厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究荒木班

平成2年度研究報告書

平成3年3月（1991年）

研究報告書の作成にあたって〃生者精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究」班は，平成2年4月に発足し，平成3年3月を以て満1年を終え，ここに初年度の研究報告書を作成する運びとなりました。

平成2年9几西ドイツで開催された，第7回国際神経筋学会と筋ジトロフィー
協会世非会誹に川棚しましたが，分子生物学的研究の演題が増加し，今日，筋ジス
トロフィー研究には，分子遺伝学に最も大きな関心が払われていることを認識することができました。またわが国の筋ジストロフィーの研究甘，国際的にも高い評価を得ていることにrH言と喜びを感じました。

本研究班の初年度の目標は，筋ジストロフィーの各病型におけるジストロフィンの発現様式の検■軋mdxマウスを利いた病態解明，ミトコンドリア脳筋症の分子遺伝学的解析および沼掠法の開発でありましたが，各班月の努力によって立派な成果をあげることが出来ました。班長として心から感謝を申し上げます。

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因の解明と治療法の開発に向って今後とも，
班眉各位の一層の努力と研究の発展を期待したいと存じます。おわりに，本研究に対し終始懇切な御指導を賜りました国立精神・神経センターの里青紫二郎総長，杉田秀夫研究所長，厚生省の関係各位と日本筋ジストロフィー協会の深い御理解と御支援に感謝申し上げます。

平成3年3月〈班長〉荒 木 淑 郎

目次

平成2年度総括研究報告7

平成2年度総合班会議研究報告抄録

13

分担研究報告23

Ⅰ．筋ジストロフィー（1）33

Ⅱ．筋ジストロフィー（2）51

Ⅲ．筋ジストロフィー（3）

73

Ⅳ．遺伝子

101

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症（1）123

Ⅵ. mdxマウスほか

165

Ⅶ．生 化 学

209

Ⅷ．ミトコンドリア脳筋症（2）231

平成2年度研究班名簿267

平成 2 年度

総括研

究報告

総括研究報告
主任研究者

荒

木

淑

郎

研究員標
本研究班は，杉田班（昭和59年〜平成元年に及ぶ筋ジストロフィー症及び関連疾
患の病態とその病因に関する研究）の後をうけて，筋ジストロフィーおよび関連疾患（とくにミトコンドリア脳筋症）の成因の解明と治療法の開発を目標として分担
研究者を再編成して，平成2年4月に発足した．平成2年度は，新しい班の初年度Iに当たるため，目標に向かって班月各自の研究を発展させた．班長は荒木淑郎，姓
月38名および顧問3名の計42名である．
1年度の研究目標は次の如くである．
1）各病型におけるジストロフィンの発現様式の検討
2）mdxマウスを用いた病態の解明
3）ミトコンドリア脳筋症の分子遺伝学的解析
4）治療法の開発
1．筋ジストロフィーと筋細胞膜のジストロフィン
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）はⅩ染色体劣性遺伝を呈する進行性の筋萎縮症で，20歳台前半で死亡するが，Becker型（BMD）は，予後良好である（良性型）・両者とも・同じⅩ染色体短腕でコードされるジストロフィンの欠損によって生じることが明らかにされた．ジストロフィンは，筋細胞膜に局在する分子量427KDの巨大タンパク質で細胞骨格の一種である．ジストロフィンCDNAの全構造は解明され，現在まで，DMD／BMDの60％以上が遺伝子欠損によって生じることが解明されている．
本年度は，ジストロフィン抗体を用いて，DMD，BMD，肢帯型ジストロフィー，
福山型先天性筋ジストロフィー，筋緊張型ジストロフイ＿−など各病型におけるジス
トロフィンの発現様式が検討された．またジストロフィンのヒト臓器分布が検討された．これらの成績は以下の如くである．
1）筋ジストロフィー各病型におけるジストロフィンの発現様式（1）DMD：欠損−9−

（2）BMD：減少（3）肢帯型：正常（87％）（4）福山型先天性筋ジストロフィー：正常（94％）（5）先天性筋緊張性ジストロフィー：生後10カ月以下は染色不良，生後1歳6ヵ月
以後は正常
2）ジストロフィンのヒト各臓器における発現

正常（＋），DMD（−），BMD（多様性）
2．筋ジストロフィーマウス（mdxマウス）による病態の研究
1）筋小胞体からのCa漏出冗進がphenytoinで抑制されること，2）筋核のDNA量を経時的に測定し，DNA合成の面から筋細胞の変性，分裂，再生を検討
し，これらの変化と密接な関係があることを認め，3）Immobilizationによる筋変性への影響をしらべ，DMDの運動制限は病気の進行遅延をおこす可能性があること，4）筋ジストロフィーハムスターの神経筋接合部の未熟性を電顕で明らかにし，
5）筋再生と成長因子（fibroblastgrowthfactor）との関係を検討し，mdxマウスとコントロール群の組織中のbasic FGF（bFGF）の量に差がないことなどを明らかにした．
以上の研究は，いずれもmdxマウスを用いての骨格筋の壊死と，再生機構，筋DNA合成と筋の機能などを検討した重要な所見である．
3．ミトコンドリア脳筋症
ミトコンドリア脳筋症とは，骨格筋内に異常形態を示すミトコンドリアが認められる疾患の総称で，筋生検にてragged−redfiber（崩壊赤色線維）を認める．狭義のミトコンドリアミオパテーは骨格筋のみの障害を呈するが，広義のミトコンドリ
ア脳筋症は，骨格筋の症状だけでなく脳や心臓など多彩な症状を伴うものをいう．
ミトコンドリア脳筋症の臨床的特徴は，KeamS−Sayre症候群，ミトコンドリア異常を伴うミオクローヌスてんかん（MERRF）および脳卒中様発作を伴うミトコンドリ
ア脳筋症（MELAS）に代表される．
近年，慢性進行性外眼筋麻痔（CPEO，KSS）において，ミトコンドリア（mt）
DNAの欠夫が兄いだされ，さらに欠失様式（単一欠失あるいは多重欠失と正常
mtDNAの混在），欠失機構（反復配列を含むslippedmispairingなど），および欠−10−失mtDNAとその筋病変であるragged−red fiberさらにcytochrome c oxidase
欠損線経との関係などが明らかにされてきたが，今年度は，ひきつづき，これらの研究が進められ

またKSS以外の疾患における欠失mtDNAの検討なども報告された．
また，MERRFやMELASにおいては，以前からmtDNAの異常が示唆されていたが，今回，MERRFにおいてはtRNALyS，MELASにおいてはtRNALeuの点突
然変異が報告され，それぞれの変異は，患者群においてのみ特異であることから，病因であることが示唆された（図1）．またMELAS多数例における臨床，病理，生化学的検討やmtDNA以外の原因でおこるミトコンドリア異常症の遺伝子レベルでの解析などが報告された．
MERRFのtRNALys（8344）の発見MELASのtRNALeu（3243）の発見は，わが国の研究者によって成功されたことは，本研究が世界的に最先端に位置することを示したものといえよう．
4．筋ジストロフィーの治療
今年度は治療に関する研究は，1）ジストロフィー筋への正常myoblastの注射
成績と，2）dantrolenesodiumの投与効果を検討する研究がみられたにすぎない．
dantrolenesodiumは，筋細胞膜の安定作用をもつ抗痙縮薬で，血清CKを減少させる作用を有している．ジストロフィー患者に対する影響は今後の研究テーマとな
ろう．

5．1年後の研究成果の要約
平成2年度の研究は，第1年目に当り，班月の協力によって，1）PMDにおけるジストロフィンテストの応用と問題点を明らかにし，2）mdxマウスに筋ジストロ
フィーの病態の解明に当り，3）ミトコンドリア脳筋症の分子遺伝学的解析では，
MERRFではtRNALys（8344），MELASではtRNALeu（3243）の点突然変異の発見という世界的な業績をあげ，4）治療の開発では，移植の実験と，dantrolene
SOdiumなどの検討が行われた．

6．2年後の研究計画としては，次のテ⊥マを考えている．
1）ジストロフィンテストの適用−11−

（1）普及化：どの抗体を用いれば充分か．
（例：N末端とC末端領域）
2）ジストロフィンの欠損部位と臨床との対比
3）ジストロフィーの成因：mdxマウスの利用
4）ミトコンドリア脳筋症：分子遺伝学と臨床との対比
5）治療法の開発：dautrolene sodiumなど治療薬の検討
以上の他に，新しい薬があれば取り上げて前進したい．

ミトコンドリア脳航症とミトコンドリアDNA異常

ATPaSeWallaeeら（1990）
宮武ら（1990班会議）

Horgan−仙 I川畑ら（1988）
D川auroら（1988）
Ozawaら（1988）−12−平成2年度厚生省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー」総合班会議

筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法に関する研究

研究報告抄録PMDにおけるジストロフィンテストの応用と問題点荒畑喜

一（国立精神・神経センター神経研究所）
ジストロフィン遺伝子のクローニング（Monaco，Kunkelら：1985），全cDNA塩基配列の決定とジストロフィン分子モデルの発表（Koenig，Kunkelら；1987），さらにジストロフィンの発見（Hoffman，Kunkelら：1987）とジストロフィンの筋組織における局在様式（Sugita，Arahataら：1988）が相次いで報告されたのは我々の記憶に新しい．これらを筋ジストロフィー研究の新たな幕開けととらえるならば，今や我々はジストロフィン研究の第二段階に入ったといえる．今後ジスト
ロフィンの全貌が明らかにされて行く過程の中で，筋ジストロフィー（PMD）の病因と病態機序がより具体的に解明されるであろうが，ここでPMDにおけるジストロフィンテスト（①免疫組織化学，②イムノブロット，③multiplex−PCR）の臨床応用と問題点を整理しておくことも有意義であ
ろう．
1．抗ジストロ．フィン抗体
ジストロフィンの免疫組織化学イムノブロットテストには，特異抗体が必要である。抗体を使用する際に注意すべき事柄は，昨年度の総合珪会議で述べてあるので詳細は省略する．大切なことは，① 特異的な抗体を用いることと，② ジストロフィン分子上の異なるドメインを認識する複数の抗体を用いて一つの生検筋を検索する事である．後者の理由は，仮に欠失遺伝子部分がコードするペプチドを抗原とした抗体を用いた時には，ジストロフィンの検出が不能となるからである（false
negative）．具体的には，モノクローナル抗体2−5E2，3−4E5，4−4C5の3着を用いれば，ほぼ目的を達する．NichoIsonらのDy8（C未）は有用であるが，Dy4（ロッド部分）は特異性に若干の問題を残す．またvanOmmenらのP−20はDMD筋の動静脈や筋細胞質をも染色するので，やはり特異性に疑問を残している．Kunkelらの30kと60kは有用であるが，ポリクローナル抗体のため結合組織のバックグラウンドが高く出るので注意深い観察が必要である．
2．ジストロフィンの免疫組織化学と臨床診断
臨床診断的側面で特筆すべきは，これまで必ずしも容易では無かった，①DMDとBMDの鑑別，②DMDとFukuyama型筋ジストロフィーの鑑別，③DMDといわゆる肢帯型筋ジストロフィー（一般にジストロフィンは正常）の鑑別などが可能になった点であろう．また，④DMD保因者のうち，臨床症状を有するmanifestedcarrierではモザイクパターンが必ず出現しているので，これを肢帯型筋ジストロフィーとの鑑別のポイントとすることが可能である．さらに，⑤大腱四頭筋ミオバナーにはBMDが相当数存在する可能性が報告されている．
3

イムノプロット法によるDMD／BMDの診断

前述した免疫組織化学法はある意味では主観的な検査法であるので，これを補完する意味からも，
並行してジストロフィンのイムノブロットテストを実施することが必須である．現在われわれの研ー15−

究室では，ルーチンの組織化学用凍結切片20枚からジストロフィンのウエスタン・プロットを実施している．BMDの場合ジストロフィンは存在するが，分子量とタンパタ量のいずれか或いは両者に異常が兄いだされている．
4．multipIex−PCR法による遺伝子診断
PCR法（Polymerase ChainReaction）によって微量のサンプルからでも遺伝子診断が出来るが，とくにChamberlainとBeggsにより調製された36個のプライマーを用いてmultiplexTPCR法を実施すれば，サザンプロットで兄いだされる遺伝子欠矢の98％が発見出来るので臨床診断的価値は高い．我々の研究室では現在，筋生検材料の一部から，または末梢血リンパ球からDNAを抽出してPCR解析を実施している．前述の，免疫組織化学法，イムノブロット法と並び，極めて重要なテストである．
5．ジストロフィンの欠陥によって生ずる臨床像の多様性
おなじジストロフィン遺伝子に欠陥を持っていても，実際の臨床像は様々である．DMDとBMDの差異はよく知られているが，このほかにも高CK血症と筋のCrampを見るⅩ−linkedmyalgia家系の存在や，大腿四頭筋ミオバナー等の報告もある。また一方のみが臨床症状を呈した一卵性双生児の姉妹例（skewedinactivationの存在を示唆する）も知られている．さらにジストロフィンの46％が欠損していても臨床的にはmildなミオパテ一に止どまる家系も報告されているし，BMD兄弟
例で臨床的経過が大きく異なる症例等も存在する．
我々の最近の検索では，ジストロフィンテストを実施しない場合，いわゆる肢帯型筋ジストロフ
ィーと臨床診断されている孤発症例の中には，男性の31％にBMDが，女性の12％にDMD保因者が含まれていた．かかる症例については，適切な遺伝相談の資料としてジストロフィンテストが不可欠である．

−16−

mdxマウスによる筋ジストロ7イ」病態研究
高

木

昭

夫

（虎の門病院神経内科）
Dystrophin遺伝子や蛋白の発見以来，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）研究iま大きく前進した．しかし，dystrophin欠損と筋変性・壊死の関係については未だ充分解明されているとはいえない．荒木姓においてはmdxマウスをDMDのモデルとして使用したこの分野の研究が10編近く報告された．ここではその一部を紹介するとともに，焦点となるion channelの問題につき言及したい．
川井らは筋核のDNA量を分析して，Cellcycleの時間経過を追求した．mdxでは30日齢と60日
齢ではS期とG2M期の筋核が増加しており，この時期の壊死・再生の冗進を示している．90日齢ではS期とG2M期の核は減少していた．mdxの筋障害が非進行性であるのは，加齢とともに筋壊死が発生しなくなるためと推論した．
田過，水野らはmdxマウスを使用して，筋壊死の発生に影響する因子を分析した．前年まではtetanustoxin使用による不動化により筋壊死が抑制されることを明らかにしている．本年は小さなケージ内で拘束飼育して，運動量を制限した．運動量制限により筋壊死が抑制されることを明らかにした．
栗原らは横隔膜標本を使用して微小電極による細胞内記録を行った．mdxでは静止膜電位低下が観察され，33％の筋線経にelectricalmyotoniaが出現した．このmyotoniaはphenytoinやmex−
iletineにより回復した．薬理学的分析から，筋細胞には複数のionchannelの異常が推定された．
すなわち，dystrophin欠損のために膜構造の異常をきたし，多チャンネル異常が発生する可能性を指摘した．
寺尾は筋芽細胞移植による実験的治療を行っている．hostマウスの全身Ⅹ線照射後に移植を行うと，dystrophin陽性細胞は0．4％から2．2％に増加した．しかしまだ陽性細胞の比率はかなり低く，治療応用への展望は開けない．この理由として，注射の技術的問題，拒絶反応，移植細胞の移動能などが考慮された．
MorandiらはDMD保因者においてdystrophin欠損線経と筋変性の関連を分析している．細胞内にalbuminやcalcium（Ca）の侵入した変性線経はdystrophinを欠損する線経に多かった1）．
Turnerらによるとmdxの静止時筋細胞内Ca濃度は92nMと対照の2．3倍に増量していた．またmdxmyotubeでCaleakchannelのOpenprObabilityの増加が観察され，Ca濃度増加の原因と推定している2）3）．
吉田らは3週齢と16週齢のmdxマウス長址伸筋のCaイオン濃度は35−80nM（50−130nM）であり，対照との間に差を認めなかった．後述のように筋小胞体（SR）のCa摂取能を分析すると，mdxと対照の両者において，100nMCa附近で強力なポンプ作動を示した．したがって非変性筋線経においてCa濃度が上昇してくるとは考えにくい．
高木らは4週齢のmdxにおいて，SRのCa摂取能とCa誘発性Ca遊離（CICR）は正常であることを示した．しかしEGTAを含む溶液中でのCa漏出はmdxで冗進していた．この異常はphenytoinにより修復された．

−17−

これらの報告を総合すると，mdxマウスでdystrophin欠損のため複数のionchannelに異常が生じており，細胞内環境の維持には余分のエネルギー消費が必要と推定される．
このhomeostasisは種々の要因により破綻され，細胞壊死が発生する．運動負荷が誘因となる可能性も指摘され，本症の治療に関して重要な問題を提起している．
文献1）Morandi L et al：Ann Neuro128：674，1990
2）Turner PR et al：Nature335：735，1988
3）Fong P et al：Science250：673，1990−18−

ミトコンドリア脳筋症分子遺伝学的解析
一MBRRF富武正（新潟大学脳研究所神経内科）
Myoclonusepilepsyassociatedwithragged−redfibers（MERRF）は，ミオタロヌス，てんかん小脳失調，ミオパテーを主徴とする疾患で，その他足変形を伴う．骨格筋生検でragged−redfiberが認められ，血中乳酸及びビルビン酸が増加することから，ミトコンドリアの酸化的リン酸化酵素
系の異常，さらに本症が母系遺伝を呈することからミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常が病因と推定されていた．
しかし，これまでSouthern blotではmtDNAの欠矢はなく一塩基置換ないしはSouthern解析
では検出できない程度の小さな欠夫が病因である可能性が示唆されていた．
そこで我々は，本症の病因解明を目的に分子遺伝学的解析を行った．
〔対象及び方法〕
分析対象は，本症の疾患概念が最初に提唱された際に報告された2例，及び他の母子例の4例である．このうち1例の生検骨格筋よりgenomicDNAを抽出し，PCRで増幅した後，directsequence
法あるいは，pUC19ないしはpBlue Script KS−plasmid vectorにSubcloningL，mDNAの全
sequenceを検討した．
〔結果及び考察〕
患者骨格筋mtDNAの98％の領域について塩基配列を解析した．これをAndersonらによって報告されている正常ヒトmtDNAの塩基配列と比較したところ，33箇所の単塩基置換が兄いだされた．このうちの23箇所が蛋白質のCOding regionであった．この蛋白質coding regionのうち，12箇所がアミノ酸の置換をきたすものであり，3箇所の塩基置換（塩基番号6，547のT→C，11，718のG→A，14，858のG→A）がhuman，bovine，mOuSe間で保有されたアミノ酸を置換するものであった．さらにD」oopに7箇所，rRNA（12S）領域に2箇所，tRNA領域に1箇所の塩基置換が兄いだされた．D−loop領域の3箇所は，正常ヒトmtDNAの塩基置換として報告されており，また，
rRNA領域の塩基置換もMERRF以外の疾患で認められていることから，これらの部位が本症の病因である可能性は低い．
一方，tRNALys塩基番号8，344のA→Gの置換は，この塩基がhuman，bovine，mOuSe，rat，
xenopus及びcodで広く保有されているため，この部位での塩基置換は重要である．
以上より，本症の病因になり得る塩基置換として，蛋白質codingregionの3箇所とtRNALys領域の1箇所の置換が考えられた．
そこで，これらの置換がMERRF患者で共通に存在するかどうかを検討した．その結果，tRNALys
塩基番号8，344のA→Gの置換のみがすべての患者で存在し，正常コントロール15例では全く認められなかったので，この塩基置換を本症の病因と考えた．
この置換はtRNALysのT￠CloopのStemの3，側より2塩基下流に位置する．本症の病因とし−19−

て，このT￠Cloopの塩基置換がtRNAの構造を変化させ，その結果mtDNAでCOdeされる酵素
蛋白サブユニットの合成が障害され，本症が発症する機序が考えられた．

−20−

MELASの分子遺伝学的解析
＊

＊

聴男

＊

＊

＊

＊

成

●

＊

＊

＊

＊

＊

●

＊

釆田

宝太

＊

里

哉子将

征真高

中井澤

＊

埜桃小

雅

＊

中

■

田

一■

＊

菓

＊

雄

林

＊

藤

ヂ即

後
小

（＊国立精神・神経センター神経研究所，†＊国立遺伝学研究所…自治医科大学小児札

HH同生化学，…＝名古屋大学生化学）

MELAS（mitochondrialmyopathy，enCephalopathy，lacticacidosisandstrokeLlikeepisodes）
は，脳卒中様発作を特徴とするミトコンドリア脳筋症の一病型で，患者数も多く，重症度も高い．
今年度，我が国の3グループがそれぞれのアプローチで独立にMELASの変異遺伝子の同定を試
み，同一の結論に達した．さらに，遺伝様式，組織間分布，変異遺伝子の役割について明らかにされたので報告する．
（1）mtDNAの変位遺伝子の同定（1，2）
後藤らは，ミトコンドリアDNA（mtDNA）は母性遺伝することから，明らかに母性遺伝を示した患者骨格筋のmtDNAのtRNA領域の塩基配列を決定した．その結果，tRNA−Leu（UUR）の塩
基番号3243のAがGに置換していることを兄いだした．この置換によって，制限酵素切断部位Apalが生じ，容易に変異の有無を判断できた．患者31例の骨格筋DNAを調べると26例に変異塩基が認められた．いづれの例でも変異mtDNAと正常mtDNAは混在しており，その比率は，50から92％と患者によって異なっていた．
小林らは，同一MELAS患者骨格筋より筋芽細胞株を確立し，酵素活性染色と培養液依存性から呼吸鎖の変異株と正常株を選択した．この二つの培養細胞株の全mtDNAの塩基配列を比較することによって，変異塩基とミトコンドリア異常の因果関係を明らかにした．塩基配列を決定すると全mtDNAのなかで僅かに一塩基のみが異なっていた．こ甲塩基置換は，前述の変異と同じで，9患者で変異mtDNAが認められた．
田中らは，二人のMELAS患者のmtDNA塩基配列を比較することで同じ結論に達した．
（2）変異mtDNAの遺伝様式および分布
さらに，小林らは，7例中6例の患者のリンパ球細胞に変異mtDNAを検出し，血球細胞を用いて家系調査が行われた．例外なく母親には，患者より少量の変異mtDNAが検出され，発症していない兄弟姉妹の大部分にも変異mtDNAが認められた．その変異mtDNAの量は，母親と患者の中間であった．父親には，変異mtDNAはいづれも認められなかった．このことは，明瞭にキャリアの母親から患者へと変異mtDNAが遺伝したことを示している．剖検一例では，大脳に最も変異mtDNAが蓄積しており，牌臓は最も少なく，組織間で変異mtDNAの分布が異なっていた．
（3）呼吸鎖欠損の分子機構
変異塩基はtRNA，Leu（UUR）遺伝子上に位置しており，ミトコンドリア内でのタンパク質合成が阻害されることが想像された．前述の呼吸鎖欠損株と正常株のタンパク質合成を比較することに
よって変異tRNAの役割を分子レベルで調べると，変異tRNAbtRNAとしての機能は正常であー21−

った．ところが，特定のタンパク質の合成のみが低下しており，呼吸鎖の欠損の原因は全体のタン
パク質合成低下ではなく，特定のタンパク質合成の低下に基づくと考えられた．この分子機構は現在検討中である．
ミトコンドリアのRNA合成の制御機構は特殊で，リポソームRNAとmRNAの比率は転写終
結因子の結合によって調節される．変異のあった領域はこの終結因子の結合部位でもあり，tRNA−
Leu（UUR）遺伝子は二重機能を持つ．RNA合成の調節に関しては，通常状態ではrRNAとmRNAの比率は変異株でも正常であったが，酸素濃度の低下による制御は変異株では正常に働かず，
mtDNAの変異によってRNA合成の調節能が欠如することが明らかとなった．
（1）GotoY，NonakaIandHoraiS：Nature438：651，1990・（2）KobayashiY et al：Biochem Biophys Res Comm，1990・

−22−

担

研

究

分

報

＿理工
仁1

目

次

Ⅰ．筋ジストロフィー(1)1) Duchenne型筋ジストロフィーおよび筋緊張性ジストロフィーにおける

部検内喉頭筋の組織学的ならびに免疫組織化学的検討
東京都立神経病院神経内科

田

33

邊

等

2) 筋ジストロフィー及び多発筋炎における筋MRI
九州大学医学部脳研神経内科

37

後

藤

幾

生

3）筋エコー法による中間広筋障害の検討
信州大学医学部第三内科

39

庄

司

進

一

4) 筋ジストロフィー症におけるDantrolene Sodiumの血清CPK値に及ぼす影響

43

京都大学医学部神経内科

梶

龍

児

5）骨格筋ライアノジンリセプターのオートラジオグラフィー（ARG）

45

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

Ⅱ．筋ジストロフィー(2)6）ジストロフィン・テストによる肢帯型筋ジストロフィーの再検討
国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

537) Dystrophin :ヒト臓器分布並びにBecker型筋ジストロフィーにおける発現様式について
56
国立療養所再春荘病院神経内科

内

野

誠

8）各種筋ジストロフィーにおける抗ジストロフィン抗体による免疫組織化学的検討
鹿児島大学医学部第三内科 納

60

光 弘

9）先天性筋緊張性ジストロフィーにおけるジストロフィン発現様式の免疫学的解新64

東京大学医学部脳研神経内科 清 水 輝 夫

10) Becker型筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの動態(財)東京都神経科学総合研究所分子研究系神経生化学 堀

25

眞一郎

68

Ⅲ．筋ジストロフィー(3)11）福山型先天性筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの研究
国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

7512) dvstroohinおよびその遺伝子の検討

78

国立療養所下志津病院神経内科

松

村

喜一郎

13) ジストロフィンcDNAに基づくcysteine‑richおよびC末端領域
各種合成ペプチドの抗原性と抗体の反応性について
昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

81

弘

14) ラット脊髄付加ヒト培養筋細胞に於けるdystrophinの発現,局在に関する免疫組織化学的，電顕的検討

85

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義15) 急速凍結･ディープエッチング(QF‑DE)法による培養筋管
細胞内dystrophinの三次元的局在90

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義16) DeeD etching replica法によるマウス骨格筋細胞膜関連細胞骨格の研究
96─化学固定と無化学固定標本の差異について─
昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

Ⅳ．遺伝子
17) 女性筋ジストロフィー患者細胞のX染色体における脱メチル化とDNA複製パターンについて

103

東京医科歯科大学医学部難治疾患研究所細胞遺伝 斎 藤 深美子

18）ミトコンドリア脳筋症の病因解明
─ピルビン酸脱水素酵素複合体異常症における変異遺伝子解析
徳島大学医学部小児科

黒

田

泰

弘

19）筋ジストロフィー組織ジストロフィンファミリーと生体膜機能
宮崎医科大学衛生学

濱

田

112

稔

20）筋ジストロフィー家系における分子遺伝学的検討
東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

26

107

116

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症(1)21) ミトコンドリアDNA配列からみたヒト上科の子進化

125

国立遺伝学研究所 宝 来聰22) MELASにおけるミトコンドリアtRNALeu (UUR)変異名古屋大学医学部第二生化学

小

澤

129

高

将

23) COX部分欠損を伴ったLeigh症候群の生化学的分子遺伝学的検討

134

東京大学医学部脳研神経内科 清 水 輝 夫

24) 筋緊張性ジストロフィーにおけるミトコンドリアDNA異常
愛知医科大学第四内科 佐 橋

138功25) 家族性労作性ミオグロビン尿症におけるミトコンドリアDNA変異
名古屋大学医学部神経内科

高橋26）ミトコンドリア・ミオパチーにおける末梢神経障害
筑波大学臨床医学系神経内科

水

142

昭
148

澤

英

洋

27）家族性進行性外眼筋麻痺症候群の2剖検例における
多重欠失ミトコンドリアDNAの臓器分布
順天堂大学医学部脳神経内科

153

佐

藤

猛

28) Kearns‑Sayre症候群におけるミトコンドリアDNAの解析

157

大阪大学医学部第二内科・神経内科 垂 井 清一郎

29) 慢性進行性外眼麻痺症候群における欠失mitochondrial (mt)DNAの解析
─非RI標識mtDNA probeを用いての検討─
熊本大学医学部第一内科

荒

木

淑

161

郎

Ⅵ. mdxマウスほか
30) mdxマウス骨格筋におけるカルシウム(Ca)濃度調節

167

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

31) MDXマウス骨格筋の強収縮状態に於ける細胞内Ca2+濃度
国立精神・神経センター神経研究所

吉

田

瑞

170

子

32) mdxマウスの電気生理学的及び治療的研究
東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸

27

172

33）筋細胞膜モデルによるミオトニー発生機序の数理的解析

177

東邦大学医学部第四内科 栗 原 照 幸34) Heterozygote mdx mouseの筋細胞におけるdystrophinの発現と筋核との関係181

徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

臣

mdx mouseの骨格筋におけるDNA合成
徳島大学医学部第一内科

186

川

井

尚

臣

36) ｢Immobilization｣によるmdxマウス筋変性への影響
─第2報─
東京都立神経病院神経内科

田

191

邊

等

37）筋ジストロフィーハムスターにおける神経筋接合部の電顕的研究

197

国立療養所犀潟病院 福 原 信 義38) ジストロフィー筋への正常myoblastの注射に関する研究
─X線照射の効黒─
帝京大学医学部第一内科

寺

200

尾

寿

夫

39）骨格筋特異的蛋白発現に関する神経ペプチドの研究

204

金沢大学医学部神経内科

高

守

正

治

九州大学医学部脳研神経内科

後

藤

幾

生

40）筋再生と成長因子

207

Ⅶ．生化学
41）筋細胞死とリソゾームプロテアーゼ群
順天堂大学医学部生化学第一講座

211

木

南

英

紀

42）骨格筋筋原繊維の構成成分であるc‑蛋白質を変換する因子について(財)東京都神経科学総合研究所神経生化学 堀眞一郎43) clofibrateの骨格筋の速筋と遅筋グルコース･アップテイクに対する影響
信州大学医学部第三内科

庄

司

進

219

一

44）蛋白質のミトコンドリア移行とその異常
熊本大学医学部遺伝医学研究施設

215

222

森

正

敬

45) 一次元ならびに二次元電気泳動によるconnectinの免疫化学的析:

福山型先天性筋ジストロフィーにおける変性･分解の検討を中心に
国立療養所下志津病院神経内科

28

松

村

喜一郎

226

Ⅷ. ミトコンドリア脳筋症(2)46) MERRF様症状を呈したMELASにおけるミトコンドリアDNAの解析

233

筑波大学臨床医学系神経内科 水 澤 英 洋47) Myoclonus epilepsy associated with ragged‑red fibers(MERRF)の病因に関する分子遺伝学的研究

238

新潟大学脳研究所神経内科

宮

武

正

48) MELASにおける遺伝子異常の発見

242

国立精神・神経センター神経研究所 埜 中 征 哉
49) Strongly succinate dehydrogenase‑reactive blood vessels (SSV)の

診断的意義

246

国立精神・神経センター神経研究所 埜 中 征 哉50) MELASにおけるミトコンドリアDNAの点変異によるタンパク質,

RNA合成の変化

250

自治医科大学生化学

太

田

成

男

51) MELAS症候群の臨床的検討とミトコンドリアDNAの解析
大阪大学医学部小児科

岡

田

254

伸太郎

MELAS母娘例におけるミトコンドリアDNAの解析

258

自治医科大学神経内科 西 澤 正 豊53) MELASの遺伝子変異:骨格筋ミトコンドリアにおける点変異
自治医科大学小児科 桃 井 真里子

29

261

Ⅰ．筋ジストロフィー（1）1）Duchenne型筋ジストロフィーおよび筋緊張性ジストロフィーにおける剖検内喉頭筋の組織学的ならびに免疫組織化学的検討
田

研究協力者

緒

通

等＊

磯 崎 英 治● 高 元 喜代美■
宮 本 和 人● 小 田 雅 也■■

言結

我々は，これまで種々な神経筋疾患における内喉頭筋（声帯開大筋および声帯閉鎖筋）の組織学的変化を検討してきた．その結果，声帯麻痺を伴った多系統萎縮症では声帯開大筋のみの1），また筋萎縮性側索硬化症では全ての内喉頭筋において，
神経原性変化を認めるなど，疾患や病態により特徴的な所見を呈することを報告してきた．今回は筋ジストロフィーを対象とし，組織学的所見とともに免疫組織化学的染色（ジストロフィン染色）も行ったので併せて報告する．
対象および方法
対象は，Ducehnne型筋ジストロフィー（DMD）
1例（死亡時18歳），筋緊張性ジストロフィー（MD）2例（死亡時46歳および52歳）で，何れも末期まで発声・囁下機能は保たれていた．方法は，
剖検時，内喉頭筋（前筋，横筋，後筋），横隔膜および大腿四頭筋を採取し，生検材料に準じて凍結切片の作製および組織学的染色を行い，併せてジストロフィン染色も行った．ジストロフィン抗体
は，味の素株式会社および富士レビオ株式会社から供与されたC末端に対する4−4C5モノクロー
ナル抗体を使用した．

果

図1は，DMD例の横隔膜および内喉頭筋である．横隔膜では，明らかな大小不同，横断面の円形化，問質の増大，脂肪浸潤，Opaque fiberを認め典型的なDMDの所見を認めた．それに対し，
内喉頭筋ではいずれにおいても少数のOpaquefiberの散在，筋鞘核の増加を認めるものの，横隔膜に比し全体として極めて変化は軽度であった．
図2は，MD例である．横隔膜では脂肪浸潤を伴ったいわゆるmyopathicchangeに加え，多数の中心核を認め，MDに特徴的な所見を呈する．
同様な変化は内喉頭筋（後筋，前筋）においても認められる．他のMD例についても基本的には同様の結果を示した（表）．
図3は疾患コントロールすなわち脳梗塞で死亡した例における各筋のジストロフィン染色を示す．
大腿四頭筋では，各筋線経はいずれも仝周性に染色され正常パターンを示した．しかし，内喉頭筋においてはほとんどの筋線経はジストロフィン陰性であり，横隔膜においても，ごく一部に不完全な陽性線経を認めるものの，基本的には内喉頭筋と同様，大部分が陰性線経だった．図4はMD例の内喉頭筋および横隔膜である．いずれもコント
ロール例よりは陽性線経の数も多く，全体としてモザイク様に染色されたが，やはり陰性線経を認めた（表）．

＊東京都立神経病院神経内科＊＊東京都立神経病院検査料病理−33−

図1Duchenne型筋ジストロ7イーHE
染色 ×40横隔膜（上）に比し，内喉頭筋（下）の変化は極めて軽微である．

図2

考察
一般に，DMDでは末期まで発声・囁下機能は保たれるとされるが，実際にそれらに関連した筋の組織学的検索を行った報告は少ない．今回の我々の検索は一例のみであるが，確かにDMDの内喉頭筋は，四肢の随意運動がほぼ消失した末期にもかかわらず，ジストロフィーとしての変化は極めて軽度であり，喉頭の前面に位置する外喉頭筋群と比べてもなお，その変化は軽微であった．DMDにおいて，臨床的にあるいは画像ないし組織学的検索により比較的障害が軽度すなわち末期まで保たれるとされる筋は，外眼筋，後筋，側頭筋，胸鎖乳突筋，舌筋2），外肛門括約筋3）などであるが，我々の結果から内喉頭筋もこれらの一つと考えてよいと思われる．発生学的に内喉頭筋は，嘆筋とともに胎生期の鯉弓由来の筋であり，筋節由来の筋緊張性ジストロフィーHE染色 ×40
横隔膜（上），内喉頭筋（下）のいずれも多数の中心核を有したmyopathicchangeを認める。

中軸筋とはかなり性質を異にする4）．DMDではこうした特殊な筋（敗弓筋）がspareされる可能性も考えられるが，臨床的には前述したように必ずしも敗弓筋だけが軽度の障害にとどまるわけではなく（外眼筋や外月工門括約筋は中軸筋由来），単に発生学的母地の違いのみから障害部位を規定することは困難である．一方，MD例においては2例
とも四肢筋とほぼ同様の変化が内喉頭筋にも認められた．何れの例も臨床的には明らかな嘆下障害は認められなかったが，Subclinicalな誤囁（喉頭ファイバー下での唾液の声門下流入所見）の可能性は否定できず，本例がさらに長期間生存していれば，いずれ明らかな囁下障害をきたした可能性がある．従来，MDの囁下障害については食道の平滑筋障害と関連して論ぜられてきたが5），上記の結果から，喉頭レベルにおける横紋筋障害とい−34−

表 採取筋の組織学的所見およびジストロフィン
染色の結果
採取筋の組織学的所見

声帯閉鎖筋 声等開大筋 横隔膜前筋 横筋 後筋
DMD
MDI
MD2

＋
M

＋
M
M M

±

±：軽微な変化

M

M

M

M

M

M：nyOPathicchange

ジストロフィン染色
大脳四頭筋
DMD
MDl

内喉頭筋

横隔膜

＋
＋
（げイク様）（げイク様）●一●●一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一■一一一■

Contr01＋±±（正常）（ごく一部）（ごく一部）

図3 正常例（脳梗塞例）におけるジストロフィ
ン染色 ×40
大腿四頭筋（上）は，全周性に染色されるが・内喉頭筋（中）および横隔膜（下）では，極めて染色性が低い．

図4

筋緊張性ジストロフィーにおけるジストロ
フィン染色 ×40
内喉頭筋（上）も横隔膜（下）も，ともにモザイク様の染色を示す．

ー35−

結

う観点からも今後検討する必要があろう．
さて，DMDの内喉頭筋では前述したように
dystrophic changeが軽微であったこともあり，
ジストロフィン染色を行ったところ結果的には表に示したように全ての採取筋で陰性であった．しかし，対照のために行ったcontrol例において，四肢筋では正常な陽性所見を認めたにもかかわらず，
内喉頭筋や横隔隈においてはごく一部の線推しか染色されず，筋による染色性の違いを認めた．この理由を考えるにあたり，まず問題となるのが剖
検検体では，果してどの程度ジストロフィンの免疫活性能が保たれているのかという点である．

論

1）Duchenムe型筋ジストロフィーにおける内喉頭筋は，四肢の随意運動がほぼ消失した末期に
おいてもなお，極めてよく保たれる筋の一つである．一方，筋緊張性ジストロフィーの内喉頭筋では四肢筋とほぼ同様の変化を認めた．
2）ジストロフィン染色上，疾患コントロール
例の内喉頭筋および横隔膜でみられた染色不良の原因として，死後変化や筋の易傷性などの関与を考えた．
追記）脱稿後，布村らにより「DMDの内喉頭筋はMatsumuraら6）は，inviiYOにおける経時的なジストロフィンの分解について検討しており，それによれば検体（兎の骨格筋）を室温にて2時間放置するとWestern blotting上ジストロフィンバ
ンドは消失したという．我々の例では，死亡から解剖までの時間がcontrol例では5時間，MD例

一般骨格筋に比し，軽度であるが変性が認められでは1．5時間であり，MD例の方が染色性が良好な理由はこうした死後時間の違いによるのかも知れない．但し今回のジストロフィン染色の結果において興味あるのは同一剖検例，即ち死亡から検体採取までの時間はほぼ同じにもかかわらず，四肢筋では正常に染色されたにもかかわらず内喉頭筋や横隔股では染色性が乏しかった点である．内喉病理組織学的検討一特に内喉頭筋，反回神経にる」との報告が，同時期（平成2年度）の筋ジス
第3班から発表された．
文献1）磯崎英治ら：多系統萎縮症における声帯麻痺のついて−． 厚生省特定疾患運動失調症調査研究
班 昭和63年度研究報告書，1989，pp64−69．
2）Kakukas BA and Adams RD：MusCular
dystrophies．In

DiseasesofMuscles・（FouthEdition，Harper＆Row），Philadelphia，1985，p397．

頭筋や横隔膜は四肢筋と異なり，頻回に収縮，弛
緩を繰り返すという生理的特徴を有し，筋細胞膜のturn overが早いことが考えられる．こうした筋では，ジストロフィンの合成遅延あるいは分解の促進状態が考えられ，結果的にジストロフィンの免疫活性能の低下を招くのかも知れない．筋による染色性の違いの原因は，この様に筋自体の特3）Ohtake T，et al：Sparing of the perineal

殊性の他，死後の自己融解の速さの追い−すなわ
ち四肢筋に比し，より急速に進行するという可能性−も考えられる．この意味において内喉頭筋や横隔膜では四肢筋より筋細胞膜の易傷性がより強
いとも考えられ，今後スペクトリン染色との比較
やimmunoblot法による検討が必要と思われる．

滑筋障害について．神経内科29：582−588，

musclesinmusculardystrophies．J

Neurol■236：252，1989．

4）ローマー＆パーソンズ：脊椎動物のからだくその比較解剖学〉平光萬司訳，第5版，法政大学
出版局，東京，1983，pp223−257．
5）奥村利勝ら：筋緊張性ジストロフィーの内臓平
1989．

6）Matsumurak，etal：Invitrodegradationofthe−36−

Duchenne muscular dystrophygene product（dystrophin）．BiomedicalResearchlO：325−
328，1989．

2）筋ジストロフィー及び多発筋炎における筋MRI
後
研究協力者

藤

野

宏

之＊

は じめに
筋ジストロフィー及びその他の筋肉疾患の診断には血清酵素，筋電図，筋生検などが重要な検査法であるが，最近CT，超音波などの非侵襲的な検査法が進歩してきている1）．MRIも同様に非侵嚢的な検査法であり，中枢神経疾患の臨床診断に多大な影響を与えている．筋肉疾患におけるMRl
検査に関しては2，3の報告があるが，その有用性はまだ明確でない．今臥 我々は筋ジストロフ
ィー，多発筋炎及びその他の筋肉疾患でMRIを施行し，それらの鑑別にMRIが有用であることを兄いだしたので報告する．
対象及び方法
対象は3例の筋ジストロフィー（肢帯型2，三好型遠位型1），12例の多発筋炎群（多発筋炎及び皮膚筋炎），3例のその他のミオパテ一，及び3例の正常コントロールである．これら筋肉疾患の診断は臨床徴候，血清CK値，筋電図，筋生検像により確かめた．12例の多発筋炎群のうち8例は活動期で治療前にMRI検査を行った．そのうち4

藤

幾

山

田

生
猛＊

小

林

卓

肝

しており，−一部の筋では，Tl，T2ともに高信号を示した（図1）．この高信号は筋力の低下した筋肉に多くみられたが，患者により高信号の分布は異なっていた．この筋肉の高信号域は画像の性質より筋肉の脂肪変性を表わすと考えられた．
多発筋炎群の非活動期の症例では筋肉MRIは正常とほぼ同じであるか，一部Tl，T2ともに高信号を示した．しかし，活動期の患者ではTl強調画
像では正常のMRI像を示すのに対し，T2強調画
像では高信号を示す筋肉が見られた（図2A）．この
高信号は8例中7例に見られ，左右対称性のことが多かった．しかし，患者により高信号域の分布は異なっていた．筋力低下との相関は明らかでなかったが，筋の庄痛が見られる場所に高信号が見られる傾向であった．副腎皮質ホルモン治療により非活動期になった患者でMRIを再検すると4例で高信号域が消失し，ほぼ正常になっていた（図2B）．この治療による信号の変化及び高信号がT2強調画像のみで呈することより多発筋炎の高例は副腎皮質ホルモン治療後非活動期になり
MRIの再検を行った．MRIは1．5テスラGE社製
SignaMR装置にてTlはTR600ms，TE20ms，T2
はTR2000ms，TE80msで軸位にて撮像した．
結果及び考察正常コントロールではTl，T2強調画像ともに同様の所見であった．すなわち，皮下脂肪や結合織は高信号，骨皮質は低信号であり，筋肉はその中間であった．筋ジストロフィーでは筋肉は萎縮＊九州大学医学部悩研神経内科−37−

図1肢帯型筋ジストロフィー39歳女性例の下腿部MRI．TIT2強調画像ともに高信号域が見られる．

部分的な筋変性と考えられた．2例のミトコンド
リアミオバナー及び1例のネマリンミオパテーの筋肉MRIは正常と差がなかった．
以上のごとく種々の筋肉疾患において筋肉
MRIを施行したが，その画像において筋ジストロ
フィー及び活動期多発筋炎は特徴的な所見を呈した．すなわち筋ジストロフィーではTl，T2ともに高信号が見られ，一方，多発筋炎ではT2のみに高信号が見られた．これらの結果はMRIにて筋ジ
ストロフィーや多発筋炎とその他の筋肉疾患例えばミトコンドリアミオバナーやネマリンミオパテーなどと鑑別が可能であることを示唆した．さらにTl，T2強調画像両者をとることにより筋ジストロフィーと多発筋炎の鑑別も可能であった．
MRI検査のその他の利点として罷患した筋肉の分布がある程度把握できるとともに経時的な検査により，疾患の進行や回復を知ることができることなどがあげられる．一方，MRIの欠点は検査時聞及び検査費用がかかることである．現在のところMRIのみで疾患の確定診断は困難であるが他の検査と組み合わせることにより，この非侵襲的な検査法は今後筋肉疾患の補助検査法として大きく寄与するものと考えられる。
文献1）BohanA，PeterJB，BowmanRLandPearson
CM：A computerLaSSisted analysIS Of153
patients with polymyositis and der−

図2 多発筋炎65歳女性例の大腿部MRI．㈲活動期（血清CK3682IU／1）．T2強調画像において大腿四頭筋を中心に高信号域が見られるが，Tl強調画像では正常である．（籾ステ
ロイド治療後の非活動期（血清CK 55
IU／1）．活動期に見られたT2強調画像の高信号城はほぼ正常化している．

matomyositis．Medicine56：255−286，1977．
2）YuhTC，SchreiberAE，MontgomeryWJand
Ehara S：Magnetic resonanceimaging ofpyomyositis．Skeletal Radiol17：190−193，
1988．

3）KitamuraJ，Maruyama H，Yamamura Y，
Kurihara T andMatsukura S：Twocasesof

信号は筋肉の炎症あるいは浮腫を表わすと考えられる．同様なT2のみの高信号は熱帯性化膿性筋炎や横紋筋融解症などに見られるという報告がある2）3）．非活動期のTl，T2両強調画像の高信号域は−38−

acute rhabdomyolysis．Pathogenesis，muSCle

biopsy，EMG，XLCT and MRI．Rinshou
Shinkei28：485r488，1988．

3）筋エコー法による中問広筋障害の検討
庄 司 進 一＊
研究協力者

朴

木
松

下

清
茂

人＊
樹＊

武

田

伸

一＊

柳

沢

信

夫＊

は じめに

吉

表

田

邦

広・

Number of cases

我々は，Heckmattら1）および田代ら2）の筋エ
コー法の神経筋疾患の診断に有効との報告以来，今まで約500例の神経筋疾患患者に筋エコー法を実施し検討してきたが，神経原性筋萎縮症では，筋エコー法上筋肉内エコーの増加は軽く筋束の減少が強いという特徴を認めた．さらに，神経原性筋萎縮症では，進行が遅い疾患群ほど中間広筋が大腿直筋に比べより強く障害される傾向がある印
象があり，今回，筋萎縮性側索硬化症（ALS），遺伝性運動感覚性ニューロバナー（HMSN），脊髄性筋萎縮症（SMA）で，中間広筋の大腿直筋に対する障害の強さについて数値化し各疾患間の差を検討し，筋原性疾患では，Duchenne，Becker，筋緊張性，肢帯型の各ジストロフィー症，多発性筋炎・皮膚筋炎で同様の検討を行った．
対象および方法
対象は，ALS 21例，HMSNll例，SMA 7
例，筋原性疾患として，Duchenne Muscular
Dystrophy（DMD）

Dystrophy（MMD）11例，Limb・GirdleMuscu＿

lar Dystrophy（LG）8例，PolymyOSitis andDermatomyositis（PM＆DM）6例，健常対照8例である（表）．超音波断層装置は，日立EUB−40を用い，大腿中央部前面にて3．5MHzのプローブを用い，Gain30dB，NearGain−30dB，Far
Gain3．OdBの一定条件で横断像を記録した．得ら

ALS

21

29〜74

EHSN

11

14〜65

SHA

7

43〜65

DMD

6

8〜19

BHD

5

11〜20

HHD

11

27〜59

LG

8

19〜54

PH andDH

6

31〜66

Eealthy Cont．ro1

8

24〜44

れたエコー像で，大腿中央部での大腿直筋の厚みを（a），中間広筋の厚みを（b）とし，大腿直筋および中間広筋の幅2cmおよび筋束の厚さ分の単位面積あたりのエコー輝度（echogenesity）をそれぞれ
槻および03）とする（図1）と，b／aおよびB／Aをもとめ，これらの疾患で検討した．

6例，Becker Muscular

Dystrophy（BMD）5例，MyotonicMuscular＊信州大学医学部第三内科

No．of Cases Range of Age

結果

図2−1に，33歳の健常対照例の大腿中央部の筋エコー像を示す．筋肉内エコーはこの程度が正常であり，大腿直筋，中間広筋の筋束も保たれている．
図2−2に，67歳ALS患者の大腿中央部の筋エコー像を示す．大腿直筋および中間広筋ともに著しい筋束の減少がみられ，両筋の軽度の筋肉内エコーの増加を認めた．図2−3に，47歳HMSN患者の大腿中央部の筋エコー像を示す．大腿直筋に比べ中間広筋の筋束の減少が目だち，両筋の軽度の筋肉
内エコーの増加を認めた．図2−4に，58歳SMA患−39−

図1Measuring of thicknessand echogenesity of muscles on US

者の大腿中央部の筋エコー像を示す．大腿直筋の筋束は保たれているのに比べ，中間広筋の著しい筋束の減少があり，同筋の筋肉内エコーの著しい増加も伴っていた．
図3は，中間広筋の厚み（b）を大腿直筋の厚み（a）
で割った値b／aを，各疾患毎に統計的に処理したものである．HMSNおよびSMAは，ALSおよび対照例に比べ有意（t検定で危険率1％以下）に低下を示した．HMSNとSMA間およびALSと対照例間では，有意差はなかった．筋原性疾患では，MMDでのみ対照例に比べ有意（t検定で危険率1％以下）に低下を示した．
図4は，中間広筋の単位面積あたりのechogenesity（B）を大腿直筋の単位面積あたりのechogenesity仏）で割った値B／Aを，各疾患毎に統計的に処理したものである．SMAは，ALSお
よび対照例に比べ有意（t検定で危険率1％以下）に増加を示したが，SMAとHMSN間および
HMSNとALS間では，有意差はなかった．また．筋原性疾患では，MMDでのみ対照例に比べ有意（t検定で危険率1％以下）に増加を示した．LGでは増加を示すものと示さないものがあり，疾患の多様性を示唆していた．

各疾患の屏病期間とb／aあるいはB／Aとの関係を検討してみたが，今回明らかな関係は見られなかった．ただ，6年間に4回検索したHMSN例
では，年数がたつにつれB／Aが増加する傾向を示した．進行の遅い（曜病期間10年）ALS例は，非定型的なので今回ALSグループから除いたが，同症例のb／aはALS群のRangeにはいるもののB／AはSMA群のRangeに入った．
考察

HMSNおよびSMAで，ALSおよび対照例に比べb／aが有意に低下を示したことは，神経原性筋萎縮症の中でも進行の遅いこれらの疾患では，
大腿直筋に比べ中間広筋の筋束の減少が強いこと意味している．また，SMAで，ALSおよび対照例に比べA／Aが有意に増加を示したことは，
SMAでは，筋束の減少と同時に筋肉内エコーの増加も大腿直筋に比べ中間広筋で強いことを意味している．HMSNでは，図4からも分かるように，中間広筋での筋肉内エコーの増加の仕方には症例によりかなりの幅がみられ，明らかにより強い増加を示すものもある．
疾患の屏病期間とb／aおよびB／Aには，今回

ー40−

白LS

川D

川mN S目白甜D HHD

−

6

．

8

−

11

−

5

−1Ul−

I − − ・ ■ 0 − − − −

与1

一

6

−1nT1

7

7

−−−−17

1

・−⊥T

−

−

﹁⁚︑．．

与−

−

11

．4 ．

・

21

LG PH＆DH Control

8mean l．打田8．6d3臥654臥913臥＄；応臥5968．8：碍8．913臥妬3
S．D． 臥221臥113臥179臥119臥126臥2338．2198．はれ匹必S．E． 臥84台田．834軌跡∋8臥849軋殴るB．B7B8．877臥窃：汚臥駁詑

図3
ヽ、

J

、−

J

J

The ratio of vastusintermedius andrectus femoriSinthickness

Rectus F川口ris
B／A

Vastuslnlerm山IIS

T
Femur

ミここ＝ク
Rectus Fe刑ris

甲sLus；nLerl陀dius

Ft・ml汀

図2

Ultrasonogram of quadricepsin ahealthycontrolandin patients withALS，
HMSN or SMA．

明らかな関係はみられなかったが，進行の遅い
ALS例および経過を追えたHMSN例では，B／Aが増加しており，症例を積み重ねてさらに検討する必要があると思われる．筋エコー法上，筋肉内
ェコーの増加は，結合織ないし脂肪織の筋組織内への浸潤と考えられている．また，筋束の減少は，筋萎縮そのものを示している．このことから判断すると，HMSNおよびSMA等の進行の遅い神経原性筋萎縮症では，中間広筋が大腿直筋より強く障害されていることになる．進行の遅い疾患群
で中間広筋の障害がより強いということは，大腿

11．
柑
7
4
5
5
8
8
5
8
m鯛n l．1631．5792．1898．9471．8731．割81．7齢臥7781．187
S．D． 8．2588．656臥489臥1568．224臥361臥9728．4438．172
S．E． 9．B828．248臥244B．都Ⅶ6．1紺色．128臥3448．1988．￠61

図4

The ratiovastusintermediusandrectus
femorisin echogenesity

能性がある．すなわち，姿勢保持筋の方が強く障
害されるということを示唆している．筋展性筋萎縮症の中でTypeI線推萎縮が知られている
MMDで選択的に中間広筋障害がみられたことについても，同様な要因が関与している可能性がある．臨床的には，ALSとSMA間でb／aおよびB／Aにおいて統計的に有意差がみられたことは，
筋エコー法がこれら疾患の鑑別に役立つことを意味している．

直筋がTypeII線維優位3）の速筋であるのに対し，
中間広筋がTYPEI線維優位4）の姿勢保持筋ないし抗重力筋であるということに関連している可
−41−

結

論

神経原性筋萎縮症では，進行の遅いHMSNおよびSMAで大腿直筋に比べ中間広筋がより強く

ultrasoundimaging−CT所見および筋生検所

障害される．筋原性筋萎縮症では，MMDでも同見との関連について． 厚生省「神経疾患研究委

様の結果を示す．これらのことは，姿勢保持筋な託費」筋ジストロフィーの臨床，病態と成因にいし抗重力筋が強く障害されることを示唆してい関する研究 （杉田班）昭和59年度報告書，る．筋エコー法は，ALSとSMAの鑑別に役立
つ．

1985，p90．

3）Johnson MA，Polgar A，et al：Data onthe
distributionoffibretypesinthirty・Sixhuman文

献muscles．Anautopsystudy．JNeuroISci18：

1）HeckmattJZ，Leeman S，etal：Ultrasound

111，1973．

4）EdgertonVR，SmithJL，etal：Musclefibre

imaglngin the diagnosis ofmuscle disease．
J PediatrlOl：656，1982．

type populations of humanleg musCles．

2）田代邦雄，松浦享ら：神経筋疾患におけるHistochemJ7（3）：259，1975．

−42−4）筋ジストロフィー症におけるDantroleneSodiumの血清CPK値に及ぼす影響
木 村
研究協力者

要

淳■
梶

寵

方

約

筋ジストロフィー症の進行を遅延させる治療法を見出すため，FSH型2例，Limb−girdle型3例
において，DantroleneSodiumの経口投与の血清CPK値に及ぼす効果を検討した．5例中4例において投薬量の増減は有意にCPK値の変化と相関しており，投薬によりCPK値が低下することが示唆された．
は じめに
近年Duchenne型をはじめとする筋ジストロフ
ィー症の病因が遺伝子レベルで解明されてきたが，未だ有効な治療法を確立するに到っていない．
Duchenne型ではdystrophinの欠乏が示されているが，その正確な病因論的役割は明らかではな
い．しかし共通のメカニズムとしてカルシウムの細胞体内への異常な流入が関与していることが示
唆されている1）．細胞体内のカルシウム濃度の異常な上昇は永続的な筋収縮をひきおこし，組織学的に見られるOpaqueFiberなどの所見を説明す
るものと考えられる．DantroleneSodiumはsar−

びLimb−girdle型3例について，Informed Con−
sentを得て行なった．
Dantrolene Sodiumは経口にて25−50mg／日
を1回〜2回にわけて投与した．
CPKは原則として月1回は採血をし，1例を除き（Casel），外来通院時に調べた．同時に副作用のチェックのため肝機能も毎回検査を行なった．
自宅から外来に受診するための行程は毎回同じで，ほぼ毎回同程度の筋肉に対する負荷が与えられる様にした．毎回，受診時には徒手筋力テストにて筋力評価を行なった．
得られたCPK値は，Dantrolene Sodiumの投与量（25又は50mg）との相関についてsimple
regressionanalysis法（Statworks⑧による）を用いて検討した．
結果

表に，各例の統計処理の結果（p−Value）を示
す．5例中4例で，DantroleneSodiumの投与量
表
t
Py
︒

CaSO

Summary
duration（yrs）

p−Va，ue0．019

51
0．002■

3

3

0．045●

01

40．020■

8

5

F SHFS日用2

我々は，今回FSH型筋ジストロフィー症2例，
Limb−girdle型筋ジストロフィー症3例において，経口Dantrolene Sodiumの血清CPKに与える影響を4−18カ月にわたり調べた．

法

対象は，19〜39歳の男性2名，女性3名で筋生検及び筋電図により確診のついたFSH型2例及1

coplasmicmembraneを安定化させる作用をもつ
抗痙縮剤で，Duchenne型筋ジストロフィー症やその動物モデルであるmdxマウスで血清CPKを有意に下げることが報告されている2）3）．

＊京都大学医学部神経内科

児■

0．208

CASEKT31F；L−G

0

0

一

∩ ︶ 0

8

0 0

b

0
4
1
2

▲ U

人

■

8 ′ 0 4

O

0
0

O

l

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一

二／予＼二一

0

2

0 0
0 0

DANTRJUM

0 0

d50

50
DANTRIUM

0。．。膿。．1鼻息h■朋hl。肌

0

∝

1000
0

O

1

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■

Ⅰ／

■

2000

1

0く30002■

4000

CASETK37M；L−G

・．∵仁

＼■

′■

5000

O

O
6

8

9

■11

89

8

347891011

90

9

12

2

5

7

89

8

9

10

11

90

図1

図2

はCPK値の変動に関与しない確率は0．05以下で，何らかの関与がある，即ち低下させることが示唆された．
図1は，入院中に投与を開始した例のCPK値の変動を示すもので，下段にDantroleneSodium

投薬による副作用は認めなかった．
考察以上比較的短期間の観察で，本剤投与により見られたCPK値の減少が，筋ジストロフィー症のの投与量を棒グラフで示している．入院時にCPK
値は低下するが（admissionで示す）Dantrolene
Sodium開始後さらに低下し，休薬すると上昇の傾向を示し，退院（dischargeで示す）と投与量減少により急激に高値になるが，また外来にて増量することにより低下し，CPK値の変動が投与量の増減でよく説明できた．
図2は外来にて投与を開始した例の同様のグラフであり，やはりCPK値は投与量に応じて増減を示した．

進行を遅延させるか否かは不明であるが，今後有全例において徒手筋力テスト上で筋力に変化なく，2例において自覚的な一過性の易疲労性を投薬開始直後に認めた．
1例において（Case5），投薬前より軽度の肝機

2）QuinlainJG，JohnsOn SR，etal：Dantrolenenor−

能障害を認めたが，DantroleneSodiumの投与後肝機能の増悪を認めたため投薬を中止した．他のdantroleneinDuchennemusculardystrophy．

効な治療法となり得る可能性が示唆された．将来
より多施設の長期にわたる研究が必要と考えられた．
文

献1）TurnerLFG，WtstwoodT，etal：Increasedpro−
teindegradationresultsfromelevatedfree cal−
Ciumlevels foundinmuscle from mdx mouse．
Nature335：735−738，1988，

malizes serum creatinine kinasein mdx mouse．

Muscle＆Nerve13：268−269，1990．
3）BertoriniTE，PalmieriGMA，etal：Effect of−44−

Muscle＆Nerve，in press．

5）骨格筋ライアノジンリセプターのオートラジオ
グラフィー（ARG）
高 木 昭 夫＊
研究協力者

小

島

進＊

竹

村

玲

子＝

荒

木

誠＝

紫

芝

良

昌＝

は じめに

井

田

雅

祥＊

異常の有無につき検討したので報告する．

筋の興奮収縮連関（E．C coupling）における未解決の問題はT小菅（T−tubule）から筋小胞体（SR）への興奮伝達機構にある．最近，植物アルカ
ロイドであるryanodineが結合するryanodine

対象及び方法
対象はDuchenne型筋ジストロフィー1例，
Becker型筋ジストロフィー1例，Duchenne型筋

高熱の責任遺伝子は第19染色体長腕にありジストロフィーの保因者1例，肢体型筋ジストロ
フィー1例，悪性高熱1例，悪性症候群1例，ヒト正常対照1例，およびmdxマウスとその対照のBlOである．いずれの筋も一800Cのdeep fre−ezerに最長2年間保有されていた検体である．また悪性高熱と悪性症候群例はskinned fiber法により確定診断した例であり，詳細は別に報告した8）．

ryanodinereceptorの遺伝子と同一であると推定方法は1979年にYoung＆Kuharらが開発したされた事である3）4）．すなわちryanodinereceptor
遺伝子の突然変異が悪性高熱の原因である可能性

1nvit7Vlabeling 法を用いた9）．

receptorについての研究が進歩した1）．1989年にTakeshimaらはryanodine receptor蛋白のcDNAをクローニングし，N端が

Foot

構造

を，C端がCa2＋遊維チャンネルを形成していると推定した2）．
一方この領域に於ける一つの話題は，常染色体性優性遺伝を示す悪性高熱の家系において，悪性が指摘された4）．悪性高熱の診断に有用とされて通常の方法で6JJmのクリオスタット切片をスライドグラス上にとり風乾後，0．1％formalde−

いるskinned fiber法によるCa2＋誘発性Ca2＋遊hydeinPBS（PH7．4），で10分間弱固定した．次離（CICR）やカフェイン拘縞の元進は5）6），この筋に緩衝液A（20mM TrisHCI pH

小胞体のCa2＋チャンネルの異常に起因するとし

CaC12，4mMATP，0．1MKCl）で40C，10分間て矛盾しない．またヒト悪性高熱の実験モデルでpreincubationした．その後各種濃度の〔3H〕

あるブタ悪性高熱においてryanodine receptorの生化学的特性の変化が報告されている7）．

ryanodine（DuPont−NewEnglandNuclear）を

今回，我々はヒトryanodinereceptor異常を検

緩衝液A中でincubateした．incubation時間，標本の厚さに関する基礎的検討も同時に行った．

討する目的で，①筋生検cryostat標本に ？nviiYV
labeling法によるautoradiographyが可能か否

7．0，25／JM

オートラジオグラフィー（ARG）は，incubation
後のスライド グラスを乳剤（InfoldK5）中へdip

か，②実際の生検筋に於けるryanodinereceptor

した後，暗箱中で4fC，4週間及び8週間の露出後＊虎の門病院神経内科＊＊沖中記念成人病研究所に現像定着した二後染色はHematoxyliP＆Eosin
染色を用いた．
結合実験はincubateした切片をスライドグラ−45−

ス上より削り取りシンチレーションバイヤルにいれ，蛋白溶解剤（NCS：Amersham）で370C，60
分間溶解後シンチレーションカクテル（Ready
Safe；Becknlan）を加え液体シンチレーションカ
ウンターで計測した．ヒト剖検筋より調整した
heavy microsome分画を用いての結合実験も別に行った．
ARGにおいて銀粒子の密度を1標本上で無作為に10箇所選び計測し平均と標準偏差を求めた．
統計学的手法はStudentのt検定を用いた．
結果1）結合曲線：Incubationの時間に関する検討

microsome分画でも同様の結果を得た（図2）．すなわち本法におけるスライドグラス上のrece−
ptorへのligandの結合を確認した．
2）Autoradiography（ARG）：筋線経に一致して銀粒子がみられた．赤筋と白筋，正常の筋線経と萎縮，肥大線経などの間に銀粒子の分布の差はなかった（図3）．
3）mdxとBlOマウスの間には銀粒子の分布の差は認められなかった．しかし，銀粒子の密度はmdxで少ない傾向を認めた．
一方，Saturationcurveは両者の間に差を認めなかった．
4）ヒト筋ジストロフィーではDuchenne型，では，370Cではほぼ30分後より結合量が一定となった．ARGは〔3H〕ryanodinelOOnMを370C，
90分で施行することとした（図1A）．標本の厚さは80−100nMにおいて結合が飽和した．ヒトheavy
表 Autoradiographにおけるsilvergrainsの数．
各標本で無作為に10箇所をcountした．
Student

sttest．＊p＜0．01，＊＊p＜0．001

MH：悪性高熱，NMS：悪性症候群，DMD：
Duchenne型筋ジストロフィー，DMDc：

DMDの保因者，BMD：Becker型，LG：肢体型
grajns／1000um2（m±SD）
B10

104±13mdx

84±10儲

Norma1

59±

9

41±

9うほ

SZ〇一トU山S C仁山d□Z⊃〇g山Z一口OZ＜＞仁山O S山﹂〇三−12ルm以上の厚さとなると結合量は増加しなかった．Ligandの浸透度の問題と，切片が剥がれ易くなることが理由として考えられた（図1B）．
370C，90分間のincubationでの結合曲線を得た．正常対照，BlOマウスでは〔3H〕ryanodine

A

30

60

90

1

TIME（M肌）

6

1012

16

THICKNESS（JJm）

58± 6
76±11碁図1A）Incubationの時間と結合量の関係．370
Cでは，ほぼ30分後より結合量が一定となった．B）標本の厚さと結合量の関係．12ミ
クロン以上の厚さとなると結合量は増加し
なかった．

69±11
68±11
73±11倍−46−

Becker型，肢体型ともに銀粒子の分布の異常を認めなかった．しかし密度はDuchenne型，肢体型
で増加していた（図4，表）．
5）悪性高熱，悪性症候群では銀粒子の分布の差は認められなかった．しかし密度は悪性高熱で少ない傾向を認めた．悪性症候群では差はなかった（図5，表）．
考案

今回の検討により以下の事を明らかにした．
1）筋生検cryostat標本においてもin uitrolabeling法による結合実験とARGが応用可能である．2）mdxとBlOマウスではARG上ryanodine receptorの分布異常は認めないが，mdxで密度が低い傾向がある．しかし，結合曲線

20

40

60

80

1−HI RvanDdlneけい1

図2

100

20

40

60

80

100

はほぼ同一である．3）ヒト筋ジストロフィーではDuchenne型，Becker型，肢体型ともに銀粒子の分布の異常を認めなかった．しかし密度はDu−

lJHJ RYa∩αかne：〔り〔3H〕ryanodineによる飽和曲線．A：ヒトheavy microsome分画の〔3H〕
ryanodineの飽和曲線．B：inuihvlabel−ing法で得られた飽和曲線．両者ともに80〜100nMで飽和を示す．

chenne型，肢体型で増加していた．4）ヒト悪性高熱でryanodinereceptorの異常（銀粒子密度の減少）を指摘した．
今回の検討で一800Cのdeep freezerで最長2年間保有した検体を用いてARGが可能であるこ

図3 〔3H〕ryanodineのautoradiography．筋線経に一致して鍍粒子がみられた．赤筋と白筋の間に銀粒子の分布の差はなかった．正常対照，A）NADH−TR，B）ARG，×800，Hematoxylin＆Eosin（HE）染色で後染色．
−47−

D．DM皿℃

図4〔3H〕ryanodineのARG．A，B）Duchenne型筋ジストロフィー（DMD），C）Becker型
筋ジストロフィー（BMD），D）DMD保因者（DMDc）．×800，HE染色で後染色．

とを確認した．すなわち，本法は過去の通常に施行したcryostat検体が使えるという利点をもつ．
また少量の標本量でも結合曲線が得られる．これらの事は筋疾患に於て適当なligandが得られれ線ではBlOとほぼ同様の結果を得た．これはmdx
マウスではCa2＋誘発性Ca2＋進級（CICR）が，BlOと変わらないと言う結果を支持する所見と考える11）．

ば，その病態解析が通常の筋生検標本で可能であ

今後，本症におけるCa2＋遊離チャンネルの病ることを意味しておりその有用性がきわめて高い態とdystrophin異常の関連を追求することが重要と考える．

と考える．

同様のCa2＋調節異常が指摘されている悪性高

RyanodinereceptorはCa2＋逢隈チャンネルを形成し筋細胞内のCa2＋調節に重要な役割をなし

熱でARG上ryanodine receptorを示す銀粒子ている．Duchenne型筋ジストロフィーにおいてが少ないこと，結合曲線ではその結合度が正常と

skinned fiber法でカフェイン拘縞が克進してい異なることは8），reCeptOr分子の減少とその機能

る6），電顕的にT管と筋小胞体の間のjunctionalの異常があることを示唆している．

gapが拡大しているなどの異常が指摘されている10）．今回の検討でもryanodinereceptorを示す

今後症例を追加して検討する必要がある．

今回は症例数が少なく各一例のみの結果であり，銀粒子の密度がDuchenne型筋ジストロフィーで増加の傾向を示したことは，筋細胞内のCa2十調
節異常を反映していると推定される．一方，mdx
マウスでは銀粒子の密度が減少していたが結合曲結論

1）筋生検cryostat標本においてもYoung＆KuharのE7n vitYVlabelling 法が可能である．

−48−

図5〔3H〕ryanodineのARG．悪性高熱（MH：A，C．），悪性症候群（NMS：B），正常（Normal：D）silver grainsの分布異常は認められないがMHでは密度の低下がみられる．×800，HE
染色で後染色．

2）mdxとBlOマウスではARG上，mdxで銀粒子の密度が低い傾向があった．結合曲線はほぼ−13．2．Nature343：562，1990．
4）MacLennanDH，Duff C，et al：Ryanodine

同一であった．

receptorgeneis a candidate for predisposi−3）ヒト筋ジストロフィーではDuchenne型，tiontomalignanthyperthermia．Nature343：

