浦 上財 団 研究 報 告書VoLl3(2005)

104〈平成16年度〉

培 養細 胞 を用 いた 迅速 で精 度の 高い麻 痺性 貝毒 試験 法 の開発 に関す る研 究
奥村正直・ 都築秀明

・富田伴一

(愛知県衛生研究所毒性部)

1.はじ めにい試験 法 を開発す るこ とを本研究 の 目的 と した。
2.材料及び 方法

る麻痺 性 貝毒 は,主 に神経 細 胞 な どの細 胞膜 の2.1細胞培養Nàチ ャン ネルを阻害 して神経 ・筋伝 達を ブロ ッ

供 試 した マ ウ ス由 来 神経 芽 細 胞(Neuro2a,

海洋性 天然毒 の うち,主 と して二枚 貝に起 因す

クする結 果,呼 吸麻痺 を起 こ し,ま た,フ グ毒 とATCCCCL131)は,大日本製 薬か ら入手 し,そ同 じ薬理作 用 を有す る致 死性毒 であ る'1。の継 代方 法はMangerらの方 法5を 一 部改 変 して行 った。細 胞は,1%のペニ シ リン・ス トレプ トマ

貝類 におけ る麻痺性貝 毒 の発 生 は,我 が 国のみならず,欧 米,ア ジア,及 び中南米 地域で も報告21

イ シ ン(Gibco)をされてい こ とか ら,国 産 ・輸 入を問 わず毒化 した(Gibco)添 加RPMII640培

貝 類の国 内で の流通 を未然 に防止す るこ とが,食37℃ 条件 下の5%炭品衛生上重 要 な課題 となっ ている。

沢製 作所)で 継代培 養 を行 った。 また,細 胞毒性我 が 国 の食 品衛 生 法 では,麻 痺 性 貝毒 の試 験法3ト(公定法)は マ ウスを用 いるこ とにな ってい る

添 加 した10%ウ

シ胎児血清地(Gibco)を用いて酸 ガス培養 器(CPD‑170,平試 験 時 は,血 清無 添 加 のRPMII640培

地 を用 いた。

が,近 年,動 物 愛護の 観点か ら も実験 動物 の使用

2.2被は社会通 念上 困難に なって きてい る。

愛 知県三 河湾内 で採補 された アサ リ30件 を公 定

験液 及び標準 麻痺性 貝毒の調 製

これ ま で,機 器 分析 に よ る麻痺 性 貝毒 の検 査

法 によ り処 理 して被 験液 を作製 し,さ らに,限 外法iが 開発 されて いるが,そ の毒成 分は20種 程度

ろ 過 フ ィル ター(分 子 量10,000,Ultrafree‑MC,で構 成 され るた め,毒 素 の検 出条 件 を変 え る なMillipore)で 処理 した。

ど,分 析 に要す る時 間ある いは標準毒 素の入 手の標 準麻痺性 貝毒 と して,和 光純 薬の ゴニ オ トキ

困難 さ等 の問題 があ る。 また,免 疫抗 体法 では抗シ ン混合 液(GTX1.1,0.5μM)をO.OIM塩

体 の特異性 の ゆえに個 々の毒素 を一 度に反 映す る光純 薬)を 用いて 公比3で 希釈 して調製 した。

酸(和有 効な試験 法が ない のが現状 であ る。一方,一 度2.3細に多検体 が処理 で きる培 養神経 細胞 を用い た試験

方 法は,96穴 マ イ クロプ レー トに培養 細胞 を播

胞毒性 試験法;.r,も開発 されて いるが,検 査時間 と して 少な く種(5×10;/well)し,10%ウ

とも24〜48時 間程度 を必要 と してい る。そ こで,

RPMII640培

シ胎児血清添 加

地 を加 えて1晩 前培 養 した。

この試験 法 を即 日で検 査を終 了で きる ように改良

被験 液あ るい は培 養液等 の試薬 類の使 用量 を,を加え るこ とで,比 較 的簡便 ・迅速 な だけでな く,これまでの 方法 に比 べて半 量にす る試験 条件 を設公 定法で あ るマウス試験 より高感度 な汎用性 の高定 した。す なわ ち,被 験 液(5ul),lmMウ

アバ

培養細胞を用いた迅速で精度の高い麻辣性貝毒試験法の開発に関する研究
イ ン(Sigma)+10mMベ(0/V,10‑15,ul)及ラ ト リ ジ ン(Sigma)
び血 清無添加RPMII640培

