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浦 上 財団 研 究報 告書Vol.8(2000)

内分泌障害抑制作用 (抗環境 ホルモ ン作 用)を 持 つ
機能性食品の開発
横田

2.実

験 方 法

様々 な形 で環境 中に放出 され る種 々 の合成化 合

2.1細胞 系及 び培養

物 が,人 間 を含 む多様 な生 物 に対 して極 めて重 大MCF‑7細1.はじ め に一成(島 根大学生物資源科学部教授)

胞:転 移性乳 癌患 者 の胸水 浸 出細胞な内分 泌障害(環 境 ホル モン作用)を 引 き起 こしか ら樹立 され た ヒ トの乳腺上 皮由来 の癌細 胞株 で,っっ ある ことが近年 指摘 されて きてお り,こ の障

エス トロゲ ン受容体 の発現 レベル が高 く,エ ス ト

害の防 止 は,そ の発 生機構 の解明 と共 に,緊 急 のロゲ ン投 与 によ り,プ ロゲ ステ ロン受容体,プ ラ

最重 要課 題 の一 つ とな って い る1・2)。
一方,こ のス ミノー ゲ ンア クチベ ー ター,52kDaのよ うな合成化 合物以 外 に,天 然の化 合物,さ らに白質等 を発現 す る。

は 日常 の食材 に本来 含 まれ る化合物 の 中に も,内フ ェノール レ ッ ドを含む ダルベ コの変 法Eagle

分泌 障害作 用 を持 つ ものが 発見 され て きてい る3>。 培 地(DMEM)に,最しか しな が ら,外 来の 内分泌障 害性物 質に よ り分泌蛋

終 濃度10%の 仔 ウ シ胎児

血 清(FCS),3mg/500mlの

引 き起 こ され る とされ る障 害の多 くは,近 年 にな100units/mlのイ ン シ ュ リ ン,ペニ シ リ ン/ス トレプ トマ イ シって顕在 化 して きた もので あ り,こ れ は,伝 統 的ン,1%(v/v)の非 必 須 ア ミノ 酸 を 添 加 し,

食 材 は,内 分 泌障害性 物質 に加 えてそ の作用 を阻5%CO、,95%空気 及び湿 度100%の止 す る成 分,い わ ば内分泌 障害抑制 性物 質を も含37℃ で培 養 した。実験 を行 う前 に,こ の フェ ノー

条件 下で,むが,そ の効 果が近 年激増 した合成 化合物 に よ り

ル レッ ドを含 む継代培 地 を除 き,カ ル シウム/マ

凌 駕 されつ つあ るため とも考 えられ る。従 って,グ ネ シ ウム を 含 ま な い リ ン酸 緩衝 生 理食 塩 水

食 品 に含 まれ る内分 泌障害 性及 び障害抑制 性 の両(PBS)で 細 胞 を洗浄 し,0.1%ト物 質 に関す る詳細 な情 報 を活用す れば,現 実的 に%EDTAをは避 け難 い合 成化合 物へ の暴露 による 内分泌障 害

た後,細 胞の 濃度 を測定 した。 フェノー ル レッ ド

リプ シン と0.2

含 む混 合液 で処理 して細 胞 を懸濁 しを,日 常の食 生活 の中で安 全かっ安 価 に制 御 ・防を含 まず,か つ活性炭 処理 した血清 を添加 した培

止で きる ような機能 を もつ 食品 を創 製 しうる こ と地 に,2〜3×105/mlのが期待 され る。

懸濁 し,48時 間培養 して,付 着 させ た。被 検物 質

この よ うな新規食 品機能 の開拓 をね らい,本 研
究で は,内 分 泌障害性 及び 障害抑制 性の両 作用 を
簡 便で短 期 に検 出で きる短期 検出 系の構築 と,それに よる食品 由来の 活性因 子の解析 を試 みた。

