アプリケーションノート

Ultra シリーズ(43MHz, 60MHz, 80MHz)
溶媒抑制と 13 C デカップリングに依り合成と反応制御に効力を発揮します。

図 1.製品の迅速な分析のために化学実験室で使⽤される Spinsolve NMR 分光計
典型的なサンプル中のプロトン化溶媒の分析には、溶媒抑制および対象化合物のスペクトルを取得するための炭素デカップリング法の使⽤が必要です。

溶剤抑制
化学実験室に設置された卓上型 NMR システムは、通常、重⽔素化溶媒の代わりに軽⽔化溶媒に溶解した試料の識別または定量化に適⽤されます。軽⽔化溶媒のサンプルでは、 NMR スペクトルを取得する際に 2 つの大きな課題があります。
1 つ目の課題は、分光計の受信機を飽和させる可能性のある軽⽔化溶媒からの信号により、受信機から受ける信号が強制的に低下し、スペクトルの感度や SNR（信号対雑⾳⽐）が急激に低下します。この問題は特に⾼磁場NMR システムに影響します。この⼀般的な問題の解決策は測定開始前に溶媒抑制法を適⽤して、溶媒由来の信号を減衰させることです。これらの⽅法の使⽤は⾼磁場システムでは必須ですが、卓上型 NMR システムでは必要ありません。これらのシステムのより低い電界強度では、NMR 信号の振幅は⼩さく、レシーバーアンプは純粋な溶媒のシグナルを取得できるような⼗分に広いダイナミックレンジで設計されています。
これにより、スペクトルで最適な SNR を取得することが可能となります。Spinsolve でレシーバーの広いダイナミックレンジを⽰します。具体例として純⽔に 10mM ヒスチジンを溶解させたスペクトルでは、⽔のスペクトルを取り除きます。純⽔は約 55Ｍの濃度を持っており、NMR のスペクトルでは 110M の単⼀ピークになって現れます。図 2a)は実物スケールで、図 2b)はズームスペクトルを⽰します。受信機の飽和によって引き起こされる歪みを⽰しています。溶質の濃度が溶媒より 1 万倍⼩さいこと（ヒスチジン 10mM、純⽔ 110M）を考慮に⼊れると、溶質の信号を確認するには、垂直スケールをズームする必要があります（図 2 b）
。これが 2 つ目の課題です。
図 2b(⾚)に⽰しています。スペクトルより、ヒスチジンからの⼩さい信号は純⽔の信号により被さっているよう1

に⾒えます。純粋のピークがスペクトルの大部分をカバーしてしまい、定量化はほとんどできません。溶媒のピークを抑制することは卓上型システムにとって溶媒のピークを削除するために⾮常に役⽴ちますが、これらの⽅法は周波数を選択しているため、磁⽯の磁場が⾮常に均⼀である場合にのみ効率的に機能します。均⼀な磁場において、特定の官能基のすべての原⼦核は同じ共鳴周波数を持っており、NMR のスペクトルの形状は、サンプルの緩和時間によってのみ定義されるローレンツ関数で記述されます。この基準が満たされている場合、NMR信号は均⼀な広がりであり、すべての核は共鳴周波数を実際に持っています。

図 2.
a）ヒスチジン(純⽔を溶解させた濃度 10mM)のスペクトルb) a)で実際に得られたスペクトルを 2000 倍に拡大したスペクトル
⾚のスペクトル：標準シーケンスの測定で得られたスペクトル緑のスペクトル：溶媒抑制シーケンスの測定で得られたスペクトル2垂直スケールで表⽰され、55 モルの濃度（実効 110 モルの⽔素スペクトル）。ヒスチジンのシグナルが純⽔のピークとどのようにオーバーラップするかを観察できます。標準シーケンス（⾚）の巨大な⽔のピークですが、溶媒抑制シーケンスを使⽤することで、⽔のピークが減衰するポイントで、スペクトルですべて⾮常によく解決されます。⽔のピークは共振周波数で現れるため、ヒスチジンの信号に影響を与えることなく効率的に除去されます。b）のスペクトルは、Spinsolve 60MHz カーボン ULTRA で 64 回のスキャンと 10 秒の繰り返し時間を使⽤して取得されました。

