下中科学研究助成金取得者研究発表

研究発表⼀覧は下記からご覧いただけます。
https://www.shimonaka.or.jp/3s-grant-contest/アクアポリン遺伝子から探るデンジソウの水上葉形成メ
カニズム
ノートルダム清心学園 清心女子高等学校
田中 福人
１．はじめに ― デンジソウについて ―耕作方法の変化、さらには水田の減少など

デンジソウ（学名：Marsilea quadrifolia L

で個体数が激減し、環境省レッドリストで英名：Water clover） は夏緑性の水生シダ植は、絶滅の危険が増大している種として『絶物であり、水田や沼などの流れのない水域滅危惧Ⅱ類』に選定されている。そのため、で生育する。和名を漢字で記すと「田字草」

自然保護センターや植物園等を除いて、野となるが、これはクローバーのような小葉外で見かけることはほとんどなくなってし４枚が開いたときに「田」の字のように見まった。

えることからこの名前がつけられている（図１）。ホームセンターでは、アクアリウムの２．研究目的水草として市販されており、睡蓮鉢等でつデンジソウの４枚の小葉は、その生育環くられるビオトープに植栽されるなど、観境の特性から、葉柄を空中に伸張させて展賞用としても人気がある植物種である。

開する「地上葉」と、水面上で展開する「浮き葉」の存在が知られている（図２，３）。
特に浮き葉は、周りの水位が高くなって個体が完全に沈んだ環境でよく見られる。小葉と茎をつなぐ部分を葉柄とよぶが（デンジソウの茎は地面を這って伸びており、匍匐茎とよばれる。通常、茎のように見える部分は葉柄である）、地上葉の葉柄の長さは通常、10～15㎝程度であるのに対し、浮き葉は水面上に葉を展開するため、水位が高くなるほど葉柄が伸長し、25㎝を越えることもある。浮き葉をつくる理由として、小葉の組織が水によってふやけたり、光合成

図１．デンジソウ（於：岡山自然保護センター）が阻害されるのを防ぐためであると考えられている。浮き葉を形成する際は、水面に野外での分布範囲はヨーロッパ・インド

葉を浮かべるために前述の「葉柄」が非常

北部から東アジアで、国内では北海道・本に良く伸びるが、その詳しいしくみを報告

州・四国・九州と奄美大島の低地に生育すした先行研究は見当たらない。そこで本研る。かつては、暖かい地域を中心に普通に究では、浮き葉形成の際に葉柄が伸びるメ見られ、水田の雑草とされていたが、農薬カニズムを明らかにすることを目的とした。

・除草剤の使用による水質の汚染、水田の−
- 58
58 −

たいと考え、実験はこの「課題研究」の時間内に、生徒に指導する形で進めた。
３．研究仮説通常、成長した植物細胞では、液胞がよく発達していることが知られている（図４）。
液胞の中身の大半は水分であるため、細胞が成長し、葉柄が伸びるときには、細胞内の液胞に水がさかんに入ると考えられる。
そこで、デンジソウは葉柄をより長く伸ばすために、細胞への吸水性を高めるしくみがあるのではないかと考えた。そして本研
図２

地上葉究では、そのしくみとして、特に、細胞内外の水の通り道であるアクアポリンが関係していると仮説を立てた（図５）。アクアポリンは細胞膜上あるいは液胞膜上に存在していて、水分子を通す孔をもっている。また、アクアポリンの成分はタンパク質であり、遺伝子の働きによってつくられることが知られている。つまり、アクアポリン遺伝子の働きが活発になり、細胞内にアクアポリンが多くつくられたならば、細胞内へ水が入りやすくなり、細胞の成長及び、葉柄の伸長が急速に進むと考えられる。

図３

浮き葉

また、遺伝子が働く際には、DNA に含ま現行の高等学校「生物」の教科書では、れる遺伝情報から mRNA がつくられ（＝旧教科書と比べ、遺伝子やタンパク質の働転写）、その後、mRNA をもとにタンパクき等を扱った分子生物学の内容が増えてい質が合成される（＝翻訳）。アクアポリンる。しかし、それらを高校の教育現場で体遺伝子の働きが活発になることを示すため験的に理解する実験教材については、コスに、この「転写量」と「翻訳量」に注目し

