病原体検出マニュアル 2019-nCoV
令和 2 年 2 月註註）HP での公開用に多少の文言修正・追加はありますが、基本的な検査内容は、すでに地方衛生研究所にお配りした「2019-nCoV 検査マニュアル Ver.2.1（令和 2 年 1 月 28 日）」と同じになっております。

新型コロナウイルス（2019-nCoV）の遺伝子領域２か所、open reading flame 1a (ORF1a)および spike (S) を特異的に検出する 2-step RT-PCR 法、あるいは TaqMan プローブを用いたリアルタイム one-step RT-PCR 法による遺伝子検査により 2019-nCoV を同定する。
【操作法】
1．検体の採取と保存「2019-nCoV(新型コロナウイルス)感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル」（国立感染症研究所ホームページ掲載）を参照のこと。
2．RNA の抽出広く使用されている QIAamp Viral RNA Mini Kit を用いた方法を示すが、他のウイルス
RNA 抽出キットを用いてもよい。
2.1. 材料、機器、器具および試薬

1) 機器・器具
冷却遠心機、1.5ml エッペンドルフチューブ用高速冷却遠心機、1.5ml エッペンドルフチ
ューブ用卓上遠心機、ボルテックスミキサー、チューブ
2) 試薬
QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN、Cat.No.52904)、エタノール、Distilled water(Deionized, Sterile, autoclaved, DNase free, RNase free、和光純薬工業、Cat No.
318-90105 など (以下 DDW)、陽性コントロール RNA
2.2. 操作上の注意

1) 検体の取り扱いは、バイオセイフティーレベル 2+でおこなう。安全キャビネット内で取り扱い、操作中は手袋・マスク等の personal protective equipment (PPE)を着用する。

1

チューブの蓋を開ける時には遠心し、チューブオープナーなどを用い、エアロゾルの発生を極力防止する。
2) 実験室内遺伝子コンタミネーション防止と RNase の混入防止に細心の注意を払う。コンタミネーション防止には、試薬調製場所と PCR 産物などサンプルを扱う場所を物理的に分けることが望ましい。できない場合は、それぞれの操作を別々のキャビネット内で行う。
2.3. QIAamp Viral RNA Mini キットによる RNA の抽出

1) 使用前に行う試薬の調製等(1) サンプルを室温 (15～25°C)に戻す。
(2) Carrier RNA 溶液 1µg/µl の調製
Carrier RNA (凍結乾燥品)310µg の入ったチューブに Buffer AVE を 310µl 添加し、1µg/µl の溶液を調製する。Carrier RNA 溶液は、-20°C 保存で、凍結融解 3 回までなので、適した量に分注して保存する。Buffer AVL が沈殿を生じていた場合は、80°C でインキュベートし、沈殿を溶解した後、調製に使用する。
(3) Buffer AVL/Carrier RNA 混和物の調製
1 サンプルあたり Buffer AVL 560µl、Carrier RNA 溶液 5.6µl になるように Buffer
AVL/Carrier RNA 混和物を調製する(詳細はキット添付の Handbook Table1.を参照)。2～8°C で保存すると沈殿物が生じるので、使用直前に 80°C でインキュベートし溶解する。このインキュベートは、5 分以内とする。なお、Buffer AVLL/Carrier RNA 混和物
は、あらかじめ 560µl ずつ分注し、-20°C に保存しておくと便利である。
(4) Buffer AW1、Buffer AW2 の調製
Buffer AW1 (Kit Cat.No.51104)に 96～100%エタノールを 25ml 加える。
Buffer AW2 (Kit Cat.No.51104)に 96～100%エタノールを 30ml 加える。
2) 操作手順
以下の操作はすべて室温で行う。
(1) 1.5ml チューブに Buffer AVL/Carrier RNA 560µl を入れる。
(2) 検体 140µl と Buffer を充分混合するため 15 秒間 vortex にかけ、室温 (15～25°C)に 10 分間置く。チューブの壁面等に付着している液体を落とすため卓上遠心機で数秒間遠心する (スピンダウン)。
(3) エタノール (96～100%)560µl をチューブに加え、15 秒間 vortex をかけた後、チューブをスピンダウンする。
(4) (3)の液 630µl を QIAamp スピンカラム(2ml コレクションチューブ中)に入れ、蓋を閉め、6,000×g (8,000 rpm)、1 分間遠心する。QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチューブに移し、残りの(3)の液 630µl を入れ、同様に遠心し、全ての液が無くなるまで行う (この操作は 2 回で終わる)。

