岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 31 (№ 2), 43−45 (2005).

原著

繁殖障害ホルスタイン種乳牛に対する経腟生体内卵子吸引−体外受精・培養法の適用
平田統一１) , 塩倉健一２) , 宇名澤和幸３) , 山本公平４) , 伊藤葉子４) ,佐々木修一１) , 佐々木 修１) , 杉澤 規１)
要約

地域の基幹牛として期待されながら, 繁殖障害で廃用予定であった牛に経腟生体内卵子吸引−体外受精・培養法 (OPU-IVF・IVP法) を13回適用して20個の移植可能胚を生産することができた. 本試験では胚移植後に産子を得ることはできなかったが, 遺伝的価値が高い繁殖障害牛
ではOPU-IVF・IVP法を治療代替的手法として採用することができる.
キーワード：OPU, IVF, 繁殖障害牛

経腟生体内卵子吸引−体外受精・培養法

交配などの成績が不良で淘汰予定であった. 本(OPU-IVF・IVP法) は, その適用により妊娠牛を平成15年７月に岩手大学農学部附属御明神

期間がやや延長し産子の出生時体重や難産率が牧場に移動して約５ヶ月間飼養しOPUを実施

やや増加する [３] ものの, 特定血統の牛胚をした. OPUは, 超音波診断装置 (アロカ, SSD-短期間に大量生産できることのみならず, 卵管900) に7.5MHzの探触子を装着し, 吸引針に17や子宮環境に問題がある繁殖障害牛や多排卵誘ＧのCOVA Needle (ミサワ医科工業) を, 吸起ホルモン処理に反応しない牛に適用して, 移引ポンプにModel FV４ (富士平工業) を用い,植可能な胚を生産できる治療代替的手法として吸引圧70〜80mmHgの条件下で実施した. 回も有効である (表１). 今回我々は, 地域のホ収液にはエンブリオテック (日本全薬工業) にルスタイン種乳牛の改良に資するためカナダかノボヘパリン (10単位/ml､ アベンティス ファーら導入したものの, 繁殖障害で淘汰予定であっマ) と抗生物質 (ストレプトマイシン硫酸塩た１頭にOPU-IVF・IVP法を適用し, 産子を得100μg/ml､ ペニシリンＧカリウムることを試みた.

ml､ ナカライ) を加えて用いた. メッシュ付

100単位/きシャーレ (ニプロ医工､ セルコレクト) を用材料および方法

いて回収した未成熟卵子は, 形態によってＡか

供試牛は, 大野村農村青年クラブホルスタイ

らＤランクに区分けし, 機能性ペプチド研究所

ン改良組合所有のホルスタイン種経産牛１頭の方法 [４] に準拠して体外成熟, 受精, 発生(平成９年生まれ, １産) で, 産後６回の多排を行なった. すなわち, 培養シャーレ (リプロ

卵処理や３回の人工授精, あるいは放牧地でのＣ−１) のウエルに200μlの成熟培地 (IVMD

１) 岩手支会

岩手大学農学部附属寒冷フィールドサイエンス教育研究センター

２) 岩手県大野村農村青年クラブ

３) いわてくじ農協

４) 久慈農業改良普及センター― 43 ―

表１

経腟生体内卵子吸引−体外受精・培養 (OPU-IVF・IVP) 法の特徴

長所

短・特定血統牛胚の大量生産 (週２回の連続適用可能)(３ヶ月で多排卵処理の３〜13倍の胚生産が可能)
・性周期に関係なく適用可能(スケジュールの柔軟さ)
・ホルモン剤を使わなくとも良いのでドナーに負担が少ない・適用対象牛の広範さ
妊娠牛, 若齢・高齢牛でも適用可
繁殖障害牛でも適用可能(多排卵処理のホルモン剤に反応しない, 子宮・卵管系に障害がある場合も胚生産できる場合がある)
肥育雌牛にも利用可能(枝肉成績が判明した後に成績優秀な牛の胚を移植して後継牛を得られる)・育種に応用可能 (種雄牛候補の作成)
・稀少精液の有効活用
・血統登録可能表２所(体外受精・培養法の一般的な課題と一部重複する)・設備, 備品, 技術者に対する投資, 必要経費が大きい・複合した熟練技術力・労力が必要である・培養設備などの面からステーション方式にならざ
るを得ない・種雄牛, 卵子ドナー牛によって発育率に差がある
・産子生産率が低い
凍結・融解後の生存率がやや低い
受胎率がやや低い
流産率がやや高い・奇形・過大子・難産の割合がやや高い
・分娩徴候不良, 妊娠期間の延長
・虚弱子・ドナー牛に繁殖障害の可能性

OPU-IVF・IVP成績

ランク別回収卵子数
Ａ Ｂ Ｃ
Ｄ

回収日

回収
卵子数

03/07/04
03/07/18
03/08/1103/08/29
03/09/2203/10/0603/10/20
03/10/28

６８６２２８１６１０
７０１００１０２
２０２０11１３３５３２
５７１
９３０３３１４５３(透明帯１)
２０

種雄牛２
種雄牛３
黒毛和種＊１
種雄牛１
種雄牛１
種雄牛１
種雄牛１
種雄牛４００３６３３３０03/11/1303/11/2803/12/0903/12/18

１３４７９３０１０４１１０３１１４３２４３(透明帯２)

種雄牛５＊２
種雄牛５＊２
種雄牛４＊２
種雄牛４＊２００１１

合計13回

１１６Ａ−Ｃランク

合計８０種雄牛合計

移植可能
胚数

２０

＊１：供試牛卵子の発育能を確認するため, 体外受精成績が明らかな黒毛和種精液で体外受精した.
＊２：凍結精液洗浄条件を改変.

