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食品添加物ナノ粒子が引き起こす腸内細菌叢の変化とその解析＜平成 27 年度助成＞

食品添加物ナノ粒子が引き起こす腸内細菌叢の変化とその解析
徳本勇人（大阪府立大学大学院 工学研究科）

1. 緒言

抽出した。抽出した DNA を鋳型として PCR を行い、16S rRNA 遺伝子の可変領域である V3-V4 領域、約ナノ粒子（NPs）の製造技術の進歩に伴い、食感460 bp の DNA 断片を増幅した。その後、次世代シーや色合いを向上させる食品添加物ナノ粒子が多数市

クエンサーを用いて、PCR 産物の塩基配列を読み取販されるようになり、食事により摂取する頻度が増り、腸内細菌叢内の微生物種の同定や存在比率を算加している。しかし、既往の研究では、食品添加物出した。

NPs をマウスに摂取させると、腸炎発生を予防する

Lactobacillus 属が、腸内で有意に減少することなど

2.3 腸内細菌の発酵挙動が報告されており、安全面について懸念され始めて容積 20.6 mL のバイアル瓶に、マウスより採取しいる。本研究では、食品添加物ナノ粒子をマウスにた糞便 300 mg と 5 g/L スキムミルク水溶液を全液経口投与し、糞便から腸内細菌叢の構成菌種の変化量 10 mL で封入し、気相を窒素で置換した。嫌気条を解析するとともに、疾病に繋がるリスクについて件下、37 ℃で静置培養を行い、発酵産物である気も検討を加えた。

相のバイオガス生成量を GC で測定した。

2. 実験方法

3. 実験結果

2.1 TiO 2 、SiO 2 、Fe 2 O 3 NPs の経口投与実験

3.1 TiO 2 NPs の経口投与実験

公称径 0.5 µm のアナターゼ型 TiO2 NPs と公称径

経口投与期間中、摂餌量、飲水量、糞便の含水0.8 µm の SiO2 NPs、および公称径 0.3µm の Fe2O3

率共に異常はなかった。Fig. 1 に TiO2 NPs 経口投

NPs の 3 種類の NPs について検討を行った。マウス

与 21 日目における腸内細菌叢の構成菌種の存在の粉末飼料に、TiO2 NPs は 0.05, 0.15, 1.0 %、SiO2割 合 を 示 し た。 Control と 比 較 す る と、TiO2 NPs

NPs は 0.05, 0.15, 1.0 %、粒径 0.3 µm の Fe2O3 NPsの 含 有 率 が 高 く な る に つ れ て、Lactobacillaceae

は 0.014, 0.14%、
粒径 1.0 µm の Fe2O3 NPs は 0.007,

科 と Bifidobacteriaceae 科 が 減 少 す る と と も に0.07% の含有率で混錬し、飼料を調製した。この飼

Clostridiales 目 が 増 加 し、TiO2 NPs の 経 口 投 与料をマウスに給餌し、排出された糞便に含まれる腸に よ り 腸 内 細 菌 叢 が 変 化 し た こ と が 示 さ れ た。

内細菌叢の発酵挙動と構成菌種の変動を解析した。

Lactobacillaceae 科と Bifidobacteriaceae 科の菌には、マウスの健康状態は、体重変化と糞便の含水率を指腸内有用菌として腸内腐敗菌の増殖を抑制し、腸内標にした。

環境を整える働きがあると報告されている 1)。一方、Clostridiales 目には酸を生成する主要な腸内腐敗菌

2.2 腸内細菌叢の構造変化
腸内細菌の DNA は MORA-EXTRACT kit を用いてが含まれることから 2)、TiO2 NPs により前者の菌の増殖が抑制されたことが、Clostridiales 目の増加に

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浦上財団研究報告書

Lactobacillaceae科
Clostridiales目

Bifidobacteriaceae科

Control

細菌叢中の腸内有用菌である Lactobacillaceae 科とBifidobacterium 科が減少することで、腸内腐敗菌である Clostridiales 目が優勢化し、菌叢構造が変化すると示された。

0.05%
0.15%

3.2 SiO 2 NPs の経口投与実験
経口投与期間中、マウスの摂餌量、飲水量、糞1%
0

Fig.1Vol.25（2018）

0.20.40.6

存在割合[-]

