岩獣会報（Iwate Vet.）,Vol. 42（№ 2）,51－55（2016）.

家畜・野生動物における肝蛭寄生バイオマーカーを用いた血清診断法の開発とその応用

関要まどか

約

肝蛭症は世界中で畜産業に甚大な経済被害を与えており，家畜衛生上，最も重要な寄生虫病の一つである．
また，感染動物のレバーを生食することにより感染する人獣共通感染症としても重要である．獣医師の努力により家畜の肝蛭症は減少し続けてきた．一方で，シカなどの肝蛭のレゼルボアとなりうる野生動物の急増が肝蛭症のリスクを高めている．近年，シカなどの有害野生鳥獣を食肉資源として活用しようという試みがはじまっていることから，食用に供される野生動物の肝蛭保有率を正確に把握する必要がある．そこで，本稿では肝蛭症の診断法とその問題点について整理する．さらに，肝蛭寄生バイオマーカーに着目したリコンビナント抗原を用いた血清診断法の開発とその応用について解説する．
キーワード：肝蛭，寄生バイオマーカー，ELISA，血清診断
１．序論

海道では同じ遺伝子型を示す肝蛭がエゾシカとウシで肝蛭（Fasciola 属の吸虫）が主に反芻類の胆管に寄検出されたため，肝蛭症の野生動物と家畜の間で肝蛭生することにより引き起こされる肝蛭症は，家畜の肝症が相互伝播していることが示された（論文投稿中）．

障害の原因となるために世界中で畜産業に甚大な影響すなわち，これまで家畜ウシが主体であった肝蛭症がを与えている．国内では肝蛭の中間宿主はヒメモノア

最近ではエゾシカの疾患になりつつあるといえる．エ

ラガイで，終宿主は幼虫に汚染された稲わらや牧草なゾシカは野生動物なので投薬ができないため，今後，どの飼料の経口摂取により感染する（図１）．また，肝蛭症は人獣共通感染症でもあり，ヒトへの感染源としては，幼虫が付着した水耕野菜や，感染した反芻家畜の腸管・肝臓（レバー）に寄生する幼虫を摂取することがあげられる．
肝蛭症は国内では主に放牧牛で感染が知られており，最盛期には家畜ウシの感染率が80%を超えた地域もあった．1990年代以降，駆虫薬としてトリクラベンダゾール（商品名：ファシネックス, ノバルティスアニマルヘルス）が承認されてから，家畜ウシの肝蛭症は激減し，と畜場における検出率は本州では1%を下回るようになった［1］．一方，北海道では放牧を主体

図１にした畜産農家が多いので，未だに肝蛭の寄生率が高肝蛭のライフサイクルとヒトへの感染様式

ウシやシカは幼虫に汚染された稲わらや牧草などの経口摂取により感染する．ヒトは感染した動物の肝臓に寄生する幼虫を摂取することでも感染する．

い地域が存在する．また，全国的にシカの個体数増加が問題となっているが，著者の直近の研究により，北岩手大学農学部共同獣医学科獣医寄生虫学研究室
岩手大学支会― 51 ―

エゾシカの肝蛭保有率は上昇し続けると予想される．

µm）ため（図３），獣医師であっても摘発は難しい．

さらに，牧野に侵入するエゾシカが肝蛭を持ち込むこまた，シカなどの野生鳥獣は，と畜場法の対象動物でとにより，肝蛭が家畜ウシの再興感染症として猛威をはなく，獣医師による検査が義務付けられていない．

振るうことが懸念される．また，本誌第42巻１号で紹そのため，肝蛭に感染したレバーが見逃されて市場に介されたように，最近，有害野生鳥獣を食肉資源とし出回る可能性は否定できない．て活用しようとする試みが始まっている．そのため，野生動物における肝蛭保有率を正確に把握することは２）糞便検査重要な課題である．このような現状から，肝蛭症に対糞便検査は主に家畜臨床現場で実施される．肝蛭卵して簡便かつ信頼性の高い診断法を確立することが求は比重が大きいために水に沈む．この特性を生かしためられている．本総説では，肝蛭症の診断法の現状と渡辺法［2］，ビーズ法［3］などの沈澱法が検査法と肝蛭寄生バイオマーカーを用いた診断法の開発と応用して推奨されている．１匹の肝蛭が１日に産卵する虫について解説する．

卵数は約10,000個に及ぶと推定されているが，ウシ１頭の１日当たりの糞便量を20kgとすれば，糞便1gあ２．肝蛭症の診断法と各診断法の難点

たりの虫卵数は0.5個と推計される［4］．したがって，１）目視検査

少数寄生例の場合には糞便検査で虫卵が検出されない

目視による肝蛭症の検査は家畜および野生動物を食ことがある．

肉として処理する際に行われる．我が国では食肉衛生

さらに，虫卵が検出されたとしても，ウシで普通に検査所で獣医師による検査が実施されており，肝蛭症見られる双口吸虫卵と鑑別するためには虫卵の形態にに罹患した家畜ウシの肝臓は摘発・廃棄される（図２）．

