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浦 上財 団 研究 報 告書Vol.7(1999)

ビフ ィズス 菌の特 異 的糖 資化 機能 の解 明 と利用

熊

谷

英

彦(京 都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻教授)て利用 され るこ とを示唆す る もの であ る。 そ こで,
1.緒言

この β一フコ シダー ゼ活性 を有 す る酵素 を ビ フィ
ビフ ィズス菌 はヒ トを始 め とする動物 の腸管 内

ズス菌 か ら精製 し,そ の性質 を解明,さ らに本酵に広 く棲 息 し1),腸管 の感 染 防禦2),免 疫 機 能 の素の遺伝 子の クロー ニン グ,大 腸菌 高発現 株の作

増強 やガ ン予防3),あ るい は酢酸 や乳 酸産 生 によ

製な どを行 い,ビ フィズ ス因子の酵 素的合 成へ のる整 腸作 用4)などの有益 な作 用 を宿主 に もた らす。

有効利 用 を検討 した。 さ らに本菌 の α一ガ ラ ク ト

また本 菌 は母 乳栄 養児の腸 管下部 にお ける最優 先シ ダー ゼに ついて も精 製 と性 質の解 明,遺 伝子 の菌で あ り5),それ ら と人 工乳 栄養 児 との間 に は下ク ロー ニン グ と解析 を行 った。

痢 な どの罹 患率 に大 きな差 があ るこ とが 知 られ てい る6)。したが って,本 菌 は乳児 の健康 維持 に重2.Bifidobacteriumbreveのβ一グ ル コ シ ダーゼ

要な役 割 を演 じて いる と考 え られ てい る。
このよ うな母乳 につい ての研究 に端 を発 し,腸ビフ ィズ ス菌B.伽乙,6203のβ一グル コシダー ゼ

管内 で ビフィズ ス菌 の生育 を特異 的 に支 持す るい

は β一D一グル コシ ド水解 活性(図1A)のわゆ る 「ビフ ィズス因子」 に関 する研究 が行わ れ,内細菌 の中で は ビフィズ ス菌 に特異 的 とされ る β

幾つ かのオ リゴ糖 が報 告 されて いる7‑14)。さ らに,

一D一フ コシ ド水解 活性(図1A)を

本菌 を ヒ ト腸 管内 で増 殖 させ るこ とを目的 として,た本酵 素 には,β 一D一フ コシル基 の みを他 の単糖

多 くの種類 のオ リゴ糖が,食 品添 加あ るいは製 剤に転 移 させ る糖転 移活性(図1B)もの形 で実用化 され てい る。 本菌 の健康へ の好影響

い る2°)。
そ こで,β 一グル コ シダ ーゼ の生 産 性 をを裏付 け る研 究結果 としては,本 菌が腸 管内で の上 げるため,セ ロ ビオー スを単一炭 素源 と して本

病原性 細菌 の増殖 を抑 えた りisas),腸管上 皮細胞

菌 を長期 にわ た って馴 養 し,R一 グ ル コシ ダー ゼへの 病原性 大腸菌 の接 着 を阻止 した りす る ことが及びR一 フコ シダー ゼ両活 性 が著 し く上 昇 した馴

報告 されて いる17)。

養株B.breveclbを

本 報告者 らの研 究室で は,成 人 ヒト糞便 より単

B.breveclbよ他 に腸も有す る。 ま認 め られ て得た21・22)。
さらに この馴養株

り電 気泳動的 に単一 な精製 酵素標

離 し,光 岡の方法18)に基づ いて同定 した ビフ ィズ

品 を得 た22}。得 られた精 製酵素 を用 いて各種 酵素

ス菌Bifidobacteriarrnbreve203を 用 いて,糖 代 謝

化学的性 質 を調 べた と ころ,本 酵素 は分子 サ イズに っいて詳 細な研 究 を行 って きた。 そして本菌 が,50キ ロダル トンのモ ノマー タンパ ク質で,基 質特

腸 内棲息 菌 の中で ビ フィズ ス菌 に特異 的 な β一フ異1生その他か らB.breve203から得 られ た酵 素23}

コシダーゼ 活性 を もつ こ とを明 らか に して いる19)。 と同等 であ るこ とが確 認 された。
この こ とは逆 に フコー スを含 むオ リゴ糖 は腸 内では ビフ ィズ ス菌 にのみ加 水分解 され,炭 素源 と しビフィズス菌の特異的糖資化機能の解明と利用

