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ナノメカニカル特性を指標にしたがん転移抑制効果を持つ香辛料成分の研究＜平成 21 年度助成＞

ナノメカニカル特性を指標にしたがん転移抑制効果を持つ香辛料成分の研究菅沼雅美（埼玉県立がんセンター臨床腫瘍研究所）

1.

はじめに

1985 年、IBM の G. Binnig 博士らによって開発されたプローブ顕微鏡であり、カンチレバーの先端

現在、日本では 2 人に 1 人が がんに罹患し、に構築されたプローブと細胞の間に働く原子間力

また 3 人に１人が がんにより死亡している。しを、カンチレバーの「反り」としてレーザーで増かも、がんによる死亡の約９割が がん転移によ幅する、いわゆる「光てこの原理」で、ナノニューる。がん転移を効果的に抑制することができれば、トンという微細な力を検出できるために、生きたがんによる死亡率を減少することができる。

細胞の「弾性・固さ」の測定を可能にする（図 1）。

1987 年、私どもは緑茶カテキン (-)-epigallocatechingallate（EGCG）が、がんを予防することを世界で最初に発表して以来、「緑茶によるがん予防」の研究を継続している 1 , 2 ）。最近、緑茶抽出物 GTEのサプリメントを用いて、1 日 10 杯の緑茶飲用が、大腸ポリープの再発を予防することを臨床介入試
験で証明することができた 3 ）。現在日本では、緑茶は「がん予防飲み物」として広く認められている。一方、欧米では、緑茶カテキンカプセルをが

図1

AFM の原理ん予防薬とする臨床研究が進められている 4 , 5 ）。

2007 年、UCLA の Gimzewski 教授らは、肺がん、更に重要なことは、緑茶カテキン EGCG は、が乳がん、膵臓がんの患者の腹水や胸水中から分離んの発症を予防するだけでなく、がんの転移を抑した転移性のがん細胞が、正常な中皮細胞よりも制する活性を持つことである。たとえば、EGCG軟らかいナノメカニカル特性を持つことを発表しを含む飲料水の投与は、マウス悪性黒色腫 B16 細た 7 ）。以来、AFM で測定するがん細胞のナノメ胞の実験的な肺転移を抑制した 6 ）。これらの結果

カニカル特性が、これまでの病理診断とは異なるをもとに EGCG のがん転移抑制機構を基盤にす新しい定量的な診断の指標として注目されていれば、副作用のない新しいがん転移抑制化合物をる。おもしろいことに、彼らは、緑茶カテキンの開発できると考える。

処理が肺がん細胞の弾性を固く、正常細胞様の弾最近のナノテクノロジーの進歩によって開発さ性に変化させることを発表した。がん細胞の弾性れた原子間力顕微鏡（AFM）は、これまで観察での変化は、緑茶カテキンのがん転移抑制機構としきなかった細胞の物理学特性、すなわち、ナノメて私どもが提唱している「シーリング効果」を説

カニカル特性の測定を可能にし、生きた細胞の「弾明するものと考え 8 ）、AFM を用いたナノメカニ性・固さ」を非破壊的に測定できる。AFM は、

カル特性を指標に緑茶カテキンのがん転移抑制機

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

2.4

構の研究を行っている。

生 存 率 ア ッ セ イ：

B16-F10 細 胞（1 x4

本研究は、ナノメカニカル特性である細胞の弾10 /100μl）を 96 well プレートに播種し、それ性を指標にして、緑茶カテキンと同様に副作用のぞれの濃度の化合物を加えて 4 時間インキュベー

ない新しいがん転移抑制化合物を、香辛料成分のトした。生細胞数は、MTT 試薬を加え 3 時間後中から見出すことを目的として研究を行った。の 570 nm の吸収で測定した。生存率は未処理の

2.

方

2.1

化合物と細胞：細胞を 100％として表した。

法

2.5

統計解析：

Young ’s modulus のデータはCurcumin, shogaol, diallyl

ノンパラメトリカル Wilcoxon-Mann-Whitney でsulfide, capsaicin 及 び piperine は 和 光 純 薬、解析した。Migration アッセイの結果は Student ’s

resveratrol はシグマアルドリッチ、(-)-epicatechint test で解析した。

（EC）はフナコシより購入した。EGCG は緑茶から精製した 98％以上の純品を用いた 2）。マウス
悪 性 黒 色 腫 B16-F10 細 胞 は、10 % FBS を 含 む
DMEM で培養維持した。

3.

