岩獣会報（Iwate Vet.）,Vol. 43（№ 1）,3－8（2017）.

バイオインフォマティクスを高度利用した病原性タンパク質の検索・組換え体作出とその利用：カビアレルゲンタンパク質を例にして

大内勇樹
要約

真菌由来の病原性タンパク質であるアレルゲンを同定するには，IgE結合性試験，質量分析，コーディング領域（Cording sequence : CDS）全長の把握を行うため，非常に多くの労力と時間を要する．そこで，次世代シーケンス（Next generation sequencing : NGS）解析を利用することで，真菌由来アレルゲンを迅速かつ網羅的に同定する新たな手法を確立した．アレルゲン検索の対象として，Aspergillus restrictus からmRNAを抽出し，NGS解析を行った．得られた塩基配列をInternational Union of Immunological Societiesに登録されている真菌アレルゲンに対して相同性検索を行ったところ，６つのA. restrictus 由来候補アレルゲン（ARAC1～6）遺伝子が特定された．大腸菌発現系により，これら６つのARACを作出し，アレルギー患者血清と反応させたところ，ARAC4およびARAC6においてIgE結合性を確認した．また，ARAC6のアナフィラキシー誘導性も確認された．
本総説において提案された新規アレルゲン同定法は，バイオインフォマティクスを利用した病原性タンパク質の同定法として，広く有用であると考えられる．
キーワード：バイオインフォマティクス，次世代シーケンス解析，アレルゲン，病原性タンパク質，Aspergillus restrictus
１．序論

いる．しかし，同じ真菌種であっても，菌株間の違い

真菌はダニ，花粉，ペットと並んでアレルギー疾患や抽出時のバッチ間の違い，真菌の培養条件や抽出方の主要な原因となっている．真菌に対するⅠ型アレル法によって，真菌エキスのタンパク質組成は大きく変

ギー反応が原因で起こる疾患には様々なものがあり，動するため，真菌エキスの質は診断を行ううえで不均気管支喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎，一なものとなっている［3，4］．

アレルギー性気管支肺真菌症（ABPM）などが知ら

この真菌エキスにおける質の問題を克服するため，れている［1］．真菌の胞子や菌糸の吸入および接触に診断に利用されているのが組換えアレルゲンである．

より真菌アレルギーは生じるが，人体に定着し，毒素アレルゲンとはアレルギーの原因となる物質のことでや酵素，揮発性有機化合物の産生により気道を損傷すあり，通常，アレルギー源となる花粉や食品は２～３る点で他のアレルギー源よりも患者の免疫系に多大な種類のアレルゲンによって構成されているのに対し，影響を与えていると考えられている［2］．

真菌エキスは10種類以上のアレルゲンによって構成さ

真菌アレルギーの診断は，患者の病歴や，真菌エキれており，それぞれのアレルゲンがアレルギー患者にスを用いた皮膚プリック試験，皮内試験などのin vivo対して異なる反応性を示し，その病態を多様化してい試験，Radioallergosorbent Test（RAST），Enzyme-る［5］．組換えアレルゲンとは分子生物学的手法によLinked Immunosorbent Assay（ELISA），ウエスタり作出されたアレルゲンのことであり，タンパク質のンブロッティングなどのin vitro 試験に基づいている．

調製に再現性がある点，純度の高いタンパク質の大量

in vivo 試験およびin vitro 試験での評価の正確性や信生産が行える点，感作および暴露における交差反応性

頼性は，用いられる真菌エキスの質に大きく依存しての分析が可能であり，各アレルギー患者における病態

北海道大学大学院獣医学研究科

人獣共通感染症リサーチセンター―3―

バイオリソース部門

の性質を特定できる点において，真菌エキスよりも優くの研究機関で次世代シーケンサーが導入され，多くれている．また，これらの利点により，組換えアレルの生物種でゲノム解析やトランスクリプトーム解析，ゲンを用いた特異的な免疫療法は，真菌エキスと比較メタゲノム解析などが行われている．そこで，次世代して副作用を抑えることができ，アレルギーや真菌症シーケンサーを利用し，培養真菌において転写されたの効果的な治療法になると考えられている［6］．

mRNAを網羅的に調べるトランスクリプトーム解析

従来のアレルゲン同定法には，アレルギー患者血を行うことで，真菌由来アレルゲンを迅速に同定する

清を用いて，真菌エキスからIgEと特異的に結合する新たな手法を検討した．

タンパク質を分離する方法がある［7］．この方法は，アレルギー疾患の原因真菌としてAspergillus 属真二次元電気泳動やウエスタンブロッティングにより，菌は最も知られている［1］．Aspergillus 属真菌の関IgE結合性タンパク質を単離または同定した後，その係したアレルギー疾患の大半がAspergillus fumigatus

