厚生

省

神経疾患研究委託費

筋の発生と分化に関する

基礎的研究
江

橋

班

昭和56年度研究報告書

昭和57年3月

研究報告書の作成に当って本年も厚生省神経疾患研究委託費による筋ジストロフィー症の研究の報告書をお送りすることになりました。
過去3年間「筋ジストロフィー症の基礎的研究班」として多くの研究成果を挙げてきた班を発展的に解消し，新に二名の班員を加え「筋の発生と分化に関する基礎的研究班」
として本年度より出発致しました。新しい班の名称には「筋ジストロフィー症の研究」＼という言葉は表面的には入っておりません。しかしこれは筋ジストロフィー症の研究の最も重要な方向の一つを便宜的に班の名称を用いたものにすぎません。筋ジストロフィー症の研究には一日の僻怠も許されません。従って班の名称は上記のようではあります
が，我々の目的とするところはあくまでも筋ジストロフィーという難病を如何にして解決するかということであります。
我々はこの目的のために，これまで用いていた筋ジストロフィー症ニワトリのほかに同症ハムスターを導入し，本年は差当ってその基礎データを集めることを目的としました。そしてすでにいくらかの新しい結果を得ております。
本年度から出発する新しい班が組織されたのは56年の初夏のことでありますが，研究費の配分が可能になったのは12月に入ってからのことでありました。このような事情にもかヽわらず，12月初旬に開かれた班会議では，この報告書にみられるような高度の研究成果が発表されました。このことはいうまでもなく班員および研究協力者各位の筋ジストロフィー症解決に対する熱意と努力の賜物であります。
本年度も班会議後わずかの間に報告集をまとめることができました。多忙な中を執筆下さいました班員各位に御礼申し上げます。また本委託金の取扱いに色々とお骨折り下さった厚生省医務局，国立武蔵療養所，日本筋ジストロフィー協会の方々に御礼申し上げます。
昭和57年3月

班長 江 橋 節 郎

目

次

Ⅰ

特別レポート

1．ジストロフィ・ハムスターに関する知見3

野々村 禎 昭Ⅱ 発生生物学・細胞培養

2．哺乳動物の発生初期で起こる細胞間のCompactionに関係する細胞表面分子

11

岡

田

節

人

3．バクテリオファージ入にパッケージした

遺伝子の培養細胞への挿入

14

岡

田

善

雄

4．家鶏ジストロフィー筋の培養法による研究

16

米 沢

猛

5．筋ジストロフィー（dy／dy）マウス筋芽細胞の分裂能低下の機作の研究

19

香

川

務

6．トランスフェリンと筋細胞の成長26

小 沢 鍈二郎

Ⅲ

Whole Animal

7．ジストロフィー筋などの移植に関する研究−筋再生に及ぼす神経支配の影響

33

寺

尾

寿

夫

ⅳ
8．ジストロフィーおよび正常チキンにおける筋線維数の経時変化

39

大

塚

正

徳

9．筋ジスマウスの筋線維の成熟成長障害

44

戸

塚

武

10．三つの筋神経系異常マウスにおける指標酵素の活性変動の比較

49

松

Ⅳ

生

理

下

宏

学

11．L6筋芽細胞培養におけるテトロドトキシン感受性活動電位の発達

59

加

濃

正

明

12．筋細胞膜における膜興奮機能の発生

64

高 橋 國太郎13．両生類骨格筋の遅速両筋線維の比較

69

遠 藤

實

Ⅴ アセチルコリンセプター

14．眼瞼型重症筋無力症における抗−AChR−抗体

79

栗 山

熙

15．培養筋細胞のAChレセプターの代謝安定性と神経細胞由来因子

82

萩 原 彌四郎
16．培養骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体の合成と分化
杉

山

86

博

之

ⅴ

17．発生初期におけるジストロフィー筋のアセケルコリンレセプターの代謝速度

91

堀

Ⅵ

微

細

構

田

健

造

18．鶏骨格筋の凍結割断像について

101

岩

崎

祐

三

19．細胞骨格の分化発達−急速凍結エッチングレプリカ観察
石

106

川

春

律

Ⅶ 構造蛋白・その他

20・ミオシンH鎖及びL鎖isoformの発生過程における発現様式
江

橋

113

節

郎

21．ウサギ骨格筋トロポニン成分の局在

124

大

槻

磐

男

22．再生筋における筋蛋白質の分化

127

嶋

田

裕

23．骨格筋の発生・成長に伴うミオシンアイソザイム

及びC−タンパク質の分子種変異

135

大日方
24．ニワトリ胸筋のNative High昂

MW Protein

141

丸

山

工

作

25．ジフテリア毒素によるEF2のADPリボシル化を抑制する因子と筋発生におけるその変化
真 崎 知 生144

ⅵ
26．脱神経及び神経再生による支配筋の分離筋小胞体膜のCa−uptake筋について

149

酒

Ⅷ

井

敏

夫

Proteinase

27．ニワトリ発生における筋組織プロテアーゼの動態

157

高

橋

健

治

28．骨格筋のチオールプロテアーゼインヒビターの諸性質と筋ジストロフィー症における活性変動

162

勝

沼

信

彦

29．筋肉代謝網に対する酵素阻害物質の影響

168

青

柳

高

明

30．筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

173

今

堀

和

友

31．Ca依存性プロテアーゼの生体内での作用

178

杉

田

秀

夫

Ⅰ

1

特別レポートジストロフイ・ハムスターに関する知見

1

ジストロフイ・ハムスターに関する知見

野々村 禎 昭ジストロフイ・ハムスターは1962年，Hom−製を行った。心筋障碍が進行し，壊死部分が広がburgerらによってはじめて導入された。

っていくと共に心筋ミトコンドリア中のカルシウ

ジストロフイ実験動物としてはマウス，鶏に遅れ

ムイオン含量が増加していく㌔）て検討されたわけであるが，そのいくつかの特徴

本研究においてはジストロフイ・ハムスターのによって筋ジストロフイ実験動物としては秀れた

主として骨格筋の各種を経時的に光顕レベル及びものであり，我国においても今後もっと利用すべ

電顕レベルで観察し組織的変化を概観することをきものと考える。先ず簡単にこれ迄得られている試みた。

知見をまとめておく。

材料と方法 材料としてBIO14．6 ジストロフ

遺伝型はもっとも単純な常染色体劣性型である。

イ・ハムスター雄を用いた。各種筋を腰付きでとはじめはBIOl．501ineとしてとられたが，現りだし，歯科用ワックス上に生体長迄伸展して固在はBIO14．61ineという系が広く用いられて定し，4％グルタールアルデヒド，0．135Mカコ

おり．この系は白色化してあるので利別が容易で

ジル酸緩衝液で1時間前固定し，緩衝液で洗い標ある。ジストロフイ・マウス，鶏と較べて異常の本をはずし，細切する。1％オスミック酸・カコ

発現が筋細胞に限局されるのが特徴であり，骨格

ジル緩衝液で45分後固定後，水洗，1％酢酸ウラ

筋だけでなく心筋にも障碍が発現する。

ンでブロック染色後アルコール・アセトン脱水し筋障碍の発現は緩徐であり，心筋障碍に対する

エボンに包埋した。標本は厚切してトルイジンブ

代償として心肥大が生後100日位よりはじまり，

ルー染色し光顕下で観察し，薄切したものは鉛染

心不全をおこして死に到るが180日位から死亡す

色して電顕下で観察した。心臓は動脈切断後そのるものが出，一年位の経過ではヾ全て死亡する。

まゝグルタールアルデヒド固定し，30分後心房，

この間血中CPK値は生後30日日頃より上昇しは

心室にわけ，細切してさらに30分固定し，以下他

じめ70〜80日頃ピークに達し以後少し減少したま骨格筋と同様に処理した。骨格筋の障碍程度を測

ま或る高値を維持する。他の初期診断法としてはるのは主として横断切片光顕観察をもちい，縦断

筋肉の生検法，水浴超勤法などがあるが容易では切片のものもこれに加えた。

ないム最近，舌の下側部に1−5mの白斑の出現

骨格筋組織障碍度の判定は光顆下観察でHom−が舌筋障碍の可視化であり，心筋障碍の発現と平b。rg。，37こ従い，光顔で不確かなところは連続

行化するといわれているプ）

切片の竃朗観察で確認した。判定は次の様になる。

心筋障碍に関してBha。ら詣ミオシン軽針2に特異的な蛋白分解酵素がジストロフイ・ハムス
ターの心筋では増加していることを報告しその精

正常＋）異常全くなし
疑異常闇

縦断100細胞中4以下核列状配列，又は横断100細胞中4以下の中心核，筋
紡錘，核周辺空孔数の増加★東京大学医学部第二薬理軽度異常（＋）上記同様の変化及び100細胞中4以上

Ⅰ 特別レポートの核列状配列と中心核中程度異常Hj 長い核列状配列と100横断細胞中ている。これを再生とすると全て再生細胞ということになってしまう。一一万一部中心核がある細胞

8以上の中心核組織でも，いわゆる幼若，未熟型の再生細胞が共空胞化を伴った核の細胞外突出存しているような像はほとんどなく，真の再生像

高度異常㈹ 多数の中心核，pyknosisやfra−の中に中心核があるようなパターンが認められてgmentation，hyperchromatosis等いない。以上の様な理由でジストロフイハムスタの核異常

ー骨格筋に認められる中心核は特徴的な変化で本

極度異常棚 壊死細胞出現，再生細胞の出現，マ来発達途上で周辺核となるべき機構が失われて中クロファージの浸出，問質組織の増殖

心核のまゝ細胞が成長してしまったと考えられる。

一応この判断規準に従って，77日，97日，110

本来の骨格筋でない食道横紋筋にも異常が認めら

日各時期の各種骨格筋を判定した。同時に心筋もれた。この細胞は直径が小さいので横断像では中心房筋，心室筋にわけて骨格筋同様固定包埋し切心核を決めるのが難しいと考えられるが，実際は片をつくって観察した。77日の数種の筋をホモジェ

周辺核とはかなり異なっているので比較的容易にナイズして，微量二次元電気泳動にかけ，主とし判定出来る。食道横紋筋は下端附近迄存在していて酸性蛋白質側についてコントロールとジストロるが，異常は中心核だけでなく壊死細胞を含んでフィーの収縮蛋白質パターンについて検討した。

いるものまであり，又縦断像では第2図にみるよ

結果と考察 各時期にわたって心房筋には著しい

うに仮りに核が周辺にあっても列状配列をしてい変化は認められなかった。心室筋は全く正常の場るので容易に異常といえる。この列状配列は長く所もあった。この様に比較的正常な場所でのIn−続くことが多いので，横断像で正常の周辺核の出

tercalated−Diskについても特に間隙が広くな

現頻度に較べて圧倒的に中心核の出現が多くみえっているようなことはなかった。独立したブロッる理由である。第2図にみられるような核小体のクの約半数の心室筋では異常が認められた。これ多数が認められることが多い。核の異常としてはらの場所ではポリゾームが増加していた。細胞内

核周辺空孔があるが，Homburgerはこれをtjjよ間隙がみられ，異常の強いところでは空胞変性がり入れているが，むしろ（欄以上の異常度の高いも認められた。この様な場所では，Intercalatedのに多い。

−Disk間隙が広がっていたが，これは細胞変性の結果のように思われた。

中心核の他はほとんど正常の細胞が多い。しかし竃顕観察によってポリゾームが正常に較べて多骨格筋としては上肢筋，扁筋，腹直筋，模隔膜

数存在することがわかる。さらに膜結合型リポゾ

各種下肢筋と，食道横紋筋の12種の筋を調べた。

ーム又は粗面小胞体も存在することもわかる。こ

最終結果は表1に示すが，全ての筋が少くとも77

れは正常筋では生後70日以降ではほとんど認めら日以降においては異常像を示していた。

れないものである。筋紡錘が多出するといわれて中心核は異常の判定にもっとも容易である（第いるが，確かに比較的頻ぽんに筋紡錘を認めるこ

1図）。再生細胞に中心核が認められることから，とが出来た。

中心核の存在を再生現象を考えるグループもある

壊死を生じている細胞の現われ方に3種類認めが，少くともジストロフィーハムスターにおいてられた。ひとつは比較的異常の少い細胞群の中には再生とは全く関係なく生来このような状態に筋

突然壊死細胞が出現しているような型で，この時細胞があったと思われる。理由は全ての組織に中は空胞変性的なものが多い。他は異常度の高い細心核をもった細胞が認められ，肩筋や背筋の様に胞群の中に生じるもので，筋線維走行の乱れの著

異常皮の高い組織では全ての細胞が中心核をもっしいものであるが，縦断像でこの経過をたどって

1

ジストロフイ・ハムスターに関する知見

第1図 中心核を示す。骨格筋横断光顕像ジストロフイ・ハムスター肩筋の横断切片をトルイジンブルー
染色したもの。矢印は中心核を示している。ほとんど全ての細胞が中心核を示していることに注意○

第2図 核列状配列を示す。骨格筋縦断電顕像ジストロフィ・ハムスター横隔膜の縦断超薄切片を鉛染色したもの。核が列状配列しているところを示している。核内には核小体が示されている。筋原線
経は全く正常像を示している。

Ⅰ 特別レポート

第3図 広範な組織透明化変性を示した異常都と正常部境界の電顕像。
左端に筋細胞横断像（正常部境界）が示され，他は透明化変性をおこした部分で主として問質細胞，線維芽細胞から成る。小血管，コラーゲンも含まれている。

みると，空胞の出現，やがて異常収縮，超収縮，かめる方法はない。

ついに筋線経の乱れと移り変っていく。周辺の細第一表から一般に上肢筋は比較的軽い異常，肩胞も中心核，一断面2，3核の存在，核周辺空孔

背筋は強度，横隔膜もやゝ強鼠下肢筋は中等度も多くみられる。第3のものは可視的にも生後90の変化といえるかもしれないが，もう少し例数を日以降のものに認められるもので，筋組織の一部みるべきであろう。経時的変化もこの例では少なすが透明化，白蟻化している。この様な部分の正常

ぎるが，傾向としては生後77日ではすでにかなり部との境界を固定したものが第3図に示される。

な障碍度に達しており，以後日を追って異常度は

この図の左はしにみえる筋細胞は正常部の境界で増すというよりすでにピークに達して横ばい気味

以下左側には中心核は存在するが一見正常な筋細というべきであろう。

胞群が続く。透明化した部分は実は第3図にみら77日目の心室筋，心房筋，下肢筋（M．soleus

れるような線維芽細胞又は問質細胞群であり，こM．extensor digitorumlongus）について正の処々に僅かに筋細胞が残っている。この筋細胞

常及びジストロフィー筋の各々一部をとりホモジ

は肥大，空胞変性をおこしているものもあるが，ェナイズして二次元電気泳動で観察した。主とし中心核の点を除いては一見正常のものもある。こて酸性側蛋白質（アクチン，トロポミオシン，ミのような変化がどのような機序で生じたかは全く

オシン軽鎖1，2，3及びトロポニンC）について正不明である。浸潤のように徐々に筋細胞が変性し常とジストロフィーについて比較検討したが，ほ線維芽細胞におきかわっていったのが，はじめか

とんど差を見出せなかった。Bhanらがいうよう

らこのような組織であったのか，現在のところ確な心室筋ミオシン軽鎖1の分解などは全く生じて

1

ジストロフイ・ハムスターに関する知見いなかった。すなわち正常に対してジストロフィ

このようにジストロフィーハムスターでは骨格一筋での収縮蛋白相対量の減少はなかったし，新 筋の全てに中心核を主とした異常が出現する。しらしい蛋白の出現等も見出せなかった。

第1蓑

かし筋自体としては目立った変化は少く，筋蛋白

各種骨格筋の異常
7 7d97d

1 10 d130 d

上肢筋
M ．ex ten sor d ig ito rum com m un is±≠

M ．ex ten sor ca rp l rad ia lis brev is
肩 筋
州欄

M ．om otran sv ersa riu s

描普

M ．om ob ra ch ia lis
背 筋

榊

M ．1u
m bodo rsa l aponeur os is
腹 筋

川音

M ．ex terna l abdom ina l ob liqu e
食道筋＋

M ．esophagus
横隔膜

＋着

＋

M ．d iaph ragm a
下肢筋

十
什

≠覚

≠

十

M ．sem itend inosu s
M ．so leu s≠

M ．ex ten so r d ig itorum lougu s

1≠

M ．Sar to riu s
米は変性細胞の出現を示す。

≠≠

レベルで異常を見出すことは出来ない。変性も一文部で生じるが，生後100日以後著しく増加するわ献ィーモデル動物として安定して異変が筋に限局さ

1）Homburger，F．et aL，（1962）〟ed助p．6，339．
2）Handler，A．H．et止，（1975）ル化助仁政p．βわエ〟妃148，573．
3）Bhan，A．etaL，（1978）⊥〟0人α払α′dlO，769．
4）Strobeck，E．etal．，（1979）Ann．NYlAcadScLれるという意味では使い易いが，変化を何を規準

5）的usz，E．etaL，（1966）A〝れ〃r加〃d助￡138，

けでは射、。むしろ安定した状態が異常をもった
まゝ長く続くといって良いであろう。ジストロフにするかという意味では良い指標を求める基礎的研究をつみ重さねる必要がある。

317，59．
213．

Ⅱ 発生生物・細胞培養
2 哺乳動物の発生初期で起こる細胞間のCompactionに関係する細胞表面分子113バクテリオファージ人にパッケージした遺伝子の培養細胞への挿入14

4

家鶏ジストロフィー筋の培養法による研究16

5 筋ジストロフィー（d班y）マウス筋芽細胞の分裂能低下の機作の研究19
6

トランスフェリンと筋細胞の成長

26

11

2 哺乳動物り発生初期で起こる細胞間のCompactinに関係する細胞表面分子

研究協力者

岡

田

節

人

小

台

宗

一

1．は じめに多くの哺乳動物胚では受精卵が3〜4回の分裂

吉

田

知加子

この≠細胞接着の2元仮税 は現在では一般的に受け入れられている。

を繰返した後に，Compactinと呼ぶ現象が起こ

マウス初期胚を生化学的に研究する材料としてる。これは，それまでは割球は殆んど球形であっ

129系マウスに生ずる奇形がん腫細胞をモデル的てお互いの接着面がごく僅かであったのが，急にに利用すると多くの便があるので，まずこの腫瘍

割球間の接着面が広がって胚全体の形状にも著し細胞について細胞接着の機構を調べた㌔）その結果，

い変化の起こるような現象をいうのである。胚の奇形がん腫細胞の表面にも2つの異なったクラス

発生において細胞間の相互の関係が生じ，多細胞の細胞接着基が存在し，特にそのうちCaに依存体制としての組織と呼ぶ系が最初に確立するのは，して機能するクラスのもの（Calcium−depe−

このCompactinによってであると考えてよい根

ndeut site，CDSと略記する）が多くある。と拠がある。従って，この現象は初期発生におけるりわけ，分化能力を欠いたF9株軋ま多量のCD

極めて重要なイベントとして最近強く注目されてSが存在しているので，この細胞を抗原として得いるのである。COmpaCtinは個々の細胞の変形た抗血清を吸収して，CDSに対する抗体を得るによって起こる現象であるから，これが個体発生でことができた。

みられる最初の細胞収縮の現象であろう，という見この抗体を利用してCDS分子を電気泳動ゲル

地からの研究も少なからず行なわれつゝある。わ

上で同定することが可能である。その結果，CDS

れわれは，この現象に直接機能する細胞表面分子

は細胞表面に存在する分子量140Kの蛋白質であの存在することを見出し，かつそのような分子の同ることが判った書しかし，このF9細胞を抗原と定に成功したので．それらの結果について報告する。

して得られた抗CDSは，もろもろの繊維芽細胞の細胞株とは交叉反応しない。後者の細胞にも，も2・マウス奇形がん踵細胞における細胞間接着分子
多細胞動物において細胞間の接着が，その機能

ちろんCDS分子は存在しているがこれらは分子量150Kのもの別の蛋白質である。

がCaの存在に依存するかどうかによって判然と従って細胞接着という同じ機能をもったCDS区別される，2つの異なったクラスの細胞表面基と呼ぶクラスの分子は一種煩でなく，分子的に多の存在によっていることは，1977年以来われわ様性がある。以下では奇形がん腫細胞のものをt

れの一連の研究によって明らかにされてきたよ）2）−CDS，繊維芽細胞のものをf−CDSと呼んで区別することとする。

＊京都大学理学部生物物理学教皇

Ⅱ 発生生物・細胞培養

12

A

J
′
I
L
︑

㍗

B

、、・●ふ■∴J′▲J・

＼J

図1

ノ

LA）Compactin直前の8細胞期のマウス。
（B）やがてCompactinが起こる。
（C）Compactinを起こした胚を抗t−CDSのFabで処理するとde−COmpaCtinが起こる。

2

哺乳動物の発生初期で起こる細胞間のCompactinに関係する細胞表面分子3．マウス初期胚のCDS分子
それではマウス初期胚にもCDSは存在するのだろうか？存在するとすればt−CDSであろうか，f−CDSであろうか？

13

るが繊維芽細胞で吸収しても全く低下しない。
従って，COmpaCtinにはt−CDS分子が特異的に機能していると結論される。

この問題に答え

すでに述べたように，t−CDSは未分割卵かるため，抗t−CDSのFabフラグメントの初期ら存在している。COmPaCtinが3回の分裂後で胚細胞の集合阻止活性の有無を調べた。すると，初めて起こる原因は，この時期でt−Ct）Sの合

このような抗体のFabは集合阻止の働らきがある

成がさかんになるのか，或は多量のt−CDSがが，その活性はf−CDSをもっている細胞で吸割球の表面に露出するのかによると想像される。

収しても除去されない。しかし，奇形がん腫細胞で吸収すると非活性となる。従って，マウス初期

5．ま と め胚にはCDS分子は存在し，それはt−CDSでマウス初期胚には奇形がん嘩細胞とは共通でああって奇形がん脛細胞と共通のものであることがるが，分化した体細胞とは別の分子量140Kの細明らかとなった。なお，t−CDSは分割前から

胞接着分子が存在する。この分子が細胞の変形に胚盤胞の時期までにその存在が確認された㌔）

よって起こるCOmpaCtinに機能していることが，抗体Fabを用いた実験から明らかにされた。

4・CompactinとCDSの機能
マウス初期発生において細胞接着に関係した重要な現象はCompactinである。この現象にCD文

献

de−COmpaCtinが起こるのである。抗t−CDS1）Takeichi，M．（1977）．Functional correlation be−
tween celladhesiYePrOPertiesand some cellsur−
racepTOteins．J C封βわし75，464−474．
2）Takeichi，M．，Ozaki，H．S．，Tokunaga，K．，and
Okada，T．S．（1979）．ExpeTimentalmanipulationof
Cell surface to affect cellular recognition mecha−
nisms．加yebp．βわ上，70，195−205．
3）Takeichi，M．，Atsumi，T．，Yoshida，C．，Uno，K．，and
Okada，T．S．（1981）．Selective．adhesion of em・bryonalcarcinomacellsanddifferentiatedce11sby
CaJependent sites．Deyetop．Bi01．，87，340−350．

のFabのもつこのような効果は可逆的であって，

4）Yoshida，C．and Takeichi，M・（1982）・Teratocar−
Cinoma cell adhesion：Identification of a cellde−COmpaCtinを起こした胚を正常培地に戻す

SurfaceproteininYOIYedincalciumdependentcell
aggregation．αtL（inpress）．
5）Ogou，S．−H．，Okada，T．S．，and Takeichi，M．
（Cleavage stage mouse embryos share acommon
Cell adhesion system with teratocarcinoma cells．
βeyeわp．βわエ（hpress）．

Sが機能しているかどうかを知るために，8細胞期の胚（図1A）がCompactinを起こした直後（図1B）に，抗tqCDSのFabを含む培地においた。すると，・COmpaCtion の状態は維持されず各割球問の接着は再びルーズなものとなって，と再びCOmpaCtinが見られる。
抗t−CDSのde−COmpaCtinを起こさせる
効果は，奇形がん腫細胞で吸収すれば非活性とな143

バイテリオファージ人にパッケージした遺伝子の培養細胞への挿入

岡 田 善 雄＊研究協力者 内 田鹿＊ 石 浦 正 寛＊＊

2．方

1．は じめに法

遺伝病細胞を用いた退伝子解折の研究は，遺伝

HSV−1tk遺伝子（2kb）を組込んだpBR322

病そのものを理解する上からも，ヒト遺伝子そのプラスミドをEco Rlで限定分解し，Charon4

ものを理解する上からも今後必須の道である事はAのアームにT4−DNAligase

論をまたない。その作業としては，遺伝病細胞のち，入ファージ粒子内にパッケージした。この組機能失調を回復させ得る遺伝子をヒト遺伝子バン

換えファージを大量に採取し実験に供した。

で連結したのクから選別するのが第1のステップとなる。然し

ファージは250mM CaC12を含むpH7．9の1／100万の確率しかない困難な作業で，これをバッファーに浮液させ，等量の1．5mM Na2HP04

或功さすためには遺伝子の細胞内注入，及び遺伝を含むpH6．87のバッファーと混合し，250cl0

子発現の頻度をできるだけ上げる技術開発が必要分置いてゲル化した。このリン酸カルシウムゲルである。現在までの方法としては．DNA断片

17几〜をLtk￣細胞の単層培養（PlOシャーレ）にを直接リン酸カルシウムでゲル化して細胞に添加

加えか024時間して洗い新らしい培地を加えて更らにする方法が一般的で，その他SV40に遺伝子を組370で40時間培養した。その後tk」雫田胞を選別す込ませたのち細胞に感染させる方法も開発されてるためのHAT培地に代え，10日培養で現われるいる。然し効率その他の面で遺伝病細胞に利用す細胞のコロニー数を計測し，tk遺伝子の細胞内るには不満である。また細胞核に，微小ガラス管発現頻度とした。

を用いて，直接DNAを注入する方法もあるが，これは1回に高々1，000ケの細胞が処理できるぐ
らいのもので，1／100万の頻度の退伝子選別に利用できる一般方法とはなり得ない。
私共はヘルペスワイスのチミジンキナーゼ構造
遺伝子（HSV−1tk gene）をマーカー遺伝子と3．結果
ファージに迫伝子をパッケージした形のまゝで，リン酸カルシウムゲル法を用いて，極めて高い遺伝子挿入，発現頻度の得られることがわかった。
即ちし，マウスLtk￣細胞を用いて遺伝子挿入頻度を／transformant／105phage／106Ltk−cells

上昇させる方法を種々検討しているが，その中のの頻度が得られ，ファージ数の増加に比例し1つが有効な頻度上昇を示すものとなったのでこて発現細胞数は直線的に増加し5×107pha−

ゝに報告する。

ge までその傾向は続いた。これは今迄の方法に比べて10〜100倍の高頻度であることを示すもの
で，ヒト遺伝子バンクから特定の遺伝子を選別す＊大阪大学・微研＊＊国立基礎生物学研究所

るのに有効な頻度の少くとも下限に入るものであ3 バイテリオファージ人にパッケージした遺伝子の培養細胞への挿入る。

15

伝病の機能欠損を利用して，ヒト遺伝子バンクか

この方法での頻度上昇に関係する大きな因子がらの選別の道こそがより自由度の高いものである

リン酸カルシウムゲルを作るときのpHと放置時

事は論をまたない。そのための1つの新しい技術間である事も判明した。ゲルが大粒子になると効として入ファージにパッケージしたヒト遺伝子′ヾ率は極端に落ち，できるだけ微粒子で．しかも充ンクを利用して，遺伝子注入発現を可能にする具分の沈澱の得られる事が必要条件のようで，ゲル体的方法が開発されたと考えられる。

化のために加えるバッファのpHが6．87が最適で，

5．発

放置時間は25℃7分〜20分が適当と結論された。
Phage

4．おわり に
現在までヒト遺伝子の切り出しは主に特殊に分化した組織細胞からのmRNAをスタート材料とし，CDNAを経て成功したものであるが，この方法は特別なもの以外，一般化できる方法ではない。退表

particleP一mediatedgenetransferinto cultured mammaliancells

MoLCellular Biology
投

稿

中

16

4

家鶏ジストロフィー筋の培養法による研究

米沢

著者等は培養法により家鶏ジストロフィー筋の後，2．5％グルタールアルデハイド溶液（pH7．4）

研究を行って釆たが，今回その微細構造の検索や，塩類溶液で洗藤（30分），1％オスミウム固定

ベルオキシダーゼ法を用いた筋内空胞と外部との（pH7．4，30分）脱水後，ヴェストパールに包埋

交通性などの結果をも併せてジストロフ1−病変した。これらはカバーグラスに附著した培養をカの成立について検討を加えた。

バーグラスのまま処理し，包埋剤を固めた後．−〔実験方法〕

80℃フリーザー内にてカ′ヾ−グラスをはずす方法

ジストロフィー家鶏（Califolnia Davis413）

をとった。

及び対照の健康鶏（同412）の9−11日鶏胚よりまた培養経過の種々の時期に0．25／旬Jベルオキ

脊髄及び浅胸筋を取り出し次の如きグループに分

シダーゼ溶液を培養に加え，約3時間後BSSにけて脊髄及び筋の同時培養を行った。

て洗軋 2．5％グルタール溶液にて固定，更にB

A：健康動物脊髄及び健康筋

SSにて一昼夜洗赦し，0．2％H202存在下にて

B：健康動物脊髄及びジス筋

発色せしめた。

C：筋ジス動物脊髄及びジス筋〔実験結果〕

D：筋ジス動物脊髄及び健康筋（1）筋組織を単独で培養した場合，対照筋，ジス

E：健康筋

筋ともに12時間後には双極性の筋原細胞が遊出

F：ジス筋

し，活発な分裂増殖を示した。2日日頃よりこ培養には径22mm円形のカバーグラスにラット尾よれらの細胞の融合による筋管形成が始まり，2り抽出したコラジェンを塗布し，ゲル化せしめた−3日のうちに急速な伸長を示した。融合直後

ものの上に上述の脊髄と筋とを約1mの間隔をもの筋管は胞体が乏しく，横径は不均一で核は中つように植えつけた。培養はMaximowの二重カ心位をとっている。その後4−5日目には胞体′ヾ−グラス法により，培養液はが増大し，内部に縦走する筋原線経を認めるよ

Gey氏塩煩溶液

9

うになり，自発性収縮が始まる。そして横径はEagle氏MEM

9次第に均一化し，横紋が形成され，次いで核は

馬血清

9

次第に筋膜直下へと移動する。この発育過程は

鶏胚抽出液

9

培養開始後10〜14日で完了するが，時間的経過

10％プドー糖2は対照とジス筋との問に殆んど差は認められなのものを用い，毎3日に培養を塩類溶液で洗赦後，新しい培養液を加えた。
微細構造の検索には塩類溶液で洗藤（5分間）

かった。
（2）脊髄を加えて培養を行った場合，筋組織片よりの筋原細胞の遊出と，その融合開始までの時
間的経過は筋単独培養の場合と同様である。一＊京都府立医科大学病理学教室

方脊髄片から，植え付け12時間頃よりダリア細4 家鶏ジストロフィー筋の培養法による研究

17

胞及びシュワン細胞の増生とともに運動神経軸㊥ 筋の表面膜の細孔形成と細胞外との異常な交索の延長が認められる。この軸索は当初裸のま通性：培養約2週以降になると筋の表面膜は細まのこともあるが，次第にシュワン細胞が髄伴孔形成が認められるが，このような部ではHRしてくる占いずれにせよ運動神経軸索は，培養Pによって筋内の管構造と外界との異常な交通開始後2日目には筋管細胞との接触を示し，そが認められ，HRPに対する透過性が冗進しての後間もなく，筋菅の周期性収縮が開始される。

いる。屡々胞体の浮腫状変化によると思われる

そして筋胞体は急速に増大し，4日日頃までに腫大が見られる。そしてSarcomereの過収縮

は，ほとんど全ての筋線経で槙紋形成と核の筋と縦配列のズレが認められる。

膜直下への移動が行われ，7日目までにこれら

このような部では，それまで同期して収縮，弛の変化が終了し，ほぼ成熟した形態を示してく

緩を繰り返していた筋線維群内に，過度の収縮やる。しかし支配神経に髄鞘形成が見られるのは，

弛緩過程の緩徐な筋繰経が出現してくる。その他

なお1〜2週間を要する。

過収縮を示しているいわゆるopaque fiberの出

このように脊髄を加えて筋の培養を行った場

現も認める事が出来る。

合は，加えない場合に比して，運動神経が筋線

このような過収縮に伴い，上記の異常な交通性

経に接触した後に筋の成熟が促進される。こののある部では，筋の収縮異常の出現後，Sarc0−

促進は健康筋とジス筋との間で差は見られなかmereの配列に乱れが生じ，横紋が不鮮明となり，った。

やがて筋緑経の断裂および融解が生ずる。

ジス筋における変化：ジス筋に於てはその発育

それと相前後して，その郡の筋胞体は次第に顆粒と成熟に伴って種々の変化が出現する。そのうち状を呈して壊死に陥る。この壊死性変化は，通常，ジス筋特有の変化と見倣されるものを挙げると

筋線経の一部に限局しており，節性壊死（Seg一① 筋芽細胞融合の異常：ジス筋では筋管形成に

mental necrosis） と呼ばれる状態をとる。こ際して，筋芽細胞の集合融合が対照に比し不規のように外界との異常交通性を示す部位で，筋の則であり，従って形成された筋管の径にばらつ

過収縮及び節性壊死の変化が進行するわけである。

きが多く，かつ，全般に径の細いものが多かっ〔考案〕た。11日日鶏胚浅胸筋を単独培養した場合，培この対照筋およびジス筋のin vitroでの増殖

養開始後3週目で筋緑経の最大径の平均は対照

・成熟に閲し，その時間的経過より見る限り両者

群13．80±0．79／ m（P＜0．01）であるのに対し，間に有意の差は認められない。この事はWilson

ジス筋では9．77±1．20JJm（P＜0．01）で有意らによるin vitroでの増殖・代謝の解析においに細い事が明らかにされた。また個々の筋繰経ても同様の結果が報告されている。これらの事実においても，太い部分と細い部分の差が著しい。

から，この家鶏筋ジストロフィーにおける遺伝的㊥ 空胞形成：脊髄添加の有無に拘らず，浅胸筋

欠陥は筋の増殖・分化能力に関与する生合成系に培養開始後．4〜5日頃より一部の筋線経に大は大きな異常をもたらさない事が示唆される。

小の空胞形成がみられる。このような空胞の周骨格筋の分化および保持に関し，運動神経支配

囲には筋菜は変性を伴う事は殆どない。これらが重要な役割を有しているが，脊髄添加に伴う神空胞はHRP処理染色によって外表との交通性

経支配とそれによる成熟過程への影響は，対照おが証明され，T管の拡張によるものと思われる。

よびジス筋と右同様であり，この事はジストロフ

この空胞は必ずしもジス筋特有の変化ではなく，

ィーおよび対照鶏間の脊髄と筋肉との組み換え培

健康筋においても同様の時期に少数ではあるが養実験において，神経因子の異常にもとずく病変認められる。

出現は認め得なかった。ジス筋に特有な変化は，

Ⅱ 発生生物・細胞培養

18

発生の比較的初期に筋芽細胞の融合の異常として

照に比し筋径の大小不同および小径緑経の出現が認められる。この異常そのものは変性壊死と直接有意に高い。②ジス病変としては培養約1過後頃結びつくものではないが，ジス鶏の遺伝的欠陥のより筋表面の細孔形成，T管の異常拡張が見られ，細胞膜上での表現として理解出来るものであろう。

この部はHRP法により外液の侵入と貯溜が昂進

この膜異常は，ヒトのDuchenne型筋ジストロフ

している。（参このHRP侵入部位では筋線経の過ィー症においても赤血球膜での異常が指摘されて収縮や節性壊死が見られる。この事は筋でのこれいる事実とともに，これらジストロフィー症群でらの病変は筋の外界との異常な交通性に基因するは，膜を介して異常な形質の表現がなされるといものと思われる。④このようなジス病変の出現にう共通性がある。ジス筋での壊死性変化は表面膜

は筋の神経支配は必ずしも必要ではないが，神経の細孔形成およびそれと密に関連したHRPの異支配のある筋では成熟や分化が促進され，かつ壊

常なとり込みを示す部位から進展する。また，こ死性病変がすみやかに大量に出現する。

の壊死性変化のみならず筋原線経の過収縮およびそれにもとずく筋原線経の断裂などもこのHRPの取り込みの昂進した部に認められる。

文献

この成熟には，神経支配は必須ではないが，神経

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culture studies ofdystrophicand experimentdly
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4）Liberius，R．，Lundquist，1．，Templeton，W．＆Thes−
leff，S．：Intracellular uptakeand degradation of
extracellular tracersinmouse skeletalmusclein
Yitro．The effect ofdenerYation．NeuTOSCience3：

支配が筋組織の成熟を促進している。そしてこの5）

このようにジス筋変性に際して見られる節性壊
死や過収縮などの変化は何れもHRPの取り込みで示される如く，筋細胞への外液の侵入と貯潜と関係している。この事はT管内でのCJト濃度の上昇による筋原緑経過収縮や，蛋白分解酵素の賦癌化による節性壊死の原因となるのであろう。また，ジス病変出現には，筋緑経の成熟を要する。

ことが筋線経での変性の出現を促進せしめていると思われる。
〔要

約〕筋ジストロフィー鶏（California Davis413）とその対照鶏の9−13日鶏胚浅胸筋と脊髄とを培養し，HRP法による筋線維内管構造と外液との交通性を検討し，併せて竃顕による検索を行った。
その結果，①ジス鶏の特異なジス病変として，筋発生早期に筋芽細胞の融合の異常が認められ，対

641・647，1978．
Liberius，R．，Jirmanova，Ⅰ．，Lundsquist，Ⅰ．，Tnes−

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CelIs on aphosphatebufferedmedium．L＞oc．Soc．
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19

5．「筋ジストロフィ（d班y）マウス筋

芽細胞の分裂能低下の機作の研究」
香

川

務＊

研究協力者 智 片 英 治＊：実典 之＊＊橋 本 孝 二＊＊各種動物で見られる筋ジストロフィ羅患動物事，一万，線維芽細胞の分裂能は，正常，筋ジスの筋，その他諸組織の形態的，機能的異常は多彩の間で有意の差の削、事を明らかにし鳶以上の且つ複雑である。我々は筋ジストロフィ症の病因

各結果をふまえて，次の各実験を計画した。

の解析の為に，最も顕著な変化を示す筋組織に研Ⅰ〕筋ジストロフイ再生筋由来筋芽細胞の分裂能究の対象を絞り，既に以下の事について報告した。

低下の機作の解析（1）正常成熟（V＋）及び筋ジストロフイ発症（dy／dy）マウスから単核筋芽細胞を分離し，各々のi乃如JrOにおける筋線推分化の実験系を開発し（a）正常及び筋ジス再生筋芽細胞の各成長曲線をとる。
（b）正常及び筋ジス骨格筋のサテライト細胞のた吾2）この実験系を利用して，正常及び筋ジスト

培養。

ロフイ発症マウス由来筋芽細胞の培養（disper−］〕一正常（＋／＋）及び筋ジストロフィ（dルdy）

Sed cell culture）を行い，いづれも，invitro

マウス骨格筋の九日症川における再生で収縮性を示す筋線経に分化する事を明らかには

今年度は〔Ⅰ〕（a），〔Ⅰ〕（b）について行ったが，〔Ⅰ〕（3）dy遺伝子発現の結果とされた筋ジストロフイ（b）については未だ発表するだけのデータを得てい（dyAy）マウス筋の，invitroにおけるpseudo−

ないので〔Ⅰ〕（aIについて報告する。

straps形成ま，dy遺伝子を持た別、正常

材料と方法（七／＋）マウス筋の培養に於いても．培養条件に再生筋，8〜12週令の正常（C57Bl／6＋／十）よって見られる事を証明し，pSeudostraps形成及び筋ジストロフイ発症（C57Bl／唱J dy／dy）

はdy遺伝子と関係の射、事を明らかにし震）（4）正マウス大腿直筋に20％食塩水を注射（正常マウス

常筋，ジストロフイ筋の定量的な比較を可能とす

では各0．1mg／肢チ）筋ジスマウスでは各0．05mみる為に，正常（＋／＋）及び筋ジストロフイ（dy／肢）し，3日後に同筋を採り，再生筋として．以dy）再生筋由来細胞の筋クロン培養の方法を開発