ピークはスペクトルの広範囲に及ぶ可能性がありますが、ラインの中⼼周波数で連続して励起ことにより、全体としてピークを減衰させることができます。この状況で、溶媒抑制は溶媒ピークのテールを大幅に減らし、⽣成物のシグナルをより正確に定量化することができます。図 2a および 2b に⽰すシアンのスペクトルは、選択的励起パルスは、NMR 信号の取得に⽔のピークの共振周波数で 2 秒間適⽤されます。この測定では⽔の信号が約100 程度減少させたのに対し、ヒスチジンに対応する信号は影響を受けませんでした。
2 つ目の事例として、図 3 に、⽔に溶解したショ糖 25 mM サンプルでの溶媒抑制法のスペクトルを⽰します。
このサンプルは、5.4ppm 領域におけるアノマー効果のプロトンのシグナルに影響を与えることなく、⽔のピークを飽和させるための溶媒抑制の標準的なテストサンプルとして使われます。Spinsolve 卓上型 NMR 分光計はサンプルとは独⽴した測定機能を有する外部のハードロックシステムを備えているので、サンプルは重⽔を必要としないことを留意してください。このピークは、標準測定（⾚）の⽔ピークのテールと完全に重なっていますが、溶媒抑制（緑）で測定されたスペクトルで完全に分離されます。

図 3.ショ糖（純⽔に溶解させた 25mM）のスペクトル（⾚は標準のシーケンスで測定した場合、緑は溶媒抑制法で測定した場合。スペクトルは、64 回のスキャンと10 秒の繰り返し時間を使⽤）
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この⾼性能の溶媒抑制は、磁場が⾮常に⾼く均⼀な場合にのみ達成できます。
これは卓上型 NMR の課題です。
卓上型分光計における永久磁⽯の形状は可能な限り⼩さくし、最大の磁場を形成させる必要があり、標準の5mmNMR チューブを使⽤するようにサンプル量を制限します。試験を開始するために最適化で最も苦労するのは、磁場の均⼀性です。⼀般的に、チューブの中⼼で適度な均⼀にすることがよいのですが、不均⼀になる傾向があります。サンプル溶液がチューブの壁に近づくと、半分程度の⾼さで⽐較的狭い線形状になり、ピーク底辺部が⾮常にブロードに可能性があります。磁場の不均⼀性によるテールによって定義されている場合、溶媒抑制⽅法は適切に機能しません。
これは、この⽅法で使⽤される選択的励起はピークの中⼼に近い周波数でのみ核共鳴で飽和させるだけだからです。テールは、磁場はチューブの壁の近くのような、異なる強度を持っています。単なる核の信号であるため、チューブ中央部の飽和状態において、核の⼀種が異なる配列になるため⼗分な飽和状態ではありません。極端な場合、テールは影響を受けません。したがって、ピークの中⼼は減衰できますが、テールのオーバーラップは残り、溶媒抑制の⽅法は私たちにとってメリットがありません。
磁場の均⼀性がスペクトルのピークの線形を定義するので、磁⽯の均⼀性を指定するための⼀般的な⽅法は、クロロホルムの標準サンプルの NMR ピークの分析によるさまざまな⾼さで線幅（LW）を提供することです。
主な指標として、ピークの 50％で LW を使⽤するのが⼀般的ですが、溶剤抑制法⽤により期待できるパフォーマンスを決定するのは LW です。⾼磁場の場合、線の幅はピーク⾼さの 50％、0.55％、および 0.11％で通常指定されます。アプリケーションで溶剤抑制が必要なとき、最⾼のパフォーマンスを実現するには、Magritek は2017 年に SpinsolveULTRA モデルを紹介しました。これまでの Spinsolve のバージョンは、今日まで卓上 NMR市場で利⽤可能な最⾼の均質性を提供しております（Spinsolve ではピーク⾼さの 50％で LW <0.5 Hz、ピーク⾼さの 0.55％で<20 Hz。ULTRA モデルはピーク⾼さの 50％で<0.2 Hz、0.55％で<6 Hz、0.11％で<12Hz）。上記のデータは⾼磁場磁⽯によって提供される均⼀性と同等です。そのような線形の例は図 4 に⽰すように、標準のクロロホルムサンプルを測定した場合に⽰されました。この点で、Spinsolve ULTRA は、LW を 0.11%という濃度で測定ができることが市場で唯⼀のモデルであることです。この ULTRA による⾼い均⼀性により、他の卓上型システムとは異なり、溶媒シグナルのような、最⼩の信号を解決することができます(図 4 参照)。