結果

3.1

緑茶カテキンによる B16-F10 細胞のmigration の抑制と弾性変化

AFM による細胞の弾性測定：MFP-3D-Bio-J

がん転移のプロセスは、invasion、migration、AFM（アサイラム）を用いた。B16-F10 細胞（4 xadhesion、 お よ び angiogenesis 等 の 様 々 な 機 構

10 4 ）を 6 cm カルチャーディシュに播種した 2 日が関与しているが、今回は、転移性がん細胞の特後、それぞれの化合物を添加し、4 時間処理した。

徴である migration を指標とした。B16-F10 細胞1 細胞あたり、5 回の force curve 測定を 10 〜 15

は B16 細胞亜株の中で転移能が高く、Transwell個の細胞について行った。測定用のカンチレバ

assay で 5μg/ml の fibronectin 存在下、4 時間でーは TR400PSA（オリンパス）を用い、1 Hz で計約 100 個の細胞が migrate した。この系に 100μ測した。弾性の指標である Young ’s modulus（E,M EGCG を加えると migrate した細胞数は 30％Pa）は force curve を基に、ポアソン比 0.5 としてに減少した。一方、不活性な緑茶カテキン EC はHeltz 理論により求めた。

有意な抑制効果を示さなかった（図 2A）。

2.2

2.3

Migration ア ッ セ イ：

B16-F10 細 胞 の次に、100μM EGCG 処理後 4 時間の B16-F10

migration 活性は Transwell cell culture chamber

細 胞 の 弾 性 を AFM に よ っ て 測 定 し、100 μM(Becton Dickinson）を用いて行った。B16-F10 細EC 処理と比較した。未処理の B16-F10 細胞はほ胞（1 x 10 4 /100μl）をそれぞれの濃度の化合物存

とんどが 1,000 Pa 以下の Young ’s modulus を示在下で insert well に播種した。下のチャンバーし、中央値に は、5 μg/ml fibronectin と 0.1 ％ BSA を 含 むニカル特性を示した。100μM EGCG を処理する

無血清 DMEM を添加し、37℃、4 時間インキュと、1,000 Pa 以上の固い細胞が増加し、中央値ベートした。70％エタノールで固定した後、トリは 770 Pa と約 1.7 倍に固く、統計学的にも有意なパンブルーで染色し、フィルターの上面の細胞を（p<0.0001）変化を示した。一方、100μM EC の除いた後、下面に migrate した細胞を x 200 倍で処理では、ヒストグラムのピークや中央値（538顕微鏡観察し、3 視野の細胞数をカウントした。

Pa）は未処理の細胞と同様であり、固く変化しな未処理の migrate した細胞数を 100%として計算かった（ 図 2B）。この結果は、migration 抑制のした。

結果と良く一致した。

444 Pa と非常に軟らかいナノメカ

ナノメカニカル特性を指標にしたがん転移抑制効果を持つ香辛料成分の研究

93以上の結果から、ナノメカニカル特性に及ぼす香の capsaicin、 コ シ ョ ウ 成 分 の piperine お よ び、辛料成分の活性評価は、処理後 4 時間で検討し、赤ワインのポリフェノールである resveratrol の転移能は migration アッセイで行うこととした。

6 種を用いた（図 3）。
AFM 測定を行うにあたって、それぞれの化合

ナノメカニカル特性に及ぼす香辛料成分の効果物が毒性を示さない濃度を予め検討し、70％以上香辛料成分は、カレー粉に含まれるウコンの主の生存率を示す濃度で細胞のナノメカニカル特性3.2成分である curcumin、ショウガ成分の shogaol、ニンニク成分の diallyl sulfide、トウガラシ成分

