食と農の総合研究所研究プロジェクト 研究成果報告書

穀物温度応答の人為制御による食料増産の試み
研究課題

研究種別

■共同

個人

古本 強(農学部・教授)研究代表者
研究組織

上野 宜久(農学部・実験実習助手)

研究期間

キーワード

□1 年研究（１）大気温度感受（４）オオムギ（２）環境応答（５）自然系統■2 年研究（３）遺伝子発現（６）突然変異

１．研究計画（簡潔にまとめて記入してください。）
野外に生息する植物は、常に変動する環境下で生存している。例えば「日長変化」のように年周期的に変化するものや、「光量」のように数分という短時間のうちに大きく変動する環境要素などもある。それぞれ「振れ幅」や「変化時間」「周期性」に程度の差はあれど、「変動する」ことが前提となっている。中でも、「大気温度」は朝晩と周期的に変動する変化パターンと、気圧などの気象変化に伴う急激な変化パターンの二つの要因によって変動する。この温度変化を植物がどのように感知し、そして応答するのか、しかもその応答性がそれがどれほど生存に有効化されているかについて、あまり知見は多くない。 申請者たちは、作物を含む多くの植物で最適温度に比べ少しの高温あるいは低温にたいして植物が機敏に応答することを見出した。具体的には、高温による徒長現象という「形態変化」と、「病原応答性」に認めた。
温度応答性を自在に変化させることができれば、形態や耐病性の獲得に役立つことにつながる。また、温度応答性の変異株が見つかり、その解析ができればシグナル応答のメカニズムの理解が進む。そこで①「温度に依存した新規シグナル伝達機構に対して影響しうる化合物を探索する」こととした。また、並行して、②「温度応答性に異常を示す変異植物を探索する実験」を行った。

２．研究成果の概要（4 ページ程度）① 温度に依存した新規シグナル伝達機構に対して影響しうる化合物の探索
化合物ライブラリー
化合物ライブラリーを所有する機関に交渉を進め、名古屋大学 ITbM から 20,000 以上からなるライブラリーの供与を受けることができた。ここから以下の二つのスクリーニングを開始した。
高温徒長を抑制する化合物の探索
化合物を培地に含ませると発芽阻害活性がある場合には徒長への効果を検証できない。また、ライブラリーに含まれる個々の化合物の量は限られている。従って培地に添加して播種することは適切ではないと判断し、まずシロイヌナズナでのスクリーニングの条件検討を行った。その結果、0.1 mL の糖含有寒天培地で常温発芽させ、播種２日後に 25 µL の0.1 mM の化合物を投与して高温でさらに３日間栽培するというマイクロタイタープレー
トで実施可能な条件を決定した。この条件で ITbM ライブラリーから２０１７年３月現在、約 2,500 の化合物から一次スクリーニングを行っており、陽性の化合物が 74 得られている。
今後も同じ頻度でヒットすると仮定すると 500~600 の一次陽性化合物が得られる計算になる。次年度は二次スクリーニングの条件検討を行う必要がある。
低温等の環境ストレスによる耐病性低下を抑制する化合物の探索
化合物を探索するためにまず WRKY45 遺伝子にレポーター遺伝子 GUS を連結したレポーター系統を得、スクリーニング系を構築した。WRKY45 は SA に応答して短時間（転写産物量は〜２時間で最大に近づく）で発現が誘導される。このことは、多数の化合物から探索を行う際に試料間のハンドリング時間差が無視できないレベルになる可能性を懸念させる。そこで、十分な時間レポーター遺伝子活性が持続できる条件を検討した。その結果、内在性 WRKY45 転写産物量とレポーターの活性は、細部は異なっていたもののいずれもサイトカイニンによって正の影響を受けることがわかった（図１）。この結果から、ABAおよびサイトカイニンの量を調節することでスクリーニング条件を調節することが技術的に可能になった。レポーター系統はイネ植物体であり、世代促進に時間を要すことから種子数の確保が本年度終盤にずれ込んだがなんとか年度内にスクリーニングを開始することができた。２０１７年３月現在、約 1,200 の化合物を調査しているが顕著な効果のある化合物はまだヒットしていない。

図１ レポーター系統 WRKY45-GUS の発現条件サイトカイニン(50 µM kinetin)が共存すると GUS 活性が増強されることがわかった。

② 温度応答性に異常を示す変異植物の探索
研究の概要
コムギやオオムギは、生育初期の高温により徒長し、冬越しに適さない軟弱形態となる。
これが、初冬まで播種時期を待たねばならない主因である。このようにムギ類は、冬越しに適した「硬化型」と適していない「軟弱型」の二つの葉の形態を示す。申請者は、これまでの岡山大学のオオムギの 273 標準系統に対して、異なる温度条件下での伸長成長具合を評価するスクリーニングを行った。その結果、「高温による徒長を示さない系統」、「低温を感知できない系統」、そして「温度応答性が顕著な系統」を見出すことに成功した。
材料及び方法
これまで の共同研究 の取り組み によってす でに候補系 統として 2 系統を単 離しているが、ほかにも応答性を示さない系統（１７系統）や、逆に強く示す系統（９系統）などを見いだすことに成功している（表１）。
表１

