2018.04.01

ESI-TOF-MS(Burker・micrOTOF)
一般ユーザーマニュアル
分析計測分野kikibun@okayama-u.ac.jp

目 次〇分析機器の構成

1〇分析開始の前準備

2〇試料の測定

5〇測定結果の解析

7〇終了操作

10〇参考資料

11〇トラブル発生時の連絡先

16＜設置場所＞
自然科学研究科棟 4 階 405 号室 （内線 8633）＜試料調製について＞(1) 溶媒にはメタノールやアセトニトリルを用いるが、水が 5%以上含まれていた方がイオン化しやすい。
★ベンゼンやトルエンやクロロホルムは PEEK チューブを溶かすので、使用する場合は SUS 配管への付け替えが必要。
★ペプチドなどの両性イオンの試料の場合、pH3（ギ酸，アセニト系）などとし、positive モードで測定することが多い。
(2) 試料濃度は 10 µg/mL を最高濃度として、10 倍希釈系列で３つほど調製（0.1, 1, 10 µg/mL）し、低濃度のものから測定する。
★Peak intensity 104-105 程度が適している。106 オーダーになると、ハイマスが合いにくくなる。

＜持参するもの＞(1) 試料（上記各濃度品；200-1000 uL。MS 室で希釈するなら最高濃度品 100 uL だけでも可）(2) 希釈用溶媒及び細バイアル（希釈用。MS 室で希釈するなら，１試料あたり３本ほど）(3) 3.5 mM ギ酸ナトリウム in 5-50% H20-MeOH or MeCN（キャリブレーション用 m/z 100-1,000 程度）（Tune mix は m/z 2,700 程度まで，CsI は m/z 10,000 まで）(4) 装置洗浄用アセトニトリル or メタノール （質量分析グレード品）(3.5 mM ギ酸ナトリウム in 50% H20-MeOH 、80%メタノール（洗浄用）は測定室に共同利用品あり)

分析機器の構成

micrOTOF ベーシックトレーニングテキスト virsion 3.2 (14.03.09) より抜粋

1

分析開始の前準備
本体電源投入前の「使用申込書・使用報告書」記入

使用簿に、使用者・開始時刻など、必要事項を記入し、以下の「使用前の確認事項」を確認する。

１. 【稼働前のチェック】★ 下記の項目（チェック表 4）をチェックすること。
1. 室内空調のエアコンは正常に作動しているか（設定 23～25℃）
換気扇を ON にする
2. 部屋隅の温度計は正常な範囲(23～28℃)にあるか？
3. MicroTOF Control は起動しているか
4. MicroTOF Control 内の「Standby」（黄色）が選択されているか
5. MicroTOF Control 内の「PC」「MS」はグリーンになっているか
6. MicroTOF Control 内の「Neb Gas」「Dry Gas」欄にチェックが入っているか
7. メソッドファイルとして esi-standby.m が呼び出されているか
8. esi-standby.m の設定値通り「Neb Gas 0.4 Bar,Dry Gas 1.5 L/min, Dry
Temp 180℃」となっているか
9. 窒素ガス発生装置の Flow 値は正常(2.2～5.0 L/min)か
10. 窒素ガス発生装置の Pressure 値は正常(0.550-0.605 Mpa)か
11. 真空度は正常か （High: 1e-06mbar 以下, Fore: 3e+00mbar 程度）
12. MicroTOF Control 内の「Operate」(緑色)を選択するとピークが検出されているか

910

測定開始後に確認、記入する

7345682112. 【Method の呼び出し】
Method メニュー → open をクリック

2 回目以降、同じ条件の Method を
基本 Method の中から目的に応じた分子量範囲の Method を選択する。
選択した Method をコピーして研究室用の Method として名前を付けて保存する。

使用する際は、コピーした研究室用のMethod を読み込んで使用する。

Neg, Pos のモードを変更した時は10min 程度待つ

Method 内容の詳細は参考資料で確認する。
★ 装置設置時に作成された基本Methodファイルそのものは使用しない。
それをコピーしたもの、あるいはコピーを自分用にカスタマイズしたものをMethodフォルダ内に自分の名前のフォルダを作って格納し、それを使うようにする。

注意：・default メソッドの上書き禁止！
・使用メソッドは、各研究室フォルダに save しておくこと（ファイル名 ”20100128esi_pos_low.m” など）＊基本 Method は目的に応じた分子量範囲のメソッドを選択する。表記の分子量は目安なので、これを元に、使用目的に応じたパラメータ変更を行う。
ポジティブイオンモード

ネガティブイオンモード

・esi_pos_low (m/z: 100-1000)

・esi_neg_low (m/z: 100-1000)

・esi_pos_wide (m/z: 300-2000)

・esi_neg_wide (m/z: 300-2000)

・esi_pos_high (m/z: 1000-3000)

・esi_neg_high (m/z: 1000-3000)

3

3. 【キャリブレーション】
1. Calibration タブの Reference List で使用する標準物質を選択する。
通常は「Na Formate (pos)」もしくは「Na Formate (neg)」

5

1

6(5)

(6)

