1

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築＜令和元年度助成＞

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

木下英樹（東海大学 農学部）物に対して発酵性試験を行い新たな発酵食品の可能背景および目的性について示した。当研究室では 1,000 株以上のオ
現在、農家の高齢化、若者の減少など日本の食糧リジナル乳酸菌を保有しており、使用する食材、求生産現場が窮地に陥っている。若者の就農者を増やめる機能性に応じた「乳酸菌ライブラリ」の構築をし、日本の食糧問題を解決するためには、農業を魅目指して研究を行っている。しかしながら、本取り力的な職業にする必要があると考えられる。そのた組みは発酵性試験と一部の機能性試験を行っただけ

め、農家が生産（一次産業）、加工（二次産業）、販で、まだ十分とは言えない。そこで本研究では、六売（三次産業）までを行う六次産業が注目されてい次産業化や地域活性化のための新規機能性発酵食品る。六次産業化を行うためには、未利用資源の活用の創出を目指し、先行研究において乳酸菌による発や商品への付加価値の創出が重要になってくる。そ

酵性が優れていた野菜を用いて機能性試験を行い、こで我々は乳酸菌を用いた青果物の発酵に着目し商業利用できる乳酸菌ライブラリの構築を行うことた。乳酸菌は安全性が高く、多くの機能性を有してを目的とした。

いるため商品に付加価値を付けるためにはもってこいの有用微生物である。そこで我々は農家や企業に方法研究室保有の乳酸菌を活用してもらう取り組みを行っている。これまで野菜の乳酸発酵といえば漬物本研究では様々な食品から単離した 13 菌株の乳ぐらいしかなかったが、我々は様々な青果物の抽出酸菌を用いた（表 1）。本研究では乳酸菌で植物ベー表1本研究で使用した乳酸菌

2

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

スの食品を発酵させて機能性を解析することで新しロプレートリーダーにて測定（励起波長 370 nm/

い発酵食品を創出することを目的として実施した。

検出波長 440 nm および励起波長 335 nm/ 検出波長

サンプルとしては年中安定的に入手可能なトマトお385 nm）することで行った。NO 産生試験では、マよびニンジンと、植物代替ミルクとして注目されてウスマクロファージである RAW264.7 細胞を用いているアーモンドミルクおよびオーツミルクを用い行った。まず、WST-8 法にて細胞毒性試験を行った

た。アーモンドミルクは 2 種（グリコ・アーモンド後、毒性が見られないサンプル濃度で培養し上清の効果砂糖不使用および筑波乳業・無添加濃いアーモ

NO をグリース試薬にて検出した。遊離アミノ酸分ンドミルク）、オーツミルク（アルプロ・オーツミ

析は脱脂後、70％エタノール抽出し行った。なお、ルク砂糖不使用）は 1 種用いた。トマトは冷凍トマ

トマトと人参サンプルではアセトンによる脱脂は行

トペーストを解凍したのち、蒸留水と 1：1 の割合でわなかった。HPLC 分析は下記の条件で実施した。

ジュースミキサー（FUKAI 工業株式会社、大阪）を用いて混ぜ合わせ、8,000 rpm、10 min、4℃の条件

カラム：COSMOSIL Packed Column 5C18-AR-Ⅱで遠心分離（株式会社トミー精工、東京）を行った。

4.6ID × 250 mm得られた上清を回収し、5 mL ずつ試験管に分注し、移動相：A：0.05％ TFA 超純水、121℃、15 分間でオートクレーブしたものをトマト培地とした。ニンジンでは細かくカットしたものを

