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記憶障害に予防効果を持つ食品成分の有用性の解明＜平成19年度＞

記憶障害に予防効果を持つ食品成分の有用性の解明
小宇田智子

・今井秀

樹

（宮崎大学医学部社会医学講座衛生学分野）

1.

はじめにになっている。げっ歯類への単回投与により，脳の辺縁領域，特に海馬に重篤な傷害を及ぼし，記

日本人の平均寿命は他国に例をみないほど急速憶の減弱，情動変化（攻撃性増大）などの表現型に延伸し，平成 18 年の簡易生命表では男性 79.00に加えて，海馬内で惹起されるアミロイド前駆体，歳，女性 85.81 歳となっており，世界有数の長寿

プレセニリン 1 および炎症性サイトカイン国である。長寿は人々の共通の願いであるが，生（interleukin（IL）-1b）の発現変化がアルツハイ

命活動を維持するだけでは人間らしい豊かな生活マー病態に類似している。従って，TMT を処置を送ることはできない。健康で障害のない期間，したラットは非常に有効な記憶障害のモデル動物

つまり支援や介護を必要としない期間は健康寿命となり得る。TMT を処置した記憶障害モデルラと定義され，この健康寿命の延伸こそが人々の真ットを用いて，食品成分による記憶能低下抑制効の願いである。平成 16 年度の厚生労働省による果の作用機序を解明することで，アルツハイマー国民生活調査において，健康寿命を縮める原因す病の病因解析にも応用できる可能性がある。

なわち介護が必要となった原因の第三位が認知症

ソバポリフェノール類混合物には，ルチン，カであり，要介護となる原因の 12.5％を占めている。 テキンおよびケルセチンなどが含まれている。本
つまり，認知症を予防することができれば，人々研究では，これらの成分のうちルチンに注目した。の健康寿命の延伸が多いに期待できると言える。

ルチンはフラボノイド類の一種であり，主にソバ認知症に伴う記憶障害の予防の一つとして，よに多く含まれている。ソバは米や小麦と同様に主り多くの人が普段の生活に取り入れやすい手軽な食となりうるため，一度の食事で無理なく比較的方法が必要であると考える。我々はこれまでに，大量に摂取することが可能である。また，荒地や身近な食品の中で記憶障害に対して予防効果を持やせ地でも栽培できるという利点もあり，日本以つものを探索すべく，記憶障害モデルラットを使外でも様々な調理法で食されている。ソバは脳のった行動学的な実験によりソバポリフェノール類老化を予防すると言われているが，科学的に証明混合物の記憶能低下抑制効果を明らかにした。本

されておらず有効成分も同定されていない。今回研究では，ソバポリフェノール類混合物のどの成我々は，ルチンが記憶能低下抑制効果を持つ有効分が有効であるかを特定し，作用機序の一端を明成分の一つであることを見出し，さらにその作用らかにすることを目的とした。

機序の一端を解明したので報告する。

記憶障害モデルラットはトリメチルスズ（TMT）を用いて作成した。TMT はヒトやげっ歯類に対して中枢機能障害を及ぼすことが明らか

2. 材料と方法
2. 1

材料

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

トリメチルスズ（TMT）（CAS No. 56-24-6）は120 秒間）を 1 日 2 回，4 日間連続して測定した。

Strem Chemicals 社 製 を， ル チ ン（CAS No.