異なる温度での伸張成長（単位は mm）

系統

12℃

28℃ ／ 12℃

28℃

162.66667

23410.65425532

92.490.60.98051948

56

65.25

1.16517857

4130.8333

161.8333

1.23694268

5

119

150.5

1.26470588

6

101129.8571

1.28571429

7151.5714

195.7143

1.29123468

8

100

129.3333

1.29333333

9146.4286

190.1429

1.29853659

10

103.8

136.2857

1.31296449

11103.2857

136.8571

1.32503458

12

134

182.4286

1.36140725

13

92.14286

127.2857

1.38139535

14

117

162.2

1.38632479

15

149.3333

210.8333

1.41183036

16

37.5

53

1.41333333

1727411.51851852

18

40

124.25

3.10625

1937.66667

1193.15929204

2048.75

1573.22051282

2138.75

1263.2516129

2249.75

162.3333

3.26298157

2341.25

136.1667

3.3010101

24

43.57143

158.3333

3.63387978

25

33.42857

158.4286

4.73931624

26

28.5

147.4286

5.17293233

これらが、既知の矮性形質である uz などの遺伝子座と関係するものかどうか、栽培実験によって各種生理特性を調査する。
すでに得られている系統の温度応答性データをもとに Genome Wide Association (GWAS)
解析を行うことで、座乗候補位置を明らかにするとともに、シロイヌナズナにおいて先行する分子生物学的な解析結果と併せて、オオムギ系統におこった変異を推定する。
結果及び考察①候補 2 系統の性状解析
これまでのスクリーニング結果から、標準系統のなかでも幼苗期の高温応答性の不全を示す２つの系統を単離した。これらはともに６条性を示したが、同様に６条の系統でかつゲノムシークエンスが明らかにされた「Morex」を掛け合わせの相手方として交配を行い、F1 種子および F2 種子を入手した。
標準系統が栽培されている岡山とは独立に、龍谷大学の温室においてもこれらの系統を栽培し、次世代種子を入手した。この次世代種子では、期待している高温応答性の不全が認められず、この表現型の安定性に問題を見いだした。
この予期せぬ事態により、マッピングによる座乗位置の同定が困難となったが、再現性を示す条件を探し出した後に、改めてマッピング作業を行う。
次世代種子での再現性が認められなかった事態については、この研究期間内には原因を求めるには至らなかった。分譲された種子ロットでの再現性は確認できていたことから、その種子ロットに起こったエピジェネティックな効果などの関与が考えられる。
②
上記以外の候補系統の生育調査
大気温度感受性は、高温（28℃）あるいは低温（12℃）に暴露後の第一葉の葉身の長さを測定し、それぞれの値で除した値（28℃／12℃）をもって評価した。この場合、高温で伸びない系統とともに、低温で伸びてしまう系統も原理的に区別せずに含まれる。
17 系統の栽培試験によって、高温で伸びない 5 系統（表中の灰色背景で示した５系統）には、uzu である 3 系統が含まれることがわかった。これらの 5 系統については、葉の幅が広く緑が濃いそして矮性を示す特徴が共通した。オオムギにおける uz の原因遺伝子は、ブラシノステロイド受容体であることが明らかにされている（図１）。

図 1 葉の形態的特徴 （左図；左、uzu 性を示す系統、中、比較のためのコントロール
系統 Morex、右、低温で伸びる系統）。右図；それぞれの葉の幅、長さ、厚みを測定した。

また、近年、シロイヌナズナを用いた研究から、高温徒長に中心的に寄与すると明らかにされている転写因子 PIF4 と、ブラシノステロイドシグナルに関わる転写因子 BZR1 が物理的に結合し、高温時の徒長現象に共同的に機能することが明らかにされている。オオムギ
においても PIF4 ととの相互作用をシロイヌナズナのデータも考慮しつつ検討してみたい。
それ以外の高温応答性不全の 12 系統（表中 4−15）は、低温で伸びてしまうことが主因であることが明らかとなった。またこの 12 系統のうち 5 系統において「葉が細く、分けつが進む」共通する性質を見いだした。
温度応答性の高い 9 系統（表中 18-25）は、すべて低温条件でよく矮性を示した。この特徴が 28℃／12℃の比に反映される結果であることが判明した。これは「低温をよく感知する系統」として再評価できる。
③
GWAS 解析佐藤和広先生との共同で、測定に供した標準系統のうち発芽率に問題がなかった系統を選抜したデータをもとに、GWAS 解析を行った。ゲノム場に複数の候補座乗位置を見いだすことができた。それぞれの遺伝子の特定と、候補としての有望性の評価を引き続き行いたい。

３．収支報告（ 非公開 ）

４．研究発表等（研究代表者及び研究分担者）＜発表論文（査読有り）＞
1. Ueno, Y., Matsushita, A., Inoue, H., Yoshida, R., Jiang, C.-J., and Takatsuji, H.
(2017) WRKY45 phosphorylation at threonine 266 acts negatively on
WRKY45-dependent blast resistance in rice. Plant Signal. Behav. 12(8):e1356968.
2. Hayashi, M., Inoue, S., Ueno, Y., and Kinoshita, T. (2017) A Raf-like protein kinase
BHP mediates blue light-dependent stomatal opening. Scientific Reports 7:45586.

＜学外資金獲得状況＞
古本 強
研究領域
新光合成：光エネルギー変換システムの再最適化
研究課題/領域番号16H06557
研究種目
新学術領域研究(研究領域提案型)