岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 35 (№ 2), 43−48 (2009).

原著

ブドウ球菌エンテロトキシンを網羅的に検出するmultiplex PCR

狩野真由子

要重茂克彦

品川邦汎

約

ブドウ球菌エンテロトキシン (staphylococcal enterotoxoin, SEs) はブドウ球菌食中毒の原因毒素である. SEsはSEA-SEEの５型に加え, さらに16種のSEsあるいはブドウ球菌エンテロトキシン様毒素 (staphylococcal enterotoxin-like toxins, SEls) が存在する. 本研究では,19種類のSE/SEl遺伝子を網羅的に検出するためのmultiplex PCRシステムを確立した. さらに, 食中毒事例由来株49株および健康ヒト鼻腔由来株124株を対象にSE/SE遺伝子の保有状況を調査した. その結果, 新型SE/SEl遺伝子は黄色ブドウ球菌集団中に広く分布していること,また, 最も新しい毒素であるSESおよびSETのブドウ球菌集団中における頻度は極めて小さいことが明らかになった.
キーワード：ブドウ球菌エンテロトキシン, 細菌毒素, multiplex PCRシステム, 食中毒

ブドウ球菌食中毒の原因毒素はブドウ球菌エ

ture Committee for Staphylococcal Superant-ンテロトキシン (staphylococcal enterotoxins,igen Nomenclature (INCSSN) によりブド ウSEs) であり, 黄色ブドウ球菌が食品中で増殖球菌の産生するスーパー抗原性毒素の命名規約する際に産生されたSEsを摂食することにより,が提出された [2]. この規約によれば, SEsと嘔吐を主徴とする食中毒を発症する. また,類似した蛋白質で, スーパー抗原活性を有し,SEsは嘔吐活性とは別にスーパー抗原活性を有さらに霊長類への経口投与により嘔吐活性が証し, 毒素性ショック症候群にも関与することが明されたものを知られている [1]. 従来, SEsは複数の型が存

ブドウ球菌エンテロトキシン

在することが知られており, 以前はその抗原性類の嘔吐実験で嘔吐活性陰性のもの, あるいはによりSEA, SEB, SEC, SED, SEEの５型の未だ嘔吐実験が行われていないものは存在が報告されていた. しかし, 近年ブドウ球

ylococcal enterotoxin-like (SEl) ブド ウ球菌菌の遺伝子解析・ゲノム解析の進展に伴って従エンテロトキシン様毒素 と命名することとなっ来から知られていたSEsと類似する遺伝子の存ている. 現在までにSEH, SEG, SEI, SElJ,在が次々と明らかにされ, 新型SEsとして報告

SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP,された. 2004年には, International Nomencla-SElQ, SER, SElUおよびSElVが報告されてい岩手大学支会

岩手大学農学部獣医学課程食品安全学研究室― 43 ―

staphylococcal enterotoxinと命名し, 霊長staph-る [1,3,4]. これらの新型SEs/SElsの食中毒

アルに従ってDNAを回収した.

への関与については未だ明らかではないが,PCRに供する黄色ブド ウ球菌は, HI agar

SEA-SEEによる食中毒はブド ウ球菌食中毒の(Difco) で一夜培養し, コロニーを形成させた.

95％とされており, 残る５％の型別不明食中毒

コロニーから滅菌爪楊枝で菌体を微量採取し,はこれら新型毒素によって発生している可能性

Lyse-N-Go PCR reagentを用いて溶菌後, PCRがある.

を行った.

本研究では, 以前にOmoeら [5] が報告しmultiplex PCR：multiplex PCRに用いたprimer

た SE/SEl 遺 伝 子 を 検 出 す る た め の multiplexの塩基配列とprimer set, および増幅産物のサPCRを改良し, 新たに報告されたSEsも検出でイズを表２に示す. Omoeら [5] が報告したきる系を確立すると共に, 本法を用いて食中毒multiplex PCR primersのうち, sen primersと事例株および健康ヒト鼻腔分離株のSE/SEl遺femB primersを新しい配列に変更し, 新たに伝子保有状況の調査を行った.

