31

環境化学物質による健康リスク軽減に寄与するニンニク中活性イオウ分子の探索＜平成 29 年度助成＞

環境化学物質による健康リスク軽減に寄与する
ニンニク中活性イオウ分子の探索

安孫子

ユミ

（筑波大学 医学医療系）

背30 分間攪拌することで成分を抽出した。ニンニク

景ヘキサン抽出液は、ニンニクをジューサーで粉砕し我々の生活している環境中には多種多様な化学物た搾り汁にヘキサンおよび超純水を混和して室温で質が遍在し、それらの摂取で生じる環境ストレスによ2 時間以上攪拌して抽出した。各抽出液の溶媒を減る健康リスクが危惧されている。特に、親電子性を有圧蒸留して得られた抽出物をクロロホルムもしくはする物質は、タンパク質のシステイン残基に共有結合DMSO に再溶解した。当該抽出液を、シリカゲルカし、安定なタンパク質付加体を形成するために被修飾ラムで分離し、薄層クロマトグラフィーおよび高速タンパク質の機能を変化させることで、生体応答およ液体クロマトグラフィー（HPLC、島津）により溶び毒性を発揮する。たとえば、マグロ等の魚介類には出液の化学成分を検出しながら分画した。

タウリンや不飽和脂肪酸等の有益な物質が豊富に含まれている一方で、生物濃縮を介して親電子物質であるメチル水銀（MeHg）が蓄積するために、健康リス・（MeHg）
2 S の検出
HPLC/ 原子吸光分析（AAS）で分離・定量した 2)。

クと栄養摂取のトレードオフに苛まれているのが現状である。我々の先行研究において、MeHg の新規解・イオウ化合物および揮発性 Hg の検出

毒代謝物としてイオウ原子を含んだビス MeHg サル

試料の揮発性成分を XAD-4 に吸着させ、アセトンファイド［（MeHg）2S］を同定し 、本代謝物生成にで溶出した溶出液をガスクロマトグラフ質量分析計

イオウ原子を分子内に二原子以上有するようなパー /（GC-MS、島津）で分析した。抽出液中の化合物は、ポリスルフィドのような活性イオウ分子種（ReactiveGCMSsolution（島津）を用いてシミラリティ検索をSulfur Species, RSS）が関与していることを世界に先行い類似度が高いものと特定した。

1)

駆けて報告した 。興味深いことに、そのようなイオ2)ウ付加体は MeHg の有する毒性は消失していること

・ニンニクヘキサン抽出液による MeHg 毒 性から、解毒代謝物であることも明らかとなった。そこに対する細胞保護効果

で、本研究では食用植物であり、イオウ化合物を豊富

細 胞 生 存 率 は 3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-に含むとされる Allium sativum L.（ニンニク）が植物

diphenyltetrazolium bromide（MTT） 法 で 求 め た。

由来活性イオウ分子種（PRSS）を含むか否か、MeHg

HepG2 細胞（4 × 104 細胞 /well）を 96-well プレーから（MeHg）
2S の産生を指標として検出した。

トに播種して 24 時間培養後、血清不含培地に交換した。ニンニクヘキサン抽出液と MeHg に細胞を同方法

時 曝 露 し て 12 時 間 後、5 mg/mL MTT を 培 地 の1/10 量加えて 30 分間培養した。培地除去後、生成・ニンニク抽出液の調製と PRSS の分離
擦り潰したニンニクを各有機溶媒と混和し室温でしたホルマザンを DMSO で溶解し、OD540 を測定した。

32

浦上財団研究報告書

Vol.28（2021）

MeHg と 反 応 さ せ た 結 果、 低 分 子 画 分 で 顕 著 な結果と考察（MeHg）（MeHg）
2S が確認された。このことから、
2S
これまでに筆者らは、内在性の RSS であるシステ生成においてタンパク質等の高分子よりも低分子化

インパー / ポリスルフィド（CysSSH /CysSSnH）お合物の貢献が大きいことが示唆された（データ非掲

よ び グ ル タ チ オ ン パ ー / ポ リ ス ル フ ィ ド（GSSH/載）。そこで低分子化合物、各溶媒で順次抽出してGSSnH）等と環境中親電子物質［1,4- ナフトキノン検討したところ、ヘキサンおよびクロロホルム抽出（1,4-NQ）および MeHg］が反応し、CysS-1,4-NQ，液が効率良く（MeHg）2S を生成した（図 2）。ニン（1,4-NQ）
2S および（MeHg）
2S が生成することを明

ニクヘキサン抽出物（7.5 g）をシリカゲルカラムに。また、RSS は当該親電子物質に供し、クロロホルム（4.12 L）およびクロロホルムよるシグナルの活性化や毒性を抑制することも報告- メタノール（95：5, 1.2 L および 90：10, 0.6 L）

した 3〜5)。本研究では、食用植物中に RSS が存在す

で S1 〜 S13 の 画 分 に 分 離 し て、 そ れ ぞ れ HPLC/

るのか、また当該 RSS が環境化学物質による健康リ

AAS および GC/MS 分析を行った（一部データ非掲

スクを軽減するのか検討した。

載）。図 3 に示すようにいずれの画分においてもらかにしてきた

2, 3)