ト、実験設備、指導者の力量等、様々なハた。浮き葉が発生する環境条件（個体が完ードルをクリアする必要があり、開発が遅全に水につかった状態）と、地上葉が発生れている。本校の教育課程では、理科の教科内に「課題研究」の時間が設定されており、この時間では、各々の生徒が興味を持ったテーマについて研究活動を行う。そこ
で、本研究を遂行するにあたり、高校生を対象とした分子生物学実験の実践例を示しする環境条件（個体が水につかっていない状態）の株から葉柄の組織サンプルを各々採取し、アクアポリン遺伝子の「転写量」及び「翻訳量」を比較することで、前述の仮説の検証を行った。

−- 59
59 −

図４

植物細胞の成長図６

デンジソウ小葉の初期形態

ソウ株から、葉柄を含む小葉を 0.1g 採取し、組織内でつくられている全 RNA を抽出した 。 抽 出 試 薬 は RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN 社）を用い、付属のマニュアルに沿って抽出を行った。実験後、RNA がき
図５

研究仮説

ちんと抽出されているかについては、分光光度計で確認した。
b．cDNA の作製

４．実験方法４－１

a で抽出した RNA に逆転写反応（RNAアクアポリン遺伝子の「転写量」に含まれる塩基配列の情報をもとに DNAの比較
デンジソウの小葉は最初、ゼンマイのよを合成すること。この時に合成された DNA

うな形態をとっており、４枚の小葉も重なを特に cDNA とよぶ）を起こさせ、cDNAっているが（図６）、その後、小葉が開き、を作製した。逆転写反応のための試薬は「田」の字のように見えてくる。一度葉がReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with

開いてしまうと、葉柄の伸長が見られなくgDNA Remover（ 東洋紡社）を用い、実験なるため、実験では主に、展開前の小葉をは付属のマニュアルに沿って行った。

使用した。実験方法は RT-PCR 法を採用し、c．PCR

その概略は図７に示すが、実験は下記の ab で得られた cDNA は微量であるため、PCR～ d の順序で行った。

法により増幅し、量を増やした。PCR 法でa．RNA の抽出は、DNA のある一部分だけを選択的に増幅実験室内の窓際で生育させているデンジさせることができるので、cDNA 内のアク−- 6060 −図７ アクアポリン遺伝子の「転写量」の比較

実験の流れアポリン遺伝子の部分を増幅した。過去、粉末を 1 × TAE バッファーに２%の割合に未知であったデンジソウのアクアポリン遺なるよう溶かし、電子レンジで加熱して完伝子を同定したので、その遺伝情報から全に溶解させた。溶解後、付属のトレイにPCR 法に必要なプライマーを設計した（プ流し込み、常温で冷やして固めた。

ライマーの合成はユーロフィンジェノミク

泳動層には 1 × TAE バッファーを注ぎ、ス社に依頼した）。プライマー以外に必要な各ウェルに PCR サンプルを添加後、100V

試薬は Quick Taq® HS DyeMix（ 東洋紡社）の電圧で 40 分間泳動した。また、PCR サを用いた。

ンプルと共に、100bp ～ 1000bp の 範囲のd．電気泳動（アガロースゲル電気泳動）

DNA ラダー（様々な長さの DNA 断片が予c で得られた PCR サンプルを電気泳動にめ含まれている）も合わせて泳動した。

かけ、アクアポリン遺伝子の転写量を確認

泳動後、ゲルを泳動層から取り出し、0.5した。電気泳動を行うことで、PCR サンプ

μ g/mL のエチジウムブロマイド溶液で染ル内に含まれる DNA 断片を長さに応じて色した。その後、ゲルを水道水で洗浄し、分離することが出来る。電気泳動装置は紫外線トランスイルミネーターを用いてバMupid®-2plus（ タカラバイオ社）を用いた。

ンドの有無を確認した。

支持体（ゲル）の作製のため、アガロース
−
- 61
61 −

以上の実験から得られた電気泳動写真を用いて、水につかったデンジソウ株から得ATTO 社）、既成ゲル（e・PAGEL、ATTO 社）られたサンプルと、つかっていない株からを使用した。泳動層に泳動バッファー

