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浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）＜平成 29 年度助成＞

腸管出血性大腸菌を保菌しない家畜を育てるための腸内フローラ研究

井口純（宮崎大学 農学部 畜産草地科学科）

背や保菌を抑制することは複数の研究で報告されてい景る。また同一飼育環境下であっても EHEC を排菌す
腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia

る牛と排菌しない牛が存在することが知られていcoli ：EHEC）は下痢症や出血性大腸炎を引き起こし、る。このような家畜牛と EHEC の関係には、個々の患者の一部は重症化して死に至ることから、最も注牛における腸内細菌叢の動態が大きく関与している意が必要な食中毒原因細菌の一つに挙げられる。こものと推測されるが、これまでに細菌叢の特徴を調れまでの調査・研究などから EHEC の主な保菌宿主べた報告は少なく、EHEC 定着の促進や阻害に関与は家畜牛であると考えられており、農林水産省が平する菌群も特定されていない。これら菌叢の特徴が成 19 年度に実施した「肉用牛農場の EHEC 保有状明らかになれば、EHEC 清浄化に向けた有用な情報

況調査」によると、国内 2,436 頭（406 農場）のうとなり、畜産物を含む食品の安全性確保に大きく貢ち、228 頭（9.4%）から EHEC が分離されている 。

献できると考えた。そこで本研究では「EHEC 非排畜産物が消費者へ流通するまでの様々な箇所で菌牛のフローラ特性の解明」と「EHEC 排除に有効EHEC 対策が講じられているが、国立感染症研究所な生菌材の開発」を目指した。

1)の報告によると、EHEC 感染者数は 2009 年以降毎年 4,000 件前後で推移しており、死亡者は 2009 年

材料と方法から 2015 年の間で 49 名に上る。2011 年には、富山県等の焼肉チェーン店で提供された「牛ユッケ」

１．供試検体が原因と考えられる EHEC による食中毒事件が発生

大阪市食肉衛生検査所および宮崎大学農学部附属し、5 名が死亡した。この事件を受けて、食品衛生

住吉フィールド（附属牧場）で採材した牛糞便計 60法に基づく新たな規格基準（2011 年 10 月には「生検体（60 頭由来）を用いた。検体は採材直後から 4℃食用牛肉の提供規制」、2012 年 7 月には「牛生レバーで保存し、採材後 4 日以内に下記 2、3、4 の作業をの提供禁止」）が定められた。しかし、この対策後始めた。

も感染者数は減少しておらず、本菌の感染経路の多様性が示唆されるとともに、EHEC 感染被害を低減

２．志賀毒素遺伝子の検出するためには個々の食品に対する注意や規制だけで糞便を等量の生理食塩水と混和し、一白金耳程度はなく、抜本的な対策が必要であると考えられた。

を DHL 寒天培地（日水製薬株式会社）に塗抹し、対策の一つとして、EHEC 保菌牛の絶対数を減ら37℃で 18 ～ 24 時間培養した。培養後、生育したすことができれば、ヒト感染者数の低減につながる菌床を掻き取って 400 µl の生理食塩水に懸濁し、アと考えられた。そのためにはまず保菌牛の特徴を知ルカリ熱抽出法により DNA を抽出した。また、糞る必要がある。排菌牛に対して抗菌効果を有する飼便 4g を mEC 液体培地（日水製薬株式会社）36ml

料添加物や生菌剤の給与が、一時的に EHEC の排菌に加えて 37℃で 18 ～ 24 時間培養し、その培養液

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1ml からアルカリ熱抽出法により DNA を抽出した。

式会社）に塗抹し、37℃で 48 ～ 72 時間嫌気培養

両手法により抽出した DNA を用いて、EHEC の遺伝した。生育したコロニーを各培地から最大 3 コロ子マーカーである志賀毒素遺伝子（stx1 と stx2 ）をニー釣菌して増菌し、使用するまで -80℃で保存し標的とした PCR 2) を行なった。両方またはどちらかた。菌種は 16S rRNA 配列（1,400bp 程度）を決定