105性の抑 制がみ られ たが,低 濃 度の毒 素ほ どよ り強地

い抑 制効 果が 得 られ た。こ のこ とか ら,MTXのを加 えて総 量100u1と した後,6時 間炭 酸 ガス 培

存在 下 で よ り強 い相 関性 が 得 られ る結果 となっ養 を行 っ た。な お,培 養終 了15分 前 に15nMマ イた。

トトキ シン(MTX,和光純 薬,7.5,ul)を 加 えてさらに培養 し,培 地で軽 く洗浄 した後,細 胞活 性測定 試薬(WST‑8,同仁 化学,10,ul)と培地(90,ul)

を加 えて さ らに60分間培 養 した。 その後,反 応 停止液(0.1MH̲>SO,和光純薬,50,ul)を

加 えてマ

イクロ プレー トリーダ(MPR‑A4ill,東吸光 度(450nm)をソー)で測定 し,細 胞活性 を求 めた。

本 試験法 の有効性 を検 討する ため,公 定法 によ

以上 の結 果 か ら,以 後 の細胞 毒性 試験 はMTX添加0/V(H)の3.2検条件 で実施す る ことと した。

出感度

図1に 示す よう に,本 試験法 での検 出感度 は,
標準 麻痺 性 毒 素の 検 出可 能範 囲 がo.i〜17.5MU/mlで あ り,そ の う ち,良 好 な直 線性 を示す02〜5.8MU/mlが有 効検 出範 囲 と考 え られ たので,以後の細 胞毒性試 験で は,こ の範 囲 より高い毒性 をり既 に結果 が得 られて いる冷凍保 存 した アサ リ30

示す検 体 につ いて は,0.OIMHCIで検体 を被験 液 として細胞毒 性試験 を行 った。標 準後に有 効検出範 囲 に入 るよ うに して試験 を行 って毒素 検量線 か らそ れぞれ の毒力 を求め,そ こで 得

毒 力 を算定 した。 なお,本 法 での有効 検出下 限値られた結果 と公定 法の結 果 とを比較 した 。なお,

0.2MU/mlは

標 準毒 素 の 公 定 法 に よる毒 力 は175マ ウス 単 位5倍 の 感度で あった。

(MU)/mlで3.3試あ った。 さらに,貝 毒 に よって惹 起

され る培 養 細 胞の 形態 の変 化 につ いて も観 察 した。

適宜希 釈 した公定 法 の下 限値0.9MU/mlに比べ約験 の有用性アサ リ30件 の検体 を用 いて,本 試験 法 と公 定法
であ るマウス試験 法 において得 られ た毒 力の 値で3.結比較 検討 した ところ,図2に果示 す ように良好 な相関性 が 認め られ た。 と りわけ,比 較 的低毒力 の範
3.1試

験方法 の検討囲(10MU/ml以測 定条件 として,試 験 に際 してNa↓チ ャ ンネル下)で は,本 試 験法 と公定法 との結 果は よ く相 関してい た。た だ し,ア サ リ30検体を 阻害 す るた め に使 用す るO/V混 合液 の 量 を15ul添 加(0/V(H))と10μ1添を比べ る と,図1にで は,O/V無加(0/V(L))と示す標 準毒素 の用量 反応 曲線

添 加(0/V(O))では毒素 に よる用量反応 は認 め られ なか った。 しか し,0/V処

置を行 った場 合 は,ほ ぼ同 様 な用量 相 関 を示 した。
0/V(H)の傾 きは,0/V(L)に比 べて よ り強 い

結 果 と な っ た。 さ らに,MTXを7.5,ul添と,MTX単てそ の活性 はお よそ5%の未公 表)。一方,0/V(H)及もにMTX無加する

独 投与細 胞で は,無 処置 の細 胞に比べ低 下で あった(デ ー タび0/V(L)投添加 時に比べ る とMTXに与とよる細胞 活図i細胞毒性 試験法に より得られた標準麻痺性貝毒の用量反応曲線(各 プロットは.平 均値±標準偏差 を表す、〉

106

浦一
ヒ財 団 研究 報告 書VoL13(2005)b)。 一方,MTX単独処 置で は,細 胞 のわず か な膨化 は認め られる ものの無 処置 とほぼ同様 の形態
であ った(デ ー タ未 公表)。 さ らに,0/VとMTX
同時 処置 では,麻 痺性 貝毒(GTXI。 又は貝 毒毒 素陽1生検体)が 存在 しない場 合あ るいは極 く低濃 度の存 在下で は,培 養6時 間後で は各ウ ェル内の大半 の細胞で の膨化 に加 え核 濃縮 や消失 などが認 められたが(図3c),毒素 の濃度 に比例 して細胞 の形態 を観察 する限 り,そ れ らの正 常性 はほぼ保 た
れ ていた(図3d)。

図2細4.考胞毒性試験法とマ ウス試験法による毒力の比較(破 線は麻痺性貝毒の規制値(2NIUml)を示す.)

