岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 35 (№ 1), ４−10 (2009).

総説

牛ウイルス性下痢ウイルス持続感染牛保有群の検出に関する研究

関要

慶久

約

牛ウイルス性下痢ウイルス (BVDV) 持続感染 (PI) 牛保有群を精度高く検出するスポットテストの確立を目的に, 46群2,454頭の牛および177株のBVDVを検査した. 各群から６〜12カ
月齢の子牛3頭を抽出して, 感染ウイルスと同一の遺伝子型の攻撃ウイルスを用いた中和試験およびウイルス分離から成るスポットテストを実施し, ３頭中２頭以上から64倍以上の抗体価が検出または１頭以上からBVDVが分離された際に, 当該群に高い確率でPI牛が存在することを推計学的に検討し, 野外応用により証明した. ６種類の制限酵素を用いた制限酵素断片長多型解析による遺伝子型別が, 適切な攻撃ウイルスの簡便な選択に有用であることを明らかにした.
キーワード：牛ウイルス性下痢ウイルス, 持続感染牛, 制限酵素断片長多型解析,スクリーニング, スポットテスト.

牛ウイルス性下痢ウイルス (BVDV) 感染症に死亡するか, あるいは淘汰されている [1].の防疫上, 牛群から持続感染 (PI) 牛を除去す

この事実は, 産歴を有する, すなわち泌乳期のることが重要である [1]. 飼養牛全頭を対象とPI牛が少数例にとどまることを示唆する. バル

したウイルス分離は, PI牛を検出するための最ク乳検査は１検体により100頭以上の泌乳牛をも正確な検査であるが, 本検査に先立ち, 牛群飼養する群を評価し得るが [2], 非泌乳期のPI中のPI牛の存在の有無を推察し得るスクリーニ牛のみが存在する牛群を検出することはできず

ング法を活用することにより, BVDV防疫の効[3], 肉用牛群に応用することも困難である.

率的な推進が可能となる.

Houeら [4] は, 牛群から抽出した子牛５頭

わが国の幾つかの地域では, PI牛を保有する中３頭以上から, 高いBVDV中和抗体価が検出

乳用牛群を検出するスクリーニング法として,された時に牛群内にPI牛が存在すると判定する,バルク乳からBVDV遺伝子を検出する方法 (バいわゆるルク乳検査) が応用され, 多数のPI牛が検出さストはPI牛の泌乳状態に関わらず, 牛群内のPIれている [2]. 他方, 多くのPI牛は粘膜病や発牛の存在を調査することができるため, 北欧諸育遅延を含む様々な障害により繁殖適齢期まで国およびアメリカ合衆国で応用されている [3-岩手支会

岩手県農林水産部畜産課―4―

スポットテストを考案した. 本テ

6]. 他方, PI牛はBVDVに対して免疫寛容を示

およびPI牛が１頭以上含まれる確率 (ＰVI) をし, その抗体価は陰性または低い値にとどまる

そ れ ぞ れ hypergeometric probability model

ことから [1], PI牛が抗体検査対象として抽出[4,5] を用いて算出した. さらに, 両条件のいされた時は偽陰性と判定される可能性がある.

ずれかが満たされる確率 (ＰTotal ) を, ＰTotal ＝また, わが国の野外には少なくとも７種類の遺ＰSN ＋ＰⅥ −ＰＢ の計算式により算出した. ＰＢ

伝子型 (1a, 1b, 1c, 1e, 1f, So, 2a) のは高い抗体価を有する２頭の非PI牛および１頭BVDVが存在し [7-9], 異なった遺伝子型ののPI牛から成る３頭が抽出される確率を意味し,BVDVは抗原学的に区別されるため [7,9], 血PI牛が存在しない群のＰTotalはＰSNと一致する.

清中和試験に用いる攻撃ウイルスと感染ウイル

PI牛, 高い抗体価の非PI牛および低い抗体価のスの遺伝子型が相違した時は正確な判定が困難

非PI牛の存在頭数がそれぞれx, yおよびz頭でになると考えられる. 精度の高いスポットテスある群において, ３頭を抽出した時のＰSN ,トの開発はBVDV防疫の推進を図る上で重要でＰVIおよびＰＢの各確率は,ＰSN＝１−(Ｃｘ＋ｚ,３×あるが, そのための諸条件は十分に検討されてＣｙ,０＋Ｃｘ＋ｚ,２×Ｃｙ,１)／Ｃｘ＋ｙ＋ｚ,３, ＰVI＝１−いない.

