岡山理科大学構内の植物における倍数性の研究報告
2015 年 3 月 31 日作成
岡山理科大学理学部生物化学科 竹内 直樹

経緯・目的2014 年 7 月初旬 12 号館前のサクラの木(写真 1)は、同じ木の葉であるにもかかわらず、葉の大きさが明らかに違うものが多いことを友人の指摘から発見した(写真 3)。植物学専門の先生に伺ったところ、細胞の倍数化が起こっているのではないかと指摘をされた。その時、自分自身非常に興味を抱いたことを覚えている。倍数化とは、1 細胞内に 2 セット以上のゲノムが存在する現象のことであり、植物の種分化における顕著な特徴である。被子植物の 50％近く、シダ植物では 90％以上が倍数体と推定されている。近縁種に 2 倍体と倍数体がある場

写真 1：12 号館前のサクラの木合には、両者は異なった生態的環境に適応し、倍数体の方がより過酷な環境に適応的であることが多い。また、倍数体では植物体のサイズが大きくなることも知られている。ほとんどの作物は倍数体起源である。
そこで、その木で起こっている現象が何であるのかを突き止めたいと思い、総合機器センターの自由研究テーマに応募した。
なぜなら、フローサイトメーターという機器を用いれば本当に倍数化が起こっているのかどうか証明することができるからである。そして、研究を進めるうえで、倍数化のメカニズムや原因等にも踏み込んで研究できればと考えている。また、この研究を
写真 2：1 号館前のサクラの木通して実験者の研究技術や知識を磨くとともに、研究の楽しさを伝えていければと考えている。
1

写真 3：

写真 4：総合機器センターにあるフローサ

右：12 号館前の大きな葉のサクラの葉

イトメーター(日本 BD 社製 FACS Calibur)

中央：右と同じ木の中でも小さめの葉
左：1 号館前の普通のサイズのサクラの葉《サイトメトリーとは》
サイトメトリー（Cytometry）とは、短時間（数秒から数分）に多量（数千個から数百万個）の細胞を 1 個ずつ定量測定する原理
核の単離溶液中で植物組織をカミソリで統計的精度の高い細胞測定法である。 その切り刻むことにより、核が遊離される。こ測定装置をサイトメーター（Cytometer）

れを蛍光色素で染色し、染色した核の蛍光と呼ぶ。光や光センサーなどを用いて、細強度の違いにより、DNA 含量の差異を検出胞を観察し、細胞ごとの複数の測定情報かする。核の蛍光強度から DNA 含量の差異

ら相関解析と統計解析を行う。 さらに、細を調べるにはフローサイトメーター（FCM）胞を分取することも可能である。

を用いる。
《フローサイトメトリーの原理》《フローサイトメーター》

フローサイトメトリーシステムは、一点フローサイトメーターは細胞などの粒子に集められたレーザー光をフローセルの中1 個ずつから、大きさなどの形態の情報、心を通過する細胞に照射し、そこから生じならびに、 DNA／RNA 蛍光染色や、タンる散乱光と、蛍光を同時に測定する。測定

パクなどを蛍光抗体で染色した蛍光の情報結果は、相関ヒストグラムとして示される。

を 1 秒間に数千個以上の速度で取得し、そこれらのヒストグラムを解析することによれらの相関を解析するヒストグラムを作成

りサンプルの特性を明らかにできる。そしする。さらに目的の細胞集団などを 1 秒間て、これらの特性に基づいて、2 種類から 6に数千個以上の速度で分取することが可能

種類の細胞集団を同時に試験管やマルチウな装置で、生命工学や臨床検査などの分野ェルプレート分取することができる。フロにおいて、重要な役割を果たす装置としてーサイトメーターの測定原理は、以下の 5なくてはならないものとなった。

