厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び類縁疾患の病態と治療法に関する研究
木：旺

平成7年度研究報告書

平成8年3月（1996年）

総

括

研

究

報

告

主任研究者 高 木 昭 夫

1．研究目標とその成果
1）研究目標 筋ジストロフィーや類縁疾患の病態解明と治療法の開発を目的として3年間の班研究活動をおこなった．筋ジストロフィーとしてはDuchenne／Becker型（DMD／BMD），先天型（CMD），肢帯型（LGMD），顔面肩甲上腕型（FSH），遠位型などを対象とした．類縁疾患としてはミトコンドリア脳筋症，筋緊張性ジストロフィー，その他のミオパチーを対象とした．治療法開発としては，遺伝子治療を第一に取り上げた．
さらに病変進行にたいする緩和治療も考慮した．以下に各々の疾病につき報告する．
2）DMD／BMD
これらの疾病ではdystrophin分子の欠失ないし異常が病因であることは既に判明している．進行性筋変性の発症機序が未解決問題の1つである．筋細胞膜下においてdystrophin分子のN端はactinと結合し，他端はdystroglycanと結合すると推定されている．さらにdystroglycanは細胞外マトリックスと結合して筋細胞の補強に関与すると仮定されている．
金粒子を使用した免疫電顕によると，adhalin（a−SarCOglycan）のcytoplasmicdomainとβ−
dystroglycanは細胞膜下でいずれもdystrophinと近接して存在した（若山）．ちなみにβ−dystroglycanはDMDで中等度に減少していた．またDMDではadhalinが二次的に著減している．Adhalinが遺伝的に欠損するAdhalin欠損症では臨床経過や筋病理はDMDに類似しているがやや軽症といわれた（川井）．脳型dystrophinは中枢神経の後シナプス部に発現している．しかしDMD脳でシナプス部に明瞭な超微構造の変化は指摘できなかった（内野）．
通常はDMDの遺伝子診断は末梢血白血球を使用して行われる．骨格筋のdystrophinmRNAの分析結果は臨床像とよく相関していた（斉藤加）．Apoptosisに関連するFas抗原はDMDを含む数種の疾患筋に非特異的に発現した．しかし核変化を伴わないなど細胞死への直接関与は否定的であった（佐橋，杉村）．重篤な心筋障害を合併したBMD28症例の遺伝子異常が分析された．exon1−13のN端側に異常を持つ症例では心症状が先行Lより重症であった．C端側の異常では骨格筋症状が先行した（池田）．
治療

妊婦末梢血中の単一有核赤血球のDNAを増幅して，胎児の性別やDMD保因の診断法が開発された（佐藤）．より非侵襲的診断法として完成が期待される．遺伝子治療に関して基礎実験が行われた．exvivo遺伝子治療を考慮して培養細胞への遺伝子導入法が検討された．その結果ポリカチオン脂質法が効率が良いと判明した（庄司）．しかし本法は

効率の悪さと組織障害性のためinvivoでの応用は困雉と考えられた．同様にHVJ−liposome法で全長のdystrophincDNAをマウス培養筋芽細胞に導入できた（岡田）．しかしinvivo実
験では安定した発現をみるに至っていない．DMDの治療法として筋芽細胞移植が成功しない一因は拒絶反応のためである．拒絶反応予防を目的としてⅠし12に桔抗するⅠし12p40
遺伝子を筋芽細胞に導入する実験が行われた（佐藤）．予報段階であるがこの操作の有効性が確認された．mdxマウスを使用した実験的治療が継続されている．mdxの骨格筋はinvitroでは膜電位の低下とミオトニア放電をきたすことが知られる．idebenoneがこの現象を著明に抑制した（栗原）．プレドニン投与がDMD治療法として成果をあげている．プ
レドニン投与が筋壊死を抑制するか否かが検討された．prednisolone（30mg爪g／day）はmdx骨格筋壊死の進行には影響しなかった（高木）．しかしrevertantfiberの分裂促進ある
いは免疫的影響も示唆された．nifedipine（60r14mgA（g／day）が血清CKを低下させ，筋壊死を抑制する可能性が示された（吉田）．しかし溶媒の関与も考慮されている．BMD，
FSH，LGMDの臨床例にdantrolene及びglycyrrhizineの効果が検討された（田代）．少数例であるが長期投与の有効性が示唆された．

3）先天性筋ジストロフィー（CMD）
福山型筋ジストロフィー（FCMD）本症の責任遺伝子の同定に関して大きな前進がみられている．まず近親婚による発症の家系におけるホモ接合マッピング法による連鎖解析から，遺伝子の局在は9q31−33と判明した（戸田）．さらにFCMD遺伝子はD9S127−−
CA246の5cMの間にしぼられた．markermf220とに強い連鎖不平衡をみとめた．その後より強い連鎖不平衡を示すJ12がクローン化された．FCMDはJ12を含む100kb以内に存在す
る．FCMD患者の88％に共通するハプロタイプが発見され，弧発例のFCMDの診断に応用可能となった（戸田）．FCMD同胞間で臨床像が著しく相違することがある．遺伝子解析の結果からは同一疾病であることが判明し，臨床症候の広がりが確認された（斉藤加）．
FCMD胎児脳の病理が研究され貴重な所見が報告された（戸田，斉藤加）．前頭・頭頂葉の大脳皮質は異常組織（neurogliomesenchymaltissue）で覆われていた．この部位ではglia
limitansに亀裂がみとめられた．グリア基底膜に異常が推定され，小多脳回や脳回融合の原因と想定される．
非福山型先天性筋ジストロフィーこの群には異種の疾病が含まれる．この中には基底膜蛋白ラミニンの亜分画であるmerosin（ラミニンα2）M銀を遺伝的に欠損する病型がある．欧米ではmerosin陽性と陰性の比は1：1であった．本邦ではこの比は25：1と著しく異なった（後藤）．また本邦のCMDのうちmerosinM鎖欠損は2．8％に認められた（荒畑）．
merosinM銀欠損では知能障害や中枢神経形態異常は合併しない．

4）FSH

FSHの原因遺伝子は4q35−terに局在するとされている．しかし現時点で同定されていな
い．診断にはp13E一日ないしpFR−1をプローブとするサザン解析が行われている．すなわ
ちEcoRI断片の28Kb以下の短縮がFSHの特徴とされた．本邦のFSH158症例の97％は本法で診断可能であった（荒畑）．別の報告では33例中の82％に異常を検出した（納）．

5）LG
このグループは分子レベルでの研究が遅れていた分野であった．しかし近年欠失する
蛋白が相次いで発見され，疾病の再分類が試みられている．本邦ではα−SarCOglycan（50DAG，adhalin）欠損の病型が確認された（荒畑，清水，川井，納）．この病型は三好により悪性肢帯型として記載された筋ジスの一型である．Adhalin遺伝子は17q12−21に局在し，本症では点変異，挿入，欠矢などが主として細胞外ドメインに認められた（川井）．
臨床像はDMDに似るがやや軽症であった．心臓異常は比較的少なく，知能障害はみられない（川井）．
6）三好型遠位筋ジストロフィー
microsatellitepolymorphismを応用して遺伝子座が決定された（水野）．2p12−14の15種の総てのマーカーと有意な連鎖を認めた．D2S292−D2S286の6cMの間に存在した．候補遺伝
子としてTGFAとsyndecanを検討したが該当しなかった（水野）．

7）遠位型ミオパチー（DMRV）
常染色体劣性のDMRVは本邦に比較的多く，解明の待たれる疾病である．稀ではあるが，常染色体優性DMRVの家系が報告された（高木）．DMRV発症者がいずれもRh（−）
であったことから，1pのmicrosatellitemarkerとの連鎖を調べた（高守）．また第20染色体のmarkerとの連鎖も分析された（辻）．しかしいずれの分析においても有意な連鎖は証明されていない．
8）筋緊張性ジストロフィー（MYD）
myotoninkinase遺伝子の異常による疾病と既に判明しているが，その病態解明は遅れている．合成ペプチドに対する抗体を使用して原意組織における蛋白発現を調べた（荒畑）．
本症の骨格筋や心筋では蛋白量の著明な減少を観察した．しかし蛋白の過剰発現との報告もあり，一致した結果を得てはいない．この遺伝子にみられる（CTG）nの反復配列は転写調節に関与するとの説が有力である．この遺伝子のcDNAをtransfectした筋芽細胞における筋関連蛋白の発現を分析した（寺尾）．myogenin，SyntrOphin−1，Cardiacα−aCtinの発現は対照より遅延した．すなわち分化抑制の起こる可能性を推定した．一方，

galagtosylceramidaseに（CTG）．5。を組み込んだ遺伝子を発現させると，GALC活性は著増した（小林卓）．cTG反復が発現を増強させたと推論した．MYDにおいてCTG反復の伸展は臨床的にも重要であるが，その伸展機序は不明である．CTGの伸展はMYD遺伝子に特異的であると推定された．myotoninkinaseC端の合成ペプチドに対する抗体を用いて酵素の局在を調べた（小林高）．酵素はⅠ帯に存在し，特に小胞体終槽に多かった．
9）ミトコンドリア脳筋症

この分野では3年間にまた大きな前進をみた．筋組織化学検査ではsmoothredfiber（SRF）やSDH染色性の意義が検討された．sRFはraggedredfiberとほぼ同等の診断意義を持っていた（田代）．sDH染色性の強弱は変異mtDNA量と相関していた（内野）．mtDNA
を系統的に検査する方法が提唱された（後藤）．insituhybridizationによりDNA欠尖の解析法が考案された（水野）．新しいmtDNAの変異が追加された．MELAS／MERRFoverlap症
候群で新しい点変異が発見された（梶）．MERRFの変異に関して，lysinetRNA上の2種の点変異が追加された（宝来）．MELAS，MERRF，LHONの間でまた3243変異をともなう糖尿病におけるheteroplasmyと臓器障害の関係が検討された（桃井，高木）．LHONでは
homoplasmyのみの細胞が64％存在した・P。細胞（cybrid）を使用して病態研究がおこなわれた（小沢，太田）．
2．未解決の問題点と解決の見通し
病因遺伝子の未同定の疾患がいくつかある．既に遺伝子局在の確定している病気としてはFSH，FCMD，一部のLGなどである．遺伝子局在未定のものとしてはDMRVや一部のLGである ．MYDについては遺伝子は同定されたが，多系統疾病としての病態は未解決である．これらの諸問題に関しては，既に方法論はほぼ確立しているため解決は近いと考えられる．類縁疾患を含めて筋ジストロフィーの治療の領域では未解決の問題が多い．
DMDの根本治療はやはり遺伝子治療を得たねばならない．モデル動物レベルでdystrophin
遺伝子導入による治療が充分に成功したとは言いがたい現状である」遺伝子導入の効率や安全性の研究が必要と考える．筋芽細胞移植は拒絶反応の問題が解決されれば展望がひらけると思われる．corticosteroids投与がDMDに有効との報告が散見される．その作用機序はまだ不明である．

目

次Ⅰ．臨床・分子病理学
151）Rigid spine syndromeの臨床・筋病理学的検討
東京都立神経病院

田邊等

2) MDXマウス及び諸種神経筋疾患におけるFibroblast growth factors,
Heparan sulfate proteoglycanの免疫組識学的研究
東京都立神経病院

田

18

邊

等

3）サイトカインと筋萎縮21

順天堂大学医学部生化学第一講座

木

南

英

紀

4）共焦点レーザー顕微鏡を使用したヒト疾患培養筋細胞内の動的細胞内カルシウム濃度変化

24

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義5）筋ジストロフィーおよびミトコンドリア病生検筋における28

熱ショック蛋白の免疫染色愛知医科大学第四内科 佐 橋功6)ミトコンドリア脳筋症の生検筋におけるsuperoxide dismutase(SOD)および
nitric oxide synthase (NOS)の局在
筑波大学臨床医学系神経内科

庄

司

進

31

一

7）筋ジストロフィー生検筋における細胞死関連蛋白の免疫組織学的観察

34

愛知医科大学第四内科 佐 橋

功8）筋細胞障害におけるFas抗原とApoptosis

38

名古屋大学医療技術短期大学部

杉

村

公

也

9）筋フォスフォリラーゼ遺伝子コドン49のナンセンス変異を示した
41

McArdle病の一例

京都大学医学部神経内科 梶龍 兒10) Gomori‑Trichrome変法における薄層赤染線維の意義について
─慢性進行性外眼筋麻痺の母子例を中心に─
北海道大学医学部神経内科

44

田

代

邦

雄

11)ミトコンドリア脳筋症患者のragged‑red fiberにおけるミオグロビン量とそのmRNA量徳島大学医学部第一内科

48

川

井

尚

臣

Ⅱ．臨床・分子遺伝学
12）リンパ芽球細胞の樹立とその解析

55

東京医科歯科大学難治疾患研究所遺伝疾患研究部門（細胞遺伝） 斎 藤 深美子

713）眼咽頭筋ジストロフィー：日本人2家系例の臨床・筋病理・遺伝子連鎖解析の検討

58

熊本大学医学部附属病院神経内科

内

野

誠

14) Paramyotonia congenita日本人1家系の遺伝子解析

62

九州大学医学部脳研神経内科 小 林 卓 郎

15) Emery‑Dreifuss型筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究

64

国立精神・袖経センター神経研究所 荒 畑 喜 一16）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）の臨床的多様性と遺伝子診断
鹿児島大学医学部第三内科

納

67

光

弘

17）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）の遺伝子領域の構造と遺伝子診断

70

国立精神・神鐘センター神経研究所 荒 畑 喜 一

18）脊髄性筋萎縮症の遺伝子診断

73

東京女子医科大学小児科

斎

藤

加代子

Ⅲ．福山型先天性筋ジストロフィー
19）福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）遺伝子のポジショナルクローニング

77

東京大学医学部人類遺伝学 戸 田 達 史20）出生前診断が行われた福山型先天性筋ジストロフィー
胎児2症例の大脳皮質病変─神経病理学的考察─

80

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

21）非典型的（歩行可能）福山型筋ジストロフィーの
第9染色体長腕31への局在の検討

82

東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

22) 福山型先天性筋ジストロフィー(FCMD) : glia limitans─基底膜複合体の破れが大脳micropolygyriaの遠因か?
─FCMD胎児(18週)脳の免疫組織学的･電顕的検索から─
東京大学医学部人類遺伝学

84

戸

田

達

史

Ⅳ．遠位型ミオパチー
23) Rimmed Vacuoleを伴う遠位型ミオパチーに対する91

homozygosity mappingを用いた分子遺伝学的研究

新潟大学脳研究所神経内科

辻

省

次

24) Rimmed‑vacuole型遠位型ミオパチーの連鎖解析

95

金沢大学医学部神経内科 高 守 正 治25) 常染色体優性rimmed vacuolar myopathyの一家系
虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

8

98

101

26) Rimmed vacuoleにおけるアミロイド蛋白関連物質の発現について
東京都立神経病院

田

邊

等
104

27）三好型遠位型筋ジストロフィーの遺伝子解析
順天堂大学医学部脳神経内科

水

野

美

邦

Ⅴ. 筋緊張性ジストロフィー,その他(1)28) ミオトニンプロテインキナーゼ(MtPK)cDNA導入筋芽細胞
109における筋関連蛋白遺伝子の発現解析
帝京大学医学部神経内科

寺

尾

壽

夫
112

29) Mvtonin Protein Kinase (MtPK)のin vivo及びin vitroにおける局在

東京医科歯科大学医学部神経内科 小 林 高 義
11530) CTGリピートの遺伝子発現に及ぼす影響の解析
九州大学医学部脳研神経内科 小 林 卓 郎

11931）三塩基対反復配列延長疾患の配列延長に関する解析
自治医科大学小児科 桃 井 真里子

Ⅵ. 筋緊張性ジストロフィー,その他(2)
32)

123

筋緊張性ジストロフィーにおけるinsulin receptorの糖鎖異常
名古屋大学医療技術短期大学部 杉 村 公 也33) 骨格筋組織にリソソーム由来と思われる空砲を認めたα‑mannosidase症例の
α‑D‑mannosidase遺伝子の解析
徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

125

臣

34) 筋型AMPデアミナーゼ遺伝子(AMPD1)のスプライシング調節:
甲状腺機能低下性ミオパチーにおける検討128

国家公務員等共済組合連合会大手前病院 垂 井 清一郎

Ⅶ. DMD/BMD
13335) 妊婦末梢血を用いたDuchenne型筋ジストロフィーの出生前遺伝子診断
国立精神・神経センター国府台病院神経内科 佐 藤

猛36) DMD/BMD骨格筋のジストロフィンmRNAと臨床像
東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

13637) Duchenne型筋ジストロフィー中枢神経におけるシナッブス部の変化について

138

熊本大学医学部神経内科

内

野

誠
141

38) 重篤な心筋障害を呈するBecker型筋ジストロフィーの全国調査結果
信州大学医学部第三内科

9

池

田

修

一

Ⅷ. Adhalin欠損症
39) Adhalin欠損悪性肢帯型筋ジストロフィーにおける臨床像と147

adhalin遺伝子異常の特徴
徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

臣

40) Adhalin欠損悪性肢帯型筋ジストロフィーの心所見

154

─臨床像と剖検所見について
徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

臣

若

山

吉

弘

41) 正常骨格筋線維におけるadhalinの超微局在とdystrophin,
β‑dystroglycan, β‑spectrinとの相互関係について
昭和大学藤が丘病院神経内科

15942) Adhalin欠損症の細胞接着分子に関する免疫組織化学的研究

163

鹿児島大学医学部第三内科 納

光 弘43) 末梢神経におけるdystorophin関連･結合蛋白の機能･構造解析

166

帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫44) dyマウス骨格筋細胞膜微細構造の解析‑mdxマウスとの比較検討─
昭和大学藤が丘病院神経内科

171

若

山

弘

Ⅸ．ミトコンドリア脳筋症45）ミトコンドリア脳筋症各病型の筋病理所見と変異mtDNAの比較検討
熊本大学医学部神経内科

内

177

野

誠

46）ミトコンドリアミオパチーの成因に関する分子生物学的研究

180

国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部 後 藤 雄 一47) MERRFにおける新たなミトコンドリアtRNA遺伝子上の変異

182

国立遺伝学研究所 宝 来聰48) MERRFの心筋ミトコンドリア病変についての研究
国立療養所犀潟病院神経内科

185

福

原

信

義

49）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたin situ hybridizationによる

4977bpの欠失を伴う変異ミトコンドリアDNAの検出
順天堂大学医学部脳神経内科

188

水

野

美

邦

50）ミトコンドリア遺伝子変異型と表現型

193

名古屋大学医学部生化学第二講座

小

澤

高

将

51）ミトコンドリア損傷によるアポトーシス誘導のシグナル
─ミトコンドリア脳筋症の負の遺伝子治療をめざして
日本医科大学老人病研究所生化学部門

10

198

太

田

成

男

Ⅹ. 治 療20552) プレドニゾロンによるmdxマウスの実験的治療
虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

20853) ジストロフィン欠損症heterozygoteの筋病理学的研究
東京都立神経病院

田

邊

等
211

54) mdx骨格筋崩壊抑制の試み(治療)
国立精神・神経センター神経研究所 吉 田 瑞 子

21355) mdxマウスに対する治療的研究: idebenoneとglycyrrhizinの効果
東邦大学医学部第四内科

栗

原

照

幸
217

56) 筋ジストロフィーに対するGlycyrrhizineの効果について
北海道大学医学部神経内科 田 代 邦 雄

57) Duchenne型筋ジストロフィーに対する遺伝子治療の基礎的研究
221─カチオン性脂質を用いた培養筋細胞への遺伝子導入
筑波大学臨床医学系神経内科

庄

司

進

一

58）ラット骨格筋における遺伝子直接導入法によるポリカチオン，
ポリアニオンの影響に関する研究
金沢大学医学部神経内科

224

高

守

正

治

59）筋ジストロフィーにおける接着分子の検討と遺伝子治療の可能性に関する研究

227

大阪大学医学部小児科 岡 田 伸太郎60) IL‑12p40遺伝子導入による同種筋芽組胞移植拒絶抑制効果
国立精神神経センター国府台病院神経内科 佐 藤

229

猛
233

平成7年度研究班名簿11Ⅰ．臨床・分子病理学

l）Rigid spine syndromeの臨床・筋病理学的検討
田

研究協力者

連

等＊

磯 崎 英 治＊ 藤 本 陽
宮 本 和 人＊ 松 原 四

子＊
郎＊

川

田

明

広＊

は じ めにRigid spine syndrome（RSS）は，1965年にDubowit21）が提唱した疾患であり，現在までに約60例の報告例がある．しかし，種々な合併症を有する
RSSのvariantとしての報告も多く，例えば心筋症，
著明な呼吸不全，高CX血症，あるいは筋萎縮の分布が四肢近位部でなく肩甲下腿型を示した例などであり，それ故RSSが一つの独立した疾患単位であるのか否かが問題となっている．こうした点をふまえ，我々は目
敏例の臨床・筋病理学的所見をsplittingでなく，むしろlumpingの立場から再検討し，さらに文献報告例との比較検討を行った．
対象および方法
対象は，当院にてRSSと診断された6例（表1）および記載の十分な文献報告49例である．自験例の症例6についてはすでに共同研究者の一人肛awata2））により報告されている．筋病理所見については半定量化のため，筋線経の大小不同およびendomysium〜
perimysiumの線維化の程度をそれぞれ軽度，中等度，高度に分け，文献報告例についても記載内容を参考に同様に分類した．
蓑1日駿RSS6例の臨床・筋病理所見
4

F
／
06
2

ニー錮

一＋一75

図1頸部における骨格筋CT像
正常対照例における胸鎖乳突筋（SCM，・で示す）に比し，RSS例ではいずれも中等度から高度の萎縮を認める．
結

タ

＋＋一＋＋

＋

＋十の＋一

＊東京都立神経病院神経内科

2

＋＋プ＋一
＋＋舛

＋十一l一

＋＋

＋＋一＋＋
＋

SCM：胸鎖乳突筋 RV：rimmed vacuoles

5
F
／
14

uM
42238＋一uM
21320＋t

3
H

3

RV

H

構築異

位常

タイ7 僅

＋＋一＋＋
＋＋ ＋

同

年令／性
発症年令
歩行不能年令SCHの萎縮
心電図異常
％肺活量
筋病理
大小不
線維化

2

32426＋一鍋

15710警●錮

症例

果

自壊6例の検討：全例で胸鎖乳突筋（SCM）の萎縮を肉眼的に認め，頸部の骨格筋CT像では同筋のvolumeの減少ないし消失を認めた他，傍脊柱筋を中心とする後頸部の筋群の低吸収域を認めた．症例6のようにまだ歩行可能な例においても上記の所見は明らかであった（図1）．呼吸機能については，全例で％肺活量（％VC）の低下を認め，特に症例1，6においてはそのために気

−15−

例数

大糾（＋）
小

不RV（−）
同線RV（．）

ロSCl未記載■Sα萎縮あり

維
化RVト）
01

201

401

601

口軽度： ■虻中等度
一5

−10

−15

−20

−25

−3〇・一35

■−40

−45

80％

1∝鵜

■高度

図4 Rimmed vacuoles（RV）と筋病変の程度
RVを有する筋（14検体）では，それを認めない筋￠7検体）に比し，より高度の筋病理所見（大小不同，線維化）を呈する．

−的

罵病期間（年）

図2 胸鎖乳突筋（SCM）萎縮の出現頻度
発症早期より，SCMの萎縮を認める．

ノ

例数

けると，RV陽性群（22例）では，RV陰性群（33例）に此し，拘束性換気障書やSCM萎縮の出現率がやや高い傾向にあったか，同時に擢病期間も有意に長かった．

25

20□lVC未記載15

考■

日％VC低下
■気切

10

5

0
〜5

■−10−15−20−25−30〜35−40−45・−50

罵病期間（年）
図3 拘束性換気障等の出現頻度
発症早期より，気管切開術を必要とする重症例を含め，高率に拘束性換気障書を認める．
管切開術を必要としたが，喚下機能はいずれの例もよく保たれていた．筋生検所見は，全例で種々な程度に
筋線経の大小不同，線維化 中心核の増加などいわゆる筋原性変化を示し，症例5では神経庶性変化も混在していた． さらに，症例1，2，6あ3例ではr血med
vacuole（RV）を認めたが，その数は全視野で3から4個程度であった．
自験6例に文献報告個例をあわせた5例の検討：SCMの萎縮を認めた例は，22／55例伍0％），また拘束性換
気障書（％VCの低下）を認めた例は，44／55例匝0％）であり，何れも発症早期（罷病期間5年以内）から認められた（図2．3）．筋生検所見上，延べ51枚体中14検体（27％）でRVの出現をみた．RVを認めた筋（14検体）
は，RVを認めない筋（37検体）に此し，筋線経の大小不同や線維化の程度が強く（図4），lobulated fiberやmoth−eatenfiberなどの筋構築異常も高率に示し，また神経原性変化を加味する傾向にあった．一方，生検
部位別にRVの出現率をみると，四肢筋では49例中13例（27％）であるのに対し，傍脊柱筋では11例中8例（73％）と高率であった．RSSをRVの有無で2群に分蕪

1965年仁Dubowitzl）が提唱したR5Sの臨床的特徴
は，「乳児期発症，頸椎から腰背部脊椎の前屈障書，
肘・足関節の運動制限，四肢近位筋の筋力低下を主敏とする緩徐進行性ないし非進行性のミオパチーであり，側考や関節拘棺は進行しうる」というも のであった．
しかし，その後，前述したような種々なvariantsの報
告，不定の遺伝形式，病態名である「rigidspineJと疾患名である「rigid spine syndrome」との用語使用上の混同，筋生検所見の多様性などのため，現在でもなおRSSはheterogeneousな疾患であるとする傾向にある．我々は，自助例を含めた55例の臨床・筋病理
学的検討の結果，上記のDubowitzの記載以外に，発症早期からのSCMの萎縮および進行性の拘束性換気
障書もRSSの特徴であると考えた．後者についてはすでに指摘されており3）〜の，拘束性換気障書の原因は，呼吸筋の筋力低下およびrigid spineに起因する胸郭運動制限によると考えられている6）．scMは頭部前屈作用の他に，呼吸補助筋としての作用（吸気時に胸郭の挙上関大を行う）も有することから，同筋の萎縮・筋力低下は換気障害の一因になりうる．SCMの萎縮をきたすミオパチ一には筋緊張性ジストロフィー甲他，
RVを伴う遠位型ミオバチ一，封人体筋炎，糖原病（Debrancher欠祖症）などが知られているが，RSSもその一つと考えられる．
一方，RVは前述した様に筋線練の大小不同や線維化など筋原性変化のより強い筋で出現する傾向にあり，
しかも日放例で見る限りRVの数は金視野で3〜4個と少ないことより，筋の変性た伴って非特異的，二次的に出現したと考えた．一般にRSSでは四肢筋に此し，−16−傍脊柱筋においてより筋の変性所見が強いとされており，それ故にRVは変性所見の強い傍脊柱筋において，より高率に出現したと思われる．同一症例で，四肢筋と傍脊柱筋の両方を検索した上原ら7）も同様に考えている．RVの有無によりRSSが2群に分かれる可能性

2）Kawata A，Suga M，Miyamoto K，et al：
Rigid spine syndrome and nocturnal alve0−
1ar hypoventilation・Internal Med

32：638−640，1993．

3）Poewe W，Willeit H，Sluga E，et al：The
rigidspinesyndrome−amyOpathyof uncer−を指摘している報告もあるが），55例を対象とした
我々の結果からは，呼吸機能上両群間で明らかな差は

tAin nosological position・J NeuroI Neuro−
surgPsychiatry48：887−893，1985・

なく，また上述したようにRSSにおけるRVは二次的に出現したと考えられるので，RVの有無でRSSを24）Merlini L，Granata C，Ballestrazzi A，et群に分けることは本質的ではないと思われる．ただし，

al：Rigid splne Syndrome and rigid splne

Lotzら5）の報告は，筋病変の程度についての記載がな
く，彼らのいうvacuolar typeのRSSにみられるRVが，二次的に出現したRVとみなせるか否かは不明である．Emery−Dreifuss型筋ジストロフィー（EDMD）
は，RSSと最も鑑別を要する疾患であり，症候学的な特徴のみではしばしば鑑別が困難である．実際，RSSとして経過観察されていた例が，その後心伝導障害をslgninmyopathies・J Child Neuro14：273−
282，1989．
5）Lot2：BP and StubgenJP：The rigid spine
syndrome‥Avacuolarvariant・

Muscleand Nerve16：530−536，1993．
6）Ras GJ，Staden MV，Schult2：C，et al：Res−
piratory manifestations of rigid splne Syn−drome．AmJ RespirCrit CareMed150：540

きたし，またgeneticstudyの結果からEDMDと診断−546，1994．

された例もある9）．しかし，我々が調べた限りでは，
少なくとも典型的なEDMDにおいては，重篤な呼吸障害もSCMの萎掛こついても，またRVについても報告がなく，これらは心伝導障害とともにRSSとEDMDとの臨床的鑑別点になりうると思われる．
文
献1）Dubowit2；Ⅴ：Pseudo muscular dystrophy・
In Reserch Committee of the Muscular Dys−

7）上原真理子，原 朋邦，上原 哲ほか：強直性脊椎症候群（rigidspinesyndrome）の1例一骨格筋の組織学的，組織化学的所見を中心として−．神経内科16：50−56，−1982．
8）小野寺 理，山崎元義，渥美哲至ほか：Rimmed
vacuoleを認めたRigidspine syndromeの一例・
臨床神経罰：516−519，1990．
9）Voit T，Ⅹrogmann O and Lenard HG：

trophy Group of Great Britain：Proceedings
ofthe Third Symposium．Pitman Medical，London，1965，p57．

−17−

Emery−Dreifuss muscular dystrophy：Dis−ease spectrum and differential diagnosis・

Neuropediatrics19：62−71，1988・

2）MDXマウス及び諸種神経筋疾患におけるFibroblast growth factors，

Heparan sulfateproteoglycanの免疫組織学的研究
田

研究協力者

水

野

美

連

彦＊

は じ めにFibroblastgrowthfactor（FGF）は体内の多くの細胞に存在し，細胞の再生・分化に重要な役割を果たしている．FGFはacidic FGF（aFGF），basic FGF（bFGF）を初めとして7つのものが現在までに発見され，また，そのreceptor（FGFR）も4つが見つかっている．ところでaFGF及びbFGFはheparin−binding
growthfactorfamilyに屈する蛋白で1），heparinあ
るいはheparansulfate proteoglycan（HSPG）と強く結合し2），その作用の一つとして血涙roで筋細胞の発育・分化にも深く関わっていることが報告されている3）4）．

ところで，MDXマウスはBulfieldらによって最初に見出され，Ⅹ−1inked recessiveな遺伝を示し，dystrophin欠損を示すことより，DMDの動物モデルと考えられている．しかしながら，DMDが進行性を示すのに対して，MDXマウスは再生が活発で進行性を示さない．同じ退伝子欠組を示しながら臨床症状が異なる原因については未だ解明されていない．01iver
らはMDXマウスにおいてaFGFがcontrol mouseに比べて強く細胞外matrixに染色されることを免疫粗放学的研究によって報告している5）．一方，DiMario
らもbFGFがMDXマウスの細胞外matrixに存在することを示している6）．これらFGFの存在は筋細胞の再生と密接な関係があると考えられており，MDXマ
ウスにおけるsatellite cellの活性化及び変性後の活発な再生をもたらしていると考えられる．一方，ヒトの筋におけるFGFの局在については，文献的に調べた限り記載はない．D，Amoreら7）はDMD患者血清中にbFGFが増加していることを報告しているが，免疫組
織学的には証明しておらず，それが筋由来のものか否かは断定できない．今回，我々はMDXマウス及び諸種神経筋疾患の筋組織におけるaFGF，bFGF及び＊東京都立神経病民神経内科＊＊東京都立神経病掟神経小児科

等＊

繁

友

律

子＊

小

森

穂

子綿

HSPGの局在について免疫組織学的に検討したので報
告する．
対象・方法
MDXマウス，対照B−10マウス，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD），福山塑先天性筋ジストロ
フィー（FCMD），皮膚筋炎（DM），Werdnig−
Hoffmann病（WH），中枢性hypotonia（CII）症例，各2例の生検筋を使用した．凍結標本より8〝の切片を作り，HISTOFINEXitt（ニチレイ）を用い，免疫蛍光法
により施行した．使用した抗体はaFGF，bFGFはpurifiedhuman recombinant aFGF及びbFGFを，
HSPGについてはBovineoriginの各々モノクロナー
ル抗体を使用した．抗体の希釈倍率はそれぞれaFGF（300×），bFGF（400×），HSPG（150×）である．
結果

まずMDX，B−10においてはaFGF，bFGF，HSPG
とも細胞外matrix，及び変性筋線維内に存在し，
bFGFはその他に再生期の筋翰核，血管内皮細胞核，
問質細胞核などの核膜に，そしてaFGF，HSPGは血管内皮細胞にも存在した（図1）．一方，ヒトの神経筋疾患ではbFGFが同様に一部の筋鞠核，血管内皮細胞
核，問質細胞核の核膜に，aFGF，HSPGが血管内皮細胞に存在したのみで，細胞外matrixや変性線維内にはいずれも認められなかった（図2）．
考察

aFGF，bFGFは体内の種々の細胞において再生・分化に影響を与えていると考えられている．骨格筋においてもhJ正和ではこれらFGFはmyoblastの増殖を促すことが知られている．FGFは細胞内で合成され細胞の変性に際しては一旦細胞外に分泌され，extracellular matrixに存在するHSPGとlow af−
finity bindingを生じ活性化される．次にやはり細胞膜に存在するFGFRとhighaffinitybindingを生じ，

−18−

aFGF

bFGF

細胞内に取り込まれ再生斌活作用を現すとされている8）・今岡の結果からMDXではaFGF，bFGF，
HSPGとも主としてextracellular mtarixに存在していることが示された．変性筋線維内で強く染色されたことは，上に述べた横序によってFGFが細胞内に入り活性を現していることが考えられた．これに対してヒトではこれらはいずれも extracellular matrixにも変性放線稚内にも存在していないことが明らかとなった．M工）Ⅹにおける活発な再生がこれらFGFによってもたらされると仮定するならは，ヒトの筋ジス
トロフィーにおいてはFGFあるいはHSPGの欠如が

HSPG

J

bFGF

鼻筋卜増．h﹃

aFGF

笥
上
■
l
ト
ト
⁚
漣
い
い
㌧
■
⁚
1
㌧
匡

聞朝刊封﹂三十l︑

図1B−10及びMDXマウスにおける，aFGF，bFGF，
HSPGの免疫蛍光染色所見．MDXでは変性線錐
は細胞内に強く染色される．

活発な再生を阻害していることが考えられ，進行性を説明しているものと考えられた．一方，bFGFは筋細胞からreleaseされDMD患者の血清中に増加していることが報告されているが，例え分泌されてもHSPGの欠如により筋腫に結合しなければ，血清中に吸収されることが考えられる．また，一方では遊離した bFGF
はfibroblaStを刺激し，fibrosiSを生ずることも考えられる．以上の結果より，MDXマウス及びDMDにおける再生能力，すなわち進行性の違いはヒトにおけるこれらFGF，あるいはHSPGの欠如による可能性が示唆された．

HSPG

aFGF

bFGF

HSPG

図2MDXマウス及びヒト神経筋疾患におけるaFGF，bFGF，HSPGの免疫蛍光染色所見−19−今後検討すべき問題として，human originのHSPGでの検討，TGF−β，IGF等，やはりmyo一
genesisに関係しているといわれている他のFGFによる検討，ヒト筋細胞膜にFGFRが存在するか否かの検討，更に，ヒト筋からのaFGF，bFGF，HSPGなどのbioassayなどが必要である．h dfroでHSPGが欠如している細胞において，外からheparinを投与す

3）01iver L，Raulais D and Vigny M：Acidic
fibroblast growthfactor（aFGF）in develop−
ing normal

and dystrophic（mdx）mousemuscles．Distribution

indegenerating andregenerating mdx myofibers．Growth Fac−
tors7：97−106，1992．

4）GrouxTMuscatelli B，Bassaglia Y，

るとbFGFはFGFRとhighaffinity bindingを生じ，Barritault D，CaruelleJP and GautronJ：

その結果筋細胞のmitogenic reactionを起こし活発な再生が生じることが報告されており8），治療上からも重要な問題を含んでいる．

Proliferating satellite cells express acidic
fibroblast growth factor duringin vitro

myogenesis．DevelBiol142：380−385，1990．
5）Jose−SilverstainJ，Consigli SA，Lyser KM

結and Pault CV：Basic fibroblast growth fac−

言責

1．MDXマウス，B−10マウス及びヒト神経筋疾患に

torin the chick embryo：lmun0localization

おけるaFGF，bFGF，HSPGの局在を免疫蛍光法により検討した．

to striated muscle cellsand their precursors．

2．aFGF，bFGF，HSPGともMDXマウス，B−10マ
ウスでは細胞外マトリックス，変性筋線維内に存在したが，ヒトでは認められなかった．
3．MDXマウスとヒト筋ジストロフィーにおける再生能力の違いはこれらFGFあるいはHSPGの欠如による可能性が示唆された．

6）DiMarioJ，Buffinger S，Yamada S and
Strolman RC：Fibroblast growth factor

J CellBiollO8：2459−2466，1989．

inthe extracellular matrix of dystrophic（mdx）mouse muscle．Science244：688−690，
1989．
7）D

Amore

PA，Brown，Jr．RH，Eu

P−T，

Hoffmann EP，Watanabe H，Arahata：K，文

献

Ishihara T and Folkman J：Elevated basic

1）Burgess WH：and Maciag T：The heparin−

fibroblast growthfactorinthe serum of pa−

binding（fibroblast）growth factor family oftients with Duchenne muscular dystrophy．

PrOtein．Amu Rev Biochem 58：575−606，

Ann Neuro135：362−365．1994；
8）Klagsberg M，Baird A：A dual receptor

1989．

2）Saksela O，Moscatelli D，Sommer A and
Rifkin DB：Endothelialcell−derivedheparan

SulEate binds basic fibroblast growth factor
and protectsit from proteolytic degradation．

J CellBiollO7：743−51，1988．

−20−

SyStemis required for basic fibroblast
growth factor activity．Ce1167：229−231，
1991．

3）サイトカインと筋萎縮
木 南 英 紀＊
研究協力者

辻 仲 利
藤 田 淳

政榊 戎 井也＊＊ 門 田力＊＊
守 人粋は じ めに∞
2筋ジストロフィー症や急性筋壊死のモデルでは，筋細胞の変性・壊死の初期過程に自食作用の誘起とリソ
ゾーム内タンパク分解の完進像がみられることを報告

00
0

してきた1）．しかし，筋崩壊に伴うタンパクの分解のメディエータ一，とくにサイトカインの関与については十分に検討されていない．IL−6は筋蛋白分解の誘導因子として一つの有力候補であり，実際筋萎縮が明ら
かな癌の悪疫質では，筋蛋白分解を誘導することが報告されている2）．我々は2C12C筋管細胞を用いた実験

00nO︵u∈︶朝田渥∞6∞42

ンスジェニックマウスを用いて，IL−6による筋蛋白分解の誘導・筋萎縮とリソソーム蛋白分解系の関連について解析した結果を報告する．

Cて作成した．
活性測定：カテプシンBおよびLの活性はZ−Arg−
Arg−MCA，Z−Phe−Arg−MCAをそれぞれ基質として

TM

TM＋Ab

C

TM

TM＋Ab

図1コントロール（C），IL−6トランスジェニッ
クマウス（TM）および抗−マウスIL−6受容体抗体処理IL−6トランスジェニックマウス（TM＋Ab）における体重（A）および俳腹筋の重量（B）．

材料と方法
トランスジェニックマウス：C57BL／6JLd−IL−6トラ
ンスジェニックマウスはすでに報告されている方法4）
に従い，Hト2Ldプロモーターと融合させたヒトⅠレ
6cDNAを含む3．3キロ塩基対をマウス受精卵に注入し∞で，Ⅰレ6が長寿命のタンパク質の半減期を短くし，それに対応してリソソームカテプシン群の活性増加をもたらすことを明らかにしてきた3）．今回はⅠレ6のトラ

トランスジェニックマウスの筋力テプシンおよびL（B）活性が著明に上昇していた（図2）．この二つのカテプシン活性の増加はプロテアーゼ抗原およびmRNAの上昇を伴っており，生合成の増加によると考えられた．Duchenne型筋ジストロフィー症およびmdxマウ

柳足した
RNA解析：俳腹筋から全mRNAを抽出し，アイソ
トープ標識したラットカテプシンおよびLcDNAをプローブとしてノーザンプロッテイングを行なった．

スでの筋力テプシン活性の著明な増加は主として浸潤
マクロファージに由来することを以前に報告した1）．

免疫組織化学的検査：俳腹筋の凍結切片を作成し，抗ラットカテプシン抗体を用い，ABC法で染色した．

トランスジェニックマウスではコントロールマウスに調べたところ，筋線経の周辺に単球系およびプラズ
マ細胞が散在している所見は見られるが，筋線稚内にはまったく浸潤細胞は見られなかった．免疫組織化学的手法では，図3に示すようにカテプシンBおよびL抗体に陽性の微細な顆粒状の染色像がトランスジェに比べ，体重が重いにもかかわらず，排腹筋の重量は有意に低下していた（図1）．筋重量の減少に関連してニックマウスの筋細胞内に観察できる．しかしコント
ロールマウスでは陽性反応はみられなかった．そこで，

結果＊順天堂大学医学部生化学帯一講座＊＊大阪大学医学部第二外科

そこで，IL−6トランスジェニックマウスでのカテプシン活性の増加がマクロファージ由来かどうか組織学的

次にⅠレ6の受容体に対するモノクロナール抗休を投与して，IL−6によって誘起された筋タンパクの崩壊・萎
−21−

考
察
IL−6トランスジェニックマウスではリンパ節，牌膿，縮が抑制されるかどうかを検討した．生後5週目に大量の抗体（2mg／体重）を静脈注射し，6週目から14週目
までは過2回0．1mg／体重を投与し，16過齢で投与の効果を調べた．図1に示すように，受容体抗体の投与でほぼ完全に，トランスジェニックマウスでみられる休重の増加と筋重量の低下が抑制されている．また，トランスジェニックマウスの俳腹筋で検出されたカテ
プシンBおよびLの活性並びにそれらのmRNAのレベルの著明な増加もほぼ完全に抑制されていた（図2）．
俳腹筋線経にみられた自食作用先進を示唆するカテプ
シンの免疫組織化学的パターンも正常化していた（図3）．

Cathopstnl】

C

TM

TM十Ab

言010Ld研∈≧﹁0≡三〇∈三

音量雇羞扇ゑ

言〇一〇hdn∈︑WO≡V−○∈U︶

丁目

子十千千￣￣∵

図2 コントロール（C），IL−6トランスジェニッ
クマウス（TM）および抗−マウスⅠレ6受容体抗体処理IL−6トランスジェニックマウ
ス汀M＋Ab）俳腹筋におけるカテプシンBおよびカテプシンL十B活性．

胸腺に著明なplasmaeytosisと肺，肝，腎にプラスマ細胞の浸潤をきたす．肝脾の脛大のためコントロール
マウスより体重の増加がみられるが，逆に筋肉は著明な萎縮をおこす．トランスジェニックマウスにおける
ヒトⅠレ6の血清濃度は生後4〜8週で200〜400pg／ml，
12適齢では600pg／mlに達する．今回の結果はIL−6の過剰産生が筋の萎縮をもたらすこと，また萎縮の進行に伴い，俳腹筋の著明なカテプシン活性およびmRNAの増加をひきおこすことを示した．IL−6トラ
ンスジェニックマウス筋におけるカテプシンの免疫組
織化学的染色パターンは，プラスモシドーミオパチーの初期や幼弱mdxマウスでみられるまだマクロファー
ジの浸潤が軽微な委縮筋線経の染色パターンと酷似している．筋線維内のカテプシンの増加は活発なリソ
ソーム蛋白分解系の働きを示すものであり，細胞内に苦境した異常タンパクの除去と共に，障害を受けた筋細胞膜を積極的に除去・修復している像と理解できる．
リソソーム分解系は細胞の容積のコントロールに大きな役割をもっており，障害細胞膜の持続的な処理の結果，筋の萎縮をもたらすと考えられる．
マウスIL−6受容体抗体の投与は上述したすべての
IL−6過剰発現によってもたらされた現象を阻止した．
この実験結果は，ヒトⅠレ6がマウスIL−6受容体に結合してその後のIL−6の情報伝達を阻害したことを示唆する．Ⅰレ6によって誘導されるシグナリングの過程がカテプシンの増加やおそらくオートファゴゾームの形
成と密接な関連があると考えられる．その詳しいメカ
ニズムは今後の課題である．Ⅰレ6トランスジェニック

トランスジェニックマウス
十生理的食塩水

トランスジェニックマウス＋lL6受容体抗体

カテプシンB

カテプシンL

図3 コントロール（C），IL−6トランスジェニックマウス（TM）および抗一マウスIL−6受容体抗体処理IL−6トランスジェニックマウス（TM＋Aも）俳腹筋におけるカテプシンBおよびカテプシンLの免疫組織像．

−22−

マウス筋では，リソソーム蛋白分解系のみならず，エ
ビキチンープロテアソーム蛋白分解系の活性化ももたらす7）．Ⅰレ6による筋萎縮はこれら細胞内の主要な蛋

4）Yamamura：K，Ⅹikntani H，Taknhashi N，

白分解系の活性化の結果によると思われる．IL−6受容体抗体は主要な蛋白分解系の発現の冗進をブロックす

Taga T，Akira S，Kawai K，Fukuchi K，Kumahara Y，Honjo T and Kishimoto T：

るため，著明な効果が得られたのであろう．本研究は筋ジストロフィーを含む種々の筋消耗性疾患に対するIL−6受容体抗体の治療薬としての可能性を示すが，その効果は筋ジストロフィーの筋病像の形成にIL−6かど

Ⅰntroduction of humanの程度関与しているかに依存すると考えられる．
文献1）KominamiE，IiX and Katunuma N：JAc−

in C2C12

myotubes．Clin Sci

89：431−439，

1995．

γ1immunoglobulin

genesinto fertilized mouse eggs・J Biochem
96：357−363，1984．

5）木南英紀，板東祥晃：チオールプロテアーゼ． 蛋
白質分解酵素Ⅰ，生物化学実験法30 （鶴 大典，
船津 勝垢）学会出版センター，1993，pp39−56．
6）Tsujinaka T，EbisuiC，FujitaJ，Kishibuchi

cachexia．J ClinInves89：1681−1684，1992．

M，Morimoto T，Ogawa A，Kasume A，
Ohsugi Y，Kominami E and Monden M：
Muscle undergoes atrophyin association
withincrease oflysosomal cathepsin activity
ininterleukin−6transgenic mouse．Biochem
Biophys Res Commun 207：168−174，1995・
7）Tsujinaka T，FujitaJ，Ebisui C，Yano M，Kominami E，Tanaka K，Katsume A，

3）EbisuiC，TsujinaknT，Morimoto T，Kan X，Ohsugi Y，Shiozaki H and Monden M：

Ilijima S，Yano M，Kominami E，Tanaka
K and Monden M：Interleukin−6 induces

Interleukin−6−reCeptOrantibodyinhibits mus−proteolysis by activating intracellular

te血Sinproteases cathepsins B and L，PrOteaSOme

ClinInvest：in press．

tivation of theintramyofibral autophagic
lysosomal systemin muscular dystrophy．

AmerJ Pathol127：21−26，1987．
2）Strassmann G，Fong M，KenneyJS andJacob CO：Evidence for theinvoIvement ofinterleukin

6

in experimental cancer−23−

cle atrophy and modulates proteolytic sys−
interleukin−6transgenic mice．J

4）共焦点レーザー顕微鏡を使用したヒト疾患培養筋細胞内の動的細胞内カルシウム濃度変化
小 林 高 義＊

研究協力者

目

田

中

宏

明＊

的

細胞内カルシウムは，細胞内の各種情報伝達系の中で重要な役割を果たし，一方その細胞内での異常は，細胞死の引き金になると考えられている．我々は，最近開発された共焦点レーザー顕微鏡を使用して，各種イオンの動的変化を同時に測定することにより，神経筋疾患の病態解明を行うためのシステムの開発を行っ

山

本

雅

彦＊

525nm付近で螢光を測定した．濯流系には，ぺリスタ
ポンプを使用し，低速濯流し，4mMのカリウム法度溶液を標準液として，脱分極利敵として，10，20，50mカリウム濃度溶液及びカフェインによるCICRを測定するために，1，2．5，5，10，20mMのカフェイン標準液を作成し，測定を行った．

ているが，今回は，蛍光カルシウム指示薬を使用して，ヒト培養筋細胞における脱分極刺激による細胞内カル
シウムの変化及びカフェイン負荷によるcalciumin−
duced calcium release（CICR）に関して検討を行ったので報告する．

lt●∩●1I▼
60

〈

40
20

＼ヽ

00
V

80

対象及び方法＼60

対象は，多発筋炎，運動ニューロン疾患など筋細胞
自身に内因性の障聾がないと考えられる筋組織4例を
contorol筋として，低カリウム性周期性四肢麻痺1例，
臨床的に筋萎縮・筋力低下を認めず，ジストロフィン
染色を含む筋病理に特異的変化の認められない一過性

／′＼
40
20
0
0

200

400

600

200

400

600

80010001200140016001800

sec

高CK血症5例，筋緊張性ジストロフィー6例の生検筋の一部を培養に使用した．また，ヒト筋細胞との比較検討のために，ラット筋細胞のcellline（R615）及び不死化ラット神経細胞（CL8C4．7）を使用した．ヒト筋細胞の培養は，以前より報告している如くexplant−
reexplantation法により筋単層培養を作成した．ラット筋細胞及び神経細胞のcelllineはトリプシンで分離培養して用いた．培養液は，DMEM67％，medium

80010001200140016001800

SOC

19923％，FBSl0％，25ng／mlFGF，10ng／ml EGF，

10ug／mlinsulinを添加した培養液を使用，Celllineに関しては10％FBS以外特にgrowth factorの添加していない培養液を使用した．細胞内カルシウム濃度の

図1脱分極刺激による［Ca］iの変化
A．Cotrol（運動ニューロン疾患，47歳，女性）
培養26日目．

測定には，flu0−3を使用し，flu0−3／AMlOuMを37度のhcubator内で30〜120分loadingして使用した．
共焦点顕微鏡は，LSM310（Carl Zeiss社）を使用し，アルゴンイオンレーザーを用い，波長488nmで励起し，B．筋緊張性ジストロフィー（56歳，男性）．
培養25日目．
50mM，20mM，10mMの高カリウム溶液及びlmMの低カリウム溶液を連続的に濯流した時の［Ca］iの変化を示す．

＊東京医科歯科大学医学部神経内科

ー24−

結
果
（1）脱分極刺激による［Ca］iの変化：ヒト培養筋細胞では，COntrOl及びいずれの疾患筋においても，10，20，50mMの脱分極刺激によって，細胞内カルシウム濃度は一過性に上昇し，その後脱分極中であっても急速に低下した．その一過性上昇の程度は，細胞外カリウム10mM Cafhin

A

50mM KCl−−ニ

濃度に比例した（図1）．ラット培養筋細胞においても同様の傾向が認められた．特に低カリウム牲周期性四肢麻痺の培養筋細胞では，50mMの脱分極液中では，一過性の［Ca］iの上昇後急速に低下し元のレベルにもどり，その後の4mMカリウム中では，むしろ［Ca］iが低下する時期が認められた．一方，ラット培養神経細胞では，高カリウム液湾流中は，細胞内のカルシウム
濃度は，高濃度のまま維持され，その後4mM濯流液
に戻した後ゆっくりとカルシウム濃度は低下するが，CaIIoirlO

aPplication

lくCt

上ユ空想ヱ且芸芸i呈
80
60

2：：
0

80

0

200

1l00

600

800

100（〉1200140011iOO

用00

事○○

60

3：：

CaHenM aPplicationi。t．輌上巳望巴且ji呈芸KC−○

10mM Caffein

50mM KCl

−

0

−

200

400

− −

600

−

800

50mM KC1

C．∩帆，川T

0

1伸一∩

200

−

400

−

−

600

800

seC

0

200

400

600

800

100012001400

t6001800●●t

図2 カフェイン負荷及び脱分極刺激による［Ca］iの変化

図3 異なる濃度の連続カフェイン負荷及び脱分極刺激による忙a］iの変化

A．Cotrol（皮膚筋炎，30歳，女性）．
培養30日目．
B．一過性高CX血症（錮歳，男性）．
培養29日目．
C．筋緊張性ジストロフィー（22歳，男性）．
培養45日目．
10mMカフェイン溶液及び50mM高カリウム溶液を連続的に滞流した時の［Ca］iの変化を示
す．A−1，2，3は異なる筋管細胞の反応を示す．

A．Cotrol（ポリニューロバチ一，25歳，女性）．
培養97日目．

−25−

B．一過性高CK血症（34歳，男性）．
培養29日臥C．筋緊張性ジストロフィー（22歳，月蝕）．
培養45日目．
1，2．5，5，10，20mMカフェイン溶液及び50mM
高カリウム溶液を連続的に濯流した時の忙a］iの変化を示す．

元のレベルいもどるには5〜10数分以上の時間を必要とした．

［Ca］iの上昇が認められた．表1に培養ヒト筋細胞におけるカフェイン負荷によって起こるCICRによる（2）カフェイン負荷による細胞内［C8］iの変化：ヒト筋

K：a］iの変化を示す．control筋では，10mMカフェ
インで［Ca］iの上昇が認められる筋管細胞が48．1％に管細胞に対して，10mMカフェイン負荷及び50mMカ
リウム負荷による忙a］iの上昇に関して枚討を行った

認められ，少数ではあるが，2．5〜5mMで，［Ca］iの一過性の上昇を認める筋管細胞が存在した．一方，一過性高CX血症の5症例で79．8％の筋管細胞に10mMが，COntrOl筋，疾患筋共に50mMの脱分極刺激では，急速な［Ca］iの上昇が一般的に観察されるのに対し，10mMカフェイン負荷では，［Ca］iの立ち上がりは，50mM脱分極刺激に比し急峻ではなく，その後プラトー成分が長く続く傾向があった（図2）．しかしながカフェインで［Ca］iの上昇が認められ skinned fiberによるカフェイン拘縮試験の感受性か軽度冗進していた2例で1mMから明らかに反応する筋管細胞が存在した．筋緊張性ジストロフィーの6例では，10mMカ
フェインで［Ca］iの上昇が認められる筋管細胞が63．3

ら，筋緊張性ジストロフィーの6例中4例でカフェイ
ン負荷によって［Ca］iの急峻な立ち上がりを認める筋管細胞が観察され（図2−C．図3−C），MD培養筋の特徴と考えられるかどうか現在更に検討中である．図3に10mMカフェインに反応した筋細胞の低濃度カフェイ％に認められ，2．5nlMから反応する細胞が存在し，コントロールと一過性高CX血症との中間の値を示した．

ンに対する反応性を示す．図3−Aのcontrol筋は，
考蕪及び結論今まで培養ヒト筋細胞の細胞内カルシウム温度の軌5mMから［Ca］iの上昇が認められ，Bの一過性高CK血症では，lmMからはっきりとした［Ca］iの上昇が認められ，カフェイン負荷の時間的経過では，忙a］iの上昇の状態がcontrol筋に比して遷延し，プラトー
波が長く続く傾向が存在した．【Ca］iの上昇の程度は，
カフェインの濃度が上がるにつれ上昇するが，連続負定は，hd0−1などを使用した静的状態での細胞内カル
シウム温度の検討の報告はあるが，高濃度カリウム液の負荷による脱分極利敵あるいはカフェイン負荷によるCICRの検討は行われていない．今回の我々の枚討

荷では20mMでの反応はむしろ弱く，10mMで最大になっていることがわかる．一方，Cの筋緊張性ジスト
ロフィーの筋細胞では10mMカフェインから急速なでは，ヒト培養筋細胞では，脱分極刺激により細胞内
カルシウム濃度が一過性に上昇し，脱分極中であっても速やかに低下し，一方培養神経細胞では，脱分梅中義1培養ヒト筋細胞におけるカフェイン負荷による［Ca］iの変化
1 0 m M カ フ ェイ ン
培 養 日数

1 0 m M カ フ ェ イ ン感 受性 細 胞 の

s k in n e d fib e rに よ る

感 受 性 細 胞 致 （％ ） 低 濃 度 カ フ ェ イ ン に 対 す る 反 応

カ フェ イ ン拘指 試 験

1
一過 性 高 C K 血症

1

29
l
33

78 ．
8

（∩＝3 3 ）

2

22

60

（∩＝1 0 ）3

2 1 ．2 8

9 2．
3（∩三1 ・
3 ）

4

33

90

（∩＝1 0 ）

5．

14

77．
7

（∩＝9 ）m ean

10ty p e lty p e Z

9 ．
6 ±3 ．
7−7 ．5

9．
7 ± 2 ．6

＋

十

十

±

十

十

十

十

十

±

十

76

75

（∩＝8 ）

±

十

十

2

4 5，
62

8 5 ．7（∩＝1 4 ）

±

十

十

3

42

8 5．
7

（∩＝7 ）

十

十

十

4

65

33 ．
3

（∩＝6 ）

550

50（∩＝2 ）

十

十

＋

6

20

50

（∩＝4 ）

m ea nm e an＋59．
7 ± 2 ．0

10

9 ．8 ± 3 ．
4（2 0 ）

1 3 ．0 ± 0 ．1 5

（2 ．5 −1 5 ）

1 2 ．1 ± 1 ．
9

1 0 ± 3 ．7

1 2 ．4 ± 1 ．8

79．
8 ±1 2 ．
8

筋 緊 張 性 ジ ス トロ フ ィ ー 1

コ ン トロ ー ル

＋

2 ．
5

±

6 3．
3 ±2 1 ．
8
1

9 7

2 7 ．3（∩三日 ）

±

＋

2

30

5 7 ．1（∩＝7 ）

十

十

十

3

14

60

（∩＝5 ）±＋

十4 8 ．1 ± 1 8 ．1

−26−

細胞内カルシウム温度はほぼプラトーの状態であった．
このことは，培養筋細胞が神経細胞に比較して，細胞内でカルシウムを再取り込みをするSR系が発達しているためと考えられた．
今回の我々の実験で，ヒト培養筋細胞では，10mM前後のカフェイン負荷でCICRによる一過性の［Ca］iの上昇が認められた．特に一過性高CX血症の培養筋管細胞では，10mMカフェインに対し反応する筋管細胞が多く存在し，低濃度カフェインによるCICRが明らかに認められ，カフェイン感受性の完進している筋管細胞が培養下でも存在していることが明らかにされた．筋緊銀性ジストロフィーの筋管細胞では，カフェインによるCICRの反応はcontrol筋と一過性高CK血myotonin protein kinase（MtPK）が，SRのtermi−
nalcisternaeに強く局在していることを明らかにしており，筋緊張性ジストロフィーにおける，SRの機能異常の有無に関して更に検討をしていく予定である・
また今後筋細胞の各発達段階での，［Ca］iの変化を，
SRの発達とCICRの変化との関係でより詳細に検討すると同時に，今後，神経筋疾患の遺伝子レベルでの異常と，機能異常との関連，更に細胞死との関連の追究に本システムを活用していく予定である．
謝 辞：Skinned fiberによるカフェイン拘縮試験を施行していただいた虎の門病院神経内科高木昭夫先生に深謝いたします．

症の培養筋管細胞との中間の借を示したが，我々は−27−5）筋ジストロフィーおよびミトコンドリア病生検筋における熱ショック蛋白の免疫染色
佐

研究協力者

衣

斐

橋

達＊

は じ め にHeat shock protein（HSP）は熱ショックを含む
種々のストレスにより誘導され，変性蛋白と結合し，その凝集を妨げ，ストレスの防御反応に関与する．さらにHSPはストレス時だけではなく正常の細胞環境のなかでも分子シャペロンとして機能し，蛋白の「折

功＊

井

軒

丸

井

公

軌＊

染色，mOdifiedGomoritrichrome染色およびコハ
ク酸脱水素酵素（SI）H），CytOChrome c oxidase（CCO）活性染色を行い比較した．
結果

卜 筋ジストロフィーにおけるHSPl）HSP70：病的筋において筋形質に限局性およびび
まん性に染色された．すなわち限局性パターンを示しりたたみ」および「会合」に関与している．
HSPはいくつかのHSPファミリーからなり，それぞれの機能は異なり，細胞質・核・ミトコンドリア（mt）など様々に分布する．我々は筋ジストロフィー（PMD）とミトコンドリア病生検筋におけるそれぞれのHSPの局在を免疫染色にて観察し，その病態へのたものはDMDのopaque fiber（図1A），BMDなどに顆粒状，MyDでのringfiberのring・部（図1B）およ

関与について検討した．
対象および方法
対象はPMDはdystrophinopathyとしてDuchenne
塑（DMI））4，DMD保因者6，Becker型（BMD）12，
その他のジストロフィーとして肢帯型（LG）15，顔面肩甲上腕型（FSH）6，rimmed vacuole型遠位塑（DMRV）4，眼筋咽頭塑（OPMD）4，筋緊張性ジス
トロフィー（MyD）21，およびミトコンドリア病として慢性進行性外眼筋麻痺忙PEO）14， MELAS6，
mtDNA多重欠矢を伴う労作性ミオグロビン尿症2，Leber病2例である．生検筋は上腕二頭筋または大腿四頭筋より採取した．対照筋は病的所見を疑い筋病理
学的異常を認めなかった10筋を用いた．
方法は新鮮凍結切片（8〟m厚）を作成し，アセトン
固定後ABC法（Vectastain ABC eliteキット）による免疫組織化学を行った．一次抗体としては細胞質および核に存在するHSPとしてHSP70（Sigma），HSP90，
HSP27（Stress Gene），ubiquitin（Chemicon），ミトコンドリアに存在するHSPとしてmtHSP70（StressGene），およびIISP60（Sigma），SuPerOXide di8−
mutaseとしてMnSOD（BMS），Cu／ZnSOI）（Sigma）の単クローン抗体を用いた．さらに連続切片にてHE＊愛知医科大学第四内科
ー28−

図1筋ジストロフィーにおける各HSPの発現
A，B：HSP70，C：HSP90，D：HSP27，E：
Ubiquitin（×100）

HSP70はDMDでのopaque fiber（A）がHSP70で顆粒状に，MyDにおけるring fiberと萎縮typel fiberが HSP70で濃染した但）．HSP90はBMDにおける再生線経が濃染した．HSP27はLGにおけるlobulated
fiberが濃染した．UbiquitinはI）MRVにおけるrimmed vacuoleが濃染した．

びsarcoplasmic mass，DMRVでのrimmed vacu−と複合体を形成しターゲット蛋白質の機能と細胞内局

0le，ミトコンドリアミオパチーなどでのcytoplasmic
bodyが陽性であった．一方びまん性パターンを示したものはMyDでのtype1線経であり筋形質に一様に染色された（図18）．

在を制御するとされており1），筋形質内での機能蛋白との結合が示唆された．
HSP27はHSP70，HSP90などに比し機能の解明が2）HSP90：PMDを含む病的筋において，一般に再生線経の筋形質にびまん性に染まった（図1C）が，MyDのsarcoplasmic mass，LG のlobulated fiber，
DMRVでのrimmed vacuoleが軽度限局性に陽性であった．
3）HSP27：限局性にはDMD，BMD，その他で細胞質が顆粒状に染まる線経が散見され，LGではlobulated
fiberが顕著であり（図1D），MyDでのsarcoplasmic
mass，DMRVのrimmed vacuoleが陽性であった．
びまん性にはBMDなどのtype2線経，再生線推，DMRVの小径線経が筋形質が一様に染色された．

乏しいが，lobulated fiber，rimmed vacuole（RV），
sarcoplasmic mass，再生線推などで染まり，筋の変性や再生に関与して発現している．
Ubiquitinは標的蛋白に結合し蛋白質分解のシグナ
ルとなるl）が，DMRVのRVを中心に局在し，RVでの変性蛋白の処理に関与しているものと推察される．
次にミトコンドリア病での結果はRRFにmtHSP70とHSP60が，MELASのSSVにmtHSP70が強く発現していた．その発現機序は；1）ミトコンドリアの数
的増加，2）ミトコンドリア内での電子伝達系複合休5）Ubiquitin：I）MRVやOPMDなどでのrimmed
vacuoleが濃染した（図1E）．
2．ミトコンドリア病
ミトコンドリア病では，ミトコンドリアに局在する
ストレス蛋白の発現がより特異的にみられた．
すなわち，mtHSP70はraggted red fiber（RRF）
およびstrong・1y SDH reactive vessel（SSV）に特異的に発現していた（図2A，E），HSP60はRRFに特異的に発現していた（図2C）がSSVでは対照筋の血管との差異はみられなかった．mtHSP70とHSP60のRRF
への発現様式は同じであり，CCO陰性線経に比し，SDH陽性線維により対応していた．その他のHSPはRRFで若干陽性であったがミトコンドリアHSP ほ
ど明瞭ではなかった．SOI）ではMnSODはRRFおよびSSVに特異的に発現し（図2D，G）Cu／ZnSODは非RRFの細胞質にも発現していたがRRFでより増強し
ていた．
考

案

PMDを含む病的筋では各HSPが病的構造に対し様々に発現していた．すなわちHSP70はopaque fi−
berやその他のジストロフィーにおける一部の筋線経，

図2rlng・fiber，SarCOPlasmic mass，rimmed vacu−
01e，MyDのtype1線経などに発現していた．HSP70
は細胞質に存在し分子シャペロンとして蛋白の折りた
たみや会合を補助し，蛋白の合成，膜透過，分解に関ミトコンドリア病におけるragged−redfiber（RRF）， StrOngly SI〕H reactive
vesSels（SSV）におけるmtHSP70，HSP70
およびMnSODの局在
A，E：mtHSP70，C：HSP60，

与するとされている1）が，病的筋での変性した筋構成蛋白の修復・処理に関与して発現していることが今回

D，G：MnSOD，B，F，：SDH（×100）

慢性進行性外眼筋麻埠（CPEO：A−D）では
RRFはSDH 高活性であり，mtHSP70，
HSP60，MIISODで濃染する．
MELAS（F，H）での SSV は mtHSP70，
MnSODで濃染するが，その他の疾患ではCPEO（E，G）を含め血管は染まらない．

の検討で明らかになった．MyDでは萎縮したtype1
線経にHSP70が陽性であったことは，ストレス状態のより強い反映であると思われた．
HSP90は再生筋やlobulated fiber，SarCOplasmic
massなどに発現していた．HSP90は様々な桟能蛋白29−

の会合障害，3）フリーラジカルの増加によるストレス状態などを反映している可能性が考えられた．
すなわちミトコンドリア内にはHSP60とmtHSP70が存在し，mtHSP70は分子シャペロンとして核由来のミトコンドリア蛋白のミトコンドリア膜透過に関与
し1），HSP60はミトコンドリア内での折りたたみおよび会合に関与する1）．ミトコンドリア病では，とくにRRFおよびSSVにおいて，mtDNA異常に伴いmtDNA由来の電子伝達系蛋白の合成障書が推察される．故に核由来の蛋白の過剰状態となり，mtDNA由来の蛋白と会合できずにHSP60やmtHSP70が結合した状態で存在し，苔墳するものと考えられる．他方
mt内ではフリーラジカルが増加し2），酸化ストレスによるmt蛋白の障害も加味し，HSP60，mtHSP70がさらに増加する可能性が考えられる．すなわち今回のミトコンドリア病の生検筋におけるmt関連HSPの発現は，上記の1）mtの増加に加え，2）3）の可能性も十分に考えられた．またRRF においてはその他のHSPも軽度に染まるものがあったか，mt外の筋形質にも異常が一部波及していることが推察された．またSOD

ま と め
筋ジストロフィーおよびミトコンドリア（mt）病の生検筋において各熟ショック蛋白（HSP）の免疫染色を行った．
ジストロフィー筋では筋の変性・再生に関与し，病的構造物に各HSPの異なった発現がみられた．ミトコ
ンドリア病ではRRFおよびSSVにmtHSPやMnSODが発現しており，ミトコンドリア異常を反映していた．
以上 HSPは骨格筋の様々な病態と関連して，各HSPが特徴をもって発現し，HSPの免疫染色は筋病
理学的に病態把握の指標■としての有用性が示唆された．
文献1）伊藤維昭，川崎泰生ほか：ストレス蛋白質の機能と構造．ストレス蛋白質一基礎と臨床（永田和宏編），中外医学社，東京，1994，pp49−175．
2）小川紀雄：フリーラジカルと神経細胞降誓：神経内科42：195−202，1995．
3）Weisiger RA and FridovichI：Superoxide

もミトコンドリアに局在するMnSOI）3）がRRF，SSVに濃染し，ミトコンドリアの増加およびsuperoxideの増加を反映しているものと推察された．

−30−

dismutase，Organelle specificity．J BioI
Chem248：3582−3592，1973．

、、、

トコンドリア脳筋症の生検筋におけるsuperoxide dismutase（SOD）および
nitric oxide synthase（NOS）の局在
庄

司

進

一＊

研究協力者 大 越 敦 夫＊

は じ め にミトコンドリア電子伝達系酵素では，ミトコンド
リアの酸素消費とともに活性酸素の生成が行われ1），細胞内で生成する活性酸素の約15％を生成するといわれている．その主な発生部位は複合体Ⅰおよび複合体
Ⅲとされている2）3）．superoxide dismutaSe（以下SOD）は（superoxide，021を消去する酵素であり，フリーラジカルからの細胞保護作用を有する4）．soDの中でCu／Zn−SODは細胞質に存在するが，Mn−SODはミトコンドリアに分布する5）．異常ミトコンドリアの増加がみられるミトコンドリア脳筋症生検筋におけるMn−SODの分布の変化の有無を検討し，ミトコンドリ
ア脳筋症の骨格筋と活性酸素との関連を考察する．
一方，nitric oxide（NO）は，nitric oxide synthase（NOS）によりレアルギニンより生成され，多彩な分
布と生理作用を示すことで最近注目されている6）．骨格筋内にもneuronal−tyPe NOS（nNOS）が存在し，
おもにtype2線経の筋鞠膜に分布し，骨格筋の弛緩作用に関連すると報告されている7）．病的状態の骨格筋での局在を検討した報告は，わずかにDuchenne型筋
ジストロフィー症にてdystro−Phinと関連してsarcolemmaにおける欠損が報告されているのみである8）．NOもsuperoxideと反応し，細胞障宇佐を有するperoxynitrite（ONOO￣）を生じることから9）ミトコ
ンドリア脳筋症の筋障書にNOが何らか関連すると予想される．今回，ミトコンドリア脳筋症の筋病変とNOの関与を検討するため，ミトコンドリア脳筋症の生検筋におけるnNOSの分布をnNOS抗体を用いた免疫組織とNADPH−dia−phorase染色により酵素化学的に検討した．
対象および方法
1．Mn−SODの分布
対象は，ミトコンドリア脳筋症7例（MELAS3例，＊筑波大学臨床医学系神経内科

CPEO4例）と，対照として多発筋炎6例，筋ジストロ
フィー4例，軽微変化例4例の生検筋を用いた．
方法は，それぞれの10〝m凍結切片を用い，一次抗体としてanti−Mn−SOD（polyclonal antibody；TheBindingSite社，1／400希釈，mOnOClonal antibody；
Bender社，1／50希釈）を反応後，ABC法，DAB反応
にて発色し，SOD陽性筋線経の分布を観察した．また，連続切片にてGomori−trichrome変法を施行した．
2．nNOSの分布
対象は，ミトコンドリア脳筋症4例（MELASl例，
CPEO3例）と，対照として多発筋炎7例，筋緊張性ジストロフィー1例，ネマリンミオパチー1例，進行性脊髄性筋萎縮症（SPMA）2例，軽微変化例2例を用いた．
（1）NOS免疫染色：生検筋凍結切片を用い，一次抗体として抗nNOS抗体（polycIonal antiTbNOS anti−
body；Transduction Labo）を反応後，ABC法，
DAB染色にて免疫組織染色を施行した．
（2）NADPH−diaphorase組織化学染色：2％para−
formaldehydeにて10分間反応後，0．1mg／ml
nitroblue tetrazolium，1mg／ml NADPH，0．3％
Triton X−100，37℃，1時間反応した．
結果

1．Mn−SODの分布
対照例の通常の筋線経では，Mn−SOD免疫組織化学
染色にてほとんど染色性を有しないか，あるいはtype
1線経の筋翰膜下や筋線推内にごく薄く染色されるのみであった．MELASおよびCPEOにおけるragged−
red fiberでは，Mn−SODの免疫組織化学染色は筋鞠
膜下に濃染し，内部は縞状，顆粒状に染色され，変性崩壊した筋線経ではびまん性に濃染した（図1）．Mn−
SOD陽性線経は，ragged−red fiberとほぼ一致した分布および形態をとった（図2）．
2．nNOSの分布（1）NOS免疫染色：対照例の通常の筋線経では，
nNOS免疫組織化学染色はtype2線経の筋翰膜に強く，−31−

図1Mn−SOD免疫染色
A．ミトコンドリア脳筋症（MELAS）生検筋では，
筋鞠膜下周囲および筋線維内に網状に強陽性に染色される線経が散在する（×80）．
B．ミトコンドリア脳筋症（MELAS）生検筋の中には，一個の筋線維全体にびまん性に陽性に染色される症例もある（×80）．
C．対照例（軽微変化例）では，Mn−SODは筋鞠
膜下および筋線維内にわずかに染色される程度
である．

図2

ミトコンドリア脳筋症例のMn−SOD免疫染色とGomori−trichrome変法染色の関連．
A．CPEO症例生検筋にて，ragged−red fiberに一致して筋報膜下，筋線維内に強陽性に染色される（×40）．
B．Aの連銭切片のGomori−trichrome変法染色（×40）．

C．MELAS症例生検筋にて，raggedてed fiberに一致して筋鞠膜下，筋線維内に強陽性に染色される（×80）．
D．Cの連続切片のGomori−trichrome変法染色（×80）．

図3 ミトコンドリア脳筋症例（CPEO）における各種染
色間の関連
A．nNOS免疫染色：nNOS免疫組織化学染色は通常の筋線経では，type2線経の筋鞠膜に強く，
type1線経の筋鞠膜に弱い染色性を有する・
Ragged−redfiberでは，通常線経に此し，筋鞠
膜および筋鞠膜下に強い染色性を有し，一部の筋
線経では筋線推内にびまん性に認められるパターンもみられ，ragged−red fiberの形態に一致した所見であった（×66）．
B．NADPH−diaphorase組織化学染色：通常の筋線雑では，type 2線経の筋鞠膜に漫染し，type1線経では筋鞠膜および筋線維内に網状に弱く染色された．Ragged−red fiberでは，筋鞠
膜に強い染色性を有した．Raggedてed fiberはtype1線維にもかかわらずtype2線経と同様あるいはより強い染色性が認められた．
C．：Mn−SOD免疫染色，D：Gomori−trichrome
変法染色，E：ATPase染色（pHll．1）（2）NADPH−diaphorase組織化学染色：通常の筋線経では，NADPH−diaphorase組織化学染色にてtype
2線経の筋鞘膜に濃染し，type1線経では筋鞠膜および筋線維内に網状に弱く染色された．CPEOおよびtype1線経で筋熊鷹に弱く染色された．CPEOおよびMELAS例のragged−redfiberでは，通常線経に比し，筋鞠膜および筋鞠膜下に強い染色性を有し，一部の筋
線経では筋線維内にびまん性に認められるパターンも

MELAS例のragged−redfiberでは，nNOSと同様に筋鞠膜のみならず筋鞘膜下にも染色性を有した．
Ragged−redfiberはtype1線維にもかかわらずtype
2線経と同様あるいはより強い染色性が認められた（国みられ，raggedてed fiberの形態に一致した所見であった（図3）．

3）．

−32−

考

察

ミトコンドリア脳筋症生検筋では，ragged−red fi−
berにおいてMn−SODおよびnNOS免疫染色，NADPH−diaphorase染色ともに強陽性に染色され，ragged−redfiberにほぼ一致した分布，形態をと，・，た．
Ragged−red fiberにおけるMnTSOD陽性線経の意
義として次の2つの可能性が考えられる．
（1）Mn−SODの分布はミトコンドリアの量的変化に左右され，ragged−redfiber内ではミトコンドリアが豊富に存在することより単なる量的な変化を反映している．
（2）ミトコンドリア脳筋症のragged−red fiberでは，異常なミトコンドリアが集族していることより多量の4．Ragged−red fiber内でMn−SOD，nNOSともに強陽性に染色されることは，これらが豊富に存在することを示唆し，ragged−redfiber内での異常なミトコ
ンドリアで産生される活性酸素を消去する作用やNO産生を示唆し，何らかの酸化ストレスに関与している可能性が考えられる．
文1）Boveris A and Chance】】：The mitochondrial
generation of hydrogen peroxide．Generalproperties and effect of hyperbaric oxygen・BiochemJ l訓：707−716，1973．
2）TurrensJF，Alexander A and

活性酸素が生成されることが予想される．その結果，活性酸素の消去のためMn−SODが多量に誘導され，
Mn−SODが強陽性に染色される．

AL：Ubisemiquinoneis

いずれにせよragged−red fiberにMn−SODが多量に分布し，その作用として豊富なミトコンドリアにより産生される活性酸素の消去に役立っている可能性が237：408−414，1985．

るを得ない．SuperoxideとNOの作用との関連に閲し，
次のような二つの相反する機序が推定されている．一

Lehninger

the electron donor

for superoxide formation by complex：Ⅲofheart mitochondria．Arch Biochem Biophys
3）BeyerRE：An analysis of the role of coen−2；yme Qinfree radicalgeneration and as anantioxidant．Biochem Cell Bio170：390−403．

考えられる．
本研究では，ragged−red fiberにNOSが豊富に存在することを示したが，NOSと骨格筋の関連は前述したようにこれまでの知見が十分でなく，ragged−redfiberにおけるnNOS陽性線経の意義は不明と言わざ

献

1992．

4）McCordJM and FridovichI：Superoxide
dismutase：an enzymic function forerythrocuprein（hemocuprein）．J BioI Chem
244：6049−6055，1969．

5）SlotJW，Geu2：e HJ，Freeman BA and Crapo

方はsuperoxideと結合することにより活性酸素を不活化することによる細胞保護的作用であり，他方はsuperoxideと反応し，強力な細胞障害性を有する
peroxynitrite（ONOO，）の産生による細胞障害的作用

JD：Intracellularlocalization of the copper−

である9）．RagLgedてedfiberにNOSおよびMn−SODが豊富に存在することは，SuPerOXideとNOの反応が容易に起こることが推定され これらの2つの作用のどちらかに関与している可能性がある．

6）Knowles RG and Moncada S：Nitric oxide

ま

と

め

zinc and manganese superoxide dismutases
in ratliver parenchymal cells．LabInvest
55：363−371，1986．

synthasesin mammals．BiochemJ

298：249−258，1994．

7）Ⅹob2：ik L，Reid MB，Bredt DS and Stamler
JS：Nitric oxidein skeletal muscle．Nature

