基礎老化研究 48（1）; 31－34, 2024

【奨励賞受賞者研究トピックス】

ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の生細胞イメージングと筋肉抗老化・筋疾患治療への応用

竹岩俊彦、井上東京都健康長寿医療センター研究所

１．はじめに聡

老化機構研究チーム

システム加齢医学

クレオチド（FADH2）から酸素分子への電子伝達を担い、超高齢化社会を迎えた本邦では、加齢や疾患に伴う筋その過程で生じたプロトンの濃度勾配を利用して ATP

肉量や筋力の低下を示すサルコペニアなどをはじめとし合成酵素が ATP を産生する。生化学的な解析及びクて健康障害が増加しており、社会問題となっている。サライオ電子顕微鏡を用いた解析から、呼吸鎖複合体 I、ルコペニアは、フレイルや要介護に至る重要な要因の一III、及び IV は会合し、呼吸鎖超複合体を形成することつと考えられており、その予防・治療法の開発は社会的が報告されている［4］。I/III2、III2/IV、及び I/III2/IV と急務であるが、その病態メカニズムはいまだ十分に解明いった組成の超複合体が知られており、I/III2/IV の超されていない。

複合体は特にレスピラソームと呼ばれている。

ミトコンドリアは好気呼吸によるエネルギー産生に重我々は性ホルモンであるエストロゲンの作用に関す要な役割を担う細胞小器官であり、筋肉の有酸素運動・る研究から独自に同定したエストロゲンの標的のひ恒常性維持に関わることが報告されている［1-3］。ミトコと つ で あ る cytochrome c oxidase subunit 7a related

ンドリアの内膜に存在しエネルギー産生に関わる呼吸鎖polypeptide（COX7RP）が超複合体の形成制御因子そ複合体は、より高次の呼吸鎖超複合体を形成することがのものであることを世界に先駆けて解明した。さらに、知られているが［4］、我々を含む最近の研究から、超複超複合体の形成促進によりエネルギー産生が亢進し、マ合体はエネルギー産生の亢進や筋肉の運動持久力の向上

ウスでは筋肉の運動持久力が高まりマラソンランナー型［5-8］。一になることを明らかにした［5，6］。超複合体は筋肉の能力方で、超複合体を生細胞で精密に観察・測定する手法がを向上させるキープレイヤーであり、筋肉の抗老化やサなく、その形成制御のメカニズムは十分に解明されていルコペニア等の筋疾患の予防・治療への応用が期待されなかった。

る。しかし、生細胞で超複合体を精密に測定する技術がに重要な役割を担うことが明らかとなってきた

我々は世界で初めて超複合体の生細胞イメージング・なかったことから、超複合体の実態を観察することには定量評価法を開発し、その筋肉抗老化やサルコペニア等困難が伴い、その形成制御のメカニズムについての研究の筋疾患の治療・予防への応用を目指し研究を進めていは立ち遅れていた。そこで、我々は超複合体の生細胞イる。本稿では、超複合体の生細胞イメージングと筋肉抗メージング及び定量評価法の開発を進めることとした。

老化・筋疾患治療への応用に関する我々の最新の研究成３．ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の可視・定量化手法

果について紹介する。の開発とハイスループットスクリーニングへの応用
２．ミトコンドリア呼吸鎖超複合体超複合体を生細胞においてイメージング・定量評価す

真核細胞において、ミトコンドリアは酸化的リン酸化るため、我々は蛍光タンパク質の間で起こる Förster 共と呼ばれる反応により ATP を産生する。酸化的リン酸鳴エネルギー移動（Förster resonance energy transfer；

化反応には、ミトコンドリアの内膜に存在する呼吸鎖複［10］と い う 現 象 を 利 用 し た（ 図 ２）。 ま ず、 複FRET）［4，9］。

合体 I と IV のサブユニットである NADH-ubiquinone

呼吸鎖複合体は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ

oxidoreductase subunit B8（NDUFB8）と cytochromeオチド（NADH）または還元型フラビンアデニンジヌ

c oxidase subunit 8 A（COX8A）に蛍光タンパク質で合体（I-IV）及び ATP 合成酵素が関与する（図１）

あ る AcGFP 及 び DsRed-Monomer を 融 合 し、 マ ウ ス
連絡先：：竹岩〒 173-0015

俊彦

東京都板橋区栄町 35-2

TEL：03-3964-3241

FAX：03-3579-4776

E-mail：ttakeiwa@tmig.or.jp

C2C12 筋芽細胞様細胞に安定発現させた。超複合体（レスピラソーム）において蛍光標識した複合体が近接すると、AcGFP に対する励起光を照射した時に DsRedMonomer が蛍光を発するという FRET 現象が起きる。
この現象を共焦点蛍光顕微鏡や、イメージングサイト－ 31 －

