基礎老化研究 47（3）; 35－41, 2023

【総説】

データ駆動型アプローチによる未病の解明
春木孝之 1，2、小泉

桂一 1，3、米澤翔汰 1、奥朋信 5，6、門脇渡邉

牧人 1，3、大嶋真 1、齋藤佑介 1，4、林周作 1，3、

滋 1，7

1

富山大学 未病研究センター
富山大学 学術研究部 都市デザイン学系
3
富山大学 学術研究部 薬学・和漢系
4
富山大学 学術研究部 工学系
5
理化学研究所 生命機能科学研究センター
6
広島大学 原爆放射線医科学研究所
7
富山大学 学術研究部 医学系
2

要約
動的ネットワークバイオマーカー理論は、健康から疾病状態へ変化する間にある未病、すなわち遷移状態で生じる早期警戒信号を検出することができる。この分岐理論を基礎にした
データ駆動型アプローチにより、様々な疾患で多くの成果を上げている。遺伝子発現量に着目した自然発症メタボリックシンドロームマウスの実験では、この理論により肥満になる直前で未病状態が発見され、さらに和漢薬である防風通聖散が未病の状態を抑えることも報告された。また、非染色かつ非・低侵襲で取得可能なラマンスペクトルから、マウス T 細胞活性化過程の遷移状態も細胞レベルで明らかにされた。未病の解明には理論、実験、データ駆動型研究の融合は必要不可欠であり、本稿ではその研究成果の一端を紹介する。

キーワード：dynamical network biomarkers（DNB）theory, metabolic syndrome, pre-diseasestate, Raman spectra, T cell activation

１．はじめに加により、いかに人が健康的に長生きできるかという「健病気になる直前を表す「未病」という言葉が登場する

康寿命」の延伸が重要になってきている社会背景もある。

中国最古の医学書「黄帝内経（こうていだいけい）」には、

さて、この未病は人の健康状態が病気（疾病状態）へ「聖人不治已病治未病」という記述がある。これは「名医と変化する間にあるが、「未病のタイミングはいつなのは既にかかった病気を治すのではなく、未病を治す」とか？」、「未病を引き起こす要因は何か？」、「未病の要因いう意味である。この時代には科学が十分に発展していに介入することで、病気の発症や重症化を防ぐことがでなかったため、医者が自身の経験から未病を捉えていたきるのか？」等、未病に対する興味、関心、疑問は様々と考えられる。一方、日本でも平成25（2013）年以降、閣である。古来、経験知であった未病を最新の理論、デー議決定された「健康・医療戦略」に未病が登場し、「健康タ駆動型研究により科学知に変換し、未病を解明するこか病気かという二分論ではなく健康と病気を連続的に捉とが重要である。

える『未病』の考え方などが重要になると予想される」と記載されている［1］。また、国内の高齢化、要介護者の増２．バイオマーカー
バイオマーカーの例として、よく知られている「血圧」

連絡先：春木〒 930-8555

孝之
富山県富山市五福 3190

電話：03-5454-4327
E-mail：haruki@sus.u-toyama.ac.jpを考えてみる。血圧には最高血圧および最低血圧の二種類があるが、ここでは話を簡単にするため最高血圧のみに限る。診察室における測定において、最高血圧が 140mmHg 以上の状態が繰り返し測定されれば、高血圧と診断される。閾値である140mmHg という値を境に高血－ 35 －

図１

バイオマーカーの概要

圧が診断されるため、血圧そのものが高血圧のバイオる未病状態、すなわち状態遷移の直前（遷移状態）で生マーカーとなっている。また、多くの学術論文で対照群じる予兆（早期警戒信号）を検出することができる［2-3］。と実験群の比較がされる場合、平均値の差が有意であれ

本稿では、この DNB 理論を生体データに適用して解析ば薬等の介入の効果があるとされる。先の閾値に加えて、することを単に DNB 解析と呼ぶ。
この DNB 理論が考案される前から、生態系において平均値の差に着目することが一般的である。
図１はバイオマーカーの概要である。緑色実線は通常状態が別の状態に遷移する際、早期警戒信号が検出されの静的なバイオマーカー、青色破線は静的なバイオマーることが既に知られていた［4-5］。Schefferらによる2001