1．ミトコンドリア脳筋症生検筋におけるSODの免372：546−548，1994．

疫組績化学染色では，Mn−SODは筋鞠膜下周囲に強く染色され，筋線超内に網状，顆粒状，びまん性，斑状に染色された．Mn−SOD陽性線経の分布はragged−
red f沌erにほほ一致していた．また，程度の軽い

8）BrenmanJE，Chao DS，Ⅹia H，Aldape K

ragged−redfiberにも陽性に染色され，ミトコンドリ
ア脳筋症の診断に有用であった．

muscular dystrophy．Ce1182：743−752，1995．

and Bredt DS：Nitric oxide synthase com−
plexed with dystrophin and absent from
Skeletal muscle sarcolemma in Duchenne9）Lipton SA，Choi YB，Pan ZH，Lei SZ，

2．通常の筋線経ではnNOSは，type2線経の筋鞘膜に存在することを免疫組織化学およびNADPH−

Chen HSV，Sucher NJ，Loscalzo J，diaphorase染色にて確認した．
3．Ragged−red fiberにおけるnNOS免疫組織化学
染色は筋鞠膜および筋鞠旗下周囲に強い染色性を有し，

nism for the neuroprotective and neuro−

NADPII−diaphorase組織化学染色でも同様であった．

1993．

ー33−

SingelDJ and Stamler・JS：A redox−based mecha−
destructive effects of nitric oxide and related

nitroso−COmPOunds．Nature

364：626−632，

7）筋ジストロフィー生検筋における細胞死関連蛋白の免疫組織学的観察
佐

研究協力者

衣

斐

橋

遠雷

は じ め に筋ジストロフィー（PMD）は核遺伝子異常により筋構築蛋白や細胞膜またその他乱修復，エネルギー産生，情報伝達などが障害され，筋の変性・壊死をきたす疾患群である．さて近年注目されている細胞死（programcelldeath：apOptOSis）は外的要因などによる壊死（necrosis）とは異なり，細胞核枚能の破壊に伴う細胞・組織・個体の「生」を維持するための死とされる1）・我々は各種のPMD生検筋において，疾患の病態へ細胞死の機構が関与するかに閑し，免疫染色によるFas，Bcト2などの細胞死関連蛋白の筋細胞への発現と筋細胞核の超微形態的検討を行なった．
対象および方法
対象のMDはdystrophinopathyとしてDuchenne塑（DMD）4例，DMD保因者（DMD−C）6例，Becker
塑（BMD）10例，他のPMDとして肢帯型（LG）11例，
顔面・扁甲・上腕型（FSH）7軌 rimmed vacuole塾
遠位型（DMRV）5例，眼・咽頭・遠位塑4例，筋緊張型（MyD）26例，ミオパチーはミトコンドリア病18例である．対照筋としては病的所見を疑い筋病理上異常を認めなかった生検10筋を用いた．生検部位は上腕二頭筋および一部は大腿四頭筋の外側頭を用い，その凍
結連続切片にて以下の検討を行なった．
方法は細胞死関連蛋白に対する抗体として抗Fas（MBL；IgGl，UB2 clone），抗Fas（MBL；IgM，CHll clone）（MBL），抗Bc1−2（Dako；Clone124およびNovocastra；Clone Bcl一針100／D5），抗p53（Dako；Clone D0−7），抗Ⅹi−67（Dako；抗家兎
polyclonal抗体），抗myotonin protein kinase（MtPX，抗家兎polyclonal抗体2））を用い，ABC法にて免疫染色を行ない観察した．また連続切片にてGomoritrichrome変法染色などの一般染色に加え，
NAI）H−TR，コハク酸脱水素酵素反応但DH）および
routine ATPase染色，他にdystrophin（dys．；
Novocastra），ミオシン重鎖（MyHC）のneonatal，＊愛知医科大学第四内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

功＊

井

玲＊

荒

畑

喜

一綿

developmentalの各isoforms（Novocastra）を用いた免疫染色を行ない比較検討した．
また透過型電掛こよる形態観察および定量的解析は，オスミウム固定→酢酸鉛・オスミウム二重染色を行な
い，各PMD型につき30佃以上の筋核につき倍率6000
倍の写真をほぼランダムな核の中央部にて撮影し，イメージリーダーにてMacintoshに取り込みNIHイメー
ジにより核質内の高電子密度領域の観察と量的な定量化を行なった．
結果仏）免疫染色結果
1．Fas（IgGl）
正常対照筋では加齢筋を含めFas陽性線経はなかった．Dystrophinopathies（DMD，I）MD−C，BMD）
では陽性線維はけpe2b，2e線経に対応し，とくにDMDでのopaquefibersやCa2十染色陽性線経と関連しなかった（図1A）．またDMDl〕筋ではdys．陰性
線柾とよく対応した（図1B）．他のPMDではDMRV
では高頻度にtype2小径線経が陽性で，空胞内容は一部陽性であったが空胞壁は陰性であり，FSH では
Fas陽性線錐の出現頻度が極少なく，MyDでは高頻度に陽性（図1C）であり，中心核を有するtype2線経に多くみられた．
2．Fas（IgM）
正常対照筋および病的筋ともtype2線経の筋形質内にび浸性に染色された（図1D，E）．
3．Bcト2対照筋はATPase染色と比較して大部分のtype2b＞
飴と極一部のtype1線経の形質に淡くび漫性に染色された．また陽性線経の核膜はより強く染色されたが，陰性線柾の核はほぼ陰性であった（図2A）．PMDではDMD（図28）と一部LGでは筋線経での陽性率が低く，これらではATPase染色にて2b deficiency，2C級維増加を認めた．DMD−Cではdys．陰性線経はBc1−2陰性の2C線維（再生線維）であった（図2C）．DMRVでは空胞を有する小径線経，MyDではpyknotic nu−
Clearclumpを示す極小径線掛こ陽性であり，他の筋−34−

疾患でも小径繊維に陽性であった．しかし，MyHC
dev，neOで染まる鮎（再生）線経は温染しなかった．その他Sarcoplasmicmassは陰性，OPaque＆ringfi−
bersは濃染しなかった．またミトコンドリア筋症ではtype2線経のraggedredfiberSのミトコンドリア蓄
積部分が陽性であった．
4．p53

正常筋および病的筋とも全て陰性であった．
5．Xト67正常筋に発現はなく，病的筋では再生筋に発現し，LGでのlobulated fiberが染色された（図3A−D）．
6．MtPK
今回使用した抗体では細胞膜・筋小脇体膜がよく染色されたが，核や形質内も一部染色された．また再生

図1筋ジストロフィー生検筋におけるFas抗原の免疫染色A一℃：抗FasIgGl抗体，D，E：抗Fas
IgM抗休，F：ATPasepH4．5（×100）
抗FasIgGl抗体では病的筋（A：DMD，
B：DMD−C，C：MyI））でのtype2線経に，抗FasIgM抗体では対照筋（D）
DMD筋（E）ともtype2線維形質に陽性である．

筋やDMDのopaquefiberの細胞質やringfiberがより濃染されたが（図3［，F），疾患特異性はなかった．
（B）透過電顆による筋核の超徴形態変化
1．核質の検討
正常筋ではほぼ核辺縁に比較的均一な幅で淡黒色のクロマチンが局在し，核内部は微細顛粒状の所見を示し，核小体は2種のRNAよりなる整然とした核小体糸済惑．∵言聖≠級配瀾邁級㈲無明標芸摺惑鞋■藩照義

国3筋ジストロフィー生検筋におけるKi−67とMtPX（×100）

A−D：（Ki−67），E，F：（MtPX）
Ki−67はジストロフィー筋（A：DMD，

図2

B：BMD，C：DMD−C）などでは再生筋に，LGではlobulated fiber に陽性であった（D）．MtPXは筋形質，核などが染色されたがI）MD のopaque fiber（E），MyDのring fiber（F）などが強陽性であった．

筋ジストロフィー生検筋におけるBcト2（×100）

Bc1−2は対照筋ではtype2b線維優位に染まり（A），DMD筋では陽性線経は少な
く，DMD一℃ではdys．陰性線経はBc1−2
陰性であることか多い．
−35−

が存在した．DMDやFSHはほぼ正常の核質であったが，DMDでは核サイズがやや大きくまたより淡明で
vesicular nucleiの所見を示した．
DMRVでは一部の核膜は蚊袋化し，また辺縁のクロマチンは追給・増加し，核膜に接したクロマチン内には小空胞変化がしばしは観察された．MyDでは核サイズが全体に小さく，クロマチンや核質は濃縮化・断片化・散在し，核膜はより飯豊化し，核小休糸もより黒く不整化しているものが多かった．以上の結果はDMRVやMyDでは細胞死に関連した筋核変化がより強い可能性が示唆された．
2．核質内高電子密度領域の定量化（蓑）現時点では各疾患でのカウント核数は不十分で有意な結果は見出せなかったが，DMRVとMyDなど3疾患は核60個以上での検討で信頼性がより高いと考えているものの，分散幅も大きく更に核数を増して結論を出すべきと考えている．
考察および結語
細胞死または関連抑制関連蛋白としては，前者ではFas抗原が後者ではBcl（B celllymphoma／leu−kemiaト2が注目されている．さてFas抗原は細胞膜に局在するTNF receptor familyに属する糖蛋白であり，抗Fas抗体などFas抗原の刺激にて細胞死が誘導される3）．そして抗Fas抗休による細胞死誘導はⅠがタイプではなくIgMタイプで観察されるという4）．
今回はこれら2種の抗Fas単クローン抗体についての染色結果は異なっており，FasIgGl抗体は病的筋のtype2線経の筋細胞膜を中心に発現し，IgM抗体は対照筋も含む全type2線経の筋形質に染まった．これはIgM抗休が，より非特異的にFas関連抗原を認識する
義 筋核の透過電顕写真における定量解析
核サイズおよびクロマチンを中心とした
dark areaの百分率および，50％以上のdark areaを示す核の百分率を示した．

核のサイズLlml

1
0
4
3
7
一
0
8
0
5
2

引用文献
1）丸山征郎：アポトーシスー「生」のための「死」．
最新医学伯：1079，1994．
2）Koga R，Nakao Y，et al：Decreased myo−tonin−prOtein

4kinasein the skeletal and5

4 8 7 − つ J 8
2 8 9 0
43
フL1
46Z
l

PM／DM
IBM
BSMA

47．9± 9．630．5±12．4
43．6±13．1
47．3± 8．946．9± 8．943．6± 8．2
43．0± 9．7
32．0± 6．4
47．0±11．6
53．1± 6．845．0± 9．735．7±12．5

7 ・
3

CPEO★

8一．⊃16107−15399
8320377■12923
335436425345

MyD★

MyC

±±±±±±±±±±±±
230686393418
14490．7．
5．3．
3．
9．
52．
990982969891
211

DMD
BMD
LG
FSH
DMRV

411223412211

Control★

50％＜％DarkArea DarkArea

一方，筋線維別の選択性の発現（陽性）は筋線維内の代謝の相違と密接に関連していることが示唆された．しかしFaSIgGl抗体は，一部筋線維別陽性度の相違と同時に病的筋のPMDではとくにMyDとDMRVにて
type2線経に細胞膜優位に局在し，DMDl〕のdys．
陰性線経で陽性でもあり，明らかに多彩な病態と関連していることは事実であろう．
次にBeト2は細胞死抑制蛋白としてミトコンドリア
内膜や核膜や小胞体に存在し，リンパ系および神経系
組撥での発現が顕著であるとされている5）．本研究では骨格筋には正常筋を含めBcト2が陽性であり，とくにtype2b線推優位に細胞質に発現し，tyPel／2C級経ではほとんど発現していなかったが，その意義は現時点では不明であった．
p53は細胞死を誘導する癌抑制遺伝子であるが，骨格筋でのp53遺伝子産物は免疫染色では検出されなかった．またKi−67は細胞増殖に関する蛋白であり6），
本研究では再生線経に発現していることが示された．
MtPXはMyD病因遺伝子解析にて発見された蛋白であり，横能は現在不明である．MyDでは臨床的に早期老化徴候も見られMtPXと細胞死との閑適も推察されたが，本研究で使用した抗体での染色結果では主に細胞膜により強く陽性であったが，一般的に再生筋
でより温染していたもののMyDでの特異的所見は観察されなかった．
最後に筋細胞核の超微形態変化については，光顕的にMyDでしばしば観察される虎斑様核は，かつては本疾患での神経原性変化を示唆する所見とも考えられたが，それに対応した核の乱隠クロマチンの温指と偏在，核膜の凸凹分岐はMyDとDMRVにより強かった．これは細胞死での初期変化所見とも共通し，これら2疾患では細胞死の機構が骨格筋の病態に関与していることが考えられた．
以上 各種病因に基づく筋ジストロフィー生検筋の一部においては，疾患別の定常性ある所見は必ずしも明らかにできなかったが，壊死とは別に一部の細胞死・抑制関連因子蛋白の発現（陽性所見）がある．しかしその発現が細胞死と関連して発現しているのか，または他の機能をもって発現しているのかは検討の余地があるものと考えた．

cardial musclesin myotonic dystrophy．

★核数＞50，写真倍率 x6000

BiochemiBiophys Res Comm202：577，1994．

−36−

3）Yonehara S，Ishii A，et al：A cell−killingmonoclonal antibody（anti−Fas）to a cellsurface antigen co−downregulatedwith thereceptor of tumor necrosis factor．J Exp

Med169：1747，1989．
4）小林信之：アポトーシス誘導法．生物学的因子．
ウイルス，Fas抗原．最新アポトーシス実験法，（辻本賛美ほか）軌 羊土社，東京，1995，pl12．
5）奥山隆造，高橋 玲ほか：アポトーシスと痛遺伝子．最新医学伯：1096，1994．
6）Key G，PetersenJL，et al：New antiserum
against Ki−67 antigen suitable for double
immunostaining of paraffin wax sections．J
Clin Patho146：1080，1993．

−37−8）筋細胞障害におけるFas抗原とApoptosis
杉

他事
♯

ガピ

慶

＊

藤田

♯

伊本

＊

靖美

明

林野

蝉
蝉

的

近年，neerOSisとは異なる細胞死の形態として
apOptOSisが提唱され，その筋細胞での存在も電顕的に観察されたとする報告がある．さらにapoptosis関連抗原として膜結合蛋白であるFas抗原が発見され，筋細胞における発現も報告されている．本抗原に関して多くの研究がなされているが，筋組織における発現に関して詳細な検討はなされていない．我々は，種々の疾患筋での組織障害過程におけるapOptOSisの関与をさぐるため，筋組掛こおける本抗原の発現および性状と機能について，免疫組織化学法，免疫沈降法，
TUNEL法，RT−PCR法を用いて検討した．
対
象①免疫組織化学法；筋緊張性ジストロフィー18例，Duchenne型筋ジストロフィー4例，Becker型筋ジス
トロフィー4例，顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー4例，多発筋炎10例，筋萎縮性側索硬化症4例，脊髄性筋萎縮症4例，正常対照例5例の計53例．
②免疫沈降法；健常成人男子3例（31−36歳）の末梢血から分離した有核血球成分．52歳，Myotonic dys−
trophy男子剖検例の筋組織3g．
⑧TUNEL法；免疫組織化学染色で筋細胞FaS抗原の発現頻度の高かったMyD3例，DMD2例，BMD3例，
PM4例，ALSl例，SMA2例，非神経筋疾患2例の生検筋．
④筋組織RT−PCR；健常成人男子3例（31〜36歳）の末
梢血から分離した有核血球成分．各疾患筋組織と正常
対照筋組織．
方法①免疫組織化学法；生検筋組織を急速凍結し，クリオ
スタットで厚さ8〟mの切片を作製．抗Fas一IgG抗体（UB2，MBL杜）を反応させ，ABC法を用い（Vector＊名古屋大学医療技輪短期大学缶＊＊名古屋大学神経内科＊＊＊福井医科大学第二内科

公

小高

綽

晃学元

父

目

飼勇江

犬道祖

研究協力者

村

杜），DABで発色した．
②免疫沈降法；分離有核血球成分を，IFN−γにて24時間培養後，細胞膜成分に調整．筋組織は，ホモジ
ネート後，細胞膜成分に調整．両試料ともTriton一Ⅹに溶解後，抗Fas−IgG抗体（UB2），Protein A−
agaroseにて免疫沈降し，SDS−PAGEで分離後，ニトロセルロースベーパーにトランスファーし，
抗Fas−IgG抗体（ZB4）にて免疫染色し，ECLにて発色した．
⑧TUNEL法；生検筋を急速凍結後，厚さ8〝mの切片を作製，terminal deoxynucleotidyl transferase
OldT）を用いてdigoxigenin（DIG）−nuCleotideを反応させた後，PerOXidase標識の抗I）IG抗体を用い，
DABで発色した．陽性コントロールとして DNaseI
処理した切片を同時に作製した．また，各症例とも連続切片で，抗Fas抗体（UB2）を用いた免疫組織化学染色を行った．
④筋組織RTl⊃CR；分髄有核血球成分はConA，IL−2，
PMA，ionomycinで培養後，各筋組織と同様に
TRIヱ01でtotalRNAを抽出し，Fasligand，β−aC−tinのprimerを用いてRT−PCRを行った．
結果①免疫組織化学法；正常対照例では，筋細胞は抗Fas抗体で染色されなかった．疾患筋ではFaS陽性の線経が，萎縮線経にも，肥大線柾にも存在し，SarC0−
1emmaを中心に，一部のものは胞体内も染色された（図1）．陽性線維数の金筋線維数に占める割合（％）は，
MyDlO．0±14．1，DMD17．0±12．6，BMD15．8±
7．7，FSHl．4±1．2，PMlO．4±13．6，ALS5．1±4．
6，SMA12．4±12．1であり，疾患間に有意差はな
かった．H．E．標本での筋障害の程度と筋細胞のFas
陽性率（％）との関連は，軽度群1．79，中等度群7．91，
重度群17．鎚であり，筋障磐の程度が強いほど，筋細胞のFaS陽性率は増した（図2）．Fas陽性線経におけるtypeIIfiberの割合（％）は，上記疾患順に88．3±
26．1，81．9±17．9，96．2±4．0，85．0±10．8，96．0±−38−

8・0，91・1±4・1，96．2±3．9であり，各疾患間でほぼ一定であった．
⑧免疫沈降法；IFN−γ存在下での培養有核血球成分
からの試料，筋組織試料ともに45kDaの明瞭なバンドが得られた（図3）．
④TUNEL法；いずれの症例においても，免疫組織化学
染色にてFas抗原陽性の筋線掛こおいてもTUNEL染
色でその核は染色されなかった（図1）．
⑤筋組織RT−PCR；正常対照筋組乳各疾患筋組掛、ずれからもFasligandのmRNAは検出されなかった
（図4）．
軽度群

中等度群

（12）

重度群

（17）

（19）

図2 組織障害度別，Fas陽性線維頻度
ノ
・

tJ

ノ二

王

←1

払澄

図3

Fasantigenimmunoprecipitation
左；IFN一γ，別時間培養有核血球
右；MyD剖検筋組織
L ContBMD MyDI，M SMA
Fβ

Fβ

Fβ

Fβ

Fβ

Fβ

Fasligamd一十β・aCtin −●ト

図1生検筋H・E．染色，Fas免疫染色TUNEL染色
上段より・DMD，BMD，MyD，PM，ALS，
SMA症例
左列；H．E．染色 中列；Fas染色右列；TUNEL染色

図4

ー39−

FasligandRT−PCR
左より・ConA，Ⅰレ2，PMA，ionomycin培養
有核血球・正常筋組織，BMD，MyD，PM，SMA症例筋組織
F；Fasligandのprimerによるもの
β；β−aCtinのprimerによるもの

考察てFas抗原は，従来報告されているようなFasligand

疾患筋細胞においてはapoptosisのシグナル伝達をになう45kDaのFas抗原が発現していることが免疫沈降法にて確認された．その発現の状態は，正常筋細胞には発現せず，変性性疾患，炎症性疾患にはともに同程度に認められ 疾患特異性は明らかでなかった．しかし，正常筋では発現せず，筋障著度が増すほど，発現率が増していることから，Fas抗原は組織障害の過程に何らかの関与をしているものと思われた．しかし
TUNEL染色の結果からはFas抗原が強く発現している筋細胞でさえ，該当する細胞の核のfragmentationは否定的であり，筋組織においてFaS抗原が
apoptosisのsignaltransductionに直接関与している所見は得られなかった．またFas抗原のapoptosisのsignal transductionのtriggerとなるFasligand
も，そのmRNAの検討から，疾患筋組織においても存在していなかった．これらの結果は，筋組抱におい→Fas antigen→signal transduction−・apoptosisという情報伝達には必ずしも働いてはいないことを示唆
し，いまだ知られていない何らかのsignaltransductionに関与しているか，または組織障害の過程で何らかのcytokineに誘導されたepipheno−menonである可能性が推察される．
結論

筋組掛こおけるFas抗原は，①apoptosisのsignaltransductionの機能を持つとされる45kDaの分子が発現し，②その発現状態は，正常筋細胞では発現せず，種々の疾患筋細胞で発現は認めるが疾患特異性は明らかでなく，筋組織の障害度が増す程，発現は増しているが，③筋細胞にapoptosisを誘導している事実はな
く，④Fas抗原にapoptosisのsignal transuductionを惹起するFasligand mRNAも存在しなかった．

−40−9）筋フオスフォリラーゼ遺伝子コドン49のナンセンス変異を示したMcArdle病の一例
梶
研究協力者

緒

中

野

秋

口

龍 兄＊

智＊
一

川

郎＊

村

信

書＊

里

井

斉＊

淳＊

筋生検組織所見

遺伝性の酵素欠損症であるMcArdle病は，一般に例

患者：症例は72歳の女性で，歩行後の下腿筋を中心とした筋のクランプを主訴に当科を受診した．既往歴として，20年来のインスリン依存性の糖尿病がある．また，6年前に心房中隔欠扱症の閉鎖手術を受けている．
両乱 同胞3人，子ども3人に筋疾患を疑わせる家族
歴はない．また，糖尿病の家族歴もない．
現病歴は，約1年前より，特に長期間歩行後に
gastrocnemiusを中心とした部位にクランプが生じる
ようになった．しばらく休憩すると回復する．かなり
以前より両足指の痺れ，約半年前より，右下腱の筋力低下を自覚していた．現症として，四肢腱反射の低下，下肢振動覚の高度低下，下肢近位筋の軽度筋力低下を認めた．肝牌は触知されなかった．
末梢血CX債は317〜5954IU／mlの間を著明に変動していた．心電図ではmBBB，上宝性期外収縮が認められた．心胸比は56．9％であった．心エコーでは，
心室壁の肥厚はなかった．阻血下運動負荷試験では，血中乳艶 ピルビン酸の上昇不良が認められた．
神経竜気生理学的検査では，神経伝導速度の低下，電位の低下が認められ，糖尿病性のニューロパチ一に一致する所見であった．EMGでは，myOpathic pat−ternを一部の筋に認めた．

＊束帯大学医学帝神経内科

木言

小児期，若年期例が多いが，稀に高齢者において発症がみられることがある1）．我々は，70歳代で発症し，多年にわたるインスリン依存性糖尿病を合併していた症例を経験した．さらに遺伝子解析の結果，本例は，欧米では頻度が高いがわが国のMcArdle病では現在まで報告のない，コドン49におけるナンセンス変異を有していることが判明した．
症

嶋

凍結切片では，筋線経の大小不同，中心核の増加を示した．多数の筋線経の筋鞠下に空胞を認め，電顕用のsemithin切片におけるPAS染色において筋鞠下に陽性物質の蓄積を示した．このPAS陽性物質は α−アミラーゼで消化されたためグリコーゲンと考えられた．筋線稚内の酸性フォスファクーゼ活性の上昇なし．
フオスフォリラーゼ染色で筋線錐における活性が認められず，筋フオスフォリラーゼ欠組症と診断した．
電顕では，筋鞠下，筋級維間に著しいグリコーゲン
顆粒の貯留を認めた（図1）．また，長期にわたる糖尿病を反映して，筋内毛細血管の基底膿の肥厚，二重像．
が認められた（図2），
PCR−RFLP

方法：生検筋よりゲノムDNAを抽出し，myO−phosphorylase geneのエクソン1をPCRにて増幅，
ⅣbJJJで消化後，3％アガロースゲルで電気泳動，臭化エチジウムにて染色した2）．

図1生検筋の電顕像（1）．筋鞠下に著明なグリコーゲ
ン額粒の苔稔が認められる．
ー41−

図4

図2 電顕像（2）．筋内毛細血管基底膜の肥厚，多層化，
debrisが存在する．
56bp
Norm8lNonsensemutation

250bp

cc甲nGnCl l l
146bp

図3

104bp

Myophosphorylase geneコドン49におけるナンセンス変異の検出（PCR−RFLP法）．正常では306bpのPCR産物は，NlaIIIにより，56bpと250bpの2つの断片に分かれるが，コドン49に図のようにC→T置換があるとこの制限酵素の認識部位が新たに生じるため，250bpの断端はさらに146bpと104bpに分かれる．
結例は糖尿病発症後20年を経過しており，両者の合併は偶然であろう．しかし，糖尿病を合併したことによって，糖原病症状の発症が遅れた可能性は考えられる．
TsujinOは，米国人を中心に，50例近くのMcArdle
病の遺伝子型を解析している．それによると，米国人

lCCllT研16nC〟JaJJJ

本例におけるPCR−RFLPの結果．左端のレーンより，1：MWマーカー，2：対照例のPCR産物，
3：対照例，ⅣbJJJによる消化後，4：患者のPCR産物，5：患者，ⅣhJ〃消化後．患者ではⅣね〃∫消化後の250bpの断片は認められずに，
146bpと1朋もpの2本のバンドのみが認められる．

果

PCRによって306bpのヌクレオチドが増幅される．
対照例ではⅣヱαJJJによって，このPCR産物は250bpと56もpに切断される（図凱 本例では250bpのバンドは認められず，コドン49のC→T置換のために生じた
ⅣbJJJの新たな認識部位により，146bpと104bpのバンドのみが認められ，コドン49におけるナンセンス変異のホモ接合体であることが判明した（図3，図4）．

40例のうち30例がコドン49の！pA（Arg）→三qAナンセンス変異を有し，そのうちの18例が本例のように，この変異のホモ接合体であった3）．また，英国のBartramらは16例の患者を解析し，全例でこのナン
センス変異が認められ，10例はホモ接合体であったと報告している4）．このように，欧米例ではコドン49のナンセンス変異が圧倒的に多いわけであるが，おもしろいことに，日本人例の既報7例ではこの変異は認められていない．日本人例では欧米にないタイプの，コ
ドン708／709におけるTTCコドンの欠矢が7例中4例に認められている3）．本例は，日本人例ではじめてコド
ン49のナンセンス変異が証明されたMcArdle病である．しかし，日本では欧米と異なった変異が多数を占めるという事実には変わりはない．
文1）Pourmand．R，SanderS I）B and CorwinHM：考察
糖原病は，低血糖を伴うことが一般的である．栃原病と糖尿病の合併については，Ⅰ型von Gierke病で献

Late−OnSet

McArdleS

diseasewith

unusual electromyographic findings．Arch
Neuro140：374−377，1983．
2）Tsujino S，Shanske S and DiMauro S：M0−の報告がある．しかしこれはⅠ型に特異的で，長期にわたる低血糖症状の後にみられる．糖原病性ミオパ1ecular genetic heterogeneity of myophoS−

チーでは，糖尿病を合併した報告は見当たらない．本

−245，1993．

−42−

phorylase deficiency．N EnglJ Med329：241

3）Tsujino S，Shanske S，NonakaI and
DiMauro S：The molecular genetic basis of4）Bartram C，Dwards RH，ClagueJ and
Beynon RJ：McArdle，s disease：a nOnSenSemutationin exonl ofthe muscle glycogenmyophosphorylase deficiency（McArdle Dis−ease）．Muscleand Nerve，Supp13：S23−27，

phosphorylase gene explains some but not
all

1995．

1993．

−43−

cases．Hum

MoI

Genet

2‥1291−1293，

10）Gomori−Trichrome変法における薄層赤染線経の意義について一慢性進行性外眼筋麻痔の母子例を中心に−
田

研究協力者

吉

田

一

代

人＊

は じ め に筋病理観察において，Gomori−Trichrome変法染色でみられるraggedredfiber（RRF）は1），横隔膜では正常でも多数観察される2）．一般の骨格筋では多くの疾患で非特異的に少量が観察され3），高齢者では非特異的に増加するとの報告もある4）．ミトコンドリア脳筋症ではある程度以上存在するのが特徴であり，電子
顕微鏡的観察において大小不同ミトコンドリアの異常集積と，ミトコンドリア内バラクリスタリン封人体などのクリスタ異常を示す．
一方，われわれは，ミトコンドリア脳筋症と考えられる症例においても必ずしもRRFを認めず，Gomori−
Trichrome変法染色で細胞膜下の薄層が均一に赤染され 内部が比較的保たれているものがしばしば出現することに注目した．しかし，これらの辺縁平滑薄層
赤染線維（smoothredfiber）は，RRFの前段階なのか，あるいはこれらと異なる出現機序を示すものなのか不明であり，病理学的意味は十分には解明できていない．そこで，1）smooth red fiber（SRF）とRRFと邦

島

1月から1994年10月までの14年10カ月間に得られた
ヒト筋生検の738例（男391，女鋸7例），年齢は生後
1過より78歳，平均39．4歳（男37．9，女41．2歳）を用
い以下の枚索を行った．
1．組織学的検索

生検筋は大腿四頭筋から，また一部は上腕二頭筋から採取した．筋姐級吼Gomori−Trichrome変法，H＆E，NSE，ALP，NADH，ATPaseに対する組織化
学染色し，光学顕微鏡で観察した．また，一部の試料は電子顕微鏡で観察した．
＊北海道大学医学部神経内科＊＊国立療養所札蛙甫病院神経内科

功

二綽

森

若

文

雄＊

光顕観察，Gomori−Trichrome変法染色で筋細胞膜下に平滑均一に赤染する薄層が存在し，筋線錐内部が比較的保たれかつNADH染色で辺縁が濃染される筋線経を，「SRF」と定義した．またRRFは上記のようなEngelらの定義に従って観察した1）．
SRFあるいはRRFが疑われた症例では染色条件による所見の差異を避けるために，可能な限り同一条
件，同時染色を行い，横断面に加え，縦断面でも観察した．対凪と対比して観察し，陽性と認められた症例
ではcytochromec oxidase（CCO），SDHに対する組
抱化学染色を加えた．これらの標本に対して組織学的に，SRFとRRFの形態および染色性の比較を行った．
2．臨床病型との関係
記録における臨床診断および筋病理診断とSRF，RRFが観察される症例との関係を検討した．
3．代表例における検索
SRFが観察された代表例を呈示した．
結の形態的相違，2）SRFとRRFの出現する筋疾患を検討し，SRFの出現機序を考察した．
材料・方法
北海道大学医学部附属病院神経内科において1980年

雄＊

果

1．組織学的検索
1）RRFの形態
RRFは，GomoriTTrichrome変法染色において筋細胞膜下に赤く均一に濃染する不整の綾取りを示す．
この縁取りは必ずしも全周性ではなく，厚さも薄い部
分から厚い部分まで様々であった．また，赤染部が筋線推内部にまで及ぶものもみられた．筋線推内部は空胞や亀裂を示した．］NADH染色では筋細胞膜下が洩染され 筋線維内部の乱れが確認された．CCO染色では活性の低下，SDH染色では活性の上昇を認め，ミトコンドリアの異常があることを示した．電顕で観察すると，RRFでは筋細胞膜の乳頭状陥軌細胞残法の増加に加え，筋細胞膜下のミトコンドリアの肥大，異常集穂を示すとともにミトコンドリア内部にパラクリ
スタリン封人体が高頻度に出現することを確認した
（表1）．

−44−

蓑1PathologicalfindingsofRRFandSRF
RRF

SRF

lightmicroscopicfinding＋＋

frequencyofRRFin fiberbundles
frequencyofSRFin fiberbundles＋＋

marginoffiber

rough smooth＋＋＋＋

derangementofsarcoplasmicreticuIum
eTectronmicroscopicfinding

hypertrophy＋＋＋＋＋

ineinclusion＋＋＋

PaPiHaryfolding＋＋

Celldebris＋＋＋

abnormalcryste
ParaCrySta

＋
＋

＋＋＋

＋
＋

increaseofnumber＋＋

mitochondria

Plasmicmembrane

SRF：SmOOth red fiber，RRF：regged red fiber＋＋＋：muCh，十十：mOderate，＋：mild，＋−：litteincreased，−：nO Observed

表2

Casewith RRFin

738

cases of muscle biospiesin neurology clinic on

Hokkaido University

gradeofoccurrenceofRRF
numbers（％）＋
64（8．7％）＋＋31（4．2％）

numbersoutof＋CaSeS nUmbersoutof＋＋CaSeS

diagnosis

31

mitochondrialmyopathy

9

POlymyositis

7

PrOgreSSivemusculardystrophy3dermatomyositis

22

COngenita］myopathy

myotonicdystrophy

1

CO＝agenmyopathy

1

OCutOPharyngeaImusculardystrophy

1

nonspecificmyopathy

7＋and＋＋：mOre thanl and30 0 0 0 0 0 0 0Chronicdenervation

ragged red fibers

are seeninalow powerlight microscopic finedで観察してもRRFへ移行することなく，RRFとは明らかに異なっていたが，電顕所見はRRFと近似した（蓑1）．

2）SRFの形態
G。m。ri−Trichrome変法染色で辺縁赤染部は平滑であったが，筋線推内部まで点状かつ散在性に染色される傾向を示した．NADH染色では筋細胞膜下が濃染され筋線推内部の乱れは軽度であった．一部の線経ではCCO染色では活性の低下，SDH染色では活性の上昇を認め，電顕観察でも筋細胞膜の乳頭状陥凹，細胞残姪の増加に加え，ミトコンドリアの肥大と集積，および一部のミトコンドリア内部のパラクリスタリン

異常封人体の蓄積を示した．光顕観察では，連続切片

2．臨床病型との関係
RRFは，光学顕微鏡40倍，1視野（径4mm）あたり1個以上認めるものを陽性とすると，全症例の64症例（8．
7％）が陽性であり，診断的価値はなかった．40倍，i
視野に3個以上認めるものを陽性とすると，31症例（4．
2％）に限定され，金例がミトコンドリア脳筋症であった（蓑2）．

−45−

表3Number of cases with RRF and SRFin
mitchondrialmyopathy
caseswith caseswithout
SRF

2
4
1
1

CaSeSWithRRF
caseswithoutRRF

RRF：ragged red fiber，

臨床的にミトコンドリア脳筋症と診断された42症例中19例（45．2％）にSRFが観察された（表3）．そのうち10例はRRFとSRFの両者を，9例はSRFのみを，21
例はRRFのみを認めた．両者とも認めなかった2例はDNA検索にて診断された．
3．代表的症例における検索
慢性進行性外眼筋麻痔忙PEO）の家族例で，母親は，RRFを，長女はSRFのみを認めた個1）．

SRF：SmmOth red fiber

眼筋麻痔を示す．筋線錐には，Gomori−Trichrome
変法染色でRRFは認めず，筋膜下から内部にかけて
点状，散在性に赤染するSRFが散見された（図2−6）．
電顕で観察すると，大小不同ミトコンドリアの著明な集積，筋膜の乳頭状陥凹がみられた．これらミトコン
ドリア内部にはパラクリスタリン封人体，異常クリスタが認められた（図2−め．

十

Case1
75

…三…二二′

SRF

1
3

numbersofcases

′

′∵′
Cf堰0

⊂hron・⊂

p一〇gTeSかVe Oph小且加OP軸la

図1Pedigree ofCPEO ramily1）Casel．75歳，女性．
20歳代より，眼瞼下垂，外眼筋麻痺出現し，70歳台になり，四肢脱力が加わる．血清CX借の上昇，負荷試験での乳軌 ビルビン酸の持続的高値を認めた．筋病理で典型的なRRFを有し，電子顕微鏡観察でもパラクリスタリン封人体が確認された．
幻Case2．50歳，女性．
Caselの長女．20歳代台より眼瞼下垂出現，40歳
台後半より，上方視制限が加わる．血液検査は異常を認めなかった．筋線経にはGomori−Trichrome変法
染色でRRFは観察されなかったが，一部の筋線経は筋膜下から内部にかけて点状，散在性に赤染するSRFであった（図2−8）．電顕で観察すると，赤染部の筋膜下および筋線維内部に著しい大小不同ミトコンドリアの著しい集境がみられた．これらのミトコンドリアは，
パラクリスタリン封人体は示さなかった（図2−b）．
3）CaSe3．35歳，男性．
臨床経過15年の孤発性CPEOであり，限瞼下垂，外図2

a：Case 2
stain264 ×

modified Gomori−Trichromeb：Case2EM8，000×
C：Case 3 Case 2 modiEied Gomori−
Trichrome stain264 ×
d：Case3EM16，000×
Arrows show smooth redlayer
考察

今回の結果でも明らかなように，Gomori−Tri−ehrome変法染色は筋線椎でミトコンドリアが集墳する部分を赤染する．とくに，これまで，RRFがある程
度以上の数が出現するときは，ミトコンドリア異常の指標として重要視されていた．今回の検討でも40倍，
1視野に3個以上のRRFを認めた症例は，全てミトコ
ンドリア脳筋症であり，RRFはミトコンドリア異常の特徴的所見であることが確認された．

一方，今臥注目したSRFは，ミトコンドリア脳筋症と関連して出一46−

現する．そこで，RRFとSRFの関連を考察し，筋病
理の特徴を整理した．

なお，今回呈示した，CPEO母子例では遺伝子検索は未施行であり，今後検討が必要である．

SRFは組織学的に，光顕観察では，辺縁は平滑であり，赤染部は筋細胞膜下，および一部筋線維内部にまでおよび，筋線維構築の乱れは軽度であり，RRFとは異なるが，電顕観察では，パラクリスタリン封人体を高頻度に認め，RRFと近い存在である（蓑1）．

文献1）01son W，EngelWX，Walsh GO，Einaugler
R：Oculocraniosomatic

ease

with

neuromuscular

Ragged−RedP

EiberS

dis＿Histoche−

また臨床的にも，家族歴を有するCPEOの症例で，重症の母親（Casel）では典型的なRRFおよび電子顕顕微鏡観察でパラクリスタリン封人体が見られたが，軽症状の娘忙ase2）ではRRFはみられず，SRFをの

micaland ultrastruCtural changeS in1imb
muscles of a group of patients withidioみ認めた．また，SRFを持つ症例の一部では忙ase3），
電子顕顕微鏡観察でパラクリスタリン封人体がみられた，さらにミトコンドリア脳筋症ではRRFとSRFが2）磯崎英治，宮本和人 田速 等，小田雅也：ヒト
横隔膜における多様性筋病変（raggd rd fiber，

混在して認められる症例もあった．このように，SRF
は，遺伝性の問題がみられ ミトコンドリア自体に問題のあるミトコンドリア脳筋症と密接に関連している．

fiber）の検討．臨床神経か：726−7332，1989．
3）埜中征哉，古賀靖軌 山本雅彦：ミトコンドリア
脳筋症の病理．31：624−633，1987．

以上のように，ミトコンドリア脳筋症で見られるSRF

pathic progressive external opthalmoplegia．

Arch Neuro126：193−211，1972．

COre／targetoidfiber，CytOplasmic body，ring4）Ziadは，RRFと同様の横序により発現すると推測され，
SRFは，ミトコンドリア脳筋症の進行に伴ってRRFへ移行していく前段階の線推であると考える．

−47−

R，Stephen

W，Cornelia

二K，Charles

AT：Ragged red fiberinnormal aging andinflammatory myopathy．Ann Neuro137：
24−29，1995．

11）ミトコンドリア脳筋症患者のragged−red fiberにおけるミオグロビン量とそのmRNA量

井崎

＊

臣

三岡

好打

秀延

松

峯若

＊

ガ郡

貴誠

ツ

■

誠彦郎
＊

善史

は じ めにミトコンドリア脳筋症患者の骨格筋組織には異常ミ
トコンドリアの集穏したragged−red fiber（RRF）が通常認められ，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常が認められることも多い1）．本症患者のミトコンド
リアには機能異常があり，ミトコンドリアにおける酸素の利用障害が生じていると考えられる1）2）．
一方，myOglobh（Mb）は筋細胞中で酸素の貯蔵や運搬を行うヘム蛋白質であり，ミトコンドリアへの酸素の供給に密接な関係がある．また，本蛋白質は筋組
紙中に発生する活性酸素である過酸化水素（H202）と反応することにより，さらに組織障害性の強い活性酸素の一種であるhydroxylradical（・OH）を発生させることが知られている3）．
本研究ではミトコンドリア脳筋症患者のRRF中のMbとそのmRNAの量を調べMbの生合成とその役割を検討し，あわせて活性酸素の消去酵素であるman一
ganese superoxide dismutase（Mn−SOI）），COpper
2：inc（CuZn）−SOI）およびcatalase（CAT）についてもその量を調べ，RRFにおける酸素の供給と活性酸素の消去挽椿との関係について検討した．
対象と方法
対象はミトコンドリア脳筋症患者5例で，その内訳
は慢性進行性外眼筋麻痔（CPEO）4例，Kearns−Sayre症候群（KSS）1例である．これらの患者の生検骨格筋および正常対照2例（膝関節症患者）の骨格筋を用いて研究を行った．
方法は，これらの筋組織より新鮮凍結連続切片（6〟m）を作製し，その切片についてmodified Gomori
trichrome染色，ATPase染色（pH4．4），SuCCinate
dehydrogenase（SDH）染色 cytochrome c oxidase
忙0Ⅹ）染色を行った．また，Mb，SOD，CATは抗Mb抗体・（Dako），抗Mn−SOD抗体（日本油脂），抗＊徳島大学医学部粛一内科

尚井■ ■ ■ ′

重田藤

国西粛

研究協力者

CuZn−SOD抗体（Sigma），抗CAT抗体仏thens re−search）を用いて免疫組織化学的に染色した．また，
MbmRNAはブタMb cDNAをPstIで処理して得られた209bpの断片をビオチン化したものをプローブとして用い，insltwhybridi21ationにより検出した．
Mbの定量には，Mbを染色した切片1枚につき50本の筋線経を無作為に選び，1本の筋線経につき1カ所を選び，一定面積（314〟m2）の530nmの吸光度（OD）を
顕微分光測光装置（CarlZeiss，UMSP−Ⅰ）で測定した・
Mn−SOD，CuZn−SODおよびCATの定量には，連続切片上でMbの定量を行った全ての筋線経について同一部位を測定し，MbmRNAの定量には染色した切片
1枚につき200本の筋線経を無作為に選んで同様に測定した．それぞれの染色で得られたODの平均値より陰性対照のOD値を差し引き，それぞれの蛋白質，酵素，
mRNAの含有量を表した．なお，本研究では筋線経の横断面の最大径が40〝m以上のものを非萎縮筋線経，
それ未満のものを萎縮筋線経とした4）5）．
成

練1．正常骨格筋の成績
Mbは筋線維全体か細顆粒状に染色され，染色性の強い線経と弱い線経がモザイク状に分布しており（図1B），前者はtype1線経に，後者はtype2線経に相当
していた（図1A，B）．MbmRNAは筋線株全体に顆粒状のシグナルとしてみられ（図1C），fiber typeによる差はみられなかった．Mn−SODでは微細親日状に筋細胞質が染色され，type1線経に強く染まるモザイク状のパターンがみられた（図1D）．CuZn−SODも同様の
染色パターンを示し，fiber typeによる差がわずかにみられた（図1E）．CATは筋線維全体が均一に染色され，
fiber typeによる差はみられなかった（図1F）・
乙 ミトコンドリア脳筋症患者の成株
MbおよびMbmRNAの染色性は筋線維全体に顆粒状に認められ，非萎縮筋線椎では，RRFはMb，
MbmRNAともに非RRFに比べて強く染色された（国−48−mRNAの染色を示す．A：ATPase（pH4．4）．
B：Mb．C：MbmRNA．D：Mn−SOD． E：

二≡−町∵

A−Eはそれぞれ下記の酵素，蛋白質あるいは

壁
⁚
l
卜
−
−
．
・
爛
れ
■
叫
⁚
−
J

j

図1正常骨格筋組織像

CuZn−SOD．E：CAT．（A−E x200）．
2A−G，矢印）．萎縮筋線経では，RRFはMb，
MbmRNAともに非RRFと同様の染色性を示した（図2A−G，矢頭）．MnrSOD，CuZn−SODおよびCATは非萎縮，萎縮筋線維ともにRRFは非RRFに比べて強く染色されたが，この所見は非萎縮筋で顕著であった（図2H−」）．
3．MbおよびMbmRNAの豊図2 ミトコンドリア脳筋症患者の組織像
A−Jはそれぞれ下記の酵素，蛋白質あるいはmRNAの染色を示す．A：Modiried Gomori
trichrome．B：SDH．C：COX．二D：ATPase（pII4．4）．E：Mb．

F：Modified Gomori

trichrome．G：MbmRNA．Ii：Mn−SOD．Ⅰ：

正常骨格筋では，Mb量はtype2線維（OD＝0．350±0．023，mean±SD）に比べtype1線維（OD＝0．400±0．022）では有意（p＜0．001）に高値であったが（図3A），

CuZn−SOD．J：CAT．（A−E，H−J x200，G，
H x400）．

MbmRNA量は筋線経のtype別の有意差はなかった（図3B）．

CuZn−SOD量（OD＝0．250±0．030）に比べ有意（ともにCPEO／KSS患者の骨格筋では，非萎縮筋線経のうち，RRFではMb量（typel：OD＝0．538±0．105，type2：OD＝0．531±0．119）およびMbmRNA量（OD＝線経のtype別の有意差はなかった（図4C）．

0．085±0．024）は，非RRFのMb量（typel：OI）＝0．403±0．056，type 2：OD＝0．370±0．044）およびMbmRNA量（OD＝0．067±0．023）に比べ有意（それぞ0．264，tyPe2：OD＝0．736±0．284）．CuZn−SOD量

れp＜0．001，p＜0．005）に高値であったが，萎縮筋線経ではRRIrと非RRFとの間に有意差はなかった（図3A，B）．
4．SODおよびCATの量

type2：OD＝0．701±0．093）は，非RRFのMn−SOD

正常骨格筋のtype1線錐のMn−SOD量（OD＝0．309±0．026）およびCuZn−SOD量（OD＝0．292±0．027）はtype2線椎のMn−SOD量（OD＝0．207±0．033）および

p＜0．001）に高値であったが（図4A，B），CAT量は筋
CPEO／KSS患者の骨格筋では，非萎縮，萎縮筋線錐ともに，RRFのMn−SOD量（typel：OD＝0．736±（typel：OD＝0．668±0．260，type2：OD＝0．671±
0．289）およびCAT量（typel：OI）＝0．715±0．119，量（Lypel：OD＝0．408±0．081，type2：OD＝0．359±
0．097），CuZnTSOD量（typel：OD＝0．434±0．096，
type2：OD＝0．401±0．074）およびCAT量（typel：
OD＝0．530±0．085，type2：OD＝0．532±0．079）に比べ有意（それぞれp＜0．001，p＜0．001，p＜0．003）に高値を示した（図4A−C）．

−49−

匿いagged・redfiber□nonragged−redfiber（mean±S．D．）

8
0

6
0
0

4

0．2

﹂

0．3

．

0．4

0

≡

⁚

已0．5
J⊃

1

q o．6

2

︵占．〇︶＜Z∝Eq≡

一T O・7

2
0
0．

0．1

0

0

TypelType2

Typel Type2
Non・atrO hic

Normal（n：100）

Non・atrOPhic Atrophic
Atro

CPEO／KSS（n＝250）

NormalCPEO／KSS（∩＝200）（∩＝800）A

図3

MbおよびMbmRNAの量

A：Mb量．B：MbmRNA量．＊：正常type2線掛こ比べ有意（p＜0・001）に高値・†‥正常type1線維およびtypel非RRFに比べ有意（p＜0・001）に高値・‡‥正常type2線維およびtype2非RRFに比べ有意（p＜0．001）に高値・§：非RRFに比べて有意差なし・＃：正常筋線推および非RRFに比べて有意（p＜0・005）に高値．

国ragged・redfiber
ロnonragged−redfiber（mean±S．D．）

9
8
7
6

︵．0．0︶ト＜U

6
0

■

5
0
3

5
0

Normal（n：100）CPEOIKSStn＝2501

7
0

6
0

一丁￣

8
0

dO
7
0
0

Typel Type2

「「￣■

9
0

︵占．〇︶凸OS・UNコ090言．〇︶凸OS・∪≡

TypelType27

TypelType27

Typel Type2「￣「￣

Normal（n＝100）CPEO／KSStn＝250）

A

TypelType2
7￣「￣

NoTmal（n：100）CPEOIKSS（n＝100）

C

B

図4

Typel Type2「

SODおよびCATの量

A：Mn−SOD量．B：CuZnSOD量．C：CAT鼠＊：正常type2線掛こ比べ有意（p＜0・001）に高値・†‥
正常type1線推およびtypel非RRFに比べ有意（p＜0・001）に高値・‡‥正常type2線維およびtype2
非RRFに比べ有意（p＜0．001）に高値・§‥正常type1線維およびtypel非RRFに比べて有意（p＜0・01）に
高低＃：正常type2線柾およびtype2非RRFに比べて有意（p＜0・01）に高値・考

5．Mb量とSOD量およびCAT量の関係

察と有意（それぞれp＜0．001，p＜0．001，p＜0・01）に正の相関を示した（それぞれrニ0．779，r＝0．754，r＝0・畏0）

本研究ではミトコンドリア脳筋症患者の骨格筋の非萎縮のRRFでMbとそのmRNAの畳が増加している
ことを示した．このことは，非萎縮のRRFではMbの（図5A−C）．

生合成が増加していることを示すものであり，このよ

Mn−SOD亀CuZn−SOD量およびCAT量はMb量

−50−

4

1
1

2

1

0

0

8

0

6

0

4

A

言．〇︶凸OS・u≡り7），われわれも患者の筋組掛こおいてDNA損傷の02指標である8−hydroxy−deoxyguanosine（8−OHTdG）
が増加していることを報告した8）．一方，活性酸素を減少させる機構の存在については，患者の血焚および赤血球中の還元型glutathioneが減少していることや7），
RRFでMn−SODやCuZn−SODが増加していることが報告されている9）．本研究では，非萎縮ならびに萎縮のRRFではMn−SODやCuZn−SODのみならずH202を処理するCATも増加していることを見出した．さら

0

0．2

0．4

0．6

0．8
Mb（0．D．I

言1．
邑1．

に，非萎縮RRFでは，SODおよびCATの増加はMbの増加に対応していることを示した．
以上の成績より，非萎縮RRFでは，低下したエネ
ルギー産生を代償するためMbの生合成が増加し，酸素の供給を増加させていると考えられる．その結果

亡1

01．

B 占0・
占0・

0．2

0．4

0．6

RRFでは活性酸素の発生が増加することになり，これにより細胞障書が増強するとともにミトコンドリアの機能障害も進行すると考えられる．Mbの増加に対応

0．8
Hb（0．D．）

したSODおよびCATの増加は，RRFにおいては過剰に発生した活性酸素の処理機構が冗進していることを示唆するものであり，萎縮RRFではこのような代償機構は失われていると考えられる．
まとめ

図5 ミトコンドリア脳筋症患者の骨格筋線経のMb量とSOD屋およびCAT量の関係

ミトコンドリア脳筋症患者の非萎縮RRFでは，Mbの生合成の増加による酸素供給の増加が起こりミトコ
ンドリアの機能障害を補っていると考えられるが，これにより活性酸素が増加するためその処理機構が完進していることが示唆された．

A：Mb量とMn−SOD量，B：Mb量とCuZn−
SOD量．C：Mb量とCAT量．Mn−SOD，CuZn−SOD量およびCAT量はそれぞれMb量と有意に正の相関がみられた．

1）Luft R：The deveropment of mitochondrial
medicine．Proc Natl Acad Sci USA 91：8731

0．2

0．4

0．6

0．8

Mb（0．D．1

文

献−8738，1994．

うな筋細胞では酸素の供給が増加していることを示唆

2）Ozawa T，

Sahashi K，Nakase Y andする．すなわち，異常ミトコンドリアでは低下したエ
ネルギー産生を代償するためにMbを増加し酸素の供給を増加する機構が働いていると考えられる．文献的にも，患者の筋組織より単離したミトコンドリアあた

Chance B：Extensive tissue oxygenation as−sociated with mitochondrial DNA mutations．
Biochem Biophys Res Comm

213：432−438，

1995．

りの酸素消費は低下しているが，患者の身体全体の酸

3）PuppoAand HalliwellB：Formation of hy−

素の取り込みは増加していることが報告されている1）．
また，本症患者の骨格筋組織では，運動負荷時に0Ⅹyhemoglobinの増加があり，酸素の供給が増加しdroxylradicalsin biologicalsystems．Doesているとの報告もある2）．しかし，この酸素供給の増加は活性酸素を過剰に発生させる要因にもなり6），ミトコンドリアの機能障害をさらに増強させる可能性がある．

Res Comms4：415−422，1988．

myoglobinstimulate hydroxyl radical for−mation from hydrogen peroxide？Free Rad4）MitsuiT，KawaiH，Naruo T Ni申ino H

ミトコンドリア脳筋症における活性酸素による組織の障害を示す所見として，血清過酸化脂質の増加があ−51−

and Saito S：In situ hybridization of my0−globin mRNA：reSults on the skeletal mus−cles of normal subjects and patients withneuromuscular diseases．

Acta Neuropathol

鮎：313−318，1993．
5）Ⅹunishige M，mitochondrial

Mitsui T，Akaike M，

myopathies with progressive

external ophthalmoplegia．J NeuroI Sci

Shono M，Ⅹawai H and Saito S：Localiza−

lO5：57−60，1991．

tion and amount of myoglobin and

8）Mitsui T，Ⅹawai

H，

Nagasawa M，ragged−red fiber ofKunishige M，Akaike M，Kimura Y andpatients with mitochondrial encephal0−

Saito S：0Xidative damage to skeletal mus−myopathy．Muscle Nerve（1996in press）．

Cle DNA from patients with mitochondrial

myoglobin mRNA6）Kinnula VL，

in

CrapoJD and Raivio KO：

encephalomyopathies．J NeuroI Sci，1996，in

Generation and disposal of reactive oxygen
metabolitesin thelung．LabInvest73：3−19，

preSS・
9）Ohkoshi N，MiヱuSaWa H，Shiraiwa N，

Shoji S，Harada K and Yoshizawa X：

1995．

7）Piccolo G，Bar止i P，AZan G，Rizzuto R，
BissonR，一Sandona

DandBellomoSuperoxide dismutases of muscle in

G：Bio

Iogical markers of oxidative stress in−52−

mitochondrial encephalomyopathies．Muscle
Nerve18：1265−1271，1995．

ⅠⅠ．臨床・分子遺伝学

12）リンパ芽球細胞の樹立とその解析
斎 藤 深美子＊

EBウイルス（Epstein−Bar virus）はリンパ球Bcellに特異的に感染し，それをtransformさせる能力がある．こうして樹立した細胞株はリンパ芽球細胞株（1ymphoid cellline：LCL）と称されている．LCL
は，その樹立の際に患者に苦痛を与えることもなく，また，細胞は半永久的に増殖し，染色体構成も安定で，その凍結保存やDNA抽出も容易なことから，分子遺伝学的解析資料として大変有用とされている．実際，
DMDをはじめ数多くの遺伝性疾患原因遺伝子のポジ
ショナルクローニングの際に，必要不可欠の細胞資料として利用されてきた．
本研究は，筋ジストロフィーおよび類縁疾患の患者およびその家族のLCLの樹立・保存とその細胞遺伝学的および分子細胞遺伝学的解析を目的とした．

（hv（Ⅹ））が見出された（図1）．
この症例は，DMDに合併した精神遅滞と染色体構造異常切断点との関連性を示唆する貴重な例と思われる．この患者の染色体構成は46，Y，hv（Ⅹ）（p21．2q
22．2）で，このhv（Ⅹ）は，軽い精神遅滞を伴う母親由来であることが判明した．患者および母親の臨床症状と染色体切断点との関連性を考慮すると，Ⅹ染色体の短腕側の切断によりDMDを発症し，一方，長腕側の切断により中枢神経障害を発症した可能性が考えられ，
Ⅹ染色体上に存在するといわれる幾つかの中枢神経障
害関連疾患遺伝子の1つの候補儲域として更に検討を
重ねたい．

︶
4
︶
6

t

り ん

′

0

︵

6
2

4

︵
︵

Duchenne muscular dystrophy（D班I））：

4︵

Charcot−harie−Tooth disease typel（ChTl）：

︶
︶
︶
3 2 4
2

ヽ

3

a，myOt，rOphiclateral sclerosis（ALS）：

hereditary neuropathy withliability topressure−SenSitive palsies（HNPP）：1（1）一■−−一−−−▼−−−一一■・1■

合計58（40）［数字は人数、（）内は患者数を現わす］

′lt一l

′l■
′▲▼15

︶︒

11牒儀膚
1

O

−−12

′11

雷1

1

■■■■i

等

溝1 さ X

2

2

愚

妄 琴

■l

国1G分染法による患者の染色体核塑

藍ンlY

⁝郎17

墓−6
ヽ■1
亀

亀2

20

適
掴
9

19

ー書

6

・・！I

甜闇8 匪15

t

哲雄

やl

l

2い凝7

l−−一■11

−

●

−55−

myotonic dystrophy（mD）：√＊東京医科歯科大学難治疾患研究所遺伝疾患研究部門（細島遺伝）

muscular dystrophy，late onset distal：i t 電 蓄 曇 雷 l瞥甘rl〜翳

（2）細胞遺伝学的検索
細胞遺伝学的検索に関しては，末梢血培養および樹立したLCLを用いて検索を行った．末梢血培養の場合は，PHAを添加した後，48〜72時間培養して染色体標本を作製する．LCLを使用する場合は，通常の染色体標本作製法では，高精度分析の可能な細長い
染色体標本を得ることは困難なので，本研究者らが開発した同調培養およびェチジウムブロマイド併用法を義1樹立した細胞株（LCL）のリスト

ノ ′ l l ■ l（1）細胞株軋CL）の樹立
患者およびその家族の静脈血から無菌的にヘパリン採血された，リンフォプレップ（比重＝1．077）を用いてリンパ球を分離する．一部は凍結保存し，残りのリンパ球に調製したEBウイルス抽出液を混合して，37℃
で1時間処理する．その後細胞を2回洗浄し，培養液（牛胎児血清を含む）を加えた後，37℃の恒温清で培養を開始する．細胞が樹立するまで，細胞の増殖の程度をチェックしながら培養液の交換をする．樹立した後は，一80℃ディープフリーザーまたは液体窒素で細胞株を凍結保存し，必要なときに解凍保存し，再培養を行う．
各細胞珠はEBウイルス感染後，1〜2週間で樹立した．現在までに，家族を含め58人分（その内患者は40名）のLCLを樹立し，凍結保存している．その内訳を
表1に示した．

用いた1）．
染色体解析の結果，ALSでのt（7；13）転座2）ぉよび
DMDでのt（Ⅹ；22）転座の染色体構造異常の他に，重度の精神遅滞を伴う DMDの患者にⅩ染色体の逆位￠）分子細胞遺伝学的検索観察された．つまりこの黄色の部分は，trinucleotide

Myotonic dystrophy（MD）の責任造伝子は，19q13．3に座位するmyotoninproteinkinase（MTPX）をコードしており，このMTPX遺伝子の3 側の非翻訳領域にある3塩基（CTG）反復配列の異常拡大3）によって，疾患が発症すると言われているが，その本態はまだ不明である．また，この遺伝子のmRNAの発現量がexpandしている遺伝子部分を示し，他の赤いfocus
は，その転写産物を示していると考えられる．
患者と健常人の核で比較した結果を表2に示した．
アンチセンスのシグナルが陽性の細胞（CAG（＋））は，健常人ではほぼ0〜1％であるが，患者の細胞では43〜93％と明らかに高かった．またその割合は，hybridi一皿tionの時間に依存して増加していることがわかった．

に関しては，正常細胞と比較して，増大4）ぁるいは減少5）という報告がなされており，未だ結論が出ていな

一方，パラフォルムアルデヒドで固定した細胞では，シグナルを定量化することが困難であったが，患者のい．そこで今回は，3塩基反復配列のアンチセンスのオリゴプローブ（30base）によるh shLE hybridization（ほH）法6）を用いて，患者及び健常人のMTPX遺伝子の転写産物の細胞核内での局在を調べた．
資細胞では，多くのbrightな固まりが観察された．
以上のことから，アンチセンスプローブは患者の核では，MTPX遺伝子とその転写産物の両方を示し，散在するシグナルのf∝uSの1つのみ遺伝子DNAとRNAを含み，センスプローブはpost transcriptional

料

なRNAを示し，それが核内に集填していると思われる．この転写産物の核内集積はMDの病態の1つの側MDの患者5例，および健常人4例の各々のLCLを検索の資料として用いた．
方法

表2患者および健常人の細胞（LCL）における使用したオリゴヌクレオチドプローブは，アンチセンスプローブとしてのCAGの10回repeatから成る
CAG−30，およびセンスプローブとしてのCTGの10＿hybridizationの時間とCAG−30（＋）の割合と関係
Hybritime Patient CAG・30（＋）Norma）CAG−30（＋）

回repeatから成るCTG−30で，前者はTRで標識する
ためそのシグナルは赤く観察され，また後者はFITCで標識されるため線色に見える．

3．5hrs DM2

45．3％
DM3

今回用いたIn s由れhybridization法は図2に示した．

DM4

50．9

DM6

37．5

6．5hrs DM1

結果
センスプローブCTG−30では，患者の細胞核内の一ヶ所に緑色のシグナルが検出された．一方，アンチ

DM7

0．5％

DM7

0．8

43．O

93．4

Nl O．2
N2

2．7
8．2
88

センスプローブCAG−30では，核内の数カ所に赤色のシグナルが存在し，その中の一ヶ所は，センスプロー
ブの線色のシグナルと重なって黄色のシグナルとして

2M
6
M
DD

17．Ohrs

Cells

CeIIs

l

I
O．075MKCHor15■at37●clfixedin4％paraIoTmamideinPBS．5mMMgCl2rorlOlfixedinmethanoL／acelicacidforlOlatT．t．

in70％E10Hat4■c
l

l

d
一 匹
■．引■■■■■．什

in2ndmethanot／acelicacId

hydratedinPBS．5rnMMgC12IorlO■ltreatedwith40％formamide．2XSSC10rlO■alr．t．

epreparation

ridiZedlor3hrs−at 37●cwilholigonucl00tidOPrObOS（10−50∩9）in2011lof40％formamide．2XSSC．0．2％BSA．10％dextTanSUltat8．
2mMvanadyladenosinecomplex．1mg／ml0fE．colitRNA．
1mg／mJofsalmonsp8rrnDNA
WaShedl

StainedwithDAPJandphenylerLedjamine】

SJgnaJdeteclionbyCyloVision

図2In s血hybridization with oligonucleotide probes
−56−

0．3

N3

0．4

DM7

1．3

N1

1．4

N3

1．0

面であるとも考えられるため，さらに解析例数を増やし，診断との応用等に関して検討していきたい．

nese patients with amyotrophiclateral scle−rosis．Clin Genet47：158−160，1995．
3）Fu YH，PizzutiA，Fenwick RGJr，et al：

最後に，御協力頂いた以下の先生方に，心より深謝いたします．（順不同，敬称略）
虎の門病院（神経内科）高木昭夫，中瀬浩史，竹内壮介；国立精神・神経センター（神経研）荒畑喜一，中村昭則；新潟大学（神経内科）辻 省次，小野寺 理，牧野邦此古；東京医科歯科大学（神経内科）金子清俊；東京大学（神経内科）後藤 順；公立昭和病院（神経内科）
佐野元規；都立墨東病院（小児科）伊藤昌弘；日本電子（株）植松善英

An．unstable triplet repeatin a gene related
to mytonic muscular dystrophy．Science255（5049）：1256−1258，1992．

4）SabouriLA，Mahadevan MS，Narang・M，
LeeI）S，Surh LC and：Korneluk RG：Effectof the mytonic dystophy（DM）mutation on
mRNAlevels of the DM gene．Nature Genet
4（3）：233−238，1993．

5）Fu YH，Friedman DL，Richards S，PearlmanJA，et al：Decreased expression

参考文献

Of myotonin−PrOtein kinase messenger RNA

1）YeMH，Sait0−0haraFandIkeuchiT：Highand proteinin adult form of myotonic dys−

−reSOlution chromosome R−banding introphy．Science260（5150）：235−238．1993．

lymphoblastoid celllines by the combined6）Taneja XL，McCurrach M，Schalling・M，

use of cell synchronization and ethidium

Housman D and Singer RII：Foci of trinu−

bromide treatment．JpnJ Hum Genet，inCleotide repeat transcripts in nuclei ofpreSS．

myotonic dystrophy cells and tissues．J Cell

2）Kaneko X，Saito F，Sunohara N and
Ikeuchi T：Cytogenetic analysis of23Japa−−57−

Biol128（6）：995−1002，1995．

13）眼咽頭筋ジストロフィー：日本人2家系例の臨床・筋病理・遺伝子連鎖解析の検討

＊

誠志

榊

細
瀾
1
S

永部Bra

徳岡R

〇

で

肘裳

一

英

山平M

宇野R

研究協力者

安

藤

正

幸綿

D．Chateau＊＊＊＊G．A．Rouleau＊＊著書＊

は じ め に限咽頭筋ジストロフィー（oculopharyngeal mus−cular dystrophy：MIM164300）1）は1915年に
Taylor2）が脳神経核の障書による疾患として最初に記載し，1962年にVictorら3）が筋原性の疾患として命名した，常染色体優性の退伝性疾患である．一般に40歳以降に発症し，限瞼下垂と壌下障害を主徴とする．進行は非常に競徐で，発症早期から外眼筋麻痺を伴うことは稀であり，生命予後は比較的良好である4）．従来
French Canadianを中心に多数の白人家系例が報告されてきたが，他の人種には，筋病理学的に診断が確定した家系例は見出されていなかった．最近，カナダの研究グループにより，本疾患の候補遺伝子は心臓のaとβのmyosin heavy chainが存在する染色体の14qll．2−q13に局在していることが明らかにされた幻．
今回私共は，熊本と静岡に日本人の本症家系例を見出し，欧米の白人家系例と比較検討するため，臨床・筋
病理・遺伝子連鎖解析を行ったので報告する．
対象および方法
熊本の家系（図1A；発病者3世代5例，静岡の家系（図18；発病者4世代25例について臨床的比較検討を行い，両家系の詳細な家系調査を行った．
筋病理学的検討は，熊本の発端者では生検で得られた三角筋に加え，喚下降書の治療のため施行した輪状咽頭筋切開術の際，同意のもとに得られた両側の輪状咽頭筋と胸骨舌骨筋，および静岡の発端者の生検で得られた上腕二頭筋を用いて行った．
遺伝子連鎖解析は，同意の得られた静岡の家系について，発病者と非発病者の計33例の末梢血20mlよりゲノムDNAを抽出し，14qll．2−q13のマイクロサテラ＊熊本大学医学部附属病院神経内科＊＊熊本大学医学部第一内科＊＊＊静岡赤十字病院神経内科＊＊＊＊lNSERM U．153，France

イト多型DNAマーカーの，D14S50，D14S283，
Genethonl，MYH7．24，およびMYH7．1を用いてハプロタイプを検討した．二点連鎖解析には LINK−
AGE5．1packngeのMLINK programを用いた．
結果本症の日本人2家系の発病者は30例（男性14例，女性16例）で発症年齢は40歳以降，平均年齢は58歳であった．熊本の家系例は眼瞼下垂，静岡の家系例は
囁下降書が初発症状であったが，発病後10年以上経過した症例の病状に有意な差は認めなかった．明らかな外眼筋麻痺や四肢遠位筋の萎縮をきたした例はなく，
頸部屈筋と四肢近位筋に軽度の筋力低下を認めた．血清CXは熊本の家系例では正常で，静岡の家系例では軽度ないし中等皮上昇していた．筋病理学的には，筋力低下が軽度であった三角筋と上腕二頭筋では，筋線経の軽度の大小不同に加え，少数のrimmed vacuoleと小角化線経が散見されたが，両側の輪状咽頭筋では筋線経の基本構築の崩壊，著明なfibrosis，および問質の月旨肪浸潤を認めた（蓑1）．壊死・再生線経はわず
かに確認された程度であった．電顕では，本症患者の骨格筋筋線維核内にのみ見出されるとされている
intranuclear tubulofilamentous inclusions（rrI）が三角筋で3．5％，胸骨舌骨筋で5％，輪状咽頭筋2％，
上腕二頭筋で3％認められた（図3）．静岡の家系例における遺伝子連鎖解析では，用いた14番目の染色体長腕（14qll．2−q13）のマーカーすべてに対して組換え率0＝0．00，0．01，0．002で最大lod scoreは3以上であり，日本人の本症家系例の候補遺伝子もFrench Cana−
dianの家系例と同様に14qll．2−q13上に存在することが明らかとなった．また，両家系間に共通祖先はなく，いずれも日本人以外の祖先との関連は調査した限りでは確認されなかった（嘉2）．また，ハプロタイプ解析では，発病者はすべて共通の本症遺伝子領域のハプロタ
イプをヘテロに有していた（図2）．

＊＊＊＊＊McGiHUnivor8ity＆MontroalGenOr81トbspit机C肌da

−58−

咽・‖

●○

コl；Hl＋Jq

4137

10

27

量†糾

■11●

B

図1熊本（A）と静岡（B）の家系図．矢印が発端者，黒塗印が発病者，斜線印が死亡者である．Anticipationは静岡の家系で軽度みられる．

一■ ︳1t〇一一ulH I●●一事叫︐1一帖−1Ⅶ●●

1●8一■116
MJ折卜1不日■一H●∵t■肛︸MI12−⁝⁚⁝⁚⁝⁚

抑m7．1

柑 tOrは書目−佗一博−

m 7．24

け 叩丁︐2■
恥Ot●▼●

pllS50
D14S283
Cen亡th0111

図2 静岡の家系のハプロタイプ解析（耗面の都合で一部を示す）．各マーカーのアレルを適宜数字で示し，限咽頭筋ジストロフィー遺伝子領域のハプロタイプを枠で囲んである．一人の危険保因者（39歳）を除き，発病者はいずれも共通の本症遺伝子領域のハプロタイプをヘテロに保有している．
考察
なわち，発症年齢は40歳以降で，高度の眼瞼下垂と囁
日本にも，French Canadianをはじめとする白人下降啓を呈するも外眼筋麻痔は伴わず，四肢筋の降等の眼咽頭筋ジストロフィーの家系例と酷似した臨床像も近位部に軽度認められる程度である点など，欧米家を呈する家系例が存在することが明らかにされた．す系例と共通した臨床症状の特徴を呈した．また，熊本−59−嘉1日本人眼咽頭筋ジストロフィー患者の筋病理所見
筋病理

熊本の発端着静岡の発端青胸骨舌骨筋 輪状咽頭筋
右 左
右
左

上腐二譲筋
左

三角筋
右

＋
十
十

NE

＋

⁝ここ

2

十

十

＋

＋

＋

◆

︸

＋

◆

十

In吐血ddnbmi8

十Smdl址g山akdnkm
mmm vv cc ooeS

十L8SSdnh澗

⁝二二

光貼所見、

電級所見
ITl（％）

3．5

5

NE

3

−：なし．◆：軽度，十十：中等度．＋十十：著明
rrI：inuanuclea∫lubulorua皿enblはbく11はions．NEnOtC血d

表214qll．2−q13マーカーとOPMD−静岡との二点連
鎖解析
マーカー

OPMD：∝uLopharynBeaImuscuhrdysLrophy
各マーカーはC8nlmme代価からlモlome代償の順に列記している

1605鎚0884
21・121．
32
38
70
71
9
5

糾72436159

8118833611

9127917052
43244
0036919786

09
54
．078
770

175
14
5．
9679

2663230487
5▼3354

D14＄50
D14＄283
Genethonl
MYH7．24
MYH7．1

組み替え牽く○）0．00 0．010．02 0．03 0．04 0．05 0．1 0．2 0．3

図3 熊本の家系（発端者）の骨格筋筋線線内ITI．
A．汀Ⅰの電顕像（胸骨舌骨筋，×15，500）
B．ITI（A）の高倍率電顕像（胸骨舌骨筋，×110，000）．外径8．5mm，内径3mm，長径0．25FLmまでの無数のフィラメントの集束像がみられ，しばしばtangleやpalisadeを形成している．
人以外の人種において，筋病理学的にも本症の診断が確定した最初の症例である．従来French Canadianと静岡の各発端者の骨格筋に，欧米の白人家系例と同様の性状のITIを電顕的に証明し得たことから，本症の診断は確実である．lTIの出現頻度は3〜6％と低く，構成蛋白の性状も不明だが4），今回検索し得たすべての骨格筋の筋線推核内に確認できたことと，これまで
本症以外の疾患や正常対照群では見出されていないことから，現時点では本症に特異的であり，診断には不可欠のものと思われる．これまで三角筋をはじめとする四肢筋，外眼筋，上限除草筋，および槍状咽頭筋で確認されていたが4），今回新たに胸骨舌骨筋においても見出された．本症の発病者が両親である患者，すな
わち本症のホモの発病者が最近2家系で3例見出され
たが，いずれも発症が20歳ないし30歳代と早く，汀Ⅰが10％前後と約2倍高頻度に認められたこと6）7）は汀Ⅰの意義を考える上で重要と思われる．
ITIが証明された本症確実例は，これまで12カ国の白人社会で確認されており，ITIが証明されてない本症疑い例が4カ国の白人社会と1黒人社会8）で報告されている．疫学的に注目される点は，本症の白人社会における有病率が地域により著しく異なっていることである．一般に，フランスでは20万人に1人9），カナダのケ
ベックのSaguenay−Lac−S仁Jean地域では7500人に1人10），ウズベキスタン共和国から移住してきた
Bukhara地域のイスラエル人では625人に1人7）とされている．今回我々が検討した日本人2家系例は，自の本症家系例は，すべて1夫婦の共通祖先に由来すると推定されているが，我々の日本人2家系例との関連は，調査した範囲では認めなかった．しかし，遺伝子連鎖解析にて，日本人家系例においても本症の候補遺伝子
がFrench Canadianと同じ14q11．2−q13に局在することが確認されたことから，今後さらに詳細なハプロタイプの分析を行い，白人家系例と共通の祖先を有するのか否かを遺伝子レベルで解明する必要がある．
Braisら5）は，本症の候補遺伝子として，心臓のαとβのmyosin heavy chain遺伝子を最も有力視している．両蛋白は心臓で最も多く発現しているが，前者はラットの外眼筋とウサギの嗅筋でも発現し，後者はヒトの8low twieh fiberにおいても発現している点では注目される．しかし，これらの遺伝子変異は，一般に神経筋症状を呈さない特発性肥大牲心筋症で報告されているにすぎないし，限咽頭筋ジストロフィーでは心筋は通常侵されない4）など矛盾するところもある．
いずれにしても本研究により，本症が自人以外の人種にも確実に存在することがで明らかにされたことは
疫学的，人類学的にも非常に重要な意義を有すると思
われる．
文

献

1）McXusick VA，Francomano CA，Antonarakis
SE and Pearson PL：Mendelianinheritance−60一

in man：a Catalog of human genes and ge−
netic disorders．（11th ed），Baltimore，The

Jolms Hopkins University Press，1994，

A more severe form

pplO40−1041．

muscular dystrophy（OPMD）is d∝umented
in8genetically proven homo2：ygOuS Patient2）Taylor EW：Progressive vaguSglossopha−ryngeal paralysis with

（abstract）．Neurology

ptosis：a COntrilmーtion to the group offamily diseases．J Nerv
Ment Dis42：129−139，1915．

Of oculopharyngeal

45（Supp14）：A243，

1995．

7）Blumen SC：Oculopharyngeal muscular dys−

Oculopharyngealmuscle dystrophy：a famil−

trophy（OPMD）among Bukhara Jews（ab−stract）．Abstract of the lstInternational

ial disease oflatelife characterized by

Symposium on Oculopharyngeal Muscular3）Victor M，Hayes R and Adams RD：

Dystrophy4，1995．

dysphagia and progressive ptosis of the eye−

1ids．New EnglJ Med267：1267−1272，1962・
4）Tom6MS and Fardeau M：Oculopharyngeal
musculardystrophy．In

VMyology，2nd8）Rubin FH and Cross SA：Oculopharyngeal
dystrophy（letter）．ArchIntern Med141：
1103，1981．

ed（Engel AG，Franzini−Armstrong C，eds），
New York，McGraw−Hill，1994，pp1233−

9）Brunet G，Tom6

JM and Fardeau M：Dystrophie musculaire
oculopharyngee：reCenSement des familleS

1245．

franGaises et etudegenealogique．Rev Neurol5）Brais B，Ⅹie Y−G，Sanson M，et al：The

146：425−429，1990．

oculopharyngeal muscular dystrophylocus
maps to the region of the cardiac aandmyosin heavy chain

FMS，Samson F，Robert10）TremblayTTymczuk S，MathieuJ，Morganβgenes on chromosome

14qll．2−q13．Hum MoI Genet

4：429−434，X，

et al：Etude genealogique de la

dystrophie oculo−Pharyngee au Saguenay−

Lac−St−Jean，Quebec，Canada．Rev Neurol

1995．

6）Brais B，BouchardJ−P，Ⅹie Y−−G，et al：

148：601−604，1992．

−61−14）Par虔myotonia congenita日本人1家系の遺伝子解析
小林

研究協力者 越 智 博

卓

郎＊

文＊

山

田

猛＊

は じ めに最近，ion channel遺伝子のクローニング，連鎖解析に続く遭伝子変異の発見により，ion channelの機能異常によっておこる疾患群がion channel病として理解されるようになってきた．骨格筋Na◆Channel遺伝子（SCN4A）の異常に基づく疾患として，para−
myotonia congenitaC）MC），hyperkalemic peri−
Odic paralysis，myOtOnia fluctuans（potassium−
aggravated myotonia）の3疾患が知られている．
PMCは寒冷刺激や反復運動によって誘発，増強されるmyotoniaあるいは脱力を示す常染色体優性遺伝の疾患である．PMCの日本人一家系について，遺伝子学的検索の結果を報告する．

