コリアンダー摂取による炎症性腸疾患抑制作用の腸内細菌叢メタゲノム解析およびその活性成分の解明

45＜平成 29 年度助成＞

コリアンダー摂取による炎症性腸疾患抑制作用の腸内細菌叢メタゲノム解析およびその活性成分の解明
賈慧娟（東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命化学専攻）

緒言イトカインのバランスおよび腸管のバリア機能に寄与するため、本研究では、メタゲノミクスを中心と炎症性腸疾患（IBD）は腸管に難治性慢性の炎症したオミクス解析を行い、COR の抑制効果は腸内細を引き起こす疾患であり、難病指定されて国内にお菌叢バランス失調の緩和に起因するかどうかを調ける患者数は増加の一途を辿っているが、有効な治べ、その作用機構の詳細な探索を行うことを目的と療は未だになく対症療法に留まっている。IBD の正した。さらに、ヒト結腸癌由来 Caco-2 細胞を用い、確な病因は完全に解明されていないが、最近ではリポ多糖（LPS）による炎症誘導条件下に炎症性サIBD が食物抗原に対する調節不全による粘膜免疫応

イトカインの発現を抑制する COR 各成分を特定し、答であることを示唆する証拠が増えている。この応COR の添加による IBD の進行抑制の有効成分を明ら

答は、病原体やウイルスおよび腸内細菌叢不均衡かにすることを目指した。

（dysbiosis）などの様々な環境因子による影響を受ける。
私たちは先行研究によりコリアンダー（Coriandrumsativum , COR）摂取がデキストラン硫酸ナトリウム研究方法
1．遺伝子、タンパク質のオミクス解析（DSS）誘発性大腸炎の抑制効果を有することを明らか

解剖時に採取した大腸粘膜の DNA マイクロアレにした。DSS 誘発大腸炎のマウスモデル実験においイ解析（Affymetrix システム）、プロテオーム解析て、通常飼料および滅菌水道水を与える群（CON 群）、（ 超 高 感 度 な タ ン パ ク 質 同 定 定 量 シ ス テ ム iTRAQ

通常飼料および 1.5％ DSS（M.W. 36000-50000）水Nano-LC-MS/MS（AB SCIEX）システム）による徹を与える群（DSS 群）、COR 粉末を添加した飼料およ底的な解析を行い、その上で各パラメータ間での関び 1.5％ DSS 水を与える群（DCOR 群）の 3 群に分け連性も解析した。

た。COR の摂取により体重減少、血便、下痢の 3 ス
コアからなる大腸炎の指標である Disease Activity

2．腸内細菌叢のメタゲノム解析

Index（DAI）の上昇、腸管短縮の改善、血中炎症マー

COR 摂取による大腸炎抑制効果の詳細な作用機序

カーの IL-6 濃度の減少、および好中球浸潤の指標とを明らかにするため、次世代シーケンサーを用いてなる myeloperoxidase 活性値の上昇抑制を示した。

腸内細菌叢変化のメタゲノム解析を網羅的に行っまた、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、た。盲腸内容物から細菌メタゲノミック DNA を精メタボロミクスといったオミクスを多層的に組み合製した。16S rRNA 遺伝子の可変領域 3 および 4 をわせ解析し、その生理応答について分子レベルでの増幅した後、ライブラリを作成し、次世代シーケン詳細な解析を行った。

サー（Illumina MiSeq システム）にてランを実施した。

腸内細菌は免疫系の発達、制御性 T 細胞とヘル取得した配列を Quantitative Insights Microbial Ecology

パー T 細胞（Th17）の分化、炎症性と抗炎症性サ（QIIME v1.8.3）ソフトウェアにより解析した。得ら

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Vol.31（2024）

れた大量の配列データを Quality Check した後、高品よう添加した DMEM 培養液でさらに 24 時間培養し質な塩基配列は公開 Greengenes データベースに照会た。回収した培地上清および細胞懸濁液から炎症性し、相同性が 97％以上のものをクラスタリングし、サイトカインマーカーの IL6 および IL1βの含量おoperational taxonomic units（OTUs） を 作 成 し た。

