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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）＜平成19年度＞

食品中に含まれる香気成分とその受容体の消化管における機能発現に関する分子および器官生理学的研究
加治いずみ ・ 唐木晋一郎 ・ 桑原厚和

（静岡県立大学大学院環境科学研究所環境生理学研究室）

1.

はじめにいることを確認した 4, 5）。本研究では，申請者らの研究成果を踏まえ，１）味覚・嗅覚受容体の消消化管の最も内側を覆っている粘膜上皮は，常化管上皮で発現を分子生物学的および組織化学的に外部環境と接しており，摂取した栄養素を効率手法を用いて明らかにすると共に，２）これら受よく吸収すると共に，食物と一緒に入ってくる生容体のリガンドが粘膜上皮でのイオン輸送に及ぼ体にとって有害な異物や細菌が体内に侵入しないす影響についても生理学的に解析した。

ように働いている。そのため消化管壁には，常に外部環境をモニターし，蠕動運動や上皮膜におけ2. 方法

る 吸 収・ 分 泌， 生 体 防 御 機 構 を 制 御 す る セ ン

2. 1サー / 制御機構として，腸管神経，腸内分泌細胞放血屠殺したラットから結腸を摘出し腸間膜付および腸管免疫系の 3 種類の機構が存在する。中着部位より長軸方向に切開し，実体顕微鏡下で筋で も， 粘 膜 上 皮 に 存 在 す る 腸 内 分 泌 細 胞および粘膜下組織を剥離し粘膜のみを採取した。

（Enteroendocrine cell；EC cell）は消化管菅腔にこのような方法で採取した粘膜組織より，total直接接し，食物として摂取した栄養素，食品中にRNA を抽出した。poly-T プライマーと AMV 由含まれる各種化学成分などを感受する感覚細胞と来逆転写酵素を用いて mRNA を逆転写させて考えられてきたが，その実態については殆ど明ら

cDNA を 合 成 し， こ れ を PCR 法 に 供 し た。

かにされていなかった。最近，消化管の粘膜上皮

thymol 受容体，ヒト OR1G1 に相同なラットの細胞に香辛料や香気成分を感受する受容体を発現

遺伝子配列を NCBI および KEGG データベース

している腸内分泌細胞が発見され，粘膜での味にて検索したところ，ratOR1G1（Olr430：gene

覚・嗅覚細胞として機能しているのではと考えらID 296691）お よ び，ratOlr1480（NM̲214831）

れるようになってきている 1, 6）。しかしながら，（query coverage 89％）が候補として挙がった。

これらの受容体がどのタイプの腸内分泌細胞に発

ま た，eugenol 受 容 体， ヒ ト OR73（OR5D18：現しており，どのように消化管の運動や分泌機能NM̲001001952.1）に相同なラット遺伝子を検索

RT-PCR 法に影響するかといったことは殆ど分かっていない。 し た と こ ろ， ラ ッ ト で は ratOR73
申請者らはこれまでに，腸内細菌の代謝産物であ（XM̲001075255.1）（query coverage 94％），る短鎖脂肪酸が下部消化管で受容され，腸管運動

ratOlr604（NM̲001000656）お よ び，ratOlr1161

やイオン分泌といった生理機能に影響することを（XM̲001075229）が候補として挙がった。さらに，報告している 7, 8, 12, 13）。また，短鎖脂肪酸受容体

バニロイド受容体（transient receptor potentialが粘膜の腸内分泌細胞および肥満細胞に発現してchannel: TRP）フ ァ ミ リ ー の メ ン バ ー で あ る食品中に含まれる香気成分とその受容体の消化管における機能発現に関する分子および器官生理学的研究

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TRPV3 が，thymol や eugenol の受容体として機で固めた塩橋を介してボルテージクランプアンプ能することが報告されている 10, 11）。そこで，以上に接続した。また，1 分毎に 3 秒間，10 mV のコ