部分アミノ酸配列を質量分析により特定し，縮重ポリによるものと考えられており，現在までに22種類のメラーゼ連鎖反応（縮重PCR）やRapid Amplificationアレルゲンが同定されている．同属の真菌で あるof cDNA End（RACE）法を用いてコーディング領

Aspergillus restrictus は，A. fumigatus に匹敵するア域（CDS）全長をクローニングし同定する．最も一般レルギー誘発性を持ち交差抗原性を示すと近年報告さ的なアレルゲン同定法ではあるが，抗原抗体反応時のれている［8］にもかかわらず，未だアレルゲンが同バックグラウンドが高くなり，IgE結合性タンパク質定されていないことから，A. restrictus を本手法検討を特定できないことが多い．また，そのタンパク質のの対象とした．

精製，アミノ酸配列の決定，CDSの選別には非常に多A. restrictus 培 養 菌 体 か らmRNAを 抽 出 し，NGSくの時間と労力が必要であり，一度に１つのアレルゲ

解 析 を 行 う こ と で1556のCDSを 示 す コ ン テ ィ グ 配ンしか同定できないため，より効率的な新しいアレル列 が 得 ら れ た．Translated Basic Local Alignment

ゲン同定法の開発が求められている．

Search Tool（blastx）により，これらの塩基配列をInternational Union of Immunological Societies（IUIS）

２． 次世代シーケンス（NGS）解析を利用した新規に登録されている98種の真菌アレルゲンアミノ酸配列

真菌アレルゲンの同定に対して相同性検索を行った（表１）．E-value<10-100

NGS解析とは次世代シーケンサーを用いた遺伝子解の高い相同性を示すアレルゲン遺伝子15種のうち，析のことであり，従来のDNA塩基配列解読法であるCDS全長が解読できた６種をA. restrictus 由来候補

サンガー法とは比較にならないほど低コスト，短時間アレルゲン（ARAC1～6）遺伝子とした（表２）．各で簡便に大量の塩基配列データを得ることができる．

ARAC遺伝子について，大腸菌発現系により組換え

近年では，シーケンシングコストが低下したため，多タンパク質を作製し，IgEウエスタンブロッティング

表１

既知真菌アレルゲンとの相同性が高かったコンティグ配列

Query ID

Subject

Characteristics

Identity%

E-valuecontig00511

Asp f 12Heat shock protein P90

90.20contig00513

Pen c 19

Heat shock protein P70

93.90

contig00527

Asp f 18

Vacuolar serine protease

77.70contig00681

Asp f 23

L3 ribosomal protein

90.70contig00732Pen ch 35

Transaldolase

80.90contig00811

Cla h 10

Aldehyde dehydrogenase

75.80contig00853

Pen c 30

Catalase

80.60contig01077

Asp f 22

Enolase92.9

1.0x10-177

contig00533

Rhi o 1

Aspartyl endopeptidase

53.0

8.0x10-150

contig01019

Cla h 8Mannitol dehydrogenase

76.7

8.0x10-132

contig00628

Asp f 4-57.7

2.0x10-123

contig00785

Mala f 4

Mitochondrial malate dehydrogenase

55.7

2.0x10-110

contig01401

Asp f 6

Mn superoxide dismutase

68.3

2.0x10-106

contig00591

Asp f 9-60.8

1.0x10-102

contig01592

Asp f 3Peroxysomal membrane protein

81.0

6.0x10-102―4―

によってABPM患者血清中のIgEとの結合性を評価し体成分に対するウエスタンブロッティングを行ったとた．その結果，ARAC4およびARAC6においてIgE結ころ，菌体外成分および菌体成分においてARAC6の合性があることが判った（図１）．このうち，ARAC6存在が確認された（図２）．このことより，ARAC6はに 対 す る ウ サ ギ ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し，A.

