岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 36 (№ 2), 56−61 (2010).

原著

合併浄化槽の流入水および放流水におけるノロウイルス遺伝子
検出状況と垂下カキのノロウイルス汚染高橋知子１)

要高橋朱実２)

高橋雅輝１)

蛇口哲夫

約

2007年10月から2009年２月の間の２流行シーズン (2007/08, 2008/09シーズン) に, カキ養殖が行なわれている閉鎖湾に面した下水道未整備地区において, 中規模の合併浄化槽の流入水,放流水についてノロウイルス (NV) 汚染状況の調査を行った. 2007/08シーズンは, 対象とした３カ所の浄化槽すべてからGⅠ/11型が検出され, 当該地域においては, 全国的な主流行株のGⅡ/４型以外に, GⅠ/11型も流行していた. 浄化槽へ流入したNVが十分に除去されずに排出される場合があり, 中規模浄化槽が放流先河川や海域のNV汚染源となりうることが示された. 放流水からNV遺伝子が検出され始めると, ２週間後には河口部に垂下したカキ (垂下カキ) からNV遺伝子が検出されることから, 垂下カキのモニタリングが, その地域全体の感染性胃腸炎の流行状況の把握やその先の養殖海域のNV汚染開始の指標となることが示唆された.
キーワード：ノロウイルス, 合併浄化槽, 放流水, 汚染, カキ

カリシウイルス科に属するRNAウイルスで総 事 件 数 1,369 件 中 NV に よ る 食 中 毒 は 303 件あるノロウイルス (NV) は, 乳幼児から成人(22.1％) を占め, カンピロバクター・ジェジュにわたる全年齢層に下痢や嘔吐等の急性胃腸炎

ニ/コリの509件 (37.2％) に続き第２位, 患者をおこす病原体である [1-3]. また, NVは冬季数では総患者数24,303人中11,618人 (47.8％)に多発する食中毒や感染性胃腸炎の主要な原因で第１位となっている. 岩手県においても, 平であり, ｢感染症の予防及び感染症の患者に対

成21年２月に大型リゾート宿泊施設で35都道府する医療に関する法律｣ の５類感染症における県にまたがる患者656人の大規模なNV食中毒

感染性胃腸炎の主要な原因であり, 特に2006/が発生したことは, 記憶に新しいところである.

07年シーズン以降, 集団感染事例が全国的に多NVは感染者の小腸粘膜でのみ増殖し, 糞便と発している. 平成20年の全国の食中毒統計では,ともに排出され, 活水処理施設に流入する. 活１)

紫波支会

岩手県環境保健研究センター

２)

花巻支会

岩手県県南広域振興局― 56 ―

水処理により除去されなかった一部のNVが河及び表１). 調査対象の浄化槽は300人槽前後の川に放流され, 海域を汚染する. カキ等の二枚比較的中規模の施設３カ所で, 処理前の流入水

貝は食餌として海水中のプランクトンと一緒に及び処理後の放流水, 放流先の河川水を検体と海水中のNVも取り込み, 体内に蓄積すると考し, 2007年10月から2009年２月の２シーズン

えられている [4]. 現在, 下水処理における(2007/08, 2008/09シーズン) にかけて調査をNVの挙動についての定量的な知見は十分では行い, 2007年10月〜2008年３月2007/08シーズ

なく, 特に浄化槽によって水洗化が図られていン) に６回, 2008年10月〜2009年２月 (2008/09

る下水道未整備地区での, 浄化槽によるNV挙シーズン) に５回の計11回, 午前11時前後に検動の実態は明らかにされていない.

体を採取した. また, 浄化槽処理水の放流先河

本稿では, カキを養殖している閉鎖湾に面し川の河口部にカキを垂下し検体とした. カキは,た下水道未整備地区において, 浄化槽の流入水

2007/08シーズンは第41週 (07年10月) に垂下のNV汚染の実態と, 処理後のNVの状況を把し08年の第８週までに９回, 2008/09シーズン握するとともに, 放流水の放流先の河川河口部は第46週 (08年11月) に垂下し09年第６週までにカキを垂下し, 湾に流れ込むNVによりカキに９回採取した.
ウイルス濃縮方法：流入水および放流水, 河が汚染される状況を調査した.

川水の検体は静置後の上清を用いPEG沈澱法と材料及び方法超遠心法を組み合わせて濃縮を行った. PEG沈調査材料：調査地区はカキ養殖を行なってい澱法後の濃縮液を30％ショ糖液に重層後超遠心る閉鎖湾に面した, 世帯数約1,500世帯, 人口(36,000rpm, 150分) を行い, 得られた沈澱を約3,860人の下水道未整備地区で, 汚水処理は滅菌蒸留水で再浮遊し, ウイルス濃縮検体とし汲取りもしくは浄化槽で行っており, 町全体のた.