症

症例2
図1家系図

例

発端者（症例1）は42歳女性で，父親と第一子（症例2）に同様の症状を認めた（図1）．7歳頃より，冬場になると四肢のこわばりが出現するようになり，時には脱力を自覚することもあった．寒さの厳しい時には，眼が聞きにくい，喋りにくいということもあったか，いずれの症状も身体を暖めることで軽快した．現症として顔面，頸部に軽度の筋力低下を認めた．両側眼輸筋にmyotoniaを認めたが，grip myotonia，PerCuS−＄ionmyotoniaはいずれも陰性であった．その他神経学的には異常所見を認めなかった．血液生化学検査は
CX，Ⅹを含めて異常を認めなかった．電気生理学的検査では，室温（皮膚温33℃）安静時にて，短母指外転筋よりmyotonicdiSChargeを認め，反復運軌 寒冷
刺激（皮膚温＜20℃）による増強効果を認めた．
方法・結果
本家系についてSCN4A遺伝子の検索を行った．従来PMCではexon22，24内の点変異が報告されているためカ〜3），末梢血白血球より抽出したDNAを用い，Ptacekら2）の報告に従いexon22，23，24の領域を
PCR−SSCP（singlestrand conformation polymor−

phism）法により解析した．その結果，eXOn22に正常

C

C

23
P

C

24
P

G

Normal PatientA T C G A T C

癖癖蝕

叫

廟

深藤

波
A

国2

B

PCR−SSCPによる解析．A：eXOn22に正常対照とは異なるバンドを認める（＊）．C：正常対照，P：患者．B：eXOn22の領域の塩基配列．患者において3938番C→T（図では相補鎖のためG→A）変異を認める．

対席とは異なるbandを認めたため（図2A），eXOn22の領域の塩基配列を決定した．3938番目にC→T（図28では相補鎖のためG→A）への変異を認めた．他の家族については，miSmatChed primerを用いたPCR−RFLP（restriction fragmentlengthpolymorphism）法により解析を行った．Mismatched primer（N22−5 m：
5＊九州大学医学部脳研神経内科

22
P

AGGGGGGA−AAGACATCTTTACCA3

mer（N22−3

ー62−

−2：5

）と

pri−

AGGTCTGTACCTGGGGCCG3）を用いてPCRを行い，ヽ113bpのPCR産物を得た．得られたPCR産物においてC→Tへの変異がある場合

文

献1）McClatchey AI．Van den BerghP，Pericak−

ぶ抄Ⅰ認識部位を生じ，5秒Ⅰ消化により92bpと21もpの断片が得られる（図3A）．家系解析の結果，症例1と2のみにヘテロの変異を認めた（図38）．

Vance MA，et al：Temperature−SenSitive
mutationsinthe cytoplasmicloop reg・10n Of
the skeletal muscle sodium channel genein
ParamyOtOnia congenita．Cel168：769−774，
1992．

2）Ptacek LJ，George AL，Barchi RL，etal：MutationsinanS4Segment of the adult
Skeletal muscle sodium channel cause
N22−3

−2

一一一

paramyotonia congenita．Neuron8：891−897，W欝騨蝉警警1992．
3）Ptacek LJ，Gouw L，′ⅩwiecinskiII，etal：Sodium channel mutationsin para−
myotonia congenita and hyperkalemic peri−

図3

Mismatched primerを用いたPCR−RFLPによる解析．A：C→T変異を認める場合，5秒I
Siteを生じ，増幅されたPCR産物（113bp）は92bpと21bpの断片に切断される．B：症例1と2にヘテロの変異を認める．

考

Odic paralysi鼠Ann Neuro133：300−307，

1993．

4）PlaSSartE，ReboulJ，Rime CS，et al：Mu−
tationsinthe muscle sodium channel gene
（SCN4A）in13French families with hyper−
kalemic periodic paralySis and para−
myotonia congenita：Phenotype to genotype

棄

COrrelations and demonstration of the pre−

PMCは骨格筋Na十cbamel遺伝子の異常に基づく疾dominance of two mutations．EurJ Hum

患であり，これまでにGly1306Val，Thr1313Met，Leu1433Arg，Arg1448Cys，Arg1448Hisの5つの変異が報告されている．今回我々が検索した家系は，
Thr1313Metの変異を有していた．この変異はフラン5）MeyerXleine C，Otto M，Zoll B．et al：

Genet2：110−124，1994．

ス人家系において報告が多く4），一方Arg1448Cys，
Arg1448Hisはドイツ人家系において報告が多い5）．
Thr1313Metの変異部位は，塩基配列では変異のhot
SpOtとされているCG配列を構成しており，本変異は人種を越えて広く存在するものと考えられる．

−63−

Molecular and genetic characterisation ofGerman families with paramyotonia con−genita and demonstration of founder effectin the Ravensberg families．

的：707−710，1994．

Hum Genet15）Emery−Dreifuss型筋ジストロフィーの分子遺伝学的研究
荒

研究協力者

目

永

野

河

田

純

畑

喜

一＊

敦岬

塚

原

也榊

岡

田

俊

了

文＊

小

川

恵＊

三＊＊＊＊

的

表

EDMD症例の臨床所見まとめ

Emery−Dreifuss型筋ジストロフィー（EI）MD）は通

家系 1

常Ⅹ染色体性劣性遺伝形式をとり，臨床的に（1）病初期より認められる肘・アキレス腱・後較部の拘縮，（2）

症

1

2

3

別

3 0 ・M

2 7 ・M

15 ・M

筋 萎 鉛 ・筋 力 低 下

十

＋

＋

関 五日 句 拉

＋

＋r

＋

心

＋

年

scapulo−humero−PerOneal型の筋萎縮と筋力低下，（3）重篤な伝導障害を伴う心筋症を3主徴とし，Becker型とは明らかに異なる，良性の経過を示す進行性筋ジストロフィーである．
1966年EmeryとI）reifussが最初の1家系を報告し，1979年Rowlandにより疾患概念が確立されて以後，多型解析によって本症の疾患遺伝子座はⅩ染色体短腕

家系 2

例

齢

筋

・ 性

症

＋

＋

心電 図異 常 （A V ブロ ッ ク）

＋

＋

＋

筋

有

r無

有

無

有

有

生

検

ペー ス メー カー挿 入の遠位側Ⅸq28）に存在することが知られていた．
Bioneらは1994年，STA geneに変異を来した
EDMD患者5例を報告し，疾患遺伝子を明らかにすると同時に，この丑伝子産物をemerinと命名した．さらに1995年にはβrA遺伝子の全ゲノム配列を報告した．

検討が加えられた．
遼伝子解析は次のように行った．生検筋または末梢grA遺伝子はⅩq28に存在し，6個のexonからなる
2147bpの遺伝子である．そのmRNAの全長は1218ntSで，762ntsのopen reading frame（ORF）を有している．遺伝子産物emerinはserine−richな254
アミノ酸からなり，C末端側に膜質通domainと想定

スミドDNAの精製（Qiagenカラム）を行い，塩基配列を決定した（Autoread se9ueicing kit・A・L・F・
Autosequencer，Pharmacia社）．
ゲノムDNAについては全例末梢血リンパ球を用い，される部分を持つ・．これらのことからemerinはN末端側を細胞質に向けた，新しいanchor proteinと考えられている．
今回我々は日本人EDMD2家系3症例についてβrA産物を制限酵素β／αⅠで消化し変異の存在確認やポリモルフイズムの検討を行った．

退伝子を解析し，共通の変異を見出したのでこれを報
告する．

結
果
RT−PCR：いずれのlaneにおいても想定される大きさ

対象及び方法
対象はEDMD症例3例を含む2家系5例と健常日本
人17例の合計22例である．表に今回検索したEDMDのバンド，すなわちSTA gene regionの858bp，β−actinの348bp，筋特異的creatine kinaseの414bpのバンドが認められた．しかしSTA遺伝子の大きな欠損や発現の異常は認められなかった（図1）．
シーケンス結果：EDMD症例3例ともにゲノムの塩基症例の臨床所見のまとめを示す．このうち家系1の症
例1と2は兄弟であり，この家系では両親に対しても＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究粛一部＊＊東京医科大学内科学第三購座＊＊＊金沢医科大学神経内科＊＊＊＊順天堂大学医学捗心臓血管病理学研究室

血液リンパ球を用い，AGPC法によりtotal RNAを抽出した．ORFを増幅するようにプライマーセットを設定してRT−PCRを行った．増幅産物をクロpニング（TAクローニングキット，Invitrdden社）の後，プラ

プライマーセットをexon6の一部（354bp）を増幅するように設定し，同様の方法で行った．さらにこの増幅

番号1735番塩基にGからAへの点変異を認めた．
家系1の母親では変異を含むalleleと正常なalleleの両者が認められた（図か．
ゲノムDNAの検討：症例及び健常コントロール全例で変異部分を含む354bpが予想される大きさのバントと−64−

はcDNAのそれと完全に一致していた（結果省略）．
β／∂lによる消化：変異により新たに月′αⅠの制限酵
素切断部位が生じ，健常者にある278bpのフラグメン
トは症例では191bpと78bpに分かれることから変異の存在が検討された．家系1の母親ではこれら3つのバ

bp
一一858

ンドが存廃し，heterozygous asymptomatic car−rierであることが確認できた．健常コントロール17例
ではこの短いバンドは存在しなかった（図3）．

←414

考

■−348

案

今回の症例ではSTAgene regionのRTLPCRで，予想された858bpのフラグメントが同定されたことか

図1Emerin，βTaCtin，Creatine kinaseの発現遺伝子（mRNA）のRT−PCR法による検討

ら，SrA遺伝子に大きな欠矢や重複は存在せず，小さな欠損や挿入や点変異が存在する可能性が示唆された．

Emerin（1anel，6），β−aCtin（lane7，8），
筋特異的CK（9，10）に対するRT−PCR．それぞれ858bp，348bp，414bpのバンドが増幅される．健常対照（1anel，2，7，9）と症例1（1ane5，8，10）は生検筋を，これ以外は末梢血液リンパ球を用いた．対照としたβ−
actinと筋特異的CXがほぼ同じ程度に増幅され，またlane 2のreverse trans−
criptaseを除いたものではバンドを認めないことからDNAの混入が否定される．

そして，このPCR産物のシーケンスの結果，我々は独立した2家系のEDMD症例3例に，grA遺伝子1735
番塩基のGからAへのナンセンス突然変異を認めた．
また家系1の母親では正常なalleleと，変異を含むaLleleの両方を認め，heterozygOuSな無症候性キャリ
アーの存在を明らかにした．さらに制限酵素即αⅠによる消化実験から，変異の存在確認やキャリアー診断

1

2

ト2rm山atedaHe勅CCCGCTC工⊆邸GCCAGC

CCCGCTCI塾⊆PGCCAGC
N

lH patien11

ル2patient2

CCCGCTq巡GCCAGC CCC（〕CTCIAg3GCCAGC
の

図2

n」
ヾ
トー

CCCGCTCT BGGCCAGC

ミぎnormalsub」eCl

CCCGCTC塞きGGCCAGC

卜ヽ
N
ト＿

家系1の変異部分周辺のgrA遺伝子の
シーケンス

図3

症例1（Ⅱ−1）および2（Ⅱ−2）の1735番塩基には同じGからAへの変異を認める．母親（Ⅰ−2）は変異alleleと正常alleleの両者

BfaI digestionによる検討
EDMD症例（1ane5，6）では変異により新たに
即αⅠの制限酵素部位が生じ，191bpと987bpのフラグメントを，また父親（lane3）
及び健常対照（男性：lanel，女性：lane2）
では278bpの正常フラグメントのみを有する．
これに対し母親（lane4）では変異フラグメン
トと正常フラグメントの両者を有している．

を有するheterozygousなcarrierである．
父親（Ⅰ−1）と健常対照では正常な配列のみ
を認める．

−65−

を行い，さらにこの変異がポリモルフイズムによるものではない可能性も示した．このように日本人のEDMD症例においてもSTA遺伝子に変異が見出されたことは基礎及び臨床造伝学的に重要であろう．
STA遺伝子がコードするタンパクemerinは254ア
ミノ酸からなり，その226番目のアミノ酸はトリプト
ファンである．しかし本症例では変異によってこのト
リプトファンコドン（TGG）はナンセンスコドン（TAG）へと変化した．今回変異が認められた場所はemerinの膜貫通domainの中の上流に位置することか

1ar dystrophy．Ann Neuro15：111−117，1979．
3）Emery AEH：Emery−Dreifuss syndrome．J
Med Genet26：637−641，1989．
4）Bione S．et al：Identification of a novel X−
1inked gene responsible for Emery−Dreifuss
muscular dystrophy．Nat Genet8：323−327，
1994．

5）Cabine M，et al：Identification of novel mu−
tations in three families with Emery−

Dreifuss muscular dystrophy．Hum MoI
GenetlD：1853−1857，1995．

ら，これらの症例では膜貫通domainの大半を含むC
末端側の29アミノ酸を欠いたタンパクしか合成されず，
このことが発症に深く関係していると考えられた．

6）Bione S，et al：Identification of new muta−
tionsin the Emery−Dreifuss muscular dys−
trophy gene and evidence for genetic heter0−

文

献

geneity of the disease．Hum MoI GenetlO：

1）Emery AEH and Dreifuss FE：Unusual typeof benign X−linked muscular dystrophy．J
NeuroI Neurosurg Psychiat

1859−1863，1995．

7）Nagano A，et al：A novel nonsense muta−

29：338−342，

tion of the STA jenein patients with Emery−Dreifuss muscular dystrophiy．AmJ Hum

1966．

2）Rowland LP，et al：Emery−Dreifuss muscu−

ー66−

Genet57：A222．1995．

16）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）の臨床的多様性と遺伝子診断
納

明尚

蝉

宏

梱

榊

留切

吉堀

■

郎敏男

▲事

稗

蓑1今回検討したFSHDとその家族のサザンプロット
分析の結果
対象

︶

8

︶

7

︵

︶

く

9

％％％

′．ヽ

16家系

孤発例
若年発症例
難圧．眼底血管走行異常の合併
呼吸不全の合併
広帯型箭ジストロフィ頸†以例

35 8
9 9 8

F SHD
家系例

異常丘oRl断片を示す例／検討症例
けヴ仔−仔二や23 9 632′／ ／ ／ 60 2 8
3 2＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊国立療養所南九州病院＊＊＊国立療養所沖穐病院

逸秀敏

榊

方法および結果
対象は，FSHDが疑われた16家系23例，孤発例9例
およびその家族21例の計53例である．擢患者32例（男141札 女18例）の平均発症年齢は19．0±16．9歳であり，歩行不能例の平均歩行不能年齢は基．7±10．9歳であった．32例中，若年発症例6例，難聴，眼底血管の走行異常の合併を2例，呼吸不全の合併を3例，肢帯型筋
ジストロフィー類似の筋萎縮を5例に認めた（表1）．家系例について親子間での発症年齢，歩行不能年齢を比較検討したところ，子の発症年齢および歩行不能年齢が有意に若年化していた（表2）．
筋生検は21例に行い，19例に筋原性変化，2例に神経原性変化を認めた．筋原性変化を認めた19例中，血管周囲への細胞浸潤およびlobulated fiberをそれぞれ5例に認めた．
FSHD擢患者32例，その家族21例および健常成人

口永崎＊

は じ めに
顔面扁甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）は，顔面，
肩甲，上腕近位部の筋萎縮に始まり，徐々に下肢筋，腰帯筋群へと降雪が広がる常染色体優性遺伝の筋疾患である．家系内または家系間でその臨床症状が多様性であることが特徴のひとつであり1〜3），家族性典型例の診断は容易であるが，非典型孤発例では診断が困難
なことがある．FSHDの原因遺伝子は，いまだ不明であるが，第4染色休長戊末端部の遺伝子マーカーとの連鎖が報告されている4）．この3年間，FSIiDの臨床的多様性と遺伝子異常の関連を明らかにするために第4染色体長腕の遺伝子マーカーを用いて，臨床症状と遺伝子異常の関連について検討してきた．第4染色体
長腕の遺伝子異常と臨床症状に，一定の関連を認めたが，この遺伝子マーカーのみでは説明困難な点が多く，
FSHD原因遺伝子の解明が待たれる．

樋福松

＊

法之輝

正宏峰

川城藤

中岩斉

研究協力者

2／2例
3／3例
5／5例

FSHDの家族

3／21例

駿常成人

0／30例

去2FSHD家系例の発症年齢と歩行不能年齢の比較
親の発症年齢32．0±17．0歳
子の発症年齢11．2士．4．5歳］

P三0．004

規の歩行不能年邑861．8±15．2歳以上
子の歩行不能年齢24．0±11．5歳

30例より，同意を得た上で採血を行い，全血よりI）NAを抽出した．抽出したDNAを制限酵素EcoRI
にてdigesion後，0．5％アガロースゲルにて電気泳動
し，ナイロン膜に転写した．そのナイロン膜をα−32P−dCTPにてラベルしたプローブp13E−11とハイプリグ
イゼーションし，洗浄後，−70℃にてオートラジオグ
ラフィーを行った．その結果，羅患者32例中30例で30kbより短いgcoRI断片が検出された（図1，表1）．
罷患者の家族21例中，無症状の母親2名と無症状の娘
1名の計3例に擢患者と同じサイズの異常バンドを認めた．また，若年発症重症例ほど，より短いgcoRI断片を示す傾向がみられたが（図2，衷3），家系内での
助oRI断片のサイズに変化は認められなかった．30kb

−67−

表3

今回検討したFSHD32例の臨床的特徴と遺伝子分析のまとめ

血oRl断片 症例数のサイズ（kb）

＜20
20−22

9
12

男女比

平均発症
年齢

家族歴 網膜血管
走行異常

4：5

8．2歳

6／9

3：9

26．2歳10／12

2／9

0／12

難聴

歩行
筋生検所見
不能 筋原性 神技原性

備考

6／9

呼吸不全2例
腹帯型1例

2／9

6／6

0／6

0／12

2／12

7／7

0／7

肢帯型1例

1／7

4／4

0／4

呼吸不全1例
第9短腕欠損例1例
肢等型3例

23−25

7

4：3

21．1歳

5／7

0／7

1／7

28−30

2

2：0

23．5歳

1／2

0／2

1／2

0／2

2／2

1／2

0／2 1／2

0／2

1／2

1／2

2

1：1 27．0歳 1／2

霊岩U0−0 竺苫

︻叫

癖 紳

︻．−

靡脚

−

一瞥

霧繰

編臓器懸
＝ニニ

鵜

＼一／／姦竹グ

kb48．33292−
1柑
22191

Age

聯闊瀾攣

75

后票彗

5（）

「

25

ここ

●

■■

●●
●

■●●
●●
●
●

●

0

乃

●●●●

●●
●
●
●

0

1■■
¶−■

−」坤

・td■

＜20

20−22

23−30

15

20

25

30

kb

Size of EcoRl fragments

図2gcoRI断片サイズと発症年齢の関連

図1プローブp13E−11を用いたFSHDのSouthernblot分析（gcoRIdigestion）
より短いgcoRI断片が検出されなかった2例中1例は，家族発症で筋生検にて神経原性変化を示した．他の1例は，血管周囲に軽度の細胞浸潤を示す孤発例であった．なお，健常成人30例には，30kbより短いgcoRI
断片は検出されなかった（義3）．
考案

今回の検討から，第4染色体長腕末端部のプローブ
p13E−11にて異常EcoRI断片が検出されるFSHDの臨床病型は，進行性呼吸不全から，緩徐進行性の肢滞型
筋萎縮症まであり，FSIIDにおける家系内または家系間での臨床症状の多様性が確認された．また，EcoRI
断片のサイズが小さい（欠矢が大きい）ほど，臨床症状がより重症である傾向がみられたが，家系内の茸coRI
断片のサイズは，臨床症状の重症度に関わらず一定であった．FSHDの家系内で，臨床症状の表現促進（an−ticipation）が存在するか否かは，論議のあるところであるが，少なくともわれわれの検討した例では，発症年齢および歩行不能年齢に表現促進が示唆された．
FSHDの筋病理所見では，血管周囲の細胞浸潤例があることが知られているが，われわれの検討でも，炎症細胞の血管周囲への浸潤を24％に認めた．多発筋炎との鑑別が問題となる場合があり5），鑑別診断に際してはFSHDの遺伝子異常の検討が必要であろう．一方，

第4染色体長腕遺伝子マーカーと連鎖しないFSHD家
系例もあり，FSHDが臨床的にも遺伝学的にも多様であることが示された．FSHDの病態は不明であるが，網膜血管病変や生検筋での血管周囲へのリンパ球浸潤が認められることより，本疾患の少なくとも一部の例
では，炎症（血管炎鋸こ関与する異常が存在することか示唆されている6）．FSHDの臨床症状の多様性を，今回用いた第4染色体長腕の遺伝子マーカーにて示され
るβcoRI断片の欠失サイズのみで説明することは困難であり，今後のFSHD原因遺伝子の解明が望まれる．
謝 辞：プローブp13E−11を供与いただきました
Leiden大学R．R．Frants先生（The Netherlands），ならびに貴重な症例をご紹介いただきました大分医科大学第三内科：上山秀嗣先生，国立療養所徳島病院：乾俊夫先生，大分県立病院：有村仁志先生に深謝いた
します．
文

献

1）Lunt PW and Harper PS：Genetic counse1−
1ingin facioscapulohumeral muscular dy8−

trophy．J Med Genet28：655−664，1991．
2）Nakngawa M，HiguchiI，Yoshidome H，etー68−

al：Facioscapulohumeral muscular dystro−
phy：phenotypic diversity and genetic abnor−

lar dystrophy．Nature Gent2：26−30，1992．

mality．Acta NeuroIScand（in press）

5）Munsat TL，Piper D，Cancilla P and

3）Ueyama H，Kumamoto T，Mita S，et al：
Facioscapulohumeral muscular dystrophy

Mednick J：Inflammatory myopathy

with chromosome

9p deletion．NeuroIogy

facio−SCapulohumeral distribution．Neuro1−4）Wiimenga C，HewittJE，Sandkuijl LA，etogy2：335−347，1972．
6）Fitzsimons RB：Facioscapulohumeral dys−

（h press）．
al：Chromosome

4q DNA rearrangements

trophy：the role ofinflammation・Lancet

鋤：902−903，1994．

associatedwith facioscapulohumeralmuscu

−69−

with

17）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）の遺伝子領域の構造と遺伝子診断
荒

研究協力者

目

宋
李

畑

一＊

泥 東＊ 後 藤 加奈子＊済 賢綿 佐 橋
功綿的

顔面扁甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）は，現在
世界各国のFSHD研究者グループが互いに協力して
hternationalConsortiumを組織し，原因遺伝子の同定と病態機序の早急な解明を目指している．FSHD
は，顔面と上肢帯〜腕の筋肉が主として障著される常染色体位優性遺伝形式の進行性筋ジストロフィーで浸透度は高い（20歳までに95％）．進行すると筋病変が下肢帯〜下肢にも及び，約20％の患者が40歳までに車椅
子生活を余儀なくされる．また，高率に網膜症や神経性難聴を合併する．さらに，臨床的表現型の著しい差
異が家族間のみならず，家族内においても認められたり，筋原性以外に神経原性変化を呈する症例も知られている．本研究課題では，このような医学的並びに社会的要請に応えるペくFSHDの遺伝子領域の構造解析と遺伝子診断法の確立を図ることを目的としている．
方喜

解析を検討する．FSHD関連遺伝子のクローン化には，
コスミドC51とpSMlおよびFSHD患者由来のgenomicI）NAlibraryからプローブpFR−1，p13E−11を用いてこれらをスクリーニングし，クローンを得る．FSHD退伝子領域の塩基配列を決定し，DNAの構造を明らかにする．FSHDの検索対象は52家族（unrelated：家族性29，孤発性23）である．さらに，
このうち40家族についてはEcoRI断片内に存在する
3．3kb gp几Ⅰ反復配列部分内の反復ユニット数の定量をLA（Long and Accurate）−PCR法にて実施する．
まず反復配列部分の両端の非反復部分の塩基配列を決定し，LA−PCR法に適当なプライマーを設計した．内部標準にはβグロビンの22．5kbを増幅するプライマーを用いた．増幅産物の同定には，SB結果から予乱されるサイズとの比較のはかに，反復ユニット内のホメオドメインを含むぶ亡比Ⅰ断片をプローブとしたSBを実施した．

法

我々が独自に開発したpFR−1（1．1kb）とFrantsらにより供与されたp13E−11（0．8kb）プローブを用いて，ゲノムのサザンプロット解析（SB）を実施し，ゲノムのEcoRI断片長を測定する（図1）．また，現在まで検討されているgcoRI以外に遺伝子クローン化に適当な制限酵素をgi几dⅢ，gp几Ⅰ等を用いたサザンプロット
4cen・・・

・・・D4S163TD4Sl39−D4F35Sl−D4FlO4Sl／D4Z4−FSHD………・qter
【

E

結

果

FSHD52家族のゲノムSBの結果は，これまでの報告を支持するものであった．すなわち，ヒト第4染色
体長脱の最も遠位マーカーであるp13E−11と独自に開発したpFR−1プローブによって，家族性FSHDと孤発性FSHDおよびそれらの両親と同胞については，患者の97％以上に疾患とcosegregateする短い（く公kb）
gcoRI断片を検出し，これとは逆に正常者群の鋸％で28kb以上の長い断片を検出した（図が）2）．そして，ゲノムのgcoRI断片内に存在する 3．3kb反復配列部分

E pFR−1p13亡一日
t−−（D4Z4）の反復ユニット（3．3kb旦叩Ⅰ断片）に欠矢が存在するものと考えられた．

E

−

−
K

K
4．9

K
3．3

K
3．3

K
3．3

K

K

K

K

K

3．3

3．3

3．3

3．3

3．3

1．3kb

図1Genomic mapofthe FSHD gene regionhq35−ter）＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究帯一部＊＊Tak訂8−Kor8aBiomodicaHnO‥S00uI＊＊＊愛知医科大学第四内科

臨床的には，表現促進hnticipation）の存在する可能性も示唆された．FSHDの臨床的重症度は同一家族
内でもきわめて多彩であることから，一般にantici−
pationは無いものと考えられて来た．しかし実際にはgcoRI断片のサイズの短い症例ほど，また親よりも子ほど，若年発症となる傾向が認められたし，さらに，
これまで知られているうちで最も短い（欠矢の最も大−70−

C O N T R O L （3 5 ）

3％
q
； 80：

F濫

3％

94％
ロ ロロ
⊂ Ⅰ：
エコ

ロ
1 7 ％●

されるFSHDの責任退伝子が，染色体上で相対的位置
関係を変えてしまい，結果として表現型を変え得るであろう．ただ，この場合，FSHDの責任遺伝子自体には突然変異は起こっていないので，遺伝子が元の位置

3％● ● ●●● ●●●●●…．
…．
」膿 ．
t t ●雷．
．
．
…t t ●．
徽雷．
．
．
．
．
．
徽 象．
．
… …‥
孤発性（
23）

： 9 1％

コ●■；1人図2に戻れば位置効果は解消する．その他，⑨Reciprocaltranslocationsも挙げられる．これはp13E−11／pFR−1
プローブの認識する（ホモロガスの）DNA配列が染色

9％

t
■
T
t ■ ■ ■雷 ≡■T ■ ■ ■T t ■
■
l
l
l
l
10
15
20
25
亡C ORl断 片の 大 きさ（kb ）■■＞2 8 kb

体4q35の他にYや10等にも存在する事実から推定さ
れている．

口；10人

次にFSHDの遺伝子診断にあたって留意すべき事柄

pFR−1プローブで検出されるgcoRI断片きい）10kbのgcoRI断片が検出された症例は，いずれも重症例であった2）〜4）．これら事実は，FSHDにおけるanticipationの存在を想起させる．なお，家族例
よりも孤発例のほうがgcoRI断片のサイズは短い傾向にあった，重症例ほど子供をもうける機会が少ない可能性が考えられる．なお，10kbのgcoRI切断断片をもっていたFSHD症例（2例）では，FSHD遺伝子領域の構造は同一であった．
先に述べたFSHD遺伝子関連領域の反復ユニット数の定量的解析の結果，FSHD40家族の LA−PCR解析
では，βグロビンがきちんと増幅されたものが31（77．5％）で，このうちGC含量の高い（73％）反復配列
部分が特異的に増幅されたものが 93．5％（29／31）であった．これは全体の72．5％（29／40）に相当した．なお，反復ユニット数では4リピートまで（ゲノムSBで20kbに相当；実測値では20−23kbの症例に相当）の増幅が可能であった．
考察および結論
今回の研究からFSHDに伴う染色体の異常（DNArearrangements）がp13E−11／pFR−1プローブによって検出されたことから，FSHDではこのプローブの近傍にゲノムDNAの異常が推定され，さらにFSHDに伴う染色体の異常は，EcoRI断片内に存在する3．3kb
反復配列の反復ユニット（3．3kb gp几Ⅰ断片）の欠矢に由来する事が判明した．すなわち通常の場合，正常者で7回以上みられる反復ユニットの繰り返し構造が，FSHD患者では1〜6回に減少していた．このようなことから，FSHD発病のメカニズムとして，まず①
Truncation deletionがあげられた．個々の3．3kb繰
り返し構造の中には，ホメオボックス配列が2つずつ含まれるが，この中でも特に重要な部分が欠失することによって，dominant negative effectが生ずる可能性が考えられる．つぎに，②Position effectがある．
FSHD関連遺伝子領域は，テロメアのヘテロクロマチ
ンに極めて近接していることから，位置効果を容易にがいくつか指摘された．このなかには，①遺伝的異質性（染色体4に連鎖しないFSHD家系），②プローブの限界（p13E−11／pFR−1プローブは染色体4q35のみならず，これとホモロジーの高い染色体Y，10等のDNA断片をも認識してしまう），③遺伝子組換えの存在，◎突然変異（頻度は，従来10％程度とされてきたが，実際にはもっと高く，〜30％以上であること），⑤胚細胞
モザイクkerminal mosaicism）の存在する可能性，⑥表現促進（anticipation）の問題等，遺伝相談にあたって解決すべき重要な検討課題が示された．なお，
ゲノムDNAの抽出にあたり，FSHDの遺伝子診断のように大きなDNA断片を扱う場合には，DNAに機械的な損傷を与えてSBの結果に修飾（アーチファクト）をきたさぬよう，DNAの扱いには格別の注意を払わねばならないことは特に強調された．
最後に，今回の検索からFSHb関連遺伝子領域のLA−PCR法による増幅は（DNAの保存状態が良好な場
合には），ゲノムSBで検出されるgcoRI断片長が23kbまでのFSHD家族で可能であることが判明した．
これは，我々の診断し得たFSIiD家族全体の84．6％に相当したことから，LA−PCR法は迅速なFSHDの遺伝子診断法となり得る方法であることが示された．
文献1）荒畑喜一，古川哲雄，佐橋 功他：染色体4q35−
qtcrマーカーp13E−11による顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの遺伝子診断．医学のあゆみ1糾：
865−866，1993．

2）Goto K，LeeJH，Matsuda C，et al：DNA
rearrangementsinJapanese facioscapulohu−
meral muscular dystrophy patients：clinicalCOrrelations．Neuromusc Disord5：201−208，
1995．

3）LeeJH，Goto K，Matsuda C，et al：Char−

受けやすいものと考えられる．この場合，近傍に想定−71−

acterization of a tandemly repeated

3．3kb

XpnI unitin the facioscapulohumeral mus−
Cular dystrophy（FSHD）gene regionon
Chromosome4q35．Muscle Nerve Supp12：S6

−S13，1995．
fragment4）LeeJH，GotoK，SahashiX，et al：Cloning
and mapping of a very short（10−kb）EcoRI−72−

associatedwithfacioscapulohu一meral muscular dystrophy（FSHD）．Muscle
Nerve Supp12：S27−S31，1995．

18）脊髄性筋萎縮症の遺伝子診断
斎 藤 加代子＊
＊

軒紆

＊
＊

穣堆

田本

榊

池森

＊

親

子養

有博

北出

＊

榊

河小

＊
■

木

美夫子

由幸真

岩山澤

自福大

研究協力者

緒
言
脊髄性筋萎縮症（SMA）は脊髄の前角細胞の変性に起因する筋萎縮と筋力低下を特徴とする常染色休劣性

方法
SMA患者16名を1990年のInternational SMA
Collaborationの分類に基づいて分類した．

遺伝病である．本疾患は発症年齢，到達運動能力，経過，重症度によって，3型に分類される．

患者の末梢血のリンパ球より調製したDNAを用いて，NAIP遺伝子についてはPCR増幅をして，SMN
遺伝子についてはPCR産物をDraIまたはDdeIで消化

1990年，SMAの遺伝子座が5qll．2−13．3の額域に局在することが明らかになり，異なる臨床経過を示す
3つの型が同じ遺伝子座に位置することが判明した．
各国でSMA遺伝子のクローニングを試みているが，いまだ，SMAの遺伝子そのものは得られていない．
1995年，5q13に局在するNAIP（neuronal apoptosis
inhibitory protein）遺伝子とSMN（survival motor
neuron）遺伝子の2つが候補遺伝子として報告され，注目されている．RoyらはNAIP遺伝子のexon5，6
がSMAI型の45％，Ⅱ型，Ⅲ型の18％に欠失していることを報告した．彼等はNAIP遺伝子が欠失することによって，神経細胞のアポトーシスが抑制されず，本疾患が発症しているものと推測した．一方，LefebvreらはSMN遺伝子のexon7，8がSMAの93％で欠失していたことを報告した．
私たちは，SMA患者16名について臨床的分類をし，NAIP遺伝子とSMN遺伝子における変異の検討をした．
lAI Royら結果SMA16名を1990年のInternational SMA Co1−
1aborationの分類に基づいて分類した結果，Ⅰ型が3例，Ⅱ型が11例，Ⅲ型が2例であった．
この症例16名のうちⅠ型に分類された1名において
NAIP遺伝子のexon5のホモ接合性の欠矢が認められた．この症例において同遺伝子のexon4，6については欠矢が認められなかった．
SMN遺伝子については16名中15名94％においてテロメア側のSMN遺伝子のexon7，8の欠矢が認められた．各々のセントロメア側のコピーについては全例バンドが検出された．欠矢が認められなかった1例はⅠ型に分類され，NAIP遺伝子にも欠矢を認めなかった症例であった．

fCanadal

SMNcopYt

して，NAIP遺伝子のexon4，5，6，SMN遺伝子のexon7，8の欠矢の有無を確認した．

」

考察
SMA患者16名について遺伝子診断を試みた．NAIP￠NAIP NAIP SMNsMA

く＝＝＞

く＝＝＞

l

】

遺伝子，SMN遺伝子両者ともに欠矢が認められた症
例は生後まもなくよりfloppyinEantを呈しており，
生後6カ月時に呼吸器感染後死亡すろという重症の経lB）LeIebvreら（FTanCO）￠NAIP SMNcopY
く＝＝＞

■

＿＿＿二J

過をとった典型的なSMAI型であった．また，NAIP
遺伝子およびSMN遺伝子両者ともに欠矢が認められ

SMNsHA NAIP
■

1

く＝＝＞

なかった症例は生後4カ月時より呼吸器管理を施行しているSMAI型であった．この症例の遺伝子変異は

HAIP：MU−OnlI叩叩tP山一lnhlbltorY pl01●hSHN；turVlY■l motor n●urOn
CoJl．γOL dOJ■何日rrIJ．柑9∫＊東京女子医科大学小児科＊＊東海大学分子医学医療研究センター分子神経学部門＊＊＊埼玉医科大学小児科＊＊＊＊国立善通寺病院小児科

点変異や極めて小さい欠矢の可能性もあり，さらに詳細な検討が必要である．
遺伝子変異と臨床型の相関は，NAIP遺伝子については，重症度が高くなるほど欠失頻度が高い傾向にあるが，その関係はいまだ明らかでない．

ー73−

今後は，さらにSMAとその辺縁疾患の症例数を増やし，臨床型との関係の検討が必要である．

2）LefebvreS，etal：Cel180：155−165，1995・
3）Steege G，et al：Lancet 345（15）：985−986，
1995．

参考文献

4）I）ubowit2；V：Neuromuscul．Disordl（2）：81，
1995．1995．

1）Roy N，etal：Cel180：167−178，1995．

−74−

ⅠⅠⅠ．福山型先天性筋ジストロフィー

19）福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）遺伝子のポジショナルクローニング

群で

千勝

林永

♯

榊

小徳

＊

彦樹

野井

邦青

ガ

水平

＊

志美豊

遠

田

戸

正育

＊

宅下堀

三松中

研究協力者

4
2

福山型先天性筋ジストロフィー（Fukuyama−type

C

1

‖M

3
0

訊〃

1−1

7

1

6

1

SS
99
DD

D9S58

3cM

Candjdatere910n

S．ScM
2．8cH

D9SlOS

一
つL3

域内に存在する9q31のマーカー，mm220との間に連鎖不平衡を兄い出し，この近傍100万塩基対以内に存在すると報告してきた（図1）6）〜8）（平成6年度）．

7cH

CA246

J

FCMD遺伝子座を軸31−33に決定した4）5）（平成5年度）．
さらに近親婚患者における同祖ホモ領域の同定や，組み換えマッピングにより，FCMD遁伝子座をD9S127とCA246の間の約5cMに絞り込むとともに，この領lかったので，我々はポジショナルクローニングによる方法を選択した．
そして我々は，主に近親婚を利用した解析法（ホモ接合性マッピング3））を用いて連鎖解析を行い，

霧島欝雪

J

して，原因遺伝子の同定が非常に重要であるが，FCMDでは確実なマーカー蛋白となり得る物質がな

lフ

8﹁

人の発生率で認め2），我々の約80人に1人が保因者である．さらには日本で最も多い常染色体位劣性遺伝病の一つである．FCMDの病態を分子的に追求するに際

3111222123 4 441222222333 3 33

病1）であり，わが国の筋ジストロフィー中Duchenne型筋ジストロフィーの次に多い．10万人に6．2〜11．9

S
9
D

1 2
1 1

CongenitalMuscular Dystrophy；FCMD）は，重度の筋ジストロフィー病変とともに，小多脳回を基本とする高度の脳奇形を特故とする常染色体位劣性遺伝

︒
■
／
ミ

32− 321222 111Pは じ めに

4．9cM
D9S59

9

図1連鎖を示したマーカーの第9番染色体長腕における物理的，遺伝学的位置．1cMは約100万塩基
対．FCMD遺伝子は，D9S127とCA246の間で，連鎖不平衡を示すmm220（9q31）の約100万塩基対以内に存在する4）〜8）
新しいDNA多型マーカーの単離
さらに，FCMDは遺伝的孤立集団である日本人に特異的に頻度が高いことから病気の創始者，すなわち祖YAC，コスミドを用いた物理地図の作製
そこでこのⅡdd220を含む酵母人工染色体（Yeast
Artificial Chromosome；YAC）クローンをYACラ

先は一人であり，それが全国にひろがっていったと考え，フィンランドでdiastrophic dysplasialO）やBat−ten病（NCLtype3）11）で行われたような連鎖不平衡マッ

イブラリーより3−DPCR法にて単離し，周辺の領域
をYACクローンで約3Mbコンティグ化し，rare Cut−

ピングを行？た．
しかし連鎖不平衡を示す既知のマーカーはmfd220

tingenzymeを用いて制限酵素地図を作製した（図2）・
またYACをコスミドへサブクローニングし，コスミ
ドコンテイグの構築を進めた．後述する重要な領域のほとんどの部分を，コスミドでコンテイグ化したの．

のみで，その両側は近くても1．7cMも離れており（図1のD9S127），連鎖不平衡も存在しない．そこでYAC
コンテイグよりコスミドライブラリーを作成し，CA
リピートを持つクローンを単離し，そのリピートの両＊東京大学医学部人類遺伝学＊＊東京大学大学l晃理学系研究科生物科学

端の塩基配列を決定し，PCRプライマーをデザインして，新たなマイクロサテライトDNA多型マーカーを単離した．これらのマーカーのYAC上での位置を決−77−

正常での割合Pnormalから下記のように定義される．

YR【S Span仙1g the rCMD can山date re910n
N：NDtl．M：Mlul，HrHrul
Hr
H HHl】rlllkb

Pexcess＝貯dfected−Pnom凪l）／（1−Pnomal）＝（ト〟gq￣1）（トの■l■1＝T：・・・・・ R

連鎖不平衡の強度を示すPexcess値はmfd220，
ⅩF9，M8，J12，J8，GATA，A4でそれぞれ0．32，

▲﹁

96

85

二

1

l
1
．
．
．
．
．
．
．
．
．
．

34

＼：；JM

相川

もoI norma暮thromosomeS

1︑≡⁝．Ⅳ92
u一日lrlllll．1；⁝．．

7 一
∪︼H

47Ⅷ

l 1 1 − 1 ・ ・ ． 1 ≡ ⁝ ⁝ ． ≡ ． ■ ． ⁝ ⁝

q−7
u一日

38川

101FCMtI Ch川ml】iOml！5

85

23

旦l t柑

78

75

48

44

56

29

0．75，0．81，0．95，0．81，0．60，0．45であり，J12を極大にして，左右に行くに連れて小さくなっている（図2）．FCMDと各マーカーとの距離はそれぞれlMb，230kb，160kb，30kb，160kb，450kb，740kbと推定された．この推定距離は各マーカーのYAC上での位置とよく一致していた（図2）．このようにFCMDは
マーカーJ12を含んだ約100kb以下の領域に存在する／／＼
P eHCeS＄

血はtan【e O†FCM【llkbI

図2

8．32

1898

0．75

0．81旦上皇呈

23q t川玉里

8．810．68

0．45

1日I

741I

450

さらに突然変異率を〟，祖先からの世代をg，FCMD
丑伝子頻度をqとすれば，FCMDとマーカー間の距離（組み換え率）βが求められる13）．

と考えられ，FCMD退伝子の単軌こ高度に焦点をしぼることが可能になった12）．

FCMD遺伝子領域のYACコンテイグと連鎖不平衡マッピング．新たに単離したマイクロサテ
ライトDNA多型マーカーの位置を示す．
mfd220はこの図の左方に存在する．連鎖不平衡の強度を示すPexcess値はJ12を極大にして，左右に行くに連れて小さくなる．FCMDと各マー
カーとの推定距離を最下段に示した．FCMDは
マーカー112を含んだ100kb以下の領域に存在すると考えられる9）12）定するとともに，これらのマーカーを用いて患者ならハプロタイプによる診断の可能性
またPexcess値が極大を示すJ12とそのすぐ近傍のマーカーでハプロタイプを調べると，FCMD染色体の77％が祖先由来である一つのハプロタイプを示した．
またFCMD患者の88％が祖先由来のハプロタイプのホモかヘテロであった．このハプロタイプは正常染色体には現在までに一つも見出されていない．このこと
はFCMDの祖先は一人という我々の仮説を支持するとともに，今まで原則的には不可能であった「ある一人の患者がFCMDか否か」の診断が，かなりの程度まで可能になったことを意味する12）．

びに正常をアレルタイプした12）．

明らかになってきたこと′連鎖不平衝マッピング
新たに単離したマイクロサテライトDNA多型マー
カーのYAC上での位置を示す（図2）．各マーカーでの
FCMDの祖先のアレルは，任意の数字で表わすと
mfd220からテロメア側に向かって，111，4，130，8，
2，4，2のようになり，マーカーJ12では患者の97％が祖先のアレルを持ち，それは正常の48％に認められた．同様にM8では患者の85％，正常の23％，またJ8では患者の86％，正常の29％が祖先のアレルを持っていた（図2）．しかしながら，仮にマーカーとFCMDが遠くて，組み換えにより祖先のアレルが失われても，
正常染色休にも祖先のアレルの頻度が高ければ，祖先のアレルは保たれることになるため，それを補正する
ため連鎖不平衡の強度を表わすPexcessを求めた．
Pexce甲畔祖先のアレルの患者での割合Paffected，

これまでの過程で可能になってきたこと，明らかになってきたことを表わすと，
1）9q31領域には既知の蛋白質は存在しない．FCMD
遺伝子産物は未知の蛋白質と思われる．
2）上述したように日本人のFCMDの祖先は一人である12）．
3）これらの連鎖しているマーカーを用いて，FCMD
家系における出生前，保因者診断は可能であり，すでに応用されている14）〜16）

4）上述したように連鎖不平衡マッピングの進展によ
りFCMDか否かの診断も可能になった12）．
5）FCMDには時に軽症例，非典型例とでも言うべき，歩行可能であった症例が存在し，CMDⅢ型，Ⅳ型といわれ非典型的FCMDとされていた1）．歩行可能例
のみの連鎖解析でも9q31のマーカーと連鎖し，これらの症例は，FCMDの一連のスペクトラムにはいること−78−

が明らかになった17）（本報告書参照）．
6）重度の脳奇形，限奇形，先天性筋ジストロフィーを示す西洋に多いWalker−Warburg症候群と福山型が，遺伝的には一瓢 同一である可能性が得られた18）．
7）胎児剖検例の検討から，FCMDの脳奇形はglia
limitans一基底膜複合体の亀裂が一因であることが明らかになった14）16）（本報告書参照）．

Y，et al：BrainDev（in press）．

8）Toda T，Ikegawa S，Miyake M，et al：Jpn
J Hum Genet40：333−334，1995．
9）Miyake M，Toda T，MizunoK，et al：（sub−mitted）．

10）HaStbackaJ，dela Chapelle A，Mahtani
MM，et al：Cel178：1073−1087，1994．

おわリ に
以上FCMD遺伝子は，22対の全常染色体から9番染
色体長腕の31−おバンドに局在化され，組み換え解析
等により約500万塩基対，連鎖不平衡の同定により100万塩基対，連鎖不平衡マッピングによりピンポイ
ントに絞られようとしている．FCMD原因遺伝子が単離され，蛋白レベルでの解析が進むことが期待される．
文

Hum Genet55：946−950，1994．
7）Toda T，Miyake M，Naknhori

献1）Fukuyama Y，Osawa M and Su2；uki H：
Brain Dev3：1−30，1981．
2）Fukuyama Y and Ohsawa M：Brain Dev6：
373−390，1984．

3）Lander ES and Botstein D：Science236：1567−1570，1987．

4）Toda T，Segawa M，Nomura Y，et al：Na−
ture Genet5：283−286，1993．
5）Toda T，Segawa M，Nomura Y，et al：
Muscle Nerve18：463−466，1995．
6）Toda T，Ikegawa S，0kni X，et al：AmJ11）Mitchinson

HM，0

Rawe

AM，Taschner

PEM，et al：AmJ Hum Genet56：654−662，
1995．

12）Toda T，Miyake M，Kobayashi K，et al：伝ubmitted）．

13）Lehesjoki AE，Koskiniemi M，Norio R，etal：Hum MoIGenet2：1229−1234，1993．
14）NaknnoI，FunahashiM，Takada K，et al：
Acta Neuropathol（inpress）．
15）Kondo E，Saito K，Toda T，et al：AmJ
MedGenet（in press）．
16）Yamamoto T，Ⅹomori T，Shibata N，etal：（submitted）．

17）斎藤加代子，近藤恵里，戸田達史ほか：厚生省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー及び類縁疾患の病態と治療法に関する研究」平成7年
度班会議報告書．
18）Toda T，YoshioknM，Nakahori Y，et al：
Ann Neuro137：99−101，1995．

−79−20）出生前診断が行われた福山型先天性筋ジストロフィー
胎児2症例の大脳皮質病変 −神経病理学的考察−

綽
＊

代■

雄子

槙紀

＊

林谷

小池

綽

規

行子史

⊥事

榊

亮有遠

＊東京女子医科大学小児科＊＊東京女子医科大学第一病理＊＊＊東京大学医学部人類遺伝学

田北田春

剖検時脳重量は41．6gで，道教相当と考えられた．
肉眼的に脳表面は顆粒状を呈し，後頭葉の一部では軽度の隆起が認められた．組織学的には，基底核，皮質，
germinalmatrix等，大脳の基本構築の形成は過数相当と考えられたが，脳表面にはTakadaらが）23過の胎児例で報告されているように，typel：脳外表面へのneuronalclusterの小突出，type2：脳外表病変
内でのneuroglialclusterの形成，tyPe3：さらに厚い脳外表面の病変の形成，の大きく3型に類別される病変が認められた．20週の症例では，typel病変が前頭葉から側頭葉，後頭葉にかけて地図状に最も広く分布しており，type2は前頭葉，側頭葉，後頭葉の一部に，type3は後頭葉の一部に認められるのみであった．小脳，脳幹に関しては，一部のみ組織標本が作製されたが，観察した範囲内には明らかな病変は認められなかった．

ヂ＊症 例1
同胞は，第1子は健康であるが，第2子は自然流産，第3子はFCMDである．胎齢16過の羊水穿刺による出生前遺伝子診断において，約86％の確率でFCMDが疑われたため，両親の合意のもと胎齢20過で人工妊
娠中絶が行われた．

柴河戸

稗

木

子里子

智恵真

緒
言
福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）の脳病変の形成には神経細胞の遁走異常が想定されており，中でも脳表面のpial一glialbarrierの破綻による神経細胞のovermigrationが注目されている．神経細胞の遊走は胎齢7〜10週頃から 20〜24過頃にかけておこるとされており，FCMD脳病変の形成過程を解明していく上でこの時期の脳病変の検討は重要と考えられる．
今回，胎齢20過，18週胎児において認められた脳病
変に関して報告する．

代
加

藤

斎

木藤澤

山近大

研究協力者

症

例

2

胎齢15過の出生前遺伝子診断で第1子（2才8ケ月のFCMD児）と同様のハプロタイプが認められたため，両親の希望により胎齢18過で人工妊娠中絶が行われた．
剖検時脳重量は29．5gとはば過数相当であった．肉眼的に大脳表面は微細な顆粒状を呈していた．組織学的には大脳の基本構造はほぼ道教相当と考えられたが，脳表面には病変が認められた．18通例では，type2，3の病変は認められず，前頭葉を主体にtypel病変が一部に認められるのみであったが，脳表面は全体に異常な間糞組織に覆われていた．本来の脳表面には
PAM染色陽性の線状に走る基底膜様構造が観察されるが，本症例においては，微小な欠損が多数認められ欠組部から外側の間薫組織内に向かって脳実質の吹き出し状の病変が形成されていた．脳表面を覆う聞糞組
織内には軟膜直下の顆粒細胞と考えられる小型円形細胞が認められた．免疫組織化学的には病変内にグリア細胞と考えられるS−100蛋白陽性細胞が散見され，また，SynaptOPhysinもかなり広範囲に陽性を示した．
小脳においても，表面を覆う間糞組織内には外顆粒層の細胞や，グリア細胞を含む組織からなる小クラス
ターが散見された．歯状核には大きな異常はないと考えられた．
脳幹表面にも所々に表面のbarrierの欠損と考えられる所見が認められた．脳幹の核に関しては大きな異常はないと考えられたが，錐体路には走行の異常が示
唆された．
考
察
肉眼的，組織学的に観察された脳表面の病変の性状からはFCMD脳病変の形成にpia1−glialbarricrの破綻が大きく関わっていることが示唆される．Pia1−
glialbarrierは基底膜，glialimitans，分子屑の神経突起から形成されると考えられている．FCMD胎児
例では脳組織全体の構成や成熟状態がほぼ道教相当であり，病変が脳表面に有意に認められること，また，−80−

PAM染色で基底膜と考えられる構造物に断裂が認められること等から，FCMD脳病変の形成には神経細胞自体の異常よりもむしろ基底膜ないしグリアの異常が前面にでモいるものと考えられる．
Takadaらの23過の報告例では1），大脳のcorticaldysplasiaはtype2，3が主体であるが，我々の20週の症例ではtypelが主体で，type2，3はごく一部に認められるのみであり，18過の症例においてはtypel
がごく一部にしか観察されなかった．20通例の，特にtype3病変部分では脳表面により大きな欠損が多発する傾向がみられたが，18過例では欠祖は小さく，やや大きな欠損部にtypelの病変が認められた．これらの所見からは，typel〜3の病変の形成には脳表面のbarrierの欠損の程度が反映されていると思われるが，
18通例でより程度の軽い病変が認められたことを考慮

すると，typelからtype2，3への経時的な移行の可能性も充分ありうると考えられる．
脳表面の病変は，神経細胞の遊走時期に一致して形成されると考えられるが，18過の症例において，脳外表の病変内に大脳皮質軟膜直下の顆粒細胞や，小脳外顆粒層に由来すると考えられる細胞が認められた．いずれの細胞も胎齢12〜13週頃形成が始まるとされており，少なくともこの頃から形態的に捉えうる病変の形成が始まるものと考えられた．
文

献1）Taknda E，NakamuraII，et al：Cortical−81−

dysplasiain a23−Week fetus with Fukuyama
congenital muscular dystrophy（FCMD）．
Acta Neuropatho174：300−306，1987

21）非典型的（歩行可能）福山型筋ジストロフィーの
第9染色体長腕31への局在の検討
斎 藤 加代子＊
研究協力者

近

藤

恵

里事

戸

田

達

史稗

大

澤

真木子＊

福

山

幸

夫＊

田

中

綿

は じ め に示唆する所見が得られていた．また，俳腹筋に仮性肥福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）では，臨床症状に軽症，重症の差を認め，非典型例がしばしば存在することが知られている．昨年我々は，典型的（歩行不能）と非典型的（歩行可能）なFCMDが混在する2
同胞例において，第9染色体長腕31−33に存在するマ
イクロサテライトDNA多型マーカーを用いた多型解析を施行した結果，それぞれのハプロタイプは一致し，独立歩行を獲得する症例もFCMDのスペクトラムに入ることが示唆されたことを報告した．そこで，さらに今回は，非典型的（歩行可能）FCMI）の家系を集め，9q31近傍のDNA多型マーカーを用いた連鎖解析を行い，このような非典型例の遺伝子座と，すでに報告のあるFCMDの遣伝子座9q31とを比較し，FCMDの臨床型と遭伝子型について検討したので報告する．

大が認められたものが5例あったか，他の6例では仮性肥大の記載はなかった．

対象
非典型的（歩行可能）FCMD患者を有する10家系34
名（患者11名，うち血族婚3家系）を対象とした．対象とする診断基準は，1981年福山ら1）が提唱したものに準じ，先天性筋ジストロフィーとしての必須条件［（1）性差のない罷息，（2）生後8ヵ月までの発症，（3）運動発達遅延，（4）全身対称性の筋力および筋緊張低下，（5）深部健反射減弱または消失，（6）顔面筋罷患，（7）
高CX血症，￠）筋組織のジストロフィー変化］を全て満たし，さらに追加条件として，（9）知能障害を認め，（10）独立歩行の獲得のあった（期間は問わず）患者を対象とした．なお，典型例（歩行不能）が混在する家系は除外した．
対象患者の補足臨床所見一覧を姦1に示した．歩行可能期間は最短1年，最長9年で，うち2例は階段昇降も可能となっていたが，患者病歴不足により，歩行不能となった年齢が不明なものもあった．頭部画像診断
または剖検が行われた5例では，それぞれにFCMDを＊東京女子医科大学小児科＊＊真東大学医学部人類遺伝学＊＊＊薪貴大学脳研究所神経内科

方法

9q31近傍に存在する5種類のマイクロサテライト
DNA多塑マーカーD9S176，D9SlO9，D9S127，
mrd220，CA246を用いて各人のアレルを決定し，コンピュータープログラムLINKAGEにて2点連鎖解析を施行した．
去1補足臨床所見
性別

最 技u 霹 歩行 可 能 白 只L D 0正相賞成萎縮不全 厚 鼠 回
年 齢 け：m ） 年齢け

1

M

10 ；
ll

−7

0

1

F

20 ：1

1−

ユ

M

27 ；7

ユー

1

F

1】：

4 −7

5

F

17 ：3

4 −5

0

0

l

p

20 ：
10

ト Id

0

0

7

M

2 1；0

2 −8

ND

8

F

21 ；0

1 −7

ND

I

M

ま！：7

ユーIl

ND

10 ■l

F

22 二王

1 −7

ND

10 ●Il

M

l ：l

2 −7

ND

良書N o

0

仮 性肥 大叩fY：m ）0
11 日0 二
日）
22 （
三〇二
1）

○

〇

14 （
丁こ
111
ND
0

52 （
ユニ
71
〇

〇

〇

ND；NoID）nC・剛史昇降（＋）一 大広丘只多小脳回l即

結果

5種のマーカーのうち，従来FCMDに最も近いとされるマーカーm！d220において3．09（β＝0．00）の最大ロッドスコアを獲得し，有意な連鎖を認めた．また，そのセントロメア側のマーカーD9SlO9，D9S127でも，2を超えるロッドスコアが得られた．
一方，m兄220の示すlllbpのアレルとFCMDには連鎖不平衡が判明している2）．今回我々が解析した非典型的FCMDのグループにつき同様の検討を試みた
ところ，染色体19のうち5（26％）にlllbpのアレルが認められ，このグループがFCMDに属することをサポートする結果となった．

−82−

去2

Pairwise lod scores of chromosome

結9

独立歩行を獲得する非典型的FCMD家系におけるmarkers withatypicalFCMD

Lo亡uj

D，517

∂mu ZmlX

0．05

0．00

0．，0

D，SlO，

0．00

D，Sl27

0．00

1

2．ユ2

mrd220

0．00

3．09

C▲封

0．07

0．5‡

，

0．01

0．48

1

0．05

0．7二I

0．10

0．90

0．】5

0．‡0

0．20

0．山

0．4才

0JO O．40

0．21

0．の

122

2」】1．7，1．40

1．0

0．78

0．37

，

1

1．1月

1．15

0．−日

0．21

0．砧

0．24

0．柑

0．05

3．0，
．0．08

0

●12

1，‡
0．2

1．g5

155
0．5

10

Ⅰ．
Oj

論

2

1．24

0．47

0J7

0．1二I

連鎖解析の結果，従来FCMD原因遺伝子に最も近いと報告されているマーカ一mm220において有意な連鎖が認められ これらの非典型的グループは遺伝子型
としては典型的FCMDと同一であることが判明した．
昨年の我々の報告，および，今回の連鎖解析の結果より，独立歩行を獲得する症例もFCMDのスペクトラ
ムに入るものと結論づけられた．

参考文献
1）FukuyamaY，et al：Brain Dev3（1）‥卜29，
1981．

2）Toda T，et al：AmJ Hum genet
946−950，1994．

−83−

55：

22）福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）：glialimitans一基底膜複合体の破れが大脳micropolygyriaの−遠因か？−FCMD胎児（18過）脳の免疫組織学的・電顕的検索から−戸 田 逮 史♯

研究協力者

中

野

今

治＊

高

田

邦

安＊

舟

橋

満寺子＊

図1

A：前頭葉皮質
表面は， neurOgliomesenchymal tissue（NGMT）で覆われており，皮質板神経細胞がglialimitansの破れからとび出している・HE，
×10．挿入図：glialimitansの破れ部分の拡大．

は じ め に

FCMDにおける脳病理の中核をなす大脳の小多脳回の形成機序に関してはほとんど知られていない．本症と考えられる在胎23過胎児の脳において，大脳皮質板
神経細胞がglialimitans（GL）の破れから過剰遊走している像が見出され，これがFCMD脳でみられる小多脳回の原因であろうと推測された隼 しかし，この胎児では骨格筋のジストロフィー変化はなく，大脳皮質のGLの破れは他の疾患でも観察される2）ため，大脳の変化のみをもってFCMDとは断定しかたい．
ところが，最近，本症の遺伝子座が9番染色体長腕（9q31）にあることが分かって3），胎児DNAの解析により非常に高い確率で本症の出生前診断が可能となり，その大脳病変の初期像が検索できるようになった．
本報告では，上記手法により出生前診断を行い，在胎18過にて人工流産したFCMDの胎児1例の大脳皮質病変について記載する．
症例と方法
同胞にFCMD患者1人を有する在胎18過の胎児．
本胎児は，そのDNAのmicrosatellite polymor−
phismanalysisにより，99％の確率でFCMDと診断され，人工流産された．脳重は約20gで，大脳表面には広範に細かいシワがみられ，小さなイボ状の突出が少数認められた．大脳のくも膜血管は不明瞭で，柔膜と脳とは強く連結していた．
10％中性ホルマリンで固定した左半球を，パラフィ

8：後頭葉皮質異形性の強い左半分と正常の右半分の境は明晩
KB，×5．挿入図：異形性の強い部分のglia
limitansと思われる部位の拡大．横に走る線は前頭葉に此して貧弱である．
A，Bの挿入図：エボン包埋0．1〝切片，トルイ
ディンプルー＝フクシン染色，×100．

ン包埋し，種々の染色を施した．また，抗GFAP抗体，
抗collagentypeⅣ抗体で免疫染色を行った・前頭葉と後頭葉の一部を電顕用に2，5％glutaraldehyde十4％paraformaldehyde固定し，エボン包塊の後型の如く処理して電顕観察した．
正常対照として，神経疾患の無い在胎19過と23過の胎児脳を使った．
轄果l．光畢所見大脳皮質は広範に異常な組織で覆われていた（図1）．

＊東京大学医学蕃人類遺伝学
−84−

図2

A：前頭葉のglialimitansとその上のNGMT．
下方のglialimitanSに平行してpialfibroblast扶印）が走っている．×6，000．
B：glialimibns表面の拡大図．
glialimitanS側の基底膜は連続しているが，NGMT側のは不連続である．
C：NGMT無いのpialfibroblastとコラーゲン線維
B，C：×30，000

GLの破れと破れの間では，皮質板神経細胞はGLの下に留まっていて，それを迂回して進出している像はみられなかった．

図3

NGMTの最表面
血管内皮には基底膜が形成されている（矢印）が，NGMTかくも膜下脛に露出する部分には形成されていない．×16，000．

これは，神経細胞，グリア，間薫系の組織を含んでいるのでneurogliomesenchymal tissue（NGMTと略）と呼ぶ．
前頭糞では，GLに多数の破れが生じており，そこから皮質板の神経細胞が噴水のように過剰遊走していた（図1A）・NGMTには，Subpialgranularlayerの細胞や少数のCajalLRetzius細胞も認められた．

GFAP染色では，GLの表層が線状に陽性に染まり，破れの部分ではこれが途切れていた．また，NGMTの中にGFAP陽性の細胞が少数観察された．CollagentypeⅣ染色では，NGMT表層や深部自質の血管壁は陽性に染まったが，GLや皮質坂内の血管壁は陰性であり，コントロール脳でも同様の染色態度が認められた．
後頭葉では，異形性の強い皮質とほぼ正常に見える皮質とが隣り合っている部分があった（図1B）．異形性の強い部分ではGLの破れが大きくかつ多数で，
GFAP染色でもGLとしての陽性像は認められず，皮質板神経細胞の大半が，この破れを通って過剰遊走していた．この過剰遊走した神経細胞は，概ね脳表面に垂直な柱状配列を示し，脳裏に平行に移動する傾向は呈していなかった．このことは，異形性の強い部分と正常部分との明瞭な境界からも伺える．
後頭葉の正常皮質部分では，GLの部分にGFAP陽性の連続した線状構造が認められ，その外表には
NGMTは観察されなかった．ただし，この部分でもSubpialgranularlayerの細胞は少なかった．
ll．電子顕微鏡所見

ー85−

前頭葉では，GLを形成しているastroeyteの

図4

A：前頭葉
glialimitans（矢印）の破れから皮質板から突起がとび出している・破れの上ではpialfibroblast（二重矢）の層も途切れている．cr：Cajal−Retzius細胞・挿入図＝Aのcrの拡大・濃いクロマチン・粗面小胞体のよく発達した暗い細胞質が特徴的．
A：×2，000．挿入図とB：×20，000・
GLの破れの部分では，GLのBLやpial fibroblastの層も斬列して，皮質板神経細胞やradialgliaの突起と思われる突起が貫通していた個恥

endfeetの最表面と，このendfeetに面するNGMT部
分に基底膜（basallamina：BL）が認められた（国2）・
このBLは電子密度が均質に高く，1amina densaと1aminalucidaの区別はできなかった．両者のBLは通常癒合していたが，しばしばコラーゲン線経と思われる構造が介在していた．
GL側のBLは連続だったが，NGMT側のは不連続

後頭葉の異形性の強い皮質部分のGLに相当すると思われるところには，BLを有するendfeetはなく，表面に平行に走るpialfibroblastの細い突起が少数のコ
ラーゲン線経を伴って走るのか観察されるのみであっであった（図2A）．GL側，NGMT側を問わず，BLを有する細胞膜は滑らかな直線であるのに対し，NGMT
側でBLを欠く細胞膜の走行は凸凹していた．
NGMTの深部には，pialfibroblastSの細い突起のた（図5）．

層が2〜3層，少数のコラーゲン線経を伴ってGLと平行に走っていた（図28）．この突起に接するダリアには
BLは形成されていなかった．また，NGMTの最表層られ この皮質でも正常に保たれたGL部分では皮質板神経細胞はGL下に留まっていた．また，異形性の強い皮質部分では，過剰遭走した皮質板神経細胞は表でくも膜下腔に藤山している部分にもBLは見られなかった（図3）．

面に垂直に柱状配列をしており，正常皮質と＿の境界部
でもこの細胞は異常側に留まっており，脳表の接線方考察

本例では，GLに破れの在る皮質でのみNGMTがみー86−

られる小多脳回の遠因である可能性を示すものである．
異形性の強い皮質部分で完全なGLがほとんどみられなかった・ここでは元来GLの破れが大きく，過剰遊走した大量の神経組掛こ埋まってBLをもったGLが消失した可能性がある．
BLは実質組歳を問質組織から隔離する働きがあり4），
脳においては脳回間を分離する作用がある5）．本例において，NGMT表面にBLが形成されていないことは，本症の生後例の脳にみられる脳回癒合を促進した可能
性がある．
文

献

1）Takada X，Nakamura H，Suzumori X，etal：Cortical dysplasiain a 23−Week fetus
WithFukuyama congenital muscular dyStrO−
Phy（FCMD）．Acta Neuropathol（Berl）74：
300−306，1987．
2）Choi

BH

andMatthias

Plasia aSSOCiated

SC＝Corticaldys−with massive ectopia ofneurons and glial cells within the

Subaraclmoid space・（Berl）73：105−109，1987．

Acta Neuropathol

3）TodaT，SegawaM，NomuraY，etal：Lo−
Calization ofagenefor Fukuyama type con−genital muscular dystrophy to chromoSOme

9q31−33・Nature Genet5：283−286，1993．

図5 後頭葉の異形性の強い皮質の深部表面に平行して走る突起（矢印）が認められる．
×4，000．挿入図：＊部分の拡大図．基底膜を有するglialimitansはなく，少数のコラーゲン線
錐（矢印）を伴うpialfibroblastの突起がみられる，×20，000．

4）Furthmayr H：Basement membranes．In：
ClarkRAF，HensonPM（eds），The molecu−
lar and cellular biology of wound repalr．

PlenumPreSS，New York，1988．pp525−558，5）SieversJ，MangoldU，BerryM，et al：Ex−
perimentalstudies on cerebellar foliation．Ⅰ．

A qualitative morphological analysis of

向にはほとんど移動しないと考えられた．以上の所見
は，NGMTの形成にはその場におけるGLBLの破れが必要条件であり，ひいてはこの破れがFCMDで見

Cerebellar fissuてation defects after neonatal
treatment with61）HDAin the rat．J Comp
Neuro1203：751−769，1981．

87−

Ⅳ．遠位型ミオパテー

23）Rimmed Vacuoleを伴う遠位型ミオパチ一に対するhomozygOSity mappingを用いた分子遺伝学的研究
省

辻

■
＊

軒﹂ 茂 子 郎

恭英

稗
書

精

綽

■

生・

群
出

正

山 押

田山

樺

榊§

藤中

＊

斉田林斉宇

書

里子俊治義

＊

砂恵永正信

榊

口中田守原

＊

樋田新高福

＊

英

健絵也三薫洋奈知長

内原賀竹泉澤池松浅佐奥水研究協力者

目的Rimmed vacuoleを伴う遠位型ミオパチーdistal
myopathywithrimmed vacuole（以下DMRV）は，下肢の遠位筋，特に前脛骨筋の筋力低下を示し，筋病
理組織学的にはrinmed vacuoleを認める疾患である．
DMRVの退伝形式は常染色体劣性遺伝を呈する家系が多く報告されているが1），孤発例や常染色体優性遺伝を呈する症例もある．DMRVの遺伝子座について
は，浅安らにより1p34−p32に連鎖する可能性がある

DMRV・S

Dl虞RV・g DMRV−10ると考え，ホモ接合性homozygosity mappingを応用してDMRVの遺伝子座の解析を施行した．

家系の計に家系の発症者18名を対象とした（図1）．効率よくgenomesearchを行うために，1．血族結婚のある家系の場合は発症者がDMRV遺伝子座周辺でホ＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊金沢大学医学部神経内科＊＊＊国立療養所宇多野病院神経内科＊＊＊＊国立療養所犀潟病院神経内科＊＊＊＊＊熊本大学医学部第一内科§筑波大学臨床医学系神経内科

DMRV−8DMRV−11

DMRV・12∴三二二三二方法
対象は血族結婚がある10家系と同胞発症を認める2

系の計12家系の発症者18名にしぼり，％heterozygosityが70％を超えるような多塑性に富む
マーカーを用いて（図2），迅速に解析するストラテ
ジーを選択した．また，マイクロサテライト多型を自DMRV一T

二二二三三

家系が報告されたが，複数家系における解析では，有意なロッド得点は得られていない2）．そこで我々は，系統的なgenome searchによる連鎖解析が必要であモ接合を示す確率が高い，2．血族結婚のない場合においても，発症者はDMRV遺伝子座の周辺においては，同一のgenotypeを示す確率が高いと考え，解析
対象を血族結婚のある10家系と同胞発症を認める2家

DMRV・＄■towhomDNAanaかSiswaspOけ0∩¶ed

図1DMRV家系図
動DNAシークエンサーを用いて解析する際の分析精度を高めるために，可能な限りtrinucleotide repeat
あるいはtetranu−Cleotiderepeatを用いるようにし，各染色体を15−20cMや間隔でカバーするように設計した．
多点連鎖解析によるロッド得点の算出には，
Ⅹruglyakらに報岳された MApMARKER佃OMOZ
によるalgorithmを用いた3）．各マイクロサテライト
マーカーにおける正常者のアレル頻度は，Genome
Data Base（GI）B）もしくはThe Cooperative Hu−
man Linkage Center（CHLC）により公表されている
借を用いた．

−91−

Chromosome20

Chromosome19mSRl

D20S59／D20S271
D20S6622−1
11
2−．12333
3
1
11
11
11111

GATA21GOS／一

32．1
333 −1

dM

13．1

123

13．2

13．3
13．4

図2第19，20染色体上のマイクロサテライトマーカー
microsatellitemarkerwithdinucleotjderepeat microsate

iternarkerwithtetranucleotiderepeat

図3Tetranucleotiderepeatはdinucleotiderepeatよりもホモ接合かヘテロ接合かの判別に優れている

結果（1）TetranUCleotid8reP8atマーカーはホモ接合かヘテロ接合の判定に有用である
自動DNAシークエンサーを用いた解析では，dinu−

DMRV遺伝子座周辺では十分有意なロッド得点が得られると考えられた．
（3）第19，20番染色体では高いホモ接合率．有意なロッド得点を呈する領域は認めない

完全となり，ホモ接合かヘテロ接合かの判別が困難な場合が少なくない．一方，tetranuCleotide repeat
マーカーでは1リピート差が4塩基対の違いとなり，

第19番染色体の各マイクロサテライトマーカーにおけるホモ接合率とロッド得点を図4に示した．ホモ接合率はGATA21GO5，D19S586，D19S178において50％を示した．多点連鎖解析ではGATA21G05のtelomea側で最高ロッド得点0．72を呈した．

ピークの分離が良好で，自動DNAシークエンサーによる解析精度が高まるものと思われた（図3）．
（幻 DMRVのホモ捷合性マッピングにおいて第20番染色体では，D20S66において最高50％のホ
モ接合率を呈し，多点連鎖解析ではD20Sl02のtelomere側で最高ロッド得点2．08を呈した（図5）．

cleotiderepeatマーカーを用いた場合には，1リピー
ト差のヘテロ接合では2塩基違いのピークの分離が不MAPMARKER／HOMOZは有用な81gorithmである
今回解析したDMRV12家系において，第19番染色体上のマイクロサテライトを用い，すべてホモ結合を星したと仮定してMAPMARKER／HOMOZにて多点連鎖解析を行うと，最高ロッド得点16．02を示した．
このことは，I）MRV家系にgenetic heterogeneityがないとすれば，現在の12家系を対象とした解析で，

考察
ホモ接合マッピングを用いたDMRVの分子遼伝学的研究を報告した．現在までに解析した第19番ならびに第20番染色体では，高いホモ接合率および有意なロッド得点を呈する領域は認められな．かった．
D20Sl02のtelomere側にてロッド得点が2．08と比較

−92−

・20

0

13

33

52

75

93

・20

120（CM）

0

24

44

63

68

90

0I rつ

で疇

103122（CM）％homo町90Sity％homozygosity

Mの†SのlDやOSSのlD

SSUINVトくり

79

ト

の

拐

㌫

喜

喜

lO tO t0

拐

E

至；呂≡

等

二

呂

等

呂呂

■■

2

品

喜

図4 第19番染色体の各マイクロサテライトマーカー
におけるロッド得点と％homozytosity

図5

第20番染色体の各マイクロサテライトマーカー
におけるロッド得点と％homozytosity

的高い倍が認められたが，その領域のD20S94でのアレル頻度が明らかにさせていなかったため，見かけ上，ロッド得点が高くなっている可能性があると思われた．

ruglyakらにより発表されたMAPMARKER／HOMOZによるalgoritlmを用いた． MAP−
MARXER／HOMOZは，発症者とその両親のgeno−

事実，D20S94でのホモ接合率は23％と低い値を示していた．
今回のDMRV遺伝子座の決定にむけて用いたホモ

typeLか入力できない，アレル頻度がロッド得点に大きく影習するなどの欠点もあるが，今回のように各染色体を迅速に解析することを目的とする場合には，有接合性マッピングは，常染色体劣性遺伝病の連鎖解析
においては，非常に有力なストラテジーであることが知られている4）5）．ホモ接合性マッピングは，その利力なalgorithmであると考えられた．
DMRVの遺伝子座の同定に向けて，このようなス
トラテジーは非常に有効であると思われ，今後は他の点として，血族結婚を認める場合には，小さな家系でも有意なロッド得点を得ることが可能なことがあげら

染色体の解析を予定している．

れる．我々は今回の解析で，ホモ接合性マッピングの解析対象を発症者のみに絞り込み，効率化をはかった．
加えて，％hereto2：ygOSityが高いマイクロサテライト
マーカーを選択し，tetranuCleotide repeatを75％という高い割合で使用することにより，分析精度の向上をはかった．
多点連鎖解析によるロッド得点の計算は通常
LathropらによるLINXAGEの中のLINKMAPプロ
グラムが用いられているが，特に血族結婚を認める場
合には，連鎖解析によるロッド得点の算出に多大な時間を要することが問題とされている6）．そこで我々は，短時間に効率的に連鎖解析を行うために，最近

文献1）NonakaI，Sunohara N，et al：Femilial dis−tal myopathywith rimmed vacuole andla−
mellar（myeloid）body formation．J NeuroI
Sci51：141−155，1981．

2）洩貿知也，樋口砂里ほか：Rimmed−VaCuOle型ミオパチーの連鎖解析．神経内科 伯：112−116，
1995．

3）Ⅹruglyak L，Daly MJ，et al：Rapid multi−−93−

Pointlinkage analysis of recessive traitsin
nuclear families，including hompZygOSity

mapping．AmJ Hum Genet56：519−527，

1995．

miliarity＃breeds debility．Nature Genet5：

4）Lander ES and Botstein D：Homozygosity

107−108，1993．

mapplng：a Way tO map human recessive
traits with the DNA of inbred children．

6）Lathrop GM，LalouelJM，et al：Strategies
for multilocuslinkage analysisin human．
Pro NatlAcad USA81：3443−3446，1984．

Science236：1567−1570，1987．
5）MartinFarrall：Homozygosity mapping：fa−94−24）Rimmed−VaCuOle型遠位型ミオパチーの連鎖解析
高 守 正 治書
＊

茂 一 子

山 什
絨

意

榊

中中

耕

林田田

筆

俊里絵

永砂奈

♯

田口原

＊

新植松

＊

也三明次

榊

知良正省

賀竹藤

浅佐斉辻

研究協力者

Rimmed−VaCuOleを伴う遠位塑ミオバチp（DMRV）

vacuoleを認めた1家系（両親は近親婚）を用いた．

は1978年水澤1）らによりWelander型や三好型遠位型
ジストロフィーとは明らかに異なる疾患単位として提方唱されて以来2），本邦を中心に病態の解明が行われてきた．典型的なDMRVは臨床的には以下のような特徴を有するものと考えられる．
（1）遺伝様式は常染色体劣性遺伝．
（2）病初期の筋力低下，筋萎縮の分布はこの疾患群に極めて特徴的で，下腿遠位部の伸筋群（前脛骨筋など）が侵される．更に比較的早期より大腿後両の屈筋群の筋力低下，筋萎縮も認めることが多い．
（3）筋病理学的には筋線維内にrimmed−VaCuOleを認める．

1）第1染色休短腕RH式血液型遺伝子座近傍の人プロタイプをマイクロサテライト多塑DNAマーカーを用いて決定した．マーカーについてはセントロメア側よりDIS200，DIS193，DIS255，DIS496，DIS201，
DIS241，DIS233，DIS513，DIS247を用いた・
2）第2染色体については，三好塑遠位型ジストロ
フィーの疾患遺伝子座近傍のハプロタイプをマイクロサテライト多型DNAマーカーを用いて決定した．
マーカーはテロメア側よりD2S134，D2S292，D2S291，
D2S286，D2S329を用いた．

本研究ではDMRVの疾患の遺伝子座を決める目的で行われた．
対象1）ある家系の発症者2名のRh式血液型がRh（−）であるのに対し非発症者はRh（＋）であったことから，RH
式血液型遺伝子座のある1番染色体の短腕p34−32近傍を中心にマイクロサテライト多型DNAマーカーを用
いて連鎖解析を行った．第1染色体短腕上のRH式血液型遺伝子座近傍については全国の施設よりお送りいただいたrimmed−VaCuOleを伴う遠位型ミオバチ〜17
家系（近親婚6家系）を対象とした．
2）三好型遠位型ジストロフィーと思われる様な臨床症状で発症しながら，筋病理学的にrimmed−VaCuOleが認められる症例があることから，DMRVの独立性を明らかにする目的で三好型遠位塑ジストロフィーの疾患遺伝子座の存在する第2染色体について検討した．
対象として血族結婚が明らかなDMRV3家系，血族結婚のないDMRVl家系および臨床的には三好型遠位塑ジストロフイPと思われ，筋病理学的にrimmed−＊金沢大学医学部神経内科＊＊新潟大学魁研究所神経内科

法結吏
DMRVは通常常染色体劣性遺伝様式をとると考えられ両親が近親婚である場合，DMRVの疾患遺伝子の近傍のハプロタイプはホモ接合となることが予想される．
1）本研究の発端となった家系について上記の各マーカーを用いPCR法で連鎖解析を行なうと，発症者2名のハプロタイプはRh式血液型遺伝子座と考えられているlp34−32よりも，セントロメア側のマーカー
DIS247からDIS255に対して共にホモ接合となっていた（図1）．しかし，本研究で検討した近親婚が明らかなrimmed−VaCuOleを伴う遠位型ミオバチー6家系の発症者全てにホモ接合となる領域はRH式血液型遺伝
子座近傍には存在しなかった．
2）第2染色体については（図2）マイクロサテライト多型DNAマーカーD2S292に対して血族結婚のある
DMRV3家系ともにホモ接合となり，血族結婚のない
DMRVl家系についても発症者と非発症者が異なるハ
プロタイプを有していた．一方，三好塑遠位塑ジスト
ロフィ，と思われ，筋病理学的にrimmed−VaCuOleを認めた1家系についてはD2S292に対してヘテロ接合となっており，更に全ての三好塑遠位塑ジストロフィー