肢体型で銀粒子の密度が増加の傾向を示した．

559，1990．

4）ヒト悪性高熱でryanodine receptorの異5）遠藤常（銀粒子密度の減少）を指摘した．

実：筋生検におけるMHスクリーニン

グテスト．麻酔と蘇生23（別冊）：145，1987．
6）高木昭夫，小島 進ほか：悪性高熱およびDu・文

献Chenne型筋ジストロフィーにおけるカフェイ1）高木昭夫，小島 進：悪性高熱研究の進歩．日ン拘縮克進の機序と診断的意義．臨床神経29：

本臨床48：197，1990．

301，1989．

2）Takeshima H，Nishimura S，etal：Primary7）MickelsonJR，GallantEM，etal：Abnormal

StruCtureandexpressionfromcomplementa−

SarCOplasmiCreticulumryanodinereceptorin

ry DNA of skeletalmuscle ryanodine rece−malignant hyperthermia．J BioIChem263：

ptor．Nature339：439，1989．

9310，1988．

3）McCarthyTV，HealyJMS，etal：Localiza−

8）小島 進，高木昭夫ほか：悪性高熱，悪性症候tion of the malignant hyperthermia susce−

群におけるライアノジンレセプター異常一生検

ptibilitylocus tohuman chromosome19q12

骨格筋のオートラジオグラフィーによる検討．
−49−

託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態

麻酔と蘇生26（別冊）：1990，印刷中．

とその病因に関する研究 （杉田班）平成元年度

9）YoungWS and Kuhar MJ：Anew method

研究報告書，1990，p136．

forreceptorautoradiography：〔3H〕opioid
receptorsinratbrain．BrainResearch179：11）TakagiA，KojimaS，etal：Increasedleakage
of calcium（Ca）ion from sarcoplasmic

255，1979．

reticulum（SR）ofmdxmouse．J NeuroISci10）吉岡利息，田中みどりほか：mdxマウス下肢骨格筋のSR−T membrane system及びdipe−98（Suppl）：408，1990．

ptides含有量． 厚生省「精神・神経疾患研究委−50−

ⅠⅠ．筋ジストロフィー（2）6）ジストロフィン・テストによる脂帯型
筋ジストロフィーの再検討
荒
研究協力者

緒
ジスト

ロフィ

畑

喜

一＊

有 川 恵 理＊石 浦 章 一＊階 堂 三砂子＊埜 中 征 哉＊

言
ン遺伝子のクローニング（Monaco，Kunkelら：1985），全cDNA塩基配列の決定とジストロフィ

ン分子モデルの発表（Koenig，Kunkelら：1987），さらにジストロフィンの発見（Hoffman，Kunkelら：1987）とジスト
ロフィンの筋組織における局在様式（Sugita，Arahataら：1988）が相次いで報告されたのは
我々の記憶に新しい．これらを筋ジストロフィー
研究の新たな幕開けととらえるならば，今や我々はジストロフィン研究の第二段階に入った．
ジストロフィンが正常筋でいかなる生理・解剖学的役割を担っているかなお不明の部分がおおく，
これを解明して行くには様々な手だてが必要であろうが，大別すれば基礎医学的研究（分子遺伝学，細胞生物学，生化学等）と臨床医学的研究（臨床
遺伝学，診断学，治療学等）に分けられよう．そして今回我々は，特にジストロフィン・テストの臨床医学的側面に的を絞り，（ヨジストロフィンの免疫組織化学，②ジストロフィンのイムノブロッ
ト，③ジストロフィン遺伝子のmultiplexPCR解析を通して，いわゆる肢帯型筋ジストロフィーの再検討を試みたので報告する（図1，2，3）．
目

的肢帯型筋ジストロフィー（LGD）は決して単一の疾患ではないが，一般に腰帯・肩甲帯・四肢近位筋部分に筋萎縮の分布を認める常染色体劣性遺＊国立棉神・神経センター神経研究所−53−

図1 ジストロフィンの免疫組織化学．
ジストロフィン遺伝子に異常の認められない肢帯型筋ジストロフィー（A：常染色体劣性）ではジストロフィンは筋形質膜部分に明瞭に染色されるが，一方ジストロフィン遺伝子の欠矢と分子量に異常を認めた症
例では不均一な染色が見られ，ベッカー型
筋ジストロフィーである可能性が示された．
抗ジストロフィン抗体はモノクローナル4−4C5（C末端）を使用．（×200）

DystrophinGeneA規IysiSUsi濃gM扇tiplexpCR
Exon

坤血

1

℡

念

尋

g

▲T3

相即

2人

71謂

2−▲

舵引

111

治ほ

Multiplex PCR法によるDMD／BMDのジストロフィン遺伝子解析．
Lanelは正常コントロール：lane2はDMD（エクソン52に欠夫を見る），lanes
3，4はBMD（それぞれエクソン3−13，47に欠夫を見る）．DNA試料は生検筋より直接フェノール／クロロフォルム抽出，エタ
ノール沈澱法にて得た．Gene amp kitを用い，genOmicDNA250ng，Taqpolymer−
ase5units，各プライマーを0．5JLlずつ使用しDDWにて50JLlとした．Thermal
Cyclerは94cc，7分（変性），のあと25サイ
クルの940C，30秒：550C，30秒（プライマーの付加とアニーリング）；650C，4分（DNAポリメラーゼによる伸長）を実施した．
PCR productsは1．4％アグロースゲルに20〆ずつ乗せた．
結伝もしくは孤発例の筋ジストロフィーを示す．こ

毘−筋を示し，いづれも400kdのジストロフィン・バンドを認める．Lanes2，4，6はBMDで，ジストロフィン（矢印）は分子量（＜4000r＞400kd），蛋白量（減少）とも異常を見る．
Lanes8，10はDMDで，ジストロフィンは検出されない．MHCは筋タンパクの指標として用いたミオシン重鎖を示す．骨格筋の試料はクリオスタット切片（1叫）を20枚使用した．

二

Lanesl，3，5，7，9，11は正常対照

二イムノブロット法によるDMD／BMDのジ
ストロフィン解析．

二

図2●●●ヽ■●●●●●●■■

二

60㍑

MHC

二

紬136沼

図3

二

3
43

瀬

一 一 一 二PrOmOl亡r
lhs亡】t果のため，Becker型筋ジストロフィー（BMD），

LGDと臨床診断されていた41例中34例ではジ

DMD保因者等との鑑別診断が困難な症例も存在

ストロフィンは正常に発現していた．ところが5するはずである．我々は，臨床的にLGDと診断さ例（全体の12％，孤発例男性に限れば31％）におれた症例について上記した各種のジストロフィ

いては，BMDの場合に報告されているようなジ
ストロフィンの異常発現を確認した．即ちジスト

ン・テストを実施してみた．

ロフィン分子量とタンパク量の減少および筋形質

対象と方法

膜の異常な免疫染色パターン（全体的な淡染性な

対象は過去12年間にLGDと臨床診断された41

いしは部分的欠損等によるheterogeneousな染症例（3048例の生検筋リストより抽出）である．

色）とともにDMD遺伝子の欠矢が認められた．

これらの生検骨格筋についてジストロフィン・テ

従ってこれらの5症例は当面BMDと見なすこと

スト（免疫組織化学法，イムノブロット法，multi−が妥当であるものと考えられた．また女性の2症

plex PCR法）を実施した．

例（孤発例女性の13％）において免疫組織化学的
モザイシズムが確認され，これらはmanifested
DMD carrierと見なされた．
−54−

考

察

ン遺伝子の欠矢をみいだすことが出来る．

最近ジストロフィンの欠陥によって生ずる臨床

ジストロフィン・テストを実施しない場合，いわゆるLGDと臨床診断されている症例の中にはかなりの程度にBMD孤発例，DMD保因者孤発例が含まれているものと推察された．かかる症例については，適切な遺伝相談の資料としてジスト
ロフィン・テストが不可欠である．また今後これらの症例については更にその臨床的側面についても掘り下げて検討を加えて行く必要があるものと思われた．臨床症状を何等示さ ない（asymptomatic）保因者でしかも血清CK値が正常の症例では，モザイクパターンをとらず正常の像の多様性がいくつか報告されている．おなじジストロフィン遺伝子に欠陥を持っていても，実際の臨床像は様々であり（DMDとBMDの差異は既に述べたとおりであるが1）このほかにも高CK血症と筋のCrampを見るⅩ−1inked myalgia家系の存在や，大腿四頭筋ミオパテ一等の報告もある．また一方のみが臨床症状を呈した一卵性双生児の姉妹例（skewedinactivationの存在を示唆する）も知られている．あるいはジストロフィンに46％の巨大欠損が存在しても臨床的にはmildなBMDに止どまる家系も報告されているし，BMD
兄弟例で臨床的経過が大きく異なる症例等も存在する．
現在われわれの研究室では，ルーチンの組織化
学用凍結切片20枚からジストロフィンのイムノプ
ロットを実施している．前述した免疫組織化学法
はある意味では主観的な検査法であるので，これ免疫染色をみるとの報告もあり，免疫組織化学法
での保因者診断には限界がある．ジストロフィンのCDNAプローブとDNA多形解析，さらには組織培養法によるDMDの保因者診断はDMDの遺伝相談に重要な資料を提供するわけで，免疫組織
化学的診断法，イムノブロット法と並んで重要であることは言うまでもない．

を補完する意味からも並行してジストロフィンのイムノブロット・テストを実施することは必要である．
さらにより信頼度の高い結果を得るために，

文
献1）ArahataK，HoffmanEP，KunkelLM，etal：
Dystrophindiagnosis＝Comparisonofdystro−

我々の研究室では，筋生検材料の一部から直接

phin abnormalities byimmunofluorescence

DNAを抽出してmultiplex PCR解析法による

andimmunoblot analyses．Proc NatlAcad

遺伝子診断を並行して実施している．とくに，ChamberlainとBeggsにより調製されたmulti−

SciUSA86：7154L7158，1989．
2）Arikawa E，HoffmanEP，Kaido M，etal：

plexプライマーによるPCR法を用いれば，サザThefrequencyofpatientshavingdystrophin

ンプロットで兄いだされる遺伝子欠夫の98％が発

abnormalitiesinalimb−girdlepatientpopula−

見出来るので臨床診断的価値は高い．いずれにしtion，Neurology（In Press）てもDMD／BMD患者の50〜70％にジストロフイ−55−7）Dystrophin：ヒト臓器分布並びにBecker型
筋ジストロフィーにおける発現様式について

研究協力者

三

内

野

池

輝

誠＊

久■■

は じめに
骨格筋及び心筋におけるdystrophin（ d ）の発現状況については，疾病の場合を含め，詳細に検討されているが，筋以外のヒト臓器における dの発現状況は今日なお不明である．そこで今回ヒト臓器における d の分布，特に脳における発現様式を明らかにするため，健常者及びDuchen−
ne型筋ジストロフィー（DMD）患者の剖検臓器を用いて，抗 d 抗体による検索を行った．また昨年にひき続きBecker型筋ジストロフィー（BMD）における d の発現様式についても検討したので，それらの結果について報告する．
対象と方法
対象は神経筋疾患以外で死亡した正常対照剖検
例2例，筋緊張性ジストロフィー1例，並びにDMDl例で，骨格筋，心筋，胃，膀胱，腎臓，
肺，脳などの各臓器について，4種類の抗 d抗体（ハーバード大学小児科のDr．耳．P．Hoffman
より供与された60kd，30kd抗体，及び神経センター杉田先生より供与されたペプチドⅠⅠ，ペプチドIV）を用いて，Westernblotting及び免疫組織化
学染色（ABC法，螢光抗体法）による検索を行った．
また，BMD9例の生検筋についても同様の検索を行った．

＊国立療養所再審荘病院神経内科＊＊熊本大学医学部発達小児科＊＊＊熊本大学医学部第一内科

荒

木

淑

郎…

結

果

I Dystrophinのヒト臓器分布1）Western b10tting
ペプチドⅠⅤ（ d のC末端抗体）を用いた正常対照剖検例のWestern blottingにおいて，骨格筋，心筋ではほぼ同じ程度の明瞭な d の発現がみられ，大脳（前頭葉皮質，頭頂薬皮質），胃においても，微量ながら明らかな d bandの発現がみられた．膀胱でも痕跡的な d bandの発現を認めたが，肺や腎臓では明らかではなかった（図1）．60kd抗体及び30kd抗体でもほぼ同様の結果であった．ペプチドⅠⅠは抗体価が低く，通常の1000
倍稀釈による検索では検出困雉であった．
筋緊張性ジストロフィー例は骨格筋，心筋，及び大脳において d の発現がみられ，■正常対照とほぼ同様の結果が得られたが，胃・膀胱などの平滑筋臓器における d bandの発現は明らかではなかった．
DMDでは死後1時間前後で剖検が実施されたが，骨格筋，心筋，大脳，膀胱など検索した全臓器で d の発現はみられなかった（図2）．抗体による差もみられなかった．
2）免疫組織化学染色
正常対照剖検例の骨格筋では死後4時間程度経過して，一部の筋線経で融解像がみられたが，大半の筋線経では筋表面膜に全周性に抗 d 抗体の局在がみられた．心筋では筋線経の中心部にリボクステンの沈着が目立ち，螢光抗体法では黄色に光ってみえたが， d は筋線維表面陵に全周性に局在していた．胃，膀胱，肺，腎臓などにおいても平滑筋線経の筋表面に抗 d 抗体の局在が−56−

lmmullO b10t an的S】S Of帽nOUS human t侍SUe SPeこIne喝

図1 正常対照剖検例（74歳）各臓器のWestern

図2

blotting

DMD剖検例（26歳）各臓器のWestern
blottingl（C）：正常対照の骨格筋をWesternblot・ting後アミドブラック染色したマーカー，
2，3（M）：骨格筋，4（BrF）：大脳（前頭葉），5（BrP）：大脳（頭頂葉），6（St）：
胃，7（K）：腎臓，8（Bl）：膀胱，9（L）：
肺，10，11（H）：心筋l，2（C）：正常対照骨格筋，3（M）：DMD
骨格筋，4，5（Br）：BMD大脳，6，7（Bl）：DMD膀胱，8，9（H）：DMD心筋，10（cH）：正常対照心筋認められた．大脳については螢光抗体法ではリボ
フスナンの沈着が著明で，正確な抗体の局在は不明瞭であった．そのためABC法による検索を行ったが，60kd抗体による検索ではneuronの胞体が褐色に染色され，C末端抗体による染色ではneuronは染色されず，glia特にastrogliaの胞体及び神経突起が染色された．
筋緊張性ジストロフィーにおいても正常対照例とほぼ同様の結果が得られた．
一方，DMDにおいては，骨格筋，心筋，勝胱などにおいて d の局在はみられず，大脳でも明らかな d の局在を認めなかった．
正常マウス脳における検索でも，60kd抗体では
neuronの胞体特に表面膜が浪染し，C末端抗体ではgliaが染色された．小脳においても60kd抗体
及び30kd抗体ではプルキンエ細胞の胞体が染色され，C末端抗体ではgliaが染色された．
Preliminary studyとして，マウス骨格筋に対して，C末端抗体を用いてゴールド標識免疫電顕による検索を行ったが，筋表面のcaveolaの中にはゴールドの沈着はみられず，主に形質膜の直上にゴールドの沈着がみられたが，凍結超薄切片のような鮮明な像は得られないため，形質膜との位置関係が不明瞭であった．
II BMDにおけるdystrophinの発現様式について9例のBMD生検筋で検討したが，60kd抗体及び30kd抗体によるWbstemblottingでは，DMDと同様に d の発現がみられないもの，正常の427kdとは異なる分子量を有するもの，及び正常
分子量で含量が減少したものの3つのタイプがみられた．
C末端抗体によるWbsternblottingでは60kd
抗体では d bandの発現を認めなかったBMD
例で，痕跡的ながら，正常分子量の位置にbandの発現がみられた．また60kd抗体では異常分子量を−57−

n、∵1．「二二〇●‥】・、；ミ．、）．●⊃∵二・S＼●⊃∴・、、

COntm muSCieいD・Ⅳ盲
1

2

3

4

5

6

7

おり，DMDで高率にみられるIQ異常との関連も考えられた．
興味深いのは抗体による脳組織での認識細胞種

8の違いで，60kd抗体ではneuronが染色されるの0， 轡nに対して，C末端抗体ではgliaが染色された．こd、．・ゝtrOPl＝∩のことは培養系で証明されているneuronとglia
での d 産生の違い3）や，約75個の d ェクソ
ンのalternativesplicingにより，C末端領域の一次構造が異なる複数の d isoformの存在が推定されている4）点とも関連し，neurOnとgliaでは質的に異なった d を塵生している可能性が示唆された．
BMD生検筋を用いたWesternblottingで60kd
抗体では dnbandの発現を認めず，C末端抗体
では正常位置に痕跡的なbandの発現がみられた点に関しては，抗体による検出感度の違いによるのか，■■d 以外の蛋白とのCrOSSreaCtionなのか
C DMD

図3

8MD・C

8MD二

C

今後検討が必要と思われた．今回検索した9例のBMD中5例は正常分子量で含量が減少した例であり，いわゆるframe−Shift仮説での説明が困難であるが，原因としては1）遺伝子の欠矢が短か

眺股上竃Duchenne型（DMD）．Becker 型（BMDl，2，3）及び正常対照（C）の生検筋のC末端抗体によるWestern blotting示した例では，異常分子量のmainbandの他に正常分子量の位置にもう一本の薄いbandが認められた（図3）．DMDではC末端抗体でも明らかな
d bandの発現は認めなかった．

く，Ⅵ屯stemblottingではとらえられない，2）
pointmutation，3）promoter領域の異常，4）
その他が考えられる．BMDの重症度と d の含量は密接に関連するので，今後 d の産生機構についての検討を多面的に推進していくことが重要と考えられた．

免疫組織化学染色では大半の症例は筋表面膜がpatchyに染色されたが，一部仝周性に染色される症例もみられた．
考d

察のmRNAは骨格筋，心筋のみならず，微量ながら胃や腸などの平滑筋組織，さらに脳組織にも含まれることが知られている1）2）が，今回の4種の抗d抗体を用いたWbsternblottingでは正常対照例及び筋緊張性ジストロフィー例において，骨格筋や心筋のみならず，痕跡的ながら平滑筋臓器（胃，勝胱），さらに脳においても d が発現しているのが認められた．一方DMDでは骨格筋，心筋のみならず，脳でも

d

を欠如して

要約と結論
1）ヒト臓器における d の発現様式を明らかにするため，抗 d 抗体を用いて，Western
blotting及び免疫組織化学染色による検索を行った．
2）Western blottingによる分析で， d は正常対照及び筋緊張ジストロフィー例の骨格筋，心筋のみならず，胃，膀胱などの平滑筋臓器，さらに脳においても発現が認められた．DMDでは全臓器で d の発現はみられなかった．
3）免疫組織化学染色では dMは正常対照及び筋緊張性ジストロフィー例の骨格筋，心筋，平滑筋線経の表面膜に局在し，脳においては60kd抗−58−

体ではneuronの胞体，C末端抗体ではgliaが染色され，抗体により認識細胞種に違いがみられた．
DMDでは全臓器で d の発現はみられず，IQ異常との関連も考えられた．
4）BMDでは正常の427kdより低分子化した文

献1）ChellyJ，KaplanJC，MaireP，GautronSand
Kahn A：Transcription of the dystrophin
genein human muscle and non−muSCle
tissues．Nature333：858−860，1988．

d を有する例の他， d を欠如する例，及び正常分子量で含量が減少する例がみられた．免疫染色では筋表面膜がpatchyに染色される例が大半を占めたが，一部に全周性に染色される例もみられた．
5）いわゆるframe−Shift仮説だけでは説明困

2）NudelU・RobzykKandYaffeD：Expres−

難なBMDが少なからず存在する可能性があり，d の産生機構について，今後多面的検討が必要である．

KahnAandBerwald−NetterY：Pystrophin

Sion of the putative Duchenne muscular
dystrophy geneindifferentiated myogenic
Cellculturesandinthebrain．Nature331：635−638，1988．

3）ChellyJ，HamardG，KoulakoffA，KaplanJC，genetranscribedfromdifferentpromotersin
neuronalandglialcells．Nature344：64−65，
1990．

4）Feener CA，Koenig M and Kunkel LM：
Alternative splicing of human dystrophin
mRNA generatesisoforms at the carboxy
terminus．Nature338：509−511，1989．

−59−8）各種筋ジストロフィーにおける抗ジストロフィン
抗体による免疫組織化学的検討

γ
．
⁚
佐

●

＊

＊

対象とした症例の臨床診断は，Duchenne型筋
ジストロフィー（DMD）14例，家族歴のあるBeck−
er型筋ジストロフィー（BMD）2例，肢帯型筋ジストロフィー（L−G）あるいは孤発例のBMDの可能性のあるもの49例，先天性筋ジストロフィー

扶啓●

対象及び方法杵原●

各種筋ジストロフィーを含む神経筋疾患におけるジストロフィン発現異常の有無を免疫組織化学的に検討し，臨床診断と，ジストロフィン染色を加味した最終診断を比較検討した．

日 中

法良智

正公

川村永

中有竹

納 肘尉〃

逸秀雅

口 永原

樋福未

研究協力者

た．
結

果

表1にジストロフィン染色にてDMDと診断した症例を示した．年齢は筋生検施行時のものである．Aが高頻度で平均97％であった．すべての筋
線経がまったく染色されない症例は3例のみで他の11例は一部の筋線経が多少とも染色された．正常の染色性を示した筋線経の頻度は症例8の5％が最高であった．症例13と14の2例が臨床的には
CMDと診断されていた症例である．症例13を簡（CMD）12例，女性保因者5例，その他の神経筋疾
患68例の計150例である．
抗ジストロフィンモノクローナル抗体は，味の素株式会社及び富士レビオ株式会社から供与されたものを使用しABC法にて免疫組織化学的染色を行った．ジストロフィン染色との比較のため，
抗スペクトリンポリクローナル抗体を用いて同様の染色を行った．各症例200本以上の筋線経につい単に呈示する．症例；Y．N．3ヵ月，男．主訴：四肢筋力低下．現病歴；出生時体重2500g．羊水混濁あり．泣き声は弱く，四肢筋緊張低下あり．生後の運動発達不良．現症；四肢筋緊張低下，筋萎縮あり．顔面筋力低下，限瞼下垂あり．検査所見；
血清CK：540（正常26−200）．筋生検所見；筋線経の大小不同があり変性線経が散在し結合織の軽て，ジストロフィンの染色性をAbsent（A），Faint（F），Patchy（P）及びNormal（N）に分類し各々の頻度を求めた．填死線経など変性の強い筋線経は除外した．染色性の低下が軽度で正常との鑑別が難しい筋線経はすべてNに含めた．尚，今回の分類ではFかつPの場合はFに含め，正常に近い濃度で不連続に染まっているもののみをPに分類し

表1 ジストロフィン染色にてDMDと診断した
症例＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊国立療養所南九州病院＊＊＊国立療養所沖縄病院

症例

ll
ll

−60−

年お

】■〇m．
i

daJ

臨床診断

Cllp
CllD

最終診断

A F P N

度増加がみられた．スペクトリン染色では正常に

三二■塁＋−二二表2ジストロフィン染色にてBMDと診断した
症例

染色されたが，ジストロフィン染色では99％の筋線経が欠損を示した（図1）．

症例
1

2

3

4

臨床診断
8ぶD BhD

50

8kD B

4

最終診断
6D

D

8

日O B約

2

i DHD B撼D D

22

A F P N

39．5

0．5

0

35

0

59

41

17
0

40
78

0
8
0
▲
U
O
▲
U

痩町︑品

汐∵輪湖巧打．a3

年齢
24

2g P（】lypyOSitis

餉D

次に，ジストロフィン染色にてBMDと診断した症例を表2に示した．欠損線経の頻度は0〜81％と症例により大きく異なり，Fの筋線経は平均42％と高頻度であった．症例3と4が臨床的には
DMDと診断されていた症例である．2例ともA￡＼二言で︑﹂

・
・
一
㌦
／
︵
︑

予言 ㍉b ∴︑′甘イJJF．．︶′

は少く，FあるいはPが認められた．症例9は欠損線経が81％と最も高頻度にもかかわらず骨格筋障害は比較的軽度で，心不全を主症状とした症例である．また症例13は臨床的には多発性筋炎が疑われた症例である．症例3，9及び13を簡単に呈図1臨床的にCMDと診断され，ジストロフィン染色にてDMDと診断された症例の生検
筋a：HE染色 ×250
b：ジストロフィン染色 ×250
C：スペクトリン染色 ×250

示する．症例3ほ，おじが16歳時にDMDで死亡しており本患児も10歳で歩行不能となっており，
臨床的にはDMDと診断されている．しかし，ジストロフィン染色ではFとPの染色性を示す典型
的なBMDのパターンを呈していた．症例9は22
歳男性で主訴は呼吸困難である．血清CKの上昇もあり近医で一時心筋梗塞も疑われているが，当大学で拡張型心筋症と診断された．四肢近位筋の軽度筋力低下，筋萎縮があり下腿筋の軽度の仮性肥大が認められた．スペクトリンの染色は正常であったが，ジストロフィン染色ではAが81％，Fが15％と著明な低下を示した（図2）．症例13は臨床的に多発性筋炎が疑われた29歳男性で，主訴は大腿部痛である．家族歴は特記すべきことなく，
今年の1月運動後に大腿部痛が出現するまで異常を自覚していなかった．四肢の軽度の筋力低下と大腿部の庄痛を認めたが，筋萎縮や仮性肥大は明らかではなかった．血清CKが1170（正常＜55）と高度上昇しており，抗核抗体陽性で筋電図でも

−61−

臨床診断

ジストロフ ィ ン染色を加味した最終診断

C M D

12

D Ml）

14

B M D
L

−

その他

2
G or B M D

4

9

6

8

O

三笠喜…
≡表空三

C

M

D

4

D M D

3

B MI）

l L

−G

7

その他

図3 臨床診断とジストロフィン染色を加味した
最終診断の比較○で囲んだ数字は診断が変更あるいは新たに確定された症例数である．

は軽度で変性線経が散在し，部位によっては神経原性変化が混在していた．ジストロフィン染色では，組織学的に正常に近い筋線経にも明らかな欠損線経が認められ，Fの筋線経も含めると20％の筋線椎が異常を示した．これらのジストロフィン
欠損線経は，スペクトリン染色では正常であった．
女性保因者5例のジストロフィン染色の結果は，欠損線経が存在したのは36歳の症例で軽度の四肢筋力低下を呈した1例のみであった．他の3例のSymptOmatic carrierでは，Aの線経は認められ㌔頑

ずFの染色性を里するものが2−5％の頻度で認められた．無症候性のdefinitecarrierの1例においてほ，ほとんどの筋線経が正常に近い染色性を示した．また，欠損線経が存在した1例は4例のSymptOmatic carrierの中では臨床的には最も軽症であった．
図3は臨床診断とジストロフィン染色を加味した最終診断を比較したものである．CMD12例中2例がDMDの染色性を示し，DMD14例中2例がBMDの染色性を示した．その他の1例は臨床的に多発性筋炎と診断されBMDの染色性を示した症例である．L−G型と臨床的に鑑別が困難であっ

図2 臨床的に拡張型心筋症と診断され，骨格筋症状が軽度であったBMDの生検筋
a：HE染色 ×250
b：ジストロフィン染色 ×250
C：スペクトリン染色 ×250

たBMD8例の診断もジストロフィン染色により確定した．

Shortduration，lowamplitudeMUP，fibrillation

考察
福山型先天性筋ジストロフィーの症例の中にが認められ筋炎が疑われている．各種鎮痛剤は無効でステロイド投与にて筋痛が改善し，血清CKも低下しつつある．筋生検所見は，炎症細胞浸潤

DMDと同様のジストロフィン欠損を呈する症例が存在することは，既にArahataら1）により報告−62−

されているが，我々の検討でもCMD12例中2例においてジストロフィンを全く欠損することが明らかとなった．CMDとDMDの合併，あるいはDMDと他の疾患の合併と考えるには頻度が高す
ぎるものと思われる．生下時より発症するDMD要があると思われる．また免疫組織化学的には正常との鑑別が困難な，BMDが存在する可能性もあり，現在ウエスタンプロットにて検索中である．
さらに今後，分子遺伝学的検討も行い，より完全な診断を目指したいと思う．

が存在する可能性があるものと考えられる．
DMD14例の中でBMDの染色性を里したものが2例存在したが，この2例はⅩ染色体性劣性遺伝の家族歴があり，4歳時に筋生検を施行してからそれぞれ9歳及び12歳まで経過観察中であるが臨床的にはDMDに分類される症例である．BMD

2）臨床的にDMDと診断された14例中2例がジと診断を確定するには，より長期の経過観察と，ウエスタンプロット及び分子遺伝学的検討が必要

3）臨床的にCMDと診断された12例中2例が，であるが，この2症例はジストロフィンが比較的保たれているにもかかわらず重症であるという点で，これまで報告がなく極めて注目される症例で
ある．

結

語

1）ジストロフィン染色を行った150例中13例（9％）において最終診断が変更あるいは新たに確定された．
ストロフィン染色ではBMDに分類された．
DMDと同様のジストロフィン欠損を示した．
4）BMDの中には，拡張型心筋症を主体とするものや多発性筋炎類似の症状で発症する非定型的なものが存在した．

また，心不全症状を呈し拡張型心筋症と診断され，骨格筋の障害が軽度であったBMDの1例で欠損線経が81％に達したことも，臨床症状とジス
トロフィン量が必ずしも相関しないという点で注目される．
臨床的に非定型的なBMDとして報告されてい

5）BMDにおいては，ジストロフィン欠損線経るものとして，myalgiaやcrampを主徴とする症例2）やミオグロビン尿症を呈するが筋力低下のみ

Dystrophindiagnosis：Comparisonofdystro・られない症例3）などが報告されている．我々の多発性筋炎様の症状を呈した1例も今後詳細に検討する必要があると思われる．BMDは，ジストロフ

andimmunoblot analyses．Proc Natl Acadの頻度と臨床的な骨格筋障害の重症度とは明らかな相関は認められなかった．
文献1）ArahataK，HoffmanEP，KunkelLM，etal：
phin abnormalities byimmunofluorescence
Sci USA86：7154−7158，1989．
2）GospeJr SM，Lazaro RP，Lava NS，etal：

ィンの発現量においても臨床病型においても多型性があり，診断及び予後判定の際注意する必要がある．

Familial X−1inked myalgia and cramps：A

今回の我々の検討は，ジストロフィンのC末端に対するモノクローナル抗体のみによる検討であるが，今後ジストロフィンの他の部位に対する抗体を用いた検討を行い，今回の結果と比較する必

39：1277−1280，1989．

nonprogressivemyopathyassociatedwitha
deletioninthe dystrophic gene．Neurology3）Fischbeck KH，KamhoIzJ，Shi YJ，et al：−63−

Ⅹ−1inkedmyoglobinuria．（Abstract）Neur0−
logy38（Suppll）：174，1988．

9）先天性筋緊張性ジストロフィーにおけるジストロフィン発現様式の免疫学的解析
清 水 輝 夫＊

研究協力者

砂 田
高

芳

年

は じめに
先天性筋緊張性ジストロフィーは子宮内発症を特徴とする筋緊張性ジストロフィーで通常筋緊張性ジストロフィーの母親から生まれるこどもにみられる．臨床的には生下時よりfloppyinfantで精神運動発達遅滞を呈し，病理学的には筋線経の未熟性を示すことからmuscle maturationに異常があると考えられている．筋細胞の発生・分化過程におけるジストロフィンの発現調節機構を明らかにすることは，その生理機能を知る上でも重要であると考え先天性筋緊張性ジストロフィーにおけるジストロフィン発現様式を免疫組織化学とウ
エスタンプロットにより検討した．
対象と方法

秀■

戸

田

達

史書

徹■

埜

中

征

哉＝

齢：14歳〜63歳，男7例，女9例）2例の多発筋炎（年齢：38歳，56歳，女）の生検筋について検討した．なお先天性筋緊張性ジストロフィーの診断根拠としては，（1）筋病理像が壊死・再生所見に乏しく，筋肉の未熟性（小円形線維・中心核線維・
タイ702C線経の増加，タイプ2B線維欠損などのタイプ分化不良）を呈すること（2）母親に筋緊張性ジストロフィーの病歴があることを重視した．
抗ジストロフィン抗体：本研究では3種類の抗ジストロフィン抗体を使用した．AICは我々の研究室で作成した単クローン抗体でN米側のアクチン結合ドメイン（アミノ酸215−264）を認識し，PO4eは三重らせん構造部分（アミノ酸440−489）を認識する抗血清（国立神経センター小沢先生よ

生後40日〜18鼠男5例，女3例，表）および疾り提供），NCL−DYS2（NewCastleLaboratory
社）はC末端の17個のアミノ酸を認識する単クローン抗体である．

患対照として16例の筋緊張性ジストロフィー（年

免疫組織化学：採取後一800Cにて凍結保有し表 Clinicaldataof8patientswithcongenital
MyD

た生検筋ブロックより8JJmの凍結切片を作製し，50％正常羊血清で30分間ブロッキングした後，
AIC，NCL−DYS2は室温で1時間，PO4eは370C
でovernight反応させた．反応終了後PBSで洗浄

8例の先天性筋緊張性ジストロフィー（年齢：＃Case Age Sex Affected Biopsiedsite
mother

1
2
3
4

40d F
3m F
10m M
18m F

5
6
7
8

4y M
5y M
11y M
18y M

＋

lt・quad．kmods＋

rLquad．femoris＋

lt．bicepsbrachii＋

lLbicepsbrachii＋？

1（．quad．femoriS
1Labd．hallucis＋

lt．ext．hal．brevis＋

1t．bicepsbrachii＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

し，FITC標識二次抗体を室温で30分反応させた．
電気泳動およびWestern Blot：−800Cにて凍結保有された生検筋ブロックの一部を蛋白溶解液（0．24M Tris／HCl pH6．7，10％SDS，10％ 2−
mercaptoethanol，3．4mMEDTA）でhomogen−izeL，直ちに3分間煮沸した後13，000xgで20分
間遠沈しその上清をRoss＆Schatzの方法で蛋白定量した．蛋白量100JJg相当の試料をDoucet−64−いて電気泳動した．電気泳動終了後，Kyhse−Anー

インが全周性に良好に発現している筋線経もみられるものの，細胞膜上のジストロフィンの発現がdersen（1984）の方法により蛋白をPVDF膜に転

部分的・不連続であったり全くジストロフィンが写し，杭ジストロフィン抗体PO4e，NCLDYS2と反応させABC法を用いて発色させた．

発現していない筋線経が観察された．これらジス＆Trifaro（1988）の方法により8％のゲルを用

トロフィンの発現が不良であった3症例は生後10ヶ月以下の症例であり生後18ヶ月以降の5症例

結（case4−8）では形質膜上に正常なジストロフィ

果

免疫組織化学：3種類の抗ジストロフィン抗体

ン染色パターンが観察された（図1D）．ジストロフ

はいずれも疾患対照とした筋緊張性ジストロフィィンの発現が不良であった3例について連続切片

ーおよび多発筋炎の患者の骨格筋細胞膜を全周に上でスペクトリンの免疫組織化学を行ったところ，

わたって均一に染色した．ところが先天性筋緊張

ジストロフィンの染色が不良であった筋線経も含性ジストロフィー8例中3症例（casel．2，3）ではめて全ての骨格筋細胞膜上に全周性・均一にスペ3種類全ての抗体についてジストロフィンの染色

クトリンが染色された（図2）．

が不良であった（図1A，B，C）．すなわちジストロ7WesternB10t：対照とした多発筋炎および筋緊

図1抗ジストロフィン抗体PO4eによる先天性筋緊張性ジストロフィー骨格筋の免疫組織化学
A：casel（生後40日），B：case2（生後3ヶ月），C：case3（生後10ヶ月），D：case4（生後18ヶ月）−65−

図2

先天性筋緊張性ジストロフィー骨格筋（case3）のA：ジストロフィンの免疫組
織化学 B：スペクトリンの免疫組織化学

図4

NCLDYS2によるウエスタンプロット
lanel：COntrOl，lane2−4：CaSeト3，
lane5：CaSe6，1ane6：COntrOl十CaSe3

生後18ヶ月以降の5例では対照とほぼ同量のジス
トロフィンbandがみられ（図31ane6LlO，図41ane5），正常量のジストロフィンが発現して図3いることが示唆された．またジストロフィンの発PO4eによるウエスタンプロット
Ianel，2：COntrOl，lane3−5：CaSeト3，

現量が少なかったcase3の試料を多発筋炎の試

1ane6rlO：case4−8

料と混和し同一レーンで電気泳動してブロッティ
ングしたところ400kDaの単一bandだけが検出

張性ジストロフィーではPO4e，NCL−DYS2の2され，分子量の異なったジストロフィンisoform

種類の抗体により明瞭な400kDaのジストロフィは検出されなかった（図41ane6）．

ンbandが検出される（図31anel，2，図41anel）．先天性筋緊張性ジストロフィーの生後40日の

考察

CaSelおよび生後3ヶ月のcase2はPO4eでほ最近骨格筋の発生過程におけるジストロフィン

とんどbandは検出されず（図31ane3，4），発現様式が経時的に検討されている．Hagiwara

NCL−DYS2で薄いbandが検出された（図41ane2，3）．生後10ヶ月のCaSe3ではこれより若干ら1）はラット骨格筋細胞においてジストロフィンのdevelopmental expressionを免疫組織化学お明瞭なジストロフィン染色が不良であった生後10よびウエスタンプロットにより検討し，胎生15日

ケ月以下のCaSel，2，3では対顔に比べてジスよりprimary myotube上にジストロフィンの発トロフィン発現量が明らかに低下していた．他九現が始まり生後5日にはprimaryおよびsecon−−66一dary myOtubeの形質膜上へのジストロフィンのジストロフィンの生理機能は十分解明されてい発現が完成することを報告している．またヒトの胎児筋におけるジストロフィン発現も検討されてないが形質膜の裏打ち構造を支える細胞骨格蛋白であると推定されている．このことからDMDにおりStrongら2）は胎生8週ですでにジストロフ

おいてはジストロフィン欠損により細胞膜が脆弱

ィンが検出されると報告している．一方Prelleら3）は免疫組織化学上は胎生9週ではジストロフ

化し細胞膜の破壊やCaイオンの透過性の増大がィンが検出されず胎生11週頃から細胞質および形
質膜上に発現し始め22週には成人と同程度に形質いる．ところが先天性筋緊張性ジストロフィーではジストロフィンの発現が不良であった症例にお股上に発現していると報告している．我々も17週

いても筋線経の壊死所見を欠いており，臨床症状と35週の胎児筋におけるジストロフィン発現をがまだみられない同時期のDMDでは既に筋に

AICによる免疫組織化学で検討し，35週ではほとdystrophicな変化がみられることと極めて対照

んどの筋線経の形質膜上にジストロフィンが均一に発現していることを確認している4）．すなわち的である．このことは膜におけるジストロフィンの欠損が直接細胞膜の破壊につながるわけではな

もたらされ，最終的に筋崩壊に至ると考えられてヒトでは生下時には既に筋形質膜上のジストロフ

いことを示唆していると思われる．従ってDMD

ィン発現を完成しているわけだが本研究で生後10発症にはジストロフィン欠損以外にも何かの要因が関与していると思われる．

ヶ月までの先天性筋緊張性ジストロフィーにおいてはジストロフィンの発現が不良であることが蛋
白レベルで明らかにされた．連続切片上でのジス

文

献トロフィンとスペクトリンの免疫染色で，ジスト

1）Hagiwara Y，Yoshida M，NonakaI andロフィンがnegativeな筋線経においてもスペク
トリンは正常に発現していることからジストロフ

Ozawa E：Developmental expression ofdystrophin on the plasma membrane of rat

ィンの発現が悪いのは壊死に伴う二次的な現象と

musclecells．Protoplasma151：11−18，1989．

は考えられない．また18カ月以降の症例ではジス2）StrongPN，ClerkA，SherrattTGandSewry

トロフィンが正常に発現してくることからもこれ

CA：Dystrophinexpressioninfoetusesatrisk

はジストロフィンの発現遅延によると考えられ，

forDMDandBMD．JNeuroISci98（supple）：

本症におけるmuscle maturationの異常を支持

231a，1990．

する所見といえる．息児骨格筋になぜ成熟障害が3）PrelleA，ChianeseL，GallantiA，MoggioM，生じるのかその理由は明らかにされていない．ジ

Scarpini E，Bonilla E and Scarlato G：

ストロフィンの発現調節には神経系の関与は少な

Appearanceandlocalizationofdystrophinin

いと考えられる事例があり，今回の我々のデータ

normalhumanfetalmuscle．J NeuroISci98

は先天性筋緊張性ジストロフィーにおける筋発生（supple）：229a，1990．

遅延は神経系以外の要因によることを示唆してい4）Shimizu T，Matsumura K，Hashimoto K，る．先天性筋緊張性ジストロフィーは筋緊張性ジストロフィーが母親から遺伝した場合に発症するMannen T，Ishiguro T，EguchiC，Nonaka
I，Yoshida M and Ozawa E：A monoclonal

ことが知られているので筋緊張性ジストロフィー

antibody against a synthetic polypeptideの母親の母胎環境の中に筋のmaturationを阻害

fragmentofdystrophin（aminoacidsequence

するような何等かの因子が存在する可能性が考え

fromposition215to264）．ProcJapanAcad

られる．

64B：205−208，1988．

−67−10）Becker型筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの動態
堀

研究協力者

眞一郎＊

清 水 輝 夫＝ 埜 中 征 哉日暮 田 通

は じめに

結

等書目■

果

Duchenne型筋ジストロフィーにおける異常遺10例のBMD患者について検索した．図1にそ伝子が単推され，それにコードされている蛋白質の代表例を示した．銀染色した二次元電気泳動図（ジストロフィン）が明らかになった．Becker型
筋ジストロフィーは，Duchenne型と類似の遺伝に矢印で示すように，BMD患者では，AIC抗体に対して反応する複数のスポットが観察された．32

子異常をもつが，臨床症状はDuchenne型に比し歳男性のBMD患者の上腕二頭筋では叙染色図に軽度である．ジストロフィンの免疫組級化学的検

矢印で示した2つの位置に一致するスポットに

索では，Duchenne型ではほとんどの例で完全欠AIC陽性が認められた．一つは正常ジストロフィ

損しているのに，Becker型では部分欠損の像をンよりやや分子量が小さくアルカリよりのもの，示す．ジストロフィンの分子量に関して，Becker

二つ日はミオシン重鎖よりやや分子量が大きく，型では正常に比べ，大小の多様性が指摘されてい正常ジストロフィンよりややアルカリよりのものる．
私達は，先に，ジストロフィンを二次元電気泳であった．7歳男性のBMD患者の上腕二頭筋では，銀染色図に矢印で示した3つの位置に一致す

動で単艶検出することに成功した1）．そこでBeck−

るスポットに認められた．一つは正常ジストロフ

er型筋ジストロフィー（以下，BMDと略す）のジ

ィンと同じ位置のもの，二つ日は正常ジストロフ

ストロフィンの多様性について，この二次元電気ィンより分子量が大きく酸性よりのも・の，三つ目泳動法で検討した．

は正常ジストロフィンとミオシン重鎖の中間の分子量で，やや酸性よりのものであった．23歳男性
方法

既に報告した1）ように，摘出した筋組織を8M
塩酸グアニジン含溶液で処理した後，0．15MKClのBMD患者の上腕二頭筋では，銀染色図に矢印で示した3つの位置に一致するスポットに認められた．正常ジストロフィンより分子量が大きく酸溶液に対し透析し，ミオシンの大部分を沈澱として取り除き，上清を，5M尿素溶解液に対して透析した後，二次元電気泳動法により分散した．分推
した蛋白質は銀染色で発色した後に観察した．ジ性よりのものについては先ほどの7歳男性のストロフィンはジストロフィンに対するモノクロ

れた．更に，8歳男性のBMD患者の上腕二頭筋ーン抗体AICを使って，Western Blottingによでは，銀染色図に矢印で示した5つの位置に一致り検出した．

するスポットに認められた．一つは正常ジストロ＊（財）東京都神経科学総合研究所分子研究系神経生化学＊＊東京大学医学部脳研究施設神経内科＊＊＊国立精神・手中経センター神経研究所＊＊＊＊東京都立神経病院

BMD患者と同じ位置に検出されたが，他の二つについては異なっており，C一蛋白質に近い位置に分子量のやや大きいものと小さいものが検出さフィンと同じ位置のもの，二つ日は正常ジストロフィンより分子量が大きく酸性よりのもの（7歳
男性および23歳男性に認められた位置と同じ），三
つ目は正常ジストロフィンとミオシン重鎖の中間
ー68−

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の分子量で，やや酸性よりのもの（7歳男性に認められた位置と同じ），四つ目と五つ目はC一蛋白質に近い位置に分子量のやや大きいものと小さいもの（23歳男性に認められた位置と同じ）の5カ
所に検出された．32歳男性の患者の弟もBMD患

兄弟に認められたミオシン重鎮よりやや分子量が者であるが，この患者の大腿四頭筋を検索したところ，兄と同様な2つの位置にAIC陽性スポットが検出された．また，図1の56歳女性例は，これらBMD患者の兄弟の母親で，BMDキャ））ヤーである．このキャリヤーの上腕二頭筋では，正常ジストロフィンと同じ位置と正常ジストロフィン

置に一致して抗ジストロフィン抗体AICに反応よりやや分子量が小さくアルカリよりの位置（このスポットはBMD兄弟に認められたのと同じ位として，正常ジストロフィンと同じ位置のもの

置）の2カ所に認められた．しかし，BMD患者の酸性よりのもの（No．2），正常ジストロフィンより大きく，正常ジストロフィンよりややアルカリよりのものは，キャリヤーには認められなかった．
76歳女性のParkinson病患者の前頸骨筋では，既に報告1）したように，銀染色図に矢印で示した位するスポットが，ただ一つ検出された．この位置は分子量約40万，等電点約5．5であった．以上10例のBMD患者と一例のBMDのキャリヤーについての検索では，図2に示すように，抗ジストロフィン・モノクローン抗体AICに反応するスポット（No．1），正常ジストロフィンより分子量が大きく−69−

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76

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図2

P O S itio nM ．
bic 岬 かaCh ii
M．
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b m on s

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3，
4

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1，
2．
4

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6．
7

1

1，
2，
4，
6，
7

1

3

やや分子量が小さくアルカリよりのもの（No．

53），正常ジストロフィンとミオシン重鎖の中間の10分子量で，やや酸性よりのもの（No．4），ミオシン
重鎖よりやや分子量が大きく，正常ジストロフィンよりややアルカリよりのもの（No．5），C一蛋白（No．3），ミオシン重鎖よりやや分子量が大きく，質に近い位置に分子量のやや大きいもの（No．6）

正常ジストロフィンよりややアルカリよりの位置と小さいもの（No．7）の7つの位置に検出され（No．5）の2カ所に検出されたのが，10例中7例

た．どのBMD患者においてもAICに反応するス

で，No．2，6及び7の3カ所，No．1，2及び4のポットは単一ではなく，2つから5つの組合せと3カ所，No．1，2，4，6及び7の5カ所に検出して，検出された．また，肢帯型筋ジストロフィされた例が，それぞれ1例であった．

ー4例，顔面・肩甲・上腕型筋ジストロフィー1

考例，福山型筋ジストロフィー1例について検索し察

ロフィー患者では正常ジストロフィンと同じ位置

最近，Angeliniら2）はduplicationによって，巨大なジストロフィンをもったBMD患者の例を報に単一スポットとして検出された．

告している．ここで観察したBMD患者でのジスたところ，表1に示すように，これらの筋ジスト

現頻度をまとめると（表2），正常ジストロフィン

トロフィンの多様性はジストロフィン遺伝子のterminalcodeにmutationが入って，蛋白質合成に比べやや分子量が小さくアルカリよりの位置に際して，ペプチドの延長あるいは短縮が起こっ

BMD患者でのAIC陽性スポットの位置の出−70−

たのか，frame shiftによるのか，またsplicing
siteの崩壊によるexonの組合せの変化によるの蛋白質に近い位置に分子量のやや大きいもの

か，またこの様な遺伝子そのものにおける多様性（No．6）と小さいもの（No．7）の7つの位置に検出によるのではなく，筋ジストロフィーに際して冗された．どの例も単一のスポットとしてではなく，フィンよりややアルカリよりのもの（No．5），C一進している蛋白分解酵素によるジストロフィンの2つから5つの組合せとして，検出され，No．3及

分解3）によっているのか今後の検討課題である．

び5の2カ所に検出されたのが，10例中7例で最も高い頻度であった．

ま

と

め

文

献

BMDのジストロフィンの多様性について，二次元電気泳動法で検討した．10例のBMD患者と

1）HoriS，etal：Detectionofdystrophinontwo−

一例のキャリヤーについて検索したところ，抗ジdimensional gel electrophoresis．Biochem

ストロフィン・モノクローン抗体AICに反応する

Biophys Res Comm161：726−731，1989．

スポットとして，正常ジストロフィンと同じ位置

2）AngeliniC，etal：Enormousdystrophininaのもの（No．1），正常ジストロフィンより分子量が大きく酸性よりのもの（No．2），正常ジストロフィ

patient with

Becker muscular dystrophy．

Neurology40：808−812，1990．

ンよりやや分子量が小さくアルカリよりのもの

3）MatsumuraK，etal：Invitrodegradationof（No．3），正常ジストロフィンとミオシン垂鎖の中

the Duchenne muscular dystrophy gene

間の分子量で，やや酸性よりのもの（No．4），ミオ

product（dystrophin）．BiomedReslO：325−

シン重鎖よりやや分子量が大きく，正常ジストロ

328，1989．

−71−ⅠⅠⅠ．筋ジストロフィー（3）11）福山型先天性筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの研究
荒 畑 喜 一＊研究協力者

有 川 恵 理＊石 浦 章 一＊

ジストロフィンの欠損がDuchenne型筋ジスト
ロフィー（以下DMD）で明らかになり，その病因と病態機序の解明が近年急速に進んでいる。今回
我々は一般筋病理像がきわめてDMDに類似する
福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）におけるジストロフィンの発現様式を免疫組織化学的に検討したので報告する．

階 堂 三砂子＊埜 中 征 哉＊またジストロフィンの欠損しているDMDについては筋形質膜のマーカーとしてスペクトリンを用い膜障害の程度をFCMDと比較してみた（図2）．以上の免疫組織化学染色はベルオキシダー
ゼ間接法を用いた．
FCMD
Case（坤戸No・ 0％

20

対象及び方法先天性筋ジストロフィー51例，うちFCMD36
例，非福山型先天性筋ジストロフィー（nonFC−MD）15例，及びDMD5例，Spinal muscularatrophy（SMA）17例，の計73例（表）について
凍結切片のジストロフィン免疫染色を行った。また各ジストロフィン染色異常線経の特徴を知るた

non FCMD

め連続切片においてC5bL9 complement mem−brane atack complex（MAC）の免疫染色，ア
タリジンオレンジ染色，ATPase染色を含む一般
組織化学染色を行った。ジストロフィン免疫染色につき定員的検討を加えるためジストロフィンの免疫染色パターンを5型に分類し（ジストロフィンが完全に欠損しているnegative，筋形質が淡染するfluffy，一部が断裂しているpartiallydefec−
tive，正常の染色性を示すnormal，筋表面膜がnormalより一段強く染まるintense），その出現頻度をage−matChedのFCMD，nOnFCMD，
SMA各5例で各生検筋あたり約500本について比較検討した（図1）．
＊国立精神・神経センター神経研究所−75−

NORMAL ABNORMAL
Eコ∈ヨFluHyェ■ht椚●E琵ヨpa川叫de−ect−V。匠ヨNegatlv。

図1FCMD，nOnFCMD，SMAにおける各ジストロフィン免疫染色パターンの出現頻度の比較

結

果

FCMD

ジストロフィンはDMDでは欠損していたがSMA，nOn FCMDでは筋形質膜に正常の発現をCaso t▲9●）＊
N〇・

〇％

20

40

印

書0

100

示していた．SMAとnon FCMDではImmuno−
blot法でも正常のジストロフィンが確認された．
一方FCMDでは基本的にジストロフィンが存在したが，免疫染色のパターンではnormalの他に
fluffy，partiallydefective，intense，negativeの4型の異常染色パターンを認め，それらの平均は約28％と高値であり特有のパターンを呈した（図3）．SMA（平均0％）やnonFCMD（平均4％）のパターンとは明らかに異なっていた．fluffyパ
ターンを示した筋線経はアタリジンオレンジ染色陽性，type 2Cの再生初期の線経，negative，

intense，及びpartially defective，はopaque線
経を含む壊死変性線経に大部分が一致し本質的には二次的，非特異的所見であった．しかしながら，これらに加えてFCMDでは一般組織化学的染色

NORMAL ABNORMAL
E＝】

図2

Eヨ蝕呵■hton事。田内rt馴yd〇一∝加●

匿伽9州●

FCMD，DMDにおける各スペクトリ
ン免疫染色パターンの出現頻度の比較

表 対象73症例の年齢，性別，CK値

ClinicalNllmber

Diagnosis●l

of

Sex

Age

patientちMF

cK（U／L）●2

range

mean

range

mean

CMD

FCMD
non FCMD

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22
5

14

10

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5

0

17

8

9

congenital

3m−14y ly7m

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27

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2ylm

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−

3m−12y

2y4m

20

−

4326．5

1955

2910012014．0
179

dyStrOphy，

non FCMD：nOn Fukuyama congenital tnuscular dystrophy，
DMD：
・2

Duchenne muscular dystrophy，CK：creatine kinase normal：12−75

SMA：Spinal muscular atrophy

U／L

−76−

386．7

101．1

も有意に高率であった．Immunoblot法ではFCMDではジストロフィンの分子量は2例を除

＊

工了十ヽj

き正常であった．
㌢∵㌢

考察

CMD51例（FCMD36例，nOnFCMD15例），
SMA17例，DMD5例においてジストロフィンの免疫組織化学的検討を行った．FCMDではジスト
ロフィン染色異常を里した線経がnon FCMDよ′り有意に高率であり，これはFCMDにおける活発な壊死再生による筋形質膜の2次的変化を反映

図3

福山型筋ジストロフィーのジストロフィンするものと思われた．FCMDでは一見正常と思わ

免疫染色像（×200）
筋形質膜部分が正常に染色される線経の間にしばしばより強く染色される線推（intense；arrOW head），部分的に欠損の見られる線維（partially defective；
arrow），及び染色性が完全に欠損している線維（negative；aSterisk）等が認められ，特有のジストロフィン染色パターンを呈す
る．抗ジストロフィン抗体はモノクローナ
ル4−4C5抗体（C末端）を用いた．

れる線経の中にも明らかにジストロフィン染色の異常を示した線経が観察され筋形質膜の脆弱性が存在する可能性も併せて示唆された．またジス
トロフィンの欠損による膜の異常が疑われている
DMDとの比較においてスペクトリン免疫染色異常線経の出現頻度がFCMDでより高率であった
こともFCMDにおける瞑障害の程度が強いことを示唆するものと思われた．
結で一見正常と思われる筋線椎の中に明らかにジス

語

FCMDではジストロフィンの免疫染色パター

トロフィンの異常染色を示す線経が散見されたこンの異なる幼君な筋線経と変性線維とが正常筋線とは興味深い．

経の間に多数散在し，それによって特有なジスト

連続切片においてスペクトリンとジストロフィ

ロフィンの免疫染色像を呈していることが注目さ

ンの免疫染色像を比較するとFCMD，nOn

れた．これは臨床診断上，FCMDとnon FCMD

FCMD，SMAともほぼ同様の染色態度を呈してを鑑別する一つの補助検査法としても有用である

いた．例えばジストロフィン染色でnegativeパタ

ものと思われる．また，FCMDの病態にも筋形質ーンの線椎はスペクト1）ン染色でもnegativeパ
ターンをとっていた．DMD筋についてスペクト膜の障害が関与している可能性が示唆された．
文

献

リンを筋形質隈のマーカーとして用いて膜障害の程度をFCMDと比較した結果ではFCMDにお1）Arikawa E，Arahata K，Ishihara T，et al：

いてスペクトリン染色異常線推数は平均25％とImmunocytochemicalanalysis ofdystrophin

age−matChedのDMDでのそれ（平均9％）より

in congenitalmuscular dystrophy．J NeuroI
Sci，in press．

−77−12）Duchenne型筋ジストロフィーを合併した
福山型先天性筋ジストロフィーの1家系：
dystrophinおよびその遺伝子の検討
松 村 喜一郎＊
研究協力者

戸 田 達 史書 長谷川
伊 本 夏 樹＝ 清 水

輝

毅＊ 亀
夫＝＊

井

真

樹＊

は じめに
福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）の原
因は未だ不明である．FCMDの大多数の症例においてdystrophinは正常に発現していることが明らかにされている一方，部分的な異常を認める症例やごく希ではあるがdystrophinを完全に欠損する症例も報告されており，FCMDとDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）との病因論的関連は完全には確立されていない1ト3）．我々はDMDの表現型を呈する1症例とFCMDの表現型を呈する3症例を合併した特異な家系を経験したので，本家系についてdystrophinの遺伝子学的ならびに蛋白生化学的検討を行い，上記の問題点につき検討した4）．
症例

図1に家系図を示した．症例はいずれも男児である．
症例1：妊娠，分娩歴に異常なし．乳児期母乳の吸引力が弱かった．定頸6カ月．1歳頃2回てんかん発作あり．2歳6カ月より歩行可能となるも不安定であった．12歳で起立・歩行不能となった後，四肢の関節拘縮，筋萎縮が進行した．生下時より知能低下著明でわずかに2−3語文を話すのみであった．いつも口を半開きに口唇を突出さ＊国立療養所下志津病院神経内科＊＊筑波大学臨床医学系小児科＊＊＊東京大学医学部脳神経内科

占 占

ム 占

「
自 白
（
⊃

1

2

3

4

■＝FCMD phenotYPO

図1Thepedigree ofthepresentfami1y
せ，洗えん著明であった．17歳で呼吸器感染症にて死亡した．16歳時CK値は1，400−2，700IU／
1（正常54−263）であり，同時期の前頸骨筋よりの筋生検所見はnon−SpeCific dystrophic changeを示した．
症例2（図2A）：妊娠，分娩歴に異常なし．乳児期母乳の吸引力が弱かった．定頸1歳．1−2歳頃3回てんかん発作あり．四這い，起立・歩行は不能であった．5−6歳頃より四肢の関節拘縮，
筋萎縮が進行した．生下時より知能低下著明でわ
ずかに2−3語文を話すのみであった．いつも口を半開きに口唇を突出させ，流えん著明であった．
15歳時CK値は1，000−2，000IU／1であった．
症例3：詳細は不明であるが知能低下，顔面筋障害を伴い歩行不能であったらしい．10代後半に死亡した．
症例4（図2B）：母方の家系に神経・筋疾患患者はいない．妊娠，分娩，発育歴に異常なし．3歳−78−

図2 Portraits of patients2（A）and4（B）

図3Immunohistochemistry byindirectim−（Informedconsentwasobtainedfromthe
parents）．NotethemarkeddifEerenceof

munofluorescence of the biopsied
Skeletalmusclesfrompatientsl（A）andthe facial expression between the2

4（B）with an anti−dystrophin mono−

patients：Onlypatient2hadseverefacial
Weaknesswjthopenmouthanddrooling

Clonalantibody，AIC，×180．The sarco・

Whichis characteristic of Fukuyama

COntinuously wjth AICin all of thetype conge11ita】muscular dystrophy．

muscle fibersin patientl，Whileit was

Patientl，theelder

COmpletely negativein patient4．

plasmic membrane wasimmunostainedbrotherofpatient2，

hadremarkablysimilarfacialfeaturesto
Patient2．

頃より起立・歩行障害が始まり進行しており，5
歳時腰帯筋・下肢近位筋の筋力低下，俳腹筋の仮性肥大，アキレス腱反射以外の深部瞳反射低下を認めた．知能低下．てんかん発作，顔面筋障害はない．5歳時CK値は18，000U／1（正常24−195）であり，同時期の大腿四頭筋よりの筋生検所見は線椎においてdystrophinが筋細胞膜に一致して存在したが，症例4では完全に欠損していた（図3）．同じくAICを用いてWesternblot解析を行った6）7）．症例1では正常者と同じ〜400kdの
dystrophin bandを認めたが，症例4では完全に欠損していた（図4）．

non−SpeCific dystrophic changeを示した．なお
母親のCK値は正常範囲内であった．
Dystrophin遺伝子異常の検討
症例2と4および両人の母親を対象に，dystro−phincDNA1−2a，2b−3，4−5a，5b−7，
8，9−14を用いてSouthern blot解析（制限酵素としてHindlllとBgl11を使用）を行ったが，いずれも異常を認めなかった5）．
Dystrophinの免疫化学的検討
症例1と4の生検筋を用いて抗dystrophinモ
ノクローン抗体（AIC）による間接蛍光抗体法による免疫組織化学を行った6）．症例1ではほぼ仝筋

考案ならびにまとめ（1）前述のようにFCMDとDMDとの病因論的関連が完全には確立されていない現在，本家系内の筋疾患の解析は重要と考えられた．Dystrophinの遺伝子学的検討からは情報は得られなかったが，dystrophinの蛋白生化学的検討の結果より症例
1（従って症例2そしておそらく 3も）はFCMD，症例4はDMDと診断され，本家系中の筋疾患は単一ではなく2つの異なる疾患の合併と考えられた．この結果は，FCMDの原因はdystro−
phinの欠損ではないことを示唆している．
（2）DMDにおいて遺伝子レベルでの異常が検出される割合はせいぜい60−70％以下である．

−79−

文

献

1）ArahataK，HoffmanEP，KunkelLM，etal：
Dystrophindiagnosis：COmparisonofdystro・
phin abnormalities byimmunofluorescence
andimmunoblot analyses．Proc Natl Acad
Sci USA86：7154A7158，1989．
2）有川恵理，荒畑喜一，埜中征哉ほか：福山型先天性筋ジストロフィーにおけるジストロフィンの研究．医学のあゆみ150：747−748，1989．
3）Matsumura K，Shimizu T，SunadaY，etal：
Degradation of connectin（titin）inFu−

kuyamatypecongenitalmusculardystrophy：
immunochemical study

with monoclonal

antibodies．J NeuroISci1990，inpress．
4）MatsumuraK，HasegawaT，KameiM，etal：
AJapanesefamilywithbothFukuyamatype
COngenitalmusculardystrophyandDuchenne
muscular dystrophy（DMD）：DNA analysis
Of the DMD gene andimmunochemiCal
analysisofitsproteinproduct，dystrophin．J

図4

Child Neurol，Submitted．

Westernblottingofthebiopsiedskeletal
muscles from patientsl and4with an5）KoenigM，BeggsAH，MoyerM，etal：The

anti−dystrophin monoclonal antibody，molecularbasisforDuchenneversusBecker

AIC．Lanesl，2，and3arenormaldontrol
muscular dystrophy：COrrelation ofseverity（44−year−01d polymyositis female），pa−
tient4，andpatientl，reSpeCtively．C，N，and M shows the position of connectin（also called titin），nebulin，and myosin
heavy

chain，reSpeCtively．〜400

Withtypeofdeletion．AmJHumGenet45：498【506，1989．

6）Shimizu T，Matsumura K，HashimotoK，etkd

al：Amonoclonalantibodyagainstsynthetic

dystrophinband wasimmunostainedin
patientl as well asin normal control，polypeptide fragment of dystrophin（amino

Whileitwascompletelyabsentinpatient
4．

acidsequencefromposition215to264）．Proc
Jap Acad64B：205−208，1988．

Dystrophinの免疫化学的検討は，侵襲的検査である筋生検を必要とするが，dystrophinの遺伝子レベルでの異常が検出されない場合極めて有効であ
る．

−80−

7）MatsumuraK，ShimizuTandMannenT：In
VitrodegradationoftheDuchennemuscular
dystrophy gene product（dystrophin）．
Biomed ReslO：325−328，1989．

13）ジストロフィンcDNAに基づくcysteine−rich
およびC末端領域各種合成ペプチドの抗原性と抗体の反応性について

研究協力者

自

見

隆

若

山

吉

弘■

弘■

武

田

篤＝

三

杉

信

子＝◆

三 宅 捷 大書■● 熊 谷 俊 幸＊■■■埜 中 征 哉■1日■■■は じめに

表l Materials
Duchenne muscuTar dystrophy31

病型と遺伝子欠失もしくは蛋白欠損部位との対

01ジストロフィンに関する知見の集積に伴い臨床

Becker muscular dyStrOPhy
umb

g事rdledystrophy

PolymyosMs
MJtochondrtal myopathy

1

Nemallne myopathy

4

報告する．

2

Myotonlc dystrophy

3

いCySteine−rich（高システイン）およびC末端領

3Fac10SCaPUIohurTlera暮dystrophy

域でジストロフィンCDNAよりペプチドを合成し，それらに対する抗体の反応性を検討したので

1

portion2）につづき，本年度はこれまで報告の少な2応l）が注目されている．我々は昨年度のmid

AnlyOtrOPhlclateral scIerosls症

Normal human chHd

例

以下の61症例生検骨格筋について検索した（表Normal human adult1）．すべてにジストロフィン免疫染色を，また一部の症例にイムノブロットを施行した．
方法

Amlno At：ld SequenCe

既報の方法2）により高システイン領域より3種≡ELISA Tltel（tyStdno−rlch po祀011）（ⅠⅤ，Ⅴ，ⅤⅠ），C末端領域より3種（ⅥⅠ，Ⅷ，ⅠⅩ）

Ⅳ：引nL−D−L−L−S−L−5−人−A−C刀刃×の計6種のペプチドをジストロフィンCDNAに

V：3165日−N−N−l＿−V−N−V−P−L−C−V−D−M−C3178

×

6，400

Ⅵ：mC−D−0−R−R−L−6−L−L−L−H3239

×25．6001，600

基づき合成し家兎に免疫，ポリクローナル抗体を得た．各ペプチドのアミノ酸配列を図に示す（図1）．高システイン領域ではEFハンドの部分を除
外しペプチドを合成した．免疫染色は約6JJm凍結

3．200（C−termInさt PO州On）
Ⅶ：3466D−D−E−H−L−L−ト0−H−Y−C3476

×

Ⅷ：㍊P−L−P−5−P−P−E−M一日−P封7−C

×128，0α）

Ⅸ：脚中一G−K−P一日−R−E−D一丁−M珊−C

×128．∝旧図1Amino acid sequences of synthetic
peptides and the ELISA titer of
their antiboies＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院臨床病理＊＊＊神奈川県立ことも医療センター＊＊＊＊愛知県コロニー中央病院＊＊＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所−81−

切片をアセトン固定，正常ブタ血清により非特異的染色をブロックした後，上記抗ジストロフィン
抗体（希釈率100−400倍）に4亡、C終夜，蛍光標識2次抗体に室温，1時間反応させ観察した．イムノ
ブロットは生検筋を10倍量の0．1M Tris二HCI
buffer（pH8．0）（10％SDS，10mM EDTA，1％2AmerCaptOethanol，10％glycerol）を加えて
homogenize L，3分間煮沸後遠沈して得られた
上活の蛋白濃度を3．2〜5■．8mg／mlとなるように調整し4．7％ゲルを用いてSDSポリアクリラミ
ドゲル電気泳動を行った．ホライズプロット法で108mA，90分通電しクリアプロット・P膜（アト一社）に転写し，各抗体と反応後発色させた．
結

果

各合成ペプチドに対する抗体価は，特にC末端領域ペプチドに対する抗体で128，000倍と良好な値を示した（図1）．免疫染色では抗体Ⅳを除く5種の抗体で正常対照骨格筋の表面膜を明瞭に染色した．特にC末端領域抗体（Ⅷ，IX）では強い免疫染色性を得た（図2A）．抗体V，ⅥⅠは問質も僅かに認識する傾向が認められた．DuchennemuscuT
lardystrophy（DMD）10例の高システイン，C
末端領域抗体に対する反応は，一部の症例で散在性に陽性線経を極く少数認める場合がある以外，すべての抗体で反応を欠如していた（図2B）．
Beckermusculardystrophy（BMD）の高シ
ステイン領域抗体に対する反応は，13例中10例はpatchyでfaintないわゆるBMDにしばしば認められる染色パターンを示した（図2C）．また1例
では，正常より染色性が弱いもののcontinuousに表面膜が染色された．一方，筋表面膜の反応を欠如し，DMDと染色パターン上は区別不可能な症例が13例中2例存在した．C末端領域抗体に対する反応は，BMD13例中7例はpatchyでfaintな
染色パターンを認めたが5例は反応を欠如（図2
D）していた．
イムノブロットでは，正常対照骨格筋ではいずれの抗体に対しても分子量約400kDaの位置に一本のバンドを認めた．これに加えてC末端領域抗体（Ⅵ1，Ⅷ，ⅠⅩ）では分子量約320kDaの位置にバンドを認めた．DMDでは全ての抗体と，反応する
バンドは検出できなかった（図3）．BMDl例では抗体ⅥⅠ，ⅠXを用いたとき，分子量約380kDaの位置にうすいバンドを認めた．
考察

我々は昨年度，ジストロ7インmidportionのCDNAに基づく合成ペプチドに対する抗体の反応性を検討し報告した2）．今回，我々はこれまで報告の殆どない高システイン領域および他の蛋白質と相同性がなく，細胞膜との関連で重要な部分と考えられるC末端領域3）に注目し，合成ペプチドに対する抗体の反応性を主として免疫組織学的に検討した．正常対照骨格筋に対するこれら抗体の
免疫染色性は概して良好で筋表面膜を明瞭に染色した．一方，DMDではこの反応を欠如しイムノブ
ロットでも同様の結果を得たことから，これらの抗体は臨床的にも十分使用可能なものと思われた．
今回の我々の検索のうち正常対凰 DMDに対す
る免疫染色のパターンは，これまでの諸家の報告と一致2）4）するもの′であったがBMDについては，若干異なる結果を得た．すなわち，いわゆるpat−
Chyでfaintな染色パターンを示したものが高シ
ステイン，C末端領域いずれの抗体においても過半数を占めたが，高システイン領域抗体で13例中2例，C末端領域抗体で13例中5例では反応を欠如LDMDと染色パターン上区別できなかった（表2）．一部のBMD症例で反応を欠如したことについてはいくつかの可能性が考えられた．第一には実際にジストロフィンが著減している可能性，
第二にはBMDでは特にC末端でジストロフィ
ン分子の分解が克進している可能性，第三には，我々の抗体の感度の問題などである．これらについては，BMD症例のジストロフィン遺伝子欠失部位や臨床的重症度との関連も含め，今後更に検討を加える必要がある．

図3
衰2

Western blot analysis

文献1）KoenigM，BeggsAH，etal：Themolecular

Dystrophinimmunoreactivity ofcontrol
musclesand muscleswithDMD＆BMD

basis for Duchenne versus Beckermuscular
dystrophy‥Correlationofseveritywithtype

eystelne一日
ch po州OnC−
term in8l po相On

∩
．
d．

∩．
d．

DM D

BM D

C on tro l

Ofdeletion・AmJHumGenet45：498−506，
1989．

PatChy，dl就Ontlnuous 10／
13 PatChy，d lscon帥 uous

7／
13

W eak，COn仙lUOuS

l／13 W eak，CO nt仙ルUS

1／
13

m d．

2／
13 m d．

5／
13

＋I＋

2）Wakayama＋I＋

Y，JimiT，etal：Immunor＿

eactivity of antibodies raised against syn−theticpeptidefragmentspredictedfrommid
portions ofdystrophin cDNA．J NeuroISci

