5食品タンパク質の熱安定化技術の開発＜平成 29 年度助成＞

食品タンパク質の熱安定化技術の開発
村岡貴博（東京農工大学 グローバルイノベーション研究院）

緒言が働くことが、タンパク質分子間での凝集を抑制する上で有効であると考えた。そこで、より効果的にタンパク質を熱に対して安定化する技術は、タン疎水性相互作用の形成を期待し、疎水的な芳香族性パク質が有する様々な高付加価値機能を活かした応部位を導入したポリエチレングリコール誘導体を開用展開の幅を広げる上で重要である。例えば、これ発することとした。ポリエチレングリコール部位とまでに卵白タンパク質であるリゾチームを熱安定化して、長さの異なるテトラエチレングリコールとオする添加物質として、アルギニンエチルエステルなクタエチレングリコールを用いることとした。ウィどが用いられている。これに対して申請者は、独自リアムソンエーテル合成反応などの有機合成反応をに開発した三角形型 PEG が、アルギニンエチルエス行うことによって、目的物を得た。目的分子の構造

テルの 8 分の 1 の量で、アルギニンエチルエステル決定は、核磁気共鳴スペクトル、質量分析スペクトを上回る高い安定化効率を示すことを見いだしていルにて行った。安定化効果を検討するターゲットタる。ここで、ポリエチレングリコールは、タンパクンパク質として、代表的な食品タンパク質である鶏質に対する沈殿剤、結晶化剤として用いられる。つ卵白リゾチームを用いた。

まりポリエチレングリコールは、タンパク質分子の合成したテトラエチレングリコール型分子とオク会合を促進する。これに対して申請者は、ポリエチタエチレングリコール型分子は、いずれも室温で水レングリコールの分子形状を変えることで、その性に分散した。水中で 10 nm から 1000 nm にわたる質が変わることを見いだした。通常鎖状であるポリブロードな粒子径分布を有する分子集合体が形成さエチレングリコールを三角形や十字形に変えたとこれていることが、動的光散乱測定の結果、示された。

ろ、確かにその性質が大きく変わり、特に三角形型

ここで、70 度に加熱すると、100 nm スケールの大PEG がリゾチームに対し、高い凝集抑制効果を示す

きさを有する分子集合体を示す、単分散性の高い光ことを明らかにした。この知見を踏まえ本研究では、散乱プロファイルへと変化したことから、温度変化さらに構造修飾を施したポリエチレングリコールをに応答した分子集合体変化が見られた。ここで、両合成し、食品タンパク質に対して有効な熱安定化剤化合物の臨界ミセル濃度は、両親媒性テトラエチレの開発を行うこととした。

ングリコールが 0.80 mM、両親媒性オクタエチレングリコールが 1.3 mM であった。両親媒性テトラエ実験結果と考察

チレングリコールの方が小さい臨界ミセル濃度を示したことは、ポリエチレングリコール鎖の長さが短変性タンパク質では、疎水性アミノ酸残基が表面に露出し、分子間で形成される疎水性相互作用にいことによる疎水性の高さに起因するものと考えられる。

よって凝集が形成されると考えられる。ポリエチレ

両親媒性テトラエチレングリコールおよび両親媒

ングリコールと変性タンパク質間で疎水性相互作用性オクタエチレングリコールの温度変化に伴うコン

6

浦上財団研究報告書

図1Vol.26（2019）

添加物入りリゾチーム水溶液の 25 度と 90 度での観察

フォメーション変化について、温度可変赤外吸収スグリコールを混合し、加熱した（図 1）。加熱前はいペクトル、温度可変核磁気共鳴スペクトル測定を用

ずれも溶液を与えたが、両親媒性テトラエチレングいて検討した。両親媒性オクタエチレングリコールリコールを混合したサンプルの場合、90 度への加は、30 度において、ゴーシュ形のエチレンオキシ熱後白色の沈殿物を与えた。これは、添加剤を加えドに由来する赤外吸収を示した。100 度に加熱するていないリゾチーム水溶液を加熱した場合に見られと、アンチ形のエチレンオキシドに由来する赤外吸る現象と同様であり、リゾチームが凝集したことを収強度が増加した。また、重水中における 13C 核磁示す結果である。一方、両親媒性オクタエチレング

気共鳴スペクトル測定の結果、エチレン部の炭素にリコールを混合したサンプルでは、90 度で 30 分加帰属されるシグナルが、温度上昇に伴い低磁場シフ熱した後も、一切白濁は見られなかった。従って、トした。これらのスペクトル変化から、両親媒性オマクロスコピックなタンパク質凝集は抑制されるこ

クタエチレングリコールのエチレンオキシド部分とが示された。リゾチーム分子の立体構造についてが、温度上昇に伴いゴーシュからアンチ形へコンの情報を得るために、温度可変円偏光二色性（CD）フォメーション変化することが示唆された。両親媒スペクトル測定を行った。添加剤を加えていない場性テトラエチレングリコールも同様のスペクトル変合、加熱により CD シグナル強度は連続的に減少し、化を示した。

