基礎老化研究 46（1）; 33－36, 2022

【奨励賞受賞者研究トピックス】

上喉頭神経への慢性電気刺激は骨粗鬆症モデルラットの骨密度減少を部分的に抑制する
飯村佳織、渡辺東京都健康長寿医療センター研究所

信博、堀田晴美

老化脳神経科学研究チーム

自律神経機能研究

キーワード：骨粗鬆症、カルシトニン、上喉頭神経、骨密度、ニューロモデュレーション

１．はじめに迷走神経から分岐する上喉頭神経（superior laryngeal

ヒトでは、骨粗鬆症は加齢とともに増加し、特に閉経nerve; SLN）を電気刺激すると、甲状腺からのカルシ後の女性に頻発する。通常、骨はリモデリングにより骨トニン（内因性カルシトニン）分泌が増加することを見

吸収と骨形成を繰り返すことで、骨組織の劣化が修復さ出した [9]。もし、意識下の動物においても SLN への電れ骨密度が維持される。しかし、閉経によるエストロゲ

気刺激が安全、かつ効果的にカルシトニン分泌を増加さンの減少などにより、骨吸収と骨形成がアンバランスにせることが実験的に示されれば、骨粗鬆症に対する新たなると、破骨細胞による骨吸収が異常に高まり、それになカルシトニン治療法として発展する可能性が期待で骨芽細胞による骨形成が追い付かないことで、骨密度がきる。本稿では、英国 Galvani Bioelectronics 社と米国低下し骨粗鬆症を招く [1]。骨粗鬆症の治療薬の一つとしCase Western Reserve University との共同研究によりてカルシトニンが挙げられる。カルシトニンは甲状腺か実施した、意識下における上喉頭神経への電気刺激がカら分泌されるホルモンで、破骨細胞の表面に発現するカルシトニン分泌や骨密度に与える影響についての研究成

ルシトニン受容体に結合すると、破骨細胞によるアクチ

果 [10] を、筆者らが共同研究先（米国）で学んだ神経慢ンリングの形成を阻害し、骨吸収を急速に抑制する［2］。

性電気刺激の手法の紹介を交え報告する。

アクチンリングは破骨細胞の細胞骨格の一つであるアクチンフィラメントがリング状に集合したものであり、破２． 意識下における上喉頭神経電気刺激のカルシトニン分泌への影響（健常動物での検討）

骨細胞が骨基質表面に密着して骨吸収を行う時に形成される。アクチンリングの内側では骨基質の融解および分SLN を電気刺激するために、麻酔下でラット（雄、解が行われ、骨基質表面にハウシップ窩と呼ばれるくぼ11-16 週齢）の前頸部から両側 SLN に約 2㎜の小さなカんだ形状が見られるのが特徴である。カルシトニンは破フ電極を埋め込み、さらに、血中のカルシトニン濃度を骨細胞に作用し骨吸収を停止させることで、相対的に骨測定するために採血用のカテーテルを上大静脈（右心房形成を促進するホルモンといえる。治療には、サケカルの手前）に留置した（図１a）。手術後から２週間の回シトニンやウナギカルシトニンの誘導体製剤等が用いら

復期間中、術後管理のために抗生剤を２日間、抗炎症鎮れており、骨密度の増加効果 [3,4] のほか、鎮痛作用 [5,6] が痛剤を５日間投与し、餌は通常のペレットに加えて、ペ基礎および臨床研究において認められている。しかしな

レットをふやかしたものやゼリー状飼料などの軟らかいがら、一定量以上のカルシトニン製剤の投与はカルシト餌も与えた。また、４日に１度のペースでカテーテル内ニン受容体のダウンレギュレーションを誘発し、破骨細の充填物（ヘパリングリセロール）を新しいものに置き胞に対する抑制効果を減弱させる[7]

ため、カルシトニ換えることでカテーテルが詰まらないよう管理した。

ン製剤治療では効果が見られる最小量の製剤を断続的に上喉頭神経は咽頭筋や輪状甲状筋、甲状腺に分布する投与する必要があり [8]、通院が患者の負担となってコンほか、咽頭や喉頭の知覚を中枢に伝えて嚥下反射を引きプライアンスが保たれにくいという課題も抱えている。