下の各実験に用いた。なお，各実験内で用いた，

しだ（5協ク。ン培養を利用して，正常（＋／＋）

正常，筋ジスマウスの日令の違いは14日以内であ及び筋ジストロフイ（dy／dy）再生筋由来単核細る。

胞の分裂能を定量的に比較した。その結果，筋ジ単核細胞の分離．各再生筋を細切し，10・戒のス再生筋由来筋芽細胞は．正常再生筋由来筋芽細Freshmedium

胞に比較して，その分裂能が有意に低下している

ペット撹拝法鼠単核細胞を遊離し，白金網＊国立療養所刀根山病院＊＊大阪市立大学医学部を入れた硝子遠心管に加え，ピ150−meSh）でろ過，各再生筋由来単核細胞浮遊液を得た。Fr。Shm。di。孟）を適宜加え，細胞数Ⅱ 発生生物・細胞培養

20

Table lAverage nuInber
Of celi divisions（0−7Cuiture l Cuiture

2

days）
Cuiture3

Norm．6．21士2．08（43）

5．02士2．04（31）

5．24士2．18（23）

Dyst．3．80士1．73（29）

2・37士1・11（16）

4・25士1・86（26）

七一Stat．

p O．01

0・01

NS

七一Stat．：七一 Statistics．（）：Numberof
C010nies used for the count of number
Of celi divisions．NS：nOt Significant．

7
6
5
4
3
つ ん

SuOJSTATp一一父U u0 ＃

1

2

3

4

5

6

Days ofincubation
F土gurel7

5．「筋ジストロフイ（d〝dy）マウス筋芽細胞の分裂能低下の機作の研究」

21

7
一
b
5
4
一
3
2

SuOT．qJ＞Tp ↓T禦U uO ♯

1

2

3

4

5

6

7

Days ofincubation
Figure100個／戒の各細胞浮遊液を調製し，以下の各培
養に用いた。

ロット番号のものを使用した。
培養開始2日目，倒立顕微鏡上で観察しながら培養方法 0．2％ゼラチン処理，60m研一Fal−

培養皿の底面から，各コロニーを円で囲み，番号

con培養皿を用い細胞培養を行った。培養開始24をつけた。各コロニーの細胞数を培養2日目から

時間後，各5meのGrowthm。di。r振培地交換を7日目まで毎日算定し，次の式で定義されるXを行い，更に6日間培養し，固定した。培養条件は各コロニーの細胞分裂回数とした。Ⅹ＝logN／

37℃，湿度100％，CO2 5％，空気95％である。

log2 N：各コロニーの細胞数。成長曲線をとる
為の培養は3回行った。細胞数の算定を始めて後．

（1）Freshmediuml）Eag16sMEM85％
馬血清
10％
鶏胚抽出液

細胞数の増加を認めないコロニーは除外した。又培養の途中で細胞数の増加の停止，或いは，細胞5％数の減少を見たコロニーはその後の細胞分裂回数（2）G，。Wthm。di。孟）※条件培地 90％の計算から除外した。従って，正常，筋ジスのい

牛胎児血清 10％づれの培養においても，分裂回数の計算に用いた※条件培地 Freshmedium を正常マウス再コロニーの数は，培養日数と共に域少した。増殖

生筋由来細胞培養に加え，24時間培養した後，培を示すコロニーの数及び，その細胞数から，次の地を回収し，3000rpm20分間遠心沈殿を行い，各′ヾラメータを求め，正常及び筋ジストロフイ筋

上宿を条件培地として使用した。なおこの実験で芽細胞の間で比較した。

用いた馳glds MEM（阪大微研），馬血清（阪（1）細胞分裂回数の平均：各コロニーで同調的に大微研），牛胎児血清（M．B．A．）は各々，同じ細胞分裂が起ったと仮定し，各コロニーの最大Ⅱ 発生生物・細胞培養

22

Table

2

Average numberof ceii divisions（2−7Cuiture i Cuiture
Norm．3．06士1．89（43）

Dyst・1・45土1・47
（29）

daYS）
Culture2

3

2．99士1．86

2．93士1．63

（31）

（23）

1・32士0・92
（16）
0．01

2．51±1．50

七一Stat．

p O．01

七一Stat．

七一Stat土st 土cs．（）

（26）

NS
Number of

C01onies．used for the count of numberof ce11divisions．NS：nOt Significant・

細胞数に達する迄の細胞分裂回数の平均。

（3）増殖能を示すコロニーの数：その時点迄持続（2）細胞分裂速度：その時点迄細胞増殖を示した 的に細胞数の増加を示したコロニーの数。
コロニーの平均分裂回数を時間（日数）に対して

結 果

プロットし，その時の勾配を平均細胞分裂速度と培養は3回繰り返し行った（培養1，培養2，

培養3）。

した。

7
6
5
4
3
つ ん

SuOTSTATp T一里U u0 ♯

1

2

3

Dtays of・4

5

6

incubation

Fiqure37

5．「筋ジストロフイ（dルdy）マウス筋芽細胞の分裂能低下の機作の研究」

23

u
m

M m岩nJ↓nU

寸
M
N
S
寸
M
N
卜
り
S

丘uT八OtIS

SaTuOTO⊃JO

亀寸 心hnかThu

T Uhコ刃↓nU

SuOTSTATp TTa〇uOT一再qコUuJ 叫O Shd凸卜

N＝岩nJTnU⊂）

Ⅱ 発生生物・細胞培養

24培養のそれに比べて，著しく急速に域少した。し（1）細胞分裂回数
培養開始から培養7日目迄に見られた正常及びかし，培養3では，正常と筋ジスの問で，差を認

筋ジス筋芽細胞の分裂回数の平均値を（Tablel）

めなかった。

にまとめた。全ての培養において，筋ジス筋芽細検 討

胞の分裂回数の平均値は，正常筋芽細胞のそれよ培養1，2，3の札培養1，2に於いて筋ジス筋芽

りも小さく，培養1，2でその差は有意であった。

細胞の平均分裂回数は正常筋芽細胞のそれよりも培養開始2日目に，培養1及び2において，正常，有意に少なかった。筋芽細胞の平均分裂速度は3筋ジス筋芽細胞の間でその分裂回数に有意の差を回行った全ての培養において，正常と筋ジスとの認めた（Figs．1，2）。この差の原因として，（a）

間で有意の差を認めなかった。筋ジス筋芽細胞の筋ジス筋芽細胞は正常筋芽細胞に比較して，細胞平均分裂回数が有意に減少していた培養1，2にお分裂を起す迄の1ag timeが長い，（b）正常筋芽細いて，筋ジス培養の増殖能を示すコロニー数の減胞のコロニーの中には．いくつかのコロニーが融少は，正常培養のそれに比較して著明であった。

合して，細胞数が多くなったものがある，の2つ以上の結果から，筋ジス筋芽細胞の平均分裂回数の可能性が考えられる。（b）の可能性は少いが否定の減少があるとすればそれは細胞分裂速度の減少

出来射、。（b）の原因による誤りを除外する為に培（世代時間の延長）によるものでなく，筋ジス筋

養2日目以後の分裂回数を求め1もble2にまとめ芽細胞は正常筋芽細胞に比し，より早期に細胞分た。培養2日目以後の分裂回数の平均値も．いづ

裂を停止する事によると考えられる。又，Figs．

れの培養に於ても，筋ジス筋芽細胞の培養で小さ

1，2，3に示す様に，培養開始後，細胞分裂を起す

く，培養1，2でその差は有意であった。以上の

迄のlag timeが筋ジス筋芽細胞において延長し6）

結果は我々の昨年度の報告の結果と一致する。

ている事もその原因の1つとして考えられよう。

（21細胞分裂速度

全く同じ条件で3回の培養を行ったが，培養1，2

正常及び筋ジス筋芽細胞の細胞分裂速度をと培養3との間で，一致した結果を得る事は出来

Figs．1，2，3に示した（各グラフの勾配）。正常及なかった。用いた血清（馬血清，牛胎児血清），び筋ジス筋芽細胞の細胞分裂速度の平均値の差の鶏胚抽出液，基礎培地は，3回の培養で同じロッ有意性の検定をする為に培養2日目の細胞数を各トのものを使用した。しかし，細抱培養には細抱

コロニー共1個と仮定し，その後の正常及び筋ジ分離操作，培地の条件化等，未だ完全に同じ条件

ス筋芽細抱の各培養日における各平均分裂回数を下で行う事が不可能な過程を含む。この様な事情求め，各々の間で平均値の有意性の検定を行い，が関与しているかも知れない。

その結果をFigs．1，2，3に示した。3回行った

結 論（1）正常（＋／＋）及び筋ジストロフイ（dル旬の全ての培養において，正常及び筋ジス筋芽細胞の平均分裂回数の間に有意の差を認めなかった。即筋芽細胞の細胞分裂速度（又は世代時間）には有

ち，正常及び筋ジス筋芽細胞の分裂速度の間に有意の差を認めな．かった。

意の差がないと結論出来る。

（2）3回行った培養の内2回の培養で．筋ジス筋（3）増殖能を示すコロニーの数

芽細胞のコロニーは，正常筋芽細胞のコロニーに

前記の様に，正常，筋ジスのいづれの培養にお比較して，著しく早期に細胞の増殖を停止した。

いても，増殖能を示すコロニーの数は，培養日数と共に減少した。各培養日数での増殖能を示すコ
ロニーの数をFig．4にまとめb培養1，2では筋ジス培養での増殖能を示すコロニーの数は，正常

Reft汀enCeSl）Kagawa，T．，Chikata，E．，and Tani，J．（1977）．
βeyebp．βわ155，402．

5．「筋ジストロフイ（dルdy）マウス筋芽細胞の分裂能低下の械作の研究」
2）Kagawa，T．，Chikata，E．，Tani，J・，andTsutamune，T．（1978）．伽yebp．βわエ65，526．

3）Parsons，R．（1974）．肋rure251，621・
4）香川務（1979），第12回日本発生生物学会溝涜
要旨集 A49
5）香川務（1980），第13回日本発生生物学会講演25

要旨集 20A4
6）香川務（1981）．第14回日本発生生物学会講演
要旨集7）香川務，智片英治，谷淳吉，蔦宗俊明（1977），
第30回日本細胞生物学会予稿集A−28

26

6．トランスフェリンと筋細胞の成長小 沢 瑛二郎

研究協力者

木村一郎
伊井一夫

斎藤公司
長谷川孝幸

萩原康子

培養ニワトリ筋細胞が成長するためには，培けて細胞を分散させて単細胞を得た。細胞を85％養液としてEagleのminimum essential me−

MEM，15％ウマ血清から成る培養液（avian

dium（MEM）とウマ血清とニワトリ胚抽出物

basal culturemedium，ABCM）に浮涼し，（EE）の混合液が適しており，広く用いられてゲラチンをぬった35mmのプラスチックシャーレにいる。我々はEEの代りにニワトリ血清を，さら

1〜3×105cell／旬ishに播いた。培養液量は25にニワトリ血清の構成成分である筋成長因子（M戒でこれに適当量の附加物を加え，CO2インキュTF）を用いてもよいことを繰返し発表して来た。

ベーターで4日培養し写真を撮り筋管細胞中に含MTFは，筋芽細胞の増殖を促進し，筋管細胞のまれるCK活性を測定するために細胞を集めた。

変性を抑制してクレアチンキナーゼ（CK）活性

生後2日目ラット後肢筋をWfeの方法に従っの蓄積を促進する物質である。分子量80Kdalト、てトリプシン処理をして単細胞をとり，ニワトリ

On，鮭紅色の蛋白である。酸性において脱色され筋細胞と同じようにして培養を行った。ただし培ると同時に，蛋白はfloccula．tionとなり，遠沈

養液は．85％MEN，15％ニワトリ血液の混合液によって集めることができる。この蛋白には筋細（mammalian basal cultureI代dium，MBC

胞成長促進能はない。しかし塩基性で蛋白と上宿とを混合すると蛙紅色は回復し．筋細胞成長促進

MTFは以前報告した方法モ）ニワトリTfは能も回復する。分子量や色調はトランスフェリン

L。ilmanとAis。nのリヴアノ＿ルを用いた方法（Tf）のそれと一致する。またTfは酸性でFeで精製し，オヴオトランスフェリン（OT）は卵を遊離し，塩基性で結合することを考慮に入れる

白のアセトン粉末から抽出した。その他のTfはMと，MTFはTfである可能性が考えられた。

TFの精製法にはゞ等しい方法によったが，アセ以下の報文では，MTFがTfであること，筋細胞成長促進にはTfはFeを結合した形が必要

トン処理を省略し，DEAE Sephadexの代りにCM Sephadexを用いた。

であること，Feイオンそのものでも有効である

EEは12日ニワトリ胚を，等量の0．9％NaCl

こと，Tfには哺乳煩，一馬頬間では類特異性があ中でホモジェナイズし，その遠沈上清を用いた。

ることを示した。

免疫血清はTfやOTを雄家兎に注射することによって得た。

材料と方法

CK活性は，クレアチン燐酸とADPからATP

培養細胞：11日日ニワトリ胚胸筋を機械的に解を合成させ，最終的にNADPHを測定する方法と．
ATPとクレアチンとからクレアチン燐酸を合成＊国立武蔵療養所神経センター．機能研究部

させ，移った燐酸量を測定する方法とを用いた。
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6．トランスフェリンと筋細胞の成長

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第1図

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ニワトリトランスフェリンのSDSゲル電気泳動パターン3）
左から分子量マーカーの位置，MTF，MTFとTfの混合試料，Tf，とOT。MTFとTfは区別できないがOTは分子量がやヽ小さいところに現われた。
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第2図トランスフェリンの筋細胞成長促進作用3）a）0・9％NaCl．b）MTF．C）Feを結合したTf，d）Feを結合しないTf。
e）Feを結合したOT，f）Feを結合し射、OTをそれぞれ10pg／mB加えて培養した筋細胞
Bar：100／上m

Ⅱ 発生生物・細胞培養

28

EffectoIF㌔◆onskeletalMyogenicCeIIG，。WthtF●】●hr代ルH
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︵名石＼ミ己小石∈ユ︶倉＞宅巾ゞU

第3図 TfとF。のニワトリ筋細胞成長に対する用量反応曲射∠
図の上線の横軸は，加えたFeから培養液中に存在するウマapOTfを引いた値⁝■ ●一 ︑ 亡︑■〇一主ニー亭享石一YU

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第4図 ニワトリ筋細胞成長に対する各種動物のTfの用量反応曲線5）

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第5図 ラット筋細胞成長に対する各種動物のTfの用量反応曲線5）

6．トランスフェリンと筋細胞の成長

CK活性は殆んどすべて筋管細胞に由来し，単29になった。（第2図参照）

核細胞には極くわずかしか含まれない。筋管細胞

Tfには種々の金属イオンが結合することが分は筋芽細胞が分裂した後融合して形成されるので，っているが，OTにFeの代りにCu PMnを結CK活性は筋細胞の成長の度合を示す指標として合させたものでは筋細抱成長促進能は認められな用いることができる。

かった。
トランスフェリン蛋白に結合していないFeイ

結果

ニワトリMTF，Tf，OTは，何れもSDS

オンの筋細胞成長促進能を調べた。Tfに結合したFeの約200Xの濃度のFe

イオンにはかなり

ゲル電気泳動上単一バンドを示した（第1図）。

の作用が認められた。ABCMには，ウマ血清がMTF，Tfは分子量80Kで，二つを混合して泳含まれているので，当然ウマTf が大屋に含まれ動した場合にも単一′ヾンドを示した。OTの分子ている。そのうちはヾ％はaI刀Tfであるし，apO

量はやゝ低い値を示した。

TfめFe結合能は非常に高いので少量のFeはウ

MTF，Tf，OTの蛋白構造の異同の大よその目安をつけるために，α−ChymOtrypSinやpap−

マapOTfにとられることになる。従ってこの効果を差引いて考えなければならない。（第3図）

ainで処理した後，SDSゲル電気泳動を行ってニワトリ筋細胞はABCM中では成長しない。

ペプチドマップを作ったところ，三種の物質は区

このことはウマTfがニワトリ筋細胞には有効で別できないパターンを示した。

ないことを示す。事実MEMとウマ血清の割合を

抗Tf及び抗OTウサギIgGに対するMTF，

広範囲にかえてみても，ABCMにウマTfを加Tf，OTの反応をOuchterlonyの二重拡散法

えてみても，その中ではニワトリ筋の成長はみらで検討した。何れの組合せでも単一の沈降線を生れなかった。

じそれらはお互に融合した。

ニワトリ筋細胞をABCMに各種動物のTfを

以上から三種の蛋白は同一性質を持つと思われ加えた培養液で培養した。ニワトリ，ガチョウ，るが，この三種の蛋白とFeの結合性と筋細胞成

シチメンチョウのTfは有効であったが，ウマ，ウ

長促進作用との関係を調べた。

サギのTfは無効であった（第4図）。ラット筋細MでF，Tfを0．1MNaqAcetate，0．2MNb−

胞をMBCMに各種動物のTfを加えた培養液でphosphate，10mMEDTA（pH4．5）に透析し培養した。ウマ，ウサギのTfは有効であったが，てFeを除き，apOMTF，apOTfを作った。O

ニワトリ，ガチョウ，シチメンチョウのTfは無

TはFeを持っていない。三種の蛋白に一定量の効であった（第5図）。ウシのTfは高い濃度ではFeを与えた後結合しないFeをゲJL／炉過をしてニワトリ，ラットの筋細胞に対して有効であった除いた。与えるFeの量が増すにつれて結合したが，程度は低かった。

Feの量も増加し，465miLm（Fe を結合したトラ

筋細胞成長促進という作用に関しては，EEとンスフェリンに特徴的であるとされる波長）の吸

Tfとは類似の作用を呈するので，EEとTfの収が増加した。蛋白量1モル：Fe2モルに与えた関係を調べた≡）EEを抗ニワトリTfIgGで処理時に最高に達しそれ以上のFeを与えてもFeの結合し沈降物を除いたものや，EEを酸性で透析LTfは増一さなかった。このモル比はトランスフェリンに結合したFeを除く条件で処理したものは，Eの性質として報告されているFeの結合量と一致

Eは筋細胞成長促進能を失った。しかしこれにニワする。このようにしてFeを結合した蛋白の筋細トリTfか，Feを加えると成長促進能が回復した。

胞成長促進能は，結合したFeの量と比例して増

またEEからTfを精製することも可能であった。

加しモル比1：2の点で最高に達し以後プラトー

一方Tfを除いたEEのみでは成長促進能はないが．

30

Ⅱ 発生生物・細胞培養

Tfを加えると加えたTfの持つ成長促進能より．しても，筋疾患の一つの原因としてFeの欠乏をもずっと大きな成長促進能を示した。従ってEE挙げ得る可能性は顧慮してもよいだろうと思われはTfを増強する物質も含んでいる。

る。我々はFe欠乏というと貧血を考え勝ちであるし，それは又正しい。しかし骨髄における造血
組織は血清そのものと接触するためにかなり大量

ca，r。指i1911年初めてEEを導入して以来のTfの供給が可能である。一方筋細胞は組織液

その本体をになっている物質を知ろうとする試みと接触するだけなのでかなり稀釈されたTfが供は，繰返して行われた。しかし何れも成功するに給されるにすぎない。従ってわずかの血清Tfの至らなかった。上に述べたように我々はEEの最低下が，筋細胞に供給されるFeの絶対量の低下も重要な因子の一つがTfであることを明らかにを釆たす可能性は存在すると思われる。なお組織夜した。しかもそれはTf蛋白そのものではなく，の一種と考えられる脊髄液中に含まれるTfの濃蛋白についているF、eに本質的な意味があり，Tfは度が，培養液で必要とされるTfの濃度とはヾ同Feの担体として細胞表面のレセプターにつき，じ桁であることは，Tfの生理機能を知る上での何らかの方法で細胞へFeを与える役割を行うと一つの手がかりとなるだろう。

考えられる。我々はすでに筋原綿抱にTfに対するレセプターが存在していることを確認した。
我々はTfが筋芽細胞の増殖に必要であること
文のみならず，筋原細胞特に大きな筋管細胞の 健．献康∬ を保つために必要であることを示した。すな

1）Hagiwara，Y．etal：Develop．GrowthandDiffer・
23，249，1981．

わち，一度成長した筋管細胞も，Tfを培養液か

2）Leibman，A．J．and Aisen，P．：Archiv．Biochem・ら除くことによって変性してしまう。我々はこの変化がFeイオンによってもある程度阻止し得ることを認めた。
これらのin vitro研究の結果をただちにinVivoの筋疾患と結びつけて考えることは困難にBiophys．122，717，1968．
3）Kimura，Ⅰ．etal．：Proc．JapanAcad．57（も），200，
1981．
4）Hasegawa，T．etal．：ibid．57（B），206，1981．
5）

Ozawa，E．and Hagiwara，Y．：ibid57（B），406，
1981．

6）Ii，Ⅰ．etal．：f鋸d57（B）211，1981．
7）Carrel，A．：J．Exper．Med．14，244，1911．

Ⅲ

7

Whole Animal

ジストロフィー筋などの移植に関する研究一筋再生に及ぼす神経支配の影響

33

8 ジストロフィーおよび正常チキンにおける筋線維数の経時変化 39
9筋ジスマウスの筋線経の成熟成長障害

44

10 三つの筋神経系異常マウスにおける指標酵素の活性変動の比較 49

33

7．筋再生に及ぼす神経支配の影響
寺 尾 寿 夫＊
研究協力者 増 野 和 子＊ 大 沢 仲 昭＊＊

目

的出し，その後すぐにその部位に軽いtenSionをか動物の筋肉を取り出し，これを再びもとの動物

けて移植を行なった。この移植は左右のEDLにに移植したり，またはヌードマウスなどの他の動ついて行ない，さらにその際に一側の坐骨神経を物に移植した場合，これがどの様な変化を受け，背部の大腿骨頭附近で切断し，約5mに亘って切再生してくるかについて研究を行なってきた。移除した。

植された筋肉はSatellite cellよりmyotube

移植筋は，種々の時間後に左右とも取り出し重量が形成され，さらに構紋が作られて，成熟した筋など測定の後，クリオスタットを用いて薄切LH．E．，

線維となる。しかし，もとの筋線維にく．らべ，とTrichromeなどによる通常の染色とATPase，

くに異なるのは再生して出来た筋線経の直径が細DPNH，SDHなどの組織化学的染色を行なって，

いことである。この現象は皮下に／ト筋肉を移植しcontrol側とdenervation側とを比較した。

た場合も，Studitskyの方法によりminced fr−
agmentを移植した場合も，EDLなどの筋肉をそのまゝの形で移植した場合も同様である。

結果

移植後の変化を時間を追ってみてみよう。

これらの再生筋の直径の増大には，血流の回復

1）移植後4日目の移植筋を見ると，中心部にはや筋に加わるtensionなどが関係していることは

もとのEDLの筋緑経が残存している。しかし，明らかであるが，これと共に重要なのは移植筋に

graft周辺部にはfilroblast．myoblast，ma−

対する神経の再支配，すなわち，hげSt側からのCrOPhagdなどの細胞が増し，核の増加がみられ神経の再生と再生筋への連絡も重要なものと考える。これをへマトキシリンのみで染色してみるとられる。

第1図の如く，graft周辺部に環状に核の濃染す

この研究は．このような神経の再支配が筋の再生に及ぼす影響を知るために行なったものである。

る帯がみられる。それらの変化は除神経側とコントロール側でほとんど差がみられなかった。
2）さらに．移植後1週を経過すると，この細胞

方法

筋肉の移植には種々の方法があるが，この研究

分裂帯の輪は中央に向って進み，その後に再生筋がみられるようになる。これをAT Pase染色

ではラットのEDLを用いてOrthatopical au−（pH9．4）でみると，最外層にすでに酵素活性を

totransplantationを行なった。すなわち，ネ有する再生筋がとりまき，中央部はなお残存する

ンブタール麻酔下にラットの長指伸筋を，これにEDLによるCheckerboard patternが残って入れる深誹旨神経などをなるべく長く残して切りいる。第2図はco丘（テol側の移植1週目のATP＊帝京大学第一内科＊＊東京大学第三内科

ase染色を示したものである。これをdenervaト
ion側と比べると，denervation側でやヽ筋の再IB Whole Animal

34

第1図 移植後4日目の再生筋 へマトキシリン染色

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第2園 移植後1週目の再生筋 ATPase染色（pH9．4）

7．筋再生に及ぼす神経支配の影響

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第3図 移植後2週目の再生筋 左：コントロール側，右：除神経側第4園 移植後3週目の再生筋 上：コントロール側，下：除神経側TJ■・ごVhm Whole Animal

36

第5図

移植後3週の再生筋（コントロール側）

ATPase染色

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第6図

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移植後3週の再生筋（除神経側）ATPase染色指優澗叫．筍

7．筋再生に及ぼす神経支配の影響

37

▼

独コ溜中

ー
ー
ー I ．

移植後3週日の再生節 ATPase染色
左：コントロール側，右：除神経側生がおくれる傾向はあるが，COntrOl側との間に下のことが多い。

大きな差はみられなかった。

組織化学的にはATPase7gどの酵素活性は第23）2週目：移植後2週目のものを見ると，gr−

週のものに比し，より強くなっており，また一部

aftの中心部まで完全に再生筋で埋まるようになにはすでにfiber typeのdifferentiationがる。これらの再生筋は組織化学的に見ると，すべみられる所もある。しかし大部分の再生筋はこのての再生筋線経がAT Pase活性を有しており，同時にDPNH，SDH73：どの活性も有している。

時期でもATPase，DPNH，SDH7まどのすべての酵素活性を有している。3週目の再生筋を

第3図はdenervation側とcontrol側とを比較した

COntrOl側（第5図）とdenervation側（第6図）

ものゝ1例であるが，一般にdenervation側とを比較してみると，denervation側の再生状態の再生筋はcontrol側より細い傾向があった。

は悪く，結合織が多く，とくに中心部はしばしば

この時間までは両者間の差は軽度であるが，それ線維化を示していた。

以降は両者の差が目立つようになる。

また再生筋線経の数がdenervation側で減少して

4）3週以降：第4図は移植後3週目の再生筋をいるのみでなく，個々の再生筋繰経をみても，とり出し，denervation側とcontrol側とを比較

COntrOl側は第7図に示すように比較的直径の揃したものである。これにみるように再生筋の外観った再生筋線経がみられるがdenervation側ではではdenervation側は明らかにcontrol側より小さ

再生筋線経の直径にばらつきがあり，また細いもくなっている。この差は時間が経つと共に明らかにのが目立った。

なり，移植後4週目ではcontrol側再生筋重量は約501ng前後なのにdenervation側の重量は半分以Ⅲ

38Whole Animalの分化はmyoblastic stageでとまってしまうこ
考

察とはないと報告している。我々の研究は筋全体を除神経が筋の再生に如何なる影響を及ぼすかに移植するものであり，筋の一部をCruShする場合

ついては既にいくつかの研究が行なわれている。

よりも，筋の再生に関して結果の判定が容易であ

しかし，その結果には相反するものもあり，かなる。そしてこの観察でもmyoblast，rTWOtubeのらずLも意見の一致をみていない。この様な異る形成は神経支配の影響を受けていないことを示し結果をもたらす理由の第1は実験法の差によるもていた。しかし時間と共に再生筋の発達は除神経のであり，第2は実験動物の差によるものであろ側では障害され始める。現在は更にその後の長期う。

間の影響について研究中である。

Saundersらは，神経切断後3週目の筋にCruSh
injuryを与え，その再生を観察したが，筋再生

結

果には神経の存在は無関係であったと述べている。

本研究はラットのEDLのautOtranSplantat−

Vidikの報告では，結崇による筋損傷後の再生は，ionによる再生を坐骨神経を切断した場合と，し除神経筋では正常筋より再生過程の遅延がみられ，ない場合とで比較した。myOblast，myOtubeのまた再生筋線経の配列の不規則がみられる以外変形成は除神経で影響されないが，2週目以降では化がなかったという。これに対し，Denny−Br−

再生筋は数も直径も減ずることが明らかになった。

OWnはネコの除神経筋と正常筋に損傷を与えその今後更に長期の観察を続ける予定である。

再生を比較した所，除神経後3週までは差がない
が，それを過ぎた除神経筋ではmyotube までしか再生しなかったと報告している。
Studitsky らによれば．再生している筋にと文

献1）Gutmann，E．：Tbedenervatedmuscle．Pubushinghouse of the CzechosloYak Academy ofScience，う。これに対し，Zhenevskayaはラットの俳腹筋

Prague，1962．p．121．
2）Saunders，J．H．and Sissions，A．：The effect of
denerYationontheregenerationofskelctalmuscle
がteri頭u汀．エβ0月eα〃dJo加血略，358：113，
1953．

をcrushL，その再生を正常の神経支配下と誹骨

3）Denny−Brown，D．：Theinfluence of tensionand
innerYationontheregenerationofskeletalmuscle．

って神経支配は不可欠であり，再生筋に神経支配がないとmyoblastic stageで退化消失するとい神経を切断した後で比較した。その結果は，神経の支配は筋の再生に重要ではあるが，除神経筋で

エ肋〟rOp山九10：94，1951．

39

8．ジストロフィ

ーおよび正常チキンにおける筋線推数の経時変化
大 塚 正 徳＊研究協力者 弘 中 哲 治＊＊五十里 良 生＊＊
宮 田 雄 平＊ニワトリの筋ジストロフィー症の発症原因おより発生させた単収縮をオッシロスフープ上に観察

びその桟序の解明を目的として正常およびジスト

し，Ⅹ−Yレコーダーにスコープメモリーを介しロフィーチキン（line412および413）の筋のて記録した。筋の収縮を記録した後，筋を摘出し，収縮力および形態の経時変化を比較検討した結果，重量を測定した後ホルマリンで固定した。固定し主としてその筋線維数において両者の間に著しいた筋の近位端から約％の部位を横断LHE染色を差違が存在することが明らかとなった。すなわち，

行ない筋線経の数を顕微鏡下に測定した。

ジストロフィーチキンでは筋線維数が正常チキンにくらべて有意に減少しており，その原因は貯化

結

果後1〜2週間にみられる約70％におよぶ筋線維数

筋成長の比較：筋成長の過程をより定量的に比の増加がジストロフィーチキンにおいて強く抑え較するために相対成長式（1）を利用して分析したミ）

られていることによるものであった。この将化後

y＝bxk

（1）

初期における筋発生異常が成長後の筋におよぼすこゝにkは平衡定数を，bは初成長指数を示して影響についても考察する。

いる。式（1）の両辺の対数をとると，logy＝logb十klogx

方法

正常およびジストロフィーチキンをほヾ同数僻化し，以下の実験に用いた。アトロピン前処置（2）となり一次式の形に変換され，最小二乗法により
kおよびbを決定することができる。
図1は横軸に体重g），縦軸に筋重量（mg）の対（100〟g／kg，i．p．）後，酸素吸入下にエーテル麻数をプロットしたものであり正常，ジストロフィ

酔を行倒、，ニワトリを背位に固定した。皮膚をーチキンとも2つの直線成分から成る関係が得ら

切り開き長横側手椴伸筋を露出し，切開した皮膚れた。成長の初期の段階における第1の成分の平を利用してパラフィンプールをつくり筋の温度を衡定数（勾配）は正常およびジストロフィーチキ

41−42℃に保って等尺性収縮を記録した。麻酔

ンで2．28および2．31であり大きな差はみられなかの深度は眼球運動の停止と安定した呼吸運動を目ったが，初成長指数はそれぞれ0．0028，0．0036で安に調節した。

ありジストロフィーチキンにおいて約1．3倍大で白金電極を用い持続0．5msecの矩形波刺激をSupramaXimalの強度で筋こ直接与えることによあった。第2の成分の平衡定数はそれぞれ0．965．

＊東京医科歯科大学医学部薬理学教室
華＊帝京大学医学部薬理学教室

0．902であり，ジストロフィーチキンでやゝ小さい値を示したが初成長指数はそれぞれ1．13，1．86
であり逆にジストロフィーチキンの方が約1．6倍

︻ロ∈︼l鳥芯‡ ヱUS⊃≡︻ひ∈︶ lエ澄む‡ 旦US⊃≡
20

Body weight tgl）
ト

図1．体竜と炭焼側手根伸筋の相対成長

A B

媚化後2日から駄目にわたる成長期にあるニワトリを対象とした。■丁8．ジストロフィーおよび正常チキンにおける筋緑椎数の経時変化大であった。すなわち，相対成長の全過程においてジストロフィーチキンの初成長指数が増大して

No

N＝

41

＋N∞（3）

1＋exp〔Tk′（T−t）〕

いることが明らかとなった。体重の径時的変化は

こヽにNoは変性脱落して行く筋線経の総数を，N

本実験で取り扱った正常およびジストロフィーチ

は時間tにおける生存数，N∞は成長後一定になキンにおいて認めるべき差がなかった（図2）こった時期の筋繚維数を表わす。実際の計算にあたとから上記の両者間における差違は筋におけるジっては（3）式を変形し，対数をとることにより一次ストロフィー変化を表現しているものと思われる。

式の形に直して最小二乗法によりk′およびTを決

筋線維数の径時変化：図3は正常（●）および定した。図3の曲線はこのようにして得られた理ジストロフィー（○）チキンにおける長榛側手根

論曲線である。図3にみられるようにk′およびT

伸筋の筋線維数の経時的変化を示したものである。

について正常およびジストロフィー間に認めるべ

酵化後2〜3日においては両者とも約15，000本でき差はなかった。しかし500日日あたりの高齢で認めるべき差がなかったが．13日目では両者とも

は正常チキンは緑維数の械少をみたが（矢印），筋緑維数が増加し，ジストロフィーではその増加

ジズトロフィーチキンではその減少はみられなかの程度が抑制されていることがわかった。以後そった。すなわち，ジストロフィーでは野化後の筋の数は正常，ジストロフィーとも漸減し，60日日

発生に異常が存在するが，加齢による老化的変化

位までには一定の値に達した。この減少の仕方をはむしろ少ないことが明らかとなった。

下記の〈3）式で解析したミ）

単収縮の経時変化の比較：図3で調べた筋線

lmE︼ l舌芯葺 合〇日

AgeIdaysI
図2

体重の経時変化●，正常チキン；○，ジストロフィーチキン。
曲緑は3次のpolynomial regressionを示す。

Ⅲ

Whole Animal

竜王S巴q岩山竜Sコ∈−︒・忘丘∈⊃Z＿−‥−＿‥一

150

I

1

500

Age tdaysI
図3

長暁側手根伸筋の緑維数の経時変化●，正常チキン；0．ジストロフィーチキン。縦棒はS・E・を示す。

維数を用いて筋線維1本当りの単収縮を図4に示した。図にみられるように，ジストロフィーチキン

量には正常チキンとの問に大きな差がなかった（未発表データ）ことから，ジストロフィーチキ

における著しい筋線維数の減少にもかゝわらず1

ンで筋線経のサイズが著しく増大していることが本当りの筋収縮力の平均はほとんど変わらないこ考えられる。
ジストロフィーチキンでは老化による筋のとが明らかとなった。

変性消失がみられなかった（図3矢印参照）。
考察正常チキンで老化に伴って起こる筋線経の減少と，本実験で明らかとなった正常チキンとジストロ

ジストロフィーチキンで野化直後に発生が抑えらフィーチキンにおけるきわだった差違は筋の線維れた細胞とが対応している可能性があるが，結論数の違いであった。従来，筋の変性，再生の過程を得るには今後の研究に持たねばならない。成鶏がジストロフィー筋において顕著であるとされてを用いた実験においてはこの老化による変化の差いるかく）図3に示されたように正常チキンでも同をジストロフィーによるものと間違えないようにじように筋の変性，消失が起こっているので，このする必要があろう。

筋緑維数の差はジストロフィーチキンにおける膵

図4に示したように筋線維1本当りの収縮力は化後の初期筋発生の抑制によってもたらされたもジストロフィーチキンでも正常と同程度に保たれのであることがわかる。ジストロフィーチキンでている。このことは別の見方をすると肥大した筋

筋線維数が少ないにもかゝわらず（図3），筋垂

肉は収縮力の増大に寄与していないことが考えら

8・ジストロフィーおよび正常チキンにおける筋線維数の経時変化

43︵ロ∈一巴q；ヱUSコ⁝＼亡0仙SuU︸上Uljト

Age（days）
図4

筋緑維1本当りの単収縮の経時変化●，正常チキン；○，ジストロフィーチキン縦棒はS．E．を示す。

れる。いずれにしても，ジストロフィー筋の収縮
文

力減弱の一義的原因は野化後の初期筋発生の欠陥にあることが強く示唆される。
ラットにおいてもやはりposinatalに筋の発生が進むことが報告されている雲5）この時期はまたpolyinnervation−eliminationの行7＝われる期間でもありで）発生異常の起こる確率が高いことが予想される。
ジストロフィーチキンの婿化後の筋発生異常が筋自体に原因があるのか，この筋群を支配する
神経側にあるのか，あるいは両方に異常が存在す
るのかについては今後の研究にまたねばならない
が，この点に関して我々が先に報告した異常放電をするニューロンがジストロフィーチキンの中枢神経系に存在する事嘉左興味あることと思われる。

献1）Huxley，J．S．（1924）．Constantdifferentialgrowth−ratiosandtheirsignificance．肋hLre114，895−896．
2）Johnson，F．H，，Eyring，H．andStoYer，B．J．（1974）．
The theoryofrateprocessesinbiologyandmedi・
Cine．JohnWiley＆Sons，NewYork．
3）Yorita，T．，Nakamura，H．andNonaka，T．（1980）．
Satellite ce11s and muscle regeneration in thedeYeloping dystrophicchicken．EkpE．NburoL70，
567・575．

4）Betz，W．J．，Caldwell，J．H．and Ribchester，R．R．
（1979）．The eize ofmotorunitsduringpostnatal
developmentofratlumbriCalmuscle．J．用ysicat．
297，463−478．
5）Ontell，M．andDum，R．F．（1978）．Neonatalmuscle
growth：AquantitatiYe Study．Am・J・Anat・152，539−556．

6）Bennett，M．R．and Pettigrew，A．G．（1974）．The
formation of syhapsesinstriated muscle during
developmenLJ助γよねエ241，515−545．
7）Miyata，Y．，Morimoto，S．，Ikari，Y．，andHironaka，T．（1981）．0riginofthespikedischa∫geSObserved
inmusclesofdystrophicchickens．BiomedRes．2，
664−672．

44

9．筋ジスマウスの筋線経の成熟成長障害

＊

勲 子彦

＊
＊

＊

＊

章勝

＊

浦大嶋

本島田

武＊

＊

美博 昭

塚貴茂

戸辺野谷
渡清水

研究協力者

マウスの筋ジストロフィー症（dy）は，骨格筋

マウスの坐骨神経刺激による排腹筋の誘発筋電位の成長が阻害されることによる疾患であることを，を，針電極で単極導出した。刺激は双極電極を用実験的に明らかにしてきた。成長の停止した筋が，いて0．05msecの矩形波を0．5、または5Hzで与成長を続ける骨によって引き伸ばされる（加齢にえた。刺激強度は，最大振巾の誘発筋電位が得ら伴う筋一骨の不均衡の増大）ことが症状と密接にれた強度の2倍に設定tた。誘発筋電位は10−20

関連していると考えられる（Fig．t）。実際に，コ重ね焼きし，尖頭間振巾などを計測した。

我々は，小人症遺伝子（dw）を用いてdyマウ

生化学的研究5）スの成長を抑制することで，dy症状の不顕化にマウスから前肢筋（t．、riceps）を摘出し．0．02

成功したt）最近，Zatzらは，D。Ch。nn。型筋ジ％NaN】と0．2mMphenylmeihylsulfonylfl−ス症とGH欠乏による小人症の重複疾患児で，筋uorideを含む50mMNa・P・buffer（pH7．4）

ジス症状が軽いことを報告している≡）また，Ki一

中で，PolytronPT−10を貝いてホモジナイズ

mg らは，抗甲状腺剤の一つであるプロピルチオ

し，28，000gX30minの遠心分離で得られた沈恋

ワラシル投与で，筋ジスニワトリの症状を軽減すを上記bufferに懸濁した後，−20℃で凍結保存ることに成功している（筋線経の異常肥大を抑えした。適時，凍結試料に1／々5容量の50mMEDTる目的で抗甲状腺剤を使用した）ヲ