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い て宿 主 大腸 菌DH5αを形 質 転換 してB.breveclbの ゲノム ライ ブラ リー約15万 コ ロニー を作成
し,先 の プロー ブを用い てス クリーニ ング した ところ10個 のポ ジティヴ クロー ンを得た。 これ らの
ポ ジテ ィヴ クロー ン中,2個の クロー ン にβ一グ

ル コシ ダーゼ及 びR一 フコ シダー ゼ両活 性 が認 められた ため,酵 素 活性 の高 い 方の 株 をOK1と 命
名 した。
組 換 え大腸 菌株OK1かドpOKla(B.breveclbのら得 た組換 えプ ラス ミ
ゲノムDNA4.2kbp

を有 してい た)を 用 いてサ ブ クローニ ングを行 っ
た とこ ろ,1.9kbpのPvull‑EcoRI断
pOKleま
図1B.brereのa一

3.ビ

片 を有 す るで 本 酵 素 活 性 が 認 め ら れ た。 こ の

1)z,irll‑EcoRI断片 の 全塩 基配 列 を 決定 した と こ

グ ル コシ ダ ー ゼ が触 媒 す る反 応

フィズス 菌 β一グル ⊇シ ダーゼの 大腸菌

で の発 現ろ,1380bpからなるオ ー プン リー デ ィン グフ レ

ーム を見 出 し,こ こには460ア ミノ酸残 基か ら成る分子 量51,513ダ ル トンの タンパ ク質が コー ドさ

B.breveclbよ酵素N末り得 た精 製酵素 標品 を用い て本

端 ア ミノ酸 配列 を30残基 決定 した22)。

この ア ミノ酸 配列 の一部 を もとに本酵素 構造遺 伝
子 の塩基 配列 の一 部 を類推 し,20‑mer,128種

類れて いた23)。この値は電 気泳動 で決定 され た精製
酵 素 タンパ ク質の分子 量の値 とよく一致 していた。
本酵 素の ア ミノ酸配 列 とデー タバ ン クの β一グ
ルコ シダーゼ のア ミノ酸配列 との相 同性 を検 討 しのオ リゴヌ クレオ チ ドミクスチ ャーを合 成 して,た結果,本 酵素 はセ ルラーゼ フ ァミ リー24)の中の本 酵素遺 伝子 に対 するプ ローブ とした。 ベ クター

BGAサとしてpUC18を起 源 由来 のBGAサ

用 い,こ れ に制 限酵 素 で部 分 的に消化 したB.breveclbの

ゲ ノムDNAをブ ファ ミリー に属 して いた。図2に は他
ブフ ァ ミ リー に属 す る β一グ

イ ンサ

ルコ シダーゼ の活性中心 とされてい る配列 を示 し,ー トして組換 えプ ラス ミ ドを作製 した。 これ を用

相 同 性 が高 い部 分 は反 転 で 示 した25)。Asn‑Glu一

図2BGAサブファミリーに属 するB.δ1膿 ・203および他種 由来 β一グルコシダーゼの活性中心 とされているア ミノ酸配列の比較
ア ミノ酸配列で保存性 の高 い部 分は反転 で示 した。高度に保存 されてい るHis‑ASI1‑Glu‑Proモチー フ
は太字で示し,モ チー フの中で も酵素の活性 発現に特に重要な役割 を持っア ミノ酸残基は矢印で示 した。

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浦上 財 団研 究 報告 書Vol.7(1999)
表1無細胞抽出液中の酵素活性 の比較

固定化 酵素 を利用 した方法 を改良 し,糖 縮 合反 応によ り良好 な結果 を得て いる。 そ こで,ホ ル ミル
セ ルロ ファイ ンを固定化担 体 として,こ れ に酵 素
タンパ ク質 を固定 化 した。その結 果本酵 素 は固定化操 作 による活性 の低下 が若干認 め られたが,安Proモ チー フ中 のGlu残 基 が活 性 中心 で あ る こ