察培 養細胞 を用 いた麻痺性 貝毒 試験法の 有用性 にの うち,マ ウス試験法 で検 出感度以 下 となった10

つ いては,こ れ まで 報告 三'7さ れてい る とお りで件につ いて は,マ ウス試験法 での検 出下 限値でああ るが,今 回は主 に試験 時間の 短縮 につ いて検 討る0.9MU/mlとを加 えた。感 度に 関 して も従 来の報 告.;と3.4培

み なして計上 した 。

養細胞 の形態ほぼ同様な結果 であ り,時 間短縮 によるデ メ リッ トは培養細 胞 の試験開始6時 間後の形 態像 は,培 養認 め られ なか った。 さらに,今 回検討 した試験 で液添加 のみ の無処置 では神経 細胞特 有の紡 錘形〜

使 用す る培 地 を半 減す るこ とによ り低 コス ト化 を楕円形 であ ったが(図3a),O/V単図る ことが 可能 となっ た。 とりわけ,培 地 に10%

独処置 では細胞質の 膨化 した大小 不同の類 円形 であ った(図3

図3細a:無処 置 対照,bOV単の割合で添 加す るウ シ胎児血清 は,ウ シのBSE問胞Rz'P̀1:試験でフ レー ト内にみ られた各条件下での細胞形態の差違 〔×201
独 処 理,c極

低濃 度 麻 卿'1ゾi;具毒 添bn.d高濃 度 麻 痺 性 貝 毒 添 加.0=ウ

ア バ イン、‑;ベ ラ ト リジ ン

培養細胞を用いた迅速で精度の高い麻輝性貝毒試験法の開発に関する研究

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題 によ り,国 際的 な供給量 の激減 に伴 う高騰化 か試験 法 を,公 定 法に対す る スクリーニ ング としてら,そ の削 減効果 はか な り大 きいもの となった。

用いれ ば,マ ウスの供試 数 を減 らす ことがで きる

添加量 をことか ら,本 法 は有用 な試験法 と考 える。以 上の2倍 に増や したが,こ の増 加が麻痺 性貝毒 の検 出

成果 に加 えて,本 研究 で検討 した培養細 胞 を用いにあ た り,そ の短縮 化 に大 きく寄与 した と思わ れる。 すなわ ち,こ れ らの化 合物 によって培 養細胞る試験法 は,こ れ まで さ らに改 良を加 えた結 果,一連の麻 痺性貝毒 試験 を5時 間で完了 で きる 方法のNa一チ ャンネ ルゲー トが解 放 され,細 胞 内へ のがほぼ構 築で きた。

今 回の試験 法の改 変 において,0/VのNa〒の 流入 が増 える とされ るが,O/Vの用量 依存

我 が 国での麻痺 性貝毒 の発生 は,近 年,そ の広性 にその作 用が充進 し,検 出時 間の短縮 につ なが域 化の みな らず周 年化の 傾向 にあるi°。加 え て,った もの と思われ る。 なお,上 述 した0/V使 用量

今後海外 か らの 食品輸入 の需要 も増す と思わ れ,につ いては,本 研究 で は試験 法全体 につ いての試

公衆 衛生 の観点 か らも,今 後,他 の海洋 性天 然毒薬類 の使用量 を半減 して いるため,相 対 的に倍量を含め た被害防 止に向 けた対策 が重要 になる ことを使用 する こ とにした として も,使 用す る絶対量から,よ り簡便 で感度 の高い検 査法の 開発が 望まとしては従 来の試験 法5'61と同量 にな る。

れる。

一 方,今 回使 用 したMTXはシ ガテ ラ といわ れる海洋性 天 然毒 の1種 で あ り,そ の作用 はチ ャン

謝

ネル非 依存性 のCa++代 謝昂 進作用 を持つ8に とか

本研究 にあた り,多 大 なる理解 と研究 助成 を賜辞ら,試 験 時 に加 えられた0/Vに よってNa+チ ャン

りま した浦上食 品 ・食文 化助成 財団 ならび に関係

ネ ルが 解放 され る結果,活 性 の 低下 した細 胞 を各位 に厚 くお礼 申 し上 げます。

MTXの添 加 によ りCa++代 謝が昂 進 し,相 乗 効果に よって細 胞 を疲 弊 させ るが,Nゴ チ ャ ンネル を阻害す る麻痺性 貝毒 が培地 中に共存 する場 合 には追記

本研究 の成果 は,Toxicon46(2005)93‑98に掲

載 され ま した。

細胞活性 の低 下が比 較的抑 制 され,よ り明瞭 な麻痺性 貝毒 に よ る用量 相 関が 得 られ た もの と考 え文献1)KaoCY(1993)In:FalconerIR(Ed)AlgalToxinsinる。
本試 験法 は,感 度の 点か らはHPLCなどの機器

SeafoodandDrinkingWater.AcademicPressInc,SanDiego,CA,USA,pp75‑86.

