43抗肥満性食品成分の効果的摂取に関するニュートリゲノミクス解析〈平成17年度〉

抗肥満性食品成分の効果的摂取に関するニュートリゲノミクス解析
加藤久典（東京大学大学院農学生命科学研究科）

1.

緒

言の可能性を探る。
実験は解析対象をカルニチンに絞って行った

近年，様々な機能性食品成分が消費者の注目をが，大豆タンパク質の単回投与に対する遺伝子発集めているが，なかにはその効果の実験的・理現の応答についても予備的な結果を取得した。ま

論的根拠が曖昧なものも含まれている。例えば本

た今回得られた知見を他の様々な活性を有する成研究では抗肥満活性を有するとされる食品成分の分に幅広く応用し，新しい機能性成分の発見にもうちカルニチンに着目するが，これは生化学的なつながるよう，方法の確立に特に焦点を絞った。

役割は明確である一方でサプリメントとして摂取

2.

材料および方法なる情報の蓄積が期待されている。また，本研究

2. 1

動物実験において，大豆タンパク質の単回投与に対する遺L-カルニチン（関東化学㈱）を10mg/mlとな伝子発現の応答についても予備的な結果を取得しるように生理食塩水に溶解し投与サンプルとした。

た。また同様に大豆タンパク質（不二製油㈱）をした際の効果には具体的な裏づけが乏しく，さらポストゲノム食品・栄養学として注目されてい600mg/mlとなるように溶解し投与サンプルとしるニュートリゲノミクスが発展し，なかでもトラた。５週齢のWistar系雄ラット（日本チャールス

ンスクリプトーム解析（DNAマイクロアレイ）は，リバー㈱）を環境に馴化させるため３日間ステン何万もの遺伝子の発現を一度に測定できる手法とレスケージ内にて個別に飼育した。ケージはコンして，有効性が認められ広範に利用されている。

トロールされた環境条件下（温度21℃±１，照明

一方で，この研究分野は新しい学問領域であるた

８時〜18時，湿度55〜65％）に置かれ，飼料は市め発展途上な側面もあり，ゲノミクス解析の特性販ペレット（AIN-93G）を与えた。その際，飼料を活かした効率的な研究アプローチが日々試行錯と飲水は随意に採れるようにした。４日目に全て誤されている。のケージからペレット飼料を抜き取り，ラットを本研究では，DNAマイクロアレイの威力を最16時間絶食させた後，投与実験に供した。ラット大限に活用し，機能性成分の効果の新しい評価方はカルニチン溶液を５mg/100g（wt）となるよ法を模索することを主な目的とした。具体的にはう（大豆タンパク質については300mg/100g（wt））（1）抗肥満活性を有するとされるL-カルニチンをに経口ゾンデにより胃内に直接投与され，投与３対象に単回投与による初期応答（３時間及び９時時間，９時間後に頚動脈採血により屠殺された。

間）からの機能性評価・予測を試みる。
（2）
参照デー

なお，カルニチンのラット胃内投与後の血中濃タベース構築による実験間でのデータ共有・活用

度は投与10分後から上昇し40分でピークに達した44

浦上財団研究報告書

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後，24時間以上をかけて緩徐に低下することが知ルギー生産や脂質異化代謝に重要な役割を果たすられている１）。採血後は速やかに肝臓を採取し液栄養成分と考えられている。我々はマイクロアレ体窒素を用いて凍結後，解析に用いるまで−80℃イの特性を活かすため，これらのメカニズムに拘で保存した。また，生理食塩水を等量投与した群ることなく全体的な視点から解析を始めた。

を対照群とし，同様に実験を行った。
2. 2

マイクロアレイを用いる実験では膨大な遺伝子

DNAマイクロアレイ解析

発現変化を基に複数の生体応答を一度に捉えるこ

TRIzolＲ reagentを 用 い て 各 肝 臓 組 織 か らとができる反面，まずどの変化に着目して解析すTotalRNAを抽出した。続いてAffymetrix社標準ればよいのかという方向性決定には難点も多い。

プロトコルにしたがってcDNAを作成後，cRNA

我々はまずバイアスの無い機械的な解析によっを 含 むHybridization Cocktailを 作 成 し た。 上てカルニチン刺激によって最も変動した遺伝子

