岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 34 (№ 4), 127−132 (2008).

総説

超音波診断装置を用いた妊娠末期におけるホルスタイン種
クローン胚由来産子の体重モニタリング法に関する研究

高橋正弘
要

約

クローン胚由来産子は過大子の発生率が高く, そのため難産および死産の発生率が増加し,さらに出生後の生存率が低下した. ホルスタイン種産子の中手幅もしくは中足幅は生時体重と高い相関性が認められた. 妊娠末期に超音波診断法により測定される胎子中手幅, また, その測定値から推定される胎子体重は, 産子の中手幅および生時体重と近似していた. よって, 妊
娠末期の胎子中手幅の測定により生時体重が推定され, 過大子が予測される場合には分娩誘起することにより, クローン胚由来産子の難産およびそれに起因する産子の損耗を最小限に防止できることが示された.
キーワード：クローン, 難産, ホルスタイン種, 中手幅, 超音波診断法.

家畜繁殖技術は凍結精液による人工授精, 胚実施した.

移植, 体外受精および培養などを経て, クローン技術へと発展してきた. クローン技術が期待

１

ホルスタイン種受精卵クローン胚由来産子

されていることとして, 家畜では育種改良およの特徴および分娩状況

び増殖 [１,２], 絶滅が危惧されている希少種

クローン胚の作製手順は, 以下の通りである.の遺伝的資源の保存 [３−５], 人医学では再ド ナ ー 胚 は , ５ ％ 牛 胎 児 血 清 加 TCM199 液

生医療への応用 [６,７], 有用物質生産のため(Earle's salt, Gibco, USA) のドロップ中で,の遺伝子組換え家畜の生産 [８] などである.

ホールディングピペットとカッティングニード

しかし, 一方で, クローン胚由来産子では過大ルを用いて, ５−６日齢胚の透明帯を切開して子, 難産, 死産および虚弱子など多発すること

胚を透明帯から取り出し, 口径の細いパスツーが指摘されており [９−11], クローン技術のルピペットを用いてピペッティングにより割球フィ−ルドでの実用化を目指すためには, 分娩に単離した. 胚の割球が移植されるレシピエン時においてクローン胚由来産子の生存性を高めト卵子は, 食肉処理場由来の交雑種 (ホルスタることが必要不可欠である. そこで本研究は,イン種雌牛×黒毛和種雄牛) の卵巣から常法それらの問題点を解決するために, 調査研究を[12] に準じて採取し, 体外成熟培養22−24時

二戸支会

NOSAI岩手北部― 127 ―

間後, 顕微操作により10−15％量の細胞質とと子と比較して有意に長かった (Ｐ＜0.05). まもに核質を除去した. 除核後, Caイオノフォ

た, クローン胚由来産子の分娩難易度および難アA23187 (５μM, SIGMA) で５分間, シク産率はいずれも対照群に比較して高く (Ｐ＜ロヘキシミド (10μg/ml, SIGMA) で４−６0.05), 尾位, 死産, 過大子および球節が攣縮・時間浸漬して活性化処理を行った. 核移植操作

屈曲した状態の突球などが多発した (表２).

は, 単離したドナー割球を活性化処理したレシ

受精卵クローン胚由来産子の在胎日数が延長

ピエント卵子の透明帯内に挿入し, 細胞融合装するほど, 生時体重が増加し, 生時体重が増加

置 (ECM200, BTX, USA) を用いて電気的すると分娩難易度も高くなる傾向が認められ,融合処理 (0.75kv/㎝, 50μ秒, ２回) を行っ難産で生まれたものと正常分娩で生まれたものた. 融合液には, 0.1mM硫酸マグネシウム,の生時体重は, それぞれ58.0±7.0㎏と49.3±6.00.05mM塩化カルシウムを含む0.3Mシュクロー㎏であり有意な差が認められた (Ｐ＜0.05).

ス液を使用した. 細胞融合処理後のクローン胚

クローン胚由来産子は過大子の発生率が高く,の発生培養には, Tervitら [13] の５％牛胎児

そのため難産および死産の発生率が増加し, さ血清加卵管合成培養液を修正し, ５％CO２, ５らに出生後の生存率が低下することが示唆され％O２, 90％空気, 湿度飽和, 38.5℃の気相条件た.

