香辛料成分の有用生理機能の高機能化とさらなる有効利用のための酵素的分子設計

71〈平成16年度〉

香辛料成分の有用生理機能の高機能化とさらなる有効利用のための酵素的分子設計
中島伸佳（岡山県立大学大学院保健福祉学研究科助教授）

1. は じ め に品，生薬として豊富に取り入れられてる。クルクミンはウコンの根茎に含まれる黄色色素成分の一香辛料成分であるカプサイシン（トウガラシ）

つで，肝機能の向上，抗腫瘍作用，抗炎症作用，やクルクミン（ウコン）などを始めとして，カル抗酸化作用，抗癌作用などの生理機能が認められバクロール，チモール（タイム），ペリルアルコーている１）。また，アルツハイマー痴呆を予防する

ル（シソ），ラズベリーケトン（キイチゴ），バニという報告もあり２），現在，健康食品として汎用リルアルコールなどのポリフェノール，テルペンされるされるだけでなく，医薬としても注目され関連物質などの天然由来の生薬成分や食品機能性ている。しかし，クルクミンは水溶性が低く，そ物質の多くは，古くから人類の食生活と密接な関の使用範囲が制限されているのが現状である。そ係を有する化合物であり，特に近年，食生活の多こで，本研究では，クルクミンの高機能化，特に，様化や自然環境の変化に伴って，これらの成分に水溶性の向上について検討したので報告する。

よる抗菌・抗ウイルス作用，抗酸化性（ラジカル2. 実 験 方 法消去能），制癌作用などが注目されるに至っている。

2. 1 植物培養細胞によるクルクミンの変換

そこで，本研究では，香辛料成分の生体内でのSH液体培地にニチニチソウ培養細胞20gを移植

新たな薬理作用に着目し，「食品の二次機能」を期して１週間前培養を行った。培養後，培地部と細待するのみにとどまらず，これまでに研究を重ね胞部にろ別し，細胞部を2.5％アルギン酸ナトリウてきた「植物培養細胞による配糖化」や「酵素的ム水溶液に懸濁させ，50mM塩化カルシウム水溶配糖化法」を応用して，「水への溶解度の上昇，光液に滴下し，ビーズ状の固定化ニチニチソウ培養や熱に対する安定性の増大，生理機能の向上化」

細胞を得た。

等に基づく食品機能素材としての新規な薬理効果

この固定化ニチニチソウ培養細胞を液体培地にを探求する。すなわち，安全で効率的な生体触媒移植して３日間振とう培養を行った。培養後，クによる配糖化法の確立を通して，これら香辛料成ルクミン（10mg/100μDMSO）を24時間ごとに分の加工食品へのさらなる使用範囲の拡大を可能

５回連続投与し，さらに48時間培養を行った。培にすることを主目的とする。ここでは，特にウコ養後，培地部と細胞部をろ別し，培地部は酢酸エン成分クルクミンに着目することにした。

チルで抽出し，その後，水層を水飽和 −ブタノ

ショウガ科植物ウコン（ ）は，ールで抽出した。細胞部はホモジナイズした後，インド原産でインドネシア，中国，日本では沖縄

メタノールで静置抽出を行い，抽出液は減圧下でなどの熱帯地域で栽培されており，インドでは食濃縮し，濃縮物について，培地部と同様に酢酸エ浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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チルで抽出した。培地部と細胞部のそれぞれからがどのように加水分解されるかを確認した。

抽出した有機層を減圧下で濃縮してサンプルと（２） グルコアミラーゼによる加水分解し，逆相HPLC分析，およびLC-MS分析を行った。

2. 2の（２）で酵素合成した，α−CDを糖供与

2. 2 CGTaseによるクルクミンオリゴ配糖体体存在下で反応時間を５分間としたクルクミンオの酵素合成（１） 可 溶 性 デ ン プ ン を 糖 供 与 体 と し た
CGTaseによる配糖化３）

リゴ配糖体の混合物を用いて以下の実験を行った。クルクミンオリゴ配糖体混合物にグルコアミ
ラ ー ゼ（）を10units加 え，50℃

2. 1で得られたクルクミンモノ配糖体を５μで48時間反応を行った。終了後，80℃ で１時間加mol，糖供与体として可溶性デンプン600mgおよ

熱処理，ろ過後，逆相HPLCにて分析し，オリゴ配び塩化カルシウム３mgを50mMクエン酸緩衝液糖体がどのように加水分解されるかを確認した。

（pH5.5）３mに 懸 濁 し，さ ら に，CGTase（３） β−アミラーゼによる加水分解（  由来）を600units加え，55℃ で2. 2の（２）で酵素合成した，α−CDを糖供与24時間攪拌した。80℃ で１時間インキュベート体存在下で反応時間を５分間としたクルクミンオ（酵素を失活させるため）後，ろ過してサンプルリゴ配糖体の混合物を用いて以下の実験を行っとし，逆相HPLCで分析した。

