岩獣会報（Iwate Vet.）,Vol. 43（№ 1）,9－14（2017）.

二枚貝の下痢性及び脂溶性貝毒同時分析法の検討

梶田弘子

要

約LC-MS/MSを用いたホタテ試料中の下痢性貝毒オカダ酸群（OA，DTX），脂溶性貝毒ペクテノトキシン群
及びエッソトキシンの同時分析法を構築した．本法は，試験法としての妥当性評価ガイドラインの目標値を概ね満たしていた． 本法を用いて，マウス試験法で規制値0.05 MU/gを超過したため出荷規制された県内A海域のホタテ試料を分析した結果，下痢性貝毒DTX1が新たに設定された規制値0.16 µgOA当量/gを超える量検出され，脂溶性貝毒の含有量を同時に定量することができた．貝毒の毒性は，その成分ごとに差があり，その組成比は海域や二枚貝の種類によって異なることから，下痢性貝毒及び脂溶性貝毒成分を同時に把握できる本法は有用と考えられた．
キーワード：下痢性貝毒，脂溶性貝毒，オカダ酸群，LC-MS/MS
緒言を特異的に検出し，毒性を正しく評価可能なLC-MS/下痢性貝毒は，1976年６月に宮城県産のムラサキイ

MSによる機器分析法の導入を進めているが，その規ガイを原因食品とする食中毒が端緒となり発見され制状況は国によって異なっている．アメリカはOA群た．その後，1983年までに1,300人以上の患者数が報に0.16 ㎎ OA当量/㎏，カナダはOA群に0.2 ㎎ OA当告されたことから，国は，食品衛生法により麻痺性及量/㎏，PTX群に0.2 ㎎ /㎏の規制値を設定している．

び下痢性貝毒に関する規制値を設定し，試験法として

EUはOA群とPTX群を合わせて0.16 ㎎ OA当量/㎏のマウス試験法［1］が通知された．

規制値を設定し，YTX群には3.75㎎ /㎏を設定してお都道府県及び漁業関係者は連携し，原因プランクト

り，EUにホタテなど二枚貝可食部を輸出する場合は，ンの監視（毒化予知）や出荷前に貝毒検査を行い，規これらの貝毒成分について規制値以下であることを確制値超過の場合は出荷規制する監視体制を構築しリス認することが求められている［7］．

ク管理を進めた結果，下痢性貝毒による食中毒事件数

我が国は，国際的な現状を鑑み，2015年４月からは大幅に減少し，平成以降は３件［2］のみである．

OA群にCodex規格である0.16 ㎎ OA当量/㎏の規制値

下痢性貝毒の成分は，オカダ酸（OA），関連物質を設定し，試験法として機器分析法が通知された［8］．

ジノフィシストキシン（DTX）及びそのエステル体

LC-MS/MSによるOA群，PTX群及びYTX群の分析のOA群からなり，その組成は二枚貝の種類，海域や法は複数報告［9-11］されているが，これらを同時に季節によって異なることが報告されている［3-4］．マ

精製する試料調製法はほとんど報告されていない．

ウス試験法は下痢原性を有するOA群に加え，下痢原

岩手県保健環境研究センターでは，この通知発出に性をもたないぺクテノトキシン（PTX）群やエッソ先立ち，機器分析法への速やかな移行を図り，岩手県

トキシン（YTX）群の脂溶性貝毒成分［5］や飽和脂の検査体制強化を目的にOA群に加え，EU等で規制対肪酸［6］も一括して検出することから，下痢性貝毒象であるPTX群及びYTX群を含めた試料調製法とLC-としての毒性を過大評価する可能性がある．

MS/MS同時分析法を検討した．

諸外国では，感度・特異性の低さ，動物実験というこの分析法を用いて，過去に生産者が実施した自主倫理的な問題から，マウス試験法に替わって各成分検査で規制値超過となり出荷規制となったホタテ試料

盛岡支会

岩手県環境保健研究センター―9―装置および測定条件：や市販流通品について，各成分の定量を行ったので報告する．

液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ はAgilent technologies社 製
1100シリーズ，質量分析装置はAB SCIEX社製API
材料及び方法4000を用い，表１に示す条件を用いた．イオン化はエ

