岩獣会報 (Iwate Vet.), Vol. 41 (№ 2), 41−47 (2015).

総説

新規分泌型Ly-6 ドメインタンパク質1の牛妊娠子宮・胎盤における発現と機能に関する研究

マハムド モハメド アブデルハミド アハメド アワド要約

牛の着床, 妊娠維持の過程は多様の分子が関与し, それらが複合的に関わる複雑な機序をとることから, 未解明の課題が山積する研究領域である. 最近, 新規に同定されたLy-6スーパーファミリー分子であるSOLD1の着床, 胎盤機能維持における役割について検証した. 定量的遺伝子発現解析並びにin situ hybridizationにより, SOLD1の着床期および妊娠各期における発現動態を検索した. SOLD1は着床介面の２種類の栄養膜細胞のいずれにも顕著に発現した. その後, 発現強度は低下するものの妊娠各期を通し, 栄養膜細胞に発現すること, 絨毛叢間充織や子宮腺周囲の間質への蓄積を認めた. また, 培養細胞系を用いた細胞機能の検証から,
SOLD1は細胞の浸潤能並びに走化能を促進することが明らかとなった. これらの結果は, SOLD1は着床介面の栄養膜細胞並びに胎盤節に特異的に発現し, 着床の開始や胎盤節形成に伴う組織改編, 再構築に関わると共に, 着床や胎盤構築時の細胞移動の誘因となることを示唆している.
キーワード：SOLD1, Ly-6スーパーファミリー, 着床, 栄養膜細胞, 子宮内膜

Ly-6 ドメインタンパク質１ (Secreted Protein ofだ不明の点が多く有るが, CD59は免疫機能, PLAUR

Ly-6 Domain 1, SOLD1) とは, 牛の着床時期におけは細胞外マトリックス分解機能, SLURP1はアポトーる子宮・胎盤組織の遺伝子発現の網羅的解析から [1],シス, また, 雄生殖腺で検出される分泌型の物質は精Ushizawaら [2] により同定, 命名されたウロキナー子形成と深く関連しているなど, 多様な細胞機能に関ゼプラスミノーゲン活性化因子受容体 (Ly6/urokinase-わることが知られている [1, 9-11]. SLURP1やLYNX

type plasminogen activator receptor, uPAR) タン

1は生体内でnAChR (nicotinic cholinergic receptor)パク質・スーパーファミリーの一種である. Ly-6/を介して細胞機能を調節することが明らかである [12-uPARスーパーファミリーは, GPI (glycosyl-phoso14]. しかし, 新規分子であるSOLD1は, これらの発hatidylinositol) メインにより細胞膜にアンカーされ現動態と異なり雌生殖腺の子宮・胎盤に発現し, 主とる膜型と細胞間質に存在する分泌型の２種に大別出来

して栄養膜二核細胞 (binucleate cell, BNC) で産生,る. 膜型にはCD59 (complement regulatory protein),分泌され, 発育する胎子胎膜に特異的に結合, 集積すPLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor),

る特徴をもつ分子である [2, 15].

LY6D (lymphocyte antigen 6 complex, and locus

牛における着床機構には, 多様な分子が複雑に関与D) などが含まれ, 分泌型にはSLURP1 (secretedしており, 着床誘導の機序は不明の点が多い. 牛胎盤

LY6/PLAUR domain containing 1), LYNX1およびは結合上皮絨毛性胎盤 (synepitheliochorial placenta)

SLURP2 (Ly6/neurotoxin 1), ACRV1およびSP10であり, 着床時期には牛受精胚は大きく伸長し, 伸長(acrosomal vesicle protein 1), PATE (prostate and