(Ｃｘ,０ ×Ｃｙ＋ｚ,３ )／Ｃｘ＋ｙ＋ｚ,３ およびＰＢ ＝Ｃｘ,１

本研究では, PI牛保有群を精度高く検出する

×Ｃｙ,２×Ｃｚ,０／Ｃｘ＋ｙ＋ｚ,３の計算式を用いて算スクリーニング法の確立を目的として, はじめ出された. これらの確率は, 他の月齢区分, すに, わが国の牛群に適用し得るスポットテスト

なわち６〜18カ月齢, ６〜24カ月齢および６カの諸条件を推計学的観点から検討した. 続いて,月齢以上から３頭を抽出した条件下でも計算さ推計学的検討により得られた最適条件下で本テれた.

ストを野外応用し, PI牛保有群の検出における表１に各群から検出されたPI牛の頭数および精度を検証した. さらに, スポットテストの精月齢ならびにPI牛から得たBVDV分離株の遺伝度を確保する上で重要となる中和試験用攻撃ウ子型を示す. 20群1,272頭のウイルス分離によイルスの選択に資するため, わが国で分離されり, ５群 (Nos. 1-5) から２〜102カ月齢のPIたBVDVを遺伝学的に解析し, 制限酵素断片長牛18頭が検出された. 18頭中12頭は６カ月齢以多型 (RFLP) 解析による本ウイルスの簡便な上であり, ３群 (Nos. 1-3) に存在した12頭中遺伝子型別法を検討した.

８頭および２群 (Nos. 4,5) に存在した６頭中１頭が６〜12カ月齢の月齢区分に含まれた. ６

スポットテストの諸条件の推計学的検討

カ月齢以上のPI牛12頭中９頭におけるBVDV中2000〜2004年に, 岩手県内の20群 (Nos. 1-20)和抗体は陰性であり, 他の３頭においては２まの飼養牛1,272頭を対象として, ウイルス分離たは４倍の低い値の抗体が検出された. 分子系および1a遺伝子型株を攻撃ウイルスとした血清表１中和試験を実施した.

PI牛の検出および分離株の遺伝子型群No. 検査
頭数ウイルス学的検査成績に基づき, ６カ月齢以PI牛の頭数

分離株の遺伝子型

上の全ての検査牛をPI牛および非PI牛に分類し

１19 ５ (６,７,９,56,102)ａ)1aた. また, 非PI牛の抗体価において, 64倍以上

２102 ５ (５,５,６,６,８)

1a

３30 ２ (10,11)

1a

４73 ５ (２,４,４,４,12)

1b1bを高い抗体価, 32倍以下を低い抗体価として区別した. 各群から６〜12カ月齢のBVDVワクチ

５55 １ (28)

ン未接種牛３頭を抽出した時に, 高い抗体価を６-20

993 ０有する非PI牛が２頭以上含まれる確率 (ＰSN)ａ) 括弧内の数値はPI牛の月齢を示す.
―5―

統解析により, ３群 (Nos. 1-3) 由来の12株おず高いＰTotal が得られた当該２群 (Nos. 6,7)

よび２群 (Nos. 4,5) 由来の６株は, 血清中和の成績は, ウイルスの群内感染が比較的最近ま試験の攻撃ウイルスと同一の1a遺伝子型またはで成立していたことを示唆した [6]. 残りの５抗原性状が類似する1b遺伝子型 [9] に分類さ群 (Nos. 8-12) のＰTotalは, ６〜12カ月齢の月齢れた.

区分では0.000であったが, より高齢の牛が含６〜12カ月齢, ６〜18カ月齢, ６〜24カ月齢

まれる他の月齢区分においては0.000〜0.782のおよび６カ月齢以上の各月齢区分における範囲に増加し, 過去のウイルス感染が示唆されＰTotalを表２に示す. PI牛を保有した５群 (Nos.

