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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）＜平成 26 年度助成＞

生体成分の炭素安定同位体比を用いた食品の産地判別川島洋人（秋田県立大学システム科学技術学部）

1.

はじめにるためには個別成分中の同位体分析（CompoundSpecific Isotope Analysis）が必要である。

2000 年に『農林物資の規格化及び品質表示の適2000 年代の後半、液体クロマトグラフィ/ 安定正化に関する法律』（JAS 法）の改正により、すべ同位体比質量分析計（LC/IRMS）の融合・実用化ての生鮮食品に対して原産地表示が義務付けられが行われた1）。その結果、揮発性が低く、熱に不た。また、加工食品の原料原産地表示対象品目の安定な個別成分の炭素安定同位体比が測定可能に拡大、流通過程での表示義務化、外食産業におけなった。今まで分析が困難であった生体を構成する原材料の原産地表示のように、食品及びその原る成分の糖1-3）、アミノ酸 4,5）、アルコール 6,7）、農材料に対して原産地を表示する流れが拡大してい薬 8）の分析が可能になりつつある。これらの情報る。しかし、中国産を国産と偽装する事件だけでは産地判別のための有力なツールになる可能性がなく、2013 年 10 月には阪急ホテル系列のレストある。そこで本研究では、LC/IRMS の基本的なランによる食材偽装の問題も勃発するなど、あと分析方法から見直し、アミノ酸、糖に含まれる炭を絶たない。さらに我が国は環太平洋戦略的経済

素安定同位体比の高精度分析法を確立し、起源推連携（TPP）協定に加入するなど、国民の食の安定方法を確立することを目的とした。

全の確保や国内ブランド食品を守る意味から、食品の産地判別技術は最重要な課題となっている。

2.

実験方法

産地判別するための方法として、近年、安定同対象物質としては、以下のアミノ酸（10 種類）、位体比の利用が活発に利用され始めている。生物

糖（6 種類）、カフェイン（2 種類）の試薬類を分析の安定同位体比は、その生物が育ってきた環境した。アミノ酸としては、ヒスチジン（SI サイエ

要因を反映するため、今まで識別不可能であったンス社製）、アラニン（SI サイエンス社製）、ヒスチ食品や産地偽装が多い食品を中心に利用され始ジン（和光純薬工業社製、100g）、アラニン（和光めている。特に欧州では、2000 年代の後半には純薬工業社製、100g）、グリシン（和光純薬工業社

Trace（Tracing the origin of food）Project を立ち製、100g）、バリン（和光純薬工業社製、25g）、ロ上げ、様々な食品の安定同位体比のデータベースイシン（和光純薬工業社製、25g）、アラニン（和光を公表し始めている。例えば、小麦粉、ワイン、純薬工業社製、25g）、ヒスチジン（和光純薬工業社

米などの農産物や、牛肉、バター、チーズなどの製、25g）、グリシン（和光純薬工業社製、25g）、糖畜産物など応用範囲は非常に広い。しかし、これとしては、グルコース（和光純薬工業社製、25g）、らの安定同位体比の分析は、バルク分析（個別成キシロース（和光純薬工業社製、25g）、ガラクトー

分ではなく、全炭素や全窒素の分析）であるため、ス（和光純薬工業社製、25g）、マンノース（和光一部の食品では識別が出来ず、さらに情報量を得純薬工業社製、25g）、スクロース（和光純薬工業

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生体成分の炭素安定同位体比を用いた食品の産地判別社 製、25g）、フルクトース（ 和 光 純 薬 工 業 社 製、測定の流れとしては、移動相（水 100 %）に酸化25g）、カフェインとしては、カフェイン（和光純薬剤（ペルオキソ二硫酸ナトリウム、Na 2 S 2 O8 ）、リ工業社製）、カフェイン（IAEA）を分析した。

ン酸などの緩衝液が添加され、Liquiface 内部をまた、海外産の糖として、日本（8 種類）、マレー通過する。そこに液シリンジを用いてサンプルがシア産（2 種類）、バングラデシュ（1 種）、タイ（1 種導入される。サンプルは、100 ℃の燃焼炉におい類）を収集した。日本産としては白砂糖（日新製糖て試料に含まれる有機炭素が完全に湿式酸化し、社製）、グラニュー糖（日新製糖社製）、カップシュ

