岩獣会報（Iwate Vet.）,Vol. 48（№ 1）, 9 － 12（2022）.

原著

本県で分離されたヨーネ菌のVariable Number of Tandem Repeats（VNTR）法による遺伝子型別澤田徳子 1），市村要鋭 1）

約

本県における牛のヨーネ病の発生戸数は減少傾向にあるものの，大規模農場における発生が相次ぎ，発生頭数は増加している．2011 年から 2020 年に分離されたヨーネ菌 38 株（乳用牛 3 戸 9 頭由来 9 株，肉用牛 11 戸29 頭由来 29 株）を VNTR 法で分子疫学的に解析した．乳用牛由来 9 株のうち 1 株が Map-1，6 株が Map-2，2 株が Map-3 に分類され，うち 8 株が北海道産または育成期に北海道に預託された牛から分離されていた．これらの Map 型は既報において導入元地域で検出されている型と一致し，導入による本菌の侵入が裏付けられた．肉用牛は全 29 株が Map-2 に分類された．うち 12 株（41％）が北海道，東北，九州等の 5 道県からの導入牛由来であり，Map-2 が国内の肉用牛に広く浸潤する可能性が示唆された．導入牛検査の重要性を改めて示すとともに，本県において，更なるデータの蓄積と解析を継続する．
キーワード：ヨーネ病，M. avium subsp. paratuberculosis，VNTR，分子疫学解析

ヨーネ病はヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis）の経口感染により起こる反芻獣の慢性肉芽腫性腸炎であり，長い潜伏期間の後，持続性の下痢，栄養状態の悪化による削痩等を起こし，やがて死に至る［1］．本病は酪農・肉牛経営に多大な被害を与えている細菌性伝染病の一つである．［2, 3］
本病はわが国で 1930 年に本県種畜場が輸入した英国産ショートホーン種において初確認され［4］，以降米国及びカナダ産を中心に輸入牛で摘発されており，輸入乳牛の偶発的疾病とみなされていた［1］．しかし，

1 近年の本県における牛のヨーネ病発生状況
図1.図
近年の本県における⽜のヨーネ病発⽣状況

1980 年代以降に国内で集団発生事例が相次ぎ，増加の一途を辿る［1］．1998 年の家畜伝染病予防法（法）改正において本病は撲滅対象疾病に指定され，法 5 条

2015 年までに漸減したものの，2016 年以降，大規模に基づき少なくとも 5 年ごとのサーベイランスの実施農場において本病が発生し，発生頭数が再び増加傾向が定められた［5］．本県においても，1998 年から乳にある（図 1）．

用牛，2008 年から肉用牛のサーベイランスを開始し，ヨーネ菌の分子疫学的解析手法として，これまで両者で発生が確認され，摘発淘汰による清浄化対策をに IS900-restriction fragment length polymorphisms進めている．発生戸数及び頭数は，2008 年をピークに，（IS900-RFLP）, VNTR, Pulsed-ﬁeld gel electrophoresis1）岩手支会

岩手県中央家畜保健衛生所〒 020-0605

滝沢市砂込 390-5

連絡担当者（E-mail）：澤田徳子（n-ido@pref.iwate.jp）―9―（PFGE）, Multi-locus short sequence repeats（MLSSR）

蒸留水 11μl を加え，全量 25μl になるよう調整した．

等が報告されている［6］．中でも，縦列反復配列の94℃ 3 分間のプレヒーティング後，94℃ 20 秒，65℃

反復数によって型別する VNTR 法は，識別能が高く，20 秒，72℃ 10 秒の増幅サイクルを 36 回繰り返し，最PCR と電気泳動装置を有する一般的な検査室で実施

後に 72℃ 7 分間の伸長反応を行った．電気泳動は，可能である．必要菌量が少ないため，培養に数か月をAgarose 21（㈱ニッポンジーン）で作成した 2.5％アガ要するヨーネ菌でも速やかに実施できる．また，縦列ロースゲルを用いて，0.5 × TBE バッファーにより反復配列の反復数をアリルタイプとして数値化するた100V で 30～50 分泳動した．