分析法31に,簡 便性 の点か らは免疫 学的手 法で あるELISA法9'などに比 べ てやや難点 があ る。 しかし,麻 痺 性貝毒 がサ キ シ トキシ ンと約20種 の誘導

2)LehaneL(2000)ParalyticShellfishpoisoning:AReview.
NationalOfficeofAnimalandPlantHealth.Agriculture.
FisheriesandForestry.Canberra.Australia,pp26‑43.
3)厚体か ら構 成 され,毒 素 の構成比 も多様Pで あ ることか ら,い まだにマ ウス を用い る試験 法 が世界標
準か らはずせ ない実 態があ り,生 物 試験 の有用性が残 されて いる。

生 省 環 境 衛 生 局 乳 肉 衛 生 課(1980)麻痺 性 貝 毒 検 査 法:

麻 痺 性 貝 毒 等 に よ り 毒 化 し た 貝 類 の 取 り扱 い に つ い て.環
乳 第29号(昭和55年7月1日)pp1‑12.

4)OshimaY(1995)Postcolumnderivatizationliquid
chromatographicmethodforparalyticshellfishtoxins.78(2),528‑532.

今 回の培 養 細 胞 を用 いた 麻痺 性貝 毒 試験 法 で5)dangerRLetal.(1995)Detectionofsodiumchannel

は,8時 間以 内に試験 結 果が 得 られる こ とか ら迅

toxins:directedcytotoxicityassaysofpurifiedciguatoxins.

速な行 政対応が 可能 とな った。今 回検討 を加 えた

brevetoxinssaxitoxinsandseafoodextracts.J.AOACInt..

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浦 上財 団研 究 報告 書Vo1.13(2005)

78(2).521‑527.
6)JellettJFetal.(1992)Paralyticshellfishpoison(Saxitoxinfamily)bioassay:automatedendpointdeter‑urinationandstandardizationoftheinvitrotissueculturebioassay,andcomparisonwiththestandardmousebioassay.Toxicon,30(10).1143‑1156.
7)MangerRLetal.(2003)Detectionofparalyticshellfish
poisonbyrapidcellbioassay:antagonismofvoltage‑gatedsodiumchannelactivetoxinsinvitro.J.aOACInt.,86(3),540‑543.
8)YasumotoT(2001)Thechemistryandbiological
functionofnaturalmarinetoxins.ChemRec.1.228‑242.
9)UsleberE(2001)Immunoassaymethodsforparalytic
shellfishpoisoningtoxins.J.AOACInt.84(5)1649‑1655.
10)水産 庁 漁 場 資 源 課(1997>平検 討 会 議 資 料.

成8年

度貝毒対 策事業結 果

AnEstablishmentofRapidDetectionMethodforParalyticShellfishPoisoning
ToxinsbyCellBioassay

109

AnEstablishmentofRapidDetectionMethodforParalyticShellfishPoisoning
ToxinsbyCellBioassay

MasanaoOkumura,HideakiTsuzuki,Ban‑ichiTomita(AichiPrefecturalInstituteofPublicHealth)

Wereportherearapiddetectionmethodforparalyticshellfishpoisoning(PSP)toxinsusingculturedneuroblastomacellline,modifiedfromthebioassaysystempreviously
establishedbyMangeretal.(1995,J.AOACInt.,78(2),521‑527).Inthepresentstudy,weattemptedtofurthermodifytheirmethod.Therearetwomajormodificationstotheprevious
method:thefirstistheuseofmaitotoxin,akindofmarinetoxinsofciguaterafishpoisoning,whichenablestoshortentheincubationperiodto6hourswhenappliedtothemicroplate15
minutespriortotheendoftheincubation.ThesecondistheuseofWST‑8,adehydrogenase
detectingwater‑solubletetrazoliumsaltfordeterminingthetargetcellviability,whichpermitstheomissionofawashingstepandsimplifiesthecountingprocess.Inaddition,weattemptedtoreducetherequiredmaterialsasmuchaspossible.Thus,ourmodifiedmethod
wouldbeusefulforscreeningthePSP‑toxinsinshellfish.