胚の最外層の栄養膜細胞が子宮上皮細胞と接着, 最終

testis expression secreted TFP/Ly-6/uPAR protein),的には一部の栄養膜BNCが子宮内膜上皮細胞と融合,

Sslp-1 (secreted seminal vesicle Ly6 protein) など

子宮内膜上に点在する特異領域である子宮小丘に対応多様な分子が知られている [3-9]. それらの機能は未して, 胎膜上に胎盤節の形成が始まる. この胎子と母

岩手大学農学部共同獣医学科獣医生理学研究室― 41 ―

体の接点での細胞融合や胎盤節形成には, 胎盤性ラクトジェン, 妊娠関連糖タンパク質, ステロイドホルモン, プロスタグランジンなど多様な分子が関与することが明らかである [16, 17]. また, 同領域には, 受精胚から分泌されるインターフェロン・タウ, 抗黄体退行因子, マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP),トランスフォーミング成長因子 , シクロオキシゲナー
ゼ２などの発現, 分泌が知られている. これら各種の物質が着床や胎盤形成に必須であることは疑い無く,その調節の不調が早期胚死滅の一因である [17-20].
それ故, 異なる起源の子宮内膜と受精胚由来の細胞系が互いに寄り添い, 接着を始め, 一体化した器官, 組織を形成する機序の解明は, 牛における着床機構のみならず妊娠成立・維持の機序を明らかにする糸口である. 妊娠期間を通して胎盤での母体側と胎子側の相互
図１

作用は, 同種移植片 (Allograft) としての免疫学的寛容状態を維持しており, その分子機構は不明の点が多い. すなわち, 起源が異なる細胞の接着面における誘因とその調節制御は複雑であり, その機序を分子的に明らかにすることは, 動物種を問わず妊娠成立, 維持機構の解明に大きく寄与する.
SOLD1は, 牛の着床介面に発現, 変動する膨大な遺伝子の解析から抽出された分子でその機能は, ほと着床時期におけるSOLD1遺伝子発現動態Ａ) 妊娠35日の子宮内膜および胎膜におけるRT-PCRにより検出したSOLD1mRNAの発現. 基準としてGAPDHを用いた.
Ｂ) 定量的RT-PCRにより測定した妊娠35日の子宮内膜および胎膜におけるSOLD1mRNAの発現. 測定
値はGAPDHを用いて標準化した. Means +/- SEM.
*：P<0.05で優位差あり. END：妊娠35日の子宮内膜, FM：妊娠35日の胎子胎膜.

んど明らかでない. SOLD1の機能解析は, Ly-6 スーパーファミリーで知られている多様な機能から類推して, 着床介面と言う複雑な機能調節機構への新しい観点を提供すると考えられる.
本研究では, 牛子宮・胎盤に発現する新規分子SOLD1の両組織間での相互作用に焦点を絞り, １. 異なる妊娠時期におけるSOLD1分子の子宮・胎盤での発現動態, ２. 細胞培養系を用いたSOLD1の機能解析について紹介する.
１. 異なる妊娠時期におけるSOLD1分子の子宮・胎盤での発現妊娠期間を, 着床直後早期 (妊娠35日), 妊娠初期(約60−90日), 中期 (約120−180日), 後期 (約220−260日) に大別し, 子宮・胎盤でのSOLD1の遺伝子発現を定量的RT-PCR並びにin situ hybridization (ISH)により解析すると, 着床直後では胎子胎膜での顕著な

図２発現を認めた. 一方, 子宮内膜での発現は著しく低値であった (図１および２). この時期の胎膜での発現は, 他の妊娠期間に比べ顕著な発現であり, 着床時期における栄養膜細胞由来のSOLD1の役割が特異的であることが窺えた. 胎膜側と子宮内膜における発現差の傾向は, どの妊娠時期においても子宮内膜側が低値であったが, どの妊娠期においても, 胎膜および子宮妊娠各期における胎子胎膜並びに子宮内膜組織におけるSOLD1遺伝子の発現動態

子宮内膜および胎膜におけるSOLD1mRNA発現は定量的RT-PCRにより測定した. S発現値はGAPDHを用いて標準化した. COT：絨毛叢, ICOT：絨毛叢間,CAR：子宮小丘, ICAR：子宮小丘間. E：妊娠64-75
日 (白帯), M：妊娠120-174日 (灰帯), L：妊娠245259日 (黒帯). Mean+/-SEM. 異なるアルファベット(a-bあるいはc-d) は統計学的有意差 (P<0.05) を表す.