カーによる判別結果、赤色実線は動的ネットワークワー

年のレビュー論文［4］によると、湖、サンゴ礁、森林、砂（詳細については後述）を示す。横クバイオマーカー［2-3］漠、海洋等、対象は多岐にわたる。また、2009年の同様

軸は時間（対象とする過程を全体時間で規格化）、縦軸もの論文［5］に紹介されているバイオマス（生物資源）の例が同様に規格化された対象とする物理量である。先の高血分かりやすい。これは横軸に時間と共に増加する収穫割圧の例で示されたように、血圧は静的なバイオマーカー（緑合、縦軸に残留バイオマスを物理量とする時系列データ色実線）、医者による診断結果は青色破線に対応する。診である。時間が経つにつれ、この物理量は徐々に減って断はまさにゼロまたはイチを表すステップ関数であり、いくが、最後に劇的に減少して状態遷移が起こる。状態その背景には徐々に上昇する静的なバイオマーカーがあが別の状態に遷移したことを意味する。さらに重要なことるイメージである。これを一般的な病気に置き換えれば、は、この状態遷移が起こる前のある時点から、この物理量時間0.0において健康であった状態が、時間が経つにつの標準偏差、および自己相関が徐々に増加していることでれて悪化して時間 1.0 で完全に病気となる（縦軸の値がある。これには数学の分岐理論が大きく関係している。時0.0を健康、1.0を病気と仮定）。時間 0.6 において、医者系列データの場合、自己回帰モデル近似に基づく簡単なが病気と診断すれば、青色破線のようになる。

導出により、状態遷移付近で自己相関が１に近づき、分一方、動的ネットワークバイオマーカー（赤色実線）散（標準偏差の二乗）が無限大になることが知られている。

は、健康から病気へ遷移する間の遷移状態で生じる早期すなわち、標準偏差と自己相関の値をモニタリングして警戒信号を検出することによりピークを示す（図１中のいれば、状態遷移の予兆を検出できるという原理である。

0.2 付近）。このバイオマーカーは平均値ではなく、揺らこのアイディアを生体の複雑システムに応用したのがぎやネットワークに着目する点が大きな特徴である。未DNB 理論と言える。多次元に拡張された状態空間の各病のタイミングやその要因が明らかになれば、生活習慣変数がノードとして複雑ネットワークを構成しているとの改善、医療介入ができ、発症や重症化の前に対策を講仮定する。図２は系の状態遷移の様子を示し、ボールをじることが可能となる。様々な疾患に対して、まずはこ状態と考える。安定状態１の場合、外部から力が加えらの動的ネットワークバイオマーカーが何かを探索するこれても、ポテンシャルの勾配があるため、ボールは底付とから始める。

近で安定を維持する（図２（a））。その後、図２（b）のように、条件が変わってポテンシャルの底が平らに近づい

３．動的ネットワークバイオマーカー理論てくると、ボールは左右に動きやすくなり（灰色矢印）、

2012 年に Aihara らにより考案された動的ネットワー

より低いポテンシャルに転がろうとして別の状態（図２

ク バ イ オ マ ー カ ー（Dynamical Network Biomarkers;（c）参照）に落ち着くことになる。この灰色矢印が DNBDNB）理論は、複雑ネットワークを構成する要素（変数）理論における「揺らぎ」に相当する。図２は簡略化されの揺らぎの大きさ、および要素間の相関の強さから特徴た１次元グラフであるが、実際には多次元のため非常に的な集団を抽出することにより、生体内・生物学におけ複雑である。なお、日本語の文献［6-7］も大変参考になる。

－ 36 －

として定義される。大きく揺らぐ変数を選択するために、片側の等分散検定（one-tailed F-test）が用いられる。
「２群間の分散が等しい」という帰無仮説を立て、検定を行う。統計検定量 F 値から対応する p 値を求め、仮説が棄却される水準（有意水準）を慣例的に 0.05 とし、対立仮説を支持する領域であれば「２群間の分散が等しくない」、つまり揺らぎが大きいと判断する。一般的に、
デー
タは離散的に指定された各時点で得られるため、例えば、初期データを対照群、初期以外の時間が経過した時点のデータを実験群とする。変数が多いと多重検定になるため、Benjamini–Hochberg 法により、p 値を q 値に変換する多重検定補正を行っておく。
続いて、大きく揺らぐ変数を対象に変数同士の関係 を 評 価 す る た め、 こ れ ら の 相 関 係 数（correlationcoefficient）を計算する。相関係数 r は広く知られている次の式である。

