2021 年度外部精度評価 結果報告書

特定非営利活動法人 日本病理精度保証機構〒150-0032 東京都渋谷区鶯谷町 7-3 トミーリージェンシー101

目 次

1.

2.

前期染色サーベイA) はじめにB) 前期サーベイの外部精度評価概要
C) 前期サーベイの結果と考察
D) 図譜（組織像）

P. 1 ～ P. 2
P. 3 ～ P. 7
P. 8 ～ P.15
P.16 ～ P.22

[参考資料 1] コア 4 についてのコメント（抜粋）P.23 ～ P.24

後期フォトサーベイ
A) 後期サーベイ設問
P.25 ～ P.28
B) 後期サーベイの回答結果内訳
P.29 ～ P.33
C) 後期サーベイの結果と考察
P.34 ～ P.54
[参考資料 2] アンケート「子宮頸部の生検診断における p16 免疫染色について」
P.55[参考資料 3] アンケート質問 2 についてのコメント（抜粋）
P.56
謝辞

3.

その他サーベイA) オプション･サーベイ等 （遺伝子パネル検査関連）①パラフィンブロックの DNA 品質チェック②腫瘍細胞含有割合の評価フォトサーベイ
謝辞B) プレサーベイ
Ki-67 染色プレサーベイ
謝辞

P.57

P.58 ～ P.64
P.65 ～ P.71
P.72
P.73 ～ P.83
P.84

2021 年度前期染色サーベイ（p16）A ) はじめに
特定非営利活動法人日本病理精度保証機構 ( Japan Pathology Quality Assuarance
System:JPQAS )は、病理診断の精度管理の向上を目指して 2014 年（平成 26 年）3 月に設立されました。
本機構の活動には正会員として日本病理学会、日本臨床衛生検査技師会、日本乳癌学会、日本胃癌学会、日本肺癌学会、日本リンパ網内系学会（令和 4 年 3 月現在、順不同）が団体として参画しており、活動が有効的かつ効率的に行えるよう体制を整えています。
「病理診断」は最終診断として大きな役割を果たしておりますが、診断の精度の確保は勿論のこと、病理診断のために供される病理組織標本の精度管理についても 1)正確度、 2)精密度、 3)再現性の三つの要素が保たれていなくてはなりません。
日本病理精度保証機構が行う外部精度評価調査は、前期調査におきましては、ご施設で通常行っている方法で染色を施して頂いた標本で評価・判定を行った結果と、同一の標本で当方の外部評価委員が同じ基準で評価・判定した際の一致率で比較する他、ご施設の染色標本の完成度をあらゆる側面から評価した上で、総合評価しています。また、後期調査では、WSI (whole slide imaging)装置によりデジタル病理画像とした症例を用いてフォトサーベイを行っています。
2014 年度より開始した外部精度評価活動におきましては、初年度は後期フォトサーベイのみでしたが、2015 年以降は前期の免疫染色サーベイと後期のフォトサーベイを組み合わせて実施してまいりました（表 1)。従来から比較的患者数の多い悪性腫瘍の組織を対象とし、その治療選択に重要な免疫染色抗体をサーベイ対象としてきました。
表１．今までのサーベイ一覧
回数年度

前期（免疫染色）後期（フォト）1

2014(H26)

実施なし

乳癌 ER, PgR, HER2

2

2015(H27)

GIST/c-kit

GIST, 胃癌 HER2

3

2016(H28)

リンパ腫/CD30

悪性リンパ腫42017(H29)

肺癌/TTF-1、p40、ALK

肺癌、他

5

2018(H30)

肺神経内分泌腫瘍/chromo,synapt

原発不明がん6

2019(H31/R1)

乳癌/ER, HER2

乳がん/ER, HER2

7

2020(R2)

中皮腫/calretinin, podoplanin

中皮腫、他

8

2021(R3)

子宮頸癌などの婦人科系腫瘍/p16

子宮頸癌などの婦人科系病変－1－

今回は子宮頸癌など婦人科領域の腫瘍を対象とし、免疫染色抗体としては p16 を対象としました。p16 (p16INK4a)は 16kDa の蛋白で、細胞周期において inhibitor of cyclin dependent
kinase (INK)として細胞周期を抑制する機能をもちます。同じく細胞周期を抑制する重要な蛋白として p53 や Rb がありますが、ハイリスク HPV 感染などのさまざまな理由で p53 や Rb が不活化すると、代償的に p16 の過剰発現が生じると理解されています。このような背景から、頭頸部や子宮頸部など HPV 関連腫瘍が発生する領域においては、p16 は HPV 感染の代替マーカー(surrogate marker)として広く免疫染色が行われるようになっています。
子宮頸部の病理診断において p16 免疫染色が最も有用であるのは、生検診断で良性病変と前癌病変の鑑別が問題となった場合です。扁平上皮では未熟化生、萎縮、反応性異型などの良性病変と HSIL/CIN2,3 の鑑別、腺上皮では反応性異型や化生と上皮内腺癌の鑑別が非常に困難なことがあります。HSIL/CIN2,3 や上皮内腺癌は通常 HPV 関連腫瘍であることから p16 陽性となりますが、良性病変は p16 陰性であり、鑑別に有用です。生検での病理診断が良性か前癌病変かによってその後の診療方針が異なりますので、p16 免疫染色が適切に行われ判定されることは大変重要です。
前期染色サーベイは、染色技術自体と、染色結果の判定に対するサーベイです。染色技術
自体をみるために、各施設に同一セットの未染色標本を配布し免疫染色を行ってもらいます
が、全施設に配布するだけの未染色標本を生検検体や円錐切除検体から作製することは非常に困難です。そのため浸潤癌の手術検体から標本を作製しました。一方、後期フォトサー
ベイは免疫染色の判定や病理診断に対するサーベイです。標本をバーチャルスライド化してウェブ上に掲載するため、小さな組織でも画像として共有することができます。そのため、後期フォトサーベイでは子宮頸部の生検標本について p16 の判定や病理診断を問うものとしま
した。また、子宮頸部生検診断における p16 免疫染色についてアンケート調査も行いました。
今回は前期、後期いずれのサーベイにも、回答のばらつきが予想される問題をいれました。サーベイの結果、それらの問題では実際に判定や病理診断の不一致が認められました。
判定のばらつきについては、判定というものをどう考えるか、その立場の違いが反映されたと考えられます。また、病理診断の不一致については、免疫染色というよりも HE 診断そのものの不一致であり、interobserver variation として受けとめる必要があります。
サーベイの性格上、各施設の回答を点数化していますが、上記のように正解・不正解では割り切れない問題もあるため、そのような問題での中央回答は作業仮説としてとらえていただければと思います。今回のサーベイが、子宮頸部における免疫染色や病理診断の問題を共有し、精度管理について考えるきっかけになることを願っております。

－2－B ) 前期サーベイの外部精度評価概要
令和 3 年度（2021 年度）精度管理調査を図 1 のように実施しました。参加施設数は 392 施設であり、前年度より 18 施設増となっています。
【参加募集】
当機構ホームページに案内を掲載するほか、前回調査参加施設および日本病理学会の認定・登録施設を中心に書面で案内を送付しました。
【調査方法】
１．試料発送と参加施設による染色（施設染色）と評価（施設判定）
当機構より 1 種類の TMA 組織標本、判定記入用紙および染色法及び p16 免疫染色についてのアンケートを参加希望施設に郵送し、JPQAS ホームページからもダウンロードできる
ようご案内しました。免疫染色は各施設で日常実施している方法を施行して頂いた後、抗体、コア毎に評価していただきました。この参加施設の自己評価は「施設判定」と位置付けました。染色標本および判定記入用紙およびアンケート用紙を当機構事務局に返送して頂きました。
２．主要企業による標本作製
アンケート結果から、参加施設の多くが国内販売 2 社（ロシュ/ベンタナ、ライカ）の抗 p16抗体を用いていることが判りました。この 2 社が販売する抗体はそれぞれ別のクローンを使用しています。一方、ニチレイやベクトン・ディキンソンなど他社の抗体を使用する施設は少ないですが、これらの会社の抗体は上記２社以外のさまざまなクローンを使用しています。今回はロシュ/ベンタナ、ライカ、ニチレイの３社が販売する抗体について、それぞれの企業に推奨
染色法による「企業染色標本」の作製を依頼し、これを標準対照標本として位置づけました。
３．機構による評価方法
当機構による評価は、日本病理学会の精度管理委員会委員等の見識ある病理医と、日本
臨床衛生検査技師会の精度管理や標準化に携わる認定病理検査技師によって構成される
外部精度評価委員会および評価判定小委員会が行いました。

－3－１） 染色評価
染色は陽性、陰性で評価しました。腫瘍細胞の核と細胞質が連続してびまん性に強く染色される場合を陽性と評価しました。全く染色されない場合や、染色される細胞が非連続的に分布して斑状や巣状の染色パターンを示す場合を陰性と評価しました。なお、
核と細胞質の染色強度が弱い場合も陰性と評価しました。
中央染色中央判定は実施責任者による染色標本ならびに企業染色標本を当機構が評価したものです。施設染色中央染色評価は、参加施設の標本の染色性を当機構が評価したもので、陽性検体、陰性検体ともに染色性が良好であれば 1 点、不良であれ
ば 0 点が付与されています。染色評価点数は表２．に示す通りです。
表２．染色評価点数
コア 1

コア 2

コア 3

コア 4

コア 5

陽性

陰性

陽性

陰性

陽性

中央染色中央判定
施設染色

良

不

良

不

良

不

良

不

良

不

中央染色評価

好

良

好

良

好

良

好

良

好

良

染色評価点数

1

0

1

0

1

0

1

0

1

0

２）判定評価施設染色施設判定とは参加施設が自施設の標本を評価したもので陽性、陰性、判定困
難の 3 種類に分かれます。施設染色中央判定は参加施設の標本を当機構が判定したもので、上記の染色評価基準で、陽性、陰性の 2 種類です。
評価点数は表３．に示す通りです。
表３．判定評価点数
施設染色中央判定

陽性

陰性

陽性

陰性

陽性

陰性

施設染色施設判定

陽性

陰性

陰性

陽性

判定困難

判定困難

判定評価点数

２

２

０

０

1

１

３）総合評価合計点数＝｜染色評価点数｜＋｜判定評価点数｜－4－

図１ 令和 3 年度 JPQAS 精度管理調査スケジュール表P16

図２ 各施設に配布した TMA 標本

1 5 はいずれも手術例（子宮頸癌もしくは子宮体癌）
はいずれも手術例（子宮頸癌もしくは子宮体癌
1-5【結果報告書】
提出頂きました標本及び施設解答についての評価・判定結果を結果報告書として、ご参加頂いた抗体毎に施設結果報告書をお送りいたします。報告書の見方については、後述いたします。また、それぞれの抗体毎の詳細な解説も後述しておりますのでご参考ください。

－5－

中央染色中央判定
実施責任者にて
染色標本ならびに企業染色
標本を当機構で評価した結果を記載。

施設染色中央染色評価
貴施設で染色を行った標本の染色性を
染色性を当機構が評価した結果を記載。

施設コメント
染色性に関して付記すべきコメントがあれば記載。

施設染色中央判定
貴施設で染色を行った標本を中央にて判定した結果を記載。

総合評価
貴施設の染色を基にした判定評価と染色評価の合計点で「総合評価」を出しております。
施設染色施設判定
貴施設にて染色を実施し、貴施設で判定した結果を記載。

－6－

正
適
許容範囲
不適正

： 13点～： 11点～12点： ～10点

施設回答
貴施設にて回答を頂いた内容を記載。
記述を入れている施設はあわせて記載しております。

中央回答
バーチャルスライドの画像から
中央にて想定している回答を記載。
記述内容など含め検討し、正解としている回答あり。

総合評価
点数

適
正
許容範囲
不適正

： 11点～： 9点～10点
： ～8点

－7－

施設回答と中央回答が一致した場合1点として計算

C ) 前期サーベイの結果と考察【結果】
1.

