朗−d静脈内投与後のERG要素における変化を図1および図2に示した。E−64−d投与により，＿al，a2およびb波の軽度な延長が認められたが，溶媒である50％ェクノールでも同様な変化が認められたことにより，E一朗Jl投与
によるERGの変化は溶媒に起因するものと考えられた。なお，陽性対照として用いたメタノールではERG頂点潜時の延長と振幅の減少が顕著であった。
2．視党系に及はす影響
投与期間終了後の眼底で，E−64−d投与群に視神経乳頭，網膜脈絡膜の浮腫，出血等の異常が認められた例はなかった。また，ERGにおいて表1に示すように変化は認められず，他のERPおよびVEPでもE−64−d投与による変化は認められなかった。
さらに，眼球の組織学的検査においても，角膜，毛様体，網膜等に異常な所見は認められなかった。

＊大正製薬株式会社総合研究所
75

I E−64類縁体の開発
PEAKLATENCTof al WAVE

02

5

10

15

20

30

45

nl SeでPEAK LATENCYof blVAVE

45．0

02

5

10

15

20

30

Control

C
壬

A A

〇

E・64・de E・64・d

50％Ethano1

25mg／kg

45

三

二

50％E山anOl

5．O ml／kg

ロコ

Methanol

2000mg／kg

E］MethanoI

4000mg／kg

50mg／kg E】

2．5ml／kg

≡

60min

＝

Methanol

図1E−64−d，50％ェクノールおよびメタノールを静脈内投与したラットにおけるERG頂点潜時の変化
766000mg／kg

9．E−64−dの感覚器に及ぼ影響：ulPLITUDE or al WAVE

02

5

1（115

20

30

45

Control

C
＝

A A

〇

E−64・d・＝E・64・d

即％E止anO1

二25mg／kg
50mg／kg

2．5ml／厄ロ

二50％E止anolコ

Methanol

2000mg／kg

E］MethanoI

4000mg／kg

MethanOl

6000mg／kg

【∃

≡

60min

＝

5．O ml／kg

図2 E−64−d，50％ェタノールおよびメタノールを静脈内投与したラットにおけるERG振幅の変化
77

I E−64類縁体の開発
表1E−64−dとメタノールを30日間経口投与したラットにおけるERG各要素の変化
Peak Latency（msec）
Group

Amplitude（FLV）

N
alWaVe a2WaVe b wave alWaVe a2WaVe b wave

E−64−d 2000mg／kg
METHANOL
4000mg／kg

4199
8871
士士士土
．4172
99
08
99
6
8
4652
2212
土土土士
l157
29加盟29E−64−d lOOOmg／kg

0953
1001
土土士±
0663
31
21
21
3
1

6666

Dark Adaptation
CONTROL573士49544土612，070土129

592土59551土25

1，938土105

609土74548±73

1，851土230

656土96625±66

1，867土191

Light Adaptation
CONTROLE−64−d45．2土7．9

6E−64−dlOOOmg／kg
2000mg／kg

METHANOL
4000mg／kg

87土

840．0土3．177土14

6

44．1土2．8

92土

654．5土6．0＊＊

75土24

6

−：Incapableof precise measurment＊＊：p＜0．01

9Mean±S・D・

表2 E−64−dを30日間経口授与したラットにおける耳介反射閥値の変化
Frequency（kHz）
Group

CONTROLN

6

E−64−dlOOOmg／kg

0．5

1

2

3土4

6土9

6

2土4

2士4

E−64−d2000mg／kg61土5

2土6

4

6

8

3土4

5土2

2土2

5土3

5土2

4土2

5士11

5土10

1土6

1士8

2土6

3土6

−3土6

2士3

0土5

0土6

3土7

4士8

10

Mean土S．D．

3．聴党系に及はす影響
E−64−d投与による耳介反射閥値の変化は表2に示すごとく顕著な変化は認められず，内耳の組織学的検索においてもラセソ器，血管条およびラセソ神経節の変性は認められなかった○
以上により，E−64−dは視覚および聴覚に対して影響がないものと推察された。

12

15

20

3土2
2土2

3土2
−1土7

0±5

2土3

（unit：dB）

結論

E−64−dの視覚および聴覚に及ぼす影響をラットにおいて検討した結果，視覚，聴覚とも影響は認められなかった0
文献1）蓮井勲：シロネズミの網膜電図。一般波形及び早期電位について，日限，72，3鋸−376，196878

10．E−64−dの一般薬理作用
一呼吸・循環機能および中枢神経系に及ぼす影響ならびに諸種摘出臓器標本に及ぼす影響−

夫

＊

野

＊

訝高

武史

■

的

原直

福村

日

木

研究協力者

L∝ke液を蒲したマグヌス装置（マグヌス管
内容積57ml）に懸垂した。張力トランスデュ

E一朗巨およびその類縁体の進行性筋ジストローサー（Forcetransducer，tyPe45196A，

フィー症に対する治療薬としての有効性評価に

三栄測器）を用いて各標本の自発収縮あるいは関する研究の一環として既に56年度までにE一

電気刺激により誘発される収縮に対するE一朗−

朗（DL体，L体）およびE−弘一Cの呼吸，循

dの影響を検討した。

環撥能および中枢神経系の活動に及ぼす影響な

3．被験薬物の適用液量ならびに最終濃度

らびにE一朗−Cの諸種摘出臓器標本に及ぼす影

E一朗−d3mgを無水エタノールlmlに溶解

響について薬理学的研究を行ってきた1）〜6）。本

し，濃度3×10￣3g／mlの薬液を調製した。ま

年度はさらに，E一朗−dの呼吸，循環横能および中枢神経系の活動に及ぼす影響ならびに諸種た，これをさらに蒸留水で10倍に希釈し，濃度
3×101g／mlの液をえた。両溶液の適用液量

摘出臓器漂本に及ぼす影響について検討した。

を0．57mlとして実験を行った。したがってマ

Ⅰ．E−64−dの諸種摘出臓器標本に及ほす影響

グヌス管（内容積57ml）内最終濃度はそれぞれ3×10−5g／mlまたは3×10−6g／mlであった。

方法

1．実験動物および摘出臓器標本
実験にはハムスター（BIOFIB系，雄性，体重100〜150g）を用い，断頭，放血後に各種臓E一朗dは水に不溶であるため，今回の実験条
件下に適用しうる最高濃度はマグヌス管内最終濃度で3×10￣5g／mlであった。なお，対照としてE一朗−dを調製するに用いたと同量のエタノール溶液を適用しその影響を検討した。また比器標本を摘出した。今回検討した臓器標本は，較のために用いた

回腸，輸精管，心房ならびに横隔神経一横隔膜標本の四種である。

noradrenaline

2．実験条件ACh，histamineおよびの最終濃度はそれぞれ10−7

g／mi，10￣5g／mlおよび10−6g／mlであった。
結果

各臓器標本のうち，回腸，輸精管ならびに横隔神経一横隔膜標本は摘出後，95％酸素ガス，

1．摘出回腸標本に及はす影響

5％炭酸ガスの混合ガスで飽和した370Cの（1）E−64−dの影響

Krebs−Ringerbicarbonate液を，心房標本

3×10￣6g／mlのE一朗−d適用により著明な変は100％酸素ガスで飽和した250CのRinger・化は認められなかった（図1，A）。また3×＊東京慈恵会医科大学第2薬理学教室

10￣5g／mlの適用により相動性収縮の著明な減少が認められた（図1，B）。
79

I E−64類縁体の開発

図1摘出回腸標本の自発収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響
A：E−64−d3×10￣6g／ml適用，B：E−64−d3×10￣5g／ml適用，C：0．1％ェクノール（Aの溶媒）適用，D：1％ェクノール（Bの溶媒）適用各例。図の右下部の横線は時標30secを，縦線は校正0．25gを示す。「●」はE−64−dあるいはェクノールの適用時点を示す。

A仙了㌦JrB仙誹＿JW
●

▲

●

●

▲

●

C√▲仙√1。佃脚＿＿了
●

図2

▲

摘出回腸標本におけるAChならびにhistamineによる収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響
E−64−d3×10−Sg／ml適用前後におけるAChlO．1g／ml適用（A）ならびにhistaminelO￣与g／ml
適用（B）による収縮と1％ェクノール適用前後における AChlO￣7g／ml適用（C）ならびに
histaminel0−5g／ml適用（D）による収縮。図の右下部の横線は時標30secを，縦線は校正
0．5gを示す。「●」はAChあるいはhistamineの適用時点を示し，「▲」はE−64−d3×10−5
g／mlまたは1％ェクノールの適用時点を示す。

●●

図3 摘出回腸標本のフィールド刺激により誘発された収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響
A：E−64−d3×10−8g／mi適用（A，左の「●」），3×10￣5g／ml適用（A，右の「●」）による収縮，B：0．1％ェクノール適用（B，左の「●」），1％ェクノール適用（B，右の「●」）による収縮。図の右下部の横線は時標60secを，縦線は校正0．5gを示す。「●」の時点はE−64−dまたはエタノールの適用時点を示す。
80

10．E−64−dの一般薬理作用（2）溶媒の影響対照としてE−64−dの3×10−6g／ml溶液の溶媒である0．1％ェクノール溶液を適用した場
合には回腸標木の自発収縮に変化が認められなかった（図1，C）が，3×10−5g／ml溶液の溶（図5，A），1例では軽度の持続性収締高の増大が認められた（図4，B）。
（2）溶媒の影響
0．1％ェタノール（E−64−d3×10−6g／ml溶液の溶媒）により摘出輸精管標本の自発収縮には媒である1％ェクノール溶液の適用によってはE−64−d3×10￣5g／ml適用時と同程度め相動性収縮の著明な減少が認められた（図1，D）。

影響が認められなかった。1％ェクノール（E−（3）ACh，histamine収縮に及ぼすE−64−dの影響が認められた（図4，B，C；図5，A，B）。

AChl0−7g／mlならびにhistaminel0−5g／miの適用による収縮高（図2，A左；B左）はE−64−d3×1075g／ml適用後，対照値の60〜70％に減少した（図2，A右；B右）。この収縮高減少の程度は溶媒（1％ェクノール溶液）を前処置した場合と同程度であった（図2，C右；D
右）。

64−d3×10￣5g／ml溶液の溶媒）により10例
でE−64−dによる変化と同方向，同程度の変化（3）Noradrenalineによる収縮に及ぼすE−64−
dの影響
NoradrenalinelO，6gImlの適用による輸精管標本の収縮はE−64−d3×10￣5g／ml前処
置により有意の変化は認められなかった（実験例数，N＝11）。また1％ェクノール（E−64−d3×10￣5g／ml溶液の溶媒）の前処置においても noradrenaline収縮に有意の変化が認めら（4）フィールド刺激による収縮に及ぼす影響
刺激電圧15〜50V，持続5〜10msec，頻度
0・5Hzの矩形波により回腸標本にフィールド
刺激を加えて収縮を誘発し，これに対するE−
64−dの影響を検討した。
i）E一朗−dの影響れなかった（N＝10）。

フィールド刺激により惹起された収縮に対してE−64−d3×10￣6g／mlは影響を与えなかっ後から収縮回数の増加の傾向が認められ，収縮た（図3，A左）がE−64−d3×10−5g／mlの適用により収縮は著明に抑制された（図3，A右）。
ii）溶媒の影響（2）溶媒の影響

E一朗−d3×10￣6g／ml溶液の溶媒である0．1％ェクノールの適用時にはフィールド刺敦で惹起した回腸標本の収縮に影響が認められなかった（図3，B左）が3×10−5g／ml溶液の溶媒である1％ェクノールの適用によ．って，E−64−d3．摘出心房標本に及ほす影響（1）E−64−dの影響
E−64−d3×10￣6g／mlの適用により心房標本の自発性収縮には影響が認められなかった（図6，A）。3×10−5g／mlの適用により，適用2分
振幅は対照時のほぼ50％に減少した（図6，B）。
E一朗−d3×10￣6g／mlの溶媒である0．1％のェクノール適用により心房標本の自発収縮には影響が認められなかったが（図6，C），3×10￣5g／mlの溶媒である1％ェクノール適用により，適用2分後に収縮回数の増加と振幅の減少が認められ，その程度はE−64−d、3×10￣5g／ml
適用時と同程度であった（図6，D）。

3×10￣5g／ml適用時と同程度の収縮の抑制が認められた（図3，B右）。
2．摘出輸精管標本に及ぼす影響（1）E−64−dの影響

4．摘出杭隔神経一横隔膜標本に及ほす影響

E−64−d3×10￣6g／mlの適用により摘出輸精
管標本の自発収縮に影響は認められなかった

64−dの影響を検討した。刺激には矩形波を用（図4，A）。3×10￣5g／mlの適用により10例中5例では影響が認められなかったが，4例で相動性収縮の減弱ならびに持続性収縮高の減少

は0．2Hzであり，刺激電圧は間接刺激の場合

横隔神経一横隔膜標本の横隔神経を電気刺激する間接刺激および横隔膜筋を電気刺激する直接刺激によりそれぞれ筋収縮を惹起させ，E−
い両刺激とも刺激持続が0．2msec，刺激頻度は9〜15V，直接刺激では7〜20Vであった。
（1）E−64−dの影響
81I E−64類縁体の開発

C叫……ナ…山仙川山】
図4 摘出輸精管の自発収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響（Ⅰ）
A；E−64−d3×10￣6g／ml適用，B：E−64−d3×10￣5g／ml適用，C：1％ェクノール適用による収縮。E−64−dおよび1％ェクノールで持続性収縮の認められた1例（10適用例中）。図の右下部の横線は時標30secを，縦線は校正0．05gを示す。「●」はE−64−dまたはエタノールの適用時点を示す。

図5 摘出輸精管標本の自発収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響（Ⅰ）
A：E−64Td3×10．1g／mi適用，B：1％ェクノール適用による収縮。EL64−dならびに1％ェクノ
ールで相動性収縮ならびに持続性収縮高の減少が認められた1例（10例中4例）。図の右下部の横線は10secを，縦線は校正0．05gを示す。「●」の時点はE−64−dまたはエタノールの適用時点
を示す。

『≡竺竺翌
し∴、

図6 摘出心房標本の自発収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響
A：E−64−d3×10−6g／mlの適用，B：E−64−d3×10￣Sg／mlの適用，C：0．1％ェクノール適用，
D：1％ェクノール適用による収縮。図の右下部の横線は時標30secを，縦線は校正0．25gを示す。「●」の時点はE−64−dあるいはェクノールの適用時点を示す。
82

10．E−64−dの一般薬理作用

図7 摘出横隔神経一横隔膜標本の直接ならびに間接刺激による収縮に及ぼすE−64−dならびに溶媒の影響
A：ET64−d3×10￣6g／ml適用，B：E−64−d3×10￣5／ml適用，C：0，1％ェクノール適用，D：
1％ェクノール適用による影響。A〜D における高振幅の収縮：間接刺激（刺激電圧10V，刺激持続0．2msec，刺激頻度0．2Hz）による収縮。A〜D の振幅の小さな収縮：直接刺激（刺激電圧20V，刺敦持続0．2msec，刺激頻度0．2Hz）による収縮。図の右下部横線はlminを，縦線は校正1gを示す。「●」はE−64−dあるいはェクノールの適用時点を示す。
2

3

4

5

150
mmHg
50

B禦禦禦禦酬鮒拙淵拙僧拙僧鼎糟轍鮒珊瑚酬鼎綽tc中仙卜頼＋付←付十日ヰ叫＋恒・付小甘十

州仲川柵帖叫仰山榊柵帆E小山叫ルル仙ノ、リ小叫岬仇直へ帰、W間

FVmmmⅣ肌Ⅳ爪ⅣWW抑制VmW膵
図8 E−64−dl，000mg／kgの経口適用の影響（脳波に変化の認められた1例）
A：大腿動脈血圧，B：心電図，C：横隔神経発射活動，D：腎交感神経発射活動，E：脳波，
F：呼気ガスCO2濃度。1：E−64−d適用前，2：1，000mg／kg経口適用30分後，3：適用60分後，
4：適用90分後，5：適用120分後を示す。図の右下部の横線は時標1secを，B，C，DおよびEの右端の縦線は校正電圧200J Ⅴを示す。

間接および直接刺激により誘発された横隔膜筋の収縮に対してE一朗−d3×10￣6g／mlは影響を与えなかった（図7，A）。E−64−d3×10￣5g／mlの適用により適用直後，直接および間接
両刺激に対する両応答において，共に一過性の収縮増大が，また3〜5分後には収縮の減少が認められた（図7，B）。
（2）溶媒の影響
E−64−d3×10￣6g／mlの溶媒である0．1％ェ
クノール適用により，両刺激による筋収縮に影響が認められなかったが（図7，C），3×10￣5g／mlの溶媒である1％ェクノール適用により両刺激83I E−64常緑体の開発

Al

田口

」

3

」．」｝・［警C幽幽椚幽椚幽鮒幽幽幽幽D叫鮒鵜川幽】＝幽E血判冊棚棚減佃紳胸叫軸刷醐紬軸佃讐
図9 E−64−dl，000mg／kgの経口適用の影響
図7と同一の実験例で坊隔神経ならびに腎交感神経活動の積分記録を行った成績を示す。
A：大腿動脈血圧，B：心拍数，C：横隔神経発射活動の包路線積分，D：腎交感神経発射活動の包路線積分，E：脳波，F：呼気ガスCO2濃度，1：E−64，dl，000mg／kg経口適用前．持続および直後。1上部の短い横線部で適用持続を示した。2：適用30分後，3：適用60分後，4：適用
90分後，5；適用120分後を示す。図の右下部の横線は時漂60secを示す。

応答において，E−64−d3×10￣5g／ml適用時と同程度の変化が認められた（図7，D）。
ⅠⅠ．E−64−dの呼吸，循環機能および脳波に及ほす影響
方法

1．実験動物
体重2．2〜2．6kgの成熟，両性のウサギを用いた。
2．実験条件エーテル麻酔下に gallamine triethiodide（5mg／kg，i．V．）により非動化後，呼気ガス二酸化炭素および酸素濃度の連続監視下に人工呼吸により換気条件を適正レベルに維持した。また動物を温熱マットで保温し，直腸温を36．8〜
37．60Cに維持した。両側の迷走，減圧および頸部交感神経を頸部で切断した。

84

3．枚験薫物の適用法および適用量
E−64−dを5％アラビアゴム溶液，または0．5％CMC溶液に懸濁し，カテーテルを介して胃内に適用した。E−64−dの適用量を500〜1，000
mg／kg，適用液量は5ml／kgとした。
4．呼吸，循環機能および脳波
呼吸の中枢性調節神経機構の神経性出力の指標として横隔神経活動を，血管運動の中枢性調節神経機構の神経性出力の指標として腎交感神経活動を各神経の切断中枢端より同時に導出し，大腿動脈血圧，心電図，前頭一後頭頭皮上脳波および呼気ガス炭酸ガス濃度と共にデータレコーダー（TEAC，R−81）を用い磁気テープに収録した。薬物適用後80〜160分間にわたり
上記各パラメーターに及ぼす影響を検討した。
実験終了後，医用電算校（三栄測器，7TO8）を用いて，パワースペクトル分析を行い，両神経活動ならびに脳波の計量的評価を行った0

10．E−64−dの一般薬理作用表1E−64−d500〜1，000mg／kgの経口適用による影響
Before After E−64−d（500〜1，000mg／kg p．0．）

30min
60min SOmin
120minMean±SD Mean±SD Mean±SD Meall士SD Mean±SD

Parameters

（N＝6）

（N＝6）

（N＝6）

（N＝5）

（N＝3）

Mean blood pressure（mmHg）
Heart rate（／min）

97士16

90士19

86土18＊

87土15

81±18

297±15295土18308士14

304土6

305±1

FEco2（％）

4．2土0．4

4．2土0．4

4．3土0．4

4．2土0．5

4．1土0．7

FEo2（％）

16．7土0．9

16．7土0．7

16．6土0．8

16．6士1．0

16．8土1．3

PNA period（SeC）

1．59±0．33

1．52土0．28

1．45±0．27

1．39土0．231）1．41±0．23のPNA total power

100

97±11

87土10＊

98土371）

RNA total power

100

86士19

102土4998土43引

EEG totalpower

100

78±27

87土37

95土66

105土694．1±1．7

3．9±1．7

3．9士1，3

4．0±1．3

4．2土1．6

EEG mean frequency（Hz）90土63）

FEco2：呼気ガスCO2濃度，FEo2：呼気ガス02 濃度，PNA：横隔神経発射活動，RNA：腎交感神経発射
活動，EEG：脳波，N：例数，＊：p＜0．05，1） N＝4，2）：N＝3，3）：N＝2
結果

1．循環機能に及はす影響（1）平均大腿動脈血圧
平均大腿動脈血圧（薬物適用前，平均値土標
準偏差：97土16mmHg，実験例数N＝6）はE−
64−d500〜1，000mg／kg経口適用後30〜120分

析により，E−64−dの血管運動中枢に対する作用の一面を評価できると考えられる。E−64−d500〜1，000mg／kgの経口適用後，30〜90分間にわたり，腎交感神経活動のパワー値には有意の変化が認められなかった（図8，D；図9，D；
図13，G；表1）。図11，BはE−64−dl，000
mg／kg経口適用前後における腎交感神経活動

心拍数は60〜120分間にわたり増加の傾向を示

パワースペクトルの経時変化の1例である。
2．呼吸機能に及ほす影響（1）横隔神経発射活動
呼吸の中枢性調節神経機構の神経性出力の指標である横隔神経遠心性発射活動は図8のごと
く周期的に呼吸性活動放電群を示す。E−64−d500〜1，000mg／kgの経口適用後，周期的に発現する放電群の周期（薬物適用前：1．6土0．3
秒，N＝6）は短縮の傾向を示したが有意の変したがこの変化は有意ではなかった（図8，B；
図9，B；図13，B；表1）。なお心拍数の変化

化ではなかった（薬物適用60分後：1．5土0．3
秒，N＝6）（図8，C；図13，E；表1）。しかしは心電図R−R間隔から計測したが，その1例

ながら，横隔神経発射活動の総体を示すと考えられるパワー値は，E−64−d500〜1，000mg／kg
適用60分後において軽度ではあるが有意の減少を示した（薬物適用前の87土10％，N＝6，
p＜0．05）（図13，F；表1，1例を図11，Aに示す）。この横隔神経活動のパワー値の減少は間にわたり，軽度の下降を示した（薬物適用60
分後：86土18mmHg，N＝6，p＜0．05）（図8，
A；図9，A；図13，A；表1）。この動脈血圧の下降はE−64−dを懸濁した5％アラビアゴム
溶液の適用（5ml／kg p．0．）時にも同程度に認められた。
（2）心拍数E−64−d500〜1，000mg／kgの経口適用後，を図10に示す。
（3）腎交感神経活動
腎交感神経遠心性発射活動の増減は，血管運動中枢の中枢性出力を反映すると考えられる0
したがってこの発射活動のパワースペクトル分85I E−64類縁体の開発

1L⊥十⊥2L⊥5L⊥

3L⊥6L十。
図10 心電図R−R間隔ヒストグラムにおけるE−64−dl，000mg／kg経口適用の影響
1：薬物適用前，2：E−64−dl，000mg／kg経口適用30分後，3：適用60分後，4：適用90分後，
5：適用120分後，6：適用150分後の各R−R間隔ヒストグラムを示す。各グラフの縦軸は心拍数を
横軸は時間（横軸右端が410msec）を示す。

」」⊥＿⊥⊥≡止」＿LL−止」＿止」
図11杭隔神経および腎交感神経活動のパワースペクトルに及ぼすE−64−dl，000mg／kg経口適用の影響
A：桟隔神経発射活動，B：腎交感神経発射活動のパワースペクトル。1；薬物適用前，2：E−
64−dl，000mg／kg経口適用30分後，3：適用60分後，4：適用90分後。各グラフの縦軸はパワー値，
横軸は周波数（0〜828Hz）を示す。各グラフの右端の縦線は校正値を示す。
86

10．E−64−dの一般薬理作用

2句．8

Hz

図12 脳波のパワースペクトルに及ぼすE−64−dl，000mg／kg経口適用の影響
E−64−dl，000mg／kg を適用した3例中，脳波に変化の認められた1例（図7，および8と同一例）。1：薬物適用前，2：E−64−dl，000mg／kg経口適用30分後，3：適用60分後，4：適用90分後，
5：適用120分後。適用90分後日）での総パワー値は対照時の173％，120分（5）では163％と増大した。
縦軸はパワー値，横軸は周波数（0〜24．8Hz）を示す。1〜5の右端の短い縦線は校正倍を示す。

87

I E−64類縁体の開発
120【mmH9）
100

A
80

60
320
（／minI

B

300
280
5．0

（引
叫．0

3．0

D：甘ト一寸一一一十一．4−⊥−→
1．70

E l霊
1．30

120

は】

F lOO
80
2

﹁

i 1 9

︑一

1 ′ − t

0
〇

l

■

▲ U

G

〇
8
∃

6．0
（Hz）

H q・0
2．0

Before
N＝6

30

∝）
N＝6

90
N＝6

120minN＝S N＝3

図13 E−64−d500〜1，000mg／kg経口適用の呼吸，循環及び中枢威能の諸種パラメーターに及ぼす影響
A：大腿動脈平均血圧，B：心拍数，C：呼気ガスCO2浪度，D：呼気ガス02濃度，E：横隔神経発射活動の周期，F：横隔神経発射活動のパワー値，G：腎交感神経発射活動のパワー値，H：脳波の平均周波数を示す。＊：p＜0．05，1）：実験例数N＝4，2）：N＝3，3）：N＝2
各時点における平均値と標準誤差（縦線）を示してある。

88

10．E−64−dの一般薬理作用

5％アラビアゴム溶液（5ml／kg，p．0．）適用例

く，これらの変化がE−64−d自体の作用によるにおいては認められなかった。

ものとは考え難い。またE−64−d3×10￣5g／ml

3．呼吸，循環機能の化学調節因子に及ほす影響

は摘出心房標本の収綺回数の増加および振幅の呼気ガス炭酸ガスならびに酸素濃度には，E−減少をひきおこしたが，この変化もェクノール

64−d 500〜1，000mg／kg 経口適用後30〜120
分間にわたり有意の変化は認められなかった

L．ら（1962年）7）はラット心房を用い，エタノーの影響によるものと考えられる。Gimeno A．

（図8，F；図9，F；図13，C，D）。薬物適用

ルが心房の収縮力を減少させることを報告し，前の呼気ガスならびに酸素濃度はそれぞれ，

その原田が活動電位の減少と収縮撥構に対する

4．2土0．4％（N＝6），16．7土0．9％（N＝6）で直接作用であることを示唆している。また，梼

あり，E−64−d適用60分後においてはそれぞ

隔神経一横隔膜標本において，E−64−d3×10￣5

れ，4．3土0．4％（N＝6），16．6土0．8％（N＝g／mlと溶媒として用いた1％ェクノール溶液

6）であった（表1）。

の影響との問に差異が認められなかったことか

4．脳波に及ほす影響

ら，E−64−dは3×10￣5g／mlの濃度以下では

E−64−dlOO〜500mg／kgの経口適用例5例
においては脳波上の変化は認められなかった

影響を与えないものと考えられる。直接および間接刺激による収縮が，E−64−d3×10．5g／ml（図13，H；表1）が，E−64−dl，000mg／kg適または溶媒に用いた1％ェクノール溶液適用後

用例3例中1例において薬物適用後，60〜120

いずれの場合にも一過性に増大した。エタノー

分以上にわたり，脳波のパワー値の増加と平均ルの影響についてはGage P．W．（1965年）8）

周波数の低下（薬物適用前：6．5Hz，薬物適用の報告があり，この収縮の一過性増大は脂肪族
アルコールの神経インパルスによる神経終末か120分後：3．5Hz）が認められた（図8，E；図9，E）。しかし，この時期に他のパラメーター

らのACh放出増加作用と，シナプス後睦でのに著明な変化は認められなかった（図8，図9）。

ACh感受性増大作用によるものと説明されて図12はE−64，dl，000mg／kgの経口適用によりいる。

脳波上に変化の認められた1例のパワースペク

Ⅰ．に述べた通り，両側の迷走，交感およびトルを示す。また対照の5％アラビアゴム溶液

減圧神経を切断した人工換気下の非動化ウサギ（5ml／kg，p．0．）単独適用例においては，このにおける急性実験における実験成績から考えて急性条件下では経口適用されたE−64−dは循環ような脳波の変化は認められなかった。
考察機能ならびに呼吸，循環撥能の化学調節因子に対し，ほとんど影響を与えないものと考えられⅠ．で述べた通りE−64−d3×10￣5g／ml適用

る。E−64−d の適用後，動脈血圧は軽度に下降による摘出回腸標本の収縮抑制作用，AChお
よびhistamineによる収縮の抑制作用ならびしたが，アラビアゴム溶液適用によっても同様に動脈血圧の下降が認められた。また E−64−dにフィールド刺激による収縮の抑制作用はいず

適用により心拍数が増加したが，有意の変化でれもE−64−dの溶媒として用いたェクノールの抑制作用と考えられ，3×10￣5g／ml以下の濃度はなく，動脈血圧下降による反射性の効果と考えられる。しかしながら，E−64−d500〜1，000のE−64−d 自体の作用によると考えられる変化

mg／kg経口適用60分後において，横隔神経活は兄い出されなかった。さらに摘出輸精管標本

動の総パワー値の軽度の減少b＜0．05）が認の自発収縮ならびにnOradrenaline収縮に対められた。また1実験例においてではあるが，するE−64−d3×10￣5g／mlの作用には収縮の増E−64−dl，000mg／kg経口適用60分後から脳波

大および減少と両方向性の変化が認められたの総パワー値の増大と平均周波数の低周波帯域

が，溶媒として用いたェクノール適用による対側への移動が認められた。これらの実験結果か

照実験における変化方向および程度には差がな

らE−64−dが極めて大量に経口適用された場
89

I E−64類縁体の開発

合，軽度の中枢性の呼吸抑制および軽度の中枢神経系の抑制状態が発現する可能性もあることが示唆される。
要

約

本研究においてハムスター摘出回腸，輸精管，心房ならびに横隔神経一横隔瞑標本を用い，これらの自発収縮ならびに薬物および電気刺激により誘発される収縮に及ぼすE−64−dの影響を検討した。さらにウサギを用い非動化の急性実験条件下にE−64−dの呼吸・循環機能および脳波に及ぼす影響を検討した。

液の適用（5ml／kg，p．0．）により，下記の（8）におけるE−64−d経口適用と同様，有意の動脈血圧下降が認められたが，下記の（9），的の様な横隔神経発射活動の総パワー値の減少および脳波の総パワー値の増大は認められなかった。
（8）経口適用された E−64−d500〜1，000
mg／kgは動脈血圧の有意の下降を示した。
（9）E−64−d500〜1，000mg／kgの経口適用
により，横隔神経発射活動のパワー値が適用後60分において有意に減少した。
㈹ E−64−dl，000mg／kg経口適用3例中1
例で適用後，脳波の総パワー値が増大した。

（1）E−64−d3×10￣5g／mlの溶媒である1％
エタノールの適用により，以下の（3），囲，（5）お参考文献

よび（6）におけるE−64−d3×10−5g／ml適用と同方向，同程度の変化が各摘出臓器標本で認められた。したがって，E−64−d3×10￣5g／mlの適用による各摘出臓器標本の変化は，E−64−dそのものによる影響とは考え難い。
（2）E−64−dは3×10￣6g／ml以下の濃度で，いずれの摘出臓器標本においても著明な影響を及ぼさなかった。
（3）E−64−dは3×10￣5g／mlの濃度において，摘出回腸標本の自発収縮を抑制し，摘出心房標本の自発性収縮回数の増加および振幅の抑制を引きおこした。また摘出輸精管標本では10例中5例で影響が認められず，4例で自発収縮の減少，1例でわずかな収縮の増大が認められた。
匝）摘出回腸標本のフィールド刺激による収縮はE−64−d3×10￣5g／ml適用により抑制された。
（5）AChおよびhistamineによる摘出回
腸標本の収縮はE−64−d3×10￣5g／ml適用により抑制された。また摘出輸精管標本のnor・adrenalineによる収縮はE−64−d3×10￣5g／ml

適用により影響を受けなかった。
（6）直接および間接刺激により惹起された杭隔神経一横隔膜標本の収縮はE−64−d3×10−5g／ml適用により一過性の増大とそれに続く抑制を示した。
（7）E−64−dを懸濁した5％アラビアゴム溶901）福原武彦：E−64の一般薬理作用一特に呼吸・循環機能及び中枢神経系に及ぼす影響一，厚生省「新薬開発研究事業」傲生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（E−64）の開発研究，今堀班，昭和54年度研究報告書，p・63−79，1980・
2）福原武彦：E−64−Cの一般薬理作用一特に呼吸・循環槙能及び中枢神経系に及ぼす影響−，厚生省「新薬開発研究事業」徴生物の二次代謝産物に由来
する難病治療薬（E−64）の開発研究，今堀班，昭
和55年度研究報告書，p・14ト158，1981・
3）木口百合子，後藤和利，高野一夫，西川嘉伸，
八反丸善文，宮川政昭，亀井淳三，福原武彦：微生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の呼吸，循環扱能および脳波に及ぼす影響，慈恵医大誌，96，701−711，1981．
4）木口百合子，高野一夫，西川嘉伸，八反丸善文，
宮川政昭，木村直史，福原武彦：E−64類縁体（E−64−C）の循環琉能に及ぼす影響，慈恵医大誌，97，
1−9，1982．

5）木口百合子，福原武彦：ウサギ，ネコの横隔神経発射活動に及ぼすE−64の影響，東京慈恵会医科大学昭和55年度学内共同研究報告書，p・74−77，
1981．

6）福原武彦：E−64−Cの一般薬理作用一諸種摘出臓
器標本に及ぼす影響一，厚生省「新薬開発研究事業」徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p．121−130，1982・
7）Gimeno，A．L．et al．：Effects of ethanol on
cellular membrane potentials and contractili−

tyofisolated rat atrium，Amer・J・Physiol・，
203，194−196，1962．

10．E−64−dの一般薬理作用8）Gage，P・W・：The efEect of methyl，ethyl
andn−PrOpylalcoholonneuromusculartrans・

missionintherat，J．Pharmacol．exp．Ther．，
150，236−243，1965．

91

11．E−64−dの中枢作用緒

みやかに加水分解され，脱エチル体の E−64−Cとなる。すなわちE−64−dはE−64−CのprOr

言

E−64−dはE−64−CすなわちL−tranS−epO−
ⅩySuCCiny1−1eucylamido（37methyl）buta−

neのエチルエステルであり，大正製薬により独自に開発されれた薬物である（図1）。E−64−C
は筋タンパク分解酵素である Ca2＋−aCtivatedneutralprotease

＊
＊

実験協力者

和

野昭

正木

閑植

大

およびカテプシソB，L等の阻害作用を有することから，臨床的に進行性
筋ジストロフィー症の治療薬としてその有効性

drug であり，筋ジストロフィー治療薬として
その臨床応用が期待される。本薬物の主作用部
位は末梢骨格筋であるが，中枢へ移行し何らかの中枢作用を発現する可能性も考えられるが，中枢神経系に対する作用についての研究はこれまでのところほとんどない。そこで著者らは本
薬物の中枢作用を調べる目的で，マウスおよびラットを用い，行動薬理学的検討を行った。

が期待されている。しかしE−64−Cは，その化

実験材料

学構造式からも明らかなようにカルポキシル基を有し，脂溶性が低く経口投与時に消化管からの吸収が極めて悪い。E−64−dは，このE−64−Cのカルポキシル基をェチルエステル化したものであり，その結果脂溶性は高くなり，消化管からの吸収も良い。本薬物は消化管における吸収過程および肝臓のfirst−PaSS effect によりす実験に使用した動物はddY系雄性マウス（クロダ純系動物産），Wistar系雄性ラット（クロダ純系動物産）である。E−64−d（大正製薬）は白色の結晶性粉末であり，アルコールおよびェーテルには可溶であるが，水にはほとん
ど不溶である。そこで5％アラビアゴム水溶液

H＼
C／CO−L−Leu−NH・CH2・CH2−CH＼cH3

C2H500C／＼。／＼H
図1化学構造式＊大正製薬株式会社総合研究所＊＊九州大学薬学部薬理学教室
93

I E−64類縁体の開発に懸濁して経口的に投与した。投与容量は特記る反応性には対照群とほとんど差異はなく，歩しない限りマウスでは，0．1ml／10g，ラット

行障害および筋弛緩も全くみられなかった。対照群のアラビアゴム水溶液投与群では投与後15および30分において2例に軽度の下痢が認められた。
5g／kg投与では15分後における立毛および下痢の発現はいずれも10匹中2匹で，1および2g／kg投与時とほぼ同程度であった。投与後30分には10匹中8匹のマウスに軽度のptOSis（半閉）が認められた。運動量は減少し，背中をまるめてお互いに体を寄せ合いうずくまっていることが多かった。また動物の取り扱いも比較的容易となったが，歩行の際の運動失調およでは0．1ml／100gとした。対照群には0．1ml／10g（マウス），0．1ml／100g（ラット）の5％アラビアゴム水溶液を経口投与した。
その他本実験に使用した薬物はpentetrazol（Cardiazol，三共），thiopentalsodium（Ra−VOnal，田辺製薬）である。
動物の飼育ならびにすべての実験は室温22土
20Cに調節された部屋で行った。実験データの統計的処理にはMann−WhitneyU−teStおよびStudent s t−teSt を用いた。
実験方法ならびに実験成揖
1．一般症状の観察
体重20−25gのddY系雄性マウスおよび体重250−275gのWistar系雄性ラットを用い
E−64−dの投与によって現われる一般症状につき検討した。動物は一群10匹とし，マウスでは最高用量5g／kg，ラットでは2g／kgまで経口投与して投与後15，30，60，120，240分および24時間の各時間における動物の体位，歩行状態，
立毛，呼吸および外来刺激に対する反応など一般症状を観察した。外来刺激としては，1）背部を棒で軽くたたく，2）背部に空気を軽く吹きつける，の2種規の刺激を用いた。実験はマウス，ラットいずれもホームケージ（縦36×横30
×高さ16cm）と同じケージにマウスは1群10匹，ラットは1群5匹を入れ，各動物に同時に薬物を授与して経時的に観察した。

び筋弛緩は全く認められず，呼吸も正常であった。立毛および下痢は60分後でも持続していたが，その他の症状は軽減し，ptOSisは10匹中3匹のマウスで認められるのみであった。2時間
後にはすべての症状が完全に消失し，正常に復した。なお投与後24時間ではいずれの投与群でも正常マウスと比べて認むべき行動の変化はな
く，死亡例もなかった。
（2）ラットE−64−dO．5g／kgを経口投与15分後には軽度の立毛および下痢がそれぞれ10匹中3および4匹のラットに認められた。しかしラットは行数
上何ら著明な変化を示さず，外来刺激に対する反応にも全く変化は認められなかった。
1時間後には立毛，下痢のいずれも10匹中2匹で減少し，2時間後には完全に正常に復した。対照のアラビアゴム水溶液投与群では，投E−64−dlg／kg経口投与後15分には10匹中3匹のマウスに軽度の立毛，1匹に軽度の下痢が認められたが，その他には対照群に比べて行動上の変化はみられなかった。また背中を軽く叩いたり，空気を吹きかけるなどの外来刺激に対する反応性にも特に変化は認められなかった。立毛と下痢は30分後まで続いたが，60分後には完全に正常に復した。2g／kgに増量して与後15−60分において3例で軽度の下痢が発現したが，その他には著明な変化は認められなかった。
1g／kgに増量すると15分後には軽度の立毛および下痢がともに10匹中3匹に発現し，30分・
後には著明な立毛および下痢が10匹中4匹のラットで認められた。しかし60分後には立毛およ
び下痢のいずれも減少し，120分後には完全に正常に復した。一方行動上ラットに特に著明なも1g／kg投与時と同程度の出現率で立毛，下痢が観察されたがいずれも60分後には正常に復した。その他一般の症状および外来刺激に対す変化は認められなかったが，対照群に比べて，軽度ながら鎮静状態となり，運動量も少なかった。しかし運動失調は全く認められず，呼吸に（1）マウス

94

11．E−d−64の中枢作用

び軽度の下痢がそれぞれ10匹中8匹および3匹に認められた。これらは30分後において■もほぼ同程度であったが，その後時間の経過とともに減少し，60分後には立毛，下痢のいずれも10匹
中2匹に減少し，120分後にはほぼ正常に復した。呼吸はいずれの時間においても対照群と全く差はなかった。行動面では投与後15−60分において10匹中3匹のラットで運動量が軽度に減
少し，背中を丸くしてうずくまるなどの鎮静作用が認められ，捕獲も比較的容易となった。これらの作用は120分後には完全に消失し，ラットの行動は正常に復した。一方，外来刺激に対する反応性の変化や運動失調などは全く認められなかった。

A ambuhtioll

餌4 0200
亡〇二句︻⊃一⊆扁

も変化はなかった。また外来刺激に対する反応性にも変化は認められなかった。
2g／kgでは投与15分後には著明な立毛およ

15

30

60

120

mh

30

60

120

mh

15

ぎ10
こ
■
■）

5

0

0

15

0．．．日．0

VehiC1e p．0．（n＝8）

E−64−d O．5g，1g，および2g／kgのいずれの投与群ラットにおいても24時間後の一般症状
は正常ラットと全く変わりなく，また死亡した例もなかった。

図2 0pen→丘eld テストにおけるマウスの探索行動に及ぼすE−64−dの影響

2．一般活動性に及はす影響（open一点eld test）
体重24−28gのddY 系雄性マウスおよび体30，60および120分の各時期にテストを実施し

重230−280gのWistar系雄性ラットを用い，
OPen一点eldにおける一般活動性とくに探索行
動におよはすE−64−dの作用を検討した。
実験にはHallのOpen−fiield装置を用いた。本装置は底面の直径60cm，壁の高さ50cm，壁の上縁の直径80cmのバケツ状のもの
で，内面は灰白色に塗っており，底面は黒ペン
キで線を引きほぼ等面積の19区画に分けてある。装置の底面中央上80cmの高さに100Wの白色光を置き，装置内はくまなく一定の照度が床たれるようになっている。動物を装置内に

こ

こ

と

▲1．∝肋¶g／kg p．0．（n王8）5001mg／kg p．0．（n＝8）

た。
データの有意差検討はMann−Whitney U−
testにより両側検定を行った。

（1）マウス
E−64−dのOpen−field testにおけるマウスのambulationおよびrearingに対する作用は図2AおよびBに示した。対照群のマウス
は初回約40のambulationを示すが，テストを反復するに従ってadaptationを起こし，
ambulation

は次第に減少した。E−64−d500

mg／kgおよび1，000mg／kg投与のいずれの入れてからのambulation（区画を横切る数，
自発運動量）およびrearing（立ち上り動作）の回数を測定した。なお測定時間はマウスでは場合にもambulation

1分間，ラットでは3分間とした。薬物投与前に1回予備テストを行い，ambulationおよび
rearingの平均値にできるだけ群問の差がな

500mg／kgおよび1，000mg／kgのいずれの投は対照群と同様，テス

トを反復するに従って減少し，対照群との問に差は認められなかった。rearingはE−64−d与群でも，投与後および30分において対照群に比べてやや高い値を示したが，いずれの場合にいように群別を行った。なおマウスは1群10も有意差は認められなかった。なおOPen−field匹，ラットは1群8匹とした。薬物投与後15，

test施行中にE−64−d投与によりマウスが特95I E−64類縁体の開発
表1条件回避反応（Shuttle box法）に及ぼすE−64−dの影響

Dose（mg／kg p．0．）120（min）

96．3士1．8

89．4土2．9

895．0土1．5

91．4土2．4

85．7士3．4

178

91．9土2．5

89．3士3．4
84．3土3．5

90．7土2．0

92．1±1．8

90．0土2．2は対照群に比べて差は認められなかった。re−

巨≡芸
！

0

15

30

60

−

120

min

aringは500mg／rg投与後15分では対照群よりも軽度に低かったが，それ以外の各時期では対照群よりもやや高い値を示した。1，000mg／kg投与群ではいずれの時期においても対照群
よりも軽度ながら高い値を示した。しかしいずれの場合にも対照群との間に有意な差は認められなかった。また本テスト施行中ラットに著明な行動変化は認められなかった。
以上，OPenqfieldにおけるラットの探索行
動に対してE−64−dは著明な作用を及ぼさなかった。

B rearing

15

30

60

ト￣

品o min0‥・…O vehicle p．0．（n＝10）

こ

こ

と

A l，∝氾mg／kg p．0．（n＝10）

500mg／kg p．0．（n＝10）

図3 0pen一点eld テストにおけるラットの探索行
動に及ぼすE−64−dの影響にその他の著明な行動変化を示すようなことはなかった。
以上，Open−fieldにおけるマウスの探索行動に対してE−64−dは著明な作用を及ぼさなかった。
（2）ラットOpen−field testにおけるラットのambu・
lationならびにrearing対するE−64−d500
mg／kgおよび1，000mg／kg投与の影響は図3AおよびBに示した。対照群ラットでは初回のambulationは約60であったが，マウスの場合と同様にテストの反復により adaptation
を起こし次第に減少した。E−64−d500mg／kg
および1，000mg／kgの投与ではambulation
9660

85．0±1．9

A ambulation

0

30

9

2
9

1
1
2
土 士 ±
O
l
1

5
8

1，000

7

500

15

7

E−64−dCAR（％）

rat
8

ControI

No．of

3．8mttle box におけるラ・yトの条件回避反応に及ほす影響
体重280−350gのWistar系雄性ラットを用い，Shuttle boxにおける条件回避反応に対するE−64−dの作用を調べた。実験装置は
two−COmPartment Shuttleboxで床の高さが5cmの段違いになっているものを使用した。回避条件付けは，条件刺激として400Hz，
約70dbの純音を5秒間与え，この間にラットが他方のCOmPartmentに移動しなければ，
床のグリッドから無条件刺敦としてlmAの交流通電が与えられるようにして行った。この条
件刺激期間中にラットが移動した場合は直ちに
音刺激は中止されるようにした。試行間隔は平均40（30，40，50）秒のVariableintervalとし，毎日1session20施行の訓練を行った。
回遊反応の完成基準はラットが2session連
続して80％以上の回避反応を示した場合とし，この完成基準に達したラットを用いてE−64−dの条件回避に及ぼす影響を調べた。結果は表1に示す通りである。
E−64−d500および1，000mg／kgの経口投11．E−64−dの中枢作用

0

0

15

・・・・・O30

120min60

vehiclep．0．

＝

＝

A A

E・64・d500mg／kg p．0．

1，000mg／kg p．0．

図4 マウスの正常体温に及ぼすE−64−dの影響

与では投与後15，30，60，120分のいずれの時お対照群には5％アラビアゴム水溶液0．1ml／

期においても条件回避反応に何らの影響もみられなかった。またその他の行動上の変化も全く認められなかった。
4．体温に及ほす影響
体重25−30gのddY系雄性マウス1群10匹
および体重230−260gのWistar系雄性ラッ10g（マウス），0．1ml／100g（ラット）を経口

ト1群8匹を用いてE−64−d の体温に及ぼす影響を調べた。体温の測定にはサーミスター温度計（日本光電製）を用い，感温部をマウスあ
るいはラットの直腸内に肛門から約2．5cmの深さまで挿入し，薬物投与前，投与後15，30，
60および120分の各時期に体温を測定した。な
表2 thiopental麻酔に及ぼすE−64−dの影響（mg羞S芸．。．） hcid誤認pOt雷雲慧n

授与した。
（1）マウス

マウスの体温に及ぼすE−64−dの作用は図4で示した。E−64Td500mg／kg投与群は投与後15，30および60分に対照群よりやや低い体温を示したが，対照群との間に有意差は認められなかった。投与120分後では対照群との間に全く差は認めらななかった。1，000mg／kg投与では投与60分後に軽度の体温下降がみられたが，対照群との間に有意の差はなかった。120分後には対照群との問に全く差は認められなかった。

