大豆イソフラボンの抗酸化作用と植物エストロゲン作用による抗肥満効果の検討
青木直人＊・荒川恵梨菜・伊藤美幸
三重大学大学院生物資源学研究科

Studies on Anti-Obesity Effects of Soy Isoflavones with Anti-Oxidant andPhytoestrogenic Activity
Naohito AOKI, Erina ARAKAWA and Miyuki ITO
Department of Life Science, Graduate School of Bioresources, Mie University Tsu 514-8507

ABSTRACTC57BL/6J mice (male, 4wk old) were fed low fat diet (LF), high fat diet (HF), or HF
supplemented with 1.0% soy isoflavone mixture (HF+Iso) for 10 wks. As expected,
final body weight and adipose tissue weight were increased in HF group over LF one,but no significant difference was observed between HF and HF+Iso groups. Plasma
triglyceride and TBARS were decreased in HF+Iso group as compared to HF one,
whereas plasma cholesterol and glucose were indistinguishable. Gene expression andplasma level of adiponectin decreased by HF was upregulated by soy isoflavone, while
no obvious effect of soy isoflavone upon resistin and leptin expression was observed.
Further, expressions of macrophage markers CD68 and F4/80, and NADPH oxidase
in adipose tissue induced by high fat diet were significantly reduced by soy isoflavone.
Glycosylated soy isoflavones (genistin, glycitin, daizin) reduced ROS production in
3T3-L1 adipocyte and potentiated adiponectin secretion into cell culture medium.
Unexpectedly, resistin secretion of 3T3-L1 adipocytes were also increased byglycosylated soy isoflavones. Thus, it is suggested that soy isoflavone modulates
physiological functions of adipocyte/adipose tissue through its anti-oxidant activity.
Soy Protein Research, Japan 9, 96-101, 2006.
Key words : soy isoflavone, adipocyte, 3T3-L1, ROS, obesity大豆イソフラボンは抗酸化作用と植物エストロゲン

う肥満は，脂肪組織におけるマクロファージの浸潤・作用を併せ持つことが広く知られており，その作用に活性化に起因する炎症と活性酸素種（ROS, reactive

根ざした様々な応用が模索されてきている．過食に伴oxygen species）の増加を伴うこと1〜3)，また脂肪組織（細胞）ではエストロゲン受容体を介して脂肪取り込＊〒514-8507 津市栗真町屋町1577

96

み作用が阻害されることから4)，食事として摂取する

大豆たん白質研究 Vol. （9 2006）

大豆イソフラボンが抗酸化作用と植物エストロゲン作ブコントロールとしてN-acetyl cysteine（NAC）を終用を通じて抗肥満作用を示すことは十分期待される．

濃度10 mMになるように加えた．培地を除去してそこで本研究課題では，脂肪組織へのマクロファージ

0.2％NBT/PBSを0.5 mL加え，再度各種大豆イソフラの浸潤・活性化，血液中のROSおよびアディポサイト

ボン成分あるいはNACを同様の濃度で加えて90分間

カイン量を指標として，大豆イソフラボンの抗肥満作培養を続けた．培地を除去し，酢酸溶液を0.5 mL加え用を調べることを目的とする．て10分間振とうし，マイクロプレートリーダーで吸光度（550 nm）を測定した3)．

実 験 方 法結果と考察
実験動物および飼育４週齢の近交系C57BL/6J雄性マウスを用いた．市

食餌誘発性肥満モデルマウスとして汎用されている

販非精製飼料（CE-2，日本クレア）で１週間予備飼

C57BL/6Jマウスに対し10週間による高脂脂肪食摂取

育後，体重が揃うように低脂肪食群（５％コーンオイをさせたところ，これまでの報告通りHF群ではLF群

ル：LF群），高脂肪食群（５％コーンオイル，30％ラに比べ飼育後の体重は有意に増加した．しかしながらード：HF群）および高脂肪食に大豆イソフラボン混

HF+Iso群の終体重はHF群と有意差は認められず，イ合物を加えた群（0.5％ソヤフラボン：HF+Iso群）にソフラボン添加による顕著な体重軽減効果は認められ分け，10週間飼育した．その間，体重，摂食量を２〜なかった（Fig. 1）．また脂肪組織重量は同じくHF群３日ごとに計測した．飼育後，採血し，脂肪組織（皮で有意に増加したが，HF+Iso群との間に有意差はな下，副睾丸周囲，腎周囲，腹膜後）を摘出し，秤量後く，体重同様大豆イソフラボンの軽減効果は認められ直ちに液体窒素中で凍結させ，−80℃で保存した．血なかった（Fig. 2）．

