生物窒素固定を促進する細胞外電子伝達を担う固体腐植様物質の構造解明
研究代表者：名古屋大学未来材料・システム研究所 教授 片山 新太
助教 笠井 拓哉
1．緒言
現在、全世界で一年間に 1 億 8000 万トンのアンモニアが生産され（小島ら 2011）、その約 8 割が窒素肥料の製造に使用されている（田島 2011)。アンモニアは、高温高圧を用いるハーバー・ボッシュ法によって大気中の窒素ガスを固定して工業的に製造されている。
ハーバー・ボッシュ法の化学反応は、以下の化学反応式で表され、窒素 1kg あたり 26MJのエネルギーが必要とされる（Boys 2011）。これは窒素ガスの反応性が乏しく、高温高圧下（20MPa、500℃）で反応させる必要があるためである。
N� + 3 H� ⇆ 2 NH� , Δ𝐺𝐺� = −12kcal/mol

ハーバー・ボッシュ法によって 1 年間に消費されるエネルギーは、世界エネルギー消費量の約 1%（原油換算で 1 億 2000 万トンに相当）を占めている。省エネルギー技術が世界的に必要とされる現在、この工業的空中窒素固定法の省エネルギー化は、将来必要不可欠の技術開発とされている。生物による空中窒素固定は常温常圧で省エネルギーであるため期待されているが、活性が低いため高活性化が必要である。近年、細胞外からの直接電子供与によって微生物の高活性化が可能であることが判ってきた。窒素固定微生物は細胞外電子を利用できないが、細胞外電子伝達物質を介すことによって電子供与・高活性化が可能である。しかし、これまで細胞外電子伝達物質としては、メチルビオローゲン等の水溶性有害化学物質が用いられており、実用化には無害且つ固体の細胞外電子伝達物質が必要とされる。これに対し本研究代表者は、あらゆる pH で不溶の固体腐植ヒューミン（以下、ヒューミン）とその類似物質が細胞外電子伝達能力を有し、脱ハロゲン菌(Zhang &Katayama 2012)、硝酸還元菌(Xiao et al 2016) 等の還元反応の活性化に加え、嫌気性非共生的窒素固定菌の高活性化も可能であることを明らかにしつつある。ヒューミンは、土壌の一画分で無害である上、アルカリ処理、酸処理、100℃煮沸処理でも機能が失われない非常に安定な物質である。しかし自然物であるため、その細胞外電子伝達効果はヒューミンによって異なる。窒素固定活性に必要なヒューミンの化学構造を明らかにできれば、将来それを出発点に生物窒素固定を促進する安定で高活性な新規環境材料としての利用が期待される。
そこで本研究では、ヒューミンが嫌気性窒素固定菌の窒素固定活性を細胞外電子供与によって高めることを明らかにするとともに、ヒューミンの化学構造を解析し、細胞外電子伝達に必要な化学的構造を明らかにすることを目的とした。

－ 335 －

2．実験方法
2.1 ヒューミンの調製
各種土壌および河川底質からヒューミンを抽出・調製した。風乾した試料を乳鉢・乳棒ですり潰し、ふるい（目開き 2mm）に通した。ふるった試料 100g を 250 ml 容遠心ボトルに入れ、150 ml の 2%HF 水溶液を加えて室温で 24 時間振とう（110 rpm）した。遠心分離（6000 g、10 分、24℃）し、傾斜法で HF 水溶液を除いた。同様の HF 処理を 10回繰り返した。次に HF 処理と同様に 150 ml 0.1M NaOH を加え 24 時間振とう後、遠心分離して水溶液を傾斜法で取り除く処理を 10 回繰り返した。処理後、試料を超純水で 20回洗浄（懸濁と遠心分離による）した。洗浄試料を 0.1 M NaOH 溶液を使用して pH 7.5に調整し、凍結乾燥後、乳鉢と乳棒で粉末にした。表 1 にヒューミン抽出に用いた各種試料を示す。
表1

