INFLUENCE OF TEMPLATE OLIGONUCLEOTIDES ON THE CONDENSATION OF
OLIGONUCLEOTIDES IN THE PRESENCE OF WATER-SOLUBLE CARBODIIMIDE: SEARCHFOR MODEL REACTIONS OF THE FORMATION OF RNA WHICH COULD BE EFECTIVE AT
HIGH TEMPERATURES

Kunio Kawamura*, Fumitaka Okamoto and Noriko Okuda
Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Osaka Prefecture University,
Gakuen-cho 1-1, Sakai, Osaka 599-8531, Japan.
Fax: +81-72-254-9903; Email: kawamura@chem.osakafu-u.ac.jp(Received 15 January 2004 Accepted 18 February 2004)(Abstract)
The condensation reaction of oligonucleotides was investigated to develop a prebiotic model reaction for theformation of oligonucleotides which can be examined under hydrothermal conditions.

The reaction behavior of(1) the condensation of 12-mer oligonucleotide (5’-pGGGCCCCCCGGrG, 5’-pGGGCCCGGGCCrC), (2) the
condensation of oligoguanylate (5’-pGGGGGrG, 5’-pGGGGGGGrG) in the absence and presence of aoligocytidylate template, (3) the condensation of mix-hexanucleotide including guanine and cytosine (5’pGGGCCrC，5’-pGCGCGrC，5’-pGCCCGrG) in the absence and presence of several 12-mer oligonucleotides,
was investigated at 0 – 25 oC.

In these systems, it was expected that the dimerization of the starting

oligonucleotides would be enhanced using 12-mer oligonucleotides or in the presence of a template
oligonucleotide.

However, the cyclization of oligonucleotides proceeded as the main process and thedimerization was not efficient.

The rates of the cyclization of 12-mer oligonucleotides were not much different

from those of hexanucleotides determined in previous studies.

The rate of cyclization of 5’-pGGGGGrG or 5’-

pGGGGGGGrG was somewhat affected with a oligocytidylate template.

Although the cyclization of mix-

hexanucleotides was not much affected by the presence of 5’-GGGCCCCCCGGG or 5’-GGGCCCGGGCCC，thecondensation of mix-hexanucleotides did not proceed in the presence of 5’-GCGCGCGCGCGC or 5’GCCCGGGCCCGG.

These resultes indicate that cyclization of short oligonucleotides have readily proceeded

even in the presence of template oligonucleotides so that the accumulation of RNA would not be efficient throughthe dimerization of short oligonucleotides.

Conclusively, the reactions tested in this study are not suitable forthe elongation model of oligonucleotide which acts under hydrothermal conditions(Keyword)chemical evolution of RNA, RNA world, oligonucleotide, condensation, cyclization, template-directed reaction,hydrothermal reaction

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© 2004 by SSOEL Japan- 68 -

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水溶性カルボジイミドを用いるオリゴヌクレオチドの縮合反応に対する鋳型オリゴヌクレオチ
ド の 影 響 ： 高 温 下 で 働 く こ と を め ざ し た RNA 生 成 モ デ ル の 探 索

川村邦男*，岡本文敬，奥田宜子
大阪府立大学大学院工学研究科応用化学分野〒599-8531 大阪府堺市学園町 1-1
Fax: 072-254-9903; Email: kawamura@chem.osakafu-u.ac.jp

１．序論

鋳型指示反応の温度依存性を調べた[6]．この反

地球上で生命が出現する過程でリボ核酸

応ではオリゴヌクレオチドの生成効率は 80℃以（RNA）は重要な役割をはたしたと考えられて上ではたいへん低くなるが，これは 2 量体が生いる（RNA ワールド仮説）[1]．しかし，この RNA

成するときにモノマーどうしの会合が温度の上

ワールド仮説は生命は深海底の熱水噴出孔のよ

昇にともなって起こりにくくなることが一因で

うな高温の海水中で誕生したとする熱水起原説あることが分かった．また，この種の反応に適からみると問題がある．例えば RNA は高温水中した条件を見つけるためには速度論的な解析がでは不安定であるので酵素機能や情報を保持す有効であるが，鋳型指示反応では生成物は種々る機能を発現することは難しそうであり，このの鎖長からなるオリゴヌクレオチドを含むためことは RNA ワールド仮説と熱水起原説は矛盾す