DMD：Dl」Ch即nel¶USCubrdystrophy
8MD：BeC即mUSCUIardyShOPhy＋H−：∝ln柚uousclealimmunob鮎川n oHhemyoftbelSUrlacemembranen．d．：not det餌ted

97：241−250，1990．

−83−3）杉田秀夫，荒畑喜一ら：ジストロフィン分子に4）Sugita H，Arahata K，et al：Negative

おけるC末端ドメインの臨床的意義． 厚生省

immunostaining of Duchenne muscular dys−

「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー

trophy（DMD）and mdx muscle surface症および関連疾患の病態とその病因に関する研

membranewith antibody against synthetic

究 （杉田珪）平成元年度研究報告書，1990，

peptide fragment predicted from DMD

pp121−123．

CDNA．ProcJapanAcad64：210−212，1988．

−84−14）ラット脊髄付加ヒト培養筋細胞に於けるdystrophinの発現，局在に問する
免疫組織化学的，電顕的検討
小 林 高 義＊

研究協力者

松 本 答
塚

越

Dsytrophin（DP）は正常骨格筋細胞膜の直下に存在すると考えられているが1）2），ヒトの胎生期の未熟な筋細胞では細胞膜と細胞質の一部に散在性に存在することが報告されている3）．従来，筋細胞の分化，発達に伴うDPの局在の変化に関して検討した報告は少なく，特にDPの細胞内の局在，構成に神経支配及び筋収縮活動が及ぼす影響に関して検討した報告はない．今回我々はそれらを明らかにするために，ヒト培養骨格筋−ラット胎児脊随片併置培養系を用いて免疫細月包化学的に光顕及び電顕にて検討したので報告する．
材料及び方法
4例の内因性筋疾患を有しないと考えられるヒトの生検筋及び1例のDuchenne型筋ジストロフ
ィー症（DMD）患者の生検筋より，既に報告した方法により筋単層培養を行い，それに後根神経節を含んだ13日日ラット胎児脊随片を併置培養した．
併置培養後平均10日前後で筋細胞は自発収縮を始めるが，神経支配されていない筋細胞（AM）と神経支配後の自発収縮している筋細胞（ICM）につき，DP蛋白C末端，N末端に対するモノクロー
ナル抗体を用いてベルオキシターゼ間接法と蛍光抗体間接法にてDPの局在を光顕的，電顕的に検討した．DPのC末端に対する抗体は4C−5抗体＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊東京大学医学部脳研神経内科

秋＊ 亀 田 典 佳＊
贋＊ 清 水 輝 夫＝

（味の素及び富士レビオ社），NCLDYS2（NOVOCASTRA社）の抗体を使用し，N末端に対する抗体はAIC（東大神経内科清水先生より供与）抗体を使用した．
DPの細胞内局在，構成に及ぼす筋収縮活動の影響を明らかにするために，神経支配後最初の自発収縮が見られた時点でtetrodotoxin（TTX）2〟Mを投与し筋収縮活動を2週間停止させた．筋収縮活動を停止させた筋細胞（IPM）につき，ベルオキンダーゼ間接法にて免疫染色した．対照として，正常筋由来のAMで一次抗体の代わりとしてphosphatebuffersaline（PBS）を使用し免疫染色した．又，DMD由来のAMでもベルオキ
シターゼ間接法にて免疫染色した．ベルオキシターゼ間接法は以下のよう施行した．培養細胞を2％パラホルムアルデヒドで10分間固定し抗体の浸透性を良くするために0．05％サポニンで10分間処理した．その後一次抗体を370Cで2時間反応させ，二次抗体（家兎抗マウス二次血清）を1時間反応させた後diaminobenzidineにて5分間反応させた．免疫染色後，電顕用に固定しエボンに包埋し，光顕用に2JJm厚切り切片を作成し免疫反応産物を確認後，超薄切片を作成した．超薄切片は無染色にて電顕で観察した．
結果
位相差顕微鏡による検討では，正常及びDMD筋由来の筋細胞は，神経支配後共に良好に自発収−85−

図1ヒト培養筋細胞の光顕免疫染色像（2／ M厚切り切片）
a，b：培養5週目の神経支配のない筋細胞では，細胞膜と細胞質の一部に散在性に免疫反応が認められる．（×3000）C，d：ラット胎児脊随との併置培養により神経支配を受け，2週間
自発収縮している筋細胞では細胞膜に沿ってび慢性に免疫反応が認められる．（×3000）e：
神経支配していないDMD由来培養筋細胞では免疫反応を認めない，（×3000）f二一次抗体の代わりにPBSを使用した筋細胞では免疫反応は認められない．（×3000）

縮し横紋形成も良好であった．筋芽細胞，筋管細胞及び神経支配後の筋細胞の分化，発達に関して，正常筋とDMD筋由来筋細胞との間で明らかな差は認められなかった．
光顕免疫染色：正常筋及びDMD筋由来筋芽細胞には，免疫反応は認められなかった．培養7日
目の未熟なAMでは，細胞全体に微かな免疫反応を認め一執こ強く染まる免疫反応を細胞質内に認めた．培養5週日の比較的分化したAMでは，細胞全体にほぼび浬性に免疫反応を認めると共に，
一部細胞膜にも散在性に免疫反応を認めた．厚切
り切片の観察では，培養5週目のAMで，筋細胞膜と細胞質に散在性に免疫反応を認めた（図la，b）．神経支配後3週目の併置培養で2週間自発収縮を続けている正常筋由来ICMでは，DPは細胞全体にび漫性に免疫反応を認め，その縦断厚切り

一86−

切片での観察で筋細胞膜に沿ってび損性に免疫反応を認めた（図lc）．また横断厚切り切片でも，同様にDPは筋細胞膜に沿って仝周性に免疫反応を認め（図1d），細胞質にDPの免疫反応は認めなかった．DMD筋由来AM及び一次抗体の代わりにPBSを用いて免疫染色したAMでは，DPの免疫反応を認めなかった．またDP蛋白のN末端を用いた蛍光免疫染色では，正常筋由来ICMの横断
切片でC末端の抗体と同様に筋細胞膜に沿って仝周性にDPの蛍光反応を認めた．
電顕免疫染色：正常筋由来培養5週目のAMで，細胞膜直下と細胞隈の近傍に散在性に免疫反応を認め（図2b），一部の細胞質にも顆粒状の免疫反応を認めた（図2a）．正常筋由来のICMでは，細胞膜の直下にび浬性に免疫反応を認め，一部を認めず，又免疫反応とT−tubuleとの明らかを相関も認めなかった．またDMD筋由来AMでは，免疫反応を認めなかった．
TTXexperiment：TTXで2週間筋収縮活動を停止させた筋細胞（IPM）では，光顕で細胞全体にほぼび漫性に免疫反応が観察されると共に一部の筋細胞膜に散在性に免疫反応を認めた．光顕厚
切り切片では，筋細胞膜に散在性に不連続性に免疫反応を認めた（図3a，b）．更に一部の筋細胞で，細胞質内にも免疫反応が観察されると共にDPの免疫反応が認められない筋細胞も一部に認められた（図3a，b）．電顕による観察では，DPは筋細胞膜直下に散在性不連続性に免疫反応が観察された（図3C，d）．

periodicityをもって染色される部分も観察された（図2C，d）．ICMでは，細胞質には，免疫反応

考察

従来DPの細胞内の局在に関してヒトの培養筋

図2 ヒト培養筋細胞の電顕免疫染色像
a，b培養5週目の神経支配のない筋細胞では細胞膜の直下に散在性に免疫反応を認め，細胞質と細胞膜の近傍にも顆粒状の免疫反応を認める（矢印）．C，d：ラット胎児脊随との併置培養により筋が成熟し2週間自発収縮している筋細胞では細胞膜の直下にび慢性に免疫反応を認め，一部にperiodicityをもって染色される部分を認める（矢印）．barlJJm．
−87−

・、

一

・一・・

図3 ラット胎児脊随との併置培養に2週間TTXを投与し筋収縮を停止させた培養筋細胞の免疫染色像
a，b：光顕免疫染色では細胞膜の一部に散在性に免疫反応を認める．（×3000）
d，e：電顕免疫染色では細胞膜の直下に不規則に散在性に免疫反応を認める．barlJLm．

細胞では，神経支配されていないAMでは筋細胞
膜と細胞質に散在性に存在すること4），マウス脊のどちらがDPの細胞内の局在，配列に主な影響

髄を使用したOrganOtypic cultureでは，再生ICM筋細胞膜に一様に存在することが既に報告されている5）．一方ヒト胎児の研究では，神経支配

かにするために，TTXによって筋収縮を停止さを及ぼしているのかが問題となる．この点を明らせる実験をおこなった．TTXはよく知られているように低濃度で筋細胞膜のTTX感受性が完全でない胎生11週で既にDPが細胞質に発現することが報告されている．今回の我々の検討においても，筋芽細胞ではDPは存在しないが，神経支配がなく自発収縮していない未熟な筋細胞においてはDPが発現し筋細胞膜と細胞質の一部に散在性に存在していることから考えて，DPの発現には神経支配も筋収縮活動も必要ないと考えられる．しかし，ICMではDPは筋細胞膜に沿ってび

SOdium channelをブロックする事により筋収縮浸性に存在することから，神経支配後の股の発達あるいは筋収縮活動によりDPは筋細胞膜直下に一様にび糧性に配列されるようになると考えられる．この培養系では筋細胞は神経支配後初めて自発収縮を開始するので，神経支配及び筋収縮活動

浬性の配列やDPの細胞膜におけるperiodicityを持った配列は認められなかった．このことからを停止させるが，活動電位をブロックしてもmin−iature endplate potentialはブロックしないことから，化学的神経筋伝達を残したまま筋収縮活動の影響を調べるのに適した薬物であると考えられ
る．TTXを投与したIPMではDPは筋細胞膜に散在性に存在し，ほぼAMと同じようなDPの分布を示し，ICMで観察された細胞膜への一様なびDPの筋細胞膜へのび洩性の分布，periodicityを有する配列には筋収縮活動が重要な役割を有している事が明らかとなった．我々はこの培養系で横−88−

紋形成及び核の細胞膜直下への移動は，筋収縮活866，1988．

動により支配されるが，神経筋接合部の形成は筋収縮活動の影響を受けないことをすでに報告して

2）Cullen MJ，WashJ，et al：UltrastruCturalいる6）．一方マウス培養筋細胞で，TTXを授与した
筋細胞では細胞骨格蛋白であるdesminの分布，配列に乱れを生じることが報告されている7）．DP
は膜関連細胞骨格蛋白として膜の裏打ち構造に重byusinggoldimmunolabelling．Proc RSoc

要な役割を果たし，aCtinをanchoringしていると考えられているが，SpeCtrin，desminなどの他の細胞骨格蛋白との関係は依然として不明である．
これらの細胞骨格蛋白が相互に結合しあい成熟した筋細胞に必要な最終的な筋細胞骨格系を完成させる上で，筋収縮活動がDPの細胞膜直下への局
在，配列と同様に他の細胞骨格蛋白の配列，構成に重要な役割を果たしていることが考えられる．
また最近DPは，神経筋接合部あるいは筋腱接合部に多いことが報告されており，筋の収縮弛緩のみならず膜を貫通しているacetylcholine rece−ptor■の保持にも何等かの役割を果たしている可能性があり，今後DPの局在と機能に関して，この培養系を利用して更に検討していく予定である．

localization ofdystrophinin human muscle
Lond B240：197−210，1990．
3）PrelleA，ChianeseL，etal：Appearanceand
localizationofdystrophininnormalhuman
fetalmuscle．JNeuroISci98（Suppl）：229，
1990．

4）MirandaA，Bonilla E，etal：lmmunocyto−
ChemiCal study of dystrophinin muscle
CulturefrompatientswithDuchennemuscu・
lardystrophyandunaffectedcontrolpatients．

AmerJ Pathol132：410−416，1988．
5）Ecob−Prince MS，Hi11MA，et al：Localiza−tion of dystrophinin cultures of humanmuscle．12：594−597，1989．
6）Park YC，Askanas V，et al：Paralysis of

innervated cultured human muscle fibers
affects their morphologic phenotype differ−entially．Neurology40（Suppll）：122，1990．
7）Tassin AM，Raymond M，et al：Unusual文

献

Organization of desminintermediate fila−

1）Watkins SC，Hoffman EP，et al：lm−
munoelectron

ments

microscopiclocalization ofinmuscular dysgenesis and TTX−

treatedmyotubes．DevelopBiol129：37−47，

dystrophinin myofibers．Nature333：863T−89−

198，1988．

15）急速凍結・ディープェッテング（QF−DE）法による
培養筋管細胞内dystrophinの三次元的局在
小 林 高 義■

研究協力者

大 野 伸

一日

馬

健■■＊塚 越場

1987−88年Kunkelらのgroupによって，Du−chennC型筋ジストロフィー（DMD）のgeneがcloningされ，その遺伝子産物である427kDaの蛋
白質がdystrophin（DP）となづけられた．光顕免
疫組織化学的にはDPは細胞膜に存在し，二次元の透過電宗則こよる観察ではDPは細胞膜直下に存在し，成熟した筋細胞ではperiodicityをもっていることがいままで報告されている．一方DPは，いままでに知られていなかった未知の蛋白質である
ため，その正確な細胞内の局在及び他の細胞骨格蛋白との相互関係を明らかにすることが，その桟能を知る上で重要である．我々は，DPの正確な三次元的局在を知るために高解像力で三次元的観察のできるQFTDE法を用いマウス培養筋管細胞内のDPを免疫細胞学的に観察すると同時に他の細胞骨格蛋白（特にactinfilaments［AF］）との相互関係を検討したので報告する．
材料及び方法DMDのmodel動物であるmdxマウス及びそ

松

本

春

秋＊
廣＊

の実験に使用した．QF−DE用に，培養組織を2％
パラホルムアルデヒドで5分間固定し，更に0．5％サポニンで15分間処理した．一部の試料は 細胞二分割法 で細胞内の可溶性蛋白質を除去した．
免疫染色はDP蛋白C末端に対するモノクローナル抗体（4C−5：味の素及び富士レビオ社）で30分染色後，perOXidase標識抗マウスlgG抗体で染色した．免疫染色対照群としてSCnマウス由来
筋管細胞に，正常マウス血清とPBSを一次抗体として使用し，またmdxマウス由来筋管細胞にDP抗体を使用した．0．25％グルタールアルデヒ
ドで30分間再固定後diaminobenzidine（DAB）反応を5分間行った．AF同定のために一部の試料はmyosinsubfragmentl（S−1）で修飾した．
電顕レプリカ股作成のためには10％メタノール浸
漬後，液体窒素で冷却し液体窒素中で凍結割断を加えた．Eiko社製FD−3S装置内（−950C，2−
6×10−7Torr）で15−30分間deep etching後白金と炭素で回転蒸着した．型のごとくレプリカ股を作成し，日立HS−9，H−700電顕で観察した．

のCOntrOlマウスであるscnマウスを使用した．
結新生マウス下肢筋より無菌的に筋組織を採取し，果

tureした．培養液はDulbecco smodifiedEagle s

Ⅰ．位相差顕微鏡的観察：筋をexplant後24時
間以内に単核細胞が遊走し，数日以内に多核の筋

MEM67％，medium199 23％，fetal bovine
serum10％の組成のものを使用した．培養は約1

管細胞を形成し不規則な自発収縮を開始した．
Scn及びmdx培養筋細胞間に特に差は認められ週間行い，充分な筋管細胞が得られた段階で以下なかった．
ⅠⅠ．透過電顕的観察：Scn及びmdx培養筋管細胞とも，筋細胞の長軸方向に沿ってZ−bandを形成した未熟なmyosinとactin線経の束が認め

コラーゲン塗布カバースリップ上にexplant cul−

＊東京医科歯科大学医学部神経内科＊＊信州大学医学部第一解剖学＊＊＊信州大学医学部第二病理学

−90−

等転

図1Lightmicrographsforimmunoperoxidasestaining ofcultured scnandmdx myotubes
at5−6daysofculture．（a）T（e）：Immunostainingofdystrophin．（a）Thediaminobenzidine（DAB）reaction products areobserveddiffuselyinthecytoplasm andsomescatteredimmunostainedspots（arrows）arenotedundertheplasmamembraneinscnmyotubes．
（b）At another focuslevelnearthehorizontalcellsurface，ClearspottyDABreaction
products（arrows）areidentified under the plasma membrane．（C）ⅠmmunO reaCtion

products（arrow）arealsolocalizedinsomepartsofthecytoplasmofflatmyotubes．
（d）Atanotherfocuslevel，SOmearelocalizedundel・theplasmamembrane（（arrow）．
（e）Theimmunoreactionproductswithlinearpattern（arrows）arelocalizedalongthe
plasmamemebraneofwelldevelopedscnmyotubes．（fト（h）：ImmunostainingcontroIs．
NoDABreactionproductisobservedinscnmyotubes，WhichareimmunOStainedwith
normalmouseserum（f）orphosphatebufferedsaline（g），insteadoftheprimaryanti−dystropin antibody．（h）ImmunOSatiningwithanti−dystrophinantibodyiscompletely
negativein mdx myotubes．

−91−

図2

Replicaelectronmicrographsforpuremorphology（a）andS−1decorated。ltrastruCt。reS（b−e）inscn（a−d）andmdx（e）myotubesat5−6daysofculture・Bar：0．5JLm（a）
Microfilaments（largearrows），thinfilaments（smallarrows）areassociatedwitheach
Otherundertheplasmamembraneofscnmyotubes．（b）Mostof8−10nmmicrofilaments
insubsarcolemmalnetworksaredecoratedwithS−1toidentifyactinfilaments（large
arrows）・Somethinfilaments

are

not

decorated（small

arrows）．Arr。Wheads‥

Intermediatefilaments・（C）Parallelrunningmicrofilamentsundersomepartsofthe
plasmamemebranearedecoratedwithS−1toformtypicalrope−likestructures，butintermediatefilamentsarenotdecorated（arrow）．PM：Plasmamembrane．（d）Lattice＿

likecytoskeletonsrsmall arrows）areattachedtothecytoplasmicsidesoftheplasma
membraneandnot deeoratedwithS−1・OthermicrofilementsaredecoratedwithS−1
toidentifyactinfilamelltStlargearrows）．Arrowhead：Ⅰntermediatefilament，（e）M。St

OfcytoskeletonsaredecoratedwithS−1inmdxmyotubes・Lattice−likecytoskeletons，
however，are rarely observed．

−92−

られ，またミトコドリアも細胞内に多数認められた．筋細胞膜も両者とも良好に保たれ差を認めなかった．
III．DPの光顕免疫細胞化学的観察：DPは筋芽細胞ではscn，mdxとも陰性であった．しかしscnの培養細胞では，未熟な筋管細胞では，細胞膜の一部が部分的に強く染色されると共に細胞内にもび慢性の染色が確認された（図1a−d）．また，よく収縮している成熟した厚みのある筋管細胞では，細胞膜に一致して一様に染色された（図1−e）．一方，mdxマウス培養筋管細胞及びcontrolの免疫染色は完全に陰性であった（図1トh）．
ⅠV．QF−DE法による観察：
1）純形態像及びAFの観察：培養筋管細胞の細胞膜直下では所々相互に結合を有する線維状のnetworkが密に存在した（図2a）．これらの細胞膜直下のnetworkは，主として8−10nmの直径を有する線経から構成されており，またこのnet−
workの線維問同志とcross−linkしている5−7nmの直径を有する細線経も観察された（図2−
a＆bの短い矢印）．12−14nmの直径を有する中間大線経は細胞質内のより深い所に観察された（図2−bの矢印）．S−1による修飾によってAFを同定し観察すると，図2b−eで示すごとく，細胞膜直下に存在する8−10nmの線経の大部分はS−1によってロープ状に修飾されてAFと考えられた．一方図2−dで短い矢印で示すごとく格子状の構造をもったS−1で修飾されない細胞骨格がscn筋管細胞膜の細胞膜内面に密着して存在するのが観察されたが，mdx筋管細胞では，このような細胞骨格は観察されなかった（図2−e）．
2）DPの免疫細胞学的観察：DAB反応産物
はレプリカ上で図3a，bで長い矢印で示すごと
く顆粒状の反応産物として観察された．この免疫反応産物はscn培養筋管細胞の細胞膜の直下に部分的に不規則に散在性に存在した．この構造物は一部でAF様線経と密接に結合していた（図3
a＆bの短い矢印）．また一部の反応産物は，細胞膜内面に接着していた．DPは主としてAFが豊富に存在する場所に存在し，AFの殆どない場所には存在しなかった．Mdx培養筋管細胞の免疫染色では，DAB反応産物は全く存在せず，またscn培
養筋管細胞を使用したcontrolの染色でもDAB
反応産物は認められないことからscn培養筋管細胞中のDAB反応産物はDPに特異的と考えられた．
考察

いままでに伝統的透過電顕的手法による免疫細月包化学的観察によって，DPは細胞膜直下に存在することが明らかにされているが，他の細胞骨格蛋白との関係は明らかでなかった．今回我々は，マウス培養筋管細胞を使用して初めて三次元的にDPが細胞膜直下に散在性に存在し，局所的にAF様線経と結合していることを明らかにした．AFがDPと結合を有する可能性は，そのN末端がα−aCtininと同様な分子構造を有することから推測
されl）2），Levineら3）はNMRを使用してN末端とF−aCtinが強く・・結合することを報告しているが，今回の我々の実験によって，DPがAF様線経と結合部分を有していることが初めて形態学的に明らかにされた．一方，SCn培養筋管細胞膜直下に存在するAFでない細胞骨格の格子様構造は，mdx
培養筋管細胞では観察されず，その一部がDPである可能性が高いと思われる．この格子様構造物
は，Koenig ＆ Kunkel4）らが最近明らかにしたDPの新しいmodelに類似しており，更に他のDPのdomainを認識するモノクローナル抗体を用いて検討していく予定である．
DPは細胞の裏打ち構造を形成し，骨格筋の特徴である長軸に伸び腱で固定されている長円形の細胞の収縮一弛緩に重要な役割を担っていると考えられる．一方，DPは神経筋接合部に密に存在すること，また電気ウナギではそのアセチルコリン
受容体と密接な関係があることが最近明らかになり，膜を貫通している受容体の細胞膜上での固定にも重要な役割を担っている可能性があると思われる．このようなDPの構造と機能を詳細に明らかにしていくことは，生体の中で最も可動性のある筋組織の維持機構を明らかにする上でも，またDMDを代表とする筋ジストロフィーの筋崩壊の機序，更に治療法を確立する上でも重要であると

−93−

図3

Replicaelectronmicrographsforirnmunoperoxidasestainingofdystrophininscnand
mdxmyotubesat5−6daysofculture．Bar：0．5JLm．（a）GranularDABreactionproducts（largearrows）aremainlylocalizedjustundertheplasmamembrane．Theyarelinked
toactin→likefilaments（smallarrows，8−10nmindiameter）inscnmyotubes．（b）Some

granular reaction products are also observedtobelocalizedonthecytoplasmic sideof theplasma membrane（large arrows）．Smallarrowsindicate actinlikefilaments．
（C）Immunostainingcontrolofscnmyotubeswithnormalmouseseruminsteadoftheprimary antトdystrophin antibody．No reaction productislocalizedinmicrofilament
networks．（d）Immunoreaction producwith anti−dystrophin antibody are completely
negativein mdx myotubes．

−94−2）KoenigM，MonacoAPandKunkelLM：The考えられる．

COmplete sequence of dystrophin predicts a

結論

rod−Shapedcytoskeletalprotein．Cel153：219

我々は，マウス培養筋管細胞にQF−DE法を応−228，1988．

用しDPと細胞骨格蛋白の一つであるAFとの関

3）LevineBA，MoirAJG，PatchellVBandPerry

係を三次元的に検討し，初めて形態学的にAF様

SV：Theinteractionofactinwithdystrophin．

線経がDPと局所的に結合していることを明らかにした．

4）KoenigMandKunkelLM：Detailedanalysis

FEBS263：159−162，1990．

Ofthe repeat domain of dystrophin reveals

文献four potential hinge segments that may

1）Hammonds RG：Protein sequence of DMD

COnfer flexibility．J Bio Chem265：4560−
4566，1990．

geneisrelatedtoactin−bindingdomainofα−aCtinin．Ce1151：1，1987．

−95−16）Deepetchingreplica法によるマウス骨格筋細胞膜
関連細胞骨格の研究
一化学固定と無化学固定標本の差異について

若 山 吉 弘＊
研究協力者

緒

渋 谷 誠 二＊言を2分し生の新鮮骨格筋の本法による研究用のた

Heuserにより開発されたquick freeze，deep
etching，rOtary Shadow法によるreplica膜の電顕的観察は細胞骨格の3次元的観察に適しており，
membrane cytoskeletalinteractionやcytos−
keletalelementsの微細構造の解明やその相互間の関連を研究するのに極めて有力な手段となりうる．特に細胞好莫と細胞膜関連細胞骨格との相互関係を解析するには極めて有用である．近年Du−
Chenne筋ジストロフィー症（DMD）の遺伝子産物
である分子量427kDaの蛋白質dystrophinは正常骨格筋細胞膜の細胞質側に存在することが明らかにされつつあり，DMDではdystrophinが筋細胞膜に欠損している．我々はDMDgene相同部位の異常により同じくdystrophinが欠損していると報告されているmdxマウスとdystrophinが存在するmdxコントロールマウスを用い，deep
etching replica法によるreplica股の電顕的観察
にてdystrophinの超微形態とその存在様式を研究してきている．昨年度は無化学固定の新鮮骨格
筋標本の本法による研究結果を報告したが，本年度は抗dystrophin抗体標識骨格筋標本の本法による研究のためには化学固定が必要となるので，
化学固定による影響につき検討した．
材料と方法
6匹の成熟mdxコントロールマウスの後肢筋

め1．5mm四方くらいの立方体に細切し，すばや
く以下の方法で急速凍結する．もう一つの部分はまず冷却した4％パラフォルムアルデヒド溶液で1時間固定後洗浄し，クリオスタットで細切し，2．5％グルタールアルデヒド溶液で30分間再固定
後洗浄し，以下のように急速凍結Lreplica膜を作成した．方法は，
1）急速試料凍結装置Eiko RF−23型に液体
窒素と液体ヘリウムを入れ−2690Cまで冷えた純
銅blockに採取した筋の小片を庄着し急速凍結
する．
2）上記標本をEiko FD−5A凍結割断装置に移し−150〜−1700Cに凍結面の表層を割断する．
3）割断後試料台の温度を−900Cまで上昇し真空度1〜2×10￣7Torrで約30分間deep etch・
ingをおこなう．
4）Deep etching後試料台に装着した標本の温度を−1600C前後まで冷やす．
5）その後電子銃に装着した白金を院庄計でその厚さを監視しながら，また試料台を回転しながら蒸着し，次に同じく電子銃に装着したカーボンを試料の上の白金膜に回転蒸着してreplica膜を作製する．
6）次に試料のついたreplica膜を凍結割断装
置から取り出し，塩素系漂白剤で筋肉だけを消化
しreplica膜を得る．
7）Replica股を蒸留水で3分ずつ3回洗浄す＊昭和大学藤が丘病院神経内科

る．
−96−

図1A−C Quickfreeze，deepetch，rOtaryShadowreplica（QDR）法による骨格筋筋原線経の電顕像 図A，Bは比較的低倍像でそれぞれ無化学国定，化学固定標本の同一倍率の所見で，両者にほとんど形態的差異は認められない．図Cはactinfilamentの高倍像で，矢印のような5nmの縞紋様が認められる．（図A，Bx32，900 図Cx131，800）
一97−

−98【

図2

A−C QDR法による筋細胞膜周辺の微細構造．図Aは無化学固定，図B，Cは化学国定標本のreplica像である．また図A，Bは筋細胞の外腔よりその内部を観察したもので，図Aでは筋細胞膜P面に近接した部位に矢印のように筋細胞膜関連細胞骨格が見られる．図Bでも基底膜（BL），筋細胞膜真表面（ES）に接して矢印のようなY字形ないしⅤ字形の筋細胞膜
関連細胞骨格がみられる．尚BLとESの間にそれを結ぶ細線維構造が比較的規則的に存在しているのがみられる．図Cは筋細胞内部から筋細胞膜内面（CS）を観察したもので，多数の種々の形態の筋細胞膜関連細胞骨格がみられる．（図Ax65，900 図Bx131，800 図C
X65，900）

8）Replica険を鋼メッシュにすくい取る．
9）得られたreplica膜を乾燥後，電顕にて観察し，写真を撮影する．
なお，Heuserらはcytoskeletal elementの写
真は反転して論文に発表している．こうすると
CytOSkeletalelementが黒のbackgroundから浮き出したように白く観察され，より良く見えるので多くの発表でこの方法が採用されている．しかしreplica膜の電顕写真はもともとcontrastが強く，そのうえこのように白黒反転させるため何度も写真を焼き直すと更にcontrastが増加するた
め，本論文では電顕ネガをそのまま印画紙に焼き付け，CytOSkeletalelementは白のbackgroundに黒い構造物として観察されるようにした．
結果

Replica膜の良否は筋原線経の低倍及び高倍の写真で容易に判定可能である．水晶などによる筋
原線経のひずみが著しい場合は低倍像で一見してわかるが，構造物が良く保持されている場合には低倍像よりむしろ高倍像にしないと判定は困難である．我々の経験では人口産物の少ないreplica
膜では無化学固定標本，化学固定標本とも筋原線
経は整然と配列し，高倍像ではmyosinのcross−99−

bridgeやactin filamentでは約5nmの周期をもつ縞紋様構造が観察された（図1A，B，C）が，このような良好なreplica膜は化学固定標本の方が，より作製し易かった．

ドで化学国定しなければならないので本年度は化学固定による影響を検討した．筋細胞膜関連細胞
骨格にはSpeCtrin2），fodrin3），ankyrin2），dystro−
phin4）などが含まれているとされており，このうちところで筋細胞への割断面の入り方でreplica
膜で観察される部位が異なる．大別すると2種類あるが，その1つは割断面が細胞外腔，筋細胞の幾つかはその特徴が記載されているが，化学固定標

基底膜から細胞膜の真表面，細胞膜疎水性の内部を通り，細胞膜直下から細胞質内部へと走るものである．この場合筋細胞膜割断面のP面とそれに関連する細胞骨格がみられる（図2A，B）．他の1つは割断面が筋細胞内部から細胞陵直下を通り細胞骨格のなかに約5nmの周期性をもつ細胞骨筋細胞膜内表面，細胞膜の疎水性内部から基底膜，
筋細胞外腔へと進むものである．この場合は筋細胞膜E面，筋細胞膜真内表面とこれに付着する細胞膜関連細胞骨格が網目構造を形成しているのが観察された（図2C）．筋細胞膜関連細胞骨格の形
態は種々であり，なかに5nmの周期性をもつ細胞本でも，．これらを識別することは因雉であった．しかし本年度の研究で判明したことは筋細胞膜関連格が含まれていることである．Heuserに5）よると
これはactinfilamentではないかと考えられた．
以上より筋細胞骨格の微細構造には化学固定標
本，無化学固定標本とも大きな差異はなくむしろ
人口産物は化学固定標本に少ないこと，及び筋細
胞膜関連細胞骨格にはactinfilamentも含まれていることが判明した．
文

献1）WakayamaYandShibuyaS：Observations

骨格が組み込まれているのも観察された．尚，筋細胞膜関連細胞骨格の微細構造についても無化学
固定標本と化学国定標本では大きな差異は認めら

Onthemuscleplasmamembrane−aSSOCiatedCytOSkeletons ofmdx micebyquick−freeze，deep etch，rOtary，Shadow replica method．

れなかった（図2A，B）．

ActaNeuropathol（Berl）80：618−623，1990．
2）ShottonDM，BurkeBEandBrantOnD：The

考察とまとめDystrophin異常がDuchenne／Becker筋ジス
トロフィー症や幾種類かの動物の骨格筋異常の原因であることが判明したことはすぼらしい医学のmolecular structure of human erythrocyte
SpeCtrin．Biophysical and electron micros−

COpicstudies．JMoIBio1131：303−329，1979．
3）Miranda AF，Bonilla E，MartucciG，etal：

進歩であるが，dystrophinの形態，機能やその存在様式などについては不明な点が多い．我々はその機能の一端を解明するため，分子の超微形態やその存在様式を研究している．現在までに生の骨

ImmunocytochemicalstudyofdystrophininmuscleculturesfrompatientswithDuchenne

格筋標本のquick freeze，deep etching，rOtary
Shadow replica（QDR）法によるdystrophin分子観察を行ってきている1）が，種々の形態の筋細胞
膜関連細胞骨格からdystrophin分子を同定することは困難であった．したがって抗dystrophin抗体でラベルした筋組織を用いQDR法を用いて
replica膜を作製Ldystrophin分子を同定するた
めには筋組織をあらかじめパラフォルムアルデヒ

4）KoenigM，MonacoAPandKunkelLM：The

muscular dystrophy and unaffected control

patients．AmJ Patho1132：410−416，1988．
COmplete sequence ofdystrophinpredicts arod−Shapedcytoskeletalprotein．Cel153：219−228，1988．

5）HeuserJE and Kirschner MW：Filament−100−

Organizationrevealedinplatinumreplicasof
freeze−dried cytoskeletons．J Cell Bio186：212−234，1980．

ⅠⅤ．遺 伝 子

17）女性筋ジストロフィー患者細胞のⅩ染色体における脱メチル化とDNA複製パターンについて斎 藤 深美子＊
研究協力者

山

本

輿太郎H

は じめに

外

村

日 暮
日日

表l Chromosome banding techniques

哺乳動物では，第2の，そしてすべての付加的なⅩ染色体は発生初期に不活性化され，その後安Banding technique Basis of technique

定して子孫細胞に伝達されてゆく（M．Lyonの仮説）．保因者の女性（ⅩⅩd）の場合，原則的にはatrandomにⅩが不活性化して，あまり発症に至らないはずであるが，稀に発症する場合は，正常なXが不活性化する割合が多いためと考えられて0−bandlnq

AT−SPeCific fluorochrorrLeS；
quinacrine，DAP工 andHoechst 33258

G−bandingGiemsa staining after
lncubation in warm SSC
Or tryPSin

いる．また，Ⅹp21を切断点とする転座染色体を有する女性では，正常のⅩが選択的に不活性化するため発症するとされている1）2）．この不活性化Xは

R−bandin9

Giemsa satining after
incubation in hot buffer

Repllcation
bandinq

工ncorporation of BrdU
during either early（T−Pulse）
Orldte S phase（B−Pulse）
followed by Gimsa satining

DNA合成（S）期の後期に複製されるので，この時期にTdRの類似体のBrd Uを取り込ませる内の保存メチラーゼ・システムが鋳型のDNA鎖でのメチル化部位を見付け，新しいDNA鎖の（B−pulse）と，後期複製パターンがReplication
banding（又はRBGrbanding）として観察することができる（表1）．現在では，このDNA複製パターンの経時的順序が遺伝子発現と関連している

ajacentな部位にメチル基を付加してゆくためである3）4）．この様なコピー・プロセスは通常安定ではあるが，5−aZaCytidine（5−aZaCR）を含む培養液で細胞を増殖させた場合，回避される．
5−aZaCRはシトシン類似体で，複製中のDNAの中に取り込まれるが，メチル基を受け入れることはできない5）．そのためDNAの低メチル化状態が生ずる．最近，後期複製の不活性化したか又は，部分的にこれをコントロールしていると考えられている3）．
一方，遺伝子発現とDNAメチル化に関するわ7
正和あるいはわZ粛和における研究により，不活性化されたⅩ染色体上の遺伝子とDNAのメチル化とは深く関連していることが示されている．
これらの研究結果は，メチル化されていない遺伝
子は発現され メチル化された遺伝子は抑制されたり，不活性化されたりすることを意味していた．
さらに，DNAのメチル化パターンはDNA複製過程の一部として娘細月包へ伝達されてゆく．細胞＊東京医科歯科大学医学部難治疾患研究所
細胞遺伝ウイルス／免疫疾患＊＊東京医科歯科大学医学部

Ⅹ染色体上のHPRT等の数種の遺伝子が，5−azaCR処理によって再活性化されたことにより6）7），5−aZaCR処理によって低メチル化状態を誘導すると，不活性化した遺伝子が再活性化される可能性のあることが示唆されている．
そこで本研究では，遺伝子発現と深く関連していると考えられるDNA複製パターンを指標に，後期複製の不活性Xに対する5−aZaCRの効果
を細胞遺伝学的に検索したのでその結果を報告す
る．

−103−

方

法

今回の実験には，Duchenne型筋ジストロフィー症患者で，Ⅹ染色体と常染色体間に相互転座を有する2名の女性から由来したリンパ芽球細胞（1：46，X，t（Ⅹ：15），2：46，Ⅹ，t（Ⅹ：19））を用いた．これらの細胞では，転座に関与していない正常なⅩ染色体の方が不活性化して後期複製するため，この不活性化したⅩのDNA後期複製パターンに対する5−aZaCRの効果について，
5−aZaCR無処理の場合と比較検討した．
方法は，細胞数と増殖を調整した上記リンパ芽球細胞に各々，5−aZaCR（2−3JLm）を48時間処理した後（対照として，無処理のものも用意する），TdR（300JLg／ml）で一昼夜処理し，その後BrdU（10￣4M）を数時間添加して（B−pulse法）
細胞を回収した後，通常の方法で固定し，染色体標本を作製する．その後標本を，Hoechst
33258（2．5／Jg／ml）で15分間染色してからD．W．で洗浄し，2×S岳Cで封入した後，blacklight（15W，360nm）を照射し，ギムザ液で染色する（FPG
法）．
結

果

B−pulse法によるReplication bandingでは，後期にDNA複製する部位は，淡染色される．その
22．3
22．1
11．4
11．2
11．2
13

ため，不活性化された後期複製のⅩ染色体は，通常，全体的に淡染色されることになる．中には，浪染色される部位（early replication site）もあるので，観察結果を数値化するために，earlyre−
plicationbandのクラス分けを行い，10のバンドに分けた（図1）．
その結果を，表2に示す．ここで，例えばTotallOとは，不活性化Ⅹ染色体上で，図1の10箇所のすべての部位でearly replication band（浪染バンド）が観察されたことを示している．この結果
より，症例1（46，X，t（Ⅹ；15））および症例2（46，Ⅹ，t（Ⅹ；19））において，共に，5−aZaCR処理をした方（1A−Bおよび2A−B）が無処理（1C−Bおよび2C−B）の場合に比べて，潰染
部位つまりearly replication部位が多くなっていることが判った．この結果をまとめてグラフにしたのが図2である．因みにTotalcountの平均値は，対照の無処理の場合の3．61（1C−B）および4．44（2C−B）に対して，5−aZaCR処理の場合は，6．04（l A−B）および6．28（2A−B）と高い値を示していた．又，浪染部位は全体的に，対照に比べてより強く，より広範囲に染色されていることが観察された．
考察DNAのメチル化は遺伝子の不活性化機構に関連があり，これは又，5−aZaCRの処理によって脱メチル化される．Xの転座染色体を保有する女

つ ﹈
つん性筋ジストロフィー症患者のリンパ芽球細胞を用いた今回の細胞遺伝学的研究により，DNA複製のバンドパターンに対する5−aZaCRのある特
別な効果のあることが判明した．
（1）培養リンパ芽球細胞の不活性化XにおけるDNA複製の遅延は，5−aZaCR処理によって短縮された．この知見は，ShaferとPriestの報告8）

4
つん
6
つん
8
つん

や，低メチル化は不活性なⅩを再活性化させると同様にそのDNAの早期複製化を誘導するという仮説を支持していると考えられる．
（2）不活性なⅩの複製パターンは，5−aZaCR
処理によって変化した．新しいバンド部位の出現は観察されなかったが，染色性が強まることによ−104−

Total O
1A−8

1

23

2

0

1

3
4

4
3

5
0

2

6

7

8

2

0

4

9
3

10
4

（100．0日 0 日 4．3日17．4日13．0日 0 日 8・7日 8・7日 0 日17・4日13・0日17・4）
1C−B

28

3

4

3

5

2

5

2

2

1

1

0

（100．0日10．7日14．3日10．7日17．9日 7．1日17．9日 7．1日 7．1日 3．6日 3．6日 0）
2A−B

56

0

2

4

5

4

6

5

8

8

9

5

（100．0日 0 日 3．6日 7．1日 8．9日 7．1日10．7日 8．9日14．3日14．3日16．1日 8．9）
2C−8

32

5

3

4

3

0

3

3

3

5

2

1

（100．0日15．6日 9．4日12．5日 9．4日 0 日 9．4日 9．4日 9．4日15．6日 6．3日 3．1）
（亀）DNA上の重要なメチル化部位は，DNAおよびRNAの両方のポリメラーゼの結合や伸展を阻害するのだろう．
今後さらに，（1）観察数や例数を増やし，また（2）より高精度なbanding法を導入して，同様の実験をすすめると共に，新しいreplicationbandの出
現やreplicationのtiming等について検討して行
きたい．

0

1．5

3．5

5．5

文

7．5
9．5
COUNT

献

1）Saito F，TonomuraA，KimuraS，MisugiN
andSugitaH：High−reSOlutionbandingstudyof an X／4translocationin a femalewith
Duchenne muscular dystrophy，Hum Genet
71：370，1985．

2）斎藤深美子，外相晶，山本輿太郎：女性筋ジス
トロフィー患者における細胞遺伝学的研究並びにリンパ芽球細胞株の樹立． 厚生省「精神・神経疾患研究委託狩」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）昭和62年度研究報告書，1988，p194．
0

1．5

3．5

5．5

7．5

9．5
COUNT

3）Riggs AD：DNA methylation andlate
replication probably aid cell memory，and

図2

typeIDNA reeling couldaid chromosome

り独特のパターンが観られた．
これらの結果やいままでの報告から，DNAのメチル化によって，染色体の複製と遺伝子発現は共に，部分的にあるいは領域的に制御されていることが示唆される．たぶん，これは，これら2つの現象を結びつける共通なメカニズムと思われる．
−105−

foldingandenhancerfunction．PhilTransR
Soc Lond B326：285，1990，
4）Razin A and Riggs AD：DNA methylation
andgene function．Science210：604，1980・
5）Jones PA and Taylor SM：Cellular differ−entiation，Cytidine analogs and DNA meth・ylation．Cel120：85−93，1980．

22：199，1988．

6）Mohandas T，Sparkes RS and Shapiro LJ：

8）ShaferDAandPriestJH：ReversalofDNA

ReactivationofaninactivehumanXchromo−

methylation

SOme：evidence for Xinactivationby DNA

Chromosome replication patternsin human

methylation．Science24：393，1981．

lymphocyte and fibroblast cultures．AmJ7）GrantSGandChapmanVM：Mechanismsof
X−Chromosome regulation．Ann Rev Genet

−106−

with

5−aZaCytidine alters

Hum Genet36：534，1984．

18）ミトコンドリア脳筋症の病因解明−ピルビン酸脱水素酵素複合体異常症における変異遺伝子解析−
黒

研究協力者

要

田

泰

弘＊

伊 藤 道

徳＊

内

藤

悦

雄＊

西

彦＊

武

田

英

二＊

候

隆

ぴProtein−Ⅹ（Ⅹ）から構成されており，その活

約

ミトコンドリア脳筋症の病因としてピルビン酸
脱水素酵素（PDH）複合体の異常が報告されている．今回我々は，PDH複合体異常症の一次的な原因を明らかにするためにウエスタンプロット分析
でPDHのα（Elα）とβサブユニット（Elβ）がともに著明に減少していたPDH欠損症の1女児例においてElαに対するcDNAの塩基配列を分析した．息児のCDNAでは分析した20クローン中
19クローンにおいて4bpの挿入が認められ1ク
ローンは正常な塩基配列を示した．ゲノムDNAの分析では，患児は正常遺伝子と変異遺伝子のヘテロ接合体と考えられたが，RNAの分析ではほとんどの細胞で変異遺伝子のみが発現していると性はPDHホス77ターゼおよびPDHキナーゼ
による脱リン酸化−リン酸化機構によって調節されている．また，PDHはαおよびβの2種類のサブユニット（Elα，Elβ）の4量体として存在している．ミトコンドリア脳筋症の病因としてピルビン酸脱水素酵素（PDH）複合体異常が報告されている．また，PDH複合体異常の中ではPDH活
性低下やPDH複合体活性化障害が多い．PDH複合体異常症の一次的な原因を明らかにするためには，蛋白質レベルとともに遺伝子レベルでの検討が必要である．そこで今回我々は，PDH欠損症の1女児児例においてElαに対するcDNAの塩基配列を分析した．

考えられた．Elαの遺伝子はⅩ染色体上に存在す

対象ウエスタンプロット法でElαとElβがともにることが知られており，患児においては何らかの原因により変異遺伝子を持つⅩ染色体が優位に活性化されていると思われる．また，Elαの遺伝子において変異を認めたことからElβはElαの異常により二次的に減少しているものと考えられた．
緒

著明に減少していたPDH欠損症の1女児例（図1）から得られた培養皮膚線維芽細胞を対象とした．また，高乳酸血症の認められない患者から得られた培養皮膚線維芽細胞を対照とした．

言

方

ピルビン酸脱水素酵素（PDH）複合体は6つの成分，すなわちPDH（El），リボ酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ（E2），リボアミド脱水素酵素（E3），PDHホスフアターゼ，PDHキナーゼおよ＊徳島大学医学部小児科

法1）PCRおよび塩基配列の決定
培養皮膚線維芽細胞からChomczynskiらの方
法1）でtotalRNAを抽出した．このtotalRNAを鋳型にしてM−MLVtranscriptase（BRL社）
によりsingle strand cDNAを作製してこれを−107−

図1培養皮裾線維芽細胞PDH酵素蛋白質のimmunoblot分析仏）抗Elα抗体によるimmunoblot分析（B）抗Elβ抗体によるimmunoblot分析
レーン1：牛心臓精製PDH複合体
レーン2：対照
レーン3：PDH欠損症女児例
レーン4：対照

冒プ5
T∝TCTTCCTC††AAaTATGMTATCT▲CT亡く▲GCG▲cc⊂▲CCTTTTGA▲一一■・
CACA▼eTACTCく：▲C⊂CACC⊂▲⊂⊂TTTTCAACTT TTTAAGT⊂AGTl：ACTT▲AGCCGACCACAGG
GTG▼AC▲▼⊂▲GGT亡G⊂TGGCTGも▲▲▲▲亡TTt▲▲▲▲▲Tl⊂▲GTt▲JlT⊂．AATTCCCrICCTm
一●■■TT⊂ACT⊂▲GTCAATTCCC⊂T⊂CTC

図2

PCRによるcDNAおよびDNAフラグメントの増幅紬totalRNAから作製したsinglestrandcDNAを鋳型としたElαCDNAの増幅＊：Eco RI認識部位作製のための塩基置換部位を示す．
（切 ゲノムDNAフラグメントの増幅
矢印は4bpの挿入部位を示す．

一108−

PCRの鋳型にした．ついですでに報告されている塩基配列を参考にして，4種類のプライマーを合成した．それぞれのプライマーには2または3塩基を置換してほぼ中央にEco RIの認識部位を作製した．これらのプライマーを用いたPCR法によりElαのCDNAを−30から＋705までと＋641
から＋1205までの2つのフラグメントに分けて増幅した（図2A）．PCR法はTaqDNApolymer−
aseを利用したGene AmplMキット（Perkin−
ElmerCetus社）を用い，変性940C1分間，アニーリング600C2分間，伸長反応720C3分間を1サ2）ゲノムDNAおよび変異遺伝子発現の解析
患者cDNAの塩基配列決定により推定された4bpの挿入がゲノムDNA上に存在することを確認するためにゲノムDNAを鋳型としてこの変異部分を含む第11エクソン部分のDNAフラグメン
トを増幅した．すなわち，図2Bに示す特異的プライマーを用いて変性950C1分間，アニーリング
620C1分間，伸長反応720C1分間を1サイクルとして30回の増幅を行った．得られたPCR産物は，6％NuSieveアガロースゲル電気泳動でそのサイズの決定を行った．また，tOtalRNAから作製

イクルとして30回の増幅を行った．増幅した

したSinglestrandcDNAを鋳型として同様の条

cDNAの両端をEcoRIで切断後，低融点アガロ

件でPCRを行い，PCR産物のサイズを決定した．

ースゲルで分馳精製した．これをプラスミッドベ

結クターBluescriptIIのEcoRI認識部位に組み込

果み，大腸菌ⅩLトBlueに移入して得られたクロー

Elαに対するcDNAの塩基配列を決定したとンを単級して，dideoxy法によりcDNAの塩基配

ころ，対照ではDahlらが報告2）3）している塩基配列と完全に一致していた．患者では5 側のフラグ列を決定した．

図3

PDH欠損症患者と対照のElαCDNAの塩基配列の比較
PDH欠損症患者において塩基配列を決定した20クローン中19クローンがSB−5と同じ4bpの挿入を示した．
−109−

ProPheGl血1ArgGlyAlaAsnGlnTyrIleLYSPheIqsSerValSerH・
ControI CCTTmAAGTTCGTGGTGCCAATCAGTCX；ATCAAGTTAPGTCAGTCAGTで職AGGAG

Patient CCTTTTGAAGTTCGTCm

二三二」∴工∴∴ProPheGluValArgGlyAlaAsnG1両ね1Asp31nVal★★★

図4 PDH欠損症患者における遺伝子変異とアミノ酸配列の変異

図5

遺伝子変異部位のDNAおよびcDNAフラグメントの電気泳動パターン
仏）ゲノムDNAフラグメント（B）totalRNAから作製したsingle strand cDNAを鋳型としたcDNAフラグメント−110−メントでは分析した10クローンの塩基配列はすべ体が発現される割合は50％と考えられている．して正常であったが，3，側のフラグメントでは分析した20クローン中19クローンにおいて＋1146の位
置にATCAの4塩基対の挿入が認められた（図3）．しかし，残る1クローンの塩基配列は正常であった（図3）．この4塩基対の挿入によりフレームシフトを生じ，正常の停止コドンより上流に新たな停止コドンが出現した（図4）．
ゲノムDNAを鋳型として変異部分を含む
DNAフラグメントの増幅を行ったところ，患者

かし，本患児では何らかの原因によりほとんどのでは対照と同じ81bpのフラグメントに加えて，4
bp長い85bpのフラグメントが認められた（図5A）．また，この2つのフラグメントはほぼ同量であった（図5A）．次に，tOtal RNAから作製し細胞で正常なⅩ染色体が不活性化され変異遺伝子を含むⅩ染色体が発現しているために，ヘテロ接合体であるにもかかわらず，高乳酸血症などの症状を示したものと思われた．
ウエスタンプロット法で本忠児においてはElαとElβがともに著明に減少していたが，Elαの塩基配列に異常を認めたことからElαに一次的な異常がありElβはElαと安定な4景体を形成できないため二次的に減少しているものと考え
られた．
結

論

PDH欠損症の1女児例において遺伝子増幅法

たsingle strandcDNAを鋳型として変異部分を含むcDNAフラグメントの増幅を行ったところ，を応用してElacDNAの塩基配列を決定し，4喝
基対の挿入を同定した．また，忠児は変異遺伝子

患者では85bpのフラグメントのみが認められた（図5B）．

と正常遺伝子のヘテロ接合体であったがほとんどの細胞で変異遺伝子が発現していた．

考察Elαの遺伝子はⅩ染色体上に局在することが報告4〉されている．今回我々は，PDH欠損症の女

文

献1）Chomczynski P and Sacchi N：Single−StepmethodofRNAisolationbyacidguanidium
thiocyanate−phenol−Chioroform extraction．

児例においてElαに対するcDNAの塩基配列を決定し，20クローン中19クローンにおいて4塩基対の挿入を認めた．しかし，1クローンは正常の塩基配列を示し患児がヘテロ按合体である可能性が示された．そこで，ゲノムDNA上での変異を検Anal Biochem162：156−159，1987．
2）DahlH−H M，HuntS M，Hutchison W M，
et al：The human pyruvate dehydrogenase
COmplex：Isolation ofcDNA clones for the

討したところ，息児においては対照と同じ81bpのDNAフラグメントに加えて変異遺伝子由来の85

Ela subunit，SequenCe analysIS，and chaf−

bpのDNAフラグメントを認めその量はほぼ同じであり，患児は正常遺伝子と変異遺伝子のヘテロ接合体であることが確認された．また，塩基配列を決定した20クローン中19クローンが変異配列を示したため，息児における変異遺伝子の発現を検討したところ，息児のmRNA由来のCDNAで7398−7403，1987．

は変異遺伝子由来の85bpのCDNAフラグメント
しか認められず，息児の培養皮膚線推芽細胞ではほとんどの細胞で変異遺伝子が発現しているものと考えられた．女性においては2つのⅩ染色体の1つは不活性化されていることが知られているが，一般にこの不活性化は任意に起こり一方のⅩ染色

acterizationofthemRNA．J BioIChem262：

3）Maragan C，HutchisonW M，IJayasaka Ki
etal：Structuralorganizationofthegeneforthe Elα

Subunit of the human pyruvate

dehydrogenase complex．J BioI Chem264：
12294−12298，1989．

4）BrownRM，DahlH−HMandBrownGK：−111−

Ⅹ−Chromosomelocalizationofthefunctional
gene for the ElαSubunit of the human

pyruvatedehydrogenasecomplex．Genomics
4：174−181，1989．

19）筋ジストロフィー組織ジストロフィン
ファミリーと生体膜機能

研究協力者

丸

山

英

濱

田

晴＊

山

稔＊
下

塩 坂 孝 彦＊＊＊仲 地

は じめに

秀

一＊

澄

田

遺

博＊＊

剛＊＊＊＊井 上 謙二郎＊＊＊＊目

的Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）遺伝子

筆者らはこれまでにヒト本疾患にみられる赤血はⅩ染色体短腕p21領域（Ⅹp21）に遺伝子座位が存在する．その欠矢や転座などの変異が同発症と関係することが明らかにされ，また，DMD遺伝子は2，000kbに近い巨大な遺伝子（群）で構成されることが判明した1）．最近，Kunkel，Hoffmanらはジストロフィーマウス（mdx）のジストロフィン
について，CDNA及びencodeされた同ペプチドに対するポリクローナル抗体を用い，DMD遺伝
子の65exonからなる14kbの長さのmRNAを確

球膜性状の変異を，細胞に一定のhypoosmotic
StreSS処理をし，赤血球からのアデニル酸キナー

認し，またその産生タンパク質が427kDのヒトと相同のジストロフィンであることを見出した2）．
Arahata，SugitaらはDMD患者に欠失している
ジストロフィンのDNAの一部に対応するペプチドを合成し，その抗体を用いて筋細胞形質膜でのジストロフィンでの局在と同病態との関連を明らかにした3）．その後，ジストロフィンタンパク質の生理的役割や，病態との関係が究明された．ジス
トロフィンに特異的なドメインの構造も明かにされ，このうち，細胞骨格タンパク質の一つである
スペクトリンやアクチンとの相同性が認められ，
いわゆるジストロフィンファミリーの存在が同病との関係でクローズアップされた．

＊宮崎医科大学衛生学＊＊愛媛大学医学部生化学第二＊＊＊愛媛県医療短期大学＊＊＊＊国立療養所東宮崎病院

ゼやヘモグロビンのleakagekineticsの異常を認めて報告した4）．この結果を応用して本病態における骨格筋細胞膜や赤血球膜の細胞骨格タンパク質に変異とも関連する可能性を明らかにする事を目的とした．そのために，宮崎県内の在宅および国立療養所束宮崎病院在院中の恩児ならびに患者（DMD：13例，L−G：11例，FCMD：5例）を対象に同病態の臨床診断に基づき，その成因を〔Ⅰ〕
ジストロフィンペプチドで作成した抗体に対する反応性及び〔ⅠⅠ〕遺伝子増幅法を応用して検討した．〔Ⅰ）に対しては，赤血球膜構成タンパク質の性状変化をジストロフィン抗体（富士レビオより供与を受けた4−4C5抗体，及びHoffman博士より恵与された30K抗体を利用）をWesternblotting
法に適用して，また，〔II〕についてはChamber−
1ainら5）の用いた5種のジストロフィンDNAを
プライマーとして，正常例では増幅され，同DNA構造に異常があれば増幅されない性質を指標として検索を試みた．しかし，〔Ⅰ〕の方法では赤血球
股構成タンパク質の可溶化をジギトニンなど界面活性剤や変性剤共存下の影響等の試料作成法や，同抗体による検出法について予備実験を行っている．そこで諸種の不明な点が生じたので，さらに検討する．今年度は患者から得られた各試料のジストロフィー遺伝子の変異について上記のブロー−112−

プを用い，遺伝子診断を行いその確定を試みたので報告する．

19），D（4．1kbHindlIIgenomiC断片），E（0．・5
kb HindIII），F（1．2／3．8kb HindIII）は合成
後，アンモニアクリページ，550Cで10時間の脱塩

材料と方法

基保護基を行った後，減圧乾燥した．このprimer
を核酸精製用カラムNACS−52（BRL社製）で精製し，上記反応に用いた．また，次年度の実験に備え，ジストロフィ ンC端17アミノ酸残基（1）DNAの抽出と分離：筋ジストロフィーの各病型より得られたヘパリン加血液（5ml）を採血後2時間以内に7イコールハイパーク混合溶液（フローラボラトリー社，3ml）に重層し，250Cで300Ⅹg，30分間遠心分離した．リンパ球単球屑，好中球屑を分取後，各々，生理食塩水で遠心洗浄後
0．05M K−PO4（pH7．21ml）に懸濁し，直ちに液体窒素で凍結保有した．DNAの抽出は，上記
保存リンパ球を20mMEDTA−0．5％Sarcosyl溶
液中に溶解（DNA濃度200JLg／ml）し，Proteinase
K（メルク社，10恥g／ml）を加え，370C，30分間温置した．フェノール／10mMトリス・HCl，

pH8．0（1mM EDTA含有）溶液で2回処理後，エタノール沈澱とし，次に50mM Tris−HCl（pH8．0）／10mM EDTA／10mM NaClに溶解L
RNase A（ベーリンガー社，終濃度100JLg／ml）
を添加し，370C，3時間温置した．続いて，フェノール／TEで2回処理し，エタノール沈澱とした．
沈澱はTE buffer（pH8．0）に溶解してDNA標品とし，各プライマーを用いて遺伝子増幅をした．
（2）遺伝子増幅法： 反応条件はInnisら6）の方
法に従い行った．10mMTris−HCl（pH8．3），50
mM KCl，1・5mM MgC12，200JLMの各dNTP（dTTP，dGTP，dCTP，dATP），0．01％ケラチ（SFGGSNIEPSVRSCFQF）をHoffmanら2）のシーケンス成果に基づいてペプチドシンセサイザー（ミリジェン・バイオサーチ社，EXELL）にて合成し，減圧乾燥後，レンジに切り出し脱保護剤としてm−クレゾール0．6ml，チオアニソール3．6
ml，トリフルオロ錯酸（TFA）20mlを加え，250
Cで1時間のペプチドの切り出しを行なった．
Argの脱保護剤（TMS−Br 4．Oml）を加え，00
C，1時間の脱保護操作後，TMS−BrをN2ガスフ
ラッシングで除去した．この反応液にエーテル100
mlを加え，沈澱したcrudepeptideを得て減圧乾固した．精製はFEBondasphere 5JL C18100AO（3．9×150mm）のウォータースM600，U6K，
M481，M740システムのHPLCを用いて2種の溶
離液A：0．1％TFA，B■：0．1％TFA（95％アセ
トニトリル）で，B液20−62％の30分間直線グラジェントにより220nm波長でモニタリングしながら流速1．Oml／minで試みた．なお，この合成ペプチドはserin，glycin含量が多い特異なCa結合部位とされ，骨格筋，心筋，脳に存在するジスト
ロフィンを特徴づけているペプチド部分であるの

ン，1JLMの各プライマー，0．2FLgのtemplate
DNAおよび1unit Taqポリメラーゼ（宝酒造社）を加え，遺伝子増幅装置（アステック社）により行った．最初のDNA変性は930C7分間で行ない，次にアニーリングを550C，2分間，合成反応を700C，3分間，変性を930C，2分間として30サイ
クル繰り返した．増幅後のDNAの検出は分子雑種法に従い5％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動法を行い，エチジウムブロマイドで染めた．なで，その特異性を利用し，この合成peptideに個有なモノクローナル抗体を作製して，Westernblot−ting法により，中枢神経症状，心筋障害を早期に前景とする本症患者や保因者の診断や病態の解明に資する予定である．
（3）結果と考察：Chamberlainら5）のDMD遺お，primerはChamberlainらの報告5）に従い，DNA合成装置（ミリジェン・バイオサーチ社）を用いて化学合成し，6つのprobeA〜Fとした．
各プローブA（Exon8），B（Exon17），C（Exon

で，増幅されるべきEのDNAのサイズは547bp（Aは360bp，Bは416bp，Dは268bp）である．このprimerl）2）を用いてDNA増幅を行ったところ，

伝子のE領域のprimer−1の構造はAAACATG−GAACATCCTTGTGGGGAC，primer72のそれはCATTCCTATTAGATCTGTCGCCCTAC

正常女子2例（図1のレーン1，2）男子4例（図

−113−

図3

DNAamplificationoflymphocytesDNA
fromsubjectsoflimbgirdletypedisease．

図4

DNAamplificationoflymphocytesDNA
fromsubjectsofFukuyamatypedisease．

図1DNAamplificationoflymphocytesDNA
from healthy males and females．

図2

DNAamplificationoflymphocytesDNA
from subjects of DMD．

1のレーン3−6）でE領域のDNA合成が確認された．また性差によるバンドの漉きには差は見られなかった．C，FのDNA領域については今回は正常に対しても増幅の至適条件が得られなかった．ついで，DMD13例について同条件下に遺伝子増幅を行い図2に示した．レーン3−6，8−10
及び13の8例にEに相当する遺伝子領域が増幅されなかった．この結果，高率にその領域の欠矢があると考えられた．また，L−G型11例についての検出結果（図3）ではprimer Eに関してはレー
ン2，4，6，9の4例に欠夫が存在することになるがL−Gと筋ジス診断の基準に基づいて診断された例にBMDとの鑑別が困難なものが含まれるものと予想された．次に，福山型（FCMD）と診断された5例の場合（図4），E領域についてレーン4，5の2例の写真のバンドが不明であったが，ネガにはバンドの存在が認められ，欠夫が観察されなかった．しかしFCMDにおいても生検
筋ジストロフィンに陽性線経と欠損線経が混在するとの報告もあり，筋病理像がDMDに近似する症例があるので，その鑑別が臨床的に困難となる場合があろう．そこで，他のprimerによる異なる
遺伝子領域での同様の確認も併せで慎重に検討する必要がある．
さらに，本研究の経過において，primerのアニーリング，55cc，45sec及び210sec（extension−114−

times）条件下ではDNAは増幅されなかった．そこで，種々の検討の結果，primerA，B，Dに関しては，反応条件を，変性950C，45sec，アニーリン
グ 650C，1min，合成 720C，2min＋45sec．とし，また，primer Eの場合はそれぞれ930C，2
min；560C，2min：700C，3minとして増幅に通した条件が得られた。
全般的考察としてはジストロフィンの遺伝子領

ま

と

め

Kunkelら2）が分馳したジストロフィン遺伝子のexon部分のprimerを用いて，遺伝子増幅法で本症患患児ならびに患者の病因遺伝子の欠損を調べたところ，DMDの61％にこの遺伝子の部分的な欠夫が観察された．
文

献

域A，B，Dに関しては対照とDMD，L−Gの間で差異は見られなかったが，領域Eに関してDMD，LGの症例に欠矢が確認され，領域Eは前者の診断に有用と判断された．しかし，LG例における
領域Eの欠夫については他の領域のprimerや，

1）Koenig M，et al：Ce1150：509，1987．
2）Hoffman E P and KunkelL M：Neuron2：

酵素を併用したprimerなどを用いて検討し，その結果も診断の基準とすることが必要であると思われる．

Processes（edbyLennonDLF，etal）Enzyme

1019，1989．

3）Arahata K，et al：Nature333：861，1988．
4）Kuby SA，et al：Biochemistry of Metabolic

Catalysis，1983，pp303−322．
5）ChamberlainJS，etal：NucleicAcidsRes．16：
11141，1988．

6）Innis MA，et al：Proc NatlAcad Sci USA
85：9436，1988．

−115−20）筋ジストロフィー家系における分子遺伝学的検討
斎 藤 加代子＊
研究協力者

池 谷 紀代子＊＊＊ 山 内 あけみ＊ 原 田 隆 代＊
小 澤 鉄二郎＊＊ 福 山 幸 夫＊

筋ジストロフィーの遺伝子異常と遺伝子産物の異常の関連を調べ，本症の病因・病態を解明することを目的として，本年度はDuchenne型（DMD）

0

およびBecker型筋ジストロフィー（BMD）を対象として，遺伝子解析1）と抗ジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学的検討を行った．さらに1
例ではpolymerase chain reaction（PCR）法を用いて，欠夫を有する遺伝子から転写された筋組織のmRNAの構造を解析した2）．
対象と方法
遺伝子解析の対象はDMD26家系に属する患者28例と，BMD4家系に属する患者4例である．患者リンパ球からの高分子DNAをDMDのCDNAプローブを用いて，Southern blotting−hybridizationにて解析した．
遺伝子解析により，遺伝子欠矢を証明し得た例
で，生検筋の免疫組織化学的検討をあわせて行った例はDMD3例とBMD2例である．抗ジスト
ロフィン抗体は00：cDNAマップのアミノ酸11−

1

2

0002

04

6

7

23

8

9

10

1112

13

14

kb

34

図1使用したcDNAプローブと抗体の位置

A

DMD

B

DMD

C

DMD

D

BMD

E

BMD

◆

日脚叱t・md叫四川

図2

DMDのcDNAプローブを用いて判定した遺伝子欠失領域．DMD，BMD，Out−Of−
frame，in−frameに分けて図示した．A，
B，C，D，Eは生検筋の免疫組織化学的検討もあわせて行い得た症例である．

−▲一り）■lll■■U〉■‖︼

38の一部のSequenCeからそれぞれsence primer

5

T二．■．ロを行った．またimmunoblottingも行った．用いた
CDNAプローブ，抗体の位置関係を図1に示す．
exon10−37の遺伝子欠夫を有する1例では，筋生検組織からRNAを調製した．exon 9とexon

4a．cDNA
b．cDNAp「obec．antトdystrophin即砧body

60，02：215−264，043）：440−489，234）：2360−

2409，34；3495−3544の合成ペプチドに対する抗体であり，これを用いて筋生検組織の蛍光抗体法

3−DMtI：Out・0t・什ame⊂＝コ8MtI：ilト什ame【＝コDMtI：in一打ame
UI：j山地旭日ragm即t

図3 遺伝子欠矢を有する症例で生検筋の免疫組級化学的検討を行い得た5症例の結果＊東京女子医科大学小児科＊＊国立精神・神経センター神経研究所機能研究部−116−

Fqmiiy C
亡DNA probeト2ロ⊂DNA probe5b−7

二十±．二二￣二＝二＝三二』二二三1
kb

delelioIl

ノ遠野

Ib

kb

kb

一・・一・一1

卸卜的・；lb一読「一芯図4 家系Cの家族構成員のDNAの制限酵素切断断片のパターン（上段）とその遺伝子欠失領域（中段）および息児の生検筋の抗ジストロフィン抗体（00，04，23，34）による免疫組織染色像（下段）・制限酵素はHindIII，BglIIを用い，CDNAプローブ1−2aで遺伝子欠矢の5′端を調べ，5b−7で3′端を調べた・それらの間に相当するプローブ2b−3，4−5aでは患児で全くバンドが認められなかった．
（E9）とantiLSenCe primer（AE38）として合成

結果01igonucleotide primerを作製し，患者筋組織由（1）患者における遺伝子欠矢

来のRNAをPCRにて増幅し，PCR産物をM13

患者の遺伝子欠矢は，DMD14家系16例とBMD

mp19ベクターにてサブクローニングしてその塩基配列をしらべた2）．

2家系2例で認めた．各々の欠失領域を図2に示す．Koenigら5）のエクソンーイントロン境界の検

−117−

図5

家系Cの患児の生検筋のimmunOblotting

C：正常
P：患児
抗体は00，04，23，34を用いた．DYSはジストロフィン（分子量400kD）を示す．左側の数
値は分子量マーカー（単位kD）

討に従ってこれらの症例をみると，DMDのうち1例でin−frameの欠尖を示した以外はDMD13
家系がoutTOfTframeの欠矢であり，BMDの2例
がin−frameの欠夫であり，readingframetheoryに合致していた．
（2）遺伝子欠失例における生検筋の免疫組織化学的検討
遺伝子欠夫を有し，筋生検組織におけるジスト
ロフィンの検討を行った例はDMD3例とBMD2例である．これらの症例の遺伝子欠失領域と，免疫組織化学の結果をあわせて図3に示した．各
抗ジストロフィン抗体の位置の下にその反応を＋，−で示している．DMDと臨床診断した症例
A，B，Cでは，いずれの抗体でも螢光抗体法の結果は陰性であり，immunoblottingでも400kDのジストロフィンの分子量に相当するバンドはみられなかった．BMDと臨床診断した2例では，症
例Dでは抗ジストロフィン抗体に対する反応はうすく陽性であった．症例Eは，以下に述べるような特異な結果を示した．以上のうち，症例CとEについて示す．
症例C（図4）は，遺伝子欠失はexon10−41である．欠夫はin−frameであり，reading frame

theoryに合致していない症例である．生検筋の蛍光抗体では，欠夫の上流，下流，欠矢内のいずれの部位に対する抗体によっても筋細胞膜にジスト
ロフィンは陰性であった．ImmunOblottingの結果，コントロールにみられる400kDのジストロフ
ィンのバンドは，いずれの抗体によっても，患者では証明されなかった（図5）．従って本症例はin−frameの欠夫を示すDMDであり，reading
frame theoryの例外例であった．
症例E（図6）は，欠夫はexon10−37であった．exon9LlOの境界，eXOn37−38の境界はtriplet
COdonの境界となっており，in−frameの欠矢であった．臨床的には本症例の年齢は6歳であり，
DMDかBMDかの臨床診断の確定は困難であるが，同年齢のDMDより良性の経過をとっており，
現時点では，BMDと診断している．蛍光抗体法では，抗体04以外の4種の抗体，すなわち欠夫の上流と下流に対する抗体では筋細胞膜にジストロフ
ィンの蛍光を示したが，欠失領域内（抗体04）では筋細胞膜に蛍光は全くみられなかった．Im一
munoblottingでも抗体00，23，34では，260kDのバンドが認められるが，抗体04では，260kDのバ
ンドがみとめられず（図7），この領域の遺伝子欠−118−

