岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 39 (№ 1), 3−15 (2013).

総説

ヘビ類の主嗅覚系および鋤鼻系におけるレクチン
組織化学的ならびに免疫組織化学的研究

近藤大輔

要

約

多くの脊椎動物において, 主嗅覚系は主に一般的な匂い物質を受容して捕食行動に関与し, 鋤鼻系は主に種特異的なフェロモンを受容して繁殖行動に関与するが, ヘビ類では主嗅覚系と鋤鼻系の両方が捕食行動と繁殖行動の両方に関与することが知られている. 本研究では, シマヘビの主嗅覚系と鋤鼻系に関して, 一次投射経路におけるレクチン結合パターンが類似することを明らかにした. また, 抗Ｇα免疫組織化学によって, 主嗅
覚系には匂い受容体 (OR) と共役するＧαｏlfが発現し, 鋤鼻系には鋤鼻受容体２型 (V2R) と共役するＧαｏが発現することを明らかにした. さらに, 冬眠中の嗅上皮および鋤鼻上皮が繁殖期のものよりも多くのシアル酸残基を含んでいることを明らかにした. これらの結果から, ①ヘビ類の主嗅覚系と鋤鼻系は異なる物質を受容するが刺激伝導や情報の処理過程が類似する可能性, ②冬眠中のヘビ類の嗅覚器は刺激受容よりも感染防御に有利な状態である可能性が考えられる.
キーワード：ヘビ類, 主嗅覚系, 鋤鼻系, 嗅覚受容体, 冬眠

動物は食物や周辺の環境を示す化学物質, さらに社る. この舌のフリッキング行動は主嗅覚系と鋤鼻系の会的行動や性行動を調節するシグナルを外部環境中で両方によって調節される [3, 4]. 他の動物の場合と絶えず探索し, 特異に分化した化学感覚神経細胞によっ異なり, ヘビ類の鋤鼻系はフェロモンなどの種特異的てそれらを受容する. 多くの脊椎動物において, このな物質だけではなく捕食物や天敵由来の物質も受容し,化学受容は一般的に２つの系, 主嗅覚系と鋤鼻系とに

主嗅覚系と同様に捕食行動や逃避行動などに関与する

大別され, 前者は主に無数の揮発性匂い物質を, 後者[6, ７]. さらに, ヘビ類の主嗅覚系はフェロモンをは主に種特異的な情報を含む物質 (フェロモン等) を受容し, 鋤鼻系と同様に繁殖行動に関与することが報受容すると考えられている [1]. 主嗅覚系と鋤鼻系は告されている [8]. ヘビ類において, 主嗅覚系と鋤鼻共通の原基から発生過程で分化する [2, 3] が, 主嗅系は形態学的には完全に分離されるが, 両系が同一の覚系は鼻腔内の嗅上皮で受容した情報を主嗅球へ, 鋤

行動に関与することから, 哺乳類などの動物種とは異鼻系は鋤鼻器の鋤鼻上皮で受容した情報を副嗅球へ投なり主嗅覚系と鋤鼻系が完全に異なる分化をせず, 主射しており､ 両者の経路は完全に独立する [1, 4, 5].

嗅覚系と鋤鼻系における匂い刺激の受容および伝導,

系統発生学的に, 主嗅覚系は全ての脊椎動物に存在す

処理の各過程が類似する可能性が考えられる. しかしる一方で, 鋤鼻系は両生類から発達する. 脊椎動物のながら, 現在までに組織化学によってヘビ類の主嗅覚中で, 爬虫類有鱗目に属するヘビ類や一部のトカゲ類

系と鋤鼻系を比較した研究は少ない.

は最も発達した鋤鼻系を有している [1, 2].

また, ヘビ類は外温動物であり全ての行動を停止す

ヘビ類は舌をフリッキングさせて環境中の化学物質

る冬眠という過酷な生活を過ごす. 嗅覚器である嗅上を収集し, 舌の先端を口腔に開口している鋤鼻器へ運皮や鋤鼻上皮は直接外部環境と接する部位であるため,

ぶことによって, 鋤鼻系で高濃度の化学物質を受容す

冬眠中の動物は嗅覚受容よりもむしろ生存のために生

岩手大学農学部獣医解剖学研究室, 岐阜大学大学院連合獣医学研究科基礎獣医学講座―3―

材料と方法

体防御機構を活性化させている可能性が考えられる.
１

このような季節変化に関する知見は冬眠中の動物の生レクチン組織化学

理学的な活動を理解する上で重要であると考えられる

繁殖期 (５月〜６月) の５個体を嗅覚器 (嗅上皮おが, 現在までに冬眠中の動物における嗅覚器に関するよび鋤鼻上皮) のレクチン組織化学に, 他の繁殖期の報告はない.

6個体を嗅球 (主嗅球および副嗅球) のレクチン組織

組織切片上で発現する複合糖質 (糖タンパク質およ

化学に供した. また, 冬眠中 (２月) の４個体を嗅覚び糖脂質) の類似性を評価する手法として, 糖鎖と結器のレクチン組織化学に供した.

