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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）＜平成 25 年度助成＞

キトサンと脂肪酸の複合化による食用サブミクロン微粒子製造と機能成分の担持・分散化
黒岩崇（東京都市大学工学部エネルギー化学科）

よび水酸化ナトリウムは和光純薬工業株式会社かはじめに1.

ら購入し使用した。

分子が自発的に集合化・組織化することで微細構造を形成するボトムアップアプローチは省エネ

2.2. キトサン - オレイン酸複合サブミクロン微粒子の作製

ルギーなものづくりプロセスとして注目を集めて0.2 M の酢酸水溶液に 5 g/L の濃度になるよういる。本アプローチに基づく素材加工技術は、特にキトサンを溶解し pH を 5.0 に調整した後、吸に食品をはじめとする激しいせん断や発熱等の物引濾過により固形夾雑物を除去してキトサン溶液

理的ストレスに弱い対象物の加工に適しているとを作製した。このキトサン溶液 20 mL に種々の濃期待され、様々な検討がなされている1 ）。一方、度のオレイン酸エタノール溶液 2 mL を滴下し、所分子の自己組織化を利用した材料開発において定の温度下で 400 rpm で一日撹拌してキトサン-は、高分子電解質と両親媒性分子といった異種分脂肪酸複合微粒子の分散液を得た。キトサンと脂子の複合化が注目されており、多様な微細構造と肪酸の混合モル比を「キトサンのグルコサミン残物性を発現する例が知られている 2 ）。

基（GluN）あたりのオレイン酸添加モル量（OA/

本研究では、海洋性バイオマスとして注目されGluN）」と定義し、混合モル比を種々変化させてる多糖類であるキトサンと、動植物由来の長鎖脂微粒子を作製した。微粒子の形成は紫外可視分光

肪酸を水溶液中で混合するだけという極めてシン光度計（UV-1600、島津製作所）を用いた光透過プルな手法で食用のサブミクロンサイズ微粒子を率測定（測定波長 660 nm）および 2.6 に示す蛍光作製する手法について検討した。本稿では、長プローブを用いた蛍光強度測定により判定した。

鎖脂肪酸としてオレイン酸を用いて作製した複合

2.3. 走査型電子顕微鏡（SEM）観察

微粒子のキャラクタリゼーションを行うとともに、適当な濃度に希釈した微粒子分散液をシリコン機能成分の分散剤としての利用について検討した基板上で自然乾燥後、SEM（S-4100、日立製作所）結果について報告する。

による観察を行った。
2.4. 粒子径およびゼータ電位の測定

実験材料および方法

2.
2.1.

分散微粒子の粒径および分散微粒子のゼータ電

試薬類

位はゼータサイザーナノZS（マルバーン株式会社）

キトサンとしては、キトサンHD（ヤエガキ発酵

ラー電気泳動法により測定した。上記方法により4）調製した微粒子分散液は必要に応じて超純水で希技研株式会社）を使用した。コロイド滴定法 により測定した脱アセチル化度は 98 %、粘度法を利用した動的光散乱法およびレーザードップ

3）により測定した分子量は 58,000 g/mol であった。オレイン酸、エタノール（99.5 %）、ピレン、酢酸お釈し、測定はいずれも 25 ℃で行った。

キトサンと脂肪酸の複合化による食用サブミクロン微粒子製造と機能成分の担持・分散化

2.5. キトサン - オレイン酸複合体のフーリエ変換赤外吸収（FT-IR）スペクトルの測定

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遠心分離後の光透過率を示す。分散液は遠心分離後も白濁状態を維持しており、キトサンとオレイ

キトサン- オレイン酸複合微粒子分散液をセルン酸の混合モル比（OA/GluN）が高いほど試料のロースチューブに封入し、超純水中で 72 時間以透過率は低下した。この透過率の低下は微粒子形上透析して脱塩した後、チューブ内の残存試料を成による濁度上昇に起因するものと考えられた。

