厚生労働省精神・神経疾患研究委託費
筋ジストロフイ」の治療と医学的管理に関する臨床研究〈筋ジ不臨床研究川井班〉
http：／／ww．pmdrinsho．jp／

平成16年度ワークショップ講演集
Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断
一現況とその問題点−

日時：平成16年9月11日（±）9：30〜12：15
場所：全共連ビル別館1階コンベンションホール
東京都千代田区平河町2−7−9
TEL

03−5215−9501

Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断 −現況とその問題点−
座長

石

川

幸

辰

09：30〜09：40
1．Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断

国立病院機構八雲病院小児科
石

川

幸

辰

09：40〜10：55
2．Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子解析とその現状

1）Multiplex PCR、MAPH法

国立病院機構八雲病院小児科
石2）定量サザンブロット、半定量PCR

3) RT-nested PCR/direct sequencing•A DNAMicro-Arrey

4）FISH法川幸辰

国立病院機構東埼玉病院小児科
加 藤 るみ子

神戸大学小児科竹島泰

弘

三菱化学ビーシーエル
遺伝子検査部染色体グループ
玉

垣

誠

川

井

充

5）総 合 討 議10：55〜11：15

休

憩

座長
11：15〜12：15
3．Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝相談の実際とその倫理的問題点

東京女子医科大学小児科
大 澤 真木子1．DuGhenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断

国立病院機構八雲病院小児科 石Jl倖辰

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の原因遺伝子であるジストロフィン遺伝子が、1987年に発見されてからすでに17年が経過した［Koenigeta1．，1987，1988］。現在までに得られたジストロフィン遺伝子異常の知見を概観し、今後のDMD遺伝子診断の指針とすることを本ワークショップの目的とする。
DMD臨床診断のフアースチョイスは、針筋生検、開放筋生検を行ない、生検筋の免疫組織染色やウエス
タン・プロットによりジストロフィン蛋白異常を証明することであった。この侵嚢的診断法と異なり、末梢血白血球由来DNAを出発材料とするジストロフィン遺伝子のエクソン欠失診断は、multiplex PCR［chamberlain et
a1．，1988；Beggseta1．，1990］の開発により、現時点では60％の症例のエクソン欠失を証明することを可能とした。さらに、サザン・プロット解析により、10％の希な欠矢や重複が検出可能である。残り35％は、塩基置換によるナンセンス変異、フレームシフトを引き起こす微少欠失・挿入、スプライス部位の変異と考えられている。
これらの解析を困難にしているのは、ジストロフィン遺伝子がヒト遺伝病原因遺伝子では最大のそのサイズにある。ジストロフィンは、X染色体の0．1％を占め、2．4Mbにわたり79個のエクソンがゲノムDNA上に散在している。また、組織特異的な8種類のプロモーターを有している。初期の文献的考察［Roberts et a1．，1994］では、DMDでの変異の内訳は、欠失・重複：65％、ナンセンス変異：18％、微少欠失・挿入（フレームシフト）：8％、スプライス部位変異：7％、ミスセンス変異：2％であった。これらのジストロフィン遺伝子異常を解析する方法としては、その解析出発材料により、末梢血白血球由来DNA（DNA−mediated）と末梢リンパ球または、生検筋由来mRNAを逆転写して得られたcDNA（RNATmediated）を解析する方法に分けられる。
DNATmediatedな方法：SSCP（singlestrandconfbrmationpolymorphism）［Nigroetal．，1992；Knepperseta1．，1995］、heteroduplex法［prioreta1．，1993］が報告されている。これらは、ジストロフィン遺伝子すべてのエクソンを検索しているわけではなく、当然、遺伝子変異の検出率は、10％程度である。一方、最近、全エクソン領域をスキャンし、半および全自動的に解析するシステム（mutation scanning）が報告されている。
全自動DHPLC（denaturinghighperfbrmanceliquidchromatography）［Bennet eta1．，2001］、DOVAM−S（detectionofvirtuallyal1mutation−SSCP）［Mendelleta1．，2001］、SCAIP（singleconditionamplincation／internalprimer sequencing）［Flanigan et a1．，2003］、DGGE（denaturing gradient gelelectrophoresis）［Hofgtraeta1．，2004］などの大規模な解析システムであるが、本邦ではいずれも導入されていない。最近、Yanらは、multiplexPCR／MAPH（multiplexamplifiableprobehybridisation）／DOVAM−Sの3段階からなる解析システムを行うと、遺伝子変異の検出率は96％にもなると報告している［Yaneta1．，2004］。内訳は、欠失：59％、点変異：29％、重複：5％、見逃された欠失：3％、変異なし：4％であった。点変異の内訳は、ナンセンス変
異：49％、フレームシフト：42％、スプライス部位の変異：9％であった。
RNA−mediatedな方法：基本的には、RT−neStedPCRをジストロフィンcDNA全領域で行う方法［Robertset
a1．，1990］ですでに確立されているが、歩行消失後の年長症例では、末梢血リンパ球からは充分なtranscriptが得られず［Whittocketa1．，1997］、10歳までのDMD症例が確実に解析可能な対象となる。また、
mRNAを末梢血リンパ球より採取する場合には、数時間以内に処理する必要があるなどの制約もある。
CDNAが得られれば、direct−SequenCing ofentire cDNA、ProteinTTruncation−Test（PTT）［Roest etal．，
1993］が可能である。
今後の課題：いづれの方法にしても、比較的長いDNA断片の直接シークエンスが必要となるので、外注可
能なmultiplex PCR、サザン・プロット解析を除き、解析は一部の研究施設、機関に限られる。平成14年度の川井班アンケートでは、自施設でmultiplex PCRなど遺伝子診断を行っているのは4施設のみであった。本
邦では、未だ全エクソン領域をスキャンし、半および全自動的に解析するシステムは導入されておらず、mRNA由来cDNAの直接シークエンスが主流であることから、今後、これら施設でのシークエンス処理能力を増強、維持する必要があろう。