2

(5) QIAamp スピンカラムを開け、Buffer AW1 を 500µl 入れる。蓋を閉め、6,000×g(8,000 rpm)、1 分間遠心する。QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチ
ューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。
(6) QIAamp スピンカラムを開け、Buffer AW2 を 500µl 入れる。蓋を閉め、20,000×g(14,000 rpm)、3 分間遠心する。スピンカラムとろ液等が接触することが無いよう静かに取り出す。接触した時には(7)を行う。
(7) QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。フルスピード (20,000×g )で 1 分間遠心する。
(8) QIAamp スピンカラムを新しい蓋つき 1.5ml のチューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。
QIAamp スピンカラムの蓋を開け、室温に戻した Buffer AVE を 60µl入れ、蓋を閉めて 1 分間置いた後、6,000×g (8,000 rpm)、1 分間遠心し、ろ液を回収する。なお、抽出 RNA を保存するときは-80°C が望ましい。
3. 2-step RT-PCR 法による 2019-nCoV の定性的検出法

以下に検査・結果判定の概要図を示す。

判定フローPCR2例目から目的のサイズのバンドが見られない目的のサイズのバンドが見られる
陽性

陰性
シークエンス解析
1例目は念のため2019-nCoV配列を確認する

例として SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo)および Quick Taq HS
Dymix (Toyobo)を用いた反応条件を示す。詳細はキットに添付のマニュアルを参照すること。尚、本マニュアルではプロトコルを１部変更している。なお逆転写反応、PCR 反応に用いる酵素等について、類似品で各施設において運用実績のあるものがあればそれを用いても良い。試薬等の分注操作は全て氷上にて行うことが望ましい。
3.1 必要な器具と試薬

1) 器具
サーマルサイクラー、マイクロピペット、チューブ、電気泳動層

32) 試薬SuperScript IV Reverse Transcriptase (RT) [Thermo, Cat.No. 18090010. 50, 200 または類似品(PrimeScript RT reagent Kit, Takara RR037A 等)]、
[Quick Taq HS Dymix Toyobo
DTM-101 または類似品(PerfectShot Ex Taq, Takara RR005A 等)]、2019-nCoV 特異的プ
ラ イ マ ー 、 Oligo(dT)12–18 Primer (Thermo, 18418012 ま た は 類 似 品 ) 、 Random
Hexamers (Thermo, N8080127、または類似品。特に指定はない)、Recombinant RNase
Inhibitor (Takara-Bio, 2313A、または類似品)、ゲル精製キット(Wizard SV Gel and PCR
Clean-UpSystem, Promega A9281、または類似品)、DDW。
No.

Namedirection

sequence (5' to 3')

Expectedsize (bp)

ORF1a セット①

1st

NIID_WH-1_F501

Sense

TTCGGATGCTCGAACTGCACC②

1stNIID_WH-1_R913

Antisense

CTTTACCAGCACGTGCTAGAAGG③2nd

NIID_WH-1_F509

Sense

CTCGAACTGCACCTCATGG④2nd

NIID_WH-1_R854

Antisense

CAGAAGTTGTTATCGACATAGC⑤Seq

NIID_WH-1_Seq_F519

Sense

ACCTCATGGTCATGTTATGG⑥Seq

NIID_WH-1_Seq_R840

Antisense

GACATAGCGAGTGTATGCC

413346

S セット
⑦

1st

WuhanCoV-spk1-f

Sense

TTGGCAAAATTCAAGACTCACTTT⑧

1stWuhanCoV-spk2-r

Antisense

TGTGGTTCATAAAAATTCCTTTGTG⑨2nd

NIID_WH-1_F24381

Sense

TCAAGACTCACTTTCTTCCAC⑩2nd

NIID_WH-1_R24873

Antisense

ATTTGAAACAAAGACACCTTCAC⑪SeqNIID_WH-1_Seq_F24383

Sense

AAGACTCACTTTCTTCCACAG⑫Seq

NIID_WH-1_Seq_R24865

Antisense

CAAAGACACCTTCACGAGG

プライマー位置模式図

45474933.2 1st strand cDNA の合成

1) 陽性コントロールは ORF1a セット、S セットそれぞれ専用のものを用いる。105/µlに希釈された陽性コントロール RNA 10µl に DDW を 990µl 添加する。
2) 1)の陽性コントロール RNA 5µl に等量の DDW を加えて 10µl とし、以下に用いる(5000 コピーを用いる)。
3) 抽出された RNA 液および陽性コントロール RNA を用いて、表に示した反応液を調製し、0.2ml チューブに入れる
表 1 逆転写反応液の調製
5×SSIV Buffer