定性 が増加 し37℃で10日 間放 置して も固定す る前とがす でに明 らか となって いる26)。

の値 の80%以 上 の活性 が保持 されて いた。一 方,組換 えプ ラス ミドpOKleで菌 株OKle(pOKle/DH5α)の

形質 転換 した大腸ネイテ ィヴな酵素 で は,37℃ で放置す る と急 速 に

無細 胞抽 出液 は,

失 活 し始 め約1週間 で完全 に失活 してい た。

表1に 示す ように本酵 素活性 が非 常に上昇 して お

この固 定化酵 素を充填 した カラム に活性炭 を充り,本 酵素 タンパ ク質の量 は可溶性 タ ンパク質 の填 した カラム を直列 につな いで図3に 示 した よう

40%に 達 してい た。OKleか

らの酵素 の精 製 はビなタ ンデム カラム システム を作製 し,そ れ ぞれ1

フ ィズス菌 に比べ て容易 であ り,酵 素 の収 量 も大Mの グ ルコー ス とフ コー スの基 質混 合液 をゆ っ

幅 に増 大 した23)。す なわ ち,絶 対嫌 気的 で複雑 な

くりと循環 させた。酵 素の糖 縮合反 応に よ り生成

培養 条件 を必 要 とし増殖 時間 も長 くか かるな ど取した オ リゴ糖 は活性 炭カ ラムに吸着 され,未 反応

扱 いが困難 な ビフィズ ス菌に比 べて,好 気的振 蕩の単糖 類は再 び酵素 カラ ムの方 に送 る ことで反応培養 が可能 で培地 組成 も比 較的単 純で取 扱い が容を連続 的 に行 う ことがで きた。酵素 タ ンパ ク質 の

易 な組 換 え大 腸菌OKleか変性 を防 ぐため にこの システム を4℃ で4日 間運ら本 酵素 が 簡便 にかっ大 量 に調 製で きた。

転 したの ち,活 性炭 カ ラムを取 り外 して 水で洗 浄

本 酵素 が大量 に得 られたた め,本 酵 素 タンパ ク

し,吸 着 した オ リゴ糖 を7.5%エ タ ノール にて溶質 の結晶 化 を試 みた。 ハン ギング ドロ ップ法2ηに出 させた。酵 素 カラム には また新 しい活性 炭 カラ

よ り様々 な沈殿 化剤 を検 討 した結果,ポ リエチ レ

ム を連結 して運転 した。 固定化 した酵素 は4℃ でング リコール6000を 用 いる こ とで本酵 素の結 晶 をの使 用で は殆 ど失活 せず,2カ

得 る ことに も成 功 した。

も十 分 な糖 縮合活性 を示 した。 活性炭 カラ ムのエ

4.オ

リゴ糖 の酵素 的合成 と腸 内細菌類 での資月間使用 した後 で

タノー ル溶出 画分 に対 し,更 に分取 用TLCと糖転 移反応 は,し ば しば2糖 類 や3糖 類 の合成に利用 され る28・29)。
しか しなが らフコシ ル基 転移反応(図1B)を

利 用 した方 法で は適 当な フ コシ

ル基供 与体 がな く,実 用 的で はなか った。そ こで本酵 素の 縮合 反応(図1C)に

着 目 した。 この 糖

縮合反 応が利 用で きれ ばグル コース とフ コー スを用い た安価 なオ リゴ糖合成 が可能 とな る。 しか し
縮合反 応 は加 水分解 酵素 の本来 の反応 の逆反応 であ るため,一 般 に収 率が非 常 に低い。 鰺坂 ら3°)はゲ

ルろ過 を行 った。2つ の縮合生 成物 を単 離 し,最化性

図3ビ フィズス因子,オ リコ糖 を酵素合成す る
ためのタンデムカラムシステム

ビフィズス菌の特異的糖資化機能の解明 と利用
終 的 に 一 方(Product‑1)を460mg(収約4.4%),他%)そ混合物 が得 られたが2°),糖縮合反 応 を用 いて合 成

約3.8

す ると β1→6結合のみ が得 られた。 このこ とは転方(Product‑2)を400mg(同移活性 よ りも縮 合活性 の方が 高い位置 選択性 を有れ ぞれ得た 。

