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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）＜平成 25 年度助成＞

交差反応性・抗原量・形態に着目した
新たな食物アレルギー in vitro 評価法の開発
秋山 晴代 1)・中村 亮介 2)・福冨 友馬 3)・栗原中野 泰子 5)・根来 孝治 5)・宮澤 眞紀 1)

和幸 4)（ 1) 神奈川県衛生研究所 理化学部、2) 国立医薬品食品衛生研究所 医薬安全科学部、
3)
国立病院機構相模原病院 臨床研究センター、4) 神奈川県立こども医療センター アレルギー科、
5)
昭和大学薬学部 遺伝解析薬学教室）

緒

法は、ヒト FcεRI を発現させたラット培養マス

言ト細胞株（RS-ATL8）の転写因子（NF-AT）活性口腔アレルギー症候群（OAS）とは口腔粘膜に化をルシフェラーゼアッセイにより検出する方法

限局した IgE 抗体を介した即時型アレルギー症状であり、感度・特異度が高く、より臨床に近い形のことで、クラス 2 食物アレルギーに分類され、で FcεRI の架橋によるマスト細胞活性化測定を主要な原因食品として生野菜や果物が知られてい行うことが出来る4, 5 ）。さらに、用いる患者検体

る1, 2 ）。OAS 患者の多くはシラカバやイネ科などは−80 ℃で保存の利く血清でよく、固相と液相の花粉症を有しており、シラカバ花粉症では 40が CAP 法などと逆であることから、粗抽出液の〜 50 %が、イネ科花粉症だと 20 %が OAS を合併測定も可能という利点がある。通常、アレルギーしている。の in vitro 検査法は精製抗原を用いて行うのがOAS の診断には血中特異的 IgE 抗体価（CAP-一般的であるが、prick-prick test は新鮮な野菜や果FEIA 法）のほか、prick-prick test の結果を参考物を用いて行うこと、さらに検査の度に野菜や果物にするが、用いるクラス 2 食物アレルギーの原因のすりおろし液を作製するのは手がかかることか

食材（野菜や果物）は、アレルゲン性が不安定なもら、本研究ではまず、野菜・果物由来の全食物抗原のが多いという問題点がある。in vitro 検査法であの抽出液作製を検討した。さらに、加熱処理した食る CAP-FEIA 法は、簡便・安価・高感度であり、種々材もしく加工品抽出物を用いて EXiLE 法を行い、の抗原を固定出来るが、その過程で不安定な抗原患者が摂取可能な食品の量と加工法を推測した。

は壊れてしまうため、conformation が変化したものを測定することは出来ない。一方、最も有用な免疫学的検査法として prick-prick test（in vivo）が3）

方法

食材からの抽出液作製、患者が持参した野菜や果物を穿刺したトマトを縦に 4 等分し、−80 ℃で 1 日以上保針を、実際に患者に穿刺して反応をみる試験であ存 し た。20 mM リ ン 酸 緩 衝 液（PB）（pH6.8）にるため、患者負担が大きく、さらにスループット

protease inhibitor cocktail（PI）（cOmplete, Rocheが低い。

Diagnostics K.K.）を加え、抽出液を作製した。氷あるがそこで、近年開発された I 型アレルギー試験

冷したフードプロセッサーに、凍結したトマトと法 EXiLE（IgE Crosslinking-induced Luciferase等量の抽出液を加え、トマトを粉砕した。シャーExpression）法を検討し、in vitro OAS 試験法とベット状のトマトを 4 ℃、7500 rpm で 60 分遠心後、して有用かどうかを評価することにした。EXiLE

上清を分取し、さらに 4 ℃、15,000 rpm で 30 分遠81

交差反応性・抗原量・形態に着目した新たな食物アレルギー in vitro 評価法の開発心した。上清は使用するまで−80 ℃で保存した。
このほか、4 等分したトマトをフードプロセッサーにかけ、ただちに EXiLE 法を行うトマトすりおろ結果EXiLE 法を用いた花粉症患者血清のトマト /リンゴ抽出液との応答性評価

1.

