基礎老化研究 46（1）; 33－36, 2022

【奨励賞受賞者研究トピックス】

上喉頭神経への慢性電気刺激は骨粗鬆症モデルラットの骨密度減少を部分的に抑制する
飯村

佳織、渡辺

東京都健康長寿医療センター研究所

信博、堀田

晴美

老化脳神経科学研究チーム

自律神経機能研究

キーワード：骨粗鬆症、カルシトニン、上喉頭神経、骨密度、ニューロモデュレーション

１．はじめに迷走神経から分岐する上喉頭神経（superior laryngeal

ヒトでは、骨粗鬆症は加齢とともに増加し、特に閉経

nerve; SLN）を電気刺激すると、甲状腺からのカルシ

後の女性に頻発する。通常、骨はリモデリングにより骨トニン（内因性カルシトニン）分泌が増加することを見

吸収と骨形成を繰り返すことで、骨組織の劣化が修復さ出した [9]。もし、意識下の動物においても SLN への電れ骨密度が維持される。しかし、閉経によるエストロゲ

気刺激が安全、かつ効果的にカルシトニン分泌を増加さ

ンの減少などにより、骨吸収と骨形成がアンバランスにせることが実験的に示されれば、骨粗鬆症に対する新たなると、破骨細胞による骨吸収が異常に高まり、それになカルシトニン治療法として発展する可能性が期待で骨芽細胞による骨形成が追い付かないことで、骨密度がきる。本稿では、英国 Galvani Bioelectronics 社と米国低下し骨粗鬆症を招く [1]。骨粗鬆症の治療薬の一つとしCase Western Reserve University との共同研究によりてカルシトニンが挙げられる。カルシトニンは甲状腺か実施した、意識下における上喉頭神経への電気刺激がカら分泌されるホルモンで、破骨細胞の表面に発現するカ

ルシトニン分泌や骨密度に与える影響についての研究成

ルシトニン受容体に結合すると、破骨細胞によるアクチ

果 [10] を、筆者らが共同研究先（米国）で学んだ神経慢

ンリングの形成を阻害し、骨吸収を急速に抑制する［2］。

性電気刺激の手法の紹介を交え報告する。

アクチンリングは破骨細胞の細胞骨格の一つであるアク
チンフィラメントがリング状に集合したものであり、破２． 意識下における上喉頭神経電気刺激のカルシトニ
ン分泌への影響（健常動物での検討）

骨細胞が骨基質表面に密着して骨吸収を行う時に形成される。アクチンリングの内側では骨基質の融解および分SLN を電気刺激するために、麻酔下でラット（雄、解が行われ、骨基質表面にハウシップ窩と呼ばれるくぼ

11-16 週齢）の前頸部から両側 SLN に約 2㎜の小さなカんだ形状が見られるのが特徴である。カルシトニンは破フ電極を埋め込み、さらに、血中のカルシトニン濃度を骨細胞に作用し骨吸収を停止させることで、相対的に骨測定するために採血用のカテーテルを上大静脈（右心房形成を促進するホルモンといえる。治療には、サケカルの手前）に留置した（図１a）。手術後から２週間の回

シトニンやウナギカルシトニンの誘導体製剤等が用いら

復期間中、術後管理のために抗生剤を２日間、抗炎症鎮

れており、骨密度の増加効果 [3,4] のほか、鎮痛作用 [5,6] が痛剤を５日間投与し、餌は通常のペレットに加えて、ペ基礎および臨床研究において認められている。しかしな

レットをふやかしたものやゼリー状飼料などの軟らかいがら、一定量以上のカルシトニン製剤の投与はカルシト

餌も与えた。また、４日に１度のペースでカテーテル内ニン受容体のダウンレギュレーションを誘発し、破骨細の充填物（ヘパリングリセロール）を新しいものに置き胞に対する抑制効果を減弱させる[7]

