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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 25 年度助成＞

味覚認識時における嗅覚の役割
西住裕文・齊藤

治美・坂野仁（福井大学 医学部高次脳機能）

かっていない。そこで本研究では先天的本能回路に緒言着目し、天敵臭がどのような神経回路を介してマウヒトにとって食嗜好への欲求は本能的なものであり、生命維持に必要な養分摂取のみならず、幸福感スに忌避や恐怖行動を誘起するのかについて解析を行った。

を生み人生をより豊かにするために重要な役割を担っている。これまでの研究から、摂食時、食物の方法および結果

味は舌上の味蕾細胞で発現する味覚受容体を介して知覚され、甘味、酸味、塩味、苦味、旨味として認

これまでのマウスを用いた嗅覚研究により、個々識されることが明らかとなっている 。しかし舌をの嗅神経細胞の発現する嗅覚受容体（OR）は 1,000

介した味覚知覚は非常に曖昧で、目を塞いで視覚を種類の遺伝子ファミリーの中から 1 種類に限られ、遮断したり、風邪で鼻が詰まり嗅覚が働かない場合同じ種類の OR を発現する軸索は互いに収斂し、嗅には、料理の味が十分味わえないことを我々は実体球上の特定の位置に糸球体構造をつくって投射する験として知っている。このように味覚は、視覚や嗅ことが知られている 2,3)。従ってマウスの嗅球表面に覚など他の感覚から多大な影響を受ける。そこで本は、OR の種類に対応して約 1,000 個の糸球体を素研究では、食の嗜好に対し嗅覚情報がどのような影子とするデジタルマップが形成され、糸球体の発火響を及ぼすかについて理解するために、マウスの嗅パターンとして二次元展開された匂い地図を脳の中覚系からアプローチを試みた。

枢が識別することによって、情動や行動の判断が行

１)

大きな目標の一つは、味覚・嗅覚両方の感覚から、われていると考えられている。当グループでは以前、マウスにとって相反する “ 快（好き）の情報 ” と “ 不マウスにとって天敵の一つであるキツネが分泌する快（嫌い）の情報 ” を同時に与えた場合に、脳内の物質（TMT）をマウスに嗅がせると、嗅球上の複数どこで両感覚情報がぶつかった後に統合され、情動の糸球体が活性化し、背側の本能回路を介して忌避判断や意思決定を行うに至るかを理解することであや恐怖行動が誘引され、腹側の学習回路を介して学る。例えば、天敵臭はマウスにとって非常に強いス

習判断することを報告した 4)（図 1）。そこでまず本トレスを与え、忌避ならびに恐怖反応を引き起こす。

能回路を特定することを念頭に、TMT を受容し、嗅しかし我々が行った予備実験では、空腹時のマウス

球背側に位置する糸球体の OR を単離することを試は食欲が勝り、天敵臭がする餌であっても接近してみた。具体的には、イメージングと神経細胞のラベ食べようとする。このような意思決定が脳内のどこリングを組み合わせる方法をとった。まず麻酔下にで生じるかを、将来明らかにしたいと考えている。

あるマウスに TMT を嗅がせ、発火する糸球に DiI を

しかし現在は、ようやく嗅覚一次神経回路形成の分注入した。これにより、発火した糸球に投射する嗅子基盤が明らかになった段階であり、嗅球以降の二神経細胞が蛍光標識される。続いて嗅上皮組織を摘次神経回路にどのような原理が存在するのか全く分出して、トリプシンによって細胞分離させ、顕微鏡味覚認識時における嗅覚の役割

図１63

マウス嗅覚系における天敵臭ＴＭＴの情報を処理する二種類の神経回路
一つは本能判断のための回路（赤色の経路）で嗅上皮の背側で、もう一つは学習判断のための回路（緑色の経路）で嗅上皮の腹側の神経細胞で受容される。

