101

骨粗懸症に対するビタ ミンCの効果

骨 粗 霧 症 に 対 す る ビ タ ミ ンCの塚

効 果

本 幾 代(奈良女子大学生活環境学部教授)れた。 その結 果,コ ラーゲ ンのハ イ ドロキ シル化
1.緒

言阻害剤 の存在 下で も,ビ タ ミンCに よ るア ルカ リ
高齢 化社 会 を迎 え,骨 粗 籟症 の予防 と症状 の改

ホ スフ ァターゼ の合成 量の増 加 が認 め られ た3)。

善が重 要 な課題 とな って いる。加 齢 と ともに骨 量

この よ うに,ビ タ ミンCの 骨 に対 する作用 機構 は,の減 少が起 こるが,そ の病 的 な変 化の代 表的 な も培 養細 胞系 において も まだ十 分 に明 らかに されてのが骨 粗霧 症で ある。骨粗 霧症 は,骨 老化の代 表い ない。 さらに,生 体 の骨(invivobonesys‑的疾 患で ある。 ビタ ミンC欠 乏症 として は壊血 病tem)は,いが代表 的 な もの であ るが,骨 へ の影響 もまた大 きsystem)と は 異 な って い る。骨 組織 で は,骨 芽

い こ とが知 られ てい る。妊 娠時 の ビタ ミンC欠 乏細胞,破 骨細 胞,軟 骨 細胞 お よびそれ らの 前駆細は胎 児の骨 形成 を阻害 し,成 人 にお いて も骨 折修胞等,種 々 の細胞が 同時 に局在 してお り,ビ タミ

くつ かの 点 で培 養 細 胞 系(culture

復 の阻害 遅延 を起 こす こ とが 知 られ てい る1)。しンC欠 乏開始 時 に,既 にコラー ゲンマ トリ ックス

か し,骨 老 化予 防に対 しては カル シウムの重 要性は存 在 し,骨 芽細胞 は分化 して お り,typeIcol‑

ばか りが強 調 され,ビ タ ミンC(アlagen,alkalinephosphatase,osteocalcinをス コル ビ ン発現酸)の 影響 につ いて は,こ れ まで全 く検討 されてしてい る。 ビタ ミンC欠 乏は,骨 に どのよ うなメいない。今 回,我 々 はビタ ミンCの 骨 形成 と骨吸カ ニズム でいっ何 を引 き起 こす のであ ろうか。生収 に対す る影響 を明 らかにす る ことによ って,骨体 の骨の レベルで その機構 は ほとん ど明 らか にさ粗懸 症の 予防 と症 状の改 善 に対 す るビタ ミンCのれ てい ない。

機能 を評価 し,健 康の維 持 と向上 に貢 献 しよ うとする ものであ る。

ヒ トはビタ ミンCを 自ら合成 で きな いが,ラ ット,マ ウスは完全 な合成 酵素群 を有 している ため,ビタ ミンCの 骨 に対 する作 用機構 につ いては,ヒ トの ような ビ タ ミンC欠 乏 症状 を表 さな い。

培 養細胞 を用 いた実験 が多 く行われ て きた。マ ウ

1973年 牧 野 らによ って発 見 されたODSラス骨芽細 胞系培 養細胞MC3T3にL‑gulonolactoneoxidase遺

お いて,ア ス コッ トは,伝子 を欠損 して いる

ル ビン酸 欠乏下 では プロ コラーゲ ンのプ ロ リンのた め ビ タ ミンC要 求性 で あ る4)。このODSラハイ ドロキ シル化が起 こ らず,三 重 鎖構造 を形成

トを用 いて ビタ ミンC欠 乏の モデル病 態を作成 すで きな い。 そのため細胞 外分 泌が阻 害 され,細 胞る こ とが で きる。我 々 は既 に,ODSラ

外コ ラーゲ ンマ トリックス形 成が阻 害 され,骨 芽いて ビタ ミンC欠 乏状態 にお ける実験 的骨折 治癒

細 胞へ の分化,組 織構 築に障 害が もた らされ ると過 程の解 析を行 った。 その結果,ビ タ ミンC欠 乏報 告 され て い る2》。MC3T3は,膜状 態 において,軟 骨細胞 の成熟 お よび,新 生 骨の性 骨化 を行 う

