向科学技術振興財団

研究助成成果報告書

リソソーム機能不全細胞からのリソソームの磁気分離とプロテオーム解析
Magnetic Separation of Lysosomes from Cells with Lysosomal dysfunction
and Their Proteome Analysis

助成年度

令和 5 年度研究助成

助成番号

MZR2023003

研究期間

2023/4/01

代表研究者

高橋 麻里

～

2024/3/31

北陸先端科学技術大学院大学キーワード

先端科学技術研究科

リソソーム, リソソーム, 病磁性体ナノ粒子, エンドサイトーシス

１．研究の背景と目的
リソソームは、全ての真核生物に共通して存在する細胞小器官であり、細胞内消化の場として機ームを単離精製し、単離したリソソームをプロテオミクス解析に供して構成タンパク質を同定することを目的とした。

能している。個の生体分子分解システムは、単に生体分子を分解・再利用するためだけに機能して

２．研究の内容・方法いるのではなく、細胞内エネルギー状態のセンシ

まず、分子活性が不明なリソソーム病遺伝子群ングに機能していたり、また、近年においては、（神経セロイドリポフスチン症原因遺伝子であ細胞内に侵入してきたバクテリアの分解産物をる CLN3）を CRISPR-Cas9 によりノックアウト（KO）リソソームで感知することによって、自然免疫応した培養細胞を樹立するための検討を行った。

答の活性化にも機能していることが明らかにさ

HEK293 細胞にベクターをトランスフェクションれてきた。[1,2]さらに、リソソームに局在するタンし、クローニングを行うことで CLN3-KO HEK293 をパク質の変異が、多種多様な疾患の原因となるこ構築した。KO が成功しているかどうかを確認すると[3]から、リソソーム機能の理解は人類の健康にため、DNA シーケンシングとウェスタンブロットとって重要な課題の 1 つである。

を行った。

そこで本研究では、リソソーム機能不全細胞かCLN3-KO HEK293 細胞の DNA シーケンシングでらのリソソームの高純度磁気的単離とその構成は KO が成功しているような結果が得られたものタンパク質のプロテオミクス解析を目的とした。の、CLN3 の抗体を使ったウェスタンブロットでは具体的には、多機能磁性ナノ粒子をリソソーム機CLN3 が検出された。このことは CLN3 抗体が非特能不全細胞のリソソーム内腔に送達（ターゲティ異吸着を起こしているか、あるいは遺伝子編集にング）して帯磁させ、磁力によって迅速にリソソよる CLN3 KO が成功していないかのどちらかである。そこで、以下の 4 つの実験を実施した。

子を COS1 細胞へマクロピノサイトーシスによって導入した。[4]そこで、MEF 細胞についても同様

1. オートファジーフラックスへの影響を調べるの方法により、ナノ粒子を導入しリソソームへ送→ 既往の報告通り、顕著な異常は見られなかっ達することを試みた。具体的には、培地に 100た。

µg/mL の濃度で分散させたナノ粒子を MEF 細胞に

2. リソソーム膜環境の評価（Lamp1 の免疫染色）添加し、1 時間培養した後、上清を洗浄すること→小さいリソソームが増えている印象

で取り込まれなかったナノ粒子を洗い流し、更に3. ノックアウトレスキュー実験

5 時間培養した。しかし、図 1 に示すように、COS1→ humanCLN３の安定発現細胞を樹立し、上記表現細胞には効率的にナノ粒子が取り込まれ、リソソ系がレスキューできるか確認

ームへ送達されるものの、MEF 細胞ではナノ粒子

4. ノックダウン実験の導入が見られなかった。この原因は細胞腫の違→ siRNA を用いてノックダウンにより、同様な表いによるものと思われるが、詳細は明らかでない。