反応速度解析が複雑であるという問題もあった．

ることを示しているように思われる[2-4]．そこ

第 2 のモデルとして，6 鎖長程度のオリゴヌク

で著者らを含むグループでは，RNA ワールドを

レオチドは縮合剤の存在下で環化することを見

生命の熱水起源から検証する研究を行ってきた

いだし，この環化反応を用いればリン酸ジエス[4-7]．例えば， RNA の半減期は 200℃で 2〜70 s，テル結合の生成速度とその温度依存性を調べる

300℃で 0.01〜0.9 s であり，これは人間の感覚ことができることを示した[4,7]．しかし，環化を基準にすると大変短い[5]．しかし，このこと反応はリン酸ジエステル結合の生成を調べるモをもって RNA ワールドが高温下で不可能であっデルとしては良いが，ポリメラーゼモデルとしたと断定することはできないことを，これまでては不十分である．

の研究で示した．また熱水中での RNA の化学進

そこで本研究では３種類の反応について検討

化の研究の次の段階として，高温下で働く RNA

した．第１として，グアニンとシトシンを含むの生成モデルを設計し，実際にそのモデル反応

12 鎖長からなるオリゴヌクレオチドの環化反応を用いて RNA が分解速度よりも速く生成するこについて検討した（Scheme 1）．これまでは 6 鎖とを示すことが必要である[4,6,7]．

長程度のオリゴヌクレオチドを原料として用い

そこで，高温下で働く RNA の前生物的なモたが，鎖長を大きくすれば duplex を生成しやす

デル反応の候補として 2 種類の反応の温度依存くなるので２量体の生成効率は大きくなると期性について研究してきた．第 1 のモデルとして待される．第 2 はオリゴグアニル酸の環化反応- 69 -

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5'

3'

G

G

G

C

C

C

C

C

C

G

G

G

G G

C

G

C

G

C

G

C
G C C

3'

5'
C

C

C

C

G

G

G

G

G

G

C

C

C

G

G

G

C

C

C

C

C

C

G

G

G

3'

5'
Scheme 1. Possible pathways of the condensation of oligo12b.

に対して鋳型となるオリゴシチジル酸を添加し，

２−１

試薬

環化を抑制して 2 量化が起こる反応系を構築しオリゴヌクレオチド（5’-pGGGCCCCCCGGrG

ようと試みた（Scheme 2）．第 3 に，同様にして(oligo-12a), 5’-pGGGCCCGGGCCrC（oligo-12b）,

グアニンとシトシンを含むヘキサヌクレオチド

5’-pGGGGGrGの環化反応に対して，その 2 量体と相補的ある(oligo-G8), 5’-CCCCCCCCCCCC (temp-C12), 5’-

いは非相補的な塩基配列をもつ 12 鎖長のオリゴ

CCCCCCCCCCCCCCCC (temp-16), 5’-pGGGCCrC

ヌクレオチドを共存させて反応を行った(oligo-6a),5’-pGCGCGrC（Scheme 3）．これらの系で期待される２量化反pGCCCGrG(oligo-6c),応は，環化反応よりも実際のポリメラーゼ反応（temp-12a）, 5’-GGGCCCGGGCCC（temp-12b）,のモデルとして適している．また，構成成分の5’-GCGCGCGCGCGC

種類が少ないので鋳型指示反応よりも解析が容GCCCGGGCCCGG (temp-12d)）はプロリゴジャ

易であると期待される．これらの反応系についパン製の HPLC 精製グレードのものを用いた．

て期待通り２量化反応の効率が向上するかどう

その他の試薬は和光純薬製の特級品を用いた．

(oligo-G6),

5’-pGGGGGGGrG(oligo-6b),

5’-5’-GGGCCCCCCGGG(temp-12c),5’-かを検討し，結果を化学進化の観点から考察した．

２−２

鋳型存在下での環化反応

12 鎖長のオリゴヌクレオチドの縮合反応：0.05
２．実験

mM oligo-12a または-12b，0.1 M NaCl，0.1 M- 70 -

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G
5'

G

G

G

G

G

G

G

G

G
G

G

5'

3'

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

3'

5'

Scheme 2. Possible pathways of the condensation of oligo-G6 in the presence of (C)12
template.
oligo-G6: 5’-pGGGGGrG.