た [6]. 以上の成績は, 検査時におけるウイル

1-5) のＰTotalはいずれの月齢区分でも0.975以上

スの流行の有無, すなわちPI牛の存在の有無をの高い値を示した. PI牛を保有しない15群中８特定するためには, ６〜12カ月齢の子牛の解析

群 (Nos. 13-20) のＰTotalはいずれの月齢区分でがより効果的であることを示した既報 [5] のも0.000であった. 他の２群 (Nos. 6,7) のＰTotal

成績を支持した.

は, ６〜12カ月齢の月齢区分において0.714以

表３に６〜12カ月齢の３頭を抽出した時の各上であり, より高齢の牛が含まれる他の月齢区確率値を示す. ６〜12カ月齢の範囲に計８頭の分では0.929以上を示した. 月齢区分に関わらPI牛が存在した３群 (Nos. 1-3) のＰSNは0.500以下と低く, ＰVIは0.886以上と高かった. 当該月表２
群No.

各月齢区分におけるＰTotal値

齢に１頭のPI牛が存在した, あるいはPI牛が存

月齢区分在しなかった２群 (Nos. 4,5) のＰSNは1.000で６-12６-18６-24６≦

１-４

1.000

1.000

1.000

1.000

５1.000

1.000

0.975

0.998

６0.774

0.944

0.973

0.982

７0.714

0.929

0.954

0.976

抗体価を示す多数のPI牛が含まれたことに起因

８0.000

0.050

0.125

0.782

すること, このため, 血清中和試験による高い

９0.000

0.000

0.000

0.638

抗体価の検出のみではPI牛保有群を偽陰性と判

100.000

0.000

0.0000.206

定する可能性があること, また, 偽陰性の判定

110.000

0.000

0.000

0.013

12

0.000

0.000

0.000

0.001

13-20

0.000

0.000

0.0000.000

表３群No.

PI子牛ａ)

１あり, ＰVIは0.375以下と低かった. これらの成績から, ３群 (Nos. 1-3) で認められた低い値のＰSNは当該月齢区分に抗体陰性あるいは低いはウイルス分離の併用により低減されることが示唆された.

６〜12カ月齢における各確率値

非PI子牛ｂ)確率値≧64≦32ＰSN

ＰVIＰＢ

ＰTotal３

３０0.500

0.950

0.450

1.000

２

３

３

１0.371

0.886

0.257

1.000

３２

２

１0.300

0.900

0.200

1.000

４

１７

０

1.000

0.375

0.375

1.000

５０５

１

1.000

0.000

0.000

1.000

６０

６

３0.774

0.000

0.000

0.774

７０５

３0.714

0.000

0.000

0.714

８-20

００５-23

0.000

0.000

0.000

0.000ａ) ６〜12カ月齢のPI子牛頭数.
ｂ) 血清中和抗体価.
―6―以上より, 各群から６〜12カ月齢のBVDVワ場 (Y,Z) 由来５株の遺伝子型はそれぞれ1a,クチン未接種子牛３頭を抽出して, 血清中和試

1cおよび1bに分類された (表４). PI牛が存在

験およびウイルス分離を行うことにより, PI牛した８農場 (A-F,Y,Z) から抽出した子牛３を保有する群を精度高く検出し得ると推察され頭の血清中和抗体価は, 農場ごとに攻撃ウイルた.

スにより様々な程度で相違し, ７農場 (A-F,Y) の陽性判定は攻撃ウイルスと分離株の遺伝スポットテストの野外応用子型が相違した時にも得られたが, 他の１農場

2005〜2006年に岩手県内の他の26群, すなわ(Z) の陽性判定は両ウイルスの遺伝子型が同

ち24酪農場 (A-X) および２肉用牛繁殖農場

一時に限られた. この事実は, 攻撃ウイルスの(Y,Z) において, ６〜12カ月齢のBVDVワク遺伝子型が抗体価の正確な評価, すなわちスポッチン未接種子牛３頭を抽出し, 血清中和試験おトテストにおける精度の高い判定のために重要よびウイルス分離から成るスポットテストを実であること示す既報 [3] の成績と一致した.