浄化槽等による水洗化人口は42％である (図１

カキは中腸腺を10％乳剤にし, 10,000rpm,20分間冷却遠心後の上清に60％PEG, NaCl及びアミラーゼを加え４℃で一晩静置し, 10,000rpm, 20分間冷却遠心した沈渣を滅菌蒸留水で再浮遊し, ウイルス濃縮検体とした.
NV遺伝子の検出方法：各濃縮検体のRNAの抽 出 は , QIAamp Viral RNA Mini キ ッ ト(QIAGEN) を用いた. DNaseⅠ処理を行った
後, ABIのHigh Capacity cDNA 合成キットを用いてcDNAを合成した.
NVのnested-PCRを行い, １st PCR にはCOG １ F/G １ -SKR , COG ２ F/G ２ -SKR を ,図１

調査地区と浄化槽等の概要
表１

nested-PCRにはそれぞれG１-SKF/G１-SKR,合併浄化槽の概要

G２-SKF/G２-SKRを用いた. 増幅産物が確認

処理水量
使用人員／日された検体は, １st PCR産物をUniversal PCR

合併浄化槽

処理方式

人槽

１

長時間ばっ気30060200

Master Mix (ABI) を用い, Realtime-PCR法

２

長時間ばっ気20346318で定性確認した. NV遺伝子が検出された検体

３

接触ばっ気

35046.2170

は, 同様のRealtime-PCR法を用いて, 濃縮検― 57 ―

表２

合併浄化槽１

合併浄化槽２

合併浄化槽３ＧⅠ

ＧⅡ

ＧⅠ

ＧⅡ

ＧⅠ

ＧⅡ

ＧⅠ

ＧⅡＧⅠ

ＧⅡ

51

11４11４−４111311−52

NTNTNTNTNTNTNTNT11４２11４−−11４−−

114.13４−

４11−−

４−−

11４６11４11−

11４−

型別不能

114.13８−型別不能

４−1113−−

11４

1011４４13−４−

型別不能

NT

NT

43−−−

型別不能

−−−−

NTNT

46

11４−−−４−−

NT

NT

48

NTNTNTNT

NTNT

NTNT−

４49NTNTNTNTNTNTNTNT

14４50−４−

型別不能−４10

型別不能

14−51NTNTNTNTNTNTNTNT

141052NTNTNTNTNTNTNTNTNT10年週

20072008

2008

合併浄化槽流入水等および垂下カキのNV遺伝子型
調査河川

カキ(垂下)

NT：未検査− ：検出せず

体についてNVコピー数を測定した.

10型が検出された.

PCR産物についてはダイレクトシークエンス

合併浄化槽のNV検出状況：2007/08, 2008/法によりキャプシド領域の塩基配列を決定し,09の２シーズンの流入水の調査において, ３カ遺伝子型を同定した.

所の合併浄化槽でＧⅠ, ＧⅡの両方または一方NVの除去率の算出方法：流入水と放流水にが検出されたのは, 合併浄化槽１では11回の調おいて, Realtime−PCR法で検出されたNVコ

査中10回, ２で９回, ３で10回あり, 平均87.9

ピー数を比較し, 流入水のNVが放流水でどの％であった. 放流水においては, 合併浄化槽１程度減少しているか割合を算出し, その平均値で10回, ２で６回, ３で９回, 平均75.8％からを出し, 合併浄化槽におけるNVの除去効果のNVが検出された (表３). 合併浄化槽１および傾向をみる目安とした.

３の流入水では, ほとんどの調査でＧⅠ, ＧⅡの一方もしくは両方が検出された. ＧⅡの方が成績

多く検出される傾向があった. 合併浄化槽２で浄化槽流入水及び垂下カキの遺伝子型の状況：

は, 流入水, 放流水ともに３施設中, 最もNV２シーズンにおけるNVの遺伝子型は, 2007/検出率が低かった. 2007/08シーズンはＧⅠが08シーズンでは浄化槽３施設とも流入水でＧⅠ/多く検出され, 2008/09シーズンはＧⅡが多く11型, ＧⅡ/４型, ＧⅡ/13型が検出され, それ検出される傾向があった. 合併浄化槽３の流入を反映して河口の垂下カキにおいても同様の型

水からは１mlあたり最大10５近いオーダー, 放のNVが検出された (表２). 2008/09シーズン

流水でも10４ を超えるオーダーのNVが検出さの浄化槽流入水においては, ＧⅠでは2008年第れることがあった (図２,３,４). 流入水およ46週にＧⅠ/11型が１施設から検出されたのみ

び放流水のコピー数から算出したNVの除去率

で, ＧⅡではＧⅡ/４型, ＧⅡ/10型が検出されの平均値は, 合併浄化槽１で約49％, ２で約70た. 垂下カキではＧⅠ/14型, ＧⅡ/４型, ＧⅡ/％, ３で約45％であった.