下で培養した. クローン胚は, 核移植 (＝０日)

産子の生時体重と母牛の骨盤サイズ (腰角幅,後６−７日に形態的に正常な桑実胚−脱出胚盤寛幅, 坐骨幅および尻長) と難産率の関係 (表胞を20％子牛血清加TCM199液 (Earle's salt,３) では, 母牛の腰角幅において, NT区の難Gibco, USA) に入れて0.25mlストローに１胚産群ではNT区の正常分娩群やAI・ET区の正を封入して移植した.

常分娩群および難産群と比較し, 有意に (Ｐ＜ホルスタイン種受精卵クローン胚由来産子の0.05) 大きかった. 母牛の寛幅において, AI・特徴と分娩状況について, AIおよびETによるET区の難産群はNT区およびAI・ET区の正常産子と比較検討した (表１). クローン胚由来分娩群と比較して, 有意に (Ｐ＜0.05) 大きかっ

産子の生時体重は, AIおよびET産子と比較した. 産子の生時体重がある一定以上を超えると,て有意に大きく (Ｐ＜0.05), 在胎日数はAI産骨盤サイズにかかわらず難産に陥るリスクが高

表１

受精卵クローン胚由来産子 (NT), 人工授精 (AI) および生体由来胚移植(ET) によるホルスタイン種産子の出生状況
産子

生時体重(㎏)

在胎日数(日)

分娩難易度ａａ

難産率 (％)

283.4±5.4

2.2±0.730.0ａ

53.9±5.6

284.9±5.0

2.4±0.6

35.7♀ (ｎ＝16)50.1±8.5

282.0±5.6

2.0±0.7

25.0

AI(ｎ＝1571)

45.2±5.5ｂ

280.8±5.8ｂ

1.7±0.7ｂ12.7ｂ♂ (ｎ＝859)

46.5±5.5

281.2±5.6

1.8±0.7

15.1♀ (ｎ＝712)

43.5±5.2

280.3±5.9

1.7±0.7

9.7ET(ｎ＝81)45.3±5.6ｂ282.7±7.5ａ

1.8±0.8ｂ13.6ｂ♂ (ｎ＝45)47.3±5.3

285.0±8.2

1.8±0.8

13.3♀ (ｎ＝36)42.7±5.1

279.9±5.4

1.7±0.7

13.9

NT(ｎ＝30)51.9±7.4♂ (ｎ＝14)ａ

平均値±標準偏差, 同列異符号間で有意差あり (Ｐ＜0.05).
分娩難易度：１：自然分娩, ２：ごく軽い介助, ３：大人２−３人の牽引, ４：多人数の牽引,
５：帝王切開, 切胎術など外科的処置. 分娩難易度３以上を難産.
― 128 ―表２

受精卵クローン胚由来産子 (NT), AIおよびETによるホルスタイン種産子の尾位, 死産, 過大子および突球の発生率
尾位率 (％)ａ

死産率 (％)ａｂ

過大子率 (％)

突球率 (％)(３/30)

20.0ａ(６/30)

3.8ｃ(60/1,571)

0.6ｃ(９/1,571)

1.8ｂ(28/1,571)

4.9ｂｃ(４/81)

1.2ｂｃ(１/81)

1.2ｂ(１/81)

NT(ｎ＝30)

23.3 (７/30)

16.7

AI(ｎ＝1571)

5.2ｂ(82/1,571)

ET(ｎ＝81)4.9ｂ(４/81)(５/30)ａｂ10.0

同列異符号間で有意差あり (Ｐ＜0.05).
過大子：生時体重が60㎏以上.

表３

受精卵クローン胚由来産子 (NT), 人工授精 (AI) および生体由来胚移植 (ET) 由来産子を娩出した雌牛の骨盤サイズ (腰角幅, 寛幅, 坐骨幅, 尻長) と分娩状況

産子由来
NT(ｎ＝30)

AI・ET(ｎ＝110)

分娩状況

生時体重(㎏) 腰角幅 (㎝)

寛幅 (㎝)

坐骨幅 (㎝)

尻長 (㎝)

正常分娩
21 (70.0％)49.3±6.0ａ

56.5±2.9ａ

51.1±2.0ａ

38.7±3.054.7±2.0

難産
９ (30.0％)ａ

58.0±7.0ｂ

59.8±2.7ｂ

53.5±3.6ａｂ

39.5±3.955.4±2.6

正常分娩
97 (88.2％)

44.5±5.1ｃ

57.2±2.9ａ

51.5±2.2ａ

38.6±2.954.3±2.1

難産
13 (11.8％)ｂ

47.4±7.6ａｃ

57.9±2.1ａ

53.0±2.3ｂ

39.0±2.854.9±2.0

同列異符号間で有意差あり (Ｐ＜0.05)

くなる傾向が認められており, 難産の発生には,２ ホルスタイン種受精卵クローン胚由来産子に母牛の骨盤サイズ以上に産子の生時体重がかなおける中手幅および中足幅と生時体重の関係りの影響を及ぼすと考えられた.