ー95−

Familyl
邦35封3

3

／
座

332

Rh（
−
）

DIS247
DIS513
DIS233
DIS241
DIS201
D1549ti
DIS255

■■

N

＞ヽ

＞ヽ

E

E

く弓
』

亡弓
【ち

Rh（
十
）
2二6
クーd二6

262465
4．4■〇一丁一4．4−−

2 4 2 3 7 4 1 3 4

■う

0

0

l

5 4 2 3 1 3 1 6 66

4 6 ■ 3ーク ー 6 2

2．4

5 3
5 9

6

︵

3
6
3 4 0 9l

D D

2 4 2 1 2S S S S S

D D −U D

7 3
4 1

2 5 2 2S S S SD D D

図2

第1染色体短腕のRHlocus近傍の遺伝子地図
マーカーはすべてマイクロサテライト多型DNA
マーカー．右は各家系のDMRV発症者のハプロ
タイプがホモ接合であった範囲を示す．

寸 覚 岩 U

図1発端者の家系図とハプロタイプ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ⁝ ・ ⁝ ⁝ ⁝ ・が連鎖するとされていたD2S291に対してもヘテロ接合となっていた．Rimmed−VaCuOleを伴う遠位型ミオ
パチー全体では，第2染色体上の三好型遠位型ジスト
ロフィーの疾患遺伝子座近傍に共通してホモ接合となる領域は認められなかった（図3）．
考案
1）現在までの連鎖解析の結果では比較的進行の遅い
DMRV，特に発症後長期間が経過しても下腿屈筋群，
大腰伸筋群の筋力が正常に保たれるDMRVの2家系について，DIS241からDIS255に対して発症者に共通してホモ接合となる領域が認められた．DMRVのう
ち大脳伸筋群の筋力は正常に保たれる一群の存在は
1984年Argovら3）により既に報告されており，少なくともDMRVの中にこのようなユニークな筋陸曹の分布を保ったまま経過する一群が存在することは事実と思われる4）．しかし，r血med一・vaCuOleを伴う遠位塑ミオパチー全体の解析では，DIS241からDIS255に対して発症者と非発症者が同じハプロタイプを有する家−Con点れ騨inily（◆）……

Con滋n卯inity（・）

図3 第2染色体短腕の三好型遠位型ジストロフィーの疾患遼伝子座近傍の遺伝子地図
マーカーはすべてマイクロサテライト多塑DNA
マーカー．実線は各家系のDMRV発症者のハプロタイプがホモ接合であった範囲を示す．＊は初発症状が三好型遠位塑ジストロフィー類似で病理学的にrimmd−VaCuOleを認めた家系．

系も認められることから，更に家系を増やして検討していく必要性があるものと考えられた．

れた．Rimmed−VaCuOle塑退位型ミオパチー（DMRV）自体は臨床的に明らかに独立した疾患単位と2）最近，肢帯型筋ジストロフィー（LGMD2B）と三好型遠位型ジストロフィーの疾患遺伝子座が共に第2染考えられるが，症例によっては三好型遠位型ジストロ
フィーと思われる臨床症状で発症しなから，筋病理学
的にrimmed−VaCuOleが認められることもあり，連鎖

色体短腕に連鎖するという興味深い研究結果が提示さ−96−

解析のレベルでDMRVの独立性を確認することも意
味があるものと思われる．本研究では三好型遠位塑ジ
ストロフィーの疾患遺伝子座近傍のマーカーD2S292
に対して近親婚を有するDMRV3家系でホモ接合となり，今後症例を増やして検討を進める必要があるものと思われた．一方で三好型遠位型ジストロフィーと思われる臨床症状で発症しなから，筋病理学的に
rimmed−VaCuOleが認められた1家系では，全ての三好型遠位塑ジストロフィーが連鎖するとされていた
D2S291に対してヘテロ接合となっていたことは興味深く，D2S291とD2S286の間のマーカーについて検討を加えて行く必要性があるものと思われた．

内科 斉藤豊和，東京都立神経病院神経内科 松原四郎，国立療養所鈴鹿病院神経内科 小長谷正明，国立療養所宇多野病院神経内科 斉田恭子，国立療養所南岡山病院神経内科 難波玲子，高田裕，長崎大学医療短大 吉村俊朗，日赤長崎原爆病院 松尾秀徳
文献1）水澤英洋，中野今治，井上聖啓ほか：筋線経に高度の空胞変性を伴ったdistalmyopathyの一病型．

神経内科12：40，1980．
2）水澤英洋，豊倉康夫：遠位型ミオバチ一．神経内科罰：555，19弘3）Argov，Z，Yarom，R：

謝 辞：以上の研究をご協力戴きました厚生省筋ジス
トロフィー研究班の諸先生方，また貴重な検体をお送り戴きました下記の諸先生方に深謝致します．
新潟大学脳研究所神経内科 遠藤耕太郎，小宅琢郎，
国立療養所犀潟病院神経内科 奥泉 薫，福原信義，
筑波大学神経内科 石川欽也，水澤英洋，国立精神神経センター神経内科 春原経彦，北里大学東病院神経myopathy

sparingtheRimmedvacuoleQuadriceps・Aunlque disorderinIranianJews・J NeuroI
Sci糾：33，1984．
4）Suohara N and NonakaI：Distal myopathy−97−

with rimmed vacuole formation．A follow−
up study．Brain112：65，1989・

25）常染色体優性rimmed vacuolar myopathyの一家系
高
研究協力者

北
中

村
道

曜
健

木

昭

夫＊

子＊

上

坂

一＊

小

義
島

和＊

井

田

雅

祥＊

進締

Rimmed vacuoleを伴う遠位塑ミオパチー（DMRV）は通常は孤発ないし常染色体劣性遺伝である．しかし常染色体優性の家系が本邦でも報告された1）．今回我々の経験した常染色体優性rimmed
vacuolarmyopathyの一家系を臨床的・筋理学的に検討し既報の病型と比較した．
症

図1家系図

例

図1に家系図を示した．3世代に8名の発症者がみられる．近親婚は無く，常染色体優性遺伝と考えられた．
発症者のうちⅠⅠト4，1ⅠⅠ−5，Ⅰト2につき診察や検索の機会があった．
症例1：30歳男性（ⅠⅠト5）乳幼児期発育や既往歴に特記すべき異常はない．小学校では徒競走で1，2番で，中学時代バスケットボール部活動で支障を感じなかった．高校生時代下腿の重さを感じ，走るのか困難になり始めた．1990年当科初診時（25歳），股関節と膝関節周囲筋にMMT4＋レベルの筋力低下を指摘された．上肢筋力はほぼ正常であり，爪先立ちや踵立ちは可能であった．この時点で血清CXは412IU／L（正常域100以下）．以後徐々に下肢萎縮と脱力が進行した．1995
年になり榔鋸からの立ち上がりが困難となり，階段昇降に手すりを必要とするようになり，入院した．身体所見として，口蓋高位が認められた．脳神経系では閉
眼力軽度低下とわずかな礁下障害を時に認めた．下腿は著明に萎縮していた．Gowers徴候が陽性，爪先立
ち・踵立ち不可能であった．握力は右20kg，左24kg．
頸部前屈は4−，上腕肩甲部に4レベル，腰帯部・大腱部に3−〜4レベル，足関節には底屈が2，背屈が3レベ
ルの筋力低下を認めた，深部脛反射はPTRとATRは低下していた．病的反射なし．感覚系，小脳系に異常を認めなかった．入院時の血液生化学検査ではCKが416IU／1と上昇している他異常なく，胸部Ⅹ線像や心電図12誘導は正常であった．神経伝導速度検査は正常．
針筋電図検査では少量の安静時放電を伴う筋原性変化＊虎の門病院神経内科＊＊三宿病院神経内科

図2症例1（ⅠⅠト5）の30歳時の筋肉CT像を認めた．筋肉CT像個2）では殿筋群，大腱四頭筋，下腿三頭筋に低吸収域を認めた．前歴骨筋の変化は比較的軽度であった．
症例2：34歳女性（Ⅱト4）．高校時代まで徒競走は遅い方だったが歩行異常はなかった．24歳時腰痛を自覚した．この頃，同僚から歩容異常を指摘された．25歳時，8cmのハイヒールから低いものに変えたところ歩きにくさを自覚した．爪先立ちの困難と階段の登りに手すりを要することに気づき，27歳時当科を受診した．初診時（27歳）現症では脳神経，感覚系，小脳系は正常．
運動系では握力が右33kg，左30kg．凍上筋に桓軽度の筋力低下を認める他は上肢肩甲帯の筋力は正常．腰帯部・大腱ではMMT4レベルの筋力低下．足関節背屈は正常，同底屈が4レベルの筋力低下を認めた．腱反射は正常．検査所見では血清LDH278HU，CK421
IU／Lの他一般血液検査に異常なし．心電図12誘導，
胸部Ⅹ線像に異常なし．神経伝導速度は正常．針筋電−98−

図3 症例1（ⅠⅠト5）の左大腰四頭筋組織像（HE染色，200倍）．筋径の大小不同，空胞，rimmed
vacuole（△），CytOplasmic body（▲）などを認める．

図5Cytoplasmic bodyの電顕像．電子密度の高い物
質とfilamentよりなる．filament径は7〜9mm
であった．
党系や小脳系は正常．運動系では上肢はMMT4＋レベル，腰帯部・大腱にMMT3＋〜4レベルの筋力低下を認めた．足関節背屈はMMT4レベル，同底屈はMMT2レベルであった．腱反射は上腕二頭筋，同三頑筋とPTRにて低下，ATRは消失．検査所見ではCK
は揖U／L．心電図12誘導と胸腹単純Ⅹ一線像は正常であった．神経伝導速度検査は正常．針筋電図にて安静
時放電を伴う筋原性変化を認めた．

図4 抗desmin抗体による免疫組織化学染色（200倍）．
CytoplaSmic bodyが染色される筋線維（△）と一様に染色される筋線維（▲）がみられる．

筋病理学的所見
症例1，2，4にて筋生検が施行された（症例4は都立神経病院の資料）．症例1の左大願四頭筋のHE染色標本（図3）では筋線経の大小不同，小角化線経の散在，図にて筋原性変化を認めた．27歳時の筋肉CTでは，下腱では下腱三頭筋変性が強い．前脛骨筋は比較的保たれていた．症例1に比して厳筋群の低吸収域は軽度であった．
症例3：60歳女性（Ⅰト2）20歳代までは登山をしていた．30歳代後半に下肢のだるさにて発症．49歳まで外出が可能であったが，50歳より起立不能．53歳時には上肢挙上不能となった．現在車椅子介助レベルとなっている．症候としては脳神経，感覚系や小脳系には異常を認めない．筋力は上下肢ともMMT2ないしそれ以下レベルだが，腱反射は保持されている．血清CKは263IU／L．心電図12誘導と胸腹単純Ⅹ線像は正常であった．
症例4：52歳男性（Ⅰト4，都立神経病院にて経過観察中）30歳代後半より下肢筋力が次第に低下，階段を上るのに手すりを必要とするようになった．45歳時より杖歩行となっている．亜歳時の診察では脳神経，感空胞，rimmed vacuole，好塩基性なcytoplasmic
bodyなどを認めた．また好塩基性subSarCOlemmal
bodyを認めた筋線椎も存在した．rimmed vacuoleは金筋線経の約1帆に認められた．壊死再生の所見は僅かに認められた．抗desminモノクローナル抗体，抗vimentinモノクローナル抗体，抗dystrophin抗体4−
4C5及びAICを用いてABC法により免疫組織染色を行った．図4に抗desmin抗体を用いた染色標本を示した．一部の筋線経は均一にあるいはcytoplasmic
bodyに一致して染色された．抗vimen血抗体や抗dystrophin抗体を用いた検討でもほぼ同様の所見を認めた．抗deSmin抗体を用いたimmunoblotにより筋組織でのdesmin増加を証明した．電顕所見では
granulofilamentousinclusionやミエリン様構造物の貯留を観察した．前者はZ帯様物質と7〜9nmの中間径filamentからなっていた（囲め．症例2大願外側広筋の組織像は症例1と同一の所見であった．

−99−

考

後の検討課題である．

察

本家系の特徴をまとめると，1）10歳代後半から30
成代後半の発症で世代間で発症促進の可能性がある．
2）経過中には上肢帯や腰帯筋群も障書されるが，初発は下腿脱力であり，前脛骨筋より下腿三頭筋がより強く障害される．顔面筋・咽頭筋のごく軽度の障字を示す症例も存在する．3）生検筋ではrimmed vacu−
01eやcytoplasmic bodyを認める．cytoplasmic
bodyの電顕所見ではgranuloイilamentousな構造を認め，filamentの径は7〜9nmであった．4）desmin，
vimentinやdyStrOPhinの抗体により染色される封人体を認めた．
従来報告されている病型とは以下の点で異なる．
Markesberyのものは発症が40歳代以降の例が多く晩発型で，筋力低下の分布も前脛骨筋が下腿三頭筋より障害が強く，顔面筋も陸曹されない2）．welanderのものは初発が上肢遠位，特に手指筋が強く障零され，近位筋の障書は稀であるとされている3）．Finnish
typeは前脛骨筋の障磐が強く初発症状となる4）．
oculopharyngealdystrophyについては一例で極めて軽微な顔面筋の障磐が疑われたのみで症状を異にす
る．Edstromらがdesmin storage typeとして報告
している症例では手内筋と手関節背屈，呼吸筋，心筋障
害が強く進行も急速であり本症と異なる5）．Helliwell
らはdesmin，Vimentin，dystrophinの増加した遠位型ミオパチーの家系を報告した6）．この家系では血清CKは正常であり，前脛骨筋の障害が下腿三頭筋より強かった．また心障害を伴うことが多いなど臨床像は異なっている．desmin，Vimentin，dystrophinの増加は筋変性過程の非特異的現象の可能性もあろう．本
家系は従来の欧米の報告例とは厳密には一致しない．
同一疾病における症候の多様性なのか別の疾病かは今

謝 辞：症例4の資料をご提供いただきました都立神経病院神経内科 宮本和人先生に深謝いたします．
文献1）春原経彦，岸林 潤，斉藤陽子ほか：Autosomal
dominantlimbてirdlemyopathy． 厚生省r精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィーの臨
床・疫学及び遺伝相談に関する研究 （高橋班）平成
5年度研究報告書，1994，p145．
2）Markesbery WR，Griggs RC，Leach RP，etal：Late onset hereditary distal

myopathy．

Neurology24：127，1974．
3）Welander L：Myopathia distalis tarda
hereditaria．Acta Med Scand141（Supp1265）：1，1951．

4）Udd B，PartanenJ，Halonen P，et al：Tib−
ial muscular dystrophy：Late adult−OnSet
distal myopathyin66

Finnish patients．

Arch Neurol駈：604，1993．
5）Edstrom L，ThornellL−E and Eriksson A：
A new type of hereditary distal

myopathy

with characteristic sarcoplasmic bodies andintermediate（skeletin）filamentS．J NeuroI
Sci47：171，1980．
6）HelliwellTR，Green ART，Green A，et al：−100−

Hereditary distal myopathy withfilamentous cytoplasmic

granulo−inclusions contain−

ing desmin，dystrophin and vimentin．J
NeuroISci124：174，1994．

26）Rimmed vacuoleにおけるアミロイド蛋白関連物質の発現について田研究協力者

連宮 本 和 人精松 原 四 郎桝は じ めに
H6年度より，rimmed vacuole（以下RV）を伴う疾
患の形成横序について検討を進めている．RVの疾患
特異性や疾患分類について見解の違いがあり，米国ではRVを認めた疾患の多くをinclusion body
myositis（以下IBM）と診断することが多く，本邦で言うRV型distalmyopathy（以下RVDM）もIBMに分類されている．mMの診断基準は，おもにRVの微細構築上の特徴として15−20mmの線推性封人体がmarkerとされてきた．最近では，蓄積物質を免疫染色にて同定し，Askansらはprion蛋白の，またChouらはamyloid−β蛋白とubiquitinの重要性を指摘し，amyloid−β蛋白とubiquitinが診断基準となりうるとしている．しかし，筋肉内のRVにprion蛋白やamyloid−β蛋白が蓄積する横序について十分な解明がなされていないように思われた．

等＊

菅
新

谷
井

慶
信

三拝 磯
隆榊

目

的

状の差が見られないかをも検討し，疾患の特異性について検討を進めたい．
対象
新鮮凍結切片のGomori−Trichrome変法にてRVを認めた神糸筋疾患10例，内訳RV型遠位ミオパチー（以下RVDM）5例，封人体筋炎（以下IBM）1例，限咽頭型ミオパチー（以下OPI）M）2例，その他2例．
方法

Prion蛋白に対する抗体は，prion蛋白のアミノ酸
配列90番から102番に相当する合成peptideを作成し，家兎に免疫し，pOlyclonal抗体を作成した．生検筋を＊文京市立神経病院＊＊東京都立神経病院神経内科＊＊＊東京郁神経科学研究所臨床病理英治蝉

ホルマリン固定後パラフィン封埋し，6〝切片を切り出し，脱パラ後リン酸緩衝液でよく洗い50％蟻酸3分，0．3％加メタノール10分で処理した後，1次抗体を4℃
overnight作用させ，biotin−abidine法にて2段階免
疫染色を実施した．その他，市版の抗ubiquitin poly−cIonal，抗タウ（polyclonal），抗amyloid−P compo−
nent（polycIonal），抗Amyoloid−βprotein（mono−clonal），eyStatin−C（polyelonal）等の抗体を用いて連続切片を染色した．
一部の症例では，中枢神経系で老人斑や neur0−−
fibrally tangle（NFT）を染め出すときに用いるメセナ
ミン銀染色 ガリアス染色を実施した．
また，アミロイド染色として小さなamyloid
depositでも十分観察可能なthioflavin−T染色を実施した．
措

筋肉内のRVに，prion蛋白やamyloid−β蛋白の蓄積機序やアミロイド生成の横序を解明する．さらにはRVを呈する疾患についてその蓄積物質により臨床症

崎黒まず，本研究を着手するきっかけになった症例を提示したい．症例は，8年以上前に経験されていたもの
で，筋生検で認められたrimmed vacuoleの意義が解決されないままになっていた．
症例1：S．S．66歳男性（NHS−1148）．
主訴：手足の運動障書，ものが見づらい，手足の筋萎縮
家族歴：妹と長女に運動失調症
病歴：47歳のときふらつき歩行で発症．53歳，言語障書．55嵐 痴呆や自殺企図などの精神症状．60歳，眼球運動障害と下肢筋萎縮が明らかになった．
神経症状：痴呆，限瞼下垂，眼球運動障害，限振，顔面筋萎輪，仮性球麻痺，断綴言語，協調運動陸曹，四肢筋萎縮，脛反射は初期に完進していたが，後に低下．
Babinski反射陽性，尿便失禁がみられた．
検査：頭部CTスキャン及びMRIにて小脳と脳幹の萎縮を認めた．筋電図で運動単位電位は，1mV以下の低振幅のものと5mV程度のものが同一筋に混在しており，干渉汝は減少傾向が認められた．安静時の自発放電は認められなかった．筋生検で，大小不同と小群集萎縮を認め，萎縮線経を中心にRVを多数認めた．

−101−

症例ニ88 65才 究INHS・1148）
主訴：首領障害、運動失駒、筋萎縮

家族匿：妹と長女Jo＄印h病の遺伝子異常
経過：47才歩行時ふらつき、53才言語障害
55才精神症状、60才暇球運動障害、筋萎縮
膿瞼下壷、暢球速鋤陣嘗
く達観．F症候群）
線反射：初期大漁、その礁徐々に低下J
馳加瀬油日力、闊失禁、便失禁

Gallyas Amyloid−β

図3

図1症例1，SSの概略

Priorl症例1のRVの染色，左からGallyas，Amyloid−β蛋白，prion蛋白

また，H6年度に痴呆を伴った家族性小脳変成症という観点から prion遺伝子を4組のprimerを用いたPCR法にて検索したところ，5 近傍に遺伝子異常があることが示唆されたが，既知の遺伝子変異と一致しな
いものであった．
以上より，本例はJoseph病の遺伝子異常とprion
蛋白の遺伝子異常が併存した例と考えた．RVについてAskanasらは免疫染色にてprion蛋白が証明されると報告していたので，本例のRV形成とprion蛋白の遺伝子異常との間に何らかの関連があるのではないかと考え，上記の合成peptideを作成し，家兎にて抗体を得て骨格筋を免疫組織学的に検索した．その結果，
RVの光顕的封人体と思われる部位にprion蛋白の免
疫活性を認めた．すなわち，異常なprion蛋白遺伝子により異常なprion蛋白が産生され，RV内に沈着した可能性が示唆された．筋内のRVの形成は，Joseph病とは独立したできごとと考えた．以上のことをH6
年度の班会議にて報告した．

図2 抗prion抗体を作成した時の抗原のデザイン
経過：優性遺伝形式をとる小脳変成症で核上性の眼球運動障害を強く認める点から小脳変成症についてはJoseph病を考えていた．しかし，顔面筋萎縮がみられたこと，筋生検でRVが出現した点がJoseph病では報告がなく，他の神経筋疾患が合併した可能性を残していた．その後，Joseph病の遺伝子診断が確立した段階
で，本人及び株，長女がJoseph病の遺伝子異常を保有していることが明らかになった．

器二＝■竺−

一一一

102

16
0
7
VR
D⁚十十■ND

十

ー

M

十

メセナミン
ガリアス

ND：未試行12耶■十■＋＋

温：：十m：

十−Cyst且tin981別：・■竺N︒N︒＋＋

Amyloid−β

ことが分かった．そのことから，当施設で経験された芸⁚・十二二M

Amyloid−P

品：N︒＋．竺■品

M＋＋

amyloid−β蛋白の発現を免疫組織学的に検討したところ，いずれも発現していることが確かめられ，ASkanaSやChouらのIBMにおける知見に一致する

表
誓⁚十十NDND＋NDND

品
Uもiquitin
Tau

H7年度に入り，上記症例についてubiquitinや

10例のRVを有する疾患についても同様の免疫組織学的検討を加えた．結果は，次の表に示した．Prion蛋
白の陽性例は10例中7例に及んだ．その臨床診断は，IBMのみならず，RVDMやOPDMに及んだ．
Ubiquitinについては，RVを認めた全例で陽性であった．Amyloid−β蛋白も陽性例が多く，Prion蛋
白陽性例と一致する傾向があるようにも思えた．
Thioflavin−Tによるamyloid染色をNHS120，250，
852，961，981，1148で実施して250，981，1148陽性であった．Amyloidの沈着がRVと一致しないものがみられた．

原牲パターンであった．筋生検では，筋線経の大小不同が著明で萎縮線経にRVを多数諾めたが，壊死・再生現象や炎症細胞浸潤はほとんど認めなかった．
経過：臨床症状と筋生検の結果よりRVDMと診断し，その後他院に転院となった．本例も10年以上前の症例であるが，今回の免疫組織学的検索で，prion蛋白と
amyloid蛋白が光顕的封人体に強く染まるため，筋生検の凍結切片よりDNAを抽出し，九大に解析を依頼
して上記の結果を得た．

今回，免疫組織学的検討を進める過程で定量化は困難であるが，NHS−250などは，prion蛋白などの抗原性の発現が特に強かったので，この例を九州大学医学部脳検病理の北本先生に依頼し，prion蛋白遺伝子の変異を調べて琉いたところ，COdon−129のMet−Valへの変異がホモ結合の状態で存在することが明らかになった．すなわち，RVを呈する例でprion蛋白の遺伝子異常が見つかった第2例となった．次にこの症例の概要を示す．
危訊：MS46yFtNHS・250）RVDM
16年前、と葉の脱力にて発症。

図5

く、精神
t CPK134ルe
OrPhism

Codon129Met−∨叫Val〃aりホモ

ま

1Dl

と

め

各抗体での陽性率は，Prion 7／10，Ubiquitin
■
l
t
﹁
−
ト
ー

−−■靂¶

■

ー
鴫
I
I
．
．
．
・

■

ノ
ちーーI
lI〜r・．−

日払Ⅵ

証糊言

■■■■

一hHけれ﹂−・・−1

呈︑

一 ′1．′二▼．． −佃叫榊

別の例の染色結果，左上amyloid−β，右上
prion蛋白，左下Cystatin−C，右下ubiquitinいずれも陽性で，この例ではeystatin一℃と
ubiquitinが光顕的封人体に染まる．

図4 症例2の概略，筋生検Gomori−trichrome変法とNADH−TR，筋電図にて上肢の第1背側骨間筋に筋原性変化をみる．
症例2：M．S．46歳女性（NHS−250）
主訴：四肢遠位部の筋萎縮
病歴：30歳頃，下腱前面と手の筋萎縮にて発症，緩徐に進行し最近では，近位筋にも脱力を生じ，車椅子生
活となった．
現症：意識知能に問題なく，顔面筋や舌に萎縮を認めない．胸鎖乳突筋に萎縮を認めるが，僧帽筋や肩甲周囲筋には有意な萎縮は認められない．筋力は上肢近位部で3／5程度，遠位で3／5程度，下肢近位も3／5，下肢遠位は0／5であった．知覚障害や排尿排便障害・協調
運動障害は認めなかった．
検査：CK借の上昇はなく，筋電図では遠位有意の筋

lO／10，tau5／9，Amyloid−P6／9，Amyloid−β 3／8，
Cystatin3／6であった．Thiflavin−Tによる amyloid
染色でRVは染まるが，さらにRVから離れた部位に蛍光が認められる場合があった．メセナミンとガリア
スは陽性例がなかった．以上より，RVでのamyloid
蛋白関連物質では，prionの発現頻度が最も高く，tau
蛋白とamyloid−β蛋白は多少低かった．Thioflavin−
Tの結果から，一部のRVにのみamyloidが蓄積しており，またこのような疾患においては，RV以外にも
amyloidか蓄積していることが示唆された．老人班やNFTなどとは，アミロイド生成の機構に違いが示唆さ
れた．

参考文献
1）Chou SM：Inclusion body myositis．Baill−
ieres ClinNeuro12：557−577，1993．
2）Askanas V and EngelWX：New advancesin−103−

inclusion body myositis．Crr Opin Rheuma−
to15：732−741，1993．

27）三好型遠位型筋ジストロフィーの遺伝子解析
水 野 美 邦＊

研究協力者

平

林

久

吾＊・糾

は じ めに三好型遠位型筋ジストロフィーすなわちMiyoshi
distalmuscular dystrophy（MDMD）は1967年三好らにより初めて家族例が報告され，その後1977年に一疾患単位として提唱された常染色体劣性遺伝疾患である．三好らの報告によれば，四国での推定される有病率は10万人に0．5人である．本症は日本のみならず，
東アジア，欧米，北アフリカにも存在する．（MDMDの臨床特徴）発症年齢は12−35歳にわたるが，多くの例（80％）では15〜20歳であり，常染色体劣性遼伝形式をとる．臨床的には早期より選択的に俳腹筋，ヒラメ筋の筋力低下と筋萎縮を認め，進行期には下肢近位筋
や上肢筋も侵されることを特徴とする．中枢および末梢神経に異常は認めない．検査所見では血清CK倍は正常の10−150倍と高値を示す．筋病理は，壊死，再生像を含む一般的な筋ジストロフィーの特徴を示す．
目

的

荒

畑

喜

一榊

Brown，R．H．Jr．綿

今回の対象は近親婚のある家系，ないしは両親と複数の同胞のいる家系を選抜し，近栽婚5家系を含む12家
系（内訳は，日本人5家系，欧米人5家系，チュニジア人2家系）の総数88例で，うち患者は35例であった．
検索可能なsimple repeat polymorphysms DNA多形マーカーを約20センチモルガン（cM）間隔で設定し，連鎖解析を全ての常染色体にわたって行った．
2．MDMDの遺伝子座が第2染色体短腕13領域にmapされたことより，第2染色体短腕13領域にmpされている退伝子のうち筋細胞で発現しているものは
MDMDの原因退伝子として可能性を持つ．既に第2染色休短腕13領域にmapされている遺伝子群として，
transforming growth factor alpha（TGFA），thy−roid peroxidase，anneXin4，early growth re−sponse4，aCta3，hexikinase2，OrXl，madが知られており，そして第2染色体短腕にmapされているが，明確な染色体上の位置が示されていない膜関連蛋

2．平成7年D2S291が2p13．1にmapされたことより，
MDMDの原因遺伝子は第2染色体垣腕13領域に存在

白質として，Syndecan，integrin．aipha−3，integrinalphal；，integrin beta−6，が判明している，今回
我々は，MDMDのcandidate geneとして2p13にmapされている造伝子に焦点をあてPCAを試みた．
対象はマイクロサテライト多形マーカーD2S291にて連鎖することを確認した近親婚5家系を含む，することが判明した．このことより，平成7年本研究で我々はMDMDの原因遺伝子を同定するため，

MDMD12家系（内訳は，正常者4例，保因者28例，発症者22例）合計54例を用いた．第2染色体短腕13領域

MDMDのcandidate geneとして2p13にmapされている遺伝子に焦点をあて，pOSitional candidate ap−
proach（PCA）を試みたため報告する．

にmpされている遺伝子群のうち細胞発育に関連し，

1．平成6年本研究で，MDMDの原因遺伝子を解明する第一歩として，連鎖解析を行いその遼伝子座を明らかにしたため報告する．

方法
1．MDMDの連鎖解析：我々はMDMDの退伝子座の決定を行うにあたり，マイクロサテライトDNA多形

epidermic growth factor receptorに結合する
mFA，及びファイブロネクチンと結合し，fibr0−
blastgrowthfactorと複合体を形成する膜関連蛋白質syndecanについて遺伝子解析を行った．二つの退伝子の各々のエクソンをはさむプライマーを設定し，PCR法にて増幅した．PCR産物のサイズはsequenc−

VAX4500computer／Lipin version2・l data man−ing gelにて同定し，欠損や挿入を調べた．さらに
SSCP法にて点変異を含む退伝子異常の検索を行った．
TGFAはintron−eXOn borderを含むプライマーを設

agement program及びLIPEDを用いて解析した．

定し，Syndecanはexon内でプライマーを設定した．

（dinucleotide−tetranuCleotide repcat polymor−

phisms）を利用した連鎖解析を行った．その結果は＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊村MGH，ハーバード大学医学部

結果

MDMDの連鎖解析の結果：図1は連鎖解析の結果のま

−104−

系11
家
9

4

0

5

2

4

．3．2．1
52
52
52
4
2

1

tel

21●

25

27

マーカー
■

DZS134

Zp13−14︼

2

3

D2S296︼

D2S290−2

D2S28Z

一

2

︼

1
2

DZS285
DZS358DZS303

■

●

⁝

一

■

一

一

︼

︼

L
一

l

−

■

一

一
一

−

−

●

■

−

−

DZS135

︼

l

−

■

3

−

DZS113︻l−

DZS329i■巳■■一

DZS169∵4−

1

DZS286︼■i■︼﹃■■︼■

一

−

■

︼

■

−

■■■

■

−

︻J

一

1

D2S291−

D2S292−

6−弓・＝＝十十．⁚巨

DZS136

Ⅰ連鎖領域●血放結婚●●チュニジアの大家系

図1とめである．左側にマーカーの個位とそのマーカー間SSCP法による解析ではグリセロールの濃度を変えてのgenetic distanceを示している．記載した15個のマーカーの順位はGenethonが発表したものを使用しもmobilityshiftは認めず，点変異は除外された．
結論ている．第2染色体短腕12−14にmapされた15種のマーカーはすべてMDMDと有意の連鎖を示し

MDMDの原因遺伝子は第2染色体短腕13領域に存

I）2S291（Zmax＝15．3，theta＝0）で最大のlod scoreを得た．同じくD2S286（Zmax＝10．7，theta＝0），及び
D2S292（Zmax＝7．2，theta＝0．5）でそれぞれ高いlodscoreを得ている．縦のバーは各々の家族において連在する．しかしながらtransforming growth factor
alpha（TGFA）及び，SyndecanにはMDMD家系において，遺伝子変異は兄いだせなかった．今後さらにその他の遺伝子についても検索していくつもりである．

鎖の認められた領域を示している．例えばfamily2
では，検索したマーカーに対して組み替えなしに連鎖を認めたが，hmilyllではD2S291−D2S292の間とD2S329−D2Sl13の間でそれぞれ組み替えが起こった．
マーカーD2S291は全ての家系とlinkageした．
D2S291の約2cM telomeric sideのD2S286は2家系と1inkageがなく，D2S291の約4cM centromericsideのD2S292はねmily21で組み替えを認めた．つまり，MDMDの責任遺伝子はD2S292とD2S286の間，
約6cMの間に存在することが判明した．このことより
MDMDの遺伝子座は2p12〜14にmapされた．
MDMDのPCAの結果：TGFA及びsyndecanのPCRにより増幅された各エクソンサイズはゲノムDNAの文

献1）BejaouiK，etal：Neurology45，768，1995．
2）Bashir R，et al：Hum MoI Genet 3，455，
1994．

3）MiyoshiK，etal：BrainlO9，31，1986．
4）WeissenbachJ，etal：Nature359，794，1992．
5）Gyapay G，etal：NatureGenet7，246，1994．
6）TrofatterJA，et al：AMJ Hum Genet39，
147，1986．

7）OttJ：AmJ Hum Genet26，588，1974．
8）三好和夫ほか：日本臨床35，3922，1977．
9）三好和夫ほか：日人造誌12，113，1967．．

ものと一致しており，欠損は認められなかった．
−105−

Ⅴ．筋緊張性ジストロフィー，その他（1）28）ミオトニンプロテインキナーゼ（MtPK）cDNA．導入筋芽細胞における筋関連蛋白遺伝子の発現解析
寺

尾

寿

夫＊

研究協力者 臼 杵 扶佐子＊・榊斉 藤 直 人綿
笹

川

昇＊

は じ め に

筋緊張性ジストロフィー（DM）の原因遺伝子は常染色休19q13．3に存在するミオトニンプロテインキナーゼ（MtPX）であることが1992年に同定された1〜3）
MtPXはトリプレットCTGのリピートが3 非翻訳領域中にあり，そのリピート数と症状に比例関係があることが認められている．MtPXは，その塩基配列よりプロテインキナーゼと命名されたが，真にキナーゼであるのか，MtPXの生理作用に関しては未だ不明な部
分が多く残されている．そこで今回，株化された筋芽細胞にヒトMtPXのcI）NAを 導入しstableにMtPXを発現させた筋芽細胞を用いて，MtPX変異遺伝子が筋肉に及ぼす影響を検討した．
方法

遺伝子導入の方法として，カチオン性リポゾームであるLipofectinを用いてリポゾーム核酸複合体を作らせ，eDNAを細胞に取り込ませる方法をとった．
MtPX変異遺伝子としては，これまでのところ CTG
リピート数を人工的に増幅させることに成功した最大値である46個のものを用いた4）．この変異ヒト
MtPX cDNAの全長をプラスミドpSRDに構築したものと，neOmyCin耐性遺伝子を組み込ませたプラ
スミドpSV2−neOをLipofectinとともにマウス筋芽細胞株C2C12にco−tranSfectionした．controlとしては
インサイトフリーのpSRDプラスミドとpSV2−neOを導入した筋芽細胞株C2C12を用いた． co−transection後16hr cultureした後増殖培地へ変換，
48hrの培養後，G418400FLg／mlにてneomycin耐性細胞の選択培養を行った．このようにして得られた
G418耐性細胞株を，抗MtPX抗体による
immunoblot及びCTGリピート部をはさむprimerにて行ったRT−PCRにてMtPK変異遺伝子の発現解析を行い，MtPX購安定発＊帝京大学医学部神経内科＊＊東京大学分子細胞生物学研究所＊＊＊現）国立水俣病研究センター

石

清

華

一書＊

現細胞株を得た．
このMtPK嶋安定発現細胞株における筋分化過程でのMtPK及び筋関連蛋白遺伝子kardiac a−aCtin，
myogenin，SyntrOphin−1）の発現をRT−PCR法にて検討した．10cmシャーレに3×105個のcellをplate
して増殖培地で培養1日目のmyoblastic sbge（Mb），融合培地へ変換1日目（Fl），4日目（F4）のto−tal RNAを抽出し，それぞれのprimerにて RT−
PCRを行った．MtPKのprimerはkinase domain
にて作成した．G3PDHはpositive controlとして用いた．
また，筋芽細胞の融合度を細胞組織化学的に検討した．gelatin−COatのカバーグラスへ細胞をplateL，1
日後融合培地へ変換，変換1日目から4日目で各々細胞を固定し，tOluidine blue O染色後，randomに6視野を選択，核数を評価した．すなわち，3個以上の核をもつ細胞を融合したものとして，これらの核数とtotalの核数の比をfusionindexとして表した．
結果及び考察MtPX変異遺伝子の発現解析にて，COntrOlである
C2C12−neOはRT−PCR，immunoblotともnegativeであった．変異遺伝子導入株C2C12−MtPX4。では RT−PCRにおいて予想される337bpのバンドを，
immunoblotにて約70kDaのMtPK蛋白の発現を認めた．MtPK蛋白は，分化培地へ変換7日目においても同様に約70kDaの蛋白として認められた．
増殖曲線より得られたdoubling tlmeはMtPX．6導入株が16．7hrs，COntrOlが18hrsとMtPX．6導入株がややはやい増殖を示した．
このようなMtPX．6導入株における筋分化過程におけるMtPK及び筋関連蛋白遺伝子の発現をRT−PCR
法にて検討した．図1に結果を示す．MtPXは，COn−trolではnegative，MtPK．6導入株ではmyoblastより発現を認め，融合培地へ変換4日日まで発現量には変化を認めなかった．cardiac a−aCtinはcontrolでは分化とともに発現の増強がみられたが，MtPK鵬導入株−109−

C2C12。e。MtPK．。
MbFI F4MbFI F4

ェ

r l二

L − L −−− −7

Syntrophin−l

5

−

1

」−L

Myogenin

一0−

Cardiac cl−aCtin

1

・

MtPK

5

m

︵邑×gu三〇扇⊃﹈

二二一一二

G3PDH

図1RT−PCRを用いた筋分化過程における筋関連蛋
白遺伝子の発現Mb；myOblasticstage，Fl；融合培地へ変換
1日目，F4；融合培地へ変換4日目

0

1

2

3

4

5

Daysjndifferentiationmedium
図3

分化培地へ変換後のfuSionindexの変化

C2C12n。。MtPK．6
C2C12∩伽

MtPK。6

MbFI F4MbFI F4

nNOS
G3PDH
図4

分化過程におけるneuonal NO synthetase（nNOS）の発現
Mb；myOblastic stage，Fl；融合培地へ変換1
日目，F4；融合培地へ変換4日目

図2 分化培地へ変換4日目の位相差顕微鏡写真（×75）
controlでは，多核の筋管細胞の形成がみられる
が，MtPK．6CDNA導入株では融合の遅れを認める．
では融合培地へ変換4日目までほとんど発現を認めなかった．分化マーカーであるmyogeninはcontrolでは分化とともに発現の増強を諾めたが，MtPX嶋導入
珠では発現の遅れを認めた．syntrophin−1は筋芽細胞より発現を認め，MtPK舶導入株でも同様に発現が認められた．分化で影草をうけないG3PDHはcon−trol，MtPX哺導入珠でもすべてのレーンで同様に発現が認められた．
従って，導入筋芽細胞株C2C12−MtPX嶋では，分化過程において筋関連蛋白遺伝子の発現に遅れが認められることが明らかになった．
融合培地へ変換4日目の位相差顕微鏡写真を図2に示す．controlでは多核のmyotubeの形成が認められたが，MtPK哺導入株ではmyotubeの形成は稀であった．この筋芽細胞の融合度をtoluidine blueO染色後，定量的に評価した結果を図3に示す．eontrolでは2日目よりfusionindexは増加したが，MtPK側導入株では，融合の遅れが明らかであった．
筋芽細胞の融合に関するfactorとして，最近nitricoxideが報告されている5）．nitric。Xide はNO
synthetase（NOS）により合成されるが，筋芽細胞の融合の際に一過性にNOSが増加すること，また，筋肉組
織に存在するNOSはneuronal typeでtypeⅡfiberの鼠rCOlemmaに存在すること6）が報告され，筋肉におけるNOの作用が注目されている．そこで，neurOnal
typeのNOSに開Lprimerを作成し，各々の celllineの分化過程におけるNOS mRNAの変化を検討した．図4に結果を示す．controlでは分化にともない
NOS mRNAは増加を諾めたが，MtPX．6導入株では融合培地へ変換4日目までまったくnegativeであった．
以上より，導入珠C2C12−MtPK．6では分化抑制がおこることが明らかになった．この結果は，myOtOnic−111〕−

dystrophyにおける筋線椎の未熟性という生検筋の組

2）Fu YH，PizzutiA，Fenwick RG，eial：An

織化学的所見と一致すると思われる．分化抑制の原因に関しては，NOS mRNAの発現がみられなかったことと併せ，シグナル伝達系を含めたさらなる検討が必要である．

unstabletripletrepeatin a gene related to
myotonic muscular dystrophy．Science255：1256−1258，1992．

3）JansenG，MahadevanM，Amemiya，et al：Characterization of the myotonic dystrophy

ま

と

め

reglOn Predicts multiple proteinisoform−en−

CTGリピートを46個延長させたヒトMtPK変異遺伝子の全長を導入した筋芽細胞株C2C12−MtPX．卓では，分化過程において筋関連蛋白遺伝子の発現の遅れや形態学的に融合の遅れが認められるなど，分化抑制がおこっていることが明らかになった．

COdingmRNAs．NatureGeneticsl：261−266，
1992．

4）Sasagwa N，SorimachiH，Maruyama X，etal：Expression of a novel human myotoninprotein kinase（MtPK）cDNA clone which
encodes a protein with a thymopoietin−1ike文献domaininCOScells．FEBSLett351：22−26，

1）BrookJD，McCurrach ME，Harley HG，etal：Molecularbasis ofmyotonic dystrophy：
Expansionofa trinucleotide（CTG）repeat at
the3

end

ofa

transcript

encodinga1994．

5）LeeKH，BaekMY，MoonKY，etal：Nitric
OXide asamessengermolecule for myoblast
fusion．J「BioIChem269：14371−14374，1994．・

pro−tein kinase family member．Cel168：799−

6）Ⅹobzik L，Reid MB，Bredt DS，et al：Ni−

808，1992．

tric oxidein skeletal muscle．Nature546−548，1994．

−111−

372：

29）Mytonin Protein Kinase（MtPK）のin vivo及び‡花が肋・0における局在

＊

彦 一 一

＊
＊
締

雅章紘

蝉

本浦木

綿

山石鈴

＊

佳穂之

典秀洋

＊

田田町

・事

綽

紆

蝉

筋緊張性ジストロフィー（DM）の原因遺伝子は，19

亀植反

＊

文 一 昇

雅仲

的

高

林

小

目

川野川

下大笹

研究協力者

MtPXの局在の有無を検討するためにα−bungaro−
toxin（α−BGT）を使用した．2次抗体としてはFITC

番染色体長腕に存在し，Serine，threonine protein
kinaseとmonologyを有することから，myOtOnin
proteinkinase（MtPX）と名付けられているが，その機能，局在に関しては十分解明されていない．今回，我々は，MtPI亡のC末端領域のポリクローナル抗体を作成し，i花血0及びf几Uか0における局在を，共焦点レーザー顕微鏡による免疫組紐化学的検討を行うと共及びrhodaminを使用し，MtPK／ミオシン，MtPK／アクチン，MtPX／a−BGTの2重染色でMtPXの局在の検討を行った．
共焦点レーザー顕微鏡はCarl−Zeiss社製LSM310をに，DM筋におけるMtPXの局在に関しても検討を行ったので報告する．

い，単独，盃ね合わせ像，微分干渉像をとり検討を行った．

材料及び方法

免疫電顕的検討のために，光顕的観察で使用したものと同一のcontrol筋及びDM筋を使用して，（1）MtPKpolyclonaIantibodYの作成
Sasagawaら（1994）1）がクローニングを行った
cDNAの酉己列を基にしてC末端の合成ペプチド（SGAAQEPPALPEP）を作成し，これを兎に免疫し，ポリクローナル抗体を作成し，affinity columnに通し精製して使用した．
（2）Wostern blotによるMtPKの生化学的同定
Cos−1細胞にMtPK cDNAを導入し，fulllengthのMtPKを得ると共に，ヒト筋肉を超遠心によって，膜及び可溶性分画に分けてWestel・n blotで我々の作成した抗体の特異性に関する検討を行った．
（3）ヒト筋細粒に対する免疫組織化学的検討及び免疫電顕的検討材料として，神経筋疾患を有しない剖検時に取られた筋組積及び組抱化学的に非特異的変化のみの生検
筋及びDM筋に関して検討を行った．
免疫組織化学は，一次抗体として，MtPKのポリク
ローナル抗体，ヒトミオシンに対するモノクローナル
抗休，F−aCtinに対してはロダミンでラベルした
phalloidinを使用し，更に神経筋接合部における
辛東京医科歯科大学医学部神技内科
暮春山梨医科大学第1解剖＊＊＊東京大学分子生物学研究所生体超高分子分野

使用し，FITCラベルの蛍光染色は亜8nm励起波長を用い，525nmの帯域で測定，rhodaminラベルの蛍光染色は543nmの励起波長で590mmの帯域で測定を行

immunoperxodase法及びimmunogold法により免疫染色し，HitachiH−600及びH−8100を使用して超微構造的検討を行った．
伺）培養ヒト筋細胞に対する免疫組織化学的検討
内因性筋疾患を有しないと考えられた生検筋の一部を使用した．ヒト筋細胞の培養は以前より報告している如く，eXplant−reCXplantation法により筋単層培養を作成し，更に，ラット胎児脊髄片を併置してinner−vation cultureを作成した．
免疫組結化学は，ヒト生検筋と同様にMtPX／ミオシン，MtPX／アクチン，MtPX／α−BGでの2重染色を行い，MtPXの局在の変化に関する検討を行った．
結果（1）W8StOrn blotによるMtPKの同定（図1）Western blotによる検討では，我々の抗体はヒト筋組織の70kDaの脳分画及び55kDaの可溶性分画を認識した．同時にこの抗体は，COS細胞にcDNAを
transfectして得られた69kDaのfulllengthの合成
MtPXfusion proteinと特異的に反応しており，ヒト
筋組織の70kDaの脱分画にはfulllcngthのMtPXが存在していると考えられた．
（2）ヒト骨格筋組織におけるMtPKの局在

−112−

12

3

MtPKの生検組織の単独染色では，縦断面ではband
状に，横断面では顆粒状に染色され，細胞膜は染色されなかった（図2−A，B）．生検筋組織の2垂染色による観察では，MtPKとミオシンでは，両者のbandの境界部分にcolocalizationがあり，Mtpkとアクチンでは，
MtPXとアクチンのcolocalizationしているbandとkDa

アクチンのみのbandが交互に存在するのが観察された．この所見から，MtPXは，光顕的にはA帯とⅠ帯の境界及びⅠ帯にMtPXが強く局在していると考えら
れた．

43

−

更に免疫電顕によって，丸仇PXの起語構造的局在の検討を行ったが，MtPKはsarcoplasmic reticulum（SR）のterminal cisternaeに強く限局して存在した

30（図2−C，D）．
（3）培養ヒト筋細胞に対する免疫組織化学的検討
一方，培養下では，MtPXは未熟な筋管細胞では，

図1Western blotによるMtPKの同定
1anel：Cos−1cellにMtPKのc DNAを導入して得られたMtPX】alle2：ヒト骨格筋の膜分画
lane3：ヒト骨格筋の可溶性分画核周辺あるいは細胞膜下に不規則に存在し，アクチン
及びミオシンとの相互関係は明らかではないが，innervation後，横紋が形成された筋線経ではミオシンbandの間にMtPKは局在するようになり，アクチンbandとは2bandsがMtPK bandとcolocali2；ationがあり，次のbandかアクチンbandのみとなるtripletの配列となり，基本的にⅠ帯に局在していくことが明らかとなった．
（4）組織及び培養下におけるMtPKの神経筋接合部における局在
ヒト骨格筋組織に対するMtPK／α−BGTの二重染色による検討では，α−BGTに一致したMtPXのcolo−
Calizationの部位が認められ（図3），また，inner−vation cultureにおいても位相差顕微鏡像の観察で神経終末と考えられる部位に一致して，MtPXとα−
BGTがcolocalizationしている部位が観察された．
（5）DM筋におけるMtPKの局在の変化
DM筋の光顕的観察では，MtPXの染色が正常組織において観察されるband状の染色がStrealningしている＝教が観察され（図4−A，B），一部の筋線経では
MtPXの染色性の低下が認められた．免疫竃顕による検討では，筋線錐の構造がよく保たれている部位では，

図2

正常筋組織におけるMtPXの局在
A，B：MtPKの免疫組織化学のヒト骨格筋縦断像（A）及び横断像（B）の光顕写真
C：MtPKのimmunoperoxidase法による電顕
写真：Triadの部分のSRのternimal cisternaeに強い染色性（矢印）が認められる．
D：MtPXのimmunogold法による電顕写真：T菅（T）の外側に5nmのgold particleの集積（矢尻）が認められる．

control筋と同様にtriadがよく保たれ，その部位のSRのterminal cisternaeにMtPXが強く限局していた（図3−C）が，筋線経の内部構造が乱れている部位では，膨化した膜系の集族した像が観察され，その膨化した膜系の一部にMtPXの強い染色性が認められた（図4−D）．
考察及び結論今まで報告されてきたMtPKの分子量は42〜62kDa
であり，MtPXのcDNAから推定される分子量より低−113−

れておらず，今回の我々の研究が初めての報告である．
今回の我々の抗体による免疫組織化学的検討で特異的な点としては，この抗体では骨格筋の細胞膜は染色されず，光顕的にはMtPXはⅠ帯及びA−Ⅰ帯の境界に存在し，免疫電顕によってSRのterminal cisternaeに強く存在することが明らかにされたことである．更に，DM筋に関して同様に免疫組織化学的に検討を行った

図3 正常筋組織におけるa−BGT（A），MtPX（B）の蛍光二重染色共焦点レーザー顕微鏡像が，DM筋においてもMtPXは，SRのterminal
cisternaeに強く存在し，変性の強い筋線経では一部に
MtPX染色陽性を示す膨化した膜系の集族が観察された．SRは，細砲内のカルシウムの代謝調節，e又Cita−tion−COntraCtion couplingに重要な役割を果たしており，このようなDMでのSRの変化は，DMの筋変性及び，病態の発症機構を考える上で興味深い．
また，MtPXの局在に関しては，今まで骨格筋では
神経筋接合部に存在するという報告がいくつかなされており，我々の抗体も神経筋接合部を認識していると考えられる．DM筋では，従来から形態学的にin血0
及び血ひか0において神経筋接合部異常が報告されており4），今後神経筋接合部におけるMtPXの機能と病態生理との関係を追究していくことが必要であると考
えられる．
文

献

1）Sasagawa N，Sorimachi H，Maruyama：K，
Arahata K，Ishiura S，et al：Expression of
a novel human myotonin protein kinase（MtPX）cDNA clone which encodes a proteinwith a thymopoietin，1ike domainin COS
Cells．FEBSletters351：22−26，1994．

図4

筋緊張性ジストロフィー骨格筋組織における
MtPXの局在
A，B：MtPX免疫組織化学のDM筋縦断像（A）及び横断像（B）の光顕写真
C，D：MtPKのimmunoperO｝こ三dase法による電顕写真2）Whiting EJ， Waring JD， Tamai X，Somerville MJ，Hincke M，et al：Charac−terization of myotonic dystrophy kinase（DMK）proteinin human and TOdent muscle
and centTal IlerVOtlS tissue． Human MoI
Genet4：ieS3−1072，1995．
3）Maeda M，Taft CS，Bush EW，王iolder E，いものが多く報告されてきたが，最近Whitingら2），
Maedaら3）は74，82kDaあるいは71，81kDaの分子量をもつMtPKが骨格筋，心筋にあることを報告してBailey WM，et al：Identification，tissureL
SpCCific exprcSSion，and subcellularlocaliza−
tjon of

班e

80−

and

71−

kDa

ぎOrms ofいる．今回我々が作成した抗休は，70kDaのfull
lengthのMtPXを認識し，骨格筋組織の70kDaの膜分画の蛋白を認識する抗体である．いままで報告されている42〜62kDaの蛋白及び我々の可溶性分画に存在
スル55kDaの蛋白は，isoformあるいは分解産物である可能性が推測される．

Ll）Kobayashi T，Askanas V，Saito X，Engel

今までに，MtPKの局在に関して共焦点レーザー顕微鏡及び電子顕微鏡による免疫組歳化学的検討は行わ（dystrophy）．Arch Neuro147：893−・896，1990．

myotonic dyStrOphy kinaSe PrOtein．J BioI
Chem270：20246−20249，1995．

−114−

WK and Ishikawa X：Abnormalities ofaneural andinnervated cultured muscle fi−

bers from patientswith mytonic atrophy30）CTGリピートの遺伝子発現に及ぼす影響の解析
小 林 卓 郎＊

研究協力者

古

谷

山

田

博

打

長

猛＊

は じ めに
筋緊張性ジストロフィー（以下MyDと略す）はCTG
リピートの延長で発症する常染色体優性の遺伝性疾患であり，近年ではHuntington舞踏病，DRPLA，
Machado−Joseph病，脆弱Ⅹ染色体症候群，SCAl，
球脊髄性筋萎縮症などとともにリピート病として分類されている．しかし，この中でMyDと脆弱Ⅹ染色体症候群以外のリピート病はCAGリピートの延長であり，しかもこの領域はアミノ酸に翻訳されるのでポリグルタミン病というgain−Of−functionの概念でとらえられている．それに対してMyDではCTGリピートがミオトニンカイネース退伝子（以下MKと略す）の3 非
翻訳領域にあり，しかもその延長の程度が激しい点などが他のリピート病と異なっている1）．
またMyDは常染色体優性の遺伝性疾患であるので，病因がgain−OHunctionでないとすると，リピートの延長が疾患発症機序にどのようにしてかかわってくる
か興味がもたれる．
そこでまずCTGの延長が遺伝子発現に及ぼす影響を調べるために，allele別のMX遺伝子の発現をMyD患者の種々の組織で検討し，リピートの存在が変異型
allele，野生型alleleのMX遺伝子にどのような影響を及ぼすかを検討した．次に既知の遺伝子をリポーター遺伝子として用い，その3 非翻訳領域に人工的にCTGリピートを挿入したコンストラクトを作成し，リポーター遺伝子の発現を定量した．

対象・方法

野

林

祐

久■

健

志韓

RT−PCRに用いた．2）RT−PCR法による8日ole別mRNA発現豊の解析延長したCTGリピpトのあるalleleとポリモルフイ
ズムとの関連を調べるためにポリモルフイズムをヘテロで有するMyD患者のゲノムDNAを制限酵素ghd
Ⅲ，gbαⅠで処理してサザンプロッテイングを行い，同時にゲル電気泳動を行った同じサンプルから正常
alleleを切り出し，ポリモルフイズム周辺（257bp）の領域を増幅した後にポリモルフイズムの有無を検出し，それがCTGリピートのある変異alleleか，野生型a1−1eleにあるかを決定した．
次にcDNA合成キット（ファーマシア社）のランダムプライマーを用いてcDNAを合成した後，これをテンプレートとしてポリモルフイズム周辺（257bp）の領域を［a−32p］dCTPでアイソトープラベルしてPCRを行
い，5サイクルごとに一部のサンプルを取り出して制限酵素月訂Ⅰで切断して10％アクリルアミドゲルで電気泳動後オートラジオグラフィーを行い，バンドをスキャナーで読み取った後，NIHimageをソフトウェ
アとして用いてその濃度を解析し，mRNA発現量のallele別のMK遺伝子発現量を比較した．なお，手技の詳細に関しては既に平成5年度研究報告書に報告している4）．
3）CTGリピートを挿入した遺伝子発現系の作成
リポータージーンとしてはリソソーム酵素のga−
1actosylceramidase（GALC）を用いた5）〜7）・まずリ
ピート領域をサブクローニングするためにMyD患者のMK遺伝子3，側非翻訳領域をゲノムDNAをテンプ

1）ゲノムDNAおよびtotalRNAの抽出レートとしてPCR法で増幅後制限酵素〟叩Ⅰで処理

MX遺伝子ハプロタイプ解析の結果，MXcDNA内にBsrIRFLP2）・3）をヘテロで有するMyD患者（2例），

して，一旦pUC19のgdIサイトにサブクローニング
し，シーケンスにてリピートの数を確認した・∴その後，
このCTGリピートをCMVプロモ「ターとSV400ri

先天性MyD（1例）の末梢血白血球と線推芽細胞よりゲ
ノムI）NAとtotalRNAを抽出した．次にBsT・I
RFLPをヘテロで有する凍結剖検脳（2例）よりtotal
RNAを抽出した．ゲノムDNAはハプロタイプの解析
及びCTGリピートのクローニングに，tOtal RNAは
＊九州大学医学部脳研神経内科＊＊九州大学遺伝情報研究穐投●ゲノム解析寺門を有するpRC／C〟γ真核細胞発現づク▼ター（JれⅤか。geれ杜）のgbαⅠ，ApαⅠサイトにサブグローニ
ングして，さらにリギートの5 上流のgbαⅠサイトに
野生塑（作成したクローン．をWT，Rep（十）で示す・以下同様），およびGALC活性を全く有t！ない270Asp変
異を有する変異型qALC cDNA（MT，Rep（＋））を挿入挿入した．またこれとは別に野生型GALCcDNAの

−115−

βgJⅢ

〟rlJl

1

W，Rep（巾2

3

4

3．97 3．45 4．93 8．6

MT，Rep（＋）

0．9

1．6

1．071．5

ⅥT，Rep（・） 2．44 2．612．22 3．14
WT．R●PM HT．ReH◆I T．R印り

図3

図1CTGリピートをGALCcDNAの3，下流に挿入したp月C／C〟Ⅴ真核細胞発現ベクターの構造

CTGリピートの5 上流リポーター遺伝子
炬ALC）発現に及ぼす影替．（WT，Rep（＋）），（MT，Rep（＋）），（WT，Rep（」）のベクターのGALC活性のバックグラウンド忙OS−Ⅰ細胞のみの活性）に対する比を示した．測定は4回行い，表にはそのデータ一，図にはmean±SDを示した．

みをp月C／C〟Ⅴベクターに入れたもの（WT，Rep（−））も作成した（図1）．
これらのDNA2LLgを5LLlのLipofectamin（BRL社）
でCOS−Ⅰ細胞にトランスフェクションし，3日後に回収してそのGALC活性を測定した．
結果1）MK遺伝子の8日ob別発現の検討
CTGリピートとBsrIRFLPとの相関を枚討した結果，5例のサンプルではこれまでの報告とおりに二つの変異は同じalleleに存在することが判明し，CTGリ
ピートのある変異alleleのハプロタイプが均一である

月grIRFLPをヘテロで有する2名のMyD患者（既にMXcDNA上のBsT・I（＋）のRFLPとCTG
リピートの延長が同じallele上にあることが確認されている）の線維芽細胞仏，b）と末梢血白血球（C，d）のmRNAをテンプレートとしてBsT・I
RFLP近傍（257bp）を［a−32p］dCTPでアイソ
トープラベルしたRT−PCRで増幅した．25，30，
35サイクルで一部のサンプルを取り出して月餅Ⅰで切断し，10％アクリルアミドゲルで電気泳動後，オートラジオグラフィーを行った．
図には257bpのサイズのバンドの法度を162bpのサイズのバンドで割った借をmean±SDで示している．実験はそれぞれ6回行った．
CTGリピートのあるalleleのMX遣伝子の発現量は162bpのサイズのバンドに反映されリピー
トのないalleleのMX遺伝子の発現量は257bpのサイズのバンドに反映されている．［α−32p］
dCTPはPCR断片にランダムに取り込まれるので，双方のalleleが同量発現していても，理論上257／162（≒1．58）の借をとるはずである．

ことが確認された8）．
また，このRFLPを用いてallele別の発現を脳組粗末梢血白血球，線推芽細胞の間で検討したが，変異
alleleと野生型alleleとでMXmRNAの発現量に差は認められなかった（図れ また，通常のMyDと先天性MyDとの間にも差は認められなかった．
かCTGリピートの5−上流遺伝子発現に及ぼす影響
サブクローニングしたCTGリピートをシーケンスした結果，リピートは135回の繰り返し配列であることがわかった．またトランスフェクションの結果は表に示すようにCTGリピートの入った野生型（WT，Reph））ではリピートのないもの（WT，Rep（−））に比べて2．5倍近く高いGALC活性が得られた．一般にGALC
酵素活性は蛋白の発現量に比例しているので，リピートの入ったベクターではリポーター遺伝子の発現量が増加していると考えられた（図3）．

−116−

考

案

CTG配列の延長がMX遺伝子の発現に及ぼす影響に関してはこれまでmRNAの増加3），減少9），MX蛋白

ofthe myotonic dystrophy（DM）mutation on
mRNAlevels of the DM．Nat Genet4：233−

発現量の減少10）など種々の報告があり，いまだに定説が得られていない．
mRNAの3，翻訳領域はmRNAの安定性や蛋白の翻訳時の効率に関与するなどの説があり，この領域に非常に安定した高次構造を形成するCTGリピートが存在することは退伝子の発現に関して大きな影響を及ぼすことが考えられる11）12）
患者の組織別にMX遺伝子のallele別発現の検討を行った結果からはMX遺伝子の発現は対立遺伝子の間で差がないことを示している．MyDは常染色体優性の疾患であるので，仮にmRNAやMK蛋白の発現量の増減があるにしても，CTGの存在がトランスに働き対立遺伝子の発現をコントロールする可能性が示唆された．

238，1993．

4）古谷博和，小林卓郎，林 健志，後藤幾生．：筋緊張牲ジストロフィー症関連遺伝子の脳内発現の検討． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジス
トロフィー及び類縁疾患の病態と治療法に関する研究 （高木班）平成5年度研究報告書，1994，PP
68−70．

5）LuziP，RafiMAandWenger DA：Structure
and organization of the human galacto−

cerebrosidase（GALC）gene．Genomics

26：407−409，1995．

6）ChenYQ，RafiMA，de Gala G and Wenger
DA：Cloning and expression of cDNA en−

そこでこのことに関して基礎的な研究を行うため，リピートの影苦を真核細胞で容易に検出できるシステ

COding human galactocerebrosidase，the en−
Zyme deficientingloboid cellleukodystrophy．
Hum MoIGenet2：1841−1845，1993．

ムとして，CTGリピートをp月C／C〟γ真核細胞発現
ベクターに挿入した系を作成したが，その結果からは

7）Sakni N，Inui K，Fujii N，Fukushima H，リピートはリポーター遺伝子に対してシスに働き，その発現量を増やす可能性が考えられた．

NishimotoJ，YanagiharaI，Isegawa Y，Iwamatsu A and Okada S：Ⅹrabbe disease：

最近MK遺伝子の周辺には筋肉，心筋および脳で発現する別の遺伝子がオーバーラップして存在する可能性が示唆されており13），CTGリピートがMX遺伝子のみならず，これらの遺伝子やさらに周辺の遺伝子のisolation and characterization of a ful1−発現に影響を及ぼす可能性も考えられ これらの遺伝子でmRNAの発現や蛋白の発現がどのように変化す
るか興味のもたれるところである．

8）Neville CE，Mahadevan MS，Barcelo JM
and Korneluk RG．：High resolution genetic

もちろん今回の結果はMKとは異なる遺伝子，異なるプロモーターの下で得られたものであり，今後さらにリポータージーンやプロモーターを変え，同様の結果が得られるかどうか調べて行く必要があると考えられる．

1engthcDNA human galactocerebrosidase．

Biochem Biophys Res Commun198：485−491，
1994．

analysis suggests one ancestral predisposlng
haplotype for the orlgln Of

the myotonic

dystrophy mutation．Hum MoI Genet

3：45−51，1994．

9）Fu Y−H，Friedman DL，Richards S，Pearlman JA， Gibbs RA， Piz2：uti A，Ashizawa T，Perryman M】】，Scarlato G，

参考文献

Fenwick RGJr and Caskey CT：Decreased

1）Wieringa B：Myotonic dystrophy reviewed：
back to the future？Hum MoIGenet

expression of myotonin−prOtein kinase mes−3（1）：1

Senger RNA and proteinin adult form of−7，1994．

myotonic dyStrOPhy．Science2）Mahadevan MS，Amemiya C，Jansen G，
Sabourin L，Baird S，

Wormskamp N，Sefers B，Neville CE，260：235−238，

1993．

10）Carango P，NobleJE，Marks HG and

Batzer M，

Funanage VL：Absence of myotonic dystro−

Lamerdin J，Jong P，Wieringa B andphy protein kinase（I）MPK）mRNA as a re−

Xorneluk RG：Structure and genetic Se−

Sult of a triplet repeat expansion

quence of the myotonic dystrophy（DMmyotonic dystrophy．Genomics18：304−348，

kinase）gene．Hum MoI Genet2：299−304，

1993．

in

11）Yu A，DillJ，WirthSS，HuangG，Lee VH，

1993．

3）Sabouri LA，Mahadevan MS，Narang M，
Lee DS，Surh LC and Xorneluk RG：Effect−117−

HaworthIS and Mitas M：The trinucleotide
repeat sequence d（GTC）15adopts a hairpin

COnfomation．Nucl．Acids

寧es

23：2706−

13）BoucherCA，EingSX，Carey N，Krahe R，

12）Mitas M，Yu A，DillJ，Ⅹamp TJ，Cham−

Winchester CL，Ralman S，Creavin T，
MeghjiP，Bailey MES．Chartier FL，Brown

bers EJ and HaworthIS：Hairpln PrOPerties

SD・Siciliano MJ andJohnson KJ：A n？Vel

Of Single−Stranded DNA containing a GCT

homeodomain−enCding geneis associatedrich triplet repeat：（CTG）15．NucI Acids

With alarge CpGislandinterrupted by the

Res23：1050−1059，1995．

myotonic dystrophyunStable（CTG）n repeat．

2714，1995．

Hum MoIGenet4：1919−1925，1995．

−118−31）三塩基対反復配列延長疾患の配列延長に関する解析
桃 井 真里子＊
研究協力者

津 留 智 彦＊ 山 形 崇 倫＊
桃 井
隆綿 斉 藤 茂 子＊

は じ め に産物をブローぺとしてライブラリーをスクリーニング

筋強直牲ジストロフィー症（DM）は病因遺伝子MT−し，CAG／CTG配列を有する遺伝子を検出．これらをブローベとして，ヒト胎児脳cDNAライブラリー，ヒト胎盤genomicDNAライブラリーをスクリーニング
し，サブクローニング後，FISHを含む同定，解析を行った．
配列延長の解析：DM細胞に関しては，MT−PXの延長配列を含むプローブであるFlO2，RlOll）と，ヒト脳に発現するCTG−B332）のCTG配列を含むプライマp

PXの3 端近傍の（CTG）n酉己列の異常延長と関連することが解明されたが，他の三塩基対反復配列延長疾患と同様，配列延長の機構は不明である．これらの疾患においては特定の遺伝子の三塩基対反復配列の異常延長程度と臨床的重症度と相関すること，linkage
analysisの結果と配列延長遺伝子座位が一致することなどから，特定遺伝子の配列延長と病態が開通することは明らかであるが，配列を延長させる機構に関しては不明である．この配列延長機構の解析を目的として，
ヒト脳から三塩基対反復酉己列保有遺伝子をクローニン
グし，その特性，機能などを解析すると同時に延長機
構に関する解析を行った．塩基対反復配列の延長に関しては，テロメラーゼが知られており，6塩基対反復配列として延長する機構がヒトにも存在することが報告されている．テロメラーゼ活性はヒトでは生殖細胞に限定されており，反復配列自体を認識する機構である．忙AG／CTG）n延長に関しても類似の機構が想定されるとすると，反復配列を認識する機構のため，該
当遺伝子以外の反復配列保有遺伝子も延長する可能性がある．配列延長が該当遺伝子のみに生きているとす
ると，延長桟橋は該当遺伝子の固有の配列を認識する必要がある．以上を明らかにするために，三塩基対反復配列疾患の細胞において酉己列延長が固有遺伝子のみの現象であるかどうかを検討した．
方

産物を標識して用い，BAS200で解析した．DRPLA細胞においてはCAGを含んでプライマー2），
Machado−Joseph病のMJ52，MJ25を用いてPCRL，同様にサザン解析した．
結果

ヒト胎児脳ライブラリーからCARG／CTGを有する
遺伝子が多数クローニングされ，その一部は既に脳特異的発現のCTG遺伝子として報告されているCTG−
B33が含まれていた．現在，これらCAG／CTG遺伝子に関して機能の解析を行っている．DM細胞におけるCTG遺伝子の延長を図1，2に示す．CTGTB33はDM細胞ではCTG延長は無く，この延長はCTG配列以外の配列の認識が存在することを示唆した．同様に，
DRPLA細胞においても（図3．4）CAGの認識ではなく，DRPLA遺伝子固有の機構が存在することを示唆した．

法

細胞：CTG延長疾患としてDM，CAG延長疾患としてDRPLA患者の末梢リンパ球をEVウイルスでトランスフォームしたものを用いた．
（CAG／CTG）n保有遺伝子のクE］−ン化：ヒト胎児脳cDNAライブラリーを（CAG）5を含むプライマpとファージベクター（AgtlO）のプライマーでPCRL，＊自治医科大学小児科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

を用いて，CTG延長を解析した．TaKaRaLA−PCR
システムを用い，35サイクル増幅し，サザン解析した．
プローブは各々の反復配列を含むフラグメントのPCR

考案

脳においてはCTG−B33のように脳特異的発現を示す9CAG／CTG）n保有遺伝子が多数鏑存在することが明らかになった．これら遺伝子の機能の解析は三塩基対反復配列延長疾患の病態解析，新たな疾患遺伝子の同定に挙すると考えられる．また，配列延長機構に関してはテロメラーゼ様の忙AG／CTG）nを認識する枚構ではなく，遺伝子固有の配列を認識する桟橋が存在−119−

PrimerF102−RlOI LA−PCR Southern解析
21，226−

汝翠

−
′
・

・
㌧
澤
ノ
．
・

3，530−
2，027M
947、・3，530−

21．226、

2，027＿

947

一二二二二二二「・トPrimerDRPLAFトRIPCR Southern解析
12345678

2345678300

図1筋強直性ジストロフィー症細胞におけるMT−PK
遺伝子のCTG延長の解析
2−4は先天性筋強檀性ジストロフィー症細胞，5−■●●■−

憲二噸鵬為銀7はDRPLA細胞，8は正常細胞．
12345678

2345678

primerCTG−B33F4Z5−R541LA−PCR Southern解析

図3DRPLA細胞におけるCAGB37の延長の解析
2−8は図1と同様．5−7に配列延長を求める．

21，226−
21，226、＼3，530−

3，530【乙027−

2，027−

947−−

P「imerMJDF52−R25PCR Southern解析

947−

芸二二二二二二500・12345678

300−
200−

2345678100

圃2筋強直性ジストロフィー症細胞における他のCTG遺伝子の延長の解析
2−8は図1と同級 プライマー，サザンのプロー
ブはCTG−B33遺伝子のCTGを含む領域を使用．
延長を認めない．
することを示唆した．この機構は該当遺伝子に近接し該当遺伝子の固有配列を認識し，かつ減数分裂時に著明に発現し，棒組抱でも一定程度発現する機構が想定
される．
文
献

12345678

図4DRPLA細胞におけるMachado−Joseph病遺伝
子の延長の解析2−8は図1と同様．
3Cript encoding a protein kinase family：1ユ〇三・mber．Cel158：799−808，1992．
二〉1）ヨrook JD，Ot al：Molecular bユSisi of
myotonic

dystr。phy＝Expansion

otide（CTG）ItePaetat

the3

of

end

trinucle−ofa

2345678

Li−SH，et al：N〇、／01乞ごまpletごep〇a七・二〇∴LalIllng＝enCSin human brain＝Cloning，○XpreSSion

andlength polymorphisms．Genomics16：
572−579，1993．

tran

ー120−

Ⅵ．筋緊張性ジストロフィー，その他（2）32）筋緊張性ジストロフィーにおけるinsulin receptorの
糖鎖異常

綽

靖仁

綿

林田

小本

胞内部分にtyrosine残基をもち，tyrOSine kinase活性を持っている．α鎖にhsulinが結合すると，β鎖

榊

一方，MyD患者ではしばしば耐糖能異常が認められるが，その原因として腰におけるhsulin抵抗性が指摘されている．Insulin receptorはa2β2の形をとる糖蛋白質であり，β鎖は細胞膜を貫通しており，細榊化hypogalactosylation，はMyD患者の筋組織や赤血球膜においても存在することが確認された2）．

札

MyD患者と正常群で差を認めなかったが，S−WGAでは筋組織と同様に患者赤血球では結合性が増加していた．即ち，MyD患者においてIgGと同様の糖鎖の変大元させ，FACS解析を行うと，ガラクトースやN一アセ
チルガラクトサミンと結合するPNAやRCA−1では

慶染色される多数の筋線経が見られた．MyDにおけるS−WGA陽性筋線経は特にtypeI線掛こおいて多く認められた．患者末梢赤血球をF汀C標識レクチンと反応＊名古屋大学医療技術短期大学部＊＊名古屋大学医学部神経内科
剰＊現）福井医科大学内料学第二構座＊＊＊＊兵庫県立成人病臨床研究所

父

ることが知られているが，このS−WGAを用いて生検
筋の凍結切片をレクチン染色すると，正常の筋細胞膜はほとんど染色されないのに対し，MyDでは陽性に

藤江

鰊

終わっているdigalactosyloligosaccharidesが少な
く，逆にガラクトースが付いていない，即ち，非還元末端にN−アセチルグルコサミンが露出する糖鎖，が増加していた．レクチンの中でS−WGAは，N−アセチ
ルグルコサミンが非還元末端に露出する糖鎖と結合す＊IgGにはFcportionに2本のアスパラギン結合塑糖鎖があり，この糖鎖部分をHPLCで解析すると，MyD患者では正常群に比べ，糖鎖の先端がガラグトースで甘山神（MyD）患者の免疫グロブリンG（IgG）の糖蛋白において糖鎖異常（Ⅳ一アセチルグルコサミンが非違元末端に露出する糖蛋白の増加）が見られることを指摘した幻．

伊祖

精

美晃瑞

光

的

私達はこれまでに，筋緊張性ジストロフィー

公

村

杉
明

目

野飼井

高犬志

研究協力者

のtyrosineに燐酸化が起こり，tyrOSine kinaseが活性化される3）．
Insulinreceptorをsialidase処理，次いでβ一galactosidase処理をするとinSulin結合能が消失した
り4），β鎖から糖鎖を除くとhsulin結合性は保たれているものの，tyrOSinekinaseの活性化が起こらない
ことが報告されており，insulinreceptorにおいて糖鎖修飾が機能発現に重要であることが知られている．
そこで今回は，MyD患者に見られる代表的な症候の一つである耐糖能異常につき，insulin receptorの糖鎖構造おいて，Ⅰ辞や筋組軌 赤血球膜と同様の変化 即ちhypogalactosylationが認められるか否か，また，糖鎖構造の変化がinsulin receptorの機能異常に関与しているかについて検討した．
対象と方法
試料は，培養皮膚線推芽細胞および赤血球のwhiteghostを用いた．対象は成人型筋緊張性ジストロフィー患者3例，対照3例である．
lmsulinreceptorの糖鎖構造のhypogalactosyla−
ti。nを検出するために培養皮膚線維芽細胞および赤血球膜を用いサンドイッチELISA法を行った．ELISAは志井らの報告した方法6）を一部改変して行った．培
養皮膚線維芽細胞および赤血球膜ををTNE buだerにて可溶化し，Crude cellhomogenateの蛋白定量はLowry法にて行った．ELISAプレートにinsulin re−
ceptorのintracellular portionを認識する
monoclonal抗体（4Alあるいは2H2）をコーティング
した．次に，蛋白量を同一に調整した可溶化試料をserialdilutionL，反応させた．2次抗体としてビオ
チン化S−WGAを用い0−phenylenediamineで発色させ，ELISAプレートリーグpで測定波長492nmにて測定した．
次にinsulin receptorの自己燐酸化反応について
celHree systemにおいて検討を行った・MyDとcontrolの培養皮膚線推芽細胞および赤血球膜を用い，−123−

EuOの寸ldのUU可qJOSq＜

AntHR Ab Antトp．tyrosine Ab
M

M

C

C

M

M

C

C
イトー135
イトー95

0．3

0．2

0．1

図2 皮膚線維芽細胞からのinsulinreceptorの自己燐
酸化．

0

MyD患者において抗phosphotyrosine抗体によるkはulin receptorのβ鎖の染色性は低下している．M＝MyD，C＝正常対敵SerjaJ dilution
図1赤血球膜のinsulin receptorに対するS−WGAの結合性（サンドイッチELISA法）．Insulin re−
ceptorに対するS−WGAの結合性は正常対照に
此LMyDにおいて増加している．
抗ヒトinSulin receptor抗体（4Alあるいは2H2）にて免疫沈降を行った．免疫沈降産物に1×101Mのin−sulinを作用させた後，120mM HEPES，90mM
ATP，12mM MnCは，24mM MgC．2で自己燐酸化反応を行った．その後，SDS−PAGEに展開し，nitro−
cellulose膜に転写した後，ヒトinsulin receptorのα鎖を認識するmonoclonal抗体（3B6），β鎖を認識するmonoclonal抗体（2H2），抗phosphotyrosine抗体（PT−66）で染色し，ECL法にて検出し，その染色性をcontrolとMyDとで比較検討した．

じにした結果，insulinreceptorのS−WGA反応性は正常対照に比べMyD患者で増加していた．したがってMyD患者のinsulinreceptorの糖鎖部分にはIgG，
筋組織や赤血球膜と同様にN−アセチルグルコサミン
が非違元末端に露出する糖蛋白の増加が存在し，また，
insulin刺激による同受容体の自己燐酸化能が低下していることが示唆された．今回の検討結果から，MyD
ではinsulinreceptorの糖鎖構造の変化が耐糖能異常という膜受容体の機能異常に関与している可能性が推定された．
尚，これらの糖鎖構造の変化の程度とCTG repeat数との相関性については現在検討中である．
文

結果
培養皮膚線維芽細胞を用いたELISA法で，hsulin
receptorのS−WGA反応性は対照に比べMyDで増加していた．赤血球膜を用いたサンドイッチELISA法の結果でも，inSulinreceptorに対するS−WGAの結合性は，MyD患者では正常対照に比べ増加していた（図1）．免疫沈降を用いた培養皮膚線維芽細胞および赤血球腰のinsulinreceptorのwestern blottingでは，MyD患者において対照と比べinsulin刺激後の抗phosphotyrosine抗体による染色性が95kDaのβ鎖のバンドで低下していた（国2）．

献1）Ito X，Takabshi N，Hirayama M，Honda
H and Takahashi A：J ClinBiochem Nutri
14：60−69，1993．