液は固体毎に遠心分離し，得られた血清を各種パラメ

血液中のトリグリセライド濃度はHF群，LF群で有ータの測定まで−80℃で保存した．

意な差は認められなかったが，イソフラボン添加によ血液パラメータの測定

り有意な減少効果が認められた（Fig. 3）．コレステロ

血液中の中性脂肪値，遊離脂肪酸値，総コレステローール，グルコース，遊離脂肪酸に対する大豆イソフラル値，血糖値はそれぞれトリグリセライドE-テストワコー，ボンの軽減効果は認められなかった．一方，血液中のNEFA C-テスト ワコー，コレステロールE-テスト ワコー，TBARS濃度はHF群で有意に上昇したが，大豆イソフ

グルコースCⅡ-テスト ワコー（いずれも和光純薬工業）

ラボンの添加により有意な軽減効果が認められたことを用いて測定した．レプチン，アディポネクチン濃度から（Fig. 3），全身性の酸化状態に対しては，大豆イ

はをELISAキット（いずれも大塚製薬）あるいは特異抗体を用いたウエスタンブロット法により測定した．
血液中の酸化状態はTBARS法により定量した．
遺伝子発現の定量(g)50

遺伝子発現の定量はLine GeneおよびSYBR Green
Realtime PCR Master Mix（いずれも東洋紡）を用いた定量的リアルタイムPCR法により行った．脂肪組織および培養脂肪細胞からのRNA抽出はTrizol（インビトロジェン），cDNAの合成はSuper Script Ⅲ（インビ*403020トロジェン）を用いてそれぞれ行った．
3T3-L1細胞の培養とROS産生測定

10

3T3-L1細胞はDMEM培地に10%ウシ胎児血清（FCS）を添加して培養し，分化誘導カクテル（Dexamethasone，IBMX，インスリン）により脂肪細胞へと分化させた5)．
分化誘導後10日前後の十分に分化した脂肪細胞を用いて実験を行った．分化誘導した3T3-L1脂肪細胞（12well plate）に，各種大豆イソフラボン成分を終濃度100μMになるように加え１時間培養した．ポジティ

大豆たん白質研究 Vol. （9 2006）

0initial final

initial final

initial final

LF

HF

HF+IsoFig. 1. Effect of soy isoflavone on the high-fat diet
induced body weight gain of C57BL/6 mice.
Results are expressed as means + SEM (n=5).
*P <0.05 vs high-fat group (HF).
97ィポネクチン，レプチンの遺伝子発現もほぼ同様な挙

ソフラボンは一定の効果を示すと考えられる．
血液中のアディポネクチン濃度はHF群で有意に低動を示した（Fig. 4）．またマウスにおいては悪玉アデ下したが，大豆イソフラボンの添加により増加し，ィポサイトカインとして知られるレジスチンはHF群LF群を上回った（Fig. 4）．一方，HF群でのレプチンでむしろ低下し，大豆イソフラボンの添加効果は認め濃度の上昇に対する軽減効果は認められなかった．こられなかった．これらの結果は，大豆イソフラボンがれを支持するように副精巣周囲脂肪組織におけるアデ脂肪細胞に対して一定の機能改変効果を持つことを示唆している．
ROS産生はNADPHオキシダーゼによると考えられ

(g)
3.5
LF
HF
HF+Iso3.0*

2.5

るが，HF群でのNADPHオキシダーゼサブユニットの一つp47phoxの発現がHF群に比べ有意に上昇した（Fig. 5）．HF+Iso群ではその上昇が有意に抑えられ大豆イソフラボンの軽減効果が認められた．一方，逆の*2.0作用をする抗酸化酵素グルタチオンペルオキシダーゼ
1.5（GPx）の遺伝子発現は各群間で有意な変動は認めら*