ため、カルシトニ

換えることでカテーテルが詰まらないよう管理した。

ン製剤治療では効果が見られる最小量の製剤を断続的に上喉頭神経は咽頭筋や輪状甲状筋、甲状腺に分布する投与する必要があり [8]、通院が患者の負担となってコン

ほか、咽頭や喉頭の知覚を中枢に伝えて嚥下反射を引き

プライアンスが保たれにくいという課題も抱えている。

起すことや [11-14]、ラットでは呼吸の抑制に関与すること

一方、我々は最近、麻酔下ラットを用いた研究で、も示唆されている [15]。そのため、まずは、意識下における上喉頭神経刺激が安全に行えるかを明らかにするた

連絡先：飯村〒 173-0015

佳織
東京都板橋区栄町 35-2

TEL：03-3964-3241
E-mail： kiimura@tmig.or.jp

めの探索を行った。動物用プレスチモグラフを用いて、SLN 刺激中（刺激幅 0.5ms, 頻度 40Hz, 刺激強度 15 〜
120μA）の一回換気量や呼吸頻度をモニターしながら、忌避行動がおこらないかを注意深く観察した結果、30秒間または５分間の刺激中、いずれの刺激強度でも一回－ 33 －

a

カテーテル（上大静脈に留置し、背部に固定）cb

iCT濃度の変化量(⊿pg/ml)

電極リード線（SLNに埋め込み、頭に固定）

p = 0.038

SLN刺激 採血

Control
n=9(3)

アクリル
ケース

SLN刺激
n=7(7)

図１ 意識下 SLN 刺激の方法と末梢血中 iCT 濃度への影響
a：SLN に埋め込んだ電極のリード線と上大静脈に留置したカテーテルは、皮下を通しラットの口が届かない
頭頂部と背部に固定した。b：SLN 刺激（0.5ms, 40Hz, 90 μ A）および採血（各 500 μ l）は、アクリルケー
ス内でラットの動きを制限することなく行われた。c：刺激前に対する刺激中の iCT 濃度の変化量を示す。平
均値±標準偏差、●は各例の値を示す．unpaired t-test（one-tailed）。文献 10 より一部改変して引用。

換気量や呼吸頻度が抑制されることはなく、刺激を嫌が骨密度の経時的変化を観察した。すると、術後２週目にる行動も見られなかった。一方、90μA 以上の強度では、は卵巣を摘出していない偽手術ラットに比べて顕著な骨刺激中にラットが嚥下様の動きをしているのが見て取れ

密度の低下が認められた。術後８週目に解剖し、大腿骨た。

と脛骨の骨密度を DXA 法により厳密に調べると、大腿次に、安全性が確認できた刺激強度（90μA）で SLN

骨では遠位骨幹端、脛骨では近位骨幹端の骨密度が偽手

刺激を 8 分間おこない、刺激前と刺激中に、カテーテル術ラットに比べて約 30％も減少していた。この結果は、を介して末梢血を採取した（図１b）。ELISA 法にて血11 週齢で卵巣摘出されたラットにおいて、脛骨近位部

漿中の免疫反応性カルシトニン（iCT）の濃度を計測し、と大腿部遠位部で局所性の骨量減少が見られた先行研究

刺激による変化を調べた結果、刺激中の iCT 濃度の増[16]の結果と一致した。

加はコントロール群（埋め込み手術をしたが刺激をしな

次に、上記モデルを用いて SLN を慢性的に刺激した

い群 , ３匹９例）に比べて刺激群（７匹７例）で有意に場合の骨密度への影響を調べた。11 匹のラットに埋め

大きく、SLN 刺激群では刺激前よりも刺激中に約 13.3

込み手術を行ったが、そのうち５匹は、ラット自身がpg/mL 増加していた（図１c）。これまでの麻酔下ラッ電極接続部分を破壊してしまったため SLN 刺激が不可トにおける研究 [9] では SLN 刺激による甲状腺静脈血中能となってしまった。そのため、本研究における慢性での iCT の増加が明らかになっていたが、本研究によSLN 刺激モデル作成の成功率は約５割であった。２週り初めて意識下で末梢血レベルでの iCT 濃度の増加を

間の回復期間後、前述の実験で末梢血中の iCT 濃度を確認することができた。ヒトでは末梢血中カルシトニン増加させた刺激パラメーターを用いて、SLN 刺激を断が 1pg/ml 増加すると骨吸収率が 1.27％減少することか

続的（１時間ごとに１回８分間の刺激を１日７回、これら [8]、意識下 SLN 刺激の骨密度低下に対する効果が大を週に４日間）に３- ４週間実施した（図２a）。なお、

いに期待できる結果が得られた。

OVX ラットに対するカルシトニン製剤投与は暗期よりも明期が効果的であった報告 [17] から SLN 刺激は明期の３． 骨密度低下に対する上喉頭神経の慢性電気刺激の効果（骨粗鬆症モデルでの検討）み実施した。刺激期間終了後ラットを安楽殺し、カフ電極内に SLN が収まっているか、周囲組織に炎症がない