5 µl

Random Hexamers

1 µl

Oligo(dT)12–18 Primer

1 µl

dNTP (2mM each)

5 µl

100 mM DTT

1 µl

Recombinant RNase Inhibitor

1 µl

SuperScript IV Reverse Transcriptase 1 µl
RNA10 µl

Total25 µl4) サーマルサイクラーにて以下のプログラムで反応させる。
23℃

10 min50℃

10 min80℃

10 min5) 反応後、35µl の DDW を添加して希釈し、次の PCR 反応に用いる。
3.3 1st PCR 反応

1) 以下のように反応液を調整する。

52×Quick Taq HS DyeMix

25 µl

Forward primer (50µM)

0.4µl

Reverse primer (50µM)

0.4 µl

DDW

19.2 µl

cDNA

5 µl

Total

50 µl

ORF1a セットでは①NIID_WH-1_F501 および②NIID_WH-1_R913
S セットでは⑦WuhanCoV-spk1-f および⑧WuhanCoV-spk2-rを用いる。
2) 陰性対照として DDW 5µl を用いる。
3) 反応条件を以下のように設定し、PCR 反応を行う。
94℃

1 min

94℃

30 sec56℃

30 sec

68℃

1 min

68℃

5 min

40 サイクル3.4 2nd PCR 反応

1) 以下のように反応液を調整する。
2×Quick Taq HS DyeMix

25 µl

Forward primer (50µM)

0.4µl

Reverse primer (50µM)

0.4 µl

DDW

23.2 µl

1st PCR 反応液

1 µl

Total

50 µl

ORF1a セットでは③NIID_WH-1_F509 および④NIID_WH-1_R854
S セットでは⑨NIID_WH-1_F24381 および⑩NIID_WH-1_R24873
を用いる。
2) 陰性対照として DDW 1µl を用いる。
陰性対照の 1stPCR 産物を 1µl 用いても構わない。
どちらでも非特異増幅が起きないことは確認済みである。
3) 反応条件を以下のように設定し、PCR 反応を行う。
94℃

1 min

94℃

30 sec56℃

30 sec68℃

1 min

40 サイクル

668℃

5 min

4) 反応終了後、1stPCR、2ndPCR 反応液ともに 5uL の増幅産物を用いて 2％アガロースゲ
ル(アガロース ME, 岩井化学または同等品)で TAE バッファー(ニッポンジーンなど)電気泳動し、エチジウムブロマイド(または代用品)による染色後、バンドの有無について確認を行う。1stPCR 終了後に 1st PCR のみの電気泳動を行っても構わない。泳動に際し、必ずマーカーを置き、バンドサイズの確認ができるようにする。2～4％のアガロースゲ
ルを用いることを推奨するが、他濃度でもバンドサイズの確認ができるようであれば用いて構わない。
陽性コントロールの増幅サイズは以下のとおりである。
ORF１a セット 1stPCR292bp

2ndPCR 261bp
S セット

1stPCR 329bp
2ndPCR 294bp5) 陽性コントロールでバンドが検出され、陰性コントロールで検出されないときに試験成立とする。2nd PCR で目的のサイズに近い大きさのバンドが検出された場合は陽性とする。されなければ陰性とする。Nested RT-PCR においてはバンドが確認されれば陽性と考えることができるが、各施設における 1 例目の検出においては、シークエンス解析を行う事を推奨する。増幅産物から 2019-nCoV 配列が確認されれば 2 例目からはシークエンス解析を行わなくてもよい。
3.5．(シークエンス解析を行う場合)PCR 産物のクリーンアップ

PCR 産物のクリーンアップをしたのち、シークエンス解析を行う。例として Wizard SV
Gel and PCR Clean-Up System を使用したものを示す。なお、他のクリーンナップ（Agencourt AMPure XP 等）を使用してもよい。
1) 残りの PCR 産物(45µl)を PCR 産物と等量（45ul）の Membrane Binding Solutionと混合する。
2) SV minicolumn を Collection tube に挿入し、１）をアプライし、室温で 1 分間培養し、16,000 ×g で 1 分遠心する。
3) Collection tube 中の廃液を捨て、SV minicolumn を戻し、エタノール添加済みのMembrane Wash Solution を 700µl アプライし、16,000 ×g で 1 分遠心する。
4)

