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浦上財団研究報告書

Vol.16（2008）＜平成19年度＞

放線菌由来新規アシラーゼを用いたカプサイシン誘導体の量産化と抗酸化性・抗菌性の検証
中西一弘 ・ 今村維克 ・ 今中洋行

（岡山大学自然科学研究科）

1.

はじめに−研究の背景と目的泌亢進作用など様々な機能を有することが，近年明らかにされてきている 5 〜 7）。しかし，カプサイ

申 請 代 表 者 ら は， 最 近， 放 線 菌 Streptomyces

シンの辛味がその利用の拡大を妨げている。カプ

mobaraensis の培養上清中から単離した新規アシサイシンの脂肪酸部位（8-メチル-6-ノネン酸）がラーゼが，唐辛子の辛み成分であるカプサイシン中鎖もしくは長鎖飽和脂肪酸で置換されたカプサ（8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide） を 効 率 よ く

イシン誘導体は，カプサイシンとしての機能は，加水分解することを見出した１）。本酵素のカプサ程度の差はあるものの維持されるが，辛味が大幅

イシンに対する加水分解活性は，既に報告されてに減少する。例えば，N-ラウロイルバニリルアミいるラット肝臓由来の Carboxyesterase ２） やブド（C12-vanillylamide） 及 び N-ミ リ ス ト イ ル バ

タ腎臓由来アミノアシラーゼと比較して，100 〜ニリルアミド（C14-vanillylamide）は，カプサイ10,000 倍程度高い。さらに，基質特異性について

シンと比較して辛みが 1/20 程度であることが報

検討を加えたところ，本酵素はカプサイシンだけ告されている５）。この様な背景の下で，国内の研ではなく，N-脂肪アシルアミノ酸及び N-脂肪ア究者によりカプサイシン誘導体合成反応法についシルペプチドなどのアミド結合をも効率よく加水て研究されてきたが，未だに十分な方法は開発さ分解する興味深い酵素であることがわかった。最れていない 8, 9）。そこで，本研究では，Sm-PVA終的に，遺伝子解析の結果，本酵素は，広い基質を用いたカプサイシン誘導体の効率的合成に着目

特異性を有する新規なペニシリン V アシラーゼした。当初，１）遺伝子組換え菌を用いた酵素の（以降，本酵素を Sm-PVA と略する）であること

量産，２）酵素の固定化とバイオリアクターによが判明した ３）。ペニシリン G アシラーゼなどのる大量合成方法の構築を行い，３）調製したカプb-ラクタムアシラーゼは，アミド結合の加水分解

サイシン誘導体を用いて，十分な検討がなされて反応を触媒するだけではなく，エステル化合物いない抗酸化性や抗菌性の検証を最終目標とした（アシル供与体）と求核性物質を基質とするエスが，下記に述べるように，遺伝子組換え菌によるテル交換反応をも触媒することが知られている４）酵素の大量発現が，予想していた以上に難しく，ので，Sm-PVA も同じ反応を触媒することが推

酵素を大量に必要とする酵素の固定化と抗菌性に定された。

関する検討は，予定通りに行うことができなかっ本研究では，本酵素を用いてカプサイシン誘導体の量産化に必要な技術的基盤を確立する。カプサイシンはトウガラシに含まれる辛味成分であり，代謝亢進作用，鎮痛作用，食欲増進作用・胃酸分た。現在，研究を続行しているので，別の機会に発表させて頂ければと考えている。

放線菌由来新規アシラーゼを用いたカプサイシン誘導体の量産化と抗酸化性・抗菌性の検証

2. Sm-PVA を用いるカプサイシン誘導体合成
反応のスキーム

77/100 mM トリス緩衝液，pH7 中，37℃で反応を行うと，最大収率約 60％でラウロイルバニリルアミドが合成される。しかも，反応後期には，生Sm-PVA は，カプサイシン（Ⅰ）のアミド結成物はヘキサン中に結晶として生成する。しかし，合の加水分解反応を触媒するだけではなく，エス本方法の問題点は，有機溶媒（上記の場合はヘキテル交換反応も触媒する 10）。加水分解反応では， サン）の添加が必要であること及び合成反応速度カプサイシンから 8-メチル-6-ノネン酸（Ⅱ）とが低いことである。