101) を入れ, 100μlのミネラルオイルを重層発育能を検証するため, 一部黒毛和種精液も利し, 38.5℃, ５％ CO２, 95％ 空気で約20時間用した. 媒精終了後は, 200μlの発生培地 (機成熟培養した. 凍結精液は媒精液 (IVF100)

能性ペプチド研, IVD101) にて, 38.5℃, ５で２回の遠心分離 (3000rpm, ５min) により,％Ｏ２, ５％CO２, 90％空気で約１週間培養をあるいは後に改良を加え, 同じ遠心分離条件で継続した. 発生した移植可能胚はクライオトッ

１回目をリン酸緩衝液 (PBS) で, ２回目を媒プ法 [２] でガラス化凍結した. 一部の胚は精液で洗浄後, 100μlドロップ中で最終濃度

LAMP法 [１] で性判別を行った. 凍結胚は1,000万sperm/mlの精子により約６時間媒精し

雫石町の当牧場で融解し, 35℃の温湯中で約３た. ホルスタイン種凍結精液は国内生産のもの時間運搬し, 性周期同期化処置により準備したを１種, 輸入精液を４種用いた. 供試牛卵子の大野村の受胚牛に移植した.

― 44 ―

成績

時間運搬し, 大野村で発情同期化した受胚牛に合計13回のOPUで116個の卵子を回収し, こ移植した. この胚輸送中の振動等が悪影響を及のうち形態的に体外培養できるＡからＣランクぼしたことも考えられる. 特に, 性判別のためのものは80個 (69.0％) であった. ペプチド研に胚の一部を採材し, 回復が不十分なまま新鮮法において, 国産凍結精液 (種雄牛1) を用い胚運搬した可能性があり, 悪影響が大きくて受たときの体外胚発生率は, 15/41 (Ａ−Ｃ)

胎に至らなかったと思われた. 振動に対する対(36.6％) で良好だったが, 輸入精液 (種雄牛応策等によっては産子を得る可能性が考えられ２, ３, ４) では発生しなかった (０/15). そる. 一方で, 生産された牛胚に外見上異常は見こで, 凍結精液の洗浄方法を, 媒精液による２あたらず, 胚の発育能そのものに障害が存在し回洗浄からPBSと媒精液による洗浄に改良した

たか否かは定かでなかった. 繁殖障害牛由来体

ところ, 輸入精液 (種雄牛４) でも移植可能胚

外受精・生産胚の正常性についてはさらに詳細が得られた (２/７, 28.6％). 移植可能胚数はな検討が必要であると思われた.

合計20個生産でき, Ａ−Ｃランク培養適卵子の総じて, 地域の基幹牛として期待されながら,25.0％であった (表２). 黒毛和種精液で体外多排卵処理や人工授精成績が優れず惜しまれな受精して生産した３個を除く17個の移植可能胚がら廃用となる例も散見されるので, 有用な雌のうち, ８個を性判別したところ５個が雌胚で牛ではOPU-IVF・IVP法を適用する価値があるあった. ガラス化凍結・融解後12個の胚 (内５と考えられた.

個は雌胚) を11頭の受胚牛に移植したところ,(本報告は, 2004年産業動物獣医学会 (東北)

３頭 (27.3％) では移植後の初回発情が遅延しで発表した内容に一部加筆したものである.)

たものの受胎に至らなかった.
引用文献
考察[１] 陰山聡一, 平山博樹：日本胚移植学雑誌

いわゆる繁殖障害牛でも卵巣に正常な卵胞が発育するものも多く, OPU- IVF・IVP法を用いることにより産子を得られることが示された.
採取したＡ−Ｃランク未成熟卵子に対して, 得25, 136-140 (2003)[２] Kuwayama M., Kato O.：J Assist Reprod Genet 17, 477 (2000)[３] van Wagtendonk-de Leeuw A. M.,られた移植可能胚の割合は25.0％ (Ｆ１胚を含Aerts B. J. G., den Daas J. H. G.：む) でやや低かった. これは体外受精に用いた

Theriogenology 49, 883-894 (1998)

種雄牛によって, 胚発生率に大きな相違があっ[４] Yamashita S., Satoh T. Hoshil H.：

たことの影響が大きかったと考えられた. また,

Theriogenology, 45, 197 (1996)

各研究機関等で実施されているIVF・IVP方法がそのまま適用できず, 条件を検討しなければならない場合があることが示された. 本試験では移植後の初回発情が遅延した例もあったが受胎に至らなかった. 本試験では凍結・融解後の胚生存性を優先して, ガラス化凍結法を採用した結果, 融解後の凍結保護剤除去操作が必要なことから, 雫石町の御明神牧場で融解し, 移植用ストローに充填して, 約35℃の温湯中で約３― 45 ―