向科学技術振興財団

研究助成成果報告書

環状分子を基盤とする多成分結晶粒子群の分離精製に向けた晶析プロセスの開発
Development of crystallization process for obtaining crystalline particles of co-crystals with desired quality

助成年度

令和 4 年度研究助成

助成番号

MZR2022001

研究期間2022/04/01

代表研究者

甘利 俊太朗

東京農工大学大学院工学研究院応用化学部門

共同研究者

宇野 沙映

東京農工大学大学院工学府応用化学専攻システム化学工学専修

共同研究者

滝山 博志

東京農工大学大学院工学研究院応用化学部門

キーワード

多成分結晶, 溶媒和物， 晶析, 粒子群特性, 相図～2023/03/31

溶解性を有するため，医薬品分野では，有効成１．研究の背景と目的
多成分結晶は複数の成分から構成され、単一分の溶解性を改善する化合物の 1 つとして期待さ成分から成る結晶とは異なる物性を発現するたれている 5．初期検討により，CB7 水溶液から固め、新たな機能性材料として注目されている 1-3。

相を析出させると、操作条件によってアモルフ

しかし、多成分結晶の工業的な製造に向けて、ァスが析出する場合と、明確な面を有する結晶多成分結晶の粒子群の特性を考慮した晶析操作が析出する場合が存在することを見出した。こは十分に検討されていない。多成分結晶の場合，れは，CB7 が水分子と共に多成分の固相として液相から複数の成分を決まった比率で析出させ析出することに起因していると考えられる 9,10．

なければならない．したがって，所望の特性をそこで，多成分結晶の一つである CB7 と水から有する多成分結晶粒子群を得るためには，単一成る CB7 水和物の結晶化条件を検討することに成分の場合に比べ，厳密な晶析操作の設計が必

よって，多成分結晶を粒子群として獲得するた要となる．

めの晶析操作を設計する上で必要な基礎的知見

多成分結晶の粒子群特性と晶析操作の関係をを見出せると考えた。そこで、本研究では、多検討する上で，本研究では、当初、環状構造内成分結晶粒子群の分離精製に向けて、多成分結に様々な分子をゲスト分子として取り込み，包晶を構成する環状分子を利用して、晶析操作条接化合物を形成する環状分子の Cucurbit[7] uril

件と結晶粒子群特性の関係を明らかにすること（CB7）4 に着目した．CB7 は比較的高い水へのを目的とした。

1

群特性に与える影響を調べるために、30℃のエ２．研究の内容・方法(1) 実験系

クトイン 飽和水 溶液に 対 して、エ タノー ルを当初、水と共に多成分結晶を構成する CB7 をTable 1 に示した組成で添加し、混合から 12 時間モデル化合物として利用する予定であったが、後の懸濁液を固液分離して、結晶粒子群を回収晶析条件と結晶粒子群特性の関係を調査するたした。

めの十分な試薬量を確保できず、予定していたTable 1 Mixing ratio of each experimental condition.

研究計画が実施できない可能性が出てきた。そこで、本研究では、新たなモデル化合物としてエクトインに着目した（Figure 1）。

Figure 1 Structural formula of ectoine.

エクトインは、高塩耐性メタン酸化細菌がメRun

xEthanol[g/g-soln.]

Ectoine aq.
soln. [g]Ethanol [g]

10.95

2.00

38.00

20.90

2.00

18.00

30.85

2.00

11.33

40.80

2.00

8.00

50.75

2.00

6.00

60.70

2.00

4.67

70.50

2.00

2.00

回収した結晶粒子群は光学顕微鏡（VHX-6000,

タンをエネルギー源として合成する環状アミノKEYENCE） を 用 い て 観 察 し た 。 ま た 、XRD

酸の 1 つであり、近年、機能性化合物として医薬（UltimaⅣ, Rigaku）を用いて、得られた結晶粒品や化粧品分野での需要増加見込まれている 6-10。

子群の結晶形を同定した。

また、先行研究により、エクトインは CB7 と同様に，水と共に結晶化することが報告されてい(2-2) 三成分相図の作成

る 11。しかし、結晶の粒径や結晶形を含め、晶析

非溶媒添加晶析後の溶液濃度は 30℃での混合の操作条件と結晶粒子群特性との関係は明らか溶媒に対するエクトインの飽和濃度として考えになっていない。そこで、CB7 よりも安価なエることができる。そこで、溶液濃度を測定し、クトインをモデル化合物として、多成分結晶の晶析操作の基礎データとして、エクトイン‐水粒子群特性と晶析操作条件の関係を調査するこ‐エタノールの三成分系での溶解度曲線を含むととした。