各測定日の 2 回の平均値を測定値とし，2 日目以153-18-4）は東京化成工業社製を用いた。

降については 1 日目の逃避潜時に対する割合

2. 2（％）を求めた。この測定段階を training trial と実験デザイン

４週齢の Sprague-Dawley（Jcl：SD）雄性ラッし，ラットは周りの風景によりプラットフォーム

トを 12 時間の明暗周期で飼育し，自由に飲水さの位置の記憶を獲得していく。Training trial のせた。粉末飼料はオリエンタル酵母社製の NIH-最終日の翌日に probe trial を行った。プラット

07PLD を 用 い た。 ラ ッ ト を 4 群（Control 群 ,フォームを除去したプールで，ラットを 120 秒間

rutin 群 , TMT 群および TMT+rutin 群）に分け，泳がせ，プラットフォームが存在していた全体のcontrol 群と TMT 群には粉末飼料を，rutin 群と4 分の 1 にあたる象限における滞在時間の割合

TMT+rutin 群にはルチンを 0.75％の重量比で混（ ％） を 測 定 し た。 こ の 測 定 に よ り，training合した粉末飼料を実験期間中，自由に摂食させた。 trial で獲得した記憶がどの程度，保持・想起さ
６ 週 齢 時 に TMT 群 と TMT+rutin 群 に TMT

れ た か が 比 較 で き る。Training trial や probe（8.5mg/kg 体重）を単回強制経口投与した。尚，trial の結果が空間記憶によるもので，泳力や視力，粉末飼料およびルチン添加粉末飼料は４週齢目か麻痺等による影響がないことを確認するため，ら実験終了まで同じ物を与えた。TMT を投与しprobe trial の翌日に cue test を行った。泳いでてから 2 週間後より、モリス水迷路試験にて空間いるラットからプラットフォームが見えるように記憶能を測定し，屠殺後すばやく脳を取り出し，するため，水面上２ cm になるように水を張り，組織学的実験および分子生物学的実験に供した。

ラットを放ち，プラットフォームまでの潜時を測

動物実験の内容については宮崎大学動物実験委員

定した。

会の承認を得て実施した。
2. 3

2. 4

モリス水迷路試験

組織学的実験

モリス水迷路試験終了後，屠殺したラットの大直径 145cm，深さ 45cm の円形プールに 20℃

脳の左半分をドライアイスで素早く凍結し，クラ前後の水を入れ，避難場所として 10cm × 10cm

イオスタット（LEICA CM1850）にて凍結切片のプラットフォームを水面下２ cm の位置に置い（16nm）を作成した。ヘマトキシリン・エオシた。ラットからプラットフォームが見えないようン染色を行い，海馬の各領域（CA1, CA3a, CA3bに，白い絵の具を水に溶かした。プールの側壁のおよび CA3c）の神経細胞数（個 /mm2）を光学ランダムな位置よりラットを入水させ，プラット顕微鏡下で数えた。また，TUNEL 法（ApopTagr

フォームへ逃避するまでの時間（逃避潜時：最大Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit: ケミ実験

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記憶障害に予防効果を持つ食品成分の有用性の解明

コン社製）により TUNEL 陽性細胞を検出し，る神経細胞数および mRNA の発現量について，海馬の各領域において，１ mm2 あたりの神経細一元配置分散分析（ANOVA）および，Fisher s胞数に対する TUNEL 陽性細胞数の割合（％）をProtectes Least Squares Difference（PLSD）test

光学顕微鏡下で数えた。1 個体あたり 1 枚の切片の多重比較検定を用いて平均値の差を解析した。の神経細胞数および TUNEL 陽性細胞数を数え，TUNEL 陽 性 細 胞 は control 群 と rutin 群 で は 検各群の平均値を求めた。

出されなかったため，TMT 群と TMT+rutin 群

2. 5の TUNEL 陽性細胞数の割合について，対応の分子生物学的実験屠殺したラットの右側の脳から海馬を取り出し， な い t 検 定 を 行 っ た。 危 険 率 ５ ％ 未 満（P ＜重 量 を 測 定 し た 後 SV Total RNA Isolation0.05）を有意差ありと判定した。これら統計処理

System（プロメガ社製）を用いてトータル RNAには StatView-J 5.0（SAS Institute Inc.）を用いを抽出した。トータル RNA の濃度を測定した後，た。

