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アブラナ科野菜根こぶ病の分類・同定と保存法

植物防疫基礎講座：

アブラナ科野菜根こぶ病の分類・同定と保存法
岐阜大学流域圏科学研究センター

はじめにあさのたか浅野貴IIひろ博＊

根こぶ病菌の生活環

アブラナ科野菜根こぶ病（以下，根こぶ病）は

根こぶ病菌の生活環は，不明な点も残されているがPlasmodiophora brassicae によって引き起こされる土壌図― 1 のように考えられている（T OMMERUP and I NGRAM ,伝染病害である。根こぶ病菌に侵された作物は根部にこ1971 ; MITHEN and MAGRATH, 1992 ; KAGEYAMA and ASANO,ぶを形成するため，アブラナ科野菜の品質低下および収2009）。根こぶ病の第一次伝染源は，根こぶ病罹病植物量にも影響を与えている。根こぶ病の初発生は，のこぶの腐敗に伴って土壌中に分散した休眠胞子であA.D.400 年ごろに根こぶ病菌による発病と思われる記録る。この休眠胞子は耐久性があり 10 年近くも生存するが残されているが，一般的には 1736 年の英国での発生と言われており，土壌環境が好適条件となったとき発芽とされる。1877 年にはロシアの菌学者 WORONIN によっして，第一次遊走子を放出する。第一次遊走子は根毛にて世界最初の学術論文が発表された。その後，本菌は世感染し，根毛内で第一次変形体となり，速やかに遊走子界各国にまん延し，アブラナ科野菜の重要病害となってのうに分化する。遊走子のう中には 4 〜 16 個の第二次いる。我が国においては，1892 年に北海道で最初の発遊走子が形成される。この根毛への感染は，第一次感染生が確認され，現在では北海道から九州までの広い地域あるいは根毛感染と呼ばれている。その後，遊走子のうで発病が認められ問題となっている。本稿では，根こぶから第二次遊走子が放出され，根毛内から皮層細胞に，病菌の見分け方と根こぶ病菌を用いて実験を行うに当たあるいは根毛から再度土壌に放出したのち皮層細胞に感っての留意点について紹介する。

染するとされている。この皮層への感染は，第二次感染Iあるいは皮層感染と呼ばれているが，いまだにこの感染

根こぶ病菌の分類学的位置と特徴過程は解明されていない。皮層細胞に感染したのち，以前，根こぶ病菌は栄養体である変形体が変形菌のそMyxamoeba と呼ばれるアメーバ状の形態となり，次いれと似ていたため，変形菌門，ネコブカビ綱で多核の第二次変形体へと成熟し，根部組織の異常肥大（Plasmodiophoromycetes）ネコブカビ目を引き起こす。その後，第二次変形体は休眠胞子とな（Plasmodiophorales）に分類されていた。しかし，近年り，こぶの腐敗に伴って土壌中に分散する。の分子系統解析に基づいた分類では，寄生性の原生生物IIIとして，リザリア（Rhizaria）界，ケルコゾア

根こぶ病菌の同定（Cercozoa）門，フィトミクサ綱（Phytomyxea），ネコある作物に根こぶ症状が認められた場合，根こぶ病菌ブカビ目（Plasmodiophorida）に分類されている（ADLによる被害とネコブセンチュウによる被害の両者が考えet al., 2005）。

られる。根こぶ病菌による症状とネコブセンチュウによネコブカビ目は 10 属 30 種ほどが知られており，主とる症状の違いは，植物によっては即座に診断を下すことして休眠胞子の集まる状態，休眠胞子堆の形態によっては難しく，総合的に判断しているが，次の点に注意して属の区別がなされている。根こぶ病菌を含む診断する。

Plasmodiophora 属菌の休眠胞子は，休眠胞子堆や休眠（ 1 ） 被害植物の差異胞子集団を形成せず決まった形態を取らないのが特徴とされている（KARLING, 1968）。