試料，試薬および器具：

レクトロスプレー（ESI）によりOA群及びYTXはネ

試料は，平成26年４月から12月にかけて県内で販売

ガティブイオンモード，PTX群はポジティブイオン

された岩手県及び青森県産ホタテの中腸腺及びむき身モードで測定した．

を用いた．また，過去に生産者が実施したマウス試験

検量線の作成：

法による自主検査で0.05～0.1 MU/gと規制値を超え，DTX3を除く標準原液を90％メタノール溶液で希釈

出荷規制された県内A海域のホタテ（中腸腺，むき身）

し，YTXは0.001～0.2 µg/mL，YTX以外は0.0001～0.02と平成26年６月及び７月に販売されたホタテ流通品µg/mL濃度範囲の標準溶液を調製し，5 µLをLC-MS/（以下６月および７月市販品）を，本論文で検討したMSに注入した．得られたクロマトグラムから各成分方法で貝毒の定量を行った．のピーク面積をそれぞれ求め，絶対検量線法で検量線標準品のオカダ酸群（OA，DTX1，DTX3），PTXを作成した．
試験溶液の調製：群（PTX1，PTX2，PTX6） 及 びYTXは， 水 産 庁 貝
毒安全対策事業配付標準品を使用した．各々標準品10試験溶液の調製方法を図１に示した．試料2 gに９㎎を精秤し，メタノールに溶解して20 mLとしたもの

倍量の90％メタノール溶液を加え，３分間振とう抽出を標準原液とし，冷凍保存した．なお，DTX2についし遠心分離後，上清を分取し20 mLに定容した．このては標準品を入手できなかったことから検討項目から抽出液2 mLに同量の蒸留水を加え，HLBカラムに負除外した．

荷する溶液を調製した．エステル体のDTX3は，HLB

試 料 精 製 用 の 固 相 抽 出 カ ー ト リ ッ ジ カ ラ ム は，カラムに負荷した場合，メタノール溶液では脱離しWaters社製のジビニルベンゼンN-ビニルピロリドンないため，この溶液に１N水酸化ナトリウム300µLを共重合体ミニカラムOASIS HLB 60 ㎎（以下HLBカ加え，80℃で40分間のアルカリ加水分解処理を行いラム）を用い，最終試験溶液用の除粒子フィルターは，DTX １に変換した．室温に冷却後，１N塩酸約300µL

アドバンテック東洋㈱製DISMIC（親水性PTEE，0.2を加え，pH7前後に調整したものをHLBカラムに負荷µm）を用いた．

し試験溶液を作製した． PTX群は，アルカリ加水分
表１

ColumnColumn Temp.
Mobile Phase
Gradient
Flow rate
Injection Volumn
Ionization
Mode
Run time
IS Temp.
Ion voltage
MRM(m/z)

LC-MS/MS測定条件

Waters X Terra MS C8（ 2.1mm × 150mm、3.5μm）
40℃
A：0.1% formic Acid+10mM ammonium formate
B：acetonitrile
0161515.0120Time（min）
B（%）
9090
101090900.2mL/min
5μL
ESI
Multiple Reaction Monitoring(MRM)
20min（－）500℃（＋）600℃（＋）5kv（－）-4kv
（＋）
PTX1
PTX2
PTX6

Quantitation
892.6 → 839.6
876.6 → 823.5
906.5 → 853.3

Confirmation
892.6 → 821.6
876.6 → 841.6
906.5 → 835.5

（－）
OA
DTX1
YTX

Quantitation
803.6 → 255.3
817.5 → 255.3
1141.6 → 1061.7

Confirmation
803.6 → 113.0
817.5 → 113.0
1141.6 → 855.4― 10 ―

図１

試料調製法

解により消失することから，OA群及びYTXとは別フ着しメタノールで溶出しないため，HLBカラムによローで精製した．

る他の成分との同時処理が困難であった．DTX3を除添加回収試験：

く６成分は負荷液のメタノール濃度が50％を超えるとホタテ中腸腺およびむき身試料に混合標準溶液を保持されず溶出するため，抽出液のメタノール濃度を0.1 µg/g（YTX0.5 µg/g）添加し，試行数５回で試験50％以下に調整しHLBカラムに負荷することとした．

を行った．

アルカリ加水分解処理の貝毒回収率への影響：

なお，試験に用いた中腸腺試料は定量下限値を超え使用したエステル体のDTX3標準品は，アルカリるPTX6を含有していたことから，PTX6については加水分解処理により，DTX1としての回収率が91.1±マトリックス標準添加法で検量線を作成した．

4.0%（試行数５回）であったことから，DTX3は全量DTX1に変換していると推定された．ネガティブモー成績

ドで測定するOA，DTX1及びYTXについて，アルカHLBカラムにおける各種貝毒保持能の検討：

リ加水分解の影響の有無を見るため，ホタテむき身試

HLBカラムにおける挙動を把握するため，混合標料に混合標準溶液を添加し，抽出液についてアルカリ準溶液のメタノール濃度を10～90％の範囲で段階的に加水分解したものと未実施の試料についてHLBカラ変え，HLBカラムに負荷し各種貝毒成分の保持能をムにそれぞれ負荷する添加回収試験を行った（表２）．