FqmilyE

lb

■■tも○

凛寺お
イト軌l

±一一

撃㌶

ヨ∵十七∵宣

服∵攣ふ

一一一一一

●、．、・→い、戦犠鞘一3．2

二㌔
lb

損⁝㍍

毒祭喜

二三一
一

・■lO，鳥⊂DNA probe5b−7

㍍

謎

．叶⁚

cDNA probeト20

ぺ0．寧

Hindlll Bgt11
3●

14抽

10
delelion ・．・．・」

即11i−dy・ab

00

02

0▲1

23

図6 家系Eの家族構成員のDNAの制限酵素切断断片のパターン（上段）とその遺伝子欠失領域（中段）および息児の生検筋の抗ジストロフィン抗体（00，02，04，23，34）による免疫組織
染色像（下段）．

夫のため，コードするジストロフィンの一部が合としてPCRで増幅し，約200bpのPCR産物を得成されておらず，分子量260kDの変異ジストロフ

た．このPCR産物をサブクローニングして，塩基配列を調べたところ，塩基番号1168番のGが5534
番のGに直接つながっている，すなわち，eXOn9のC末端とexon38のN末端が本来のスプライシ

ィンとなっていることが示唆された．
（3）生検筋組織のmRNAの検討2）
症例Eに関して，欠夫を有する遺伝子から恵写されたmRNAの構造の解析を試みた．生検筋から調製したtotalRNAをexon9およびexon38の一部の配列から合成したE9，AE38をprimer

ングをうける部位でつながっていることが証明できた（図8）．従ってこの遺伝子欠失により，eXOn
l0−37に相当して転写されておらず，Openreading

−119−

kD
→DYS

212←

118−

トmuIonI dyllrophin
図7

家系Eの鮭児の生検筋のimmunoblotting
C：正′乱 P：息児
抗体は00，04，23，34を用いた．DYSはジストロフィン（分子量400kD）を示す．
トは分子量260kDの変異ジストロフィン
Dには260kDに相当するバンドが認められない．

F

図8

P

S

Q

A

S

I

P

症例Eの生検筋組織由来のPCR産物の構造
上段は正常のジストロフィンのcDNAの構造（塩基配列とアミノ酸配列）．
▼ではさまれた領域（exonl0−37）が欠失し，下段のような構造になっている．

frameを保持していることを塩基レベルでも証明できた．
考保たれていない場合（outLOf−frameの欠失）は，
DMDとして重症な臨床症状を示し，ジストロフ
ィンが合成されないことを述べている（reading
frame仮説）．我々の検討では，16例中DMDの1察

DMD，BMDの臨床症状と遺伝子欠矢の関係についてKunkelたちのグループ5）はtranslation
においてopen reading frameが保持されている場合（inrframeの欠失），BMDとして臨床的に軽症でありジストロフィンが不完全であるが合成されていることを，そしてopen reading frameが例（症例C）でreadingframe仮説に合致していなかった以外は仮説を支持する結果であった．この例外であるin−frame欠矢を示したDMD例では筋組織の抗ジストロフィン抗体による蛍光抗体，
immunoblottingの結果ではともにジストロフィンが証明されなかった．現在のところ，この理由

一120−

は不明である．

Moleculargeneticandimmunohistochemical
analysisofdystrophinofayoungpatientwith

また，我々は症例Eにおいて，PCR法を用い

XLlinked muscular dystrophy．投稿中て遺伝子欠失領域を転写レベルでも検討し得た．
さらに，この症例は，Englandら6）の述べた症例と

3）ArahataK，IshiuraS，etal：Immunostaining

同様に欠失領域に相当した抗体ではジストロフィ

of skeletal and cardiac muscle surface

ン陰性，欠失以外の領域では陽性という特異な蛍

membranewith antibody against Duchenne

光抗体，immunoblottingの結果を呈し，分子量

musculardystrophypeptide．Nature333：861

260kDの変異ジストロフィンを有する症例であ−863，1988．

った．ジストロフィンの分子構造からみると，中4）Shimizu T，Matsumura K，et al：A mono−

央のスペクトリン様三重らせん構造ドメインがアClonal antibody against a synthetic poly−

ミノ酸としては，1456個（ヌクレオタイドとして

peptidefragmentofdystrophin（aminoacid

4366個）短くなっている構造をとっていることがsequencefromposition215to264）．ProcJpnわかった．本症例は同年齢のDMDよりは軽症でAcad64B：205−208，1988．

あるが少なくともEnglandらの報告例より臨床

5）KoenigM，BeggsAH，MoyerM，etal：The

的に症状は重い．この点からも，この変異ジスト

molecular basis for DuchenneversusBecker

ロフィンが本来のジストロフィンとしての機能を

muscular dystrophy：Correlationofseverity

どの程度有しているか，今後の検討が必要である．

Withtype ofdeletion．AmJ HumGenet45：498−506，1989．

文献6）EnglandSB，NichoIsonLVB，JohnsonMA，etal：Verymildmusculardystrophyassociated1）斎藤加代子：ジストロフィン遺伝子解析とそのWith the deletion of 46％ of dystrophin．

応用．細胞．23：43−50，1991．

Nature343：180−182，1990．

2）Ikeya K，Saito K，Hayashi K，et al：−121−

Ⅴ．ミトコンドリア脳筋症（1）21）ミトコンドリアDNA配列からみた
ヒト上科の分子進化

＊

み 子

る優

＊

久美子＊

藤部

葉 子＊

斤一眼

＊

＊

＊

田山上

諷村井

＊

二 司文

田

談誠貴

坂

早林石

研究協力者

正＊＊＊

は じめに
種間で相同遺伝子の配列を比較することは，種の系統関係を明らかにするのみでなく，進化の過程で起こった変異を定量することにより，各遺伝
子あるいは塩基配列上における機能的制約の程度を類推することができる．ミトコンドリアDNA
は，核DNAに比べて塩基置換速度が5倍から10倍高いことにより1），近縁種間の比較や種内変異の分析に有効である．霊長類におけるミトコンド
リアDNAの塩基配列の比較による分子進化の研
究は，Brownら2）およびHayasakaら3）によるものがあるが，比較した配列は，約900塩基対であった．とくに，ヒト，チンパンジー，ゴリラの属するヒト上科においては，3種の分岐に関して決定的な系統関係は確立していない．我々はヒトに最も近縁な種は何か明らかにするため，ミトコンド
リアDNAの4．9Kbの相同領域の塩基配列を，ヒト上科の4種・チンパンジー，ピグミーチンパン
ジー，ゴリラ，オランウータンにおいて決定した．
この領域には，11個のtRNA遺伝子，6個のタンパク質遺伝子（NDl，D2，COI，COII，ATPase8，
ATPase6）が含まれている（図1）．

図1

ヒト・ミトコンドリアDNAの模式図とヒト上科4種で塩基配列を決定した領域（斜線のバー）を示す．

たBセルラインを大量培養し，ミトコンドリア画分を分椎し，ミトコンドリアDNAを抽出した．ピ
グミーチンパンジーおよびゴリラは全DNAより
PCR法によりミトコンドリアDNA断片を増幅材料および方法
チンパンジーおよびオランウータンより確立し＊国立遺伝学研究所＊＊東京大学理学部＊＊＊日本大学農獣医学部

した．塩基配列を決定した相同領域は，ヒトのEcoRIサイト（bp 4121）からPstIサイト（bp9020）までで，ヒト上科の4種でもこれらのサイトが保有されていた．このEcoRトPstI断片をさらに別の制限酵素で切断し，pBluescriptにタロ−125−

表1Percentsimilarityofnucleotidesequence

一二ングし，4種で4．9Kbをカバーするクローン（above the diagonal）and propotion ofを得た．各クローンの挿入部位をさらにHaeIII

transition（belowthediagonal）between

あるいはAluIで切断し，M13にサブクローニン

species（whole positions）

グし，タイデオキシ法により各クローンの塩基配
Speeles Col叩ared

列を決定した．さらに，各クローンのオーバーラ
ップする領域の配列を結合し，4桂に関して4．9Specles Compared C−Cbl皿p．

Gorllld

既に，仝塩基配列が決定されているヒトの配Oranglltan

列4）と合わせて整列し，各種間において，塩基置換数を算出し，さらに塩基置換の特徴を検討した．

軋れ84．84．一

掛目nAn

果

Gor・

90
8
・
1・
8
9・
一l3・

結

ュ▲
6
・
8・
一93・2
1・
0︸○︶88P−el11mpanZee

6．一5．7．2．
99■V〇〇

C−eblmpanZee

一3．5．8．L

Kbの塩基配列を完成した．

トCbl皿p・Hl皿・Whole positions

表1に示すように各種間における塩基配列の相同性は，チンパンジー・ピグミーチンパンジー問で

Py9my−Chlmp．

96％，ヒトと2種のチンパンジー間で91〜92％，
ヒトとゴリラ間で89％，ゴリラと2種のチンパン

Chlmpされ王○○ジー間で89−90％，オランウータンと他の4柱間では約85％であった．また，全塩基置換に占める

Hurn■nトランジッション型置換の割合を柱間で定量した
ところ，2種のチンパンジー問で，94％，ヒトと2校のチンパンジー間では95％，ゴリラとヒトおよび2種のチンパンジー問では88−89％，オラン

OrさnOutln

ウータンと上記4種の間では約82％の値が得られた．このことは系統関係が遠くなるに従って，塩基置換においてトランスバージョン型置換の割合
町gmy−Chtmp．

が増加することを示している．柱間の塩基置換数に基づいて，2種類の系統樹作成法（UPGMAおChlmpln王●O

よびNJ）を用いてミトコンドリアDNAの分子系統樹を構築した（図2）．両方法とも全く同じトHum■nポロジーが得られ，まず，チンパンジーとピグミ
ーチンパンジーがクラスターし，ついで，ヒト，
ゴリラ，オランウータンの順でクラスターする系
統関係が得られた．また系統樹上の各分岐点におOr▲nOUt■n

ける標準誤差は重なり合わないことより，ヒトに一番近縁な種は，チンパンジーであることが統計

0．1

学的に有意の差をもって結論することができた．
これは，比較する塩基配列の長さが，従来の研究の5倍以上であり，各分岐点における標準誤差は比較する塩基数が多いほど，減少するからである．
さらに，6個のミトコンドリアタンパク質のアミノ酸配列を5柱間で比較した結果を表2に示し
−126−

0．05
N0．0I Nucleotlde Substltutlons

図2 各種問の塩基置換数に基づいて構築した遺伝子系統樹．UPGMA（平均距艶法）およびNJ（近隣接合法）の2種類の系統樹作成法を用いた．各分岐点の標準誤差を斜線のバーで示した．

表2

Percent homology of amino−aCid

表3

SequenCeSin6proteins
SpeCles
eompared NDl m2

8

ATPdSe

P−C

93．5

97．1

COI COI工

99．6

100．0

ATPase

96．2

98．7

E−P

87．0

95．7

98．8

97．8

94．3

94．7

好一C

93．4

96．3

98．8

97．8

94．3

94．0

H−6

95．7

93．4

98．1

96．5

88．7

92．0

8

SynonymotJ5（percent）

万一0

C−G

97．8

93．4

98．2

97．8

83．0

90．7

P−6

91，3

93．7

97．9

97．8

83．0

91．3

G−0

87．O

83．5

96．1

97．4

82．3

81．3

H−0

87．O

83．9

95．7

g4．7

64．2

84．0

C−0

84．8

83．6

95．3

96．0

62．3

84．0

P−0

82．6

84，1

94．9

96．0

64．2

87．3

G；

Gorll18．

53．4

51．1

34．1

50．6

C−0

37．5

42．3

52．3

53．9

38．8

52．O

P−0

37．5

42．4

55．5

50．3

37．2

54．8

G−0

43．7

42．6

57．6

52．0

35．2

49．9

24．1

47．1

Nonsynonynous（pereent）

Ⅱ一〇

C： ChlnpanZee．
0：Orangutan

Synonymous and nonsynonymous nu・
cleotide substitutionsinprotein genes（orangutanvshominines）

P：Pygny−ehllnpanZee．H：Hl皿an．

6．7

8．7

2．2

2．5

20．7

9．1

2．4

1．9

21．6

8．5

8．4

2．6

1．9

21．3

6．7

9．1

1．9

1．2

22．8

9．5

C−0

8．1

8．7

P−0

9．1

G−0

7．2

た．各タンパク質は柱間のアミノ酸配列の相同性とが明かとなった．これは，従来の分子進化学のの程度によって3つのグループ分類された．第1のグループは種間でアミノ酸配列がよく保有され研究における新しい知見であり，一見，全体の塩ているもので，COIとCOIIがこれに含まれる．第び非同義置換の均衡機構が存在するかのようであ2のグループはアミノ酸置換のよく起こっているる．本研究で決定した4．9kbの配列の比較から，オATPase8である．第3のグループは前2グルー

ランウータンと他の4種の分岐を1300万年と推定プの中間型となるもので，NDl，ND2およびATPase 6が含まれる．このことは，各々のミト

し，それぞれの種の分岐時間を求めたところ，ゴコンドリアタンパク質において機能上の制約の程

万年前，最後にチンパンジーとピグミーチンパン

基置換の総数を一定化するような，同義置換およリラが約630万年前に分岐し，続いてヒトが約410

度がかなり異なることを示唆している．このようジーが約180万年前に分岐したという結果が得らな各タンパク質におけるアミノ酸配列の相同性のれた．

差異が，塩基配列ではどのように反映されているかを明らかにするため，各タンパク質遺伝子で同

文

献

義塩基置換と非同義塩基置換の割合を比較した．

1）Brown WM，GeorgeJrM and Wilson AC：

ヒト，チンパンジー，ピグミーチンパンジーおよ

Rapid evolution of animalmitochondrial
DNA．Prot Natl Acad Sci USA76：1967−

びゴリラを系統的に遠いオランウータンと比較したところ，表3に示すようにCOIおよびCOIIで1971，1979．

は50％以上が同義置換であるのに対し，非同義置

2）BrownWM，PragerEM，WangAandWilson

換は1−3％と低く抑えられていることが明かと

AC：Mitochondrial DNA sequences ofなった．一方，ATPase8では，同義置換の割合

primates：Tempsandmode ofEvolution．J

が34〜39％であるのに対し，非同義置換は21〜23

MoI Evol18：225−239，1982．

％と高い割合を示した．また，NDIおよびND2で3）Hayasaka K，Gojobori T and Horai S：

は，同義置換が24〜47％であるのに対し，非同義

Molecular phylogeny and evolution of pri−

置換は7〜9％の間にあった．さらに，ATPase6

r mate mitochondrialでは同義置換の割合は50−55％であるのに対し，5（6）：626−644，1988．

DNA．MoI BioI Evo1

非同義置換は7〜10％であった．このようにミト

4）Anderson S，Bankier AT，Barrell BG，deコンドリアDNAにコードされる各タンパク質遺BruijiMHL，CoulsonAR，DrouinJ，Eperon

伝子の問で塩基置換の様相をきわめて異にするこIC，NierlichDP，RoeBA，SangerF，Schreier−127−

PH，Smith AJH，Staden R and YoungIG：

mitochondrialgenome．Nature290：457−465，

Sequence and organization of the human

1981．

ー128−

22）MELASにおけるミトコンドリアtRNALeu（UUR）変異小 澤 高 将＊研究協力者

田 中 雅 嗣＊ 井 野 秀 一＊
大 野 欽 司書 池 辺 紳一郎＊

は じめに

症

ミトコンドリア脳筋症は多様な疾患単位から構成されている．Kearns−Sayre症候群およびMERRF症候群においては前者では大きな欠失1）〜3），後者ではtRNALysの点変異4）5），とそれぞれのミトコンドリア遺伝子変異が明らかにされているが，もう一つの代表的疾患単位である
MELAS（mitochondrial myopathy，enCe−
phalopathy，lactic acidosis，and stroke−like

episodes）症候群ではその遺伝子変異は確定していない．MELAS症候群は低身長，嘔吐，半盲・皮質盲などの視覚異常を伴った脳卒中様発作を主症状とし，これらに加えて高乳酸血症，発作に伴ったCT上での低吸収域の出現，生検骨格筋の組
織化学におけるミトコンドリアの異常所見により診断される6）．また本疾患は心筋症を伴うことが多く7），心不全は代謝性アシドーンスとともにその死因として重要である．近年，MELAS症候群
においてミトコンドリア電子伝達系酵素複合体Ⅰ（NADH−ubiquinone oxidoreductase）の欠損が報告された8）9）．ウエスタンプロット10）およびEPR（electronparamagnetic resonance）11）ス
ペクトルによる分析から，複合体Ⅰの分子構築が障害されていることが示された．今回我々は，放射性物質を使用せず螢光法による全自動DNA解析装置を用い，安全でかつ短期間にミトコンドリ
アDNA（mtDNA）全塩基配列を決定する方法を例

患者1：18歳女性．頭痛，嘔吐を主訴とし入院．
CTで頭頂後頭葉に低吸収城を認めた．低身長，知能低下，痙攣発作，筋力低下，繰り返す嘔吐，片麻痺，半盲，乳酸アシドーシスを呈し，糖尿病，および肥大型心筋症を伴っていた．20歳で心不全のため死亡した．
患者2：13歳男性．低身長，知能低下，痙攣発
作，筋力低下，繰り返す嘔吐，片麻痺，皮質盲，
乳酸アンドーシスを呈し，肥大型心筋症を伴っていた．15歳で突然死した．
両症例ともに筋生検でragged−red fibersを認めた．家族歴はともに認められなかった．また骨格筋より単離したミトコンドリアのNADH−
ubiquinone oxidoreductase活性はともに低下していた．
方法
プライマー作製 約300塩基対の間隔でmtDNAのL鎖，H鎖それぞれに特異的な配列をもつ20merのプライマー（Lプライマー，Hプライマー）を各60種ずつ作製した．プライマーはアプライドバイオシステムズ社の390B型BNA合成

確立し，MELAS症候群の病因を解明した．

装置で作製し，同社のオリゴヌクレオチド精製カートリッジを用いて精製した．我々は次のようなプライマーの命名法を用いている．L（n）プライ
マーは塩基番号10n＋1から10n＋20までのL鎖の塩基配列をもつ20mefのプライマーをさす．H＊名古屋大学医学部第2生化学（n）プライマーは塩基番号10m＋20から10m＋1までのH鎖の塩基配列をもつ20merのプライマーをさす．さらに各Lプライマーの5，端側にM13−129−

mp18のユニバーサル配列（5，−TGTAAAAC−GACGGCCAGT−3，）をつけた38merのプライマ

性後，6％のアクリルアミドゲルで10時間泳動し，ーを60種作製し，FL（n）プライマーとした．

アプライドバイオシステムズ社自動DNA解析装

一次増幅

シークエンス反応を行なった．900C，2分間加熱変患者1の骨格筋，患者2の心筋組織置によりmtDNAの全塩基配列を決定した．またからtotalDNAを抽出した．以下のプライマー対コントロールとして正常ヒト組織より抽出したを用いmtDNA全長をカバーするように10のフ

mtDNAを用いた．

ラグメントに分けpolymerase chain reaction（PCR）法にて増幅した．L1641−H136，L6ト
H339，L231−H454，L372−H559，L488−H702，L680−H929，L853TH1338，L1250−H1534，L1482L
H1619，L1594−H60．
二次増幅

FLプライマーおよびHプライマー

を1：100の比で加え，aSymmetric PCR法により60種の一本鎖DNAを増幅した（図1）．それぞれのプライマー対の間隔は約500ないし800塩基対とした．
螢光色素シークエンス反応

調製した一本鎖

DNAを鋳型として，M13mp18のユニバーサル配列に螢光色素で標識した螢光プライマーを用いてH primer1

果

翻訳領域において患者1，2共通にアミノ酸置換をもたらさない10個の変異が見られたが，これらの変異はいずれもコントロールにも認められた．
さらに患者1に4個，患者2に7個のそれぞれに特異的な変異が見られた．またアミノ酸残基の置換をもたらす変異として，10個の共通な変異が見られ，そのうちの一つはヒト12），ウシ13），ラット14），マウス15）で保有されているものであった
が，コントロールにも認められた．さらに患者1
でNDI領域に，また患者2でND4領域に，上記哺乳類で保有されているアミノ酸残基の置換をもたらす変異を認めた．非翻訳領域では，2症例に共通してmtDNAの塩基番号3243番tRNALeu（UUR）遺伝子のdihydrouridine（DHU）ループにA→G塩基転位型突然変異が兄いだされた（図2，3）．この変異は他の2例のMELAS患者にお

− ，
− 1

SequenCe＼霊堂望空er

結

−−
− 1

mtDNA

AsymmetricPCR

いても検出されたが，7例の正常者およびMERRFl例とCPEO2例のmtDNAの塩基配

Single・Strand DNA

MELAS
Mutant G3，243

G

C

∝

−

−

−
−

−

−

−

■ −

−

1 1

−
●
■

IrL・HJいりHいい目−

T−＿．．．．叫．．r

−

−

C−

● ■

1

Djdeoxylerminalion

1

A
G
A lいバ⁚日日⁚H⁚⁚日日日日Cl

Dye prlmer

卜日日日日日日＝＝⁚

hhhhHhh
呈 上 l照雄潮目↓

日臣日日号‖PCR SequencLng

GGCAGGGCCCG

WiId type A3，243
GH日日日日＝ ＝＝＝＝⁚⁚⁚＝qくHいりHいりHHHH

1ControI

−
1
一

↓
図2

AutomatedDNASequenceAnaIysIS
図1

Detection ofA to Gtransitionmutation
atnucleotide3243inthetRNALeu（UUR）

Schema for fluorescence−based direct

genebyfluorescentbaseddirectsequenc・SequenClng

ing
ー130−

列の分析ではこの変異は認められなかった．
考察
我々は複合体Ⅰ欠損の原因としてND領域の変異を推定し，MELAS2症例の全塩基配列を決MitochondrialtRNALeu（UUR）

この変異により制限酵素A♪αJの認識部位を形成し，この制限酵素での切断により変異tRNALeu（UUR）はヘテロプラスミーの状態で存在することがわかった．現在，組織間および家系における変異DNAの占める割合の違い，また変異DNAの占める割合と酵素活性との関連につき検討中である．
また，患者2のtRNAAlaのTVCループにA一→

A Aminoacyl
G＝C acceptorstem
T＝A
T＝A
A＝T

TVCIoop
C川G

丁目

A

CT
C

二
＃

C

A

T

A

G塩基転位があり，このA塩基は哺乳類で保有されていた．MELAS症候群にこの変異をもつサブグループがあるのか今後の検索が必要であろう．
Tanakaらは小児発症の重症心筋症の1例でtRNAHeのTWCループのA→G塩基転位を報告しており，この変異も哺乳類で保有されていた17）．
tRNALeuに変異のある18）MELAS2症例でも心

A

二一一二

ATTTC

TAAAA

A

DHUIoop

CHG

丁目A

GHC

C‖G
A ＃ C
G ＃ T
A

G
T

CHG

A＝丁

T

T

G≡C
G

G

CCG

C

窃→A

A＝T

Variableloop

Anticodon
100p

工A A
図3

走した16）．しかしこの2症例に共通して認められ，かつコントロールに見られなかった変異は
tRNALeu（UUR）のA→G塩基転位型変異のみであった．このA塩基はヒト，ウシ，マウス，ラッ
トの他，ニワトリ，カエル，ウニ，およびショウ
ジョウバエまで保存されており（表1），このA塩
基のG塩基への転位がtRNALeu（UUR）の機能に大きく影響を及ぼすことが考えられた．

筋症をともなっていたことから，tRNA遺伝子上の柱間保存の高い塩基の置換による変異が心筋症の発症と関わっている可能性が示された．
一方，この2症例でそれぞれに特異的で，かつ柱間保存の高いアミノ酸の置換をもたらす変異がND領域に認められた．しかし，今回我々のコント
ロール2例ではこのような変異は一つも認めなか

Proposed tRNALeu（UUR）secondary
structure showing the mutation at3243
intheDHUloop．Barsindicatehydrogenbonds：＃indicates non−Standard basepalrS foundin tRNA．Nucleotide A（normal）and G（mutation）atposition
3243are highIighted

表l Comparison oftRNALeu（UUR）gene DNA sequences ofvaious species・
八八バ／J・り〃中心′・川′ハー′椚／叫軌血ヾJリ・J加′（・川／川JJバ／汗J血＼・
AtoGTransitionatthe5●EndofDHULoopoftRNALeu（UUR）inMELAS

AmillO■Cyl
ll亡m

MELAS
Human
80YineMouse
Ral
Chickcn
Jr爪印M
UrChin（∫．〝．）
Urchin（P．りDrOJ叩〟b

mAAGA
mAAGG
ATTAGGG
ATTAGGG
GCでAGCGGCTAGCGGCTAAAGACTAA姐TCTAATA

mU

DHU

〜ltln

l00p
G
AGCCCGGTAATG GCAGTG GCAGTG GCAGTG GmGTG GCAGTG GCAG
TA ∝抽
TA ∝姐
¶

GCAG

AGCCCGGTAA
AGCChGGAAAAGCCAAGTAAAGCTCGGCAA
AGCCTGGCTA

α1U Antit0くbn A仙亡don ▲nlito血n V山■bl亡 ¶忙Stem Slem
100p Sl亡m tOOp St亡爪TCGC A TAAAATTGC A TAAAA

mAh娘
mAAAC

CmA

TTGC G TAAGATrGC G TAAGh
ATGC A AAAGG

mA九hA

CCTTG

AG一一TGGTTA

ATGC A AAAGAATGC A GAAGG
ATGC A GAAGG

入T−TAGTGCA

ATGC A ATGGA

AG一一TGGTTAmA以CTTAAGC
CCTAAGC
CCTAAGACCTAAGATATAAGC−131−■iLfi了A

Cm
CCm
TCTTT
CCTTC
CCTTC
TCCAT

nGTC
TATCC

AGAGG
AGAGA

TTCCC
TTCCC

AGAGG
AGAGG
AGAGG
AGGGG

AT一cc

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CrATC
CTACA

AAAGG
AAGGT
AAA−G

T亡亡

忙

loop

如m

TTCAAでT CCTCTTTCAAAT CCTCTTTCAAAT CCTCTTrCAAAT CCTCTTrCAAAT CCTCTTTCAAAT CCCCTTTCAACT CCCTTTTCAACT CCCTr
TATTATT

C一m

AlninoICが〜lem
TCTTAACACCTTAACACCCTAATACCCTAATACCCTAGCTCGCTAACTCTTTAGCTTTTTAGCTTATTAGAA

った．種間保有の高いアミノ酸の置換をもたらす
変異は，MEALS症候群の発症になんらかの関わりを持ち，置換されたアミノ酸残基の種類によっ

Vivo DCand Rowland LP：Ann Neuro116：
481−488，1984．

7）Nishizawa M，Tanaka K，Shinozawa K，ては機能的な変化をもたらす可能性があると考えられた．

Kuwabara T，AtsumiT，Miyatake Tand

本研究において，我々は適当なprimerpairを作製，調整することにより螢光法を用いた全ミトコ

8）TanakaM，NishikimiM，SuzukiH，Ozawa

ンドリア遺伝子の塩基配列決定システムを確立した．このシステムを用いることにより一回の電気泳動の際に24種の試料を泳動でき，1試料あたりBiochem Biophys Res Commun140：88−93，

350−450塩基対を読むことができるため，3回の泳動で全長を読むことができ，数日で1症例のmtDNAの変異の解析を完了することが可能である．
まとOhama E：J NeuroISci78：189−201，1987．
T，NishizawaM，TanakaKandMiyatakeT：
1986．

9）IchikiT，TanakaM，NishikimiM，SuzukiH，Ozawa T，KobayashiM and Wada Y：Ann
Neuro123：287−294，1988．
10）IchikiT，TanakaM，KobayashiM，Sugiyama
N，Suzuki H，Nishikimi M，Ohnishi T，NonakaI，Wada Y and Ozawa T：Pediatr

めRes25：194−201，Ⅰ989．

螢光色素によるmtDNA全長16，569塩基対シークエンス法を確立した．MELAS症候群の2症

11）ChomynA，MariottniP，CleeterMWJ，Ragan
CI，DoolittleRF，Matsuno−YagiA，HatefiY

例に共通してミトコンドリアtRNALeu（UUR）遺and

伝子に変異を認めた．さらに症例特異的に種間保tivesofMitochondrialResearch，VolumeII：

存の高いアミノ酸残基の置換をともなう変異がBiogenesis

ND領域に見られた．

Palmieri，Saccone and Kroon）EIsevier

AttardiG：（ed

AchievementsandPerspec・

byQuagliariello，Slater，

Science Publishers，Amsterdam，NewYork，

文

献

0Xford，1985，pp259−275．

1）MoraesCT，DiMauroS，ZevianiM，Lombes12）Anderson S，Bankier AT，Barrell BG，deA，Shanske S，Miranda AF，Nakase H，BruijnMHL，CoulsonAR，DrouinJ，Eperon

BonillaE，Werneck LC，ServideiS，etal：NIC，NierlichDP，RoeBA，SangerF，Schreier

EnglJ Med320：1293−1299，1987．

PH，Smith AJH，Staden R and YoungIG：2）HoltIJ，Harding AE and Morgan−Hughes

Nature290：457−465，1981．

JA：Nature331：717，719，1988．

13）Anderson S，de Bruijn MHL，Coulson AR，3）Ozawa T，YonedaM，Tanaka，M，OhnoK，SatoW，SuzukiH，NishikimiM，Yamamoto

EperonIC，SangerFandYoungIG：J MoI

M，NonakaIandHoraiS：BiochemBiophys14）GadaletaG，PepeG，DeCandiaG，Quagliar−

Biol156：683−717，1982．

Res Commum154：1240−1247，1988．

ielloC，SbisaEandSacconeC：J MoIEvo1

4）ShoffnerJM，LottMTLezzaAMS，SeibelP，Ballinger SW andWallaceDC：Cel161：931−937，1990．

28：497−516，1989．

15）Bibb MJ，Van Etten AV，Wright CT，
WalbergMWandClaytonDA：Cel126：167

5）Yoneda M，Tanno S，Horai S，Ozawa T，
MiyatakeTandTsujiS：BiochemInt27：789−180，1981．

16）Tanaka M，Ino H，Ohno K，OhbayashiT，
Ikebe S，Sano T，Ichiki T，Kobayashi M，−796，1990．

6）Pavlakis SG，Phillips PC，DiMauro S，Der

WadaYandOzawaT：BiochemBiophysResー132−18）InoH，TanakaM，OhnoK，HattoriK，Ikebe

Commun（inpress）．
17）TanakaM，InoH，OhnoK，HattoriK，Sato
W，Ozawa T，Tanaka T andItoyama S：
Lancet336：1452，1990．

−133−

S，SanoT，OzawaT，IchikiT，KobayashiMand Wada Y：hancet337：234−235，1991．

23）COX部分欠損を伴ったLeigh症候群の生化学的分子遺伝学的検討
清 水 輝 夫＊
研究協力者

中

瀬

浩

Leigh症候群は主に乳幼児期に見られる亜急性の脳症として知られ，病理学的に中枢神経系特に脳幹・基底核・小脳・視床・まれには脊髄などに血管増生を伴う壊死組亀を認める点が病理学的な特徴とされてきたl）．臨床的に高乳酸血症を認めることより，その病因として好気性糖代謝異常が存在すると考えられている．多くの代謝異常が報
告されており，1）thiamine diphosphateから

史＊

萬

年

徹＊

的にLeigh症候群と確定診断されたcytochrome
OXidase部分欠損症の剖検例3例について生化学
的分子遺伝学的に検討しその結果を報告する．
方法

症例は第一例は5歳，第二例は二歳，第三例は7ヶ月の剖検例であり，第二例・第三例では同胞に同一疾患を認める．正常対照としては神経疾患

thiamine triphosphateへの転換の障害，2）
pyruvatecarboxylase deficiency，3）pyruvate
dehydrogenase deficiency，4）cytochromeoxidase（COX）deficiencyがあげられる2）3）．しかし，現在までに多数例の報告が認められるのは3）のpyruvate dehydrogenase deficiency及び4）のCOX deficiencyである．本研究では4）のCOX deficiencyに関して報告する．これらの症例の遺伝形式は通常は常染色体劣性遺伝であり，以外で死亡した7ヶ月及び3歳の剖検例を用いた．

本研究のCOX deficiencyにおいても，常染色体劣性遺伝と考えられている．またArmondMiranda

により還元されたcytochrome cを2から80JLM
基質として用いることによりKm及びVmaxをらはCOX deficiencyを伴うLeigh症候群のfibroblastとHela cellとのfusion cellを用いた測定した．

実験に於てHela ce11由来のmitochonderial

蛋白を電気泳動しニトロセルロース膜に転写後DNA（mtDNA）が消失LLeigh患者由来の

COX subunitII及びVIに対する抗体で検出した．

mtDNAのみになっているにもかかわらずCOX

免疫組織化学は各症例の骨格筋凍結切片を用い活性が保たれていることより，このCytOChrome

COX subunitII，VI，Vab，Vbc，ⅦIab，VtlIにoxidase欠損はmtDNAの異常ではなく核DNA

対する抗体を用いて行った．

剖検組織は死後3時間以内に凍結保有したものを以下の検討には用いた．
酵素活性はcytochrome c oxidase，rOtenOne−
SenSitive NADH cytochrome c reductase，
SuCCinate cytochrome c reductase，Citrate
Synthetase，NADH dehydrogenase，SuCCinate
dehydrogenase活性を既述の方法で測定した5）．
COXのMichelis定数測定のために，dithionate

Westernblottingには100Jgのミトコンドリアにコードされた因子の異常によることを示した一）．

mtDNAの定量のために各臓器のDNAを抽出

今回Ann Lombesらとの共同研究により病理学

し0．8％ agarose gelにおいて電気泳動後ニトロ＊東京大学医学部脳研神経内科

セルロース膜に転写後Southern hybridizationを行った6）．プローブはauthenticmtDNAを抽出して用い，また核由来のDNAのマーカーとして−134−

おいて明らかな活性低下を示してた．このように

18S rDNAを用いて検出した．
Northern analysisには各臓器より糾lanidium−isothiocyanate法によりRNAを抽出後

formaldehydeをふくむ1％agarose gelで電気泳動後nylone membraneに転写し，hybridiza−
tionを行なった．プローブはCOX subunitI，
ⅠⅠ，ⅠII，ⅤⅠ，Va，Vb，VIa，Vlb，VIc，ⅥIa，vuC，ⅦⅠすなわちⅦbを除くすべてのSubunitの本症の酵素活性の低下は中枢神経のみならず全身に及ぶものである．
次に還元型cytochrome cを基質としてMi−
chaelis定数を求めたが（図2），Kmは約6pMと各症例とも正常対照と同様の値を示した．
Vmaxは正常の30〜40％の値を示した．したがって正常と同じ性格を持つCOXが存在しているが量的に減少していることが推定された．
COX subunitII及びⅠⅤに対する抗体を用いた

CDNAを用いた．
結果

剖検された各臓器のミトコンドリア酵素活性は
図1に示したsuccinate dehydrogenase・Citratesynthetaseを含め他の電子伝達系各酵素の活性が正常であるのに対し，CytOChrome oxidaseの活性は部分的に低下を示し，特に骨格筋・心筋に

肌∃
ACTIV汀はS二■Cy10亡hlOmO C

Westernblottingの結果では，正常対照に比較してsubunitII及びIVは明らかな減少を示している（図3）．但し，Subunit間の量の比には変化は認められなかった．すなわち，COXは全体として蛋白量が減少していると考えられます．
このことは免疫組織化学的にも示されており（写真省略），SubunitII，IV，VIIabに対する抗体を用いた免疫組織染色では，正常対顔に比較して第2例の骨格筋において各subunitに対する染色性は明らかな低下を示してる．これは検索した○事はaseESu⊂C爪ale d油yd−Ogen85や田C・trate Synthase

図1各臓器のミトコンドリア酵素活性

60
40
加

︵lOLd D∈︑u盲︑の0−○∈ュ︶ ＞︑▼

＿0．3

．02

−0．1

0．0

01

02

0．3

04

05

1／S仙M）
図2

図3

COX subunitII及びⅥに対する抗体を用いたWesternblotting
同一量のミトコンドリア蛋白を電気泳動し各症例でのCOXのMichaelis定数の測定（●は正常対照，他は各症例）Kmは一定であることを示す．

た．ⅠⅠはsubunitII，ⅤⅠはsubunitVlを示
す．
−135−

Subunit Vab，ⅤIbc，Ⅷにおいても同様の結果であった．すなわち，本症の酵素活性の低下はCOX

は核にコードされたrDNAに対応するbandで蛋白量自体の低下による可能性が示されている．
このことは前に示したMichaelis定数Kmが正て，mtDNAの相対的な量を見ることができる．脳常であったこととも一致する結果である．症例2
でミトコンドリアDNAにコードされている
COmplexIのSubunlt，NDlのC末端に対応する
合成ペプチドを用いて作成した抗体で染色してみると，正常対照及び第2例の骨格筋の両者とも同様に染色され，NDlは正常量存在すると考えられあり，下のbandに対する上のbandの漉きによっにおいては明らかにmtDNAの増加を認め，このことはragged−red fiberが通常認められない骨格筋においても同様の増加を認める．肝臓を含めすべての臓器においてmtDNAの増加を認める．
最後にNorthern blottingにより，Ⅶbをのぞ
くすべてのSubunitのCDNAをプローブとして検討した．第一にすべてのSubunitのRNAは存る．すなわち染色性の低下はCOXに特異的なものであると示唆される．

在しsizeも正常であったことが言える．図5（B）

次にmtDNAを脳・骨格筋・肝臓に於て定量においては図4の上のbandはmtDNA，下のband様の結果であった．次にmtDNAの増加に対応す

8RAtN MUSCU≡
C

1．‥こ．∴諾ミ

2

3

C

LlVER
2

3

C

ミt曹￣●ご￣￣

2に示されていないSubunitHI及びⅧに関しても同るmtRNAの増加の有無を見ると，βractinをinternalcontrolとして，第3例では対照とほぼ同

3

一
一乱4
−6．7

図4

mtDNAのSouthernblottingを用いた定量
核DNAのマーカーとして18S rDNAをプローブとして用いた．上下のbandの相対的な量比で判定する．
出旺旺虻Ll lC沖）

岨

甲岬旦＿

8

8欝ネ

川■■ ■匹

・√■
∴：■

PAm冊2

8崇準

l

＿

V・・■疇

匹pl

出払h

岨

8

‡‡森鍋繰

州●

′…

−

V…鱒
図5

COX各subunitに対するcDNAをプローブとするNorthernanalysis
紬は症例3，（軌は症例1及び2の結果を示す．各パネルの左側は正常対凰右側は各症例．
β−aCtinをinternalcontrolとして用いた．
−136−

量でありmtDNAの増加に対応するmtRNAの増量は認められません．つぎに図5（A）では玩
VitYVである第1例のfibroblastを除いて，in
正和においては第1例の脳においてはむしろ減少しています．第2例の脳及び骨格筋に置いてはまだ始まったばかりであり，今後様々な検討が必要と考えるが，本症の異常がかなり複雑な機構である可能性があると考えられる．

多少の増加は認められるが，mtDNAのような著しい増加は見られていない．これはKSSやMERRFではmtDNAの増加にほぼ対応してmtRNAが増加していたことと対照的な一つの特徴点である．

文

献1）Leigh D：Subacute necrotizing ence−phalopathyninaninfant．JNeuroINeurosurg
Psychiatr14：216−221，1951．
2）DiMauro S，Servidei S，Zeviani M，et al：
Cytochrome c oxidase deficiencyin LeighSyndrome．Ann Neuro122：498−506，1987．

考察3）RobinsonBH：Cellculturestudiesonpatients

本症はCOX活性が全身的に低下する病態を示しているが，その本態はいぜんとして不明のままである．本研究で示されたようにCOXは各
Subunitとも蛋白量として低下することが明らかになった．しかし各subunitのRNAは相当量存在し，Sizeも正常であった．本症の本態として核にコードされたsubunitの異常である可能性は当然残されているが，すべてのSubunitの減少があることがはたして核にコードされたsubunitのpoint mutationで説明可能か問題が残る．またRNAの量的変化で蛋白量の減少を説明することは各subunitのRNAの絶対量は比較的保たれていることから言っても無理があると考えられる．
mtRNAがmtDNAの増加に対応して増加していない点に関してもこれが本症の病態に一義的なものなのか，二次的な減少であるのかは不明である．したがってむしろ核にコードされた調節因子の異常によるtranslationレベルの異常も考慮の対照になると考える．本症の原因に関する検索は−137−

With mitochondrial diseases：mOlecular
defectsin pyruvate dehydrogenase．JBio−
Snerg Biomembr20：313−323，1988．
4）MirandaAF，IshiiS，DiMauro S and Shay
JW：Cytochrome c oxidase deficiencyin
Leigh

s

syndrome：gehetic

evidenceforanuclar DNA−enCOded mutation．Neurology
39：697−702，1989．

5）Lombes A，MendellJR，Nakase H，et al：
Myoclonic epilepsy and ragged−red fibers（MERRF）withcytochromeoxidasedeficien・
Cy：neurOpathology，biochemistry，andmoleculargenetics．Ann．Neuro126：20−33，
1989．′

6）ZevianiM，Moraes CT，DiMauro S，et al：Deletions of mitochondrial DNAinKearns−
Sayre symdrome．Neurology38：1339−1346，
1988．

24）筋緊張性ジストロフィーにおけるミトコンドリアDNA異常
佐

衣

斐

達＊

の特徴は中心核の増加と，type1線維萎縮である．
またミトコンドリア・ミオバナーである慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）などに特徴的に認められる
ragged−redfiber（RRF），CytOChromecoxidase（CCO）活性陰性線経やミトコンドリア内封入体などのミトコンドリア異常の存在も示唆されている2）．本研究はMyDにおける好気的エネルギー代
謝を反映するミトコンドリア異常の病態への関与を明確化するために，生検骨格筋においてミトコ＊

筋緊張性ジストロフィー（MyD）は常染色体優性遺伝を示し，異常遺伝子坐位はChromosome19
長腕上にあることが明らかにされている．主要な臨床症状として特徴的な骨格筋症状に加え，知能低下，白内障，禿頭，心伝導障害などを呈し，早老症としての所見を有している1）．本症の筋病理

＊

は じめに

＊

大 野 欽 司＊＊ 田 中 雅 嗣＊＊＊

＊

為＊

拡将

伯

高

代

防澤

田

周小

研究協力者

功＊

橋

例歩行可能な成人MyD13例〔（男7，女6），年齢
39．9±9．3（平均±標準偏差）歳，罷病期間12．2±
6．8年，生検部位は上腕二頭筋7例，大腿四頭筋5
例，俳腹筋1例〕につき実施した．
組織化学的検討は，新鮮凍結連続切片におけるGomori trichrome変法，コハク酸脱水素酵素（SDH）およびCCO活性染色標本につき，ランダ
ム検鏡下にてRRFおよびCCO活性陰性線維頻度を算出した．
ミトコンドリアDNA（mtDNA）解析は，MyD
生検筋および年齢対照の非悪性腫瘍・非神経筋疾患患者より得られた生検筋（男12，女8：20筋，
平均年齢46．9±19．9歳，年齢分布7歳〜76歳）より得た全DNAを用いた．mtDNA解析はSbuth−
g用あわJ解析，PCR法を用い，さらに詳細な欠失確認を目的としてPCRサザン，primershiftPCR

ンドリア異常に関する病理的および遺伝子学的解析を行なった．

法，欠失部位周辺のmtDNAの直接塩基配列決定を自動シークエンサー法（アプライド・バイオシ
ステムズ・ジャパン社製）により行なった．また対象および方法

PCR産物（0．5JLl template DNA中の塩基番号
8，531〜13，400間を増幅した8／JIPCR産物）について欠失mtDNA量を定量化した．

方法は成人発症MyDにつき以下の検討を行なったがその詳細は割愛する．
まずミトコンドリア異常のスクリーニング法である自転車エルゴメータ負荷試験の血清中の乳酸，
ピルビン酸値の推移を，検索可能であったMyD
例と正常対照とミトコンドリア・ミオバナー患者の結果と比較し，その意義を検討した．
ついで生検筋の病理，分子遺伝学的検索を，全＊愛知医科大学第四内科＊＊名古屋大学医学部神経内科＊＊：＊名古屋大学医学部第二生化学

そして以上の結果を加齢を含むMyDおよび対照例につき相関を検討した．
結果
自転車運動負荷：血清中の乳酸・ピルビン酸値

は，MyDでは負荷方法の問題例を除外したため症例数が少なかったが，有意な増加を示したミトコンドリア・サイトバナー比較してMyDでも負荷後に上昇し，また運動負荷前後値の差（デルタ−138−値）またデルタ値と負荷前借との比（増加率：％）においてミトコンドリア・サイトバナーおよび対
照例との間に有意差はなかったものの，高値傾向が示された．
病理解析：RRFは13例中8例，CCO活性陰性
線経は9例に認め，その頻度（平均±標準偏差）
は夫々筋線維10，000本中で前者は50±116，後者は41±116であり，連続切片にて両者はほぼ対応して存在した．なおRRFはSDH染色にて評価した．
30歳以下の対照例ではRRFもCCO活性陰性−Hl，643）間をオリゴヌクレオチド・プライマー（20mer）を用い30回増幅し，mtDNA断片を検出した結果，仝13症例に複数の異常バンドを証明したが（図1），一定の欠失バンドは明らかではなかった．なお検索した30歳以下の対照例では正常
mtDNAのみを認めた．
表

MyD患者での病理学的定量解析と欠失
mtDNA量解析の結果
RRF：ragged−red fiber，CCO活性（A）・
F：CytOChrome c oxidase活性陰性線経，
M：男，F：女，B：上腕二頭筋，VL：外側広筋，G：排腹筋

線経も認められず，またMyDの2男性例では約1−4．5％と異常線維密度が高く，また全くRRF

C8Se Sex A卵＃

Site（YearS）（／104）（／104）（ng／山）

2
2

︻
6
3
8

9
8
0

∧

6

0

0
7

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︻

2

一
1

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7

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■

3

4

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．
D

0

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2

1

．

虻 r

L

r

0

1

V

1

‖
V

5

−

R

l■−二︻

︺

910111213

図1MyD患者生検筋PCR解析での多重欠失mtDNA
mtDNAマップ上塩基番号8，531〜13，400間を示す．Lanel〜13：MyD，LaneC二24嵐
男性，事故死例
−139−

▲ 4

4

U

0

V

2

8

9

．

n

0

L

4

7

﹁ 〇

0

0

2

U

︻ J

8

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ウ リ

3

2

L

3

n

亡 つ

L

7

U

3

5

7

7

3

2

D

q −

M

4

U

9

9

D

3

M

C123

9

8

9

1

n

5

13．400

4．9−

6 ・ −

▲

1

▲

8

7

F

Å勒汝等蕗

kb

8

U

6

V

M

7 L

ll kb

暮

8，531

9

Q

O

1

B

F

▲ q

4

10kb

暮

3

H

−

U

F

9kb

−

7

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▲

−

n

3

M

∧ U

4 ． 4

■ U

M
F

F

4

4

F

4

6 0 5．4 0 2 dU 5 nU 8 7 2 0

8

￡ U

M

mtDNA上の塩基番号8，531−13，4000（primer；
L853−Hl，338）間および13，101−16，450（Ll，310

っ一方PCR解析はdenature940C，15秒；aneal−
ing550C，15秒：extend，720C，40秒の反応系で白iopsY Ouration RRF CCO（」・F deletedmt DNA（y・〇・）
Mか②③骨⑤⑥君⑧昏⑫⑪曾⑬が観察されない症例は4例，CCO活性陰性線経のそれは3例であった（表）．
分子遺伝学的解析：制限酵素吾川ⅠⅠ消化によるSourthem blot解析では16．6kb正常mtDNA
バンドのみを認め，欠失mtDNAは確認されなか
った．

0
5
0
4
0
3

︵一ユ盲⊂︶くNQI∈PO盲一〇P−Olu⊃○∈く

100

400

NumberoHib訂8（per10．000fibers）

図3

l
l

図2

RRF（黒丸）とは相関係数r＝0．8．，危険率p＜0．01（回帰直線：実線），CCO活性陰性線維（白丸）とは相関係数r＝0．77，危
険率p＜0．01（回帰直線：破線）で有意の正の相関を認める．但し図右端の一例は棄却検定により棄却した．

MyD患者1（表）におけるprimer shift
PCR法の結果︵きき︶VNQ盲P01￠︼名IOlu⊃OEく

1症例（表 Lanel）におけるprimer shift
PCR解析（primerL932，H1308間）では，塩基番号9，321−13，100間の約3．8kbの欠夫が確認された（図2）．さらに同部位は，自動シークエンサ
ー解析にて欠矢部両端に5′−TAGAAG−3′の6塩基の直接繰り返し塩基配列が証明され，欠失確
認領域はwild typeのmtDNAマップ上のCO3gene内の5，側のposition 9，593からND5 gene
内の3，側position13，052間の3，460bpの欠矢が確認された．
mtDNA解析結果と病理・加齢の比較検討：欠失mtDNA量とRRFおよびCCO活性陰性線経の頻度は相関した（図3）．すなわちRRFとCCO
活性陰性線維密度と欠失mtDNA量との結果は一部を棄却し検定した結果，RRFは相関係数0．80，ccO活性陰性線維0．77と正の相関を示した．
また欠失mtDNA量は加齢（図4）とともに増加し，とくに30歳以降の症例にて対照と比較してRRF，CCO活性陰性線経と，欠失mtDNAの相関80
A9台（years）

図4

MyD患者と対照例における欠失mtDNA
量と加齢との相関
MyD患者（黒丸），対照例（白丸）とも加齢とともに欠失mtDNA量が増加し，MyDにおいて増加が顕著である．

mtDNA欠矢に関連LRRFやCCO活性陰性線

考察
ミトコンドリア・サイトバナーとしてのCPEO経が多数観察されるが彗本研究においてMyD例の骨格筋においても低頻度ではあるが定量的に確認された．
そしてmtDNA解析では多重欠失mtDNAがPCR法にて示されたが，低密度のRRF，CCO活
性陰性線経におそらく対応し欠失mtDNA量はおよびKearnsrSayre症候群の生検骨格筋には微量であった．さて欠失mtDNAの蓄積が，変性も明らかにMyD例に顕著で有意（p＜0．05）な増加を示した．

−140−

疾患や加齢現象と密接な関係を示すことが一部に報告されている．すなわち加齢によりミトコンド
リア呼吸鎖活性は低下し，また心筋のCCO活性
陰性線経は増加するとされ4），加齢者やパーキン
ソン病患者の線条体に欠失mtDNAが確認されている5）．
本研究にてRRFおよびCCO活性陰性線経は欠失mtDNA量と相関し，かつ欠失mtDNA量はと加齢とともに増加することが確認された．とくに加齢に伴う欠失mtDNA増加がMyDにて促進され，故に本疾患における早老性所見としての
骨格筋所見，知能障害，白内障，禿頭などはmtDNA欠夫の加速と蓄積と何らかの関連を持つことが示唆された．そしてMyDにおける欠失
mtDNAの蓄積は，核遺伝子との相互作用の結果
あるいはmtDNA障害により発生した蛋白合成

文献1）Goldstein S：Human genetic disorders thatfeature premature onset and accelerated
progression

genetics

ofofbiologicalaging．

（edbyaging．

The

SchneiderEL）

NewYork PlenumPress，1978，pp171−224．
2）Isashiki Y，Kawabata E，Ohba N，et al：
Mitochondrial abnormalitiesin extraocular
musclesinmyotonicdystrophy．Neur0−Ophth−almology9：115−122，1989．

3）HoltIJ，Harding AE，CooperJM，et al：
Clinical and biochemical features ofpatients

30

with major deletions of muscle

mitochondrial DNA．Ann Neurol162：664−
672，1989．

4）MQ11er−H6ckerJ：Cytochrome，C，0Xidase

障害の結果である可能性も推察された．
最後に，MyDにおける欠失mtDNAとそれに伴うミトコンドリア機能異常はMyDにおける臨

deficientcardiomyocytesinthehumanheart

床病態と深く関連している事が明らかとなった．

5）IkebeS，TanakaM，OhnoK，etal：Increases−An age−related phenomenon．AmJ Pathol
134：1167−1173，1989．

ofdeletedmitochondrialDNAinthestriatum
in Parkinson，s disease and senescence．
Biochem Biophys Res Commun170：1044−
1048，1990．

−141−25）家族性労作性ミオグロビン尿症におけるミトコンドリアDNA変異

秀
＊

＊

＊

功

＊

＊

野二桁

井佐

＊

ビン尿症の兄弟例を経験し，その骨格筋ミトコン
ドリアDNA（mtDNA）変異の検索を行なった2）．

脚紆

＊

＊

天代謝異常症はいずれも骨格筋エネルギー産生に重要な役割を担っている酵素の欠損症である1）．
一方，骨格筋における最も重要なエネルギー産生装置であるミトコンドリア電子伝達系の欠損による本症の報告は従来ない．我々は，骨格筋ミトコ
ンドリアの形態異常を伴う家族性労作性ミオグロ

雅＊

労作性ミオグロビン尿症は運動・過労・飲酒後に誘発される発作性の筋肉痛・脱力および褐色尿を特徴とし，腎不全の合併が時に問題となる．本症には家族性に発症する一群があり，先天代謝異常症に起因すると考えられている．原因となる先

＊

＊

は じめに

中斐

田衣

＊

司為将

欽伯高

野代澤

大田小

研究協力者

国内であったが，15ワット15分間のエルゴメータ
運動負荷にて血清乳酸・ピルビン酸は両者とも異常高値を示し，骨格筋におけるミトコンドリア電子伝達系の異常が示唆された．
生検骨格筋病理：生検は上腕二頭筋より行なった．Gomori染色変法・CytOChromecoxidase活
性染色・SuCCinate dehydrogenase活性染色を行ない，さらに電顕による検索を行なった．
酵素活性：ミトコンドリア電子伝達系複合体Ⅰ，
ⅠトⅠⅠⅠ，ⅠⅤの活性を単離したミトコンドリアにつき既報に従い測定を行なった3）．
Southern blot法：10mgの生検骨格筋より単離したtotal DNAを制限酵素PvuIIにて切断後，0．6％アガロースにて電気泳動・アルカリプロットを行なった．全長mtDNAをプローブとして対象と方法
症例：症例は，3人兄弟の次男・三男で，両親は血族結婚ではない．患者1は，26歳男性で，18

hybridization後，ECL（Enl1anCedChemilumines−
cence）法にて検出を行なった．
PrimershiftPCR法：mtDNA欠失の好発部位

歳時，飲酒後・過労後の褐色尿を自覚し，22歳時
よりしゃがみ立ち困雉・労作時呼吸困難が発現し，入院精査をした．患者2は，21歳男性で，18歳時
大量飲酒後の高CK血症の指摘を受け，登山時の褐色尿・大腿部筋痛にて入院精査をした．血清CK
値は両者とも変動を示しながらも高値を示した．
安静時の血清乳酸・ビルビン酸は両者とも正常範を挟むプライマー対を用い，PCR法にて異常バンドを検出した．さらに左右のプライマーをそれぞれ約300塩基ずつずらすprimershiftPCR法にて
異常バンドが欠失mtDNAに由来することを確認した．

＊名古屋大学医学部神経内科＊＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊＊愛知医科大学第四内科

Coronydirectsequencing法：PCR法にて増幅された異常バンドを適当な制限酵素にて切断後，プラスミドpUC19にクローン化した．欠失領域を決定する目的で，トランスフォームされた大腸菌
JM109のコロニーより直接にPCRを行ない，挿−142−

入DNAの塩基配列を決定した．
Direct sequencing法：mtDNA多重欠夫の病因を検索するため，aSymmetric PCR法による
mtDNAのmajor non−COding領域の直接塩基配列決定を行なった．
結果

電顕による検索では，結晶様封入体を含む異常ミ
トコンドリアが認められ，グリコーゲン顆粒の増加も認められた．
酵素活性：患者2の生検骨格筋より単離したミトコンドリアの電子伝達系酵素活性は，いずれも正常範囲内であった．

生検骨格筋病理：図1に患者1生検骨格筋の組
織化学染色と電顕の結果を示す．中心核・硝子様変性に加え，raggedィed fiber，CytOChrome c
OXidase活性陰性線経が認められた．患者1・2のragged−redfiberの比率はそれぞれ4．7％，1．1％であった．さらに，CytOChrome coxidase活性Southern b10t法：図2に生検骨格筋mtDNAのSouthern blot分析の結果を示す．患者1・2（1anesl，2）では，コントロール（laneC）では認められない複数の異常バンドを検出した．異常バンドは両者に共通に検出されたが，患者1では7kbのバンドが優位に，患者2では13kbのバンドが優位に認められた．

陰性線経の比率はそれぞれ8．7％，7．9％であった．

Primer shift PCR法：図3にprimer shift

図1患者1生検上腕二頭筋の組織化学染色・電顕㈹Gomori染色変法，担）電顕（bar＝0．1JLm），（C）コハク酸脱水素酵素活性染色，（切チトクロームC酸化酵素活性染色−143−

PCR分析の結果を示す．ATPase8／6遺伝子から
ND5遺伝子の領域の増幅にて，患者1では3．7kbと4．1kbのmtDNA欠夫がprimer shift PCR法
により確認された．患者2では3．5kb，3．9kbのmtDNA欠夫が確認された．
Colony direct sequencing法：上記primer
shift PCR法にて検出された異常バンドを制限酵
素切断後，Shot−gun法にてsubcloningL，欠失領
域の塩基配列決定を行なった（図4）．3，915bpから5，550bpの欠失mtDNAの欠失領域には，2bpから12bpの直接繰り返し塩基配列が認められた．
同様にCOl遺伝子からmajornon−COding領域にわたるmtDNA欠夫の欠失領域塩基配列決定を行なった（図5）．図4に示すmtDNA欠矢と同様に，欠失領域の両端に完全もしくは不完全な直接繰り返し配列が存在した．この多重欠矢は，塩基番号16，052から16．075の約20bpの範囲に終止していた．
Directsequencing法：患者1・2のmajornon−COding領域の直接塩基配列決定を行なったところ，Andersonら4）の報告したヒトmtDNA塩基配列からの変異が16ヶ所に認められた．変異はいず

図2

図3Southern blot分析

れもinsertionもしくはtransitionであり，tran−

Primer shift PCR分析 白矢印の先は正常mtDNA断片を示す．黒矢印の先はL鎖とH鎖の両方のprimershiftにて確認された欠失mtDNA断片を示す．各レーンは，C：コントロール，Pl：患者1，P2：患者2を示す．
−144−

9kb lOkb ll kb
l

12kb

l

13kb

l

I

14kb

l

l

ATPaseS／6＝⇒L853

H1420台コム▲

βn‖〃i万rllr・dgmn一

一†…・・

r一事−州二ム
βrJI…・5．487bp

二日目………………4，368

bp

F叫叩川り

一一（＝…■＝3．798

Fn甘¶川tl■

5，550

FrTm州1

ト・・…‥…＝……・4．240

▲
〝hCIl

bp deletionbp deIel10n

bp deklion…………・＝…＝…‥…‥‥…………：

t＝eLg53ム▲▲▲
J／hrH〝血rH／／〃比・ll

日1338く＝＝コ▲β（イⅠFrag叩両7−−■・…‥

▲

▲

▲

▲

坤旭II J巾dHβrJIJ巾d‖…・3．915／伽lI

bp deleIion……………………ニPatientl
Flagmentl CAACCQmでCACt一日一一一etaa亡M）ATAACC・5．咄7bp
T8．657
Fragment2

T14．145CGACCCTATATCCCCト一一一一一日一一一一エ⊆）TAGkCC・3，798bp†10，195†13，994

Fragment3

ccGCTA肌m卜一一一一aateeeCt）でCTAGG・4，368bp

Fragment4

CATTCTATm（一一一一一一一ttm）GAGCAA・5．5刃bp†9．587†8．609†13，956

Tlり60

Fragmont S TTCTTCG⊂AGGmトーtte甲やatttICTCATA・4．240bp†9．494

T13．735

Patient2
Fragment7

C∝TTA芯誠ド皿ト一一一一知己ヱgコエ）GTAGGA・3，915bp
T8．859†12．775

図4 Colony direct sequencing（COding領域）．
（A）PCR増幅に用いたプライマー対を自矢印で示す．黒のバーはPCR
増幅された領域を示している．subcloningに用いた制限酵素の認
織部位の矢印の先で示す．欠失領域は括弧内に示されている．（B）欠失点は括弧で示す．小文字は欠失領域内の配列を示す．直接繰り返し
配列を下線で示している．右のカラムには，欠失mtDNAのサイズを示す．

SVerSion，deletionは認められなかった．5ヶ所の変異は自験コントロール例にも既報告コントロー

phofructokinasedeficiency（Tarui），3）phos−

ル例5）においても認められない変異であった．16
ヶ所の変異の内，哺乳類で保有されている領域における変異は3ヶ所であった．コントロール例において認められず，保有された領域に存在する変異は，塩基番号217におけるTからCへのtran−

phosphoglyceromutasedeficiency（Kanno），5）

sitionのみであった．この変異は，CSB−Ⅰ（Conser・
Ved Sequence Block−I）に位置していた．
考察
家族性労作性ミオグロビン尿症において報告されている酵素欠損は以下の6種類である1）：1）
phosphorylasedeficiency（McArdle），2）phos・

phoglyceratekinasedeficiency（DiMauro），4）
Lactate dehydrogenase deficiency，6）Car−
nitine palmitoyl transferase deficiency（DiMauro）．1）から5）は糖代謝に重要な役割を果たし，6）は脂肪利用に重要な役割を果たしている．本例では前腕虚血運動負荷試験が正常反応を示したことにより1）から5）の酵素欠損は否定される．6）は電顕にて脂肪滴のみの増加を特徴とし6），本例の電頭像とは異なる．本例において認められたragged−red fibersとcytochrome coxidase活性陰性線推，さらに電顕でのグリコーゲン頗粒の増加は，ミトコンドリアにおける電子

−145−

8kb

lOkb

l

l

ATPase8／6

12kb

14kb

ND3ND4L

H1619￠コ

E⇒L731
A A A▲▲∬毎日一肌kl

加dI〟〝′H

Fragmen11−−■………………………………・8，127
FraBTnenl2

こ……・

Fragm即t3……‥7．778bp delelion…………………………ト
bp deletion

く……………………………7．664

・…・

……＞

bp deletion…………………………ナ

H1619￠コ＝⇒L731A A A▲▲

加dIガムdlFragm印t4

ズ♭dl

勘川I

ぐ＝…………………………・7，815

Fragment5■■十・・・・・・・・・・・・・・・……

Fragmen16−−（………・・・……

・・・

・

…・

bp delelion・・・‥・…………………‥十＝・・・8，151bp deletion……

・8，214・・・・・・・………・＞

bp deletion………・・・・・・・・・…………＞Patien11
Fragmentl CTAATCTTCAACTCCト一一一一一一一一一⊆⊆）CATCAA†7．945−8．127bp†16，073

Fragment2

ccccTCTAGAgCC；遇い一一一一一一一エ∈エi）TCAACA・7，丁78bp

F柑gment3

AACTAAATACTACCE止且一一一一一一一山）CCACCC・7．6朗bp

T

8．296

T16．075†8．387†16，052

Palient2
Fragmont

4

TTGAAATAG（和￡G（一一一一一一一一一一一一）13＝ATC・7，815bp

Fr8gment

5

CGAGTACACCGACT息（一一一一一一一一一一一且

T8，255†16，071†7．923Fragヮ1ent

6

TAACAGACGAGGエ払（−−−でロ仏⊂九・印51bp
T16．075

一一土工i）CCCATC・8．214bp

図5 Colonydirect sequencing（non−COding領域）．
（A），（B）ともに図中のマーカーは図4に準ずる．

伝達の障害を特徴的に示している7）．

麻痺を伴っていない点が特異である．欠失領域両骨格筋ミトコンドリア電子伝達系の障害は，好気的運動負荷試験による乳酸・ピルビン酸の異常
上昇によっても示され，ミトコンドリアミオバナーと診断され得る．しかし，本例はミトコンドリ
アミオバナーに特徴的な外眼筋麻痺などの症状を欠き，ミトコンドリアミオバナーの非典型例と考えられた．
外眼筋麻痺を伴うミトコンドリアミオバナーにおけるmtDNA変異の多くは正常mtDNAと欠
失mtDNAの2種類が混在するへテロプラスミ
ー型である8ト10）．一方，正常mtDNAと多重欠失
mtDNAが混在するプレイオプラスミー型変異も報告されている1ト13）．本例はプレイオプラスミー
型mtDNA変異であったが，前述のごとく外眼筋端における直接繰り返し配列の存在は，既報告と同様に，本例におけるmtDNA欠失にrecom−
bination類似の機構が働いている可能性が示された14）15）
MtDNAでは，D−loop領域を中心とする
majornon−COding領域に，mtDNAの複製・転写に重要な各種因子の認識部位が存在している．図5に示すように，多重欠矢の終止点がmajornon−COding領域の約20bpの範囲に存在したことより，この領域におけるmtDNA点変異が多重欠矢を惹起する可能性が考えられた．
Major non−COding領域の直接塩基配列決定では，H鎖複製開始点（D−loop開始点）の上流に位置するCSB−Ⅰ領域にコントロール例では認めらー146−

れない変異が患者に存在した．CSB−I領域はD−
loopstrandのRNAprimerを合成する上で重要な役割を果たしており，また二次構造予測でもステム構造を取る部位に一致しており，機能的に重要な部位と考えられた．この点変異の他に15ヶ所のinsertion，deletionが本例で同定されており，
これらの変異のいずれか一つかあるいはその集合
が，mtDNA多重欠矢を惹起する機序が想定された．
今回の検討により，mtDNA多重欠夫によるミトコンドリア電子伝達系の欠損が，家族性労作性
ミオグロビン尿症の病因となることが判明した．

7）DiMauroS，SchotlandDL，Bonilla E，etal：
Progressive ophthalmoplegia，glycogenstor・

age，and abnomral

Neuro129：170−179，1973．
8）HoltIJ，Harding AE and Morgan−Hughes
JA：DeletionsofmusclemitochondrialDNA
in patientswithmitochondrial myopathies．
Nature331：717−719，1988．
9）Ozawa T，Yoneda M，Tanaka M，et al：Maternalinheritance of deleted mitochon−
drial DNAin a fami1ywithmitochondrial
myopathy．Biochem Biophys Res Commun

さらに，本症におけるmtDNA多重欠矢の原因に，mOjornon，COding領域における変異が関与している可能性が示された．

mitochondria．Arch

154：1240−1247，1988．

10）Moraes CT，DiMauro S，Zeviani M，etal：
MitochondrialDNAdeletionsinprogressive
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文献1）PennAS：Myoglobinuria．

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Myology

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11）ZevianiM，ServideiS，Gellera C，et al：An

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2）Ohno K，Tanaka M，Sahashi K，et al：deletions ofmitochondrialDNA startingat

Mitochondrial DNA deletionsininherited

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recurrent myoglobinuria．Ann Neurol（in1989．

12）Yuzaki M，Ohkoshi N，KanazawaI，et al：press）

3）Yoneda M，Tanaka M，NishikimiM，etal：
PleiotroplC mOlecular defects
transducing complexesininMultipledeletionsinmitochondrialDNAatenergyTdirectrepeatsofnon−D−loopregionsincases

mitochondrial

offami1ialmitochondrialmyopathy．Biochem
BiophysResCommun164：1352−1357，1989・

encephalomyopathy（MELAS）．JNeuroISci

13）SatoW，TanakaM，OhnoK，etal：Multiple

92：143−158，1989．

4）AndersonS，BankierAT，BarrellBG，et al：

populations of deletedmitochondrialDNA

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mitochondrialgenome．Nature290：457−465，

method．BiochemBiophysResCommun162：

1981．

664−672，1989．

5）Horai S and Hayasaka K：Intraspecific14）Tanaka M，Sato W，Ohno K，et al：Direct

nucleotidesequencedifferencesinthemajor

sequenclngOfdeletedmitochondrialDNAinnoncoding region of human mitochondrial

myopathic patients．Biochem Biophys Res

DNA．AmJ Hum Genet46：828−842，1990．

Commun164：156−163，1989．

6）Bank WJ，DiMauro S，Bonilla E，et al：A15）Schon EA，Rizzuto R，MoraesCT，etal：A

disorder of musclelipid metabolism anddirect repeatis a hotspot forlargerscale

myoglobinuria．NEnglJMed292：443−449，

deletion of human mitochondrial DNA．

1975．

Science244：346−349，1989．
−147−26）ミトコンドリア・ミオパテ一における末梢神経障害水 澤 英 洋＊研究協力者

大 越 敦 夫＝ 金 澤 一 郎＊

ミトコンドリア脳筋症は，臨床的に多種多様であり骨格筋以外にも末梢神経を含むさまざまな臓
器・組織が障害され得る1）．しかしながら，末梢神経障害はこれまであまり注目されていない2）3）．本研
究の目的は，ミトコンドリア脳筋症における末梢神経障害の特徴とその意義を明らかにすることに
ある．
方

法

末梢神経障害をともなうミトコンドリア脳筋症
6例（表1）について，その臨床症状および神経
伝導速度，筋電図，神経・筋生検などの検査所見の分析を行った．さらに，文献上報告された末梢神経障害をともなうミトコンドリア脳筋症の症例につしごても同様な分析を行い，自験例の分析結果とあわせて検討した4）．
結果

自験6例の臨床症状，検査所見のまとめを表1に示す．症例1−3は，主に骨格筋と末梢神経が障害されているのに対して，症例4−6は，骨格筋，末梢神経，中枢神経などが広範囲に障害されておりmyoclonus epilepsy with ragged−redfibers（MERRF）あるいはmitochondrial
myopathy，enCephalopathy，lacticacidosisand
StrOke−1ikeepisodes（MELAS）と診断された．
まず，症例1−3に注目すると，これらでは障害が骨格筋と末梢神経にほぼ限局していることか＊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊日立総合病院神経内科

ら，例えばmitochondrial myopathy and peri−
pheralneuropathy（MMPN）と呼ぶことができる．臨床的に明らかな感覚障害を呈し，感覚・運
動神経伝導速度の低下，筋電図・筋生検での神経原性変化の混在（図1，2）を認めた．肪腹神経
生検では有髄神経線経の減少，小神経の集族，髄鞘の非薄化に加えてOnionLbulb形成（図3）や節性脱髄が認められた．文献上，このような症例は多くはないが確実に存在しており（表2），その認識は重要である5）．とくに症例3のように筋障害が軽く末梢神経障害が前景に立ってくることがあり，このことはミトコンドリア異常によりほぼ純粋な末梢神経障害が生じ得ることを示唆している．
Kearns−Sayre症候群（KSS）については，自験
例のなかに典型的症例はないが，症例1−3には軽度の眼症状があり症例1，2ではKSSに見られるようなミトコンドリアDNAの大きな欠矢が認められた6）．ぉそらく，近縁の病態と思われる．
文献上，KSSでは表3のように多数の報告があり，その臨床・検査所見はMMPNとよく似ていた．
症例4はMERRFで，臨床的には感覚障害はな
かったが，検査上明らかな末梢神経障害が認められた．文献的にも非常に高頻度に認められ，むしろ末梢神経障害はMERRFの特徴の一つと言える（表4）．剖検例の検索でも脊髄に加えて，末梢神経，後根神経節，脊髄神経根の病変が確認されている．
症例6はMELASで，臨床的に感覚障害は見られず，神経生検でも一見正常と思われるほどであったが，よく観察すると軽度ながら明らかな軸索ー148−

