岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 32 (№ 4), 141−146 (2006).

原著

岩手県で分離された伝染性気管支炎ウイルスの遺伝子学的および血清学的解析

関要慶久, 清宮幸男, 本川正人, 八重樫岳司

約2004年および2005年に岩手県内４農場の病鶏から分離された伝染性気管支炎ウイルス４株を遺伝子学的および血清学的に解析した. S１蛋白領域の分子系統解析により, ４株 (IW１〜４)は同順序でJP−Ⅰ, −Ⅱ, −ⅢおよびUK/４/91遺伝子型に分類された. HaeⅡ, EcoRⅠおよびPstⅠを用いたRFLP解析により, ３株 (IW１,３,４) の切断像はそれぞれ既存の同一遺伝子型 株 の そ れ と 一 致 し た . 他 の １ 株 ( IW ２ ) の Hae Ⅱ 切 断 像 は 既 存 の JP − Ⅰ , − Ⅱ ,−Ⅲ, UK/４/91, MassachusettsおよびGray遺伝子型株のそれらと相違した. 交差中和試験では, ４株 (IW１〜４), Ｈ120およびGrayの各指示ウイルスは, 同一遺伝子型株に対する免疫血清により強く中和される傾向がみられた. 得られた成績から, 分離株の遺伝子型と抗原性状は関連することが示唆された.
キーワード：伝染性気管支炎ウイルス, 中和試験, 分子系統解析, RFLP解析, S１蛋白.

伝染性気管支炎ウイルス (IBV) は感染鶏にMaseら [17] は1951〜2003年のわが国で分呼吸器症状や産卵低下を含む様々な臨床症状を離されたIBV31株のS１蛋白領域を分子系統学引き起こす [５]. IBVは他の病原体感染の誘的 に 解 析 し , 分 離 株 が JP − Ⅰ , − Ⅱ , − Ⅲ ,発因子としても関与して, しばしば大腸菌の気MassachusettsおよびGrayから成る５種類の遺道感染を促す [６,19]. 本病予防にワクチンが伝子型に分類され, 近年の主要な流行株は前３用いられているが, IBVの抗原性は多様であり者に属し, 欧米諸国における流行株のそれと相[２,７,９,10,15,20], 流行株の抗原性に近似違することを報告している. IBV株の遺伝子型したワクチン株を選択する必要がある.と抗原性状の関連性について, 諸外国の分離株

IBVのスパイク蛋白はS１およびS２蛋白から構成され [１], 中和抗体を誘導する主要な抗で検討されているが [15,23], わが国の分離株
では十分に検討されていない.

原決定基はS１蛋白に含まれる [３,11,13].

この報告では, 岩手県内で分離されたIBV４

この事実から, S１蛋白コード遺伝子の変異が株の遺伝子学的および血清学的検査成績を述べIBVの抗原性状の変化に帰することが示唆される.

[４,18,24,25], 同遺伝子の解析がIBVの抗原性の推測に応用されている [８,12,14-17,22,供試株：2004年および翌年に, ４株のIBV23].

岩手支会材料および方法

岩手県中央家畜保健衛生所― 141 ―

(IW１〜４) が岩手県内４農場の病鶏から２合法 [21] により作成した.

〜３代の発育鶏卵培養により分離された. ２株

RT-PCR産物のRFLP解析 [17] を実施した.

(IW１,４) は大腸菌症と診断された約50日齢

制限酵素には HaeⅡｅ) および EcoRⅠｅ) [17] との肉用鶏の気管から, 他の２株 (IW２,３) はともに, MassachusettsおよびUK/４/91の両産卵低下が観察された約15ヶ月齢の採卵鶏の腎遺伝子型株を識別し得る PstⅠｅ) (真瀬ら, 未臓および卵管から分離された. ４農場では公表) を用いた. 本解析の参照株として,IBVワクチンを用いていなかった.

GenBankからわが国の既存株, UK/４/91,遺伝子学的解析には発育鶏卵で２〜３代培養UK/７/93およびGray株の塩基配列を得て, そして得た尿膜腔液を供試した. 中和試験には発れぞれのRFLP像を推測し, 供試株のそれと比育鶏卵を用いた16〜20代培養後の尿膜腔液を,較した.

さらに鶏初代腎 (CK) 細胞で３代継代し, 明交差中和試験：96穴マイクロプレートで単層瞭な細胞変性効果 (CPE) を確認した培養上清培養したCK細胞を用いて, 血清希釈法によりを使用した.