根こぶ病による被害は，アブラナ科植物のみに症状が起きる。一方，ネコブセンチュウによる被害は，ほとん
どの場合がウリ科（スイカ，メロン，キュウリ等）およIdentification and Maintenance of Clubroot Disease Caused byPlasmodiophora brassicae.
By Takahiro ASANO（キーワード：アブラナ科野菜根こぶ病，同定，保存法，休眠胞
子発芽，人工培養）＊
現所属：日本原子力研究開発機構

びナス科（トマト，ナス），たまにアブラナ科植物である。よって，被害植物によってある程度，類別することができる。ウリ科，ナス科のこぶ症状はほぼネコブセンチュウである。ただし，念のため後出（ 3 ）の検鏡による―― 57 ――

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第 63 巻 第 10 号 （2009 年）

植 物 防 疫

土壌中

休眠胞子

第一次遊走子休眠胞子
第一次感染（根毛感染）

第一次変形体？
？

第二次変形体

遊走子のう

第二次感染
（皮層感染）
第二次遊走子アメーバ

図 −1 アブラナ科野菜根こぶ病菌の生活環

根こぶをよく洗い，土壌粒子などの不純物を取り除き，根こぶを適度な大きさにする変形体A

徒手切片を作成

0.05％コットンブルー溶液（50％氷酢酸）で染色

休眠胞子

20 μm

B20 μm

第二次変形体や休眠胞子が観察できる

図 −2 根こぶ病菌の観察方法

確認は実施する。

妙な判定であるため，以下（ 3 ）の検鏡で確定診断を行う。

（ 2 ） 被害形態の差異（ 3 ） 被害植物の根部切片の検鏡

根こぶ病の場合，激発症状であれば罹病したアブラナ

アブラナ科植物の場合，根こぶ病の初期とネコブセン科植物の根には大人の親指に近い太さのこぶを生じていチュウの症状が類似しているため，判断に迷った場合にる。このような大きなこぶがあれば根こぶ病と診断しては根の切片を検鏡する。ここで，センチュウがよく見らいる。一方，ネコブセンチュウの場合，激しい症状でもれる場合にはネコブセンチュウと判定し，根こぶ病菌の親指大ほどで，太い根部の肥大はほとんど見られない。

変形体または休眠胞子が見られる場合には根こぶ病と診

ただし，根こぶ病の発生初期である場合は，ネコブセン断する。

チュウによる被害と同様の症状であるため，即座に判断

検鏡方法は以下の手順で行う。罹病個体をよく洗い，することは難しい。よく観察すると，根こぶ病の初期症

土壌粒子などの不純物を取り除き，徒手切片を作成し，状における根の表面はややなめらかで，ネコブセンチュスライドガラスにのせる。そこに，0.05％コットンブル

ウの場合はごつごつしているとは言われる。しかし，微ー溶液（50％氷酢酸）を適量入れてカバーガラスをし，―― 58 ――

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アブラナ科野菜根こぶ病の分類・同定と保存法

顕微鏡で観察する。感染初期であると第二次変形体が，V感染後期であれば休眠胞子が観察される（図― 2）。

IV

実験の再現性

実験データを取得するときには，冷凍保存した根こぶ根こぶ病菌の保存ではなく，休眠胞子懸濁液を作成し，改良スラリー法

根こぶ病菌は絶対寄生菌であるため，純粋培養をする（ASANO et al., 1999）や病土挿入接種法（吉川，1993）をことはできない。そのため，接種源となる休眠胞子は，用いて人工接種し，栽培環境を制御して発病させた根こ罹病植物の根こぶから休眠胞子懸濁液を作成して実験にぶを収穫後速やかに使用することが望ましい。これは，使用する。休眠胞子は懸濁液の状態で 4℃で数か月間の根こぶの保存条件と休眠胞子の成熟度によって休眠胞子保存が可能であるが，長期保存するときには，根こぶも発芽率が異なるためである。