ッッ トを用細 胞で あるが,一 方,内 軟骨 性骨化 に対 する ビタ形 成が全 く起 こらない とい う組 織学的 所見 を得た。

ミンCの 影響 は トリ軟 骨初代 培養 系を用 いて行 わ今 回,こ のODSラッ トとい うビ タ ミンC欠 乏の102

浦 上 財団 研究 報告 書Vol.6(1998)

lllvivobonesystemを用い て,骨 組 織に おけ る

リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 活 性,酸ホス ファター ゼ活性 のビタ ミンCの 作用,ビ タ ミンC欠 乏 とカル シウム

測 定 に 用 い ら れ た 。 大 腿 骨 ・脛 骨 は,軟X線

欠乏 との相 互作用 を明 らか にするた めに,ビ タ ミと骨 組 織 標 本 作 成 に 用 い ら れ た 。

ンC欠 乏 とカル シウム 欠乏時 の骨代謝 の生化 学的

2.2生

マ ーカー を測定 し,さ らに骨塩 量 を測 定す る とと

尿 中 のCreatinineは,ク化 学的測 定方法
レア チニ ン テ ス トワもに,骨 組 織切 片を作成 し組織 学的特 徴の観 察 を

コ ー を 用 い て,Hydroxyprolineは,Bergman

行 った。

&Loxleyの方 法 を 用 い て 測 定 さ れ た5)。

血 漿 中 のICTPは,RIA法

2.実に よ って定 量 され験 方法た6)。 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 活 性,酸2.1動物

タ ー ゼ 活 性 は,4一9週 齢ODS雌

ラ ッ ト を ビ タ ミ ンCを食 餌(C‑freeDiet)とiectomyを

含 まない

ビ タ ミ ンCを水1mg/ml)で1週

間 予 備 飼 育 を し た 後,Ovar‑

行 っ た 。Ovariectomyは,飼Ovariectomy後,各群4匹に わ け,6で6週し た もの をControl,C‑freeDietとC水
そ の4週

間 後 に ビ タ ミ ンCを

タ ミ ンCをと し た 。3週

含 ま な い 水 に 換 え,3週の をC3群,2週

間後 に ビ前 の24時

ヒ ドーo.1Mリ

浸 漬 固 定ロロホル ムで

与 え て,同様 の飼育 を

片 を ヘ マ トキ シ リ ン/エと し た。

期 的 に体 重 測 定 を 行 い,飼育 修了

中 のCreatinine,

織 をパ ラフ ィ ンに切 片 を作 成 し た 。 パ ラ フ ィ ン切
オ シ ン染 色 し,組織学 的特徴 を観察 した。
色パ ラ フ ィ ン 切 片 を 脱 パ ラ フ ィ ン 後,Diagnostickit(AcidPhosphatase,leukocyte,Sigma)をも ち い て37℃,30min反定 量 を 行 っ た 。 飼 育 終 了 後,

エ ー テ ル 麻 酔 科 で 開 腹 し,血び 加 水 し た 組 織 を0.5MEDTA(pH脱 灰 した 。 脱 灰 後,組2.4TRAP染と した 。 全 実 験 動