― 42 ―

内膜の両側に発現を確認した. 胎膜での発現は, 絨毛これら遺伝子およびタンパク質発現の動態は, 先に報叢形成 (すなわち胎盤節形成) の有無にかかわらず,告されているUshizawaら [2] の結果と概ね一致する妊娠期間を通して大きな変動を認めなかった. 母体側ものであり, SOLD1分子は栄養膜細胞や一部の子宮の子宮組織においては, 妊娠期の進行に伴うSOLD1内膜上皮および間質細胞で産生され, 主として間充織発現の高進を認めた (図２). SOLD1遺伝子の胎盤で並びに子宮内膜上皮細胞に集積される. それ故, そのの発現をISHにより検証すると, 同遺伝子は主として生理的役割は, 胎盤および子宮内膜の細胞外マトリッ単核細胞およびBNCからなる栄養膜細胞に発現する

クスの改変並びに着床介面および胎盤節における細胞こと, 母体側組織にはほとんど発現しないことが確認

接着に関わると推測された.

できた. また, 子宮小丘間では, 子宮内膜上皮細胞お栄養膜細胞は単核およびBNCから構成されている

よび子宮腺周囲の間質細胞に妊娠期を問わず発現を認が, BNCがSOLD1産生の主体細胞であることは疑いめた (図３, 表１および２).

が無い. この時期におけるBNCのSOLD1タンパク質

SOLD1タンパク質は, 主として胎盤節の間充織おの分泌, 集積動態は特異的であり, 栄養膜細胞は, 一よび胎盤節間での子宮内膜上皮細胞に認めた (図４).

般的な上皮細胞のように頂上側 (apical) に分泌する

表１

表２

牛胎盤節におけるSOLD1 mRNAの発現部位

妊娠期間

絨毛叢

子宮小丘

TMC

BNC

MCV

CE

CS

初期

*

ND

ND

ND

ND

中期

*

ND

ND

ND

ND

後期

**

ND

ND

ND

妊娠牛の子宮内膜組織におけるSOLD1 mRNAの発現部位

妊娠期間

上皮細胞

間質細胞

内腔腺上皮下腺周囲

初期

＊＊

ND

＊

＊＊

中期

＊＊

ND

＊

＊＊

後期

＊＊

ND＊

＊＊

TMC, 単核栄養膜細胞；BNC, 二核栄養膜細胞；CE,内膜上皮細胞；CS, 内膜間質細胞；MCV, 胎盤節の間充織；＊はmRNAが検出されたことを示す；NDはmRNAが検出限界以下であることを示す.

(＊), 弱陽性； (＊＊), 強陽性；ND, 検出限界以下

図３

図４

妊娠胎盤節におけるSOLD1遺伝子の発現領域

A-C：H.E染色, D-F：Crossmon's Trichrome染色,
G-I：SOLD1 アンチセンスプローブ, G'-I'：SOLD1センスプローブ. Early：妊娠初期, Mid：妊娠中期,Late：妊娠後期, これらの試料は図２と同じ. TMC：栄養膜単核細胞 (矢印), BNC：栄養膜二核細胞 (矢頭), CE：小丘上皮, CS：小丘間質, MSV：二次絨毛の間充織, MTV：三次絨毛の間充織, BV：血管,G-Iにおける挿入拡大図はBNCを示す. 指標バンドは50マイクロメーター.

妊娠胎盤節における免疫組織化学的SOLD1タ
ンパク質の検出動態

A-C, A'-C'およびA''-C"：胎盤節, D-FおよびD'-F'：子宮内膜小丘間組織, A-C, A'-C'およびD-F：抗SOLD
1抗体染色, A"-C"およびD'-F'：正常ウサギ血清. A'-C'：
A-Cの高倍率像. MPV：一次絨毛の間充織. 指標バン
ドはA-Cでは200マイクロメーター, A'-C', A"-C", D-F
およびD'-F'では50マイクロメーター.