合するタンパク質であるレクチンを用いた組織化学が動物は深麻酔下でザンボニ固定液による灌流固定を広く行われている [9]. また, 発現する嗅覚受容体ファ

行い, 嗅覚器および嗅球をパラフィン包埋後, ５μm

ミリー (匂い物質受容体 (OR) および鋤鼻受容体１の厚さに前額断および水平断で薄切した. 切片は内因型 (V1R), ２型 (V2R)) の特定には, それぞれに共性ペルオキシダーゼを失活させた後, リン酸緩衝生理

役するGタンパクのαサブユニット (Ｇα) を 同 定 す る

食塩水 (PBS；10mM, pH 7.4) で洗浄し, １%ウシ

た め の 免 疫 組 織 化 学 が 用 い ら れ る . す な わ ち , ORに

血清アルブミンを含むPBSでブロッキングした. PBS

対 し て は Ｇαｏlfが, V1Rに対してはＧαi2が, V2Rに対で洗浄後, 表１に示すlectin screening kit I〜III

してはＧαｏが指標として用いられる [10, 11]. 本研(Vector Laboratories, Burlingame, CA, U.S.A.) に

究では, レクチン組織化学によってシマヘビ ( Elaphe

含まれる21種類のビオチン化レクチンをそれぞれ４℃

quadrivirgata ) の主嗅覚系と鋤鼻系に発現する複合で18時間適用した. その後, avidin-biotin complex

糖質の類似性を検証し, さらに抗Ｇα免疫組織化学に(ABC) reagent (Vector) を適用し, 0.006%過酸化

よって両系に発現する嗅覚受容体の特定を行い, これ

水素と0.02% 3-3'-ジアミノベンチジン (DAB) を加えらを総合してヘビ類の嗅覚系における組織化学的特徴

たTris-HCl (pH 7.4) で発色させた. また, 陰性対照を考察した. また, シマヘビの嗅覚器におけるレクチ

切片として, 1) 希釈した各レクチンに表１に示す阻

ン組織化学的特徴が冬眠によってどのように変化する

害糖を500mMとなるように加え, 室温で１時間静置のかについても詳細に観察した.

した後に適用した切片, 2) レクチンを加えず, 0.5%
Triton Xを含むPBSを適用した切片を作製した.
なお, 糖鎖末端のシアル酸残基を除去するために,
表１

レクチン

Wheat germ agglutinin
Succinylated-wheat germ agglutinin
Lycopersicon esculentum lectin
Solanum tuberosum lectin
Datura stramonium lectin
Bandeiraea simplicifolia lectin-II
Dolichos biflorus agglutinin
Soybean agglutinin
Bandeiraea simplicifolia lectin-I
Vicia villosa agglutinin
Sophora japonica agglutinin
Ricinus communis agglutinin-I
Jacalin
Peanut agglutinin
Erythrina cristagalli lectin
Ulex europaeus agglutinin-I
Concanavalin A
Pisum sativum agglutinin
Lens culinaris agglutinin
Phaseolus vulgaris agglutinin-E
Phaseolus vulgaris agglutinin-L

本研究に用いたレクチンとその特異性
略

語

WGA
s-WGA
LEL
STL
DSL
BSL-II
DBA
SBA
BSL-I
VVA
SJA
RCA-120
PNA
ECL
UEA-I
ConA
PSA
LCA
PHA-E
PHA-L

濃度 (mg/−２

1.0×10
1.0×10−２
2.0×10−３
1.0×10−２
4.0×10−３
4.0×10−３
1.0×10−２
1.0×10−２
4.0×10−３
4.0×10−３
2.0×10−２
2.0×10−３
5.0×10−４
4.0×10−３
2.0×10−２
2.0×10−２
3.3×10−３
4.0×10−３
4.0×10−３
5.0×10−３
2.5×10−３)

結合特異性
GlcNAc, NeuAc(GlcNAc)n(GlcNAc)2−4(GlcNAc)2−4(GlcNAc)2−4
GlcNAcGal, GalNAc
Gal, GalNAc
Gal, GalNAc
Gal, GalNAc
Gal, GalNAc
Gal, GalNAc
Gal, GalNAc
Gal
Gal, GalNAc
FucMan, Glc
Man, Glc
Man, Glc
Oligosaccharide
Oligosaccharide

Fuc：フコース, Gal：ガラクトース, GalNAc：N-アセチルガラクトサミン, Glc：グルコース, GlcNAc：
N-アセチルグルコサミン, Man：マンノース, NeuAc：N-アセチルノイラミン酸.
―4―いくつかの切片では Clostridium perfringens 由来のABC reagent を適用した後, 0.006%過酸化水素とノイラミニダーゼ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO,

0.02% DABを加えたTris-HCl (pH 7.4) で発色させ

U.S.A.) 0.35 U/mlを37℃で18時間適用した後にブロッた. 陰性対照は一次抗体を加えず, 正常ロバ血清を適

キング以降の反応を行った.

用した.

２

３

ウエスタンブロット法

免疫組織化学シマヘビ３個体をウエスタンブロット法に供した.