Product‑1及49

率 と してび 一2の 構 造 を 決 定 す べ く,質分 析 ス ペ ク トル と,'H‑NMR,13C‑NMR及量
び こ

れ ら を組 み 合 わ せ たHMBC('H‑detectedmul‑

す るこ とを示 唆す るもので あった。
得 られた フコシル グル コー スが,実 際に腸内 細菌 類の 中で ビフ ィズ ス菌にの み資化 されるか ど う

tiple‑bondheteronuclearmultiplequantum

かにつ いて検討 した。 表2に 示 した様 々な腸内 細coherencespectrum)に菌26菌 株 を フコシル グルコー スを1%含

果,Product‑1は,フの6位

よ る 構 造 解 析 を行 っ た 結
コ ー ス の1位

が β 結 合 し て い るD一と グル コー ス

む資化 テ

ス ト用 培地 で37℃で 培 養 し,菌 の増 殖 を610nmの濁度 で調べ た。 コン トロー ル としてグル コー ス

フ コ シ ル(R1→6)

グ ル コ ー ス で あ る こ とが 明 ら か と な っ た31)。 ま たを1%含

Product‑2とゲ ン チ オ ビ オ ー ス の1H‑NMR及果,本 オ リゴ糖 は試験 した ビフィズ ス菌9菌 株 中13C̀・NMRス

ペ ク トラ ム は 全 く一 致 し て い たび。本む培地 で も同様 の実験 を行 った。 その 結8菌 株 で 資化 された。 ビ フ ィズ ス菌以 外 で は,

酵 素の糖 転移反 応 を用いて フコ シルグル コース を

Lactobacilluscasei1菌合 成 す る と フ コ ー ス と グ ル コ ー ス が そ れ ぞ れR1

以 外,腸 内の悪玉 菌 とされるバ クテ ロイデ スや ク

→2 ,β1→3,R1→4,R1→6結

ロス トリジウ ムの他,腸 球 菌 や大腸菌 な どで は資合 した オ リ ゴ 糖 の表2フコシルグルコースの各種腸内細菌による資化性

株が 弱い資 化性 を示 した

50

浦上 財 団研 究報 告 書Vo1.7(1999)

化 され なか った31)。これ らの結 果 は,本 オ リゴ糖とが明 らか とな った。 さらにプ ロモー ター配列 のが比較 的選択 性の高 い ビフ ィズス因子 に成 りうる

5'上 流 側 にはcAMP‑CRP結可能性 を示唆 して いる。

高 い配列 が,ま た,転 写 開 始点 よ り約30bp下 流

5.ビ

フィズ ス菌に おけ るQ一グル コシ ダーゼ

遺 伝子 の発現調 節32)

側 には大腸菌 のlacリ プレ ッサ ーが 結合す る配 列に相 同性 の高 い配 列 を認 めた。 さ らにcAMPによる本酵素mRNA転セ ロ ビ オー ス に よ る馴 養 に よ って,B.breve

合部 位 に相 同 性 の写量 へ の影響 を検討 したが,コン トロー ル と有意 な差 は見 られなか った。 これ

203の β一グルコ シダーゼ活 性が著 しく上 昇す るメ

らの 結果 よ り,セ ロ ビオ ースの馴 養 による本酵 素

カニ ズム ついて検 討 した。本酵 素の精 製標品 をウ

活性 の上昇 は遺伝子 の調 節領域 の変異 によ るもの

サ ギに感作 して ポ リクローナ ル抗体 を作成 し,こで はな いこ とが明 らか にな った。本酵素 の発 現調

れ を用い て親株B.breve203及節 には何 らかのDNA結養株B.breveclbよびセ ロビオ ース馴

り調 製 した無細胞 抽出液 につ

い て ウエ ス タン ブ ロ ッ トを行 った。 そ の結 果,
B.breve203に比べ て馴養株B.breveclbで合 タ ンパ ク質が 関与 している と推測 され,馴 養 の現象 もその調 節タ ンパ ク
質 にお ける何 らかの変化 に よる もの と考 えられた。

は β一
6.Bifidobacteriumbreveの

グル コシダーゼ タ ンパ ク質が 大量 に発 現 してい る

α一ガ ラ ク ト シ

ダーゼ

こ とが明 らか となった。 そ こで両株 よ り総RNA
特 異的 なプ ロー ブを用

従来 よ り腸内 ガス発生 の原 因 となる膨満 因子 といて ノー ザ ンプ ロ ッ トを行 っ た とこ ろ,馴 養株

して問題 に され て きた大豆 オ リゴ糖 も,良 好な ビ

B.breveclbでを調製 し,本 酵素ORFに

親株 に比べフ ィズス因子 であ るこ とが近 来の研 究に よ り明 ら

大 量 に転 写 されてい る ことが明 らか とな った。次は本 酵素 のmRNAがかに なって きた。 そこで本研 究 において大 豆中 にに両 株か ら染 色 体DNAを