つに分けることができる(図 1)。
2

1.フロー系の二本鎖間に挿入されるインターカレータ

ラミナーシースフローを利用して細胞 1 個ーで、核酸染色剤として分子生物学の分野ずつの流れを作る。

で頻繁に使われる。紫外線を当てると赤橙色の蛍光を発するが、その強度は DNA に2.光学検出系結合することで約 20 倍になる。強い変異原

流れの中心を流れる細胞へレーザー光照射性があり、また皮膚・眼・粘膜などへの刺し、発生した散乱光と蛍光の測定をする。

激性がある。二本鎖 DNA にインターカレートして、DNA の複製や転写を阻害するこ

3.電気パルス処理系とにより変異原性を示すと考えられている。

検出された電気パルスを回路で数値化する。

そのため、取扱いの際には、常にゴム手袋、保護メガネ、白衣を着用し、皮膚や眼につ4.データ処理系いた時には大量の水で 15 分以上洗い流す。

各種ヒストグラムを作成し、解析する。

分子が大きく正電荷を持っているため、皮膚への浸透はそれほど早くない。

5.ソーティング系
目的細胞の分取をする。

図 2：臭化エチジウム構造

図 1：フローサイトメーターの測定原理

器具・試薬・サンプル《器具》《臭化エチジウム》

・フローサイトメーター（写真 4）

臭化エチジウム(図 2)は、化学式が・カミソリ

C21H20BrN3 と表される有機化合物の塩で・ピンセットある。モル質量は 394.31 で融点は 260～・シャーレ

262℃である。エチジウムブロマイド、エチ・マイクロピペット

ジウムブロミドともよばれ、EtBr やエチ

・30～40μm メッシュとロート

ブロと略記されることもある。水にはわず

・1～2ml 容ポリエチレンピペット

かに溶ける（溶解度 5g/100g）。特に DNA3

・PA 用サンプルチューブ
・キムワイプ・マスク・ゴム手袋《試薬》
Chopping buffer 組成（必要量 2.5ml）
・50ｍM Tris-HCl (㏗ 7.5） {緩衝液}・1.0％ Triton Ｘ-100 {非イオン系界面
写真 5：使用したタバコの葉活性剤}
・140mM 2-メルカプトエタノール{タンパク質の S-S 結合を切る還元剤}
・50ｍM NaHSO3{還元剤}方法
実際に実験を始めたのが 12 月であり、サ蛍光色素（必要量 50～100μL）ンプルであるサクラの葉が落葉してしまう

・EtBr(臭化エチジウム) 10ng/ml

ため、予め 9 月に葉を採取した。そして、採取した葉を液体窒素で凍結させてから、サンプル固定試薬

タッパーに入れて－83℃の冷凍庫で保存し・1％ホルマリン入り PBS (PB、NaCl、た。

ホルムアルデヒド液を用いて調製)
以下に実験手順を記す。
《扱うサンプル》

1）葉 1 枚 2 ㎠以上を準備する。古い葉は不・1 号館前の普通のサクラの葉(写真 2)適である。

・12 号館前の倍数化が疑われる巨大なサク

2）葉の中央を走る太い葉脈(中肋)を除き、ラの葉(写真 1、3)カミソリで刻みやすい大きさにする。

・普通の葉と倍数化が疑われるサクラの葉

3）シャーレに葉を置き、chopping bufferの混合1ml 加え、葉を湿らせる。

・実験用培養植物のタバコの葉(猪口研究室

4）カミソリ(新しい刃を用いる)で葉を細か提供、写真 5)く刻む。極端に刻みすぎるとノイズが増えそれぞれ染色ありと染色なしのサンプルをる(写真 6)。

作製し、計 8 本のサンプルを使用した。

5）chopping buffer を 1ml 加え、30～40μm のメッシュを通す。
6）
1000rpm2 分遠心後に上精を除去する(写真 7)。
7）chopping buffer を 500μl 程度加え懸濁する。
48）EtBr を最終濃度 10ng/ml になるように加える(0.5μL/500μL)。
9）約 30 分放置する。
10）溶液の入った容器を光が入らないようにアルミホイルで包む。
11）1000rpm で 2 分遠心後に上精を除去する。
12）1%ホルマリン入り PBS を加え、ピペッティングする。(サンプルの固定)
13）容器をアルミホイルで包み、遮光し、