B：0.05％ TFA アセトニトリル
移動相のグラジェント：A：B ＝ 60：40 →90：10（開始から 45 分）

トマトと同様の方法でジュースミキサーを用いて混ぜ合わせ、同条件で遠心分離、オートクレーブをカラム温度：40℃行ったものを培地とした。アーモンドミルク、オーツ

流速：1.0 mL/min

ミルクはそのまま試験管に分注し同条件でオートク

検出波長：210 nm

レーブ殺菌した。なお、アーモンド効果砂糖不使用

サンプル添加量：20 µL

は成分調整アーモンドミルク、無添加濃いアーモン
ドミルクは無調整アーモンドミルクと表記する。こ

結果および考察

れらの培地を用いて培養した乳酸菌を 2％接種にて37℃、24 時間培養した。さらにもう一度新しい培

1．発酵性試験地に継代し、同条件で培養したものを生菌数測定の発酵後の生菌数測定の結果、多くの乳酸菌で 8サンプルとした。また、本培養した発酵物に 70％エ

logCFU/mL 以上と良好な生育を示したが、サンプルタノールを添加し、4℃で一晩保存し成分を抽出しによって生菌数は変動が見られた。トマトでは TK5た。保存したものを遠心分離（8,000 rpm、10 min、株以外は全て 8 logCFU/mL 以上の生菌数を示した4℃）し、上清を採取した。その後、蒸留によるエ（図 1）。TK37 株において最も高い値（8.8 logCFU/タノール除去を行い、凍結乾燥し、抗酸化試験、蛍mL）を示した。ニンジンでは TK65m 以外は全て 8光性終末糖化産物（AGEs）生成阻害試験、一酸化窒

logCFU/mL 以上の生菌数を示した（図 2）。また、素（NO）産生試験、HPLC 分析のサンプルとした。

TK15 株において 9.0 logCFU/mL と最も高い値を示

生菌数測定は BCP 加プレートカウントアガールした。成分調整アーモンドミルクにおいて生育が良にて 37℃で 48 時間嫌気培養することで実施した。

好な菌株は、TK5、17、35、242、244、41m、65m

抗酸化能は DPPH ラジカル消去活性にて評価した。

株で 8 logCFU/mL 以上の値を示した（図 3）。その中蛍光性 AGEs 生成阻害試験はウシ血清アルブミンで、TK65m 株において最も高い値（9.2 logCFU/mL）（BSA）、グルコース、サンプルを混合し、60℃で 40が示された。特に生育が良好であった 6 菌株を用い時間インキュベートした後、蛍光強度を蛍光マイクて無調整アーモンドミルクで生菌数測定を行った結

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

図3

図1

発酵トマトの生菌数測定

図2

発酵ニンジンの生菌数測定

発酵成分調整アーモンドミルクの生菌数測定

3

4

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

果を図 4 に示した。TK5、17、35、242、244、65m

2．抗酸化試験（DPPH ラジカル消去活性試験）株で 8 logCFU/mL 以上の値を示し生育が良好であっ抗酸化測定ではトマトでは TK5 株が高い傾向が見たが、TK41m 株のみ 6 logCFU/mL 以下となった。

られたが（図 6）、ニンジンでは未発酵より低くなる

オーツミルクでは、生育が良好な菌株は、TK5、13、など（図 7）、サンプルによって異なる結果となった。

17、35、37、242、243、244、248、65m、759m

これは乳酸菌が普遍的に作り出されている抗酸化物株であった（図 5）。また、TK35 株において最も高質ではなく、サンプル中の成分の変化（分解、修飾

い値（9.5 logCFU/mL）が示された。ここでも TK41mなど）によるものと考えられた。また、アーモンド株は生育性が良くなかった。

ミルクおよびオーツミルクでは抗酸化能はほとんど見られなかった（図 8 ～ 10）。こちらは脂質成分が多いことが要因の一つと考えられ、脱脂後に再度実施する必要があるだろう。