本実験には、閉経後骨粗鬆症モデルである卵巣摘出かを確認した。SLN 刺激を実施した６匹中１匹では電（OVX）ラットを用いた。12 週齢で卵巣摘出した３週後極を埋め込んだ部分の周囲に炎症が見られたため、このに、麻酔下で両側 SLN にカフ電極を埋め込み、前述し例を除いた５匹を SLN 刺激群として解析した。コント

た方法で術後管理をした。餌は標準的な量のカルシウム

ロール群（卵巣摘出と埋め込み手術は行ったが SLN 刺を含有する（約１％）ペレットを主に与えた。まず、筆激は受けなかった群 , n=5）では炎症は確認されなかっ者らの飼育環境下で骨粗鬆症モデルが作成できるのかをた。続いて、これら刺激群とコントロール群から大腿骨確認するために、in vivo で X 線像を撮影して大腿骨のと脛骨を取り出し、DXA 法にて骨密度を計測した。卵－ 34 －

b
慢性SLN刺激
1回8分間、1日7回、
週4日、3～4週間実施

電極ケーブル

飼育
ケージ

ペレット
や水

大腿骨-遠位骨幹端

脛骨-近位骨幹端p = 0.032

p = 0.051

DXA-骨密度(mg/cm2)aエ ン リ ッチ
メント
control SLN刺激(n=5) (n=5)

control SLN刺激(n=5) (n=5)

図２ 卵巣摘出ラットへの慢性 SLN 刺激の方法と骨密度低下に対する効果
a：慢性 SLN 刺激はラットが生活している飼育ケージ内で実施した。電極ケーブルはラットがケージ内を行
動するために十分な長さ（約 40㎝）であり、自由給餌および給水が可能であった。b：慢性 SLN 刺激後における大腿骨（遠位骨幹端）および脛骨（近位骨幹端）の骨密度を示す。SLN 刺激群の骨密度は control 群に比べて大腿骨では高い傾向があり、脛骨では有意に高かった．平均値±標準偏差、●および■は各例の値を示す。Unpaired t-teat（one-tailed)。文献 10 より一部改変して引用。

巣摘出により最も影響を受ける部位（大腿骨の遠位骨幹治療とは異なる制御メカニズムを介して骨に対して機能端部、脛骨の近位骨幹端部）を、SLN 刺激群とコントロー

することも考えられるが [21]、より長期間の SLN 刺激でル群とで比較したところ、刺激群ではコントロール群には骨密度低下に対し、より明確な効果が見られる可能性

比べて、いずれの部位でも 4-5％骨密度が高かった。こもある。本研究では、神経に埋め込んだ電極から刺激装れらのことから、意識下における３- ４週間の間歇的な置の間で断線するトラブルから、埋め込み手術をした約SLN 刺激は、卵巣摘出による骨密度低下を部分的に抑半数のラットで刺激を行えなくなってしまった。
今後は、制することが示唆された。

無線による SLN 刺激などの長期間の検討に耐えうるデ前述の SLN 刺激時に末梢血中カルシトニン濃度が増

バイスへの変更も視野に入れ、より長い期間の SLN 電

加した結果と本結果を合わせると、慢性的な SLN 刺激

気刺激による骨密度への影響を追求していく必要があ

により、おそらくカルシトニン放出が促進したことで、る。

卵巣摘出における骨密度低下を部分的に抑制したと予想された。一方で、カルシトニンとは別の骨密度の制御メ

引用文献

カニズムが相互的に働いていた可能性もある。例えば、

1． Seeman E, Delmas PD. Bone quality — The

SLN の電気刺激は交感神経を介して反射的に麻酔動物

material and structural basis of bone strength andの下肢の血管拡張を誘導することが報告されており
19]

[18,

、この反応は大腿骨や脛骨の骨密度の増加にも寄与しfragility. N Engl J Med 354(21): 2250-2261, 2006.
2． Kuroda H, Nakamura M, Kamiyama K. Effectsているかもしれない。

of calcitonin and parathyroid hormone on the
distribution of F-actin in the clear zone of

４．おわりにosteoclasts in vivo. Bone 19(2): 115-120, 1996.