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文 献
1．ArmourJA，SismaniC，Patsalis PC，Cross G．Measurement oflocus copy numberbyhybridisation
withampli鮎bleprobes．NucleicAcidsRes2000；28：60579・
2．BeggsAH，KunkelLM．Improveddiagnosis ofDuchenne／Beckermusculardystrophy・JClinInvest
1990；85：613−619．
3．Bennett

RR，denDunnenJ，0Brien

KF，Darras

BT，KunkelLM．Detection

ofmutationsin

thedystrophingeneviaautomatedDHPLCscreeninganddirectsequencing・BMCGenet2001；2：17・
4．ChamberlainJS，GibbsRA，RanierJE，NguyenPN，CaskeyCT．DeletionscreeningoftheDuchenne
musculardystrophylocusviamultiplexDNAamplification・NucleicAcidsRes1988；16：11141−56・
5．FlaniganKM，VOnNiederhausernA，DunnDM，AlderJ，MendellJR，WeissRB・Rapiddirectsequence
analysisofthedystrophingene．AmJHumGenet2003；72：931−9・6．Hof如ra RM，MulderIM，Vossen R，de Koning−Gans PA，Kraak M，GinjaarIB，Van derHoutAH，Bakker E，Buys CH，Van Ommen GJ，Van Essen AJ，den DunnenJT・DGGE−based whole−genemutationscanningofthedystrophingeneinDuchenneandBeckermusculardystrophypatients・Hum
Mutat2004；23：57−66．
7．Kneppers AL，Deutz−Terlouw PP，den DunnenJT，Van Ommen GJ，Bakker E・Point mutation
screeningfbr16exonsofthedystrophingenebymultiplexsingle−Strandconfbrmationpolymorphism
analysis．HumMutat1995；5：235−42．
8．KoenigM，HommanEP，BertelsonCJ，MonacoAP，FeenerC，KunkelLM・Completecloningofthe
Duchennemusculardystrophy（DMD）cDNAandpreliminarygenomicorganizationoftheDMDgene
innormaland affbctedindividuals．Cell1987；50：509−517．
9．Koenig M，Monaco AP，KunkelLM・The complete sequence ofdystrophin predicts arod−Shaped
cytoskeletalprotein．Cel11988；53：219−226．