得られたサンプルとでアクアポリン遺伝子（AE-1410 EzRun、 ATTO 社）を注ぎ、各を示すバンドの濃度から、転写量を比較しウェルに e で得られた全タンパク質及び分た。

子量ラダーマーカーを添加後、250V・20mAで60分間泳動を行った。電気泳動後、スパ

４－２

アクアポリン遺伝子の「翻訳量」の比較チュラを使ってゲルをトレイから外し、以降の実験で使用した。

４－１と同様、水につかったデンジソウ

g．ウエスタンブロット

株と、つかっていない株からタンパク質をセミドライブロッティング装置（サンプ抽出し、その中に含まれるアクアポリンのラテック社）を用いて、ゲルに含まれるタ量を比較した。実験方法はウエスタンブロ

ンパク質を PVDF（ポリフッ化ビニリデン）ット法を採用し、その概略は図８に示すが、メンブレン上に写した。その後、メンブレ

実験は下記の e ～ g の順序で行った。

ンをポンソー S 染色液（アプロサイエンス

e．タンパク質の抽出社）で染色し、タンパク質がきちんと写し葉柄を含む植物サンプルを各 0.2g ずつと取られているかどうかを確認した。確認後、り、液体窒素で凍らせた後に破砕した。そ染色液を捨て、蒸留水及び 0.1M NaOH をの後、植物サンプルの３倍量のサンプルバ用いてメンブレンを洗浄した。

ッファー（0.3M Sucrose、 50mM Tris、8mM洗浄したメンブレンをブロッキングバッ

EDTA、4mM DTT）を加えてすりつぶし、

ファー（TAKARA 社）中で 1 時間振とうし、10,000g、4 ℃で10分間遠心分離を行った。

メンブレン上のアクアポリン以外のタンパ

その後、タンパク質が含まれている上澄みク質との反応を抑制させる、ブロッキング部分を新しいチューブに移し、上澄み液と処理を行った。その後、ブロッキングバッ

等量の可溶化バッファー（60 ％ Sucrose、10ファーを除き、Tween-PBS で メンブレンを％ LDS、純水を 1:1:2 の割合で混ぜて DTT洗浄してから、アクアポリンと一次抗体をを加えたもの）を加え、沸騰した湯の中で反応させた。この際用いた一次抗体は、デ１分間ボイルした。その後、氷上で急冷した。

ンジソウのアクアポリンのアミノ酸配列をf．電気泳動（SDS-PAGE）

もとに、ユーロフィンジェノミクス社に作

e で得られたデンジソウのタンパク質溶製を依頼したもので、ウサギの体内で合成液には、様々な種類のタンパク質溶液が含させたものである。その後、再び Tween-PBSまれている。今回、特に必要としているタでメンブレンを洗浄し、デンジソウのアクンパク質はアクアポリンであるため、電気アポリンに付着した一次抗体と、二次抗体泳動を行い、タンパク質を分離した。４－（ヤギ抗ウサギ IgG-AP、バイオラッド社）

１ d の時と同様、電気泳動を行えば、タンとを反応させた。更に、BCIP-NBT 溶 液キパク質をその大きさに応じて分離することット （ナカライテスク社）を用いて、メンが出来る。先行研究から、アクアポリンのブレン上の二次抗体をアルカリフォスファ大体の大きさは分かっているため、この方ターゼ（AP）反応により染色し、デンジソ法でアクアポリンを分離することが可能でウのアクアポリンを検出した。

ある。実験では、縦型電気泳動装置（AE-6530 、−- 6262 −図８ アクアポリン遺伝子の「翻訳量」の比較

実験の流れ

５．結果るために行った電気泳動写真を図10に示す。

５－１

アクアポリン遺伝子の「転写量」の比較

電気泳動の結果、単一のバンドが確認できたが、PCR の際に用いたプライマー配列

過去の研究で同定したデンジソウのアクや想定される PCR 産 物の長さから考えるアポリン遺伝子は10種類であった（図９）。と、得られたバンドはデンジソウのアクアPCR 実験の際に用いたプライマーは、それポリン遺伝子由来のものである可能性が高い。

