105

山椒による食物アレルギーの治療に関する研究＜平成 23 年度助成＞

山椒による食物アレルギーの治療に関する研究
林

周作・王

暁宇・山本

武・門脇

真

（富山大学和漢医薬学総合研究所消化管生理学分野）

緒

胞から放出されるβ-hexosaminidase を脱顆粒の言指標とし、80 種類の生薬抽出物の効果を検討した。

食物アレルギーは、原因食物を摂取した後に免その結果、檳榔子、桂皮、鬱金、大黄および山椒

疫学的機序を介し生体にとって不利益な症状（蕁

の水抽出物に強い脱顆粒抑制作用を見出した。さ麻疹、血管性浮腫または呼吸困難等）が惹起されらに食物アレルギーモデルマウスを用いた予備検る現象であり、厚生労働省による調査では、約討において、山椒抽出物がアレルギー性下痢症状

33 万人の児童が食物アレルギーを罹患しているの発症を抑制する知見を得た。そこで、報告者ら

ことが報告されている。これまで食物アレルギーは山椒抽出物の粘膜型マスト細胞に対する直接作に対しては有効な治療薬が見出されておらず、原用を検討するため、BALB/c マウスの骨髄細胞か

因食物の除去といった対処療法的な対策しか取ら

ら粘膜型マスト細胞（mucosal-type murine bone1)

れていない 。しかし、卵や牛乳などの原因食物

marrow-derived mast cells; mBMMCs）を分化誘の完全な排除が困難な場合が多いこと、原因食物

導し、山椒抽出物が抗原刺激による mBMMCs のとして挙げられる食物は高栄養の食品が多く、除脱顆粒を強力に抑制することを見出した。

去によって幼児の身体的および精神的成育に支障

本研究は、mBMMCs を用い、山椒抽出物によるをきたす場合もあること、また食物アレルギーに

粘膜型マスト細胞の活性化抑制作用の詳細な機序よりアナフィラキシーなど生命に関わる症状が惹を解明するとともに、食物アレルギーモデルマウ

起される可能性があることから、食物アレルギースを用いた in vivo 解析により、個体レベルでの抗に対する根治的な治療薬の創製が期待されていアレルギー作用も明らかにすることを目的とした。

る。報告者らはヒト食物アレルギーの病態に類似したマウス病態モデルを確立し、腸管で粘膜型マ

実験方法

スト細胞が著しく増多すること、腸管マスト細胞

1. 粘膜型骨髄由来マスト細胞（mBMMCs）の培養を欠損したマウスにおいて食物アレルギーが発症

6 週 齢 の 雄 性 BALB/c マ ウ ス の 両 足 大 腿 骨しないことなどから、粘膜型マスト細胞が食物ア

お よ び 頸 骨 よ り 骨 髄 細 胞 を 採 取 し、20 ng/ml

レルギーの発症に深く関与することを明らかにしinterleukin（IL）-3 および 40 ng/ml stem cell factorている 2) 。さらに、ヒトにおいても粘膜型マストを添加した 10 %ウシ胎児血清含有 RPMI-1640 培

細胞が、食物アレルギーの病態形成に関与するこ

地にて、37ºC、5 % CO 2 存在下で培養を行った。

とが知られている。そこで、食物アレルギーに対培養 10 日後から前述の培地に 0.5 ng/ml IL-9 およ

して治療効果を示す薬剤を和漢薬や薬用植物の中

び 1 ng/ml transforming growth factor-β1 を追加から探索することを目的として、マスト細胞株した培地に交換し、培養開始日より 4 週間後の浮RBL-2H3 細胞を用い、抗原刺激に伴いマスト細遊細胞を mBMMC として実験に使用した 3) 。

106

2.

浦上財団研究報告書

mBMMCs の活性化

結果および考察mBMMCs を 1.5 μg/ml マ ウ ス 抗 DNP-IgE で
6 時間感作し、その後 100 ng/ml DNP-BSA を加山椒抽出物は抗原刺激による mBMMCs の活性化を抑制する

1.