10．MendellJR，Buzin CH，FengJ，YanJ，Serrano C，SanganiDS，WallC，Prior TW，Sommer SS・
DiagnosisofDuchennedystrophybyenhanceddetectionofsmallmutations・Neurology2001；57：6457
50．

11．MonacoAP，BertelsonCJ，LiechtトGallatiS，MoserH，KunkelLM．Anexplanationfbrthephenotypic
di馳rencesbetweenpatientsbearingpartialdeletionsoftheDMDlocus・Genomics1988；2‥90−95・
12．NigroV，PolitanoL，NigroG，RomanoSC，MolinariAM，PucaGA・Detectionofanonsensemutation
inthedystrophingenebymultipleSSCP．HumMoIGenet1992；1：517−20・
13．Prior TW，Papp AC，Snyder PJ，Burghes AH，Sedra MS，Western LM，Bartello C，MendellJR・Identification oftwo point mutations andaonebase deletioninexon190fthedystrophingene byheteroduplexfbrmation．HumMoIGenet1993；2：311−3・
14．RobertsRG，BentleyDR，BarbyTF，MannersE，BobrowM・DirectdiagnosisofcarriersofDuchenne
andBeckermusculardystrophybyamplificationoflymphocyteRNA．Lancet1990；336：1523−6・
15．Roberts RG，GardnerRJ，BobrowM．SearChingfbrthelin2，400，000：areViewofdystrophingene
pointmutations．HumMutat1994；4：1pll．
16，RoestPA，RobertsRG，SuginoS，VanOmmenGJ，denDunnenJT．Proteintruncationtest（PTT）fbr
rapiddetectionoftranslationTterminatingmutations・HumMoIGenet1993；2‥1719−21・

17．Roest PA，Roberts RG，Van derTuijn AC，HeikoopJC，Van Ommen GJ，den DunnenJT・Protein
truncation test（PTT）to rapidly screen the DMD gene fbr translation terminating mutations・
NeuromusculDisord1993；3：391−4．

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2．Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断とその現状
1）MultipJex PCR，MAPH法