シマヘビ８個体を免疫組織化学に供した. 動物は深動物をペントバルビタールの過投与によって殺処分し,麻酔下で４%パラホルムアルデヒド液による灌流固定

嗅上皮および鋤鼻上皮, 脳をそれぞれタンパク質抽出を行い, 嗅覚器および嗅球をOCT compound (Sakura

緩衝液 (500mM Tris-HCl, 70 mMドデシル硫酸ナト

Finetek, Tokyo, Japan) に包埋後, 10μmの厚さにリウム (SDS), ６% β-メルカプトエタノール, 10%

前額断および水平断で薄切した.

グリセロール) 中でホモジネートし, 95℃で５分間変嗅上皮および鋤鼻上皮の免疫組織化学は蛍光法によっ性させた. 抽出したタンパク質をSDS−ポリアクリルて検出した. 鼻部の切片をPBSで洗浄後, ５%ウシ血

アミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) し, polyvinylidene

清アルブミンを含むPBSでブロッキングし, 表２で示

fluoride membranes (PVDF；Pall Corporation, East

す一次抗体をそれぞれ４℃で18時間適用した. PBSでHills, NY, USA) へ転写した. 転写したPVDF膜は10%

洗浄後, 表３で示すAlexa Flour 594標識二次抗体を

EzBlock (ATTO, Tokyo, Japan) を含むTris緩衝

室温で１時間適用し, 蛍光顕微鏡で観察した.

食塩水−Tween 20 (TBST；0.05% Tween 20, 25

主嗅球および副嗅球の免疫組織化学はABC法で検mM Tris-HCl, 150mM 塩化ナトリウム；pH 7.4) で出した. 脳の切片をPBSで洗浄し, 内因性ペルオキシ

ブロッキングし, 表２で示す一次抗体をそれぞれ含む

ダーゼを失活させた後, ５%ウシ血清アルブミンを含TBSTを室温で１時間適用した. PBSで洗浄後, 表３

むPBSでブロッキングし, 表２で示す一次抗体をそれで示すビオチン化二次抗体を室温で30分間適用し,ぞれ４℃で18時間適用した. PBSで洗浄後, 表３で示

表２
一次抗体

品番

本研究に用いた一次抗体リストおよび使用濃度
抗体由来動物, 抗体の種類(製造元)

抗原ペプチド抗Gαolf/s抗体 sc-383

ラットGαolfのC末端
ウサギ, ポリクローナル抗体(364-381；ラットGas(Santa Cruz Biotech.,のC末端領域と一致)
Santa Cruz, CA, U.S.A.)

抗Gαi2抗体sc-80007

ラット Gαi2の全配列抗Gαo抗体sc-387ラットGαoの特異性が高い領域 (105-124)

使用濃度
IH
TEM

WB
1:10001:500−

マウス, モノクローナル抗体(Santa Cruz Biotech.)

1:1000

1:100

1:500

ウサギ, ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotech.)

1:1000

1:200

1:500

WB

使用濃度
IH

TEM

1:5000

1:500

1:10001:5000

1:500

1:1000

−

1:100

−

−

1:100

−

IH：免疫組織化学, TEM：免疫電顕法, WB：ウエスタンブロット法.

表3

本研究に用いた二次抗体リストおよび使用濃度

二次抗体

品番

ビオチン化
抗ウサギIgG抗体

711-066-152

抗マウスIgG抗体

715-066-151

Alexa Fluor 594標識
抗ウサギIgG抗体

A-11037

抗マウスIgG抗体

A-11032

抗体由来動物, 抗体の種類(製造元)
ロバ, ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch Lab.,West Grove, PA, U.S.A.)
ロバ, ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch Lab.)ヤギ, ポリクローナル抗体(Molecular Probes,
Eugene, OR, U.S.A)
ヤギ, ポリクローナル抗体(Molecular Probes)

IH：免疫組織化学, TEM：免疫電顕法, WB：ウエスタンブロット法.
―5―

すビオチン化二次抗体を室温で30分間適用し, ABC胞, 基底細胞の３種類の細胞から構成されていた. 嗅

reagent を 適 用 し た 後 , 0.006% 過 酸 化 水 素 と 0.02%

上皮および鋤鼻上皮において, 代表的な結合パターン

DABを加えたTris-HCl (pH 7.4) で発色させた.

を示した３種類のレクチン, DSLおよびVVA, DBA

陰性対照切片として, 抗Ｇαｏlf/s抗体および抗Ｇαｏの染色像を図１に示し, 用いた21種類全てのレクチン

抗体とそれぞれに対する同濃度のブロッキングペプチ

結合パターンを表４としてまとめた. なお, 陰性対照

ド (sc-383Pおよびsc-387P；Santa Cruz) を室温で１では特異的な反応は認められなかった.

時間反応させた後に適用した切片を作製した.

①感覚細胞

４

胞と鋤鼻上皮感覚細胞とで類似した結合パターンを示

s-WGA を除く20種類のレクチンは, 嗅上皮感覚細免疫電顕法
シマヘビ３個体を免疫電顕法に供した. 動物は深麻した (表４, 図１；矢印). 嗅上皮感覚細胞および鋤

酔下で３%パラホルムアルデヒドと0.2%グルタールア

鼻上皮感覚細胞において, s-WGAの結合パターンはルデヒドの混合液によって灌流固定した. 頭部から鋤個体によって異なり, 明瞭な傾向は認められなかった.

