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ピロリ菌からの発がん因子の分泌とその生理活性を抑制する香辛料成分の研究＜平成 23 年度助成＞

ピロリ菌からの発がん因子の分泌とその生理活性を抑制する香辛料成分の研究
渡邉達郎（埼玉県立がんセンター臨床腫瘍研究所）

1

出している 4）。この結果は Tipαがヒトの胃発がはじめにんを促進することを示唆する。

日本におけるがんによる死者数を比べると、現ヒトの疫学調査において、アメリカやヨーロッ

在、胃がんは男性では肺がんに次いで第 2 位、女パに比べて、日本や韓国の東アジアではピロリ菌性では大腸がん、肺がんに次ぐ第 3 位の主要なが感染率が高く、胃がんの発症率も高い。一方、バんである。世界的に見ても、がんによる死亡のおングラデシュやインド、タイといった一部の東ア

よそ半数は胃がんが原因であり、効果的な予防法

ジアではピロリ菌の感染率（抗体陽性率）が 7 ～ 8や治療法の開発は極めて重要と考える。

割と高いにも関わらず 5）、同程度の感染率をもつ胃がんの原因として、ヘリコバクターピロリ

日本や韓国に比べて、胃がんの発症率は顕著に低菌（ピロリ菌）の感染が多くの研究から示されてい 6）。Asian Paradox あるいは Asian Enigma といる。ピロリ菌はヒトの胃に持続感染するグラム呼ばれるこの現象の機構を明らかにすれば、新し陰性らせん桿菌であり、1983 年に、マーシャル、い胃がんの予防法につながると期待できる。

ウォーレン博士らにより、慢性胃炎の患者の胃にTipα遺伝子はこれまでに分離されたほとんど存在し、さらに胃炎の原因であることが報告されのピロリ菌が保持し、また日本で分離したピロ1）

た 。以降、スナネズミを用いた動物実験で、ピリ菌から Tipαの分泌量が異なる株を見出してきロリ菌感染は胃炎だけでなく、発がん剤による胃た。そこで、今回は株の違いではなく、ピロリ菌発がんを促進することが示された 2）。

が生育する胃内の環境に注目した。つまり、バピロリ菌による胃発がん機構において、私どもングラデシュやインド、タイで特徴的に使用さはピロリ菌が分泌するタンパク質である TNF-α

れる香辛料成分の中に、ピロリ菌の増殖を抑制inducing protein（Tipα）に注目している。Tipαするだけでなく、Tipαの分泌を抑制するものがは 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る 腫 瘍 壊 死 因 子、あるのではないかと考えた。本研究では、Asian

TNF-αを誘導する因子として、私どもがピロリParadox を解くため、胃がん発症率の低い地域の3）菌 か ら ク ロ ー ニ ン グ し た 。Tipα は 分 子 量 17

代表的な香辛料の成分による、ピロリ菌の増殖抑

kDa のタンパク質でピロリ菌から二量体を形成し制と Tipαの分泌抑制を in vitro で検討した。

分泌される。分泌された Tipαは胃粘膜上皮細胞

2.

方TNF-α発現を亢進し、発がんを促進する 3）。こ

2.1

化合物と抗体：Curcumin, shogaol, capsicin,

れまでに私どもは胃がん患者の胃から分離したピpiperine 及 び diaryl sulfide は 和 光 純 薬 か ら 購

ロリ菌は胃炎患者から分離したピロリ菌に比べて入した。EGCG は緑茶から精製した 98 %以上のより多くの Tipαを培養液中に分泌することを見

純 品 を 使 用 し た。Tipα 抗 体 は Tipα の ア ミ ノの細胞表面に存在する nucleolin を受容体として、

法

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酸 31 - 48+Cys の 19 mer ペプチドを抗原として

NaCl , 1 % Triton X-100, 0.1 % SDS, 1 % sodium

ウサギに免疫し作製した。CagA 抗体は Australdeoxycholate）に懸濁し、超音波破砕した。得ら

Biologicals より購入した。

れた菌体破砕液を遠心分離（12,000 x g, 20 min）

ピロリ菌からの発がん因子の分泌とその生理活性を抑制する香辛料成分の研究

ピロリ菌の培養：ピロリ菌は標準株である

し、上清を SDS - PAGE により分離した後、Tip26695 株を使用した。ピロリの培養はアネロパッαと CagA 抗体を用いた Western blot で 2.3 と同ク・微好気（三菱ガス化学）を用いて、微好気環境
piperine、トウガラシ成分
capsicin、様に解析した。
以上の濃度で弱い増殖抑制活性を示し、diaryl sulfide は全く増殖に影響