た。クルクミンオリゴ配糖体混合物にβ−アミラ（２） シクロデキストリンを糖供与体としたクーゼ（大豆由来）を10units加え，55℃ で48時間反ルクミンオリゴ配糖体の酵素合成応を行った。終了後，80℃ で１時間加熱処理，ろ糖 供 与 体 と し て，α − シ ク ロ デ キ ス ト リ ン

過後，逆相HPLCにて分析し，オリゴ配糖体がど（CD），β−CD，およびγ−CDを用いて2. 2ののように加水分解されるかを確認した。

（１）と同様な実験を行った。2. 1で得られたクル（４） 阻害剤存在下でのα−アミラーゼによるクミンモノ配糖体５μmol，シクロデキストリン

加水分解

0.5μmol，塩化カルシウム３mgを50mMクエン酸

アミラーゼの阻害剤を反応系に添加すること緩衝液（pH5.5）３mに懸濁し，さらにCGTaseをで，生成する加水分解物（配糖体）の糖の数をコ600units加え，55℃ で48時間攪拌した。80℃ で１ントロールするために以下の実験を行った。阻害

時間インキュベート後，ろ過してサンプルとし，剤としては，ポリフェノールとして（＋）−カテHPLC分析を行った。

キンを用いることにした。

2. 3 加水分解酵素によるクルクミンオリゴ配糖体の分解

2. 2の（２）で酵素合成した，α−CDを糖供与体存在下で反応時間を５分間としたクルクミンオ（１） α−アミラーゼによる加水分解

リゴ配糖体の混合物を用いて以下の実験を行っ

2. 2の（２）で酵素合成した，α−CDを糖供与た。クルクミンオリゴ配糖体混合物にα−アミラ体存在下で反応時間を５分間としたクルクミンオーゼ（）を10units，タンニン酸，リゴ配糖体の混合物を用いて以下の実験を行っもしくは（＋）−カテキンを10μmol加え，55℃た。クルクミンオリゴ配糖体混合物にα−アミラで24時間反応を行った。終了後，80℃ で１時間熱ーゼ（）を10units加え，55℃ で48処理，ろ過後，逆相HPLCにて分析し，オリゴ配糖時間反応を行った。終了後，80℃ で１時間熱処体がどのように加水分解されるかを確認した。

理，ろ過後，逆相HPLCにて分析し，オリゴ配糖体

2. 4 クルクミン，およびクルクミン配糖体の香辛料成分の有用生理機能の高機能化とさらなる有効利用のための酵素的分子設計

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; 553［M＋Na］＋，別途確認された（ESI＋MS，水溶性の測定４）
2. 2，2. 3で酵素合成したクルクミン配糖体，お化学合成した標品の13C-NMRスペクトルと一致しよびクルクミンを用いて水溶性の測定を行った。

た）。また，クルクミンモノ配糖体
（２）
以外に，ク

基質0.5μmolをスクリュー管瓶に入れ，そこへ十ルクミン−β−ゲンチオビオシド（３）とクル分な量の蒸留水を加えて５時間攪拌した後，水相

クミン−β−D−ジグルコシドと思われる二配を逆相HPLC分析し，水にどの程度溶けているか糖体の存在を確認した。
3. 2 CGTaseによるクルクミンオリゴ配糖体を定量した。の酵素合成

3. 結果と考察（１） 可 溶 性 デ ン プ ン を 糖 供 与 体 と し た
3. 1 植物培養細胞によるクルクミンの変換

CGTaseによる配糖化

HPLC分析の結果を以下に示す（Fig. 1とFig.

