20

浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）＜平成19年度＞

魚の摂取と脳保護効果の分子基盤小泉修一（山梨大学医学部薬理学講座）

1.

はじめにい。そこで本研究では，DHA が脳内抗酸化作用で中心的な役割を果たすグリア細胞（アストロサ『魚を食べると頭が良くなる』などと雑誌やテイト）の遺伝子発現に与える影響を解析することレビが盛んに伝え，またそれを支持する調査・報により，その抗酸化作用発現機序の解明を行う。

告もある。
『頭がよくなる』ことの真偽は別とし先ず（１）DHA 刺激をした初代培養アストロサて，青魚等に多く含まれる n-3 系不飽和脂肪酸ドイトを用いて，グリア細胞の機能調節に最も重要コサヘキサエン酸（DHA）が脳の発達やシナプな ATP 受容体（P2 受容体）発現変化の解析を

ス伝達等に影響を与え，またその抗酸化作用から， 行う。
（２）（１）で得られた分子のうち，最も有DHA は酸化ストレスに対する脳保護効果を有し力 な P2 受 容 体 に つ い て 定 量 的 PCR 法 及 びていることが指摘されている。脳は他の組織に比Western blotting 法等で確認したのち，これらがべて DHA が多く含み，DHA と高次脳機能及び神経細胞保護に与える影響を in vitro 酸化ストレその維持との関連性が注目されている。一般に多スモデルを用いて精査する。
（３）候補因子の薬

価不飽和脂肪酸は生体内での酸化ストレスを受け理学的遮断及び RNA 干渉法による遺伝子ノックやすく，各種疾患の危険因子になる可能性を有す

ダウン法により，これら候補因子が酸化ストレスるが，DHA のような n-3 系多価不飽和脂肪酸は， に対する脳保護効果に果たす役割を明らかとする。
脳内に取り込まれると逆に抗酸化作用を促進する

前述したように，グリア細胞は脳の恒常性維持，ことが知られている。その理由の一つに，DHA機能制御に必須であり，その破綻は種々の脳疾患が核内受容体 RXR（レチノイン酸 X 受容体）のを引き起こす。脳内に入った医薬品，有害環境物内在性アゴニストとして機能し 1），種々の遺伝子質，さらに今回の DHA 等の食品が脳内に入った発現制御に積極的に関わることが挙げられる。一際に，必ずグリア細胞もこれらに暴露されるが，方，近年，脳機能が神経細胞だけでなく，グリア食品等化学物質がグリア細胞に与える影響は全く細胞によって強く・積極的に制御されていることわかっていない。本研究の遂行により，脳を神経が明らかとなり 2, 3），今や脳研究を展開するにあ細胞 - グリア細胞の共同体ととらえて，食品等化たりグリア細胞の視点は不可欠である。特に，脳学物質の影響を検討する重要性が明らかとなるこ疾患との関連性は大きく，例えば殆どの脳疾患はとが期待できる。さらに本研究は，魚介類を多くグリア細胞の機能変調が付随し，また逆に正常グ摂る日本の伝統的な食文化が，DHA を介して脳リア細胞は，神経細胞を酸化ストレスから保護すの健康増進に果たす役割を分子の言葉で解き明かるために必須の細胞である 4）。しかし，DHA のす可能性を有するものである。

グリア細胞機能に果たす役割は全くわかっていな

魚の摂取と脳保護効果の分子基盤

2. 方法

21

Gq 共役がた P2Y2 受容体を刺激すると，細胞内カルシウムイオン濃度（［Ca2 ＋］i）が観察される。

初代培養アストロサイト 5）及びミクログリア 6）

図 1c で示すように，DHA を処置したアストロの培養は既報に従って行った。アストロサイトは

サ イ ト は UTP 刺 激 に よ る（
［Ca2 ＋ ］i の 上 昇

１日齢ラットの海馬より採取し，またミクログリ（F340/F380）が有意に亢進していた。

アは１日齢ラット大脳皮質のアストロサイトを培

3. 2

養 12 日後にアストロサイト上で産生されるミク神経細胞死に対する DHA 処理アストロサイトの作用ログリアを回収して用いた。神経細胞は，17 日

次に海馬培養神経細胞の純培養系を用い，酸化齢の胎児海馬を採取し，既報によって培養を行っストレスに対する障害モデルを作成した。H2O2た。DHA 処置による P2 受容体発現変化の解析は， 処置により，神経細胞の生存率（Cell viability）主に定量的 RT-PCR 法を用いた。また，Westernは濃度依存的に低下した（図 2a）。神経細胞の生blotting によるタンパク量の解析及び fura-2 法に存率が約 30％となる H2O2 の濃度として 300 nM