表3 ether麻酔に及ぼすE−64−dの影響

0
1
／
0

0
1
／
4

0
1
／
6

0
0
1
1
／
／
7 3

0
1
／
9
0
1
／
4

0
1
／
0

Dose Incidence of potentiation（mg／kg p．0．）
15min
30mi
500

0／10

1／10

1，000

0／10

1／10

97

I E−64類縁体の開発

0

1

O…一一一−C

2
VehicIep．0，

3

4
3

△

5

6

hr

壬E−64−d500mg／kgp．0．

△

1000mg／kgp．0．

図5 ラットの正常体温に及ぼすE−64−dの影響（2）ラットラットの体温に及ぼすE−64−dの作用は図5に示す通りである。E−64−d500および1，000
mg／kgの経口投与では投与後いずれの時間においても対照群との間に有意な差は認められなかった。以上E−64−dはマウスでは体温をごく軽度に下降させたが，ラットでは全く影響を及ぼさなかった。
5．thiopemtaleならびにe仙er麻酔に及はす影響（1）thiopental麻酔
体重24−31gのddY系雄性マウス1群10匹を用い，thiopental麻酔時間に及ぼすE−64−dの影響を調べた。
E−64−dを経口投与し，その15分後および30分後にthiopentalNa40mg／kgをマウスの尾静脈に注射し，正向反射を指標にして麻酔時間を測定した。対照群には5％アラビアゴム水溶液を投与したが，その15分ならびに30分後にthiopentalを投与した時の麻酔時間はそれぞれ491土483および643．5土433．2秒（Mean土
98S．D．）であった。thiopental麻酔時間が対照群の平均値の2倍以上延長した場合を麻酔増強
作用陽性と判定した。ET64−dlOOmg／kg投与
では麻酔増強作用は全く認められなかったが，200→1，000mg／kg投与により顕著な麻酔増強作用が認められた。その作用はいずれの投与量においても投与後30分にthiopentalを静注した時の方が15分後に投与した時よりも強力であった。またE−64−dのこの作用は必ずしも用量依存的ではなく，今回用いた投与量の範囲内では500mg／kgで最大であった（表2）。
（2）ether麻酔
体重25−28gのddY系雄性マウスを用い，
ether麻酔に及ぼすE−64−dの影響を調べた。
内容量11のグロッケにdiethyletherを浸した脱脂綿を入れ，その中にマウスを1匹ずつ入れて密閉し，正向反射が消失して規則正しい呼吸が始まった直後にマウスをグロッケから出し，この時点から正向反射が回復するまでの時
間（麻酔時間）を測定した。5％アラビアゴム

11．E−64」の中枢作用

D一一一一〇一一一一Q一・一一一＿＿−＿＿一〇＿一一一一一一一一一一一一一一一一一一一Q

＼

0

／

15

＝￣

30

→

120

60

0−−−−−O vehicIe p．0．（n：10）

＝

＝

min

500mg／kg p．0．（n＝10）
1，000mg／kg

p．0．（n＝10）

図6 E−64−dの鎮痛作用−Haだner法

水溶液投与15分後ならびに30分後にether麻酔を施すと，麻酔時間はそれぞれ56．5土15．9および53．2土17．1秒（Mean土S．D．）であった。
麻酔時間が対照群の平均値の2倍以上に延長した場合を麻酔増強作用陽性と判定した。E−64−
d500および1，000mg／kg投与15分後にether
麻酔を施した場合には麻酔時間は軽度ながら延長する傾向を示したが，上記の判定規準で陽性となったマウスは1例も認められなかった。30
分後では，いずれの投与量でも10例中1例において麻酔増強作用が陽性となった（表3）。
6．pentetraZOlけいれんに及ほす影響
体重22−25gのddY系雄性マウス1群10匹
表4 pentetrazolけいれんに及ぼすE−64−dの影響
Dose Incidence of prevention（mg／kgp．0．）
15min
30min
0／10

0／10

0／10

1／10

1／10

2／10

を用い，PentetraZOllOOmg／kgの皮下注射によって起こるけいれんについて，間代性けいれん（CL）の発現を指標として，これに対するE−64−dの影響を調べた。pentetraZOlけいれん発現のピークに合わせるため，被験薬物を経口授与して15および30分後にPentetraZOllOOmg／kgの皮下注射を行い，PentetraZOl
投与後30分間けいれん発現状態を観察した。
実験の結果は，表4に示す通りである。対照のアラビアゴム水溶液投与群にpentetrazOllOOmg／kgを投与すると，10例全例のマウス
でCLが発現した。E−64−d500mg／kg投与では15分後にPentetraZOlを投与した群では全例でけいれんが発現したが，30分後に投与した群では10例中1例でけいれん発現が抑制された。1，000mg／kg投与では15分後にPentet−
razol投与群で1例，30分後投与群で2例抑制され，有意ではないがけいれんが抑制される傾向が認められた。
7．鎮痛作用Haffner法およびhot plate法を用いて，
99

I E−64類縁体の開発

0

15

30

60

0−−−O vehicle p．0．（n＝10）120minこム＊p＜0．1こ

別O mg／kgp・0・（n＝10）△1，000mg／kg p．0．（n＝10）＊＊p＜0．01

図7 E−64−dの鎮痛作用−bot plate法

巴ud∈5℃鼠JOUUu鳶七u川
0

15

30

60

120minC＞‥・・・・・・O vehicle p．0．（n＝10）壬

△

図8
100

e

ト￣￣玉hr500mg／kg p．0．（n＝10）△1，000mg／kg p．0．（n＝10）

Rotarod法におけるE−64−dの作用11・E−64−dの中枢作用

uO二gニUuこOgJ苦p
：

0

15

30

O……・一〇

120min6nvehiCle p．0．（n＝10）

壬
△

．壬
′

1

24hr

500mg／kg p．0．（n＝10）△1，000mg／kg p．0．（n＝10）＊ pく0．01
図9inclined screenテストにおけるE−64，dの作用

E−64−dの鎮痛作用を調べた。
（1）Hagner法
体重20−25gのddY系雄性マウスを1群10匹として用いた。動脈クレソメを用いてマウスの尾根部を500gの圧力ではさむと，マウスはふり向いてクレンメに喫みつく。この疫病反応が5秒以内に発現しない場合を鎮痛作用陽性と判定した。薬物投与前に2回テストを行い，いずれの場合にも5秒以内に疹痛反応が発現する
マウスのみを薬物実験に供した。
E−64−d500および1，000mg／kg経口投与
後15，30，60および120分の各時期に測定を実施した。結果は図6に示す通りで，いずれの用量でも全く鎮痛作用は認められなかった。
（2）hotplate法
マウスを55土lOCに保たれた鋼板製のhot
plate上にのせたときにみられる跳躍運動あるいは後肢をなめる反応を指標として，疫病反応発現までの時間を測定した。薫物投与前に30分間隔で2回テストを行い，反応発現時間が平均

7〜13秒のマウスのみを選び以下の実験に用いた。薬物投与後に反応時間が投与前のそれぞれのマウスの平均値の2倍以上に延長した場合を鎮痛作用陽性と判定した。E−64−d投与後15，30，60および120分の各時期に測定を実施した。
その結果E−64−d500mg／kgの痙口投与では鎮痛作用は全く認められなかったが，1，000
mg／kg投与では投与後15および60分において反応発現時間が有意に延長した。しかし投与120分後にはほぼ正常に回復した（図7）。
以上，E−64−dはHaffner法では鎮痛作用は全く認められなかったが，hot plate法では有意な鎮痛作用を示した。
8．0ⅩOtremOrine tremorに及ほす影響
体重15−20gのddY系雄性マウスを用いて0ⅩOtremOrineによって起こる振戦（tremor）に及ぼすE−64−dの影響を調べた。
0ⅩOtremOrine0．25mg／kgを腹艦内に投与すると10−15分後には著明なtremerが全例のマウスに発現する。E−64−dの作用ピーク101

I E−64炉縁体の開発
表50ⅩOtremOrine振戦に及ぼすET64−d
の影響
Dose

Score

（mg／kg p．0．）oftremor0−15min15−30min

一．
7．8．
0
334

は投与後15および30分と考えられる。一万，0ⅩOtremOrineによるtremor 発現のピーク
は投与後15分である。そこでE−64−dと 0Ⅹ0−
tremorineを同時に投与した群およびE−64−d投与15分後に 0ⅩOtremOrine を投与した2群について，0ⅩOtremOrine投与直後から30分
間にわたってtremorの観察を行った。
tremor の判定は，tremOrが著明に発現し，しかも10分以上続く場合をSCOre4，tre−
morの程度が中程度でその発現も断続的である場合をSCOre2，正常時の場合0をとし，それぞれの中間をSCOre3およびSCOrelとした0 さらにSCOre3以上をtremor発現陽性と判定した場合の発現率を求めた。
結果は表5に示す通りである。E−64−dと0ⅩOtremOrineの同時投与およびE−64−d投
与15分後に0ⅩOtremOrineを投与したいずれにおいても0ⅩOtremOrineのピーク時におけるSCOre の平均値にはほとんど差異はなかった。ただE−64−dlおよび2g／kg同時投与群
および3g／kg15分前投与群ではSCOreの平均値がやや低かったが，これはSCOre3を示
すマウスが数匹いたためであり，SCOre2以下になるようなことは決してなかった。SCOre3
以上をtremor陽性としてtremor発現率を算出すると，その発現率は今回実験したすべての群において100％であった。
以上の結果，E−64−dは中枢性 Cholinergic
SyStemが関与しているといわれる 0ⅩOtre−
morine tremorに対して著明な作用を有さないものと思われる。
9．協調運動に及ほす影響（rotarod法）
体重22−24gddY系雄性マウス1群10匹お102

よび体重220−250gのWistar系雄性ラット
1群8匹を用い，rOtar∝1法によって協調運動に及ぼすE−64−dの影響を調べた。
（1）マウス

rotard法は直径2．5cmの木製の棒でその表面を麻布でおおい，水平に支えて毎分30回
転させるようにした。予備試験を行い，5分以内に決して落下しないマウスだけを選び，1群10匹のマウスを用いて被検薬物を経口投与した
後，15，30，60，120分および24時間の各時期にテストを行った。2度にわたって3分以内に
rotarodから落下した場合を薬物の作用陽性と判定した。
E−64−dの結果は図8に示した。E−64−d500
mg／kgでは観察したいずれの時期においても3分以内に落下するマウスは1例もなかった。
1，000mg／kgでは投与後15分で3例，30分で2例のマウスにおいてrotard performanceが抑制されたが，対照群との問に有意差は認められなかった。投与後60分では完全に正常に回復した。
（2）ラット

1群8匹のラットを用い，協調運動に及ぼすE−64−dの影響を調べた。実験に用いたrota−rdは直径5cmの木製の棒でこれを水平に支え，毎分5回転する様に作られている。ラットを回転方向に向けてrotard上にのせると正常ラットは1分以内に落下することはない。薬物を投与した後同様のテストを行い，ラットが1分以内に落下した場合を協調運動抑制作用陽性と判定した。被検薬物を経口投与した後15，
30，60，120分および24時間の各時期にテストを行った。その結果，E−64−d500mg／kgおよび1，000mg／kg投与群のいずれにおいても1分以内にrotarodから落下するラットは1例
もなく，E−64−d は協調運動に対しては全く影響を及ぼさなかった。
10．imclimed screen test

体重22−24gのddY系雄性マウスを用いてinclined screen法により E−64−dの筋弛緩作用を検討した。
inclinedscreenは画布で作製し，その角11．E−64−dの中枢作用

度を自由に変えられるようになっている。マウスを斜面に対して下向きにのせ，マウスが斜面を滑り落ちる最小角度を測定した。この方法で正常マウスを用い3回測定を行い，平均を求めると51土10であった。1群10匹のマウスを用

いずれにおいても何ら影響を及ぼさなかったの

い，被検薬物を経口投与後15，30，60．120分
および24時間の各時期にそれぞれ3回ずつ測定を行い，その平均値を算出した。

応に対してE−64−dは1g／kgまでの経口投与

E−64−d投与後マウスが滑り落ちる斜面の最少角度を経時的に測定した結果は，図9に示す通りである。E−64−d500mg／kg投与によ り
投与15分後ではマウスの滑り落ちる最小角度は
ごく軽度に減少したのみであったが30分後では有意な減少が認められた。しかし投与後60分には作用は消失し完全に正常に復した。1，000
mg／kg投与では投与後15および30分において有意な角度の減少が認められたが，60分には完
全に正常に回復した。
考察で，このE−64−dの鎮静作用はOpen−field tegt
で検出できない程度の極めて弱いものと考えられる。
Sbuttle boxにおけるラットの条件回避反により全く影響を及ぼさなかった。この場合，Shuttlebox内でのラットの行動や自発的移動にも全く変化は認められなかった。
正常体温に対してE−64−dはマウスではごく軽度の下降を起こしただけであったが，ラット
では1g／kg投与により有意な下降を起こし，この作用はラットにおける作用の方がマウスよりやや著明であった。
E−64−dはマウスのthiopental麻酔に対して100mg／kg以下の用量では有意な影響を及ぼさないが，200mg／kg以下では著明に増強す畠。このE−64−dの麻酔増強作用はE−64−d投与後30分で最大である。etIler麻酔に対す
るE−64，dの作用はthiopental麻酔に対する

本研究はE−64−dが中枢神経系に如何なる作用よりもはるかに弱かったが，その作用はや作用を有するかについて，行動薬理学的に検討したものである。マウスにE−64−dの1−2g／

はり投与後30分の方が15分よりも強力であった。

kg投与ではごく軽度の立毛と下痢が認められpentetrazolけいれんに対してもE−64−d

たのみで，そのほか動物の一般状態，行動上には軽度の抑制作用を示し，この場合にもその作

認むべき変化は起こらなかった。下痢は対照の用は投与後30分の方が15分より強力であった。

アラビアゴム水溶液投与群でも同様に認められまたE−64−dは大量投与では軽度ながら鎮痛作用を有すると考えられる。

たので，これはE−64−d投与による影響ではなく懸濁剤として用いたアラビアゴムの作用にE−64−dは0ⅩOtremOrine tremorに対しよるものと考えられる。5g／kg投与では立毛，て3g／kgの大量投与でも有意な影響を及ぼさ下痢の他に限瞼下垂，運動量減少および1ヶ所なかったので，中枢のCholinergicsystemに群居し静止状態を保つなど鎮静状態が認められた。

には著明な作用を着きないと思われる。
rotarod test

における協調運動に対してラットでは2g／kgまで投与したがマウスのE−64−dはマウスでは1g／kg投与後15および

場合とほぼ同様で軽度の下痢および鎮静作用が認められた。下痢はマウスの場合と同様に対照

30分において軽度の抑制作用を示したが，ラットでは全く影響を及ぼさなかった。

群で認めら，アラビアゴムの作用によると思わinclinedscreen testにおいて，E−64−dはれる。これらの一般症状観察の結果からみる

500および1，000mg／kg投与により用量依存と，E−64−d は大量では中枢神経抑制作用を有性の筋弛緩作用を示し，その作用は投与後30分するように思われる。しかしOpen一点eld における一般活動性あるいは探索行動に対してE−において最大であった。

64−dは1g／kgまでの投与でマウス，ラット

E−64−dは大量では弱いながら中枢抑制作用を以上の行動薬理学的実験を通じて，全般的に103

I E−64類縁体の開発

示し，いずれの実験においても中枢興奮作用を示唆するような結果は得られなかった。なお今回実験した範囲内ではthiopental麻酔増強作用が最も強力であった。作用の発現は比較的速く，Peaktimeは投与後30分であった。しかし作用消失も速やかで，ほとんどの実験で投与

104

後60分にはほぼ完全な回復が得られた。
以上，E−64−dは通常の使用量では特に中枢神経作用が問題となる薬物とは思われないが，大量投与した場合には軽度の中枢抑制作用をもたらすものと考えられる。

12．E−64−dのラット脊髄反射に対する作用

大

関

正

弘＊

研究協力者 福 田 英 臣＊＊

目

的ほど変わらなかった（図2）。
3，E−64−dl，000mg，i．d．

ラットの脊髄反射に対するE−64−dの作用を
検討する。
方

法

MSR，PSRの上昇，I）RRの低下の傾向が見られたが，投与容積が1．5mlという大量であったことによるアーチファクトの可能性もある（図3）。

ラット（Wistar系，8，400g）をウレク∵／（1g／kg，i．p．）およびα−クPラローゼ（おmg／kg，i．p．）で麻酔し，脊椎を2ヶ所で固定し，腰仙髄を露出した。L4以下の前板および後根をすべて切断した。L5の後板を刺激し（0．2Hz，0．05msec，5V）L5の前板に誘発された前根反射（MSR および PSR）および
L4後板へ誘発された後板反射（DRR）を双極銀線電極で導出し，オシロスコープに表示した。データ処理装置（ATAC−350）で1分毎に8回加算平均し，レコーダで記録した。直腸体温および脊髄のパラフィンプール温度は360Cとした。
E−64−dは5％アラビヤ・ゴムに懸濁して，十二指腸内カニューレを介して授与した。
結果および考察
1．5％アラビア・ゴムlml／ラット，i．d．
MSR，PSRおよびDRRの変動は非投与の場合とそれほど変わらなかった（図1）。
2．E−64−d500mg／kg，i．d．

各反射の変動は通常の対照実験の場合とそれ＊大正製薬株式会社給合研究所＊＊東京大学薬学部毒性薬理学教室
105

I E−64類縁体の開発
5％

gum arabic i．d．

︹訳︺ 凹凸⊃↑コd≡く

00t
OS

−20

−10

0

10

20

30

40

50

60

TIME（hllN〕

図1脊髄反射に対するアラビヤ・ゴムの効果
MSR：単シナプス反射，PSR：多シナプス反射，DRR：後板反射
縦軸：反射電位の相対振幅。投与直前を100％とした。横軸；投与後の時間

E．64．d500

mg／kg i．d．

︵辞︺ 凹凸⊃トコdZく

喜一
OS

ー20

−10

0

10

20

30

40

50

TIME〔hlIN）

図2 脊髄反射に対するE−64−d500mg／kg，i．d，の効果
10660

12．E−64−dのラット脊髄反射に対する作用
E・64・d lOOO mg／kg i．d．
MSR

■●▲−▼

PSR

▲di＿．．・i−︹㌔︺ 凹ロコトコd≡く00t■一示；王†・∴て●、1・／＼

ロー一口／＼＼□一一口＼＼ロー一口ー一口＼DRR＼D一一口一一口
〇m

−20

−10

0

10

20

30

40

50

60

TIME〔hlIN〕

図3 脊髄反射に対するE−64−d，1，000mg／kg，i．d．の効果

107

13．E−64−dの平滑筋臓器への作用

大

関

正

弘＊

研究協力者 高 柳 一 成＊＊

目

的E−64−dの平滑筋臓器への作用を摘出器官および生体位の臓器において検討する。
方法

1．摘出臓器を用いた実験
雄モルモット（250〜350g）から回腸，気管，雄ラット（150〜200g）から輸精管，胃底，雄ウサギ（2．0〜2．5kg）から腸管，大動脈血管を摘出し，常法に従い標本を作成し，320Cに保温し，Carbogenを通じたLockeRinger
液で溝した20mlのOrganbathにつるし，反応は等張性に記録した。また耳介濯流は，雄
ウサギ（2〜3kg）の耳をとり，50cmの水圧
セLockeRinger液を濯流し，薬物は潅流液中に注入した。なおE−64−dはェクノールに
2×10￣3g／mlになるように溶かし，Organ
bathに注入した。エタノールの効果をみるた
めにE−64−dを溶かすのに用いた同量のエタノールを与えた。なお括抗薬は5分前に処置した。いずれも8例の平均土S．E．で示してある。

（0．2ml／kg）を皮下注射して，30，60，120分
後に唾液量を測定した。また別の実験においてE−64−dを皮下注射した30分後に塩酸ピロカル
ビソ（10mg／kg s．C．）を与え30，60，120，
180，240分後に唾液を採取し測定した。対照群
は0・01％Tween80 を含んだSalineを，
E−64−d（20，200mg／kg）は，0．01％Tween
80のSalipe懸濁液として用いた。
（2）瞳孔
ddY系雄マウス（18〜30g）を1群5匹とし，E−64−d（100，500mg／kg）は0．3％CMC懸濁液として，0．1ml／10gの割で経口投与し，15，30，60，120分後に瞳孔径を測定した。
（3）腸管移送
ddY系マウス（15〜30g）を24時間絶食し，1群5匹とし，E−64−d（500mg／kg）は，0．3％
CMC懸濁液として0．1ml／10gの割で経口投与した。その30，90分後にCbarcoal懸濁液を0．1ml／bodyの割で経口投与し，30分後に小腸全体に対するCharcoalの移動を求め移動率（％）として示した。
匝）小腸運動雄モルモット（300〜370g）をタロラロース

2．生体位の実験（60mg／kg），ウレタン（600mg／kg）i．p．授（1）唾液分泌与して麻酔し，回腸にゴム球を挿入し，低圧ト

雌モルモット（180〜250g）をベントパルビ

ランスデューサーを介して内圧の変化を記録しタール・Na（30mg／kgi．p．）で麻酔し，E−64−d

た。E−64−dは総頸動脈より0．1ml／100gの割で与えた。なおVehicleとしてェクノール，＊大正製薬株式会社総合研究所＊＊東邦大学薬学部薬理学教室

プロピレングリコール，生理食塩水（1：3：1）
を用いた。
109

I E−64類縁体の開発
100

7

0

︵㌔︶ uOコU巴luOU0︵訳︶ u︒コU巴一U︒U

8

8

6

−10g【Ach】

7

6−10g【Hist】

図1モルモット回腸でのアセチルコリン（左）とヒスタミン（右）の用量作用曲線
に対するE−64−dの作用（5）胃運動堆ラット（310〜360g）を用い小腸運動についての実験と同じように行った。

1．摘出臓器を用いた実験（1）モルモット回腸
Achとヒスタミンの用量作用曲線は10￣5g／（6）子宮運動

mlで非競合的に抑制された（図1）。またBaC121）未妊娠雌ラット（Wistar系230〜270g）（3×10￣4g／ml）による収縮は3×10￣5g／mlでに安息香酸エストラジオール（2mg／kg s．C・）抑制された（図2）。しかし，溶媒であるェタ

を使用前48，24時間に注射し発情させた。この

ノールが抑制作用を示すので，E−64−dの抑制

ラットをクロラロース，ウレタン（i．p．）で麻作用は弱いと考えられる。

酔し，子宮頸部を切開しカニューレを挿入し内圧を低圧トラγスデューサーを介して記録し（2）ウサギ回腸
ウサギ回腸の自動運動は3×10￣5g／mlで抑制された（図3）が，エタノールによってもかた。
2）妊娠ラット（Wistar系，320〜600g，妊娠16日）をクロラロース，ウレタン麻酔下に胎なり抑制されるのでE−64−dの作用は弱いと考えられる。

児を取出し，そこにゴム球を挿入し，内圧を低圧トランスデューサーを介して記録した。なお（3）ラット胃
セロトニンの用量作用曲線はェクノールによvebicle としてェタノール，プロピレンダリゴって幾分抑制されるが，E−64−dによっては抑ール，生理食塩水（1：3：1）を用いた。E−64−dは0．1ml／100gの割で尾静脈より与えた。
生体位の実験は特に記載していない場合，6例の実験が繰り返されている。

制が強められていないので，3×10￣5g／mlで

結

110

果

ほとんど作用はないと考えられる（図4）。
匝）ラット輸精管
ノルエビネフリンの用量作用曲線はェクノールでかなり抑制されたが，これにE−64−dlO￣5g／mlを加えても抑制作用はあまり大きく

13．E−64−dの平滑筋臓器への作用
BaC12（3×10−4g／ml）

0︵㌔︶ u︒叫︼UE盲OU

1

3

×10−5g／ml

図2 モルモット回腸でのバリウム収縮に対するE−64−dの作用
O EtOH●

E・64・d0︵訳︶ UO叫lU巴一uOU

1

3

×10￣5g／mI

図3 ラット子宮でのオキシトシソ収縮に対するE−64−dの作用ならなかった（図5）。

イソプレナリソによる弛緩は，E−64−d3×（5）ウサギ大動脈10￣5g／mlまでの濃度で影響されなかった（図ノルエビネフリソへの反応はェクノールで増7）。

大される。E−64−dはこの効果を促進させる傾（7）ラット子宮向を示したが，有意ではなかった（図6）。
（6）モルモット気管

オキシトシソ（10￣」unit／mi）による収縮は
3×10￣5g／mlで完全に弛緩されたが，溶媒であ111

I E−64類縁体の開発

0︵㌔︶ U︒ ︺U巴一亡︒U

8

7

6

5

ーlog［5・HT］

図4 ラット胃粂片でのセロトニンの用量作用曲線に対するE−64−dの作用0︵㌔︶ uO叫︼畏dtU出

6

5

4

−10g【Nor】

図5112

ラット輸精管でのノルエビネフリンの用量作用曲線に対するE−64−dの作用13．E−64−dの平滑筋臓器への作用

0︵㌔︶ uOで巴luOU

8

7

6

5

−10g【Nor】

図6 ウサギ大動脈でのルノエビネフリンの用量作用曲線に対するE−64−dの作用

0︵訳︶ uO叫︺票dtqだ

図7 モルモット気管でのイソプレナリンの用量作用曲線に対するE−64−dの作用

るエタノールででも強い抑制がみられた（図8）。
（8）耳介漂流図9に示すように，E−64−dは1mgによってもvehicleの作用と有意の差はなかった。
なお，エビネフリン10〝gで流量は有意に減少
113

I E−64類縁体の開発

0︵訳︶ UOコ岩上uOU

1

図8

3

×10￣5g／ml

ラット子宮でのオキシトシソ収縮に対するE−64−dの作用

・・・・
l二
＋

吾

l

I
ト

l
J
l
U

ll
e

P 1

l ■ ヽ l
l

・∴・
r目

l

l

■
1 1

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IL・
‥

q

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1

ll

l
l

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I

h r l n
l

l

V g
1●
T l ■
l l I
．
．
l＿
；

：

1mjn

図9 ウサギ耳介血管淀流量に対するE−64−dの作用
表1麻酔モルモットの唾液分泌に対するE−64−dの作用
Salivary secretion（ml）

Treatment（mg／kg，S．C．）■

ControI

Dose

Time（hr）after drugSinjection
O．5

1

2

3

N．D．

N．D．

N．D．

N．D．

N．D．

2
0
0

N．D．
N．D．

N．D．
N．D．

N．D．
N．D．

N．n N．D．
N．D．

N．D．

2
0

pilocarpine
bydrocbloride

2

E−64−d0E−64−d

1．38土0．43 2．25土0．44 3．27±0．28 4．70土0．51 5．07土0．54

N．D．：nOndetectable，mean士S．E．of5animals
した。

きるほどの唾液分泌を観察できなかったが，塩

2．生体位の実験

酸ピpカルビソ 20mg／kg（S．C．）では有意に（1）唾液分泌分泌を増加した（表1）。一方，ピロカルビソ

E−64−dは，20，200mg／kg（S．C．）で測定でで誘起した唾液分泌は，20，200mg／kg（S・C・）

114

13．E−64−dの平滑筋臓器への作用
表2 麻酔モルモットのピpカルビソ誘発の唾液分泌に対するE−64−dの作用
Salivary secretion（ml）

Dose（mg／kg，S．C．）

TreatmentTime（hr）afterpilocarpine hydrochloridein3ection

一

■

2

一 2 0 0 0 3 0

r

〇

禦
八
M
加
■

O．5

1

2

3

4

1．03土0．35 2．31土0．34 2．86土0．38 3．40±0．38 3．78土0．42
1．02土0．26 1．75土0．26 2．62±0．32 3．35土0．37 4．04土0．44
0．80土0．19 1．58土0．29 2．27土0．48 3．26土0．75 3．57土0．86
N．D．
N．D．
N．D．
N．D．
N．D．

N．D．：nOndetectable，mean土S．E．of6animals

432︵t∈︶ UO叫一巴UむS ご空二品

0

0

0．5

1

2

3

4

Time（hr）after pilocarpine hydrochlorideinjection

図10 麻酔モルモットでのピpカルビソ誘発の唾液分泌に対するE−64−dの作用でほとんど影響を受けなかったが，硫酸アトロ
ピソ30mg／kg（S．C．）で有意に抑制された（表2，図10）。
（2）瞳孔
硫酸アトロピソ（3mg／kg）で散瞳をおこしたが，E−64−dは500mg／kgまでで影響を与えなかった（表3，図11）。
（3）腸管移送

塩酸モルヒネ（30mg／kg）では有意に抑制されたが，E−64−dの500mg／kgではほとんど抑制されなかった（表4）。
（4）小腸運動
E−64−dlmg／kgではほとんど運動に影響を与えないが，10mg／kgでやや抑制傾向を示した。塩酸ピロカルビソ（0．2mg／kg）で運動促進が観察された（図12）。
115

I E−64煩縁体の開発
表3 マウス瞳孔径に対するE−64−dの作用
Pupilsize（×10￣1mm）

Treatment

Dose（mg／kg，p．0．）

Time（hr）afteradministration
O l／4

4．2土0．49

ControI
E−64−d100

E−64−d500

atroplne3

1／2

4．2土0．49

12

4．4土0．40

4．2土0．49

4．4土0．40

3．6土0．68

4．6土0．51 5．2土1．24

4．2士0．73

3．8土0．49

3．4土0．24

4．2土0．37

4．4土0．51 4．8土0．37

4．4土0．51

3．4土0，51 23．2土4．66＊ 23．6土4．37＊ 24．6±5．23＊1．98土4．03＊

mean±S．E．of5animals．＊：P＜0．05

O controI●

atropine

3mg／kg︵EETOtX︶ ぷS t苫d

O E−64・d lOO mg／kg
●

0

1／4

1／2

E・64・d500mg／kg

1

Time（hr）after administration

図11マウス瞳孔径に対するE−64−dの作用

表4 マウス腸管での炭末移送に対するE−64−dの作用

Treatment（mg琵冨e。．。．）％（30min）％（90min）

ControI

46．92土5．17

48．99土3．51

E−64−d52．06土4．70

46．59±2．15

morpbine
bydrocbloride

30．28土1．87＊

25．04土3．11＊

mean土S．E．of5animals，＊：p＜0．05

11613．E−64−dの平滑筋臓器への作用

図12 麻酔モルモット回腸の自動運動に対するE−64−dの作用▲
E−64−dE−64−d0・3mg／kgi・V・

1mg／kgi．V．

atropine
O．5m9／kg j．V．

図13 麻酔ラットの胃に対するE−64−dの作用＝isoproterenOl
5Vg／kg j・V・丁図14 麻酔非妊娠ラットの子宮自動運動に対するE−64−dの作用▲
Vehiclei．V．

▲

▲

H

▲

E−64−d E−64−d5min isoproterenol
O．3mg／kgi．V．1nlg／kgi．V．
5ug／kgi・V・

図15 麻酔妊娠ラットの子宮自動運動に対するE−64−dの作用117

I・・り・・−1∴し．﹁リ﹂▲E−64−d pilocarplnelO mg／kg O．2mg／kg

用冊川川仙川㍍用ほど

紺Ⅲ甘藍

l mg／kg

湘肌理嘉

制哩謬息

▲
E−64−dI E−64類縁体の開発（5）胃運動E−64−dの1mg／kgで胃運動にほとんど影響を与えなかった。一方，硫酸アトロピソ（0．5mg／kg）で運動は完全に抑制された（図13）。
（6）子宮運動
1）未妊娠ラット
E−64−dの1mg／kgで子宮運動に影響を与えなかったが，イソプロテレノール（5mg／kg）
で運動は完全に抑制された（図14）。
2）妊娠ラット
E−64−dの1mg／kgで子宮運動に影響を与え118なかった。イソプロテレノール 5J堰／kg で強く抑制された（図15）。
結論

E−64−dは水に溶解しないので特異な溶媒を用いた。そのため，E−64−dの効果の判定は難しいが，少なくとも摘出器官においてほ10￣5g／mlまではほとんど作用を示さず，生体位においても1mg／kg（i．Y．）では作用はほとんどないと結論できる。

14．E−64−dの十二指腸内投与による呼吸，血圧，心拍数，前腸間膜動脈血流，大腿動脈血流および心電図に及ぼす影響
大

関

正

弘＊

研究協力者 佐 藤緒

言E−64−dを十二指腸内に投与し，呼吸，血圧，
心拍数，前腸間膜動脈血流量，大腿動脈血流量および心電図に及ぼす影響を観察した。
実験方法
ベントパルビタール麻酔犬（雄性，8kg）を用いた。気管カニューレを挿入し，サーミスタ
呼吸ピックアップ（日本光電，TR−612T）を用いて呼吸頻度を測定した。前腸間膜動脈および左大腿動脈に非観血型血流測定プローブを装着し，両血管床の血流量を電磁血流計（日本光電，
MF−27）で測定した。右大腿動脈血圧を圧トラ
ンスジューサー（東洋ポールウィソ，MPU−0．5）を用いて測定した。心電図（四肢第Ⅰ誘導）を
生体電気プリアンプ（日本光電，RB−5）で誘導し，R波で心拍計（日本光電，RT−5）を駆動
し，心拍数を測定した。上記の各パラメーターをイソク書きオッシログラフ（日本光電，RJG−
3008，RJG−3004）で記録した。
E−64−dを5％アラビアゴムに懸濁し，十二指腸への投与は十二指腸にあらかじめ装着したカテーテルから行った。E−64Tdの用量は1g／kg（2ml／kg）とした。

進＊＊

結果および考察E−64−dの投与直後に前腸間膜動脈血流量の援徐な増加が認められた以外には，投与180分
にわたり呼吸，血圧（収縮期圧，拡張期圧，平均圧），心拍数，大腿動脈血流量，心電図には何ら認むべき変化は生じなかった。前腸間膜動
脈血流量増加作用は投与直後に発現し，約2分
後に最大に達し，以後経時的に減少し，約5分後には消失した。この血流増加作用は溶媒である5％アラビアゴムを同容量投与した場合でもほは同様に認められた。したがって，E−64−d（5％アラビアゴム懸濁）投与時に観察された血流増加作用は，E−64−dの薬理作用に基づくとは考え難い。薬液容量（2ml／kg，16ml）が比較的大量であることを考慮すると，血流増加
作用は十二指腸への物理的刺激に対する非特異的な生理反応と考えられる。
結論

ベントパルビタール麻酔犬において，E−64−dの十二指腸内投与（1g／kg）は呼吸，血圧，心拍数，前腸間膜動脈血流量，大腿動脈血流量および心電図に対し何ら特記すべき薬理作用を示さなかった。

＊大正製薬株式会社総合研究所
綿東北大学薬学部薬理学教室
119

I E−64類縁体の開発

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120

夢

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重義15．E−64−dの一般薬理作用−その他の薬理作用−

＊

平彦義

＊
＊

昭好勝

＊

口 辺子

＊

樋磯金

＊

晴厳郎

三
陸

＊

実験方法
1．ネコ瞬膜および血圧，心拍数に対する影響
体重2．5〜3．0kgのネコ（雑種，雌雄を問わず）をpentobarbital−Na（50mg／kgi．p．）により麻酔し，血圧は左大腿動脈に逆行性に挿入
した動舵カニューレから圧トランスデューサー（NihonKohdenMPU−0．5）を介して，圧力ひずみ計（Nihon Kohden AP−620G）に導き，また心拍数は動脈波をtriggerとして瞬時
心拍計（NihonKohdenAT−600G）により測定した。次に上頸神経節節前線経を露出切断し，その末梢切断端を矩形波（20Hz，1msec，間刺激

し，これによって惹起される瞬膜の収縮をForce−Displacement transducer（Nihon
Xohden SB−1T）より圧力ひずみ計（Nihon
Kohden AP−620G）を介して測定した。E−64−dは5％アラビアゴム溶液中に10mg／mlの割合で懸濁し，1，3および10mg／kgを十二指腸内投与した。なお対照薬にはhexametho−nium bromide（C6）（山之内製薬）を使用した。
2．ウサギ摘出心旗
体重2．5〜3．0kgの日本白色種系雄性ウサギ＊大正製薬株式会社総合研究所

勝＊E−64−dの一般薬理作用を検討する。

5sec

田井崎

＊

研究目的

4−6volt supramaximum）で

土新山

＊

和雄茂准

弘道

原地山藤

相倉奥五

研究協力者

大 関 正 弘＊を使用し，無麻酔下に頸動脈を切断して放血し，直ちに胸睦を開き心臓を摘出した。常法に従ってLangendorff標本を作成し，心尖にセルフインを付け，心臓の動きをForce・
Displacement transducer（NihonKohden
SBTIT）より圧力ひずみ計（Nihon Kohden
AP−620G）を介して収縮力を測定した。心拍数は，その収縮力波形をtriggerとして瞬時心拍計（Nihon KohdenAT−600G）により測定した。また潅流量は，電磁血流計プローブ（Ni−honKohdenFR−030T）を港流回路の一部に挿入して，これを電磁血流計（NihonKoIlden
MFV−1200）に接続して測定した。E−64−dは，0．3，1，3mgを授与した。E−64−dは，2×10￣3
g／ml の濃度になるようにェタノール中に溶解した。
3．胃液分泌
体重160〜200gのWistar系雄性ラットを用い18時間絶食後，Shayによる幽門結条を行い，E−64−dlOO，300mg／kg を5％アラビア
ゴム懸濁溶液で0．2ml／100gの割で皮下投与
し，4時間後に胃液の量と酸度とを測定した。
4．胃障害作用
体重150〜170gのWistar系雄性ラットを用い16〜18時間絶食後，E−64−dlOO，300，
1，000mg／kgを5％アラビアゴム溶液に懸濁して0．5ml／100g の割で経口投与し，4時間後に潰瘍係数を測定した。
5．局部麻酔作用（1）表面麻酔121

I E−64類縁体の開発

体重200〜300gのHartley系雄性モルモッ
トを1群5匹として使用した。1側の下限瞼をポケット状にして，E−64−dは，エタノール，
ポリェチレングリコール，Tween80，生理食塩液（3：3：1：3）より成る溶媒に1％溶液になるよう溶解し，その0．2mlを滴下して1分間維持した後除去し，直後から5分間隔で30分
間角膜を始マンドリン線で6回眼球（中心，
左，右，上，下，中心）を刺激し，瞬目反射の消失回数から抑制率を求めた。対側の角膜には溶媒のみを投与して作用をみた。

（2）浸潤麻酔体重200〜300gのHartley系雄性モルモット（1群5匹）を使用した。背中の毛を刈り取
り，E−64−d O・1mlを皮内に注入し浸潤させる。5分後より5分間隔で30分後まで砲皮下針で6回ずつ注入部位（中心左，右，上下，中心）を刺赦し，皮膚の攣綿の消失を指標として抑制率を求めた。
なお，表面麻酔では対照薬として1．0および
2・0％の，浸潤麻酔では0．5および1．0％のlidocaine hydrochloride（藤沢薬品）を使用した。
6．神経茄標本
体重150〜200gのWistar系雄性ラットを
urethanl・2g／kgi．p．で麻酔し，坐骨神経の電気刺激（0・1Hz，0．1msec，SupramaXimum
VOltage）による前脛骨筋の収縮をForce・
Displacement transducer（NihonXohden
SB−1T）に導き，圧ひずみ計（NihonKohdenRP−3）を介して測定した。E−64−dは5％アラ
ビアゴム溶液に懸濁し，1，000mg／kgを0．2
ml／100gの割合で胃内投与した。
7．尿排泄作用
体重150−200gのWistar系雄性ラットを16時間絶食し，E−64−d500および1，000mg／kg
を5％アラビアゴム懸濁液として2．5ml／100gの割合で経口投与し，5時間に渡り採尿し，尿量と尿中Na，K量を測定した。
8．血液凝固に対する作用
体重150〜200gのWistar系雄性ラットを1群8匹とし，E−64−d1，000mg／kgを0．2％
122

CMC懸濁液で2．5ml／100g の割合で経口投与後，3時間日に腹部大動脈より3．8％
Na−Citrate存在下に採血し，3，000rpmで10分間の遠心分離後，Plasmaをprothrombin
時間の測定に使用した。
9．酢酸writIlimg
体重18〜22gのddY系雄性マウスを1群10匹用い，E−64−dlOO，300および1，000mg／kg
を5％アラビアゴム懸濁液で0．2ml／10gの割合で経口投与し，30分後に0．7％酢酸を0．1ml／10g の割合で腹腔内投与した。酢酸投
与10分後より10分間のWrithing数を測定した。E−64−d投与群のWrithing数の対照群に対する抑制率を求め，ED50を算出した。
実験結果
1．ネコ瞬膜および血圧，心拍数に対する影響
頸部交感神経節の節前線経の電気刺激による瞬膜の収縮はE−64−dl，3および10mg／kg
i．d．投与では全く影響を受けず，対照薬bexa−
methonium（C6）3mg／kgi．V．投与により抑制された。なおネコの血圧，心拍数に対して
E−64−dl，3および10mg／kgi．d．は，何ら影響を与えなかった（図1）。
2．ウサギ摘出心肢図2に示すように溶媒として用いたェクノール1．5ml（E−64−d3mg相当）の投与で収縮力の著明な抑制，心拍数の減少，淀流量の減少が認められ，E−64−d O．3，1および3mg／kg
投与の影響は，ユタノ⊥ルの作用と大差はなかった。
3．胃液分泌
E−64−dlOOおよび300mg／kg の皮下投与
により胃液の量と酸度に対して，ほとんど影響を与えなかった（表1）。
4．胃障害作用E−64−dlOO，300および1，000mg／kgの経口投与では胃障害作用は，全く認められなかった（表2）。
5．局所麻酔作用（1）表面麻酔E−64−d1％ の濃度では何ら作用は認められ

15．E−64−dの一般薬理作用り亡巴q∈qE
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123

I E−64類縁体の開発
E・64−d E・64・d E・64・dO．3mg lmg

3mg

Contractite For（・e（g）Heart RAte
（be山5／min）

Coronlry Flow
（ml／min）

；

；
2min

図2 摘出ウサギ心臓（ラソゲソドルフ標本）に対するE−6411の作用
表1 ラット胃液分泌に対するE−64−dの作用
Dose

No．of

（mg／kg）

rats

Volume（ml／100g）

AcidityAcid（mEqH＋／1）

Output（FLEqH＋／100g）

E−64−d lOO

2．5土0．3
2．1±0．2

78．0土4．8
76．5土6．2

195．4土24．9
158．0土16．0

E−64−d

2．1土0．3

85．3土6．7

184．0土38．3

ControI300

Mean±S．E．

表2 ラットでのE−64−dの胃障作用
Drug Dose（mg／kg）

N UIcerIndex（mmt）

ControI
E−64−dE−64−dE−64dMean±S．E．

表3 モルモットでのE−64−dの表面麻酔作用
Disappearance rate（％）of the cornealreflex
Drug

Control

number（Saline）

E−64−d O％（vehicle）
1．0％
Lidocainel．0％
2．0％＊＊＊p＜0．001

124

Mean土S．E．

ofthereflex disappeared
total number of stimulation

12．5土16．6
16．7±5．3
14．2土4．2
39．2土2．8＊＊＊59．1±10．3＊＊＊

15．E−64−dの一般薬理作用
表4 モルモットでのE−64−dの浸潤麻酔作用

Disappearance rate（％）of the contraction
number of the contraction disappeared
total nllmber of stimulation

Control13．9±6．5（Saline）

E−64−d O％（Vehicle）
1．0％
Lidocaine O．5％
1．0％

41．7土3．0＊＊＊
40．3土3．3＊＊＊
60．4土6．6＊＊＊AA△
93．1土0．8＊＊＊△△△＊＊＊p＜0．001△△A p＜0．001

Mean士S．E．

▲

E・64・dlOOOmg／kg p．0．
図3 麻酔ラットの神経筋標本に対するE−64−dの作用
表5 ラットの尿排泄に対するE−64−dの作用
Dose Urine volume Na K
（mg／kg，P．0．）（ml／100g B．W．／5hrs） （mEq／100g B．W．／5hrs）
ControI005E−64−d00011．42土0．12

10．1土2．8

1．05±0．16

9．9土2．3

31．0土7．5
31．6土4．4

1．63土0．05

14．0土0．5

47．1土14．6

Mean±S．E．

なかった。なお対照薬lidocaine hydrochlo・
rideの1および2％で強い局麻作用が認められた（表3）。
（2）浸潤麻酔E−64−d1％ の濃度で40．3％の抑制が認められたものの溶媒のみでも41．7％の抑制が認められたため，E−64−dの作用によるものとは考えられない。なお対照薬lidocaine hydrochlo・
ride O．5および1％で，表4に示すように強い抑制が認められた。
6．神経筋標本
坐骨神経の電気刺激による前脛骨筋の収縮に対してE−64−dl，000mg／kg の胃内投与は，何ら影響を与えなか？た（図3）。
7．尿排泄作用E−64−d500mg／kgの経口投与で，対照群と比べ尿量がやや減少したが，有意ではなかった。また尿中Na，K量に対してはほとんど影響を与えなかった。1，000mg／kg の経口投与
では尿量に著変は認められなかったものの尿中Na，K量共に対照群に比べ増加していたが，有意ではなかった（表5）。
8．血液凝固に対する作用
Er64−dl，000mg／kgの経口投与は，血祭
prothrombin時間に影響を与えなかった（表6）。
125I E−64類縁体の開発

Mean土S．E．

またウサギ摘出心臓Langendorff標本において，E−64−dの作用は溶媒として用いたェク
ノールと何ら変わらなかった。
さらに胃液分泌に対しては全く影響せず，胃障害作用も認められなかった。
局所麻酔作用についても，表面麻酔作用は全表7く認められず，浸潤麻酔についても溶媒の効果と差はなかった。

表6 ラットの血液凝固に対するE−64−dの作用

Drug（mg足芸；．。．）Proth雫㌢timc
Controll0．1土0．1

E−64−d l，000

10．3土0．1

マウスの酢酸writbingに対するE−64−dの作用

Drug（mg／kgp．0．）NE−64−d lOO lO％inhibition
34．5

300

10

57．6＊＊

1，000

10

65．1＊＊＊＊＊p＜0．01，＊＊＊p＜0．001

N：Number of animals

9．酢酸writhing
ET64−dlO0−1，000mg／kg の経口投与により，用量依存にWrithing数は抑制され，ED50
は258．4mg／kgであった（表7）。
結論および考察E−64−dl〜10mg／kgi．d．投与は，麻酔ネ
コの血圧，心拍数，頸部交感神経節伝達に全く影響を与えなかった。

126

麻酔チット神経筋標本においても何ら影響を与えなかった。
ラットの尿排泄については，E−64−d500および1，000mg／kgの経口投与で，それぞれ尿量の減少，尿中Na，K量の増加が認められた
ものの有意ではなかった。
血液凝固に対しても何ら影響しなかった0
マウスの酢酸writhingに対してET64−dは，300および1，000mg／kgの経口投与で用量依存に抑制したが，この抑制はE−64−dの大量投与により，マウスでthiopental麻酔を増強する事およびinclinedscreentestで筋弛緩作用が認められる事（大関，植木1983）などから示されるように，E−64−dの大量投与での非特異的な中枢抑制作用に基づくものと考えられる。

16．E−64−dの生体内動態に関する研究

＊

弘

正

関

＊
＊

恵

生子

英美

＊

田 川

書坪

＊

郎記旭

＊

書直和

＊

野田極

＊

仁

河増京

＊

大実亘子

清

島部藤

福長後

研究協力者

研究日的
先の研究から，E−64−CのプロドラッグであるE−64−dが，ラットを用いた生物薬剤学的研

H＼／CONH？HCONHCH2CH2C彗cH3

日5C200C／q手C＼H＊fH2
＊CH

でH3

究によりE−64−Cに比べ経口吸収が良好である＊CH3

こと1），また筋ジストロフィーハムスターを用

図1日C−E−64−dの構造＊標識位置

いた薬効評価試験の結果，筋線経の壊死抑制効
果が認められ2），経口剤としてE−64類縁体の中で最も高い有用性を持つことが兄い出され種堆ウサギ（体重2．5〜3．0kg）および堆ピー

た。

グル犬（体重10〜15kg）を使用した。また，

そこで，現在我々は，筋ジストロフィーの治

病態動物は，BIO14．6系の雄筋ジストロフィ

療薬としてE−64−dを選出し，薬効および毒性

ーハムスター（体重80〜90g）を使用した。

試験とともに，PhaseI試験を試みつつある。

ラットは静岡実験動物協同組合，ハムスター

本研究の目的は，前臨床試験の一環としておよびウサギは金丸動物（株），BIO14．6系ハE−64−dの生体内動態を明らかにし，その評価の一助とすることにある。

ムスターはBIO Research ConsultantsInc．，

実験材料および方法
1．標識化合物
HC−E−64−dは，L−［U」4C］−leucineから当社研究所において合成した（図1）。比放射能は，8．92／JCi／mg，放射化学的純度は，薄層ク
ロマトグラフィー（以下TLC）の結果，ほぼ100％であった。
2．実験動物（ボストン，米国）より購入し，1週間以上予備飼育したのち，一夜絶食後実験に供した。いずれの動物も薬物投与後2時間から給餌した。
3．投与法および投与剤型
標識化合物は5％アラビアゴムに懸濁し，特記する場合を除いて5mg／kgで経口投与した。
なお，イヌの場合は，標識薬物を乳鉢で粉砕した後，カプセルに項め，経口投与した。
4．血中放射能濃度の測定
HC−E−64−dを経口投与した後，ラットではg），同系雌ラット（体重120〜140g），Golden

