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浦上 財 団研 究報 告書VoL6(1998)

辛 味 受容体 タンパ ク質 の単離 と構 造解 析

河1.はじめ に田2.辛照雄(京 都大学大学院農学研究科助教授)

味 お よび副腎 か らの カテ コールア ミン分
泌 を指標 と した生 体 におけ るカプサ イシ ン

香辛料 は,味 覚,嗅 覚,視 覚 など様々 な感覚神
同族 体(カ プサ イシ ノイ ド)の 構 造認 識
経へ の刺 激 を介 して,食 味 を向上 させた り,単 調な食 品の風味 に変化 を与 えて食欲増 進 をもた らす。

トウガラ シ果 実 中に はカプサ イ シン以外 に図2

この よ うな特 性 は,現 代 の食 品加工 並び に調理 にに示 した様 に多 くの同族 体が存 在す る ことが知 らは必 要不可 欠な要素 とな って きてい る。香 辛料 のれてい る。 これ らの 同族 体 はカプサ イ シノイ ドと特性 なかで,最 も多 用 され てい る ものが,ト ウガ総 称 されてい る。カ プサイ シノイ ドは,構 造 的 にラ シやコ シ ョウ に代 表 され る辛味 特性で ある。 こは類似 してい るが辛味 の点で は大 き く2種 類 に分れ らの辛味成 分 は,痛 覚 あるい は温覚 を刺 激す る

別 され る。す なわ ち辛 味 を有 す るグルー プ と辛味ことに よって辛味特 性 を発 現す る もの と考 えられのない グルー プで ある。既 にわれわ れ は辛 味を有て いる。 また,こ れ らの多 くの辛 味成 分は,図1する カプサ イシンが,交 感神 経 を刺 激 し副 腎か らに示 した ように化学 構造上 類似 し,辛 味 の程度 とのカ テコール ア ミン(ア ドレナ リンお よびノル ア

構造 の間 には,い わゆ る構 造活性 相関が 成立 するドレナ リン)分 泌 を充 進 してエネ ルギー代 謝 を促ことが知 られ てい る1)。この こ とか ら,生 体 にお進す る こ とを見 い だ した3,4)。
そ こで辛 味 の な い

ける辛味成 分分子 の認識機 構 は,か な り厳密 であカプサ イ シノイ ドが,辛 味 のあ るカプサ イシ ンなるこ とが推 察 され,辛 味 成分分 子の受容 体(レ セどと同様 に生体 に認識 され エネル ギー代謝 を促進プ ター)の 存在 お よび構造 が推 察 され てい る1,2)。 す るか 否か をラ ッ トの副腎 か らの ア ドレナ リン分
また,ト ウガ ラシ辛味成 分感受 性神経 が存在 する泌 を指 標 にして検討 した。 その結果,脂 肪 酸側 鎖との報告 もあ る。 そ こで本研究 にお いては,ま ずがC9か

最初 に トウガ ラシ辛味成 分,カ プサ イシンの生 体

らのア ドレナ リ ン分 泌 を充 進 した(図3)。C9によ る認識 機構 の解析 を行 うために カテ コー ルアか らC12ま では辛味 を有す るが,一 方C14か らCミンの分泌 と辛味 を指標 としてカプサ イ シン同族

18ま では辛味 を有 さない こ とか ら,ア ドレナ リン

体 の構造 との関係 を検討 した。 さ らにその辛味 成

分泌 のため のカプ サイ シノイ ド構造 の生体 認識 は,

分 感受性神 経の 窓口 とも言 える辛味受 容体 タンパ

必ず し も 「辛 味」 が必須条 件で はない こ とが判 明

ク質 をラッ トよ り単離 し部分構 造 を決 定す る ととした。 さらに,構 造 認識機 構の詳細 を明 らか にす

もに,遺 伝 子工 学的手 法を用 いてそ の全構造 を明るために,カ プサ イシ ン受 容体(推 定)の ア ンタ

らか にす る ことを試み た。

ゴニス トで あ るカ プサゼ ピン5)(図4)を
C18‑VAとらC18ま でのカ プサイ シノイ ドは副腎 か用いてカ プサ イ シン受容 体 との相 互作 用 を検討 した。 その結 果,カ プサ イシン による副 腎か41