ただし、添え字 j は i とは異なる変数のインデックスである。相関係数の範囲は -1 ≤ r ≤ +1 であるため、単に相関強度に着目する場合には絶対値をとる。変数同士の関係が相関強度で定義できるので、非類似度（dissimilarity）を d = 1-¦ r ¦ とすれば階層型クラスタリングが可能となる。カットオフを決めることで、個々の揺らぎが大きく、かつ互いの相関強度の高い要素（変数）
図２群（＝同調的な揺らぎ）からなるクラスターを抽出する

様々な条件下におけるエネルギーポテンシャル（a）安定状態１、（b）遷移状態、（c）安定状態２ことができ、この集団が DNB 候補となる。経験的に、最も要素数の多い１番大きなクラスターに着目するが、このクラスターの要素数の半分より多い場合、２番目以降であっても DNB 候補とする。

具体的に DNB 解析の手順の例を次に示す。

最後に、DNB 候補の要素群の元データに戻り、各

１．前処理
２．揺らぎの評価のための等分散検定（F-test）

時点における DNB スコアを求める。DNB スコアは、

３．揺らぐ変数同士の関係を評価するための相関

DNB 候補の要素群から求められる平均標準偏差と平均相関強度の積として定義される。状態遷移が近づくと係数の計算
４．DNB 候補を抽出するための階層型クラスタ

平均標準偏差と平均相関強度が急激に上昇するため、DNB スコアのピークを探せば良い。DNB 候補を抽出しリング
５．遷移状態および DNB 要素群を同定するための DNB スコアの計算
各時点のデータをX =｛ xik ｝と表す。添え字 i は変数で1，2，…，N（N は変数の全体数）、添え字 k はサンプルで 1，た時点で DNB スコアがピークになれば遷移状態（未病）であり、その要素群が DNB 要素として同定される。
４．遺伝子発現量と DNB 解析
DNB 理論はこれまで遺伝子発現量に着目し、肺損傷［2，K（K はサンプルの全体数）を示す。遺伝子の場合、2，…，変数の全体数Ｎは数万、また、ラマンシフトの場合、数8-10］千のオーダーである（詳細は後述）。組織、細胞の数や機器による測定の回数により、サンプル全体数 K も決

糖尿病［11，12］、メタボリックシンドローム［13，14］、肝細胞がん［8，15］に適用された実績がある。この中から、自然定される。

発症メタボリックシンドロームマウス（TSOD マウス）

、および変数の各インデックスの平均（mean）m（i X）
は標準偏差（standard deviation）s（i X）を用いた実証研究を紹介する。TSOD マウスは３から、肝臓がん［2，10］、乳がん［9，10］、インフルエンザ感染症［9］、７ヵ月齢にかけて高脂血症や糖尿病、さらに脂肪性肝炎の病態を順次発症するヒトのメタボリックシンドロームの進展と類似している病態モデルマウスである。上記病態を呈していない超早期の状態（３から７週齢）の各週齢においてTSODマウスの脂肪組織が摘出され、マイクロアレイ法により網羅的に遺伝子発現量データが取得された。

－ 37 －その後、DNB解析により、同調して揺らぐ遺伝子のDNBはその波長差からラマンシフトと呼ばれ、ラマンシフトスコアがピークとなる週齢を探索した。その結果、４に対応した散乱光の強度のプロットがラマンスペクトルから５週齢目にかけて、このDNBスコアが急激に増加である。先に述べた遺伝子発現量データの取得には生体し、６週齢目で急激に減少していることが明らかとなっ組織の採取を伴うため、臨床への応用に向けては大きなた。よって、TSODマウスの５週齢目の時点が DNB理障害となる。そこで、非染色かつ非・低侵襲測定が可能論で定義される未病であることが実証された［13］。さらなラマン分光法はこの課題を解決し、疾患の超早期診断に、肥満に効果があるとされる防風通聖散を用いた実証や予後予測を実現する方法のひとつとなりうる［24］。