図4

発酵無調整アーモンドミルクの生菌数測定

図5

発酵オーツミルクの生菌数測定

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

A

B

図6

発酵トマトにおける DPPH ラジカル消去活性試験（A）および IC50 値（B）

5

6

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

A

B

図7

発酵ニンジンにおける DPPH ラジカル消去活性試験（A）および IC50 値（B）

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

図8

発酵成分調整アーモンドミルクにおける DPPH ラジカル消去活性試験

図9

発酵無調整アーモンドミルクにおける DPPH ラジカル消去活性試験

図 10

発酵オーツミルクにおける DPPH ラジカル消去活性試験

7

8

浦上財団研究報告書

3．蛍光性 AGEs 生成阻害試験

Vol.31（2024）

ら AGEs 生成阻害物質が作られているか、乳酸菌の蛍光性 AGEs 生成阻害試験（図 11 〜 15）では、代謝物の中に AGEs 生成阻害物質が含まれている可TK65m 株が多くのサンプルで未発酵より高くなる能性が示唆された。AGEs 生成阻害物質は老化や肌傾向を示した。そのほか TK242 株や TK5 株などものシミ・シワ、様々な疾病に効果が期待できるため高い活性を示したが、サンプルに依存する結果と発酵による AGEs 生成阻害能は非常に有用である可なった。TK65m 株ではサンプルに共通する物質か能性が示唆された。

AB

図 11 発酵トマトにおける蛍光性 AGEs 生成阻害試験
A；励起波長 370 nm、検出波長 440 nm、B；励起波長 335 nm、検出波長 385 nm

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

AB

図 12 発酵ニンジンにおける蛍光性 AGEs 生成阻害試験
A；励起波長 370 nm、検出波長 440 nm、B；励起波長 335 nm、検出波長 385 nm

910

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

AB

図 13 発酵成分調整アーモンドミルクにおける蛍光性 AGEs 生成阻害試験
A；励起波長 370 nm、検出波長 440 nm、B；励起波長 335 nm、検出波長 385 nm

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

AB

図 14 発酵無調整アーモンドミルクにおける蛍光性 AGEs 生成阻害試験
A；励起波長 370 nm、検出波長 440 nm、B；励起波長 335 nm、検出波長 385 nm

11

12

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

AB

図 15 発酵オーツミルクにおける蛍光性 AGEs 生成阻害試験
A；励起波長 370 nm、検出波長 440 nm、B；励起波長 335 nm、検出波長 385 nm

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

13の差は見られなかったが（図 17）、TK243 株で作製

4．NO 産生試験
マクロファージの免疫応答の一つとして NO の産した発酵オーツミルクで NO 産生の増加が見られた生がある。そこで本試験ではアーモンドミルクと（図 18）。NO 産生は免疫賦活化という見方もできるオーツミルクのみ NO 産生試験を実施した。まずはほか、炎症反応という見方もできるため今後はサイ培養細胞への毒性を見るため、WST-8 を用いて細胞トカインなどを見ていく必要があると考えられた。

毒性試験を行ったところ 1 mg/mL では一部毒性がまた、実施できなかったトマトとニンジンについて見られたため（図 16）、0.1 mg/mL で行った。そのの試験も行っていく予定である。

結果、発酵無調整アーモンドミルクではサンプル間AB

図 16

発酵無調整アーモンドミルク（A）および発酵オーツミルク（B）における細胞毒性試験（WST-8）

14浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

AB

図 17

発酵無調整アーモンドミルクにおける NO 産生試験
A；LPS 刺激なし、B；LPS 刺激あり

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

AB

図 18

発酵オーツミルクにおける NO 産生試験
A；LPS 刺激なし、B；LPS 刺激あり

15

16

浦上財団研究報告書

5．遊離アミノ酸分析

Vol.31（2024）

サンプルに含まれるタンパク質量に依存するものと遊離アミノ酸分析では多くのサンプルにおいて未考えられた。また、サンプルに応じて最も高い値を発酵サンプルより多くのアミノ酸が検出された（表示した菌株が異なった。トマトでは、TK243 株（表2 〜 6）
。サンプルにより遊離アミノ酸は異なり、ト2）、ニンジンでは TK244 株（表 3）、成分調整アーマト、ニンジン、アーモンドミルクの順で高く、モンドミルクでは TK15 株（表 4）、無調整アーモン

オーツミルクでは全体的に遊離アミノ酸量は非常にドミルクでは TK17 株（表 5）、オーツミルクでは未低い値となった。製品の成分表によると成分調整発酵物（表 6）が最も高い値を示した。これらは発アーモンドミルクは 100 mL あたりのタンパク質量酵性の違いに加え、乳酸菌が持つプロテアーゼの違が 0.5 g で、無調整アーモンドミルクが 2.3 g あるいによるものと考えられた。のに対し、オーツミルクでは 0.2 g と低いことから、
表2

