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スパイスを用いた歯周病バイオフィルム制御法に関する研究＜平成 25 年度助成＞

スパイスを用いた歯周病バイオフィルム制御法に関する研究
中

尾龍

馬

国立感染症研究所細菌第一部第六室（口腔細菌感染症室）

い。本研究では、このような歯周病原細菌の中で背景と目的も、特に病態形成に深く関与すると考えられてい薬剤耐性菌、エボラ、新型インフルエンザ、ジる Porphyromonas gingivalis に対し、Cu, Gi, Cl のカ熱など、世界各地で新興・再興感染症が頻発し、3 種類のスパイス、特に Cu を中心とした抗菌作用、医学的かつ社会的な懸案事項となっている。このおよび Cu 含有軟膏の歯周病患者への投与によるような背景のもと、新たな感染症治療法への応用治療効果について検討した。

可能性を秘めた抗菌活性を有する食品に注目が集まっている。食品は安全性に優れ、また使用者に方法安心感を与えることから、様々な感染症分野でのP. gingivalis、および 8 株の口腔レンサ球菌を実応用が期待されている。本研究で対象疾患となっ験に供試した（表 1）。各スパイスからエタノールた歯周病は、ヒトにおいて最も罹患率の高い感染抽出物を得て、各実験に供試した。各種細菌の生症であり、口腔のみならず様々な全身疾患とも関育に対する効果は、CLSI（Clinical & Laboratory

連している 1 ）。

Standards Institute）ガイドラインに準じた最小

歯周病原性細菌として Red complex と呼ばれる発育阻止濃度（MIC）の決定 5 ）、殺菌性試験等に細菌群が知られている。これらはいずれも偏性嫌より評価した。各食品添加による菌体の形態変化

気性のグラム陰性桿菌であり、歯周ポケット内とは電子顕微鏡観察、および原子間力顕微鏡を用いう嫌気環境下でバイオフィルムを形成し生息しいたリアルタイム動画撮影システムにより評価している。たとえばジンジャー（Gi）、クローブ（Cl）た。さらに、歯周病患者の歯周ポケットへのカレーについては、歯周病原性細菌に対する抗菌効果がリーフ軟膏投与による歯周病の改善効果につき、2,3）。カレーリーフ（Cu）については、被験者 23 名のランダム化比較介入試験により調インフルエンザや下痢、がんなどに対する民間療

べた（図１）6 ）。評価項目は、歯肉溝滲出液および示されている法として用いられてきた歴史がある。またプロポ
リスは、樹液や花粉等にミツバチの唾液を混ぜ合わせて作られる樹枝状の物質であるが、歯周病原性細菌に対する抗菌効果が報告されている 4 ）。しかしながら、これら食品による殺菌作用機序やその殺菌過程の詳細な検討は行われていない。また、過去の文献を渉猟した限り、歯周病臨床で汎用される歯周ポケット用軟膏という剤形での投与、歯周病への治療効果についての報告はなされていな

表1

MIC of ethanol-extracted curry leaf to strainsused in this study

Strains

MIC (μg/ml）

Streptcoccus mutans
UA159
Streptcoccus mitis
ATCC 6245
Streptcoccus anginosus
ATCC 3397
Streptcoccus sobrinus
ATCC 6715
Streptcoccus gordonii
ATCC 10558
Streptcoccus salivalius
ATCC 9795
Streptcoccus sanguinis
ATCC 10556
Streptcoccus oralis
No.10
P. gingivalis ATCC 33277

4848
48 <4848
48 <4848 <32Ò 1. ƘõŸƀ:ŉL浦上財団研究報告書 Vol.24（2017）54

図1

臨床研究の流れ唾液中の各種口腔細菌数のリアルタイム PCR によは、口腔レンサ球菌群よりも P. gingivalis に対しる定量、歯周病の臨床評価項目の測定であった。て高かった（表 1）。電子顕微鏡や原子間力顕微結鏡を用いた観察（図４、５）では、Cu 添加により果

P. gingivalis 菌体表層に直径 100 nm 以下の小胞

Cu, Gi, Cl の P. gingivalis に対する MIC は、そを形成することが明らかとなった。また Gi を P.

