12浦上 財 団研 究報 告書VoL13(2005)〈
平成14年 度〉

食 品 中 におけ るVNC細 菌 の危 険性 評価 に関 す る研 究

牧

野

壮

一

(帯広畜産大学大動物特殊疾病研究センター教授)
PassageinmicecausesachangeintheabilityofSalmonellaentericaserovarOranienburgto
surviveNaCIosmoticstress:resuscitationfromtheviablebutnon‑culturable(VNC)state要

け る こ と に よ り食 品 媒 介 感 染 症 の 防 止 に 効 果 が あ

約る と 広 く考 え ら れ て き たL'5"6.'?a31。

しか しながSalmonellaOranienburgの 汚 染 した乾 燥 イカ にら,Salmonellaentericasubsp.entericaserovar

よる集 団食 中毒 が1999年 に発 生 した。原 因食品 由Oranienburgとs.entericasubsp.entericaserovar

来サル モネ ラは食塩耐 性で あったが,患 者 由来株

Chesterには感受性 であ った。両 由来分 離株 はマ ウスへ の毒に 渡 る 食 中毒 が1999年

力はほ ぼ同 じであ ったが,食 塩耐性 の食品 由来株や 胃 腸 炎 を 伴 う1500人

をマ ウス体内 か ら回収 する と食塩感 受性株 に変わた31.3ai。原 因 食 品 は 一 つ の 工 場 で 作 ら れ,生った。一 方,患 者 由来株は マウス体 内 を通過 させが製 造工程 中でサ ルモ ネラの汚染 が起 こった もの

汚 染 さ れ た 乾 燥 イ カ に よ る46都

道府 県に わ が 国 で 発 生 し,敗血症

以 上 の患 者 が確 認 さ れて も食塩 感受性 は変化 しな かった。 サルモ ネラ をと想 定 され た 。 こ の こ と か ら,サ

人工的 に汚染 させた乾 燥 イカを作成 する と,耐 性

水 の 浸 潤 及 び 乾 燥 中 に 生 イ カ に 汚 染 し,し

株の みが 直接 製 品 か ら分離 で きた。 しか しなが

原 性 を 保 持 し て い た と考 え られ た 。

イカ

ルモ ネラは食 塩
か も病ら,食 塩 感受性 株 を人工的 に汚染 させた場 合,蛍Campylobacterjejuni,C.coli,Listeriamono‑

光 染色 で菌体 を観察す る と90%以 上 が生 きてい る

cytognenes,EsherichiacoliやBacillusceYeusな

こ とが確 認で きた。 この ことは食塩 のス トレス存

細 菌 は 乾 燥 食 品 中 で 検 出 さ れ て き だ'U3旧8・27瀞

在 下 で 感 受 性 株 がviablebutnon‑culturable

さ ら に,Vibriocholerae,E.coliOl57:H7,C.jejuni(VNC)状態 に陥 っていた こと を示 唆 している。

この推論 は有効 な増菌 法を使 用すれ ばサ ルモネ ラが 蘇生で きた ことで確 かめ られた といえ る。結論と して,VNC状

態 のS.Oranienburgは

食 塩保 存そ し てSalmonellaspp.な
可 能 な 状 態,す(VNC)状結 果,そ

食品検査 で注意 す る必 要があ る。

理

序

。

ど が 生 きて い る が 培 養 不

な わ ちviablebutnon‑culturable態 に 海 水 や 河 川,そして食塩 か食品 中で 陥 る こ と が 報 告 さ れ て き た'?.9.]1."?3."?6.3⑪.3'?。
そ のされた食 品中 で人 に危 害を与 える可 能性が あ り,

払口
冊

どの

解

れ らの細 菌の生菌 数が過 小計算 され るとされ てOranienburgが

い

る。本

研

究

で

は,な

ぜS.

厳 し い 条 件 下 で 生 き残 る こ とが でき た の か に 焦 点 を 当 て る。

日本で は,生 イ カの 一部 は高濃度 の食塩水 に漬け,乾 燥 させ て,乾 燥 イカ としてス ナ ック菓 子などに食 されて いる。生 もの は高濃度 の食塩水 に漬

材料及び方法(1)菌株 と培地

乾燥 イカ及 び患者 か ら分 離

食品中におけるVNC細 菌の危険性評価に関する研究
Tab且e1

S.Oranienburgisolatesusedinthisstudy

適 当 量 をDHL及

13

びTSAplates上に塗 抹 して,生菌数 を 測 定 し た。
(5)S.Oranienburgのマ ウ ス へ の 感 染 実 験:

6週 齢 の メ ス のBALB/cマス に は,約6.6×105個

ウ スを使用 した。 マ ウのS.Oranienburgを

腹 腔 内

接 収 し た 。 肺 及 び 脾 臓 か ら菌 の 回 収 を 行 っ た 。
(6)実Sai‑1とSai‑2は散発 例 で.他

験 的 に 作 成 した 乾 燥 イ カ か らの サ ル モ

ネ ラ の 回 収 実 験:生は 集 団発 生 例 由 来 株 で あ っ た。

イ カ5gを7%濃に 浸 潤 さ せ,約6.6×10'個
さ れ た9株のs.Oranienburgを使 用 し た(Tablel)。 乾 燥 イ カ の 水 分 活 性 は0.6で あ っ たP。

後,4℃

液体 培

地 は 食 塩 を 含 ま な いnutrientbroth(NB;Difco

で24時

接種

間 培 養 した 。 イ カ を 取 り出 し,45

間 風 乾 し,乾

燥 イカ を作成 した。 そ こに,5mlのbufferedpeptonewater(BPW,pH7.2)

Lab..Mich..USA),Hajnatetrathionatebroth(HTB:Eikenco.ltd.,Tokyo,Japan)そ

℃

で24時

度 の食 塩水のS.Oranienburgをし てbrain

を 加 え,37℃

で1時

DHLplates上に塗抹 した。同 時 に上清 を使 用 し間 培 養 し,そheartinfusionbroth(BHI;DifcoLab.,Mich.,USA)てHTB(IOml)中を 用 い た 。 固 形 培 地 はDHLagar(DHL;Eikenco.

mostprobablenumber(MPN)をltd.,Tokyo)とtrypticasesoyagar(TSA;BBL/Bec

う一方 の増 菌 法 として サ ルモ ネ ラの培 養ろ 液 を

tonDickinson,Mich.,USA)で

ある。

5%濃

(2)Pulsed‑fieldgelelectrophoresis:Pulsed‑
fieldgelelectrophoresis(PFGE)に
析 をGautom等
素従 い実 施 した。使 用酵

はXbalorBlnl(TOYOBO,Tokyo,Japan)

で,解

析

(3)乾

間 増 菌 培 養 し,
計 測 した。 も加 え,増菌 を 行 っ た321。

計測 した。
光

染

色:サ

ル

モ

ネ

ラ

蛍 光 顕 微 鏡 で1000個

よ り行 っ た 。

菌 体はLIVE/DEADBacLightBacterialViabilitykit
染 色 した 。

の 菌 体 を 観 察 した 。

結

果

(1)サ

ルモ ネラのDNA解燥 に 対 す る 感 受 性 の 試 験 方 法:NBで37℃,20時

間 培 養 し た菌 体 を生 理 食 塩 水 で 洗 浄 後,

同 量 の 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し た 。そ の50,ulを450,ul
の 生

(7)蛍

で20時

(MolecularProbes,Netherland)ではGeneNavigator(Amersham

Pharmacia,co.,Ltd)に

度 のBHI‑brothに

同 様 に,MPNをよる遺伝 子解の 方 法1Pにで37℃の 適 当量 を食を 含 む48‑wellmicrotitreplate(Nalge

NuncInternational)内に 移 した 。 そ の 後,プトを 蓋 を し な い で45℃,24時
た 。 そ の 後,滅間 放 置 して 乾 燥 させ

菌 蒸 留 水500,ulをそ の 適 当 量 をDHL及

レー

加 え,懸

びTSAplatesに

濁 後,

菌 数(CFU)(4)s.Oranienburgの験:約108‑109個

食塩 水 中 で の 生存 試のs.Oranienburgを食 塩 水 中 に添 加 し,37℃,24時と考 え られてい るので,9株(Tablel)を用 いて,

遺伝 子 型別 を行 った。予 想通 り,PFGEパ

ター ン

は感染事 例由来株 は同一 で(lanes3‑5and8‑10in
Fig.1),散 発例由 来 とは異 なっ ていた(lanes1,2,
6and7inFig.1)o(2)乾を計 るため に塗抹 した。

析:疫 学研 究31.341

か ら,患 者由来サ ルモ ネラは乾燥 イ カ由来で ある燥 イカ由来s.Oranienburg株の性 質:

9株 の乾 燥 に対す る感受 性 を調 べた。 まずサ ルモ

濃 度 の異 な る

ネラ を食 塩水 に懸 濁 し,45℃ で24時 間培 養 して菌間培 養 した。そ の数の推移 を比較 したが,優 位差 は観察 で きなかっ

14

浦 上財 団研 究報 告書Vol.13(2005)

Fig.iPFGEpatternsofS.Oranienburgisolates.Five
representativeisolatescontainingtwoS.Oranienburg
isolates.Sai‑1andSai‑?,isolatedfromothersporadic
outbreaks.wereanalyzedbyPFGEusingBlnl(lanesl‑5)
andXhol(lanes6‑10).Lanesland6.Sai‑1:2and7.Sai‑2:3
and8.Sa99004;4andA.Sa9911T;5and10,Sa9921K.