国立病院機構八雲病院小児科

石川幸辰

MultiplexPCRは、DMDエクソン欠失診断に最も有用な検査法で、サザン・プロット解析の96％をカバーして
おり、Yanらの文献的集積［Yan et a1．，2004］では、Chamberlain／Beggsの標準的な19エクソンによる
multiplexPCRでの欠失検出率は、58・7％（437／745）であった。CAP（CollegeofAmericanPathologist）推奨の26エクソンのPCRでも58．9％（439／745）と同様であった。欠失の hotspot として、5，側のエクソン3−19、エク
ソン44−52に欠矢は集中している。また、これらの欠矢は、フレームシフト仮説に合致し、DMD症例の93％がOutOf什ameであった［Monacoeta1．，1988］。例外としては、エクソン3−7、3−11、44、45などあり、場合によっては、末梢血リンパ球さらに生検筋由来mRNAのスプライシングパターンを検索する必要がある。当科でのこれまでの解析総数135家系150例中68家系75例（50．4％）に欠矢を認めた。
一方、MAPH法は、両端に共通配列を持つ特殊なプローブにより定量的サザン・プロットを行い、回収されたプローブをPCR増幅し蛍光DNAシークエンサーで欠失、重複を解析する方法である［Armouret a1．，
2000、Whiteetal・，2002］。Amplinableprobe（DNAprobesetは、96wellplateに分注されており、各々、10ngのtemplateをPCR再増幅したもの）は、平成14年10月に、DR．JT den Dunnen（Leiden University
Humanand ClinicalGenetics、TheNetherlands）とDNAprobeのmaterialtransfbrの同意契約を終え、同年12月末に入手し、平成15年度班会議において、基礎的な予備実験結果を報告した。現在まで、3例の新しい重複が同定されている。Whiteらによると、重複はDMD遺伝子変異のおよそ6％を占めると報告している。本法により、重複およびmultiplexPCRで見逃されている希な欠失の診断が可能となる。また、平成14年度班
会議で配布した79領域の欠失エクソンの結果を入力して、欠失断端の確定、フレームシフトの有無を判定する自作PC版解析ソフト（Windows98SE対応版）を併用するとより迅速な確定診断が可能である。今後の遺伝子診断のシステムとして、私共は、multiplex PCR／MAPH／RT−neSted PCR＋PTTによりDMD遺伝子診断を進めていきたいと考えている。RNA−mediatedな解析に必要なmRNA採取についても、室温で採取、保存可能なPAXgene BloodRNAシステム（QIAGEN）を採用し、三菱化学ピーシーエルの御協力により、全国規模で検体移送可能な系を提案している。
将来のDMD遺伝子治療の臨床応用のためには、分子レベルの正確な記載が不可欠である。このためにも、
筋ジストロフィー病棟を有する国立病院機構傘下の病院におけるジストロフィン遺伝子診断・解析システムを再構築Lかつ標準化することは急務といえる。今後、各施設の状況に即した検査・診断システムを施設ごとに御提案していきたいと考えている。
文 献
1・ArmourJA・SismaniC，PatsalisPC，CrossG・Measurementoflocuscopynumberbyhybridisation
Withamplifiableprobes・NucleicAcidsRes2000；28：605−9．
2・MonacoAP，BertelsonCJ，Liechti−GallatiS，MoserH，KunkelLM．Anexplanationfbrthephenotypic
di恥rencesbetweenpatientsbearingpartialdeletionsoftheDMDlocus．Genomics1988；2：90−95．
3・WhiteS，KalfM，LiuQ，VilleriusM，EngelsmaD，KriekM，VollebregtE，BakkerB，VanOmmenGJ，
BreuningMH，denDunnenJT．Comprehensivedetectionofgenomicduplicationsanddeletionsinthe
DMDgene，byuseofmultiplexamplifiableprobehybridization．AmJHumGenet2002；71：365−74．
4・YanJ，FengJ，BuzinCH，ScaringeW，LiuQ，MendellJR，denDunnenJ，SommerSS．Three−tiered
noninvasive diagnosisin96％ofpatients with Duchenne muscular dystrophy（DMD）．Hum Mutat
2004；23：203−4．

