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消化管で食品機能性を媒介する未知因子の解明＜設立 30 周年記念研究助成（平成 27 年度助成）＞

消化管で食品機能性を媒介する未知因子の解明
村上明（兵庫県立大学 環境人間学部）

研究目的（a）培養細胞からの調製
HT29 細胞（ヒト結腸がん細胞、3.0 × 107 cells）

ポリフェノールに代表されるファイトケミカルを DMEM 中で前培養した。培地を捨て PBS で洗浄後、は、抗発がん作用や抗肥満作用など様々な生理機能ウシ胎児血清を含まない DMEM 中で 48 時間培養し性を有することが古くから知られている。その一方た後、培地を回収し、1,600 g で 1 分間遠心分離した。

で、ファイトケミカルの作用機構は薬剤などに比べ上清を回収し、再び 100,000 g で 60 分間遠心分離ると不透明な部分が多い。本研究では、ファイトケした。上清を捨て PBS でペレットを懸濁し、再び上ミカルが吸収されにくい反面、血中でも効果を示す記と同じ方法で遠心分離した。DMEM でペレットを点に着目し、ファイトケミカルによって消化管から懸濁し、使用時まで -80℃で保存した。ウエスタン

何らかの未知のメディエーターが分泌され、機能性ブ ロ ッ ト 法 に よ っ て、EV 特 異 的 マ ー カ ー で あ るを媒介しているという仮説を立て、その実証を目的

CD9 お よ び CD63 さ ら に 細 胞 質 マ ー カ ー と し てとした。具体的なメディエーター候補としては、細α-tubulin の検出を試みた。その結果、EV マーカー

胞 外 小 胞（extracellular vesicles, 以 下 EV と 記 す ）である CD9 および CD63 は EV 画分で、細胞質マーに焦点を当てた。

カーであるα-tubulin は細胞質画分（cell lysate, CL）

EV は、20-200 nm の球状のリン脂質二重層膜小でそれぞれ選択的に検出された。

胞で、種々の外界ストレスを受けると分泌される。
EV 内には分泌細胞の形質を反映するストレス応答性の防御タンパク質、例えば種々の熱ショックタンパク質（Heat shock proteins, HSPs）や miRNA が数百種類内包されている。

実験方法および結果（1） 培 養 細 胞 お よ び ラ ッ ト 血 清 中 EV の 精 製法の確立
生体試料からの EV の回収・精製法にはいまだ決

図1

細胞質および EV マーカーの確認
EV マーカー : CD9、CD63; 細胞質マーカー : α-tubulin; 解析タンパ
ク質量：14μg/lane; CL: 細胞溶解液（cell lysate）（b）ラット血清からの EV 試料の調製定的なものはなく、高比重タンパク質の混入などがSD ラット血清から EV 試料を調製するに際し、①問題となっている。本研究課題を遂行するにあたり、分画法（qEV カラム , 市販）、②超遠心法、および③

簡便で効率の良い EV 調製法は極めて重要であるこ

濃 縮 回 収 法（Total Exosome Isolation 試 薬 , 市 販 ）とから、まずその検討を実施した。

を用いて、それぞれにおける EV の純度比較を行った。また、使用した血清量は① 500 µL、② 500 µL、

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浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）③ 1 mL とし、CD9 と血清アルブミンをウエスタン

においては、炎症関連遺伝子の鍵転写因子であるブロット法で検出した（予備実験により CD63 は検

nuclear factor kappaB (NFκB) の活性化などが抑制さ出されないことを確認している）。

れることが知られている 2, 3)。従って、ケルセチン処

Murota らは、ケルセチン代謝物はアルブミンに理によって細胞から分泌される EV 中における HSPため、EV 画分からアルの発現量が増加するという事実は、これを介したケブミンを除去する必要がある。CD9 に関しては、方ルセチンの新しい抗炎症機構を強く示唆するもので

法① -8、9、方法②、方法③で顕著に検出された。

あると考えている。

結合すると報告している

1)

しかし、方法②、方法③では、アルブミンが混入していた。一方、方法①では、EV が顕著に検出された画分ではアルブミンは検出されなかった。したがって、qEV カラムを用いることで、純度の高いEV 画分が回収できることが明らかとなった。

図2

ラット血清由来 EV 画分のウエスタンブロット解析
図3（2） ケ ル セ チ ン 処 理 し た 細 胞 由 来 EV に お ける機能性分子の発現解析
HT29 ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞（1 × 107 cells/10 mL

ケルセチン処理した HT29 細胞およびその EV 試料におけるマーカー
解析①コントロールの細胞試料、②ケルセチン処理した細胞試料③コントロールの EV 試料、④ケルセチン処理した細胞由来の EV 試料
CD9 と CD63 は EV マーカー、α-tubulin は細胞質マーカー

on 100 mm dish を ３ 枚 分 ） を 前 培 養 し、 無 血 清DMEM へ置換後、ケルセチン（100 µM）で 1 時間処理した。細胞を PBS で洗浄後、細胞培地中のケルセチンを除去し、さらに 24 時間培養した。EV 試料
は（1）に記した方法で調製した。

（3） ケ ル セ チ ン 処 理 細 胞 EV 由 来 の 代 謝 産 物の解析
一方、摂取したファイトケミカルが EV 中に内包され、それが血中へ放出される可能性も検証した。