た(Table2)。

しか しなが ら生理 食塩水 にサ ルモ

ネ ラを懸濁 後,乾 燥 する と,患 者 由来サ ルモ ネラの菌 数の 顕著 な減 少が 観察 され,Sa99004株

が特Fig.2BacterialcellnumbersofS.Oranienburgin¥aClsolutions.

に顕著 であ った。 一方,食 品由来 株の減 少は顕著
で なく,特 にSa9911T株 で菌数 の減 少が少 なか っ

24時 間後 には100倍程 度 しか減 少 しなか っ たが,た(Table2)。

患 者 由来株Sa99004は7%NaCl水そ のため これ らの2株 を標 準株 と申で24時 間後 にして以 後の実 験に使 用 した。 しか し,サ ルモ ネラ

は生菌数 はゼ ロであ った(Fig.2)。 以上 よ り,食を滅菌 蒸留水 に懸濁 後,乾 燥 して菌数 の推 移 を観品 由来株 は乾燥,す なわち食塩 耐性 で,患 者由来察す ると,全 ての株 は菌数 の減少 は観察 され なか

株 は感受 性で ある と結 論で きた。 またこの違 い はった(Table2)。

寒 天培地 の違 いでの影響 は なかっ た。

そのた め,乾 燥へ の感 受性 は食塩に対 する 感受性 と同 じことであ る と結 論 した。
それ ぞれ の株の 各種食塩 濃度 におけ る生 菌数 を比較 した。 食品 由来 株は17%NaC1水

Table2中で さえ も(3)マウ スへ の病 原性:食 塩 に対 す る感受性が 違 う株 にお いて,マ ウスへ の病原性 の違 いを調べ た。 しか し,全 く差 は観 察で きなか った(Fig.

SureicalofS.Oranienburgisolatesthrooughthedry‑upprocess'.allisolatesn‑ereincubatedinsalineat4bCfor24h.

食品中におけるVNC細 菌の危険性評価に関する研究
A1

B

Fig.3Comparisonofpathogenicity‑ofS.Oranienburginmice.S.OranienburgisolatesSa9911Toffoodorigin(A)andSa990040fpatientorigin(B)wereintraperitoneall}‑injectedintoB‑aLBcmiceandtheviablebacteria≪‑erecountedinliver.spleen,peritonealblood
andfecesevervweekfor4weeksafterinfection,

Table3

NumbersofNaCI‑sensitiveS.Oranienburgrecoveredfrommice

NaCI‑sensitivities.ofamaximumof50colonieswereexaminedbydrysensitivitytests.
ND,notdetected.

3)o
(4)マ

ネ ラにつ いて:患 者 由来サ ルモ ネラは17%NaCl水
ウス感染後 の分離 菌株の 食塩感 受性:

中 で培養 して も耐性 株 は分離で きなか った。 しかマウス感 染後,回 収 されたサ ルモ ネラ50コ ロニー

し,乾 燥 イカの 中で感受性 が変 わるか どうか不 明につい て食塩感 受性 を調べ た。食塩 耐性食 品由来

で あ る。 そ こ で,Sa99004とSa9911T(約6.6×

Sa9911T株 にお いて は,回 収 菌 の内,4‑88%が食

1ぴcells)がイ カと混合 し,乾 燥 イカが作 られ た。

反対 に,

約4.0×108個のSa9911T株 が乾 燥 イ カか ら分離 で

塩 感受性 株に変 化 していた(Table3)。

食 塩感 受性 で患 者由 来株Sa99004を 接種 した場合

きたが,Sa99004株

は,食 塩 感受性 に関 しての変 化は認 め られなか っ

きなか った(Table4)。

た。

蛍光 染色 され調べ た結果,90%以(5)実験的 に作成 した乾燥 イカか らのサルモ(Fig.4)oで は全 くサ ルモ ネラ は分離 で
それ ぞれのBPW懸

濁液 が上が生 きていた

16

浦上 財 団研 究報 告書VoLl3(2005)

Tab且e1

ResuscitationofS.OranienburgcellsuspensionfromVNCstate

OnemlanditsserialdilutionsoftheSa99004cellscontaminated‑BP¥Csuspensionswith
drg‑processedsquids≪sereusedforeachexperimentasdescribedinMaterialsand¥Methods.