ses primersをset １に, set primersをset ３に加えた. PCR反応はQIAGEN Multiplex PCR

材料および方法

Kit (QIAGEN) を用い, 0.2ml PCR tube中で菌株：本研究で使用した標準菌株を表１に示し総液量50μlの系で行った. PCR master mix

た. これらの標準菌株は, サザンブロットあるは, １X Multiplex PCR mix／0.2 μM each

いはゲノム全塩基配列決定によりその保有するprimerとし, １−４setのprimerを含むmasterSE/SEl遺伝子が同定されているものである.

mixを４種類調製した. 0.2ml PCR tubeにLyse-

また, multiplex PCRによるSE/SEl遺伝子のN-Go PCR reagent を５μl分注しておき, こ検索には, 岩手大学農学部獣医学課程食品安全

れに滅菌爪楊枝で菌体を微量懸濁し, サーマル

学研究室で保管している黄色ブド ウ球菌菌株

サ イ ク ラ ー を 用 い て 65 ℃ , 30sec ； ８ ℃ ,(食中毒事例由来株49株および健康ヒト鼻腔由30sec；65℃, 90sec；97℃, 180sec；８℃, 60来株124株) を用いた.

sec；65℃, 180sec；97℃, 60sec；65℃, 60sec；

ブド ウ球菌の培養とDNA精製：黄色ブド ウ球

80℃, ＞180secの処理を行うことにより, 溶菌

菌からのtotal DNA精製は, QIAamp DNA反応を行った. 溶菌終了後, 直ちにPCR mastermini kitを用いて精製した. 黄色ブドウ球菌をmixを添加し, 95℃15分を１サイクル,BHI broth (Difco) で１夜振とう培養し, 培30sec

養液0.5mlを10Krpm, 30秒間遠心菌体を回収し72℃10分を１サイクルのPCR反応を行った.

た. 菌体を180μlの20mM Tris/HCl pH 8.0/

PCR産物は４％アガロースゲル電気泳動後,

２mM EDTA/1.2％ Triton X-100/100μg/ml

0.5μg/ml EtBrで染色してバンドの検出を行っlysostaphin (SIGMA) に懸濁し, 37℃, 30分た. 泳動バッファーは0.5×TBE, アガロース間処理して細胞壁を消化した後, キットのマニュ

はNuSieveR ３：１ agarose (CAMBREX),

表１
菌株
196E
S６
FRI 361
FRI 326
FRI 569
N315
Mu50
MW２
Fukuoka ５
RN422057℃90sec

72℃60secを35サイクル,黄色ブドウ球菌標準菌株のSE/SEl遺伝子型

SE/SEl遺伝子型
Referencesea, sed, selj, ser５sea, seb, selk, selq
５sec, sed, seg, sei, selj, sell, selm, seln, selo, ser５see, selq
５seh
５sec, seg, sei, sell, selm, seln, selo, selp, tst-１
９sea, sec, seg, sei, sell, selm, seln, selo, tst-１
９sea, sec, seh, selk, sell, selq
10selj, ser, ses, set
５
no se/sel gene５
― 44 ―

94℃

マーカーはφx174/ Hae Ⅲ digest (TAKARA)

株は全てがSE/SEl遺伝子を保有しており, 11を用いた.

パターンのSE/SEl遺伝子型が観察された (表１). これらの株のうち, 従来食中毒に関与す成績および考察ることが多いとされていた sea を保有する株は種々のSE/SEl遺伝子を保有する標準菌株を30株 (61.2％) と, やはり今回の調査でも多数用い, 今回新たに設計したプライマーセットをを占めていた. しかしながら, sea〜see を保加えたmultiplex PCRの正当性を確認した. 今有しない食中毒由来株も11株存在し, 新型SEs/回改変を加えたプライマーセットによって検出SElsによる食中毒事例の存在が示唆された.

された標準株のバンドパターンは, すべての株

ses お よ び set が 検 出 さ れ た の は Hiroshima

で全ゲノム塩基配列決定あるいはサザンブロッ３株, Hiroshima 10株, Hiroshima 13株 (いトにより決定されたそれぞれの株のSE/SEl遺ずれも同一事例由来) の計３株であった. これ

伝子型に完全に一致した (表１, 図１). 新たらの菌株は, 同時に seg, sei, selm, seln, seloに加えた ses および set 検出プライマーにより,を保有していた. 健康ヒト鼻腔由来株124株でses / set 保有株 (Fukuoka ５株) のみに予測

は96株 (77.4％) にSE/SEl遺伝子が検出された.