を添加 し,6日

濃度 とな るよ うに細胞 を間培 養 した後,種 々 の分析 を行 った。
2.2MCF‑7細胞 の 全RNAの調 製 とcDNAの合 成
60‑mmディッシ ュに培 養 したMCF‑7細胞を

エス トラジオ ール または ゲニステ イン単独,あ る29

内分泌障害抑制作用(抗環境ホルモン作用)を 持つ機能性食品の開発
いは両者 を合 わせ て処理 した後,グ アニ ジ ンイソ
チオ シア ネー トとR一メルカ プ トエタ ノー ル を含む破 砕 用 緩 衝 液 を 用 い るRNeasyMiniKit(QIAGEN)によ り,全RNAを件 を確立 す るこ とが で きた。
本 系で,培 地 に エス トラジオ ー ル(1nM)を添 加す る と,何 も添加 しな い場 合及 び溶媒 であ る

高 い効 率及 び 純

エタ ノール を添 加 した 場合 に比 し,有 意に細胞 の度 で 精製 した 。1枚 の デ ィ ッシ ュか ら,15〜60増 殖が 引 き起 こされ,こ れ は既 に報告 され てい るμgの 全RNAがMCF‑7の得 ら れた。1.2μgの 全RNAを鋳 型 と し,oligo(dT)、z‐iaプ ラ イ マ ー 及 びSuperScriptII逆いてcDNAを2.3各

転写 酵素(GIBCOBRL)を分泌 障害性 ・障 害抑制 性因 子 に よる遺用調製 した。

種mRNAの挙動 と一致 する ものであ った4・5)。

3.2内伝子 変動 の解 析エ ス トラ ジオール及 び大豆 に含 まれ る植物 エス

検出

トロゲ ンであ るゲニス テイ ンを,そ れ ぞれ単独 あ

各種 の薬剤処 理 において発 現の変 動が少 ない ハ

るい は組 み合 わせてMCF‑7細胞 に投与 して培 養

ウスキ ー ピング遺伝子 として,グ リセル アルデ ヒ

した後,各 デ ィ ッシュか ら全RNAを

ドー3一リン酸脱 水 素酵 素(GAPDH)を

内部 標準の 一定量 を用 いてcDNAを

遺 伝子 と して用 い た。 このGAPDHに加 え,マ先 ず,ハウ ス キ ー ピ ン グ 遺 伝 子 と し て,

トリッ クス メ タロ プロ テア ーゼ ー9(MMP‑9),

GAPDHのペ ル オ キ シソ ー ム増 殖 因 子 応答 性 レ セ プ タ ー

マ ー及 びTaKaRaTaqDNAポ(PPARγ1及 びPPARγ2)にー(表1)を 用 い,MCF‑7細い,94°C/2分(1サ製 した1本 鎖cDNAを連 鎖 反応(PCR)を

特異 的 な プ ラ イ マ
胞の 全RNAよ表1各

検 出 を試 み た。表1に 示 した プ ライ
リメラーゼ を用

種PCR検イ ク ル):94℃/1分,
出反応 に用いたプライマーの塩基配列

鋳 型 として ポ リメ ラー ゼ
行 った 。TaqDNAポ

ラー ゼ に は,通 常 のTaqDNAポ(TaKaRa),まり調精 製 し,そ調 製 した。

た は,TaqDNAポにPyrococcusspeciesGB‑D耐リメ

リメ ラ ー ゼ
リメ ラ ー ゼ
熱 性DNAポリ

メラーゼ を加 える ことでヌ クレオチ ドの取込 み ミ
スを校正 する機能 を持 たせたELONGase酵ックス(GIBCOBRL)を3.結素ミ用い た。

果 と考察

3.1内分 泌障 害性 ・障害 抑制 性 因子 の検 出系の構築

MCF‑7細胞 は,血 清等 に含 まれ る微量 の エ ス

60°C/1分,72°C/1分(35サ10分(1サイ クル):72℃/°イ クル)の 温 度制御 条件 でPCRを行った。 その結果,い ず れの処理 を受 けた細胞 におい て も,明 確 に特異 的 な増幅 産 物 が検 出 され た(図1)。 伸長 反応 の サ イクル 数 を種 々変化 させて,GAPDHcDNAの増 幅 を 精 査 した と ころ,トロゲ ン関 連物質 の影響 を敏感 に受 けるた め,血そ の発現量 は,今 回の各 処理 において ほぼ一定 で清 を活性 炭で処 理 した後 に培 養 に供 した4)。しかあ る ことが 確認 された。