尾静脈，ハムスターは眼底静脈，ウサギは耳介静脈，イヌでは前肢静脈より経時的に20または系雄ハムスター（体重80〜90g），日本在来白色

40〝1ずつ採血し，放射能を測定した。

動物は，Wistar系雄ラット（体重160〜200＊大正製薬株式会社総合研究所

5．尿糞中排泄率の測定
llC−E−64−dを経口投与後，動物を代謝ケー
127

I E−64類縁体の開発

ジに収め，所定時間ごとに自然排泄尿および糞した。各代謝物の量的割合は，直接TLCリニを分列採取した0採取した尿は，水で希釈後その一部にシソチレークーを加え，糞は，水を加LCプレートを工業用Ⅹ線フイルムに密着，露えて掟拝均質化した後その一部を取り放射能を出し，オートラジオグラムを作製し，プレート測定した。

上の放射能領域をかき取り，．放射能を測定する

6．胆汁排泄率および腸肝循環
ラットおよびハムスターを軽くェーテル麻酔ことにより算出した。

アアナライザー（Bertold）で測定，またはT

9．放射能の測定した後，総胆管にポリェチレンカニューレを挿各試料は，必要に応じて30％過酸化水素水で入し，麻酔覚醒後，14C−E−64−dを経口投与し，脱色した後，Insta−Gel（Packard）10mlを

ポールマンケージに収めて所定時間ごとに胆汁加えて液体シンチレーションカウンター（Pa・を採取した。

ckard3255型）で放射能を測定した。TLCのウサギおよびイヌでは，ベントパルビタール

場合は，かき取ったシリカゲルにゲル化剤Ca・麻酔下で，同様に総胆管にカニユーレを挿入

rbosil（Packard）を含むInsta−GellOml

し，固定器に保定したままHC−E−64−dを経を加え，均質化した後，放射能を測定した。

口投与し，所定時間ごとに胆汁を採取した〇

10．オートラジオグラフィー

一万，ラットに14C−E−64−dを投与後6時

雌雄ラットおよびハムスターに14C−E−64−d間までの胆汁を，胆管カニューレを施した別のを15mg／kg，筋ジストロフィーハムスターにラヅトの十二指腸内に投与して，同様に胆汁をは50mg／kg経口投与後，所定時間に動物をェ採取した。得られた胆汁は，尿の場合と同様にーテル麻酔死させ，直ちにドライアイス，n−ヘ

放射能を測定した。

キサン中で凍結した後，PMWクライオミク

7．組織内濃度の測定

ロトーム（LKB，2250型）で40′j厚の全身切雌雄ラット または正常および筋ジストロフィーハムスターに14C−E−64−dを経口投与し，片を作成した。切片は，凍結乾燥後工業用Ⅹ線

所定時間に放血致死後，各種組織を摘出した0全身オートラジオグラムを得た。

フィルム（フジ，No．150）で1ヶ月間露出し，血液は一部を採取後，残部を遠心分離して血祭

また，筋ジストロフィー′、ムスターに14C−Eを得た。その他の組織は，湿重量100mgまたは水を加えて20％ホモジネートとし，その0．5−64−d50mg／kgを経口投与後，所定時間に心筋，骨格筋（前脛骨筋）を摘出し，5′ 厚の凍mlを，あるいは小臓器はそのままを，Solue−

結切片を作成した。次いで，−200下で原子核乾板（フジ）iと40日間露出し，現像，定着後
Hematoxyline−Eosin染色を施し，ミクロオ
ートラジオグラムを得た。

ne350（Packard）lmlで可溶化後，放射能を測定した。
8．代謝物の分析
採取した尿および胆汁は，20％硫酸により
pH2．0に調整した後，酢酸エチルにより代謝物を抽出した。血菜は4倍量のメタノールを加えて振塗し，組織および糞は4倍量のメタノー
ルでホモジナイズ後，遠心分離し上清をメタノール抽出画分とした。抽出物は，減圧下濃縮乾
国後少量のメタノールに溶解し，TLCにより代謝物を分離，定量した。プレートはシリカゲ
ル60F254（メルク）を用い，クロロホルム：
メタノール：酢酸（9：1：0．5），またはクロロ
ホルム：メタノール：酢酸（9：1：2）で展開
128

結

果

1．血中濃度推移
各種動物に14C−E−64−dを経口投与した時の血中放射能濃度推移を図2および図3に示す。
雄ラットでは，用量依存的に血中濃度は上昇
し，最高濃度は5，20，100mg／kgで，それぞれE−64−dに換算して0．4，0．8，3．OFLgeq．／mlであった。また，ラットにおいて性差は認められなかった。ハムスターおよびウサギでは，ラットよりも吸収は速やかで，いずれも投16・E−64−dの生体内動態に関する研究
Rat female N＝53

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24hr

図2 ラットに［1−C］E−64−dを経口投与後の血中放射能濃度
各点は平均値土S．E．を示す。

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24hr

図3 ウサギ，イヌおよびハムスターに［HC］E−64−dを経口投与後の血中放射能濃度
各点は平均値土S．E．を示す。
129

I E−64芙再縁体の開発

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図4

2

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24hr

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8

24hr

正常およびジストロフィーハムスターに［1−C］E−64−d50mg／kgを経口投与後の血中放射能濃度
各点は正常ハムスターN＝4，ジストロフィーハムスターN＝3の平均値±S．E．を示す。

与後30分以内に最高値（それぞれ1．5，1．2′唱

ほぼ同様な排泄パターンを示した。

eq．／ml）に達し，その後3から6時間までは速やかな低下を示した。イヌでは，吸収は遅く
4時間で最高値（0．8／Jgeqノml）に達し，その後の消失も比較的緩慢であった。なお，いずれの動物種においても，24時間以降長期にわたって低レベルの放射能が検出された。

3．胆汁中への排泄および腸肝循環
胆汁中への放射能の排泄は，図5に示すように，24時間後までに雄ラットでは約50％であり，雌ラットでは約45％と雄ラットに比べてやや少なかった。一方，イヌ，ウサギ，ハムスタ
ーでは極めて少なく，それぞれ約15％，11％，一方，筋ジストロフィーハムスターに1−C−E

5％にすぎなかった。一方，HC−E−64−dを経−64−d50mg／kgを経口投与後の血中濃度は，口投与したラットの胆汁を別のラットの十二指

正常ハムスターの場合と同様に，最高濃度は7腸内に投与したところ，24時間後までに投与量〜8〃geq．／mlであり，ほぼ同様な推移を示しの約22％が胆汁中に再回収された（図6）。

た（図4）。

4．全身オートラジオグラフィ一2．尿糞中への排泄
HC−E−64−dを経口投与した後の尿糞中への排泄は，表1に示すように，いずれの動物種とも投与放射能の大部分が48時間までに排泄された。しかし，排泄経路に種差が認められ，ラッ
トおよびイヌでは，尿中への排泄は少なく，主に糞中に排泄され（60〜70％），ハムスターおよびウサギでは，糞中排泄は少なく，尿中への排泄が多かった（約67％）。また，ラットでは性差が認められ，雌ラットの方が尿中への排泄が多かった。なお，筋ジストロフィーハムスタ
ーでは，投与量が異なるが，正常ハムスターと130

雄ラットに投与後30分では，消化管内容，膀
胱内尿に最大の放射活性がみられ，次いで腎，肝に認められたが，血液，肺での活性はわずかであり，他の臓器ではほとんど検出されなかった。2時間においても，ほぼ同様な分布像であったが，骨髄，唾液腺に活性が若干認められ，
以降6，24時間と放射活性は低下するものの，
腎皮質内帯，膵臓，ハーダー腺，骨髄，唾液腺，消化管壁，皮膚で高い放射活性が認められた。また，120時間に至っても腎皮質内帯の活性は残存し，肝においても，わずかに残存が認められた（図7）。一方，雌ラットに投与後の分

16．E−64−dの生体内動態に関する研究

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I E−64頼経体の開発︵︒∽Op uO訳︶

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24
hr

図5

ラット，ウサギ，ハムスターおよびイヌに［HC］E−64−dを経口投与後の放射能の胆汁中排泄
各点は，雄ラットN＝4，ウサギN＝3ハムスターN＝4の平均値±S・E・および雌ラットN＝2の平均値，イヌの値を示す。

れた。以降6時間まで，分布像に大きな変化は認められなかったが，膵臓，唾液腺，骨髄等の活性は，正常ハムスターと同様に著明にみら0︵麗OPh︒ま．︶

液，肺に認められたが，その他の臓器は，脳，脊髄を除きほぼ筋肉レベルの活性が広く観察さ0

れ また，副腎，甲状腺，心筋においても，比較的高い活性が認められた。24時間に至ると，
肝をはじめ各臓器の放射活性は低下したが，消

0

1

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3

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6

24hr

図6 ラットにおける腸肝循環
各点はN＝4の平均値土S．E・を示す。
布像の推移は，雄ラットの場合とほぼ同様であり，また，卵巣，子宮での活性は微弱であった（図8）。
正常ハムスターに投与後の分布像は，30分で消化管内容，胆嚢，腎，膀胱内尿に強い放射活性がみられ，次いで肝，血液，肺に認められたが，以降6，24時間の特徴的な分布像は，ラットの場合とほは同様の推移を示した（図9）。
次に，50mg／kg経口投与した筋ジスハムス
ターの全身オートラジオグラムを図10に示す。
投与後30分で，最大の放射活性が消化管内容，
胆嚢，膀胱内尿，腎にみられ，次いで肝，血132

化管壁，骨髄，腎皮質内帯に活性の残存が認められた。
5．ミクロオートラジオグラフィー
14C−E−64Td50mg／kgを筋ジストロフィー
ハムスターに経口投与後3時間の骨格筋（前脛骨筋）および心筋のミクロオートラジオグラム

を写真1，2に示す。
前脛骨筋においては，中心核を有する筋線稚内に多くの現像銀粒子を認め，また心筋においても，より多くの銀粒子が筋線維内に認められた。両者とも間菓系細胞の増殖を伴う筋線維壊
死付近には，集中した銀粒子が観察された。
6．組織内濃度雌雄ラットにlJC−E−64−d5mg／kgを経口投与後，30分，2，6，24，120時間の組織内放射能濃度を表2および表3に示す。雄ラットでは，投与後30分，2，6時間とも消化管，腎，16・E−64−dの生体内動態に関する研究
StomachKjdneyLiver Stomach Intestinal contents

Liver‡ntestinal

mucosaIntestinal contents

KjdneJ′

図7

雄ラットに［HC］E−64−d15mg／kgを経口投与後の全身オートラジオグラム

133

I E−64類縁体の開発
Kidney Intestinal contents

Urinary bladder

LIver
Pancreas Kidney

Liver Intestinal mucosa Intestinal contents
Kjdney

図8134

雌ラットに［HC］E−64−d15mg／kgを経口投与後の全身オートラジオグラム

16・E−64−dの生体内動態に関する研究

L．5 hrSalivary gland Liyer
Gastrjc mucosa

Salivary gland Liver

図9

Intestinal contents
Kidney Intestinal contents

Intestinal mucosa

正常ハムスターに［14C］E−64−d15mg／kgを経口投与後の全身オートラジオグラム

肝，次いで膵，骨髄の順に血液レベルよりも高投与後の主要組織内濃度について比較した。そい放射能の分布が認められた。その他の組織は，血液レベルと同等かそれ以下の濃度を示しの結果，蓑4，表5および表6に示すように，
正常ハムスターでは，投与後6時間までは肝のた。24時間後では，腎に最も高く，6時間後とほぼ同等の分布を示し，次いで肝，消化管に比較的高かった。120時間後では，依然として腎に24時間後の約鳩の放射能が残存しており，また，他の組織においても極めて低いレベルでは濃度がラットの約塊であり，他はラットより高あるが残存が認められた。雌ラットでは，雄ラットとほぼ同様なパターンを示したが，若干高濃度に分布する傾向が認められた。
一万，14C−E−64−d50mg／kgを雄ラット，
正常および筋ジストロフィーハムスターに経口ーンは正常ハムスターとほぼ同様であるが，病濃度の分布を示した。24時間後では，いずれの組織においてもラットに比べて高く，副腎に比較的高い濃度が認められた。筋ジストロフィー
ハムスターでは，投与後6時間までの分布パタ
変組織である心筋，骨格筋は正常ハムスターよりも2〜3倍高い分布が認められた。
7．代謝物の分離，定量（1）血祭中代謝物
135

I E−64類縁体の開発

図10
136

ジストロフィーハムスターに［14C］E−64−d50mg／kgを経口投与後の全身オートラジオグラム

16・E−64−dの生体内動態に関する研究

軍資

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（×600）（×200）障害部付近

写真1ジストロフィーハムスターに［14C］E−64−d50mg／kg経口投与後3hrの前脛骨筋におけるミクロオートラジオグラム

写真2

ジストロフィーハムスターに［ljC］E−64−d50mg／kgを経口投与後3brの心筋におけるミクロオートラジオグラム
137

I E−64類縁体の閲発
表2 堆ラットに［HC］E−64−d5mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLg eq．／g or ml）

30min

2br

6br

24br

120hr

Blood

0．41土0．04

0．30土0．03

0．31士0．05

0．19土0．00

0．16土0．01

PlasmaLiver

0．50土0．04
8．38土0．80

0．40土0．04
4．96土0．34

0．32土0．03
2．18士0，10

0．19土0．00
1．34土0．06

0．13土0．02
0．38±0．04

Xidney4．87土0．70

5．02土0．09

4．85土0．05

4．04土0．09

1．26土0．07

Heart

0．22土0．05

0．15士0．01

0．12土0．02

0．22土0．03

0．09土0．01

Lung
Brain

0．40±0．13
0．08土0．03

0．22土0．02
0．11±0．03

0．25士0．06
0．09土0．02

0．25±0．07
0．11土0．02

0．11土0．01
0．05土0．01

Spleen0．18土0．04

0．24土0．02

0．30土0．03

0．26土0．05

0．12土0．01

Pancreas

0．54土0．09

0．96土0．12

0．43土0．04

0．52土0．09

0．10土0．01

Muscle0．14土0．04

0．11±0．03

0．07±0．02

0．08土0．02

0．06土0．00

Skin

0．24士0．08

0．14土0．01

0．14士0．01

0．13土0．03

0．08土0．01

Fat

0．16土0．07

0．06土0．01

0．10±0．02

0．09土0．05

0．05土0．01

Adrenal0．32土0．06

0．42土0．05

0．48土0．02

0．38土0．01

0．11土0．04

Hypopbysis
TIlyrOid0．40±0．04
0．40土0．17

0．34土0．04
0．26土0．05

0．59土0．15
0．85±0．06

0．43土0．07
0．25士0．06

0．28土0．09
0．13土0．03

Salivary gland

0．38土0．09

0．49±0．07

0．45土0．05

0．25±0．02

0．10土0．01

Bone marrow

0．69土0．06

0．46土0．06

0．42土0．13

0．59土0．11

0．11土0．03

Eyeball

0．12士0．04

0．06土0．00

0．07土0．01

0．07±0．01＊

Tbymus

0．30土0．18

0．18土0．02

0．19土0．04

0．31土0．03

0．12土0．01

Testis

0．12±0．03

0．10土0．01

0．12士0．03

0．15土0．05

0．07士0．01

Prostate
Stomach0．24土0．09
34．82±6．54

0．32土0．05
19．91士7．50

0．25±0．05
2．80土0．75

0．26±0．07
0．49土0．11

0．13土0．01
0．10土0．01

Smallintestine

22．22土5．46

11．15土0．96

2．80土0．13

1．44±0．41

0．10土0．01

数値はN＝5の平均値±S．E．を示す。
ラット，正常および筋ジストロフィーハムス
ターには14C−E−64−d50mg／kgを，ウサギ，
イヌについては5mg／kg経口投与し，血菜中代謝物を経時的に分析した結果を図11および図12に示す。メタノールによる放射能の抽出率
は，いずれの動物種も投与後初期は高く，以降経時的にその割合は低下し，血菜蛋自画分（メタノール沈澱画分）の割合は増加した。メタノール抽出画分中の主代謝物は，各動物種ともェ
ステル分解産物E−64−Cであり，未変化体は認められなかった。
（2）尿および胆汁中代謝物
14C−E−64−dを各動物種に経口投与後24時間の尿および胆汁中代謝物について検討した。
硫酸酸性（pH2．0）にした尿から酢酸エチ
ルにより代謝物を抽出したところ，いずれの動物種も尿中放射能の70〜90％（非抱合体画分）
138が抽出され，水屑（抱合体画分）は少量であった。非抱合体画分を別途合成した推定代謝物との同時クロマトにより分析した結果を図13に示す。いずれの動物桂も未変化体は認められず，
主代謝物はェステル分解産物E−64−Cであり，
またハムスターにのみ，他の動物種にはほとん
ど検出されない M−a4）に近似した未知代謝物が認められた。各代謝物の量的割合は，表7に示すように，E−64−Cはウサギで最も多く77．0％を占めており，他の動物種ではいずれも50％前後であった。ジオール体は各動物種とも5〜13％と少なかったが，ハムスターにのみ認められた未知代謝物は17．6％と比較的多く存在した。なお，筋ジストロフィーハムスターの尿中代謝物パターンは，正常ハムスターとほぼ同様であった。
一方，胆汁中代謝物は，尿の場合と異なり抱16．E−64−dの生体内動態に関する研究
表3 雌ラットに［14C］ET64Td5mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLgeq．／g ormi）

Tissue
30min

2br

6br

24もr

120br

Blood

0．39土0．01

0．33土0．03

0．26土0．01

0．23士0．02

0．15士0．02

Plasma0．40土0．06
4．87土0．37

0．31土0．02
1．13土0．04

0．21土0．01

0．07士0．01

Liver

0．70土0．06
9．88土0．41

Kidney8．69土0．49

8．94土1．42

7．81士0．41

1．51土0．05
6．44土0．14

0．52土0．01
3．35土0．44Heart

0．15±0．01

0．16土0．02

0．17土0．03

0．17±0．00

0．21土0．02

Lung

0．31±0．03

0．26土0．04

0．27土0．03

0．27土0．01

0．24士0．02

Brain

0．06±0．01

0．09土0．01

0．11土0．01

0．12土0．00

0．10土0．01

Spleen0．27土0．04
1．08土0．19

0．34土0．04
0．63±0．13

0．36±0．01

0．23土0．02

Pancreas

0．19土0．02
0．69土0．12

Muscle0．07土0．01

0．07士0．02

0．07土0．01

0．41土0．02
0．11士0．01

0．31±0．03
0．10土0．02

Skin

0．18土0．01

0．13土0．01

0．10土0．01

0．14土0．01

0．18土0．02

Fat

0．04±0．01

0．06土0．02

0．07±0．02

0．07±0．01

0．16土0．02

Adrenal0．25土0．05

0．37士0．04

0．30土0．05

0．52土0．04

0．25土0．02

HypopIlySis
Thyroid

0．29土0．03
0．16土0．02

0．62土0．04
0．67土0．07

0．69土0．07
0．58±0．15

0．59土0．04
0．56±0．03

0．36土0．06
0．30土0．05

Salivary gland

0，23土0．03

0．42土0．05

0．51土0．05

Bone marrow

0．22±0．03

0．55土0．07

0．74土0．15

0．31土0．02
0．74土0．03

0．20±0．02
0．50土0．06

Eyeball

0．10土0．01

0．08±0．01

0．06土0．00

0．06士0．00

0．09土0．02

Thymus

0．15土0．02
0．22±0．04

0．21士0．02
0．25±0．02

0．31土0．04
0．38土0．02

0．37±0．02
0．34±0．07

0．20土0．01
0．22土0．03

UterusOvarium

0．22土0．03

0．31土0．06

0．36土0．03

0．34土0．02

0．21士0．02

Stomach27．15±3．90

9．29土3．33

2．85土0．90

0．86土0．24

0．23土0．04

Smallintestine

18．47土1．96

12．00±3．58

3．81±0．82

0．59±0．07

0．42土0．14

数値はN＝5の平均値±S．E．を示す。
表4 正常ハムスターに［HC］E−64−d50mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLgeq．／g or ml）

30min lbr

3br

6br

Blood

7．94士0．50

4．48土0．56

2．66土0．14

2．05土0．13

Plasma18．40土1．57

9．40土1．11

5．33士0．36

4．20土0．28

Liver21，62土3．79

11．64±1．39

10．37土0．44

9．65土0．50

Kidney168．07±28．14

73．24土8．32

53．52±4．49

50．50土3．89

Heart

4．07±0．35

2．42士0．19

Lllng

2．26土0．44
7．70：土0．60

1．58±0．49
4．41±0．37

2．47士0．15
0．72±0．08

2．75土0．11

MuscleBrain

1．18土0．16

Spleen4，84土0．52

Pancreas
Adrenal3．56±0．23

0．75士0．13
4．40土0．32

1．53土0．55

1．50土0．05

1．76土0．28

3．10±0．20

3．83土0．23

4．30±0．29

11．63土1．33

13．58土0．63

22．61±2．45

7．92土1．52

5．16士0．25

7．58土0．34

16．78土1．07
8．45土0．87

数値はN＝4の平均値土S．E．を示す。

139

I E−64類縁体の開発
表5 ジストロフィーハムスターに［HC］E−64−d50mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FEg eq．／g or ml）

30min lhr

3br

6br

7．56土0．13
15．49土0．56

4．90土0．45

2．60土0．24

1．37土0．13

Plasma9．85土0．79

4．91土0．22

2．52土0．19

Liver

24．56士3．65

17．56土0．75

8．76土1．03

6．14±0．49

Kidney68．48土4．07

45．29土2．61

25．47土3．35

18．50土0．95

Heart

3．53土0．84

4．34土0．16

6．14土0．51

2．59土0．09

Muscle1．99土0．47

3．32±0．37

3．42土0．98

0．65土0．10

Lung

4．68土1．27
0．87土0．11

3．10土0．06
1．36土0．03

2．38土0．07

Brain

3．35土0．41
0．89土0．07

Spleen2．54士0．93

2．20土0．16

1．08土0．05
1．80土0．07

Pancreas

1．67土0．38
11．19土4．15

13．38±2．2210．92土3．38

7．76土0．21

Adrenal3．55土0．78

4．44土0．21

0．99土0．15

1．17±0．17

Blood

数値はN＝3の平均値土S．E．を示す
表6 雄ラットに［HC］E−64−d50mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（〃g eqノg or ml）

lhr

311r

6br

Blood

2．05

2．17

2．14

Plasma

3．56

3．10

2．79

Liver

45．88

33．43

18．83

Xidney
Heart

37．29

31．70

41．23

0．89

0．93

1．19

Muscle

0．41

0．59

0．46

Luェg

1．52

1．74

2．05

Spleen

1．56

1．58

2．27

Pancreas

11．16

4．82

3．31

Adrenal

1．68

2．10

3．21

数値はN＝2の平均値を示す。

20

15
E

冨10
u
コ．
5

0

0

1

3

6hr

0

1

3

6hr

図11正常およびジストロフィーハムスターに［1−C］E−64−d50mg／kgを経口投与後の血渠中代謝物の濃度
140

16．E−64−dの生体内動態に関する研究

4

一己＼b三言〇一一一・〇

Total radioactivity＝

壬

MeOH extractsム△ E−64−C

0

6

0

1

9hr

3

012

6hr

3

4

5

6

9hr

図12 ラット，ウサギおよびイヌに［HC］E−64−dを経口投与後の血琵中代謝物の濃度
表7［HC］E−64−dを経口投与後の尿中代謝物
ジストロフィーハムスターは50mg／kg，他はすべて75mg／kg％of totalurinaryradioactivity
Metabolites

di−OH

12．1

7．6

M−a

1．6

Unknown
OttlerS

Conjugates

6．0

11・．3

23．7

19．01

合体が50〜80％を占めた。非抱合体の代謝物バターンは，図14に示すように，各動物種とも尿中の場合と類似し，E−64−Cが大部分を占めていたが，ハムスターでは，尿と同様に未知代謝物が比較的多かった。ジオール体は，いずれの

18．3

11．1

90．4
77．0
13．4

9．6

13・6ニ0・1
2．
3・5
7

62．0

98．4ニ16．10．
8・5
8

89．99

56．6

1・4
8

76．3

E−64−C

78・6ニ17・9．

Unconjugated metabolites

Rat
Hamster
Male Female Normal Dystrophy

26．9

動物種においても微量検出したにすぎなかった（表8）。
（3）糞中代謝物
HC−E−64−dを経口投与した各動物種の24時間後までの糞をメタノールでホモジナイズし，
141I E−64類縁体の開発
Rat

Hamster

4

3

0

0

2

0

1

4

3

2

1

0

＿丑

ノ丑北nknown

Rabblt

馳g

J」

＿へ虻

0．O Rf value l．0

0．O Rf value l．0

†

†

†

◆

†

†

S01ventsystem、；CHC13−MeOH−AcOH（9；1；2）

1：【−64−d2；M−a3：ト64−C

4：dトOH

図13［1−C］E−64−d5mg／kgを経口投与後24時間の尿抽出物のラジオ薄層クロマトグラム

Rat

Hamster

4

3

0

0

2

1

00

4

3

0

0

2

1

00

」」
Rabblt

hg

JL 」」

l

l

0．O Rf value l．0ll0．O Rf value l．0

Solventsystem￣：CHC13−MeOH−AcOH（9‥1‥2）

1：ト64−d2：M−83；【−64−亡

4：dトOH

図14［llC］E−64−d5mg／kgを経口投与後24時間胆汁抽出物のラジオ蒋層クロマトグラム

142

16・E−64−dの生体内動態に関する研究
表8［HC］E−64−d5mg／kgを経口投与後の胆汁中代謝物％of totalbiliary radioactivity
metabolites

Rat

Unconjugated metabolites

Hamster49．2

26．9

E−64−C
di−OH

Rabbit
41．2

25．1

26．5

36．8

l．8

3．0

4．4

UnknownDog

17．7

Conjugates

73．1

50．8

58．8

79．1

Hamster

Rat
4

3

0

0

2

1

4

3

00

0

0

2

1

00

⊥丑 ＿＿一児nknown

二八㌦OWn」山

l◆

0．O Rf value l．0†

十0．O Rf value l．0

SoIventsystem CHC13−MeOH−AcOH（9：1：2）
l；【−64−d2：M−a3；E＿64＿C

4：dトOH

図15［HC］E−64−d5mg／kgを経口投与後24時間の糞抽出物のラジオ蒋層クロマトグラム

代謝物を抽出した。メタノール抽出物のラジオ

的多く，他の動物種とは異なったパターンを示

蒋層クロマトグラムを図15に，各代謝物の量的した。

割合を表9に示す。ラットでは，M−aが53．9（4）心筋および骨格筋中代謝物％と最も多く，E−64−Cは3．0％にすぎなかっ筋ジストロフィーハムスターに14C−E−64−dた。正常ハムスター，筋ジストロフィーハムス

を50mg／kg経口投与し，経時的に心筋および骨格筋中代謝物について検討した。組織をメタノールにより抽出した結果，図16に示すよう

ターとも未知代謝物が，それぞれ80．7％，77．8％と大部分を占め，E−64−Cは検出されなかった。ウサギでは，E−64−Cが34．4％と多く，未知代謝物も27．8％存在していた。また，ラット，ハムスター，ウサギとも未変化体は全く検出されなかった。一方，イヌでは，E−64−Cが52．5％存在しており，未変化体も30．1％と比較に，心筋では抽出された放射能の割合は低く，大部分が蛋白画分（メタノール沈澱画分）に存在し，その割合は経時的に増加した。メタノー
ル抽出画分のうち，活性代謝物であるE−64−C
は1／瑠／g以下の濃度であり，経時的に減少し143

I E−64類縁体の閲発表9［HC］E−64−dを経口投与後の糞中代謝物
ジストロフィーハムスターは50mg／kg，他はすべて5mg／kg％of totalfecalradioactivity
E−64−d E−64−C M−a Unknown

1

7
1

4

7
3

8

9
1

3

2
2

2

Dystrophy hamster

3
4

Normal hamster

53．9

●270
．．
877．

Rabbit

32
0
・
5・
44・＝

Dog

53

82485165
07

Rat

S
r
e
．n
t
O

MeOH exts．

窒SSコu＼．bむ等

芸S叫lu＼・bU等
0

1

0

3

1

3

図16 正常およびジストロフィーハムスターに［1−C］E−64−d50mg／kgを経口投与後の心筋および骨格筋中代謝物の濃度
各点はN＝2〜3の平均値を示す。

た。一方，骨格筋では，組織中放射能濃度は心筋に比べて低いものの，その大部分はメタノー
ルにより抽出され，蛋自画分の放射能は少なかった。また，メタノール抽出画分の大部分はE−64−Cであった。
′

考察

HC−E−64−dを各動物種に経口投与した際の血中放射能濃度には種差が認められ，ハムスター〉ウサギ〉イヌ 〉ラットの順に高かった。また血中濃度推移は，ハムスター，ウサギでは速やかに最高血中濃度に達するのに対し，ラット イヌでは遅かった。特にハムスターでは，投与後5分ですでに最高血中濃度に達することから，胃からもかなり吸収されるものと考えら144れる。
組織への分布を全身オートラジオグラフィー
および定量実験により調べた結果，ラットでは腎，肝および消化管に高い放射活性が認めら
れ，特に腎では，120時間後においてもなお最高濃度の坑が残留した。また，血中濃度に性差はみられなかったが，組織内濃度は雌ラットの方が高い煩向を示した。
一方，ハムスターの場合は，ARGから投与
後30分ですでに膀胱内に高濃度の活性が検出され，尿中への速やかな排泄が示された。他の多くの組織については，血中濃度と同様にラットに比べより高濃度であったが，肝の濃度はラットの方が明らかに高く，このことは亜急性毒性試験でみられたラットの肝毒性との関連を示唆16．E−64−dの生体内動態に関する研究していると思われる。
また，ハムスターの場合も，ラットと同様に，腎では高濃度に，他の組織においても極めて低レベルながら放射能の残留が認められた。

今後，薬効発現撥序を明らかにするとともに，毒性発現機序等より詳細な生体内動態を実施するためには，ロイシン部分を標識したE−

心筋および骨格筋についてメタノール抽出を行

64−dでは不充分であり，エポキシコハク酸部分の標識体を用いて実施せねばならないであろった結果，非抽出画分（蛋白結合画分）の割合

う。

が経時的に増加したことから，組織内残留性は

結論

先のE−64−Cの場合3）・4）と同様に，蛋白と？不可逆的な結合によるものと推察される。

14C−E−64−dを用いて，ラット，正常ハムス

尿糞中および胆汁中への排泄は，著しい種差

ター，筋ジストロフィーハムスター，ウサギおが認められた。すなわち，ラットでは性差が認よびイヌにおける生体内動態について検討しめられたものの，イヌと同様に尿中への排泄がた。

少なく，糞中への排泄が多か．った。しかし，ハ1．経口投与後の血中濃度は，ハムスター≧

ムスター，ウサギでは，尿中への排泄がラット

ウサギ〉イヌ 〉ラットの順に高く，／、ムスターに比べて高かった。これらの結果は胆汁中へのおよびウサギでは速やかな吸収が認められた。

排泄の差（ラット》イ ヌ 〉ウサギ〉ハムスタ

2．組織への分布は，ラット，ハムスターとー）と一致しており，ラットでは，胆汁を介しともに腎，肝に最も高濃度分布し，ラットの場て，主に糞中へ排泄されるものと考えられる。

合，特に腎に高濃度，長時間残留した。

一方，イヌでは，胆汁中への排泄が比較的少な

3．排泄ルートに種差が認められ，ラットでいにもかかわらず，糞中への排泄がラットと同は，胆汁を介して主に糞中に排泄され，ハムス

様に多く，また糞中代謝物中には未変化体が多く認められたことから，吸収の悪いことが考え

ター，ウサギでは，主に尿中に排泄された。イられる。これはイヌへの投与剤型が原薬物末の4．いずれの動物種も，血祭，尿および胆汁カプセル剤であることも一因であると考えられ

中主代謝物はE−64−Cであった。ラット，ウる。血祭，尿および胆汁中代謝物は，いずれのサギ，ハムスターでは，腸内細菌によると考え動物種も未変化体は認められず，主代謝物はられる未知代謝物が認められた。

ヌでは，未吸収薬物が一部糞中に認められた。

E−64−Cであった。したがって，E−64−dは消化5．筋ジストロフィーハムスターにおける生管や肝で速やかに加水分解され，E−64−Cに代体内動態は，正常ハムスターとほは同様であっ

謝されるものと考えられる。筋ジストロフィー

たが，心筋および骨格筋により高濃度分布しハムスターにおけるE−64−dの生体内動態は，た。

おおむね正常ハムスターと一致していたが，組6．筋ジストロフィーハムスターの心筋およ

織分布において，病変部位である心筋，骨格筋

び骨格筋（前脛骨筋）のミクロオートラジオグにのみ，より高濃度の分布が認められる。まラフィーの結果，筋線維壊死部に高濃度の現像

た，心筋，骨格筋のミクロオートラジオグラム

銀粒子が認められた。

から，いずれも問葉系細胞の増殖を主徴とした
壊死部に放射能が比較的多く分布し，心筋により多くの現像銀粒子が観察された。さらに，心筋中の放射能の大部分は蛋自画分に存在するという結果は，昨年度報告した心筋線経の壊死抑制効果2）およびE−64がCANP にCovalentに結合して不可逆的阻害をおこすという事実との相関を示唆するものと・して興味深い。

文献1）沢田二郎：E−64−Cエステル誘導体の生物薬剤学的研究，厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p．29，1982．
2）大関正弘：E−64およびその類縁体の肪ジストロ
フィーハムスターに対する薬効に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物
145

I E−64類縁体の開発に由来する難病治療藁（E−64）の開発研究，今堀班，昭和56年度研究報告書，p．135，1982・
3）大関正弘：E−64−Cの生体内動態に関する研究，
厚生省「新薬開発研究事業」数生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今堀班，昭和55年度研究報告書，p．163，1981．
4）大関正弘：E−64−Cの生体内動態に関する研究（その2），厚生省「新薬開発研究事業」傲生物の146

二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今相法，昭和56年度研究報告書，p・47，
1982．

5）今堀和友：Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）に対するE−64の効果，厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療
藁（E−64）の開発研究，今堀班，昭和封年度研究報告書，p．131，1980．

17．E−64の第1相臨床試験
一第一段階−

＊

郎洋

＊

健雅

井谷

今亀

ごが

弘

正

関

が敬英⁝

原 田

原豊本

官がど大

兵真

條島

下官

研究協力者

研究日的

〜43歳，平均36．5歳，体重は53〜76kg，平均
59．3kgであった。なお，ボランティアの年齢，

偉常成人男子にE−64−dlOOmgを1回経口授与し，ヒトにおける安全性および生体内動態を検討する。

体重，身長については，表1に示した。
2．被験者の管理被験者はできるだけ同一環境，同一条件下に

試験方法
1．被験者
被験者は，E−64−dにつき，その安全性・薬理学的諸性質ならびに本ボランティア試験計画について詳細な説明を受け，十分納得した上で，自発的に本試験への参加を志願した成人男子で，試験に影響を与える可能性のある病歴を持たず，さらに医師による診察および各種臨床検査の結果から，本試験に参加することに問題ないと判断されたもの6名を選んだ。年齢は30
表1被験者の背景

おき，また不測の事態に際して，直ちに救急処置がとれるように，試験前日より東京慈恵会医科大学第二内科に入院させ，1名ずつ順次試験を実施した。
3．被験藁
被験薬はE−64−d50mgを含有するゼラチ
ンカプセル剤（Lot．R13201）を使用した。
4．試験スケジュールおよび投与方法
試験スケジュールを図1に示した。投与方法
は，午前8時空腹時にE−64−dlOOmg（50mg含有カプセル2カプセル）を適量の水にて服用
し，朝食は抜き，以後昼食，夕食，翌日の朝食は通常どおりとした。
表2

主な検査項目

薬物生体内動態：血清中濃度，尿中排泄量
血液一般検査：白血球数，赤血球数，へモグロピ
ソ，ヘマトクリット，血小板数，

網赤血球数，白血球像
血液生化学検査：GOT，GPT，LI）H，Al−P，LAP，
γ−GTP，CPK，BUN，クレアチニ
ソ，尿酸，総コレステロール，トリ

平均士S・E・l36・5土5・2匝3士9・9い73土4・9

グリセライド，血清総タ∵／バク，
タンバク分画，Cl，Na，K，Ca，P＊東京慈恵会医科大学 第二内科＊＊大正製薬株式会社総合研究所

その他：尿検査，体温，撞力，血圧，心拍数，
心電図，自覚症状
147

I E−64類縁体の開発

日

程

1

試 験 開 始 後 一円 ．
里
時
間（
hr）
投
藁
◎
食
諸

子

7

9

査＊ 廿

踊 検査（
管 ）
採
採

‖＋

日

令

△

△

血 l ll l

l

2 日目

号

112

†

事
検

日

24
1

†

†

†

†

†

†

令
△

l

1

1

尿（
hr）苛 l 0 −2 1 2 〜4 l 4 −6 l 6 〜8 1
尿

1
8

〜 12

l

l 12

−

l

2

血圧，心拍数，体温，抱けJ，心電図＊二≡ 血圧，心拍数，体温，握力

図I E−64第1相臨床試験スケジュール

一極毎1

2

4

6

図2
一極毎1

2

4

8

12

24

体温の変化
6

8

醸蜃
12

ン

50

（kg）4024（hr）−

30；′一一一￣一占：9二二7声一三二二二」と±：二二、，．ム■・￣・・・．−▲一一一￣￣

図3
148

捉力の変化

C

〇

No．1

△…・・…△

No．4

×

〉く

No．2

▲……・・▲

No．5

壬

≡

No．3

◎……・・◎No．6

心拍数︵回／分︶
図4−1／2毎1 2

4

心拍数の変化

6

8

C

図5

〇

No．l

△…．．…△No．4

X X No．2▲．…‥＿．▲

No．5●一一・・・一●0‥・・…・O No．6

N0．3

血圧の変化

5．検査項目
主な検査項目については表2に示した。
（1）臨床症状の観察
生体への影響を観察するため，体温，握力，
血圧，心拍数を服薬前30分，服薬後30分，1，
2，4，6，8，12，24時間目に，心電図について
は服薬前30分，服薬後2，24時間目に測定した。

（2）臨床検査
服薬前30分，服薬後2，24時間目に臨床検査として血液一般検査，血液生化学検査ならびに尿検査を実施した。
（3）生体内動態
血清中薬物濃度の経時的推移を調べるために，服薬前30分，服薬後15，30分，1，2，4，6，
8，12，24時間目に採血を行った。また，尿中排泄量の経時的推移を調べるため，0〜2，2〜
4，4〜6，6〜8，8〜12，12〜24時間に分けて蓄
尿した。

149

I E−64類縁体の開発

む口Op一〇月 ︵寸︵t︶ 咲■ 裏臣営芯恕奴藍150

臣営N悪療岳虫罵橿檻彗糊 堂 既 出 の彬（（（▼■■ eq oつ17．E−64の第1相臨床試験−第一段階一一

寧冨裏道義

女Oの柘様撃臣皆N憩裸出年︵N︶ 喋 堂 鞘 堂 壁 題 寸僻

151

（
の

（
（
▼・」 N

E−64類縁体の開発

霊堂寸N弱樵璧
臣皆N麗椋聖女OM橿株璧︵C︶ 喋 霊 糊 富 民 題 の瞞

152

の

N

t．■

（

（

／−＼

17．E−64の第1相臨床試験−第一段階−
●l

0
0
4

0
0

0
0

0
1

0
0
0−−−0 ︵tE＼ぎ︶堪璧甘磐召02︵冒︶ 蛸真義畠瞳憲露

5

4

3

2

︵JモuE︶空堂＼瑞雲蓋与瞳

図7 E−64−Cの単位時間あたりの尿中排泄量153

I E−64類縁体の開発
表6 E−64−Cの血清中濃度（〃g／ml）

6．定量法

表7 薬物速度論的係数

血清中および尿中の薬物の定量は島浮LKB−
9，600ガスタロ1マトグラフー質量分析計を用い
大正製薬㈱総合研究所において行った。
試験成按
1．1臨床症状
体温，握力，心拍数，血圧の経時的変化を図2〜5に示した。体温，握力，心拍数，血圧および心電図において服薬による変化は何ら認められなかった。また，自覚症状についても異常
l享全く認められなかった。
2．臨床検査成績
血液一般検査，血液生化学検査および尿検査の結果を表3〜5に示した。いずれにおいても，被験薬によると判断される変動あるいは所見は全く認められなかった。
3．生体内動態E−64−dを経口投与した場合，生体内においてェステル部分が加水分解を受け，活性体であるE−64−Cとして検出され，未変化体は検出されなかった。したがって以下に示す生体内動態の成績は活性体であるE−64−Cに関するものである。
（1）血清中濃度
血清中濃度を表6に，平均血清中濃度推移を
図6に示した。また，薬物速度論的係数を表7に示した。E−64−d投与後の血清中E−64−Cの最高血清中濃度（Cmax）は0．38〜0．50FLg／ml，
平均0．44′唱／ml，最高血清濃度到達時間（Tm−
154＊AUC：Area Under the Blood Concentration

Curveax）は0．25〜2時間，平均1．21時間，血清中濃度曲線下面積（AUC）は1．02〜1．54FLg・hr／
ml，平均1．35〝g・hr／ml，生物学的半減期（T兢）は0．89時間であった。いずれの被験者においてもE−64−Cは投与12時間後には血清中より消失していた。
（2）尿中排泄量
尿中排泄量を表8に，累積尿中排泄量を図6に，単位時間あたりの尿中排泄量を図7に示した。服薬後24時間目までに，E−64−Cとして23．2mgが尿中へ排泄され，E−64−dに換算す
ると投与量の25．2％が尿中排泄されたことになる。
考察

1．臨床症状および臨床検査所見
体温，捉九心拍数，血圧．心電図，自覚症

17．E−64の第1相臨床試験−第一段階−
表8E−64−Cの尿中排曙量（mg）＊：E−64−d換算値
状などの臨床症状には，本薬剤投与による影響は何ら認められなかった。
また，ラット マウス，家兎，ハムスター，
イヌ，サル等での亜急性毒性試験1）のうち，ラットおよびマウスにおいてのみ肝への影響を示唆するGOT，GPTの上昇が認められたが，本試験ではそのような影響および憤向は全く認められなかった。さらに，他の臨床検査項目についても，薬剤投与による変化は何ら認められなかった。したがって，本試験項目から判断す
る限り，健常成人男子にE−64−dlOOmgを
空腹時1回投与した際の安全性は高いものと考えられる。
2．生体内動態E−64−dをヒトに経口投与した場合，動物試
験での結果2）と同様に，血清中にE−64−dは全く認められず，活性体であるE−64−Cのみが検出されることから，E−64−dは生体内で速やかにエステル部分が加水分解を受けるものと考えられる。
E−64−d経口投与後のE−64−Cの血清中濃度の上昇は速やかで，Tmaxは1．21時間であった0また，投与後12時間目には，血清中から消失していた。さらに，投与後24時間目までに平均25．2％が尿中にE−64−Cとして検出され，その約90％が投与後8時間以内に排泄されており，血中から尿中に速やかにE−64−Cの型で移行することが示唆された。
まとめ

E−64−dのヒトにおける経口投与時の安全性
および生体内動態を検討するため，6名の健康成人男子に空腹時100mgを経口投与した。
安全性に関しては，血液検査，尿検査，一般
症状，心電図，血圧，心拍数，体温，握力において，薬剤によると思われる影響は認められなかった。血清中濃度については，Cmaxは0．44
FLg／mi，Tmaxは1．21時間で投与12時間後には血清中より消失していた。尿中には24時間で投与量の25．2％が回収された。
文献1）大関正弘ら；E−64−dの蚕急性毒性に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，
今掘班，昭和57年度研究報告。
2）大関正弘ら：E−64−dの生体内動態に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」徽生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研
究，今掘班，昭和57年度研究報告。

155

Ⅰ 酵素レベルでの効果

18．カルシウムプロテアーゼによる蛋白質燐酸化酵素の限定分解………‥・…………西塚

春美

19．天然型〝一CANPの精製と性質

今堀 和友

20．カルシウムプロテアーゼの撥能発現機構鈴木 紘一

21．リソゾームチオールカテプシソ群の性質と測定法の進歩

勝沼 信彦

18．カルシウムプロテアーゼによる蛋白質燐酸化酵素の限定分解

西 塚 春 美＊
研究協力者 岸 本梶川明＊ 安 江 悠 子＊ 竹 山 宜 典＊
憲

雄＊

はじめに
形質膜に与えられた種々の変化，すなわちホルモンや神経伝達物質等のシグナルがどのようにして細胞内へ伝達され形態や機能を調節するかは極めて重要な課題であり，種々の疾患の病態解明に直結している。私共は形質膜イノシトール燐脂質（PI）の代謝回転に共役して活性化される蛋白質燐酸化酵素（Cキナーゼ）の解析を行っているが，この酵素は従来のCyClic
AMPを介するものとは異なった極めて重要な情報伝達系であると考えられる1）・2）。この機構
では形質膜に与えられたシグナルによりPIが選択的に加水分解され，ここに生成する数量のジグリセリド（DG）がCキナーゼを活性化し，その活動の引き金となっている。ところで，Cキナーゼの活性化にはCa2＋プロテアーゼによる限定分解の方式もあり，Cキナーゼ系の情報伝達枚構の一環となっていることを前年度報告した3）。すなわち，CキナーゼはPIの代謝回転に共役して形質膜に結合し，活性を発現するが，この際の細胞内Ca2＋濃度の上昇に伴ってCa2十プロテアーゼが形質膜結合型のCキナー
ゼに選択的に作用し，恒久的な活性化の状態に導くものである（図1）。このようにCキナー

西

山

馨＊

高

井

義

美＊

の応用が必須なものとなってきたと言える。この観点から，本年度は強力な発癌プロモーター
であるホルポールエステル（TPA，図2）の効果についてinvitroおよびinvivoの両面からの解析を実施し，TPAが受容機構を経由す
ることなくCキナーゼの可逆的および不可逆的活性化を促進することが明らかとなった。このことはTPAがCキナーゼ系の情報伝達機構，
特に細胞内プロテアーゼ反応の生理意義の解明に有効な手段となることを示すものであり，以下にその概略を報告する。
材料および方法
CキナーゼおよびCa2十プロテアーゼはすでに記載した方法4）に従いラット大脳の可溶性画分より調整した。燐脂質は赤血球膜より抽出分画した。ジオレイソ，TPA（12−0−Tetradeca・
noylphorbo1−13−aCetate），その他試薬は市販品を用いた。E−64は大正製薬より寄贈をうけた。
Cキナーゼは［γ−32P］ATPから仔牛胸腺
Hlヒストンへの平Pの取り込みをもって測定した。Ca2＋プロテアーゼの活性は125Ⅰで漂鼓したカゼインを基質として5％トリタロル酢酸に可溶性の放射能を測定するか，あるいはCキゼ系の情報伝達機構の化学的基盤をほぼ明確なものになし得たことから，今後の解析の焦点のナーゼを基質として限定分解の結果生成する活性フラグメソトのキナーゼ活性をHlヒストン

一つとしてこの機構の制御・増幅剤の吟味とそを基質として測定した。

＊神戸大学 医学部 第二生化学教室
159

Ⅰ酵素レベルでの効果

Signall

Receptor

Ca2＋（10￣5M）…‥・・

Ca2＋−Protease

ActiveFragment

日 日
Phosphorylation
図1Cキナーゼの活性化機構った。その一例として，ジオレインによるCキ

質膜燐脂質に結合し，活性を発現する。ジオレ
インのみでは効果はない。一方，TPAは10ng／mlという超数量でジオレインと同等の作用を示し，Cキナーゼを形質膜燐脂質に結合させ活性化する（図3）。本稿ではその詳細は省略するが，血小板を用いた検討から，TPAはinvivoにおいてもCキナーゼを活性化していナーゼの活性化を図3に示している01′唱／ml
程度のジオレインが存在するとCキナーゼは形る可能性が極めて強い。DGが生体内で速やかに代謝を受けるのとは対照的に，TPAは極め