施した. BVDV株間での抗原性状の違いを考慮

わが国の分離株は高い頻度で1aおよび1b, 中して, 血清中和試験には４種類の遺伝子型 (1a,頻度で1c, 1eおよび2a, 稀に1fおよびSoの遺伝

1b, 1e, 2a) の攻撃ウイルスを用い, 各ウイ子型に型別されている [7-9]. したがって, わルス抗体価のうち最高値を中和抗体価とした.

が国で流行する主要な５種類の遺伝子型株 (1a,３頭中２頭以上から64倍以上の抗体価が検出ま

1b, 1c, 1e, 2a) を血清中和試験の攻撃ウイ

たは１頭以上からBVDVが分離された時にスポッルスとして使用することにより, 攻撃ウイルストテスト陽性と判定した. 同テスト後に, 26群と感染ウイルスの抗原性状の相違に起因する偽の全飼養牛1,182頭のウイルス分離を実施し,陰性判定の出現を低減し得ると考えられた.

PI牛の有無を調査した.
表４に26農場のウイルス学的検査成績を示す.

RFLP解析による遺伝子型別スポットテストにより, ９農場 (A-G,Y,Z)

1957〜2006年に日本で分離された177株のが陽性と判定された. ８農場 (A-E,G,Y,Z)

BVDVを用いて, 遺伝子型を簡便に識別し得るの陽性判定は血清中和試験により, 他の１農場RFLP解析法を検討した. 175株はわが国の病(F) のそれは血清中和試験およびウイルス分牛から, 他の２株は輸入された牛胎子血清から離の両検査により得られた. 全飼養牛を対象と分離された.

したウイルス分離により, ６酪農場および２肉BVDV遺伝子のE2領域を標的として, 新た用牛繁殖農場から成る８農場 (A-F,Y,Z) かに設計した42Ｆ (5'-ATG GRC CRG CYT TCC

ら12頭のPI牛が検出された. PI牛のうち, 泌乳ARA TGG T-3') および既報の6R [10] から期の乳用牛は１農場 (A) から検出された38カ成るプライマー組を用いたRT-PCR法を行った.

月齢の１頭に限られ, 他の11頭は31カ月齢以下

177株の全てから予測された大きさの増幅産物の未経産の乳用牛または肉用牛であった. これが得られ, シークエンシングに基づく塩基配列らの成績から, 本テストにより, PI牛の泌乳状上, いずれの増幅産物も532bpであった. 同配態に関わらず, 乳用および肉用の両牛群におけ列に基づく分子系統樹上, わが国の牛から分離る同牛の存在を高い精度で推測し得ることが示された175株中63, 69および18株は1a, 1bおよ唆された.

び1c, ４, ２, ２および17株は1e, 1f, Soおよ

分子系統解析により, ４農場 (A-D) 由来のび2aの各遺伝子型に分類された. 輸入された牛５株, ２農場 (E,F) 由来２株および他の２農胎子血清由来の２株は1d型に属した. 得られ―7―

た遺伝子型の種類およびそれらの出現頻度から,６種類の制限酵素 ( Apo Ⅰ, Mly Ⅰ, BstAP

これら供試株はわが国の流行株 [7-9] を代表

Ⅰ, Pvu Ⅱ, Ear Ⅰ, EcoR Ⅴ) を用いた177

すると考えられた.

株のRFLP解析パターンは表５に示す11グルー

表４

スポットテストおよび飼養牛全頭からのウイルス分離成績
スポットテスト

農場Ａ

飼養頭数
61

抽出
子牛
１２３Ｂ

35

１２３Ｃ

55

１２３Ｄ33

１２３Ｅ

38

１２３Ｆ

84

１２３Ｇ37

１２３Ｈ

38

１２３Ｉ-Ｘ

16-76

１２３Ｙ35

１２３Ｚ

45

１２３

PI牛の頭数血清中和抗体価1a型ａ)1b型

1e型

2a型

ウイルス
分離

非泌乳期泌乳期256ｂ)
1024
2048
10244096≦
4096≦
5121024
1024
512
2048
2048
＜210242048＜22564096≦＜2512102448
512＜2＜2＜22562048
2048
＜216
64

64

64

32−

１(31)ｃ)１(38)ｃ)

