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機能性食品の開発に貢献する新しい吸収改善理論の確立と新規配合剤の開発＜平成19年度＞

機能性食品の開発に貢献する新しい吸収改善理論の確立と新規配合剤の開発
板

垣

史郎

（北海道大学大学院薬学研究院）

1.

はじめに多く存在する。機能性食品の開発において，高いエビデンスを求めることと開発費用の増大は表裏

超高齢化社会が進行するわが国では国民の最大一体である。科学的根拠に基づき，多くの健康食の関心事は健康維持に関する諸問題にあり，「病品素材に適応可能な吸収性改善理論を確立するこ気にならないように健康を維持する」という予防とは機能性食品の開発費用の削減に大きく貢献す医学への関心が高まっている。また，高齢化に伴る。

う医療費の高騰を反映し，代替医薬品としての機従来，小腸上皮の刷子縁膜構造は吸収面積拡大

能性食品市場は拡大の一途を辿っており，直近でのため物質の吸収を可能にすると解釈されてきた。

は 1 兆円規模を超えたと推測されている。市場拡

しかしながら，近年，刷子縁膜構造には様々な栄大に伴い，機能性食品の科学的根拠が重視される養物に対してエネルギーを使って吸収する輸送担ようになってきている。しかしながら，最高レベ体，すなわちトランスポータが存在していることルのエビデンスを持つ「特定保健用食品」の許可が明らかにされてきた。特に，小腸吸収上皮細胞を得るには億単位の試験費用が必要となるため，の刷子縁膜に発現し，食事摂取されたタンパク質エビデンスに乏しい製品も未だ多い。の消化産物であるジペプチドやトリペプチドの消医薬品が疾病の治療を目的とするのに対し，機化管吸収を担うオリゴペプチドトランスポータ

能性食品は疾病の予防を目的とする。機能性食品

PEPT1 は，ジ -, トリペプチドのみならず，ペプは医薬品に比べ効果が穏やかであり，副作用が少チ ド 類 似 構 造 を 有 す る b-ラ ク タ ム 抗 生 物 質 やなく，マルチターゲットであるなど，医薬品にはACE 阻害薬などの化合物をも輸送することから，ない特徴を有する。反面，効果の発現には長期間吸収改善の有力なターゲットとされている １）。の摂取を必要とする。経口投与の他にも静脈内投PEPT1 をターゲットとした消化管吸収改善の具与，経皮・経肺投与など多様な投与法の存在する体的な応用例として，パーキンソン病治療薬とし医薬品とは異なり，機能性食品の摂取法は「食て 用 い ら れ る レ ボ ド パ の Phe-ジ ペ プ チ ド 誘 導品」という性質上，経口摂取に限られる。経口摂体 ２） や，抗ウイルス薬アシクロビルの Val-エス取された化合物が生体内で効果を発揮するためにテルプロドラッグ３） 等が挙げられる。本研究では消化管から吸収され，標的臓器へと分布する必はトランスポータ制御による機能性食品成分の吸要がある。しかしながら，コエンザイム Q10 の収改善方法を構築し，標的トランスポータを効率ように試験管レベルで優れた効果を発揮するにも的に制御することのできる配合剤の開発へ貢献すかかわらず，吸収性の低さのため，摂取した場合ることを目的とした。には期待されたほどの効果が得られない化合物も

1. 1

コエンザイム Q10 とは

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

本研究では，モデル化合物として健康食品素材低下させることは吸収活性を上昇させることよりとして繁用されているコエンザイム Q10 を用いも遥かに容易であるにもかかわらず，従来のトラた。コエンザイム Q10 は元来，酸化的リン酸化ンスポータを標的とした薬物吸収性改善戦略ではにおける電子伝達系の補酵素として見出された化PEPT をはじめとする吸収トランスポータをター合物であり ４），1973 年には本邦で世界に先駆けゲットとしたものがほとんどであり，排出トランてうっ血性心不全治療薬として認可された。そのスポータに着目した例は極めて少ない。