症例の選択と TMA の作製

婦人科領域の病理診断で p16 免疫染色を行うのは、子宮頸部の前癌病変と良性病変（未熟化生、反応性異型など）の鑑別に迷う場合を中心に、ほとんどが生検診断のときである。しかしながら、前期染色サーベイでは未染標本が 350 枚以上必要であるため、生検や円錐切除の検体を用いることは事実上不可能である。そのため浸潤癌の手術検体を用いた。5 例のうち 3 例は子宮頸癌（扁平上皮癌、胃型腺癌、通常型内頸部腺癌）、2 例は子宮体癌（類内膜癌、漿液性癌）である。子宮体癌を加えたのは、頸部進展の際、子宮頸癌との鑑別が問題になることがあるためである。浸潤癌における p16 の免疫染色パターンは大きく、①びまん性に全ての細胞が染まる ②染まる細胞と染まらない細胞が斑状・モザイク状に混在する ③
全く染まらない、の３つのパターンに分かれる。前期染色サーベイでは、これら 3 つのパターンを適切に染め分けられるか、それぞれの染色性が妥当かをみることを目的とした。そのため、それぞれの染色パターンを示す代表的な組織型を選択した。すなわち、①が扁平上皮癌、通常型内頸部腺癌、漿液性癌、②が類内膜癌、③が胃型腺癌である。
未染標本が 350 枚以上必要であるため、TMA(tissue microarray)は 2 個のブロックを作製した（P16-1XXX および P16-2XXX。 XXX は施設ごとに異なる番号）。すなわち、同一患者の同一ブロック内の近接した部位から 3mm 径の腫瘍組織を 2 個 punch out し、TMA を２セット作製した。TMA 作製と使用にあたっては学内の倫理審査を通した。

－8－

2.

参加施設の使用抗体

各施設に送付した p16 抗体の調査表を示す。
製造メーカー

製品名*1

品番

*2

（code、

精製抗体

cat.番号）

×(希釈倍数)

抗 p16INK4a□ ニチレイ

モノクローナル
抗体(JC8)(ヒスLot.番号

RTU*3 /

クローン名

□ RTU
JC8

718351□ 精製抗体×()

トステイナー用)□ RTU

抗 p16INK4a□ ニチレイ

モノクローナルJC8418351抗体(JC8)□ロシュ /CINtec p16

ベンタナ

Histology□ 精製抗体×(E6H4518109912/705-4713)□ RTU□ 精製抗体
×(

)

□ RTU
□ ライカ

p16

6H12

PA0016□ 精製抗体
×(

)

□ RTU

その他
□ (

□ 精製抗体
)

×(

－9－

)

3.

結果

1) コア別の染色評価について
コア別に施設染色の中央判定の内訳を円グラフで示す。中央染色中央判定と一致したもの
は 1 点（青色）、不一致のものは 0 点(ピンク色）である。
いずれのコアにおいても 95%以上の施設で中央染色と同様の染色結果を示しており、染色性は良好であった。
染色不良の内訳は大きく、①コア 2（胃型腺癌）で細胞膜に非特異的染色がみられる ②コ
アを問わず全体的に染色が弱い、の２つであった（図譜 p.21-22 参照）。
2) コア別の判定評価について
コア別に施設染色に対する施設判定と中央判定の一致・不一致の内訳を円グラフで示す。
施設判定と中央判定が一致したものは 2 点（青色）、不一致のものは 0 点（ピンク色）、施設判定が「判定困難」であった場合は 1 点（黄色）である。
コア 1,2,3,5 では 95%以上の施設で、施設判定と中央判定が一致していた。それに対して、コ
ア 4 では一致と不一致がほとんど拮抗し、「判定困難」の回答も約 1/4 を占めていた。

－ 10 －

3) 使用抗体の種類について
使用抗体の種類（クローン別）を円グラフで示す。

77.7%の施設がロシュの一次抗体(クローン: E6H4)を使用していた。それ以外ではライカの一次抗体(クローン: 6H12)が 6.6%の施設で使用され、その他、複数メーカーの一次抗体（クローン: G175-405, JC8, EPR1473 ほか）が用いられていた。全 12 種類の抗体のうち、11 種類がモノクローナル抗体であり、ポリクローナル抗体は１種類のみであった。
4) 抗体クローン別の染色結果について
抗体クローン/メーカー別に使用施設数、および合計点数（5 点満点）の内訳を示す。

－ 11 －

クローンにより合計点に差がみられた。クローンが E6H4, 6H12, JC8 の抗体を使用した施設の大部分が満点(5 点)であり、良好な染色性が得られていた。それに対して、クローンがG175-405, EPR1473 の抗体を使用した施設では合計点が 1-5 点とばらつきがみられた（それ以外のクローンについては使用施設数が少数のためグラフ参照）
5) 一次抗体濃度（RTU・自家希釈）と染色結果について一次抗体として RTU(ready to use)抗体をそのまま使用した施設と、濃縮抗体および RTU
抗体を自家希釈した施設の染色結果を円グラフで示す。

RTU 抗体をそのまま使用した施設では 97.7%が満点(5 点)であり、良好な染色性が得られていた。それに対して、自家希釈の抗体を使用した施設では約 30%が 1-4 点であり、染色結果にばらつきがみられた。

－ 12 －

6) 染色装置・試薬の一致性と染色結果について染色装置使用率を円グラフで、染色装置・試薬の一致性と染色評価を棒グラフで示す。
一致、不一致、用手法の分類は以下のとおりである。
［一致］・RTU 抗体をそのまま使用 ・全自動染色装置（賦活化から染色まで同一装置）
・全ての試薬と装置が同じメーカーで統一されている[不一致] ・精製抗体あるいは RTU を希釈している ・賦活化と染色装置が別・試薬と装置の組み合わせが部分的に同じか全て異なる[用手法]

・自動染色装置を使用しない（賦活化や試薬の組み合わせは問わない）

ロシュの自動免疫染色装置が最も多くの施設で使用され、次いでライカ、ニチレイであった。上記の分類において“一致”の施設ではほぼ 100%が満点(5 点)であり、良好な染色性が得られていた。それに対して、“不一致”や“用手法”の施設では約 20%が 1-4 点であり、染色結果にばらつきがみられた。

－ 13 －

4. 「判定評価」、「染色評価」および「総合評価」の合計点の分布・割合「判定評価」、「染色評価」の分布・割合「総合評価」の分布・割合－ 14 －

【考察】
染色性については 95%以上の施設で良好であった。染色不良（細胞膜に非特異的染色、染色性が弱い）と関連していたのは、大きく次の３つであった。
・ 抗体クローン（E6H4, 6H12, JC8、この３種類以外の抗体クローンで染色不良が多い）
・ 抗体の濃度（RTU ではなく自家希釈で染色不良が多い）
・ 染色装置・試薬（メーカーのプロトコールと完全一致していない場合に染色不良が多い）
良好な染色性が得られない場合には、この 3 点について考慮する必要がある。
判定については、施設間でほぼ一致したものと不一致のものがあった。腫瘍細胞がびまん性・連続性に染まるもの（コア 1,3,5）、全く染まらないもの（コア 2）では、判定はほとんど一致しており、問題はないと考えられた。それに対して、染まる細胞と染まらない細胞が混在して斑状・モザイク状の染色パターンを示すもの（コア 4）では陽性 40.7%、陰性 36.0%、判定困難
23.3%と判定が大きく分かれた。この結果は、判定というものを“染色性そのもの”とする立場と、染色性の“解釈”とする立場と、そのいずれかで迷う立場と、大きく 3 つに分かれたことを意味する。このコア 4 については、回答の根拠や実地での具体的な対応について、多くの施設からコメントが寄せられた（参考資料 1 p.23-24）。以上からは、婦人科領域においては、
p16 の判定というものに対するコンセンサスが必ずしも十分ではないことがうかがわれる。
婦人科領域以外では近年、頭頸部領域で p16 免疫染色が用いられているが、頭頸部癌では p16 陽性判定基準を「70%以上の腫瘍細胞の核がびまん性に強陽性像を示す」としている（頭頸部癌取扱い規約 第 6 版、2018、p.85）。婦人科領域の場合、判定基準は明示されていないものの、「びまん性に強陽性である場合にのみ陽性であると解釈する」と記載されている(子宮頸癌取扱い規約 第 4 版、2017、p.55、表 2)。WHO 分類(2020)においても、strong anddiffuse, block-positive, block-type (or every cell) staining などの染色性が“positive”、一方でpatchy, mosaic などの染色性が“negative”と記載されている。頭頸部癌の場合は、p16 免疫染色の対象となる病変がほとんど扁平上皮癌であり、目的が HPV 陽性、陰性の判定に特化している。それに対して婦人科領域の場合は、対照となる病変が多彩であり、p16 過剰発現の原因も必ずしも HPV だけではないこと、また p16 免疫染色の主たる目的が生検診断における良性病変と前癌病変の鑑別であること、など頭頸部とは事情が大きく異なることを理解した上で、判定というものに対するコンセンサスを形成していくことが望まれる。

－ 15 －

－ 16 －④①

1) TMAを構成するコアの組織像

D) ［図譜］⑤②＊①②③は子宮頸癌、④⑤は子宮体癌。
いずれも手術例。

①扁平上皮癌②胃型腺癌③通常型内頸部腺癌
④類内膜癌
⑤漿液性癌

③

－ 17 －

ライカ

ロシュ/
ベンタナ

ニチレイ

コア①

2) p16企業染色 全コア
コア②

コア③

コア④

コア⑤

－ 18 －

ロシュ/ベンタナ

いずれも腫瘍細胞の核と細胞質にびまん性に強く染まり、陽性と評価される

ニチレイ

3) p16企業染色 コア①強拡大

ライカ

－ 19 －

5

ロシュ/ベンタナ

いずれも腫瘍細胞の核と細胞質にびまん性に強く染まり、陽性と評価される。
なお、腫瘍細胞に入り込んでいる炎症細胞は染まらず、虫食い状にみえる。

ニチレイ4) p16企業染色 コア③強拡大

ライカ

－ 20 －

5

ロシュ/ベンタナ

ライカ

いずれにおいても染まる細胞と染まらない細胞が混在して斑状、モザイク状にみえ、陰性と評価される。染まっていても細胞質だけで、核が染まらないものも多い。

ニチレイ5) p16企業染色 コア④強拡大

－ 21 －

コア②強拡大いずれにおいても腫瘍細胞の膜に非特異的な染色がみられる（左から２つはa社、右はb社の抗体で染色）。

6) p16施設染色 ー非特異的染色がみられた施設例ー－ 22 －

コア①強拡大いずれにおいても核および細胞質の染色性が弱い（左から順にx社、y社、z社の抗体で染色）。

７) p16施設染色 ー染色性が弱かった施設例ー[参考資料 1]
コア 4 についてのコメント（抜粋）「陰性」と判定した施設のコメント
・ブロック陽性でない・びまん性に強陽性ではないため、HPV 関連とは言えず陰性と判定した・斑状かつ弱陽性を示したため。当院ではびまん性かつ強陽性を示した場合、陽性と判定しています。
・主に HPV 関連の腫瘍でのびまん性陽性像＝陽性として判断しています。通常は陽性/陰性での判定はしておらず、コメントをつけています。
・「一部陽性」。しかし HPV 関連かを確認する意味では「陰性」。
・HPV 関連を示唆する染まりではないので陰性と判定した
・類内膜腺癌と考え陰性とした
・通常、一部陽性と判定して、過剰発現はないと判断している
・染色自体は陽性ですが HPV を目的とした染色ならば陽性部分が 70%以下なので陰性と判定しました「判定困難」とした施設のコメント
・びまん性に染まっていない・びまん性強陽性ではないため、実際診断するときは「斑状に陽性細胞が見られるがびまん性強陽性ではない」と記載します。
・不規則かつ部分的に染まっており、HPV とは関連のない aberrant expression の可能性がある
・斑状の染まり、HE 所見、部位など総合的に考えて評価する。所見に「軽度斑状に染まっているが、染まっていない所も多い」などと正直に書く。
・通常は、染色結果を見たまま「斑状に陽性/部分的に陽性」と判定し、腫瘍としての評価/解釈はそれぞれにコメントする形をとっています。今回は「判定困難」としましたが。
・染色結果としては「一部陽性」と記載しますが、HPV 関連かどうかの判定としては「陰性」として取り扱っています。
・判定が陽性２名、陰性２名、判定困難１名と割れた。判定基準や癌腫が不明なので、染色されているかで判定をした。
・子宮膣部の腺癌であれば陰性と判断します。他の部位の腺癌であればモザイク状に染色されているとしています。