バニリルアミン（Ⅲ）が生成する（（1）式）。し

一方，上述したように，Sm-PVA はエステル

たがって，カプサイシン誘導体を合成するために交換反応も触媒する。本酵素を用いると，水溶液は，例えば，ラウリン酸（Ⅳ）とバニリルアミン中での反応で，中鎖・長鎖脂肪酸メチル（エチから，加水分解反応の逆反応により，脱水縮合しル）エステルをアシル供与体，バニリルアミンをて，カプサイシン誘導体であるラウロイルバニリ

求核試薬としてカプサイシン誘導体を，効率よくルアミド（Ⅴ）を生成することができる（（1）' 式）。 合成できることが期待される。図 1 にエステル交
しかし，（1）' 式の反応の平衡関係は，基質側（ラ換反応のスキームを示す。フェノキシ酢酸メチル

ウリン酸とバニリルアミン）に偏っているので，エステルをアシル供与体，6- アミノペニシラン酸

水溶液中での反応では，極めて，低い収率しか得を求核基質としたエステル交換反応によりペニシられないが，有機溶媒の添加などにより高い収率

リン V を合成するモデル反応の結果によると，を達成することが可能となる 11, 12）。実際，本反応

Sm-PVA は a=（kcat/Km）P/（kcat/Km）S の 値 が 小 さ系では，緩衝液に水不溶性有機溶媒であるヘキサ

く，一方，b=k4/k3Kn は大きいことから，転移能ンを添加すると，カプサイシン誘導体の合成収率が高い酵素であることが明らかにされている 10）。

が著しく増加する１）。20 mM バニリルアミンと200 mM ラ ウ リ ン 酸 を 基 質 と し て， ヘ キ サ ン

図1

3. 酵素の構造

エステル交換反応モデル
カプサイシン誘導体合成反応の場合は，アシル供与体として脂肪酸メチルエステルを，求核基質としてバニリルアミンを用いる。加水分解物（副生成物）は，脂肪酸である。

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浦上財団研究報告書

Sm-PVA の遺伝子の塩基配列及び発現タンパ
ク質のドメイン構造は，既に，申請者らにより明らかにされている３）。Sm-PVA 遺伝子の ORF（オVol.16（2008）

4.
4. 1

実験方法
遺伝子組換え菌の調製及び Sm-PVA の発現と精製ープンリーディングフレーム）は，2445 bp，アミノ酸配列として 814 残基である。本遺伝子にSm-PVA のような放線菌由来の酵素は，コーより翻訳される酵素前駆体ポリペプチドは，N 末ディング領域中に大腸菌などの宿主におけるレア端からシグナル配列（43 aa），a サブユニット

コドンを多く含み，GC 含量も比較的高いことか（173 aa），リンカー領域（28 aa），b サブユニッら，異種宿主を用いた大量発現系の構築は困難な

ト（570 aa） か ら な る。 こ の 酵 素 前 駆 体 は S.

場合多い。そこで本研究では先ず，同属の放線菌

mobaraensis の細胞膜を通過する際に，シグナルS. lividans TK24 を 宿 主，Herai ら の 開 発 し た配列が切断される。細胞内で，a サブユニット及pSH1913） を発現用ベクターとする宿主−ベクタ

び b サブユニットが生成・会合することにより，ー系を利用することとした。インサートとして，酵素活性体を形成し，菌体外に分泌されるものとSm-PVA の全 ORF を含む遺伝子断片（SaLb），