中和試験を行った. 指示ウイルスにはIW１〜

遺伝子学的解析：供試４株のRNAをTRIzolａ)

４, H120およびGrayの６株を, 抗血清にはJP/を用いて抽出した. Maseら [17] のToyama/2000, TM86, JP/Fukui/2000, UK/

方法に従い, IBVのS１蛋白コード遺伝子を標４/91, H120およびGrayの各株で免疫し, 56℃,的としたプライマー組 (IBV-S１：５ -AGG

30分間の非働化処理を施した鶏血清を用いた.

AAT GGT AAG TTR CTR GTW AGA

２倍階段希釈した抗血清を200 TCID50 /0.1ml

G-３ , IBV-S２：５ -GCG CAG TAC CRTに調整した等量の各指示ウイルスと混合し, 37

TRA YAA AAT AAG C- ３ ) を 用 い ,℃で60分間感作させた. ２穴のCK細胞にそれSuperwith

ぞれ0.1mlの感作液を接種し, 37℃で３日間培

Platinum Taqａ) によりRT-PCRを実施した.

養した. CPEの出現を抑制した血清の最高希釈

LS試薬

ScriptOne-Stepｂ)

増幅産物をMicrocon-PCR

RT-PCRにより精製後, 前述のプライマー組およびBigDye Terminatorv1.１ Cycle Sequencing Kitｃ)

倍数の逆数を抗体価とし, ５倍以上を陽性とした.

を用いてシー成クエンス反応を行った. 反応産物をCentriSepｃ)

績により精製し, ABI377 DNA

遺伝子学的解析：S１蛋白の推定アミノ酸配Sequencerｃ) を用いて塩基配列を解読し, 推定列に基づく分子系統樹を図１に示す. 供試４株

アミノ酸配列を得た. わが国のIBV生ワクチン(IW１〜４) は同順序でJP-Ⅰ, -Ⅱ, -Ⅲおよび株 (Ｃ78, JP9758, TM86, Miyazaki, UK/４/UK/４/91の４種類の遺伝子型に分類された.

91, H120, KU, Kita-１, Nerima, ON/74)

わが国の生ワクチン株および中和試験に供したおよび後述の抗血清作成に用いた免疫株 (JP/抗血清の免疫株のうち, Ｃ78, JP9758およびToyama/2000, TM86, JP/Fukui/2000, UK/

JP/Toyama/2000 株 は JP- Ⅰ に , TM86 お よ び

４/91, H120, Gray) を含む既存の50株の同配Miyazaki株はJP-Ⅱに, JP/Fukui/2000株はJP-列をGenBankから入手した. 計54株の系統樹

Ⅲに, UK/４/91株はUK/４/91に, Ｈ120,をDNASTARソフトウェアｄ) を用いて近隣接

KU, NerimaおよびKita-１株はMassachusetts

Spin Columnsａ)

Invitrogen, USA.

ｅ)

Promega, USA.

ｂ)Millipore, USA.

ｃ)

Applied Biosystems, USA.

― 142 ―ｄ)

DNASTAR, USA.

*̪̪
-7,2-$
0GTKOC75#/CUU-KVC
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,26Q[COC
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,25JK\WQMC,2,2,21MC[COC,21MC[COC
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図１ S１蛋白の分子系統樹※：供試株；１) 分離順位, ２) 分離年.
※※：イタリック体はデータベース上の参照株を示す.に, ならびにON/74およびGray株はGrayの各

既存株 (JP/Yamanashi/93, JP/Miyazaki/89,遺伝子型に属した.

JP/Kanagawa/2001, Miyazaki, TM86, JP/

供試４株 (IW１〜４) および参照株のRFLP

Osaka/2000) の287, 175, 162および50bpある解析成績を表１に示す. ３株 (IW１,３,４)

いは287, 212および175bpと相違していた (表の切断パターンは, それぞれ同一の遺伝子型株１). 同株 (IW２) の増幅産物の塩基配列上,のいずれかのそれと一致した. すなわち, IW１

５'末端側から212番目のシトシンがチミンに置はJP-Ⅰ遺伝子型に属する６株 (JP/Toyama/

換され, JP-Ⅱ遺伝子型の既存株に存在する

2000, JP/Okayama-１/2000, JP/Okayama-２/

HaeⅡ認識部位が消失していた (図２). Hae

2000, JP/Mie/92, JP/KH/64, Ｃ78) と, IWⅡを含む各制限酵素による同株 (IW２) の３ は JP- Ⅲ 遺 伝 子 型 に 属 す る ２ 株

RFLP像はJP-Ⅱ以外の各遺伝子型株のそれとも( JP/Fukui/2000, JP/Aichi/2000) と, IW４はUK/相違していた.