記 の Hybridization Cocktail を GeneChip （Rat

グループを抽出する目的でDAVID - Functional

Genome 230 2.0） に 添 加 し て，45 ℃，16時 間 ハ

Annotation Tool２） の 遺 伝 子 機 能 分 類 を 適 用 し

イ ブ リ ダ イ ズ さ せ た の ち，GeneChip Fluidics

た。これは共起性に基づき最も変動の多い遺伝Station 450を用いてチップの洗浄及び染色を行っ子を含む機能カテゴリーを発見するためのWEBた。最後に，蛍光スキャナーによりチップに搭載ツールであり，解析対象をフォーカスするのにされた31099プローブの蛍光強度を検出した。得

有効である。解析の結果，表１に示すように投ら れ た 生 デ ー タ はGCOS（GeneChip Operating

与後３時間及び９時間で減少した遺伝子群につSystem v1.3）を用いてAll probe set間で正規化いて有意な機能カテゴリーが得られた（Fisher

後，Comparison解析により対照群との発現量のs exact p-value: 0.0001＞p）。まず投与後３時間比率を算出した。False positive データを減らす

で 減 少 と 判 定 さ れ た 遺 伝 子 に お い て はantigen

ために全ての群においてPresentと判定された遺presentationやimmune response，apoptosisな ど伝子プローブ（約15000個）に絞り解析を行った。

免疫応答・細胞増殖に関する機能カテゴリーがまたGCOSによる解析の結果，Changeが「I」ま変動している様子が伺えた。生化学的な機能か

たは「D」（Change p-valueはそれぞれp ＜0.002，ら，脂質代謝との関係で注目されることの多いL-p＞9.998）と判定されたもののうち発現変化倍率

カルニチンであるが，既に免疫調節作用についてが1.41倍以上（Signal log ratio値で±0.5以上）あっ多数の報告がなされている ３〜５）。作用メカニズ

たものを解析対象とした。対照群と比較してカルムの詳細については不明なものが多いが，一つのニチン投与３時間後で変動が認められた遺伝子は経路としてL-カルニチンのグルココルチコイド受334個（増加：259個，減少：75個），９時間後で容体への刺激を介した免疫調節作用６） が提唱さ変動が認められた遺伝子は342個（増加：236個，れている。一般的にグルココルチコイドは炎症反減少：106個）であった。

応に関与する遺伝子発現を抑制すると言われておＲり７），このことも今回の結果を支持している。ま

3.

結果と考察

3. 1

Functional Annotation Toolによる解析（lipopolysaccharide）により誘導されるサイトカ

L-カルニチンは脂肪のミトコンドリア膜内へのイン産生を抑制するという興味深い報告もある８）。

輸送を担いβ酸化に必須であるため，一般にエネ

このように免疫応答の調節はL-カルニチンの重要た，ラットへのカルニチン投与がエンドトキシン

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抗肥満性食品成分の効果的摂取に関するニュートリゲノミクス解析
表１����������������������

��������������������������を用いた遺伝子の機能分類��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
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な生理作用の一つであるが，今回の結果から投与は培地へのカルニチン添加によって4時間という後3時間という早い段階で転写活性に影響を与え

短 時 間 で 濃 度 依 存 的 なCPT-1, CPT-2, CRATのる様子を捉えることができた。

mRNAレベル上昇が認められるが，一定濃度を一方，カルニチン投与９時間後に減少した遺超えた場合には逆に抑制がかかることが示されて

伝 子 群 に お い てlipid metabolism，cellular lipidいる９）。今回の実験においても細胞内カルニチンmetabolismに関する機能カテゴリーの遺伝子へ濃度上昇が脂質分解系経路のネガティブフィードの 影 響 が 示 唆 さ れ た。Lipid metabolismに 含 まバックを引き起こした可能性が考えられ，これはれ る 遺 伝 子 はcytosolic acyl-CoA thioesterase 1

カルニチンの効果的な摂取方法や摂取量を検討すや mitochondorial acyl-coa thioesterase 1など細る上で興味深い知見である。

胞内において脂質異化に働く因子であり，これらIncreaseと判定された遺伝子群に関しては３が増加ではなく抑制されていた事は予想外であっ時間，９時間実験ともに有意な変動（0.0001＞p）