しなが ら,こ の処 理条件 は極 めてデ リケー トで,次 ぎに,MMP‑9の検 出を試 みた。MMP‑9は,活性 炭の多寡 が細胞 の増 殖効率 に大 き く影響 した、IV型 コラ ゲナー ゼ またはゼ ラチ ナー ゼBと も呼数度 にわた る試行錯 誤 の結果,ほ ぼ適切 な培 養条

ば れ,癌 細 胞 の転移性 と密 接 に関 わ ってい る6)。

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浦 上財 団研 究 報告 書Vo1.8(2000)

子 の発現量 はやや 増大 する一方,ゲ ニ ステ イン処理 は逆 に減 少 させ,ま た これ はエス トラジ オールの効果 を打 ち消 すよ うに も思 われた。 ゲニ ステインは,大 豆の主 要な イソフ ラボンで,代 表的 な植物 エス トロゲ ンの一種 であ るが,こ の位置 づけ は,主に,エ ス トロゲ ンレセプ ターに対 する結合 能 に基 づ いた もの であ る7)。ゲ ニ ステイ ンがMMP‑9
遺 伝子 の発現 を抑 制す る との作用 は,エ ス トラ ジ
図1PCRによるGAPDHのオール とは全 く異な り,本 イソ フラボン を含 む食検出用植物,あ るいはそ れを用 いた種々 の伝統 的食品

内分泌修飾因 子で処理 したMCF‑7細 胞全RNAから調製 したcDNAを 鋳型 として,GAPDH遺伝子の発現 をPCRに て検出 した。
1薬 剤及び溶媒処理が,未 だ解明 されて いない未 知の多様 な有 益効果を有す る ことを強 く示 唆す る。

2° エ タ ノー ル(1.6μ1/m1)
3:エス トラ ジ オ ー ル(1nM)

4:ゲ

ニ ステ イ ン(20μg/ml)

5:エス トラ ジ オ ー ル+ゲ

M200‑bラダー

3.3MCF‑7細胞 におけ るPPARγの 発現

ペ ルオ キ シ ソーム増 殖 因子 応答 性 レセ プ タ ーニステイン(PPAR)は,種々 の脂 溶性 化合 物 と結 合 して,内分泌 の撹 乱 と癌転 移 との関係 は未 だ不明な と こ

多様 な遺伝子 の発現 を調節 する核 内レセ プター でろ も多いが,本 研 究で構 築 したMCF‑7細あ る。α,δ,及 び γの 各サ ブ タイプ が,さ らに,胞 を用いた試 験系 は,そ の ような観点 か らの解 析 も可能

PPARγで ある。MMP‑9のイ ソ マ ー が,そ れ ぞ れ 同 定 さ れ て お り,各

検出 には,TaqDNAポ

ラーゼ を用 い,94℃/2分(1サイク ル):94°C/1分,55℃/1分,72℃/1分(25〜35サル):72°C/10分(1サでPCRをリメ

イクイ クル)の 温 度制 御条 件行 った。図2に 示 す よ うに,約550bpの特 異的生 成物 を検出 する こ とがで きた。
このMMP‑9遺びPPARγ2の2種

伝のア

ブタ イプ 及び ア イ ソマー は それ ぞれ異な る 組 織 分 布 を 示 す。MCF‑7細胞 で は,PPARγサ ブタイ プが検 出 され てい るが8),そ れが,1及び2の いずれの アイ ソマーで あるか の明