え 1 時間刺激した。山椒抽出物は DNP-BSA 刺激
30 分前に適用した。抗原刺激終了後、細胞を回収

まず初めに、抗原刺激による mBMMCs の脱し、脱顆粒はβ-hexosaminidase 放出を指標とし顆粒に対する山椒抽出物（0.1 ～ 1 mg/ml）の効果

吸光光度法を用い、mRNA 発現はリアルタイム

について検討を行った。山椒抽出物は濃度依存

PCR 法を用い、また網羅的全遺伝子発現解析は 6

Evidence-Based Co
的に抗原刺激による mBMMCs の脱顆粒を抑制

DNA マイクロアレイを用い検討を行った。

し、対照群と比較し 0.32 mg/ml 以上の濃度におTest drug

食物アレルギーモデルマウス

orvehicle。一方、
いてその抑制効果は有意であった（ 図 1）
6h

30 min1h

BALB/c マウスに抗原である卵白アルブミン

mBMMCs の細胞生存率に対しては 0.32 mg/ml（ovalbumin; OVA）50μg とアジュバントである

山椒抽出物は何ら影響を与えなかったことから、

aluminum hydroxide gel との混合物を 2 週間毎

山椒抽出物による脱顆粒抑制作用はその毒性によに計 2 回腹腔内投与し、全身感作を行った。さらるものではないことが示された。これらの結果か
45にその 2 週間後より隔日に 50 mg OVA の経口投

40
ら、以降の検討においては0.32 mg/ml 山椒抽出与を行い、投与 1 時間後にアレルギー性下痢症状物を用いた。

β-hexosaminidase release (%)

80

35
30

20 る tumor necrosis factor
カインであ
-α、
∗ （TNF）∗

Evidence-Based Complementary
15 and Alternative Medicine

Th 2 サイトカインである IL-4、IL-13 などを産
10

データは全て平均値±標準偏差で表示した。統Test drug

生し放出する。抗原刺激は、mBMMCs
における
5

6 h の t -30
検定または
計学的有意差は Student
min
1Dunnetth

TNF-α、IL-4
および IL-13 の mRNA 発現を対照
0or vehicle

0.1

Vehicle

0.32

60

40

20

0

1

。山椒抽出物群と比較し著明に増大させた（図ZF2）(mg/mL)
Degranulation assay
DNP-BSA (+)
Real-time PCR analysis
DNP-BSA (−)
は、抗原刺激によるこれらサイトカイン
mRNA
Transcriptome analysisの多重比較検定を用いて検討し、危険率
P<0.05+/ − DNP-BSA
Anti-DNP IgEの場合に有意であると判定した。

(b)

(a)

45

100

TNF-α

350

#

IL-4

IL-13

160

#

40

25
20

∗

∗

15
10

#

250
60

40

20

5

Relative mRNA

30

200

∗

#

∗

∗

150

F340 /F380 (%)

300

80

35
Viability (%)β-hexosaminidase release (%)

100

マスト細胞は様々な刺激により炎症性サイト
25経口投与 1 時間前に経口にて行った。
統計学的処理Degranulatio
Real-time PC
Transcriptom(a)の有無を評価した。山椒抽出物の投与は OVA の4.

+/ − DNP-BSA

Anti-DNP IgE

Viability (%)

3.

6Vol.20（2013）

140

120

100
50

0

VehicleDNP-BSA (+)
DNP-BSA (−)

0.1

0.32

0

1

ZF (mg/mL)

100
Vehicle0
Vehicle

ZF
ZF

VehicleZF

VehicleZF

0

DNP-BSA (+)
DNP-BSA (−)

(d)
(c)
(b)
抗原刺激による mBMMCsの脱顆粒に対するにおけるサイトカインの mRNA 発現に対する
図 2 mBMMCs
（ZF）
山椒抽出物
（ZF）
TNF-α 山椒抽出物
IL-4 の抑制効果
IL-13
160 Figure 2: Theeﬀect of ZF(0.32の抑制効果
mg/mL) on degranulation, cytokine levels, and [Ca2+ ]i elevation#
mBMMCsは DNP-IgE（1.5 μg/ml）で 6 時 間 感 作 し、DNPmBMMCs
はtime
DNP-IgE（1.5μg/ml）
で 6 時 間assay,
感 作 real-time
し、DNPDNP-BSA.
(a) Theschemefor the degranulation
PCR analysis, and tran#
DNP-BSA
were sensitizedwith
1.5 µg/mL
anti-DNP IgE (6 h) were incubated（ZF;
with ZF for 30 min. The ce
BSA（100 ng/ml）を加え抗原刺激を行った。山椒抽出物（0.1BSA（100ng/ml）
を加え抗原刺激を行った。山椒抽出物(open)0.32
DNP-BSA(1 h),and the β-hexosaminidase
release was determined.
1 mg/ml）は抗原刺激 30 分前に適用した。脱顆粒は mBMMCs
mg/ml）
は抗原刺激
30 分前に適用した。その後
RNA を (c) The mBMMCs
and stained with PI; thePCR
viability
was analyzed using the FACSvs
Calibur system. (d) Th
か ら の β-hexosaminidaseの 放 出 を 指 標 と し 測 定 を 行 っ た。140 90 min抽出し、リアルタイム
にて解析を行った。#P<0.05#∗
ZF (0.32
mg/mL) (-)、*P<0.05
or vehicle for 30vsmin
and thenstimulated with DNP-BSA for 1 h, and the t
Vehicle*P<0.05 vs Vehicle（n=4）.
DNP-BSA
Vehicle(n=4).