G
5'
G

G

G
G

G

C

C

C

C
C

C

5'

G

3'

G

G

G

C

C

C

G

G

G

C

C

C

C

C

G

G

G

C

C

C

G

G

3'

C

5'

Scheme 3. Possible pathways of the condensation of oligo-6a in the presence of temp-12d.
Oligo-6a: 5’-pGGGCCrC, temp-12d: GCCCGGGCCCGG.

MgCl2，0.1 M イミダゾール，および 0.2 M 1-エ

レアーゼ T2（0.05 unit/100 µL）を加えて 37℃で

チル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイ

6 h 処理した．

ミド（EDAC）を含む水溶液（pH=7.5）を調製

オリゴグアニル酸の環化反応に対するオリゴ

し，温度 0℃で最大 168 h（7 d）反応させ経時変

シ チ ジ ル 酸 の 影 響 ： 0.1 mM oligo-G6 ま た は化を調べた．また反応後の試料 20 µL を採取し，

oligo-G8， 0.2 M NaCl，0.075 M MgCl2，0.1 M イ

酢酸アンモニア緩衝溶液中（4 mM）でリボヌク

ミダゾール，および 0.2 M EDAC を含む水溶液- 71 -

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（pH=8.0）を調製し，温度 25℃で最大 43 h 反応

反応と 2 量化の効率を検討した．生成物を HPLCさせ経時変化を調べた．また鋳型として 0.1 mMで分析した結果，それぞれ原料のうしろにあらtemp-C12 または temp-C16 を加えて同様に検討

たなピークが出現した（Fig. 1）．これまでの研した．

究で６鎖長のオリゴヌクレオチドの場合には環ヘキサヌクレオチドの環化反応に対する 12化反応が起こることが確かめられているので，鎖長オリゴヌクレオチド鋳型の影響：0.1 mM

生成物の同定は HPLC の保持時間とリボヌクレ

oligo-6a，-6b，または-6c，0.2 mM temp-12a，-12b，

アーゼ T2 による処理に基づいて行った． oligo--12c，または-12d，0.2 M NaCl，0.075 M MgCl2，

12a および oligo-12b の生成物の HPLC の保持時

0.1 M イミダゾール，および 0.2 M EDAC を含間を，原料の 2 量体すなわち 24 鎖長の対応する

む水溶液（pH=8.0）を調製し，温度 0℃で 168 h配列をもつオリゴヌクレオチドと比較したが一（7 d）反応させた．

致しなかった．また，リボヌクレアーゼ T2 で処理すると生成物が減少し原料のピークが増加し

２−３

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

および熱測定た．すなわち，この生成物はリン酸ジエステル
結合を持っておりかつ２量体ではないので，12

HPLC 分 析： 生 成 物 は， HPLC 装 置（ 島 津
LC10A）に陰イオン交換カラム（φ4.6 mm，長さ 15 cm，DNA-NPR，東ソー）を用いて，oligo12a および oligo-12b の反応系では NaCl 濃度が 0.3
M（0 min）， 0.6 M （30 min）
， 1.2 M （45 min）となるように，またその他の反応系では NaCl 濃
度が 0.15 M（0 min）から 1.2 M（80 min）となるように直線グラジエントをかけて分析した．
温度は 35℃，検出波長は 253 nm とした．
融解温度（Tm）の測定：0.63 mM oligo-G6 と0.31 mM temp-C12，0.2 M NaCl，0.075 M MgCl2，
および 0.1 M イミダゾールを含む溶液を調製（pH=8.0）し，Calorimetory Sciences Corp. (USA)製の CSC 6100 Nano II DSC を用いて測定した．

３．結果および考察
３−１

12 鎖長オリゴヌクレオチドの縮合反応

これまで 6 鎖長のオリゴヌクレオチドの縮合反応を主に研究してきたが，鎖長が大きくなると duplex の生成の影響も大きくなると期待される．そこで 12 鎖長のオリゴヌクレオチドの環化- 72 -

Figure 1. HPLC profiles of the condesation
reaction of 5’-pGGGCCCCCCGGrG (oligo12a) and 5’-pGGGCCCGGGCCrC (oligo12b). [NaCl] = 0.1 M, [MgCl2] = 0.1 M,[imidazole] = 0.1 M, [EDAC] = 0.2 M, [oligo12a or –12b] = 0.05 mM, pH = 7.5, 0 oC.

