岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 34 (№ 2), 43−48 (2008).

原著

犬のリンパ腫20例における組織形態学的および免疫組織化学的検索

牛尾祥彦 御領政信 佐々木 淳 谷 健二
佐藤れえ子 百田 豊 岡田幸助

要約

犬のリンパ腫20例についてパラフィン切片の免疫組織化学染色における抗原賦活化緩衝液
pHと固定条件について検討し, 発症部位, 腫瘍細胞の形態学的特徴と免疫表現型との関連性について検索した. 染色性は抗原賦活化緩衝液がpH8.0のとき最適となり, 固定条件による差はみられなかった. 腫瘍細胞はび漫性大細胞型６例, び漫性混合型９例, 濾胞性混合型４例の形態を示し, その他としてホジキン様リンパ腫が１例であった. 免疫表現型はCD３−CD79＋のＢ細胞性６例, CD３＋CD79−のT細胞性12例, CD３−CD79−のNon-B, Non-T性２例であった.
抗原賦活化緩衝液のpHによる染色性の差は大きく, pHの決定は診断をする上で欠かせないことが示唆された.
キーワード：イヌ, 免疫組織化学染色, リンパ腫, 形態学的特徴

犬における造血系腫瘍のうち最もよく認めら

解剖学的発症部位と免疫表現型との関連性は多れるのはリンパ腫である. その発症率は年間13−数検索されているが, 形態学的特徴, 特に, 腫24／10万 (匹) である [１]. 好発品種はボク

瘍細胞の大きさと免疫表現型との関連性はあま

サー, バセットハウンド, セントバーナードなり検討されていない. 一方, 凍結切片におけるどであり, 好発年齢は５−11歳である. リンパ免疫組織化学染色では良好な成績が得られるが,腫はその解剖学的発症部位, 形態学的特徴, 免パラフィン包埋切片では不適な場合が多い. 本

疫表現型などを基準として分類される [１].

研究では, パラフィン切片でも良好な成績が得

犬リンパ腫の免疫表現型は, 予後因子としてられる条件について検討するとともに, 犬のリ重要な役割を担っており, 治療として主流であンパ腫の腫瘍細胞の形態学的特徴と免疫表現型

る化学療法への反応性と再発率はＢ細胞性よりとの関連性および腫瘍摘出後の経過観察についＴ細胞性の方が悪いとされる [１,２]. 近年,て検索した.

岩大支会

岩手大学農学部― 43 ―

材料および方法

条件を設定した. 抗原賦活化液のpHはChemMate Target Retrieval Solution ( pH 6.0,

検索材料は1996年から現在に至るまでに本研Dako), それを１N NaOHでpH 7.0に調整した究室に病性鑑定・剖検依頼として持ち込まれたもの, １mM EDTA含有10mMトリス塩酸緩犬の症例のうち, ヘマトキシリン・エオジン

衝液 (TE緩衝液) (pH 8.0) およびTE緩衝液(HE) 染色によりリンパ腫と診断された症例で,(pH 9.0) の４条件とした. ホルマリン固定時

ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックあるい間は１日と１ヵ月とし, ユフィックス固定は２はホルマリン固定として組織が保存されていた時間とした.

20例の生検・剖検材料を用いた.

一 次 抗 体 に は Monoclonal Mouse Anti-

検索材料は10％ホルマリン液にて固定後, 定Human CD３ (１：200, Dako) とMonoclonal法に従いパラフィン包埋ブロックを作製した.

Mouse Anti-Human CD79acy (１：100, Dako)

これを４μmに薄切し, HE染色を施し, 光学を使用した. それぞれ, 正常犬扁桃, 脾臓ある顕微鏡にて病理組織学的に検索した. 腫瘍細胞

いはリンパ節を対照とした. ４μmに薄切したの形態学的特徴はNational Cancer Institute-組 織 切 片 を MAS コ ー ト ス ラ イ ド ガ ラ スWorking Formulation (WF) 分類 [１,３](Matsunami) に伸展した. 脱パラフィン後,に基づき行った.