A（pH7．4）を加えた後解凍し，超音波処理をし我々はまた，dyマウスの筋成長阻害が，筋線て以下の実験に使用した。

経の成熟成長阻害によることを，生化学的，形態

湿重で2．5mg（1月齢より若いマウスについ

学的に明らかにしてきた！）このことをさらに確かては1．25mg）の筋とlnMの125I−a−bunga−

めるために，本研究を行った。

rotoxin（a−BGT）を50mMのNa・P・buffer（pH74，2mg／mlのBSA，0．02％のNaNJを材料 と 方 法含む）中で37℃1時間振塗加温し，それをミリポ

筋ジストロフィー症（dy）マウス（C57由L／

アフィルターで炉過した。試験管およびフィルタ

6Jdy／dy）と，正常マウス（dル／十と＋／＋）をーをBSAとNaNJを含むNa・P・bufferで洗っ用いた。

た後，フィルター上の放射能をr−カウンターで電気生理学的研究測定した（Rl）。反応液中にlJ上Mの非標識α−ウレタン（1．0−1．5g／kg，i．p．）で麻酔した＊愛知県心身障害者コロニー，発達障害研究所＊＊名古屋市立女子短期大学

BGTが存在した時の値（R2）を同様に測定し，RlからR2を引いた値夏怒トα−B／釘の特虞的結
合とした。

45

9．筋ジスマウスの筋繰経の成熟成長障害
ABONE−MUSCLEIMBALANCEHYPOTHESISGenedyThegrowthofskeletalmuscles
Isarrested：
Maturationaldefects ofmusclefibers．

The growth orbones
Isalmostnormal．

Age−relatedincreaseinbone−muSCleimbalance：
Progressofthedisease？
POSSIBLESYMPTOMATICTREATMENTS？
Ⅰ．Hypophysectomy＊oranti−CHdrugS．
ⅠⅠ．Thyroidectomyoranti−thyroiddrugS＊＊．

Fig・1・Abone−muSCleimbalancehypothesisforthepathogenestsofmurinemuscular
dystrophyandpossiblesymptomatictreatments？
＊Latentdystrophicsymptomingenotypicallydystrophic・dwarfmice（Totsuka，T．etal．，1981），andasimilarclinicalcase（Zatz，H．eta1．，1981）．
＊＊Improvedactivityinpropylthiouracil−treateddystrophicchickens（King，D．B．eta1．，

1981）．

結果

電気生理学的研究
まず，0．5Hz刺激を行い，誘発筋電位の波形の特徴などを調べ，振巾値（尖頭間）を，羅患群，した14匹中7匹）さえ観察された。
生化学的研究2週齢から8週齢のマウスを用いて，前肢筋のα−BGT結合活性の加齢に伴う変動を調べた

正常群で比較した。誘発筋電位は，高振巾の2相（Fig．3）。dyマウスの発症（2週齢頃）後，初性の波（Fig．2，Aの上図）で，擢患群，正常群

期の時点では，まだ正常群と雁患群の問にほとんとも，外側より内側（同一俳腹筋では）で大きか

ど差はみられなかった。1月齢を過ぎる頃から，ったミ）また，正常群に比べると，擢患群の振巾は

擢患群は，正常群に比べて異常に高い値を示すよ少レJ＼さめで，しかも個体間の変動が大きかった。

うになった（筋湿重あたり）。しかし，加齢に伴すなわち，正常群に近い大きさ（例えば2月齢でう変化としてこれを観察すると，正常群の値は加80mV弱）のものや，％の大きさにも満たない

齢に伴い減少する傾向にある一方，罷患群の値は（45mV）ものもあった。

加齢と無関係にほぼ一定の傾向にあることが認め

つぎに，刺激の頻度を5Hzに上げたところ，
Fig．2．Aの下図とB（各点は平均値）に示す通られた。
形態学的研究り・，正常群の2月齢，7月齢のものでは，急激に後肢筋（biceps）については，マウスの生後振巾が減少した。しかし，正常群の16日齢，雁患

成長に伴い，正常群の筋線経の太さが10日齢（20群の16日齢と2月齢，のものは，5Hzの反復刺〟m位）から3月齢（40／上m位）にかけて急激に激に抵抗性を示し，あまり顕著な振巾の域少はみ増大する一方，擢患群の大部分の筋線経の太さはられなかった。特に，2月齢の例にみられるよう

20／ m位に止まっていることを，さきに明らかにに，擢患群のなかには，振巾が増大するものl（試した思）前肢筋については，まったく報告がない。

Ⅲ

46

Whole Animal

1−Ⅰ

3

4

Cα血d

Fig．2．MuscularpotentialsofgastrocnemiuseYOkedbysciatic−nerVeStimulationindys・
trophicandnormalmice．
A）Representativepatternsby O．5Hzー（upper）and5Hz−Stimulation（lower）・1・Iandl−ⅠⅠ；16−day−and2−mOnth−01ddystrophicmice．2，3and4；2−mOnth−，7・mOnth−and16−

day−01dnormalmice．Calibration；40mV−4msec．
B）Time−COurSeSOfchangesinmusculaTPOtentialsduling5Hz−Stimulation．Anarrow
indicatesthatthesevalueswereobtainedimmediatelyafterthestartof5Hz−Stimulation．
＋；2−mOnth・01ddystrophicmice（n＝7and7）．△，OandD；16・day−（n＝8），2−mOnth−（n＝13）and7−mOnth−01d（n＝7）normalmice．Means（％）atYarioustimesareplotted・

9．筋ジスマウスの筋緑経の成熟成長障害

47︵当SS；ひE︑む一〇∈こPu⊃Oq h望甲も4

Age of mouse（week）

Fig・3・Age−relatedchangesinuptakeof1251・qBGTbyhomogenizedmuscles（forelimb，
triceps）ofdystrophicandnormalmice．

そこで前章毘同様の方法（パラフィン，横断切片

考察HE染色）で，2〜3月齢の羅患マウスと正常マ

成熟マウスで，5Hzの坐骨神経刺激に対する

ウスの前肢筋（triceps）の筋線経の太さを測定

誹腹筋の反応性は，正常群と曜患群で大きく異なした。正常群の筋線経の太さ，37．1±10．7／上mっていた。誘発筋電位の振巾からみるかぎり，正（mean±S．D．，n＝716）に対して，羅患群の筋常群が見掛け上急速に疲労する一方，罷患群には緑経の太さは，22．5±11．5（n＝1，100）と頚著

ほとんど疲労がみられなかった。ただ，正常群のに細いことが分かった。生後成長との関連はまだ械衰後の振巾値が雁患群の振巾値に近かったこと調べていないが，本結果と後肢筋の結果を合わせは，正常群の振巾の可変域は，羅患群の振巾を越考えると，前肢筋についても，正常マウスでは生

えて正常成熟マウスが獲得した余裕分（優秀さを後成長に伴う筋線経の肥大成長があり，羅患マウ

示す？）とも思われる。今回の実験結果は，Sa−スでは筋線経の肥大成長が停止してしまっているndow＆Brust（1962）の結果（筋の直接刺激にらしいことが推察される。

よる筋張力測定→、by筋は疲労に強い〝）と相通ず

Ⅲ

48

Whole Animal

るものと思われる。

ん，正常マウスでも誘発筋電位の振巾の減少傾向

若いマウスでは，5Hzの刺激に対する俳腹筋

は非常に小さかった。このことから，筋ジスマウの反応性が，正常群，雁患群とも，成熟曜患マウスの筋が見掛け上疲労に強いのは，筋の成熟度がスの場合とよく似て，誘発筋電位の振巾の減衰が低く，若い筋の状態に止まっているからだろうとわずかであった。これらの結果を総合して考える推察された。

と， dy筋は疲労に対して強い抵抗性をもつ〝

2．筋ジスマウス前肢筋のα一一BGT結合量（筋というよりは， dy筋では成熟成長が停止してい湿重あたり）は，加齢と無関係にはぼ一定であっ

るて とみるべきであると思われる。

た（今回の実験条件下で）。正常マウス前肢筋

我々は，dyマウスの前肢筋と後肢筋がいろいのα−BGT結合量は，2−3週齢では筋ジスマ

ろな観点から，ほぼ同時に病に冒されることを明ウスの値とはぼ同様であったが，その後加齢に伴らかにしてきた≡）今回の形態学的研究も，これをい減少した。これは，筋線経が成熟成長（肥大，

支持している。したがって，正常マウス前肢筋の伸長）するためであろうということを討論した。

加齢に伴うα−BGT結合量（筋湿重あたり）の減少は，筋線維容量の増大に伴う表面積の相対的な減少によると推察される。2−8週齢にかけて，
前肢筋線経の太さが2倍（前肢筋，後肢筋の結果からの予測）になったとすれば，容量に対する表
面積の比はほぼ邦になると考えられ，筋湿垂あたりのα−BGT結合塁が％になったことが説明される。前肢に関する形態学的研究は，今後さらに詳しく行うつもりである。dyマウス後肢筋のα−BGT結合能が異常に高去っている（筋による差もある）ことは，Howeらが報告している（5−12週齢の129strainのマウスでのinvivo実

感）。

文

献

1）Totsuka，T．，Watanabe，K．andKiyono，S．：Masking
Ofa dystrophicsymptomingenotypical1ydystro−Phic−dwarfmice．E＞oc．JcpanAccd．，57B：109−113（1981）．

2）Zatz，M．，Betti，R．T．B．andLevy，J．A．：Benign
Duchenne muscular dystrophyin a patient withgrowthhormonedeficiency．Amer．J．Med．Gene1．，
10：301・304（1981）．
3）King，D．B．，King，C．R．andJacaruSO，R．B．：AYian
muscular dystrophy：Thyroid influence on
PeCtOralis muscle growth andglucose−6−phosphate

dehydrogenase activity．L的 ScL，28：577−585（1981）．

4）Totsuka，T．，Watanabe，K．andKiyono，S．：Matura−
tional defects of muscle fibersin the muscular
dystrophic mouse．Cbng．Anom．，21：253−259（1981）．

結論

1．成熟マウスで，ウレタン麻酔下5Hzの坐骨神経刺激による排腹筋の誘発筋電位の振巾は，正常マウスの場合時間と共に急速に減衰（一種の疲労？）したが，筋ジスマウスでは，少し変動（減衰する個体と増大する個体があった）がみられただけであった。この点に関する加齢変化を調べた
ところ，若いマウスでは，筋ジスマウスはもちろ

5）浦本勲，渡辺貴美，戸塚武，活野茂博：筋ジストロ
フィー症マウスの誘発筋電位：反復刺激による経時的変化．脳研究会誌，印刷中．
6）Totsuka，T．andWatanabe，K．：SomeeYidencefor
COnCurrentinvoIvement of the fore−andhindleg

musclesin murine muscular dystrophy．血p．
A〃わ札，30；465470（1981）．
7）Sandow，A．and BruSt，M．：Effects ofactivityon
COntraCtions of normal and dystrophic mouse
mllSCles．d桝．エ劫γ∫わ上，202：815−820（1962）．
8）Howe，P．R．C．，LiYett，B．G．and Austin，L．：In−
CreaSed binding ofa・bungarotoxinindystrophic

mouse muscle．助p．Neuro7．，51：132−140（1976）．

49

10．「三つの筋神経系異常マウスにおける指標酵素の活性変動の比較」

宏

松 下
研究協力者

辻

繁

勝

筋の発生と分化を研究する手段の一つとして，

はMYD／J−myd系統をJaCkson研究所より輸

先天性の筋異常形質を発現する実験動物を用いて入し，当教室で目家繁殖したものを，又new汀ト

正常形質と比較対照し両形質間に在る差異を分析

utantは金沢大学医学部動物実験施設より提供しする方法が考えられる。更に同一動物種内で生じて載いたものをそれぞれ実験に使用した。使用時

た類似の筋異常形質を数多く集めて，相互の発現のマウスの週令は6〜12週である。血清は断頭採形質の差異を比較検討することによってより微細

血後30分間室温静置後2，000rpm，10分間遠心分は変化を追求出来るものと思われる。マウスの筋

離して取出したものを酵素標品として使用した。

異常形質としては従来，dyおよびdy2J形質が専ら

骨格筋，脳および脊髄神経組織は断頭潟血後速や利用されて釆たが，最近に至って，muSCle de−かに10倍容（骨格筋）又は20倍容（神経組織）のficient（mdf），muSCular dysgenesis（mdg）

0．32M庶糖液に入れ，テフロンホモジナイザTでmotor end−plate disease（med），myOdyst−

ホモジナイズする。以下筋ホモジネートは通常b

rophy（myd）などの筋異常突然変異形質が次々

Schneider法に従って可溶分画を分離し，又神に見出されて，筋の発生と分化の研究に好適な材

経組織のホモジネートはN。，t。n遠2）に従って，。T料として利用されるようになって来ている。我々

rified rryelin分画を分離しそれぞれ酵素標品はこれらの異常形質の中で発現症状がdy形質にとして使用した。酵素活性の測定はCPKはHも−（11

最も近いmydマウス，および金沢大学（早川純一郎

ssら・。UV法（PL。TおよびGPTはKa，m。遇

助教授）で見出された新しい筋異常突然変異体

L DHはWroblewski 法（戸） PKはTanakaらの方（newmutant，仮称）とdyマウ欠の三形質を用法（戸）cNPはS。gin法ワ）cEHは遊離したコレス

いて主として筋の分化に対する神経系の影響に就テロールをコレステロールオキシダーゼ法によっいて研究を進めたいと計画している。本年度は，て定量する方法（戸）がそれぞれ用いられた。尿 中の発現症状の未だよく判ってい巧いmydマウスおよクレアチン・クレアチニン量測定はJaffgの方

びnewmutantに就いて骨格筋，血清，中枢神経酵素標品中の蛋白含員はLowry法によって測定し系などの臓器における疾病の指標酵素群の活性変た。

動を測定しdyマウスのそれと比較検討した。
結材料と方法
dyマウスはC57BL／6J−dy，mydマウス

果

尿中クレアチン・クレアチニン含量：まず3突然変異体マウスの尿中クレアチンおよびクレアチ
ニン排泄量を測定したところ表1の如く3形質共＊和歌山県立医科大学，第二生理学教室に著しいクレアチン尿症を呈していることが認めWhole Animal
Ⅲ
50

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51

10．「三つの筋神経系異常マウスにおける指標酵素の活性変動の比較」

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Ⅲ
52

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53

10．「三つの筋神経系異常マウスにおける指標酵素の活性変動の比較」の．SOL

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54

ⅢWhole Animalられた。又，クレアチン・クレアチニン比もいず

考案

れの場合にも正常対照の2倍以上に増加しており，尿中のクレアチン・クレアチニン比がいずれのdyマウスが最も高く，mydマウスとnewmut−

場合も著しく高くなっていることから，これら3

antはほぼ同程度であった。

形質の骨格筋ではクレアチン保持能力の低下が存

骨格筋および血清中の酵素活性：CPK活性は表2在することがうかがわれる。又骨格筋中および血の如く，3形質共に骨格筋で低下し，血清中で上昇

清中の指標酵素の活性変動からいずれの形質も進するという，同じ傾向を示していたが，中でもmydマ

行性筋萎縮症状を発現していることは明らかであウスで最も顕著な変化が認められた。neWmutant

る。然し，その中でmydマウスの血清中指標酵素

はdyマウスに近い変化を示していた。次にPK活性の変化は所謂仮性肥大型の筋ジストロフィー症にの変化は表3に示される如く，骨格筋の場合，3形類似したパターンを示しているのに対して1他の質共に著しい減少を見せているのに対して血清中2形質ではやや異なった変化を示しているのが注への漏出がnewmutantでは全く認められなかっ目される。又，血清中へのPK酵素の漏出に就いた。表4はLt）H酵素の活性に就いての結果であて，3形質の間に相違が見られたことは，3形質

るが，mydマウスでは骨格筋中で域少し，血清中の間に膜の透過性の異常に関して差異があることに多量に漏出するという典型的なパターンが見らを示唆しており，更にneWmntantではPKとCれるのに対して，dyマウスでは骨格筋中での低PKで血清中への漏出程度が全く異ることから，

下は認められたかざ血清中の変化は有意差が無く，この変化がPK酵素の分子量がCPK酵素の3倍

又newmutantでは両臓器で共に大きな変化が見

大きいという事に由来するのか，或いはnewn卜られなかった。GOT酵素の活性変化は表5の如

utantでは糖代謝に関して他の2形質とは違った

く，dyマウスとmydマウスで共に骨格筋中と血変化をしているのかなどの疑問が残り，筋ジスト

清中で増加の傾向を示しているのに対してneW

ロフィー症状発現におけるPK酵素の役割，或いmtantでは両臓器で共に減少するという，他のは血清中指標酵素としての意義を知る上で興味あ2形質とは異った変化を示していた。一方GPTる変化と考えられる。中枢神経系中の2酵素の活活性の変化は3形質共に骨格筋中で有意に増加を性変動に就いては，mydマウスに見られたCNPしているが，血清中での変化には′ヾラ付きが大き活性の低下は脊髄根部声こミエリン鞘の欠落した神

くて統計的な有意差が無いという同一のパターンを示していた（表6）。

経軸索がdyマウ甜場合と同様に・束になって存在するという報告があり，うなずける結果であ

中枢神経組織中の酵素活性：dyマウスでは既にる。一方newmutantではCEH活性が正常対照

中枢神経系中のミエリン分画に存在するCEH酵の半分以下になっており，中枢神経系のミエリン

素およびCNP酵素の活性が著しく変化している

分画におけるコレステロール代謝に欠陥が存在す事実が認められてい助で，他の2形質に就いてる可能性を示唆している。この点に関してはdy

も，これら酵素の活性測定を行い，dyマウスのマウスも類似の変化を示しており，今後両者の比場合と比較した。結果は表7の如く，mydマウス

較研究に興味が持たれる。

の場合はCNP活性が有意に低下しているのに対して，CEH活性には変化がなく．又newmut−

要約

antの場合はCEH活性が著しく低下しているの（1）myodystrophy（myd）マウスおよび新たにに対してCNP活性には変化が見られないという見出された筋神経系突然変異体（newmutant）

3者3様の結果が得られた。

の骨格筋，血清および中枢神経系中の指標酵素の活性変動を測定し．dyマウスの場合と比較検討10．「三つの筋神経系異常マウスにおける指標酵素の活性変動の比較」
した。いずれの変異体マウスも進行性筋萎縮症特有の変化を示していたが，mydマウスと他の2形質では変化のパターンがやや相違しているのが認められた。
（2）newmutantの変化は種々の点でdyマウス5）Wroblewski，F．and LaDue，J．S．：Lacticdehydr0−

genaseactiYityinblood．hoc．Soc．軸BibL肋d

90：210・213，1955．
6）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F．andMorimura，H．：
Cristallization，Characterization and metabolic
regulation of two types of pyruYatekinasesis0−1atedfromrattissues．LBioche〃162：71・91，1967．
7）Sogin，D．C．：2と類似しているが，症状進行速度，血清漏出酵素のパターンなどに関して差異が認められた。

文

献1）Lane，P．W．，J3eamer，T．C．and Myers，D．D．：Myo−dystrophy，aneWmyOPathyonchromosome80f
themouse．J〟ered67；135−138，1976．
2）Norton，W．T．ind Poduslo，S．E．：Myelinationin
rat brain，Method ofmyelinisolation．J．NeuTO・
C如爪．21：749−757，1973．
3）Hess，J．W．，Murdock，K．J．and Natho．G．J．W．：
Creatine phosphokinase，a SpeCtrOPhotometricmethod withimproved sensitiYity．Am．J．aLn．
魚油0人5叫1）：89−97，1968．
4）Ka∫men，A．，Wroblewski，F．and LaDue，T．S．：
Transaminase activityin human blood．Jl ain．
血ye比34；126，1955．

55，3−CyClicNADPasa

substratefor

2 ，3 −CyClic 3 ・Phosphohydrolase．L 肋urochem．
27：1333−1337，1976．
8）Richmond，W．：Preparation and properties ofCholesterol oxidase from Noca∫dia sp．andits
apphcation to the enzymatic assay of total
Cholesteroli刀L5貯rum．α加．C加朋．19（12）：1350−
1356，1973．
9）Taussky，H．H．：A microcolorimetric determina−tion of creatineinurine by theJaffe reaction．
上月わエαem．208：853−861，1954．
10）Tsuji，S．andMatsushita，H．：2
3−Phosphohydrohse

and

，3

ヾyClicnuceotidecholesterolester

hydr0−

1aseinbrainand spinalcord ofdystrophicmicc．
Current Researchin Muscular Dystrophy，Japan．
1；47−48，1979．
11）Rayburn，H．B．andPeterson，A．C．：Nakedaxonsin
myodystrophic mice．BMin Res．146：380−384，
1978．

Ⅳ

生

理

学

11 L6筋芽細胞培養におけるテトロドトキシン感受性活動電位の発達 59
12 筋細胞膜における膜興奮機能の発生 64
13 両生類骨格筋の遅速両筋線経の比較 69

59

11

L6筋芽細胞培養におけるテトロドキシン
感受性活動電位の発達
＊

明夫 意

＊

吉

諦

藤

佐

＊
＊

正捨 三

濃崎本

加 山山

研究協力者

脊椎動物成体の骨格筋で発生する活動電位は，代りに神経性組織の抽出液をマウス骨格筋の器官

Naチャンネルの作用によるスパイク電位である
ことは周知のことである。このNaチャンネルは培養に加えることによってTTX感受性Naチャンネ
ルの減少が抑制されるという報告があり，神経支

非常に低濃度（10−7〜10￣8M）のテトロドキシン

配を代行する栄養物質の存在が確かめられてい威（TTX）により遮断されるのが特徴である㌔2）しさらに，ニワトリ胚由来の培養骨格筋に於ても，かし，ラットやマウスの骨格筋においては，神経培養液にニワトリ神経組織の抽出液を加えること支配を断つことにより，このTTX感受性のNaによって、TTX感受性Naチャンネルの発達が促チャンネルが，TTX抵抗性のNaチャンネルに変進さ潰？ラット筋芽細胞株（L6）を用いての化することが知られている。さらに，生後間もな培養においても，神経性組織抽出液を加えること

いラットの骨格筋では，Naチャンネルの殆んどによってTTX感受性Naチャンネルの発達が起こ

がTTX抵抗性であり，生後神経支配の完成に伴るのではないかと考えられる。

なって，TTX感受性のNaチャンネルへと変化し

本研究では，このことを確めるべく，L6株細ていくだNaチャンネルには，TTX抵抗性及び，胞の培養に，ラット胎児の脳抽出液を加えて，ス

TTX感受性という二種類の異なるタイプのもの

パイク電位のTTX感受性を調べてみた。

が存在し，前者から後者への分化には神経支配が重要な役割を果していることがわかる。ラット由

方

法

5）

乗の筋芽細胞株（L6）を用いての細胞培養骨格

細胞培養： ラット由来の筋芽細胞珠（L6）筋においては，単核細胞の融合がおこると．スパ

は，三菱化成生命科学研究所の天野武彦先生から

イク電位を発生する性質が急速に発達する。このの僧与を受けた。これを，ダルペコ変法イーグル

多核の筋管でみられるスパイク電位は，外液のNa培地（DMEM）にウシ胎児血清10％を加えた培養

イオンの除去で消失するのでNaチャンネルの作液を用いて継代培養して増殖させたのち，上述の用による電位である。しかし，1『6M程度の濃度

培養液に10％のジメチルスルホキシドを添加したのTTXによっては遮断されず，TTX抵抗性の旭

液中で細胞を凍結して，これを−80℃で保存し，チャンネルの作用によるものであ農ごこれは除神

必要に応じてこれを融解して使用した。

経されたラットやマウスの成体骨格筋に相当し，凍結保存されたL6筋芽細胞は37℃の水槽内で神経支配がない為と考えられる。最近，神経支配の手早く融解し，培養液を加えて遠心することによ＊北里大学医学部生理ってジメチルスルホキシドを除去した後，継代培
養して実験用の細胞を得た。実験用培養は，10％

60

Ⅳ

生

理

学

図1L6筋芽細胞株を用いての培養。脳抽出液を加えない対照培養の写真で，Aは培養4日目のもので，多核の筋管が形成されている。Bは培養11日日のもので長い筋管が多数みられる。Bにあるスケールは100匹nを示す。

ll L6筋芽細胞培養におけるテトロドキシン感受性活動電位の発達l5xlO￣8A

●

一

む」

」

日・

5nl三望
50msec

図2 L6筋芽細胞株を用いての培養17日目でえられた筋管からの活動電位の記録。脳抽出液を加えない対照培養における例である。通電により静止膜電位を一80mVに移動させた後脱分極性電流刺激（a）を行ない，発生した活動電位を速い掃引速度（b）と遅い掃引速度（d）で同時記録した。（C）は活動電位の微分波形を速い掃引速度で示したものである。点線はトレース（b）に対する0電位を示している。

表1培養17〜18日目の筋管におけるスパイク電位の最大立上り速度（Ⅴ／sec）。

Normal Saline TTX Containing Saline

Contro1132．50±10．72（14）122．23±15．54（13）Br．Extract

153．34±10．23（16）78．75±

9．04（16）★

Values are Mean±SE．Numbersin the parentheses are
myotubes examined．★indicates a slgnificant decrease・

対照培養と脳抽出液を加えた実験培養について，正常塩類溶液およびTTX（灯6M）を含む塩類溶液の両方の外液中で測定した。

61

62

Ⅳ 生 理

の馬血清を含むMEMを用い，細胞濃度を106

学

cells／〟とした乳 これをコラーゲン塗布した60

こでは図示されていないが，培養液中にラット胎児から得た脳抽出液を加えた実験群の培養の場合

mのプラスチック培養皿に3mg加えて培養を行っには，この筋管の発達が促進される。すなわち，た。培養液交換は，8日目まで半量の交換を2日

培養日数の同じものでは，脳抽出液を加えた培養毎に行ない，15日目に全量の交換を行なった。尚の方が筋管の数が多く，横紋の形成も早い。この対照群には馬血清を，実験群にはラット胎児脳の場合の培養では，2週目で半数以上の筋管に明瞭抽出液を，全培養期間中2日毎に各100／αづつ加な構紋が見られたが，対照培養ではこの時期で，えた。本培養は，培養17〜18日目で次に述べる

槙紋は非常に稀であり，あっても不明瞭である。

電気生理学的実験に供された。ラット胎児脳の抽

17〜18日令のL6株細胞培養での電気生理学

出液は妊娠20日令のウィスター系ラットより胎児的知見は以下の様であった。先づ，静止膜電位をを無菌操作の下で取り出し，さらに脳のみを集めみると，対照群及び脳抽出液を加えた実験群の両これに2倍量のタイロイド溶液を加えてホモジナ

方共，同じ様な値を示しており約−50mVであっ

イザ一にかけ，それを遠心してえられた上清であた。

る。

図2は，培養17日令の対照培養の筋管で得られ電気生理学：上述したように，17〜18日令た活動電位を示したものである。（a）は刺激電流．

の培養を用い，培養液を塩類溶液に置換した後に仲）は活動電位，（C）はこの活動電位波形を微分した

倒立顕微鏡下で実験を行なった。実験は，培養細もので，活動電位の立上り速度を得ることができ胞を約37℃に保ち，酸素の供与を行ない乍ら行なる。（dは，（b）の活動電位を1パ0のスピードで記われた。培養で形成された多核の筋管一本に，二録したものである。図からわかる様に，L6株細本の細胞内電極を挿入して，一方より通流を行な胞の培養で得られる骨格筋細胞においては，二種

い，他方で膜電位を記録した。活動電位の記録に類の活動電位の成分が見られる。一つは立上がり

際しては，あらかじめ静止膜電位を通流によっての速い持続の短いスパイク電位で，他はこのスパ−80mvにして，Naチャンネルの不活性化を除

イク電位に続く持続の長いプラトー電位である。

いた後，脱分極性の電流刺激を行ない，最大の活培養17日令は，トレース（b）に示される様にオーバーシュートを示す活動電位が殆んどである。

動電位が得られる様に配慮した。

Kid。k霊やLandらによれば，この活動電位の結

果うちスパイク電位は，Na依存性の活動電位であ

図1は，L6筋芽細胞の培養状態を示す例であるが，ld￣6M程度のTTXに対しては影響され弟る。本図は馬血清を加えた対照培養における筋細TTX抵抗性Naチャンネルの作用によるものであ

胞発生を示したものである。Aは培養4日目のものる。一方，プラトー電位の方は，Caチャンネルのであり，この前後から筋芽細胞の融合により長い作用によるものである。我々は，ここで，このNa

多核の細胞（筋管）の形成が始まり，日を追って次チャンネルによる活動電位の発達を見る為に，図第にその数が増加してゆく。又，この筋管の長さ2（C）に示されているスパイク電位の立上が㌻り速も増してゆくことが多い。Bは培養11日目のもの

度の最大値を計測して，これをNaチャンネルのであるが，この頃ではまだ槙紋の見られることは発達の指標とした。表1はこの結果をまとめたもの少ない。しかし，長い筋管の数はかなり増加してである。馬血清を加えた対照群では，その最大立いる。さらに培養を続けていくと，14日日頃から上がり速度が約132V／sec前後となっており，T時々横紋を持つ筋管が見られるようになり，培養TX（10￣6M）を投与しても，有意な減少は見られ3週目では，殆んどの筋管に横紋が出現する。こなかった。一方，胎児脳の抽出液を加えた実験群

11L6筋芽細胞培養におけるテトロドキシン感受性活動電位の発達では，TTX投与前で，対照群よりやや高い最大立上がり速度を示しているものの，有意な差は見ら

文

63

献

1）Naral1aShi，T．，Deguchi，Tリ

れなかった。しかし，TTXを前述と同様の濃度で投与することによって，この最大立上がり速度は約半分に低下し，統計的に有意な差が認められた。

Urakawa，N．and

Ohkubo，Y．（1960）Stabilizationand rectification
ofmusclefibermembranebytetrodotoxin．AmeTl
JJ竹γ∫わエ198：934−938．
2）HamiS，J．B．and Thesleff，S．（1971）Studies ontetrodotoxinresistant action potentialSindener−
Vated skeletal muscle．Acねmysiot．Scand 83：
382−388．

3）Redfem，P．andThesleff，S．（1971）Actionpoten−

考察

本実験では，スパイク電位の最大立上がり速度を指標として，L6筋芽細胞株の培養における，
NaチャンネノLの発達を見てきた。Naチャンネルのtialgenerationindenervated rat skeletalmuscle．

II．ne action of tetrodotoxin．Acta mysioL．
助α〝止，82：70−78．
4）HarriS，J．B．and Marshal1，M．W．（1973）Tetro−
dotoxin−reSistant aCtion potentialsinnewbornrat
muscle．肋山re肋Wβわエ243：191−192．

これはLandらや，Kidokoroによって報告され

5）Yaffe，D．（1968）Retention of differentiation
potentialities during prolonged cultivation of
myogeniccells．hoc．NA．S161：477−483．
6）Land，B．R．，Sastre，A．and Podleski，T．R．（1973）
Tetrodotoxin−SenSitiYe and −insensitive adtionているものと同じと考えられる。しかし，本実験

POtentialS・in myotubes．J．CbtL．JYuJSioL．82：
479−510．

発達は，馬血清を培養液に加えた対照群では殆んどがTTX抵抗性のものであることがわかった。

で示された様に，培養液にラット胎児脳の抽出液を加えることによって，TTX感受性のNaチャンネルの出現がみられる。このことは，TTX投与（10￣6M）で，スパイク電位の最大立上がり速度が有意に減少することによって分かる。つまり，神経性組織の抽出液は，培養条件下で，神経支配を代行しうるものであると考えられ，神経栄養物
質がその中に含まれていると考えられる。これは，我々が今まで行なって来たニワトリ胚由来の骨格筋細胞培養での知見と一致するものである。

7）Kidokoro，Y・．（1973）Development of action
POtentialSina clonalratskeletalmusclecellline．
〟α蝕だ〟ewβわた241：158−159．
8）Kuromi，H．，Gonoi，T．andHasegawa，S．（1979）
Partialpurification and characterizationofneuro−
trophicsubstanceaffectingtetrodotoxinsensitivity
Of organ−Cultured mousc muscle．Brab7Research
175：109−118．
9）Kano，M．，Suzuki，N．andQjima，H．（1979）Neuro−
trophic effectofnerveextractondevelopmentof
tetrodotoxin−SenSitiYe Spike potentialin ske）etal
muscle cellsin culture．Jl Cbtt，LnysioL99：327・332．

10）Yamazaki，S．and Kano，M．（1981）J）eYelopment
and maintenance of tetrodotoxin・SenSitive action
potentialinculturedmusclece11sfromdystrophic
and normd chickens．且甲．〃e〟′0エ74：408−418．

64

12 筋細胞膜における膜興奮機能の発生
高 橋 園太郎
研究協力者 平 野 丈 夫

脱分極によってCaイオン透過性が増加して細存性の不活性化が見られることが最近報告されて胞内にCaイオン流入をひき起こす機構すなわちいる。これはCaチャYネルを透過するCaイオン

1）

Caチャンネルは興奮性膜の重要な成分であり，が細胞膜内面にたまり，Caチャンネルの開放が個休発生的にみても，系統発生的にみても広い分抑制されることによると考えられている。

1）

布をしめしている。たとえば脊椎動物成体め骨格

ところが我々の研究によるとホヤ・ウニ・ヒト筋は従来典型的なNaスパイクを発生し，殆んどCa

デ・ハツカネズミなど各種の卵細胞に見られるCa

チャンネルはないと考えられていたが，最近の研チャンネルではSrイオンに対し透過性が高く，か究によるとTTXおよびTEA存在下で電圧固定をつ電流の時間経過はチャンネルを通過するイオン

おこない電流を解析すると明らかにNa電流とはの種頬にはよらず，不活性化の時定数も比較的短ことなった時間経過を示すCaイオン依存性の電くNaチャンネルに見られるようなHodgkin−流が見られている。もちろん心筋・平滑筋におけHuxley型の電圧依存型不活性化が見られる。他

るCaチャンネルの存在はすでに多くの報告がある。骨格筋についても発生初期の筋管細胞膜におの興奮性膜に見られるCaイオン依存性の不活性化は考えにくい。すなわち卵細胞のCaチャンネ

いてはNaスパイクとともに長い持続をもつCaプルは明らかに他の分化した細胞に見られるものと2）りラトーからなる複合電位がみられている。したが異なっている。卵細胞は発生という面から見るとって興奮性膜として骨格筋細胞が分化する際に，出発点に属し，この時点でのCaチャンネルが発Caチャンネルの質的・塁的な変化がともなって生分化につれて出来上って行く興奮性膜にみられいることは充分予想できる。

るものとどのように関係するのかは興奮性膜の分一方甲殻類の横紋筋で発見され，シナプス前部・化という面から極めて重要な問題である。

軟体動物の神経節細胞などに見られるCa電流はホヤ発生卵においては8細胞から16細胞胚な持続がきわめて長く不活性化が少ないのが特徴でどの初期に細胞分裂を停止しても，大型の割球に1）ある。またこれらのCa電流は外液のCaイオンをそれぞれの分化がおこり，予定領域の運命にした

Baイオンでおきかえるとさらに持続の長いBa電がって興奮性膜の分化が見られることはすでに報流となり，電流振巾も増大するので，そのCaチャ告した。最近さらに初期の1細胞・2細胞・4細ンネルはBaイオンに対し透過性が高いと考えられ

胞胚でサイトカラシンBで分裂停止した場合にはl）1）ている。またCaチャンネルの場合には不活性化

体細胞のすべての膜の性質がモザイク的に表面に過程は透過するイオンにより差があり，Ca電流現れるのではなくて一定の細胞に見られる形質す

ではBa電流よりも電流の減少が大きく，電流依

なわち表皮細胞型の活動電位が発生することがわかった。この活動電位はSr溶液中で観察すると＊東京大学医学部脳研究施設神経生物学研究室

持続がきわめて長く，他の興奮性股におけるCa12 筋細胞膜における膜興奮機能の発生

65

チャンネルによる活動電位とよくにていることが続2秒以上もある活動電位を発生した。活動電位わかった。したがって，この発生直後に分裂を停止した未分裂ホヤ発生卵における膜の分化過程を

は外液のNaイオンを除去しても変化せずSrイオ
ン依存性でオーバーシュートは40〜50mVであ観察して，卵細胞型から分化型のCaチャンネルった。遅延整流特性を示唆する急速な下降期は見への発生にともなう変化を解析することを目的とられなかった。この活動電位はすでに報告した分した。

裂停止8細胞胚・16細胞胚においても見られ，その場合には予定表皮細胞域で発生するので表皮細
研

究

方

法

胞型活動電位として報告したものである。

低温海水槽（1．5〜2．5℃）に保存してある抱卵（2）未分裂発生胚を100n血t Sr基準人工海水中

ホヤを一昼夜高温海水（11〜12℃）で飼うと放で電圧固定して解析すると図1に示すように−30卵する。この卵と他の個体が放精した精子海水をmVから内向き電流が流れ始め，＋15mVで最大混合して受精をおこなった。受精後は8℃の恒温になった。Mn溶液中では漏れ電流のはかは外向槽に受精卵を入れたシャーレを入れて発生させた。

き電流はみられず，膜電流は殆んど純粋のCaチ

受精卵のうち一部は対照としてそのまま発生させ，

ャンネル電流であることがわかった。電流の時間経

残りは第一分裂開始前にサイトカラシンB2／協イ諺

過は同じSr溶液中での卵細胞の電流に比べて遅を含有する海水に入れて飼育した。この未分裂発

く，電流電圧曲線も卵細胞にくらべて負の方向に生胚を対照の発生卵から幼生が貯化する時点まで

15mVはど移動していた。分化した未分裂発生胚

飼育すると細胞膜が分化して興奮膜となる。

のCaチャンネル電流は他の興奮性膜において見

未受精卵および未分裂発生胚のコリオン膜は，
プロネース10軌を含む海水に30分以上浸しられるのと同様にLaイオンなど多価イオンで効
果的に抑制された。

てから解剖針をもちいて除去した。この裸になっ（3）分化した未分裂発生胚を100mM Ca溶液（基た卵あるいは胚細胞を100mMSrCL2，400mM

準人工海水のSrイオンをCaイオンで置換したも

NaCL，10mM KCL，5mM PIPESrNa（pHの）中で電圧固定すると膜電流はCaイオンによ7．0），10巧／磁BSA，2／徳パ戒 サイトカラシン

る内向き電流とKイオンによる外向き電流の二相Bからなる基準人工海水中に入れ，電圧固定法を性となった。この外向き電流は遅延整流性K電流

もちいて膜電流の解析をおこなった。電圧固定はではなく，電流電極に1M EGTAK2電極をもち通常の二本の3MKCヱガラス微小電極を刺入しいて細胞内にEGTAを注入すると消失し，Ba溶ておこ撃、，その装置については他にすでに発表してある。またCaチャンネルの不活性化の過程で液中でも消失したのでCa依存性K電流であることがわかった。（図2）。

解析する際に，外向き電流の影響を除外するため（4）lMEGTAK2電流電極から細胞内に1mM程にCa電流のTail電流を測定しこれより内向き電度にEGTAを注入してから，Ca・Sr・Ba溶液

流の時間経過を解析した。

中で次々に電圧固定し，卵細胞の膜電流と比較したのが図3である。卵細胞においてはCaチャン

研

究

結

果

ネルのイオン選択性はCa≒Ba＜Srの順であり，（1床分裂発生胚を対照の発生卵が僻化するまで閉値はBa＜Sr＜Caの順に高くなった。これにの時間サイトカラシンB含有海水中で飼育したの反して分化した未分裂発生胚ではCa＜Sr＜Ba

ち，この実験で基準とした100mM Sr人工海水の順で透過し，閲値はBa＜Sr＜Caの順で高く中で記録すると，静止電位は約−70mVでK平衡なった。時間経過はBa溶液・Sr溶液中では卵細電位に近く，また−30mV以上脱分極すると持胞の方が早い不活性化過程をしめす。Ca電流につ

66

Ⅳ

生

理

学

Egg Ca−Ch．

100Sr
−11

土ご三悪

ふふふ伊豆岬聖Epidcrm．Ca−Ch．

100Sr

Jこ＿
19lC

BlOOSr
tO

「￣

15tC

レ′

q25stて．

図1 卵細胞および表皮型に分化した未分裂発生胚におけるCaチャンネル電流。基準人工海水（100mM Sr）および15mM Mn人工海水中で記録したもの（A）。2mMhによる表皮型Caチャンネル電流の抑制（B）。各電流トレース上の小数字は膜電位をミリボルトで表したもの。