－ 23 －

「陽性」と判定した施設のコメント
・陽性（一部）・斑状に染まる④はあえて陽性・陰性に分ける必要があるのでしょうか？
・内部から主語がはっきりしないと言われ（HPV 判定、腫瘍細胞の判定なのかなど）事務局に問い合わせました →「HPV 感染によるものも含めまして、腫瘍における p16 過剰発現が陽性か陰性かの判定をお願いします」と事務局を通して回答
・block-positive とは判定できない「陽性」と表現するか「判定困難」と表現するかで意見が分かれました
・斑状の染色が HPV 感染を意味するとは考えないが、陽性であること自体はまちがいないと考える
・検体は類内膜癌であり斑状に染まるのが特徴です。斑状ではありますが染まった部分があるので陽性としました。

－ 24 －

2021 年度後期フォトサーベイ（婦人科系病変）
A） 後期サーベイ設問【 問 1 フォルダ名：問 1 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.未熟化生
2.LSIL/CIN1
3.HSIL/CIN2
4.HSIL/CIN3
5.その他（※）※上記①で「判定困難」と回答した方はその理由を、②で「その他」を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。
【 問 2 フォルダ名：問 2 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.未熟化生
2.LSIL/CIN1
3.HSIL/CIN2
4.HSIL/CIN3
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

－ 25 －

【 問 3 フォルダ名：問 3 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.反応性異型/再生異型
2.LSIL/CIN1
3.HSIL/CIN2
4.HSIL/CIN3
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

【 問 4 フォルダ名：問 4 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.萎縮
2.LSIL/CIN1
3.HSIL/CIN2-3
4.微小浸潤扁平上皮癌
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

－ 26 －

【 問 5 フォルダ名：問 5 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.未熟化生
2.LSIL/CIN1
3.HSIL/CIN2
4.HSIL/CIN3
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

【 問 6 フォルダ名：問 6 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.反応性腺異型
2.上皮内腺癌
3.HSIL/CIN34.上皮内腺癌 ＋ HSIL/CIN3
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

－ 27 －

【 問 7 フォルダ名：問 7 】
材料： 子宮頸部生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.反応性腺異型
2.子宮内膜症
3.上皮内腺癌
4.通常型内頸部腺癌
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

【 問 8 フォルダ名：問 8 】
材料： 外陰生検①p16 の判定について陽性、陰性、判定困難(※)のいずれかを回答用紙にて選択ください。
②最も適切な病理診断名を回答用紙にて選択ください。
回答選択肢
1.尖圭コンジローマ
2.脂漏性角化症
3.外陰上皮内腫瘍(VIN)
4.扁平上皮癌
5.その他（※）※上記①で判定困難と回答した方はその理由を、②でその他を選んだ方は病理診断名を、回答用紙に記載してください。

－ 28 －

B) 後期サーベイの回答結果内訳
総施設数 392 施設 （回答 388 施設、未回答 4 施設）＊中央回答を赤字としております。

問1
① 判定

正答率：63.8%
施設回答数(%)

陽性

110 (28.1%)

陰性

250 (63.8%)

判定困難

28 (7.1%)② 最も適切な診断名

正答率：63.3%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.未熟化生120 (30.6%)

2. LSIL/CIN1

248 (63.3%)

3. HSIL/CIN2

4 (1.0%)4. HSIL/CIN3

0 (0%)

5. その他

16 (4.1%)

5.その他 の内訳：
慢性頸管炎,
異型未熟化生, 反応性異型

問2
③ 判定

正答率：97.2%
施設回答数(%)

陽性

381 (97.2%)

陰性

6 (1.5%)

判定困難

1 (0.3%)④ 最も適切な診断名

正答率：36.5%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.未熟化生0 (0%)

2. LSIL/CIN1

245 (62.5%)

3. HSIL/CIN2

143 (36.5%)

4. HSIL/CIN3

0 (0%)

5. その他

0 (0%)－ 29 －

問3① 判定

正答率：96.7%
施設回答数(%)

陽性

5 (1.3%)

陰性379 (96.7%)

判定困難

4 (1.0%)②最も適切な診断名

正答率：89.5%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.反応性異型/再生異型

326 (83.2%)

2. LSIL/CIN1

8 (2.0%)3. HSIL/CIN2

13 (3.3%)

4. HSIL/CIN3

13 (3.3%)

5. その他

28 (7.1%)

5.その他 の内訳：
未熟化生, 萎縮
［いずれも正解としました］

問4
① 判定

正答率：97.2%
施設回答数(%)

陽性

381 (97.2%)

陰性

6 (1.5%)

判定困難

1 (0.3%)②最も適切な診断名

正答率：53.8%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.萎縮

2 (0.5%)

2. LSIL/CIN1

120 (30.6%)

3. HSIL/CIN2-3

206 (52.6%)

4. 微小浸潤扁平上皮癌

54 (13.8%)

5. その他

6 (1.5%)

5.その他 の内訳：
HSIL 以上の病変、微小浸潤も否定できないため深切り etc.
［正解としました］－ 30 －

問5① 判定

正答率：98.7%
施設回答数(%)

陽性

387 (98.7%)

陰性

1 (0.3%)

判定困難

0 (0%)②最も適切な診断名

正答率：94.1%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.未熟化生0 (0%)

2. LSIL/CIN1

0 (0%)

3. HSIL/CIN2

19 (4.8%)

4. HSIL/CIN3

369 (94.1%)

5. その他

0 (0%)

問6① 判定

正答率：95.4%
施設回答数(%)

陽性

374 (95.4%)

陰性

9 (2.3%)

判定困難

5 (1.3%)主体は上皮内腺癌で、HSIL/CIN3 は小範囲であることから、2 も正解と②最も適切な診断名しました。

正答率：92.6%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.反応性腺異型

6 (1.5%)2. 上皮内腺癌

68 (17.3%)

3. HSIL/CIN3

15 (3.8%)

4. 上皮内腺癌 + HSIL/CIN3

285 (72.7%)

5. その他

14 (3.6%)

5.その他 の内訳：
SMILE(=上皮内腺癌のバリエーション）［正解としました］－ 31 －

問7① 判定

正答率：73.0%
施設回答数(%)

陽性65 (16.6%)

陰性286 (73.0%)

子宮内膜症の腺上皮に核腫大を判定困難

37 (9.4%)伴っていることから、1 も正解としました。

②最も適切な診断名

正答率：77.5%

回答選択肢

施設回答数(%)

1. 反応性腺異型

163 (41.6%)

2. 子宮内膜症

132 (33.7%)

3. 上皮内腺癌

55 (14.0%)

4. 通常型内頸部腺癌

19 (4.8%)

5. その他

19 (4.8%)

5.その他 の内訳：
線毛上皮化生, 卵管上皮化生,
卵管類内膜化生［いずれも正解としました］

問8
① 判定

正答率：94.6%
施設回答数(%)

陽性

13 (3.3%)

陰性371 (94.6%)

判定困難

4 (1.0%)② 最も適切な診断名

正答率：94.9%

回答選択肢

施設回答数(%)

1.尖圭コンジローマ

1 (0.3%)2. 脂漏性角化症

12 (3.1%)

3. 外陰上皮内腫瘍(VIN)

2 (0.5%)4. 扁平上皮癌

372 (94.9%)

5. その他

1 (0.3%)

5.その他 の内訳：
Florid squamous metaplasia－ 32 －

問 1～問 8 の回答結果内訳グラフ① 判定②

最も適切な診断名－ 33 －C) 後期サーベイの結果と考察
①判定

評価点分布

②最も適切な診断名

評価点分布－ 34 －

「総合評価」

評価点分布「総合評価」

評価点割合※392 施設 （未回答 4 施設）－ 35 －

【問 1】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 未熟化生 b. LSIL/CIN1 c. HSIL/CIN2 d. HSIL/CIN3 e. その他－ 36 －

解答: 1) 陰性
2) b. LSIL/CIN1
解説
p16 免疫染色では巣状の染色にとどまり、陰性と判定される。
HE 染色では一部に幼弱な化生領域を伴う重層扁平上皮の表層および中層側に、核の腫大と大小不同、核形不整、核周囲明庭（halo）を伴うコイロサイトーシスがみられる。２核にみえる細胞もある。基底側での核腫大は軽度である。
以上より、b. LSIL/CIN1 が最も考えられる。

－ 37 －

【問 2】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 未熟化生 b. LSIL/CIN1 c. HSIL/CIN2 d. HSIL/CIN3 e. その他

B
A
C

A

－ 38 －

解答: 1) 陽性
2) c. HSIL/CIN2
解説
p16 免疫染色では基底層および傍基底層を含む細胞の核と細胞質が連続してびまん性に強陽性 (block-positive)となり、陽性と判定される。
HE 染色では表層側にコイロサイトーシスがみられる。また一部では中層を越えて核の腫大や不整、核クロマチンの増量、核の極性・配列の乱れがみられる。核異型は表層側のコイロ
サイトーシスよりも基底側で目立つ。核分裂像も増加し、表層側にも分布している。以上は、一部（C）にみられる LSIL/ CIN1 とは異なる。以上より最高病変は c. HSIL/CIN2 が考えられるが、やや tangential section であり、LSIL/CIN1 との鑑別に迷う症例である。

BC－ 39 －

【問 3】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 反応性異型/再生異型 b. LSIL/CIN1 c. HSIL/CIN2 d. HSIL/CIN3
e. その他－ 40 －

解答: 1) 陰性
2) a. 反応性異型/再生異型
解説
p16 免疫染色ではごく一部の弱い染色にとどまり、陰性と判断される。
HE 染色では全体をとおして重層扁平上皮が薄く、その全層にわたり核の腫大や不整、核クロマチンの増量、核の極性・配列の乱れが目立つ。HE 染色だけでは良性の異型か菲薄型
HSIL か、鑑別が難しい。
p16 免疫染色と合わせ、a. 反応性異型/再生異型が最も考えられる。

－ 41 －

【問 4】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 萎縮 b. LSIL/CIN1 c. HSIL/CIN2-3 d. 微小浸潤扁平上皮癌
e. その他－ 42 －

