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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 27 年度助成＞

ヒト腸内細菌叢によるクルクミン代謝に関する研究
丹羽利 夫 1) ・ 横 山

慎 一 郎 ２）

（ 1) 修文大学 健康栄養学部、 ２）岐阜県産業技術センター 食品部）

果 YY7918 株ではほとんど反応が生じていないのに目的

対し、SY8519 株ではテトラヒドロクルクミンと思
近年、腸内細菌が生体に及ぼす影響が示唆されてわれるスポットが確認された。そこで、まずは分取きている。その一方で、菌あるいは物質レベルでのTLC による精製により実際の重量を測定することに解明についてはまだ十分とは言えないのが現状であした。10 mM クルクミン溶液を与え、最終濃度 50μMる。とした GAM 500 ml に SY8519 株を添加し、嫌気条

そのような中、筆者らも大豆イソフラボノイドの件下 37 ℃で 4 日間培養したものを酢酸エチルによヒト腸内細菌に関する研究を進め、代謝産物の化学り抽出した後、分取 TLC により精製した。精製をし構造ならびに生理機能について検討してきた 。またものの TLC の結果を Fig.1 に示す。

1）

た、これらの代謝においてみられるような二重結合TLC を UV254 nm で観察後、リンモリブデン酸エの還元・カルボニルの還元・脱メチル化といった代タノール溶液でスポットを観察した。Fig.1 では T（テ謝反応により、他のポリフェノールも代謝できるのトラヒドロクルクミンの標品）、MT（テトラヒドロではないかと考えた。そこで、近年その生理機能がクルクミンの標品と精製したテトラヒドロクルクミ

世界中で注目されるとともに、上述の三つの代謝反ンのミックス）、Te（精製したテトラヒドロクルク応が起こる可能性のあるクルクミンについて研究すミン）を比較すると、ほぼ同じ発色時間で同位置にることにした。

スポットが確認でき、テトラヒドロクルクミンが確

本研究においては主に以下の 2 点について検討を認できた。また粗抽出液にマイナーなスポットが存行った。

在していたことから、クルクミンの分解産物として１報告があるフェルラ酸と比較した。F（フェルラ酸

ヒト由来大豆イソフラボノイド代謝菌（SY8519 株，YY7918 株）によるクルクミン代謝２

ヒト腸内細菌によるクルクミン代謝

１．ヒト由来大豆イソフラボノイド代謝菌（SY8519 株，YY7918 株）によるクルクミン代謝
当初、クルクミン、テトラヒドロクルクミンのHPLC 分析がうまくいかなかったため、まず菌を含む Gifu Anaerobic Medium（GAM）500 ml に 50μMとなるようクルクミンを添加し、培養したものを酢酸エチルで抽出し、TLC により分析した。その結Fig.1

SY8519 株によるクルクミンの代謝反応生成物の TLC（発色：リンモリブデン酸）
T：テトラヒドロクルクミン標品、MT：テトラヒドロクルクミンの標品と精製したテトラヒドロクルクミンのミックス、Te：テト
ラヒドロクルクミン相当部分精製サンプル
フェルラ酸についても同様ヒト腸内細菌叢によるクルクミン代謝に関する研究

57の標品）、MF（フェルラ酸の標品と精製したフェルmg のフェルラ酸が代謝産物として精製できた。まラ酸のミックス）、Fe（精製したフェルラ酸）を比た、菌なし培地 500 ml より 2.3 mg のフェルラ酸が較すると、Fe にもフェルラ酸が少量ながら含まれて得られた。これらのことから、クルクミンは腸内細いることが示唆された。なお Fig.1 において①②③

菌 SY8519 株によりテトラヒドロクルクミンに代謝はテトラヒドロクルクミン、フェルラ酸以外の回収されることが分かった。また、菌なしの結果から、画分であり、菌を添加しない場合にも観測されたこ

クルクミンは SY8519 株を含む状態よりも培地のみとから、現時点でこれらは培地等に由来する成分との方がフェルラ酸への自然分解が進むことが考えら考えられる。

れる。この原因としては、テトラヒドロクルクミン同様に培地のみでクルクミンを培養したもので、Fig.1 と同じく分取 TLC により精製したものでもフェからのデヒドロフェルラ酸への変換が行われにくいためと推測されるが、詳細は不明である。

ルラ酸と思われるスポットを確認できたことから、さらに詳細な検討のため HPLC 分析を行ったとこ

フェルラ酸生成は菌の代謝によるものではなく、自ろ、分取 TLC で精製したサンプルにおいて標品とほ然分解により生じることが示唆された。

ぼ同じ 13.1 分にピークが確認できたことから、TLCクルクミンの自然分解物はいくつか報告されておで確認できた通り、SY8519 株はクルクミンをテトり、その中にフェルラ酸も含まれる。ただフェルラ