確 な報告 は ない。今 回,先 ず,MCF‑7細伝 子の発 現量 を詳細 に検討 した

結果,エ ス トラジオー ル処理 に よ りMMP‑9遺PPARサに はPPARγ1及胞 におけるPPAR,1及び γ2の特 異的 な検 出 を試 み た。

PPAR,1は,N末端側28ア ミノ酸領域 が欠 失 した

もの で あ る が,組 織 分 布 は両 者 で 異 な っ て いる9・1°)。
表1に 示 す よう に,両 アイ ソマー に それぞれ特異的 な上流側 プ ライマー,及 び,両 者 に共通 の 下 流 側 プ ラ イ マ ー を用 い,ま た,通 常 のTaqDNAポGB‑D耐

リメラー ゼにPyrococcusspecies
熱性DNAポリメラ ーゼ を加 える こ とによ り,ヌ ク レオチ ドの取込 み ミス を校 正す る機
能 を持たせ たELONGase酵
図2PCRによ るMMP9の
レー ン1〜5はM:100‑bラ

図1とダー

検出

94°C/30秒(1サ素 ミックスを用 いて,イ クル):94°C/30秒,58°C/同様。

30秒,68℃/2分(35サ

イクル):68℃/10分(131

内分泌障害抑制作用(抗 環境ホルモン作用)を 持つ機能性食品の開発

系 は,エ ス トロゲ ンの作用 をよ く反映 し,そ の作
用 を増 強あ るい は抑 制す る食 品由来 因子 を速 やかに解析 す るに極 めて 有効で ある。エ ス トラジオー
ル及 び代表的 な植物 エス トロゲ ンの1種 で ある ゲニ ステ イ ンは,GAPDHのった が,MMP‑9の発 現 には影 響 しなか

発現 はゲ ニステイ ンに よ り抑制 され,大 豆 関連 伝統 食 品の 有用 性 を改 め て示唆で きた。一 方,細 胞分 化に関 わ るPPAR,の検出系 の構築 を も合 わせ て進 め る中で,MCF‑9細図3PCRによるPPARγ の検出
1:PPARア1特 異的反応
2:PPARrz特異的反応
M:100‑bラダー胞がPPARrzではな くPPARγ1を 発現 して い る

こ とが 明か とな り,本 核内 レセプ ター とマ トリッ
クス メタロ プロテア ーゼー9の発現動 向,及 び これサイ クル)の 温 度制 御条 件 でPCRをの結果,PPAR,1に行 った。 そら とMCF‑9細胞 の乳癌細 胞 としての挙 動 との関

特 異的 な上 流側 プラ イマー を連を解析 す る手掛 りを得 ることがで きた。本 試験用 いた場 合 の み適切 なサ イズ の生 成物 が得 られ系を用 いた今後 の よ り幅広 い展 開が期 待 され る。

(図3),この もの をク ローニ ング して塩基 配列 を調 べ て み る と,間 違 い な くPPARγ1でが確認 された 。一方,PPARγ2には,PCR生あること

この一連 の 研究 を進 める にあ た り,働 浦上 食

特異 的 な反応 で

品 ・食文 化振興 財団 よ り極 めて貴重 なご援助 を賜

成 物 は得 られ なか った(図3)。

結 果 は,通 常 状 態 に お け るMCF‑7細PPARγ2で は な く,PPARγ1をこの胞 は,りました ことに心 より感 謝い た します ともに,貴財 団の益 々の ご発 展 をお祈 り申 し上 げます。

発現 してい る ことを示唆 してい る。PPARγ2は 白色及 び褐 色脂 肪細
胞 で主 に発現 され る一 方,PPAR,1は免疫 系臓器,文献1)L.H.Keith(1997)"EnvironmentalEndocrine
Disruptors‑AHandbookofPropertyData"p.1232,

大 腸,小 腸,副 腎及び 脂肪細 胞 と,多 様 な組織 に
お け る複 雑な生 理調節 に関 わって いる。エ ス トラ
ジオ ール とPPARγ1と の 相互 作用 に 関す る知見は未 だ限 られ てい る た め11・12),今回検 出 されたWiley‑lnterscience.
2)T.colborn,C.Clement(1992)"Chemically‑in‑
ducedAlterationsinSexualandFunctionalDevelop‑
ment‑TheWildlife/HumanConnection"p.403,Prin‑
cetonScientificPublishingCo.