検討した（図２）．エステル体のDTX3はカラムに吸各成分とも両処理群の回収率に有意差はなかったこと― 11 ―

から，OA群及びYTXはアルカリ加水分解処理-HLB

告［3-4］と一致していた．

カラム精製の方法を採用した．

マウス試験法により規制値0.05 MU/gを超えたた

ホタテ試料における各種貝毒の添加回収試験：

め出荷が自主規制となった海域で採取されたホタテ

ホタテ試料を用いた各種貝毒の添加回収試験結果をの中腸腺，むき身試料では，DTX1が各々0.95，0.19

表３に示した．中腸腺試料のYTXのみ回収率が68.3％µgOA当量/g検出され，現行の規制値0.16 µgOA当量と70%未満であったが，その他の成分の回収率は70～/gを超えていた（表４）．

120%の範囲内であった．併行精度（RSD）は，むき市販品のむき身試料については２検体ともDTX1身試料のOAが16.0％とやや高めであったが，その他は検出されなかった．一方，脂溶性貝毒のPTX1は6の成分は10％未満と良好な結果が得られた．

月市販品，７月市販品から各々0.04µg/g，0.01µg/g，規制値超過検体および市販品における貝毒の定量：

PTX6は 各 々0.31µg/g，0.19µg/g検 出 さ れ た． ま た，

OAは，LC-MS/MSを用いる本法においても，いずYTXが６月市販品から0.35µg/g検出された．DTX1標れの検体からも検出されず，このことはこれまでの報

図２
表２

準溶液と検体のクロマトグラムを図３に示す．

HLBカラムにおける各種貝毒保持能

アルカリ加水分解処理の貝毒回収率への影響

成分

Alkaline hydrolysis + OasisHLB

DTX3DTX1として91.1 ± 4.0

OasisHLB

OA

85.3 ± 9.1

94.6 ± 10.0

DTX1

85.6 ± 1.6

87.8 ± 12.9

YTX

91.3 ± 5.9

94.8 ± 10.2

表３ホタテ試料における各種貝毒の添加回収試験結果
回収率（真度）± 併行精度（RSD）（％）

ホタテ試料

OA

DTX1

PTX1

PTX2

PTX6YTX※

中腸腺

117.6± 5.8

81.1±2.1

86.9±2.4

84.2±2.4

103.3±6.1

68.3±4.8

むき身

106.9±16.0

87.5±2.0

72.0±4.774.7±6.487.2±1.7

91.3±5.9※供試料に含まれていたため標準添加法により定量
表４
検体

規制値超過検体および市販品における貝毒の定量
OA群（µg OA当量/g）
OA

PTX群（µg/g）

DTX1

PTX1

PTX2

YTX（µg/g）
PTX6

YTX

規制値超過検体（中腸腺）

－

0.95

0.340.02

3.01.1

規制値超過検体（むき身）－

0.190.09

－

0.60

－

市販品（Ｈ26年６月購入）

－

－

0.04

－

0.310.35

市販品（Ｈ26年７月購入）

－－

0.01

－

0.19

－

― 12 ―

図３
考

下痢性貝毒DTX1のクロマトグラム

察た結果，規制値0.16 µgOA当量/gを超えるDTX1が検LC-MS/MSによる下痢性貝毒のOA群，脂溶性貝毒出された．マウス試験法における規制値0.05 MU/gとのPTX群及びYTXの同時分析法を検討した．試料調

0.16 µgOA当量/gは，ほぼ同程度の毒力であることが製法は90%メタノールで試料を抽出し蒸留水を同量加わかっている．今回の分析結果より，マウス試験法でえ，メタノール濃度50％以下に調整した抽出液につい規制対象となった海域で同時期に採取されたホタテにて，PTX群はHLBカラムで精製，OA群及びYTXはは規制値0.16 µgOA当量/gを超えるOA酸群が含まれ抽出液をアルカリ加水分解した後，HLBカラムで精ており，マウス試験法のスクリーニング法としての有製する方法を構築した．

用性が確認できた．

エステル体であるDTX3は二枚貝体内でOA，DTX1

本県海域では平成27年春にホヤにおいて下痢性貝毒及びDTX2の代謝物として蓄積し，ヒトが摂取した場の出荷規制措置が講じられている．今後，ホタテ以外合，胃腸内で加水分解され，OA，DTX1等として下の水産物を対象とした試験法としての妥当性評価を行

痢原性を発現する．今回，DTX3は夾雑物除去を目的

い，検査体制の整備を図っていくことが必要と考えらに用いたHLBカラムに吸着し，他の貝毒成分との同れる．

時処理が困難であったことから80℃で40分間のアルカ

今回，市販品について同じ産地で購入時期が異なる

リ加水分解処理を行い，変換物をHLBカラムで精製

ホタテを調査したところ，OA群はいずれからも検出する方法を採用した．

されなかったが，脂溶性貝毒のPTX1，PTX6と１検本試験法によるホタテ中腸腺及びむき身試料のOA体からYTXが検出された．各成分の含有量は異なっ

及びDTX1の回収率は，絶対検量線法で81.1～117.6%，ていたことから脂溶性貝毒成分の組成比が時期によっ併行精度（RSD）は2.0～16.0%で，PTX群及びYTXて変動することが確認できた．このことは神ら［4］は回収率68.3～103.3％，RSD 1.7～6.4%であった．通の報告と一致していた．