た。また，これら以外にもカルニチンの脂質異を示す機能カテゴリーは得られなかった。

化代謝に重要なCarnitine transporter, Acyl-CoA

以 上 の よ う に， 経 口 投 与 実 験 に お け るsynthase, Carnitine O-palmitoyltransferase type

Functional Annotaion Toolによるバイアスの無I（CPT-1）and Carnitine O-palmitoyltransferase

い解析からカルニチンの生理作用の中でも特に重type II（CPT-2）, Carnitine acetyltransferase

要な脂質代謝や免疫調節作用に関する遺伝子の変（CRAT）についても変化は小さいものの有意な動を捕らえることができた。

減少が認められた。つまり，投与９時間後におけ3. 2発現変動が顕著な遺伝子に着目した解析

る脂質異化代謝に関する遺伝子の発現は全体的に続いて発現変化が特に顕著な遺伝子群に着目は抑制の方向に変化していることが推察された。

し た。 具 体 的 に は ３ 時 間 あ る い は ９ 時 間 の い

ヒト肝ガン細胞HepG2を用いたin vitroの実験でず れ か で 対 照 群 に 比 べ て ２ 倍 以 上・ ２ 分 の １

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浦上財団研究報告書
表２��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

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L-カルニチン投与により顕著に発現が上昇した遺伝子�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

表３������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

L-カルニチン投与により顕著に発現が減少した遺伝子���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������

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以下に変動したものを全て抽出した（表２，表割を果たすとされるCytochrome p450ファミリー３）。3.1で得られた結果をもとに脂質代謝・免タンパク質に着目したが，そのうち投与3時間後

疫調節・細胞増殖に関する遺伝子を中心に生理に お い てCyp2c40，Cyp3a13の 発 現 増 加 が 認 め機能との関係が明確なものに絞って解析を試みられた。Cyp2c40は免疫的炎症反応に重要なアた。我々はまず脂質代謝・薬物代謝に重要な役ラキドン酸の代謝に関わる酵素である10）。今回

抗肥満性食品成分の効果的摂取に関するニュートリゲノミクス解析

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Cyp2c40以外にもアラキドン酸代謝に重要な酵素用を持つとして有名なサイトカインTGF-βの受

arachidonate 12-lipoxygenaseの 発 現 抑 制（-1.52容体及び肝癌抑制作用を持つとされるmet proto-倍），代謝産物であるプロスタグランジンの受容oncogene（HGF受容体）が特に顕著に増加した。

体prostaglandin E receptor 3の発現上昇（1.5倍）

何れも薬剤ターゲットとして，また細胞増殖の調が観察された。このことからカルニチンの免疫節シグナルとして極めて重要な意味を持つ分子で賦活作用の一部がアラキドン酸カスケードへの影あり，既に知られるカルニチンによる細胞制御機響を介している可能性が示唆された。同じく薬物

構14）に新たな知見を提供できた。

代謝酵素であるCyp3a13については知見が少ない

3. 3が様々な核内受容体によって発現が制御されるこ以上までに得られた結果は膨大なマイクロアレと，デキサメタゾンなどの薬剤により顕著に誘導

イ解析データのほんの一部に過ぎない。遺伝子発11, 12）される因子として良く知られている参照データベースの構築と活用について。前述の現変化を取りこぼし無く活用するためには情報共ようにカルニチンはグルココルチコイドのアゴニ有を指向した専用のデータベースが必要であるとストとして作用することが示されおり，Cyp3a1考えられる。そこでWeb上でのデータ共有を指の顕著な発現上昇もこの事実と一致する。

向した参照データベースを構築しているが，本研

細胞増殖については，３時間及び９時間で顕究において本データベースを大きく改良し，デー著に減少した遺伝子の中に細胞周期をG1からSタの横断的比較の機能を増強した（図１）。これ期へ移行するのに必須のCyclin D1が含まれていによりアレイプラットフォームや研究室間のデーた。Cyclin D1は多くのがん細胞において異常発タを相互に比較することが可能になった。本研現していることから抗ガン剤のターゲットと考究で得られたカルニチン投与による発現プロファ