よるカルシウムイメージング法により機能解析を（２時間処置）を採用し，以下の検討を行った。

行った。神経細胞の生存率の解析は，過酸化水素DHA（0.1 及び 1.0 nM）を処置したアストロサイ（H2O2）により惹起される神経細胞障害を惹起し，トの培養上清（DHA-ACM；astrocyte-conditioned

こ れ に 対 す る ア ス ト ロ サ イ ト DHA の 作 用 をmedium） を 神 経 細 胞 に 処 置 し，24 時 間 後 に

WST-1 アッセイにより行った。トランスクリプ

H2O2 を負荷すると，神経細胞の生存率低下は有トーム解析には，Agilent 社製 DNA マイクロア意に抑制された（図 2b）。また，同濃度の DHAレイを用いた。

単独（1.0 nM）を神経細胞に処置した場合でも，3. 結果及び考察神経細胞に対する保護効果が認められたが，この作用は DHA-ACM を処置した場合に比べて明らアストロサイト及びミクログリアの P2かに弱かった。従って，DHA には，神経細胞に受容体発現変化に対する DHA の作用直接作用して細胞を保護する作用以外に，アスト

図 1 は，アストロサイト及びミクログリアそれロサイトを介した強力な二次的神経細胞保護作用

3. 1

ぞれに種々濃度の DHA を加えた際の，P2 受容体 mRNA の変化を示したものである。表 1 上段
で示すように，アストロサイトでは P2Y2 受容体を有していることが明らかとなった。
3. 3

神経細胞死に対する UTP 処理アストロサイトの作用の発現亢進が大きく，１ nM で約７倍に達した。

P2Y2 受容体アゴニストの UTP（100 nM）でまたミクログリアでは，P2Y2 及び P2X7 受容体処置したアストロサイト上清（UTP-ACM），さの発現亢進が顕著で，１ nM DHA により約２倍らに DHA（１ nM）処置アストロサイトにさら（P2Y2）及び 2.5 倍（P2X7）の発現亢進が認めらに UTP（100 nM）を処置した上清（DHA-UTP-れた（表 1 下段）。アストロサイト P2Y2 受容体ACM）には，それぞれさらに強い神経細胞保護

発現亢進の時間変化及びタンパク質レベルでの変作 用 が 認 め ら れ た（ 図 3）。 そ の 効 果 は DHA-化も確認できた（ 図 1a 及び b）。また，uridine

UTP-ACM ＞ UTP-ACM ＞ DHA-ACM ＜ の 順

５ -triphosphate（UTP）は内在性の P2Y2 受容番に強かった。これら総ての効果は，P2 受容体体の選択的リガンドであり，UTP の刺激により

阻 害 薬 の suramin（100 nM） 及 び PPADS（3022

浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）

図１ DHA によるアストロサイトの P2Y2 受容体の発現亢進
ａ．DHA は濃度依存的にアストロサイト P2Y2 受容体 mRNA の発現を亢進させた。
ｂ．Western blotting により，P2Y2 受容体の発現亢進はタンパク質レベルで確認できた。
ｃ．DHA を処置したアストロサイトは UTP（100n）刺激により惹起される［Ca2+］i 変化（F340/F380 比として表示）を有意に増大させた。
表１ DHA（1nM, 1hr）により惹起されるアストロサイト（上段）及びミクログリア（下段）のP2 受容体 mRNA の発現変化
アストロサイト

Folds

P2Y1

P2Y2

P2Y4

P2Y6

P2Y12

P2X1

P2X2

P2X3

P2X4P2X7

1.16.81.31.51.61.11.4

1.6

1.5

1.1

P2Y1

P2Y2

P2Y4

P2Y6

P2Y12

P2X1

P2X2

P2X3

P2X4

P2X7

1.3

2.2

1.0

1.7

1.70.9

1.6

1.7

1.4

2.6

ミクログリアFoldsnM，データ省略）により消失したことから，進させたことが強く示唆される。P2Y2 受容体発

ACM 中の神経保護因子は，P2Y2 受容体を介し現が亢進しても，そのリガンドが通常存在しなけて産生されていることが明らかとなった。既にれば，P2Y2 受容体の活性化が亢進しない。しか我々 7） 及び他の研究グループ 8） が，それぞれ皮し，アストロサイトは ATP（P2Y2 受容体にも膚及び子宮頸部の P2Y2 受容体を用いた研究によ作用）及び UTP を恒常的に放出している。従っり，retinoid 受容体が P2Y2 受容体の発現亢進にて，P2Y2 受容体の発現亢進それ自身が，アスト

