LAGUNA（汽水域研究）16，13〜18 頁（2009 年 6 月）
LAGUNA 16，p.13–18（2009）

マガキ属自然交雑個体の二対立遺伝子解析
岩崎健史 ・田中智美 ・飯塚祐輔 ・菱田泰宏 2・蕭聖代 ・荒西太士
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A biallelic microsatellite DNA analysis for natural hybrid Crassostrea oysters
Takeshi Iwasaki1, Tomomi Tanaka1, Yusuke Iidzuka1, Yasuhiro Hishida2, Sheng-Tai Hsiao3,and Futoshi Aranishi1

Abstract: Pacific oyster Crassostrea gigas and Portuguese oyster C. angulata are morphologically related species that are sympatrically distributed at nearshore blackish areas inthe subtropical zone of East Asia. Although these two species have thus far been known asinter-fertilizable under controlled conditions, molecular-based studies on mitochondrial DNA
analysis verified obvious genetic differences between them. Huvet et al. (2004) reported anovel microsatellite DNA marker enabling to discriminate allelic sequence variants for C.
gigas and C. angulata. In this study, we developed a rapid, reliable, and secure PCR-RFLP
analysis of the biallelic microsatellite marker to diagnose hybrid oysters between C. gigas andC. angulata in wild stocks. An array of wild oyster specimens of C. gigas haplotypes and C.
angulata haplotypes collected from Japan, Taiwan, and Korea were subjected to PCR amplification of the microsatellite marker and subsequent RFLP assay using FastDigest® Bsp1407I
restriction enzyme, followed by microchip electrophoretic diagnosis of both PCR and RFLP
products. It took about 2 hours for the whole process of our analysis, and the frequencies ofbiallelic variants observed in C. gigas and C. angulata haplotype stocks were at the equivalentlevel of those of the previous report. In addition, a high frequency of the allelic variants for C.
angulata in C. gigas haplotype stock in Tokyo Bay suggests the occurrence of natural hybrid
oysters between C. gigas and C. angulata.

Key words: Crassostrea gigas, Crassostrea angulata, natural hybrid, microsatellite locus,microchip electrophoresis

はじめに以上に亘って主に日本から南北アメリカやヨーロッパ，オーストラリア，アフリカまで移植されており，現在では世界各地で生産されている（Chew, 1990;
Matthiessen, 2000）．一方，亜熱帯種の C. angulata は，マガキ属 Crassostrea のカキ類は世界最大の年間生産量を誇る水産経済動物種であり，特に東アジアの島嶼域ではマガキ C. gigas とポルトガルガキ C.
angulata の 2 種が重要種とされている（FAO, 2003）．
日本や韓国を原産とする温帯種の C. gigas は，100 年

台湾の南西部の台西から布袋，七股周辺で採苗し，台西海域から布袋海域と澎湖湾で主に生産されており（森，2009），また南ヨーロッパでも 19 世紀末から

島根大学汽水域研究センター Coastal Lagoon Research Center, Shimane University, Matsue 690-8504, Japan.
大仁科技大學人文暨社會學院 College of Humanities and Social Sciences, Tajen University, Pingtung 908, Taiwan.
3
台湾行政院農業委員會水産試驗所 Marine Fisheries Division, Fisheries Research Institute, Keelung 20246, Taiwan.
1
213岩崎健史・田中智美・飯塚祐輔・菱田泰宏・蕭聖代・荒西太士

141970 年代初頭まで生産されていた（Comps, 1988）．このように C. angulata には台湾と南ヨーロッパで異所20 個体および C. angulata と同定された 21 個体を使用した．各個体から閉殻筋を分離し，DNA 調製に供的に分布するユニークな特徴があったが，現在では台湾が本種の起源であると証明されている（Boudryet al., 1998; O’Foighil et al., 1998）．なお，ヨーロッパ
では，16 世紀頃の貿易船によるアジアからポルトガルへの移植説が伝えられているそうである．
C. gigas は 1793 年に Thunberg により日本の在来種として，また C. angulata は 1819 年に Lamark によりポルトガルの在来種として，主に分布域の違いにより別種に分類された．しかし，その後の形態分類（Ranson, 1948）や交配実験（Gaffney and Allen, 1993），アイソザイム分析（Mathers et al., 1974; Mattiucci andVillani, 1983）では両種のシノニム説を提起していするまで−20℃で冷凍保存した．