350
300

Relative mRNA

250
200
150
100

∗

#
∗

F340 /F380 (%)

図1

of TNF-α, IL-4, and IL-13 were analyzed by real-time PCR. The results are expressed as the rewithout DNP-BSA stimulation. The data are expressed as the mean ± SD (n = 3–4; b, c, d). # P∗
P < 0.05 compared with the vehicle (b, d). (e) The sensitized mBMMCs were labeled with Fu
determined following stimulation with DNP-BSA
120 or vehicle for 30 min. Ca2+ -mobilization wasZF
independent experiments.

Cbfa2t3
ATP6|Gm10925
NynrinHist1h1c
Arrdc3
山椒による食物アレルギーの治療に関する研究
Gfi1b発現の増大を有意に抑制した。さらに、山椒抽出

Sphk 115

物は抗原刺激による mBMMCs の細胞内カルシウ

to 3 (human)
ATP synthase F0 subunit 6 | predicted gene 10925
NYN domain and retroviral integrase containing
Histone cluster 1, H1c
Arrestin domain containing 3
107
Growth-factor-independent 1B#

be suppressed byresults suggest thaof a novel, potent

ム濃度の上昇反応を減弱させた。以上のことから、介し粘膜型マスト細胞を不活性化させることが示
唆された。
2.

山椒抽出物の mBMMCs 活性化抑制作用は
Sphk1 に依存する
山椒抽出物による粘膜型マスト細胞の活性化

抑 制 作 用 の 詳 細 な 機 序 を 検 討 す る た め、DNA
マイクロアレイを用い、山椒抽出物の標的遺伝子を網羅的に解析した。28,853 個のマウス遺伝
子のうち、山椒抽出物は抗原刺激により発現が増加した 49 個の遺伝子発現を抑制することが明らかとなった。これら遺伝子の中で、抗原刺激は sphingosine kinase 1（Sphk1）の 発 現 を 定 常
mBMMCs の 5.7 倍 に 上 昇 さ せ、 山 椒 抽 出 物 の4.1. Inhibitory Eﬀ
Cell Activation In
allergic responses
to play pivotal ro
8]. They respondindependent (suchstimulation and re5
into adjacent tissu
Although the∗degranulation ininhibited antigen
RBL-2H3 cells. M
matory and Th2
04, and IL-13, in
VehicleZF
largely responsibl
IL-13 are necessa
DNP-BSA (+)
responses and th
DNP-BSA (−)
ZF significantly icytokines in the m
図 3 mBMMCs における Sphk1 mRNA 発現に対するFigure 3: Theeﬀect of（ZF）
ZF (0.32
mg/mL) on the mRNA expression
in a connective-t
山椒抽出物
の抑制効果
levels of Sphk1. The sensitized mBMMCs were incubated with ZF
mBMMCs は DNP-IgE（1.5μg/ml）で 6 時 間 感 作 し、DNP- in the Zanthoxyli
or vehicle for 30 min and were stimulated with (filled) or without
release of histamin
BSA（100
ng/ml）
を加え抗原刺激を行った。山椒抽出物(open)
DNP-BSA.
ThemRNA levels of Sphk1 were analyzed （ZF;by
48/80-treated hum
0.32
mg/ml）
30
分前に適用した。その後
real-time
PCR. は抗原刺激
The results are
expressed
as the relative ratio toRNA
the を cells, ZF displayed
vehicle-treated mBMMCsPCR
without
DNP-BSA stimulation. The data vs
抽出し、リアルタイム
にて解析を行った。#P<0.05
and proinflamma
are expressedas the mean ± SD
= 3). # P(n=4).
< 0.05 compared with
DNP-BSA(-)、*P<0.05
vs (nVehicleand ZF suppresse∗
DNP-BSA (−), P < 0.05 compared with the vehicle.
by antigens in RB
10

