24

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）＜平成 22 年度助成＞

母乳オリゴ糖に作用するビフィズス菌の酵素～分子機能の解明とプレバイオティクス開発への応用～
片山高嶺（石川県立大学生物資源工学研究所）

緒言

中性オリゴ糖画分を調整し、単一炭素源として培地に添加してビフィズス菌を培養した。菌の生育

母乳栄養児の腸管では、授乳開始後速やかにビは OD 600 で測定し、経時的にその培養液を回収しフィズス菌優勢な腸内細菌叢（ビフィズスフローた。遠心分離によって培養上清を得た後、2 –アミラ）が形成される。このビフィズスフローラの形

ノ安息香酸でオリゴ糖を蛍光ラベル化し、HPLC成には、人乳に含まれるオリゴ糖（母乳オリゴ糖）に て 分 析 し た。 使 用 し た カ ラ ム は Amide-80

が関与していることが 50 年以上も前から指摘さ（Tosoh）で、内部標準としてはイソマルトペンタれてきたが、その分子基盤は不明なままであった。

オースを使用した。

申請者は最近、ビフィズス菌 Bifidobacterium

使 用 し た 乳 児 型 ビ フ ィ ズ ス 菌 の う ち、B.

bifidum が母乳オリゴ糖資化に関わるユニークなbifidum および B. longum subsp. infantis は母代謝経路を有することを見出すと共に、この経路乳オリゴ糖培地で良く生育したが（OD 600 > 1.5）、を構成する遺伝子群のホモログが腸内細菌の中でB. breve および B. longum subsp. longum はわもある種のビフィズス菌にしか存在しないことを（図 1）。
ずかにしか生育しなかった（OD 600 < 0.5）明らかとした。このことは、母乳栄養児の腸管におけるビフィズスフローラ形成の謎を解明する大2.5

きな手がかりとなると考えている。

2.0路の生理的意義を理解すること、経路上の酵素の構造機能解析を行うこと、また、その酵素を機能改変することで真のプレバイオティクスである母乳オリゴ糖を精密酵素合成することを目標とした。
乳児型ビフィズス菌による母乳オリゴ糖資化様式
一般に、乳児糞便からは B. bifidum, B. breve,菌密度（OD 600 )本研究では，ビフィズス菌の母乳オリゴ糖資化経

B. longum subsp. infantis JMC1222
B. bifidum JMC1254
1.5
1.00.50

B. longum subsp. longum JMC1217
B. breve JMC1192
01020304050

培養時間（h)

図 1. 母乳オリゴ糖培地での乳児型ビフィズス菌の増殖

B. longum subsp. infantis および B. longum subsp.

B. bifidum の培養上清では、分泌型 1, 2 –α– L - フlongum の 4 種のビフィズス菌が単離される（以降、コシダーゼおよびラクト – N – ビオシダーゼによっ

乳児型ビフィズス菌と総称する）。これらの菌種が– フコシルラクトースおよびラクト – N – テトて 2’

実際に母乳オリゴ糖をどのように資化するかにつラオースが速やかに分解され、それに伴い L - フいて調べた。分娩後 30 日～ 120 日（平均年齢 33 歳、コース、ラクト – N – ビオース I およびラクトース

妊娠期間 36 ～ 40 週）の母親から集めた母乳よりの濃度が上昇した（ 図 2）。ここで注目すべきは、

母乳オリゴ糖に作用するビフィズス菌の酵素 ～分子機能の解明とプレバイオティクス開発への応用～

3.5

1.5

2.50.92.00.6

1.5FucGal
Glc
GlcNAc0.3

濃度（g/L)Lac
LNB
2’-FL3-FL

3.0

1.225

1.00.500051015 20

1.525305103.5LDFTLNT
LN nT

1.20352.52.00.6

1.5253035

LNFP ILNFP II/III
LNDFH ILNDFH II

3.00.915 20

1.00.30.500051015 20253035051015 20253035

培養時間（h)
図 2. B. biﬁdum による母乳オリゴ糖分解細胞が旺盛に増殖を開始する対数増殖期の初期

longum subsp. longum はラクト – N – テトラオーにも関わらず、ラクト – N – ビオース （I 1 . 3 mM）

スのみを資化した（データ非掲載）。

およびラクトース（6.7 mM）が培養上清に残され以上のことから、乳児型ビフィズス菌において– フコシルラクトースとラクていたことである（ 2 ’は菌種間で母乳オリゴ糖資化様式が異なることがト – N – テトラオースの初濃度はそれぞれ 3.0 mM明らかとなった。母乳オリゴ糖資化能は腸内細菌と1.6 mM）。 ま た、 培 養 の 後 期 に は す べ て の 母の中でも乳児型ビフィズス菌にのみ検出される乳オリゴ糖が分解されたが、L - フコースおよびが、その限られた能力が Bifidobacterium 属とガラクトースが消費されないままに培養上清にいう 1 つの属の中でも多様な方法で獲得されてき残っていた。これらのことは，実際の腸管内でたということは非常に興味深いことである。また、は B. bifidum に よ っ て分解された母乳オリゴ糖

乳児型ビフィズス菌がラクト – N – テトラオースをが他の菌に分配されていることを示唆している。B.