娩出直後のホルスタイン種産子の中手幅もし

受胚牛の周産期疾病の発生率は, 受精卵クロー

くは中足幅の最狭部横径幅 (皮膚−骨−皮膚)

ン胚由来産子の受胚牛が66.7％ (20/30) であをノギスにより測定し, 生時体重や難産との関り, ホルスタイン種ET産子の受胚牛の発生率係を調査した.

30.6％ (11/36) より２倍以上有意に (Ｐ＜0.01)

ホルスタイン種産子 (ｎ＝187) の中手幅と生時体重の関係は, ｙ＝2.152ｘ１−15.015, ｒ＝高いことが認められた.
ホルスタイン種受精卵クローン胚 (NT) お

0.780 (Ｐ＜0.05), そのうち, ホルスタイン種

よび生体由来胚移植 (ET) 由来産子を分娩しクローン胚由来産子 (ｎ＝30) については, ｙ＝た受胚牛の繁殖状況は, 以下の通りであった.

1.662ｘ１ ＋0.907, ｒ＝0.740 (Ｐ＜0.05), ホル

受精卵クローン胚由来産子を分娩した受胚牛20

スタイン種AIおよびET産子 (ｎ＝157) では,頭における分娩後の初回AI受胎率 (％) は,

ｙ＝2.232ｘ１ −17.527, ｒ＝0.780 (Ｐ＜0.05)

正常分娩群で46.7％ (７/15), 難産群０％ (０/であった.

５), 合計35.0％ (７/20) で, 空胎日数は160.1

ホルスタイン種産子の中足幅と生時体重の関±92.8日であった. ET産子の受胚牛29頭にお係では, ｙ＝2.169ｘ２ −7.204, ｒ＝0.684 (Ｐける初回AI受胎率 (％) は, 正常分娩群42.9％＜0.05), そのうち, ホルスタイン種クローン(12/28), 難産群０％ (０/１), 合計41.4％

胚由来産子は, ｙ＝1.360ｘ２＋15.878, ｒ＝0.487(12/29), 空胎日数は124.7±68.3日であった.

(Ｐ＜0.05), ホルスタイン種AIおよびET産子

NT区で初回AI受胎率が低く, 空胎日数が長くは, ｙ＝2.268ｘ２ −10.087, ｒ＝0.711 (Ｐ＜なる傾向が認められたものの, 有意差は認めら0.05) であった.
中手幅もしくは中足幅が大きくなるほど難産れなかった.
― 129 ―

の発生は増加し, 難産の発生率は, 中手幅が30および生時体重 (30.0±2.1㎜, 51.2±5.5㎏) と㎜未満の場合は6.7％ (７/105) であり, 中手近似していて, 分娩１週間前では超音波診断法

幅が30㎜以上の場合は32.9％ (27/82), 中足幅により生時体重を推定できると思われた (表４).

が26㎜未満の場合は9.8％ (11/112) であり,胎子中手幅が30㎜以上で分娩誘起を実施した

中手幅が26㎜以上の場合は30.7％ (23/75) で,Ａ群は, 胎子の中手幅が30㎜以上で分娩誘起をそれぞれ両群の間に有意な差が認められた (Ｐ

実施しなかったＢ群と比較して, 在胎日数で＜0.01). 中手幅もしくは中足幅の測定により2.2日短いにもかかわらず, 生時体重で1.9㎏大生時体重や難産の推測が可能であることが示さ

きかった (表５). Ａ群では, １頭で難産が発れた.

生し４頭は正常分娩であり, 死産の発生はなく,もし分娩誘起を実施していなければ, さらに在３

超音波診断装置を用いた妊娠末期における胎日数が延長して生時体重が増加し, 過大子症

ホルスタイン種クローン胚由来産子の体重モ候群で難産になった可能性は高いと考えられた.