TE緩衝液 (pH 8.0) に浸け, オートクレーブ

抗原賦活化液のpH, 組織のホルマリン固定(121℃, 15分) を用いて抗原賦活化した. 30分

時間およびユフィックス固定についてそれぞれ間室温にて冷却後, 洗浄し, 0.3％過酸化水素

図１ABCD

ＡとＢはCD３抗原に対する正常扁桃の胚中心領域を示しており, ＡはpH8.0, ＢはpH9.0でありＡの条件の方が染色性は良好である. ＣとＤはCD79a抗原に対する正常扁桃の胚中心領域を示しており, ＣはpH8.0, ＤはpH9.0でありＣの条件の方が染色性は良好である.
― 44 ―

水と室温で10分間反応させ, 洗浄した. 15mMン, ウェルッシュ・コーギー, ミニチュア・ダッ

NaN３とキャリアープロテイン含有トリス緩衝クス, スコティッシュ・テリア, ヨークシャ・液, pH7.2 (Dako) で一次抗体を希釈し, ４℃,テリア, パグ各１例と雑種７例の合計20例であっ一晩反応させた. 翌日, 洗浄し, LSAB＋キッた. 年齢は９ヵ月−14歳, 平均年齢が8.9歳でト/HRP (Dako) を用いて室温で15分間反応さあった. 性別は雄15例, 雌３例で, 去勢雄１例,せ, 洗浄した. ３,３'-Diaminobenzidine Tetra-避妊雌１例であった.

hydrochlorideと２分間反応させ, 蒸留水で５

解剖学的発症部位は, 消化管型10例, 皮膚型分×３回洗浄後, ヘマトキシリンで対比染色を５例, 多中心型３例, 孤在型と縦隔型がそれぞ行った. 反応はすべてチャンバー内で行った.

れ１例であった. 組織学的特徴は, び漫性大細CD３をＴ細胞性マーカー, CD79をＢ細胞性マー胞型６例, び漫性混合型９例, 濾胞性混合型４カーとし, 両者に陰性なものをNon-B, Non-T例であり, その他としてホジキン様リンパ腫ととした. 洗浄はすべて10mMリン酸緩衝液を用診断された症例が１例含まれていた.

い, ５分×３回とした.

犬のリンパ腫の免疫表現型については, Ｂ細胞性が６例であり, これら解剖学的発症部位で成績みると多中心型３/３例, 皮膚型２/５例, 消化管型１/10例であった. 形態学的特徴に基づく抗原賦活化緩衝液pH 6.0ではCD79, CD３とと, 濾胞性混合型３/４例, び漫性混合型２/９もに染色性は弱く, pH 7.0およびpH 9.0では例, び漫性大細胞型１/６例であった. Ｔ細胞

CD79, CD３ともにバックグランドに非特異反性は12例であり, 解剖学的発症部位でみると消応が強く評価できなかった. pH 8.0において化管型８/10例, 皮膚型２/５例, 孤在型と縦隔はCD79, CD３ともに染色性は特異的であり,型がそれぞれ１/１例であった. 形態学的特徴非特異反応は認められず, 染色性は良好であっによると, び漫性混合型７/９例, び漫性大細た (図１). 固定条件による染色性の違いは認胞型５/６例であった. Non-B, Non-Tはホジめられなかった.

キン様リンパ腫を含め２例であった (表１,２).

リンパ腫と診断された犬の症例は, ビーグル

追跡調査で腫瘍摘出後の経過観察が可能であっ３例, ゴールデン・レトリーバとマルチーズ各た症例は, ９症例あり, その生存期間は, 表３２例, ラブラドール・レトリーバ, ドーベルマに示す通りである. Ｂ細胞性リンパ腫の２例の表１

解剖学的発症部位別の細胞型

細胞型

消化管型

皮膚型

多中心型

Ｂ

１２３Ｔ８２Non-B, Non-T

１１Total10５

孤在型

１12２３１１20

形態学的分類別の細胞型

細胞型

び漫性大細胞型

び漫性混合型

濾胞性混合型Ｂ

１２３Ｔ５７

その他

合計
６12Non-B, Non-T
６合計
６１

表２Total

縦隔型

９― 45 ―

１１２４１20表３

腫瘍摘出後の生存期間

年齢

性別

主な腫瘍部位細胞型

化学療法

初診時からの生存期間

13歳

雌リンパ節

Ｂ無94日

13歳

雄リンパ節

Ｂ有325日 (経過観察中)７ヵ月

雄縦隔Ｔ有67日

６歳

雄十二指腸

Ｔ

無35日

７歳

雄十二指腸

Ｔ

有41日

11歳

雌皮膚

Ｔ

有41日

11歳

雄回腸

Ｔ

有97日

11歳

雄指間Ｔ

無276日 (経過観察中)

１歳

雄リンパ節

NonT/B

有308日

うち１例では, 初診時からの経過観察では, １

染色性は組織の固定法, 固定時間などの影響年近くになっており, 現在も生存中であった.

を受けるという報告 [７] がヒトにおいてなさ

Ｔ細胞性リンパ腫の６例うち５例は35−97日でれており, 犬においてもその可能性が考えられ死亡したが, 指間の小腫瘤であった皮膚型リンているが [４], 今回の検討において差異は認パ腫１例は現在も生存中である.