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鎖長のオリゴヌクレオチドの場合でも６鎖長のしに追跡するとともに，それぞれ temp-C12 およオリゴヌクレオチドと同様に環化反応が主反応

び temp-C16 の存在下で同様に環化反応を行ってとして起こったということができる．この反応

鋳型の影響を調べた．ここでオリゴグアニル酸の原料の減少速度を 1 次プロットして反応速度

モノマーと鋳型オリゴシチジル酸の組み合わせ定数を決定した結果， oligo-6a，oligo-6b，oligo-

を選んだ主な理由は，ヌクレオシド 5’-モノリン

6c などの場合と比べて oligo-12a ではほぼ同じ範酸イミダゾリドをモノマーとして用いる鋳型指囲であり oligo-12b では少し大きかった（Table 1）．

示反応の研究によってグアニンを含むモノマーとシトシンを含む鋳型の組み合わせがもっとも

Table 1. The rate constants for the cyclization of 12-merand 6-mer oligonucleotides.

効率良く重合することが分かっており，本系でSystemoligo-12a(4.4±0.2)×10-7

oligo-12b(1.2±0.1)×10-6

oligo-6aa)(4.6±0.1)×10-7

oligo-6ba)(6.3±0.1)×10-7

けからなるヌクレオチド鎖は４量体を生成する

a)(2.7±0.1)×10-7ことが知られているので[9]，数本の HPLC ピー

oligo-6c

kcyc / s-1も効率が高いと期待したことにある[8]．原料のoligo-G6 を HPLC で分析した結果，HPLC 上に数本のピークが出現した（Fig. 2）．グアニンだ[NaCl] = 0.1 M, [MgCl2] = 0.1 M, [imidazole] = 0.1 M,[EDAC] = 0.2 M, [oligo-12a or –12b] = 0.05 mM, pH = 7.5,
0 oC.
a: Data from reference [7], [oligo-6a, -6b, or –6c] = 0.1
mM was added instead of oligo-12a or –12b.

生成したためであると考えられる．この会合体

また，この反応の oligo-12b の２量体に対応する

oligo-G6 を 100℃の水中で 1〜3 min 加熱してか

24 鎖長のオリゴヌクレオチドの HPLC 保持時間

ら分析した結果，1 本のピークが得られた（Fig.

は，原料の oligo-12b よりも小さかった．これは2）．また，いったん加熱した oligo-G6 を 12 h 間クが現れたことは oligo-G6 がこの種の会合体を

は温度の上昇にともない融解し解離するので，陰イオン交換カラムで通常は電荷数の増加に伴って保持時間が大きくなる傾向と異なっている．
この理由は HPLC 上で水素結合形成による３次構造を形成し，有効に働く電荷が見かけ上小さくなったためと考えられる．
以上のように，これまでの研究で調べたもの
よりも鎖長の大きなオリゴヌクレオチドを用いて，水素結合の数を増やし会合体を安定化させ2 量化を起こりやすくするというモデルは有効に働かなかった．

３−２

オリゴグアニル酸の環化反応に対する鋳型の影響
oligo-G6 および oligo-G8 の環化反応を鋳型な- 73 -

Figure 2. HPLC profiles of 5’-pGGGGGrG (oligo-G6)
on anion-exchange column. (a) oligo-G6 was injectedwithout any treatment, (b) oligo-G6 was heated for 3 min
at 100 oC.

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4℃で放置してもピークはほとんど変化しなかっと比べると環化生成物の量が小さく，この理由た．そこで，以後，oligo-G6 はこの加熱操作を

は環化反応の過程で４量体が生成する反応を抑してから使用した．しかし，この加熱操作をつ制できなかったためであると推測される．このけ加えた方法で反応させた試料を HPLC で分析

反応曲線を Fig. 4（黒丸）に示すが，鋳型が存在した結果，4 量体と推定されるピークが oligo-G6

しない場合の減少曲線にはこのような会合体のでは少し現れた．また，oligo-G6 の反応では鋳生成による影響が含まれている．同様にして，型のない場合には原料のピークに近いところに

oligo-G8 の反応について調べた．４量体の生成

あらたに生成物に対応するピークが確認されたを抑制するため oligo-6G の時と同様に 100℃の（Fig. 3a）．この生成物は oligo-G6 が２量化した