解答: 1) 陽性
2) c. HSIL/CIN2-3
解説
p16 免疫染色では基底層および傍基底層を含む細胞の核と細胞質が連続してびまん性に強陽性 (block-positive)となり、陽性と判定される。
HE 染色では全体をとおして重層扁平上皮が薄く、表層側にはコイロサイトーシスや過角化を伴うが、菲薄上皮の表層付近まで核の腫大やクロマチン増量、配列の乱れ、核分裂像がみられるところや頸管腺進展を伴うところもある。
以上より、c. HSIL/CIN2-3 が最も考えられる。

－ 43 －

【問 5】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 未熟化生 b. LSIL/CIN1 c. HSIL/CIN2 d. HSIL/CIN3 e. その他－ 44 －

解答: 1) 陽性
2) d. HSIL/CIN3
解説
p16 免疫染色では重層扁平上皮が全層性にびまん性に強陽性 (block-positive)となり、陽性と判定される。
HE 染色では N/C 比の高い異型細胞が重層扁平上皮のほぼ全層性に増殖している。
以上より、d. HSLL/CIN3 が考えられる。

－ 45 －

【問 6】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 反応性腺異型 b. 上皮内腺癌 c. HSIL/CIN3d. 上皮内腺癌 + HSIL/CIN3 e. その他

C
A
D
B

A

B

－ 46 －

解答: 1) 陽性
2) d. 上皮内腺癌 + HSIL/CIN3
解説
p16 免疫染色では腺上皮もしくは重層性上皮がフロントを形成してびまん性に強陽性(block-positive)となり、陽性と判定される。
HE 染色では、細胞質粘液に乏しく核クロマチン増量や核重積を示す異型腺細胞が正常頸管腺上皮とフロントを形成して認められ、上皮内腺癌の所見である。上皮内腺癌は通常型(A)の像に加えて、杯細胞に似た細胞からなる腸型(B)や、重層性粘液産生上皮内病変(SMILE)
相当の領域(C)もある。部分的に HSIL/CIN3(D)もみられる。
以上より、d. 上皮内腺癌+HSIL/CIN3 が最も考えられる。

CD－ 47 －

【問 7】
材料：子宮頸部生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 反応性腺異型 b. 子宮内膜症 c. 上皮内腺癌
d. 通常型内頸部腺癌 e. その他－ 48 －

解答: 1) 陰性
2) b. 子宮内膜症
解説
p16 免疫染色では一部の腺上皮の巣状、斑状の染色にとどまり、陰性と判断される。
HE 染色では、重層扁平上皮下に屈曲や蛇行を示す腺管が小集合性に認められる。間質は浮腫状である。腺上皮は高円柱状で核下空胞を伴う。一部の腺上皮には線毛がみられ、卵管上皮に似た像を示している（p16 免疫染色は主にこのような部分に染まる）。反応性と考えられる軽度の核腫大もみられる。
以上より、選択肢の中からは b. 子宮内膜症が最も考えられる。

－ 49 －

【問 8】
材料：外陰生検1) p16 の判定

陽性、陰性、判定困難

2) 病理診断名

a. 尖圭コンジローマ b. 脂漏性角化症 c. 外陰上皮内腫瘍(VIN)d. 扁平上皮癌 e. その他－ 50 －

解答: 1) 陰性
2) d. 扁平上皮癌
解説
p16 免疫染色ではごく一部の弱い染色性にとどまり、陰性と判断される。
HE 染色では、異型扁平上皮の大小の胞巣が、角化を伴いながら浸潤性に増殖している。
不規則な索状・小胞巣状に浸潤性増殖を示すところもある。
以上より、扁平上皮癌が最も考えられる（外陰の扁平上皮癌は 25%以上が HPV 非依存性であり、p16 免疫染色も陰性となることに注意）。

－ 51 －

［考察］1) p16 の判定について
8 問は染色性の点で大きく２群 (A,B) に分けられるが、それぞれで回答の傾向が異なっていた。
A. 染色性（染まる、染まらない）がはっきりした問題
問 2、問 4、問 5、問 6 では病変が連続性、びまん性に強く染色され、陽性の回答がいずれも 95%以上であった。一方、問 3、問 8 はほとんど染色されないもので、いずれも陰性の回答
が 95%前後であった。これらについては判定がほぼ一致していた。
B. 一部にのみ染色される問題
問 1 と問 7 がこれに該当する。いずれも巣状、斑状の染色性にとどまり、判定としては陰性と解釈されるものである。問 1 では 63.8%、問 7 では 73%の施設が陰性と回答していたが、それ以外は陽性ないし判定困難と回答しており、判定が分かれていた。この結果の解釈に当たってはアンケート（「子宮頸部の生検診断における p16 免疫染色について」）の結果が参考になる。質問 2「通常、判定はどうしていますか」に対して「陽性、陰性」が 150 施設であったが、「陽性、一部陽性、陰性」も 182 施設あり、回答が分かれていた(参考資料 2, p.55)。このことは、判定に関しての立場の違いがあることを示唆している。すなわち、判定を染色性の“解釈”とする立場と、 “染色性そのもの”とする立場の違いである。アンケート質問 2 についてのコメント(参考資料 3 p.56)、および前期染色サーベイのコア 4 についてのコメント(参考資料 1,
p.23-24)にもあるように、染色性そのものを記載し、その解釈については別個に記載している、という施設が少なくないと考えられる。扁平上皮内病変(SIL)における p16 判定に関して
は、子宮頸癌取扱い規約 4 版に「基底層および傍基底層を含む細胞の細胞質と核が連続してびまん性に強陽性(block-positive)である場合にのみ、陽性であると解釈する」(p.28)と記載がある。しかしながら、アンケート結果（質問 3、4、参考資料 2, p.55）からも分かるように、生検のような小検体でアーチファクトも加わっている場合には、陽性か陰性かの解釈が困難なケースがあることも事実である。判定のばらつきは、以上のような事情を反映していると考えられる。

－ 52 －

2) 病理診断について
8 問は次のような 4 タイプ (a-d) に分けられるが、それぞれで回答の傾向が異なっていた。
a. HE 染色、p16 免疫染色の両方が典型的な問題
問 5、問 6 が該当し、いずれも 90%以上の正答率であった。問５は HSIL/CIN3、問６は上皮内腺癌についての問題であった（問 6 は上皮内腺癌の主診断がなされていれば、亜型での回答も含め全て正解とした）。
b. HE 染色で迷うが、p16 免疫染色が鑑別に有用な問題
問 3 は菲薄型 HSIL か反応性異型/再生異型か、HE 染色だけでの鑑別が難しく、p16 免疫染色が補助となる症例である。正答率はほぼ 90%と良好であった（未熟化生など、良性を意味する回答は全て正解とした）。子宮頸癌取扱い規約第 4 版において p16 免疫染色は HSILと未熟化生、萎縮、反応性異型などとの判別に有用と記載されている (p.28)。アンケートの質
問 1 「子宮頸部の生検診断で p16 免疫染色を行うことがありますか。」に対して、「必要に応じて行う」と回答した施設が 378 施設中 315 施設 (83%)あり(参考資料 2, p.55)、婦人科領域でも p16 免疫染色が普及していることがうかがえる。なお、「全例/ほぼ全例で行う」と回答した
施設も 378 施設中 25 施設 (6.6%)あったが、p16 免疫染色の過度の適用 (overapplication)
は、逆に望ましくないとされている。2012 年の米国病理学会(CAP)および米国コルポスコピ
ー・頸部病理学会(ASCCP)による LAST ガイドラインでは、HE で明瞭な HSIL/CIN3 およびLSIL に対しては p16 免疫染色を行うべきでなく、子宮頸部生検における p16 免疫染色の適用は 20～40%にとどめるべきとしており、このことは 2020 年発刊の WHO 分類第 5 版(p.345)にも記載されている。病理診断の基本は HE 染色であり、必要に応じて p16 免疫染色を適切に用いていくことが大切である。
p16 免疫染色は子宮頸部の腺系病変においても、良性と悪性/前癌病変の鑑別に有用である。そのような例として問 7（子宮内膜症）を出題した（卵管類内膜化生、卵管化生、反応性
腺異型など、良性を意味する回答は全て正解とした）。正答率は 77%と、問 3 に比べてやや低かったが、これについては一部の施設で p16 免疫染色の判定を陽性としたことが影響したものと考えられる。
c. HE 染色は典型的だが、p16 免疫染色に要注意の問題
問 8 で外陰の扁平上皮癌を出題した。HE 染色では典型的な扁平上皮癌であるが、p16 免
疫染色は陰性である。正答率は約 95%と良好であった。外陰の扁平上皮癌は子宮頸部とは異なり、HPV 非依存性のものが約 25%（報告によっては 50%以上）を占め、これらは p16 陰性となることに注意が必要である。病理診断の基本は HE 染色であり、HE 標本をきちんと観察することが大切である。

－ 53 －

d. 病理診断のばらつき (interobserver variation) に関する問題
問 1、問 2、問 4 が該当する。この病理診断のばらつきは、p16 の判定とは別に、HE 診断そのもののばらつきを示しているものと考えられた。なぜなら p16 判定については、問 1 は正答率 63.8%とやや低かったものの、問 2、問 4 はいずれも 97%と良好であったからである。この病
理診断のばらつきは出題時にある程度予想されたが、その程度を上回っていたものもあった。
問 1 は LSIL/CIN1 の症例であり、正答率は 63.3%であった。約 30%は未熟化生の回答であった。このばらつきは、コイロサイトーシスの所見をとるかとらないかで生じたものと考えられる。問 2 は LSIL/CIN1 が 62.5%を占めており、HSIL/CIN2（中央回答）の 36.5%より多かった。
CIN1 か CIN2 かの鑑別については従来、観察者間不一致(interobserver variation)が指摘されており、本結果もそれを反映しているものと考えられる。問 4 は菲薄型 HSIL/CIN2-3 で、正答率は 53.8%であった。その他の回答は LSIL/CIN1 が 30.6%、微小浸潤扁平上皮癌が13.8%と、予想外のばらつきを示していた。菲薄上皮のため異型が必ずしも目立たず過小診断になった、一方で間質の浮腫やアーチファクト、上皮索の不規則延長のため微小浸潤を考えた、その両方があると考えられる。実際の診断業務であればその後の診療方針が大きく異なってくるため、注意が必要な症例である。

－ 54 －

【参考資料 2】
アンケート 「子宮頸部の生検診断における p16 免疫染色について」
回答結果内訳【質問１】

子宮頸部の生検診断で p16 免疫染色を行うことがありますか。 （回答 378 施設）
施設回答数(%)
ない/ほとんどない
31 (8.2%)
必要に応じて行う
315 (83.3%)
全例/ほぼ全例で行う
25 (6.6%)
その他
7 (1.9%)【質問 2】

通常、判定はどうしていますか。

陽性、陰性
陽性、一部陽性、陰性
陽性、弱陽性、陰性その他（回答 374 施設）

施設回答数
150
182
32
22
＊複数回答の施設あり【質問 3】

判定に迷うことはありますか。

ない/ほとんどない
ときにある
しばしばある【質問 4】（回答 365 施設）

施設回答数(%)
120 (32.9%)234 (64.1%)
11 (3.0%)