Relative mRNA

山椒抽出物は細胞内カルシウム濃度の上昇抑制を

前 処 置 は 上 昇 し た Sphk1 の 発 現 を 16 % ま で 減

粘 膜 型 マ ス ト 細 胞 の 脱 顆 粒 に お け る Sphk1

少させた。さらに、リアルタイム PCR を用いての 関 与 を 明 ら か に す る た め、 抗 原 刺 激 に よ る

mBMMCs に お け る Sphk1 の mRNA 発 現 に 対 す

mBMMCs の 脱 顆 粒 に 対 す る Sphks の 阻 害 薬 でる山椒抽出物の効果について検討を行ったとこ

あ る N, N-dimethylsphingosine（DMS）の 効 果 にろ、網羅的遺伝子解析と同様に、抗原刺激によつ い て 検 討 を 行 っ た。DMS は 抗 原 刺 激 に よ る

る Sphk1 の発現亢進は山椒抽出物によって著明mBMMCs の脱顆粒を有意に抑制した。以上の結に抑制された（ 図 3）。マスト細胞は抗原刺激に果から、Sphk1 は抗原刺激による mBMMCs の活より Sphk1 および Sphk2 を誘導し、sphingosine

性化に関与することが明らかとなり、山椒抽出物

1-phosphate（S1P）を産生する。S1P はマスト細胞

は Sphk1 の mRNA 発現を抑制し、細胞内カルシの生存、増殖および細胞内カルシウムの動員におウム濃度の上昇を阻害することで mBMMCs を不いてセカンドメッセンジャーとして働くことが報活性化することが示唆された。

告されている。最近、骨髄由来マスト細胞を用いた検討において、Sphk1 が抗原刺激による細胞内

3.

山椒抽出物は食物アレルギーモデルマウスにおける下痢症状を抑制する

カルシウム濃度の上昇、脱顆粒およびサイトカイ

食物アレルギーモデルマウスを用い、アレルン産生に関与し、Sphk2 は関与しないことが示さ

ギー性下痢症状に対する山椒抽出物の効果につれた 4, 5) 。さらに報告者らは、mBMMCs におけいて検討を行った。対照（Vehicle）群におけるアる Sphk2 の mRNA 発現は抗原刺激により影響をレルギー性下痢症状の発症率は OVA 投与 3 回目

受けないことを認めている。よって、mBMMCs

から認められ、OVA 投与 6 回目ではほぼ 100 %における山椒抽出物の標的因子として Sphk1 に着に達した（図 4）。山椒抽出物（320 mg/kg）の投与

目し以降の検討を行った。

は OVA 誘発アレルギー性下痢症状の発症率を有

80

浦上財団研究報告書

2nd

3rd

Vehicle32 mg/kg
(a)

60

∗

40
∗

Food allergy occurrence (%)の知見から、山椒抽出物は個体レベルにおいても
0

100
4th
5th

3rd

Vehicle Normal
32 mg/kg

4thµm 5th
200

6th

5th

Evidence-Based Complementary and Alternativ
∗

1.5

1st
200 µm

2nd

3rd

1.5

IL-4

4th

(a)

食物アレルギーモデルマウスにおける下痢症状に対する山椒抽出物（ZF）の抑制効果

BALB/c マウスに 50μg OVA を腹腔内投与し、全身感作を行った。さらにその 2 週間後より隔日に 50 mg OVA の経口投与を
1.5
200 µm200 µm
行い、投与 1 時間後にアレルギー性下痢症状の有無を評価した。
ZF
DMS
山椒抽出物の投与は OVA の経口投与 1 時間前に経口にて行った。
(c)200 µm*P<0.05 vs Vehicle
200 µm (n=8). 120

120

(b)
0.5

1

0.5

∗

Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine
1.5

IL-4

Sphk 1

5th

Vehicle 1
DMS

Vehicle100 mg/kg
320 mg/kg

4th

∗

40

0
2nd

3rd

(b)