ラホ ルムアル デし た 。 エ タ ノ ー ル 系 列 で 脱 水 後,ク

包 埋 し,4umの間 の 尿 を 採 取 し,尿応 し た 。 対 比 染 色 は,ヘ マ トキ シ リ ンで 行 っ た 。

液 を 及 び 大 腿 骨 ・脛3.結
コ ラ ー出 後4%パン 酸 緩 衝 液(pH7.4)で

含 まな い食骨 を 採 取 し た 。 血 液 は,血ル,1型

組 織切 片お よび組織標 本の作成

ビ タ ミ ンCをし た 後,Ca/C‑freeDietとC水

Hydroxyprolineの2.3骨7.2)で

間 飼 育 した も の をCa群

物 に つ い て,定ル ロ ー ス ア セ テ ー ト膜 電 気 泳 動 法に よ り同 定 さ れ た8)。

脱 脂 し,再行 っ た も の をCa/C2群,Ca/C4群
Ovariectomyを

石 酸 ナ トリウ ム のと し た 。C餌(Ca/C‑freeDiet)を

そ れ ぞれ 測 定
ホス フ ァ ター ゼ

存 在 下 で 測 ら れ た 。 ア ル カ リホ ス フ ァ タ ー ゼ ア イ

含 まない水間 飼 育 し た もの をC4群

か わ り にCaと活 性(TRAP)は,16mM酒大 腿 骨 ・脛 骨 は,摘間飼育 した も間 後 に ビ タ ミ ンCをに換 え,4週
‑freeのを 与 え,

含 ま な い 水 に換 え,

2週 間 飼 育 し た ものC2群

エ タ ノ ー ル ア ミ ン(pH9.8),50

エ ン 酸 緩 衝 液(pH4.8)でソザ イ ム は,セ間飼育

ホ ス ファ

ニ ト ロ フ ェ ニ ル リ ン酸 を 基 質 とさ れ た7)。Tartrateresistent酸

育 終 了

ず つ7群

週 問 飼 育 し た 。C‑freeDietとC水

し て,0.1Mジ
mMク

含 む 水(C時 の 血 中 エ ス トラ ジ オ ー ル 量 に よ っ て 確 認 さ れ た 。

で6週撮 影果 と考察

漿 中のエ ス トラジオー

ゲ ン ーC一テ ロ ペプ チド(Pyridinolinecross‑linkedcarboxyterminal
telopeptideoftypeIcollagen:ICTP),ア

3.1体

重お よび生化 学的骨 代謝 マーカー(1)体ル カ

Ca/C2,C2,C3群

重 変 化Fig.1に

示 す よ う に,Ca,に お い て は,Control群と

103

骨粗嶺症に対するビタミンCの 効果
同様 に順 調 な体重 増加 がみ られ た。 しか し,V℃

これ らの群 で は,既 に分解 され るべ きコラーゲ ン

欠 乏4週 間の 群,Ca/C4,C4群にお いて は,V.

が 消失 してお り,新 た な形成 も阻害 され たため とC欠 食2週 間 まではControl群と同様 の体重 増加を示す ものの,3週

以 降 に,体 重減 少 した(Fig.

1)0

思 われ る。
(3)血中 アルカ リフォス ファ ターゼ 活性

骨形 成の指標 と考 え られ てい る血 中アル カ リフォス(2)尿ンTable1に
C3群

中ハ イ ドロキ シプ ロ リン/ク レアチ ニ
示 す よ うに,Hyp/Cre比は,C2,に おい てContro1群 の約2倍 に上昇 した。

この結 果 は,C2とC3群におい て コラー ゲ ンのファ ターゼ活性 は,V.C欠 乏食4週 間 の群,C4,rC
a/C4群 にお い てControl群 の 各々約50%,30%に 減少 した。C2,C3,Ca,Ca/C2群