鼻上皮を摘出し, OCT compoundへ凍結包埋して25②支持細胞μm厚に薄切した. 浮遊切片はPBSで洗浄後, 2.5%ウ

BSL-IIを除く20種類のレクチンが, 嗅上皮支持細胞

シ血清アルブミンを含むPBSでブロッキングし, 表２と鋤鼻上皮支持細胞の両方と結合した (図１A；矢頭,で示す２種類の一次抗体 (抗Ｇαi2抗体および抗ＧαoB；矢頭, G；矢頭, H；矢頭). しかしながら４種類抗体) を４℃で３日間適用した. PBSで洗浄後, 表３のレクチン, BSL-IIおよびDBA, SJA, ECLは, 嗅上で示すビオチン化二次抗体を４℃で２時間適用し, ABC

皮支持細胞と鋤鼻上皮支持細胞とで異なる結合パター

reagent を 適 用 し た 後 , 0.006% 過 酸 化 水 素 と 0.02%

ンを示した (図１C；矢頭, I). またBSL-IIは, 嗅上DABを加えたTris-HCl (pH 7.4) で発色させた. その皮支持細胞のみと結合した.

後, １%四酸化オスミウムを４℃で１時間適用して後③基底細胞固定した後, エポキシ樹脂包埋し, 80nm厚の超薄切用いた全てのレクチンが, 嗅上皮基底細胞および鋤片を作製して透過型電子顕微鏡で観察した.

鼻上皮基底細胞では, それぞれ嗅上皮感覚細胞および鋤鼻上皮感覚細胞と同様のパターンで結合した (図１結１果A；二重矢印, B；二重矢印, C；二重矢印).

繁殖期の嗅上皮および鋤鼻上皮におけるレクチン

④自由縁

組織化学

BSL-IIおよびDBA, VVA, SJAを除く17種類のレ

嗅上皮と鋤鼻上皮はともに, 感覚細胞および支持細
表４
レクチン
WGA
s-WGA
LEL
STL
DSL
BSL-II
DBA
SBA
BSL-I
VVA
SJA
RCA -120
Jacalin
PNA
ECL
UEA-I
ConA
PSA
LCA
PHA-E
PHA-L

クチンは, 嗅上皮自由縁と鋤鼻上皮自由縁の両方と結繁殖期のシマヘビ嗅上皮および鋤鼻上皮におけるレクチン結合パターン

感覚細胞および基底細胞
嗅上皮
鋤鼻上皮
+++
++
+++
+++
+++
++
+
++
+
++
+
+++
+++
++
±
++
+++
++
+++
+++
+++

+++
±〜+
+++
+++
+++
++
+
++
++
+++
+
+++
+++
+++
±
+
+++
+
+++
++
++

支持細胞
嗅上皮
鋤鼻上皮

嗅上皮

自由縁
鋤鼻上皮

+++
+++
+++
+++
+++
−
±
+++
− or +++
±
±
+++
+++
+
±
±
+++
±
+
++
++

+++
++
+++
+++
+++
−
−
+++
+
++
−
+++
+++
+
++
±〜++
+++
±〜++
++
+++
++

+++
+++
+++
+++
+++
−
−
+++
−〜+++
−
−
+++
++
+++
+
±
+++
+
++
+++
+++

+++
++
+++
+++
+++
++
+++
+++
− or +++
+++
++
+++
+++
++
++
±
+++
±
+++
+++
+++

−：陰性, ±：偽陽性, +：弱陽性, ++：中陽性, +++：強陽性.
―6―

図１ 繁殖期のシマヘビ嗅上皮および鋤鼻上皮におけるレクチン染色像
A-C：嗅上皮におけるDSL (A) およびVVA (B), DBA (C) 染色像. 矢印は感覚細胞の, 矢頭は支持細胞の, 二重矢印は基底細胞の染色像を示す. D-F：鋤鼻上皮におけるDSL (D) およびVVA (E), D
BA (F) 染色像. G-I：鋤鼻上皮におけるDSL (G) およびVVA (H), DBA (I) 染色の自由縁領域における強拡大像. 矢印は感覚細胞の, 矢頭は支持細胞の染色像を示す. バーは (A-C, G-I) で20μm,(D-F) で100μm.

―7―図２ 繁殖期のシマヘビ主嗅球および副嗅球におけるレクチン染色像
A-C：主嗅球におけるLEL (A) およびSBA (B), VVA (C) 染色の前額断像. 写真上部が背側を, 右部が外側を示す. D-F：副嗅球におけるLEL (D) およびSBA (E), VVA (F) 染色の前額断像. 写真
上部が背側を, 右部が外側を示す. G-I：副嗅球におけるLEL (D) およびSBA (E), VVA (F) 染色の水平断像. 写真上部が内側を, 右部が吻側を示す. GL:糸球体層, IPL：内網状層, NL：神経層, V
NN：鋤鼻神経. バーは300μm.