考 え ら れ る。Signal P3.0 で 調 査 し た と こ ろ，aシグナルペプチドを欠失した Sm-PVA 遺伝子断サブユニットの N 末端側 16 残基が分泌のための片（aLb）及びシグナルペプチドおよびリンカーシグナルペプチドを構成していることも判明した。 ペプチドを欠失した Sm-PVA 遺伝子断片（ab）
さ ら に， 本 酵 素 の ア ミ ノ 酸 配 列 を，DNASIS®の 3 種類を調製した。各遺伝子断片を pSH19 にPro を用いて Multiple alignment したところ，上挿 入 し て 構 築 し た 発 現 ベ ク タ ー pSH19-SaLb,

述したように，N- アシルホモセリンラクトンア

pSH19-aLb および pSH19-ab を用いて，あらかシラーゼ，アクレアシン A アシラーゼ，セファじめ調製したプロトプラストの形質転換を行い，ロスポリンアシラーゼ及びペニシリン G アシラ

組 換 え Sm-PVA（rSm-PVAsl） 発 現 用 の 放 線 菌ーゼなどの b-ラクタムアシラーゼと同じ酵素前（S. lividans/pSH19-SaLb，S. lividans/ pSH19-

駆体の構造をとるだけではなく，比較的高い相同aLb 及び S. lividans/ pSH19-ab）を調製した。

性を示した。さらに，Sm-PVA は b-ラクタムア

S. lividans/pSH19-PVA の 胞 子 懸 濁 液 を 20 ng/シラーゼにみられる活性部位を形成する Ser1b，mL チ オ ス ト レ プ ト ン を 含 む 30 mL TSB 培 地

His23b，Val70b 及 び Asn276b も 保 存 し て い る/100 mL 坂口フラスコに植菌し，30℃で 2 〜 3ことがわかった。これらの知見に基づいて，b-ラ日間本培養した。f-カプロラクタムまたはイソバクタム系抗生物質に対する加水分解活性を調べた

レロニトリルを用いて，タンパク質発現を誘導しところ，本酵素はペニシリン V 及び既往のペニた。菌体及び培養上清を回収し，菌体懸濁液を超シ リ ン V ア シ ラ − ゼ の 良 好 な 基 質 で あ る，音波処理した後，可溶性画分を取得した。培養上NIPOAB（2-Nitro-5-phenoxyacetamido benzoic

清および可溶性画分を用いて SDS-PAGE ならびacid）に対して極めて高い活性を示した３）。これに活性測定を行い，目的タンパク質の発現等の検らの結果から，本酵素は，広い基質特異性を有す討を行った。

る新規なペニシリン V アシラーゼであることが判明した。

4. 2

遺伝子組換え大腸菌の調製と Sm-PVA の発現

Sm-PVA とサブユニット構造が類似の大腸菌

放線菌由来新規アシラーゼを用いたカプサイシン誘導体の量産化と抗酸化性・抗菌性の検証

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由来ペニシリン G アシラーゼ組換え体の発現及び１％に溶解したリノール酸メチルを，ショ糖

例 14） を参照し，大腸菌を用いた発現系の構築をエステルを含むリン酸緩衝液 pH7.0 中に分散さ試みた。まず，Sm-PVA 遺伝子の a サブユニッせてエマルション（終油含量；３％）を調製した。

ト及び b サブユニットをコードする遺伝子断片

こ の エ マ ル シ ョ ン に AAPH（2,2-azolebisに制限酵素認識配列を付加し，それぞれサブクロ（2-aminopropane）dihydrochloride を 添 加 し，ーニングした。そして，4 アミノ酸残基より構成脂質酸化を誘導した。37℃で 48 時間後の過酸化されるリンカー（Linker）コーディング配列を間物価（POV）及びチオバルビツール酸（TBA）に含み，b-Linker-a の順に配列させた遺伝子断を測定した。

片を pET22b ベクターに挿入し，発現用ベクター pET-SCbLa を構築した。宿主として，大腸菌のレアコドンに対応した E. coli Rosetta2（DE3）（Novagen） を 用 い た。pET-SCbLa を 用 い て 形

5. 実験結果と考察
5. 1

遺伝子組換え菌の調製及び Sm-PVA の発現と精製質転換を行い，得られた形質転換体の培養を行っ

形 質 転 換 体 S. lividans/pSH19-SaLb，S.