三成分相図を作成した。

予備実験より、エクトインは水に比べてエタノールにはほとんど溶解しない（純粋溶媒に対(2-3) 湿度の影響する 60℃での溶解度は水のとき 57.3 wt%、エタ水和物の場合、保管環境の湿度に応じて結晶ノールのとき 0.7 wt%）。そこで、本研究では、形 が 変 化 す る 可 能 性 が あ る 。 そ こ で 、XRD

水を良溶媒、エタノールを非溶媒とした非溶媒（UltimaⅣ, Rigaku） を 用 い て 、 室 温 下 で 湿 度

添加晶析の操作条件と析出する結晶粒子群特性（RH）を変更しながら、エクトインの結晶粒子の関係を評価した。

群の XRD スペクトルを測定し、湿度がエクトインの結晶形に及ぼす影響を調査した。

(2)実験手法(2-1)混合溶媒組成の影響
非溶媒添加晶析にて混合溶媒組成が結晶粒子

2３．研究の成果

Anhydrate
Dihydrate(1) 溶媒の混合比が粒子群特性に及ぼす影響

xEthanol=0.50

30℃のエクトイン飽和水溶液とエタノールの

xEthanol=0.70
Intensity [a.u.]

混合比を変更して非溶媒添加晶析を行った際に得られた結晶粒子群を光学顕微鏡で観察した結果を Figure 2 に示す。

xEthanol=0.75
xEthanol=0.80xEthanol=0.85(a)(b)
xEthanol=0.90
xEthanol=0.95
5500 μm(c)10152025303540452θ [degree]

500 μmFigure 3 XRD spectra of crystalline particles obtainedby anti-solvent crystallization.

(d)Figure 3 より、xEthanol [g/g-soln.] = 0.80 以上では、
500 μm(e)

エクトインの無水物が析出していることがわかっ

500 μmた。一方、xEthanol= 0.5～0.75 で析出した結晶は、エ(f)クトインの二水和物であることが分かった。
Figure 2 および Figure 3 の実験結果を総合すると、柱状晶は無水物、プリズム晶は二水和物であるこ

500 μmとを見出した。

500 μm以上より、多成分結晶の一つで、溶媒分子と共(g)に固相を形成する溶媒和物の場合、混合時の溶媒組成によって析出する結晶の結晶形が異なることが分かった。すなわち、非溶媒添加晶析の場合、非溶媒の組成を変更することによって、エクトイ

500 μmンの無水物と二水和物の作り分けが可能であるこFigure 2 Optical microscope photographs of crystalline
particles obtained by anti-solvent crystallization. xEthanol=(a) 0.95, (b) 0.90, (c) 0.85, (d) 0.80, (e) 0.75, (f) 0.70 and(g) 0.50.とが示唆された。

(2)三成分相図を用いた解析
Figure 2 より、混合溶媒組成によって析出する

次に、30℃のエクトイン‐水‐エタノール系で、結晶形態は大きく変化した。具体的には、xEthanol

測定した飽和濃度から作成した三成分相図をが 0.50～0.75 ではプリズム晶、0.80~0.95 では針状

Figure 4 に示す。

（柱状）晶が得られた。そこで、結晶形を同定するために、得られた結晶粒子群を XRD で分析した結果を Figure 3 に示す。

31.0Anhydrate

0.8Dihydrateった。そこで、下記の式（1）を用いて、エクトイ

wEctoine [g/g-soln.]