優先的に資化する能力を有していたことは特筆す

longum subsp. infantis の培養上清では、対数増べきことである。というのも、ラクト – N – テトラ

殖期にほぼすべての母乳オリゴ糖が消失し、そのオースはヒトの母乳中に最も多く含まれるコア構後、単糖がわずかに検出された（データ非掲載）。

造で有り、霊長類を含む他の哺乳類には存在しな

このことから、本菌は母乳オリゴ糖をそのままいか、存在してもごく微量である。つまり、これの形で細胞内に取り込んでいることが明らかとらのことはヒトとビフィズス菌が共進化してきたなり、このことは、本菌の母乳オリゴ糖分解にことを示唆しており、ヒトはその乳児期にビフィ関わる酵素がすべて細胞質に局在していることズス菌と積極的に共生する戦略を取ってきたと考（次項参照）と良く一致した。B. breve および B.

えられた。

26

浦上財団研究報告書

ラクト – N – テトラオース β-1, 3 - ガラクトシダーゼの単離と機能解析
上記の結果より、B. longum subsp. infantis は優れた母乳オリゴ糖資化能を有していることが明らかとなった。本菌のゲノム上には母乳オリゴ糖分解に関わると推定される遺伝子群がクラスターを形成して存在しており（HMO cluster-1）、比較

Vol.20（2013）

ラクトシダーゼ ; Bga42Aと命名）であることが明らかとなった（表 1）。本酵素のホモログは乳児型
ビフィズス菌にのみ存在しており、このことは上述したヒトとビフィズス菌の共進化を考える上でも興味深い結果である。
1, 3 -1, 4 -α- L - フコシダーゼの構造機能解析
およびフコシルオリゴ糖の精密酵素合成ゲノムによる解析結果から、本菌種の母乳オリゴ

上 記 の 研 究 過 程 に お い て、B. longum subsp.

糖資化能は本クラスターの存在によるものである

infantis のHMO cluster-1 内に存在するBlon_2336と考えられていた。ところが、本クラスター内のは 1, 3 -1, 4 -α- L - フコシダーゼ（Bi AfcB ）をコード酵素を精製してその基質特異性を調べたところ、していることが明らかとなった。Bi AfcB は糖質母乳オリゴ糖の主要コア構造であるラクト – N – テ加水分解酵素ファミリー（GH）29 に属しているトラオースには全く作用しないことが明らかとが、GH29 のメンバーを分子系統樹解析すると 2なった。一方、B. longum subsp. infantis の無細

種 の サ ブ フ ァ ミ リ ー（GH29-A お よ び GH29-B）

胞抽出液を用いた場合は、ラクト – N – テトラオーに分類されること、またこの分類が基質特異性スからガラクトースの遊離が観察され、このことを良く反映していることを見出した（図 3）。すなから HMO cluster-1 とは別の遺伝子座にあるβ–わち、GH29-A の酵素は p - ニトロフェニル -α- L -ガラクトシダーゼが母乳オリゴ糖の分解に重要でフコピラノシドを含む種々のフコシル結合に作あることが明らかとなった。なお一般に殆どのβ–用 す る（EC 3.2.1.51）の に 対 し、Bi AfcB が 属 す

ガラクトシダーゼはβ– 1, 4 結合に特異的であり、る GH29-B の酵素は 1, 3 / 4 -α- L - フコシル基を特β– 1, 3 結合に作用する酵素は植物病原菌およびバ異的に切断する（EC 3.2.1.111）。この差異の分チルス属細菌由来の 2 例のみが報告されていただ

子基盤を明らかとするため、Bi AfcB の X 線結晶けであった。そこで、本菌のゲノム上に存在する構造解析を行った。野生型のデオキシフコノジリすべてのβ– ガラクトシダーゼホモログを組換えマイシン（DFJ）複合体（WT-DFJ）および触媒残タンパク質として発現させ、その基質特異性につ基 2 重変異体のラクト – N – フコペンタオース II