められなかった. しかし, 今回は１日および１ヵ月の固定時間とユフィックス固定においての考察みの検討であったので, 更なる検討が必要であると思われた.

パラフィン切片におけるCD抗原の染色には今回の検索では性差が認められ, 雄の症例数前処理として, 熱による抗原賦活化処理が必要(16例) が雌 (４例) の４倍であり, その差はなものが多い. 今回使用したCD79およびCD３明らかであった. 犬におけるリンパ腫では, 消はともに強めの熱処理が必要であった. 加熱処化管型においては雄の方が雌よりも発生が多い

理としてはマイクロウェーブ, 恒温槽, オートことが知られているが, それ以外では通常性差クレーブなどが主に知られているが, オートクは認められていない [１,８,９,10]. しかし,レーブは条件設定が容易であり, 加熱効果も安Sueiroら [８] の報告によると, 雄34例 (61.8定していることから今回使用することとした％), 雌21例 (38.2％) となっており, 性差が[４,５,６]. 一般に免疫組織化学染色において,認められている.

前処理における抗原賦活化緩衝液のpHは染色犬におけるリンパ腫の解剖学的発症部位は多性に影響を与える重要な因子であり [５],い順に多中心型, 消化管型である [１]. 多中

Dako推奨の緩衝液のpHは両者とも9.0である.

心型は全体のおよそ80％を占める [１,８]. 今

今回の検討ではpH 8.0が最も良好な染色性を回の検索においては, 消化管型が50％と半数を示したが, ヒトにおいても推奨条件下において占め, 多中心型は15％と少数であった. 多中心

染色性が不安定なものも認められている [５].

型の場合そのおよそ80％は左右対称性に末梢リ

今回の条件設定では, pHが染色性に及ぼす影ンパ節が腫大する [１,11]ので, 腫大したリン響を解明することは出来なかったが, オートク

パ節のfine needle aspirationにより臨床の現場レーブによる免疫組織化学染色を行うにあたり,で診断が可能である [10,12]. このことが今回各施設, 各抗体における最適pHを設定するこの検索において多中心型が少なかった原因のひとも重要であると思われた.

とつであると考えられた.
― 46 ―

犬のリンパ腫の免疫表現型についてはSueiro

よりＴ細胞性の方が悪いとされる [１,２]. 今ら [８] やCaniattiら [12] が示すようにＢ細回の症例における初診時からの生存期間は, Ｔ胞性リンパ腫の方が多数を占めるが, 今回の検細胞性リンパ腫の方が短くなる傾向が伺えたも索では, Ｔ細胞性が60％, Ｂ細胞性が30％であっのの, 症例数が少ないため比較検討は困難であた. これは, 多中心型のおおよそ80％がＢ細胞り, 今後さらに症例数を多くして検討する必要性であるということ [12,13] と今回の検索にがあるものと思われた.

おいては多中心型が少数であり, 今回の検索で引用文献はその多くがＴ細胞性である消化管型が多数を占めたということに起因すると考えられた. ヒトにおける消化管型リンパ腫は, そのほとんど[１] Jacobs RM, Messick JB, Valli VE：

がＢ細胞性であり, Ｔ細胞性は極稀であるがTumor of the hemolymphatic system,[９], 犬の消化管型リンパ腫のおおよそ70〜80

Tumors in Domestic Animals, Meuten％がＴ細胞性である [９,10].

DJ ed, ４th ed, 119-151, Iowa State

今回の検索において, 皮膚型リンパ腫のうち,Press, Ames, USA (2002)

ホジキン様リンパ腫を除く４例のうちＢ細胞性[２] Patterson-Kane JC, Perrins Kugler B,

およびＴ細胞性がともに２例であった. 過去にFrancis K：The possible prognostic

おいても, Sueiroら [８] は７例の皮膚型リンsignificance of immunophenotype in

パ腫のうち４例がT細胞性, ３例がＢ細胞性でfeline alimentary lymphoma：A pilot

あったとしており, Day [14] も上皮向性を示

study, J Comp Pathol, 130, 220-222

した７例の皮膚型リンパ腫のうち３例がＴ細胞(2004)

性, 残る４例はＴ細胞およびＢ細胞に陰性であっ[３] Carter RF, Valli VEO, Lumsden JH：たと報告している. これらは, すべて症例数がThe cytology, histology, and prevalence

４例あるいは７例と少数であり, 今後の詳細なof cell types in canine lymphoma

検索が望まれる.

classified according to the National

腫瘍細胞が混合型を示したのは, Ｂ細胞性でCancer Institute Working Formulation,は約83％, Ｔ細胞性では約67％であった. Ｂ細Can J Vet Res, 50, 154-164 (1986)