実験も行われた［14］。防風通聖散を服用したTSODマウス

最近、マウス T 細胞がナイーブ状態から活性化状態のDNBスコアのピークが見事に抑えられたことが報告に遷移する過程のラマンスペクトルが取得され、多変量された。これは未病の解明に向けた大きな成果である。

解析等を用いてナイーブ状態と活性化状態を分類できる同様に、炎症性腸疾患発症モデルマウスにおいても現ことが報告された［19］。データは、活性化刺激開始後 0、在、検討が行われている。マウスはデキストラン硫酸ナ

2、6、12、24、48 時間におけるラマンシフト（500 からトリウム（Dextran Sulfate Sodium Salt；DSS）を７日1799cm-1までの範囲）に対するラマンスペクトル強度で間にわたり自由飲水することで、出血を伴った下痢を発あり、各時点の測定回数は数十から数百である。ラマン症する［25］。DSS 飲水開始後０、１、３、５および７日

スペクトルに対して DNB 理論が適用可能かどうかを検目においてマウスから腸管を摘出し、マイクロアレイ法証するため、このマウス T 細胞活性化過程をモデルデーにより取得された全遺伝子の発現量に対して DNB 解析タとして、DNB 解析が試みられた［26］。このマウス T 細が行われた。その結果、発症より早期の DSS 飲水開始胞活性化過程の DNB 解析を詳しく説明する。

後３日目に未病が検出された（論文投稿準備中）。この

DNB 解析に限らず、一般的な解析であっても前処理ように、DNB 理論における未病の定義が、実際の疾病が必要となり、生データのラマンスペクトルをベースラ動物モデル（自然発症メタボリックシンドロームおよびイン補正しなければならない。いくつか提案されている大腸炎）にも適用できることが明らかとなった。しかし手法のうち、楕円型ボールがラマンスペクトルの下側ながら、現状では臓器を摘出する必要があり、実際の臨を転がるように強度を補正するローリングボール法が用床への応用は困難である。

いられた。この手法には任意に指定できる二種類のパラメーターである長径、楕円率があり、18 パターンの条５．ラマンスペクトルと DNB 解析件で前処理（DNB 解析の手順 1）を行った。ここではラマン分光法は、赤外分光法と同様に振動分光法のカ

長径 1000、楕円率 0.05 の条件の結果を紹介する。DNBテゴリーに属し、光と分子の相互作用を利用した化学解析を実施する前に、本ラマンスペクトルを単純に可視分析手法である。計測技術の進歩により、近年では生化することにより、その特徴を確認する。

［16］、細図３はマウス T 細胞活性化過程の平均ラマンスペク

胞分化［17，18］、免疫細胞の活性化［19，20］、動物やヒト組織トルである。各時点のスペクトルが異なった色で表されにおける疾患状態［21-23］等の検出で成果が上げられていており、ローリングボール法で前処理されたデータである。この最大の特徴は、非染色かつ非・低侵襲的に試料る。横軸はラマンシフト、縦軸はスペクトル強度である。

中の分子構造や組成を解析できる点である。この非染色ラマンシフトは 500 から1799cm-1までの 1cm-1刻みの範かつ非・低侵襲という点は今後の臨床応用を見越せると囲で約 1300 次元となるため、一般的には多変量解析がいう意味で大変重要である。物質に照射された光（入射用いられる。また、多くのラマンシフトは既知の分子振光）が、物質内の分子と衝突する際、入射光とは異なる動モードに帰属する。例えば、1004cm-1にあるピークは波長をもつ非常に弱い強度の散乱光が観測され、試料中フェニルアラニンの呼吸振動に相当することが知られての分子構造や組成を知る手掛かりとなる。この原理は、いる。