2）松岡幸彦ほか：平成6年度精神・神経疾患研究筋ジス第3班報告書，1995．
3）Kasuga M，Karisson FA amd Xalm CR：
S。ienee215：185−187，1982．
4）Hayes GR and Lockwood DH：J BioI Chem
261：2791−2798，1986．

5）LeconteI，A2：uan C，Debantm A，Rossi A
and Clauser E：J BioI Chem

267：17415−

17423，1992．

結論6）Hagino H，Shii X，Yokono K，et al：Dia−

MyD患者の赤血球腰における1細胞あたりのinsu−
lin receptorの数は正常対照と同じであると報告されている7）．MyD患者と正常対照の試料中の蛋白量を同

betes43：274−280，1994．

7）Kakehi T，Kuzuya H，Ⅹosaki A，．et al：JLab Clin Med115：688−695，1990．

−124−33）骨格筋組織にリソソーム由来と思われる空胞を認めた
a一mannOSidosis患者のa−D−mannOSidase

遺伝子の解析
川 井 尚 臣事
研究協力者

若

松

延

昭＊

後藤田

康

夫事

西

田

善

彦事

斎

史

郎＊

藤

は じ め に力は低下しており下肢の深部腱反射は完進し，病的

α一マンノシドーシスは，リソソーム水解酵素の一種であるα−D一マンノシダーゼの欠損により，マンノースを含んだオリゴ糖が主として神経や肝細胞内の反射も陽性であった．
症例2：36歳，女性
主訴：精神発達遅延，難聴，歩行障書
家族歴：妹（症例1）が同様の症状を示す．
現病歴：妹と同様に乳児期に感染症に頻回に寝息してリソソームに蓄積し，精神運動発達遅延，難聴，粗な顔貌，肝腫大等甲特異な症状を呈する常染色体劣性遺伝の代謝性疾患である．また本症は臨床経過より，乳児期に発症レ予後不良なⅠ型と幼児期以後に発症し予後良好なⅠⅠ型に分類されている．葬々はさきに筋に多数のリソソーム由来の空胞を認めたⅠⅠ型の家系例を報告したが02），本例の筋病変の原因を明らかにするため，α−D−マンノシダーゼ遺伝子の構造を決定し，患者の同遺伝子の解析を試みたので報告する．
対象

対象は，日放のα−マンノシドーシス患者2名とCoriellCellRepositoriesより購入した4名の患者の皮膚線推芽細胞（Ⅰ塑−GM4518，ⅠⅠ−GM654，GM2817，
GM2051）およびErasme病院（ベルギー）より供与されたⅠ型患者（A2541）のゲノムDNAである．
自験例
症例1：29歳，女性
主訴：精神発達遅延，難聴，歩行障害
家族歴：両親は近親婚である．

いた．2歳時に難聴を指摘され，8歳時に聾学校に入学した．その後徐々に歩行障害が進行し36歳時に当科に入院した．
現症：身長139cm，体重40kgと妹と同様に体格は小柄で声り，粗な顔貌がみられた・IQは19と低下し，70dBの感音性難聴が認められた．肝牌腰はみられず，四肢の筋力低下，失調性歩行，四肢の協調運動障害などが認められた，生検骨格筋の光顕所見では，筋線経
は全体に細く餐度の大小不同が認められ，電顕所見では，筋鞘膜下に直径1〜10′ mの空胞が多数認められた．これらの空胞は一層の膜で限界され，その中に電子密度の高い大小不同の顆粒や膜構造物を認めた．さ
らに，一部の筋線経には空胞に加えてサルコメア配列の乱れ，Z帯の乱れなどの変化がみられた1）2）．
∝−D−マンノシダーゼ活性値：症例1，症例2ともに白血球のα−D−マンノシダーゼ活性は2nmol／h／mg蛋白（正常値35〜178nmol／hん1g蛋白）と低下していた．両親の同酵素活性は正常値のほぼ50％の活性を示した．

現病歴：乳児期より頻回に上気道炎，中耳炎に寝息していた．生後の運動発達は正常だったが，会話は3歳でようやく幼児語が可能となった．5歳頃より階段のしかし，他の7種類のリソソーム酵素の活性は正常値を示した．

昇降に手すりが必要になった．その後，歩行障害は徐々に進行し，28歳頃より痙性歩行となり，起立が不能となったため当科を受診した．

方法
1．人∝−D一mannOSid850遺伝子のゲノム構造の決定

現症：身長145cm，体重35kgと体格は小柄であり，粗な顔貌がみられた．IQは32と低下し，60dBの感音
盤難聴も認められた．肝脾腹はなかったが，四肢の筋＊徳島大学医学部第一内科

若松らは，マウスのヘキソサミニダーゼA遺伝子を含むコクミドクローンを単離し，遺伝子構造を決定しており3），本研究でも同様の方法を用いた．すなわち，100万個の人コスミドク ロー ン（SuperCos，
Strabgene）をナイロンメンプレンに吸着させた後，
P2p］ラベルしたa二D一mふ。。Sidase遺伝子のcDNA−125−

をプローブに用いて同遺伝子を含むゲノム遺伝子をス
クリーニングした．
乙 エクソン／イントロン接合部の決定
単離したコスミドクローンをEcoRIで切断し，同遺伝子の制限摩素地図を作成した後，エクソンを含む
DNA断片をサザンプロッティング法にて同定した．

一h■

2 −

■
l
一

⁝‖

︐細目

一

20−晶川

一

本研究班で長年とりあげてきたdistal myopathy
withrimmed vacuole4）では，筋細胞内にリソソーム
酵素活性のある異常な空胞が認められ その成因としてリソソーム酵素の関与も指摘されている．一方，
α−マンノシドーシスの自験例では四肢に筋力低下が

5
l

1

察

1

考

0

記のエクソン内には異常はみられなかった．

l

ダーゼ患者のゲノムDNAを用いて，現在20個のエク
ソン（エクソン6，14，15，21以外の全エクソン）のDNAをPCRで増幅しSSCPによる解析が終了した．
その内エクソン8においては，Ⅰ塑患者（GM4518）に移動度の異なる異常なDNAバンドが認められ（図2），ダ
イレクトシーケンシング法による解析では，C→Gのミスセンス変異が確認された．しかし，自験例では上一

Z マンノシダーゼ患者の異常遺伝子の同定
自験例の姉および海外より入手した6例のマンノシ

O t

23kbであり，24個のエクソンより構成されていた（図1）．プロモーター領域の塩基配列の解析では，上流
200bp内にG，Cが76％認められ GC boxも2箇所認
められた．

⁝‖

123456789を作製し，自験例及び入手したマンノシドーシス患者（Ⅰ型2名，ⅠⅠ型4名）のDNAをテンプレートに用いて個々のエクソンをPCRで増幅した後，SSCP法により異常遺伝子の同定を試みた．

リグイズするコスミドクローン（pCos5．4）を単離した．
同クローンをEcoRIで切断し，全長のcDNAをプ
ローブに用いてサザン解析を行った結果，13．5kb，
6．Okb，2個の3．5kb，1．6kb，0．9kbのDNA断片にエクソンが含まれることが判明した．さらに，これらのDNAの塩基配列を決定した結果，本遺伝子は全長約㌦‖

図1人α−D−mannOSidase遺伝子のゲノム構造を示す．24個のエクソンより構成されている．

常遺伝子の同定決定したイントロンの塩基配列をもとにプライマー

結果1．人α−D一m8nnOSidaS0遺伝子のゲノム構造
人コスミドライブラリーより，α一D−マンノシダー
ゼcDNAの5 側と3 側の両方のDNA断片にハイプ

l

eXOn

■−

0

51 T l

S
一V
S
a

k

肋

同定したDNAは，プラスミドにサブクローニングし，
プロモーター領域，エクソン，およびエクソン／イン
トロン接合部の塩基配列を決定した．
3．SSCP−PCR法による￠−マンノシドーシス患者の異Human q−D−mannOSidase gene

exon8

●●−●●
騨 一鯵
蝉 騨

図2 エクソン8のSSCP−PCRの結果を示す．
レーン7（GM4518）に移動度の異なる異常なDNAを認める．レーン1．自助例（姉），2，3．正常対照，4．GM654，5．GM2051，6．GM2817， 7．
GM4518，8．A2541，9．blank
あり，骨格筋細胞内にリソソーム由来と考えられる多数の空胞がみられ，これらの両疾患の病因や病態にリソソーム異常という共通のものがあると推定される．
そこで我々は，リソソーム異常に伴う筋崩壊の磯序ならびに病態解明のため，自験例のα一マンノシドー
シス患者の遺伝子解析を行った．まず本研究において，我々は，初めて人α−D−マンノシダーゼ遺伝子のゲノ
ム構造を明らかにし，さらに患者の異常遺伝子を同定する方法を確立した．まだ全てのエクソンの解析が終了してはいないが，Ⅰ型の患者のエクソン8内にミスセンス変異が認められたことより，2個以上の遺伝子異常が本症の病因に関与していることが示された．自験
例には四肢の筋力低下があり，骨格筋内にリソソーム由来と考えられる空胞が認められた．これらの異常所
見は，α−マンノシダーゼの遺伝子異常に起因すると思われるが，我々の2例がⅠⅠ型であることを考えると，
Ⅰ型とは異なった特異な遺伝子異常が存在することが考えられる．今後引き続き，α−マンノシドーシス患
者の異常遺伝子の解析，さらには筋細胞内での発現実験を行い，リソソーム異常に伴う筋崩壊の過程を解明したいと考えている．本研究の成果は，α−マンノシ
ドーシスの病因解明のみならず，他の空胞形成を有す
るミオパチーの病因や病態の解明にも役立つことが期
待できる．

−126−

ま

と

め

Skeletal muscle pathology of mannosidosis

1．人a−D−mannOSidase遺伝子を含むコスミドク
ローンを単離し，同遺伝子のゲノム構造を決定した．
2．骨格筋内にリソソーム由来の空胞を有するα−マンノシドーシス症例を含め6例の同患者の遺伝子解析を
行った．

in

two siblings

with spastic paraplegia．

Acta Neuropatho168：201−204，1985．
3）Waknmatsu N，Benoit G，Lamhonwah AM，etal：StruCtural organi2：ation，SequenCe．and
expression of the mouse HEXA gene encod−
lng the a subunit of hexosiaminidase A．

文

献

Genomics24：110−119，1994．

1）川井尚臣， 西田幸彦， 西野 洋ほか：
Mannosi−dosisの1家系2症例と筋病理所見．日
本内科学会雑誌75：638−643，1986．
2）Eawai H，Nishino H，Nishida Y，et al：4）NonakaI，Sunohara N，Ishiura S，et al：−127−

Familial distal myopathy with rimmed

vacuoleandlamellar（myeloid）body forma−tion．J NeuroISci51：141−155，1981．

34）筋型AMPデアミナーゼ遺伝子（A〃タガリ）のスプライシング調節：甲状腺機能低下性ミオパチ一に
おける検討
垂

研究協力者

嶺

尾

井

郁

清一郎＊

夫＊

は じめ に私どもは，グリコーゲン病ⅤⅠⅠ型をはじめとする代
謝性ミオパチ一において，運動筋のエネルギー危機に基づいてAMPデアミナーゼ（AMPD）反応が完進する
結果，高尿酸血症が発現する病態（筋原性高尿酸血症）を明らかにしてきた1）2）．AMPDはプリン分解系の
key enヱymeとして広く生体の各組織に存在するが，特に骨格筋で強い酵素活性が認められる．筋肉には同組織に特異的なアイソザイムが発現し，これをコードする遺伝子A〟PかJが単離されている3）．A九日1DJ
は15個のエキソンより構成されるが，翻訳領域にある
第2エキソンは12baseより成るミニユキソンで，選択的スプライシングalternative splicingによりmRNAに含まれる場合（TypeI mRNA）と除外される場合
01ypeIImRNA）がある4）．TypeIおよびTypeIImRNAにコードされる酵素蛋白は，共にAMPD活性を有することが示されている．ラットでは筋ファイ

バータイプにより両mRNAの比率が異なる4）．また，欧米人に極めて多い筋AMPD欠択症の追伝子変異は第2エクソン中にあるが，TypeIImRNAが産生されて完全な酵素活性欠損から免れるためにミオバチーを示さない例のある可能性が示されている5）．そこで本
研究では，代謝性ミオパチ一におけるA九日1DJの選
択的スプライシングの意義を明らかにする目的で，甲状腺ホルモン低下性ミオパチ一におけるA肘夕月Jの

西

川

嘉

郎＊

サイオウラシル（PTU）溶液を，対照群には水道水を与え飼育した．8過後に屠殺し，ヒラメ筋（SOL）と長祉伸筋（EDL）を採取，測定まで−80℃で保存した．
RNA分析：筋肉をグアニジン溶液でホモゲナイズし，セシウム超遠心法でtotal RNAを単離した．ラット
AMPDlに相補的なcRNAプローブを合成し，RNase
マッピング法にてTypeImRNAとTypeII mRNAを検出した4）．ォートラジオグラフィー後，両mRNAの相対比率を島津モデル5500densitometerで測定した．
酵素活性：筋肉をリン酸緩衝液でホモゲナイズ後，
遠心上清についてAMPD活性を分光光度法で削定し
た7）．
結

果

甲状腺ホルモン欠乏群ラットの屠殺時体重は，対照群ラットに比較して著しく軽く（285±10vs556±42g，mean±SE，n＝5，P＜0．01），PTU溶液の投与によって甲状腺機能低下症に陥ったと判定される．SOLおよびEDLの筋重量も，甲状腺ホルモン欠乏群で有意に低値であった（SOL；121±7vs189±13mg，P＜0．01，
EDL；142±5vs252±15mg，P＜0．01）．図1に単位
筋重量あたりから抽出されるtotal RNA量を示した．
EDLのtotalRNA量は，対照群に此し甲状腺ホルモン欠乏群で有意に低値であった．ただし，その差違はそれ程大きいものではなかった．SOLのtohl RNA

スプライシング産物と酵素活性を分析した．これまで
甲状腺ホルモンが欠乏すると解糖系やミトコンドリア
機能の降雪により運動筋におけるAMPD反応が完進

量は，EDLの約2倍に及ぶが，対照群と甲状腺ホルモ
ン欠乏群間で有意差を認めなかった．

することが示されているが6），AMPD酵素自身の変化について検討した成績はない．

グラフィーの典型例を図2に示した．215ntと170ntの

方法

実験動物：約150gのSD系雄性ラットを2群に分け，甲状腺ホルモン欠乏群には飲水として0．05％プロビル＊国家公務員等共済組合連合会大手前病掟

RNaSeマッピング法によって得られるオートラジオ
バンドは，それぞれTypeImRNAとTypeIImRNAに由来する．これまでの報告通り4），対照群ラットのSOLではTypeImRNAとTypeII mRNAがほぼ等しく産生され，EDLではもっぱらTypeI mRNAが優位に産生される．一方，甲状腺ホルモン欠乏群
ラットでは，SOLにおけるTypeII mRNAの産生が対照群に比し著しく減少していた．しかし，EDLにお−128−

ける選択的スプライシングには甲状腺ホルモンが欠乏する影轡は認められなかった．

totalRNA（mg／gmuscle）
0．0

0．4

0．8

1．2

オートラジオグラフィーからdensitometry法にて定量化したA九日㌣DJmRNA量と酵素活性を図3に表わした．TypeIとTypeIIを併せた総AMPDl
mRNA量は，SOLとEDLのいずれの筋肉においても，甲状腺ホルモン欠乏群と対照群で有意差を認めな

SOL
muscleかった（図3A）．ところが，TypeIとTypeIIの比率は，
SOLでは甲状腺ホルモン欠乏群が対周群に此し有意に高値を示した．一方，EDLでは両群間で有意差を認めなかった（図3B）．AMPD活性についても，SOLでは
甲状腺ホルモン欠乏群が対照群に此し有意に高値を示したが，EDLでは両群間で有意差を認めなかった（図

EDL
musde

3C）．
考

図1ラット骨格筋における単位筋重量あたりのtotal
RNA量SOL：ヒラメ筋，EDL：長址伸筋．
田：甲状腺ホルモン欠乏群，ロ：対照群，SOLmuscle EDLmuscle

帯

帯

170−

締
線

伊部

本研究では，甲状腺機能低下性ミオパチーおいて
AMPDl遺伝子のTypeImRNAに対するTypeIImRNAの相対産生量が減少することを明らかにした．
このように選択的スプライシングの様式が甲状腺ホルモンの欠乏によって変化する例は，脳神経組掛こ発現するtau遺伝子について報告されているだけである8）．
甲状腺ホルモンは，ポリ仏）尾部の伸長に関わって転写物の安定性に影響することが知られている9）10）．一

mean±SE，・P＜0．01

215一

察

九 A〟タカノの選択的スプライシングの調節には，
エキソン2に隣接するイントロンの除去効率とその後の核一細胞質移行が関係することが示されている11）．
したがって，スプライシング過程と並行するポリ仏）
尾部の伸長が，甲状腺ホルモンの欠乏によって増強するためにエキソン2のスキッビングが抑制される結果，
TypeII mRNAの産生が減少したのかも知れない．

幸甚

なお，A〝PかJの選択的スプライシングに対する甲状腺ホルモン欠乏の影響は，代表的な赤筋である
SOLで観察されたが，自筋であるEDLでは認められ
図2

ラット骨格筋におけるTypeIとTypeIImRNAの産生（RNaseマッピング法）
A

B

C（a憬群帯繊禦忠明 柵…yp。l・ 匝諦儲粛盟叫00．20．10，60．81．01．2

0

2．0

4．0

6，0

なかった．筋肉に対する甲状腺ホルモンの影響が，これまでの多くの報告と同様に，筋ファイバータイプによって異なることを示す成績である．
AMPD活性は，赤筋（typeI fiber）に比べ自筋（typeII fiber）で数倍高いことが知られている．
AMPDlmRNAについて，SOLとEDLを比較すると，総mRNA量に大きな差ははなく，TypeI／Type
II比が異なることに気付かれる（図3）．甲状腺ホルモンの欠乏によってSOLではAMPD活性が増加したが，EDL
musele

図3

AMPDl mRNAとAMPD酵素活性に対する甲状腺ホルモン欠乏の影響
mean±SE，・P＜0．01

この際AMPDlの掩mRNA量に変化はなく，TypeI／TypeII比の増加が観察された．以上のことから，
A九日nDJの選択的スプライシングが筋AMPD酵素活性の変動に関与することか示唆される．大腸菌の発現システムを用いた検討では，TypeIとTypeIImRNAにコードされる蛋白に酵素活性上の差異は認められて−129−

いないが），in血0筋組掛こあっては本酵素の活性化に関係するミオシンとの結合性7）などに違いが存在する可能性も考えられる．

5）

Morisaki H，Morisaki T，Newby LK and
Holmes EW：Alternative splicing：a meCha−
nismfor phenotypic rescue ofa commonin−
herited defect．J Clin hvest 91：2275−2280，

結

語

1993．

A〟や刀リのスプライシング調節には，筋ファイバータイプに特異的な様式で甲状腺ホルモンが関与し，これが筋AMPD活性の変動にも関係することが示唆された．

6）Dudley GA，Tullson PC and Terjung RL：
Influence of mitochondrial content on thesensitivity of respiratory control．J BioI
Chem262：9109−9114，1987．
7）RundellXW，Tullson PC and Terjung RL：

参考文献

AMP deaminase bindingin contracting rat1）MineoI，Ⅹono N，Hara N，Shimizu T，skeletal muscle．AmJ Physio1263（Cell

Yamada Y，Kawachi M，Ⅹiyoknwa H，Physio132）：C287−C293，1992．

Wang YL and Tarui S：Myogenic hyper−8）AnielloF，Couchie D，Bridoux AM，Gripois

uricemia：a COmmOn pathophysiologic fea−

D and Nune2；J：Splicing of juvenile andture of glycogenoses typesIII，V，and VII．

adult tau mRNA variantsis regulated by

New EnglJ Med317：75−80，1987．

thyroid hormone．Proc Natl Acad Sci USA，

2）MineoIand

TaruiS：Myogenic

揖：4035−39，1991．

Hyperurice一

mia：what can we learn from metabolic9）KraneIM，Spindel ER and ChinWW：Thy−

myopathy？Muscle Nerve（suppl）3：S75−81，

roid hormone decreases the stability and the

1995．

poly仏）tractlengthof rat thyrotropin

β−3）Sabina RL，MorisakiT，Clarke P，Eddy R，Shows TB，Morton CC and Holmes EW：

subunit messenger RNA．MoI Endocrin01

CharaCterization of the human and rat myo−10）Murphy D，Pardy X，Seah V and Carter

adenylate deaminase genes．J BioI Chem

D：Posttranscriptional regulation of rat

265：9423−9433，1990．

growth hormone gene expression：increased

5：469−475，1991．

message stability and nuclear polyadeny−4）MineoI，Clarke PRH，Sabina RLandHolmes

1ation accompany thyroid hormone depletion．

EW：A novel pathway foralternative splicing：

MoICellBiol12：2624−2632，1992．

identification ofan RNAintermediatethat gen−11）MineoI and Holmes EW：Exon recognition

erates a・n alternative5，splice donor site notand nucleocytoplasmic partitionlng deter−

presentinthe prlmary tranSCript of AMPDl．
MoICellBiollO：5271−5278，1990．

mine AMPDl alternative transcript produc−tion．MoICellBiolll：5356−5363．1991．

−130−

Ⅶ．DMD／BMD35）妊婦末梢血を用いたDuchenne型筋ジストロフィーの出生前遺伝子診断

研究協力者

関

沢

佐

藤

猛＊

明

彦■＊

木

村

武

彦榔

は じ め に一細胞中のDNA塩基配列は78％以上が増幅されると現在，胎児遺伝性疾患の出生前診断は主に羊水穿刺，
経歴的絨毛採取，臍帯穿刺などにより行われているが，母体細胞の混入による誤診や出血，感染などによる流され，単一細胞を用いた遺伝子診断の可能性を著しく広げる方法である．

産などの問題がある．そこで母体・胎児双方にとって理想的あるいはより安全な方法として妊婦末梢血中に混入してくるとされる胎児細胞が注目され，世界中で研究されている．
妊婦末梢血中に混入していることが知られている胎児由来細胞には絨毛細胞，リンパ球，赤血球などがある．絨毛細胞は出現頻度が著しく低いこと，リンパ球は母体由来の細胞との鑑別が困難なことや分娩後も数年にわたり母体血中に残存することなどから出生前診断への応用は困難である．しかし，有核赤血球は胎児
血中には豊富に存在する反面，健常成人血中には存在しないことや母体血中で長期間存在し続けないことなどから胎児遺伝子診断の好適な標的として注目されている．
妊婦末梢血中に僅かに存在する有核赤血球の分離は，特異的な細胞表面抗原を認識するモノクロナール抗体を利用し，flow cytometry，magnetic sortingなどを用いて回収する方法で主に行われていた．しかし，現時点では胎児細胞に特異的な抗原は発見されておらず，母体細胞の混入が避けられないことから遺伝子分
析には応用できなかった．しかし，パーコールを用いた比重遠沈法で有核赤血球を含む分画を分離し，形態的に直接有核赤血球を識別した後，それをmicro一
manipulatorにて単一細胞レベルで回収する方法が高林ら1）により開発された．
さらに，近年の分子生物学領域における進歩はめざ
ましく，その応用範囲は著しく拡大している．1992年，
Zhangら2）が報告したprimer extension pre−amPli−
fication（PEP）法は，15塩基からなるrandom pri−mer（415種の塩基鎖のmix），Taq polymeraseなどを加え，PCR法で50cycle行い基となったDNAを250倍に増幅しようとする方法である．この方法により，単これらの成果をふまえ，妊婦末梢血中の有核赤血球を用いての胎児遺伝子診断法を昨年度の本研究班で報告した．本年度はその精度を含め報告する幻．
対象および方法
妊娠9〜30過の妊婦10例より同意のもと末梢血を7ml採取しEDTA処理した後，バーコール不連続密度勾配遠沈法を用い，顆粒球と有核赤血球を含む分画を分離し，塗津，ギムザ染色した．さらにその標本より
形態的に有核赤血球を識別し，micromanipulatorを用いて単一の有核赤血球を回収した．その細胞を強ア
ルカリ性のlysissolution（5LLl）中に入れ，65℃にてインキュベーションした後，neutralization solution（5〝1）にて中和し，10〝1中にDNAを抽出した．
DNAは15merの01igonucleotideからなるrandom
primer，Taqpolymeraseなどを加え，総量60FLlにてprimer extension pre−amplification（PEP）法にて全遺伝子増幅を行い，そのPEP産物を用いて各種遺伝子診断を行う．まず，性別診断はPEP産物2′ 1を用いてZFX／ZFYlocusをnested−PCR法にて増幅した後，制限酵素Hae−Ⅲにて消化し，2．5％アガロース
ゲルにて電気泳動し，男性では 300，216，叫44basepairs（bp）の4本の，女性では300，44bpの2本のバンドが出現することで判定した．さらに，性別判定可能であった細胞について，Duchenne型筋ジストロ
フィーの遺伝子診断を同一細胞のPEP産物5〝1ずつを用いてChamberlainらの報告4）したジストロフィン
遺伝子のエクソン4，8，12，45，48，50，51についてhemi−neSted PCR法にて遺伝子増幅した後，2．5％アガロースゲルにて電気泳動し，遺伝子欠矢の有無について検討した．また，コントロールとしてDuchenne型
筋ジストロフィーでエクソン50の欠矢がある患者から単一リンパ球を回収し同様に検討した．

＊国立輔神・神経センター国府台病院神経内科＊＊国立精神・神鐘センター国府台病院産婦人科
ー133−

結

果

考

図1は妊娠9過の妊婦末梢血中をパーコール不連続
密度勾配遠沈法にて分離後，塗沫，ギムザ染色した標本である．矢印は妊婦末梢血中に存在する有核赤血球である．こ￣、の単一の有核赤血球をPEP法で全遺伝子増
幅し，性別および筋ジストロフィーの各エクソンについて検討した結果を図2Aに示す．性別では同一標本から採取した単一のリンパ球は300，崩bpと女性型を示したが，有核赤血球は300，216，84，崩bpのバンドを認め男性由来の細胞であり，胎児由来であることがわ
かる．また，この有核赤血球はジストロフィンのエク
ソン4，8，12，45，亜，50，51に欠矢がないことが示されている．さらに，Duchenne型筋ジストロフィーでexon50の欠矢が明かな患者末梢血中の単一リンパ球より検討した結果を図2Bに示す．この患者は遺伝子診断結果でも男性であり，また，エクソン4，8，12，45，
喝，51についてはバンドが検出されたが，eXOn50についてはバンドは検出されず，ジストロフィン遺伝子のエクソン50の欠矢が単一細胞でも診断できることが確認できた．

察

妊婦血中より単一の有核赤血球を回収し，そのDNAを全遺伝子増幅したPEP産物の一部で性別判定を行い，その細胞が胎児由来であるかどうか確認した上で，さらに残りの一部で筋ジストロフィーなどの遺伝子診断を行うことが可能となった．
今回，出生前診断に用いた筋ジストロフィーの7種
類のエクソンはChamberlainらの報告4）に準じて設定したものである．これらの組み合わせで筋ジストロ
フィーのすべてを診断できるわけではなく，あらかじめ保因者であることがわかっている妊婦の出生前診断において特に有用であると考えらた．
妊婦末梢血中の有核赤血球を用いたこの出生前診断
法は，従来の絨毛や羊水細胞を用いた胎児診断で最も問題になっている母体細胞の混入を遺伝子レベルで否定した上で目的の遺伝子診断を同一細胞で行うことが可能である．さらに，この方法は母体・胎児に対し非侵襲的であること，妊娠6過と妊娠の極初期から遺伝子診断が可能なことなどの利点を有している．さらに，
我々は，ここで示したDuchenne型筋ジストロフィー

この妊娠9過の症例を含む正常妊婦10例についてこの方法でDuchenne型筋ジストロフィーが出生前遺伝
子診断できるかどうか検討した結果を表1に示す．妊婦末梢血7mlから平均3．3個の有核赤血球が識別され，
その有核赤血球33佃中21個の細胞がmicromani＿pulatorを用いて回収し，そのうち13細胞で性別診断可能であった．性別診断できた細胞では92．3％（12／13）でDuchenne型筋ジストロフィーの出生前遺伝子診断が可能であった．対患者当たりの診断効率は60％であったが，診断結果は分娩後の検査結果と全例で一
致した．

∫：−

．ノヽ、′∴叫〆ィ、ノ訝㌦涌こ∵）√、ヽ

図2 A：正常胎児のジストロフィン・エクソン4−51，
およびZFX／ZFYlocusにて男児であることを示
す．
B：Duchenne塑筋ジストロフィー児の1個のリ

図1妊婦（妊娠9週）末梢血中の胎児由来
有核赤血球（矢印）（×360）．

ンパ球からジストロフィン・エクソン50の欠矢とZFX／ZFYlocusにて男児であることを示す．
−134−

義1正常妊婦10例の末梢血中の胎児有核赤血球のPCR：ジストロフィン・エクソンと男児証明
newborn

nucleated RBCin maternalb100d
刑だFY ExonsotDMD

DMD

CaSe Weeks detected retrjeveddeletions

SeX 芸言霊霊。de・etions′sex。州．med

male

l

★

2

male

O

★

3／3
2
／
0

temale

2

3
／
3

4

0

3

★

male

−

tema旭

−

l

2

2

3

2

male

1

9

2

■

1

3

4
／
3

7

4

3
l

一

1
2
／
／
ク ー
O

5
l

一

／
l

8

1

0

★

0／1

9

4

temale

3／4

3

0

＿

mate

−

ma旭

＿

†emat0−2／3†emato＿1／1temale

一

1／1

一

2

0

temab

謙

1

9

1

2

8

9

−

※

2

8

＿

mat8

叢

5

6
7

temalo

2／2

2

2

l

5

4

3／3

3

2

33

temateり2

12日3★ notdetected

13／21

潔 nOtPOrIormed

子診断が可能なことなどの利点を有している．さらに，

nosis from maternal blood．

我々は，ここで示したDuchenne型筋ジストロフィーの出生前遺伝子診断の他に，同様の方法でRh陰性妊
婦の胎児Rh式血液型の遺伝子診断が可能であること

15：74−77，1994．

を報告している5）．本法はこの他にも，Fabry病，
Tay−Sacks病，脆弱Ⅹ症候群，ステロイドサルファ
ターゼ欠損症，血友病A，B，ミトコンドリア脳筋症，Leber病など多種の現在DNA診断可能な遺伝性疾患の出生前診断ばかりではなく，風疹，サイトメガロウ
イルスなどの胎児感染症の診断にも広く応用可能な方法と考えられる．
これらのことより，本法は遺伝性疾患の非侵費的な胎児退伝子診断の実用化に広く道を開く方法であり，近い将来，現在の羊水穿刺や絨毛採取法などの侵襲的方法にとってかわる日がくると考える．
この検査法は現時点で有効な治療法のない遺伝性疾2）Zhang L，Cui X，Schmitt X，Hubert R，
Navidi W and Arnheim N：Wh01e genome
amplification from a slngle cell：Implica
tions for genetic analysis．Proc Natl Sci
USA87：4580−4584，1990．
3）Sekizawa A，Prenatal diagnosis of Duchenne musclar
cytein maternal blood．

NeuroIogy，1996．

in press．

4）ChamberlainJS，Gibbs RA，Ranier・JE and
Caskey CT：Detection of gene deletions us−lng multiplex polymerase chain reaction．In（MathewC，ed）．Method・inmolecularbi−0logy，ⅠⅩ：Protocolinhuman molecular ge−
neticsclifton

NJ：Thehuman

Express，

1991，pp299−312．1

5）Sekizawa A，Watanabe A，Kimura T，Saito

献

T

and

Sdto

T：Prenatal

diag一

mosis of the RhD blood type．uslng a Single

1）Takabayashi H，Ⅹuwabara S，Ukita T，Iknwa X，Yamafuji X andIgarashi T：De−
velopment of non−invasive fctal

Sasaki M，dystrophy uslng a Single nucleated erythro−

H，．，Yanaihara

文

Kimura T，

Nakamura，S，Kobayashi R and Sato T：

患を非侵襲的に診断可能であり，その胎児診断の結果が人工妊娠中絶のきっかけや前提になる可能性がある．
本法は患者にとって極めて簡便であるために実地応用に際しては倫理的・社会的側面からさらに慎重な対応が必要と考えられる．

Prenat Diagn

DNA diag−135−

nucleated erythrocytein maternal blood．
Obstet Gynecol，1996，in press．

36）DMD／BMD骨格筋のジストロフィンmRNAと臨床像
斎 藤 加代子＊

研究協力者

緒

杜
娼＊
宮 川 桃 香＊

池

谷

紀代子＊

河

北

有親子＊

大 澤 真木子＊

言

age

F
F
・
●
R
R

45・47

E

46・49
44
45

−

45

1
1
1

49・50
50
51
48・52
48・52

DD

1

6：2
12：9
15：7
8：9

45−48
45・48

DDDDD

1

14：1
7：8
9：3
2：2

D

8：1
7：11

D

1

て，リンパ球における遺伝子欠矢との整合性を調べ，ジストロフィンの発現，臨床像を合わせて分析した．

89012345

認める例を経験する．このような症例を含めて，骨格筋のジストロフィンmRNAを解析1）することによっ

10：1
6：11

F

2：7

b二日DD

14：0

3

DNA
R

2

4567

筋ジストロフィー（BMD）のジストロフィン遺伝子の部分欠矢と臨床像はreading−frame theoryによって主に説明できる．しかし，リンパ球における遺伝子欠矢が臨床像やジストロフィン染色の結果と合致しない
例や，遺伝子欠矢が同一のエクソンでも臨床像に差をI 日 暮 一 V ＝ Ⅵ ‖ ⁝ 日 日 W W ⁝I）uchenne型筋ジストロフィー（DMD）やBecker塑

48・52
52

−
「
く

8：BMD．D二DMD．FJiinLR：∫●YO血nl

図1結果

本年はmajorhotspotに欠矢が認められた例に関して施行した．

対象はエクソン44から52のいずれかの欠矢を示す
2y2mから15y7mのDMDll例（厚生省ステージ分類ス

3）リンパ球DNAにてエクソン48−52の欠矢を示す
DMDの3例のうち，症例14でmRNAは欠矢から推定されるサイズより大きかった．この症例はリンパ球
DNAのSouthernblot法にて，エクソン48のシグナ

テージⅠからⅦ）と，2y7mから14yOmのBMI）4例（ステージⅠからⅡ）である．全例骨格筋組織にてジスト
ロフィン染色を施行した．運動横能障書進展過程は症
例5はDMDとしては緩徐である．症例11は運動機能ルが認められなかったが，16kbのjunction fragmentが認められた．なお全例のPCR−Southern法によって，バンドはhybridi2Lationsignalとして確認された．
4）BMDの4例ではmRNAは欠矢から推定されるサ獲得が遅れている．症例13は痙攣重積を合併，座位保
持不能，先天型との異同が考えられた例，症例14は骨格筋原発の横紋筋肉腫により死亡した例2）である．
方法は骨格筋よりAGPC法によってRNAを単離し，リンパ球における遺伝子欠失領域をはさむプライマー

イズと整合性があり，ジストロフィンの分子量も整合性があった．

を設計し，10例ではエクソン43から51の，5例ではエクソン46から53の領域のRT−PCRをnestedにて行っ

6）PCR産物のdirectsequencingの結果，症例1ではエクソン45−49の欠失により，エクソン44と50がスプた・症例1，5，14ではPCR産物のdirect sequencing
をALFDNAsequencerにて行った．

ライシングによってreadingframeを保持して，つながっていることが確認された．

対象と方法

結

6）ジストロフィン染色でrevertantを示したI）MI）2
例は，欠矢とmRNAサイズに整合性があり，臨床像
もDMDとして軽症とはいえなかった．

7）症例5ではエクソン46−49の欠矢によって，Out−Of
frameにてエクソン45と50がつながっていた．

果

1）I）MDのRNA量は，BMI）より少ない傾向があった．
2）骨格筋mRNAのRT−PCRにより，DMD9例，
BMD4例に欠矢をはさむ領域の転写産物を認めたが，DMDの2例では認めなかった（図1）．

の症例14ではリンパ球DNAにてエクソン48−52の欠矢が認められたが，エクソン48が全て欠失しているわ
けではなかった．エクソン48の3 端の15塩基のエク
ソン内欠矢に引き続き，エクソン49−52の欠失，7301−
CのAへのmissense mutationを認めた（図2）．

＊東京女子医科大学小児科

−136−

結
論
遺伝子変異とジストロフィン蛋白の発現，臨床像の関係を明らかにしていくために，リンパ球における遺伝子欠矢が臨床像やジストロフィン染色の結果と合致しない例や，遺伝子欠矢が同一のエクソンでも臨床像に差を認める例において，骨格筋mRNAを調べることは有用である．major hot spotに欠矢を示す例以外に関しても検討したい．
図2

Nucleotide sequence of E48−53
case14

segment

参考文献

in1）ChellyJ，Gilgenkrant2；H，et al：Ce1163：
1239−1248，1990．

2）小峯 聴，斎藤加代子ほか：東女医大陀：1208−
1215，1992．

−137−37）Duchenne型筋ジストロフィー中枢神経におけるシナッブス部の変化について
野

内

＊

之治郎

＊
榊

照修仁

榊

野田本

＊

平箕寺

＊
綿

IQの下位テストでは特に記銘九記憶九計算力が低値で，電気生理学的にも認知電位（P−300）に異常が認

一書

中枢神経系のニューロン（postsynaptic region）にいわゆる脳型Dyとして局在し，知能障書を認める
DMD脳ではDyを欠如することを世界に先かけて報告してきた1）2）．また詳細なIQ分析によりDMDでは誠郎雄幸

生理機能はまだ完全には解明されておらず，Dyの欠如により骨格筋が変性，壊死に陥る横序も今日なお不明である．またDMD児では高率に精神発達遅延やIQ異常が認められるが，その理由についても明らかではない．我々はこれまでDyは骨格筋のみならず，ヒト

英由正

dystrophinが1987年Hoffmanらによりreverse ge−
neticsの手法により発見されて以来，その局在や特性に関する数多くの知見が集超されてきた．しかしその

永山東藤

目
的
Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）の原因蛋白

徳宇安安

榊

生弘治昭

．．榊

暁通鉄弘
木村江

原藤中直

研究協力者

を行い，一定倍率で引き伸ばしたのち，印画妖中の100〟m2内に含まれるシナッブス数を拡大鏡で確認することにより算定した．なお6，000倍で撮影した同じ部位をシナッブスの観察に正確を期すために，観察が容易な約20，000倍の倍率で分割撮影した．またシナッブス間隙および後シナッブス部の超微構造の変化は70，000〜100，000倍の倍率で観察を行った．
結果

対照例では単位面積（100′Jm2）あたりのシナッブスの数は8．027±1．041（Mean±SE）であり，一方DMDでは11．鋸1±0．949であった．DMDのほうが単位面
墳（100〟m2）あたりのシナッブスの数は多い傾向がみられた（P＜0．1）（図1A，18）．
また対照例のシナッブス間隙についてはシナッブス（postsynaptic region）の起微構造の変化について正常対照とDMD脳で比較検討した．

部分以外の細胞間隙にくらべて電子密度の高い物質で埋められており，前後のシナッブス膜をむすぶ線維状
構造やときに前後のシナッブス膜の中央に横線が認められた（図2A）．DMDにおいては前後のシナッブス膜
をむすぶ線維状構造は対照と同様に比較的観察が容易

対象・方法であったが，前後のシナッブス膜の中央の横線は殆ど確認することが困難であった．後シナッブス膜の細胞められることを明らかにしてきた3）．そこで今回Dyの局在が想定されている後シナッブス部

神経筋疾患以外で死亡した対照5例伍2〜鎚歳，平均52．4歳）とDMD3例（17〜26歳，平均21．7歳）の大脳を剖検時に採取し，電顕用に固定した頭頂糞（postcentralgyrus）の皮質第3層について，単位面積（100〟m2）あたりのシナッブスの数，シナッブス間隙内の変化，後シナッブス部の超微構造の変化を中心に枚索した．なお各症例の頭頂糞（postcentralgyrus）の単位面積（100〝m2）あたりのシナッブス数は，皮質第3眉をニューロンの胞体をはずして，無作為に18箇
所〜60箇所（平均33箇所）を6，000倍の倍率で写真撮影＊熊本大学医学部神経内科＊＊熊本大学医学母第一内科＊＊＊国立痺糞所再審荘病院神経内科

質に向かう面は電子密度の高い物質（postsynaptic
density：PSD）により裏打ちされており，その形態学的特徴からシナッブスはTypeI（非対称塑）とTypeⅡ（対称型）に分類される．今回検索したシナッブスはす
べてTypeIに該当すると思われたが，対照例ならびにDMD例ともPSDの形態に著しい差異はみられなかった．ただ対照例のPSDは境界が比較的鮮明であるのに対してDMDのPSDは全般的に境界がやや不鮮明なものが多く観察された（図28）．
考案

ヒト骨格筋においてはdystrophin（Dy）はN端側でactinに結合し，CySteine−richdomainとC−terminal−138−図1A対照例の頑頂薫皮質第3層におけるシナッブス（矢印）の分布．×6，000．
B DMDの頑頂薫皮質第3層におけるシナッブス（矢印）の分布．単位面積あたりのシナッブス数
が対照より増加しているようにみえる．×6，000．

図2A対照例のシナッブスの拡大像．シナッブス間隙の中央の横線（矢印）が観察され，pOStSynaptic
density（PSD）の境界も比較的明瞭である．
×70，000．

B DMDのシナッブスの拡大像．シナッブス間隙の
中央の横線が不明瞭であり，PSDの境界も不鮮明である．×70，000．

domainの一部で細胞膜に存在する Dy−aSSOCiatedprotein8（DAPs）と結合し，さらに基底膜の1amininと連結することが知られているが4）5），ヒト脳においてはDyがpostsynaptic regionに局在が想定されること以外は何ら明らかになっていない．DMD骨格筋
ではanchorproteinとしてのDyが欠如することで，殆ど全てのDAPsが減少し，Dy−DAPs−lamininの連結が破綻して細胞死につながると推定されるのに対して，DMD脳ではDyは欠如していても細胞死は生じない．このことは同じくDyを欠如しなから，DMD
骨格筋と脳でDyの欠如を通じて二次的に生じる病態の変化に何らかの違いがあることが予想される．前回
Dyが直接結合することが想定されるDAPsの一つのβ−dystroglyeanがヒト中枢神経内にも存在しており，DMDの骨格筋ではβ−dyStrOglycanは著減している
ものの，脳においては比較的よく保たれていることを報告した6）．現在骨格筋線掛こおける基底掛こ相当するものは脳では血管周囲に存在するほかは知られておらず，後シナッブス腹部にβ−dyStrOglyeanが局在しても筋線経のようにそれが連結するlamininのような基底膜成分が脳においては存在しないのか，あるいは類似の構造物が実際は存在しているのか解決が急がれる重要な問題と思われる．超微構造上 前後のシナッ
ブス膜を結ぶ線維状構造や前後のシナッブス腰の中央に認められる暗線が前後のシナッブスを機械的に結合する接着作用を有すると考えられており7），これらの構造物がDyとβ−dystroglycanの連結相手として働いている可能性もあり今後検討が必要である．今回の検索ではDMD脳におけるDyの欠損によって惹起されたと思われる明瞭な超微構造上の変化は認めること−139−

はできなかったが，DMDのPSDは全般的に境界がやや不鮮明であること，前後のシナッブス膜の中央の暗線が殆ど確認が困難であること，単位面積（100〟m2）
あたりのシナッブスの数が対照より多い傾向がみられることなど若干の違いもみられたので今後さらに症例を増して検討することが大切と思われる．さらにシ
ナッブス部にはCa＋＋／calmodulin（CAM）−dependent
protein kinase，CAM kinaseⅡなどの調整酵素のほかtubulin，aCtin．fodrinなどの細胞骨格蛋白の存在が知られており8），Dyがこれらの既知の蛋白といかなる関係をもってシナッブス部の生理機構に係わっているのか，今後に残された重要な問題である．
結2）Uchino M，Teramoto H，Naoe H，et al：
Dystrophin and dystrophin−related proteinin
the central nervous system of normal con−troIs and Duchenne muscular dystrophy．
Acta Neuropatho187：129−134，1994．
3）池田晃章，福島達臣，内野 誠ほか：筋ジストロ
フィー患者における聴覚および視覚利敵P300の検討． 厚生省「精神・神経疾患委託研究費」筋ジス
トロフィーの臨床病態と遺伝相談及び疫学に関する研究班 （高橋班）平成5年度研究報告書，1993．
4）Ibraghimov−Beskrovnaya O，Ervasti JM，Leveille GJ，et al：Primary structure ofdystrophin−aSSOeiated glycoproteinslinking
dystrophinto the extracellular matrix．Na−論

Dyの局在が想定されている後，シナッブス部

ture35：696−702，1992．

bostsynaptic region）の超微構造の変化について正常対凪とDMD脳で比較検討した．今回の検索では

5）Suzuki A，Yoshida M，Hayashi K，et al：

DMD脳におけるDyの欠損によって惹起されたと思われる明瞭な超微構造上の変化は認めることはできな

COmPlex−binding site of dystrophin．EurJ

かったが，DMDのPSDは全般的に境界がやや不鮮明であること，前後のシナッブス膜の中央の暗線が殆ど
確認が困難であること，単位面積（100mm2）あたりのシナッブスの数が対照より多い傾向がみられることな

6）Uchino M，Hara A，Mi2：unO Y，et al：Dis−

Molecular organization at the glycoprotein−
Biochem220：畏3−292，1994．
tribution ofdystrophin and dystrophin−aSSO−
Ciated protein

43DAG（β−dystroglycan）in

the central nervous system of normal con−

ど若干の違いもみられたので，今後さらに症例を増して枚討することが大切と思われる．

troIs and patientswith Duchenne muscular

dystrophy．InternalMedicine，1996，in press．
7）Ichimura T and Hashimoto PH：Structural

文

献

COmPOnentSin thesynaptic cleft captured by

1）Uchino M，Teramoto H，Naoe H，et al：
Locali2＝ation

andcharacterizationof

free2＝e−Substitution

deep

etchingofdi−rectlyfrozencerebellarcortex．J：Neurocytol

dystro−Phininthe central nervous system of con−troIs and patientsand17：3−12，1988．

with Duchenne muscular8）Ⅹennedy MB：The postsynaptic density．

dystrophy．J NeuroI Neurosurg Psychitry

CurrentOpinioninNeurobiology3：732−737，

57：426−429，1994．

1993．

−140−

38）重篤な心筋障書を呈するBecker型筋ジストロフィーの全国調査結果
池

研究協力者

田

修

一＊

中

村

昭

別事

矢

崎

正

英＊

柳

沢

信

夫＊

武

田

伸

一綿

は じ めに
Becker型筋ジストロフィー（BMD）は，Duchenne
塑筋ジストロフィー（DMD）と同じくdystrophin遺伝
子異常により発症するが，骨格筋症状が軽微であるのに対し心筋障害が強い例がみられるなどDMDに比べ表現型のスペクトラムが広いことで知られている．
我々は拡張型心筋症類似の病態を主徴としたBMD症
例に着日し，遺伝子解析を行ってきた．今年度は遺伝
子異常と表現型の関連を検討するため，重篤な心筋障書を合併したBMDについて全国調査を行った．
方法
神経内科・循環器科のある全国の大学附属病院，国立病院 国立療養所124施設を対象に，各施設で過去5年間に経験された拡張型心筋症類似の病態を呈する
BMDまたは，高CK血症を伴う家族性拡張型心筋症（以下DCM）の症例について調査を依頼した．
調査項目は性別・年齢，発症年齢，診断，骨格筋および心症状，血清CX値，骨格筋生検所見，心電図・心エコー・心臓カテーテル検査を用いた心機能，ジス
トロフィン免疫組織化学，ジストロフィン遺伝子解析，転帰の各項目について調査票の記入を依頼し，その結果をもとに遺伝子異常と表現型の関連について検討した．

patchy patternを認めたが，残りのI）CMl例では正常パターンであった．このdystrophinが正常パターンを示した家族性DCMl例は臨床的には大腿筋群の萎
縮・筋力低下も認め，骨格筋生検所見でも筋線経の大小不同，壊死再生像，問質結合織の増生を認めた．転帰については26例が生存し，4例が既に死亡していた．
Dystrophin遺伝子の解析は30例中19例で施行されており（表1），eXOnlの欠矢が3例，eXOn2−7の欠矢が1例，eXOn3・4の欠矢が1例，eXOn13の欠失及び一塩基置換が各1例，eXOn45−48内の欠矢が7例だった．またPCRで欠矢を認めなかったものが2例，詳細不明が3例，未施行が11例だった．遺伝子検索が行われ，dystrophin異常が明らかであった14例は，13例がBMD．残りの1例がexon2−7の欠矢によるDCMであった．この14例についてdystrophin遭伝子異常と表現型の関連を詳細に検討した．
遺伝子異常と骨格筋症状の関連（去2）については，
全例に下腿の仮性肥大を諾めたが，eXOnl，eXOn2−7の欠失例では，明らかな筋萎縮・筋力低下は認められなかった．その他の症例では，いずれも軽度ないし中等度の近位筋の筋力低下が認められた．Exon45−48内の欠失例は全て経過年数が長く，四肢の筋萎縮・筋力義1dystrophin遺伝子解析結果
遺伝子異常

結
果
全国124施設中49施設から返答があり，16施設30
例の症例の報告があった．性別は全て男性で調査時年

齢は13−65歳，発症年齢は1〜40歳．拡張型心筋症を示すBMDが25例，高CX血症を伴う家族性DCMが3例であった．高CX血症を全例に認めた．また全例に心機能検査上異常を認め，心不全症状を呈するものは30例中17例であった．Dystrophin免疫組織化学は9例で施行され，BMD7例およびDCMl例で払ht and＊信州大学医学部第三内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

−141−

症例数

給節

給節方法

亡ヽUn
l ddcur椚

3

BMD SOulhrmbkll◆KR

三・T JekuUn

1

DChl Soulkmbl（lt◆PCR

3．4

1

811D

JdeIilれ13

血leuOn l
1

臥lD PCR◆トqUCnCe

dcIrtIUn

1

BMD

PCR

dckllく）n

4

BMD

PCR

13

plntmut山川

4ゝ47
4摘

PCR

BltD Soulhrmbht◆FでR

47

ddctJOn l

BMD S【）ulhemblot＋PCR

PCRで欠矢を認めない例

三

DCM

拝錮不明例

3

BMD

未施行例

1

BMD

三十

30

PCR

低下が明らかであった．遺伝子異常と心症状・心機能の関連（表3）については，心不全症状を14例中11例に認め，左宝壁運動障害を全例に認めた．またexonlからexon13までの異常例では経過年数に比し，左室駆出率の低下が顕著であった．
以上の結果から，心筋障害を呈するdystrophiIl異常症は5 端の異常を持つものと，hot spot部の異常を持つものに大別されると仮定し，左宝駆出率が示されていた症例について，5 端の異常をもつ群とhot
SpOt部の異常を持つ群に分けて，経過年数と左宝駆出率との関係を調べた（図1）．5 端の異常のものは発症早期から駆出率の低下傾向を示すが，hotSpOt部の異常例では緩徐に駆出率が低下してくると考えられた．

ただし，対象とした症例数が少ないこと，経過年数が正確でないこと，駆出率の計測が使用機種で異なるこ

槌召臼国側
1

10

15

：○

コ

】0

1三通手記

図1経過年数と左室駆出率（ejectionfraction）の関係

表2dystrophin遺伝子異常と骨格筋症状の関連
C混鵠Dl伸一 加b昔11ne錮：霊霊 忘．．，P郎bh｝叩−Phy M血血t∬dcl仙0∩

3ユ

45−4ト血l仙On

18

47

1klCu（¶】】47

tklCuun＋＋＋kkkk叱kkkm 拙 腑 仰 mi l ︒ 血im・ ︒ 血 血 血 血 血 血 血

45−47

＋

B

ヽ n

3三

＋

ヽ い

B

d亡CuOnpqnlmuuuon

＋

l J

−U

▲ J

tkltdon

4ゝは

＋

︳ い

8

−

1 ・1

tD 旧 の m tD

l ハ

hP

・ 1

45−48

15

＋

tklc110爪

の

l け

B

0

1・ 11

21 39 27 側 27

9

19

＋

ヽ け

B

47

8

45−48（kk山肌

＋

劇

7

tD tD

l い

h p

心

一 〇

25

＋

J﹁

5

11

＋

t

4

Ⅰ】

4

＋

1

︑ ■

珊0000珊鵬．．u．u．u．u．u
血・むし∝ふーん

7

●

ー
74
ll12t一9BM︒M M m M

封 18 14 封 19

・ −

1】

仙dth甲y仙pnddoneO門此nkr
爪ddon亡nddoneh叩Ncnkrlに⊂rOuChkrp）山の山肌dd汀damp
nddoneYユnaboninnkr王iヱ亡れ亡ロに山Clikr

Y血donhnkrdz上皿icnh汀
nkr叫Il血g
Ylna On爪nk痛王亡れddon亡nd血eれdd（m亡Y打iauonhnkrsiZf
OF叫u亡nk−＋

n亡灯αKhbJilY血川Itr釦ilialu∬∪く：

表3dystrophin退伝子異常と心症状・心機能の関連
C心亡鵠D岬鳩▲SDun芯了肋⊂∬思想ごみ仙仙um ECGrIn山W UCG仙np
2▲l
2

】8

3

14

4

24

飢旧

19

BゝtD

7

BhtD ll

DCht

1

1

血khon

一

帥叩rr∝liW

曲帖mlqln札uいVr l〟h）■Pun亡Sは

0．26

匹kmlllCdh〉 匹uneSi5 0・435
血C
tn叩＋abn（一mユlQm軋l軋▲Vr
山IRH1Vl・3
1．Vdlt山alion O．15
1血l仁山0m＋ibmlqi爪Ⅰ，■VLV4−6
b川RhVl

2−7

dd仙肌

＋

b血l）qr山，仙T

LVdil山aioI1

0．〜47

dlrru父hy甲山⊂如

5

19

Bhの

4

6

42

8トの

13

7

41

Bh旧

4

＋

仙yq仙a
l〟H 仙STTcユ爪が

11

＆l仙On

＋

lRBB軋LAlo．d

U／hyPunCS■1

13

pqnlmuuU叫＋

VIR／S＞l．O
STlinLV44

UJDiTlmm O．1・l
U／N69mm

45■8

＆l仙0爪

4ゝ481kl的（Ⅵ一＋gトTlinhVl−V34≠i山nlYY¶lユ‖lml1

45−47

＆ku州

＋

LAld．奴h）Qd■1

45−47

血khm

tklCkれ47

血lrunninIra、帥山川hc珊Ju血）爪血1坤

−十M正郎川・nunblOll¶

UnLno、川■k叩Q川軋＝いVr
bI日日llVI・三l〟h）pkmds

u◆MlldSTl川軋llLaVr．V54

LVdlュ加10mー142−l〟h）匹LlnCil；

︼
0

− 1

8

47

＋

LVbpunCSk

舶0unho≠れ

か
0

1 −

t 一

ヽ ︑

D

−

t 一

hU

＋

ⅨM llCm

0・27

汐

一

■

ゝ

B

D

45−4R dCl仙Onu／d）Srulにlion

粛 ︻
0

5

ヽ ．

−U

D

− 一

ヽ ．

bP

D

−

川¶

−

H

しVllal血ioll

血lCu00

︼

1 一

9

ヽ ︑

hp

D

川〟

−

1 −

粥

1

0

8ゝtD

く 一

つ −

ヽ ︑

︻P

21

9

34

D

椚

〇 〇

4

34

とが問題点としてあげられた．
考

謝 辞：本研究にあたり，症例を呈示頂きました秋田
大学医学部第二内科，筑波大学医学部神経内科，国立案

心筋降等を呈するBMDは，dystropbin遺伝子の5瑞の異常を持つものと，hot spot部の異常を持つものに大別されると考えられた．5 端の異常例では骨格筋症状に比べ心症状・心筋障字が先行Lより重篤である
症例が多かった．Hot spot部の異常例では骨格筋症状が先行し，進行期に至って心筋障書が出現してくると考えられた．Exon13に異常をもつ2例については，
他の5 端の異常例と同様に骨格筋症状に比べ心症状の出現が早く，重篤であったが，近位筋の筋力低下が明らかであったことから，5 端の異常例の中でも表現型にheterogeneityがあると考えられた．
拡張型心筋症を呈した5 端のdystrophin異常症はBMDおよびⅩ1inked cardiomyopathy（ⅩLCM）として報告されている．我が国においてはexonlの欠失1），eXOn3，4の欠失2）ぉよぴexon13のone point
mutation3）により拡張型心筋症を主徴としたBMD例が報告されている．またイタリアのMunt。niら4）は療養所東埼玉病院内札千葉大学医学部神経内科，東京医科歯科大学神経内札 東京医科歯科大学第三内科，
日本医科大学第一内科，東海大学医学部第四内科，国立精神・神経センター武蔵病院神経内科，松本共立病院，愛知医科大学第四内科，国立循環器病センター内科脳血管部門，大阪医科大学第一内税 近畿大学医学部第一内科，神戸大学医学部第一内科，岡山大学医学部神経内科，九州大学医学部神経内科の各施設および調査票をお送り頂きました施設に対して深謝します．
文献1）Yoshida X，Ikeda S，Nakamura A，et al：
Molecular analysis of the Duchenne muscu−
lar dystrophiy genein patients with dilated

Cardiomyopathy．Muscle＆Nerve16：1161−
1166，1993．

2）Ohkoshi N，Yoshizawa T，Mi2：uSaWa H，Ct
al：Malignant hyperthemiain a paticnt withⅩLCM琴系でpromoter〜exOnlにかけての欠矢を見出し，アメリカのTowbinら5）6）はexon8−10内のアミノ酸変異を伴った異常を見出したと報告した．さらにBecker muscular dystrophy：dystrophin

最近イタリアのBartoloniら7）はpromoter領域のPOint mutationで，心筋障害を主致とし，骨格筋障
害が軽度であったをBMD例を報告した．今回の調査
でもexonlが欠失したBMD例およびexon2−7が欠失したDCM例は下腿の仮性肥大以外明らかな筋力低下

3）YuY，YamabeH，Fujita H，et al：Cardiac

はみられず，ⅩLCM類似の病態と考えられた．しかし，
5 端の異常の中でもexon3−4の欠失例やexon13の欠失例ではいずれも軽度ながら近位筋の筋力低下がみられたことから，5 端の中にも重篤な心筋障害を起こす

tion of the dystrophin muscle−PrPmOter re−locusがいくつかあって，そのloeusにより骨格筋降雪の程度が異なる可能性があると考えられた．一方

5）TowbinJA，HejtmancikJF，Brink P，etexon45−48はBMDでdystrophinの欠矢が生じるhot
spotであり，以前からこの部位の異常を持つ一部の例
で心筋障零を起こすことが報告されている．今回の調

1ecular genetic evidence oflinkage to thq

査結果からも5 端の異常例に比べ心筋障害の出現は遅く，従来の報告と同様の結果と考えられた．

analysis and caffeine contructure study．

Neuromusc Disord5：53−58，1995．
inVoIvementin a family with Becker muscu−
lar dystrophy．Internal Medicine

34：919−923，1995．

4）MuntoniF，Cau M，Ganau A，et al：Dele−
glOn aSSOCiated with X−1inked dilated cardi−
OmyOPathy．N EnglJ Med

329：921−925，

1993．

al：Ⅹ−linked dilated cardiomyopathy；m0−
Duchenne muscular dystrophy（dyStrOPhin）
gene at the Xp21locus．Circulation87：L1854−1865，1993．
6）TowbinJA，Orti2＝−Lopez

R，BulmanD，et

5 端の異常を持つBMD症例が病初期から心筋降雪の程度が強く，骨格筋症状が軽微であることが明らか

al：A novelcardio−SPeCific dystrophinmuta−にされたことで，このような異常を持つ患者の予後の改善・生活レベルの向上を図るため，将来的には心移植を含めた窮極的な治療法を導入検討することが可能となる．従って5 端の異常を持つBMDにおいて退伝
子異常と心筋障害の発症機序をより詳細に明らかにす

myopathy（ⅩLCM）．Cardiology
A203，1995．

tion

as

a

cause

of

X−1inkeddilatedcardio＿36（suppl）：

7）BartoloniL，Fanin M，Freda MP，Ct al：

ることは，心筋におけるdystrophinの機能ならびに治療方針を検討する上で重要と考えられた．
−143−

Point mutationsin muscle promoter reglOn
Of dystrophin gene associated with cardio−
pathy and myoglobinemia・Neurology（Supp14）：A182−83P，1995．

45

Ⅷ．Adhalin欠損症39）Adhalin欠損悪性肢帯型筋ジストロフィーにおける臨床像とadhalin遺伝子異常の特徴

m

藤立井村

㍊

訂

記

遠足平松

日

史輝

史誠郎夫

雅

尚

井

／

池重野水

赤国奥清

研究協力者

武

徳■

柏

木

節

克

仁科

藤

嘉

勝榊

CampbellKP榊＊

原

子＊
力榊

喜一郎榊＊＊は じ めに
感性肢苛塑筋ジストロフィーは，1966年三好らにより提唱された筋ジストロフィーの遺伝・臨床型の一つ
で1）2），臨床像はDuchenne塑筋ジストロフィー（DMD）に類似しているが常染色体劣性の遺伝型を示す．Ben Hamidaら（1983年）3）により報告されたse−vere childhood autosomal recessive muscular

dystrophy（SCARMD）の臨床像は本症に類似しており，両者はI計じものと考えられる．1992年，
Matsumuraら4）によりSCARMD症例の骨格筋にadhalinの欠損が明らかにされたが，我々は悪性肢帝型症例の中にも同蛋白質の欠損例があることを見出
し5），それらの症例にadhalin遺伝子の異常を見出した6）．
本論文では日放の悪性肢苛型症例のadhalinの遺伝
子解析の結果を述べ，併せて文献報告のadhalin欠損
筋ジストロフィーの臨床像とadhalin遺伝子の異常についても述べる．
対象と方法∴

検討した．
Z AdhaHn遺伝子の解析と遺伝子異常の検討
1）目敏例のadhalin遺伝子の解析：症例1〜3については生検筋によりRNAを抽出し，Roberdsら15）のadhalin遺伝子の塩基配列をもとに6対のプライマーを作成し6），reVerSed transcription PCR（RT−PCR）を行った．症例4に関してはホルマリン固定の筋組織
標本よりDNAを抽出し，ゲノムDNA解析用のプライマー対6）を用いてDNAを増幅した．得られたDNAの塩基配列は自動DNA sequencer（ALF，Pharmacia）
により解析した．症例1〜鋸まゲノムDNAの解析も行った．両親と，一部の家系見については白血球より抽出したゲノムDNAについて検索を行った．
2）文献例のadhalin遺伝子異常：Adhalin遺伝子の異常が報告された症例あるいは家系6）14）17）18）25）の遺伝子異常をまとめた．
3．変異adh81inのHydrophobicity／HydrophHicity Plot
遺伝子異変から推定される変異adhalinの構成アミノ酸の疎水性，親水性26）の変化を調べ，正常adhalinのものと比較検討した．

【対象】
自験の悪性肢帯型筋ジストロフィー（MLGMD）3家
系4症例と，現在までに報告された4）〜18）25）adhalin欠損筋ジストロフィー52家系71症例である．
【方法】
1．臨床像の検討
1）MLGMD症例：目敏の3家系4症例の臨床事項を要約して表1に示した．
2）文献報告例：前記の文献例の臨床像と筋組織像を＊徳島大学医学部第一内科＊＊国立撲ヰ所徳島病院＊＊＊大塚製茶Gon研究所＊＊＊＊HHMlおよびlowa大学医学辞＊＊＊＊＊帝京大学医学部神経内科

成境の統計処理は二項検定にて行った．
結

果

1．臨床像
1）目敏例：臨床事項の要約を蓑1に示した．Wa．家系とTa．家系では患者の両親は近親婚であるが，Ma．
家系には近親婚はない．若年の症例1と4には血清CX
活性倍の著しい上昇がみられた．筋力低下は主として四肢近位部と体幹に認められ，大脳俳腹筋には末期の症例2を除き仮性肥大がみられた．症例1〜3について
は骨格筋中のadhalinの欠損を免疫組織学的に確認した5）6）．
2）Adhalin欠損筋ジストロフィーの報告例の臨床像
Adhalin欠損例の文献報告例（自助例を含む）は52家系71症例である．このうち，adhalinの遺伝子異常をー147−

表1Adhalin遺伝子に異常が認められた悪性肢帯型筋ジストロフィーの3家系．Adhalin遺伝子の変異一報告例

症例
年齢・
性
発症年齢

Wa．
家系
1
23歳・
女性
3歳

家族巴

中
魅

Ta．
家系
2
56歳・
女性
5歳
琶

†

3
31歳・
女性
5歳
…
… †

…a．
家系
4
10歳・
男性
2歳
†
† † †

惑
．
一
。仰塊
占靡

I 無 象 鹿．石「 も
：
一二

（
，
52）8 （ミ…
）q Q q q （
無策 。
，
（
川
4）（
64）

主

訴

初発症状

歩行障害．四肢の筋力低下
歩 行時 よ く‡
孟倒

四 肢．体 幹 の 筋 力低 下
駆 走 遅 い． 転倒

起 立 困難駆 走 遅 い ．転 倒

動 は性 歩 行

歩 行不 能年 齢

11歳

13歳

16歳

9歳

現 知 能
筋 萎掩
腸腹筋
仮 性 肥大症 起 立 ・歩 行

正 常
四 肢近 位 部 ．躯 幹

正 常
（全 身 性 ）正 常四肢 近 他 部， 躯 幹

正 常
四 肢 近 位 部． 躯 幹

血 清CKは （lU／し）6．550 （
11歳）

く＋）
不

能

（± ）

（＋）

（＋ ）

不

不

不

能
4 00

能
680

能

6．264 （正常 値 く200）■●：患者（乱用朗，80；保届書．す究濁音．†：死亡ノ：検束乱（）内はCK活性伍（正常性：く200川几）．ロ．0内の数字は同地数を表す
（％）
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

図1Adhalin欠損筋ジストロフィーの臨床像（1）．Adhalinは他のsarcoglycan（β，γ）の遺伝子の異常でも欠拇するのでadhlain欠扱例とadhalin造伝子異常例をわけて示した．

有する例は19家系36症例である．Adhalinの完全欠損例と不完全欠損例に分けると前者は27家系44症例4）〜9）11）〜14）17）〜19）で，後者は23家系別症例7）10）15）〜17）ぁっ
た．臨床事項の概要を図1と図2に示した．
以下臨床事項について述べる．
男女比：男性29例，女性41例で，男女比は（1：1．4）である．
発症年齢：1歳〜15歳と幅広く分布しており，平均6．6±3．6歳であった．Adhalin完全欠姐の28例は1
歳〜12歳に分布し，平均6．0歳であった．不完全欠損の13例は1歳〜15歳に分布し，平均7．6歳であった．
これらはDMD（50例）の平均3．1±0．9歳に比べ高い（p＜0．01）．

歩行不能年齢：平均14．3±5．1歳であった．完全欠損例（18例）は9〜21歳に分布し，平均14．2歳で，不完全欠祖例の（4例）は10〜21嵐 平均15．5歳であった．
これはDMD（50例）の平均10．1±1．4歳に比べ遅い（p＜0．05）．

−148−

両親の近親婚：41例中21例（50％）にみられた．
家系内発症：51家系中29家系（57％）に認められた．

家系 Wa．

74

75

76

77

78

79

80

Arg Trp Leu Arg Tyr Thr Grn
7

正常遺伝子

一 ▲ V

▲往

変異遺伝子

例

■ ヽ ∨

An

一 †

Cys

家系 丁乱

131132

133

134

135

136

137

■ 一

Leu Leu Pro Tyr Grn Ala Glu

2
1
0

変異遺伝子

丁

家系 Ma．

▲症

一 〇

正常遺伝子

Ala Pro Gly Aは
136

409
GIn Pro Gly
137

74

78

75

76

77

79

80

Arg TTP Leu Arg Tyr Thr Gln

5

例日

変異遺伝子

一 7

数

Cy■
132

133

134

135

136

137

138

Leu Pro Tyr Gln Ala Glu Phe
3

正常遺伝子

2
1

変異遺伝子
Gln

0

ト2 3−4 5−6 7−8 9−101日213−1115−1617−1819−2021−22
年齢（歳）

154

図2Adhalin欠損筋ジストロフィーの発症年齢と歩行不能年齢（白験4例，RoberdsSL，etal（3例），
Piccolo F，etal（12例），Passos−Bueno MR，et al（1例））．
俳腹筋の仮性肥大：26例中19例（73％）に認められた．
心障書：心電図異常は38例中6例（16％）に認められ，完全欠損例20例中4例（20％＝こ異常Q波があり，不完全欠損例の15例中のうち2例（13％）に左基肥大所見が認められた．心不全症状を示したのは完全欠祖例の3例（8％）のみであった．
知能障害：30例に知能に関する記載があったが，知能障害を有する例はなかった（図1）．
血清CX活性倍：10歳以下ではDMDに比べ低いが，それ以上の年齢では高い傾向を示した．
下肢筋のCT：俳腹筋，ヒラメ筋などの屈筋群に強い萎縮像が認められ，これはDMDと類似の所見であった（図略）．
図2はadhalin遺伝子に異常を有する症例のみめ発症年取歩行不能年齢の成境を示したが，adhalin欠損例の成境とほぼ同じであった．
3）筋病理組織所見
筋線経の大小不同が著明で，壊死，変性，は少なく，
opaque線推，再生筋線経などの所見もDMDに比べ少なかったが，多数の分薫線経が5例（12％）に認められた．免疫組織化学ではジストロフィンはほぼ正常に認められたが，adhalin（50kDa DAG）の欠損が認められた．43k（β）と35k（γ）の弘icoglycanも同様に欠組
していた．

155

156

AIa Ser Ar9

1＄7
Ph●

Pro

Ser

Ser

158

159

160

しそU Ser Ala

正常遺伝子
Ir▲m●Shin

変異遺伝子

CCA；GCC∈GCT

CCC；TCT…CAG；CCT

Pro Ala Ala Pro Ser Gln Pro

図3 日放3家系のadhalin遺伝子の異常．症例1（Wa．
家系）では，adhalin遺伝子のcDNAにC229Tの変異が見出され，ゲノムDNAでも同じ変異が確認された．症例2と症例3（Ta．家）ではA410Gの変異が認められ，さらに塩基番号（nt．）408とnt．
409の間に15塩基（一ccTGGTGCGCAGCCA−）の挿入が認められた．これらの変異により
Wa．家ではArg77Cysの置換が，Ta．家では
Glu137Glyの置換とPro−Gly−Ala−Gln−Proの5
っのアミノ酸の挿入が生じる6）．症例4では，一方の対立遺伝子にnt．404あるいは405のadenune（A）の欠矢とT470Cの変異が見出された．このAの欠失により3 側にはフレームシフトが生じ，
コドシ136よりC末端側は異なったアミソ酸配列となり，下流のエクソン6にはナンセンス変異が生じていた．■そしてもう一方の対立遺伝子には症
例1と同じくC229での異常が認められた．なこお，正常人75例の白血球DNAで上記の変異を調べたが変異はみられなかった．
Z Adh81in遺伝子の異常
1）自験例のadhalill遺伝子の解析
成境の要約は図3に示した．Wa．家系とTa．家系では患者にはホモ接合型の遺伝子異常が認められ，両親には正常と変異型の両者が認められた．Ta．家は。。m＿pound hetero2：ygOte（複合ヘテロ接合体）の変異が諾

−149−

められた．正常人75例について変異部位の塩基百己列を調べたが，異常はなかった．
2）文献報告例の遺伝子異常

表2Adhalinの遺伝子異常一報告例
家系

対象

塩基番号

1

7んゾ 11け人 −1 1はOn 7

2

モロ，
コ人

塩基置換

クソ
ン

G 一人

7

変
異
（
コ ドン 番号 ）
1ブラ
ルン
ク
●異 常

5 ■フレ
ー
1シ
フト

挿入 8bp

4 6

フラン
ス人

2 38
2 29

C・
一丁
．C 一丁

5
3
3
3

5

ト
ーィ
ッ人

22 9

C 一丁

3

A rg 77 C y s

6●

2 29

C 一丁

3

l rg 77 C y s

7 § フーラ
シ1 人

2 29

C 一丁 ′

3

A rg 77 C y s

8 5

3！

人
一
一欠 失 ．
ト→C
C一丁

40 4．
4 70
22 9

フレ
ー
ムシ
フト
． P h0 157 P ro
A rだ77 CY S
ナン
セン
ス（
80 ）
A rg 77 Cy s

デラ
シ
●
ん人

2 29

C 一丁

3

A rg 77 C y ＄9 § フ■ぅ
ゾん人

22 9

C 一・
T

3

A rg7 7 C y s

10C

フラ
ンス人

18 4
72 5

ト→C
丁一 C

3
6

T yr6 2 日isV 8 12 47 A la

11

イI リ
7人

変異はadhalinの筋菜膜外をコードする部分に多く（図の，筋簗脳内には1箇所のみで，膜貫通部分の報告
はない．
3．遺伝子異常による8dhaHn分子の変化
変異adhalinの親水性・疎水性表示の変化を調べた

10 1

G・
一人

2

A rg34 H is

4 08−40 9
4 10

挿 入 15b pA−G

5P r0−G ly一
山 a−
G ln −P ro
G lu 137 G Iy

6・
一人
丁
−C

フラ
ン
ス人

2 93
5 24
293
−1 8 XOn 8

6 −人
G 一丁

3
5
3
8

イ
タリ
ア人

4 52
7 39

C一
一G
G一
一人

5
6

フ
ラン
ス人

22 9
20 3

フラン
ス人

73 9

18 ぎ 7 7 冊 系
7 メ冊 人
19 ム

12●
頑
14 6
15 C
16 C
17 C

フラ
ン
ス人

察 茶逃 嵩A rg 9 8 H is
Va l 175 A la3
3
6

A rg 77 Cy s
引 y 68 G ln
V a は4 7 1b t

293
2 93

（
C一 丁
）
（
G一月

3
3

A rg9 8 C ys
A rg 9 8 H is

22 9

C一 丁

3

A rg 77 C y S

歩行不能年齢についても同様のことがいえる．
考察
悪性肢帯型筋ジストロフィー（MLDMD）の診断基＊：Robords．SL．．0t al．（t994）：●：著者らの家系（1994．1995）：§：Passos−Bu8nO．MR‥．0t al．（1995）：＃：Ljunggron．Aリ

Ot al．

（1995）：その他はPicGOl0．F‥ Ot aL（1995）：家系番号のC印：
複合ヘテロ持合体：ム；徳島大学小児科例

V 針け 餌け−‥・ ・ G ln 8 0 51。P ＼也

三三呈出 （9 ㌧ 叫 朋 H l暮

監慧

n

；霊
監

；誌

鮒2

…慧 謡 ∩一

G 岬

115 b p in s e n
仁山1 3 7 G IY l
E 血相心引山はrlE b 旦1 互乙巳出V a l1 5 1 s to p

6−∩

ないことや，知能障害がないなどの特徴があるが，前者についてはadhalinの欠損を代償する機構が存在す

T y 応2 H l＄
98H3）
A rg 9 8 C

ぺ■
豆、
1−
−
■
∴
リセJ 、
こ、
＿
∴
とこ−
．
か＿
∴℃臼1 ∵−
，
二∴㌣
■
ふ、
†∴〉
ここ
￣
七
・
さて
、
：
tJ一
一
∴∵九
㌦二・
二
∴．
ヾ￣
￣
〜
￣
〜∴ふ二
で ㌧∴
良好∝血臍折嶋 ■
ミ
で二
・
二
号1こ
と−
：
三
、
二
・
デ・
しゝ
；‡＝
、
ヤ
∴二
誓、
丸．
ニ
薫 く￣
で√：
′
叫 、
き1、
、
㌔−
い
震
、
■
ミ
・
ゾ
■
七・
㌧
一
、
−、
、
「
・
さ
−
や
′￣
三
二
、
㌧・
＿
ち瑞↓
′
■
〉
打 、ぺぶへ
J、∵ゝ÷
．
＿
￣
・
小・
，
、
叫，
二
■
′∴ぐ
Jもノ
八・、
・
・
㍍∴七
二
′
、
モ
・
、
沖．
・
・
し
、
・
∴ 一
） ゝこ
・
ln ね ∽軋血 r

準1）2）は，1）両性に発症し，2）筋萎掛は腰帯，四肢近位部に有意，3）1−5歳に発症，以後急速に進行し，多くは15歳までに歩行不能となり，4）血清CX活性値
は中等皮の上昇が認められるが，両親の多くは血晴
CX活性借の上昇はない，5）知能障害はない．加えて，
6）臨床症状の程度には多少の幅が認められる，などである．本論文の自験MLGMD症例は上記の特徴を有し，悪性肢苛型と考えられる．
Adhalin欠損筋ジストロフィーの臨床像は，
Duchenne型に比べると症状はやや軽く，経過が遅い
ものがあるなどの特徴を有する．その他に心障書が少V ▲じ4 2A 」■
v a に4 7 M e t（2）

結果，変異部位の近辺ではかなり大きい変化がみられた（図略）．
4．Adh8linの欠損と臨床経過との関係
Adhalinの免疫組織化学あるいはウェスタンプロッ
トの所見によりadhalinの発現量を判断し，発症年齢や歩行不能年齢との関係をみると，adhalinの欠祖の程度の強い例が発症年齢が早い傾向を示した（図2）．

A rg 98 H is
スフ
●ラ
イシ
ンク
■
異常
ナン
セン
ス（
15 日
V a 124 7 1わー

C一丁
G一
一人
G・
一A
（
も う一 方 不 明）

現時点までに報告されたadhalinの遺伝子異常をまとめて義2に示した．19家系の報告があるが変異は退伝子の各部位に起こり，ミスセンス変異，欠失，挿入など各種の変異が認められた，変異部位はnt．229の
C→Tの変異が全体の47％と多い．複合へテロ按合体が約半数にみられた．

るか，あるいは心筋におけるadhalinのisoformの存

A b e m n l IP h d n o

在による可能性も考えられる畏）．後者については骨格筋型のadhalinの中枢神経系における発現がないこと

CO 仇1

図4Adhalin分子上のアミノ酸変異とその部位（自験例＋文献例）．（Piccolo，et allO），一部改変）
Arg77Cysの変異が多く，この部位はhot spot
である．挿入や欠矢はnt．400〜408の部分に多い．
口は自験例，（）内の数倍は変異を有する家系数．
0印はアミノ酸1個を示す．0は変異アミノ酸．

によると考えられる盟）．
文献例の中には，臨床症状や経過にかなりの幅があり，筋組織のadhalinの発現程度をみるとadhalinの完全欠損例4）〜9）11）〜14）18）19）と不完全欠組例7）10）15）〜17）に分けることができる．両者の臨床症状には基本的には差はなかったが，前者は後者に比べ初発年齢が早く，歩行不能年齢も若年であり，症状はやや重症である．