現系が出るか確認

しかし、CLN3 の plasmid を用いていくつか実験を行った結果、マウスの細胞では発現するが、HEK293 では発現しないという問題に直面した。このようなことは経験したことがいままでになく、難しい遺伝子であることが判明した。CLN3 KO の表現型に関して、HEK 細胞がそもそもオルガネラを見るのに適していないこともあるが、CLN3 は細胞レベルでは重要な機能をしていないという結論に至った。
上記の結果を受け、他の遺伝子 KO で検討を進めたほうが良いと判断し、ターゲットとするリソソーム病を、当初の神経セロイドリポフスチン症から、代表的なリソソーム病であるニーマンピック病 C1 に変更し、NPC1 遺伝子 KO マウス胚線維芽細胞（MEF）を保有している研究者から MEF 細胞

図 1 aDxt 修飾 Ag@FeCo@Ag ナノ粒子を細胞と共培養し洗浄した後、免疫染色を施した細胞の共焦点顕微鏡像。
（上段） MEF細胞、(下段) COS1 細胞。青は核（DAPI 染色）、赤はリソソーム（LAMP1）、緑はナノ粒子のプラズモン散乱。COS1 細胞ではナノ粒子の取り込みとリソソームへの集積が見られるのに対し、MEF 細胞ではナノ粒子の取り込みが観察されなかった。

を譲渡していただき、その細胞を不死化して利用することとした。

(2)シンクロナイズドエンドサイトーシスによるAg@FeCo@Ag ナノ粒子の MEF 細胞への導入検討
３．研究の成果

そこで、次の手段として、受容体媒介エンドサ(1)マクロピノサイトーシスによる Ag@FeCo@Ag ナ

イトーシスによってリソソームへナノ粒子を送ノ粒子の MEF 細胞への導入検討達することを検討した。本研究では MEF 細胞表面

我々の以前の研究では、アミノデキストランの上皮成長因子受容体（EGFR）に特異的にナノ粒（aDxt）で表面被覆した Ag@FeCo@Ag コア@シェル

子を結合させてから、シンクロナイズドエンドサ@シェル型磁性－プラズモンハイブリッドナノ粒イトーシスによってリソソームへ送達することを考えた（図 2）。まず、MEF 細胞表面の EGFR にポリ L リジン（PLL）で表面修飾した Ag@FeCo@Ag

ビオチン化上皮成長因子（EGF）をエンドサイトー

ナノ粒子の表面に EGF を静電相互作用によって結シスが抑制される温度（4℃）において結合させた。

合させ、その EGF 結合ナノ粒子を MEF 細胞に添加

その後、中性アビジンで表面修飾した Ag@FeCo@Ag

し、37℃で 1 時間培養することによって、エンドナノ粒子を培地に添加し、4℃で 1 時間培養した。

サイトーシスによる細胞内への導入を試みた。

この時点では、ナノ粒子は MEF 細胞表面の EGFR

PLL は多くのアミノ基を持つカチオン性ポリマーに EGF を介して結合した状態が保たれており、まであるため、バッファー中で正に帯電している。

だ細胞内に取り込まれてはいない。その後、温度そこに EGF を添加すると静電相互作用によってを 37℃に上げて培養することによって、一斉にエ

PLL 修飾ナノ粒子の表面に EGF が結合する。EGF

ンドサイトーシスが起こり、ナノ粒子が MEF 細胞が結合したナノ粒子は MEF 細胞表面の EGFR に結内に取り込まれると期待したが、結果として MEF合し、エンドサイトーシスによって細胞内に取り細胞内へのナノ粒子の取り込みは確認できなか込まれると考えられる。その結果、COS1 細胞に比った。考えられる要因としては、4℃では EGF のべるとわずかではあるが、ナノ粒子は MEF 細胞へ活性が低下しており、EGFR への結合が起こらなか取り込まれていることを確認した（図 3）。

ったことが挙げられる。

図 3 EGFR 媒介エンドサイトーシスによる Ag@FeCo@Ag ナノ粒
子の MEF 細胞への取り込み
図 2 シンクロナイズドエンドサイトーシスの概念図

４．結び
当初、リソソーム病遺伝子群（神経セロイドリ(3)EGFR 媒 介 エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ る