含 まれ るオ リゴ糖で ある ラフ ィノーズな ど,α 一D

調 製 し,本 酵素ORFに特異的 な プロー ブを用 いてサザ ンプ ロッ トを行

一ガラ ク トシル基 を有す るオ リ ゴ糖 を炭 素源 としった ところ,両 株の遺 伝子 の制限酵 素 によ る切 断て ビフ ィズス菌 を培 養 した とこ ろ,菌 体 内 に α一

パター ンに差 異は認 め られ ず,染 色体で の構造遺ガ ラク トシダーゼが特 異的 に強 く誘 導生成 す るこ

伝 子の重 複 はない こ とが明 らか とな った。 これ らとを見 い出 した。 この結果 よ り,本 酵素 が ビフィの結果 か ら馴 養 による酵素 活性 の上昇 は転写 レベ

ズ ス菌 の増殖 に とって重要 な役割 を果 たして いる

ルで の変化 であ るこ とが明 らか とな った。更 に詳と考 え,α 一ガ ラク トシル基 を有す る オ リゴ糖 の細 に この現 象を解明 す るため,親 株B.breve203

代謝機 構 について の詳細 な解明 を目的 と して,本と馴養 株B.breveclbの酵素 を精製 し,酵 素 化学的 性質 を明 らかにす る とそれぞ れにお いて本酵 素

構造 遺伝 子 の5'上 流 域 の構 造 を検討 した。 その結果,両 株 と も翻訳 開始 点 よ り100〜130bp上 流

共 に,本 酵 素の遺伝 子解析 を行 った。
B.breve203を,ラフ ィノ ー スを炭 素 源 とす る

側 にプロモ ー ター配 列 を認めた 。 さらに両株 の上培地 で培 養す る と,菌 体 中の α一ガ ラク トシダー

流域約600bpま での塩 基配列 に差異 は認 め られな

ゼ活 性が グル コー ス培地 で菌体 を培養 した場 合のか った。 また プライマ ーエ クステ ンシ ョン法 に よ

活性 と比 べて約50倍 程高 くな る ことを見い 出 した。

り本 酵素mRNAの

転 写開始 点 は,両 株 とも翻訳

そこで,ラ フ ィノー スを炭素源 として生育 させた

開始 点 よ り94bp上 流側 の アデニ ン残 基で あ る こ

本 菌の無 細胞 抽出液 より α一ガ ラ ク トシダー ゼ をビフィズス菌の特異的糖資化機能の解明 と利用
様 々 なカ ラムク ロマ トグラフ ィー に よって単一 タ
ンパ ク質 にまで精製 し,諸 性質 を検 討 した。精製
酵 素 は約80kDaのズ約160kDaの

サ ブユニ ッ トを もつ分子 サ イ

ホモ ダイマ ーのタ ンパ ク質 で あ り,

熱 に対 して,比 較的 安定 な酵素で あ った 。 また,
α一ガラ ク トシル基 に対 して 特異性 が 高 く,β 一ガ

514)V.Scardivi&L.D.Trovate11i:んz;1〃.〃icrobinl.,15,
19(1965).
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6)K.Kawase,T.Suzuki,IKiyosawa.S.Okonogi,T.

Kawashima,&M.Kuboyama:Bifidoろ召惚1勿Micノη17θ'η,2,25(1983).
7)P.Gy6gy.R.W.Jeanloz,H.V.Nicolai,&F.ZHIiken:
Earr.ノ,Bi(,〔 ゾaem.,43,29(1947).

ラク トシル基 や α一N一アセチル ガ ラク トサ ミニ ル
基 は加水 分解 しなか った。

8)R.Tanaka,H.Takayama,M.Morotomi.T.Kuro‑
shima,S.Ueyama,K.Matsumoto,A.Kuroda,&一:41.
Mutai:BifidobacteriaMicroflora,2,1i(1983).