後，2001 年に食薬区分の変更により食品成分と1. 3

本研究の方針しての利用が認可されると５），そのエネルギー産

コエンザイム Q10 の消化管吸収性はその構造生作用と抗酸化作用に注目が集まり，機能性食品から予想される値よりも低い。我々はこの点に着のなかでも特に大きな位置を占めるに至っている。 目し，コエンザイム Q10 の消化管吸収にはなん
しかしながら，従来医薬品として認可されるも，らかの排出トランスポータが影響を及ぼしている体内動態に関する知見が重要視されなかった時代と仮定した。本研究ではコエンザイム Q10 消化に承認されたため，その消化管吸収およびバイオ管排出機構の詳細を明らかにした後，その制御にアベイラビリティは非常に低く，また，消化管吸よる吸収改善方策の構築を行った収機構に関する報告も極めて乏しいのが現状であ

2.

実験方法

化合物の消化管吸収と排出トランスポー

2. 1

使用細胞

タ

ヒト結腸癌由来 Caco-2 細胞を使用した。理化る。
1. 2

小腸上皮細胞の刷子縁膜に発現するトランスポ学研究所バイオリソースセンターより購入したータは栄養成分の吸収のみならず，生体にとってCaco-2 細 胞 を 継 代 数 45-60 で 使 用 し た。Caco-2異物となる物質を排出する機能を有している。そ細胞の培養には，D-MEM に 10%（v/v）FBS, 0.1の よ う な ト ラ ン ス ポ ー タ と し て，MDR1/mM NEAA, ２ mM L-グルタミン，100IU/mL ペ

P-glycoprotein や Multidrug resistance-

ニシリン -100ng/mL ストレプトマイシンを添加

associated protein 2（Mrp2）などが挙げられる６）。 した培養液を用いた。培養は 75cm2 フラスコに栄養素の吸収を目的とするトランスポータの基質培養液 15mL を加え，37℃，５％（v/v）CO2/O2

認識性が比較的厳密であるのに対し，自然界に存下で行った。

在する多種多様な物質の排出を目的とするこれらのトランスポータの基質認識性は非常に幅広く，

2. 2

Caco-2 細胞によるコエンザイム Q10 輸送活性の測定

一部の薬物については上皮細胞中に取り込まれた

コエンザイム Q10 細胞内蓄積量の測定には 12

後，血液中に移行する前に，汲み出しによって小穴プレートで培養し，コンフルエントに達した細腸管腔側へ排出されることが知られている。それ胞を用いた。培養液を吸引除去後，37℃の HBSS

故，排出トランスポータによる汲み出しが吸収性で 2 回 洗 浄 し，HBSS を １ mL 加 え，37 ℃ で 10の低さの要因となっている薬物については排出ト分間プレインキュベーションした。HBSS を除去

ランスポータの機能制御によって，その吸収性・し，37℃のコエンザイム Q10 含有 HBSS 溶液をバイオアベイラビリティを改善できる可能性があ

１ mL 添加した。一定時間後に氷冷した HBSSる。しかしながら，トランスポータの排出活性を１ mL で 2 回洗浄し，反応を停止させた。0.5mL

機能性食品の開発に貢献する新しい吸収改善理論の確立と新規配合剤の開発の 1N リン酸：メタノール＝ 1：1 溶液により細胞を破砕，回収しサンプルとした。サンプルはヘキサンにて抽出し，HPLC にて定量した。

