30. 迅速簡便な残留農薬一斉分析法の開発○吉光 真人 （地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所）【研究目的】
残留基準を超過する作物の流通を防止するため、当所では青果物の残留農薬検査を実施している。検査対象とする農薬数は約 200、作物数は 70 以上であり、これらの多種多様な組み合わせに対応するため、一斉分析法を導入している。しかし、現行法は精製操作での溶媒使用量が多く、その減圧濃縮に時間と専用器具を要する。そこで本研究では、これらの手順を簡略化し、迅速簡便な残留農薬分析法を確立することを目指す。
【研究の必要性】
農作業の効率化、また農作物の収量の維持、向上のため、農薬の適正使用は必要である。
一方、収穫後の作物には使用した農薬が残留することがあり、これを残留農薬という。ヒトに対する健康被害を防止する目的で、残留農薬は作物ごとに残留基準が定められている。
基準を超過した作物の流通を防止するため、地方衛生研究所等では検査を実施し、残留農薬の実態を監視している。現在、日本で登録されている農薬の有効成分数は約 600 で、作物数は 70 以上である。このような多種多様な農薬、作物の組み合わせに対応するため、各検査機関では、より効率的な一斉分析法が求められている。
当所においても一斉分析法を採用しているが、作物から農薬を抽出した溶液を固相カートリッジカラムで精製する際、多量の溶媒を使用するため、環境への負荷が大きい。また、その後の溶媒の減圧濃縮操作で長時間を要し、かつ専用のガラス器具を使用することから、検査効率化の点で問題となっている。そこで、本研究では、カラム精製において、食品成分のみを保持し、農薬を保持しないカラムを用い、使用溶媒量を削減する。また、同時に多検体処理が可能な遠心エバポレータによる減圧濃縮を用いた、迅速簡便な分析法の確立を目指す。
【研究計画】
1. 試料
農薬が残留していないことを確認したオレンジ、ほうれんそう、玄米、キャベツ、ネギ、パイナップルの 6 試料を用いた。
2. 試薬
農薬標準品は、残留農薬分析用標準品もしくはその同等品合計 221 項目を用いた。これ
らをアセトンに溶解し、2.5 µg/mL 農薬混合標準溶液として用いた。溶媒等の試薬は残留農薬分析用、もしくはその同等品を用いた。固相カートリッジカラムは Oasis PRiME HLB
Cartridge 6 cc/200 mg（HLB）、および Sep-Pak PSA Plus Light 130 mg/0.3 mL（PSA）（以上 Waters 社製）を用いた。GC-MS/MS 分析時の内部標準としてトリフェニルリン酸（TPP）（一級）（富士フイルム和光純薬（株）製）を、アナライトプロテクタントとして SFA10Mix（10 種類混合）各 200 µg/mL（SFA）（林純薬工業（株）製）を用いた。TPP 溶液は、TPP をアセトンに溶解し、アセトン：ヘキサン混合溶液（1：1）（A/H）を用いて 200 µg/mL の濃度となるように調製した。
3. 分析装置、分析カラム
LC-MS/MS は ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S、分析カラムは ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 µm,2.1 mm X 100 mm（以上 Waters 社製）を用いた。GC-MS/MS は 7890A/7000B、分析カラムはDB-5ms UI, 30 m, 0.25 mm, 0.25 µm（以上 Agilent 社製）を用いた。
4. 試験溶液、検量線の調製
抽出溶液の調製：玄米以外の試料の抽出溶液の調製は既報 1)に従った。玄米は、試料量 5 gに精製水 5 mL を添加した。以降の操作は既報 1)に従った。
試験溶液の調製： HLB に抽出溶液 4 mL を負荷し、溶出液を廃棄した後、HLB にアセトニトリル 1 mL を負荷し、溶出液を回収した。PSA に回収した溶出液を全て負荷し、その溶出液を回収した。さらにアセトニトリル 1 mL を負荷し、溶出液を合わせてアセトニトリルで 2 mLに定容した。
GC-MS/MS 測定用試験溶液の調製：試験溶液 1 mL を遠心エバポレータで乾固後、0.5 mL のA/H に再溶解した。ガラスインサートバイアルに再溶解した試験溶液 0.2 mL、TPP 溶液 0.1mL、SFA 0.1 mL を添加、混合したものを測定用試験溶液とした。
LC-MS/MS 測定用試験溶液の調製：50%（v/v）アセトニトリル水溶液、かつ試料の希釈率が200 倍となるように、バイアルに試験溶液、精製水、およびアセトニトリルを添加、混合したものを測定用試験溶液とした。
検量線の調製：GC-MS/MS 用には A/H、LC-MS/MS 用にはアセトニトリルを用い、農薬混合標準溶液を希釈して検量線用標準溶液を調製した。GC-MS/MS 用検量線は、試料の測定用試験溶液と同一の濃度となるように、検量線用標準溶液に TPP 溶液および SFA を添加し、調製した。LC-MS/MS 用検量線は、50%（v/v）アセトニトリル水溶液となるように、バイアルに検量線用標準溶液、精製水、およびアセトニトリルを添加、混合して調製した。
5. 添加回収試験
6 試料について、50 ppb の濃度となるように農薬混合標準溶液を添加し、5 併行の添加回収試験を実施した。
【実施内容・結果】
農薬混合標準溶液に含まれる農薬のうち、用いた機器で測定可能であった、GC-MS/MS 107項目（表 1）、LC-MS/MS 108 項目（表 2）を測定対象とした。共通の 2 項目は下線を付した。