一方の抽出 DNA で陽性となった検体を EHEC 保菌して同定した。

検体とした。

５．EHEC 生育試験
乳酸菌を MRS 液体培地で 2 日間培養し、その菌３．菌叢解析
糞便 0.25 g から DNeasy PowerSoil Kit（キアゲン）液を 0.22 µm 穴フィルターでろ過した。ろ過液 1.5を用いてトータル DNA を抽出した。アダプター配列

ml と LB 液体培地 3 ml を混和して試験液とした。

（Illumina flowcell adapter, イルミナ）を付加したプライ試験液の pH は 4.0 〜 4.5 であったため、コントロー

マー（515F_Microbiome：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA、ル（LB 培地と菌未接種 MRS 培地の混和液）も pH 4.5806rcbcXX：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）を用いて、に調整した。LB 培地による EHEC O157（Sakai）の16S rRNA 遺伝子の V4 領域を標的とした増幅を行っ

前培養液 45 µl を試験液に摂取して 37℃で培養し、た。増幅産物を MinElute 96 UF PCR Purification Kit

0、１、2 時間経過時の菌数を測定した。

（キアゲン）を用いて精製し、各検体の濃度が均一になるように調整して、MiSeq によるシーケンシン結果と考察グを行った。得られた配列情報を用いて、SILVA
デ ー タ ベ ー ス（11） に 基 づ い た 菌 叢 解 析 と OTU

本研究では、図１で示すように同一検体から 3 種（Operational Taxonomic Unit）解析などを実施した。

類の実験を同時に開始し、EHEC の保菌調査と菌叢解析の結果を踏まえて、保存しておいた乳酸菌を用いた EHEC O157 への生育阻害試験を行なった。

４．乳酸菌の分離
糞便を等量の生理食塩水と混和し、一白金耳程度を乳酸菌用選択培地である MRS 寒天培地（Difco）と TOS プロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株

図1

１．EHEC の保菌調査
志賀毒素遺伝子を標的とした PCR の結果、stx1研究の流れ

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図2Vol.26（2019）

菌叢解析の結果（属レベル）

単独陽性は 7 検体（12 %）、stx2 単独陽性は 17 検かった。代表的な乳酸菌である Lactobacillus 属は体（28 %）、stx1 と stx2 の両陽性は 6 検体（10 %）EHEC 保菌検体の 18 検体、非保菌検体の 22 検体、となり、30 検体（50 %）で EHEC の保菌が確認されBifidobacterium 属は保菌検体の 5 検体、非保菌検体た。残る 30 検体（50 %）で EHEC は検出されなかっの 8 検体で確認された。

た。一部の検体について EHEC の分離を試みたところ、ヒトへの感染事例が多数報告されている EHEC

３．乳酸菌の分離

O157、O111、O121 をはじめ、散発的な感染事例

1 と 2 の結果を基に、6 つの非保菌検体を選抜し、報告がある O91、O113、O156 などが分離された。

それぞれから分離した乳酸菌（計 30 株）を同定したと本試験により、牛における EHEC の高い保菌率が確、Lactobacillus
ころ、Streptococcus lutetiensis（10 株）認された。

ruminis （7 株）、L. reuteri （5 株）、S. pasteurianus（4 株）、L. plantarum （3 株）、L. animalis （1 株）で２．菌叢解析あった。この中で 48 時間の嫌気培養において十分それぞれの検体から 20,000 リード以上を取得し、L. ruminisな増殖が確認された S. lutetiensis （3 株）て菌叢解析に用いた。主要な菌属（または科）とし（3 株）、S. pasteurianus （1 株）、L. plantarum （1 株）、Bacteroidaceaeては、Ruminococcaceae 科（属不明）の計 8 株を選抜し、次の EHEC 生育阻害試験に用い科（属不明）、Clostridium 属、Treponema 属などがた。