拡大図4

図 4：20％重アセトンに溶解したクロロホルムサンプルのスペクトル。
この図は、ピーク振幅の 50％での線幅が指定されている完全な線形を⽰しています（黒）。拡大したスペクトルは、ピーク⾼さの 0.55％を特定するための参照として、クロロホルムの炭素のスペクトルを⽰しています。この
ピーク底部の幅も 0.11％で⽰しています（茶）。

13C デカップリング

前例では、⽔を溶媒として使⽤しました。しかしながら、スペクトル中における複数のピークを含む有機溶媒は、サンプルの溶解度や調査中の反応に応じて頻繁に使⽤されます。図 5a)は、エタノールに⼀定濃度で溶解した170mM のパラセタモールサンプルのフルスケールスペクトルを⽰しています。溶媒としてのエタノールの濃度は約 17M なので、溶媒の信号のみが実サイズのスケールで表⽰されます。100 倍のズームにより、大きな溶媒のベースに含まれるパラセタモールのピークシグナルを特定できます（図 5 b）。この例は、Spinsolve レシーバ
ーが飽和の影響を⽰したり、感度を損なうことなくきちんと溶媒のシグナルを減衰させていることを取得できているこが再度確認できます。3 つの溶媒シグナルの中⼼での溶媒のピーク抑制を図 5c)で観察することができます。スペクトルの取得前に適⽤される選択的励起パルスは、約 100 倍の飽和を達成し、溶媒のピークの振幅はパラセタモールのシグナルと同等になります。

5図5a）170mM パラセタモールのスペクトル（エタノールに溶解させた）。
b）a)のスペクトルを 100 倍に拡大したもの
c) 溶媒であるエタノールのシグナルを抑制させた⽅法で測定したスペクトル

溶媒を抑制するシーケンスは溶媒ピークのテールを除去する役割を果たすだけでなく、有機溶媒によって引き起こされる新しい問題をすばやく特定します。有機溶媒には CH 基があるため、これらのグループの炭素原⼦がスペクトルに表⽰されます。同位体の 13 C は 1％存在し、17M のエタノール分⼦には 13 C が 170 mM あります。
この例では、サンプル中のパラセタモールと同じ濃度です。ここで使⽤されるエタノール濃度は、通常の反応で期待できる濃度と類似しており、炭素原⼦は、有機溶媒を使⽤するときに予想される共通の問題です。強力なNMR スペクトルから炭素原⼦のスペクトルを取り除くことは、炭素デカップリングとして知られています。
溶媒抑制期間中または信号取得中は 13 C 核の継続的な励起が必要です。図 6 は Spinsolve Carbon ULTRA シス
テムに実装された 2 番目のオプションで得られた結果で、1H 信号と炭素チャンネルの励起を同時にできます。
このことが、炭素原⼦をモニタリングできる装置を含めた、反応モニタリングアプリケーションに有利であると考えます。というのも 13 C の測定には測定時間を長時間必要なため、フローアプリケーションで検出しようとすることは核ではないという根底があるからです。

6図 6：カーボンデカップリングあり a）となし b）で取得されたスペクトルの⽐較。
炭素デカップリングの存在下では、13 C 炭素は完全に排除され、製品のシグナルのみが検出されている。

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