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食品成分を機軸としたケミカルバイオロジー研究＜平成 20 年度助成＞

食品成分を機軸としたケミカルバイオロジー研究
掛谷秀昭（京都大学大学院薬学研究科）

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対して、新しい予防法・治療法を確立することがはじめに強く望まれている。

人類は有史以来、合成医薬と並んで、天然有機心筋細胞は、心臓の主な構成成分であり、出生化合物（天然物）を薬として利用してきた。天然と同時にその分裂能をほぼ失うと考えられてお有機化合物の資源を考えてみると、微生物代謝産り、心臓の成長は個々の心筋細胞の大きさが増す

物、生薬・漢方、植物、機能性食品、海洋無脊椎こと（肥大）による。すなわち、肥大とは限界の1)動物など多種多様である 。ブロックバスター的ある代償機構であり、刺激の継続によりこの代償化合物は人類の福祉に貢献してきたのみならず、は破綻し、心臓は収縮機能不全（心不全）に陥る 3)。

新しい学問領域であるケミカルバイオロジー（化そこで、本研究では、画期的な心不全治療薬リー学生物学）の発展にも大きく貢献しつつある。例

ド化合物の開発基盤の確立を目指して、i ）培養心

えば、微生物代謝産物由来の免疫抑制剤 FK506

筋細胞を用いて、効果的に心筋肥大細胞反応を抑（タクロリムス）、シクロスポリンA、高脂血症治制する天然資源成分等を探索するための評価系を療薬プラバスタチンなどは、人類の福祉に貢献し用いて、食品成分、生薬・漢方、薬用植物由来のてきたのみならず、免疫領域、代謝・循環器内科

心筋肥大抑制物質を見出すこと、ii ）各種類縁化領域などの関連領域科学の発展にも大きく貢献し合物・誘導化合物を合成すること、iii ）有望な化ている。さらに、タイヘイヨウイチイの樹皮由来合物に関して作用機構解析に適した機能性分子プの抗がん剤パクリタキセル（タキソール）は、微ローブ合成のための基盤を確立すること、などを小管制御機構の解明に大いに貢献している。1980目的とした（図 1）。

年以降 30 年間に承認された医薬品の由来を調べてみると、天然物それ自体の比率は 5 % 程度であるが、天然物誘導体、天然物模倣型合成化合物などを含めると約 5 0 % を占め、天然物の有する化学的多様性、生物学的多様性が創薬研究に果たしている役割は非常に大きい 2)。
ところで、近年、虚血性心疾患や高血圧性心疾患に起因する心不全は増加の一途をたどっており、健康長寿社会を目指す我が国にとっては大きな問題である。平成 19 年度の主な死因別死亡数の割合では、これら心疾患は、悪性新生物に続く第 2 位であり、ますます増加傾向にある心不全に

図1

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浦上財団研究報告書

2.

実験方法

2.1

培養心筋細胞の肥大評価

Vol.20（2013）

蛍光団、および機能性分子プローブの合成法を検討した。

ラット初代新生仔培養心筋細胞を用いて、フェ2.6 出芽酵母株コレクションにおける薬剤感受性試験

ニ レ フ リ ン（α1 受 容 体 作 動 薬、30 μM ）刺 激 にゲノムワイド出芽酵母株コレクション（DAmP4, 5)。検体（スクcollection: decreased abundance by mRNA

リーニングサンプル）試験時には、各種検体溶液perturbation collection）; Open Biosystems）6) のあるいは溶媒コントロール溶液を添加し、適宜、各株を 96 穴マイクロプレート（YPD 培地）に植菌細胞形態を顕微鏡下で観察するとともに、2 日後し 27 度で 24 時間前培養を行い、続いて検体を添の心筋細胞径の変化を定量した。

加し、さらに 24 時間培養後の細胞数を濁度によ

よって心筋細胞肥大を誘導した

2.2

スクリーニングサンプルの調製

様々な食品成分抽出液、植物抽出液（生薬・漢方を含む）を濃縮乾固後、DMSO に溶解しスクリーニングに供するサンプルとした。また、当り検出した。
3.