二酸化炭素に変換されて溶液中に保持される。溶ガー（日新製糖社製）、スリムアップシュガー（味液は空冷にて冷やされたのち（サンプル分析は水の素社製）、パルスイート（味の素社製）、シュガー冷に変更）、ガス交換膜においてヘリウムガスに二カット（浅田飴社製）、脳に速攻ぶどう糖（パール

酸化炭素が分配される。ここで移動相を含む試エース社製）、粉黒糖（美味安心社製）、マレーシア

薬はすべて廃液として除かれる。ヘリウムガスにとしてはパルスイート（味の素社製）、白砂糖（不移動した二酸化炭素相には水分が含まれるため、明）、バングラディッシュとしては白砂糖（不明）、Nafion で水分をヘリウムとともに除去し、オープタイとしては砂糖（Mitr Phol 社製）を分析した。

ンスプリットを通して IRMS に運ばれ、同位体測分析は湿式燃焼部（LC、Isoprime 社製 Liquiface）と 同 位 体 比 質 量 分 析 計（ IRMS、IsoPrime 社 製定が行われることになる。
なお、同位体比は（1）式によって表される。

IsoPrime IRMS）が融合した装置を用いて測定を（1）行った（図 1, 2 参照）。

図 1. LC/IRMS の写真

LC（Liquiface）

IRMS
図 2. LC/IRMS の流路図

90

浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

ここで、Rsample と Rstandard はそれぞれ試料と国切片が 0.4、決定係数 1.0 となり、リン酸の有無は際標準物質であり、例えば、炭素の場合は白亜紀関係なく、また EA/IRMS ともほぼ同一の結果がPeedee 層ベルムナイト炭酸塩（Peedee Belemnite,得られた。

PDB, 13 C/ 12 C = 0.011180）に対する千分率（‰）で表せられる。また、国際標準としてはδ13 C（‰）の 値 が 決 ま っ た Caffeine（IAEA-600, – 27.771 ±0.043‰）、Graphite（USGS24, – 16.049±0.035‰）、
Cellulose（IAEA-CH-3, – 24.724±0.041 ‰）を 用 いた。LC/IRMS の場合は適切な国際標準がないた
め、まず EA/IRMS でこれらの国際標準を測定した。次に、ダブルアンカー法より得た直線を用いて、すべてのサンプルの値を決めた。なお、ダブルアンカー法の決定係数は、R 2 = 1.00 となった。
LC/IRMS の基礎試験として、燃焼の温度変更（90℃, 100℃）、冷却システムの導入（空冷から水冷の導入）、還元路の導入、低濃度試験、リン酸有無の効果も行った。
3．結 果 考 察3.1

低濃度試験の結果（糖 3 種で試験）

図 3. 6 種の糖の EA/IRMS と LC/IRMS との相関図

10 種のアミノ酸においては、マニュアル測定（リン酸有無）、オート測定（リン酸有）は EA/IRMSと LC/IRMS は誤差は約 2 ‰程度であったが、オー

低 濃 度 領 域 を 試 験 す る た め に、3 種 の 糖（ ガト測定（リン酸無）に関しては 10 ‰と大きな差がラ ク ト ー ス、グ ル コ ー ス、マ ン ノ ー ス ）を 対 象あった（図 4 参照）。その理由としては、イオンクに 3 nmolC か ら 67 nmolC の 絶 対 量 の 範 囲 で

ロマトグラフの溶離液は四ホウ酸ナトリウム・十試 験 を 行 っ た。 そ の 結 果、ガラクトース、グル水和物であり、塩基性溶離液（pH = 9）であったた

コ ー ス、マ ン ノ ー ス は、そ れ ぞ れ、– 27.93 ‰ ～め、ペルオキソ二硫酸ナトリウムによる湿式酸化– 26.37‰（標準偏差（1SD）< 0.34 ‰）– 10.91‰～の燃焼効率が落ちてしまったことが原因だと考え– 10.45 ‰（1SD < 0.38 ‰）、– 11.78 ‰ ～ – 10.55 ‰られた。また，糖と異なり、マニュアル測定にお（1SD < 0.36 ‰）となった。低濃度領域としては、いても、誤差が生じたのは、アミノ酸には窒素がEA/IRMS との差が 0.3‰と考えれば、ガラクトー含有しており、燃焼の際に N 2 O が生じてしまい、ス、グルコース、マンノース は、約 17 nmolC、約誤差を生んでいると考えられた。

