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食事由来ビタミン K の生体内変換による生体機能制御機構の解析＜令和元年度助成＞

食事由来ビタミン K の生体内変換による生体機能制御機構の解析中川公恵（神戸学院大学 薬学部 社会薬学部門衛生化学研究室）

UBIAD1 には MK-4 を合成する機能以外にも重要な背景および目的生理作用があるのではないかと推察している。
血液凝固や骨形成に重要な役割を担う脂溶性ビタ

本研究では、UBIAD1 を時期組織特異的に欠損さミンであるビタミン K には、植物で合成されるビタせることができるコンディショナルノックアウトマ

ミン K1（フィロキノン：PK）と動物性食品に含まウ ス を 作 出 し、 発 育 過 程 ご と に お け る 全 身 で の、細菌類がれるビタミン K2（メナキノン-4：MK-4）

UBIAD1 欠損の影響や、成熟後における UBIAD1 欠合成するメナキノン類（MK-n）の他、合成品であり損の影響を評価した。また、超高齢化社会の中で問PK の尿中代謝物であるビタミン K3（メナジオン：題となる脳疾患、骨血管疾患に関連する組織として、MD）が存在する。ヒトや哺乳類における MK-4 摂脳・血管・骨特異的に UBIAD1 を欠損させたマウス

取量は他の同族体に比べて非常にわずかであるが、の作出にも着手し、組織特異的 UBIAD1 欠損マウス

組織中には MK-4 が最も高濃度に存在している。この表現型を解析することにより、UBIAD1 およびビれは、摂取した PK や MK-n、MD が体内で MK-4 にタミン K が担う生体機能の解明を試みた。

変換されているからである。著者らは、安定同位体である重水素で標識した PK（PK-d7）を独自に合成方法し、 摂 取 し た PK-d7 が マ ウ ス 体 内 で 重 水 素 標 識MK-4（MK-4-d7）に変換されることを世界で初めて

UBIAD1 を時期組織特異的に欠損させることがで

証 明 し、 さ ら に こ の 変 換 反 応 を 担 う 酵 素 が UbiA

きるコンディショナルノックアウトマウス（CAG-cre-prenyltransferase domain containing 1 protein

ER Ubiad1-cKO マウス）は、Tamoxifen 誘導型全身（UBIAD1）であることを見出すことに成功してきた 。

性 cre 発 現 マ ウ ス（CAG-cre-ERt） を 用 い て、cre/

この UBIAD1 は、ヒトにおいて角膜にコレステロー

loxP システムにより作出した。CAG-cre-ER Ubiad1-

ルが蓄積する遺伝疾患であるシュナイダー角膜ジス

cKO マウスに生後すぐあるいは成熟後に Tamoxifenトロフィーの原因遺伝子であるが、全組織に発現すを 5 日間連続腹腔内投与し、UBIAD1 欠損を誘導しるにもかかわらず、UBIAD1 の生理機能は MK-4 をた。UBIAD1 欠損誘導後は、時期を追って各組織に合成する酵素であるということ以外、明らかにされおける種々の遺伝子の mRNA 発現量の変化を Realていない。著者らはこれまでに、全身性 UBIAD1 欠time RT-PCR にて評価した。また、各組織の組織標損マウスの作出を行なったところ、このマウスは胎本を作製し、ヘマトキシリン - エオジン（HE）染色

生早期に致死となり、UBIAD1 が個体発生に必須のおよび免疫組織染色を行うことにより、種々のタン因子であることが判明した 。UBIAD1 は各組織にパク質の発現変化を組織学的に解析した。Tamoxifen

発現しており、MK-4 も各組織に存在するが、それ投与 CAG-cre-ER Ubiad1-cKO マウスにおいて、特にらがなぜ各組織に必要であるのか、どのような生理顕著な組織的変化が認められた組織については、初機能を担っているのかは明らかではない。申請者は、

代培養細胞を単離し、UBIAD1 欠損に伴う細胞機能

1)

2)

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浦上財団研究報告書

Vol.29（2022）

め、免疫組織染色により調べた結果、空胞は脂肪滴への影響を解析した。
組織特異的な UBIAD1 欠損マウスについては、心の膜タンパク質 perilipin や脂肪酸結合タンパク質

血管系特異的に cre を発現するマウス（SM22α-cre）

FABP4 の抗体で特異的に染色されたことから、脂肪を用いて、心筋細胞および血管平滑筋細胞特異的細胞であることがわかった。このことから、膵臓におUBIAD1 欠損マウス（SM22α-cre Ubiad1-cKO マウ