PrimeScript

TM

RT Reagent Kit（タカラバイオ社製）を用いて iCyclerTM（バイオラッドラボラト
リ ー 株 式 会 社 製 ） に よ り cDNA を 合 成 し，

3. 結
3. 1

果

実験開始前の体重，実験期間中の摂食量，体重増加量および右側海馬重量

TaqMan Gene Expression Assays（アプライドバイオシステム社製）を用いてリアルタイム各群間で実験開始前の体重と実験期間中の摂食PCR（7300 Real-Tmne PCR system）を行った。

量 に 有 意 差 は み ら れ な か っ た。TMT 群 とこ の 方 法 に よ り， 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア の 指 標

TMT+rutin 群の体重増加量および右側海馬重量（OX-42），アストロサイトの指標（GFAP），抗酸は control 群および rutin 群に比べて統計学的に化 酵 素 類（superoxide dismutase（SOD1），有意に少なかった（表 1 参照）。

glutathione peroxidase 1 （GPx1），catalase

3. 2（CAT））および炎症性サイトカイン類

Training trial により測定した逃避潜時の割合（interleukin（IL）-1b, IL-6, tumor necrosis factor

は，4 日間とも各群間で有意差はみられなかった（TNF）-a）の mRNA 発現量を，ハウスキーピン（図 1（A）参照）。Probe trial では，TMT 群は他グ遺伝子である b-actin の発現量と比較定量した。の群に比べてプラットフォームの存在していた象

2. 6

モリス水迷路試験限に滞在していた時間の割合が有意に小さかった。

統計処理

モリス水迷路試験のデータ（逃避潜時およびプ

また，TMT+rutin 群では rutin 群と比較して滞ラットフォームの存在した象限への滞在時間の割在時間の割合が有意に小さかったが，control 群合），実験開始前の体重，実験期間中の摂食量，との間に有意差はみられなかった（図 1（B）参照）。

体重増加量，右側海馬重量，海馬の各領域におけ

また，これらの結果は cue test により泳力や視力，�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

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図1Vol.16（2008）

モリス水迷路試験。
（A）逃避潜時の割合（%, mean ± SEM），（B）プラットフォームの存在した象限で####の 滞 在 時 間 の 割 合（%, mean ± SEM）。***P ＜ 0.001 vs control 群， P ＜ 0.05， P ＜ 0.001 vs rutin
群，+ P ＜ 0.05 vs TMT 群。

麻痺等による影響がないことを確認した（データ示さず）。
3. 3

海馬の各領域における神経細胞数

CA1 領域と CA3a 領域においては，各群間で有 意 差 は み ら れ な か っ た が，CA3b 領 域 で はTMT 群の神経細胞数は他の群の神経細胞数と比較して有意に少なかった。CA3c 領域においては，
TMT 群と TMT+rutin 群の神経細胞数は control群と rutin 群の神経細胞数に比べて有意に少なかった。統計学的な有意差はみられなかったが，TMT+rutin 群の神経細胞数は TMT 群の神経細図2

左側海馬の各領域（CA1, CA3a, CA3b および CA3c）の神経細 胞 数（ 個 /mm2, mean ± SEM）。*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001
vs control 群，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001 vs rutin 群，+ P ＜0.05 vs TMT 群。

図3

左 側 海 馬 の 各 領 域（CA1, CA3a, CA3b お よ び CA3c） のTUNEL 陽性細胞数の割合（%, mean ± SEM）。+ P ＜ 0.05vs TMT 群。

胞数よりも多い傾向にあった（図 2 参照）。
3. 4

海馬の各領域における TUNEL 陽性細胞数の割合

Control 群と rutin 群では TUNEL 陽性細胞が検出できなかったため，TMT 群と TMT+rutin群の比較を行った。CA1 領域と CA3a 領域では両群間で TUNEL 陽性細胞数の割合に有意差はみられなかったが，CA3b 領域と CA3c 領域ではTMT+rutin 群 の TUNEL 陽 性 細 胞 数 の 割 合 はTMT 群と比較して有意に少なかった（図 3 参照）。
3. 5