各ヒューミンの由来

ヒューミンの由来
鎌島水田土壌

名古屋大学農場
荒子川底質

茨城畑土壌

弥富水田土壌

場所

土壌分類

愛知県弥富市Endoaquept

愛知県東郷町

愛知県名古屋市
愛知県弥富市シルト質壌土Palehumult

シルト質壌土Melanudand

軽埴土−

茨城県つくば市

特徴

Endoaquept

シルト質壌土シルト質壌土また、鎌島水田土壌から異なる方法を用いてヒューミンを調製した（表 2）。
表2 各種ヒューミンの抽出方法
抽出法

抽出操作
操作1

方法
0.1 N NaOH
1
方法 Benzene/meth
2anol (1:1 v/v)
方法
0.1 N NaOH
3操作2操作 3操作 42% HF

0.1 N NaOH

2% HF

0.1 N NaOH

HCl/HF (1:9 v/v)

Methyl isobutyl
kentone0.1 N NaOH

参考文献
操作 操作
操作 7560.1 N 蒸留 凍結
Zhang &NaOH 水
乾燥 Katayama 2012
Hatcher et al
蒸留 凍結水乾燥1985
Rice &蒸留 凍結水
乾燥
Maccarthy 1989

0.1 N
NaOH
0.1 N
NaOH
CHBr3 /0.1 N
ethanol
NaOH
3(1.8 g/cm )Almendros et al1996

方法40.1 M H3PO40.1 M Na4P2O70.1N NaOH

方法50.1 N NaOH

0.1 N NaOHと30 g/L Na2SO4混合物

30 g/L Na2SO40.1 N
NaOH

蒸留
水

凍結
乾燥

Tsutsuki &Kuwatsuka
1992

方法
60.1 N NaOH

6M尿素含有0.1 N NaOHDMSO + H2SO46% (v/v)→固相

0.1 N
NaOH

蒸留
水

凍結
乾燥

Hayes et al2010

方法70.1 N NaOH

6M尿素含有0.1 N NaOHDMSO + H2SO46% (v/v)→液相

Adjust pH 9 0.1 Nby NaOH NaOH

蒸留
水

蒸留
水

凍結
乾燥

凍結
乾燥

Hayes et al2010＊それぞれの抽出操作で24 時間振とう後、遠心分離して沈殿物を回収して次の操作を行った－ 336 －2.2 窒素固定微生物集積培養
Ashby 培地（マンニトール 20g/L、KH2PO4 0.2g/L、MgSO4・7H2O 0.2g/L、NaCl0.2g/L、K2SO4 0.1g/L、CaCO3 5.0g/L、pH=7.4+0.2）を作製後、1 時間窒素ガスでスパージングし、培地を各培養用バイアルへ移した。バイアルごとに数分間窒素バブリングを行い、ブチルゴム栓とアルミキャップで密閉し、オートクレーブ（121℃、20 分）で滅菌した。培地は使用するまで常温で保存した。ヒューミン添加培地を作製する際には、Ashby 培地を、あらかじめ最終濃度 15g/l となるようにヒューミンを添加したバイアルに移した。250 ml Ashby 培地を入れた 600 ml バイアルへ湿潤土（ほぼ水飽和した土壌）150ml を微生物源として添加し、ブチルゴム栓とアルミキャップで密閉したのち、ヘッドスペースを窒素ガス置換したものを 2 本作製し、30℃で 7 週間培養し、これを第 0 世代とした。
その後、第 6 世代までは各 4 週間、第 7 世代以降は各 2 週間の培養後に植え継ぎを行った。
第 1 世代以降は、50 ml バイアルに 20 ml の Ashby 培地を入れ、ヘッドスペースを窒素ガスで置換したものを用意し、前世代の培養物をそれぞれ 2 ml 接種して植え継ぎを行った。全て 30℃暗条件で静置培養した。
2.3 窒素固定促進効果試験
2.3.1 アセチレン還元活性試験
窒素固定酵素ニトロゲナーゼは、以下に示す反応式のように、窒素ガスと同様に三重結合を持つアセチレンガスを還元する能力を持っている（Schöllhorn et al., 1967）。そこで、窒素固定活性は、アセチレン還元活性試験により評価した（Burris et al., 1991）。
アセチレン還元反応 HC≡CH
窒素固定反応N≡N→ H2 C=CH2→ HN=NH→ H2 N-NH2→