これらの結果は、SLN 刺激によるカルシトニン分泌

3． Hsiao CY, Chen TH, Chu TH, et al . Calcitoninの促進が、骨粗鬆症に対する新たな治療法として発展すinduces bone formation by increasing expression

る可能性を示した。しかしながら、SLN 刺激群の骨密of Wnt10b in osteoclasts in ovariectomy-induced

osteoporotic rats. Front Endocrinol (Lausanne) 11:

度は卵巣摘出をしていないラットに比べると著しく低く

613, 2020.

（約 - 40㎎ /㎠）、３- ４週間の SLN 刺激による効果は卵巣摘出による骨密度低下を部分的に改善するに留まっ

4． Orimo H, Hirotoshi M, Tetsuo I, et al . Effect ofた。また、骨密度以外の組織学的指標（破骨細胞数など）

elcatonin on involutional osteoporosis. J Bone
Miner Metab 14: 73-78, 1996.

には明確な差を見ることはできなかった。OVX ラット
への約２か月間のカルシトニン製剤の投与は、大腿骨の5． Shibata K, Takeda M, Ito A, et al . Ovariectomy-

約 15％の骨密度増加 [20] や、破骨細胞数の有意な減少 [3]induced hyperalgesia and antinociceptive effect

を起こすことが報告されている。神経性調節による内因

of elcatonin, a synthetic eel calcitonin. Pharmacol

性カルシトニン分泌増加は、従来の外因性カルシトニン

Biochem Behav 60(2): 371-376, 1998.

－ 35 －

6． Knopp JA. Diner BM, Blitz M, et al . Calcitonin

42(2): 369-387, 1974.

for treating acute pain of osteoporotic vertebral

14． K itagawa J, Shinga i T, Taka hashi Y, et al .

compression fractures: a systematic review ofPharyngeal branch of the glossopharyngeal nerve

randomized, controlled trials. Osteoporos Int

plays a major role in reflex swallowing from16(10): 1281-1290, 2005.

the pharynx. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol 282(5): R1342-R1347, 2002.

7． I kega me M , Eji r i S , Ozawa H . Ca lciton ininduced change in serum calcium levels and its

15． Sun QJ, Bautista TG, Berkowitz RG, et al . The

relationship to osteoclast morphology and number

temporal relationship between non-respiratoryof calcitonin receptors. Bone 35(1): 27-33, 2004.

burst activity of expiratory laryngeal motoneurons

8． Yamauchi H, Suzuki H, Orimo H. Calcitonin forand phrenic apnoea during stimulation of thethe treatment of osteoporosis: dosage and dosing

superior laryngeal nerve in rat. J Physiol 589(Ptinterval in Japan. J Bone Miner Metab 21: 198-204,7): 1819-1830, 2011.
16． Nakamuta H , Sasaki M , Ichikawa M , et al .

2003.
9． Hotta H, Onda A, Suzuki H, et al . Modulation

An acute and focal osteopenia model usingof calcitonin, parathyroid hormone, and thyroid

ovariectomized rats: a rapid detection of thehormone secretion by electrical stimulation ofprotective effect of salmon calcitonin. Biol Pharm

sympathetic and parasympathetic nerves in

Bull 16(3): 325-327, 1993.
17． Simmons DJ, Yang C, Gundberg CM , et al .

anesthetized rats. Front Neurosci 11: 375, 2017.
10． Iimura K, Watanabe N, Milliken P, et al . Chronic

Calcitonin: chronotherapeutic effect on osteopenia

electrical stimulation of the superior laryngeal

in the ovariectomized rat. Prog Clin Biol Res

nerve in the rat: A potential therapeutic approachfor postmenopausal osteoporosis. Biomedicines

341A: 517-527, 1990.
18． Faber J E , Brody MJ. Ref lex hemodyna mic

8(9): 369, 2020.

response to superior laryngeal nerve stimulation

11． A nd rew BL . A f u nct iona l a na lys is of t hemyelinated fibres of the superior laryngeal nervein the rat. J Auton Nerv Syst 9(4): 607-622, 1983.
19． Possas OS , Lewis SJ. NO - containing factorsof the rat. J Physiol 133(2): 420-432, 1956.

mediate hindlimb vasodilation produced by

12． Furusawa K, Yasuda K, Okuda D, et al . Central

superior laryngeal nerve stimulation. Am J

distribution and peripheral functional properties

Physiol 273(1 Pt 2): H234-H243, 1997.

of a f ferent and ef ferent components of the

20． Rico H, Valencia MJ, Villa LF, et al . Calcitoninsuperior laryngeal nerve: morphological andver sus clo d ronat e i n t he prevent ion ofelectrophysiological studies in the rat. J Compovariectomy-induced osteopenia in rats. Clin
Rheumatol 19(1): 47-50, 2000.