表1. GC-MS/MS 分析対象農薬
BHC (γ)EPN
イサゾホス
イプロベンホスエタルフルラリン
エチオン
エディフェンホス
エトフェンプロックス
エトプロホス
エトリムホス
オキサジアゾン
カルフェントラゾンエチル
キナルホス
キノキシフェン
キノクラミン
キントゼン
クロメプロップ
クロルタールジメチル
クロルピリホスクロルピリホスメチル
クロルフェンソン
クロルベンシド
クロロベンジレート
シアノホス
ジクロトホス
ジクロフェンチオン
ジクロホップメチル
ジクロラン
ジチオピル
シハロホップブチル

シフルフェナミド
シプロジニル
シマジン
ジメチルビンホス
シメトリン
ジメピペレート
シラフルオフェン
スルプロホスターバシル
ダイアジノン
チオメトン
チフルザミドテトラクロルビンホス
テトラジホンテフルトリン
テルブトリン
トリアゾホス
トリアレートトリブホス
トリフルラリン
トルクロホスメチル
トルフェンピラド
ナフチルアセタミド
ニトロタールイソプロピル
パラチオン
パラチオンメチル
ビフェントリン
ピペロニルブトキシド
ピペロホス
ピラゾホス

ピラフルフェンエチル
ピリダフェンチオン
ピリダベン
ピリフェノックス
ピリブチカルブ
ピリミジフェン
ピリミノバックメチル
ピリミホスメチル
ビンクロゾリン
フェナリモルフェニトロチオン
フェノキサニル
フェンクロルホス
フェントエート
フェンプロパトリン
フサライド
ブタクロール
ブタミホス
フリラゾール
フルアクリピリム
フルジオキソニル
フルトラニル
フルミオキサジン
プロシミドン
プロチオホス
プロパクロール
プロパジン
プロパニル
プロパホス
プロピコナゾール

プロフェノホスブロマシル
プロメトリン
ブロモホス
ヘプタクロル
ヘプタクロルEA
ヘプタクロルEB
ペルメトリン
ベンフルラリン
ベンフレセート
ホレート
マラチオン
メチダチオン
メトキシクロール
メトミノストロビン
メフェンピルジエチル
メプロニル