れぞれ 32、16、64μg/ml であった（表 1 & data

gingivalis に添加すると、Cu を添加した時と同様not shown）。これら 3 種のスパイスはいずれも P.に菌体表層に小胞を形成したが、Cu の時よりもgingivalis に対して増殖を阻害（図２（Cu) & data

大きな 100 nm 程度の小胞を形成することが明らnot shown）した。Cu, Gi, Cl のうち 2 種を同時かとなった。また Cl を P. gingivalis に添加すると、投与した時に、相加効果は認められたが、相乗効菌体表層に亀裂が生じ、その後溶菌することが明果は認められなかった（data not shown）。殺菌らかとなった。一方、アンピシリン処理では、一試験では、30 分間の Cu 処理により P. gingivalis部の菌において溶菌している像が観察されたが、を完全に殺菌することができた（図３）。また Cu,形 態 変 化 を 伴 わ な い 菌 体 も 多 か っ た（data not

Gi は 100 ℃、20 分の熱処理でその殺菌活性が維shown）。テトラサイクリンは P. gingivalis の形態持された（data not shown）。Cu の発育阻止効果変化を引き起こさなかった（data not shown）。
1000.8

Òǣ.80ÁſƝ­5 30 ©ǉ§šÿ: P.

20

図2

Growth curve of P. gingivalis in the presence of Cu at
different concentrations

urryleline
C

50m

40

A

30Time(h)ycrolon
t

20

C

10Ve
hic0le0.0

af00.1

rac0.2

40

lin

0.3

ĿƺTet0.4

60
gingivalis:[kûČ·(CFU):

piciVehicle control2 µg/ml
4 µg/ml
8 µg/ml
16 µg/ml
32 µg/ml

0.5100

図3

各種薬剤で 30 分間処理後の P. gingivalis のコロニー形成単位 (CFU) の比較

80(%)

OD620

0.6

CFU (%)

0.760

スパイスを用いた歯周病バイオフィルム制御法に関する研究

図4図5

各種薬剤で 30 分間処理後の P. gingivalis 形態の比較（走査型電子顕微鏡）

各種薬剤添加後の P. gingivalis の経時的形態観察（高速 AFM、上：Cl、下：Cu）

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浦上財団研究報告書

Vol.24（2017）

In vitro で P. gingivalis への効果が高かった Cu

gingivalis などの歯周病原性細菌群に比べていずと、先行研究でやはり効果の高かったプロポリス

れも低い結果となった（表 1）。歯周病に使用するを用いて介入型の臨床研究を行った。Cu および抗菌薬としては、口腔常在菌叢には影響が少なプロポリスを含む含有軟膏の歯周ポケット内投与

く歯周病原性細菌に選択的に作用するものが望し、口腔内の微生物学的プロファイリング（図 6）ましい。この点で、Cu は歯周病予防・治療薬とと歯周病に対する治療効果などを調べた。唾液

しての好ましい性質を有しているといえる。ま

中の総菌数は、ミノサイクリン抗菌薬投与群ではた、Cu は静菌性のテトラサイクリンとは異なり、全 6 名において増加した一方で、プロポリス投与

歯周病原性細菌 P. gingivalis に対して殺菌的に作群では 6 名中 5 名が減少した。また、プロポリス用した（図 3）。殺菌性の抗菌薬であるアンピシリ群の 6 名の歯肉溝滲出液中 P. gingivalis 菌数につンも P. gingivalis に対し殺菌的に作用したが、30いては、介入前には 6 名全員から P. gingivalis 菌分間の処理によってもコロニー形成は完全に阻害が検出されたが、介入後には 3 名で検出限界（菌できず 10 %程度の菌が生き残った。一方で、Cu数 2.5 × 102）以下となった。Cu 投与群 5 名の唾は、30 分間処理によりコロニー形成を完全に阻害液中の P. gingivalis の菌数４名において減少したした（図 3 ）。これはアンピシリンよりも Cu の方が、統計学的な有意差は認められなかった。まが P. gingivalis を速やかに殺菌できることを示した歯周ポケット深さについては、プラセボ群に比ている。また、原子間力顕微鏡による形態観察か

べプロポリス投与群で有意な改善が認められたら、Cu による菌体表層でのナノレベルでの経時的（ p < 0.05, data not shown）が、Cu 介入による臨な細菌破壊のプロセス、すなわち菌体表層の異常床的パラメータ改善の効果は認められなかった。

な小胞形成のイメージングに成功した（図 5 ）。上考記の原子間力顕微鏡と電子顕微鏡による観察（図察４、5）から、Cu は菌体の膜に作用し溶菌させてい今回、Cu については、口腔常在菌の主たる構ることが示唆された。アンピシリンの作用機序は成細菌であるグラム陽性の口腔レンサ球菌 8 種

細胞壁合成過程での阻害であり殺菌までのタイム

8 株の MIC も同時に調べたが、その感受性は P.