ラヒドロクルクミンに代謝することが確認された酸は酸化的条件下でクルクミンから生成すると考え（Fig. 2）。しかし他にも多くのピークがみられておられるが、今回、嫌気的培養条件下かつチオグリコーり、面積比からテトラヒドロクルクミン量を算出しル酸を含むような培地においても確認された。このたところ、2.2 mg となった。真空乾燥時の重量 5.3

はフェルラ酸の生成が溶存酸素mg と比較すると、約 40％になる。ただし、今回用と反比例すると報告しており、フェルラ酸生成は酸いた標品テトラヒドロクルクミンの HPLC 分析では、化のみでは説明できないと考えられる。いずれにせベースラインの盛り上がりや、不純物の存在もみらよ、食べ残しを含め、カレーなどにおいても一晩寝れており、十分な精度で定量できたとは考えていな

かせることによりクルクミンからフェルラ酸への変い。とはいえ、少なくとも SY8519 株によりクル換が生じているものと推察される。

クミンからテトラヒドロクルクミンが生成されるこ点について坂元ら

2）

分取 TLC による重量測定の結果、クルクミン 9.2とが明らかとなった。なお、菌なし培地のみではテmg を添加した腸内細菌 SY8519 株を含む培地 500

トラヒドロクルクミンに相当するピークはみられな

ml に対して、5.3 mg のテトラヒドロクルクミン、1.5かった。

Fig.2

SY8519 株によるクルクミン代謝産物 ( テトラヒドロクルクミン ) の HPLC 結果

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浦上財団研究報告書

フェルラ酸についても同様に行い HPLC で測定しVol.25（2018）２．ヒト腸内細菌によるクルクミン代謝たところ、フェルラ酸と考えられるピークが確認できた。TLC でも確認できた通り、菌なし培地での培テトラヒドロクルクミン以外の新たなクルクミン養で、クルクミンは自然分解によりフェルラ酸を産のヒト腸内細菌代謝産物の探索を行うため、ヒト糞生することが確認された。しかしながら他のピーク便中腸内細菌をクルクミンと培養した。その中でもあり、分取 TLC 精製サンプル中には不純物も含ま1C と名付けた細菌サンプルをクルクミンと培養すれていたことが確認された。

ることにより、TLC 上新たな生成物を確認した（Fig.

次に、クルクミンおよびその代謝産物の活性比較を行うため、クルクミンの生理機能として報告4a）。そこでこの生成物の精製・構造解析を行うことにした。

Monocyte Chemoattractant Protein-1

なお、１C は希釈と 96 穴プレートでの培養をし（MCP-1）への影響について、マウス脂肪細胞を用ながら精製を進めたものであるが、現時点では Fig.5

いて実験を行った（Fig. 3）。なお実験操作に関してに示すような 2 種類（以上）の菌を含むことが分かっ

は市販の ELISA kit を leptin から MCP-1 に変更したている。この点については後述のように、最近までに準じて行った。

代謝産物の HPLC 分析条件を確立することができず、されている3）のみで、既報1）

フェルラ酸についてはデータにばらつきがあり記

大量培養して抽出・TLC を行う必要があったため、載していないが、クルクミンおよびテトラヒドロクうまく進めることができなかったことが大きな要因

ルクミン間で有意な差はないものと考えられる。まである。しかしながらその後 HPLC 分析条件が進展たこの点については、control にもばらつきがあるたしたため、今後、菌の単離を進める予定である。

め、次項で記載する代謝産物も含め、今後さらに検討が必要だと考えている。

腸内細菌群１C とクルクミンを培養後、酢酸エチ
ルで抽出し、分取 TLC および分取 HPLC で精製を行っ

今回観測されたような腸内細菌によるクルクミンた。しかし、分取 HPLC では精製後、カラムをメタノーからテトラヒドロクルクミンへの変換については、ル洗浄したところに生成物が存在していた。この原その酵素を含め報告がされており 、このような変因としては同じ ODS ではあるものの、分析カラム換が腸内細菌によって広く行われる可能性があると分取カラムのメーカーが異なることによる特性のが、その代謝による生理機能変化については in vitro違い、あるいはいずれかのカラムの劣化という可能の評価が多く、今後フェルラ酸あるいは後述の代謝性が考えられたが、現時点で詳細は不明である。し産物への変換に伴う生理機能を含めて明らかにしてかしながらこのようにして得られたものは、Fig.4bいく必要がある。のように TLC 上ほとんど不純物がみられなかったた