3 nmolC、約 7 nmolC まで測定可能であることがわかった。

2 種のカフェインにおいては、マニュアル測定（リン酸有無）、オート測定（リン酸有無）は EA/IRMS と LC/IRMS は約 7 ‰もの差があった。アミアミノ酸（10 種類）、糖（6 種類）、カフェイン（2 種類）の EA と LC の比較検討

ノ酸においては窒素含有率は平均で約 19 %であっリン酸の有無を確認するために、マニュアルたが、カフェインは約 30 %程度と大きく、窒素によ3.2

測定にて 6 種の糖を試験した。EA/IRMS と LC/IRMS との相関図において（ 図 3 参照）、傾き 1.0、る影響がさらに顕著になったと考えられた。

91

生体成分の炭素安定同位体比を用いた食品の産地判別

図 4. 糖（6 種類）、アミノ酸（10 種類）、カフェイン（2 種類）の測定結果
図 4. 糖（6種類），アミノ酸（10 種類），カフェイン（2 種類）の測定結果入っており、またアミノ酸を使った糖においては日本（8 種類）、マレーシア産（2 種類）、バン– 21.27 ‰～ – 18.51 ‰と白糖とは異なる結果であグラデシュ（1 種類）、タイ（1 種類）の糖に
表 1	  国内産，海外産の糖の結果ついての結果（表 1 参照）ることがわかった。植物由来の糖とアミノ酸由来
sampleLC/IRMS
EA-LCCountry
EA/IRMS
国 内 産 の 糖（8 種 類 ）の 結 果 は – 21.27 ‰ ～の糖とは異なる結果となり、識別可能であること
1White sugar－14.65±0.11－14.78±0.01
Japan0.13– 10.66 ‰となり、1SD は＜ 0.22 ‰であることががわかった。さらに、今回はバルク（全体）の測
2
Caster sugar－14.52±0.16－15.13±0.02
Japan0.62わかった。また、海外産の糖の結果は－14.62±0.13定であったが、今後はさらに成分を分離して同位3
Cup sugar （4 種類）－14.32±0.17－0.30
Japan
3.3– 18.35 ‰ ～ 4– 11.71Slim‰ とsugar
な り、1SD は＜ 0.23 ‰ で－13.28±0.38
体比を測定することで、より明確に識別できる可－12.45±0.04－0.83Japanあることがわかった。通常の白糖においては国能性があることがわかった。
5Pal sweet－21.10±0.37－21.27±0.12
Japan0.18