512

256

64−

512

512

256−

128

64

32−

2048

2048

64−

2048

1024

128

−

256

16

32−

512

128

64−

512

256

64−

256

32

32−

128

128

16−

512

64

32

−

＜2＜2＜2−

512

256

256−

1024

1024

128

−

＜2＜2＜2＋

128

８

４−

1024

128

64−

＜2＜2＜2−

2048
4096≦
２８
512
＜2＜2＜210244096≦
4096≦＜264128256256−

512＜2＜2512＜2＜2＜2256512
512＜2816128−＜2−＜2−

128−＜2−＜2−

＜2−

64−

128−

256−

＜2−4−32−ａ) 攻撃ウイルスの遺伝子型を示す.
ｂ) イタリック体は各攻撃ウイルスにより得られた抗体価のうち最高値を示す.
ｃ) 括弧内にPI牛の月齢を示す.
ｄ) PI牛からの分離株の遺伝子型を示す.
―8―1aｄ)１(４)０1a１(１)０1a１(21)０1a１(26)０1c１(12)０1c００００００４(２−５)

０1b１(２)０1b表５グループ 遺伝子型 株数
Ⅰ1a37

Ⅱ1a26Ⅲ1b22Ⅳ

1b47Ⅴ1c14Ⅵ

1c４Ⅶ

1d２Ⅷ

1e４Ⅸ

1f２Ⅹ

So２2a17177株のRFLP解析に基づくグループ分類
下記酵素により得られた切断片長 (bp)Apo Ⅰ
265,267
265,267
ndndndｅ)ndnd265,267
nd
nd
nd

Mly Ⅰ
BstAP Ⅰａ)
146,386ndｂ)
ndndｃ)
252,280
ndｄ)
95,185,252
ndndｆ)
256,276
nd256,276ｇ)
ndndｈ)nd
nd
nd
nd
252,280
256,276
nd
nd

Pvu Ⅱ
nd
nd
nd
nd
nd
52,480nd
218,314nd
175,357
nd

Ear Ⅰ
nd
nd
nd
nd
nd
nd
262,270
nd
nd
nd
nd

EcoR Ⅴndndndndnd
ndndndndnd167,365

nd：切断されず.
ａ) 106, 146および280bpに切断されるNose株を除く.
ｂ) 190および342bpに切断されるIW20/97/NCP株を除く.
ｃ) 174および358bpに切断されるIW59/05/NCPおよびIS21NCP/00株を除く.
ｄ) 95, 118, 134および185bpに切断されるIS3NCP/95およびIS6NCP/95株を除く.
ｅ) 265および267 bpに切断されるIW1/87/NCPおよびTC TA142/01株を除く.
ｆ) 252および280 bpに切断されるIW1/87/NCP, IW4/89/NCPおよびTC TA142/01株を除く.
ｇ) Okazaki/01/04株は切断されず.
ｈ) 174および358bpに切断されるOK１(CA)NCP/03株を除く.

プ (Ⅰ〜総) に分類された. 各グループを構成

括する大多数の株は同一の切断パターンを, 少数牛群から抽出した６〜12カ月齢のBVDVワク株が異なる切断パターンを示した. 他方, 後者

チン未接種子牛３頭を対象として, 感染ウイルの少数株の切断パターンは, ６種類の制限酵素

スと同一遺伝子型の攻撃ウイルスを用いた血清を用いた解析により, 他のグループ株の切断パ中和試験およびウイルス分離の両者から成るスターンから区別された. 各グループは単一の遺ポットテストを実施することにより, PI牛を保伝子型株から構成され, 1a遺伝子型株はグルー有する群を高い精度で検出し得ることが明らか

プⅠおよびⅡに, 1b型株はグループⅢおよびとなった. また, RFLP解析は流行株の簡便なⅣに, 1c型株はグループⅤおよびⅥに含まれた.

遺伝子型別法として有用であり, 本法の実施に

1d, 1e, 1f, Soおよび2aの各遺伝子型株はそれより血清中和試験における適切な攻撃ウイルス

ぞれⅦ, Ⅷ, Ⅸ, Ⅹおよびのグループに属しの選択が可能になった. 以上より, 今回開発した. グループ間の切断像の相違は２％アガロー

たスポットテストおよびRFLP解析は, BVDVスゲル電気泳動後のエチジウムブロマイド染色防疫の効率的な推進に貢献し得ると考えられた.