関する専門的な知識と経験が要求される（表１，図４）．

しかしながら，感染初期の幼虫は非常に小さい（数百

図３
図２

Newly excysted juvenile（NEJ）と呼称される感染初期の幼虫．（写真提供：岩手大学獣医寄生虫学研究室 林慶）

肝蛭の濃厚感染例（海外の一例）

矢印は寄生している虫体を示す．

図４

肝蛭の幼虫

肝蛭卵（左）と双口吸虫卵（右）の比較

色調（肝蛭卵は黄色，双口吸虫卵は無色）の違いの他，小蓋に対する卵細胞の位置が重要な鑑別点である.
― 52 ―表１

肝蛭卵と双口吸虫卵の特徴の比較

色

卵細胞の位置

外観

肝蛭卵

黄褐色

卵内やや小蓋寄り

比較的大型

双口吸虫卵

無色

卵内ほぼ中央肝蛭卵より概して小さい

引用文献［4］.一部改変
３）血清診断法原を用いたELISA法は，特異性が高く，大規模な疫ELISA法やゲル内沈降反応などの血清診断法は，寄学調査に適している．しかしながら，ELISA法は試薬・生虫学の専門的な知識や特別な手技を必要としない．

機材を備えた研究機関では実施できるが，ジビエ処理

国内ではこれまで肝蛭の粗抗原を用いた方法が用いら業者などの食肉処理現場や，家畜臨床現場で実施するれてきた［5］．しかしながら，一般的に粗抗原は感度ことは難しい．そこで，特別な機材や肝蛭に対する専が高いが特異度が低い欠点があり，家畜や野生動物の門知識がなくても実施できる簡易診断キットが求めらように種々の病原体の感染症が疑われる場合にはクロれている．簡易診断キットの一例（イムノクロマト

スリアクションが起こりやすく，感染している病原体法）を示した（図６）．この診断法では，ストリップを正確に診断できないことがある［6］．また，粗抗原上に診断用リコンビナント抗原を吸着させてあり，血を精製するためには，新鮮な肝蛭虫体を入手する必要

清中に含まれる肝蛭抗体と反応すると発色する原理をがあるため，日常的な診断に粗抗原を用いることは難用いている．ストリップ上に血清を添加するだけで検しい．

査できる非常に簡便な方法である．このような簡易診断キットを開発し，普及させることで，肝蛭感染個体

３．肝蛭の寄生バイオマーカーの簡便かつ正確な摘発が可能になると考えている．

１）肝蛭が分泌するタンパク質群
肝蛭の幼虫が宿主に経口的に摂取されたのちに，自らの分泌する消化酵素（タンパク質）により，宿主の腸粘膜を破壊し，粘膜筋層および漿膜を貫通して腹腔に出る（図５）．このような体内移行期をはじめ，肝蛭が宿主の体内で分泌するタンパク質群のライブラリー［7］が報告されている（表２）．これらのタンパク質群（寄生バイオマーカー）は診断用抗原の候補として有望である．
２）診断用抗原としての応用
図５

遺伝子組み換え技術を用いれば，肝蛭の遺伝子を導入した大腸菌に肝蛭のタンパク質を作製させて精製し，それを診断用抗原として用いることができる．このようなリコンビナントタンパク質を用いた血清診断は，粗抗原よりも特異性が高くなることが期待される．
ヨーロッパなど肝蛭の高度汚染地域では肝蛭寄生バ

 蛭の体内移行経路（原図. 家畜寄生虫病学
肝一部改変）

肝蛭の幼虫は宿主の消化管を貫通して腹腔に出た後に肝臓に到達する．このとき，肝蛭が分泌する消化酵素（タンパク質）が重要な役割を果たす．これらのタンパク質群は診断用抗原の候補として重要である．
表２

イオマーカーの中でも分泌量の多いCathepsin Lを抗原としたELISA法が開発され，家畜の疫学調査に用いられている［8-13］．現在，著者の研究チームは肝蛭寄生バイオマーカーのリコンビナント抗原を用いたELISA法の確立に取組んでいる．これまでのところ，良好な予備試験結果が得られており，近々，国内ではじめて疫学調査に応用できるようになる．
３）簡易診断キットの開発
前述したように，現行の肝蛭症診断法には難点が多肝蛭寄生バイオマーカーの例