ニンニクの搾り汁と MeHg とを反応させると、精MeHg と反応して（MeHg）
2S の生成が認められた。

製した（MeHg）
2S と同じ保持時間に Hg を示すピー

GC/MS 解析で検出されたポリスルフィドの種類が多クが認められたことから、ニンニクは（MeHg）
2S にかった S8 画分について（図 3D）、さらに 4 つに分変換するような PRSS を含むことが示唆された（図画したところ、S8-1 〜 -4 いずれの画分においても1A 〜 C）
。本搾り汁をエコノパックカラム（Bio-rad）（MeHg）
2S の生成効率が分離前と比較して低下してで高分子画分と低分子画分に分けて、それぞれをいた（図 3C および 4A、データ非掲載）。また、他

2S図 1 ニンニク搾り汁、その低分子画分および高分子画分と MeHg との反応で生じる（MeHg）
2S 標準品（B）およびニンニク搾り汁と MeHg との反応生成物（C）を HPLC/AAS で分析した。
MeHg 標準品（A）、（MeHg）
ニンニク搾り汁の低分子画分（D）もしくは高分子画分（E）をそれぞれ MeHg と反応させた。

環境化学物質による健康リスク軽減に寄与するニンニク中活性イオウ分子の探索

図22S
各溶媒で抽出したニンニク抽出液と MeHg との反応で生じる（MeHg）

2S と S8 分画中イオウ化合物の GC/MS 解析
図 3 ヘキサンニンニク抽出液中化合物の分画と MeHg との反応で生じる（MeHg）
シリカゲルカラムで S1 〜 13 に分画したヘキサンニンニク抽出液中化合物（0.5 mg/mL）を MeHg（100 µM）を 20 mM Tris2S（A）と残存した MeHg（B）を示した。S8 分画について、
HCl（pH 7.5）中で反応させて HPLC/AAS を行い、生成した（MeHg）
MeHg と反応後 HPLC/AAS 分析（C）および GC/MS 解析を行った（D）。

33

34

浦上財団研究報告書

Vol.28（2021）

2S 生成におけるジアリルテトラスルフィド（DATS）の影響
図 4 S8-2 と MeHg との反応で生じる（MeHg）
S8-2（2 mg/mL, A）、DATS（100 µM, B）もしくは S8-2（2 mg/mL）および DATS（100 µM）の混合液（C）と MeHg（100 µM）を10 mM Tris-HCl（pH 7.5）
-60% メタノール中で反応させて HPLC/AAS 分析を行った。の画分（S3 および S12）においても同様な結果が得られたことから（データ非掲載）、PRSS が効果を発揮するためには何か他の化合物が必要であると示唆された。そこでニンニク中に含まれるポリスルフィドの１つであるジアリルテトラスルフィド（DATS）と S8-2 を 混 和 し て 検 討 し た。 興 味 深 い こ と に、DATS も し く は S8-2 分 画 そ れ ぞ れ で は（MeHg）
2Sの生成がわずかしか認められなかったにも関わらず（図 4A および B）、DATS 共存下では当該ビス体の生成が顕著であった（図 4）。S8-2 には DATS（C3H5SSS-C3H5）を還元して、C3H5-SSH などの反応性の高い物質に返還するような化合物が含まれていることが示唆された。
これらのことから、ニンニク抽出液は多くの PRSSおよびその前駆物質を含むと示唆される。ニンニク抽出液は、MeHg を（MeHg）2S に変換することで本毒 性 を 軽 減 す る こ と が 想 定 さ れ る。 予 想 通 り、

図5

HepG2 細胞における MeHg 毒性に対するヘキサンニンニク抽出物同時曝露の影響
HepG2 細胞を MeHg と DMSO に溶解したヘキサンニンニク抽出物に同時曝露し、MTT 法にて細胞生存率を求めた（*p <0.05, **p <0.01 vs. 0 µMMeHg）。

HepG2 細 胞 に お い て ニ ン ニ ク ヘ キ サ ン 抽 出 物 とことおよび Hg の臓器蓄積を抑制することが示唆さ

MeHg との同時曝露は当該有機金属の毒性を有意にれた。

軽減した（図 5）。また、MeHg（0.1 mmol/kg）と本研究により、（1）ニンニクの脂溶性成分中にはニンニクヘキサン抽出物（50 mg/kg）の混合物の経親 電 子 物 質 で あ る MeHg を 親 電 子 性 を 有 さ な い

口投与は MeHg 単独投与と比較して、肝臓、心臓、（MeHg）2S に変換するような PRSS およびその前駆全脳および肺において投与 24 時間後の Hg の蓄積物質が豊富に含まれること、および（2）ニンニクが少ない傾向が見られた（データ非掲載）。ニンニ

中 PRSS は（MeHg）
2S の生成を介して MeHg の細胞クヘキサン抽出物は、MeHg の細胞毒性を軽減する毒性を軽減することが示唆された。これまでの研究環境化学物質による健康リスク軽減に寄与するニンニク中活性イオウ分子の探索