100Ca．KC1

100Ba．KCl

β100Gl．EGTA

100Ca．KCl

三三

」−

こ

二一＝ 二二0．1sec

図2

表皮型に分化した未分裂発生胚の100mMCa溶液中あるいは100mMBa溶液中での膜電流（膜電位は＋18mV）。電流電極は3MKCLでEGTAは注入していない（A）。同じ
く100mMCa溶液中の膜電流のうち外向き電流成分がEGTA電流電極からEGTAを細胞内に注入することにより消失することを示す（B）。

12 筋細胞膜における膜興奮機能の発生

67

A EGG TYPElOO Ca

旧O Ba

100Sr

】悔小嶋。亘ポ嘩；

三甲＿

6℃声斎

・γ・′㌣疇「一7伝河￣2密−70轟ここ禦7−；藍丁や評8β腱鱒二・〜師￣2 叫￣JO出た 一往→h肘・70−h小雪
−t nA
Ot〜〜⊂

B ERDERM，TYPE
的O

Ca

lOO

1′一一・．

旧O Ba

Sr

山L

5仙1．95Hg

漬T一一リー−−

鴨7コ唱

「
し／ノ

■

一・」−

￣」

J

l三＿＿＿＿
8「一一日一

7コ

土コ

「二二二

J

−

一一

T￣「
−上土・

一一『コヰ±

汽

占

」 ／

一一￣−

・‥二一二＝〒．．．一≡二一

図3 卵細胞（A）および表皮型に分化した未分裂発生胚（B）のCaチャンネル電流の比較。
溶液はCa，Sr，Ba，Mh−Mg溶液中でそれぞれ比較した。

いては分化した未分裂発生胚でも不活性化が認めともわかっている。したがって卵細胞膜のCaチられるが，これは卵細胞にみられるような電圧依
存性はなく電流依存性で他の興奮性膜のCa電流

ャンネルが他の興奮膜にみられるものと質的にことなっていたのは，単に動物種差によるものではで報告されているCa依存性Ca電流抑制であるこ

なく，分化した興奮性膜と未分化の卵細胞膜でのとがわかった。

差異によると考えられた。このことはウニ卵・ハツカネズミ卵のCaチャンネルはホヤ卵のそれと研究 の 考察

きわめてよくにている点からも支持される。
また未分裂発生胚におけるCaチャンネルの塁

以上述べた様に卵細胞膜にみられるCaチャン
ネルと分化した未分裂発生胚にみられるCaチャ

的変化を予備的に調べたところによると，対照のンネルイオン選択的透過性，不活性化過程の膜電正常胚が嚢胚になるまでの初期発生時点で卵細胞

位依存性と細胞内Ca依存性において質的にこと膜にあったCaチャンネルは一旦殆んど消失するなっていた。予備的な実験によれば分化した未分

が，オタマジャクシ幼生の尾部が50％はど成長

裂発生胚のCaチャンネルはホヤの分化した筋細した時点で再びCaチャンネルが増加し，さらに胞におけるCaチャンネルと同一の性質を示すこ

その直後にCaチャンネルの性質が急激に分化型

Ⅳ

68

生

のそれとなって後，量的に増加することがわかった。この特異的な時点は正常胚で始めて筋細胞に全か無のCa活動電位が発生する時期に相当する。
このことは筋細胞膜等が興奮性膜として分化を完成する際に，Caチャンネルの量的増加の他に質的変化も重要であることを示唆した。
文

献l）Hagiwara，S．＆Byerly，L．（1981）．Calciumchannel．
A〃几Rey．〟e〟′0∫Cエ4：69−125．

理学2）Kan0，M．（1975）．Development ofexcitabilityin
emb乃・Onic chick skeletd muscle cells．J．（お肌Cbmp．勒如上86：503−510．
3）Okamoto，H．，Takahashi，K．＆ Yama血ita，N．
（1977）．Ionic currents through the membTane Of
the mammalianoocyteandtheircomparisonwith
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267：465−495．
4）Takahashi，K．＆Yosh追，M．（1981）．Development
Ofsodium，Calciumandpotassiumchannelsinthe
Cleavage−aLreStedembryoofanascidian．J．mysioL，
315：515−529．

5）Okamoto，H．，Takahashi，K．＆Yoshii，M．（1976）．
Membrane currents ofthe tunicate eggunderthe
VOltage−Clampcondition．J．mysioL．，254：607−638．

13 両生類骨格筋の遅速両筋線経の比較
遠藤賓

研究協力者 堀 内 桂 輔

両生類の骨格筋を構成する筋線経には，収縮のして，標本の筋節の長さが2．8ないし3．0／打nとな

経過の遅いものとより速いものとの2種類の存在

るようにした。このようにして標本の等尺性張力を計することが古くから知られており，両者の性質の測しながら，実験槽内の弛緩液をCaミ＋sr2＋ぁる

違いについては単一筋線維標本を用いた生理学的いはBa2ち適当に含んだ活性化液で置換し，そのの研究を含むかなり詳しい報告が数多く為されて時に標本の発生する張力を測定した。即ち，このいる。しかし，筋線維細胞の細胞膜を破壊してその細胞内容を露出させた「スキンドファイバ」標

張力発生を指標として，そのイオンに対する収鱒
系の感受性を調べたのである。

本を用いて，この筋収縮系を直接に活性化した時短縮速度。これを測る時には，予め上記の標本のその遅速両筋線経の態度の違いについての報告の固定端側を，電流によって標本の長軸方向に駆はこれまでにほとんど無罠そこで今回我われは，動できるように設計した棒の先端につけ，最大の筋肉の分化の基礎的研究の手始めとして，両生類の張力の発生した時にこの棒を駆動し，標本の両骨格筋に存在するこの2種類の筋緑経の収桁系の端の間の距離を1／3だけ急激に短くなるようにし性質がどのように異なるかを，スキンドファイバ

た。すると図3に示すように，この急激な駆動にを用いて比較研究することにした。

よって標本は一旦弛んで張力が消失するが，時間を経てその短くした長さ分だけ標本の短縮が進む

実 験 方 法と，再び張力は回復してくる。そこで，この弛め

標本。成長したアフリカツメガエルを材料としてから力の再発生し始めるまでの時間を測定して，た。この腸俳骨筋をリンゲル液中に固定して，実体顕微鏡の下，そこから筋線経の細束を切出した。

短縮速度の指標としたのである。
溶液。弛緩液（Ca2＋＜16．9M）は．pH7．0，イオン

次いで細胞内環境に似せた適当な溶液，即ち弛緩

強度（I）0．15M，Mg2＋1mM，MgATP4mM，液の中でそれを単一筋緑維細胞にまで解剖した後EGTAlOmM，PIPES20mMで，この他のイ

これをピンセットでつまんで引裂くことによってオン種は主に灯せメタンスルホン酸イオン（M㌻）或いは界面活性剤（0．5％W／V，Brij58）で処理となるように，M〆Ms）25．4mM，ATPNa24．3

することによって，その細胞膜を破壊し，スキン

rTM，KMs53．2mM，EGTAlOmM，PIPES

ドファイバとした。

20mMを合わせ，これにKOH適当量（約60mM）張力測定。このスキンドファイバ標本を小さなを加えてpHを当該温度において調整した。

実験槽に移し，一端をストレンゲージ（Uゲージ

Ca2TsrオぁるいはBa汁を含む活性化液の作製

2g用または20g用，新興通信）に接続，他端

法の概略は，EGTAとそれらのイオンの結合定数を固定した後，この両端の問の距離を適当に調節を各10640，103°71，10｝62M−1として（これはⅠ＝0．15
M2℃の場合であり，12℃の時には各106●29，10｝80，＊東北大学医学部薬理学第一教室

10171，Ⅰ＝0．29Mでま106・11，1016㌔10153M￣1とし

Ⅳ

70

生

理

学

た2も計算した時に必要な量だけそれをメタンスルホンをも調べた。図1はその結果で，遊離イオン濃慶一酸塩として弛緩液の組成に加え，これによるイオ張力曲線である。これに見るように，速筋線経は

ン強度の変化分はKMsを減らすことによっ七相殺∴

数fLMのCaで張力を発生したが，Srではその約するというものである。例えば，遊離Caイオン濃30倍にして初めて力を発生し得た。Baを用いた

度が16￣6Mの活性化液（Ⅰ＝0．15叫 2℃）の組成

時にはCaやSrと違って1mMにしても最大の張は，Ca（Ms）26．0，Mg（Ms）25．2，ATPNa24．3，

力の発生を見ることができなかった。
次に既にある報』こ照らして，外観から遅筋線

KMs41．5，EGTAlO，PIPES20，KOH約71経であろうと思われるものを切出し，そのスキンmMである。
なお高イオン強度の実験ではそれを0．29Mにまドファイバの性質を上と同様にして調べた。図2

で，主としてKMsを多く加えることで高めた。まに結果を示す。これに見るように，これらの線経

たカフェインの効果を調べる時には上記の活性化

ではSrで活性化した時にもCaによる時とほとん

液に無水カフェインを添加してそれが25血Mとなど同じ濃度で相当の張力を発生し得た。そればかるようにした。

りか，Baでも0．1mMにするのみで，はば最大の温度。実験では実験槽の直下に2℃または12℃

張力の発生をみた。

の冷却水を流すことによってその温度を調節した。

2．以上のように，従来スキンドファイバの実験に用いられてきた速筋線経とはSrならびにBaに結

対する感受性の著しく異なる庖線経の存在するこ果

1．最初にこれまで普通に用いられてきた速筋線とが判ったので，これがいわゆる遅筋線経である経のスキンドファイバのCa2十とSr2＋に対する感ことを，スキンドファイバの短縮の速さを調べる

受性を確認すると共に，新たにそのBa2＋感受性

ことによって確認した。即ち，「実験方法」の項でNO−SNUh 聖F＜﹂因︼
10−も

10−5

10Ji

CONCENTRATIONCrTHEFREEMmL10N
図1 速筋線経の2価イオン感受性曲線

10−3H

13 両生類骨格筋の遅速両筋緑経の比較

71

N〇一SNUト u≧トく一山∝
0

10ぺ
10づ
10J
CONCErTTRATK）NOFTttFREE METALlON
図2

10−3H

遅筋線経の2価イオン感受性曲線

述べた様な，いわゆる弛ませ試験をスキンドファ

たが，ここで得られた速さの比は，20℃付近の生イバに施して，それが無負荷の下で筋節長3〃m筋で測定したL。nn。rgr。ガの報告とはぼ一致するから2〝mまで短縮するに要する時間を測定し，こので，我々の得た高Sr感受性の筋線経は遅筋線の時間を上記2群の筋線経の間で比較することに維であると結論した。

したのである。

3．ところでカフェインは筋小胞体からのCaの

図3にはその弛ませ試験における記録の一例，

遊離を促す薬物として良く知られている。しかし

高Sr感受性の筋線経の例を示すが，この線経は

この薬物は筋収縮系にも直接に作用して，見掛け

高々筋節毎1〝mの短縮を完了するのに約2秒をのCa感受性を少し高めるような効果をも生むこ要している。図4にはこのような測定の結果をまとが，速筋線経のスキンドファイバで既に明らか

とめてあるが，これに見るように，外観から遅筋にされていた。そこで我われは遅筋緑経において

繰経と思われたSr感受性の高い線経の短縮に要もこのカフェインの効果を確かめてみることにしする時間はどれも著しく長く，Sr感受性の低いた。図5の下は遅筋線維12℃でのCa感受性曲線

ものの約7ないし8倍も時間のかかることが判っを，Caと共に存在する25mMのカフェインがどた。我われのこの実験は2℃におけるものであっのように変化させるかを示している。これに見る

」Pl
∈
⊂〉
N

PCa4・6
lminor sec

図3 弛ませ試験における記録の一例（高Sr感受性線維）

Ⅳ

72

生

理

学

Sr2T＿SENSITlV汀Y
図4

Sr感受性と短縮速度の関係

Z01S註hu≧↑＜﹂山∝
10−9

10−7
FREE

10−6

10−5H

Ca◆◆

図5 遅筋線経のCa感受性曲線に対するカフェインの効果（Ⅰ＝0．15M）

ユ3 両生類骨格筋の遅速両筋緑経の比較

73

ように，0．1FLMのCa＋（遊離Caイオン濃度）のみ

収縮系にも作用してその見掛けのCa感受性を高ではほとんど張力が発生しなかったにも拘らず，こめるが．それは極くわずかの程度である」というれにカフェインを加えると著しく大きな力が観察

知見とは確かに異なるものだった。

された。そればかりかlnM以下というほとんどC諾十しかし同図の上に示すように，この遅筋線経にの存在しない溶液によっても，カフェイン25mM

おけるカフェインの張力発生を促す効果も，従来の添加されている時には最大の毎にも達する張の実験が行われてきたような低温，例えば2℃に力が発生した。この実験における標本の筋小胞体

おいては滅弱することが判った。そこで我われはは界面活性剤で完全に破壊されていたので，この

速筋線経におけるこの効果を再検討することにしカフェインによる張力の発生が筋小胞体からdcaた。結果を6図に示す。これに見るように，確かの遊離を介していたという事はあり得ない。したに速筋線維2℃におけるその効果は軽度だったががって，この遅筋線経で観察された事柄は，従来12℃にするとやはり少し著しくなることが判った。

の速筋緑経の実験で得られていた「カフェインはけれども「12℃，C；戸十＜lnM」においてカフェイ

10−9

10−7

10−6

10−5H

FREE Ca◆

図6 速筋線経のCa感受性曲線に対するカフェインの効果（Ⅰ＝0．15M）

ンで発生する張力は速筋線経における方が確かにバで既知のことだった。しかし，図5と図6を比小さかった。

較すると，このカフェインの効果もやはり遅筋線

4．ところで図5においても明らかな様に，カフ経で著しいようである。実際，図7に示すように

ェインにはCaによる最大張力を減少させる作用

張力発生を促進するカフェインの効果が弱まる，もあるが，これも実は速筋線経のスキンドファイ「Ⅰ＝0．29M，2℃」の条件下において，最大張力を

Ⅳ

生

理

学

ZeSZu↑u≧↑＜Ju∝

10−7

灯6

10−5日

−0−7

−0−6

10−5日

【Ca●●コ

図7

カフェインによる最大張力抑制効果（Ⅰ＝0．29M，どC）

抑制する効果を両筋線経の間で比較しでも，それ乳類のトロポニンのSrに対する親和性は赤筋

は確かに遅筋線経における方が著しかった。

における方が白筋におけるよりも高いことが報告されている7）8）。

考察

それでは一体，骨格筋の収縮の制禦という同じ両生類骨格筋の収縮系はCaのみならずSrやBa機能をもつトロポニンが，今回の研究の結果からによっても活性化されて張力を発生するが，この示唆されるような2種類の互いに異なる構造に分SrやBaに対する感受性は遅筋線経における方が化するのは発生のいかなる時期からなのだろうか。

速筋線経におけるよりも著しく高いことが今回のこの問題は極めて興味深いものであるが，我われ研究で明らかになった。これと似たことは哺乳類の行なったようなスキンドファイバのSr感受性のスキンドファイバにおいても知られており，そを調べる実験を発生過程の筋肉について行なえばの赤筋（遅筋）は白筋（速筋）よりもSr感受性

これを解決できるかもしれない。

の高いことが報告されてい羞また興味深いこと

また，上の問題とは別に，一体どうして収縮のに，嘱乳類の心筋も赤筋と同様にSr感受性の高

経過の速さの違う筋肉が分化するときに，それといことがグリセリン筋を用いた実験で明らかにさは直接に関係しないと思われる制禦蛋白としてのれてい蓑

トロポニンまでもふたつに分化する必要があった

ところでSr2辱Ba2＋は化学的にCa2十に極めてのかという疑問も生じる。しかし，この目的論的近縁の，いわゆるアルカリ土類金属のイオンであの疑問には，トロポニンによる収細の制禦の機序る。それであるから，これらのイオンによる収縮がはっきり判るまでは答えられないと言えよう。

系の活性化は，生理的に収縮を制禦している，Ca

ところで今回，カフェインは筋収縮系に直接に結合蛋白トロポニンに，それらがCaの代替とし作用して，低いCa濃度における張力を大きくして結合することによって生じると考えられる。しまた高い濃度のCaによって発生する張力を小さたがって，そのSrやBaに対する感受性が遅速両くする効果を現わすが，そのどちらの効果も遅筋

筋線経の問で著しく異なっているという事実は，線経における方が速筋線経におけるよりも著しい

両者のトロポニンのSrやBaに対する親和性の異ことが判った。ここには，上のSr感受性の違い

な′ることを，また更に従ってそのトロポニンの化と同様の発生・分化上の問題の他に，別の問題も学構造の稟なっていることを，反映していると考ある。即ち，カフェインがこのふたつの効果を生えるのが最も自然である。実際，生化学的に，哺む時の作用点はどこか，またふたつの効果は同じ

13 両生類骨格筋の遅速両筋繰経の比較

75

作用点に働いた結果として生じるのか否かである。

最大張力の抑制はミオシンーアクチンの収縮蛋白

これについて論じるには，まだ研究が不足してい系に対する作用の結果であり，低Ca濃度下におるが，予備的の実験から次のようなことが判ってける張力の発生を促進するのはトロポニンートロ

いる。

ポミオシンの制禦蛋白系に対する作用の結果であ（1）イオン強度0．15M，12℃，Cが＜1。Mで遅筋ると考えておいても，現段階では良さそうである

線経はカフェインによって張力を発生するが（5図），ということ。

その時繰経は，Caで相当の張力を発生している時と同じかむしろそれより大きい速度で短縮しうる。したがってこのカフェインによって発生す文献（2）イオン強度0．15M，12℃，Ca2blfLMの条件

1）Constantin，LL．，PodoIsky，R．J．＆Tice，L．W．L
用γ∫わエ188：261・271，1967．
2）Haramji，H．＆Ogawa，Y．J．Biochem．87：1305−
1312，1980．
3）Smith，R．S．＆OYaue，Jr，W．K．⊥ノ〝〟．116：1−24，
1973．

下で，カフェインが遅筋線経に張力の発生を促す

4）L盆nnergren，J．JJ功yJわエ283：501−521，1978．

る張力は低MgATPによって発生する張力とその性質を異にするようであるということ。

効果は0．5mMから既に明らかであるのに対して，

5）Takagi，A．＆Endo，M．放p．肋uTOL55：95・101，
1977．

CaZ十10／上Mによって発生する最大の張力をカフェ

6）Kitazawa，T．√βわC如朋．80：1129・1147，1976．
7）Ebashi，S．，Endo，M．＆Ohtsuki，Ⅰ．Qucrt．Ret，．

インが抑制するのは20mMにして初めて明瞭にな

βわp妙∫fc．214：351−384，1969．
8）Kohama，K．上月ぬぐ加爪．86：811・820，1979．

るので，カフェインのこのふたっの効果は，別の作用の結果であるように思われる。したがって，

Ⅴ

14

アセチルコリンリセプター

眼瞼型重症筋無力症における抗−AChR一抗体

79

15 培養筋細胞のAChレセプターの代謝安定性と神経細胞由来因子 82
16 培養骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体の合成と分化 86
17

発生初期におけるジストロフィー筋のアセチルコリンレセプターの代謝速度

91

79

14

眼険型重症筋無力症における抗−AChR一抗体

栗

山

璧

研究協力者 伊 東 祐 之

小 田 健一郎序

全身型重症筋無力症（G．M．G．）患者血清中筋を細断し（1．0×1．0×2．0m），0℃の緩衝液には高頻度で抗−AChR一抗体が存在する（NaCLlOOmM，Tris」印C・e・50mM，pH7．4）（Almon＆Appel1976，Lindstromet alを加え，ホモジェナイズした。ついで10％Tri−

1976，Oda et al，1980）。しかし眼険型重症筋

tonX−100溶液を最終濃度1％となるように添無力症（0．M．G．）患者血清中に抗rAChR一抗

加し，室温で90分間撹はんし，そ．甲．後4℃に冷却体が検出される頻度は全身型のそれに比べはるか

28，000才で15分間遠心分離した。赤渇色の上活に低く，さらにその抗体価も全身型に比し極めてを粗AChR標品とした。

低い（Lefvert et al1978）。さらにG．M．G．

粗AChR標品に高濃度（400pmol）の125卜a

患者の筋麻捧症状は抗コリンエステラーゼ剤によ−プンガロトキシン（125トα−BuTx）を添加し，り改善されるが，ptOSis，Ophthalmoparesis等

4℃で16時間反応させ，セファデックスG−200の0．M．G．の臨床症状を抗コリンエステラーゼにのカラムによりゲルろ過し，125Ⅰ−α−BuTx−

より制御するのは困難である。

AChR複合体分画を得た。この分画をAmicon

我々は眼険型重症筋無力症の臨床症状発現に果PM30を用いて0．4pmol／適及び2．Opmolル

たして抗−AChR一抗体が関与するのか否かを検索

濃縮し，従来型及び改良型ラジオイムノアッセイにする目的で，従来，抗−AChR−抗体の検出に用い用いた。

て来たラジオイムノアッセイ法の改良を試みた。

従来型ラジオイムノアッセイ：検体の血清をTrト

本報告に於ては従来型及び改良型のラジオイムノ

ton−Ⅹ−1000．5％を含むリン酸緩衝液で10倍にアッセイ法により，全身型及び眼険型重症筋無力希釈した。その10−50JJヱアリクォットに500J 且症患者血清中の抗−AChR」完体を比較検討し，臨の125I−a−BuTx−AChR（0．4pmoレ勿β）を加え床像との関連について考察した。

さらに450′化のウサギー抗ヒトtIgG血清を加え，最終容積をリン酸緩衝液により1mヱとし，4

方法℃で16時間反応させ，2500回転5分間の遠沈に

検体：九州大学神経内科に於て全身型及び眼瞼型

より免疫反応沈澱物を採集し，リン酸緩衝液によ重症筋無力症と診断されたそれぞれ37名及び17名

り3回洗聴後，免疫複合体の125Ⅰ一活性をr一功の患者血清，さらに10名の正常者血清を検体とした。
抗原：ヒト骨格筋のAChRを抗原とし，ラジオイ

ウンタ一により測定した。
改良型ラジオイムノアッセイ：従来型ラジオイム

ムノアッセイ法により血清中の抗−AChR一抗体価

ノアッセイにより1pmol／鰯以下の抗−AChR一を測定した。胸部外科手術中に得られたヒト骨格

抗体価を示す血清については以下に述べる改良型＊九州大学医学部薬理学致室

ラジオイ阜ノアッセイにより抗体価の再測定を行Ⅴ80

アセチルコリンリセプター

った。希釈血清の250−50伸上を濃縮125Ⅰ−α−

清をAmicon PM30を用いて従来型で用いた濃BuTx−AChR（2．Opmol／融）100FLLと免疫反応度の5−10倍に濃縮し，アッセイをくり返すと抗させ，ついで5−10倍に濃縮したウサギー抗ヒ

原及びウサギ血清の希釈効果により，抗原一抗体

トーIgG血清400FLLを加え（抗−AChR．抗体）

複合体の形成が影響されることはなかった。さら−（125トa−BuTx−AChR）複合体を沈澱させ，に大量の血清を用いることにより，125Ⅰ−α−Bu′政

その125ト活性をγカウンターにより測定した。

の非特異的結合によるバックグランドノイズが減

IgG，IgMIgA含有量の測定：血清中のIgA，少し，ラジオイムノアッセイの感度が上昇した。

IgM，IgA含有量をラジオイムノディフュージョ

すなわち正常血清の抗休価はOpmoレ融−0．04

ンキットにより測定した。

pmoレ融の範囲に分布し，その平均値は0．011±
0．016（±S．D，n＝10）であり，従来型の約10倍

結果の感受性を示した。そこで正常血清で観察された従来型ラジオイムノアッセイ法により37例の0．

抗−AChR一抗体価の上限値以上が有意な抗体価でM．G．患者血清中35例に於て抗−AChR−一抗体が険あるという仮定のもとで，従来型ラジオイムノア

出され，その抗体価は0．44pmolb−252pmoレ緑

ッセイでlpmol／成以下の抗体価を示した0．M．

の広範囲に分布し，その平均値は25．4±43．3

G．患者血清を用いて，ラジオイムノアッセイをく

pmol／録（±S．D．）であった。なおこの方法で測り返した。この方法により，従来型アッセイで抗定した正常血清中の抗−AChR一抗体価は0−0．4

体が検出されなかった12例の0．M，G．患者血清中pmol舟であり，平均値は0．18±0．10pmolh

8例に於て抗休が検出され，その値は0．042−であった。一万0．M．G．患者血清17例に於てはわ

0．16pmol／戒を示した。従って0．M．G．患者血清

ずか5例に於てのみ抗−AChR」克休が検出され，17例のうち13例で抗体が検出されたことになる。

その抗体価はOpmol／誠一11．24pmol／五gの範囲

しかしながら0．M，G．患者血清に於ける抗rqChRに分布した。すなわち従来型ラジオイムノアッセ

一疇抗体価の平均値は1．79±3．18pmoレ磁（±S．D，イ法により測定した抗−AChR」抗体の出現率は全n＝13）であり，全身型のそれに比べ有意に低い値

身型で90％，眼瞼型で30％と明らかな相違が観を示した。

察された。しかし従来型ラジオイムノアッセイ法

0．M．G．患者血清中における抗−AChR」完体のにより抗−AChR一一・抗体が検出されない0．M．G．患

濃度は全身型に比し有意に低い。そこで全身型及者血清中に0．4pmol彪以下の抗−AChR−抗体がび眼瞼型患者血清中のIgG，IgM，IgA，の濃度存在すれば，その出現率は増加するはずである。

を比較検討した。G．M．G．及び0．M．G．患者血清

そこでラジオイムノアッセイ法の感度を増強す

中のIgGの含有量の平均値はそれぞれ1565±475

る目的で，より大量の血清（250−500J化，従来

mgノ旬L（±SD，n＝34）と1613±399m診旬L（±SD，型の10倍）を用いてラジオイムノアッセイを試み

n＝17）であり有意差は認められなかった。さらた。しかし大量の血清により抗原である125Ⅰ−αに両グループにおけるIgMの含有量は243±177−BuTx−AChR及びウサギー抗ヒトーIgG血清が

喝旬L（±SD，n＝34）と239±131か珍旬L（±SD，希釈され，血清中の抗−AChR」完体と125I−a−n＝17），そしてIgAは200±88醜（±SD，・n＝34二BuTx−AChRの免疫複合体の形成が阻害されると152±86机上（±SD，n＝17）であり，何れにと推察できる。事実予備実験により抗原を3倍にも有意差は認められなかった。

希釈することにより，複合体の形成は正常時の巧以下に減少することが判明した。そこで抗原（1251−a−BuTx−AChR）及びウサギ抗ヒトIgG血考察

重症筋無力症患者血清中の抗−AChR十抗体の検14 眼険型重症筋無力症における抗−AChR−抗体

81

出には従来1′化ー5／化の血清が用いられてきた。

もかかわらず，抗−AChR一抗体が血清中には存在（Almon＆Appel1976，Lindstromet al

しない。iii）抗原として用いたヒト胸節のAChR

1976，Oda et a11980）。しかしこの範囲の血と0．M．G．患者血清に存在する抗−AChR一抗体の清塁では125Ⅰ一a−BuTxの三脚寺異的結合に由来す

交差反応性が著しく低いという三つの可能性を示

るバックグランドノイズにより0．40pmol／緑 以

唆する。

下の抗体の検出は不可能である。本実験に於ては0．M．G．に於て，微量の抗−AChR−抗体の存在

約10倍量の血清を用い，さらに抗原（125トα−
BuTxTAChR）とウサギ血清を濃縮することによあるいはその存在なしに眼険下垂といった臨床症
状がどのような機序により発現するのか，あるいり最終容量を従来型と同様の1戒に保ち，アッセは何故これらの症状が抗コリンエステラーゼによイを行い，その感度を従来型の約10倍に増加するり制御できないのか，今後の研究が待たれる。

ことが可能となった。この方法によると，約70％の眼険型患者血清に於て抗−AChR」抗体が検出された。全身型患者血清における検出率が90％であり，両グループにおける抗−AChR．抗体の出現率に有意差が存在するとは考えられない。しかしその抗体価は眼険型に於て著しく低いことが本実験から結論できる。さらに加良型ラジオイムノアッ
セイ法によっても眼険下垂等の臨床症状を有する
4例の0．M．G．患者血清中に於て，有意な抗−AChR一抗体は検出されなかった。この結果は，0．M．G．に於てはi）改良型ラジオイムノアッセ
イによっても検出できない感量の抗−AChR一抗体
が血清中に存在する。ii）種々臨床症状の発現に文

献1）Almon，R．R．．＆Appel，S．H．（1976）．Serumacetyl−
Choline receptor antibodiesinmyasthenia gIaYis．
」∬仇ノ坑y∴心細d」如i274：235−243．

2）Lindstrom，J．M．，Seybold，M．E．，Lennon，V．A．，；
Whittingham，S．＆Duane，D．D．（1976）．Antibodies
to acetylcholine receptor inmyasthenia gravis．
〟b〟mbの′．26：1054−1059．
3）Oda，K．，Goto，Ⅰ．，Kuroiwa，Y．，Onoue，K．＆Ito，Y．（1980）．Myastheniagravis；antibodiestoacetyl・Choline receptor with human and rat an晦ens．
肋〟′0わ幻／．30：543−546．
4）LefYert，A．K．，Bergstram，K．，Matell，G．，Osteman，
P．0．＆ Pirskanen，R．（1978）．Determination ofacetylcholine receptor antibody on myasthenia
gravis；Clinicalusefblness and pathogenicimplica−
tions．エ〟e〟′βと肋〟r（）∫〟ヴ．勒Cカね乙41：394403．

．82

15 培養筋細胞のACh レセプターの代謝安定性と神経細胞由来因子
萩 原 摘四郎
研究協力者 長谷川 修 司

骨格筋のアセチルコリン・レセプター（AChR）

NCMの調製；Bauerら2）の方法に従って調製しの分布と代謝安定性は支配神経の影響を強く受けた。1週間以上培養したNGlO8−15細胞を血清ている。成熟した動物の骨格筋ではAChRは神経を含まないメジュウム中でさらに24時間培養し筋シナプスに限局して存在し，代謝的に安定でゆメジュウムを分離する。これを濃縮・透析したのっくりと分解される。・未熟な動物の筋ではAChR

ち凍結乾燥しNCM標品とした。培養筋をNCM

は筋線経の全長にわたって存在し，不安定ですみで処理するとき，上記の牛血清アルブミンを含む

やかに分解される。また培養筋のAChRは未熟筋

メジュウムに終濃度0，4軌に加えた。

ににてすみやかに代謝されること■が知られている。

AChR分解速度の測定：7−10日の筋培養をあ筋にたいする神経のトロクイック支配の機構をらかじめNCMあるいはChloroquine（10FLM）

明らかにすることは神経筋疾患の理解を深めるたと16−35時間保温したのち，10nM125Ⅰ−α−バ

めに重要である。われわれは，筋の発達にともな

ンガロトキシン（ABT）と60分保温した。培養筋

い，AChRが代謝的に安定化するトロフィック機に結合しなかった125卜ABTを取り除き，培養筋

積に，神経細胞が産生し放出するある種の生理活を充分に洗ったのち，一定時間毎にメジュウムを性物質が関与していることを示唆する実験成績をNCMあるいはChloroquineを含む新らしいメジ得たので報告する。

ュウムと交換し，メジュウム中にあらわれる125ト
ABT−AChR校合休の分解産物を測定した。125I

実験材料と方法
クローン神経細胞NGlO8−15のCOnditioned
medium（NCM）中でラット胎児の筋細胞を培養し，筋管表面のAChRの分解速度を測定した。

qABT−AChR複合体が半減する時間T与を算定L
AChRの分解速度のパラメーターとした。なお，
実験毎にコントロール筋のT与を測定し・NCM処
理筋の値は百分率であらわした。この方法で測定

筋培養：ラット胎児骨格筋の培養はChristianb

した125卜ABT−AChR複合体の分解速度はABTの方法に従った。筋培養をNCMで処理する1日に結合していないAChRの分解速度にほぼ等しい

前にメジュウム中の馬血清を2柚の牛血清アルブミンで置換した。メジュウムは次の組成である；

ことがすでに知られてい岩三細胞内部に蓄積した分解途中の125Ⅰ−ABT−

90％■Dulbecco′s modified Eagle′s medium

AChR複合体：培養筋を125I−ABTと1時間保温（DMEM）−10％馬血清−0．5FL乳／磁テトロド

すると（short．label）結合した125トABTの大キシンー抗生物質。

部分は細胞表面に存在する。24時間保温すると，l）＿■千葉大学医学部脳機能研究施設 神経薬理研究部：longlabel）分解途中の細胞内部にあるAChR
もラベルされている。longlabelとshortla−

15 培養筋細胞のAChレセプターの代謝安定性と神経細胞由来因子

83

罰一辞︶凸uZ一く↑﹈∝ ∝こじく

10
0

10

20￣

30

40

50

TIME tHrsl
図1

AChRの分解速度
9日培養筋をNCMを加えて（口，｛）あるいは対照の（△▲）メジュウム中で，あらかじめ17時間保温したのち，AChRの分解速度を本文に記した方法で測定した。各シンボル
はそれぞれ1枚の培養皿のデータである。

belの差は細胞内部に蓄積した121−ABTrAChR
複合体とその分解産物の塁をあらわす。
実 験 結 果
分解されずに筋細胞に残った125Ⅰ−ABTrAC城ることを示している。
NCMの代りにNGlO8−15のホモジネート遠心上活を加えても125I−ABT−AChR複合体のT古は用員に依存して延長した。
NCMによる125−ABT−AChRのT与の延長は複合体員を時間に対して対数でプロットすると，AChRが細胞表面で安定化されたことによるのか

40時間まで直線となり（図1），AChRの分解はあるいは細胞内での分解過程や分解産物を外部に1次反応に従った。コントロール筋の125Ⅰ−ABT−

放出するステップが遅延したことによるのか，こAChR複合体の半減時間は実験によって異なり，の疑問を明らかにする−ために，細胞内郡の分解途

16〜30時間の範囲で＿あり，平均22・6±0・9時間中のAChR量に及ぼすNCMの効果を調べた。対照（n＝22）であった（表1）。ただし，図1にみるとしてlysozomeでのタンパク質の分解を阻害す

ように同一実験内での培養皿によるばらつきは少ることが知られているchloroquineについて同様なかった。NCMを添加した培養では125卜ABTqの実験をおこなった。NCMを加えた培養では短瓜hR複合体のT吉はコントか−ルの132％に延長

時間ラベルで培養筋に結合した1251rABTの量がし，30時間であった（表1）。ダリオーマ細胞C6B

コントロールにくらべて多いが，長時間ラベルとU−1のCM（GCM）を調製し，NCMの代りに加短時間ラベルの差はコントロールと同じであった

えた培養筋のT上はコントロールとかわりなかった（表2）。一方，dlloroquine処理筋では，短時間（表1）。このことはCM添加による筋細胞のラベルでの結合量はコントロールと同じであった

AChRの半減時間の延長が神経細胞に特異的であが，長時間ラベルとの差はコントロールの3倍で

Ⅴ アセチルコリンリセプター

84

義1

AChRの分解速度に及ぼすCMの効果

Conditioned℡1／2relative

エー125−A8T bound N¶ediumto control（亀）relative toCOntrOl（も）NG lO8−15
C6BU−1（mean土SE）（mean土SE）

131．9

114．7

＋

2．9

、99．2

＋

9．8

＋

3．9

97．1＋13．2

Tl／20f controI cultures vas22・6土0・9（N＝22）

表2

細胞内部に蓄積した125Ⅰ−ABT−AChR複合体とその分解産物に対するNCMとChloroquineの効果

エー125−ABl bound（cpm）

Condition

Longlabel Shortlabel Difference

ControI

30．580（9）21．740（10）

8′840

NCM

35′582（10）27．670（10）7．912Contro1

25．559（4）

15，594（6）

Chloroquine

42，708（4）

14，072（6）あった。Chloroquineを加えた培養で125ILABT

9．965
28′636

同じNCM標品が培養筋細胞のAChRの凝集を促進することが報告されていiZNCM中のAChRを−瓜hR複合体のT古は880％に延長したo
ChloroquineとNCMはともiとAChRの分解を代謝的に安定化する物質とAChRの凝集を促す物

遅くらすが，NCMの場合には，Chloroquineの質が同一であるかどうか明らかでない。筋の発生

ばあいと異なり，細胞内部の125卜ABT−AChR

・成熟の過程でAChRが神経筋シナプスに限局し複合体とその分解産物が増量しないことから，細代謝的に安定化されるトロフィック機構にこれら胞内の分解過程と放出段階を阻害するのではない。

の物質が関与している可能性は充分に考えられる。

NCMはAChRが細胞内部へ移行する速度を遅くし，AChRの分解をおくらすのであろう。

結語

1．神経細胞のCMは培養筋細胞のAChRの分解
考案

以上の結果は神経細胞が産生しメジュウム中に速度を遅くした。
2．この効果は神経細胞に特異的であり，用量依放出した物質によって培養筋細胞のAChRの代謝存的に作用した。

が制御されていることを示す。本実験で用いたと3．NCMによりひきおこされたAChR分解の遅15 培養筋細川包のAChレセプターの代謝安定性と神経細胞山来因子

延は，AChRが細胞内部へ移行する速度が減少した結果である。

85

Z．，Jacques，L．＆Nelson，P．G．介oc．〟加L Amd
gcとU且4，75：40114015，1978．
2）Bauer，H．C．，DaAiels，M．P．，Pudimat，P．A．，Jacques，
L．，Sugiyama，H．＆Christian，C．N．BTqEnRes．，209：
395404，1981．

文

献1）Christian，C．N．，Daniels，M．P．，Sugiyama，H．，Vogel，

3）DeYreOteS，■P．N．＆FambrouれD．M．⊥Cb〃βfo上，65：335−358，1975．

86

16

培養骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体の合成と分化

杉 山 博 之＊
研究協力者

山

下

幸

子＊

骨格筋のアセチルコリン受容体（AChR）は筋材 料 と 方 法

肉の発生とともに合成され，その含量が増大する。

培養細胞としては，ウィスター系新生ラットま更に筋の分化が進み，運動神経の支配を受ける

たは鶏胚（嫡卵11日）の下肢筋より得た筋細胞，ようになると，AChRは神経と筋の接合部に凝集およびマウスのクローン化筋細胞株G8−1を用いし，その部位に局在するようになる。成熟筋の神た。培養法の詳細は既に発表し長三経筋接合部に凝集局在したAChRを筋発生初期の

AChRは全て125Ⅰまたは3上Ⅰで放射性標識したαAChRと比較すると，両者は基本的には極めて類−ブンガ。トキシン（。BTf）との放射性複合体

似した膜タンパク質であるが，詳細な点でいくつとして解析した。細胞表面股上のAChRは培養中

か異った性質を示す。例えば前者は後者よりも代の培地に放射性αBTを加えることによって校合謝的に遥かに安定で，細胞股上にとどまる時間が体を形成。細胞内αBT結合成分は，まず，表面ずっと長い。また両者は電気生理学的性質も微妙

AChRを非標識αBTで完全にブロックしたあとに異っており，アセチルコリンに反応してイオン細胞をホモジェナイズし，その後放射性αBTと透過性をコントロールする速度が異る。生化学的反応させて複合体とした。放射性複合体は，2％には，前者は後者よりも等電点がわずかに低く，分′RitonX−100で可溶化し，ゲル泣過，ショ糖密子構造の上でなんらかの違いがあると考えられる。

度遠心，等電点電気泳動等による解析も全てTHト

このように，AChRは筋の発生・分化に伴いこれら2つのタイプの間を分化変遷して行くが，その分化の制御機構や両タイプAChRの差異の実体

tonX−100の存在下で行った。
詳細な実験条件は予備的報告として一部すでに発表し定24）

相互関係等については，不明の点が多い。本研究では培養骨格筋細胞を用い，その、AChRの性質を結果検討した。特にその等竃点に注目し，培養細胞に

1．細胞表面AChR

おいて上記2タイプの等電点をもつAChRが合成

表面AChRはラット，マウス，ニワトリのいずされるか否か，合成の条件，動物種の違いによるれについてもゲル濾過的に均一な分子種から成る。

種差等について検討した。また，細胞表面股上の図1に典型的な例としてラットAChRのSephac−

AChRと細胞内前駆体とを比較し，骨格筋細胞に

rylS−200 によるゲル濾過図を示す。この分子

おいてAChRが合成され，膜に挿入され分化する

種の沈降係数は9Sであることが知られている。

過程を検討することを試みた。

ゲル濾過的には均一なこの成分を，等竃点電気泳動で分析してみると，ラットの場合，図2に示＊生理学研究所細胞益官研究系

されているように等電点を異にする2成分より成16 培養骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体の合成と分化