さらに冷却後も強度は減少する。これは加熱により合成したポリエチレングリコール誘導体のタンパリゾチームの高次構造が崩れて変性し、冷却過程にク質安定化効果について調べるために、リゾチームおいて凝集したことを示す。同様のスペクトル変化を溶解させたリン酸緩衝生理食塩水に、両親媒性テが両親媒性テトラエチレングリコールで観察された

トラエチレングリコール、両親媒性オクタエチレン

ことから、確かに両親媒性テトラエチレングリコー

食品タンパク質の熱安定化技術の開発

7

ルはタンパク質凝集抑制効果を有していないことがら成る両親媒性テトラエチレングリコールの方が、示された。一方、両親媒性オクタエチレングリコー

両親媒性オクタエチレングリコールよりも疎水性がルでは、温度上昇に伴い CD シグナル強度は減少し高いことも明らかとなった。加熱によるリゾチームたものの、90 度における残存シグナル強度は、両の凝集を抑制する効果について定量的に調べた結親媒性テトラエチレングリコールを加えたものより果、オクタエチレングリコール、両親媒性テトラエも大きかった。さらに冷却後、元のスペクトルがほチレングリコールを添加したサンプルでは無添加のぼ回復したことから、大部分のリゾチーム分子の凝場合と同様の凝集形成、および酵素活性消失が見ら集が抑制され、かつ冷却過程でリフォールディングれたのに対し、両親媒性オクタエチレングリコールが進行していることが示された。実際に、リゾチーを用いた場合、顕著な凝集抑制効果、ならびに酵素ムの酵素活性であるバクテリアの溶菌活性を調べて活性の保持が見られた。従って、両親媒性構造と、みたところ、両親媒性テトラエチレングリコールをある程度高い親水性、という二つの要素を満たすこ添加したリゾチームの場合、冷却後もほとんど活性とが重要であることが示唆された。変性リゾチームが見られなかったのに対し、両親媒性オクタエチレのリフォールディング促進効果についても同様に、ングリコールを添加したものについては活性が見ら

両親媒性オクタエチレングリコールが最も高い効果れ、部分的ではあるが、確実にリフォールディングを示した。従って、熱および化学的に変性されたリが起きていることが確認された。なお、芳香族性基ゾチームに対して、安定化効果を示すポリエチレンを持たないオクタエチレングリコールの場合、加熱グリコール誘導体を開発することに成功した。今回によりリゾチームのマクロスコピックな凝集形成がの成果は、食品タンパク質を熱に対して安定化する見られ、かつ溶菌活性の回復は全く見られなかった。

新材料開発につながるものである。

従って、芳香族性基を導入したことによる両親媒性構造が、タンパク質凝集抑制効果において重要な働謝辞きをしていることが示された。また、両親媒性オク研究助成のご支援をいただきました公益財団法人

タエチレングリコールと両親媒性テトラエチレング

浦上食品・食文化振興財団に深く御礼申し上げます。

リコールを比較したところ、より疎水性の高い両親媒性テトラエチレングリコールでは、安定化効果がほとんど見られなかったことから、ポリエチレングリコール部分の鎖長、つまり親水部と疎水部のバランスも、重要なパラメーターであることが分かった。

結言

両親媒性構造を有する新たなポリエチレングリコール誘導体として、芳香族性基を片末端に導入したテトラエチレングリコール、およびオクタエチレングリコールを合成することに成功した。両者は、水中で温度上昇に伴いゴーシュ形からアンチ形へのコンフォメーションを示し、疎水性を増す性質を有することが明らかとなった。また、臨界ミセル濃度測定の結果、より短いポリエチレングリコール鎖か8

浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）

Development of protein stabilizing materials
Takahiro MURAOKATokyo University of Agriculture and Technology
Institute of Global Innovation ResearchProteins denature in response to the application of various stimuli, suchas heat ing, and then form agg reg ates irreversibly due to intermolecularhydrophobic interactions. In this study, materials were developed to enhance
the thermal stabilities of proteins. Specifically, amphiphilic poly(ethyleneglycol)s bearing an aromatic unit were synthesized. These amphiphilicpoly(ethylene glycol)s showed a response to temperature elevation, in terms ofa change in the conformation of the poly(ethylene glycol) chain which is known
to enhance hydrophobicity. One of these synthesized amphiphilic poly(ethyleneglycol) displayed the ability to suppress the formation of protein aggregates
upon heating. This suppressive effect is likely due to the thermal response ofthe poly(ethylene glycol) chain to increase its hydrophobicity, allowing it tointeract with denaturing proteins. This suppressive effect was also found todepend on the length of the poly(ethylene glycol) chain, so that longer chainsdisplay a higher suppressive effect.