された。

60

0
1st

2nd

Vehicle80100 mg/kg
320 mg/kg 粘膜型マスト細胞の活性化を阻害することが示唆
DMS

20

20

1st

抗原刺激による Sphk1 の発現亢進の抑制を介し、

6th

Relative mRNA

Food allergy occurrence (%)

1st

80

∗
の mRNA
発現を有意に抑制した（ 図 6）。これら
20

120

0

100

11∗

40

Sphk 100Vehicle

ZF

120
(d)

Food allergy occurrence (%)

20

120

80

60
Vol.20（2013）
∗

∗

100

Relative mRNA

60

Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine40

図4

Food allergy occurrence (%)

Food allergy occurrence (%)

108

100

100
80
∗

60
Vehicle

ZF

40

VehicleZF
DMSにおける粘膜型マスト細胞について解析を行っ

ZF

Food allergy occurrence (%)

Food allergy occurrence (%)

Relative mRNA

Relative mRNA

1
食物アレルギーモデルマウスにおけるサイトカイン
1
図(a)
6 The
Figure 6: The eﬀect of
ZF and DMS on the developmentof FA in vivo.
inductionof allergic diarrhea was compared between the
VehiclemRNA
発現に対する山椒抽出物（ZF）
vehicle- and ZF-treated groups. ZF was orally administered during the inductionof allergic
diarrhea100
by OVA oral challenge
as described in the
20 の抑制効果
意に抑制し、OVA投与
6100
回目における発症率はMaterials andMethods
section (n = 8). (b) DMS (1 mg/kg) suppressed
the incidenceof 50μg
allergic diarrhea(n = 5–8). (c) The
proximal colons
BALB/c
マウスにOVA を腹腔内投与し、全身感作を行っof the vehicle, ZF (320 mg/kg), and DMS (1 mg/kg) treated mice after
oral challenge2with
OVA were stainedwithantibody.
た。さらにその週間後より隔日に50
mganti-mMCP1
OVA の経口投与を約 40 %であった。同様に
DMSの投与
The scale bar represents
200（1µm.mg/kg）(d) The expression
levels of IL-4 and sphk1 in 0.5
the proximal colons were measured
using real-time PCR.
00.580
行い、食物アレルギーモデルマウスを作製した。山椒抽出物
80 as the relative ratio to the proximal colons of the vehicle-treated FA mice. The data are expressed as the mean（ZF;
The results are expressed± SD∗ 1 時間前に経口にて行っ
1st
2nd
320 mg/kg）の投与は OVA の経口投与∗(n = 5). P < 0.05 compared with the vehicle.
もアレルギー性下痢症状の発症率を有意に抑制し∗た。OVA の経口投与 6 回目終了後に各群マウスから近位結腸を60
60
採取し、RNA 抽出を行いリアルタイム
PCR にて解析を行った。
た。さらに、免疫組織化学を用いマウス近位結腸Vehicle200 µm200 µm0
0*P<0.05 vs Vehicle (n=5).
32 mg/kg
Normal∗Vehicle