7.α

一ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ 遣 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ

9)T.Hidaka,T.Hara,T.Sakaeda,J.Okada,K.
Shimada,&T.Mitsuoka:RikenFloraSy,ゆ05ガz̀,)Z,4,

本酵素 の遺伝 子の ク ロー ニン グをシ ョッ トガ ン
法 で行 った。 すなわ ち,ゲ ノムDNAを

制 限酵素

で 部 分分 解 した 後,ベ クター に組 み 込 み大 腸菌
DH5αに導入 した。 ラ フィ ノー ズ資 化反 応 を指39(1984).
10)Y.Benno,K.Endo,N.Shiragami,K.Sayama,&T.
Mitsuoka:Bificloろacteria〃ノcη〃ω η,6,59(1987).

‑‑)H.Hidaka,T.Eida,T.Adachi,&Y.Saitoh:Nippon
NoeikagakuKaislai,61,915(1981).

標 に したス クリーニ ング法 によ って得 られ たポ ジ
テイ ブク ロー ンは,本 酵 素遺 伝子 を含 む約8kbのDNA断

片 を持 って お り,α 一ガ ラク トシダ ー

ゼ 遺伝子 が大腸 菌内 で発現 してい る ことを確認 した 。 さらにサ ブク ローニ ングの後,活 性 を発現す

12)M.Okazaki,S.Fujikawa,&S.Matsumoto:Zノ加.

Soc.Nzrtr.FoodSci.,43,395(1990).
13)T.Kohmoto,F.Fukui,H.Takaku,&T.Mitsuoka:
Agric.Bzol.Chem.,55,2151(1991).
14)K.Wada,J.Watabe,J.Mizutani,M.Tomoda,H.
Suzuki,&Y.Saitoh:八ripponNoeikagakzrKaishi,66,

る約5.5kbの

イ ンサ ー ト断 片 にっ いて その 塩基

配列 を決 定 した。2,319bpの 長 さを持 つORF1
は推定分 子量 約76kDAのタンパ ク質 を コー ドし127(1992).
15)M.Hotta,Y.Okikawa,Y,Morikawa,N.Yamashita,
S.Iwata,Y.Satoh,J.Hanada,&R.Tanaka:ActaRz6漉

て お り,精 製 α一ガ ラク トシ ダーゼ の それ とほ ぼ
一致 した。 また他 起源 の同酵 素 とコンセ ンサスのあ る配列部 分が 見い出 され ている。 さ らにこのO
RFの上 流域 に はCcpA結合部 位 と相 同 性 の高

α'1㌔ノヵアz.,29,160(1987).

16)S.K.Anand,R.A.Srinivasan,&L.K.Rao:C〃'〃L)'airy1)1りd〃6たg,6,8(1985).
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vinAppl.Enviroya.Microbiol.,59,4121(1993).
18)T.Mitsuoka:Zbl.f.Bakt.,LAbt.Orig.,210,52

い配 列が見 られ た。

(1969).

CcpAは,グラム陽 性細菌 にお いて知 られて いる糖 代謝 の発現調 節機 構にお いて レセプ ター として機能 す るDNA結合 タ ンパ ク質で ある こ とか ら

本 酵素 のORFの発 現 はCcpAに19)T.Tochikura,K.Sakai,T.Fujiyoshi,T.Tachiki,&
H.Kumagai:Agric.Biol.Ckerra.,50,2279(1986).
20)K.Sakai,T.Tachki,H.Kumagai,&T.Tochikura:ノ4gア
ゴ己Biol.Claern.,53,313(1989).

れ てい る可 能性 が示唆 された。

よ って 制御 さ21)K.Sakai,M.Tanaka,T.Tachki,H.Kumagai,&T.
Tochikura:Agric.Biol.Chem.,51,699(1987).
22)N.Nunoura,K.Ohdan.T.1'ano,K.Yamamoto,&H.

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ノ密

52

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B1〆r'doba('tCTII〃rtbreve203durillgAcclimationtoCe工
lobiose.Z勲

ηη61z'.Bì招 η9.,83(4)309(1997).