よび発現量を測定し、COR 中の炎症抑制に関与してこのように細菌の系統解析を行い、各サンプルの細いる有効成分を特定した。なお、LPS 刺激と同時に菌組成を求める。分子系統関係に基づいた細菌叢構

各成分を細胞に添加し、同様のスケジュールで各成造の類似性解析（UniFrac 解析）を行い、菌種多様性分の影響を確認した。には Alpha Rarefaction および Principal CoordinateAnalysis（PCoA）を使用してグラフィカルに視覚化

結果および考察した。

1．DNA マイクロアレイの解析
3． LPS 刺 激 ヒ ト 結 腸 癌 由 来 Caco-2 細 胞 の腸管粘膜のマイクロアレイ解析では、免疫反応調炎症性サイトカインの産生により有効成節、ケモカイン、サイトカイン、急性期タンパク質分の検討

等関連遺伝子の発現量が DSS により増加し、その増ヒ ト 結 腸 癌 由 来 Caco-2 細 胞（Human colorectal

加が COR で抑制されてると観察された（表 1）。IL-6adenocarcinoma）を用い、14 日間培養後、それぞれ遺伝子発現の結果は血中の IL-6 の含量と一致するもCOR の７成分を添加した DMEM 培養液で 24 時間イのであり、腸管の IL-6 発現の変化が血中の濃度変化ンキュベートした。その後、LPS を 1 mg/mL となるに寄与している可能性が考えられた。

表1

腸管粘膜のマイクロアレイ解析における免疫反応関連因子の結果

Abbreviation

Log ratio
DSS vs CON

Log ratio
DCOR vs DSS

S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A)

S100a8

5.31-1.06

S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B)

S100a94.66-0.83

chemokine (C-X-C motif ) ligand 13

Cxcl13

2.25-0.68

chemokine (C-C motif ) ligand 20

Ccl20

1.580.95interleukin 1 receptor-like 1Il1rl1

2.00

-1.51

interleukin 6Il6

1.70

-0.99

interleukin 11Il110.88-0.72

interleukin 18 binding protein

Il18bp0.770.65

serum amyloid A 3

Saa3

2.26-1.51

haptoglobin

Hp

3.20

-1.63

chitinase 3-like 3

Chi3l3

2.62

-1.14

angiogenin, ribonuclease A family, member 4

Ang4

-4.41

2.37

angiogenin, ribonuclease A family, member 4

Ang4

-3.96

2.07

WAP four-disulfide core domain 12Wfdc12

1.41-1.06

Gene nameFDR ≤ 0.05、Log ratio ≥ 0.6, ≤ -0.6 の条件下で変化した遺伝子

コリアンダー摂取による炎症性腸疾患抑制作用の腸内細菌叢メタゲノム解析およびその活性成分の解明

2．プロテオーム解析

47の抗炎症効果を示すものである。また、脂質代謝・DSS 投与時には腸管において重篤な炎症反応が引解糖系・転写活性調節タンパク質および分子シャペき起こされるため、腸管粘膜には炎症反応に起因すロン・急性期タンパク質・ヒートショックプロテイるタンパク質が高発現することが予想される。本研

ンでは DCOR が DSS と反対の変動を示した（表 2）。

究におけるプロテオーム解析では、炎症時に誘導さ腸管粘膜においても脂質代謝に関連するタンパクれる急性期タンパク質が DSS 投与により顕著に増加質に変動が見られた。カイロミクロンの構成タンパしていた（Haptogloblin は 43 倍、Fibrionogen のサブク質となる Apolipoprotein A-IV は DSS 投与によりユニットは 8 ～ 10 倍）。しかしながら、COR 給餌に増加し、COR 給餌によりその増加は抑制された。こより約 50％近くが下方調節されており、これは CORのタンパク質は脂質代謝以外にも抗酸化や抗炎症効