起すことや [11-14]、ラットでは呼吸の抑制に関与すること

一方、我々は最近、麻酔下ラットを用いた研究で、も示唆されている [15]。そのため、まずは、意識下における上喉頭神経刺激が安全に行えるかを明らかにするた

連絡先：飯村〒 173-0015

佳織
東京都板橋区栄町 35-2

TEL：03-3964-3241
E-mail： kiimura@tmig.or.jp

めの探索を行った。動物用プレスチモグラフを用いて、SLN 刺激中（刺激幅 0.5ms, 頻度 40Hz, 刺激強度 15 〜120μA）の一回換気量や呼吸頻度をモニターしながら、忌避行動がおこらないかを注意深く観察した結果、30秒間または５分間の刺激中、いずれの刺激強度でも一回－ 33 －

a

カテーテル（上大静脈に留置し、背部に固定）

cb

iCT濃度の変化量(⊿pg/ml)

電極リード線（SLNに埋め込み、頭に固定）

p = 0.038

SLN刺激 採血

Controln=9(3)アクリルケース

SLN刺激
n=7(7)

図１ 意識下 SLN 刺激の方法と末梢血中 iCT 濃度への影響
a：SLN に埋め込んだ電極のリード線と上大静脈に留置したカテーテルは、皮下を通しラットの口が届かない頭頂部と背部に固定した。b：SLN 刺激（0.5ms, 40Hz, 90 μ A）および採血（各 500 μ l）は、アクリルケース内でラットの動きを制限することなく行われた。c：刺激前に対する刺激中の iCT 濃度の変化量を示す。平
均値±標準偏差、●は各例の値を示す．unpaired t-test（one-tailed）。文献 10 より一部改変して引用。

換気量や呼吸頻度が抑制されることはなく、刺激を嫌が骨密度の経時的変化を観察した。すると、術後２週目にる行動も見られなかった。一方、90μA 以上の強度では、は卵巣を摘出していない偽手術ラットに比べて顕著な骨刺激中にラットが嚥下様の動きをしているのが見て取れ密度の低下が認められた。術後８週目に解剖し、大腿骨た。と脛骨の骨密度を DXA 法により厳密に調べると、大腿次に、安全性が確認できた刺激強度（90μA）で SLN

骨では遠位骨幹端、脛骨では近位骨幹端の骨密度が偽手刺激を 8 分間おこない、刺激前と刺激中に、カテーテル術ラットに比べて約 30％も減少していた。この結果は、を介して末梢血を採取した（図１b）。ELISA 法にて血11 週齢で卵巣摘出されたラットにおいて、脛骨近位部漿中の免疫反応性カルシトニン（iCT）の濃度を計測し、と大腿部遠位部で局所性の骨量減少が見られた先行研究

刺激による変化を調べた結果、刺激中の iCT 濃度の増[16]の結果と一致した。

加はコントロール群（埋め込み手術をしたが刺激をしな

次に、上記モデルを用いて SLN を慢性的に刺激した

い群 , ３匹９例）に比べて刺激群（７匹７例）で有意に場合の骨密度への影響を調べた。11 匹のラットに埋め大きく、SLN 刺激群では刺激前よりも刺激中に約 13.3

込み手術を行ったが、そのうち５匹は、ラット自身がpg/mL 増加していた（図１c）。これまでの麻酔下ラッ電極接続部分を破壊してしまったため SLN 刺激が不可トにおける研究 [9] では SLN 刺激による甲状腺静脈血中能となってしまった。そのため、本研究における慢性での iCT の増加が明らかになっていたが、本研究によSLN 刺激モデル作成の成功率は約５割であった。２週り初めて意識下で末梢血レベルでの iCT 濃度の増加を間の回復期間後、前述の実験で末梢血中の iCT 濃度を確認することができた。ヒトでは末梢血中カルシトニン増加させた刺激パラメーターを用いて、SLN 刺激を断が 1pg/ml 増加すると骨吸収率が 1.27％減少することか続的（１時間ごとに１回８分間の刺激を１日７回、これら [8]、意識下 SLN 刺激の骨密度低下に対する効果が大を週に４日間）に３- ４週間実施した（図２a）。なお、

いに期待できる結果が得られた。

OVX ラットに対するカルシトニン製剤投与は暗期よりも明期が効果的であった報告 [17] から SLN 刺激は明期の３． 骨密度低下に対する上喉頭神経の慢性電気刺激の効果（骨粗鬆症モデルでの検討）み実施した。刺激期間終了後ラットを安楽殺し、カフ電極内に SLN が収まっているか、周囲組織に炎症がない

本実験には、閉経後骨粗鬆症モデルである卵巣摘出かを確認した。SLN 刺激を実施した６匹中１匹では電（OVX）ラットを用いた。12 週齢で卵巣摘出した３週後極を埋め込んだ部分の周囲に炎症が見られたため、このに、麻酔下で両側 SLN にカフ電極を埋め込み、前述し例を除いた５匹を SLN 刺激群として解析した。コント