0.81TiO2NPs（粒径 0.5µm）を含有した飼料を経口投与した場合の、NPs 含有率ごとのマウス腸内細菌叢の構成菌種の存在割合繋がったと考えられる。

便の含水率共に異常は観察されなかった。Fig.3 にSiO2 NPs を 1% 含有した飼料を経口投与した条件の、腸内細菌叢の構成菌種の経時変化を示す。SiO2
NPs 投 与 前 は 腸 内 有 用 菌 で あ る Lactobacillaceae
科の存在割合は 34% であったが、投与 28 日目で次に、Fig. 1 で同定された菌叢変化を発酵挙動かは、Lactobacillaceae 科 が 9% ま で 減 少 し た。 そ こら 確 認 す る た め に、TiO2 NPs 経 口 投 与 21 日 目 にで、SiO2 NPs 含 有 試 料 の 投 与 を 中 止 し た と こ ろ、採取した腸内細菌叢を 4 日間培養した時の、糞便Lactobacillaceae 科の存在割合は 58% まで回復した。

1 mg あたりのバイオガス生成量の経時変化を観察

この結果から、SiO2 NPs の投与により、腸内細菌叢した（Fig. 2）。培養 4 日目の H2 および CO2 生成量中の Lactobacillaceae 科が顕著に減少することが示は Control でそれぞれ 21.3、31.8 µL/mg-feces であされた。一方、腸内腐敗菌である Clostridiales 目のる一方、TiO2 NPs 含有率 1 % の条件で 29.1、42.4

存在比率は変化が観察されなかった。

µL/mg-feces と な り、TiO2 NPs 含 有 率 が 高 い 条 件

SiO2 NPs 含有率 1% の飼料を経口投与した条件でではバイオガス生成量が顕著に増加することが分の、投与前、投与 28 日目、投与中止 17 日目に採かった。嫌気発酵の中間段階である酸生成過程に取した糞便を 4 日間培養した時の、バイオガス生成おいて、嫌気性微生物は酢酸や H2、CO2 を生成す量の経時変化を Fig. 4 に示す。培養 4 日目におけるる。Clostridiales 目はこの酸生成過程に関与しておH2 および CO2 生成量は、投与前の腸内細菌叢でそり H2 や CO2 を生成することから 3)、Clostridiales 目

れぞれ 10.8、25.6 µL/mg-feces、投与 28 日目のもが菌叢中で優勢化したことで、H2 と CO2 生成量がので 9.2、26.4 µL/mg-feces、投与中止 17 日目では増加したと考えられ、構成菌種の変化からの予測さ9.6、24.8 µL/mg-feces となり、大きく変化しなかっれる結果と良い一致を示した。以上より、TiO2 NPs

た。これは、TiO2 NPs 含有飼料を投与した場合とはが消化管を介して腸内に過剰量流入すると、腸内異なり、酸生成過程に関与して H2 や CO2 を生成す
Lactobacillaceae科

Clostridiales目

投与前
NPs含有飼料
投与28日目
NPs含有飼料
投与中止17日目

Fig.2

TiO2NPs 投与マウスから採取した腸内細菌叢を用いた発酵試
験における、（a）水素、（b）二酸化炭素生成量の経時変化（培養温度 37℃、エラーバーは独立した 3 サンプルの標準誤差を示す）

0

Fig.30.5

存在割合[-]

1

SiO2NPs（粒径 0.8µm）を 1% 含有した飼料を経口投与した
場合の、マウス腸内細菌叢の構成菌種の経時変化

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食品添加物ナノ粒子が引き起こす腸内細菌叢の変化とその解析

Lactobacillaceae科

Clostridiaceae科

下痢発症前

下痢発症時

治癒後
0%

Fig.4

SiO2NPs 投与マウスから採取した腸内細菌叢を用いた発酵試験における、（a）水素、（b）二酸化炭素生成量の経時変化（培養温度 37℃、エラーバーは独立した 3 サンプルの標準誤差を示す）

Fig.5

50%

存在割合[-]

100%

Fe2O3NPs（粒径 0.3µm）を 0.14% 含有した飼料を経口投与した場合の、下痢発症時およびその前後でのマウス腸内細菌叢の構成菌種の変化

る酸生成菌が腸内で増減せず一定量で存在していたることが知られており、これらの菌が腸内細菌叢ことを示唆している。Fig. 3 に示したように、嫌気中で優勢化すると下痢の症状を発症する 4)。そのた発酵の中間段階である酸生成過程に関与し、酢酸やめ、粒子径が比較的小さい Fe2O3 NPs を過剰に摂取

H2、CO2 を生成する Clostridiales 目の存在比率は変したことで、Clostridiaceae 科が腸内細菌叢中で優化がなかったことから、菌叢構造解析の結果と一致勢化し、下痢が誘発されたと推測される。そこで、する結果が得られた。以上より、SiO2 NPs が消化管腸内菌叢の発酵挙動から菌叢構造の変化を確認する