判定に迷う場合、どういう点で迷いますか（複数回答可）。

染色が弱い
染色が斑状、部分的小検体のため、染色されても小範囲
その他

施設回答数
132
231
158
26

＊複数回答の施設あり－ 55 －（回答 330 施設）

【参考資料 3】
アンケート質問 2 についてのコメント（抜粋）・Block Positive or Negative
・Block Positive 以外は陰性と判定
・陽性・陰性+コメント
・ブロック陽性像の有無で判定をしています。染色される細胞がみられても、ブロック陽性でなければ、陰性/ブロック陽性像なしと判定します。
・腫瘍細胞全てが核胞体に陽性の時のみ陽性としている。一部陽性の場合は記載にとどめています。
・染色強度、割合を含めたコメントでの評価を行っている。びまん性強陽性像の症例は陽性（＝腫瘍）、斑な陽性像の症例は陰性（=反応）と判断しています。
・斑状陽性の場合はその旨記入して陰性としている
・diffuse に陽性、focal に陽性、陰性。IHC の判定としては以上ですが、有意な所見としているのは diffuse positive です。
・一部陽性（斑状）は陰性と解釈していますが、子宮内膜癌では一部陽性となることもあり、所見としては一部陽性を使用しています。
・子宮頸部ではブロック状 or びまん性に陽性、モザイク状に陽性、陰性（中咽頭は陰性、陽性）・ブロック陽性像があるか否かを記載。（陰性-弱陽性-一部陽性-陽性（ブロック陽性））・陽性割合 10%未満を「一部陽性」としている・あきらかな陽性・陰性以外は所見をかく。
・びまん性陽性、斑状に弱陽性とあるがまま記載はしていますが、基底部に染色されていな
い場合は、非特異的反応と考えております。
・陽性、陰性、染色強度、染色態度を全て記載
・必要に応じて表現は変更する：陽性、陰性、HPV 感染パターン、陰性/斑に染まる、陰性/一部細胞の胞体に染まる・コメントとして HPV 関連と判断する/しないを付記
・判定しておらず診断の参考所見としている
・HE 標本にて診断困難症例の場合に詳細を記載する－ 56 －

謝辞
今回の 2021 年度外部精度評価にご協力頂きました企業、団体の関係者の皆様に深謝申し上げます。（順不同）・アジレント・テクノロジー株式会社
・サクラファインテックジャパン株式会社
・ニチレイバイオサイエンス株式会社
・浜松ホトニクス株式会社
・ライカマイクロシステムズ株式会社
・ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社
・一般社団法人 日本病理学会
・一般社団法人 日本臨床衛生検査技師会
・国立大学法人 弘前大学
・学校法人 日本大学
企画・実施責任者
・弘前大学医学部附属病院病理部

加藤 哲子

協力者
・弘前大学医学部附属病院病理部

熊谷 直哉

資料作成者
特定非営利活動法人 日本病理精度保証機構 外部精度評価委員会
お問い合わせ先〒150-0032
東京都渋谷区鶯谷町 7-3-101
特定非営利活動法人 日本病理精度保証機構
TEL:03-3496-6950 FAX:03-3496-2150
E-mail：info@jpqas.jp－ 57 －

オプションサーベイ （遺伝子パネル検査関連）
パラフィンブロックの DNA 品質チェック【はじめに】
近年、保険診療下においてホルマリン固定パラフィンブロック（FFPE）ブロックから抽出した核酸を次世代シークエンサー（NGS）にて解析する検査が増加し、FFPE ブロックの品質がますます重要となってきています。その重要性に鑑み、当機構では、診療用に作製された FFPE ブロックから
DNA を抽出し、その品質を確認するサーベイを今年度初めて行いました。

【サーベイの概要】
1. 参加施設の募集方法
当機構ホームページに案内を掲載するほか、前回調査参加施設および日本病理学会の認定・登録施設を中心に書面で案内を送付した。
2. サーベイのスケジュール
本サーベイは以下のスケジュールで行った。
2021 年 7 月～8 月上旬

手順書作成、資材準備、発送

2021 年 8 月 6 日～9 月 17 日

核酸品質確認サーベイ実施

2021 年 8 月中旬～10 月下旬

核酸抽出・測定

2022 年 12 月上旬～2 月下旬

結果の解析・報告書作成

2022 年 3 月上旬

評価結果報告書発送

3. 調査方法
3.1 送付物
当機構より各参加施設へ手順書、マイクロチューブ（2.0 mL スクリューキャップマイクロチューブ
および 1.5 mL マイクロチューブを各 1 本）、チャック付きポリ袋、調査回答用紙を送付した。
3.2 検体準備
各参加施設における検体準備は、手順書に従い行われた。症例選択基準は以下の通り。
① 対象検体：肺癌、なければ乳癌、どちらもなければ大腸癌（上記いずれもなければ他癌）② FFPE ブロック作製日時：2018 年 10 月から 2019 年 1 月の間に手術され、FFPE ブロックが作製された手術材料（FFPE ブロック作製後、2 年半から 3 年以内の FFPE ブロックが対象）③ 大きさ：腫瘍部を 10 mm×10 mm 以上含むもの
対象 FFPE ブロック選定後、厚さ 10 µm でロール状に連続切片で 4 枚薄切し、2 種類のチュー
ブに、パラフィンロールをそれぞれ 2 枚ずつ入れ、チューブの蓋が開かないように、パラフィルム等－ 58 －

でとめ、検体を入れた 2 本のチューブを、チャック付きポリ袋に入れ、薄切後 1 週間内に各参加施設から当機構事務局へ提出された。
3.3 核酸抽出・測定当機構事務局にて受領確認が完了した検体は、1 週間ごとに北海道大学病院 先端診断技術
開発センターへ送付され、到着確認後、随時 DNA 抽出を行った。DNA 抽出は自動核酸抽出装置（QIAsymphoney、キアゲン社）を用い、その後、吸光度法（Nanodrop）、蛍光法（Qubit）にて濃度測定を行った。次に、TapeStation システム（TapeStation 4200、アジレント社)を用いて DNA Integrity
Number (DIN)を測定した。初回の DNA 抽出にて濃度が低かった症例に関しては、用手法（QIAamp、キアゲン社）にて再抽出を行い、DIN の測定を行った。また、DIN が 2.5 未満であった検体は、リアルタイム PCR を用い、ddCq 値*も測定した（NGS FFPE QC キット、アジレント社）。
*ddCq 値；OncoGuide™ NCC オンコパネルシステムにおいて DNA 抽出後の QC に用いられており、2 未満であれば PASS と判定され、次の工程に進む。

3.4 評価方法
DIN が 2.5 以上であれば、「適正」とした。DIN が 2.5 未満の場合には ddCq の測定を行い、ddCq
が 2 未満であれば、「適正」、ddCq が 2 以上の場合は「要精査」とした。

【結果・考察】1. 結 果1.1 参加施設と提出検体種
309 施設が参加した。施設種別は、がんゲノム医療中核拠点病院が 8 施設 (2%)、拠点病院 27
施設（9%）、連携病院 120 施設（39%）、その他 149 施設（48%）、不明 5 施設（2%）と、がんゲノム医
療関連病院が約半数を占めた。提出検体種は、肺癌（n=250、81%）、乳癌（n=44、14%）、大腸癌（n=14、5%）、その他として胃癌（n=1、0%）であった。
1.2 核酸抽出と品質確認
DNA 抽出後、蛍光法にて濃度が 5 ng/ul 以上であった検体は、99% (n=306)であり、引き続き DIN測定を行った（図１）。5 ng/ul に満たなかった症例（1%、n=4)は、用手法にて再度 DNA を抽出後、蛍光法にて濃度を測定し、DIN を測定した。再抽出した 4 例中、1 例は 5 ng/ul 以上となり DIN 測定を行った。その他の 3 例は濃度を満たさなかったが DIN を測定した。
5 ng/ul 以上得られた 306 例のうち DIN が 2.5 以上であった症例は 284 例 (92%)であった。一方、DIN が 2.5 未満の症例は 22 例見られ、これらの症例に関しては ddCq の測定を行った。この
結果 ddCq が 2 未満症例は 8 例、2 以上の症例は 16 例となった。再抽出後の濃度を満たさなかった 3 例においては、2 例は参考値データが取得できたが、1 例は測定不可であった。

－ 59 －

図 1 本サーベイにおける核酸品質評価のダイアグラム

1.3 各因子が核酸品質に与える影響
1.3.1 手術曜日
参加 309 施設のうち、DIN の測定が可能であった 308 検体および手術曜日別と DIN の関係を
図 2 に示す。検体全体の DIN の中央値、平均値はともに 4.2、最大値 6.4、最小値 1.7 であった。
このうち、月曜日の手術群は金曜日の手術群に比して有意に DIN が高かったが (p=0.0276)、その他の曜日群間では有意な差は見られなかった。また、各曜日内においても DIN に施設間差が見られた。

図 2 各手術曜日別の DIN－ 60 －

1.3.2 固定日数
手術日から切り出し日までを固定日数とした場合（固定日数 A）、83%の検体が 2 日以内固定、92%が 3 日以内固定であった。固定日数が長いと DIN 中央値、平均値ともに低下傾向を示した（図３上段）。一方、手術日から自動包埋開始日を固定日数とした場合（固定日数 B）、67%の検体が 2日以内固定、80%が 3 日以内固定であった（図３下段）。

図 3 固定日数と DIN(上) 固定日数 A（手術日～切り出し日）、(下) 固定日数 B（手術日～自動包埋開始日）

固定日数 A、固定日数 B を各々2 日以内固定と 3 日以上固定、3 日以内固定と 4 日以上固定の 2 群に分けて解析を行ったところ、固定日数 A において、3 日以内の群は 4 日以降の群に比して有意に DIN が高く（p=0.0019）、切り出し日までの固定日数が品質に影響を与えている可能性が示唆された (図４）。

－ 61 －

図４ 固定日数カテゴリー別と DIN

1.3.3 固定液の種類
検体固定液の種類は、全体の 83% (n=257)が 10%中性緩衝ホルマリン液（10%NBF）を用いており、10%NBF 群の DIN の中央値は 4.4、平均値は 4.3 であった。一方、それ以外の固定液（nonNBF）群（17%、n=51）の DIN の中央値、平均値ともに 3.5 であった。両群を比較すると、10%NBF 群の DIN は有意に高かった（p<0.001）(図５）。non-NBF 群には、10%の緩衝ではないホルマリン液、20%のホルマリン液などが見られた。なお、上記は提出検体の固定液 (2018 年 10 月-2019 年 1月)であるが、現在の固定液について質問したところ、10%NBF を使用している施設は 93% (n=287)、
その他の固定液は 6% (n=18)、両方 1% (n=2)、未記入 0% (n=1)であった。

図５ 固定液の種類と DIN－ 62 －

2. 考 察
保険診療下でのがんゲノム医療が開始となり、今回のサーベイでは初めて FFPE 検体の DNA
品質確認を行った。日本病理学会が策定した「ゲノム診療用病理組織取検体取扱い規程」では、使用する遺伝子パネルにより異なるものの、次世代シークエンサーを用いた解析において、作製
後 3 年以内の FFPE ブロックの使用が望ましいとされている。これを踏まえ、本サーベイでは、作製後 2 年半から 3 年以内の FFPE ブロックを対象に行った。結果として 309 検体中、94%にあたる
292 検体が NGS 解析に耐えうる品質を有していると考えられ、多くの施設が適切な FFPE ブロック作製・管理を行っていると考えられた。本サーベイでは、癌種を絞ってその評価を行ったが、大部分 95%を占めた肺癌・乳癌では、すでに免疫染色を用いたコンパニオン診断などが診断に取り入れられ、日常の検体の取り扱いが病理にも臨床にも広く周知されている癌種であることも上記の良好な結果の原因である可能性が考えられる。
一方で、全体として DIN は中央値、平均値はともに 4.2 であったが、最大値 6.4、最小値 1.7 であり、品質の点で施設間にかなりのばらつきが認められた。FFPE ブロックの品質は、年月を経るごとに低下することが知られており、今回の調査で高品質であった FFPE ブロックは数年後でもNGS を用いた解析に耐えうる可能性があるが、すでに品質の低い FFPE ブロックは今後使用できない可能性が高く、施設の FFPE ブロック作製過程を一度見直すよい機会としてとらえていただきたい。

