光極性変化するナノ界⾯の創製とタンパク質分離膜の光制御の基礎研究
Preparation of cytocompatible polymeric separation membrane filmwith photo-reversible phospholipid polymer
東北⼤学⼤学院薬学研究科 ⾦野 智浩【研究の目的】
本研究では，光刺激による分⼦構造の異性化に伴い親⽔−疎⽔性が可逆的に変化するポリマー界⾯の創製，およびこれを⽤いた⽣体分⼦の⾮侵襲分離のための基礎研究を実施する。
界⾯におけるポリマー鎖の分⼦構造の光極性変化により，疎⽔性相互作⽤や静電的相互作⽤の動的変化など界⾯の物理化学特性を明らかにすることを⽬的とする。光異性化分⼦として知られるスピロピラン⾻格を導⼊したメタクリル酸エステルモノマーを合成し，これを⼀成分とした光異性化ポリマーからなるスマートナノ界⾯を創製する。この界⾯を修飾した基材表⾯を構築し，タンパク質の変性や細胞の活性化を抑⽌して天然状態のまま吸着・脱着を実現する光分離技法を確⽴する。
【研究の内容，成果】
１．光異性化モノマー（MEOSP）の合成
光異性化ユニットとして，スピロピラン⾻格を有するメタクリル酸エステル(MEOSP)を合成した。MEOSP は，ポリエチレングリコールモノメタクリレートにスピロピラン⾻格を有するアルコール(SPOH)を縮合反応により導⼊することで合成した。合成した MEOSP の構造は 1H-NMR 解析により帰属した。
２．光異性化ポリマーの合成
MEOSP を⼀成分に含むポリマーを合成した。MEOSPおよびタンパク質分⼦との相互作⽤が極めて低く，細胞親CH3CH2 C

CH3CH2 CnC O

OO (CH2)2 OPO (CH2)2 N(CH3)3

MPCユニットリン(MPC)，基板表⾯への物

CH2 C

lC O

C O

O (CH2)3CH3O (CH2CH2O)nCOOCH2CH2O

NO

NO2BMAユニット
CH3和性を有する 2-メタクリロイ
ルオキシエチルホスホリルコ

CH3mCH3MEOSPユニット

Fig. 1 Chemical structure of phospholipid polymer bearing
photoisomerizable unit

理吸着時における成膜性が良好な n-ブチルメタクリレート(BMA)からなる三元共重合体を合成した。
代表的なポリマーの化学構造式を Fig. 1 に⽰す。

各ユニットの配列がランダムなランダムコポ
リマー，および各ユニットの配列を規定したブ
ロックコポリマーをフリーラジカル重合または可逆的付加開裂連鎖移動ラジカル重合により⾏った。ランダムコポリマーおよびブロックコポリマーともに重合に成功し，⼀定の組成をもつ光異性化ポリマーを得ることができた。
得られたポリマーをエタノールに溶解し，その溶液の光異性化反応を検討した。MEOSP ユニットは紫外線照射時にメロシアニン構造に

Fig. 2 UV spectra of photoisomeizable PMBSPMAs in 1 mg/mL ethanol solution (dashedline: spiropyran form, solid line: merocyanineform)

異性化し，可視光線照射時にスピロピラン構造に逆反応することを特徴とする。あらかじめ可視光線を 5 分間照射することでスピロピラン構造にした後に，続けて照射波⻑を切り替えて紫外線を照射することでメロシアニン構造への異性化を評価した。Fig. 2 に紫外線可視吸収スペクトルを⽰す。545 nm の吸収はメロシアニン構造に由来する吸収である。この結果，紫外線照射 10 分間で⼗分に光異性化反応が⽣起することがわかった。また，メロシアニン構造

Fig 3 UV absorption at 545 nm attributed tomerocyanine form of PMB-SPMA toward tophoto-irradiation time.のポリマーに対して可視光線を照射することで逆反応が⽣起し，スピロピラン構造に戻ることも確認できた（Fig. 3）。
３．光異性化ポリマー表面の調製と機能評価
ランダムコポリマー型の PMB-r- MEOSP，およびブロックコポリマー型の PM-b-(BMA-co-MEOSP)を修飾した基板表⾯を調製した。調製条件はいずれも 0.2 wt%エタノール溶液を⽤いたディップコーティング法で⾏った。得られたポリマー表⾯の接触⾓測定を⾏った。
いずれのポリマー表⾯もスピロピラン構造／メロシアニン構造に依らずほぼ⼀定の接触⾓であることがわかった。したがって，親⽔性ユニットとして 20 mol%の MPC ユニットを含むポリマーの場合，その最表⾯には極めて親⽔性に優れる MPC ユニットが⽀配的になっていることが⽰唆された。この場合においても光照射によって基板表⾯の⾊調変化は認められたことから，光異性化反応は液相側ではなく固相側で⽣起していると考えられる。

吸着特性を評価した。低分⼦化合物はモデル薬物としてメチレンブルーを⽤いた。Fig. 4 にスピロピラン構造（疎⽔的）またはメロシアニン構造（親⽔的）に対するメチレンブルーの吸着量を⽰す。この結果，いずれの表⾯においても⼀定の吸着量を認め，特にスピロピラン構造に対して有意に吸着が起こっていることがわかAdsorption rate (%)