下で蛍光標識された嗅神経細胞を単離した。この単別の OR を選び直しているため、蛍光標識された嗅離した細胞から RNA を抽出し、逆転写反応により神経細胞の軸索が複数の糸球体に紛れ込んでいる様

cDNA を回収した。OR 遺伝子に対する縮重プライ子が観察された。

マーによる PCR を行うことにより、単離された嗅神

我々はまず、光照射によって活性化された糸球体経細胞で発現する OR 遺伝子を同定した。同定されに接続する二次神経細胞が、匂い分子で刺激されたた OR 分子が実際に TMT に応答するかは、既に確立されている heterologous な再構成系を用いた。即ち、HEK293 細胞株に OR 遺伝子を発現させ、TMT の添加により細胞が活性化するかどうかをルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイにより検定した。その結果、TMT に応答する OR を複数単離することに成功した。その中で TMT に対して特異性が高く、親和性が最も高かったものを ORTMT と命名し、以降の実験に用いた。
ORTMT の 生 理 的 な 機 能 を 解 析 す る た め、loss-offunction の実験として ORTMT を欠失させたノックア
ウ ト（knockout: KO） マ ウ ス と、gain-of-functionの実験として ORTMT にチャネルロドプシンを繋いだノックイン（knockin: KI）マウスをそれぞれ樹立した（図 2）。KI マウスでは、蛍光標識された ORTMTの糸球体が嗅球背側後方に位置することが分かった。 ま た 光 学 イ メ ー ジ ン グ を 行 う こ と に よ っ て、
ORTMT の糸球体が TMT を嗅がせた時に活性化する複数の糸球体の一つであることが確認された。一方KO マウスでは、選択したが ORTMT 欠損し、新たに

図２

ORTMTKI マウスおよび KO マウスの樹立
KI マウスでは、蛍光標識された ORTMT の糸球体が嗅球背側後方に観察された。KO マウスでは、蛍光標識された嗅神経細胞の軸索は複数の糸球体に紛れ込んでいた。

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Vol.25（2018）時と同様に活動するかどうかを電気生理学的に解析

ウスの頭部に光ファイバーを挿入し、光照射を行っした。その結果、光量が弱いと房飾細胞だけが活性て ORTMT の糸球体のみを活性化した。その結果、KI化し、光量が十分に強いと房飾細胞と共に僧房細胞

マウスは体の動きを停止してすくむ行動（freezing）も活性化され、高次中枢へ電気信号が伝達されるこを示すことが判明した（図 3）。勿論この光刺激によとを確認できた。この結果は、TMT の濃度に依存しりすくみ行動が誘引される現象は、野生型マウスや、て房飾細胞および僧房細胞がそれぞれ発火する様式

頭部をアルミホイルで遮蔽して光が当たらないようと同様であった。にした KI マウスでは認められなかった。以上の結果

次に我々は、immediate early gene の一つであるは、高等動物の主嗅覚系において、単一糸球体の光Egr1 の発現を指標として、TMT を嗅いだ時と同様刺激によって本能行動を誘導した最初の例である。に、光照射した KI マウスでも嗅皮質の各領野が活性化されるかを網羅的に解析した。その結果、活性化考察・展望される嗅皮質細胞の数はおしなべて減少するが、恐怖行動を誘引する領野として報告されている BNST

本研究で得られた成果は、単一糸球体の光刺激にや CoA などは、光照射で顕著に活性化されることをより、天敵臭に対する恐怖反応の gain-of-function見出した。

を神経回路レベルで再現した画期的なものである。

光照射によって、匂いを嗅がせた時と同様に電気

今後 ORTMT の糸球体から順を追って神経回路をト信号が嗅球から嗅皮質へと伝達されることが確認さレースすることによって、匂い情報がすくみ行動をれたので、我々は光刺激後のマウスの行動について引き起すまでの本能回路の全容が明らかになると期解析を行った。KO マウスに TMT を嗅がせた場合、待される。しかし実験を行っていて一つ不思議だっ野生型より反応性はやや落ちるが、やはり忌避ならたのは、KI マウスに光照射すると、忌避反応を示すびに恐怖行動を示した。これは他の TMT 応答性 ORことなくいきなり freezing を示した点である。天敵が残存するので、TMT の天敵臭としての情報を補