一StudiesOllCarbohydratesMetab()1ismSpecifictoBif{dobacterium

StudiesonCarbohydratesMetabolismSpecifictoBifidobacterium
HldehikOKUmagal(DivisionofIntegratedLifeScience,GraduateSchoolofBiostudies,K}‑otoUniversity)β拶40∂ α6'爾 αareGram‑positive,non‑spore‑forminganaerobe,predominantbacteria
intheintestinaltractofhumanandsomeanimals.Itisknownthattheyareusefulfor
maintenanceofthehost'shealthandhavesomebeneficialeffectssuchasreinforcementof
immunefunctionsandpreventionofcancer.Moreover,Bifidobacteriaareconsideredasa
naturaldrugdeliverysystem(probiotics),becausetheymetabolizesugarstoproduce
aceticacidandlacticacidwhichinhibitthegrowthofpathogenicmicroorganismsinthe
intestinaltract.Recently,severalstudieshavebeenmadetofindanoligosaccharide,
Bifidus‑factorwhichisspecificallyassimilatedbyBifidobacteria.
Inourlaboratory,Bifidobacteyiumb7eve203wasisolatedfromhumanadultfecesandthisstrainwasfoundtoproduceanovel/3‑D‑glucosidaseanda‑D‑galactosidase.We
purifiedandcharacterizedbothenzymesfromanacclimatizedorinducedstrainandclonedthegenestoexaminethemechanismincreasingtheenzymeactivityandtoestimate
theirusefulnesstosynthesizeaBifidus‑factor.
TheR‑glucosidase(EC.3.2.1.21)activityofB.breve203wasincreasedbyacclima‑
tionwithcellobiose,succesivecultivationonthemediumcontainingcellobioseasthesolecarbonsource.Theenzymewaspurifiedtohomogeneityfromcell‑freeextractsofan
acclimatizedstrainofB.breveclb.ThisenzymehadnotonlyR‑glucosidaseactivitybut
also/3‑D‑fucosidaseactivity.ThisenzymehadalsotransferaseactivityfortheR‑D‑fucosylgroupbutnotforthe/3‑D‑glucosylgroup.
GenomicDNAencodinga/3‑glucosidase,whichhas/3‑fucosidaseactivity,wascloned
fromB.breve203clb.Therecombinantenzymewaspurifiedandtherecoveryofenzyme
wasabout138‑foldhigherthanfromB.breve203clb.
CirculationofasolutionofD‑fucoseandD‑glucosethroughareactionsystemconsist‑
ingofcolumns,inseriesofimmobilizedrecombinantβ

一glucosidaseandactivatedcharcoal

gavetwooligosaccharides。TheseoligosaccharideswereidentifiedtoD‑fucosyl(R‑1‑6)D‑glucoseandgentiobiose(D‑glucosyl(β一1‑6)D‑glucose).TheD‑fucosylglucosew・aswellassimilatedbymanyBifidobacteriabutnotbyotherintestinalbacteriatested.
Toelucidatethemechanismofacclimation,thetranslationandtranscriptionof
R‑glucosidasegenewereexaminedeandmarkeddifferencesintheexpressionofthe
enzymeandthelabelofitsmRNAbetweenB.breve203andB.breve203clbfound.The
transcriptionalstartingpointandpromoterandoperatorregionswereassigned.
α一D‑galactosidasewaspurifiedfromB.6ノ'eve203grownonraffinoseanditsgenewas

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URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVol.7(1999)

clonedtoexamineandelucidatearoleoftheenzymeinthemetabolismindetail.
Thepurifieda‑galactosidasefromB.bYeve203hadamolecularweightof160,000(determinedbynative‑gradientPAGE),andoptimumpHwas5.5‑6.5.ItsstablepHwas5.
5‑12,andtheoptimumtemperatureforactivitywas37°C.Theenzymeretained80%ofits
originalactivityafterincubationforIOminat60°C.Thepurifieda‑galactosidasewas
specificallyactivetowarda‑D‑galactosylmoiety.
Thea‑galactosidasegenewasclonedandexpressedinE.coli.Cell‑freeextractsfrom
therecombinanthadhighspecificactivitywhichwassameasthatofB.breve203grown
onraffinose.The5.5kbpinsertfragmentintheplasmidpKT12hadtwoopenreading
frame,ORFIandORF2.ORFIwas2,018bplongandhadapredictedmolecularmassof
74,831Da,whichwasalmostidenticaltotheresultsofSDS‑PAGEofthepurifiedαgalactosidasefromB.breve203.AminoacidsequenceofORFIrevealedthatithad
consensussequenceofa‑galactosidasefromvarioussoueces.

一