−150−

また，最近β−SarCOglycanやγ−SarCOglycan仏3b）の遺伝子欠損例鋤〜32）の報告もあり，これらの例では
adhalinも欠損するので，adhalin欠損例とadhalinの遺伝子異常を有する例に分けて臨床像を検討したが，両者の間に明らかな差はなかった．
筋病理組織像では，基本的にはDMDと同じである
が筋障害は比較的軽く，また分乗線経が多く，これらの変化は筋障害がより緩徐に生じたことを衰していると思われる．
Adhalin欠損例のadhalin遺伝子については，Benれ その高次構造の変化や物理化学的な変化により，他の膜閑適蛋白質との結合障害が生じ，その結果
adhalinの分解促進，筋細胞膜の機能異常，ついで筋凍膜の崩壊，そして最後に筋細胞の壊死が生じると考
えられる．
おわリ に
Adhalin欠損MLGMDあるいはSCARMDの臨床像とadhalin迫伝子の異常について報告し，遺伝子異常と筋細胞の崩壊の横序について述べた．

othmaneら27）がチュニジアのSCARMD家系で染色体13qに連鎖していることを報告したが，Roberdsら

文

献14）はadhalin遺伝子が17番染色体上（17q12−q21．33）に存在し，フランス人のadhalin欠孤の1家系で同遺伝子の変異があることを報告した．本庄（MLGMD）ある
いはSCARMDにおけるadhalinの遺伝子異常は，は

1）三好和夫，西条一夫，粟生陽次郎ほか：進行性ジ

じめ米国（1994年）14）より報告があり，ついで我が国−Clinicaltypes of progressive muscular dys−

（1994年33），1995年6）），フランス（1995年）17），ブラジル（1995年）18），米国（1995年）公）などより続々と報告された．

trophy，Withspecialreference

ストロフィー症の1病塑 Malignant Limb−gir−
dle typeの提唱（会）．臨床神経6：491，1966．
2）MiyoshiX，TadaY and Xawai H：Geneticolimb−girdle

type

・JpnJ

to

やmalignant

Hum

Genet19：39−42，1974．

我々はMLGMDの3家系にadhalin遺伝子の点変異，
塩基挿入および欠矢を見出したが，Roberdsら14）がSCARMDで見出した変異は，一方の遺伝子にG293A3）Ben Hamida M，Fardeau M and Attia N：の変異仏rg98Hisに置換）があり，その対立遺伝子にはT524Cの変異（Val175Alaに置換）がある複合ヘテロ

Muscle Nerve6：469−480，1983．
4）Matsumura K，Tome FMS，Collin H，et

按合体であった．従って，この変異を本庄の原因とす
るには多少問題もあった．しかし我々の報告6）や，その後Picc。1。ら17）の家系にホモ接合型の変異が発見されたことにより，Roberds14）らによるadhalinの遺伝
子異常が本症の原因であることがより明確になった．
遺伝子異常としては，nt．229のadenineから

al：Deficiency of the50K dystrophin−aSSOCi−

Severe childhood muscular dystrophy affect−lng both sexes and frequentin Tunisia・

ated glycoproteinin severc childhood auto−

somalrecessive muscular dystrophy．Nature
359：320−322，1992．

5）川井尚臣，乾 俊夫，三ッ井貴夫ほか：悪性肢帯
塑筋ジストロフィー（三好）の骨格筋におけるthymineへの変異が最も多く，約半数を占めhot spotと考えられているが，その他に種々の部位に塩基の欠adhalin（50kDa dystrophin associated glyco−

失，挿入，スプライシング異常を生じるものなど各種の変異がある．本症には半数の例に複合ヘテロ接合体が存在する．これも本症の退伝子異常の特徴の一つで1995．

あるが，報告例の多くが先進国の例で，近親婚率が低いことや，一般人の間の変異遺伝子頻度が高いことなどが考えられる．
Adhalinの遺伝子異常によるアミノ酸の変異や置換の大部分はadhalinの筋菜膜外の部分にあるので，これらの部分は本蛋白質の安定化や他の蛋白との結合に重要な役割をしていると考えられる．
遺伝子異常のうちArg77Cysの変異例はadhalinの完全欠損があり，重症である．その他の変異では両者の関係は明らかでない．
Adhalinの遺伝子異常とadhalin欠矢との関係につprotein）の完全欠損．臨床神経学35：184−189，

6）KawaiH，Aknike M，Endo T，et al：Adhalin gene mutationsin patients with
autosomal recessive childhood onset muscu−
lar dystrophy with adhalin deficiency・J
ClinInvest96：1202−1207，1995．
7）Fardeau M，Matsumura X，Tom色FMS．etal：Deficiency of the50kDa dystrophin−aSSO−
ciatedglycoprotein（adhalin）in severe auto−
somal recessive muscular dystrophiesin
children native from European countries．C．R Acad Sci PariS316：799−804，1993．
8）Passos−Bueno MR，Bakker E，LMarie SXN，et

いては，異常遺伝子により異常adhalin分子が生成さ−151−

al：Exclusion of the15qlocus as a candi−date gene for severe childhood autosomal

recessive Duchenne−1ike muscular dyStrOPhy
in Brazilian families．Hum MoI Genet 2：

Oradhalin）deficiencyinamuscular dystro−

201−202，1993．

45：551−554，1995．

Phy patient populationinJapan．Neurology9）PassosTBueno MR，RichardI．Vainzof M，

17）Piccolo F，Roberds SL，Jeanpierre M，etet al：Evidence of genetic heterogeneityin

al：Primary adhalinopathy．；a COmmOn

the autosomal recesSive adult forms oflimb

CauSe Ofautosomal recessive muscular dy．8−−girdle muscular dystrophy followlnglink−

trophy of variable severity．Nat GenetlD：1．≡age analysis with15q probesin

BraZ；ilianfamilies．J Med Genet30：385−387，1993．

243−245，1995．
18）Passos−BuenoMR，Moreira ES，VainヱOf M，

et al：A common missense mutationin the10）AzibiX，Bachner L，BeckmannJS，et al：
Severechildhoodautosomal

recessive

adhalin genemuscu＿

lar dystrophy with the deficiency of the50

familiesinthree unrelated Bra2；ilian

with a relatively mild form of

kDa dystro−Phin−aSSOCiated glycoprotein

autosomal recessivelimb−girdle muscularmaps to chromosome13q12．Hum MoI Genet

dystrophy．Hum MoI Genet

2：1423−1428，1993．

1995．

4：1163−1167，

11）ZatzM，MatsumuraK，Vainzof M，etal：

19）Chomczynski P and Sacchi N：Single−Step

Assessment of the50−kDa dystrophin−aSSOCi−

method of RNAisolation by acid guani−

ated glycoproteinin Braヱilian patients with

dinium thiocyanate−Phenol−Chloroform ex−

seYereChildhoodautosomal

recessive

traction．AnalBiochem162：156−159，1987．

muscu＿

lar dystrophy．J NcuroI Sci123：122−128，20）Frohman MA，Dush MK and MartinGR：

1994．

Rapid production offulト1ength cDNAs from

12）Romero NB，Tom色FMS，Leturcq F，etrare transcripts：amPlification uslng a Sin−al：Genetic heterogeneity of severe child−gle genespecific oligonucIcotide prlmer．Proc

hood autosomal recessive muscular dystro−

NatlAcad SciUSA85：8998−9002，1988．

Phywith adhalin（50kI）a dystrophin−aSSOCi−21）Ⅹaufman I）L and EYanS GA：Restriction

ated glycoprotein）deficiency．C R Acad Sci

endonuclease cleavage at the termini ofParis317：70−76，1994．

PCR products．Biotechniques

9：304−306，13）Sewry CA，Sansome A，Matsumura K，etal：Defficiency of the50kDa dystrophin−aS−22）SangerF，Nickl占nsandCoulsonAR‥DNA

SOCiated glycoprotein and almormal expres−SequenClngwith chain−terminatinginhibitors．

Sion of utrophinin two south asian cousins

Proc Natl Acad Sci USA

With variable expression of severe childhood

1977．

autosomal recessive muscular dystrophy．

Neuromusc Disord4：121−129，1994．

74：5463−5467，

23）Smith LM，SandersJZ，Kaiser RJ，et al：
Fluorcscence detectionin automated DNA

14）Roberds SL，Leturcq F，Allamand V，et

SequenCe analysis．Nature321：674−679，1986．

al：Missense mutationsin the adhalin gene24）GrossTBellard M，Oudet P and Chambon

linked to autosomalrecessive muscular dy8−

P：Isolation

trophy．Cel178：625−633，1994．
15）HiguchiI，Yamada H，Fukunaga H，etal：Abnormal

expression

oflamininofhigh一mOlecular−Weightfrom mammalian cells．EurJ Biochem

sug一

DNA

36：

32−38，1973．

25）Ljunggren A，Duggan D．McNally E，etgests disturbance of sarcolemma−

al：Primary adhalin deficiency as a cause

extracellular matriⅩinteractioninJapanese

Ofmuscular dystrophyin patients with nor−

Patients with autosomal recessive muscularmal dystrophin．Ann Neuro138：367−372，

dystrophy deficientinadhalin．J ClinInvest
糾：601−606，1994．
16）HayaShi YX，Mizuno Y，Yoshida M，etal：The frequency of patients with 50−kd
dystrophin−aSSOCiated glyco−PrOtein（50DAG

1995．
26）KyteJ

and二Doolittle

RF：A

simplemethodfor displaying the hydrophobic character ofa protein．J MoIBio1157：105−132，1982．
27）Ben Othmane X，Ben Hamida M，Pericak−−152−

VanCe MA，et al：Linknge of Tunisian

1imb一girdle

musculardyStrOphylinked

to

4q12．Nature Genetll：257−265，1995．

autosomal recessive Duchenne−like muscular
dystrophy to the pericentromeric reglOn Of

31）Bonnemann CG，Modi R，Noguchi S，et

Chromosome13q．Nature Genet2：315−317，

al：β−SarCOglycan（A3b）mutations cause

1992．

auto−SOmal recessive muscular dystrophy28）McNally EM，Yoshida M，Mi2：unO Y，etwithloss of the sarcoglycan complex．Na−
ture Genetll：266−273，1995．

al：Human adhalinis alternatively spliced
and the geneislocated on chromosome
17q21．Proc Natl Acad Sci USA32）Noguchi S，McNally EM，Otlmane KB，Ct

91：9690−

al：Mutationsin the dystrophin−aSSOCiated9694，1994．

PrOtein

29）松村喜一郎：Adhalin（50kDa dystrophin−aSSO−

muscular dystrophy．Science

Ciated glycoprotein）欠損とSevere childhood
autosomal recessive muscular dystrophy（SCARMD）．

Annual Review神経1995（後

藤文男ほか・樹）中外医学社，東京，1995，pp13−20．

30）Lim LE，Duclos F，Broux O，Ct al：β−7−1aCrOglycanin chromosome13
270：819−822，

1995．

33）川井尚臣，赤池雅史，遠藤式後ほか：悪性肢苛型
筋ジストロフィー患者のadhalin遺伝子の解析．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ
フィー及び類縁疾患の病態と治療法に関する研究
平成6年度研究班会議抄録（演題番号10）．1994．

SaCrOglycan：Characteri2：ation and rolein−153−40）Adhalin欠損悪性肢帯型筋ジストロフィーの心所見
一臨床像と剖検所見について
＊

臣

尚

井

■ ■ ■ ′

＊

子子

柚

節典

木川

柏香

紆ピ

武克

藤立

＊

遠足

＊
榊

一

史誠夫

雅

池重澤

赤国槍

研究協力者

は じめ にWa．家系 症例1

Ta．家系 症例2

Ⅰヨ二二VにⅠ−、Vl」一

Adhalinは骨格筋と同様に心筋においてもdystro−
phinと複合体を形成し，細胞膜の安定化の役割を担っていると考えられる1）2）．Duchenne／Becker型筋

一一＿：．L＿Lu

ジストロフィーでは，dystrophinの欠損ないし異常により拡張型心筋症に類似した心病変をきたすことが知

＿＿＿

Ⅲ室

られているが）4），adhalin欠損筋ジストロフィー5）6）の心病変についてはこれまでまとまった報告はない．
本研究では目敏および文献例のadhalin欠損筋ジス

・−一一一−二Ⅲ十斗．

＿lL一二■．

Ⅲ−V㌧ト

トロフィーの心病変を臨床的に検討し，さらに1例の
剖検例については病理学的に検討した．

〟l￣一「−V一」一4

対象および方法
対象はadhalin遺伝子の異常が確認されたadhalin

几一十一一・・・・・・・・V5− 」

欠損筋ジストロフィー症例で，日放の3家系4症例（図1）と文献例の13家系21例（男性8例，女性13例，年齢

V億 爪心V・｝貴

7〜36歳）である7）〜10）

日放例はいずれも小児期（3−8歳）に発症し，歩行障書や四肢体幹の筋力低下が主症状である．両親は近親婚である．骨格筋にはadhalinの完全欠損があり，どの症例にもadhalin遺伝子の異常が認められた（義1）．
症例2は呼吸不全で死亡し（57歳）剖検を行った．心機能検査としては，心電図でQ汝および高電位R汝の有無を調べ，また，心機図により駆出前期／駆出時間
PEP／ET）を算出し，さらに心エコー図により左宝拡
張末期径，短縮率を計測した．症例3については201タ
リウム心筋SPECTを行った．症例2については剖検心の検討も行った．対照としてDuchenne型筋ジストロ
フィー44例（年齢12〜31歳）の心機能を調べた．

＊徳島大学医学部第一内科＊＊国立捷葺所徳島病民内科＊＊＊徳島大学医療技術短期大学部＊＊＊＊四国中央病院

図1心電図．症例1ではaVL誘導に小さなQS汝がみられる．症例2ではVl誘導に高電位R汝が認められⅠ，aVL誘導には小さなq波がみられる．
結
果
1．日験例
心電図：症例1ではaVL誘導にQS汝，症例2ではⅠとaVL誘導にQ波とVl誘導に高電位R汝，症例3にはaVL誘導にQ波が認められた（図1）．
心機図：PEP／ETはadhalin欠規悪性肢帯型では仝例で正常であったが，Duchenne塑（29例）では高値の例が多かった（5劫；）（図2）．
心エコ一国：Adhalin欠損悪性肢苛型では断層法で左宝壁の井薄化や内腔の拡大はなく，壁運動の低下もみられなかった．Mモード法ではadhalin欠壬艮悪性肢
帯型では左宝拡張末期径と左宝短縮率が全例で正常であったが，Duchenne型では左宝拡張末期径が増大した例がみられ（16％），左宝駆出率は低値の例が多かっ−154−

表1日験例の臨床所見
W a．家 系
症例
年 齢 ・性23歳 ・女 性1

発 症 年齢3歳

Ta．家系
2
53歳 ・女 性5歳

B a．家系
3
3 1歳 ・女 性
5歳

r

8歳

J

†

J

家 系図

●

†
．
刀
d 〟 凸 ● †▲†一刀4
9歳 ・男性

●

メ

初 発症状

歩行 障 害四 肢 の筋 力低 下
歩行 時 よ く転 倒

駈 走遅 い， 転倒駈 走遅 い， 転倒

歩 行 不 能年齢

11歳

13 歳

16 歳

筋 萎縮

四 肢近 位 部 ，躯 幹

全 身性

排 腹 筋仮性 肥大

（
＋）

（
±）

（
＋）

（
＋）

血 清 CK値 （lU／
L）

6．550 （
11 歳）

400

680

8415 ＿

骨 格 筋 adha lin

完 全 欠損

完全 欠損

完全欠損

完 全欠 損Adh a lin遺 伝子

C229T

主 症状

四肢 ，体幹 の 筋 力低 下

歩 行 障害四肢 の 筋 力低下
下 肢 痛 ，歩 行障 害−
四 肢近 位 部 ，躯 幹 四 肢近 位 部 ，躯幹

A4 106，nt．408−409間 の 15 塩基 挿 入

C229T

雷．●：患者，ロ．0：保因者，メ：発端看，†：死亡／：遺伝子解析済み，血清CK活性値の正常値＜2∞川／L

PEP／ET

Adhalin欠損
（n＝4）

DMD

（n＝29）

左室拡張末期径

左室短縮率

Adha＝n欠損

AdhaHn欠損

（n＝4）

DMD

（n＝44）（n＝4）

DMD（n＝44）

図2心境能検査の成績．Duchenne塑（目敏）ではPEP／ETと左室拡張末期径が高値で左室短縮率が低値の例が多いが，自験のadhalin欠損悪性肢帯型ではこれらの借は正常範囲であった．網かけは正常値を示す．
PEP／ET：駆出前期／駆出時間，DMD：Duchenne型筋ジストロフィー．
●：Adhalin欠損悪性肢苛型，口：Duchenne型．
た（59％）．

Z AdhaHn欠損筋ジストロフィーの文献報告例

的1タリウム心筋SPECT：症例3のみ調べたが，側壁， 25例（含自験例）の心所見について検討したが，心不後下壁の濯流がわずかに低下していたが，あさらかな
全症状を示した例はなかった．心電図異常は3例（12％）
濯流欠損は検出されなかった．
にみられたが，いずれも自験例（3例）であった．
−155−

図3心筋組織像．症例2の剖検心であるが，心筋線経の大小不同，問質の線維化 脂肪浸潤などが認められる．
HE染色．45倍．

CARDlACMUSCLE

NormaIcontroI Presentcase

DMDpatient

Dystrophin〕trophin

Adhalinβ・dystroglycan

図4 心筋の免疫組織化学．症例2の心筋細胞にはadhalinはほぼ完全に欠規している．

−156−

3．剖検心所見（症例2）ていないadhalin欠損筋ジストロフィーで心不全の発心重量は360gとやや増加し，心室壁の外側には厚い脂肪屑が認められた．心筋層には肉眼的に左宝の後下壁にわずかに自色調の部分が認められた．同部位の心症例を報告している．Adhalin遺伝子異常が確認された症例の報告は少なく，今後さらに詳細に槙討すれば心機能異常のある例が見出される可能性は残っている．
以上述べたごとく本庄の心臓は基本的にはDuchenne／Becker型と同じ変化を示すため，臨床的には心症状が不顕性であっても心不全の発症に留意すべきであると考えられる．

筋組織のHematoxylin−Eosin（HE）染色像では心筋線経の大小不同，問質の線推化，心筋層内の脂肪浸潤などが認められた（図3）．また，心宝中隔，左室の前壁，
側壁，右宝にも軽度ではあるが同様の所見がみられた．
免疫組織化学ではdystrophin，β−dystroglycanの染色性はほぼ正常に認められたが，adhalinはほぼ完全に欠損していた（図4）．
考

謝 辞：本研究の症例4は徳島大学小児科学教室のご協力を絡ました．深謝いたします．
文察

Adhalin欠損筋ジストロフィーには，心不全で死亡する例が殆どないとされている．本研究では目敏例と文献例の心所見を示した．目敏例では心電図でVlの高電位R汝やⅠ，aVL誘導のQ汝が認められ，病変としては左重の後壁，下壁，側壁に心筋障書が存在する
ことが示唆された．これらの心電図変化はDuchenne
型／Becker型の症例ではしばしば認められるものであり4），また，剖検例（症例2）の左宝後下壁の心筋組織にみられた心筋線椎の大小不同，問質の線椎化などの所見もやはりDuchenne塑／Becker型の心筋組織所見とほぼ同じものである4）11）．剖検例については心筋に
adhalinの完全欠損を確認したことより，adhalin欠損筋ジストロフィーでは心筋細胞におけるadhalinの欠損により心筋細胞膜の異常をきたし，心筋の壊死・変性が生じると考えられる．
一般にDuchenne／Becker型では左室の後下壁ある
いは側壁が早期に変性をきたし，時間経過とともに変性領域が進展し末期には左室全休に及ぶとされている4）11）．Duchenne／Becker型で心病変の進行した例では左室内腔の拡大，左宝壁の井薄化と全周性の壁運動

献1）RoberdsSL，Anderson RD，et al：Primarystructure and muscle−SPeCific expression ofthe

50−kDa dystrophin−aSSOCiated glycopro−tein（Adhalin）．J BioIChem268：23739，1993．
2）CampbellKP：Three muscular dystrophies：
Loss of cytoskeleton−eXtraCellular matrix
linkage．Cel180‥675，1995．

3）Hunsaker RH，Fulkerson PK，et al：Car−diacfunctionin

Duchennesmusculardys−trophy：reSults oflO−year follow−up Studyand noninvasive tests．AmJ Med 73：235，
1982．

4）斎藤美穂，川井尚臣ほか：Becker型筋ジストロ
フィーにおける心不全の病態とその発生機序．臨
床神経学糾：134，1994．
5）川井尚臣，乾 俊夫ほか：悪性肢帯型筋ジストロ
フィー（三好）の骨格筋におけるadhalin（50kDa
dystrophin−aSSOCiated glycoprotein）の完全欠

祖．臨床神経学茄：184，1995．
6）Ⅹawai

H，Akaike M，et al：Adhalin geLle

mutationsin patientswith autosomal rpces−低下などの所見がみられ，いわゆる拡張型心筋症に類似した所見を呈する4）11）．しかし，adhalin欠損筋ジストロフィーでは日放例の検討で左宝拡張末期径が増

sive childhood onset muscular dystrophy

withadhalin

deficiency．J ClinInveSt96：

大した例はなく，PEP／ETおよび左宝短縮率はいずれも正常であり左宝収縮機能の低下はみられなかった．

7）RoberdsSL，Leturcq F，etal：MisseI・Se mu−

また，却1タリウム心筋SPECTでも滞流低下はごく軽度のものであった．自験例を含む文献例の検討でも心

autosomal recessive muscular dyt；trOphy．

電図変化を示す頻度も少なく，心不全を発症した例はなかった．すなわち，adhalin欠損筋ジストロフィーの心病変はDuchenne／Becker型に比べると臨床的には軽症といえる．本庄で臨床的に心障書が軽症である
理由としては，心筋には骨格筋のadhalinとは異なる
isofomが存在する可能性やadhalin欠税を代償する

1202，1995．

tation in the adhalin

gene linked toCe1178：625，1994．

8）Piccolo F，Roberds SL，et al：Prlmary
adhalinopathy：a COmmOn CauSe Of aut0−
80mal recessive muscular dystrophy ofvariableseverity．NatureGenetlO：243，1995．
9）Ljunggren A，Dug・gan D，et al：Primary機構の存在の可能性などがあげられる．しかし，Zatz
ら12）やPicc。1。ら8）はadhalinの遺伝子異常を確認し−157−

adhalin deficiency as a cause of muscular

dystrophyin patientswith normal dystro−Phin．Ann Neuro138：367，1995．

greSSive muscular dystrophy．An electro−

10）Passos Bueno MR，Moreira ES，et al：A
common missense mutationin the adhalin
gene

With

in

three

unrelated

Braヱilianfamilies

Cardiographic−Pathologic correlative study．

AmJ Med42：179，1967．
12）Zat2；M，Matsumura

a relatively mild form of autosomal

Of the二K，etal：Assessment

50−kDa dystrophin−aSSOCiated glyco−

recessivelimb−girdle muscular dystrophy．

PrOteinin Brazilian patients with severe

Hum Molec Genet4：1163，1995．

Childhood autosomalrecessive muscular dys−11）PerloffJK，Roberts WC，et al：The distinc−
tive electrocardiogram of Duchenne，s pro

ー158−

trophy．J NeuroISci123：122，1994．

41）正常骨格筋線経におけるadhalinの超微局在とdystrophin，
β−dystroglycan，β−SPeCtrinとの相互関係について
若

研究協力者

山

吉

弘＊

井

上

昌

彦＊

村

橋

白

見

隆

弘＊

小

嶋

は じ めにDystrophinassociated（glyco）proteinS（DAG又は
DAP）は156kDa，50kDa，43kDa，35kDa，25kDaの成分から成る複合体である1）．このうち50kDaの成分はadhalinと呼ばれ，筋細胞膜貫通蛋白である．この成分の異常は severe childhood autosomal rc−
cessive muscular dystrophy（SCARMD）の原因の1つと考えられ，細胞外部分ペプチド遺伝子の点変異など種々の原因で生ずるとされている．このように
adhalinの異常はヒト進行性筋萎縮症の原因にも成りうる重要な筋細胞膜成分であり，dystrophinや43kDa
DAGの1つの成分β−dystroglycanやβ−SpeCtrinとの関係を解析するため，我々はadhalinのcDNAより
そのcytoplasmicdomainに対する合成ペプチドを作
製，その筋細胞内における超微局在とdystrophin，βJystroglycan，β−SpeCtrinとの関係を金コロイド2
重標識免疫電顕法により検討する目的で本研究を
行った．
材料と方法
（1）合成ペプチドとその性状分析
ペプチドはRoberds SLらのウサギ骨格筋adhalinのC端アミノ酸（373−387）15残基を合成した2）．ハブテ
ンとしてthyroglobulinをつけ，ウサギと羊にて免疫し抗体を得，アフイニティー精製した．イムノプロッ
トは以前報告した方法4）に準じた．
正常マウス骨格筋の光顕レベルでの免疫蛍光抗体法
による標本は，6〝mの厚さの骨格筋のクリオスタッ
ト横断標本を間接蛍光抗体法により作製した．
（2日mmuno901dl8bo＝ng法による2重免疫電顕標本の作製についてmdxコントロールマウス大腿四頭筋を冷却した4％
パラフォルムアルデヒド0．1Mリン酸バッファー液で氷漬して1時間固定後，1次抗体を反応させるまでは既報4）に準じて行った．1次抗体として抗adhalin抗体＊昭和大学墓が丘病院神経内科＊＊昭和大学蔵が丘病院電顕圭

真書
宏

子＊

溢

谷

誠

二半

鬼

木

弘

明綿

単独又は異種動物で産生した抗adhalin抗体と抗dystrophin抗体（Dr．Byers，Dr．Kunkelより供与），
抗adhalin抗体と抗β−dystroglycan抗体，抗ad−halin抗体とβTSPeCtrin抗体の組合せの至適希釈1次
抗体液の混合液で細切骨格筋標本をcold roomで24時間反応させた．1次抗体の性状や濃度は文献3）に示す．
反応後，試料を冷却PBSでよく洗浄した．2次抗体は20倍希釈5nm金コロイド標識ロバ抗羊抗体，20倍希
釈10nm金コロイド標識ロバ抗羊抗体（いずれもBio
Cell社製），20倍希釈5nm金コロイド標識ヤギ抗ウサ
ギ抗体，20倍希釈10nm金コロイド標識ヤギ抗ウサギ
抗体（いずれもAmersham社製）のうち（i）adhalinの
単染色は5mm金粒子で標識した2次抗体を用い，2重染色では（ii）adhalinは5nm金粒子で標識し，もう1つの1次抗体を10mm金粒子で標識する．（iii）粒子サ
イズを逆転し，adhalinを10nm金粒子で標識し，もう1つの1次抗体を5mm金粒子で標識する組合せの標本を作製した．試料はこれらの2次抗体液の混合液とC。ld r。。mで24時間反応させた．また免疫対照標本
として1次抗体を作製したものと同じ動物の正常血清を作用させたものを作製した．以下既報4）に準じて国定包埋し電顕にて観察した．
侍）doub10t形成率の算定方法
adhalinとdystrophin，adhalinとβ−dystr0−
glycan，adhalinとβ一SPeCtrinのそれぞれの抗体組合
せにて2つのepitopeが30nm以内の距離で接近して存在するものをdoubletと定義し，3つの組合せにおける出現率を既報4）に準じて算出し統計的に有意差を検定
した3）．
結

果

（1）lmmunob10t及び光顕蛍光抗体染色所見
Immunoblotでは骨格筋の50kDaの成分を認識する
bandがウサギ，羊両抗休で認められ（図1），光顕蛍光
抗体染色標本では，骨格筋の周辺部に抗体の認識部位が認められた．
（2）lmmunogoldlabO＝ng法による2重免疫電顕榎本

−159−

表1

Double t Forma tion

血tih適y copbil仏tion

くgroup凸ean土SE）l

Adhalin and dystrophin

30・8±3・2（5−m■gOld）（10−nn gOld）「
pく0．05ldhalin andβ−dystr喝1ycan

2軋2 ± 3．2

−1（5−m日脚1d） （10−mn gOld）▲dhalin andβ−SpeCtrin

pf0．059．6±1．2」

19・6±0・8「（5−nn gOld） く10−nn gOld）

ldhalin and dyStrllphin（10−nn g。ld）（5−n gOld）▲dhalin andβ−dystruglycan（10−nn gOld）（5−nn gOld）

Adhalin and

図1A，BImmunoblot of adhalininnormal mus−Cle tissue．Immunostaining waS With

P〉0．1

25．8 ± 3．9→
p√0．018．5±1．0−」

β−SpeCtrin（10−nD gOld）（5−nt gOld）

rabbit antibody（lane A）and withsheep antibody（1ane B）．The adhalin
bandis observed at 50−kDa molecular＊Percentage ofdotJblets of5−np Particles Tith10TTl■Particles

lYeightinboth antibodieS．

Yithin30m■VerSUS a115−m＝阿rticles at theinner surfatニe tIf
8uSCle plas¶alemain three antibdy c皿bil迫tiuns shuTm

所見
抗adhalin抗体だけの免疫染色標本では抗体の存在を示す5nmの金粒子は骨格筋細胞膜の内側に細胞膜に随伴して認められた．また筋細胞膜に随伴するVeSicle
膜にもその筋形質側に抗体のsignalが認められた．しかし内部構造には有意なsignalは認められなかった．
次に抗adhalinと抗dy＄trOphin抗体，抗adhalinと抗βHdystroglycan抗体，抗adhalinと抗β−SpeCtrin
抗体との組合せの2重免疫染色標本では，それぞれの抗体の存在を示す5nmと10nmの金粒子はいずれも骨格筋黒肢鷺の内側で細胞膜に随伴して認められ（溺2A−D），また訪細胞膜内側に随伴したYeSicle膜にもその筋形質側に金粒子が認められた．興味ある所見として5nmと10nmの金粒子が30mm以下の距離で′doubletを形成する像が3組の抗体の組合せにつきいずれも認

dystrophin抗体b．抗adhalin一抗β−dystroglycan抗体 C．抗adhalin一抗β−SpeCtrin抗体のそれぞれにおいてdoublet形成率のgroup mean±SEはそれぞれ表1のようで，粒子サイズを逆転したものでもそれぞれ
嘉1のようになり，doublet形成率は8，bの組において有意に高率であった．
考嚢

正常骨格筋細胞膜貫通蛋白であるadhalinと，これにlinkしている細胞骨格や恕蒐外基質との関係を検討することは，adhalinの機能を追求する意味においても重要と考えられる．これらの関係は生化学的手法を用いてよく研究されているが，超微形態学的側面よりの研究は少ない．

められたが，抗adhalinと抗dystrophin抗体及び抗β−dystroglycan抗体との2つの組合せにおいて抗ad−halinと抗β−SpeCtrin抗体との組合せより高率に出現していた（図2B−D）．この所見は粒子サイズを逆転し今回の結果より，adhalinとdystrophin，adhalinと同じ膜質通蛋白であるβ−dystroglycanとは超微形
態的に近位置にこれらのepitopeが存在することが示された．しかしこれらの蛋白の間に直接的な何らかのた標本においても同様であった．尚，抗体を正常血清と置き換えて作製した免疫対照標本では金粒子の存在は認められなかった．

lhkがあるかどうかについてや，またない場合，どのような国子により近接関係にあるのかなどについては（3）doublOt形成率について

freeze etchreplicaの電顕的検索などにより今後更に検討を加えられる必要がある．

3種類の抗体の組合せ，すなわちa．抗adhalin一抗
ー160−

B

図2

Electron micrographs of（A）sheep anti−adhalin antibody，doubleimmunOStaining with（B）
Sheep anti−adhalin and rabbit anti−6−10−dystrophin antibodies，（C）rabbit anti−adhalin and sheepanti−β−dystroglycanantibodies，and（D）sheep anti−adhalin and rabbitanti−β−SpeCtrinantibod−
iesinnormalmurine myofibers．Both5−nmgOld particles（adhalin）andlOqnmgold parti−Cles
くわrstrophin，β−dystroglycanandβ−SpeCtrin）are presentat theinnersurface ofnormalmurine
myofibers．Particles

of

both

sizt！S

arefrequently（×128，000）¶161−

associated

with

each

otherin

Fig．B

and

C．

ま

と

め

StruCture and muscle−SPeCific expressiion of（1）抗adhalin抗体は正常骨格筋細胞膜の内側で細胞膜に随伴して認められた．
（2）抗adhalinと抗dystrophin抗体，抗adhalinと抗β−dystroglycan抗体は抗adhalinと抗β−SpeCtrin抗体に比し近接して存在する傾向がみられた．
（3）（2）の所見は統計的に確認された．

1）Alm

the

50−kDadystrophin一aSSOCiatcd

glycopro−tein（adhalin）．J BioIChem268：23739−23742，
1993．

3）wakayamaY，InoueM，etal：Ultrastructu−
rallocalization of adhalinin normal murine

Skeletalmyofiber．Ann Neurol（inpress）．
4）WaknyamaY，ShibuyaS，et al：Ultrastructu−

文
献AH and Xunkel LM：The structuraland functional diversity of dystrophin．Na−
ture Genet3：283−291，1993．
2）Roberds SL，Anderson RD，et al：Primary−162−

rallocalization of the CTterminus of the43−kd dystrophin−aSSOCiated glycoprotein

and

its relation to dystrophinin normal murine

Skeletal myofiber．AmJ Patho1146：189−
196，1995．

42）Adhalin欠損症の細胞接着分子に関する免疫組織化学的研究

研究協力者

樋

口

逸

納

光 弘＊

郎＊

中

川

正

法＊

新

山

尚

仁＊

福 永 秀 敏坤

我々はこれまでに本邦初のadhalin欠組症の2症例を報告し，本症の筋腰上においてadhalin（50kDa
dyStrOphin−a眉SOCiatedglycoprotein）の欠損と共に，
laminkL Bll）およびへパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）2）の発現異常がみられることを明らかにした．
今回我々はadhalin欠損症の新たな2症例を提示するとともに，さらに本庄の病態を明らかにするため，各種細胞接着分子に対する免疫組織化学的検索を施行
した．
対象と方法
対象としてadhalin欠損症4例，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）5例，Becker塑筋ジストロ

結果ジストロフィンの免疫染色は，DMDでは欠損していたが正常対照およびadhalin欠挽症ではよく保たれており，β−dystroglycanの免疫染色は，adhalin欠損症，DMDをはじめ検索したすべての症例で，COn−trolとほぼ同様に染色された．Adhalinの免疫染色は，
adhalin欠損症では著明に低下していたが，DMDではcontrolに比べ軽度低下していた（図1）．］NCAMの発現は検索したすべての疾患で正常対照に比べ，再生線経を中心に増加しており，疾患特異性は認められなかった（図2）．またICAM−1の筋膜上の発現は，各疾患とも稀であり疾患による違いは明らかではなかった．
CD44の免疫組織化学であるが，CD崩は正常筋の筋腰フィー（BMD）5例，福山塑先天性筋ジストロフィー（FCMD）3例および正常対照（control）3例の生検筋の凍結切片を用いた．免疫組織化学は，一次抗体として上にはほとんど発現していなかったが，DMD，BMD，FCMDでは筋腰上の発現が増加していた．一方
adhalin欠損症の4例においては全症例で筋腰上の発dystrophin，adhalin，β−dystroglycanのモノク

現が極めて少なく，血管や結合鰍このみ発現が増加していた（図3）．Adhalin欠損症の免疫組織化学的染色
結果のまとめを衷2に示す．筋膜上の発現に限定したものであるか，ラミニンBlは比較的若年で筋生検をした症例3を除いた3例で低下しており，HSPGとローナル抗体の他に，細胞接着分子に対する抗休としてneuralcell adhesion molecule（NCAM），inter−
Cellular adhesion molecule−1（ICAM−1），およびCD亜（HCAM）に対するモノクローナル抗体を使用し，ABC法にて染色した．
Adhalin欠損症の4例を嘉1に示すが，症例3と4か
新たに見出された症例である．発症年齢は4歳から10歳に分布し，仝例両親が血族結婚であり，知能は正常
でCXがやや上昇していた．症例3かこの中では最も
若年時に筋生検を受けていた．
表1Adhalin欠損症4例のまとめ
症例1

症例2

症例3

性別

男

男

女

女

発症年齢
筋生検時年齢

5歳
30歳

10歳
41歳

4歳
19歳

9歳
46歳
上腕二頭筋

生検筋

知能

血清CKト195）

症例4

前屈骨筋

か順筋

pI正筋

人工呼吸

手拍子

ヰ綺子

臥床

正常

正常

正常

正常

480

240

235
（十）

220
（十）

図1Adhalinの免疫組織化学的染色（＋）

adhalin欠損症の症例3（3）および症例4細では著明に低下しており，DMD（D）ではeontrol（C）に比べ軽度低下している．

＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊国立療養所甫九州病院−163−

CD崩はadhalin欠扱症の全症例において発現が極め′−て少なく，他の筋ジストロフィーとの違いが際だって
いた．

′l
ヽク

Jl一

喝

′−

●．′

二＼・・一

考

察

u

細胞接着分子は，筋細胞の分化 再生および神経再1秒−I支配等に関与すると考えられており，さらに炎症性筋疾患やDMDの病態に関与する可能性も指摘されている．今回の検索結果のうち最も注目すべき所見は，各

／′♂

、軋り

F、■ヽ

．華養

i

．

●ト￣

種筋ジストロフィーにおいては筋膜上のCD44の発現が増加しているにもかかわらず，adhalin欠祖症では発現が極めて微量であるという点である．
CD44は生体内に広範に分布する細胞接着分子であ

㌦
一
軒

tL■

●

ゝ譲歩 や．．匂
tt′

T

図2

C

NCAMの免疫組織化学的染色
NCAMの発現は検索したすべての疾患でeon−trolに比べ増加しており疾患特異性は認められない．ここにはadhalin欠担症の症例1（1）と症
例3（3），DMD（D）およびcontrol（C）を提示する・

り，リンパ球活性化や癌の転移との関連で注目されており，細胞外マトリックスの各種成分（hyaluronan，
fibronectin，laminin，COllagenI）との相互作用も報告されている．正常筋の筋腰上ではCD44の発現はほとんどみられないが，筋芽細胞や筋管細胞では強い発現が報告されている．また，keratinocyteのCD44は創傷治癒に関与すると報告されている．今回の検索結果は，adhalin欠組症においては他の筋ジストロ
フィーと異なる筋変成あるいは筋再生過程が存在する
ことを示唆するものと考えられる．
Adhalin欠祖症の自験4例の遺伝子学的検索は束だ
進行中であるが，HSPGやCD44の発現異常がすべてのadhalin欠損症において認められるのか，あるいは本症のある種の遺伝子異常に特徴的であるのか，今後検索する必要がある．
結論
1．NCAMおよびICAM−1の発現様式に関しては，疾国3 CD44の免疫組織化学的染色
CD崩は正常筋ではほとんど染色されないが，DMD，BMD，FCMDでは筋股上の発現が増加している．Adha．lin欠税症の4例にいおいては全症例で筋膜上の発現が極めて少なく，血管や結合掛このみ発現が増加している．Adhalin欠祖症の症例1（1），症例2（2），症例3（3），症例4（4）DMD（I））M，BMD（B），FCMD（F），正常対照（C）．

患特異性は認められなかった．
2．Adhalin欠規症では，DMD，BMDおよびFCMDに比べ筋膜上のHSPGおよびCD44の発現が極めて微量であった．
3．Adhalin欠扱症においては，他の筋ジストロ
フィーと異なる筋変成あるいは筋再生過程が存在する
可能性があると思われる．
参考文献
1）HiguchiI，Yamada H，FukunagalI，Iwaki
H，Okubo R，Nakagawa M，Osame M，

義2免疫組織化学所見のまとめ
Adhalin deFiciency DMD

Roberds SL．Shimizu T，Campbell KP and
Matsumura X：Abnormal expression of

8MD FCMD Control

症例1症例2 症例3 症例4
AdhaHn土

DystrOPhin

十

β−DG

十

土

十

十

十
土

土

十

十

Lam．81

土

HSPG

土

士

土

CD44

士

土

土

十
一

十

＋

土
土

土

＋

十

十

十

十

土

十

十

十

十

十＋

＋＋

十十

十十

十

十
十十

十十

laminin suggests disturbance of sarc0−
1emmaextracellular matrix interaction in

十Japanese patients with autosomal recessive

十十muscular dystrophy deficientin adhalin・J

土

ClinInvest糾：601−606，1994．
−164−2）HiguchhiI，Fukunaga H，Matsumura：K，Inose M，IzumiK，0knbo R，Nakagawa M，Shimizu Tand Osame M：Abnormalexpres−
Sion of heparan sulfate proteoglycan of ba−165−

Sallamina of muscle fibersin two tJapanesepatients

with adhalin

deficiency．Neur0−

musc Disord5：467−474，1995．

43）末梢神経におけるdystorophin関連・結合蛋白の機能・構造解析清 水 輝 夫＊

研究協力者

山

田

広

樹＊

松

村

喜一郎＊

現在までに5つの筋ジストロフィーが，dyStrOphin
糖蛋白複合体（DGC）を介する細胞外基質と筋細胞膜下

ける神経症状発症の分子機構を知るためには，神経系におけるDGCの発現様式および，存在するとすれば細胞骨格の架橋の破綻によって起こることが明らかに

lamininおよびagrinとの相互作用を知る必要がある．
そこで我々は，末梢神経を材料として，DGC構成要素

なっており，すべて重篤な筋症状を呈するが，その神経症状は疾患によって異なっている．これらの疾患はdystrophinの欠組によるデュシャンヌ塑筋ジストロ
フィー（DMD），adhalin（a−SarCOglycan），7−Sar−

coglycan，β−SareOglycanの欠損による3種の重症小児常染色体劣性筋ジストロフィー但CARMD），および1aminh−2欠現先天性筋ジストロフィーである．
このうちDMDでは軽度の中枢神経障害が存在するが，3種のSCARMDのうち少なくともadhalinおよびγ一
弘rCOglycanによるもの2種では神経症状は皆無である．またlaminin−2欠損先天性筋ジストロフィーおよ
びその動物モデルであるd）′／dy mOuSeでは末梢神経の髄鞘形成不全を来す1）〜3）．DGCを構成するdys−
trophin結合蛋白の一部やdystrophinのisoformは骨格筋以外の組掛こも発現しており4），この機能障害が上述の筋ジストロフィーの神経症状に関与していると推定される．一方，末梢神経Schwann細胞の髄鞘形
成には基底膜にlamininが存在することが必須であるとの事実が知られており5），この作用のSchwann細胞側のレセプターがdyStrOphin結合糖蛋白の一つで骨格筋でlamininと結合するa−dystroglycanである可能性が考えられる．
骨格筋a−dystroglycanは1aminin以外にagrinとも結合することが明らかになっている．Agrinはace−tylcholinereceptorを集簸させる活性を持ち，神経筋
接合部の形成に関与する細胞外基質糖蛋白として知られているが），多くのisoformを持ち6）〜8），その一つが末梢押掛こ存在している可能性が指摘されている9）．
Agrinが末梢神経に存在するとすれば筋ジストロ
フィーにおける末梢神経障書の病像を修飾している可能性，lamininと共に髄鞘形成に関与している可能性がある．
これらの事実を背景として，筋ジストロフィーにお＊帝京大学医学部神経内科

および1aminin，agrinの発現，a−dystroglycanとlamininおよびagrinの相互作用について検討した．
材料および方法
生化学的分析には主にウシ末梢神経を，免疫組織化学的分析には主にウサギ坐骨神経を用いた．末梢神経
dystroglycan複合休およびa−dystroglycanの単軌こは，ウシ末梢神経粗膜分画のそれぞれ1％digitonin
抽出物またはアルカリ抽出物からWGA−SepharoseおよびlamininーSepharoseによるaffinity chromatog−

raphyを連続して用いた．単離した末梢神経α−dys−troglycanと1amininおよびagrinとの結合を主に
blotoverlayの手法で検討した．
使用した抗体，レクチン，脱糖鎖酵素，その他の材料および方法，その他の実験の詳細については文献を参照10）〜12）
結果

末梢神掛こおけるdystrogIyc8n複合体の発現と機能
免疫染色，および末梢神経SDS抽出物の検討で末梢神経にはフルサイズのdystrophinは発現せず，
dystrophinのC末端相同産物の一つであるDpl16および常染色体佐相同産物であるutrophinが発現していること，末梢神経にはdystrophin結合蛋白のうちadhalinは発現せず，a−およびβ−dystroglycanが発現していること，末梢神経α−dystroglycanの分子量は筋型の156kDaとは異なり的120kDaであることが明らかになった（図示せず）．共焦点レーザー顕微鏡による光学的薄切像で見るとα−およびβ−dystroglycan，
18mininα2鎖，β1鎖は髄鞘最外層に沿って発現していた（図1）．すなわち髄翰最外層でα−およびβ−dystroglycanとlaminin72が共局在していた．これに対し，Dpl16およびutrophinはSchwann細胞質のマーカーであるS−100と同様の分布を示し，Schwann

−166−

■■

■■トー

224−1』i■●■｛■

崇

■−

−

●■

畿

」

｛■

−l』

−

縁］L

磯叫8t．。g■y叫

109−
72・−

46．・−

29■−

㌔㌔ご Fダ㌔㌔ ぎ㌔♂＋♂￣ j￣ 盲タダ

事

図2末梢神経α−dystroかycanの1aminin−2への結合・ウシ末梢神経粗膜分画のdigitonin抽出物をSDS−PAGE後，ニトロセルロース膜に転写し，lmM
CaC12および1mMMgC12存在下で，laminin−2を含む（＋Merosin），あるいは含まない（−
Merosin）溶液をオーバーレイした．Lは末梢神
経内在性の1amininである．Laminin−2の120kDa末梢神経α−dystroglycanへの結合は10mMEDTA（＋EDTA），またはEGTA（＋EGTA）
をオーバーレイ溶液に加えることにより完全に阻止された．10mMのEDTAに加えて20mMのCaC12の添加はhEDTA＆Ca）は結合を回復させたが，20mMのMgC12の添加は（＋EDTA＆Mg）は結合を回復させなかった・0・5M NaCl（＋NaCl），または1aminin−2に対し重量比1000倍のheparinの添加（＋Heparin）は結合を阻害した．左端に分子量マーカー（×10￣さDa）を示す．

図1ウサギ坐骨神経組織における，α−，β−dys−troglycan，laminin−2，Dpl16およびutrophinのcLSM画像．
ウサギ坐骨神経の凍結切片中にα−dyStrOglycan（DGl），β−dystroglycan（DG2），laminina2鎖（M），lamininal鎖仏），1amininβ1鎖（Bl），

Dpl16およびutrophin（UTR）を以下に述べる抗体を用いて検出し，CLSMにより観察した．用いた抗体はアフイニティー精製したdystrog・lycan
fusion protein Dに対するヒツジ抗体（FPD），
アフイニティー精製したβ−dystroglycanヒツジ
抗体，ヒトlaminina2鎖に対するモノクローナ
ル抗体5H2，ヒト1amininal鎖に対するモノク
ロ，ナル抗体11D5，ヒトIamininβ1鎖に対するモノクローナル抗体4E8，ⅤIA42およびDRPl
である．抗ウシS−100モノクローナル抗体（S−100）によってSchwann細胞を同定した，ヒト
lamininγ1鎖に対するモノクローナル抗体はウ
サギ組織と反応しなかったが，ヒトおよびウシ
末梢神経で，抗α2鎖，抗β1鎖と同じ部位を染色した（図示せず）．Bar，10′Jm．

細胞体細胞質に局在していると考えられた（図1）．ウ
シ末梢神経粗膜分画の1％digitonin抽出物に対し，
WGA−Shepharoseとlaminin，Sepharoseを連続して用いaffitty chromatographyを行うと，自身はlamininと結合しないβ一dystroglycanがa−dys−troglycanとco−purifyした．アルカリ抽出では末梢神経a−dystroglycanはpHllで容易に抽出されたのに対し，β−dystroglycanはpH12でも抽出されず沈殿に残った（図示せず）．このことはα−dystroglycanが膜表在任蛋白であり，β−dystroglycanが膜質通蛋
白であることを意味する．
仁一dystroglY68nは末梢神掛こおける主要なIaminin結合蛋白である
ウシ末梢神経粗膜分画から1％diかtoninによって蛋白を抽出，各種の条件下でlaminin−2をオーバーレイ
した（図2）．この分画中でlamininとの結合が確認で−167−

きたのはα−dysgroglycanのみであり，この結合はCa2＋依存性であり，高塩濃度またはheparinによって抑制された（図2）．

による光学顕微鏡観察でβ−dystroglyeanと共局在していた（図3）．単離した末梢神経α−dyStrOglycanを用い，末梢神経粗膜分画のアルカリ抽出液からα−末梢神経a−dystroglycanはJamininとagrinのduaIr8−
GOPtOrである

dyStrOglycan結合分画を単離すると，laminin−2と共にagrinがこの分画中に存在した（図示せず）．単離したα−dystroglyeanにlaminh−2およびニワトリ胚
recombk凪ntagrinをオーバーレイし結合能を検討した（図4）．Agrinはhmininー2と同様α−dyStrOglycanと結合し（図4），その結合はEDTAまたはEGTAに

Agrinに対する抗血清はウシ末梢神経組掛こおいて，
髄常長外層，Schwann細胞表面を染色し，二重染色
Dystroglycan
and Laminin

Dystroglycan
andAgrin

よって抑制された（図示せず）．適量のagrinをオー
バーレイ溶液に加えると，laminh−2との結合は抑制され（図4），適量のlaminin−2を加えるとagrinとの結合が阻害された（国机 また末梢神経α−dys−troglycanとagrinとの結合は，kmininとの結合同
Antf・
Anti−
Laminln AgrIn漂蓼ぶ倭転㌘慧迄1熱く¶〉、聖，菅▼ ち

図3 ウシ末梢神経におけるdystroglycanとlaminin，
dystroglyeanとagrinの二重染色
以下の方法で二重染色を行った．（a）dy8−
troglycan（DG）とlaminin（Lam）に関してはβ−dystroglyeanに対するモノクローナル抗体

0

50

5

5

5
0

5

Agrln（nM）

50

Lam仙n・2（nM）

図4末梢神経α−dySkoglycanに対するlaminh−2およびagrinの結合．

43DAG／8D5とmouse EHS sarcomalaminin

単離した末梢神経α−dystrglycanにヒト
Iaminin−2およびニワトリ胚recombinantに対するアフイニティー精製したウサギ抗体を用いて（左列），（b）dystroglycanとagrin仏G）
に関してはモノクローナル抗体43DAG／8D5とニagrinをオーバーレイした．第1列は5nMのlaminin−2を，第2列は5nMのlaminin一台とワトリ胚recombinantagrinに対するウサギ抗血清を用いた（右列）．マウス一次抗体は4列は5nMのagrinと50nMlaminin−2を加えた．
結合した1aminin−2およびagrinはそれぞれ
mouSe EHS sarcomalamininに対するアフイ

rhodamineを結合させた抗マウスIgGヒツジ抗体によって，ウサギ一次抗体はbiotinを結合させた抗ウサギIgGヒツジ抗体にFITC−StrePtO−
avidinを連続して使用し境出した．矢印は血管を示す．Bar，20〟m．

−168−

50nMのagrinも

第3列は5nMのagrhを，第ニティー精製したウサギ抗体（第1列および第2列）とニワトリ胚recombinantagrinに対するウサギ抗血清（第3列および第4列）を用いて検出した．左端に分子量マーカー（×10■3Da）を示す．

様n。uraminidase処理により消失した（図示せず）・このことは，末梢神経a−dystroglycan上の1amininおよびagrhとの結合部位が少なくとも部分的に重複している可能性を示唆する．
考察

結果のまとめを図5に示す．末梢神経Schwann細胞
外膜において，α−およびβ−dystroglycanが複合体を形成し，腰表在位蛋白であるα−dystroglycanを膜貫通蛋白であるβdystroglycanが細胞膜につないでいる構造が予想される．
本研究は末梢神経α−dystroglycanはlamhh／
agrinのdualrecptorであることを示した・既に述べたようにlaminin−2欠損先天性筋ジストロフィーおよびd〆dymOuSeでは末梢神経の髄鞘形成不全が存在するが，dγ〟ッmouseでは末梢神経近位部のみが障著され遠位部の髄鞘は保たれている13）・このことか
ら末梢神経遠位部では何らかの分子が1aminin−2の作用を代償していることが予想され，我々の結果からagrinはこのような分子の候補の一つであると考えられる．
末梢神経dystroglycan複合体の構成は，図5に示したように骨格筋とは異なっていると考えられ，Dpl16
やutrophinとの相互作用も確認できなかった・このことは，骨格筋が強大な機械的ストレスに絶えずさらされる臓器であるという違いに加えて，末梢神経dys−
troglycan複合体と骨格筋DGCの果たす機能の違いを反映している可能性がある．

図5結果 末梢神経dystroglycan複合体模式図・（8）および（b）α−dystroglycanおよびβ−dys−troglycan，Dpl16，utrOphinの局在の模式図k）神経内膜laminin−2およびagrinと末梢神経
dystroglyean複合休の相互作用の模式図a−およびβ−dystroglycanはSchwann細胞／髄鞘の最外層に存在したのに対し，Dpl16および
utrophinはSchwann細胞質および外層のsemicompactedmyelinの部分に存在した・
α一Dystroglycanは膜表在牲糖蛋白であり，膜貫通糖蛋白であるβ−dystroglycanと神経内膜基底層のlaminin−2およびagrinの間を結んでいる・
α一Dystroglycanはmu血型の糖鎖を持つと考えられ，この部分は棒状に引き伸ばされていると予想される．α−Dystroglycaは0型糖鎖に
cluster状のシァル酸残基を持ち，これがlaminin
α2鎖のG−domainと相互作用すると考えられる・
糖鎖部分は多価の結合能を持つ可能性があり，二分子以上のlaminin−2またはagrinと結合するのかもしれない．

最近，骨格筋β−dystroglycanが信号伝達のadapterproteinであるGrb−2と結合することが報告
され14），骨格筋DGCが単に筋細胞膜を構造的に支持しているのではなく，信号伝達の場になっている可能性が示された．今後，末梢神経でもdystroglycan複合体を介する信号伝達が髄鞘形成などの生理現象に関与しているとの仮説のもとに，dystroglycan複合体とDp116，utrOphinとの相互作用に加え・Grb−2や何らかのtyrosine phosphokinaseなど信号伝達に関与する因子との相互作用を検討する必要がある・

of the dystrophin−glycoprotein complex・
Science270：755−756，1995．

4）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM・文

献

Leveille GJ，et al：Primary structure of1）CampbellKP：Three muscular dystrophies：

dystrophin−aSSOCiated glycoproteinslinking

10ss of cytoskeleton−eXtraCellular matrix

dystrophintothe extracellular matrix・Na−

linkag・e．Ce1180：675−679，1995・

ture355：696−702，1992．

2）Ozawa

E，Yoshida

M，SuzukiA，et5）BungeMB，BungeRP，Rleitman N・et al：al‥

Dystrophin−aSSOCiated proteinsin muscular

Role of peripheral nerve extracellular ma−

dystrophy・IIum MoI Genet4：1711−1716・

trixinSchwanncellfunction andin neurite

1995．

regeneration・I）evNeuroscill：348−360・1989・

3）WortonR：Musculardystrophies：diseases−169一6）FallonJRandHallZW：Buildingsynapses：

inperipheralnerve・FEBSLett334：281−285，
1993．

agrln and dystroglycan stick together．

TrendsNeurosci17：469−473，1994．

11）Yamada H，Shimizu T，Tanaka T，et al：7）HochW，CampanelliJT and Scheller RH：I）ystroglycanisa binding proteinoflaminin

Agrin−inducedclusteringofacetylcholine re−
CePtOrS：A cytoskeletallink．J Cell Bioland merosinin pcripheral nerve．
Lett352：49−53，1994．

126：1−4，1994．

FEBS12）Yamada H，Chiba A，Endo T，et al：8）Gesemann M，DenzerAJand Ruegg MA：

Characteriationof dystroglycan−1amininin−

Acetylcholine receptor−aggregating activity

teractioninperipheralnerve・J Neurochem，Ofag・rlnisoformsandmapplngOf the active

1995（inpress）．

Site・JCellBiol128：625−636．1995．

13）Bradley WG andJenkison M：Abn。malities

9）Reist NE，Magill C and McMahan UJ：

Of peripheral nervesin murine muscular

Agrin−like molecules at synaptic sitesin
normal・denervated，and damaged skeletal

dystrophy・J NeuroISci18：227−247，1973．
14）YangB，JungD，Motto

D，etal：SH3d。●

muscles・J CellBiollO5：2457−2469，1987．

main−mediatedinteraction of dystroglycan10）Matsumura X，Yamada H，Shimizu T，etand Grb2・J BioI Chem 270：1171卜11714，al：I）ifferential expression of dystrophin，
utrophinand dystrophinーaSSOCiated proteins

−170−

1995．

44）dyマウス骨格筋細胞膜微細構造の解析−mdxマウスとの比較検討−
若 山 吉 弘事研究協力者

姓 谷 誠 二＊ 鬼 木 弘 明榊 江斎 藤 宗 雄榊 埜 中 征 哉榊＊

藤

智

生柵

は じ め にウス群60枚，合計120枚ずつ，さらにmdxマウスにつ細胞外マトリックス成分であるラミニンM鎖の欠損によっても筋ジストロフィー変化が引き起こされることが最近判明している1）2）．

いても同様に，各々の電顕写真を抽出しC∝leL，混ぜ合わせ，Single blind法により，intramembranous

本研究では，このラミニンM鎖が特異的に欠損しているdyマウス骨格筋3）を用いて，Freez。−F，aCt。re法
により詳細な筋細胞膜微細構造を解析し，すでに報告したmdxマウスの筋細胞膜微細構築異常4）5）と比較検討した．

Particle（IMP）密度，Orthogonal array（OA）密度，OAを構成するorthogonalarray subunit particleのASP）密度を算定し，decoding後，各日齢毎のdy
マウス群およびcontrol群について統計学的に比較検討した．同様に，dyマウスとmdxマウスも比較検討した．

材料および方法

結材料‥凍結受精卵を仮薫別こ移植して得られた，すべて発症群であるが，まだ筋力低下を認めない生後78，14日の幼君マウスおよび後肢ひきずりが明らかになる
生後28日のdyマウス（C571】U釘dy克y），さらにそのeontrolマウス忙57】〕L／餌）各々6匹ずつの前脛骨筋および長址伸筋を用いた．またdyマウスとの比較検討のため，同じ日齢のmdxマウス（C57BL／10ScSn−mdx）およびそのcontrolマウス忙57BL／10 ScSn）
各々6匹ずつの同部位の骨格筋も用いた．
FrOeZO−Fracture法：それぞれのマウスから掃出した
筋標本を，直ちに2．5％グルタールアルデヒドリン酸
緩衝液で固定匝℃2h）し，小さなブロックに細切し，10％〜30％グリセリン溶液で浸軟した後，Eiko FD
I仏にて標本を剖断ト120℃，2．5−4×10￣7Torr）した．
さらに1％コロジオン液を滴下後，市販の次亜塩素酸
Na液で余分な組轍を消化し，数回蒸留水で洗浄した．
作製した筋細胞膜のレプリカ膜を電顕用鋼メッシュですくい，酢酸イソアミルでコロジオン液を除去した後，レプリカ膜を電顕にて観察した．筋細胞膜電顕写真は，最終倍率16万倍で，各々の標本につき最低10本の筋線維（5P面および5E面）について無作為に撮影した．
各日齢ごとにdyマウス群60枚およびそのC。ntr。1マ＊昭和大学藤が丘病院神経内科＊＊昭和大学藤が丘病院電顆宝＊＊＊実験動物中央研究所＊＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所

果：MP密度（蓑1）：各日齢別のcontrolマウスおよびdyマ
ウスにおけるIMP密度は，OASPを含まないP面の密度，OASPを含むP両の密度，E面の密度それぞれにおいて，いずれの日齢のdyマウスもcontrolマウスと比較して，統計的に有意差を認めなかった（p＞0．1by
two−tailed t−teSt）．

OA密度（蓑2）：各日齢における1〝m2あたりのgroupmediandensityと25％〜75％のmidrange（括弧内）は，
生後7日，14日，28日のcontrolマウスにおいて，それぞれ，5．4（2．7〜10．2），7．5（4．3〜9．7），5．3（1．7〜8・6）であった・一方dyマウスでは3．0（1．6〜7．5），
4・3（2・7−8・6），0・5（0〜2．7）であり，生後7日のdyマ
ウスでは，まだcontェ・01マウスに対して統計的に有意差を認めないがb＞0．1by Wilcoxon rank−Sumtest），生後14日では有意にcontrolマウスより減少しており（p＜0．01），さらに生後28日では，OA密度の絶対値そのものも顕著に減少し，COntrOlマウスより統計的に有意に減少していた（p＜0．01）．
OASP密度（表3）：生後7日，14日，28日のcontrolマ
ウスにおいて，そのgroupmcandensity±SEは11．3±0・3，13．8±0．5，15．1±0．9で，dyマウスでは11．6±0・2，12・0±0・7，12・0±0．6であり，生後朗日のdy
マウスのOASP密度は減少していたが（p＜0．01by
two−taild t−teSt），それより幼若な生後7日，14日のdyマウスではcontrolマウスと統計的に有意差を認めなかった（p＞0．1）．

−171−表1Groupmeanintramembranousparticledensity／FLm2inmuscleplasmamembrancsfromcontrol
anddymiceat7，14and28daysafterbirth
厄e Control
P face−P faceb E face7

1522士107・1693土85‥

141755土153，1951±125‥28

1853土213●

P

face■

P

faceb

E

race

847土62日1505±82●1665土63●●

810土39…

860±80日1632土150●1704土164日

852±43日

2027±203・・956±155…1683土202●1744土216日

833±83…

P．protopla印ic
E．extracellular
a．Tithout orthogonal array Subunit particles
b．Tith orthogonal array subtJnit particles

The figureslisted are group bean density±standard errorof theJLean
暮p〉0．1，書事p〉0．1．書＊■p〉0．1‡p〉0．1．‡‡p〉0．1，封書p〉0．1≠p〉0．1．H p〉0．1，IH p〉0．l
P Yalues Tere Calculated by tTO−tailed t−teSt

表2

表3

Groupmediandensity oforthogonalarrays

Subunitparticlenumber perorthogonalar−and their pits／LLm2in muscle plasmaraymembranes from controland dy mice at7，

controland dy mice at7，14and28days

inmuscle plasma mcmbrancs from

14and28days after birth

after birth
Controt

lediam lidr抑ge（25‡−751）

Age

dy

（days）

7

14

Contro1

5．4

dy

3．0

：：：二1：：；十Contro1

7．5

4．3−9．7dy

4．3

2．7−8，6Contro1

5．3

1．7−8，611．3±0．3●

11．6±0．2●

13．8±0．5●●

12．0土0．7‥15．1±0．9■＝

12．0±0．6‥●

The figureslistedarethegrouplean±standard
error of the tean28

dy O．5

0−2．7

書

p〉0．1

＊＊

p〉0．1

手書事

pく0．05

P Yalues Tere Calculated by tTO−tailed t−teSt
＊

p〉0．1

＊＊

pく0．01＊手書

pく0．0l表4Groupmediandensity oforthogonal arrays
andtheirpits／FLm2inmuscleplasma mem−

P Yalues Tere Calculated by Tilcoxon rank−Sul teStbranes from mdx and dy mice at28days

mdxマウスとの比較（表4，回）：生後7日，14日，28
日のmdxマウスの筋細胞膜微細構造変化は，以前報告した結果4）と同様であり，P面におけるIMP密度の減少，OA密度の減少，OASP密度の減少であったが，dyマウスの主要な変化は生後2退頃よりみられるOA
密度の著明な減少であった．従って，生後28日のmdxマウスとdyマウスにおけるOA密度を比較するにあたって，それぞれのcontrolマウス同士の密度を
一172−

after birth
鮎dian lidrange（25％−75％）

n血
dy

＊

2．2
O・5

0．5−3．80−2・7

pく0．05

P Yalue YaS Calculatcd by Tilcoxon rank−SuJL teSt

詞

Highmagnification electron micrographs of rrceze，fracture prepaI・ationsillustrating densities oforthogonalarrays（arrows）on the protoplasmicfacein muscle plasma membranesin（A）mdx
controlmouse，（B）mdx mouse，（C）dy controlmouse and（D）dy mouse at28days after birth．
Decrcased densities are apparentin mdx and dy mouse muscle plasma membrancs．Orthogonalarray densityis more decreasedin muscle plasma membrane from dy mouse thanin mdx
mouse．×144，000．

最初に比較した・mdxのcontrolマウスでは，1〃m2あたりのgroup median density値と25％〜75％のmidrange（括弧内）が，6．3（0．8〜12．4）であり，同じ
日齢のdyのcontrolマウスと統計的に有意差はみられず（p＞0・l by Wilcoxon rank−Sum teSt），従って，生後28日のmdxマウスとdyマウスのOA密度を単純に統計的に検定した．その結果，生後28日のmdxマウスのOA密度は，2．2（0．5〜3．8）であり，筋力低下が著明になる同じ日齢のdyマウスのOA密度はm血マ
ウスより有意に減少していた（p＜0．05）．
考

ホモを得るため，凍結受精卵を仮親に移植して，すべて発症群の生後早期からのdyマウスを得た上で，Freeze−Fracture法による筋細胞膜微細構造の解析に供した．
木研究より，生後7日から28日のmdxマウスの筋細胞膜微細構造変化は，P面におけるIMP密度の減少，
OA密度の減少，OASP密度の減少であり，以前の報告と同様であったが，dyマウスにおける筋細胞膜微細構造の主要な変化は，まだ筋症状をみない生後14日頃
からみられるOA密度の減少であり，後肢ひきずりが顕著となる生後28日のdyマウスでは，筋症状の軽いmdxマウスのものより強い変化といえた．OAの生化

察

常染色体劣性遺伝形式にて発症するdyマウスは，
ヒト筋ジストロフィー症モデル動物として古くより知られている．dyマウスは生後2〜3週頃になると後肢ひきずりが出現し，生後4過以降には筋力低下とるい

学的特牡，機能については依然として不明であるが，正常マウスやヒトでは成長過程にある若いマウスやヒトの方に多く認められ6），一方，筋ジストロフィー症の障害の強さとも相関することを我々は紬告していそうが著明になる．予後は不良であり，通常の交配では確実にホモを得ることが難しい．本研究では確実にる7）．oAがtypeⅡ筋線掛こ多く認められることから8），
この筋線経の特性である瞬発力などに関係した機能とー173−

併せて，よりlリ滑な筋細胞膜内外の物質輸送やエネル
ギー変換践阻 また筋収縮から細胞膜そのものを保護する役割などに関係している可能性も考えられる．
最近，dyマウス骨格筋においてラミニンM鎖が特異的に欠航していることが判明し，筋ジストロフィー
変化が細胞外マトリックスの異常によっても引き起こされることが報告されている1）〜3）．dyマウス筋細胞膜のOAの減少は二次的な変化と考えられるが，基底股成分と何らかの関係があるものと思われ，今後さらに検討の必要がある．

文献1）TomeFMS．etal：CRAcad SciParis［Ⅲ］317：351−357，1994．
2）HilaireD，etal：HumMoI

Genet3：1657￣

1661，1994．

3）Arahata K，et al：ProJapan Acad6gB：259−264，1993．

4）Shibuya S．et al：Acta Neuropatho176：179−184，1988．

5）Shibuya S，et al：NeuropathoI Appl Ncur0−
biol17：335−344，1991．

まと6）WakayamaY，etal：J NeuroI Sci91：191−

め1）dyマウス筋細胞朕微細構造変化は，生後14日頃の無症状期からみられるOA密皮の減少といえた．
2）後肢ひきずりのみられる生後28日のdyマウスの
OA窟庇は，同じ日齢のmdxマウスと比較して，その減少堤皮はより顕著といえた．

205，1989．

7）Shibuya S，et al：NcuropathoI AppI Ncuro−
bio120：487−494，1994．

8）Ellisman MH，et al：J Ccll Bio163：752−−174−

774，1976．

トコンドリア脳筋症

45）ミトコンドリア脳筋症各病型の筋病理所見と変異mtDNAの比較検討
内

研究協力者

箕

田

修

野

治＊

誠＊

徳

永

誠＊

安

藤

正

幸綿

は じ めにSDH活性がどのように変化するかを検討した．

我々はミトコンドリア（mt）脳筋症の原因である
mtDNA変異とその主要な筋病理学的特故である

結果

各病型の筋病理学的特赦であるCCO活性欠損とragged−red fibers（RRF），およびcytochrome coxidase（CCO）活性欠損線経との関係を明らかにして，
mt脳筋症の病態解明を行うことを目標に研究を進め

SDH活性増加（活性が著明に増加した筋線経をRRFとする）の関連を明らかにするために，各病型患者筋ている．CPEO，MELAS，MERRF患者筋において各病型間の筋病理は微妙に異なっており，RRFにおいてCPEO，MERRFではほとんどCCO活性は欠損の個々の筋線経のCCO活性とSDH活性をfiber type
別に検討した（図1）．typeHibersにおいてはCCO活
性低下に伴いSDH活性が増加してRRFへ移行するとしているのに対し，MEIJASではCCO活性を有する
筋線経が多い．また，筋線経を縦断面で見るとCCO
活性はいずれもsegmentalな欠損であるが，その境界
面はCPEOでは鮮明であり，MELASおよびMERRF

考えられたが，MELASではSDH活性が増加してもCCO活性がほとんど低下しない筋線維忙CO活性陽性

では不鮮明である1）．これまで，我々は，これら3病型患者筋において個々の筋線経のCCO活性およびsuccusinatedehydrogenase（SDH）活性と，tOtal（正常および変異）mtDNA量，さらにそこに占める変異
mtDNAの割合の関係を報告してきた2）〜5）
今回はこれら3病型の筋病理所見の相違と変異
mtDNAの関係をRRFとnon−RRFとの移行部位に着目して比較検討した．

RRF）も認めた．しかしながら，typeⅡfibersはもともとCCO活性が低いため，本法による検討でははっきりした相関は認めなかった．
lns血hybridization法を用いた検討では，いずれの病型においてもRRFでtotalmtI）NA量は著明に増加しており，SDH活性とtotalmtDNA量とはよく相関していた．ln shLBhybridization法あるいはsingle
fiberPCR法を用いて，個々の筋線経における正常と変異mtDNAの割合を検討すると，RRFで高率に変異対象および方法
対象はCPEO，MELAS，MERRF患者より得られた生検筋各3症例である．各連続筋切片をCCO染色，
SDII染色を行い，写真投影後，Desk scanⅡおよびNIHimageを用いて個々の筋線経における染色性を定量化した．個々の筋線経におけるtobl mtDNAを●

insituhybridization法を用いて組織切片上で検出した．個々の筋線経における変異mtDNAの割合を検討するため，CPEOでは欠失部位のmtDNAをプローブとしてin siluhybridizationにより正常mtDNAを検出してtotalmtDNAから差し引き，また，MELAS
およびMERRFではsinglefiberPCR法を用いた2）−5）．
各病型患者の生検筋を20〝mごとに連続切片を作成してSDH染色を行い，200〝m間に個々の筋線経の＊熊本大学医学部神経内科＊＊熊本大学医学郵第一内科

■■

SDH

t■

■●

−

■■

SDH

Otype・Jnon−RRF●typo・JRRF＋type・llnon・RRF＋typ〇・llRRF

図1個々の筋線経におけるCCO活性とSDH活性の関係連続筋切片をCCO染色，SDH染色を行い写真
投影後，Desk scanⅡ およびNIHimageを用いて，個々の筋線経における染色性を定量化した．
また，fiber typcを区別するため，ATPase染色を行った．本例はMERRF患者症例を示す．縦軸にCCO活性，横軸にSDH活性を示し，数字は活性の強さを表す．

−177−

表1各病型患者の筋線維200〟m間におけるRRFとnon−RRF間の移行筋線雑の頻度．
各病型患者1症例ごとに500本の筋線経を検討した．ここでは各病型1症例の結果を示す．
C PE OM E R R F

M E LA S

R ＜…＞ N o n

42

27

36

R ＜H ＞ ln t

22

24

15

ln t く−ウ N on

43

27

21

R く一
一
＞R

113

93

50

ln t ＜−−＞ In t39

19

8

N o n く一一
＞N o

241

3 10

37 0

合計

5 00

5 00

50 0

R：RRF．hl：中間乳Non：non・RRF
R＜一一＞Nonの占める割合
CPE08．4％．MELAS5．4％．MERRF7．2％

RRFでのCCO活性
CCO漠色■■丘￣．1■FSDH泣邑
駁敲面の竣界だ′

図2個々の筋線維200〝m間におけるSDH活性変化
各病型患者筋の連続切片を20JJmごとに作成して，200〟m離れた部位でのSDH活性を比較し，
RRFとnon−RRF間の移行が見られた筋線経の頻度を検討した．
本例はCPEO患者症例を示す．0はRRFとnon−RRF間の移行がみられた筋線経．
mtDNAを認めた．

RRFiI界缶での正常及び蛮貿mtDNAの分布

CPE0

MELAS

MERRF

トト｝

Typel RRF：藩性
TypellRRF：陰性

ト｛−】

日

諸宗

蒜留
l

■

■
S亡H亡．

、◆一】

SDH■＝′

呵SコHr±l

！・一：

圏■
W・R肝

ト）l●−

不鮮明

不鮮明

∴一二二三一

l

一

■

CCOト】
鮮明

RTF

匿濾■
T愴n

RRF

RRF

●変異mtDNA ＿ 正常mtDNA
RRFでの全m旧NAl
RRFでの正常¶心NAl
RRFでの変異mlDNAt

図3

蔓糧
減少
等櫓

書増

書糟

やや加］

やや舶D

看増

警欄

3病型における筋病理学的特徴と変異mtDNAの関係．

られ，正常なCCO活性を有する線維→CCO活性が低下した線維→CCO活性を欠税したnon−RRF→CCO活

これらの3病型では，SDH活性がtotal mtDNA量を反映していることが明らかになったので，RRIrとnon−RRFの移行部のSDH活性を観察することで，移行部における変異mtDNAの分布を推測した．各病型性を欠損したRRFへと進行する可能性が示唆された．
MELASにおけるCCO活性陽性RRFがCCO活性を欠の患者筋において200LLmの間隔でRRFからnon，
RRFへ，あるいはnon−RRFからRRFへと変化した・
筋線経は各々5−10％に認められた（図2，表1）．そして，移行のパターンを検討したところ，CPEOでは急な移行が見られる筋線錐が多かったが，MELASおよびMERRFでは比較的徐々に移行が見られる筋線経が多かった．

増加しており，その中に占める変異mtDNAの割合が非常に高率であったことから，著明に増加したtotal
mtDNAの多くは変異mtDNA由来と考えられる．ま考察

国3はこれまでの我々の結果をもとに3病型における変異mtDNAと筋病理学的特徴の関係についてまとめたものである．
3病型の個々の筋線経におけるCCO活性とSDH活性の間には，特にtypeIfibersにおいて逆相関が認め

祝したRRFから形成されるのか，CCO活性が残った
ままRRFになるのか今後の検討が必要である．
3病型ともRRFにおいてtotalmtDNA量が著明にた，筋組織切片上で，個々の筋線経におけるtotal
mtDNA量とSDH染色性とはほぼ一致していたので，
SDH染色性の強弱で変異mtDNA量の多少を推察できることが明らかになった．
この知見を利用して，nOn−RRFからRRFへの移行を検討したが，CPEOでは変異mtI）NAが比較的明瞭な境界をもってSegmentalに増加する筋線経が多い傾向にあり，MELASおよびMERRFでは変異mtDNAが徐々に増加する筋線経が多い傾向にあった．これは，−178−

先にMatSuOkaら1）によって報告されたMERRF，
CPEO患者筋の縦断面におけるCCO活性欠損の境界部位の研究と異なった側面から検討したものであり，変異mtDNAとの関係が明らかになった．ただ，CPEO
でも変異mtDNAが徐々に増加する筋線経，MELAS
およびMERRFでも変異mtDNAが急に増加する筋線経が観察されることから，さらに検討が必要と思われる．

3）TokunagaM，Mita S，Sakuta R，et al：In−
creased mitochondrial DNAin blood vessels
and ragged−red fibers

inmitochondrial

myopathy，enCephalopathy，lactic acidosis，and stroke−like episodes（MELAS）．Ann
Neuro133：275−280，1993．
4）TokunagaM，Mita S，Murakami T，et al：Single muscle fiber analysiS Of mitochon−

drial myopathy，enCePhalopathy，lactic aci−

文献1）Matsuoka T，Goto Y，Yoneda M，et al：

dosis and stroke−like episodes（MELAS）．
Ann Neuro135：413−419，1994．

Muscle histochemistryln myOClonus epilepsy
with ragged−red fibers（MERRF）．J NeuroI
Scil【裕：193−198，1991．
2）Mita S，Schmidt B，Schon EA，et al：De−5）Mita S，Tokunaga M，KumamotoT，et al：
Mitochondrial DNA mutation and muscle

tectionofdeletedmitochondrial

genomesin cytochromec oxidasepdeficient muscle fi−
bers of a patient with Xearns−Sayre syn，drome．Proc Natl Acad Sci USA86：9509−
9513，1989．

−179−

pathology in mitochondrial myopathy，

encephalopathy，lactic acidosis，and stroke−
like episode．Muscle Nerve Sup3：113−118，1995．

トコンドリアミオパチーの成因に関する分子生物学的研究
後

研究協力者

埜
宝

中

征

雄

一＊

哉＊

西

野

聴杵

DavidA．Clayton輌

来

藤

緒
言
ミトコンドリアミオパチーの成因・病態研究にとっ

一三＊ご」．∴∵・こ

小

澤

真津子牛

二十二二ここて，ミトコンドリアDNA（mtDNA）異常の発見は大きなインパクトを与えた．1990年には，ミトコンドリ
アミオバチーの三大病型に特徴的と考えられる
mtDNA異常が出そろった．しかし，実際は，mtDNA異常と臨床症状（生化学的異常や病理学的異常など）との関係は複雑であり，たとえば3243変異とMELASとの関係だけみても単純ではない（図1）．われわれは，このような遺伝子型一表現型の関係を明らかにすべく，以下の2点について研究したので報告する．
1．ミトコンドリアチロシン転移RNA近傍の挿入変異とRN8SO活性MELAS（mitochondrial myopathy，enCePhalo−
pathy，1actic acidosis，and stroke−1ike episodes）の80％には，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の3243
番塩基のAからGへの点変異が認められる．この3243
変異は，CPEO（Chronic progressive externaloph−
thalmoplegia）の症例でも認められることが知られている．MELASと深い関係のある3243変異が，なぜCPEOに認めることがあるのであろうか．その点を明らかにするために，このようなCPEO患者（3243CPEO）では，mtDNAの他の部位にさらなる変異が存在するのではないかという仮説を立てて塩基配

