金属酸化物を電極材料としたバイオセンシング
2022年1月26日
第39回無機材料に関する最近の研究成果発表会＠オンライン開催（Zoom）

東京医科歯科大学生体材料工学研究所
バイオエレクトロニクス分野
田畑 美幸

マイクロpHセンサの作製
熱酸化法
Acetone x 215mm
Etanol x 2
3-5 mm Ultrapure water x 2

Wash withultrapure water
Li2CO3Cover byepoxy

Au
AuIrФ 0.3mm
Alumina crucible

ネルンスト式

Pure Ir wire𝑅𝑇𝑎𝑜𝑥
𝐸 = 𝐸𝑜 +𝑙𝑛𝑧𝐹
𝑎𝑟𝑒𝑑

E0: the standard electrode potential
R: the ideal gas constant
T: the temperature in Kelvinz: the number of moles of electrons
F: the Faraday constanta: the ion activity.

𝐸 = 𝐸0 − 59.2 log 𝐶

Ir/IrOx

1cm(at 25oC)

1マイクロpHセンサの特性評価
SEMによる表面観察
IrIrOx100 μm-400

Ir count (a.u.)-50 μm

熱酸化処理後、Irワイヤの表面粗さが大きく変化していた。
外層にて酸素含量の増加が認められた。

50Iridium

40300

30200

Oxygen

20100

10000400

y = -56.96x + 641.25
R² = 0.9998

300
200
100
2 3 4 5 6 7 8 9 10pH

Slope responsivity (mV/pH)

Potential(mV)

500

••

-50-52-54•-56-58-60
05101520

50

100

150

200

Distance (a.u.)

再利用評価

pH感度評価O count (a.u.)

50 μm25

SEM観察によりIrOx層の形成を確認
理論値に近い-57 mV/pHの傾き
pH感度に優れたセンサ
30回オートクレーブしても感度はほとんど変化しない
繰り返し使用に耐えうるセンサ

30

Number of autoclaving cycles2う蝕（虫歯）の成り立ちと進行①細菌による糖分取り込み、プラークの形成②代謝産物の有機酸を産生③唾液によるリフレッシュ
脱灰pH低下健康な歯進行性う蝕

再石灰化

非進行性う蝕

Sturdevant's Art & Science of Operative Dentistry 6th Edition, 2012, Elsevier

3

う蝕の診断歯科用探針

定量的な診断法がない
新たな定量診断法の開発

画像診断

視診・触診
ミラー

現状
視診及び歯科用探針による触診と画像診断の組み合わせ-

最も標準的な方法
歯科医師の経験や技術に左右される Calcium imaging device

CALCiVis HPより歯間や裏面の撮像が困難
初期う蝕の発見が困難
Laser imaging device

MORITA HPより

Ion-sensitive field effect transistor (ISFET)
K. Murakami et al., Dental Materials
Journal, 2006, 25(3), 423

イメージングとAIを組み合わせた診断法も開発が進められている。

歯科領域で一般的に用いられている歯科用探針に実装することを目的として、小型化・加工性に優れたIr/IrOxワイヤを用いてう蝕の簡便診断を行うマイクロpHセンサを作製する。
4抜去う蝕歯のpH測定
作用電極 : Ir/IrOx
参照電極 : Ag/AgCl
pH9pH4pH7
各10分

9647

生理食塩水
10分

2385pH710分

1,102分

9500
400
300
200
1000pH 4pH 98抜去う蝕歯測定pH 7 生理食塩水
1 23 4 5 6 7 8 9 10 安定性確認

20765キャリブレーション

0pH

Potential (mV)pHマッピングデータ取得のタイムコース

40Time (min)6080

40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Position

東京医科歯科大学歯学部倫理審査委員会（承認番号：725）

5pHを指標としたう蝕マッピング
進行性う蝕

非進行性う蝕
Caries-affected dentin

785432Caries

7564Caries
21,104012345678*

非進行性う蝕

*進行性う蝕pH

123456789 10Position

歯科医師の目視によるう蝕分類後、う蝕表層pH計測によるう蝕のpHマッピングを実施した結果、健康な歯根、非進行性う蝕、進行性う蝕はそれぞれ6.85、6.07、5.30のpH値を有していることがわかった。

健康な歯根

660

抜去う蝕歯18サンプルのpHマッピング解析5759 10Position

49351,108678

pH6pH897*8*p<0.05

pH計測に基づくう蝕の定量評価に成功

C. Ratanoporncharoen, Analytical Chemistry, 2018, 90(7), 4925

6プロトタイプの作製
ワイヤレスマイクロpHセンサ
Ir/IrOx pH sensor
16-bitADC
Reference electrode

RXTX

PC 1
Microcontroller
Wi-Fi module

Precision 187.5 μV

Wi-Fi
Router

PC 2PC 37

ワイヤレスpHセンサを用いたう蝕マッピング
pH感度評価Potential (mV)600

理論値に近い-57 mV/pHの傾き
エレクトロメータを用いた電極計測系と同程度の感度

-

500
400
300

200

E = -56.96*pH + 541.27
R² = 0.9997

100246pH

進行性う蝕のpHマッピング
7.5

1,87pH

6 73 4 526.56

ワイヤレス化しても高感度計測を維持pH感度に優れたセンサ• う蝕マッピングにおいても、ワイヤレスpHセンサ
で進行性う蝕の識別可能•

0810Caries「削らない治療」へ向けた歯科医師の診断をサポートするプラットフォームへ

5.550 1 2 3 4 5 6 7 8 9• Commercial high resistance meterPosition• Wireless pH sensor
8電気化学的な核酸検出
電気化学的なアプローチの利点
・ 装置全体の小型化
・ センサの集積化
・ 低コスト化
代表的な電気化学的核酸検出法
・ Differential pulse voltammetry (DPV)・ Square wave voltammetry (SWV)・ Chronocoulometry (CC)
トランジスタ型DNAシーケンサ