結

果

研究室で単離精製、あるいは合成した化合物群

3.1 クルクミン、およびクルクミン誘導体・類縁化合物の効率的な合成経路の検討・確立（フォーカストライブラリー）も DMSO に溶解しラット初代新生仔培養心筋細胞を用いて、心筋スクリーニングサンプルとした。
2.3

クルクミンの効率的な合成経路の検討

肥大細胞反応を抑制する検体のスクリーニングを行った。その結果、ショウガ科ウコンに含まれる3 –メチル – 4 –ヒドロキシベンズアルデヒドを出成分であるクルクミンが細胞毒性を示さない濃度

発原料として、縮合試薬、反応溶媒、反応温度等、域において、心筋肥大抑制効果を示した。また、様々な反応条件検討を行った。反応経過、ならびクルクミン（10μM ）は、フェニレフリンによっに反応生成物の追跡は、シリカゲル薄層クロマトて誘導される心筋細胞径の増大、ならびに心房性グラフィー（TLC）を用いて行った。さらに、反利尿因子（ANF）やβ–ミオシン重鎖（β–MHC）プ応生成物の同定・構造解析は、核磁気共鳴スペクロモーターの転写活性化も有意に抑制した。しかトル（NMR）解析、質量分析スペクトル（MS）解し、動物実験や構造活性相関研究等を行うために析等を用いて行った。

は、大量の化合物が必要となる。そこで、クルク

クルクミン誘導体・類縁化合物の合成経路の検討

ミンおよび各種類縁化合物の効率の良い合成経路

上記 2 . 3 において確立した縮合経路を鍵とし、考にして、3 –メチル – 4 –ヒドロキシベンズアルデ

合成経路に供することが可能なモノマー化合物のヒドを出発原料として、縮合試薬、反応溶媒、反合成・検討、ならびに合成したクルクミンを基質応温度等、様々な反応条件の検討を行った。そのとした各種変換反応の検討を行った。

結果、図 2 で示した合成経路を確立することがで

2.42.5分子プローブ用の各種リンカー結合型蛍光団、ならびに二官能性分子プローブの合成法の検討の確立を行った。すなわち、既報の方法等 7) を参きた。
続いて、図 2 で確立した反応条件を利用して化合物 2 を得た。なお、3, 4 –ジヒドロキシベンズア

クルクミン誘導体・類縁化合物の細胞内局在やルデヒドは、本反応条件下では反応が進行しな標的蛋白質を検討するための各種リンカー結合型かった。そこで、クルクミンを原料として脱メチ

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食品成分を機軸としたケミカルバイオロジー研究（1）（約 3 0 ％）324
図2ル化反応を行うことで、化合物 3 を得た。また、

おいては、クルクミン類の機能性分子プローブ化

クルクミンを水素添加反応条件に付すことで化合研究の１つとして、各種リンカーの合成検討や標物 4 を得た。

識タグ部分の合成検討を行った。その結果、図 4

3.2 分子プローブ用の各種リンカー結合型蛍光団、ならびに二官能性分子プローブの合成法の検討・確立
近年、クルクミンの生体への薬効として、抗酸化作用、抗炎症作用、細胞保護作用をはじめとして、様々な効果が報告されている。しかし、これに示した合成経路にて、化合物の細胞内局在を可視化可能なプロ―ブ部分として化合物 6、細胞内結合タンパク質の探索・同定に適したプローブ部分として化合物 7 の合成を行った。
3.3

出芽酵母株コレクションにおける薬剤感受性試験までの研究で、クルクミンの細胞内局在や物理的3.2 で合成した二官能性分子プローブ（化合物 7）に相互作用する結合タンパク質に関する知見は乏などは、目的化合物のビオチン標識体と標的タンしい。そこで、これらの知見を得るためのアプロー

パク質の物理的相互作用を指標にした利用が可能

チの 1 つとしては、機能性分子プローブの創製・である。一方で、標的タンパク質の発現量が少な活用が有効であると考えられる（図 3）。本研究にい、あるいは形成すべき複合体が生体外では不安定である、といった場合には目的化合物の標的タンパク質の探索・同定は決して容易ではない。
そこで、近年、目的化合物の標的パスウェイを検討する手法として、取得した大規模なデータを活用したデータマイニング法が考案されており、
特に、クラスター解析は簡便な方法で有用な情報を提示可能である8, 9)。この場合、作用機序が類似した化合物をグループ化することが可能である（図 5）。そこで、目的化合物の標的パスウェイ解

図3

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Vol.20（2013）

56

57

図4A

BCZ

図5析用プラットフォームとして本項では、ゲノムワとして実施したある化合物においては、850 株中

イド出芽酵母株コレクション（DAmP collection:

約 40 株において高感受性を示したことから、標decreased abundance by mRNA perturbation

的パスウェイ解析が可能になりつつある。

6)

collection） のうち、約 850 株を用いて、感受性試験に適した細胞数、培養時間等を検討した。

4．考察

DAmP 株とは、出芽酵母における各必須遺伝子

本研究においては、心筋肥大抑制化合物としての発現レベルを 1/4 ～ 1/10 に減少させた出芽酵見出されたクルクミンの天然資源からの大量供給母変異株ライブラリーである。その結果、各被検の代替として、効率の良い合成経路を確立した。