2 NH3アセチレンは、Molecular Sieve 5A (60/80) 3m のカラムを付けた水素炎検出器付きガスクロマトグラフィー（GC-14B、島津製作所、京都）で測定した。
2.3.2 窒素含有量評価試験
また、窒素固定量を元素分析により評価した。元素分析には、ヤナコ MT-5 CHN 分析計（ヤナコ、京都）を用いた。
2.4 ヒューミンの酸化還元処理
ヒューミンを懸濁した嫌気性 Ashby 培地を入れた容器に、作用電極（白金ワイヤー、直径 0.8mm、長さ 1m）、カウンター電極（白金ワイヤー、同じサイズ）、参照電極（Ag/AgCl、+250mV vs.標準水素電極（SHE））をセットし、ポテンシオスタット（HSV-110、北斗電工、大阪）につないだ。還元する場合には－350mV(vs. SHE)、酸化する場合は+450mV (vs.
SHE) に電位を 24 時間維持した。処理の間、ヒューミン懸濁液は、嫌気チャンバー内で室温条件下、スターラーで連続撹拌した。還元型・酸化型ヒューミンの効果は、マンニト－ 337 －ールを抜いた Ashby 培地にヒューミンを加え、そこに飢餓培養した集積窒素固定菌群を接種してアセチレン還元活性を調べた。
2.5 ヒューミンの特性評価
2.5.1 元素分析
ヤナコ MT-5 CHN 分析計（ヤナコ、京都）を用いて、ヒューミンおよび培養物の炭素、水素、窒素の分析を行った。ヒューミンの場合は、灰分測定も行い、全量から炭素、水素、窒素および灰分の量を差し引くことで、酸素量を推定した。
2.5.2 フーリエ変換赤外分光分析（FT-IR）
FT-IR スペクトルは、JASCO FT-IR 6100 スペクトロメーター（JASCO、東京）を用いて KBr 法で測定した。4500 から 500cm-1 の範囲で 4cm-1 の解像度で 8 回の測定の積分を行った。
2.5.3 電子スピン共鳴分析（ESR）
ESR スペクトルは、JES-FA200 ESR スペクトロメーター (JEOL、東京)を用いて、分析した。ヒューミンは、固体粉末のまま石英硝子チューブ（JEOL、部品番号 422000281、内径 4mm）に、底から 40mm 詰めて測定した。ヒューミンは、あらかじめ 0.1N HCl ま
たは 0.1N NaOH を用いて、pH3 または pH11 に調製して測定した。
2.5.4

13C 核磁気共鳴スペクトル分析（13C NMR）

固体試料分析が可能なECA-700スペクトルメータ（JEOL、東京）を用い、13C CP/MASNMR測定を行った。
ヒューミンは、ジルコニア試料管に詰め、緩和時間1秒、接触時間2ms、共鳴振動数176MHz、スイーピング速度70.4KHzとし、80,000回ないし160,000回のスキャンを積分した。
2.5.5 X 線光電子分光分析（XPS）
シンクロトロン光を用いた XPS 分析を行った。ヒューミン試料は、銅粉末（サイズ 75μm、99.95%純度、ニラコ、東京）と 1:1 の容量比で混和した後、175MPa の圧力でペレット化して SUS 製試料台に両面炭素テープで貼り付けボルトナットで固定した。これらの作業は嫌気チャンバー内で行った。測定は、あいちシンクロトロン光センターのビームライン
7U（超軟 X 線, 32–1000 eV）で、ワイドスキャン分析とナロースキャン分析を行った。
金（Au）4f をキャリブレーションに用いた。

－ 338 －

3．結果と考察
3.1 ヒューミンによる窒素固定の活性化効果
鎌島水田土壌より Ashby 培地で集積培養した微生物群の窒素固定活性に対するヒューミンの効果を調べた。表 3 に示すように、集積微生物のアセチレン還元活性を 5 割以上高めた。ヒューミンのみで微生物の無い条件では、アセチレン還元活性はみられなかった。
このことは、ヒューミンによる化学的アセチレン還元は起きていないこと、および集積微生物にヒューミンが共存することで微生物の窒素固定活性が高まる事を示している。また
培養物全体に含まれる窒素含量を培地のみを 100%とすると、集積微生物のみやヒューミンのみの条件では 120～125%の窒素含量であったのに対し、集積微生物とヒューミンが共存した場合は 340%と窒素含量が 3 倍以上に増加した。
表3 アセチレン還元活性と窒素固定活性への鎌島ヒューミンの効果
条件

アセチレン還元活性（エチレンmL/L)

相対的窒素含量(%)