表2

腸管粘膜のプロテオーム解析

DSS vs CON
UniProt ID

Protein name

DCOR vs DSS

Ratio

P value

Ratio

P value

Lipid metabolism-related protein
P06728

Apolipoprotein A-IV

1.84

0.001

0.752

0.045

P55050Fatty acid-binding protein, intestinal

0.429

0.052

2.559

0.048

P16858Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

3.22

0.002

0.608

0.017

P06745

Glucose-6-phosphate isomerase

4.83

0.004

0.56

0.088

P09411

Phosphoglycerate kinase 1

2.86

0.019

0.560.054

Glycolysis

Transcriptional activity and protein chaperone
P10126

Elongation factor 1-alpha 1

5.81

0.000

0.54

0.032

Q9D8N0Elongation factor 1-gamma

3.31

0.040

0.48

0.056

P58252Elongation factor 2

4.02

0.000

0.545

0.013

P2002978 kDa glucose-regulated protein

2.81

0.000

0.679

0.079

P14211

Calreticulin

2.58

0.000

0.63

0.015

P08113Endoplasmin

4.79

0.000

0.59

0.005

Acute phase proteins
Q61646

Haptoglobin

43.25

0.000

0.60

0.001

Q61838Alpha-2-macroglobulin

3.40

0.000

0.58

0.006

Q8K0E8Fibrinogen beta chain

8.240.0000.540.013

Q8VCM7

Fibrinogen gamma chain

10.770.001

0.610.053P01027

Complement C34.250.000

0.520.011

5.600.000

0.520.036

Heat shock protein
P63017

Heat shock cognate 71 kDa protein

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果、さらには DSS 誘導性の大腸炎症を抑制すること 1)の相対量を減少させる傾向（p=0.078）を示し、CORが知られている。したがって、DSS により誘導されが DSS 誘発したマウスの腸炎症を弱化する可能性がた過剰な炎症反応への応答として、抗炎症作用のあ示唆された（図 1）。

る Apolipoprotein A-IV を発現させるが、COR 給餌

属レベルでは、COR の摂取により病原菌や炎症関連時には炎症反応が一部抑制されるためにその発現が細菌であるEnterococcus、Granulitella、Mesorhizobium

抑制されている可能性が考えられる。同様の結果がを含む炎症促進性細菌の減少が見られ（図 2）、COR

Germfree マウスへの Enterobacter cloacae B29 株とが大腸の炎症を改善したことを示した。一方、COR

高脂肪食を与えた実験系でも認められている 。

摂取群では、Lactococcus の増加により Lactobacillales

2)

したがって、本研究におけるプロテオーム解析は、の豊富さが増加し、短鎖脂肪酸の産生と免疫システ

DSS 投与時の炎症反応およびそれに関連する酸化ス

ムの増強および腸の完全性 3) を通じて大腸炎を緩和

トレスが COR 給餌により抑制される分子メカニズムする際の Lactococcus の有益な効果を示した。CORを示すものとなった。

給餌で有意に増加した Mucispirillum は、ムチンをDNA マイクロアレイ解析と統合解析の結果では、分解することにより、炎症反応と関連していた 4, 5)。

急性期タンパク質が同様の変化を示した。また、プさらに、COR 給餌は、低免疫系の指標である Serratia 6)

ロテオーム解析では、タンパク質合成や脂質代謝にの異常増殖を減少させた傾向があった。もう一つ減関与するものが変動していたが、マイクロアレイで少傾向を示した Ruminococcaceae は、抗炎症作用かは同様の変化は確認されなかったことから、これらら大腸炎に対する保護作用を発揮することが報告さタンパク質の変動は転写調節によるものではないとれている 7)。このように、COR 給餌後のプロバイオ考えられる。