IgE結合性のアレルゲンとしてA. restrictus から実際restrictus から抽出した菌分泌成分，菌体外成分，菌に産生されていることが証明された．

表２

相同性検索により得られたAspergillus restrictus 由来候補アレルゲン（ARAC）
相同アレルゲン

候補アレルゲン名称

由来真菌種

Identity%E-value

ARAC1

Asp f 1290.20.0

Asp f 18

Aspergillus fumigatus
Aspergillus fumigatus

ARAC2
ARAC3

77.70.0

Asp f 23

Aspergillus fumigatus

90.70.0

ARAC4

Pen c 19

Penicillium citrinum

93.90.0

ARAC5

Pen ch 35

80.90.0

ARAC6

Asp f 3

Penicillium chrysogenum
Aspergillus fumigatus

81.0

6.0x10-102

図１

ARACの作出およびIgE結合性の検出

Ａ：精製済みARAC1～6のSDS-PAGE泳動像（CBB染色）．
Ｂ：ウ エスタンブロッティングを用いた精製済みARAC1～6とアレルギー性気管支肺真菌症（ABPM）患者血清中のIgEとの結合性評価．

図２ Aspergillus restrictus におけるARAC6の発現状況
A：各真菌エキス分画のSDS-PAGE泳動像（銀染色）．
B：抗ARAC6ウサギIgGを用いたウエスタンブロッティング．
Lane 1：A. restrictus 菌分泌成分エキス．Lane 2：A. restrictus 菌体外成分エキス．
Lane 3：A. restrictus 菌体成分エキス―5―３．作出された組換えアレルゲンの免疫学的性状解析ている可能性が示唆された．加えて，マウスモデルをARAC6はペルオキシゾーム膜タンパク質ファミ用いたアナフィラキシー試験を行うことで，ARAC6リーに属しており，このファミリー内では，Asp f 3のアレルギー誘発性を評価した．アレルゲンを皮下投（A. fumigatus ），Pen c 3（Penicillium citrinum ），与により感作し，IgE抗体価を上昇させた後，同じア

Cand a 3（Candida albicans ），Cand b 2（Candida

レルゲンを尾静脈内投与により曝露し，体温低下を指boidinii ），Mala f 2（Malassezia furfur ），Mala f 3が標としたアナフィラキシー症状を観察した．その結果，アレルゲンとして既にIUISに登録されている［9-13］．

陽性対照として用いたオボアルブミンおよびAsp f 3

また，RAST抑制試験および阻害ELISAによって，A.と同様に，ARAC6はマウスにおいてアナフィラキシー

restrictus とA. fumigatus の真菌エキス中には共通ア症状を引き起こした（図４）．ARAC6がA. restrictus

レルゲンが存在し，そのアレルゲンが主要アレルゲン独自のアレルゲンとしてアレルギー疾患の原因となるになっていると考えられている［14，15］．そこで，A.

ことが示唆された．

fumigatus の主要アレルゲンとして知られているAsp相同性検索より得られた候補アレルゲンである

f 3のアミノ酸配列に対して，81.0%の相同性を示した

ARAC6と既知アレルゲンであるAsp f 3のアライメ

ARAC6が同様の免疫学的性状を有しているか確認す

ント解析に，エピトープ予測ツール（Linear Epitopeる必要があった．

Prediction Based on Propensity Scale and SVM

ARAC6と同様にAsp f 3を作製し，46人のABPM（LEPS））を導入することで図５のような結果が得

患者血清を用いてIgE ELISAを行い，ARAC6およびられた．加えて，タンパク質の三次元構造予測ツー

Asp f 3の患者血清中IgEに対する結合性の陽性率を評ル（SWISS MODEL）を利用することで，エピトー価した．ABPM患者血清中のIgEに対し，ARAC6はプのアレルゲン表面上における立体構造を予測した

39.1%（18/46），Asp f 3は65.2%（30/46）とどちらも（図６）．その結果，N末端側37-45残基目のペプチド高い陽性率を示した（図３）．この結果から，ARAC6がARAC6およびAsp f 3の共有エピトープであり，Cがアレルギー患者においてアレルゲンとして認識され末端側150-160残基目のペプチドはAsp f 3特異的な図３