知「下痢性貝毒（オカダ酸群）の検査について」［8］

通知法［8］では，脂溶性貝毒のPTX群及びYTX群

では，OA群の試験法の妥当性確認の精度について，は下痢原性を持たないため下痢性貝毒としての規制対回収率（真度）70～120％，併行精度15%以下の目標象から除外されたが，Viscianoら［12］は，YTXのヒ値が示されている．今回，むき身試料のOAの併行精トへの毒性は明らかではないが，YTXをマウスに腹度が16.0%と目標値をわずかに超えたが，概ね満足で腔内投与した場合，致死毒性があることを報告していきる結果が得られたことから，下痢性貝毒による食中る．今後，脂溶性貝毒の下痢原性以外の毒性が明らか毒事例などが発生した場合，迅速な検査対応が可能ととなった場合，各成分を定量し評価する必要が生じるなり，本県の健康危機管理体制の強化を図ることがで可能性が考えられる．その場合，本法を用いて県内主きたものと考えられた．

要海域における下痢性貝毒及び脂溶性貝毒の地域性，本法を用いて，マウス試験法で規制値超過となった

季節性の情報を把握することにより将来的なリスク管海域で採取したホタテ中腸腺及びむき身試料を分析し理が可能になると考えられる．
― 13 ―

また，通知「対EU輸出水産食品の取扱いについて」

acid,dinophysistoxin-1 and pectenotoxin-6 in［7］にあるように，貝可食部をEUに輸出する場合，bivalves, J. Chromatogr. A., 874,199-206（2000）

OA群，PTX群及びYTX群等の定量分析が必要となる［10］Suzuki T, Quilliam MA：LC-MS/MS analysis

ことから，本県において二枚貝の対EU輸出が検討さ

of diarrhetic shellfish poisoning（DSP）toxins,

れた場合，貝毒組成を同時に把握できる本法の活用がokadaic acid and dinophysistoxin analogues, and期待される．

other lipophilic toxins, Anal. Sci., 27, 571-584

貝毒の毒性は，その成分ごとに異なり，その組成比（2011）

は季節，海域や二枚貝の種類によって異なることから，［11］Yamaguchi M, Yamaguchi T, Kakimoto K et

下痢性及び脂溶性貝毒成分を同時に把握できる本法はal. ：Validation study for analytical method

有用と考えられた．

of diarrhetic shellfish poisons in 9 kinds ofshellfish，J. Food Hyg. Soc. Japan, 57, 19-22
引用文献（2016）［12］V isciano P, Schirone M, Tofalo R et al. ：［１］昭 和56年５月19日付け環乳第37号「下痢性貝毒

Detection of yessotoxin by three differentの検査について」［２］Toda M, Uneyama C, Toyofuku H, Morikawa K：

methods in Mytilus galloprovincialis of Adriatic

Trends of food poisonings caused by naturalSea, Italy, J.Chemosphere, 90, 1077–1082（2013）

toxins in Japan,1989-2011, J. Food Hyg.Soc.
Japan, 53, 105-120（2012）［３］薬事・食品衛生審議会食品衛生分科会乳肉水産
食品部会資料「下痢性貝毒の検査法と国内外の基準値」（平成25年８月２日開催）［４］神毅統，三津谷正，鈴木敏之：陸奥湾における新たな下痢性貝毒モニタリング手法の開発（第１報），青森県環境保健センター研究報告，15，8-11（2004）［５］H ashimoto S, Suzuki T, Shirota Y et al：
Lipophilic toxin profiles associated withdiarrhetic shellfish poisoning in Scallops,Patinopecten yessoensis, collected in Hokkaido
and comparison of the quantitative results
between LC/MS and mouse bioassay, J. FoodHyg. Soc. Japan, 47，33-40（2006）［６］H ashimoto S, Nishimura K, Takahashi K,
Itabashi Y：Evaluation of the possibility that
free fatty acids cause false-positive result in
diarrhetic shellfish poisoning，J. Food Hyg. Soc.
Japan, 52，194-198（2011）［７］平成21年６月４日付け食安発第0603001号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知「対EU輸出水産食品の取扱いについて」（最終改正平成28年６月30日）［８］平 成27年３月６日付け食安基発0306号第３号厚生労働省医薬食品局食品安全部基準審査課長「下痢性貝毒（オカダ酸群）の検査について」［９］Suzuki T, Yasumoto T：Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry ofthe diarrhetic shellfish-poisoning toxins okadaic― 14 ―