(A)

(B)

Fig.dFluorescentmicroscopyassa}‑forviabilityofS.OranienburgSa99‑‑T(.alandSa99004(B)inBPIFsuspensionsrecoveredfrom
theexperimentallyprocesseddriedsquids,(6)VNC状態 の サ ル モ ネ ラ の 蘇 生:サラ をHTBで増 菌 後,MPNが

株 で は,1ml当

た り0‑45(SD=17.76)個

数 で あ っ た(Table4)。
と,1ml当の生 菌

第二 の増 菌 法 で調 べ る

た り225‑550(SDニ187.64)個

数 で あ っ た(Table4)。

ル モネ

計 測 さ れ た 。Sa99004の生 菌

直 接 培 地 に 塗 抹 す る と,性 の 食 品中 では 増殖 が鈍 くな る と考 え られ て いる251。しか しなが らS.Oranienburgが 原材 料 や最終食品 加工 品か ら分離 され たので(Tablel),乾燥 イカは加工 前 もし くは加工 中に高 度の汚 染が起
こっ ていた と考え られた。
MPN法で 約10〜10'個 のS.Oranienburgが 原 因

食材1グ ラム当た りに存在 してい たが,直 接培養

全 く コ ロ ニ ー は 生 育 し な か っ た の で(Table3),
か も法で は20個 程度 しか分離 で きなか った31。この食両 増 菌 方 法 で 蘇 生 さ れ た こ とが 明 らか に な っ た 。

中毒事 例で は,患 者 の主症状 は敗血 症で あ り,そSa99004株

考はVNC状

態 に 入 り 込 ん で お り,しのた めその程 度の低 い菌数 では全 身感染が 起 こ り察に くい とい える。 しか しなが ら,大 量の細 菌が乾S.Oranienburgに 汚 染 され た乾燥 イカに よる集

燥 イカに付着 し,し か もVNC状 態 に入 り込 んで い

団 食中毒 事例 が1999年 に起 きた3L31。食 品及 び患

た ら,通 常 の検出法 では分離 で きないが,感 染 を者 由来株 は それぞ れPFGEフィ ンガー プリ ンテ ィ起 こすで あろ う。Salmonellaは事 実水 溶液 中で急ング法で 同一 と判 断 され たので,サ ルモ ネラに汚

速 にVNC状 態 に入 り込み9・26'321,実
際 に乾燥 イカ染 され た乾 燥 イ カが 原因 の食 中毒 で あ ると結 論

中で はサル モネ ラの 菌数 は保 存中 に徐 々に減少 しされ た。 一 般 に 細 菌 は約0.6程 度 の低 い水 分 活

てい た:i1。この ように食 品中 の汚染病 原菌 の正確

食品lllにお け るVNC細菌の 危険'1'1:;'1̀Tdliに関す るf71究

17

な数が 不明 であれ ば,真 の危険性 の評価 に大 きな

か もしれ ない。 しか しなが ら,マ ウ ス感染実験 を

影響 を与え るであ ろう。

行った結 果,食 塩 感受性 の変化 は毒力 に変化 を及

今 回の研究 では,食 品 由来のサ ルモ ネラは食塩耐性 であっ たが,患 者由来 株は感受 性で あった 。

ぼす ことはな いと考 えられた。
食塩 などで誘 導され る浸透圧 の変化や,熱,そまた,食 品 由来食塩 耐性株 はマ ウス体内通 過後 にして冷 凍な どの種 々の ス トレス条件 下で レ'脚'̀2レ,は感受性 株 に変化 したが,そ の機構 は明 らか には

細 菌 は 自ら を守 るた めにVNC状 態 に 変化 す る。

で きなか った。個 の一方 的な変化 はinvivoで の み

VNC状 態 の細菌 は,あ る種の条件 下で蘇 生が起 こ

起 こ り,invitroで は観 察で きない現 象であ った。

るであ ろ う二層2'『3コ。本研 究で,VNC状

我 々は 以 前,enterohaemorrhagicE.coli(EHEC)Ol57汚態の サル モネラの蘇 生に は増 菌過程 が必要 で,試 験 管内の 方