6 つの受容体候補の遺伝子配列に特異的な配列のマンドパルスを組織に与え，短絡電流の変化量かプライマーを設計し，PCR を行った。プライマ

ら膜コンダクタンス（Gt）を算出した。Ussingー 設 計 に は，Primer3 plus お よ び，NCBI

chamber に標本を装着してから 1 − 1.5 時間後，Primer-BLAST を用いた。陽性コントロールと

basal Isc および Gt の値が安定したところで粘膜して，イントロンを含む領域の ratb-actin を増幅

下神経に電気刺激（25V, duration of 0.5 ms, 5Hz,させ，ゲノムの混入がないことを確認した。

120s）を行い，組織の状態を確認した。実験は，

2. 2

短絡電流法

ウィスター系雄性ラット（体重 200 − 230g）

電気刺激による Isc や Gt の上昇が再び基線に戻った後に開始した。

より遠位結腸を摘出し，腸間膜付着部位より長軸Isc および Gt に対する香気成分の作用を検討す

方 向 に 切 開 し て シ ー ト 状 に し た。 こ れ を 氷 冷るために，濃度を変えて thymol（チモール）まKrebs-Ringer 液潅流下で筋層を剥離して粘膜 -たは eugenol（オイゲノール）を粘膜側または血粘膜下組織標本を作成し，Ussing ﬂux chamber

管側に一回投与し，Isc および Gt の変化を測定しに装着した。粘膜側，血管側共に 37℃の Krebs-た。なお，本実験では香気成分をジメチルスルホ

Ringer 液（117mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mMキシド（DMSO）を用いて溶解したが，ヒトおMgCl2, 1.2mM NaH2PO4, 2.5mM CaCl2 お よ び

よびラット結腸では循環クレブス液量の１％以下

11mM glucose）を 10mL ずつ循環させ，95％酸の DMSO は Isc および Gt に影響しないことを確

素−５％二酸化炭素混合ガスを曝気し pH を 7.4認している。に維持した。電位差および短絡電流 short-circuitcurrent（Isc）測定には銀 - 塩化銀電極を用い，グルコース非添加の Krebs-Ringer 液を 4％の寒天

図１3. 結果および考察
3. 1

消化管内味覚受容器の発現

ラット遠位結腸粘膜における thymol（A）および eugenol（B）受容体候補分子の発現（RT-PCR 法）

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）

RT-PCR 法により，ラット遠位結腸の粘膜にお短絡電流（Isc）および膜コンダクタンス（Gt）をいて，thymol および eugenol をリガンドとする増加させた（Fig.2A および B）。また，ヒト結腸受体 ratOR1G1, ratOlr1480, ratOR73,

組織においても，同濃度の eugenol によってラッratOlr604, ratOlr1161 お よ び TRPV3 の mRNA

ト組織と類似したイオン輸送の反射が観察されたレベルでの発現が確認できた（Fig.1）。この結果（Fig.2C）。

容から，下部消化管の粘膜には味覚受容器が存在し，（２） thymol

さまざまな化学物質に対して生理的に反射を引きの粘膜側または漿膜側投与により濃度依存的に起こす機構が備わっている可能性が示唆された。

Isc および Gt の増加が観察された（Fig.3A および3. 2

ラット遠位結腸では，Thymol

味覚受容体リガンドの消化管イオン輸送B）。Thymol（１mM）投与後，Isc が増加し始めに及ぼす影響るまでには 1 − 2 分間を要し，投与約 5 分後に最（１） eugenol

Ussing ﬂux chamber を 用 い大反応が観察された（Fig.3C）。Gt は，Isc よりもた 実 験 に お い て， ラ ッ ト 遠 位 結 腸 の 粘 膜 側 に遅く上昇し始め，7 − 10 分後に最大値が観察さeugenol を投与すると，eugenol は濃度依存的にれた（Fig.3D）。これにより，起電的イオン輸送

図２

Ussing ﬂux chamber 法により測定した，粘膜側への eugenol 投与による短絡電流（Isc）の変化。Isc 増加は thymol の濃度に依存的であった（A）。ラット遠位結腸（B）およびヒト上行結腸（C）の粘膜−粘膜下組織標本を用いた時間経過を示した。