を介して腸内に過剰量流入すると、腸内細菌叢中のことを目的として、経口投与 15 日目に排出された

Lactobacillaceae 科が減少し、腸内細菌叢の菌叢構糞便を培養し、バイオガス生成量の経時変化を観察

造が変化するが、Clostridiales 目のような腸内腐敗した（Fig. 6）。培養 7 日目における糞便 1 mg あた菌の存在比率に与える影響は比較的小さいことがわりの H2 および CO2 生成量は Control ではそれぞれかった。これは SiO2 NPs が不溶性であり、なおかつ2.5、14.9 µL/mg-feces で あ る の に 対 し、 粒 径 0.3

粒径も比較的大きいことから、腸内菌叢周囲の環境µm の Fe2O3 NPs を 0.14% 含有した飼料を投与したへ与える影響が小さいためであると考えられる。

条件では、24.9、38.1 µL/mg-feces と大幅に増加し、Clostridiaceae 科による H2、CO2 生成量の劇的な増3.3 Fe 2 O 3 NPs の経口投与実験加を確認することができた。以上より、Fe2O3 NPs

粒径 0.3 µm の Fe2O3 NPs を 0.14% 飼料に含有さが消化管を介して過剰量流入すると、腸内細菌叢中せ投与すると、経口投与 11-15 日目にかけてマウの Clostridiaceae 科が優勢化して菌叢構造が変化し、スの体重が激減し、全てのマウスが下痢を発症した。この原因が Fe2O3 NPs による腸内細菌叢の変化にあるのではないかと考え、マウスが下痢を発症する前、発症した際、下痢から回復した後の糞便を採取し、腸内細菌叢における構成菌種の存在割合を測定し、Fig. 5 に示した。図より、下痢を発症する前と治癒した後の腸内菌叢における、Clostridiaceae科の存在比は数 % であったが、下痢を発症した際の腸内菌叢では Clostridiaceae 科の存在比が約 40% まで増加していた。Clostridiaceae 科には、C. difficileや C. perfringens など下痢の原因菌が多く分類され

Fig.6

Fe2O3NPs 投与マウスから採取した腸内細菌叢を用いた発酵試験における、（a）水素、（b）二酸化炭素生成量の経時変化（培養温度 37℃、エラーバーは独立した 3 サンプルの標準誤差を示す）

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浦上財団研究報告書

マウスの下痢の原因となることが示唆された。これは Fe2O3 NPs が、SiO2 NPs とは逆に粒径が小さく、また Fe が可溶性であるためだと考えられる。
以上の結果から、食品添加物ナノ粒子は、可溶性

Vol.25（2018）

謝辞本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました 公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者の皆様に篤く御礼申し上げます。

で粒径の小さなものほど、過剰摂取により腸内細菌叢の構造を大きく変化させ、下痢の原因菌であるClostridiaceae の優勢化により、消化器官に関連する疾病に繋がる恐れのあることが明らかとなった。

参考文献

1) H. Hove et al .（1999）European Journal of ClinicalNutrition, 53(5), 344-345
2) K. Ueki 嫌気微生物学 (1993)
3) Y. Zhang et al .（2015）Environmental Biotechnology,
99, 6091-6102
4) L. Marks et al .（2002）J Vet Intern Med, 16,533–540

Analysis of changes in the intestinal flora due to food additive nanoparticles

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Analysis of changes in the intestinal flora due
to food additive nanoparticles
Hayato Tokumoto
Graduate School of Engineering, Osaka Prefecture University
SummaryDevelopments in nanoparticle（NP）production have resulted in theappearance of numerous food additive NPs in the market for the improvementof food texture and color, which are being consumed with increasing frequency.
However, concerns exist regarding the risks of consuming these NPs. In thisresearch, in order to study the effects of such NPs on the intestinal flora, threetypes of NPs, viz. , anatase TiO 2 NPs with a nominal particle size of 0.5 µm,
SiO 2 NPs with a nominal particle size of 0.8 µm, and Fe 2O 3 NPs with a nominal
particle size of 0.3 µm, were orally administered to mice, and the excreted
feces were analyzed for intestinal flora. When either insoluble TiO 2 NPs or SiO 2NPs were orally administered, the proportion of the useful intestinal bacteria,
Lactobacillaceae , present in the intestinal flora decreased. Moreover, when
only TiO 2 NPs were administered, Clostridiales , which cause diarrhea, exhibiteda slight predominance, whereas this phenomenon was not seen with SiO 2 NP
administration. However, when excessive soluble Fe 2O 3 NPs, whose particle size
is small, was administered, there was a dramatic increase in the Clostridiaceae ,and all of the mice developed diarrhea. These results indicate that the excessive
consumption of soluble food additive NPs having a small particle size causes
large changes in the intestinal flora composition, and there is a risk that these
could lead to digestive tract disorders due to the increasing predominance ofClostridiaceae .