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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）＜平成 27 年度助成＞

大腸菌の細胞外小胞によって起因する炎症と乳酸菌の抗炎症作用機序の解明
岡真優子（京都府立大学大学院生命環境科学研究科応用生命科学専攻食環境安全生学）

背もたらすことが知られるようになってきたが、大景腸菌由来 OMV が腸管マクロファージに作用して腸管は、食物を消化・吸収する器官であると同時に、病原性細菌の最大の侵入門戸でもあり、免炎症を引き起こすかについての知見はほとんどない。

疫機関としての重要性が注目されている。腸管上

近年、乳酸菌のプロバイオティクス作用が注目

皮パイエル板に存在する M 細胞は、腸管内腔のされている。そこで腸管内に存在する細菌の大異物を生体内に取り込み貪食細胞のマクロファー腸菌と乳酸菌に着目し、大腸菌の OMV がマクロジなどによる消化を促す。しかし、病原性細菌やファージを介して引き起こす炎症反応の機序解明

毒素によるマクロファージの過剰な活性化は、局と、その炎症反応に対する乳酸菌の役割の解明を

所の急性炎症、また全身性の慢性炎症を引き起目指した。

こして生活習慣病の要因となると考えられている。したがって、細菌に対する腸管マクロファージの過剰な炎症反応を抑制することは健康維持に方法

1.

菌の培養重要と考える。細菌は毒素やエフェクター因子をE. coli K12 株は、Lysogeny Broth（LB）培地で分泌して宿主に炎症反応を引き起こすが、近年、

24 時間培養後、1×10 7 cfu の菌をDulbecco’s Modified

グラム陰 性 細 菌 の 分 泌 す る 細 胞 外 小 胞 の outer

Eagle’s Medium（D-MEM）培地で 24 時間、37 ℃、membrane vesicle（OMV）に よ る 炎 症 反 応 が 知

5 % CO 2 存在下培養後の培養液（Ec-CM）を回収られるようになった 1 ）。菌の外膜表面から放出し た。 乳 酸 菌 Enterococcus faecalis は、de Man-される直径 20 から 250 nm の OMV の存在は、40Rogosa - Sharpe（MRS）培地で 24 時間培養後、5×年以上前から確認されていたが、その役割につ10 5 cfu/mL で 24 時間、37 ℃で静置培養した培養いて不明であった。近年、大腸菌 Escherichia coli液（Ef-CM）を回収した。の OMV が、バクテリオファージの感染や抗菌ペ2.

2）OMV の調製や、ま菌の培養液は、10,000 × g で 30 分遠心後、0.22た 緑 膿 菌 が クオラムセンシング 機 構 に よ っ てm のフィルターでろ過した。フィルターろ過後のOMV 分泌を調節していること 3 ）などが報告さ

Ec-CM および Ef-CM を細胞に作用させた。次に、れ た。 一 方、 グラム陽 性 菌 の 黄 色 ブドウ球 菌

それぞれを 100,000×g で 3 時間超遠心後、上清Staphylococcus aureus もまた細胞外小胞を分泌しを sup またはペレットを OMV とした。ており、α毒素を含む OMV がアトピー性皮膚炎

3.

プチドに対する防御の役割を持つこと

細胞培養を悪化因子の 1 つとなっている 4 ）。このように、マウスマクロファージ RAW264.7 細胞は、D-MEM

種々の細菌が細胞外小胞を介して宿主に病原性を培 地（10 % fetal bovine albumin（FBS）含 有 ）で大腸菌の細胞外小胞によって起因する炎症と乳酸菌の抗炎症作用機序の解明

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継 体 し、 刺 激 に は FBS 不 含 の D-MEM 培 地 をした（Fig. 1B）。よって、E. coli 感染によって引用 い た。 野 生 型（WT）、MyD88 欠 損、toll-like

き起こされる炎症には、生菌による直接的な反receptor（TLR）2 欠損、TLR4 欠損、または TLR9応と分泌因子による間接的な反応の両方が関与

欠 損 の 各 マ ウ ス の 大 腿 骨 よ り bone marrow をしていると考えられた。これまでに、これらの採 取 し、20 % L929 培 養 液 を 含 む D-MEM 培 地