【おわりに】
今回の調査回答用紙では、本サーベイに対するご意見として、今回のような FFPE 検体の品質サーベイがよい取り組みでありがたい、可能であれば複数のブロックを出して検討してもらいたい、
もっと古い時期の検体に関しても調べてもらいたい、DNA だけではなく RNA も検討してはどうか、など複数のご意見をいただきました。今後のサーベイを考えるにあたり貴重なご意見をいただきありがとうございました。
日本病理精度保証機構として初の取り組みでしたが、大きな混乱もなく終了でき、参加していただきました施設の皆様に御礼申し上げます。今回のサーベイ結果が皆様の今後の診療における
FFPE 検体の精度管理に役立つことを祈っております。

－ 63 －

【本サーベイ実施体制】
・主幹機関実施責任者
北海道大学病院 先端診断技術開発センター
畑中 佳奈子・主幹機関実施分担者/協力者
北海道大学病院 ゲノムコンパニオン診断研究部門
畑中 豊、奥村 麻美、南家 綾江
・測定委託機関（核酸抽出・核酸品質測定）
北海道大学病院 先端診断技術開発センター 生体試料管理室
・実施事務局（お問い合わせ先）〒150-0032 東京都渋谷区鶯谷町 7-3-101
特定非営利活動法人 日本病理精度保証機構
TEL:03-3496-6950 FAX:03-3496-2150
E-mail：info@jpqas.jp－ 64 －

オプションサーベイ （遺伝子パネル検査関連）
腫瘍細胞含有割合の評価フォトサーベイ【はじめに】
本邦におけるがん遺伝子パネル検査は、2019 年 6 月より保険診療として開始されました。日本
病理精度保証機構は日本病理学会精度管理委員会と協働し、保険診療開始前の 2018 年度から
2 年にわたり、腫瘍細胞含有割合評価の現状把握のための調査研究（フォトサーベイとアンケート調査）を実施いたしましたが、その重要性に鑑み、今年度より日本病理精度保証機構の正式な外部精度評価項目として、フォトサーベイを実施することとなりました。

【サーベイの概要】
1. 参加施設の募集方法
当機構ホームページに案内を掲載するほか、前回調査参加施設および日本病理学会の認定・登録施設を中心に書面で案内を送付した。
2. サーベイのスケジュール
本フォトサーベイは以下のスケジュールで行った。
2021 年 7 月上旬～9 月下旬

症例選択およびバーチャルスライド画像準備

2021 年 10 月 12 日～11 月 15 日

サーベイ実施2021 年 12 月上旬～12 月下旬

評価結果の集計

2022 年 12 月上旬～2 月下旬

評価結果の解析・報告書作成

2022 年 3 月上旬

評価結果報告書発送

3. 調査方法
本サーベイは以下の手順で行った。
① 所定の URL より ID/パスワードを入力してログインしたのちに、以下の 5 症例のバーチャルス
ライド画像（TC-11～TC-15）を閲覧② あらかじめダウンロードした評価記入用紙へ腫瘍含有割合（10%間隔）の評価結果を入力（プルダウンメニューからの選択方式）➂ 判定記入用紙（アンケート項目を含む）を当機構事務局にメールにて返送－ 65 －

問題

ファイル名

症例

検体種

腫瘍細胞含有割合評価対象
エリア

問1

TC-11

大腸癌

手術

赤線サークル
内を評価

問2

TC-12

胃癌リンパ
節転移

FNA

スライドグラス上の組織全体
で評価

問3

TC-13

小腸癌

手術

赤線サークル
内を評価

問4

TC-14

膵癌

FNA

スライドグラス上の組織全体
で評価

問5

TC-15

大腸癌の肺
転移

生検

スライドグラス上の組織全体で評価

4. 評価方法
AI 画像解析システムの結果および目視による確認に基づいて決定した当機構による中央判定に対し、各参加施設の施設判定が適正範囲区分内であれば 3 点、1 区分差であれば許容範囲区分内として 2 点、2 区分差であれば要確認範囲区分内として 1 点とし、5 症例（各症例 3 点満点）の合計点（15 点満点）で評価し、9 点以上を「適正」とし、9 点未満を「要精査」をとした。

－ 66 －

【結果・考察】1. 集計結果
本サーベイには 341 施設が参加し、過去 2 回の調査研究を通じ最多となった。腫瘍細胞含有割合（Tumor Content: TC）の各症例の集計結果を以下にまとめた（■(適正範囲)は 3 点、■(許容範囲)は 2 点、■(要確認範囲)は 1 点とした区分）。
問 1 の結果：
画像解析 TC は 64%、参考値として NGS 解析
から算出された TC は 69.8%であった。腫瘍細胞が比較的多く、炎症細胞などの非腫瘍細胞はそれほど多くなく、多くの施設が 3 点、2 点の範囲内に収まった。

問 2 の結果：
画像解析 TC は 38%、参考値として NGS 解析
から算出された TC は 43.1%であった。FNA 検
体としては比較的多くの腫瘍細胞が採取されていた検体であったが、リンパ球などの非腫瘍細胞が含まれている領域も見られ、やや多めに TC を算出した施設が多かったと考えられる。

問 3 の結果：
画像解析 TC は 62%であった。赤線マーキン
グ内の上側では比較的腫瘍細胞が密にみられ、一方で下側では好中球などの非腫瘍細胞が比較的多く含まれた検体であった。

－ 67 －

問 4 の結果：
画像解析 TC は 37%、参考値として NGS 解析
から算出された TC は 36.7%であった。線維性間質内に腫瘍細胞が分布しており、非腫瘍細胞として炎症細胞はそれほど多くなく、面積比で考えるよりやや高めの TC になると考えられた。

問 5 の結果：多数の炎症細胞や複数の生検検体を合計して考える必要のある症例で難易度が高かったと考えらえる。画像解析 TC は 6%、参考値
として NGS 解析から算出された TC は 20%であり、この検体では、3 点の区分を 3 区分とした。NGS を用いた検査に提出するか否かの判断も要する検体と考えられた。

2. 腫瘍細胞含有割合の外部精度評価結果
本サーベイ参加 392 施設における得点別の施設数（割合％）を下表に示す。

適正範囲
の区分
適正範囲内
3点
許容範囲内
2点
要確認範囲内
1点
範囲外
0点

問1

問2

問3

問4

問5

60%、70%30%、40%60%、70%30%、40%0%、10%、20%

156（45.7 %）
117
（34.3 %）
55
（16.1 %）
13
（3.8 %）

54（15.8 %）
72
（21.1 %）
89
（26.1 %）
126
（37.0 %）

105（30.8 %）
116
（34.0 %）
66
（19.4 %）
54
（15.8 %）

135
（39.6%）
124（36.4 %）
62
（18.2 %）
20
（5.9 %）

296（86.8 %）
29
（8.5 %）
7（2.1 %）
9（2.6 %）

5 問いずれも許容範囲内（2 点）以上であった施設では合計点は 10 点となるが、問 2 では 0 点の施設が多くなったことから、9 点以上を「適正」とした。また、9 点未満は「要精査」とし、「要精査－ 68 －

①」を 9 点未満 6 点以上、全体と比較して、かなり TC 範囲の離れてしまった 6 点未満を「要精査②」とした。
合計点（15 点満点）の得点別の施設数のグラフを下に示す。341 施設のうち、適正範囲内となった施設は 269 施設（79%）、要精査①となった施設が 64 施設（19%）、要精査②となった施設は 8
施設（2%）であった。

3. アンケート調査の結果
参加施設区分を下に示す。がんゲノム医療中核拠点病院 11 施設 (3%)、同拠点病院 24 施設(7%)、同連携病院 128 施設 (37%)と、がんゲノム医療関連病院が全体の約半数を占めた。参加施
設における常勤・非常勤の病理医数と暫定を含む分子病理専門医数、本 TC 評価に加わった病理医数を下図に示す（調査項目と DIN の関係は今後報告予定）。

－ 69 －

4. 考察本サーベイは、2018 年度から 2 度にわたる調査研究（腫瘍含有割合に関するフォトサーベイとアンケート調査）を経て、今回初めて日本病理精度保証機構の正式な外部精度サーベイとして行った。初回調査の 2018 年度は 86 施設、2 回目調査の 2019 年度は 175 施設の参加であったが、今回は 341 施設が参加した。一貫して HP 上でバーチャルスライドを用いて行い、TC は 0-100%を10%刻みの選択法、また評価領域が標本全体なのかマーキングエリア内のみなのかを HP 上で提示した。また HP 上では、腫瘍細胞含有割合の注意点として「腫瘍細胞含有割合評価は『全有核細胞数に占める腫瘍細胞数』としてご評価ください。※組織全体における腫瘍占有面積ではありませんのでご注意ください」と記載した。2018 年度は結果にばらつきが見られ、特に炎症細胞浸潤など非腫瘍細胞の混在が多かった症例においては TC に二峰性の分布が見られ、「評価方法がよくわからない」といった意見を記載している施設もみられた。しかし、NGS を用いた検査に
FFPE 検体の提出を求められる場面が増加し、また、日本病理学会からも「ゲノム診療用病理組
織検体取扱い規程」が発出され、病理医・病理技師に対する様々な講習会の開催や、e-Learningの導入、さらに分子病理専門医制度が 2021 年から開始し、評価方法の周知が進み、今回のサーベイではどの問題においても一峰性の分布となった。
今回の判定では、画像解析で得られた TC 結果を目視で確認の上、その数値に近い区分から
3 点、2 点、1 点と点数付けを行い評価した。例えば、問 1 では 60%、70%が 3 点、50%、80%が 2 点、40-90%が 1 点となり、かなり広い区分が許容範囲とされている。総合判定では 9 点以上、すなわ
ち 5 問でいずれも 2 点以上であった施設は「適正」として評価され、269 施設（79%）が該当し、比較的良好な結果であったように思われる。他施設の評価分布と自施設の立ち位置を知る機会は少ないと考えられ、本サーベイ結果を、再度自分自身、もしくは施設内の評価へのフィードバックの－ 70 －

機会としてとらえていただきたい。また、参考値データとして、NGS 解析結果の variant allele
frequency (VAF)から推定される TC (TC-VAF)が参考情報となる症例には付記した。NGS 解析において、TC-VAF が提示される場合もあるが、目視 TC と乖離した結果が得られる場合がある。乖
離した場合は本サーベイの結果も参考にしつつ、乖離の大きかった症例について再度目視 TC について問題がなかったか確認することが望ましいように思われる。

【おわりに】
本サーベイにおいては、出題問題に対して「よかった」との評価を 113 施設（33%）に、「概ねよかった」との評価を 197 施設（58%）に、合計 9 割近くの施設に好評価をいただきました。また、今後の調査に関して、「参加する」とした施設が 229 施設（67%）、「おそらく参加する」とした施設が 95 施
設（28%）でした。「実臨床で困っているので良問だと思った」「日常診療で自分が評価している腫瘍割合の適否について知る機会が少なく、今回のサーベイ結果を参考にし、今後の判定に役立てたい」などのご意見もいただき、今後の日常診療にフィードバックしていただけるサーベイになったと思っております。
一方で、バーチャルスライドにて参加してもらうことから、「バーチャルスライドでの評価に慣れておらず難しかった」といったご意見や、「評価範囲を記載した赤線が途中で消えていた」「他の人のアノテーションが記録されていた」など、今後の運用面で検討が必要な事項のご指摘もいただきました。本サーベイが、今後の日常診療の一助となることを祈っております。