Neurol 375(1): 147-156, 1996.
13． Miller AJ, Loizzi RF. Anatomical and functional

21． Davey RA, Findlay DM. Calcitonin: Physiology ordifferentiation of superior laryngeal nerve fibers
affecting swallowing and respiration. Exp Neurol－ 36 －

Fantasy? J Bone Miner Res 28(5): 973-979, 2013.

基礎老化研究 46（1）; 37－41, 2022

【奨励賞受賞者研究トピックス】

呼吸鎖超複合体形成による骨格筋のミトコンドリア機能調節とその制御因子
小林1

天美 1, 2ハーバード大学附属ブリガム・アンド・ウィメンズ病院脳神経内科
東京都健康長寿医療センター研究所システム加齢医学研究チーム

2

キーワード：mitochondria, respiratory chain supercomplex, FRET, skeletal muscle

１．はじめに因子を遺伝子導入にて過剰発現させたマウスにおいては、骨格筋は、筋タンパク質の合成と分解が繰り返し行わトレッドミルにおける運動持続時間が延長していた［12］。

れることによって維持されている組織であり、骨格筋量

このことより、呼吸鎖超複合体形成がエネルギー産生率と筋力は老化と共に減少する［1］。骨格筋の老化メカニズを上昇させる働きを有し、筋持久力に関わることを示唆

ムとして、性ホルモン濃度の減少、筋組織におけるアポしている。その他、加齢ラットの骨格筋においては、若トーシスの誘発などが加齢と共に生じることが要因と齢ラットと比較して呼吸鎖超複合体の形成が減少するこなっている。その背景として、筋肉の質を維持するミトとが報告されている［13］。ヒトの骨格筋においては、高

［2-9］

、骨格筋量

齢になるにつれて OPA1（optic atrophy 1）というミトの低下に先行してミトコンドリア機能障害が生じること

コンドリア内膜の構造維持とともに呼吸鎖超複合体形成も報告されている［10］。また、骨格筋は収縮速度の観点にもかかわるタンパク質の発現の低下がみられた 4。以

から速筋及び遅筋に分類されるが、ミトコンドリアは遅上から、骨格筋の老化メカニズムにミトコンドリア呼吸

筋に多く分布しており、ミトコンドリアタンパク質の変鎖超複合体の形成変化が関与していることが示唆されて化に伴うミトコンドリア機能低下は姿勢維持及び歩行ないる。

コンドリアの機能低下が指摘されており

どの低強度運動を支える遅筋に大きな影響を与えると考えられている。

ミトコンドリア呼吸鎖超複合体に着目し、老化と関連する疾患のメカニズム解明・治療薬開発には、呼吸鎖超ミトコンドリアは、ほぼ全ての真核生物の細胞に存複合体の構造変化を生体内に近い状態で簡便に検出する

在する細胞内小器官で、酸化的リン酸化により生命手法が必要とされる。本稿では、我々が確立したライブ活動に必要なエネルギーであるアデノシン三リン酸

セル内で呼吸鎖超複合体の形成を可視化・定量化する手（Adenosine Triphosphate; ATP）産生を主に行ってい法と、それを応用させた著者の最新の研究成果を紹介する。外膜と内膜という２枚の脂質膜を有しており、真核る。

生物では内膜に酸化的リン酸化を担う呼吸鎖複合体が配列している。この呼吸鎖複合体は複合体 I, II, III, IV と

２．ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の可視化

いう４つの異なる複合体により構成され、ATP 合成酵

従来のミトコンドリア呼吸鎖超複合体の検出方法

素が働くためのプロトン（H+）濃度勾配をつくり出し

は、細胞・組織から単離したミトコンドリア分画を用ている。呼吸鎖複合体のうち、複合体 I, III, IV は複合

いたタンパク質電気泳動法の一つである Blue Native-

体同士が結合しさらに高次の超複合体を形成することがPolyacrylamide Gel Electrophoresis（BN-PAGE）やクラ報告されている［2］。我々が過去に報告した研究では、呼イオ電子顕微鏡法によるタンパク質構造解析が主に用い