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国立病院機構東埼玉病院小児科 加藤るみ子

2）定量サザンプロット、半定量PCR【当院におけるDMD／BMD遺伝子診断法の歴史】

当院では1992年からジストロフィン遺伝子変異解析を開始した。当初はラジオアイソトープによる定量的サザ
ンプロット法が用いられ、エクソン単位での欠失および重複を検出し、保因者診断も行っていた。2、3年後には現在スクリーニングとして広く行われているChamberlain−Beggsのプライマーセットによるmultiplex PCR法が導入された。より簡便、迅速な欠失症例の検出が可能になり、解析の第一手段になった。この両者によっても遺伝子異常が検出されない場合はRNA解析を行い、CDNAの全塩基配列を決定し、点変異などの微小変異やスプライシング異常を同定している。1998年からは半定量PCR法の技術を取り入れ、増幅したPCR産物を定量的に検出することで欠失のみならず重複の同定が可能になり、保因者診断にも応用できるようになった。現在当院ではまず半定量PCR法をスクリーニングも兼ねて行い、変異が同定できない場合にRNA解析を進め、サザンプロット法は変異部位の確認などの第三次的手段になっている。
【定量的サザンプロット法と問題点】
DNAを制限酵素で切断し、生じたDNA断片をゲル電気泳動で分離する。これをナイロン膜に転写・固定してアイソトープで標識したDNAプローブと反応させる（hybridization）。このナイロン膜をX線フイルムに感光させることにより、プローブと相補的な配列を持つDNA断片がバンドとして検出される。ジストロフィン遺伝子のmRNAに相補的なcDNAをプローブにすると、ジストロフィン遺伝子のエクソン部分に結合するため、遺伝子欠矢の場合はそのエクソンに相当するバンドが消失し、遺伝子重複の場合はバンドの濃度が濃くなる。正常女性はジストロフィン遺伝子を2コピー有するが、欠失の女性保因者はその領域を1コどこしか持たないため、バンドの濃度は正常女性の1／2に、また重複の場合は3倍の濃度で検出される。また遺伝子欠矢や重複により制限酵素切断部位がずれてDNA断片の長さが変わることにより正常とは異なる長さのバンド（ジャンクショ
ンフラグメント）が出現することがあり、このバンドの有無だけでも保因者であるという判定は可能である。3年前からはラジオアイソトープによらない化学発光でのサザンプロット法に切り替え、プローブにゲノムDNAのPCR産物も用いるなど改良をはかっている。しかし、サザンプロット法は操作過程が多いこと、ジストロフィン
遺伝子のcDNAは14kbpと大きいため、数個のセグメントに分けてサザンプロットを行う必要があること、また定量判定のためにはレーン毎に正確なDNA量を均質に電気泳動しなければならないことなどから非常な労力を要する。また結果を出すまでに少なくとも数日かかるため迅速診断にはほど遠い。
【半定量PCR法と問題点】
ェクソンに対応するプライマーセットを用いDNAをPCR増幅する際に、蛍光標識したdUTPを加えて反応させる。通常のPCRと異なり、反応がプラトーに達する前の指数関数的に増幅しているサイクル数で停止させ、PCR産物をオートシークエンサーによりフラグメント解析する。この際、PCR産物量は蛍光強度に反映される
ため定量的な測定が可能になり、エクソンの欠矢や重複が同定される。欠失患者では蛍光は検出されず、重複の場合は正常対照の約2倍の強度を示す。欠失・重複の保因者においては、それぞれ正常の0．5倍、1．5倍となり保因者診断も可能である。実際には複数個のプライマーセットを組み合わせ、同時に複数のエク
ソンにつき解析する。従来のmultiplex PCR法やサザンプロット法のプローブではカバーできなかったエクソ
ンのプライマーも取り入れることで、解析の精度が上がっている。現在は3種の反応系の計52個のエクソンにっき、簡便・迅速な欠失・重複の同定が可能である。さらに以前cDNAの全塩基配列決定法で変異の同定ができなかった症例に半定量PCR法を行い、新たに欠矢や重複が検出できたものもある。しかしPCR法の弱点であるが、プライマー部分の塩基配列に異常がある場合はDNAが増幅しないため、エクソン自体に問題がなくても欠夫と判定される恐れがある。他の解析手段も組み合わせて、慎重に判断する必要がある。
【問題点】
1992年から現在までにDMD418家系、BMD62家系の計480家系を解析しており、欠失265家系（55．2％）、重複52家系（10．8％）、微小変異74家系（15．4％）を確認した。16家系がRNA解析中である。
DMD／BMDの遺伝子診断においては、遺伝子治療の実施や着床前診断の承認などにより、正確な変異の

一

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同定が要求されるようになってきた。もはや研究の域を超えており、診療の一部として認められるべきものだと考える。現在国内にはスクリーニング以上の解析が可能な施設は数えるほどしかなく、そこに全国の症例が集められる。経済的にも人的にも困窮している小さな研究室がその重責を担っている現実を問題提起したい。DMD／BMDの遺伝子医療の向上のためには、センターに診断機能を集約し、十分な予算と解析態勢を整えた上で、協力周辺施設とのネットワークを構築していくことが急務と考える。

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3）RT−neSted PCR，direct sequencing，DNAmicroArray