集積微生物＋ヒューミン

16 + 2340 + 30

集積微生物

10 + 1120 + 30

ヒューミン

検出限界以下125 + 20

培地のみ

検出限界以下100とする

各種ヒューミンの効果を同様に調べたところ、各種土壌および河川底質の異なる由来のヒューミンに程度の差はあれ促進効果がみられた（表 4）。このことは、窒素固定活性に対する促進効果はヒューミン一般にみられることを示している。

表4 アセチレン還元活性に対する各種ヒューミンの効果
ヒューミン

アセチレン還元活性（エチレンmL/L)なし（コントロール）

0.35 + 0.1

鎌島

2.6 + 0.3

名大農場

2.2 + 0.2

荒子川

1.1 + 0.3茨城

1.3 + 0.3

弥富

1.6 + 0.5

次に、ヒューミンの効果を、還元剤の効果と比較した。用いた還元剤は、15 mM 硫化ナトリウム（Na2S）（Remberger et al.，1993），1.7 mM L-システイン塩酸塩（Hatamotoet al.，2014），0.025 mM 塩化チタン（III）- ニトリロ三酢酸（Ti-NTA）（Li et al., 2014）の 3 種である。どの還元剤も、ヒューミンに比べアセチレン還元活性が低かった（表 5）。
このことより、ヒューミンの効果は培地を還元する効果とは異なることが明らかとなった。

－ 339 －

表5 アセチレン還元活性に対する各種還元剤の効果
ヒューミン

アセチレン還元活性（エチレンmL/L)なし（コントロール）

0.6 + 0.2

鎌島ヒューミン

3.4 + 0.2

Na2S

検出されず

システイン塩酸塩

0.5 + 0.1

Ti-NTA

0.5 + 0.2

更に、還元型・酸化型のヒューミンを懸濁した培地を用意し、飢餓培養した集積窒素固定菌群のアセチレン還元活性を比較したところ、還元型ヒューミンでは窒素固定反応の促進がみられたが、酸化型ヒューミンではみられなかった(表 6)。このことから、ヒューミンが窒素固定微生物に対して電子供与していることによって反応促進していることが示唆された。
表6 アセチレン還元活性に対する還元型・酸化型ヒューミンの効果
ヒューミン

アセチレン還元活性（エチレンμL/L)なし（コントロール）

検出されず処理無しヒューミン

検出されず

還元型ヒューミン

21 + 2酸化型ヒューミン

検出されず

そこで、各種ヒューミンの元素組成（表 7）とアセチレン還元活性の促進効果（表 4）を比較した。図 1 に示すように、各種ヒューミンの元素組成と促進効果には相関が見られなかった。このことは、ヒューミン中の有機物が、培地中に含まれるマンニトール以外の炭素源として窒素固定活性に対する効果を示す可能性は低いことを示している。換言すれば、細胞外電子伝達によって窒素固定活性を高めていることが示唆される。

表7 各種ヒューミンの元素組成
ヒューミ 炭素
ン（％）
8.27
鎌島

水素（％）
1.61

窒素（％）
0.67

灰分（％）

C/N
元素比

75.6

14.4

2.34

名大農場

13.98

2.23

2.31

49.3

7.1

1.91

荒子川

9.48

1.42

0.671.618.4

1.80

茨城

4.26

0.97

0.39

78.2

12.7

2.73

弥富

2.56

1.02

0.15

88.0

19.9

4.78

－ 340 －H/C
元素比

100.0

5.0

10.0
炭素(%)

15.0

2

100.0

1.0

2.0
水素(%)

3.0

アセチレン還元活性（エチレンml/L)

22

100.0

20.0

40.0 60.0
灰分(%)

80.0 100.0

2

100.0

1.0

2.0
窒素(%)

3.0

10.0
15.0
C/N元素比

20.0

32

100.0

1.0

2.0
3.0
H/C元素比4.05.0

アセチレン還元活性（エチレンml/L)

3アセチレン還元活性（エチレンml/L)

3アセチレン還元活性（エチレンml/L)

33
アセチレン還元活性（エチレンml/L)

アセチレン還元活性（エチレンml/L)