表1Peripheral neuropathy in 6
mitochondrialmyopathies
Case l Case

DiagnoBIs

3

Case

4

CaSe

5

胱PN kERRF XEuは
H
︐3
9
⊥

3

2

F
2
94
4

3

73

F

4

8⊥

H

十

Case

6

XEuは
37，¶
19

十

十

■

＋

十

■

■

十
＋／＋ ＋
−

一

■−■

■

一

十

十

＋／−−＋

＋
−＋／
十一
＋

＋／

＋

■

−︼ l ＋／ 十 十 十
十

︼

十

十

■

十／−
−

十

＋

十

＋

十

十

工 ュ
−43N

＋
＋−＋

十

2
5N

■

■

07N
＋33 ＋
口

十
＋

N
24 十
＋34概

51Ⅳ
＋34
＋
心

十

＋
︼ 十

十

＋

十

十−−

十

■
︻

■

十

十

（CaSeSl and2；nlzus洲a et al1988，CaSeCaSe6；Suzukl et a11988）

十

＋

＋

Onln⊥bulb fo王1natlon＋

thln myelln
Segmental demyellnatlon＋

myellnated flberloSS
axonal degenet、atlon
8mall nerve eluBter＋

Suェ、al nerve blopSy：

Case

胱PN

8

Sen80rylosS
SCV．sural（皿／See）
HCV，perOneal（m／sec）
EHG

6⊥
4

Stroke−1まke eplsodeLa（：tle aeld0616

H

Age．SeX
Onset age
Famlly hlstory
Optle atrophy
Ptos18Husele veakne88
Hyodonus／ebl．ataxia
SelZure2

胱PN

cases of

4；Sa5aki et al1983，

JNl

！十

m・gaStrOC．

図1筋電図で高電位，多相性で持続の長いユニットが見られる（症例1）

図3 有髄神経線経の脱落，髄鞘の井薄化，Onion−bulb形成が明らかである（症例1，俳腹神
経生検，tOluidineblue染色，×1000）

図2 筋生検でタイプ・グルーピング，小角化線
維とその集族など神経原性変化が見られる（症例2，大腿四頭筋，ATPase，pH4．6，
×170）

変性，小神経の集族，Onion−bulb形成が認められた（図4）．文献的には，頻度は多くないがかなりの報告例が見られた（表5）．症例5は，末梢神経障害が高度でMERRF様症状をともなう
MELASと考えられたが，MERRFあるいはMELASに報告されているミトコンドリアDNAの点変異は認められなかった．
そのほか，Leigh脳症などでも末梢神経障害が知られている4）．また，膀胱・直腸障害を呈する症例が報告されており，そのほとんどが末梢神経障
害も伴っていた4）．
−149−

表2
1980
1986
1988
1988
1989
1990

Mitochondrialmyopathyandperipheralneuropathy

Fitzsimons Case

Yiannikas Case l5（1986Yiamikas Case

3）

Mizusawa Casel，2（this presentation Case1，2）
Onishi
Yamanaka
Hizusawa（this presentation Case

表33）

KSS or ophthalmoplegia plus with peripheralneuropathy
1967
1968
1969
1975
1975

Shy／Gonatas
Drachman Case
3，4
Valsh Patients
4
Yamamura（1980Atsumi＋）
Kawasaki Case
2

1977
1978
1979

Croft CaselO＋，11，12，13
Bastiaensen Patient
2
Saito

1980
1981
1982
1985

Peyronnard
0kamoto Casel，2Genignami
Furuya1986

Yiamikas Case

1987
1987
1989

Tsuchiya
Pezeshkpour Patient KL
RIvner

Cf．1980
1989

2，4，5，6，7，8，9

Groothuis：demyelinating polyradiculopathy
Xonishi：reCurrent pOlyradiculoneuropathy

表4

NERRFwith peripheralneuropathy

1980
1980
1981

Fukuhara Casel，2（1988Takeda Casel＋，2＋）
Nakano Casel（1982Nakano）＋，2
Kitamura

1981

Fitzsimons（1986

Yiannikas CaselO）

王；…… ≡三；慧H漂≡諾……e三tati。nCas。．）
1983
1983

Fukuhara Case
Feit

1985
1988

Byrne
Federico

表5
（1979
（1982
1982
1985

3

MELASwith peripheralneuropathy

Markesbery）
Yoshida）＋
Bogousslavsky
Goda
＋

1986
1987
1987

Hukoyama
YamamOtO＋
01dfors

1987
1987

Pezeshkpour Patient DC
工hara

1988

工hara

1988

0hara＋（1988Nishizava，1983Fukuhara Case9）−150−

障害は，通常手袋靴下型で深部感覚のほうが表在感覚より障害が高度である．一般的に障害は軽度であり，しばしば潜在性である．すなわち，臨床的には明らかでなく検査により初めて末梢神経障
害が判明することも少なくない．検査所見では，神経伝導速度の軽度〜中等度の低下，筋電図・筋生検での神経原性変化の混在，神経生検での大径優位の有髄神経線維脱落，髄鞘の罪薄化，Onion−
bulb形成，節性脱髄などがよく見られる．まれには，多発単神経炎の形や小径線推優位の障害が報告されている．また，症例数は少ないが自律神経障害も生じ得るものと思われる．末梢神経障害の機序としては，軸索（神経細胞）障害のほかシュワン細胞や髄鞘の障害も加わっているものと考えられる．そして，症例によってどちらの機序がより大きく寄与するか，その比率が変化し得るものと思われる．
今後，ミトコンドリア脳筋症については末梢神経障害を念頭において検索する必要があり，逆に末梢神経障害についてはミトコンドリア異常がか
図4a，b 有髄神経の減少は明らかではないが，軸索変性（a）やonion−bulb形成（b）が見られる（症例6，俳腹神経生検，tOluidineblue
染色，×850）

かわっている可能性を考慮する必要があると思わ
れる．
文

献

1）DiMauro S，Bonl11a E，Zeviani M，et al：
Mitochondrial myopathies．Ann Neurol17：

考察・結論

521−538，1985．

以上の検討から，末梢神経障害はミトコンドリ

2）PeyronnardJM，CharronL，BellavanceA，et

ア脳筋症の広汎なスペクトラムの中でまれならず

al：Neuropathyandmitochondrialmyopathy．

認められ，しかも他の症状がさまざまであるにもかかわらず類似の臨床・検査所見を呈することがAnn Neuro17：262−268，1980．
3）YiannikasC，McLeodJG，PollardJD，etal：

明らかとなった4）．このことは，末梢神経障害が二Peripheral neuropathy associated

次的なものでなくミトコンドリア異常にもとづく

mitochondrialmyoDathy．AnnNeuro120：249

一次的なものであることを示唆している．すなわ−257，1986．

ちミトコンドリア・ニューロバナーmitochon−

with4）MizusawaH，OhkoshiN，WatanabeM，etal：

drialneuropathyとも言うことができる．もちろ

Peripheral neuropathy ofん，個々の症例の検索に際しては，ミトコンドリ

myopathies．Rev Neurol1990，in press．

ア脳筋症に伴い易い内分泌障害や治療薬剤などの5）Mizusawa H，Watanabe M，KanazawaI，et

mitochondrial

影響も考慮する必要がある．ミトコンドリア・ニ

al：Familial mitochondrialューロバナーは，感覚運動ニューロバナーの形を

SOCiatedwithperipheralneuropathy：partial

とり，ふつう感覚障害が運動障害より強い．感覚

deficienciesofcomplexIandcomplexIV．J−151−

myopathy as・NeuroISci86：171−184，1988．

possible multiple deletions ofmitochondrial6）OhkoshiH，HariharaS，NakanishiT，etal：
A familial mitochondrial myopathy

with

−152−

DNA．Biomed ReslO：453−457，1989．

27）家庭性進行性外眼筋麻痺症候群の2剖検例における
多重欠失ミトコンドリアDNAの臓器分布

佐 藤

＊
＊

＊

＊

見出した．さらに骨格筋と脳の欠失mtDNAの欠慢性進行性外眼筋麻痺症候群（CPEO）には，Kearns−Sayre症候群（KSS），眼筋ミオバナーなどが含まれ，その大多数においてミトコンドリア
DNA（mtDNA）の大欠矢が認められ，かつ多重欠失mtDNAの存在も示されている．その多くの症例は孤発例であるが，家族例も少数報告されている．その中で重要な報告は本邦の兄弟例の骨格筋において全く同一パターンを示す多重欠失
mtDNAが検出されたことで，本症の遺伝形式をうかがう上で重要である1）．別に常染色体性優性遺伝を示す家系に筋mtDNAのD−Loop領域における多重欠矢が認められており，mtDNAの欠矢に核DNAが関与しているのではないかとの推定がなされている2）．一方，前述の本邦の兄弟例ではnonD−Loop領域の多重欠矢であり，かつ塩基配列の解析から4−12bpのdirect repentが存在することが明らかにされている．
われわれは昨年度の本研究班の報告において
CPEOの兄妹例の筋mtDNAにおいてSouthernblottingとPCRにおいて同一パターンを示す多重欠失mtDNAの存在を報告した3）．その後，兄と同様に妹も死亡した．この兄妹の剖検例の多臓器におけるmtDNAをPCR法にて分析し，臓器ごとに同一パターンを呈する多重欠失mtDNAを＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊順天堂大学医学部共同病理＊＊＊順天堂大学医学部寄生虫学＊＊＊＊国立遺伝学研究所

二肝

は じめに

眞

福 田 芳 郎＊石 垣 泰 則＊北潔＝＊村釆

平 訳 浩 子＊

中宝

研究協力者

猛＊

矢部の塩基配列を決定したので報告する．
症例

症例147歳長男，3歳まで正常に発育していたが，その頃から難聴を生じた．34歳頃から限瞼
下垂，外眼筋麻痺，四肢筋萎縮，易疲労性など漸次進行した．昭和59年，入院，眼底に異常なし，
小脳症状，知覚障害なども認めなかった．検査にで性腺機能低下，腎機能障害，末梢神経伝導速度遅延を認めた．脳CTにて大脳自質のぴまん性低吸収がみられた．47歳時恐らく急性心不全にて死亡した．
神経病理学所見：大脳自質のぴまん性淡明化，
被穀の神経細胞の高度脱落とグリア細胞の著明な増加を認めた．他に前頭葉皮質，プルキンエ細胞，
下オリーブ核，脊髄前角に軽度変性を認めた．
症例2 46歳女性（症例1の妹）．15歳時難聴，
27歳から外眼筋麻痺と全身筋萎縮，46歳，囁下障
害にて急死．神経病理学的所見は兄の所見と極めて類似していた．
次女も同じ経過を示し，27歳くも股下出血にて死亡した．母（75歳）は健在，血族結婚なし．骨格筋のミトコンドリア酵素活性は症例1，2ともに複合体ⅠおよびⅠⅤが著明に低下していた．
方法

材料：剖検後，各臓器を−700Cに保有，DNAを
抽出した．
−153−

Southern blottingによるmtDNA分析：抽出したDNAを制限酵素PvuIIにより消化した．
Probeはヒト胎盤から精製したtotal mtDNA，およびtotal mtDNAを適当な制限分解酵素で切断した16種の断片を用いSouthern blottingを施行した．
0日gonucleotides：自動DNA合成装置により01igonucleotidesを合成後，PCR法にて増幅してprobeとして用いた．DNA塩基配列の決定用には次のものを用いた．Probel：5，rTCCACC−
CTCCTCTCCCT−3，（nucleotidenumber5，205
r5，222）およびprobe

2：5LGTCGTGGTT−

GTAGTCCGTGC−3，（14，681Rr14，701）である．
PCR法によるmtDNA分析：Southern blot・
tingで得られた2例のmtDNAの欠失部位を参考に上述の01igonucleotideprimerを用い，患者の各臓器のmtDNAを増幅し，電気泳動を行った．
DNA塩基配列：症例1，2の脳および骨格筋か
ら得たmtDNA断片を制限酵素EcoRIおよび
BamHIにて消化後subclone化し，欠失mtDNAの塩基配列をdideoxy nucleotide法により決定した．
図1ElectrophoreticpatternofmtDNAfrag，

結

ments of quadriceps muscleand brain
amplified by PCR．No．1−patientl，No．2

果Southern bl0ttingによるmtDNA分析：Total−patient2．

mtDNA，および断片mtDNA probeを用いてSouthernblottingを施行した結果，症例1および2共に，骨格筋と脳に8．1−7．6Kbの欠矢を有す

全く同一のパターンを示す多重欠失mtDNAのる数本のextra bandを認めた．これらの欠失

多数のbandが検出された（図1）．各症例において骨格筋と大脳とではこれらのbandのパターンは異なっていた．次に症例2において大腿四頭筋，
腸腰筋，横隔膜，外眼筋の多重欠失mtDNAのパ
ターンを比較したがほぼ同一であった（図2）．
骨格筋，大脳に加え，肝，腎，肺，小腸，脾臓のmtDNAにも多重欠失がPCR法にて検出されmtDNAの占める比率は症例1では2．4〜4．4％，
症例2では約1．0％であった．断片mtDNAプローブにより，欠失mtDNAの遺伝子上の部位は骨格筋では約5，780〜13，922（−8．1Kb）のものと約6，340〜14，000（一7．7Kb）のものとが同定でき，2症例とも同一の部位であった3）．
PCR法を用いたmtDNA分析：各臓器から抽出したDNAを欠失領域近傍をPCR法にて増幅し，電気泳動にて分離した結果，図1に示すように骨格筋と大脳において，それぞれの組織ごとにたが，肝，肺，小腸，牌臓は症例1，2において同一の多重欠失mtDNAパターンを示した．しかし，腎臓だけは症例2の方が症例1よりはるかに
多数のbandが認められた（図3）．

−154−

DNA80qUOne08atthobroakpd【t rOglonHn mtDNA

6880
6380

8840

Mu8￠l08

Braln

1

2

1

＋

＋

2

14010

6人TCCTCCGTA AA CTT AC（Ct一一一t叩8eeta粥￠汀GACTAQAA

11bp ropo小5770

関42−14004卜7863〉

5780

13980

18940

GGCAQQTTTGAA（；CTGCTTC一一−CCCTGACATCACACACC（iCA

5788−13922

8120

8130

TACCCATCATAATCGGAGGCt

ト818引

14250
一gC，CCCCQCACCAATA

61台5−14244卜81lOI

8168

6170

14250

ccTAATAATCGGTQCCCCCGトーーg）ccCCCQCACCAATA
8け5−14243

図4

卜8069）

NucleotideseequenCeSOfthebreakpoint
regionof4differentdeletionsinmtDNA
fragments of muscle and brain frompatientl and2．

DNA塩基配列：PCR法にて増幅した各band
をEcoRI，BamHIにて消化してsubclone後，塩基配列を決定した．1個の異常mtDNAの欠失領
域は症例1，2において骨格鼠 大脳共に全く同
図2

Electrophoreticpattern ofmtDNAfrag−mentsofquadriceps，diaphragm，OCular，psoas muscles and brain amplified by
PCRin patient2．

一の部位であった．しかも11塩基対のrepeatを示していた（図4）．
他の1個の欠失mtDNAは骨格筋において症
例1と2に同一の欠失領域を示すものが同定された．
考察ミトコンドリア脳筋症の中の代表的疾患にはCPEO，MERRF，MELASが知られている．
CPEOではmtDNAの大欠夫が認められるが，最近MERRFおよびMELASではtRNAの1塩02基置換が見出され4）5），病型ごとにmtDNAの変異
形式が異なるという極めて重要な報告がなされている．CPEOにおけるmtDNAの部分欠矢についてはHolt以来，多くの報告がみられる．その多くは孤発例であるが，家族例については小沢ら6）の

0
t
O
5

図3

ElectrophoreticpatternofmtDNAfragTments of various tissues amplified by

PCR．No．トpatientl，No．2−patient2．

母娘例での筋mtDNAの部分欠矢の報告があり，母系遺伝が示唆されている．しかし，母娘における欠失領域は異なっている．
Zevianiら2）は常染色体性優性遺伝を示す家系においてmtDNAのD−Loop領域を起始部とす
る多重欠矢を報告している．Yuzakiら1）は兄弟例−155−

の筋mtDNAの多重欠矢を認めており，全く同一パターンは異なっていた．しかし，各抜器の多重パターンを示し，D−Loop領域を含まないことを報告している．

欠失パターンは兄妹では同一であった．

われわれの検索した兄妹例でも筋mtDNAに
全く同様のパターンを示す多重欠矢を認めた．数種の骨格筋や外眼筋でも同一のパターンであったが，脳mtDNAでは骨格筋とは異なったパターンの多重欠失が認められた．また，Southern blot−

筋，大脳に共通の欠失領域を示す変異mtDNAがtingでは検出できなかったが，PCR法では肝，肺，小腸，牌臓においても兄妹同一パターンの多重欠矢を認めた．これらの諸臓器の欠失mtDNAのパターンは骨格筋と大脳のものとは異なっていた．

Multiple deletionsin mitochondrialDNA at

4

存在しており，11塩基対のrepeatを示していた．
文れている．しかし，兄妹例において全く同一の比率で多重欠夫を示す変異mtDNAが各臓器ごとに存在していることは，臓器特有の遺伝的に兄妹共通の因子がなければ説明できない．欠失
mtDNAの塩基配列の分析では欠失領域が共通したものが骨格筋と脳に存在していたことから，卵子のレベルでは母親から遺伝した共通の欠失

献1）YuzakiM，OhkoshiN，KanazawaI，et al：
directrepeatsofnon−loopregionsincasesof
familial mitochondrial myopathy．Biochem−Biophys Res Commun164：1352，1989．
2）ZevianiM，ServideiS，GelleraC，et al：An

CPEOの剖検例において多臓器にわたって
mtDNAの欠矢が認められることは報告されているが7），兄妹例についての検索はわれわれの報告がはじめてである．各脱着削こわたり欠失mtDNAの多重欠矢が存在することは，卵子の段階ですでに欠失mtDNAが存在し，卵分割と共にrandam
な分配で各臓器の原基に配分されることが示唆さ

欠失mtDNAの塩基解析では兄妹の骨格▼autOSOmal

dominant

disorderwith

multipledeletions of mitochondrialDNA starting at
the D−loop region．Nature339：309，1989．
3）佐藤猛，平訳浩子，関公一

他：ミトコン

ドリア脳筋症におけるミトコンドリアDNAの欠失． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田珪）平成元年度研究報告
書，1990，p259，
4）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，et al：
Myoclonic epilepsy and ragged−red fiber
disease（MERRF）is associated with amitochondrial DNA tRNALYS mutation．Cel1
61：931，1990．

mtDNAが存在しており，卵分割後に臓器特有の何らかの遺伝的因子の影響をうけ，兄妹同一の多重欠失mtDNAが生じたものと推定される．本報

5）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation

告は臓器特有の多重欠失mtDNAの遺伝的解析が必要なことを示唆している．

encephalomyopathies．Nature348：651，1990．

in the transfer RNALeu（Ut：R）gene associatedwiththeMELASsubgroupofmitochondrial

6）Ozawa T，Yoneda M，Tanaka M，et al：Maternalinl1eritance of deleted mitochon−

1

結論
CPEOの兄妹例の剖検例においてSouth−

ern blottingおよびPCR法により各臓器のミトコンドリアDNAの解析を施行した．
2 兄妹共に骨格筋，大脳，一般放器（肝，肺，
小腸，牌）にmtDNAの多重欠矢を認めた．
3 各臓器ごとに欠失mtDNAの欠失領域のdrial DNAin a fami1ywith mitochondrial
myopathy．Biochem Biophys Res Commun
154：1240，1988．

7）Zeviani M，Gellera C，Pannacci M，et al：−156−

Tissue Distribution and transmission of
mitochondrial DNA deletionsin mitochon・
drialmyopathies．Ann Neuro128：94，1990．

28）Kearns−Sayre症候群におけるミトコンドリア
DNAの解析

野道

＊

︵ J

白い

嘉史

′ ＼ J

点

＊

川 藤

西依

虹
い
︑
一

知

＊

＊

＊

は じめに

骨格筋mtDNAのSouthern b10t解析

Kearns−Sayre症候群（KSS）では骨格筋のミトコンドリアDNA（mtDNA）に大欠矢が高率に兄いだされることからmtDNAの異常が電子伝達系酵素蛋白の合成異常にむすぴつき，ミトコンド
リア内のエネルギー産生障害をきたしていると考えられる1）．我々は，これまで7例のKSS骨格筋
mtDNAのSouthern blot解析を行い，5症例においてmtDNAに3．4〜9．2kbの欠矢が存在する
こと，この欠矢とミトコンドリア内膜電子伝達系
酵素活性，筋力低下との関連を報告してきた2）．本
研究では，5例のmtDNA欠失断端の塩基配列を決定，さらに欠矢がSouthernblot法で検出できなかった2例においてPCR法を用いて欠矢を兄
いだし，これらの結果をもとにKSSにおける
mtDNA欠矢の意義を検討した．さらにMERRF，MELAS，分類困難なミトコンドリア脳筋症症例のtRNA（Lys）の一塩基置換3），mtDNA
サイズの異常の有無について検索した．
方法と対象対象としたKSS 7例の臨床特徴はすでに報告した2）．5例（症例1，4，5，6，7）は筋力低下を有していた．

＊大阪大学医学部第二内科・神経内科＊＊国立遺伝学研究所

＊

郎
⁝

上上

＊

久行聴

圭H

井

垂

文信

我橋乗

曽高宝

研究協力者

KSS7例の生検骨格筋から総DNAを抽出し，制限酵素（BamHl，EcoRl，Pstl）消化後，ヒト
胎盤組織から分社精製した正常mtDNAをプローブとしてSouthernblot解析を行った．この結果から各症例におけるmtDNA部分欠夫の同定，
欠失mtDNA／総mtDNA比率を算出した．
部分欠失mtDNA断片のPCR法による増幅
Southern blot解析により同定された欠失領域の約200bp外側に5，側ではL鎖配列，3，側ではH
鎖配列をもつオリゴヌクレオチドプライマー（20−23塩基）を合成した．総DNAlOOngにプライマー100pmol，および基質を加え，Taqpolymeraseを用いたPCR法により欠失断端を含む領域を選択的に増幅した．
mtDNA欠失断端塩基配列の決定
増幅DNA断片を制限酵素消化によって約200
bpの断片とし，M13ファージベクターに組み込み，一本鎖DNAを精製してジデオキン酵素法で塩基配列を決定した．増幅および塩基配列決定の際のアーチ7ァクトを除外するために，6個以上の独立クローンの塩基配列を決定した．
mtDNA欠矢のPCR解析
Southern blot解析ではmtDNAの欠夫を検出できなかったKSS2例を対象とし，mtDNA欠夫の有無をPCR法を用いて検索した．mtDNAを複製開始点を境界にして2つの領域に分け，種々のプライマーの組合せでPCR増幅を行った．

−157−

プライマー配列から計算されるTmより5−80C
低い温度でアニーリングし，30サイクル増幅したDNA断片のサイズを正常対照と比較した．
tRNA（Lys）−塩基置換の検出
MERRF症例において報告されているtRNA（Lys）遺伝子における−塩基置換3）が我々のKSS，MERRF，MELAS，その他のミトコンドリ

ア脳筋症症例に存在するか否かをPCR法を用いたRFLP解析で検索した．まずこの一塩基置換に加えて新たに一塩基置換を導入して制限酵素
Hincll認識部位が生ずるようにミスマッチプラ
イマー（5，−ATTTCACTGTAAAGAGGTGTT＿GA ）を合成する．これを用いてtRNA（Lys）遺伝子を含む領域（8169−8367）を増幅した．この増幅DNA断片をHincIIで消化後，電気泳動し，DNA断片のサイズから塩基置換の有無を検索した．
結

ATPaSe8

図1KeamS−Sayre症候群7例の骨格筋ミトコ
ンドリアDNA欠失領域
Southem blot解析により欠夫を検出し，断端位置はシークエンスで決定した．

果

mtDNA欠失領域および欠失mtDNA比率Southern blot解析によりKSS7例中5例でmtDNA部分欠失を兄いだした（図1）．欠矢の大きさは，症例1：3．4kb，症例4：5．6kb，症例5：5．5kb，症例6：9．2kb，症例7：5．Okbであった．3例（症例4，5，7）では欠失領域はmtDNAのH鎖，L鎖の複製開始点間の中央部に位置してPatJEntl

M5
Pat馴t4

12496

−−−−

）ATGGGCCTGTCCTTGTAGTATAA

15880

ACGCCTAACCGCTAACA（−−−ATPa父69016

C舛b tRNA（Pro）−ACCGCTAACA）ATCAATACTAAACCCCCATAAAT
14576

ND6

Pat即t5 TCATTCATTGCCG⊆⊆皇⊆（−−−−−−q堪墜）TCATCCTAACCCTACTCCTAATC
ATPa父6／8

Pat榔t6おり，2例（症例1，6）では複製開始点に近接していた．デンシトメーターによる解析の結果，欠失mtDNAが骨格筋mtDNA総数に占める割CTTCCCCACAACAATAT（−−−

8564

ND5

ccTCGGAGCTGGTAAAA（−−−−−−−H一一Hq−）CTCAGAAACCTGAAACATCGGCAtRNA（Cys）
Pat血t7

図2

5833

15073

Cnb

tRM汀河
…
ACCTACCTCCCTCACCA（H−ACCTCCCTCACCA）TTGGCAGCCTAGCATTAGCAGGA
ATP瑚8

合は37−80％であった（症例1：53％，4：57％，
5：80％，6：37％，7：47％）．
欠失断端塩基配列

14120

8482

13460

ND5

ミトコンドリアDNA欠失断端の塩基配列（）は欠失領域を，＊＊＊は終止コドンを示す．

5例の断端塩基配列を決定した結果，3例にそれぞれ5，10，13bpの反復配列（direct repeat）
が兄いだされた（図2）．症例4では断端に10bpのdirectrepeat

5，−ACCGCTAACA−3，（mtDNA

配列4）9007−9016，14566−14575），症例5では5bpの5−CCCAC−3，

例7では13bpの（8560−8564，14115−14119），症
5，−ACCTCCCTCACCAT3・（8470−8482，13447−13459）が存在した．他の2例
では断端に反復配列はなく，症例1の欠失断端はmtDNA配列12497と15879，症例6では5834と15072に位置していた．
4例（症例1，4，5，7）では欠失により二つの蛋白遺伝子が融合しているが，断端部でフレームシフトが生じ，断端から11〜23bp下流に終止コドンが出現していた．他の1例（症例6）ではtRNA（Tyr）とcytochromeb遺伝子が融合しており，開始コドンが失われていた．

−158−

mtDNA欠矢のPCR解析結果
Southern blot解析ではmtDNAの欠夫を検出できなかった2例（症例2，3）についてPCR法
を用いてmtDNA欠夫の有無を検討した．症例2
では，PCR増幅で多重欠矢が検出され，症例3では断端にdirect repeatを伴う3例の欠矢とほぼ同じ領域の単一の欠失mtDNAが検出された．
症例2ではmtDNAのrRNA遺伝子が存在する領域をPCR増幅し，電気泳動すると5830bpを標的として増幅しているにもかかわらず0．5〜2．Okbの数本のバンドが検出された（図3二Lanel）．プライマーの位置をシフトし増幅してもそれに対応した増幅断片サイズの変化が認められ，多重欠矢が存在していると考えられた．
症例3ではPCR増幅により一本のDNA断片が検出された．（図4）．このDNA断片を抽出精製

図4

KSS症例3におけるミトコンドリアDNA
欠矢のPCR解析
PCR増幅したミトコンドリアDNA領域はLanel：8817−14847，Lane 2：8817−
15582，Lane3：8817−16310
シークエンスにより欠失領域は9017−
14575であることが決定された．

図5

ミトコンドリア脳筋症症例におけるtRNA（Lys）−塩基置換の検出
ミスマッチプライマー（5，−ATTTCACTTGTAAAGAGGTGTTGA−3，），正常プライマー（5，−ATGCTCTGAAATCTGTG−
GAGCr3，）を用いてcytochromecoxidasesubunit2遺伝子からtRNA（Lys）遺伝子
にかけての199bp（8169−8367）の領域を
PCR増幅した．一塩基置換（8344A→G）
が存在するとHincll消化により180bpと19bpの断片となる．M．E．は分類困難であったミトコンドリア脳筋症症例を示す．

し塩基配列を決定した結果，10bpのdirectrepeat（5LACCGCTAACA−3，）を断端に有する欠失
mtDNAを同定した．16クローンの塩基配列を決定したがすべて同一配列であった．
tRNA（Lys）遺伝子一塩基置換検出結果
KSS7例，MELAS2例，分類困難例5例には
この変異遺伝子（8344A→G）は検出できなかっ
た．MERRF症例では199bpのPCR増幅断片の90％以上がHincIIで切断され約20bp短い断片となっており，報告されている変異が我々の症例にも存在していた（図5左）．
一方，tRNA（Lys）遺伝子からcytochromec
oxidase subunit2遺伝子にかけての199bpを標的にPCR増幅したにもかかわらず，PCR増幅断

Lane1

114・→5933

Lane216291●→5933
Larle3114●−→8839

Lane416291●→8839

図3

KSS症例2におけるミトコンドリアDNA
欠矢のPCR解析
図右にPCR増幅したミト コンドリア
DNA領域を示す．

片のサイズがわずかながら大きい一症例が兄いだされた（図5右）．この断片サイズの差を確認する
ために，先ほどのMERRF症例，およびコントロールのPCR増幅断片と混合して泳動した．この−159−

結果，断片サイズが約30bp大きいことがわかった．この症例はミオクローヌス，重度精神運動発
達遅延，完全房室ブロック，CT上大脳基底核の低吸収域の存在を特徴とするミトコンドリア脳筋症
症例であり，骨格筋ミトコンドリア内膜電子伝達系酵素活性測定ではcytochrome c oxidase活性の低下が認められている．

の病因であるかどうかは不明であるが，欠失
mtDNA比率が37％以上の症例でのみ筋症状を有していたことから，ある閥倍以上の欠失mtDNAの存在はKSSにおける筋症状の発現に関与していると考えられた．
また，我々のMERRF症例でも既報の変異が兄いだされ，特異な臨床症状を呈するミトコンドリ
ア脳筋症症例においては挿入が疑われるmtDNA

考察Southern blot法により骨格筋mtDNA欠夫が同定されたKSS5例のうち断端にdirect repeatが存在する3例の欠失領域はすべてmtDNAの
H鎖，L鎖の複製開始点間の中央部に位置していた．複製開始点間の中央部はmtDNAの非対称な複製過程において数kbにおよぶ一本鎖DNA領
域になることが知られており5），そのためdirect
repeatが関与する欠夫の好発領域になると考えられた．一方，欠失断端が複製開始点に近接していた2例の断端にdirect repeatは存在していな
い．核DNAにコードされるいくつかのmtDNA
複製に関連する蛋白はmtDNAのH鎖複製開始点を含むDループ領域およびL鎖複製開始点近傍に結合して作用することが知られている5）．これ
ら2症例の欠失断端はこれらの領域から100bp以
内にあり，核由来のmtDNA複製関連蛋白の機能異常が欠失生成に関与している可能性も考えられた．Southern blot法で欠矢を検出できなかった
2例においてPCR法で欠矢の有無を検索した結変異が検出された．ミトコンドリア脳筋症では臨床病型によりミトコンドリアDNA異常の様式が異なると考えられた．
文

献1）ZevianiM，Moraes CT，DiMauro S，et al：Deletions of mitochondrial DNAin Kearn−
Sayresyndrome．Neurology38：1339−1346，
1988．

2）垂井清一郎，曽我文久ほか：KearnsTSayre症
候群における異常ミトコンドリアDNAの解析．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジスト
ロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田姓）平成元年度研究報告書，
1990，pp218−221．

3）SchoffnerJM，LottMT，LezzaAMS，etal：
Myoclonic epilepsy and ragged−red fiber
disease（MERRF）is associated with amitochondrial tRNAL，S mutation．Cel161：931−937，1990．

果，1例で10bp direct repeatを伴う単一の欠夫

4）AndersonS，BankierAT，BarrellBG，etal：

を兄いだした．．もう1例ではサイズの異なる複数の欠矢の存在が検出された．KSS症候群においては普遍的に欠失mtDNAが存在すると考えられるが，その欠失機序，および異常mtDNA比率は症例により異なる．mtDNA欠矢がKSSの直接

Sequence and organization of the humanmitochondrialgenome．Nature290：457−465，
1981．

5）ClaytonDA：Replicationofanimalmitochon−−160−

drialDNA．Ce1128：693−705，1982．

29）慢性進行性外眼筋麻痺症候群における欠失mitochondril（mt）DNAの解析−非RI標識mtDNA probeを用いての検討
荒 木 淑 郎■研究協力者

要

箕 田 修 治＊された．このうち，60％（12／20）は同一欠失部位

旨

慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）患者筋において，非RI標識mtDNAprobeを用いてSouthern
blot法と光顕レベルでのin situ hybridization（ISH）法による欠失mtDNAの検出を行った．
制限酵素で切断されたmtDNAは，Southemblot法にて特異的に，かつ容易に検出された．ISHでは，Cytochrome c oxidase（CCO）活性が欠損したRagged−red fiber（RRF）において欠失
mtDNAが著明に増加しており，CCO活性が正常な線経において正常mtDNAがより多く存在していた．この結果は，先に報告したRI標識probeを用いて得た結果と同様であり1），この方法がCPEOにおいて，光顕レベルでの欠失mtDNA検出に有効であることを明らかにした．今後，電顕レベルへの応用を検討する．
は じめに
近年，KearnTSayre症候群を含むCPEO患者において，大きな欠矢を有するmtDNAと正常
mtDNAが混在するheteroplasmyであることが明らかになった2）3）．先に我々はmtDNAの欠失機
構を明らかにするため，28例の欠失部位をpolymerasechainreaction法及びdirectsequen−
Cing法を用いて検討した．約70％（20／28）の患者に5−13bpのdirectrepeat（DR）が存在しており，その欠失機構にslippedmispairingの関与が示唆＊熊本大学医学部第一内科に13bpのDRを有し，hotspotと考えられた4）5）．
また，全ての欠矢は少なくとも1つのtRNAを含んでいた．更に，CPEOの筋病理学的特徴である
RRF及びCCO欠損線経と欠失mtDNAとの関係をISH及びImmunocytochemistry法を用いて検討したl）．そして，正常mtDNAの分布は
CCO活性の分布にほぼ一致しており，CCO活性のないRRFにおいて欠失mtDNAが著明に増加していることを明らかにした．また，単一筋線経において，正常mtDNA及びCCO活性はseg−
mentalに障害されていた．さらに，CCO活性のな
いRRFにおいて，欠失mtDNAはmRNAへ宏写されていたが，蛋白へは翻訳されていなかった．
これらの結果は，欠失mtDNAを含むmtにおいて，tRNA欠如に伴う翻訳レベルでの蛋白合成障害を示唆した．また，光顕レベルにおいて正常と欠失mtDNAが細胞間及び細胞内heteroplas−
my，mt内homoplasmyであることを示唆した．
しかしながら，これまでの解析が光顕レベルであり，その感度が十分でない可能性や，実際はmt内
heteroplasmyであるが，なんらかの庶因により欠失mtDNAが正常mtDNAによ ってcom・
plementationされていない可能性がある．さらに，形態的に正常及び異常なmtと正常及び欠失
mtDNAとの関係は明らかでない．これらの点を明らかにすることは欠失mtDNAの発生・増殖のメカニズム及び臨床病態を考える上で非常に重要と思われる．このため，ISHと電子顕微鏡（ISH−161−電路）を用いてmtDNAの観察を試みようと考のち，prOteinaseK，RNaseAにて処理し，70％

えた．このためには，従来のRI標識を用いた
DNAprobeではISH電顕への応用は不可能であり，非RI標識probeの使用が不可欠となる．今臥その第一段階として非RI標識mtDNAprobeを用いてSouthernblot法と光顕レベルでのISH法によりmtDNAの検出を検討した．

formamide，2XSSCの溶液中，70℃にて組織片のmtDNAを変性（denaturation）させ，エタノー
ルを用いて脱水した．これに，変性させたmtDNA
probeを用いて，42℃で12−16時間hybridizationを行った．洗浄後，同様の方法を用いて発色・検出し，グリセリンジェリーにて封入後臨検した．
結

対象と方法

果

対象はmtDNAの欠矢が4977bpで断端に13bpのDRを有するCPEO患者（common
deletion）1）4）5）の生検筋である．CCO欠損線経は約50％，RRFは約8％で全てCCO欠損線経であっ

制限酵素PvuII，PstIで切断されたmtDNAは，DIG標識mtDNA probeを用いたSouthern
blot法により，特異的に，しかも容易（検出操作終了後数分以内）に検出された（図2）．また，検た．probeとして欠矢部に含まれ正常mtDNAのみを検出するmt12DNAと非欠失部で正常と欠出感度の検討では，Singlecopyの遺伝子の検出も容易であった．これらのmtDNAprobeを用いて対照及び患者筋のISHを行ったが，対照筋では

失mtDNAを検出するmt9DNAを用いた（図1）1）．方法として，Boehringer Mannheim社の非RI標識キットであるDigoxigenin（DIG）標識dUTPを用いてrandom primer法によりmtDNAを標識した，患者及び対照筋より抽出した染色体DNAを制限酵素PvuII，PstIにて切

typeII線経に比べtypeI線経でやや濃染した．
患者筋では，CCO活性が欠損したRRFにおいて欠失mtDNAが増加していた（図3）．一方，CCO
活性正常線経において正常mtDNAがより多く存在していた．

断後，Southernblothybridizationを行い，洗浄後，アルカリフオスファターゼ付加の抗DIG抗体
及び基質（Ⅹ−phosphatase＋NBT）を用いて発色・検出した．ISHでは，対照及び患者筋の凍結

考

今回，非RI標識を用いたSouthernblot法及び光顕レベルでのISH法によりmtDNAの解析が可能であることを明らかにした．従来，遺伝子レベルでの研究においてDNAをRIで標識する方切片をpoly−1−1ysineでコートしたスライドガラ
ス上にのせ，4％paraformaldehydeで固定した
2

4

6

察

8

10

12

日

16

塩胞題塾堅塾ゴ
OL P勾卜止り・−−−−−−cc巾ccTCCCICACC如G
ATPas08l

t8．482）

竿二二二丁￣−−一一一TCA済CCTCCCTCAcc句†TG −．−￣l ND5
日3．160）

図1CPEO患者のmtDNA欠失部位と用いたmtDNAprobe−162−

PvullC

P法が広く用いられてきた．先の我々の研究においても32Pや35Sを付加したヌクレオチドを使って

Pstl
C P

DNAやRNAを標識して解析に用いた．この方法は，感度がよく，検出が容易であるという長所がある一方，RIは高価で長期保存ができず，その取り扱いには特別なRI専用施設での使用が必要
で，手続きも煩雑であるという欠点をもっている．
近年，このような制限を受けずに使用できる非RI標識法が開発され，感度や特異性等においてややーi．一一fl翳

−−
図2

一之l

DIG標識mtDNA probeを用いたSouth・
ern blot解析
CPEO患者筋（P）において対照筋（C）に認められない欠失nltDNA由来のバンド（・）がPvuⅠⅠ，PstI切断により1つずつ認められる．

問題があるものの次第に使用されるようになってきた．さらに，非RI標識probeはRI標識では不可能な電顕レベルでの解析に応用できる可能性をもっている．
今回用いたDIG標識システム及びアルカリ7
オスファターゼ付加した抗DIG抗体を用いた検出システムは，感度も良好でsingle copyの遺伝子でも容易に検出可能であった．mtDNAは1細胞当り数千存在しており，そのうち1−2個でも欠矢があれば理論的には，Southernblothybrid−izationで欠失mtDNAの検出は可能である．今回解析した患者筋には50％以上の欠失mtDNAが含まれており，数分以内に欠失mtDNAが検出されたのは当然のことと思われる．また，mtDNA
以外のバンドは認めておらず，用いたprobeはmtDNAとのみ特異的に反応すると考えられた．
今回示さなかったが，biotin標識でストレプトア
ピジン・アルカリフオスファターゼによる検出シ

図3

CPEO患者筋におけるDIG標識mtDNA
probeを用いたISH
mt9DNA probeを用いて欠失及び正常
mtDNAの検出を行ったものであるが，連続切片におけるCCO染色，SDH染色，正常mtDNA検出より，CCO活性のない
RRFにおいて欠失mtDNAが著明に増加している（○）．

ステムにおいても同様の感度を得ている．次に，これらのmtDNA probeを用いて行った対照及び患者筋でのISHでは，対顔筋においてtypeI，
typeII線維間で染色性に差異を認め，typeI線経でやや濃染した．また，患者筋では，CCO活性が欠損したRRFにおいて欠失mtDNAが増加して
おり，CCO活性が正常な線経において正常
mtDNAがより多く存在していた．これらの結果は先に報告したRI標識mtDNA probeを用いて得た結果とほぼ同様であった．しかしながら，CCO活性が部分欠損を示す線経の横断面において，RI標識probeでは活性を示す部位と示さない
部位で，正常mtDNAを示すsilvergrainの数の差異は明らかであったが，DIG標識probeではこ−163−

の差異を検出することはできなかった．このよう

USA86：9505−9513，1989．

に光顕レベルでは，半定量性や細胞内でのおおま2）HoltIJ，et al：Deletions of mitochondrial

かな局在は，RI標識probeが少し優れているようDNAin patients with mitochondrialに思われた．

myopathies．Nature331：717−719，1988．

現時点では，ここで示したように光顕レベルの3）Moreas CT，et al：Mitochondrial DNA

ISHでmtDNAは特異的に検出することができ

deletionsinprogressiveexternalophthalmo−

た．この方法を電顕に応用するためには，例えば

plegla and Kearns−Sayre syndrome．New

いかにミトコンドリアの形態を保持していくか等1

EnglJ Med320：1293−1299，1989．

いくつかの問題を解決しなければならない．ISH4）SchonEA，etal：Adirectrepeatisahotspot

電顕に関してはすでに報告があり6），これらを参forlargescaledeletionofhumanmitochon−

考にしながら，今後このシステムがmtDNAのdrialDNA．Science244：346−349，1989．

ISH電顕へ応用可能かどうかを検討していく予

5）Mita S，et al：Recombination via flanking

定である．

directrepeatisamajorcauseoflarge−SCale
deletionsofhumanmitochondrialDNA，NucI

文

献

Acids Res18：561−567，1990．

1）MitaS，etal：DetectionofdeletedmitochonT6）Wolber RA，et al：Ultrastructurallocali・

drial genomesin cytochrome c oxidase

ZationofherpessimplexviruSRNAbyinsitu

deficient muscle ficers of a patient withhybridization．J HistochemCytochem37：97

Kearns−Sayresyndrome．ProcNatlAcadSci−104，1989．

−164−ⅤⅠ．mdxマウスほか

30）mdxマウス骨格筋におけるカルシウム（Ca）濃度調節
高 木 昭 夫■一日
研究協力者

小

島

進＊

井

田

雅

黒 岩 義 之＊ 荒 木

昨年度は3−4週齢のmdxマウスにおいて，caffeine拘絹の冗進を証明した1）．この原因として，筋小胞体（SR）からのCa漏出の増加が関係している可能性を推定した．本年は引続き，SRにおけるCa出納の問題を分析した．ことにCa漏出とCa誘発性Ca遊離（CICR）の関係，adenine
nucleotideやphenytoinの影響に注目した．
方法
4−6週齢のmdxマウスと対照マウスは芙中研より供給された．筋小胞体（SR）によるCa摂取，Ca遊離やCa漏出はskinned fiber法により測定した1）．Ca摂取量は各種Caイオン濃度を含む溶液（pH7．00）中でSkinned fiberをin−
cubate後，Caffeine拘縞の大きさ（収縮曲線の積分値）から推定した．Ca誘発性Ca遊離（CICR）
はATPおよびMgS04を除去した溶液中，あるいはAMP・PCP（adenylylmethylene−diphos−
phonate）および1mMMgS04を含む溶液中で測定した2）．CICR測定中に生ずるSRからのCa喪失（Ca−inducedでない部分）はbasalleakageとして記載した．Ca遊離ないし漏出速度は1分間に基準量のCaイオンがSRから全て遊離した時を1minTlとした．およそ0．5mmoleCa／g／minに相当する．Ca漏出を測定したのは弛緩溶液中であり，その組成は4mMATP，4mMMgSO4，20mM
Tris−maleate（pH7．00），120mMK−methan−sulfonateである．また弛緩溶液からATPと＊虎の門病院神経内科＊＊沖中吉己念成人病研究所

祥＊
誠＊＊

MgSO．除去した溶液，あるいはATPとMgS04
を1mMAMP・PCPと1mMMgS04で置換した溶液でも測定した．
Phenytoin投与は腹腔内注射群（0．2mg／日）と飲水によるadlib経口投与（0．2mg／ml）の2群で行った．腹腔内注射は3週齢から5週齢まで行った．経口投与は母親マウスの妊娠中より開始
した．深麻酔下で心臓穿刺を行い得られた血清につき，phenytoin濃度とCK活性を測定した．5週
齢で濁血屠殺後，前脛骨筋，排腹筋，大腿四頭筋を採取した．組織学的評価は著者の1人が盲検で行った（表4参照）．
結果1）Ca摂取（図1）
各種Caイオン濃度の溶液中でのCa摂取の時間経過をmdxと対照の間で比較した．両者ともにpCa7よりCa摂取が開始した．pCa6．5からpCa6．0でCa摂取量は飽和する．pCa6．0やpCa5．5では時間経過とともにCa貯留量は逆に減少した．mdxと対照の問に有意差をみとめなかった．
2）Ca誘発性Ca遊離（CICR）（表1）
ATPとMgS04を除去した溶液中でのCICR
はmdxと対照の間で差を認めなかった．測定操
作中に生ずるbasalleakageはこの条件下では両者間に差がなかった．ATPの代りにAMP・PCP（分解されないadenine nucleotide）を使用した溶液中では，やはりmdxと対照の間にCICRに関して差を認めていない（表1）．しかし，AMP・PCPを含む条件下では，basalleakageはmdxで

−167−

1

2

3

4min

1

2

3

4

汀血

図1各種Caイオン泣皮溶液中におけるCa
摂取の時間経過横軸：Caイオン溶液中でのincubation
時間．
縦軸：Caffeine拘縞の大きさ（SR中のCa量を反映するとされる）．図中の数字
はCaイオン浪皮（pH7．00）．mdxと対照の間に有意差はない．

1

図2

2

3

4

mM【GTA

弛緩溶液中でのSRからのCa漏出速度
横軸：溶液（pH7．00）中のEGTA浪度．
縦軸：Ca漏出速度．procaine（5mM）
あるいは，Mg（10mM）は漏出速度に影響を与えない．2mMおよび4mMEGTA
中のCa漏出はmdxで有意に増加していた（■P＝0．01）．n＝5forcontroland
n＝4for mdx．

表l Ca誘発性Ca進級速度（min−1）の比較
A ATP，MXSO一を除去した荷漬

刺激Ca濃度m d x

表2

COntrO1md

Caイオン編出に対するphenytoinの影響
xbasat leakage

O．34±0．04（7）0．28±0．09（7）n．S．

pCa

7．O

0．43土0，47（7）0．31±0．52（7）n．S．

Phenytoin

PCa

6．5

1．58±1．29（7）0．86±0．70（7）n．S

Phenytoin

PCa

6．O

3．66±0．51（7）3．47±0．80（7）n．S．

PCa

5．0

3．99土0．02（7〉4．00±0．06（7〉n．S．

rateく1／Hn〉
O■g／L

O．31±0．11く7）

301g／L O．22±0．13く7）（p＝0．05）

COntrOI

B．l■M AMP・PCP−1■M MZSO一の宿泊

刺激C軋

m d x

PhenytoinO■g／L

O．23±0．08（8〉COntrO1

PhenytoinbasalIeakage O．43±0．03（4）0．33土0．02（4）p；0．01

PCa

6．5

0．16±0．22（4）0．94土0．95（4）∩．S．

pCa

5．5

3．56土0．42（4）3．70±0．60（4）n．S．

30Lg／LO．22土0．10（8）くn．S．）■ean±

中でのみ観察された（表1）．Ca漏出冗進は2mMないし4mM EGTAを含む溶液中で認められたS．D．（nu■ber oI experi■ent）（図2）．Ca漏出速度は5mM procaineや10mM
Mgにより影響をうけない．一方，phenytoinによりmdxのCa漏出克進は完全に抑制された（表爪．S．：not sl旦nHlCanl

有意に冗進していた．
3）Ca漏出（図2，表3）
2mM EGTAを含む弛緩溶液中でのCa漏出速度（min￣1）はmdx O．31±0．11（7），COntrO1
0．23±0．13（7）（p＝0．05）であり，mdxで有意に増加していた．このCa漏出増加は，ATPあるいはAMP・PCPのadeninenucleotideを含む溶液

2）．controlのCa漏出速度はphenytoinにより影響をうけなかった．
4）Phenytoinによる実験的治療（表3）屠殺時のphenytoin血中濃度は腹腔内投与群
1．5±0．2mg／L（n＝4），経口投与群6．1±1．0mg／L（n＝4）であった．血清CK値は投薬群と非投薬

−168−

表3

A．

中心核緩碓

漏出に対するphenytoinの効果は，mdxにおいてのみ観察され，対照筋では影響がないのが注目される．その理由は不明である．phenytoinのSR機能に対する情報は調べた範囲では見出せず，この点の検討も必要であろう．今回のphenytoinによ

指数●

井投華

2．8±0．5（Ⅰ2）

血中濃度1．5■g／L●■
血中凛日置

B．

ている．SR膜に表面膜と同様なNa channelやCa channelが存在するか否かは不明である．Ca

mdxマウス骨格筋組織に対するphenytoinの影響

2．8士0．4（12）（∩．S．）

6．1■g／L■義■

2．1±0．5（12）（p；0．01〉

壊死抜稚

非は薫

1．6±0．8（12）血中濃度1．5tg／L l．8±0．6（12）（∩．S，〉
血中虞＊6．1■8／L

病的妨抜相の占める割合を1：0・33％．2：34・66％．
3：67・100％

ま＊ト．0±0 （12）（p＝0．05）

る実験的治療では，血中濃度はまだ充分に治療域に達していないと思われる．血清CK値には影響を与えなかった．形態学的には筋壊死の抑制を示
唆する結果を得た．今後投与法を検討して再実験の予定である．

の3段階に分類して表示した．

結

相性内授与した4匹の平均論

書末書1運に卜投与した4匹の平均

1）mdxマウスSRのCa摂取とCICRは対照のそれらと同一であった．

群の間に差はなく，phenytoin投与がCK値に影響を与えることはなかった．
筋組織標本につき，壊死筋線経と中心核筋線経の頻度を定量した．経口投与群においてのみ，壊死線経と中心核線経は減少していた（表3）．

2）ATPやAMP・PCPを含む溶液中においてのみ，mdx SRからのCa漏出冗進を観察した．

考察
mdxマウスのSRにおけるCa漏出冗進はATPやAMP・PCPのようなadeninenucleotideの存在下でのみ観察された．一方，CICRはATP（−）あるいはAMP・PCPの存在下においてもmdxと対照の間で差をみとめなかった．Ca漏出
はprocaineやMgイオンの影響をうけないことと併せ考えて，CICRとは別の機序によるものとこの異常はphenytoinにより修復された．
3）Phenytoinのin viuo投与により，筋線維壊死が抑制される可能性を指摘した．
文献1）高木昭夫，小島進，井田雅祥他：mdxマウスの
筋小胞体機能（続報）． 厚生省「精神・神経疾
患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾
患の病態とその病因に関する研究 （杉田改）平成元年度研究報告書，1990，pp141−144．
2）Ohta T，Endo M，Nakano T，et al：CaT
induced Ca releasein malignant hyperther−

推定している．phenytoinはmdxSRにおいてのみCa漏出冗進を抑制した．骨格筋に対する

mia−SuSCeptible pig skeletal muscle．AmJ

phenytoinの作用は，主として表面膜に関してのみ記載されている3）．他の興奮性膜と同様にNa
infiuxを抑制して，膜安定化をきたすとされている．Naと同様にCainfluxも減少すると推定され

1989．

Physio1256（Cellphysio125）：C358−C367，

3）Jones GL，Wimbish GH：Hydantoinsin−169−

Handbook

VO174

of

Experimental

pp351−419，1985．

Pharmacology31）MDXマウス骨格筋の強収縮状態に於ける細胞内Ca2＋濃度
吉 田 端 子＊
研究協力者

且

宮

川

厚

的

Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）は，
ジストロフィン欠損の膜異常であることが明らかになった．しかしジストロフィンが欠損しているだけでは，筋細胞は崩壊しないようである．
従って未だに筋細胞崩壊への引き金は明らかになっていない．
私達はこの引き金を兄いだす為にモデルマウス
MDXの骨格筋の強収縮状態における細胞内カル
シウムイオン（Ca2十）濃度を蛍光プローブfura−2で測定した．
方法

DMDのモテリレマウスMDX（3−6週齢，16匹）とその対照マウスBlO（3−6週齢，11匹）の長指伸筋引睦から腱まで採取し，1匹につき1

天日（10JLM）とpluronic F−127（0．08％）を含む
Hanks−HEPES緩徳液に長持伸筋を入れ，酸素と炭酸ガス（＝95：5）の混合ガスを充満させながら，10℃で，2−2．5時間浮置し，その後Hanks−
HEPES緩衝液に移し，25℃で約10分間浮置した．
fura−2を負荷した長指伸筋を培養用カバーグラス（厚さ0．1mm）とシリコン製フレキシムパームで作成したセルに固定した．固定方法は腱の一方をアロンアルファーで固定し，他方の腱を持ち長指＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊オリンパス研究所
バイオメデカルリサーチセンター

池

建

機＊

伸筋が九日痛知の長さになるまで伸ばし，その腱をアロンアルファーで固定した．セルをHanks−
HEPES緩衝液で満たし，落射型蛍光顕微鏡（オリンパスIMT−2）下に置いた．細胞内Ca2＋濃度の測定は顕微鏡に，細胞内カルシウム測定装置（オリンパスOSP−3）を接続し，340nmと380nmの励起光による蛍光強度比で検量線より算出した．検量線は80mg／mlγ−globulinと筋細胞内に負荷したのと同濃度のfura−2を加えたCa2十緩衝液（pH7．00，Ⅰ＝0．20，250C）1）を，キャピラリー（筋細胞の太さ）に封入し，筋細胞と同様に測定して作成した．
長指伸筋の強収縮状態は，筋に平行に白金電極を置き，interva150msec，durationlmsecの電気刺激を与えた．
測定は25℃で行った．

本から3本の単一筋細胞（セルに固定した時，長持伸筋の両端にある単一細胞）を用いた．細胞内への蛍光プローブfura−2の負荷は，fura−2−AM

菊

結

果

筋細胞の静止状態と強収縮状態の細胞内Ca2＋濃度を図に示す．矢印（a）で長指伸筋に電気刺激を与え強収縮状態を起こし，矢印（b）で電気刺激を切り静止状態に戻している．MDXマウスの場
合，強収縮状態では約700nMを示している．他の
MDXマウスの筋細胞内Ca2＋濃度は，この濃度以上にはならず，550nM前後を示す細胞が多かった（範囲330−700nM）．対照のBlOマウスの細胞内Ca2十浪度は約1100nMで，他のBlOマウスはこの濃度以上にはならず，800mM前後を示す細胞が多かった（範囲550−1100nM）．MDXマウス骨格筋の強収縮状態に於ける細胞内Ca2＋浪度は，対庶マ
ウスBlOのそれよりも僅かに低いが大差ない結果−170−

である．この結果はTurnerPR2）等の結果とほぼ一致するが，測定した筋細胞の数が少ないので報告では結論は避ける．

M D X；∪︼亡ロコqLH uUUOU

ヽ

榊

1▲
（a）
tb）

ま

と

め

MDXマウス骨格筋内Ca2＋濃度は，対照のBlO
マウスのそれに比べ大差ないが，細胞内Ca2十濃度を測定した筋細胞の数が少ないので結論を避け
B

l O

る．

ハ

︻王エリ三一巾上∪3COU

文
l
（
i）
tb）

Y lV V ￣■

献1）Horiuti，K：Somepropertiesofthecontrac−ttile system and sarcoplasmic reticulum ofSkinnedslowfibresfromXenqpus muscle．J
Physio1373：1−23，1986．

0．10
川Tlmels】（Numb亡「）150．00l1500）

2）Turner PR，Westwood T，Regen CM andSteinhardt RA：Increased protein degrada−

図

MDXマウスとその対照マウスBlOの骨格筋の静止状態と強収縮状態の細胞内Ca2＋
濃度．
矢印（a）で筋細胞に電気刺激を与え，強収縮状態を起こし，（b）で刺激を切り静止状態に戻した．縦軸はCa2＋浪度，横軸は測定時間，括弧内は測定回数．

tionresultsfromelevatedfreecalciumlevels

foundinmusclefrommdrmice．Nature335：735−738，1988．

−171−32）mdxマウスの電気生理学的及び治療的研究
栗 原 照 幸＊

研究協力者

日 高 隆

信書

岸

根

博＊

木

本

は じめに
Duchenne型筋ジストロフィー症とmdxマウ
スでは，免疫組織染色上ほとんどの筋線経でその細胞膜にdystrophinの欠損があることが知られているが，そのdystrophinの生理学的機能は依然不明である．
我々は，これまでのmdxマウスの筋細胞において電気生理学的に検討し，次のような事実を見出している1）2）．
①静止膜電位（RMP）の低下した筋線経があること．
（診微小電極刺入時にelectrical myotoniaを認めること．
今回，これらの機能的異常を更に検討するとと

下

雅

彦＊

寅

男＊

1）Tyrode溶液の温度を13，18，23，26，37℃に設定してRMP，及びelectricalmyotoniaの記録を行った．
2）Na電流の不活化阻害剤であるサソリ毒（Leiurus quinquestriatus hebraeus，α−サソリ毒）の粗毒を用いてラット，B．。マウスにおいてその筋活動電位を記録，観察した．この際にみられたrepetitiveburstについて，mdxマウスのelec−

trical myotonia，低Cl溶液中で観察される
myotonic burstと比較した．
3）diphenylhydantoin

20mg／1，meXiletine

20mg／1，bestatin40mg／1をそれぞれTyrode溶
液中に混入し，RMP，electrical myotoniaを記録した．

もに，段安定化作用のある薬物を用いてこれらの結機能異常を改善する効果があるか否かを検討した．

果（1）温度変化がもたらすmdxマウスのRMPと方法

electricalmyotoniaの変化

mdxマウス（C57BL／10ScSn−mdx）及びそのTyrode溶液の温度を変化させて得たmdxマ対照のC57BL／10ScSn（Bl。）マウスの横隔膜標

ウスのRMPではその変化による有為な差は認め本を作成し，95％02と5％C02の混合ガスで酸られなかった．しかし，electricalmyotoniaの頻素化したTyrode溶液中で3M KClを満たしたガ
ラス管微小電極を用いて筋細胞内記録を行なった．

度は，低温で高く，高温にては減少していた（表RMP，electrical myotoniaについては，各筋
標本で100本前後の筋線経にて測定を行った．

の膜電位は低下していた1）．この現象は先天性パ筋活動電位については，ラット，Bl。マウスにつパラミオトニアでは，Naチャンネルの異常（一いて横隔膜・神経標本を作成し，神経刺激した際

皮開いたチャンネルが閉じなくなる）が指摘されている3）．

の波形をメモリースコープにとり，写真撮影して1）．またelectricalmyotoniaを起こす筋線経
ラミオトニアに類似している．

（2）サソリ毒投与時の筋活動電位
また，今回用いたサソリ毒はα−サソリ毒であ記録した．
＊東邦大学医学部第四内科

り，精製毒においてはNa電流の不活性化を抑制−172−

表l mdxマウスのPMPとelectrical
myotoniaの頻度
Tyrode溶液の温度を変化させて観察す
るとelectrical myotoniaは明らかに低温で出現しやすい．

BlO mOUSe

サソリ毒0．2mg／ 投与後

温度変化

RM P 土S．
D ．（
mV）

電 気的 ミオ 仁 一の頻度 （％）

13 ± 1℃−7 2 ．5 土 13 ．
6

2 4 ．8 ％18 土 r c−7 5 ．3 土 13 ．1

3 9 ．1 ％2 3 土 1pc

−7 7 ．5 ± 1 1 ．
5

2 6 ．7 ％2 6 ± 1℃

−7 0 ．3 ± 16 ．
9

1 6 ．9 ％3 7 土 1℃

−7 0 ．2 土 1 1 ．
5

6 ．6 ％

Rat hemidiaphragm

サソリ毒0．8mg／ 投与後

＿」lmV
lOOmS

図2 B．。マウスの横隔膜標本
サソリ毒を0．2mg／1と低濃度に投与し，微小電極を刺大した際の機械的刺激で起こったburst．

」10mV
O．4rnS

激によって生じた筋活動電位は，0．8mg／1の濃度
サソリ毒0．4mg／ 投与後では筋活動電位は発火後の再分極が粗害されているのが明らかである（図1）．
0．4mg／1の濃度でも発火後，元のRMPまで戻っていない．
さらに，0．2mg／1では低振幅のrepetitiveburstが認められた（図2）．この反復発火を記録し，検
」10mV
lmS

討すると振幅も小さく，mdxマウスのelectrical
myotoniaや低Cl溶液中で観察されるelectrical

図1 Ratの横隔膜標本
サソリ毒を0．8mg／l（上図），0．4mg／l（下図）の濃度で投与し，神経刺激を1回行って誘発した筋活動電位．

myotoniaとは明らかに異なる．
（3）mdxマウスにおけるRMPとelectrical
myotoniaに対する薬物の効果（図3，表2）
DiphenylhydantoinではRMPの改善は認めらする作用があり，他のイオンチャンネルには全くれないが，electricalmyotoniaは減少した．Mex−

作用を及ぼさないが，粗毒ではNa電流の不活性

iletineとbestatinではRMPの低い線維群にお化の抑制のほかに，Kチャンネルのイオン透過性

いてRMPを改善し，更にmexiletineにおいてはも抑える．

著明にelectricalmyotoniaを抑制している．Di−

この粗毒をラット，Bl。マウスに投与し，電気刺

phenylhydantoinはNaチャンネルを選択的に抑

−173−

表2

RMPoImdx（nomodicaUon）（爪＝100）

50

60

70

80

90

mdxマウスのPMPと3つの薬剤投与
前後のelectricalmyotoniaの頻度
DiphenylhydantoinではRMPの改善は認められないが，meXiletine，及びbes−
tatinではRMPの改善がみられた．
3剤ともにelectrical myotoniaの頻度を減少させる効果がみられた．

100

RMPトmV）

D．
） l 投輔RM P （m o a n 土S ．

RMPotmdx（Diphonylhydantain20mg／り（nミミ61）
禾 活弁 群3 3 ．3 ％＝8 23 ）
1 ． − 69 ．5 士 2 ．
0m ∨d ip h叩 Ihy2 由 n ／り
t0 1∩
（0 ■■

2 ． − 12 ．0 土（

（28 叫 ／り

70

80

＝6 日
■

1 ． − 83 ．9 土 8 ．Om V
山 崎b tin■◆

3 ．3 ％
後

3 8 ．4 ％◆2 1 ．7 ％◆前（∩＝5 0 ）（4小 暮／り2 6 ．7 ％6 ．0 ％

1 ．8 ％

2 ． − 84 ．7 ±（∩＝8
7 ，0巾∨
6 ）■RMPトmV）
RMPoImdx（Moxilo伽020mヱ／り（n＝100）

◆

前

100

90

後

3 6 ．7 ％0 ．
8 巾V（∩＝ 10 0 ）m ●■il●山 l●

60

前＝5 0 ）

1 ． − 82 ．5 土 7 ．1m V

50

後のt 気的 ミオ トニ ーの 繊度− 72 ．6 ± 0 ．
9m V2

1 ．2 ％
後

4 6 ．0 ％◆1 2 ．0 ％5 1 ．0 ％◆3 1 ．4 ％−8 1 9 土 9 ．O m V ■（∩＝12 0）

■WikoxontoSt有意羞あり（p＜0．05）ていない．今回の結果ではbestatinの筋細胞膜への直接作用としてはmexiletineに近い作用，つまりNaチャンネル及びKチャンネルの両方を抑制する作用があると考えられる．
考案

mdxマウスのelectricalmyotoniaは低温で多く起こり，又myotoniaが起こったmdxマウスの筋線経においては膜電位が低いことが観察され
40

図3

50

60

70

80

90

100
RMP（−mV）

た．このことは先天性パラミオトニアと似た変化である．パラミオトニアではNaチャンネルの機

mdxマウスのRMP
各種薬剤投与後のRMPのヒストグラム
を示す．
DiphenylhydantoinではRMPの改善は認められないが，meXiletine，bestatinでは改善がみられた．

能的異常が存在することか仮説として提唱されている．しかし，mdxマウスでみられるelectrical
myotoniaは，Na電流の不活化阻害作用のあるサ
ソリ毒を用いた際に認められたrepetiveburstとは異なったものであり，むしろClチャンネルをブ制することが知られており，またmexiletineはク
ラスI bに属する抗不整脈剤として用いられるが，その作用はNaチャンネルのreopeningに対する作用とともにK conductanceに対する抑制作用があり，我々の結果もこれを支持するものと考えられる．Bestatin2）はプロテアーゼ阻害剤であるが，その電気生理学的作用はほとんど知られロックした際にみられるmyotonic burstに酷似していた．
mdxマウスではRMPの低下とelectrical
myotoniaがあり，一つのチャンネル異常では説
明のつかない現象があることから，機能的には多チャンネルの異常が，程度としては軽度に起こっていると考えられる．

ー174−

ミオトニアの発生機序に関して，先天性筋緊張症とヤギの先天性ミオトニアについてはCI con−で起こりやすい．Electrical myotoniaの波形をductanceの低下がLipickyらにより証明され，観察するとmdxマウスのelectricalmyotoniaは

myotonia dystrophyについてはKチャンネルの

低Cl溶液中でのelectricalmyotoniaと酷似する．

異常がMerickelらにより提唱され，adynamia

Bl。を用いたNaチャンネル再分極阻害剤であ

episodicaではNa電流の不活性化が抑制されているとのLehmann−Homらの報告がある4）．又，いburstが見られたが，これはmdxマウスや低パラミオトニアの赤血球膜での検討で，Naチャ

Clによるelectricalmyotoniaとは異なり，Na電

ンネルの異常がMarxらにより報告されている5）．

流不活化阻害剤によってはrepetitive small

mdxマウスのelectricalmyotoniaについては，

burstは起こるが，mdxマウス＿のelectrical

我々の記録では活動電位のburstの形が低Cl溶るサソリ毒投与による観察では低濃度投与では短myotoniaとは明らかに異なることを示した．

液によるmyotonicburstやアントラセンー9−カル2）薬物の効果

ポン酸によって，Clチャンネルをブロックするこ

今回用いた3剤のうちbestatinとmexiletineとにより生じるmyotonicburstと酷似する．Na
電流の不活化阻害剤によっては低振幅の反復発火

はmdxマウスの低下したRMPを改善する作用があるもののfullsizeの活動電位がburstを来す

mdxマウスのelectricalmyotoniaについてはことはなかった．mdxマウスにおけるelectrical

Naチャンネルを阻止する作用のある薬剤である

myotoniaは，Na−Channelblockerでは阻止する

diphenylhydantoin，bestatin，及びmexiletineのことができるが，膜電位の低下はK−Channel

3剤で阻止効果が認められた．

が認められた．

blockerとしての作用もある薬剤でないと改善す

3）これらの結果よりmdxマウスでは，機能ることはない．このことは，mdxマウスの筋細胞

的には多チャンネルの異常が，程度としては軽度膜異常が，一つのチャンネルの異常ではなく，多に起こっていると考えられる．

チャンネルの異常があると推測される．Dystro−
文

phinの欠損が，筋細胞膜の蛋白及び脂質の異常を献来して多チャンネルに変化をもたらすと考える方

1）Kurihara T，Kishi M，Saito N，Komoto M，が，一つのチャンネルにだけ異常を来すと考える

Hidaka T and Kinosita M：Electrical

より自然であり，その可能性が大きいと考えられ

myotoniaandcataractinX−linkedmuscular

る．

dystrophy（mdx）mouse．JNeuroISci99：83

また，現在イオンチャンネル構造は全てについ−92，1990．

て明らかになっている訳ではないが，Naチャン

2）Kishi M，Kurihara T，Hidaka T and

ネルについていえば，その構造は細胞膜貫通部においては組織間でのホモロジーが高いが，その構

Kinoshita M：The stabilizing effect of

造全体の半分を占める細胞質側ではホモロジーは

Of X−1inkedmusculardystrophymice．JpnJ

低いことが知られている．Dystrophinは種々の組織で欠損が知られているにもかかわらず筋での3）Lehmann−Horn F，ROdel R and Ricker K：

変化が大きい．つまり，これらのイオンチャンネ

Membrane defectsin paramyotonia con−

ルの組織特異性とdystrophin欠損による膜構造変化が関与して筋細胞膜での多チャンネルの異常

genita（Eulenburg）．MuscleNervelO：633−をもたらす可能性があると考えられる．

bestatinontherestingmembranepotentials

Psychiatr Neuro144：595−600，1990．

641，1987．

4）Lehmann−HornF，KdtherG，RickerK，Grafe
P，Ballanyi K and Rndel R：Adynamia

結

語episodica hereditaria with myotonia：a1）mdxマウスのelectricalmyotoniaは低温−175−

noninactivatingsodiumcurrentandtheeffectOfextracellularpH，MuscleNervelO：363−

COmpOSitionoferythrocyteghostsfromthree374，1987．

patients with paramyotonia congenita．

5）MarxA，SzymanskaG，MelznerIandRGdel
R：The membranelipid and fatty acid−176−

Muscle Nervell：471−477．1988．

33）筋細胞膜モデルによるミオトニー発生機序の数理的解析

栗 原 照 幸＊
研究協力者 寺 田 和 子＊＊ 西 村 千 秋＊＊ 吉 沢 修 治＊＊＊岸雅 彦＊ 木 下 寅 男＊

表1数理解析の対象とした筋細胞院モデル

は じめに
ミオトニーは，筋細胞膜のイオン透過性の異

Adぬn■sequations（frog■ssa加血SmUSCle）：SPaCeClamp

常により生じるといわれている．この異常は，膜の数理モデル上では生理定数の変化として表現される．そこで，数理モデル上でミオトニーの発生機序を解析できると考えられる．実際この方向の試みとして，Barchiが先天性ミオトニーの主因といわれるClコングクタンス低下時に，膜の微分方