ら10種のアクアポリン遺伝子に対応したもさらに、どのアクアポリン遺伝子においても、のを８種類作製して用いた。それらのアク水に浸した株から得られたサンプルの方がバアポリン遺伝子について、転写量を比較すンドが濃くなっていることが確認できた。

−- 63
63 −

図９

過去の研究で同定したデンジソウア

図11

キアポリン遺伝子のアミノ酸配列をもアクアポリン遺伝子の翻訳量の違いとにに作成した分子系統樹

図10

アクアポリン遺伝子の転写量の違い（A：水につかった株 B：水につかっていない株）（A：水につかった株

５－２

アクアポリン遺伝子の「翻訳量」

両サンプルにおいておいて、バンドが確認の比較できた。双方に共通しているバンドは大き

本研究では、液胞膜上に存在するアクアさが 45kDa 程度のあたりに見られた。先行

ポリン（図９）の MgTIPg1）について一次研究によると、被子植物の液胞膜上に存在抗体を作製し、アクアポリンの検出を行っするアクアポリンの分子量は約 20 ～ 25kDaた。ウエスタンブロットの結果を図11に示との報告されている。そこから考えると、す。水につかった株、つかっていない株の今回得られたバンドはアクアポリンの２量−- 6464 −体の可能性が高い。そして、特に水に浸しクアポリンが働かないと、細胞の吸水がでた株の方では、複数の濃いバンドが確認できず、細胞の成長が抑制されたからだと考きた。

えられる。この結果からも、アクアポリンと葉柄伸長との関連性は高いことが示唆さ４．考察れる。以上の結果をまとめると、デンジソデンジソウを材料とした RT-PCR やウエウの葉柄伸長のメカニズムについては、「水スタンブロットについては先行研究がない

生シダ植物であるデンジソウは水に浸されため、本研究ではまず、実験方法の確立がた際、アクアポリン遺伝子の働きを活発に求められた。実験を繰り返し行った結果、し、アクアポリンを多量に合成する。その一応の結果が得られたため、実験方法の確

結果、細胞内への吸水性が高まり、葉柄の立は概ね達成できたと考えられる。図10を伸長が促進される」と考えることが出来る。

見ると、水につかった株の方が濃いバンド

デンジソウはため池や圃場など、水位のを示していたため、デンジソウは周りの水変化が比較的激しい場所で生育するため、位が高くなると、アクアポリン遺伝子の転このようなメカニズムで葉柄を伸ばして浮写量を増加させていると考えられる。また、き葉を形成することは、個体の生存率を高

図11より、ウエスタンブロットにより翻訳めることにつながっていると考えられる。

量を比較した結果においても、水につかっ浮き稲を用いて行われた先行研究では、田た株の方が濃いバンドが確認できたので、植え後の梅雨時、苗が早く空中に葉を出す

アクアポリン遺伝子の転写量だけでなく、ために、アクアポリン遺伝子の働きを活発翻訳量も増加していると考えられる。図11にしていることが報告されているが、本研において、水につかったサンプルで複数の究のような水性シダ植物を用いた研究につバンドが見られたため、水につけることで、いては研究例がなく、本研究が初の報告と単一のアクアポリンだけではなく、複数のなる。

アクアポリンの発現が促された可能性があアクアポリンは、1992年にアメリカ人研る。ただし、アクアポリン以外の非特異的究者のピーター・アグレ氏（2003年にノーなタンパク質が検出されている可能性もあベル賞受賞）によって発見された。水と生る。これをはっきりさせるためには、まず命をつなぐ役割をもっているとされ、様々は、抗体濃度の検討や、染色及び洗浄時間な生物を対象に現在も研究が進められていの変更等、実験方法についての改善を今後る。高等学校「生物」の教科書内の「細胞進めていきたい。と分子」の項においては、細胞膜内外で物DNA ―（転写）→ RNA ―（翻訳）→タ質を輸送する〝チャネル″の具体例としてンパク質という遺伝子発現の流れ（＝センも紹介されており、一般的にも広く認知さトラルドグマ）の各段階において、違いがれるようになってきた。本研究が示す結果はっきりと確認できたため、水につかるこは、アクアポリンの役割についての新たなとでアクアポリン遺伝の働きが活発になる知見であり、これを教科指導に役立てるこことは間違いない。また、この研究に至るとで生徒の生命現象に対する深い理解を促までに、塩化水銀を用いてアクアポリンのすことにつながると考えている。