OX-42 と GFAP の mRNA 発現量

TMT 群 と TMT+rutin 群 の OX-42 と GFAPの mRNA 発現量は control 群および rutin 群と比較して有意に多かった。また，TMT+rutin 群のOX-42 と GFAP の mRNA 発現量は TMT 群と比較して有意に少なかった（図 4（A）参照）。
3. 6

SOD1，GPx1 お よ び CAT の mRNA 発現量

SOD1 の mRNA 発現量は各群間で有意差はみ記憶障害に予防効果を持つ食品成分の有用性の解明

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図 4 （A）OX-42 および GFAP の mRNA 発現量，（B）SOD1，GPx1 および CAT の mRNA 発現量，（C）IL-1b，IL-6 およ び TNF-a の mRNA 発 現 量。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001 vs control 群，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001 vsrutin 群，+P ＜ 0.05，++P ＜ 0.01vs TMT 群。

ら れ な か っ た。TMT 群 の GPx1 の mRNA 発 現の錐体細胞への傷害により，CA3 領域から CA1量は他の群と比較して有意に多かった。TMT 群領域へ至る神経回路の形成が阻害されたことによと TMT+rutin 群 の CAT の mRNA 発 現 量 はる可能性がある。TMT による神経細胞傷害性のcontrol 群および rutin 群と比較して有意に少な詳しい作用機序は明らかになっていないが，inかった（図 4（B）参照）。

vitro 試験では活性酸素種生成を介して細胞のア

3. 7IL-1b，IL-6 お よ び TNF-a の mRNA 発ポトーシスを誘導することが報告されている５）。

現量

また，マウスの海馬と前頭葉において，TMT をTMT 群の IL-1b の mRNA 発現量は control 群処置してから 48 時間後で H2O2 などの活性酸素

お よ び rutin 群 と 比 較 し て 有 意 に 多 か っ た。

種が産生されることが報告されている６）。今回のTMT 群 の IL-6 の mRNA 発 現 量 は control 群 お研究では，TMT 処置により傷害をうけた CA3

よび rutin 群と比較して有意に多く，TMT+rutin領域の神経細胞が，ルチン摂食により保護された。

群は control 群に比べて有意に多かった。TNF-a

ま た，TMT 処 置 に よ る GPx1 の mRNA 発 現 量の mRNA 発現量については，各群間で有意差はの増加をルチン摂食が抑制することが明らかになみられなかった（図 4（C）参照）。

った。抗酸化酵素である GPx1 と CAT はアスト

4. 結論と考察

ロ グ リ ア に お い て H2O2 を 無 害 化 す る が 7, 8），
GPx1 は低濃度の H2O2 の無害化に重要であり ７），

Pu らは繰り返し脳虚血による空間記憶能の低

一方 CAT は高濃度の H2O2 の無害化に重要であ下および海馬 CA1 領域の神経細胞に対するルチる９）。つまり，TMT 処置によって海馬で産生さンの保護効果を報告している １）。本研究では，れた低濃度の H2O2 による CA3 領域の神経細胞TMT 処置による記憶障害モデルラットを用いて， に対する傷害が，ルチンの抗酸化作用により保護記憶能低下および海馬 CA3 領域の神経細胞に対された可能性が示唆された。

するルチンの保護効果を明らかにした。TMT は，

TMT 処 置 に よ り OX-42，GFAP，IL-1b お よ

げっ歯類への単回投与により，CA3 領域をはじび IL-6 の mRNA 発現量が増加した。この結果はめとする海馬を特異的に傷害することで記憶障害他の研究結果と一致していた 3, 10）。本研究では，を誘導することが知られている 2, 3）。記憶の形成