Fig. 3と4に示すように，HPLC分析の結果，G12）。固定化ニチニチソウ培養細胞によるクルクミ（クルクミン−β−D−グルコシド），G（クルク2ンの変換により，クルクミンモノ配糖体の生成がミン−β−マルトシド），G3（クルクミン−βFig 1 HPLC Profiles of 1 by Immobilized Cells of 




HPLC Conditions; Column; CrestPak C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

Fig 2 Biotransformation of 1 by Immobilized Cells of Fig 3 Enzymatic Synthesis of 5

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Fig. 4 HPLC Profiles of Transglycosylation Products of Curcumin −β−D−glucoside by CGTase.
Glycosyl Donor; Soluble Starch, Reactin Time; 24hrCurcumin Oligosccharides; Gn（n＝2〜）
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption−マルトトリオシド），G4（クルクミン−β−マルトテトラオシド），G5（クルクミン−β−マルトペンタオシド）からG7（ヘプタ配糖体）以上のった（Fig. 5〜7）。
3. 3 加水分解酵素によるクルクミンオリゴ配糖体の分解配糖体と考えられるピークを確認した。G1からG5（１） α−アミラーゼによる加水分解までのピークを単離精製し，それぞれLC−MS分逆相HPLC分析の結果，時間ごとに多配糖体が: 553
析を行ったところ，G1はESI＋MS測定で，加水分解されて減少し，モノ配糖体である２が増
: 715［M＋Na］＋，G3は

:［M＋Na］＋，G2は加する傾向が見られた。24時間後では，ほぼG2，

: 1039［M＋Na］＋，G5は877［M＋Na］＋，G4は

G3，２の３種だけとなり，48時間後のHPLCチャー: 1201［M＋Na］＋であり，クルクミンのオリゴトとを比較しても，G2とG3のピークはほとんど変配 糖 体 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た。ま た，13C−わらなかった（Fig. 8）。

NMR測定結果からも，これらの化合物がクルク（２） グルコアミラーゼによる加水分解

ミンオリゴ配糖体であることが示唆されたため，逆相HPLC分析の結果，時間ごとに多配糖体がG1からG5はそれぞれ，クルクミンの１糖配糖体か加水分解されて減少し，モノ配糖体である２が増ら５糖配糖体であると確認した。

加する傾向が見られた。24時間以降は，２以外は（２） シクロデキストリンを糖供与体としたクほぼ確認できなかった（Fig. 9）。

ルクミンオリゴ配糖体の酵素合成（３） β−アミラーゼによる加水分解１）α−CDを糖供与体とした時（経時変化）

逆相HPLC分析の結果，時間ごとに多配糖体が２）β−CDを糖供与体とした時（経時変化）加水分解されて減少する傾向が見られたが，α−３）γ−CDを糖供与体とした時（経時変化）

アミラーゼやグルコアミラーゼを使用した場合と糖供与体としてα−CDを用いた場合，反応時は異なり，48時間後では，ほぼG1とG2だけになっ間が５分という短時間に間に，７糖以上のオリゴた（Fig.10）。

配糖体が生成し，その後，多配糖体は時間ととも（４） 阻害剤存在下でのα−アミラーゼによるに加水分解される傾向にあることがわかった。β

加水分解−CDを使用した場合は３時間後，γ−CD使用時

植物に含まれるフラボノイドなどのポリフェノは６時間後に配糖体が多く生成されることがわかール類の中には，α−アミラーゼの阻害効果が報

香辛料成分の有用生理機能の高機能化とさらなる有効利用のための酵素的分子設計

75Fig. 5 HPLC Profiles of Transglycosylation Products of Curcumin −β−D−glucoside by CGTase.
Glycosyl Donor; α−CD, Curcumin Oligosccharides; Gn（n＝2〜）
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

告されているものがある。そこで，タンニン酸，−グルコシドと比較した結果，クルクミン−βおよび（＋）−カテキンを阻害剤として用い，加−マルトペンタオシドでは約83倍もの水溶性の向水分解反応の制御を試みた。その結果，タンニン上が認められた（Table 1）。

酸ではほとんど阻害効果は認められなかったが，4. まとめ（＋）−カテキンを添加した場合，加水分解して生成する配糖体が，G1，G2，G3の３種類になることわかった（Fig. 11）。
3. 4 クルクミン，およびクルクミン配糖体の水溶性の測定



固定化ニチニチソウ培養細胞によるクルクミンの変換では，クルクミンモノ配糖体（２）以外に，クルクミン−β−ゲンチオビオシ
ド，およびクルクミン−β−D−ジグルコシ

水溶性試験の結果，クルクミンは全く溶けておドと考えられる変換物の存在を確認できた。

らず，HPLC分析ではピークを確認できなかった。

 糖転移酵素であるCGTaseを用いたクルクその他の配糖体については，クルクミン−β−Dミンオリゴ配糖体の酵素合成に成功した。特浦上財団研究報告書 Vol.14（2006）

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Fig. 6 HPLC Profiles of Transglycosylation Products of Curcumin −β−D−glucoside by CGTase.
Glycosyl Donor; β−CD, Curcumin Oligosccharides; Gn（n＝2〜）
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