2.2, CO 2 : 5 - 8 %）に調整し、10%のウマ（O 2 : 6 - 12%
ニンニク成分diarylsulfide、ショウ血清を含むブルセラブロス液体培地を37 ℃で振ガ成分である shogaol を用いた。
また、香辛料には含まれないが、がん予防効とう培養した。ピロリ菌の増殖は600 nm におけ果が示されており、日本で良く飲まれる O.D. 値で測定した。化合物処理は対数増殖期
る 緑O.D.
茶に含まれる緑茶カテキンのピロリ菌を= 0.1となるように調整し、化EGCG、の計 6 種類を検討した(図 1)。	  初めに、液体培養における各化合物合物を含む新しい培養液中で 24 時間培養した。
菌体と培養液上清は遠心分離（3,000 x g, 15 min）のピロリ菌の増殖抑制活性を検討した。O.D.=0.1 で培養を開始すると 24理）の O.D.
値を 100 %として、2 回の平均で表した。
時間でおよそO.D.=2.0付近までピロ2.3 培養液中のTipαの検出：分取した培養液
リ菌は増殖した(data not shown)。こを等量のSDS - sample buffer と 混 合 し、SDS れまでにピロリ菌の増殖抑制活性がcurcuminや抗EGCGは Tipα体をPAGE に報告されているよ り 分 離 し た。Tipαは濃度依存的に増殖を抑制し、報告と用いた Westernblot により検出した。単量体を一致した。この時、増殖が50%阻害さ示す 17 kDaの位置に得られたシグナル強度をれる濃度(IC50)は curcumin: 65 µM、で分取した。増殖抑制は control（0.1 % DMSO 処Image J を用いて定量した。control（0.1 % DMSOEGCG ： 35 µM で あ っ た 。 今 回 、
capsicin と shogaol が curcumin と同
2.4 菌 体 中 の Tipα と CagA の 検 出： 菌 体 を程度に増殖を抑制することを見出し
Lysis buffer（ 20 mM Tris - HCl（pH8.0）, 150
た。一方、piperine
は IC50 が80 mMµM処理）の値を 100 %として、2 回の平均で表した。

図1

3.

結果

しなかった。今回検討した 6 種類の化合物はピロリ菌の増殖抑制活性の違
3.1 香辛料成分と EGCG によるピロリ菌の増殖

いから大きく3 つのグループに分けら抑制れた(増殖抑制活性
高：EGCG、中 :本研究ではバングラデシュやインド、タイで
curcumin, capsicin, shogaol 、 低 :よく用いられる香辛料として、カレー粉に含まpiperine, diaryl sulfide) (図 2)。また、れるウコン成分である curcumin やコショウ成分
現在、日本でピロリ菌除菌治療に用いpiperine、トウガラシ成分 capsicin、ニンニク成られている抗生物質 amoxillin の IC50
分 diaryl
shogaol をは0.13 sulfide、ショウガ成分であるµM であり、香辛料成分は用いた。また、香辛料には含まれないが、がん予
amoxilinの 270-500 倍の濃度を用い防効果が示されており、日本で良く飲まれる緑茶れば同等の増殖抑制活性を示すことが分かった(datanot shown)。に含まれる緑茶カテキン
EGCG、の計 6 種類を検討した（ 図 1）。

3.2
香辛料成分と EGCG によるピ初めに、液体培養における各化合物のピロリロリ菌からの Tipαの分泌��菌の増殖抑制活性を検討した。O.D. = 0.1 で培養	  続いて、ピロリ菌が培養液中に分泌を開始すると 24 時間でおよそ O.D. = 2.0 付近ました Tipαと菌体中の Tipαタンパク質でピロリ菌は増殖した（data not shown）。これを Western blot により解析した。こまでにピロリ菌の増殖抑制活性が報告されていの時、ピロリ菌がもつ他の発がん因子

香辛料成分と EGCG の構造

curcumin, piperine, capsicin, diaryl sulfide, shogaol 及び EGCG の構造式を示す。

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る curcumin や EGCG は濃度依存的に増殖を抑制

Western blot のシグナルの強さから算出する

し、報告と一致した。この時、増殖が 50%阻害と、ピロリ菌を O.D. = 0.1 で培養開始し、24 時間される濃度（ IC 50 ）は curcumin : 65μM、EGCG：

で 8-16μg の Tipαが培養液中に分泌される。こ35μM で あ っ た。 今 回、capsicin と shogaol がの系に curcumin と capsicin を加えると、ピロリcurcumin と同程度に増殖を抑制することを見出菌の増殖を抑制した濃度に一致して培養液中に分した。一方、piperine は IC 50 が 80μM 以上の濃泌された Tipα量を減少した（ 図 3）。また EGCG度で弱い増殖抑制活性を示し、diaryl sulfide は全は増殖の抑制を示さない濃度においても分泌されく増殖に影響しなかった。今回検討した 6 種類のた Tipα量を強く減少させた（ 図 4）。この時、菌化合物はピロリ菌の増殖抑制活性の違いから大体中の Tipαと CagA 量を比較すると CagA 量はきく 3 つのグループに分けられた（増殖抑制活性変化しないが、capsicin と EGCG は菌体中の Tipα