体計測への応用が進んでおり、例えば、細胞死発見したインドの研究者チャンドラセカール・ラマン

まず、ラマンシフトを固定して（図３中の逆三角マー（Chandrasekhara Venkata Raman）から「ラマン効果」

ク）、その強度の時間変化を追跡した。フェニルアラニと名付けられている。入射光とは異なる（ずれた）波長

ン に 加 え て、 チ ト ク ロ ムCの751cm-1お よ び 1126cm-1、

図３

マウス T 細胞活性化過程の平均ラマンスペクトル（文献［26］の Fig. 2（b）を引用）－ 38 －

図４

揺らぐラマンシフトのネットワーク（文献［26］の Fig. 5（a）元に作成）。

DNA に関する 1374cm-1、または糖、タンパク質に関すらの研究［26］においても同様に、線形判別分析が行われ、る 1655cm-1 の時間変化を確認した。特に共通する変化判定スコアが（CD69 の発現ではなく）細胞面積の時間は見られず、未病に至ってはその兆候すら見られなかっ変化と良い相関を示したことから、細胞面積も活性化のた。

バイオマーカーであることが分かった。この活性化のバ

図３で明らかなように、ラマンスペクトルの特性からイオマーカー（線形判別分析の判定スコア：LD1）が初ピークは１種類のラマンシフトに対応するのではなく、期の -3.0（ナイーブ状態）から、24 時間を超えて 2.0（活その周辺のシフトに幅をもって分布している。これは性化状態）に近づいていくのに対し、DNB スコアは活ピークの情報が周辺のシフトに畳み込まれていることを性化刺激開始後６時間でピークを示す。よって、T 細胞意味し、変数をそのまま独立として取り扱うことは難しが完全に活性化する活性化刺激開始後 48 時間に対して、い。そこで、この課題を回避するため、ピークのみを自活性化刺激開始後６時間が遷移状態であることが明らか

動検出することで 81 種類の代表的なラマンシフトを選となった。

択し（ピークフィルタリング）、DNB 解析の対象とした。

マウスＴ細胞活性化過程のラマンスペクトルのDNB

これら 81 種類の代表的なラマンシフトに対して DNB

解析結果について、前処理に大きく依存していることに解析を行い、等分散検定から活性化刺激開始後 6 時間に注意が必要である。他のローリングボール法による前処おいて 10 種類の揺らぐラマンシフトが得られた（手順

理のパターンでも活性化の遷移状態が活性化刺激開始後２）。続いて、揺らぐラマンシフト同士の相関係数（手６時間でほぼ共通しているが、DNB ラマンシフトの内順３）を求めて非類似度を計算し、階層型クラスタリン訳が前処理によって異なっている。よって、ラマンシフグを行った（手順４）。カットオフを 0.3 としてクラスタートが帰属する物質を議論したいところであるが、現時点を抽出した。

では時期尚早であり、今後、検討が必要である。

図４はピークフィルタリングの場合の揺らぐラマンシフトのネットワークである（Harukiらの論文［26］の Fig. 5（a）の樹形図を参考に作成した）。揺らぐラマンシフト 10 種類のノード、相関強度の高いもの同士はエッジで結ばれている。この場合、１番大きなクラスターは緑色破線で囲まれた４種類のラマンシフトであり、その内訳は735、751、755、1254cm-1 であった。２番目に大きなクラスター（ラマンシフトが 608 と 661）も存在するが、経験的に着目するのは１番大きなクラスターの要素数の半分より多い場合に限るため、本解析では対象外とされた。１番大きなクラスター内の相関について赤色は正、青色は負の相関を意味する。この時点で１番大きなクラスターは DNB 候補に過ぎず、次に示す DNB スコアを評価しなければならない（手順５）。
図５は線形判別分析の判定スコアと DNB スコアの時間変化を示す［26］。Ichimura らによる先行研究［19］において、ナイーブ状態と活性化状態を分類する線形判別分析の判定スコア（LD1）が活性化のバイオマーカー CD69の発現と良い相関を示すことが示された。つまり、この判定スコアも活性化のバイオマーカーと言える。Haruki

図５－ 39 －線形判別分析の判定スコアと DNB スコアの時間変化（文献［26］の図５（b）を引用）。

６．おわりに2012.

これまで経験知として知られていた未病を科学的に解9.