― 43 ―

だけでなく, 基底側 (basal) にも同分子を分泌, 絨毛叢の間充織に集積する. 着床時期に焦点を充てると栄養膜細胞は子宮内膜側に進行しBNCが内膜上皮細胞と融合する [2]. これらの証拠や一般的な着床現象の状態から, SOLD1は, 胎盤絨毛叢形成の構造的な裏打ち物質としての役割だけでなく, 間充織における組織構造の再構築並びに栄養膜細胞の子宮内膜側への進行を誘導する役割を担っていると言える.
SOLD1は, 着床期に比較して低値であるものの,妊娠期のいずれの時期の胎盤節においても発現を認め,この分子の胎盤形成・発達と機能維持に関わる作用機作が問われる. すなわち, 胎盤節は着床開始時に絨毛叢を形成し, その物理的大きさと機能を分娩直前まで

図５拡大してゆく. そのためには胎盤節内での組織改編および再構築を主導する分子が必要である. これまで明らかにされているMMPやEMMPRIN (extracellularmatrix metalloproteinase inducer) などの機能に加え, SOLD1の役割の重要性が窺える [18, 21, 22].
SOLD1は間充織などに多量に蓄積されることから,選択した培養細胞系におけるSOLD1mRNAの発現強度

BT-C, BT-K：選択した栄養膜細胞系, BEE：牛子宮内膜上皮細胞系, BES：牛子宮内膜間質細胞系,発現量は定量的RT-PCRにより測定. GAPDHを基準として発現量を表示. Mean±SE. 異なるアルファベッ
トは統計学的有意差を示す (P<0.05).

胎盤節や子宮内膜においてカテプシンやTKDP (trophoblast Kunitz domain protein) などのプロテアー
ゼやMMPにより活性化され組織改編の原動力になることが窺える. Ly-6スーパーファミリー分子は免疫機能調節作用を持つことが知られていることから, SOL
D1は母体と胎子側の接着介面での調節機能を有していることが窺える [23-26].
２. 細胞培養系を用いたSOLD1機能の解析
SOLD1分子の細胞の移動や浸潤を誘導する機能を検証するために, 細胞培養系は優れたモデルを提供することは言うまでもない. 検証モデルを構築するには,適正な細胞系を選択する必要が有る. 既に確立されている13系の栄養膜細胞系を検証し [25, 27], SOLD1の発現量を基準として高および低発現量を示す異なる２細胞系 (BT-C, BT-K) を選択した (図５). 両系のSOLD1遺伝子レベルでの発現はタンパク質発現を伴っていることを確認した. それらの細胞系を用い細胞浸潤能 (invasion assay) および細胞走化能 (migrationassay) を検証すると, いずれの細胞系も浸潤能並び図６に走化能を併せ持つことが判明した. ２系を比較するＡ) 上段：BT-CおよびBT-K細胞系のMatrigel浸潤法を用いた細胞浸潤能の測定. 下段：Matorigelに浸潤した細胞像 (H.E.染色). サイズ標識：200マイク
ロメーター (抜けている). ＊：統計学的有意差(P<0.05).
Ｂ) 細胞浸潤能に及ぼすSOLD1抗体の影響 (希釈濃度1：100, 1：500, 1：1000). 浸潤能は正常ウサギ
血清 (1：100希釈) を基準として倍率強度で示した.
Mean±SE, n=3. 異なるアルファベットは統計学的有意差を示す (P<0.05).と内因性SOLD1を高発現するBT-K細胞は高い浸潤能を持つが走化能はBT-Cと差がなかった (図６および７). SOLD1分子をBT-K細胞培養系へ添加すると,添加SOLD1により細胞走化能が高進した. また, 両細胞系にSOLD1抗体を添加することにより, 浸潤能および走化能を検証すると, いずれの細胞でも用量依存的にその両機能が抑制された . これらの結果は,― 44 ―