DNA 調製全 ゲノム DNA は，凍 結閉殻 筋から尿 素 –SDS–Proteinase K 法に従い調製した（Aranishi and Okimoto,2004, 2005; Aranishi, 2006; Aranishi and Iidzuka, 2007）．
閉殻筋約 20 mg を 200 µl の抽出溶液（10 mM TrisHCl pH 7.5，20 mM EDTA pH 8.0，1 % SDS，4 M
urea，25 µg Proteinase K）に懸濁し，55℃にて 60 分間攪拌加熱した．25 µl の 5 M NaCl を添加して十分た．一方，天然環境での成長率が両種間で有意に差があるなど（Parache, 1989; Soletchnick et al., 2002），多くの異なる生理生態学的特徴も報告されている（Goulletquer et al., 1999; Haure et al., 2003）．また，近年飛躍的に発展している分子遺伝学的解析では，ミトコンドリア DNA（Boudry et al., 1998; O’Foighil etal., 1998; 飯 塚，2008; 岩 崎，2008）お よ び 核 DNA（Huvet et al., 2000）ともに両種間で有意な遺伝的差に混合した後，フェノール溶液（phenol：chloroform
isoamyl：alcohol ＝ 25：24：1）およびクロロホルム溶液（chloroform：isoamyl alcohol ＝ 24：1）により精製し，引き続きエタノールにより沈殿した．DNA 沈殿をエタノールで洗浄して十分に乾燥した後，10T0.1E 溶液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，0.1 mM EDTA pH 8.0）に再溶解した．なお，DNA 溶液の濃度および純度はEppendorf 社製 BioPhotometer により測定した．

異が確認されており，現在ではシノニム説は否定されている．但し，実験環境下では両種間の F1 交雑個体の形成および正常な生存が観察されており，種分化が不十分であることも事実である（Huvet et al.,2001, 2002）．さらに，1970 年代以降の積極的な C.
gigas の人為的移植により（Ruano, 1997），両種が同所的に分布するポルトガル南部の Crassostrea 個体群では，二対立遺伝子マイクロサテライトマーカー
CG44 座の分析で自然交雑個体の出現が報告されている（Huvet et al., 2004）．本研究では，両種が同所的に分布する東アジア島嶼域においてフィールド調査により自然交雑個体を探索するため，CG44 座の迅速かつ簡便で高精度な分析方法を開発するとともに，その適用性を検討した．

試料

日本の中海（島根県）と九州南部（鹿児島県，宮崎県および沖縄県），韓国の慶尚南道および台湾の屏東縣から採集した Crassostrea 個体の内，ミトコンド
リア DNA の調節領域（沖本，2006），チトクローム
c 酸化還元酵素サブユニットⅠ遺伝子（飯塚，2008）
または 16S リボゾーム RNA 遺伝子（岩崎，2008）を指標とした分子分類により，C. gigas と同定された

実

験

方法

PCR-RFLP 解析
CG44 座の PCR 増幅は，MgCl2 終濃度を 3.0 mM に調整した Promega 社製 GoTaq Green Master Mix，各0.5 µM のプライマーおよび 10 ng の DNA 溶液で反応した．プライマーの塩基配列は 5’ GAAGAATGTCATAGATTGATGG 3’ および 5’ CATGCCTGTTTACCAGTATTC 3’ である（Magoulas et al., 1998）．Techne社製 TC-312 サーマルサイクラーによる PCR 条件
は，94℃で 2 分間の初期変性後，94℃で 10 秒間の変性／53℃で 20 秒間の会合／72℃で 30 秒間の伸長を 35 回繰り返し，72℃で 2 分間の最終伸長により終了した．RFLP 解析は，1 µl の PCR 産物，0.17 µl®の Fermentas 社製 FastDigest Bsp1407I 制限酵素およ®
び 終 濃 度 ×1 の Fermentas 社 製 FastDigest buffer を含む 10 µl の反応溶液により，37℃で 5 分間反応した．PCR 産物および RFLP 産物は，Invitrogen 社製
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain を含む島津製作所
社製 DNA-1000 Reagent Kit と混合し，マニュアルに従い島津製作所社製 MCE-202 マイクロチップ電気泳動装置 MultiNA により分析した．