―8―

表５
レクチン
WGA
s-WGA
LEL
STL
DSL
BSL-II
DBA
SBA
BSL-I
VVA
SJA
RCA -120
Jacalin
PNA
ECL
UEA-I
ConA
PSA
LCA
PHA-E
PHA-L

繁殖期のシマヘビ主嗅球および副嗅球におけるレクチン結合パターン
僧帽細胞層および内網状層,
顆粒細胞層, 上衣細胞層
主嗅球
副嗅球

神経層および糸球体層
主嗅球

副嗅球

+
−
+++
+++
++
−
−
++
−
± or ++ａ)
−
+
++
++
±
−
++
±
±
++
++

+
−
++
++
++
−
−
++
−
± or ++ａ)
−
+
++
++
±
−
++
±
±
++
++

+
−
−
−
++
−
−
+
−
± or + ｂ)
−
+
++
+
±
−
++
±
±
++
+

+
−
−
−
++
−
−
+
−
± or + ｂ)
−
+
++
+
±
−
++
±
±
++
+

−：陰性, ±：偽陽性, +：弱陽性, ++：中陽性, +++：強陽性.
a) 神経層は偽陽性を, 糸球体層は中陽性を示した.
b) 内網状層は弱陽性を, 僧帽細胞層および顆粒細胞層, 上衣細胞層は偽陽性を示した.

合した (図１A, C, G, I). VVAは, 嗅上皮自由縁

一バンドが得られた (図３B). 抗Ｇαｏ抗体を用いたのみと結合し (図１B, H), PNAは, 嗅上皮自由縁

ウエスタンブロット法では, 嗅上皮および鋤鼻上皮,よりも顕著に強く鋤鼻上皮自由縁と結合した. BSL-I

脳の全てにおいて期待される分子量 (40kDa) 付近におよびUEA-I, PSAは, 嗅上皮自由縁ないし鋤鼻上皮

特異的な単一バンドが得られた (図３C). 陰性対照

自由縁と個体によって異なる強度で結合した.

では特異的な反応は認められなかった (図３D).

２

４

繁殖期の主嗅球および副嗅球におけるレクチン組

抗Gαolf/sおよび抗Gαi2, 抗Gαo抗体を用いた織化学

免疫組織化学および免疫電顕法

主嗅球と副嗅球ともに, 神経層および糸球体層, 僧嗅上皮では, 抗Ｇαｏlf/s抗体は感覚細胞の線毛にお帽細胞層, 内網状層, 顆粒細胞層, 上衣細胞層の６層いて強陽性を示し (図４A；矢頭), 樹状突起および構造を示した. 主嗅球および副嗅球において, 代表的細胞体, 軸索において弱陽性を示した (図４A). 抗

な結合パターンを示した３レクチン, LELおよびSBA,

Ｇαｏ抗体は感覚細胞の樹状突起および細胞体, 軸索に

VVAの染色像を図２に示し, 用いた21種類全てのレ

おいて弱陽性を示した (図４C) が, 線毛では陽性をクチン結合パターンを表５としてまとめた. 本研究で示さなかった (図４C；矢頭). 抗Ｇαi2抗体は嗅上皮用いた全てのレクチンが, ６つの層全てにおいて, 主において陽性を示さなかった (図４B). 抗Ｇαｏlf/s抗嗅球と副嗅球とで類似した結合パターンを示した. な体とブロッキングペプチドを反応させた陰性対照では,

お, 陰性対照では特異的な反応は認められなかった.

特異的な反応は認められなかった (図４D).

３細胞の細胞体, 軸索において強陽性を示し, 非感覚上

鋤鼻上皮において, 抗Ｇαｏ抗体は自由縁および感覚抗Gαolf/sおよび抗αi2, 抗Gαo抗体を用いたウ
エスタンブロット法

皮で被われるマッシュルームボディーでは陽性を示さ

抗Ｇαｏlf/s抗体を用いたウエスタンブロット法では,なかった (図４G). 抗Ｇαｏlf/s抗体および抗Ｇαi2抗体

嗅上皮および脳において期待される分子量 (45kDa)は鋤鼻上皮において陽性を示さなかった (図４E, F).

付近に特異的な単一バンドが得られた (図３A). 抗

抗Ｇαｏ抗体とブロッキングペプチドを反応させた陰性Ｇαi2抗体を用いたウエスタンブロット法では, 脳に対照では, 特異的な反応は認められなかった (図４H).

おいて期待される分子量 (40kDa) 付近に特異的な単鋤鼻上皮における免疫電顕法において, 感覚細胞と支―9―

図３ シマヘビ由来組織における抗Gα抗体を用いたウエスタンブロット像
A：抗Gαolf/s抗体. B：抗Gαi2抗体. C：抗Gαo抗体. D：陰性対照. 1レーン：嗅上皮, ２レーン：
鋤鼻上皮, ３レーン：脳. 期待される蛋白質の分子量は (A) で約45kDa, (B, C) で約40kDa.