3rd

4th

ZF

40
allergyprevious studies may further support theagents(d)that act via the inhibition
of Sphk1-dependent and (c) [15]. These40(a)findings of this study that ZF may have a potential for foodindependent
pathways.
∗
た。正常マウスの近位結腸において粘膜型マスト
Figure 6: The eﬀect of ZF
and DMSon the Taken
developmentof FA in(a) The inductionof allergic diarrhea was compared between theallergytreatment.
all together,it vivo.
is suggested
that ZF∗
結論
vehicle- and ZF-treated groups.
ZF was orally
administeredinductionofof allergic
20described in the
may provide
a novelfor thethe
treatment
FA via diarrhea by OVA oral challenge as
20 strategy during
細胞はほとんど観察されなかったが、Vehicle
群
Materials and Methods section(n = of
8).the(b) Sphk
DMS pathway.
(1 mg/kg) suppressed the incidence of allergicAcknowledgments
diarrhea (n = 5–8). (c) The proximal colons
inhibitionof the vehicle, ZF (320 mg/kg),
and DMS
mg/kg)
treated miceoral challengewith OVA were stained with anti-mMCP1 antibody.
Althoughthe(1active
compounds
inafter
ZF have
not yet beenでは粘膜型マスト細胞の顕著な増多が認められ本研究において、報告者らは山椒抽出物が抗原
The scale bar represents identified,
200 µm. (d)ZF
Theprovides
expression
levelsof IL-4into
and thesphk1
in the proximal The
colonswere measured
using
PCR.Faisal Haider Zaidi
0real-timeinsights
development
authors
would liketo thank
Dr. Syed
0 novelThe results are expressed ofas therelative ratiodrug
to theagainst
proximalcolonsof the vehicle-treated
The data areofexpressedas themean± SD 2nd
1st
4th
a therapeuticboth
Sphk1-dependentand-FA mice.
(Department
BiologicalandBiomedical
Sciences,
Aga
1st
2nd
3rd
4th
5th
6th
。山椒抽出物の投与は粘膜型マスト細胞
in 3rdvitro
た（刺激による粘膜型マスト細胞の活性化を∗ 図 5）(n = 5). P < 0.05 comparedwith the vehicle.
independent
mechanisms of FA that are closely related to the
Khan University, Pakistan) for his kind assistance in theactivity of mucosal mast cells. Furthermore, ZF or its activeof this paper and Dr. Tatsuo
Katagiri (Departの増多を抑制した。また、山椒抽出物の投与はinmg/kgvivo において抑制することを明らかにし及びVehicle100preparation
Vehiclement of Biology, University of Toyama, Japan) for his helpful
constituents may provide a novel
prototype for antiallergic
32およびmg/kg Sphk1
Vehicle 群の近位結腸における IL-4

Normal
図5

agents(a) that act via the inhibition of Sphk1-dependent and Normal
independent pathways.

(b)

VehicleAcknowledgments
The authors would like to thank Dr. Syed Faisal Haider Zaidi
1.5(Department of Biological and Biomedical
Sciences, Aga IL-4
Khan University, Pakistan) for his kind assistance in the
preparation of this paper and Dr. Tatsuo Katagiri (Department of Biology, University of Toyama, Japan) for his helpful

200 µmVehicle1.5200 µm1

ZF

食物アレルギーモデルマウスにおける粘膜型マスト細胞の増多に対する山椒抽出物（ZF）の抑制効果(c)

Relative mRNA

200 µm

320 mg/kg

DMSた。また、この作用は主として
Sphk1の mRNA
200 µmRelative mRNA

allergy [15]. These previous studies may further support thefindings of this study that ZF may have a potential for foodallergy treatment. Taken all together, it is suggested that ZF
may provide a novel strategy for the treatment of FA via
inhibition of the Sphk pathway.
Although the active compounds in ZF have not yet been
identified, ZF provides novel insights into the developmentof a therapeutic drug against both Sphk1-dependent and independent mechanisms of FA that are closely related to theactivity of mucosal mast cells. Furthermore, ZF or its active
constituents may provide a novel prototype for antiallergic

5

1

DMS

BALB/c
マウスに 50μg OVA を腹腔内投与し、全身感作を行った。さらにその2 週間
Figure 6: Theeﬀect of;FA,GZF and DMS on the develop
5 5 _G"!#!KW6LS78:(ZF) >-/E

後より隔日に 50 mg OVA の経口投与を行い、食物アレルギーモデルマウスを作製した。
0.5 and ZF-treated groups. ZF was0.5
vehicleorally admini
山椒抽出物（ZF; 320 mg/kg）の投与は OVA の経口投与 1 時間前に経口にて行った。
Materials
andMethods
section(n=8).
(b) DMS (1
OVA の経口投与 6 回目終了後に各群マウスから近位結腸を採取し、粘膜型マスト細胞の∗ and DMS (1 mg/kg)
ofthevehicle,ZF(320
mg/kg),
マーカーである抗 mMCP-1 抗体を用い、免疫組織化学を行った。

BALB/c  50 µg OVA VT+?$ *Z=(X\]
The scale bar represents 200
µm.2(d)The expression
200 µm200 µm The results are expressed as the relative ratio to the p0<^C 50 mg OVA O2?$X_G"!# !(Y
;0
∗
ZF

DMS

(n = 5). P <Vehicle
0.05 compared with
ZF the vehicle.