叫故，1転m3h（V・VNa）・翫n4（V−VK）・gIrV−VLH／CM
dm′dt−αmM・（1−m）＋βmM・m

曲血・αhM・（1−h）・βhM・h叫d・α。M・（1−n）・βnM・nimM・

程式モデルが周期発射を示すことを数値的に示している1）．
今回，Barchiが取り扱ったと同一のモデルにおいて，ClコングクタンスとNa再分極時間（その延長がパラミオトニーの主因という説が近年出されている）をそれぞれ変化させた場合について，

βmM・′爪印トⅣ・Vm）／181

αhM・布○嘲・Ⅳ・Vh）／14・乃 JhMt

覇Ⅳ・Vn）αnM・・

1◆OX朗・Ⅳ・V巾／7・6）

β．Mt石。叶Ⅳ・前日叫

1−8朝一Ⅳ・Vn）／刀ConstantsoIAddan●se甲atbnsat22℃

ミ：三三‥二二二￣ここ￣：≡芋≡…、：南，45 mmh。′ポ 芸：器，87慧1

数値解を求めるのみならず，解空間の構造を解析し，その結果を生理的知見と対照した．
以下，その内容を報告する．
方

罷Ⅳ・職1・e朝一〝・向ハOIVK−イO mV
9t−0・3βh−4・肪
mmho′耶2

ms・1

両三→1mV言二二 ≡寺；…三：法1）筋細胞膜モデル
解析の対象とした筋細胞院モデルを表1に示．した．これは，カエルの経工掛こついて実験的に導出された式2）でSpaCe−Clamp（総電流＝0）を仮定したものである．この式の形はヤリイカ神経軸索のHodgkin−Huxley方程式と同一で，膜電位Ⅴとチャンネル関連因子m，h，nの時間微分に関する連立方程式であり，Ⅴの変化はNa項・K項・
leak項の和で定まる．m，h，nの流入速度α，流出速度βが，電位Ⅴの関数として与えられている．生理定数は，温度22℃の値を標準値として用いた．
上の定数のうち，リークコングクタンスglは，
その7−8割がClによると言われている．また，＊東邦大学医学部第四内科＊＊東邦大学医学部医学情報学研究室＊＊＊東京大学工学部計数工学科∇二は，Na不活性化因子hの移動速度の電位依存性を規定する定数であり，これが脱分極側に変化−177−

することは，Naの再分極時間が延長することに相当する．
2）解析方法91【mmho／cm2】

上記の膜モデルの微分方程式において，生理定数のうちglと∇二をそれぞれパラメータとして変化させ，他はpormalな値として，解空間の構造を解析した．
解のうち，平衡点（dV／dt＝dm／dt＝dh／dt＝dn／dt＝0なる点）は，Newton法を用いて求め，
その安定性を平衡点での固有値の芙部の符号を調べて判定した．（その点から少しずれた値が時間経

図1gl（リーク（主にCl）コングクタンスをパラメータとしたときのモデル方程式の平衡点の電位と安定性

過とともにその点に近づくとき安定，離れて行く
とき不安定という：不安定な点は定点として観測されることはない．）その他の解は，Runge−
Kutta法を用いて数値的に求めた．特に，ミオトニ
ーの反復発射に関連する周期解または振動解の存在する生理定数の値の範囲と，その解が生じる初期値の範囲を調べた．
解析結果
1）gl（Clコンダクタンス）変化の場合（1）平衡点
図1に，glをパラメータとした時のモデル方程式の平衡点の電位とその安定性を示した．glがnormalの値0．3の時は，膜の静止状態（電位−95mV）に対応する点が唯一の平衡点である．この点は，glを変化させてもほぼ一定の値で，常に安定である．gl＜0．11で，新たに2個の不安定な平衡点が脱分極側に現れる．これらの新平衡点は，他の生理定数を以下の方向に変化させると消失する．
Na項減少：VNa低下・gNa減少・Vm低下・て拓上
昇

K項増大：VK上昇・京増大・∇上昇
leak項増大：gl大・静止電位（≒Ⅴ．）上昇（2）周期解
gI＜0．014で，方程式には安定な周期解が存在す
る．この安定周期解に収束していく電位波形の一例として，gl＝0．001の場合を図2に示した．この周期解の電位の振幅はglによらずほぼ一定で，最大値は20mV付近であり，最低値は−70mV付近
即ち二つの不安定平衡点の間にある．また，周期

図2

gl低下時に出現する周期発射を示す数値
解の一例

もglによらずほぼ一定で；16ms程度である．
一皮発火聞値をこえた場合は，静止状態には戻らず，この周期解に巻き付いていく．
この周期解が安定に存在する時に，生理定数を
新平衡点を消失させる方向に変化させるか膜容量を増大させると，この解は消失する．
2）乾（Na再分極時間）変化の場合（1）平衡点
図3に，∇二をパラメータとした時のモデル方程式の平衡亘の電位とその安定性を示した．膜の静止状態に対応する平衡点は，軒によらずほぼ一定で常に安定である．∇こ＞−36．1mVで，新たに2個の不安定平衡点が静止点より脱分極側に現れる．
さらに，罷＞−6．6mVで，最も脱分梅側の平衡点は安定になる．
これらの新平衡点は消失させる定数変化の方向−178−

モデル方程式において低Clコングクタンスで存在する安定周期解およびそれに巻き付いていく
解の示す電位波形は，Barchiも指摘しているとおり，Clチャンネル阻害剤を用いた電気生理実験3）4）
やミオトニーにみられる反復発射と対応している．
また，一度発射がおきるとそのまま周期解に引き込まれていくという解空間の構造は，電気生理
実験で針をいれるだけで連続発射が生じるというburstの生じ易さに開通している．
図3

図4

モデル上，低Clコングクタンスで安定周期解が存在するときも静止状態に対応する平衡点が安定であるという構造は，無刺激では筋緊張が生じないという病態と対応している．
この新平衡解および周期解を消失させる定数のVh（Na不活性化因子移動速度の電位依
存性定数）をパラメータとしたときのモデル方程式の平衡点の電位と安定性

変化方向は，モデル方程式の上で統一的に理解できるが，治療的薬物による定数変化の方向と一致している．また，静止膜電位が低下した場合にミオトニー様burstが生じ易いという知見とも一致している．このことから，ヒトのモデル方程式が確立できれば，治療に定量的指針を与えうると考えられる．
2）▽こ（Na再分極時間）変化の場合

Vhをパラメータとしたとき，脱分極側の平衡点が安定になる直前に出現する振動を示す数値解の一例

Na再分極時間を延長する作用のある薬物は，
サソリ毒から精製してえられるものが唯一知られているものであるが，筋にこれを用いた実験の報
告例はない，今回の珪研究の中で，栗原・日高ら

は，glの場合と同一である．

（2）反復発射解∇二が新平衡点のひとつが安定化する直前の値の−6．4から−6．6mV付近で，この平衡点のまわりで小さな振幅で振動したのち静止状態に到達する数値解がえられる．その一例を図4に示した．
図4は，脱分極側の平衡点のごく近くに初期値をとって得られた波形である．軒が同じ値のときも，初期値の取りかたにより，通常の発射と同じ波形も得られた．
考察
前項で述べた解析結果と，薬物を用いて当該定数を変化させた生理実験の結果およびミオトニーの病態との対応を考察する．
1）gl（Clコンダクタンス）変化の場合がサソリの粗毒を用いた実験を行っているので，その結果と数理解析の結果を対照する．実験の詳
細は，栗原・日高らの報告書を参照されたい．
まず，ラットの横隔膜筋にサソリ粗毒を多量に（0．4−0．8mg／1程度）用いた場合，静止膜電位とそこから数10mV脱分極側との二つの安定電位を示すデータが得られている．また，マウスにより少量（0．2mg／1）の毒を用いた場合，数値解と振幅の変化が逆だが，よく似通った波形が得られている．以上から，数値解と実験結果は，定性的にはよく対応しているといえる．
ここにみられた電位振動とミオトニーの関連を考察すると，振動の振幅は10mV程度と小さく，静止電位からの変位幅も通常の発火に比してはるかに小さく，また持続時間も長くて数100ms程度−179−

と短い一過性の振動であるので，この電位振動は，
ミオトニーとは異なると考えられる．

文献1）BarchiRI：Myotonia，an eValuation ofthe
chloride hypothesis．Arch Neuro132：175−結

語180，1975．

今回検討したカエルの筋細胞膜モデルは，その解の挙動が定性的には生理的知見とよく対応して
いて，ミオトニー様burstの発生機序を解析するモデルとして信頼に足るといえる．個別にみると，
Clコングクタンス低下時の周期解が存在する解空間の構造は，先天性ミオトニーの発火とよく対

2）Adrian R，Chardler W and Hodgikin A：

応している．一方，Na再分極時間の延長では，延長の程度が大きいときには膜がふたつの安定点をもち，2安定状態になる直前で振動解が生じたが，これはmyotonicburstとは異なるものである．
今後は，哺乳類のモデルを用いて定量的な解析をすすめたい．

1ic aromatic acids．J Physio1219：367−383，

Voltage clamp experimentsin striatedmusclefibers．J Physio1208：607−644，1970．
3）Bryant SHand Morales−Aguilera A：Chlo−ride conductancein normal and myotonic
musclefibresandtheactionofmonocarboxy−

1971．

4）Kurihara T，Tanaka M，Toshimori K，Tomita M and Shibata K：Experimental
myotoniain human externalintercostal

muscles．Current Researchin Muscular
Dystorophy，Japan．The Proceedings ofthe
Annual Meeting of Muscular Dystrophy
Research Group66−67，1980．

−180−34）Heterozygote mdx mouseの筋細胞におけるdystrophinの発現と筋核との問係
川 井 尚 臣＊
研究協力者

玉

木

康

民＊

三ツ井

貴

夫＊

土

橋

孝

之＊

斎

史

郎＊

は じめに
Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）ではジストロフィン遺伝子に欠矢があり，その結果ジストロフィンが塵生されず，従って骨格筋の細胞膜にジストロフィンが証明されない．そして，ジストロフィン遺伝子に関してへテロ接合体の同女性保因者の骨格筋ではジストロフィンが染色される細胞と染色されない細胞がモザイク状に存在すると報告されている1）．私たちはDMDの女性
保因者の骨格筋細胞におけるジストロフィンの発
現様式は2個のⅩ染色体の一方の不活性化と密接に関連していると考え，DMDのモデル動物であるmdxマウス2）のヘテロ接合体の筋細胞膜におけるジストロフィンの局在部位と筋核との位置的関係を検討した．
対象及び方法
対象はC57BL／10−mdx雄マウスとC57BL／10−ScN雌マウス，およびC57BL／10亭CN雄マウスとC57BL／10−mdx雌マウスを交配して得たヘテ
ロ按合体の雌マウスである．正常対照として，C57
BL／10ScNの雌マウスを用いた．親マウスは実験
動物中央研究所の斎藤宗雄先生より供与を受けたものであり，当教室で飼育，増殖して用いた．
得られたヘテロ接合体及び正常マウスを生後5日日，10日目，15日目，20日日，30日目に頸椎脱

藤

尾

隆

子＊

切片を作製，この組織切片をDr．Hoffmanより供与を受けた60Kdの抗ジストロフィン抗体を用いABC法にて染色し，さらにmethylgreenあるいはhematoxylinにより核染色を行った．なお，抗ジストロフィン抗体は1000倍に希釈して用い，組織切片と37℃，60分間反応させた．そして，ABC法により染色した筋組織標本中の筋核に接した部
分の細胞膜にジストロフィンが強く染色される核を（＋），僅かに染色されるものを（±），染色されないものを（−）と分類し（図1），各時期の標本について筋核300個を無作意に調べ，（＋），（±），（−）の核の比率を算出した．
成績

1．成熟マウス骨格筋のジストロフィン染色像
図2に左より正常雌マウス（N），mdxへテロ摸
合体（H），mdxへミ接合体（D）の筋組織のジス
トロフィン染色像を示した．正常マウスでは全ての筋細胞の細胞膜に一様に全周性に染色性がみら
れ，へミ接合体では全く染色性がみられなかった．
ヘテロ按合体では生後60日の成熟期には殆ど全ての筋細胞にジストロフィンの染色性が全周性にみられた．
2．mdxマウスへテロヨ妾合体の骨格筋細胞のジストロフィン染色部位と筋核との位置的な関係
1）各日齢における（＋），（±），（−）の核の比率

臼法により殺処分し，俳腹筋を採取して6JJの凍結＊徳島大学医学部第一内科

鳴

mdxへテロ接合体では生後5日目は（＋）甲核は33％，（±）の核は40％，（−）の核は27％，10
−181−

（土）

（十）

（−）

図1周辺の筋細胞膜のジストロフィンの染色性による筋核の分類．筋核に接した細胞膜に染色性が強く認められる核を（＋），僅かに認められる核を（±），認められない核を（−）とした．

図2

左から正常雌マウス（N），mdxマウスのヘテロ接合体（H），mdxマウスのへミ接合体（D）の生後60日目の骨格筋のジストロフィン染色像（×150）．ヘテロ接合体で殆ど全ての筋細胞の細胞院にジストロフィンの染色性が全周性に認められる．

日日では（＋）の核は60％，（±）は26％，（−）

合体の骨格筋のジストロフィン染色像は14％，15日目では（＋）の核は78％，（±）は15

生後10日日のジストロフィン染色像を図3に示した．正常マウス（N）では殆ど全ての筋細胞が全周性に染色されるのに対し，ヘテロ接合体（H）では筋細胞膜が全周性に染色されるもの，部分的に染色されるもの，染色されないものなどが認められた．

％，（−）は7％，20日目では（＋）の核は69％，（±）は20％，（一）は11％であり，30日Hでは（＋）の核は77％，（±）は18％，（−）は5％であった．
正常マウスでは生後5日目では（＋）の核が89％，（±）の核は9％，（−）は2％であった．10
日目では（十）の核が86％，（±）の核は13％，（−）

3）生後30日目のジストロフィン染色像
生後30日目のジストロフィン染色像を図4に示は1％であった．15日では（＋）の核は98％，（±）
は2％，（−）は0％であり，20日削ま（＋）の核は94％，（±）の核は6％，（−）は0％，30日目
では（＋）の核は94％，（±）の核は6％，（−）
は0％であった．
2）生後10日目の正常マウスならびにへテロ接した．左が正常マウス（N），右がヘテロ接合体（H）の成績である．30日目にはヘテロ按合体において殆ど全ての筋細胞の細胞膜部分にジストロフィンの染色性がみられたが，染色性は必ずしも一様ではなく，染色性のみられない細胞も小数ながら認

ー182−

図3

生後10日目の骨格筋のジストロフィン染
色像（×580）．
左が正常マウス（N）
右がヘテロ接合体（H）．

図4

められた．

生後30日日の骨格筋のジストロフィン染色像（×150）．
左が正常マウス（N）
右がヘテロ接合体（H）．

た．

3．筋核近辺の細胞膜のジストロフィンの染色

また，（＋）の核と（−）の核の和に対する（−）

性により分類した筋核と出生後の経過日数との関係の核の比率は，m血のヘテロ接合体では生後5日

図5に示した如くmdxマウスのヘテロ接合体
では，明らかに筋核の近辺が染色される核（＋）（closedcolumn）の数は生後5日目では全体の約3分の1を占めるが，日齢と共に増加して15日日には約80％となり，その後30日目までは明かな増加がみられなかった．これに対して核近辺の細胞

日目では14％，30日目では6％と成長に伴って減少した．

目では45％とほぼ半数を占めたが，この比率は20

考察

骨格筋細胞にLyon仮説3）が当てはまるとすれば，女性保因者ではジストロフィン遺伝子に関し膜が染色されない筋核（r）（Opencolumn）の数は生後5日目では全体の27％と正常筋に比べ多く，その後この比率は成長に伴い減少し，30日日
で5％になった．正常マウスでは，生後5日目に￣個の筋核中の2個のⅩ染色体のうち一方のみ

始まり30日日まで殆ど全ての筋細胞で筋核に近接した細胞膜にジストロフィンの染色性が認められの2種類の核が存在することが考えられる．一方，が活性化され，もう一方は不活性化されている筈
である．従ってジストロフィン遺伝子に関してはジストロフィンを塵生できる核と産生できない核￣個の筋核の遺伝子で産生されるタンパク質はそ

−183−

8
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i一l脛さ︒糾l一七

kbⅦ打直月山＝札朗

0l㌍（由yS）

図5 筋核に近接した細胞膜のジストロフィンの染色性により分類した筋核と生後の経過日数との関係．■：（＋）の核，謹壷：（±）の核，［コ：（−）の核．

の核の近辺に局在するとの報告があり4），ジスト
ロフィンに関しても同様と推定される．従って
mdxのヘテロ接合体の骨格筋の筋核には，近辺の細胞膜にジストロフィンを有する核と有しない核の2種類の核が存在することが考えられる．我々の成績では，mdxマウスのヘテロ接合体の骨格筋

ジストロフィン（−）の核の経時的な減少の機序については，やはりLyon仮説が作動しているとすれば，ジストロフィン産生核による代償的な産生の増加あるいは細胞内におけるジストロフィ
ン産生核から非産生核の近辺へのジストロフィンの拡散分布が推定される．多数の（±）の核の存
在はこれを支持する成績である．
文献的には，WatkinSら5）はmdxマウスへテロ接合体の骨格筋でジストロフィンが染色される細胞（陽性細胞）とされない細胞（陰性細胞）がモザイク状に存在し，ま￣た幼若期には細胞膜に染色されない部分とされる部分のある細胞，すなわ
ちpatchyに染色される細胞が存在し，マウスが成長するに従ってジストロフィン陽性筋細胞が増加すると報告している．そしてこの機序についてはやはりジストロフィンの産生の代償的な増加あるいはジストロフィン産生核を有するsatellite
Cellが増殖，融合することによると考えられている．一方，筋細胞内の蛋白の流動，拡散について
はRalstonら6）が多核筋管細胞において一つの筋核でコードされた蛋白は隣接する核にまで及ぶと報告している．これらの報告は我々のジストロフ
ィンが筋細胞内で移動し，隣のジストロフィン非
産生核にまで及び，（−）の核が（±）あるいは（＋）に変わるとの考えを支持するものである．
以上のことにより，mdxマウスのヘテロ技合体
ではLyon仮説が作動しており，また，1つのジス
トロフィン産生筋核にて産生されたジストロフィンは近接の筋核の近辺にまで及ぶと考えられる．

細胞において生後5日〜10日目の幼若期には近接した細胞膜にジストロフィンが強く染色される核

ま

と

め

（（＋）の核），僅かに染色される核（（±）の核），

mdxマウスのヘテロ接合体の骨格筋組織のジおよび染色されない核（（−）の核）などが存在しストロフィン染色を行い，近接した筋細胞膜に染た．このことは，筋細胞においてLyon仮説が作動

色性を有する筋核と有しない筋核があり，mdxマ

していることを示唆する成績である．10日日以後

ウスのジストロフィン遺伝子に関してLyon仮説

ジストロフィン（−）の核は，経過とともに減少が作動しているとの考えを述べた．また，ヘテロ

し，30日目ではジストロフィン（−）の核は殆ど接合体mdxマウスの筋細胞ではジストロフィン

認められなくなった．また，我々は（±）の核は産生核によって生成されたジストロフィンは非産

本来はジストロフィン非産生核であり近接したジ生核の近辺にまで移動するため成熟へテロ接合体

ストロフィン産生核のジストロフィンが移動してmdxマウスでは殆ど全ての筋細胞の細胞膜にジきたものと考えている．

ストロフィンが全周性に一様に証明されるものと−184−

mammalian X−Chromosome．AmJ Hum

考えられる．

Genet14：135−148，1962．

文
献1）Arahata K，Ishihara T，et al：Mosaic
expression of dystrophin
CarriersofDuchennein4）Pavlath GK，Rich K，et al：Localization ofmuscle gene productsinnuclear domains．
Nature337：570，573，1989．

symptomatic5）WatkinsSC，HoffmanEP，etal：Dystrophin

smusculardystrophy．N

EnglJ Med320：138−142，1989．
2）BulfieldG，SillerWG，etal：Xchromosome

distributionin heterozygote mdx mouse．

−linked muscular dystrophy（mdx）in the6）Ralston E and Hall ZW：Localization ofmouse．Proc NatlAcad Sci USA81：1189−

muscle gene productsin nuclear domainS．

1192，1984．

Nature337：570−573，1989．

3）LyonMF：Sexchromatinandgeneactionin−185−

Musle Nerve12：861−868，1989．

35）mdx mouseの骨格筋におけるDNA合成
川 井 尚 臣＊研究協力者

玉 木 康 民＊ 有 井 敬 治＊
増 田 健二郎＊ 横 井 健 治＊

は じめに
mdxマウスは人のDuchenne型筋ジストロフ
ィー症と異なり非進行性である．筋病理組織学的1）にも生後4週〜8週では筋細胞の変性・壊死が強く，その後これらの変化は少なくなり次第に再生筋に置き換えられ，90日目では変性・壊死細胞は殆どみられなくなる．本研究では，このようなmdxマウスの骨格筋の変化を筋細胞のCell
cycleの面より究明するため，mdxマウスの骨格筋の筋核のDNA量を生後日を追って測定し，そのDNA合成曲線より筋細胞のCell cycleを調べ，
mdxマウスにおける筋細胞の変性，再生と症状との関係について検討を加えた．
試料と方法
実験に用いたのは雄のmdxマウスである．正常対照としてはC57BL／10ScNマウスを用いた．
親マウスは実験動物中央研究所の斎藤宗雄先生より供与をうけたもので，その後当教室で飼育，増殖し実験に用いた．これらのmdxマウスを生後15日目，30日目，60日目，ならびに90日目に頸椎脱臼法により殺処分し，俳腹筋を採取，厚さ3恥の凍結切片を作成した．それぞれの時期の組織切片にFeulgen染色を行い，万能顕微分光測光装置（UMSP）（Karl Zeiss社）にて波長560JLmを用
い，測定面積314JJm2で筋核の吸光度を測定し，これをDNA量とLarbitrary unit（A．U．）で表した．一枚の筋組織切片当たり無作意的に200個の筋核を測定し，各時期（15〜90日日）の筋核DNAの＊徳島大学医学部第一内科

赤

池

雅

史＊

分布を調べると共に三好ら2）の考案した方法に従ってDNA合成曲線を作成し，各時期における筋細胞のCellcycleを検討した．
三好ら2）3）によると縦に筋核のDNA量をとり，横に等間隔にDNA量の少ない順に筋核を左から右へ並べると曲線を示し，diploidcellのDNA量2Cを中心としたpresyntheticgap（Gl期），直線状のSyntheticperiod（S期），4Cの横線を横切る
postsyntheticgap（G2M）期，4Cより大きい核（＞4C）などのCell cycleが区別できるとされている．
成績
1．mdxマウスの筋病理組織像
図1に生後15日，30日，90日の筋病理組織像を示した．15日では異常所見は殆どみられないが，30日では，多数の壊死・変性筋細胞や再生筋細胞が見られる．90日目ではそれらの所見はきわめて少なくなり，大部分が中心核を有する再生後の筋細胞と思われる細胞で占められていた．
2．筋組織のFeulgen染色像
図2にmdxの生後90日目の骨格筋組織のFeulgen染色像を示した．Feulgen染色では核は濃い赤紫色に染色される．肉眼的にも核によって多少の浪淡の差がみられる．核部分の吸光度をUMSPにて測定したが，筋線経からはみ出た核や部分的に重なり合っている核は測定から除外した．
3．正常マウスとmdxマウスの筋核DNA量の分布
図3の左に正常マウス，右にmdxマウスの成績を示した．上から順に生後15日，30日，60日，−186−

図1右からmdxマウスの生後15日目，30日目，90日目の筋病理組織像を示した．
HE染色，×120．15日目では殆ど変化はみられないが，30日目では筋細胞の壊死，変性，萎縮，再生が著明である．
正書マウス■dxマウス（∫〉日日⊥∴こ…−⊥∴
pN▲tl▲．U．）」＿⊥‥
DNAl（A．U．I
くり

DドAt（A，U．）

図2

mdxマウス90日日の筋組織のFeulgen
染色像，×250．細胞核が浪染してみられる．

DN▲ttA．U．1

日日⊥∴
DNAt（▲．U．〉

（

L．＿T

pN／Hl（A．U．】

図3

−187−

DN▲■tA．U．〉

正常マウスとmdxマウスの各時期（15日〜90日）における筋核のDNA量の分布．

90日の成績を示し，横軸にDNA量，縦軸に筋核の数を示した．生後15日日では正常マウス，mdxマ
ウスにDNA量が1．OA．U．を中心とした筋核が多くみられたが，30日目ではmdxはDNA量が3．O
A．U．近辺のDNA量の多い核が増加しているのが認められた．
正常筋では，その後の60日目，90日目でも1．OA．
U．附近の核が多く，DNA量の分布に経時的変化は殆どみられなかった．mdxマウス筋ではその後DNA量の多い核が減少し，90日目では再び核の多くがDNA量1．OA．U．近辺のものになった．
4．正常マウスとmdxマウスの骨格筋細胞のDNA合成曲線とCellcycle
図4に正常マウスとmdxマウスの30日目の3．5％みられるのみであり，pOStSynthetic gap（G2期）のものは認められなかった．これに対し，mdxでは2Cを中心としたGl期の核が61．5％，S期が12．5％，G2M期は10．5％とS期，G2M期の核が多く，4Cより大きい核も15．5％と多数認められた．この成績は，mdxマウス筋ではこの時期に正常期に比べDNAの合成期と分裂期の核が著しく多いことを示す．
図5は同様の方法で調べた15日日〜90日目の各
時期の筋組織の筋核のCellcycleを比較して示したものである．正常筋では，各時期を通じS期の核は3．0〜3．5％とほぼ一定していたが，下段のmdxマウスでは15日巨＝まS期はまだ5％と増加

DNA量の分布をもとに作成したDNA合成曲線を示した．なお，リンパ球の核のDNAの平均値
A．U．倍を2Cとした．
正常マウスの筋では2Cを中心としてpresynth−はわずかで，その他の時期の核も少ないが，30日
では前述のごとくS期の核は12．6％と多くなり，
G2Mも多く，60日目でもS期の核はやはり12．0％と多数見られた．しかし，90日ではS期の核は再び著明に減少し；5．5％とほぼ15日目の値に近い

etic gap（Gl期）の核が多く，S期の核はわずか数値を示した．

︵．n．V︶■くえ白m d xマウス
（1−

ほ円

ゝG川

1〔＞

3日円

60日

12．5‡10・5115．51

図4

90日

図5

正常ならびにmdxマウスの筋細胞のDNA合成曲線とcell cycle−筋組織
の成績．
−188−

正常ならびにmdxマウスの各時期における筋細胞のCellcycleの比較．

考

察

筋核のCellcycleと筋病理組織像を経時的に比mdxマウスには人の筋ジストロフィー症のDuchenne型と同じく，ジストロフィン遺伝子に異常があり骨格筋細胞にジストロフィンは証明されないが筋力低下などの症状は非進行性であることがDuchenne型とは異なっている．この病態についてはまだ十分研究が進んでおらず，mdxマウスの非進行性の機序は解明されていない．これを解明することは人の筋ジストロフィー症の治療法の開発にも結びつく重要な事柄である．
人の病的骨格筋の筋細胞のCellcycleに関しては同じ方法を用いて八木4）がすでにDuchenne型
筋ジストロフィー症，その他の筋萎縮症の骨格筋におけるcellcycleの成績を発表しており，対照の成人骨格筋ではcellcycleはGl期93．3％，S期
1．3％，G2M期4．7％，＞4C O．7％であるに対して，Duchenne型ではGl期83．4％，S期10．7％，
G2M期4．6％，＞4Cl．3％で，対照に比べS琴の核が増加しており筋細胞のCellcycleの面からもDuchenne型では再生筋細胞が多いことが示唆されている．DMDのS期核の率は我々の生後30日
目，60日日のmdxマウスの成績，30日日12．6％，
60日日12．0％ときわめてよく似た値であり，Cell
CyCleの面からmdxマウスのこの時期の筋組織の筋細胞のDNA合成の状態，すなわち細胞の変性，壊死，再生の状態は人のDuchenne型に似たものであることが示唆される．そして，Duchenne型
では筋組織が著しく崩壊するまでS期が多い状態が持続4）し病状は進行性であるのに対して，mdxでは生後90日目でS期の核が減少し，すなわ
ち再生筋細胞が減少し，病状が非進行性になることはDuchenne型とは極めて大きい違いである．
本文ではmdxマウスの筋核は生後15日では正常マウスとほぼ同じcellcycleを示し，30−60日
ではS期の細胞が増え，90日目にはS期のものが再び減少し元に戻るとの成績を示した．一方，筋の病理組織像は15日までは正常所見を示し，30日
目，60日日では筋細胞の変性・壊死，そして再生が多く，90日目は中心核を有する細胞に置き変わっており，それまでにみられた変性・壊死細胞や再生筋細胞は極めて少ない．

較検討すると，生後15日目ではce11cycleではS期が少なく，再生筋細胞も多くないことを示しており，この時期には筋細胞の変性壊死が少なく，従って筋の再生も起こらないと考えられる．
30−60日ではS期，G2M期の核が増加しており，
Cell cycleの面からは再生筋細胞の著しい増加が示唆される．筋組織所見でもこの時期には変性・壊死細胞，再生細胞が多い．すなわち，この時期には筋細胞の脱落が多いためその補充のため筋核
DNA合成の増加，すなわち筋細胞の再生が増加するものと考えられる．その後は筋細胞の変性・壊死が少なくなり，その結果DNA合成も減少（S期の核の減少），すなわち再生筋細胞が減少するものと思われる．
以上の成績から直ちにmdxマウスの病状が進行性でないことに対する解答は得られないが，mdxマウスで症状が進行しないのははじめ壊死・変性により脱落した筋細胞を再生筋細胞によって補充しているが，その後はS期やG2M期の核を有する再生筋を増やし持続的に脱落細胞を補っているからではなく，再生筋の変性・壊死が何らかの原因によって抑制されていることによると考えられる．
本研究に示した成績はマウスの一個体を連続的に追って得たものではないので，今後実験の数を重ねて成績をさらに信頼度の高いものにしたい．
まとめ

mdxマウスの骨格筋細胞のCell cycleを経過を迫って調べ，mdxマウスの病状が進行しないのは再生筋細胞が増加し，脱落した細胞を持続的に補っているのではなく，再生した筋細胞の変性，壊死が抑制されるためと考えられる．
文献1）DangainJ andVrbovaG：Muscle develop−
mentin mdx mutantmice．Muscle Nerve7：
700−704，1984．

2）三好和夫，高野尚之：血球のDNA合成に及ぼ−189−

す放射線の影響−DNA合成曲線の解析による成績．日血会誌28：319−328，1960．

4）矢木文和：筋ジストロフィー症及び各種筋疾患

3）岡 耕一：DNA合成曲線より見たcell cycle．
とくに正常人骨髄細胞について．四国医誌24：603−612，1960．

−190−

における骨格筋核のDNA合成とcellcycle．四
国医誌37：130−142，1981．

36）「Immobilization」によるmdxマウス筋変性への影響

−第2報−
関

等＊

連

研究協力者

水 野 美 彦＊＊昨年の本会議で我々はlocaltetanus法を用い，
mdxマウスにおいて筋の不動化により筋変性が抑制されることを報告した1）．今回は昨年の実験を更に拡大すると共に，運動制限のみを与えることによる筋変性への影響をも調べたので併せて報
告する．
対象・方法
生後3Wのmdxマウス24匹を使用した．8匹は昨年と同様右肺腹筋にtetanus toxinを1回筋注
Llocaltetanusを作成した．別の8匹は身体の大きさより若干広い程度の狭い部屋で1匹づつ飼育した（図1）．残りの8匹は何も処置を施さず，通常の飼育とし対照とした．1，2，4，8週後（Rx群のみ4，8週後）に各4匹づつを殺し，tOXin注
射群は両側，それ以外は右SOL，EDLを採取し，HE染色標本における横断面での全線維数に対する中心核線経の頻度を測定し変性の指標とし，一方，湿重量，中心核を有しない線経の平均直径を測定し筋萎縮の指標とした．中心核を有する線経は再生途上にあり，従って線維直径は増加途中にあるので計測からは除外した．
各筋の同定は次の如くである．
Tx：Toxin注射群の注射側（右）Cx：Toxin注射群の非注射側（左）Rx：運動制限群
Ux：無処置対象群＊東京都立神経病院神経内科＊＊乗京都立神経病院神経小児科

図1運動制限用の飼育室

結

果1．中心核線維頻度
図2Aに示すごとく，SOLではTX群はUX群に比べ常に少なく，4，8週では有意差が認められた．Rx群でも4週でUx群との間に有意差をもって減少が見られた．一方，Cx群では1，2週
ではむしろUx群より多く，かつTx群との間に有意差をもって増加を示した．
一方，EDLでは図2Bに示すごとくTx群は1，8週後にUx群と比べて有意に減少し，8週後ではCx群，Rx群もUx群に比べて有意に減少を示した．図3，4に組織像の一部を示す．
2．湿重量
図5Aに示すごとく，SOLにおいては全体的にUx群に比べ湿重量は小さい傾向があり，4，8週
で有意差が認められた．Cx群は1，8週でTx群との間に，2週でUx群との間にそれぞれ有意差が認められた．一方，Rx群ではUx群との間には有意差はなく8週ではむしろ増加が認められた．

ー191−

INCIDENCE OF CENTRONUCLEATED F川ERSINCIDENCE OF CENTRONUCL．EATED FIBERS
（EDL）

（SOL）

80−

O Cx
● Tx
☆Rx
★Ux

1

80−

2

4

8

岨S

O Cx
● Tx
女Rx
★Ux

1

霊pく0．05

霊pく0．05

霊暮pく0．01

暮事pく0．01

図2A

図2B

4週，UxTSOL．HEx150

EDLでは図5Bに示すごとくCx群，Tx群ともUx群と比べて少ない傾向にあり，2週で有意差が認められた．Rx群はUx群との間には有意差はなく，8週でTx群との間に有意差が認められた．
3．平均直径中心核を有しない線経の平均直径の測定では，SOLでは図6Aに示すごとくTx群，Cx群ではUx群に比べ小さく4，8週で有意差が認められた．Rx群ではUx群との間には差は認められなかった．EDLでは2週でCx群，Tx群がUx群に比べて有意に小さかったほかは有意差は認められなかった（図6B）．

2

4

8

VKS

4週，Tx−SOL．HEx190

4．変性抑制と筋萎縮の関係
表は中心核線経の減少，すなわち変性抑制が有意に認められた組合せと，平均直径，湿重量が有意差を示した組合せを表にして比較したものである．表から分かるように，平均直径，湿重量の間にはかなり良い相関がみられたが，変性抑制と平均直径，湿重量との間には数カ所を除いて相関は
ほとんど認められなかった．
考察
今回の実験ではlocaltetanus，運動制限の何れの方法でも対照と比較して筋変性は抑制されており，筋のimmobilizationが変性を抑制することが

−192−

図3A

8週，UxTEDL．HEx

図3B

8週，Tx−EDL．HEx150

図3C

8週，Rx−EDM．HE x75

図4A

60

−193−

We t wei p：h t．
＜SOL＞

Wet

Y＿eip＝ht

＜EDL＞

0
1

0
1

9

9

6−
5−

5−
4−

4−
3−

3−
2−

2−
1−

ト
0一

1

2

4

8

0−

wks

1

2

4

8

vk s

＊p＜0．05＊暮p＜0．01

霊p＜0．05

図5A

図5B

示ざれた．また，SOLにおいて1，2週後にCx群がTx群に比べ有意に変性が強かったことは，Cx群が片足で歩くため過重労働になっていたことを考えると，筋運動自身が変性を促進することを示しているものと思われた．ジストロフィンは筋膜の内面を裏打ちするようにnetworkを作っていると考えられているが2），MDXマウスではジスト
ロフィン欠損のためこの裏打ち構造が粗となり，膜の透過性が冗進し，カルシウムの流入が増加し筋変性をもたらすと考えられる．筋に対する運動抑制の間には相関はなく彼等の結論は支持できな

負荷はこの透過性を一層克進させる可能性が考えられた．Karpatiら3）4）はdystrophic hamsterにおける脱神経・再支配実験において，脱神経時に変性が抑制され，再支配時に変性が現われること
より，筋の発達障害が筋変性抑制に影響していると推察している．今回の実験では平均直径と変性かった．筋運動自身が変性を促すとすれば，彼等の実験結果はこの観点から容易に解釈できるわけ
であり，筋萎縮は単なる廃用性萎縮に過ぎないと考えられた．
ところで，今回の結論を臨床に適用できるか否かについて考察してみたい．Duchenneの患者（DMD）の場合，2歳前後では元気に走り回っており，臨床症状だけからは疾患に気がつかないことが普通である．しかしながら，筋組織では立派に変性が見られている．この状態はMDXマウスの場合も同様で，臨床的に筋力低下は分からないにも拘らず，変性は進んでいる．かつ，両者ともジストロフィン欠損を示している．ジストロフィン欠損が筋変性に関係していることはほぼ間違いないと思われ，従って，今回の結論をDMDに通

−194−

1

MEAN FIBER DIA【FrERHEAN FIBER DI川FrER

（SOL）

（EDL）

2

4

8

−KS

1

霊pく0．05■pく0．05

霊暮pく0．01

雷霊pく0．01

用して考えることは妥当と考えられる．実際，DMD患者が合併症の治療のため臥床生活を送っていると，CPKが低下してくることはよく観察さ
表 筋変性抑制と平均直径，湿重量の関係
筋

実 験 群

変 性 抑 制平 均 直 往

過 重丑

S OL

C l ． 110 ．0 5 ●0 ．0 50 ．0 5E DL

Ul −Tl0 ．0 5

NS

NS

S OL

Cx −Tェ
C l − Ul0 ．0 5NSNS
0 ．0 5NS
0 ．0 5

T■ −UxCl −UlMS
MS

0 ．0 50 ．0 10 ．0 5

1

2
E DL

4

S OL

S OL

0 ．0 5

Tl
Rl

t Ul
・Ul

0 ．0 50 ．0 1−Tl

NS

0 ．0 5MS￣0 ．0 10 ．0 5NSRl

T六 一 C x
Tl − U l
Tx − R x

NS0 ．0 50 ．0 50 ．0 1〃S

NS

0 ．0 10 ．0 10 ．0 5

Cx
Tl
Rl
Rx

0 ．0 10 ．0 10 ．0 5
NS

NS
MS
NS
NS

NS
NS
NS
0 ．0 5¶S

8E DL

暮 数値は有意差P値
MS：Not si￡nificant

・Ux
−Uェ
−U■
−Tl

4

8

−1S

図6B

図6A

週

2

れる所である．これはr運動制限により筋変性が抑制されたことに他ならないと考えられる．一方，学童が夏休みなど長期休暇中に自宅であまり動かずに生活していると，新学期になって筋力が低下することも，また，観察されるところである．しかし，この場合は病気がかなり進行した症例であることが多く，この場合は廃用性萎縮の影響の方が強く出るのではないかと考えられる．従って，幼児期のまだ元気な内から運動を制限することで筋変性を抑制し，病気の進行を遅らせることが出来るのではないかと考えられた．
結論
1．Localtetanus，運動制限何れの方法でもmdx
マウスにおける筋変性を抑制出来た．この場合tetanus群の方が抑制が強い傾向が見られた．
2．筋萎縮と筋変性抑制との間には有意な相関は認められず，筋線経の発育障害が変性抑制の原因とは考えられなかった．

−195−

3．運動負荷の強い筋では変性の増強が見られ，

2）KoenigMandKunkelLM：Detailedanalysis

MDXマウスにおける筋変性は筋運動自身によOf the repeat domain of dystrophin revealsって促進されることが示唆された．

four potential hinge segments that may

4．DMD息児においても，幼児期より運動を制限することによって，病気の進行を遅らせる可能性が示唆された．

COnfer flexibility．

3）Karpati G，Armani M，Carpenter S and
Prescott S：Reinnervationis followed bynecrosisin previously denervated skeletal

文

献musclesofdystrophichamsters．ExpNeuro1

1）田遠 等，水野美彦：Immobilizationによる

82：358−365，1983．

mdxマウス筋変性への影響−Localtetanus法

4）Karpati G，Carpenter S and Prescott S：

による検討−． 厚生省「神経疾患研究委託費」

Prevention of skeletalmuscle fiber necrosis

筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とそのinhamster dystrophy．Muscle Nerve5：369

病因に関する研究 （杉田班）平成元年度研究報−372，1982．

告書，1990，pp151−155．

−196−37）筋ジストロフィーハムスターにおける
神経筋接合部の電顕的研究
福 原 信 義＊は じめにた．ジストロフィン染色にはホフマン博士より供

進行性筋ジストロフィーのモデル動物としては，種々のものが用いられているが，その中でジスト
ロフィーハムスターは臨床症状が軽く，非進行性

与された60Kの抗ジストロフィン抗体を用い，間であり，組織学的には中心核線経を特徴とするため，myOtubularmyopathyとの類似性がうかがわれる．myotubularmyopathyは近年になり染色体の異常（Xq28など）1）がいわれているものの，その病理学的発症機序は不明である．しかし，他の先天性ミオバナーと同様にタイプⅠ線経の萎縮，タイプⅠⅠ線経の肥大，群集萎縮などの組織学的所見が見られ，神経原性の要素があることが疑われている．そこでmyotubular myopathyのモデル動物としてのジストロフィーハムスターの神経筋
接合部の形態的異常の有無を検討した．
対象・方法
生後130日目の雄性ジストロフィーハムスター（BIO14．6）と対象ハムスター（BIO FIB）の各3匹を使用した．それぞれ長址伸筋（EDL）とヒラメ筋（SOL）を取り出し，2．5％グルタールア

接蛍光法により染色した．
結果

1）光顕的観察
筋ジス群では筋線雄の大小不同，fibersplittingが目立ち，ほとんど全ての筋線経に中心核が見られた（図1）が，筋線椎の平均直径は35−38〝mで対照群とは有意差が見られなかった．一一部の筋線
経でわずかに再生線経の出現が見られたが，壊死や細胞浸潤はほとんど見られなかった．また，一部の筋ではNADH−TR染色でタイプI線経の萎縮の認められるところがあった．問質の線維化はみられなかった．ジストロフィン染色では筋ジス
群，対照群とも染色性には差はなく，筋鞘膜，筋鞘核が良く染まっていた．
骨格筋内の有髄神経線経には異常は見られなかったが，運動終枚は幅が30−40耳mにも拡大しているものが多く（図1），terminal collateral
ramificationが複雑化していることがうかがえた．

2）電顕的形態計測

ルデヒドで固定後，神経筋接合部を切り出し，電子顕微鏡により観察するとともに，preSynapticarea（PreA），preSynapticlength（PreL），pOSt−

表 神経筋接合部の形態計測データ

Synapticarea（PoA），SeCOndarysymapticcleftsの数（SC）について形態計測を行った．synaptic
Cleftsの数としてはprimary synaptic cleftと連PreA（〟mZ）PreL（〟山

4．06±0．37

続して観察されるSecondary symaptic cleftsの数をもってSCとした．また，EDL，SOLの他，

対照ハムスター 5．01±0．82（n＝幻）
ジストロフィー 4．餌±0．三氾

イソペンタンで凍結した多数の筋肉について各種

堕し対照ハムスター 3．03±0．31 3．79±0．22（n＝73）の染色を行い，組織学的，組織化学的検討を行っPol（〝mりSC

SOL（n＝62）

ジストロフィー 3．詔±0．55（n＝21）＊国立療養所犀潟病院

n：nlⅢ加rー197−

4．98：±0．56（n三2g）（n三2）

3．75±0．26

4．98±0．29（n＝73）（皿＝22）（n＝74）（n＝73）

3．67±0．24

6．10±0．41（n＝65）（n＝6）

乙92±0．36●

7．08±0．7（】（∩＝詔）
5．73±0．42 ■3．23±0．51（n＝23）（n≡65）
4．70±0．61‥（n＝㍊）（‡P＜0．05；H P＜0．005）

図1 ヒラメ筋 ×136
A：対照群，B：筋ジス群，直径の大小不同があり，拡大した運動終板（矢印）が多数見られる．

図3 筋ジス群：EDLの神経筋接合部

図2 対照群：EDLの神経筋接合部

図4 筋ジス群：SOLの神経筋接合部
Secondary synaptic cleftの数が非常に少ない． ×10，500

×6，800

神経終末が小さく，SeCOndary synaptic
Cleftの数も少ない．

×10，500

詳細は表に示したが，観察した神経筋接合部の数は対照群がSOL29個，EDL65個，筋ジス群がSOL74個，EDL23個であった．Pre AはSOL，
EDLともに筋ジス群と対照群とでは有意差は認められなかったが，PreLはEDLで対照群が3．79
JLm±0．22（S．E．）に対して筋ジス群は2．92JLm±
0．36と筋ジス群が有意に（P＜0．05）短縮してい
た．PoAはSOL，EDLとも筋ジス群と対照群では有意差は認められなかった．SCはSOLで対照群が7．00±0．70，筋ジス群が5．73±0．42，EDLで対照群が6．10±0．41，筋ジス群が4．70±0．61であり，何れも筋ジス群の方がsynaptic cleftの数が有意に（P＜0．005）少なかった．代表的な電顔写
真を図2，3，4に示した．
考察

筋ジストロフィーハムスターは1962年にHom−burgerら2）により発見されたもので，臨床的には心筋障害があるが，骨格筋の症状は軽く非進行性なのが特徴とされている．病理学的にも，生後2週以後に壊死，再生が強く，4月までに中心核線経が大部分となってくるのに結合織の増加や脂肪ー198−

織の浸潤はみられないのを特徴としている．

形態について検討した．光顕では運動終板が拡大

中心核は筋線椎の再生や，fiber splittingの一時期に出現するものであり，慢性のミオバナー，

し，terminalcollateralramificationが複雑化しニューロノkチーで見られる．しかし，このジストていることがうかがえた．電顕的形態計測ではロフィーハムスターでみられるほどに著明に多い

presynapticlengthがEDLで短縮し，SeCOndary
Symaptic cleftsの数がSOL，EDLともに減少し

中心核線経は人の疾患では緊張性筋ジストロフィており，神経筋接合部の未熟性のためと考えられ

ー，myOtubularmyopathyで見られるぐらいであた．

る．緊張性筋ジストロフィーで中心核線経の多い
文

献理由はこの病気におけるfiber splittingと関係して生じているものと考えられているが，

1）LehesjokiAE，SankilaEM，MiaoJ，SomerM，

myotubular myopathyでの理由は不明である．

SalonenR，RapolaJandDelachapelleA：Ⅹ

緊張性筋ジストロフィーでは神経筋接合部の−1inkedneonatalmyotubularmyopathy．One

SeCOndary synaptic cleftの数はむしろ増加してrecombinationdetectedwith4polymorphic

いる3）．myotubularmyopathyでの神経筋接合部

DNAmarkersfromXq28．JMedGenet27：の変化についての報告はないが，筋生検でタイプ

288−291，1990．

Ⅰ線維萎縮，群集萎縮が見られることより神経原

2）HomburgerF：Myopathyofhamsterdystro・性の要素のあることが推定されている．ジストロ

phy：Historyandmorphologicaspects．Ann

フィーハムスターはこのmyotubular myopathyのモデル動物とみなされるが，この動物での神経
筋接合部の変化についての報告は見られない．しNY Acad Sci317：2，1979．

3）福原信義，熊本俊秀，揚浅龍彦，椿 忠雄：筋強直症の組織化学的，電顕的研究．臨床神経19：

かし，Euら4）は我々の用いたハムスターとは種類が異なるが，UM−Ⅹ7．1で骨格筋の終末神経支配

4）Eu H，Coers C，Jasmin G and Telerman−の異常について報告しているが，彼らは神経支配

Toppet N：Terminal motorinnervationinの異常を筋病変の原因というよりは筋変性の結果

myopathic hamsters．J NeuroISci47：329，であると推定している．Becker型筋ジストロフ

1980．

909−909，1979．

ィーやネマリンミオバナーの神経筋接合部は筋ジ5）FukuharaN，YuasaT，TsubakiT，Kushiro

ストロフィーハムスターと同様に，SeCOndary
Synaptic cleftの数が非常に少ないのが特徴であS and Takasawa N：Nemaline myopathy．
Histological，histochemicalandultrastruCtur＿り5）6），神経筋接合部の未熟性のためと考えられてalstudies．ActaNeuropathol（Berl）42：33−

いる．今回の筋ジストロフィーハムスターでみら

41，1978．

れたsecondary synaptic cleftsの数の減少も同様に考えられる．

6）FukuharaN，SuzukiM，TsubakiT，Kushiro
SandTakasawa N：Ultrastructuralstuides
On the neuromuscularjunctions of Becker，s

ま

と

め

muscular dystrophy．Acta Neuropathol

筋ジストロフィーハムスターの神経筋接合部の−199−（Berl）66：283−291，1985．

38）ジストロフィー筋への正常myoblastの注射に関する研究−Ⅹ線照射の効果

寺 尾 寿 夫＊
研究協力者

加 藤 洋 司＊ 岡 下 恭 子＊
永 井 由紀子＊ 石 岡 邦 明＊＊は じめ に
最近多くの研究グループより，正常のmyoblast
をジストロフィー筋に注射し，ジストロフィー筋の性質を正常化しようとする試みが行なわれている1ト4）．
我々も，ジストロフィー動物を用い，正常
myoblastをジストロフィー筋に注射して，その変化につき研究を行なっており，昨年の報告に続き，現在までの研究結果を報告する．
方

先回報告した如く，mdxの筋にB，10のmyo−blastを注射すると，拒絶反応が起ってくる．これ

法（1）Precursor ce日の取り方
これは昨年報告した方法と同じである5）．まず
C57

した．注射は筋の数ヶ所に分割して行ない，注射量は1本のEDLにつき約0．05ml，細胞数としては約3×106個である．
なお注射は皮膚を切開し，直視下に行ない，注
射後皮膚を縫合した．その後種々の時間後取り出
し，一般組織学的に観察し，また抗ジストロフィン抗体を用いて免疫組織学的に検討した．
（3）拒絶反応の抑制

BL／10Scの生後1−3日目の幼若マウスの下肢筋をとり出し，結合組織，血管などを取り除いた後にtrypsinで処理し，iFi過後collagencoat−
ingdishに移し，incubatcを行なった．この際使用したmediumはDulbecco，s modified Eagle
mediumである．
培養終了後に，増殖したmuscleprecursorcellを防ぐために，昨年はcyclosporin Aを50mg／kg
オリーブ油に洛解し，30日間連日経口投与した．
しかしこれでは十分に抑制できなかった．そのため今回はhostの全身的なⅩ線照射を行なった．
方法はmdxマウスを特殊なケージに入れ，一匹
当り全身に450radのⅩ線を照射した．そして照射24時間後にEDLに3×106程度のprecursor
cellを注射した．注射後1ケ月日にEDLをとり出
し，immunostainingを行なって再生筋線経を調べた．

をtrypsinを用いて再び集め，遠心後適量のmediumを加えて5×107mlになるようにsus−pendL，これをジストロフィー筋に注射した．

（2）注射法Hostは生後2ケ月の雄のmdxマウスを用い，注射する筋は主として長指伸筋（EDL）を使用＊帝京大学医学部第一内科＊＊帝京大学医学部放射線科

結果
Myoblast transferを行なって1ケ月後，EDLをとり出し，H−E染色を施して観察すると，
myoblastを注射した場所に一致して，新たに再生した筋線経が集まってみられた．これらは周囲の筋線雑より直径が小さい線維群である．無処置のmdxにmyoblastを注射した場合は，拒絶反応による細胞浸潤がみられる．しかし450radのⅩ線−200−図1正常myoblast注射後1か月のmdxのEDLの抗ジストロフィン抗休によるim・munostaining（hostに450radのⅩ線照図2

射）正常myoblast注射後1か月のmdxのEDLの抗ジストロフィン抗体によるim−
munostaining（hostに450radのⅩ線鼎射）照射を行なったものには，拒絶反応はほとんどみールより僅かな増加があるのみで，有意な上昇はられなかった．

みられなかった．これに比較すると，radiationのMyoblastを注射した場所に再生した筋線経を方が効果があったことになる．

抗ジストロフィン抗体で免疫染色を行ってみると，

さて，上記の実験ではhostのmdxマウスは，数本〜十数本のジストロフィン陽性の線維群がと

生後2ケ月のものを使用しており，EDL中の筋線

ころどころに集まっているのがみられる．

経はほとんど再生を経ている．したがって再生後

図1，図2はこれを示したものである．ときに安定した筋線推中のSatelite cellは休止状態にあは陽性線経は群をなさず，孤立して存在するもの

る．もしmdx側のSatelitecellが活性化されていもあった．

る時に，正常myoblastを注射すれば，ジストロフ

10匹のmdxマウスのmyoblast注射後のEDLを取り出し，各々のEDLにつき2〜3ヶ所の

ィン陽性線経の出現率を上げることができると考えられる．

CrOSS−SeCtionのimmunostainingを行い，1本のEDLの各sectionから合計約1000本の線経を観

一般に筋を移植した場合には，移植された筋線
経はほとんどすべて壊死におちいる．しかし移植察し，ジストロフィン陽性線経の数を数えた．こ後のanoniaの状態で筋線椎が崩壊してもSatelite cellは生き残り，これも残存する基底膜れを表にしたのが表1である．
この表に示された通り，radiationを行った例での下でdonorのmyoblastが活性化され，筋再生はジストロフィン陽性線経の出現率はかなりバラは進行していく．この時評aftがジストロフィー

ツキがあり，0．7〜5．1％にみられる．平均値は2．2筋でこれに正常myoblastが注射で与えられた場％となる．一方myoblastを注射しなかったコン合，ジストロフィン陽性線経の出現率がどのようトロール側にも陽性線経は少数みられ平均0．4％になるかをみるため次の実験を行った．

存在していた．これら両者の間には有意な差がみ

まずmdxマウスに450radのWholebodyirra−

られ radiation後，myOblastをtransferした側では有意に増加していた．

diationを行い，24時間後にEDLを取り出し，体これをcyclosporinAを使用した場合に比べる外でこれに培養して得たmyoblastを3×106個
注射した．注射後直ちにそのEDLを取り出したと，この場合には或程度拒絶反応が起こるためか，

mdxマウスのもとの場所にautotransplantation

陽性線経の出現率は0．8％位にとどまり，コントロを行った．2ケ月後，これをとり出し，同様にim一−201−

表l DystrophinpositivefibersinmdxEDL，

表2 Dystrophinpositivefibersinautograft−

1month afternormalmyoblasttrans−fer（wholebody X，rayirradiation）

ed mdx EDL，2months after normal

H ost
N 0．

仙

O t 匹 S緬 ㈹ 触／T otd 私 闘

m y鵬t 廿釦嘗†甘C O n tr0 1

m y d 鹿 t h 曙 IF

C Onb dmyoblast transfer％

H o StNo．

仙oI画㈹ 馳椚 ／
Totd 佗椚

％m yd 鹿 t b nd r

C On b d

m yd b t b ∬威す

C O nb d

1

15 ／8 9 8

3 ／7 14

1．
7

0．
4

2

2 0 ／1 0 58

1 1 ／10 8 9

1．
9

1．
0

3

3 ／8 5 7

3 ／10 7 1

0．
4

0．
3

4

10 ／1 16 3

0 ／10 1 1

0．
9

0．
0

1

3 0 ／9 1 7

10 ／ 13 98

3 ．
3

0．
7

2

1 8 ／6 7 3

2 ／6 3 0

2＿
7

0．
3

3

1 2 ／9 9 5

0 ／6 0 2

1．
2

0．
0

4

1 0 ／1 1 2 4

10 ／ 12 78

0 ．
9

0．
8

5

5 3 ／1 0 4 5○ ／5 4 1

5 ．
1

0．
0

6

2 0 ／7 0 5

2 ／8 7 2

2 ．
8

0 ，
2

5

7 ／8 4 2

3 ／6 3 8

2．
0

0．
5

7

1 5 ／7 9 6

1 0 ／8 6 2

1．
9

1．
2

6

2 3 ／70 0

8 ／10 2 6

3．
3

0．
8

8

2 5 ／ 12 35

2 ／1 0 4 1

2．
0

0 ．
2

7

3 ／5 0 0

10 ／8 0 0

0．
6

1．
3

9

1 0 ／6 9 7

6 ／8 5 7

1．
4

0 ．
7

8

10 ／6 5 4

0 ／7 5 0

1．
5

0．
0

10

10 ／ 1 3 7 7

3 ／ 14 7 7

0 ．
7

0 ．
2

9

28 ／1 0 1 3

15 ／1 3 6 4

2．
8

1．
1

2 ．
2 ± 1．
30 ．
4 土0 ．
4

A ve ra 9e1．
7 ±0 ．
90．
6 土0 ．
4

A v e ra g e」

p＜0．01」」munostainingを行い観察した．
表2は9匹のmdxマウスにつき行った結果を示している．やはり一本のEDLにつき1000本前後の筋線経を調べたものである．
これでもかなりバラツキがみられる．平均は1．7％であり，コントロールよりも有意に増加していた．しかしこれは乃Sわ〟で注射した場合に比し，有意な差は見られなかった．この理由は明らかでないが，一つには移植後の筋再生は残存する基底膜の下で行われ，これが注射された正常のmyob−
lastとのfusionを妨げるためと考えられる．
考察

正常のmyoblastをジストロフィー筋に注射し細胞移植を行なおうとする試みはLawら1）により始められ，この後多くの報告がみられるようになった．
Hostのmdxマウスをヌード化し，拒絶反応を防いで行ったPartridgeら2）の報告によれば，陽性化率は10〜40％であるという．
Lawらl）はmyoblastをsoleusに注射し，筋重量の増加とtetanic tensionの増加を報告していp＜仇01」

昨年我々はcyclosporinAを使用したが，抑制は充分セなく，ジストロフィン陽性線経の出現も0．8％（コントロール0．6％）であった．今回行ったⅩ
線照射では拒絶反応は良く抑えられたが，ジスト
ロフィン陽性線経の割合は2．2％（コントロール0．6％）にとどまっていた．
陽性線経の比率が十分上昇しない理由としては次の要因が考えられる．
1）注射時にprecursorcellが筋組織内にとどまらず，筋肉外に流出してしまう可能性
2）注射されたmyoblastが佳かしかmigrate
しないこと
3）Myoblastの注射後起こる拒絶反応
4）Myoblastを注射しても，host側のSatelite
cellがactivateされず，dormantの状態にとどまり，注射されたmyoblastとfusionを起さないことなどであろう．4）に関してはsatelite cellを
activateさせるため，移植筋に注射したが，陽性化率を上昇させることはできなかった．これは筋移植後の筋線経の崩壊時にも移植筋線経の基底膜

Myoblastを注射後，もっとも問題になるもの

はしばらく残存し，注射されたmyoblastとのfusionを妨げるのも原因と考えられる．
さて，この程度のジストロフィン陽性線経の増加が果して筋力の増強に効果があるだろうか．これは直接治療効果に関連する重要な問題である．
mdxマウスの筋力低下に関しては諸説があるのひとつは拒絶反応である．これを抑制するため，が，最近のCarlsonら6）の報告によれば，mdxマる．また竹光ら4）は塩酸プビバカインと共にmyoblastの注射を行い，ジストロフィン陽性筋線
経は3．86％となり，コントロールに比し増加したと報告している．

−202−

ウスではwhole body tensionの低下があり，またiv vivoでの筋直接刺激でtwitchおよび−pOSitive byinjection of normalmyoblasts．

tetanictensionの低下があるという．我々も昨年の本会議でmdxマウスの玩 ひねでの筋直接刺激でtwitchおよびtetanic tensionの低下を報告
した7）．

3）KarpatiG，PouliotY，Zubrzycka−GaamE，et

しかし，CyClosporinAで拒絶反応を抑制しながら行った昨年の報告では，ジストロフィン陽性
線経の増加が僅かであり，myOblast注射後のEDLの直接刺激でtwitchおよびtetanic tension4）竹光正和，荒畑喜一，埜中征哉：mdxマウスのNature337：176−179，1989．
al：Dystrophinisexpressedinmdx skeletal
muscle fibers after normal myoblastim−

plantation．AmJ Path135：27−32，1989．
筋再生能と，その過程における正常筋芽細胞の移植．臨床神経学30：1066−1071，1990．
5）寺尾寿夫他：ジストロフィー筋への正常マイオ
ブラストの注射に関する研究． 厚生省「精神・の増加はみられなかった．現在Ⅹ線照射マウスのmyoblast注射後のEDLにつき筋力を検討中である．
さらにジストロフィン陽性化率を増加させるた
め如何に多くのmyoblastを注射し，これを筋内にとどめるか，また拒絶反応を有効に抑制する方法の研究が今後の課題であろう．

神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田妊）平成元年度研究報告書，1990，pp177−
182．

6）Carlson，CG and Makiejus RU：A
noninvasive procedure to detect muscle

weaknessin the mdx mouse．Muscle and文献1）Law PK，Goodwin TG and Wang MG：

Nerve13：480−484，1990．
7）寺尾寿夫他：骨格筋の移植に関する研究．1）

Normalmyoblastinjectionsprovidegenetic

ヌードマウスに移植後の再生筋の収縮特性，2）treatmentformurinedystrophy．Muscleand

再生筋の由来． 厚生省「精神・神経疾患研究委

Nervell：525−533，1988．

託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態

2）Partridge TA，MorganJE，Coulton GR，とその成因に関する研究 （杉訂旺）昭和63年度
研究報告書，1989，pp99−104，

HoffmanEP andKunkelLM：Conversionof
mdxmyofibersfromdystrophinーnegativeto−203−39）骨格筋特異的蛋白発現に問する神経ペプチドの研究
高 守 正 治＊研究協力者■

吉

川

弘

明＊

安

川

善

博＊

押

野

惣

一＊

は じめに

トリプシン処理して得られた初代培養細胞を使っ最近，筋細胞決定因子としてLassarらによる

た．60mmのゼラチンコートしたプラスチックデ

MyoDll）やWrightらによるmyogenin2）が発見され，骨格筋細胞分化調節機構の遺伝子レベルの解析という新たな展開が始まった．また分化過程
のみならず，筋細胞がそれ自身を維持し，収縮・弛緩といった特殊な生理機能を果たすには，数多くの遺伝子の発現が何らかの因子により的確に制御される必要があるものと考えられる．

ィッシュに細胞を入れDulbecco改変Eagle培

地に10％胎仔牛血清，1％ペニシリンーストレプ
トマイシン液を加えた培地で5日間培養した．培
養3日め以降は繊維芽細胞の混入を防ぐため10￣5
MのCytOSine arabinosideを加えた．10￣7Mの

CGRP添加群と無添加群に分け，2時間培養後，guanidine／thiocianate液を加え細胞を回収し，これまで，筋の機能を制御する因子として支配神経の役割が重要視されてきた．脱神経された筋は萎縮するとともに，アセチルコリン受容体（AChR）の分布も変化をきたす．Drachmanら3）は，この神経性の因子としてアセチルコリン（ACh）自体の重要性を指摘した．一方Takami
ら4）により，運動神経終末部にはカルシトニン遺

CsClのクッションを置き超遠心によりtotal

伝子関連ペプチド（CGRP）が，AChと共存することが示された．CGRPの生理作用として筋細胞のAChRの増加をmRNA転写のレベルで促進することや，筋の張力を増強することが明らかとなった．
本報では，CGRPが細胞の生理機能に重要な役与されたhumanAChRα，Subunit5），Dr．Davisよ割を持つプロトオンコジーン発現に及ぼす影響を調べるとともに，我々の用いているラット骨格筋
初代培養細胞に筋決定因子であるMyoDlとmyogenin発現があるかを調べ，筋タンパク質の発現調節機構を理解していくことを目的とした．

ラット筋初代培養細胞ではプロトオンコジーン

RNAを集めた．このtotalRNAをサンプルに使い，ノーザンプロットハイプリグイゼーションを行った．
プローブはオンコジーンの中からerbA，SrC，raf，Sis，fos，tmyC，Ha−raS，KiTraS，erbB，mybを，筋構成タンパク質としてDr．Lindstromより供り供与されたMyoDl，Dr．Wrightより供与されたmyogeninをランダムプライムDNAラベリン
グキットにより32Pラベルして使った．
結果の中でerbBとmybは発現が認められなかったが，erbA，SrC，raf，Sis，fos，myC，Ha−raS，Ki−raSが発現していた．発現がみられたプロトオンコジ
ーンのなかでCGRP添加により変化があったのはKトrasで，約2倍に発現が増強した．AChRα

方法−Subunitの発現も約2倍に増強した（表，図培養筋細胞はウィスター系ラット胎仔下肢筋を

1）．

MyoDlとmyogeninについては，今回はラット＊金沢大学医学部神経内科

初代培養筋細胞における発現の有無を検討するた
−204−

表

Summary of prot0−0nCOgene eXpreSSion0ⅣCαiEⅣES

control

CGRP

＋
＋
＋
＋
＋
＋

i

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ H

＋

SS
aa
旭 ■ 憾 b C f S S rr
C一一
er er 町 Sr m．Sl h
町ぬE

み11T t▲｝■・1、・l r！＝′t〕さ；ぐ11i

図2‖

Northernblotanalysisofratmyotube
total RNA probedwithMyoDl andmyogenin

めCGRP無添加群について調べた．その結果，
MyoDlの発現は見られなかったがmyogeninの発現が認められた（図2）．
考察

運動神経は単に興奮を筋に伝えるだけではなく，筋細胞の栄養因子の供給という重要な働きもしていると考えられている．これまで栄養因子の候補としてAChが調べられてきたが，神経終末に神経ペプチドであるCGRPが兄いだされたことにより，その作用が注目を集めた．我々は，CGRPが筋膜上に存在する高親和性受容体・GTP結合タン
パク貿・アデニレートシクラーゼからなる情報転換ユニットを介し，CAMPをセカンドメッセンジ
ャーとしてAChRの増加作用，筋収縮力の増強作用などをもたらすことを明かとしてきた6〉7）．しかし，アデニレートシクラーゼ活性化によるcAMP
図1Northernblotanalysisofratmyotube
totalRNAprobedwithoncogenesand
human AChR

α−Subunitの増加とAChRの増加の間にはどの様な過程が介在しているのかは明らかではなかった．今回は，この点を明らかにすることを目的とした．CGRP
−205−

五

位

l l162

C／H

壬基性

101川21〜l HH162

Myc S／T s／丁

日！

2朋

246

2日

響を与えるかという点も興味ある問題であり，今3川後の課題として現在検討している．
文

献1）Davis RL，Weintraub H and Lassar AB：

図3

Expression of a slngle transfected cDNA

Structure ofMyoDl and myogenin

COnVertS fibroblasts to myoblasts．Cel151：
987−1000，1987．

により発現が変化する遺伝子の候補として，まずプロトオンコジーンを考えた．
プロトオンコジーンはウィルス癌遺伝子と同じ配列を持った細胞内に存在する遺伝子で，それぞれEGFレセプター，GTP結合タンパク質，甲状腺ホルモン受容体といった細胞の活動に必須の機能を持ったタンパク質をコードしている．今回の結果では，プロトオンコジーンの中でGTP結合
タンパク質をコードするKi−raSの発現がCGRPにより増加することがわかった．AChRの発現増
加がKi−raS産物によるというように単純に両者を結び付けることはできないが，Ki−raS産物がさらに多くの遺伝子の発現を制御する可能性があり，重要な変化として注目できると思われる．

2）Wright WE，Sassoon DA and

Lin VK：

Myogenin，a factor regulating myogenesis，
hasadomainhomologoustoMyoD．Cel156：607−617，1989．
3）PestronkA，DrachmanDB，StanleyEF，Price
DLandGriffinJW：Cholinergictransmission
regulatesextrajunctionalacetylcholinerece−ptors．Exp Neuro170：690−696，1980．
4）TakamiK，KawaiY，UchidaS，TohyamaM，ShiotaniY，YoshidaH，EmsonPC，GirgisS，Hillyard CJ and MacIntyreI：Effect ofCalcitonin gene−related peptide on contrac−
tionofstriatedmuscleinthemouse．Neurosci
ktt60：227−230，1985．

筋特異的蛋白として今回新たに，MyoDlとmyogeninの発現を調べた．両者とも筋の決定因

5）SchoepferR，LutherMandLindstromJ：The子もしくは分化因子として，MyoDlはマウス繊維芽細胞株（10Tl／2）から，myOgeninはラット筋細胞株（L6）より得られた．ともに高塩基性の領

expresses a muscle−1ike acetylcholine rece−

域とmyc相同性の領域を持つアミノ酸配列を持っており，DNA結合性タンパク質として機能すると考えられている（図3）．我々が使用しているラットの初代培養細胞ではmyogeninの発現は認められたが，MyoDlの発現は見られなかった．これはL6細胞にMyoDlの発現が見られないのと同様に，ラットとマウスという種の違いによるものと考えられるが，系代培養株と初代培養細胞による性質の違い，培養日数の影響も否定できないと思われる．また神経性栄養因子であるCGRPが

6）Takamori M and Yoshikawa H：Effect of

筋決定因子であるMyoDl，myOgeninの発現に影−206−

human medulloblastoma cellline TE671

ptor．Cloningoftheα一SubunitcDNA．FEBS

letters226：235−240，1988．

Calcitonin gene−related peptide on skeletalmuscme via specific binding site and G
protein，J NeuroISci90：99−109，1989．
7）高守正治，吉川弘明，安川善博：ジストロフィ
ンおよびアセチルコリン受容体mRNA発現に対するカルシトニン遺伝子関連ペプチドの修飾に関する研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委
託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）平成元年度
研究報告書，1990，p88．

40）筋再生と成長因子
後 藤 幾 生＊
研究協力者

笹ケ迫
山

直

一＊

田

宮

田

清

典＊

小

林

卓

郎＊

猛＊

は じめに

表l Pleiotropic activities of FGFs on
normal cells

成長因子の一つであるfibroblast growth fac−tor（FGF）は，．＊胚葉・外胚葉由来のさまざまな細胞に対して増殖を促進させる作用がある事が知られ，筋芽細胞に対してもその増殖を促進させる
事が知られている1）（表1）．また，筋ジストロフ
ィー症の動物モデルであるMDXマウスは活発な筋再生を示しそのため致死的な脱力を呈きない事が知られているが，このMDXマウスの骨格筋の細胞外基質には正常マウスと比べて多くの
basic FGF（bFGF）が発現されている事が報告
された2）．そこで我々はこのbFGFが筋再生の過程において重要な役割を果たしているのではないかと考え，実験的損傷筋を作成し，筋再生が行われている組織中のbFGF量を経時的に測定した．
また，MDXマウス筋肉におけるbFGFの量も測
定した．
対照・方法
実験的損傷筋作成は8週齢の雄のC57BLマウスを用いた．エーテルおよびネンブタール麻酔下に後脚を切開，ヒラメ筋を露出．右ヒラメ筋に0．5％bupivacaine hydrochlorideO．lmlを，左ヒラメ筋には生食0．1mlをそれぞれ26G針を用いて直視下に注入し，皮膚を縫合した．1，3，5，7，9日
後にそれぞれ3匹ずつよりヒラメ筋を摘出した．
そのうち1匹分を組織学的検索のためHE染色を行い，2匹分をbFGF測定に用いた．MDXマ
ウスは雄の16週齢のものを用い，正常対照として