結果と考察
1．Cキナーゼ系とTPAの関連
前年度までの解析で明らかにしたように，PIの代謝回転によるDGの生成が引き金となってCキナーゼ系が作動することがほぼ確実とな

160

18．カルシウムプロテアーゼによる蛋白質燐酸化酵素の限定分解

表1血小板膜へのCキナーゼの結合のTPAによる促進
C−Kinase activity
Treatment

Soluble Membrane boundContro1
TPA（100ng／ml）

62％
9％

38％
91％

CH20H
図2

TPA（12−0−Tetradecanoylphorbo1−
13−aCetate）の構造

D iglyceride＋Phospholipid
Ca2＋（1×10￣5M）＋Phospholipid
Ca2＋（1×10￣5M）

6
3︵∽■01×邑︒︶意A⁝︶︒可冨u⁝出︒蔓︒Jd

P horboI E ster

TPA alone

Diolein alone．‥。．・・・‥・・・・‥・・…‥・・・81fJ

・〇・て7…‥〇・・日……・・○…・・……8

TPA（ng／ml）

Diolein（FLg／ml）

図3

ホルポールエステル（TPA）によるCキナーゼの活性化
161

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表2

低濃度Ca打で活性化されるCa2＋プロテアーゼ

Brain Heart musclel Skeletal muscle2（rat）（Canine）

Skeletal muscleい（porcine）（rabbit）

Molecular weight

88K

Isoelectric point

5．5

Ka for Ca2＋

20J

40／上M

45J

Optimum pH

7．5−8．0

7．0

7．5−8．0

7．6

Inbibitor

Leupeptin

Leupeptin

Leupeptin

Leupeptin

135K

M

80Ⅰ（＋30K

50JIM

M

E−64
Substrate

80K＋30Ⅹ

E−64

C−Kinase

CaseinMyo丘bril

Phosphorylase
Kinase8SA

CaseinCaseinCasein1Mellgren（1980）FEBS Lett．109，129
2

Dayton eL at．（1981）Biochim．Biophys．Acta659，48

3 Kubota eE at．（1982）Biomed．Res．3，699
41nomata gf d．（1983）J．Biocbem．93，291

C a2＋−P rotease

C−Kinase

A ctive F ragm ent

M．W．77，000

M．W．51，000

ca2＋

Ca

Pho＄Pholipid

Phospholipid

Diglyceride

Diglyceride
図42＋
independent

Ca2＋プロテアーゼによるCキナーゼの活性化て分解を受けにくい。実際，TPAで血小板を和佐の異なった二種の酵素が知られている5）。

刺赦した後，Cキナーゼの動態を検索すると，

この二種のプロテアーゼのうちCa2十に親和性

大部分が膜に結合した活性型の酵素として回収の高い酵素をラット大脳より精製し，その性質される（表1）。TPAの発癌プロモーターととMellgren6），Daytonら7），Kubotaら8）およびInomataら9）がそれぞれイヌ心筋，ブタ

しての作用とCキナーゼの関連は現在不明であるが，少なくともTPAを種々の実殴系に応用することがCキナーゼ系の生理意義の解明に重要な手がかりとなると考えられる。この観点か

骨格筋，ウサギ骨格筋より調整したCa2＋プロ
テアーゼの性質とを比較した（表2）。分子量にいくぶん相違が認められるが，Ca2十に対すら，Ca2十プロテアーゼとCキナーゼの関連にるKa値が数十〃Mであり，中性付近に至適ついての解析を以下のように実施した。

pHをもち，チオールプロテアーゼのインヒビ

2．Ca2＋プロテアーゼとの関連

ターで阻害されること，さらにカゼインが極め

Ca2＋プロテアーゼとしてはCa2十に対する親162てよい基質になることなどその性質はよく一致

18・カルシウムプロテアーゼによる蛋白質燐酸化酵素の限定分解︵C一〇tX邑U︶uO叫lj︸Ud望u叫￥U
3Time（min）

図5

Ca2＋プロテアーゼによるCキナーゼの活性化に及ぼすTPAの効果

20
E・64（〝g／ml）

図6

Ca2＋プロテアーゼによるCキナーゼの活性化に及ぼすE−64の効果
163

Ⅰ 酵素レベルでの効果している。したがって，これらのCa2十 プロテれまでの報告とよく一致している。他方，形質アーゼはすべて同じ種類の酵素であると考えられる。

院燐脂質に結合した活性型のCキデーゼの限定分解反応もE−64によって阻害されるが，その効果は弱く，Ki値は10／唱／mlである0さらに，Ca2十プロテアーゼの粗抽出液（100，000×g
上活画分）を用いた際にはCキナーゼの限定分
解反応はE−64によって阻害されない。これらのことが何に起因するかは現在さらに解析中であるが，E−64の有効性の検討にあたっては，Cキナーゼの限定分解反応が進行する場の問題，特に脂質と蛋白質の相互関連や形質膜を含む局在の問題を考慮する必要が提起されてきたといえる。こういった観点からも，今回明らかにしたTPAの有効利用が今後の解析の重要なCa2十に親和性の高いプロテアーゼはDG存
在下に形質膜燐月旨質に結合したCキナーゼ（分子量77，000）に選択的に作用し，遊離型の活性
ララグメソト（分子量51，000）に変換する（図4）。今回，TPAの効果について検討を行ったところ，TPAはDG と同様に限定分解反応を著明に促進し，10ng／ml程度の超微量で最大効果を発揮した（図5）。この際にも燐脂質が必須であり，TPAのみでは促進効果は得られない。一方，カゼインを基質とした際には
燐脂質やTPAの効果は認められず，これらの因子はCa2＋プロテアーゼに作用して活性化しているのではなく，基質であるCキナーゼに作用していると推定される。さきに述べたように，TPAが存在するとCキナーゼほ可逆的に形質膜燐脂質に結合し活性化されるので，DGの場合と同様にTPAによって活性化された膜結合型のCキナーゼが選択的に限定分解される手段であると期待される。
昭和57年度の報告を終えるに当り，本研究に多大の御支援と御助言を賜った今堀和友博士，
ならびに大正製薬株式会社の各位，厚生省新薬開発研究助成に対して深い感謝の意を捧げます。
文

ことを示している。
今回の解析によっても Ca2＋プロテアーゼの生理意義についてその核心に迫ることに成功し

献1）Nishizuka，Y．：Trendsin Biochem・Scien−
CeS，8，13，1983，

たとはいい難い。しかし，細胞内プロテアーゼ

2）Takai，Y．，Kishimoto，A・and Nishizuka，の持つ意義の解析の焦点と問題が明らかになっ

Y．：Calciumandcellfunction，AcademicPress，てきたように思われる。特に，TPAはCa2＋
プロテアーゼを介する反応を含めたCキナーゼ
系の情報伝達機構を持続的に刺激する物質であり，種々の実験系に応用することによってCキナーゼの意義とともにCa2十プロテアーゼによる限定分解反応の生理的解釈の一端をときはく●
す手がかりが得られる可能性が強く，現在解析を進めている。
3．E−64による阻害作用
Ca2＋ プロテアーゼがE−64により強く阻害されることは今堀らによって詳細に解析されている10）。私共がラット大脳から精製したCa2十に親和性の高い酵素に対する阻害効果を図6に示した。通常の形質膜に結合していないCキナーゼを基質に用いた場合はE−64は強力な抑制効果を示し，そのKi値はほぼ1J唱／mlとこ
164

2，386，1982．

3）西塚春美：厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘証，昭和56年度研究報告書，p．57，
1982．

4）Kishimoto，A．．Kajikawa．N・，Shiota，M・and
Nishizuka，Y．：J．Biol．Chem．，258，1156，
1983．

5）Kisllimoto，A・，Kajikawa，N・，Tabuchi，H・，Shiota，M．and Nishizuka，Y．：J．Biochem．，
90，889，1981．

6）Mellgren，R．L・：FEBS Lett・，109，129，1980・
7）Dayton，W．R．，Shollmeyer，J・V・，Lepley，R・
A．and Cortes，L R．C．：Biochim．Biophys．
Acta，659，48，1981．
8）Kubota，S．and Suzuki，K．：Biomed．Res・，3，
699，1982．

9）Idomata，M．，Hayashi，M．，Nakamura，M・，
Imahori，K．and Kawashima，S．：J．Biochem．，

18．カルシウムプロテアーゼによる蛋白質燐酸化酵素の限定分解
93，291，1983．
10）今掘和友：厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今堀江，昭和56年度研究報告雷，p．63，
1982．

165

19．天然型〟−CANPの精製と性質

今

掘

和

友＊

研究協力者 川 島 誠 一＊＊ 猪 股 光 司＊＊
林

昌

はじめに

美＊＊

中

村

愛＊＊

は以下に述べるように，完全なカラムクロマト
グラフィーのみの組み合わせで，単一にまで精カルシウムで活性化される中性プロテアーゼ

製することに成功した4）。精製上の最大難関は，（CANP）には，mM程度のCa2＋を必要とす

イオン交換カラムクロマトグラフィ ーにおいるm−CANPと，FLM程度のCa2＋で活性化さて，〝−CANPは内在性インヒビターと挙動を共にし，分離ができない点である。我々は，フれるrCANPとがあることが分っているが，筋ジストロフィー症にどちらが関与するのか等については全く判明していない。

ェニルセ7ァロースが，両者の分離に極めて有用であることを発見した。

昨年度の本報告において1），我々はm−CANP

精製の手順は表1に示す通りである。用いたは自己消化により〝一CANPに転換することを緩衝液は，20mMTris−HCl（pH7．5），5mM

報告した0 これを誘導型〝−CANPと呼ぶこと

EDTA，10mM2−メルカプトェタノールを含にする。一方細胞内に存在する〝−CANPは，

むもので，これを溶液Aと呼ぶ。ウサギ骨格筋

この誘導型rCANPと同一物であるか否かは5kgを3倍量の溶液A中でホモジェナイズし，12，000gで遠心した後上澄をガラスウールで漏過し，脂肪を除く。これを粗抽出液とする（14．2わ。粗抽出液に2．3kgのDE−52のセル
ロースを加え，2時間放置後，非吸着物質を憤潟で捨てる。樹脂を5gの溶液Aに懸濁し，カラム（5×130cm）に注ぎ，充填する。これをさらに2．6gの溶液Aで洗浄後，0−8．6Mの不明であるから，一応区別して天然型rCANPと呼ぶこととした。本年度は誘導型，天然型の〃−CANPの同一性を明らかにする目的もあって，ウサギ骨格筋より天然型rCANPの精製を行った。ついで，天然型rCANPの種々の性質を明らかにし，これを誘導型〃−CANPな
らびにm−CANPと比較した。以下にそれらの結果について述べることとする。
精製

従来用いられた〝−CANPの精製法において
ほ，最終段階付近でポリアクリルアミドゲルの電気泳動を用いるため2）・3），収量は極めて悪く，
ややもすれば比活性も下り気味であった。我々＊東京都老人総合研究所所長＊＊東京都老人総合研究所臨床生化研究室

直線匂配のNaClで溶出する。′卜CANPは
0．2MNaCl付近で溶出されるはずであるが，前述のように内在性インヒビターも共溶出されるから，表1には活性を示していない。そこで，0．15M〜0．25Mで溶出される部分を集め，0．3
M NaClを含む溶液Aで平衝化したフェニル
セファロースのカラムに加える。これを0．3M
NaClを含む溶液Aで洗うと，FL−CANPはカラムに吸着するがインヒビターは溶出されるので，両者を分離できる。したがって表1に示す
167

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表1

ウサギ骨格筋（5kg）よりのrCANPの精製操作

等欝

粗 抽 出 液267，500

等晶賢

DEAE−セルロース（DE−52）

4，820

第一回フェニル七ファロース

193

1，377

DEAE−セルロース（DE−53）

28．5

1，916

第二回フェニル七ファロース

2．7

436

（隻爵鳥

Purification oflJCANP by DE−53CoIumn Chromatography

様に〃−CANPの活性が測定できるようになる。

と，図2に示すように活性は単一ピークとして

P−CANPの画分を集めこれをDE−53のクロマ
トグラフィーにかける。DE−53はDE−52と異得られる。以上の様に，4段のカラム操作だけなり，試料に混在しているインヒビターを，rCANPより分離するのに有効であった。結果を図1に示す。黒丸と点線とで示す様に，〃−
CANPの活性は約65木目位で現れるが，その後80本目から100本目にかけてにみられる凹み
はインヒビターが溶出されていることを示している。

で，〝一CANPを単一に精製する方法を確立したのである。
天然型〝一CANPの性質4）
図2のカラムより溶出されたrCANPは単一にまで精製されていたが，これを図3に示す。国中左の2列はFL−およびm−CANPのデ
ィスク電気泳動を示すものである。次の7列は最後に，〃一CANPの画分を集め，固体の

いわゆるSDSポリアクリルアミド電気泳動で，NaClを加えて0．3Mに調節した後，フェニル

真申の3列は15％ゲル，右の4列は7．5％ゲ

セファロースのカラムにかける。NaCl（0．3M

ルである。まず15％ゲルの結果から明らかな様→0．OM），エチレングリコール（0％→50％）に，天然型FL−CANPはm−CANPと同様，の二重直線匂配のかかった溶液Aで溶出する

80Kと30Kとのサブユニットからなることで168

19．天然型〟−CANPの精製と性質

Purifkation ofllCANP by PhenyL−Sep旭rose
CoIumn Chromatography

20．

− ∈uOのN

0．

1巾 OUU巾qJOSqく

50

100

150

2∞

250

Fraction Number

図2

EIcLCtrq血yetic BaJdi咽FhItems ofyCANP ard mCArPin the Prpserにeα・Absence of SDS

ーSDS

◆SDS

7．5％
−■▲−−

15％

7．5％

．こ．1−一・・＝＝一一三＝I−■■■−＿＿＿＿＿＿二￣￣

〃

m

￡

〃

m

8t

〃 〃
m
＄t

−m JJ
m

図3
ある。これは誘導型〃−CANPでは30Kのサ
ブユニットを欠いていた点と異なる。
7．5％ゲルは，いわゆる80Kサブユニット

明らかに，〃のサブユニットの方がmのものよ
りわずかであるが大きいのである。

につき，〝とmとの差を明らかにしたものでこの時点において，天然型〃−CANPは誘導型のものとは別物であることが明らかになっある。両者を共泳動したものを右端に示すが，た。すなわちm−CANPの自己消化物が，m−169

EffectofCi

ard mCANP

ontheActiVityofJJCAW

68
0．5
1・0
1・5
Concentration ot C㌔＋（mM）
図4

Effect of DivalenlCations on the Activity ofl」CANP ard mCAトP

7
55025

︵︒三言＞膏＜聖篭一度

、一一、

，●

′

＿＿＿＿＿＿＿＿璽生し一一一一一一▲5
1015Concentration of DiYatent Cation （mM）

20

図5
CANPより大きいことはあり得ないからであ全に交叉するからである。

る0
それにもかかわらず，天然型〃−CANPはm一

一方，天然型fL−CANPと誘導型p−CANPの問には著しい頼似性がある。図4にはウサギ

CANPと何等かの関係にあると考えられる。
サブユニット構成は似ているし，免疫的にも完

骨格筋より得られたFL−およびm−CANP活性のCa2十依存性を示してある。このうち天然

170

19．天然型〃−CANPの精製と性質

型〃−CANPの曲線は，前年度報告書1）に示した誘導型〝−CANPの曲線と全くといってよいほど一致する。図1から明らかな様に，天然型意しておくことがある。誘導型〃一CANPは主としてトリの筋肉のm−CANPから得られたものであるのに対して，本報告に述べてある天然

jL−CANPのI）EAEセルロースからの溶出位
置はNaClO．07Mであるが，これは誘導型の型fL−CANP，m−CANPはともにウサギ骨格筋

ものと一致している4）。すなわち，図3のディス

天然型の〝−CANPはその材料を異にするから，

ク電気泳動の結果と併せてみても両rCANP
はm−CANPより等電点を塩基性側にもつ。

あまり比較の対象とはならないのである。他より得られたものである。それだけに誘導型と方，トリ骨格筋より天然型〃−CANPを得る

図5には天然型FL−CANP活性のSr2十，Ba2十ことには，かなりの努力にもかかわらず現在ま

依存性を示してあるが，これより得られるKaでは成功していない。しかもTlリのm−CANP

値（最大の半分まで活性化するに要する濃度）のCa2＋感受性はウサギのm−CANPのそれよは，誘導型〃−CANPについて報告した値，
0．6mM，2mMとほぼ一致する5）。なお，図かによる誘導型rCANPの生成は必ずしも再現

らも明らかな様に，m−CANPはBa2十ではほり高い。他方ウサギのm−CANPの自己消化

とんど活性化されない○ したがって，rCANP

性がよくなく，その分子量もm−CANPとは異ならない。

活性のみの測定用としてBa2十を用いることが考えられる。

関係につき一般的説明を与えることは現時点でいずれにせよ，m−CANPより分子量の大きは困難であることを物語る。それに伴って，m−い天然型iLTCANPと，小さい誘導型p−CANPとが極めて瑛似した性質を示すことは興味ある

CANP，P−CANPのいずれがジストtlフィー

事実であり，〝−CANPのCa2十感受性の高さ等の研究にも資するところが大きいと考えられる。
考察

誘導型fL−CANPがm−CANPの自己消化にこれらの事実は，m−CANPとFL−CANPのに関与するのかも断定し難いのである。
文献1）今相和友他；厚生省「新薬研究開発事業」緻生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p．63−67，1982．

2）Dayton，W．R．，Schollmeyer，J．V．，Lepley，

よって得られた折には，m−CANPはFL−CANPの前駆体という考え方が可能であったが，今回R・A・and Cortes，L R・：Bioctlim・Biophys．

の研究により，m−CANPと′FL−CANPとの関

3）Szpacenko，A．，Kay，J．，Goll，D．E．and

係は再び白紙に戻ってしまった。天然型r
CANPはm−CANPより分子量が大きいので，

Otsuka，Y．inHProteaseandTheirInhibitorsH

天然型FL−CANPがm−CANPの前駆体であるのではないかとも考えられる。しかし少なく
とも，天然型〝−CANPの自己消化の，いかなる段階においても，m−CANP活性は出現しなかった。
m−CANPとFL−CANPとの関係の解明は今

Acta，659，48−61，1981．

（Turk，V．＆ Vitale，L．J．eds）p．154−161，
Mladinska Knjiga・Pergamon Press，0Xford，
1981．

4）Inomata，M．，Hayashi，M．，Nakamura，M．，
Imahori，K．andKawashima，S．：J．Biochem．，
93，291−294，1983．
5）Suzuki，l（．，Tsuji，S．，Kubota，SりKimura，Y．andImahori，K．：J．Biochem．，90，275−278，
1981．

後の研究にまつより仕方がないが，その前に注171

20．カルシウムプロテアーゼの機能発現機構

鈴 木 紘 一＊，＊＊
研究協力者

久保田
今 城

俊一郎＊

木

村

舌

雄＊

忍＊・＊＊ 如 月 正 継＊・＊＊

はじめに

酵素抗体法によるCANPの定量にはウサギ
およびモルモットの抗ニワトリm−CANP抗体

筋ジストロフィー症における筋タンパク質の崩掛こはカルシウム依存性中性プロテアーゼ

を使い，市販のベルオキシダーゼラベルの抗ウサギIgG抗体とマイクロタイタープレートを（CANP）が関与していると考えられるが，粗使って行った。

抽出液中の微量なCANPを定量する方法がないので，CANPと筋ジストロフィー症の関係についてはっきりした結論が得られていない。
CANPにはFLMおよびmMCa2＋で活性化される2種塀のCANP，jL−CANP，m，CANPがあるが1），①生体内で実際に作用する分子種は何か，②2種のCANPは相互変換をするの結果および考察
1．CANPの定量法の開発
租抽出液中のCANPを定量するにはa．酵
素抗体法（ELISA法），b．2次元電気泳動法，
C．イオン交換カラム法の3つの方法が考えらのCが十感受性は何で規定されているのか，等々の問題が未解決である。

れる0万法的にはaが最も簡単で，多数の検体を同時に測定できるだけでなく，感度も良い。
bは抽出液中に存在する千種煩以上のタンパク質を2次元電気泳動で分離し，その中にある
CANPのスポットを同定し，それをデソシト

本年度は以上の問題点を解決するために，メーターで比色定量する方法である。この方法

CANPの定量法の開発，CANPの構造と撥能の解析，の2つの点から研究を行った。

は手間はかかるが，原理的にはm−CANP，〃一
CANP，およびイソヒビターなどを同時にタンパク質として検出できる利点がある。Cは小さなDEAE−セルロースカラムを使って抽出液

か，③m−CANPはCa2＋感受性が著しく増大
しない限り生体内では作用しないが，m−CANP

実験方法
CANPはトリ2）およびウサギ3）の精製m−
CANPを使用した。FL−CANPとしては，精製
m−CANPをCa2＋存在下で自己消化させて調製したderived FL−CANP4）と，生体中にm−
CANPと共に存在するnaturalFL−CANP5）の両者を用いた。

＊東京大学医学部第二生化学教室＊＊現所属 東京都臨床医学総合研究所

中のm−CANPをインヒビターなどから分離してその活性を測定するものである6）。活性を測定するので，Cでは活性を持つCANPのみを測ることができる点で他の方法とは異なっている。以上の3法はいずれも特徴があるが，今後多数の検体を処理することを考え，まずa法の確立を目ざし，その結果の確認のためにb，C法をも検討した。
方法の詳細は省略するが，図1はa，C法を
173

Ⅱ 酵素レベルでの効果

ELISA

DE−52Chromatography
Breast Muscle

●

Liver

7．9！3．7●●●●ヽ

9．6±2．70●●● ●●Dystrophy oNormal
図1ELISA法とカラム法（DE−52chromatography）によるニワトリ
組織抽出液中のCANPの定量

02︵冨S叫iJgu＼等︶トトlAH54dN401020

2DEP hg／gwettissue）
図2 カラム法（縦軸）と二次元電気泳動法（横軸）によるニワトリ組織抽出液
中のCANPの定量。黒印はジストロフィー，日印はコソトロールを示す。

174

20．カルシウムプロテアーゼの機能発現域構蓑1ウサギCANPの性質の比較
m−CANP

分子量とサブユニット組成
比活性（unit／mg）
Ca汁感受性（Ka，〃M）
熱安定性（560，20分）
至適pH
m−CANP抗体との反応

derivedFトCANP

73K＋30Ⅹ

naturalp−CANP

73Ⅹ＋30K

280

280

700

50

7．5−8．0

7．5−8．0＋＋80K＋30Ⅰ（︵訳︶意＞でくUEhzuH址ju叫dE還00︵dNdUUt︒∈＼UtOE︶h01遅Jui3uO⁝l巴邑旨UuI

10

20

30

90

Reaction Time（min）
図3

CANPとE−64−Cおよびヨード酢酸の反応△，▲；口，T：各々EL64−Cとヨード酢酸（IAA）のとりこみ。黒印はCa2＋のな
い所，日印はCa2＋のある所での反応。○，●；0，0：E−64−CおよびIAA処理
時の酵素活性。各組の記号の前者はCa2＋存在下，後者は非存在下の反応。

用いて正常と筋ジストロフィーのニワトリの抽
出液中のCANPの量を測ったものである。図2は同じくb，C法を比較したものであるが，どの方法を用いても結果は良く一致し，CANP

直ちに論ずることは難しいが，ニワトリの種々の組織で筋ジストロフィーとコントロールの間にCANPの含量に差がないことがわかる。

をELISA法で定量した結果を他の分析法で得

今後は年令，性差などに注意しつつ例数を増して疾患とCANPの関係を明らかにしたい。

た結果と直接比較できることがわかった。

ただ，残念ながらニワトリ

CANPの抗体はヒ

図1，2の結果はまだ例数も少なく，年令，トのCANPの定量には使えないので，ヒトの性などが筋ジストロフィーとコントロールで必筋ジストロフィー症とCANPの関係はヒトのずしも合致していないので，この結果の意味を

CANPの抗体がないと分析できない。現在ヒト
175

Ⅰ

酵素レベルでの効果
1

2

3

4

5

6

7

chicken CANP
rat cathepsin B
papalnbromelainstreptococcal
protease

図4
表2

ニワトリCANPの活性中心（Cys）のまわりのアミノ酸配列順序

CANPとE−64−Cおよびヨード酢酸（IAA）の反応に及ぼすMn2＋とCa2

金属イオン濃度（mM） 最大活性
Mが十Ca汁
（相対値，％）

とりこみ量a】
残存活性mol／mol 相対値（％） （％）

1
5

5
5

0

7
0

7

0

2
9

0
0
1

0

5

0

3
7

5
0

9
1

0
0
1

0

6
8

0
9

0

6

0

0
0
1

3
7

6
0

8

5
1

3
6

0

8
7

1
8

7
5

0

6

5

0

0
0
1

4

5
0

8

7

0

8
7

5

0

一．
1．1．
4
001

IAA

一．
1．1．4
001

E−64−Cの効果a）100倍量の試薬をpH7．5で60分反応させたときo
CANPの抗体を調製中であるので，インヒビ
ターや〃−CANPの定量と合せてさらに検討を行っている。
2．CANPの構造と機能（1）naturalFL−CANP5）
ウサギ骨格筋のnaturalFL−CANPを完全に精製し，その性質をderivedFL−CANPと比較した（麦1）。著しい特徴は，natural FL−CANPの大きいサブユニットの分子量が8万で，derived FL−CANPやm−CANPの7．3万に比べて明らかに大きいことである。したがって，naturaljL−CANPはderived FL−CANPとCa2＋感受性をはじめ多くの性質で区別できないが，両者は別物である。すなわち，natural
FL−CANPはm，CANPの自己消化で生じたものではなく，m−CANPとnaturalFL−CANP
はおそらく別の遺伝子から出来るものと思われる。

176（2）CANPの活性中心6）m−CANP に対するヨ，ド酢酸（IAA）とE−64−Cの反応を図3に示す。IAAとE−64−C
はCa2＋ の存在下でのみ CANP と反応し，
CANPl分子当り1モルの試薬がとりこまれて失活した。CANPとインヒビターの反応は00Cでも非常に速く，CANPの活性の至適pHとインヒビターの反応の至適pHは良く一致した。また，大過剰の試薬を添加しても1分子しかCANPと反応しなかった。
E−64−CまたはIAAで修飾したCANPの構造は末修飾のCANPと変わらなかったが，SH基の摘定では修飾した酵素はCa2十の添加で表面に露出する3個のSH基（classI SH基）のうちの1個のSH基を欠いていた。また，
E−64−CとIAAの両者をCANPに交互に作用させても合計1モルの試薬しかCANPと反応しなかった。これらの結果から，CANPの活性中心はCa2＋の添加で表面に露出する3個

20．カルシウムプロテアーゼの揆能発現機構㊦

mM Ca2＋effect。r（Mn2＋）（mCANP）

二∴←
ⅠⅠⅠ

autolysis￣三￣

active form

permanently
Open form

図5

CANPの活性化機構○：Ca2＋結合部位 ●：Ca2＋が結合したCa2＋結合部位のSH基のうちの1個でE，64−CとIAAは同

Mg2十などの他の2価金属では見られなかっじ活性中心のSH基と反応すると結論した。

た。そこで，Mn2＋が共存すると何故m−CANP

IAAで修飾したCANPをプロテアーゼで消のCa2＋感受性が増大するかを検討した。

化し，IAAでラベルされたペプチドを単離しまず，CANPの構造に対する金属イオンのてそのアミノ酸配列順序を決定した（図4）の。

効果を円偏光二色性とSH基の滴定で調べた。

図に示すように，CANPの活性中心はシステ

m−CANPの構造はmM Ca2十の存在下で変イソであることが確認され，メチルプロテアー化したが，mM Mn2＋中でも全く同じ構造変ゼでなく，チオールプロテアーゼに属すること化が認められた。しかし，Mg2＋中ではCANPが判明した。活性中心のまわりの配列がパパイ
ンやカテプシソなどのチオールプロテアーゼとの構造は全く変化しなかった。（2）で述べたよう

良く似ていることから，CANPは発生的にはの存在下でのみCANPと反応する。Mn2＋にヨード酢酸（IAA）やE−64−CはmMCa2十とこれらのプロテアーゼと同一のものであると予Ca2＋によっておこるm−CANPの構造変化が想される。

全く同一なら，E−64−CやIAAはmMMn2＋（3）CANPに対する金属イオン効果8）

中でもCANPと反応するはずである。しかし，や表2に示すようにMn2＋や0．1mM Ca2十のMg2■などでは全く活性化されず，また，0．1

下ではE−64−CやIAAはほとんど全くCANP

mMのCa2＋でも活性化されない。しかし，2と反応せず，Mn2＋

ニワトリ

m−CANPは2mMのMn2＋と0．1mM Ca2十が共存と0．1mM Ca2十が共存すると活してはじめてCANPはE−64−CやIAAと反性が発現することが判明した9）。この効果はMn2＋の他，Ba2＋やSr2＋でも見られたが，応した。この反応はmM Ca2十が存在する場

mM Mn2十合に比べ若干違いが，本質的には同一の反応と177

Ⅰ酵素レベルでの効果思われる。すなわち，Mn2＋ほCANPの構造を変化させCa三十感受性を変化させるが，
CANPの活性を発現させるにはFLM Ca2十の共存が不可欠であると結論できる。
以上の結果を図5にまとめた。CANPには少なくとも2個のCa2＋結合部位があり，そのうち1個は分子表面にあって露出しているが他の1個は埋もれている0第1，第2の結合部位のCa2十の解離定数は各々mMおよび〝Mである。CANPの活性中心（SH基）は埋もれているのでこれをclosed型と呼ぶ。mM Ca2＋が存在すると第1結合部位にCa2十が結合し，活性中心をふさぐ蓋がはずれOpen型となる。
このとき第2結合部位も露出するので，ここにもCa2＋が結合し，活性中心のSH基が活性化されてactive型となる。第1結合部位にはCa2十の他にMn2十も結合できると考えれば，

文献1）鈴木紘一：カルシウム依存性中性プロテアーゼの活性化扱構，生化学，54，1264，1982．
2）Ishiura，S．，Murofushi，H．，Suzuki，K．and
Imahori，K．：Studies of a calcium−aCtivatedneutral protease from chicken muscle，Ⅰ．
Purification andcharacterization，J．Biochem．，
84，225，1978．

3）Tsuji，S．andImahori，K．：Studies on a
Cが十一aCtivated neutral protease of rabbit

Skeletalmuscle，J．Biochem．，90，233，1981．
4）Suzuki，K．，Tsuji，S．，Kubota，S．，Kimura，Y．andImahori，K．：Limited autolysis of
Ca2＋−aCtivatedneutralprotease（CANP）chan−gesits sensitivity to Ca2＋ions，J．Biochem．，

90，275，1981．

5）Eubota，S．and Suzuki，K．：Comparison of
two forms oflow calcium−requlrlng PrOteaSe，Biomed．Res．，3，699，1982．

Mn2＋は一種のアロスチリックエフェクターで6）Murachi，T．，Hatanaka，M．，Yasumoto，Y．，

CANPをclosedからOpen型に変換するといえる。第2の結合部位はCa2十に特異的なので，Mn2十だけでは活性化されない。しかし，
Mn2＋の存在下ではm−CANPはOPen塑なので〃M Ca2十があれは第2結合部位にCa2十がNakayama，N．and Tanaka，K．：Biochem．

ただちに結合でき，活性が発現する。
DerivedfL，CANPの場合には自己消化により活性中心をふさぐ蓋がはずれた型で第2結合部位が常時露出しているとして説明できる。
第1，第2 Ca2＋結合部位に相当するものが
CANPに本当に存在するか否かを検討するため，透析平衡でCa2＋の結合を調べたところ，
CANPには最大6個のCa2十が結合し，その平均解離定数は150／ Mであった。今のところ第1，第2結合部位を区別して求めることは不可能であるが，少なくとも図5の考えと矛盾する結果は得られていない。

178

Internリ2，651，1981．

7）Suzuki，K．：Reaction of calcium−aCtivatedneutralprotease（CANP）Withanepoxysuccinyl
derivative（E−64−C）andiodoacetic acid，J・Biochemリ93．inpress，1983．

8）Suzuki，K．，Hayashi，H・，Hayashi，T・and
Iwai，K．：Amino acid sequence around theactivesitecysteineresidueofcalcium−aCtivat−
edneutralprotease（CANP），FEBS Letters，
152，67，1983．

9）Suzuki，KandIshiura，S．：Effect of metal
ions onthestruCtureandactivityofcalcium−
activated neutral protease（CANP），J・Biochem．，93，1463，1983．
10）Suzuki，K．andTsuji，S．：Synergisticactiva−tion of calcium−aCtivated neutral proteaseby Mn2＋
1982．

and Ca2十，FEBS Letters，140，16，

21．リソゾームチオールカテプシン群の性質と測定法の進歩

勝

沼

信

彦＊

研究協力者 木 南 英 紀＊ 唐 渡 孝 枝＊

法3）・4）に従って，ラット肝より精製した。カテ
はじめに

プシソHはSchwarz

生体内でのタンパク質の分解に，リソゾームのチオールプロテアーゼ（カテプシソB．H．L）が重要な役割りを演じていることは，E−64やロイプべチソなどを用いた実験で明らかになってきた。筋ジストロフィー症では，このリソゾームのプロテアーゼ群の活性が著明に上昇し，E−64の投与で上昇したカテプシソ活性を抑制
しうることを報告してきた。一方，これらのチオール性カテプシソの構造に関する研究はセリン性プロテアーゼに比べ，非常に遅れていたが，我々は最近リソゾームのチオールプロテアーゼ（カテプシソB．H．L）の内，カテプシソ
BとHの全一次構造を決定した1）。また，これらのチオールプロテアーゼのペプチドの切断部位を検討して，それぞれ固有の基質特異性をもつことを明らかにした2）。特にリソゾーム含量の少ない骨格筋の抽出液を用いて，カテプシソ
B．H．Lの活性を分別測定するには，高感度の特異性の高い基質を開発せねばならないが，我々はペプチド基質の選択的な切断の結果を土台に，カテプシソLにかなり特異的な基質を兄い出した。リソゾームのチオール性カテプシソの最近の進歩について報告する。

カテプシソBおよびLは＊徳島大学医学部

Towatariによる切断は pH5．0 で行った。消化物はTLCと Dowex50Wを用いたイオン交換樹脂で分離後，加水分解し，アミノ酸組成を決定した。同時に消化物のアミノ末端をダソシル法で同定し，既知のアミノ酸配列から各々の消化物のアミノ酸配列を求めた。骨格筋におけるカ
テプシソ活性の測定は以下のように行った。骨格筋を5倍量の20mM KCl，0．1mMEDTA，
10mMTris−HClbufferpH7．2を含む0．25M
庶糖液中で，ポリトロソホモゲナイザー（Kine・
matica）を用いて，最大速度の80％で5秒ホ
モゲナイズし，10，000×g，20分間遠心する。
その沈澱を1mM EDTA

らの方を含む0．05M酢酸buだer pH5．0で元の量に合わせ，もう一度，上述のようにホモゲナイズする。これを酵素液とした。カテプシソB＆L活性は，Suc−
Tyr−Met−2−ナフチルアミドを基質とし，0．1M酢酸bufferpH5．5，1ml中に2FLmOl
システイソ，lFLmOIEDTA，0・2％Brij，10％
DMSOを含む反応液で，370，15〜30分イン
キュべ−トし，遊離してきた2一ナフチルアミソをBarrettの方法6）で測定した。
結材料および方法とBarrettの方法5）によった。各種ペプチドのカテプシソBおよびL

果

1．ラ・yト肝カテプシンBとHのアミノ酸配列
ラット肝より精製されたカテプシソBは，252残基からかたり，N端から29番が活性システイ
179

Ⅱ
表1

3つのチオール性エンドペプチダーゼのアミノ酸配列の同一性

Areaofcomparison

震霊．terminal 空三豊 慧慧yl￣terminal wholeprotein
一

3

3
．

0

4

9

1

4

9

5

81−164165−252

17．3

46．5

16．0

32．1

18．8

44．4

52679
23
1
−3．3138

1

Cathepsin：B／Cathepsin H

Cathepsin H／Papain

08Residuesin cathepsin B

Cathepsin B／Papain

酵素レベルでの効果

ソであり，もう一つの活性基ヒスチジンは197

イPテンシソ，黄体ホルモン遊離ホルモンでも番に位置する。糖鎖を除く分子量は，27，411である。カテプシソHは220残基とカテプシソB

そのことが確認された。カテプシソLは，P2
部位にフェニルアラニソ，ロイシン，バリン，

より分子サイズは小さく，活性基のシステイソ

トリブトファ ソのような疎水性アミノ酸，あるおよびヒスチジンは26番目と167番目にある。

いは，チロシソがあることが水解に必要と思わ糖鎖を除く分子量は24，000であった。植物由れる。P3部位に上記のア1ミノ酸がくれは水解性

来のチオールプロテアーゼパパインとカテプシが増すが，全てには適応できない。Pl，Pl

ソBおよびHとその一次構造を比較するには，
アミノ酸配列を3つの部分に分けると考えやす

位のアミノ酸は，それほど重要とは思われない。カテプシソLは，トリプシンやキモトリプ

い（表1）。N末端の部分では活性基システイ

シンのように厳格な特異性をもたず，パパインンの周辺で3者の間に驚くべき同一性がみられと同じようにかなり広い特異性をもち，リソゾる。全体でみると，カテプシソBとHの同一性
は以外に少なく（30％同一），パパインとカテームの中で多くのタンパク質の分解にかかわると考えられる。

プシソHの同一性が高い（46％）。中間部は同

3．カテプシンBおよびLの測定法について一性が非常に低いところで，カテプシソBでは部

従来は，カテプシソBの測定は，BZ−7ルギ

3つの挿入が現われる。C末端部分になるとまニンーβナフチルアミドを用い，カテプシソLた同一性が高くなる。この部分では，カテプシは良い基質がないため，アゾカゼインを用いてソHのカテプシソBおよびパパインに対する同測定するのが一般的であった。しかし，骨格筋

一性は，それぞれ47％と44％であった。全体
的には，カテプシソHとパパインの同一性が一のプロテアーゼ活性は余りに弱く，測定感度以下にある。カテプシソBについては，最近，

番高く，チオールプロテアーゼの分子進化を考BZ一アルギニソーアルギニンーβ−ナ7チルアミド

える上で興味深い。

（あるいは−MCA）が開発され，特異的かつ感度

2．カテプシンBおよびLの基質特異性の高い基質が得られるようになった。カテプシ

リソゾームチオール性カテプシソのタンパク性基質，特に筋構成タンパクの分解性についてにして，大正製薬の花田，玉井との共同研究では以前に明らかにした。今回は，より詳細な基質特異性を調べるため，各種のペプチドに対す合成して検討した結果，表2に示すように，従ソLの上述のペプチド基質への作用結果を土台
メチオニンをベースとして，28種のペプチドをる作用を検討した。カテプシソBおよびLのヘ

来用いられてきた基質よりはるかに高感度で特キサペプチド，ノイロテンシソ，黄体ホルモン

異性の高い何種類かのナフチルアミドが合成で遊離ホルモン，インシュリンA鎖のペプチド結合切断の部位が図1に示されている。カテプシきた7）。Suc−Tyr−Met−β−ナフチルアミドは，
カテプシソHによってほとんど水解されず，カ

ソBは，グルカゴンやウサギ骨格筋のアルドラ

テプシソLとBを測定する標準基質として以下ーゼを基質とした場合，C末端からジペプチド用いることとした。

を連続的に遊離させるが，ヘキサペプチド，ノ180

骨格筋の粗抽出液を用いて，カテプシソ

21．リソゾームチオールカテプシソ群の性質と測定法の進歩

︵﹂
u

州

S

d

U

J

J

d

U

︶

Eと将小戻りー岩淵Lもトで畳車Q的b月弟Jゝゝト
h只
l︻区

∵
︹
︶

ご ご︑−︶−

u増等uS㌢コ斗1㌢ココ・J肇・誓S・増環U・号U・≡l・合St

u叫dJU く uココSuH

u州Suむ一〇JコむN㌫⁝＝∵毒素雪d・Sj・ヰすJよ

賢叫SdUl巴gOE旨工賢叫Z叫u叫3コ﹂㍉∴∴∵⁝三二㌢十‡三・三二20∈岩上㌫‖∵玉音ト・ココ

葛コd星雲むH

181

Ⅱ 酵素レベルでの効果
表2

カテプシソL，BおよびHの各種基質に対する活性と速度定数
Activity（pmol・min−l・mg￣1）

Substrate

CathepsinBz−DL−Arg−NA

L

Cathepsin

B

Cathepsin

H

O．017

Z−L−Arg−L−Arg−NA O．495
Suc−L−Tyr−L−Met−NA

5．107
Cathepsin B

Cathepsin L

Substrate

Km Kcat Kcat／Km（mM）

Km Kcat Kcat／Km
（mM）

（S￣1）

（S￣1）

3

2
0

0
6

4
5

0
0

0

2

5

6
0

0
5

3
6

4

3

0

5
0

5
0

3
3

1

8

3

7
4

0
6

7
7

0
1

0

0

4
2

3
3

0

3

Bz−DL−Arg−NA

一6021お9㌶20

D−Leu−L−Tyr−L−Met−NA

一 ．2 0
8．
2
9．
9
325

β一Ala−L−Tyr−L−Met−NA

一 ．3 3
1．
0
2．
9
000

Z−L−Arg−L−Arg−NA
Suc−L−Tyr−Met−NA

B＆L活性を測定する場合，内在性のチオー

ソLよりもBの方が量が多いと考えられ，租抽ルプロテアーゼインヒビターの影響をできるだ

出液を用いて測定すればカテプシソB＋Lの活性を測定することになる。最近，Z−Phe−

け除去することが重安である。我々は方法のところで示したように，できるだけリソゾーム足莫を壊さないように筋をホモゲナイズし，インヒ

Arg−MCAがカテプシソLの測定に用いられることが分ったが，この基質もカテプシソLのビターを含む上清分画を除き酵素活性を測定す

みならずBも水解する。リソゾームの分離が難ることにしている。ホモジネートそのものを用いて測定するよりも，遠心沈没分画を元の量にしい骨格筋などの組織では，どうしても内在性
インヒビターの影響なしにプロテアーゼ活性を合わせた懸濁液を用いた方が30〜40％活性が高測定することは難しく，カテプシソに対するベく，酵素濃度変化に対し直線性がよい。また，
E−64を投与して骨格筋のカテプシソB＆L

ルオキシダーゼ標識抗体を作成して，酵素抗体法を用いて測定する方法も併用することを考えている。

活性の抑制をみる場合，ホモジネートを用いての測定では，カテプシソとは結合していない遊離のE−64を含んだ状態で酵素活性を測定することとなり，E−64の効果を過剰に見積もる可能性がある。それは特に，E−64投与後短時間では重要である。

文

献1）Takio，K．，Towatari，T．．Katunuma，N．and
Titani，K．：Proc．Natl．Acad．Sci．US，80，3666−3670，1983．
2）Towatari，T．andEatunuma，N．：J．Biochem．，
93ト1119−1128，1983．

考察

カテプシソB，HおよびLの細胞内政能およびジストロフィー症における役割を調べるためには，特異的かつ簡単な活性測定法の開発が要求される0カテプシソLの場合，特によい人工基質がなかったため，その要求は強かった。今回開発されたSuc−Tyr−Met−βNAはカテプ
シソBよりもカテプシソLにかなり特異的であり，一応の成果といえる。組織内ではカテプシ
1823）Towatari，T．，Tanaka，K．，Yoshikawa，D．
and Katunuma．N．：J．Biochem．，84，659−671，
1979．

4）Towatari，T．，Kawabata，Y．andKatunuma，
N・：Eur・J．Biochem．，102，279−289，1979．
5）Schwarz，W．N．andBarrett，A．J．：Biochem．
Jり191，487−497，1980．

6）Barrett，A・J．：Anal．Biochem．，47，280．293，
1972．

7）Katunuma，N．，Towatari．T．，Tamai，M．and
Hanada，K・：J．Biochem．，93，1129−1135，1983．

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果22．高濃度カリウムイオン溶液中における筋蛋白質代謝に及ぼすE−64−Cの影響…江橋 節郎
23．筋衛星細胞の培養について

小沢鉄二郎

24．急性筋崩壊におけるE−64−Cの効果石浦章一

25．移植筋の再生ならびにアミノ酸代謝に対するE−64の効果………………………寺尾寿夫

26．ニューロフィラメント変性とrCANP

杉田 秀夫

27．ヒト脳Calcium−ActivatedNeutralProteaseの部分精製およびヒト脳Myelin蛋白の分解に対するE−64−aの抑制効果………………………宮武正

22．高濃度カリウムイオン溶液中における筋蛋白質代謝に及ぼすE−64−Cの影響

江 橋 節 郎＊・＊＊
研究協力者

野々村

碩

筋ジストロフィー症にみられる萎縮筋は，筋蛋白質分解の克進で特徴づけられる。一方培養
筋細胞では，培養液のカリウムイオン濃度を高めることにより筋蛋白質の分解が促進されることが知られている1）。我々はこの方法を用いて蛋白分解促進状態にある筋細胞に対するE−64−
Cの作用を検討し，正常筋細胞に対する作用と
比較した。
方

法

1．筋細胞の培養
12日自発胚胸筋を細切し，コラゲナーゼ処理
により細胞を分離し，ゼラチンを塗布した径100mmのファルコンシャーレを用い，イーグ

ルMEM，馬血清，鶏胚抽出液を容量比で8：1：1の割合に混ぜた混合液中で培養した。この組成の液を，以下「正常液」と呼ぶ。シャー
レ1枚当りの細胞数は2．25×106とした。
2．培養液組成
イーグルMEM液には5．4mMのK＋が含まれているが，この液中のNa十のうち10mMを等量のK十に置換して得られた溶液（15．4mMのK＋を含む）に，馬血清，鶏胚抽出液を容量比で8：1：1の割合で混ぜた混合液を高濃度カリウム液とした。この液を以下「高K液」と呼ぶ。正常液（N），高K液（K）にそれぞれ＊東京大学医学部薬理学教室＊＊現所属 岡崎国立共同研究棟構生理学研究所
分子生理研究系化学研究部門

昭＊

山

下

茂＊

20／唱／mlのE−64−Cを添加した液をE−64−C
添加正常液（EN），E−64−C添加高K液（EK）とし，4種炉の培養条件（N，K，EN，EX）の下で実験を行い成績を比較した。
3．ミオシンBの調製
筋細胞をシャーレより剥離し，1mMPMSF．
0．3mMNaHCOさを含む0．1M KCl溶液中で破砕した。得られた懸濁液を10，000×glO分
間遠心し，沈澱に1mM PMSF，2mM ATPを含むグノミ・ストラウプ液を加えてミオシソBを抽出した。抽出液に5倍量の冷水を加えてミオシンBを沈澱させ，12，0∝lxg20分間の遠心で沈澱を集めた。さらに，これを0．3mMNa
HC03を含む0．6MKClで溶解し，10，000×
glO分間の遠心で得た上清に5倍量の冷水を加え12，000×g20分間の遠心により沈澱を集め，これをミオシンBとして実験に用いた。
結果

1．高K液中における培養筋細胞の位相差顕微鏡による観察
正常液中で筋細胞を培養すると，培養2日目
から5日日の間に急速な細胞融合がおこる。高K液中でも正常液中と同様に細胞融合が進行し，多数の筋管が形成された。培養6日目以後，正常液中の培養では梼紋の形成が進行し自発収縮が観察されるが，高K液中では横紋形成も自発収縮もみられなかった。これはStrohman
らの報告と一致する1）。培養8日目以後になると，高K液中の筋細胞は正常液中の筋細胞に比185

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
表1収縮蛋白の分解に対する高濃度カリウムイオンおよびE−64−Cの影響
放射活性比〔11C（dpm）／3H（dpm）×102］