87＞ヒ≧ト0く〇一〇く∝ト皿弓・JNr
3040

ELUTTON VOLUME〔mr）
図1ラット培養筋細胞AChRのSephacryl S−200によるゲルろ過。●，表面AChR．
〇・細胞内αBT結合成分O標準マーカーはBD・blue dextran；CAT，Catalse；
BSA，bovine serum albumin，0VA，OValbumin．

20

コ山口で？OLX≡dO︺×山﹂d≡00望0く・卜望二軍
1

3

0−−・−−○︵﹂山口でN．OrX≡dO︶×uJd≡00竺0く・トロ弓土の図2

ラット骨格筋AChRの等電点電気泳動による分析。●L，培養細胞表面AChR．0，除神経横隔膜のAChR．AおよびBはそれぞれ．シナプス型および非シナプス型AChR．

ることがわかる。しかもこの両成分の等竃点は，したもの）よりのAChRのシナプス型と非シナプ対照として用いた成熟ラット横隔膜（除神経処理 ス型のものの等電点とほとんど同じ値を示す。こⅤ

88

アセチルコリンリセプターのことから，少くとも培養系においては，ラット

無いか，あっても極めて小さな差で我々の用いた骨格筋細胞は等電点に関する限り非シナプス型の方法では検出できない程度のものと考えられる。

みならずシナプス型に対応するタイプのAChRを2．細胞内αBT結合成分

も，神経の存在しない条件下で産出する，と考え

培養筋細胞は連続的にAChRを合成し，代謝回ることが出来よう。同様の結果は．マウスのクロ転している。従って細胞内には表面AChRの前駆ーン細胞G8−1についても観察される。

体プールが存在し，これも放射性αBTと複合体

これに対して，ニワトリ胚よりの筋細胞の表面を形成する。細胞内αBT結合成分をゲル濾過でAChRは等電点的に非シナプス型に対応する成分調べてみると，図1に示されているように，分子一種類しか検出されない（図3）。ニワトリにおい

量の異る3種の成分が兄い出される。このうち最ては，ラットやマウスの場合と異り，シナプス型

初に表面AChRと同じ位置に溶出される成分は，と非シナプス型のAChRの間に等電点的な差異は沈降係数も表面AChRと全く同じ（9S）で，表

5
1
0
1−
5

．▲︵SUJ〇三こ×uJ琶宍＝昌子ト電主M

FRACTlON NUMBER

図3 ニワトリ培養筋細胞の表面AChRの等電点電気泳動。

7

2
6

工d

■ ■ − − − − − 一

0︵？OrコuOぞ三dO︶×当d≡00竺0†ト習⊥mNl

0111−●︵TOrjuqで≡dO︶×当d≡00望0†トmF工の

10

20

30

FRACTJON NUMBER

図4 ラット培養筋細胞AChRの等電点電気泳動。○，表面AChR．●．細胞内前駆体（9S成分）

16 培養骨格筋細胞におけるアセチルコリン受容体の合成と分化

89

0︵盟↑管⊥の〜︻ 凸Z⊃○凸10

20
TrME【HOURS）

図5 ラット培養筋細胞表面AChRの代謝回転。
最初100％あった125Ⅰ・ABT−AChR複合休が時間とともに代謝され減少して行く経過を示す。

面AChRへの直接の前駆体と考えられる。
第二の成分（CATとほぼ同じ位置に溶出されには一種類のものが検出されるのみであり，その等電点は非シナプス型表面AChRのそれと極めてる成分）は沈降係数が約5Sで，分子量は9S成近い。

分の1／2〜1／3程度と思われる。αBTの結合

3．表面AChRの代謝回転は特異的で，過剰の非標識αBTやカルバミルコ

ラットまたはマウスについては，筋細胞表面A

リン，クラーレ等のコリン性リガンドで結合を阻

ChRが等竃的．にシナプス型と非シナプス型に対応害することができる。・従って，この成分はAChR

する2成分より成ることが分ったので，両型のもまたはその直接の前駆体と密接にかかわったもの

つもうひとつの差異，代謝的安定性についても，であると考えられる。これに対し，最後に溶出さ不均一性が見られるか否かを検討した。図5にラれる成分はそのαBT結合がコリン性リガンドでット筋細胞表面AChRについての結果を示した。

括抗されない。非特異的吸着によるものと考えら

図に明らかなように，表面AChRの代謝回転速度れる。

は単一の指数函数ではぼ完全に記述できる。図に

これら細胞内aBT結合成分のうち表面AChRは比較としてほぼ同量の2成分が異った代謝速度の直接の前駆体と考えられる9S成分を等電点電をもつと仮定した時期待される予想曲線を示した。

気泳動で分析した結果を図4に示した（ラットの（代謝速度が3倍一一一一，または6倍・‥，場合）。表面AChRは前述のように2成分が見ら異る場合）。これから，ラット筋細胞表面ACbRの上記2成分は，その代謝速度にほとんど差はなれるのに，同じ細胞の細胞内9S成分は等電点的90Ⅴ

アセチルコリンリセプター

く，仮りにあるとしてもその違いは3倍よりは小つ共通の前駆体より由来し，表面膜に挿入される

さいであろう，と考えられる。

段階以降で何らかのpost−tranSlationalな修飾を受けて2種類の成分に分化すると考えられる。

考案

ニワトリの場合，この分化の機構が欠けているか

以上の結果を要約すると，次のようになる。骨格またはラットやマウスのそれとはかなり異ったも筋培養細胞は2種類の細胞内αBT結合成分をもつ。

のであろう′。

ひとつは沈降係数約5Sの成分，他のひとつは9S

3．細胞内には，直接の前駆体と考えられる9S

で表面AChRとほとんど同じ分子量をもち，直接成分の他，分子量が約1／2〜1／3程度の5S成の前馬区体と考えられる。細胞内9S成分は等電点

分が兄い出される。このものは，サブユニット構

的には，非シナプス型AChRのそれとほぼ同じ値

造が未だ完成していない，いわば「前駆体の前駆をもつ成分が一つ検出されるのみである。細胞表体」とも言うべきものである可能性が掛、。これ

面AChRは，分子量的には均一であるが（沈降係に他の成分が結合して9Sの前駆体になるのでは数9S），等電点的にはシナプス型と非シナプス

ないかと考えられる。

型の両タイプにそれぞれ相当する等電点をもつ2成分より成る。しかし，この両成分の代謝回転速

今後．これらの解釈の適否について更に検討を加えていく予定である。

度にはほとんど差は見られない。
これらの結果は，次のように解釈される。
1．ラットおよびマウスの培養骨格筋細胞はシナ
プス型・非シナプス型の両型AChR．と同じ等電点をもつ2種類の表面AChRを，神経の存在しない条件下で産生する。これに対し，ニワトリにおいては両型のAChRは等竃点に差異はないかあっても極めて小さい。
2．ラット筋細胞表面の2種類のAChRは，非シ
ナプス型AChRの等電点にほぼ等しい等竃点をも

ll

文

献

1）H・Sugiyama：Multiple forms of acetylcholine−
SteraSeinclonalmuscle cells・jTBS Lett・84，
257・260，1977．
2）H・SugiyamaandY・Yamashita：Tritiumlabelingof
a−neurOtOXins with N−SuCCinimidyl【3H】propio−
nate・上月わC加m・rn）砂可90，729−735，1981．
3）H・Sugiyama：Heterogeneity ofracetylcholine re−
CeptOrmOlecules9nthesurfaceofclonalmuscle
CeuS・ル0仁力pα〃Acdd55B，75−78，1979．
4）H，Sugiyama：Ispelectric focusing analysis ofacetylcholinereceptorsinmouseandchickmuscle
Ce11Sinculture．Biomed．Res．1，91・95，1980．

91

17

発生初期におけるジストロフィー筋のアセチルコリンレセプターの代謝速度

堀

田

健

研究協力者 冨 田 伸 子

発生初期におけるdystrophy筋の異常を把握す

筋管が形成される。第2図は培養開始後6日目のるためにわれわれは組織培養および細胞培養したものであり，正常とdystrophy筋の問に目立った筋の電気生理的，形態的性質を正常のそれと比較して追跡し，dystrophyでは筋管が形成されて間相違はないが，発育の状態は卵によってかなりのバラつきがあった。さらに培養をつづけると8日もなく，正常とのちがいがあらわれることを前報

目あたりで桟紋が観察されるようになり，筋細胞で報告し正三が完成する。第2図Cは9日日の正常筋であるが今回はアセチルコリンレセプターの代謝を指標として膜の構成成分に異常があるかどうか，又これがジストロフィーの発症にどんな意義をもって実験の再現性は培養6〜7日目のものが最もよかった。
Erabutoxinによる結果：Erabutoxinを作用させ，結合しているものを正常とdystrophyで比いるかを考察した。

較してみると，第3図aに示すようにToxinの材料及び方法結合塁は正常の方が多く，dystrophyではその50

Dystrophy（N．H．413）及びNormal（412）〜80％の範囲であることが分った。Receptorの受精卵を37℃で12日間貯化したenトに結合したToxinのTotal量をそれぞれ100

bryoの胸部から筋をとり出し，コラーゲンを塗として縦軸に残留している量の対数，横軸に時間布した培養皿で培養を開始した。Control，Dys−をプロットすると，第3図bのように10時間あtrophyは常にペアで培養し5〜11日のものにたりまでは直線的に減少する。傾斜はdystrophy

ついて3H−Erabutoxin又は125トα−Btngaro−筋の方が大きく，従ってはやく代謝されることがtoxin，3H−a−Bungarotoxinを1時間作用さ分った。第3図の実験例では半減期は正常とdys−

せてレセプターに結合させる。過剰のToxinを洗

trophy筋でそれぞれ9．3時間，8時間でありこい流したのち，新らしい培養液を加え，3〜5時

れは再現性のある有意の差であると考えられる。

間毎に液を交換して代謝されて出てくる代謝産物

異る試料についての結果をTableIにまとめた。

の放射能を計測した。実際の手順は第1図に示す。

α−Bungarotoxinによる結果：第4図aはChick

3H−α−Bungarotoxinを作用させてレセプター
結果との結合をみたものであるがErabutoxinと同様，培養細胞の発育過程：植付けた細胞は培地中でdystrophy筋では正常の60％〜70％の結合しか急速に生長し，融合して5日日ごろまでに多数のみられなかった。初期countを100として対数と時間をプロットすると減少はErabutoxi甲の場合＊名古屋市立大学医学部第一生理学教室

よりずっとおそく，30時間まで追跡した限りで

92

V

アセチルコリンリセプター

17発生初期におけるジストロフィー筋のアセチルコリンレセプターの代謝速度

第1図 培養筋の位相差顕微鏡による観察 ×200，12日間37Cでふ化した血血yOから得た胸筋
a・正常臥 6日間培養 b，Dystro由y筋，6日間培養．C．正常乳 9日間培養
EXPEFHMENTAL PROCEDURECHICK BREAST MUSCLE CELLS（12daysincubation，5−7

daYSin culture）

MEM．ハ1b．

MEM

ELb（30nM）or

Etbく30nM）or

Bgで（2

Bgで（2

1hour

nM）

BACKGROUND

wash with MEM（5nM）

dTe（1mM）

370C S亀CO2times）

incubation in MEM

Change Ml：M−ゝ

130←

every

3

−

5

hours一・＞

counting

MEM（medium）
10号 HS
3亀
FCS
2亀
CEE

Etb：Erabutoxin b（3Hlabelledl

hours

residue

discard

一・・皐・COunting＋

BgT：〇一bun9arOtOXin（125工Or3Hlabe11ed）

SDS

−「声

COunting

dTc：d−tubocurarine

第2図 アセチルコリンセレブターの総量ならびに代謝速度測定手順。打S：馬血清，FCS：仔牛血清，CEE：鶏胚抽出液

93

94

30

HOURS

b

REMA川ING ACH RES．

30

HOURS

第3図 Erabutoxinの結合と減少率 ○：正常筋，●：dystrophy筋 a．結合量の割合，正常筋を100とする。 b．残留Toxinの時間経過。

は直線的であった。傾斜は，しかしながら，dys−のToxinを用いたが125Ⅰを用いたものは正常とtrophyの方が大きく，代謝速度は速いことが示の差は殆んど認められなかった。

唆された。この場合の半減期は正常筋34．2時間に対してdystrophyは26．7時間であった。6回の測考察

定結果は第1表bのようにまとめられる。Exp．

Ehlbryoの発育状態は正常，dystrophy共に卵

21，22，24，は125Ⅰ，27，28，29，は3H−ラベルの新鮮度に依存すると思われるかなりのバラつき

17発生初期におけるジストロフイ⊥筋のアセチルコリンレセプターの代謝速度

TOTAL COUNT95

EXP29BGT

30

HOURS

REト1AIN川G ACH RES

30

第4図

HOURS

Bungarotoxinの結合と減少率。記号は第3図に同じがあった。このため一回の実験に4ケの卵を入卵かったが，総じてdystrophyの方が成育がわるくして，そのなかから最も状態のよいものを選び，

はやくこわれる傾向があった。

pairとして培養を開始した。平均の辟化率は50％前後であった。

いので8−9日から桟紋のあらわれる成長の過程

培養開始後の生長，融合及び筋管形成過程におは前報の結果と比較してむ順調であるという′とど

ここで用いた培養液は神経性因子を含んでいなl）

いては正常とdystrophyの問に目立った相異はな

ができる。

′

Ⅴ

96

ERABUTOX川

Exp．

アセチルコリンリセプター

B

No．

17

18

0．72

0．74

7．7

7．7

7．7

6．1

6．7

6．5

5．7

0．78

0．87

0．84

0．74

11

12

0．40

0．85

8

9

To亡al D／N

0．65

0．40

N

9．3

9

7．7

D

8

8．3

0．92

D／N O．86

N：8．3

＋

0．8

D：7．1＋

1．e8−BUNGAROTOXIN

Exp．Jo．

21

Total D／N O．62

22

24

27

28

0．61

0．36

1．n O．78

29

0．68

N

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34．4

31．8

41．5

31．0

34．2

D

39．2

34．4

31．0

40．9

26．4

26．7

l、

1

1

0．96

0．84

0．80

r

hrs

D／N

：J：
D：

35．3

＋

4．O

33．2

＋

5．7

第1表 測定結果のまとめ N：正常筋，D：dystrophy筋，J ：総結合量のft，丁：半減期

Erabutoxinとa−Bungarotoxinはいずれもあろうと思われる。

アセチルコリンレセプターに特異的に結合するが然しながら得られた結果が極めてよい再現性を示

結合力（親和性）は後者が約10倍強しだいずれのしたことはレセプターとToxinの親和性に，正常場合も結合量がdystrophyにおいて少なく，正常とdystrophyの問で差があることを示唆している。

の約65％（TableI）程度であったことはdys−a−Bungarotoxinによる測定で得られた半減

trophy筋のレセプターが少ない可能性を示すも期は約30時間で，晴乳動物で報告されている標？である。代謝速度の指標である半減期はEra−bu．toxinによる場合は1／3程度であったが，こ準的な価（22時間程遠タに比してかなり長い。
これは種差によるものか，培養の条件その他にれはErabutoxinとレセプターの結合が弱く，結よるものかははっきりしない。いずれにしてもこ合したToxinがそのまま遊離してしまうためでの条件ではDystrophyの方が代謝がはやく，不安17発生初期におけるジストロフィー筋のアセチルコリンレセプターの代謝速度定であることは確かであろう。この傾向はDys−
trophy筋では細胞内蛋白分解酵素の活性が高く，蛋白合品び分角み元進しているという報告と同じ方向である。
今後培養条件をかえ，神経性因子の影響を追求
し，あわせて電気生理的な性質を明らかにする。

97

ストロフィー筋の電気生理的，形態的及び代謝的特性について．筋ジストロフィー症の基礎的研究，昭和55年度報告書 89−96（1980）
2）田宮信雄：神経毒とアセチルコリン受容体の結合，蛋白質，核軌 酵素22154−165（1977）
3）Steinbach，J．H．，Merline，J．，Heinemann，S・andBloch，R．：Degradation ofjunctionaland extra−
JunCtional acetylcholine receptors by developing
rat skeletalmuscle，Proc．Natil．Acad．Sci．（USA）

並3547−3551（1979）
謝辞
本研究は生理学研究所杉山博之助教授の御指導と御援助によりました。深く感謝の意を表します。
文献1）堀田 健，冨田伸子，杉山博之：培養法による鶏ジ

4）眞崎知生，吉川 昭：ジストロフィー鶏筋における蛋白合成能上昇の機構について．筋ジストロフィー症の基礎的研究．昭和55年度報告書103−107（1980）

5）青柳高明．和田孝雄：筋ジスニワトリおよびマウス
筋肉内各種酵素活性への対比，筋ジストロフィー症の基礎的研究，昭和55年度報告書159−165（19
80）

Ⅵ

微

細

構

造

18 鶏骨格筋の凍結割断像について 101

19 細胞骨格の分化発達−急速凍結エッチングレプリカ観察 106

101

18 鶏骨格筋の凍結剖断像について

岩

崎

祐

三

研究協力者 石 井 弘 子

骨格筋筋膜にみられるcaveolaeはその大きさに

写真を3倍に引き伸したものを用い，各サンプル

大小不同が顕著で，他の組織の組胞膜にみられる約200個のCaVeOlaeについてコントロン社製画

pinocytotic vesiclesとは異なるものと考えら

像解析装置を用いてその最小径を測定した。

れているが，その生理学的意義については未だ明らかにされていない点が多い。
われわれは，このcoveolaeの変化に注目し，ジ結果と考案
トリ骨格筋のcaveolaeは径30−40nmのもの

ストロフィー鶏と対照鶏の骨格筋筋膜の構築のちと50mm以上のものに大分しうるようにみえる。

がいを凍結剖断法により検索をつづけてきた。昨一般に30−40nmの径のものは，これをP面でみ年度は解化直後から5過日までの幼鶏について観た場合大きな径のものにくらべ，より深い陥人と察した結果を報告した。僻化直後には，単位面積

してとらえられることが多い。今のところ，このあたりのcaveolaeの数は対照鶏とジストロフィ

ような分類は便宜的なものにすぎないが，各筋群ー鶏の間に有意な差がないが，浅胸筋では2過以について10nnfあたりの個数をサイズ別に分けた

降，下肢筋では5週目に，ジストロフィー鶏におものをTablelに示す。

いてcaveolaeの数の顕著な増加がみられ．このまず浅胸筋についてみると僻化時にはジストロ

ような数の増加は排列の不規性の出現をともなっ

フィー鶏，対照鶏ともに，大部分のcaveolaeはていた。今回は27過令の成鶏についての観察結50nm以下の小さなもので，その平均はジストロ

果を各週令のジストロフィー鶏，対照鶏におけるフィー鶏で43．7±6．5，対照鶏で36．8±6．1であCaVeOlaeの直径分布について報告する。

る。2適合，5週令の対照鶏では50nm以上の大きなcaveolaeが半数近くを占め，その平均は2

材料及び方法過令で60．9±16．1，5週令で50．5±10．4である。

ジストロフィー鶏（413株）と対照鶏（412株）

一方，ジストロフィー鶏では，2週令，5週令での浅胸筋と後肢外転筋について検索した。ネンプ

単位面積あたりのcaveolaeの数が対照鶏にくら

タール麻酔下に採取した筋組織はリン酸緩衝液でべ有意に増加するが，この増加は491m以下の小希釈した2．5％グルタールアルデヒドで固定後，さなcaveolaeの増加によるもののようにみえる。

グリセリン処理を行ない，昨年度報告したごとく，

したがってその平均も2週令で47．1士9．0，5適合でエイコー社製凍結作製装置を用いて割断面のレプ

42．1±7．7と対照鶏にくらべ小さい値を示している。

リカを作製した。
caveolaeの直径計測には40，000倍で撮影した

次いで下肢筋についてみると，浅胸筋とは異なり，酵化時，すでに大部分のcaveolae．が50nm以上の大きなものであり，その平均は対照鶏で60．2＊国立武蔵療養所神経センター±9．8，ジストロフィー鶏で73．3±14．3である。5

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細

構
微
Ⅵ
102

103

図127遇令対照鶏，浅胸筋

×3叩00

週令のジストロフィp鶏にみられるcaveolaeのBonillaらはと卜のジストロフィp症について

顕著な増加は浅胸筋の場合と同乱49nm以下の検索を行ない，病的筋にみられるcaveolaeの増

小さなcaveolaeの増加によるもののようであるC

加は小径のcaveolaeの増加によるものであると5週令における平均は対照鶏で64・6±11・3，ジス 述べているが，同様のことが，生長期にあるジストロフィー鶏で48・4±9・3であった0

トロフィー鶏 こついても言えそうである。

104

Ⅵ

微

細

構

造

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18 鶏骨格筋の凍結割断俊について

ところがこれは27週令のジストロフィー成鶏については必らずLもあてはまらないようである。
図は27週令の対照鶏の浅胸筋の一部である。ここにみられるように，対照鶏では成鶏になっても

105

CaVeOlaeがほとんどみられないことを説明し得ると思われる。また・CaVeOIaeをpinocytotic
VeSiclesであるとする考えは成熟した正常骨格筋については否定的であるがT−SyStemの発達

CaVeOlaeの配列の規則性は保たれている。一方，が未熟な筋や病的状態ではpinocytotis も重要

ジストロフィー鶏ではこのような配列の規則性は幼鶏，成鶏とも失なっている。したがって，CaVe−

な役割をはたしており，pinocytotic vesiclesに対応するものが小径のcaveolaeであると仮定

01aeの配列の規則性についてみれば，ジストロ

すればジストロフィー筋における小径のcave。Iae

フィー鶏と対照鶏のちがいは，幼鶏でも成鶏でもの増加が生長期にのみみられ，成熟した時期には同じであると言えよう。しかし，CaVeOlaeの大目立たないことも説明し得るように思われる。

きさについてみるとTable2に示すどとく成鶏においては，幼矧こみられたような対照鶏とジス
トロフィー鶏のちがいを兄い出すことができないのである。
前述したごとく，CaVeOlaeを径50nm以上のものとそれ以下のものに分ける特別な根拠がある
わけではない。しかし，卿ヒ時にT−SyStemを含め，他の筋にくらべ筋細胞の構築で未熟であると言われている浅胸筋では大多数のものが小径で．
あったことは注目すべきであると思われるし，またジストロフィー鶏では生長期にある幼鶏に限って小径のcaveolaeが増加していた点も興味深い。
現在，CaVeOlaeの本態として最も確からしいT−
systemの開口部に対応するものが大径のcave−
01aeであると考えると僻化時，浅胸筋に大径の文献1）岩崎祐三，石井弘子：チキン骨格筋筋細胞膜の凍結
判断像「筋ジストロフィー症の基礎的研究昭和55年度報告書」53−朗．1981
2）徳臣晴比古ほか：筋の発達過程における変化−特に筋ジストロフィーチキンに構細管系について−「筋ジストロフィー症の臨床病態および疫学的研究
成果報告書」336一別3，1979
3）Bonnla，E．，Fischbeck，K and Schotland，D．L．：
Freeze・fracture studies of muscle caveolae inhuman muscular dystrophy．Ame J∴助th．104：
167・173，1981．
4）Costello，B．R．and Shanq，S．A．：Freeze−fracture
Study of muscle plasmalemmainnormalanddystrophic chickens．肋scte＆Nbn・e2：191−201，
1979．

106

19

細胞骨格の分化発達一急速凍結エッチング
レプリカ観察

智

に

律郎子

め

春治早

じ

川 倉 田

は

石 臼 月

研究協力者

承一郎

凍結レプリカ法の問題点はいかに急速に凍結させ細胞骨格は細胞を機械的に支持する細胞質構造ても，水晶をつくらない良好な凍結は凍結面直下の総称であり，細胞外形を維持し，細胞内オルガの極くわずかな表層域に限られることである。しネラの分布や輸送をコントロールしている。細胞たがって，通常の凍結レプリカ装置で，この表層

骨格では微小管，中間径フィラメントおよびマイ域を割断ないし内部露出することは難しい。＿わクロフィラメントが主な構成要素である。近年，

れわれは，この困難を克服すべく，ミクロトーム

筋細胞について，とくに収縮活動や筋原線経の構による凍結薄切法（クライオトミー）を応用して

成・配列との関連で，細胞骨格要素が注目されて凍結の良い表層域を広く正確に割断，露出し，レきた。

プリカ股を作製することができるようになったの

われわれは，これまで，培養筋細胞についてそ

で，その手技と応用結果を報告する。

の分化・発達過程で果す細胞骨格の役割を電子顕
微鏡的に検索してき・たこ筋細胞の伸長や，筋原線経の発達に伴ない微小管や中間径フィラメントの急速凍結エッチングレプリカ観察
手技と改良点一過性の増加が認められる。成熟筋細胞では，微細切した筋や神経組織を凍結レプリカ装置専用

小管の数は少ないが，しばしばⅠ帯のレベルを構ホルダーに載せ，液体窒素または液体ヘリウムに走しているのが観察される（図1）。

て冷却した純銅ブロックに接触（圧着）させ，急

細胞骨格の形態学的研究はこれまで，ほとんど

速凍結する。凍結時に組織片が強く庄平されない

超薄切片法によるものであったが，最近になってよう工夫した。試料ホルダーには濾紙を敷き，そ新しく2つの方法が細胞骨格の研究に有力な手段の上に組織片を載せるとともに，組織片を囲んでとなり得ることが明らかになった。一つは固定しビニールテープ環を一層貼りつけた。次にこの凍た培養筋細胞を無包哩のまま，乾燥試料として透結組織片をSorval1MT−2型ミクロトームに組

過電子顕微鏡で観察するものである。細胞内郡を込んだクライオキット（FTS／LTS−2）内に持露出するように試料を作製すれば，走査電子顕微

ち込み，一110℃〜−120℃の液体窒素ガスの中鏡でも観察できる。もう一つは，無固定・新鮮材

で，ガラスナイフで組織最表層を切削し，除去す料を急速凍結し，凍結乾燥ののち，金属蒸着による（図2）。クライオキット内では，ビニールテるレプリカ試料として観察するものである。このープ環を除き．テープの厚さだけ突出した組織片表層を切削することになる。．通常，lJJmの厚さで・東京大学医学部解剖学教室

削っていき，液体窒素凍結組織では，3〜5仰−107

19 細胞骨格の分化発達

申∪

竿
酉
︺
Q

図1ニワトリ縫工筋線経の縦断像。Ⅰ帯に横走する微小管（矢印）が観察される。

⊂

図2

d

急速凍結エッチングレプリカ法。a−b：試料ホルダーに載せた新鮮材料。筋組織の場合
伸展位でホルダーに固定する。C：クライキット内で表層域を切削し，内部構造を露出させる。d：フリーズ・レプリカ装置内で，深いエッチングを施す。e：試料回転とともに白金を蒸着させる。

の深さ，液体ヘリウム凍結組織では，3〜15／ m筋および神経への応用の深さ内で全面を露出させる。こうして，表層域

材料として，筋ではマウス排腹筋およびカエルを露出させた組織片をフリーズ・レプリカ装置

縫工筋を用い，神経では，ラット三叉神経を用い（Eiko FDL2S型）内に移し，高真空下で加熱た。筋をカミソリで帯状に切り出し，伸展位で，により，深くエッチングしたのち，白金の回転蒸

試料ホルダーに固定し，神経はカミソリで2分し着により，レプリカ膜を作製する（図2）。

てホルダーに載せ，液体ヘリウム冷却による金属

108

Ⅵ

微

細

構

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転王這萎襲・惹意
義髪蓋恵

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図3 骨格筋線経の急速凍結エッチングレプリカ像。新鮮無固定筋線経のレプリカ像で，筋原線経の構紋構造（A．Ⅰ．M）も明瞭に観察される。カエル縫工筋。

接触法で急速凍結した。レフ リカの観察に際してを呈してい逮は，立体対写真を撮影し，立体鏡卜で分析した。
凍結レプリカ像でみる筋原線経の構造は姑本的に結

語

は超薄切片像とはぼ一致するものであっ震大．

以上 急速凍結エッチングレプリカ法の手技改

小2種の筋フィラメントが明瞭に観察され，筋原良を行ない，この方法が細胞骨格の形態学的検索

線維内で規則正しい配列を示した（図3）。個々に有力な手段となることを示すことができた。今の筋フィラメントの詳細もかなり高分解能かつ立後，発達中の筋細胞に応用して，細胞骨格の役割

体的に観察された。ミオシンフィラメント上にはを解明していきたい。

多数の粒状構造が認められ，これらの粒子は細糸に沿い約40nmの間隔で配列しており，クロスブ

文

献

リッジに相当すると考えられる。また，アクチン
1）Ishikawa，H．，Usukura，J．andYamada，E．＝Applica−

フィラメントやZ板，M線も明瞭に観察された。
神経軸索内の細胞骨格系は，このレプリカ法により，極めて保存よく，明瞭に観察された（図4）。
長軸方向に密に配列した微小管やニューロフィラ
メントに加えて，横方向に連絡する微細な線維構造が発達しており，軸索内に密な格子様縞目構造

tion of cryomicrotomyto the freeze−etCh replica
method for unfixed tissues．J．Electron漉crosc．，
30，215（1981）．
2）Usukura，J．，Ishikawa，H．and Yamada，E．：Fine
StruCture Of umifixed frog sartorius muscle as re−
Vealed by deep−etCh−replicaandfreezesubstitu−

tion methods．J．E／ectro，7 MicTOSC．．30，237（1981）．
3）Tsukita，S．，Usukura，J．，Tsukita，S．，andIshikawa，

19 細胞骨格の分化発達

訳本丁−ギ：云‡Ⅴ
図4 有髄神経軸索の急速凍結エッチングレプリカ像。新鮮無固定の神経軸索内を埋めている細胞骨格網は，主としてニューロフィラメント，微小管，およびそれらを横に橋渡している
微細線維構造からなる。膜成分も散在してみられる。上端は軸索膜の内表面とミエリン膜が見えている。ラット三叉神経。

H．：Quick−freeze，deepCtCh，replica study onaxonalcytoskeleton．J」訂ectronMicroscり30，263（1981）．

109

Ⅶ 構造蛋白・その他

20

ミオシンH鎖及びL鎖isoformの発生過程における発現様式113

21

ウサギ骨格筋トロポニン成分の局在124

22 再生筋における筋蛋白質の分化127
23 骨格筋の発生・成長に伴うミオシンアイソザイム及びC一タンパク質の分子種変異135

24

ニワトリ胸筋のttNative HighMW Protein

25

ジフテリア毒素によるEF2の141

ADPリボシル化を抑制する因子と筋発生におけるその変化144

26 脱神経及び神経再生による支配筋の分離筋小胞体膜のCa−uptake筋について149

113

20

ミオシンH鎖及びL鎖isoformの発生過程
における発現様式
＊

郎隆生

粕
＊
＊

＊

弘

昂 美

日

方室

＊
＊
＊

大 大

＊

細胞運動に主要な機能を有する蛋白である。

知Myosinはactinと共に動物細胞一般に存在し

節

橋川崎

江 三 真

研究協力者

して発現されており，この制御には少なくとも3つの構造遺伝子からの発現に対する全か無か的な

1moleのmyosinは分子量約20万のheavy

調節が必要であろう。本研究では細胞分化の形質

chain（HC）2moleと，分子量数万の最低2種類発現のマーカーとしてmyOSinを取り上げ，細胞のIight chain（LC）が2moleずつ会合してで機能に応じた特異分子を細胞が発生過程でどの様きる，合計6moleのサブユニットからなる複合蛋に獲得していくかを検索する。

白である。分化した細胞ではその道動機能の特異性に応じて特有のmyosinを利用している。現在

実 験 方 法のところpost−tranSlational modificationに

1）材料：胚および僻化後種々のstageのニワト

よるものを除くと，同一個体内に（ニワトリの場

リanteriorlatissimus dorsi筋（ALD筋）を合）HCに6種類，LCに7種類のisofomの存

実体顕微鏡下に，採取し，ALD筋組織中に含ま在することが知られている。HCと最低2種類のれる，各isoformについて分析した。

LCの組合せがランダムなものだとすると270種

2）LCisoformの分析：（1）等電点，（2）分子量，にものぼるmyosinisoformの存在が仮定される。

（3）ペプチドマップ，（4航原性，の4点を指標に各

しかしながら実際に生体内で認められている組合

isoformの同定分析をおこなった。（1）t（2）は2次

せはその1割にも満たない。その理由の一つは，

元電気泳動（2D−PAG占ブ分析，ほ）については等

例えばLCに関して言えば，成体において7種の電点電気泳動（IEF）後，ゲルを蛋白分解酵素とLCisoformの中から選択される組合せには3通反応させてから，2次元目のSDS−ポリアクリル

りしかなく，これは各組合せに共通に利用される

アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を用いた分

isoformがない為である。しかも分化した細胞で析によった。蛋白スポットの染色はクーマシープ

はその機能に応じて3通りの組合せの中から1つノレ（CBB）法あるいは銀鄭品による。（4粧関しだけを選択して発現させている1㌔

複合蛋白ては2D−PAGE後展開した蛋白をニトロセルロ

であるmyosinの各サブユニットが多くのiso−ース膜に電気泳動的に転尋し1％BSAでプ。ッ

rorm遺伝子のプールから比較的厳密なセットとク後1次抗体と結合蛋白をFITCで標識した2次＊東京大学医学部薬理学教室＊＊千葉大学理学部生物学教室＊＊＊筑波大学基礎医学系＊事柄東京都臨床医学総合研究所

抗体で染色した。
3）HCの分析：myosinisozymeの分析に用いられるピロリン酸ゲル電気泳動（PPi−PAGE）
lこよりmyosinをisozymeに分離後，各isozyme

Ⅶ 構造蛋白・その他

114

l＝＝＝＝＝＝＝＝＝

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（f）］ighIChOinsoffos†musCle

myosin′′（⊂日i9hICkins ofCqdioC′′（9日ighIchQinsof；m∞fh′′b

図1（a）2D−PAGEによる収縮蛋白および調節蛋白のマップ（bhyosin LCisoformの2D−PAGE によるマップ（低分子酸性部分のみを示す）

20

ミオシンH鎖及びL鎖isofomの発生過程における発現様式

毎にゲルを切り出し蛋白分解酵素による限定分解の乳ペプチドのバターンをSDS−PAGE，銀染

115

結果と考案
2D−PAGEにより収縮蛋白およびその調節蛋

色により分析した。

白のisoformが比較的分解能よく分析できる（図4）isol■ormの定量：2次元に展開CBB染色され1）。図1−bに示すように7種類のLCisoform

たLCisoformのスポットを切り出し25％ピリ

は全て異なる位置にマップされる。

ジンによりCBBを抽出し，比色定員した。HCに胚と成鶏ALD筋よりurea−Nonidate P40可

関してはPPi−PAGEにより分析したisozyme

溶性分画を得，その全蛋白を2次元に展開して比毎のCBB染色度をデンシトメータにより測定，定較するとそのパターンには多くの相違点が認めら量した。

れる（図2）。LCだけに注目しても，成鶏のA

○

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l山じくd−S凸S■ † ⁝ いS2

H十17d etTb

l山0孟−S凸S

図2

成鶏および胚ALD筋の2D−PAGEによる構成蛋白の比較。

Ⅶ 構造蛋白・その他
116

ど血警甲ヽ1こご︑EJ0−0の叫UJ将士載∪噌せ瑠朝鮮 の図20

ミオシンH鎖及びL鎖isobnnの発生過程における発現様式

LD筋でははば遅筋型（S型）のisoformが特異

117

EMBRYO ALD MUSCLE

的に発現しているのに対し，胚の場合にはS型以外に速筋型（f型）のisoformに相当する2種のスポットが認められる。発生過程を追ってこれらのスポットの′ヾターン変化を見ると（図3），10
日胚ではf−1型とS−2型に相当するスポットが比較的多量存在し，S−1型およびf−2型の相対量は少ない。Stageが進むにつれf−2型のスポットが急速に消失する。この過程で認められる最も動的な変化はf−1型とS−1型の相対量の置換である。卵字化後，数日でf−1型のスポットは急速にADULT ALD MUSCLE

消失してゆき，ほぼsr型だけとなりALD筋特異形質となる。
2D−PAGEでみる限り，即ち等電点および分子量を指標とする限り，胚ALD筋に成鶏ではみられないf型に相当するペプチドが存在している。
しかし，このスポットがf型のLCisoformではなく単に等電点と分子量がf型に一致するような全く別の遺伝子産物である可能性を否定できない。
そこでf−1型isoformに特異的なpOlyclonal抗ADULT PECT MUSCLE

体を用い，r−1型に相当する位置にマップされるペプチドの抗原性を検索した。ここでpolyclonal
抗体を用いるのは，単一ハブテンに対する相同性ではなく多くのハブテン，即ちできるだけ多くの一次アミノ酸配列上の相同性を検出したい為である。図4に示す様に胚ALD筋構成蛋白を2次元に展開しニトロセルロース膜に転写後，抗f−1型ウサギ抗体と反応させ，FITCで標識した抗ウ
サギIgG抗体で染色すると f卜1型に相当するス
ポットが抗原性を有することが明らかとなった。

図4 抗f−1型抗体による抗体染色

成鶏ALD筋ではこの手法では抗原性を示すスポットは検出できない。従って等電点，分子量，抗原性という独立した3つの性質を指標にして見る

2D−PAGEで固定された各LC−isoform

限り，胚のALD筋には成鶏にはないf型LC

当するスポットはLCを含んでおり，LCがそのisoformが発現されていることになる。また図5

スポットの主構成成分であるといえる。従って，に示す様に2D−PAGEで分離したスポットとL

2D−PAGEのパターン変化を見ることで，rrUOSin

Cisoformのα−キモトリプシンによる限定分解

LCisoformの形質発現の細胞特異性獲得の過程で得られるパターンも一致する。以上のことからを追うことができる。tranSCription→Splicing

胚より得られたurea−Nonidate P40可溶分画の→translation→folding→aSSemblyという多くに相︒Q逓吏兎刃榊ゆ球史Q小量エト等代地義盛苛羨道．︒吏事犯導堅匪なト UトmP八へ￠卜﹁一上申＋1苧e uや遠景 望

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Ⅶ 構造蛋白・その他
118

20

ミオシンH鎖及びL鎖isofomの発生過程における発現様式−1山UくdlS凸S●・‥一一●l●−●▲■●

図6胚myosinの2D−PAGEのパターン，
得た結果。

LC部位のみを示した。Aは胸筋，BはALD

よりのステップの各々の中でtranslation以後のLC

るisozyme（FM3）以上3種類である。これら3

isoformの存在様式に関するもう1点の重要な問

種のisozyme を変性剤不在下，即ちHCL・LCが題はassemblyの様式である。発現されたLCが会合状態のままmyosin分子としてPPi−PAGE

実際にmyosin分子に組込まれているか否かを確を行なうと3種のisozymeが各々異なる移動度をかめるために胚よりmyosinを調製し，そのLC示す（図7）。胚のALD筋に存在するLCはS型，組成を見たのが図6である。図3と比較すると，とf型の混合物であり，これらがどのように細胞内での存在パターンとはぼ同様の相対比で，HCと会合しているかをppipPAGEによりmyosin分子に会合している。成鶏ALD筋では分析した。図8に示すように成鶏ALD筋のmyo−

1moleのmyosinのLC構成は2moleのS−1sinは単一バンドを示す。胚の主構成成分は成鶏型と2moleのS−2型である。心筋も同様であり型（Ad型）に比べ少し速い移動度を示す（B血−筋胃（平滑筋）では2moleのg−1型2moleのg1型）。Emb−1型よりさらに速い移動度を示す−2型である。一方速筋においては約1．3moleの成分（Bmb−2型）も少量存在する。発生初期の