しくは休眠胞子を− 20℃から− 80℃で冷凍保存する。

根こぶの冷凍保存期間が休眠胞子の発芽率に与える影

この状態で，根こぶは 1 〜数年間は保存することが可能

響について図― 4 に示す。採取直後および− 20℃で 1 〜である（図― 3）。

3 か月冷凍保存した根こぶから休眠胞子懸濁液を作成

根こぶの状態で− 20 〜
− 80℃で保存
1 〜数年間は保存することが可能

袋に入れる

切り刻むこぶの採取 外部の除去 （おろし金でも可）ホモジナイズ

休眠胞子懸濁液を 4℃で保存

ろ過

数回，遠心分離をした後，休眠胞子濃度を調整する

数か月から半年間は保存三角することが可能
フラスコ
休眠胞子を− 20 〜− 80℃
で保存マイクロ 1 〜数年間は保存すること
チューブ が可能

図 −3 根こぶ病菌の保存方法

50.070.0
蒸留水

40.0
休眠
胞
子 30.0
発
芽率 20.0︵％︶ 10.0
0.060.0

蒸留水＋ 10 mM MES
改変 Hoagland 溶液＋ 10 mM MES

休眠 50.0
胞
子 40.0発
芽 30.0率︵ 20.0％︶ 10.0

白色蒸留水＋ 10 mM MES
白色改変 Hoagland 溶液＋ 10 mM MES
黒色蒸留水＋ 10 mM MES
黒色改変 Hoagland 溶液＋ 10 mM MES0.0012
冷凍期間（月）

3茨城菌

岐阜菌

群馬菌菌株

高山菌

豊橋菌

図 −4 根こぶの冷凍保存期間および休眠胞子採取部位が休眠胞子発芽率に及ぼす影響
根こぶ：接種 8 週目，温室栽培．発芽実験：pH 5.8，25℃，暗所，12 日間培養．Hoagland 溶液：
KNO3 0.506 g，Ca（NO3）2・4H2O 1.181 g，MgSO4・7H2O 0.493 g，KH2PO4 0.272 g，蒸留水 1 l．
ethanesulfonicacid．
MES：pH 緩衝液 2 ―（N ― morpholino）―― 59 ――

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植 物 防 疫第 63 巻 第 10 号 （2009 年）

し，25℃，暗所で 12 日間培養した。その後，休眠胞子al., 2000）。さらに，毛状根での根こぶ病菌の継代培養も発芽をノマルスキー微分干渉顕微鏡で観察した。培養溶可能となっている（ASANO et al., 2006）。

液には，蒸留水もしくは 5 倍希釈した Hoagland 溶液をまた，毛状根に形成した根こぶの振とう培養による根用いた。その結果，− 20℃で 3 か月保存することで休こぶ病菌の維持方法も試みられ，感染細胞内での根こぶ眠胞子発芽率は最大で約 30％減少した。

病菌の生育段階について詳細な報告がなされている

また，休眠胞子の成熟度も実験の再現性に影響を与え（ASANO and KAGEYAMA, 2006）。

る。休眠胞子の成熟度は，根こぶの生育状態・成熟程度おによって異なり，休眠胞子の発芽能力に差異を生じる。

わりに根こぶの成熟度は，外見からおおよその判断がつく。若

根こぶ病の発病に及ぼす環境要因については，内記

い根こぶは白色からクリーム色をしており，成熟するに（1987）の総説に詳しく記載されているので，参照されつれて徐々に褐色から黒色となり，やがて腐敗する。そたい。しかし，根こぶ病の発病にふさわしい条件で実験

こで，根こぶを白色部と黒色部に分け，それぞれの休眠を行っても再現性のある結果が得られない場合がある。

胞子発芽率を調査した。根こぶ病菌は 5 菌株，培養溶液

これは本稿で述べたように使用する根こぶの状態，すなには蒸留水と 5 倍希釈した Hoagland 溶液を用いた。そわち休眠胞子の発芽能力の差異に起因していると考えらの結果，いずれの菌株においても黒色部で発芽率が高くれる。特に，休眠胞子発芽実験や根毛感染実験を行うとなった（図― 4）。なお，腐敗したこぶでは細菌などの雑きには，使用する根こぶの状態に十分に注意を払うべき菌が混入しており，遠心分離してもそれらを取り除くこである。とができないので実験に使用するにはふさわしくないと謝辞言える。