凍結乾燥して分析用試料とした。FT-IR スペクト

そこで、混合モル比 0.18 の条件において得られた

ルの測定はフーリエ変換赤外分光光度計（FT/IR-分散液試料について SEM 観察を行ったところ、サ5300、日本分光株式会社）を用いて KBr プレートブミクロンサイズの微粒子が認められた（Fig. 2）。

法により行った。

同様の分散液を遠心分離後、動的光散乱法により

2.6. 蛍光プローブを利用した微粒子の形成挙動の解析

粒径分布を測定したところ、平均粒径約 600 nm の微粒子が形成されていることがわかった（Fig. 3）。

キトサン- オレイン酸複合微粒子の形成挙動を、ピレンを利用した蛍光プローブ法 5 ）により調べた。種々の混合モル比で作製したキトサン- オレイン酸複合微粒子分散液にピレンを添加し、2 時間平衡化させた後、分光蛍光光度計（RF-5300、島津製作所）を用いて励起波長 335 nm における蛍光スペクトルを測定した。

Fig. 1 種々の混合モル比で作製したキトサン - オレイン酸

2.7. キトサン - オレイン酸複合微粒子を利用したクルクミンの分散安定化
Fig. 1

複合微粒子分散液の外観および光透過率

上記の微粒子作製方法において、オレイン酸エタノール溶液にクルクミンを添加したものを利用して、クルクミンを担持したキトサン- オレイン酸複合微粒子を作製した。遠心分離により粗大粒子を除去後、分散液をエタノールで希釈したものの吸収スペクトルを上記紫外可視分光光度計で測定し、分散化されたクルクミン量を求めた。得られたクルクミン担持複合微粒子分散液を室温下で保Fig. 2 キトサン - オレイン酸複合微粒子の SEM 画像蔵し、所定の時間ごとに遠心分離して分散液の濁度変化を調べることで分散液の安定性を評価した。
Fig. 33.

結果および考察3.1. キトサンとオレイン酸の複合化によるサブミクロン微粒子の形成
キトサン水溶液にオレイン酸エタノール溶液を滴下し室温下で一日撹拌すると白濁した分散液が得られた。Fig. 1 には、得られた分散液の外観とFig. 3 動的光散乱法により測定したキトサン - オレイン酸複合微粒子の粒径分布

Fig. 2

18

浦上財団研究報告書

このとき、粒径の多分散指数は 0.14 程度と比較的小さく、キトサン水溶液とオレイン酸エタノール

Vol.22（2015）

3.2. 蛍光プローブを利用したキトサン - 脂肪酸複合微粒子の形成挙動評価

溶液を混合する簡便な方法により均一性の高いサ両親媒性分子の自己集合挙動の評価には、ピレブミクロンサイズの微粒子分散液が得られることンを蛍光プローブとして利用する手法が広く用いが明らかとなった。微粒子のゼータ電位を測定しられている 5 ）。すなわち、蛍光スペクトルにみらたところ、約 + 50 mV 程度の値であった。この値れるピークのうち、ピレンの置かれている微視的はキトサンのアミノ基がプロトン化したことによ環境の影響を受けるピークの強度（I 1）と環境の影る正電荷に由来すると考えられ、微粒子の正電荷響をほとんど受けないピークの強度（I 3）の比は、による静電的な反発によって微粒子の分散状態がピレン分子の周囲の環境を反映する指標として集維持されているものと推察される。

合体形成の評価に利用できる。Fig. 5 には、5 g/L

キトサン- オレイン酸複合微粒子を透析膜を用の濃度のキトサン溶液に対して種々の混合モル比いて洗浄後、凍結乾燥して得られたキトサン- オでオレイン酸を添加したときの蛍光スペクトルのレイン酸複合体の FT-IR スペクトルを Fig. 4 に示変化を示す。混合モル比の増大に伴い、蛍光スす。キトサン- オレイン酸複合体のスペクトルでは、ペクトルの形状が変化していることがわかる。蛍オレイン酸のみのスペクトルにみられるカルボキ