Liu R, Yu X, Liu X, et al. Identifying critical

明し、科学知にすることは非常に重要である。DNB 理

transitions of complex diseases based on a single

論の登場は、興味対象とする物理量の平均の差が有意で

sample. Bioinformatics 30：1579–1586, 2014.

あるかどうかの従来の視点に一石を投じ、同調的に揺ら10. Chen P, Liu R, Li Y, et al. Detecting critical state

ぐネットワークという新たな可能性を見出した。自然発

before phase transition of complex biological症メタボリックシンドロームマウスの遺伝子発現量デー

systems by hidden Markov model. Bioinformatics
32：2143–2150, 2016.

タに対して行われた DNB 理論の適用は大きな成果であり、防風通聖散の効果も明らかにされた点は特筆すべき

11. Liu X, Liu R, Zhao XM, et al. Detecting early-

ことである。また、ラマンスペクトルに対しても DNBwarning signals of type 1 diabetes and its leading

理論の適用が試され、未病に限らず、細胞レベルでマウ

biomolecular networks by dynamical network

ス T 細胞活性化の遷移状態を検出できたことも非常に

biomarkers. BMC Medical Genom. 6：S8, 2013.

重要である。これまで遺伝子と DNB 理論の組み合わせ

12.

Li M, Zeng T, Liu R, et al. Detecting tissue-の研究が多くの実績を積み重ねてきたが、現在は DNB

specific early warning signals for complex diseases

理論とラマン分光法の融合という新たなフェーズを迎えbased on dynamical network biomarkers：Studyている。現在のところ、まだ課題が残されているが、臨of type 2 diabetes by cross-tissue analysis. Brief.
Bioinformatics 15：229–243, 2014.

床に向け少しずつ未病検出系の確立へと向かっている。
超高齢化社会を迎える日本において、老化に関する未13. Koizumi K, Oku M, Hayashi S, et al. Identifying

病の検出は特に重要である。非・低侵襲的に糖尿病の未pre-disease signals before metabolic syndrome in病検出が可能となれば、糖尿病発症を予防し、または延mice by dynamical network biomarkers. Sci. Rep.

期させることが期待される。フレイルについても未病が9：8767, 2019.

明らかになれば、運動療法等により健康寿命を延伸でき

14. Koizumi K, Oku M, Hayashi S, et al. Suppression

る可能性がある。今後も理論、実験、データ駆動型研究of Dynamical Network Biomarker Signals atの積極的な連携は欠かせず、様々で異なるバックグラウ

the Predisease State（ Mibyou）before Metabolic

ンドをもつ研究者が集まることで未病の解明が進むこと

Syndrome in Mice by a Traditional Japaneseが期待される。

Medicine（Kampo Formula）Bofutsushosan. Evid.
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Takayuki Haruki 1，2 ／ Keiichi Koizumi 1，3 ／ Shota Yonezawa 1 ／ Makito Oku 1，3 ／Yusuke Oshima 1，4 ／ Shusaku Hayashi 1，3 ／ Tomonobu M. Watanabe 5，6 ／Makoto Kadowaki 1 ／ Shigeru Saito 1，71

Research Center for Pre-Disease Science, University of Toyama
23Faculty of Sustainable Design, University of Toyama

Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Toyama
456

Faculty of Engineering, University of Toyama

RIKEN Center for Biosystems Dynamics ResearchResearch Institute for Radiation Biology and Medicine, Hiroshima University
7

Faculty of Medicine, University of Toyama

Abstract
Dynamical network biomarkers theory detects the early warning signals of the predisease state, or transition state, from a healthy to a disease state. A data-driven approachbased on bifurcation theory has achieved many results in various diseases. In an experimenton spontaneous metabolic syndrome mice focusing on gene expression levels, this theory
detected a pre-disease state just before obesity, and a traditional Japanese medicine
Bofutsushosan suppressed the pre-disease state. Also, the transition state in the mouseT-cell activation process was clarified at the cellular level using Raman spectra obtainedin a non-labeling and non-invasive manner. Combining theory, experiment, and data-driven
research is essential to reveal the pre-disease science. In this paper, we will introduce someof the research results.

Keywords：dynamical network biomarkers（DNB）theory, metabolic syndrome, pre-diseasestate, Raman spectra, T cell activation－ 41 －