図４ シマヘビ嗅上皮および鋤鼻上皮における抗Gα免疫組織化学像
A-D：嗅上皮における抗Gαolf/s抗体 (A) および抗Gαi2抗体 (B), 抗Gαo抗体 (C) を用いた免疫
組織化学像ならびに陰性対照 (D). 矢頭は嗅上皮感覚細胞の線毛を, アスタリスクは嗅腺 (陰性対照部位) を示す. E-H：嗅上皮における抗Gαolf/s抗体 (E) および抗Gαi2抗体 (F), 抗Gαo抗体 (G)を用いた免疫組織化学像ならびに陰性対照 (H). MB：マッシュルームボディー, VNE：鋤鼻上皮.
バーは (A-D) で20μm, (E-H) で200μm.
持細胞の両方が微絨毛を有したが, 抗Ｇαｏ抗体は感覚嗅球において, 抗Ｇαｏlf/s抗体は主嗅球の神経層お細胞の微絨毛において陽性を示し (図５A；矢頭, B；

よび糸球体層において陽性を示した (図６A；矢印)矢頭), 支持細胞の微絨毛では陽性を示さなかったが, 副嗅球のこれらの層では陽性を示さなかった (図(図５A；矢印, B；矢印). 対照的に, 抗Ｇαi2抗体は６E；矢印). 抗Ｇαｏ抗体は主嗅球と副嗅球の両方の感覚細胞と支持細胞の両方の微絨毛において陽性を示

神経層および糸球体層において陽性を示した (図６C；

さなかった (図５C).

矢印, G；矢印). 抗Ｇαi2抗体は主嗅球と副嗅球の両― 10 ―

図５ シマヘビ鋤鼻上皮自由縁における抗Gα免疫電顕像
A, B：抗Gαo抗体を用いた免疫電顕像. 矢頭は鋤鼻上皮感覚細胞の微絨毛を, 矢印は支持細胞の微絨毛を示す. C：抗Gαi2抗体を用いた免疫電顕像. R：感覚細胞, S：支持細胞, c：感覚細胞内のセントリオール, sg：支持細胞内の分泌顆粒. バーは１μm.

図６ シマヘビ主嗅球および副嗅球における抗Gα免疫組織化学像
A-D：主嗅球における抗Gαolf/s抗体 (A) および抗Gαi2抗体 (B), 抗Gαo抗体 (C) を用いた免疫
組織化学像ならびに陰性対照 (D). 矢印は糸球体層を示す. E-H：副嗅球における抗Gαolf/s抗体(E) および抗Gαi2抗体 (F), 抗Gαo抗体 (G) を用いた免疫組織化学像ならびに陰性対照 (H). 矢
印は糸球体層を示す. バーは300μm.
― 11 ―

図７ シマヘビ嗅上皮および鋤鼻上皮におけるDSL染色像の季節変化
A-C：繁殖期 (A) および冬眠中 (B), シアル酸除去後の冬眠中 (C) の嗅上皮におけるDSL染色像.
矢印は感覚細胞を, 矢頭は支持細胞を示す. D-F：繁殖期 (D) および冬眠中 (E), シアル酸除去後の冬眠中 (F) の鋤鼻上皮におけるDSL染色像. バーは (A-C) で20μm, (D-E) で100μm.
方の神経層および糸球体層において陽性反応を示さな

細胞のレクチン結合パターンはs-WGAを除く20種類

かった (図６B；矢印, F；矢印). 抗Ｇαｏlf/s抗体おで類似し, 主嗅球と副嗅球における結合パターンも21よび抗Ｇαｏ抗体とブロッキングペプチドを反応させた

種類全てのレクチンで類似した. このことから, シマ

陰性対照では, 特異的な反応は認められなかった (図ヘビの主嗅覚系と鋤鼻系に発現する複合糖質 (糖タン

６D, H).

パク質や糖脂質) は類似していることが示唆された.
多くの動物種において, 主嗅覚系と鋤鼻系のレクチン

５

冬眠中の嗅上皮および鋤鼻上皮におけるレクチン

結合パターンは異なることが報告されている [12-15].

組織化学

しかしながら, ヘビ類と同様に非常によく発達した鋤鼻

繁殖期および冬眠中, さらにシアル酸除去後の冬眠系を有するトカゲ類のミドリカナヘビ Lacerta viridis

中の嗅上皮と鋤鼻上皮において, 代表的な結合パターとイタリアカベカナヘビ Podarcis sicula では, いずンを示したDSLの染色像を図７に, LCAの染色像をれも主嗅覚系と鋤鼻系における５種類のレクチン

図８に示した. 用いた21種類のレクチン全てが, 冬眠(SBA, DBA, BSL-I, BSL-I-B4, LEL) で結合パター

中の嗅上皮および鋤鼻上皮 (感覚細胞および支持細胞,ンが類似し, 異なる結合パターンを示すレクチンは報

基底細胞, 自由縁) と繁殖期の個体よりも弱く結合し告されていない [16]. 対照的に, 同じトカゲ亜目にた (図７, ８). しかしながら, シアル酸除去後の冬属し, 嗅覚刺激よりも視覚刺激の受容に優れたヒガシ

眠中の嗅上皮および鋤鼻上皮において, 用いた21種類

ウォータードラゴンPhysignathus lesueurii では, SBAのレクチン全てが繁殖期の嗅上皮および鋤鼻上皮のもとBSL-I-B4によって鋤鼻系が主嗅覚系よりも顕著に染のと類似した結合パターンを示した (図７, ８).