えられている因子である13）。また細胞増殖抑制作イルもここから閲覧が可能となっている（http://

図１

参照データベース
左図は発現プロファイルのデータ検索画面。右図は検索結果を示している。

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浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）

133.11.220.243/nutdb.html）。また，
本報告ではデー経口急性毒性（LD50≧5g/kg）をはじめ，様々タは省略したが，ラットに大豆タンパク質を単回な毒性試験において安全性が証明されている。そ投与した際の肝臓の遺伝子発現プロファイルも本

こで，実際にデータベースに登録された48個の肝研究において得ており，同データベースに搭載し臓毒応答遺伝子（増加:22遺伝子，減少:26遺伝子）ている。通常，タンパク質摂取の効果は，週単位をカルニチンの発現データと比較した。その結果，の一定期間投与して解析するが，この実験では摂投与３時間及び９時間と同方向への２倍以上の変取後数時間での応答を見ている点がユニークとい化が認められたものは無く，遺伝子レベルで安全える。大豆タンパク質も抗肥満作用が知られてい性を裏づける結果を得た（当研究で行われた肝障る食品成分のひとつであり，その効果が遺伝子発害誘導薬剤投与実験における発現比較では相当数

現プロファイルレベルでは非常に早く見られるこの遺伝子がこれら毒物バイオマーカーに応答するとを期待して解析を行った。単回投与では，脂質事が示されている）。なお今回の実験で肝臓障害代謝関連遺伝子のごく一部のみが応答することがマーカーGOT，GPTは群間に有意差は認められわかったが，本データも他の抗肥満成分の効果をなかった（Data not shown）。このように，発現比較する場合のリファレンスデータのひとつとしプロファイルは従来の食品安全性評価系を補完すて活用が期待される。

る形でも活用されうると考えられる。今後，様々また，生理的な意味を持つ遺伝子バイオマーな成分や条件で実験データを蓄積し，より多様でカーセットを予め登録することで，より効率的な信頼性の高い食品機能評価システムを構築していデータ解析が実現できると考えられる。例えば本

く予定である。

データベースには毒物ゲノミクス研究から得られ3. 4

まとめた肝毒応答遺伝子15） が登録されており，これら

今回，L-カルニチンを対象として単回投与実験は直感的な操作によって入力（登録）データと比による新しいトランスクリプトーム解析例を提示較することができる。

できた。食品成分による生体応答は比較的弱くブ

今回実験に用いたL-カルニチンは経口摂取時にロードであるため，観察期間が長期に及ぶ場合もは極めて安全性の高いサプリメント素材であり，多い。マイクロアレイを用いた解析では僅かで短

図２

食品成分のニュートリゲノミクス解析

抗肥満性食品成分の効果的摂取に関するニュートリゲノミクス解析

期的な応答を網羅的に検出できるため，今回のような単回投与による解析からも多くの情報を得ることができる。今後，こうした解析に加え，デー

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glucocorticoids in vivo. Am J Pathol. 162: 47-56, 2003
８）Winter BK, Fiskum G, Gallo LL. Effects of L-carnitine
on serum triglyceride and cytokine levels in rat models ofcachexia and septic shock. Br J Cancer. 72: 1173-9, 1995

タベースと解析基盤データの整備が進むことで，

９）Alzbeta G, Elke L, Sylvia B, Alison CA, Alfred L,

ゲノム情報を活用した効率的な食品機能の評価がReinhold H. . L-Carnitine Regulates mRNA Expression

可能になると期待される（図２）。

Levels of the Carnitine Acyltransferases 〓 CPT1A, CPT2,and CRAT. An International Journal of Chemistry. 136:1349-1363, 2005