－ 71 －

【謝 辞】
本外部精度評価にご協力頂きました以下企業、団体の関係者の皆様に深謝申し上げます。
・日本電気株式会社（画像解析 AI 評価）
・中外製薬株式会社（CGP 検査情報の照会対応）【本サーベイ実施体制】
・実施責任者
北海道大学病院 先端診断技術開発センター
畑中 佳奈子・実施分担者/協力者
北海道大学病院 ゲノムコンパニオン診断研究部門
畑中 豊、奥村 麻美、南家 綾江
・実施事務局（問い合わせ先）〒150-0032 東京都渋谷区鶯谷町 7-3-101
特定非営利活動法人 日本病理精度保証機構
TEL:03-3496-6950 FAX:03-3496-2150
E-mail：info@jpqas.jp－ 72 －

プレサーベイ
Ki-67 染色サーベイ【はじめに】
日病理診断において、Ki-67 は重要な細胞増殖マーカーとして最も多く実施されている IHC 項目であり、乳癌をはじめ、多くのがん種で用いられています。一方で、本検査の本邦での標準化は、いまなお進んでおらず、多くの施設で独自に確立した染色条件が用いられている状況にあり、外部精度評価（EQA）の必要性が予てより指摘されていました。こうした背景を受け、当機構では今後の EQA 項目化に向けた事前準備のためのサーベイ（プレサーベイ）を今年度実施することとなりました。

【サーベイの概要】
1. 参加施設の募集方法
当機構ホームページに案内を掲載するほか、前回調査参加施設および日本病理学会の認定・登録施設を中心に書面で案内を送付した。
2. プレサーベイのスケジュール
本プレサーベイは以下のスケジュールで行った。
2021 年 2 月上旬～3 月下旬

機構内予備検討サーベイ実施

2021 年 4 月上旬

募集開始

2021 年 4 月下旬～6 月下旬

症例選択および TMA ブロック作製

2021 年 7 月上旬～7 月下旬

自動薄切装置による薄切2021 年 8 月 6 日～9 月 17 日

染色サーベイ実施

2021 年 10 月上旬～10 月下旬

バーチャルスライド画像作成

2021 年 11 月上旬～12 月下旬

AI システムを用いた判定作業および担当者会議開催

2022 年 1 月上旬～2 月下旬

評価結果の解析・報告書作成

2022 年 3 月上旬

評価結果報告書発送

3. 調査方法
本プレサーベイは以下の手順により行った。
① 当機構事務局より、本染色サーベイ手順書 １部、Ki-67 プレサーベイ用乳癌 TMA 未染色標
本 1 枚、調査回答用紙 1 部を参加施設へ送付。

－ 73 －

② 参加施設において日常診療で行っている染色方法により、Ki-67 プレサーベイ用乳癌 TMA 未染色標本（４コア搭載；Ki-67 高値例 1 コア[#1]、低値）例１コア[#2]、中等度値例２コア[#3、#4]。
下図参照）を用いて Ki-67 染色を実施。

➂ 日常診療で用いている判定方法（目視判定、目視計数、画像解析など）により、Ki-67 標識率（ラベリングインデックス；LI）を判定し、調査回答用紙へ回答。
④ 判定記入用紙（アンケート項目を含む）を当機構事務局へ返送。
4. 評価方法
本プレサーベイの評価には以下の 3 種の判定値を用いた。
染色・判定の組合せ区分

判定値(A) 施設染色・施設判定

A 階級値(B) 施設染色・中央判定**

B 階級値

判定値の説明参加施設の施設染色・施設判定により得られた回答値を 10%間隔の階級値へ変換した値
参加施設の施設染色、当機構の中央判定（AI 判定）により得(R) 中央染色*・中央判定**(リファレンス)

R 階級値

られた計数値を 10%間隔の階級値へ変換した値
協力企業の中央染色、当機構の中央判定（AI 判定）により得られた計数値を 10%間隔の階級値へ変換した値*; 各協力企業が推奨する染色、**; 機構による deep Learning による画像解析

また本プレサーベイにおける精度評価は以下の染色評価と総合評価により行った。AI 判定（目視確認を含む）に基づいて決定した当機構による R 階級値に対し、各参加施設の A 階級値もしくは B 階級値が適正範囲区分内であれば 3 点、許容範囲区分内として 1 区分差であれば 2 点、2区分差であれば 1 点とし、4 コア（各コア 3 点満点）の合計点（12 点満点）に、Ki 高値コアと Ki 低値コアの比に基づいた値（≥3 は 6 点、≥2 は 4 点、≥1.5 は 2 点）を加点して評価し、総得点 12 点以上を「適正」、12 点未満を「要精査」とした（後述の図 5 参照）。
精度評価

説明

染色評価

R 階級値と B 階級値の比較（階級差）に基づく点数で評価

総合評価

R 階級値と A 階級値の比較（階級差）に基づく点数で評価－ 74 －

【結果・考察】1. 中央染色・中央判定によるリファレンス設定
中央染色は、国内の主要な IHC 診断薬企業（協力企業）4 社が推奨する 9 種の最適化条件を用いて、各企業サイトで染色された標本のうち、各協力企業が最も推奨する以下の 4 条件で実施された染色とした（表 1）。なおアジレント社では、下記の条件のうち抗原賦活処理液を Low pH 処理液としたものを推奨の第一選択としているが、①国内においては MIB1 抗体を用いた Ki-67 染
色において大部分の施設で High pH 処理液が選択されており、すでにデファクト･スタンダードが存在すること、②海外 EQA 機関（NordiQC）が推奨する MIB1 抗体を用いた Ki-67 染色の染色条
件のほぼすべてが High pH 処理となっていることから、今回 High pH 処理の染色条件をリファレン
ス設定（【サーベイの概要】「4. 評価方法」参照）に採用した。
表 1 リファレンス設定に用いた各協力企業で推奨する最適化条件
使用試薬/使用機器
アジレント
ニチレイ
自動染色
機器

一次抗体

抗原賦活
処理

ロシュ

機種名

Autostainer Link48

ヒストステイナー

BOND III

ベンチマーク
ULTRA

クローン

MIB-1

SP6

K2

30-9

RTU/希釈倍率

RTU

RTU

RTU

RTU

反応時間・温度

20 分間/ 常温

30 分間/常温

15 分間/常温

16 分間/36℃

処理機器

PT Link 200

HEATPROⅡ

一体型

一体型

抗原賦活
処理液

EnVision FLEX
Target Retrieval
Solution、High pH

HEAT
PROCESSOR
Solution pH9

BOND Epitope
CC1 バッファー
Retrieval Solution 2 ULTRA (pH9)
(pH9)

40 分間

20 分間

64 分間

97℃

100℃

100℃

95℃

EnVision
FLEX/HRP

ヒストファインシンプ BOND Polymer
Refine Detection
ルステイン MAXPO (MULTI) (HS用)ベンタナ ultraView
DAB ユニバーサ
ルキット

無

無

無

最高温度における
20 分間
処理時間
最高処理温度
製品名

検出試薬

ライカ

リンカー試薬の使用

有Post Primary(BOND Polymer
Refine Detection)

中央判定は、上記 4 種の染色標本を対象に当機構による AI 判定とした。各条件の中央判定による Ki-67 標識率およびこれらの平均値として算出した R 計数値および R 階級値を図１に示す。

－ 75 －

図１ 各協力企業による Ki-67 標識率(左)とこれにより算出した R 計数値・R 階級値(右)2. 参加施設の Ki-67 染色における一次抗体・検出試薬・自動染色装置の使用状況
本プレサーベイ参加 342 施設において使用されている一次抗体の種別を図 2 に示す。最も使用されている抗体は clone MIB1（アジレント社、61.7%）であり、次いで clone 30-9（ロシュ社、26.0%）
で、これら２クローンで全体の約 9 割を占めていた。これらのうち clone 30-9 は、すべて希釈済み（ready-to-use; RTU）抗体が用いられている一方、clone MIB1 では、RTU 抗体の使用は 25.1%にとどまり、74.9%は精製抗体が用いられ、その希釈倍率もさまざまであった。また clone MIB1 を用いた染色時に行う抗原賦活処理については、High pH 処理液を使用している施設が全体の 82.5%（174/211 施設）を占めた。

図２ 参加 342 施設における Ki-67 染色時に使用する一次抗体の種別－ 76 －

また参加施設の Ki-67 染色で用いられている検出試薬および自動染色装置の種別を図３に示す。いずれもロシュ社とライカ社の染色システムが全体の 80%近くを占めていた。

図 3 参加 342 施設における Ki-67 染色時に使用する検出試薬および自動染色装置の種別－ 77 －

3. 染色評価
本プレサーベイ参加 342 施設の施設染色・中央判定（組合せ区分 B）による B 計数値を図４に示す。当該値は、概ね中央染色・中央判定の計数値と同じ傾向を示したが、すべてのコアにおいて大きなばらつきが認められた。抗原賦活処理法別の B 計数値は、High pH 使用施設に比べ、Low pH 使用施設のほうが、相対的に低い傾向にあった。

図４ 参加施設における中央判定結果（計数値）と抗原賦活処理法別の結果

上記各参加施設の B 計数値は B 階級値へそれぞれ変換後、R 階級値（#1; 60%、#2; 10%、#3;
30%、#4; 30%、図 1 参照）と比較し、図５左の点数表に基づき染色評価を行った。全参加施設における得点分布を図５右に示す。また総合点（18 点満点）のヒストグラムを図６に示す。342 施設のう
ち「適正」評価となった 12 点以上の高得点施設は 87.7%（300 施設）であった。これら施設に比べ「要精査」評価となった 12 点未満の低得点施設では、Ki-67 標識率のバラつきが極めて大きかった。

図５ 染色評価に用いる点数表(左)と R 値･B 値間の得点分布(右)(左) R 値比較に基づく点数表。コア#1~#4；適正範囲内(50～70%)は３点、許容範囲内①は２点、許容範囲内②は 1 点、範囲外は 0 点。コア#1/#2 比；適正範囲内(3 倍以上)は 6 点、許容範囲内①(2 倍以上)は 4 点、許容範囲内②(1.5 倍以上)は 1 点、範囲外は 0 点。(右)各コアおよびコア#1/#2 比における点数分布。

－ 78 －

図６ R 階級値･B 階級値間比較の得点分布(左)と高得点・低得点施設間の比較(右)染色評価において「要精査」となった 42 施設が使用している一次抗体について精査したところ、
アジレント社の clone MIB1 の精製抗体を使用している施設が 26 施設（61.9%）を占め、最も多かった（図 7 左）。この 26 施設は clone MIB1 の精製抗体使用施設全体の 16.4%に相当する。一方、ライカ社を除く 3 社の RTU 抗体使用施設全体（174 施設）における「要精査」となった割合は 6.4%であった。また「要精査」26 施設における使用検出試薬について精査したところ、25 施設は他社検
出試薬と組み合わせて使用していた（図 7 右）。なおライカ社の clone MM1 使用 10 施設（RTU 試
薬；９施設、精製抗体；1 施設）における「適正」の割合は 50.0%にとどまり、他のクローンと比較し、著しく低かった。