辛味受容体 タンパク質の単離 と構造解析

図1主な香辛料の辛味成分の名称と化学構造

らの ア ドレナ リン分泌 はカプサ ゼ ピンに よって有意 に抑制 された が,C18‑VAによ るア ドレ ナ リン分 泌 は ま った く影響 されな か った(図5)。

従3.カプサイ シン同族体 の構造 と辛味 関連SP
感受性 神経って,辛 味 を もた ない カプサ イシ ノイ ドの ア ドレ

辛 味は,一 種の痛 覚(さ らには温覚)刺 激機構

ナ リン分泌促 進作 用 は,辛 味 を もつ カプサ イシンを介 して発現 され る と考 え られて お り,こ の機構

な どとは別 の受容機 構 を介 して行われ てい るこ とに は内因性神 経情報 伝達 物質 であ るP物 質(sub‑が推察 され た。す なわ ち,カ プサイ シン及び そのstanceP:SP)が同族体 に は少 な くと も2種 類の 受容体 及び受容 機激機構 の経路 を介 してい るか否か を判定 する には,構の存 在が示 唆 された。

脊髄 内のSP濃介在 してい る。 従 って,痛 覚刺度 を測定 すれば可 能 となる。 そこ42

浦上 財 団研 究報 告 書Vol.6(1998)

図2カプサイシン同族体(カ プサイシノイ ド)の化学構造と辛味
CAP:カ アサ イシン,C18:オ レイルバニリルアミド(C18‑VA)

味 のな いC18‑VAにお いて は全 く認 め られ なかった。 この こ とか ら,辛 味 の ないC18‑VAは少

な くとも痛 覚刺激 機構 において構 造認識 され てい
な い ことが明 らか とな った6)。この結 果 と上記 のア ドレナ リン分泌 の結果 とを考 え合わ せる と,以下の 二つ の経路 の存在が推 察 された。 こ こで カプサ イシ ン受容 体 は,辛 味 に対す る もの を1型,また非 辛味性 カプサ イシ ノイ ドについて は2型 と定義 した。
経路A:
辛味カプサイシノイ ドー→カプサイシン受容体1型 一→
図3カ プサイシノイ ドによるラッ ト副腎からのア ドレナ リン分
泌促進効果
各カプサ イシノイドは655nmo1/kg大 腿静脈か ら投与 した4)。
VA:バ ニ リルア ミン

交感神経一痛覚神経刺激(SP)一→ア ドレナリン分泌経路B:
非辛味力プサイシノイ ドー→カプサ イシン受容体2型
一→交感神経一未知神経刺激一→ア ドレナリン分泌4.辛味 受容体 タンパ ク質の精 製 と遺 伝子 のク ローニ ング

上 記の結 果か ら少な くと も2種 類の辛 味成分 受
容体 の存在 が示唆 された ため,先 ず カプサイ シ ン
図4カプサゼピンの化学構造式5)な どの辛味 を受容 する カプサイ シン受容 体1型 にで,ヒ トにおい て辛味 を有 す るカプサ イ シンと辛つ いてその構 造的 な諸性質 を明 らか にすべ く受 容

味 を有 さな いC18‑VAのSP分体 タンパ ク質の精製 と遺伝 子の クロー ニン グを試泌へ の 影響 を比較す る ことに よって実験動 物で の辛味 発現の構 造的知見 を得 る ことを試 みた。 その結果,図6にした よう に実 験動 物脊髄 内で のSP濃示み た。
方 法1:カプサ イシ ン結 合 タンパ ク質 の精製

度 の上昇 は,生体 の粘膜 組織 および舌 上皮組 織 はカプサ イシ

カ プサイ シンに おいて顕著 に認 め られ た もの の辛ンの辛 味 を敏 感 に感 受す る ことか らそれ らの組 織

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辛味受容体タンパ ク質の単離 と構造解析

図5カ プサイシン及 び非辛味性カプサイシノイ ド(C18‑VA)投与による副腎か らのア ドレナ
リン分泌に及ぼ すカプサイシン受容体 アンタゴニス ト,カ プサゼ ピンの影響
ヵプサイシン及びC18‑VAは30nmo1/kgを経 口投与 した。
カブサゼピンは170nmo1/kgを カプサイシンノイ ド投与1時 間お よび5分 前に投与 した。

