岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 31 (№ 1), ４−７ (2005).

原著

血清希釈にマイクロプレートを用いた直接蛍光法によるレチノール測定の有用性
大山要貴行１), 八重畑みどり１), 佐藤敦２) , 木戸口勝彰２)

約

血清レチノール濃度の把握は肥育牛の肉質を向上させる観点から有益である. 通常は高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 法により測定されるが, 迅速性, コスト面で改善の余地が残されている. 今回, マイクロプレートを用いた直接蛍光法 (マイクロプレート法) を応用し,HPLC法と比較検討した. マイクロプレートとHPLC法によるレチノール濃度とレチノール結合蛋白との相関係数はそれぞれ0.875と0.867であった. マイクロプレート法の反復測定における変動率は３％未満であり, HPLC法と比べて処理時間は１/60に短縮し, 試薬代も１/10に削減された. 以上より, マイクロプレート法の精度・再現性の高さ, 迅速性およびコスト面における有用性が確認された.
キーワード：肥育牛, 直接蛍光法, マイクロプレート, レチノール血清

黒毛和種肥育牛の肉質向上, とくに脂肪交雑

宮本ら [４], 森脇 [５] および山崎と山本率を高める目的でビタミンＡを制限する給餌方[９] は同法を牛症例に応用している. これら法が推奨されている [８]. 一方, 過度の制限の応用はいずれも試験管で希釈された血清を測

給餌はビタミンＡ欠乏症を招き, 筋間水腫等に定する方法であるが, 今回著者らは血清の希釈よる生産性阻害要因にもなり得る [６, ７].

作業を効率的に行う目的で, 96穴マイクロプレー

他県の肉牛生産地域と同様に, 管内でも肥育牛

トを用いた. HPLC法と比較することより, マの肉質を向上させる目的で代謝プロファイルテ

イクロプレート法の精度, 再現性および実用性

スト (MPT) を活用する農場がみられる. MPTを検討した.

において生産者が最も知りたい情報は血清レチノール濃度であり, その測定には一般的に高速材料および方法液体クロマトグラフィー (HPLC) 法が用いら

平成15年５月から12月にかけて管内11戸の黒れる. HPLC法は精度の高い検査法であるが,毛和種肥育農場から295頭の血清あるいは血漿検査に多くの時間と経費を要することから, 多を得た.

検体の検査への活用には難点を有する.

マイクロプレート法ではマイクロプレートに直接蛍光法はFutterman [２] により開発さ

被検血清10μlと0.1Ｍ塩化ナトリウム190μlをれ, ヒト症例に実用化されている [２, ３].

加え, 試験管では被検血清0.1mlに0.1Ｍ塩化ナ１) 岩手県中央家畜保健衛生所

２) 岩手県県南家畜保健衛生所―4―トリウム1.9mlを加えて,それぞれ希釈した. マ

た, 測定に要する時間と試薬代を試算した.

イクロプレート希釈血清あるいは試験管希釈血HPLC法については山崎らの報告 [９] を参考

清はマイクロプレート１穴あたり200μlを, 蛍にし, 100件体当たりの測定時間および経費を

光マイクロプレートリーダーａ) および解析ソフ算出した.

ｂ)トを用い, 330nmの励起および465nmの蛍光成波長の条件下で計測した. HPLC測定は外部検績査機関に検査を依頼した. また, 牛レチノール

マイクロプレート法による蛍光強度とHPLC結合蛋白質 (RBP) の測定には市販キットｃ) を法により得たレチノール濃度の回帰分析により,使用した.

0.875 (ｎ＝295, ｐ<0.01) の相関係数が得られ

上記検査値をそれぞれ回帰分析し, HPLC法で得たレチノール濃度と蛍光強度値から検量線を作成し, マイクロプレート法によるレチノール濃度測定法を検討した.