吸鎖超複合体の形成が減少したマウスの胎児より樹立しられている。これらの手法は呼吸鎖超複合体の抽出効率

た胎仔線維芽細胞では ATP 産生が低下した［12］。また、や存在状態が容易に変化することが知られており、高度同様の成体マウスにおいては、トレッドミルにおける運動な技術の習熟を要する他、特殊な電子顕微鏡を要する

持続時間が短縮した一方で、呼吸鎖超複合体の形成促進

ことから汎用性に欠ける。そこで、呼吸鎖超複合体の検出法にあたって、我々は Förster 共鳴エネルギー移動

連絡先：小林天美

60 Fenwood Rd, Boston, Massachusetts, USA, 02115
TEL：617-732-5500
E-mail： mikirespect@gmail.com
akobayashi1@bwh.harvard.edu（Förster Resonance Energy Transfer; FRET）の原理に着目した。FRET 現象は、２つの蛍光分子が近接して存在する時に、一方の蛍光タンパク質の蛍光スペクトル
ともう一方の蛍光タンパク質の励起スペクトルに重なりがあり、両蛍光タンパク質の相対的向きが適切な方向関係にあると、一つの蛍光分子（donor）からもう一つの蛍－ 37 －

光分子（acceptor）へエネルギーが移行する現象である。

質間で FRET 現象が起きていたことが確認された。次

その結果、acceptor が励起され蛍光（FRET シグナル）に、これら２種の融合タンパク質を安定的に発現するを発生する。会合状態を調べたい２分子それぞれを、励C2C12 細胞（マウスの筋衛星細胞由来の筋芽細胞）株

起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりがある donor、の樹立を行い、また陰性コントロールとして呼吸鎖複

acceptor 用の蛍光タンパク質との融合タンパク質として合体同士が会合しない呼吸鎖複合体 III のサブユニット

細胞内に発現させ、両蛍光タンパク質の方向関係が適切と ATP 合成酵素のサブユニットの、蛍光融合タンパクな条件下で、両分子が近接した時のみ FRET シグナル質を共発現する細胞株も樹立した。固定細胞、生細胞［15］。本研究では、呼吸鎖複合体同士が会のいずれの場合も、呼吸鎖複合体 I のサブユニットと呼合し、超複合体形成時に近接する呼吸鎖複合体のサブユ

吸鎖複合体 IV のサブユニットの組み合わせで donor のニットにそれぞれ別々の donor および acceptor として励起時に acceptor の蛍光波長のシグナルが検出された

使用可能な蛍光タンパク質 AcGFP と DsRed monomer（未発表データ）。一方で、呼吸鎖複合体Ⅲのサブユニッを融合させた（図１）。共焦点レーザー顕微鏡で観察をトと ATP 合成酵素のサブユニットの組み合わせでは、行い、まずヒト胚性腎臓細胞である HEK293 細胞におdonor の励起時に acceptor の蛍光波長のシグナルが検いて呼吸鎖複合体Ⅰのサブユニットを標識した AcGFP

出されなかった（未発表データ）。このことより、呼吸の励起波長により呼吸鎖複合体Ⅳのサブユニットを標鎖複合体 I と呼吸鎖複合体 IV のサブユニットの蛍光標

識した DsRed monomer の蛍光が検出された。顕微鏡識により検出された FRET シグナルがミトコンドリアに付随する FRET 解析用ソフトウェアを使用して補正

呼吸鎖超複合体形成を反映していることが示唆された。

が観察されるを行い、FRET 効率を擬似カラーとして示すことができ（未発表データ）、上記の呼吸鎖複合体同士の近接

３． ミトコンドリア呼吸鎖超複合体形成変化の検出と定量化が FRET シグナルとして検出されている可能性が示唆された。ここで、検出された蛍光シグナルが FRET 現

我々の研究チーム並びに他の複数の研究室は、ミ象を反映しているかを検証するために我々は Acceptor

ト コ ン ド リ ア タ ン パ ク 質 の COX7RP（Cytochrome

Photobleaching を行った。Acceptor Photobleaching とc oxidase subunit 7a related polypeptide）/SCAF1/

は、acceptor の蛍光タンパク質である DsRed monomer

COX7A2L が、 呼 吸 鎖 超 複 合 体 形 成 を 促 進 す るを退色させ、donor の蛍光タンパク質から acceptor のassembly factor であり、その L 字型構造により複合体

蛍光タンパク質へのエネルギー移動を打ち消すことをいIII と複合体 IV および複合体 I と複合体 IV の結合に寄う。画像内に９ヶ所の ROI（Region of interest）を設定し、与していることを見出した［12, 16-18］。これを踏まえ本研究