た方法で術後管理をした。餌は標準的な量のカルシウムロール群（卵巣摘出と埋め込み手術は行ったが SLN 刺を含有する（約１％）ペレットを主に与えた。まず、筆激は受けなかった群 , n=5）では炎症は確認されなかっ者らの飼育環境下で骨粗鬆症モデルが作成できるのかをた。続いて、これら刺激群とコントロール群から大腿骨確認するために、in vivo で X 線像を撮影して大腿骨のと脛骨を取り出し、DXA 法にて骨密度を計測した。卵－ 34 －b
慢性SLN刺激
1回8分間、1日7回、週4日、3～4週間実施

電極ケーブル

飼育ケージ

ペレットや水大腿骨-遠位骨幹端

脛骨-近位骨幹端p = 0.032

p = 0.051

DXA-骨密度(mg/cm2)aエ ン リ ッチ
メント
control SLN刺激(n=5) (n=5)

control SLN刺激(n=5) (n=5)

図２ 卵巣摘出ラットへの慢性 SLN 刺激の方法と骨密度低下に対する効果
a：慢性 SLN 刺激はラットが生活している飼育ケージ内で実施した。電極ケーブルはラットがケージ内を行動するために十分な長さ（約 40㎝）であり、自由給餌および給水が可能であった。b：慢性 SLN 刺激後における大腿骨（遠位骨幹端）および脛骨（近位骨幹端）の骨密度を示す。SLN 刺激群の骨密度は control 群に比べて大腿骨では高い傾向があり、脛骨では有意に高かった．平均値±標準偏差、●および■は各例の値を示す。Unpaired t-teat（one-tailed)。文献 10 より一部改変して引用。

巣摘出により最も影響を受ける部位（大腿骨の遠位骨幹治療とは異なる制御メカニズムを介して骨に対して機能端部、脛骨の近位骨幹端部）を、SLN 刺激群とコントローすることも考えられるが [21]、より長期間の SLN 刺激でル群とで比較したところ、刺激群ではコントロール群には骨密度低下に対し、より明確な効果が見られる可能性比べて、いずれの部位でも 4-5％骨密度が高かった。こもある。本研究では、神経に埋め込んだ電極から刺激装れらのことから、意識下における３- ４週間の間歇的な置の間で断線するトラブルから、埋め込み手術をした約SLN 刺激は、卵巣摘出による骨密度低下を部分的に抑半数のラットで刺激を行えなくなってしまった。
今後は、制することが示唆された。

無線による SLN 刺激などの長期間の検討に耐えうるデ前述の SLN 刺激時に末梢血中カルシトニン濃度が増バイスへの変更も視野に入れ、より長い期間の SLN 電加した結果と本結果を合わせると、慢性的な SLN 刺激

気刺激による骨密度への影響を追求していく必要があにより、おそらくカルシトニン放出が促進したことで、る。

卵巣摘出における骨密度低下を部分的に抑制したと予想された。一方で、カルシトニンとは別の骨密度の制御メ

引用文献

カニズムが相互的に働いていた可能性もある。例えば、

1． Seeman E, Delmas PD. Bone quality — The

SLN の電気刺激は交感神経を介して反射的に麻酔動物

material and structural basis of bone strength andの下肢の血管拡張を誘導することが報告されており
19]

[18,

、この反応は大腿骨や脛骨の骨密度の増加にも寄与しfragility. N Engl J Med 354(21): 2250-2261, 2006.
2． Kuroda H, Nakamura M, Kamiyama K. Effectsているかもしれない。

of calcitonin and parathyroid hormone on thedistribution of F-actin in the clear zone of

４．おわりにosteoclasts in vivo. Bone 19(2): 115-120, 1996.

これらの結果は、SLN 刺激によるカルシトニン分泌

3． Hsiao CY, Chen TH, Chu TH, et al . Calcitoninの促進が、骨粗鬆症に対する新たな治療法として発展すinduces bone formation by increasing expressionる可能性を示した。しかしながら、SLN 刺激群の骨密of Wnt10b in osteoclasts in ovariectomy-induced

osteoporotic rats. Front Endocrinol (Lausanne) 11:

度は卵巣摘出をしていないラットに比べると著しく低く

613, 2020.