水中で 1〜3 min 加熱してから原料として用いた

場合に生成するものと同じ鎖長をもつ(G)12 と比, で分析すると 4 量体
が，反応後の試料を HPLC

べて保持時間がかなり短かった．また，これまと考えられるピークが大きく現れたため解析はでのオリゴヌクレオチドの環化反応の研究の結困難であった．

果，グアニンおよびシトシンを含む６鎖長のオリゴヌクレオチドは環化し，HPLC 上で原料の直鎖状のオリゴヌクレオチドと比較的近い位置に新しいピークを与えることが確認されている[7]．したがって，oligo-G6 系でも環化反応が起こったと考えられる（Scheme 2）．しかし，これまでに研究した他のオリゴヌクレオチドの場合

Figure 4. Reaction curves of the disappearance ofoligo-G6 in the absence and presence of temp-C12.
Reaction conditions: [NaCl] = 0.2 M, [MgCl2] =0.075 M, [imidazole] = 0.1 M, [EDAC] = 0.2 M[oligo-G6] = 0.1 mM, pH = 8.0, 25 oC.
Closed circles: no template, open circles: [template] =0.1 mM.

一方，鋳型が存在する場合の oligo-G6 の反応
では鋳型のピークの少し後ろに原料のピークが現れた（Fig. 3b）．このときは， HPLC 上で原料のピークは鋳型がない場合よりも鋭くなった．
これは oligo-G6 では鋳型と duplex を形成するたFigure 3. HPLC profiles of the reaction products ofoligo-G6 in the absence and presence of (C)12 (tempC12).
Reaction conditions: [NaCl] = 0.2 M, [MgCl2] = 0.075
M, [imidazole] = 0.1 M, [EDAC] = 0.2 M, [oligo-G6] =0.1 mM, pH = 8.0, 25 oC.
(a) no template, 18 h, (b) [template] = 0.1 mM, 24 h.

め，4 量体の生成が抑制されたためだと推定される．このときの oligo-G6 の減少の反応曲線をFig. 4（白丸）に示す．しかし，oligo-G8 では原料のピークは４量体の生成によるものと思われ- 74 -

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る多数のピークを含んでいた．またどちらの鎖用いて測定したが，エンタルピー変化は検出さ長の場合にも２量体の生成は確認されなかった．

れなかった．従って，HPLC による oligo-G6 の

このように oligo-G6 および oligo-G8 系では生成

分析結果は oligo-G6 の４量体の生成を示唆した物の分析が難しいという問題点があるが，原料が，化学両論的な４量体の生成だけでなくそのの減少の初速度に基づいて反応速度定数を得た

ほかのアグリケーションの影響を含んでいるも（Table 2）．これらの速度定数は oligo-G6 で鋳型のと推察される．以上の結果から，本実験条件がある場合以外の系では４量体の生成の影響を下では oligo-G6 と temp-C12 の混合系ではこれら含んでいると見なされる．oligo-G8 では oligo-G6

からなる duplex を生成し得たと推定される．まよりも反応速度が大きくなった．これはオリゴ

た，temp-C12 を添加した系の方が HPLC 上でシチジル酸の場合に鎖長の増加にともなって環

oligo-G6 のピークが明瞭に現れたこともこのこ化速度が増加する傾向と一致しているが，4 量とを支持している．ただし本実験条件下では，体の生成による影響を含むと考えられる．一方，Scheme 2 に示すような oligo-G6 および temp-C12

oligo-G6 の系で鋳型が存在する場合の速度定数の化学両論比が 2:1 からなる duplex だけを含む

はほぼ環化反応の速度定数と見なすことができかどうかについてはさらに確認が必要である．

るが，過去の研究で調べた他のオリゴヌクレオ

また以上の結果は，duplex の生成は２量化の効

チドの環化速度定数とあまり変わらず，鋳型の率を上げることにただちに結びつくものではな

影響は小さいと言うことができる．

いことを示唆している．一方，我々の先行研究

Table 2. The rate constants for the disappearance ofoligoguanylates in the absence and presence ofpolycytidylic acid template.