されるサイズの特異的なバンド ( ses：201 bp,sea を保有する株は11株 (8.9％) であり, SE/set：114 bp) が検出され, 非保有株ではバンSEls遺伝子型は32パターンの存在が確認された.

ドは認められなかった. また, 以前報告された食中毒由来株に比して, sea 遺伝子頻度が低く,プライマーセットではバンドの蛍光強度が弱くさらにその遺伝子型は極めて多様性に富むことなる傾向が見られた seln (448 bp) および femBが明らかになった. しかしながら, 健康ヒト鼻(101 bp) のバンドも, 今回改変したプライマー

腔由来株では ses および set は検出されなかっセットでは他のバンドの蛍光強度と同等のシグた (表３). 食中毒事例株, 健康ヒト鼻腔由来ナルが観察された.

株共に, 複数のSE/SEl遺伝子を保有する株が次いで, 本multiplex PCRを用いて食中毒事
例由来および健康ヒト鼻腔由来の黄色ブドウ球多く, 最大11種のSE/SEl遺伝子を保有する株も見られた.

菌を対象に, SE/SElおよび tst-１ 遺伝子の保有今回, ４系列のmultiplex PCRを同時に行う状況を調査した. 食中毒由来黄色ブドウ球菌49

ことにより, 19種のSE/SElとtst-１遺伝子を網羅的に検出することのできるmultiplex PCRシステムを確立した. 本システムは, 内部陽性対照として S. aureus に特異的な fem Aあるいはfem B遺伝子検出プライマーを各セットに加えることにより, DNA抽出の失敗や菌体に含まれるTaq polymerase阻害因子の影響により発生する偽陰性を排除することを可能としている.
以前開発された方法では, fem Bを検出するプライマーセットの設計上, fem B増幅産物のサイズが651 bpと大きく, 増幅に安定性を欠く場合が見られた. 今回, 新たに設計した fem Bプライマーセットにより, 安定した内部陽性対照評価が可能となった. また, 黄色ブドウ球菌
は菌体にTaq polymerase阻害因子を含み, 単なる熱処理によるDNA抽出では偽陰性が発生
図１

multiplex PCRによる黄色ブドウ球菌標準株のSE/SE１遺伝子検出する場合が多いことから, 市販のスピンカラム― 45 ―

等を用いて精製したDNAをサンプルとして用にmultiplex PCRを行うことが可能になった.

いる必要があった [5]. 今回, DNA抽出ステッ本法を用いることにより, 黄色ブドウ球菌の保プに市販の溶菌試薬であるLyse-N-Go PCR有するスーパー抗原性毒素遺伝子を簡便かつ短reagentを用いることにより, 簡易かつ短時間時間で同定することができる. 近年, SEA-SEE

表２GenePrimersea
SEA３
SEA４seb
SEB１
SEB４sec
SEC３
SEC４sed
SED３
SED４see
SEE３
SEE２
seg
SEG１
SEG２seh
SEH１
SEH２
sei
SEI１
SEI２
selj
SEJ１
SEJ２
selk
SEK１
SEK２
sell
SEL１
SEL２
selm SEM１
SEM２
seln
sen forward
sen reverse
selo
SEO１
SEO２
selp
SEP３
SEP４
selq
SEQ１
SEQ２
ser
SER１
SER４
ses
SES-kanoS
SES-kanoAS
set
SET-kanoS
SET-kanoAS
tst-１ TST-３
TST-６
fem A femA１
femA２
fem B femB-３
femB-４Multiplex PCR primerの塩基配列と増幅産物