め，異なる検査室間でも成績の再現性が高く，遺伝子VNTR 産物サイズの判定：得られたアリルプロファイ型の比較が容易である．その簡便性及び汎用性の高さ

ルを基に，国立研究開発法人農業・食品産業技術総合から，ヨーネ菌を含む多くの抗酸菌で実施されている研究機構動物衛生研究部門に遺伝子型（Map 型）の［7-9］．ヨーネ菌の VNTR 解析の報告は，国内では乳判定を依頼した．

用牛由来株を中心に認められるが，肉用牛由来株につ成いては本県を除き見当たらない［10-16］（図 2）．

検出された Map 型：乳用牛では，1 株が Map-1，6 株①北海道 [10]
乳⽤⽜172株
⾁⽤⽜1株
Map-1(45.7%)
Map-2(12.6%)
Map-3(23.5%)
Map-4(7.4%)
Map-6(2.3%)
Map-14(8.0%)
Map-15(0.5%)②北海道 [11]乳⽤⽜（株数不明）
Map-2
Map-8

⑤京都府 [13]が Map-2，2 株 が Map-3 に 分 類 さ れ た（ 表 1）．9 株
メモ：

中 8 株が北海道産または育成期に北海道に預託されて
2005

2005
いた．a 農場では，2019 年に Map-2 による本病が発生しているが，2013 年には，北海道から導入した牛2006

から着地時検査において同一の型が検出され，淘汰さ2007れていた．c 農場では，2 種類の型（Map-22009及び Map-

乳⽤⽜9株
Map-2

⑥⼭梨県[12]⑦兵庫県 [14]
乳⽤⽜3株
Map-1

乳⽤⽜11株
Map-1(9.1%)
Map-2(90.9%)

20113）が検出された．

③岩⼿県 [15]

⾁⽤⽜18株
Map-1(11.1%)
Map-2(66.7%)
Map-8(22.2%)④岩⼿県 [16]
乳⽤⽜1株
⾁⽤⽜22株
Map-1(30.4%)
Map-2(69.6%)

肉用牛では，全株が Map-2 に分類された．このう
ち，12 株（41％）が北海道，東北，九州等の 5 道県からの導入牛由来であった．
f 及び j 農場では，初発時の患畜は導入牛であったが，以降の同居牛検査では多くの自家産牛が患畜として摘発された．

図2：国内で報告されたヨーネ菌のMap型

図2績

本県分離株の VNTR 型の推移：乳用牛では Map-2 が国内で報告されたヨーネ菌の Map 型最多であり，2016 年まで Map-1 及び 3 型も検出されそこで，本病対策に資することを目的に，肉用牛由ていた（表 2）．

来株を含む近年の本県分離株を解析し，各遺伝子型の肉用牛でも Map-2 が最多を占めたが，2004～2010浸潤状況を確認するとともに，侵入経路を考察した．

年に認められた Map-1 及び Map-8 は 2011 年以降検出されなかった．

材料と方法
供試菌株：2011 年から 2020 年に分離されたヨーネ菌

考38 株（乳用牛 3 戸 9 頭由来 9 株，肉用牛 11 戸 29 頭察

これまで，国内では乳用牛由来株を中心に VNTR由来 29 株）を使用した．

型別が行われ，Map-1 及び 2 型が最も多数を占めていVNTR 用テンプレート DNA 作成：各菌株について，る（図 2）．本州では Map-1，2 および 8 のみ検出さ-80℃保存株からヨーネ菌用培地（共立製薬㈱）で 2れている［10-16］．最も解析株数の多い北海道では，か月間培養し，GenCheck（㈱ファスマック）によりMap-3，4，6，14 及び 15 と，多様な型が検出されてDNA を 抽 出 し た． 上 清 2μl を TE100μl で 希 釈 し，いる［10, 11］．また，輸入家畜においては，Map-1，2，テンプレート DNA とした．