染 イ ク ラに よる 事 例 を報 告

法 では二種 類の方 法 を示 した。 これ らの 方法が サ

し>a,今 回の サルモ ネ ラの例 と非常 に近い 結果 でルモネ ラの検出 に使用 されるのみ な らず,VNC状

あ った。 す なわ ち,患 者 由来EHECO157は態 の細菌 の数 を測 定す るのに も利 用可能 であ ろう

食塩

感受性 であ り,イ クラ由来株 は耐性 であ った。 さと考 え られた。 食塩な どの浸透圧 に よる遺伝子 レ

ら に食塩 耐 性0157株 はinvivoで 感 受性 に変 化 し

ベ ル での変 化 は い くつ か の細 菌で 報告 され て いた。 これ らの 結 果 か ら,環 境 中 のSalmonellaやるr.i̲.ss。
将来 は サル モネ ラのVNC状 態 の遺 伝 子

Ol57の よう な腸管 病 原菌 の もと もとの 性 質は食レベ ルで の解析が 進み,VNCと塩 耐性 なのか も しれ ない。 しか し,感 染 を起 こす

なる もの と期待 される。

は何かが 明 らか にと,体 内の種 々の環境 変化 で感受性 株に変 わる のResuscitationandsystemicinfectionofSalmonellaentericaserovarOranienburgintheviablebutnon‑culturable(VNC)statethroughmicewithmorphine‑treatment

要

血液 か らサ ルモ ネラを分離 する ことがサ ルモ ネラ

約症 の同定 につなが り,食 品か らの分離が 重要で あ食品 中でviablebutnon‑culturable(VNC)に入る。 しか しな が ら病 原 細 菌 は 簡 単 にviablebut

り込 んだS.Oranienburgの 蘇生 と病原性 につい て

non‑culturable(VNC)に

モ ル ヒ ネ投 与 マ ウ ス を 用 い て実 験 を行 った。

食 品中の本 当の生 菌数が過 少計測 され,通 常の 細入 り込 むr,,n。
この 結果,VNCサル モネ ラは無 処 理の マ ウスで は 完全 に排菌検 査法 では食 中毒 の原 因食品 の判明 を困難 にさ除され たが,モ ル ヒネ投与マ ウス は菌血症 にな り

せ る:3°。病 原菌が 患者か ら分離 され て も原因食 品

死 亡 した 。そ のた めモ ル ヒネ投 与 マ ウス はVNC

か ら分離 で きな いと きは,原 因菌 が食品 中でVNC

サ ルモ ネラの病 原性 を評価す るの に適 している とに入 って い るのか もしれ ない 。す なわ ちVNC状いえる だろ う。

態 の病原菌 は人 に潜在的 に危害 を もた らす といえ

序

論

る。
S.OranienburgとS.Chesterに汚染 され た乾 燥

チ フス以外の サルモ ネ ラは胃腸炎 を起 こ し,食イカに よる46都道 府県 に渡 る食 中毒 が1999年 にわ

品 媒介感染 症の 原因 となる。 食品や患 者yの 分やが 国で発生 し,敗 血症や 胃腸炎 を伴 う1500人以 上

浦 上財 団研 究 報告 書Vol.13(2005)

18の患 者が確 認 された31.:31。
原 因食 品は一 つの工 場

同 量 の 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 し た 。 そ の50,ulを450,ul