た。終濃度 0.1 mM の IPTG の添加により，目的lividans/pSH19-aLb及 びS. lividans/ pSH19-abタンパク質（rSm-PVAec）の発現を誘導した。

を用いて rSm-PVAsl の発現を調べた。TSB 培地

4. 3

エステル交換反応を用いたカプサイシンを用いて前培養および本培養を行った後，0.1％誘導体の合成

f-カプロラクタムまたはイソバレロニトリルを添アシル供与体の脂肪酸エステルとして，オクタ加し，30℃で 24 時間誘導を行った。図 2 に，培ン酸メチルエステル，ラウリン酸メチルエステル

養上清及び可溶性画分中に含まれる酵素活性を比及びミリスチン酸メチルエステルを，一方，バニ較した結果を示す。ネガティブコントロールであリルアミンを求核基質として用い，エステル交換

る No.1 〜 4 では目的酵素をコードする遺伝子が反応を行い，それぞれの飽和脂肪酸によりカプサ組み込まれていないので，全く活性が見られない。

イシンの脂肪酸部位が置換されたカプサイシン誘

一方，形質転換体 S. lividans/pSH19-SaLb を用い，導体合成反応を行った。反応初期の脂肪酸エステ

f-カプロラクタムまたはイソバレロニトリルで誘ルの濃度は 20 mM，バニリルアミンの濃度は 40

導した場合（No.6，7）に，培養上清，可溶性画mM，酵素濃度は 4 U/mL −反応溶液で，pH7，分のどちらにおいても酵素活性が認められた。特30℃の条件で反応を行い，反応中の基質濃度及びに，イソバレロニトリルで誘導した場合に，培養生成物濃度の経時変化を追跡した。脂肪酸エステ

上清において，最も高い酵素活性が認められた

ル及び生成物の分析は，高速液体クロマトグラフ（1.3 U/mL）。 し か し， 形 質 転 換 体 S. lividans/ィ ー に よ り 行 っ た。YMC-Pack C8 A-202（4.6pSH19-aLb 及 び S. lividans/pSH19-ab を 用 い たmm × 150 mm）を用い，移動相としては，0.05

場合には，rSm-PVAsl の発現は確認できなかった。

％リン酸を含む 50 〜 80％ メタノールを用い，そこで，rSm-PVAsl の発現量を増やすため，210 nm で検出した。
4. 4

抗酸化性の検証

形質転換体 S. lividans/pSH19-SaLb の培養において，本培養の培地組成，本培養の時間，フラスコカプサイシン及びカプサイシン誘導体のラウロの容量，誘導剤の濃度，誘導時間などについて検イルバニリルアミドを，0.25％（wt/vol），0.5％討を行った。その結果，TSB 培地中で 30℃，2

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図2

図3Vol.16（2008）

rSm-PVAsl の発現確認

SDS − PAGE による rSm-PVAec の発現確認〜 2.5 日間本培養後，0.01％ イソバレロニトリル発現を試みた。発現の誘導条件を 20℃，15 時間，で 24 時間誘導することにより，最大 2.0 U/mL

24℃，15 時間及び 30℃，5 時間とし，発現後のの酵素活性が得られた。しかし，野生株を培養し各 種 分 画 サ ン プ ル を SDS-PAGE に 供 し，rSm-て得られる酵素活性と比較して十分高いとはいえPVAec の発現量，可溶化度について調べた。そない。その理由の一つとして，翻訳後のタンパクの 結 果， 温 度 を 下 げ る こ と に よ っ て，rSm-質のプロセッシングに問題があるのではないかと

PVAec の発現量は低下したものの，可溶化率の考え，形質転換体 S. lividans/pSH19-SaLb の培養向上がみられた（図 3）。そこで，可溶性画分を上清から組換え PVA（rSm-PVAsl）を精製した。 用いて活性測定を行ったが，目的の酵素活性は検
このため，rSm-PVAsl の比活性は，野生型 PVA出されなかった。本タンパク質（Sm-PVA）は野の お よ そ 半 分 で あ る こ と が 判 明 し た。 ま た，