た (図１). 得られた検量線から次式により被検血清のレチノール濃度を算出した.
レチノール濃度 (IU/dl) ＝(蛍光強度−56.404)
0.634

再現性および実用性：レチノール濃度の異な(相関係数0.875, ｐ<0.01)

る10検体を用いてマイクロプレート法により,RBPとHPLC法によるレチノール濃度の相関それぞれ10回反復して蛍光強度を測定した. ま

係数は0.875 (ｎ＝46, ｐ<0.01), RBPとマイク㪉㪇㪇㪉㪌㪇㪉㪇㪇⹜㛎▤䋨Ⱟశᒝᐲ䋩Ⱟశᒝᐲ㪈㪌㪇㪈㪇㪇㪌㪇㪈㪌㪇㪈㪇㪇㪌㪇㪇㪇㪇㪊㪇㪍㪇㪐㪇㪈㪉㪇㪈㪌㪇ⴊᷡ䊧䉼䊉䊷䊦Ớᐲ㩿㪠㪬㪆㪻㫃㪀䋺㪟㪧㪣㪚㪈㪏㪇㪇㪉㪇㪋㪇㪍㪇㪏㪇㪈㪇㪇䍭䍐䍖䍹䍪䍽䍸䍎䍢䋨Ⱟశᒝᐲ䋩㪈㪉㪇㪈㪋㪇㪈㪍㪇࿑㪊㩷㩷Ꮧ㉼ᣇᴺ䈫䈱⋧㑐㪊㩷㩷Ꮧ㉼ᣇᴺ䈫䈱⋧㑐࿑㪈䇭㪟㪧㪣㪚䈫䈱⋧㑐㪟㪧㪣㪚䈫䈱⋧㑐㪰㩷㪔㩷㪈㪅㪊㪐㪎㩷㪯㩷䋫㪰㩷㪔㩷㪈㪅㪊㪐㪎㩷㪯㩷䋫 㪐㪅㪇㪏㪊䇭㪐㪅㪇㪏㪊䇭㩿㩷㫅㩷㪔㩷㪉㪐㪌㪃㩷㫉㩷㪔㩷㩷㪇㪅㪐㪋㪐㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩㩿㩷㫅㩷㪔㩷㪉㪐㪌㪃㩷㫉㩷㪔㩷㩷㪇㪅㪐㪋㪐㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩㪈㪏㪇㪉㪇㪇㪈㪌㪇㪈㪍㪇㪈㪉㪇㪈㪉㪇㪐㪇㪏㪇㪍㪇㪋㪇㪊㪇㪇㪇㪉㪇㪋㪇㪍㪇㪩㪙㪧㩿㱘㪾㪆㫄㫃㪀㪏㪇ⴊᷡ䊧䉼䊉䊷䊦Ớᐲ㩿㪠㪬㪆㪻㫃㪀䋺㪟㪧㪣㪚Ⱟశᒝᐲ㫐㩷㪔㩷㪇㪅㪍㪊㪋㩷㫏㩷㩷㪂㩷㩷㪌㪍㪅㪋㪇㪋㩷䋨㫐㩷㪔㩷㪇㪅㪍㪊㪋㩷㫏㩷㩷㪂㩷㩷㪌㪍㪅㪋㪇㪋㩷䋨 㫅㩷㪔㩷㪉㪐㪌㪃㩷㫉㩷㪔㩷㪇㪅㪏㪎㪌㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩㫅㩷㪔㩷㪉㪐㪌㪃㩷㫉㩷㪔㩷㪇㪅㪏㪎㪌㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩㪇㪈㪇㪇࿑㪉䇭㪩㪙㪧䈫䈱⋧㑐㪩㪙㪧䈫䈱⋧㑐䃂䇭Ⱟశᒝᐲ 䋺 㫐㩷㩷㪔㩷㪈㪅㪎㪏㪇㩷㫏㩷䋫㫐㩷㩷㪔㩷㪈㪅㪎㪏㪇㩷㫏㩷䋫 㪈㪋㪅㪉㪊㪇㩷䋨㪈㪋㪅㪉㪊㪇㩷䋨 㫅㩷㪔㩷㪋㪍㪃㩷㫉 㪔㩷㪇㪅㪏㪍㪎㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩㪔㩷㪇㪅㪏㪍㪎㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩

表１再現試験 (反復測定)

番号

平均蛍光強度

標準偏差

１２
３
４
５
６
７８
９
10

53.50561.70662.53394.98596.324108.360
118.516126.013138.132
151.764

1.51
1.14
1.15
1.37
1.80
1.73
2.00
1.57
1.28
1.28

CV(％)
2.81
1.85
1.83
1.44
1.87
1.60
1.69
1.25
0.93
0.85 ｎ＝10

同一検体を10日測定䋪䇭㪟㪧㪣㪚㩷䋺 㫐㩷㩷㪔㩷㪉㪅㪌㪇㪊㩷㫏㩷–䋪䇭㪟㪧㪣㪚㩷䋺㫐㩷㩷㪔㩷㪉㪅㪌㪇㪊㩷㫏㩷– 㪌㪇㪅㪍㪈㪋㩷䋨㪌㪇㪅㪍㪈㪋㩷䋨 㫅㩷㪔㩷㪋㪍㪃㩷㫉 㪔㩷㪇㪅㪏㪎㪌㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩㪔㩷㪇㪅㪏㪎㪌㪃㩷㫇㩷㪓㩷㪇㪅㪇㪈㩷䋩ａ) GeminiXS, 日本モレキュラー・ディバイス社, 東京.
ｂ) SOFTmaxPRO, 日本モレキュラー・ディバイス社, 東京.
ｃ) 牛レチノール結合蛋白SRID定量キット (単純放射状免疫拡散法), ㈱ヤガイ, 東京.

―5―

ロプレート法による蛍光強度との相関係数は山崎および山本 [９] による試験管法やHPLC0.867 (n＝46, p<0.01) であり, RBPと両者間法とほぼ同等であり, マイクロプレート法の精に高い正の相関が認められた (図２).

度の高さが確認された. また, RBPとHPLC法

試験管による希釈とマイクロプレートによるによるレチノール濃度との相関は0.875であり,希釈との検査値の相関係数は0.949 (ｐ<0.01)

RBPとマイクロプレート法の蛍光強度との相関であった (図３).

は0.867であり, マイクロプレート法による蛍再現性および実用性：得られた値の変動率

光強度とレチノール濃度との正の相関性を間接(CV) は, 0.85〜2.81％であった (表１). HPLC的にも裏付けられた. これらのことから検量線法に要する時間は25〜33時間であり, マイクロで得られたレチノール濃度は十分に評価できるプレート法では30分であった. 経費はHPLC法値であると考えられた. 試験管による希釈とマの1,660円に対し, マイクロプレート法では147イクロプレートによる希釈の蛍光強度の相関係円であった.

数は0.949であり,検査値は血清の希釈方法の相検査値を生産者に還元するまでの日数は,違により著しく影響されないことが示唆された.

HPLC法では外部検査機関に検査を依頼するこ

レチノール濃度の異なる検体を反復測定したとから概ね３週間を要するが, 本法は家畜保健際の変動率は0.85〜2.81％であり, 高い再現性衛生所で多くの作業を行うことから, ２〜３日が認められた.

で還元することができた. これにより, 早期治療等よる欠乏症予防が可能となった.

実用性に関し, HPLC法との比較により, 測定に要する時間は概ね１/60に短縮され, 試薬代は概ね１/10に削減された. マイクロプレー

考察ト法は短時間で多検体を処理することも可能で直接蛍光法は紫外線照射により波長の長い蛍あり, 迅速かつ頻回の検査を望む生産者のニー光を発するレチノールの特性を利用して, 供試ズに対応し得る実用性を有すると考えられた.