で は,Control群 との差 は み られ なか った。 さら に,ア分 解が増 加 してい る ことを示唆 してい る もの と考

イ ソザ イム を見 てみ ると,V℃

え られ る。C4,Ca,Ca/C2群

ル カ リフ ォス ファター ゼ活性 の減少 は,骨 アルカ

では,Control群

欠乏食4週 間 のアとの差異 は,認 め られなか った。 しか し,Ca/C‑

リフ ォスフ ァターゼ活性 の減 少で あるこ とが明 ら

4群 で は,尿 中Hyp/Cre比か となった(Table1)。

が有 意 に減 少 した。

(4)血中酸 性 フォスフ ァターゼ活性酸性 フ

ォス ファターゼ 活性 は,い ず れの欠乏食 群 において も,Control群と比 べて上 昇傾 向が認 め られた。

特 に,破 骨細胞 か ら放 出 され た もの と考 えられる
血 中TRAPのCa/C4群

活 性 は,C2群のCa欠血 中TRAPのとCa,Ca/C2,乏 群に おい て有意 に上昇 した。

上昇 は,こ れ らの欠 乏食 群 において破骨細 胞の活 性化,骨 吸収 の増加 を示唆 する もので ある(Table1)。
(5)血中ICTP破骨細 胞 に よる骨 吸収 時には,骨 組織 中の1型 コラー ゲンが分 解 され て血中に放 出され る。 この と き,1型
Ftig.1Weightgainineachgroup.Eachpointrepresentsthe
meanoffourrats.

コラーゲ ンのC末端 部分 か らピ リジノ リン またはデ オキ シピ リジ ノリンによ って架橋 された まま放出 され るペ プチ ド
TablelBiochemicalanalysisofserumandurine.

Datawereshownasmeans±SDof4rats.

Asterisksindicatesignificantlydifferentfronthecontrolvalue(p<0.05).

104

が,1型

浦上 財 団研 究報 告 書Vol.6(1998)

コラー ゲ ンーC一テ ロペ プチ ド(ICTP)

で あ り,血 中 のICTP濃度 は骨 組織 の 骨 吸収 量

節 部 位condyle,tibialtuberosityの消 失,fibula,遠 位 大腿 骨(distalfemur)や近位けいを反映 す る 指標 と考 え られ て い る。血 中ICTP骨(proximaltibia)のは,V.C欠端(epiphysis)の乏4週 間 の群,C4,Ca/C4群て,Control群のそれ ぞれ1.3,1.9倍 に有 意 に上昇 して い た。C2,C3,Ca,Ca/C2群
中ICTPのにおい

で は,血上 昇 は認 め られ なか った(Table1)。

骨代謝 の生化 学的マ ーカー の結果 は,V.C欠
2週 間のPhaseIのC欠れ た。Caで は全体 的 に骨塩 量の 減少 がみ られ,Ca/C2では さ らに大 腿 骨 と脛 骨の 骨 幹端(metaphysis)部
乏乏で まず破骨 細胞 によ る

骨幹 端(metaphysis)骨骨塩 量 の著 しい減 少 が認 め ら

分 の骨 塩 量 が減 少 した。2週

間 のV.C欠 乏 にお いて は,ま だV.C欠乏 の臨 床症 状 を呈 して い な い に もか か わ らず,大 腿 骨

骨 吸収の活 性化 が起 こ り,そ の後体重 減少,体 毛(distalfemur)や脛 骨(proximaltibia)のの 粗雑化,眼 や 鼻孔周 辺の出血,歩 行 異常 な どの

幹 端(metaphysis)骨端(epiphysis)部

ア ス コル ビ ン 酸 欠乏 の 臨 床症 状 が観 察 され る塩量 の減少 を引 き起 こす こ とが明 らか とな った。

PhaseHのV.C欠乏 にお いて,ア ル カ リホ ス フ

デン シ トメー ターで測定 した結 果,大 腿骨 ではァターゼ が減 少 し骨形 成阻害 が起 こった事 を示唆

C2,C3,C4,でしてい る。

41%,Ca/C2で軟x線 に よる骨 塩量 の 結果 を,Fig.2に示 した。 コン トロール と比 較す る と大腿骨,脛 骨 とも
乏2週

各々,86,77,44%,Caでは29%にはまで 減少 して いた。 カル シ ウム欠 乏 によ る骨塩 量 減少 はC欠 乏 に よっ

3.2骨 塩量に,C欠骨分の骨間 で す で に 骨 幹 端(meta‑て さ らに増 大 した。
さ らに骨幹端 部だ け を測 定 した値 で は,C2で既 に60%,C3で50%,C4では6%に 減 少 していphysis)部 分 の骨塩 量の減 少が認 め られた。 さらた。 また,Caでに3週 間,4週減 少 して いた。骨 塩量 の骨 幹端部 での減 少が著 し間 と減 少 して,4週間に なる と関は24%,Ca/C2では9%にまでいこ とが判 明 した。脛骨 で も同様 の傾 向がみ られた。
3.3骨の組織 観察