Ion Torrent/Life Technologies
Integration of transitors

Beads＋DNA probes

Detection of H+
Personal Genome Machine

J.M. Rothberg, et al, Nature, 475, 348-352 (2011)9プロトンを指標とした核酸定量検出
テンプレート合成鎖

3’5’

3’5’PAA

TC

CT

PAA

PGPC

GDNAポリメラーゼによる合成反応

CPC

PGCGPOH
AA

3’PC

OH
5’PdNTP

P－P－

P－

PPi－－

T

C

AA

H

OH+Detection
targetC

3’5’10等温核酸増幅法と電気化学計測
トランジスタ型DNAシーケンサの課題-

PCR：迅速な温度コントロールが必要
98oC：DNAの熱変性 55oC：アニーリング 72oC：ポリメラーゼによるプライマーの伸長反応-

熱サイクルによりトランジスタの温度特性が変化 → PCR中のノイズの低減が求められている。

リキッドバイオプシーに有用な増幅と計測を同一チップで行う小型・可搬型バイオセンサの開発

DNA isolation
New
combination
Ag/AgCl
Ir/IrOx

Amplification

Detection等温核酸増幅法

電気化学計測Primer-generation rolling circle
amplification (PG-RCA)

電位計測 (pH)・ 簡便な操作・ 正確な計測・ 等温反応 (30oC付近)
・ 指数関数的にな増幅

ラベルフリーで迅速にターゲット核酸を検出する

0.5 mm11

PG-RCA_pHセンサシステム
PG-RCA-pH sensorによる DNAの検出
直線的な
Linear rolling circle amplification

Target DNA

3’

Circular probe
ハイブリダイHybridization
site
ゼーション部位

Polymerase
phi29ポリメラーゼ

Polymerase
dNTP

多点でのMultiple hybridization
ハイブリダイゼーション

切断部位
Nickingsite

Pyrophosphoric acidProton

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’
制限酵素による切断(Primer generation)••complex
Primer-circular probe 複合体

サーマルサイクラー不要：小型化に有利指数関数的増幅

Circular DNA: 5’GTGGTTGTCTTCTCCTCAGCTCTATCGGATTTGTATCTCTCCTCAGCCTATCGGATTTGTATCTCTAAGCAGT-3’（73 nt）
Target DNA：5’-CAACCACACTGCTT-3’（14 nt）
Enzymes and reagents：phi29 DNA polymerase, Exonuclease I, ssDNA
ligase, dNTP mixture, Reaction buffer•

核酸増幅反応生成物であるプロトンの検出【Nernstの式】
𝐸 = 𝐸𝑜 +𝑅𝑇
𝑎𝑜𝑥𝑙𝑛𝑧𝐹
𝑎𝑟𝑒𝑑

E: 電極電位、E0: 標準電極電位、R: 気体定数、T: 温度、z: 移動電子数、F: ファラデー定数、a: 活量12PG-RCAリアルタイムモニタリング
PG-RCA-pH sensorによる DNAの検出
蛍光リアルタイムモニタリング

プロトンを指標としたリアルタイムモニタリング

電気泳動結果NC 10 100 1000 p M

Time (min)PG-RCA増幅産物確認•••

電極電位換算pH変化のtargetDNA濃度依存性を実証
液相反応、PG-RCA採用により反応効率向上を達成
Rate assayにより更なる高速化可能
Tabata M, et al. In preparation0

試料DNA濃度 [pM]
10100
1000

-0.01
-0.02
-0.03

反応時間：20分

-0.04
-0.05
-0.06

微細加工技術と組み合わせた
高集積化・高感度化

-0.07
-0.08
-0.09
-0.113

3WJ PG-RCA_pHセンサシステム
Three way junction PG-RCA-pH sensorによる miRNAの検出
酸化イリジウム薄膜マイクロpHセンサ

1.5 cm3 cm
T. Murakami, et al, Nacl. Acids Res., 40, 3 (2011)

NameSequence

Circular probe

5’-phosphateGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTG(Tm:93.1)

CTCAAGGTGTGTGAAT -3’
hsa-miR-16-5p

UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG

3WJ template (Tm:84.9)

TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCGTGGGCTGCTGCTATTTTT

3WJ primer (Tm:56.2)

CGCCAATATTTATTGATTATG

Red: template sequences for signal primer generation
Green & blue: hybridization sequences among microRNA, template, and primer
Solid underline: hybridization sequences between three-way junction probes
Bold character: recognition sequence of Nb.BsmI

pH感度：-58.6 mV/pH（理論値：-59.2 mV/pH ）【Nernstの式】
𝐸 = 𝐸𝑜 +𝑅𝑇
𝑎𝑜𝑥𝑙𝑛𝑧𝐹
𝑎𝑟𝑒𝑑

E: 電極電位、E0: 標準電極電位、R: 気体定数、
T: 温度、z: 移動電子数、F: ファラデー定数、a: 活量14

未来医療へ向けた核酸解析
Society5.0に対応した未来医療-集積化・小型化
センシング（例：ウェアラブルセンサ）

IoTAI
質の高い情報ロボット
機械学習
ビッグデータ解析

新興感染症
環境医学

診療形態の階層化・多様化への対応
病院

社会技術として開発

患者のそばで検査・治療
公共回線 / ｲﾝﾀｰﾈｯﾄ
microRNAＤＢ
医療情報システム
・高度治療
・精密検査
・難治疾患

Glu

中・小病院

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患者宅

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