2. シリンジを洗浄し、洗浄液をセットする。
3. Operate をクリックし、MS スペクトルが表示されることを確認する。

1.稼動前のチェック 12. 記入（Operate が緑色になる）
4. スペクトル強度が低いことを確認後、シリンジを外し、標準物質に入れ替えてシリンジポンプにセットする。
5. ギ酸ナトリウムのスペクトルが検出されたら、Calibrate ボタン押す。
（「Show」ボタンを押すとキャリブレーターのマステーブルを見ることができる。）
6. スコアが黄色（70-95%）もしくは緑色（95-100%）が出たら Accept 押す。赤色（70%未満）では Accept 押しても受け入れられない。

★ 外部標準法を行う場合は、標準物質の測定データをとっておく。

7. 必要に応じて、使用溶媒でシリンジとラインの洗浄を行う（MS operate のままで良い）

4試料の測定メソッドパラメーターの編集・確認、データ取り込み開始【試料測定】
Sample Info のタブにサンプル情報を入力する。

2
1
2

1

1. Data File の Analysis Name, Subdirectory（保存先）を入力する。
各自研究室フォルダに保存する。（Path は D:/DATA/のまま変更しない。）
2. Sample Parameter に試料情報を入力することも可能。
入力すると緑文字で入力され、Apply で確定すると黒字になる。

3. 測定時間を入力する。
クロマト内で右クリックし、「Edit Segment Limit」をクリックし、測定時間を入力して、「OK」をクリックする。
（途中で標準試料に入れ替えて測定する場合は、5min 程度は必要）

３
３

5

4.

ボタンをクリックして、測定をスタートする。
（「Operate」「PC」「MS」が青色になる）

4
5. 途中で標準試料に入れ替えて測定する場合は、1.5min 過ぎたくらいでシリンジを外して、溶媒で洗浄後、校正物質を流す。
（試料と同程度の強度が良い）

6. 設定時間が経過すると自動的に取り込みが終了する。

6(設定時間前に中断する時は、 ボタンをクリックする。)

6

測定結果の解析【データ解析】（解析例）

解析中は溶媒を流して洗浄する。
MS は Standby にしておく（HV は消え、Nebulizer はついている）。
1. Compass Data Analysis で解析したいファイルを開く。

2. MS スペクトルの確認
矢印のあるアイコンをクリックし、クロマト上で、クリックすると中段に MS スペクトルが表示される。（右ドラッグで範囲指定することも可能）

3. MS スペクトルの保存表示させた中段の MS スペクトル上で右クリックし、「copy to compoundSpectra」で下段にコピーされる。
同様に標準物質のスペクトルを表示させ、下段にコピーする。
（Compound Spectra にサンプルと標準物質のスペクトルがある状態）

7

4. MS スペクトルの校正
標準物質の MS スペクトルを選択した状態で、上部バーの Calibrate → Internal をクリックする。

使用した校正用標準溶液を選択する

Mode を「Linear」「Quadratic」「Enhanced quadratic」から選択する。(＊参考)「Auto Search」をクリックする。
Calibration list の Error が 1ppm 以内になるように不要な値は「Remove」で除く。
（目的物の値を挟み込むように残す値を選ぶ。）「Recalibrate」をクリックすると、Compound Spectra の MS スペクトルの値が補正さ＊参考：
Enhanced quadratic モードは狭いm/z 範囲には向かないが、Linear は通常使用しない。
<広い範囲>
Enhanced quadratic
Quadratic
Linear<狭い範囲>れる。

8

5. 組成式の推定
上部バーの Chemistry → SmartFormula Manually をクリックする。

C,H,N,O の既知の数や、C,H,N,O 以外で、含まれている可能性のある組成があれば入力し、Tolerance で誤差を入力し、SmartFormula Manually の画面を開いたまま、Compound Spectra の目的物のイオンピーク上でクリックすると、SmartFormula Manually の画面に組成式推定の結果が表示される。
クリック

6. 印刷：
Print Preview の Layout で形式を選択して、印刷または、PDF で保存する。
（例）

Generic Display Report （Display で表示させている内容）
Mass Spectrum SmartFormula Report （組成式推定結果）
Auquisition Parameter Report （測定条件）

9

終了操作
1. スタンバイ method の読み込み
micrOTOF control 画面で Method → open → 「esi-standby.m」を開く。
（MS は standby 状態。「Neb Gas」「Dry Gas」は on で「HV」は off）
2. イオン源の洗浄
イオン源右側面のレバーを奥方向に倒し、イオン源を開ける。
ネブライザーニードルの下にキムワイプを置き、洗浄したシリンジを用いて、洗浄用溶媒をイオン源に手押しで送液する。この操作を 2 回程行う。
溶媒を湿らせたキムワイプでスプレーシールド表面を拭き、イオン源を閉じる。
3. シリンジポンプの電源を OFF にする。
★ 下記の項目（チェック表 4）をチェックする。
1. 配管チューブ・イオン源の洗浄は行ったか
2. メソッドファイルとして esi-standby.m を呼び出したか3. 2.の設定通り「Neb Gas 0.4 Bar,Dry Gas 1.5 L/min, Dry Temp 180℃」となっているか
4. MicroTOF Control 内の「Standby」(黄色)が選択されているか
5. MicroTOF Control 内の「PC」「MS」はグリーンになっているか
6. MicroTOF Control 内の「Neb Gas」「Dry Gas」の欄にチェックが入っているか
7. 真空度は正常か （High: 1e-06mbar 以下, Fore: 3e+00mbar 程度）
8. 窒素ガス発生装置の Flow 値は正常（2.2～5.0 L/min）か
9. 窒素ガス発生装置の Pressure 値は正常(0.550-0.605 Mpa)か
10. シリンジ・溶媒類は適切に片付けたか
11. インフュージョンポンプは OFF にしたか
12. プリンター・PC ディスプレイは OFF にしたか
換気扇を OFF にする