図1遺伝子型と表現型の多様性

列を調べ，チロシン転移RNAとcyt∝brome coxidaseサブユニットIとの間のnon−COding領域に約10塩基（poly−G sequence）の挿入変異を発見した（図2）．
2例の3243変異を有するCPEO例には，両者とも挿入変異を認め，この挿入変異の病気への関与を疑わせた．しかし，さらに2例の挿入変異と3243変異を有する例は，ともに典型的MELASの症状を持ち，ptOSis
やophthalmoplegiaは認めなかった（去1）．
そこで，Wild−typeとmutantの塩基配列を＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部＊＊国立遺伝学研究所＊＊＊スタンフォード大学

図2

ー180−

mtDNA全体図と挿入変異の位置

表13243変異を有する患者と正常対照での挿入変異の
頻度
症 状

例 数

挿入変異陽性者致68

ミオパチーのみ

4

0

CPEO

2

2

2

MELAS

正常コントロール

欠失確認
比率計測

116

pBluescriptにクローニングし，in ultro転写で得られたRNAに対して，RNaseを含むcrudeな核蛋自分画を用いてプロセシング実験を行ったところ，mubnt
transcriptsのみが切断された．切断部位は2ヶ所で，チロシン転移RNAとシステイン転移RNAの境界部
位，及びチロシン転移RNA内部に認められた．また，この切断に関与している蛋白因子を調べたところ，
RNase P類似物質であるという確証を得た．結局，
この挿入変異があると異常な転移RNAが出現し，翻訳レベルの異常を惹起する可能性が示唆された．このことは，mtI）NAの多型の中に，mtDNAの発現に影苦を与えるものが存在する可能性を示すものであり，
病因的mtDNA異常を考える上で，示唆的である．
乙 構造異常をもつミトコンドリアDNAの検出システ
ムの確立
ミトコンドリアDNAの構造異常は，欠矢と重複が知られている．ともに慢性進行性外眼筋麻痺症候群
忙PEO）の表現型と密接に関わっており，ここにも遺伝子型一表現型の関係の追求が必要である．欠矢に比べ，重複はあまり研究されておらず，それは検出法に問題があった．われわれは，従来の検査法を再構築し，重複を含めた構造異常を検出するシステムを確立した（図3）．
まずはじめに，従来から行われているサザン法とPCR法で，欠矢の有無を調べる．その際，PCRには，
longPCRと呼ばれる方法を応用し，16kilobaseのmtDNAを2組のプライマーでカバーした．もし，欠矢に由来するPCR産物が得られたならば，3つの制限酵素を同時に反応させ，DNA断片の長さを正常の場合と比較することで，欠失部位の推定を行い，さらにそのDNA断片を用いて，欠失断点確定のための塩基

重複確認
比率計測

図3

断点確定

mtDNA構造異常検出システム

配列決定を行った．この方法で，欠失断点決定にかかる時間が，飛躍的に短縮できた．
そして，次に重複の有無を調べるための2回目のサザン法を行った．これは，①欠失領域内と非欠失領域
内でそれぞれmtDNAを1回切断する2種類の制限酵素を用いること，②欠失領域と非欠失領域内を認識する2種類の部分プローブを用いることが特徴である．
これにより，欠失DNAと重複DNAの区別が可能であり，25例のCPEOの症例の検討では，わずか2例に重複DNAが存在するのみであった．しかも，重複DNAは，正常大DNAや欠失DNAに対する存在比が低く，病気との関わりの程度はけっして大きいとは考えられない結果であった．
今回確立した検出システムを用いて重複DNAの研究を行い，詳細に重複DNAの病態への関わりを研究する予定である．
結論
ミトコンドリアミオパチーの成因・病態研究は，ミトコンドリア，細胞，組織／臓器そして個体という種々の対象を用いて検討することが重要である」そしてその際，mtDNA異常が，転写レベル，RNAレベル，
翻訳レベル，蛋白レベル，活性レベルという各レベルにどのように反映されるのかを明らかにしなければならない．このような観点から，新しい治療法の開発に向けて，さらに研究を押し進めていく予定である．

−181−47）MERRFにおける新たなミ トコンドリアtRNA遺伝子上の
変異

研究協力者

宝

釆

聴＊

西

野

一

三綿

小

澤

真津子＊

埜

中

征

哉綿

後

藤

雄

一糾

表1Clinicalandlaboratory features

は じ めに山

腎障害，難聴などを認めた．
患者5は本研究エントリー後に，脳梗塞を釆たし，
さらには以前にも頭痛や悪心などのエピソードがあっ◆−

児期発症で，中枢神経症状およびミオバチ一に加え，乳酸借高値を認めた．患者1および2では，心筋症，◆者の内，8344変異の認められない5人を対象として，
MERRF発症と関わる新たな変異があるかどうかを検討した．
去1に5人の対象患者の臨床像を要約した．全例小5◆

本邦MERRF患者で8344変異以外の変異によるものがあるかどうかを調べる目的で，臨床的にMERRF
あるいはその疑いと診断され 筋生検を施行された患

q−

目的・対象

4

31y／M
lOy

■

これまでのところ，本邦のMERRF患者で退伝子異常が明らかにされた例はすべて8344変異である．

eMyopathy
CardiaehvoIvement
OtherS

3

15y／F
9y
◆

Cerebellaralax嘉ahのA→G点変異2）と8356番のT→C点変異3）4）とが報告されている．8344変異は，MERRF患者の80％前後に認められるとされる．一方，8356変異は欧米より2家系の報告がある3）4）が本邦での報告例はない．従って，

2

8y／M
7y

SekUreS
Myoclonuj

uclate●lmmoVl）

Serum
CSF

cytochrome c oxidase部分欠姐，RRF，StrOngly
SDH−reaCtive blood vessels（SSV）がみられる．

分子遺伝学的には，MERRFと関わる変異として，
これまでにミトコンドリア・リジンtRNA上の8344番

1

2y9m作
Sm

：：◆霊

Age／Sox
Age8tOnSet◆±？◆◆帽lUr
帽．
利Ragged−redfibers（RRF）を伴うミオクローヌスてんかん（myoclonus epilepsy associated withragged−redfibers：MERRF）は，1980年にFukuharaらにより初めて報告された疾患概念で1），典型的には小児期に発症し，小脳性失調・ミオクローヌス・てん
かん発作を中心とする中枢神経症状に加え，進行性の筋力低下を来す疾患である．筋病理学的には

Mb
叫旬．．土．．柑

Palient

†7．5

†5．6

†4．3

†4．3

†3．8
†2．2

1．4
†2，2

†10．1
†5．8

norm81帽ngO；0．5−2．Ommon

方法

ミトコンドリアDNA（mtDNA）はアンダーソンらによりすでにその全塩基配列が決定されており，環状の
mtDNA分子上には22個のtRNA遺伝子がコードされている5）．MERRFを含めミトコンドリア病の多くは，ミトコンドリアDNA（mtDNA）上の点変異に由来するものが多く，tRNA遺伝子はミトコンドリア病点変異のホット・スポットとして知られている．そこで我々は，仝tRNA領域の塩基配列を決定し，得られた配列
をアンダーソン酉己列と比較した．
具体的には，全ミトコンドリアDNAをカバーする
ように12組のPCRプライマーをセットし，その内，tRNA遺伝子領域をカバーする11本のPCR断片をテ
ンプレートとして，オートシークエンサー（mode1377，
Applied BioSystems）による直接シークエンスを行った．シークエンスプライマーは，tRNA丑伝子領域を上流と下流から挟むような位置に，合計30カ所にセッ
トし（図1），PRISM Ready Reaction Terminator
Cycle SequenceXitを用いてサイクル・シークエン
ス反応を行った．

結果・考察たことが明らかにされたため，診断がMERRFから「ミオクローヌスを伴うMELAS」に変更された．

結果を表2に示す．この表ではアンダーソン配列と異なっていたヌクレオチドをtRNA丑伝子ごとに示している．患者1では8298番のチミンがシトシンへと変＊国立遺伝学研究所＊＊国立精神・神経センター神経研究所繊細構造研究蕃

異し，患者2と3で8363番のグアニンがアデニンへと変異していた．これらの変異は，現在までに報告のない新しい点変異であった．
−182−

30Sequence
Primers

蓑2Results

PCRIragments

AA一一一一一一一一一一一一でT

OrangUtan
BovineCATTGC

AA一一一一一一一一一一一一でTCAC℡AA

AA一一一一一一一一一一一一TC

MouSe
Rat
ChickenCAC℡GT

AA一一一一一一一一一一一一でCCAT℡GC

AA一一一一一一一一一一一一でCCAT℡AA

AA一一一一一一一一一一一一cc

ズenqpuきJaeyね

CACでAA

AA一一一一一一一一一一一一cc

CCで℡AA

TA一一一一一一一一一一一一TT

TでAAGGACAT℡AG

TG一一一一一一一一一一一一CT

TCTAATQATAAGCT

AA一一一一一一一一一一一一AG

TAGCでTTTQGGTGT

TA一一一一一一一一一一一一GC

TAでACCCAQGG℡GでTA一一一一一一一一一一一一GC■

pr050戸山bmeね〃0．
岬〟〟5e血〟s
Zbamay5
8招ききたanapuき︒

Seaurchln

でGCAGAGACTTQGT（；A
CATAGTGACACAATGACTTAATGAがあると考えられた．

G ↓A
一一〇一一一一一一一一一一一一−一一一一一一
6
2 3

AA一一一一一一一一一一一一でTCAC℡GT

また，患者4では8356番のチミンからシトシンへの点変異を，患者5では3260番のアデニンからグアニンへの点変異をそれぞれ見出した．これらの変異はいず

TTAATGATATACCCA↓CAC℡GTC

ChimpanZeO
Gorma

TACAGTGATACAGTGATGCAGTQA

T
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一
一6一一一一一一一一
53
8

AA一一一一一一一一一一一一TT

G
一一一一一−一一一一一一−3一一●一−一一一
6
3
8

8363

CAC℡GT≡二≡≡■−墾伽≡≡

8298
Human

C
↓
T一一一一一一一一一一一一8一一一一一一一一
一
9
2

落N
語孟叫雷管P・R

LeS

図1Sequence analysis of MitochondrialI）NA

れも，本邦第一例日の報告である．
MERRFではなく「ミオクローヌスを伴う
MELAS」とされた患者5において認めた3260変異は，
これまでにヨーロッパから2家系の報告があり，いず

図2Conservation throughevolution
これら2つの点変異の病的意義を確認するために，
ミスマッチプライマーを作成し酵素切断多型検査を行った．いずれの変異も患者・同胞・母親にヘテロプ

Hattoriらにより多型として報告されているもので，障害を示唆する所見はない．MIMyCaの原因変異とされる3260変異でMELASを来たし得ることは興味深いが，一万，3260番のヌクレオチドが存在するロイシン（UUR）tRNAは，MELASと関連する変異のホット・スポットとして知られている．何らかの理由でロイシン（UUR）tRNA上の変異はMEIJASの表現型をとりやすいと想定すると，3260変異でMELASを来すこともJ

リア・リジンtRNAのaminoacyl acceptor stem
（AA stem）上で対側の塩基と塩基結合を形成してAA

MIMyCa）の表現型をとっている7）8）．我々の患者では経時的に調べた胸部Ⅹ線写真，心電図，心エコーではいずれも異常を認めておらず，現在までのところ心筋AC

その頻度は日本人60人につき2人とされている6）．
従って，8363変異をもつ2例はそれぞれ遭伝学的に異なるクラスターに属することが示唆された．
8298番のチミンも8363番のグアニンもミトコンド

inherited myopathy and cardiomyopathy：A

ラスミーが認められ，血液よりも筋肉に変異型が多い
傾向があった．相当数の正常入植298変異は133人，8363変異は50人）を対象として同様の検査を行ったが，全員陰性であった．さらに患者2には，10410番のT→Cの一塩基置換を認めた．この塩基置換はすでにれも母系遺伝するミオパチーと心筋症（matemally

理解可能である．遺伝型と表現型との関係については，さらなる検討が必要と考えられた．

stemの二垂らせん構造の維持に関わっており，ひいてはtRNA全体の立体構造の維持に何らかの役割を

1．2つのミトコンドリア・リジンtRNA上の新たな変担っている可能性が考えられた．進化の面からは，8298番・8363番とも，AA stem上の対側の塩基とと異（8363（G→A）変異，8298（T→C）変異）を報告した．
これらは，相当数の正常者で変異が認められないこと，

もに種を越えてよく保存されており，重要な塩基であることが示唆された（図2）．

進化の過程でよく保存されていること，ヘテロプラ
スミーを認めることなどから，多型ではなく症状発現と関わる変異であることが強く示唆された．

以上の結果を併せて考えると，今回見出された新たな変異が，ともに単なる多型ではなく，MERRF発症に深く関わっている変異であることが強く示唆される．
しかし，これらの変異が直接MERRF発症の原因となっているかどうか確かめるためには，今後更に細胞レベルで蛋白合成能や酸化的リン酸化能を調べる必要

ま

と

め

2．2つの本邦第一例日となる変異（8356変異，3260変異）を報告した．3260変異を認めた患者はMERRFよりもMELASの範噂に入るものであったが，従来よりMIMyCaの変異として報告されてきた3260変異でMELASを釆たし得ることは興味深い．

−183−

文

献

tRNALys gene．EurJ Hum Genetl：80−87，

1）Fukuhara N．et al：Myoclonus epilepsy as−

1993．

with ragged−red Eibers（mitochon−5）Anderson S，et al：Sequence and organiZia−

drialabnormalities）．Disease entity or syn−tion of the human mitochondrial genome．

drome？Light andelectron microscopIC Stud−Nature2鋤：457−465，1981．

SOCiated

ies of two cased and review ofliterature．J

6）Hattori Y，NeuroISci47：117−133，1980．

Ciatedwith a mitochondrial DNA tRNALys
mutation．Cel161：931−937，1990．

Sis of chronic progressive external oph−

thalmoplegia（CPEO）．J NeuroI Sci125：50−
55，1994．

7）Zeviani M，et al：Maternal1y inherited3）SilvestriG，et al：A new mtDNA mutation

myopathy andwithwith mutation（MERRF）．AnJ HumGenet51：1213−1217，
1992．

8）Sweeney MG，transfer RNA4）Zeviani M，et al：A MERRF／MELAS over−
1ap syndrome associated with a new point
in

Cardiomyopathy：aSSOCiationinmitochondrial I）NAtRNALeu（UUR）． Lancet3刃：143−147，1991．

myoclonic epilepsy and ragged−red fibers

mutationinmitochondrial tRNA genes：SequenCe analy−2）ShoffnerJM，et al：Myoclonic epilepsy andragged−red fiber disease（MERRF）is asso−in the tRNALys gene associatedet al：Point mutations

the mitochondrial DNA−184−

et al：Mitochondrial I）NA
mutation Leu（UUR）A→G

3260：a second familywith myopathy andCardiomyopathy． QJ Med86：435−438，1993．

48）MERRFの心筋ミトコンドリア病変についての研究
福

研究協力者

中

原

島

信

義＊

5㌢

巻

は じ めにMERRFl）はミトコンドリア脳筋症の1つで，脳と骨格筋のミトコンドリア異常が認められており，脳では神経細胞自体にミトコンドリアの形態的変化がみら
れる2）．そして，そのミトコンドリアの形態異常は，骨格筋のミトコンドリアの形態的変化と同一のものである3）．したがって，MERRFはMELASと異なり，脳の神経細胞の一次的な病変によって生じていると考えられている2）．
MELASでは，神経症状の他に心筋障害，腎障害（ネフローゼ症候群）3）や，糖尿病の合併がしばしば報告されている4）5）が，MERRFではこのような報告はまれである．MERRFの剖検例で心筋に注目し，ミトコンドリアのDNA変異と形態的変化について検討したので報告する．
症例2）3）

60歳 男性家系内に同様の疾患を持つものが多数みられる・45
歳頃より構音障書が始まり，次第にミオクローヌス，
全般性痙攣，小脳性失調が生じ，徐々に痴呆と全身の筋萎縮が増強した．血液のmtDNA分析により
tRNALys僅基番号8344）の点変異が認められた．約15年の経過で死亡．病理学的には，小脳，脳幹の萎縮が著明で，上小脳脚，小脳虫瓢被殻，下オリーブ核などにびまん性グリオージスがみられ，MERRFと診断された．生前の心電図では異常は認められず，胸部レ線写真でも心肥大は認められなかった・
材料，方法
剖検時に心筋を切り出し，直ちにグルタールアルデ
ヒドで固定，オスミウムで後固定した後，型のごとく
包埋，染色処理し，電顕で観察した．一方，組織の一部はmtDNAの分析の時まで凍結保存した．DNAを抽出した後，Yonedaら6）の方法によりPrimerl：5㌧
TCACTGTAAAGAGGTGCCGG−3 （塩基番号8345−
8364）とPrimer2：5−AACCACAGTTTCATGCCCA

渕

隆

夫榊

−3，（垣基番号8191−8210）を用い，PCRを93℃30sec，50℃1min，72℃3minの条件で25cyclesで行なった・
NaeIで消化の後，2．5％アガローズゲルにて電気泳動
し，エチジウムブロマイド染色のDNAバンドにより判定した．mtDNAのヘテロプラスミ〜の定量のためには，上記のPCRの条件で，蛍光ラベルしたdUTPを
dNTP mixに1：100の割合で混合し，PCRを行ない，同様の条件でNaeIで消化した．ABI PRIZSM310
geneticanalyzerでDNAのフラグメントを分離し・解析ソフトであるGenscanおよびGenotyperにて正常および異常DNAの割合をpeakareaより算出した・
結果1）mtDNAの変異心筋でも脳組織と同様，tRNALysの塩基番号8344におけるAよりGへの点変異が認められたが，変異mtDNAの比率は33％で，他臓器に比べて低かった．
ちなみに，
小脳歯状核
大胸筋
膵臓
リンパ球
心筋
か電顕的観察

60．5％
65．7
75．6
68．9
30．3

心臓は，肉眼的にはごく軽度の線推化がみられたが，著明な変化はみられなかった．電顕的には，少数のライソゾームが所々にみられたが，心筋の筋原線維自体には大きな変化は無く，月旨肪沈着もみられなかった・
一方，ミトコンドリアは非常に大きく，クリスタが著明に増加し，VeSicularになっているもの（図1，2）が多く，また中に電子密度のさまざまな無構造物質を入れているもの（図2，3）が多くみられた．クリスタの一部が層状（図2，3）となり，骨格筋，神経細胞で観察されたいわゆる結晶様構造物に近いもの（図4）も観察されたが，いずれも小さく，未熟なものと考えられた・心筋線経の間にみられた小血管（網細血管，静脈）ではこのような異常ミトコンドリアは観察されず．また，ミトコンドリアの集積もみられなかった．

＊国立療養所雷渇病院神経内科＊＊国立療養所犀昇病院神桂病理−185−

図1心筋．筋原線維自体には大きな変化はないが，ミトコンドリアは巨大化し，種々の封人体がみられる．
×7．000図3心筋ミトコンドリア．クリスタが層状に配列している．
×15，500

図2 心筋のミトコンドリア．ミトコンドリアは巨大化し，クリスタの一部は多層化し，結晶様構造となっている．
×7．000図4心筋ミトコンドリア．高電子密度の封人体のほか，未熟な，いわゆる結晶様封入休がみられる．

考案

MERRFは，mtDNAの塩基番号8344（tRNALysのcodingregion）の変異によることが知られている・細胞内では，変異DNAと正常DNAがヘテロプラス
ミーを生じている．患者の家系内に遺伝子的には異常でありながら，臨床的に無症状のものが見出されるが，このヘテロプラスミーの比率がその臓器，あるいは組織の臨床症状の有無と関係していると疑われている．
しかし，変異DNAの比率の高いものが必ず臨床症状を呈するとは限らず，この点は未だよく判っていない2）．
Xearns−Sayre症候群は，心伝導ブロックをその三主徴としているように病気の経過と共に高率に心臓異常を生じるようになり，死亡原因となる．また，
MELASはミトコンドリアの異常集積が血管内膜，中腰に生じる7）8）と言われ，臨床的に心筋障害がみられ，病理学的にもかなり多くの例で心筋症があり，心筋に×35，000

ミトコンドリアの集積のあることが報告されている9）．
一方，MERRFでは，脳神経系と骨格筋の障害のみで，一般臓器は侵されないとされてきたが，Amnら10）は
MERRFで左心室の肥大と壁の動きの異常がみられやすいこと報告している．また，Ozawaら11）はMERRFの10例中4例で臨床的に心筋障害があり，その詳細は不明であるが，うち2例では心不全を生じており，
MERRFでも心筋障害の頻度は高いという．しかし，病理学的な裏付けはなかった．Ozawaら11）は定型的な臨床症状を備えたMERRF例では骨格筋における変異DNAの比率は85％以上であるとしているが，本報告の症例の骨格筋の変異DNAの比率は65．7％であり，心筋の変異DNAはもっと少なく，30．33％であった．電顕で観察されるミトコンドリアの形態も明らかに異常であるが，骨格筋に比べればはるかに軽度なもので
あった．

−186−

結

6）Yoneda M，Tanno Y，NonakaI，et al：論

Simple detection of tRNALys mutationin

MERRFでは，骨格筋よりは軽度であるが，心筋にもミトコンドリアの形態異常が観察される．

myoclonus epilepsy associatedwith ragged−
red fibers（MERRF）by polymerase chainre−

文

献action witha mismatched prlmer．Neuro1−

al：Myoclonus epilepsy associated with

Ogy朝1：1838−1840，1991・
7）Ohama E，Ohara S，Ikuta F，et al：Mito−

ragged−red fibres．Disease entity or a syn−chondrial anglOPathyin cerebral blood ves−

drome？Light−and electronmicroscopIC Stud−sels of mitochondrial encephalomyopathy．

1）Fukuhara N，TokiguchiS，Shirakawa X，eties of two cases and review oftheliterature．

Acta Neuropatho174：226−233，1987．

2）Fukuhara N：Clinicopathological features of8）Monar M，Neudecker S and SchroderJM：
Increase of mitochondriain vasa nervorum

MERRF．Muscle Nerve．Supp13：S90−S94，

of cases with mitochondrial myopathy，

1995．

Ⅹearns−Sayre syndrome，prOgreSSive exter−

J NeuroISci47：117−133，1980．

3）福原信義，中島 孝，巻淵隆夫：MERRF脳の電顕的研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」
筋ジストロフィー及び類縁疾患の病態と治療法に関する研究サ（高木班）平成6年度研究報告書，（印刷中）．
4）OnishiH，Inoue X，Osaka H，et al：Mito−
chondrial myopathy，enCephalopathy，1actic
acidosis and stroke−like episodes（MELAS）
and diabetes mellitus：mOlecular genetic
analysis and family study．J NeuroI Sci

nal ophthalmoplegia and MELAS．Neuro−
PathoIApplNeurobio121：432−439，1995・
9）大浜栄作，武田茂樹：ミトコンドリア脳筋症の病
理．脳神経41：735−746，1990．
10）Anan

R，Nakngawa

M，Miyata

M，et

al：

CardiacinvoIvementin mitochondrial dis−eases．A

study

on17

patients

with

docu一

mented mitochondrial DNA defects．Circula−tion91：955−961，1995．

11）Ozawa M，Goto Y，Sakuta R，et al：The8，344

114：205−208，1993．

mutationinmitochondrial I）NA：A

5）ⅩadowakiT，ⅩadowakiH，MoriY，et al：comparison between the proportion of mu−

A subtype of diabetes mellitus associatedwith a mutation of mitochondrial DNA．Ntant DNA and clinico−pathological findingS．

EJ Med330：962−968，1994．

−187−

Neuromusular Disord5：483−488，1995．

49）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いた
in situ hybridizationによる

4977bpの欠矢を伴う変異ミトコンドリアDNAの検出

部藤

＊

邦

＊

郎哉

■

綿

紳征

蝉

連中

池埜

＊

孝一

信雄

＊

服後

＊

行理嗣

美

野

水

榊

範恵雅

目

村澤中

中平田

研究協力者

的

失1例）・MELAS2例・MERRF2例・筋緊張性ジス

ミトコンドリアに機能異常のある多くの場合，ミトコンドリアの数の増加・変形がみられ，raggd−redfiber（RRF）と称されている．これは，主としてミトコンドリアDNAに異常をもつミトコンドリア脳筋症
で観察されるが，その他高齢者・筋ジストロフィー・
筋炎等で非特異的に観察されることが知られている．
一方我々は，パーキンソン病の発症機序を追求する

トロフィー症1例・高齢者MGl例，計9例で，表1に詳細を示した．それぞれの生検筋組織から6〟mの凍結切片を切り出し，連続切片でSDH染色とCCO染色を施行した．
プローブの調整：図1に示すような部位に相補的な45bpのオリゴヌクレオチド2種類を合成し，DNA（mtDNA）の苦境を報告した1）．その後，加齢2）・

BoehringerMannheim社のDig tailing kitを用い，ジゴキシゲニンで標識してプローブとし，変異DNA
検出用をATPB／ND5chimera probe，正常DNA検
出用をWild probeと明記した．

肥大型心筋症3）・筋緊張性ジストロフィー症4）で，COmmOn deletionのみならず様々なサイズの欠矢の蓄積を伴うことが報告されている．特にcommon de＿

サザンハイブリダイゼーション：高齢者剖検脳から抽出したDNAをテンプレートと−し，COmmOn deletion
を挟むプライマー対（L790とH1363）を用いて増幅した

1etionは，加齢現象の指標となりうるものであり，諸組掛こ認められている5）．

後，得られたPCR産物をサザンプロット解析し，プローブの特異性を確認した．

これらの欠矢を伴う変異mtDNAの組織上分布を検討することは，従来の生化学的方法では不可能であり，組織上分布を検討するにはinsiluhybridizationを用いることが有効である．しかし，サブトラクションを用いた従来の方法6）7）では，KSSのように欠矢が多量／n situ hybridiz8tion：ISHはPinkelら8），
Breitschopfら9）の方法に基づき，42℃で一昼夜hy−
bridiZ；ationを行い37℃で洗浄した．ジゴキシゲニン

過程で，パーキンソン病において4977bpの欠失（いわゆるcommOn deletion）を伴う変異ミトコンドリアに存在する組織での検出は可能であるが，組織中で数％程度の欠矢を検出することは不可能である．我々は，老化で多く認められるcommon deletionに焦点をあて，この欠矢を伴う変異DNAを直接検出する合成オ
リゴヌクレオチドプローブを調整し，その有用性を検討するともに，非特異的に観察されるRRFとの関連について検討した．
方の検出は，抗ジゴキシゲこン単クローン性抗体を一次抗体として用い，二次抗体にアルカリフオスファター
ゼ標識抗マウスIgGを用い，さらにAPAAPを反応させ，NBT佃CIPにて発色した．

表1
症例

法

対象：ⅩSS3例（common deletion2例，7663bpの欠＊噸天堂大学医学郎脳神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究部繊細構造研究部＊＊＊名古屋大学医学部第二生化学

−188−

l
2

診断
KSS
ESS

年齢
14

M

性別

2．59も

RRF mutali。ncommolldeletion

2

F

ll．5％

でommondeIetiom

3

Ⅹ55

15

F

l．5％

COmmOndelelion

4

MELAS

23

F

l％＞

3243（一）5htEIAS2

F

7．5％

3243（＋）hIERRF12F

10％8344（＋）

1％＞8344（−）

7

hlERRF

ll

F

8

htyD

52

f−

9

hlG

72

F

0・659もO．

8％

mulliple
でommondeletiom

A． Subtractionmethod
normalmtDNAA B C

deletedmtDNA

7
5

〇〇

●

mOrmdprobe

0．77−

probehrbolhnomalanddeletedmtDNA

B． Fusedgenemethod

normalmtDNA

ddetedmtDNA

（kbp）

Oq

図2

PCR及びサザンプロット解析
レーンA：PCR
レーンB：ATP8／ND5chimera probeを用いた
サザンプロット
レーンC：Wild probeを用いたサザンプロット

Wildprobe AT門／ND5chimeraprobe

図1プローブの設定位置められた（図3−D）．
症例3（common deletionをこえてATP8／ND5chi＿

轄果PCR・サザンハイブリダイゼーション：高齢者剖検脳から抽出したDNAをテンプレートとしてcommon

mera probeの設定部位をも含む，7663bpの欠矢が判明しているKSSの症例）では，RRFに一致したATP8／

deletionを挟むプライマー対（L790とH1363）を用いてPCRを行うと，正常ミトコンドリアDNA由来の5．7
kbpのband（wild band）とcommon deletionを伴う

Wild probeのシグナルもほぼ均一に分布していた（図変異ミトコンドリアDN■A由来の770bpのband（mu−tant band）の2本を認めた（図2，1aneA）．さらにこれを，サザンプロットで解析すると，ATP8／ND5Chimera probeを用いてはmutant bandのみにシグナルを認め（図2，1aneB），また，Wild probeを用いては，Wild bandのみにシグナルを認めた（図2，
1and：）．症例8の筋から抽出したDNAをテンプレー
トとしてPCRを行うと，770bpのmutant bandを含む3本のバンドを認めた．これらは，100bpずらしたプライマー対（L800とH1363）でプライマーシフトを確認した．症例9の筋から抽出したDNAをテンプレー
トとしてPCRを行い，770bpのmutant bandを認めた（data not shown）．
／n situhybridization：症例1（common deletionが判明しているⅩSS）では，図3−Aで認められる11本のRRF（このうち10本がCCO negative fiber，図3−B）のうち9本にATP8／ND5chimera probeの集積を認めた個3−C）．WildprobeではRRFとその他のfiberで差がなく，ほぼ均一にWild probeのシグナルが認

ND5chimera probeの集積は認められず（図3−G），
3−日）．

症例5（MELAS）および症例6（MERRF）では，RRFにはATP8／ND5chimera probeの集積は認められなかった（data not shown）．症例8（筋緊張性ジストロフィー症）では，ここに示す2本のSDH positive fi−ber（図4−A）のうち1本はCCO negativefiber（図4−B）
で，ここにATP8／ND5chimera prObeの集額を認めた（図4−C）．症例9（高齢者MG）では，切片上のSDH positive fiber（図4−D）はすべてCCO negative
fiber（図4−E）で，そこにATP8／ND5chimera probeの集積を認めた（図4−F）．
考察

我々の作成したATP8／ND5chimera probe及びWild probeは，サザンプロットにて特異性の高いオ
リゴヌクレオチドプローブであることを確認できた．
またISHでも，COmmOn deletionが判明している筋
組織のRRFには，ATP8／ND5chimera probeの集積を認めるものの，7663bpの欠矢が判明している
RRFや，MELAS・MERRFのRRFにはATP8／ND5Chimera probeの集頓を認めないことより，ATP8／→189−

図3 症例1（KSS，COmmOndeletion）及び症例3（KSS，7663bp deletion）の連続切片（A）（E）：SDH染色（B）（F）：CCO染色（C）（G）：ATP8／ND5chimera probeを用いたISH（D）（H）：Wild probeを用いたISH Bar＝50〝m
ND5chimera probeを用いたISHは，COmmOn de−letionを伴う変異ミトコンドリアDNAを特異的に検出し得ると考えた．
MELASやMERRFでのRRFにおけるcommon
deletionの関与する割合は低く，少なくとも検出感度以下であると考えられた．

認めることができた．今後，それぞれの症例数を重ね，この傾向を確認していきたい．
また，この方法を用いることにより，筋緊張性ジス
トロフィー症のようにmultiple deletionを有する疾患群において，特定の欠矢を伴う変異mtDN■Aを組織上で特異的に検出することが可能と考える．

高齢者に認められるcommon deletionを伴う変異
mtDNAを，組織上で検出し得た報告はこれまでになく，本法を用いることにより，COmmOn deletionを伴う変異mtDNAが，RRFに一致して集積していることを証明することができた．また，ⅩSSでの報告6）7）と同様に筋緊張性ジストロフィー症でも，COmmOn

文献1）Ikebe S，Tanaka M，0lm0deletionを伴う変異mtDNAが，SDH positive fiberの中でもCCO negative fiberに多く存在する傾向を−190−

K，Sato W，HattoriX，Kondo T，Mi2；unO Y and Ozawa
T：Increase of deleted mitochondrialI）NAin
thestriatuminParkinsonsdiseaseand

se＿nescence．Biochem BiophyS ReS Commun

三二一軍三重音声岳葛撃＿監禁＿「・●、図4 症例8（筋緊張性ジストロフィー症）及び症例9（高齢者MG）の連続切片（A）（D）：SDH染色（B）（E）：CCO染色（C）（F）：ATP8／ND5chimera probeを用いたISH Bar＝50LLm

5）ZhangC，Baumer A，Maxwell RJ，Linnane

170：1044−1048，1990．

2）Hattori X，Tanaka M，Sugiyama S，Obayashi T，Ito T，Satake T，Hanaki Y，
AsaiJ，Nagano M and Ozawa T：Age−de−pendentincrease in deleted mitochondrial

AW and Nagley P：Multiple mitochondrial
DNA deletionsin an elderly humanindivid−
ual．Febs Lett297：34−38，1992．

6）Mita S，Schmidt B，Schon EA，DiMauro S

DNAin the human heart：pOSSible contribu−

andtory factor to presbycardia．Am HeartJ

Chondrialgenomesincytochrome−C OXidase−

1735−1742，1991．

deficient muscle fibers of a patient with

E：Detectionofdeletedmito＿

XearnsTSayre syndrome．Proc Natl Acad3）OzawaT，Tanaka M，Sugiyama S，Hattori

SciU S A86：9509−9513，1989．

X，Ito T，Ohno K，TakahaShi A，Sato W，
Takada G，Mayumi B，Yamamoto X，

Bonilla7）Collins S，Rudduck C，Marzuki S，Dermett

AdachiK，Ⅹoga Y and Toshima H：Multi−X

ple mitochondrial DNA deletions existin

tribution

Cardiomyocytes of patients withOXidase−negative muscle fibresin patients

hypertrophic or dilated cardiomyopathy．

With a mixture of deleted and wild type

Biochem Biophys Res Commun170：830−836，

mitochondrial DNA．Biochim Biophys Acta1990．

lO97：309−317，1991．

4）SahashiX，Tanaka M，Tashiro M，0lmo K，

and

Byme

E‥Mitochondrialingenomedis−histochemically cytochrome c

Ibi T，Takahashi A and O2aWa T：Increased8）Pinkel D，Straume T and Gray JW：
Cytogenetic analysis uslng quantitative，highmitochondrial DNA deletionsin the skeletal，＄enSitivity，fluorescence hybridization．Proc

muscle of myotonic dystrophy［publishederratum appearsinGerontology1993；39

NatlAcad SeiU S A83：2934−2938，1986．
9）Breitschopf H，Suchanek G，Gould RM，
Colman DR and Lassmann H：In situ hy−（2）：124］．Gerontology38：18−29，1992．

−191−

bridization with digoxlgeninーlabeled probes：

Plied to myelinating rat brain．Acta Neuro−

SenSitive and reliable detection method ap

pathoIBerl糾：581−587，1992．

−192−

トコンドリア遺伝子変異型と表現型
小

澤

高 将＊

は じ めに研究の成果

我々は，個人が生産に獲得するミトコンドリア・DNA（mtDNA）の体細胞変異は遺伝された変異の蓄積よりも題に速い速度で起き，これら変異の蓄積が加齢変化およびミトコンドリア病などの退行性疾患を起こす重要な因子であろうとしが）．本研究はこの主題にi．日本人およびイギリス系オーストラリア人のミト
コンドリア・心筋症患者のmtDNA全周塩基配列を決定した．そこにみられた塩基置換の集積には顕著なク

そって，ミトコンドリア病と考えられる患者について，
生殖腺細胞由来の点変異の全解析を行い，さらに点変
異によって誘起される体細胞変異である遺伝子欠矢を包括的に定量し，患者の遺伝子型とその表現型である病態との相関を明確にしようとした．
本研究前半の骨子はストックホルム・ノーベル財団
主催による「ミトコンドリア病」に関するノーベル・
シンポジウムで招待講演し，出版した8）．
研究計画及び材料と方法
i．生殖腺細胞変異：剖検，生検心筋などの微量の標
品中のmtDNAをPCRによって増幅し，我々の考案ラスターが認められ変異がミトコンドリア・イブから順次系統的に分岐したことを示しており，患者は世界的な広がりを持った一つの遺伝子ファミリーを形成している8）．
ミトコンドリア病患者のmtDNA生殖腺細胞遺伝子型は，構造遺伝子上の点変異のみ存在するmit￣型と蛋
白合成系遺伝子の点変異のみを有するsyn￣型，mit￣変異とsyn￣変異が共存するmit￣＋syn￣型に大別できる・
死亡患者についてその死亡年齢にもとづいてKaplan−
Meier法によって累積生存率を計算した．メデアン生
存率はmit￣型患者が75歳であるのに対してmit￣＋syn−
塑患者は21歳と著明な差のあることが判明した（図1）．
即ち，点変異の表現型に及ぼす影響は相乗的である9）・した直接塩基配列決定法11）を用いmtDNA全周塩基寵列を決定した．
ii．休細胞変異：PCR増幅したmtDNAでは失われる
体細胞変異の情報，特に活性酸素ラジカルによって生成し，複製に際して誤読され体細胞変異の原因となる
8−hydroxyrleoxyguanosine（8−OH−dG）を直接ミク
ロHPLC／質量分析計を使って定量した4）．また，8−OH−dGの昔掛こよって惹起されるmtDNAの欠矢をH鎖およびL鎖の複製開始点（OrH，OrL）も含めてく
まなく検出するため，180対のプライマーを合成してtotaldetection system（TDシステム）を開発し標品のmtDNAの欠矢を網羅的に検出した6）．
ia．最近Chanceによって開発された光ダイオードを用いた近赤外二波長光度計で，健常者，高齢者，およびmtDNA変異が確認されているmt・ミオパチ一息
者の運動時における筋肉組織酸素温度を非侵襲的に測定した10）．
k．ヒト培養細胞系を高濃度酸素に暴露する酸素・ス
トレスを与えアポトーシスを惹起させ，この際のmtDNAの断片化を解析した13）．対照として同一の核遺伝子を保有するが，mtDNAを欠落させたpO細胞を用いた．

＊名古屋大学医学部生化学第二慎座

0

20

40

60

80

Age（years）

図1mtDNA点変異型と患者生存率
ミトコンドリア病患者の点変異をmit￣変異のみ存在するmit￣型とsyn￣変異のみを共有するsyn￣型，mit￣変異とsyn￣変異が共存するmit■＋syn￣型に大別し，死亡患者についてその死亡年齢にもとづいてⅩaplan−Meier法によって累積生存率を計算した．メデアン生存時間は，ふit￣型患者が75歳であるのに対してmit￣＋syn￣型患者は21歳と著明な差がある．点変異の表現型に及ぼす影響は相乗的である9）．

一193−

追．65歳以上の高齢者で8−OH−dG量が急増し，これとよい相関（r＝0．93）を示して，欠矢が増大した4）5）．

A

mtDNA二本鎖中に8−OH−dG量が蓄穏すると，その部分は相補鎖とミスマッチを起こし，二重鎖の一定範囲が解け持続的な一本鎖になった状態での疑似組み換
え，ないし再配列が欠矢を起こす機構として考えられる．
重篤な点変異を有し19歳ミトコンドリア心筋症のため死亡した患者心筋mtDNAをTDシステムによって検索した結果，実に235種類の欠矢が検出され（図2），
こうした欠失により野生型mtDNAの鋸％が断片化し崩壊していた6）．orHおよびOrLを持つ欠矢は全欠矢の20％に過ぎず，残りの欠矢は，複製開始点の一方か，両方を欠いたminicircleであった．また，同様に重篤な点変異を有し拡張型心筋症のためユタ大学で心臓移植を受けた7歳児の心筋mtDNAは212種類の欠矢が証明された9）．対象とした3歳児の心筋mtDNAでは欠矢は5種類にとどまっていた．また97歳で死亡した
女性の心筋mtDNAでは欠矢は358種類，全mtDNAの朗％に及んだ こうしたmtDNAの顕著な断片化，
崩壊はエネルギー産生の著しい低下，細胞死，個体の死をもたらすものと考えられた．
迄．歩行時，正常者では運動に伴う組織呼吸の増大に
よって著明な組織酸素法度の低下を示すが，重篤な点変異を持つミトコンドリア病患者や，mtDNA欠矢が顕著な老人，ミトコンドリア病患者では逆に新鮮血流人により組織中のオキシ・ヘモグロビンは，遺伝子変異，欠矢による断片化の程度に比例して利用されず著
明な酸素化が証明された（図3）．組織酸素化の程度は正常者との比較において鏡像を示し最大で数オーダーの差をしめしていた10）．
加．ヒト培養細胞系を2日間酸素・ストレスを与えると，通常大気に戻した後もアポトーシスが進行して，
図2

0nH

O■lL

▲Tl−■ヾ■仲、l）l

ミトコンドリア心筋症患者心筋mtDNAの断片化による崩壊19歳でミトコンドリア心筋症のため死亡した患者心筋mtDNAをTDシステムによって全欠矢を放出し，欠失部位を黒色で示した．アラビア数字
で示した欠矢のクロス・オーバー部位は直接塩基配列決定を行った．
A一上段：OrLを欠くminicircle，59種類
A一下段：OrHを欠くminicircle，31種類
B一上段：OrL，OrH考共に欠くminicircle，97
種類

hh

B一下段：OrL，OrHを共に有する断片，48種類
患者の野生型mtDNAの朗％が，上記の235種類の断片に崩壊していた6）．

−194−

P・Cell

30ye的malo

POceIl

︵ U
O
8
O
6
O
O
4

︵ボ︶卓二q属＞O
2

Poht仙伽lS
G㈹︵ぎ﹂︶LQq∈⊃uニQU

的Nl▲Cb丸ik

S一針山河P桝貯■
5lTd ND2
C
▲
84川
▲瑚
C T
lの叩

ND】

▲

JmlRN▲T■Y G

劫搾計30はmlew仙CPE0

G
▲

＿

0X脚t加

日
日
‖・劃

．qO

bIy帰 山
▲▲
■
tt
●．
P
州
U ■l■
rr
才叫T I什
叫
王や

一

成

詑

蜘
C
−

0

P
−

kb

2

3

4

0

1

2

3

4

Daysinculture＿16．6

図4 ヒト培養系細胞の酸素ストレスによるアポトーシ−＿12．4

t28

ス

SoL

ヒト培養系，701．2．8C，p＋細胞と，対照として同一の核遺伝子を保有するが，mtDNAを欠落さ

図3 進行性外眠筋麻痺症患者における運動時筋組織の著しい酸素化
光ダイオードを用いた近赤外二波長光度計を装着した，健常者，高齢者，および図示したようにmtDNA変異が確認されている進行性外眼筋
麻痔症患者をエルゴ・メーター上で1mile／hrで緩やかに歩行させた際の，筋肉組織中オキシ・
ヘモグロビンおよび全血量の変動を非侵襲的に測定し記録した．
30歳の健常者では運動開始と共に，ミトコンド
リアによる酸素消費のためのオキシ・ヘモグロ
ビンのレベルは低下し，運動終了と共に元のレベルに復帰する．一方，3ケのmiもーと1ケのsynを保持する38歳の進行性外眼筋麻痔症患者では，
オキシ・ヘモグロビンの低下はみられず，ミトコンドリアにおける酸素消費の障害が示された．
80歳以上の高齢者ではこうしたパターンが一般的であった．
さらに野生型mtDNAの80％以上が欠矢を持つことがサザンプロットにより示された29歳の進
行性外眼筋麻痺症患者の場合，新鮮血と共に組織に流入したオキシ・ヘモグロビンはほとんど利用されず，健常者と鏡像を示し組織の著しい
10）1

酸素化が証明された
即ち，mtDNAの変異，断片化に比例したミトコ
ンドリアにおける酸素利用の障亨が非侵望的に証明された．

せたpO細胞を95％酸素に暴露する酸素ストレスを与えて，アポトーシスさせ，細胞生存率，細胞数を経目的に観察し，その際のmtDNAの断片化をTDシステムによって解析した．
●−●：4日間連続してストレスを与えた細胞△…△：2日間酸素ストレスを与えた後，大気圧に戻した細胞
ローロ：1日間酸素ストレスを与えた後，大気圧に戻した細胞○…○：4日間大気圧に保った対照細胞
酸素ストレス開始前に49種類であった欠矢は，酸素ストレス3日目にして187種類に激増し，mtDNAの断片化の進行を示した．一方，pO細胞
は酸素ストレスに対して生存率，細胞数を保って
おり，mtDNAの断片化がこのアポトーシスの原因であることを示した13）．
系の細胞は4〜5日で死滅する（図4）．この時，mtDNAは酸素暴露3日にして187種類の欠矢によって著明に断裂していた．一方，mtDNAを欠落させたpO細胞は高濃度酸素暴露の影響を受けず，細胞数は保たれていた13）．即ち，mtDNAの断片化，崩壊がアポトーシスに必要なエネルギーである活性酸素の産生を促し酸素・ストレスによる細胞アポトーシスの原因であることが証明された．

−195−

考

案

ミトコンドリア病患者のメデアン生存時間はmtDNA生殖腺細胞変異の丑伝子型の分類によって大きく変動する．mit￣塑患者が75歳であるのに対して
mit￣＋syn￣型患者は21歳と著明に差がある9）．このことは，生殖腺細胞変異が相乗的な効果を患者に表現することを示しており，mtDNA全周塩基配列決定による退伝子診断は，患者の平均余命を知り，その治療，心臓移植，遺伝子治療への適応などを知る上に極めて有用であると考えられる（図1）．
体細胞変異が主である欠矢については，従来のミト
コンドリア病報告の間で表現型である症状との間に不一致が奇異な点として指摘されていた3）．その原因は，
OrH，OrLがmtDNAの複製のために必須であると言われた2）ため，研究者がOrHおよびOrL領域を避けた部分についてのみ検索を行っていた12）ためである．
我々がTDシステムによって，ミトコンドリア病患者を検索したところ，多量の欠矢が見出された（図2）．
即ち，従来の検索は全欠矢の氷山の一角を検出していたのみであり，表現型との帝掛ま当然であったと言える．綿羅的に全欠矢を検索することによって，遺伝子型と表現型との奇異な不一致は解消されるものと考えられる．またこうした多種類の欠失，その結果としての多量のminicircleの寄掛ま，mtDNAの断片化，細胞死をもたらすものである．こうしたminicircleの昔
境は，従来説明されてきたヒトmtDNA複製機構が再考を要することを示している．またDNAの著しい
minicircle化は生物種中TrypanOSOmaで知られてい

E．T．C．

図5 mtDNA変異，断片化の模式図
末梢組織の生理的酸素温度（50〟M）では，細胞内での主たる活性酸素源は，ミトコンドリア電子伝達系（E．T．
C・）のチトクローム酸化酵素である．即ち，酸素を4電子還元してH20を生成する中．刃体として，1電子還元による02￣，2電子還元によるH202が生成され，一定の割合で（1−3％）漏出し，Fenton反応によってハイロドキシ・ラジカル（OH）となる．反応性に富むOHはmtDNAのデオキシ・グアノシン（dG）との付加
化合物8−OH−dGを生成する．8−OH−dGは複製に際して点変異を生ずるとともに，一定に蓄積すると二重鎖を解裂させ欠矢に導く．こうした変異の蓄掛こよって電子伝達系からの活性酸素漏出が増大して更なる変異の蓄積という悪循環のためmtDNAは断片化崩壊して細胞死に至る．
OH，8−OH−dGの生成を増大せしめる細胞内要因は，遺伝された生赦腺細胞変異であり，細胞外要因としては，各種の毒気 ウイルス感染が挙げられる．また，0Ii産生はガン制御遺伝子p53によって個別に制御されるプロト・オンコジェン産物Bcト2およびBaxによってそれぞれ抑制，促進され細胞のアポトーシスに
関与する．

ー196−

た1）だけであり，その生成，複製機構は現在の分子生
物学では説明がつかず，将来の研究課題である．
ミトコンドリア病患者の運動時における筋肉組織中3）Grivell LA：Mitochondrial I）NA：Sma．11，のオキシ・ヘモグロビンは，遺伝子変異，欠矢による断片化の程度に比例して利用されず組織の著明な酸素化が証明された（図3）．このことは，体細胞変異の蓄積が細胞呼吸活性を低下させ，その結果，組織酸素化

4）Hayaknwa M，Hattori X，Sugiyama S andを促進し，これが要因となって更なる体細胞変異を促す悪循環が実際に人体組織において進行していることを示している8）．このことは，加齢やミトコンドリア
病に伴って不可避的に進行する脳神経，筋肉の萎掛こ，
組織酸素化による細胞死が重要となっていることを示している．

beautiful and essential．Nature341：569−571，
1989．

Ozawa T：AgeTaSSOCiated oxygen damage
andmutationsin

mitochondrial

DNAin

hu一

man hearts．Biochem Biophys Res Commun
189：979−985，1992．

5）Hayakawa M，Sugiyama S，Hattori X，etal：Age−aSSOCiated damage in mitochon−
dorialI）NAin human hearts．MoI Cell
Biocheml19：95−103，1993．

6）Katsumata X，Hayaknwa M，Tanaka M，et

こうしたミトコンドリア病に伴う組織酸素濃度の変化が与える効果についてヒト培養細胞系を用いて再現

al：Fragmentation of human heart mito−

したところ，酸素・ストレスによるアポトーシスに際してmtDNAが多量の欠矢によって著明に断裂していaglng．Biochem Biophys Res Commun202：

ることが判明した13）．一方，pO細胞は高濃度酸素暴露の影響を受けず，mtDNAの断片化が，活性酸素の産生を促しアポトーシスの原因であることが証明された（図4）．
研究の結果得られた事実を総合すると，毒物などの7）Linnane AW，Mar2：uki S，02：aWa T and
Tanaka M：Mitochondrial DNA mutations

外部要因，点変異集積の内部要因によりエネルギー産
生系の構築が障害され，活性酸素の産生を促し，8−
OHTdGが増大してmtI）NAの一部が一本銃状態となることにより大小の欠矢が体細胞変異として獲得され，

8）Ozawa T：Mechanism of somatic mito−

その結果さらに，活性酸素の産生を促進し体細胞変異の新生を促進するという悪循環が，体細胞変異の指数
級数的な増大として実測されたものといえる．こうした欠矢と点変異の蓄積とが複合した変異mtDNA量の9）Ozawa T，Katsumata：K，Hayakawa M，et増大によって退伝子の断片化，崩壊が進行した結果，細胞のエネルギー産生が需要の閲値を下まわると，横B：Extensive tissue oxygenation associated

能障書として顕在化しミトコンドリア病あるいはアポトーシスとして発現し，高齢者の体細胞死，ひいては個体の死を規定しているものと考えられる（図5）．

chem Biophys Res Commun

文chondrial DNA associated withpremature102−110，1994．

as animportant contributor to aglng anddegenerative diseases．Lancet i：642−645，
1989．

Chondrial DNA mutations associated withage and diseases・Biochim Biophy Acta
1271：177−189，1995．

al：Mitochondrial DNA mutations and sur−vival rate．エαnCef355，189，1995．
10）Ozawa T，SahashiK，Nakase T and Chancewith mitochondrial DNA mutations．

Bio−

213：423−438．

1995．

11）Tanaka M and Ozawa T：Analysis of
Mitochondrial DNA Mutations TrotocoIsin

献

Molecular Neurobiology．（Longstaff＆

1）Abeliovich H，Tzfaty Y and ShlomaiJ：A

Revest ed）．The human Press．Totawa，1992．

TrypanosomalCCHC−Type Zinc Finger Pro−
tein which Binds the conserved universal se−12）WallaceI）C：Disease of the mitochondrial
61：1175−1212，

1992．

13）Yoneda M，Katsumata X，Hayakawa M，
al：0Ⅹygen StreSSinduces an apoptonic c

death associated

13：7766−7773，1993．

2）Clayton DA：Replication of animal mito−
chondorial DNA．Cel128：693−705，1982．

−197−

with

mitochondrial genome．

te
ll
rO
⊥
e

quence of kinetoplast DNA minicircles：Is0−
1ation and analysis of the complete cDNAfrom crithidiaL fasciculata．MoI Cell Biol

DNA．Annu Rev Biochem

fragmentation
Biochem Biophys

Res Commun209：723−729，1995．

51）ミトコンドリア損傷によるアポトーシス誘導のシグナル
ーミトコンドリア脳筋症の負の遺伝子治療をめざして
太 田 成 男事

研究協力者

目

麻

生

定

光＊

抗FaS抗体に対する感受性

的

ミトコンドリア脳筋症は退伝的変異を持ったミトコ
ンドリアDNA（mtDNA）によって引き起こされる疾患で，その退伝子診断は部分的に可能となったにもかかわらずその根本的治療法は確立されていない．現在
退伝子治療法が様々な疾患で実験的に模索されているが，その根底となっている考え（正常な遺伝子の導入とその発現）をミトコンドリア脳筋症に適用することはできない．mtDNAは一細胞に数十から数千存在し，
ミトコンドリア退伝子病では正常mtDNAと変異
mtDNAがひとつの細胞に混在している（ヘテロプラズミー）のが通常である．正常mtDNAを選択的に増殖させることができれば，正常mtDNAを導入する必要はない．ミトコンドリア遺伝病の治療法として正常
mtDNAの導入ではなく変異mtDN■Aの除去が有効であると考えている．変異mtDNAは特定の細胞に蓄積する傾向があり，変異mtI）NAを蓄積した細胞を取り除いたあと正常細胞による枚能的補償も期待できる．
細胞を除去するのには炎症を引き起こさないアポトー

5×104の細胞を35−mmディシュに植えついだ．抗FaS抗体4）を加えて24時間保温した．トリプシンを用いて細胞を回収し，トリバンプルー排除法で生細胞数を測定した．抗体未処理のものを100％として感受性（生存率）を計算した．
断片化されたDNAの検出
抗Fas抗体（20mg／ml）でEl38細胞を2，4，6，8，10，12時間処理した．細胞をトリトンⅩ−100で溶解し，正常な核を遠心で除いた．遠心上清にある断片化されたDNAをエタノール沈殿で回収し，アガロース電気泳動で解析した．
細胞核の染色細胞を抗体（20mg／ml）で5時間処理した後カバーグラ
ス上にアルコール固定した．TUNEL法により断片化されたクロマチンを特異的に染色した．後染色としてヘマトキシリンを用いた．
mRNAの調製とRT−RCR法
増植期の細胞をグアニジンチオシアネートで溶解しシスによる細胞死が適している．変異mtDNAが苔頓した細胞に選択的にアポトーシスを誘導する方法を検索した．

01igo（dT）セルロースカラムを用いてmRNAを精製した．01igo（dT）をプライマーにして逆転写酵素を用いてmRNAからcDNAを合成した，Fas抗原のmRNA

材料と方法

量を故討するためにFas遺伝子の。DNA5）に特異的な一組のプライマーと［a−32p］dCTPの存在下PCRに
よってFasのcDNAを増幅した（8〜15サイクル）．

用いた細胞
細胞EI】8およびEB3はHeLa細胞由来でmtDNAを完全に欠失している1）．EB8にCPEO患者由来の部分欠失（約5kb）したmtDNA（欠失mtDNA）導入して得たサイプリドCP8細胞ではひとつの細胞の中に正常
mtDNAと欠失mtDNAが共存している2）．サイプリ
ドCMl−ト4−5は心筋症患者からミトコンドリア
tRNA−Ile迫伝子に点変異がある変異mtDNAをEB8に導入して得られた3）．対象としてEB8に正常胎児由来のミトコンドリアを導入したサイプリドFt2−11を用いた．

＊日本医科大学老人病研究所生化学部門

個々のPCR反応を定量的に比較するために，PCR反応途中で解糖系酵素グリセルアルデヒドリン酸デヒド
ロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子に特異的なプライマーを加えてGAPDHのcDNAを増幅した（15サイクル）．
ポリアクリルアミド電気泳動でPCR産物を分画した後，FasのPCR産物の放射能をGAPDHのPCR産物の放射能で規格化し，対象のそれを1にしてFas遺伝
子発現量の増加（倍率）を計算した．
CP8サブクローンの欠失mtDNAの定量
細胞からSDSとプロティナーゼKを用いて全DNAを調製した．制限酵素動じⅠⅠで切断後，アガロース電気泳動で正常mtDNA（16kb）と欠失mtDNA（11kb）を分けた．メンプレンにプロットしたのち，これらの−198−

mtDNAを32pで標識されたmtDNA特異的なプロー
ブを用いて検出した．正常mtDNAと欠失mtDNAのそれぞれの放射能の和を100％として，欠失mtDNAの相対的含有量を求めた ．
結果と考察
変異mtDNAを持つ細胞の抗FaS抗体に対する感受性
mtDNAを持たない細胞EB8は，1，10ng／mlの抗体に対しそれぞれ70，35％の生存率を示し，感受性であるに対し対象の細胞Ft2−11では耐性であった（図1）．
20ng／mlの抗体に対する他の細胞の感受性を調べた（図2）．mtDNAを持たない細胞EB8，EB3は10％から20％の生存率で，変異mtI）NAを持つ細胞CM1−1−4−
5，CP8−4（CP8のサブクローンのひとつ）でも30％の生存率であった．Fas抗原と同じレセプターファミリーに属するTNFレセプターのリガンドTNFα（660U／ml）に対する感受性にはEB8，Ft2−11は差を示さなかった．抗Fas抗体がFasリガンドとしてFas抗原と結合し，選択的に遺伝的に異常なミトコンドリアを持
つ細胞を死に至らすことがわかった．
抗F85抗休による細胞死の特徴
EB8のFas抗原を介した細胞死がアポトーシスであるか否かを検討した．抗倖処理6時間で著しく斬片化されたDNAが検出され，ヌクレオソーム単位からなる梯子状の切断パターンが認められた（図3）．抗体処理5

F8S遺伝子発現の増加
抗Fas抗体による細胞死の原因を明らかにするために，
poly（A）＋RNAを細胞から調製し，RT−PCR法でFas遺伝子の相対的転写量を検討した．FasのcDNAに由来するPCR産物量をGAPI）H cDNAのそれで規格化したところ，対象のFt2−11に比べてEB8（mtDNAの完全欠損）で50倍，CM1−1−4−5（点変異を持つmtDNA）で3倍，Fas遺伝子の転写量が増加していることがわかった（図4）．部分欠損がある欠失
mtDNAを持つCP8も以下に述べるようにFasmRNAの量を高めていた．これらのことから，異常なミトコンドリアを持つ細胞ではFas遺伝子の発現が誘導されており，これが原因の一つとなって抗Fas抗体によって細胞死に至ることが示唆された．
欠失lⅢDNAを持つ細胞でのFaS遺伝子の発現量，坑Fas抗体感受性および呼吸鎖酵素活性の相関関係
CPEO患者由来の細胞からEB8にミトコンドリアを導入して得たCP8では，正常mtI）NAと欠失mtDNAが種々の割合で共存している（ヘテロプラズミー）．CP8から5個の細胞をサブクローン化して，これらの細胞が持つ欠失mtDNAの割合を調べた．さらに，これらサブクローンの抗Fas抗体に対する感受性とRT−PCR
法でFas遺伝子の転写量を調べ，その結果を図5に示した．5個のサブクローンでFas mRNAの発現量が︵邑倉云書＞ニUU

時間の核では凝縮したクロマチンが観察され，細胞体積の減少および空胞の発達がみられた．同じように抗体処理したFt2−11ではこれらのことは認められなかった．以上の結果から，抗Fas抗体によるE工場の細胞死はアポトーシスであると結論された．

100

Ft2・ll EB8EB3

CM CP8−4
1・1・4・5

CelIs

図2

0．1

1

10

100

Anti・Fasantibody（ng／ml）
図1抗Fas抗休に対する細胞の感受性．
mtDNAを持たない細胞EB8（○）は正常mtDNAを持つ細胞Ft2−11（⑳）に比べ抗Fas抗体に対して感受性であった．

−199−

各種変異mtDNAを持つ細胞の抗Fas抗体およびTNFαに対する感受性．
mtDNAを持たない二つの異なる細胞（EB8とEB3），点変異があるmtDNAを持つ細胞（CM1−
1−4−5），部分欠失しているmtDNAを持つ細胞（CP8−4）いずれも抗Fas抗体（20ng／ml）に感受性であった．TNFα（660U／ml，24時間処理）に対してはEB8とFt2−11に感受性の差は認められなかった．

CellsTemplates

qcles＋ANTJ・Fas（hr）

2

46

81012

EB8

CM1−145

CDNA

・RT cDNA・RT cDNA

Ft2・11
・RT

2827262524232乱調292830諏2928刃

Fas−1｝l｝−＿

．

…

GAPDH
（X15）

図4RT−PCR法によるFas mRNAの発現量の解析．
各種細胞から調製されたmRNAから01igo（dT）
をプライマーにして逆転写酵素でcDNAを合成した．Fas cDNAに特異的なプライマーを用いて，その一部の領域をPCRによって増幅した．
反応のサイクル数を各レーンの上部に示した．最後の15サイクルはGAPDHのcI）NAに特異的なプライマーを加えて行われた．PCRは［a−32p］
dCTP存在下で行った．mtDNAを持たないEB8，
点変異mtDNAを持つCMl−ト4−5では正常
mtDNAをもつFt2−11に比べFasの発現量が50（bp）1136−−■

587＿．＿
434−■一倍，3倍にそれぞれ増加していた．染色体DNAのmRNA試料への混入を検討するために，−RTのレーンでは逆転写酵素を除いてeDNA合成反応させた試料で行ったPCR産物を解析した．
FasPCR産物：346bp
GAPDH PCR産物：214bp

驚二盛87−
図3 断片化されたDNAの検出．
mtDNAを持たない細胞EB8を抗Fas抗体（20ng／ml）で2〜12時間処理し断片化されたDNAを調製してアガロース電気泳動によって分析した．
抗体処理6時間でDNA断片化がはっきりと認められた．
一ANTトFas：抗体未処理の細胞
M：分子量マーカー

誘導されやすかった．以上のように，変異mtDNAを持つ細胞をFas抗原を介したアポトーシスによって生体から除去することは可能である．
文

献1）HayashiJI，Yonekawa H，Watanabe S，et
2．4倍から4．5倍増加していた．しかしながら，抗体に対する感受性はFas mRNAの発現量の増加に比例していないことがわかった．欠失mtDNAを一番多く持

al：Somatic cell genetical approaches tomitochondrialdiseaSeSin

ropathology

つ細胞はFasニnRNAの発現量の増加が一番低いのにもかかわらず，抗体に対する感受性は一番高かった．
欠失mtDNAを62％以上の割合で持つ細胞では，ミトコンドリアの蛋白合成活性とシトクロムCオキシダー

progressinNeu−（edSSatoT＆DiMauro S）Ra−ven Press，Ncw York，1990，Vol．7，pp93−
102．

2）HayashiJI，Ohta S，Kikuchi A，et al：In−
troduction of disease−related mitoehondrial

ゼ活性が著しく低下している2）．Fas抗原の発現量が増加している細胞のFasリガンドに対する感受性の強DNA deletions

さは，その細胞が持つ呼吸鎖酵素活性に依存していることが考えられる．

dySfunction．Proc Natl Acad Sci USA88：

結into HeLa cells lacking

mitochondrial DNA resultsin mitochondrial

10614−10618，1991．

3）HayashiJI，Ohta S，Kagawa Y，et al：論

FunCtionaland Morphological Abnormalities

遺伝的に異常なミトコンドリアを持つ細胞ではFas
遺伝子の発現が高まっていた．また，Fas遺伝子発現の増加がわずかであってもミトコンドリアの機能が十分低いと細胞はFasリガンドによってアポトーシスがー200−of mitochondriain human cells containing
mitochondrial DNA with pathogenic point
mutationsintRNAgenes．J BioIChem269：

19060−19066．

4）Yonehara S，Ishii A and Yonehara M：A
5
4
3
2

45

50

55

60

65

﹃富OL︶uO量JUSUgS丘亜cell−killing monoclonal antibody（anti−Fas）
to a cell surface antigen co−downregulatedwith the receptor of tumor necrosis factor．

J Exp Medl田：1747−1756，1989．
5）Itoh N，Yonehara S．Ishii A，et al：The
polypeptide encoded by the cDNAfor humancell surface antigen Fas can mediate apop−
tosis．Cel166：233−243，1991．

70

MutantmtDNAcontent（％）
Respiratory Viable
Tevel without
glu00Se

図5

Pa相alIy
deficient

LossoI
activiyac伽吋

部分欠失している変異mtDNAの相対含屋と抗Fas抗体感受性とFas mRNA発現量の相関関係．
細胞CP8には部分欠矢が起きている変異
mtDNA（欠失mtDNA）と正常なmtDNAとが共存している．CP8から5個の細胞をサブクローニ
ングした．それぞれの細胞について，細胞のもつ全mtDNAに対する欠失mtDNAの相対含量（妨抽），抗Fas抗休に対する感受性（○），RT−
PCR法によって検討されたFas mRNA発現量の増加（甘）を示した．欠失mtDNAの相対含量50％まではグルコース非存在下でも細胞は生育
し，相対含量約60％を境にしてミトコンドリアの蛋白合成活性とシトクロムCオキシダーゼ活性が著しく減少する2）．

−201−

Ⅹ．治

療

52）プレドニゾロンによるmdxマウスの実験的治療
高

木

研究協力者

昭

渡

は じ めにDuchenne塑筋ジストロフィーの副腎皮質ステロイ
ド投与による治療では筋九 肺活量などの点で改善を認めたとする報告が散見される1）〜4）．一方，mdxマ
ウスについてはWelIerらによって行われた実験がある
が，血清CK，筋病理所見についての改善は認められていない5）．しかし，彼等の実験では体重1kgあたり1mgと通常量のプレドニゾロンが授与されており，大量の副腎皮質ステロイドを授与した際の変化については不明である．今回我々はmdxマウスに対しプレ
ドニゾロンの大量投与を行い，筋壊死の進行を抑制す
るか否かを検討した．

夫＊

辺

知

司＊

線維化や脂肪変性は認めなかった．壊死線維数，周辺
核線維教の比率は両群で有意差を認めなかった（義3−
1，か．単位面墳あたりの浸潤細胞群集巣の個数は，PSL投与群のTAにおいて減少していた（表3−3）．
dystrophin染色では，PSL投与群の一部においてdystrophin陽性細胞の小群集が認められた（図2−A，B）・
考案
DMD骨格筋に対するPSL治療の効果については2
つの機序が考えられている．すなわち免疫系の抑制と筋再生の促進である6）．xisselらはDMD生検筋を用
義1体重k，平均±SD）

対象・方法
対象として4〜5週給のmdxマウスを用いた．内訳
は，プレドニゾロン投与群13匹，対照群16匹とした．
プレドニゾロン（PSL）投与群には，PSL30mg／kg（生食0．1mlに溶解）対照群には生食0．1mlを過6回4週
間，背部に皮下注射した．注射終了後，体重測定しpentobarbitalによる深麻酔下で，心臓または腹部大動脈より採血した．血清CK活性をSSCC準拠法により瓢足した．大腿四頭筋鴨F）と前脛骨什A）より凍結標本を作成しHE染色を行った．横断面において500〜1，000本の筋線推中の填死線練乳 周辺核線維数を計測した．壊死線維教の一部は，壊死面稔から推定した．標本1平方ミリあたりの浸潤細胞集団の個数を計測した．D90抗体を用いBiotinーStreptavidin法によりdyStrOphin染色を施行した．体重，血清CX値，
壊死線推数および周辺核線維数の比率（％），炎症細胞群集巣の個数についてt検定法にて有意差を検定した．
結

19．6±3．3

対

19．5±2，9

照t O．79（p＞0．1）

義2血清CX債（IU／L，平均±SD）
P S L

20400

±

対

18000

±12300照18100

t O．39（p＞0．5）

果

体重は，両群間で有意差を認めなかった（表1）．血清CX債は，個体差によるばらつきが大きかった．平均値ではPSL投与群がむしろ高値を示したが，有意差は認めなかった（表2）．組織学的には，両群ともに壊死・再生線艶 炎症性細胞浸潤の所見を認めた（図1）．
＊虎の門病院神経内科

P S L

図1PSL投与群の大腱四頭筋のHE染色標本．細胞良
潤をともなう境死線経，中心核を有する再生線経
を認める．

−205−

蓑3−1壊死線維数（％，平均±SD）
3−2 周辺核線維数（％，平均±SD）
3−3 浸潤細胞群集巣（個／平方ミリ，平均±SD）
QF

TA

P S L

4．4±4．7

4．1±5．0

対 凧

7．3±8．24，1±4．5

t l．03（p＞0．1）0．02（p＞0．5）（QF；大腱国頭筋，TA；前歴骨筋）
QF

TA

P S L

7．9±4．0

12．4±9．4

対 凧

8．5±3．1 10．8±4．0

t o．23（p＞0．5）0．58（p＞0．5）

QF

TA

P S L l．3±0．2

0．1±0．0

対 照 1．1±0．1

0．6±0．1

t O．14（p＞0．5）2．25（pく0．05）

い浸潤リンパ球の解析を行っている．その結果，総細胞数，CD8陽性細胞の減少を認めたと報告した．しかし，壊死細胞の減少は認められなかった7）．我々の実
験では，PSL投与群のTAにおいて浸潤細胞集団の個数が減少していた．このことはPSL投与がmdxマウスの免疫系を抑制した可能性を示唆した．しかし，壊死線維教，周辺核線維数については対照群と有意差は認められなかった．すなわち免疫系の抑制を通じて筋壊死の進行が抑制される証拠は得られなかったといえる（周辺核筋線経は壊死・再生の過程を経ていない正常筋線経と考えている）．
筋再生の促進については正常筋とdystrophy筋で同じ作用を示すか否かは議論がある．mdxマウス筋においてヒトdystrophy筋と同様の作用があるかどうかは知られていない．i花山か0のヒト正常筋においてはス
テロイドが筋新生の過程で筋管細胞の壊死を抑制したという報告がある．その結果，新生筋が増加しdystrophin発現量も増加したと述べられている8）．一方，dystrophy筋では筋新生が抑制されたという報告がある．これは筋芽細胞の融合を阻害した結果であると説明されている9）．しかし，dyStrOphin発現に関しては筋芽細胞の融合とは無関係に増加させたという報告もある10）．BurrowらはDMD生検筋において，
western blotting法によってdystrophinの定量を行った．PSL投与によるdystrophin発現量の増加ハ

図2qA，B PSL投与群の大腿四頭筋のdystrophin染
色標本．dystrophin陽性線経の小群集を認める．
認められなかった．しかし，組織化学的検査ではdystrophin陽性線経の増加が認められたと報告している11）．我々の実験でも，PSL投与群の一部においてdystrophin陽性線経の小群集が認められた．これがPSL投与の効果かどうかはさらに検討が必要だが，興味深い所見と考えられた．
結論

1．血清CX億，壊死線維および周辺核線総数の比率についてPSL投与群と対照群の間に有意差は認められなかった．
2．少なくともmdxマウスにおいては，副腎皮質ステ
ロイドの大量投与によっても筋壊死は抑制されな
かった．
文

献

1）De SiIva S，Draclman DB，Mellitis D，etal：Prednisone treatment

in

Duchenne mus−cular dystrophy．Long term benefit．Arch
Neurol」的：818−822，1987．
2）Griggs RC，Moxley RT，MendelJR，et al：−206−

Prednisonein Duchenne dystrophy．A ran−

opsiesdomiZ；ed，COntrOlled trial defining the time

Duchenne muscular dystrophy．Neurology

prednisone−treated and untreated

41：667−672，1991．

course and dose response．Arch Neuro148：8）Sklar RM and Brown Jr RH：Methyl−383−388，1991．

3）Kawai H，AdachiX，Nishida Y，et al：De−
CreaSed in urinary excretion ofin

prednisoloneincrease dystrophinlevels by

3−

inhibiting myotube death during myogenesis

methylhistidine by patients with Duchenneof normal human musclein vitro．J NeuroI

muscular dystrophy during glucocorticoid

ScilOl：73−81，1991．

treatment．J Neuro1240：181−186，1993．

9）HardimanO，BrownJr RH，Beggs AH，et4）AngeliniC，Pegoraro E，Turella E，et al：

al：Differential glucocorticoid effects on the

Deflazacortin Duchenne dystrophy：Study

fusion of Duchenne／Becker and control mus−oflong−term effect．Muscle Nerve17：386−

cle cultures：Pharmacologic detection of ac−

391，1994．

celerated aglngindystrophic muscle．Neu−
rology42：1085−1091，1992．

5）Weller B，Massa R，Ⅹarpati G，et al：
Glucocorticoids andimmunosuppressants do10）Hardiman O and BrownJr RH：Methyl−

not change the prevalence of necrosis andprednisolone selectively affects dystrophin

regenerationinmdx skeletal muscles．Mus−
Cle Nerve14：771−774，1991．

expressioninhuman muscle cultures．Neu−

6）Brown Jr RH：Prednisone therapy for11）Burrow KL，Coovert BS，Bulman DE，etDuchenne，s muscular dystrophy．N EnglJ

al：Dystrophin expression and somatic re−Med320：1621−1623，1989．

versionin

rology43：342−345，1993．

7）KisselJT，Burrow KL，Rammohan KW，etal：Mononuclear cell analysis of muscle bi−207−

prednisone−treated and untreatedI）uchenne dystrophy．Neurology41：661−666，
1991．

53）ジストロフィン欠損症heterozygOteの筋病理学的研究
田

研究協力者

松

原

四

連

郎精

等＊

磯

崎

英

治＊

宮

結

背景と目的
Duchenne型筋ジストロフィーの病態解明が進み，欠租したdyStrOphinの補充が試みられている・しかし得られた 部分的にdystrophinが存在する状態 を治療に結びつけるためには，有用なdystrophinの存在様式を確かめる必要がある．これを検討するモデルの1つとして，ヒトおよびm血マウスheteroヱygOteの筋病理学的な解析を行った．特に，ヒトとm血マ
ウスのheterozygoteの間にみられる症状および病理学的な差には重要な意味が含まれている可能性があり，この点に注目して調べる必要があると考えられる．
Dystrophinの存在様式を考える上で，特に注目されるのは微細なレベルでのdystrophinの構造である
が，この点，近年の共焦点レーザー顕微鏡（CIJSM）による知見は特に重要な情報をもたらした．hetero一
名ygOteの解析にあたっても不可欠なアプローチと思われる．今回はなかでも，dystrophin存在部と欠規部の移行状態，および欠現部に増加するdystrophinre−
latedprotein（DRP，utrOphin）の構造に注目して観
察した．

本

和

人琳

果

正常筋dystrophinのCLSM像では，横断面では陽性部分は筋線維周辺に見られ，一部周期的に濃淡に差のあるほぼ連続した線として観察された（図1A）．縦断面でも類似の所見であった．筋膜を筋線維長軸に近い
斜め，すなわち接線方向に検断するいわゆるun face
像では．抗dy或rophh抗体と反応するリボン様の構造が0．37から0．劇〝mのほぼ一定の間隔で，筋線維長軸と直角の方向に配列するのが見られた（図18）．さらに
このリボン様構造は，85ないし170（平均127）nmの間
隔で平行に配列する幅85から255mmの紡錘状構造の列から構成されていた個1C）．
通常の蛍光顕微鏡で観察すると，D11ehenne carrier
では，症例1，2のいずれでもdystrophinの蛍光強度
は多くの筋線経で欠扱しているか，あるいは微弱で不規則であった（図2Å）．dystrophinが欠損した線経の大部分でspectrinは保たれていた・
CLSM像（図2B）でもdystrophinの分布は弱く不規則であった．正常筋と似た周期性を示す濃淡の換り返
しかみとめられ線経が存在する一方，dyStrOphinが認められない線経が多数観察された．

対象と方法

〇二

I）uchenne型筋ジストロフィーのdefinite carrier2
例の生検筋を用いた．抗dystrophin，SPeCtrinおよび
dystrophinrelatedprotein（DRP）抗体を使用し，主にF汀Cを用いた蛍光抗体法でCLSM（カールツァイス
LSMlO）により観察した．対物レンズとして63倍油産
レンズを用い，スリット幅20，コントラストと輝度は固定した．通常はズーム率160倍，8秒の低速スキャ

図1A Confocallaserscanmicrograph（CLSM）of

ンで16回のlinearaveragingを行った．別に抗dys−
trophin抗体をビオチンで標識し，筋に作用させた後
FITC標識streptavidinを作用させる直接法でも観察した．
一方，雄m血マウスと雌BlOマウスの交軒で得られたFl雌の俳腹筋を切除し，直接法でdystrophinを

dystrophinpositive StruCtureina trans−verse section of normal muscle．Altera−
tion

in

brightnes8

0f positive structure

was noticed along the periphery of thefibre．

B h an en face view，numerOuS Parallellines were seen runnlng perPendicular tothelongaxis ofthemusclefibre・

FITC標識StreptavidinとABC法で可視化した・

C Eachline consisted of rod−8haped struc−tures．Thelongaxesofthe rods ran per−pendicular to theline・＊東京都立神軽病玩＊＊東京都立神経病院神経内科−208−

図2A Dystrophinofskeletalmuscle of a female
carrier ofDMD（ca．sel）．
B CLSM of dystrophinin a transverSe SeC−
tion of the carrier muscle．

CAnenface view of dystrophinin the car−rier muscle at an area between

図3A Dystrophin related protein（DRP）in a．
transverse section of female DMD carriermusele．

dystrophinpo8itiveand negative regions・

B CLSM of DRPina transverse section．
C An en face view of DRP in a carrier

Carrierのenface像では，dystrophinがよく発現した筋線経では正常と同じ所見が得られた．しかしdystrophin陽性と陰性部位の移行部におけるen face
像ではほぼ一定の間隔で配列する構造が不規則に中断され，中断部位の近くには構造のはっきりしない陽性部分が認められた（図2C）．
Carrierでは，I）RPの発現が一部の線鰍こ認められた（図3A）．DRPのCLSMでは横断面で淡いながら
dystrophinに似た濃淡の繰り返されたプロフィルが見られた個38）．しかし，少数のみ観察できたen払ee
像ではdystrophinで観察されたような微細な配列は確認できなかった（図3C）．
Mdxのheterozygoteでは，dyStrOphinの筋表面での発現は比較的保たれており，筋線維横断両全周にわたる欠損は比較的少数しか観察されなかった．
考蕪

CLSMでdystrophinの形態についてはMasudaら1），

Minettiら2），Ponsら3）の詳細な報告がある．従来正常筋でdystrophinが周期的に濃淡を示し，一部破線

musele．

状にみえることが指摘されたが，今回長時間スキャンを多数回平均加算すると，これが一部周期的な濃淡を伴ったほぼ連続した構造として観察された．このような観察条件の差や，ヒトと動物の差が影響している可能性も考えられる．さらにen払ce像では，すでに従来報告されている周期性をもって並ぶリボン状の構造が観察され，従来の報告と共通する点であった．しかし，今回の観察ではリボンの配列の周期は約400nmと従来の所見より短めで，また紡錘状構造の長さおよび隣接する紡錘間の距能は100から170nmであった．この数値は従来CLSMで観察された間隔周期よりむしろ
電顕免疫組織化学的にWatkhsら4）の観察した配列周期である約125nmに近いものと考えられる．
Duchennecarrierでは，dystrophinの量的な減少と不規則性があると思われた．DRPに関しては横断面
でPonsらが記載したようなドット状の所見に対応すると思われる濃淡の繰り返しが見られたが，従来記載のないenface像に関しては明瞭な規則的酎列を示す−209−