ティクス菌の増加に伴って炎症促進細菌の減少が免疫系を改善し、大腸炎による腸内微生物叢や腹部不快感を減衰させることが可能である。すなわち、腸3．腸内細菌叢の変化
門レベルの解析では、DSS 群において炎症性細菌内環境におけるプロバイオティクスの拡大が病原微が多く含まれる Proteobacteria の相対量が増加し、炎生物に対する強力な防御システムを提供することを症状態を示した。COR の給餌により Proteobacteria示している 8)。

図1

門レベルのプロファイルコリアンダー摂取による炎症性腸疾患抑制作用の腸内細菌叢メタゲノム解析およびその活性成分の解明

図 2 有意に変動したマイクロバイオームの相対量
mean ± SE (n = 5-7), ANOVA and Tukey’s test; *p < 0.05 and **p < 0.0149

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以上のことから、大腸炎進行に伴い発現上昇する炎症サイトカイン、急性反応タンパク質および炎症性腸内細菌が COR の摂取により減少したことから、
COR が免疫細胞応答およびそれに伴うサイトカイン分泌変動、炎症反応抑制に関与する遺伝子、タンパク質、腸内細菌など免疫反応の抑制に関与していることが示唆された。

4． LPS 刺 激 ヒ ト 結 腸 癌 由 来 Caco-2 細 胞 の炎症性サイトカインの産生により有効成分の特定
ヒ ト 結 腸 癌 由 来 Caco-2 細 胞（Human colorectaladenocarcinoma）を用い、14 日間培養後、食品に含まれる 6 成分を添加した。その中、3 つの成分の添加により、LPS で誘導した炎症性サイトカインマーカーの IL6 および Tnfαの発現量が抑制された。
これらの成分が、炎症抑制に関与している有効成分の可能性があると考えられた。また、細胞実験から食品に含まれる一つの成分ではなく、いくつかの成分の相乗効果により炎症反応を軽減されたことを明らかにした。
謝辞
研究を遂行するにあたり、多大なご支援を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。

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参考文献

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Alleviation of inflammatory bowel disease in mice supplemented with Coriander (Coriandrum sativum)51
as assessed via a metagenomic analysis of intestinal microbiota

Alleviation of inflammatory bowel disease in mice supplementedwith Coriander (Coriandrum sativum ) as assessed via a
metagenomic analysis of intestinal microbiota
Huijuan JIA
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo
Inflammatory bowel disease (IBD) is a complex, multifactorial
immunomodulatory disorder. We employed a multi-omics analysis to investigate
t h e s u p p r e s s i v e e f f e c t s o f 2 % C o r i a n d e r (C o r i a n d r u m s a t i v u m , C O R ) supplemented diets on dextran sodium sulphate (DSS)-induced colitis in mice.
Seven-week-old male C57BL/6J mice were divided into three groups, and fed
either a 2% COR or basal diet throughout the experiment. They were given
normal drinking water for 2 weeks, after which colitis was induced byadministering 1.5% (w/v) DSS drinking water for 9 days. Control mice were fed
basal diet and given normal drinking water. COR significantly suppressed thedisease activity index and colon shortening, and lowered myeloperoxidase
activity. Results from colonic transcriptome and proteome profiles showed that
COR supplementat ion significantly reduced the expression of genes andproteins associated with inflammatory mediators and acute reaction proteins.
Concomitantly, cecal metagenomic information established the essential role of
COR in improving dysbiosis, suppressing inflammatory intestinal bacteria, andeventually alleviating mucosal inflammation. Thus, the integrated nutrigenomic
approach revealed the molecular mechanisms underlying the ameliorative
effect of COR on IBD. In addition, the results from Caco-2 cell lines in vitro
showed that rather than a single component, COR suppressed the production of
LPS-induced inflammatory cytokines, suggesting synergistic effects between
several components in COR. These findings provide the first insights into theeffects of COR on modulating microbiota and suppressing IBD, which might
open new perspectives in the prevention and treatment of IBD.