ク質 は得 られなか った。
方法2:RT‑PCRによるカ プサイ シン受 容体

候 補の 同定
カプサ イシン は,そ の分 子内 に中鎖脂肪 酸の構
造 を有 して お りカプサ イシン受容体1型 は厳密 にこの脂肪酸構 造 を認 識 してい る。 そ こで この特性と類 似の性 質を有 する ことが知 られて いる脂肪酸結合 タ ンパ ク質(fattyacidbindingprotein)やス カベ ンジ ャー レセ プター(SR‑BI),脂肪 酸結合受 容体(oxidisedlowdensitylipoprotein,
CD36/FAT,LIMPII,CLA‑1)の
図6カ プサイシ ン及び非辛味性 カプサイシ ノイ ド(C18‑VA)投与によるマウス脳脊髄液(CSF)中のP物 質(SP)濃 度変化に及ぼす影響
ペ ントバ ルビタール麻酔下の マウスに カプサイシ ン及びC18‑VAは30nmol/kgを経 口投与 し経時的に脳 脊髄液 をサンプ リン グした。SP濃 度はケイマン社製のEIAキ ットにて定量した。

びcDNA情タ ンパ クお よ報(ア ミノ酸 配列 も しくは塩基配 列)を も とにディ ジェネレー シ ョンプライ マー を作製し,RT‑PCRを行 っ た。鋳 型mRNAは類 を用い た。にカプサ イ シン受容体が 豊富 に存在 する と考 え,これ らの組 織か らカ プサイ シンに特異 的 に結 合す
る膜 タ ンパ ク質 の単離精 製 をラ ッ トを用 いてカ プサ イシ ン結合 アフ ィニ テ ィー カラム にて行 った。
しか しな が ら,結 合 タンパ ク質に対 する カプサイシンの結 合が弱 いため か特異 的に結 合す るタンパ

ラット

舌上 皮組織 よ り抽 出 し,プ ラ イマー は以 下の8種

primer1;5'GA(A/G)(A/C)T(G/C)(T/C)T(G/C)TGGG(T/C)TA(T/C)AA(A/G)GA3'
primer2;5'GT(G/C)CC(A/G)TT(A/G)
ATCAT(A/G)T(T/C)GCA3'

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浦上 財 団研 究報 告書Vol.6(1998)受容体 の遺伝 子を脊髄 後根神 経節 か らクローニ ン

primer3;5'AA(T/G)C(T/G)(A/G)TA(G/C)(A/G)(T/C)GGGGAT

グす る ことに成功 した こ とがNature誌(T/G)CCTT3'

れ た8)。この受 容体 の ア ミノ酸 数 は838個で あ りに発表 さ

6回 膜 貫通型 のイ オンチ ャネル と して機能 していprimer4;5'GT(G/C)CCATT(A/G)AT‑

る こ とが示 されて いる。彼 らの成 功の ポイ ン トは,

CATGT(C/T)(G/A)CA3'
primer5;5'CCACAAGAGTTCCTTCAAAC

カ プサイ シン による生 体反応 の情 報 としてCaイ

3'

オ ン濃 度 の細 胞内変 化 を指 標 として遺伝 子の クロ

primer6;5'CTCTGTATGTGTAAGGACCTC

ーニ ング を行 った 点で ある と思 われ る。 彼 らは,
このレセ プター をカプサ イシ ンのみな らず痛覚 刺3'

激物 質 も含 めた広 義の レセプ ター と解釈 しバ ニロ

primer7;5'GACTCGAGTCGACATC‑GATTTTTTTTTTTTTTTTT

イ ドレセ プタ ー(vanilloidreceptor)と3'[(dT)17‐adapterprimer]て いる。 このバニ ロイ ドレセ プター は神 経節 か ら
クローニ ング され た ことか,こ の受容 体が実 際のprimer8;5'GACTCGAGTCGACATCGA3'