では，oligo-6a は自己相補的な配列であり Tm 以
下では duplex を生成するが，duplex の生成による影響はほとんどないことが示された[4]．また，

kdeg / s-1

Systemoligo-G6 without temp-C12 a)(1.8±0.2)×10

oligo-G6 with temp-C12 b)(9.7±0.8)×10-6

oligo-G8 without temp-C16 a)(6.6±1.8)×10-5

oligo-G8 with temp-C16 a) b)(3.2±0.4)×10-5-5

澤井らの poly(A)上での oligo(U)の 2 量化反応に対する研究では，2 量化は進行するが効率はあ
まり高くなかった[10]．一方，poly(U)を鋳型とc)(2.4±0.1)×10-5

し oligo(A)を伸長する反応系では金属イオン触d)-5媒を用いると効率が高くなることが知られていoligo-6ap(C)5rC(1.2±0.1)×10[NaCl] = 0.2 M, [MgCl2] = 0.075 M, [imidazole] = 0.1 M,[EDAC] = 0.2 M, [oligonucleotide] = 0.1 mM, pH = 8.0, 25oC.
a: The rate constants involve the influence of thequadrahelix formation of oligo-G6 or oligo-G8.
b: [template] = 0.1 mM.
c: Data from reference [7]d: Data from reference [4]る[11]．従って，本系で鋳型を添加しても 2 量体の顕著な増加が認められなかったことは，２量化の生成反応の効率を高めるためには鋳型を加えるだけでは不十分であることを示唆している．

ここで，oligo-G6 系での鋳型の影響を考察するために oligo-G6 と temp-C12 の濃度比 2：1 の

３−３

混合系の Tm を環化反応と同じ緩衝溶液中で測定

２鎖長鋳型の影響

ヘキサヌクレオチドの環化に対する１

した結果，52℃であった．また，ヌクレオチド

我々の先行研究では，グアニンおよびシトシとして oligo-G6 だけを含む溶液の Tm を DSC をンを含むヘキサヌクレオチド（oligo-6a，-6b，-6c）- 75 -

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を用いてその環化反応の温度依存性を調べる研

oligo-6a の環化は temp-12a の存在下で少し抑究をおこなった．この環化反応に対してヘキサ

制され，また temp-12c あるいは temp-12d の存在

ヌクレオチドと相補的あるいは非相補的な塩基下では 全く環化は 進行しな かった．2 分子の配列を含む 4 種類の 12 鎖長のオリゴヌクレオチ

oligo-6a と相補的な duplex を形成し得る temp-12bド（temp-12a，-12b，-12c，-12d）を加えて影響の存在下では，oligo-6a の生成物と鋳型のピークを調べ，鋳型を加えない場合の結果と比較した．

は重なるが，原料 oligo-6a と環化生成物の HPLC

生成物を HPLC で分析し保持時間を調べ，先行面積の和は反応前後でほぼ一定であることから，研究で得た環化生成物と２量体生成物対応する

2 量体は存在したとしてもその生成量は低いとHPLC の保持時間と比較して生成物を帰属した

推 定 さ れ る ． oligo-6b で は ， temp-12a ま た は（Fig. 5）．２量体と鋳型とが同じ塩基配列の場

temp-12b を添加しても鋳型としての効果はほぼ

合には，2 量体の構造は 5’-末端にリン酸基がつ認められなかった．また oligo-6b の 2 分子と相いていることとリボースを含む点で鋳型の構造

補的な配列をもつ temp-12c を添加した場合には，とは完全には同じではないが，HPLC では分離

環化反応生成物は検出されなかった．またされなかった．また，相補的でない種々の 12 鎖

oligo-6b の２量体と temp-12c の HPLC ピークは長のオリゴヌクレオチドを含む場合にも環化生重なるが，原料 oligo-6b の HPLC ピーク面積の成物あるいは２量化生成物のピークと 12 鎖長オ

temp-12c に対する比は反応前後でほぼ一定であリゴヌクレオチドは，HPLC 上で同じ位置にピったので，2 量体は生成しなかったと考えられークを持つ場合があるので，十分注意深く HPLCる．またさらに，temp-12d を加えた場合には環チャートを読み生成物の割合を計算した（Table