ン無水和物と二水和物の特徴的なピークの強度（Ianhydrate と Idihydrate）とその比から無水和物と二水Fittingcurve(Anhydrate)Fittingcurve(Dihydrate)

0.60.4

和物の存在比率を推算した（Figure 6）（1）

Ianhydrate= Ianhydrate/( Ianhydrate+K・Idihydrate)

0.2Anhydrate

0.00.2 0.4 0.6 0.8
wEthanol [g/g-soln.]

1.0Ratio of anhydrate/dihydride [-]0.0

Figure 4 Ternary phase diagram of ectoine-waterethanol at 30℃ with mass fraction solubility of ectoine
as a function composition of mixture solvent.
xEthanol＝0.75 付近で安定な結晶形が入れ替わることを考慮した結果、各結晶形の析出領域を相図上で推定することができた。すなわち、この相図を

10.8
0.6
0.4
0.200

用いれば、非溶媒の混合比を変更することで所望20 40 60 80
Relative humidity[%]

100の結晶形の粒子群を作り分けることが可能である
ことを見出した

Figure 6 Relationship between the relative humidity
and ratio of anhydrate/dihydrate.

(3-3)エクトインの結晶形に対する湿度の影響

Figure 6 より、RH＝75％付近で、エクトインエクトイン無水和物の結晶粒子群を室温下で湿無水和物の割合が急減し、エクトイン二水和物度（RH）を変更しながら XRD スペクトルを測定へ転移していることが明らかになった。前項よした結果を Figure 5 に示す。

り、エクトインの無水和物と二水和物では、結晶粒子群の様子が大きく異なるため、晶析後のRH=85%工程での操作性を考慮すると、得られた結晶粒

RH=75%子群を所望の結晶形として維持するためには保RH=65%

管環境を適切に制御することが重要であると考RH=50%えられる。

RH=25%
Dihydrate1015

20 25 30
2θ [degree]

４．結論

Anhydrate

多成分結晶粒子群の特性制御に向けた晶析プ35

ロセスの開発に向けて、水と共に結晶化するエ40

クトインを用いて、非溶媒添加晶析時の混合溶

Figure 5 XRD spectra of crystalline particles ofectoine under various RH conditions.

媒組成が結晶粒子群の形態や結晶形といった特性に及ぼす影響を検討した。

その結果、RH=65％付近でわずかに二水和物由

光学顕微鏡観察の結果、エクトインの結晶形来のピークが検出され、RH＝75％付近で無水和物態は混合溶媒組成に応じて大きく変化することから二水和物への転移が進行していることが分か

4６．参考文献が分かった。さらに、XRD による分析の結果、(1) Bond, A. D. What is a co-crystal? CrystEngComm
2007, 9, 833.
(2) Mazur, L.; Materek, I.; Bond, A. D.; Jones, W.
Multicomponent Crystal Forms of a Biologically
Active Hydrazone with Some Dicarboxylic Acids:
Salts or Cocrystals? Cryst. Growth Des. 2019, 19, 2663.
(3) Wong, S. N.; Chen, Y. C. S.; Xuan, B. F.; Sun, C.
C.; Chow, S. F. Cocrystal engineering ofpharmaceutical solids: therapeutic potential andchallenges. CrystEngComm 2021, 23, 7005.
(4) Barrow, S. J.; Kasera, S.; Rowland, M. J.; delBarrio, J.; Scherman, O. A. Cucurbituril-Based
Molecular Recognition. Chem. Rev. 2015, 115, 12320.
(5) Kuok, K. I.; Li, S. K.; Wyman, I. W.; Wang, R. B.
Cucurbit[7]uril: an emerging candidate forpharmaceutical excipients. Ann Ny Acad Sci 2017,1398, 108.
(6) Kauth, M.; Trusova, O. V. Topical Ectoine
Application in Children and Adults to Treat
Inflammatory Diseases Associated with an Impaired
Skin Barrier: A Systematic Review. Dermatology Ther
2022.
(7) Bethlehem, L.; Van Echten-Deckert, G. Ectoines
as novel anti-inflammatory and tissue protective leadcompounds with special focus on inflammatory bowel
disease and lung inflammation. Pharmacol Res 2021,164.
(8) Wittmar, J.; Ohle, C.; Kunte, J.; Brand, I. Effect ofEctoine on the Conformation and Hybridization ofdsDNA in Monolayer Films: A Spectroelectrochemical
Study. Chemelectrochem 2021, 8, 3844.
(9) Schroter, M. A.; Meyer, S.; Hahn, M. B.; Solomun,T.; Sturm, H.; Kunte, H. J. Ectoine protects DNA fromdamage by ionizing radiation. Sci Rep-Uk 2017, 7.
(10) Boroujeni, M. B.; Nayeri, H. Stabilization ofbovine lactoperoxidase in the presence of ectoine.
Food Chem 2018, 265, 208.
(11) Hutzler, W. M.; Mossou, E.; Vollrath, R.;
Kohagen, M.; El Ghrissi, I.; Grininger, M.; Zaccai, G.;
Smiatek, J.; Oesterhelt, D. Complex transitions
between dihydrate and anhydrate forms of ectoine unexpected behavior of a highly hygroscopic
compatible solute in the solid state. CrystEngComm
2020, 22, 169.