し液も作製した。
リンゴを縦に 8 等分し、芯を取り除いて皮と果肉

Table 1 に示すように、本研究では、精製抗原に分けた。皮はただちに液体窒素で凍らせ、−80℃を用いた CAP 法でイネ科 and/or シラカバ花粉症で 1 日以上保存した。果肉は 0.5 cm 幅にスライスと判明しており、かつ prick-prick test によりトし、液体窒素で処理した後、−80 ℃で保存した。

マトand/or リンゴの OAS 合併が判明している患

凍結したリンゴ皮もしくは果肉に氷冷した抽出液

者血清を用いた。イネ科及びシラカバ花粉に関し（PB+PI）を等量加え、氷冷フードプロセッサーにては EXiLE 法においても 1μg/mL の抗原刺激で、かけた。トマト抽出法と同様に遠心後、上清をCAP 法とほぼ同様の応答を確認した（いずれも−80 ℃で保存した。このほか、8 等分したリンゴ

カットオフ値 1.5）。

をフードプレセッサーにかけ、ただちに EXiLE 法

トマトOAS 患者血清 4 例（1, 4, 5, 6）を用いて、を行うリンゴすりおろし液も作製した。

EXiLE 法を行ったところ、市販のトマトアレルゲ
ンエキスの抗原刺激では、4 例中 2 例でわずかにEXiLE 法応答が見られた（Fig. 1A）（ いずれもカットオフ最適化した抽出条件で作製したリンゴまたはト値 1.5）。Prick-prick test では新鮮な野菜や果物マト抽出液のほか、シラカバ花粉（ Biostir Inc. ）、を用いることから、市販のトマトを丸ごとすりおチモシーアレルゲンエキス（ Torii Pharmaceutical

ろして EXiLE 法を行ったところ、全ての患者血Co.）を抗原として用いた。クリアボトム白色プレー

清で上昇が認められた（Fig. 1B）。また、同じトト（ BD falcon 353377）に RS-ATL8 細胞を播種しマトであっても、品種や季節によってアレルゲン4（ 5.0 x 10 cells/50μl/well ）、OAS を発症してい性が異なる可能性があること、検査のために毎回るチモシー / シラカバ花粉症患者の血清 1 / 100 量すりおろし液を作製するのは in vitro 試験としてを添加して一晩感作した。PBS で細胞を洗浄後不完全であることから、トマトのリン酸緩衝液抽（ BioTec, MW-96AR）、各種抗原希釈溶液または出液を作製して EXiLE 法を行った（Fig. 1C）。そ

抗ヒト IgE 抗体を添加して（ 50μL/well ）、37 ℃の結果、無刺激時のコントロールに比べ高いルシで 3 時間刺激後、ホモジニアス系ルシフェラーゼフェラーゼ活性を誘導し、prick-prick test と同様基質液（ Promega, ONEGlo）を加えて化学発光をの陽性結果が得られた。さらに、重度のトマトア測定した。

レルギー患者は加熱調理したトマト料理でもアレ
Table 1 患者情報

total IgE ImmunoCAP(UA / mL)

EXiLE(fold)

SPT(mm )Phl p 12(grasspollen)birchpollen

64.5

16.6

6.2

7.4

654

59.3

0.10＞

32.4

4NA5

1.22NA4

8.9

04

5PatientSexAllergy

1M

apple/tomato

1510

2F

apple

436

3F

apple

387

20.5

0.10＞

3.7

4F

tomato

886

56.7

15.5

4.8

5F

apple / tomato

893

＞100

1.95

3.1

3.8

85

6.5

6F

tomato

328

0.09

2.21

1.2

2.3

NA

45.5(IU/ml)

Bet v 1(birch)

timothy(Torii)

apple

tomatohistamine

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浦上財団研究報告書

ルギー症状が出現するため、トマト加工品として

Vol.23（2016）

で、高いルシフェラーゼ活性上昇が見られた。

トマトジュース（100 ℃, 1 分以上の加熱処理済み）

次にリンゴ OAS 患者血清（1, 2, 3, 5 ）を用いて、を用い、EXiLE 法を行った（Fig. 1D）。その結果、

EXiLE 法を行ったところ、市販のリンゴアレルゲ

Fig.1C で特に値の高かった患者血清（1 及び 4 ）ンエキスを用いた抗原刺激では、応答はほとんど

A. Tomato allergen extract
1456

Tomato allergen extract (ng/mL)
B. Freshly-grated tomato
1456

Freshly-grated tomato (ng/mL)
C. Tomato extract1456

D. Tomato juice

Tomato extract (ng/mL)

Luciferase(fold)

6FA280
1FA261
4MF1754MF30
6normal200.1

110100
total protein (ng/mL)