働きを阻害させた場合、葉柄の伸長が抑制

また、実験は「課題研究」の時間内に高されることは確認できている。これは、ア校生に指導する形で進めていったが、各実−- 6565 −験手順の意味を説明し、考えさせながら進【参考文献】めていくことで、生徒の科学的知識及び理（１）白岩卓巳「絶滅危惧植物水生シダ解が深まっていくことが実感できた。このは生きる」（自費出版）2000年

ような体験を通して得られた深い知識は、（２）アーネスト M. ギルフォード・エイ

大学進学後も有効であると考えられる。実ドリアンス S. フォスター．

験難度が高く、長時間に渡る実験も含まれ（訳）「維管束植物の形態と進化」（文ているため、通常の「生物」の時間内に一一総合出版）

中澤幸

2002年

般生徒を対象に本研究のような分子生物学（３）Yukari M., Shoji S., Hidehiro H., Junko

実験を進めていくことは難しいかもしれな

S., Mari M. 2011. Vacuolar Proton

いが、特に興味関心の高い生徒を対象に「総Pumps and Aquaporins Involved in合的な学習の時間」等を利用して丁寧に指Rapid Internode Elongation of Deepwater

導をすることで、高校段階でも本格的な分Rice. Biosci. Biotechnol. Biochem., 75

子生物学実験を導入することは可能である。

(1), 114-122, 2011

なお、本研究を通して得られた様々な情報（４）石川淳子, 林秀洋, 松尾直樹, 実山豊（アクアポリン遺伝子について、実験方法「ダイズの細胞膜型及び液胞膜型ア等）は今後の教科指導においても役立ててクアポリン遺伝子の器官別発現特性」

いきたい。

（日本作物学会記事） 82, 334-335,
2013年

末筆ながら、本研究に研究助成をして下（５）大藤道衛 (編集)「電気泳動なるほどさった公益財団法人下中記念財団に紙上をQ&A ―そこが知りたい! 」（羊土社）

借りて、厚く御礼申し上げます。

2011年（６）田村隆明「基礎から学ぶ遺伝子工学」（羊土社）2012年（７）岡田雅人・ 宮崎香 (編集) 「タンパク質実験ノート〈上〉タンパク質をとり出そう(抽出・精製・発現編」
（羊土社）

2011年

（８）岡田雅人, 三木裕明・ 宮崎香 (編集)「タンパク質実験ノート（下） タン
パク質をしらべよう」（羊土社）
2011年

−- 66
66 −

最近では、子嚢菌類の栽培を教育に活かす試みを新たに始めており、生徒に課題研究として取り組ませ、より良い栽培手法の検討など、試行錯誤させることで科学的知識・技能の習得と科学的思考力の育成を促している。
第49 回日本原生生物学会シンポジウム（2016）にて、「原生生物学の進展と理科教育への可能性」というテーマで勤務校の科

田中 福人先生（たなか ふくと）学教育の実践例を報告した。
岡山県総合教育センター高等学校理科研修講座（2016）にて、生物活動記録装置の作製実習を指導した。

＜略歴＞
1982年４月17日生まれ
2005年３月

岡山大学理学部生物学科卒業＜勤務校＞

2007年３月

岡山大学大学院教育学研究科

ノートルダム清心学園 清心女子高等学校修了〒701-0195

2007年３月～ノートルダム清心学園 清心女子高等学校勤務
現在に至る

＜研究歴＞
主に植物を研究材料とし、生物リズムについて自身が研究するとともに、生徒への指導も行ってきた。過去に扱った主な生物材料は、本研究対象でもある水生シダ植物のデンジソウであり、就眠運動などの生物リズムの調査や、胞子繁殖等の生態調査並びに繁殖率を向上させるための環境条件の検討、個体増殖につなげるための組織培養法の確立について研究を行ってきた。それらの研究成果は外部の研究発表会等で積極的に発信し、水生シダ植物の保全について社会に訴えてきた。また、この課題研究における教育実践例は、平成26年度（第46回）
東レ理科教育賞において本賞を受賞した。

−- 67
67 −

岡山県倉敷市二子1200
電話086－462－1661