35

成果から、RSS は MeHg だけではなく、米に含まれ参考文献

るカドミウム、および大気汚染物質 PM2.5 中成分で

1) E. Yoshida, T. Toyama, Y. Shinkai, T. Sawa, T. Akaike, Y.
Kumagai, Detoxification of methylmercury byhydrogen sulfide-producing enzyme in Mammaliancells, Chemical research in toxicology 24(10) (2011)1633-5.
2) Y. Abiko, E. Yoshida, I. Ishii, J.M. Fukuto, T. Akaike, Y.
Kumagai, Involvement of reactive persulfides inbiological bismethylmercury sulfide formation,
Chemical research in toxicology 28(6) (2015) 13016.
3) Y. Abiko, L. Sha, Y. Shinkai, T. Unoki, N.C. Luong, Y.
Tsuchiya, Y. Watanabe, R. Hirose, T. Akaike, Y.
Kumagai, 1,4-Naphthoquinone activates the HSP90/
HSF1 pathway through the S-arylation of HSP90 inA431 cells: Negative regulation of the redox signaltransduction pathway by persulfides/polysulfides,
Free radical biology & medicine 104 (2017) 118128.
4) Y. Abiko, Y. Shinkai, T. Unoki, R. Hirose, T. Uehara, Y.
Kumagai, Polysulfide Na2S4 regulates the activationof PTEN/Akt/CREB signaling and cytotoxicity
mediated by 1,4-naphthoquinone through formationof sulfur adducts, Scientific reports 7(1) (2017)4814.
5) T. Unoki, Y. Abiko, T. Toyama, T. Uehara, K. Tsuboi, M.
Nishida, T. Kaji, Y. Kumagai, Methylmercury, anenvironmental electrophile capable of activation anddisruption of the Akt/CREB/Bcl-2 signal transduction
pathway in SH-SY5Y cells, Scientific reports 6 (2016)
28944.
6) Y. Kumagai, Y. Abiko, Environmental Electrophiles:
Protein Adducts, Modulation of Redox Signaling, andInteraction with Persulfides/Polysulfides, Chemical
research in toxicology 30(1) (2017) 203-219.
7) Y. Abiko, I. Ishii, S. Kamata, Y. Tsuchiya, Y. Watanabe,H. Ihara, T. Akaike, Y. Kumagai, Formation of Sulfur
Adducts of N-Acetyl-p-benzoquinoneimine, anElectrophilic Metabolite of Acetaminophen in Vivo:
Participation of Reactive Persulfides, Chemical
research in toxicology 28(9) (2015) 1796-802.

あるナフトキノン類のような様々な親電子物質とも反応して低毒化する可能性が高いことが示唆されている 6)。また、親電子性を有さない環境化学物質や薬剤の多くが体内で代謝を受けて親電子物質になることも知られており、我々は、アセトアミノフェン投与マウスの肝臓、血液および尿サンプル中から当該物質の親電子代謝物のイオウ付加体を同定した 7)。
これらの研究成果は、RSS が親電子物質による健康リスクを軽減する重要な因子であることを示しているといえよう。ニンニク中 PRSS は様々な親電子物質と反応してイオウ付加体を形成することで、環境ストレスによる健康リスクを軽減し得るかもしれない。
謝

辞本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼を申し上げます。

36

浦上財団研究報告書

Vol.28（2021）

Reducing the health risks of environmental chemical exposureby reactive sulfur species in garlic
Yumi ABIKO
Faculty of medicine, University of Tsukuba
Methylmercury (MeHg), an environmental electrophile, binds covalently toprotein thiols, resulting in a functional loss for the modified protein. We foundthat MeHg also reacts with reactive sulfur species (RSS) with highnucleophilicity, such as persulfides and polysulfides, to yield bismethylmercury
sulfide [(MeHg) 2S], which has no electrophilicity and little toxicity. The purposeof this study was to discover plant RSS (PRSS) that are able to convert MeHg to(MeHg) 2 S in edible plants such as Allium sativum L. (garlic). Specifically, weevaluated the existence of RSS using an (MeHg) 2S assay. As a result, we foundthat a hexane extract of garlic had a high efficiency for conversion to (MeHg) 2S
from MeHg, compared to benzene, chloroform, ethyl acetate, methanol, andwater extracts. This indicates that garlic contains PRSS, which are mainly
aliphatic hydrocarbons. Interestingly, although S8-2, a fraction separated bysilica gel, had a small effect on (MeHg) 2S production from MeHg, the additionof diallyl tetrasulfide (DATS) to S8-2 enhanced (MeHg) 2S formation. This resultsuggests that garlic extract not only contains PRSS, but also pre-PRSS or areductant to yield PRSS from pre-PRSS. The simultaneous treatment of HepG2cells with the garlic hexane extract and MeHg inhibited MeHg-mediated celldeath. Our study suggests that the consumption of dietary vegetables
containing such PRSS may reduce the health risks due to exposure toenviron mental electrophiles tho ug h t he fo r mat i o n o f e l e ct r o p hi l e -sul fu radducts.