RT‑PCRの命名 し[adapterprimer]

口腔 内で の食品 レベル の 「辛味 」の受 容に実 際に結 果,脂関与 して いるの か どうかな どの検証が 今後必 要 と

肪酸 結合 ドメイ ン を有する可能性 の高 いい くつかの クロー ンが得 られたの

考 え られ る。

で そ れ ら を プ ロ ー ブ と して ラ ッ ト舌 上 皮 組 織 由 来のcDNAラ

イ ブ ラ リ ー の ス ク リー ニ ン グ を 行 っク ロ ー ン が 得 ら れ た が,塩本研究 を遂行 する にあた り,研 究助 成金 を賜 り

数 の ポジ テ ィブ

ま した浦 上食品 ・食文化 進行財 団 に心 よ り感 謝の基 配列 を調べ た ところ

意 を表 します と共 に貴 財団の益 々の ご発展 を祈念た η。 ス ク リ ー ニ ン グ の 結 果,多す べ て の も の が 既 知 のCD36/FATおよび スカベ申 し上 げます。

ン ジ ャ ー レ セ プ ター 等 の 塩 基 配 列 と 一 致 し カ プ サ
イ シ ン受 容 体 候 補 の もの は 得 られ な か っ た 。

文献1)J.SzolcsanyiandA.Jancso‑Gabor:Arzneim‑Forsh,25,

5.おわ りに

1877(1975)
2)A.Szallasi:Gen.Pharmacol.,25,223(1994)

上述 の ようにカ プサイ シン受容 体に は少な く とも2種 類 の タイ プが 存在 し生理作 用 を発 現す ることが判 明 し,遺 伝子 の クローニ ング を試 みた。 し3)T.KawadaetaL:Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,188,229(1988)
4)T.Watanabeetal.:Am.J.Physiol.,255,E23(1988)
5)C.A.Maggietal.:Br.J.Pharmaco1,,108,801(1991)

か し残 念なが ら新規 の遺伝 子 は単 離出来 なか った。

6)K‑M.Kimetal.,J.Nutr.,128,inpress(1998)

ところが,わ れわ れの本研 究実施 の途 中,1997年

7)T.Fukuwatarietal.:FEBSLett.414,461(1997)10月米 国カ リフ ォルニア大 学の研 究者 らがわ れわ

8)M.J.Caterinaetal.:Nature,389,816(1997)

れの想 定 したカ プサイ シン受容体1型と思わ れる

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Isolationandanalysisofcapsaicin‑pungentreceptor

Isolationandanalysisofcapsaicin‑pungentreceptor
TeruoKawada(DivisionofAppliedLifeSciences,GraduateSchoolofAgriculture,KyotoUniversity)

Capsaicinisamajorpungentprincipleofhotpepper.Capsicumfruitsarenowoneof
themostwidelyconsumedspicesandhavebeenusedtoflavorfoodsbecauseoftheirpungency,color,andaroma.Atpharmacologicaldoses,capsaicinexertsvariousinterest‑
ingactions:long‑lastingorpermanentdesensitizationofchemicalnoxiousstimuliwith
destructionofnerveendingsofprimaryafferentsordepletionofputativepeptideneur‑otransmitters,i.e.,substanceP,CCK,orcaltitoningenerelatedpeptide.Thephar‑macologicalactionsofcapsaicinhavethereforebeenstudiedintensively.Inspiteofits
extensiveusageinfoods,informationonthepungentacceptance,capsaicinreceptor,issparse.
Inthisstudy,itwassuggesttedthatcapsaicinanditsanalogsacceptancepathways
withorwithoutpungencyactedonthephysiologicalfunctionofcapsaicinanditsanalogs
viaadrenarinesecretionfromadrenalmedullainrats.Theyweretermedthereceptor
capsaicinreceptortype1(pungentacceptance)andtype2(non‑pungentacceptance).
Andthen,theisolationofcapsaicinreceptorinoralcavitysensoryremainsunsolved.But,
recentlythegenecloningofred‑hotrecptorlikeasourcapsaicinreceptortypelfrom
brainwasreportedinNature.Thisreceptormayrelatetoacceptanceoforalcavity
sensory,pungency.