Ag@FeCo@Ag ナノ粒子の MEF 細胞への導入検討
シンクロナイズドエンドサイトーシスの利点
は、原理的には細胞内へのナノ粒子の導入が一斉に起こるため、ナノ粒子の細胞内輸送も同期でき、ナノ粒子がリソソームへ到達した時点では、初期エンドソームや後期エンドソームに滞留しているナノ粒子はほとんど無く、磁気分離した際のリソソームの純度が高くなることである。しかし、上述のように 4℃では EGF の活性が低下し、EGFRへの結合が起こらなかった可能性が考えられる
ため、通常の受容体媒介エンドサイトーシスによるナノ粒子の細胞内導入を検討した。具体的には、ポフスチン症原因遺伝子である CLN3）を CRISPRCas9 によりノックアウト（KO）した HEK293 細胞を樹立するための検討を行ったが、CLN3 KO の表現型に関して、HEK 細胞がそもそもオルガネラを見るのに適していないことと、CLN3 は HEK293 の場合は細胞レベルでは重要な機能をしていないという結論に至った。そこで、ターゲットとするリソソーム病を、神経セロイドリポフスチン症から、代表的なリソソーム病であるニーマンピック病 C1 に変更し、NPC1 遺伝子 KO マウス胚線維芽細胞（MEF）に変更し、その細胞を不死化して利用することとした。
次に、この MEF 細胞に対し、我々の以前の COS1細胞を用いた研究と同様に、aDxt で表面修飾した[3] F. M. Platt, A. d’Azzo, B. L. Davidson,

Ag@FeCo@Ag ナノ粒子を導入しようとしたところ、

E. F. Neufeld, C. J. Tifft, Nat. Rev. Dis.

COS1 細胞とは様相が異なり、MEF 細胞ではマクロ

Prim., 4, 27, (2018）

ピノサイトーシスによるナノ粒子の取り込みが[4] T. S.

ほとんど起こらなかった。次の手段として、受容Miyazato, Y. Hiratsuka, K. Matsumura, T.

体媒介エンドサイトーシスによってリソソーム

Taguchi, S. Maenosono, ACS Nano, 16, 885

へナノ粒子を送達することを考え、MEF 細胞表面(2022）

Le, M. Takahashi, N.Isozumi, A.の上皮成長因子受容体（EGFR）に特異的にナノ粒子を結合させてから、シンクロナイズドエンドサ

６．謝辞

イトーシスによってリソソームへ送達すること

本研究の遂行にあたり、一般財団法人向科学技を検討したが、これについても EGF の活性低下な術振興財団より多大なご支援を頂きましたこと

どの問題からうまくいかなかった。そこで、ポリを深く御礼申し上げます。

L リジン（PLL）で表面修飾した Ag@FeCo@Ag ナノ粒子の表面に EGF を静電相互作用によって結合させ、その EGF 結合ナノ粒子を MEF 細胞に添加し、37℃で 1 時間培養することによって、エンドサイトーシスによる細胞内への導入を試み、最終的にナノ粒子の MEF 細胞内への導入に成功した。

５．今後の研究方向性・課題
リソソーム機能不全細胞の構築に手間取り、最終的に MEF 細胞を利用することにしたが、今度はMEF 細胞へのナノ粒子の導入にも苦戦したため、当初の予定より研究に遅れが生じたものの、MEF細胞へのナノ粒子の取り込み方法についてもある程度見通しが立ってきたため、今後は、NPC1 遺伝子 KO MEF 細胞と、通常の MEF 細胞の双方についてナノ粒子を取り込ませ、それぞれのリソソームへの送達条件を確立する。その後、各細胞からリソソームを単離し、プロテオーム解析に供する。

６．参考文献[1] O. Takeuchi, S. Akira, Cell, 140, 805,
(2010)[2] N. Nakamura, J. R. Lill, Q. Phung, Z.
Jiang, C. Bakalarski, A. de Mazière, J.
Klumperman, M. Schlatter, L. Delamarre, I.
Mellman, Nature, 509, 240, (2014)