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3. 結果及び考察
3. 1

コエンザイム Q10 蓄積量の時間依存性

コエンザイム Q10 経細胞輸送活性の測定にはは じ め に，Caco-2 細 胞 内 へ の コ エ ン ザ イ ム

12 穴トランスウェルで培養し，TEER 値が培養Q10 蓄積量のタイムコースを検討した。その結果，開始時と比較して 300W・cm2 以上増加した細胞を細胞内蓄積量は 120 分まで直線的に増加し，その用いた。培養液を吸引除去後，37℃の HBSS 0.5後緩やかに飽和する傾向が見られた（図 1）。こmL（apical）または 1.5mL（basal）で 2 回洗浄しの結果より，以降の実験では取り込み時間を 120た後，同量の HBSS を加え，37℃で 10 分間プレ分とした。

インキュベーションした。Basal 側の HBSS を除去し，37℃のコエンザイム Q10 含有 HBSS 溶液

3. 2

コエンザイム Q10 蓄積量に対する ATP枯渇の影響を 1.5mL 添 加 し た。 一 定 時 間 後，apical 側 の小腸管腔側への化合物の汲み出しは濃度勾配に

HBSS を 100nL 採 取 し， 抽 出 を 行 い，HPLC に逆らう現象であるため，何らかのエネルギーを必て定量し，輸送量を分析した。

要とする可能性が高い。そこで，多くの排出系ト

2. 3

Caco-2 細胞によるローダミン 123 輸送活ランスポータの駆動力となる ATP に着目し，コ性の測定

エンザイム Q10 の排出に ATP を駆動力とするトRho123 細胞内蓄積量の測定には 12 穴プレーランスポータが関与しているか否かについて検討

トで培養し，コンフルエントに達した細胞を用いし た。ATP 枯 渇 剤 と し て CCCP お よ び

た。培養液を吸引除去後，37℃の HBSS で 2 回NaF+NaN3 を用いて，ATP 枯渇条件下での細胞洗浄し，HBSS を１ mL 加え，37℃で 10 分間プ内コエンザイム Q10 蓄積量の変化を検討した。

レインキュベーションした。HBSS を除去し，37

その結果，いずれの ATP 枯渇条件下においても℃の Rho123 含有 HBSS 溶液を１ mL 添加した。

コエンザイム Q10 蓄積量はコントロールに対し一定時間後に氷冷した HBSS １ mL で 2 回洗浄て有意に増加した（図 2）。この結果より，コエし，反応を停止させた。0.5mL の 1N リン酸：メ

ンザイム Q10 の排出に何らかの ATP を駆動力とタノール＝ 1：1 溶液により細胞を破砕，回収しするトランスポータ（ABC トランスポータ）がサ ン プ ル と し た。 サ ン プ ル は 遠 心 分 離 後，関与していることが示唆された。

Multilabel counter を用いて測定した。

図1

Caco-2 細胞へのコエンザイム Q10 取り込みの時間依存性

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3. 3

浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

図2

Caco-2 細胞へのコエンザイム Q10 の取り込みに対する ATP 枯渇剤の影響

図3

Caco-2 細胞へのコエンザイム Q10 の取り込みに対する MDR1 阻害剤の影響

コエンザイム Q10 蓄積量に対する MDR阻害剤の影響

Caco-2 細胞刷子縁膜に存在する ABC トランス
ポ ー タ と し て は，MDR1, Mrp2, Breast Cancer
Resistance Protein（Bcrp）が挙げられる。このなかで比較的脂溶性の高い化合物を輸送する
MDR1 に着目し，その代表的阻害剤を用いて，コエンザイム Q10 の蓄積量に与える影響を検討した。その結果，ローダミン 123（Rho123），ジゴキシン及びキニジンの共存によってコエンザイ

図4

Caco-2 細 胞 に お け る Basal to Apical 方 向 の コ エ ン ザ イ ム
Q10 の輸送に対する MDR1 阻害剤の影響

ム Q10 の蓄積量を有意に増加させることが可能であることが明らかとなった（図 3）。この結果

MDR1 は排出トランスポータであるため，輸より，Caco-2 細胞刷子縁膜におけるコエンザイ送活性の評価として Basal から Apical への経細ム Q10 の 排 出 に MDR1 が 関 与 し て い る こ と，胞輸送に着目した検討が行われることが多い。そMDR1 がコエンザイム Q10 の吸収改善に際し，こ で，Caco-2 細 胞 に お け る コ エ ン ザ イ ム Q10有力なターゲットとなる可能性が示唆された。