図2を測定した。
Curcumin 20 μ M、shogaol 50 μ M、diallyl

緑茶カテキン EGCG による B16-F10 細胞の migration の抑制と細胞の弾性変化

図3

緑茶カテキンと香辛料成分の構造

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浦上財団研究報告書

sulfide 30μM の処理は 1,000 Pa 以上の細胞を増加し、ヒストグラムのピークが未処理の細胞に比Vol.18（2011）3.3

香辛料成分による B16-F10 細胞のmigration 抑制

べ幅広くなり、弾性を固く変化させた（図 4）。そそ れ ぞ れ の 香 辛 料 成 分 に よ る B16-F10 細 胞

れぞれの中央値は、curcumin: 979.6 Pa、shogaol:の migration に 及 ぼ す 効 果 を Transwell ア ッ

807.6 Pa、diallyl sulfide: 2,105 Pa と未処理：622.1

セ イ で 検 討 し た。 細 胞 の 弾 性 を 固 く 変 化 さ せ

Pa に 比 べ、1.6 〜 3.4 倍 固 く 変 化 さ せ た（ 表 1）。

た curcumin、shogaol お よ び diallyl sulfide

一 方、capsaicin、piperine、 と resveratrol は 50

は EGCG よ り も 低 い 濃 度 で B16-F10 細 胞 のμM の濃度で有意な変化をもたらさなかった（図migration を抑制した。50％抑制する濃度 IC 50 で4、 表 1）。 以 上 の 結 果 か ら、curcumin、shogaol

比較すると curcumin : 12μM、shogaol : 30μM、および diallyl sulfide が緑茶カテキン EGCG と同

diallyl sulfide : 10μM、EGCG : 62μM であった。

様な転移抑制活性を持つと考えられた。

一方、細胞の弾性を変化させなかった capsaicin、

図4

表1

香辛料成分の処理による B16-F10 細胞の弾性変化

細胞の固さにおよぼす香辛料成分の効果とがん転移抑制活性*: p<0.0001 **：p<0.001

ナノメカニカル特性を指標にしたがん転移抑制効果を持つ香辛料成分の研究

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piperine、 と resveratrol は 100 μM の 濃 度 で もリピッドラフトを著しく減少する11）ことから、細明らかな抑制効果を示さなかった（図 5、表 1）。

胞膜の脂質の変化が細胞の弾性変化をもたらす一因であると考えている。EGCG と細胞を固く変化させた化合物、curcumin、shogaol と diallylsulfide との構造の類似性はないが、同様な作用機構を介しているか今後検討したいと考えている。
最近、私どもは B16 細胞の転移能が異なる 3 種の亜株、B16-F10（高い転移能）B16-BL6（中等度の転移能）と B16-F1（低い転移能）は、細胞の形態や増殖速度などは同じであるにもかかわらず、明らかに弾性が異なり、転移能の高い B16-F10 細図5

香辛料成分による B16-F10 細胞の migration の抑制● : curcumin, ■ : shogaol, ▲ : diallyl sulfide, ○ : capsaicin,△ : piperine, □ : resveratrol, X: EGCG

4.

考胞が最も軟らかい特性を持つことを見出した 12）。
この結果は、AFM 測定による細胞の弾性が、がん転移の新しい診断に応用できることを示す。細胞の弾性は、様々な細胞内因子の変化、たとえば、

察細胞骨格を形成するアクチンの重合度や細胞膜のAFM を用いたがん細胞のナノメカニカル特変化、さらには、核の状態などを反映していると性の研究は、非常に新しい研究であり、本研究考えられる。今後、細胞の弾性の生物学的意味をに よ っ て、 緑 茶 カ テ キ ン 以 外 の 化 合 物 が 毒 性明らかにしていくとともに、緑茶カテキンや香辛を示さない濃度でがん細胞の弾性を変化させる料成分による弾性変化の作用機構と転移抑制活性こと、および、弾性を固く変化させるとがん細との関連を検討し、新しい作用機構を持つ転移予胞 の migration が 抑 制 さ れ る こ と、 の 2 点 に つ防化合物を開発する計画である。

いて初めて明らかにすることができた。今後、
curcumin、shogaol お よ び diallyl sulfide に つ い謝

本研究に研究助成いただきました浦上食品・て in vivo でのがん転移抑制効果を検討することが重要である。

辞

食文化振興財団に心より深謝いたします。また、Curcumin は緑茶カテキンと同様にがん予防効

AFM 測定にご協力下さいました（独）物質・材料

果を持つ化合物として多くの研究が行われている研究機構が、その bioavailability が低いためにヒトでの研中山知信主任研究者に感謝いたします。

国際ナノアーキテクトニクス研究拠点

9）

究が期待ほど進んでいない 。最近私共は、緑茶
カテキンの EC が curcumin の細胞への取り込み

文を促進し、curcumin のがん細胞増殖抑制効果を

1) Fujiki H. Green tea: Health benefits as cancer preventive forhumans. Chem Rec 2005; 5: 119-32.