いて検討を加えた。その結果、Blon_2016 がラク（LNFP II）複合体（D172A/E217A-LNFP II）のト – N – テトラオースに特異的に作用するβ– ガラ構造をそれぞれ 1.6 Å および 1.8 Å の分解能で決クトシダーゼ（ラクト – N – テトラオースβ– 1, 3 - ガ定した。WT-DFJ 複合体では DFJ とエチレング

表 1. B. longum subsp. infantis 由来 Bga42A の基質特異性
酵素

基質構造

pNP-β-Gal

K m (mM)

k cat (s –1 )6.7 (± 0.6) × 10

‒11.6 (± 0.2) × 10

14.4 (± 0.3) × 101

k cat / K m (mM –1 s –1 )

1.1 (± 0.0) × 10

31.6 (± 0.4) × 1019.7 (± 0.3) × 1016.1 (± 0.5) × 1001.6 (± 0.0) × 1013.8 (± 0.2) × 10-1

pNP-β-Fuc
Bga42A(Blon̲2016)

Lac
LacNAcLNn TLNB
LNT

Galβ1-4Glc
Galβ1-4GlcNAc
Galβ1-3GlcNAc
Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc

2.8 (± 0.2) × 102.2 (± 0.3) × 1003

1.1 (± 0.1) × 1008.6 (± 0.3) × 1013.0 (± 0.2) × 1002.7 (± 0.1) × 1021.2 (± 0.1) × 102

Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc11.6 (± 0.1) × 10

母乳オリゴ糖に作用するビフィズス菌の酵素 ～分子機能の解明とプレバイオティクス開発への応用～

27

図 3. GH29 の分子系統樹解析

リコール（抗凍結剤）の、D172A/E217A-LNFP造（Fucα1-3/4GlcNAc）には作用しないことと一II 複合体ではラクト – N – フコペンタオース II の致した（データ非掲載）。一方、GH29-A に属す

うちルイス a 構造の電子密度が活性中心においる Thermotoga maritima 由 来 の 酵 素（TmFuc ）て観察された（図 4）。興味深いことに、基質結合では誘導適合は見られず、また、Bi AfcB のガラに伴い活性中心近傍のループが大きく構造変化

クトース結合部位に相当する位置には R254 が存し、触媒残基が適切な位置に配置される（誘導適在し、基質および触媒残基と水素結合していた。

合）ことが明らかとなった（図 5）。また、Bi AfcB

Bi AfcB においてガラクトース結合部位を形成はフコースが結合している N – アセチルグルコサしているアミノ酸残基は GH29-B メンバー間で、ミン残基よりも、枝分かれしたガラクトース残TmFuc の R254 は GH29-A メンバー間でそれぞれ基と強く相互作用していた．これらの構造的なよく保存されていた。以上のことから、ガラクトー

特徴は、Bi AfcB がルイス a/x のような分岐したス残基結合部位の有無、また、ガラクトース結合ガラクトース残基を持つ 3 糖構造によく作用すによる誘導適合が、GH29-A/B の基質特異性をるものの、ガラクトース残基を有しない 2 糖構規定する分子基盤であることが明らかになった。

図 4. D172A/E217A-LNFP II 複合体の活性中心で観察されたルイス a の 3 糖構造

28

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

まとめ
本研究では、乳児型ビフィズス菌による母乳オリゴ糖資化様式を、それぞれの菌が有する代謝能（酵素機能）とあわせて考察するとともに、母乳オリゴ糖に作用するユニークな酵素の構造機能解析を行った。これらの結果は、母乳栄養児の腸管におけるビフィズスフローラ形成機構を解明する上で重要な成果であると考えている。また、変異型酵素を用いて精密なフコシルオリゴ糖合成が可能であることを示した。
図 5. BiAfcB 活性中心で観察された基質結合に伴う誘導適合

今後は、乳児糞便などを使用して、実際の乳児次に、本酵素の厳密な基質特異性を利用したフ腸管内における母乳オリゴ糖の分解やビフィズスコシルオリゴ糖の精密酵素合成を行った。求核残菌遺伝子の発現などを調べることで、更に詳細な基のセリン置換体を作製し、β- L - フコシルフル検討を行う必要がある。また、変異型酵素を利用オリドを供与体、ラクト – N – ビオース I もしくはした母乳オリゴ糖合成基盤を確立し、将来的にはN – アセチルラクトサミンを受容体として反応さ人工乳への添加を可能としたい。

せたところ、それぞれルイス a およびルイス x が特異的に合成され、他の副産物は全く生じなかっ謝辞本研究課題に対し多大なるご支援を賜りました

これらの結果から、本変異型酵素は極めて高い立（公財）浦上食品・食文化振興財団に心より感謝申体・位置の制御が可能な 1, 3 -1, 4 -α- L - フコシダー