析出する結晶の組成は混合溶媒組成によって変化することも見出した。また、混合溶媒に対するエクトインの飽和濃度を求めたところ、安定な結晶形が変化する転移点の存在が明らかになった。
以上より、非溶媒添加晶析にて、操作条件の 1つである混合溶媒組成が結晶粒子群特性に及ぼす影響を明らかにし、無水物と二水和物の結晶形を作り分けに利用できるエクトイン－水－エタノールの三成分相図も得ることができた。
さらに、結晶の安定形は湿度によっても変化することから、多成分結晶の一つである溶媒和物の結晶粒子群を所望の結晶形として製造するためには保管環境の制御も重要であることを見出した。

５．今後の研究方向性・課題
今回は非溶媒添加晶析の操作条件の 1 つである混合溶媒組成と粒子群特性の関係について検討したが、冷却晶析や蒸発晶析でのエクトインを対象とする晶析操作と析出する結晶粒子群の特性の関係は十分に明らかになっていない。また、エクトインの製造プロセスの都合上、晶析前の原料溶液には不純物として NaCl が含まれることが想定される。したがって、実プロセスへの応用を考えた場合、今回検討した非溶媒添加晶析に加え、他の晶析法の操作条件や、不純物の有無がエクトインの結晶粒群特性に及ぼす影響の調査が必要である。
また、今回は多成分結晶の 1 つである溶媒和物を対象として検討を進めたが、試薬価格の都合

７．論文・発表

上、当初想定していたホスト分子とゲスト分子得られた研究成果は国内外の学会で発表した。

からなる包接結晶の粒子群特性と晶析の操作条

今後学術論文として投稿すること検討している。

件の関係は検討することができなかった。今後、(7-1)国内学会（2 件）

改めてモデル化合物を選定することによって、・〇宇野 沙映・笠井 つばさ・末永 俊和・滝山 博

多成分結晶の 1 つである包接結晶の晶析操作条件

志・甘利 俊太朗, エクトイン結晶粒子群製造のたと粒子群特性の関係解明も検討する。

5

めの晶析に関する基礎研究, D217, 化学工学会新潟大会 2022（朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター）, 2022.11.9-10

・ [依頼講演] 〇甘利 俊太朗・末永 俊和, メタンを原料とする有価物生産プロセスの構築を志向した
微生物培養条件と晶析法の検討, R312, 化学工学会
第 88 年会（東京農工大学 小金井キャンパス）2023.3.15-1(7-2) 国際学会（1 件）・[Invited Lecture] 〇Shuntaro AMARI, Effect ofcrystallization conditions on characteristics of solid
phase for cucurbit[7]uril, IGS63, ICPAC Kota Kinabalu2022（The Magellan Sutera Resort, Sabah, Malaysia /ONLINE）2022.11.22-27

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