ニタリング

Ｂ群では, 胎子中手幅が30㎜以上であったが分ホルスタイン種クローン胚由来産子は, 過大娩誘起を実施せず, ２頭とも正常分娩であり,子による難産や死産の発生率が高い. そこで,死産の発生はなかった. 胎子中手幅が30㎜未満

妊娠末期においてその胎子体重をモニタリングし, 生時体重を推測することが必要不可欠である. 本試験では, ホルスタイン種クローン胚のETにより単子で妊娠しているホルスタイン種経産牛14頭 (受精卵クローン胚由来胎子妊娠牛
11頭, 体細胞クローン胚由来胎子妊娠牛３頭)を対象に, 分娩予定日のおよそ１カ月前より１週間おきに胎子中手幅を超音波診断装置により測定し, その値から胎子体重を推測した. なお,
体細胞クローン胚の作製手順は, 受精卵クローン胚と同様であり, 供核細胞としては, 11才の䋨⢛஥㕙䋩

ホルスタイン種経産牛の大腿部筋肉細胞を用いた.
直腸壁を介して探触子を胎子前肢もしくは後肢にあて, 胎子の中手もしくは中足における最狭部横径幅 (皮膚−骨−皮膚) を測定した. 背側と腹側の測定値に差は認められなかったが,エコー画像としては異なって描出されるため,それぞれのエコー画像を例示した (図１). 超音波診断装置は, 大動物用超音波断層装置
EUB−905 ((株) 日立メディコ, 東京) を用いた. 探触子はEUP-032T (５MHz) を使用し,Ｂモードにより測定した.

䋨⣻஥㕙䋩

ホルスタイン種経産牛13頭において, 分娩前１週間内の胎子中手幅および推定胎子体重(30.2±2.2㎜, 50.0±4.7㎏) は, 産子の中手幅⍫ශ㑆䉕᷹ቯ䋬㪈⋡⋓䉍㪈㪇㫄㫄䋮

図１― 130 ―妊娠末期における牛胎子中手のエコー画像

表４

妊娠末期におけるホルスタイン種クローン胎子の中手幅測定による推定胎子体重とその分娩状況

受胚牛

胎子中手幅 (㎜)№(推定胎子体重, ㎏)

産子中手幅 生時体重 在胎日数 分娩難易度 性 産子中足幅

備考

(㎜)

(㎏)

(日)

(㎜)

32

54290

2

♂

28＊

31.5

52275

2

♂

27

分娩誘起

32532802♂

272847282

1

♀

25

26.5

522862♀

24○3150288

2

♀

27.5

29.6

29.5

45277

2

♀

27

31.5

56289

2

♀

27.5

分娩誘起

30

56282

1

♀

25

分娩誘起

27.5

40276

2

♀

25

2744287

1

♀

22

31.5

58285

2

♀

27

分娩誘起

32

55283

3

♀

27

分娩誘起

30.5

54

265

5

♀

25

受胚牛の脱臼

分娩前の日数
35−29 28−22 21−15 14−８ ７−１(受精卵クロ−ン産子)
1−

30.8

27.3＊

−

(51.3)
2

−

○

32.9

中足幅(52) (55.8)○

30

31.1(49.5) (51.9)
3

○4

−

28.5

28.8(46.3)(47)(49.5) (54.1)

30

32.1

27.3

27.2

26.4

28.1(43.7) (43.5) (41.8) (45.5)
5

−

24.9

○

○(38.6)6−○27(43.1)

28.6

29.2

(46.5) (47.8)
7

−

−

−

27.8

(44.8) (48.7)
8

○

9

−

○
−

30.2

29.8(50)(49.1) (51.9)

×

○

31.1
31.2
(52.1)

10

−

−

25.4

27.2

27(39.6) (43.5) (43.1)
11×

○

○

○

27.2(43.5)(体細胞クロ−ン産子)
1229.5×○(48.5)1331.3○−○−(52.3)
14−30.9

31.9(51.5) (53.6)
31.2

32.4(52.1) (54.7)
×31.1(51.9)

帝王切開手術, 死産○: 中手幅もしくは中足幅の測定不可であったが胎子の体の一部に触知可能.
×: 中手幅もしくは中足幅の測定不可で, また胎子にも触知不可.
−: 実施せず.