1.0

れなかった（Fig. 5）．高脂肪食摂取により脂肪組織へ*0.5のマクロファージの浸潤が亢進することが報告されて0いる1, 2)．今回の実験条件下でもHF群の副精巣脂肪組
Subcutaneous Epididymal

Perirenal

Retroperitoneal

織において，末梢マクロファージの存在を示すCD68やF4/80の発現上昇が認められた（Fig. 5）．いずれのFig. 2. Effect of soy isoflavone on the high-fat diet
induced adipose tissue weight gain of C57BL/6
mice. Results are expressed as means + SEM(n=5). *P <0.01 vs high-fat group (HF).

120

**

80
60
40200LF

HFの浸潤抑制効果を持つことが強く示唆される．

200*150

100500HF+IsoGlucose

250

Plasma glncose (mg/100mL)

140100ら，大豆イソフラボンはマクロファージの脂肪組織へ

Cholesterol
Plasma cholesterol (mg/100mL)

Plasma triglyceride (mg/100mL)

Triglyceride

発現も大豆イソフラボン添加により減少することか

LF

HF

Plasma TBARS (nmol MDA/mL)

Plasma NEFA (mEq/L)

1.2
1.0
0.8
0.6
0.40.20

HF

250
200
150
10050

LF

HF

HF+IsoPeroxidized lipid

1.4

LF

300

0

HF+Iso

FFA

350

HF+Iso

4.0

**

3.5
3.0
2.5

*

2.0
1.5
1.0
0.50

LF

HF

HF+IsoFig. 3. Effect of soy isoflavone on plasma parameters of C57BL/6 mice. Each parameter was determined as
described under materials and methods. Results are expressed as means + SEM (n=5). * P <0.01,** P <0.05 vs high-fat group (HF).

98

大豆たん白質研究 Vol. （9 2006）

A

Leptin1.0***0.50Resistin*1.01.00.5

LF

HF

0HF+Iso

LF

HF

Plasma concetration (μg/mL)

**

LF

HF

HF+IsoLeptin**

300HF+IsoAdiponectin

B

*0.5

Plasma concetration (μg/mL)

Relative expression

Adiponectin

2010050
4030*

20100LF

HF

HF+IsoLF

HF

HF+IsoFig. 4. Effect of soy isoflavone on gene expression in epididymal adipose tissue (A) and plasma concentration (B) ofadipocytokines. Gene expression and plasma level of each adipocytokine were determined by real-time PCRand ELISA, respectively, as described under materials and methods. Results are expressed as means +SEM (n=5). *P <0.01, **P <0.05 vs high-fat group (HF).

GPxp47phox**

Relative expression

1.5

1.0

*
1.0

0.5
0.50

LF

HF

HF+Iso0

LF

CD68

HF

F4/80
**

Relative expression

1.5

1.0

HF+Iso**1.5*

1.00.5*0.500LF

HF

HF+IsoLF

HF

HF+IsoFig. 5. Effect of soy isoflavone on gene expression of oxidation and anti-oxidation enzymes and macrophage
markers in epididymal adipose tissue of C57BL/6 mice. Gene expression of p47phox and GPx wasdetermined by real-time PCR as described under materials and methods. Results are expressed as means +SEM (n=5). *P <0.01, **P <0.05 vs high-fat group (HF).

大豆たん白質研究 Vol. （9 2006）99

***0.1NACnoneDMSG O
enistin
GlycitinDaidzinG
enistein
Glycitein
Daidz
ein0Fig. 6. Effect of soy isoflavone on ROS production in
3T3-L1 adipocytes. ROS production wasdetermined by NBT reduction assay asdescribed under materials and methods.
Results are expressed as means + SEM of three
independent determinations. *P <0.01 vs none.

**

1.00DMSO
G
en
istin
G
lycitin
D
aidz
in
G
en
isteinGlycitein
Daidz
ein*

*

2.0none0.2

Resistin secretion (% of none)

ROS production (OD550nm)

0.3Fig. 8. Effect of soy isoflavone on resistin secreiton by
3T3-L1 adipocytes. Resistin secretion wasdetermined by Western blotting as describedunder materials and methods. Results areexpressed as means + SEM of three
independent determinations. *P<0.05 vs none.