卜1型，2moleのf−2型と0．7moleのf−3型がstage（例えば10日胚）ではEmb型が険出されるLCの構成成分である。S，f，g型が共存することは基本的にはなく，速筋の場合を除くとHC 2にすぎないがAd型も徐々に出現する様になり，

moleずつ当量的に結合している。速筋におけるトもかすかに検出でき，Emb型からAd型への置換

1型：f−2型：f−3型＝1．3：2：0．7 という比ははLCの場合（図3）に比べ，かなり時間がかか

一見等妙であるが，これは速筋myosinがLC組る。各isozymeのLC組成を，PPi−PAGE後各成の異なる3種類のisozymeの混合したものであバンドを切り出し，SDS−PAGEを行ない銀染色る為であi32即ち2m。1。のHCに対し2m。Ieのにより検出した（図9）。10日胚のEmb−1型，f−1型と2moleのf−2型LCからなるisozyme

Emb−2型ともLC組成の主構成成分はf−1型（FM3），1moleのト1型と2moleのf−2型とS−2型でありLC組成の相対比に大きな違いと1moleのf−3型LCよりなるisozyme（FM2）は認められない。ふ化後6日目の場合にもEmb−

2moleのf−2型と2moleのf−3型LCよりな

1型，Ad型ともS−1型，S−2型以外にf−1

それに伴いEmb−1型は，ふ化後16過において

120

Ⅶ 構造蛋白・その他

嶋

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HC−−

図7

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速筋myosinのPPi−PAGEのパターンと各バンドのサブユニット組成

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ALD

ALD

図8

ALD

AdBM．CM．AdBM．AdBNl．

ALD

各stageのPPi−PAGEノヤーン

十十Ad．ALD6dALD

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ミオシンH鎖及びL鎖isofomの発生過程における発現様式

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￣

FL1
FL2

￣FL3

r・・やせ

図9

各stageのPP巨PAGEの各isozymeのLC組成の比較，PPi−PAGEパターンはCBB
染色，SDS−PAGEパターンは銀染色による。

型をLCサブユニットとして含み，LC組成に差

動度の差はHCの相異に由来するものであると考は認められない。従ってAd型，Emb−1型，えられる。とすれば，HCにに関する細胞特異形

Emb−2型がPPi−PAGEで異なる移動皮を示す

質発現の獲得様式を発生過程を追って調べるには

原因はLC組成の相違によるものとは考えにくい。

PPi−PAGEのisozymeパターンを定量すればよ

これはEmb型からAd型への移行がLCの場合にいことになる。

比べずっと遅れていることからも支持される。

以上の結果からLCおよびHCisoformの発生

Ad型，Emb型各成分のHC組成を比較する為

過程での発現様式を定量的に見ると図11の様になにPPi−PAGE後各バンド毎に切り出し，α−キる。LC組成がALD筋特異性を獲得するのはほぼ

モトリプシンによる限定分解で得られるペプチド

ふ化時であるが，HCの特異形質発現が完了するのパターンをSDS−PAGEにより分析しナゴ図10）。

にはさらに数ヶ月を要する。

Emb−1型とAd型でHCが異なっていることがmyosinという1つの分子が組織あるいは細胞わかる。ALD筋と心筋のmyosinはLC組成に特異性を獲得するまでに各サブユニット毎に全く差はないが，PPi−PAGEでは心筋myosinがよ固有の発現様式を示す。LCに関しては発生初期

り速い移動度を示す。心筋のmyosinHCのペプにはS型，f型が共に発現され，しかもS−1型，チドパターンはALD筋と異なりHCに差のある。

S−2型，f−1型，f−2型各々に相対的存在比

従ってPPi−PAGEにおけるEmb型とAd型の移の調節は固有の様相を示す。HCに関しては発生

造
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細
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122

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l艶tlll20 ミオシンH鎖及びL鎖isoformの発生過程における発現様式

初期には胚固有のisoformが発現され徐々に成鶏型へと置換してゆく。これらの調節の場としては
transcription，Splicing，tranSlation fold−ing，aSSembly 各段階における代謝全てが候補として残るが，発生過程を追う限り，各サブユニ
ットのisoformの厳密なセットとしての形質発現の調節が，各サブユニットに共通の協同的なものであるとは考えにくい。

文

123

献

1）T．Mikawa，S．Takeda，T．Shimizu，＆T．Kitaura
GeneExpressionofMyofibrⅢarProteinsinSingle
Muscle Fibers of Adult Chicken：Micro Two
DimensionalGelElectrophoreticAnalysis．JIBio−
C触れ（1981）89，1951−1962．
2）H．Towbin，T．Staehclin＆J．GordonElectrophore−
tic transfer ofproteins frompolyacrylamidegels
to mitrocellulose sheets：Procedure and some
applications．L＞oc．NatL AcadlScL tJSA（1979）

76，435M354．
3）J．F．Hoh，P．A．McGrath，＆R．I．White・Electro−
phoretic analysisofmultiple formsofmyosininfast−tWitch and sloⅥトtwitch muscle ofthe chick．

βわC加机上（1976）157，87−95．

124

21

ウサギ骨格筋トロポニン成分の局在

大

槻

磐

男

研究協力者 小野山 住 道

従来ニワトリ骨格筋の免疫電子顕微鏡観察によCOmplete adjuvantを等量懸濁して，ヤギのってトロポニンの分布につき以下の事が明らかと皮下に注射した。得られた抗血清はエタノール分なった。筋肉構造の上でトロポニンは細いフィラ

画法によって精製し実験に使用した。

メント全長にわたって38nm間隔で分布しており，

b）抗体染色：成熟ウサギ及び29日日胎児の腸腰一本のフィラメントの局在部は常に24ヶ所である。

筋から作製したグリセリン筋を用いて以下の二法

これは細いフィラメントが常に一定の長さに保持を併用して観察を行った。i）解離フィラメント法。

されていることも示すものである。他方，このよ

グリセリン筋の細束を解離溶液（0．1M・KCヱ，

うに完成した筋原払維ではなく，なお形成途上にある筋肉については，筋原繊維がもろいため観察

10mM MgCB2，10mM K−phosphate（pH7．0），3mM ATP，0．4mM EGTA）中でが困難であったが，サポニン法によって可能であ

機械的に懸濁することによって，細いフィラメン

る事が示され，その結果ニワトリの骨格筋では細ト束を太いフィラメントから解離し，これに抗体

いフィラメント上のトロポニンの局在部位が25〜

処理後，カーボン蒸着を行ったグリッド上に採取31個と多く，したがって細いフィラメントが長いした。ii）サポニン法。グリセリン筋細束をよく洗事が判明した。僻化後3週程度で一定の長さに短った後，10￣4g／m＿βサポニンで10分間処理して縮することもわかった。筋ジストロフィーチキン

から，解離溶液に溶解した抗体で6時間処理し，を用いて検索すると僻化後5週を経てもなお短縮

固定包理した。

がおこっておらず，短縮化が著しく遷延していることが見出されている。

C）電子顧微鏡観察：解離フィラメント標本は酢酸ウランでネガティブに染色して観察した。包理以上の様にトロポニンの局在の検索は細いフィ

標本は超ミクロトームを用いて超薄切片を作製しラメントの構造形成をみる上に極めて優れた指標

酢酸ウランと鉛で二重染色を行って，電子顕微鏡となることがわかった。本年度は，ウサギ骨格筋下で観察した。

について同じような過程が存在するかどうかについて検討を行った。

結果，考察
通常の成熟ウサギ腸腰筋に抗トロポニンⅠ処理

材料と方法

を行うと，第1図に示すように抗体は，細いフィa）抗体の調製：ウサギ骨格筋トロポニンから分

ラメント全長に38nm間隔の横縞を形成した。横離したトロポニンⅠを抗原とし，これにFreund

縞の数はニワトリの場合の24より多く，常に26で●九大・医・臨床薬理ある事が判明した。なお抗トロポニンTlでも全く同じ結果が得られた。

125

21ウサギ骨格筋トロポニン成分の局在

図1ウサギ骨格筋解離フィラメント標本の抗トロポニンⅠ染色

豆宅建畠童主空三三チ二 ごて二＿三毒

ユ■三ヨ巴古電撃琴攣磯撞癖野津噂麺
Z

図2，3ウサギ胎児腸標筋サポニン筋標本の抗トロポニンⅠ染色

126

Ⅶ 構造蛋白・その他

図4 ウサギ胎腸腰筋解離フィラメント標本の抗トロポニンⅠ染色

次に妊娠29日目のウサギの胎児の腸腰筋のサポ

ほニワトリ骨格筋の場合に同じく，発達過程のウニン筋で細いフィラメント束が太いフィラメント

サギ骨格筋では細いフィラメント長が揃っておらからはなれて，抗体周期及びフィラメント先端がず，成熟後に比べて長い事を明示している。そし明瞭にみえる部位について検索を行った（第2，て，筋肉細胞発達のかなり後期にフィラメントが3図）。抗トロポニンⅠは成熟ウサギの場合同様

短縮して一定の長さになる事を示している。

に細いフィラメントのほぼ全長に38nm周期の横縞を形成する事がみとめられた。ただ一つのフィラメント束に沿った横縞の数は26より多く最高34個までを数える事ができた。但し，先端は必ずしも揃っていないので部位的にはもっと横縞の数が多い所も存在した。また解離フィラメント標本でも同じ結果が得られた（第4図）。これらの所見

文

献1）Ohtsuki，Ⅰ．J．Biochem．75：755−765（1974）．

2）Ohtsuki，I．J．Biochem．85：1377−1378（1979）．
3）Ohtsuki，Ⅰ．Carrent ResearchinMuscularDystro−
Phy，Japan2：23−24（1981）．

127

22 再生筋における筋蛋白質の分化

嶋 田
研究協力者

は

じ

め

裕＊

豊 田 直 二＊ 清D．A．FischmanH

水

法

子＊

の方法により，ニワトリ成体および胚の胸筋よりに損傷を受けた後の骨格筋において，筋再生には精製した。

筋衛星細胞が関与することが知られている。しか抗体の調製

し，再生筋において合成される筋蛋白質の性質に

TN成分に対する抗体の作製と，その特異性に関しては他の報告に掲載ずみである。C一蛋白質

ついて，まだ不明な点が多い。
本研究では遅筋と速筋の再生過程における筋蛋の単一抗体はMilsteinと協同研究者らの方法で白質の変化を，骨格筋および心筋のTN成分（TN

作製した。

−T，Ⅰ，C）に特異的な抗体，および親の速筋と蛍光顕微鏡的観察

胚の速筋のC−蛋白質にそれぞれ特異的な単一クTN成分の抗体に対しては間接蛍光抗体法によローン性抗体を用いることにより，免疫組織学的り観察した。すなわちグリセリン処理した筋組織に調べることを行った。さらに，再生筋の蛋白質をエタノールあるいはアセトンにて4℃，6−12について，二次元電気泳動法によっても調べ比較

時間固定し，クロロホルムに移した後，パラフィ検討した。

ンに包埋し，横断連続切片を作製し，間接蛍光抗体法により観察した。

材料と

方法

C−蛋白質の単一抗体には新鮮な標本にて凍結切片を作製し，直接蛍光抗体法にて観察した。

再生筋組織
成熟したニワトリをネンブタール腹腔注射によ

マイクロ二次元電気泳動り麻酔した後，背部正中を切開して前および後広新鮮な再生筋を用いた。二次元電気泳動は背筋（ALDおよびPLD）を露出した。液体窒

Mik。W。の方あ小型化された系を用いて，分析

素温度にまで冷却した3×4mの黄銅片を，各筋した。緩衝液等，ほとんどの手順は0′Farrellの表面に10秒間密着させ，術後2日〜8週に損傷の二次元電気泳動と同じであるが，非常に微量の部位を標本として摘出した。

試料で短時間に分析を行なうことができる。一次

抗原の調製

元目の分離にはIEFとNEPHGEを用い，二次元目

TN成分は成熟したニワトリの心室筋および胸の展開にはSDS電気泳動をLaemmliの方法を筋から江橋の方蓑精製した。C＿蛋白質は。最〜

用いて行なった。ゲルはクマージーブリリアント
ブルーにて染色した。

・千葉大学医学部解剖学第一講座＊＊Department

of

AnatOmyandCell

Biology，SUNNY，Downstate Medical
CenterⅦ 構造蛋白・その他

NormalA L DAnti−breastTNT

Anti・breastTN−L

Anti・breastTN−C

Anti・CardiacTN・T

AntトcardiacTN・l戯鎚済■冨∴∴二∴∴鍋狛

128

P L D

Anti−CardiacTN−C

図1正常なAuとPLDojuDは心筋Ⅷ卜C抗体とのみ反応した（f）oPLDは胸筋TN−TlⅠ，
C抗体によって反応したが心筋のTN抗休とは反応しなかった（g−1）。

結果

蛍光顕微鏡的観察
正常なニワトリのALDは抗心筋TN−Cによって染色されたが，他の抗心筋TN−T，Ⅰと抗胸筋TN−T，Ⅰ，C抗体によっては染色されなかった0しかし，正常なALDの中に抗胸筋TN−T，Ⅰ，Cと強く反応する細い筋線経が極く少数みられた。正常なPLDは抗胸筋TN−T，LCによって染色されたが，抗心筋TN−T，Ⅰ，Cでは染色されなかった（図1）。

Rege11eration（1v／atterinjury）

Anli−breastTNT

Anti−breastTN・lAnti・breastTN・C

Anti．cardiacTNT

AntトcardiacTN・l

A L D≠キ喜一車転賢撃≒竿毎抽葺22 再生筋における筋蛋白質の分化

129

P L D

Anti−CardiacTN−C

図2低塩による損傷の7日後のALDとPLD。ALDは心筋のTN−C抗体の他に，心筋のTN−T
および胸筋のTN−TI，C抗体によっても染色された。PLDは胸筋のTN−TI，C抗体のはかに，心筋のTN−T C抗体とも反応した。

これらの筋が低温によって傷害されると，新ら 受けてない筋繰経とは染色性が異なっていた。こしい細胞が損傷部の付近に出現してくる。それら のような細胞は衛星細胞由来の幼若な筋管であるの新らしい細胞は，正常の親の筋線経より細く， と考えられる。ALDでは，すべての再生していまた中央に核を持っており，さらに付近の損傷を る筋管は胸筋のTN−T，Ⅰ，C抗体で染色される

Ⅶ 構造蛋白・その他

H

Hl

NEPHGE OH−

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ALDTN・C叫忠温血、∴．ヾ諾㌘こpLDTN・C

ヽpLDLC3

PLDTN・l

図3心筋と胸筋のTN成分およびALD，PLD，心筋筋原線経の二次元電気泳動。ALD，PLD，心筋のTN−T，I，Cとミオシンの軽鎖LCl，LC2，LC3を区別することができる。

他に，心筋のTN−T，C抗体とも反応した。PLD

MFL21は正常なALDと反応しないが，正常なにおいても，再生筋の細胞は胸筋の3つのTN抗親のPLDとは反応する。ElOI D6は正常な親体と反応する他に，心筋のTN−T，C抗体とも反のALDともPLDとも反応しない。しかしALD

応した（図2）。われわれは，すでに胚の骨格筋とPLDの再生筋はMF−21によっても，またElOI

二二∴二二〔∵÷∴∵D6によっても染色された。
マイクロ二次元電気泳動

究の結果は，TN抗体のALDとPLDの再生筋

正常なALDおよびPLD，ならびに低温によに対する反応性は，胚の骨格筋と同じであること

る外傷後7日の各筋について二次元電気泳動を行を示しているなった。ALD，PLDならびに心筋のTN成分

正常な筋組織には結合しないこれらの抗体に対とミオシン軽鎖の同定については，あらかじめ調する反応性は，損傷後2日目から現われる。しか製した心筋と胸筋のTNならびにALD，PLD，心し4週までには，ALDは胸筋TN−T，I，C抗筋の筋原線経を泳動して行なった。心筋とALD体，および心筋TN−T抗体との反応性は消失LのTN−Cではスポットが重なり，区別できなか

PLDも心筋TN−T，C抗体と反応しなくなる。

った（図3）。正常なALDではALD型のTN−T，

これは分化が進むにつれて，再生筋が異質の抗原

Ⅰ，Cおよびミオシン軽鎖LCl，LC2がみられ性を失い，4週までにそれぞれの筋特有の蛋白質た。しかし低温損傷筋では正常の筋にみられる蛋を合成するようになることを示している。

白質以外に，PLD型のTN−T，Ⅰ，Cおよびミ

再生しているALDとPLDの横断切片を，親オシン軽鎖LCl，LC2，LC3と心筋型のTN−

および胚の胸筋のC一蛋白質に対する単一抗体

T，Cが出現していた（図4a，b）。PLDの（MF−21，ElOI D6）によって染色した。

再生筋では心筋型のTN−Cが含まれていた（図5）⊃

22 再生筋における筋蛋白質の分化

A

L

131

D

NormalRegeneration（7d afterinjuryJ
0

l【F

OH−H＋

l【F

㍗機転
二Jごr亨

ご■背

■一軍
．軟

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ALDLC−ALD−CardiacTN｛●●

ミ ＿ 恕竺二．

I

ALDTN−C粁Ⅷ層凋牒イやぼ

H＋

ALJLC二 ●。ふ。、。L．ニ；

壷；

A

L

■

1

D

NormatRegeneration（7d afterinjury）

H＋

NEPHGE

OH，H＋

NEPHGE

I￣二・・＿

OH￣

＿

ーー

b

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≠

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一●

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●●●

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1

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轡

ALDTNJTALDTN・l／●・●・、￣ニケDTN・・−・・・＼pLDTNtl
d野．■L

図4ALDの正常と損傷後7E］の二次元電気泳動。（a）ALD型のTN−Cおよびミオシン軽鎖LCl，
LC2佐）の他に心筋型TNrT C，PLD型TN−C，LCl，LC2，LC3が存在する㈲。
（b）ALD型のTNrTI（左）以外にPLD型のTN−T，Ⅰ佑）がみられる。

Ⅶ 構造蛋白・その他

132

P

L

D

NormalRegeneration（7d afterinjury）

H＋

lEF

oH−H＋

lEF

OH−

−

て蔓嶋

PLDTN・Cl

PLDTN・C・lln．＿＿一■■

図5PLDの正常と損傷後7日の二次元電気泳軌PLD型TNLCのはかに（乱心筋型のTN−C㈲が存在する。

7，8，9）

これらの結果を表1にまとめる。

ている。本研究においても，ALDの再生部分が胸筋（速筋）のTN成分の抗休と反応した。さら考察に心筋のTN−TおよびC抗体とも反応した。二本研究によって，低温により損傷を受けた筋は次元電気泳動も，ALDの再生部分にPLD型の2日後から筋蛋白質の合成を開始し，ALDとPLD

TN−T，Ⅰ，C，心筋型のTN−TとC，およびの再生部分は心筋あるいは胸筋のTN成分のいく

ミオシン軽鎖LCl，LC2，LC3が存在すること

つかと抗原性を共通にすることがわかった。またが示された。また胸筋（速筋）のC−蛋白質から

親および胚のC−蛋白質から作製した単一抗体の作製した単一抗体も再生ALDと反応した。これ両方がALDの損傷部分と反応した。そして分化らの結果から，再生しているALDは胸筋（速筋）

が進むにつれて再生筋は異質の筋に対する抗原性のTN，ミオシンおよびC一蛋白質を含んでいるを失ない，その筋組織本来の蛋白質を合成するよことが明らかである。

うになった。損傷を受けた筋が正常の筋と同じ性

PLDの再生筋に関しては，胸筋のTN抗体で染質をとりもどすのに少なくとも4週はかかった。

色される以外に，心筋のTN−TおよびC抗体によ筋の発生過程において出現する蛋白質，主にミっても染色され，さらに二次元電気泳動でも心筋

オシンの性質については多く警欝告があるが・研究者によって結果が色々である。しかし遅筋が分のTN−Cが確認された。しかしPLD再生筋の二次元電気泳動において，心筋の附，ならびに化してくる過程で，速筋型のミオシンおよびTN

ALD型のミオシン軽鎖については不明である。今が出現してくる点では，多くの研究報告は一致し

後さらに感度の良い方法を用いることが必要と考133

22 再生筋における筋蛋白質の分化

三

才

七十

t＋

＋

＋

卓1

七十

＋

‡＋

︻

七十

三

＋

＋

十

十

＋

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十

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日石こじ ぎ盲二tU﹂ヨd︵︸Sロ巴q OごqE山︶−Ouコ∈∈lUUuUUS巴○コこ沌tロUO芯UUE岩−〇三卜S︻S巴〇五OL︸UUlU

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U芯冨LdIUのQ 岩l山tZ−LE︵完口巴q 二つPく︶

U−NトUロ召﹂ロU
TNトUロ岩﹂ロU
トーNトUロ岩﹂ロU
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U
」

十

−
U
J

三 t 一口∈LON

十

三 才

十

tO∈LON＋N＋

Ⅶ 構造蛋白・その他

134

えられる。
当研究によって観察された再生筋の筋蛋白質の性質は，胚を用いて報告されている筋蛋白質の分
3，7，さ）

化の結果とよく一致している。これらのことから，
低温によって損傷を受けた筋が再生する時，再生筋は胚子期の筋の性質を獲得し，胚子期の筋蛋白質の合成が繰返されることが判明した。
文

献1）Ebashi，S．，T．Wakabayashiand F．Ebashi，1971．
Troponin andits components．J．Biochem．
（Tokyo）．69：441−445．
2）Offer，G．1972．C−prOteinand theperiodicityin
the thick filaments ofvertebrate skeletalmuscle．
In：ColdSpringHarborSymp．，37，87・93．
3）Toyota，N．andShimada．1981．Differentiationof
troponinincardiacandskeletalmusclesinchicken
embryos as studied byimmunonuorescenemicro−

SCOpy．エCb〃βわ191：497−504．
4）K6hler，G．and C．Milstein，1975．Continuous
Cultures of fused cells secretingantibody ofpre・
definedspecificity．Nature（London）256：495−497．
5）Mikawa，T．，S．TakedaandT．Shimizu．1981．Gene
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fibersofadultchicken：Microtwo−dimensionalgelelectrophoresticanalysis．J．Biochem．（Tokyo）89：
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6）Laemmli，U．K．1970．Cleavage ofstruCturalpro−
teins duringtheassemblyoftheheadofbacteri0−
phageT．．NatuIe（London）227：680−685・7）Masaki，T．andC．Yoshizaki，1974．Differentiation
Ofmyosininchickembryos．J．Biochem．（Tokyo）
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8）Rubinstein，N．A．and H．Holtzer，1979．FastandSlow musclesintissueculturesynthesiseonlyfast
myosin．Nature（London）280：323−325．
9）Dhoot，G．K．，and S．V．Perry．1980．The compo・nents of troponin complex and deYelopmentin

Skeletalmuscle．血p．αJJR即．127：75−97．

135

23

骨格筋の発生・成長に伴うミオシンアイソザイム
及びC−タンパク質の分子種変異

大日方
研究協力者

大

室

昂■
弘

美＝

真

崎

知

生■■

骨格筋の筋原線経を構成するタンパク質には，セリン含む）pH8．8に溶かし，20mMピロリン酸

それぞれ何種類もの異なる分子種（Isoform）

ソーダ（pH8．8）10％グリセリンを含む3．8％アがあることが知られている。特にミオシン・・アク

クリルアミドゲルを用いて，約16時間電気泳動を

チン・トロポニン・トロポミオシンなどについて行なった。この条件では，ミオシンアイソザイム

Isoform問の違いの内容が詳しく明らかにされは，H鎖，L鎖を含むミオシン分子として電気泳これらIsoformの種々の筋組織における分布，

動されることが知られてい震各ミオシンアイソ

又，非筋細胞の収縮性タンパク質との違いなどもザイム中のL鎖サブユニットは，ピロリン酸ゲル

調べられている。成熟した速筋，遅筋，心筋など上に分けられた各ミオシンアイソザイムを，2％の横紋筋はそれぞれに固有のタンパク質分子種をSDS，2％2−メルカプトエタノールで処理したもつことが示されてきた。我々は先に，ニワトリ

後，SDS−アクリルアミドゲル電気泳動で調べた。

胸筋の発生，成長過程で，ミオシン，アクチン，又，ピロリン酸電気泳動ゲルを，1．5％アガロー

トロポニン，トロポミオシンなどの分子種が顕著

スゲルに埋めこみ，並列して作成した溝に，抗ミ

1，2，3）に変異することを報告してきた。今回更に，幼若

オシンL鎖抗体を添加して，免疫拡散法によりミなニワトリ胸筋に存在するミオシンの特性を明ら

オシンL鎖を調べた。一方，ミオシンH鎖を比較

かにし，又，ミオシンフィラメントに結合して存するために，幼若筋，成若筋ミオシンをそれぞれ在する調節タンパク質であるC一タンパク質が明α−キモトリプシンを用いて限定分解し，生じたらかに筋成長に伴い，変異することを観察したのペプチドフラグメントを0′Farrel12次元電気で報告する。

泳動法で解析した。
C−タンパク質について：種々の発生段階の
実 験 方 法ニワトリ胚，又はヒヨコ胸筋から，SDS−メルカ

ミオシンについて：ふ卵10日，13日，15日目

プトエタノール溶液（4％SDS−4％2−メルカのニワトリ胚，ふ化後10日のヒヨコ，及び成鶏よプトエタノールー40mMリン酸緩衝液）を用いてり既述の万感こよりミオシンを調製し，各時期のタンパク質を抽出し，これをSDS−アクリルアミ

ミオシンアイソザイムをピ。リン酸電気泳動巌

ド電気泳動にかけ，分離されたタンパク質を，Tニ比較した。泳動条件はミオシンを50mMピロリン

トロセルロース膜に転写し，更に，速筋型C二タ酸ソーダ（lmM DTT，2．5mMEGT丸50％グリ

ンパク質，遅筋型C−タンパク質に対するモノク
ローン抗体及び125Ⅰ一抗マウスIg抗体で処理■千葉大学理学部生物学科＊＊東京都臨床医学総合研究所

し，オートラジオグラフィー法で，C一タンパク質のタイプを同定した。

Ⅶ 構造蛋白・その他

136

￣石ii

蒜

．＿一・．．

EM3￣、豊「忠霊整≡瀞∈凝≡野馳

鞠
a

b

c

d

e

f

g

図1ニワトリ胚及びふ化後のニワトリ胸筋から得たミオシンのピロリン酸ゲル電気泳動のパターン。（a）10日胚，（b）13日胚■C）15日胚，（d）ふ化後10日，（e）成鶏，（fHdJt（eめミオシンを混合，（gHb）と（fのミオシンを混合。EMl，EM2，EM3：胚のミオシンアイ
ソザイム。FMl，FM2，FM3：親胸筋の3種のミオシンアイソザイム。

d胃

e

f
雫 一物攣
り

L・・＿−＿
u2・淵＿

＿＿

≡二●一一
一一Lf2
Lf3

L＄2眉静＝
L†2

増

一LSl
し82

澤激

図2 ピロリン酸ゲル電気泳動で分離された各ミオシンアイソザイムに存在するL鎖サブニットの組成。SDS−ゲル電気泳動後，銀染色法により，L鎖のパターンを示した。
（a）親のFM3，（b）親のFM2，（C）親のFMl，（d）親の遅筋（ALD）ミオシン．Lfl，Lf2，Lf3，速筋ミオシンL鎖，Lsl，Ls2，二遅筋型ミオシンL鎖。

23 骨格筋の発生・成長に伴うミオシンアイソザイム及びC−タンパク質の分子種変異

結果と考察

137

サブユニットについて，胚と親とで比較した。図5）1．幼若筋のミオシンアイソザイム

2に，胚と親ミオシンの各アイソザイムのL鎖パ

図1に種々の発生段階のニワトリ胸筋から得たターンを示す。既に報告されているようささヲ親胸ミオシンのピロリン酸電気泳動のパターンを示す。
成熟胸筋ミオシンは，3種のアイソザイム（FM3，
FM2，FMl）を含むことが知られている（図1を参照）。ところが，10日胚のミオシンは，主に1本のバンドのみ（EM3）を与える（図1a）。
発生の進行につれ，徐々に，他のミオシンアイソ
ザイム（EM2．EMl）が出現し，15日胚で3種のアイソザイムが認められる。しかし，胚のミオシ
ンアイソザイム（EM3，EM2，EMl）を成熟筋ミオシン（FM3，FM2，FMl）と比較すると．ピ筋の各ミオシンアイソザイムは，各々固有のL鎖パターンを示す。一方，胚胸筋ミオシンアイソザ
イムのL鎖パターンは，親のどのアイソザイムとも一致せず，速筋型（Lf．，Lf2），遅筋型（Lsl，Ls2）（又は心筋型）L鎖サブユニットが共存することが認められた。
ミオシンアイソザイムをピロリン酸ゲル電気泳動により分離した後，アガロースゲルに埋めこみ
免疫拡散を行なったところ，ニワトリ胚のミオシ

ロリン酸ゲル上での移動度が一致しないことが明ンアイソザイム（EM3）は抗速筋L鎖（Lfl）及び抗遅筋L鎖（Lsl）と反応して沈降線を形成しらかになった。特に，10日胚のEM3は明瞭に，親た。従って，胚ミオシンアイソザイムには，速筋

ミオシンアイソザイムから識別される。ふ化10日

L鎖，及び遅筋L鎖（又は心筋L鎖）が共存するを経たヒヨコのミオシンは，3本のバンドを示しことが免疫学的にも確認された。（図3）

親ミオシンとほとんど区別されなかった。これら

図4にミオシンH鎖のα一阜モトリプシン限定の観察は，幼若胸筋のミオシンが，成熟筋ミオシ

分解によって生じたペプチドの二次電気泳動のパンとは異なるものであることを強く示唆する。

ターンを示す。この泳動条件では，ミオシンL鎖

そこで，次にミオシンアイソザイムを構成する、■・は，ゲルの先端に位置するので，図に示されたス

飴rdiacニ＞仙

一≠

1−

滋濠レ京牒
1

Emb．Breast．

㌔￣二−

antiLflt

Cardiac
￣一一一−

−−一・−

−

−antiLcl

Emb．Breast

図3ピロリン酸電気泳動と組みあわせた免疫拡散013日胚胸筋ミオシン（Emb．Breast），
心筋ミオシン（Cardiac）及び遅筋ミオシン（ALD），アイソザイムと抗連筋L鎖（antiLf2）・抗心筋L鎖（antiLcl）との反応を示す。

Ⅶ 構造蛋白・その他

138

軒 a

OH￣

ナニー

山口＜d S凸の

j■

㌦㌔

胤警

1

u

Lsl
施

d

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＿

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1
．
．
．

◆

1■−

ぎ■

⁚

鞋：

㌫㌍熟
ー′′ごご鎚、

・ −■■

・・●′

−

図413日胚（a，C）及び成鶏（b，d）胸筋ミオシンのα−キモトリプシンで処理した。
a，bはクマジー染色。C，dは銀染色法による。

ポットのほとんどは，H鎖に由来したものと考え処理した時生じたペプチドは，胚と親とでかなりることができる。非変性のミオシンをプロテアー

似かよったパターンを示した。しかし，なお胚及ゼ処理した時，ペプチドのパターンは，胚と親とび親に特異的と思われるスポットが認められた。

で著しくことなった。しかし，ミオシンを熟，又胚ミオシンのペプチドのパターンは，遅筋ミオシ

は表面活性剤（SDS）により変性後プロテアーゼ

ン，心筋ミオシンのものとは著しくことなった。

23

骨格筋の発生・成長に伴うミオシンアイソザイム及びC一タンパク質の分子種変異

139

表1ニワトリの胚及び成鶏胸筋ミオシン・アイソザイムの構成成分，EMHC：胚ミオシンH鎖，FMHC：速筋型ミオシンH鎖，一他のシンボルは図1．図2に同じ。

Iso写ymeS He言：≡in LightChain

Embryo EM3
EM2
EMI

E粕iC

Lrl・Lr2，Lsl・Ls2（Lcl・Lc2）

E沌iC

Lfl・Lf2・・・Lsl・Ls2（Lcl・Lc2）

EMHC
Lr2，Lr3′

Adult

FM3

F沌一C

FM2

F咄C

FMI

表2

Lfl，Lr2
Lrl，Lr2，Lr3

F沌iC

Lf2，Lr3

種々の発生段階のニワトリ胸筋抽出物と抗速筋型及び抗遅筋型C−タンパク質抗体との反応
性
17 日 胚20 日 胚ふ化 1 日＿ふ化 7 日親抗 速 筋 C タ ンパ ク 質

＋

＋

＋

＋

＋

抗 遅 筋 C タ ンパ ク 質

＋

＋

＋

±

十：反応性あり ±：わずかに反応 −：反応性なし

これらのことから，幼若胸筋のミオシンH鎖は親いを表1にまとめた。両者はL鎖，H鎖サブユニ

胸筋の速筋ミオシンのH鎖と類似性が多いが，同ットいずれにおいても違いがあるものと考えられ一ではないと考えられる。非変性のnative ミオ

る。

シンをプロテアーゼ処理した時のパターンが，胚2．筋成長に伴うC一タンパク質の変異と親ミオシンとでとりわけ異なることから考える

種々の発生段階のニワトリ胸筋から，タンパクと．両者のミオシンでは，L鎖サブユニットの違

質をSDS溶液で抽出し，SDS−アクリルアミドゲ

いや高次構造の違いがあり，このことにより，プル電気泳動を行ない，電気泳動のバンドに抗速筋−

ロテァーゼによる分解が影響を受けたことが考えCタンヾク，及び抗遅筋−Cタンパク質抗体を反応られる。
胚と親ニワトリ胸筋ミオシンアイソザイムの遵させて調べた結果，表2のような結果を得た。ふ
卵17日以後ニワトリ胚の胸筋に，速筋型Cタンパ

Ⅶ 構造蛋白・その他

140

ク質が検出された。更に，ふ化後数日までの時期の胸筋に遅筋型C−タンパク質も検出された。ふ化1週間をすぎると，胸筋中の遅筋型Cタンパク
質は．はば完全に消失する。このようなC−タン
パク質分子種の変異の起る時期は，既に報告した
ト。ポニンT，ト。ポミオシン分子種の変品起る時期と一致して興味深い。
文献1）大日方昂：筋肉アクチンーミオシン系（iii）発生・分化，
生休運動面173−199．学会出版センター，1982。

2）Obinata，T．，Masaki，T．＆Takano，H．Types ofmyosinlight chains present during the develop−
ment of fast skeletalmuscle in chick embryo．
エ劇加血鼎．87：81・88，1980．
3）Matsuda，R．，Obinata，T．＆Shimada，Y．TypeSOf
troponin・COmPOnentS during development ofchicken skeletalmuscle．加yeJ叩．βわエ82：11−19，
1981．
4）Hoh，J．F．Y．DeYelopmentalchangesinchickenskeletal−myosinisoz：ymeS．FEBSLeEt．98，267−270，
1979．
5）Takano・Ohmuro，H．，Obinata，T．，Masaki，T．＆Mikawa，T．Changesin myosinisozymes duIing
deYelopmentofchickenbrestmuscle・J．BLochem・
hpTeS乱

141

24

ニワトリ胸筋のllNativeHighMW Proteinh

丸 山 工 作■研究協力者 木 村 澄 子◆

脊椎動物骨格筋には，塩で溶出されない細いフ

0．1mMPMSFをずっと加えて，Proteinasesィラメント構造が存在し，これを私たちは弾性タ

活性を止めることも試みたが，結果は加えないとンパク質コネクチンと名づ最三その本体は，分きと同じであった。

子量100万におよぶ高分子量成分と，43，000ダル

筋原線経を5mMNaHC03で10回以上洗い，水トン成分から成るが，後者は，変性アクチンと判

溶性タンパク質（たとえばα−アクチニンなど）

2）

明した。

を徹底的に除く。しかるのちにDWで洗い，筋原

高分子量成分は，グアジニン塩酸処理で可溶化

繚経をぼうじゅんさせる。このさいは14，000rpm

され，単離され遥2また筋線経や筋原線経を直接30分の遠心を行った。これを0．3MNaQZになる

sDSで溶かし，ゲルろ過法で分離できi三wangPよう，3MNaCCを加え，1時間かきまぜ，ろ紙は，これをチチンと呼んだが，コネクチンにはかでこす。このろ液を以下の実験に用いた。

ならないことが示された
しかしながら，これまでコネクチンの高分子量

結

果

成分は変性した状態でしか単離できなかった。こぼうじゅんした筋原線経に中性塩を加えると，

れでは，本来示す活性なり機能は失われてしまっ

筋原綿経は収縮する。このさい，高分子量タンパている。そこで，私たちは／Native connectin・ク質が溶出される（もっとも，元来ある量のおよを得る努力をつづけてきた。今回報告するのは，そ数十％である）。時によって異なるが，少量のその第一歩で，まだ方法が確立していないし，まミオシンとアクチンが溶出される。超遠心するとた得られたタンパク質がコネクチンと同定されて50，000rpm 2時間ていどで，高分子量タンパクいないので，質（HMW Proteinと略す）とアクチン，ミオシ

NativeHighMW Proteinと仮称することにした。

ンは共沈する。その上清には少量のHMWptoteinが残り，かなり純化されるが，収量が少ない。原

材料と方法

抽出では，100gの筋肉から出発して，ほぼ0．1

実験材料としては白色レグホンのニワトリ胸筋を主として用いた。ウサギ骨格筋，コイの筋肉でも同様の結果が得られている。
筋肉は50mMKCO，1mMNaHC03

叩／meのHMW Proteinを含む抽出液が200m2ほど得られる。
ときに90％以上の純度をもったNative HMWの溶液でProteinが得られる。これをローターリー・エ

ホモジナイズし，低速遠心で筋原繰経をあつめた。

バポイターで濃縮して，いろいろな物理化学的性

これを最低10回くりかえした。この間1伽Mm，

質をしらべた。

＊千葉大学理学部生物学科

3％アクリルアミドを用いたSDS電気泳動の移
動度は，筋原線維中に含まれるコネクチンと同じ

Ⅶ 構造蛋白・その他

142

第1表

コ

アミノ酸

5
9

3
9

4
9

5
7

6
6

7
7
0
6

8
1
1

8
0
1

4
7

7
6

3
7

1
7

6
7

4
7

7
6

6
1

9
6

0．0008S￣1で17，000cpという高い値が得られた。

46

これは，構造粘性で，シクソトロピーの性質であ621る。細いフィラメントがからまりあっているため

8

9
8

6

1
1

5
7
7
1

とみなされる。

0
6
6
6
9
2

なお，Native HMW Protein溶液は典型的なタンパク質の紫外部吸収曲線を示し，280nmに

5
8
5
1
5
5

4

議

1

7

8
2

1

0

4

7

7

8

7

9

ピークがみられた。

2

2

9

8

3

2

0

7

9

6

5

6

6

8

5

2
1
5
0
9
7
0
7
2
5
5
6 1 8 1 5 6 3 2 8 1 5

5

ン

9

ジ

ヒスチジン

2

リ

1

フェニルア
ラニン

7

チ ロ シ ン

8

ロ イ シ ン7

イソロイシン

1
7

メチオニン

2
8

ン

った。そこで、0．2喝／戒で測定したところ，速

6
5
1

リ

計で低速皮勾配で測定するとほとんど無限大とな

22

バ

3 7 6 5 1 1 3 8 0
5 4 7 7 4 3 5 1 5

システィン

4

ア ラニ ン

86

ン
シン

粘度でわずか1．2であった。ところが，回転粘度0．008S−1で6000cp，0．002㌻1で11，000cp，

2
8

グリ

ン

HS
筋緑維 筋残査 抽出液

度勾配0．1S−1で70cp，0．02S−1で1000cp，

1
8

プロリ

チ

1
7

グ九タミン酸

ク

2
0
1

ン

6 3
1 4
1

リ

1
6

セ

ネ

2
7

スレオニン

HMW

粘度をOstwald粘度計で測定したところ，相対

7
9

謁パラギ

アクチン

Native HMW Proteinの0．5m抑溶液のアミノ酸組成アルギニン

論

私たちは，コネクチンがミオシンフィラメント
の両端にあって，サルコメア中央部に存在させるのにあづかっているものと考えてい羞もちろん

で，みかけの分子量が100万以上であった。

Z線の間を走って，弾性に関係しているものもあ

アミノ酸組成は，第1表にみられるように，さ羞A帯をサルコメアから遊離させると，コネク

まざまなコネクテンのそれと，ほぼ同様であった。

チンフィラメントがまとわりついてい震そこでプロリンがやや少なく，メチオニンがすこし多かぼうじゅんした筋原線経を塩収縮させると，若干った。しかし，アクチンとは，明らかに異なってのコネクチンが可溶化するものと考え，ある程度いた。この表でHS抽出液とあるのは，Haveltnch