生型ではヘテロ二量体であり，適切な 4 次構造のrSm-PVAsl の N 末端アミノ酸解析を行ったとこ形成がタンパク質の成熟過程で必須となる。一方，ろ，シグナルペプチドの切断位置が野生型酵素とrSm-PVAec は一本鎖ポリペプチドとして発現さは異なる a サブユニットが主に発現しているこ

せているため，4 次構造の形成は必要ではなく，とが分かった。したがって，野生型 PVA に比べ， 適切な 3 次構造形成のみが要求される。すなわち，
rSm-PVAsl の比活性が低いのではないかと考え活性体が得られなかった原因としてはフォールデられる。

ィングが不十分であることが考えられた。そこで，

5. 2

遺伝子組換え大腸菌の調製と Sm-PVA の現在は大量に回収可能で高純度な不溶化 rSm-発現

PVAec を用いてリフォールディング条件を検討

形 質 転 換 体 E. coli Rosetta2（DE3）/pETSCbLa を 用 い て 組 換 え PVA（rSm-PVAec） のすることにより，rSm-PVAec 活性体が取得できるものと考えられる。

放線菌由来新規アシラーゼを用いたカプサイシン誘導体の量産化と抗酸化性・抗菌性の検証

図４

カプサイシン誘導体合成反応経時変化（a）C8-Vanillylamide 合成反応（b）C12-Vanillylamide 合成反応（c）C14-Vanillylamide 合成反応●■▲

5. 381脂肪酸エステル脂肪酸
カプサイシン誘導体

エステル交換反応を用いたカプサイシン換反応の経時変化を比較すると，炭素数の少ない誘導体の合成オクタン酸メチルエステルを用いた場合に，最も図 4（a）〜（c）には，アシル基転移反応によるカプサイシン誘導体の合成初速度は速いものの，オクタン酸メチルエステル，ラウリン酸メチルエ

最大収率は 10％程度で最も低くなっている。こステル及びパルミチン酸メチルエステルとバニリ

れは，基質のラウリン酸メチルだけではなく，生ルアミンからのカプサイシン誘導体合成反応の経成物のラウロイルバニリルアミンの溶解度も高い時変化を示す。いずれの場合も，反応初期から基ために，加水分解反応が，より優先的に起こるた質の飽和脂肪酸濃度が経時的に低下し，一方，目めであると考えられる。表 1 に初期合成速度，カ的生成物のカプサイシン誘導体と加水分解物の飽プサイシン誘導体の最大収率及び合成速度と加水和脂肪酸が増加している。しかし，飽和脂肪酸は分解速度の比，S/H をまとめて示す。

経時的に増加しているが，カプサイシン誘導体は5. 4最大値に漸近していることがわかる。これらの結先 ず， コ ン ト ロ ー ル の 何 も 加 え な い 場 合 の果は，エステル化合物の生成と加水分解反応が同POV を測定したところ，212 meq./kg であった。

時に競争的に進行するエステル交換反応の典型的一方，カプサイシン及びラウロイルバニリルアミなパターンである。基質の違いによるエステル交ドを 1％添加した系では，コントロールと比較し抗酸化性の検証������������������������������������������������������������������������ �������������������������������������������������������������������� ������������������������ �������������� ����������������������������������������

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Vol.16（2008）て，1/20 以下の 6.3 meq./kg 及び 8.3 meq./kg とプチドの切断箇所が野性型酵素とは異なる場所で著しく低い値を示した。

切断されていることが示唆された。大腸菌では，また，TBA を測定した場合には，コントロー放線菌を用いた発現時に比べ，発現量が著しく増

ルでは，最大 33 nM に達したが，カプサイシン加したものの，活性体の取得には至っていない。

及びラウロイルバニリルアミドを 1％添加した系

そのため，現在，大量に回収可能で高純度な不溶では，約 1/100 程度の 0.4 nM 以下であり，二次化 rSm-PVAec を用いてリフォールディング条件酸化生成物は殆ど生成していないことが示唆されを検討し，rSm-PVAec 活性体の取得を目指してた。