臭 TMT を嗅がせた時、一般にマウスはまず匂い源完的に伝えているものと予想された。次に、KI マから逃避し、逃げ切れないと判断した後にすくんで

図3

光照射により KI マウスと野生型 (WT) マウスが示す行動
各マウスの頭部に光ファイバーを挿入し、１分ごとに５秒間光照射して、発現しているチャネルロドプシンを活性化した時にマウスが示す行動を解析した。KI マウスは光照射によって顕著にすくみ行動を示したが、WT マウスや頭部をアルミホイルで覆って光照射を遮った KI マウスは、歩いたり散策行動をしたり、毛づくろいを行い、特に変わった行動は示さなかった。

味覚認識時における嗅覚の役割死んだふり（freezing）を示すからである。これに謝65

辞以外の TMT

上述の研究成果は、文献 5）にて報告することが応答性 OR の糸球体を介して、忌避反応は別ルートできました。本研究を遂行するにあたり、ご支援をで情報処理されていると予想される。現在、TMT 応頂いた公益財団法人 浦上食品 ･ 食文化振興財団に厚ついては、嗅球背側後方にある OR

答性 OR として同定した ORTMT

TMT以外の OR に対してく御礼を申し上げます。

も、同様の gain-of-function の実験を行って検証中である。
本研究の期間内では手が回らず実施できなかったが、味覚情報が、ORTMT の糸球体から始まる先天的本能回路とどの領域で出合うのか、また、もし味覚情報と嗅覚情報が相反するとすれば、両情報が高次中枢のどこで統合され意思決定が行われるかを明らかにする研究に今後は挑戦したい。天敵臭を提示した場合でも、空腹時にはマウスはその空間にある餌に敢えて近づくことが予備実験で明らかになっている。そこで、対立する２つの先天的判断が同時に誘起された場合、脳内でどう情報が balancing されるのかを調べるため、イメージングや組織免疫学的な手法を用いて、嗅球および嗅皮質上で活性化される領野を同定していく。こうした一連の研究から得られるであろう知見は、食嗜好が味覚や嗅覚情報処理を介し、脳のどの領域で生まれているかを解明するのみならず、将来的にはヒトの心の葛藤や意識の理解にも役立つものと期待される。

参考文献

1）D.A. Yarmolinsky, C.S. Zuker, and N.J. Ryba, Common
sense about taste: from mammals to insects. Cell139, 234-244 (2009).
2）K. Mori and H. Sakano, How is the olfactory map
formed and interpreted in the mammalian brain?
Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
3）H. Nishizumi and H. Sakano, Developmental
regulation of neural map formation in the mouseolfactory system. Dev. Neurobiol. 75, 594-607(2015).
4）K. Kobayakawa et al., Innate versus learned odour
processing in the mouse olfactory bulb. Nature 450,
503-508 (2007).
5）H. Saito, H. Nishizumi et al., Immobility responses areinduced by photoactivation of single glomerularspecies responsive to fox odour TMT. Nat. Commun.
8, 16011 (2017).

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

Photo-activation of a single glomerulus for the fox odorant TMT issufficient to induce immobility responses in mice
Hirofumi Nishizumi, Harumi Saito, Hitoshi Sakano
Department of Brain Function, School of Medical Sciences, University of Fukui
Abstract
Fox odor trimethyl-thiazoline ( TMT ) is known to activate multiple glomeruli
and elicits strong fear responses. However, it was unclear whether individual
glomeruli are functionally specialized to instruct particular responses, or if apattern of activated glomeruli as a whole can be recognized to elicit behavioral
decisions. In this study, we generated knockin (KI) and knockout (KO) mice for
OR TMT, a TMT-responsive odorant receptor (OR) with high ligand affinity andselectivity. We found that photo-stimulation of a single glomerular module for
OR TMT activated the TMT-responsive cortical regions, leading to the inductionof immobility, but not aversive behavior. In the KO mice of OR TMT, immobility
responses were reduced, but not entirely abolished, most likely due to thecompensatory functions of other TMT-responsive glomeruli. These results
demonstrate that the activation of a single OR TMT glomerulus in the posterior
part of the dorsal OB is sufficient to elicit immobility responses in mice,and show that TMT-induced fear can be separated into at least two different
components: immobility and avoidance.
This work was supported by Research Grant from Urakami Foundation.