1000

10000

Fig. 1 EXiLE 法を用いた各種トマト抽出液との応答性

交差反応性・抗原量・形態に着目した新たな食物アレルギー in vitro 評価法の開発見られなかった（Fig. 2A）。リンゴをすりおろし83て EXiLE 法を行ったところ、4 例中 3 例で上昇がEXiLE 法を用いたトマト抽出液の加熱処理によるアレルゲン性の評価認められた（Fig. 2B）。さらに、最適化した条件

一般的に OAS を誘発する原因アレルゲンは熱でリンゴ皮抽出液を作製し、患者血清との反応性に弱いことが知られているため、神奈川県産の各をみたところ、すりおろし液と同様の陽性結果が種トマト抽出液を加熱処理し、EXiLE の応答性が得られた（Fig.2C）。リンゴ果肉では応答は見ら変化するかどうか検討した。

れなかった（data not shown）。

2.

Fig. 3 に示す各種トマトより抽出液を作製し、Fig. 2 EXiLE 法を用いた各種リンゴ抽出液との応答性

Fig. 3 多品種の神奈川県産トマト

84

浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

加熱処理後、EXiLE 法に供したところ、経時的熱しておいたオーブンレンジで一定時間（5, 10, 15にルシフェラーゼ活性が低下し、いずれのトマト分）加熱して焼きトマトを作製し、EXiLE 法を行っも加熱処理 5 分程度で応答がみられなくなったた と こ ろ、Fig. 5 に 示 す よ う に、5 〜 10 分 間 の（Fig.4）。

加熱によりルシフェラーゼ活性の低下が認められ次に、生トマトを実際に加熱調理しても、同様の結果が得られるかどうか検討した。湘南ポモロ

た。同様に、煮トマトに関しても 5 〜 10 分間でアレルゲン性の低下が認められた（Fig. 6）。

ンレッドのヘタを取り、4 等分して、180 ℃ で予Fig. 4 加熱処理による影響

Fig. 5 焼きトマト

Fig. 6 煮トマト

交差反応性・抗原量・形態に着目した新たな食物アレルギー in vitro 評価法の開発

考85に No. 1 及 び No. 4 の 患 者 で 高 い ルシフェラーゼ

察活 性 を 示 し た こ と は、 イネ 科 花 粉 の 精 製 抗 原

本研究ではまず、生野菜・果物の抽出液についPhl p12 を 用 い た ImmunoCAP の 結 果（Table 1）て EXiLE 法で測定可能かどうか検討した。OASと良く相関しているものと示唆された。リンゴの代表的食材は野菜・果物であるが、特に日本国抽出液を用いた EXiLE では、No. 5 > No. 1>No.2 の内でスギ花粉やイネ科花粉と交差反応性が報告さ順でルシフェラーゼ活性が見られたが、すりおろ

6）れているトマト 、と、シラカバ花粉に対する交し液同様、prick-prick test で弱陽性（ 2 mm）を示

差反応性報告例が最も多く、熱・酵素に不安定なした No.3 患者血清では応答が認められなかったリンゴをターゲットとした。

（Fig. 2C）。リンゴ抽出液作製の際の検討でも、抽Fig.1A 及 び Fig. 2A で 示 す よ う に、 特 に リン

出時間が長いと抽出効率が悪くなったことから、ゴに関しては市販のアレルゲンスクラッチエキス

RS-ATL8 細 胞 を 37 ℃ で 3 時 間 刺 激 す る EXiLE

ではほとんど反応が認められなかった。本エキス検査の最中も、リンゴ抽出液中の抗原の劣化がは原料を 50 %グリセリン食塩溶液で抽出した、起こっていることが示唆され、応答性の低下は2 - 8 ℃で保存可能な溶液であり（添付文書より）、リンゴ抗原の不安定性によるものと考えられた。

ロット差はあると思われるが、OAS 患者血清をまた、加熱処理したトマト抽出液もしくは調用いた EXiLE 法では適していないことが示唆さ

理トマト（焼きトマト / 煮トマト）抽出液を用いてれた。次に prick-prick test は新鮮な野菜や果物

EXiLE 法を行ったところ、いずれの品種においてを用いて行うことから、同じように新鮮なトマトも経時的にルシフェラーゼ活性が低下することが及びリンゴを用いてすりおろし液を作製し、直ち示され（Fig. 4 〜 6）、患者が摂取可能な食品の量に EXiLE 法に供した。その結果、トマトのすりと加工法を推測するにあたり、本法が有効である