神戸大学大学院医学系研究科小児科学 竹島泰弘
神戸大学大学院医学系研究科小児科学 八木麻理子、松尾雅文
北海道システム・サイエンス株式会社

橋本博支、安田剛、渡辺一史

Duchenne型／Becker型筋ジストロフィー（DMD／BMD）の診療において、ジストロフィン遺伝子異常の同定
は診断という意味のみではなく、治療法を検討する上においても必要不可欠なものである。当院では平成11年に遺伝子診療部が開設され、また進行性筋ジストロフィーのDNA診断が高度先進医療として承認されており、積極的に遺伝子診断に取り組んでいる。今回、当院におけるジストロフィン遺伝子異常のまとめを呈示し、現在開発に取り組んでいるマイクロアレイを用いた迅速遺伝子診断法に関して報告する。
【当院におけるジストロフィン遺伝子診断】
遺伝子診断に関するインフォームドコンセント後、サザンプロット法によってジストロフィン遺伝子の欠失・重複等の大きな変異の解析を行った。これらの方法によって変異が同定し得なかった症例においては、筋あるいは白血球より抽出したRNAを鋳型としReverse transcription（RT）−PCR法によってジストロフィンcDNA全領
域を10の領域に分けて増幅した。その増幅サイズからスプライシング異常などの解析をおこない、そのサイズに異常がみられない症例では、ジストロフィンcDNAをさらに20の領域に分けてPCR法によって増幅し、CDNA全領域の塩基配列をdirect sequence法によって決定することにより点変異などの微小変異の同定を行った。
白血球におけるジストロフィンmRNAの発現はわずかであるため、白血球より抽出したRNAを鋳型としてRT−PCRを施行する際は、いったんPCRで増幅した後さらにより内側のプライマーによってPCRを施行した（nestedPCR）。

【当院におけるジストロフィン遺伝子異常の現状】
平成3年より15年の間に当院小児科あるいは遺伝子診療部を受診した194家系221人（DMD157家系、BMD37家系）を対象とした。平成10年までの78家系（DMD52家系、BMD26家系）では欠失42家系（53．8％）、
重複1家系（1．3％）、その他の変異が12家系で、23家系が変異未同定であった。一方、遺伝子診療部が開設された平成11年以降は全症例において変異を同定するように検討を行っており、その間の116家系（DMDlO5家系、BMDll家系）では欠失66家系（56．9％）、重複10家系（8．6％）、微小変異は22家系（19・0％）で、18例（15．5％）は、現在微小変異を解析中である。全期間を通じて、欠失は55．7％、重複は5・7％であった。微小変異は34家系において同定されており、ナンセンス変異24家系、スプライシング異常を生じる変異が13家系であった。
【マイクロアレイを用いた遺伝子解析】
ジストロフィン遺伝子が巨大であり、また欠失・点変異など多彩な遺伝子異常がみられるため、従来の診断法は長時間を要する、欠矢の断端を同定できない、あるいは点変異の同定が困難であるなど十分なものではなかった。これらの問題点を解決するために、マイクロアレイを用いた迅速遺伝子診断法に関する検討を行った。
マイクロアレイは各エクソン内の60塩基の配列のオリゴDNAをスライドガラスに固定化したオリゴマイクロアレ
イを作成し、その有用性を検討した。症例から得られたDNAは、3反応に分けたマルチプレックスPCR法を用いて、全エクソンを同時に増幅した。その後、正常ゲノムより増幅した各エクソンをCy3によって、DMD症例のゲノムより増幅したエクソンをCy5によって標識した。正常および症例のDNAをオリゴマイクロアレイへ競合ハ
イプリダイゼーションさせ、各スポットにおける両者の比より欠失エクソンの同定を行った。
DMD症例（ェクソン5−11欠失）に関して検討したところ、目視においてもエクソン5−11の蛍光強度は明らかに減弱していた。さらに、エクソン5−11においてCy3／Cy5比はいずれも25以上であった。他のエクソンのCy3／Cy5比は2以下であり、エクソン5−11の欠失を明確に診断することが可能であった。エクソン48−54の欠矢など、他の欠矢を有するDMD症例においても同様の検討を行ったところ、同様に欠矢を同定することが−13−

可能であった。
【考察】
私達はDMDの治療として、アンチセンスオリゴヌクレオチドによってエクソンスキッビングを誘導し、フレームシ
フト欠矢をインフレームに修正する分子治療の臨床応用を検討している。また、ゲンタマイシンによってナン
センス変異の読み飛ばし、機能を有するジストロフィン蛋白の発現を誘導する分子治療の有用性がinvitroにおいて明らかにされており、臨床における検討が開始されている。このような状況において、欠矢の断端を正確に診断する、あるいはナンセンス変異を迅速に診断することは必要不可欠なことである。しかしマルチ
プレックスPCR法では19エクソンの有無の診断しか行なえず、また、サザンプロット法は迅速な診断法とは言い難い。一方、微小変異の同定は膨大な時間と労力を要する。
今回、オリゴマイクロアレイを用いた欠失診断システムを開発し、その有用性を明らかにすることができた。
今後、点変異解析用マイクロアレイを開発していく予定である。