高：EGCG、中 : curcumin, capsicin, shogaol、低を減少させた。

: piperine, diaryl sulfide）（ 図 2）。また、現在、日Capsicin と 同 等 に 増 殖 を 抑 制 し た shogaol は本でピロリ菌除菌治療に用いられている抗生物質

逆に培養液中の Tipα量を増加することを初めて

amoxillin の IC 50 は 0.13μM であり、香辛料成分見出した。また興味深いことに、菌体中の CagA

は amoxilin の 270 - 500 倍の濃度を用いれば同等量に変化は無いが、Tipα量は顕著に減少したの増殖抑制活性を示すことが分かった（data not（ 図 5）。
増殖抑制活性が低い、peperine と増殖抑制をshown）。
香辛料成分と EGCG によるピロリ菌からのTipαの分泌調節示さなかった diaryl sulfide は他の香辛料成分や続いて、ピロリ菌が培養液中に分泌した Tipαでの Tipα量に影響を与えなかったが peprine はと菌体中の Tipαタンパク質を Western blot に20 %ほど培養液中の Tipα量を増加させた（ 図 6）。

3.2より解析した。この時、ピロリ菌がもつ他の発がん因子である CagA についても解析した。CagA

EGCG と比べてほとんど Tipαの分泌や菌体内考察

ピロリ菌の発がん因子 Tipαのピロリ菌からのは Tipαとは異なり、ピロリ菌が標的細胞に直接ピロリ菌からの発がん因子の分泌とその生理活性を抑制する香辛料成分の研究分泌を抑制する香辛料成分が Asian paradox を解注入する発がん因子である。

図2

香辛料成分と ECGC によるピロリ菌の増殖阻害

ピロリ菌を curcumin（◆）, piperine（×）, capsicin（▲）,diaryl sulfide（＊）, shogaol（●）,
あるいは EGCG（■）を含む液体培地で培養した。24 時間後、各培養液の 600 nm の O.D. 値を測定し、control を 100％として増殖抑制を表した。

である CagA についても解析した。

興味深いことに、菌体中の CagA 量に

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A 分泌された Tipα量B 菌体中の Tipαと CagA 量

図3curcumin と capsicin による Tipαの分泌抑制（A）ピロリ菌を 24 時間、化合物存在下で培養し、培養液中の Tipαタンパク質を Western blot で定量した。Control を 100％として分泌抑制を表した。
（B）ピロリ菌の細胞破砕液を調整し、菌体中の Tipαと CagAタンパク質量をWestern blot で検出した。

A 分泌された Tipα量B 菌体中の Tipαと CagA 量

図4

EGCG による Tipαの分泌抑制（A）ピロリ菌を 24 時間、化合物存在下で培養し、培養液中の Tipαタンパク質を Western blot で定量した。Control を 100％として分泌抑制を表した。
（B）ピロリ菌の細胞破砕液を調整し、菌体中の Tipαと CagAタンパク質量をWestern blot で検出した。

ピロリ菌からの発がん因子の分泌とその生理活性を抑制する香辛料成分の研究

A 分泌された Tipα量B 菌体中の Tipαと CagA 量

図5

shogaol による Tipαの分泌促進（A）ピロリ菌を 24 時間、化合物存在下で培養し、培養液中の Tipαタンパク質を Western blot で定量した。Control を 100％として分泌促進を表した。
（B）ピロリ菌の細胞破砕液を調整し、菌体中の Tipαと CagAタンパク質量をWestern blot で検出した。

A 分泌された Tipα量B 菌体中の Tipαと CagA 量

図6

Pieperine と diaryl sulfideにによる Tipαの分泌変化（A）ピロリ菌を 24 時間、化合物存在下で培養し、培養液中の Tipαタンパク質を Western blot で定量した。Control を 100％として分泌の変化を表した。
（B）ピロリ菌の細胞破砕液を調整し、菌体中の Tipαと CagAタンパク質量をWestern blot で検出した。

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く鍵となると考え、本研究を行った。Tipαの分排出されたと考えられる。Tipαがどのようにピ泌とピロリ菌の増殖への各化合物の効果を表 1 にロリ菌から分泌されるかは依然として分かってい。
まとめた（表 1）ないため、shogaol による分泌の促進は Tipαの

表1

香辛料成分と EGCG による Tipαの分泌変化とピロリ菌の増殖抑制分泌機構を解く足掛かりとなると期待される。ピロリ菌に対する抗生物質 amoxillin を処理するとTipα分泌抑制
IC50（μM）