いる。

なお，0.5％添加時にもカプサイシン及びラウロイルバニリルアミドはともに POV 及び TBA

謝

値をほとんど上昇させなかったが，0.25％ 添加時

本研究を遂行するにあたり，研究助成を賜りまには，脂質酸化を完全に抑制することはできなかした浦上食品・食文化振興財団に心より感謝申しった。以上の結果から，合成カプサイシン誘導体上げます。実験に使用しました放線菌発現ベクタのラウロイルバニリルアミドは，カプサイシンとー pS19 をご供与頂きました筑波大学小林達彦教

ほぼ同程度の酸化抑制効果を有することがわかっ授に感謝致します。

辞た。
6. 今後の展開
本研究で取り扱った放線菌，S. mobaraensis 由来のペニシリン V アシラーゼは，カプサイシンの加水分解を極めて効率よく触媒するだけではなく，アシル基転移反応も触媒する。このアシル基転移反応を利用すると，水溶液中でもアミド化合物合成反応を効率よく触媒するので，食品関連素材物質の生産にとって非常に魅力的である。本研
究では，飽和脂肪酸メチルエステルとバニリルアミンからエステル交換反応によりカプサイシン誘導 体 が 合 成 で き る こ と を 確 認 し た。 次 に，S.

文献１） Koreishi M., D. Zhang, H. Imanaka, K. Imamura, S.
Adachi, R. Matsuno, and K. Nakanishi. A novel acylasefrom Streptomyces mobaraensis that efficiently catalyzeshydrolysis/synthesis of capsaicins as well as N-acyl-Lamino acids and N-acyl-peptides. J. Agric. Food Chem.,
54, 72（2006）.
２） Park, Y.-H. and S.-S. Lee. Identification andcharacterization of capsaicin-hydrolyzing enzymes
puriﬁed from rat liver microsomes. Biochem. Mol. Biol.
Int., 34, 351（1994）.
３） Zhang D., M. Koreishi, H. Imanaka, K. Imamura and K.
Nakanishi. Cloning and characterization of penicillin Vacylase from Streptomyces mobaraensis. J. Biotechnol., 128,788（2007）.

mobaraensis の野生株からの酵素の生成量は極め

４） Youshko, M. I., G. G. Chilov, T. A. Shcherbakova, andて少量であるので，大量発現を目指して放線菌

V. K. Svedas. Quantitative characterization of theS. lividans と E. coli を宿主とする新規なコンセプ

nucleophile reactivity in penicillin acylase-catalyzed acyltransfer reactions. Biochem. Biophys. Acta, 1599, 134

トの遺伝子組換え菌を作成した。S. lividans を宿（2002）.

主とする遺伝子組換え菌では，その程度は十分で５） Watanabe, T., T. Kawada, T. Kato, T. Harada, and K.

はないもののタンパク質発現と活性発現にも成功した。しかし，精製酵素の比活性は野性株酵素の50％程度であった。この原因として，シグナルペ

Iwai. Effects of capsaicin analogs on adrenal catecholaminesecretion in rats. Life Sci., 54, 369（1994）.
６） Minowa, S., S. Tsuchiya, S. Horie, K. Watanabe, and T.

放線菌由来新規アシラーゼを用いたカプサイシン誘導体の量産化と抗酸化性・抗菌性の検証

83

Murayama. Stimulatory effect of centrally injected11） Nakanishi, K., Y. Kimura, and R. Matsuno. Kinetics ofcapsaicin, an agonist of vanilloid receptors, on gastric acidenzymatic synthesis of peptides in aqueous/organic

secretion in rats. Eur. J. Pharmacol., 428, 349（2001）.

biphasic systems. Thermolysin-catalyzed synthesis of N-７） Winter, J., S. Bevan, and E.A. Campbell. Capsaicin and（benzyloxycarbonyl）-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl

pain mechanisms. Br. J. Anaesth., 75, 157（1995）.

ester. Eur. J. Biochem., 161, 541（1986）.