栄養膜細胞系 (BT-C, BT-K) の細胞浸潤能

細胞の浸潤性と走化性に対するSOLD1の機作が異な側への進行に深く関与することを示している. Ly-6スーることを示唆している. その機構はほとんど不明であパーファミリー分子であるSLURP-1はnAChRを介しるが, SOLD1が着床介面での栄養膜細胞の子宮内膜て細胞の走化能を調節するとの報告が有る [3, 12, 13,28]. BT細胞系でのnAChR遺伝子であるbCHRNA7(bovine acetylcholine receptor subunit alpha-7) は両細胞系で発現しており (図８), SOLD1においても本受容体を介した細胞の浸潤や走化能の調節が窺える.
これらの結果は, 起源の異なる細胞群すなわち栄養膜細胞並びに子宮内膜細胞が, 着床介面並びに胎盤節内において, 相互に作用し, 妊娠成立・維持過程における生理機能バランスを整え, その調節の首尾あるいは不首尾が妊娠成立の可否をもたらすことが類推される. また, この局面において, 両側の細胞それぞれがSOLD1を産生・分泌していることから同分子の胎盤および子宮内膜における機能調節の重要性を示唆している. すなわち, 着床介面では栄養膜細胞の産生するSOLD1は, BNC自身の走化, 浸潤を促進すると共に,細胞外に分泌, 細胞外マトリックスに蓄えた同分子による細胞移動の誘因として作用する. また, 妊娠の進行に伴い発達する胎盤節領域では, 子宮内膜並びに胎

図７

栄養膜細胞系 (BT-C, BT-K) の細胞走化能

膜組織の組織改編および再構築に他のプロテアーゼなＡ) BT-C, BT-K細胞固有の走化能.
Ｂ) 細胞走化能に及ぼすSOLD1抗体の影響 (希釈濃度1：100, 1：500, 1：1000). 浸潤能は正常ウサギ
血清 (1：100希釈) を基準として倍率強度で示した.
Mean±SE, n=3. 異なるアルファベットは統計学的有意差を示す (P< 0.05).

どの酵素系と協同して作用すると推察される (図９).
これらの新知見は, 新規Ly-6スーパーファミリー分子,SOLD1を中心とした牛の受胎や子宮内膜機能研究への新展開を提示するものである.

図９

着床介面並びに胎盤形成初期におけるSOLD1の分泌と作用機作の仮説①②

図８

培養栄養膜細胞系のCHRNA7 mRNAの発現動態

Ａ) 牛CHRNA7 mRNAの発現はRT-PCRで検証し,GAPDHを基準にして表した.
Ｂ) 定量的RT-PCRによる牛CHRNA7 mRNAの発現.
GAPDHを基準にして表した. Mean±SE, n=3.
＊：統計学的有意差を示す (P<0.05).

単核栄養膜細胞がSOLD1を産生・分泌.
分泌されたSOLD1が栄養膜細胞や子宮内膜が産生する分子により活性化, オートクラインあるいはパラクラインに因子として細胞に作用する.
③ 栄養膜細胞の浸潤および走化や誘導される. その結果, BNCと子宮内膜上皮細胞の融合や子宮内膜組織の改編, 再構築が生じる.
④ 分泌されたSOLD1は絨毛間充織や子宮内膜の細胞外マトリックスに集積される. 蓄積されたSOLD1は胎膜および子宮内膜組織で産生されるサイトカインやプロテアーゼにより分解, 活性化される.

― 45 ―

(注) 本稿は, 作成の都合上, 著者本人でなく共同研究者が, 本人の学位論文を抽出, 要約, 作成しof glycolipid-anchored membrane proteins. JBiol Chem, 268, 17539-17546 (1993)[８] Soler-Garcia AA, Maitra R, Kumar V, Ise T,たものです.

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