cut～ – 15.13Japan10.66 ‰‰ の 範 囲 に－12.38±0.01
内 産 も 海 外6産 も –Sugar－12.55±0.120.17

7

Grape sugar

8Brown sugar

9Pal sweet

1102113Japan
表1－11.38±0.05
国内産、海外産の糖の結果－10.66±0.22－0.72

Japan－12.22±0.11－11.71±0.21－0.51

MalaysiaJapan－18.51±0.07−14.65 ± 0.11

－18.35±0.23−14.78 ± 0.01

－0.16

－11.85±0.12−15.13 ± 0.02

－0.13

Cup sugar

BangladeshJapan−14.52 ± 0.16

－11.71±0.15－11.63±0.09−14.62 ± 0.13

－12.02±0.08−14.32 ± 0.17

−0.30

sampleWhite sugar

White sugar

Caster sugar

White sugar

Country

Malaysia
JapanEA/IRMS

LC/IRMS

EA-LC0.130.620.3912White sugar
Slim sugar

Japan

Thai－12.55±0.12−13.28 ± 0.38

−12.45 ± 0.04

－13.13±0.05−0.83

5Pal sweetJapan−21.10 ± 0.37

−21.27 ± 0.120.186

Sugar cut

Japan−12.38 ± 0.01

−12.55 ± 0.120.177

Grape sugar

Japan−11.38 ± 0.05

−10.66 ± 0.22

−0.72

8Brown sugarJapan−12.22±0.11−11.71 ± 0.21

−0.51

9Pal sweet

Malaysia−18.51 ± 0.07

−18.35 ± 0.23−0.16

10White sugar

Malaysia−11.85 ± 0.12−11.71 ± 0.15−0.1311White sugar

Bangladesh−11.63 ± 0.09−12.02 ± 0.08

0.3912White sugarThai−12.55 ± 0.12−13.13 ± 0.05

0.5840.58

923.4

浦上財団研究報告書

その他の実施項目

Vol.23（2016）

度が下がっておらず、その結果、ナフィオンの効感度を高めるために、湿式酸化の燃焼温度を果が下がり、IRMS に水分が導入されてしまって90 ℃から 100 ℃にて実験した。対象物質は、アミいることが疑われた。そこで、空冷式の冷却から、ノ酸やカフェインであるアラニン、ヒスチジン、グ水冷式に変更し、数 ℃付近まで下げることで、こリシン、ロイシン、バリン、カフェインを用いて実のような大きなノイズ発生を抑えることが出来た。

験した。その結果、同位体比は温度を上昇させたとしても、その差は 0.5‰以内となり、また標準偏謝

辞差も全く変わらなかった。そのため、温度の変化

本研究の遂行にあたり，貴重な研究助成を賜りは、同位体比にほぼ関係ないことがわかった。まました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団及た、ピークエリアは 1 %～ 12 %程度、上昇したもの

び関係者の皆様に御礼を申し上げます。また、本の、燃焼温度は感度上昇のためには、大きな効果

研究のデータは修士課程 2 年の須藤菜那さんにはないことがわかった。

よって実施されました。ここに御礼申し上げます。

また、前述したように成分に窒素が入っている
場 合、湿 式 酸 化 に て N 2 O が 生 成 す る た め、EA/

文IRMS との結果が異なるとの疑いがあるが、実際

1) Krummen M, Hilkert AW, Juchelka D, Duhr A, Schlüter HJ,
Pesch R. A new concept for isotope ratio monitoring liquid
chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass
Spectrom 2004; 18: 2260-2266.に本当にそれらが原因なのか調査した。実験は、湿式酸化した後に、細いセラミック管に Cu ワイ
ヤー（ニラコ社製）を入れ、650 ℃ で還元するシステムを導入した。このシステムにより、N 2 O は N 2に還元され、CO 2 とはピークが異なるため、もし、N 2 O の生成があれば、値は EA/IMS と LC/IRMSと近づくはずである。これらは上記のアミノ酸、カフェインを用いて実験した。結果は、還元炉を入れないシステムと入れたシステムではエリアも7 %以下の違いで、同位体比も 0.19‰以下の違いであり、ほぼ同一の結果になった。また、検出ピー
クを 44 から 28（N 2 ）にして、IRMS へのキャピラリーカラムを液体窒素を用いて CO 2 の流れを止めて、窒素のピークを検出ようと試みたが、IRMSにてピークは検出されなかった。このため、当初予測していた N 2 O の生成は考え難く、別の原因より、違いが生じたと思われた。
また、測定を繰り返しているとピークに大きなノイズが生じた。ベースラインに大きくノイズが生じるため、装置は使えない状況になってしまうなど問題が発生した。試行錯誤した結果、湿式酸化した後の冷却が空冷であるために、液体中の温献2) Cabañero AI, Recio JL, Rupérez M. Liquid chromatography
coupled to isotope ratio mass spectrometry: a newperspective on honey adulteration detection. J Agric Food
Chem 2006; 54: 9719-9727.
3) Morrison DJ, Taylor K, Preston T. Strong anion-exchange
liquid chromatography coupled with isotope ratio mass
spectrometry using a Liquiface interface. Rapid Commun
Mass Spectrom 2010; 24: 1755-1762.
4) McCullagh JS, Juchelka D, Hedges RE. Analysis ofamino acid 13C abundance from human and faunal bone
collagen using liquid chromatography/isotope ratio massspectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2006; 20:2761-2768.
5) Godin JP, Breuillé D, Obled C, Papet I, Schierbeek H,
Hopfgartner G, Fay LB. Liquid and gas chromatography
coupled to isotope ratio mass spectrometry for thedetermination of 13C-valine isotopic ratios in complex
biological samples. J Mass Spectrom 2008; 43: 1334-1343.
6) Cabañero AI, Recio JL, Rupérez M. Isotope ratio mass
spectrometry coupled to liquid and gas chromatography
for wine ethanol characterization. Rapid Commun Mass
Spectrom 2008; 22: 3111-3118.
7) Cabañero AI, Recio JL, Rupérez M. Simultaneous stablecarbon isotopic analysis of wine glycerol and ethanol
by liquid chromatography coupled to isotope ratio mass
spectrometry. J Agric Food Chem 2010; 58: 722-728.
8) Kujawinski DM, Wolbert JB, Zhang L, Jochmann MA,
Widory D, Baran N, Schmidt TC. Carbon isotope ratio
measurements of glyphosate and AMPA by liquid生体成分の炭素安定同位体比を用いた食品の産地判別
chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry.
Anal Bioanal Chem 2013; 405: 2869-2878.