PPARγ1のMCF‑7細胞内 での役 割,あ る いは本細 胞のエ ス トロゲン応 答性へ の関与 等,興 味深い

3)M.S.Kurzer,andX.Xu(1997)Dietaryphytoes‑
trogens,Anntc.Rev.ハ1z♂
4)P.A.Jones,V.A

検 討課題 が開か れた。

か㌦17:353‑381.
.Baker,A.Irwin,andL.K.Earl(1997)ModulationofMCF‑7cellproliferative

4.おresponsebymanipulationofassayconditions,Toxicol.

わ り に

11:769‑773.

内因性 ホルモ ンであ るエ ス トラ ジオール に対する応 答性 の高い ヒ ト乳癌 細胞 株MCF‑9細胞 を用い,内 分泌 障害性 及び 障害抑制 作用 を持つ食 品因子 の解析 を行 うた めの試 験系 を先ず構 築 した。本5)M.M.Montano,andB.S,Katzenellenbogen(1997)
Thequinonereductasegene:Auniqueestrogenrece‑
ptorregulatedgenethatisactivatedbyantiestrogens,
Proc.Natl.Acad.sci.USA94:2581‑2586.
6)今井 一 志(1997)がん細胞 の浸潤・転 移 と マ

トリッ ク

32

浦 上財 団研 究 報 告書Vol.8(2000)

ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ,蛋

白質

核 酸

酵 素,42:1694‑

tissuedistributionofhumanperoxisomeproliferator‑

1700.

activatedreceptor(PPAR)isoformsPPARrzversus

7)Z.‑M.Shao,J.Wu,Z.‑Z.Shen,andS.H.Barsky

PPAR(1998)Genisteinexertsmultiplesuppressiveeffectson

agonistsandantagonists,J.Biol.Chem.272:8071‑

humanbreastcarcinomacells,CancerRes.58:4851‑
4857.

andactivationwithretinoidXreceptor

8076.‑
11)H.Ma,H.W.Sprecher,andP.E.Kolattukudy8)M.W.Kilgore,P.L.Tate,S.Rai,E.Sengokum,(1998)Estrogen‑inducedproductionofaperoxisome

andT.M.Price(1997)MCF‑7andT47Dhumanproliferator‑activatedreceptor(PPAR)ligandina

breastcancercellscontainafunctionalperoxisome

PPARy‑expressingtissue,J.Biol.Chem.273:30131‑

response,Mol.Cell.Endocrinol.129:229‑235.
9)L.Fajas,D.Auboeuf,E.Raspe,K.Schoonjans,A.
‑M.Lefebvre,R.Saladin,J.Najib,M.Lavine,J.‑C.

30138.
12)E.Elstner,C.Muller,K.Koshizuka,E.A.William‑son,D.Park,H.Asou,P.Shintaku,J.W.Said,D.

Fruchart,S.Deeb,A.Vical‑Puig,J.Flier,M.R.Briggs,Heber,andH.P.Koeffler(1998)Ligandsforperox‑

B.Staels,H.Vidal,andJ.Auwerx(1997)Theorgani‑isomeproliferator‑activatedreceptorsandretinoic

zation,promoteranalysis,andexpressionofthe

acidreceptorinhibitgrowthandinduceapoptosisof

humanPPARggene,J.Biol.Chem.272:18779‑18789.

humanbreastcancercellsinvitroandinBNXmice,10)R.Mukherjee,L.Jow,G.E.Croston,andJ.R.
Paterniti,Jr(1997)identification,charaterization,andProc.Natl.Acad.sci.USA95:8806‑8811.