増強することを見出した 10）。EC と curcumin の併用が、単独処理よりも強くがん細胞のナノメカニカル特性を変化し、転移を抑制するか検討する計画である。
EGCG の処理は細胞膜の脂質変化をもたらし、

献2) Suganuma M, Kurusu M, Suzuki K, et al. Green tea
polyphenol stimulates cancer preventive effects of celecoxib
in human lung cancer cells by upregulation of GADD153
gene. Int J Cancer 2006; 119: 33-40.
3) Shimizu M, Fukutomi Y, Ninomiya M, et al. Green tea
extracts for the prevention of metachronous colorectal

96

浦上財団研究報告書

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6) Taniguchi S, Fujiki H, Kobayashi H, et al. Effect of(-)-epigallocatechin gallate, the main constituent of green
tea, on lung metastasis with mouse B16 melanoma celllines. Cancer Lett 1992; 65: 51-4.
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Vol.18（2011）8) Yoshizawa S HT, Suganuma M, Nishiwaki S, et al. PentaO-galloyl-β-D-glucose and (-)-epigallocatechin gallate. ACS
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New inhibitors of metastasis found in various spices, based on nanomechanical property measured by atomic force microscopy (AFM)

New inhibitors of metastasis found in various spices,
based on nanomechanical property measured
by atomic force microscopy (AFM)
Masami Suganuma
Research Institute for Clinical Oncology
Saitama Cancer Center
Despite improvement in diagnosis and treatment, metastasis remains the principal
cause of death of cancer patients. So finding of effective and non-toxic inhibitors ofmetastasis is one of the most important subject in cancer research.
We first reported the cancer preventive activity of the green tea catechin(-)-epigallocatechin gallte (EGCG) in 1987, and we have continued to expand the study ofcancer prevention based on “consumption of green tea”. We proved that drinking 10 cupsof green tea daily, supplemented with green tea tablets, significantly prevented recurrenceof colorectal adenomas in patients after polypectomy. Furthermore, EGCG can inhibit ofmetastasis of mouse melanoma cells B16-F10 cells in mice, so we think that we will able
to find new inhibitors of metastasis by studying the mechanisms of EGCG.
Atomic force microscopy (AFM) makes it possible to determine the nanomechanicalproperties of cancer cells, such as cell stiffness. In 2007, Gimzewski et al. reported thatmetastatic cells in the body fluid of cancer patients was significantly softer than normal
mesothelial cells, and that treatment with EGCG increased stiffness of cancer cells. So
we started to study the inhibitory mechanism of metastasis with EGCG focusing on thenanomechanical property of cancer cells as measured by AFM.
In the study, we first found that EGCG significantly inhibited the migration of B16-F10
cells examined by Transwell assay, but that (-)-epicatechin (EC) did not. Treatment with
100 μM EGCG for 4 hr significantly increased Young’s modulus, with a median value of
770 Pa from 444 Pa, indicating the cells became stiffer, but 100 μM EC did not have any
such effect.
Next, we examined the effects of components of some spices on cell stiffness as
determined by AFM 4 hr after treatment: curcumin in turmeric, shogaol in ginger, diallyl
sulfide in garlic, capsaicin in hot pepper, piperine in pepper and resveratrol in red wine.
Curcumin, shogaol and diallyl sulfide significantly increased stiffness of B16-F10 cells tostiffer than in non-treated cells, while capsaicin, piperine and resveratrol did not. Using
Transwell assay, we found that curcumin, shogaol and diallyl sulfide inhibited migrationof the cells, indicating inhibition of metastasis, but the other 3 compounds did not. Theseresults clearly indicate that compounds increasing cell stiffness have potential to inhibit
metastasis.

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