株を 27 度で 24 時間前培養を行い、続いて検体をさらには、各種縮合に供する多置換ベンズアルデ添加し、さらに 24 時間培養することで各種薬剤ヒド体の合成検討、ならびに縮合反応の適応性を感受性試験が可能となった。例えば、予備的実験広く検討したところ、様々なモノマータイプ・ダイ

食品成分を機軸としたケミカルバイオロジー研究

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マータイプ等の多くのクルクミン誘導体・類縁化で、バイオアベイラビリティーを向上させた高吸合物を創製することが可能になり、今後のさらな収性化合物群の創製が可能となり、今後の発展がる構造活性相関研究に利用可能である。なお、こ期待される。

れらの類縁化合物群の合成経路は、今後の動物実験等に必要な充分量の化合物量を供給可能とした。

謝辞

さらに、関連化合物の機能性分子プローブ化研

本研究を遂行する上で、多大なご支援を賜りま究の一環として、化合物の細胞内局在可視化などした（ 公財）浦上食品・食文化振興財団に深謝申に利用可能なプローブ（化合物 6）や、ビオチンタし上げます。また、研究遂行にご協力頂きました

グと光親和性官能基であるアジリジン基を有する京都医療センター・長谷川浩二博士ならびに森本二官能性分子プローブ（化合物 7）を合成したこと達也博士（現・静岡県立大学）に深謝致します。

で、関連化合物の細胞内局在や標的タンパク質の探索・同定研究が可能となった。
近年、クルクミンの生体に対する様々な薬効が注目されており、世界中で、基礎研究・応用研究の両面から研究が進められている。クルクミンの作用としては、フリーラジカル消去などを介した抗酸化作用や、転写因子 NF-κB の活性化抑制などを介した抗炎症作用など様々な作用が報告されている10, 11)。さらには、クルクミンの心筋細胞肥大抑制活性には、ヒストンアセチル化酵素（Histone acetyltransserase; HAT）活性を持つ転写コアクチベーター p300HAT の機能的阻害の関与が報告されているが 4)、クルクミンのp300HAT に対する直接的な阻害効果は不明のままである。今後、本研究で得られた化合物群の心肥大抑制活性、p300HAT 抑制活性、細胞内局在、作用機序解析、ゲノムワイドなパスウェイ解析等を詳細に解析することで、心不全の新規薬物療法開発に向けた標的タンパク質および複合体の解析研究が進展することが期待できる。
一方、クルクミンは化学構造上、高い脂溶性を有するために経口摂取時には極微量しか体内に吸収されず、吸収率の改善が臨床応用等の今後の最重要課題の一つと考えられている12)。DDS（drugdelivery system）製剤の活用も有効な手段の一つではあるが、本研究で確立したクルクミン類縁化合物群の効率的な合成経路を利用・発展すること

文献

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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

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11) Aggarwal, B.B., Shishoda, S. Molecular targets of dietary

Food ingredients-oriented chemical biology research

Food ingredients-oriented chemical biology research
Hideaki Kakeya
Department of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University

Exploitation of bioactive small molecules from natural sources such as microbial
metabolites, medicinal plants, food, and marine invertebrates has contributed to thediscovery of lead molecules for drugs as well as research tools on chemical biology.
We have discovered several novel bioactive natural products by both in vivo cell-based
phenotypic screenings and in vitro target-oriented screenings, and investigated their modesof action using a chemical genetics or a chemical genomics approach.
In this research, first we set up the screening system for identifying a lead moleculethat inhibits the hypertrophic response induced by phenylephrine, α1-adrenergic receptor
antagonist, in primary cardiomyocytes. After our extensive screening, we re-discovereda naturally occurring curcumin from Curcuma longa as an inhibitor against hypertrophic
responses in primary cultured neonatal rat cardiomyocytes, and established the efficientsynthetic route for curcumin and its derivatives via a condensation of a monomer substituted
benzaldehyde with acetylacetone. In addition, several functional molecular probes
possessing a diethyl aminocoumarin unit or a bifunctional unit comprised of diazirizin andbiotin tags were designed and synthesized efficiently, in order to analyze a localization of thecompounds in cultured cells and mining their target protein(s). These functional molecularprobes are also useful for a chemical tagging approach by using 5-sulfonyl tetrazole wehave recently established. Moreover we investigated the genome-wide approach by utilizing
Saccharomyces cerevisiae DAmP (the Decreased abundance by mRNA perturbation) strain
library for analyzing the cellular signaling pathway affected by bioactive small molecules.
These results herein would contribute to development of a new lead molecule as well as
identification of promising molecular target(s) for treatment of heart failure.

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