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DevelopmentTrialofFunctionalFoodsProtectingAgainstEndocrine‑Disruption

DevelopmentTrialofFunctionalFoodsProtectingAgainst
Endocrine‑Disruption
KazushigeYokota(FacultyofLifeandEnvironmentalScience,ShimaneUniversity)

Variousmodernchemicalcompoundsartificiallyreleasedintonaturalenvironmenthave
beenshowntosignificantlyaffectendocrinehomeostasisoflivingorganismsasiftheyaresome
extrahormonalagentsfromenvironment.Ontheotherhand,suchhormonalactivityhasalso
beendetectedinmanynaturalcompoundsincludingcomponentsoftraditionalfoods.However,fewproblemofsignificantendocrinedisruptionhaveeverbeennoticedtraditionally,suggesting
thepresenceofcompoundsprotectingagainstendocrine‑disruptingeffectoffoodcomponents.
Therecentsignificantproblemofexternalhormonalcompoundscouldbeduetotheoverexpo‑
suretomodernchemicalcompounds,overwhelmingtheprotectiveeffectsoftraditionalfood.
Thepurposeofthisstudyistoestablishanconvenientassaymethodtodetecttheendocrine‑
disruptingeffectsofvariouscompounds,andtofindendocrine‑protectingagentsaswellasnew
disruptingagentsfromfoodcomponents.
Weusedanestrogen‑respondingbreastcancercellsline,MCF‑7cells,toestablishtheassay
method.Estradiolwasusedasanstandardhormonalcompounds.Asatypicalexternalnatural
hormonalcompound,weusedgenisteinwhichisthepredominantisoflavoneinsoybeanandalsoknowntoactasanphytoestrogen.Theexpressionofglyceroaldehyde‑3‑phosphatedehy‑
drogenasewasnotaffectedeitherbyestradiol,genistein,orbothofthem,indicatingthatthe
expressionlevelofthisenzymecanbeusedasaninternalstandardtoevaluatetheexpression
ofotherproteins.Next,wetriedtodetectthechangeinthetranscriptlevelofmatrix‑metaro‑
proteinase‑9(MMP‑9),whichisoneofthekeyproteasesinvolvedinmetastasisofcancercells.
TheexpressionofMMP‑9wasloweredbygenistein,suggestingthatmanyfoodscontainingthis
phytoestrogencouldhavefurtherunknownbeneficialeffectsexpressedviaestrogenreceptor
pathway.AnothertargetinMCF‑7cellsareperoxisomeproliferator‑activatedreceptors(PPARS)inthiscells.Thereare3subtypesCa,/3,y),andPPARycontains3iroforms(1,2,3).PPARyisdetectedinMCF‑7cells,althoughitsisoformhasnotbeenidentifiedclearly.In
thisstudy,wedesignedPCRprimersspecifictoPPARisoformsγ1andγ2respectively,andtried
todetectthemseparatelybyPCRusingthespecificprimers.OnlythePPARγ1‑specific,butnot
thePPAR,z‑specific,primeryieldedspecificproductofanexpectedsize.Thisproductwas
confirmedbyDNAsequencingtobearealproductencodingPPARγ1,suggestingthattheMCF‑7cellsexpressPPARγ1,butnotPPARγ2,underusualcondition.ThePPARγ

一isoformsare

distributeddifferentlyandsoexpectedtofunctiondifferently.ThepresenceofPPARγ1inMCF‑7cellswouldsuggestthatPPARγ1mightbeinvolvedintheestrogen‑signalinginthiscells,

34

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVol.8(2000)

providingnewsystemtoanalyzethestillunclearinteractionbetweenestrogenandPPARy‑signaling.