Basal か ら Apical へ の 経 細 胞 輸 送 に 対 す る

3. 4

コエンザイム Q10 の経細胞透過に対する

MDR1 阻 害 剤 の 影 響 を 検 討 し た。 そ の 結 果，

MDR1 阻害剤の影響

MDR1 阻害剤である Rho123 およびキニジンの共機能性食品の開発に貢献する新しい吸収改善理論の確立と新規配合剤の開発

図567

Caco-2 細胞への Rho123 の取り込みに対するコエンザイム Q10 の影響

存 に よ り， コ エ ン ザ イ ム Q10 の Basal か らり込みが増加することを明らかにした。したがっApical への透過係数は有意に減少した（図 4）。て，小腸上皮細胞の刷子縁膜に発現するトランス

この結果はコエンザイム Q10 が MDR1 に基質とポータの機能を制御することが機能性食品素材のして認識されることを示しており，取り込み実験吸収性を向上させるアプローチとして十分意義がの結果ともよく合致した。

あることを示すことができたと考えている。配合

MDR1 の基質に対するコエンザイム Q10剤など，機能性食品素材としてのトランスポータの影響機能制御剤を選択する上で重要な点は，高い安全3. 5

コエンザイム Q10 が MDR1 の基質となること性を有すること，長期的に経口摂取することがでが強く示唆されたことから，コエンザイム Q10きること，直接的にトランスポータの機能を抑制が MDR1 阻害剤としても働くか否かについて検すること，などが挙げられる。これらの点を踏ま討を加えた。実験としては，MDR1 の基質であえ，現在は高い MDR1 選択的阻害作用を有するる Rho123 の Caco-2 細胞内蓄積量に対するコエ食品成分の探索に取り組んでいる。

ン ザ イ ム Q10 の 影 響 を 評 価 し た。 そ の 結 果，近年，薬と機能性食品の組み合わせによる事故

Caco-2 細胞への Rho123 の取り込みはコエンザイが問題になりつつあるなかで，機能性食品に関す

ム Q10 の 存 在 下 で 有 意 に 増 加 し，Rho123 のるさまざまな情報を直接的に医療現場の薬剤師，apical 側への排出が阻害されることが示唆された

医師，栄養士，消費現場の消費者（国民）から収（ 図 5）
。 こ の 結 果 よ り， コ エ ン ザ イ ム Q10 は集・調査するとともに，臨床解析や科学的な分MDR1 阻害剤としても働く可能性が示唆された。

析・評価を加えてゆく，新たな研究領域が生まれ

4. まとめつつある。この領域においては情報の共有が重要な意味を持つため，科学的根拠のある健康食品情

機能性食品は効能効果を表記できないため，企報を医療従事者に提供するシステムの構築・運用

業側はそのエビデンス確立には時間・費用を費やが試みられている。これらのデータベースでは，さない傾向にある。本研究では，薬学的視点から主に薬と機能性食品の相互作用による有害事象に消化管吸収の第一段階である細胞への取り込み過焦点が当てられているが，化合物がもたらす副作程に焦点を当て，機能性食品素材として繁用され用と効果は表裏一体であり，機能性食品の薬剤性ているコエンザイム Q10 の消化管吸収に排出ト

副作用惹起機構に関する知見から機能性食品の吸ランスポータ MDR1 が関与していることを明ら

収改善という視点での研究を展開することも可能かにし，その制御によりコエンザイム Q10 の取であろう。

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）
文謝辞献１） Nakanishi T, Tamai I, Takaki A and Tsuji A, Cancer