TMT 処置によって誘導された OX-42 と GFAPには海馬で神経回路ができることが必要である４）。 の mRNA 発現量の増加がルチン摂食により抑制
TMT 投与による空間記憶能の低下は，CA3 領域されることが明らかになった。さらに，統計学的60

浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

な有意差はみられなかったものの，TMT 処置にOriti, K., Egawa, T., Kitamura, Y., Egashira, N., Iwasaki, K.,

より増加した IL-1b と IL-6 の mRNA 発現量がル

Fujiwara, M. Neuroprotective effects of quercetin andチン摂食により抑制された。ミクログリアによって分泌されたこれらの炎症性サイトカイン類は，アストロサイトを増殖させ 11, 12, 13），海馬に依存した学習記憶機能をかく乱させる 14）。Maier らは活性化ミクログリアと炎症性サイトカイン類がrutin in an 8-arm radial maze task and neuronal deathinduced by repeated cerebral ischemia in rats. J Pharmacol
Sci. 104, 329-334（2007）.
２） Ishida, N., Akaike, M., Tsutsumi, S., Kanai, H., Masui,A., Sadamatsu, M., Kuroda, Y., Wakanabe, Y., McEwen, B。
S., Kato, N. Trimethyltin syndrome as a hippocampal
degeneration model: temporal changes and neurochemical

TMT 処置による神経毒性を調節していることをfeatures of seizure susceptibility and leaning impairment.

報告している 10）。ルチン摂食による記憶能低下

Neurosci. 81, 1183-1191（1997）.

抑制効果は，TMT 処置によって活性化されたミ

３） Liu, Y., Imai, H., Sadamatsu, M., Tsunashima, K., Kato,N. Cytokines participate in neuronal death induced by

クログリアによる炎症反応がもたらす神経傷害性Trimethyltin in the rat hippocampus via type 2を，ルチン摂食が保護した結果かもしれない。

glucocorticoid receptors. Neurosci Res 51, 319-327（2005）.
４） Nakazawa, K., McHugh, T.J., Wilson, M.A., Tonegawa,5. まとめS. NMDA receptors, place cells and hippocampal spatialmemory. Nat Rev Neurosci 5, 361-372（2004）.

TMT 処置による記憶障害モデルラットを使っ

５） Jenkins, S.M., Barone, S. The neurotoxicant

た今回の研究で，行動学的実験により，ルチンがtrimethyltin induces apoptotis via caspase activation, p38記憶能低下を抑制することを見出した。ルチンのprotein kinase, and oxidative stress in PC12 cells. ToxicolLett 147, 63-72（2004）.

記 憶 能 低 下 抑 制 効 果 は，TMT 処 置 が 海 馬 の６） Ali, S.F., LeBel, C.P., Bondy, S.C. Reactive oxygen

CA3b および CA3c 領域にもたらす神経細胞傷害

species formation as a biomarker of methylmercury andを，抗酸化作用および抗炎症作用によって低下さ

trimethyltin neurotoxicity. Neurotoxicol 13, 637-648（1992）.

せたことに由来する可能性が示唆された。活性酸

７） Dringen, R., Hamprecht, B. Involvement of glutathione
peroxidase and catalase in the disposal of exogenous

素種はパーキンソン病やアルツハイマー病などのhydrogen peroxide by cultured astroglial cells. Brain Res

神経変性疾患の原因となる

759, 67-75（1997）.

。作用機序を解明

15, 16）するためにさらなる研究が必要であるが，ルチン摂食は，アルツハイマー病や加齢による海馬傷害に対して有益な作用を持つ可能性がある。

８） Hirrlinger, J., Resch, A., Gutterer, J.M., Dringen, R.
Oligodendroglial cells in culture effectively dispose ofexogenous hydrogen peroxide: comparison with cultured
neurons, astroglial and microglial cells. J Neurochem 82,635-644（2002）.