８） Kobata, K., K. Yoshikawa, M. Kohashi, and T.

12） Miyanaga, M., M. Ohmori, K. Imamura, T. Sakiyama,Watanabe. Enzymatic synthesis of capsaicin analogs withand K. Nakanishi.Kinetics and equilibrium for thermolysin-liver acetone powder. Tetrahedron Lett., 37, 2789（1996）.

catalyzed synthesis of dipeptide precursors in aqueous/９） Kobata, K., M. Kawamura, M. Toyoshima, Y. Tamura,organic biphasic systems. J. Biosci. Bioeng., 90, 43（2000）.

S. Ogawa, and T. Watanabe. Lipase-catalyzed synthesis of13） Herai, S., Y. Hashioto, H. Higashibata, H. Maseda, H.

capsaicin analogs by amidation of vanillylamine with fatty

Ikeda, S. Omura, and M. Kobayashi. Hyper-inducibleacid derivatives. Biotechnol. Lett., 20, 451（1998）.

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USA, 101, 14031（2004）.

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14） Flores, G., X. Soberón, and J. Osuna. Production of aantibiotics and N-fatty-acylated amino compounds byfully functional, permuted single-chain penicillin G acylase.

penicillin V acylase from Streptomyces mobaraensis. Biosci.

Protein Sci., 13, 1677（2004）.

Biotechnol. Biochem., 71, 202（2007）.

84

URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.16（2008）

Fundamental studies on enzymatic synthesis of capsaicin derivatives using a novel
acylase from Streptomyces mobaraensis and elucidation of their functions
Kazuhiro Nakanishi, Koreyoshi Imamura and Hiroyuki Imanaka（Division of Chemistry and Biochemistry, Graduate School of Natural Scienceand Technology, Okayama University）

We have recently isolated a novel acylase from the culture supernatant of anactinomycete, Streptomyces mobaraensis that can efficiently hydrolyze an amide bond ofcapsaicine（8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide）in addition to penicillin V, Penicillin G,
N-fatty-acyl amino acids/peptides. On the basis of the nucleic acid/amino acid sequences,polypeptide organization, and substrate specificity, the enzyme from S. mobaraensis（abbreviated to Sm-PVA）was classiﬁed as a novel type penicillin V acylase belonging to
the b-lactam acylase familiy. Furthermore, Sm-PVA catalyzes acyl-transfer reaction inreactions using methyl ester of carboxylic acid（acyl donor）and various nucleophiles toproduce the corresponding amides. Thus, we planned to synthesize capsaicine derivatives
by the Sm-PVA catalyzed acyl-transfer reaction in an aqueous solution. Capsaicine
derivatives are known to possess various functions, such as enhancing energy metabolism
and analgesic activity like capsaicine with much reduced pungent taste. We carried out theacyl transfer reaction in an aqueous buffer, using methyl esters of octanoic acid, lauric acid,and myristic acid as the acyl donor and vanillylamine as the nucleophile. The maximum
yields of octanoyl vanillyalamide, lauroyl vanillylamide, and myristoyl vanillyl amide from 20mM fattyacid methyl esters and 40 mM vanillyal amine were 7.5%, 23%, and 22%,respecticely. The synthesized lauroyl vanillyl amide showed high antioxydative function in asimilar way to capsaicine. The POV value was respectively decreased to 6.3 and 8.3 meq./kg
by addition of 1% capsaicine and 1% lauroyl vanillylamide from 212 meq./kg for control
without additives.

To increase the enzyme production, we prepared two kinds ofrecombinant cells of S. lividans and Escherichia coli. In the recombinant S. lividans cells, SmPVA was produced at a level of 2.0 U/mL. However, the speciﬁc activity of the puriﬁed
enzyme was approximately a half that of the wild-type enzyme. In the recombinant E. coli
cells, we could express to more extent by expressing the protein as a single-polypeptide byremoving an internal spacer. However, the expressed enzyme did not show any activity.
Refolding of the enzyme would be necessary, which is being undertaken.