大腿骨(femur)の脱 灰後 のパ ラフ ィン切 片のヘ マ トキシ リンーエオ シン(HE)染腿 骨骨 幹端 部 分 を,Fig.3に色 標本 の大示 す。 コン トロー

ルで は十 分 な小柱骨 の発 達が み られ たが,C2では骨が浸 食 され,小 柱骨 の骨基 質が細 く短 くな ってい た。C3ではそ の傾 向 が進 み,C4では小 柱骨 の骨基 質 と軟骨 肥大細 胞が ほ とん ど消失 している様子 が うかが えた。Caにおいて は,小 柱骨 の骨 基質 が短 くな ってお り,Ca/C2では,小 柱 骨の骨基質 が細 く繊 維状 にな っていた。 骨塩量 の減少 は同時 に骨基質 の減 少を伴 ってお り,V℃
Fig,2SoftX‑rayoffemurandtibia

欠乏

2週 間 目か ら,骨 吸収 の上昇 が 起 こって い るこ と

105

骨 粗穎 症 に対 す る ビタ ミ ンCの 効 果

Fig.3H&E染色 組 織 像(originalmagnification×16)

が明 らか とな った。V.C欠 乏3週 間 では,軟 骨 肥

C3で大細胞(hypertrophicchondrocyte)の減少 が認

は骨 が浸食 され尽 くして,破 骨細胞 の付着 する とめ られ軟 骨 の分 化 にV.Cが 重 要 な役割 を果 た し

こ ろがな く,コ ン トロール よ り酵素 染色が 少なかて いる ことが示唆 され た。

っ た。Caで はControlと 同様 に,小 柱骨 の骨 基

3.4TRAP染

色

は軟骨 細胞 まで 浸食 が進 ん でい た。C4で質 の周囲 に破 骨細胞 が み られ た。Ca/C2ではか な り異 な り,C3とは,破骨 細胞 の マー カー酵 素 であ るTRAPの酵素

Caと同様,小 柱 骨 の骨活性 を ジア ゾニ ウ ム塩 を用 いて,insituで大腿基 質 の 内側 深 く まで 酵素 染 色が 見 られ た。H‑E

骨骨幹端 部 分の組織 切片 で酵素 染色 を行 った結 果

染 色 の 場 合 に見 られ た よ うに,Ca/C2でをFig.4によ りも骨基質 が繊維状 に残 存 して お り,そ のた め

示 した。

Contro1で は小柱 骨の 骨基質 の周 りに破 骨細 胞が点在 してい るが,C2では酵 素染色 が小 柱骨 の骨基質 の周 囲を覆 うよ うに存在 してお り,さ らに内側か らも骨 が浸食 され てい る様 子が見 られ た。

はCa

破 骨細 胞 もそこに よ り多 く接 着 してい るように思われ る。
TRAP染色 によ り,C欠

乏2週 目以降 にお いて,組 織学 的に大腿 骨骨幹端 部分 の破骨 細胞,骨 吸収

106

浦1二財 団研 究報 告 書VoL6(1998)

Fig.4TRAP染色 組 織 像(originalmagnificationx16)

活性 の増加 が認め られた。

閉 経後 のエス トロゲ ン欠 乏 による骨塩量 の低下 を助長 す る もの と考 え られ る。即 ち,Caと

4.おともに,わ りに十 分量 のV.Cのsubclinica1なV.C欠乏状 態 にお い て も,す で摂取 は,骨 塩 量 の減少 を阻止 す

るため に必 須で ある と思 われ る。に骨塩 量の低 下が起 きて いる ことが明 らか とな り,
Ca欠 乏状 態が 存在 す るこ とに よって,そ の影響

本研究 を行 うにあた り,ご 援助 賜 りま した浦 上は さらに大 き くな るこ とが判 明 した。V℃ 欠乏 は

食 品 ・食 文化振興 財団 に心 より深 く感謝 の意 を表とくに,軟 骨細 胞 に対す る影 響が大 であ り,遠 位します と ともに貴 財団の 益々の ご発展 を祈念 申 し大腿骨(distalfemur),近上 げ ます。