発酵トマト中の遊離アミノ酸分析（µM）※赤字は最も値が大きいもの

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

表3

発酵ニンジン中の遊離アミノ酸分析（µM）※赤字は最も値が大きいもの

表4

発酵成分調整アーモンドミルク中の遊離アミノ酸分析（µM）※赤字は最も値が大きいもの

17

18

表5

浦上財団研究報告書

発酵無調整アーモンドミルク中の遊離アミノ酸分析（µM）※赤字は最も値が大きいもの

表6

発酵オーツミルク中の遊離アミノ酸分析（µM）※赤字は最も値が大きいもの

Vol.31（2024）

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

6．HPLC による成分のプロファイリング

19

おいては顕著であった（図 19）。今後はこれらのピー

HPLC 分析では 210 nm におけるクロマトグラム

クを分取し、構造解析等による成分の同定と、機能を示したが、未発酵物では見られないいくつかの性解析が必要だと考えられた。また、他の波長でのピークが見られた（図 19 〜 22）。特に、トマトに検出も必要と考えられた。

AB

図 19 発酵トマトの HPLC クロマトグラム（210 nm）
黒色のライン：未発酵トマト、赤色のライン：TK243 株（A）および TK244 株（B）で発酵させたトマト

20

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

図 20 発酵ニンジンの HPLC クロマトグラム（210 nm）
黒色のライン：未発酵ニンジン、赤色のライン：TK5 株で発酵させたニンジン

図 21 発酵成分調整アーモンドミルクの HPLC クロマトグラム（210 nm）
黒色のライン：未発酵アーモンドミルク、赤色のライン：TK5 株で発酵させたアーモンドミルク

乳酸菌を利用した新たな機能性発酵食品の開発と菌株ライブラリの構築

21

図 22 発酵オーツミルクの HPLC クロマトグラム（210 nm）
黒色のライン：未発酵オーツミルク、赤色のライン：発酵オーツミルク

7．最後に謝辞

本試験では、植物由来のサンプルの発酵物を用い本研究は令和元年度公益財団法人 浦上食品・食文て研究を行ったが、サンプルと菌株によって生育性、化振興財団研究助成にて実施されました。この場を機能性、生成物が異なり、これらの組み合わせによ借りて厚く御礼申し上げます。

り無限の可能性のある発酵食品の創出が可能であると考えられた。今後はこれらの機能性成分を同定し、サンプルに応じた最適な乳酸菌の組み合わせについて研究し、使いたい食材と求める機能に応じた乳酸菌ライブラリの構築を進めていく予定である。

22

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

Development of new functional fermented foods using lactic
acid bacteria and construction of a strain library
Hideki KINOSHITA
School of Agriculture, Tokai University
Lactic acid bacteria (LAB) are useful microorganisms that are highly safe andhave many functions. In this study, we investigated the functionalities offermented foods that are made from vegetables and plant-based milk using LAB.
In the results from measuring the viable cell count after fermentation, many
lactic acid bacteria showed good growth of 8 log CFU / mL or more. However,the viable cell count fluctuated depending on the sample. In the DPPH radical
scavenging assay, the TK 5 strain tended to be higher in tomato samples, but
carrot samples were lower than the unfermented sample. In the inhibitory
effect on the production of fluorescent advanced glycation end products (AGEs),
the TK 65m strain tended to be higher than the unfermented strain in many
samples. In the nitric oxide (NO) production test, NO increased significantly inthe fermented oat milk with the TK 243 strain. In addition, many free aminoacids increased in many fermented samples, compared w ith unfermentedsamples. Finally, an HPLC analysis was performed at 210 nm. Some specificpeaks that were not found in the unfermented product appeared in thef e r m e n t e d s a m p l e s . I n t h i s s t u d y, w e i nve s t i g a t e d t h e f u n c t i o n a l i t i e s o ffermented products using LAB. The growth, functionalities, and products
differed depending on the foodstuff and strains. In the future, it will be possible
to develop new fermented foods with functionality.