4）

め、1H NMR（400 MHz, acetone-d6）の測定を行った。この結果から得られた代謝産物はクルクミンとFig.4
Fig.3 クルクミンおよびテトラヒドロクルクミン（ THC ）の MCP-1 低下作用

クルクミン代謝産物の TLCa) 左からクルクミン、粗抽出物
分取 HPLC 後メタノール回収品b) 左からクルクミン、

ヒト腸内細菌叢によるクルクミン代謝に関する研究

Fig.559

１C サンプル中の微生物顕微鏡写真（染色）比べ、ろんのこと、・トランスの二重結合が消失

・アルコール部分の立体選択性

・OCH3 由来のシグナルが消失・中間体の化学構造解析を含めた代謝経路

・カルボニルのα位のメチレンが消失（ベンゼン環・ヒト生体内で生成しうるか（どれくらいのヒトでの消失がないことから）確認されるか）・分子の対称性が消失（ベンゼン環のプロトンがき・代謝に関与する真の菌の特定れいに出ないことから）といったことが今後の検討課題であり、将来的には

・3.30 ppm に 1H のシグナルが存在する

このようなクルクミンや大豆イソフラボノイド代謝ことが示唆された。そこで、この代謝産物としてを指標とした、腸内細菌叢の違いによる疾病リスク

Fig.6 のような構造を考えた。さらにこの化学構造の解明につなげたいと考えている。

を検証するため LC-MS/MS (AB Sciex, 3200 QTRAP)の測定を行ったところ [M － H] －により m/z 331 が確認できた。これは C19H24O5 の推定構造を支持する結果であった。

謝

辞本研究を行うにあたり、多大なご援助を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御このような、主鎖のカルボニル基を失った骨格を持礼申し上げます。

つクルクミノイド代謝産物の報告は存在している 5、6）。

またテトラヒドロクルクミンサンプルをご提供いしかしながら、さらに文献を調べる必要があるもの

ただくとともに、LC-MS/MS 測定にもご協力いただの、この代謝産物は現時点で報告がみつからないた

いた愛知学院大学 大澤俊彦教授ならびに望月美佳助

め、今後は高分解能マススペクトルや二次元 NMR教に深謝いたします。

も視野に入れ、さらにデータをそろえる必要がある。
さらにこれまで筆者らが行ってきた大豆イソフラボノイドの代謝研究同様、クルクミンとその代謝産物の生理機能の比較を行いたいと考えている。また
この代謝産物に関連して上記の生理機能変化はもちFig.6

クルクミン代謝産物推定構造

参考文献

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adipocytes in vitro. Phytochem. Lett., 3, 122 (2010).
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響、日本食品化学学会誌 5, 211 (1998).
3) Jain, S.K., Rains, J., Croad, J., Larson, B., Jones, K.,
Curcumin supplementation lowers TNF- α, IL-6, IL8, and MCP-1 secretion in high glucose-treatedcultured monocytes and blood levels of TNF- α, IL6, MCP-1, glucose, and glycosylated hemoglobin in
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(2012).

Vol.25（2018）

Study of the curcumin metabolism by human intestinal bacteria

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Study of the curcumin metabolism by human intestinal bacteria
Faculty of Health and Nutrition, Shubun University
Department of Food Technology Industrial Technology Center,
Gifu Prefectural Government
1)

2)

Toshio Niwa1) , Shin-ichiro Yokoyama2)

We studied the metabolism of curcumin using two soy isoflavonoidmetabolizing bacteria, strains YY7918 and SY8519. The equol producing
bacterium, YY7918, did not metabolize curcumin, except for producing asmall amount of the degradation product, ferulic acid. On the other hand,strain SY8518 produced tetrahydrocurcumin. We then examined theactivity of curcumin and related compounds for the production of Monocyte
Chemoattractant Protein-1 in vitro . Tetrahydrocurcumin exhibited an activity
similar to that of curcumin in murine adipocytes. We also attempted to isolate
other metabolite（s）of curcumin via incubation with human feces. One bacterial
sample, named 1C, pro duced metabolites other than tetrahydro curcuminfrom curcumin. We purified one metabolite that lost the 1 H NMR signals
corresponding to the trans -double bonds and OCH 3 . We also analyzed theprofiles using TLC and measured the mass spectrum of the metabolites.
Based on the results, we considered that the structure is 3-hydroxy-1,7-bis（3,4-dihydroxyphenyl）heptane.