図4

 常者およびABPM患者のARAC6およびAsp f
健3に対するIgE抗体価

健常者（17名）およびABPM患者（46名）の血清を用いて，IgE ELISAを行った．太線は各群の平均値，破線はカットオフ値を示す．カットオフ値には17名の健常者血清における平均吸光度の２倍値を使用した．統計にはT検定を用いた．
―6―

ARAC6およびAsp f 3のアレルギー誘発性

各アレルゲン曝露15分後の体温変化をアナフィラキシー反応の指標とした．OVA：オボアルブミン感作後，オボアルブミン曝露．ARAC6：ARAC6感作後，ARAC6曝露．Asp f 3：Asp f 3感作後，Asp f 3曝露．
棒線は各群の平均値を示す．陰性群と各群を比較した際の統計にはMann-Whitney検定を用いた（a：p <．
0.05，b：p < 0.1）

図５

ARAC6およびAsp f 3のアミノ酸配列におけるアライメント解析

Linear Epitope Prediction Based on Propensity Scale and SVM（LEPS）により予測されたエピトープを灰色で示す．
体についてはNGS解析が頻繁に行われ，病原遺伝子や薬剤耐性遺伝子の同定，ワクチンデザインを目的とした抗体結合部位の特定などのために解読されたゲノムDNAが利用されている［16］．しかし，Aspergillus 属のような真菌のゲノムサイズは30 Mb前後と大きく，A. fumigatus，A. oryzae，A. nidulans など，限られた菌種でしかゲノムは解読されていない［17，18］．また，解読されたゲノムDNAにより一部のAspergillus 属真菌で代謝に関与する遺伝子やアレルゲン遺伝子の予測が行われ始めているものの，その遺伝子がコードするアレルゲン自体の評価は行われていなかった［19-21］．
もちろん，解読されたゲノムDNAを用いて，本総説で述べた同定法を行うことはできるが，実際に転写さ WISS MODELを用いたARAC6およびAsp f 3
Sの三次構造予測れているmRNAを特定できる点，スプライシング後LEPSにより予測されたエピトープを灰色で示す．
Ａ：ARAC6における予測リボンモデル．
Ｂ：Asp f 3における予測リボンモデル．
Ｃ：ARAC6における予測表面表示モデル．
Ｄ：Asp f 3における予測表面表示モデル．

析した本同定法の方がより効率的かつ信頼できる手法

図６の塩基配列を得られる点において，mRNAをNGS解になると考えられる．この手法は，真菌だけでなく植物や動物由来のアレルゲン，さらにはアレルゲン以外の病原性タンパク質の同定にも広く応用できるゴールドスタンダードになると予測される．

エピトープであることが考えられた．このことは，
謝ARAC6がアナフィラキシー試験においてAsp f 3に匹辞敵するアレルギー誘発性を有していたにもかかわら本稿を遂行するにあたり，多大なるご指導を賜りまず，IgE ELISAにおいてAsp f 3よりも低い陽性率をした岩手大学農学部共同獣医学科 獣医公衆衛生学研示した現象を裏付けている．これらのエピトープ予測究室 鎌田洋一教授ならびに山﨑朗子博士に心から深や三次元構造予測といったバイオインフォマティクス謝いたします．

を利用した解析を，本総説で述べたNGS解析による網引用文献

羅的アレルゲン同定法に組み込むことで，より信頼性の高いシステムが実現されると期待する．

［１］B . Simon-Nobbe, U. Denk, V. Pöll：Thespectrum of fungal allergy., Int. Arch. Allergy
Immunol, 145, 58-86（2008）４．バイオインフォマティクスを利用した病原性タン
パク質検索の展望［２］H.F. Kauffman, J.F.C. Tomee, M.A. van de Riet：

本総説では，病原性タンパク質の検索と同定の新しProtease-dependent activation of epithelialい手法として，NGS解析を利用した真菌由来アレルゲ

cells by fungal allergens leads to morphologicンの網羅的同定法を提案した．近年では，特にウイル

changes and cytokine production, J. Allergy

スや細菌などゲノムサイズが5 Mb未満と小さい病原Clin. Immunol, 105, 1185-1193（2000）―7―

［３］L . V a i l e s , S . S r i d h a r a , O . C r o m w e l l ：［13］H . Yasueda, T. Hashida-Okado, A. Saito：