色される [17]. したがって, 主嗅覚系と鋤鼻系に存在する複合糖質が類似するという組織化学的特徴は,

考
１察

鋤鼻系が発達するヘビ類や一部のトカゲ類に特有のも主嗅覚系と鋤鼻系の感覚細胞ならびに嗅球に発現のであると考えられる. このことはヘビ類や一部のトする複合糖質の類似性

カゲ類において, 主嗅覚系と鋤鼻系が類似した行動

シマヘビにおいて, 嗅上皮感覚細胞と鋤鼻上皮感覚(捕食行動および逃避行動, 性行動など) を仲介する― 12 ―

図８ シマヘビ嗅上皮および鋤鼻上皮におけるLCA染色像の季節変化
A-C：繁殖期 (A) および冬眠中 (B), シアル酸除去後の冬眠中 (C) の嗅上皮におけるLCA染色像.
矢印は感覚細胞を, 矢頭は支持細胞を示す. D-F：繁殖期 (D) および冬眠中 (E), シアル酸除去後の冬眠中 (F) の鋤鼻上皮におけるLCA染色像. バーは (A-C) で20μm, (D-E) で100μm.
[6-8] という他の動物種では認められない行動学的特受容体と共役するＧαはＧαｏlfのみであると考えられる.

徴と関連しているのかもしれない.

なお, 細胞体は抗Ｇαｏ抗体に陽性を示したが, 神経系

嗅覚系において, 複合糖質は匂い刺激の受容およびに発現するＧαｏは嗅覚受容に関連する分子の他に軸索伝導, 処理の各過程, あるいは連続的なターンオーバー

伸長やシナプス結合, 細胞間情報伝達などに関与するや個体発生において重要な役割を担うことが知られてことが知られ [19], 本研究で認められた陽性反応はいる [18]. 嗅覚系による匂い刺激の伝導は, 匂い物

嗅覚受容体と共役するものではないと判断した. 主嗅質を受容した感覚細胞の樹状突起や細胞体, 軸索を介球の糸球体層全体が同様に抗Ｇαｏlf/s抗体に陽性を示して行われ, 一次投射部位である嗅球で匂い刺激の処したことも, 主嗅覚系がＧαｏlfを発現することを支持理が行われる. シマヘビの主嗅覚系と鋤鼻系において,している. ＧαｏlfはORと共役するＧαである [11].

一次投射経路 (感覚細胞の樹状突起や細胞体, 軸索,鋤鼻上皮感覚細胞において, 全ての微絨毛が抗Ｇαｏ

さらに嗅球の各層) に発現する複合糖質が類似するこ抗体に陽性を示し, 抗Ｇαｏlf/s抗体および抗Ｇαi2抗体とから, ヘビ類の主嗅覚系と鋤鼻系における匂い刺激に陰性を示した. したがって, 鋤鼻系において嗅覚受容受容後の伝導や処理過程が類似する可能性が示された.

体と共役するＧαはＧαｏのみであると考えられる. 副嗅球の糸球体層全体が抗Ｇαｏ抗体に陽性を示し, 抗２ 主嗅覚系と鋤鼻系に発現する嗅覚受容体ファミリー
ウエスタンブロット法によって, 用いた抗Ｇαｏlf/s
抗体および抗Ｇαi2抗体, 抗Ｇαｏ抗体の全てがシマヘ

Ｇαｏlf/s抗体および抗Ｇαi2抗体に陰性を示したことも,
鋤鼻系がＧαｏのみを発現することを強く支持する.
ＧαｏはV2Rと共役するＧαである [10].

ビ由来の組織で特異的な単一バンドを形成したことから, これらの抗体をシマヘビＧαと特異的に反応する

３

他の動物種の嗅覚系との比較
本研究において, シマヘビ主嗅覚系はOR-Ｇαｏlfのと判断して免疫組織化学に用いた.
嗅上皮感覚細胞において, 多数の線毛が抗Ｇαｏlf/s

みを発現することが示唆された. 多くの動物種におい抗体にのみ陽性を示した. 嗅上皮において線毛を有すて, 主嗅覚系に発現する主な受容体はOR-Ｇαｏlfである細胞は感覚細胞のみであり, 主嗅覚系において嗅覚り [11], シマヘビの主嗅覚系に発現する嗅覚受容体― 13 ―

は他の動物種のものと類似する. 一方で, シマヘビ鋤

ル酸残基は, ｢decoy function｣によって上皮を感染か

鼻系はV2R-Ｇαｏのみを発現することが示唆された.

ら防御することが知られる [25]. したがって, 冬眠

ツメガエルなどの両生類の鋤鼻系はV2R-Ｇαｏのみを中の嗅上皮および鋤鼻上皮は繁殖期のものよりも感染発現する [20] が, げっ歯類の鋤鼻系はV2R-Ｇαｏとからの一次生体防御に有利な状態である可能性がある.