Tipα分泌促進した％と濃度（μM）

増殖抑制
IC50（μM）

ペプチドグリカン鎖の架橋反応を阻害することでCapsicin〜65μM

̶̶

60μM

Curcumin〜65μM

̶̶

65μM

は死滅し増殖は抑制されるが、この時、培養液

20〜30μM

̶̶

35μM

Shogaol̶̶

200%/40〜60μM

70μM

Piperine̶̶

20%/50〜80μM

>80μM

̶̶

>80μM化合物
分泌抑制

EGCG
分泌促進効果なし
Diaryl sulﬁde >80μM細胞壁の合成が阻害され、溶菌によりピロリ菌中の Tipαは著しく増加した（data not shown）。
Capsicin や curcumin、EGCG による増殖抑制ではこのような Tipαの増加ではなく逆に分泌の抑制が誘導された。これら香辛料成分で見られた特徴的な Tipαに対する分泌抑制作用が胃発がんリ

今回、Tipαの分泌御抑制する化合物として
capsicin、curcumin、EGCG を見出した。これらスクを減少させる要因になるのか、今後、動物実験などで証明したい。の化合物はピロリ菌の増殖も抑制した。Tipαの分泌抑制の機構として、1）ピロリ菌内での Tipα

謝辞の合成抑制 2）ピロリ菌からの分泌の抑制 3）ピロ本研究に研究助成いただきました（公財）浦上

リ菌自体の増殖抑制、が考えられる。興味深いこ

食品・食文化振興財団に心より深謝いたします。とに、capsicin と EGCG は CagA タンパク質には影響せず、特異的に菌体内の Tipα量を減少して文

おり、Tipαの合成を抑制し、その結果 Tipαの1) Marshall BJ, Warren JR. Lancet 1984;1(8390):1311-5.

分泌量が減少したと考えられる。また、EGCG は

2) Shimizu N, Inada K, Nakanishi H, et al. Carcinogenesis
1999;20(4):669-76.

ピロリ菌の増殖抑制や菌体内での Tipα量に影響が見られない濃度で培養液中に分泌された Tipα量が減少していることから菌体からの分泌も抑制していると推測される。
Shogaol はピロリ菌の増殖は抑制するにもかかわらず、分泌された Tipα量を著しく増加させた。この時、菌体内の Tipα量は減少しており、
shogaol 処理により菌体内から積極的に Tipαが献3) Suganuma M, Kurusu M, Suzuki K, et al. J Cancer Res Clin
Oncol. 2005;131(5):305-13.
4) Suganuma M, Yamaguchi K, Ono Y, et al. Int. J. Cancer
2008;123(1):117-22.
5) Miwa H, Go MF, Sato N. Am J Gastroenterol. 2002;
97(5):1106-12.
6) Nguyen LT, Uchida T, Murakami K, et al. J Med Microbiol.
2008;57:1445-53.

Suppression of secretion of Tipα, a carcinogenic factor from Helicobacter pylori by various spices

Suppression of secretion of Tipα, a carcinogenic factor fromHelicobacter pylori by various spices
Tatsuro Watanabe
Research Institute for Clinical Oncology
Saitama Cancer Center
Helicobacter pylori (H. pylori) is classified as the definitive carcinogen for stomach
cancer in humans: it induces inflammation in cancer microenvironment of the stomach
associated with induction of tumor necrosis factor-α (TNF-α), an endogenous tumor
promoter. TNF-α inducing protein (Tipα) gene was cloned from H. pylori genome as apotent inducer of TNF-α. H. pylori isolated from cancer patients secreted Tipα more thanthose from gastritis patients.
Epidemiological studies in Asian countries indicate a paradoxical phenomenon, so
called “Asian Paradox”: some Asian countries, including Bangladesh, India, and Thailand,
have low incidence of gastric cancer compared with other East Asian countries including,Japan, Korea, and China, although prevalence rates of H. pylori are similarly high. So westudied whether some spices in those countries suppress secreted amounts of Tipα.
Using liquid culture methods, we examined effects of 6 compounds: Capsicin in red
pepper, curcumin in turmeric, shogaol in ginger, piperine in pepper, diaryl sulfide in garlic,and (-)-epigallocatechin gallate, EGCG in green tea. We found that capsicin and EGCG
decreased amounts of secreted Tipα and synthesis of Tipα associated with inhibition ofH. pylori growth. Curcumin showed growth inhibition of H. pylori, resulted in reductionof Tipα secretion. Interestingly, shogaol significantly stimulated secretion of Tipα fromH. pylori. Shogaol may help to understand secretion mechanism of Tipα. Based on theseresults, we think that Tipα secretion can be changed by external environment as well asdifferent types of strains, and this change might be related to Asian paradox.

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