Collection tube 中の廃液を捨て、SV minicolumn を戻し、エタノール添加済みのMembrane Wash Solution を 500μl アプライし、16,000 ×g で 5 分遠心する。

5)

Collection tube 中の廃液を捨て、SV minicolumn を戻し、16,000 ×g で 1 分遠心する。

76) SV minicolumn を 1.5ml チューブに挿入し、30µl の TE バッファー(あるいは DDW)をアプライし、室温で 1 分間培養し、16,000 ×g で 1 分遠心する。溶出液をシークエンス解析に用いる。
3.6. (シークエンス解析を行う場合)シークエンス解析

ORF1a セットでは⑤NIID_WH-1_Seq_F519 および⑥NIID_WH-1_Seq_R840
S セットでは⑪NIID_WH-1_Seq_F24383 および⑫NIID_WH-1_Seq_R24865
を用いてサイクルシークエンス反応を行い、定法通りにシークエンス解析を行う。
配列が得られたら Blast 解析等を行い、MN908947 の配列と比較し、ほぼ一致(おおむね95％以上)するようであれば陽性とする。一致しない場合、ヒト染色体配列など明らかに2019-nCoV と異なる配列であった場合は陰性とする。シークエンス解析で波形が重なるなどして明瞭な配列が得られなかった場合、シークエンサーのメンテナンス状況を考慮したうえで、シークエンス解析をサイクルシークエンスから改めて行う。2 回目の解析でも明瞭な配列が得られない場合は、なんらかの非特異増幅である可能性が高いと考えられるため、陰性とする。
・ORF1a セット、S セットのどちらか一方で 2019-nCoV 配列が確認できれば陽性と判断する。
4. TaqMan プローブを用いた one-step RT-PCR 法を用いる場合

4.1. 機材および試薬
マイクロピペット（10、20、200、1000μl）、DDW、滅菌微量遠心チューブ（1.5ml）、96well
リアルタイム PCR 反応プレート等、8 連ストリップキャップまたはプレートシール、リア
ルタイム PCR 装置、プライマー、TaqMan プローブ、QuantiTect® Probe RT-PCR Kit (QIAGEN
Cat#204443) [AgPath-ID One-step RT-PCR Reagents (Thermo Cat# AM1005)、TaqMan Fast Virus
1-Step Master Mix (Thermo Cat＃4,444,432)等での動作確認報告有]

4.2. リアルタイム RT-PCR 用プライマーおよびプローブについて
N セットNameSequence (5’ to 3’)

Position*Concentration①

N_Sarbeco_F1

CACATTGGCACCCGCAATC

28723-28741

600nM

②

N_Sarbeco_R1

GAGGAACGAGAAGAGGCTTG
FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BHQ
N_Sarbeco_P1(または QSY**)
増幅産物の長さ 128bp

28850-28831

800nM

28770-28794

200nM

③

参照：
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-v1991527e512

82341d99287a1b17c111902.pdf?sfvrsn=d381fc88_2
N セット No.2 (N2 セット)

Sequence (5’ to 3’)

Position*

Concentration

AAATTTTGGGGACCAGGAAC

29142-29161

500nM

29299-29280

700nM⑥ NIID_2019-nCOV_N_P2 FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-BHQ(ま 29239-29258

200nM

Name
④ NIID_2019-nCOV_N_F2⑤ NIID_2019-nCOV_N_R2 TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC***
たは QSY**)
増幅産物の長さ 158bp*:Position は Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1
MN908947.1 由来である。
**: TAMRA でも動作確認済み。
***：Ver3 配列とミスマッチがあるが、ウイルス RNA の検出感度に影響がないことを確認済み。

4.3. リアルタイム one-step RT-PCR(TaqMan プローブ法)反応

QIAGEN 社の QuantiTect® Probe RT-PCR kit を用いた反応条件を示した。詳細はキットに添付のマニュアルを参照すること。なお、試薬等の分注操作は全て氷上にて行う。
反応プレートの準備と解析