培養条件

ミ

オ

7

0
5

7

4
0

7

9
1

5

6
7

5

3
7

4
8

6

7
1

6

0
3

5

3
5

6

1
2

4

5
7

4
7

6

4

9
5

3
4

6

6

0
8

3
9

8

5

3
9

6
0

6

6

6
3

7
5

N KENEK

7

5

8．05

トロポミオシソ

1
2

9
9

8
7

9．37

アクチン
7

6

1
3

5

4
1

6
5

6

6

2
5

6

4

1
5

5
1

6

7

5
8

7

3
5
7

4

4
5

8
2
7

7

軽鎖2

5
9
7

7．34

軽鎖1

1
2

NKENEK

10．30

ン′

6
6
7

重 鎖

シ

Nは正常液，Kは高K液を示す。EN，EKはこれらにEL64−C20FEg／mlを添加したものである。HC−ロイシン除去後24時間，71時間に筋細胞よりミオシンBを調製し，SDS電気泳動ゲル上の各バンドを切出した。表の数値は各／：ソド内のlJCと3Hとの放射活性の比を示す。
表2 ロイシソ遊離に対するE−64−Cの影響
19時間後
3H（dpmxl0−3）aH（dpmxlO￣3）

7
9

1

0

0

3
9

1

0

299土6

4 9 4−
1
8
0

0

255土6

◆327土7

1

287土4
7
9

63．5土0．3
65．8±0．5

168．0土0．3
66．1土0．6

aH−ロイシン除去後40分，19時間の時点で培養液0．4mlを採取し，その中の3Hの放射活性を測定した。各数値は培養皿4個について得た値を（平均値）土（標準誤差）の形で示している。

ベて，辺縁の攣曲化が観察された。E−64−Cの後，液体シンチレーションカウンターにより各添加によって，位相差顕微鏡で観察されるような変化は認められなかった。

バンドに含まれる14C，3Hの放射活性を測定

2．収縮蛋白の分解速度に対する高濃度カリウムイ
オンおよびE−64−Cの影響算した。培養液中の3H−ロイシンの比放射能は

培養5日目に，3H一ロイシン4′疋i／ml，14C一ついての比放射能は一定であると考えられ，あ

ロイシン0・4／疋i／mlを培養液中に添加し，細胞内の蛋白質を二重標識した。48時間後3H一蛋白のHCについての比放射能に比例する。しロイシンのみを含む培養液に替え培養を続けたがって蛋白分解速度が大きい程，一定時間後た。HC−ロイシンを除去した時点から一定時間の14C／3Hの値が小さくなる。

し，dpmで表した計数値の比（14C／3H）を計
一定に保たれているので，同一の蛋白の3Hにる蛋白のもつHCと3Hの放射活性の比はその後に細胞を集めミオシンBを調製した。これにHC一ロイシン除去の時点で培養皿を4群に分SDS電気泳動法を行い，クマシブリリアント

け，N・K・EN・EKの4種の培養条件にして実験結果を比較した場合には，どの蛋白についプル一により染色した後ミオシン重鎮，軽鎖
1，軽鎖2，アクチン，トロポミオシンに相当
するバンドを切出し，過酸化水素水により溶解
186ても HC／3Hの値は4群とも差がなくK十の効
果，E−64−Cの効果ともに認められなかった。

22・高濃度カリウムイオン溶液中における筋蛋白質代謝に及ぼすE−64−Cの影響

これに対し培養後48時間より培養細胞を4群に分け，N・K・EN・EKの各条件の下に培養を続け実験を行った場合の結果は表1の通りであった0 ミオシン重量削こ対してⅩ＋の効果は明瞭にみられた。すなわち，このサブユニット中の考

察

高濃度カリウムイオン存在下の培養筋細胞では，ミオシン重鎮の分解が促進されていることが示された。これは収縮蛋白のうちでもミオシ

HC／3Hの値は高濃度カリウムイオン処理群でン重鎖に特異的な現象で，ミオシン軽鎖，アク30％以上もの低値を示した。このことはミオシ

チソ，トロポミオシンではこのような変化はみ

ン重鎖の高K液中での分解速度が正常液中に比られなかった。このような分解促進状態でE−

べて著しく増大していることを示す。しかし64−Cがより明瞭な効果を示す可能性を予測し

E−64−Cの効果は正常液中でも高K液中でも認められなかった。ミオシン軽鎖，アクチン，ト

たが，E−64−Cの効果は認められなかった。一方
培養液中へのロイシン遊離に対してはE−64−C

ロポミオシンについてはK＋の効果もE−64−Cの効果も明らかでなかった。

が抑制作用をもつことが示された。これは昨年

3．細胞外液へのロイシン遊離に対するE−64−Cの影
響離抑制作用がどのような蛋白の分解抑制を反映

培養液中に流出するアミノ酸の量は蛋白分解速度を反映すると考えられる。そこで3H−ロイ
シンで24時間標識した後，放射能を含まない培養液に替え，一定時間後に培養液0．4mlを採取し，その中の計数値を測定しロイシン遊離量の示標とした0結果を表2に示す。表2にみる
通り，E−64−Cによって遊離ロイシン量は有意に減少した03H−ロイシン除去後19時間の減少
率は正常液の場合11％，高K液の場合9％であり，減少効果はほぼ同程度であった。また高濃度カリウムイオンはロイシン遊離を14％増加させた。

度の石浦の報告2）と一致する。このロイシン遊
しているのかについては，今回の実験で明らかにすることはできなかった。この問題については今後さらに検討する必要がある。
文

献1）Bandman，E．andStrohman，R．C．：Increased
K十Inhibits

Spontaneous

Contractions

andReduces Myosin Accumulationin Cultured
Chick Myotubes，J．Cell Bio1．，93，698−704，
1982．

2）石浦章一：厚生省「新薬開発研究事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発
研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，91−95，
1982．

187

23．筋衛星細胞の培養について

小 沢 瑛二郎＊

昨年の班会議に於いてカナダのJasmin教授
はハムスター新生児の筋芽細胞の培養において大要以下のような所見を得たことを報告した。
すなわち，筋ミソス塊をイーグルのMEM，馬血清，ニワトリ胚抽出物（EE）から成る培養
液中で培養すると，正常および筋ジストロフィー症動物由来の筋芽細胞は5日目位に融合し，同じような筋管細胞を作る。そして筋ジス筋管細胞は培養三週間後萎縮し，自発収縮能を失い，Z線が消失する。しかし正常筋管細胞では培養を行えばよいかということから解決することが必要である。
今回は衛星細胞の培養の方法の検討に終始し，Z線の検索にまで至らなかったが，衛星細胞の培養では，≡週間後の培養細胞でも自発収このようなことはない，という内容であった。
このことはTautu andJasminの論文1）でも明らかであった。
この問題はE−64の薬効の研究のためには非常に重要であった。Z線はCANPによる分解に敏感であり，少なくともinvitroではE−64のCANP阻害効果は確実であるからである。
したがって我々はこの問題の追試を行おうとした。しかしながらここに一つの問題が存在した。すなわち我々が入手可能なハムスターは雄の成体のみであり，新生児は入手できない。このことは普通行われているような筋芽細胞の培養ではなく，衛星細胞の培養が必要となる。衛
星細胞は成熟した筋線経のところどころに附着して存在し，筋線経と共通の基底膜をかぶっている細胞である。したがって筋芽細胞を培養する場合と異なって非常に少ない材料を播くことから出発することとなり，どのような条件下で＊国立武蔵療養所神経センター機能研究部

1

2

3

4

6

8

10

12

Age of rat（weeks）

図1

ラットの筋衛星細胞のin vitro成長能
各遇令のラット腰筋をとり出し，ハサミで細切した後，切片1ケを1つの培養コンパー
トメントに入れて，85％EagleのMEM，15％馬血清と3週間（1遇令未満のものでは2週間）培養した。培養終了後2．5％グルター
ルアルデヒド100mM カコジレート緩衝液
pH7．4で固定後メチレソブルーで染色して検鏡した。ExplantからのOutgrOWthが．はっきりした筋管細胞を含むものの全体の培養数の比をとり百分率で表示した。1ケの点の培養の数は96コソパートメソトの結果である。
189

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

0

25

0

50％

Ratage：18weeks Horseserum

25

：15％

Rat age：8weeks

図2 種々の培養液中でそだてた場合の筋管細胞の形成率（1）
8週令のラットを図1の方法で培養して筋管細胞の形成率をみたもの。ただし培養液は種々の人工培地を用いてある。図中のF12＋DMEMは，Ham

s F12

と

50％

Dulbecco

sMEMの1：1混合液である。
緬を繰返し行っているのが観察された。

Eagle

s MEM：80．8％

Horse serum：14．2％
Additions：5．0％

図3 種々の培養液中でそだてた場合の筋管細胞の形成率（2）
8週令のラットを図1の方法で培養して筋管細胞の形成率をみたもの。ただし培養液は種々のadditionを含んでいる。図中の略号は本文参照。

初めにハムスターの代りに，ラットを用いて，筋ミこ／スからの explant細胞がどの程度

表1ハムスター筋の培養液の検討

分裂して筋管細胞を形成する能力があるかを生EMEM DMEM F12

用いたところ，イーグルのMEM（EMEM）＜
ハムのF12＜ダルべッコのMEM（DMEM）＜F12とDMEMとの等比混合液（DF）であった。次に15％馬血清と85％EMEMの培養液にさらに牛胎児血清（FBS），仔牛血清（CS），
EEを加えると筋管形成率に影響を与えるが血清のロットや濃度により色々な結果を与えた（図3）。
ハムスター（7週令）の後肢帯筋をトリブシ
190

HS＋EE＋FBS

1一
3−
3一
4
一
0
23

血清15％と種々の人工培養液85％の混合液を

HS＋FBS22−2
1
1

筋管細胞の形成率を調べた（図2）。初めに馬

HS＋EE

3一
．4
一
2
334

次に種々の培養液の組成を変えることによる

Horse serum

町ト212
3−

り高い形成率がみられるが，2週以後は急速に
低下した。

0

後経時的に調べた（図1）。生後1週迄はかな

ArtifiCialmedium：80．8％
Horse serum：14．2％
Additions：5．0％
トリプシン処理ハムスター筋の単層培養を上表のような各種培養液で培養し3週間後に筋管細胞の成長を検索した。数字は筋管細胞成長度を示し，F（−）
は線維芽細胞の成長もないことを示す。0：筋管細胞は35mm径Falcon plastic dish全視野に0コ。
1：全視野に1ケ，3：ほぼ全視野で茄管細胞が観察される。2：1と3の中間，4：全視野で筋管細胞が観察され，しかも形成された筋管細胞は大きい。

23．筋衛星細胞の培養について

図4 正常ハムスターの培養筋細胞
正常ハムスター（7W）の腋筋よりの ex−
PlantからのOutgrOWthをDulbecco，sMEM
40・4％，Ham s F12 40．4％，horse serum
14・2％，EE2％fetalbovineserum3％の培養液中で3週間培養したもの。

図5 筋ジスハムスターの培養筋細胞
筋ジスハムスター（アW）の膜筋よりのex−plantからのOutgrOWthを図4と同じ条件で培養したもの。

ソ処理をして単細胞を集め培養した。培養液はは，かなり大きな筋管細胞を作った。培養を続

80．8％人工培養液，14．2％馬血清，3％FBS，2％EEの混合液であり，FBSやEEを除けたところ3週間以上経っても萎縮も起こらず
自発収縮を続けた（図4，5）。

いた場合は等量の馬血清でおきかえた（表1）。
人工培養液はEMEM，F12，DF，DMEMで我々の結果は上記のように衛星細胞の培養であった。他の条件が等しければ，上に述べた順あって，Jasmin教授のように筋芽細胞の培養ではない0 しかし我々は彼等が記載するよう序に筋管細胞の形成は良好であった。また天然に，筋ジスハムスターに特有な萎縮が存在する物質としては，馬血清のみのものが一番生えがと結論するに至っていない。

よくなく，次いで，FBS，EE，FBS＋EEのものの順によくなった。結局DMEM，馬血清，

我々の経験では彼等が示す萎縮像はハムスタ
ーに限らなければ，共存する線維芽細胞の分裂

FBS，EEの組合せが一番よかったが，この組が盛んな培養では，そのような萎縮像はよくみ合せの場合，線維芽細胞の生えも非常によく，られる0実際Jasminらの培養では線維芽細胞の増殖は盛んなようである。

ある時期以降は筋管細胞は消失した。したがって長期培養の場合にはDFに上記天然物質の組合せが一番好ましいかもしれない。
DF＋全天然物質の組合せの培養液中でハム
スター筋ミンスの培養を行った。Explant細胞

文献1）Ta11tu，C・andJasmin，G．：J．Neuropath．
Exptl．Neuro1．，41，87−103，1982．
191

24．急性筋崩壊におけるE−64−Cの効果

＊

章

浦

石

二

＊

史

浩

瀬

中

野ガ

ク質との関連についての詳細な研究は少ない。

秀

種々の病的な筋肉でのプロテアーゼ活性の上昇が報告されているが，同活性と筋構造タソバ

沢田

はじめに

官杉

野ガ

征昭

中木

埜高

研究協力者

造タソバク質の測定に使用した。電気泳動用には1週間−200Cでグリセリン処理したヒラメ筋を用いた。
結果

また，筋崩壊モデルとしてのジストロフィーハ

図1にプピノミカイン筋注後48時間のヒラメ筋

ムスター，チキンについては，前者は壊死がパッの像を示す。生食注入対照筋（図1，A）に比べて投与筋（図1，B）では筋線経の崩壊と多数の細胞浸潤が見られる。この図で明らかなように直接筋注する方法では均一な壊死像が得られるのが特徴である。

チ状をなすこと，心筋が骨格筋より侵され易いこと，後者については筋構造タ∵／バク質が正常より分解され易いという証拠はないことなど，
多くの問題がありプロテアーゼの働きを解明す
るには不十分であると考えられる。
我々は，骨格筋に均一に壊死を起こす方法
として局所麻酔剤を直接筋注することを考えた1）・2）。これにより再生筋の寄与を無視することが出来，変性しつつある筋におけるプロテアーゼの役割を観察することが可能となった。以下，筋崩壊とプロテアーゼ活性との関連，ならびにE−64−Cによる急性筋崩壊阻止の試みに関する結果を述べる。
方法

雄性ラット（200g）のヒラメ筋に0．5％プビ
バカイン溶液0．2mlを直接注入し，一定時間後，筋をとり出し10倍量のphosphate−buffered
Saline，0．1％トライトンⅩ−100溶液と共にホ
モジナイズした。上清は種々のライソゾーム酵
素活性の測定に，沈澱はアルカリで可溶化し構＊国立武蔵療養所神経センター

次に筋線経の崩壊が個々の構造タンパク質の分解とどのような関連があるかを調べる目的
で，SDS電気泳動を行った（図2）。筋注3時
間後では，分子量96，000のα一アクチニソ，ならびに分子量30，000の未知タソバク質の減少が見られた。その後，時間を追ってミオシン（H，L会則の減少も明らかであった0 しかしながら筋注48時間ではなおアクチニソの残留が顕著であることが判明し，図1，Bで見られる
ごとく大幅な崩壊像は得られなかった。以後，筋の崩掛も筋線経の数を比較するという方法
ではなく，残存筋構造タソバク質量を測定することとした。筋注192時間目で再び構造タソバ
ク質量が増加するのは筋の再生のためである。
従来，筋の崩壊はライソゾーム酵素によるという報告がなされている。そこで我々は，図1の段階でライソゾーム酵素であるカテプシソ
B＆L，D活性を測定してみたところ，いずれも数倍の上昇が観察された（表1）。特にSuc−
193

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

幾ギ曹1．麟

獣
、‥∵こ
Y

●・・

■1．㌧

＿一

隼・守

・、■▲てJ二●ご

・′．．

暮■∴−

↓4

1、∴∴．・■■t鸞ざ篭 ∴ ∵二．一 二、：・・
工ゝ・こ‥

■与

■■ヽ

■〆′

∴、．．：一二、・Jへ．∴：●

き．一・・㌦

芸

︑・︑ヽ

、l■：、
■
・

■

∴＿・．1．

■t■●1∴ 予．、三・‥・

●

誓

．・

一▲・十・■、−
1

■；

J・

零完嵩

．■．・ニ■■、か．檜J、

れ∵

、

r ︑ ヽ

二十・÷主

巧言∴−∴∴ユニ

窪音 ・B∴二・∴●・ふ∴靂轡
．t・

図1生食筋注対照筋（A），およびブビバカイン筋注ヒラメ筋（B）のHE像

6

封

48

詔192

ノ；

攣て済

・．．i．

′ノ呈−
羞 嘗 毎

●

ヽ■

熱

鴨
熱感 ＿＿

24

〃

鍋泳

6

昌⁚∵いい

3

■・⁝

20

3

欝納経．観

0

′

t† ヽ

14

ヽ■

確

●・■・■

■ヽ

図2 ブビバカイン筋注後のヒラメ筋の構造タンパク質
対照筋，3，6，24，48，72，192時間後のものを示した。左は分子量マーカー（Ⅹ）を表わす。
194

24．急性筋崩壊におけるE−64−Cの効果
表1 ブビバカイン筋注48時間後の筋ライソゾーム酵素活性
Specific Activity（Unit／mg）
Enzymes

Bupivacaine（B）

Control（C）

3

5

1

9

1．12±0．06
0．176土0．004

1

0．342土0．023＊

03．95土0．18＊

Acid phosphatase3

2．48土0．19

α一galactosidase1α−glucosidase

0．151土0．015
2．54土0．14730±60．467土0．021＊

01

329土9＊Cathepsin D

Cathepsins B＆L

Mean±SEM，＊：p＜0．01，n＝21．

三．

から0．2M〜0．35Mのニ

袖KClで溶出されることなどからカテプシソB様酵素である可能性が00強い3）。しかしながら，カテプシソLが混在しgている可能性も捨てきれないため，本稿ではカ
テプシソ∵B＆L と呼ぶことにする。

加以上の結果より，カテプシソB＆Lは浸潤

Ⅷ

八〇∈＼三﹂■由言︼Od● 一噂0

あe）

細胞の消長と行動を共にすることから，筋由来ではなく浸潤細胞由来であることが考えられ

0㌣i

墓

一一．幸一

る。このことを証明するために2つの実験を行
14

D叩●■It●rbuplY■C■ln●lnル￠tIon

図3 筋ホモジネート中のカテプシソB＆L活性○：プピパイン投与筋，●：対照筋った。第1は，投与筋から直接浸潤細胞を単離し，その中のライソゾーム酵素活性を測定することである。表3に実験手順を示す。とり出した細胞は主としてマクロファージであった。採Tyr−Met−naphthylamideを基質にしたカテ

取した単核細胞を前記トライトンⅩ−100ル1％

プシソB＆Lは対照筋の10倍もの高値を示溶液で可溶化し酵素活性を測定した結果が表4し，しかも活性上昇が筋構造タンパク質の減少
ならびに浸潤細胞数に比例することが判明したである。表4は，結果を対照筋に対する比で表わした。特に注目するカテプシソB＆L活性は（図3）。図2に見られるごとく α一アクチニソ

正常の180倍と顕著な差を示し，浸潤マクロフが減少し始める筋注3時間の時点ではカテプシ

ァージに活性が高いことを示唆した。第2に，

ソB＆Lは全く上昇せず，ミオシンH鎖が減螢光抗体法を用いてカテプシソBの局在を調べ少する24〜48時間後に急激な活性上昇が見られた。抗体は徳島大学の勝沼，木南両先生からいること，再生に伴って活性が低下することなどただいた。その結果を図4に示す。カテプシソが明らかとなった。

Bは筋線維内に点状に染色され，マクロファー

このプビバカインによって誘導されるカテプ

ジと一致することが明らかになった。以上の事

シソB＆L活性の特徴を表2にまとめた。こ実より，構造タンパク質の急激な減少に対応しの表より，至適pHが5〜6付近にあり，SHて増加するカテプシソB＆L（主としてB）

化合物で活性化されること，ヨードアセトアミ

活性は，筋細胞由来ではなく，非筋細胞由来で

ド，E−64，ロイペプチソで阻害されることi重ある可能性が強いと考えられた。

金属イオンでも失活することなどから，チオー

それでは，筋注3時間後のα−アクチニソのルプロテアーゼであることは明らかである。こ

減少は何によるものなのであろうか。この時点の他に，ゲルろ過による分子量が25，000〜

ではまだカテプシソB＆L活性も低いので，

30，000，CM一七ファデックスカラム（pH5）

何らかの別の撥構を考えねばならない。図5に195

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
表2筋ホモジネート中のSuc−Tyr−Met−naphthylamide水解活性の特異性（1）Effects of activators andinhibitors

Final conc．of effector％Activity
lOO

Iodoacetamide

O．1mg／mllOmM

Leupeptin

O．01mM

Ep−475（E−64−C）

O．01mM

Pepstatin

O．lmM

100

Bestatin

O．1mM
lmM

100

Zn2＋
Fe3＋

l mM

Ca2＋

O．01mM

Effector
TrypsininIlibitor（soybean）

Mg汁
Mg汁，ATP

0
100

100

2mM

99

−25，000（95％）＞100，000（5％）
PH5．O eluted by＞0．1M NaClのα−アクチニγの減少にチオールプロテアー
ゼが関与していることがわかる。Nonakaらの研究により，プビバカイン投与後3時間では，lChopped upwith scissorslincubatedwith RPMI−1640（10ml）
forlb at370C

筋形質膜の消失，過収縮，Ca陽性線経の出現が見られZ線も消失していることから，Ca依存性プロテアーゼの関与が示酸され，本研究に

lfiltered throughlens paperより筋注3時間後には細胞浸潤が来ていないこlCOllected by centrifugationとから，筋の崩壊は2段階の機構によって行わ（yield：Ca．12％）
Cultured for24h4

lOmM
5．5−6．0

Soleus muscle（100−120mg）

0100（3）MolecularWeigbt（G−100）

表3 ヒラメ筋より単核細胞抽出の手順

0

lOmM

（2）pHoptimunh）CM−Sephadex C−505れるものと推定した（図6）。

l（RPML1640，10％fetalcalf serum）

次に細胞浸潤を抑制することにより，筋の崩壊を阻止することを試みた。方法は，タンパク合成阻害剤であるシクロへキシイミドを腹睦内に投与し，マクロファージ合成を抑える，というものである。プビバカイン筋注と同時に適量

表4 筋単核細胞内のライソゾーム酵素活性（プビバカイン投与後48時間後）のシクロへキシイミド（2mM溶液，1ml）を

Enzymes Injected／Control

投与し，48時間の筋構造タンパク質を調べたのCathepsins B＆L

181

Catbepsin D

8．5

α一Glucosidase

23．4

α−Galactosidase

15．4が図7である。この場合はヒラメ筋を10倍量のphosphate−buffered saline，0・1％トライト
ン液でホモジナイズし遠心した後，1mlのSDS−bufferで可溶化し同量をSDS−ゲルに流したもので，シクロへキシイミド投与筋では定E−64−Cを同時注入した結果を示す。E−64−C
は，プビバカインによるα−アクチニソの減少

性的に筋の崩壊が抑制されていることが明らかを抑制することがわかる。この事実より，初期ないことが証明された。

196である。組織的にも細胞浸潤がほとんど来てい24．急性筋崩壊におけるE−64−Cの効果

図4

1

2

3

ブビバカイン投与後48時間のヒラメ筋におけるカテプシソBの局在

4

5

6

lst Step（0−12b）7

Damagein plasma membrane
J

Cainfluxinto muscle cellsl＼Dissolution of Z−lines
by Caractivated protease

94

−．＿

＿．

−

■■

●●

一

671一

1
／
Fragmentation of myo丘brils

2nd Step（12−72h）
Invasion of phagocytesJ

43岬●●●●●曽●● ● ● ● ｝

Activation oflysosomalenzymes mainly
derived from mononuclear cells
I

Degradation of struCturalproteins

図6 歳崩壊の2段階機構

30．−
■■

●』

．＿

■■

−

●−

一方，腹水中の単核細胞をとり，そのリセー
トのカテプシン B＆L活性を測定したのが図8である。プビバカインをヒラメ筋に筋注する

20

●

一

一

一・一

一

■−

とただちに腹水中にマクロファージ量が上昇することがわかる。しかしながらこの上昇は図3に見られるヒラメ筋ホモジネート中のカテプシ

図5 プビバカイン投与後3時間の筋構造タンパ
ク質
1＝分子量マーカー，2，3：生食投与筋，4，5：プビバカイン投与筋，6，7：ブビ
バカイン＋lmM E−641：投与肪

ソB＆L活性の時間経過とは異なり，timelagがないことが特徴である。シクロへキシイミドを腹腔に投与することによってこのカテプシソ
B＆Lの急激な上昇が少なくとも1日は抑えられていることがわかる。
197

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

﹁
⁚

昌︼
．

∵
・

﹃M一彗一．−

−
．

一．
叫■二↑

ノ

●

ー

●

11t霊遜猥遠協
l登竜二義●

轟顎灘攣べ⇒斗叫

旦︼
．

1︳雪
．
窃
警
−

■嶋⁚二

鼻等

抜群・−
●

910111213︵￠−−u⊃コ疇凸●u−●dOflqU

7

6

5

4

3

2

1

竜野

＄

t雷

06

−

●

48

72

Hour8aItor叫eCUOn

ヽ
増蟻■

図7

24

幅浄

崩膿

−■

図8

シクロへキシイミド投与による筋崩壊の抑制

腹水中の単核細胞リセートのカテプシソ
B＆L活性○：ブビバカイソ投与ラット●：ブビバカイン＋シクロへキシイミド投与ラット

1：マーカー酵素，2，4，7，12：プビバカ
イン投与筋，3，5，6，13：生食投与対照
筋，8，9，10，11：ブビバカインと同時にシクロへキシイミドを授与したもの

表5 E−64−d投与の効果
EnzymesCatbepsins B＆L

Bupivacaine Bupivacaine＋E−64−dCathepsin D

329±90．467±0．021

0．415土0．032

Non−COllagen P．

40．2土3．8

60．0土5．3＊

181±38＊（U／mg）（％of control）
Mean±SEM，n＝7，＊：p＜0．01，E−64−d300mg／kg／day，p．0．

最後に，E−64投与による効果について述べる。E−64−Cをブビバカインと同時に筋注下がある程度抑制されることが判明した。他のライソゾーム酵素（ここではカテプシソDのみ（1mM）しても，同時に腹腔内に投与（100mg／kg）しても，マクロファージの浸潤，ならをあげた）活性は有意な低下を見ないことかびに標的酵素であるカテプシソB＆Lの活性

特異的に阻害されたことがわかる。

を抑制することはできなかった。そこで，大量投与を試みた。

ら，標的酵素であるカテプシソB＆Lのみが

考察

実験2日前より，餌と共にE−64−d（E−64−Cのプロドラッグ）を300mg／kg／dayとなるよの2通りの経路が考えられる。小さな障害はうに投与し，上述のごとくプビバカインによっ

autophagyによって修復可能（図9，右）であ筋細胞が障害を受けると修復過程として図9て筋の崩壊を起こさせた。その結果を表5に示るが，本研究で明らかにされたCaによる第1

す○大量投与によってカテプシソB＆L活性は約半分に抑制されると共に，筋構造タンノミク

段階の崩壊とそれに続く細胞浸潤を特徴とする
左の経路はしばしば不可逆的な変性を伴うた質の量（非コラーゲンタンバク質，NCP）の低

め，Duchenne塑筋ジストロフィー症など進行198

24．急性筋崩壊におけるE−64−Cの効果

は再生能力があるが，シクロへキシイミドでマ

CellInjury
Ca……‥＝…‥／

クロファージ浸潤それ自体を抑制すると，それ＼CellDeath Autophagy
M〆……………1＼

Phagocytosis Recovery〆／＼

Regeneration Fibrosisに続く再生が遅延する可能性があることで，分解過程を抑えれば抑えるほど再生も遅れることになりはしないであろうか，という点である。
これらは，次の課題である。

図9 筋変性の経路とその問題点
性に筋が変性する疾患のモデルと考えられ，この系を使っての種々の実験が計画されている。
本研究はそのモデルとしてブビバカインによる急性筋崩壊がヒト

Duchenne型筋ジストロフ

ィー症に代表されるdegenerativemyopathyと塀似点を持つことを明らかにした。

文献1）Nonaka，Ⅰ．，Takagi，A．，Ishiura，S．，Nakase，

H．and Sugita，H．：Pathophysiologyofmuscle
丘ber necrosisinduced by bupivacaine hydro−
Chloride，Acta Neuropathol．，in press，1983．
2）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．，Nakase，H．，Tsuchiya，K・，Okada，S．and Sugita，H．：Immunocyto・Chemicallocalization of cathepsin Bin de・

また今回の実験により，筋構造タンパク質のgenerating rat skeletalmuscleinduced by a

完全な分解には，マクロファージの浸潤が必須

localanesthetic，bupivacaine，J．Biochem．，94，

であることを明らかにした。もちろん，筋タン
パク質の分解を抑制するには，マクロファージ

31ト314，1983．
3）Towatari，T．，Tanaka，K．，Yoshikawa，D．
andKatunuma，N．：Purificationandproperties

由来のカテプシソB＆Lを抑制すれば良いの

Ofanewcathepsinfromratliver，J．Bioctlem．，

であるが，ここで1つだけ問題点が残る。筋に84，659−671，1978．

199

25．移植筋の再生ならびにアミノ酸代謝に対するE−64の効果

寺

尾

寿

夫＊

研究協力者 増 野 和 子＊ 大 沢 仲 昭＊＊

研究目的
ジストロフィー筋肉を正常な動物に移植した
場合の移植筋の再生現象を検討することはジストロフィーの成因を知る上で重要であると考えられ，古くから，ジストロフィー筋の正常動物への移植実験が行われてきた1）〜6）。我々は，ジストロフィーハムスターと正常ハムスターとの問に交換移植を行いそれぞれの再生現象を比較すると共に，これに対するE−64−dの効果についても検討した。
また，筋肉が崩壊，再生を活発にくり返しているジストロフィーハムスターでは，蛋白質のみではなく，遊離アミノ酸プールにも変化があると考えられる。そこで，筋肉中，血中，尿中の遊離アミノ酸を判定し，E−64−dの与える影響も検討した。特に，筋蛋白質の崩壊の指標と目されている3−メチルヒスチジンの尿中排泄量の変化に注目して検討した。
方法

1．交換移植筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）および同系列の無発症ハムスター（BIO FIB）の行った（図1）。E−64−dは手術後から毎日定時に100mg／kg／日（5％アラビアゴム懸濁液）を連続2週間経口投与した。対照群は，5％アラ
ビアゴム溶液を同様にして投与した。2週間後にハムスターをsacrificeして移植筋をとり出し上中下の3部分に分け，凍結切片を作製した。上中下それぞれの染色標本につき再生筋線
経の数を数え，その平均値を求めてその筋の再生筋線経の数とした。また各部分の染色標本の中央部にある再生節線経の直径を約200本ずつ
合計約600本測定し，その分布を調べ，またこれら約600本の直径を平均したものをその筋の平均直径とした。
2．遊離アミノ酸の測定
遊離アミノ酸の測定には，絶食後の血祭，24
時間尿，脱血後の大腿四頭筋をサンプルとした。尿，血菜は2％スルホサリチル酸で，大腿四頭筋は0．4M過塩素酸で除蛋白後，高速アミノ酸分析計で各種アミノ酸を定量した。
E−64−d は，1と同量を同様に，2週間連続投与した。
結果および考察
1．移植筋の再生とE−64−dの与える影響

長指伸筋（EDL）を，これに入いる神経をな

ジストロフィーハムスターと正常ハムスターるべく長く残して切り出し，直ちにホストとなの間でEDLの交換移植をした場合，移植後るハムスターの同一部位に固定し，交換移植をの再生過程は，マウス・ラットで自家移植した
場合とおおむね同様であった。すなわち，移植
後3日前後で， 移植筋の周辺部にintermeadi−
ate zoneの形成がはじまり，1週目には，こ＊帝京大学第1内科＊＊東京大学第3内科

201

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

図1EDLの移植後2週目の再生筋のZOneの通過した部分では，外層から内層へ

dys．→COnt．，いずれの場合もアラビアゴム投活発な筋の再生がみられた。しかし，この時には与の対照群より少ない慎向が見られたがその差は有意ではなかった。

まだ移植筋の中心部には変性に陥ったOriginalの筋がCentralzoneとして残存していた。2

再生筋線経の平均直径はそれぞれ9〜10例を週目には，移植筋の中心まで完全に再生筋線経で占められていた（図2）。

平均した値で比べると（図4），dys．→COnt．，
が28・6土1．4FLm，COnt．→dys．が26．2±

正常ハムスターの筋をジストロフィーハムス

1・4J mとわずかに前者の方が大きかった（p＜ク，に移植した場合（cont．→dys．）とジスト

0・01）○特に40四m以上の直径をもつ筋線経

ロフィーハムスターの筋を正常ハムスターには，dys・→COnt．では11．7％であったのに対移植した場合（dys・→COnt．）について2週目

し，COnt・→dys．では5．0％と低かった。

に再生筋線経の数と直径を測定した。再生筋線
経の数は図3に示した通り，両者の間に差はな

また，EL64rd投与群でもCOnt．→dys．より，dys・→COnt．の方が平均直径は大きかっかった。E−64−d投与群では，COnt．→dys．，

たが（pく0．05），E−64−d投与群とアラビアゴ

202

25，移植筋の再生ならびにアミノ酸代謝に対するE−64の効果

漆け

図2

コントロールハムスターのEDLをジストロフィーハムスターに移植して2週後の再生筋
The etfoct oI E−64−d on moan Hbor diamotor

The eHoct oI E−64−d on number ofregenerated muscle libor8．

dys．一・・一・COnt．

Ot regonoはtOd muscleIibors．

COnト一一dys．

︒
−
1
⁝
■

u鴫中壬

1

図3

100

0

1

E−64−d（mg／kg／day）

ュ上土TA⁚

T

0﹂〇一〇∈空っ−〇一こ

こ

100

拍

︽∈1一

T

⁚ − ⊥ − 1 − 1 ・・T −・＋†⁝丁⊥200000800600

巴聖だ−ヱUの⊃∈盲．〇三

0

0

100

0

100

E−64−d（mg／kg／day）

図4

203

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
Theeffectof E・64・donfreeaminoacidsinQuadricepsofdystrophicharnster

画聖＞忘妄⁝∈＼S￠一〇∈u＊＊＊P＜0．05

図5
Theeffectof E・64・don freeamino acidsinurine ofdystrophic hamster＊■＊P＜0．05

図6
ム投与の対照群の間には差は認められなかっって，E−64−d を長期投与することにより，再た。

生筋に与える影響を検討する事が必要と思われる。

以上のことから，ハムスターの交換移植による再生過程において，2週日という初期の再生筋では，筋線経の数，その直径とも，E−64−dによる変化はみられなかった。我々は移植後2ケ月，4ケ月で，dys．→COnt．，COnt．→dys．
の再生筋を比較すると前者が筋線経の数，直径とも優っていることを兄い出している。したが204

2．ジストロフィーハムスターのアミノ酸代謝とE−64−dの与える影響
仕）骨格筋中の遊離アミノ酸
大腿四頭筋中の遊離アミノ酸は，タウリンが極めて多く，グルタミソ，アラニソ，グリシン，カルノシソなども比較的多く含まれる。ジ25．移植筋の再生ならびにアミノ酸代謝に対するE−64の効果
Theeffectof Ei4・don free aminoacidsin plasmaofdystrophicharnster＊♯Pく0．01■＊＊P＜0．05

図7
ストロフィーハムスターでは，コントロールハ

アミノ酸尿（partialamino acidurea）が見ムスターに比べて減少しているものが多かっられた6）。E−64−dを投与するとアミノ酸尿はた。特にセリン，ダリシソ，β一アラニソ，カル
ノシソは有意に減少していた6）。ジストロフィ

軽減する傾向をみせ，1−メチルヒスチジン，3一メチルヒスチジンは有意に減少した（図6）。

ーハムスターにE−64−dを投与するとこれらの3−メチルヒスチジンは筋肉中のアクチン，ミオ

アミノ酸はさらに減少するものが目立づた。しシンの崩壊量を反映しており，ヒトの DucIl−

かし，グルタミン酸，アラニソでは有意な増加

unne型筋ジストロフィーでは筋蛋白あたりのを示した（図5）。この結果は，E−64−dにより3−メチルヒスチジンの排泄が正常人に比べ大き蛋白質，ひいてはアミノ酸の代謝が変化していいと報告されている8）・9）。したがって，今回のることを示している可能性もあり，さらに検討

我々の得た結果は．ジストロフィーハムスターを要する。特に，ヒトでは，アラニソは筋中で分枝鎖アミノ酸の分解に伴い，de novoに合では，筋蛋白質の崩壊が促進しており，それをE−64−dが抑制したとも考えられるので，さら成される重要なアミノ酸であることから7），E−に詳細な検討を必要とすると思われる。

64−dにより筋中での分枝鎖アミノ酸の代謝の何らかの変化を反映しているとも考えられる。

（3）血策中遊離アミノ酸
ハムスターの血渠中には，グルクミン濃度が（2）尿中の遊離アミノ酸

最も高く，次いでアラニソ，グリシン，バリ

ハムスターの尿中に排泄される遊離アミノ酸

ン，リジン，タウリソ，プロリン，スレオニ

はタウリンが著しく多く，次にダルクミソ，グ
リシン，1−メチルヒスチジン，3一メチルヒスチ

ソ，セリンなどが多く含まれていた。ジストロ
フィーハムスターでは，正常に比べ各種遊離アミノ酸は減少しているものが多く，グルタミン

ジン，スレオニソ，セリン，アラニソ，β−アラニンが高濃度に含まれていた。ジストロフィー酸，シスチソ，トリプトファンは有意に減少しハムスターでは，正常に比べ排泄値の高いアミていた。これに反し，タウリンは有意に増加しノ酸が多く，特に3−メチルヒスチジン，β−アラ
ニソ，ロイシン，リジンは有意に高く部分的なていた6）。E−64−dを投与すると全体的に増加する傾向を示し，スレニオン，プロリン，アラ205

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

ニソ，シスチン，チロジンは有意に増加した（図7）。血中の遊離アミノ酸は筋肉だけでなく，肝臓や腎臓の影響も大きく受けるので，
E−64−dによる変化は，これらの諸器官に与えた効果の総計として表われたものと考えられる。

Arcll．Pathリ80，442，1965．

2）Hironaka，T．and Miyata，T．：Transplanta−tion of skeletal muscle in normal anddystrophic mice．Exp．Neuro1．，47，1，1975．
3）Zalewski，A．A．：Survival，reinnervation．

and histochemical maturation of skeletal
mllSCle xenograftsin the nude mouse．Exp．
Neuro1．，58，261，1978．

結語

我々は，ジストロフィーハムスターとコント
ロールハムスターのEDLを相互に交換して移植し，その再生過程におけるE−64−dの効果を検討した。2週目の再生筋では，再生筋線経の数は対照群に比べE−64−d投与群でdys．→
COnt．，COnt．→dys．とも減少する傾向をみせたが有意ではなかった。平均直径では，E−64−dによる影響はいずれの場合もみられなかった。
またジストロフィーハムスターの筋肉中，尿中，血中の遊離アミノ酸に対してE−64−dの与える影響も調べた。ジストロフィーハムスター
では部分的アミノ酸尿がみられた。しかし，
E−64−dを投与すると，アミノ酸尿は軽減し，3−メチルヒスチジンの排泄も有意に減少した。
これは，E−64−d が筋蛋白質の崩壊を抑制している可能性を示している。
文

献1）Laird，J．L and Timmer，R．F．：Homotrans−
plantation of dystrophic and normal muscle．

2064）Wakayama，Y．，Schotland，D．L．andBonilla，E．：Transplantationofhumanskeletalmuscle
tonudemice：Asequentialmorphologicstudy．
Neurology，30，740，1980．

5）大塚正徳，広中哲治，五十里良生，富田雄平：ジストロフィーおよび正常チキンにおける長境側
手取筋の交換移植一組織学的変化筋の発生と分化に関する基礎的研究，江橋班，昭和57年度研究報告書，p．15，1983．
6）寺尾芳夫，増野和子，大沢仲昭：ジストロフィーハムスターと正常ハムスターの筋の交換移植についての研究，筋の発生と分化に関する基礎的研究，江橋班，昭和57年度研究報告書 p．9，1983．
7）Felig，P．：Aminoacid metabolismin man・Annu．Rev．Biochem．．44，933，1975．
8）Mckeran，R．0．，Halliday．D・，Purkiss，P・and Royston，P．：3−Methylhistidine excretionas anindexofmyo丘byillarproteincatabolism
in neuromusclar disease．J．Neurol．Neurosur−
gery．Psychiatリ42，536，1979．

9）Ballard，F．J．，Tomas，F．M．and Stern，L
M．：Increased turnover of muscle contractile
proteinsin Duchenne musclar dystrophy asassessed by3−methylhistidine and creatinine
excretion．Clin．Sci．，56，347，1979．

26．ニューロフィラメント変性と〟−CANP

研究協力者

鎌

杉

田

秀

夫＊

倉

恵

子＊

石

浦

章

一＊

我々はこれまでに，ラット坐骨神経をinVitroでincubateする実験で，Ca2＋依存性にneurofilament（Nf）が変性し，E−64−Cで阻害されることを示し，末栴神経内にCa2＋−
activatedneutralprotease（CANP）が存在すると推測し．immunoreplica法を用いて末梢神経内CANPの存在を確かめた1）〜3）。この

pelletとして得た。その際の上清（可溶性分画）に0〜50％の硫安を加え沈澱を溶液A（50mM

ことより，末稽神経の病的状態である Waller
変性においてCANPが働いてNfが変性すると推測した。しかし，これまでの実験はすべて1〜5mMといった非生理的高濃度のCa2＋を用いて行ってきた。
最近，〃M単位の生理的濃度のCa2十で活性化するCANPの存在が各組織で報告されている4）〜7）。mM単位のCa2＋で活性化される

1単位とした3）・10）。

Tris−HCl pH6．8，0．1M NaCl，0．1mM
GEDTA，5mM2−merCaPtOethanol）に対し透析した。これを粗CANPとして用いた。
CANP活性は

SuCCinyl casein

を基質として，280nmでの吸光度増加1．0（1時間）を
2．Nfに対する粗CANPの作用
Nf（25FLg）に対し，粗CANP（0．05〜0．07
単位（0．1mM Ca2＋），0．15〜0．2単位（lmMCa2＋））を30〜350Cで2時間，以下の各条件で作用させた。①Ca2＋−free，pH6．8，②50FLM，
0．1mM，lmMのCa2十を含む，pH6．8，③50pMCa2十十0．1mg／mlE−64−Cll）・12）。Ca2＋CANPをm−CANP，fLM単位のCa2＋で活性化されるCANPをp−CANPとする5）。末梢神経内にも生理的濃度のCa2十で活性化され濃度は小川の方法13）で計算した。また溶液Aは
再留水（Ca2＋濃度10￣7〜10￣8M）を使用している。

るFL−CA甲Pが存在し，NfのturnOVerに関与しているのではないかとの推測のもとに以下の実験を行った。

Schlaepfer8），森ら9）の方法の変法でNfを抽出した3）。基本的には低張液を用いて抽出する方法である。最後に超遠心を行い，Nfを

3．〝−CANP抽出（ウサギ骨格筋）とNfへの作用
ウサギ骨格筋を溶液B（20mM Tris−HCl，
pH 7．5，0．25M sucrose，5mM EDTA，lmM EGTA，2mM2−merCaptOethanol）
でhomogenize後，7，000rpm，15分遠心。上活を溶液C（20mMTris−HCl，pH7．5，1mM
EDTA，1mM EGTA，2mM2−merCaptO−
ethanol）で平衡化したDE52に吸着させ，0〜0．4MのNaClでgradient をかけた溶液
CでChromatographyを行った。FL−CANP＊国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部のfraction／を集め0〜60％の硫安沈澱後，溶液D（20mMTris−HCl，pH7．5．0．1MNaCl，

方法

1．NetlrOGlament（Nf）の抽出と粗CANPの抽出
LWistar系のオスのラット坐骨神経よ り207

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

2−merCaptOethanol）

粗CANPは，50FLM，0．1mM．1mMの各で平衡咋したSephadex G−150chromatog−
raphyを行いFL−CANPのfractionを集め

Ca2＋濃度で活性があり，Nfを変性させた。

た。活性測定にあたっては，SuCCinyl caseinが最も感受性が高かった。ルーCANPが作用しのかわりに質として用い，366nmでの吸光度の増加をもていると思われる50／JM，0．1mM Ca2＋濃度
では，160E，68E，200Kの順に変性し，m−って測定した。

CANPが作用しているlmM Ca2＋の場合はNf（60fLg）に対し，この p−CANP20pg（366mmで吸光度0．49の増加）を，0．1mM

200Kも160Kと同程度変性した（図1）。こ（最終Ca2＋濃度）Ca2＋存在下に，30〜350C

生じなかった（図2）。

で2時間作用させた。一万0．1mM Ca2＋と共2．β−UANP抽出（ウサギ骨格筋）とNfへの作用

2mM EDTA，5mM

Sulfonylamide azocaseinを基に0．08mM／lE−64−C存在下，または，Ca2＋−

Triplet（200K，160K，68Ⅹ）のうち160K

れらの変化は，Ca2十一free，E−64，C存在下ではウサギ骨格筋homogenateをDE52chr0−

freeの状態でも作用させた。

matography，Sephadex G−150chromatog−

4．Nfに対する精製 naturalJトCANP（boYine
liYer），精製deriYedJトCANP（cbickemskeletal
muSCle），精製 m−CANP（chickem skeletal
mⅦSCle）およびtal血epsinB（ratliYer）の作用

rapIlyにかけた結果は図3に示した。この結果得られた〃−CANPをNfに作用させると，Ca2十存在下に，160E，68K，200KのJt酎こNfは変性した。この結果は未栴神経の粗CANP作用させた。Nfは溶液Aに対し透析してある。

を50pM，0．1mMCa2＋存在下にNfに作用させた場合の結果と同じである。Nf変性はNaturalFL−CANPは0．2単位（0・1mMCa2＋），

E−64−C存在下，およびCa2＋．freeの状態ではderivedFL−CANPは0．05〜0．1単位（0・1mM生じなかった（図4）。

Ca2＋），m−CANPは0．3単位（lmM Ca2＋）を加え，Ca2＋−freeの場合，Ca2＋存在下の場

3．Nfに対する精製酵素（natnralJ卜CANP，de・合，30OCで一時間incubateした。Cathepsin

Naturalp−CANPとderivedjL−CANPの場合，Nfは160K，68K，200Kの順に変性す

Nf（30邦）に対し，精製した上記各酵素をB14）・15）は0．2FLg加え30OC，1時間incubate
した。さらに対照としてNfのみを，Ca2＋存在下（0．1mM，lmM）で30OC，6時間in−Cubateした。

5．Gelelectropboresis

2，3，4の実険のincubation中，各SamPle
50JJlを経時的にとり出し，50J 1の溶液E（4％SDS，0．16MTris−HCl，pH6．8，10％（vol／vol）glycerol，10mM2−merCaptOetha・nol）で溶解し，1000C，5分，加温した。各7〜
15FLlのSampleを7．5％sodiumdodecyl
Sulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis
にかけ16），Coomassie BrilliantBlue RT250で染色した。Gelは，densitometerでスキャ
ンした。
結

果

1．Nfに対する粗CAⅣPの作用
208

rivedp−CANP，m−CANP，CathepsinB）の作用る。Naturalp−CANPの場合でも90分以上のincubationでは，200Kが68K以上に変性する。一万m−CANPやCathepsin Bの場合
は，短いincubationでは，変性の順は〃−
CANPと同じであるが，長くなると200Kが68K以上に変性する。すべての酵素に対し，160Kが最も感受性が高い（図5）o
Nf自体は，Ca三十存在下0．1mM，lmMに
6時間のincubationでも変性はみられなかった。
考察

以上の実験結果より，末梢神経内に50′JM，0．1mMのCが十で活性化LNfを変性させ，
Ca2＋−freeの状態，ET64−C存在下では活性のない酵素，つまり〃−CANPが存在することがわかった。′エーCANPが生理的状態でNfの26・ニューロフィラメント変性とrCANP

図1Nfに末棺神経より抽出した粗CANPを作用させた結果。Coomassie染色したGelをdensitometerでSCanningL，各incubation時間でのactinに対するtripletの割合を％で示した。上はCa2＋1mM，中は0．1mM，下は50FLMの場合である。すべての場合に160Kが最もはやく変性する。