関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る。 ま た，

ロサイトの恒常的な P2Y2 受容体活性化シグナル

DHA が RXR 受容体リガンド 1） として機能するを増強する結果になったものと考えられた。

ことを考慮すると，アストロサイトにおいてもDHA は RXR を介して P2Y2 受容体の転写を亢

3. 4

アストロサイト P2Y2 受容体刺激による神経保護作用の分子メカニズム

魚の摂取と脳保護効果の分子基盤

図３23

神経保護効果におけるアストロサイト P2Y2 受容体の役割
UTP（100nM）を処置した ACM（UTP-ACM）及び DHAを処置した ACM にさらに UTP を加えた ACM（DHA-UTPACM）も，強い神経細胞保護効果があった。これらの保護効果は，P2 受容体拮抗薬 suramin（100nM）により消失した。

P2Y2 受容体刺激により惹起されるアストロサイトの遺伝子発現変化を，DNA array を用いて網羅的に解析した。UTP 刺激により，発現が 3 倍以上亢進した遺伝子は 280 あり，クラスタリング

H2O2 により惹起される神経細胞死とアストロサイト DHAの効果
ａ．H2O2（２時間処理）は，濃度依存的に培養海馬神経細胞の生存率を低下させた。生存率は WST-1 アッセイによって定量した。
ｂ．DHA（0.1 または 1.0nM）を処理したアストロサイトの上清（DHA-ACM）は，H2O2 により惹起される神経細胞死を有意に抑制した。また，DHA を神経細胞に直接添加しても，神経細胞死は抑制されたが，その程度は小さかった。

IL-6 等）。このうち，もっとも顕著な発現亢進を以前我々は，アストロサイトが P2Y1 受容体を認めた IL-6 について解析を行った。UTP は濃度

介 し て，thioredoxin reductase（TrxR） 等 の 抗依存的（3-100 nM））にアストロサイトの IL-6 発酸化物質類を産生することにより，H2O2 に対す現亢進を引き起こし，またこれは DHA を前処理る抵抗性を獲得することを報告した 4）。しかし，したアストロサイト（白△）で顕著であった（図今回は，アストロサイトの P2Y2 受容体が責任受4a）。さらに，IL-6 で神経細胞に前処理すると，容体であること，またアストロサイト自身の酸化H2O2 により惹起される神経細胞障害が有意に抑ストレス抵抗性ではなくて，周辺の神経細胞に対制された。また，UTP を処理したアストロサイする抵抗性を獲得することから，TrxR 産生とはトによる神経細胞保護効果は，IL-6 の中和抗体に異なる作用と考えられる。実際，P2Y1 受容体阻より IL-6 を除去すると消失した（図 4b）。以上

害 薬 MRS2179（10 nM） を 処 置 し て も，DHA-より，炎症性サイトカイン IL-6 が，アストロサACM の神経細胞保護効果は抑制されなかった

イトの P2Y2 受容体刺激のアウトプットとして産（DHA-ACM，67.2 ＋ 4.4 vs. DHA-ACM ＋生され，このアストロサイト由来 IL-6 が，酸化MRS2179，62.6 ＋ 8.3％ cell viability）。そこで，ストレスに対する神経細胞障害に対して保護効果

図２

解析により，最も顕著な遺伝子群は炎症性サイト
カインであった（transforming growth factor-a,TNF-a；interleukin-1 b, IL-1 b；interleukin-6；

24

浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）

パ ク 質 合 成 阻 害 薬 の cycloheximide に よ り IL-6の保護効果が消失する 9） ことから，神経細胞において，新たな神経保護因子の発現を亢進する可能性が強く示唆される。Biber ら 11） は IL-6 が神経細胞の抑制性受容体，adenosine A1 受容体の発現を亢進させることを報告している。脳虚血等の酸化ストレス急性期には，神経細胞の興奮性が増し，所謂，興奮毒性により神経細胞が障害されることがよく知られている。本研究においても，
IL-6 により adenosine A1 受容体の発現が亢進しているとすると，神経細胞の興奮性を抑え，それにより興奮毒性を軽減する可能性が強く示唆されるが，IL-6 による誘導される具体的な保護分子の同定は今後の課題である。
4.