1) 陽性コントロールは N セット用、N2 セット用それぞれ専用のものを用いる。105/μlに希釈された陽性コントロール RNA 10μl に DDW を 990μl 添加する。陽性コントロー
ル用 RNA は、実験室内コンタミネーションを起こした場合に、判別可能な外来塩基配列 (BamH I サイトおよび H5 陽性コントロールチェック用の配列)を挿入してあるので、所定のコントロールを必ず用いる。
2) 1)の陽性コントロール RNA 10µl に 90µl の DDW を加えて 100µl とし、以下に用いる(100 コピー/µl)。
陽性コントロール用 RNA は、実験室内コンタミネーションを起こした場合に、判別可能な外来塩基配列（BamH I サイトおよび H5 陽性コントロールチェック用の配列)を挿入してあるので、所定のコントロールを必ず用いる。
(尚、陽性コントロールは段階希釈して用いても構わない。その場合は 5×103/5µl から 5×100/5µl コピーまで 10 倍階段希釈して用いる。)

93) RNA 抽出を行ったサンプルを用いて、表に示した反応液を調製する。
表 1 リアルタイム RT-PCR 反応液の調製
N セット

N2 セット2×Master mix

10.0 µl10.0 µl

Forward primer (10µM)

1.2 µl

1.0 µlReverse primer (10µM)

1.6 µl

1.4 µlTaqMan probe (5µM)

0.8 µl

0.8 µlQuantitect RT mix

0.2 µl

0.2 µlDDW

1.2 µl

1.6 µlTemplate RNA

5 µl

5 µl

Assay

Absolute Quantification (Standard Curve)

Run ModeStandard 7500

Total

20 µl

20 µl

プライマー・プローブはあらかじめ混合して mix`を作製し、－30 度に保存して置いて構わない。
4) プレートあるいは 8 連チューブのウェルに 15µl ずつ反応液を入れる。陰性コントロー
ルを 5uL ずつ 2 ウェルに添加し、ハサミでカットしてシールする。
5) RNA を 5µl ずつ 2 ウェルに加えて、ハサミでカットしてシールをする。
6) 陽性コントロール RNA を 5µl ずつ 2 ウェルに加えて残りのシールを貼る。(段階希釈したものを用いる場合は濃度の薄いものからウェルに添加してシールする。)
7) 反応条件を以下のように設定して反応を開始する。
＜反応条件＞
使用するリアルタイム PCR 装置、試薬および反応容器等によって、最適な反応条件は異なるので、必ず事前に検出感度等の確認をしておく。以下に、試薬に QIAGEN 社
QuantiTect® Probe RT-PCR Kit、リアルタイム PCR 装置に Applied Biosystems 社 AppliedBiosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システムもしくは Roche Diagnostics 社 LightCycler
480 (または 480II、96)を使用する場合の反応条件を示した。

Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システムを使用する場合
機器の設定は以下の通り

10

Repoter

FAM

Quencher

None(Standard モードで使用)
50℃30min.
↓95℃15min.
↓95℃

15sec.

60℃

60sec.(Data Collection)

×45 cycles

LightCycler 480 II (480、96)を使用する場合
Analysis ModeCycle

Temperature
(℃)

Ramp
TimeRate( ℃/sec)

Acquisition
ModeRT

None

15030min.

4.4

None

DenatureNone

19515min.

4.4

None

PCR

Quantification

459515sec.

4.4

None

6060sec.

2.2

SingleCoolingNone

4030sec.

4.4*

None

*:Cooling の Ramp Rate は機器の上限値でよい。
8) 陽性コントロールの増幅曲線の立ち上りが 40 サイクル以内にみられ、かつ陰性コントロールの増幅曲線の立ち上がりが見られないときに試験が成立するとみなす。検体において、どちらか 1 方あるいは両方のプローブセットについて、2 つのウェルのうち、一方あるいは両方で 40 サイクル以内に増幅曲線の立ちあがりが見られた場合に陽性とみなす。
40 サイクル以内に増幅曲線の立ち上がりがない場合は陰性とする。2nd derivative 法による自動判定などでは曲線が見られなくとも陽性と判断される場合がある。必ず増幅曲線、曲線の立ち上がりについてコントロールのものと比較して確認する。
5. 問い合わせ先

・技術情報および陽性コントロールについての問合せは、国立感染症研究所にご相談いただくようお願い致します。
・ 国立感染症研究所ウイルス第三部

11〒208-0011 東京都武蔵村山市学園 4-7-1
E-mail:info-nCoV@nih.go.jp

執筆者一覧
白戸憲也 直亨則 松山州徳 竹田誠 (国立感染症研究所ウイルス第三部)
調恒明（山口県環境保健センター）
四宮博人（愛媛県立衛生環境研究所）

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