食品中に含まれる香気成分とその受容体の消化管における機能発現に関する分子および器官生理学的研究

図３49

thymol を投与した時の短絡電流と膜コンダクタンスの変化
Ussing chamber 法によりラット遠位結腸における短絡電流と膜コンダクタンスを記録した。Isc 増加は thymol の濃度に依存的であった（A）。thymol（1 mM）の作用の時間経過（B）を，1 分ごとに短絡電流（C）および膜コンダクタンス（D）を計測し，グラフ化した。thymol によって短絡電流と膜コンダクタンスは増加するが，最大値に達するまでにかかる時間は，膜コンダクタンスの方が短絡電流よりも遅かった。

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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）と非起電的イオン輸送とが連動せず，複数の機構

menthol は，プロピオン酸の反応をコントロール

で thymol が経上皮膜イオン輸送に影響することの 30％にまで抑制した。プロピオン酸によるクが示唆された。次に，thymol による Isc 上昇にど

ロライドイオン分泌はアセチルコリンが関与してのようなイオン種が関与しているかを，各種イオ

い る こ と が 報 告 さ れ て い る が 13），1mM のチャネル阻害剤を用いて検討した。基底膜 Na-K-thymol は，アセチルコリンのアゴニストである

2Cl 共 輸 送体（NKCC）
阻 害 薬 で あ る bumetanide

carbachol による Cl 分泌を抑制しなかった。また，や頂端膜 Na チャネル（ENaC）阻害薬 amiloride

上皮細胞のイオン分泌促進因子である神経伝達物

あ る い は K チ ャ ネ ル 阻 害 剤 BaCl2 に よ っ て質，VIP の投与や，粘膜下神経への電気刺激によthymol による Isc の上昇は影響されなかった。まる Cl 分泌に対しても影響しなかった。これらのた，神経伝達遮断薬である tetrodotoxin によっ結果から，thymol による短鎖脂肪酸の反応に対ても thymol による Isc の上昇は阻害されなかっする抑制作用は，分泌上皮の抑制や神経系に対すたことから，thymol のイオン輸送への影響は，る作用によるものではなく，短鎖脂肪酸の受容機粘膜下神経経系を介さない反応であることが考え構に関与していることが考えられた。香気成分をられた。

受容する嗅覚受容体は，哺乳類の遺伝子に 1000

（３） 味覚・嗅覚受容体リガンドの相互作用以上のサブタイプをもつことが知られている２）。

短鎖脂肪酸のひとつであるプロピオン酸は，モル

これらのリガンドは，ある受容体サブタイプには

モットおよびラット結腸において，濃度依存的にアゴニストとなるが，他の幾つかのサブタイプにIsc および Gt を増加させるが，これは Cl 分泌にはアンタゴニスト作用を示すことが知られていよるものであることが明らかになっている 3, 13）。

る ９）。このことから，thymol が短鎖脂肪酸の受また，近年当研究室では，ヒトおよびラットにお容体に対してアンタゴニスト作用を持つ可能性がいて，プロピオン酸受容体を持つ細胞が，PYY示唆された。しかし，その実体は不明であり，今を 含 有 す る 腸 内 分 泌 細 胞 お よ び， セ ロ ト ニ ン

後，更なる研究が必要であると考えられる。

5-HT 含有肥満細胞であることを同定し報告した 4, 5）。短鎖脂肪酸脂肪酸は特有の臭いをもつた4.

おわりにめ，香気成分として嗅覚受容体にも何らかの作用以上の結果より，１）下部消化管粘膜においてが あ る の で は な い か と 考 え ら れ た。 そ こ で，嗅覚・味覚受容体が発現していること，２）あるThymol（１ mM）を粘膜に作用させた後に，プ種の嗅覚・味覚受容体のリガンドは，ヒトおよびロピオン酸を粘膜に投与したところ，thymol はラットの下部消化管における経粘膜上皮イオン輸

プロピオン酸による Isc の上昇をほとんど完全に送に対して影響を及ぼすことが明らかとなった。

抑制した。その後，同組織を Krebs-Ringer 液でさらに，嗅覚・味覚受容体のリガンドとなる化学３回洗浄すると，プロピオン酸への反応はコント

物質は，消化管内における受容およびイオン輸送ロール群と同レベルの反応を示した（Fig.4A）。

への影響という点において，相互作用を有していこの抑制作用は，thymol の濃度に依存した（Fig.