で作 られ,生 イカが製造工 程 中でサ ルモネ ラの汚の 生

染が 起 こった ものと想定 され た。 この こ とか ら,

NuncInternational)内

サ ルモ ネラは食塩 水の浸潤 及 び乾燥 中に生 イカにト を蓋 を し な い で45℃,24時

汚染 し,し か も病 原性 を保持 してい たと考 えられた 。 そ の 後,滅た。 実験的 にサ ルモ ネラ汚染乾 燥 イカを作成 する

そ の 適 当 量 をDHL及と,サ ル モ ネラはVNC状 態に 入 り込 み倍地上 に生を計 るため に塗抹 した。

食を 含 む48‑wellmicrotitreplate(Nalge(3)感

育 で きな くな る。多分乾 燥 イカ中 には多 くのサルに移 した 。 そ の 後,プ菌 蒸 留 水500,ulを

加 え,懸びTSAplatesに

濁 後,

菌 数(CFU)染 実 験 と モ ル ヒ ネ 投 与 方 法:6週

モ ネ ラが 存 在 して いた と考 え られる。 しか し,

メ ス のBALB/cマ

VNC状法 に 従 っ て 実 験 を 行 っ た3。0ユmlの態の サ ルモ ネラ の食 品 中か らの 回収 や病レー

間 放 置 して 乾 燥 さ せ

ウ ス を 用 い てBhaskaran等

齢 の
の 方

モ ル ヒ ネの原性 を評価 す るこ とはで きない。 そこで,モ ル ヒ

生 理 食 塩 水 懸 濁 液(体重 あ た り100mg/kg)を

ネマ ウス を用 い る こと によ りVNCサ ル モ ネラの腔 内 に12時

間 後,14日

間接 種 し た 。 マ ウ ス に は,病 原性 を評価 で きる こと を示 した。

約6.6×10"個のS.Oranienburgを結
株 と 培 地:二果

株 の サ ル モ ネ ラ株 を 使 用

し た 。S.OranienburgSa99004株

マ ウ ス の サ ル モ ネ ラ に 対 す る 感 受 性:約6.6×10'は乾燥 イ カに よる 集 団 感 染 に お い て,患者 か ら分 離 さ れ た 株 で ありS.enteritidisstrain363は人 由 来 株 で あ る?3'。液個 のS.OranienburgSa99004株

残 っ て い た(Fig.3)。

DifcoLabo.,Mich,USA)とbufferedpeptone

Sa99004株

あ る 。 平 板 培 地 はDHL

agar(Eikenco.Ltd..Tokyo,Japan)で
(2)乾
℃,20時

ある。

燥 に 対 す る 感 受 性 の 試 験 方 法:NBで37間 培 養 し た 菌 体 を 生 理 食 塩 水 で 洗 浄 後,を腹腔 内感 染 しても マ ウ ス は 少 な く と も40日 間 全 く変 化 が な く 生 き

体 培 地 は 食 塩 を 含 ま な いnutrientbroth(NB;

water(BPW,pH7.2)で腹 腔 内接 種 し た 。

肺 及 び 脾 臓 か ら菌 の 回 収 を 行 っ た 。

材料と方法
(1)菌

腹

か

も

そ の た め,も

し

れ

な

い

と

考

OranienburgstrainSa99004を同様っ と多 くのを投 与す る とサルモ ネ ラ感染 が起 きるに6.6×10'or8.1×102個

strain363もえ,3.6×10y個のs.

接 種 し た 。 ま た,のS.Enteritidis

同 時 に 接 種 し た 。 そ の 結 果,平均 死

Fig.5SurvivalofBALBcmiceagainstSalmonellainfection.Groupsoffivem1cewereorallyinoculatedwithS,Enteritidis(closedsymbols)
andS.Oranienburg(opencircle).P<0.0001forS.Enteritidisvs.S.Oranienburg.¥umbersofsurvivorsoffivemiceineachgroupare
inparenthesis.

食品中におけるVNC細 菌の危険性評価に関する研究

19

A1

B1

Fig.6Survivalofmorphine‑treatedBALBcmiceagainst∫.Oranienburginfection.(A)Groupsof5morphine‑treatedmicewereorally
inoculatedwithvariousnumbersofS.Oranienburg(opensymbols).¥ormalmiceinfectedwith6.3×10'°cellsofS.Oranienburgare
shownasaclosedcircle,P<0.0001fornorlnalmicevs.morphine‑treatedmice、vith6.3×iocells.P〈0.001fornormalmicev's.
morphine‑treatedmicewith32×1αcells.(B)Groupsof5morphine‑treatedmicewereorallyinoculated、、'ithlm'(○),100μ1(口).

10ul(D),andlul(O>oftheBPR'suspensionofV'¥CcellsandsalineO.formalmice(n=5)werealsointraperitoneallyinoculated
wkhlmloftheVNCsuspension(●),No,ofsurvivorsineachgroupareinparenthesis.

亡 日 数 は そ れ ぞ れ3.6と6.4日
対 に,S.Oranienburg接(Fig.5)。

以 上 よ りS.Oranienburgは感 染 す る が,正く,発で あ っ た(Fig.5)。

反種 群 は全 て 生 き残 っ た
低頻 度で は常 なマ ウ スに は毒 力 は非常 に低ル ヒ ネ投 与 マ ウ ス の 感 受 性:モル ヒネ

が 細 菌 感 染 へ の 感 受 性 を増 や す と い う報 告 が あ るの で3.'>°i,S.Oranienburgへ

Oranienburgへの感 受性 が 増す こ とが 明 ら かになった。 サルモ ネ ラの すべて の血清型 がマ ウスに全身症状 を引 き起 こす わけで はない ので,モ ル ヒ

症 は し な い こ とが 明 らか と な っ た 。

(2)モ

菌数で は14日後 で も全てが 生 き残 って いた(Fig.
6A)。 こ の こ と か ら モ ル ヒ ネ 投 与 に よ りS.