により区別された.

本研究の遂行にあたり, 多大なご指導およびこれらの成績から, 本RFLP解析法により,ご助言を賜った岐阜大学大学院連合獣医学研究

これまでわが国で分離された８遺伝子型を簡便科 (独立行政法人農業・食品産業技術総合研究に識別し得ることが示唆され, 本法を血清中和機構動物衛生研究所ウイルス病研究チーム長)

試験における適切な攻撃ウイルスの選択に活用の恒光することにより, PI牛保有群を検出するスポッ

また, 貴重なご指導を賜った帯広畜産大学の鈴

トテストの精度が向上すると考えられた.

木宏志教授, 岩手大学の品川邦汎教授, 東京農裕客員教授に深甚なる謝意を表する.

工大学の本多英一教授, 岐阜大学の杉山誠教授―9―

に厚く御礼申し上げる. さらに, 本研究へのごof antibody titers against bovine viral

理解とご支援を賜った岩手県中央家畜保健衛生

diarrhea virus (BVDV) as a measure

所の清宮幸男所長をはじめとする岩手県中央,

to detect herds with cattle persistently

県南および県北の各家畜保健衛生所ならびに農

infected with BVDV, J Vet Diagn

林水産部畜産課の上司, 先輩, 同僚に感謝の意

Invest, ７, 327−332 (1995)を表する.

[５] Houe H：Serological analysis of a small

本研究の推進には国内各地からの分離株と正herd sample to predict presence or

確な分子系統解析が不可欠であり, 貴重なabsence of animals persistently infected

BVDV株を分与いただいた各都道府県および独with立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構動(BVDV) in dairy herds, Res Vet Sci,

物衛生研究所の皆様ならびにシークエンス解析

53, 320−323 (1992)

bovineviraldiarrhoeavirusのご支援をいただいた財団法人岩手生物工学研[６] Houe H：Epidemiological features and究センターの西原昌宏博士に御礼申し上げる.

economical importance of bovine virus

本総説は, 2008年に岐阜大学大学院連合獣医diarrhoea virus ( BVDV ) infections,学研究科に提出した論文を基に作成した. 詳細

Vet Microbiol, 64, 89−107 (1999)に つ い て は , ｢ J Vet Med Sci, 68, 255-258[７] Hayashi M, Murakami T, Takai H：(2006)｣, ｢J Vet Med Sci, 69, 1087-1089 (2007)｣

Genomic and serological characterization

および ｢J Vet Med Sci, 70, 393-395 (2008)｣

of bovine viral diarrhea virus recentlyの３報を参照いただきたい.

isolated in Ishikawa Prefecture inJapan, J Jpn Vet Med Assoc, 59, 320−

引用文献

324 (2006)[１] Baker JC：Bovine viral diarrhea virus：[８] Matsuno K, Sakoda Y, Kameyama K：

a review, J Am Vet Med Assoc, 190,

Genetic and pathobiological characteri-1449−1458 (1987)

zation of bovine viral diarrhea viruses[２] Kozasa T, Tajima M, Yasutomi I：

recently isolated from cattle in Japan,

Relationship of bovine viral diarrhea

J Vet Med Sci, 69, 515−520 (2007)

virus persistent infection to incidence[９] Nagai M, Ito T, Sugita S：Genomicof diseases on dairy farms based onand serological diversity of bovine viralbulk tank milk test by RT-PCR, Vet

diarrhea virus in Japan, Arch Virol,

Microbiol, 106, 41−47 (2005)

146, 685−696 (2001)[ ３ ] Pillars RB, Grooms DL ： Serologic[10] Sentsui H, Nishimori T, Kirisawa R：

evaluation of five unvaccinated heifers

Mucosal disease induced in cattle

to detect herds that have cattle

persistently infected with bovine viralpersistently infected with bovine viraldiarrhea virus by antigenically different

diarrhea virus, Am J Vet Res, 63, 499−

cytopathic virus, Arch Virol, 146, 993−

505 (2002)

1006 (2001)[４] Houe H, Baker JC, Maes RK：Application― 10 ―