まとめ

本実験では，DHA が核内受容体リガンドとしてアストロサイトに作用して，神経細胞に対する保護効果を呈することが明らかとなった。この作
P2Y2 受容体刺激による IL-6 産生及びアストロサイト IL-6による神経保護作用
ａ．UTP 刺激により惹起されるアストロサイト IL-6 mRNA 発
現亢進の濃度依存性。UTP は濃度依存的に IL-6 mRNA の発現を亢進させ，これは DHA 前処置したアストロサイトではさらに顕著であった（△）
。
ｂ．IL-6 による神経保護効果。神経細胞に IL-6 を前処置（24 時間）すると，H2O2 により惹起される神経細胞死は有意に抑制された。また，UTP-ACM による神経保護作用は，IL-6の中和抗体により消失した。

図４用にはアストロサイトのグリア伝達物質 ATP の受容体，P2Y2 受容体の発現亢進が関与し，P2Y2受容体を介する IL-6 の産生が，神経細胞の保護効果と関係していることが明らかとなった。

謝

辞を呈する，実行分子であることが明らかとなった。

本研究を遂行するにあたり，研究助成を賜りまIL-6 は代表的な炎症性サイトカインであり，神経した（財）浦上食品・食文化振興財団及び関係各位細胞を障害することが知られている。しかし一方に心より感謝申し上げます。貴財団の，今後益々で，アストロサイトで産生された IL-6 が神経細のご発展をお祈りいたします。

胞に対して保護的に働くことが，我々 9） 及び他の研究グループ 10） に寄っても既に明らかとされ文ている。病態時の IL-6 は，その濃度及び神経暴

１） de Urquiza, A.M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand

露のタイミングによって，神経細胞に保護的に働

for the retinoid X receptor in mouse brain. Science 290,

くものと考えられる。IL-6 による神経細胞保護の分子メカニズムは不明であるが，IL-6 を 12 時間以上作用させないと効果が得られないこと，タン献

2140-2144（2000）.
２） Haydon, P.G. GLIA: listening and talking to thesynapse. Nat Rev Neurosci 2, 185-193（2001）.
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４） Shinozaki, Y., et al. Cytoprotection against oxidative
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via P2Y1 receptors. Glia 49, 288-300（2005）.
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25

receptor mRNA in human uterine cervical cells. Am J
Physiol 275, C758-765（1998）.
９） Fujishita, K., et al. Grape Seed Extract Acting on
Astrocytes Reveals Neuronal Protection Against
Oxidative Stress via Interleukin-6-mediated Mechanisms.
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Glia 57, 244-257（2009）.
11） Biber, K., Lubrich, B., Fiebich, B.L., Boddeke, H.W. &７） Fujishita, K., Koizumi, S. & Inoue, K. Upregulation ofvan Calker, D. Interleukin-6 enhances expression of

P2Y2 receptors by retinoids in normal human epidermal

adenosine A（1） receptor mRNA and signaling in

keratinocytes. Purinergic Signal 2, 491-498（2006）.

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Neuropsychopharmacology 24, 86-96（2001）.

26

URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.17（2009）

Molecular mechanisms by which docosahexaenoic acid（DHA）-induced neuronalprotection via glial cells
Schuichi Koizumi（Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Yamanashi）

Back ground and aim：Docosahexaenoic acid（DHA）is rich in the CNS, and has beenreported to regulate synaptic transmissions, thereby leading to control synaptic plasticity orprotection of brain damages. Recent accumulating evidence shows that glial cells, both
astrocytes and microglia, have important roles for regulation of synaptic transmissions.
Especially astrocytes dynamically control synaptic transmissions and are involved ininhibition of excess excitation of neurons. Thus, when we assess the effect of various
chemicals or ingredients in foods such as DHA on brain functions or damages, we should
investigate effects of these chemicals on the function of astrocytes, but so far, there are little
report about these.
Results and discussion：ATP and their speciﬁc receptors P2 receptors have central
roles for regulation of glial functions as well as neuronal ones via neuron-glia interactions.
When astrocytes and microglia were stimulated with DHA, the most remarkable change
was the upregulation of P2Y2 receptors in astrocytes. DHA-conditioned astrocytes（DHAACM）protected neuronal cell death against H2O2, which was dependent upon activation of
P2Y2 receptors. DHA acting directly on neurons, could protect neuronal cell death, but theeffect of DHA-ACM was more efﬁcient. Transcriptome analysis showed that activation of
P2Y2 receptors in astrocytes resulted in upregulation of pro inﬂammatory cytokines, among
which IL-6 was remarkable. Protection of H2O2‒evoked neuronal cell death by DHA-ACM
was dependent on IL-6. These results suggest that DHA protect neuronal cell death byregulating astrocytic functions.
Conclusion： DHA could protect brain damages via regulation of astrocytic functions.