し上げます。本研究の成果は下記の通り発表しま

ゼであることが明らかとなった。

した。

シ グ ナ ル 強 度（ m V ）た（図 6）。供与体に対する収率は 60 %であった。

保持時間（min)
図 6. 1, 3 -1,4 -α- L- フコシダーゼによるルイス a/x の精密合成

母乳オリゴ糖に作用するビフィズス菌の酵素 ～分子機能の解明とプレバイオティクス開発への応用～〔 原著論文〕

Sakurama H, Fushinobu S, Hidaka M, Yoshida E, Honda Y,Ashida H, Kitaoka M, Kumagai H, Yamamoto K, and Katayama
T (corresponding author). (2012). 1,3-1,4-α-L-Fucosynthasethat specifically introduces Lewis a/x antigens into type-1/2chains. Journal of Biological Chemistry. 287(20):16709-19.
Yoshida E, Sakurama H, Kiyohara M, Nakajima M, Kitaoka
M, Ashida H, Hirose J, Katayama T (corresponding author),
Yamamoto K, and Kumagai H. (2012). Bifidobacterium longum

29

subsp. infantis uses two differentβ-galactosidases for selectively
degrading type-1 and type-2 human milk oligosaccharides.
Glycobiology. 22(3):361-368.
Asakuma S, Hatakeyama E, Urashima T, Yoshida E, Katayama
T (corresponding author), Yamamoto K, Kumagai H, Ashida H,Hirose J, and Kitaoka M. (2011). Physiology of the consumptionof human milk oligosaccharides by infant-gut associatedbifidobacteria. Journal of Biological Chemistry. 286:3458334592.

30

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Infant gut-associated bifidobacteria
and human milk oligosaccharides (HMOs)
Takane Katayama
Research Institute for Bioresources and Biotechnology
Ishikawa Prefectural University
1. The bifidogenic effect of HMOs has long been known, yet the precise mechanism
underlying it remains unresolved. I measured the concentration of each neutral HMO
during cultivation of infant-gut associated bifidobacteria by using normal-phasehigh-performance liquid chromatography. Bifidobacterium bifidum used secretory
glycosidases to degrade HMOs, whereas B. longum subsp. infantis assimilated all
HMOs by incorporating them in their intact forms. B. longum subsp. longum and B.
breve consumed lacto-N-tetraose only. B. bifidum left degraded HMO metabolites
outside of the cell even when the cells initiate vegetative growth, which indicates thatthe different species/subspecies can share the degraded sugars. The predominance oftype-1 chains in HMOs and the preferential use of type-1 HMO by infant gut-associatedbifidobacteria suggest the coevolution of the bacteria with humans.
2. The ability of B. longum subsp. infantis to assimilate HMOs has been ascribed tothe presence of a gene cluster (HMO cluster-1) contained in its genome. However,
because no enzymatic studies have been completed, the metabolism of HMOs by theorganism remains ambiguous. I characterized β-galactosidases of this subspecies tounderstand how the organism degrades type-1 and type-2 isomers of HMOs. The results
revealed that, while the Blon_2334 gene located within the HMO cluster-1 encodes a
β-galactosidase specific for lactose and type-2 HMOs, the locus tag Blon_2016 gene,which is distantly located from the HMO culster-1, encodes a novel β-galactosidase(Bga42A) with a significantly higher specificity for lacto-N-tetraose. Despite thequite rare occurrence in nature of β-galactosidases acting on type-1 chains, theclose homologues of Bga42A were present in the genomes of infant-gut associatedbifidobacteria. The predominance of type-1 chains in HMOs and the conservation of
Bga42A homologues suggest the coevolution of infant-gut associated bifidobacteriawith humans.
3. Regiospecific synthesis of glycosyl bonds, especially α-L-fucosyl linkages, is quitedifficult to control. I generated an α-L-fucosynthase that specifically introduces Lewis
a/x antigens into the type-1 and type-2 chains, respectively, i.e., the enzyme specificallyaccepts the disaccharide structures (Gal β1-3/4GlcNAc) at the non-reducing ends andattaches a Fuc residue via an α-(1,4/3)-linkage to the GlcNAc. X-ray crystallographic
studies revealed the structural basis of this strict regio- and acceptor-specificity,that includes the induced-fit movement of the catalytically important residues, andthe difference between the active site structures of 1,3-1,4-α- L -fucosidase (EC3.2.1.111) and α-L-fucosidase (EC 3.2.1.51) in the glycoside hydrolase family 29.
The glycosynthase developed in this study should serve as a potentially powerful tool
to specifically introduce the Lewis a/x epitopes onto labile glycoconjugates including
glycoproteins.