Quantitation of the major fungal allergens,

Identification and cloning of two novel allergens

Alt a 1 and Asp f 1, in commercial allergenic

from the lipophilic yeast, Malassezia furfur.,products, J. Allergy Clin. Immunol, 107, 641-646

Biochem. Biophys. Res. Commun, 248, 240-4（2001）（1998）［４］S. Paris, C. Fitting, E. Ramirez：Comparison［14］T. Sakamoto, K. Ito, M. Yamada：Allergenicof different extraction methods of Alternaria

relationships between Aspergillus restrictus

allergens, J Allergy Clin Immunol, 85, 941-948

and Aspergillus fumigatus determined by（1990）

radioallergosorbent test inhibition, Japanese［５］R . Crameri, S. Zeller, A.G. Glaser：Crossreactivity among fungal allergens: A clinically

Soc. Allergol, 40, 1320-1326（1991）［15］T. Itabashi, T. Hosoe, N. Toyasaki：Allergen

relevant phenomenon?, Mycoses, 52, 99-106

activity of xerophilic fungus, Aspergillus（2009）

restrictus, Japanese Soc. Allergol, 56, 101-108（2007）［６］R . V a l e n t a , B . L i n h a r t , I . S w o b o d a ：Recombinant allergens for allergen-specific［16］F . Luciani, R.A. Bull, A.R. Lloyd：Next

immunotherapy: 10 years anniversary ofgeneration deep sequencing and vaccine design:

immunotherapy with recombinant allergens,today and tomorrow, Trends Biotechnol, 30,

Allergy Eur. J. Allergy Clin. Immunol, 66, 775-443-452（2012）

783（2011）［17］M . Machida, K. Asai, M. Sano：Genomesequencing and analysis of Aspergillus oryzae,［７］B . Singh, G.L. Sharma, M. Oellerich：Novelcytosolic allergens of Aspergillus fumigatus
identified from germinating conidia, J. Proteome

Nature, 438, 1157-1161（2005）［18］J.E. Galagan, S.E. Calvo, C. Cuomo：Sequencingof Aspergillus nidulans and comparative

Res, 9, 5530-5541（2010）

analysis with A. fumigatus and A. oryzae,［８］T. Sakamoto, K. Ito, M. Yamada：Allergenicityof the osmophilic fungus Aspergillus

Nature, 438, 1105-1115（2005）

restrictus evaluated by skin prick test and［19］W .C. Nierman, A. Pain, M.J. Anderson：

radioallergosorbent test, Japanese Soc. Allergol,

Genomic sequence of the pathogenic andallergenic filamentous fungus Aspergillus

39, 1492-1498（1990）

fumigatus., Nature, 438, 1151-1156（2005）［９］S . Hemmann, C. Ismail, K. Blaser：Skintest reactivity and isotype-specific immune［20］H.J. Pel, J.H. de Winde, D.B. Archer：Genomeresponses to recombinant Asp f 3, a major

sequencing and analysis of the versatile cellallergen of Aspergillus fumigatus, Clin. Exp.

factory Aspergillus niger CBS 513.88, Nat.

Allergy, 28, 860-867（1998）

Biotechnol, 25, 221-231（2007）［10］H . D . S h e n , C . W . W a n g , H . C h o u ：［21］P . Bowyer, M. Fraczek, D.W. Denning：

Complementary DNA cloning and immunologic

Comparative genomics of fungal allergens

characterization of a new Penicillium citrinum

and epitopes shows widespread distribution

allergen（Pen c 3)., J. Allergy Clin. Immunol,of closely related allergen and epitope

105, 827-33（2000）

orthologues., BMC Genomics, 7, 251（2006）［11］H . C h o u , M . F . T a m , C . - Y . C h a n g ：Characterization of a novel Candida albicans
29 kDa IgE-binding protein--purification, cDNA
isolation and heterologous expression of Cand a3., Allergy, 58, 1157-1164（2003）［12］L.J. Garrard, J.M. Goodman：Two genes encode
the major membrane-associated protein of
methanol-induced peroxisomes from Candida

boidinii, J. Biol. Chem, 264, 13929-13937（1989）―8―