写真 6：葉を細かく切断している様子。

測定まで冷蔵庫で保存する。
14）翌日、総合機器センターにて、フローサイトメーターを用いて測定する。
15）結果をまとめ、植物に倍数化が起こっているのか検討する。
＊葉の大きさは、全ての葉において面積が10 ㎠(5×2)になるようにした。
＊混合サンプルは面積比で 1：1 になるように調製した。
写真 7：遠心して採取できた核のサンプル＊懸濁において、今回は染色あり・なし・混合サンプルを調製しなければならなかったため、500μL の Chopping buffer をそ結果れぞれに加え、懸濁した。ただし、タバコ測定結果は、図 3 に記してある。染色にの葉については混合サンプルを作製しなかった。

おいて、EtBr（10ng/ml）で染色したが、染まりが薄かったため、EtBr（1000ng/ml）
を 2μL 加え再染色し測定した。
図 3 の A は、全体のサンプルの測定結果を表している。グラフの X 軸は大きさ、Y軸は複雑さを表している。グラフ中、左端の縦長に出ているピークはゴミ等に反射して出た結果であると考えられ、正確な値ではない。そこで、R2 の区画のみを切り出し、ピックアップした(図 3、B)。ここでのグラフは、X 軸に蛍光強度(１個あたりの EtBr5の蛍光強度)、Y 軸に細胞数を表している(以下、同様)。そうすると、それぞれのサンプルでピークの違いが見られた。染色なしのサンプルは、染色ありのサンプルと比較してきちんと染色できたか確認するために測定した。その結果、図 3 の C、D、E より、染色なしの紫色のピークと染色ありの緑色のピークが測定できた。よって、それぞれA別の箇所にピークが出たことから EtBr での染色は問題なくできたと考えられる。
染色ありのサンプルにおいて、普通のサクラの葉と倍数化が疑われるサクラの葉では、抽出された細胞数が前者の葉の方が多かったものの、EtBr のピークの位置は同じであった。これより、倍数化を証明することが難しい結果となった。
また、タバコの葉は抽出量が少なかったものの、サクラのピークよりも蛍光強度のピークが少し低めに出た。

B

普通の葉倍数化が疑われる葉タバコの葉(いずれも染色ありのピークで比較)

6

C考察
FACS の測定結果(図 3)より、それぞれのサンプルにおいて細胞数の違いは顕著に表れたものの１個あたりの EtBr の蛍光強度はあまり変化が見られなかった。このことから倍数性が証明することが難しくなり、核以外のものを観察していた可能性が高い。
これは、タバコとサクラのゲノムサイズを比較すると、タバコは 4221-4646Mbp、サD

クラは 685Mbp であったことから、タバコの方がはるかに大きいことが分かる。よって、本来であれば FACS の結果は、サクラの葉よりもタバコの葉の方がピークの位置が高く(右よりにシフトして)出ていなければならないということである。
この結果を踏まえ、核を遊離する段階で問題があったと考え、Chopping してからきちんと染色されているか蛍光顕微鏡を用いEて観察する実験を行った。
サンプルは倍数化が疑われるサクラの葉を用いた。染色する用としない用とでサンプルを分けるようにしたため、500μL を半分にして 250μL ずつエッペンチューブに入れた。したがって、Chopping buffer を 250μL に対し、EtBr を 2.5μL 加えた。これを蛍光顕微鏡で観察するもあまり蛍光を確

図 3：

認できず、1000 倍希釈(10000ng/ml)のA…全体のサンプルの測定結果EtBr を 2.5μL 加え、再観察した。

B…R2 の区画範囲だけを選択し、ヒストグ

また、ヘキスト(Hoechst 33258、ラムで表したもの

C25H27Cl3N6O=533.88、図 4)という別の試

C…普通の葉のピークのヒストグラム

薬を用いても観察してみた。この試薬は二D…倍数化が疑われる葉のピークのヒスト

本鎖 DNA の AT 配列の副溝に結合することグラムから、DNA の検出・定量に利用される。水

E…タバコの葉のピークのヒストグラムに可溶で、比較的毒性がなく、細胞透過性＊C、D、E：染色なし…紫色のピーク、があるため、細胞染色によく用いられる。

染色あり…緑色のピーク
7また、UV 光で励起し、青色に観察できるのが特徴である。
観察した結果、1％ホルマリン入り PBSで固定したサンプルも問題なく観察できた
ことから、固定は問題がなかったことがうかがえる。
写真 11 から分かるように一部切断されている細胞があったものの、写真 8、9、10のように細胞から核が遊離できていないも写真 8：倍数化が疑われる細胞(励起光なし、のの方が圧倒的に多かった。また、写真 10