209

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
1

2

3

4

5

＄

7

8

9

10

職、

一一・・｝←■一■−嶋⁚u 暮l川 蝉尊皇

C㌔j−f，ee Nf

ふ一山

50J，mC㌔十

■｝嶋

一→−

如・ぷ

50um Ca2十0・1mg′′ml E−64−℃

図2

Nfに末梢神経より抽出した粗CANPを下記の条件で作用させた結果のSDSpolyacrylamide
gelelectrophoresis。Ge17・5％。CBBR−250で染色。1，2，3；Ca2＋−free。5，6，7；50pM
Ca2＋08，9，10；50FLMCa2＋＋0．1mg／mlE−64−C。各グループの3本は左から右へ0，60，90
分のincubation時間を示す。4はNfを示す。矢印は上から下へ200K，160K，68Eのtripletを示す。
A

0

凰3

210

10

20

30

40

50

00

70

80

90

A：DE52chromatographyでのCANP活性（●）と，蛋白濃度（◎）を示した。横軸はfractionnumberを示す（10ml）。CANP活性は0〜0．4MNaClgradientをかけた2，000miの溶液C（本文参照）で2峰性となる。PrCANPはNo．25〜33に，m−CANPはNo・55〜70に出現する。

26．ニューロフィラメント変性と〃−CANP

8
00366

3
0
2
0
1
0
0

●−● dNV0−〇三；；0く

■3

20

3

15

0
3

10

■3

5

2

0

Fracuon H0．

C0︵ボ︶h1−＞；OV

100

300
Ca2十

500

700
レM）

図3、B：SephadexG−150chromatograpllyでのCANP活性（●）と蛋白濃度（★）を示した。横軸はfractionnumberを示す（2ml）。jL−CANPはNo．13〜25に出現する。
C：A，Bで抽出したfL−CANPとm−CANP（DE52でのNo．62）の各Ca＋濃度における活性の比較。横軸はCa2＋濃度を示し，縦軸はCANP活性をmaximumの場合の％で示した。FL−CANPは50FLM Ca2＋，m−CANPは520FLM Ca2＋がhalf
maximum となった。
211

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

I↓

200K−■■′

■

11↓

・

一一

縛蝉麟鯛摩｝鯵

，…・尊さ＿

．γ．j

ー

貞V

K
8

5

1

212

2

3

4

6

7

8

9

101112

図4

Nfにウサギ骨格筋より抽出したFL−CANPを作用させた結果のSDSpolyacrylamide gelelectrophoresis。1，2；Ca2＋−free，0，60分のincubation。4，5，6，7，8；0．1mMCa2＋存在下，左より0，15，30，45，60分のincllbation。9，10，11，12；0．1mMCa2＋＋0．08mM／l
E−64−C存在下，左より0，30，60，120分のincubation。3；・ラット脊髄より抽出したNf。
矢印は上から下へ200K，160K，68Kの各tripletを示す。NfはCa2＋存在下に160E，
68K，200Kの順に変性した。

園5A（Chicken＄keletalmuscleからのderivedp−CANP，0．1mMCa2十）．B（bovineliver・⇒からのnaturalFE−CANP，0，1mMCa2＋），C（Chickenskeletalmuscleからのm−CANP，
lmMCa2＋），D（ratliverからのCathepsinB）をNfに作用させた結果で，上はSDS
gel polyacrylamide gel electrophoresis，下はそれのdensitometerでのスキャンの結果である。左の横軸はincubation時間を示し，矢印は上から下へ200K，160K，68Kの各tripletを示すO 下の境軸はincubation時間を示し，縦軸はincubationOの時の各
tripletの量を100％として計算してある。
すべての酵素に対し160Kが最も感受性が高い。

26．ニューロフィラメソト変性とrCANP

鼻剥離一輪轡∴ヂ叫∴ ∵川

le棋濁す払〜

二
葱渚

0

0

15

16

a0

30

45

O aO

80mln

45

eOllh

30

45

0

も

〇〇

15

〇〇椚h

30

45

60mh

A

lOO
鴬
80

60

40

20
0
0

15

60

0

両n．

30

60

90

120
mjn

D

C

0

15

30

45

213

Ⅲ．細胞・組織レベルでの効果

turnoverなどに関与していることが推測され文る。FL−CANPはNf tripletのうちでは160Kを最も強くはやく変性させ，以下68K，200Kの順であった。この事はウサギ骨格筋より抽出

献1）Kamakura，K．，Ihara，Y．，Sugita，H．and
Toyokura，Y．：Inhibition

byE−64−COfneuro一したrCANPをNfに作用させた場合と同様の結果であった。

缶lamentdegenerationinducedbycalciumions．
Biomed．Res．，2，327−329，1981．

さらに精製した，naturalfL−CANP（bovine2）l（amakura，K．，Ishiura，S．，Sugita，H．and
Toyokura，Y．：IdentifiCationofCaLaCtivatedliver），derived FL−CANP（chickenskeletal
muscle），m−CANP（chickenskeletalmus・

neutralprotease（CANP）intheratperipheral
nerve，Biomed．Res．，3，91−94，1982．

Cle），Cathepsin B（ratliver）をNfに，作3）Eamakura，E．，Ishiura，S．，Sugita，H．and

用させた場合，すべての酵素に対し，triplet

Toyokura，Y．：IdentificationofCa2＋−aCtivatedのうち160Kが感受性が高かった。ダーCANPと m−CANP やCathepsin B では 200Kに対する作用が異なるような結果が得られているが，naturalFL−CANPでも長期incubation
では200Kも160Kと同程度変性し，また，
m−CANP，CathepsinBでも，短期incuba−tionでは160K，68K，200Kの順で変性する
ことから，200Kに対する差はNfと酵素との量的な比のためであって木質的なものではないと考える。
最近，Willardら17），Sharpら18）によりNfの構造について68Kがcoreで，200Kは周囲に位置しているといった報告がなされている。160Kについては明確でないが，Sharp

neutralproteasein the peripheralnerve andits effects on neurofi1ament degeneration，J．
Neurochem．，40，908−913，1983．
4）Mellgren，R．L．：Canine cardiac calcium−
dependentproteases：Resolutionoftwoformes
Withdifferentrequirementsforcalcium，FEBS
Lettリ109，129−133，1980．

5）Suzuki，K．，Tsuji，S．，Kubota，S．，Kimura，T．
andImahori，K．：LimitedautolysisofCa2＋−

activated neutral protease（CANP）changes
its

sensitivity

toCa2＋ions，J．Biochem．

（Tokyo），90，275−278，1981．
6）Murachi，T．，Tanaka，K．，Hatanaka，M．and
Murakami，T．：Intracellular Ca2＋−dependent

protease（Calpain）andits high−mOlecular−
Weight endogeneousinhibitor（calpastatin）．
Adv．Enzyme Regu1．，19，4077424．1981．

ら18）によれば周囲に位置しているらしい。我々

7）Kishimoto，A．，Eajikawa，N．，Tabuchi，H．，の実験結果からは，160Kが最もproteolysis

Shiota，M．and Nishizuka，Y．：Calcium−

を受けやすい位置に存在していると推測される。

dependent neutral proteases，Widespread

我々の方法で抽出したNfは，Ca2＋存在下

OCCurrenCe Of a species of protease active atlowerconcentrations of calcium，J．Biochem．
（Tokyo），90，889−892，1981．

で6時間incubateしても変性しなかった。こ8）Schlaepfer，W．W．：Studies on theisolationの結果はNfに結合したCANPの存在を否定

and substructure of mammalian neurofila−

するものではない。この問題に関してはさらに
形態学的検討が必要と思われる。

ments，J．UltrastruCt．Res．，61，149−157．1977．
9）Mori，H・and Kurokawa，M．：Morphological
and

謝

辞

biochemical

characterizationofneuro一別amentsisolated from the rat peripheral
nerve，Biomed．Res．，1，24−31，1980．

E−64−Cを提供して下さった大正製薬総合研

10）Ebashi，S．and Sugita．H．：The role of究所花田和紀博士，naturalp−CANP（bovine
liver）を提供して下さった東京大学医学部生

Calciumin physiological and pathological

化学教室鈴木紘一助教授，CathepsinBを提供して下さった徳島大学医学部勝沼信彦教授，
野田隆博士に深謝いたします。
214

PrOCeSSeSOfskeletalmuscle．inCurrentTopics
inNerveand Muscle Research（Aguayo，A．J．
and Karpati，G・，eds），P．73−84，Excerpta
Medica，Amsterdam−0Ⅹford，1979．

11）Hanada，K．，Tamai，M．，Yamagishi，M．，

26．ニューロフィラメソト変性と〝−CANP

Ohmura，S．，Sawada，J．and Tanaka，Ⅰ．：Isola−

Katsunuma，N．：Susceptibilities of various

tion and characterizationofE−64，aneWthioI

myo丘brillar proteins to cathepsin B andproteaseinhibitor，Agric・Biol・Chem・，42，523−

morphologicalalterationofisolatedmyofibrils

528，1978．

by this enzyme，J．Biochem．（Tokyo），90，371−

12）Hanada，K．，Tamai，M．，Ohmura，S．，Sawada，379，1981．

J．，Seki，R．and Tanakn，Ⅰ．：StruCture and16）Laemmli，U．E．：Cleavage of struCtllral

Synthesis of E−64，a neW thioI proteaseproteins during the assemblyof the head ofinhibitor，Agric．Biol．Chem．，42，529−539，1978．

bacteriophage T4，Nature，227，680−685，1970．

13）Ogawa，Y．：The apparent binding constant17）Willard，M．andSimon．C．：Antibodydecora・

Of glycoletherdiamine・tetraaCetic acid fortion ofneurofi1aments，J．Cell Bio1．，89，198−

Calcium at neutralpH，J．Biochem．（Tokyo），
64，255−257，1968．

205，1981．

18）Sharp，G．A．，Shaw，G．and Weber，E．；

14）Towatari，T．andKatsunuma，N．：Crystaliza・Immunoelectronmicroscopicallocalization oftionandaminoacidcompositionofcathepsin

thethreeneuroGlamenttripletproteinsalong

B fromratliverlysosomes，Biochem．Biophys．

neuroRlamentsofcultureddorsalrootganglion

Res．Commリ83，513−520，1978．

neurones，Exp．CellRe5．，137，403−413，1982．

15）Noda，T．，Isogai．K．，Hayashi，H．and

215

27．ヒト脳Calcium−ActivatedNeutralProteaseの部分精製およびヒト脳Mydn蛋白の分解に対するE−64−aの抑制効果
官

武

正＊

研究協力者 柳 澤 勝 彦＊ 佐 藤 修 三＊

はじめに
多発性硬化症（MS）を中心とした脱髄性疾
患の多くは，その発症機構において不明な点が多いが，組織化学的，生化学的研究により，MS脳脱髄巣内におけるミニリン塩基性蛋白（BP）の減少と急性期脱髄巣周囲における酸性プロテアーゼの上昇が明らかにされている1）。また，
BPは，賦活化されたマクロファージより分泌される中性プロテアーゼによっても分解されることが報告されている2）。一方，ミェリンは内因性にプロテアーゼを有しているとの報告があり3），我々は既に精製ミニリン中のCalcium−
Activated Neutral Protease（CANP）−likeenzymeがBPを選択的に分解すること4），および，本酵素活性がMS患者脳で上昇していること5）を報告した。今回，脳内CANPの部
分精製を試み，その酵素学的特性およびヒト脳
精製ミニリンに対する作用につき検討した。
方法

1．CANP部分精製
中枢神経疾患以外で死亡し，剖検後−800C
で保存されたヒト脳を材料とした。4アCで解凍
後脳表面の軟膜，血管を除去し，石滑らの方法6）に準じCANPを部分精製した。
20mM sodium bicarbonate−lmM
EDTAとhomogenateを作り，10，000×g，15＊新潟大学脳研究所神経内科

分間遠心し得られた上清を，lN酢酸にてpH
4・9に調整後，再び10，000×g，15分間遠心し得られた沈漆を，BufferA（20mM Tris−HCl，0．1M NaCl，5mM EDTA，10mM 2−
mercaptoethanol含有，pH7．0）に溶解させ，87，000×g，60分間遠心した。得られた上清を
BufEerAにて平衡化した DEAE−Cellulose
COlumnに吸着させ，NaClO．lMから0．8Mのlinear gradient下に溶出させた。活性分
画を Micro−Thin−Channel Ultrafiltration
System（Amicon）にて濃縮後，Buffer B（20mM Tris−HCl，0．1M NaCl，5mM
EDTA，10mM2−merCaptOethanol含有，
pH7．5）にて平衡化したtJltrogel AcA 34
COlumnにてゲル炉過し，さらに，Buffer B
にて平衡化したI）EAE−Cellulose column に吸着させ，NaClO．lMから0．6Mのlinear
gradient下に溶出させ，部分精製を終了した。
2．CANP活性測定法
石浦らの方法6）に従い，alkali−denatured
CaSein（Hammersten）を基質とした。
0．24％alkali−denatured casein，25mM2−
mercaptoethanol，0．1M sodium glycero−
phosphate−HCl（pH7．0）溶液500FLlに検体
50JJlを加え，10mM CaC12の存在下，非存在下で30OC，60分間incubate した。10％
trichloroacetic acid500fLlを加え反応を止め，40C，60分間静置後，3，000×g，15分間遠心し，上清の280nm吸光度を測定した。280nm
吸光度1．0の上昇を酵素活性1単位とした。
217

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果＞ヒ≧トUく山王＞NN山

40

60

TUBE NUMBER

図1

0 804
00
0のN山OZ＜山∝○∽dq≡．⁝．．＝

つ≡＞一N⊃︶

20

0

80

2．5

5J）

日Ml／TUBE）

15

10

Ca（mM）
図3

Caイオンの酵素活性への影響
Caイオン以外の条件は図2と同じ。
2

0J

8

00

4

W

OのNuUZ＜山∝○∽山＜2回日のDEAE−｛ellulosecolumnchromatog・
raphy の elution profi1eを示す。20mM
Tris−HCl，0．1MNaCl，5mMEDTA，10mM
2−merCaPtOethanol含有（pH7．5）bufferにて平衡化した DEAE−Cellulose column にUltrogel後のCANPを吸着させ，NaC10．1Mから0．6Mのlinear gradient下に100mlで溶出させた。

10−610−510−4、E−64−a（M）
図4 E−64−aの酵素活性への影響
条件は図2と同じ01
0．

〇∞NuU1き﹁凸∝OSm＜

010−81d−7位を作用させ，1％TritonX−100含有10mM
Tris−HClbuffer（pH7．5）内で5mMCaC12，
E−64−a（10−4M，10￣5M），lmMEGTAの存

6．5

7β

乙5

8JO

8．5

在，または非存在下に30OC，18時間incubate
した。ミニリン蛋白は凍結乾燥後，脱脂し，
SDSqpolyacrylamide slab gelにて分析しPH
図2 pHの酵素活性への影響
0・24％Alkali−denatured casein，25mM
2−merCaptOethanol，10mM CaC12，0．1M
SOdium glycerophosphate含有（pH7．0）のStandardassaymixture500FLlに検体50FLl
を加え，30OC60分間incubateした。

た。
結

果

2回日のDEAE−Cellulosecolumnのelu−
tionprofileを図1に示す。CANP specificactivity2，099unit／mg まで精製した。本酵

3．ヒト脳ミエリン蛋白に対する作用

素の至適pHは7．0であった（図2）。本酵素
活性は基質溶液中のカルシウムイオン濃度にNortonらの方法7）に従いヒト脳よりミニリ

依存しており，酵素活性はカルシウムイオソンを精製した。精製ミニリンを700Cで5分間

5mM以上でほぼplateauを形成した（図3）。

熱処理し内因性プロテアーゼを不活化した後8），

E−64−ai羊本酵素のカゼイン分解作用を抑制
し，その抑制率はE−64−alO￣5Mで約50％

ミニリン蛋白200FLg当たり，CANP O．04単218

27・ヒト脳Calcium−ActivatedNeutralProteaseの部分精製およびヒト脳Myelin蛋白の分解に対するE−64−aの抑制効果
・一一

94K

−〉一

68K

w去＝＝＝＝＝‥伯K

−■

30K

PLP−■l■■■■■■■■BP亨雷亨雷雷￣21K■−14．3K

1

2

3

4

5

6

7

図5Incubation前後のミェリン蛋白のSDSqpolyacrylamideゲル電気泳動図を示す。
ヒト脳より精製したミェリン蛋白（200邦）に，CANP（0．04単位）を作用させ10mMTri＄−HCl（pH7・5），1％TritonX−100中で，300Cにてincubateしたものo Lane1−6；総蛋白量20jLg。Lanel；incubation前。Lane2−6；18時間incubation。Lane2；CANP無添加。Lane3−6；CANP添加。Lane3；
5mMCaC12添加。Lane4；5mMCaC12，10−5ME−64−a添加。Lane5；5mM
CaC12，10￣4ME−64−a添加。Lane6；lmMEGTA添加。LaneT；mOlecular
Weight standard。W；Wolfgram protein，PLP；prOteOlipidprotein，BP；
basic protein。

であった（図4）。ヒト脳精製ミェリンとのincubationの結果，本酵素はミェリン蛋白のうちBPを選択的に分解し，PrOteOlipidpro−

脱髄機構に何らかの役割を担っている可能性が考えられる。今回，E−64−aがCANPのBP

tein，Wolfgramproteinの有意な変化は認め

分解作用を抑制したことは，E−64−aの脱髄疾患におけるミユリソ崩壊抑制効果の可能性を示られなかった（図5）。また，その分解作用は，酸するものと考えられる。

10L4MEq64−a，lmMEGTAによりはぼ完
全に抑制された（図5）。

文献1）Einstein，E・RリCsejtey，J．，Dalal，K．B．，

考察

Adam，C・W・M・，Bayliss，0・B・and Hallpike，
J・F・：Proteolytic activity and basic protein

BPは中枢神経ミニリンの主たる構成蛋白でlossinandaroundmultiplesclerosisplaques：

あり，その抗原性はMSをはじめとした脱髄Combined biochemical and histochemical

性疾患において重要視されている。MS脳に関

Observation，J．Neurochem．，19，653−662，1972．

する組織化学的，生化学的研究により脱髄巣内でBPが減少していることが確認されている。

2）Cammer，W．，Bloom，B．RりNorton，W．T．

一方，脳内におけるCANPの局在，役割は不明であるが，BPを選択的に分解する特性より，

andGordon，S・：Degradation ofbasic protein
in myelin by neutral proteases secreted by
Stimulated macrophages：A possible mecha−
nism ofin且ammatory demyelination，Proc．

219

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
Natl．Acad．Sci．USA，75，1554−1558，1978．
3）Riekkinen，P・J・andClausen，J・：Proteina竺e6）Ishiura，S．，Murofushi，H．，Suzuki，K・and
Imahori，K．：Studies of a calcium−aCtivatedactivity of myelin，Brain Res．，15，413−430，

neutralprotease from chicken skeletalmus・

1969．

cle．Ⅰ．Purification and characterization，J．

4）Sato，S．andMiyatake．T．：Degradation of
myelin basic protein by calcium・aCtivatedneutralprotease（CANP）一likemyelin andinhibition by ET64

enzymeinanalogue．

Biomedical Resり3，46ト464，1982．

Biochemリ84，523−528，1978．

7）Norton，W．T．and Poduslo，S．E．：Myelina・
tionin rat brain：Methodofmyelinisolation，
J．Neurochem．，21，749−757，1973．
8）Sato，S．，Quarles，R．H．and Brady，R．0．：

5）Sato，S．，Jolmson，D．，Quarles，R．H．and

SllSCeptibilityofthemyelin−aSSOCiatedglyco・Brady，R．0．：Quantitation of the myelin−

PrOteinandbasicproteintoaneutralproteaseassociatedglycoproteininnormalandmultiple

in highly purified myelin from human andrat brain，J．Neurochem．，39，97−105，1982．

SClerosisbrain，Abstract12thWorldCongress
Of Neurology，p．429，1981．

220

Ⅳ

個体レベルでの効果

28．筋ジストロフィーハムスターの治療経過観察における新しい視点………………宮武

正−核磁気共鳴法の応用−
29．E−64投与の心筋症ハムスター（UM−Ⅹ7．1）心筋に与える影響についで…‥柴田宜彦

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）
一研究分担−（1）血液，尿，筋肉の生化学分析

大関 正弘（2）プロテアーゼ活性に及ぼす効果①

CANPに対する効果（動 力テプシソに対する効果

正弘
勝沼 信彦

田中閑田原
杉埜大和市

夫哉弘昭明
秀征正

（3）組織学的および組織化学研究紘一………………………・票盃（5）筋ガングリオシドに対する影響

官武正（6）肝薬物代謝に及ぼす影響

北川 晴雄（∋ 骨格筋の病理（∋ 心筋の病理（4）筋エネルギー代謝に及ぼす影響

28．筋ジストロフィーハムスターの治療経過観察における新しい視点−核磁気共鳴法の応用−

官

武

正＊

研究協力者 桑 原 武 夫＊

はじめに進行性筋ジストロフィー症の原因の追求と治療薬の開発には病理学的あるいは生化学的手法
で研究がなされているが，我々は核磁気共鳴〔NuclearMagneticResonance（NMR）〕を
この分野の研究にとり入れ新しい観点から筋ジ
ストロフィー症の経過を追跡することを試みた。
今回は31Pを対象核種とした31P−NMRを利用し筋組織のエネルギー代謝を観察した。

研究方法
1．材料
生後120日の正常なハムスター（BIOFIB）

湯 浅 音巨 彦＊＊

を3％Halothane麻酔下で腰部および足関節部を固定L Gastrocunemiusmuscle表面にSurfacecoil（6mm？）を固定した。
2．方法
装置は磁場強度6．3Teslaの SuperCOn−
ductingmagnetを看する Surface coil方式のJEOLFX270FTTNMR spectrometerを用いた。
31Pの共鳴周波数は109．19MHzであり，900
パルス巾を20p秒，Pulse repetitiontime
を2秒，積算回数を60回と設定した。
今回我々は吸入麻酔下のハムスターの坐骨神経を針電極を用い表皮上より電気刺激を加える
ことにより下肢筋肉を強制的に収縮させた。すなわち刺激としてpulse巾0．2msec．刺激強Train pulse
Intensity：80volt

Electric
Stimulator

Pulse width：0．2msec．
Frequency：50Hz．
Duration：40sec．

31p・NMR spectrum
図1Diagram of experimental system＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立小千谷療養所神経内科
223

Ⅳ 個体レベルでの効果

轟．日高日日l日日t．．．．l…tI．．．．l．．．tl…．l日日t…．l日日l日日l日日1．．．．1．．日l日．．1

図2」日，，I．…l．…l日．．Ⅰ…．Ⅰ．．．．hJ日．1日．．t日日l日日l．日．l日日t日日l日日L．．．し．」J

31P−NMR spectrum Obtained from gastrocunemius muscle of BIOFIB（A）and
BIO14．6（B）series hamster．

度80V，周波数50Hzの矩形波によるteta−の変化を示してある。各々のnus刺激を40秒間加えることによりGastro−
cunemiusmuscleにisometriccontraction

れぞれ刺激前と刺激後16分までの2分間ずつ60を起こさせた。
Gastrocunemius muscle

上に固定したtractionの結果PCrが減少し，それがやがて回復を示し，Piの増加が経過とともに減少し

surface coilによりハムスターの下肢筋に起て来るのが認められる。また，Piが細胞内pHこる高エネルギー燐酸化合物のbreakdownの酸性化に伴わない高磁場側（図の右側）にわ
ずかにSbift L回復に伴いもとの位置に復帰

およびrecoveryを31P−NMR

によって経時

SPeCtrumはそ

回の積算波型である。40秒間の tetanic con・するのが認められる。

的に観察した。
結β−ATP，PCr，SugarP，Piの推移を安静時に対する割合で追ってみたのが図4に示して

果

安静時筋組織よりの31P−NMRspectrumを
図2A，Bに示す。すなわち，BIOFIBからのものを図2Aに，BIO14．6からのものを図2Bに示してある。

ある。PCr，β一ATPは運動後減少し，徐々に回復して来るのが認められる。また，Sugar
P，Piは運動負荷後いったん増加するが安静によりすみやかに回復して来るのが認められるo

わち右から左へβ−ATP（peakl），α−ATP

PCr／β−ATP，PCr／Pi，PCr／sugarP の比の変化を追跡したものを図5に示してある。

（peak2），γ−ATP（peak3），Creatine

Energy reservorである

両者とも6本のpeakが分離される0すな

phosphate（PCr）（peak4），無機燐（Pi）（peak5），Sugarphosphate（peak6）が識別される。また，HMPA（Hexamethylphos−
phoramide）はexternal standard

として

surfacecoilの裏面に毛細管に封入して設置したものであるが，これにより各peakの高さを補正し，値の変化を基準状態からの変化率として追跡することを意図としたためである○
図3に筋収縮前後の31P−NMR spectrum
224

PCr

と

energyconsumptionの結果であるPiの比は筋収縮により急激に減少し安静により急速に回復して来るのが認められ，また，PCrとSugarPの比は急激に減少したのち徐々に回復し，さらに両者ともenergy reservor

であるPCrとβ一ATPの比は収縮によりわずかに減少し，回復も緩徐であるのが認められる○

28．筋ジストロフィーハムスターの治療経過観察における新しい視点

−

∫

1

−

√

4
1

農
L

ハ

什

ノ
l

〃

t

了

hn−

■

■

1

．
■
・

−

J
−

A

−

1

−

．

−

−

﹂

−

−

十︑⁚l∵∵∴工∴二

．
J
H
J

二

H

l ■ ■ ■ 見 川 1 川 W ． 1 日 川 岬 ． ・ ． ■ ▲ 日 日 ‖ 什 川 折．
ル，l此IHふ‖I．…hJ…．I．．Hl．…l．日．l日日l…．L．l日日l日．．t日日I…．！．．．．I．…l

図3

Sequence of31P−NMR spectra before and after muscle contraction．

225

Ⅳ 個体レベルでの効果

0−
図4

2−4−

6−8

−10−12−14−16両n．

Changesof PCr，β−ATP，Sugarphosphateand Pi of gastrocunemius muscle after
COntraCtion．

226

28．筋ジストロフィーハムスターの治療経過観察における新しい視点
ratio

CONTROL

図6

DYSTROPHY

Values of the proton Tl time ofquadriceps muscle from normal anddystrophic hamsters．

考察

NMRを骨格筋とりわけ筋ジストロフィー症筋の研究に応用した例としてはChalovich
ら1）のDystrophicchickenでのbiopsy筋の31P−NMR spectrumのPiとPCrの間のPhosphodiesterの部位に特異なpeakがあり，そこに，Serine ethanola叫ne phos−
Phodiesterが増加していることの報告，さら
0

−

2

−

4

ー6

−

8−10−12−14−16両n．

にChangら2）による生後1年目のDystrophic
Cllicken筋で水プロトン緩和時間が筋ジスト

図5

ChangesofPCr／β−ATP，PCr／Pi and
PCr／Sugar P ratio before and after
muscle contraction．

ロフィー症群に延長を認めたという報告がある0臨床的にはDuchenne型ジストロフィー症筋3）やMitochondrialmyopathy筋4）でのエネルギー代謝5）の研究がなされている。また筋ジストロフィー症ハムスターに関しては，図6に示す如く，我々が生後100日目のBIO se−riesのハムスターでジストロフィー症群にお227

Ⅳ 個体レベルでの効果

いて水protonTl時間がコントP−ル群に比して延長していることを既に報告している6）。
今回我々は31P−NMRを利用して筋組織のエネルギー代謝をin vivoで観察したわけであるが，この分野ではDawson，Wilkie7）・8）
らによりカェルの別出筋で我々と同様の研究がなされている。しかしながら，これらは我々と異なり低温濯流下でのinvitro の実験であり，常温下での我々の実験と比べ生理条件下と言うにはいささか問題があろうと思われる。
人を研究の対象としたものとしてはTopicalmagnetic resonance（TMR）を利用しての研究が3）−5）・9）−11）行われているが，これらは長時間定常条件下での観察，さらに各種薬物の負荷や薬効検定にはおのずから限界があるものと思われる。
今回我々はSurface coilを使用し，in vi・VOで筋肉からの燐酸化合物を観察したが，我々の症例の筋ジストロフィー症ハムスター（B
IO14．6）ではChalovichら1）がDystrophic
Chickenの胸筋にて認めたPhosphodiesterのPeakは認められなかった。このことが，動物の種の相違に基づくものであるのか，
Chalovich らの実験1）が，in vitroのものであることに由来するのか，あるいは，成熟のStageの相違によるものか，今回の我々の実験では明らかでないが，いずれにしろ，成長の段
階を追っての燐酸代謝の研究も今後の課題であると考える。
我々はまた，安静時のみならず筋肉の収縮から回復に到る燐酸化合物の動態を経過を追って観察したが，今後は筋ジストロフィー症ハムス
ターにおいても同様の観察を行い，治療薬の効果判定，副作用の監視等に応用することも試みたいと思っている。

文

献1）Chalovich，J．M．et al．：Phosphodiestersin
muscular dystrophies，Ann．N．Y．Acad．Sci．，
317，649−668，1979．

2）Chang，D．et al．：Nuclear magnetic reso−
nancestudyofmusclewaterprotonsinmuscu−
lar dystrophy of chickens，J．Cell．Physiol・，
107，139−145，1981．

3）Newman，R．J．etal．：Nuclear magnetic

resonance studies of forearm muscle inDuchenne dystrophy，Brit．Med．J．，284（6322），
1072−1074，1982．

4）Chance，B．etal．：Mitochondrialreguration
ofphosphocreatinine／inorganic phosphate ra−tiosinexercising human skeletal muscle，Agated31Pnmrstudy，Proc・NatL Acad・Sci・
USA，78（11），6714−6718，1981．
5）Chance，B．et al．：3lP NMR studies of con・
trol of mitochondrial functionin phospllO−
fructokinase＿deficienthumanskeletalmuscle，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，79，7714−7718，
1982．

6）桑原，湯浅他：核磁気共鳴による筋ジストロフ
ィー症の研究（1）筋の発育に伴うproton緩和時間
ならびにナトリウム量の変化，厚生省「神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症の発症放序に関する臨床的研究，三好班，昭和57年度研究報告乱214−218，1983．
7）Dawson，D．G．et al．：Contraction and re−
Coveryofliving muscles studied by31PNu・clearmagneticresonance，J．Physiol・，267，703−
735，1977．
8）Wilkie，D．R．etal．‥Muscularfatiguein−

vestigatedby phosphorous nuclear magnetic
resonance，Nature，274，861−866，1978・
9）Gadian，D．et al・：Examination of a myo−pathybyphosphoruSnuClear magnetic reso−
nance，LancetII8250，774−775，1981．
10）Brian，D．et al．：Examination ofa caseof
suspectedMcArdles

syndrome

by31P

Nucle−

arMagnetic Resonance，New．Engl．J．Med・，
304，1338−1342，1981．

11）Radda，G．K．et al．：31P−NMR examinationof two patients with NADH−Co Q reductase
deficiency，Nature，295，608−609，1982・

228

29．E−64投与の心筋症ハムスター（UM−Ⅹ7．1）
心筋に与える影響について

柴田

研究協力者 和 田宜彦＊

昭＊ 船 井 洋 子＊

升 谷 智 子＊ 大 西 俊 造＊＊

目的（3）混餌法1）E−64−d 30mg／kg／日 4週間投与

1

成

3

2）E−64−dlOOmg／kg／日 4週間投与
3）E−64−dlOOmg／kg／日 8週間投与

2回
2

実験材料と方法

E−64−C 75mg／kg／日 4週間投与 5回（2）ゾンデによる強制投与法
E−64−dlOOmg／kg／日 4週間投与

回 回 回

ヒトの特発性心筋症に類似した心病変を遺伝的特発性に発生するシリア系ゴールドハムスタ
ーの筋症発生には，ヒトの場合と同様にCa2＋
依存性プロテアーゼが関与することはほぼ明らかである。本実験では，Ca2＋依存性プロテアーゼ阻害剤の投与が，本動物での心筋症に与える影響を，心筋組織のカルシウム沈着に主眼をおいて，形態学的，生化学的に検討した。

（1）オスモティックミニポンプ皮下埋没法

ま責

1．予備実験
生後日令を30日単位に区切って観察した結1．予備実験
生後日令3日から288日にわたるモデル動物
UM−Ⅹ7．1ハムスターの心病変について組織学的に検討した。心臓は1個当り4〜5個の水平断面について薄切を行い，H．E．染色標本
上，心筋細胞の融解壊死巣，心筋組織への石灰
沈着巣，心筋組織の線維化巣の三項目について

果，心筋細胞融解壊死，心組織内石灰沈着，線維化の諸病変は，生後30日以内にはほとんど認められないことが分った。また融解巣は30日を観察し，病変の強さを0度，1度，2度，3度に分質して検討した。対照として健常ハムスターめ心筋を観察した。
2．E−64投与実験

識別し易い上，日令60日以上のものでは，石灰化巣陰性のものがほとんど認められなかったことより，E−64投与の影響をみる上で，石灰化巣を指標として検討することは当を得ていると考えられた。なお，対照健常動物の心臓には，
上記三病変の発生は皆無であった。
2．E−64投与実験（1）オスモテックミニポンプ埋没法
E−64−C投与群と非投与群の心組織カルシウ
ム量は，5回共，投与群において低値が認めら

心筋症ハムスターUM−Ⅹ7．1の同腹仔を二群に分け，一群にE−64を投与，他の一群を非投与群とした。E−64投与開始日令は生後16日
から40日にわたっている。
実験方法として，次の三つを行った0＊大阪府立成人病センター＊＊大阪大学医療技術短大

過ぎる頃から発生頻度が上昇，石灰化巣は60日を過ぎてから，線維化巣は120日を過ぎてからそれぞれ発生頻度が上昇することが知られた。
これら≡病変の内，石灰化巣は組織学的に最もれ，灰化法による測定値はいずれも p＜0．05，229

Ⅳ 個体レベルでの効果

Ca含量
く〟g／gwett一∬Ue〉

8，000

7．000

部分心，灰化

全心，ホモジナイズ

6，000

5，000

i−二迅
第

︻口
6
5

RH
2
6

閲齢

第

︻口
8
5

二十順は一 掴踊第洞締P＜0．05

Pく0．81

図1心組織内Ca含量−ミニポンプ法，75mg／kg／日，4週間−⊂コE−64（−）
【ZaE−64（＋）

HS．E．

第1回

第2回

第3回

第4回

図2 心組織内石灰化巣qミニポンプ法，75mg／kg／日，4週間一
230

第5回

29．E−64投与の心筋症ハムスター（UM−Ⅹ7．1）心筋に与える影響について

Ca含量
くFLg／gwettissue）⊂コE−64（一）［：コE＿64（−）

四E−64（＋）
HS．E．

囚E＿64（＋）■一一S．E．

l

l

第1回

t

l

第2回

終令60日

終令58日

l一一

1

第1回
終令60日

l

l

第2回
終令58日

Pく0．02
図3

心組織内Ca含量

一強制経口法，100mg／kg／日，4週間一p＜0．01で有意差が認められた。しかし，ホモ
ジネイトによる測定値の方は灰化法に比較して，測定値のばらつきが大きい傾向があり，有意差は認められなかった。心組織内の石灰化巣の程度は，非投与群，投与群に差は認められなかった（図1，2）。
ただし，組織学的検索は，第1回の実験を除いては全例心臓をCa量測定に提供したため十分な検索を行うことができなかった。
（2）強制経口投与
心組織内Ca含量は2回の実験共，投与群で低値を示し，第2回目の実験では，p＜0．02で有意差が認められた。心組織内石灰化巣と投与，非投与群との関係については，第1回目が非投与群に低値で，第2回目には投与群の方が低値という相反する結果が得られた（図3，4）。
（3）混商法1）30mg／kg／日 4週間投与は2回の実験

図4 心組織内石灰化巣
一強制経口法，100mg／kg／日，4週間一巣，どちらも投与群において低い傾向がみられたが，統計的に有意差は全く認められなかった（図5，6）。
2）100mg／kg／日 4週間投与実験は3回行ったが，心組織内Ca含量，心組織内石灰化巣の程度共，投与群において低い傾向がみられ，
その内第2回目の実験ではCa含量にp＜0．05で有意差が認められた（図7，8）。
3）100mg／kg／目白週間投与群心組織内Ca含量および組織学的な石灰化巣の程度共，投与群，非投与群に差がなく，しかも，数値はどちらも4週間投与群とは比較にならない程高値を示した（図7，8）。
以上の実験成績の如く，E−64投与群は，非投与群に比較して，心組織内Ca含量が低値で組織学的に石灰化巣のみられる程度が軽度である傾向を示し，中には統計学的に有意差を示す
実験群が認められた。

共，心組織内Ca含量および心組織内石灰化
231

Ⅳ 個体レベルでの効果

Ca含量［＝］E−64（−）

くFEg／gwettissue〉

四E−64（＋）−S．E．

⊂コE−64（−）
四E−64（＋）
l・．・．・．一S．E．

l

l

第1回
終令48日
図5

l

l

第2回
終令57日

心組織内のCa含量

一混餌法，30mg／kg／日，4週間−

考察

上記の如き結果が得られた。成績のうちCa含量に有意差の認められた群が存在したとはいえ，各実験の1グループの動物数が小さいこと
および個体差による石灰沈着程度のパラツキが大きいことなどより，今後実験の反復と実験方法の再考慮による再検討が望まれる。
まず，実験方法としてのミニポンプ埋没法
は，一定量の薬剤を持続的に投与出来る点で優れているが，週1回ミニポンプを皮下へうえかえるため，外科的夜襲を加えなければならない
ことおよび創面よりの感染を起こし易いことな
ど，実験成績に悪影響を及ぼす可能性が高い。
なお，この方法では，4週間以上の実験は技術的に困難である。
強制経口投与は，投与量を確実に出来る利点があるが，時に誤まって食道や気管，肺などを損傷する危険がある。連日2回の投与のため，
232

l

l

第1回
終令48日

l

l

第2回
給令57日

図6 心組織内石灰化巣一混餌法，30mg／kg／臥

4週間一動物に与えるストレスが大と思われる。
混餌法は，最も自然な投与法と思われるが動物全ての摂取量を統一することができない欠点がある。
次に，予備実験よりも明らかな如く，日令が60日を過ぎると石灰沈着巣の程度，あるいは出現頻度は急速に上昇する傾向がある。したがってE−64投与の開始日令または投与期間は，実
験成績に及ぼす影響が大である。例えは，E−64−dlOOmg／kg／日 8週間投与群では，ただ1回の実験であったが，Ca含量，組織内石灰
沈着巣共，投与，非投与両群に全く差がなかった○ このことは，E−64の影響以上に，この動物本来の心病変の進行が上回っているような感じを受ける。
第3に1つの心臓についてCa含量の測定と組織学的な石灰化巣の検索を行う必要上，必然的に心臓を二分しなければならなかった。これは致し方のないこととはいえ，どちらの測定値

29．E−64投与の心筋症ハムスター（UM−Ⅹ7．1）心筋に与える影響について

Ca含量
（〝g／g

噌tt・SSUO〉□E−64ト）

9．000

lZヨE−64（＋）
8．000

ト一一■S，E．

7．000

2
1

000 m 0

ー田山﹈紺

00
0朋
h皿
U
．0
−ヽJ43

l川脂﹈m

I一．目脂﹈銅

6．000

l

l

第4回

図7 心組織内Ca含量

図8 心組結内石灰化巣

一温田法，100mg／kg／日−

一混餌法，100mg／kg／日一も正確を期し得ない危険性があることは十分考えられる。すなわち，各個体別にCa含量と組織像を比較した場合，値が平行しない例がいく
らか存在することよりも明らかであり，また投
与群と非投与群の比較でCa含量と組織内石灰化巣の成績が逆転している実験群も認められた0 この危険を最小にするためには，組織学的検索に当り，可能な限りの多数切片で検討することが必要と思われる。
結語

着が低い傾向にあるという成績が得られ，Ca含量に統計学的に有意差を示したものも認められた。しかし，今回の実験のみでE−64投与効
果があると判断するのは危険である。特にCa含量の低値そのものが，本疾患の治癒，改善に相等しいかどうかの検討は慎重であらねばならない。今後，投与方法，実験開始日令，検索方法などを再考慮し，数多く反復した実験成績を検討する必要があると思われる。また，実験期
問も4週間群以外の長期投与例による検討が必要である。

E−64投与群において，非投与群よりCa沈233

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

序

論

研究分担

1．血液，尿，筋肉の生化学分析（分担1）
大 関 正 弘（大正製薬株式会社総合研究所）

2．プロテアーゼ活性に及ぼす効果
1）CANPに対する効果（分担2）
鈴 木 紘 一（東京大学医学部第二生化学教室）
大 関 正 弘（大正製薬株式会社総合研究所）
2）カテプシソに対する効果（分担3）
勝 沼 信 彦（徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門）

3．組織学的および組織化学的研究
1）骨格筋の病理（分担4）杉 田 秀 夫（国立武蔵療養所神経センター疾病一部）
埜 中 征 哉（国立武蔵療養所神経センター微細構造）

2）心筋の病理（分担5）大 関 正 弘（大正製薬株式会社総合研究所）
和 田昭（大阪府立成人病セソクー病理）

4．筋エネルギー代謝に及ぼす影響（分担6）
市 原明（徳島大学医学部酵素研究施設酵素病理部門）

5．筋ガングリオシドに対する影響（分担7）
官 武正（新潟大学脳研究所神経内科）

6．肝薬物代謝に及ぼす影響（分担8）北 川 晴 雄（千葉大学薬学部薬効安全性学講座薬物学）
総

括
235

序
目

論
ロフィーハムスター，UM−Ⅹ7．1系にE−64

的誘導体をミニポンプ法により授与することによ

プロテアーゼ阻害剤を筋ジストロフィーモデ

り顕著な心筋壊死抑制効果があることを報告し

ル動物に応用する試みは1978年Strackerら1）
がロイペプチソ，べブスタチソを筋ジストロフ

た。この結果は我々がE−64の有用性を検討する上で極めて示唆に富むものであった。

ィーチキンに投与し血清CPI（，羅患筋の組織

E−64−d は沢田らにより報告されたように経学的検索をparameterとして薬効の判定を行

口投与が可能であり，この秀れた性質のため種ったのが最初である。その後，ジストロフィー
マウス，ハムスター，チキンを用いたいくつかた。そこで今年度の筋ジストロフィーハムスタのグループによるプロテアーゼ阻害剤に関するーに対するE−64−dの薬効試験はジストロフィ報告がある。しかしながら，薬剤が筋ジストローチキンの場合の経験をふまえ，本研究班の多フィーモデル動物に対し有効か無効かの判定にくの班員の協力により，班全体のテーマの一つはなるべく多くの客観的データを集め総合的判として共同実験を行い多角的な評価を行うことにした。本研究の目的は筋ジストロフィーハム

断が必要であり，その意味で従来の報告は必ずしも満足すべきものとは云い難い。
先に，我々はE−64−Cのジストロフィーチキ々の投与スケジュールを組むことが可能になっスターBIO14．6系およびUM−Ⅹ7．1系に対するE−64−dの効果を検討することにある。

ンに対する薬効を臨床的，形態的，生化学的観点から詳細に検討した結果，本モデル動物においてE−64−Cは必ずしも予期した程の効果を示さないことを報告した。
一方，Jasmin等は彼等の開発した筋ジスト

実験の概要
動物および薬物投与法
筋ジストロフィーハムスターBIO14．6

は

BIO−ResearchConsultant（Boston，U．S．A．）

表1実験に使用した動物， 薬物投与方法および期間
TrialI I TrialII L TrialIII I TrialIV I Trial V I Trial VI
UM−Ⅹ7．1

UM一Ⅹ7．1

UM−Ⅹ 7．1

薬物

BIO14．6

UM−Ⅹ7．1
Normal

I E−64−C I E−64−d L E−64−d I E−64−d l Er64−d l E−64−d

開始時日齢l

投与期間l236

BIO14．6
NormalNormal28l25〜33l

25〜31l28日間135日間126日間l

79

60日間l

61日間；33日間

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）
表2

UM−Ⅹ7．1系ハムスターに対する薬効実験概要
TrialI I TrialII I TrialIII I Trial VI

Ⅰ．薬 物
Ⅰ．投与期間Ⅲ．投与法
Ⅳ．投与量
V．検査項目
1．血清分析
2．筋肉分析
1）Ca
2）CPK

3）病 理

E−64−CE−64−dE−64−dE−64−dday25〜33→60〜68 day25〜31→51〜57 day18〜20→51〜53

day28一→56

ミニポンプ

混

餌

混

混

餌

餌

75mg／kg／日

150mg／kg／日

30，300mg／kg／日

30mg／kg／日

CPK，LDH等

CPK，LDH等

CPX，LDH等

CPK，LDH等

心筋，長指伸筋
ヒラメ筋
前脛骨筋
心筋，長指伸筋
ヒラメ筋

同

左

同

左

同

左

前

肢

心

筋

同

左

長指伸筋．ヒラメ筋

心

筋

同

左

心筋，長指伸筋
ヒラメ筋

4）ガングリオシド
5）筋エネルギー代謝
6）プロテアーゼi）CANPii）カテプシソ

3．肝代謝酵素
4．尿分析

大腿四頭筋
大腿四頭筋

同

左

クレアチン′
クレアチニン′

表3 B1014．6系ハムスターに対する薬効実験概要
TrialIV

Ⅰ．薬 物
Ⅰ．投与期間
Ⅲ．投与法
Ⅳ．投与量

I

Trial

V

E−64−dE−64−dday79→139

day64一→124

強制経口投与30，100，300mg／kg／日

混餌30，100，300mg／kg／日（1日2回に分与）

Ⅴ．検査項目
1．血清分析
2．筋肉分析

CPK，LDH等

CPK，LDH等

1）Ca

心筋，長指伸筋，大腿四頭筋

長指伸筋，ヒラメ筋，大腿四頭筋，
心筋
前脛骨筋
心筋，大腿直筋，ヒラメ筋，
前脛骨筋，長指伸筋

2）CPIく3）病 理4）ガングリオシド5）ェネルギー代謝

心筋，大腿直筋，ヒラメ筋，
前脛骨筋
前 肢
大腿二頭筋

6）プロテアーゼi）CANPii）カテプシソⅥ．肝代謝酵素
Ⅶ．尿分析

大腿四頭筋

大腿四頭筋
大腿四頭筋

肝
クレアチソ
クレアチニ：／

237

Ⅳ 個体レベルでの効果

より成令の雄性を購入し，一週間飼育後実験に供した。UM−Ⅹ7．1系ハムスターは大阪成人
病セソター病理，和田昭先生の御好意により母獣または幼令仔を御恵与哉き大正製薬総合研究所にて所定令に達するまで肥育後使用した。
UM−Ⅹ7．1系に関しては可能な限り同腹の仔を均等にグループ分けし実験の精度を高めることにつとめた。薬物投与実験はBIO14．6系，
UM−Ⅹ7．1系併せて都合6回実施（TrialI〜ⅤⅠ）したが，いずれの実験も，大正製薬総合研究所にて実施し，各分担研究に供した臓器および組織サンプルは薬物投与終了時に各分担研究者による共同剖検を行い採取したものである。
薬物投与実験スケジュールの概要を表1にまとめて示した。薬物の投与は1）ミニポンプ法，
2）強制経口投与，3）混餌投与によったが，ミニポンプ法は既報の方法2）に準じ強制経口投与の場合はE−64−dを5％アラビアゴム溶液に懸濁し，午前9時および午後4時の2回に分けて与えた。混餌投与はE−64−dを所定濃度混238

ぜたオリエンタル酵母社製MFまたはCMF
飼料を自由摂取させ，−日当りの摂取量は平均
飼料摂取量より算出した。実験期間中は滅菌水
道水を自由に摂取させた。
各実験における研究分担および使用した標本については表2，3にまとめて示した。
結果

実験方法および結果は以下項を改め，分担研
究別に報告する。
参考文献
1）Stracher，AりMcGown，E．B．and

Shafiq，

S．A．：Muscular Dystrophy：Inhibition of
Degenerationin vivo with ProteaseInhibi−
tors，Science200，50−51，1978．

2）沢田二郎：E−64類縁体のin vivoにおけるプロ
テアーゼ阻害，厚生省「新薬開発研究事業」致生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘乱 昭和56年度研究報告書，p．13，
1982．