炎症性因子の発現に対する E. coli の直接的作用（10% FBS）で 7 日間培養して bone marrow derivedに は、TLR-MyD88 を 介 し た mitogen-activatedmacrophage（BMDM）に 分 化 さ せ た。 細 胞 へ のprotein（MAP）キナーゼ経路で誘導されることが大腸菌感染または Ec-CM および Ec-OMV 添加は知られている 5 ）が、間接的な作用に対するこれらmultiplicity of infection（MOI）が 1（マクロファーの関与については不明である。そこで、Ec-CM

ジ cells：細菌 cfu = 1 : 1）、Ef-CM および Ef-OMVによるこれら炎症因子の誘導への TLR-MyD88 のは MOI = 10（1 : 10）となるように添加した。

関与を WT および TLR 欠損マウスの骨髄由来マ

4.

Western blot 法

クロファージ（BMDM）を用いて検討した。WT-RIPA buffer を 用 い て 全 細 胞 液 を 調 製 し た。

BMDM で は、Ec-CM に よ り iNOS お よ び COX

SDS-PAGE 法 で 電 気 泳 動 し PVDF 膜 に 転 写 後、の 発 現 が 増 大 し た が（Fig. 1C）、一 方 TLR4 欠 損

2% skim milk で 30 分間ブロッキングし、抗 inducible

BMDM で は 2 つ の 炎 症 性 因 子 は 全 く 発 現 し な

nitric oxide synthase（iNOS）抗 体（1 : 2000）、抗か っ た。 ま た、TLR2 お よ び TLR9 欠 損 BMDM

cyclooxygenase-2（COX-2）抗 体（1 : 5000）、ま た

で の iNOS 発 現 は、WT で の 発 現 に 比 べ て 低 下は 抗β-actin 抗 体（1 : 5000）と 4 ℃ で 一 晩 反 応した。次に、TLR4 の下流に存在する MyD88 とさ せ た。 二 次 抗 体 は、 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ、MAP キナーゼのリン酸化シグナル経路について

Immobilon ECL kit（ Millipore 社 製 ）を 用 い て

検 討 し た。WT-BMDM で は、Ec-CM 添 加 20 分

Image Quant LAS4000（GE healthcare 社製）で後 に JNK お よ び ERK の リン 酸 化 体 が 増 加 し たバンドを検出した。

（Fig. 1D）のに対して、MyD88-BMDM ではこれ5.

quantitative real-time PCR 法

らリン酸化体の発現は増大しなかった。以上の結RNA は、Isogen（Nippon Geen 社製）を用いて果より、Ec-CM は、TLR4-MyD88 を介して JNK抽出した。ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix

および ERK のリン酸化経路を活性化し iNOS およ（Toyobo 社 製 ）お よ び FastStart Essential DNAび COX-2 を誘導し、また iNOS の発現には TLR2Green Master（Roche 社製）を用いて RT-PCR 反応と TLR9 を介したシグナル経路の部分的な関与がを行った。

示唆された。

結果および考察

大腸菌感染時の炎症反応における 1 つの要因と な る Ec-CM 中 の 炎 症 因 子 を 明 ら か に す る た

大腸菌 K12 株感染後の RAW264.7 マクロファー

め、Ec-CM を超遠心法により Ec-sup（上清）と Ec-ジ に 発 現 す る iNOS お よ び COX-2 の 2 つ の 炎 症

OMV（沈渣）の 2 つの画分に分離した。Ec-OMV性 因 子 の 発 現 は、 感 染 12 時 間 後 よ り 増 大 し 24の形体を Nono Sight で調べた結果、Ec-OMV の時間後まで維持され、感染後経時的に増大した

直径は平均 119 ± 3.1 nm の粒子であり、これま（Fig. 1A）。次に、E. coli の培養液（Ec-CM）をマ6）でに報告されている細胞外小胞の定義 と一致しクロファージに添加したところ、生菌を感染させていた（Fig. 2A）。この Ec-OMV による 2 つの炎た場合と同様にこれら炎症性因子の発現が増大

症性因子のタンパク質発現は、Ec-sup による作用

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Endotoxins. Infect.
Immun. 73, 2940–2950
浦上財団研究報告書
Vol.24（2017）