8，11，13 などが検出され，国内で検出されていない

VNTR（PCR）：既報［7］に従い，17 種（MATR-0～型も確認されている［17, 18］．

16）のプライマーを用いて行った．1μL の DNA テン

今回の調査において，乳用牛由来株では，Map-1，プレートに Hot-Start Gene RED PCR Mix 12.5μl（㈱Map-2 及び Map-3 が検出された．これら 9 株のうち，ニッポンジーン）, プライマー（F・R）各 0.25μl, 滅菌

8 株が北海道産または育成期に北海道に預託された牛― 10 ―

表 1．VNTR 成績（Map 型）
菌株 No.
123456789101112131415161718192021222324252627282930313233
34353637
38

分離年
20132018
20192019
2019
2016
2014
2014
2015
2012
20162013
2013
2017
2017
2016
2016
2016
2016
2019
2016
2019
2019
2020
2016
2018
2011
2013201420172017
2017201720172017
20182018
2019

農場
a品種※ 1
Hbc

H
H

d1
d2
e 預託 1e 預託 2e

B
B
B
B
B

f

B

g
hi
j

B
B
B
B

kB

摘発根拠※ 2
県外導入
県外導入
県外導入
5条
5条
県外導入
発生農場
発生農場
発生農場
5条
5条
発生農場
発生農場
5条
5条
5条
5条
5条
5条
発生農場
発生農場
発生農場
発生農場
発生農場
発生農場
発生農場
5条
発生農場
5条
5条
発生農場
発生農場
発生農場
発生農場
発生農場
5条
発生農場発生農場

区分
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
定性陽性※ 3
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜
患畜産子
患畜
患畜
患畜
患畜産子
患畜

産地及び預託歴
北海道
北海道
北海道
北海道
北海道
自家産，北海道預託
北海道産
北海道産
自家産
北海道産，九州経由
北海道産，九州経由
北海道産，e 農場経由
北海道産，e 農場経由
北海道産
県内産
北海道産
北海道産
北海道産
東北産
北海道産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産
東北産
県内産
東北産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産
自家産

Map 型
22222132322222222222222222222222222222※ 1：H；乳用牛（ホルスタイン種），B；肉用牛（黒毛和種）※ 2：県外導入；県外導入時の着地検査，発生農場；発生農場における同居牛検査，5 条；法 5 条に基づくサーベイランス※ 3：定性陽性：患畜ではないが，基準値（1 × 10-3pg/2.5μl）未満のヨーネ菌遺伝子が検出された牛表 2．本県で分離されるヨーネ菌の Map 型の推移
品種※ 1 Map 型
HB

Map-1
Map-2
Map-3
Map-1
Map-2
Map-8

分離年※ 22004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020
111113112513722591131783414※ 1：H；ホルスタイン種，B；黒毛和種※ 2：：過去調査［15, 16］：今回調査― 11 ―

計
2628574から分離されていた．これらの VNTR 型は，導入元生動向と防疫体制の現状，日獣会誌，60, 853-の地域で浸潤する型と一致した．a 農場では 2019 年

857（2007）に Map-2 による本病が発生しているが，2013 年には［₆］Fawzya A, Zschöckb M, Ewersc C, et al.：

県外導入牛から同一の型が検出されていた．また，cGenotyping methods and molecular epidemiology

農場では，2 種類（Map-2 及び Map-3）の型が確認され，of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

3 頭中 2 頭が北海道導入牛であった．Map-3 が分離さ（MAP）, International Journal of Veterinary

れた No.9 の自家産牛は，No.7 の導入牛が患畜と診断

Science and Medicine, 6, 258-264（2018）された頃に出生していた．このことから，No.7 の導［₇］西森敬，内田郁夫，田中聖，他：VNTR（Variable

入により持ち込まれた Map-3 型のヨーネ菌に農場内

Number of Tandem Repeats）型別による結核で水平感染したものと推察された．これらの成績は，菌群及び鳥型結核菌の分子疫学的解析マニュア導入によるヨーネ菌の侵入を裏付けるものであり，導ル，動衛研研究報告，109, 25-32（2003）