本研究を遂行するにあたり，多大なる研究助成を賜りました財団法人浦上食品・食文化振興財団

cell-targeted drug delivery utilizing oligopeptide transportactivity. Int. J. Cancer 88：274-280（2000）.
２） Tamai I, Nakanishi T, Nakahara H, Sai Y, Ganapathy

並びに関係者各位に心から感謝を申し上げます。

V, Leibach FH and Tsuji A, Improvement of L-dopa

それと共に，貴財団の将来にわたる益々のご発展absorption by dipeptidyl derivation, utilizing peptideをお祈り申し上げます。

transporter PepT1. J. Pharm. Sci. 87：1542-1546（1998）.
３） Balimane PV, Tamai I, Guo A, Nakanishi T, Kitada H,Leibach FH, Tsuji A and Sinko PJ, Direct evidence for

研究助成による成果

peptide transporter （PepT1）-mediated uptake of a

Itagaki, S., Ochiai, A., Kobayashi, M.,

nonpeptide prodrug, valacyclovir. Biochem. Biophys. Res.

Sugawara, M., Hirano, T. and Iseki K.

Commun. 250：246-251（1998）.
４） Crane FL, Hateﬁ Y, Lester RL and Winder C, Isolation

Interaction of Coenzyme Q10 with the intestinalof a quinone from beef heart mitochondria. Biochim.

drug transporter P-glycoprotein. J. Agric. FoodBiophys. Acta 25：220-221（1957）.

Chem. 56：6923-6927（2008）.
板垣史郎
平成 20 年度

５） 平成 13 年 6 月 28 日付食基発第 20 号医薬局食品保健部基準課長通知「「医薬品的効能効果を標ぼうしない限り食品と認められる成分本質（原材料）」の取扱いについて」

日本薬学北海道支部奨励賞受賞

６） Katsura T and Inui K, Intestinal absorption of drugs

講演「カルボン酸系薬物の消化管吸収・分泌機構

mediated by drug transporters: mechanisms andの解析」

regulation. Drug Metab. Pharmacokinet. 18：1-15（2003）.

Establishment of the new strategy to improve the intestinal absorption of functional food components anddevelopment of the new combination preparation

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Establishment of the new strategy to improve the intestinal absorption of functionalfood components and development of the new combination preparation
Shiro Itagaki（Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University）

Coenzyme Q10（CoQ10）is very widely consumed by humans as a food supplement
because of its recognition by the public as an important nutrient in supporting humanhealth. However, CoQ10 is taken up from the intestine into the circulation at a low rate. Theabsorption of compounds from the gastrointestinal tract is one of the important
determinants for oral bioavailability. When the absorption of a drug candidate is poor,
various approaches to improve absorption are undertaken. The oligopeptide transporter
PEPT1 is predominantly expressed in the brush-border membranes of small intestinal
epithelial cells, where it plays pivotal roles in the efficient absorption of di-/tripeptides.
PEPT1 has enormous potential as an oral drug delivery target, because it also mediates theintestinal absorption of peptide-mimetic and nonpeptide substrates. Secretory transport
limits the oral bioavailability of certain drugs. However, there have been a few studies on
the modulation of efflux transporter in order to improve the intestinal absorption oftherapeutic agents. We focused on intestinal efﬂux transporter, MDR1/P-glycoprotein. We
tried to improve intestinal absorption of CoQ10 by modulating the efﬂux transporter. In thisstudy, we used Caco-2 as a model in which to study intestinal absorption of CoQ10. The
uptake of CoQ10 into Caco-2 cells was signiﬁcantly increased in ATP-depleted conditions
and in the presence of MDR1 inhibitors. Furthermore, the uptake of rhodamine123（Rho123）, a typical substrate for P-gp, was signiﬁcantly increased in the presence of CoQ10.
Moreover, Rho123 signiﬁcantly decreased the basal-to-apical transport of CoQ10 by Caco-2cells. These data have provided a new aspect of the strategy to improve the intestinal
absorption of functional food components that merit further investigation.