Fig. 1 Induction of inflammatory factors by E. coli(A) After infected with E. coli (MOI=1) in RAW264.7 cells, the protein expressions ofinducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) were increased
in a time dependent manner. (B) The protein expressions of iNOS and COX-2 wereincreased by E. coli-derived culture media (Ec-CM) in RAW264.7 cells. (C) The proteinexpressions of iNOS and COX-2 were increased by E. coli-derived culture media(Ec-CM) in bone marrow derived macrophages (BMDMs) from wild-type (WT), Tolllike receptor 2 (TLR2) deficient, and TLR9 deficient mice, but not in BMDMs fromTLR4 deficient mice. The expression of β-actin was presented as a loading control.
(D) Ec-CM was treated in BMDMs from WT or MyD88 deficient mice (MyD88 KO).
The phosphorylation of JNK and ERK were increased by Ec-CM in WT at 20 minute,completed with MyD88 KO.

よりも強く（Fig. 2B）、さらに iNOS および COX-よび非依存的な 2 つの経路で誘導されることが2 mRNA の 発 現 レ ベ ル も、Ec-sup に 比 べ て Ec-

報 告 さ れ て い る 9 ）。 一 方、TNF-αは、TLR4 とOMV の方が高かった（Fig. 2C）。以上の結果から、TLR2 を介した MyD88 依存的経路で誘導される。

Ec-CM による炎症性因子の誘導は、Ec-OMV がFig. 1C で Ec-CM は、一部 TLR2 を介した経路に主な要因だと考えられた。

より iNOS 発現を増大することが示唆されたこ

こ れ ま で に、Ec-OMV 中 に は 毒 素 を 含 む 多 くとから、TLR4-MyD88 を介した炎症反応は、Ec-のタンパク質の存在が報告されている 7 ）。そこ

OMV のタンパク質によって活性化されるのに対で、Ec-OMV による炎症性因子の発現増加に対し、TLR2-MyD88 を介した反応には Ec-OMV のする OMV 中のタンパク質の関与を明らかにする

タンパク質以外の因子が関与する可能性が示唆さた め に、Ec-OMV を 室 温 で 30 分 間 Proteinase Kれた。また、IFN-βがオートクライン作用によっ（PK）で処理して Ec-OMV のタンパク質を分解して MyD88 依存的に iNOS を誘導することが報告た。PK 処 理 は、Ec-OMV に よ る IFN-β mRNAされている 9 ）ため、OMV による iNOS 誘導 は 2 つに 対 す る 誘 導 を 減 弱 さ せ た が、iNOS、COX-2、の異なる経路によるのではないかと推察された。

TNF-αの mRNA は PK 処理により変化しなかっ

Ec-OMV は、E. coli 感 染 時 に 引 き 起 こ さ れ る

た。IFN-βは TLR4-MyD88 非依存的に誘導され間接的な炎症反応の要因であり、この炎症反応にるが 8 ）、iNOS は TLR4 を介した MyD88 依存的お対する乳酸菌 E. faecalis の作用について検討した。

大腸菌の細胞外小胞によって起因する炎症と乳酸菌の抗炎症作用機序の解明

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Fig. 2 Induction of inflammatory factors by outer membrane vesicles from E. coli(A) After ultracentrifuge (100,000 x g, 3 h), Ec-CM was separated pellet (outermembrane vesicles; OMV) and supernatant (sup). Ec-OMV were assessed the size
homogeneity using NanoSight (Quantum Design Japan). (B) The protein expressions ofinducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) were increasedby each of fraction. The expression of β-actin was presented as a loading control.
(C) The ratios of iNOS/β-actin and COX-2/β-actin expression were presented as
the mean ± SD (n = 3). Significant differences were determined by ANOVA and theMann-Whitney U-test. (D) The mRNA expressions of iNOS, COX-2, tumor necrosis
factor-α (TNF-α), interferon-β (IFN-β) were increased by Ec-OMV, which were pretreated with or without proteinase K (PK ). The ratios of mRNA/18S rRNA expression
were presented as the mean ± SD (n = 3). Significant differences were determined by
ANOVA and the Mann-Whitney U-test. *P<0.05 were compered with (-)