sequences (５ −３ )PCR product(bp) PCR set
CCTTTGGAAACGGTTAAAACG
129
１
TCTGAACCTTCCCATCAAAAAC
TCGCATCAAACTGACAAACG
479
１
GCAGGTACTCTATAAGTGCCTGC
CTCAAGAACTAGACATAAAAGCTAGG
273
１
TCAAAATCGGATTAACATTATCCCTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG
321
１
TTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATCCAGTACCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC
180
１
TAACTTACCGTGGACCCTTCAAGTAGACATTTTTGGCGTTCC
289
２
AGAACCATCAAACTCGTATAGCGTCTATATGGAGGTACAACACT215
２GACCTTTACTTATTTCGCTGTCGGTGATATTGGTGTAGGTAAC
456２ATCCATATTCTTTGCCTTTACCAGATAGCATCAGAACTGTTGTTCCG
152２CTTTCTGAATTTTACCACCAAAGGTAGGTGTCTCTAATAATGCCA
293３TAGATATTCGTTAGTAGCTG
TAACGGCGATGTAGGTCCAGG
383
４
CATCTATTTCTTGTGCGGTAACGGATAATTCGACAGTAACAG
379
３
TCCTGCATTAAATCCAGAACGCTTATGAGATTGTTCTACATAGCTGC
448
４CATTAACGCCTATAACTTTCTCTTCATCTGTGTAAGAAGTCAAGTGTAG
214
３
TCTTTAGAAATCGCTGATGATGATTTATTAGTAGACCTTGG
396
２
ATAACCAACCGAATCACCAGAATCTCTGGGTCAATGGTAAGC
122４TTGTATTCGTTTTGTAGGTATTTTCGGGATAAAGCGGTAATAGCAG166４GTATTCCAAACACATCTAAC
TCGGAATATACTATGGGGCAAA201１GGTCTAACTCTTGAATTGTAGGTTC
GGTTGGTGATTATGTAGATGCTTG
114３GTAGGCTTGTCTAAAGGGCTATG
AAGCCCTTTGTTGCTTGCG
447
３ATCGAACTTTGGCCCATACTTTAAAAAAGCACATAACAAGCG
134２,３
GATAAAGAAGAAACCAGCAG
CACATGGTTACGAGCATCAT
101
１,４TGTTTCGGGTGTTTTACCTT― 46 ―Reference
11111111111111111111５５５５５５５５５５５５５５1212５５５５５５５５This study
This study
This study
This study
11111212
This study
This study

表３ 食中毒事例由来および健康ヒト由来黄色ブドウ球菌のSE/SEl遺伝子保有状況
SE/SEl遺伝子型

sea
sea, seb, selk, selq
sea, seb, seh, selk, selq
sea, sec, sellsea, sed, selj, sersea, seg, sei, selm, seln, selosea, seg, sei, seln, tst-１
sea, seg, seln, sell, tst-１
sea, seg, seln, tst-１
sea, seg, tst-１
sea, seh, selk, selq
sebseb, seg, sei, selm, seln, seloseb, sehseb, selk, selq
seb, selk, selp, selq
seb, selp
seb, selk, selp, selqsec, sel, seg, sei, selm, seln, selosec, sell, seg, sei, selm, seln, selo, tst-１
sec, sed, seg, sei, selj, sell, selm, seln, selo, selp, sersed, seg, sei, selj, selm, seln, selo, selp, serseg, seiseg, sei, selm, selnseg, sei, selm, seln, seloseg, sei, selj, selm, seln, selo, ser, ses, setseg, sei, selm, seln, selo, selk, tst-１
seg, sei, sell, selm, seln, selo, selp
seg, sei, selm, seln, selo, selp
seg, sei, selnseg, sei, seln, tst-１seg, tst-１
sehselm, selo
seln
selp
no SE gene

黄色ブドウ球菌
食中毒
健康ヒト
Total
ｎ＝49
ｎ＝124
ｎ＝173
４
１５２０２
15０15０３３２１３０１１２０２０１
１０１１０１１５２
７０２２０
７７４２
6０２２０１１４８12０
１１０３３０１
１０１１０
５５０１１０２２４26
30３0３０１１０１１４２６０１１０
７７０１１０１１０１１０１１０77０2828を産生しない株によるブドウ球菌食中毒事例が引用文献

国内外で報告されていることから [6-8], 本法[ １ ] Uchiyama T, Imanishi K, Miyoshi-

はブドウ球菌食中毒の原因究明に有用であるとAkiyama T, Kato H：Staphylococcal

考えられる.

superantigens and the diseases theycause, Comprehensive sourcebook ofbacterial protein toxins, J. E. Alouf et― 47 ―

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