表５

胎子中手幅および分娩誘起の有無と産子中手幅 (㎜), 生時体重 (㎏), 在胎日数 (日), 分娩難易度の関係

群(頭数)

胎子中手幅(㎜)分娩誘起の有無

産子中手幅(㎜)

生時体重(㎏)

在胎日数(日)

分娩難易度

Ａ (ｎ＝５)≧30㎜

有31.3±0.8ａ

55.4±2.2ａ282.8±5.1

2.0±0.7Ｂ (ｎ＝２)≧30㎜

無32.0±0.0ａ

53.5±0.7ａｂ

285.0±7.1

2.0±0.0

無ｂｂｃ

281.6±5.0

1.6±0.5

Ｃ (ｎ＝５)＜30㎜

27.7±1.245.6±4.4

平均±標準偏差.
同列異符号間で有意差あり(p<0.05).

で分娩誘起を実施しなかったＣ群は, Ａ群より予測される場合には, 分娩誘起などの処置をす

生時体重で9.8㎏小さく, ５頭とも正常分娩でることで, 難産およびそれに起因する死産およあった.

び生後直死を最小限に防止できることが示されこれらより, 超音波診断装置により過大子がた.

― 131 ―

本研究の遂行にあたり, ご指導とご校閲を賜1005 (1999)

りました帯広畜産大学畜産学部の三宅陽一教授,[６] Dai Y, Vaught T, Boone J. Targeted

小岩井農場技術研究センターの後藤太一前所長

disruption of the alpha1, ３−galactos-

および岩手大学農学部の居在家義昭教授に深甚

yltransferase gene in cloned pigs.

なる謝意を表します. また, 研究を進めるにあNature Biotechnology, 20, 251 − 255

たりご協力いただきました家畜バイテクセンター(2002)の土屋秀樹氏および農場職員に感謝いたします.

[ ７ ] Lai L, Kolber-Simonds D, Park K.

最後に, この総説は2007年度に岐阜大学連合大Production of alpha−１,３−galactosyl-学院に提出した論文を元に作成いたしました.

transferase knockout pigs by nuclear

ページ数の都合上, かなり簡略化し, 説明不足

transfer cloning. Science, 295, 1089−のところも多々あるとおもわれます. 詳細につ1092 (2002)

いては, 既発表の以下３論文を参考にしていた[８] Brink M, Bishop M, Pieper F. Develo-

だきたいと思います. ① 日獣会誌 2000；53：

ping efficient strategies for the gener-

387−390, ② J Reprod Dev 2001；47：105−

ation of transgenic cattle which produce

108, ③

biopharmaceuticals in milk. Theriogen-

J Vet Med Sci. 2005；67：807-811.

ology, 53, 139−148 (2000)
引用文献[９] Garry F, Adams R, McCann J. Postnatalcharacteristics of calves produced by[ 1 ] Hirooka H. Evaluation of testing

nuclear transfer cloning. Theriogenology,schemes with clones for carcass traits
in beef cattle. Anim Sci J, 71, J19−J2545, 141−152 (1996)[10] Willadsen S, Janzen R, McAlister R.

(2000)The viability of late morulae and[２] Ruane J, Klemetsdal G, Sehested E.

blastocysts produced by nuclear trans-Views on the potential impact ofplantation in cattle. Theriogenology,cloning

35, 161−170 (1991)

onanimalbreedingandproduction. Acta Agris Scand Sect A[11] Yang X, Anderson G. Micromanipulation

Animal Sci, 47, 209−212 (1997)of mammalian embryos ： principles,[３] Lanza R, Cibelli J, Diaz F. Cloning ofprogress and future possibilities. Ther-an endangered species (Bos Gaurus)

iogenology, 38, 315−335 (1992)

using interspecies nuclear transfer.

[12] Hamano S, Kuwayama M. In vitro
fertilization and development of bovine

Cloning, ２, 79 (2000)

oocytes recovered from the ovaries of[４] Wells D, Misica P, Tervit H. Adult
somatic cell nuclear transfer is used

individual

donors ： A

comparison

to preserve the last surviving cow ofbetween the cutting and aspiration

the Enderby Island cattle breed.

method. Theriogenology, 39, 703−712

Reprod Fertil Dev, 10, 369−378 (1998)(1993)[５] Wells D, Misica P, Tervit H. Production[13] Tervit H, Whittingham D, Rowson L.

of cloned calves following nuclear

Successful culture in vitro of sheeptransfer with cultured adult muraland cattle ova. J Reprod Fert, 30, 493−

granulosa cells. Biol Reprod, 60, 996−

497 (1972)― 132 ―