成することがわかった。今後，阻害剤や添加時間に多配糖体が生成することがわかり，効剤などを検討することで，加水分解を制御で率的なクルクミンオリゴ配糖体の合成に有効きる可能性が十分に考えられる。すなわち，であることがわかった。

CGTaseとα−CDにより，クルクミンから短に，糖供与体としてα−CDを用いた場合，短糖加水分解酵素を利用した多配糖体の加水時間にオリゴ配糖体を効率的に合成する。そ分解を行った結果，次第により小さい配糖体の後，分離することなく，多配糖体の混合物へと加水分解されることがわかった。また，のままで，添加剤などの存在下，アミラーゼ（＋）−カテキンを添加すると，選択的な加などの糖加水分解酵素を作用させることで，水分解が起こり，モノ，ジ，トリ配糖体が生目的とするオリゴ配糖体の合成が可能である

香辛料成分の有用生理機能の高機能化とさらなる有効利用のための酵素的分子設計

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Fig. 7 HPLC Profiles of Transglycosylation Products of Curcumin −β−D−glucoside by CGTase.
Glycosyl Donor; γ−CD, Curcumin Oligosccharides; Gn（n＝2〜）
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

ことが示唆された。
の応用利用も期待できる。

水溶性試験の結果，クルクミン−β−マ
ルトペンタオシドでは，クルクミンモノグル最後に，本研究を行うにあたり，多大なる研究コシドに比べて約83倍も水溶性が向上するこ助成を賜りました浦上食品・食文化振興財団ならとがわかった。クルクミンは，その生理作用びに関係各位の皆様方に心より御礼申し上げまから非常に有用な天然物の一つであるが，水す。

溶性の低さが問題となっている。本研究の成果を応用すれば，高水溶性クルクミンの合成が可能であり，食品分野だけでなく，医薬へ

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Fig. 8 HPLC Profiles of Hydrolysates of Curcumin Oligosaccharides by α−Amylase.
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

Fig. 9 HPLC Profiles of Hydrolysates of Curcumin Oligosaccharides by Glucoamylase.
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

香辛料成分の有用生理機能の高機能化とさらなる有効利用のための酵素的分子設計

Fig. 10 HPLC Profiles of Hydrolysates of Curcumin Oligosaccharides by β−Amylase.
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption

Fig. 11 HPLC Profiles of Inhibitory Effect of α−Amylase by Polyhenol.
HPLC Conditions; Column; Crestpark C18S（φ4.6×150mm）,Eluent; 25％ CH3CN, Detection by UV/VIS（430nm）absorption
Table１

Water Solubility of Curcumin and Curcumin Glycoside.

CompoundCurcumin
CurcuminCurcuminCurcuminCurcuminCurcuminO-β-D-glucoside
O-β-D-maltoside
O-β-D-maltotrioside
O-β-D-maltotetraoside
O-β-D-maltopentaoside

Number ofGlucose Residues
012345

Water Solubility
mmol/l

Fold

00.6
0.7
31.7
46.9
>46.9

01
1.2
52.8
83.2
>83.2

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文献１） Y. Kaminaga, F.P. Sahin, H. Mizukami, 
,567, 197-202（2004）.
２） 東田千尋，ファルマシア , 38（9）,891-892（2002）.
３） H. Hamada, K. Nishida, T. Furuya, K. Ishihara, N.

Nakajima,  
., 16, 115-119（2001）.
４） Y. Kaminaga, A. Nagatsu, T. Akiyama, N. Sugimoto, T.
Yamazaki, T. Maitani, H. Mizukami, 
 , 555, 311316（2004）.

Functionalization and Application of Spice Ingredients: Enzymatic Synthesis ofWater-soluble Curcumins

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Functionalization and Application of Spice Ingredients: Enzymatic Synthesisof Water-soluble Curcumins
Nobuyoshi Nakajima（Graduate School of Heath and Welfare, Okayama Prefectural University）

1. Curcumin was converted to not only curcumin - β-D-glucoside but also curcumin - βgentiobioside and curcumin - β-D-diglucoside by the immobilized plant cultured cells of
.
2. The enzymatic synthesis of curucumin oligosaccharides were accomplished by theCGTase-catalyzed-transglucosylation reaction in the presence of sugar donors such assoluble starch, α−, β−, and γ−cyclodextrins.
3. The curcumin oligosaccharides（i.e. curcumin - β-maltopentaoside）synthesized
enzymatically showed a high water solubility compared with that of curcumin.
4. The hydrolysis of mixtures of curcumin oligosaccharides by a glucosidase in the presenceof an additive suggest that the selective synthesis of the curcumin oligosaccharide having
the required number of sugars.