（約 - 40㎎ /㎠）、３- ４週間の SLN 刺激による効果は卵巣摘出による骨密度低下を部分的に改善するに留まっ

4． Orimo H, Hirotoshi M, Tetsuo I, et al . Effect ofた。また、骨密度以外の組織学的指標（破骨細胞数など）

elcatonin on involutional osteoporosis. J BoneMiner Metab 14: 73-78, 1996.には明確な差を見ることはできなかった。OVX ラット
への約２か月間のカルシトニン製剤の投与は、大腿骨の5． Shibata K, Takeda M, Ito A, et al . Ovariectomy-

約 15％の骨密度増加 [20] や、破骨細胞数の有意な減少 [3]induced hyperalgesia and antinociceptive effectを起こすことが報告されている。神経性調節による内因of elcatonin, a synthetic eel calcitonin. Pharmacol

性カルシトニン分泌増加は、従来の外因性カルシトニン

Biochem Behav 60(2): 371-376, 1998.

－ 35 －6． Knopp JA. Diner BM, Blitz M, et al . Calcitonin

42(2): 369-387, 1974.

for treating acute pain of osteoporotic vertebral

14． K itagawa J, Shinga i T, Taka hashi Y, et al .

compression fractures: a systematic review ofPharyngeal branch of the glossopharyngeal nerve

randomized, controlled trials. Osteoporos Int

plays a major role in reflex swallowing from16(10): 1281-1290, 2005.

the pharynx. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol 282(5): R1342-R1347, 2002.

7． I kega me M , Eji r i S , Ozawa H . Ca lciton ininduced change in serum calcium levels and its

15． Sun QJ, Bautista TG, Berkowitz RG, et al . The

relationship to osteoclast morphology and number

temporal relationship between non-respiratoryof calcitonin receptors. Bone 35(1): 27-33, 2004.

burst activity of expiratory laryngeal motoneurons

8． Yamauchi H, Suzuki H, Orimo H. Calcitonin forand phrenic apnoea during stimulation of thethe treatment of osteoporosis: dosage and dosing

superior laryngeal nerve in rat. J Physiol 589(Ptinterval in Japan. J Bone Miner Metab 21: 198-204,7): 1819-1830, 2011.
16． Nakamuta H , Sasaki M , Ichikawa M , et al .

2003.
9． Hotta H, Onda A, Suzuki H, et al . Modulation

An acute and focal osteopenia model usingof calcitonin, parathyroid hormone, and thyroid

ovariectomized rats: a rapid detection of thehormone secretion by electrical stimulation ofprotective effect of salmon calcitonin. Biol Pharm

sympathetic and parasympathetic nerves in

Bull 16(3): 325-327, 1993.
17． Simmons DJ, Yang C, Gundberg CM , et al .

anesthetized rats. Front Neurosci 11: 375, 2017.
10． Iimura K, Watanabe N, Milliken P, et al . Chronic

Calcitonin: chronotherapeutic effect on osteopenia

electrical stimulation of the superior laryngeal

in the ovariectomized rat. Prog Clin Biol Res

nerve in the rat: A potential therapeutic approachfor postmenopausal osteoporosis. Biomedicines

341A: 517-527, 1990.
18． Faber J E , Brody MJ. Ref lex hemodyna mic

8(9): 369, 2020.

response to superior laryngeal nerve stimulation

11． A nd rew BL . A f u nct iona l a na lys is of t hemyelinated fibres of the superior laryngeal nervein the rat. J Auton Nerv Syst 9(4): 607-622, 1983.
19． Possas OS , Lewis SJ. NO - containing factorsof the rat. J Physiol 133(2): 420-432, 1956.

mediate hindlimb vasodilation produced by

12． Furusawa K, Yasuda K, Okuda D, et al . Central

superior laryngeal nerve stimulation. Am J

distribution and peripheral functional properties

Physiol 273(1 Pt 2): H234-H243, 1997.

of a f ferent and ef ferent components of the20． Rico H, Valencia MJ, Villa LF, et al . Calcitoninsuperior laryngeal nerve: morphological andver sus clo d ronat e i n t he prevent ion ofelectrophysiological studies in the rat. J Compovariectomy-induced osteopenia in rats. Clin
Rheumatol 19(1): 47-50, 2000.

Neurol 375(1): 147-156, 1996.
13． Miller AJ, Loizzi RF. Anatomical and functional

21． Davey RA, Findlay DM. Calcitonin: Physiology ordifferentiation of superior laryngeal nerve fibers
affecting swallowing and respiration. Exp Neurol－ 36 －Fantasy? J Bone Miner Res 28(5): 973-979, 2013.