ー14−

本研究の目的
Dl■Ch仰。e型板ジストロフィーの治療
個々の症例の遺伝子異常に対応した
オーダーメイド分子治療

ジストロフィン遺伝子診断が不可欠

従来の診旺法
サザンプロット法
マルチプレックスPCR法
長日時を要する
全エクソンを検出できない
点変異の検出はできない

あらゆる型の遺伝子異常を極めて短日時に検出できる
次世代型診断法を確立しその実用化を図る−15−

正常ゲノムDNAを用いた検討

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一16−4）FISH法によるジストロフィン遺伝子欠失保因者解析
三菱化学ピーシー工ル遺伝子検査部染色体グループ
国立病院機構八雲病院小児科

玉垣誠、脅藤和正、山森俊治

石川幸辰、石川悠加、南

良二

【緒言】
我々は、FISH法によるジストロフィン遺伝子欠矢の測定系の構築を試み、欠失頻度の高いエクソンを認識するプローブを作製し、これら領域において保因者の解析が可能であることを平成15年度斑会議において報告した。FISH法では、Chamberlain−Beggsのプライマーセットでカバーされていない領域（exon46，53等）
また、サザンプロット法でバンドサイズが小さい場合（exon45，35等）や複数エクソンのバンドが重なり区別しづらい領域（exon37／46等）の解析に特に有用である。今回当施設における検査受託に伴い、更にFISH用プ
ローブの種類を増加させた。またFISH法とサザンプロット法で結果の違いが生じる例もあり、プローブ領域の見直しや2個以上のエクソンを含むプローブで分割可能なものについて検討を行った。
【方法】
1．LongTaCCurate PCRにより標的遺伝子領域を包括するDNA断片（約5〜10kb）を用い、Nicktranslation反応によりdigoxigenin−dUTP体で標識してプローブとした。
2．標的プローブ（緑色DXZlコントロールプローブを含む）と、スライドガラス上に展開した分裂像をそれぞれ熱変成し、至適条件下でハイブリダイズさせた。
3．標的遺伝子領域にハイブリダイズしたプローブに赤色蛍光抗体（anti−digoxigeninrhodamine）を反応させ、dualcolor（赤／緑色）FISHを行ない、標的遺伝子領域の有無を解析した。
【結果】
サザンプロット法で、解析の結果exon55〜62の欠矢が疑われた症例で、eXOn55の位置にバンドは検出されなかったものの、サイズが異なる位置に由来不明のバンドが確認された。そこで、FISH法でexon55の欠失解析を行ったところ、シグナルは正常であった。その結果由来不明のバンドは、eXOn55を含むHindⅢ断片
内に欠失領域の切断点が含まれていたため、バンドサイズが小さくなったものと考えられ、欠失領域は
exon56〜62であることが判明した。
また、サザンプロット法でexon47〜52の欠矢が確認されている症例においてFISH法でexon46，47，52，53の欠失解析を行ったところ、eXOn52が欠失、eXOn46，47，53が正常であった。サザンプロット法におけるHindIII
断片領域やFISHプローブの領域解析の結果、FISHプローブ内に欠失領域の切断点が含まれていることが考えられた。eXOn47についてはその切断点にかからないようにプローブを作製し直したところ、当検体では欠夫という結果になった。
他のプローブについても同様な可能性が考えられたため、特に2個以上のエクソンを含むプローブの分割を試みたところ、eXOn3−4，8−9，20−21については分割しても解析に十分な強度のシグナルが得られ、単独解析が可能となった。また、新規にexon5，6，7，56，57のプローブを作製し、保有プローブは38種類（promoter領
域〜eXOnl，2，3，4，5，6，7，8，9，12，13，16，17，18，19，
20，21，24−25，28−29，3卜34，35−37，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，
57）となった。