93

94

浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

Identification for sugar and amino acid using LC/IRMS
Hiroto Kawashima
Systems Science & Technology, Akita Prefectural University

In 2004, liquid chromatography coupled with isotope ratio mass spectrometry (LC/IRMS) has been developed, which allows the measurement of stable carbon isotope (δ13C)
composition of highly polar and non-volatile analyses without the need for derivatization.
The interface is based on a wet oxidation of organic compounds in aqueous solution toproduce CO 2 gas, and separate CO 2 from the liquid phase. Today, LC/IRMS system has
been used for various compounds e.g., sugar, amino acid, alcohol and pesticide. Stable
isotope analysis has proved to be a powerful tool for source apportionment of variouscompounds. However, the research of precision and accuracy for LC/IRMS were very
limited until now. In addition, the potential effect of including nitrogen has not beeninvestigated.
In this study, firstly, accuracy and precision in this method were investigated in theconcentration range of Galactose, Glucose and Mannose from 3 to 67nmolC. Secondly, wemeasured sugar (6), amino acid (10) and caffeine (2) reagents using direct injection mode.
We compared direct injection mode with EA/IRMS. Finally, we measured amino acidand caffeine reagents using online LC/IRMS mode. Furthermore, we collected 12 sugar
samples in Japan, Malaysia, Thai and Bangladesh. The δ13C of 12 sugar samples werecompared direct injection mode with EA/IRMS.
The accuracy for Galactose and Glucose <0.38‰ were over 16nmolC and 3nmolC,respectively. The dates were sufficiently to be compared with the existed papers. The
determination coefficient and intercept for 6 sugar reagents between EA/IRMS and LC/
IRMS were approximately 1.0 and 0.4 (with or without phosphoric acid), respectively. The
standard deviation for 6 sugar reagents were <0.14‰. The accuracy and precision seemed
to be high for direct injection.
For amino acid reagents, there were large differences between EA/IRMS and online
LC/IRMS in no phosphoric acid, from 2.54‰ to 9.93‰. The eluent used for ICS1000 is
5mM sodium tetraborate decahydrate (pH = 9.51). Thus, when the phosphoric acid was
not added, the oxidation potential of sodium peroxodisulfate was decreasing. For caffeine
reagents, the differences of 2 caffeine reagents between EA/IRMS and all LC/IRMS
measurements (direct injection and online LC/IRMS with or without phosphoric acid) wereranged from 5.09‰ to 7.45‰. The caffeine was alkalinity in aqueous solution and highnitrogen contents (29%). The difference reason may be considered incomplete combustion
by e.g. alkalinity and produced N2 O. The δ13C of 12 samples ranged from −21.27‰ (Palsweet, JPN) to −10.66‰ (Grape sugar, JPN) and the S.D. is within 0.23‰. The samples
were categorized two groups of δ13C values: one between −10.66 and −15.13‰ derived
from plant sugar, and the other between −18.35 and −21.27‰ derived from amino acid (Palsweet). We can identify different source.