蛍光強度を記録した後にこれらの ROI に対して DsRed

では、siRNA を用いて COX7RP の発現を抑制し、そのmonomer の励起波長において最大出力で照射すること際の FRET シグナルが呼吸鎖超複合体形成の変化を反により Photobleaching を行った。Photobleaching の前映しているか検証した。まず、siRNA を用いて Cox7rp

後で ROI における DsRed monomer の蛍光強度は著明の発現を抑制した C2C12 細胞より抽出したミトコンドに低下し、AcGFP の蛍光強度は有意に上昇した（未リア分画を用いて BN-PAGE による呼吸鎖超複合体形

発表データ）。この結果から、上記の蛍光融合タンパク成の比較を行った。Control と比較して siCox7rp 処理

図１． Förster 共鳴エネルギー移動（Förster Resonance Energy Transfer; FRET）のメカニズム
本研究で利用した、FRET のメカニズムを示す。Donor と acceptor となる蛍光タンパク質同士が近接したときに FRET 現象が起き、donor を励起させると acceptor の蛍光が見られる。本研究では、AcGFP と
DsRedmonomer の２種類の蛍光標識を異なる呼吸鎖複合体サブユニットに融合したタンパク質をそれぞれdonor、acceptor として使用した。

－ 38 －

時では呼吸鎖超複合体の形成が低下した（未発表デー（Tabebuia avellanedea ）の樹皮から抽出された化合物でタ）。次に、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、呼吸鎖複ある Beta-lapachone を添加した条件下での C2C12 の生合体Ⅰのサブユニットと AcGFP、呼吸鎖複合体Ⅳのサ細胞において呼吸鎖複合体ⅠとⅣのサブユニット蛍光

ブユニットと DsRed monomer の蛍光融合タンパク質

融合タンパク質間の FRET 効率を表す cFRET/Donor

を安定的に発現する C2C12 細胞内における COX7RP 発

ratio が有意に上昇していた（図３）。共焦点レーザー

現抑制時の FRET シグナルを定性的に評価したところ、顕微鏡を用いた FRET シグナルの定性評価でも同様の

siCox7rp 処理時では Control と比較して FRET 効率が結果が得られ、Beta-lapachone を添加した C2C12 細胞減少した（未発表データ）。さらに、同様の安定発現細より抽出したミトコンドリア分画を用いて行った BN-

胞を用いて、siCox7rp 処理後 48 時間経過してからこのPAGE では呼吸鎖超複合体の形成促進が確認された（未細胞を IN Cell Analyzer 6000（GE Healthcare, Chicago,

発表データ）。また、XFp Extracellular Flux Analyzer

USA）で 撮 像 し、 補 正 し た corrected FRET（cFRET）

を用いて C2C12 細胞に Beta-lapachone を添加した際のの値を求めた。Control と比較して siCox7rp 処理時では酸素消費量を計測したところ、溶媒の DMSO のみの添

Donor 1 分子あたりの FRET 効率を表す cFRET/Donor

加条件下のコントロールと比較して Beta-lapachone 1

ratio は有意に減少した（図２）。なお、同時に測定した

μM 添加下の細胞のミトコンドリアでは、基礎呼吸およDonor である AcGFP の蛍光シグナル値と Acceptor でび最大呼吸において有意な上昇を認め、ATP 産生量もある DsRed monomer の蛍光シグナル値は siControl と増加傾向を示した（未発表データ）。Beta-lapachone に

siCox7rp 処理時では差は認められなかった。これらのついては、過去の論文で加齢マウスの骨格筋におけるミ結果より、COX7RP の発現抑制に伴う呼吸鎖超複合体

トコンドリアの構造異常、ミトコンドリアの数の減少をの形成変化を FRET シグナルが反映することが強く示

緩和し、ミトコンドリアタンパク質の発現量を増加させ、唆され、超複合体形成を FRET シグナルとして定量化

マウスの筋力・運動耐用能の上昇とエネルギー代謝量をすることを可能にした。

増加させる化合物として報告されているが［19］、呼吸鎖超複合体に直接影響を与えるという報告はない。本研究*において、新規に Beta-lapachone のミトコンドリア呼吸鎖超複合体形成促進作用を明らかにし、筋肉細胞にお0.6