化生成物も 2 量化生成物のどちらも認められな3）．

かった．oligo-6c に対して temp-12a あるいは 12bを加えた場合は，鋳型と 2 量化生成物とは HPLC
ピークは重ならないが，これらでは環化生成物の生成量はあまり変化しなかった．一方，temp12d を加えると環化反応の収率は減少した．また，temp-12c を加えた場合には temp-12c と環化生成物の HPLC ピークは重なるので環化生成物の収量を直接測定することはできない．しかし，原料のピーク面積の鋳型のピーク面積に対する比は反応時間 0 d と 7 d でほぼ同じであり，2 量体の生成率は非常に小さいと推定される．
以上の結果，鋳型として temp-12a あるいはFigure 5. HPLC profiles of the condensation reaction of
5’-pGCGCGrC (oligo-6b) in the presence of 5’GGGCCCCCCGGG (temp-12b) template.
Reaction conditions: [NaCl] = 0.2 M, [MgCl2] = 0.075
M, [imidazole] = 0.1 M, [EDAC] = 0.2 M, [oligo-6b] =0.1 mM, [temp-12b] = 0.2 mM, pH = 8.0, 0 oC.
Reaction time: (a) 0 h, (b) 168 h.

temp-12b を加えた場合には環化に対してあまり影響はなく，2 量体の生成率は向上しなかった．
この理由は，12 鎖長のオリゴヌクレオチド自身が自己相補的な配列をもつため duplex を生成し，- 76 -

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Table 3. The yield of cyclic-hexanucleotide and the dimer of hexanucleotide in the presence of a possible template
oligonucleotide

systemHexanucleotide
Oligo-6aOligo-6b

Oligo-6c

template
temp-12areactant
72

yield (%)
cyclic- hexanucleotide
28

Dimer
0

temp-12ba)

(49)

(51)

(0)

temp-12c

100

0

0

temp-12d

100

0

0

no template

44

51

5

temp-12a

53

47

0

temp-12b

51

48

0

a)

temp-12c

100

0

(0)

temp-12d

100

0

0

no template

45

53

2

temp-12a

59

41

0

temp-12b

68

32

0

a

temp-12c )

(87)

(13)

(0)

a)

temp-12d

100

0

(0)

no template

62

30

8

[NaCl] = 0.2 M, [MgCl2] = 0.075 M, [imidazole] = 0.1 M, [EDAC] = 0.2 M, [oligonucleotide] = 0.1 mM,[template] = 0.2 mM, pH = 8.0, 0 oC, reaction time: 168 h.
a: These data were estimated values since one of the products was co-eluted with the template oligonucleotide on theanion-exchange HPLC column.

Scheme 3 に示す duplex との競争となり，目的とより鎖長の大きな１２鎖長のオリゴヌクレオチする duplex がうまくつくられなかったためであドを用いて，環化反応を調べた．その結果，こるかも知れない．一方，temp-12c あるいは temp-

れらの系では単純に環化反応が進行するだけで12d を加えると環化反応が進まなくなる傾向があり 2 量化は進まなかった．第 2 および 3 としあることが分かった．この理由として，鋳型とて，6 または 8 鎖長のオリゴヌクレオチドの環

原料が部分的に duplex を生成し環化を抑制した化反応に対して原料のオリゴヌクレオチドと相ことなどが考えられるが，今後詳しい研究が必

補的な塩基配列を持つ２倍の鎖長のオリゴヌク

要である．

レオチドを添加してその影響を調べた．これらの鋳型が存在する系でも主として環化が進行し，

３−４

これらの 反応の化 学進化的な 意味とRNA の生成モデルとしての評価鋳型となり得るオリゴヌクレオチドの影響は小さかった．また，環化が抑制された場合でも 2

本研究では，オリゴヌクレオチドの環化反応

量化の進行に対してはあまり効果はなかった．

を抑制し 2 量化が効率よく進行する条件を見いすなわち，短鎖オリゴヌクレオチドの 2 量化反だし，高温下で機能するオリゴヌクレオチドの応に対してその相補的な塩基配列をもつ 2 倍鎖生成系を構築するために 3 種類の反応を調べた．

長のオリゴヌクレオチドを添加する系は，高温

第 1 に従来の研究で用いたオリゴヌクレオチド下で働く RNA の生成モデルとしていまのところ- 77 -

Viva Origino 32 (2004) 68 - 80

適していない．これらの系では 5’-末端のリン酸

RNA ワールド仮説は生命の起源のモデルとし基がイミダゾールの存在下で EDAC によってイて重要である．また，試験管内分子進化法で種々

ミダゾリドとなり，活性化され原料として利用のリボザイムを創出できることや，化学進化実されるので，このイミダゾリドの生成過程が環験で RNA が生成する事実は RNA ワールド仮説