図１

ミトコンドリア呼吸鎖複合体および超複合体（A）
ミトコンドリア呼吸鎖複合体及びATP合成酵素によるATP産生。CI：複合体Ⅰ、CⅡ：複合体Ⅱ、CⅢ：複合体Ⅲ、CⅣ：複合体
Ⅳ、NADH：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、NAD+：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、FADH2：還元型フラビンアデニンジヌクレオチド、FAD+：酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド［論文４より改変引用］。（B）複合体Ⅰ、Ⅲ、及びⅣは、ミトコンドリア呼吸鎖超複合体を形成することにより、エネルギー産生の亢進や運動持久力の向上に寄与する［5，6］。

メーターを用いて観察することにより、我々は世界に先spleen tyrosine kinase（SYK）の阻害剤として作用する

駆けて、超複合体（レスピラソーム）形成の生細胞イメー3，4-methylenedioxy-β-nitrostyrene（MNS）が超複合体ジングに成功した。また、FRET の効率を算出するこの形成を最も促進したため、さらに２種類の SYK 阻害とにより超複合体の定量評価にも成功した。

剤（BAY61-3606 及び GSK143）について解析したところ、次に、我々は本手法を活用し、超複合体の形成を促進双方とも超複合体の形成を促進することが確認された。

する新しい化合物のスクリーニングを行った。1,000 種

これら３種類の SYK 阻害剤による超複合体の形成促進

類を超える化合物を対象としてハイスループットスク

は非変性電気泳動法である blue native polyacrylamide

リーニングを行った結果、超複合体の形成を促進する複gel electrophoresis（BN-PAGE） を 利 用 し た 解 析 で も数の新たな候補化合物を同定した。候補化合物の中でも、確認された。また、フラックス解析を行い、これらの

図2

ミトコンドリア呼吸鎖超複合体の生細胞イメージング及び定量評価法の開発
蛍光蛋白質で標識した呼吸鎖複合体Ⅰ及びⅣが、超複合体中で近接する際に起こる FRET 現象を測定することにより、超複合体（レスピラソーム）の生細胞イメージングと定量評価に成功した。CⅠ：複合体Ⅰ、CⅢ：複合体Ⅲ、CⅣ：複合体Ⅳ、
NDUFB8：NADH-ubiquinone oxidoreductase subunit B8、COX8A：cytochrome c oxidase subunit 8 A、
FRET：Förster resonance energy transfer［論文７より改変引用］。

－ 32 －

図３

Spleen tyrosine kinase（SYK）阻害剤の処理によりマウスの運動持久力は向上した
８週齢の雌の DBA/2 マウスに 3，4-methylenedioxy-β-nitrostyrene（MNS）（4mg/kg）または dimethyl sulfoxide（DMSO）を腹腔内投与し、トレッドミル試験（A）を行ったところ、MNS 投与マウスは、DMSO 投与マウスと比較して、有意に長時間・長距離走り続けることが示された（B，C）
。また、BAY61-3606（2mg/kg）及び GSK143（2mg/kg）
を腹腔内投与したマウスでもトレッドミル試験（D）を行った結果、DMSO 投与マウスと比較して有意に長時間・長距離走り続けることが示された（E，F）［論文７より改変引用］。

SYK 阻害剤を処理した C2C12 細胞でミトコンドリア呼５．おわりに吸が亢進することを示した。さらに、siRNA を用いた

本稿では、我々が開発した超複合体の生細胞イメージ

SYK の発現抑制実験でも、SYK の減少により超複合体ング・定量評価法と、それに基づくケミカルスクリーニの形成促進及びミトコンドリア呼吸の亢進が誘導されングから見出した超複合体の形成を促進し筋肉の運動持た。これらの結果は、SYK の適度な抑制は超複合体の久力を向上させる新規の化合物について紹介した。本成形成を促進し、ミトコンドリア代謝を活性化することを果は筋肉の抗老化やサルコペニア等の筋肉疾患の予防・示唆している［7］。