実証に成功した。ただし，ミオシンやアクチンの−Schneider溶液による筋抽出液をSDSで変性混在をミニマムにする条件を吟味する必要がある。

させたのち，ゲルろ過によってコネクチン成分を

この点は、将来、きちんとしらべるつもりである。

単離したものである。￣

Native HMW Proteinが，コネクテンの

HMW Proteinを酪酸ウランで逆染色して電native formであることが確立すると，rミオ■シ

子顕微鏡下でみると，多くは，うすい膜状ではっンとの相互作用など，興味ある問題が研究可能ときりしないが，細いフィラメント状のものもみえなってくる。

た。とくに濃縮したときにできるttひも のほじ

ニワトリ胚の発生初期にはコネクチン含量が少には，フィラメント状のものがみえた。ttひもないことがわかっている云l本法を適用すると，収を急速に凍結し，フラクチャーして，その断面を量はわずかであろうが，成体のそれと比較できる

レプリカにしてみると，細いフィラメントのあつ

点で興味ぶかい。

まりであることがわかった。そ、こで，まず，主成
分は，コネクチン・フィラメントではないかと思われる。変性アクチンが混っていると．無亭形のかたまりがフィラメント間にみられた。

謝辞

Freeze−replica法でしらべていただ

いた東大医学部の沢田元博士にお礼申しあげる。

24

文

ニワトリ胸筋の一1Native High MW Protein

献1）Maruyama，KリMatsubara，S・，Natori，R・，Nono−

143

maJOrmyOfibrillarcomponentsofstriatedmuscle．
丹oc．〟bLdc〃dgcム扶鼠4，76：3698−3702．

mura，Y．，Kimura，S．，Ohashi，K．，Handa，S・＆
Eguchi，G．（1977）．Connectin，anelasticproteinof
muscle．Characterizationandfunction．J．Biochem．
82：317−337．

5）Maruyama，K．，Kimura，S．，Kuwano，Y．＆Ohashi，K．（1981）Connectin，anelasticproteinofmuscle．

2）山田 昇，池谷仁志木村澄子，丸山工作（1981）：
日本動物学会発表（札幌）3）King，N．L．＆Kurth，L．（1980）SDSgelelectro−
phoresis studies of conYeCtin・FTb，OuS L＞01eins・lI，43−56．
4）Wang，K．，McClufe，J．＆Tu，A・（1979）Titin：

6）Ohashi，K．，Fischman，D．A．，Obinata，T．＆Maruーyama，K．（1981）．ImmunofluorescentstainingofA
bandsisolated from chicken breast muscle withl

Ⅰdentification oftitinwith connectin．J．Biochem．

89：701−709．

antibodies against myosin rod，COnneCtin
troponinT．Biomed．Res．2：330−333．

and

25

ジフテリア毒素によるEF2のADPリボシル化を抑制する因子と筋発生におけるその変化

真 崎 知 生

研究協力者 吉 川一昭‥

我々は今まで翻訳段階における蛋白合成能を正

rpm，4hr遠心し．その上清をとった。上清中常鶏および筋ジストロフィー鶏の間で比較検討しにある細胞内NADを除くため，上宿をさらに硫安てきた。その結果アミノアシルtRm合成酵素活分画（0−75％）し，その沈澱を溶液B（1mM

性およびポリ（U）依存ポリフェニルアラニン合

Em，100mMKCB，6mMメルカプトエタノ

成能が，筋ジストロフィー鶏で増加していること

ール，10mM Tris−HCB（pH7．5）およびを見出し報告し是…）この増加の原因が蛋白合成に0．25Mショ糖）に一透析し，EF2含量測定試料と関与するこれらの因子の量的な変化か質的な変化して用いた。

かを明らかにする実験の中で，蛋白合成延長因子

EF2の定量は，反応溶液0．1m必中に，

4Jl

2（EF2）含量をジフテリア毒素を用いて検討しmolm，5PmOITris−HCA（pH7．5），てきた。この過程で，ジフテリア毒素によるEF20．1mgBSA，−2pmolヒスタミン，3pgジのADPリボシル化反応を抑制する因子が骨格筋

フテリア毒素，56pmOl〔14C〕NAD（534mCiに存在することを見出した。今回はこの因子の性／mmol）および測定用試料を含む溶液を37℃，

質および筋ジフトロフィー鶏と正常鶏における量15minインキュベーションし，〔14C〕ADPリ

的変化について報告し，この因子の生理的意義にボシルEF2量を測定することによって行った。

ついて併せて考察する。

なおEF2リボシル化を阻害する因子の活性を測定する時は，精製したブタ肝EF2を反応溶液中

材料と方法に21Jg加えた。測定は反応終了後，一定量の反ジストロフィー鶏（413系統）および正常鶏

応液をワットマン3MM濾紙に吸着させ，5％冷（412系統）の13日胚から生後7週の胸筋を用い

TCAで3回，99％エタノールで1回洗浄した後た。胸筋に3倍量の溶液A（10mM MgCD2，

乾燥させ，液体シンチレーションカウンターにて100mMKCB，6mMメルカプトエタノール，20

計測した。

mMTris−HCA（pH7．5）および0．25Mショ糖）

ジフテリア毒素によるEF2リボシル化反応をを加え，ワーリングブレンダーにてホモジナイズ

阻害する因子（以下INHと略す）の精製は下記した。ホモジネイトをSorvallGSAローターにの手順で行った。EF2含量測定用試料（75％飽て10，000rpm，30min遠心し，その上清を更に和硫安沈殿物を溶液Bに透析したもの）をゲル濾

Beckman社製超遠心用ローター45Tiにて40JXX）

過（セファクリルS−200，￠26mmx90cm），
硫安分画（66．6−75％），ハイドロキシアパタイ■筑波大学基礎医学系＝（財）東京都臨床医学総合研究所

ト（100−150mM燐酸緩衝液で溶出），フェニルー
CL−セファロース4B（10mMTris−HCB（醍Ⅰ25

ジフテリア毒素によるEF2のADPリボシル化を抑制する因子と筋発生におけるその変化1457．4）で溶出）で処理することにより精製した。

反応が抑制されることを見出した。このことは筋

ジフテリア毒素は内田博士（阪大・微研），ブタ

ジストロフィーと正常鶏のEF2が量的に異なる

肝EF2は水本博士（東大・医科研）より頂いたとそのまま受けとってよいのか，または正常鶏胸ものである。

筋中にこの反応を阻害する物質が存在するのかということを明らかにするため，筋ジストロフィー結

鶏上清に正常鶏上清を加えてみると，前者による

果

ジフテリア毒素により，ADPリボシル化反応反応が抑制された。そこでEF2測定用試料の分を受ける蛋白は，真核細胞においてはEF2のみ画を試みた。EF2リボシル化反応を阻害する正が知られていだ）反応は図1のどとく，EF21

常鶏試料のゲル濾過分画と，同一操作による筋ジ分子当り1分子のNAmが反応するので一定試料中ストロフィー鶏試料の分画を電気泳動パターンでのEF2の定量が可能である。ところが生後4適比較したところ，筋ジストロフィー鶏にはなく正齢の鶏胸筋ホモジネートから得た試料において，常鶏にのみ認められるバンドが存在した。この正筋ジストロフィー鶏の試料ではジフテリア毒素に

常鶏にのみ存在するバンドが，ジフテリア毒素にょるEF2のリボシル化が起こるが，正常鶏ではよるEF2のADPリボシル化を阻害する物質でDiphtheriQ
Toxin

EF2◆【化C】NAD【liclADPR−EF2◆Nicotinqmide＋H◆（active）（inaCtive）

図1ジフテリア毒素によるEF2のADPリボシル化反応。

−TOP

欝零 ■『
細
叫

一等一義

ー80TTOM
A

B

C

D

E

F

ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるINHの解析。電気泳動はLaemmliの図2芸鼠万富紅より，10％アクリルアミドを用いた。A：ブタ肝EF2，B：4週齢正常鞠のEF2

含量測定用試料，C：4適齢筋ジストロフィー鶏のEF2含量測定用試料，D：4過齢正常鶏のゲル濾過分画，E：4適齢筋ジストロフィー鶏のゲル濾過分画，F：4適齢正常鶏の精製したINH。

Ⅶ 構造蛋白・その他

146

FOL昌dU一N誌・監qく︻Uヾl︼
0

0．03

0．1

0．3

1．0

EF2（mg′mlI

図3INHによるEF2のADP．）ポシル化反応の抑制。
○：ジフテリア毒素によるブタ肝EF2のADPリボシル化。●：反応溶液0．1細枠に40MgのINHを含む時の，ジフテリア毒素によるブタ肝EF2のADPリボシル化。
H

仙■蓼一浪

−眞遍

0

0・2

0・4

0．6

0．8

1．0

Relative mobi＝ty

云∵二∴∵∴●−∴∵三二∴㍉∴∵∵
94，000，BSA；67・000・OValubmine；43，000，Cartx）nic anhydrase；30，000，
αLlactoalbumine；14，400を用いた。

25

ジフテリア毒素によるEF2のADPリボシル化を抑制する因子と筋発生におけるその変化

147

Asp

lle Met Val
図5INHのアミノ酸組成のスター・ダイアグラム。

√○てEd︒︼ NL山・∝d呈Uゴ︼
13dEm

19dEm

lw

3Wゝ

lw

5W

7w

Stoge

図6各発生段階の鶏胸筋試料中のEF2含量の測定。白カラム：筋ジストロフィー鶏試料，黒カラム：正常鶏試料。各カラムは1回の標本試料で，筋ジストロフィーと正常鶏を各回毎に平行して処理した。

あるかどうかを確かめるためIt材料と方法 の項■ぅ．EC約40，000daltonであった。INHを酸加水で記述した方法によりこの分画を精製した（図2）。

分解し．日立835型アミノ酸自動分析機でアミノ

図3に示すように，この物質（INH）はEF2に酸組成を調べた結果図5に示すようなスター・ダ

競合的に桔抗し，反応液中のEF2を増せば阻害イアグラムを得た。

作用はなくなる。一方反応液中のジフテリア毒素、筋ジストロフィー鶏と正常鶏の試料中のジフテの量またはNADの量を変化させてら阻害作用に

リア毒素によりADPリボシル化されたEF2量を定員した結果を図6に示した。試料の単位蛋白

INHの分子量を，W。be，＆Osb。，nの方彦

量当りのEF2量は，筋ジストロフィー試料の方により電気泳動的に求めたところ図4に示したよが正常に比較し，多いかまたはほとんど同じであⅦ 構造蛋白・その他

148った。胚の時期ではINHはSDS電気泳動的に

ADPリボシル化を受ける部位を修飾している可はほとんど認められず，成長するに従いINHの能性が大であるが，詳細は不明である。

量が増加してくる。生後7週齢では電気泳動的にINHと筋ジストロフィー症との関係では，結筋ジストロフィー試料中にもINHは認められ

果で述べたように，胚の時期では筋ジストロフィ

EF2のリボシル化は阻害される。試料によりバー鶏，正常等ともにINHは存在しないか微量でラツ与は認められるが，生後3週〜7過齢の間であり，成鶏では両者において存在すると思われる（

筋ジストロフィー鶏と正常鶏の問にEF2のリボ

生後1●週〜7過齢の間では，電気泳動パターンでシル化反応に覇著な差が生じる。これが正常鶏試調べた結果．正常では2〜3過齢から，筋ジスト

料中のINHの出現と対応しているかどうか現在

ロフィーでは5〜6週齢からINHが顕著に認め更に検討中である。

られるようになり，ジフテリア毒素によるEF2リボシル化反応の抑制と結果がほぼ一致するが，考察

これに関しては更に検討中である。筋ジストロフ

ADPリボシル化反応の生理的意義については

ィー鶏におけるINHの出現の遅れは，大日方ら，

未だ確立されていないが，ヒストン，ノンヒスト

野々村どヲ 杉田払報告しているように，筋ジスン蛋白等の核内物質のポリADPリボシル化が遺トロフィー鶏は正常鶏に比較し分化が遅れること

伝子発現を制御しており，また細胞内NADレベの証拠の1つにすぎないのか，あるいは筋ジスト

ルが発生・分化の調節の役割を担っている可能性1

ロフィー症発症に直接関係しているのか今後更にが指摘されてい碧

検討する予定である。

細胞質蛋白のADPリボシル

化反応は，真核細胞においては，細胞外物質であるジフテリア毒素等によるEF2の，コレラ毒素等によるアデニルシクラーゼの調節蛋白質のモノ
ADPリボシル化が知られでいるのみで，細胞内物質のADPリボシル化反応は，ミトコンドリア
中の酵素によるミトコンドリア蛋白のADPリボ
シル化以外轍告されていな君￣ジちテリア毒素によるEF2のADPリボシル化のように，モノ
ADPリボシル化反応の意義は，修飾される蛋白質の活性を変化させることである。
今回我々が報告したようなジフテリア毒素によるEF2のリボシル化反応を阻害するような物質は，未だ知られていない。INHは本来他の生理機能を果していると思われるが，（1）これが筋細胞に特有なものか．（2）細胞内物か細胞外物質か，（3）細胞内物質なら核内に存在するかどうか等の問題を明らかにする必要がある。これらの点に関しては抗体を作製し検討する予定である。INHは現在までのところ，EF2の蛋白合成能に対して影響を及ぼさず，ジフテリア毒素によりEF2が文

献1）Masaki，T．＆Yoshikawa，A．（1977）CurrentRes．
Muscul．Dys．Japan22・23．
2）Yoshikawa，A．＆Masaki，T．（1981）J BEochem．，
90；1775−1786．
3）Honjo，TリNishiZuka，Y，，Kato，Ⅰ．，＆Hayaishi，0．
（1971）上月わエαemり246：42514260．
4）Hayaishi，0．＆Ueda，K．（1977）Annu．Rey．Bio−
C触れ，46：95−116．
5）WebeI，K．＆Osborn，M．（1969）Jβわエαe椚り244：44064412．
6）BufZio，L．0．＆Xoide，S．S．（1970）βfoc加肌βわ一
画叩．月経Cb〝1椚〟几40；1013−1020．
7）Yamada，M．，Shimada，T．，Nakayasu，M．，Okada，
H・，＆ Sugimura，T．（1978）βわで力em．βわタカγ∫．
Re∫．Cbmm〟几83；1325−1332．
8）Caplan，A．Ⅰ．＆Rosenberg，M．J．（1975）ZYoc．NatL．
Ac〃d放i以且72：1852−1857：9）Cas鑓1，D．＆P托uf托T，T．（1978）丹oc．血沈dcαd
ぶCえ比丘75：2669−2673．
10）G山，D．M．＆Meren，R．（1978）〝oc．〟かL Acdd
加えα且75：3050−3054．
11）Kun，E．，Zimber，P．H．，Chang，A．C．Y．，Puschen−
do坊Bり＆Grunicke，H．（1975）〝oc．〟かエAcdd
gci比丘72：1436−1440．
12）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H．，＆Matsuda，R．
（1980）fEβ∫上eJJ．120：195−198．
13）Takeda，SJ＆Nonomura，Y．（1980）BiomedRes．
1：176−179．

14）埜中征哉 杉田秀夫（1980）最新医学35：907−915．
15）Laemmli，U．K．（1970）伯山′e227：68か685．

149

26 脱神経及び神経再生による支配筋の分離
筋小胞体膜のCa−uptake筋について
酒 井 敏・夫●
研究協力者 西 島 博 明● 今 井 孝 行＊筋ジストロフィー症（筋dys）の発症成因は筋察した。

原性説又は神経原説を示唆する実験が数多く提出され，直ちに結論を下す事は困難といえよう。こ実 験 方 法の事は何れの考え方の根底には，genetic di−

使用した動物は体重120〜130gの雄ラット（加sorderが存在する事によると考えられる。また

令6週）である。このラット下肢片側のEDL，Sol

哺乳類の筋の分化は神経支配による事がわかって各筋の筋進入部2mの部位で各々切断（EDL−N，おり，幼若筋の骨格筋は未分化である事が知られfibralis Sol−N，fibralis）。切断後一定のている。しかし，成長した筋では十分分化が完成時期に接合術を行った。次に，知覚及び運動神経しており，従って脱神経の効果は著明に現れる。

をも含む数本のfunicuhesよりなるN，ichiadic

我々はこれまで，ジストロフィー成鶏胸筋（M．

を切断し．各期で再接合術を行った。尚，反対側

pectoralis）やfast posteriorlatismus

肢を対照とした。又対照側肢のEDL，Sol，M，dorsi muscle（PLD），antiriorlatismus

gastrocnemius，M，tibialis anteriol等

dorsi muscle（ALD）等のジストロフィー筋

は患側肢の神経切断後8週の経過でも，その体重（dys筋）の筋小胞体膜を分離し，そのCa一叩takeに示す重量比には変化がなかった。ラット下肢筋能を報告して釆震5k実験では十分分化．発育しのEDL，Solからの筋小胞体膜分離はNishijima

たラット下肢筋のM．ExteIBOrdigiforulongs

etal（19諺‰方法によった。Ca−uPtake能（EDL）やM．Soleus（Sol）が前述のPLD，の測定は，ミリポアフィルター法によって行った。

ALDに対応する遵筋，遅筋である事から，EDL，反応溶液条件は0．1M KCO，3mM MgCD2，

Sol筋支配神経の脱神経に伴う萎縮又は再神経接20mM Trisrnaleate butter pH6，8，0．1mM

合による各筋の回復に伴う筋小胞体膜のCa−

45cacc2，1．OmMATP，Tem20℃で行った。

uptake能を調べ，ジストロフィー成鶏（dys成反応溶液中のTotal Ca量は原子吸光によって測鶏）のPLD，ALDからの分離筋小胞体

定した。

Ca−

uptake能とどの様な関係を有するか調べた。さらに，EDL，Sol筋の各支配神経の切断分位に相結果

違による，また再接合による各筋の分離筋小胞体

1．筋小胞体膜の分離と考察

膜のCa−uptake能を調べる事によって，神経とラット下肢筋からの筋／ト胞体膜の分離はジスト

筋との間のtrophicinteractionの介在をも考ロフィー筋（dys筋）とは異なり，脱神経筋（den筋）では正常時とホモジナイズ時の著明な液性の＊東京慈恵会医科大学第二生理学教室

変化はなく，脱神経4過後の萎縮が進行した筋で

150

Ⅶ 構造蛋白・その他も正常な外観を持つ筋小胞体膜が得られた。

大uptake量は180×169moles／hg protein

8500〜36500×Gで得ら．れる筋小胞体膜のH−程度であった。またEDLでは最大240×10m。lesfractionの収量はden進行に従って筋1g当り／hg protein前後を示した。両筋の10％程度の減少が認められるにすぎなかった。1こ

uptake rateはSolの方が小さく，その最大の事はdys筋での分離筋小胞体膜の収量とは著し

Ca−uptake量は約45秒で示され，EDLのそれ

く異なる事を示していまままた，本実験ではd。。

より10−15秒遅く示される。このSol筋の場合に筋でもL−fraction（36500×G以上）の収量が示される分離筋小胞体膜のCa−uptake能の遅れ

著しく小量であり，そ の脱神経進行に伴う変化がはdys成鶏胸筋，PLD，ALDでも示された。また示唆されなかった。この事から，den筋内小胞体

幼若ラット下肢筋でも示され，加命と共に，早く6）なる事が判っている。

膜はdys筋の様な股構造破壊の予測は出来なかった。

Ca−

脱神経による各筋（EDL，Sol）の分離筋小胞

2．脱神経による速筋（EDL），遅筋（Soleus）

体膜のCa−uptake能は支配神経のみの切断ではの分離筋小胞体膜Ca−uptake能の変化。

Sol，EDL両筋共に，その脱神経期間経過に伴っ本実験では，Sol筋からの分離筋小胞体膜の最て・同程度の低下を示している。しかし，Fig12．

0

1

2

3

4

Weeks of denervqtion
図1脱神経によるEDL分離筋小胞体膜Ca，uptake能の変化。
N．tibialisの切断による
N．ichiadic n

26 脱神経及び神経再生による支配筋の分離筋小胞体膜のCa−uPtake筋について

0

1

2

3

4

Weeks of denervqtion
図2

脱神経によるsol分離筋小胞体膜Ca−uPtake能。
N．tibialisの切断による
N．ichiadic n︵ヂ︶旦〇一d⊃・OU
十
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1016

■

l

32

Weeks ofterinnervqlion
図3脱神経直後の再縫合によるEbLの回復過程に伴う筋小胞体膜のCa−uptake能の変化；
N．tibialisの切断・再縫合
N．ichiadic

151

152

Ⅶ 構造蛋白・その他に示した様に，坐骨神経の場合には明らかにEDL所で行い．EDL，Sol各筋の分離筋小胞体膜ののCa−uptake能の低下が示された。即ち，脱神

Ca−uptake能の変化を調べた。Fig3，4で示し経部位の相違によって，筋の′ト胞体膜Ca−uptake

た様に，脱神経直後に再結合してもEDL，Sol共能に与える影響はM．SoleusよりもEDLの方ににCa−uptake能の低下が示され，3週間はde−

著明で，脱神経期間の経過と共＿に増大した。

nervation様の現象を程する事が判った。この

一方，dys成鶏のPLD又はM．pecforalisのCa−uptake能の低下はSol．EDL共に中枢側坐分離筋小胞体膜のCa−uptake能はジストロフィ

骨神経部位で脱神経・再縫合を行った場合の方がーの進行に伴って明らかfこALDの場合よりもH−著しかった。この事は神経縫合による支配筋の再fractionにおいてCa−uptake rateの抑制が生過程におけるCa−uptake能の回復rateが同じ

示され遥〜またL＿fracti。。においてはuptake

であり，かつ，時間的相違のみであれば，脱神経・量の著明な低下が示されている。以上の事から，再縫合部位の相違による変化を神経と筋の距離にden筋やdys筋では速筋型の分離筋小胞体膜のよって説明する事が出来る。しかし，Fig3，4にCa−uptake能が低下する事が判った。
3．神経再接合による再神経支配の分離筋小胞体示した様に，Ca−uptake能の回復はEDL，Sol

膜Ca−uptake能の変化

共に再縫合後の脱神経様のCa−uptake能の低下
した下限量に逆比例して上昇している。しかも神経再支配筋の筋小胞体膜のCa−uPtake能の変化を求めるために，神経切断後再縫合術を行い，Ca−uptake能の回復ま脱神経部位にかかわらず
術後3週から始まっている。

筋のdennervate様変化に続く筋の回復程度によ以上の事から脱神経による支配筋の筋′ト胞体膜る筋小胞体膜のCa−uptake能を調べた。また，のCa−uPtake能の変化は脱神経部位と支配筋とこの脱神経直後の再神経縫合術を部位の異なる場の距離または脱神経自体のfuniculusの数等に0︵≠︶旦OId⊃−8

0

0

1

2

3

4

5

6

7・8

91016

32

Weeks otlerirlnerVOlion
図4脱神経直後の再縫合によるsolの回復過程に伴う分離別、胞体膜Ca−uptake能の変化。
N．tibialisの切断・再結合
N．ichiadic〝

26

脱神経及び神経再生による支配筋の分離筋小胞体膜のCa−uptake筋について文よる相違だけでは説明する事は出来ない。むしろ
筋一神経間のtrophicinteractionによる可能
本実験で示したラット下肢分離筋小胞体膜は
dys成鶏分離筋小胞体のHんfractionに相当する。
においては大きな変化は示されず，dystrophyの進行に伴ってのuptake rate の抑制を示すにすぎなかった。しかし，このfractionより軽い
L−fractionのCa−uptake能はdys筋で著明に低下する事はすでに簸告してい震）今回示した
den遅筋，den速筋におけるH−fractionのCa−uptake能はdys筋の遅筋．速筋，両筋からの小胞体L−fractionのそれと著しく類似している変化を示していた。また，dennervate筋によるL−fractionとdys筋のH−fractionのCa−
uptake能は共に大きな変化を示していない点を考慮すると，den筋とdys筋では筋小胞体膜に与える影響は本質的に異なるものと推定出来る。

献1）H．Nis埴ima，T．Taniand U．Ogin0・Themethod
forthe preparation of fragmented sarcoplasmic
reticulumfrom smallpiecesoflegskeletalmuscle性を示唆しているものと考えている。

このdys筋のCa−uptake能はH−fraction

153

orrats．叔e丑〃f〟edJ25：287−290，1978．
2）H．NishiiimaT．Ito，H．Kuriyama，OnthealcnityofCa−uPtakeinthe fragmented sarcoplasmicre−
ticulumextractedftomtheguineaplgmaSticatory

muscle．丹ocJれAcdd49：367・371，1973・
3）酒井敏夫，西島博明，小林啓三，吉岡利息成沢三雄，ラット骨格筋の除神経の影響並びに成鶏ジスト
ロフィー筋の筋小胞体について。筋ジストロフィー症の基礎的研究江橋班昭和53年度報告書，59−随．
4）酒井敏夫，西島博明，岩垣丞恒，小林啓三．服部昭
仁，ジストロフィー成鶏胸筋筋小胞体膜のCa−up・take能と膜構成脂質について。筋ジストロフィー症の基礎的研究江橋班昭和別年度研究報告書，125−132．

5）酒井敏夫．西島博明，今井孝行，渡辺雅之，岩垣丞
恒，ジストロフィー成鶏胸筋小胞体膜のCa−up−
take能と，その膜構成について。筋ジストロフィー症の基礎的研究江橋班昭和お年度研究報告書，136−143．
6）U．Ogin0．AgechangeSOnalCilityofCa−uptakeon
sarcopla釘nic reticulum from skeletal muscle orrats．JikeikaiMed．J．inpreparation・

Ⅷ

27

Proteinase

ニワトリ発生における筋組織プロテアーゼの動態

157

28 骨格筋のチオールプロテアーゼインヒビターの諸性質と筋ジストロフィー症における活性変動162

29 筋肉代謝網に対する酵素阻害物質の影響 168
30

筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

173

31

Ca依存性プロテアーゼの生体内での作用

178

157

27

ニワトリ発生における筋組織プロテアーゼの動態

高 橋 健 治●研究協力者 市 原 慶 和書

動物の発生過程における組織プロテアーゼの動

メチルクマリンー7−アミドを基質として，pH7．5，

態に関する研究はまだあまり進んでおらず，殊に37℃で15分間反応させ，蛍光測定（Ex．380nm；

筋組織のプロテアーゼに関する研究は少い。本年

Em．480nm）する方法によった。また，アミノ

度は，筋肉の発生と分化という問題に開通してニペプチダーゼ活性は，アラニン，ロイシンおよびワトリのふ化前後における各種筋組織（肢筋，胸アルギニンの各2−ナフチルアミドを基質として，筋，心筋，砂嚢筋）中のカテプシンDおよび数種

pH7．0，37℃で15分間反応させ，生成する2−ナのアミノペプチダーゼ活性を，可溶性分画およびフチルアミンをFast Garnet GBCを用いるジ

ミクロゾーム分画について測定し，それらの動態アゾ化法で比色定量（△A525mm）する方法によっ特性を比較検索した。

た。なお，14日および19日の試料は各20個体分，27日の試料は10個体分を合わせたものを使用した。

実験材料および方法
筋組織は白色レグホーンを用い，発生開始後14

実 験 結 果日，19日（ふ化1日前）および27日（ふ化後1週

図1〜5に得られた結果を示した。各図とも，

間目）のニワトリから後肢筋，胸筋，心筋およびSup，Ms，およびKCトMs分画についてはタンパ

砂嚢筋を得た。各筋組織を5倍容量の5mMHepeS

ク質（mg）当りの比活性を示してある。また，Sup

緩衝液，pH7．5（0．25Mショ糖および10mM2−＋MsはSup分画およびMs分画中の組紐重量（g）

メルカプトエタノールを含む）を用い，Potter−

当りの活性の和を示したものである。

Elvehjem型ホモジナイザーでホモジナイズした

まず，カテプシンD活性の変動（図1）につい後，10，000×才，10分間遠心した上清をさらにてみると，Sup分画では肢筋と胸筋の比活性にあ78，000×タ，60分間遠心し得られる上清（Sup）

まり変動はみられなかったが，心筋と砂嚢筋の比および沈殿のミクロゾーム分画（Ms）．ならび

活性はふ化直前またはふ化後に著しく増大するとにミクロゾーム分画をさらに1M KClで洗ったいう結果が得られた。同様な比活性の上昇はMs

不溶性部分（KCl−Ms）についてプロテアーゼ活

分画でも認められ，砂嚢筋の場合KCl−Ms分画性を測定した。カテプシンD活性は，ヘモグロビ

でも同様であった。一方，肢筋および胸筋の比活ンを基質として，pH3．0，37℃で10時間反応さ性はMsおよびKC1−Ms分画ではほぼ並行してせ，トリクロル酢酸可溶性部分の280nmの吸収

経時的に減少した。これらの傾向はSup＋Ms分を測定する方法によった。ジペプチジルアミノペ

画の組織重量当りの活性についても認められた。

プチダーゼⅣ活性は，ダリシループロリンー4丁＊京都大学霊長類研究所生化学研究部門

ジペプチジルアミノペプチダーゼⅣ（図2）の場合には，大方の筋において，ふ化にむかって比活性が増大し，ふ化後は一定値を保つかあるいは

Ⅶ

158

Proteinase︵u芯︺OLdぎ＼Sごu⊃∈︶−トHシートUV U HU︼dS

14

19

27

14

19

AGE（days）

図1ニワトリのふ化前後における筋組織力テプシンD活性の変動
Sup，78，000×5上宿分画；Ms，ミクロゾーム分画；KCl−Ms，1MKCl不溶性ミク
ロゾTム分画；Sup十Ms，SupとMsの活性の和。L（●），肢筋；B（○），胸筋；H（□），
心筋；G（△），砂嚢筋。表示法は図2〜5でも同様。

↓
KC1−
Ms

q
0

l

J」

I

0

l

14

19

27

14

l

19

l

27

AGE（days）

図2

ニワトリのふ化前後における筋組織ジペプチジルアミノペプチダーゼⅣ活性の変動。

︵雲SS芯＼ひ︶Sup ＋MsトUq Jくト○ト

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159

27 ニワトリ発生における筋組織プロテアーゼの動態
Hatch

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こー≡トUV﹂くト2

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0
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U芯ぢLd g︑u苫＼rOE亡︶（

27

AGE（days）
図3

ニワトリのふ化前後における筋組織アラニンアミノペプチダーゼ活性の変動0J00

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l

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27

14

l
19

t
27

AGE（days）
図4

ニワトリのふ化前後における筋組織ロイシンアミノペプチダーゼ活性の変動。

徐々に減少する傾向が認められた。ふ化にむかっ

基質により比活性にかなりの差が存在したが，3て増大する傾向は砂嚢筋のKCl−Ms分画で特に種の基質に対する比活性の経時的変動はジペプチ顕著であった。また心筋のSup分画の比活性が他

ジルアミノペプチダーゼⅣの場合に近く，各筋組の筋の場合より2倍近く高い点が注目された。

織および分画とも大体の場合ふ化にむかってや）

アミノペプチダーゼ活性（図3〜5）は用いる

増大しふ化後一定値を保つか徐々に減少すると

160

Ⅷ

Proteinase

Hatch

0
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0
2

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A7

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27

14

19

27

AGE（days）
図5ニワトリのふ化前後における筋組織アルギニンアミノペプチダーゼ活性の変動。

いうような一般的傾向が認められた。これらのアはカテプシンDのみであったが，工手ソペプチダ

ミノペプチダーゼの比活性は，それぞれの筋組織ーゼ類よりも活性変動が顕著であった。組続のタで比較的近い値であったが，砂嚢筋の比活性が他

ンパク質分解速度の律速は，分解の最終段階に作より多くの場合に顕著に低い点が注目された。

用するエキソペプチダーゼ類よりもむしろ分解の初期に作用するエンドペプチダーゼ矧こよるとこ考

察

ろが大と考えられるので．今後さらに他のエンド測定した酵素の比活性は，いずれの場合も肢筋

プロテアーゼ頬（カテプシンB類，Ca一依存プロと胸筋の場合に最も近い値をとり，かつその変動

テアーゼ，アルカリ性プロテアーゼ，膜結合中性も並行していた。これに対して，心筋と砂嚢筋のプ。テア＿．紘ど）の活性変動の比較検索も重要場合は肢筋および胸筋とはかなり・異なる比活性ととなろう。また，プロテアーゼ活性の変動を問題

変動を示し，心筋と砂嚢筋の相互間でもかなり異とする場合，組織に内在するプロテアーゼインヒ

なっていた。また，全休的にみて砂嚢筋の場合がビターの性状，動態にも十分注意する必要があろ

他の三者から最も離れた挙動を示した。これらのう。一方，筋肉の発生・分化という面から考える

結果の意味するところは十分明らかではないが，と．発生・分化の諸段階における各個筋タンパク

骨格筋，心筋，平滑筋の差を反映している点で興成分の分解機序と各プロテアーゼの関与様式の比味深い。ふ化前後におけるそれをれの筋組織での較解明も重要な問題である。また，筋ジストロフ

タンパク質代謝にかなりの差があることを推定さ

ィー症成鶏では各種のプロテアーゼ活性の上昇がせる。今回はふ化前後の3時点でのみ測定したが，知られている爵ヲ）その発生過程における変動を比さらに測定点をふやすとともに成鶏にまで延長し較検索することも有意義であろう。

て，全休的な変動傾向を比較解析する必要があろう。また，特に変動の大きかったものを中心にして，その再現性の検討も必要である。今回測定したプロテアーゼ活性はエンドペプチダーゼとして文

献1）Y．Ichhara，K．Sogawa，K．Takahashi：Occurrence
andSomePropertiesofMcmbrane−BoundNeutral
Proteinasein the Microsomal Fraction of Rat

27

ニワトリ発生における筋組織プロテアーゼの動態

SkeletalMuscle，エβわC加爪．91，87・95，1982．

2）高橋健治，市原慶机十川和博：筋組織の中性プロ
テアーゼに関する研究，筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和55年度報告書，pp166−171（1981）。

1613）青柳高明，和田孝雄：筋ジスニワトリおよびマウス
筋肉中の各種酵素活性の対比，筋ジストロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和55年度報告亀pp159−165（1981）。

162

28

骨格筋のチオールプロテアーゼインヒビターの諸性質と筋ジストロフィー症における活性変動

■

＊

昭

延

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若

＊
■

に

彦紀秀

め

信英和

じ

沼南員

は

勝木磯

研究協力者

の）は大正製薬より供して頂いた。大腱四頭筋をリソゾームのチオールプロテアーゼであるカテ

Polytron（Kinematica GmbH，スイス）を用

プシンB，H，Lは全身臓器に分布しており，我々いて5倍員の20mMNaCBを含む0．25Msucrose，はこれらの精製・諸性質及び前2者の筋構成タンpH7．0でホモゲナイズし，12000×g，20分遠心

パクの分解の様式についてはすでに報告し岩塩し，上宿をインヒビター，アルドラーゼ，乳酸脱近我々は，これらチオールプロテアーゼの特異的水素酵素の測定に，沈殿は元と同量に同じバッフ

阻害タンパクが細胞分画に存在することを兄い出ァーでけん濁した後，凍結を2回くり返し，そのし，ラット肝より単一蛋白まで精製し選今回は遠心上活をリソゾームプロテアーゼ測定に供した。

ラット骨格筋よりの本インヒビターの諸性質と筋ジストロフィーハムスターにおけるリソゾーム・

結果及び考察プロテアーゼ群及び内在性インヒビターの活性変

内在性チオールプロテアーゼインヒビターの諸動について報告する。

性質についてラット（Wister，8，200g）肝及び骨格筋の材料と方法

細胞質分画を出発材料として，木南らの報薮部

ラット肝及び骨格筋からのチオールプロテアー

分的に修飾して精製した。精製したインヒビター

ゼインヒビターの精製は概ね木南品方法に従っは，分子量12，000のモノメリックなタンパクであた。熱処理は行なわず，直接細胞質分画をパパイ

り，等電点は5．0−5．1にあった。本インヒビタン（あるいはフィシン）のアフイニティクロマト

ーの阻害のスペクトラムが表1に示されている。

グラフィーを用いて精製した。インヒビターの活

チオールプロテアーゼであるカテプシンB，L，性測定はカテプシンHに対する阻害で測定した。

H，C，パパインなどほ程度の差はあるが，すべ活性の表現は木南らの方巌従った。Z＿Arg−て阻害される。この中では，カテプシンBの阻害

Arg−βNA及びBZ−Arg−βNAの測定は，Ba−が一番弱い。しかし，同じくチオールプロテアー

rr。ttの方酪酸フオスファターゼはIg。T。Shi

ゼであるカルシウム依存性プロテアーゼが全く阻

gも方法で，アルドラーゼ及び乳酸脱水素酵素は害を受けないことは，着目すべきことと思われる。

NAmの減少で測定し是：）ジスト。フイ＿ハムス

他のセリングプロテアーゼ（トリプシン，キモト

ター（FI B系，BIO14．6系ともに15週令のもリプシン，マストセルプロテアーゼ），カルポキ
シプロテアーゼ（カテプシンD）は全く阻害を受

暮徳島大学医学部附属酵素研究施設酵素化学部門

けない。阻害の至適pHをカテプシンH，B及び

28 骨格筋のチオールプロテアーゼインヒビターの諸性質と筋ジストロフィー症における活性変動163
表1
1nhibition Spectrum of Endogenous ThioI ProteinaseInhibitor from Rat Liver
Proteinase

Inhibitor

SourceU／ml

CathepsLn H

ratIiver

Cathepsin B

ratliver

Cathepsin L

ratliver

CathepSin C

ratIiver

Papaln

PaPaya fruit

CANP

rat muscle

Chymotrypsln

bovine pancreas

Trypslnbovine pancreas

MaSt Cell proteinase

ratliver

Cathepsin A

ratliver

Cathep引n D

ratliver

パパインについて調べると，カテプシンH及びパ

肝インヒビターと免疫学的には区別できなかった。

パインに対してはその活性の至適pHである6．0

本インセビターはチオールプロテアーゼを瞬時に付近で阻害が最も強い。カテプシンBの至適活性阻害し，プロテアーゼインヒビター複合体を形成が6．0付近にあるのに対し，その阻害の至適pHする。プロテアーゼのSH基とインヒビターの相は6．5にあり，そのことはカテプシンBが阻害を互作用についてSDSを含まないポリアクリルゲ

受けにくいことと関係あるものと推察される。本ル電気泳動を用いて解析した結果が図2に示されインヒビターが細胞質に存在することを示したのている。Band−1はカテプシンHでBand−3が，表2であり，肝での細胞内分布について調べ

精製したインヒビターである。Band−2は両者をられている。骨格筋でも大部分は細胞質分画にあ混合したものであり，両者の中間にプロテアーゼ

ることをpreliminaryであるが確認している。

インヒビター複合体が観察される。Band−4はカ肝のインヒビターに対する抗体をウサギを用いてテプシンHにその阻害剤E−64を作用させたもの

作成し，骨格筋のインヒビターとの差異を免疫二で，バンドの移動度には変化がない。Band−5は

重拡散法で分析した結果が図1に示されてゝI、る。

はカテプシンH−E−64複合体に本インヒビター

抗体に対し癒合した一本の沈降線が認められ，肝を添加したものであり，プロテアーゼのSH基がと骨格筋のインヒビターは免疫学的には同一と考

予めブロックされていると，プロテアーゼ・イン

えられた。尚，他の臓器のインヒビターも同様に

ヒビター複合体の形成が抑制されることを示してが

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Proteinase
Ⅶ
164

28

骨格筋のチオールプロテアーゼインヒビターの諸性質と筋ジストロフィー症における活性変動165＝】．
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Ⅶ

166

Proteinase′一．） へ、∴
図1

r

Doublelmmunodiffusion Patterns of
ThioI Proteinaselnhibitor from
Liver and Skeletal MustLel；Jnhibitor fromJiver
2；rnhibitor from skeletal muscle
3；Antiserum ofliverinhibitor

