「マーカー利用選抜による気候変動に適応した菌床栽培用シイタケ品種の開発」

研究開発法人 森林研究・整備機構
森林総合研究所 九州支所
森林微生物管理研究グループ 宮崎和弘

研究の背景気候変動がシイタケ菌床栽培へ与える影響
・空調コストの増大
・シイタケの収穫量の減少
・病害リスクの高まり

生産者の経営を圧迫

地球温暖化

現在

将来

想定される対応策

気候変動に適応した新品種*を開発 し、現場に普及する。
（* 高温環境下でも安定的に子実体が発生する品種を想定）

本日の発表に関連する事業
農林水産業・食品産業科学技術研究推進事業「シイタケの高温発生品種を効率的に作出するための技術開発（課題番号：２３０５１）」
研究期間：平成23年度～25年度
イノベーション創出強化研究推進事業「マーカー利用選抜による気候変動に適応した菌床栽培用シイタケ品種の開発（課題番号：２８０３４Ｃ）」
研究期間：平成28年度～令和２年度

コンソーシアムの構成
イノベーション創出強化研究推進事業「マーカー利用選抜による気候変動に適応した菌床栽培用シイタケ品種の開発」

シイタケ品種共同研究機関コンソーシアム（研究総括：森林総合研究所）

テーマ：シイタケゲノムデータの整備 （担当：森林総合研究所、岩手生

テーマ：関連する遺伝領域の特定 （担当：森林総合研究所、岩手生物物工学研究センター、秋田県立大学）

工学研究センター、秋田県立大学）

テーマ：選抜用マーカーの開発

テーマ：新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜 （担当：森林総合（担当：森林総合研究所）

研究所、大分県、株式会社北研）

アドバイザー
鳥取大学

コーディネーター
九州バイオリサーチネット

シイタケゲノムデータの整備
ゲノムデータの整備の必要性：
育種の効率化を図るためには、目的の形質を制御する遺伝子、もしくは遺伝子の存在する遺伝領域を特定し、選抜に応用することが求められる。より詳細なゲノムデータがあれば、関連する遺伝領域の特定が容易になることから、シイタケのゲノムデータの整備を行った。

シイタケゲノムデータの整備
岩手生工研
de novoアッセンブル
情報統合

gap配列シークエンス

連鎖地図作製
配列情報提供RAD-seq
連鎖解析
森林総研

BACライブラリー構築
BACライブラリーシークエンス
秋田県立大シイタケゲノムデータの整備
コンティグ（contig）の作成
ゲノムDNA
ライブラリー
調製

シークエンスアッセンブルcontig

シイタケゲノムデータの整備
スキャフォールド（scaffold）化
contig~10kbp
メイトペアライブラリ
NNNNNN~10kbp
NNNNNN
NNNNNNNNN

NNNNNNNNN
ギャップ
G408PP-4株で10kbライブラリーのシークエンス完了

scaffold

シイタケゲノムデータの整備
RAD-seq法による高密度連鎖地図の作成

シイタケゲノムデータの整備
高密度連鎖地図の作成●AntMapを用いて連鎖地図を作成した。

シイタケゲノムデータの整備
高密度連鎖地図の成果
Group1
Group2
Group3
Group4Group5Group6Group7Group8Group9Group10
total

new map
No. markers Length(cM)81194.1959151.11
58
141.1957
132.12
86122.7266
105.5933
83.17
32
132.9655
102.35
76
93.75
603

1259.15

Group1Group2Group3Group4Group5Group6Group7Group8Group9Group10Group11

former map
No. markers Length(cM)
23152.46
15111.56
20111.56
1785.512288.57
2184.191465.68
1168.33
1257.53
1033.66
825.68173884.73→ 以前のmapのGroup10、11がひとつの連鎖群（Group10）にまとまり、合計10連鎖群になった。
→ 報告されたゲノム情報はアッセンブルエラーが多いことが示唆された

シイタケゲノムデータの整備
連鎖解析によるスキャフォールドの整列
linkage
SS_scaffold SS_scaffold長 group
Distance (cM)
scaffold12122448
110.0
scaffold62108732117.5
scaffold113
201897120.0
scaffold113
121.9
scaffold1
306651
126.0
scaffold139135656143.0
scaffold139
146.3
scaffold33
130516146.3
scaffold78
170081156
scaffold35
101460161.7
scaffold3
170064161.7
scaffold18
111532170
scaffold362
34848
175.1
scaffold49
202290175.1
scaffold208
8649
175.1
scaffold49
202290175.1
scaffold14
206222180.0
scaffold14
206222182
scaffold293
46747
190.5
scaffold58
78589
1130.4scaffold90