トリフルムロン
トリフロキシストロビン
ナプロアニリド
ナプロパミドパクロブトラゾール
ピラクロストロビン
ピラクロホス
ピリダリル
ピリプロキシフェン
ピリミカーブフェナミホス
フェノキシカルブ
フェノチオカルブ
フェノブカルブ
フェンアミドンフェンスルホチオン
フェンブコナゾール
フェンプロピモルフ
ブピリメートブプロフェジン
フラムプロップメチル
フラメトピルフルシラゾール
フルトリアホール
フルフェノクスロン
フルリドン
プレチラクロール
プロピザミドプロポキスル
ヘキサコナゾール

ヘキサジノン
ヘキシチアゾクス
ベナラキシル
ベノキサコール
ペンコナゾール
ペンシクロン
ベンゾフェナップ
ベンチアバリカルブイソプロピル
ボスカリド
ホスチアゼート
ホスファミドンミクロブタニル
メタベンズチアズロン
メトルカルブ
メビンホス
メフェナセット
モノクロトホスモノリニュロン

表2. LC-MS/MS 分析対象農薬
XMCアザコナゾール
アセタミプリド
アセトクロール
アゾキシストロビン
アトラジン
アニロホス
アミノカルブ
アメトリン
イソウロン
イソキサチオン
イソプロカルブ
イソプロチオラン
イプロバリカルブ
イマザメタベンズメチルエステル
イミダクロプリド
エスプロカルブ
エトキサゾール
エトフメセート
エトベンザニド
エポキシコナゾール
オキサジキシル
オキサジクロメホン
カズサホス
カルプロパミド
クミルロン
クリミジン
クロキンセットメキシル
クロチオホスクロマゾン

クロルフェンビンホス
クロルフルアズロン
シアナジン
ジウロン
ジエトフェンカルブ
ジクロブトラゾール
ジニコナゾール
ジフェナミドジフェノコナゾール
シフルフェナミド
ジフルベンズロン
シメコナゾール
ジメタメトリン
ジメトエートジメトモルフスルホテップダイアレート
ダイムロン
チアクロプリド
チアゾピル
チオベンカルブ
テトラコナゾール
テブコナゾール
テブフェンピラド
テフルベンズロン
トリアジメノール
トリアジメホン
トリアレートトリシクラゾール
トリチコナゾール