アブラナ科野菜根こぶ病菌の研究のご指導をいただきました岐阜大学流域圏科学研究センター 景山幸

VI二教授に厚く感謝の意を表する。また，ご鞭撻と種々の根こぶ病菌の人工培養ご教示をいただきました岐阜大学 池上八郎名誉教授に

根こぶ病菌は絶対寄生菌であるため純粋培養すること深く感謝の意を表する。また，成瀬裕久氏，真野百合氏，はできない。1966 年に STRANDBERG et al. が根こぶ病罹病

小川泰一郎氏，児玉明子氏をはじめとする岐阜大学農学

根から根こぶ病菌を細胞内に有するカルス（保菌カル部植物病学研究室で根こぶ病菌の研究に携わった卒業生ス）による培養法を報告した。保菌カルス内の根こぶ病諸氏にあわせて深く感謝する。

菌の形態および性状は，細胞学的にも化学的にも自然の引 用 文 献根こぶ組織中のものと極めて類似しており（WILLIAMS et1）ADL, S. M. et al.（2005）: J. Eukaryot. Microbiol. 52 : 399 〜 451.
2）ASANO, T. and K. KAGEYAMA（2006）: Plant Pathology 55 : 145 〜151.
3）―――― et al.（1999）: Phytopathology 89 : 314 〜 319.
4）―――― et al.（2000）: Mycosience 41 : 49 〜 54.
5）―――― et al.（2006）: J. Gen. Plant Patholo. 72 : 85 〜 91.
6）GRAVERAND, R. et al.（1992）: Mycol. Res. 96 : 225 〜 228.
7）HE, Y.― K.（1991）: Science in China（Series B）34 : 1444 〜1451.
8）池上八郎（1992）: 関西病虫研報 34 : 17 〜 28．
9）KAGEYAMA, K. and T. ASANO（2009）: J. Plant Growth Regul. 28 :203 〜 211.
10）K ARLING , J. S.（1968）: The Plasmodiophorales 2nd. Hafner
Publishing Co., New York, 144 pp.
11）MITHEN, R. and R. MAGRATH（1992）: Mycol. Res. 96 : 877 〜 885.
12）MUGNIER, J.（1987）: Phytopathology 77 : 539 〜 542.
13）内記 隆（1987）: 土と微生物 29 : 25 〜 39．
14）S T R A N D B E R G , J. O. et al.（1966）: Phytopathology 56 : 903（Abst.）.
15）TOMMERUP, I. C. and D. S. INGRAM（1971）: New Phytol. 70 : 327〜 332.
16）WILLIAMS, P. H. et al.（1969）: Can. J. Bot. 47 : 1217 〜 1221.
17）吉川宏昭（1993）: 野菜・茶業試験場研究報告 7 : 1 〜 164．

al., 1969），カルスから分離した休眠胞子は病原力を有している（WILLIAMS et al., 1969；池上，1992）。TOMMERUPand INGRAM（1971）はカルス中で遊走子を含む根こぶ病菌のすべての生活環が観察されたとしている。筆者らは，保菌カルスを 2 週間ごとに継代培養することで，約9 年間，第二次変形体の状態で根こぶ病菌を維持した。
近年，Agrobacterium rhizogenes の感染によって誘導される毛状根を用いた共存培養法も試みられている（MUGNIER, 1987 ; HE, 1991 ; GRAVELAND et al., 1992 ; ASANO etal., 1999）。毛状根を用いた共存培養系においても，根こぶ病菌の形態は自然の根こぶ組織中のものと極めて類似しており，根毛感染から休眠胞子形成までの生活環が観察され（ASANO et al., 1999），根毛内での根こぶ病菌の生育段階についての詳細な報告がなされている（ASANO et―― 60 ――