位 けい骨(proximaltibia)の 骨幹 端 部分 の骨 塩量 の 低 下,さ らに は関節部位 の消 失を もた らした。エ ス トロゲン欠乏に よって も近位 脛骨(proximaltibia)におけ る

骨塩量 の低下 が報告 されて いるが,V.C欠乏は,文

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107

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVol.6(1998)

108

EffectofVitaminConBone
IkuyoTsukamoto(DepartmentofFoodScienceandNutrition,NaraWomen'sUniversity)

Osteoporosis,oneofthemostimportantdisordersassociatedwithaging,isaserious
publichealthproblem.Hormonal,dietaryandotherlife‑stylefactors,aswellasgeneticfactors,mayallcontributetobonelossthatleadstothedevelopmentofosteoporosis.An
associationbetweendietandincidenceofosteoporosishasbeensuspected.Ithasbeenwellknownthatastateofsevereascorbicaciddeficiency,scurvy,resultsinthefailureof
injuredbonetoundergorepair.ToinvestigatetheeffectofvitaminConboneremodeling,
thedeterminationofthebiochemicalmarkersofboneformation(serumandbone‑specificalkalinephosphate)andboneresorption(urinaryhydroxyproline,serumcarboxy‑terminal
pyridinolinecross‑linkedtelopeptideoftypeIcollagen(ICTP),serumtartrate‑resistant
acidphosphatase(TRAP)),bonemineralcontentmeasurementsbysoftX‑rayandhis‑
tologicalanalysisweredoneinovariectomizedOsteogenicDisorderShionogi(ODS)rats,
whichhaveaninheriteddefectinascorbicacidsynthesis.ODSratsweredivided7groups
andfedfor6weeksafterovariectomy.Theyreceivedcontroldietfor6weeks(control),controldietfor4,3,0r2weeksfollowedbyaV.0‑freedietfor2,30r4weeks,respec‑tively(C2,C3,0rC4),calcium‑freedietfor6weeks(Ca),calcium‑freedietfor4weeks
followedbyV.Oandcalcium‑freedietfor2weeks(Ca/C2),orcalcium‑freedietfor2
weeksfollowedbyV.Oandcalcium‑freedietfor4weeks(Ca/C4).Thelossofweightgainandthedecreaseinalkalinephosphataseactivity(boneformationmarker)wereobservedonlyin4week‑V.C‑deficientgroups,C4andCa/C4.TheactivitiesofTRAPin
allexperimentalgroupsweresignificantlyhigherthanthecontrolwhilethehigherlevelofICTPwasobservedinC4andCa/C4group.Theincreaseintheurinaryhydroxyproline
wasobtainedinC2andC3group.Thesebiochemicalparameterssuggestedthatthe
increaseinboneresorptionoccurredundersubclinicalascorbicaciddeficiencyandwas
followedbythedecreaseinboneformationatsevereascorbicaciddeficiencywithweightloss.ThesoftX‑rayphotographalsoshowedthedecreaseinmineralcontentinmetaphysis
offemurandtibiaasearlyas2weeksofV.Odeficiency.Microscopicexaminations
confirmedthatossificationzonewasinfiltratedwithcellsandosteoclastsinthemeta‑
physealregion.offemurofV.Odeficiencyratsafter2weeks.Themetaphysealtrabecularbonematrixalmostdisappearedat3weeks.Theepiphysealcartilagewastotallydevoid
oftheunderlyingboneandthehypertrophicchondrocyteswerefewerat4weeksof
ascorbicaciddeficiency.TheeffectsofCadeficiencyandascorbicaciddeficiencyonbone
losswereadditional.TheseresultsindicatethateventhesubclinicalvitaminCdeficiency

EffectofVitaminConBone

causestheboneloss,especiallyinmetaphysicoffemurandtibiaandthattheintakeof
vitaminCaswellascalciumisneededtokeephealthofbone.

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