光強度比 I 1 /I 3 の値はある混合モル比以上になるシル基の吸収（1700 cm -1 付近）が減少し、新たにと急激に減少した（Fig. 6）。蛍光強度比が変化し1560 cm -1 付近に強い吸収が認められた。この吸たことは、ピレン分子が置かれている環境が変化収帯はカルボキシラートイオン（COO -）に帰属さしたことに対応し、試料中における疎水性ドメイ6）れる ことから、上記方法で得られる CHI-OA 複ンの形成を示唆している。混合モル比の増加に合微粒子の形成には、プロトン化したキトサンの対する蛍光強度比の低下と試料の光透過率の減アミノ基（- NH 3+）と脱プロトン化したオレイン酸少（Fig. 1）は概ね対応していることから、微粒のカルボキシラートイオンとの静電的相互作用を子の形成にはオレイン酸の疎水基の会合プロセス介した複合化過程が関与していると推察される。

が寄与していることが示唆された。上記 3.1 の結果を考慮すると、微粒子の形成は（1）静電的相互作用によるキトサンとオレイン酸の複合化およびFig. 4 オレイン酸、キトサン、およびキトサン - オレイン酸
Fig. 5
複合微粒子の FT-IR スペクトル

Fig. 5 種々の混合モル比で作製したキトサン - オレイン酸
複合微粒子懸濁液中でのピレンの蛍光スペクトル変化

ig. 67

キトサンと脂肪酸の複合化による食用サブミクロン微粒子製造と機能成分の担持・分散化

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ルクミンを担持した微粒子の粒径は約 700 nm であり、依然としてサブミクロンサイズを維持していた（Fig. 8）。クルクミン担持複合微粒子分散液の濁度を経時的に測定した結果（Fig. 9）、若干の濁度低下が認められたものの、21 日経過後にも安定な分散状態が維持されることが示された。

Fig. 6 混合モル比の増加に伴う蛍光強度比の減少（2）疎水的相互作用によるオレイン酸の会合、の2 つの要因によるものと推察された。
3.3. キトサン - オレイン酸複合サブミクロン
微粒子へのクルクミンの内包化
キトサン- オレイン酸複合微粒子作製時にクルクミンを添加し、水にほとんど溶けないクルクミン

Fig. 8 クルクミン担持複合微粒子分散液の外観および粒径分布

Fig. 8を安定に分散させることを試みた。対照として、溶媒のみ、溶媒にオレイン酸およびキトサンのいずれか一方を添加したものそれぞれにクルクミンを加えた試料も作製したが、いずれにもクルクミンはほとんど溶解・分散しなかった。これに対し、複合微粒子分散液ではクルクミンが多く含まれており、その含有量はクルクミンの水への溶解度のFig. 9 クルクミン担持複合微粒子分散液の濁度変化

約 100 倍に相当することがわかった（Fig. 7）。ク
4.
Fig. 9

おわりに
本研究では、キトサンとオレイン酸の溶液を混合するだけという極めてシンプルな手法により可食性素材からなるサブミクロン微粒子を作製できることを明らかにするとともに、得られる微粒子のキャラクタリゼーションを行った。さらに、本微粒子には機能性成分として注目されているクルクミンを担持させることができ、3 週間以上にわたって安定な分散状態を維持できることを示した。
現在は本手法をさらに発展させるべく、種々のFig. 7 各試料中のクルクミン濃度の比較分析手法を駆使してより詳細な微粒子の構造解析

20

浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）を進めている。また、様々な脂肪酸を用いて微粒市大学工学部エネルギー化学科子を作製しその形成挙動を調べることで微粒子形

らびに河内勇人、中谷将大の各氏に心より感謝申成のメカニズムについても検討を行っている。更し上げます。

金澤昭彦教授ななる研究を通じて、本法で得られる微粒子の特性および形成機序を明らかにすることで、高機能な文

食用分散液を低コストで製造可能な技術の確立に

1) 市川ら : 日本食品工学会誌 , 10, 207 (2009).