いる。逆にプロテアーゼ・インヒビター複合体に加が認められる。他のリソゾームのマーカー・酸E−64が結合できないことはJH−E−64を用い

フォスファターゼ活性がジストロフィー症で増加て証明してある。

していないことは，リソゾーム中のプロテアーゼ
活性の上昇は特異的であり，リソゾームの数の増

ジストロフィーハムスターにおけるチオール性
カテプシンとそのインヒビターの活性変動

加はないことを示唆している。一方，チオールプ
ロテアーゼインヒビターの量も増加しており，プ

12過令の筋ジストロフィーハムスター（BIO

ロテアーゼの活性増加を抑制する一つの機作かも

14．6）と対照としてのFIBlについて，大腱筋しれない。しかし，リソゾームプロテアーゼとはのプロテアーゼとインヒビターの活性を測定した。

細胞内局在性も異なり，どのような機構でプロテ筋ホモジネートを12000×g，20分間遠心し，沈アーゼ活性の調節に関与するかは全く不明である。

殿分画を用いてプロテアーゼ活性を，上宿分画を

他の細胞質の酵素，アルドラーゼや乳酸脱水素酵

用いてインヒビター量を測定した。カテプシンB素はむしろジストロフィーで活性が低かった。なの特異的基質ZLArg−Arg−βNA水解活性はジ

お，沈殿，上宿分画のg組織当りの蛋白量は対照

ストロフィーハムスターでは著明な活性増加がみ

及びジストロフィー動物との間で差はなく，ジスられる。BANA水解活性はカテプシンBとHの両トロフィーにおけるプロテアーゼ及びそのインヒ方の活性を測定しているが，やはり著明な活性増

ビターの活性増加は真の活性を測定したものと考28

骨格筋のチオールプロテアーゼインヒビターの諸性質と筋ジストロフィー症における活性変動

1

2

3

『鰐

静

4

5

鴨

蠣静

瀞

態

ト

図2

167

・

ComptexformationbetweencathepsinH
andtheinhibitorand jts retardationby preincubationofcathepsinHwithE64

えられる。同じ動物での肝臓のインヒビターのレベルを測定すると，肝臓では全く活性の上昇はな
く，ジストロフィー症が骨格掛こ特異的に発症することと考え合わせると興味深い。
文献1）Towatari，T．，Tanaka，K・，Yoshikawa，D・，and
Katunuma，N．ニ

Purification

andproperties

ofanewcathepsinfromratliYer，J・Biochem・，84†659，
1979．
2）Towatari，T．，Kawabata，Y・，and Katunuma，N・：CrystallizationandpropertiesofcathepsinBfrom
ratliver，Eur．JβわC如鳳，102，279，1979・
3）Noda，T．，Isogai，K．，Hayashi，H・，andKatunuma，
N．：Susceptibnitiesofvariousmyofibrmarproteins
to cathepsin B and morphoIogiCalaltemationpof
isolated myofibTuS by thisenzyme，J．Biochem・．
90，371，1981．

4）真田幸弘，勝沼信彦，野田隆：カテプシン打に対する筋原線維構成蛋白質の分解洋式，厚生省筋ジスト
ロフィー症病因に関する臨床的研究等二法。昭和55年度 P．275）Kominami，E．，Wakamatsu，NりandKatunuma，N・：EndogenousthioIproteaseinl1ibitorfromratliver・
月ぬぐ加椚．βわp妙J．凡即．Cb〝t椚肌99，568，1981・
6）Barrett，A．J．：A new assay ofcathepsinBland
otherthioIproteinases，AnGt・Biochem・，47，280，
1981．
7）Igarashi，M．，andHollander，V・R・：Acidphospha−tasefromratliver，LBiol．C72em．，243，6084，1968・
8）Rutter，W．J．，Hunsley，J・R・，Goves，W・E・，Calder，J．，Rqjkumar，T．VリandWoodfin，B・M・：FruCtOSe

diphospbate aldolase，肋班od助叩傲）Jリ9I479・
1966．

168

29 筋肉代謝綱に対する酵素阻書物質の影響

研究協力者

緒

青

柳

高

明

和

田

孝

雄

言

筋ジストロフィー症の発症及び進展のメカニズ
ムとして．蛋白分解酵素の異常による筋蛋白崩壊

間ホモジナイズした。5000rpm，20分間の遠沈后，その上清を採取し酵素活性の測定に用いた。
酵素活性測定の為の基質としては以下のものをが重要な役割を演じているという考え方が可成り

用いたo L−Glutamic acid

一般的になっている。我々は，従来注目されていamido hydrochloride（L−Glu・NA），L−たエンドプロテアーゼの異常のみならず，各種ア

Arg・NA．L−Pro・NA，L−Leu・NA，L−P1℃

β−naphthyl−

ミノペプチダーゼの異常も関与していることを報．NA，L−Ser−L−Tyr・NA，Acetyl−L−

告して来広めその考え方に基づき，各種のアミノ

alanyl−L−alany1−L−alanine methyl

ペプチダーゼ阻害剤を本症の治療に導入する試み

ester（Ac（AIzi）3・ME），Gly−L−Pro−L−

がなされ，その有効性が示唆されるに至っだ〜そLeu・NA，Nq−Benzoyl−L−arginine ettyl

こで今回，我々は当研究所で開発した低分子酵素

ester hydrochloride（BAEE），正しAcetyl阻害剤である。イペプチノ，）ベスタチゾ〜フオル−L−tyrOSine ethyl ester（ATEE），

フェニシノーノ鬼三者を筋ジスト。フィーマウス

P−Nitrophenylacetate（PNPA），里−Nitro−に投与し，その筋内代謝網に対して与える影響を

Phenyl−α−D−glucopyranoside（NP−GIc），

検索し逮また，その結果を他の諸臓器内の代謝

里−Nitrophenyl−α一D一mannOpyranOSide

網に対する影響と比較検討した。本論文ではその（NP十Man），里一Nitrophenyl−N−aCetyl−β

代謝網変化の統計学的解析の結果を中心として報−D−glucosaminide（NP−AG），p−Nitrophenyl

告する。

phosphate（PNPP），1−14C−Creatine，Fomy1−L−methionine−β−naphthylamide Umet・

実験材料及び方法NA）．

3過令の筋ジスマウス（C57BL／6J，dyAy）

組織ホモジネートの遠沈上宿をPBS及び基質を実験動物中央研究所より購入して使用した。ロを含む小試験管に分注し，37℃，pH7．2の条件

イペプチン（50仙g／日）を各々0．2mlの生理的食下で1時間インキュベートした。アミノペプチダー

塩水中に溶解して腹腔内に投与した。これら阻害ーゼ，カテプシンC及びェンドペプチダーゼに関剤の投与は8日間続けられ，最終投与時の3時間

しては525nmの吸光度を測定した。クレアチン

后に動物を屠殺し，各種臓器を摘出し，測定時迄

キナーゼ（CPK）の活性はDowex50−20℃にて凍結保存した。臓器は10倍量のPBS

分画内における分解産物の放射能測定を行なうこ（オⅠ7．2）の中で，utra−turraXを用いて1分とによって求めた。

の非吸着

各酵素活性の変化をコントロールを基準として，＊微生物化学研究所

SttxIentのt値で表わしたものを，そのプラス値

29筋内代謝網に対する酵素阻害物質の影響

169

Tablel．Enzyme activity changesin forelimb muscle ofdystrophicmiceinduced bylow molecularinhibitors
Sp．Act．±

EnzymeSD

None Leupeptin Bestatin Forphenicinol

1．26±0．22

1．28±

8．39±2．29

9．22±1．14

9．08土1．42

2．97±1．75

2．42±0．49

1．45±

0．43

2．54±

0．85

8．13±0．90

5．68±3．45

7．67±0．74

7．58±

0．12

AP−A

1．29±

AP−B

10．28±1．61

Pro−AP
Leu−AP

0．22

0．95±0．60

0．06

fMet−AP5．33±0．40

6．34±1．41

5．17±0．67

4．60±

0．07

Phe−AP

13．17±0．91

10．87±5．32

10．93±2．31

13．59±

0．58

1．00土0．02

0．94±0．48

0．97±0．18

1．03±

0．15

Gly−Pro−Leu−AP

Trypsin−1律e86．62±5．20

102．07±47．93

54．42±21．40

55．11±13．43

Chy−t†ツーIike

100．97±17．47

134．26±25．32

63．53±23．28

90．06±

5．96

48．74±18．50

45．76±18．82

54．11±

7．22

2．37±0．49

0．99±0．19

1．38±

0．11

Elastase−1ike
Cathepsin C

56．35±

7．78

1．19±1．01

cI−D−Glucosidase

1．04±0．42

0．74±0．16

0．40±0．04

0．43±

0．00

q−D−Mannosjdase

0．16±0．28

0．31±0．28

0．14±b．03

0．19±

0．05

GIc−NH2aSe

2．67±0．91

2．22±1．07

1．22±0．25

1．13±

0．14
3．48

CPK
Phosphatase
Esterase

22．51±4．76

19．75±10．43

16．05±2．74

19．27±

6．27±1．58

1．67±1．23

1．46±0．20

1．42±

0．19

206．20±79．30

67．62±16．80

62．57±2．8557．31±

4．81

GIc−NH2aSe：N−aCety1−8−D−glucosaminidaseの大きいものから，マイナス値の大きいものへと順

f・Met−AP

位づけし，その順位についての相関をSpearman

性の低下を生じる。ベスタチンとフオルフェニシの順位相関係数（rs）として表わした。

ノールはアミノペプチダーゼだけでなく，エンド

rs＝1−照を除く各種アミノペプチダーゼ活

ペプチダーゼ，グリコシダーゼの活性をも低下さ

れ＝16せる傾向を示した。同様の観察を後肢乱 心筋，

i＝1，2，3，………16

脾，肝，腎などにおいても行ない，その活性変化

ここでTiはStudentのt値に関する順位であをStudentのt値として表現したのが表2，表3

り，CPKを除く16種類の酵素活性について，第である。t値が2．15以上の場合，コントロール

1位から第16位まで順位づけしたものである。ま群との差が有意となる（Pく0．05）。

たXとyは相関づける2群のマウスグループ（グ表2で明らかなことは，これら三者のインヒビ

ループⅩとグループy）を表わすsufrix である。

ターが，そのin vitroにおける阻害活性とは無関係に，ほとんど全てのアミノペプチダーゼ活性結果及び考案の低下を生じていることである。またCPKもこ

表1に筋ジスマウスの前肢筋の酵素活性の変化

れら3種の組織中において，インヒビターによっを示す。これに見られるように，ロイペプチンはて抑制された。

Ⅶ

170

Table2．■EnzymaticProteinasechanges，eXPreSSedast−Values，inlimb

muscles

and

heart

t−Value

EnzymeMuscle（forelimb）

Muscle（hindlimb）

Hea．rtLeup・Besta・Forph・Leup・Besta・Forph．Leup．Besta．Forph．
AP−A

−0．92

AP−B

−1ご17

Pro−AP−0．53

Leu−AP−1．19

fMet−AP

1．19

Phe−AP−0．74

Gly−Pro−Leu−AP

−0．08

0．0

−0．93

−0．97

−1．47

−1．46

−0．38

−1．59

−0．68

−1．05

−3．62

−0．36

−3．11

0．04

−1．56

0．67

−0．22

−0．29

Trypsjn−Hke

0．56

Chy−tIツー1ike
Elastase−1ike
Cathepsin C
a−D−GIucosidase

−0．17

−0．70

0．16

0．41

−2．76

−0．68

−1．78

−0．78

−1．92

−1．85

−1．43

−0．31

−0．39

−1．55

−1．80

−0．67

−1．32

−0．63

−0．73

−1．78

−0．77

1．37

2．80

2．15

1．20

−2．74

−2．17

−2．15

−0．19

−2．23

−2．12

0．34

1．24

0．48

−1．50

0．78

0．27

1．14

−2．53

−3．79

1．17

−0．41

−0．72

−2．14

−0．83

−0．35

1．87

−2．23

＿1二02

−0．16

−1．60

−0．07

0．12

−0．51

−0．20

−0．66

−0．90

−0．37

0．30

0．23

−0．45

−0．64

−0．78

−0．59

1．15

1．82

−0．34

0．32

2．38

0．49

1．11

2．49

0．0

−2．27

−1．16

−2．63

−2．52

−1．03

−1．33

−1．93

0．0

0．0

1．79

0．0

0．66

−0．12

0．18

−1．19

−0．71

−1．82

0．0

−0．55

−2．66

−2．90

1．63

0．14

0．0

0．99

0．0

1．54

−0．42

−2．04

−0．95

−0．74

−0．30

−0．05

−1．19

−2．24

−11．47

Phosphatase

−3．98

−5．23

−5．28

−0．10

0．25

−0．08

−1．57

0．22

0．83

Esterase

−2．96

−3．14

−3．25

−1．57

−1．68

−1．19

0．95

0．48

0．81

α一D−Mannosidase

GIc−NH2aSe
CPK

表3には脾，肝，腎における酵素活性変化を示す。これらの表から少くとも3種のインヒビター

1．40

vitroの阻害の特徴とは無関係であるように思われた。

による酵素変化には何らかの類似性があることが推察される。そこでその類似性を表わすパラメー
タとして，順位相関係数（rs）を用いた。これら

考察

ロイペプテン，ベスタチン，フオルフェニシノの表に示したt値は，コントロール群からの変化

ールなどの低分子性インヒビターは，そのinの程度を表わすものであるから．その変化の程度

vitroの活性からは説明しがたい効果を，inに順位をつけることによって．あるインヒビター

Vivoにおいて示した。これはインヒビターがあによる酵素変化のパターンを示すことが出来よう。

る特定の辞素系のinput−Output

バランスを変こうして出来た順位表を，各インヒビター間で化させることによって，その他の巾広い酵素網に比較し，お互いの相関の程度を調べることは有用

対してホメオスターシス機構を介して大きな影響と考えられる。そのために順位相関系数（rs）をを及ぼすことによると考えられる。従って，in採用したものである。

Vivoにおけるインヒビターの効果には，in vitro

表4には，rSの値を示してある。これに見るごにおける如き直接作用ではなく，むしろ間接作用

とく，これら三者のインヒビターの効果には臓器によるものが大きな役割を占めていると考えられによっては可成り類似性があり，その類似性はin

る。in vitroにおける活性が一見無関係と思わ29筋内代謝網に対する酵素阻害物質の影響

171

Table3・Enzymatic changesIeXPreSSed as t−ValuesIin spleen，1iver and kidneyt−Value

SpleenEnzymeLeup・Besta．Forph．

Liver

KjdneyLeup．Besta．Forph．

Leup．Besta．Forph．

AP−A

ー0．43

−1．61

−0．10

1．34

−0．10

0．91

一2．28

−1．70

AP−B

−0．58

1．62

−0．77

−1．64

1．04

−0．88

−1．20

2．49

−0．02

Pro−AP

1．45

1．79

2．03

−1．42

0．97

−0．29

−0．42

0．10

2．53

Leu−AP

0．71

2．32

3．35

−1．71

0．54

−1．91

−0．34

0．79

0．24

fMet−AP

0．48

−0．84

−0．75

−2．51

0．50

−0．10

−0．80

0．81

2．08

Phe−AP

2．25

1．49

15．11

0．23

−0．78

−0．71

0．09

0．43

0．26

Gly−Pro−Leu−AP

2．37

4．42

6．12

−1．05

0．75

1．67

0．0

1．96

TけPSjn−1jke

−1．36

−1．76

−1．83

0．71

Chy−try−1jke

−0．54

−2．27

−1．48

−0．10

Elastase一日ke

−0．32

−0．74

−0．22

−1．00

Cathepsin C

2．17

−0．69

−0．82

10．03

cE−D−Glucosidase

−1．08

−0．93

−4．36

0．79

a−D−Mannosidase

−0．95

−1．39

−4．27

−0．45

−1．00

−0．91

−1．21

7．25

GIc−NHZaSe

0．12
0．26

0．28

−0．75

−0．15

−0．59

−1．26

−0．93

−2．84

−1．13

−3．95

1．31

2．15

−2．18

−0．62

−0．03

1．95

0．12

0．02

1．38

1．19

0．44

0．73

0．56

1．56

2．60

0．35

−0．19

0．41

0．76

2．27

−0．53

0．46

4．04

5．24

1．42

0．52

Phosphatase

1．47

0．30

1．04

−1．74

−0．95

−1．13

−1．32

2．09

−1．78

Esterase

1．29

1．42

14．44

1．19

0．74

1．50

−1．63

1．55

0．28

Table

4．

Correlations Among Enzymatic ChangesInduced by Low Molecular
WeightInhibitorsin Various Organs
X

Leupeptjn

Bestatin

OrganSy Bestatin ForphenicinoI Forphenicinol
MuscleForeljmb

0．12

0．69★★

Hjndljmb0．69★★

0．31

Heart

0．66★★

0．43（★）

Spleen0．71★★

Liver

−0．04

Kjdney0．37（＊）：Pく0．1，

Spearmans★：P＜0．05，

0．81★★★

0．75★★★

0．49（★）

0．13

0．59★

0．21

★★：P＜0．01＊＊＊：P＜0．001

rankcorrelations（rs−Values）Werecalculatedbytheequations

below．

6ヱ（TIx一丁iy）2

n＝16

rs＝1−

∩8●n．

j

＝1，2，3……16

Ⅷ

172

Proteinase

れるロイペプテン，ベスタチン．フオルフェニシ

ノールの三者間においても，その作用の類似性があることも，上記の見解を支持する事実と考えられる。
既に筋ジストロフィー症の治療において．ロイ
ペプチンおよびベスタテンの有用性がStracher，
松下らによって示されたがア 8懲研究の結果から考えると，フオルフェニシノールも，治療薬として試用する事は難病の解決のために有意義と考えられ
る。

結

論

各種の低分子性酵素阻害剤は，生体内において巾広い酵素網への影響を示し，ホメオスターシス
機構の解明ならびに，各種疾病の治療への応用が期待される。

Referencesl）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M・and
Umezawa，H．（1981）エロ血．血ye比67，51−59．
2）Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，Aoyagi，T．and
Umezawa，H．（1981）√劫〃′爪．旦γ仇4，184−190．
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COmmittee，SuPPOrted by Ministry ofHealth andWelrare），45−50．（InJapanese）
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Matsuzaki，M．，Ishizuka，M．，Takeuchi，T．and
Umezawa，H．（1969）J A〃f路わた 22，558−568．
5）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Suda，H．，Hamada，M．
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6）Aoyagi，T．，Yamamoto，T．，Kojiri，K．，Kojima，F．，
Hamada，M．，Takeuchi，T．and Umezawa，H．
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7）Aoyagi，T．，Wada，T．，Iwabuchi，M．，Kqjima，F．，
Nagai，M．andUmezawa，H．（1982），Biochemistry
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8）Stracher，A．，McGowan，E．B．and Shafiq，S．A．
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9）McGowan，E．B，Shafiq，S．A．and Stracher，A．
（1976）ap．〃e〟′0エ50，649−657．

173

30

筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

崇

辻

＊

な役割を果していることはいうまでもない。すな■＊筋の発生や分化に筋蛋白質の代謝が非常に重要

＊

に

友 一 愛

め

和紘

じ

掘木村

は

今鎗中

研究協力者

生じるものであることを示す結果を報告する。併せて，CANP活性の制御に重要な役割を果す，
内在性インヒビターについても報告する。

わち，ミオシンのL鎖に代表されるように，発生分化に伴って蛋白質の現出，消失がみられるから

材料および方法である。蛋白質の合成の面は遺伝子発現として容トリ，ウサギ骨格筋のCANPは既報の方法に易に解釈されるものの，筋蛋白質の分解に関してょり調製し浸。庵素活性はアルカリ変性したカゼは従来何一つ解明されていなかったといっても過インを基質とし，30℃に保温（2．4m9．／もⅠカゼイ言ではあるまい。1つの説明としてリソソーム中ン，30mM 2−メルカブトエタノールを含む0．1のカテプシン類がその役割を果すとも考えられた

Mグリセロリン酸緩衝液，pH7．5）に希望する員

が，巨大分子量の蛋白質が容易にリソソームにとのCaC12およびCANPを加え，20分反応させり込まれるとも考えられず，また酸性に至適pHた後，10％トリクロル酢酸を加えて反応を停止しをもつカテプシンは細胞質中で作用するとは考えた。30分後遠心し，上滋の280nmにおける吸光られない。

度を測定する。この条件で1時間にODl．0増大

われわれは細胞質中に存在し，中性に至適pHする酵素塁を1単位とした。

をもつプロテアーゼを探索し，ついにカルシウム

カゼインカラムは活性化したセフアロース4Bで活性化される中性プロテアーゼ（CANP）の完（39）に129のα−カゼインを反応させ，未反応

全精製に成功し浸〜しかしながら，この酵素はのカゼインを洗い流して得た。

mM程度のCgk必要とする（したがってm−C
ANP とよぶ）ので，生理的条件下で作用するとは考えられない。他方，最近〃M程度のCa2＋で1．カゼインカラムによるCANPの変房）活性化されるCANP（FI−CANPという）の存在

上記カゼインセフアロースをカラム（1．2×4．5が報告き：れ戎3もれわれはm−CANPとp−CA
NPとの関係こそCANPの生理学的意味を明らcm）に充填し，24mM CaC12を含む20mM Tris

かにする上で重要と考え，その解明に着手した。

着させた。同じ緩衝液でカラムを充分洗い，未吸

本報告ではFL−CANPはm−CANPの自己消化で着の蛋白質を除いた後，2mM EGTA

緩衝液pH7．5で平衡化した後，m−CANPを吸を含む20mM Tris緩衝液でCANPを溶出した。図1に＊東京都老人総合研究所＊＊東京大学医学部第二生化学教室

は，カゼインセフアロースカラムにかける前（○）と後（・日のCANPの活性のC㌔十依存性を示し

Ⅷ

174

Proteinase

︶
％
0
0
0

倉＞笥示 爪羞扇一心∝

0
0

0．5

1

Concentration

3
（mM

Ca2＋）

図1m−CANP（○）とFL−CANP（・）とのカルシウム感受性

3
0．

倉主0＜

0

−

5

10

15

20

lncubation time tmin）
図2

m−CANPの自己消化によるFL−CANPへの変換
m−CANPを自己消化させ，横軸に示した時間後に一定量をとり出し，6mM（−0−）
150pM（一一・一一），75FM（……・・…‥）Ca2十存在下で活性を測定した。

30筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

175てある。図から明らかな様にカラム以前のCANP

く進行し失活するため，0℃で行った。結果を図のKa（最大活性の半値に活性化するに要する濃2に示す，例えば75〝M Ca2＋存在下での活性は度）が0．8mMCa2㌔あるのに対し，カラム後の自己消化開始と同時に急速に上昇し，3分で最大

Kaは30／fMにまで下っている。カラム前後におけに達し，以降次第に減少する。一方，各時点でのるCANPの総活性に差がないこと，カラムから

自己消化産物をSDSゲル電気泳動で解析した。

の最初の流出部分にCANP活性が認められない

3分後には82K（m−CANP）のバンドは消失し，ことなどから，カラムを通すことにより，m−C

代わりに79Kのバンドが現われるが，その後79K

ANPからFL−CANPへの変換が起ったことが示のバンドは60Kのバンドとなり，ついには30−唆される。ついでこの変換の実態を明らかにする

33Kのバンドになる。一方，これらの分子種をゲために，m−CANPとFL−CANPとをSDSゲルル淀過で分別してしらべてみると，79K，60Kは電気泳動にかけた，m−CANPの分子量が82Kでいづれも図1のFL−CANPと同じC㌔鹿を示

あるのに対し，FL−CANPの分子量は79Kに下っす。便宜上前者をFL−CANPI，後者をFL−CANPていた。このことはカラム中に存在するC㌔＋ィ

Ⅱとよぶ，それに対し，30−33Kの分子種は全オンのため，m−CANPが限定的自己消化を起し，

く不活性であった。また，m−CANPからFL−

その結果FL−CANPが生じたことを示唆している。

CANPへの変換反応のC㌔＋依存性，pH依存性を調べたが，いづれもがm−CANP活性の依存性

2．自己消化による変房・7）と一致した。以上のことから，FL−CANPはm−

m−CANPからfL−CANPへの変換が実際に自CANPの自己消化によることが明らかになった。

己消化によることを示すために，mqCANPの自また，m−CANP，FL−CANPI，FL−CANPII

己消化を試みた。自己消化は常温ではきわめて速は抗m−CANP抗体と交叉し，スパーを生じない。

．図3

内在性インーヒピタpによるCANPの阻害

Ⅷ

176

Proteinase

他方，m−CANPにトリプシン，キモトリプシと考えられる。しかし従来注目されていたm−ン，パパイン，ブロメライン，スプチリシン等のCANPは非生理学的に高濃度のC㌔＋を要求し，プロテアpゼを作用させて，そのFL−CANPへのその生理的意義は疑問視されていた。今回のわれ変換を試みたが，いづれも成功しなかった。恐らわれの研究よりすれば，m−CANPはFL−CANP

く自己消化だけがm−CANPからFLTCANPへのの前駆体とも考えられ，必要に応じてこの変換が変換に有効な方法といえるであろう。

起り，FL−CANPが生理的役割を果すと考えられる。この変換をもたらすものは，瞬間的，あるい・3．内在性インヒビター8）は局所的なCa2＋の細胞内への流入であろうが，筋の発生分化とプロテアーゼの関係を考えるとこの流入を制御する信号は何なのかは今後の問題

き，プロテアーゼ活性は必要に応じて発現され，として残されている。

抑制されるよう制御されていなければならない。

m−CANPからFL−CANPへの変換について興

その1つは上記のm−CANPからFL−CANPへの味深いのは，カゼインカラムではFL−CANPIに変換であり，今1つはインヒビターによる阻害でのみ変換されるのに，自己消化ではFL−CANPⅡある。われわれは筋組織より内在性インヒビター

から次第に3nKにまで分解されてゆくことである。

の精製を試みこれに成功した。方法は筋の粗抽土

両者の差は基質の存在，非存在にある。細胞内の液をpH4．9にしてCANPを沈澱し，その上滋ように基質が存在する条件下では，fL−CANPIにTCAを加えて蛋白を沈澱する。これを，DEで止まる可能性が大きい。

AEセルロース，QAEセファデックス，クロマ

一方，不測のC㌔＋の大量流入やFL−CANPへ

トフォーカシング，フェニルセファロースにかけの変換に備えて，細胞はインヒビターを有するのることにより行った。得られた内在性インヒビタであろう。従ってインヒビターが細胞内に局在すーは，分子量7万の蛋白質で，3．5万のサブユニ

るのかどうか，分化発生に伴ないどの様に消長す

ット2個よりなるダイマーであや0インヒビターとCANPのモル比を種々変え，CANPの残存

るのかは興味ある問題であるが，これも今後にまつことにする。

活性を測定すると，図3の様な結果が得られる。
すなわち，インヒビターのサブユニット1つ当り，1分子のCANPが固く結合することにより，後者の活性を阻害するものである。なおこのインヒビターはm−CANP，FL−CANPの両方を同じ機構で阻害したが，いづれの場合にも，CANP活
性発現に必要なC；〜＋が存在しない限り投合体は形成されなかった。このインヒビターの阻害は
CANPに特異的で，調べた限り他のどのプロテアーゼも阻害しなかったが，CANPに関してはどの生物種より得られたものも阻害した。

文

献1）Ishiura，S．，Murofushi，H．，Suzuki，K．andImahori，
K．：Studiesofacalciumactivatedneutralprotease
I．Purification and characterization．J．Biochem．
84：225（1978）
2）Mellgren，R．L．：Caine cardiac calcium−dependent

protease．闇∫加JJe乃109；129（1980）
3）Kishimoto，A．，Kajikawa，N．，TabilChi，H．，Shiota，M．，andNishizuka，Y．：Calciumdependentneutral
protease，Widespread occurance of a species of
PrOteaSe aCtiYeatlowerconcentrationofcalcium・⊥βわC如肌90：889（1981）．
4）Tsuji，S．andImahori，K．：StudiesonCa2

acti−

Yated neutralprotease of rabbit skeletalmuscle・⊥βoc／ほ朋．90；233（1981）．
5）Kubota，S．，Suzuki，K．andImahori，Kこ：A考

察

筋の発生分化に開通するプロテアーゼの役割としては，単に筋蛋白質の消化に限らず，プロテインキナーゼの活性化等重要なものも含まれているnewmethodforthepreparationofacalciumactiYatedneutralprotease highly sensitive to calciumions・βわC加仇βわpカタ∫．Re∫．Cb〝1m．100：1189（1981）
6）Suzuki，K．，Tsuji，S．，Kubota，S．，Kimura，Y．and
Imahori，K．：Limited autolysis ofCa2

・aCtivatedneutralprotease（CANP）changesitssensitiYityto

30筋発生分化におけるプロテアーゼの役割
CaZ◆ions．エβfoc如m．90：275（1981）
7）Takahashi・Nakamura，M．，Tsuji，S・，andImahori，
K．：Purification and characterization of an in・177

hibitor ofcalcium・aCtiYatedneutralproteasefrom
rabbit skeletal muscle．J．Biochem．90；1583（1981）．

178

31Ca依存性プロテアーゼの生体内での作用
＊
＊
＊
＊

隆哉

＊
＊

征

川 中

三埜

＊ ＊
＊＊

ラット下肢筋300gよりCANP＊＊

1）ラット骨格筋のCANPの精製J＊

テアーゼ（CANP）の作用を検討した。

夫 一 紀

ラット骨格筋を用い，細胞内のCa依存性プロ

秀章和

田 浦 田

杉石 花

研究協力者

抗体がラット酵素と交叉することを利用してその確認を行った。
まず，ラットから種々の臓器をとり出し，生食を精製したで洗赦した後，1mM EDTAを含むPBS中でホ（表1）。精製標品は分子量73．000の単一ポリペ

モジナイズし，遠心後その可溶性画分をとり出し

プチドで，免疫的にニワトリ骨格筋の酵素と交叉た0別に血清は分離しておいた。次に，同タンパ

することが免疫レプリカ法で明らかになった。こク塁をSDS電気泳動し免疫レプリカに供した。

の事実は，異種の酵素が同一な抗原決定部位を保

図1はその結果である0各臓器の可溶性画分に分持していることを示しており本酵素の生体内にお子量73・000の免疫的に同一のバンドが見える。

ける重要性が示唆される。

これはニワトリCANPの抗体と交叉する分子がラット筋酵素は本質的に他種（ニワトリ，ヒト，

ラットの各臓器にただ1種存在し，しかも血清中ウサギ）と同じであるが，分子量のみが少々異なにはないことを示している。また，ニワトリCANPっているのみである。Caに対する要求性はKaの自己消化産物（分子量がCANPよりも数千小が0．5mMと高いのも同様である。最近Suzuki

さいもの）に相当するものが見えないのも特徴で

らによって報告された自己消化によるCa感受性

ある0現在，ELISAによる定量を検討中である。

の変化はラット筋酵素でも見られた。

3）生体中におけるCANPの作用の定量とその2）ラット臓器中のCANPの比較阻止についての試み。

現在ラットの種々の臓器にCANPが存在してIn vivo におけるプロテアーゼ作用の検出にいるという報告があり，その確認が急がれているは数多くの方法が考案されているが，それらにつが．そのすべての報告が「Ca依存性にカゼイン

いて二三検討してみた。まず第1は，臓器中のを水解する活性が臓器ホモジネート中に存在する」

プロテアーゼ活性を測定するという方法である。

というのみで，それがCANPによるものなのか

しかしこの方法の一番の弱点は，どのプロテアー

他に何種かのCa依存性のプロテアーゼが存在す

ゼがIn vivoでどのような働きをしているかにるのか，またそれらはすべて混在する血球中のついては全く情報を与えてくれない点である。しCANP によるものなのか，などが議論の対象にかしながら，インヒビター投与の効果は，そのホなっていた。我々は，ニワトリCANPに対する

モジネート中の活性の低下で観測されるわけであ＊東京大学医学部神崖内科＝国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部＊叫東京大学医学部薬理学教室＊＊＊■大正製薬株式会社総合研究所

るから一便法だといえるが，それとてホモジナイ
ズの時点でインヒビターを含む血清が混入したのではないかという考え方も成り立つ。次の問題は．

179

31Ca依存性プロテアーゼの生体内での作用蓑1
purification of rat muscle CANP（300g）【■I￣

prote土n（mg）

で0tal Act．
（Un土ts）（Un土ts／mg）73K†TN。D。

DEAE−Ce11ulose

1．536

4。5

Ultrogel

1．386

122

Hydroxyapatite

1．290

258

1

N。D。

．

Tissue Extract． ・ ． l l ㌧ ． 1 ・ ■ − ト ー ■SDS電気泳動図．左はCBB染色．右はその免疫レプリカ像。
A

B
■■●
二

−

−

一■

考妄

．＿ ＝＝「F−＿−．− 一一 一
ご一 一一一 二＝＝二￣料

一■一it■
一＿′一一

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F一

一■■

三

一一一

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■■

図1AはSDS一電気泳動，Bはその免疫レプリカ。左より悩，骨格筋，肝臓，心筋，胃壁乱及び血清。免疫レプリカ像で分子量73．000単一バンドが見える欧的。しかし血清にはない。

粗抽出液の活性が低い場合で，CANPの場合はの後，細胞内にCaを導入して起こる基質側の変特に効率の良い人工基質がないこと，また可溶性化（形態変化）を確認した後にそれを定量化する

分画では内因性のインヒビターと複合体を形成しているため，インヒビターを分離する従来の方法という試みを行った。まずCaイオノフォアであるA23187を用いて細胞内Ca濃度を高めると，では生体内で作用している量は測定不可能である。

特異的にZ線の消失が見られた。これはCANP

そこで第2の方法としてCANPの作用した証拠，のinvitroの作用と同じであるので，細胞内でつまり分解産物を検出すれば良いのであるが，こCANPれは困難である。ゆえに，生体内におけるCANP

線の構成成分のα−アクチニンの消失の割合を定の作用を推定するためには，組織をこわさずに見量することによりinvivoにおけるCANPの活性

るということが第1条件であり，しかもその作用とした。

が働いた結果だと解釈できる。そこでZがCANP特異的と言えなければならない。そこ

表2にその結果をまとめた。コントロールとしで，我々は，組織（ラットSoleus）をKrebs−てはCaを含まないもの（＋0．1mM FGTA）を

Ringer液中でインキュベートすることによりその細胞内の状態を生きているままに保ち，かつそ

とり，3時間後の外液に流出したα−アクチニンを定量したものである。Caがないとき，非特異

Ⅶ

180

Proteinase

表2
The reiease of cl−aCtinin fromintact rat s01eus muscie

Experiments Additions Reieased cL−aCtinin（ug／3h）

EGTA

Control

CaC12

CaC12＋E−64−C
E−64−CinコeCted EGTA
CaC12

9．1

±

2．0

（n＝5）

55・3‡5・2（n＝5）

33・l

±

12．1±

7・4（n＝5）
3．2（n＝5）56・ユ‡5・5（n＝5）（Hean±S．D．）
100m9のSoleus筋をKrebs−Ringer液中で3時間インキュベートした。A23187（25〝財布Ⅰ）はすべてに含まれている。外液のα−アクチニン量は，SDS電気泳動法で定量した。

本実験において，生体内のCa依存性プロテア

的な壊死による流出が9・1円と少々見られたが，Caの共存下（1n机のでは55．3′旬と5倍になっーゼの作用を抑制するためには阻害剤の連続投与，た（Pく0．001）。外液にCaの他CANPの阻害剤

または大量投与が必要であることが明らかになっであるE−64−Cを30／′M入れておくと，α−アた。しかしながら，全臓器に存在する本酵素へのクチニンの遊離が40％阻止された。

影響や，その副作用を考慮に入れつつ実験を行わ

次に，ラットに前もってE−64−Cを脚％9投与し，24時間後Soleusをとり出して同実験を行ねばならない。

ったところ，表2に見られるどとく CaによるZ線の遊離は56．1／旬と非投与のものと，かわらなかった。〔3H〕E−64−Cを使った実験によって24時間後には〔3H〕E−64−Cは0．23〝％ しか残存していないことが判明し，CANPに対するKi＝1．7〃Mよりに低いことから，1回投与においては生体内のCANPを抑えるだけの量が骨格筋には到達していないことがわかった。

文

献1）S・Ishiura，K・Hanth，M．Tamai，K．Kashiwagi＆H・Sugita：TheeffectofaninYivo−irdectedthioI
PrOteaSeinhibitor，E−64−C．，Onthecalciuminduced
degeneration ofmyofilaments・J・Biochem・90，
1567−1570（1981）2）S・lshiura，Ⅰ・Nonaka＆H．Sugita：Suppressionof
Calcium・inducedremovaloftheZ・1inesbyathiol−
PrOteaSeinl1ibitor，E・64−C・L Biochem・90，283−
285（1981）．

181「筋の発生と分化に関する基礎的研究」班分担研究者一覧
氏

所

名

住

属

所

班長

江橋

節郎

東京大学医学部第一薬理学教室

113

東 京都 文京 区本郷
03（
78 −3
12）−1
2111

幹事

今堀

和友

東京都老人総合研究所

173

東京都板橋 区栄町
03（35
964）
−21131

勝沼信彦

徳 島大学医学部酵素研究施設

770

徳島市 蔵本 町 088
3 −18
6（
3−15
1）
311 1

野 々村 禎 昭

東京大学 医学部第二薬理学教室

113

東京都文京 区本郷03（
87 12）−3 2111−1

小 沢瑛 二 郎

国立武蔵療養所神経 セ ンター
機 能研究部187

東京都小平市小川東 町 2620
04 23 （41 ）271 1

京都府立医科大学病理学教室602

京都市上京区河原る梶井町 465 ・075町通広小路上（
251）5 11 1

幕掌監事 一 米 沢
班員

猛

青柳

高明

微生物化学研究 所

14 1

東京都品川区上03
大崎3−
（
441）
14−23
4 173

石川

春 律 ＿ 東京大学 医学部解剖学 教室113

東京都文京区本郷
03 （
7812）
−3 −1
2 111

岩崎

祐三

国立武蔵療 養所 神経セ ンター
微細構造研 究部

187

東京都小平市小川東町 2620
0423 （4 1）27 11遠藤実

東北大学医学部薬理学 教室980

仙 台市星陵町 0222
2 −1 （74）1111

大 塚 ■正 徳

東京医科歯科大学医学 部薬理学教室

113

東京都 文京 区湯03
島（81−513）6−45
111

大 日方

昂

千葉大学理学部生物学教室

260

千 葉市弥生町 0472
1−3 3（5 1）1111岡田節人

京都大学理学部生物物理学教室

606

京都市 左京 区北
075
白川
（751）
追分町
2111

岡田

善雄

大阪大学微生物病研究所565

大阪府吹田市 山田丘
06 （
877）
3 −1
5121

香川

務

国立療養所刀根 山病院

560

豊中市刀根山 506−1（853）−1 200 1

加濃正明

北里大学医学部生理学教室

228

相模原市北里 0427
1 −15（78）−1 8 111

栗山

燕

九州大学医学部薬理学教室

8 12

福岡市東区馬出0923 （−1−1
64 1）115 1

酒井敏夫

東京慈 恵会 医科大学生理学教室

105

東京都港区西新橋
03 （
343−2
3）
51111
−8

嶋田

裕

千 葉大学 医学部解剖学教 室

28 0

千葉市亥鼻 1−80472
−1（22）7171

杉田秀夫

東京大学 医学 部脳研神経 内科
神経セ ンター疾 病研究 第一部
国立武蔵療養所187

東京都文京 区本郷
03 （
7815
−3）
−1
5411

杉山

博之

岡崎国立共 同研究機構 生理学研究所￣
細胞器 官研 究系

444

愛知県岡崎市明大寺町西郷中380564 （52）9770

182

氏
班員

名

所

高橋 健治

京都大学霊長類研究所

属一高橋園太郎 ー東京大学医学部脳研神経生物学教室

志喜

住

所

484

愛知県犬山市0568（
宮林 61）
2891

113

東京都文京区本郷7−3−1

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科学教室

03（
812）
2111

戸塚

愛知県心身障害者コロニー
発達障害研

0568（
88）
0811

武

萩原摘四郎

千葉大学医学部脳機能研究施設

280
・．
千
1−
173 ・
東葉
京市
都亥
板鼻
橋区
加8−
賀21−11−1
0472（
22）
7171

堀田

名古屋市立大医学部生理学教室

467 ＿・．愛知県名古屋市瑞樹到り
澄町1
052（
851）
5511

真崎 知生

筑波大学基礎医学系

謝⊥31■・
茨城県新治郡桜村
03（
964）
1211
0298（
53）
3061

松下

宏

和歌山県立医大生理学教室

640

丸山 工作

千葉大学理学部生物学教室

260 ■・ 千葉市弥生町1−33
0472（
51）
1111

九州大学医学部臨床薬理学教室

812
福岡市東区馬出3−1−1
4紛Ⅷ3 愛知県春日井092（
市神屋
町71
3瑠
641）
1151

健

大槻 磐男

■和歌山市九番丁90734 （31）
2151