の 感 受 性 も増 大 させ る

ネマ ウスを用 いる ことに より全 身感染 を引 き起 こ
すこ とがで きるよ うになる といえる。
(3)VNC状態 のサ ル モ ネラの マ ウス へ の病

こ と が で き る と考 え た 。 同 様 に,VNCSalmonella

原性:VNC状態 のS.Oranienburgの 懸 濁液 を希釈が病 原性 を保持 してい るこ とを確かめ るのに も使して をモル ヒネ投与マ ウス の腹腔内 に接種 した。

用 で きる の で は な い か と 考 え た。種 々 の 数 の

1mlのVNC懸Sa99004株6.3×108と3.2×10"をした とこ ろ,全 て のマ ウス は生 き残 った(Fig.

ス に 接 種 す る と,平モ ル ヒ ネ投 与 マ ウ

均 日 数6.4と7.8日

で全 ての マウ ス が 死 亡 し た(Fig.6A)。2.8×10'と7.1×10一の サ ル モ ネ ラ を接 種 す る と,平
で3お

よ び1匹

個

6B,closedcircle)。 こ のこ とは正常マ ウス はVNC
サルモ ネラの病 原性 を評価す るに は不 適格 であ る
こ とが 言えた。 しか しなが ら,全 て のモ ルヒネマ

均 に 日 数8.3と10日の マ ウ ス を 死 亡 さ せ た が,65個

濁 液 を正 常マ ウ スの腹 腔 内に 接種のウ スは1ml及び100u1のVNC懸濁 液 を投 与 さ れ

浦 上財 団 研究 報告 書VoLl3(2005)

20

ると,そ れぞ れ平均 日数2.6と2.8日で 死亡 し,10,ul

究に利 用 されてい る,i,。
E‑cadherinAtransgenicmiceが接 種群 で は二 匹の マ ウス が平均4.5日で死 亡 した
(Fig.6B)。 モ ル ヒネ投 与 マ ウス は1ulやリス テ リア の

生食

病原性 評価 に利 用 され たが2°,繁殖 とか で維持 が投 与で は死 亡 しなか った。以 上よ りモル ヒネ処理

困難 である。 モ ルヒネ投与 マウ スが病原 菌の病 原

マ ウ スは培 養 可能 なサ ル モ ネラの みな らずVNC

性評 価 に役 立つ か も しれ ない。 ま たVNC細 菌 が状 態の ものへの 感受性 も明 らかに増加 して いる こ

麻薬投 与患者 への リス クも上昇す るであ ろ う。

とを意味 して いる。
2.8×104及び7.1×10一個 の 新 鮮 培S.Oranien‑burgは モ ル ヒ ネ投与 マ ウス を4と2匹
死 亡 させ(Fig.6A),10,ulのVNC懸文

そ れ ぞれ濁 液は3匹 のモル ヒネ投与 マウ スを死亡 させ た(Fig.6B)。

このこ とは10,ul懸 濁液 に は約10'個以上 の病原 性 を
保 持 してい るサ ルモ ネラを含 んでい る と考 え られ

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VNCサ ルモ ネラのMPNは225‑550(SD=187.64)

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個 の 生菌 が1ml中に含 まれ てい る と推定 された(Table3)。 今回 のモ ルヒネ を用 いた系 では,それ よ りも約200倍 高 い数 字が 出た ので,食 品 か ら

Microbiol.12:1‑8.
5)Cappelier.J.NI.,NIinet,J,.Magras,C.,Colwell,R.R..andFederighi.M.(1999)Recoveryinembryonatedeggsof
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菌 体 を回収す るには モル ヒネ投 与マ ウスが 適 しているの か もしれない。

maintenanceofabilitytoadheretoHeLacellsafter
resuscitation.Appl.Environ,MicrobioL65:5154‑5157.

VNC状 態の 細菌 は長い 間注 目されて きたが'〔}1,
試 験 管内 で の蘇生 の みが 報告 され̀'19'28'29'321,in

6)Caro,a.,Got,P..Lesne.J..Binard.S..andBaleux,B.
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vivoでは検 討 されて こな かっ た。 本報 告で モル ヒ
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ルモ ネ ラの蘇 生 を報 告 し7)Cheville,A.vL.Arnold.K.VV.,Buchrieser,C..Cheng,C.