― 58 ―

表３

NVの検出状況および検出率

検年出状況

2007

週

20084142465152１NTNTNT●/●

NT●/● −/● ●/● −/● ●/●２NTNTNT●/●

NT−/− ●/− ●/− ●/− ●/●３NTNTNT−/●

NT●/● −/● ●/● ●/● −/●１NTNTNT●/−NT●/● ●/● ●/● ●/● ●/●２NTNTNT−/−NT●/● ●/− ●/− −/− −/−３NTNTNT−/−NT−/● ●/● ●/● ●/● ●/●河川水

NTNT−/− ●/●NT−/− −/− −/● −/− −/●垂下カキ

垂下−/− −/− ●/− ●/● ●/● −/● ●/− −/●

合併浄化槽
流入水

合併浄化槽
放流水

検２年

出４状

６８43

合併浄化槽
流入水

合併浄化槽
放流水

46NT

況

検出率 (％)

2008

週1020094849

505152

２３４ＧⅠ

ＧⅡ

ＧⅠ＋ＧⅡ

６１−/− ●/−NTNT−/●NTNTNTNT−/● ●/●559191

２−/● −/−NTNT−/●NTNTNTNT−/● −/●455582３−/− −/●NTNT−/●NTNTNTNT−/● ●/●369191１●/− −/−NTNT−/●NTNTNTNT−/● ●/●

7373

91

２−/− −/−NTNT−/−NTNTNTNT−/● ●/●453655３−/− −/●

NTNT−/●NTNTNTNT●/● ●/●558282NT−/●NTNTNTNT

河川水−/− −/−NT●/● −/●175050垂下カキ

NT−/● ●/● ●/− ●/● −/● ●/− −/● ●/● ●/●717188垂下ＧⅠ/ＧⅡ

図２合併浄化槽１のNV検出状況

図３●：陽性−：陰性

NT：未検査合併浄化槽２のNV検出状況

河川のNV検出状況：浄化槽放流水でNVが比５). しかし, 上流域の浄化槽放流水でNV検較的高濃度で検出された2007年第51週, 2009年出があっても, 希釈されるため多くは検出され第４週等でNV検出がみられ, 特に, 2009年第ず, 検出しても低レベルの濃度であった.

４週に調査した３施設の浄化槽放流水からは高垂下したカキのNV検出状況およびNVの汚染濃度のNVが検出されており, 合併浄化槽の放量：2007/08シーズンは, 第41週にカキを垂下流水のNVを反映したものと考えられた. (図したところ, 第42週及び46週には汚染が認めら― 59 ―

図４

合併浄化槽３のNV検出状況

図５

河川水のNV検出状況※※ ＧⅠコピー数と､ ＧⅡコピー数の合計※※定量限界は実測値1コピーとした

図６

垂下カキのNV検出状況

図７

垂下カキのNVコピー数れなかったが, 第51週からNVが検出され, そ調査した300人槽前後の比較的中規模の合併浄の後は毎回20〜80％のカキからNVが検出され化槽では, 流入水と放流水でのNV除去率平均

た (図６). 2008/09シーズンは, 46週にカキをは, 施設１で約49％, ２で約70％, ３で約45％垂下し, ２週間後の48週からNVが検出され始であるが, 個々の除去率は非常にバラツキも多め, その後, 毎回10〜75％のカキからNVが検く, 合併浄化槽におけるNVの除去効果は期待出された (図６). カキのNV汚染はnested-PCRできないことが示唆された. 河川, 海域のNVで増幅産物が認められたものを陽性とし, NV汚染を低減化するためには除去率の向上が望まを検出しなかったのは全体の58％であった.