32100.05.0

図1 各種ヒューミンの元素組成とアセチレン還元活性の関係

これまでに、ヒューミンの有機画分が活性化－即ち細胞外電子伝達機能－に有効であることが別の研究から明らかにされている（Zhang & Katayama 2012）。従って、ヒューミンの有機画分の化学構造上の特徴が重要であると考えられる。そこで、次にヒューミンの化学的特徴を調べることとした。
3.2 ヒューミンの化学的特徴
3.2.1 異なる抽出法で得た鎌島ヒューミンの元素組成同じ由来で異なる抽出法で得たヒューミンの持つ細胞外電子伝達機能が異なることを利用して、細胞外電子伝達機能に関与する化学的特徴を調べた。表 8 に元素組成と電子伝達能の強弱をまとめた。電子伝達能の強弱と炭素濃度をはじめとした元素組成の間の関係に一定の傾向がみられないことが確認された。

表8 各種抽出法で得たヒューミンの元素組成と電子伝達能収量
元素組成 (%) 灰分 C/N H/C 電子
ヒューミン(mg/g soil) 炭素 水素 窒素 (%) 元素比 元素比 伝達能14.5
方法16.86 1.94 0.50 76.95 15.89 3.40
強1.2
方法238.65 5.24 2.99 27.60 15.08 1.63
弱10.6
方法3
3.44 1.30 0.30 86.46 13.38 4.52
強9.4
方法46.01 1.75 0.50 81.20 14.11 3.49
弱14.0
方法5
2.48 1.32 0.17 85.14 16.71 6.38
中9.9
方法6
3.63 1.20 0.26 85.25 16.50 3.96
中1.5
方法7
13.05 2.49 0.79 64.19 19.27 2.29
無－ 341 －3.2.2 FT-IR スペクトル
そこで、異なる方法で抽出したヒューミン

Aromatic C=O-CH2C=C Aromatic CH914
290415563625
C-N28361644
3478
1030-OH3696の FT-IR スペクトルを比較した（図 2）。しかし、いずれのスペクトルも似通っており、

方法7

FT-IR スペクトルでは大きな構造上の違いは方法6見られなかった。
方法5
方法43.2.3 ESR スペクトル

次に、有機ラジカルの有無を調べるために、 方法3
ESR スペクトルを測定した（図 3）。その結果、電子伝達機能の高いヒューミン（方法 3，4，5，6）は、方法 1 と同様に pH11 に試料を調製した場合と pH4 に試料を調製した場

方法2

方法11405
COO-合での有機ラジカルを示すピーク強度が大きく変化した。この様な pH 依存性はフェノール性ラジカルに特有の特徴で有り、細胞外電

4500

3500

2500

1500500

波数 (cm-1)
図2 各種ヒューミンのFT-IRスペクトル

子伝達にフェノール性ラジカルが関与していることが示唆された。

フェノール性有機ラジカルを発生し腐植物質にみられる構造は、キノン－ハイドロキノンの骨格であることから、キノン骨格の関与が考えられる。しかし、方法 2 で抽出したヒューミンの有機ラジカルには pH 依存性がみられなかったことから、フェノール性ラジカ
ル以外の化学構造が関与しているものと考えられる。一方、電子伝達機能が無い方法 7 で抽出したヒューミンには有機ラジカルのピークがみられなかった。

－ 342 －

3.2.4

13C CP/MAS NMR スペクトル

ヒューミン中の有機画分の炭素骨格を調べるために、
13C

CP/MAS NMR スペクトルを調べた。一例を図 4に示す。化学シフトによって、炭素骨格を、脂肪族炭素、水酸化炭素（炭水化物）、芳香族炭素、カルボキシル炭素にグルーピングした（表 9）ところ、細胞外電子伝達能が高いヒューミンは、芳香族炭素が少なかった。この NMR スペクトルの解析結果は、ESR スペクトルのフェノール性ラジカル（芳香族炭化水素を示唆する）の関与を示唆する結果とは、異なるものとなった。

表913C CP/MAS NMRに基づく各ヒューミンの炭素組成

炭素の相対割合 (%)
ヒューミン

脂肪族炭素(0-45 ppm)

水酸化炭素(45-100 ppm)

芳香族炭素(100-160ppm)

カルボキシル炭素(160-215ppm)