【考察】
現在保有しているFISHプローブは38種類で、eXOn57までの約80％のエクソンをカバーしているが、当施設におけるサザンプロット法の検歴からも、ほとんどの場合において解析可能であると考えられる。今後更に症例数を増やし、プローブ内に欠失領域の切断点が含まれる例がないかどうかの再確認と、プローブサイズの縮小やプローブの分割の検討が必要である。
【文献】
PinkelD，StraumeT，GrayJW：Proc．Natl．Acad．Sci．USA83，2934−2938（1986）
MorishimaY，AriyamaT，YamanishiK，etal．：Genomics28，273−279（1995）

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3．Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝相談の実際と倫理的問題点
東京女子医大医学部小児科

大澤真木子

近年の分子生物学の進歩は、次々に新しい知見をもたらし、研究レベルであっても遺伝子検査可能な病型も増え、疾患概念・病型分類は非常に複雑化した。筋ジストロフィーの患者さんの姉妹が遺伝相談を訪れる場合、妊娠後に来院することは減ったが、患者さん自身の病型の確定診断がついていない事もあり、X連
鎖性劣性遺伝の可能性、突然変異の可能性の他に、常染色体遺伝子異常による筋ジストロフィーの可能性をも考慮しなければならないこともある。現在なお現場であり得る科学的限界を考慮し、その手順を、
SChema1、2にしめした。
遺伝相談において、その家系における遺伝的可能性を探るためには以下の方法が主流になっている。
DMD／BMDの遺伝子診断ではmultiplexPCR（PolymeraseChainReaction）法で、遺伝子欠矢の好発部位であるエクソン3〜19とエクソン43〜52領域を中心とした9箇所ずつを一度に実施する。欠矢があれば羅患者と判定される。しかし好発部位領域以外のエクソン欠矢は見逃されやすく、またPCR定量性はないため重複による異常は検出できない。
Southern blot法では、CDNAは、遺伝子欠矢と、遺伝子重複が検出できる。但LSouthern blot法は手技が煩雑なので、まずは好発部位領域の欠失スクリーニングにはmultiplex PCR法を行い、それ以外の領域の欠矢と重複検索のためにSouthernblot法が用いられる。
Southern blot法で異常が検出できない微小変異（ナンセンス、ミスセンス点変異）やスプライシング異常が原因となっている。患者リンパ球あるいは生検筋組織から得たmRNAより逆転写反応でジストロフィンcDNAを作成し、これをダイレクトシークエンスして微小変異の検索を行い、異常が検出された場合はその場所のgenomic DNAをシークエンスして確認する。また、ジストロフィン遺伝子のsingle nucleotide
polymorphism（SNPs）であるか否かの評価も必要である。
発端者の遺伝子異常（主に欠失）が同定できた家系における保因者診断にPCR法により増幅した遺伝子産物を定量する方法が用いられる。gene SCanによって内部コントロールとピーク値の比で検討を行う。保因者である場合は発端者における欠失エクソンは、非保因者の1／2量となる。
倫理的観点から考えると、遺伝相談に訪れるのは遺伝子異常の有る患児／者自身の場合よりも両親、姉妹、従姉妹であることが多い。本人のためではなく家族のために本人の遺伝子情報を使うことが何処まで許されるか。その承諾をどのように得るか。既に患児／者自身が他界している場合情報が得られないという科学的問題のみならず、その承諾を得る事は不可能であるという点をどのようにクリアーするかの問題も有る。
われわれはどのように倫理的問題を考慮すべきなのかについても考察する。
資料：遺伝子診断schema現状、遺伝子診断schema将来

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平成16年度ワークショップ講演集「Duchennne型筋ジストロフィーの遺伝子診断一現状とその問題点−」
2005年2月発行
編集発行者

厚生労働省精神・神経疾患研究委託費
筋ジストロフィーの治療と医学的管理に関する臨床研究班
遺伝子検査プロジェクト

印 刷 所

有限会社新星社