1.固相カートリッジカラムの探索抽出溶液に含まれる農薬を保持することなく、食品に含まれる夾雑成分のみを保持するカラムを探索した。農薬混合標準溶液を添加したアセトニトリル溶液を抽出溶液として想定し、様々な種類および充填量の固相カートリッジカラムに 1 mL ずつ合計 4 mL負荷し、溶出液に含まれる農薬濃度を 1 mL ずつ確認した。さらに、同じカラムにアセトニトリルを 1 mLずつ合計 2 mL 負荷し、同様に溶出液を確認した。その結果、負荷液と溶出液に含まれる農薬濃度が同じであった、すなわち農薬を保持しなかったカラムは、HLB と一部のポリマー系イオン交換カラムのみであった。また、農薬は、農薬を含むアセトニトリル溶液の負荷 1 mL では溶出せず、2 mL から4 mL、およびその後のアセトニトリル 1 mL まで溶出した（図 1）。HLB 以外のカラムでは、一部農薬でカラムへの保持が確認されたことから、HLB を採用した。
2.分析法の最適化
残留農薬分析において、オレンジは食品マトリックスの影響が大きく、分析が困難な食品に分類される。そこで、まずオレンジで分析法を確立し、他の作物へ適用した。HLB 精製への食品マトリックスの影響を確認するため、農薬の残留が認められなかったオレンジから調製した抽出溶液（オレンジのブランク抽出溶液）に農薬混合標準溶液を添加し、HLB を用いて精製した。その結果、農薬を添加したアセトニトリル溶液負荷時と同様に、農薬はカラムに保持されず、溶出するフラクションにも影響は見られなかった。
また、GC-MS/MS 測定用試験溶液を調製する際、A/H 再溶解
時に沈殿が生じた。この原因として、HLB 精製で残存した高極性物質が析出したと考えられた。そこで、PSA を用いて精製したところ、沈殿は生成せず、一方で、精製操作による農薬の回収率低下は観察されなかった。PSA での精製度を確認するため、オレンジのブランク抽出溶液、HLB 精製液、HLB
精 製 後 に PSA を 追 加 精 製（HLB/PSA 精製）した溶液を GC/MS で SCAN 分析した。TIC クロマトグラムを比較したところ、他の 2 溶液と比較して、HLB/PSA 精製液は十分に精製されていることがわかった（図 2）。
この結果から、HLB/PSA 精製を採用した。
最後に、本分析法に用いる HLB 精製のフラクションを選定した。ブランク抽出溶液に農薬混合標準溶液を添加し、HLB 精製を実施した。農薬を含む溶出フラクション 4 mL（図 1参照。2 mL から 5 mL の溶出フラクションとなる。
）について、溶出 1 mL ずつ、合計 4 フラクションに分けて採取し、それぞれに PSA 精製を実施して GC-MS/MS、LC-MS/MS で分析した。
その結果、添加濃度に対する割合が 70%-120%の範囲（ガイドライン 2)に示される真度（%）の範囲（ガイドラインの範囲））に含まれる項目数は、両機器とも最後の溶出フラクションが最多であった。そこで、本分析法にはこのフラクションを採用した。
3. 添加回収試験
オレンジにより最適化した分析法を用いて添加回収試験を実施し、結果を表 3 に示した。
【考察と今後の課題】
添加回収試験結果において、検討した 6 作物で、測定項目数に対する、平均回収率がガイドラインの範囲に収まった（合格）項目数の割合は、91-100%であった。特に、オレンジ
お よ び ネ ギ の表3. 添加回収試験結果

GC-MS/MS 測定項目を測定項目数に対する作物名
オレンジ

合格項目の平均回収率(%)
GCLC1)

合格項目 数の割合(%)
GC2)
LC3)
92
100

除いた場合、全ての作物でその割合が101

95

ほうれんそう

99988988

玄米

1001008986

キャベツ

99

998486

ネギ

91

1009996

パイナップル

100

100

82871)

98-100%となり、ほとんどの分析対象項目が合格した。また、合格した項目について平均回収率を算出
し た と こ ろ 、
82%-101%であった 。

: 平均回収率が70%–120%の範囲に収まった項目
以上から、本分析法
2): GC-MS/MS、3): LC-MS/MS

は、今回検討した 6

作物に対する残留農薬分析法として適用できる可能性が示された。
また、今回、当所での検査法から、精製に用いる固相カートリッジカラムを変更し、精製以降の工程を最適化した。その結果、本分析法に用いる抽出溶液調製後の必要溶媒量は、当所での検査法と比較して、一検体あたり 60 mL から 10 mL に減少した。加えて、操作時間は 3 時間から 1.5 時間に短縮され、目的を達成できた。
今後、残留農薬の一律基準である 10 ng/g での添加回収試験を実施する予定である。分析対象物質の濃度が低くなれば、相対的に食品マトリックス等の影響が大きくなることが予想される。また、実施日を変えて添加回収試験を実施し、分析法の室内精度を算出する。
これらの情報を収集することで、本分析法について、より正確に性能を把握することができ、検査法への導入につながると考えられる。
【参考文献】1): 高取ら、食品衛生学雑誌、54(3)、237–249(2013)2): 食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドラインの一部改正について（平成 22 年 12 月 24 日食安発 1224 第 1 号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知）【経費使途明細】
使途

固相カートリッジカラム（Sep–Pak PSA Plus Light 130 mg/0.3 mL

金額

338,800 円

4 箱、他カラム 9 箱）
溶媒（アセトニトリル）

6,600 円

振込手数料2,090 円合計

大同生命厚生事業団助成金

347,490 円
300,000 円