1350181144

scaffold12

scaffold62

scaffold113

scaffold12

scaffold62

scaffold113

低密度の連鎖地図だと、並びは分かってもスキャフォールドの向きを決定することが出来ない

RAD-seqにより高密度の連鎖地図データを得る

シイタケゲノムデータの整備
SS_scaffol SS_scaffold linkage Distanced
長group (cM)
scaffold12122448110.0
scaffold62108732117.5
scaffold113
201897120.0
scaffold113
1
21.9
scaffold13
9135656
143.0
scaffold139146.3
scaffold33
1305161
46.3
scaffold78
1700811
56
scaffold35
101460161.7
scaffold3
1700641
61.7
scaffold18
111532
1
70
scaffold36
2
34848
175.1
scaffold49
202290175.1
scaffold20
88649
175.1
scaffold49
202290175.1
scaffold14
206222180.0
scaffold14
206222
182
scaffold29
346747190.5
scaffold58
78589
1130.4scaffold90135018

1144

高密度の連鎖地図を利用することでスキャフォー
ルドの方向が決まる

scaffold113

scaffold139

方向が決まる

scaffold33
方向が決まらないシイタケゲノムデータの整備
BACライブラリーの利用
Scaffold

フォスミド ベクター
F因子由来の複製開始点を持ちかつ、cos配列を持つベクター

ギャップの両端を持つBAC
ライブラリーのシークエンス（ギャップクロージング）

完全配列シイタケゲノムデータの整備
scaffold整列化の結果
連鎖群

Scaffold数

方向性の決まったscaffold数

塩基長LG11513

6.2Mb

LG21414

4.5Mb

LG31818

5.2Mb

LG41414

3.9Mb

LG51515

5.2Mb

LG61615

4.1Mb

LG755

1.8Mb

LG877

2.0Mb

LG914143.6Mb

LG1021185.8Mb

Mitochondria

1-116kb

unmapped70-2.4Mb

シイタケゲノムデータの整備関連する遺伝領域の特定

MCR 487

高温菌（KRCF 1097）と低温菌（KRCF 1101）の交雑株MCR 487の子実体発生連鎖地図の作成へ
単胞子分離菌株集団（一核菌糸）
テスター株（KRCF 1098SS-2）と交配させ、二核菌糸とする交配菌株集団（二核菌糸）

小型菌床を用いた発生温度特性の評価試験へ関連する遺伝領域の特定

連鎖地図の作成
菌株：最終的に評価結果の得られた98の交配菌株に対応する単胞子分離菌株を解析
SNP解析方法：RAD-seq法により得られたSNPの98菌株間での分離データを使用した。
連鎖解析：AntMap（http://lbm.ab.a.u-tokyo.ac.jp/~iwata/antmap/）
参照用シイタケゲノム配列： all_LG190214.fasta

総マーカー数：1347連鎖群数: 15
総長： 846.5 cM

関連する遺伝領域の特定
小型菌床による栽培試験条件
１．培地条件（１）培地基材
広葉樹オガ粉：コットンハル＝50：50(容積比）（２）栄養体米ぬか：フスマ＝50：50(容積比)※ 培地基材の15％(容積比)（３）殺 菌：118℃ 30分（４）含水率：65％（５）培地量：80ml（40ｇ）

２．培養条件
１次培養：18℃ 4週間 全暗黒
２次培養：22℃ 4週間 明暗12時間交互関連する遺伝領域の特定
３．発生条件（１）温度条件： 22℃・18℃・14℃・10℃（QTL解析用菌株の温度特性評価）（２）光 条 件： 明暗12時間交互

４．発生処理方法
１回目：培養期間終了後袋内で培地を反転￬ 3週間（発生調査）
２回目：発生温度と同じ温度の水で24時間浸水処理￬ 3週間（発生調査）
３回目：２回目と同様の浸水処理￬ 3週間（発生調査）
廃棄関連する遺伝領域の特定

Ⅱ. 判定方法① 発生が見られた温度により高温性～低温性を判定
22℃：4、18℃：3、14℃:2、10℃：1※ 複数の発生処理回数で発生が見られた場合には、より早い処理回数の発生処理温度により判定する。
※ 同一の発生処理回数で、複数の温度で発生が見られた場合には、高い方の発生処理温度により判定する。