マガキ属自然交雑個体の二対立遺伝子解析

結果考

二対立遺伝子 CG44 座は，5’ 側から 93 bp の 5’ 上流領域，CA 反復配列および 54 bp の 3’ 下流領域の基本構造であり，C. angulata 型対立遺伝子のみ 5’ 上流領域と CA 反復配列の間に Bsp1407I 制限酵素の認識部位を含む 21 bp の挿入領域が存在する（図 1）．東アジアの C. gigas および C. angulata から PCR 増幅された同座の平均鎖長は，それぞれ 288.3 ± 12.5 bpと 310.8 ± 19.8 bp であった（表 1）．塩基配列解読による CG44 座の平均鎖長は 256.5 ± 16.3 bp と 277.5 ±15.8 bp と報告されており（Huvet et al., 2004），マイクロチップ電気泳動 MultiNA では再現的に約 12 %の誤差が発生していた．なお，MultiNA では，同座のホモ接合体はシングルピーク，ヘテロ接合体はダブルピークとして正しく検出された（図 2）．次いで，
PCR 産物の RFLP 解析では，Bsp1407I 制限酵素による未切断個体（＝ C. gigas 型対立遺伝子）および切断個体（＝ C. angulata 型対立遺伝子）が得られた（図3）．主に南ヨーロッパの各 7 集団の C. gigas およびC. angulata における C. gigas 型対立遺伝子の出現頻度は，それぞれ 0.867〜0.984 および 0.068〜0.145 と報告されており（Huvet et al., 2004），本研究での両種における出現頻度の 0.850 および 0.120 は既報の結果とほぼ一致していた（表 1）．
Fig. 1.

5’3’

C. gigas

5’-flanking region

C. angulata

5’-flanking region

Bsp1407I site

CA repeat

3’-flanking region

CA repeat

3’-flanking region

図 1．Crassostrea gigas および C. angulata の二対立遺伝子 CG44 座の構造模式図．
Fig. 1. Schematic taxon-specific structures of the biallelic
CG44 locus of Crassostrea gigas and C. angulata.
表 1．Crassostrea gigas お よ び C. angulata と 松 島 湾集団および東京湾集団の個体数および二対立遺伝子
CG44 座の対立遺伝子数と鎖長Table 1. Number of specimens and number and size of the biallelic CG44 locus of Crassostrea gigas and C.
Table 1. Number of specimens and number and size ofangulata together with the oyster stocks of Matsushima Bay and Tokyo Bay
the biallelic CG44 locus of Crassostrea gigas and C.
表 1. Crassostrea gigas および C. angulata と松島湾集団および東京湾集団の個体数および二対立遺伝子
angulata together with the oyster stocks of Matsushima
CG44 座の対立遺伝子数と鎖長Bay and Tokyo Bay
C. gigas1

C. angulata2Matsushima
BayTokyoBay

Number of specimens

20211010

Number of total alleles
Number of gigas alleles
Number of angulata alleles
gigas alleles/total alleles

201730.850

253220.120

11110
1.000

106
40.600Size of gigas alleles (bp)Size of angulata alleles (bp)288.3±12.5

283.7± 7.8

276.1± 6.2
313.8±17.6

12310.8±19.8

Specimens were collected from Nakaumi Lagoon, Japan, and Kyongsang Nando, Korea.
Specimens were collected from Southern Kyushu, Japan, and Pingtung County, Taiwan.