血液，尿および筋肉の生化学分析（分担1）

＊
＊
＊
＊
＊

＊

貞和

＊

司子章雄旭

清和

＊

結

熊本西根極

＊

法

小松河中京

＊

＊

晴秀明男己

＊

正和正保克

＊

井貝村本田

＊

玉磯木樟野

＊

紀子文子勇

和敬貞聡

田木村上田

方

花相大山湖

研究協力者

大 関 正 弘＊果

1．血液生化学分析
TrialIおよびⅠⅤでは心臓より採血し，
Heparinを加えて血菜を得た。その他の実験
では外腸動脈より採血し，血清を得た。これらの血祭または血清について日立712型自動分析装置を用い，GOT，GPT，LDH（UV法）およびCPK（01iver変法）の酵素活性を測定した。

1．VM・Ⅹ7．1系ハムスターに対する効果（1）TrialI

2．筋肉中カルシウム含量測定
筋肉片を低温プラズマ灰化装置（ICP−1003型）を用いて灰化した後，1％ランタンを含む
0．1規定塩酸水に溶解し，島津原子吸光光度計（AA−650型）を用いて測定した。
3．心靖所見心臓の外表面および縦断面（TrialVは横断面）について肉眼的にカルシウム沈着を中心核とする壊死性変化を観察し，その強度の程度
によりそれぞれ0〜3（0．5きざみ）の7段階に分けScoring L，2名の判定者の平均値により示した。
4．尿分析
個々に採尿ケージに移し24時間尿を採取した。クレアチニソおよびクレアチンを日立712
型自動分析装置を用い測定した。

明に上昇しており，UM−Ⅹ7．1系ハムスター＊大正製薬株式会社総合研究所

UM−Ⅹ7．1系ハムスターにオスモティック
ミニポンプを用い，E−64−Cを75mg／kg／日4週間投与した。
1）血莱中酵素活性発症Control群のCPK，GOT，GPTおよびLDH活性共に無発症動物のそれと比べて著においても既報のBIO14．6の場合と同様な変化を示すことがわかった1）。E−64−C投与により，これらの酵素活性は有意差はないが減少傾向を示した（図1）。
2）心臓

UM−Ⅹ7．1系ハムスターの心筋中カルシウ
ム含量は正常動物の約30倍と著明に上昇していた。また，躍息動物では正常動物には見られな
い正リン酸カルシウムを主成分とする白い凝集塊が肉眼的にも観察され，このカルシウム沈着の周囲に壊死的変化が光頗的に認められることから，この変化をNecrotic changesとして示した。E−64−C投与により，カルシウム含量，Necroticchangesは減少傾向を示したが，有意差は認められなかった（図2）。
3）骨格筋
カルシウム含量は長指伸筋およびヒラメ筋について測定した。図3に見られる様に，E−64−C
投与群の長指伸筋中カルシウム含量が非常に上
239

Ⅳ 個体レベルでの効果

00

へ■1

6

⊂〉15

4

0

▼−■

×
一一10

＼

0

こ⊃

2

︻∈＼nH

t 01 × ︶⁝u⊃uむE−付出

20

ト・・．疇

5

0

N

C

E

V

N

C

N

E

C

E

mean！S．E．

N：Normal（n＝10）
C：Dystrophic control（n＝9）
E：E−64・C（75mg／kg／day，n＝9）

図1E−64−Cを投与した肪ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7・1の血渠酵素活性（TrialI）

4

3

3

2
むPdLU

賀SSコu＼uE

N

C

E

N

C

Normal（n＝10）

E
mean！S．E．

Dystrophic control（n＝9）
E−64−C（75mg／kg／day，n＝9）

図2

240

E−64−Cを投与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7・1の心筋カルシウム含量および壊死性変化（TrialI）

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

8
4

5

2

C

0

N．Ot X≡S叫一書呈6

C．Ol X茎SS叫︶でn−

N

E

N

C

E

C

E

mean！S．E．

N：NormaT（n＝10）

C：Dystrophic contro＝n＝9）
E：E−64・C（75mg／kg／day，n＝9）

図3

N

Tibialis．a．（前陛骨筋）E．D．L．（長指伸筋）
Soleus（ヒラメ筋）

E−64−Cを投与した筋ジストロフィーハムスターUM一Ⅹ7．1の骨格筋CPK

活性およびカルシウム含量（TrialI）

昇していた。しかしながら躍患動物長指伸筋のカルシウム含量は非常に個体差が大きく上記の変化は統計学的有意差ではなかった。
しかし，前脛骨筋では比較的個体差が少なく
その組織中CPK活性は正常動物より低下傾向を示していた。
（2）TrialII
UM−Ⅹ7．1系ハムスターを用いE−64−dを混餌法で150mg／kg／日5週間投与した。
1）心臓および骨格筋の比重量
体重に対する心臓および骨格筋の比重量を図4に示した。正常群，発症Control群および
E−64−d投与群の間に大きな差は認められなかった。筋ジストロフィーハムスターでは加令と共に心臓が膨満化してくるといわれているが，本実験期間では体重に対する比重量でみる限り正常群との間に有意な差はみられなかった。
2）血清中酵素活性発症Control群では正常群に比べCPK，
GOT，GPT活性は有意に上昇していた。E−

64−d投与により CPKおよびGOTが有意に低下した（p＜0．05）（図5）。
3）心 臓
心筋中カルシウム含量およびNecroticcha−nges共に薬物投与による効果は認められなかった（図6）。
4）骨格筋
発症群の前脛骨筋CPK活性は正常動物のそれと比べて有意に減少していた。E−64−d投与群は正常群との問に有意差はなくなっており．・
改善傾向が見られる。
長指伸筋中カルシウム含量はE−64−d投与により低下傾向が見られたが，羅患筋問のばらつきが大きいため有意な差ではなかった（図7）。
（3）TrialIII
UM−Ⅹ7．1系ハムスターを用い，混餌法でE−64，dを30mg／kg／日および300mg／kg／日
4週間投与した。
1）血清酵素活性
TrialIIと同様に，E−64−d投与群では，血241

Ⅳ 個体レベルでの効果
S k e leta l M u sc le†Ot Xヱ晋き合︒q＼竜芯き一芸

MOt X竜登竜︒q＼三号⊆一芸
N

C

E

E．
D．
L．

N

C

S o le u s

N

E

C

E

mean±

N：Normal（n＝10）

S．E．

C：Dystrophic control（n＝12）
E：E−64−d（approx．150mg／kg／day，n＝12）

E．D．L．（長指伸筋）
Soleus（ヒラメ筋）
図4 E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹア・1の心臓および骨格筋の比重量（TrialII）

6

3

N．Ot Xく2

2

TOt Xだu⊃u呂J遥

0
1∈．
＼2

N

C

E

Normal（n＝10）

N

C

E

N
mean

C

E

±S．E．

≡慧3p霊慧法話iay，n＝12） ＊：P＜0・05
図5242

E−64−dを混餌授与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7・1の血清酵素活性（TrialII）

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

3
2

2
むPdJU

写SSコ餌＼uE

0

E

N

C

N

C

E

N C E

mean‡S．E．
Normal（n＝10）
Dystrophic

control（n＝■12）

E−64−d（approx．150mg／kg／day，n＝12）

図6E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1の心筋カルシウ
ム含量および壊死性変化（TrialII）

8

8

TOt X等還二三三

TOt X賀SS叫︺u＼nl
N

C

E

N

C

E

N：Normal（n＝10）

N

C
mean

E
三 S．E

C：Dystrophic control（n＝12）
E：E・64・d（approx．150mg／kg／day，n＝12）

Tibialis．a．（前脛骨筋）
E．D．L．（長指伸筋）
SoIeus（ヒラメ筋）
図7

E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1の骨格筋CPK活性およびカルシウム含量（TrialII）
243

Ⅳ 個体レベルでの効果

4

6

3

4

0
2

1∈＼⊃l

2

T01×−＼nI0
3

2

NIOt X雲⊃uむEJ遥

0
4
0
1
I

2
E

E

C

0

C

EI

E2

〉

c

EI

E2

C：Dystrophic control（n＝11）
El：E・64・d（approx．30mg／kg／day，n＝12）
E2：

図8

〝

（approx．300mg／kg／day，n＝12）

▼

C

EI

E2

mean±S．E．

＊：P＜0．05

E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターUM一Ⅹ7．1の血清酵素活性（TrialIII）

活中CPK，GOTおよびGPT活性に有意な減少が認められた（図8）。
2）心筋および骨格筋
心筋のカルシウム含量および肉眼的観察によるNecrotic changesは用量依存的に低下傾向を示した。特に300mg投与群のNecrotic
ChangesはE−64−d投与により有意な改善が認められた。前脛骨筋中CPK活性にはE−64−d投与による有意な変化は認められなかった（図9）。

匝）TrialVI
TrialI，ⅠⅠ，およびⅠⅠⅠと同様にUM−Ⅹ7．1
系ハムスターを用いたが，薬物投与開始を1週間早くし，3週令より1ケ月間，E−64−d を混餌投与した。
1）血清中酵素活性発症Control群の血中諸酵素活性は著明に上昇していたが，E−64−d投与による活性低下は認められなかった。また，本実験においては無発症動物にも薬物投与を行ったが，無投与群
244との差は認められなかった（図10）。
2）骨格筋および心筋発症群の前脛骨筋CPK活性は有意に減少しており，薬物投与群では有意差はないが多少改善傾向が認められた。
必臓中カルシウム含量は全く薬物による影響は認められなかったが，Necrotic changesには改善傾向がみられた（図11）。
2．BIO14．6系ハムスターに対する効果（1）TrialIV
BIO14．6系ハムスターにE−64−dを2ケ月間強制経口投与した。
1）筋肉中カルシウム含量
BIO14．6系ハムスターにおいて，発症動物の心筋中カルシウム含量は正常動物の4倍と増加していたが，UM−Ⅹ7．1系の場合に比べてその増加率は小さい様である。心筋カルシウム
含量でみる限り投与の効果は認められなかった（図12）。

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

6
2

2

2

UPdJU

舅S曇でuE

470t X賀SS叫︸u＼⊃l

E
十

a

一

n P

EO
5
2S O．

l

I

2
E

E

2

E

I

E

C

E me＊

0

＜

⁚

C：Dystrophic control（n＝11）
El：E・64−d（approx．30mg／kg／day，n＝12）E2：〝（approx．300mg／kg／day，n＝12）

Tibialis．a．（前脛骨筋）
図9

ET64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1の骨格筋
活性，心筋カルシウム含量および壊死性変化（TrialIII）

T01メl＼⊃−︺苫n u聖EL再出

0
5

＝）

0
0

N．Ol X︸叫un u書J遥

モ20

CPK

l−イ

10

NC NE DC
N
N
D
D

図10

E
D C E C E

0

NC NE DC DE

NC NE DC DE

Normal Control（n＝6）

NC NE DC DE
mean！S．E．

Normal E−64・d30mg／kg／day（n＝5）
Dystrophic Control（n＝13）
Dystrophic E−64−d30mg／kg／day（n＝17）

E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1の血清酵素活性（Trial VI）
245

Ⅳ 個体レベルでの効果

8

T01×賀SSコu＼買0t X 当Sヱ∝＼nH
NC NE DC DE〉

NC NE DC DE

NC NE DC DE

mean！S．E．

NC：Normal Control（n＝6）
NE：Normal E・64・d30mg／kg／day（n＝5）
DC：Dystrophic Control（n＝13）
DE：Dystrophic E・64・d30mg／kg／day（n＝17）

Tibia】is．a．（前駅用・筋）
図11E−64−dを混餌授与した肪ジストロフィ，ハムスターUM−Ⅹ7．1の骨格筋CPK
活性，心筋カルムウシ含量および壊死性変化（TrialVI）

4

2

E3

6

TOt X≡S 址＼蔓3

N．Ot X U︒SS岬︼∝＼葺

N C EI E2

N C EI E2

N：Normal（n＝10）

mean

E3
！S．E

C：Dystrophic control（n＝10）
El：E−64・d（30mg／kg／day，n＝10）E2：′・（100mg／kg／day．n＝10）E3：〝（300mg／kg／day，n＝10）

E．D．L．（長指伸筋）
図12

246

E−64−dを経口投与した筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の心筋および骨格筋カルシウム含量（TrialIV）

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

N

E3

C

EI

E2

mean

N：Normal（n＝10）

3E
ES

N C EI E2±

C：Dystrophic control（n＝10）
El：E−64−d（30mg／kg／day，n＝10

図13〝（100mg／kg／day，n＝10（300mg／kg／day，

n

E3

0
1
ニ

E2：

E−64−dを経口投与した筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の尿中クレアチ
ンおよびクレアチニン量（TrialIV）

2）尿分析
発症群では正常群と比べてクレアチン排泄量が増加し，クレアチニソは減少していた。E−64−d投与によりクレアチニソが多少増加傾向を示していたが，有意差は認められなかった（図13）。本実験においては隔離し一日尿を採集したが発症群では隔離によるストレスが強く，摂餌量が極端におち体重が平均3g減少した。したがって本データはこれらの要因による影響が
強く信頼性のある結果とは断じがたい。このことから以後の実験においては採尿を中止した。
（2）TrialV
BIO14．6系ハムスターを用い，E−64−dを混餌法により2ケ月間投与した。

1）血清酵素活性E−64−d投与により，CPK，GOT，GPTおよびLDH活性のいずれも有意な改善が認められ，昨年実施したBIO14．6系ハムスターを用いた実験結果1）を再確認した（図14）。
2）骨格筋
前脛骨筋中CPK活性はE−64−d投与により有意に上昇しており，薬物が骨格筋においても効果を示す可能性を示唆しているものと思われた（図15）。
3）心 臓
カルシウム含量およびNecrotic changes

共に薬物投与による改善は認められなかった（図16）。
247

Ⅳ 個体レベルでの効果

N．Ol X t＼⊃luむ∈Ld滅T〇一×︸叫u⊃亡賀J遥

0
1E＼n−
0

3
E

2
E

E3

I
E

C

3
E

I

2
E

E

C

C EI E2

mean！S．E．

C：Dystrophic control（n＝10）

図14〝（approx．300mg／kg／day，

0
0 1 9
日
二
二
二
n
n
n

El：E・64・d（approx．30mg／kg／day，
E2：（approx．100mg／kg／day，
E3：

C EI E2＊：P＜0．05＊＊：Pく0．01

E−64−dを温田投与した筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の血清酵素活性（TrialV）

E3

0

むコSS 址＼Mミ

701×茎SSコで2
C EI E2C EI E2

C：Dystrophic control（n＝10）
El：E・64・d（approx．30mg／kg／day，n＝10）
E2：
E3：

〝

（approx．100mg／kg／day，n＝10）

E3
mean！S．E．

＊：P＜0．05＊＊：P＜0．01（approx．300mg／kg／day，n＝9）

Tibialis．a．（前脛骨筋） E．D．L．（長指伸筋）
図15

248

E−64−dを温餌投与した筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の骨格筋CPK活性およびカルシウム含量（Trial V）

E3

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

5N．0−×冨S叫︸u＼呈

0

0

3
E

2
E

I

E

C

C EI E2

E3
mean！S．E．

C：Dystrophic control（n＝10）
El：E−64・d（approx．30mg／kg／day，n＝10）
E2：
E3：

′′

（approx．100mg／kg／day，n＝10）（approx．300mg／kg／day，n＝9）

図16E−64二dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の心筋カルシウ
ム含量および壊死性変化（TrialV）

考察

UM−Ⅹ7．1系ハムスターはBIO14．6系ハ
ムスターの亜系である2）。したがってその症状の特徴には極めて塀似性が認められるが，心筋への壊死性の変化を伴うCalcium fociの形成はこの系の際立った特徴の一つである。
昨年度我々はBIO14．6系ハムスターに関
L E−64−CおよびE−64−dの効果を予備的に検討し，E−64−d の旗睦内投与により心筋，骨格筋のCa2十沈着および壊死性の変化を抑制しうる可能性のあることを報告した1）。しかしながら本籍で，埜中，和田らによって報告されているようにこの両系のハムスターともに骨格筋の筋線経の再生が旺盛であり，その結果として筋力の低下があまり顕著には起こらない。このことは筋ジストロフィーマウスにおける後肢麻痺，筋ジス卜占フィーチキンの起立性不全の如き運動機能変化をもたらさないため，さらに薬物の効果判定を難しくしているといえる。したがっておのずからその薬効判定に当っては血液，筋肉等の生化学分析，病理所見等に頼らざるをえない。また，もう一つの問題点は症状は
比較的幼令期から進展しているにもかかわらず
BIO系ハムスターは完全に発症しきった50日
令以降の動物しか入手出来ない点にある。幸い，UM−Ⅹ7Jl系ハムスターは今年度から幼令時より実験に供することが可能になり発症初期から薬物の効果を調べることが可能になった。そこで我々は種々のCriteriaを検索しながらE−64−dの効果を調べた。この結果を表1にまとめて示す。
筋ジストロフィー患者においてその高値が報告されている CPK，GOT，GPT，LDH 等の血清酵素活性は筋ジストロフィーハムスターにおいても両系ともに有力な指標となりえた。まず，UM−Ⅹ7．1系についてみてみるとTrial
VIを除いていずれの実験でも明らかに血清酵
素活性の減少傾向がうかがえ，E−64−d投与により症状の進行が抑えられている可能性を示唆
249

Ⅳ 個体レベルでの効果
表1
Hamsterl

まとめ

UM−Ⅹ7．1

Trial

】Ⅰ

l

Ⅱ

Ⅲ

Ⅵl

BIO14．6

Ⅳ

Ⅴ

Administration l0．m．feed feed feedl p．0．
Dose（mg／kg／day）

175

150

−：nO Change，1：decrease l：P＜0．05

30

300

30130

feed
100

300

100

300

11：P＜0．01︵701×m喜S 切＼nl︶出dU．︒．↑

Y＝−1．1791Ⅹ＋5．6603

r＝−0．837772

1．0

一

2．0

Denaturation Index

図17 前脛骨筋CPK活性と肉眼的観察による筋肉変性との関係
25030

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）
0

0．1
●
●

TriaI

0．5
●

●

●

●

●
●

●

●

●

●

●

●

1．5

3

5

mg／g tissue

●
●
●
●

●

●

meam

I Control
＼
●●
●●
●●
●●
●●

＼
ヾ

隙羊

ⅠI Control

／／

巨
や貴

150mg

●

ⅠⅠI Control

嶺
＝
；
‡
呂
亨
義覇塩
瀬薄￣
さ．
3 2．68
十正憲 ．
溝 豊満
、、一二二
卓
立
1．73

／

n
9

9

3．02

12

3．64

12

2．45

11

1．99

12

1．26

12

1．27

13

1．22

17

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Ⅵ

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300mg

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●
●

Control

0
図18

50

100％

筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1の心筋カルシウム含量分布しているように思われる。また，血清CPK減少の一つの要因として筋按経の崩壊，あるいは筋肉中からの逸脱の抑制が考えられる。そこで
前脛骨筋中のCPX活性を調べた。羅患動物では明らかに正常動物に比べ低下傾向がみられ，さらに個々の筋肉について詳しく調べてみると肉眼的に明らかに認めうる弾力性の低下，白色化等を特徴とする外観的な筋の変性の強さと相関が認められた（図17）？
しかしながら，同じ下肢筋でも長指伸筋，ヒラメ筋では個体問のばらつきが大きく症状観察より判断する限り，その病変は出現頻度も低く，しかも極端な例が多く中程度のものが少ないという傾向がみられた。また，同じ個体でも251

Ⅳ 個体レベルでの効果

一方の下肢でみられた変化が他方の下肢では全く観察されないという例も多くみられた。このことは同じ標本を用いて測定したカルシウム含量に極めてばらつきが大きかったことともよく符合するように思える。したがって下肢筋標本とを示唆しているように思われる。
Jasminらはミニポンプ法の採用により薬物を恒常的に与えることにより UM−Ⅹ7．1系ハムスターにE−64誘導体が有効であることを明でも長指伸筋，ヒラメ筋の症状観察結果およびらかにした。我々は飼料中にE−64−dを混入することによりE−64−Cの血中濃度が一定濃度以カルシウム含量は必ずしも個体全体の症状を反上に保たれることからこの投与法を主として採映しているようには思えない。

用した。本投与法がE−64−dの薬効を証明する
上で極めて有用であることが明らかになった。

一方，心筋におけるCalcium fociの形成をみてみると外表面および縦断面の肉眼的なScoringによって与えたNecrotic scoreは結

語

E−64−d投与により明らかな低下傾向がみら筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1系

れ，Jasmin等3）がE−64−C で得た結果とよおよびBIO14．6系の二系統の動物に，E−64−dく一致する。しかしながら，全心臓当りのカル
シウム含量を定量すると，その値とNecroticを投与し，羅患動物の臓器重量，血中酵素活性，筋肉中カルシウム含量などの評価法をもとに，病変の進展阻止効果について研究を行った。その結果，E−64−dはCPK活性をはじめとする血清中酵素活性を低下せしめ，さらには心筋でのカルシウム沈着および筋変性抑制傾向を示すことが明らかになった。さらに追試確認

SCOreとはよく傾向を一にするが，その値は同腹の仔の問でも100〜8，000FLg／g・Wet・tissueの広範囲に分布し，このことがカルシウム定量
値の統計処理による効果判定を難しく している。図18に示したようにE−64−d投与によ り
500FLg／gtissue以下の軽症グループが増加していることはNecrotic scoreの軽減と一致

し，E−64−dの筋ジストロフィーハムスターにおける効果をより明確にしたい。

し，E−64−dによる心筋necrosisの抑制傾向を示しているように思われる。

参考文献

ル動物においても投与方法の工夫によりE−64−

1）大関正弘；E−64及びその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究，厚生省「新薬開発研究事業」歓生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，
昭和56年度研究報告書，p．135，1982．
2）Jasmin，G．and Proscheck，L．：Hereditarypolymyopathy and cardiomyopathyin syrian
hamsterI．Progression of heart and skeletal
musclelesionsin the UM−Ⅹ7．11ine，Muscle
and Nerve．，5，20−25，1982．

dが筋肉壊死に対して改善効果を発揮しうるこ

3）Jasmin，G．私信

一方，BIO系ハムスターについてみると前述した様に既発症の成令ハムスターを用いざるを得ないため50日令以降の緩徐な進展を目安として薬効を調べることは多くの困難と問題点を残す。しかし，E−64−d の混餌投与による血清
CPX等のmarker enzymesの活性低下および前脛骨筋におけるCPKの上昇等は本モデ

252

筋ジストロフィーハムスター骨格筋中CANP活性に及ぼすE−64−dの影響
（分担2）

研究協力者

鈴

木

紘

一＊

大

関

花

田

和

紀＊＊

玉

井

正

晴＊＊

磯

貝

和

秀＊＊

松

本

和

子＊＊

弘＊＊
相

木

敬

子＊＊

材料および方法

はじめに筋ジストロフィー症における筋タンパク質の正筋ジストロフィーハムスター

UM−Ⅹ7．1

崩壊を担うプロテアーゼの一つとして，我々（TrialI，ⅠⅠ，III）およびBIO14．6（TrialV）

は，カルシウムで活性化される中性プロテアーの大腿四頭筋を一700C凍結保存後使用した。

ゼ（以下CANPと略す）を考えている。このCANPには従来報告されてきたmM程度の

m−CANPfractionの調製は既報？方法2）に従って行った。まず，−700Cに凍結保存したCa2＋で活性化されるmLCANPの他にMel1−

大腿四頭筋を，0．25MSucroseを含むBuffer

grenの報告1）以後，50FLM程度のCa2十で活A（20mMTris−HCIpH7．5，1mMEGTA，性化される〃−CANPの存在が，様々な動物や5mM2−merCaptOethanol）でホモジナイズ

組織で確認されている。

した後，30，000×gで遠心分離し，得た上清画分を，Buffer A で平衡化したDEAE−Cellu−

これらのCANP活性を，筋ジストロフィー
ハムスターに対する薬効試験において測定する

lose（Whatman DE

52）カラムに載せた。

ことは，病態動物におけるCANPの挙動を知Buffer Aで洗った後，0．15MNaClを含む

る上でも，また，薬物の効果を知る上でも，非Buffer AでInhibitor fractionを溶出した

常に重要であると考えられる。
しかしながら，組織中には，CANPInhibitor

後，0．3MNaClを含むBufferAでm−CANP
fractionを溶出した。

が存在するため，粗抽出液中の本酵素活性を測得られた m−CANP fraction の活性を，定することは困難である。そこで考えうる測定［lJC］−methylcasein を基質として既報の方

法としては，木誌で述べたように，酵素抗体法3）で測定した。

法，二次元電気泳動法およびカラム法などがあ結果および考察げられるが多検体を迅速に測定するにはまだ問題点も多い。そこで今回は従来通り，カラム法により骨格筋中のm−CANPを測定した。JJ−

大腿四頭筋中のm−CANP活性をカラム法を用いて分離し，測定した結果を，UM−Ⅹ7．1

CANPについては，Inhibitorとの分離が困難なため，測定を見合わせた。

を使ったTrialI〜ⅠⅠⅠ隼ついては図1に・また，BIO14．6を使ったTrialVは図2に示す。

＊東京大学医学部第二生化学教室
現所属 東京都臨床医学総合研究所＊＊大正製薬株式会社総合研究所

UM一Ⅹ7．1およびBIO14．6のどちらの筋
ジストロフィーハムスターにおいても，正常と病態動物の間にm−CANP活性に差がなく，
253

Ⅳ 個体レベルでの効果
TrialII TrialIII

TrialI︵．凹．S引u宕∈︶賀SSコu＼n

30
201

75
9

02
31

C11

C
m：9

N：Normal
C：Dystrophic controI
TrialI：E−64−C（75mg／kg／day），Osmotic Minipump
TrialII，III，：E−64・d（approx．30，150，and300mg／kg／day），with Feed
E11筋ジストロフィーハムスターUM−Ⅹ7．1の大腿四頭筋中m−CANP活性︵．凹．S引u票∈︶茎SS u＼n

N C

30

100

300

N：Normal（n＝10）
C：Dystrophic control（n＝10）

30，100，300，：E−64・d（approx．30，100，300mg／kg／day）
図2

筋ジストロフィーハムスターBlO14．6の大腿四頭筋中m−CANP活性

また，筋ジストロフィーハムスターにE−64−C

や，E−64−dを投与した群においても薬物投与
による活性の変化は認められなかった。
以上の結果から，イオン交換樹脂を用いて骨格筋のCANPとInhibitorを分離し測定したm−CANP総活性でみると，正常と羅患動物との問に差がなく，活性型のCANP活性を
254

調べない限り病変とのかかわりあいを論議することは出来ないことがわかった。
しかしながら，もし総活性の大部分が活性型として存在するならは，E−64−CやE−64−d投与により有意な阻害が認められなかったという結果から，これらの薬物が骨格筋中ではCANPに作用しなかったということになる。その一つ

30．見方ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）の原因としてこれらの薬物の筋肉内濃度が低い可能性が考えられる。
また，逆に，E−64額縁体はCa2＋存在下の活性化されたCANP Lか阻害しない4・5）ことから判断すると，筋ジストロフィーハムスターの骨格筋中のm−CANPがごく一部しか活性型として存在していないという可能性も考えられる。
筋ジストロフィー症においてCANPがどのような役割を果たし，E−64類縁体がどのように作用するかを調べるためには，やはり m−dependent

proteases，FEBS

Lettり109，129，

1980．

2）沢田二郎：E−64額縁体のhH正和におけるプロ
テアーゼ阻害，厚生省「新薬研究開発事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，昭和56年度研究報告書，p．13，
1981．

3）大関正弘：E−64−Cの薬効に関する研究（1），厚生省「新薬研究開発事業」微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，今掘班，
昭和56年度研究報告書，p，123，1981．
4）Suzuki，E．，Tsuji，S．，＆Ishiura，S．：Effectof Ca2＋on theinhibition ofcalcium−aCtivated

CANPだけでなく，同時にfL−CANPや内在性のInhibitor の活性を測定し，できるだけ

neutralprotease byleupeptin，antipain and

細胞内の状態を再現する必要があると思われる。

119，1981．

epoxysuccinate derivatives，FEBS Lett・，136，5）Suzuki，K．：Relation of Calcium−ActivatedNeutralProtease（CANP）with an Epoxysuc・

文

献

cinylDerivative（E64C）andIodoacetic Acid．
J．Biocbemり93，1305，1983．

1）Mellgren，R．L．：Canine cardiac calcium

255

筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの薬効−カテブシンに対する作用について（分担3）

＊

研究協力者

紀

詳英

信南

沼木

勝

ドを用いた勝沼らの方法l），酸フォスファクー

はじめに

ゼはIgarashi

筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの薬効を同じ動物を使って総合的に検討する試験において，我々は大腿四頭筋のカテプシ
ソB＆L活性を測定することを分担した。

らの方法2），カテプシソCは

GlyTArg一β−ナフチルアミドを用いてBarrettの方法3）で測定した。TPIは遠心上活をpH
2．5で800，1分熱処理後，中和し，その遠心上清を用いて，木南らの方法4）で測定した。

材料と方法

結

果

使用した動物と E−64−dの投与法，投与期間は序論の通りである。大腿四頭筋を4倍量の1．BIO14．6系ハムスター骨格筋カテプシンB＆L
に対するE−64−dの効果

EDTAO．lmM，塩化カリウム20mM，トリス塩酸バッファーpH7．510mMを含む0．25M

11週令，BIO14．6系ジストロフィーハムス
ターにE−64−dを2ケ月間，1日2回強制経口

庶糖液で，ホモゲナイズし，10，000×g，20分

投与した時の，大腿四頭筋のカテプシソB＆L

遠心後その上清はチオールプロテアーゼイソヒ

活性を含む，各種リソゾーム酵素活性およびT

ビター（以下TPIと省略する）の測定に，沈渡

PIの活性が表1に示されている（TrialⅣ）。

分画は0・05M酢酸バッファーpH5．0に懸濁し，元の量に合わせ，一度軽くホモゲナイズし骨格筋リソゾームの酵素活性はジストロフィー

た後，各酵素の活性測定に供した。カテプシソ

L，β−グルクロニダーゼ）と，余り上昇しない

B＆L活性はSucTTyr−Met−β−ナフチルアミ

群（酸フォスファクーゼ，カテプシソC）に分症で著明に活性が上昇する群（カテプシソB，

表l E−64−d強制経口投与のジストロフィーハムスター（BIO14．6）大腿四頭筋におけるカテプシソBおよびL活性に及ぼす影響（TrialⅣ）
Treatment CathepsinBandL

β−Glucuronidase CathepsinC TPI

mU／g tissue

Normal（10）34．0±6．8

15．3土 7．7

274土34

144士39Control（10）

97．6士30．2

73．8土31．2

304土37539土57E−64−d（30mg）（10）E−64−d（100mg）（10）88．6土41．3
81．1土24．3

md．

310±40md．

n．d．

316士36n．d．

E−64−d（300mg）（10）48．8±7．6

77．2土28．6

321士53510土49＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門
257

Ⅳ 個体レベルでの効果
表2 E−64−d混餌投与のジストロフィームハムスター（BIO14・6）大腿四頭筋におけるカテプシソBおよびL活性に及ぼす影響（Trial V）
Treatment

CathepsinBand

L

β一Glucuronidase

CathepsinC

TPI

mU／g tissue

Normal（10）

19．8士7．6ll．4±2．8

136土15Control（10）

82．0土51．9

116土41

234土56319士50E−64−d（0．0375％）（10）（0．125％）（10）60．7土31．7
50．3土22．6

109±26md．

310土40118土35md．

270土40（0．375％）（9）28．5土10．4

135士36276土58214土39

表3 E−64−d混餌投与のジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）大腿四頭筋におけるカテプ
シソBおよびL活性に及ぼす影響（Trial
I，Ⅲ）
Treatment Cathepsin B and L TPI
Trial

▲ 0

5
5

0 十
▲ 0
0 十
▲ 0

6

0 十

6

（0．1875％）6E−64−d与のジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1）
大腿四頭筋におけるカテプシソBおよびL
活性に及ぼす影響（TrialI）
Treatment Cathepsin B and L TPI

mU／g tissue

29．5士4．9

95．5土9．4

31．2：土2．2

96．6土7．4

113土52417土27132土47442±38414土27

Norma18（5）9（5）

29．5土4931．0±2．2

95．5士9．4
96．6土7．4

6

ControI

オスモティックミニポンプによるE−64−C投

mU／g tissue

Ⅱ

Normal表4

120土1040．0±1153．2土9．7

Contro18（3）9（6）

E−64−C

415土3891．5±6．6

420土65

112土30426土318（3）50．5±10．5416±409（6）66．0土26．0

410土35

TrialⅢ
Contro18（4）134（287，35，48，165）

347土66Ⅴ）。カテプシソB＆L活性とβ一ダルクロニダーゼ活性の著明な活性増加とカテプシソCの軽71．5土29397土28E−64−d a（5）（0．0375％）？（7）E−64−d8（5）（0．375％）52．6土21．0

374土28度の上昇がジストロフィー動物でみられること

24．6士12．3
23．8士9．2

384土30

は麦1と同様である。E−64−d の投与は投与量367土30に依存してカテプシソB＆Lの活性を低下さ？（7）32．8土4．7

340土31

せている。その他のリソゾーム酵素活性に対し？（7）ては勿論，無影響であった。この実験ではE−けることができる。TPIがジストロフィー動64−dのTPI抑制効果がみられる。しかし，昨物で上昇することは昨年報告したが，そのこと

年の結果およびその他の実験結果（表1，3，4）
ではE−64−CおよびE−64−dの投与がTPIのが確認された。E−64−d の投与は，投与量に従って，カテプシソB＆Lの活性を抑制し，300レベルを変動させておらず，その原田はわから

mg／kg体重／日の投与でカテプシソは正常ハない。

ムスターのレベル近くまで阻害されたが，30

2．VM一Ⅹ7．1系ハムスター骨格筋のカテプシンB＆Lに対するE−64−CおよびE−64−dの投与効果mg／kg体重／日では10％程度の阻害しかみられなかった。E−64−d の投与は他のリソゾーム

UM−Ⅹ7．1系ハムスターではより若い動物

酵素の活性やTPIのレベルには全く影響を与えなかった。

（4週令）に早期よりE−64−dが投与されてい次に，BIO14．6系ジストロフィ∴ハムスタ

E−64−d混餌投与した時の大腿四頭筋のカテーにE−64−d を混餌投与した時の大腿四頭筋の諸酵素の活性が表2に示されている（Tria1（TrialIおよびⅢ）。BIO14．6系と同様tJM

258

る。また，同時に雌雄差を検討した。表3は，プシソB＆L活性とTPIレベルを示している

30・筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

ーⅩ7．1ハムスター骨格筋のカテプシソB＆L

L活性を測定して最も目につくことは，個体差活性およびTPI

レベルは著明に上昇しているが極めて大きいことである。動物数が少ないが，雌雄差は認められない。やはりカテプシソと，E−64−dの効果の判定も極めて難しい。ジ

活性のばらつきは大きく，TrialⅢのジストロ

ストロフィー動物でもカテプシソ活性が全く正フィー動物E−64−d無投与群雄のように4例では，余りにも偏差が大きいので，平均値と個々常レベルにあるものも少なくないことは着日に価する。たまたま大腿四頭筋でそうであったのの動物の活性を示した。UM−Ⅹ7．1系の動物

かどうか，また，加令すればカテプシソ活性はでは最も少量のE−64−d投与群（0．0375％）でも有意義なカテプシソ活性の抑制がみられる。

上昇していくのか，さらに病理組織学的変化はどうであるかなど検討せねばならないだろう。

オスモティック・ミニポソプで4週令のハムス

ジストロフィー症で活性上昇するリソゾーム

ターに1ケ月間E−64−Cを投与した結果が表4の酵素群は著明に上昇するものと，ほとんど上に示されている（TrialI）。E−64−Cの投与で，昇しない群に分けられる。著明に活性が上昇す

正常レベルまでの骨格筋カテプシソB＆L活性の抑帥まみられないが，有意の阻害は認められる。

群である。ジストロフィー筋ではマクロファー

考察る酵素は本来骨格筋中に極めて活性の弱い酵素
ジの浸潤がみられるが，マクロファージは強い
カテプシソ∴B＆L活性をもっており，ここでBIO14．6系およびUM−Ⅹ7．1系ハムスタ

示した筋力テプシソ活性は，それらをも含んで測定している。今後も十分検討していかなけれーいずれの動物でもジストロフィー群では，骨ばならないが，ジストロフィー筋で上昇したカ格筋のリソゾームプロテアーゼ，カテプシソB

テプシソB＆Lは骨格筋のリソゾームの数が増えたというよりも，外来性，それも浸潤して＆I活性が上昇している。リソゾームの酵素活性の中，カテプシソB＆Lと共にβ−グルクロニダーゼ活性が上昇していること（UM−Ⅹ7．1

きたマクロファージに由来することも十分考え系では表には示されていない），TPI レベルがて，筋の再生を促がす作用をもつといわれておられる。マクロファージは変性した筋を掃除し高値を示す点もジストロフィーに共通にみられり，E−64−dの投与効果を検討する際，筋タンる現象であった。E−64−dは強制投与でも，まパクの崩壊の阻止作用と共に筋再生への影響も十分に観察する必要があるだろう。

た，混餌投与でも，経口投与でジストロフィー症で上昇した骨格筋のカテプシソB＆L活性の

文抑制効果がみられた。しかし，動物のE−64−dに対する感受性はBIO14ニ6とUM−Ⅹ7．1系
でやや異っており，UM−Ⅹ7．1系の方がより低い投与量で抑制効果がみられた（表2，3）。
これはハムスターの系統によってE−64−dの腸管吸収を含む体内代謝に差があり，骨格中でのE−64−Cの濃度に差があるのか，あるいはUM−Ⅹ7・1系での試験がより若い動物を使っていることに起因するのかもしれない。

献1）Katumuma，N．，Towatari，T．，Tamai．M．
and Hanada．K：J．Biochem．，93，1129−1135，
1983．

2）Igarashi，M．and Hallander，Ⅴ．P．：J．Biol．
Chemり243，6084−6089，1968．

3）Barrett，A．J．：Anal．Biochem．，47，280−293，
1972．

4）Kominami，E．，Wakamatsu，N．and Katunu・
ma，N．：J．Biol．Cbemり257，14648−14652．1982．

ジストロフィー症の骨格筋のカテプシソB＆259

組織学的および組織化学的研究
1）骨格筋の病理（分担4）

杉

田

秀

夫＊

埜 中 征 哉＊＊方法

病理学的検索には長指伸筋（自筋）とヒラメ筋（赤筋）を使用した。両筋は採取後直ちに液体窒素で冷却したイソペソタン内で凍結固定
し，10Jf厚の連続切片を得た。切片には，へマ
トキシリン・エオジン（HE），Gomoriトリク
ローム変法，NADH−TR，酸フォスファクー
ゼ，ATPase（routine，PH4．5，4．3）1），Ca2＋（GBHA）染色を行った。
壊死の部は広汎で，さらに多くの貪食細胞を入れていたので容易に同定できた。壊死の部は最終倍率×100の写真よりKontronMOP2にてその面積を測定した。長指伸筋は1mm2当り平均580本，ヒラメ筋は440本の筋線経が存在することを確かめたので，壊死部の面積の測定結果より壊死の線経の数を算定した。
筋ジストロフィーハムスターでは壊死に続いて活発な再生があるが，この再生線経の同定にはATPase染色が最も優れていることを予備実験で確認した。筋が壊死を起こした後，速やかに再生するが，この再生線経はATPaseの前処理液が酸性，アルカリ性いずれでもその活性を失わない（タイプ2C線経と呼ばれる）特徴を有していたので，このタイプ2C線経の数を算定した。長指伸筋，ヒラメ筋完全横断面で壊死，再生線維（degenerating／regenerating＊国立武蔵療養所神経センター疾病一部＊＊国立武蔵療養所神経センタ一散撒構造

fibers）の数を各個体で数え比較検討した。
結果

1．筋ジストロフィーハムスター（未治療）骨格筋の組織学的，組織化学的所見
生後2〜4ケ月の時点ではすべての筋ジスト
ロフィー筋には著明な組織学的変化がみられた（図1）。最も大きな変化は強い貪食反応を伴う
広汎な壊死であり，時には数mm2の広がりをもつ壊死巣を作っていた。また壊死に続く再生も活発で，しばしば大きな群をなして存在した（図2A）。再生線経で小径のものは塩基好性の飽体をもち大型の中心核と明瞭な核小体を持っていた。しかしかなり大径化した線経にも中心核は存在し，再生がほぼ完了した後も中心核は残るものと思われた。このような壊死，再生の主病理所見以外は，筋ジストロフィー筋にみられる結合織の増生，脂肪化などの所見に極めて乏しかった。しかし中には（特にUM−Ⅹ7．1）
筋細胞内に強い石灰沈着をみる線経があり，このような筋では結合織も増加していた。
組織化学的には貪食細胞は酸フォスファクー
ゼ染色で強い活性を示した。また再生線経は
routineATPase（図2B），PH4．5（図2C），
PH4．3（図2D）いずれのPHでのATPase
染色でも活性を示し，タイプ2C線経の反応を示した。石灰沈着の強い線経，壊死に陥りつつある線経，またOpaque線経はCa2＋染色（GBHA）で陽性に染出された。
以上の所見はBIO14．6群でも UM−Ⅹ7．1
261

Ⅳ 個体レベルでの効果

蒜舗線Yもニ

l

．tb

‰ ノ 叢

．

→† 一、日王∴∵十 ・∵㌔

l′

■
＿

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＼ ′・︑れ

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も

′

∵㌍予㌧

生後2ヶ月UM−Ⅹ7・1筋ジストロフィーハムスター骨格筋。左半分に広汎な壊死と強い貪食細胞がみられる。HE，×200。

㍍畝
︑∫・

瀾撒

図1

上、J、−ノ・．

てヽ．I●ヽ
図2

生後2ヶ月UM−Ⅹ7・1筋ジストロフィーハムスター骨格筋（ヒラメ筋）。分化したタイプ1（1），2A（A）線経もみられるが，中心核をもつ小径線経はATPaseのいずれの染色でも活性あるタイプ2C反応を示して再生途上筋であることが分
る0中心核をもっていても分化したタイプ2A線維（天頭印）を示すものもある。
A：HE，B：rOutineATPase C：ATPase（pH4．5），D：（pH4．3），
A一刀：×150262

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

図3

生後2ヶ月UM−Ⅹ7．1筋ジストローフィーハムスター骨格筋。E−64−C（ミニポンプ）治療後もなお存在する広汎な壊死を示す。HE，×200．
表1DEGENERATING／REGENERATING FIBERSIN UNTREATED
AND E−64−C TREATED DYSTROPHIC MUSCLES（UM−Ⅹ7．1）

MALE

FEMALETOTAL

SOLEUSUNTREATEI）

323．6±111．7（3）836．3±662．4（3）668．0±439．4（4）405．4±126．5（4）495．8±343．2（7）589．9±455．4（7）UNTREATED

177．7±76．6（3）461．2±160．8（4）339．7±194．6（7）75mg／kg＊

325．9±119．8（3）196．8土105．98（4）252．1土123．1（7）75mg／kg＊
EXT．DIG．LONG．

（）：No．of animals examined a p＜0．05

群でも大差はなかったが，筋線稚内のCa2＋沈
着は後者で著明であった。BIO14．6では雄のみ検索したが，UM−Ⅹ7．1では雌雄検索し，性差は認められなかった。また赤筋（ヒラメ筋），自筋（長指伸筋，前脛骨筋）間にも特に差はなく両者の筋に壊死，再生像をみた。個体差が大変強いことが特記すべきことであった。
すなわち，ヒラメ筋あるいは長指伸筋の半分以上が壊死に陥るような強い変化のものがあると思うと，壊死は全くなく，中心核線維のみ存在する極めて軽症なものがあるなどのばらつきが存在した。この個体差はE−64−d投与効果判定＊daily by miniosmotic pumpに難題を残した。
2．治療群の効果（1）ミニポンプによる E−64−CのUM−Ⅹ7．1への投与（TrialI）
生後28日目より約1ケ月の投与で雄3，雌4にE−64−Cが投与されたが，どの個体にも壊死ないし再生線経がみられた（図3）。その結果は表1の如くで，治療群中雌の長指伸筋に壊死・再生線経が有意（p＜0．05）に少なかった。
（2）混餌によるE−64−dのUM−Ⅹ7．1への投与（TrialIII）
この群では生後約1ケ月の筋ジストロフィー263

Ⅳ 個体レベルでの効果
表2

DEGERATING／REGENERATING FIBERSIN UNTREATED AND
E−64−d TREATED DYSTROPHIC MUSCLES（UM−Ⅹ7．1）

MALE

FEMALE

TOTAL

403．3土228．9（5）497．1土263．8（5）403．4土168．1（7）403．3土180．7（11）30mg／kg＊

763．7土433．48（7）652．7土382．98（12）300mg／kg

438．5±162．2（5）641．1土119．5e（7）556．7±168．Ob（12）167．2土130．6（4）230．6土115．8（5）513．6±283．3（7）387．7土289．6（11）30mg／kg

323．9土251．4（7）285．1土204．0（12）300mg／kg

491．3±556．6（5）416．6士301．0（7）447．8土404．5（12）SOLEUSUNTREATED

EXT．DIG．LONG．
UNTREATED（）：No．of animals examined ap＜0．1bp＜0．05

表3

cp＜0．02＊daily，Orally

THERAPEUTIC EFFECTOF E−64−d ON DYSTROPHIC
MUSCLES（BIO14．6）
TIB．ANT．

EDL．

SOL．

RECT．FEM．

（10）

1．8土1．2＊（5）

3．0 土1．4

0．6± 0．5

2．0士1．1

1．0 土 0．0

2．8 ＝ヒ1．3

1．6±1．6

3．7 土1．0
3．4 士1．3
3．3 士1．3
3．1土1．2

100mg／kg／day（10）2．8 士1．1

0．8 ± 0．8

3．2 士1．1

3．3 ＝ヒ 0．9

1．1土1．5

ADDED TO DIETCONTROL
30mg／kg／day

300mg／kg／day（9）ORAL ADMINISTRATION（10）

2．3±1．5

1．0：土1．6

3．0 ±1．4（10）

2．4 士1．4
2．2 ±1．5

2．1±1．2

100mg／kg／day（10）1．1±1．2

2．8 士1．2
1．8 土1．3

300mg／kg／day（10）2．4 士1．5

0．2 土 0．4

3．1±1．3

CONTROL
30mg／kg／day（）：No．of animals examined＊gradedbythe extent of necrosis O（none）−4（marked）

ハムスターに30mg／kgと300mg／kgのE−

64−dが混餌して与えられた。この群での壊死・再生線経の本数は表2の如くなった。この群では雌のヒラメ筋でその数が増加（30mg／kg
群でp＜0・05，300mg／kg群でP＜0．02）．していたが，有意に減少しているものはなかった（表2）。
（3）混餌および強制経口によるE−64−dのBIO
14．6への投与（TrialIV，Ⅴ）
この群では生後約2ケ月のBIO14．6筋ジス
トロフィーハムスターに2ケ月間の経口投与が行われた。この群のみ活療効果の判定が異なる。壊死線経の数がほとんど皆無に等しいもの
は0点，最も強いものに4点を与え，その点数により評価した。表3に示すようにいずれの筋でも有意な壊死線経の減少はなかった。
264

考

察

今回の実験ではE−64−Cはミニポンプで，E−64−dは経口的に筋ジストロフィーハムスタ

ーに投与された。その骨格筋を病理学的に検索したがE−64が有効であるという確証を得るまでの結果は得られなかった○筋ジストロフィーハムスターは筋ジストロフィーチキンに続いてE−64の薬効試験に使用されたが，果してこのモデル動物がヒト筋ジスト
ロフィー（特にI）uchenne型筋ジストロフィー）とどこまで頼似性をもつかということを明らかにする必要がある。もしあまりにも類似性がないとするとE−64が動物に無効であるからといって，すぐにヒト筋ジストロフィーにも無効であるとは断言できないからである。筋ジス

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

トロフィーハムスターも骨格筋線経の変性，壊表4COMPARATIVEHISTOCHEMISTRYIN HUMAN（I）UCHENNE） AND
HAMSTER MUSCULAR DYST．