胞性混合型は全例において正常Ｔ細胞が反応性[４] 川井健司, 堤 寛：酵素抗体法, 200-208,に浸潤し, 腫瘍性Ｂ細胞と正常Ｔ細胞の間で大新染色法のすべて, 水口国雄ら編, 医歯小不同が認められた. これに対し, Ｔ細胞性混薬出版, 東京 (1999)

合型は皮膚型１例においてのみ, 正常Ｂ細胞の[５] 篠宮克彦, 細田周二, 根元充弘, 野呂昌

反応性浸潤が認められたが, その他ではＢ細胞弘, 秋草文四郎, 濱川真治：免疫組織化の浸潤は認められず, 腫瘍細胞自体に大小不同

学的染色における前処理, 医学検査, 50,が認められた. 以上のことから, HE染色標本

167-173 (2001)

において, 腫瘍細胞以外に小型正常リンパ球が[６] Bankfalvi AA, Piffko J, Ofner D, Dreier

認められれば, Ｂ細胞性である可能性が示され

R, Bocker W, Werner K：Significanceた.

of wet autoclave pretreatment in

犬リンパ腫の免疫学的表現型は, 予後因子とimmunohistochemistry, Pathol Oncol

して重要な役割を担っており, 治療として主流である化学療法への反応性と再発率はＢ細胞性Res, ２, 71-77 (1996)[７] 国仲伸男, 柳橋宏子, 三五朋子, 渡司博― 47 ―

幸, 藤川淳策, 藤本純一郎：パラフィン

43, 339-344 (2006)

切片における小児血液腫瘍のマーカー診[11] 辻本 元：白血球 (系) の疾患, 678-687,

断鑑別表の作成, 医学検査, 50, 174-182

新獣医内科学, 村上大蔵ら編, 文永堂出(2001)

版, 東京 (2003)[８] Sueiro FAR, Alessi AC, Vassallo J：[12] Caniatti M, Roccaabianca P, Scanziani

Canine lymphoma：A morphological

E, Paltrinieri S, Moore PF：Canineand immunohistochemical study of 55

lymphoma, immunocytochemical analy-cases, with observations on p53 immu-

sis of fine needle aspiration biopsy,noexpression, J Comp Pathol, 131, 207-

Vet Pathol, 33, 204-212 (1996)

213 (2004)[13] Culmsee K, Simon D, Mischke R, Nolte[９] Coyle KA, Steinberg H：Characteriza-

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Med, A47, 199-206 (2001)[10] Ozaki K, Yamagami T, Nomura K,[14] Day MJ：Immunophenotypic characte-Narama I ： T-cell lymphoma withrization of cutaneous lymphoid neoplasia

eosinophilic infiltration involving thein the dog and cat, J Comp Pathol,

intestinal tract in 11 dogs, Vet Pathol,

112, 79-96 (1995)

台湾におけるオウム類鳥類からの鳥ポリオー
マウイルスおよびオウム類嘴羽病ウイルスの検出と塩基配列分析
Hsu CM, Ko CY, Tsai HJ (国際台湾大学)
Avian Dis, 50：348-353 (2006)
鳥ポリオーマウイルス (APV) およびオウム類嘴羽病ウイルス (PBFDV) は, オウ
ム類の鳥における最も一般的なウイルス疾患である. しかし, 台湾ではオウム類の鳥におけるこれらのウイルスの存在は, これまで証明されたことがなかった. 台湾のオウム類の鳥類からの分離ウイルスに, APVとPBFDVのゲノムが存在するかどうかを確定するためにPCR法が採用された. 2002年から2005年の間に, 計22種165羽のオウム類の鳥類が検索さ れ た . 調 査 の 結 果 APV 陽 性 が 15.2 ％ ,PBFDV陽性が41.2％, APV/PBFDV混合感染が10.3％であることが明らかとなった. ク
ローニングおよびシークエンス後, PCR産物の塩基配列は, GenBank から得られた塩基配列と比較された. APVについて, VP1およびt/T抗原コード領域ヌクレオチドとの相同性は各々97.5％〜100％と97.6％〜100％であった. PBFDVについて, ORF V１およびORF C１塩基配列とのヌクレオチド相同性は, 各々92.2〜100％および83.3〜100％であった. アミノ酸塩基配列由来のPBFDV ORF
V１断片の配列によって, ２つの複製モチー
フとヌクレオチド結合領域モチーフが保存されることが明らかとなった. PBFDVにおいて, ORF V１アミノ酸配列で推定される42の位置のうちの６つが, 超可変であると考えられる. この研究で調べられた４つのゲノム断片に基づいて確立された系統発生樹では,特定のAPVまたはPBFDVの塩基配列の配置で鳥種を明確にすることはできなかった.

― 48 ―(岩手大学獣医病理学研究室)