入牛検査の重要性を示唆するものと思われた．

［₈］小川賢二：MAC の遺伝子研究，結核，86
（2）
, 62-

肉用牛由来株については，本県を除き VNTR 型別68（2011）の報告が皆無である［10-16］．今回，29 株中 12 株，［₉］黒河和広，打矢惠一，八木哲也，他：Mycobacterium

すなわち 41％が北海道，東北，九州等の 5 道県からavium の 新 規 Variable Number of Tandemの導入牛から分離されていた．また，2004～2010 年

Repeat 領域の有用性の検討，結核，87（7）, 491-に認められた 1 及び 8 型は，2011 年以降検出されて499（2012）いない．このことは，現在，Map-2 が国内の肉用牛に［10］齊藤真里子，山本章子，小笠原房恵：ヨーネ菌広く浸潤する可能性を示唆するものと思われ，本県だの遺伝子型別による疫学的検討，第 53 回北海道

けでなく全国的なデータの蓄積と解析が期待される．

家畜保健衛生業績発表会（2005）

ヨーネ菌の VNTR 法は，他の遺伝子型別法と比較し［11］前田泰治，安本守弘，山口俊昭：宗谷管内Ａ町て，必要菌量が少なく，培養に長期間を要する本菌ににおけるヨーネ病の疫学的分析による早期清浄応用しやすい．かつ，アリルプロファイルが数値化さ化へのアプローチ，宗谷管内Ａ町におけるヨーれることから，データベース化も容易である［7］．今ネ病の疫学的分析による早期清浄化へのアプ後も本県分離株について解析を続け，疫学的考察の裏ローチ，第 55 回北海道家畜保健衛生業績発表会

付けと本病対策に活用したい．

（2007）［12］牛山市忠，松下摩弥：県内で分離されたヨーネ謝

辞

菌の遺伝子解析及び細菌学的考察：平成 29 年稿を終えるに当たり，Map 型の分類及び考察に御助度山梨県家畜保健衛生業績発表会（2017）

言賜りました国立研究開発法人農業・食品産業技術総［13］寺石武史，川島康成，藤野日出海：牛ヨーネ病合研究機構 動物衛生研究部門 動物感染症研究領域細多発農場における遺伝子解析（VNTR 型別）に菌グループ 川治 聡子 上級研究員に深謝いたします．

よる疫学的考察のアプローチ，平成 18 年度京都府家畜保健衛生業績発表会（2006）

引用文献［14］寺谷知恵：管内における牛のヨーネ病発 生事例，

［₁］横溝祐一：牛ヨーネ病に関する最新知見と防疫戦略，山口獣医学雑誌，26, 1-26（1999）

第 51 回兵庫県家畜保健衛生業績発表会（2015）［15］佐々木幸治：ヨーネ病牛から分離されたヨーネ［₂］立花智，加藤一典，藤森則夫，他：黒毛和種の菌の VNTR 型別，平成 18 年度岩手県家畜保健

ヨーネ病清浄化事例の経済評価，獣医疫学雑誌，
2, 91-97（2000）

衛生業績発表会（2006）［16］長山玲子，井戸徳子：平成 20～23 年度に実施し［₃］榊原伸一，菅野宏，立花智：ヨーネ病が牛飼養た肉用牛の牛ヨーネ病防疫対策の成果と課題，農場に与える損失の評価：家畜衛生学雑誌，42

平成 23 年度岩手県中央家畜保健衛生所試験調査（4）,173-180（2017）

レポート（2011）［₄］田中修一：大規模黒毛和種繁殖牧場に発生した［17］衛藤真理子：第 46 回全国家畜保健衛生業績発表

牛ヨーネ病の防疫対策，岩獣会報，32（4）, 157159（2006）

会（2005）［18］水森恵美：第 53 回全国家畜保健衛生業績発表会［₅］小林創太，筒井俊之：わが国の牛ヨーネ病の発― 12 ―（2012）