次に，これらの表⾯に対する低分⼦化合物の109876543210SP form

MC form

Fig. 4 Adsorption of methylene blue on thephotoisomerizable polymer surface

った。メロシアニン構造になることで疎⽔性相互作⽤のみならず静電的相互作⽤が惹起し，吸着量が増⼤することはなく，溶質の吸着挙動は主に疎⽔性相互作⽤によるものであることがわかった。最表⾯を形成している MPC ユニットはタンパク質の吸着を抑制する⼀⽅，低分⼦化合物に対しては透過性を有しており，BMA ユニットまたは MEOSP ユニットに吸着することがわかった。しかしながら，スピロピラン構造において有意に吸着が起きていることから，可視光線照射時の親⽔型構造（メロシアニン）への異性化が起こったとしても脱着しにくい状態（不可逆的吸着）であった。
４．光異性化ポリマー表面への細胞接着
ポリマー表⾯への細胞接着性を評価した。ス(a) Spiropyran form

ピロピラン構造とメロシアニン構造の表⾯をそれぞれ⽤意し，上⽪様細胞（HeLa 細胞）の接着性を評価した。Fig. 5 に播種 24 時間後の位相差顕微鏡写真を⽰す。ネガティブコント
ロールとして，MEOSP ユニットを導⼊していないポリマー（PMB30,MPC/BMA=0.3/0.7 mole fraction）において(b) Merocyanine form

細胞接着を完全に抑制した。これは培養環境において BMA ユニットが安定に固相側に多点で物理吸着しており，⼀⽅，MPC ユニットが⽔相側で⽀配的になることでタンパク質吸着のみならず細胞接着も抑制することを⽰している。⼀⽅，MEOSP ユニットを導⼊したポ

Fig. 5 Cell adhesion on (a) PMB-MEOSP with

リマー表⾯ではその光異性化によって接着性

spiropyran form and (b) with merocyanineに差異があることがわかった。特に疎⽔性のform surface

スピロピラン構造において細胞接着を認めた。その傾向はランダムポリマーとブロックポリマーにおいても差異が認められ，特にブロックポリマーを修飾した基板表⾯のスピロピラン型において有意に接着を認めた。今後，ブロックポリマーを修飾した表⾯の相分離構造などを解析する必要があるが，ブロックコポリマーにすることで表⾯にミクロドメイン構造が形成されたことを⽰唆するものである。
光照射による可逆的な細胞接着は認められていないが，ポリマー分⼦内のミクロな構造変化を鋭敏に反映した細胞接着性の相違を認めることができた。
【今後の研究の方向，課題】
本研究の遂⾏により，細胞親和性を特徴とする MPC ポリマーの動的物性制御を⽬的として，光照射により親⽔−疎⽔性が切り替わる光刺激応答性ポリマーによるタンパク質および細胞分離膜の基礎的研究を実施した。本研究では，疎⽔性ユニットとして n-ブチル基を側鎖に有する BMA を中⼼に進めてきた。BMA は MPC との共重合反応性が良好であり，仕込み組成に応じて導⼊量を制御することができる。また，その単独ホモポリマーのガラス転移点は約 20℃であり，成膜性や造膜性に秀でており，基材表⾯に安定な修飾膜を形成することができる。さらに⽣体内環境においても⻑期にわたり安定な修飾膜として機能する。
その結果，⽔系では MPC ユニットが⽔相側に配向し，タンパク質吸着抑制や細胞接着抑制効果を発現する。この表⾯に対して第三成分⽬に MEOSP のような機能性ユニットを導⼊することで表⾯の光機能化を検討した。しかしながら MEOSP ユニット⾃⾝が疎⽔的モノマーであり，光異性化した後のメロシアニン構造においてもスピロピラン構造と⽐べた場合に相対的に親⽔的という程度である。したがって，極めて親⽔性に秀でた MPC ユニットが最表⾯相を⽀配する結果，光異性化反応が修飾膜の内部で⽣起することから，明瞭な⾊調変化は認められるものの，接触⾓などの表⾯物性にまで摂動効果をもたらせることは困難であった。低分⼦化合物は最表⾯の MPC ユニットを透過して固相側に吸着することが可能であった。したがって，系の pH 変化などを含めて脱着機構をさらに検討することで光照射による低分⼦化合物の溶出性を付与できると考えられる。⼀⽅，タンパク質や細胞などのスケールの分⼦群の吸着や脱着は最表⾯相の物性を反映する。そこで，疎⽔性ユニットとして，側鎖のアルキル鎖をヘキシル基にした n-ヘキシルメタクリレート(HMA)を成分とする光異性化ポリマーを合成してきている。このポリマーを基材表⾯に修飾し，細胞接着性について評価したところ，BMA を疎⽔性ユニットとするポリマーと⽐較して，明らかに細胞接着性が亢進することがわかった。現時点においては，スピロピラン構造とメロシアニン構造とで細胞接着性に明確な差異は認めていないが，光機能性表⾯を設計する際にポリマーに導⼊する疎⽔性ユニットについても⼗分に留意する必要があると考えられる。さらにブロックコポリマー化することで表⾯に明確な相分離構造を形成させるなど，より精密な表⾯設計が必要であると考えられる。
【成果の発表，論⽂等】
岩附芽⾐，能﨑優太，⾦野智浩，可逆的光応答性を特徴とする⽣体親和性リン脂質ポリマーの創製と機能評価，第 70 回⾼分⼦討論会，2021 年 9 ⽉ 6 ⽇−8 ⽇（オンライン開催）