お ろ し 液 で は 問 題 な い が（Fig. 1B）、No. 3 の 患ことが示唆された。

者は、リンゴのすりおろし液に対してルシフェ以上のことから、EXiLE 法では、保存可能な患ラーゼ発現が認められなかった（Fig. 2B）。そこ

者血清と、失活しない抗原抽出・保存法の組み合で、操作は出来るだけ手早く 4 ℃を保持するようわせにより、血液採取のみで throughput 性高く、心掛け、リンゴ抽出に関しては、細断したらすぐ原因抗原や交差反応抗原の探索が可能になることに液体窒素で凍らせた後、破砕処理をすることが示され、EXiLE 法が in vitro OAS 試験法としてとした。リンゴ、トマトとも、抽出効率の一番高有用であることが示唆された。

い抽出溶媒は pH6.8 のリン酸緩衝液だった。抽出液を加えて食材を破砕後、4 ℃で 1 時間 rotate す謝

辞る抽出行程を入れていたが、トマトでは抽出時間本研究を遂行するにあたり、多大なご支援を賜なしのものと変わらず、リンゴではかえって抽出りました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団

効 率 が 1/10 程 度 ま で 落 ち た こ と か ら、 抽 出 時およびその関係者の皆様に深く感謝申し上げます。

間は必要ないものと判断した。なお、抽出液は−80 ℃で長期保存可能であった。Fig. 1C に示す

文

ように、最適化条件で調製したトマト抽出液で刺1) Amlot PL, et al. Clin Allergy, 17, 33-42(1987)

激して EXiLE 法を行ったところ、全ての患者で

2) Ortolani C, et al. Ann Allergy, 61, 47-52(1988)

カットオフ値 1.5 を超える応答が観察された。特3) Ortolani C, et al. J Allergy Clin Immunol, 83, 683-690(1989)

献86

浦上財団研究報告書

4) Nakamura R, et al. Allergol Int, 61, 431-437(2012)
5) Nakamura R, et al. Int Arch Allergy Immunol, 160, 259264(2013)

Vol.23（2016）6) Kondo Y, et al. Clin Exp Allergy, 32, 590-594(2002)

Novel in vitro test for oral allergy syndrome using the EXiLE method

Novel in vitro test for oral allergy syndrome
using the EXiLE method
Haruyo Akiyama 1), Ryosuke Nakamura 2), Yuma Fukutomi 3),
Kazuyuki Kurihara 4), Yasuko Nakano 5), Takaharu Negoro 5), Maki Miyazawa 1)
1)
Kanagawa Prefectural Institute of Public Health, 2) National Institute of Health Sciences
3)
Clinical Research Center for Allergy and Rheumatology, Sagamihara National Hospital
4
Kanagawa Children’s Medical Center, 5 ) Showa University School of Pharmacy[Objectives] Pollinosis patients are considered to suffer from oral allergy syndrome(OAS). Prick-prick test is the most effective in vivo immunological test to detect OAS.
However, this test sometimes gives false-negative results for patients with apparent positivesymptoms, probably because of unstable allergenicity of vegetables and fruits. CAPFEIA test, a simple in vitro test that detects antigen-specific IgE antibodies, also gives
false-negative results. In this report, the utility of the IgE Crosslinking-induced Luciferase
Expression (EXiLE) Test, a recently-developed in vitro test for type I allergy, wereevaluated using simply prepared extracts of fruits.
[Methods] Extracts of apples or tomatoes and allergenic extracts from Torii
Pharmaceuticals were used as antigens. Sera from patients who contract both pollinosis
and OAS against apples or tomatoes were obtained with written consent. RS-ATL8 cells
were sensitized with 1:100 diluted patients’ sera overnight. After washing, the cells
were stimulated with 1 – 1000 ng/mL of antigens or anti-human IgE Ab at 37°C for 3h.
Luciferase activity were assayed.
[Results] No immunological response was obtained from cells stimulated with acommercial allergenic extract of apples or tomatoes as is the case in CAP tests. On theother hand, grated fruits and PBS-based extracts were judged positive as in prick-prick tests
because stimulation of sensitized cells induced 5 – 10-fold luciferase activity compared to
mock-stimulated cells. Processed tomato (juice) gave similar results.
[Discussions] It was shown that the EXiLE method can determine allergen-specificIgE level using simply prepared food samples as well as purified antigens.

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