けるミトコンドリアの機能を亢進させることを示した。

0.4

0.8

0.3
0.2

c FRET / Donorc FRET / Donor

0.5

0.1
0

#1

#2

siControl#1#2

siCox7rp( * : P < 0.05)
図２．呼吸鎖超複合体形成阻害時の FRET シグナ
ル値
呼 吸 鎖 複 合 体 Ⅰ -AcGFP お よ び 呼 吸 鎖 複 合 体 Ⅳ-DsRed monomer を共に安定発現する C2C12細胞を２種類（#1 と #2）の siCox7rp および２
種類（#1 と #2）の siControl（10 nM）にて処
理 し、 生 細 胞 の 蛍 光 を IN Cell Analyzer 6000
を 用 い て 測 定 し た（N = 12）。 補 正 値 cFRET/
Donor の比を示す。Error Bars: 平均値 ± 標準誤差。* P < 0.05（Two-way ANOVA）。

***

0.6
0.4
0.2
0

DMSO BetaLapachone
図３．Beta-lapachone 添加時の FRET シグナル値
呼 吸 鎖 複 合 体 Ⅰ -AcGFP お よ び 呼 吸 鎖 複 合 体 Ⅳ-DsRed monomer を共に安定発現する C2C12
細 胞 を Beta-lapachone（1 μM） も し く は 溶 媒（DMSO） に て 処 理 し、 生 細 胞 の 蛍 光 を IN Cell
Analyzer 6000 を 用 い て 測 定 し た（N = 12）。
Beta-lapachone もしくは溶媒（DMSO）を添加し、24 時間後に観察した。補正値 cFRET/Donorを示す。Error Bars: 平均値 ± 標準誤差。*** P <0.001（t-test）

４． Beta-lapachone のミトコンドリア呼吸鎖超複合体形成促進作用FRET シグナルによるミトコンドリア呼吸鎖超複合体の可視化・定量化をきっかけとして、我々はこの手法を応用したハイスループットスクリーニングを 1200 以

５．おわりに上の種類の薬理活性化合物ライブラリーを用いて行っミトコンドリア呼吸鎖超複合体を FRET の原理を利た。その結果、ノウゼンカズラ科植物パウダルコの木用して可視化・定量化する手法を確立した。簡便に効率－ 39 －

よく、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体をライブセル内で測定することが可能であり、汎用性が高いと考える。本6.

2624 (2002).

Short, K. R. et al . Decline in skeletal muscle

研究では、筋管化させた C2C12 細胞では呼吸鎖超複合

mitochondrial function with aging in humans.

体の評価を行なっていないが、今後は速筋型と遅筋型へ

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分化させた場合の呼吸鎖超複合体形成の違いについても本手法を利用して検証することが期待される。若齢と老7.

齢マウスでの速筋と遅筋における各呼吸鎖複合体の呼吸能、呼吸効率や発現量を比較する報告［20, 21］や、ヒトの若齢者と高齢者から採取した Type Ⅰ繊維（遅筋繊維）と Type Ⅱ a 繊維（速筋繊維）における各呼吸鎖複合体

8.

と OPA1 の発現量の違い［22］からは、呼吸鎖超複合体形
成も筋繊維のタイプによって異なることが予想される。
特に骨格筋の老化メカニズムの解明という観点ではこれらの筋繊維の違いが重要となるであろう。
また、本手法を利用したアッセイ系を構築し、新規に

9.

特定の化合物のミトコンドリア呼吸鎖超複合体形成促進作用を明らかにした。今後は、本手法を呼吸鎖超複合体
形成ならびにミトコンドリア機能を促進させる各種因子・刺激の特定に活用し、加齢性変化を伴う細胞・組織の機能を向上させるメカニズムの基礎研究から加齢性疾10.

患応用研究まで幅広く適用されることが期待される。
６．謝辞
本研究は、東京都健康長寿医療センター研究所システ
ム加齢医学研究チーム研究部長の井上聡先生、同研究員

11.

の竹岩俊彦先生、東京大学医学部附属病院老年病科の東浩太郎先生、埼玉医科大学医学部ゲノム応用医学の池田和博先生のご指導のもと行われました。東京大学大学院

12.

医学系研究科加齢医学講座の先生方にも多大な御助言をいただきました。実験材料の提供・先行実験において多大なるご尽力を賜わりました、東京都健康長寿医療センター研究所生体調節機能研究副部長の大澤郁朗先生、理化学研究所生命医科学研究センターの北見俊守先生に深13.

く感謝申し上げます。
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