図 7 染色評価において要精査となった参加施設の分布－ 79 －

4. 総合評価
本プレサーベイ参加 342 施設で行った施設染色･施設判定（組合せ区分 A）における回答値を
A 階級値へ変換後、R 階級値（#1; 60%、#2; 10%、#3; 30%、#4; 30%、図 1 参照）と比較し、図５左の点数表に基づき総合評価を行った。総合点（18 点満点）のヒストグラムを図８に示す。342 施設のうち総合評価が可能であった 329 施設について、12 点以上の高得点施設は 80.7%（276 施設）であった。これら施設に比べ 12 点未満の低得点施設（53 施設）では、染色評価同様、Ki-67 標識率のバラつきが極めて大きかった。

図８ R 階級値－A 階級値間比較の得点分布(左)と高得点・低得点施設間の比較(右)5. 考察・説明等
5.1 本プレサーベイについて
本機構 EQA における中央判定は、複数病理医による目視判定が中心となっている。こうしたプ
ラクティカルな視点での判定は、EQA での評価結果を日常診療へ還元するうえで極めて重要といえ、外部精度評価には不可欠なものといえる。一方で、定性的もしくは HER2 のような半定量的なIHC 染色とは異なり、定量評価が要求される Ki-67 IHC 染色の EQA では、画像解析等の技術利用が必要となっており、すでに NordiQC など海外 EQA 機関の一部では Ki-67 染色評価において
すでに画像解析が利用されている。さらに近年 deep learning を中心とした AI 技術の発展に伴い、より高精度な画像処理が可能となっている。こうした背景から、当機構では、今後の Ki-67 IHC
EQA 項目化に向けた事前検討のための deep learning による画像解析を用いたサーベイ（プレサーベイ）を今年度実施した。
従来の画像解析は、染色時のアーチファクトや染色条件の違いなど対し安定した精度が得られないという課題があり、チューニングに多大な工数が必要となっていたが、deep learning による画像解析では大量の画像を学習することで、高精度かつロバストに解析することができることから、
今回これを採用した。使用した解析エンジンはまだ検証段階にあるものの、多くの参加施設の Ki-－ 80 －

67 染色画像において、精度よく定量評価が行えた一方、全体の 5%程度の施設の画像で見られた想定を超える DAB 発色の共染や対比染色（ヘマトキシリン染色）の過染に対しては、精度のよい結果が得られなかった（今後報告予定）。解析エンジンの微改良が今後必要ではあるものの、今回の結果から、deep learning による画像解析（AI 判定）の EQA 利用は可能と考えられた。
5.2 使用した乳癌 TMA 標本について
本プレサーベイには、乳癌 Ki-67 高値例、低値例、中等度値例をそれぞれ 1 例、合計 3 症例を用い、Ki-67 高値例と低値例からそれぞれ 1 コア、中等度値例から 2 コアをサンプリングし計４コ
ア搭載 TMA ブロックを同一症例から３ブロック作製した。本プレサーベイでは定量評価を行う性質
上、薄切厚による影響を極力抑えるため、TMA ブロックの薄切は、自動薄切（スマートセクション、
サクラファインテック社）により行った。今回作製した 3 ブロックからそれぞれ 250～300 枚を薄切（100 枚ごとに刃交換）し、100 枚ごとに 3 枚の HE 染色標本および Ki-67 染色標本（NordiQC 推奨
染色条件に準じ実施；https://www.nordiqc.org/protocol_view.php?id=360）を主幹機関で作製し、約 500 枚をサーベイでの使用が可能と判断した。このなかで定点的に行った 16 枚のキャリブレー
ション用 Ki-67 染色標本を比較したところ、これら染色標本内の各コアの計数値は、概ね Ki-67 高値、低値、中等度値を示したが、一部では低値コアと中等度コアの差が小さくなるなど、想定の範囲であったもの 10%程度の変動が確認された（今後報告予定）。より高い精度の EQA を行うためには、こうした LI 値の変動への対応（キャリブレーションなど）が必要と思われた。上述の DAB 発
色の共染や対比染色の過染の程度をモニタリングするため、また LI 値の変動が生じにくいマテリ
アルを使用してより検体間のばらつきを低減するため、Ki-67 陽性・陰性細胞株を用いた人工検体（セルブロック）の追加使用も効果的と考えられた。今後 Ki-67 染色を正式に EQA 項目化する
際は、これらについて検討したい。
5.3 評価方法について
本機構 EQA では、通常、染色評価と判定評価をそれぞれ行い、これら２つの評価結果をもとに総合評価を行うが、本プレサーベイでは、検証段階にある AI 判定を用いたため、染色評価（組合
せ区分 R と B の比較）のみとし、判定評価（組合せ区分 A と B の比較）は行わなかった。また組合せ区分 R と A の比較結果を代替の総合評価として「施設結果評価表」に記載したが、得点の提示のみに留め、参考データとして取り扱うこととした。今後 Ki-67 染色を正式に EQA 項目化する際
は、判定評価の実施が必要と思われる。なお今回用いた deep learning による画像解析システム（NEC 社）の判定精度については、本プレサーベイ実施にあたり AI 解析検証ワーキンググループを設置し、ワーキンググループないで確認・協議を行い、判定に使用した。

－ 81 －

5.4 中央染色および施設染色の評価結果について
5.4.1 中央染色
今回調査段階にある本プレサーベイでは、①今後サーベイに使用する FFPE 組織検体の検体
品質の許容範囲を確認するため、②また各施設で採用している染色条件の頑健性（ロバストネス）についても情報を得るため、検体品質が低下していると考えられる長期保管された乳癌 FFPE 組
織検体を用いた。症例（Ki-67 高値～低値例）の選定にあたっては、上述の主幹機関が採用した
NordiQC 推奨染色条件（主幹機関染色）にて行った。表１に示す各社の最適化条件を用いた中央染色では、高い頑健性を有すると考えられるこの主幹機関染色（計数値：#1; 59.3%、#2; 10.8%、#3;
33.7%、#4; 23.8%、階級値：#1; 60%、#2; 10%、#3; 30%、#4; 20%）とほぼ同等の LI 値を示し（図 1）、また各社間の LI 値も概ね同等であったことから、各社推奨の最適化された染色条件は、一定の頑
健性かつ標準性を有すると考えられた。一方、アジレント社が推奨の第一選択としている表 1 の抗原賦活処理液を Low pH 処理液に置き換えた染色条件では低い LI 値となり、上記 4 染色条件と比較し、頑健性は劣ると思われた。
5.4.1 施設染色
図 3 に示すように本プレサーベイへ参加 342 施設の染色評価の結果については大きな施設間差が認められたが、長期保管された組織検体を使用したことも要因の一つと考えられる。乳癌 Ki67 評価（染色および判定）については、International Ki67 in Breast Cancer Working Group (IKWG)
から 2011 年に最初の推奨が示され（Dowsett M et al. J Natl Cancer Inst. 2011）、その後 2021 年にアップデートされている（Nielsen TO et al. J Natl Cancer Inst. 2021）。これらには Ki-67 評価に与える因子が取りまとめられており、アナリシス段階に関する因子としては、使用する抗原賦活処
理、一次抗体、検出試薬、対比染色の選択が挙げられている。
抗原賦活処理については、参加 342 施設中、High pH 使用は 293 施設（85.7％）と大半を占めており、Low pH 使用は 25 施設（7.3%）にとどまっている。図 3 に示すように LI 値（計数値）は HighpH 使用施設に比べ、Low pH 使用施設のほうが相対的に低く、Ki-67 高値例（コア#1）では約 20%程度低下した。こうした傾向は上述のように、表 1 の抗原賦活処理液を Low pH 処理液に置き換えたアジレント社の染色条件においても確認された。一般に抗原賦活処理能は High pH 処理液のほうが高いとされていることから、こうした差につながったと考えられる。
一次抗体については、アジレント社の clone MIB1 の使用が全体の６割以上を占め、そのうちの多くは精製抗体が用いられていた（図 2）。染色評価において、この clone MIB1 精製抗体を使用していた 158 施設のうち、26 施設（16.4%）が要精査の評価となった。一方、ライカ社を除く 3 社のRTU 抗体使用 174 施設のうち、要精査となった割合は 6.4%にとどまった。RTU 試薬を使用する場
合の多くは、各企業の最適化染色条件を使用しており、こうしたことが要精査評価割合の抑制に繋がっていると思われる。また clone MIB1 精製抗体を使用し要精査評価となった 26 施設のうち、25 施設が他社検出試薬と組み合わせて使用していたことから、各施設でカスタマイズした染色条件を使用する場合は、十分な分析妥当性評価を行うことが必要といえる。ライカ社の clone MM1－ 82 －

については、使用 10 施設のうち半数が十分な染色強度が得られず要精査となった。こうした傾向
は中央染色時にも認められ、clone MM1 そのものの頑健性は、他のクローンと比べ低いと考えられる。一方、同社の clone K2 については、十分な染色強度が得られるものの、他の抗体クローン
では見られない脂肪組織の細胞質への陽性反応が認められることから、採用にあたっては、
FFPE 組織検体における抗体反応性の確認が不可欠と思われる。
5.5 Ki-67 染色における精度保証/精度管理の重要性
上述の IKWG から発出された推奨において、2011 年の初版では簡単に触れられていた精度保証（QA）/精度管理（QC）については、2021 年のアップデート版ではアナリシス段階の因子として記載がより明確となり、定量評価可能な EQA システムの確立とそこへの参加の義務化について言及されている。海外 EQA 機関では、NordiQC では 2001 年から、UK NEQAS では 2013 年から複数回実施されており、CAP においても近年開始された。米国においては、CDK4/6 阻害剤のコ
ンパニオン診断薬として Ki-67 IHC キットが 2021 年に承認されるなど、臨床的意義がさらに広がりつつある。本邦においても Ki-67 EQA の早期開始が望まれる。

－ 83 －

【謝 辞】
本外部精度評価にご協力頂きました以下企業、団体、大学の関係者の皆様に深謝申し上げます（順不同）。
・サクラファインテックジャパン株式会社（TMA ブロックの自動薄切）・アジレント・テクノロジー株式会社（リファレンス IHC 染色）・ニチレイバイオサイエンス株式会社（リファレンス IHC 染色）・ライカマイクロシステムズ株式会社（リファレンス IHC 染色）・ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社（リファレンス IHC 染色）・日本電気株式会社（deep learning による画像解析による判定）【本プレサーベイ実施体制】
・主幹機関実施責任者（共同）北海道大学病院 ゲノムコンパニオン診断研究部門/先端診断技術開発センター
畑中 豊
関西医科大学 病理学講座
蔦 幸治
・主幹機関実施分担者/協力者
北海道大学病院 先端診断技術開発センター/ゲノムコンパニオン診断研究部門
畑中 佳奈子、南家 綾江、奥村 麻美
・日本病理精度保証機構 AI 解析検証ワーキンググループ
日本大学 医学部病態病理学系腫瘍病理学分野

増田 しのぶ

香川大学医学部附属病院 病理診断科

羽場 礼次

日本医科大学付属病院 病理診断科

坂谷 貴司

桑名市総合医療センター 病理診断科

白石 泰三

北海道大学病院 先端診断技術開発センター

畑中 佳奈子

関西医科大学 病理学講座

蔦 幸治

北海道大学病院 ゲノム･コンパニオン診断研究部門

畑中 豊

・実施事務局（問い合わせ先）〒150-0032 東京都渋谷区鶯谷町 7-3-101
特定非営利活動法人 日本病理精度保証機構
TEL:03-3496-6950 FAX:03-3496-2150
E-mail：info@jpqas.jp－ 84 －