InVi【rO
Tissu亡Targ亡lhtitOgCniC

lnViヽ・Ot

Non−Mitog亡nk

Mi−Ogmk

Non一入IitogmiCAClivi−y AClivi−y ACti、・ity ACtivily
RbroblaStS
endoIIldial
smoolhmusCl亡p亡rlCyt亡S

my呵t亡〜
Chondro⊂yt亡S
k亡ratino⊂yt亡S
myobhsts
osteObIasts
neUrObhsts
blas【亡mladrenOCOrtkat
granulosathyroid
hqOtlOphs
山yrolrOphs
m亡bn∝yteSn亡UrOnS
aStrOくyleS
OIigod亡ndr∝yt亡S
Schwann
adr亡nOm亡du‖ar
h叩aO∝yt亡S

甲山diaIkns
叩ith亡IiaICOm亡ユ叩ilh亡IialprosはtiC
hairbuIbpap川arytl】mOllrCdIs】

雄の16週齢のC57BL／10ScSnマウスを用いた．
bFGFの抽出3）4）は，ヒラメ筋を1．OM NaCl，10mM Tris，pH7．0溶液1．Omlでホモジェナイズ
後，20，000×g，4℃で20分間遠沈．上清を10mM
Tris，pH7．0，4℃で透析し，heparin−Sepharose（Pharmacia）カラムに吸着．0．5MNaCl溶液で洗浄後，2．OMNaCl溶液で溶出した．bFGFの測定は，125I−basic FGFアッセイキット（Amer−
ShamJapan）を用いて，radioimmunoassay法にて行った．
結＊九州大学医学部脳研神経内科

果Bupivacaine注入1日後では既に筋壊死が認め
−207−

表2

bFGFin soleus muscles after myonecrosis

的で広範囲なものではなく，また，筋毎に壊死の範囲が異なっていたであろうと想像される．その

berorebupivacaine

1
39．4

3
28．4

days arterinj．
5
7

9

ためにbFGFの量に一定した変化の生じなかった可能性が考えられた．筋壊死・再生と成長因子

36．7

45．0

37．2

34．9

44．5

50．7

39．4
Saline32．6

40．6との関係を探るためには，確実に広範囲に壊死を

r舶l／叫！tissue（wet weight）

表3

起こしうる方法を採用し検索筋数を増やした上で今後とも検討したいと考える．

bFGFin soleus muscles

また，今回用いた16週齢のMDXおよび正常対

uD‡Ⅱ氾uSe．16W．01d

72．1

照マウスではbFGF量に差が認められなかった．

Control，

70．1

MDXマウスでは10−12過以降筋壊死・再生が鎮

16W．01dr001／叫Iissue（wet weight）

静化することが知られている．16週ではその壊死・再生の過程が活発でないためにbFGF量に差られたが，部分的なものに止まり広範囲なものではなかった．5日後では中心核を持つ再生線経が認められた．9日後では殆んどが再生線経に置き換わった．一方，生理的食塩水注入筋では針の刺入経路にそって筋壊死・再生が認められたが，bupivacaine注入筋に比べると軽度であった．
実験的筋損傷後のbFGF量の経時的変化を表2に示す．値は2ヒラメ筋のbFGF量の平均を示す．何も処置しないヒラメ筋では39．4fmol／mg
tissue（wet weight）であった．実験的損傷筋ではbupivacaineおよび生理的食塩水注入筋とも
bFGF量は経時的に一定した変化は示さず，壊死・再生との関係は判断できなかった．
MDXおよび正常対照マウスのヒラメ筋中のbFGF量を表3に示す．値は何も処置しない2ヒが認められなかった可能性が考えられた．より若年マウスでの検討が必要であると思われた．
文

献1）BairdAandWalickeAP：Fibroblastgrowth
factors．BritMedBu1145（2）：438−452，1989．
2）DimarioJ，Buffinger N，Yamada S，et al：
Fibroblastgrowthfactorintheextracellularmatrix of dystrophic（mdx）mouse muscle．
Science244：688−690，1990．
3）Gospodarowicz D：Isolation and character−izationofacidicandbasicfibroblastgrowth
factor．MethOdsin Enzym01147：106−119，
1987．

4）Klagsbrun M，Smith S，Sullivan R，etal：

ラメ筋中のbFGF量の平均であるが，16週齢のマ
ウスでは両者の間に差は認められなかった．

Multiple fomS Of basic fibroblast growth
factor：Amino−terminalcleavagesbytumor
Cell−andbraincelトderivedacidproteinases．

考察
今回のbupivacaine注入筋では筋壊死が部分

一208−

Proc

Natl

Acad■Sci84：1839L1843，1987．

ⅤⅠⅠ．生化学41）筋細胞死とリソゾームプロテアーゼ群
木 南 英 紀＊
研究協力者

上

野

隆＊

武

野

大

策■

埜 中 征 哉＊＊ 内 山 安 男＊＊＊は標品とした．

じめにKunkel，Hoffmanらによるジストロフィーの発見1〉以来，筋ジストロフィー症の分子遺伝学的，診断学的研究は著しく進んだ．しかし，筋崩壊に至る過程特にタンパク分解の冗進のトリガー・初発機構については全くわかっていない．我々は変性死細胞の処理のために浸潤マクロファージのリ
ソゾームプロテアーゼ群が関与すること2），それ以前に障害を受けた筋細胞内に自己会食−リソゾーム系が活性化していることを示唆した3）．この筋細月包内の自己貪食の誘起はジストロフィー症ばかりでなく，自己会食の異常が病像の前面にでているRimmed vacuoleを伴う遠位性ミオバナーの例4）もあり，筋細胞死の初発段階に関与する重要なプロセスと思われる．しかし，古くから自己会食の機構の形態学的研究はあるが，細胞生物学的研究は最近始まったばかりである．今回は，自己貪食の開始機構に関するデータとその結果を踏
まえvacuolar myopthiesにおける自己会食の異常について考察する．
材料と方法
1）オートリソソームおよびリソソームの分
離：ロイペプチン投与ラット肝よりオートリソゾーム5）を，デキストラン投与肝よりリソゾームを単艶した．分離した小胞から膜分画を庶糖密度勾
配遠心で待，さらに炭酸ナトリウムで洗浄して膜＊順天堂大学医学部生化学第一講座＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊筑波大学医学専門群解剖学

2）免疫学的手法：リソゾーム膜の主要タンパ
クの一つLGP120に対する抗体はラットLGP120の細胞質に出ているドメインに対するペプチド抗体である．ユビキチン抗体はヒトエビキチンーウシ
IgGに対する抗体で，ユビキチンータンパク複合体を認識する．
3）対象：Rimmedvacuoleを伴う遠位性ミオバナー（DMRV）は27歳女性の生検筋6），封入体
筋炎は72歳の男性からの材料である．
結果1）自己貪食の機構
自己貪食胞の隔離膜の由来を明らかにすべく，
まずロイペプチン投与肝より自己会食胞（AP）とリソゾームの融合したオートリソゾーム（AL）に富む分画を単離した．一方，純粋なりソゾーム
をデキストラン投与肝より得て，両者の膜の性状から隔離膜の由来を調べるアプローチを行った．
ALとリソゾームの膜をアルカリ処理後，膜構成タンパクをSDS一電気泳動で分析した．絶食後の動物から得たAL−S膜も自由摂食させた動物のAL−F膜もリソゾーム膜の構成タンパクと非常に類似しており，明らかに小胞体膜あるいはゴルジ装置の膜構成とは異なる（図1−A）．AL−SとAL−Fの間の差は53KポリペプチドがAL−Fのみに存在することである．このポリペプチドは小胞体
膜上の主要タンパクチトクロームP450（図1−A，
レーン1）と一致している．イムノプロット分析によると，AL膜，リソゾーム膜全てがリソゾーム
膜の主要糖タンパクの一つLGP120を持っている−211−

図1各種小器官膜標品の蛋白染色（A）とイムノブロッティング．抗LGP120（B），抗チトクロームP450（C），抗シアリルトランスフェラーゼ（D）．膜：小胞体（レーン1），オートリ
ソゾームF（レーン2），オートリソゾームS（レーン3），リソゾーム（レーン4），ゴルジ装置（レーン5）．

が，ALFのみが抗−チトクローム抗体と反応し察できる（図2−b，d）．エビキチンータンパク質複た．これら何れのリソゾーム膜もゴルジ膜のマー

合体はRimmedvacuole内に，一部は自己貪食胞

カー・シアリルトランスフェラーゼ抗体とは反応様小胞に局在していることが示された（図2−C，しなかった．AL−S膜にチトクロームP450が欠損f）．

していることはこのマーカーの出現に栄養条件が重要な役割を持っていることを示す．摂食状態か

考察

ら絶食状態に移すと，自己食食の克進にともない，リソゾームの細胞質成分の取り込み機構の最もAL上のチトクロームP450は，増加してくる（図なし）．このことは小胞体，マーカーが自己会食胞

重要なものはMacroautophagyであり，細胞障害

院形成の指標となることを示す．しかし，絶食をの実験は従来いろいろ議論の多かった自己会食胞

続けると小胞体マーか−は漸減していき，この結の隔離膜がゴルジ膜というより，小胞体膜由来で果は図1での観察とよく一致している．

あることを強く示唆している．刺激に応答して形に応答して誘起されるのもこの反応である．今回

2）Vacuolarmyopathiesにおける自己合食億DMRVおよび封入体筋炎一例についてリソゾ成された二重膜を持つ自己会食胞（おそらく院はームの可溶性酵素（ジペプチジルアミノペプチダーゼl，カテプシンC），リソゾーム膜タンパク

リソゾーム膜の性質を持つ一重膜への変化，リソ
ゾーム可溶性酵素の獲得を行い，オートリソゾー

小胞体操の性質を持つ）は成熟過程で，酸性化，（LGP−120）及びエビキチンータンパク複合体の局ムへと変化していく．このプロセスは複雑であり，在を免疫組織学的に調べた（図2）．カテプシンC

自己合食胞とリソゾームの融合のステップ一つをは以前報告したと同様，Rimmedvacuolesに一致取ってみても，関与する役者がまだ全然わかってした染色像が得られた（図2−a，d）．LGP−120はいない．玩i通用の再構成実験できるようになれ

Rimmedvacuolesにも存在する（図2−e）が，細ば，一気に進むことが期待される．単稚オートリ

胞膜直下の自己会食胞あるいはエンドゾーム様のソゾーム膜に小胞体マーカーが兄い出されたこと様々なサイズの小胞に染色が集積しているのが観は 乃〝め℃実験への一つのステップであると考え−212−

図2 抗力テプシンC（a，d），抗LGP120（b，e）および抗エビキチンータンパク質複合体（C，f）抗体による骨格筋の免疫組織学的染色DMRV（a，b，C），封入体筋炎（d，e，f）を示す（×650上

られよう．

チーではリソゾーム内pHの上昇がリソゾーム内

自己会食胞は正常筋線経にはみられないが，炎タンパク分解を阻害しているからである．DMRV症性ミオバナー，リソゾーム蓄積症，遠位性ミオや封入体ミオバナーでは自己合食胞とRimmed

バナー，実験的クロロキンミオバナーなどでは著

VaCuOleにリソゾーム可溶性酵素，膜タンパク及明である．しかし，自己食食胞の蓄積の機序は同びリソゾーム外より取り込まれたタンパク（エビじではない．α−グルコングーゼ欠損症ではグリコキチン結合タンパク）すべてが陽性であり，少なーゲンのリソゾーム内蓄積が，クロロキンミオパ

くとも融合のステップが障害されているとは考え−213−

られない．リソゾーム内タンパク分解か，酸性化

919−928，1987．

の障害もしくは自己会食の著しい誘起が想定され

2）KominamiE，Bando T，liK andKatunuma

る．これらの疾患では細胞質に分解物が非常に多

N：Increasein cathepsin B andLandthiol

く蓄積しているという観察がある6）7）．これに基づ

proteinaseinl1ibitorin muscle of dystophic

くと，異常産物を処理するために自己会食胞が多hamsters．Theirlocalizationininvading

数形成され，元来少ないリソゾームと融合できず，

phagocytes．J Biochem96：1841，1848，1984．

細胞内に蓄積すると考えることが出来る．この考

3）Kominami E，Ii K and Katunuma N：えによると，Rimmedvacuoleにカテ70シンや酸Activationoftheintramyofibralautophagic

性フオスファターゼ陽性のものと陰性のものがあlysosomal system

ることは説明できる．自己会食の異常冗進のみら

AmerJ Path01127：21−26，1987．

inmuscular dystrophy．

れるミオバナーは遺伝性であれ，非遺伝性であれ，

4）Ii K，Hizawa K，NonakaI，Sugita H，

多くは細胞隈ではなく，細胞質成分の何かに異常

Kominami E and Katunuma N：Abnormalがあると考えた方がよいかもしれない．そうすれincreasesoflysosomalcysteineproteinasesin

ばリソゾームの反応は二次的変化ということにな

rimmed vacuolesin

る．DMDのように細胞膜に異常がある場合，おそAmerJ Path01122：193−198，1986．

the skeletal muscle．

らく細胞内Ca2＋の上昇を介して自己会食は冗進

5）KominamiE，HashidaS，KhairallahEAand

するが，大きな自己会食胞を形成・蓄積する前に

Katunuma N：Sequestration ofcytoplasmic

マクロファージが浸潤して処理してしまうと思わ

enzymesinanautophagicvacuole−lysosomal

れる．

SySteminduced byinjection ofleupeptin．J

異常タンパクはユビキチン化され，細胞質のBioIChem258：6093−6100，1983．

ATP依存性プロテアーゼで分解されるという機

6）NonakaI，Sunohara S，Ishiura S and序がある8）．一方エビキチン化されたタンパク質

Satoyoshi E：Familial distal myopathyのプールは多くの細胞に常にあり，リソゾームへ

rimmedvacuoleandlamellar（myeloid）body

絶えず取り込まれている．ロイペプテンでリソゾ

formation．J NeuroI Sci51：141−155，1981．

ーム内タンパク分解を止めるとリソゾーム内に多7）Fukuhara N，KumamotoTandTsubakiT：

量のエビキチン化されたタンパク質の蓄積がみら

Rimmedvacuoles．ActaNeuropath01（Berl）

れる9）．筋細胞の自己会食やRimmed vacuoleに

51：229−235，1980．

これらが証明できることは，小胞が自己会食胞−リ8）HershkoA andCiehanoverA：Mechanisms

ソゾームの性質を持つことをさらに支持するもの

ofintracellularproteinbreakdown．AnnRevと解釈できる．

Biochem51：335−364，1982．
9）Uen（）T and Kominami E：Mechanismand文献regulation oflysosomal sequestration and

1）Hoffman EP，Brown RH and Kunkel LM：

proteolysis．Biomed BiochimActa，inpress，

Dystrophin：The protein product of theDucherulemuSCulardystrophylocus．Cel151：

−214−

1991．

42）骨格筋筋原線経の構成成分であるC一蛋白質を変換する因子について
眞一郎＊

研究協力者

小 島

田

中

知

仁事

大

谷

幸

子＊

は じめに

TlOmMEDTA−10mMトリス・塩酸緩衝溶液

筋ジストロフィーマウス（C57BL／10ScSn−（pH7．8）に懸濁し，不溶性画分をさらに同溶液で3回洗ったものをこの因子の標品にした．
C一蛋白質変換因子の活性検定：精製した速筋型C一蛋白質に変換因子の標品を加えたものを，5M尿素−lMチオ尿素一10mMビロ燐酸ナトリウ

MDX，MDXマウス）はヒトのDuchenne型筋ジストロフィーと類似した遺伝子異常を持った動物モデルである．我々は，このマウスを用いて，筋蛋白質における遺伝子の情報発現の異常を二次元電気泳動で検討している過程で，MDXマウス・の
速筋型C−蛋白質のスポットが消失あるいは正常
対照マウスに比べ量的に減少することを兄いだした1）．さらに，このC一蛋白質の変化はヒラメ筋やムー0．17％メルカプトエタノール溶液に一晩透析し，SDS−PAGEとイムノプロット法を組合せ，C
一蛋白質の変化を検出した．SDS−PAGE終了後，48mMトリスー39mMグリシンー1．3mMSDST20

心筋では見られず，速筋型C−蛋白質に特異的であることが分かった．また，このC−蛋白質の変化は
8M塩酸グアニジン処理によって見られなくなった．この事から8M塩酸グアニジンによって失活する因子が筋組織中に存在する事が分かった．この因子は0．6MKCl溶液に対して不溶性画分に存％メタノ●−ル溶液（pH8．8）中で電気的にニトロセ
ルロース膜に転写した．このニトロセルロース膜

在した2）．ここでは，このC一蛋白質を変換する因子の活性は，C−蛋白質を修飾するのではなく分解する事，また，活性は生体内に一様に存在するのではなく，組織特異的に存在している事が分かったので報告する．

体で1時間インキュベイトし，TBSで洗浄してかを1．5％ゼラチンーTBS（Tris buffered saline：
0．5MNaC1−20mMトリス・塩酸緩衝溶液pH7．5）
溶液に一晩浸しブロッキングした後，一次抗体で1時間インキュベイトし，TBSで洗浄後，二次抗らNi十十一Co＋＋−DAB法で発色させた．一次抗体には，千葉大学理学部の大日方教授より供与された，速筋型C一蛋白質に対するモノクローナル抗体
FC−18を，二次抗体にはTBSで3000倍希釈した
BioTRad社のHRP−GAMIgGを用いた．

実験方法
速筋型C一蛋白質の精製：速筋型C一蛋白質は，ウサギ（NewZealandwhite）の背筋から，Offer
ら3）の方法に従って精製した．
C一蛋白質変換因子の調整：マウス（C57BL／10
ScSn及びC57BL／10ScSn−MDX）の長指伸筋，大腿直筋，ヒラメ筋，心筋，脳及び肝臓を0．6MKCl＊（財）東京都神経科学総合研究所神経生化学

結果

C一蛋白質変換における濃度依存性：
MDXマウスの長指伸筋を8M塩酸グアニジン
溶液中に懸濁してから，5M尿素溶液に透析すると，速筋型C一蛋白質のスポットの消失は見られな
くなる1）．8M塩酸グアニジンは強力な蛋白変性剤であることから，この因子は酵素であると考えられるが，酵素であるとすれば，基質であるC一蛋白−215−

‡：■毒 ・吏 ：垂二・■
；

＝−
王＝三
＝
二二
竪

ゞ≡‡：
＝

む 至二
三‡
澤

一二：
毒
・・
一一
￥・
裡
据

滋 吏
ず

：：
■
薮 ま≡＝

≒≡
≠≧■
：■
姦

…・≡；染
■
＝；
二車

重；
≡頚

≡￣〔

智

こく＿t．〉

巌

妥

善

；妻

≡
＝

図1 C−蛋白質変換因子の活性に対する希釈効果
MDXマウスの長楷伸筋を，それぞれ10倍量，20倍量，40倍量，80倍量の5M尿素溶液に懸濁し，二次元電気泳動にかけた．

質の濃度に依存して活性が変化するはずである．
そこで，MDXマウスの長指伸筋を，10倍量，20倍
量，40倍量及び80倍量の5M尿素溶液で懸濁し，それぞれについて二次元電気泳動にかけてみたと
ころ，希釈度が大きいほどC一蛋白質のスポットの減少度が小さくなっていた（図1）．即ち，この因子の活性はC一蛋白質の濃度に依存していた．また，この事は，従来，筋組織を懸濁するに際して，筋組織の希釈倍率によってC一蛋白質の消失が見られたり，見られなかったりした事を説明している．
C一蛋白質変換因子によるC一蛋白質の分解：
C一蛋白質変換因子のC−蛋白質に対する作用が蛋白質の修飾であるのか，あるいは分解であるのかを調べるため，精製したウサギの速筋型C一蛋白
図2

精製C一蛋白質に対するC一蛋白質変換因子の作用
左こクマジーブリリアントブルーRによる染色像．右：モノクローナル抗体FC−18によるイムノプロット像．1：精製したウサ
ギの速筋型C一蛋白質．2：MDXマウスの長持伸筋の0．6MKCl溶液に対する不溶性
画分．3：精製したウサギの速筋型C→蛋白
質とMDXマウス長持伸筋の0．6MKCl溶
液不溶性画分を掲ぜたもの．

質にMDXマウス長持伸筋から調整した変換因子を加えて検討した（図2）．C−蛋白質変換因子の標品中にはC一蛋白質に対する特異的モノクロー
ナル抗体FC−18に反応するものは存在していな
いが（図2−2），C一蛋白質とこの因子とを混ぜてインキュベートすると，C一蛋白質の位置に相当するバンドが減少し，新たにFC−18に反応する低分
子量のバンドが出現した（図2−3）．このことは，この因子が精製したウサギの速筋型C−蛋白質−216−

図3 C一蛋白質変換因子活性の組織特異的存在
左：クマジーブリリアントブルーRによる染色像．右：モノクローナル抗体FC−18によるイ
ムノブロット像．1：精製したウサギ速筋型C−蛋白質．2−7：MDXマウスの様々な組織の0．6MKCl溶液に対する不溶性画分に精製したC一蛋白質を加えたもの：2：長持伸筋，

3：大腿直筋，4：ひらめ鼠 5：心筋，6 ：脳，7：肝臓に作用し，C一蛋白質を分解，消失させることを示している．
C−蛋白質変換因子活性の組織特異的局在：C一蛋白質変換因子の存在の組織特異性について検討するため，長持伸筋に加えて大腿直筋，ヒラメ筋，心筋，脳及び肝臓について検討してみた（図3）．長指伸筋，大腿直筋，及びヒラメ筋ではC一蛋白質の分解がみられた（図3−2，3，4）が，心筋と脳ではC一蛋白質の分解は見られなかった（図3−6）．また，肝臓では，C→蛋白質の分解は見られた（図3−7）が，分解産物のペプチドが長楷伸筋，大腿直筋及びヒラメ筋で見られるものより分子量が大きかった．これは肝臓にはC−蛋
白質変換因子が存在するが活性が弱いためか，あるいは別種のプロテアーゼによる分解であると考
えられる．
考

察

C−蛋白質を変換する因子は，8Mグアニジン
塩酸で失括する事，その活性は基質であるC一蛋白質の濃度に依存すること，変換されたC一蛋白質は
低分子量のペプチドに分解される事などから，プ
ロテアーゼであると考えられる．
この因子は長持伸筋，大腿直筋，ヒラメ筋で活性が見られ，心筋や脳で活性が見られないことか
ら，骨格筋に特異的に存在する可能性が高い．肝臓でもC一蛋白質の分解が観察されたが，分解産物
が長持伸筋，大腿直筋及びヒラメ筋で観察されたものと異なっていた．しかし，肝臓に存在する因子と骨格筋に存在する因子が異なるものであるか否かはさらに検討を要する．
この因子は0，6MKClに不溶性であることから
膜に存在していると思われる．もし，この因子が膜に存在するのなら，この因子が生体内でどの様にして筋原線維内のC一蛋白質に作用しているのか，興味深い問題である．
また，この因子の基質であるC一蛋白質は，免疫グロブリンスーパーファミリーに属する事が明らかになっており4），この因子が免疫グロブリンス
ーパーファミリーに対しても作用するプロテアー−217−

ゼである可能性も考え得る．この因子の生理的役

ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病割を考える上で検討すべき問題である．
今後は，まずこの因子のプロテアーゼとしての性質を明らかにし，この因子の精製と組織化学的局在の検討によって生理的役割及び筋ジストロフ
ィーの発症との関連を解明する．

因に関する研究 （杉田班）昭和62年度研究報告
書，1988，pp69−73．
2）堀 眞∵郎，杉浦弘子，大谷幸子，平林民雄：
筋ジストロフィーマウス（MDX）筋のC−プロ
テインの動態について． 厚生省「精神・神経疾
患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾

まと患の病態とその病因に関する研究 （杉田姓）昭め1）マウス骨格筋中に存在するC−蛋白質変換
因子はC一蛋白質を低分子ペプチドに分解した．

和63年度研究報告書，1989，pp243−246．
3）Starr R and Offer G：Preparation of C−

2）C一蛋白質変換因子の活性は長持伸筋，大腿protein，H−prOtein，Ⅹ−prOtein，and phospho・

直筋，及びヒラメ壬鋸こおいて見られ，心筋や脳でfructokinase．Meth Enzymo185：130−138，

は見られなかった．

1982．

4）EinheberSandFischmanDA：Isolationand文

献Characterization of a cDNA clone encoding
avianskeletalmuscleC−prOtein：Anintracel・

1）堀 眞一郎，杉浦弘子，大谷幸子，平林民雄，
中村瑞穂：筋ジストロフィーマウス（MDX）に

lular member oftheimmunoglobulin super−

おける筋蛋白質の高分子領域における異常につfamily．ProcNatlAcadSciUSA87：2157−

いて． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋

2161，1990．

−218−

43）Clofidrateの骨格筋の速筋と道筋グルコース・
アップテイクに対する影響
庄 司 進 一＊
研究協力者

目

朴

木

清

人＊

柳

沢

信

夫＊

30分のインキュベート後0℃の生理的食塩水で

的

動脈硬化用剤で，血中稔脂肪や総コレステロー

洗浄し，腱を除いた．筋の表面の水分を除き，湿ルを降下させる作用のあるclofibrateは，耐糖能を改善する1）．clofibrateはまた末梢組織でのインスリン感受性を増加させると報告されている2）．
このClofibrateによる耐糖能改善の機序を追及す

重量を測定し，0．4mlのSoluene350（Packard）

るため，グルコース・アップテイクをラットの骨格筋の速筋と遅筋でclofibrate投与とインスリンityをシンチレーションカウンターで測定した．

の有無で測定比較した．

glucosespaceとsucrosespace（細胞外スペース）の差から算出した．統計処理はStudent−t検定を方中で溶解した．完全に溶解後，酢酸で中和し，この溶解液とインキュベーション溶液の一部を
ScintisoIEX−H（和光純薬）中で，そのradioactiv・グルコース・アップテイクは3−0−methyl・

用いた．

法

約40gのオスのWistarラット 6匹にClofi−
brate，2−（p，Chlorophenoxy）−2−methyl・
propionicacidethylester，を腹腔に（30mg／100
g体重／日）8日間投与した．対照ラット6匹には便薬の1％ケラチン溶液を同量投与した．最終注
射24時間後，頸稚脱臼で殺し，速筋のextensor
digitolumlongus（EDL）と遅筋のSOleus（Sol）
をわ甘めクの最大伸展位で近位と遠位の腱でホルダーに固定し取り出した．
ホルダーに国定された筋はホルダーごと，95％
02−5％C02を連続的に通気し，緩やかに震虚結果対照とclofibrate投与ラットの体重は，試験開始直前は，それぞれ38．2±2．3と38．0±1．8gで有意差無く，8日後にはそれぞれ72．2±4．1と71．2±
6．2gとこれも有意差無かった．
EDLとSolの湿重量を表1に示した．対照とclofibrate投与ラットで有意差は無かった．
グルコース・アップテイクの測定結果は表2に示した．Clofibrate投与ラットのEDLのbasalグ
ルコース・アップテイクは有意に増加した．Clofi一

し，37℃のフラスコ内のインキュベーション溶液

表l Clofibrateの筋湿重量への影響

中でインキュベートした．この溶液は，Krebs−
Henseleit緩衝液（pH7．4）に5mM sodium
pyruvate，3H−3，0−methylglucose（1FLCi／ml），
5mMglucose，14C−SuCrOSe（0．2JLCi／ml），1mM
sucroseを含む．インスリンを用いる場合は100

EDL

対照群
27．3±2．1

clofibrate投与群
26．1±2．7So122．9±2．8a

22．7±2．1b

mU／mlを含めた．

筋湿重量（mg）：平均±sd（12筋）
a：p＜0．001vs EDL，b：p＜0．01vs EDL＊信州大学医学部第三内科
−219−

表2

Clofibrate筋グルコース・アップテイク
への髪響Aグルコース・アップテイクが有意に増加した．イ
ンスリンによるグルコース・アップテイクの増加

B

量はclofibrate投与により，Solで有意に増加し，EDL対照群

EDLで有意に減少した．

Basal

0．77±0．14

21．1±3．7

Insulin1．54±0．23a

41．8±6．2aInsulinーBasal O．77±0．09

考

20．7±2．4

Basal

1．01±0．18d

26．4±4．8

Insulin1．48±0，22b

38．5±5．7b

案

本研究ではclofibrateは遅筋のインスリン感受性と速筋のbasalグルコース・アップテイクを増EDL Clofibrate投与群

加させることが判明した．前者はclofibrateの耐糖能の改善の主要な原因であろう．
この遅筋に於けるインスリン感受性の増加の原

Insulin−Basalbrate投与ラットのSolではinsulin−aCtivated

因としては，Clofibrateによる，1）インスリン受．

O．47±0．11c l2．1±2．9C

容体のインスリンとの結合率の増加，2）インスリン受容体数の増加，3）受容体後のStePでの変Sol対照群
Basal

1．20±0．21f

27．4±4．8g

Insulin1．67±0．22b

38．5±5．7b

O．47±0．07e

11．0±1．7e化などの可能性がある．Clofibrate投与による遊艶脂酸構成の変化が形質膜の物理化学的性状を変化させ，インスリンのインスリン受容体への結合

Insulin−Basal率に変化が来るとの報告があった3）．Clofibrateに近縁のmetforminがインス））ン受容体数やインスリンの結合率を変化させずに，血糖値を低下さ

SoIClofibrate投与群
Basal

1．11±0．20

Insulin

2．05±0．28adf 46．8±6．4adg

25．1±4．5

せるとの報告があった4）．従って，1）と3）の可能性が示唆される．
速筋におけるbasalグルコース・アップテイク

Insulin−Basal

O．94±0．06ceの増加とインスリンによる増加率の減少は，Clofi−

21．7±1．3ce

Basal：インスリンの無い状態でのグルコース・
アップテイク

brateがインスリン様作用があり，glucosetrans−
porterの細胞内から形質掟への動月がclofibrateで起こる可能性が示唆される．

Insulin：インスリン100mU／mlの存在する状態
でのグルコース・アップテイク

結論として，Clofibrateはラットの遅筋と速筋
でグルコース・アップテイクに関し異なる作用を示す．

平均±sd（6筋ないし6対の筋）
A：JLmOl／gww／h，B：nmol／whole muscle／h，

文

a：p＜0．001vs Basal，

献

C：p＜0．001vs Control，

1）HerriotSC，Percy−RobbIW，StrongJAandThomson CG，：The effect of atromid on

d：p＜0．05vs Control，Serum Cholesteroland glucose tolerancein

e：p＜0．001vs EDL，

diabetesmellitus．JAtheroscleroRes3：679

f：p＜0．01vs EDL，

−688，1963．

b：p＜0．01vs Basal，

g：p＜0．05vs EDL

2）YashiroH，IrieTandTakebeK：EnllanCing
effectofclofibrateoninsulinsensitivityin−220−theperipheraltissues．IgakunoAyumi130：4）Prager R and Schemthaner G：Insulin
receptorbindingtomonocytes，insulinsecre−739−741，1984．

3）GinsbergBH，BrownTJ，SimonIandSpectortion，andglucosetolerancefollowingmetfor−

AA：Effect of the membranelipid environ−

min treatment．Results of a doubleblind

ment on theproperties ofinsulinreceptors．

crossoverstudyintypeIIdiabetes．Diabete

Diabetes30：773−780，1981．

32：1083−1086，1983．

−221−44）蛋白質のミトコンドリア移行とその異常
森

正 敏＊

研究協力者

村 上

は じめに

薫＊

ついては症例が報告されはじめているが，②につミトコンドリアは細胞のエネルギー産生，アミ

いては先ず蛋白質のミトコンドリア局在化の分子ノ酸代謝，糖代謝（TCAサイクル），脂肪酸β酸化尿素合成前半などを担う重要な細胞小器官（オルガネラ）の一つである．ミトコンドリアはそれ自身が複雑な構造を持っており，サイトソルに面している方から外膜，段間分画，内膜およびマトリックスの4つの区画より成っている．ミトコン

機構を明らかにすることが重要である．我々は肝ドリアの大きな特徴の一つは，固有の遺伝子
DNAと蛋白質合成系を持ち，部分的な自律性を備えていることである．しかしミトコンドリア
DNAはきわめて小さく，2種のリポソーム
RNA，22種のtRNAおよび呼吸鎖に関与する13種のポリペプチドのみがコードされていることが臓のミトコンドリアマトリックスに局在する2つの尿素サイクル酵素一カルバミルリン酸合成酵素
Ⅰ（CPSI）とオルニナントランスカルバミラーゼ（OTC）−を実験系として蛋白質のミトコンドリ
ア局在化とその異常の研究を進めている1）．
我々はまずラットCPSIとOTCのin vibv合成を行い，両酵素が分子量の大きい前駆体の形で合成されることを明らかにした．引き続いて多くの研究室で種々のミトコンドリア蛋白質について同様の実験が行われ ミトコンドリア蛋白質の大部分が前駆体として合成されることが明らかとな分っている．最近ミトコンドリアDNAの異常にった．さらにミトコンドリア蛋白質の合成部位がよるミトコンドリア病（ミトコンドリア脳筋症）

遊離リポソームであること，前駆体がサイトソルが発見され，その研究が急速に進んでいる．一方，のプールより数分以内にミトコンドリアに移行し，外膜，段間分画，マトリックスに存在する全てのミトコンドリアに存在するプロセシングプロテア

蛋白質および内膜の大部分の蛋白質は核染色体ーゼによって成熟蛋白質に転換されることを明ら

DNAにコードされており，ミトコンドリア外部かにした．図1にCPSIとOTCのミトコンドリ
ア移行の概略を示す．

で合成されたのち，1枚または2枚のミトコンド
リア膜を通過して内部へ移行し，または膜に組みさらに玩㍑融和で合成した蛋白質前駆体を単敵込まれる．すなわち，ミトコンドリアの形成はミミトコンドリアに取り込ませて成熟酵素に転換す

トコンドリア遺伝子と核染色体遺伝子の2重支配る玩べ融和のトランスポート再構成系を開発し，を受けている．したがって核支配ミトコンドリア

このトランスポートとプロセシングの系が①組織

蛋白質のミトコンドリア移行の障害はミトコンド

特異性がなく，どの組織のミトコンドリアでも使

リア病を釆たす．蛋白質のミトコンドリア移行の用出来る，②種特異性が低く，ラットやマウスの異常は①個々のミトコンドリア蛋白質の異常と②ミトコンドリアが使用出来る，③複数の前駆体に蛋白質のミトコンドリア移行のシステムを構成す共通である，④トランスポートのステップにエネる因子の異常に分けて考えることが出来る．①にルギーが必要であることなどを明らかにした．ついでOTC前駆体cDNAをクローン化し，成熟酵＊熊本大学医学部遺伝医学研究施設

素のN末端に32アミノ酸残基の−222−

延長ペプチドミトコンドリア

CPSImRNA二￣了〒二OTC mRNA

図1カルバミルリン酸合成酵素Ⅰ（CPSI）とオルニナントランスカルバミラーゼ（OTC）のミト
コンドリア移行．CPSIは単量体または2量体，OTCは3量体である．

12

3

4

5

6

7

8

910

現が得られた（図2）．発現したOTC前駆体は封♭1入体を形成しているため，8M尿素または6Mグア
ニジン塩酸で可溶化し均一に精製した．この精製
OTC前駆体はミトコンドリアマトリックスに存在するプロセシングプロテアーゼの基質になること，また玩㍑粛和トランスポート系でミトコンド
リアに取り込まれることを確認した．この際，ウ
サギ網状赤血球中に含まれる蛋白質因子（サイトソル因子）の存在が必要であることを明らかにし
図2

た3）．

0TC前駆体（pOTC）および成熟型OTCの大腸菌内での発現と精製．レーン1，
pOTCを発現させた大腸菌抽出液；レー
ン2，抽出液上清：レーン3，抽出液沈殿；
レーン4，沈殿からの尿素抽出液：レーン
5，尿素抽出後の沈殿：レーン6−10，成熟型OTCを発現させた場合でレーン1−5に相当．M，分子量マーカー．

精製前駆体を蕉糖密度勾配遠心にかけると不溶化して沈殿してしまうが，ライセート存在下では沈降係数6〜11Sの可溶性複合体を形成した（図3），一方，OTC前駆体と同様に発現させ精製した成熟型OTCはこのような複合体を形成しなかった．これらの結果は，ライセートの中にOTC前駆体に特異的に結合する因子が存在することを示（presequence） が付着していることを明らかにした2）．この前駆体の性状およびミトコンドリア

す，この因子は前駆体のpresequence部分に特異への移行の仕組みを明らかにするためには前駆体

ding factor（PBF）と名付けた．

的に結合することが分ったのでpresequencebin−を大量調製する必要がある．そこで遺伝子工学の表はウサギ網状赤血球からのPBFの精製を示手法を用いて大腸菌でOTC前駆体の大量発現をす．OTC前駆体をリガンドとした77イニティー

試みた．

クロマトグラフィー，DEAE−5PW液体クロマト
方法と結果グラフィーおよび蕉糖密度勾配遠心法により

OTC前駆体cDNAを入ファージのPLプロモ

91，000倍に精製し均一標品を得た．30gのライセーターを持つ発現ベクターに組み込んで大腸菌にート蛋白質より0．21mgの精製標品が得られた．

発現させたところ，全菌体蛋白の10％におよぶ発PBFは分子量50，000のサブユニットのオリゴマ

−223−

9
2

9
2

5
1

4
3
2

4 6 81012
Fraction

6
1︵N．OL X∈dp︶0トOd

5 4
1

図3

2

8
2

6
1

︵TOL XEdp︶0ト○82

Bottom

Bottom2

Top

4

681012Top

Fraction

0TC前駆体とサイトソール因子の複合体形成．精製リコンビナントOTC前駆体（左）または成熟型OTC（右）を単独で（None）またはウサギ網状赤血球溶血液ライセート（RL）またはヘモグロビン（Hb）と混合後，蕉糖密度匂配遠心法で解析した．

Presequence
BindingFactor（PBF）

図4 前駆体蛋白質のミトコンドリア移行の初期ステップのモデルーであることが分った4）．精製PBFは精製OTC
前駆体のミトコンドリア移行を強く促進した．
考察

図4にミトコンドリア蛋白質前駆体のミトコン
ドリア移行の初期ステップのモデルを示す．前駆体蛋白質がリポソームで合成されてpresequence

部分がリポソームより出てくるとPBFが結合し，可溶性の複合体を形成して前駆体の凝集を防■ぎ，
前駆体を股透過可能な状態に保つものと思われ
る5）．この複合体は恐らくミトコンドリア表層に存在すると思われる PBFレセプター に結合
し，preSequenCe部分が次いてPBFからprese−
quenceに対する別のレセプターに移された後，外

一224−

表

網状赤血球ライセートからPBFの精製

drialproteintransportwithpurifiedornithine

精能ステップ

蛋白質全活性 比活性 精製倍率（mg）（単位）膵釘mg泰郎

ライ七一ト

30．00077イニティークロマト

21．6

3，300
2，400

0．1
110

DEAE−5PWHPLC O．812．250 2，800蕉糖密度勾配遠心0．212，10010，000

ranscarbamy】ase precursor expressedin

励che71chhl COli．J BioI Chem263：18437−

1

18442，1988．

1，000

25，00091．0003）MurakamiK and MoriM：Purified prese・
quencebindingfactor（PBF）formsanimport−COmpetent COmplexwith a purifiedmito−

膜と内膜のコンタクトサイトを通ってマトリック

Chondrialprecursorprotein．EMBOJ9：3201

スに移行すると考えている．今後PBFの性質を−3208，1990．

更に明らかにすると共に，遺伝子を単牡し， PBF
レセプター4）MurakamiK，Tokunaga F，Iwanaga S andの検索を行う予定である．これらのMori M：Presequence does not prevent

基礎に基いて蛋白質のミトコンドリア局在化の障foldingofapurifiedmitochondrialprecursor

害を解析したい．

proteinandis essentialfor associationwith
areticulocytecytosolicfactor（S）．JBiochem

文

lO8：207−214，1990．

献1）森 正敏：蛋白質のミトコンドリア膜識別とミ

5）Mori M and Murakami K：Transport of

トコンドリア内移行．現代化学 増刊10「タンmitochondrial precursor proteins：Their

パク質の細胞内輸送と膜透過」1987，pp174−

COnformational eompetence and related

185．

factors（Minireview）．CellStruCtFunct14：2）MurakamiK，AmayaY，TakiguchiM，Ebina
Y and Mori M：Reconstitution ofmitochon−−225−643−647，1989．

45）一次元ならびに二次元電気泳動によるCOmneCtinの免疫化学的分析：福山型先天性筋ジストロフィーにおける変性・分解の検討を中心に

埜堀
＊

＊

肘ド

＊

＊

＊

澄

年村

●

烏
■

中 征 哉＊＊＊
員一郎＊＊＊＊

＊

＊

＊

＊

（Ⅰ）一次元電気泳動
は じめに

方

法

生検筋を用いたconnectinの一次元電気泳動後

Connectinはmyosin線椎をZ帯に連結する弾性線経であり，サルコメアの保持に重要な役割を果たす1）．3，000kdの巨大蛋白質であるconnectinは脆弱で，種々の要因により容易に変性・分解をおこす1）．従って何らかの病的状態においてはれ
vivoでconnectinが変性・分解する可能性があり，またその場合connectinが分解した結果として筋構築の崩壊がさらにいっそう助長されるという悪循環が成立することも考えられる2）．我々は
抗connectinモノクローン抗体（SM1−36−2）を用いたWesternblot解析により各種神経・筋疾患におけるconnectinの変化を検討してきたが，その結果connectinは，（1）Duchenne型筋ジストロフ
ィー（DMD）では5−6歳以降で高度に分解していること，（2）Becker型筋ジストロフィー，筋緊張性ジストロフィー，肢帯型筋ジストロフィー，筋
萎縮性側索硬化症，Charcot−Marie−Tooth病などでは分解はいたって軽度であることを報告した2）．今回は同様の方法で典型的な福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）におけるconnectinの変化を検討した3）．
＊国立療養所下志津病院神経内科＊＊国立精神神経センター神経研究所＊＊＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊＊＊千葉大学理学部＊＊＊＊＊東京都神経科学総合研究所神経生化学

けhH

喜

＊

＊

徹作子

高木

村

松
工 弘

年山浦

寓丸杉

研究協力者

のWesternblot法についてはすでに報告した2）．
今回使用した2種の抗connectinモノクローン抗体（SM1−36−2と3B9）はともにconnectinの分解産物を鋭敏に検出する．対象とした11例は表に示
した．
結

果

結果を図1と表に示した．Connectinは，2−3
歳以下のFCMDでも著明な変性・分解を認めたが，一万10歳以上でも変化のいたって軽し、症例（もしくは筋肉）も存在した．
考察ならびにまとめ
前述のようにCOnneCtinの分解は5−6歳以降のDMDにおける筋変性に重要な役割を果している可能性が考えられた2）．このことは，DMDにおける骨格筋CT上の変化が5−10歳の問に最も急速に進行することと良く一致していた4）．さて本研究によりconnectinは273歳以下の早期のFCMDでも分解していることが示された．このことは，FCMDにおける骨格筋CT上の変化は極めて早期に生じるとの報告と矛盾しない5）．しかし一万10歳以上でも変化のいたって軽い症例（もしくは筋肉）も存在し，FCMDにおけるconnectinの変化はDMDよりもはるかに症例（もしくは筋

−226−

表

DegradationstateofconnectininFukuyamatypecongenitalmusculardystrophy

Sex Site ofCase AgeNo．

BiopsyDegradationof Connectina

1

5mo

H

Biceps brachii

2

2

8mo

H

Biceps brachii

4

3

lyr

M

Biceps brachii

3−44

1yrllmoF

Biceps brachii

4−5

5

2yr

F

Biceps brachii

2

6

3yr

F

Biceps brachii

2

7

3yr

F

Biceps brachii

4−584yrlmoF

Biceps brachii

1−2

9

5yr

F

Biceps brachii

3

10

14yr

F

lntercostal

1−2b

11

16yr

M

Tibialis anterior−1−−−−・−−−−−−−・−一■−−−−−−一一・−−−−−−−−−−−−−−・−一一−●一一一一一−−・−−−−−→■一一一−−−一■−−−−−−−−●−●−■−

aDegradation state of connectin revealed byimmunostaining withSMl・36−2and3B9：0＝nO

remarkable

controi（Figurelegend）．1＝Verydegradation13＝mOderatechangemild

degradationp

comparedwithdegradation，2

4＝SeVere＝normalmild

degradation，5：SeVere degradation with noidentifiabled−Orβ−COnneCtin・
bMuscle specimen was obtained at autopsy・Connectin degradation
pattern

of

this

case

was

slgnificantly・▼different

the other．S．

−227−

from

those

of

図l Westernblottingofthemyofibrillarproteinsofnormalcontrol（NC）andFukuyama
type congenitalmuscular dystrophy（FCMD）．Lanel showsthe polyacrylamide gel
Stained with Coomassie brilliant blue．Lanes2and3shownltrocellulose membrane
immunostainedwith SMIT36−2and3B9，reSpeCtively．SM1−36−2was more strongly
reactivethan3B9．C，N and M denote connectin，nebulin and myosinheavy chain，
respectively・NCisacasewhosebiopsiedquadricepsfemorismuscleturnedouttobe
withinnormallimitsbytheconventionalmusclehistology．Incases2，4and70fFCMD，bothconnectin andnebulinwerehardlyidentifiedonthepolyacrylamidegels．When
immunostained with SMIL36−2 and 3B9，COnneCtin was shown to be degraded
extensively，withlow−mOlecular−Weightdegradationfragmentsbeingstainedasbroad
SmearS．In case5，bothconnectin and nebulinwereless distinctthanin NC on thepolyacrylamidegel．WhenimmunostainedwithSM1−36−2and3B9，COnneCtinwasshown
to be degraded mildly，with degradation fragmentsbeing stained assmears．In caselOwhosemusclespecimenwasobtainedatautopsy，COnneCtinandnebulinwerereduced

On the polyacrylamide gel．Whenimmunostained with SM1−36−2and3B9，however，COnneCtinremaineddefinitely，anddegradationfragmentswerestainedoutasmultiple
Sharp bandsin a remarkably different Way from the other cases．

肉）間でのばらつきが大きかった．すなわちcon−nectinの分解は，FCMDでもDMDと同様に発症機序における重要な一過程をなす可能性が考えられるものの，その程度は症例／筋肉により異なることが示唆された．

Sieblue染色では同定されなかったが，SMIL36−2を用いたWesternblot法により明瞭に同定され，そのplは〜5．7であった（図2）．今後本法はcon−nectinの正常発生過程における変化，病的状態における変性・分解状態などを検討する際に有用と考えられた．

（ⅠⅠ）二次元電気泳動6）

文

一次元日ゲルに0．5％agarosegel，二次元日ゲ

献1）Maruyama K：Connectin，an elastic

ルに2L12％SDS polyacrylamide gelを用い，平林法によりconnectinの等電点電気泳動を試み

filamentous protein of striated muscle．Intた7）〜9）．Connectinのスポットは，ゲルのCoomas−

Rev CytollO4：81−114，1986．

−228−

†

一

・．．

†・b

lヽ

／

図2（A）Coomassie brilliant blue（CBB）staining ofthe polyacrylamidegelfollowing2−
dimensionalgelelectrophoresisofratskeletalmuscleproteinS（areamarkedIEF）．0．5％
Agarosegelwasusedatthelstdimensionandsamplewasappliedfromthebasicside（−）．2−12％GradientSDSpolyacrylamidegelwithoutstackinggelwasusedatthe
2nd dimension；this wasnecessary forthehighresolutionanalysis ofhigIrmolecularrweight proteinslike connectin．SDS−eXtraCt Ofrat skeletalmuscleproteinswas run
inlanelasmolecularweightmarkers．α，β，N，MHC，CKandTMdenoteα−COnneCtin，
β−COnneCtin，nebulin，myOSinheavychain，Creatinekinaseandtropomyosin，reSpeCtively（12，13）．Arrowpointstotheareawhereconnectinspotisrevealedbyimmunoblotting
withanantトconnectinmonoclonalantibody，SM1−36−2，aSShowninFig．2B．Connectin
SpOt WaS nOtvisualized definitely by CBB staining；this was partly due tothe trail
ofmyosinheavy chainwhichexists abundantlyinthe sample（12，13）．
（B）Immunoblottingofthetransferrednitrocellulosemembranewithanantトconnectinmonoclonalantibody，SM1−36−2．Connectinspotwasdetecteddefinitelyatanisoelectricpointof〜5．7（arrow）．On

closeinspection，thespotseemedcomposedof2closely−

locatedspots，inwhichcasetheupperandlargerpartandthelowerandsmallerpart
WerepreSumedtorepresentα一andβ一COnneCtin，reSpeCtively．Asubstantialamountof

COnneCtinwasnotfocusedpresumablyduetoaggregationofthisextremelyhugeandfilamentous protein（arrowhead）．
−229−

2）Matsumura K，Shimizu T，NonakaI，etal：

筋ジストロフィー症の遺伝，疫学，臨床およびImmunochemicalstudyofconnectin（titin）in

治療開発に関する研究．昭和63年度研究報告書，

neuromuscular diseases uslng a mOnOClonal

1989，pp127−133．

antibody：COnneCtinisdegradedextensively6）Matsumura K，Hori S，Sugiura H，et al：

inDuchenPemuSCulardystrophy・JNeuroI
Sci93：147−156，1989．

gelelectrophoresis．J Biochem，in press．

Isoelectricalfocusingofconnectinbyagarose

3）Matsumura K，Shimizu T，SunadaY，etal：

7）Hirabayashi T：Two−dimensional gel

DegradationofconnectininFukuyamatypeelectrophoresis of chicken skeletal muscle

COngenital muscular dystrophy：immuno−proteins with agarose gelsin the first

ChemiCalstudywith monoclonal antibodies．

dimension．AnalBiol117：443−451，1981．
8）HirabayashiT，Tamura R，MitsuiI，et al：

J NeuroISci，1990，in press．
4）松村喜一郎，清水 潤，田本雅也ほか：デュシャ

InvestigationofactininTetrahymenacells：

ンヌ型筋ジストロフィー症（DMD）における骨acomparisonwithskeletalmuscleactinby

格筋CT所見の経時的変化の検討．筋ジストロ

a devised2−dimensionalgelelectrophoresis

フィー症の遺伝，疫学，臨床および治療開発に

method．J Biochem93：461−468，1983．

関する研究．平成元年度研究報告書，1990，

9）Hori S，Sugiura H，Shimizu T，et al：

ppl14−118．

Detectionofdystrophinon2−dimensionalgel5）福山幸夫，新井ゆみ，炭田沢子ほか：福山型先electrophoresis．Biochem Biophys Res Com

天性筋ジストロフィー症の骨格筋CTについて．

−230−

161：726−731，1989．

Ⅴ軋 ミトコンドリア脳筋症（2）46）MERRF様症状を呈したMELASにおけるミトコンドリアDNAの解析

水 澤 英 洋＊研究協力者

太 田 成 男＊＊ 金 澤 一 郎＊

Myoclonus epilepsywith ragged−red fibers（MERRF）Dぉよぴmitochondrial myopathy，
encephalopathy，lacticacidosisandstroke−1ike

episodes（MELAS）2）は，それぞれ特徴的な臨床症状を有するミトコンドリア脳筋症の中の独立した疾患単位である3）∴最近，それぞれ異なるミトコン
ドリアDNAの点変異が兄い出されたことは，このことを裏付けるものである4ト6）．しかし，まれに両者の特徴を合わせ持つような症例も存在しており，
単にどちらかの表現型の違いであるのか，あるいは全く異なる（遺伝子）異常によるのか不明のままである．私たちは，この点を明らかにする目的で
MERRF様の症状を合わせ持つ非典型的
MELASの一例で，ミトコンドリアDNAの解析
を行った．
症

例

症例は，19歳の男性で，喋下・構晋障害，歩行障害を主訴に来院した．既往歴・家族歴には特記すべきことはなかった．現病歴としては，妊娠・分娩に異常なく満期産で出生時体重3200gであったが，3ヶ月の時に数秒間続く全身硬直発作が数回見られ，4歳からは両側の難聴を指摘されていた．10歳から大発作が出現するようになり，某大学病院で Leigh脳症の疑い と診断され，抗痙撃剤などの治療が始められた．しかし，その後構音障害，ふらつき，知能低下などが徐々に進行し，＊筑波大学臨床医学部系神経内科＊＊自治医科大学第一生化学

痙攣発作（時にミオクローヌス様）も時々見られた．17歳の時，左半盲のエピソードがあり，19歳で囁下・構音障害，歩行障害が進行したため入院となった．
入院時現症では，身長170cm，体重51kgと軽度のるいそうを認めた．神経学的には，意識は清明であったが，知能は低下しており，両側難聴，構音・囁下障害が見られた．下肢近位筋を中心に筋力低下，筋トーヌス低下があり，腱反射は全般性に低下し，Babinski徽候は両側で陽性であった．
下肢で振動覚が低下していた．動作は緩慢で四肢・体幹の失調，開脚歩行があり，左側等，便秘なども認められた．
検査所見では，尿，便，血液，髄液の一般検査には異常なかったが，乳酸は血液18mg／dl，髄液23mg／dl，ピルビン酸は血液0．9mg／dl，髄液1mg／
dlと乳酸の高値を認めた．神経伝導速度は，右脛骨神経MCV22m／′S，右肺腹神経SCV41m／Sと下肢で低下し，筋電図では一部の被検筋に神経原性NMUが見られた．脳波は，4−7Hze波が主体であった．左上腕二頭筋筋生検では，多数のrag・
ged−red fiberを認めたが，組織化学的にcyto−
chrome C oxidase活性は低下しておらず（図1），生化学的に測定したミトコンドリア電子伝達系呼吸酵素活性は正常範囲内であった．俳腹神経
生検では，有髄神経線経の高度の減少が見られた（図2）．hIRIでは脳幹・小脳・大脳の萎縮を認めた（図3）．入院後，構音・囁下障害は一時改善したが，その後頭痛，右半盲が出現，大発作，焦点発作，ミオクローヌス様発作を含む痙攣発作を頻−233−

発するようになった．さらに右三叉神経痛，右oneandahalf徽候，中枢性右顔面神経麻痺も加わった（図4）．MRIでは，T2およびPD強調画像でhighintensityの病巣を，脳幹背側部から視床にかけてと左後頭葉を中心とする大脳皮質に多発性に認めた（図3）．
本症例は，その経過中明らかに stroke−like の症状を認めており，診断基準に照らしてみても低身長でない点を除けばMELASとして問題はな
いと思われた．一方，MERRFでも stroke−likeの症状は知られており，ミオクローヌス様の痙撃
発作や高度の末梢神経障害などMERRFによく見られる症状も伴っていた（図5）．なお，Leigh
脳症は完全には否定できないが，MRI所見からはその可能性は少ないと思われた．以上のことから，
本例はMERRF様症状を伴ったMELASの可能性が高いと考えて，ミトコンドリア遺伝子の解析を行った．
ミトコンドリア遺伝子の解析

図1a，b

まず，生検筋からDNAを精製し，PCRにて関心領域すなわちMELASの変異点である第8344
塩基対およびMERRFの変異点である第3243塩
基対を含む領域を増幅した．次いで，MELASについてはAからGへの変換が新しいGGGCCCという配列を形成することを利用して，制限酵素
ApaIにて増幅DNAを切断し1．5％アガロース・

生検臥こ軽度だが多数のragged−redfiberを認めるかくa）、CytOChrome C
OXidase活性は欠損していない（b）．
（a：Gomoritrichrome染色 ×340，
b：cytochrome Coxidase 染色，
230）

ゲル電気泳動にかけェナウム・ブロマイド染色で異常DNA断片の有無を検索した．本症例では，
tRNA−LeuのAからGへの変換は認められなかった（図6）．MERRFについては，非対称PCR
にて一本鎖DNAを調整し，蛍光プライマー法を用いABIの自動塩基配列解析装置により全塩基配列を決定した．それによると，tRNA−LysのAからGへの変換も見られなかった（図7）．
考察・結論
本例においては，MELASおよびMERRFにお図2 生検俳腹神経では，有髄神経線経の高度の減少と中線経の集族を認める．（toluidine
blue染色，×850）

いて既に報告されている点変異はいずれも認められなかった．したがって，単に表現型の違いではなく異なる原因によると考えられる．しかし，そー234−図3a，b，C，d MRl所見．a，bは入院時のTl強調像で脳幹・小脳・大脳の萎縮と小脳半球の低信号化を認める．C，dは半盲や痙攣発作出現後のPD強調像で左後頭葉を中心に大脳皮質に多発性の高信号域を認める．

012

3

4

5

6

7

8

91011121314ほ16171819（歳）

K S S
外

眼

笥

麻

痺

王＋

：

網

穣

変

性

症

】＋
l
l
l ＋
ll ＋

l
l
l
l
ll

一
・楓 伝 導 随 生
ーUERC S F 蛋 白 ＞ 100 nn g ／d 〜

L e ig h tS E

T h is c a s e

−

十

（＋ ）

＋
（＋ ）
＋

（＋ ）

−

ミオタ ローヌス
小
脳
失
調

＋

筋

＋

十

＋

十

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋
；＋

＋
（十 ）

力

低

呆

低
発

下
攣

痴
身
作

皮

性

神

嘔

質
経

性

吐
盲

難

聴

乱 戦 ア シ ドー シ ス
家＋長

片 麻 種 、 半 音

族

＋
l
l
1
1
】
l

l
1
1
1
」

一
十
＋ ：

−

＋
「

：十 J
＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

十
＋

十
＋

＋

十
［：至］

＋

＋
＋

−

（＋ ）

fib e rs

＋

性

＋

蛮

十

＋

海

状

：

＋

R a g ge d ・
「e d
綿

□

＋

＋

歴

末 梢 神 経 薄 暮

図4 本症例の臨床経過

M E L AS

ー

十
＋

痙

三叉補鍾痛．中軽性譜面楕桂麻痺．眼等電動離書（〇六e＆ahalりM ER R F

＋

＋
7
［二王 ］

図5 本症例と主なミトコンドリア脳筋症との臨床・検査所見の比較

−235−

399b
3

図7

ABIの自動塩基配列解析装置によるミトコンドリアDNAの塩基配列．第8344塩基対のAからGへの変換は認められない．
文

献1）Fukuhara N，TakiguchiS，Shirakawa K，etal：Myoclonus epilepsy associatedragged−red

ApaI壬十手：2．4，6

abnor一malities）：Disease entity or a syndrome？

ト‡；3，5．7
図6fibers（mitochondrial

withLight alld electron−microscoplC Studies of
twocasesandreviewofliterature．J NeuroI

PCRで増幅したミトコンドリアDNA断片のアガロース・ゲル電気泳動．Lanelは正常対風，lane2，3とIane6，7がそれぞれ典型的MELAS症例の培養細胞および生検筋からの試料，lane4，5が本症例の試料である．MELASでは，399bpのものがApaIで305bpと90bpに切断されるのに対して，本症例ではそれが見られない．

Sci47：117−133，1980．

2）PavlakisSG，PhillipsPC，DiMauroS，etal：
Mitochondrial myopathy，enCephalopathy，
lactic acidosis，and stroke−like episodes：A
distinctive clinical syndrome．Ann Neurol
16：481−488，1984．

3）福凍信義：わが国におけるミトコンドリア・ミ
オバナーの臨床一病型分類−．神経内科24：の原因は臨床症状の類似性からMELASやMERRFの点変異とよく似ている可能性がある．
Gotoらによれば，報告された点変異を持たない
MELASが20％もあり，変異を持つMELASと臨床症状では区別できないとされている6）．このことは，典型的MELASにおいてもそれを引き起こす
遺伝子異常はひとつではないことを示唆している．

125−132，1986．

4）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，et al：
Myoclonus epilepsy and ragged−red fiber
disease（MERRF）is associatedmitochondrial

with

a

DNA tRNA−Lys mutation．

Cel161：931−937，1990．

5）KobayashiY，MomoiM，Ohta S，et al：A

今後，本例を含めこのような症例の遺伝子解析が，新しい遺伝子異常あるいは遺伝子異常と臨床症状との関係の解明に役立つものと思われる．

point mutationinthe mitochondrialtRNA−
Leu（UUR）geneinMELAS（mitochondrial
myopathy，enCephalopathy，lactic acidosis
and stroke−like episodes．Biochem Biophys

ー236−Res Comm，in press

MELAS subgroup of6）GotoY，HouraiS，NonakaI：Amutationin
the tRNALeu（UUR）gene associatedwith the−237−

mitochondrial ence−phalomyopathies．Nature，348：651q653，1990

47）Myoclonus epilepsy associatedwith ragged・red
fibers（MERRF）の病因に問する分子遺伝学的研究

吉

研究協力者

米

田

武

誠＊

正＊

辻

省

田 中 恵 子＊ 宝 来

Myoclonusepilepsyassociatedwithragged−

んかん，小脳失調，ミオバナーを主徴とする疾患であり，時に痴呆，足変形，感音性難聴，視神経萎縮などを伴う．骨格筋生検でragged−redfiber（RRF）が認められ，母系遺伝を呈することからミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常が病因と推察されてきた．
しかしながら，従来Southern blotではmtDNAの欠矢は認められておらず，一塩基置換
ないしはSouthern解析では判別できない程度の
小さな欠矢が病因である可能性が示唆されてきた．
そこで，我々は本症の病因を明らかにすることを目的に分子遺伝学的解析をおこなった．
象

我々が，分析した症例の臨床症状の概略を表に示す（表1）．症例1及び2は福原ら1）により本症の疾患概念が提唱された際に報告された症例である．症例3は67歳の女性で，55歳頃より小脳失調，動作性ミオクローヌス，てんかん ミオバナーを呈し，筋生検でRRFが認められている．症例3，
4は母子例である．

＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立遺伝学研究所＊＊＊名古屋大学医学部第二生化学

野

芳

範＊

聴＊＊ 小 澤 高 将＊＊＊（C；childfood）

red fibers（MERRF）は，ミオクローヌス，ていずれの症例も母系遺伝として矛盾しない家族歴を有し，MERRFの中核症状であるてんかん，

丹表1本研究で分析したMERRF患者の臨床所見の概略8）症例3，4は，母子例である．

は じめに

対

次＊

Patient
Fa血ly

Pl
1

P2
2

Age （
y／
0）
／
Sex
Onset（y／0）
Familial incidence

20一
用 30／
F 67／
F 25川
14
55
C
C
（
＋） （
十） （
十） （
＋）

Myoclonus
Epilepsy
Ataxia糟
yopathy（十） （十） （
十） （
＋）
（
十） （
＋） （
十） （
十）
（
十） （
＋） （
十） （十）
（
十） （
＋） （
十） （
＋）

De皿
entia
Foot deformity
鮎aringloss
Optic atrophy（十） （十） （＋） （＋）
（
＋） （
十） （
−） （
−）
（
−） （
十） （
＋） （−）（十） （−） （−） （−）

Retinal pig皿entation
Heart block
Stroke−1ike episodes（−）一（−） （−） （−）（−） （−） （−） （
−）
（
−） （
−） （
−） （
−）

Elevation of lノP
Ragged−red fib rs

（
十） （
＋） （
＋） （
十）
（
十） （
十） （
＋） （
＋）

P3

P4
3

小脳失調，ミオクローヌス，ミオバナーを有し，血中乳酸・ピルビン酸値の上昇と骨格筋生検でRRFを認めている．他のミトコンドリア脳筋症との鑑別上問題となる脳卒中様発作，網膜色素変性，
心伝導障害はいずれの症例でも認められていない．

一238−

以上のように対象とした症例は臨床的に典型的な

表2

症例1の骨格筋mtDNA分析で認められたアミノ酸の置換をきたす12箇所の塩基置
換及び他種におけるアミノ酸配列8）（＊種間での保存性の高いアミノ酸の置換を伴う
塩基置換）

MERRFの症例と考えられる．
方法

患者の生検骨格筋よ，りgenomic DNAを抽出
nt p os i ti oれ

後，PCRによって増幅したDNA断片をdirect
SequenCe法あるいはpUC19ないしはpBlue
Script KS￣plasmid vectorにsubcloningL，

mtDNAの全sequenceを決定した．
しかし，mtDNAには正常人でも多くの多型性が認められる事から，本症の分析においても多数の塩基変異が認められる可能性がある．

t l ． 65 47
2 ． 68 98
3 ． 88 80
4 ．1 03 30
事 5 ．1 17 18
6 ．1 20 9 2
7 ．1 37 0 2
8 ．1 4 19g
9 ．1 48 58
10 ．1 43 68

C OI
C OI
1 TP6
N D3
NM
NM
【D5
N【
冶
N【
冶
Ⅳ【
冶

●1 1 ．1 48 58
12 ．1 53 26

c yt bc yt b

そのため，認められた多数の塩基置換のうちどれが本症の病因となる塩基置換であるのかを鑑別することが必要となる．このためLeber遺伝性視神経萎縮症2）3）と同様に，種問での保存性の高いア

表3

仙 t anMorl
P at i en t

T
T
A
C
G
C
G
C
C

C
C
G
T
A
T
C
A
G

C
G
A

G
A
G

A■in o ac i dl Pa t ie nt
恥 va 吐 」」 処 堅 ＿＿Hu la n
L
M
T
S
G
L
G
P
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G
T

P
T
A
F
E
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T
L

L
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A
S
G
L
R
S
F

L
Ⅰ
A
T
G
Ⅰ
R
S
Ⅴ

L
S
A

M
G
M

F
G
Ⅰ

症例1の骨格筋mtDNAのタンパク質をコードしていない領域における一塩基置
換8）

ミノ酸の変化を伴う塩基置換が病因となる可能性
nt pos itio nが高いというstrategyに基づいて，詳細な検討をおこない，本症の病因と考えられる塩基置換を決定した．

タンパク質のCOding region以外では，プロモーター領域を含むD−loop領城中に7箇所，tRNA（Lys）

6．162610−loop・

7．162鎚 D−loop8．162鎚 0−loop
9．16311D−loop
lO．16519

A
A
A

G
G
G

G G T T C C C

5．83朋＝

号4，532−4，557，8，617−8，746，12，544−12，653
を除く）を分析し，Andersonらによって報告されている正常ヒトmtDNAの塩基配列4）と比重交しタンパク質のCOding regionの塩基置換のうち，14箇所がNADH−dehydrogenaseのSubunit領域に，5箇所がcytochrome c oxidase，2箇所がATPase，2箇所がcytochromeb領域に位置していた．このうち，12箇所がアミノ酸の置換をきたすものであり，3箇所の塩基置換（塩基番号6，547のTからC，11，718のGからA，14，858のGからA）がヒト，bovine，mOuSeの間で保有されたアミノ酸を置換するものであった（表2）．

D −l o o p
D −l o o p
12S

4．14：娼12S

結果及び考察
症例1の骨格筋mtDNAの98％の領域（塩基番て，33箇所の塩基置換が兄いだされた．このうちの23箇所の塩基置換がタンパク質を規定している領域で，10箇所がそれ以外のD−loop，rRNA，tRNA領域に含まれていた．

乃
2億
7甜

Pa tient l

A A C C T T T

1．
2．
3．

H u m a n ，C a m b

D−loopr−RNA（12S）領域中に2箇所，tRNALys領域中に1箇所の塩基置換が兄いだされた（表3）．
このうち，D−loop領域の3箇所（塩基番号16，261，16，311，16，519）については正常ヒト
mtDNAの塩基置換として報告5）されており，本症の病因としては考えにくい．また，塩基番号
1，437（rRNA−12S）の塩基置換については，Wa1−
1aceらにより，Leber遺伝性視神経萎縮症の解析の際に報告2）されており，いずれも本症の病因の可能性は低いと考えられる．
以上より，MERRFの病因となりうる塩基置換として，アミノ酸の柱間での保存性を考慮し3箇所のタンパク質のCOding regionの塩基置換（塩

−239−

表4

正常のヒトmtDNAの塩基配列4）とMERRF患者のmtDNAの塩基配列8）の比較

nt P Sition
6457
8344
11718
148鎚

COI
tRM （
Lys）
104
cytb

Norla lPatieI止 lPatient 2

Patient 3

T
A
G
G

C
G
A
A

T
G
G
G

T
G
G
A

の分析した症例についてheteroplasmyの程度と臨床症状との関連性について，さらに詳しい検索をおこなう必要があると考えられる．
まとめ

1．MERRF患者の骨格筋mtDNAの解析か
ら，tRNALys塩基番号8344のAからGへの塩基変異が認められた．

基番号6，457，11，718，14，858）とtRNALys領域の1箇所の塩基置換が考えられた．さらにこれらの塩基置換の中で，真にMERRF▼の病因となるものを兄いだすため，他のMERRF患者がこれらと同様の塩基置換を持つか否かを比較検討した．その結果，塩基番号8，344の塩基置換は，3例全てに認められたが，塩基番号6，457及び11，718の塩基置換については他の2家系のMERRF患者においては兄いだされなかった．また，塩基番号14，858の置換も他の2家系のMERRF患者中1人に兄いだされたのみであり，本症の病因の可能性は低いと考えられた（表4）．

2．この塩基変異は独立した3家系4症例のMERRF患者全てに認められた．
今後は，この塩基変異がtRNALysの高次構造や機能にどのような影響を及ぼし，ミトコンドリアの蛋白発現にどう影響しているのかを解明し，各臓器での発現，臨床徽候を説明していくことが必要であると考えられる．
文1）FukuharaN，TokiguchiS，ShirakawaSand
TsubakiT：Myoclonus epilepsy associatedWithragged−redfibers（mitochondrialabnor−

以上より，我々はtRNALys塩基番号8，344の位置のAからGへの置換が本症の病因として最も可能性が高いと考えた．この塩基置換はtRNALysの
TVCloopのTVCstemの3 側より2塩基下流に位置する．S．Cerevisiaeにおいては，従来より多くの変異株が知られており，t−RNAAspのTVC
loopの塩基置換によってtRNAの高次元構造や機能に障害をきたし，酸化的リン酸化系の機能に障害をもたらすことが知られている6）．本症におけるtRNALysの塩基変異も同様に，mtDNAで規定されたサブユニットのタンパク合成に影響する

献

malities）：diseaseentityorsyndrome？Light

andelectronmicroscopicstudiesoftwocases
andreviewoftheliterature．JNeuroISci47：
117〜133，1980．