材料が発する蛍光の強さ (蛍光強度) をレチノー

マイクロプレート法の有効な活用法として, 個々ル濃度に換算する簡易法である [２]. 分光光の疾病診断としてではなく, 群管理の指標とし度法とHPLC法は有機溶媒によるレチノールのての利用が考えられた. また精度を検証する目抽出過程を要するが, 本法は水溶液中で蛋白と的で, 測定時毎にレチノール濃度既知血清を検結合したレチノールを測定することから単体の体に組み入れて測定ことも必要である.

レチノールに比べて約10倍強い蛍光強度が得られ, 抽出作業を必要としない [４]. 本法の牛引用文献

症例への応用を宮本ら [４], 森脇 [５] およ[１] Driskell W J：Clin.Chem., 32(５), 867−

び山崎と山本 [９] が報告しているが, 著者ら869 (1986)

は当該法を更に簡易化した. すなわち, これま[２] Futterman S, Swanson D, Kalina RE.：での報告では血清希釈を試験管で行っていたが,Invest. Ophthalmol.,；14(２), 125−30

今回, 96穴マイクロプレートに変更し, その有(1975)

用性について検討した.

[３] John C S：J. Biochem., 253(18), 6432-

高い精度が実証されているHPLC法により得6436 (1978)

た血清レチノール濃度とマイクロプレート法に[４] 宮本亨, 太田洋一, 森脇俊輔, 高橋雄治,

よる蛍光強度とは, 相関係数が0.875の高い正大橋傅：第135回獣医学会学術集会要旨の相関を示し, この相関係数は宮本ら [４],(2003)―6―

[５] 森脇俊輔：平成15年度家畜衛生研修会抄[８] 甫立京子：獣畜新報, 52(３), 221−224

録 (生化学部門)(1999)[６] 関根貴司：獣畜新報, 50, 917−920(1997)[９] 山崎政彦, 山本安則：第44北海道家畜保[７] 甫立京子：家畜診療, 51(１), 5−17

健衛生業績発表会抄録 (1996)(2004)

文献抄録

色により全ての肉眼的罹患腎臓に検出された.
最も顕著な病変は糸球体で, 検索した動物の飼育羊と山羊におけるAAアミロイドーシスの95.5％が罹患していた. コンゴーレッド染色性病理学

沈着物は尿細管間質 (68.2％) と髄質 (57.1％)

MensuaＣ, Carrasco

Ｌ,Bautista

ＭＪ,にも認められた. 全てのアミロイド罹患動物はBiescas E, Fernandez A, Murphy C L,近位尿細管病変を示しており, 腎肉眼病変を反Weiss D T, Solomon A and Lujan L

映して直径の増大と硝子滴変性に特徴づけられ(University of Zaragoza他 Vet Pathol, 40た. 組織学的にアミロイドは血管, 脾臓, 肝臓,71-80, 2003)

リンパ節, 消化管, 副腎にもみられた. 全ての我々は, AAアミロイドーシスに罹患した小アミロイド沈着物は, 偏光で黄緑色の複屈折を型反芻獣における主な病理学的変化および傷害示し, 山羊アミロイド抽出物に対する抗血清は,された蛋白の部分的なシークエンスを記述する.

羊と山羊の複屈折, コンゴーレッド染色性沈着

21頭の羊と１頭の山羊が全身性アミロイドーシ物に特異的に反応した. 超微形態的に, これらスと一致する腎臓の肉眼病変を元に選別された.の沈着物は直線で, 枝分かれのない線維の塊を利用可能な組織材料は組織学的, 免疫組織学的,形成しており, 糸球体毛細血管の基底膜とメサ超微形態学手法により検索された. 腎臓は肉眼ンギウムに優勢に局在していた. 羊と山羊にお的に散在性, 粟粒大の黄白色巣を伴った退色皮ける蛋白の部分的シークエンスは以前に報告さ質表面と割面で直線状の黄白色線条の病変によれた羊血清アミロイドＡのシークエンスと高度り特徴付けられた. 壊疽性肺炎が21頭中16頭の相同性を示していた.

羊 (76.2％) に観察されたほか, 他の慢性炎症も認められた. アミロイドはコンゴーレッド染―7―(岩手大学獣医病理学研究室)