謝辞

本研究に対し多大なご助成を賜りました財団法人

浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。

10）Luo G, Zeldin DC, Blaisdell JA, Hodgson E, Goldstein
JA. Cloning and expression of murine CYP2Cs and theirability to metabolize arachidonic acid. Arch Biochem
Biophys. 357: 45-57, 1998
11）Anakk S, Kalsotra A, Shen Q, Vu MT, Staudinger JL,Davies PJ, Strobel HW. Genomic characterization and文献１） 羽 鳥 泰 彦， 泉 二 奈 緒 美， 吉 信 清 夫， 重 松 昭 世，l-塩 化
カルニチンの体内運命（第一報），医薬品研究，19（2）,324-340 （1988）
２）http://david.abcc.ncifcrf.gov/
３）Athanassakis I, Mouratidou M, Sakka P, Evangeliou
A, Spilioti M, Vassiliadis S. L-carnitine modiﬁes thehumoral immune response in mice after in vitro or in vivo
treatment. Int Immunopharmacol. 1: 1813-22, 2001
４）Mast J, Buyse J, Goddeeris BM. Dietary L-carnitine
supplementation increases antigen-speciﬁc immunoglobulin
G production in broiler chickens. Br J Nutr. 83: 161-6, 2000
５）Deng K, Wong CW, Nolan JV. Long-term effects ofearly-life dietary L-carnitine on lymphoid organs andimmune responses in Leghorn-type chickens. J Anim
Physiol Anim Nutr（Berl）. 90: 81-6, 2006
６）Manoli I, De Martino MU, Kino T, Alesci S. Modulatory
effects of L-carnitine on glucocorticoid receptor activity.
Ann N Y Acad Sci. 1033: 147-57, 2004
７）Fingerle-Rowson G, Koch P, Bikoff R, Lin X, MetzCN, Dhabhar FS, Meinhardt A, Bucala R. Regulation ofmacrophage migration inhibitory factor expression byregulation of CYP3a13: role of xenobiotics and nuclear
receptors. FASEB J. 17: 1736-8, 2003
12）Down MJ, Arkle S, Mills JJ. Regulation and induction ofCYP3A11, CYP3A13 and CYP3A25 in C57BL/6J mouseliver. Arch Biochem Biophys. 457: 105-10, 200713）Jimenez-Orozco FA, Lopez-Gonzalez JS, NietoRodriguez A, Velasco-Velazquez MA, Molina-Guarneros
JA, Mendoza-Patino N, Garcia-Mondragon MJ, ElizaldeGalvan P, Leon-Cedeno F, Mandoki JJ. Decrease of cyclin
D1 in the human lung adenocarcinoma cell line A-427 by
7-hydroxycoumarin. Lung Cancer. 34: 185-94, 2001
14）Conti P, Reale M, Stuard S, Spoto G, Picerno F,Ferrara T, Placido FC, Barbacane RC, Albertazzi A,Errichi BM. Reduced human lymphocyte blastogenesis
and enhancement of adenosine triphosphate（ATP）byL-carnitine. Mol Cell Biochem. 131: 1-8, 199415）Minami K, Saito T, Narahara M, Tomita H, KatoH, Sugiyama H, Katoh M, Nakajima M, Yokoi T.
Relationship between hepatic gene expression proﬁles andhepatotoxicity in ﬁve typical hepatotoxicant-administeredrats. Toxicol Sci. 87: 296-305, 2005

50URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.15（2007）

A Nutrigenomics Study on the Effective Intake of Anti-Obesity Food Factors
Hisanori Kato（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Nutrigenomics technology is about to revolutionize food and nutrition science throughits power of comprehensiveness. Of different nutrigenomics methodologies, transcriptome
analysis is the primary choice for exhaustively revealing the functionality of food factors.
Here we employed DNA microarray technology to probe the mechanisms underlying theanti-obesity effect of carnitine. Rats were administered carnitine through gavage at the doseof 5mg/100gBW and sacriﬁced after 3 and 9 hours. Their hepatic gene expression proﬁle
was obtained and was compared with that of control rats. Functional annotation analysis
revealed that many genes related to immune response and cell proliferation were downregulated at 3 hr after carnitine administration. Surprisingly, many genes for enzymes
involved in lipid catabolism were down regulated at 9 hr. Another purpose of this study
is to facilitate efﬁcient utilization of nutrigenomics data through a unique database. The
function of the database was extended to make cross-study comparison easier. The dataof the above experiment was put into the database, and comparison was made with manyother transcriptomics data. No similarity of the gene expression change was suspected whencompared with the effects of hepatotoxic reagents suggesting the safety of the carnitine
dose employed in this experiment. The result of the study indicated that transcriptomics
approach is highly useful in not only function analysis of food factors but also safetyevaluation of them. The combination of DNA microarray technology and the improved
database will contribute greatly to the realization of effective use of functional food factors.