つながると期待している。

2) Thünemann AF : Prog. Polym. Sci., 27, 1473 (2002).

謝3) キチン、キトサン研究会編 : キチン、キトサン実験マニ
ュアル, pp. 51-52, 技報堂出版 , 東京 , (1991).

辞本研究の遂行にあたり研究助成を賜りました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団に篤く御礼申し上げます。動的光散乱法による粒子径測定に際しては、筑波大学生命環境系市川創作教授ならびに独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構食品総合研究所

植村邦彦博士、同小林功博士のご指導を賜りました。フーリエ変換赤外吸収スペクトルの測定では東京都市大学工学部エネルギー化学科

献

岩村武准教授のご助言を賜りました。ここに記して深謝いたします。研究を進めるにあたりご支援・ご協力をいただきました東京都

4) Wang W et al.: Int. J. Biol. Macromol., 13, 281 (1991).
5) Wilhelm M et al.: Macromol., 24, 1033 (1991).
6) 中西ら : 赤外線吸収スペクトル ―定性と演習―（改訂版）定性編 , p. 43, 南江堂 , 東京 (1978).
［付記］

本研究の一部は以下の学会で発表された。
1. 河内勇人 , 黒岩崇 , 小林功 , 植村邦彦 , 金澤昭彦 :「キトサンと脂肪酸からなる複合微粒子の形成に対する脂肪酸種の影響」, 日本食品工学会第 15 回（2014 年度）年次大会 , つくば国際会議場（茨城県つくば市）,2014 年 8 月.
2. 河内勇人 , 黒岩崇 , 小林功 , 植村邦彦 , 金澤昭彦 :「キトサンと長鎖脂肪酸からなるサブミクロン微粒子分散系の作製と特性評価」, 第 63 回高分子討論会 , 長崎大学（長崎県長崎市）, 2014 年 9 月.

Production of submicron-sized edible particle dispersions via the complexation of chitosan with a fatty acid and their application for encapsulation and dispersion of functional food components 21

Production of submicron-sized edible particle dispersions via thecomplexation of chitosan with a fatty acid and their applicationfor encapsulation and dispersion of functional food components
Takashi Kuroiwa
Department of Chemistry and Energy Engineering
Tokyo City University[Summary]
Preparation of submicron-sized particle dispersions consisting of chitosan and along-chain fatty acid was investigated. Chitosan having molecular weight of 58,000 with
degree of deacetylation of 98% was used. Oleic acid was used as a long-chain fatty acid.
The procedure for preparing the particle dispersion was quite simple: a turbid dispersion
sample could be obtained by simply mixing chitosan aqueous solution and oleic acidethanol solution at room temperature. Transmittance of particle dispersions at 660 nm ofwavelength decreased with the increase of molar mixing ratio of oleic acid to glucosamine
unit of chitosans. Scanning electron microscopy and dynamic light scattering measurement
revealed the formation of submicron-sized particles. Average diameter of the particles
was ca. 600 nm. The zeta-potential value of the obtained particles was around +50 mV,
indicating that the particles were stably dispersed by electrostatic repulsion based on
positively charged groups derived from chitosan molecules. Fourier-transform infrared
spectrometry and fluorescence measurement using pyrene as a fluorescent probe indicatedthat the particle formation was attributed to both electrostatic and hydrophobic interactions
between mixed components. Curcumin could be encapsulated into the chitosan-oleic acidcomplex particles and be dispersed in aqueous solution. Amount of curcumin dispersed by
the chitosan-oleic acid complex particles corresponded to almost 100 times of solubilityof curcumin in water. Curcumin-encapsulated particles had an average diameter of ca.
700 nm, still a submicron level. The particles were stably dispersed without significant
precipitation for at least 3 weeks. We believe that the particle dispersions prepared by ourmethod should be useful for developing novel foods and beverages containing functional
components having low solubility in water.