ける UBIAD1 の欠損により、膵腺房細胞がアポトース）を作出し、表現型解析を行なった。

シスによって死滅消失し、その後脂肪細胞が形成されていると推察された。脂肪細胞は未分化間葉系幹細 胞 か ら 分 化 し て 形 成 さ れ る が、Tamoxifen 投 与

結果と考察

CAG-cre-ER Ubiad1-cKO マウスの膵臓では、膵腺房

（1）成熟後の UBIAD1 欠損による影響細胞の消失と共に間葉系幹細胞が多く侵入している

成熟後（11 〜 13 週齢）に Tamoxifen 投与によりことも認められたことから、間葉系幹細胞が膵島よUBIAD1 を全身欠損させた CAG-cre-ER Ubiad1-cKOり分泌されているインスリンの作用を受けて脂肪細マ ウ ス で は、 投 与 2 週 間 目 以 降 で 全 身 の 組 織 で胞に分化した可能性が高いと推察される。本結果よUBIAD1 の欠損が確認された。全身の組織のうち、り、膵腺房細胞では UBIAD1 が細胞機能にとって極

特に膵臓では著明な組織萎縮が認められた 。そこめて重要な役割を担っていると考えられることかで、膵臓の萎縮状態を観察するため組織標本を作製

ら、さらに UBIAD1 欠損の影響を細胞レベルで解析し、HE 染色および免疫組織染色を行なった。そのするため、膵腺房細胞を初代培養して解析を行なっ

結果、膵島の組織構造や細胞構成は維持されていたた。4-hydroxy-tamoxifen（4-OH-Tam）処理によりが、膵腺房細胞の消失が認められ、多くの空胞が形UBIAD1 欠損を誘導した CAG-cre-ER Ubiad1-cKO マ成されていることが観察された（図 1）。膵腺房細胞

ウス由来膵腺房細胞では、アミラーゼ分泌量の増加の消失要因を明らかにするため、アポトーシスの有が認められ、さらに細胞内に空胞の形成が認められ無を調べた結果、Caspase-3 の発現亢進が認められた。この細胞内の空胞は、Oil-red O 染色では染まらたことから、アポトーシスによる細胞死による消失ないことから脂肪滴ではなく、何らかの細胞機能のであると判断された。さらに、新たに形成された空異常に伴い生じていることが示唆された。この空胞胞が何に起因するものであるのかを明らかにするたの要因が何によるのかは現在のところ明らかではな

3)

図1

Tamoxifen 投与 40 日後の CAG-cre-ER Ubiad1-cKO マウス膵臓の組織像

食事由来ビタミン K の生体内変換による生体機能制御機構の解析17行なったところ、収縮期・拡張期ともに左心室体積く、今後の解析が必要である。
これまで、膵臓ではビタミン K のうち MK-4 の含が有意に拡張しており、心拡大を起こしていること有量が非常に多いことは明らかであったが、膵臓にがわかった。6 週齢の雄性 SM22α-cre Ubiad1-cKOおけるビタミン K の役割は解明されていなかった。

マウスについて、心臓の組織標本を作製し、組織像今回の著者らの結果より、ビタミン K および UBIAD1の解析を行なった結果、心筋線維の断裂像が認めらは、膵臓の外分泌機能の重要な役割を担っている膵

れ、心筋細胞の伸展異常並びに細胞内空胞形成が観腺房細胞の生存性と機能維持に必須の因子であるこ察された（図 2）。また、血管に関しても同様に血管とが明らかとなった。今後さらに解析を進め、膵臓平滑筋特異的に UBIAD1 欠損が誘導されており、血におけるビタミン K の役割の全貌を解明したいと考管の組織標本の解析では、SM22α-cre Ubiad1-cKOえている。

マウスの大動脈において、エラスチン線維の特徴的な波打った構造が見られず伸展した状態となり、コ（2）心血管特異的 UBIAD1 欠損による影響ラーゲン線維層の減少が観察された。これらのこと

心血管特異的に UBIAD1 欠損を誘導した SM22αか ら、 心 筋 細 胞 お よ び 血 管 平 滑 筋 細 胞 に お け る-cre Ubiad1-cKO マウスは、正常に出生したが、雄UBIAD1 の欠損は、心臓や血管の細胞および組織構性 SM22α-cre Ubiad1-cKO マウスでは 5 〜 7 週齢、造の異常を起こすことが明らかとなった。現在は、雌性 SM22α-cre Ubiad1-cKO マウスでは 6 〜 8 週