タンパク質名

発現時期

Cathepsin L

幼虫，幼若虫，成虫

Cathepsin B

幼虫，幼若虫Legumain

幼虫，幼若虫Peroxiredoxin

幼虫，幼若虫，成虫

Fatty acid-binding protein

幼虫，幼若虫，成虫

Glutathione S-transferase

幼若虫

Thioredoxin

成虫

引用文献［7］に基づく

い．著者らが開発に取り組んでいるリコンビナント抗― 53 ―

ます．さらに，本研究に一生懸命に取り組んでいる岩手大学獣医寄生虫学研究室の佐藤浩庸

君，実験にご協力を頂いている岩手大学公衆衛生学研究室の平谷寛樹

君をはじめ学生の皆様に心より感謝いたします．
図６

簡易診断キットのイメージ

引用文献

ストリップ上に血清を添加するだけで，血清中の抗体の有無をバンドパターンで簡便に検査できる．

［１］Okajima J, Shibata K, Takahashi E, Nagafuchi
T, Okajima K, Nonaka N：Current status andits epidemiological consideration of Fasciola and４．今後の展望

Eurytrema infections in beef cattle of Japan, J

序論で述べたように，かつて国内の家畜ウシの肝蛭

Vet Med Sci, 78, 785-790（2016）

感染率は極めて高かったが，効果的な駆虫薬の普及や，感染予防のための飼料給餌法の指導などの獣医師の努［２］渡辺昇蔵，永山文昭，岩田神之助：肝蛭卵の簡力により，家畜の肝蛭感染率は低下し続けてきた．一

易糞便検出法について，日獣会誌，45，176（1953）

方で，肝蛭のレゼルボアとなりうるシカの個体群の増［３］岩田神之助：糞便検査改良法と従来の簡易検出加が再興感染症としてのリスクを高めている．本稿で法との比較実験，第56回日本獣医学会記事

述べた肝蛭バイオマーカーを用いた診断法により，今［４］石井俊雄：吸虫類，獣医寄生虫学・寄生虫病学2後，以下の２つの観点からの課題に取り組むことがで蠕虫

他，石井俊雄編，第1版，183-232，講談社，きると期待している．

東京（1998）［５］Itagaki T, Ohta T, Hosaka Y, Iso H, Konishi１）家畜衛生の観点から：疫学情報の把握と対策の提言

M, Chinone S, Itagaki H：Diagnosis of Fasciola

シカの個体群が特に多い地域では，家畜ウシの感染

sp. Infections in Cattle by Enzyme-Linked

率だけでなく，シカの感染率も正確に把握する必要がImmunosorbent Assay, Jpn J Vet Sci, 51, 757-

ある．シカの感染源としてのリスクに応じて，牧野へ

764（1989）の侵入防止対策や中間宿主が生息する水場への侵入防［６］M a g n a v a l J F , F a b r e R , M a u r i è r e s P ,止対策を取る必要について考慮し，対策を提言するこCharlet JP, de Larrard B：Evaluation of anとができる．これらの疫学調査に開発したELISA法

immunoenzymatic assay detecting specific anti-を用いて取り組む予定である．

Toxocara immunoglobulin E for diagnosis andposttreatment follow-up of human toxocariasis,
J Clin Microbiol, 30, 2269-2274（1992）２）食肉衛生の観点から：ジビエ処理現場での安全性［７］R o b i n s o n M W , M e n o n R , D o n n e l l y S M ,の確保
前述したイムノクロマト法のような，寄生虫に対す

Dalton JP, Ranganathan S：An integrated

る専門知識の無い人でも正確に肝蛭感染の有無を判定

transcriptomics and proteomics analysis of the

できる簡易診断キットをジビエ処理現場に提供する．

secretome of the helminth pathogen Fasciola

ヒトへの感染ステージであり，目視での発見が困難な

hepatica : proteins associated with invasion

ために特に注意を払うべき幼虫の感染を検出できるレand infection of the mammalian host, Mol Cell

ベルまで診断キットの精度を上げることを目指して研Proteomics, 8, 1891-1907（2009）［８］O 'Neill SM, Parkinson M, Dowd AJ, Strauss

究を進めていきたい．

W, Angles R, Dalton JP：Short report:
謝辞

Immunodiagnosis of human fascioliasis using

肝蛭バイオマーカーを用いた診断法の開発にあたrecombinant Fasciola hepatica cathepsin L1

り，多大なるご指導を賜りました岩手大学公衆衛生学

cysteine proteinase, Am J Trop Med Hyg, 60,

研究室

749-751（1999）

鎌田洋一

教授，山﨑朗子助教に深謝いたします．また，コントロール血清の入手にご協力［９］C ornelissen JB, Gaasenbeek CP, Borgsteedeを頂きました岩手大学産業動物内科学研究室の一條