V1R-Ｇαi2の両方を発現し [10], 多くの哺乳類の鋤鼻
総系はV1R-Ｇαi2のみを発現する [21]. したがって, 鋤
鼻系におけるV1R-Ｇαi2の発現は両生類から哺乳類へ括

本研究では, シマヘビの主嗅覚系および鋤鼻系をレの進化の間に生じたと考えられている. シマヘビの鋤

クチン組織化学ならびに抗Ｇα免疫組織化学によって鼻系に発現する嗅覚受容体は哺乳類よりも両生類のも解析した. レクチン組織化学の結果から, 主嗅覚系とのと類似し, このことはヘビ類 (爬虫類有鱗目) が鋤鋤鼻系の一次投射経路 (感覚細胞の樹状突起から一次鼻系におけるV1R-Ｇαi2の出現よりも前の段階で哺乳中枢である嗅球まで) に発現する複合糖質は類似する類と異なる進化経路を辿った可能性を示している.

ことが示され, 匂い物質受容後の匂い刺激の伝導や処理過程は主嗅覚系と鋤鼻系とで類似することが示唆さ

４

主嗅覚系と鋤鼻系が受容する匂い物質の性質れた. この主嗅覚系と鋤鼻系における一次投射経路の本研究において, シマヘビ主嗅覚系および鋤鼻系は類似性は, 主嗅覚系と鋤鼻系の両方が類似した行動

それぞれOR-ＧαｏlfおよびV2R-Ｇαｏを発現することが(捕食行動や逃避行動, 繁殖行動など) に関与すると示唆された. 一般的に, OR-Ｇαｏlf およびV1R-Ｇαi2はいうヘビ類の行動学的特徴と関連しているのかもしれ

分子量の小さな揮発性物質と高い親和性を有し [22],ない. また, 抗Ｇα免疫組織化学の結果から, ヘビ類

V2R-Ｇαｏはペプチドなど分子量の大きい非揮発性水では主嗅覚系と鋤鼻系とで発現する嗅覚受容体は異な溶性物質と高い親和性を有する [23]. したがって,ることが示され, ヘビ類の主嗅覚系と鋤鼻系は異なる

シマヘビにおいて主嗅覚系は主に分子量の小さい揮発性質の匂い物質を受容することが示唆された. この主性物質を, 鋤鼻系は主に分子量の大きい非揮発性水溶嗅覚系と鋤鼻系における嗅覚受容体の相違性は, 類似性物質を受容することが示唆される. すなわち, ヘビした行動 (捕食行動や逃避行動, 繁殖行動など) に主類は単一の物体から生じる多様な匂い物質を２つの嗅嗅覚系と鋤鼻系の両方が関与することの利点となる可覚系によって受容することで対象物を敏感に感知する能性がある.

ことができ, このことが類似した行動 (捕食行動や逃さらに, ヘビ類の主嗅覚系と鋤鼻系における組織化

避行動, 繁殖行動など) に主嗅覚系と鋤鼻系の両方が学的特徴は季節変化することが示された. すなわち,関与する [6-8] ことの利点となっている可能性がある.

冬眠中の嗅上皮および鋤鼻上皮感覚細胞および支持細胞内の分泌顆粒では, 多量のシアル酸残基が繁殖期の５

レクチン組織化学的特徴の季節変化

ものより多くの複合糖質の糖鎖末端をキャッピングし21種類全てのレクチンが冬眠中の嗅上皮および鋤鼻ていることが示唆された. したがって, 冬眠中の主嗅上皮に対し繁殖期のものよりも弱く結合したが, シア

覚系および鋤鼻系は繁殖期のものよりもシアル酸の負ル酸除去後では, それらは冬眠中の感覚細胞を繁殖期の電荷によって匂い刺激の受容機能が低下し, さらにのものと同等の強度で結合した. したがって, 冬眠中

病原因子からの感染防御機能が亢進している可能性がの嗅上皮および鋤鼻上皮では, 感覚細胞や支持細胞にある.

おいて多量のシアル酸残基が複合糖質の糖鎖末端をキャッピングしていることが示唆される. 嗅覚系を含む神経

なお, 本研究の一部はKondoh et al. J Morphol,

系において, 糖鎖末端をキャッピングする多量のシア

271, 1197-1203 (2010) ならびにKondoh et al. Anat

ル酸は神経の可塑性を高め, 神経細胞の再生や分化を

Histol Embryol, 41, 41-53 (2012), Kondoh et al. J

調節し, 負の電荷によって神経細胞の興奮を抑制する

Vet Med Sci, (in press) に掲載および掲載予定さことが知られる [24]. したがって, 冬眠中の主嗅覚れていますので, 参照していただければ幸甚です.

系および鋤鼻系は繁殖期のものよりも高い感覚細胞の謝可塑性を有し, シアル酸の負の電荷によって匂い刺激

辞

本研究の遂行にあたり, 多大な御指導を賜りましたの受容機能が低下している可能性がある. また, 分泌タンパク質 (ムチンなど) に存在するシアル酸はいく

岩手大学

つかの病原因子によって細胞受容体として認識され,り感謝いたします. また, 本研究に供したシマヘビを

粘液層や分泌顆粒内の複合糖質に含まれる多量のシアご提供いただきました日本蛇族学術研究所― 14 ―

谷口和之教授ならびに山本欣郎教授に心よ故鳥羽通(olfactory epithelium, vomeronasal organ and

久博士に深く感謝いたします.

septal olfactory organ of Masera) in the rat,
引用文献

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