謝辞本研究を遂行するにあたり，研究助成金を賜り

９） Baud O, Greene AE, Li J, Wang H, Volpe JJ, Rosenberg
PA. Glutathione peroxidase-catalase cooperativity isrequired for resistance to hydrogen peroxide by mature

ました浦上食品・食文化振興財団並びに関係各位

rat oligodendrocytes. J Neurosci 24（7）,1531-1540,（2004）.に心から感謝を申し上げます。それとともに，貴10） Maier, W.E., Brown, H.W., Tilson, H.A., Luster, M.I.,

財団の将来にわたる益々のご発展をお祈り申し上げます。

Harry, G.J. Trimethyltin increases interleukin（IL）-1alpha, IL-6 and tumor necrosis factor alpha mRNA levels
in rat hippocampus. J Neuroimmunol 59, 65-75（1995）.
11） Giulian, D., Lachman, L.B. Interleukin-1 stimulation of文献１） Pu, F., Mishima, K., Irie, K., Motohashi, K., Tanaka, Y.,

astroglial proliferation after brain injury. Science 228,497-499（1985）.

記憶障害に予防効果を持つ食品成分の有用性の解明

6112） Selmaj, K.W., Farooq, M., Norton, W.T., Raine, C.S.,

induced microglial activation induces learning andBrosnan, C.F. Proliferation of astrocytes in vitro inmemory deficits without neuronal cell death in rats. J

response to cytokines. A primary role for tumor necrosis

Neurosci Res 83, 557-566（2006）.

factor. J Immunol 144, 129-135（1990）.
13） Benveniste, E.N. Role of macrophages/microglia in
multiple sclerosis and experimental allergic
encephalomyelitis. J Mol Med 75, 165-173（1997）.
14） Tanaka, S., Ide, M., Shibutani, T., Ohtaki, H.,
Numazawa, S., Shioda, S., Yoshida, T. Lipopolysaccharide-15） Weber, G.F. The pathophysiology of reactive oxygen
intermediates in the central nervous system. Med Hypothes
43, 223-230（1994）.
16） Bowling, A.C., Beal, M.F. Bioenergetic and oxidative
stress in neurodegenerative diseases. Life Sci 56, 1151-1171（1995）.

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.16（2008）

Studies for the effects of composition of foods on memory deﬁcits
Tomoko Koda and Hideki Imai
（Division of Environmental Health Sciences, Department of Social Medicine,
Faculty of Medicine, University of Miyazaki）

Aims: Rutin is attracting considerable attention because of its biological activities that are
beneﬁcial to human health. Trimethyltin is a toxic organotin compound, and rats injectedwith trimethyltin serve as a useful in vivo model for hippocampal neurodegeneration. To
determine the protective effect of rutin on spatial memory impairment and the molecularmechanisms of rutin-mediated neuroprotection, we investigated the protective effect of rutin
against the trimethyltin-induced impairment of the hippocampus by assessing the proﬁle ofmRNA expression levels related to antioxidative and anti-inflammatory effects in thehippocampus.
Main methods: Four-week-old male rats were fed chow with rutin（0.75 ％）during theexperimental period and administered a single dose of trimethyltin（8.5 mg/kg b.w., p.o.）at
6 weeks of age. Spatial memory was assessed using the Morris water maze task and thenhistological and molecular examinations were conducted on the hippocampal region.
Key findings: Trimethyltin induced spatial memory impairment and loss of cells in thehippocampal CA3 region, and those were signiﬁcantly reversed by rutin supplementation. Inaddition, rutin supplementation significantly suppressed the trimethyltin-induced mRNA
expression levels of activated glial cell markers, antioxidase, and pro-inflammatory
cytokines.
Significance: The present results suggest that the protective effects of rutin against
trimethyltin-induced spatial memory impairment and damage to cells in the hippocampal
CA3 region could be due to its antioxidative and anti-inflammatory effects. Rutin
supplementation may have a beneficial effect against hippocampal changes observed in
Alzheimer s disease or aging.