る可能性が示唆された。これらの詳しい機構につ4B）。同じく短鎖脂肪酸のひとつである酪酸も，いては，今後の研究の課題である。下部消化管に１ mM の thymol によって反応が完全に抑制されは，経口摂取した物質だけでなく，それらが消化た。thymol を前駆体として工業的に合成される管の作用あるいは腸内細菌の作用によって代謝さ食品中に含まれる香気成分とその受容体の消化管における機能発現に関する分子および器官生理学的研究

図４51

粘膜側 thymol 投与のプロピオン酸への反応に対する影響
粘膜に投与した thymol の濃度依存的に，それに続く粘膜へのプロピオン酸投与による Isc の反応が抑制され，1 mM の thymol 存在下
では，ほぼ完全にプロピオン酸への反応が消失した。その後，Krebs-Ringer 液で組織を 3 回洗浄することにより，プロピオン酸への反応はコントロールと同レベルの反応を示した。

れて生じた物質が存在すると考えられる。従って，

文

例えば毒物を感知して排除しようとする機構が，１） Braun T, Voland P, Kunz L, Prinz C, Gratzl M.

舌や鼻だけでなく下部消化管粘膜において機能すEnterochromaffin cells of the human gut: sensors for

ることは，生体防御の観点からも非常に有用であ献

spices and odorants. Gastroenterology 132 : 1890-1901, 2007.
２） Buck L, Axel R. A novel multigene family may

ると言える。消化管粘膜に発現している受容体とencode odorant receptors: a molecular basis for odor

その生理機能の解析は，これまで注目されていな

recognition. Cell 65 : 175-187, 1991.

かった新たな消化管機能の発見につながると考えられる。

３） Karaki S, Kuwahara A. モルモット遠位大腸の電解質
輸 送 に 対 す る 短 鎖 脂 肪 酸 の 作 用 Jpn J Physiol 55 Suppl:
S195, 2005.
４） Karaki S, Mitsui R, Hayashi H, Kato I, Sugiya H,Iwanaga T, Furness JB, Kuwahara A. Short-chain fatty

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浦上財団研究報告書acid receptor, GPR43, is expressed by enteroendocrine
cells and mucosal mast cells in rat intestine. Cell Tissue Res
324 : 353-360, 2006.
５） Karaki S, Tazoe H, Hayashi H, Kashiwabara H,Vol.16（2008）
colon. Jpn J Physiol 54 : 483-493, 2004.
９） Sanz G, Schlegel C, Pernollet JC, Briand L.
Comparison of odorant speciﬁcity of two human olfactory
receptors from different phylogenetic classes andTooyama K, Suzuki Y, Kuwahara A. Expression of theevidence for antagonism. Chem Senses 30 : 69-80, 2005.

short-chain fatty acid receptor, GPR43, in the human10） Vogt Eisele AK, Weber K, Sherkheli MA, Vielhabercolon. J Mol Histol 39 : 135-142, 2008.

G, Panten J, Gisselmann G, Hatt H. Monoterpenoid

６） Kidd M, Modlin IM, Gustafsson BI, Drozdov I,

agonists of TRPV3. Br J Pharmacol 151 : 530-540, 2007.

Hauso O, Pfragner R. Luminal regulation of normal and11） Xu H, Delling M, Jun JC, Clapham DE. Oregano,neoplastic human EC cell serotonin release is mediated bythyme and clove-derived flavors and skin sensitizers

bile salts, amines, tastants, and olfactants. Am J Physiol

activate specific TRP channels. Nat Neurosci 9 : 628-635,

Gastrointest Liver Physiol 295 : G260-272, 2008.

2006.

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12） Yajima T. Contractile effect of short-chain fatty acids

modulates spontaneous contractions via enteric nerveson the isolated colon of the rat. J Physiol 368 : 667-678,

and prostaglandin release in the rat distal colon. Jpn J

1985.