2）WallaceDC，SinghG，Lott MT，HogdeJA，
Schurr TG，Lezza AMS，EIsasII LJ and
Nikoslelainen EK：Mitochondrial DNA
mutationassociatedwithLebershereditary

Opticneuropathy．Science242：1427−1430，
1988．

3）YonedaM，TsujiS，YamauchiT，InuzukaT，可能性がある．また，TlyCloopは一般に種問での変異の多い部位であるが，このA残基は多くの種間で保有されており，tRNALysの高次構造上重要と考えられる．

Miyatake T，Horai S and Ozawa T：

最近，我々とは独立にShoffnerらによって
MERRF患者に同一の塩基変異が兄いだされ，24）Anderson S，Bankier AT，Barrell BG，de−271％の割合で正常の塩基配列に由来するクローンが存在すると報告された7）．

andorganizationofthehumanmitochondrial

さらに，彼らは発症年齢とheteroplasmyの程度に相関がみられると報告している．今後，我々

MitochondrialDNAmutationinfami1ywith
Lebershereditaryopticneuropathy．Lancet

i：1076−1077，1989．

Bruijin MHL，CoulsonAR，etal：Sequence
genome．Nature290：457−465，1981．
5）ZennaroE，FrancisciS，RangniniA，Frontalis−240−

L and Fukuhara B：A point mutationin amitochondrialtRNAgeneabolishesits3（MERRF）isassociatedwithamitochondrialend

and processing．NucI Acid Res17：5751−

DNA tRNALys mutation．Ce1161：931−937，

5764，1989．

1990．

6）HoraiS：Molecularphylogenyandevolution

8）Yoneda M，Tanno Y，Horai S，Ozawa T，ofhumanmitochondrialDNA：Newaspects

Miyatake T and Tsuji S：A common

ofthegeneticsofmolecularevolution，Sprin−mitochondrialDNAmutationintRNALys ofger−Verlag（inpress）

patientwith myoclonusepilepsy associatedwithragged−redfibers．BiochemInt21：789

7）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，Seibel−796，1990．

P，BallingerSWandWallaceDC：Myoclonus
epilepsy and ragged−red fiber disease−241−48）MELASにおける遺伝子異常の発見
埜 中 征 哉＊ ＊
研究協力者

後

藤

雄

一＊

松

岡

太

郎＊

竹

光

正

和＊

図1

母系遺伝と考えられるMELASの一家系．
矢印は，塩基配列を決定した患者を示す．

は じめにミトコンドリア脳筋症は，臨床的に3型に分類されている．すなわち，（訓限瞼下垂と外眼筋運動
制限を主徴とする慢性進行性外眼筋麻痺症候群（CPEO），②ミオクローヌスを特徴とするmyo−
Clonus epilepsy associated with ragged−redfibers（MERRF），（∋卒中様症状を特徴とする
mitochondrial myopathy，enCephalopathy，
lactic acidosis and strokelike episodes（MELAS）である2）．
これらミトコンドリア脳筋症に関する最近の分子生物学的研究，特にミトコンドリアDNA（mtDNA）研究の進歩はめざましい．まず，約65％のCPEO患者生検筋に，大きな欠夫をもつ異常
mtDNAの存在することが明らかにされた3）4）．しかも，臨床症状と欠矢の大きさや部位などと相関関係がないこと4）や，異常mtDNAの発現の研
究5）6）などから，転移RNA（tRNA）の何らかの異常が，病因と関わっていることが示唆された．また，MERRFについては，mtDNA上のLys−
tRNA内の塩基番号8，344のAがGに変異していることが明らかにされ，この疾患でも異常tRNAの病因への関与が示された7）8）．
そこで我々は，残るMELASにおいても，ミトコンドリアtRNA異常が存在する可能性が高いと考えた．その理由は，（》MELASにも母系遺伝と考えられる家系があること，（診三型とも，筋組
織学的所見が類似していること，（卦臨床症候群と酵素学的異常が一対一に対応しないこと，などで＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊国立遺伝学研究所

RRF：raggedrred fiber
COX：CytOChrome c oxidase

ある．
対

象

母系遺伝と考えられるMELAS家系の−患者の生検筋からDNAを分散した（図1）．全tRNAを含む領域をpolymerasechainreaction（PCR）
法を用いて増幅し，サンガ一法で塩基配列を決定
した1）．
結果と考察
アンダーソンの塩基配列9）と比較検討したとこ
ろ，tRNAに関する限り，塩基番号3，243のみが変異していた（図2）．この部位は，tRNA−ロイシン（UUR）のdihydrouridineループの最初の塩基にあたり，ヒトの他のミトコンドリアtRNAや核

−242−

A

G

C

T

A

G

C

MELASでは，32例（80％）でこの変異が存在しTたが，コントロールでは一例も認められなかった．
また，CPEOの例外的な一例以外，他のミトコン
ドリア脳筋症でもこの変異は存在しなかった．変
異の存在したCPEO例は，サザン法で大きな欠矢は見つかっておらず，また，その母と姉もCPEO患者であったが，姉にはMELASを思わせる脳卒′…
三二二、＼害一一MELAS Control
図2中様症状が存在していた10）．以上から，我々は，この塩基番号3，243のA→G変異が，MELASの最も主要な遺伝子異常と結論した．
また，変異を持つ全ての症例で，図4bで示す

PCRを用いたDirect sequencingの結果を示す．このMELAS患者では，Andersonの塩基配列9）3，243番のアデニン（A）がグ
アニン（G）に変わっていた．

tRNAでもアデニンのことが多い．さらに，この部位は，ヒトからウニに至るまで，厳密に保有されていることを考えると，この部位の変異は，tRNAの機能に重大な影響を与えることが予想された1）（図3）．この変異により，GAGCCCが

8

2
3

6

0

9
3

1

■

0

0
5

0

CPEO

A．C．A．C．A．C．Y．T．T．

∋

図3

4

I l
［
肌劇
m郁ATG mG
BOVINE Grr舶G併GG仇6
即SE汀粗筋伊那仇GM Am腿研腿仇G
CⅢC脚 GCm∝釘鎚mG
FROG GCm∝研郁mG
D．Y腫皿A TCTAAT椚防mG
D．阻． TCm腑が鎚仇G
S．U．（PL）GCTA舶椚偶C旭S∬．（SP）ACT舶AGTAGC旭

Ⅳ

MERRF
ControI

T．A．A．

loop stem s摘loop s佃loopstemloop stem st的
［
［
［
［
［ ll
GCC∝1訂AATCGCATAAAACTTAAAACTrTACAGTCAGAGGmCAATTCCTCTrmAACA
GCCCG6TAATrGCATAAAACTrAAACTTrTATATCCAGAGATTCAAATCCTCTCCTTAACAGCCAGGAAATrGCGTAAGACTTAAAACmTTCCCAGAGGTTCAAATCCTCTCCCTAATAGCCAAGrAATrGCGTAAGCATTAAAACmTrCCCAGAGGTTCAAATCCTCTCCCTAATAGCTCGGCAAATGCAAAAGGCrrAAGCCCTTrAT一ccAGAGGTTCAAATCCTCTCCCTAGCTGCCTGGCTAATGCGAAAGACCTAAGCTmTTATCAGGGGTTCAAATCCCCTCGCTAACT
T−一一一TAGTCCAATGGATTrAAGCTCCATAT−AT舶AGTAT−−TTrACTmmAGAA

T−−−−−−TAGTGCAATAGATTrAAGCTCTATAT−ATA舶GTAT一一TTrACTrTrmAGAA
G−−TGGTTAATGCAGAAGGCCTAAGACCTTCCTATCAAAGGTTCAACTCCCTTrTrTAGCT

G−−TGGTTAATGCAGAAGGCCTAAAACTrTCCTATCAAGGGTTCAACTCCmCTrTAGCT

ミトコンドリアtRNALeu（UUR）の塩基配列dihydrouridine（DHU）
ループの最初の塩基は，厳密に保有されている．
A．A．：aminoacid，A．C．：anticodon，V．：Variable，T．：T C，D∴

Drosophila，S．U．：Sea urtin．
−243−

G

0

Sten Stem

MELAS

A

6

DⅢ

A．A． Dm

Total
4

例，多発欠失例2例，無欠失例9例），MERRF患者6例についても検討した（表）．その結果，

表 ミトコンドリア脳筋症3型及びコントロールの塩基番号3，243の塩基を示す．Aはwild−
type，Gはmutantを表す．

0

GGGCCCとなり，新たに制限酵素ApaIの切断部位を生じていた．したがって，変異部位を含む領域をPCR法で増幅し，ApaIで切断することで，容易に変異の有無を検出できる1）（図4a，b）．そこで，我々は他のMELAS患者39例とコントロー
ル50例をはじめ，CPEO患者40例（単一欠失例29

ように，ApaIでは切断されない断片を必ず認めることから，mtDNA全部が変異mtDNAではな
く，正常と異常とが混在している（ヘテロプラス
ミー）ことが明らかである．その割合は，mtDNA

Mut■nt

WHd−typO
AGAQCCCQ
TCTCQGGC

PCRIragmOnt8

Ap81劇908tion
：

享
二二二二三

：

ユ∠二→
204bp

：

unch抑gOd

112bp l耶＝叩

図4a

塩基番号3，243を含む領域をPCRで増幅し，制限酵素Apalで切断する．mutantは2つに切断されるが，wildrtypeは切断されない．
b 電気泳動を行うと，容易に変異の有無を確認できる．マーカーは，Haem−digested ￠×174．

全体のサザンプロテイング法から計測でき，変異DNAの割合は50％から92％であった1）．

発されることが期待される．
文献

おわ り にMELASの主要な遺伝子異常が明らかになっ

1）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation

た．今後は，この遺伝子異常が，具体的にどのような生化学異常を引き起こし，ひいてはどのように臨床症状と結び付くのかを検討しなくてはならない．また，MERRFのtRNA異常とMELASのtRNA異常は，どの点で似ているのか，どの点で違っているのかも，重要な研究テーマになるであWiththeMELASsubgroupofmitochondrial

ろう．研究の発展により，ミトコンドリア脳筋症の病態がさらに明らかにされ 新しい治療法が開inthe tranSfer RNALeu（UUR）gene associatedencephalomyopathies．Nature348：651L653，
1990．

2）DiMauro S，Bonilla E，Zeviani M，et al：
Mitochondrialmyopathies．AnnNeurol17：
521−538，1985．

3）Moraes CT，DiMauro S，ZevianiM，et al：−244−

MitochondrialDNAdeletionsinprogressive

J Hum Genet46：418−427，1990．

externalophthalmoplegiaandKerans−Sayre
Syndrome．N EnglJ Med320：1293−1299，

7）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，et al：
Myoclonic epilepsy and ragged−red fiber

1989．

4）Goto Y，Koga Y，Horai S and NonakaI：

disease（MERRF）ia associatedwith aChronic progressive external ophthalmo・

mitochondrial DNA tRNALys mutation．Cel1

plegia：a COrrelativestudyofmitochondrial

61：931−937，1990．

DNAdeletionsandtheirphenotypicexpres・

8）Yoneda M，Tanno Y，Horai S，et al：A

Sioninmusclebiopsies．J NeuroScilOO：63

commonmitochondrialDNAmutationinthe−69，1990．

t−RNALysofpatientswithmyoclonusepilep−5）Mita S，Schmidt B，Schon EA，et al：
DetectionofdeletedけSy aSSOCiated withraggedrred fibers．Bio−
ChemInt21：789−796，1990．

mitochondrial

genomesin cytochrome−C OXidase−deficient9）AndersonS，BankierAT，BarrellBG，etal：musclefibersofapatientwithKearnS−Sayre

Sequence and organization of the humanSyndrome．ProcNatlAcadSciUSA86：9509

mitochondrialgenome．Nature290：457−465，−9513，1989．

1981．

6）Nakase H，Moraes CT，Rizzuto R，et al：10）西尾健資，春原経彦，埜中征哉他：多毛，両側Transcription and translation of deleted

線条体壊死を伴なう家族性進行性外眼筋麻痺症
候群．臨床神経学28：1266−1273，1988．

mitochondrial GenomesinKearnS−Sayre

Syndrome：implicationsforpathogenesis．Am−245−

49）Strongly succinate dehydrogenase−reaCtive

blood vessels（SSV）の診断的意義
埜 中 征 哉＊
研究協力者

長谷川

ひとみ＊

MELAS（mitochondrial myopathy，enCe−

松

岡

太

郎＊

後

藤

雄

一＊

コンドリア病が疑われているもの）40名，MERRF

phalopathy，lactic acidosis and stroke−like（myoclonicepilepsywithraggedTredfibers）6

episodes）は卒中様症状をくりかえすミトコンド
リア脳筋症である．Ohamaら1）はMELASの患者の剖検例を検索し，中枢神経系内の中・小動脈
平滑筋内のミトコンドリアの異常増加，壊死性の名，CPEO（Chronicprogressiveexternalophtha1−
moplegia）40名，ミトコンドリア病以外の神経筋疾患患者100名を対象とした．生検筋には各種組織
化学的染色を施した．Gomoriトリクローム変法
染色で小動脈を確認し，連続切片でそのSDH活性をみた．同じ検索をさらに300，600JJm離れた連続切片でも検索した．
SSVがはたして異常なミトコンドリアを含む変化を認めた．このことより，卒中をおこす病因
として，血管病変（angiopathy）が主なるものとし，mitochondrial angiopathyの概念を示した．
MELASの患者は低身長，心障害，時に腎障害を認めるなどその病変は全身に及ぶ．ゆえに血管系の異常は中枢神経系内に限らず全身に存在することが考えられる．Sakutaら（1989）2）はMELAS

患者の生検筋の血管壁にOhamaらが認めたものと同じ変化を高頻度に認めている．
血管壁内のミトコンドリアの増加はSDH（suc−

異常血管であるかどうか確認のため，連続凍結切片を作成した．連続切片の1枚臼をSDH染色に，次の1枚をグルタール液に固定し，さらにOs04
で後固定，エボン包埋し，電顕的に検索した4）．
SSVを持つMELASの患者6名，対象5名につき，この連続切片での検討を行った．

cinatedehydrogenase）染色で簡単に証明できる．
なぜならばSDHはミトコンドリア固有の酵素だからである．Hasegawaらは血管壁にミトコンド
リアが蓄積し，SDH活性の上昇したものをSSV（stronglySDH−reaCtivebloodvessels）とし，MELASの診断に重要な所見であるとした3）．

今回このSSVの診断的意義について検討したので報告する．
対象と方法
MELASの患者（（訃発作性反復性の頭痛，嘔吐に代表される卒中様症状，②血中，特に髄液の乳酸値の上昇，③筋生検で筋原性変化を認め，ミト＊国立精神・神経センター神経研究所

結果
MELASの患者生検筋はすべて筋線経の大小不同（タイプ1，2線経とも）があり，いわゆる筋原性変化を示した．典型的なragged−redfibers（RRF）は40例中36例に認められ，4例にはRRF
は存在しなかった．組織化学的にはcytochromec
oxidase（CCO）の部分欠損を14例にみとめた．
生化学的には複合体Ⅰ欠損を16名に，複合体ⅠⅤ欠損を5名に，Ⅰ＋ⅠⅤ欠損を5名に認めた．14名
では生化学的に異常を認めなかった．またRRFを欠く5名では生化学的にも異常を認めなかった．
同一生検筋で3枚のSDH染色切片（30叫mず
つ離れている）をみると，MELAS40名中35生検筋内（87．5％）にSSVが認められた（図1）．SSV

−246−

′釣

■・巨・■・
′ヽヽ
■Y、ヽ

一ノ・

′〟〜ノ

駿

奴謹選

疲弊欒観勤

図1正常対照の生検筋内では小動脈壁にはミトコンドリアは少数しか存在しないのでSDH染色でほとんど染色されない（A）．MELASの生検筋内にはSDHで高活性を示すSSVが高頻度認められる（B−F）．SDH染色，×190．

は血管壁に顆粒状ないし斑点状の高活性物質を入SSVではその平滑筋細胞内に多くのミトコンド

れているので，容易に判断できた．その頻度は多リアを認めた（図2）．ミトコンドリアは大型化

くの例で半数以上の血管に異常を認めた．もっとし，複雑に増殖したクリステを入れていた．ただも多いものでは38本中28本（75％）にSSVを認め

類格子状封入体（paracrystallineinclusion）は存在しなかった．

た．全生検では830本中353本（42．5％）がSSVであった．
SSVはミトコンドリアDNA（mtDNA）8344に考察

点変異があるMERRFの患者6例中5例，CPEO

MELASの患者では中枢神経系だけでなく，全では40例中2例にも認められた．ミトコンドリア

身の血管系の異常が推定される．その異常は平滑病以外の生検筋にはSSVは存在しなかった．

筋内のミトコンドリア異常で，その結果筋線社内

SSVが果して異常ミトコンドリアの集積を反映しているかどうか電顕的に確認したところ，のRRF内にみられるようなミトコンドリアの形
態異常，数の増加が出現すると考えられる．この−247−

図2 光学顕微鏡で認められたSSV（右上挿入部）は，電子顕微鏡でみると大型化したミトコンド
リアが平滑偏銅椚包内（M）に集積していることが分かる．内皮細胞（E）やpericyte（P）には異常を認めない．連続切片．ウラニール，鉛二重染色，×4800．SDH染色，×200（右上挿入写真）．

ような形態異常は電顕的にのみ確認されていたが，SDH染色により簡単にその異常が確認されることが分かった．筋生検の切片が十分に大きく（直径最低5mm以上），1個体から3切片（300／Jm
ずつ敗れて）を検索すれば，MELAS患者ではその異常（SSV）を容易に検出でき，診断的にも極めて有用であることが明らかにされた．
今回検索したMELAS患者40名中4名は，典型的な症状を備えているのにもかかわらず，その生検筋内にRRFも，生化学的異常もなく，ミトコン
ドリア病であるという決定打を欠いていた．さらにこの4名ではMELASにかなり特異的とされているmtDNAの点変異（mtDNA3243でのA→

G変異5））は認められなかった．しかし明らかなSSVを認め，さらに電顕的にも異常ミトコンドリ
アの集積を血管平滑筋細胞内に確認したため，最終診断にいたった．
血管平滑筋が侵されるため，血管の収縮力は低下し，諸臓器の末端組織細胞への血流は減少する．
筋線推内ミトコンドリア異常と共に，それは筋力低下，易疲労性をきたす大きな要因と考えられる．
中枢神経系細胞には血流が減少していても，通常は大した症状はきたさない．過剰な運動，ストレス，感染などで代償がうまくいかなくなると，局所的な虚血状態となり，乳酸値の上昇をきたし，それがさらに血管の機能不全をきたす．この悪循−248−

環がCTでみる局所的低吸収城，臨床的な卒中様症状となって出現するのだろう．ただ血管の内腔は閉塞していないので安静，輸液などの治療で回復する．このようにして卒中様症状を繰り返すの文

献1）Ohama E，Ohara S，Tanaka K，et al：
MitochondrialanglOpathyincerebralblood
VeSSelsofmitochondrialencephalomyopathy．

がMELASの主な病態であると考えられる．
MELASの全ての症状が血管異常で説明される

ActaNeuropathol（Berl）74：226−233，1987．
2）SakutaRandNonakaI：Vascularinv。1ve＿

ものでは当然ない．個々の組織細胞のミトコンド
リアも侵されている．ただ，血管がより選択的に侵されているがために，卒中様症状という特異な臨床像を示すのであろう．

mentinmitochondrialmyopathy．AnnNeuro1
25：594−601，1989．

3）Hasegawa H，MatsuokaT，Goto Y，etal：
Strong】y succinate dehydrogenase−reaCtive

bloodvesselsinmuscles．frompatientswith
まとめ

mitochondrial myopathy，enCephalopathy，

MELASでは全身の小動脈系の異常が推定されている．卒中様症状は中枢神経系の血管異常によるものと考えられている．この血管の異常は，生検筋の凍結切片をSDH染色するという簡単な方法で確認できる（NADH染色では代用できない！）．この血管では平滑筋細胞内にミトコンドリ

1acticacidosisandstroke−1ikeepisodesAnn
Neurol（inpress）．
4）Nonakal，KogaY，OhtakiE，etal：Tissue
SpeCificityincytochromecoxidasedeficient
myopathy．JNeuroISci92：193−203，1989．
5）GotoY，NonakaIandHoraiS：Amutation

アが蓄積するためSDHで高活性となる（strong−
lySDH−reaCtivebloodvessels：SSV）．RRFを筋生検内に認めない例でもSSVの存在がMELASの診断を確実にすることもある．
MELASの病因，病態を考えるうえで，また補助診断としてもSSVの確認は重要である．

−249−

inthe transfer RNALeu（UUR）gene associatedJwith MELAS subgroup of

mitochondrial

enctphalomyopathies．Nature348：651−653，
1990．

50）MELASにおけるミ．トコンドリアDNAの点変異によるタンパク質，RNA合成の変化

太 田 成 男＊研究協力者

小 林 葉 子＊＊ 桃 井 真里子＊＊ 冨 永

は じめに
最近の飛躍的な進歩によってミトコンドリア脳筋症における変異ミト

コンドリアDNA（mtDNA）が次々に同定された．慢性進行性外眼筋麻痺は，ミトコンドリアDNAの欠矢と密掛こ
関連していること1㌧

MERRF患者には，tRNA−

Lysの点変異が共通に認められる2）ことが最近明らかにされた．MELAS（mitochondrial myo−pathy，enCephalopathy，lactic acidosis andstrokeTlikeepisodes）は脳卒中様発作を特徴としたミトコンドリア脳筋症の一病型であり，重症度も高く患者数も多い．私たちは，MELASの同一患者からミトコンドリア呼吸鎖欠損筋芽細胞株（以下，変異株）と正常珠を分触し，そのmtDNAの塩基配列を比較した結果，tRNA−Leu遺伝子の点変異がミトコンドリアの呼吸鎖の異常を引き起こすことが明らかとなった．さらに変異培養細胞と正常細胞を用いて，その点変異がタンパク質合
成だけでなく，RNA合成の調節能を欠如させていることを分子レベルで明らかにしたので報告す
る．

実験方法
呼吸鎖欠損株の分離
MELAS患者骨格筋より分散した筋芽細胞に，複製開始点欠如SV40DNAを導入して形質転換し，細胞をクローン化した3）．シトクロム酸化酵素＊自治医科大学生化学＊＊自治医科大学小児科

薫＊

活性染色の有無によって，同酵素の欠損株と正常珠を選択し，さらにグルコース欠損培地での増殖の有無によって変異株と正常株を選択した．
DNA塩基配列決定法
MELASの同一患者から分散した変異珠と正常筋芽培養細胞株から全DNAを精製した．ミトコンドリアDNA断片をPCR法で増幅し，アガロース電気泳動にて精製後，非対称PCR法で一本鎖DNAを合成し，塩基配列決定の鋳型とした．
塩基配列の読み取りは，蛍光標識terminatorを用いてAppliedBiosystemInc．（ABI）自動DNA
シークエンサーでおこなった．塩基配列は，シト
クロム酸化酵素欠損株と正常株のミトコンドリア
DNAの塩基配列を同時に電気泳動し，自動シークエンサーで読み取ることができない塩基についても，二つのmtDNA塩基の違いは判断できるよ
うにした．
タンパク質合成
ミトコンドリアのタンパク質合成は，ロイシン
欠損培地中で，細胞質タンパク質合成阻害剤エメ
テン0．2mg／ml存在下，14−Cロイシンを取り込ませてミトコンドリアタンパク質合成の指標とした．さらに，ミトコンドリアを分画しSDS電気泳動によって各サブユニットを分離した．
RNA合成
全RNA画分は，イソチオシアネート中で分画
しNorthernblotに用いた．オリゴヌクレオチド
をアイソトープラベルし，各々のプローブとして
用いた．

−250−

RNA合成の制御
変異株と正常株を2％酸素，5％二酸化炭素下で培養し，指示された時間培養LRNAを抽出しNothernblotによってRNAの変動を調べた．ミトコンドリアRNAに対応するオリゴヌクレオチ
ドをプローブに用いた．核支配遺伝子としてアクチンをプローブとした．
結果と考察（1）MELASの変異遺伝子の同定4）
MELASの同一患者から分離した呼吸鎖変異
珠と正常株のmtDNAの塩基配列を比較するとわずかに一塩基のみが明瞭に置換していた．この塩基は塩基番号3243のAのGへの塩基置換であった（図1）．このひとつの塩基置換によってミトコ
ンドリア呼吸鎖の機能が損ねられることが明らかとなった．
さらに，MELAS患者10人中9人に変異A
u冊ALeu川URI
九

mtDNAは認められたので，この点変異はMELASに特有の変異であると結論した．
（2）ミトコンドリア内タンパク質合成
この変異塩基は，tRNA−Leu（UUR）の14番の塩基であり，種を越えて保有されていたのでtRNAの機能を低下させると想像された．そこ
で，細胞質阻害剤エメナン存在下でタンパク質を合成させ，タンパク質に取り込まれたアイソトー
プ量を測定することによって，ミトコンドリア内のタンパク質合成速度を測定した．すると変異株と正常株では有意の差は認められなかった（図2）．オートラジオガラフィーの結果は，シトクロ
ム酸化酵素サブユニット2が，40％に低下し，NADH脱水素酵素サブユニット4のバンドが消失していた．この原因は現在詳細に検討中であるが，少なくとも，変異tRNAがタンパク質合成全体を低下させるのではなく，特定のタンパク質の合成を阻害していることが明らかとなった．
（3）変異mtDNAがRNA合成に与える影響
ミトコンドリア内では，H一鎖のリポソームRNA（rRNA）とmRNAの量比は環境により変一3■

5■−G：：C

動する．それは転写終結因子がrRNAの3，下流に

T：：八
で：：八
八：：■r

結合してRNA合成を停止させることによって行

入：：T
G：：C

われる．その結合部位はすでに同定されており，

九

■r

九

＝

⁚

G

c

C

G

c ⁚ ． G

●r

C

C

lJI

盲U M三三

∧：；■r

− ゝ

入：：で

6

C

A

T

八

G A

A

A

︵邑︒もlエ

⁚．C

⁚．G

：C

⁚T

ccGG

。C彗

で ：∧

Aこ：■r

h：：−r
八

丁

入

B ThemltocIlOndrialtemimH。。f。。［。r．bi。di。gSiLeG（at二★at】，213
5㌧ACCCA入CA入C九ccGでTTGl
3㌧1■GGGT・rCTTCTCCCA

16s

rRNA

▲ ■

UOコ勺︼Od︼OUuH

入：：T
C

3．243）
1

2■八九CATGcc入GACCCCCGTAATCG
Tl

CAAmtCTACCGTCTCGGGCC八TT

■e

C

O

u

r

S

e

l

hI

図2 呼吸鎖変異珠と正常株のタンパク質合成．
エメテン存在下での〔14−C〕ロイシンの取り込みをミトコンドリア内でのタンパク質合成の指標とした．エメテンとクロラン7ェニコール存在下での取り込みをバックグ
ラウンドとして，差し引いた値を示した．
A，Bはそれぞれ正常株と変異株を示す．
▲●はそれぞれ全細胞とミトコンドリアでのタンパク合成を示す．

tRNALeu

図1MELASにおけるmtDNAの点変異．
tRNArLeu（UUR）の二次構造と転写終結
因子結合部を示した．RNAではTの代わりにU．MELAS患者はG（3，243）のmtDNAを持つ．
−251−

16S

NDI

12

12

ND2COX暮COXIIATP6

12

12

12

） −

料錦嫡 鞠嘘
●−

−■

−＊

■＊l■

輪静鞠蟻

攣

図3

12

徽鹸 鞠靡

Northem blotting
変異株と正常株から全RNAを抽出し，Northern blotによりRNA量を比較した．
変異株と正常株での差は認められか−．1は正常株，2は変異株のRNAを示す．

normatmutant12345678

12345678

雷雷攣讐尊卑●●
16S
rRNA−

COXll
図4

酸素分圧変動後のRNA量の変動
酸素分圧2％下で細胞を培養し，各々の時間にRNAを分艶し，Northernblotにより，RNA量を測定した．1−8レーンは0．6，12，24，48，72，96，120時間酸素分圧2％で処理した細胞のRNAを示す．

MELASのtRNA−Leu（UUR）遺伝子の変異部位に対応する5）．すなわち，終結因子がtRNA−Leu（UUR）遺伝子部に結合するとrRNAの合成量は相対的に多く なる．そこで，rRNAとH一鎖
mRNAの比をNorthern blot法により比較すると変異株と正常殊では，有意の差は認められず，
少なくとも通常の培養条件下では，終結因子は正常に作用していると考えられた（図3）．
次に，環境を変化させた時のRNA合成の調節能の変化を調べる目的で，酸素分圧を2％に低下−252−

Transcription and termination

成塁を制御できなくなったと考えると合理的であ巨≡司
COⅣTRO工．
16SRNA ND1る．
MELAS患者に兄いだされた点変異によるミ

HUTANで16SRNA NDl

トコンドリア異常を引き起こす分子機構を明らかにすることで，発症の分子機構の解明ならびに治療法の確立が期待される．
F

文†
terminator

献1）Moraes CT，et al：Mitochondrial DNA／：ldeletioninprogressiveextemalophthalmo−

terminatorplegiaandKearns−SayresyndromeN Engl

図5

酸素分圧の変動によるRNA合成制御機構のモデル
2％酸素分圧下では終結因子が結合できな
いため転写が終結せず，相対的にmRNA量（NDI）の変化が少ない．rRNA（16sRNA）の量はmRNAに比べ多い．

J Med320：1293−1299，1988．
2）YonedaM，etal：Acommonmitochondrial
DNAmutationinthetRNA−Lysofpatientswith myoclonus epilepsy associatedwithragged−redfibersBiochemInt21：789−796，
1990．

させ，その時のRNA合成の変動を調べた．rRNA
量は，酸素濃度を低くすると変異株と正常株で同しように低下し，何らかの作用によって転写開始の3）ShimoizumiH，etal：Cytochromrcoxidase

頻度が低下することが示唆された（図4，5）．核支配遺伝子であるアクチンのmRNAは，ほとんど変動しなかったので，ミトコンドリア特有の制御機構と考えられる．ところが，mRNA（図の例はシトクロム酸化酵素サブユニット2のmRNA）

4）KabayashiY，etal：Apointmutationintheは，正常株では時間をおって低下したのに比べ，変異株では，ほとんど変動しなかった．これは，変異株では，環境変化による制御が正常に機能していないことを示唆する．分子機構については，
さらに検討中であるが，mtDNA上の変異によって転写終結因子が結合できなくなりmRNAの合−deficientmyogeniccelllineinmitochondrial
myopathy．Ann Neuro125：615−621，1989．

mitochondrial tRNA−Leu（UUR）genein
MELAS（mitochondrial myopathy，・enCe−
phalopathy，lactic acidosis and stroke−like
episodes）Biochem Biophys Res Commun，
173：816−822，1990．

5）KruseB，etal：Terminationoftranscription
in humanmitochondrial：identification and−253−

purificationofaDNAbindingproteinfactor
that promotes termination．Ce1158：391−
397，1989．

51）MELAS症候群の臨床的検討とミトコンドリアDNAの解析
岡 田 仲太郎＊
研究協力者

乾
田

幸 治＊ 福 鳥 久 雄＊ 塚 本 浩 子＊
中 順 子＊ 谷 池 雅 子＊ 緑 川 光 雄＊

は じめにMELAS（mitochondrial myopathy，enCe−
phalopathy，lactic acidosis and strokelikee−

pisode）は小児期に比較的多い疾患であり，その原因，治療法も確立されていない．我々は3家系4症例（6歳から22歳）を経験し，その臨床症状を比較検討するとともに，筋生検を行い生化学的，
組織化学的に検討した．また示唆されているミト
コンドリアDNAの異常がないかを調べるため，
生検筋よりDNAを抽出し，KSSでは比較的欠矢が認められていない領域（NDI，NDII，COI，COII，COIII）を含むプライマーを作成し，polymerasechain reaction（PCR）法にて増幅し，その大きさを検討するとともに，一部サブク
ローニングし，シーケネースを用い塩基配列を決定し，Andersonの報告と比較検討し，興味ある知見を得たので報告する．
症例

症例1：HK 21歳 男
7歳時学校健診にて心雑音指摘，WPW症候群と診断．低身長のため10歳時入院，GH治療開始するも効果無く18歳で中止．13歳，14歳時卒中様発作あり，以後抗痙攣剤の投与を受ける．15歳より
蛋白尿，17歳時，ネフローゼ症候群となり，腎生検を受け，巣状糸球体硬化症の診断．この頃，僧帽弁逆流による心不全が進行，また難聴に気づかれる．20歳時，心不全の治療のため僧帽弁置換術，
三尖弁縫縮術を受ける．
＊大阪大学医学部小児科

家族歴は特記すべき事なし．身体所見としては，
低身長（−4SD），心雑音，2次性徴の発育不良あり．感音性雉聴，中等皮の知能障害．その他脳神経の異常は認めない．
血中，髄液中の乳酸，ピルビン酸の高値，L／P比の上昇を認める．CT，MRIにて後頭部優位の低吸収域と脳萎縮を認める．
症例2：KKl1歳 女
6歳時，頭痛，嘔吐に続き，痙攣，一過性の左半身麻痺．以後抗痙攣剤の投与をうけるも年2−3回の痙攣発作があった．9歳時卒中様発作あり
以後言語障害出現．家族歴では，姉（症例3）がミトコンドリア脳筋症．母親も低身長，痩せ，知能障害，精神障害がある．身体所見では，低身長，
眼瞼下垂，右外斜視，筋弱九 中等皮の知能障害．
その他異常は認めない．
血中，髄液中の乳酸，ピルビン酸の高値，L／P比の上昇を認める．心電図にてPQの短縮を認める．
CT，MRIにて両側後頭葉，側頭葉に低吸収域と脳萎縮を認める．
症例3：KKの姉 22歳 女
6歳頃より低身長，MRに気づかれる．18歳より糖尿病，22歳よりインシュリン療法開始，いままでに卒中様発作は認めない．身体所見では，低身長，知能障害，感普性難聴，筋弱九 その他異常なし．
血中，髄液中の乳酸，ピルビン酸の高値，L／P比の上昇を認める．CT，MRIにて脳の著明な萎縮を認めるが，低吸収域は認めない．
症例4：TT 6歳 男
2歳過ぎから歩行が遅く，ころびやすい．3歳−254−

表l Kearns−Sayre−Shy（KSS）症候群，福原病（MERRF），脳卒中発作を伴うミトコンドリア
脳筋症（MELAS）の鑑別診断
KSS MERRF MELAS T（4Y）

K（11Y）H（21Y）±＋

一 ＋ 一 ＋ ＋ − 一 一 十 ＋ ＋ ？ ±一 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ？ ＋ ＋ ＋ 一 ＋ 一

中枢神経系の海綿状変性

K（22Y）

一 ＋ ＋ 一 一 十 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋﹇山 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

一十＋＋＋

十・﹇山王十・・「唱dィd fikl■S⁚＝・﹇∪工＝＋

外眼筋麻痺
網旗色莱変性
心伝導障害
CSF蛋白＞100mg／出
ミオクローヌス
小脳失調
筋力低下
痙
攣
知能低下
低身長
周期性唱吐
皮質盲
片麻痔，半側音
感昔性放聴
高乳酸血症
家族歴

KSS＝Kea・nS−SayresyTdoT．e．MERRF＝nyKIcrtJSePiTepsywithraggedィedfiね・S，MELAS＝nitocrdiaJ

my叩水〜．叫嘲．kticackb由．訂d醜rdqトIike印i如es，CSF＝CFdro印irdfldd．Dlil重な鑑別息より易疲労感，3歳11カ月時発熟し，以後歩行困雉となる．5歳時嘔吐後痙攣，抗痙攣剤の投与を開始，3歳6カ月以降嘔吐，痙攣を伴う四肢の麻痺出現し，6歳時，痙攣が頻回におこり以後雇たきりとなる．家族歴では，母が28歳時卒中様発作あり，以後3回同様な発作あり，現在知能障害を残す．身体所見では，軽度知能障害以外異常認め
ない．
血中，髄液中の乳酸，ピルビン酸の高値，L／P比の上昇を認める．CT，MRIにて前頭葉，側頭葉，
後頭葉，淡蒼球に多発性の低吸収城を認める．
表1に症例のまとめを示す．症例3以外，
MELASの診断によく一致する．
【組織化学的検討】
4症例に筋生検を行ない，Gomori trichrome
染色（GT），SDH染色，CCO染色をおこない，比較検討した．GTでは，Raggedredfiber（RRF）
は，症例1，2，3，4でそれぞれ5％以下，約20％，0％，5％以下であった．SDH染色でのstrongly positive vessels（SSV）は，症例1，
2，3，4で，それぞれ陽性陰性血管の混在，陰性が主，陽性が主，陽性陰性の混在であり，CCO
染色では特に異常を認めなかった．以上をまとめると，RRFの程度は臨床的重症度とは相関せず，
SSVの有無が必ずしもMELASの病型と一致しない事が判明した．
生化学的検討
筋生検材料における電子伝達系酵素活性値を表2に示す．いずれの症例においても酵素活性の異常は認めなかった．
分子生物学的検討
筋よりDNAを抽出し，ミトコンドリアDNAの3130−3423（tRNALeu），3305−4262（NDI），4116−5283（tRNAlle，Gln，Met），4469−
5511（NDII），5904−7444（COI），7586−
8294（COII），9207−9990（COIII）領域のプライマーを作成し，PCR法にて増幅し，その大きさを
アガロース電気泳動法にて検討した．いずれの症例においても増幅され その大きさは，異常なかった．またミトコンドリアDNAの増幅は，核の

−255−

表2

Enzyme activitiesin muscle homogenates
T

Iく

H

Contr01（mean±SD）

NADH−CytOChrome c reductase（complex

tissue，U二m01e

ofsubstrate

DNAの増幅と異なり，ミトコンドI）アDNAのコピー数が多いためか，DNA量が1ngでも増幅量に差がない事が判明した．
電気泳動法では大きな欠矢が認められなかったため，症例1，2のEcoRl切断部位を含む4116−
5283のPCR増幅産物をM13ファージにサブクロ
ーニングし，シクエネース（Ver二2）を用い塩基配列を決定した．症例1では，14のクローンを検索
し，4クローンにおいて図1に示す様に，NDI領域に多塩基の塩基置換と，3カ所の欠矢が認められ，4165，4166の2塩基の欠失によりframeshiftが生じその下流にStOp COdonがくる事が判明し
4121
エ

R T A Y IIGAATTCGAACAGCATACCCC⇒

NDI PRエHEIt

4141
R F It Y D q L M h L L V K N F L P L T L
CGATTCCGCTACGACCAACTCATACACCTCCTATGA入AAAACTTCCTACCACTCACCCT▲
AT
H

T
G

A

T

F

S

■lT
P

M

2．2

1．4±0．6

1．8

1．0

1．5

0．9±0．3

2．4

1．5

1．9

1．3±0．5

ェⅠ＋工Ⅰ工）Cytochrome c oxidase（COmplex 工Ⅴ）
（U／g

2．2

工＋ⅠⅠⅠ）

Succinate−CytOChrome c reductase（COmplex

2．3

K

C

T

T

T

G

−

reduced or oxidized／min at

た．症例2では，6クローン中3クローンに1カ所塩基置換を認めたが，アミノ酸置換の伴わないものであった．
MELASにtRNA（Leu）の変異があるとの情報を得1），この領域を含む3130−3423のPCRをおこなった．3243にA→G変異があるため，この部
位での変異があると制限酵素Apalの新しい切断部位が生じ，PCR産物294bpが112bpと182bpに切断される事が判明した（図2）．症例1−4の筋由来DNAを用い，PCRをおこない，Apalにて切断後電気泳動をおこなった（図3）．症例1（H），症例2（K），症例3（KS），ではこの変異が認められたが，切断されないバンドも存在する
ためこの変異に関Lheteroplasmyである事が判明した．典型的なMELASと考えられた症例4（T）ではこの変異は存在しなかった．またCCO欠損症（1），Leigh脳症（3，4）でもこの変異は存在しなかった．しかし，卒中様発作のないミトコン
ドリア脳筋症（2）においてもこの変異が存在し
た．
3230

3130
4201
A

L

AGG▲一一
L

M

■V

Y

V

S

II

P

I

T

I

S

S

I

P

P

O

GCI

AIJ

A

G

T

CT

T

T▲

C

tRNA（LOU（UUAH
3240

GITAAGAT（3GCAG

3鋤

GCCCG（〕T●●●ACAT

GCAでTACTTATATGATATGTCTCCATACCCATTAChATCTCCAGCATTCCCCCTCAAACC
L

300C）

A

「誌

2糾叫
■

GG（3ccC▲

佃4261●
TAAGAAAT▲TCTCTGAT▲▲▲▲GAGTT▲CTTTG▲TAG▲GT▲▲▲TAAT▲GGA∝mA＾ACCC
AT

A

A

G

C

AG

T

卜
図2

図1Mt DNA sequence

11丑p

隼1叫

」

で

5−1
−256−

tRNA（Leu）領域の塩基配列とMELASにおける点突然変異（3243）

いる2）．Leber病では，NDIVの点突然変異が証明されていたが，最近その異常の無い症例が報告さ
れ変異の多様性が示唆されている3）．
MELASと臨床的につながりのあるMERRF
においては，tRNA（Lys）領域の点突然変異が証明され4），本疾患においてもtRNA領域の変異が示唆されていた．今回MELASにおいてもtRNA（Leu）の変異が判明した事は，ミトコンドリア機
能異常がtRNA異常と重要な関連を持っているのではないかと考えられる．またMERRFと同様，異常DNAがheteroplasmyの状態で存在するため，その程度が各組織内でどのように分布するのか，今後サザンプロット法にて検索する必要
図3

PCR産物のアガロース電気泳動
M：マーカー，S：コントロール，H：症例がある．この結果は，卒中様発作のない症例にも1，K：症例2，KS：症例3，T：症例

存在しており，MELASがこの変異のみで起こら

4，1：CCO欠損症，2二ないことは明白であり，またMELASの病態がこミトコンドリア脳筋症，3，4：Leigh脳症の変異のみで説明できるのか，今後ミトコンドリ
アDNAの他の領域も含め異常の検索が必要と考
えられる．

考

察

ミトコンドリアDNAの異常が証明されている疾患は，慢性進行性外眼筋麻痺（chronicprogres−
Siveexternalophthalmoplegia，CPEO），Kearns−Sayre−Shy（KSS）症候群，myOClonusepilepsy
associatedwith raggedLred fibers（MERRF），

文1）NonakaI，etal：perSOnalcommunucation．
2）MitaS，etal：ProcNatlAcadSciUSA86：
9509，1989．

3）HowellN，etal：AmJHumGenet47：629，

Leber遺伝性視神経萎縮症がある．前記2者では，ミトコンドリアDNAの欠夫が証明され，異常ミ
トコンドリアの量と症状が相関すると考えられて

献

1990．

4）SchffnerJM，et al：Cel161−：931，1990．

−257−52）MELAS母娘例におけるミトコンドリアDNAの解析
西 澤 正 豊＊
研究協力者

大 塚 美恵子＊ 吉 田 充 男＊

方ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア

法

DNA（mtDNA）の異常については，KearnsT

生検筋より骨法によりDNAを抽出し，Sayre症候群と進行性外眼筋マヒの一部の症例でdeletionが認められ，またMERRFにおいては

mtDNAのSubcloningを行なうことなく，directtRNALysのT￠ループにpointmutationが存在することが明らかになっている．一方，MELAS

sequencingにより，CCO，NDおよびtRNA領域の塩基配列を決定した．まず，Andersonら1）の報告
したmtDNAの塩基配列（Cambridgesequence）

においては異常mtがheteroplasmyを示し，まに基づき，0．5〜1．5kbのmtDNAフラグメント

た大きなdeletionはないことが確認されてきたが生成するようにprimer pairを選び，生検筋が，明らかに母系遺伝と考えられる家族例が少な

DNAをtemplateとしてpolymerase chain

いため，mtDNAに異常があるか否か明確でなか

reaction（PCR）を行なった．合成されたmtDNAった．最近我々はMELASの母娘例を経験したの断片をアガロースゲル電気泳動により分馳し，つで，その生検筋mtDNAの塩基配列を解析するこいでこれをtemplateとして非対称PCRを行なとにより，MELASにおけるmtDNA異常の有無を検討した．

pmoleをtemplateとしてさらに第三のprimer

い，一本鎖DNAを得た．精製した一本鎖DNAlをアニールさせた後，Taq polymeraseにより症

fluorescentdyeterminatorを取りこませ，ABI

例

症例1：24歳女性．13歳より難治性のけいれん発作あり．19歳の時，意識障害をきたし，高乳酸血症と頭部CTにて多発性の低吸収城を認められ社製の自動sequencerにかけて塩基配列を決定た．生検筋にてragged−redfiber（RRF）が確認され，MELASと診断された．
症例2：51歳女性．症例1の母．36歳より糖尿病にて加療．41歳より盛者性難聴あり．46歳時，娘がMELASと診断された際，高乳酸血症を認められた．50歳頃から軽度の痴呆があり，頭部CT上低吸収城が出現した．生検筋にて約5％のRRFの位置を変えて同様の方法により確認した．

を認めた．電子伝達系の酵素活性ではcomplex
I，ⅠⅠ，ⅠⅠⅠのいずれもやや低値であったが，COm−
plexIVの活性が対照の14％と特に著しく低下していた．
＊自治医科大学神経内科

した．骨にH鎖，L鎖双方の塩基配列を決め，変異が兄いだされた場合には一回目のPCRprimer

結果

上記の方法により決定された患者生検筋
mtDNAの塩基配列をCambridgesequenceと比較すると，多数の変異が認められた．変異がhomoplasmyである場合にはsequencerの記録
上のシグナルは単一のピークを示したが，hetero−plasmyの場合にはシグナルはwild typeとmutanttypeのピークの重なりとして示された・
coding領域には図1に示すごとく，アミノ酸の変異を伴わない，主にthirdletterのhomoplas−
micな塩基置換が認められた．また，図2に示すご

−258−

◆■

T

G
T
C
C

▲⁚▲n
C C

▲

考
案
mtDNAの塩基配列のなかで，種を越えて保有されている塩基が患者においてのみ変異している

ハ

T

C

URF 3

い塩基が数個残ったが，その他のtRNAには変異は認められなかった．

C
G

lll
▲ ‖

H〉400

C

CCO

G

T

cc011195TS

Ccc0111

9540

G

T

9377

T
■八
C C T

G

6

G

16L

T
C

人TPas0C

9165のWildtype（A）とmutanttype（G）とのピーク比は約4：6で，mutanttypeがやや優位を占めていた．GluとProのtRNAの一部に決定できな

∧

G

URF

■

G

cc011

8560

plasmiCな変異が認められた．sequencer記録上

G
T

cc01

7600

n
■−

7028

●■

cc01

a
P

6731

Calbridge
A

position

・A
C
C
C
T
▲⁚・A
G
T C C C T G T C C

nt

図l Synonymousbasesubstitutionsincoding
reglOnS

nt

po暮日日on
Ca■b

codon

6451cc01
9559

ccO

8031cc011

a■in01tid

ti●nt Cltb plti●nt boYin●

I

G

L

R

L

tll

G

C

R

P

P

T／G

l

t／S

▲／G

y

u／Y

9448

cc0111

▲／G

†

9800

ccO lllT／▲90671TP■暮0

図2

6

■OVS●

pointmutationはこのようにして推定され，この中で数例の患者に共通に同一の変異があれば，その変異を病的変異と同定している．このような観▼／C点からはTrp，Ala，Leu（UUR）のtRNAに認められたpoint mutation，およびcoding領域のいくつかの変異はいずれもMELASにおける

F F／L

Nucleotide substitutions resulting inamino acid changesin coding reglOnS

nt po＄ition tR…

1654
S570
5601
3243

mtDNA変異の候補となりうるものである．Trp，AlaのtRNA変異は記録上mutant typeのみが認められることから，より病的意義をもった変異である可能性が想定された．この点を明らかにすCa■b pationt bovino toH●Val
Trp
▲la T≠

場合にはその変異は単なるpolymOrphismでなく，疾患に関連したものである可能性がある．実際，Leber病2）やMERRF3）におけるmtDNAの

T￠
T≠
G

T
T
▲

Lou DHU A G／1

C
A

G
T

T
T

るためには多数のMELASおよび正常対照においてこれらの変異が認められるか否かの検討が必

G G
1

人

（U〕R）

図3 NucleotidesubstitutionsintRNAregions
とく，6451と9559の変異はアミノ酸置換を伴うもので，前者は他種問では保有された塩基の変異であり，後者は対照とした配列のみが異なっている
変異であった．さらに，heteroplasmiCな変異がい
くつか兄いだされ，これらはいずれも他種間で保有されている部位の変異であった．
tRNA領域では図3に示すごとく，Val（1654），
Trp（5570），Ala（5601）のtRNAのいずれもT￠
loopにhomoplasmiCな変異が認められた．Valの変異は他種問でも変異のみられる部位であったが，TrpとAlaの変異は他種間では保有された部位にあり，患者においてのみ認められる変異であった．また，Leu（UUR）のDHUloopにはhetero−

要条件として不可欠であった．
今年度の本研究班合議において，後藤らはMELAS40例中8割の症例にLeu（UUR）のA→
G変異（3243）を認め，他のtRNA領域には
MELASに共通して認められる変異がなかった
ことから，これをMELASにおけるmtDNA変異であると結論した．田中らも2例のMELAS患者の全mtDNA塩基配列を決定し，共通に認められたのは同じくLeu（UUR）の3243番目のA→G変異のみであったと報告した．かれらの1例にはtRNAAlaにわれわれの症例と同一の変異が認d）られている．一方，小林らはMELAS患者より筋細胞株を樹立し，これよりCCO活性陽性と陰性の株を分離した．ついで両者のmtDNAの全塩基配列を決定し，唯一tRNALeu（UUR）の3243位にA→
G変異を認めた．さらに，7例のMELASに共通−259−

にこの変異を認め，剖検例の各臓器および家系例の白血球における変異mtDNAの分布まで明らかにした．
以上よ り，大部分のMELAS症例には
tRNALeu（UUR）にA一→G変異が存在することが明らかにされた．MELASにおいてはmtDNAに変SequenCerの使用に御援助下さった同香川，浜本，太田各先生に深謝致します．

異がおきやすいという可能性は残されているが，われわれの症例に認められた他の変異はpolymorphismである可能性が高い．今後はtRNAの変異がミトコンドリアの機能にいかなる影響を与えるか，さらに細胞レベル，組織レベ2）WallaceDC，etal：Science242：1427−1430，

謝辞：PCRのためのprimerを提供して下さった自治医大生化学香JlL 太田両先生，自動文献1）Anderson S，etal：Nature290：457−465，
1981．

1988．

3）SchoffnerJM，et al：Cel161：931−937，

ル，個体レベルではどうか，遺伝様式はどうか，
加齢変化はないか，などの基礎的研究がMELASの病態を解明する上で不可欠である．

−260−

1990．

53）MELASの遺伝子変異：骨格筋ミトコンドリアにおける
点変異
＊

子
里
真

井

桃

ドッ

範成

＊

黒 田

小太

＊

目的で得た生検筋より初代培養系を作成し，培養
筋細胞に複製起始部欠損SV40・DNAを導入し形
質転換細胞をdilution method法にてクローン化＊

方法
1．細胞のクローン化：MELAS患者より診断＊

列解析を同時に行うことにより，その両者の差が，MELASにおける疾患関連遺伝子変異であるという方法論を取った．これにより，MELASにおける遺伝子変異を確定し，変異遺伝子が母系遺伝を示すことも明らかにした．

＊

し，個体差があり，患者と正常人のmtDNAの比較から疾患関連遺伝子変異を確定するのは困難で一ある．われわれは，MELAS病態解析を目的として，MELAS患者骨格筋の初代培養系を癌遺伝子導入によりクローン化し，同一個体よりの正常細胞と電子伝達系酵素欠損細胞のmtDNA塩基配＊

episodes）の遺伝子変異を解明する目的で，
MELAS骨格筋よりクローン化した筋細胞のミ
トコンドリアDNAの塩基配列を解析した．ミトコンドリアDNA（mtDNA）は多型性を特徴と

光義次

＊

＊

MELAS（mitochondrial myopathy，enCe−
phalopathy，lactic acidosis and strokelike

正健

＊

橋沢瓶

市柳二

＊

子夫雄

葉秀靖

林泉川

小下杏

研究協力者

酵素活性正常クローンと酵素活性欠損クローンを確立した2）．各々のクローンの細胞内ミトコンド
リアのCOX活性は，電屍剤こて確認した．
2．COX活性正常クローン（TNK205），活性欠損クローン（TNK203）から仝DNAを分推し，直接塩基配列決走法にて塩基配列を決定した．Se−
quencingstrategyを図1に示す．PCR増幅DNA
フラグメントを鋳型とし，蛍光ラベルした
dideoxy nucleotide terminatorを用い，ABI社のmode1373Aで解析し，97％の塩基配列を決定
した．
結

果

1．TNK203内のミトコンドリアは電顕上は全てCOX活性陰性であり，TNK205のミトコンド
リアはCOX陽性であった．従って，この2クローンは，同一個体の同一筋組織から得た筋細胞であるため，COX活性という表現型と，この表現型と直接関連する遺伝子のみを異にするクローンであることを確認した．
2．TNK203もmtDNAの塩基配列は，Ander−
sonらの報告したmtDNA塩基配列と30箇所異した1）．クローン化細胞はSeli訂Ilanらの方法でチ
トクロームC酸化酵素（COX）の活性染色をし，なっていたが，このうち，29箇所はTNK205でも同様の塩基配列の異なりであり，TNK203とTNK205の差は，1箇所，TNK203における塩基＊自治医科大学小児科＊＊自治医科大学第一生化学＊＊＊国立小児病院神経科番号3243のtRNA−Leu（UUR）遺伝子上のA→G
置換であった（表）．従って，この塩基置換がCOX
活性欠損という表現型，すなわち，MELASの病
ー261−

Sequencing Strategy
570
COズ2月rP6

75仲bpJ〃DJ

L山，6歳晶ズ′箭耶而訂。5芹缶
F

V

L

rM

W

D

K

GR

HSL

E

T

◆ト予．十㌧、．㌔ヽ←㌧ヽニ＋・．ヽゞ十二十十了㌧㌧■ヽ．写・了・←二㌧ユ声了阜←㌧・了ヽ了ゞ
図1クローン化細胞のミトコンドリアDNAのSequehcingstrategy．
矢印は，用いたprimerの位置を示す．

表

Differencesin nucleotidesin clones TNK203and TNK205
anino acid

nucleotide

nurnber reglOn
TNI（203

TNK205Andersonet al．a

n
S
▲ 八

u
l
G

u
l

a
l
A

a
l
G

A

n
S
A

A▲八

l
I

a

r

V

P

l

e

A

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r
A

g

V

g

VハU

e

T

r

r
r
V

e
S

A
G

l■n

e

t

e
l
l

P

A

▲ 八

L

S

G
L

y
▲

T

−262−

l

h
T

L

y
D

a：Anderson et al．（1981）．b；Yoneda et al．（1990）．C：Anderson．et al・（1981）．
d：Bibb et al．（1981）and e：Anderson et al．，（1982）．

O
r
▲ 几

P

O
r
P

G

D
C

15326
16519

p
O
b b O

14199
14272
14893

G

A

11447
11719
13702

G

G

S

10832
11335

G

G

l
l

9559
10607

G

G

l

8860
9027

G

G

l1 6 6 1L

517写
7028
8179

G

G

HmハU

3423
4769
4985
5147

G

G

HumanC Moused Bovineel t n r n a u r y g u e n u y y O y u r
a e l e S l l h l r e l S e l l r l e h
V Hun G S▲n A G T G A L I A L G G

tRNA−

G

G

V

3243

G

TNK203et al．bGl t n r p a P a y O u l n l y g r y u aa e l e S I S l l−r e a S a l r h l e l

D−loopD−loopD−loopD−loopD−loop12SrRNA
12SrRNA
16SrRNA1 2 2 2 2 X YA P P X 4 4 4 4 4 5 6 6 t t l
D D D D D n︶∩V T T n︶D D D D D D D
N N N 川N C C A A C N N N N N U川N N C

73
222
263
273
475
750
1438
2706

Yoneda図2

ミトコンドリアtRNA−Leu（UUR）遺伝子上の点変異を示す．TNK203クローンでは塩基番号3，243はGであり，TNK205ではAであった．

態と直接関連する遺伝子異常であると確定した3）（図2）．
3．このGAGCCCからGGGACCCの変異により，制限酵素ApaIの切断部位を新たに獲得したことになり，このMELAS関連mtDNA上の点変異の存在と正常遺伝子に対する比率を，PCR

御399bp
車

増幅DNAフラグメントをApaI処理することにより，検出することが可能となった．患者筋組織，

305

・‥・一

90

リンパ球，クローン化細胞，患者剖検組織などから，DNAを抽出し，PCR増幅し（Primerl：dTTCACAAAGCGCCTTCCCcc 塩基番号
図3 ApaI処理後のアガロースゲル電気泳動．
TNK203withApaI（A），withoutApaI（B），TNK205with ApaI（C），withoutApaI（D），MELAS患者リンパ球（E，G），正常人リンパ球（F，H）

3153〜3172，Primer2：dGCCATGGTGAGAG−CTAAGGTC 塩基番号3551〜3531）ApaI処理
後，1．5％アガロースゲル上で解析した．定量実験には，Primerlの5端を［γ32P］ATP，T4−

polynucleotidekinaseでラベル後，DNAフラグ
メントをPCR増幅し，ApaI処理後，6％polya−

明らかにされた．
（2）図4に示すように，患者リンパ球は5人中Crylamideゲル上で解析し，各バンドを切り出し，4人が先に示した点変異を50−60％の割合で持ちカウントした．
（1）図3に示すように，患者クローン化細胞

1例のみがこの点変異を持たなかった．両親，同TNK203はほとんど変異遺伝子を持ち，TNK205

胞のリンパ球では，点変異を持つ患者の母親はこは正常遺伝子のみであった．この方法により，8の点変異を患者より低い比率であるが（1．5％−

症例のMELAS患者の骨格筋が正常mtDNAと8．5％）持ち，父親は仝例正常遺伝子のみであっ変異mtDNAのヘテロプラスミーであることがた．2家系の同胞が患者と母親の中間の比率の変

−263一

Case

2

Case

3

Case

4

case

5

141518171819盈21222324為
図4

患者，およびその家族におけるリンパ球ミトコンドリアDNAの解析．
定量実験のため，5 端をラベルしてあり，オートラジオグラム上では305bpフラグメントは検出できない．90bpフラグメントが変異mtDNA由来である，症例4は，非血縁者からの養女のため家系解析は施行していない．

図5 MELAS患者剖検組織内の変異ミトコンドリア遺伝子の解析．
図4と同様ラベル実験であり，90bpが変異ミトコンドリア遺伝子由来である．
異遺伝子を持っていた（7，1％，28％）．これによに変異mtDNAは存在した．大脳前頭葉に最も変り，MELASの変異遺伝子は母系遺伝を示すこと
異遺伝子の割合が多く，灰自質，自質ともに，90が確認された．
％を占めた．心筋が，87％と変異遺伝子の比率が（3）図5に，MELAS症例の剖検組織の変異
mtDNAの局在と割合を示す．検索した組織全て

高く，ついで，肝，腎，骨格筋，脾，の順であった．骨格筋は，部位により大差なく，63％−69％−264−であった．同一組織内で約4cm匪れた部位から分維したDNAの解析では，変異遺伝子の割合はほぼ同一であった．

索，この変異を持たないMELAS患者の検索を進考察MELASをきたす遺伝子変異は，ミトコンドリ
アDNA上のtRNA−Leu（UUR）遺伝子内のA−G点変異であることを確定した．この点変異がMELASの病因であることは，1個体の同一組織

1）NakamigawaT，MomoiMY，MomoiTandから単艶したクローン化筋細胞を遺伝子解析に用い，正常形質のクローンと，COX欠損クローンのmtDNAの全塩基配列を比較することで確定が可能であった．すなわち，上記2クローンは，
MELASの表現形質であるCOX欠損という形質，
およびそれと直結する遺伝子変異のみを異にするクローンであるためである．8例のMELAS骨格

2）ShimoizumiH，MomoiMY，OhtaS，Kagawa

めている．
文

献

YanaglSaWa M：Generation of human
myogeniccelllinesbythetransformationof
primary culturewith origin−defective SV40
DNA．J NeuroI Sci83：305−319，1988．

Y，Momoi T and Yanagisawa M：Cyto−
Chrome c oxidase−deficient myogenic ce11−

1inesinmitochondrialyopathy，Ann Neuro1
25：615−621，1989．

3）Kobayashi Y，Momoi MY，Tominaga K，筋でこの変異を確認し，更に，この変異が母系遺伝を示すことを明らかにした．
今後の問題は，このmtDNA変異の増幅，分配機構であり，クローン化細胞内の変異mtDNAの増幅分配機構を検討することにより，患者という正常，異常mtDNAのヘテロプラスミーの構築機構を解明する点である．更に，治療の玩㍑正和検−265−

MomoiT，NiheiK，YanagisawaM，Kagawa
Y and Ohta S：A point mutationin the
mitochondrial tRNA−Leu（UUR）genein
MELAS（mitochondrial myopath，enCe−
phalopathy，lactic acidosis and strokelike
episodes）．Biochem Biophys Res Commun，
173：816−822，1990．

平成2年度研究班名簿

平成2年度 荒木班 名簿
区

分

主

氏
任

荒

所

名
木

淑

郎

事

垂

井

清一郎

事

寺

尾

寿

夫

〝

藤

猛

小

澤

高

将

後

藤

幾

生

運 営 幹 事

高

木

昭

夫

〒 10 5
月

荒

畑

喜

一

〝

内

野

誠

太

目

成

男

栗

原

照

幸

〝

木

南

英

妃

〝

斎

藤

加代子

〝

佐

橋

功

円

通

等

〝

西

澤

正

豊

堕

中

征

哉

0 3 −3 8 1 3 −3 1 11

教授

0 5 2 −7 4 1 −2 11 1

教手
受

0 9 2 −6 4 1 −1 15 1（
内 33 2 2 ）（内 20 3 1）（
内 22 8 1）
部

長

室

長

0 4 2 3 −4 1 −2 7 1 1

医長

0 9 6 −2 4 2 −1 0 00（
内5 1 1 4 ）（
内5 3 6 ）
講

師

教

授

教

授

講

師

0 3 −3 3 5 3 −8 11 1

助 教 授

0 5 6 1 −6 2 −3 3 1 1′
J、
平市 小 川東 町 4 − 1 − 1−269−

0 3 −3 8 1 3 −3 1 11
（内35 1 4）（
内 3 12 3 0 ）（内 2 17 6 ）院

長

0 4 2 3 −2 3 −5 11 1

助 教 授

0 2 8 5 −4 4 −2 1 1 1（
内3 2 0 1）

栃 師寺
薬木 県 3河3 1内郡
1− 南
1 河 内町国 立 精 神 ・神 経 セ ン ター神 経研 究 所

0 3 −3 4 6 8 −1 25 1
（内33 2 4）

府 中市 武蔵 台 2 − 6 − 1

自治 医 科大 学 神 経 内科

0 2 8 5 −4 4 −2 1 11
（内3 1 5 1 ）

愛作
岩
知字
県雁
愛知
ヌ2郡1 長 久 手町 大 字

東京 都 立神 経 病 院神 経 内科

0 3 −3 5 8 8 −1 11 1（
内2 0 1 6 ）新宿 区 河 田 町 8 − 1

愛知 医科 大 学神 経 内 科〒 18 7

助 教 授

栃 師寺
薬
木 県 3河内311−
郡南1 河 内町東 京女 子 医 科大 学 小 児 科

03 −3 9 6 4 −1 2 11
（内15 6 2）

文 京 区本 郷 2 − 1 − 1〒 329−04〝

授

熊 本 県 菊池 郡 西 合志 町 須 屋2 6 5 9

順 天堂 大 学 医学 部 生 化 学〒1 8 3教

目黒 区大 橋 2 − 17 − 6〒4 8 0 −1 1

J／（内22 2 1）

小 平 市 小 川 東町 4 − 1 − 1

東 邦 大学 医 学 部 第 四 内科

〒 16 2（内56 1 1 ）措 区虎 の 門 2 − 2 − 2

自治 医 科大 学 生 化学

〒 1 130 6 −4 5 1 −0 05 1

福 岡市 東 区 馬 出 3 − 1 − 1

国立 療 養所 再 審 荘病 院神 経 内 科〒 15 3

授

名古 屋 市 昭 和 区鶴 舞 町 6 5〒 329−
04〝

教

文 京 区本 郷 2 − 1 − 1〒8 6 ト 1 1〝

0 9 6 −3 4 4 −2 1 11

板 橋 区加 賀 2 − 1 1 − 1

国立 精 神 ・神 経 セ ン ター 神 経 研 究所
〒1 8 7授

大 阪 市福 島区 福 島 1 − 1 −5 0

虎 の 門病 院神 経 内科

連 絡 の 際 の電 話教

熊 本 市 本庄 1 − 1 − 1

九州 大学 医 学部 神 経 内科
〒8 1 2：
旺

け る地 位

名 古 屋大 学 医学 部 第 二生 化 学〒4 6 6〝

所 属 にお順 天 堂大 学 医 学 部脳 神 経 内科
〒 1 13〝名地

帝 京 大学 医 学 部 第一 内科〒 1 73佐設

在

大 阪大 学 医学 部 第 二 内科
〒5 53

幹

施

熊本 大 学 医学 部 第一 内科〒8 6 0

監

属所（
内3 5 2 2 ）部

長

0 4 23 −4 1 −2 7 11
（内5 2 1 1 ）

区

分

／
／

氏
福

所

名
原

一
言 義

堀

JJ

松

桃

井

吉

川

若

長里子

和

子

Ill 吉

弘

ル

ル

的

‖

肘 小市 武蔵 台 2 − 6

／
J

川

井

光

鹿 児 島大 学 医学 部 第三 内科

臣

JJ

木

村

淳

ル

黒

川

泰

弘

ル

小

林

高

義

ル

斉

藤

深 夫子

ル

輝

夫

東 京大 学 医 学部 脳 研 神経 内科

J／

庄

司

進

一

信 州 大学 医 学部 第三 内 科

ル

高

校

昭

ル

㍍

守

正

治

J／

稔

宮 崎 医科 大 学 医学 部 衛生 学

ル

宝

来

聴

国 立 遺伝 学 研究 所 人 類 遺伝 学 研 究〒889−16

水

澤

英

洋

教

授

06 −451−0 05 1

教授0992 −64−2 211（
内 269）（
内 233 6）（
内 2146）
助 教 授

0886 −31−3 111（
内 3204）

教授075 −751 −3770

教授0886 −31 −3111（内2320）講師

03 −3813 −6111（内3385）助

手

03 −3813 −6111

講師

03−3815 −5411

助 教 授

0263 −35 −4600（内6132）（内8763）（内5321）
教授052−741 −2111

教授0762 −62 −8151

教授0985 −85 −0873

助手0559−75 −0771（内2297）（内3950）宮 崎 市 宮 崎郡 清 武 町 木 原5200（内568）

三 島 市谷 田1111

筑 波 大学 臨 床 医学 系 神 経 内科
〒305045 −971− 115 1

金 沢 71i宝 町 13 − 1

田

ル

授

名 古屋 市 昭 和 区鶴 舞 町 65

濱

〒4 11

教

松 本jli旭 3 − 1 − 1

金 沢 大学 医 学部 神 経 内科〒920

0423 −41−2 711（
内 5143）

文 京 区本 郷 7 − 3 − 1

名 古屋 大 学 医学 部 付 属病 院 神 経 内 科〒466

長

文 京 区陽 島 1 − 5 −45

水

〒390

室

文 京 区湯 島 1 − 5 −45

清

〒 113

（
内 3445）

徳 島市 蔵 本町 3 −18− 15

東 京 医科 歯 科大 学 雉 治疾 患 研 究 所 細胞 遺 伝 学〒 1130285 −44−2 111

京都 市 左 京 区聖 護 院 川 原町 54

束 京 医科 歯 科大 学 医 学部 神 経 内 科
〒 113

助 教 授

徳 島11i磁 本町 3 丁 目

徳 島大 学 医学 部 小 児 手
斗
〒770

（
内 4020）0434 −22−2 511

鹿 児島 市宇 宿 町 1208 − 1

京都 大 学 医学 部 付属 病 院 神 経 内科〒6060423 −25−3881

長大 阪了
行福 島 区福 島 1 − 1 −50

徳 島大 学 医学 部 第 一 内科
〒770

研 究 員
医

横 浜 iIi緑 区藤 が 丘 1 −30

大 阪大 学 医学 部 ′
卜児科

尚

副 参 事

小平†
li小 川東 町 4 − 1 − 1

昭 和 大 学 藤 が丘 病 院神 経 内科

〒8900255− 34−3 131
（
内553）

栃師
薬
木 寺3311
県 河内 郡−河
1 内町

国立 精 神 ・神 経 セ ンター 神 経研 究所

〒553

長

連 絡 の 際 の 電話

千葉リ．
さ四街 道 市 鹿 波943 − 5

仲太郎

弘

医

新 i潟
犀
別県
68中頚
− 1城 郡大 潟 町

自治 医 科 大学 小 児科

〒227
岡

け る地 位

国 立 療養 所 下 志 津病 院 神 経 内科

〒187
ル

所属 にお

地

喜 一郎

〒329−
04

ル

名

東 京 都 神経 科 学 総合 研 究 所 生化 学

〒284
／
／

設

在

眞 一郎

〒 183
村

施

国 立 療養 所 堤 耕摘 院 神 経 内科
〒 949 −
31

J／

属

所

茨 城 県つ くば 市天 王 台 1 − 1 − 1

−270−

講

師

0298 −53 −3224

区

氏

分

宮

ル

所

名

武

正

所

森

正

敬

施

和

夫

J／

宇 尾野

公

表

国立 静 岡病 院

／
／

豊

康

夫

東京 都 老 人医 療 セ ンター〒 770〒 42 0
倉〒173
事 務 担 当 者

安

部

和

子

け る地 位教

授教

0 25 −223−6 16 1

授096−344 −2111

名誉教授

0886−3 1−3111

院長0542 −45 −0101

院長

03 −3964−1131（
内6771）

徳 島 市蔵 本 町 3 丁 目

静 岡 市 城 東町 24 − 1

板 橋 区 栄 町35 − 2

沖 中記 念成 人病 研 究所
〒105

連絡 の際 の 電話

（内5180 ）■熊 本 市 九 品寺 4 −24 − 1

好

三

所属にお

地

新 潟 市旭 町 通 1 番町 757

徳 島 大学 医 学 部 第一 内科

問名

熊 本 大学 医 学 部 遺伝 学
〒862

顧

設

在

新 潟大 学 脳 研 究所 神 経 内科
〒95 1

ル

属

03 −3588− 1111（
内 2168）

港 区虎 の 門 2 − 2 − 2l−271−