関連する遺伝領域の特定
小スケール培地

菌株名
H608
（高温）
K115
（低温）

処理発生野帳22℃①②9/26 ○10/16 ○

14℃

10℃

④①②③

④

①②③

④

①②③

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

4○

2

○

④

9/5
9/26

○

○

10/16

○
○

10/3 ○
10/24

○
○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○○○○○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

○

9/12923評価

11/7

9/12 ○
919

③18℃

10/3
10/24

○
○

○

○
○

○

○

○

○

○

○

4

1

関連する遺伝領域の特定
98菌株の評価結果（試験回数1～4回、複数の結果が得られた菌株は平均値）とRAD-seq法で得られたSNPの分離パターンのデータから、QTL解析（統計ソフトRのパッケージ｢qtl｣を使用）を行った。

関連する遺伝領域の特定各温度条件下（22, 18, 14, 10℃）で、１回目に子実体発生した菌床個数をもとにした主成分分析

22, 18℃の発生菌床数の多いグループ

各温度条件下（22, 18, 14, 10℃）で、1, 2, 3回までの子実体発生した菌床個数の総計をもとにした主成分分析

22, 18℃の発生菌床数の多いグループ22, 18℃で発生していないグループ
10, 14, 18度で発生するグループ

関連する遺伝領域の特定
１回目発生の主成分分析の座標位置（PC1-3）をもとにしたQTL解析

１〜３回までの発生の主成分分析の座標位置（PC1）をもとにしたQTL解析

選抜用マーカーの開発検出されたQTLの遺伝領域をゲノムデータと照合し特定し、親株に使用した一核菌糸菌株の間に存在するSNPを利用して、選抜用マーカーを設計した。M 1 2 3 4 5 6 7 8
M: 100 bp ラダーマーカー
1: KRCF1097PP-1 (高温株)
2: KRCF1101PP-10 (低温株）
3: MCR487SS-5
4: MCR487SS-13
5: MCR487SS-20
6: MCR487SS-27
7: MCR487SS-35
8: MCR487SS-37

LG3-scaffold08に検出されたQTLに対応するよう設計した選抜用マーカーによる増幅結果

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜選抜までの流れ
１．育種母材からの単胞子分離
２．選抜用マーカーを利用した選抜
３．交配菌株の作出
４．対峙培養試験による耐病性検定
５．ミニ菌床による選抜
６．栽培試験（１回目）
７．栽培試験（２回目）

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜

育種母材品種の選定
北研
608号
73号
607号
603号
715号
71号
57号

森産業
XR-1
KV-92
5K-16

菌興
697号
702号

キノックス
S10号
S055号

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜対峙培養試験による耐病性検定

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜
耐病性が高い場合耐病性が低い場合

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜
小型菌床による選抜試験
北研 73号

26℃

24℃

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜
小型菌床による選抜試験
MCR 2065
24℃

MCR 2066
24℃

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜
シャーレ菌作製

培地作製～培養
21±1℃
接種

20℃・30日培養→30日保管

評価・選抜
温度特性
菌床状態
収量性
きのこ品質

90、120日間（菌株によって）きのこ発生（全面、3回）
初回 ：17℃・14日間
二回～：22℃と28℃変温・14日間
休 養：22℃と28℃変温・7日間
発 茸：浸水新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜管理ステージ

管理温度

内容

初回発生
14日間

17℃一定

栽培性能（菌床仕上がり状態、きのこ形質など）を評価

休養管理
7日間

昼28℃(12h)→
夜22℃(12h)の変温サイクル

高温条件下で原基形成を行う

発芽刺激
6時間

22℃

22℃の水に水没させる事
で発芽刺激を与える

2回目発生

昼28℃(12h)→
夜22℃(12h)の変温サイクル

高温発生特性を評価

新規交配菌株の作出と有望菌株の選抜

初回発生

3回目発生

今後の予定最終選抜に残った有望菌株の品種登録に向けて試験を継続

高温特性の評価
2021年 実用化上の課題洗い出し
実用化課題の検証
2022年 実用化の可否判断
実用化「可能」の場合、2023年 品種登録データの取得
2024年 品種登録出願

謝辞本研究は、農研機構生研支援センター「イノベーション創出強化研究推進事業」の支援を受けて行いました。
本研究の実施にあたり、ご協力いただいた関係者の皆様に感謝申し上げます