Physiol 55 : 331-338, 2005.
８） Ono S, Karaki S, Kuwahara A. Short-chain fatty
acids decrease the frequency of spontaneous contractionsof longitudinal muscle via enteric nerves in rat distal13） Yajima T. Luminal propionate-induced secretory
response in the rat distal colon in vitro. J Physiol 403 :559-575, 1988.

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Secretory effects of luminal odorants and expressions of odorant receptors in human and rat large intestine

Secretory effects of luminal odorants and expressions ofodorant receptors in human and rat large intestine
Izumi Kaji, Shin-ichiro Karaki and Atsukazu Kuwahara（Laboratory of physiology, Graduate School of Nutrition and Environmental Sciences,
Institute for Environmental Science, University of Shizuoka）

Intestinal transepithelial ion transport is regulated by diverse systems including theenteric nervous system（ENS）, a variety of gut hormones and cytokines, responding tomechanical and chemical stimuli. One type of chemical stimulus at the intestinal lumen isshort-chain fatty acids（SCFAs）including propionate and butyrate, which are bacterial
metabolites especially in the large intestine.

SFCAs have been reported to evoke epithelial

ion transport through mucosal stimulation and ENS activation.

Although the sensing

mechanism for SCFAs at mucosa is still unclear, we recently found that the SCFA receptor,
GPR43, is expressed by enteroendocrine cells and mucosal mast cells in human and rat
intestine. Therefore, we speculate that other chemical receptors are expressed by sensory
cells in the intestine.
Recently, the same taste transduction mechanism found in the taste buds of lingual
papillae was also reported to be present in the intestine.

In the present study, we

examined the effect of odorants thymol and eugenol on ion transport in human and rat
colonic epithelia to elucidate the physiological function of odorant receptors in the intestine.
Furthermore, odorant receptor expressions were also investigated in isolated large intestinal
mucosa.
To ﬁnd out the odorant receptors in rat large intestinal epithelia, RT-PCR analysis wasperformed by using isolated mucosa of rat without submucosa and muscle. Speciﬁc bandsof same base pair（bp）sizes as the expected amplicon size for rOR1G1 and rTRPV3 weredetected in the mucosa of rat distal colon（Fig.1A）. We have also detected the receptor
signals responsible for eugenol（Fig.1B）. These results suggest that thymol or eugenol in
the large intestine may be detected at epithelial odorant receptors（OR1G1, Olr604 andOlr1161）.
The addition of thymol or eugenol to mucosal bathing solution evoked an increase in Isc
in both human and rat large intestine with increasing Gt（Fig. 2 and 3）. After the additionof eugenol（v/v 0.1%）, I sc increased gradually for 5-15 min, with G t increases.

To

investigate the effects of thymol on basal Isc and Gt in rat colon, various concentrations ofthymol（10−6 − 10−3M）were added to mucosal bathing solution and changes in Isc and Gt

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.16（2008）

were measured（Fig.3）. In rat tissues, serosal addition of thymol was also tested; thymol
to serosal bathing solution evoked an increase in Isc similar to that of mucosa.

Figure 3A

shows concentration-dependent increases in Isc in rat colon（Fig.3A）. In the present study,
we have shown the action of odorant receptor ligands, thymol and eugenol on epithelial ion
transport and the expressions of putative receptors for thymol and eugenol.

This study

suggests that some luminal odorants in the large intestine induce a secretory response
probably through the odorant receptor mediating chemical sensing mechanism.

Thymolinduced increases in Isc in a concentration-dependent manner in rat distal colon.

ThemRNA expression of odorant receptors, rOR1G1, rTRPV3, Olr604 and Olr1161 weredetected in colonic mucosa by RT-PCR analysis.

Although, in the present study we could

not be determined which specific receptor detect thymol or eugenol, the results suggestthat thymol or eugenol may be detected at epithelial odorant receptors.
The present results indicate that the receptors for odorant can function as sensors thatare able to modify the intestinal function including epithelial ion transport in human and rat
intestine.

Therefore, this system may be a new chemosensing mechanism in the large

intestine to maintain intestinal homeostasis.