治療への応用が期待される。最近になり、COX7RPがマウスに加えて［5，11］、ヒトの高齢者の運動・心肺機能と関４．SYK 阻害剤の処理によりマウスの運動持久力は向連することが報告され［11］、ミトコンドリア超複合体と上する老化・加齢性疾患の関連が注目されている。今後は、超次に、SYK 阻害剤が運動能に及ぼす効果を検証する複合体の生細胞イメージング・定量評価法を活用し、超ため、３種類の SYK 阻害剤を腹腔内投与した DBA/2複合体の実態や役割を解明することにより、老化や加齢マウスの運動能をトレッドミル試験及びワイヤーハング性疾患の分子基盤を詳細に理解し、治療・予防法の開発試験で評価した。その結果、3 種類の SYK 阻害剤を投等へ応用につなげることを目指して研究を進めていきた

与したマウスはいずれもトレッドミル試験において走行い。

距離・時間が有意に延長し（マラソンランナー型となる）（図３）、ワイヤーハング試験の成績も有意に向上し引用文献たことから、運動持久力が向上したことが示された。ま1． Coen PM, Musci RV, Hinkley JM, et al. Mitochondria

た、BN-PAGE 等を用いた生化学的な解析により、SYK

as a Target for Mitigating Sarcopenia. Front.
Physiol. 9：1883, 2019.

阻害剤を投与したマウスの大腿四頭筋で超複合体の形成が促進されることが示された。一方で、マウスの体重や2． Joseph AM, Adhihetty PJ, Buford TW, et al.

骨格筋の重量に影響は見られなかった。これらの結果よThe impact of aging on mitochondrial function

り、SYK 阻害剤は筋肉のミトコンドリアにおいて超複and biogenesis pathways in skeletal muscle of

合体の形成を促進し、筋肉の量でなく質を高めることにsedentary high- and low-functioning elderly［7］より、運動持久力を向上させることが示唆された 。

individuals. Aging Cell 1：801-809, 2012.
3． Gouspillou G, Sgarioto N, Kapchinsky S, et al.

－ 33 －

Increased sensitivity to mitochondrial permeability

muscle mitochondrial respiration and exercise

transition and myonuclear translocation ofperformance in mice. Nat. Commun. 14：312, 2023.

endonuclease G in atrophied muscle of physically

8． Lapuente-Brun E, Moreno-Loshuertos R, Acín-active older humans. FASEB J. 28：1621-33, 2014.

Pérez R, et al. Supercomplex assembly determines

4． Azuma K, Ikeda K, Inoue S. Functional Mechanisms

electron flux in the mitochondrial electronof Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplex

transport chain. Science 340：1567-1570, 2013.

Assembly Factors and Their Involvement in

9． Kobayashi A, Takeiwa T, Ikeda K, et al. Roles ofMuscle Quality. Int. J. Mol. Sci. 21：3182, 2020.

Noncoding RNAs in Regulation of Mitochondrial

5． Ikeda K, Shiba S, Horie-Inoue K. et al. A stabilizingElectron Transport Chain and Oxidative

factor for mitochondrial respiratory supercomplex

Phosphorylation. Int. J. Mol. Sci. 24：9414, 2023.

assembly regulates energy metabolism in muscle.

10．Zadran S, Standley S, Wong K, et al. FluorescenceNat. Commun. 4：2147, 2013.

r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r（ F R E T ）- b a s e d

6． Ikeda K, Horie-Inoue K, Suzuki T, et al.

biosensors：visualizing cellular dynamics andMitochondrial supercomplex assembly promotes

bioenergetics. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96：895-

breast and endometrial tumorigenesis by902, 2012.

metabolic alterations and enhanced hypoxia

11．Benegiamo G, Bou Sleiman M, Wohlwend M,tolerance. Nat. Commun. 10：4108, 2019.

et al. COX7A2L genetic variants determine

7． Kobayashi A, Azuma K, Takeiwa T, et al. A FRETbased respirasome assembly screen identifies
spleen tyrosine kinase as a target to improve－ 34 －

cardiorespiratory fitness in mice and human. Nat.
Metab. 4：1336-1351, 2022.