生にも効果を示すことが考えられる．十分に分化した*脂肪細胞はROSを産生することが確認されたが，配糖1.5**体（genistin，glycitin，daidzin）は有意にROSの産生を低下させた（Fig. 6）．一方，アグリコン（genistein，1.0

glycitein，daidzein）にはそのような効果は認められなかった．ROS産生の軽減は脂肪細胞の機能改善につ0.5ながることが期待されるので，培地中に放出されるアディポネクチン量を調べたところ，ROSの軽減作用と呼応するようにgenistin，glycitin，daidzinには有意なeinindz

分泌亢進が認められた（Fig. 7）．予想に反し，代表的D

aicilyGisteteinindzen
GaiDlycitin
GisSOMenGDnotin

0ne

Adiponectin secretion (% of none)

ソフラボンが直接脂肪細胞に作用するとすればROS産Fig. 7. Effect of soy isoflavone on adiponectin secreiton
by 3T3-L1 adipocytes. Adiponectin secretion
was determined by Western blotting as
described under Materials and methods.
Results are expressed as means + SEM of three
independent determinations. *P <0.05 vs none.

な悪玉アディポサイトカインの一つとされるレジスチンの分泌もgenistin，glycitin，daidzinの添加により亢進された（Fig. 8）．
以上のように，大豆イソフラボンを混合物として実験動物に与えた場合，明確な体重，脂肪組織重量軽減作用は示さなかった．大豆イソフラボンのうちgenisteinが，卵巣摘出を施した雌マウスの体重軽減を引き起こすと報告されているが6)，今回のように雄マ前記のマウスを用いたin vivo実験により，大豆イソウスに対して顕著な効果は示さなかった．しかしながフラボンは脂肪細胞に作用することが強く示唆され

ら，大豆イソフラボンは善玉アディポサイトカインとた．さらに明確に調べるために，脂肪細胞のモデルとして知られるアディポネクチンの血中濃度を上昇させして汎用されている3T3-L1脂肪細胞に対する大豆イソたこと，血液中のTBARS量を軽減させたこと，配糖フラボンの添加効果を調べた．

体が培養下の脂肪細胞におけるROS産生を軽減させた

脂肪細胞は細胞内に蓄積した中性脂肪量に比例してことから，大豆イソフラボンはその抗酸化活性を通しROSの産生が高まることが報告されている 3)．大豆イて脂肪細胞の機能改善効果を示したと考えられる．

100

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要約

食餌誘発性肥満モデルとして汎用されるC57BL/6Jマウスに高脂肪食（50％ラード含有食）を自由摂取させ，何も加えない群（HF群）と大豆イソフラボン（ソヤフラボンHG，総イソフラボン含量55.6％）を加えた群（HF+Iso群）を設定し，10週間にわたり飼育した．この間の体重増加，飼育後の体重にはHF群とHF+Iso群とで有意な差は認められなかったが，皮下および副精巣周囲脂肪組織重量はイソフラボン添加群で若干減少した．飼育後の血漿中性脂肪値，TBARS値（過酸化脂質値）はHF+Iso群で減少したが，コレステロール値，血糖（グルコース）値は両群で差は認められなかった．またマクロファージマーカー（CD68，F4/80）やNADPH oxidase酵素の発現は，HF群に比してHF+Iso群で減少した．アディポネクチンの発現はHF群で減少したが，イソフラボンの添加により改善した．一方，レジスチン，レプチンの発現，分泌に対するイソフラボンの効果は認められなかった．また培養脂肪細胞（3T3-L1細胞）では分化程度，すなわち脂肪蓄積程度に応じて細胞内で産生される活性酸素種（ROS）が増加するが，主に大豆イソフラボン配糖体（genistin，glycitin，daizin）にROS産生抑制効果が認められた．またアディポネクチンの分泌も配糖体により増加することが明らかとなった．一方レジスチンの分泌は予想に反して配糖体により増加し，アグリコン（genistein，glycitein，daizein）により減少した．以上の結果より，大豆イソフラボン成分は，顕著な抗肥満効果は示さないものの，脂肪細胞・組織の機能改変作用を有することが示唆された．

文

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