４/91遺伝子型に属する同株と同一の切断パター

交差中和試験：JP/Toyama/2000, TM86,ンを示した. これら３株 (IW１,３,４) の切UK/４/91およびGray株の各抗血清は, 同一遺断パターンは, 互いに他の遺伝子型のそれと相伝子型の指示ウイルスであるIW１, ２, ４お違していた.

よびGrayの各株に対して最も高い中和抗体価

他方, 他の１株 (IW２) の HaeⅡ切断像はを示した. 抗Ｈ120株血清は指示ウイルスが287, 225および162bpを示し, JP-Ⅱ遺伝子型のＨ120およびGrayの際に, 抗JP/Fukui/2000株― 143 ―表１ㆮવሶဳ㧖ᩣ,2ΣRFLP解析成績Ⴧ᏷↥‛DR*CG Τ೙㒢㉂⚛೎ಾᢿ'EQ 4Σ㧖㧖
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,21MC[COC
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,2#MKVC,2,2,2
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,2-CPCICYC
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表２࠙ࠗ࡞ࠬ+9+9+9+9*)TC[

6Q[COC
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交差中和試験成績6/᛫‫ޓⴊޓ‬ᷡ(WMWKDR

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0&0&0&0&0&0&0&0&0&
0&22] も含まれていた.
供試４株中３株のRFLP像は同一遺伝子型の*)TC[

既存株のそれと一致した. また, ４供試株のRFLP像は異なる遺伝子型の既存株のそれと相違しており, 互いに識別可能であった. 得られた結果は, RFLP解析がIBVの遺伝子型を迅速

血清は指示ウイルスがIW１, IW３, Ｈ120おかつ簡便に識別し得る手法であることを示唆す

よびGrayの際に最も高い中和抗体価を示した

るMaseら [17] の見解を支持するように思わ

(表２).

れた.
他方, JP-Ⅱ遺伝子型に分類された１供試株考察(IW２) の HaeⅡ切断像は, JP-Ⅱ遺伝子型の既岩手県内で分離された４株のIBV (IW1〜4)

存株のそれと相違し, 同酵素認識部位に点変異は, S１蛋白の分子系統解析によりJP-Ⅰ, -Ⅱ,が存在していた. Gelbら [８] は分子系統解-ⅢおよびUK/４/91の各遺伝子型に分類された.

析あるいはRFLP解析に基づく両遺伝子型が相限られた供試株数ではあるものの, 同県内に存違したIBV株が, 既存株が有する制限酵素認識

在するIBV株の遺伝子型は多様であり, これま部位を点変異により消失していることを確認し,でわが国で確認されていないUK/４/91 [17,分子系統解析がより精度高く遺伝子型を識別す― 144 ―

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図２

JP-Ⅱ遺伝子型の既存株および供試株のS１蛋白遺伝子の比較
HaeⅡ認識部位を枠線で示す.

ると述べている. 得られた成績からも, 既報るが, 中和抗体を誘導し得るS２蛋白 [13] の[17] のRFLP像と異なるIBV株の遺伝子型の分関与が要因のひとつとして考えられる.

類にはシークエンシングが必要であった.

終わりに, 抗血清を分与して頂いた (独) 動交差中和試験では, 指示ウイルスと抗血清免物衛生研究所の真瀬昌司博士および動物医薬品疫株の遺伝子型が同一の際に, 前者の増殖がよ検査所鶏病製剤第一検査室の諸氏ならびにシーり強く抑制される傾向が得られた. 分子系統解

クエンシングのご協力を得た岩手県農業研究セ

析により,ンター畜産研究所家畜工学研究室の佐藤洋一氏

JP- Ⅰ ,-Ⅱ,

UK/ ４ /91 ,MassachusettsおよびGrayの各遺伝子型にはひに深謝する.

とつ以上のわが国の生ワクチン株が含まれていた. この結果から, S１蛋白の分子系統解析に引用文献

基づく遺伝子型と中和試験に基づく血清型との[１] Cavanagh D：J Gen Virol, 64, 2577-

関連性を検討した諸外国の報告 [15,23] と同2583 (1983)

様に, Maseら [17] の型別法に基づく各遺伝[２] Cavanagh D, Davis PJ, Cook JKA,子型が抗原性状と関連性を有する分類であり,Li D, Kant A, Koch G：Avian Pathol,同法により, 野外流行株の抗原性状を考慮した

21, 33-43 (1992)

ワクチンの選択が可能であるように思われた.

[３] Cavanagh D, Davis PJ, Darbyshire

抗JP/Fukui/2000株血清は, 異なる遺伝子型

JH, Peters RW：J Gen Virol, 67,に属する指示ウイルスに対して広範な交差中和反応を示した. 本成績の正確な原因は不明であ1435-1442 (1986)[４] Cavanagh D, Davis PJ, Mockett APA:

― 145 ―

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