死，それに続く再生像を主病理所見としているのは共通である2・3）。壊死の部には筋ジストロ

HUMAN HAMSTER

＊

＋

＊

＋＋一

ストロフィーハムスターでは壊死部が非常に広Adipose tissue＊

Type2Cfiber
Vacuolation
Fibrosis＋＋一と，結合織の増生がほとんどなくまた脂肪織の＊Regenerating負ber

いう仮説4）が正しいとするならば，筋の崩壊過程は両者で共通であることになる。ただ，筋ジ汎であること，再生がほぼ完全に達成されるこ＊

Opaque丘ber

十一＋収縮，それに続くカルシウム依存性プロテアー
ゼ（CANP）の活性化があり，筋が崩壊するとNecrotic丘ber＋＋

損，細胞外液中のCa2十の細胞内への流入，過Variationin負ber size
Hypertrophicfiber

十一＋縮）線経が出現し，その多くは Ca2＋染色（GBHA）で陽性である。もし筋線維膜の欠＋一＋フィーハムスクr筋でも，まずopaque（過収Calcium−loadedfiber＋＊＋

Densely calci丘ed負ber

Affected muscle white＋red white＋red

侵入もほとんどないことが大きな違いである。
再生が速やかであることは，筋ジストロフィー＊frequently seeninlarge groups

ハムスターに筋力低下が少ないことをよく説明

L1ケ月間内に壊死があったとすると壊死線経する所見と思われる。ヒトとハムスター筋ジス

か，再生線維（タイプ2C線維）いずれかが存在することになる。そこで治療期間ゐ1ケ月間トロフィーの病理学的所見の違いを表4に示した。

にE−64が壊死を完全に抑制していたとするな

以上のように筋ジストロフィーハムスターでは骨格筋は壊死しても再生が活発なため，臨床らば，この壊死＋再生（タイプ2C）線経はみ

的に筋力低下が少なくE−64の薬効を筋力より判定することは難しい。また病理学的にも個体差が大きく，非治療動物でも全く壊死のみられ程を抑制していたとするならは対照に比べて壊ないものもいる。もしE−64が完全に壊死を抑えるのなら問題はないが，完全でないためその壊死＋再生線経の減少をみなかったことは，本

判定は壊死の有無のみでは決定しがたい。そこ
で再生線経も含めて効果判定を行うことにした。
骨格筋は何らかの外傷，病的過程で筋線経が壊死に陥ると続いて再生する。哺乳動物の骨格筋では再生線経は組織化学的に種々の染色性を示し同定できるが，その中で最も優れているのは前述したATPase染色である1・5）。正常ハ
ムスター骨格筋に塩酸プビバカイン（筋線維のみ破壊し速やかな再生筋をみることで知られている6））を筋注すると注射後4〜5日目に再生筋が出現し，この再生線経は自筋である長指伸筋では約3週，赤筋であるヒラメ筋では約4週間ATPase染色でタイプ2C反応を示すこと
が予備実験で確かめられている。すなわち，もられないことになる。完全でなくても壊死の過死＋再生線経の数は減少していることになる0しかしいずれの投与法でもE−64投与により，剤は筋ジストロフィーハムスター骨格筋の壊死に対する抑制効果はなかったと判断せざるを得ない。
E−64のみならずプロテアーゼインヒビターの効果をみるためには，臨床像，病理像がヒト
筋ジストロフィーにより近いモデル動物の開発がまたれるところである。
文

献1）Dut）0witz，Ⅴ．and Brooke，M．H．：Muscle
Biopsy．AModemApproach．Saunders，London，1973．

2）Homburger，F．：Myopathy of hamster dy・
StrOPhy．Histroyandmorphologicaspects，Ann．
N．Y．Acad．Sciリ317，2−17，1979．

3）野々村禎昭：ジストロフィー・ハムスターに関する知見，厚生省神経疾患，筋の発生と分化に閑265

Ⅳ 個体レベルでの効果する基礎的研究，昭和56年度研究報告書，p．3−7，
1982．

4）埜中征茂，杉田秀夫：進行性筋ジストロフィー症の筋病理−Opaque線経を中心として−，神経進歩，24，718−728，1980．
5）Nonaka，Ⅰ．，Takagi，A．and Sugita，H．：The
Significance of type2c muscle丘bersin Duc−266

henne muscular dystrophy，Muscle Nerve，4，326−333，1981．
6）Nonaka，ⅠリTakagi，A．，Ishiura．S．，Nakase，

H．and Sugita，H．：Pathophysiology ofmuscle
fiber necrosisinduced by bupivacaine hydro−

Chloride（Marcaine），ActaNeuropathol．（Berl．），
in press．

組織学的及び組織化学的研究
2）心筋の病理（分担5）大 関 正 弘＊ 和 田
研究協力者

木

村

正

明＊

河

西

櫓

本

保

男＊

中

根

昭＊＊
章＊

貞

山

上

聡

子＊

雄＊

心臓は，採取後直ちに液体窒素で冷却したイソ

本試験で対象としたUM−Ⅹ7．1系ハムスター（TrialI，ⅠⅠ，ⅤⅠ）は生後約8〜9週令である。随所に間菓系細胞の増殖を伴う心筋壊死（図1）が散見されたが，該動物の心病変の特ペンタン内で凍結固定し，中心部切断による水徴はCalcifiedfociが顕著な点である（図2）。

方法

BIO14．6系筋ジストロフィーハムスターの平断面の10JJ厚切片を作成し，へマトキシリ
ソ・エオジン（H．E）およびMassonのトリ

クローム変法染色を行った。UM−Ⅹ7．1系の場合摘出心臓をLillieの10％緩衝ホルマリソ

イ＼．・でで固定し，縦断面の約6／J厚パラフィン切片を得て，H．EおよびMassonのトリクローム変法染色標本を作成した。
筋ジストロフィーハムスターにおける心臓の組織変化はCalci丘edfociとその他のmyoly−
tic changeS（心筋の壊死，変性，fibrosis）の2種類に大別された。
そこで，この2種類の変化を指標にして，各個体の1切片中における病変範囲により0（変化なし），1（小範囲），2（広範囲）の3段階に grade分けし，治療群と未治療群の数値を比較して効力を検討した。
結果

1．第ジストロフィーハムスター（未治療）心筋の組
織学的所見＊大正製薬株式会社総合研究所＊＊大阪府立成人病セソクー，病理図2267

Ⅳ 個体レベルでの効果

図3

オスモティックミニポンプを用いてE−64−Cを投与した筋ジストロフィー
ハムスターUM−Ⅹ7．1の組織学的所見

30mg／kg／day（n：17）

48︵CI○︶一uちd

ぼ同じ程度に観察され，また個体問のバラツキ
ほ比較的少なかった。
2．治療群の効果（1）ミニポンプによる

E−64−CのUM−Ⅹ7．1

2筋ジストロフィーハムスターへの投与（Trial
I）

28日令動物に75mg／kgをミニポンプで約1ケ月間投与した場合の結果を図3に示す。

C 30（n：13）

治療群の雌1例と末治療群の雄1例には組織変化が観察されなかった。治療群ではmyolytic
Changesがやや抑制されたが，Calcified foci150mg／kg／day（n：12）48︵MlO︶三〇dはむしろ増強傾向がうかがわれた。いずれも有意な差はなかった。

2（2）UM一Ⅹ7．1系筋ジストロフィーハムスタ
ーに対するE−64−d混餌投与の効果（Trial
ⅠⅠ，ⅤⅠ）

この群ではE−64−d30mg／kgと150mg／kg
C150（n：12）

図4 E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハム
スターUM−Ⅹ7．1の組織学的所見

を1ケ月間混餌で与えられた。未治療群では上記（1）と比べてCalcifiedfociが広範囲に観察された。治療群では30mg／kgにおけるCalci負一

また，個体間のバラツキも多く，一部の動物に

edfoci，150mg／kgにおける Calcifiedfoci，ならびにmyolytic changes の軽減傾向が認は組織変化の明らかでないものもあった。
約20週令のBIO14．6系ハムスター（Trial

められたが，いずれも個体間のバラツキが大きく，有意ではなかった（図4）。

IV，V）のCalcifiedfociは前記UM−Ⅹ7．1（3）BIO14．6糸筋ジストロフィーハムスター

系ハムスターの場合と比べてさほど顕著でなに対するE−64−dの混餌および経口投与の効
果（TrialIV，Ⅴ）

く，心筋壊死などのmyolytic changes
268とは30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

図5 胃ゾンデを用いてE−64−dを経口投与した筋ジストロフィーハムスター
BIO14．6の組織学的所見（TrialIV）

図6 E−64−dを混餌投与した筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の組織学的所見（TriaiV）

この群では生後約70日目から9週間にわた
り30，100および300mg／kgが投与された。
混餌投与の場合も経口投与の場合も Calcified
fociおよびmyolyticchangesに有意な軽減は認められなかった（図5，6）。
考察

心筋の配列，走行は骨格筋のそれと比べて複雑であり，しかも筋ジストロフィーハムスター

における心臓の形態学的諸変化は断面の違い
によってその範囲も異なる可能性も考えられ
る1）・2）が，Syamalら3）は，lsttickの光顕的観察における Calciumdepositの程度は同じ
心臓のCa定量値とその傾向が一致しているとし，Ca括抗剤の薬効検定において，便法としてl s沌ckからの光顕的観察を用いている。
本試験でも，同一動物の心臓から病理組織学的検索と同時に種々の生化学的定量を実施したた
め，前記したSyamalら3）の方法に準じて縦断面あるいは横断面のl sttickを対象に評価した。
供試したUM−Ⅹ7．1とBIO14．6の2系統の筋ジストロフィーハムスターの心臓における組織変化はCalcified fociとその他のmyOly−
tic changes（心筋壊死，変性およびfibrosisなど）の2種に分類された。そこでこの2種の変化を指標にして，E−64の作用を検討した。
今回はE−64を種々の投与方法で筋ジストロフィーハムスターに投与したが，この評価法による限りいずれにおいてもE−64の有効性を示唆
269

Ⅳ 個体レベルでの効果するCalcifiedfociとmyolyticchangesの有意な抑制作用は認められなかった0
今後は，心臓の連続切片による総合的評価と同時に，他種の羅患動物での効力検定を試みていきたいと考えている0
文献1）Jasmin，G．andEu，H．Y・：Cardiomyopathyof hamster dystrophy，Ann．N．Y．Acad．Sci・，

270

317，46−58，1979．

2）Jasmin，G．and Proschek，L・：Hereditarypolymyopathy and cardiomyopathyin thesyrianhamster・1・prOgreSSion of heart andskeletal musclelesionsin theUM−Ⅹ7．11ine，Muscle＆Nerve，5，20−25，1982．
3）Bhattacharya，S．K．，Palmieri，G・M・A・，
Bertorini，T．E．andNutting，D．F．：Theeffect亭

of diltiazemin dystrophic hamsters，Muscle＆Nerve，5，73−78，1982．

筋エネルギー代謝に及ぼす影響（分担6）

市

目

原

的

明＊

表1E−64−d経口投与のジストロフィーハムス
ター

BIO14．6大腿二頭筋におけるアル

ドラーゼおよび分岐鎖アミノ酸トランス

羅患ハムスターの筋肉の解糖系の活性をフル

アミナーゼ活性におよぼす影響（Trial

クトースー1，6−ジリン酸アルドラーゼ（アルドラIV）ーゼ）で，また筋肉は分岐鎖アミノ酸からェネ

アルドラーゼ

ルギーを得ていると考えられているのでその指BCAT（芸謎min／Hg謎b／）

標として分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ活性（BCAT）を正常筋肉と比較し，またE−64

正常（n＝5）23．7士1．30

11．4土0．66−d投与の影響を見た。

羅患（以下n＝6）

19．2土0．77

21．6土1．06〝＋E−64−d30mg〝〝 100mg23．0士2．4
18．3±0．36

22．0土3．56
21．4土2．51〟

19．9土0．47

20．5土0．62

方

法

〟

300mg

E−64−dを2ケ月間強制経口投与したBIO
14．6ハムスターを除血犠牲後直ちに大腿二頭筋を採取した（TrialIV）。−800C凍結保存後筋

考察

肉を20mM Tris／lmM EDTA／0．15M KCl

アルドラーゼは解糖系の代表的酵素であるがbH7．5）buだer でホモゼネートとし，10％解糖系エネルギー産生を律速する酵素ではない

可溶画分を作製して酵素液とし，アルドラーゼ

から，この活性に変化がないからと言ってジスは酵素法1），BCATは比色法2）で測定した。

トロフィー筋で解糖系エネルギー産生が正常で結果表1に示す如くアルドラーゼで正常とE−64

あるとは言えない。しかし癌化に伴い活性が上昇しアイソザイムも変化する3）。しかし今回の検討では筋肉ではいずれの場合も変化していな

d30mg投与で，やや高値となったが誤差もかった0 またアイソザイムも筋型であった。

大きく，他のグループと有意の変化があるとは考えられない。

していると考えられている4）。飢餓，糖尿病，

一方BCATは筋肉のエネルギー産生に関係

BCATは正常に比し罷患筋では約2倍に活

肝性脳症等で分岐鎖アミノ酸代謝は筋肉で増加性が上昇していた。しかしE−64−d投与はいずすると報告され，また分岐鎖アミノ酸（殊にロれのdoseでも，これを低下させることはなかった。

イシン）は筋蛋白の合成を促進，分解を抑制すると言う。今回の実験でBCAT活性が羅患筋で2倍に上昇していることは興味深い。この機構＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素病理部門

が何によっているのかほ不明であるが，羅息ハ271

Ⅳ 個体レベルでの効果

ムスターの方が摂食量が正常より少ないことはないかも考えねばならない。次に羅患ハムスタ
ー筋肉が正常より重量的に小さくなって比活性として上昇している可能性もあるが，先述のア
ルドラーゼに著変がないことからもその可能性は少ない。BCATが上昇して分岐鎖アミノ酸
代謝が羅患ハムスタ」で上昇している可能性が伺われたが，これがどの様な生理的，病理的意味をもっているのか今後検討する必要がある。し272

かしE−64−d投与の効果は認められなかった。
文

献1）Lebherz．H．G．and Rutter，W．J．：Methods
Enzymol，ⅩLII，249−251，1975．
2）Ichihara，A，and Koyama，E．：J．Biochem．，
59，160−169，1966．

3）Weinhouse，S．et．al：Gann．monogr．13，1−17，
1972．53，324−327，1981．

4）市原 明：生化学，53，324−327，1981．

ジストロフィー筋ガングリオシドに対するE−64−dの効果（分担7）

官

武

正＊

研究協力者 官 谷 信 行＊ 渥 美 哲 至＊ 有 賀 敏 夫＊＊

はじめにかけ，中性糖脂質を除いたあと，0．2M酢酸ナトリウムにて酸性糖脂質を溶出した。この分画常が想定されている。我々は，これまで掟の成の一部よりシァル酸含量を測定し，総ガングリ
オシド量を求め，残りを0．1NNaOHにてアル分であるガングリオシドに関して検討し，ジス
トロフィーチキン筋において，ガングリオシド

カリ処理した後，蒸発乾国し，次いでSephadex
LH−20カラム（1×40cm）にかけて脱塩した。

の増加を認めている。今回は，ジストロフィー
ハムスター骨格筋のガングリオシドについて検

最後にイアトロビーズカラム（1×3cm）にかけ，C−M（1：2，溶比）にてガングリオシドを討した。

溶出し，蒸発乾固した。
シァル酸含量はSvennerholmの方法によ

筋ジストロフィー症は，その原田として性莫異

材料および方法
研究班から提供されたジストロフィーハムス

って測定した。
2．薄層クロマトグラフィー

ターBIO14．6系，E−64−d投与群（TrialⅠⅤ）

ガングリオシドの組成は，以下の展開溶媒系

および非投与群，UM一Ⅹ7．1系のE−64−d投を用いてTLCにより分析した。a）C−M−
0．22％CaC12・2H20（55：45：10，溶比），b）

与群（TrialII）および非投与群の前肢から，主として三角筋を採取し，正常筋とガングリオ
シドパターソを比較した。

C−M−5MNH．OH−2％CaC12・2H20（60：40：
4：5，溶比）。

1．ガングリオシドの抽出および定量

結筋肉3gのhomogenateからク。Pホルム（C）−メタノール（M）（2：1，溶比）にて抽出

果

1．BIO系

した総脂質をC−M（9：1，溶比）に溶解し，ジストロフィー筋では総ガングリオシド量がイアトロビーズカラム（1×10cm）にかけ，有意に増加していた（表1）。各分画では，正C−M（8：2，溶比），（7：3，溶比），（6：4，溶比），（5：5，溶比），（4：6，溶比），およびC−M一水（30：60：8，溶比）にて溶出した。次
いで，得られたガングリオシド分画を合し，常筋，ジストロフィー筋ともGM3ガソグリオ

DEAE−Sephadex A−25カラム（1×3cm）にシドが約90％を占め，その％，絶対量ともジストロフィー筋が有意の高値を示した（表2，3）。GM3ガングリオシドには，N−アセチルおよびN一グリコリルの2種類がみられたが，ジストロフィー筋と正常筋の問に，その比に差は＊新潟大・脳研・神経内科＊＊東京都臨床医学総合研究所

みられなかった。
E−64−d強制経口投与群（TrialIV）では273

Ⅳ 個体レベルでの効果
表1Totalganglioside（TrialIV BIO系）
ug NANA／g．W．W．

FLg NANA／g．dry w．

Normal

13．5土2．4（n＝9）

69．8土13．4（n＝9）

Dystrophy

19．3土6．5（n＝9）＊98．0土33．9（n＝9）＊100．0土16．2（n＝4）

Dystrophy（E−64−d39）
30mg

18．9土3．3（n＝4）

lOOmg

15．7士7．1（n＝4）

76．7士35．4（n＝4）

300mg20．5±2．5（n＝4）

100．1±10．8（n＝4）＊p＜0．01

表2 GM3ganglioside（％of totalganglioside，TrialIV BIO系）

Normal83．3土6．0（n＝9）

Dystrophy

89．4±3．7（n＝9）＊

Dystrophy（E−64−d）
30mg

83．4士9．0（n＝4）

lOOmg

88．0土3．3（n＝4）

300mg89．7±5．4（n＝3）＊p＜0．025

表3

GM3ganglioside（TrialIV BIO系）
JLg NANA／g．W．W．

FLg NANA／g．dry w．

Normal

10．8土2．0（n＝9）

54．8土11．3（n＝9）

Dystrophy

16．5土6．2（n＝7）＊

82．8土30．8（n＝9）＊

Dystroplly（E−64−da）
30mg

16．8±4．2（n＝4）

80．2±10．8（n＝4）

lOOmg

13．9士6．8（n＝4）

68．0±16．8（n＝4）

300mg

17．5±2．4（n＝3）

85．7±5．7（n＝3）＊p＜0．025

表4

Total ganglioside（TrialII UM−Ⅹ系）
FLg NANA／g．W．W．

Norma125．7±6．2（n＝5）

122土26（n＝5）

Dystrophy

25．8±3．9（n＝5）

119土22（n＝5）

22．7j＝2．4（n＝5）

111士18（n＝5）

Dystrophy（E−64−d，150mg）

30mg，100mg，300mg／kg／日

投与群のいずれにおいても，上記の指標に影響はみられなかった（表1，2，3）。
2．UnI−Ⅹ系
ジストロフィー筋においても，正常との差は認められなかった（表4）。

274

FLg NANA／g．dry w．

考

察

我々は，ジストロフィーチキン胸筋において総ガンリグオシド量が正常筋の3．6倍に増加
し，その分画ではGM3，GD3，GT3

ガングリ

オシドなどが増加していることを，既に報告した1）。その後Hoganら2），Kunduら3）もジス

30．肪ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

トロフィーチキンにおいて同様の報告を行っている。

ロフィーハムスター骨格筋におけるガングリオ

今回検索したジストロフィーハムスター，

シドの増加は比較的軽いことから，その効果判

BIO系でも同様に総力∵／グリオシドの増加，
GM3

ドに対する影響は認められなかったが，ジスト

定には，さらに検討が必要と思われる。

ガングリオシドの増加がみられたが，そ文の程度は正常の約1．5倍と比較的軽く，またU
M−Ⅹ系では正常筋との差はみられなかった。
この違いは，チキンとハムスターの種差，あるいは，骨格筋障害の程度の差を反映するものと思われる。また，検索したBIO系の方が，UM−Ⅹ
系より約2ケ月高令である影響も考えられる。
ジストロフィー筋では再生筋線経が多くみられるが，ジストロフィーチキンのガソグリオシ

献1）Miyatake，T．，Nakamura，K．，Ariga，T．and
Atsumi，T．：Gangliosideindystrophicchicken
muscle，ⅠnMusculardystrophy（ed．byEbashi，

S．），UniversityofTokyoPress，Tokyo，1982．
2）Hogan．E．L．，Happel，R．D．and ChienJ．
−L．：Membrane glycosphingolipidsinchicken
musculardystorophy，Adv．Exp．Med．＆Bio1．，
152，273，1982．

ド分画増加のパターンは，Saitoら4）の報告し3）Kundu，S．K．，Misra L．K．and Luthra，M．

ている発育によるニワトリ骨格筋のガングリオ

G．：Muscle glycolipidsininherited musclllar

シド変化のパターンとも一致しておらず，ジス
トロフィー筋におけるガングリオシド増加の秩序は現在のところ不明である。
今回の検索では，E−64−dの筋ガングリオシ

dystrophy of chickens，FEBS Lett．，150，359．
1982．

4）Saito，M．andRosenberg，A．：Glycolipidsand
theirdevelopmentalpattemsin chick thighandleg muscles．J．Lipid Res．，23，3，1982．

275自然発症筋ジストロフィーハムスターにおけるE−64−dの薬物代謝酵素ならびにグルタチオン
代謝酵素活性への影響（分担8）北 川 晴 雄＊研究協力者 佐 藤 哲 男＊ 五十嵐

研究目的
昨年度までは，E−64およびその誘導体の一つであるE−64−Cのラット肝薬物代謝酵素活性およびグルタチオン代謝に対する影響を，in
Vivoおよびin vitroにおいて検索した。本
年度はE−64の他の誘導体の一つであるE−64−dを用い，自然発症筋ジストロフィーハムス
ターにおける肝薬物代謝酵素活性およびグルタ
チオン代謝の影響について検討した。肝臓は薬物代謝の主要な場であり，生体内に取り込まれた異物のほとんどは肝の薬物代謝酵素により不括化あるいは逆に活性化され，薬効が増大もしくは軽減する。また，この様な肝における代謝をうけて初めて毒性を示す，いわゆる代謝的活性化は，毒性の発現概括を考える上でますます重要視されている。一方，活性代謝物の多くは，生体内グルタチオンと抱合しメルカプツー
ル酸となって排泄されることから，生体内グルタチオンは薬物の毒性を論ずる場合極めて重要な因子であり，薬物の解毒機構において大きく貢献している。以上の事実から，将来E−64−dが臨床に適用された場合を考える時，そのものの肝薬物代謝酵素活性およびグルタチオン代謝
酵素活性に対する影響の基礎的検討を行うことは十分に意義深いものである。
＊千葉大学薬学部薬効・安全性学講座薬物学研究室隆＊

実験材料および方法
自然発症筋ジストロフィーハムスター（筋ジスハムスター）は本共同研究概要表1に示された動物標本を用いた。すなわち，TrialIVに用いられたBIO14．6系とTrialIIに用いられたUM−Ⅹ7．1系である。いずれの場合においてもラットを犠殺し，可及的速やかに肝臓を摘出した後，その一部を実験に供した。肝臓は
重量測定後，直ちに1．15％KClにて港流脱血し再び重量を秤量し冷1．15％KClで10％ホモジネートを調製した。ホモジネートの1部
はガーゼで炉過した後，γ−ダルクミルトランス
べプチターゼ（γ一GTP）活性の測定に用いた。
また，残りのホモジネートは常法に従い超遠心分離により ミクロゾーム（Ms）画分と細胞質（Cytosol）画分を待，Ms画分は，0．1M Na，
K−リン酸緩衝液（pH7．4）に懸濁して酵素材料とした。アミノピリソ，ペソゾフェタミソ，エチルモルヒネ（基質濃度はすべてlmM）の脱メチル化活性はNash法1）により測定した。
また，アニリン（lmM）水酸化活性の測定はImaiandSatoの方法2）に準じて行った。チトクロムP−450およびb5量はOmuraandSatoの方法3）により求め，NADH−Ferricyanide還元酵素（Fpl）活性はMihara and Satoの方
法4）により，NADPH−CytOChrome P−450還元酵素（Fp2）活性は，PhillipsandLangdon277

Ⅳ

個体レベルでの効果

表1Invivoe仔ect of E−64−dadministration on hepatic microsomal
CytOChrome P−450and bs contentsin congenitalmuscular dy−
StrOPhy hamsters（BIO14．6，TrialIV）
Cytochrome P−450
Line

E−64−dCytochrome b5n（nmole／mg protein）

14．6

Untreated

14．6

Treated

14．6

Treated

14．6

Treated

30

lOO
300

1010101010

FIB（Normal）

0．98±0．03

0．54土0．01

0．78土0．03C】

0．50土0．01a）

0．72土0．01C）

0．45±0．02C】・d）

0．73土0．03e〉

0．49土0．01aI

O．74土0．03亡）

0．47土0．02bIa）p＜0．05，b）p＜0．01，C）p＜0．001vsNormal・d）p＜0・05vs Untreated・
表2In vivoeffect of E−64−dadministration＿On hepatic microsomal
NADH−ferricyanide reductase（Fpl）and NADPH−CytOChrome
P−450reductase（Fp2）activitiesin congenitalmusculardys−
trophy hamsters（BIO14．6，TrialIV）・

Line

ET64−dDose（mg／kg）

14．6

Treated

14．6

Treated

30
lOO
300

0
1

Treated

0
1

14．6

0
1

Untreated

0
1

14．6

Fp2

（Unit／mgprotein）
0
1

FIB（Normal）

Fpl

4．40土0．17

0．16±0．004

3．42土0．06a）

0．18土0．002a1

3．12士0．08a）・e）

0．18±0．0048】

3．36±0．08a）
0．18土0．004aI
3．89土0．11b）・￠） 0．20±0．005叫d）a）p＜0．001，b）p＜0．05vs Normal．C）p＜0．01，d）p＜0．05vs Untreated・の方法5）により，それぞれ測定した。一方，ホ
モジネートおよびMs中のrGTP活性は，OrlowskiandMeisterの方法6）を一部改良した方法7）で測定した。また，Cytosolのグルタ
チオンベルオキシダーゼ（GSH−Px）活性は，クメソヒドロパーオキシド（CHP）および過酸
化水素（H202）を基質とし，Lawrence and
Burkの方法8）に準じて測定した。さらに
CytOSOl中のグルタチオンーS−トランスフェラーゼ（GST）活性は基質として1−クロロー2，4−
ジニトロベンゼン（CDNB）および1，2−ジクP
ロー4−ニトロベンゼン（DCNB）を用い，Habig

らの方法9）に従い測定した。なお，蛋白定量はLowryらの方法10）により行った。
実験結果

肝MsのCyt．P−450およびb5量は，筋ジス群では無発症群（Normal群）に比較して有意に減少した（表1）。さらに，E−64−d投与群のいずれにおいても無処置筋ジス群と同様，顕著な低下がみられ，無処置筋ジス群との間に有意な差はみられなかった。また，表2に示すよ
うに，Fpl活性はP−450およびb5量と同様，
筋ジス群において著明な低下がみられたが，E−64−d投与群では投与量に依存して活性の回復がみられ，300mg／kg投与群では無処置筋
ジス群に比較して有意に活性の増加が認められた。また，Fp2活性については，Fpl活性の場
合とは逆に筋ジス群では無発症群に比較して有意な活性の上昇がみられ，E−64−d300mg／kg
投与群では無処置筋ジス群よりさらに有意な増加がみられた。また，この時の肝Msにおける1筋ジスハムスターBIO14．6 における E−64−d

アミノピリン，エチルモルヒネおよびベンゾフ

60日間連続経口投与の影響（TrialIV）

ェタミソの脱メチル化活性およびアニリンの水278

30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）
表3InvivoeffectofE−64−dadministrationonhepaticmicrosomalaminopyrine，
ethylmorphine，benzphetamine demethylation and aniline hydroxylationin
COngenitalmusculardystrophy hamsters（BIO14．6，TrialIV）

Aminopyrine Ethylmorphine Benzphetamine

E−64−d Dose n（mg／kg）

Aniline（nmole／min／mg protein）

01
01
01
01
0
1

300000
13

a −e
de
eded
reatatat
UntTre
eT
Tr
re

︶
a
m
r
O
N
B．6666
Fl14141414

9．46土0．18
9．82土0．14
9．41±0．18
0．68±0．03
8．03土0．17C1 8．03土0．19C） 8．24土0．18e） 0．67土0．01
7．04土0．12C】 7．17土0．15eI・e）7．26士0．09C）・fI 0．57±0．01叫f）
7．47土0．22CI

7．20土0．27叫dI7．24±0．23e） 0．61±0．02叫e】

7．02土0．23el・e】6．89土0．31C】，e）6．32土0．38C〉tf）0．58±0．02el・f）

a）p＜0・05，b）p＜0．01，C）p＜0．001vsNormal．d）p＜0．05，e）p＜0．01，f）p＜0．00lvsUntreated．

表4In vivo effect of E−64−d administration on gamma−glutamyltranspeptidase
activitiesinliver homogenates and microsomesin congenital muscular
dystrophyhamsters（BIO14．6，TrialIV）．

Line

E−64−dDose

Gamma−glutamyltranspeptidase（mg／kg）

Homogenates Microsomes
0
1
0
1
0
1

0
0
1

0
0
1
1

0
0
3

0
3

teddd
retaatatntrerere
UTTT

︶
a
m
r
O
N
B．6666n14144114（mUnit／mg protein）

0．57土0．02

0．98土0．05

0．21土0．02a】

0．33土0．028）

0．15±0．018】・e）
O．15±0．01町C）

0．31土0．01aI
0．33土0．02a）

0．28士0．0281沖

0．51士0．05町ela）p＜0．001vs Normal．b）p＜0．05，C）p＜0．01vs Untreated．

酸化活性は表3に示した。この結果，筋ジス群
ではいずれの代謝活性も有意に減少し，E−64−

は，表5に示す様に，クメソヒドロパーオキシ

d300mg／kg投与群では無処置筋ジス群に比較して，さらに有意な減少を示した。一方，ア
ニリンの水酸化活性は筋ジス群ではほとんど有意な阻害はみられなかったが，E−64−d投与群
ではいずれの用量においても活性の著しい阻害が認められた。それに対して，生体内グルタチオンおよびグルタチオン抱合物の唯一の分解酵素であるγ−GTP活性は，ホモジネートおよび
Ms とも筋ジス群において顕著な低下がみられ，無発症群の約鴇まで減少した（表4）。しかし，E−64−d300mg／kg投与群では明らかな活性の回復がみられ，無発症群活性レベルの約塊を示した。さらに，生体内の過酸化物の処理に際し重要な役割を演じているグルタチオン酸化酵素としてのGSH−Px活性の変動について

も筋ジス群では著明な活性の低下がみられ，特ドおよび過酸化水素いずれの基質を用いた場合にE−64−d低用量（30mg／kg）および中用量（100mg／kg）投与群では著しい活性の減少がみられた。また，薬物のグルタチオン抱合体生成を触媒するGST活性の変動は表6に示した。CDNBを基質とした場合，無処置筋ジス
群およびE−64−d300mg／kg投与群において有意な活性の減少がみられたが，他の投与群では無発症群と有意な変動はみられなかった。さらに，DCNBを基質とした場合には，いずれの群でもほとんど有意な変動はみられなかった。
2．雌雄筋ジスハムスターU別トⅩ7．1におけるE−
64−d混合飼料35日間連続摂取の影響（TrialII）
表7にはCyt．P−450およびb5量の変動を279

Ⅳ 個体レベルでの効果
表5Invivoeffect ofE−64−dadministrationonhepaticcytosolglutathione
peroxidase activitiesin congenital muscular dystrophy hamsters（BIO
14．6，TrialIV）
Glutathione Peroxidase

Dose

Line

E−64−dnCHP（mg／kg）

01

14．6

Treated

14．6

Treated

14．6

Treated01

Untreated

01

FIB（Normal）
14．6

H202

（nmole／min／mgprotein）

30

0
1

lOO

0
1

300

358．72土13．00

245．17±15．96

231．29土16．81＊＊＊153．08土20．12＊＊

223．67土6．99＊＊＊

114．47±4．38＊＊＊

218．78±6．17＊＊＊121．99土7，27＊＊＊242．22土8．44＊＊＊149．10土12．81＊＊＊＊＊p＜0．01，＊＊＊p＜0．001vs Normal・

表6InvivoeffectofE−64，dadministrationonhepaticcytosolglutathione
S−tranSferase activitiesin congenital muscular dystrophy hamsters（BIO14．6，TrialIV）
Glutathione S−tranSferase
Line

Dose

E−64−dCDNB（mg／kg）

0
1

Untreated

14．6

Treated

14．6

Treated

14．6

Treated

0
1

14．6

0
1

FIB（Normal）

30

0
1

lOO

0
1

300

DCNB

（FLmOle／min／mg（nmole／min／mg

protein）

protein）

1．07士0．03

3．29土0．13

0．97士0．03＊

2．82土0．22

1．08土0．06

3．18±0．09

1．02土0．04

3．20土0．10

0．94土0．04＊

3．63土0．26＊p＜0．05vs Normal．

表TInvivoeffect of E−64−d administration on hepatic microsomal cytochrome
P−450and b5COntentSincongenitalmusculardystrophy hamsters（UM−Ⅹ7．1，
TrialII）
Treatment

Sex

Untreated

FemaleE−64−dFemale6Female6

MaleNormal5E−64−d

6

Male

6

Male

Untreated

Cytochrome bs（nmole／mg protein）
5

NormalCytochrome P−450n1．10土0．09

0．48土0．01

0．76土0．03＊＊

0．48土0．01
0．48士0．01

0．76土0．02＊＊

0．64士0．04＊＊

0．45土0．03
0．46土0．06

0．68±0．01＊＊

0．49土0．01

0．96土0．07＊＊p＜0．01，＊＊＊p＜0．001vs Normal．

示す。P−450量は雌雄とも筋ジス群で有意な低下がみられ，その低下はE−64−d投与群でも同様であった。しかし，b5量は雌雄ともいずれの群においても有意な変動はみられなかった○
また，FplおよびFp2活性は，表8に示す様に筋ジス群においてFpl活性では阻害がみら280れたのに対し，Fp2活性は逆に活性の上昇がみられた。なお，これらの活性の変動には性差はみられなかった。表9には代謝活性の変動を示す。アミノピリン，エチルモルヒネおよびペソ
ゾフェタミソの脱メチル化活性およびアニリンの水酸化活性は雌雄とも，筋ジス群において著30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）
表8In vivo e仔ect of E−64−d administration on hepat王CmicrosomalNADH−
ferricyanide reductase（Fpl）and NADPH−CytOChrome P−450reuctase（Fp2）activitiesin congenital muscular dystrophy hamsters（UM−Ⅹ
7．1，TrialII）
Fpl

Treatment

Fp2n（Unit／mg protein）
NormalMale

4．44士0．04

0．17土0．005

UntreatedMale

4．09士0．12＊

0．19±0．004＊

E−64−dMale

4．09土0．07＊＊

0．18土0．003

NormalFemale4．75土0．21

Untreated

Female4．06土0．52

0．14±0．005
0．16土0．022

E−64−dFemale3．97土0．06＊＊

0．18±0．001＊＊＊＊p＜0．05，＊＊p＜0．01，＊＊＊p＜0．001vs Normal．

表9In vivo effect ofE−64−d administration on hepatic aminopyrine，ethylmOrphineand benzphetamine demethylation and aniline hydroxylationin congenital
muscular dystrophy hamsters（UM−Ⅹ7．1，TrialII）

TreatmentSexnAminopyrlne Ethylmorphine Benzphetamine Anililne（nmole／minute／mg protein）

NormalMale

9．81土0．23

9．49土0．11

8．86±0．10

1．11土0．05

Untreated Male

7．60土0．38＊

7．82土0．41＊

7．14土0．34＊

0．76土0．03＊＊

E−64−d Male

6．96土0．14＊＊

6．93土0．14＊＊

6．64土0．18＊＊

0．65±0．01＊＊

NormalFemale8．10土0．28

7．93±0．16

7．68土0．51

0．90土0．02

Untreated Female

5．73土0．41＊

6．83土0．77

6．04土0．87

0．70土0．05＊

E−64−d Female

5．61土0．11＊＊

6．01土0．13＊＊

5．49土0．20＊

0．62士0．01＊＊＊p＜0．01，＊＊p＜0．00l vs Normal．

明な低下がみられ，さらにE−64−d投与群ではその活性低下はいずれも増強された。同条件下におけるγ−GTP活性の変動は麦10に示した。
雌雄とも筋ジス群の無処置およびE−64−d投与群いずれも同程度の頗著な活性の低下がみられた。一方，GSH−Px活性の変動は，表11に示
す様に，筋ジス群において無処置あるいはE−
64−d投与群いずれも著明な活性低下がみられ，
H202を基質とした場合にはCHPを基質とした場合より，活性の阻害程度は小さかった。さらに，GST活性に関しては，表12に示す様に
CDNBを基質とした場合には，雌雄とも筋ジス群において有意な減少がみられたのに対し，
DCNBを基質とした場合には，雌性ハムスタ
ーの筋ジス群において著明な活性低下がみられ，雄性ではほとんど有意な変動はみられなかった。

考察および結論
本研究では筋ジスハムスターに対するE−64−dの連続投与の影響を，60日間投与群と35日間投与群の2種の実験計画に基づいて比較検討した。これら両者では，E−64−dの投与方法，
投与量および投与期間が異なるため，同一に論ずることは出来ないが，E−64−dの肝薬物代謝酵素およびグルタチオン代謝酵素活性に対する影響を知る場合，種々の重要な知見を提供している。
筋ジスハムスターにおけるE−64−dの影響は
薬物代謝酵素とグルタチオン代謝酵素とでかな
り異なることが示唆された。すなわち，薬物代謝酵素に関しては，Cyt．b5はほとんど影響を受けず，少なくとも35日間E−64−d投与では有意な減少はみられなかった。しかし，筋ジス
281

Ⅳ 個体レベルでの効果
表10In vivo effect of E−64−d administration on gamma−glutamyltranspeptidase
activitiesinliver homogenates and microsomesin congenital muscular
dystroplly hamsters（UM−Ⅹ7．1，TrialII）
Gamma−glutamyl transpeptidase

Treatment

SexnHomogenates

Microsomes（mUnit／mg protein）

FemaleUnteated

FemaleE−64−dFemale6Normal6Male5E−64−d

6

Male

5

Male

Untreated

5

Normal

0．25土0．02

0．84士0．02

0．10土0．01＊

0．33土0．01＊＊

0．05士0．01＊

0．42土0．02＊＊

0．39土0．03

1．47±0．10

0．14土0．01＊

0．67土0．08＊＊

0．14土0．02＊

0．56土0．01＊＊＊p＜0．05，＊＊p＜0．00l vs Normal・

表11InvivoeffectofE−64−dadministrationonhepaticcytosolglutathione
peroxidase activitiesiII COngenital dystrophy hamsters（UM−Ⅹ7・1，
TrialII）
Glutathione Peroxidase
Sex

Treatment

nCHP

H202
（nmole／min／mg protein）

Untreated

FemaleE−64−dFemale6Female6

MaleNormal5E−64−d359．02士14．32
330．13士22．93

6

Male

6

Male

Untreated

5

Normal209．21士9．53
175．94±11．25

275．41土17．58＊＊

153．67士20．76＊

337．82士8．90

161．12土12．18

246．13土26．01＝撃138．23土8．31
164．45士12．09

266．39土13．46＊＊＊p＜0．05，＊＊p＜0．0l vs Normalt

表12Invivoeffect ofET64−dadministrationonhepaticcytosolglutathione
S−tranSferase activitiesin congenital muscular dystrophy hamsters（UM−Ⅹ7．1，TrialII｝
Glutathione S−tranSferase

Treatment

Sex

n

CDNB

I）CN8

（FLmOle／min／mgprotein）（nmole／min／mgprotein）
Male

1．18±0．04

4．08±0．16

UntreatedMale

1．02土0．02＊＊

3．35士0．33

E−64−dMale

1．09土0．03

NormalFemale1．08土0．04

3．85士0．33
3．58土0．17

Untreated

Female0．93土0．04＊

2．63土0．22＊＊

E−64−dFemale0．92士0．03＊＊

2．24土0．20＊＊＊

Normal＊p＜0．05，＊＊p＜0．01，＊＊＊p＜0．00l vs Normal・のCyt．P−450は無発症に比較し，著しく減少
し，E−64−d60日間連続投与でも回復することはなかった。さらに，筋ジスハムスターはMs
282の電子伝達系酵素活性にも影響を与え，Fpl活性は減少し，Fp2活性は逆に増加した。また，
このFpl活性の減少はE−64−d投与により用30．筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究）

量依存的に回復する傾向を示し，Fp2活性に関しては，さらに活性の増加をもたらし，E−64−d300mg／kg投与では無発症の約1．25倍に達した。一方，薬物代謝活性では筋ジスハムスタ
ーは著明な活性の低下を示し，E−64−d投与によりその活性低下は増強される傾向を示した。
この様な代謝活性の変動は，単にCyt．P−450
およびFpl活性の減少を反映したものとは考え難く，筋ジスハムスター，特にE−64−d投与群でのCyt．P−450の質的変化も考慮しなければならない。
一方，グルタチオン代謝酵素系に対する影響に関しては，γ−GTP活性は筋ジスハムスター
で著明な低下がみられたが，E−64−d300mg／kg投与ではその低下が軽減する傾向が示された。さらに，この傾向はGSH−Px活性についても同様であった。また，GSH−Px活性においてH202を基質とした場合の活性の方がCHPを基質とした場合より活性減少の程度は小さかった。このことはGSH−Pxisozymeの違いを反映するものであり，Se一依存性GSH−Pxの方がSe−非依存性GSH−Pxより筋ジスハム
スターあるいはE−64−d投与により影響を受けにくいことを示唆するものである。以上述べた薬物代謝酵素系およびグルタチオン代謝酵素
系の変動には，性差はみられなかったが，GST活性については，筋ジスハムスターおよびE−
64−d投与群の雄性は雌性に比べ明らかに阻害が受けにくいことが判明した。このことは，
E−64−d投与時のグルタチオン抱合系における変動には性差が存在することを示唆するものであり，E−64−d使用時における代謝毒性を考える上で重要なことである。
引用文献
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and Randall，R．L，：J．Biol．Chem．，193，265，
1951．

283

総

括

筋ジストロフィーハムスターBIO14・6系お2．UM一Ⅹ7．1系，BIO14．6系ハムスタ

よびUM−Ⅹ7．1系に対するE−64−dCP効果をーともにE−64−dの持続的投与により血中検討した。我々は昨年度既にBIO14・6系ハム
スターを用いE−64−C，E−64−dの効果について

CPK，GOT，GPT，LDH等の上昇が抑制される。

予備的に検討し報告した。この研究過程において我々が直面した最も大きな問題は本疾患モデ

3．UM−Ⅹ7．1，BIO14．6ともに骨格筋線経の再生は極めて旺盛でかつ，完成される0 しル動物が十分に罷病した威令雄に限ってしか入たがって，筋力低下は急激には起らない0再生

手出来ないという点である。このことはこのハ線維（Type−2C）の数でみる限り骨格筋の壊死

ムスターの発症過程に薬物がどの様に作用するにE−64−dは影響を与えない。

かという基本的な薬物の効果を解明する点で極4．骨格筋カテプシソB，L活性はE−64−d投めて不利であった。加えて，筋ジスハムスター

与により用量依存的に抑制される。その程度はUM−Ⅹ7．1の方がBIO14．6より顕著である。

の場合，筋ジスマウス，あるいは筋ジスニワト
リでみられるような急激な筋力の低下がみられ5．骨格筋の総m−CANP活性にはE−64−d

いられるフリップテストの如き運動槍能低下をは影響を与えない。今後，実際にどの様な条件
でCANPが筋壊死に係わっているか，この動指標とした症状判定ができない点が薬物の効果物系でさらに明確にされなければならない。

ず極めて緩徐に病気が進行するため，後者で用判定上問題であることが明らかにされた0 したがって，薬効の有無を論ずる場合，●本モデル動物の症状を正確に把捉し，より多方面からの

6．筋ガングリオシド，および筋エネルギー
代謝にはE−64−dは影響を示さない07．筋ジストロフィーにおいてE−64−dは薬

approacbが必要であった。

物代謝酵素とグルタチオン代謝酵素とで異なっ

しかしながら，今年度は幸いJasmin，和田両

た影響を与える。

先生の御協力により UM−Ⅹ7．1系ハムスター

これらの点を十分吟味の上，さらに次年度のを自家繁殖た実験に供することが可能になっ課題として次の点を明らかにすべきであろう0た。そこで混餌投与を主とする薬効評価をUM−Ⅹ7．1系ハムスターを中心に実施した。この1．骨格筋に対するE−64−dの作用を明確に系での一つの問題点は発症の程度が必ずしも均するため筋壊死のParameterを確立する0その一つとして血清中のα−アクチニソの定量等

一でなく個体間のばらつきが大きいことであが考えられる。

る。我々はこれを避けるため可能な限り同腹の仔を均等分し実験に供したが，心筋の Calci丘−
Cation等でみる限り同腹の兄弟，姉妹間でも相当のばらつきがみられ，このため効果の判定

2．E−64−dの有効な投与時期および投与期間を明確にする。
3．E−64−dの筋ジスハムスターに対する延命効果の有無を明らかにする0には畢克，例数をふやさねはならなかった。同筋ジストロフィー症は難治性の生涯病であ様なことが骨格筋中のカテプシソ，CANP活る。微視的な観察にとらわれずE−64の如きプ性においても観察され，効果の有無を結論するにはさらにデータの積み重ねが必要であること

ロテアーゼ阻害剤を罷患動物，しいては，患者を痛感している。しかしながら今回のこの共同に与えることが意味があるか否かは長期の観察においてはじめて明らかにされることである。

研究を通して次のことは断言できるであろう。
1．UM−Ⅹ7．1系ハムスターに離乳直後のその意味において動物レベルにおける延命効果

幼令時からE−64−dを与えることにより心筋のCalci丘cationを伴う壊死性変化を軽減しうる。

後，これらの点を検討し，本モデル動物におけ284を明らかにすることは極めて重要であろう0今るE−64−dの有効性を明確にしていきたい。

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究班
班 員 および関係者名簿
氏

名

施

設

1

名

所

在

地

主任研究者
今 掘 和友（班長） 東京都老人総 合研究所

〒173 板橋区栄町35−
2

分担研究者
江橋 節郎

〒444 岡崎市 明大寺町字 西郷中38

岡崎 国立共 同研究機構生理学研究所
分子生理研究系神経化学研究部門
国立武蔵療養所
神経 センター 疾病研究第一部
徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素化学部門

杉田

秀夫

勝沼

信彦

西塚

春美

福原

武彦 （
幹事） 東京慈恵会医科大学 第二薬理学

神戸大学医学部第二生化学〒187 小平市小川東町2620〒770 徳島市歳本町3−18−15〒650 神戸市中央 区楠町7−5−1〒105 港区酉新橋3−25−8

小沢 瑛 二郎

国立武蔵療養所
神経 センター 機能研究部〒187 小平市 小川東町2620

野村

達次

実験動物中央 研究所〒2 13 川崎市宮前区野川1430

北川

晴雄（監事） 千葉 大学 薬学 部
薬効 ・安 全性学講座薬 物学〒280 千葉市弥生町1−33

寺尾寿夫

帝京大学医学 部第一 内科〒173 板橋区加賀2−11−1

市原明

徳 島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素病理部門〒770 徳 島市蔵本町3−18−15

官武正

新潟大学脳研究所〒951 新潟市旭町通一番町757

石浦章一

国立武蔵療養所
神経 センター 疾病研究第一部〒187 小平市小川東町2620

柴田宣彦

大阪府立成人病 センター 第一内科

〒537 大阪市東成区中道 1−3−3鈴木紘一

東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報部門〒113 文京区本駒込3−18−
22

大関

正弘 （
幹事） 大正製薬囲

総合研究所〒330 大官市青野町ト403

沢田

二郎

総合研究所

〒330 大官市吉野町 1−403

班友鼻音 栄二 郎

大正製薬的

国立武蔵療養所

神経 内科

神経 センター〒187 小平市小川東 町2620

青柳

高明

微生物 化学 研究所〒141 品川区上大崎3−14−
23

埜中

征哉

国立武蔵療 養所
神経 セ ンター 微細 構造研究部〒187 小平市小川東 町2620

285