UBIAD1 欠損により心血管に生じている種々の遺伝齢の間ですべての個体が死亡した。離乳後以降の体子発現の変化を解析し、ビタミン K による発現制御

重は、死亡する 1 週間前までは Control マウスとのを受けている因子の探索同定を進めている。

間に差異は見られなかったが、死亡直前の数日の間以上の結果より、心筋細胞および血管平滑筋細胞には有意な差が認められた。摂餌量を調査した結果、おける UBIAD1 の欠損とそれに伴う MK-4 の欠乏は、死亡直前の体重減少は、摂餌量の低下によることがこれら細胞の機能異常を引き起こし、組織構造と機示唆された。血圧測定においては、雌雄ともに 5 〜能の低下を起こすことが明らかとなった。このこと8 週齢の間で、Control マウスに比べて有意な血圧のから、心血管において UBIAD1 および MK-4 は、組低下が認められた。そこで、6 週齢の雌雄 SM22α

織機能維持に必須の役割を担っており、ビタミン K-cre Ubiad-cKO マウスについて、心臓の CT 解析をは心血管機能を正常に保つ上で必要な栄養素である

図2

SM22α-cre Ubiad1-cKO マウス心臓の組織像

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浦上財団研究報告書と推察される。

Vol.29（2022）謝辞
本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公（3）まとめビタミン K を MK-4 に変換する酵素である UBIAD1

益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼を申し上げます。の全身での欠損は、成熟後でもその影響は大きく、特に膵臓の機能には UBIAD1 および MK-4 が必須で参考文献あるといえる。また、心血管機能に関しては、組織

1) Nakagawa K, Hirota Y, Sawada N, et al. Identificationof UBIAD1 as a novel human menaquinone-4biosynthetic enzyme. Nature, 468, 117-21 (2010).
2) Nakagawa K, Sawada N, Hirota Y, et al. Vitamin K2
biosynthetic enzyme, UBIAD1 is essential forembryonic development of mice. PLoS One, 9,e104078 (2014).
3) Nakagawa K, Fujiwara K, Nishimura A, Murakami C,Kawamoto K, Ichinose C, Kunitou Y, Suhara Y, Okano
T, Hasegawa H. UBIAD1 Plays an Essential Role in
the Survival of Pancreatic Acinar Cells. Int. J. Mol.
Sci. 20, 1971 (2019).

構造の形成や維持にビタミン K が関連している可能性が高く、今後さらに解析することによって、ビタミン K および UBIAD1 が担う役割も明らかになると考えられる。ビタミン K が担う生体での役割はまだまだ広く大きいと予想されることから、今後さらに多くの組織特異的な UBIAD1 欠損マウスを作出・解析し、その全貌解明を目指したいと考えている。

Analysis of biological function control mechanism by in vivo conversion of dietary vitamin K19Analysis of biological function control mechanism by in vivo
conversion of dietary vitamin K
Kimie NAKAGAWA
Laboratory of Hygienic Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences,
Kobe Gakuin University
Vitamin K, a fat-soluble vitamin that plays important roles in blood clotting
and bone formation, includes vitamin K1 (phylloquinone, PK), which issynthesized in plants, vitamin K 2 (menaquinone-4, MK-4), which is found inanimal foods, menaquinones (MK-n), which are synthesized by bacteria, andvitamin K3 (menadione, MD), which is a synthetic product and urinarymetabolite of PK. Although the intake of MK-4 is very small in humans andmammals compared to other homologues, MK-4 is present in the highest
concentration in tissues. This is because ingested PK, MK-n, and MD are all
converted to MK-4 in the body. We demonstrated, for the first time, that PK isconverted into MK-4 in the mouse. In addition, we have succeeded indetermining that the enzyme responsible for this conversion reaction is UbiA
preny ltransfer ase domain-cont ai ni ng p r o t e i n-1 (UB IA D1 ). UB IA D1 i s t hecausative gene of Schneider’s corneal dystrophy, a genetic disorder in whichcholesterol accumulates in the human cornea. Although UBIAD1 is expressed in
all tissues, and MK-4 is present in various tissues, as well, the physiological
functions of UBIAD1 have not been clarified, other than that it functions as anenzyme that synthesizes MK-4. We speculate that UBIAD1 may have otherimportant physiological effects, in addition to its function of synthesizing MK-4.
In this study, we generated conditional knockout mice, in which UBIAD1 canbe deleted in a tissue-specific manner, and evaluated the effects of the resulting
UBIAD1 deficiency throughout the body, both during development and aftermaturation. In addition, we also generated mice lacking UBIAD1 specifically inthe brain, blood vessels, and bone, as tissues related to brain diseases and bonevascular diseases, which are problems in the super-aging society, and attempted
to elucidate the biological functions of UBIAD1 and vitamin K.