1115

察C. gigas と C. angulata の間の F1 交雑個体の形成は，実験環境下のみならず（Huvet et al., 2001, 2002），天然環境でも報告されている（Huvet et al., 2004）．C.
gigas の近縁種であるシカメガキ C. sikamea は，かつては C. gigas の地方品種であると考えられていたが（Imai and Sakai, 1961），近年の分子遺伝学的解析により別種であると実証されている（Banks et al., 1993;
Aranishi and Iidzuka, 2007; 飯塚 ･ 荒西，2008）．しかし，その両種間の F1 交雑個体は著しく低頻度ながらも実験環境下では形成される（Banks et al., 1994;薄，2002）．また，天然環境では両種間の F1 交雑個体は発見されていないが，C. sikamea の種苗生産過程では交雑が発生するという説もある（Hedgecock etal., 1993, 1999）．一方，実験環境下での C. sikamea とスミノエガキ C. ariakensis の間の F1 交雑個体の形成が，つい最近報告されている（Xu et al., 2009）．このように Crassostrea 現生近縁種間における生殖隔離機構は未だ不明な点が多い．
Huvet et al.（2004）は，C. gigas と C. angulata の間の F1 交雑個体を検出するために既存の 8 種類のマイクロサテライトマーカーを検討し，両種間の変異が最大の CG44 座が実用的であると報告した．し33
かし，CG44 座の分析方法は， P 標識した PCR 産物の鎖長をポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定した後，BsrGI 制限酵素（Bsp1407I 制限酵素の isoschizomer）で処理した RFLP 産物の断片をアガロース電気泳動により確認するという煩雑かつ危険であり，また結果を得るまでに数日を要して実用性に乏しい．そこで本研究では，同等以上の分析精度を誇り，より迅速かつ安全で大量のフィールド試料にも簡便に対応できる CG44 座の分析方法を開発した．当該方法では，ポリアクリルアミドゲル電気泳動と同等の分析精度でありながら分析時間が著しく短いマイクロチップ電気泳動を採用し（Sinvilleand Soper, 2007），放射標識の省略および PCR 産物とRFLP 産物の同時分析を可能として，大幅な工程の簡略化と時間短縮を実現した．また，再現性が高い
マイクロチップ電気泳動では，一定比率の修正により PCR 産物の正確な鎖長が算出されるため CG44 座の CA 反復数が推定でき，一般的なマイクロサテライト解析へのデータの転用も可能である．さらに，
Fermentas 社製 FastDigest® Bsp1407I 制限酵素を導入し，RFLP 解析が 2 時間から 5 分間に短縮できた．これらの改良により 24 検体程度の全分析工程が約 2 時

16Fig. 2.

岩崎健史・田中智美・飯塚祐輔・菱田泰宏・蕭聖代・荒西太士

間で終了し，大量の検体を分析しなければならないフィールド研究に最適な分析方法となった．
最後に実際のフィールド試料により分析方法の適用性を実証した．宮城県松島湾の養殖 C. gigas を分析した結果，C. gigas 型対立遺伝子の出現頻度は1.000 であった（表 1）．これは，仮に亜熱帯種の C.
angulata が松島湾に移入されたとしても，夏季の海図 2．Crassostre gigas のホモ接合体（1）とヘテロ接合体（2）および C. angulata のホモ接合体（3）とヘテロ接合体（4）の二対立遺伝子 CG44 座のマイクロチップ電気泳動分析．
Fig. 2. Microchip electrophoretic diagnosis for PCR
products of the biallelic CG44 locus of Crassostrea gigas
homozygote (1), C. gigas heterozygote (2), C. angulata
homozygote (3), and C. angulata heterozygote (4).
Fig. 3.

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図 3．Crassostrea gigas の Bsp1407I 切断前（1）と切断後（2）および C. angulata の Bsp1407I 切断前（3）と切断後（4）の二対立遺伝子 CG44 座のマイクロチップ電気泳動分析．
Fig. 3. Microchip electrophoretic diagnosis for PCRRFLP products of the biallelic CG44 locus of Crassostrea
gigas before (1) and after (2) digestion of Bsp1407I and
those of C. angulata before (3) and after (4) digestion ofBsp1407I.

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水温が低く成熟不能になることと関係しているかも知れない．次に，東京湾の天然 C. gigas を同様に分析した結果，C. gigas 型対立遺伝子の出現頻度
は 0.600 と著しく低く，さらに C. angulata 型対立遺伝子の平均鎖長の 313.8 ± 17.6 bp は東アジアの C.
angulata の平均鎖長と近似していた（表 1）．Huvet etal.（2004）は，ポルトガル南岸の Tavira に分布する
C. gigas と C. angulata の混合集団において C. gigas 型対立遺伝子の出現頻度が 0.217 と有意に高い結果から（C. angulata の純集団における出現頻度は 0.068〜0.145），両種の自然交雑個体の出現を証明した．この基準に従えば，東京湾でも両種の自然交雑個体の存在が示唆される．なお，船舶の往来が頻繁な東京湾では，船体付着やバラストなどを介したヨーロッパやアジアからの二枚貝の移入事例が多数報告されている（岩崎，2007）．

謝辞

本研究の展開にあたり台湾行政院農業委員會水産
試驗所との共同研究をご提案頂いた財団法人かき研究所理事長の森 勝義博士並びに本論文の作成にあたりご助言を賜った島根大学汽水域研究センター研究員の横尾俊博博士に謹んで感謝する．また，本研究の一部は，建設技術研究開発費補助金「再生藻場における生物多様性モニタリング技術の開発」および島根大学重点プロジェクト「地域資源循環型社会の構築」により実施された．ここに記して深謝する．

引用文

献

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