方法152.023.7

8.615.7

方法268.6

9.4

15.07.0

方法339.1

21.0

13.026.9

方法449.1

10.6

36.4

3.9

方法539.3

27.9

19.0

13.7

方法674.2

0.4

0.1

25.3

方法742.6

15.1

35.5

6.8

3.2.5 XPS スペクトル
ESR スペクトルと 13C CP/MAS NMR スペクトルの間で結果が異なった。そこで、もう一つ別の炭素組成解析法として XPS スペクトルを測定して、元素組成と比較した。
図 5 に測定例を示す。結合エネルギーに基づくデコンボリューションを行って各炭素組成に同定した（表 10）。ここ
でも、細胞外電子伝達活性が無い「方法 7」、および活性が弱い「方法 2 と 4」の 3 つのヒューミンは、C=C の割合が大きかった。従って、芳香族炭化水素の構造は、細胞外電子伝達機能にはあまり関与していないことが示唆された。
一方、細胞外電子伝達能の高いヒューミンには、O=C-N や O=C-O の構造の割合が比較的大きなものが多かった。これらの化学構造が細胞外電子伝達機能に関与している可能性が考えられる。

－ 343 －

表10

XPSスペクトルに基づく各ヒューミンの炭素組成割合
ピーク同定と面積割合(%)

ヒューミン

C=C
C-C/C-H
C-O
(C1)
(C2)
(C3)
(284.3 േ (285.5 േ (286.5 േ
0.4 eV)
0.4 eV)
0.4 eV)

C=O(C4)(287.5 േ0.4 eV)

O=C-N
(C5)
(288.5 േ
0.4 eV)

O=C-O(C6)(289.5 േ0.4 eV)

CF1(C7)(290.5 േ0.4 eV)

CF2(C8)(291.5 േ0.4 eV)

24.4

21.2

7.8

1.7

15.6

13.6

17.6

方法2

25.2

7.8

9.9

19.2

24.9

8.9

2.6

1.5

方法3

9.1

9.1

14.9

29.7

26.6

10.2

-

-

方法4

46.2

15.2

13.3

14.8

8.2

2.4-

-

方法5

8.8

8.8

12.0

27.7

32.7

10.1

-

-

方法6

18.4

14.5

15.3

16.6

25.5

9.6

-

-

方法7

55.8

13.9

10.8

14.2

5.2

-

-

-

方法1-

* 記号”-”は検出されなかったことを示す。

この様な部分構造は、ペプチドグリカンに多くみられるが、ペプチドグリカン自体には一般に酸化還元官能基が含まれないことから、ペプチドグリカンに関連する他の生体成分の関与が推察された。
4．まとめ
本研究は、ヒューミンが嫌気性窒素固定菌の窒素固定活性を細胞外電子供与によって高めることを明らかにするとともに、ヒューミンの化学構造を解析し、細胞外電子伝達に必要な化学的構造を明らかにすることを目的とした。
アセチレン還元活性および窒素含量の両方から、ヒューミン存在下で窒素固定活性が高まる事が観察された。ヒューミンの効果は、培地に用いたマンニトールに次ぐ第二の炭素源としての働きによるものではなく、還元型・酸化型ヒューミンの効果の違いから、細胞外電子の供与によるものであることが示唆された。
細胞外電子伝達の機能は、有機画分にみられるが、その効果は有機物含量に相関関係は無かった。ESR スペクトル解析からは、フェノール性有機ラジカルが関与している可能性が示唆された。フェノール性有機ラジカルを発生し腐植物質にみられる構造は、キノン－ハイドロキノンの骨格である。また、一方 NMR スペクトルおよび XPS スペクトルからは、細胞外電子伝達能の高いヒューミンは、芳香族炭素含量が少なかった。XPS スペクト
ルでは、細胞外電子伝達能の高いヒューミンに、O=C-N や O=C-O の部分構造を持つ化学構造の割合が高かった。この様な部分構造は、ペプチドグリカンに多くみられるが、ペプチドグリカンには酸化還元官能基が無いことから、ペプチドグリカンに関連する他の化学構造の細胞外電子伝達への関与が推察された。
今後は、多様なヒューミンの化学構造の解析を進めるとともに、更に電気化学解析も併せて行って、細胞外電子伝達機能－即ち窒素固定反応の促進活性化－を担うヒューミンの反応中心を解明することによって、高効率の生物窒素固定システムの開発につなげたい。

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謝辞
本研究は、公益財団法人JFE21世紀財団の技術研究助成を受けて実施されたものである。
関係各位に深く感謝の意を表します。
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