た。原 因 と推 定され る食品 か ら原因 菌を分 離す る

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こ とは非 常 に大 変 なこ とな ので,本 方法 は有用 に

andsalttoleranceinEscherichiacoliO157:H7.Appl.
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なるか も しれ ない。 また,全 ての病 原菌 に対 して

8)Chmielewskl,R.A.,andFrank,J.F.(1995)Formationof

病 原性 を評価 するた めのマ ウスモデ ル系が確 立 しviablebutnonculturableSalmonelladuringstarvationin

てい るわけで はない ので,モ ル ヒネを用 いた本方

chemicallydefinedsolutions.Lett.App1.Microbiol.20:380‑384.

法は有用 か もしれ ない。モ ル ヒネ処 理は哺乳 類のマ クロフ ァー ジの 死 を誘 導す るの で31,モ ル ヒネ
投 与マ ウス は細 胞内寄 生菌 に対 して 特に評価 可能な有用 な方法 であ ろう。例 えば,L.〃aonocytogenes

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浦上財団研究報告書

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StudiesontherecoveringandtheriskofVNC(viablebutnon‑culturable)Salmonella

23

StudiesontherecoveringandtheriskofVNC(viablebutnon‑culturable)
Salmonella
Sou‑ichiMakino(ResearchCenterforAnimalHygieneandFoodSafetyObihiroUniversity
ofAgricultureandVeterinaryMedicine)

AdiffuseoutbreakoffoodpoisoningduetoSalmonellaOranienburg(SO)andS.Chester,causedbytheintakeofcontaminateddry‑processedsquids,occurredinJapanduring1999.
AlltheimplicatedfoodsweremanufacturedbythesamecompanyandwhichwerecreatedthroughtheprocessescontainingsoakinginliquidseasoningwithhighconcentrationsofNaCIpriortodehydration.ThepreservationoffoodsbytheseconcentratedNaCIfollowedby
desiccationiswidelyviewedasaneffectivemeansofpreventingfood‑borneinfections.
Nevertheless,thepathogenwasdetectedfromthecausativefoods,whichledtohypothesize
thatSOcouldundergosoakinginconcentratedNaCIandsubsequentdrying,butstillsurvive
andretainitspathogenicityforhumans.
SOisolatesfromboththecausativefoodsandpatientsintheoutbreak,showedidentical
PFGE(Pulsed‑FieldGelElectrophoresis)patterns,however,theisolatesobtainedfromfoods
showedresistancetoNaCIosmoticstress,whileisolatesofpatients‑originweresensitiveto
NaCI.Inaddition,representativeisolatesofbothsourceswerealmostidenticalintheirvirulenceformice,butaNaCIresistantcellsoffood‑originchangedthephenotypefollowing
passagethroughmice,becomingNaCI‑sensitive.Incontrast,nophenotypicalchangewas
observedinpatient‑originatingisolate.TheSOcellsofpatientisolateformednocoloniesby
directplatingafter24hofincubationin7%NaCIsolutions,butwhichresuscitatedby
appropriateenrichment.Moreover,thenon‑culturablecellsofpatientisolateseemedtobe
viablebyepifluorescentmicrosopyassay,suggestingthatthesignificantlossofculturability
inpatientisolatebyexposuretoNaCIsolutionsmightmeantheentryintotheviablebutnon‑
culturable(VNC)state.WhentheVNCcellsoriginatingfrompatientwereinjectedintomicetreatedwithmorphine,alltheinfectedmicediedwithin3daysafterinfectionandSOcells
wererecoveredfromtheirorgans.Theinvitro/vivoassaysseemedtobeusefulmethods
inducingtheresuscitationfromtheVNCstateinSalmonellaandmightbeeffectiveforotherpathogenicbacteria.
Basedonthepresentstudy,itwasdemonstratedthatSalmonella,recognizedasthemost
majorfood‑borne,zoonoticbacterialpathogen,maintainedthesurvivalinenvironment
containingseveralstressfactorsforthisorganism.Thisstudyannouncestheimportanceof

24

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVo113(2005)

latentviabilityandpathogenicityofSalmonellainhumaninfectionandpartiallyelucidate
geneticalrelationshipwiththephenotypicchange.Finally,theexistenceofVNCSalmonella
leadstoconsiderthenecessityofnewdiagnostictoolsinsteadofgeneralculturingmethods,
whichwouldbeanimportantthemeinthefuture.Thepresentstudywouldcontributeto
suchadetectionandevaluationofpathogenicityoftheVNCSalmonella.