確認された。1 の結果を基に、EHEC 保菌検体と非保 菌 検 体 に 区 分 し（ 図 2）
、細菌叢間のα多様性

４．EHEC O157 への生育阻害試験（Shannon index 値の比較）およびβ多様性（主座標

試 験 開 始 時 の EHEC O157 の 菌 数 は 1.0 × 106

分析：Principal Coordinate Analysis：PCoA）をグルー

CFU/ml 程度であり、コントロール試験液（pH 4.5）

プ間で比較したところ、明らかな違いは見られな

では、試験を通して顕著な増減は確認されなかった

腸管出血性大腸菌を保菌しない家畜を育てるための腸内フローラ研究

図365

乳酸菌培養液の添加による EHEC O157 生育への影響（図 3）。一方、L. ruminis 3 株、L. plantarum 1 株、S.に有効であるかもしれない生菌材候補株が分離されpasteurianus 1 株では 2 時間後に 1/10 以上の減少た。今後は、未評価の乳酸菌分離株を用いた EHECが見られた。特に L. ruminis の 1 株と S. pasteurianusへの阻害評価を継続して行う予定である。それらのでは、1 時間後に生残している EHEC O157 は確認結果を踏まえて有用な乳酸菌数株を選抜するとともされなかったことから、EHEC に対する高い生育に、阻害効果の原因物質を特定していきたい。さら阻 害 性 が 確 認 さ れ た。S. pasteurianus は 現 在、S.に、各株の安全性とゲノム構造の特徴を確認した上

gallolyticus subsp. pasteurianus と分類されており、で、農場における家畜牛へのカクテル生菌材の投与ヒト腸内の常在菌の一つとして知られている。プロ試験へとつなげていきたいと考えている。

バイオティクスとしての利用はこれまでに報告されていないが、EHEC に対する高い生育阻害性が確認されたことから、有効な生菌材として利用できる可能性が示唆された。

謝辞
本研究を行うにあたり、多大なご援助を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。

今後の展望
参考文献

本研究では、EHEC 保菌牛と非保菌牛の間で特徴的な菌叢の違いは確認されなかった。しかしながら、非保菌牛から分離した乳酸菌の中に、EHEC の制御

1) Sasaki Y et al. Vet Microbiol. 2011. 2;150:140-145.
2) Cebula TA et al. J Clin Microbiol. 1995. 33:248-250.

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Vol.26（2019）

Understanding bovine microbiota to raise livestock that do not carryenterohemorrhagic Escherichia coli
Atsushi IGUCHI
Department of Animal and Grassland Sciences, Faculty of Agriculture
University of Miyazaki
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is one of the most importantgroups of food-borne pathogens worldwide, as it can cause gastroenteritis,which may be complicated by hemorrhagic colitis or hemolytic-uremicsyndrome (HUS). EHEC O157, O26, O111, O103, O121, and O145 are themajor serotypes responsible for outbreaks and sporadic cases. Bovine areconsidered to be a primary reservoir of EHEC. In order to prevent EHEC
infection, countermeasures are taken at various places from farm to table.
However, the number of patients has not decreased from roughly 4,000, formore than 10 years. If the characteristics of the microbiota of EHEC-shedding(or non-shedding) bovine are clarified, it will serve as useful information forcontrolling EHEC at the most upstream point of the food chain. When weanalyzed fecal samples collected from 60 bovine, 30 were positive for EHEC (stxgenes), while the remaining 30 were negative. A microbiota analysis targeting
16S rRNA revealed that the families Ruminococcaceae and Bacteroidaceae , andthe genus Clostridium and Treponema were enriched in all samples. Although
we attempted to clarify the differences between the two groups in alpha andbeta diversity tests, unfortunately no clear differences or biases were found.
In addition, we also conducted a growth inhibition test for EHEC O157, usinglact ic acid bacteria isolated from non-shedders. Among the 8 lact ic acidbacterial strains tested, two strains belonging to Streptococcus pasteurianus
and Lactobacillus ruminis exhibited significant inhibition of EHEC growth.
Although the mechanisms for the inhibition by these isolates remain unknown,
it was shown that these bacteria could serve as effective probiotic bacterial
candidates for EHEC control.