化と 2 量化の効率に影響を与えたかも知れない．

を強く支持している．しかし，熱水起源説とのこれを検証するために，イミダゾリドを 5’-位置関係を議論するためには，そのような環境で働にもつオリゴヌクレオチドを Joyce らの方法でくモデルを構築しその化学反応としての特性を調製したところ[12]，合成途中で環化反応が起

詳しく解析することによって，高温下でそれら

こりイミダゾリドの純度は低かった．したがっの反応が起こりやすかったのかどうかを検証して，オリゴヌクレオチドのイミダゾリドを原料なければならない．このようなモデルを構築すとして用いるためには工夫が必要である．また，るために本研究で探索した比較的短鎖長のオリグアニンを含むホモオリゴヌクレオチドは会合

ゴヌクレオチドを用いる反応系は，2 量化を起体を形成しやすいため，陰イオン交換 HPLC でこす方法としては効率は低かった．この種のネ分析するときに複数のピークを生じるなど，解ガティブデータは捨て去られがちであるが，化析が複雑になりやすかった．この点でもこの系

学進化の研究においては様々な条件下での反応は良いモデルとは言えない．

に関する知識を収集する作業が必要である[15]．

一方，本研究で行った条件下では，6 鎖長かまた，本研究で得られた結果は，環化を抑制すら 12 鎖長のオリゴヌクレオチドは非生物的な環るためには鋳型を加えるだけでは不十分である

境では鋳型指示的には伸長しにくいことが示さことを示唆しているが，熱水中では RNA の生成れた．すなわち，短鎖 RNA オリゴマーを経由し反応は起こらないことを断定するものでもない．

てそれらが鋳型指示的に伸長する反応系は，環実際，好熱性細菌の存在は，酵素を用いれば RNA化反応を抑制する経路がなければ原始地球環境の生成反応は高温下でも可能であることを示し

下では起こりにくかったことを示唆している．3ている．このような好熱性細菌の酵素のモデル

鎖長の系でも鋳型指示的な伸長を起こすためにとして，原始環境で自発的に生成するタンパクは 5’-および 3’-末端に工夫が必要であることも質状物質がこのような高度な機能を直ちに発揮[13]，これを間接的に支持していると思われる．

するかどうかは分からないが，RNA を重合する

また例えば，粘土のような触媒上である程度長ような機能を原始酵素が持ち得たかどうかといいオリゴヌクレオチドが生成しても，粘土からうことを視野にいれることも必要である．またオリゴヌクレオチドが脱着して水中で伸長が進

オリゴヌクレオチドを分析する方法の改良も必行する場合には環化反応が障害となったことが要であることを知った．

考えられる．実際，粘土存在下でも環化反応は伸長反応の効率を低下させることが示されてお謝辞り[14]，環化反応はオリゴヌクレオチドの蓄積

大阪府立大学大学院農学研究科深田はるみ助に対して障害となった可能性を支持している．

教授には DSC 測定についてお世話になりました．

４

本研究は日本学術振興会科学研究費補助金

まとめ- 78 -

Viva Origino 32 (2004) 68 - 80

（15550150）の援助をいただきました．以上の[5]

方々に謝意を表します．

Kawamura,

K.

Kinetics

parameter

analysesandofactivationhydrolysis

interconversion of 2’,5’-andand 3’,5’-linked

引用文献

dinucleotide monophosphate at extremely high[1]

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Kawamura,

K.

Kinetic

The

analysisofcleavagetheriboseguanineandRNA

World,

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White,R.

H.

Hydrolytic

phosphodiester

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[4]

bond

of

of

microspheres

stability

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[3]

the

oligonucleotides
at

65 –

200

Implications

o

of

C

and
and its(2001);

chemicalViva Origino 27, 107-118 (1999).
[6]

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the scenario on the origin of life, Viva Origino

on a poly(C) template with Zn2+, Bull. Chem.

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from

the

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water-soluble

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carbodiimide at 0 – 75 oC, Viva Origino 31,

Kawamura, K. and Okamoto, F. Cyclization

221-232 (2003).

and dmierization of hexanucleoides containingwith- 79 -

Viva Origino 32 (2004) 68 - 80

guanine

[8]

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with

water-soluble

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template-directedcondensation

of

J.

P.

Oligomerizationgroup onofuridineAdenine derivatives as phosphate-activating

short-

groups for the regioselective formation of 3’,5’-chained oligouridylates on a poly(A) template,

linked oligoadenylates on montmorillonite:

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- 80 -

123-134 (2002).