れるが, 評価にあたっては流入水の時間や日にNV陽性検体の28％が定量限界以下で, 79％はよる変動, 流入から放流までの滞留時間を考慮

カキ１個あたりのNVコピー数が10２から10５のするとともに, 日平均濃度や負荷量等を把握しオーダーであった (図７).て検討することも必要があると考えられた.
規模の大きい下水処理場等の整備地域におけ

考察るNV感染の発生動向を把握するためには, 下2007/08シーズンは, 同時期に３カ所の浄化水処理場への流入下水のNVのモニタリングが槽および垂下カキからＧⅠ/11型が検出された有用であると考えるが, 下水道未整備地域の中ことから, NV感染症で多く検出されるＧⅡ/

小規模の合併浄化槽では施設の処理対象人数や４型以外に, ＧⅠ/11型の地域流行があったこ利用者が限定され, 流入水のNVが利用者のNVとが推察された.

感染の有無に左右されるため, 単一の浄化槽の下水処理場等の規模の大きい処理場に流入すモニタリングでは, 地域全体の把握は難しい.

るNVは, 下水処理工程中概ね90〜99％以上が一方, 垂下カキは, 浄化槽放流水や河川のNV除去されているとされている [5]. 一方, 今回汚染状況を反映することから, 垂下カキのモニ― 60 ―

タリングは, 当該地域の感染性胃腸炎の発生動

New York (2001)

向を推察する上で, 有用であると考えられる.

[２] Inouye S, Yamashita K, Yoshikawa M,

なお, 海域のカキが汚染されるリスクを検討す

Kato N, Okabe N：Surrveillance ofるにあたっては, その海域でのNV量と養殖カ

viral gastroenteritis in Japan：pediatric

キの垂下状況との関係や, そのNVが不活化さcases and outbreak incidents, J Infect

れているかどうかも含め, さらに調査検討を進Dis, 181, 270-274 (2000)

める必要がある.

[３] 中田修二：ウイルス性胃腸炎, 小児科,
13-20 (2000)
謝辞[４] 齋藤幸一, 佐藤直人, 高橋朱実：カキの本研究の一部は, 平成19年度〜平成21年度厚ノロウイルス汚染経路に関する検討, 感生労働科学研究費補助金・食品の安心・安全確

染症学雑誌, 80, 399-404 (2006)

保推進研究事業 ｢食品中のウイルスの制御に関[５] 高橋朱実, 蛇口哲夫, 田中智之：流入下する研究｣ による助成を受けて実施した. ここ

水中ノロウイルス濃度から推察されるノに記して謝意を表する.

ロウイルス胃腸炎の流行状況と下水処理によるノロウイルス除去, 平成19年度の引用文献

厚生労働科学研究費 (食品の安心・安全[１] Green KY, Kapikian KZ, Chanock RM：確保推進研究事業) ｢食品中のウイルス

Human calicivirus, Field's Virology volの制御に関する研究｣ 協力研究報告, 95-

２, Lippncott-Raven, ４th ed, 841-874,102 (2008)

分裂指数は犬皮膚肥満細胞腫における余命を予測できる
Romansik EM, Reilly CM, Kass PH, Moore
PF and London CA (オハイオ州立大学,米国) Vet Pathol, 44, 335-341 (2007)
分裂指数 (Mitotic index：MI) は, 細胞増殖の間接的な指標であり, いくつかのヒトおよびイヌの癌の転帰において強力な予測材料であることが証明されてきた. この研究の目的は, 皮膚肥満細胞腫 (MCT) に罹患したイヌの生物学的挙動や余命の予測としてのMIの実用性を評価することであった. 組織学的にMCTと確認された148例の犬から得られた医療記録が検索された. 腫瘍グレード,局所再発, 転移病巣, 死亡日または最終追跡記録, 転帰に関する情報が入手された. 腫瘍のうち最も分裂活性の高い部位が評価に選ばれ, MI値は高倍視野 (400×,2.7 ) における分裂像数/10で決定された. MIの生存デー
タを比較するために, コックス比例ハザード(回帰) モデルが使用された. 局所再発と転移病巣発現の基準としてMIを比較するために, マンホイットニー検定が使用された.
MIは腫瘍グレードと直接相関していた (Ｐ<.0001). MIが５以下の犬における中央生存期間は, MIが５以上のもの (２カ月) より長く (70カ月), グレードによらなかった (Ｐ<.001). MI５以下でグレードⅡの腫瘍の中央生存期間 (MST) は, MI５以上で５カ月であったのに対して, 70カ月であった (Ｐ<.001).
MI５以上では２カ月未満であったのに比較し, MI５以下でグレードⅢの腫瘍に対してMSTは影響を受けなかった. 要するに, MIは皮膚MCTの犬の余命における強力な予測材料であり, 治療法の選択肢を決定する際の予後指標として含ませるべきである.
(岩手大学獣医病理学研究室)― 61 ―