FA,G (ZF; 320 mg/kg) ?$
OVA O2?$ 1 D].O2X(c)

OVA(d)

Veh山椒による食物アレルギーの治療に関する研究

発現の抑制を介したものであることが示された。

109

団の多大なご支援に対し心より感謝いたします。

よって、本研究で得られた知見は有効な治療薬が存在しない食物アレルギーに対し、Sphk1 の発現文抑制を目的とした新たな治療戦略の提供に応用す

1) Sicherer SH, et al: J Allergy Clin Immunol (2006) 117:
S470-475.

ることができる。さらに、山椒抽出物またはその主要活性成分が新規治療薬のリード化合物となる可能性が期待される。
謝

辞
本研究は（公財）浦上食品・食文化振興財団の研究助成により遂行することができました。貴財

献2) Yamamoto T, et al: Int Arch Allergy Immunol (2009) 148:
175-185.
3) Kageyama-Yahara N, et al: FEBS letters (2010) 584: 111118.
4) Oskeritzian CA, et al: Blood (2008) 111: 4193-4200.
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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Zanthoxyli Fructus, Sansho, Ameliorate Food Allergies
Through the Suppression of Mucosal Mast Cell Activation
Shusaku Hayashi, Xiaoyu Wang, Takeshi Yamamoto, and Makoto Kadowaki
Division of Gastrointestinal Pathophysiology, Institute of Natural Medicine
University of Toyama
Introduction: Food allergy (FA) is relatively a common disease in infants, buteffective drug therapies are not yet available. Notably, mucosal mast cells, but notconnective-tissue mast cells, play important roles in food allergic reactions via the releaseof inflammatory mediators. Therefore, we screened 80 constituent medicinal herbs of
traditional Japanese formulae which are frequently used in Japan using rat basophilic
leukemia (RBL)-2H3 mast-like cells. Of the 80 medicinal herbs, the water extracts ofZanthoxyli Fructus (ZF), which is called Sansho in Japanese, significantly inhibited
antigen-induced degranulation. It has been reported that ZF has anti-inflammatory
properties. However, it remains unclear whether ZF has suppressive effect on the activationof mucosal mast cells and the development of FA. In the present study, we examined theeffect of ZF on mucosal-type murine bone marrow-derived mast cells (mBMMCs), andinvestigated the underlying mechanisms of the inhibitory action.
Methods: The mBMMCs were prepared from the femurs of BALB/c mice andcultured with a combination of stem cell factors, interleukin (IL)-3, IL-9 and transforming
growth factor-β1. The mBMMCs were sensitized by anti-DNP IgE and pretreated with ZF
for 30 min before the stimulation with antigen, DNP-BSA. The degree of degranulation
was assessed by measuring β-hexosaminidase release. The expression levels of cytokinesmRNA in mBMMCs were examined by real-time PCR. In murine FA model experiments,
BALB/c mice were systemically sensitized twice with ovalbumin (OVA) and then wererepeatedly given orally OVA. ZF was administered orally before the OVA challenges.
Results and Discussion: ZF significantly inhibited the degranulation of mBMMCs
induced by antigen in a concentration-dependent manner. In addition, ZF significantly
suppressed the degranulation induced by calcium ionophore A23187 in mBMMCs. ZF
suppressed the increase of intracellular calcium concentration triggered by the antigen in
mBMMCs. The expression levels of tumor necrosis factor-α, IL-4 and IL-13 mRNA were
extremely enhanced by antigen in mBMMCs, which was almost completely suppressedby ZF. To investigate the pharmacological mechanism underlying the inhibitory effect of
ZF, we examined the global mRNA expression profiles of normal mBMMCs, antigenstimulated mBMMCs (activated mBMMCs), and ZF-pretreated activated mBMMCs using
mouse GeneChip. The expression level of sphingosine kinase 1 (Sphk1), which plays
an important role in the antigen-induced immune responses in mast cells, was markedly
increased in the activated mBMMCs compared with normal mBMMCs, and these eventswere almost totally inhibited by pretreatment of ZF. Furthermore, ZF inhibited allergic
symptoms in an OVA-induced murine FA model and decreased the number of infiltrating
mucosal mast cells and the enhanced mRNA expression levels of IL-4 and Sphk1 in the FA
mice colons.
Conclusion: The present study reveals that ZF suppresses the activation of mucosal
mast cells mainly through Sphk1-dependent mechanism. Therefore, our findings suggestthat ZF is utilized for the development of a novel, potent anti-FA agent.