EtBr 染色)より、ピンクのテトラポットのような細胞中に黄色い円があるのが分かる。この円が核である。核の周りは核以外の細胞内小器官などが蛍光していると考えられる。このことから、FACS の測定結果が思うように得られなかった原因は、核がうまく遊離できず、EtBr の非特異的染色による蛍光が測定時に影響を及ぼしたことがうかがえる。
よって、核を遊離する段階等で問題がある
写真 9：倍数化が疑われる細胞(励起光あり、と考えられ、今後改善していく必要がある。

EtBr)

図４：ヘキスト(Hoechst 33258)構造

写真 10：倍数化が疑われる細胞の核(励起光あり、EtBr 染色)8参考文献核染色

http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/1/j_r
ecipehhnucleifluoro.pdf#search='Hoechst%E3%81%A8%E3%81%AF (2015 年 3 月現在)
サイトメトリードットコム

写真 11：倍数化が疑われる細胞(励起光あり、 http://www.bc-cytometry.com/FCM/fcmpri
Hoechst 染色)

nciple_4.html
(2014 年 11 月現在)

臭化エチジウム

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E8%87%AD

今後の課題%E5%8C%96%E3%82%A8%E3%83%81%

これからの課題としては、以下のようなことが挙げられる。

E3%82%B8%E3%82%A6%E3%83%A0

・生のサクラの葉を使用しての実験。

(2014 年 11 月現在)

・染色時間の増加。
・葉の切断方法の改善。

同仁化学製品・Chopping buffer の組成と調製法の再検

http://dominoweb.dojindo.co.jp/goods

討。

r7.nsf/codelist/H341?OpenDocument

・EtBr の濃度の検討(EtBr の波長で観察す(2015 年 3 月現在)

ると核以外に蛍光する細胞内小器官などがあること)。

倍数性進化

http://www.fais.or.jp/okada/okada-past/f_t
okutei/tokutei/studyA05.html (2015 年 3
これからの取り組み月現在)

今回の研究では、冬季で短期間(9 月～12月)行ったこともあり、十分な実験を実施できず、生のサクラの葉を使うことができな

中内啓光 (1998) 『フローサイトメトリー自由自在』株式会社秀潤社

かった。また、試薬の調製も検討が必要である。よって、12 号館前のサクラの木が倍T.A.BROWN 著 西郷薫 監訳

数性であるかどうかを証明するには、今回(1999) 『分子遺伝学 第 3 版』株式会の実験の課題を改善した上で再実験が必要社東京化学同人である。

9JAROSLAV DOLEZEL and JAN
BARTOS. 2005. Plant DNA Flow
Cytometry and Estimation ofNuclear Genome Size. Annals of

Botany 95:99-110.
K.Arumuganathan and E.D. Earle.
1991. Nuclear DNA Content of Some
Important Plant Species. Plant

Molecular Biology Reporter
Volume 9(3):208-218.

謝辞
本研究を始めるにあたり、様々なご指導をしていただいた総合機器センターの船本利春先生をはじめ、生物化学科の猪口雅彦先生、臨床生命科学科の山崎勤先生には実験を行う上で大変お世話になり、誠にありがとうございました。
また、共同実験者である生物化学科の伊藤祐介さん、同学科の徳岡直登さんには実験に協力してくださり、本当に心強かったです。ありがとうございました。
そして、本研究で使用する試薬や実験方法等を色々とご質問をさせていただいた日
本ベクトン・ディッキンソン株式会社の二俣吉樹様には大変感謝いたします。
改めまして、本研究にご協力をしていただいたすべての皆様へ心から感謝の気持ちと御礼を申し上げたく、謝辞にかえさせていただきます｡

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