異常な点・気がついた点等あればメモをする

10

データの転送と持ち出しデータの取り出しは、測定室中央机上の解析 PC から行う。

１. 解析 PC の電源を入れる。

２. micrOTOF 制御 PC のデスクトップにある「共有フォルダ」内に研究室フォルダを作成し、そこに取り出したいファイルをコピーする。

３. 解析 PC のデスクトップにある「共有フォルダ」にコピーしたファイルが入っているので、解析 PC からデータを取り出す。
＊USB メモリ等は必ず使用直前に最新のウイルス定義でスキャンしたウイルスフリーのものを使用すること。

11

参考資料
Method 内容の詳細を以下に示した。
＜Mode タブ＞
以下 3 つにチェックが入っていることを確認する。
・ Save spectra（測定したスペクトルは毎回保存）
・ 「Include Profile Spectra」の always（常にプロファイルスペクトルも取り込む（ハイマスに必要））
・ 「Focus」の Active（これつけないと分解能落ちる。ただし、LC-MS ではデータ点かせぐためにチェックを外す）＜Source タブ＞

・ Capillary : ポジでは電圧は-4500 V のままに。電流は通常 15 nA 以上（18 など）。低い場合（3 や 5 など）は異常。 ネガでは初期値+3000V だが、+3500Vにするとピークでやすくなることもある（2011.10.28）
・ Dry Temp : 通常は 180℃付近（200℃越えないこと）。水 50％以上の溶媒を用いるときは，180℃もしくはそれ以下。200℃では溶媒が沸騰してしまい、イオン化しなくなる可能性あり。

MS Operate の時の電流の値

12・ Target Mass Range : 試料濃度が低いなど、高感度での測定を行いたいときには、特に見たい質量範囲を狭めに設定して Autotune することで、その範囲に適したイオンガイド調整となり、感度を高めることができる。その場合、Hexapole RF も調整する必要がある。ただし、校正では使わない（標準試料の各ピークの強度が変わることで校正が合わなくなることがある）。
・ Capillary Exit ： 数値を下げるほど、イオンの次の通過点である Skimmer 1 との電位差が小さくなるため、不安定なイオンや低分子のイオンが見えやすくなる（Insource CID の回避策）。ただし、検出器へ誘導されるイオンが減少するためか、感度低下することもあるので注意。ポジでは 150V が適当？（80V では校正できず。2010.11.17）★Neb ガス量と Dry ガス量はそのままに（LC 導入の場合には，指定の値に変更する必要あり）。
＜MSMS(ISCID)タブ＞ 通常は OFF にMS/MSMS(ISCID)にチェック入れると ON になり、導入されたイオンすべてがフラグメンテーション化する。選択的フラグメンテーションできないので、あまり実用性なし。
★純品でしかも MS でシングルピーク与えるものなら、フラグメントのハイマス測定できるので実用性あり！
＜右側のウィンドウ（ポジネガ，質量範囲）＞
・ Ion Polarity ： ポジネガが、ロードした Method ファ
イルに一致していることを確認。
・ Mass Range ： 測定質量範囲を入力（低分子測定なら 50-1000 にしておけばよい）★ハイマスをより正確に合わせたいときは、レンジを狭めにする。レンジ内に試料ピークをはさむ形で、ギ酸ナトリウムのピークが３本（quadratic）あるいは 4 本（linear）が入っていればよい。狭いレンジの場合はenhanced quadratic は適さない（広いレンジの場合に有効）。
・ Rolling Average ： MS クロマトの平均化処理の設定値。通常は 2.0×1.0 Hzでよい。

13

＜AutoTune＞
ほとんど使わない（Degitizer の補正により S/N 比向上させる）。
★Calibrarion を何回やってもスコアが赤色になるときには，有効なことがある。

14

positive mode

negative mode15

positive mode

negative mode16

トラブル発生時の連絡先
故障時には、 機器管理責任者 と所属研究室の指導教員へまず連絡して下さい。
装置の不具合、ご不明な点等ございましたら以下にご連絡をお願い致します。

機器管理責任者 ： 仁戸田 照彦 （内 8291）
岡山大学大学院環境生命科学研究科（農学系）

17

このマニュアルは、岡山大学 自然生命科学研究支援センターが装置ユーザーの為に作成したものです。許可なく内容の一部または全部を転載／複製することはできません。
2018.4.1 岡山大学 自然生命科学研究支援センター

18