FH, Holland WG, Harmsen MM, Boersma

俊浩

亜紀

WJ：Early immunodiagnosis of fasciolosis in

先生をはじめ関係の皆様に心より感謝の意を表し

ruminants using recombinant Fasciola hepatica子

准教授，岩手県食肉衛生検査所の藤森― 54 ―

cathepsin L-like protease, Int J Parasitol, 31,

serodiagnosis of human Fasciolosis, PLoS Negl

728-737（2001）

Trop Dis（2014）［10］Raina OK, Yadav SC, Sriveny D, Gupta SC：［12］Kuerpick B, Schnieder T, Strube C：Evaluation

Immuno-diagnosis of bubaline fasciolosis withof a recombinant cathepsin L1 ELISA andFasciola gigantica cathepsin-L and recombinantcomparison with the Pourquier and ES ELISA

cathepsin L 1-D proteases, Acta Trop, 98, 145-for the detection of antibodies against Fasciola151（2006）

hepatica, Vet Parasitol, 193, 206-213（2013）［11］G ottstein B, Schneeberger M, Boubaker［13］G onzales Santana B1, Dalton JP, Vasquez

G, Merkle B, Huber C, Spiliotis M, Müller

Camargo F, Parkinson M, Ndao M：TheN, Garate T, Doherr MG：Comparative

diagnosis of human fascioliasis by enzyme-assessment of ELISAs using recombinant

linked immunosorbent assay（ELISA）using

saposin-like protein 2 and recombinant

recombinant cathepsin L protease, PLoS Negl

cathepsin L-1 from Fasciola hepatica for theTrop Dis（2013）

アカシカに寄生するSarcocystis 種の再検討：ミト

基づいた調査で，ノルウェーのアカシカには5種のコンドリアcox1 配列に基づくSarcocystis elongata

異なるSarcocystis 種が寄生することが判明しておn. spと Sarcocystis truncata n. sp.の改名

り，これらの種はトナカイやヘラジカに寄生している種と同種であると考えられていた．そこで本研究

Sarcocystis species in red deer revisited: with a re-では，アカシカに寄生するSarcocystis 種名の再検討

description of two known species as Sarcocystis

を目的に，cox1 を指標として，これら５種の分離株

elongata n. sp. and Sarcocystis truncata n. sp.

を調査した．

based on mitochondrial cox1 sequences.

アカシカとトナカイからそれぞれ分離されたS.

tarandi，S.rangiferi の分離株について，cox1 配列をGjerde Bjorn比較した．その結果，この４種は系統樹解析によDept. Food Safety and Infection Biology,

り，宿主由来の４種の単独の系統であり，それぞれNorwegion School of Veterinary Science,P.O.Box

独立した種であることが明らかになった．アカシカに 寄 生 し て い た，S.tarandi- like，S.rangiferi- likeは8146 Dep.,0033 Oslo, Norway

形態学的情報とrDNA解析結果をあわせ，それぞれSarcocystis 属は２つの宿主を生活環に持ち，肉S.elongata，S.truncata と改名された．アカシカと食動物が終宿主に，草食動物や雑食動物が中間宿ヘラジカに寄生している，S.hjorti，S.ovalis の分離

主 と な る． こ れ ま で， ア カ シ カ や ト ナ カ イ， ノ株の配列比較により，これらの種が双方の宿主に寄ロジカ，ヘラジカのようなシカを中間宿主とする生していることが確認された．以上のように，アカSarcocystis 属は，サルコシストの形態，あるいはシカに寄生するすべてのSarcocystis 種に関する現DNAシークエンス，もしくはその両方により分類在の見識が見直された．cox1 遺伝子は将来的にも，されてきた．形態学的分類に限界があるSarcocystis

様々な宿主の異なるSarcocystis 属において分子生種では，そのほとんどがリボソームDNA（rDNA）物学的多様性を示すだろうが，rDNAに取って代わ解析によってのみ分類されている．近年，ミトコン

るものではなく，補完的マーカーとしての位置づけ

ドリアを構成するタンパク質の一つをコードする，である．糞便オーシストや腸管内スポロシストなど，チトクロムcオキシダーゼ遺伝子（cox1 ）がシカやrDNAの配列に多様性が考えられるような形態時のウシ，ヒツジのSarcocystis 種を決定する新しいマー種同定をする場合は，cox1 を指標にしてもよいだろカーであることが実証された．しかし，これまでう．

cox1 は異なった宿主間のSarcocystis 種の分類に用（木村裕亮，岩手大学農学部共同獣医学科いられる程度であった．形態とrDNAの塩基配列に

衆衛生学研究室）― 55 ―

獣医公