細菌同士の直接作用を考慮するために、両細菌のEc-OMV による炎症性因子の増加は、Ef-OMV に相互作用は培養液を用いて評価した。Ec-CM はより抑制された（Fig. 3B）。以上の結果より、Ec-時間依存的に 2 つの炎症性因子の発現を増大させ

OMV は炎症反応を惹起し、一方 Ef-OMV は抗炎たが、Ef-CM 存在下ではすべての時間において症作用を持つことが示唆された。腸内細菌としてこれら発現は抑制されていた（Fig. 3A）。さらに知られている大腸菌と乳酸菌は、炎症と抗炎症の50

浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）

Fig. 3 Suppression of inflammatory factors by outer membrane vesicles from E. faecalis( A ) The protein expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) andcyclooxygenase-2 (COX-2), which were increased by E. coli-derived culture media(Ec-CM), were downregulated in the presence of E. faecalis-derived CM (Ef-CM). (B)After ultracentrifuge (100,000 x g, 3 h), Ec-CM and Ef-CM were separated pellet (outermembrane vesicles; OMV) and supernatant (sup). The protein expressions iNOS andCOX-2, which were increased by each of fraction, were attenuated by Ef-OMV. Theexpression of β-actin was presented as a loading control.

互いに拮抗した作用を示すため、前者が悪玉菌、後者が善玉菌と一般に呼ばれている。本研究では、両細菌の分泌する細胞外小胞のマクロファージに対する影響を解析し、これらが互いに拮抗する作用を持つことを明らかにした。
謝辞
本研究は、同志社大学大学院生命医科学研究科医生命システム専攻博士前期課程の矢倉大介さんと京都府立大学大学院生命環境科学研究科応用生命科学専攻博士前期課程の木村 唯さんと行った。
また、本研究は（公財）浦上食品・食文化振興財団の助成を受けて実施した。
文

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大腸菌の細胞外小胞によって起因する炎症と乳酸菌の抗炎症作用機序の解明
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Toll-Like Receptor 4-MyD88-Dependent and -Independent
Signaling Pathways by Endotoxins Differential Inductionof the Toll-Like Receptor 4 – MyD88-Dependent and-Independent Signaling Pathways by Endotoxins. Infect.
Immun. 73, 2940 –2950

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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）

Enterococcus faecalis play a role of anti-inflammatory inthe inflammatory pathway by Escherichia coli-derived
outer membrane vesicles
Mayuko Osada-Oka
Food Hygiene and Environmental Health, Division of Applied Life Science
Graduate School of Life and Environmental Sciences
Kyoto Prefecture University
Many Gram-negative bacteria release outer membrane vesicles (OMVs) in theexternal milleu. Although OMVs contain multiple virulence factors and deliver them tothe host, it is unclear about the interaction with each of OMVs derived from Escherichia
coli and lactic acid bacteria. Here, we examined about the role of OMVs from E. coli andEnterococcus faecalis for inflammatory pathway in mouse macrophages. The OMV derivedfrom E. coli (Ec-OMV) up-regulated the protein and mRNA levels of inducible nitric oxide
synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in RAW264.7 cells. Moreover, Ec-OMV
treated with proteinase K also increased the mRNA levels of inflammatory molecules,
resulting in the role of inflammatory mediator excluding proteins. JNK (p54/p46) andERK (p44/p42), such as the mitogen-activated protein, were phosphorylated by Ec-OMV
in bone marrow derived macrophages (BMDM) from wild-type mice. In contrast, thephosphorylation was not increased in BMDM from toll-like receptor 4 knockout (TLR4KO) mice or MyD88 KO mice, suggesting that Ec-OMV increase the mRNA levels ofinflammatory factors via TLR4-MyD88. In addition, the increases in inflammatory factor
mRNA levels by Ec-OMV partially decreased in BMDM from TLR2 or TLR9 KO. The
increase in the mRNA levels of inflammatory factors by Ec-OMV attenuated by OMVderived from E. faecalis. In conclusion, E. coli-derived OMV have a role of inflammatorymediator, and in contrast, E. faecalis-derived OMV have a role of anti-inflammatory factor,
suggesting that bacterial balance is important in intestinal environment.