観察できたenface像が少数だったことから，この点についてはなお検討する必要がある．

文献1）Masuda T，Fujimaki N，Ozawa E andMdxマウスのheterozygoteにおいてdystrophin欠祖線柾が少ないことは既にTanakaら5）により報告さ

Ishikawa H：ConEocallaser microscopy ofdystrophinlocalizationingulrlea Pig skeletal

れている．ヒトとマウスのheterozygoteの間に見られるこの差異の背景にどのような病態の差が存在するのmuscle fibers．J Cell Bioll19：543−548，

かは，きわめて重要と思われるが，依然不明である．
今後はこの点を含めてマウスのbeterozygoteにおけるdystrophinの動態について更に検討を続けたい．

2）Minetti C，Beltrame F，Marcenaro G and

1992．

Boniala E：DyStrOPhin at the plasma mem−brane of human muscle fibers shows a
COStamericlacalization．

Neuromusc Disord

結論
1．共焦点レーザー顕微鏡で正常骨格筋の筋膜の接線

3）Pons F，NichoIson LVB，Robert A，Voit T

方向の断面で，抗dystrophin抗体と反応する構造がほぼ一定の間隔で配列する部分が見られた．

and LcgerJJ：Dystrophin and dystrophin−related protein（utrophin）distributionin nor−

2．Duchenne carrierではdystrophinの蛍光強度は

mal and dystrophin−deficient skeletal mus−

多くの筋線経で欠損または弱く不規則で，個々の構造の大きさや蛍光強度が不規則となっている傾向が見られた．

Cles．Neuromusc DiSOrd3：507−514．1993．

3．CarrierではDRPの発現が見られたが，低倍率で強弱の繰り返しは見られるものの，高倍率では明らか
な等間隔の配列構造は確認されなかった．

2：99−109，1992．

4）watkins SC，Hoffman EP，Slayter HS andKunkelLM：ⅠmmunOelectronmicroscopiclo−

Calization of dystrophinin myofibres．Na−

ture㍊：863−866，198＆
5）TanaknH，HayashiXand Ozawa E：Posi−

4・Mdx hetero2；ygOteでは，dystrophinの発現は比較的保たれ 全周にわたる欠損は稀であった．

tiveimmunOStaining with
Acad678：148−152，1991．

−210−

dystrophin anti−

bodiesinmdx skeletal muscle・

ProcJpn54）mdx骨格筋崩壊抑制の試み（治療）
吉

田

研究協力者

瑞

松

子＊

崎

哲

也＊

は じ めに

ラー画像解析システム；オリンパスSP500）で面積を私達は，Duchanne塑筋ジストロフイP症（DMD）の骨格筋崩壊の原因を見出すために，モデルマウス
bldx）を用いて，骨格筋崩壊現象を，細胞レベルで調べてきた．その結果，刺激により，mdxマウス骨格筋のCa2十一Channelが，対照よりも深い電位で活性化し，そのChannelを通過して細胞外Ca2十が細胞内に対照よりも多く流入する．増加した細胞内Ca2十によってある時過収縮を生じ，筋崩壊を生じる．その筋崩掛も L一
型Ca2十一Channel阻害剤によって，抑制される1）．即ちIr型Ca2十一Channelから流入するCa2十を抑制すれば，骨格筋崩壊も 防ぐことが出来るということである．
今回は，L一塑Ca2十−Channel阻害剤を用いて，mdx
マウスの個体レベルで，骨格筋崩壊抑制を試みた．

測定，線維数測定可能な面積より比例計算で，壊死線維数を算出した．CX借，組織標本計測値は，nOn−

試料と方法
mdxを無投与1群，阻害剤の溶媒投与1群，阻害剤
投与2群の4群に分けた．各1群は，3組のmdxマウ
スから生まれた仔ども，10匹から16匹を使用した．レ塑Ca2十一Channel阻害剤は，疎水性の性質を持つ，
nifedipine（純度99％，Biomol）を使用し，15％etha−nol（純度99．5％ 和光），15％polyethylene glycol
PEG：＃400，関東化学）を含む0．9％NaClに溶解した．その濃度は，6mg／Kg／dayと14mg／Ⅹg／dayとし，1日2回に分けて皮下投与（肩，背面）した．容量は1回につき，体重4gから6gまでと6g以上1祖まで，それぞれ体重比例で0．05−0．1mlとした．投与期間は骨格筋崩壊抑制を調べるために，光学顕微鏡上筋崩壊が開始していない，日齢8日目より，筋崩壊が生じている飢日日までの17日間投与した．投与終了翌日，日
齢25日目にether深麻酔をし，腹大静脈より採血した．
血液は，室温に1時間放置後，血清を分離し，CK借を測定した．また同時に，前頚骨筋を採取し，凍結標本とし，厚さ10〟mの切片を作成，H＆E染色した．
H＆E染色組織標本で，全線推数（平均，2200本）に対する，壊死・再生線株数の割合を計測した．壊死部位
で線維数を計測できない部分は，画像解析（高速カparametricのTukey法で統計処理，検定を行った．
結果
血清CK借の結果を図1及び蓑に示す．mdx無投与
群の血清CK値は，バラツキが大きかった．無投与群の血清CX値に対して，溶媒投与群及び溶媒とnifedipine投与群のCK借は1／2以下となり，p≦0．01の確立で有意差を以て減少した．しかし，nifedipine
単独のCX借減少効果は認められなかった．
前頸骨筋組織標本の全線社数に対する，壊死・再生
線維数（ダメージ線維数）の割合を図2と表に示す．無投与群の結果は，CX借の結果と同様にバラツ車が大きかった．無投与群の壊死・再生線維数に対して，溶媒投与群の壊死・再生線維数の割合は，0．01＜p≦0．05の確立で有意に減少し，nifedipineと溶媒投与群の壊死・再生線推数は，p≦0．01の確立で有意差を以て減少した．CK借の結果と同様に，溶媒が壊死・再生線
経を減少させた．nifedipineを投与した群は，投与量に応じて壊死・再生線経が減少する傾向を示した．

結論と考察
mdxマウスの個体レベルで，nifedipine（L一塑Ca2十
一Channel阻書剤）の有意な効果は，認められなかった．
理由として次のことが考えられる．1）nifedipineの効
果をみるためには，nifedipineを溶解した溶媒系が適切でなかったこと，2）nifedipineの血圧降下作用が，8時間で無効となるので，1日に2回の投与回数は治療
蓑 血清CX借と前頚骨筋の組織標本金筋線維数（平均2200本）に対する，（壊死・再生線維）ダメー
ジ線椎の割合mean±SD，n：個体数
無投与がCK低く川／l）

12400±4∝X）
nf14

ダメージ線拙くl）＊国立精神・神経センター神経研究所

37±12
nr16

−211−

溶媒投与桝
4750±200

nifedipine nildipine
6叩／【又／血y14叩／【R′day

56冥）±24甜

5珊土205【Im■ll ntほ

21±6

れ■10

19±9
ntll

lItll

16±d
n■10

4
つ 一

0

t

0

巴句U⁝︼OJUUN

6

巴りqCl雲○↑亡⁝−eUuU

●●γ●

：十●

・・・TI

・ ・ ・ ⊥ −

0

Sol

1
0080

︵辞︶001H

2︵もl火．︻︑⊃−︶巳U

Cont

Conl So1

14

6

14
1

l

1

Nif（mg爪釘day）

Nif（mg凡打day）

図1血清CK値（25日齢）
Cont：無投与群，Sol：溶媒投与群，N茸：
nifedipine投与群，−：平均値，・：P≦0．01

図2前頚骨筋の壊死・再生線維数（25日齢）
Cont：無投与群，Sol：溶媒投与群，Nif：nifedipine投与群，−：平均値，暮：0．05＜p≦0．01，鑓：p≦0．01のためには不足であったことである．しかし壊死・再生線維数の結果では，nifedipine投与量に応じて，壊死・再生線維数が減少する傾向を示しているので，nifedipineのL−型Ca2十一Channelの阻書効果を無視することはできない．
溶媒のみの投与で，CK値，壊死・再生線維数が有意に減少し，筋崩壊が抑制された．その作用機序は
現在のところ分からないが，溶媒中のPEGが作用していると考えられる．両親媒性の性質を持つPEGが，どのような作用をしているのか不明である．しかし次のようなことが考えられる．1）細胞膜の疎水性部位と接し，単に糊のような働きをし，細胞膜を補強し，細胞の崩壊を防いでいる．2）PEGのエーテル結合の酸素は，電子共与体である．この酸素は金属イオンを抱え込む性質を持つ．すなわちクラウン構造的構造を取り，Ca2十を抱え込むと考えられる．疎水性であるエチレン基側は，細胞膜と接合する可能性がある．従ってクラウン構造的構造をとって，L一塑Ca2十一Channelに作用し，Ca2十電流を減少させている可能性がある．
今後，PEGの細胞膜に対する作用を調べ，最も良い筋崩壊抑制の条件を見出すよう努力する．
文献1）吉田瑞子，松崎哲也，和田圭司：強縮刺数による
mdxマウス骨格筋崩壊現象 平成6年度厚生省精神・神経疾患研究委託費 による研究報告集，p56．

−212−55）mdxマウスに対する治療的研究：
idebenoneとglycyrrhizinの効果
栗

研究協力者

大

迫

正

原

無

行＊

岸

筋ジストロフィーの治療は，Duchenne型筋ジスト
ロフィーでdysytorophinが欠扱していることが明らかになってからも，困難を極めている．治療法としては，筋芽細胞移植，遺伝子治療，薬物療法などが試みてこられたが，実用になる治療法は未だ見出されていない1）．
我々は治療開発の目的で，種々の薬物をdystrophinが欠損しているmdxマウスに使用してみて，治療効
果のある薬物が見出せないものかと実験を行ってきた．
また，治療薬物の評価が客観的にできるように，筋細胞内記録によってmdxマウスの生理学的異常を見出し，これを指標として薬物の効果をみてきた．客観的指標がなくて薬物の効果をみるのは，極めて困難なことである．mdxマウスでは，この点生理学的に次のような異常が見つかっている．
筋細胞膜のdystrophinが欠損しているmdxマウス
では，1）膜電位が低い筋線経と膜電位が正常な筋線錐が混在し，2）微小電極を筋細胞内に刺入した際
myotonicburstが筋線鮭の約20％に認められる2）．
我々は，平成6年度の本研究で，脳代謝賦活剤であるidebenone3）4）を用い，mdxマウスに対して治療的効果の換討を行ったところ，40mg／1という濃度で用いると，膜電位を改善し，myOtOnic burstを完全に阻止することができた．平成7年度は，投与量を2〜20mg／1と，より少ない投与量で効果が得られないかどうかを検討した．また，I）uchenne塑筋ジストロ
フィー患者の車椅子移動速度を改善させたという報告
5）のあるglycyrrhidnについても筋細胞膜に対する治療的効果があるか否か検討した．
方法

4〜8過齢由mdxマウスの横隔膜標本を作成し，3MのEClを満たしたガラス管微小電極を自作して，筋細胞内記録を行った・実験は，95％02＋5％CP2め混合
ガスで酸素化したTyrode溶液にidebenoneを種々

事＊

雅

彦＊

木

下

真

男＊

rrhiZ；inは，50mg，250mgの濃度で，Tyrode溶液に加えて筋細胞内記録を行い効果をみた．対照として，同週齢のBlOマウスを用いた．
結果
平成6年度の研究では，次の4点が明らかになった．
1）mdxマウスの膜電位は，平均−75mVと対照の
BlOマウスの平均膜電位−90mVに比べて低い．これはmdxマウスの筋標本では，正常な膜電位の筋線経と，−70mV以下の筋線経が混在しているためである．
idebenone40mg／1を加えると，膜電位の平均値は−84．5mVと有意に改善した．
2）myotonic burstの出現率は，Tyrode溶液のみの
mdxマウスにおいて，筋線推250本中55本と，約22．0％にmyotonic burstが認められたが，idebenoneを加えたmdxマウスでは，筋線維268本中myotonic
burstは全く認められなかった．
3）mdxマウスはanoxiaに弱く，膜電位の変化を時
間経過を迫ってみると，90分間のanoxiaで，膜電位は，−76．2mVから一朗．OmVとなり12mVの低下が起こったが，idebenoneを加えておくと3．5mVの低下に抑えられた．対照のBlOマウスでは，90分間のan−
0Ⅹia負荷でも膜電位は，ほとんど低下しなかった．
4）筋標本に聞上刺激による運動負荷を与え，膜電位の変化を記録した．B−10マウスと，mdxマウスに
30Hz卜5Vの閲上刺激を5分間加え，その前後の膜電位の平均値を比較すると，B−10マウスの膜電位は刺激後，約0．8mVの低下しかみられなかったが，mdxマ
ウスは刺激後的6．4mVの低下がみられ，Wilcoxon検定にて1％以下の危険率で有意差を認めた．この結果
から，mdxマウスは運動負荷により膜電位が低下す
ることがわかる．このように，idebenoneは40mg／1という高濃度でもちいれば，mdxマウスの筋細胞膜異常を，機能的には改善させることができる．実際にの濃度で加えて，膜電位の串録を行■った．＿glycy−

人にidebenoneを投与するとなると，40mg／1は大量なので，もっと低い温度でも効果がみられないか否か，＊東邦大学医学革帯四内科

平成7年度に検討を加えた．idebenoneの投与量を2，5，
10，20mg／1と変化させ，膜電位の改善と，myOtOnic−213−

去1idebenoneの濃度とmdxマウスの膜電位，myO−
tonic burStの頻度．

表2glybyrrhizinとmdxマウスの膜電位，myOtOnic
burstの頻度．

idebenoneが2mg／1と5mg／1の温度では，mdx
マウスの膜電位は，前借の−74．4mVと比べ改善はみられないが，10mg／1と20mg／1では，膜電位はそれぞれ−81．9，−82．9mVと改善がみられる．
また，myOtOnic burstについても，温度依存性に抑制がみられ，20mg／1では完全に抑制された．

glycyrrlliヱ皿を50mg／1，250mg／1の温度で用いてみたが，mdxマウスの膜電位には有意な改善はみられなかった．またmyotonic burstについても，これを阻止する効果はみられなかった．

R MP
±S m

前値

m 血＋i肋 m on e

血
前値

m dx

2 m副

5咄

10 咄

加 叫が

一旬．
4
−77．
1
−75．
4
−81．
9
−】
妃．
9
：
と，
．
7 IllV ± 103 血Ⅴ ± 132 1㌦ ±＆5 血V ± 9J m V

8 ％ 15．
6％n叩tOI血 19．
h ∬St

12 ．
9％

乙5 ％

R M P
±S ．
D ．

−7 4 ．
4士 ，．
7m V

m y o to n ic
b u rst19．
8％

m d x ＋ g ly c y r rh iz in
50 m g／1

250 m g／1

−7 5 ．
8−7 6 ．
4

±2 ．
3m V
18 ．
1％

±2．
1m V
27．
2 ％

0％

burstの抑制について，有効な投与量を見出す実験を行った．去1のように，投与前のmdxマウスの膜電位は平均−74．4mVであった．idebenoneが2mg，5mgの濃度では，膜電位は約1から3mVの改善しか認められず，有意差も認められなかった．10mg，20mgの温度においては約7から8mV以上の膜電位の改善があり，これは危険率1％以下で有意差を認めた．
myotonic burStの頻度についても10mg／1以上で2．5％と著明に低下し，20mg／1では完全に抑制された．
膜電位の分布を図1に示した．横軸に膜電位を5mV間隔でとり，縦軸にはそれぞれの膜電位の筋線経の％を示した．黒は投与前を示し，縦縞はidebenone2mg
投与後，白は5mg投与後，横縞は10mg投与後，また灰色は20mg投与後の膜電位の変化を示した．5mg投与のグラフから，膜電位の分布としては，−90から−95mV付近にピークを作り，10mg投与後は−85から−90mVの筋線雌の割合が増加している．このことか
らidebenone40mg／1を投与した際と同様に，膜電位の低い筋線経が減少して，全体の膜電位平均値が改善されたものと思われる．
次にmdxマウスにglycyrrhizinを投与し，膜電位の変化とmyotonic burstの出現率を検討した．
表2のように，投与前のmdxマウスの膜電位は平均−74．4mVであった．glycyrrhizin50mg／1の濃度では膜電位平均は−75．8mVとほぼ変化は認められなかった．またglycyrrhizinを250mg／1と高法度にすると，
膜電位平均は−76．4mVとなり，膜電位の大きな改善は認められなかった．myotonic burstの出現率は投与前のmdxマウスでは19．8％の頻度で認められたが，glycyrrhizin50mg／1でも18．1％と変化はみられず，250mg／1の高温度でも27．2％とむしろ頻度は増大し，
myotonic burstの抑制効果は全く認められなかった．
腰電位の分布を図2に示した．横軸に膜電位を5mV間

図1idebenone投与量とmdxマウスの膜電位の変化．
mdxマウスの筋標本では，−70mV以下の低い膜電位の筋線経と−80mV前後の正常な膜電位の筋線経が混在している．この分布を黒のグラフで示
す．idebenoneを2，5，10，20mg／lの温度でTyrode
溶液に加えると，10mg及び20mg／1では低い膜電位の筋線経が減って，正常の膜電位をもった
筋線経が増えてくる．そして，膜電位の平均値
も一74．4から−82．9mVまで有意に改善する．
隔でとり，縦軸にはそれぞれの膜電位の筋線経の％を示した．黒は投与前のmdxマウスを示し，白はglycy−
rrhizin50mg投与後，また灰色は250mg投与後の膜電位の変化を示している．投与前は−70mVと−80mV付近に二峰性のピークを形成しているが，glycy−
rrhizin50mg／1では，−80と−90mVにピークが移動，250mg／1では−70mV付近に小さいピークと，−90mV付近に大きなピークを形成している．義2で示したよ
うに脱電位の平均値に有意差は認めないが，このグラ
フから膜電位の分布にいくらかの影撃を与えているよ
うに思える．

−214−

去3今までmdxマウスについて我々が検討してきた
種々の薬物の効果を表にまとめた．

RMⅣ（−mY）■hhr亡gけmyotonic burstは，CIconductanceが低下したときや，hst Na Currentが増加したときに起こるほか，両者の変化が一掛こ起こった時にも起こるが，治療としては，Na Channelをbloekするような薬物をもちいれば阻止できる．mdxマ
ウスの低温で見られるmyotonicburstは，表のように，diphenylhydantoin，meXiletine，
nicardipine，bestatin，そして今回のidebenone
によって阻止できる．それよりも，低下した膜電位を改善することはずっと困難であり，我々が枚索した薬物の中ではbestatin，idebenoneの2割のみが，膜電位を改善することができた．

ロ如50−叩川口gly250mg几

図2glycyrrhiZhとmdxマウスの膜電位の変化
mdxマウスでは低い膜電位と正常な膜電位をもった筋線経が混在するが，glycyrrhiヱinは，膜電位の分布においてより正常な方向へ移動させる傾向はみられるが，統計的に有意な改善はみられなかった．

効 果
薬 剤

の 改 善

d ip lle Ily lb y d a n to in

＋

−
＋

＋

id e b e m O lle

−
＋

−
＋＋

g Iy C y r rb izin−−b eS ta tin

察

d a n tr o le n e N a

1．idOb8nOnnOの効果
脳代謝賦活剤であるidebenoneの薬理作用として，①ミトコンドリアの呼吸活性を成活し，脳神経細胞のグルコース利用率とATP産生を促進する，（虚血時の脳ミトコンドリアのATP産生低下を抑制），また，乳酸の増加も抑制する3）4）．②Anoxiaの状態において，細胞内へのCaイオンの流人や適齢こよる細胞死の過程で発生するフリーラジカルの消去作用により，ミトコンドリアの破壊をおさえ，細胞壊死を抑制する作用があることが知られている．
今回我々の行った実験で，mdxマウスの筋細胞膜の電気生理学的異常の改善を認めた．またidebenoneは，
anoxiaによって膜電位が低下するmdxマウス筋標本に用いても改善効果を認めた．
この横序として，idebenoneによりATP産生が高められ筋細胞膜における能動輸送が改善するのではないかと考えられる．anoxia状態においても脳に対すると同様のエネルギー代謝改善作用を筋に及ぼし，膜電位の低下を抑制するのではないかと考えられる．
薬用量については，当初Tyrode溶液中に40mg／1の高濃度でmdxマウス筋標本に作用させたところ，膜電位の改善とmyotonicburstの抑制効果が認められたが，これは投与量としては大量と思われ，もっと少量で治療効果がみられないものかと，2〜20mg／1の4段階の濃度で実験を行い，10mg／1以上なら有効であるという結論を得た．
運動負荷：BlOマウスでは，運動負荷をかけても膜電位の低下は認められなかったが，mdxマウスでは，
30Hz，5V，5分間の神経刺激で，膜電位が−76．2から

ミ オ トニ ー の抑 制 効 果−土

m e 王ile tin em ic a rd ip in e考

低 下 し た膜 電 位＋＋−69．9mVに低下した．mdxマウスでは，dystrophinが欠如しているためにdystrophinの代わりにユートロフィンが現れ，ユートロフィン軸ができるが，これが運動負荷には耐えきれずに，膜電位が低下する要因となっているのではないかと考えられる．その他の要因としては，energyfailureの可能性も考えられる．
2．glycyrrhizinの効果
安徳ら5）により，Duchenne型筋ジストロフィーの患者の平均筋力スコアpがglycyrrhizinにより3．59から3．92に改善し，車椅子こぎ試験の所用時間にも多少の改善がみられた，という報告があった．glyeyrrhiヱinの作用としては，
1．ライソゾーム膜を中心とした細胞膜の安定化，
2．筋小胞体からのCaの遊離の抑制，
3．内因性及び外因性のsteroidホルモンの代謝抑制による活性増強作用などがある．
今回，我々のmdxマウスを用いた筋細胞内記録では，
高濃度（250mg／1）のglycyrrhidn投与でも，膜異常の改善は認められなかった．
最後に，これまでmdxマウスについて我々が検討してきた種々の薬物の効果を蓑3にまとめた．
結語
mdxマウスに対するidebenoneの効果を検討した．
10mg／1以上の濃度で膜電位の改善，並びにmyotonic−215−

burstの抑制効果が認められることが明らかになった．
また，mdxマウスは，anOXiaや運動負荷によって膜電位の低下を認めた．glycyrrhi名山についても検討したが，今回の我々の実験ではmdxマウスに対する膜電位の改善，myOtOnic burStの抑制効果は認められなかった．

3）Sugiyama Y，Fujita T，Matsumoto M，etal：Effects ofidebenone（CV−2619）andits
metaboliteson respiratory activity andlipid
PerOXidation

in

brain

mitoehondria fromratsand dogs．J Pharmacobio−Dyn8：1006，
1985．

4）SunoM，Shibota M and Nagaoka A：Eだect

引用文献
1）栗原照幸：進行性筋ジストロフィー症治療の展望・神経治療10（3）：203，1993．

Ofidebenone onlipid peroxidation andhemolysisin erythrocytes of stroke−PrOne
SpOntaneOuSly hypertensive rats．

2）Ⅹurihara T，Osako M，Rishi M，et al：
Therapeutic trial for X−linked muscuhr
dyStrOPhy mice by idebenone．

encephal ClinArch

GerontoIGeriatr8：307，1989．
5）安徳恭鼠Electro−Neurophysio197（4）：S129，

1995．

−216−

塚本括れ

小池文彦ほか：Duchenne塑

筋ジストロフィーに対するグリチルリチンの効果．

神経内科39：573，1993．

56）筋ジストロフィーに対するGlycyrrhizineの効果について
田

研究協力者

代

邦

雄＊

伊 藤 和 則＊ 牧 野均榊森 若 文 雄＊ 島
功 二削

は じ めに
今回われわれはDantrolene sodiumとGly−
CyrrhiZheを筋ジストロフィーの症例に投与し，その有効性について検討を行った．Dantrolene sodium
は骨格筋の興奮一収縮連関に作用し，筋小胞体からのCa放出を抑制する薬物である．このDantrolene so＿diumを筋ジストロフィー患者に投与し，CK借の低下と筋力の改善が報告されている．またGlycyrrhizine
はステロイド様作用を有することでその効果が期待される．この薬剤の作用機序とGlucocorticoidの作用増強，および効果延長作用が考えられている．それはcorticoidsの不活性化を抑制し，その効果を延長させる1）．
このことから筋ジストロフィー3例にDantrolene
SOdiumとGlycyrrhizineを併用または単独投与し，血清CK借，AT（Anaerobicthreshold），筋力を経時的に測定し，その有効性，安全性を含めて検討した．
対象と方法
対象は症例1：Becker型PMD，症例2：FSH塑
PMD，症例3：Limb−girdle塑PMDの各1症例に対して検討を行った．
症例1はGlycyrrhizine150mg単独投与を行った．
症例2はDailtrOlenesodium75mgとGlycyrrhizine
150mgの併用療法を，また症例3Dantrolene sodium
25mgとGlycyrrhizine150mgの併用療法を施行した．
運動能力を客観的に把握する方法としてAT（an−aerobic threshold），maX．VO2（最大酸素摂取量）が区別して用いられているが，われわれが使用しているにはVT（換気開催）を基準としいる2）3）．
1．各症例についてGlycyrrhizine，またはDantr0−
1ene sodiumとGlycyrrhizine併用投与前のVO2／W，Im，Loadを測定した．薬剤投与後経時的にVO2／W，HR，Load，Peak時のLoad等を測定し，投与前借と比較した．
2．各症例に筋訓練測定装置肛IN／COM）を使用し，
右下脳（Hamstring，Quadriceps muscle）の筋力を郵定し，薬剤投与前後での筋力差を検討した．
tVO2／W，HR，Load，筋力の測定）
呼気ガス分析はMINATO医科製 エアロモニター
AE280Eを使用しbreath by breath法で3秒毎，酸素摂取亀 二酸化炭素排出亀 換気当亀 心拍数等を連鼓して測定した．運動負荷はエルゴメーターを使用し，漸増運動負荷（ramp負荷）で行った．
筋力測定は筋訓練測定装置肛IN／COM）を用い，右下Bg（Hamstiing，Quadriceps muscle）の最大筋力を測定した．Isokinetic modeで角速度300にてcon＿centric contraction動作で実施した．最大筋力と平均の下腿筋カを測定した4）5）．
結果

症例1はGlycyrrhizine投与前のATは8．32ml／Ⅹg／
minとコントロール群の平均借と比較しても相当な低下がみられ，最大運動量も30wattsと低下していた．
Glycyrrhizin150mg（単独投与）を投与後約3か月後にはATは9．90ml／Kg／minと改善がみられ，PeakV02

代表的な指標であるが，運動処方を行う場合，
peakV02や最大心拍数を基準とする方法は最大運動が必要となり，健常人でも困難な点が多い．ましてや
種々の疾患を有する患者にはこの方法では判定できなも9．47ml／Kg／minから10．61ml／Ⅹg／minへ上昇した．
しかしPeakの運動量は投与前30wattsから投与後
31wattSと変化はみられなかった（表1）．

い．Aでは最大運動を必要とせず，トレーニング効果，
運動能力を鋭敏で安全な方法である．ATを考える場

力を測定した・Quadriceps muscleはGlycyrrhizin9
投与前の筋力測定では20N，投与3か月後でも28Nと合，種々のパラメーターが存在し，それぞれの状態で有意な改善はみられなかった．しかLFamstring
muscleは投与前27Nであったが，投与3か月後には＊北海道大学医学部神荘内科＊＊美唄労災病院リハビリテーション科＊＊＊国立療養所札幌甫病院神経内科

筋力に関してはQuadriceps，Hamstringの平均筋

49Nと上昇がみられた．自覚的筋力の改善はみられ，とくに歩行時の安定性が観察された．血綺CK借は投−217−蓑3FSH型PMDの運動機能と筋力を示す．
（上段は運動横能，下段は下肢筋力）Dantrolene sodium投与前後で有意なAT，Loadの改善がみられ，か7 94からはGly−

表1Becker型PMDの運動機能を示す．
Glycyrrhizine投与前ATは8．32ml／Kg／minと低値を示し投与後3か月ではAT9．90ml／Ⅹg／minと有夢な改善がみられた．しかしLoadの変化
peakLoadの増加はみられなかった・
D

a

t｝ a

k

T

H

R
l ／r，￣・lh 〉＼′

モ1 ／ 2

9
8

A

し

p

t t ∃l

1

tく
ヽ
＞
．
1■
｝■
a■ttdl l

く）

9

5

．3

2

0

3

1

5

1

P

O

a

t ＞ ■1 k

k

1

1

9

5

＿9

0

1

3

1

2

2

H t ′■▼ヽR l rヽlL／ 2

9≦事 ，J 暮7P1cyrrhizineとDantrolene 80diumの併用療法を開始し，AT，Load等の維持がみられ，有効性が示唆された．また筋力に関しても，Quadri−
ceps，Hamstring muscleともに有意な改善が認められた．

oヽ〝■a ■ttdt ■】

1

1

5

3

0

1

0

＿6

1

A

1

J暮 3
3

1

1

9

3

9 3

2

′ 7

9 4

5

0 ′ 7

0 ．7

1

8

．4

1 9

．9

1 8

0 2

1 0

3

1 1

9

1

2

5 ．0

6

5

．0

8

1 ．0

7 7

．2

2

1

8 ．2

3

1

．6

3 2

．6

3 0

＿8

1 0 4

1 5

8

1 4

9

1

5

5

a d

2

1 4

4

1

3 5

1

2

5

R

′3

5 ′ 1

1

T

H

2

9

5

−8

1 8

t ′∩■
1 日1 I
1
L

o

a

d

l − ■ 11 ■ l

去2Beeker塑PMDの下肢筋力を示す．

95

O

a

k

V

0

P

e

a

k H

R

k L

o

t ′m l n l

Glycyrrhizine投与前後での下肢筋力はHam−
Stringmuscleの改善は認められたが，Quadri−
ceps muscleは変化がなかった・
8／2 9

P

1 1／2 1Q u ad rlcm eup＄sC le

20 （N ）

28

H a m strln
m u scg le

27 （N ）

49

P

e a

M

a I l● I

D a te

5

．8

2 ／3

9 3

1 0 ／7

9 3

2 ′7

9 4

5 ′1 5

9 5

95

くN ）

q u a d r lc e p S（平 均 〉

14 8
（N ）

19 6
（N 〉

2 5 9
（N ）

2 3 7
（N ）

くN ）

H a rn s t r in g
（平 均 ）

14 8
（N 〉

14 2
（N ）

26 6
（N ）

2 4 6
（N ）

では196N，142NとQuadricepSmuSCleの有意な改善がみられた．Dantrolene 80dium，Glycyrrhizine併用後259N，266NとDantrolene単独投与時よりも筋力の改善がみられた．また併用後15か月ではQuadri−
与前後で変化は認められなかった（表れ
症例2ではI）antrolene sodium75mg投与後Gly−
cyrrhizine150mgを加えて検討したが，Dantrolene
sodium投与前のATは10．7ml／Kg／min，その時点での運動量は25．Owattsとコントロール群と比較して非常に低下していた．運動療法とDantrolene sodium
75mg投与後8か月後にはATが18・4ml／Eg／min，運動量は65wattSと有意な改善がみられた．この時点か
らGlycyrrhizine150mgを併用した・併用後4か月後にはATは19．9ml／Ⅹg／min，運動量81wa・ttS，peakV02も前借18．2ml／Kg／minから併用時32・6ml／
Kg／minと有意な上昇がみられた・また併用後15か月後の検討ではAT18．8ml／Kg／min，運動量77．2watts，
peakV02は30．8ml／Kg／minと運動能力としては維持していることが示唆された（去3）．
下腱筋力に関しては投与前借はQuadricepS muSCleは148N，Hamstringmuseleは148N，ともに平均筋力を示した．Dantrolenesodium75mg投与後8か月

ceps muSCle

237N，Hamstring muscle

246Nと筋力もほぼ維持されていた．また血清CX借は投与
前1250IU／1であったか，Dantrolene sodium投与後
850−500IU／1程度を推移していた．自覚的，他覚的にも筋力改善と歩行の安定，持久九 易疲労性の改善がみられた．
症例3はまずDantrolene sodium25mgから開始
し，1か月毎25mgづつ増量し，75mgまでで維持量とし，その後Glycyrrhizine150mgを追加するプロト
コールでおこなう予定であった．投与前はAT9．7ml／
Kg／min，運動量12．7watts，peakVO214・7ml／Ⅹd
minと低値を示していた．Dantrolene80dium25mg
投与後約1か月後にはATlO．5ml／Kg／miq 運動量12．8watts，peakVO213．4ml／Rg／minであった（表札 ATはやや上昇したが，運動量，p組kV02は変化なかった．つぎにDantrolene sodium50mgに増量したが，自覚的に脱力が強いとのことでこの時点での運動機能を測定したが，ATlO．Oml収g／min，運動量10．OwattsでDantrolenesodium25mg投与時よりも−218−

表4Limb一girdle塑PMDの運動機能を示す・
Dantr。1。ne S。diun25mg，50mg投与でLoadの低下を認め，GlycyrrhiEineとの併用療法開始後約1か月ではATlO．lml侃g′minと有効性はみられなかったが，併用後長期になり・その有効性が出現してきた．AT，Loadの増大がみられた．
DA

6 ′2 3
9 4

a to

T

8 ′4
9 4

1 0 ／19 4

8 ′3 19 4

1 1 ′1 0
9 4

1 2 ′8
9 4

■ ′7
9 5

8 ′3 11 1 ．3 6

9 5

9 ㌧7

l O ・5

1 0 ．01 0 ．11 1 ．4

1 0 ．4

1 1 ．5 4

1 1 4

1 0 9

1 0 7

1 1 7

1 1 5

1 1 8

1 2 0

1 0 4

1 2 ．7

1 2 ．81 0 ．01 2 ．01 6 ．01 2 ．01 3 ．01 5 ．01 4 ．7

1 3 ．4

1 6 ．91 5 ．01 6 ．01 5 ．6

1 3 ．8

1 5 ．1

1 4 6

1 4 9

1 4 2

1 4 3

1 4 9

1 4 8

1 4 5

1 5 3

3 6 ．03 1 ．03 1 ．03 1 ．03 2 ．03 0 ．02 7 ．02 8 ．0l【 l′K o ′l¶ln I
H

Rt ′【 llヽI
L O a dt−▲tt■IP O a kVO

2

tM l′K 9 ′M l可P e a k H

Rl′∩ヽln I
P e a k L o a dt｝ ●tl■〉嘉5

Limb−girdle型PMDの下肢筋力の推移を示す・
Dantr。1ene s。di。m投与にてQuadriceps，Hamstring muscleともに低下して脱力感と一致した結果となった．Dantrolenesodium25mgとGlycyrrhizine150mgの併用療法直後は同様に筋力低下は持続していたが，徐々にもとの状態にまで改善し，そのまま筋力が維持されていた・
6 ／2 3q u a d ric e p s

91

8／
4

94

8 ／3 1

94

10 ／
6

94

1 1 ／1 0

9−
1

1 2 ／8

94

6 ／9

95

8／
31

23 ．
0

1 5．
0

16．
0

17 ．
0

10 ．

28

21

23

48

53

43

45

43

64

52

48

」
‖

33

39

31

39

43

44

35

69

61

55

51

60

75

66

60

95

（平均 ）

Q u a d rlc o p s
lp 0 8 k I

H a 11下tr in g
（平均 ）

H am

lr 王
ng

（P 0 8 k I

cyrrhiヱine150mgの併用療法にて検討することとした．併用投与後1か月ではATlO．lml／Kgんlh，運動量12．Owatts，peakVO215．Oml／Kg／minと変化はみられなかった．併用療法後2か月後頃からAT，25，50mg投与にてQuadriceps，Hamstring muscle
ともに平均筋力の低下が認められた．
Dantrolene sodiumとGlycyrrhi2：ine併用療法では投与3か月頃からやや上昇傾向がみられ，約1年経過した時点での筋力は投与前借とほぼ有意差がなく，Load，peakV02の上昇，改善傾向がみられるようになってきた．8か月後にはATll．54ml／Eg／min，運動

積極的に筋力の改善には結びつかな可能性が示唆されるが，筋力の維持に対しての有効性が考えられる・や低下していた．Dantrolene sodium25mg，Gly−

量13．Owatts，約1年後にはATll．36ml／Kg／min，運動量15．Owatts，peakVO215．1ml／Kg／minと改善
し，投与前及びDantrolene sdium単独投与時と比較するとAT，ATのLoadは有意な改善が認められた．
しかし，peakV02は有意差はなかった・
筋力に関しては投与前Quadriceps muscleの最大筋力は48N，平均筋力23N，lIamstring muscleの最大筋力69N，平均筋力41Nとコントロール群の1／5程度の筋力を示していた（蓑5）．Dantrolene sodium

考察

筋ジストロフィーに対してステロイドの有効性はある程度周知ではあるが，投与量，期間などの制約があり，容易にまた安易に投与できないのが現状であるが，そこでGlycyrrhizineに注目し，検討を行った・Gly−
cyrrhidneは内因性の副腎ステロイド増強することでステロイドホルモン作用を示し，また肝臓におけるコルチコイドの酵素的不活性化を抑制し，消失速度の遅−219−

延が報告されている．今回Glycyrrhizine単独投与例
では投与3か月でATの有意な上昇がみられ，その有効性が推測された．また筋力に関してはHamstring
muscleの増強効果が考えられた．Dantrolene so●
dium単独ではFSH塑PMDに有効性が考えられるが，しかし筋力低下が著しい症例に対してはむしろ脱力感として作用することが予想された．血清CX値は投与
前借の10〜35％程度低下することは観察されたが，筋崩壊の抑制＝筋力改善にはつながることなかった．
Limb−girdle塑PMDはDantrolene sodium投与にて脱力が増強し，筋力低下，Loadの低下，peak
Load低下がみられ，Glycyrrhizine投与にてATの改善はみられたが，筋力は改善というよりは維持できたことが成果と考えられた．
1・筋ジストロフィーの3症例にGlycyrrhkhe，Dantrolene sodiumの単独または併用療法を行った．
2・Glyeyrrhizhe単独投与例では投与3か月でAT，筋力の改善が認められた．
3．併用療法ではDantrolene 80diumが有効な場合と脱力を引き起こす場合があり，有効性は一定しない，
しかしGlycyrrhizine投与ではATの改善が有意にみとめられた．しかし筋力改善までは至っていないことが予想された．
文
献1）熊谷 朗：ダリチルリチンの研究．ライフ・サイ
エンス出版，東京，1986，p65．
2）谷口輿一：心肺運動負荷テスト．南江堂，東京，
1993，p155．

3）中村好男：乳酸開催と換気聞値との関連についてのBeaver，Wasserman，Whippの主張に対する疑問．体育の科学側：453−460，1990．
4）田代邦軌 伊藤和則ほか：筋疾患の治療効果について一運動負荷試験によるAT（Amerobic
ThreShold）の検討−． 厚生省「精神・神経疾患
研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成3年度
研究報告書，1992，pp59−61．
5）田代邦雄，伊藤和則ほか：筋疾患の治療効果． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロ
フィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する−220−

研究 （荒木班）平成4年度研究報告書，1993，pp64−67．

57）Duchenne型筋ジストロフィーに対する遺伝子治療の基礎的研究−カチオン性脂質を用いた培養筋細胞への
遺伝子導入
庄

研究協力者

石
埜

目

井

進

一事

亜紀子＊一＊ 萩

原

康

荒

畑

喜一榊

中

征

司

哉蝉

的

体細胞遺伝子治療の対象として考えられているデュ
シェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular
dystrophy：DMD）において，効率的な遺伝子治療を行うためには，骨格筋細胞に対して効率と安全性の高い遺伝子導入法の開発が望まれる．カチオン牲脂質による遺伝子導入は簡便で再現性が高く，免疫反応を起しにくい方法1）として注目されている．我々は培養骨格筋細胞に対する遺伝子導入法を確立することを目的
として，種々のカチオン性月旨質を用いて遺伝子導入を行い一過性発現と安定発現の効率を検討した．さらに，筋細胞増殖・分化のどの段階でカチオン性脂質遺伝子複合体が効率よく取り込まれるかを明らかにし，i花
山ひロへの応用として塩酸プビバカインにより，壊死再生を惹起した2）ラットひらめ筋への遺伝子導入を行った．
対象および方法
1．−通性発現系および安定発現系における遺伝子導入の効率
lacZ遺伝子，CAT遺伝子をレポーターとしてリン酸カルシウム法，5種類のカチオン性脂質を用いてマ
ウス筋細胞系のC2細胞およびマウス線維芽細胞系の
10Tl／2細胞に導入し一過性発現の効率を比較した．導入効率はβ一galactosidase染色および活性，CAT活性を測定することにより比較検討した．細胞毒性については細胞抽出液の蛋白濃度を測定し検討した．
安定発現の検討のためにはneo耐性遺伝子を用い
G418存在下に3週間培養した．さらに，サザンプロッ

子稗

斎

藤

陽

子榊

武

田

伸

一榊

paSRNlacZ，PCAGGSlacZ遺伝子の導入を行い，β−galaCtOSidase活性を測定した．
3．7〃yル○実験における遺伝子導入の効率
ウイスターラット（8週給，雄）の右ひらめ筋に0．5％
塩酸プビバカインを0．2ml注射した2日後，5日後，あるいは前処置なしにDOGSと混合したpaSRNlaeZ遺伝子10〝gを注射した2）．対側は25％SuCrOSe前処置
15分後に，paSRNlaCZ遺伝子100〝gを直接注射した．
遭伝子導入7日目にラットを屠殺し，ひらめ筋を取り出し，凍結後，クリオスタットで薄切し，固定，β一galactosidase染色，HE染色を行い，β「galactosidase
陽性筋線株数を算定した．
結果
1．一過性発現系および安定発現系における遺伝子導入効率
一過性発現系においてはカチオン位牌質法はリン酸
カルシウム法に比し，有意に導入効率は高く，なかでもpolycationiclipidであるDOGSおよびDOSPA
はC2細胞，10Tl／2細胞とも高値であった（表1）．
polycationiclipidはmonocationiclipidと比較し，細胞降等が強かったが，反応時間の短縮により軽減することが可能であった．安定発現系においてもDOSPA，DOGSの導入効率は高かった（表2）．一過性発現系では培養骨格筋細胞への遺伝子導入効率は線推芽細胞に比べ，有意に低値であったが，安定発現系
では明らかな差は認められなかった。選択された細胞に対し，核内での導入遺伝子の存在様式をサザンプ
ロット法を用いて検討したところ，Neo遺伝子が染色ト法により，導入遺伝子の核内存在様式を検討した．
乙 筋細胞の増殖・分化と遺伝子導入効率の検討

体にhtegrateされていることを確認できた．

培養骨格筋細胞株であるCか4細胞について増殖ある
いは分化を誘導し，その各段階で，DOGSを用いて

乙 筋細胞の増殖・分化と遺伝子導入効率＊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊国立精神・神経センター神経研究所

カチオン性脂質による遺伝子導入を行った後に分化誘導培地に変換した場合に，最も高いβ−galaCtOSidase活性借が得られ（図1），しかも，分化誘−221−

表1一過性発現系における丑伝子導入効率
T h e m e th o d s o f t r a n s fe C tio
C al ⊂iu m

表3 几几 ひ0遺伝子導入におけるβ1ぎalaetosidase
陽性筋綴維出現率

D e r C e n t S t a in e d C e lls

p h o sp h ate

C 2 C e l ls r ％ ）1 0 T l ／2 c e lls l％ l0．
2 ± 0 ．1

1．
4 士0 ．
3

7．
2 ±2 ．
2

9．
2 士3 ．
2

4．
7 ± 1 ．1

6．
4 土2 ．
0

3．
6 ±0 ．
69．
4 ±2 ．
8

16．
4 ±0 ．
7

7 1．
9 士4 ．
4

9．
7 ±3 ．
68 3．
0 ±9 ．
0

塩 酸プ ビバカ イン処置
1 2 日・ 6 日後

対側 コン トロール

C a t io n iC l ip id s
m o n o c a t io n ic lip id s
D D A B ／D O P E
D O T W

D O PE

Plas m id D N A 筋 注
2 日 日の導 入

D O T A P
p o ly c a t io n iC lip i d s

1．
7 （0 ．
3 −3 ．
9）

乙0 （0 ・
1 3 −6 ・
9）

6 日日の 導入

D O S P A ′D O P E

2 5 ％su cro se 処置 1 5 分後

D O G S ／D N A 複 合体 筋注00．
5 く0 ．
3−
0．
6）

D O G S ／D N A 複合 体
D O GS

前処 置な しの導 入
0

去2 安定形質発現系における退伝子導入効率
C 2 C e lls（％）
C a ld u m P h o sp h a te
P re d tip a tlo n0．
2 （0 ．
1−0．
3）

1 0 T l′2 C e lls （％）

0．
0 2 士0 ．
01

0．
0 4 土0 ．
03

m o n o C a tlo n lC 11p id
D O T M A ′D O IIE

0 ．14 士0 ．
07

0．
3 1 ±0 ．
14

p o ly C a tlo n lC llp ld
D O S PA ′D O P E

4．
2 0 士 1．
27

4．
8 2 ±2 ．
25

DO GS

3．
2 0 土 1．
71

3．
7 1 士2 ．
99

C2／4CeuS（alOtdls）

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

導後2日目ないし3日目の遺伝子導入では低い導入効率しか得られなかったことから，カチオン性月旨質によって遺伝子が導入されるためには，筋芽細胞が増殖中であることが必要と考えた．
20％FCS O

1

2TransfectlOntlme（days）

3．／〃yル○実験における遺伝子導入の効率
筋再生の前処置なしにDOGS／DNA複合体を授与したところ，β−galactosidase陽性筋線経は認められなかった．単核細胞が出現し，筋管細胞形成以前である
塩酸プビバカイン処置後2日目のβ−galactosidase陽性筋線維出現率（表3）は，0．2〜6．9％であり，一方，
中心核線経が認められる塩酸プビバカイン処置後5日
目にはβ−galactosidase陽性筋線経の出現は認められなかった．β一galactosidase陽性の筋線経を見ると，
中心核線推，小径線経が多く，DOGS／DNA複合体を投与した場合には再生過程が遅延する傾向が認められた．DOGS／DNA複合体のみの投与により，筋細胞の変性，細胞浸潤を生じていることから，h uね0におけるDOGS／DNA複合体の細胞毒性が強いことが考えら
れた．
考

察

lipid／DNA複合休は細胞膜と作用し，endocytosisまたは，細胞膜を不安定化させることにより直接，細胞内に取り込まれる3）．したがって，骨格筋細胞系のC2細胞と線維芽細胞系の10Tl／2細胞の一過性導入効率の

図1筋細胞の増殖・分化の各段階でのβ−galactosidase遺伝子の発現差の原因としては，1ipid／DNA複合体と細胞膜の相互作用，endocytosis能，endosomeから細胞質への移行，細胞分裂能等の相違が考えられる．培養細胞では，倍化時間（C2細胞：16．2時間，10Tl／2細胞：16．5時間）には差はなく，細胞外多糖類の有無，endo−
cytosis能などの差であると推測される．一方，安定形
質発現系では骨格筋細胞と線椎芽細胞との差は認められず，遺伝子が核内で染色体へ取り込まれる効率には差がないことが予想された．
細胞質から核内への導入遺伝子の移行のメカニズムはまだ解明されていない．End∝ytOSisで取り込まれた場合にはendosome内にとどまれは遺伝子は消化されてしまうので，endosome膜の破壊により，細胞質内へ遺伝子が移行することが重要であり，細胞質の遺伝子が核内へ移行するには，細胞分裂による核膜の消失が必要と考えられている3）．今回の実験で，骨格筋細胞へのカチオン性月旨質による遺伝子導入には，細胞が増殖中であることが必要であったことは，このこと−222−

を支持するものであり，これまでの報告と一致する4）5）．
h dひロ実験においては，筋の壊死・再生系を用いて，
DOGS／DNA複合体を投与したが，単核の筋芽細胞が増殖している時期に導入した場合にのみβ一galaCtOSidase陽性細胞が出現し，培養細胞で得られた事実と一致していた．しかしその効率は低く，しかもばらつきが大きく，対側で実施した10倍量のDNAの直接導入と変わらなかった．しかも，DOGS／DNA
複合体の投与により強い細胞障害性が観察されたことから，カチオン牲脂質（少なくともDOGS）をけっ歯類
に対するh d血遺伝子導入に応用することは困難と考えられた．
今後は，mOnOCationiclipidのような遺伝子導入効率は低くても細胞毒性の低い安全なカチオン牲月旨質の開発が望まれる．また，カチオン性脂質を用いた骨格筋に対する遺伝子導入法が霊長類においてどのような効率を示すのかが注目される．

mary endocrine cells withlipopolyamine−
coated DNA．

Proc Natl Acad Sci USA88：

6982−6986，1989．
2）Saito Y and NonaknⅠ：Initiation of satellite

cell replication in bupivacaine−induced

myonecrosis．Acta Neuropatho188：252−257，
1994．

3）Zhou X and Huang L：I）NA transfection
mediated by cationicliposomes containing
lipopolylysine：Characterization and mecha−
nism of action．

Biochim Biophys．Acta

ll田：195−203，1994．
4）TrivediRA and Dickson G：Liposome−medi−
ated gene transfer

into normal anddystrophinーdeficient mouse myoblasts・J
Neurochem64：2230−2238，1995．
5）Kojima H，Ohishi N，Taknmori M，etal：Cationic multilamellarliposome−medi−

参考文献

ated gene transferinto primary myoblasts・

1）BehrJP，Demeneix B，LoefflerJP，et al：

Biocem Biophys ReS Commun

Efficient gene transferinto mammalian prl

−223−

1995．

207：8−12，58）ラット骨格筋における遺伝子直接導入法によるポリカチオン，ポリアニオンの影響に関する研究
高 守 正 治事

研究協力者

目土 井 建 朗＊的1990年，Wolffら1）はプラスミドDNAを単独でマウス骨格筋に注射すると，プラスミドDNA上の退伝子がその骨格筋で発現することを報告した．この現象は，
遼伝子直接導入法と名付けられ新たな遺伝子導入法として，主としてワクチンとしての利用を目的とする研

小 島 久 典＊出後，ポリエチレングリコール（polyethyleneglycol，Sigma）にて精製したもの使用した．
ll．プラスミドDNAの骨格筋内注入
生後2適齢のウイスターラット（平均体重23g）を水中で活動性を低下させ，大腿部に皮膚切開を加え，大腿四頭筋を露出した．DNA溶液の注入は，脳定位装究が進められた．また，この技術を応用して，遺伝性筋疾患の遺伝子治療の可能性が検討されてきた2）．こ

置に固定した28ゲージ注射針（ミサワ，東京）を用いて，蕗出された大腿四頭筋を直接穿刺して行なった．注入の間，精製されたDNAの，生体中の骨格筋細胞への取り込み横序解明の努力が続けられているが，未だ不明のままである3）．

時間は30秒間とし，注入後，皮膚を縫合した．注入3
日後，ラットを断頭屠殺し，大腿四頭筋を切除し，これをレポーター退伝子の発現量の測定に使用した．注

上記の疑問に対し，本研究では，精製されたDNAが陰性荷電をもつ巨大分子である点に注目して，同様に陰性荷電の巨大分子であるグリコサミノグリカンが，退伝子直接導入において導入効率に影智を与えるのか否かを中心に，DNA鯨波に骨格筋細胞基底膜機能を修飾する可能性のある物質を加え，その影響について検討した．

入したDNA溶液は，種々の濃度で調整したヘパリン

対象および方法
l．プラスミド構築およびプラスミドDNAの大量詞整
pRc／RSVプラスミド（Invitrogen社，USA）のラウ
スザルコーマウイルスロングターミナルリピート

01eparin，Sigma），ヘパラン硫酸（heparan sulfate，Sigma），スラミン（suraminsodium．フナコシ，東京），デルマタン硫酸（dermatansulfateSigma），ヒアルロン酸（hyaluronate，Sigma），pOly−Lリジン（poly−L−lysine，Sigma）， ヒスト ン（histone，Sigma），トリプシン（trypsin，Signa），プロテナー
ゼⅩ（proteinaseK，和光純薬），コラゲナーゼ（collagenase，Sigma），ヘパリナーゼ（heparinase，
Sigma）の各溶液に，プラスミドDNA20〟gを加え，100〟1の浮遊波（NaClO．9％）とした．
111．CAT活性．ルシフェラーゼ活性測定

田ous sarcoma viruslong terminal repeat，
RSV−LTR）由来のプロモーター下流にクロランフェ
ニコ ー ルアセチルト ラ ンス フ ェ ラ ー ゼ

CAT活性はRosentha14）の方法，ルシフェラーゼ活
性はWomら2）の方法に準じて測定した．

（chloramphenicolacetyltransferase，CAT）遺伝子，
あるいはホタルルシフェラーゼ近伝子を挿入し，レ

結果CATアッセイでは，DNAと静電気的に結合するこポーター造伝子として使用した．pRSV−CATはpRc／
RSVのHindIIトNotI領域にpSVO−CAT由来のクロラ
ンフェこコールアセチルトランスフェラーゼ退伝子をとが予想されるポリカチオンのpoly−Lリジン，高濃度ヒストンをDNA浮遊液に加えて筋注した場合，トランスフェクション阻菩傾向が認められた．ボリアニ

含むHindIIトHpaI断片を挿入し作成した．また，オンのヘパリンにもトランスフェクション阻普傾向が認められた．一方へパリナーゼには明らかなトランス
フェクション阻書傾向は認められなかった．蛋白分解
酵素のトリプシンに非常にはっきりしたトランスフェ
クション阻書傾向が認められた．カチオニックリビッ

pRSV−111CはPGV−B（東洋インキ，東京）のBglIト
HindIII領域にpRc／RSVのRSVプロモーターを含む
BglIトHindIII断片を挿入し作成した．骨格筋への遺伝子導入に使用するDNAは，アルカリーSDS法にて抽＊金沢大学医学辞欄経内科

ドのリポフェクチンにも若干のトランスフェクション
阻宇傾向が認められた（図1）．
−224−

ヘパリンに阻亨作用が認められたため，グリコサミ
ノグリカンに注目し，ヘパリン及びその対照としてヒ照としてDNA浮遊液を単独で筋注した．ヒアルロン
酸には遺伝子導入効率に阻害傾向は認められなかった

アルロン酸を選択し，その阻書効果の濃度依存性を検討した．各々10J上gから100pgまでの6つの濃度群に分け，DNA浮遊液に加えて筋注した．さらに陽性対が，10〝gのヘパリン群において，コントロール群と比較して遺伝子導入効率に対する有意の阻害が認められた（図2）．

n亡galiv亡COnけ01
DNAonly匹Iy−Llysine20Pg
匹Iy−uySinC2仰Pg
his10ne4llg
histone40llg
kp濾n∽−gh印加几6（氾Pg
h叩ri几1500Pg
hep扇na父0．かU
hepa血a父2．5U
h arina梵25U
lけpSinO．05％
叩pSinO．1％
lipokctin
CATsundardl．OU

図lCAT activity（％conversion）

図2CATactivity（％conversion）＊p＜0・01comparedtocontro1−225−

COllagenaSe（1011g）

proteina5eK（2叫g）trypsin（0．1％）
poly・Ltysine（1叫g）
heparin（1叫g）
Suramin50dium（1叫g）
heparansulrate（1011g）

dermatansulrateB（l叫g）hyarulonate（1011g）

DNAonly
O l（氾

300

2（氾

4叩

500

600

700

図3M。anluciferas。LU（×103）＊p＜0．01comparedtoDNAonly

さらにヘパリン以外のグリコサミノグリカンである
へバラン硫酸，デルマタン硫酸，ヒアルロン酸や低分子のヘパリン類似化合物であるスラミンについてpRc／
RSV−lucを利用して遺伝子発現量の比較を試みたが，明らかなトランスフェクション阻薯は認められなかった．蛋白分解酵素のトリプシン及びDNA分解酵素の混入のないプロテナーゼKに於ても遺伝子導入効率に対する著明な阻薯が認められた．コラゲナーゼには明らかなトランスフェクション阻害は認められなかった（図3）．

られず，筋のDNA取り込みに筋膜，又は細胞外の蛋白質が重要な役割を果たしていることが予想された．
以上骨格筋肉内へのDNA取り込みの秩序は明らかとなっていないものの，骨格筋細胞の表面にもボリアニ
オニックな分子を結合させる横横が存在する可能性が考えられた．
文

献1）WolffJA，Malone RW，Williams P，Chong
W，AcsadiG，JaniA and Felgner PL：Di−
rect gene transferinto mouseinvivo・Sci−

考察

ence247，1465−1468，1990．

遺伝子直接導入法により，骨格筋のDNA取り込み
横横に対する阻害因子の研究を行なった．ボリアニオ

2）WolffJA，Williams P，Acsadi G．Jiao S，ン，ポリカチオン両者にトランスフェクション阻普作用を認めた．トランスフェクションが阻零される理由

direct gene transferinto rodent muscleinは明らかではないが，ヘパリンとプラスミドDNAはともにポリアニオニックな巨大分子であり，高濃度のヘパリンがDNAの細胞内取り込みにおいて競合している可能性が考えられた．poly−Lリジン及び高濃度ヒストンで導入が阻害されるのは，そのカチオニッタな性状によるDNAとの静電気的結合が理由と考えられた．蛋白分解酵素のトリプシン及びDNaseの混入のないプロテナーゼKに強い導入阻害が認められたことよ

3）WolffJA，Dowty ME，Jiao S，Repetto G，Jani A and Chong W：Conditions affecting

vivo．Bioteclmiquesl1，474−485，1991・
Berg RK，Ludtke JJ，Williams P and
Slautterback DB：Expression of naked
plaSmids by cultured myotubes and entry ofplasmidsinto

T

tubes

and

caveolaeofmam一

malian Skeletal muscle．J Cell ScilO3，1249−1259，1992a．

4）Rosenthal N：Identification of regulatory

り，トランスフェクションの阻害は蛋白分解酵素に混入するDNaSeによるDNAの分解がその主因とは考え−226−

elements ofcloned genes with functional as−says．Methods EnヱymOl152，704−720，1987・

59）筋ジストロフィーにおける接着分子の検討と遺伝子治療の可能性に関する研究
岡 田 伸太郎＊

研究協力者

柳

原

格＊

緒
言
我々は昨年までDuchenne型筋ジストロフィーモデ
ルマウス（mdx）に対してヒトジストロフィン遺伝子導入を行いその効果を検討してきた．しかしながらジス
トロフィンのような巨大遺伝子を効率よく治療レベルまで発現させることは困難であった．そこで筋細胞膜を細胞外マトリックスに結合し線維化を予防できれば，
筋ジストロフィーの進行をくい止めることができるのではないかと考え，種々の接着分子に着目それらの発現を抗体染色を用いて検討した．
方

乾

幸

治＊

性を示した．3）N−Cadherinはコントロール，寝息筋
共でほぼ陰性，NCAMはDMD再生筋で強い発現を見た．mdx筋で，中心核を持った筋線経においてNCAMの発現が正常と差を認めなかった．4）ジスト
ロフィン，DAGに関しては報告されている結果と矛盾しなかった．
考察

我々は，ジストロフィンやジストロフィン関連蛋白質の欠損している筋線経の一つの治療の方向として筋線稚内のアクチンと細胞外マトリックスのラミニンな法

蓑1レクチン・ルイス抗原染色
RCASBADBAWGA ConA sLeX sLea

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD），正常コントロール，mdx及びコントロールマウス筋を1）特異的糖鎖を認識するRCAl），SBA，WGA，ConA，
DBAのレクチン染色，セレクチンのリガンドである8−LeX，S−Lea抗体染色，2）細胞外マトリックスと結合するインチグリンVLA−2，3，4，6，Vu−4のカウン
ターレセプターVCAM−12）抗体染色，3）筋自身の接SPMA（−）（−）（一）（＋＋＋）（＋＋＋）（一）（＋）DMD（−）（＋）（−）（十十＋）（十十＋）（−）（−）

controI
mouse（−）（−）（−）（十十）（＋＋）

着因子であるNCAM，N−Cadherin抗体染色，4）ジストロフィン，43K，50KDAG抗体染色などもを行っ
た．
結
果

SPMA

（一）

（＋）

（＋）

（＋）

1）レクチン染色の結果ConA，WGAのみが正常筋線

DMD

（−）

（＋）

（＋）

（十十）

維周囲，及び擢患筋の線推化を起こした部位で陽性であったことから，筋線維周囲にはAsn型糖鎖（共通構造；Mana1−6（Mana1−3）Manβ1−4GIcNAcb1−
4GIcNAc）を持つことが予想された．一方L，E，P−セ
レクチンのリガンドであるS−LeX，E，P−セレクチンの＿蓑2インチグリン染色

VLA−Z Vu−3

問質

VLA−6

血管・神経

表3CAM，Cadherin染色
NCAM N−Cadherin VCAM ICAM
SPMA

（＋＋＋）

小径筋
神経

リガンドである8−Leaは，筋線推周囲では陰性であり，セレクチンによる糖鎖を介した接着はないと考えられた．2）コラーゲン，ラミニンと結合するVLA−2，
フイプロネクチンと結合するVu−4，そのレセプターであるVCAM−1，ラミニンE8断片と結合する
VLA一一6はそれぞれ正常筋及びDMD筋線掛こは陰性で

VLA−4

DMD

（＋＋）

再生筋

（＋／−）

問質

（＋／−）

問質

myotubularmyopathy
（＋＋＋）

再生筋

あった．ただし，VLA−6は，血管周囲で特異的に陽COntrOl（＋）＊大阪大学医学部小児科

AchR

−227−

（＋）

（＋）

小径線維

血管

（−）

（＋）

血管

とを人為的な蛋白質で架橋させることができればと考えている．WGA，ConAは，ラミニン，フイプロネタ
チンなどの細胞外マトリックスに豊富に存在することが知られており，染色上これらが筋線維周囲には豊富られなかった．今後これらの因子を利用しながら筋ジストロフィーの治療に役立てたい．

に存在していることが判明した．また，調べた範囲内
では，幼若，小径筋線経では多くの細胞接着分子が膜表面に存在していたが，成熟した筋線経には殆ど認め

1）Voit T，et al：J NeuroI Sci

参考文献
89：199−211，

1989．

2）Rosen GD，etal：Cel169：1107−1119，1992．

−228−60）ⅠLl2p40遺伝子導入による同種筋芽細胞移植拒絶抑制効果
佐

研究協力者

目

藤

猛＊

星
研 一＊∫綿 加 藤
八木田 秀 雄梯 奥 村

的

筋ジストロフィーに対する治療法の1つとして正常
筋芽細胞移植が試みられているが実際には細胞導入効率の低さ，拒絶反応などの問題により長期生者は困難である．
すでにジストロフィン欠損マウスmdxに同系マウスの正常筋芽細胞を移植した場合，抗ジストロフィン
抗体の産生，CTLの誘導といった宿主側の免疫反応が認められることが報告されており1），このような免疫反応を抑制することを目的に様々な方法が試みられている．今回我々は移植筋芽細胞拒絶反応の初期に関与する細胞性免疫応答を調節しているサイトカインの一

和 則＊
康締

下

里

修樽

C2／4βp40移植マウスではその牌臓細胞の移植筋芽細胞片に対するIFN−γ産生及びCTL活性が抑制されている事を確認した．
次に1週間後にその凍結組織切片を作製した．図18
はC2／4β移植のⅩTgal，HE染色の組織像であるが正常筋組織中にβ一gal活性を持つ注入筋芽細胞部がやや黒色に染まり，多数の浸潤細胞を認めた．図1bのC2／4
βp40移植では注入筋芽細胞がより濃染し，細胞形態も分化傾向にあった．浸潤細胞に対する免疫組織化学
染色を行ない，抗M￠抗体染色ではC2〟β移植（図28）と比較してC2ねβp40移植（園如）でM￠細胞浸潤の減少を認めた．

種であるインターロイキン12（Ⅰレ12）に着目し，そのアンタゴニストとして働き得るIL−12p40の遺伝子導入を移植筋芽細胞に行いそのアロ生体内での生者延長効果について検討した．
材料・方法と結果
C3H／Heマウス由来の筋芽細胞C2ね（国立精神神経センター神経研究所鍋島先生より供与）に，マーカー
遺伝子として1acZ遺伝子をレトロウイルスベクター
lacZ／MFGを用いて導入しC飢βを作製した．さらにIL−12p40／MFG（痛研，濱田，脇本先生より供与）を用いてIL−12p40サブユニット遺伝子を導入しC2ねβ再0を樹立した・作製した筋芽細胞のⅩてal染色，FACS
法でC2／4βとC2／4βp40のみにβ−galactosidase（β−図1HE＋Ⅹgal染色130倍
a：C2ねβ移植 b：C2／4βIL12p40移植gal）の発現を確認し，さらにCか4β再0のみがIL−
12p40を産生していることをELISA法にて確認した．
次にCかすβp劇から産生されるⅠレ12p40がⅠレ12依存性のリンパ球増殖を抑制しまたIFN−γの産生を抑制することを確認し，IL−12の活性を抑制していること
を玩Ll血相で確認した．
次にアロ個休であるC57BL／6マウスの右大腿四頭筋にC2／4βまたはC2／4βp40を5×106乗個注入した．
C2／4βp40移植マウスでは血清中の抗βrgal抗体価の減少，特にIgG2a，IgG2b，IgG3の減少を認めた．また＊国立精神神経センター国府台病院神経内科＊＊噸天堂大学医学帝免疫学

図2抗M￠抗体による免疫組級化学染色130倍
a：C2hβ移植 b：Cか4βIL12p40移植
−229−

ま

次にThl塑反応であるdelayed−tyPe hypersensi−
tivityに対するIL−12p40の作用を検討した．C57BU6
マウスにC2／4βまたはC班β再0を移植し10日後の耳菜にC2／4βを接種し48時間後の同部組織を観察した．Cか4β移植後と比較して，Cか4βp40移植後の耳菜では浮腫が弱かった．良潤細胞に対する抗M￠抗体による免疫組織化学染色で，Cか4β移植後に比べCか4βp40移植後でM￠細胞浸潤の減少を認めた・
考察

抗原を認識したTヘルパー細胞は特定のサイトカイ
ンによってThlまたはTh2どちらかが優位となりThl
はIFN一丁の産生により主に細胞性免疫を増強し，一方Th2は各種インターロイキンの産生やIgclaSSス
イッチにより液性免疫を増強するというThl／Th2パラ
ダイムが提唱されている（図3）．移植細胞片の拒絶は
主に細胞性免疫，Thl型の免疫反応であるカが，このThl反応に誘導するサイトカインとしてⅠレ12がある．
Ⅰレ12は活性化されたM￠，単球等から産生される
75kDaの糖蛋白であり40kDaと35kDaの2つのサブユ
ニットがS−S結合を介したヘテロダイマー構造をもつ．
それぞれのサブユニットに対するレセプターにIL−12が結合すると，T細胞，NX細胞の増殖やそのIFN−γの産生を促進し，またNX／LAX細胞の細胞障害活性を増強することでThlタイプの免疫反応すなわち細胞性免疫を引き起こす．h Uか0の系ではⅠレ12のサブユニットIL−12p40のみを単独にレセプターに結合さ
せとⅠレ12自身の結合を競合阻害しその結果としてIL−12に対するアンタゴニストとして作用することが知とめ

h Uか0において，筋芽細胞により産生されるIL−
12p40はⅠレ12依存的反応に対するアンタゴニストとして働き，玩Ll血相において，IL−12p40の局所発現は，同種移植片に対するCTL誘導を阻著し，同種移植片に対するThl型の液性免疫反応を抑制した．すなわちIL−12p40遺伝子導入は同種細胞片移植拒絶反応を抑制する為に有効な方法と考えられた．
今後は，Ⅰレ12p40による移植片拒絶抑制がどこまで長期の生着につながるかを既に報告されている他の免疫抑制法すなわち抗接着分子抗体やFK506などとの併用を含めて検討する予定である．
謝 辞：本研究にあたり，筋芽細胞C2／4を供与して下さいました国立精神神経センター神経研究所鍋島陽一
先生，並びにⅠレ12p40／MFGを供与して下さいました（財）痛研究所濱軋 脇本先生に深謝致します．
文献1）大塚宜一，山城雄一郎，八木田秀軌 奥村 康：
mdxマウスに於ける筋移植の試み一細胞性免疫機序の関与について−．1994

日本免疫学会総会・学術集会記録．396．1994．
2）NickersonP，Steurer W，SteigerJ，ZhengX，SteeleAW and StromTB：Cytokines and theThl／Th2

paradigmin transplantation・Curr

OpinImmuno16：757−764，1994・
3）Mattner F，Fischer S，Guckes S，Jin

S，

Ⅹaulen H，Schmitt E，Rude E and Germann
T：Theinterleukin−12sibunit p408PeCificallyinhibits effects of theinterleukin−12 heterO−られている3）〜5）．本研究からわ め。においてIL−
12p40を用いてIL−12の活性を抑制することにより，より選択的な免疫抑制が可能であると考えられた．

dimer．EurJImmuno123：2202−2208，1993．

4）Gillessen S，Carva料1D，Ling P，Podlaski
EnhancementoI

FJ，Stremlo DL，Familletti PC，Gubler U，

THI CellularJmmunity

Presky DH，Stern

Ⅰし2，IFNY，
TNFαelC
FasL・nledhted

AS，and Gatcly MK：

Mouseinterleukin−12（IL−12）p40homodimer：

a potentIL−12antagonist・EurJ⊂11010二Ii⊂ily

lgGCtaSS
SlTilthlmmuno1

25：200−206，1995．

5）Ling P，Gately MK，Gubler U．Stern AS，（IgG2血，lgGヱb，lgGjJ

Lin P，Holはelder X，Su C，Pan YE and／王崇；lL●5ル6≡lg⊂la555IT如htIgGl，lgE，Iかl）
Enhancementof
HumoralHakiniJ：HumanIL−12

図3Thl／Th2パラダイム−230−

homodimer

diate biologicactivity．Jlmmuno1154：116−
127，1995．

Immunity

p40

binds to theIL−12receptor but does not me−平成7年度研究班名簿

筋ジストロフィー及び類縁疾患の病態との治療法に関する研究
平成7年度 高木班 名簿
区

分

氏

名

所
所

属

施
在

主

任

高

木

昭

夫

虎 の門病院神経 内科

監

事

寺

尾

寿

夫

北東京 寿栄 園

〒 105

〒 173
幹

事

岡

田

伸太 郎

小

澤

高

婿

佐

藤

猛

清

ク

水

輝

夫

裏

ケ

山

吉

・
弘

運 営 幹 事

荒

畑

喜

一

班

員

内

野

誠

ケ

納

光

弘

鹿 児 島大 学 医 学 部 第 三 内 科

ク

梶

龍

兄

京都大 学医学部神 経内 科

ク

川

井

尚

臣

徳 島大 学 医 学 部 第 一 内 科

ク ￣

栗

原

照

幸 ￣ 東邦大 学医学部 第四内 科

ク

後

藤

雄

一

〒2 1 1

〒8 90
〒6 06
〒7 70

〒 153

ク

小

林

高

義

ク

小

林

卓

郎

ク

木

南

英

紀

ク

斎

藤

加代子

ク

斎

藤

探美子

0 52 −74 1 −2 11 1
（内2 0 3 1）

院

長

0 47 3 −7 2 −3 50 1 ・（内2 1 12）

教授

0 3 −3 9 糾 − 12 1 1（内 19 11 ）教

授

04 5 −97 1 − 1 15 1
（内6 2 6 9）部

長

04 2 3 −4 1 −2 7 1 1（内5 1 11）

敦一授

0 96 −344 −2 11 1
（内5 147 ）敦￣ 授

04 4 −7 33 −9 2 67

教授

0 99 2 −7 5 −5 3 30

講師

07 5 −7 5 1 −3 7 72

助 教 授

0 88 6 −3 1 −3 11 1

教

授

0 3 −3 4 68 − 12 5 1

室・長（内3 2 04 ）（内2 3 2 2 ）東 京 都 目黒 区 大 橋 2 − 17 − 6
小 平市小 川東町 4 − 1 − 1
講師 一

東 京 都 文 京 区 湯 島 1 − 5 −45

04 2 3 −4 1 −2 7 11
（内5 2 14 ）0 3 −3 8 13 −6 1 11
（内 33 8 6 ）教

授

0 92 −6 4 1 − 1 15 1
（内 22 8 1）

福 岡市東 区馬出 3 − 1 − 1教

授

0 3 −5 8 02 − 10 30

助 教 授

0 3 − 33 53 −8 1 11（
内 3 12 3 0 ）

助

手

03−
−5 8 03 −5 8 2 1

助 教 授

0 5 6 1 −62 −3 3 11

東 京都文 京区本郷 2 − 1 − 1

東 京 女 子 医 科 大 学小 児 科
〒 162

授

徳 島市蔵本 町 3 ￣− 18

順 天堂大 学医学 部第一生 化学
〒 113

教

京 都 市 左 京 区 聖 護 院 川 原 町 54

九州大 学医学部神 経内 科
〒8 12

0 6 −8 79 −5 11 1
（内3 9 3 0 ）鹿 児 島 市 桜 ケ 丘 8 −3 5 − 1

東 京 医 科 歯 科 大 学 医 学 部神 経 内 科
〒 113

授

川 崎 市 中 原 区 小 杉 町 1 −39 6

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー神 経 研 究 所
〒 187

教

（内2 0 16 ）熊本 市本荘 1 − 1 − 1

日本 医 科 大 学 老 人 病 研 究所 生 化 学 部 門

田

0 3 − 35 79 −0 6 6 1

小 平市小 川東町 4 − 1 − 1

男

太

長

横 浜 市 青 葉 区 藤 が 丘 1 −30

成

ク

園

東 京 都 板 橋 区 加 賀 2 − 11 − 1

熊 本 大 学 医 学 部 附 属 病 院神 経 内 科〒8 60

0 3 − 35 88 − 1 11 1

市 川 市 国府 台 1 − 7 − 1

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー神 経 研 究所
〒 187

長

名 古 屋 市 昭 和 区鶴 舞 町 65

昭和大 学藤が丘 病院神経 内科
〒2 27

部

吹 田 市 山 田 丘 之− 2

帝京大 学医学部神 経内 科
〒 173

連絡の際の電 話

東 京都板橋 区加賀 2 − 1 − 1

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 国 府 台 病 院〒2 72

所 属 におけ る地 位

東 京都港 区虎 ノ門 2 − 2 − 2

名古屋 大学医学 部第二 生化学
〒4 66

ケ

名
地

大阪大 学医学部小 児科
〒5 65

ケ
一

設

東 京都新宿 区河 田町 8 − 1

東京医 科歯科大 学難治疾患研 究所￣
遺伝疾患研 究部 門
〒 113

ケ

佐

橋

功

東 京 都 文 京 区 湯 島 1 − 5 −45

愛知医 科大学 第四内科
〒4 80 −
1 1 愛 知県 愛 知 郡 長久 手 町岩作 雁 又 2 1−233−（内 2 17 6 ）

区

分
ケ

氏

名

庄 一司

進

所
所
一

杉

村

公

也

施
在

設

名
地

所 属 におけ る1地 位￣教

筑波大 学臨床医学系神 経 内科
〒30 5

ク

属

．授
0 2 9 8 −5 3 −3 19 2

つ くば 市 天 王 台 1 − 1 − 1

名古屋 大学医療技術短 期 大学部

教

授

作業療 法学科〒4 6 1
高

ク

守

正

治

田

ク

田

ク

代

邦

連

雄

等

垂

ク

井

清一郎

名 古 屋 市 東 区 大 幸 南 1 − 1 一 字0
教

授

教

授

0 1 1−7 16 −1 16 1
（内 6 02 7 ）院

長

0 4 23 −2 3 − 5 1 10

金 沢 市 宝 町 13 − 1

北海道 大学医学部神経 内 科〒06 0 札 幌市 北 区 北 14 条 西 5 丁 目

0 7 62 −6 2 −8 15 1（
内 3 95 0 ）二東京都立神 経病 院
〒 183

0 5 2 −7 2 3 −1 1 1 1（内 30 3 ）金沢大 学医学部神経内 科〒9 20

連 絡 の際 の 電 話

府 中市 武 蔵 台 2 − 6 − 1

国家公務 員等共済組合 連 合会

（内 3 20 1）院

長

0 6 −9 4 1 − 04 84

教授

0 25 −2 2 3 − 6 16 1

大手前病 院
〒54 0
辻

〃

省

次

〒95 1
戸

ク

田

達

史

福

原

信

義

新 潟市 旭 町 通 1 番 町7 57

東京大学 医学部人類遺 伝学

宝

来

聴

0 3 −3 8 12 −2 11 1
（内 3 654 ）副 院 長

0 25 5 −34 −3 13 1
（内2 0 1 ）助 教 授

0 55 9 −8 1 −6 7 97

順 天堂大 学医学部脳神 経 内科
〒 113 ．東 京都 文 京 区 本 郷 2 − 1 − 1教

0 3 −3 8 13 −3 11 1

自治 医 科 大 学 小 児 科教

授

0 2 85 − 44 −2 11 1
（内 344 9 ）室長

04 2 3 −4 6 − 17 15

講師

0 26 3 − 35 −4 60 0
（内5 3 24 ）名誉教授

0 96 −34 4 −2 11 1

名誉 院長

0 54 2 −4 5 −0 10 1

名誉 院長

0 3 −3 9 64 − 1 13 1

名誉教授

0 88 6 − 3 1 −3 1 1 1

国立療養所 犀潟病院

ク

水

野

美

邦

ク

桃

井

真理子

新 潟県 大 潟 町 犀 潟 4 6 8 − 1

国立遺伝学研 究所人類 遺伝研 究部 門
〒4 1 1

三 島市 谷 田 11 1 1〒32 9 一
錮
吉

田

瑞

子

国 立 精 神 ・神 経 セ ンタ ー 神 経 研 究 所

ク

池

田

修

一

信 州大学 医学部附属病 院 第三内科
〒39 0

顧

問

荒

松本市 旭 3 − 1 − 1

淑

郎

熊 本大学

ク

宇尾野

公

義

国 立 静 岡病 院

ク

豊

康

夫

東 京 都 老 人 医 療 セ ンタ ー

〒4 ？0
倉

〒17 3
ク

三

好

和

夫

事務担 当者

光村

征子

熊 本 市 本革 1 − 1 7 1

静 岡市 城革 町 2 4 − 1
東 京 都 板 橋 区 栄 町 35 − 2

徳島大学 ￣〒7 7 0

徳 島市 蔵本 町 3 丁−18

国 立 精 神 ・神 鱒 セ ン タ ー 神 経 研 究 所〒18 7（内 33 2 1 ）

小平市小 川東 町 4 「 ．
1 −1

木

〒86 0

授

栃 木県 南 河 内 町薬 師 寺 33 1ト1

ク

〒18 7

助

東 京都 文 京 区 本 郷 7 −＿3 − 1〒94 9 −
31ク

（内 5 18 0 ）
手

〒 113
ク

大 阪市 中 央 区 大 手 前 1 − 5 「3 4新 潟 大 学脳 研 究 所 神 経 内 科

小平市小 川東 町 4 − 1 − 1−234−

04 2 3 −4 1 −27 1 1（内5 119 ）