ま ず、 細 胞 溶 解 液 試 料（ ① お よ び ② ） で はHT29 細胞をケルセチン（100 µM）で 1 時間処理

α-tubulin のバンドが明確に認められ、その一方で、した後、細胞外のケルセチンを洗浄除去し、24 時

EV マーカーである CD9 と CD63 については検出さ間培養した。その後、EV を回収、ケルセチンおよれなかった。それとは対照的に、EV 試料（③およびその代謝物をメタノールで抽出し、真空デシケーび④）では完全に逆の結果が得られたことから、EVターで濃縮乾固した。また、ケルセチン除去後の細試料の調製に問題がないことが確認できた。

胞内ケルセチン量に対する 24 時間後の EV 内、細また、非常に興味深いことにケルセチン処理した

胞内、培地中のケルセチン量の比率を算出するた細胞由来の EV では、HSP40 および HSP70 の発現レ

め、各画分について上記と同様の方法で抽出およベルが顕著に増加していた。HSP タンパク質の誘導

び濃縮乾固操作を行った。濃縮乾固した各試料をに代表される熱ショック応答（heat shock response）

100 µl の メ タ ノ ー ル で 溶 解 し、 四 重 極 型 liquid消化管で食品機能性を媒介する未知因子の解明

chromatography-tandem mass spectrometry (LC-3

考察と今後の展望MS/MS) にてケルセチンおよびその代謝物の検出を試みた。また、試料回収時に、ケルセチン -3- グル

本研究課題は、EV を介した、ファイトケミカルコシドあるいはケンフェロールを内部標準として用の新しい作用メカニズムの存在を提唱することを目いた。

的とした。代表的なファイトケミカルの１種である

その結果、細胞洗浄後に細胞内に存在していたケケルセチンで処理した培養細胞から放出される、EV

ルセチンを 100％とした場合、EV 画分ではケルセ

中 に お け る 抗 炎 症 性 分 子（HSP40 お よ び HSP70）

チン自体が 0.0434 ± 0.0294％、そのメチル化代謝が増加することを見いだした。また、放出 EV 中に産物であるイソラムネチンも 1.30 ± 1.21％検出でケルセチンやそのメチル化体が存在することを示唆きた。一方、イソラムネチン以外の既知の代謝物したが、EV が血中で安定性が高い、あるいは脳関（ケルセチン -3- グルクロニド、ケルセチン -3’- サ門を通過できるという事実を考慮すると、EV を介

ルフェート、ケルセチン -4’- サルフェート）の検出した末梢組織への新しい送達機構としての可能性もも試みたが、全て検出限界以下であった。また、細想定できる。今後は、EV の機能性について広く精胞中ではケルセチンが 1.90 ± 2.46％、イソラムネ査し、また in vivo での同様な機構の検証が必要にな

チンが 11.0 ± 2.10％、培地中ではケルセチンが 5.93ると考えている。

± 10.4％、イソラムネチンが 2.96 ± 9.87％検出された。

謝辞

以上の結果から、ケルセチン処理した HT29 細胞

本研究課題を遂行するにあたり、多大な援助を賜からはケルセチンとそのメチル化代謝産物であるイりました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団にソラムネチンを放出していることが明らかとなっ深謝いたします。

た。これはファイトケミカル処理細胞由来の EV にそのファイトケミカルが内包されていることを明ら参考文献かにした初めての例である。

1) Murota K, et al ., Antioxidant capacity of albuminbound quercetin metabolites after onion
consumption in humans. J Med Invest . 2007;54:370374.
2) Heneka MT, et al ., J Cereb Blood Flow Metab .
2000;20:800-11.
3) Feinstein DL, et al ., J Biol Chem . 1996;271:1772432.

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浦上財団研究報告書

Vol.26（2019）

Identification of unknown factor(s) mediating food functionality
in the gastrointestinal tract
Akira MURAKAMI
Department of Food Science & Nutrition, School of Human Science & Environment,
University of Hyogo
Dietary phytochemicals, including polyphenols, have been shown to exhibit
pronounced and versatile bioactivities, including anti-oxidation and antiinflammation effects. However, it should be mentioned that the mechanisms ofaction underlying such bioactivities have not yet been fully elucidated. For
instance, while the ant i-oxidant effects of natural polyphenols have longattracted the attention of an untold number of food scientists, their roles in andcontribution to their bioactivities are controversial due to their poorbioavailability, which results in extremely low concentrations in the bloodstream. Meanwhile, extracellular vesicles (EV ) have recently emerged asimportant and essential signal mediators released from many types of cells. In
this study, the possibility was explored that phytochemicals exhibit their
physiological functions via EV release from gastrointestinal cells, which areexposed to phytochemicals. As a result, this study uncovered that quercetinexposed HT29 human adenocarcinoma cells release EVs in which the levels ofanti-inflammatory proteins (i .e ., HSP40 and HSP70) are markedly increased,compared to those from vehicle-treated cells. Moreover, the EV from quercetintreated cells contained quercetin and its methylated metabolite, isorhamnetin,as semi-quantified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LCMS/MS). The half-lives of biomolecules (proteins, RNA, DNA, etc .) contained in
EVs in the blood stream have been reported to be much longer than those of
EV-free forms, and they are also able to penetrate the blood-brain barrier. Thus,
the present results propose a novel delivery system for phytochemicals fromthe gastrointestinal tract to peripheral tissues, as well as a unique mechanism
underlying their bioactivities.