ラグがあるが、Cu の 場合は、おそらく菌体膜に

図6

介入による被験者の各種口腔細菌の定量 ( 上列、下列は、それぞれ唾液、歯肉溝滲出液由
来サンプルのリアルタイム PCR 解析結果を示す。

Pg: Porphyromonas gingivalis, Aa: Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Fn: Fusobacterium nucleatum, Tf: Tannerella forsythia, Td: Treponema
denticola, Pi: Prevotella intermedia)

スパイスを用いた歯周病バイオフィルム制御法に関する研究

直接作用するため、迅速な殺菌が可能であるもの

謝57

辞と考えられた。このような菌体に対する作用機序

研究助成のご支援いただいた（公財）浦上食品・の違いにより、殺菌に要する時間にラグが生じた

食文化振興財団に深く御礼申し上げます。また、ものと推測された。以上より、本研究では、Cu

本研究の遂行にあたり、日本大学小方頼昌先生との P. gingivalis に対する速やかな殺菌性とその実ご教室の皆様、日本大学森永康先生、日本大学古際の殺菌過程における形態変化を明らかにする

川壮一先生、感染研小原佳子様、感染研斉藤典子

ことができた。今後は、Cu 中の抗菌物質の同定、様、感染研吉益由莉様、感染研松本千奈様、株式および細菌側の作用点の詳細な解明が課題である。

会社オリンパス医療イメージング開発本部 MST

一方で、歯周病患者を被験者として、Cu 軟膏推進部開発 2G の皆様にご指導とご協力をいただ

等による介入研究を行った。Cu 投与群において、きました。謹んで御礼申し上げます。

一部の歯周病原性細菌を減少させる傾向は見られたが有意差は見られず、また歯周病の病態（歯周文ポケット深さ等）改善は認められなかった。した1) Lamont RJ, Jenkinson HF (1998) Life below the gum line:
pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis.
Microbiology and molecular biology reviews : MMBR 62 :1244–1263.

がって現時点では、Cu が歯周病の病態改善に効果があるのかどうかは明らかではない。今後は、歯周病治療に効果的な投与量、回数（頻度）などについて詳細に検討することで、これを明らかにできる可能性がある。
結論
Cu は P. gingivalis に対して、その菌体表層での速やかな小胞形成を促し、30 分という短時間でほぼ完全に殺菌する。また Cu 軟膏による唾液中のP. gingivalis が減少する傾向が見られたことから、歯周病の予防・治療薬としての応用の可能性が示唆された。

献2) Math MV, Balasubramaniam P. (2004) Curry leaves. Br
Dent J. 13 ; 197(9) : 519.
3) Cai L, Wu CD. (1996) Compounds from Syzygium
aromaticum possessing growth inhibitory activity against
oral pathogens. Nat Prod. 59(10) : 987-90.
4) Park M, Bae J, Lee DS. (2008) Antibacterial activityof [10]-gingerol and [12]-gingerol isolated from ginger
rhizome against periodontal bacteria. Phytother Res.
22(11) : 1446-9.
5) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
www.clsi.org/6) 臨床試験登録情報「プロポリスおよびカレーリーフの歯周ポケット内投与による口腔細菌叢に対する効果の検討」ID : UMIN000013850.

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浦上財団研究報告書Vol.24（2017）

Antimicrobial effect of herbs on periodontopathic bacteria
Ryoma Nakao
Laboratory of Oral Bacterial Infection, Department of Bacteriology I
National Institute of Infectious Diseases
Periodontitis is an oral disease characterized by destruction of periodontal tissues
and ultimately exfoliation of the teeth in humans. Recent reports have shown association
between periodontitis and systemic diseases such as diabetes mellitus, cardiovasculardisease, and atherosclerosis. In our in vitro screening of a wide range of natural products,
curry leaf, clove, and ginger, were found to be potential antibacterial agents against
periodontal pathogens. We investigated the antimicrobial effect in details of these threedifferent spices on periodontopathic bacteria, especially Porphyromonas gingivalis as animportant pathogen for the commonest infectious disease. P. gingivalis showed the higher
sensitivity to curry leaf than all tested 8 oral streptococci, regarded as major commensals.
Curry leaves showed marked bactericidal action against P. gingivalis, and the complete
killing was accomplished within 30 min. The killing speed was superior to those of twostandard antibiotics, tetracycline and ampicillin. We also succeeded in real-time imaging
showing the process of cell death of P. gingivalis after curry leaf treatment by using atomic
force microscope, demonstrating that aberrant membrane blebbing followed by bleb fusion
events were induced by addition of curry leaves.
We also examined whether the topical administration reduces the amounts ofperiodontopathic bacteria and further improves clinical parameters of periodontal tissues.
Four of 5 subjects in curry leaf group decreased the numbers of P. gingivalis after theinterventions.
We suggest a possible therapeutic application using curry leaves to periodontal
diseases, which may achieve rapid elimination of P. gingivalis from periodontal pockets tokeep minimum influence on microbial homeostasis in oral cavity.